(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の２，４−ジクロロフェノール、チウラム、トリフェニルスズクロライド（ＩＶ）、チオベンカルブ、硫酸銅（ＩＩ）またはジメチルスルホキシドを検出する方法であって、
（１）
（i）ＳＤ培地、グルコースおよびアミノ酸（アデニン、ヒスチジンおよびトリプトファン）
（ii）ＳＤ培地、グルコースおよびアミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびウラシル）
（iii）ＳＤ培地、グルコースおよびアミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびメチオニン）
（iv）ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）および
（v）ＳＤ培地、ガラクトースおよびアミノ酸（アデニン、ヒスチジンおよびトリプトファン）
それぞれに、検出すべき化学物質を含む被検試料を添加し、
（２）YBR072Wのプロモーターをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されている酵母を（１）の各培養培地に播種して一定期間培養し、
（３）各々の培養培地の組成の違いにより該酵母が該被検試料中の化学物質に対して示す該マーカータンパク質の発現レベルの差異を指標化し、ついで
（４）該指標化された該マーカータンパク質の発現レベルの差異に基づいて該被検試料中の化学物質を検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物を用いた化学物質の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人類がこれまでに作りだした化学物質は膨大な数にのぼり、さらに年々新しい化学物質が開発されている。これら化学物質は現代生活のあらゆる面で利用され、人類の生活向上に役立っている。その反面、化学物質の中には、その製造、流通、使用、廃棄等の様々な段階で環境中に放出され、環境中での残留、食物連鎖による生物学的濃縮などを通じ、人の健康や生態系に有害な影響を及ぼすものがあり、環境汚染は社会問題化している。よって、化学物質について人体や生態系に与える影響を評価する要請がある。
その評価方法として、従来、主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標とするバイオアッセイが行われている。しかし、これらの方法は、環境中の化学物質による毒性の有無が判定できるに過ぎない。環境中の化学物質による毒性の有無のみならず、毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定するアプローチとして、種々の濃度の複数種の指標化学物質とその存在下における複数種の指標微生物の生育状態との関係付けを利用する手法が報告されている（特許文献１：特開２００１−２３８６９４）。また、特定の毒性指標（エンドポイント）を検出するために開発されたバイオアッセイ法もある。例えば、既知発がん性物質の９割以上が陽性となる遺伝子突然変異試験であるames法（非特許文献１：「生理活性物質のバイオアッセイ」、講談社、1989第３刷、p.319）、および内分泌撹乱物質のスクリーニングのため、生体内ホルモンが受容体に結合したときに起きる遺伝子転写活性を測定する試験法（非特許文献２：Yamasaki K, Takeyoshi M, Yakabe Y, Sawaki M, Imatanaka N, Takatsuki M.: Comparison of reporter gene assay and immature rat uterotrophic assay of twenty-three chemicals. Toxicology. 2002 Jan 15;170(1-2):21-30.）である。しかし、これらの方法は、特定の毒性を有する化学物質の検出には有効ではあるが、その毒性指標以外の毒性を有する化学物質の検出を行うことは出来ない。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００１−２３８６９４号公報
【非特許文献１】
「生理活性物質のバイオアッセイ」、講談社、1989第３刷、p.319
【非特許文献２】
Yamasaki K, et al., Toxicology. 2002 Jan 15;170(1-2):21-30.
【非特許文献３】
Mao X, et al., Curr Microbiol 2002 Jul;45(1):37-40
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環境中の化学物質に関する詳細な情報を得るための、即ち環境中の化学物質による毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定するための、新たな方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Staib P, Moran GP, et al. J Bacteriol 2001 May; 183(9):2859-65 等に記載されているレポーター・ジーン・アッセイを用いた化学物質の毒性評価の際に、微生物の生育に用いる培養培地の組成を変えることによって化学物質に対する微生物の応答が異なることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は一つの態様として、微生物を生育させる培養培地におけるアミノ酸組成および／または糖組成の違いにより、微生物が化学物質に対して示す応答の差異を指標に用いることを特徴とする、化学物質を検出するための方法を提供する。
本発明の化学物質検出方法においては、被検試料について指標化された微生物応答に対して照合されるデータベースが重要である。本発明は別の態様として、そのようなデータベースおよびその使用方法を提供する。
なお、Mao X, Hu Y, Liang C, Lu C. Curr Microbiol 2002 Jul;45(1):37-40（非特許文献３）には、培地中のメチオニン濃度がMET3(YJR010w) 遺伝子の発現に及ぼす影響をMET3プロモーターのレポーター・ジーン・アッセイ（βgalの発現）により確認したことが記載されている。MET3遺伝子は細胞外の硫酸塩（sulfate）からメチオニンを合成する酵素をコードする遺伝子であることが知られている(MIPSのhttp://mips.gsf.de/proj/yeast/CYGD/db/index.htmlに掲載)。よって、非特許文献３はMET3遺伝子がコードする酵素から産生されるメチオニンがMET3遺伝子自身の発現に与える影響を単に確認するものであり、ここでの遺伝子の発現変動は、生合成または分解に直接関与する酵素産物によるものである。
他方、本発明はアミノ酸や糖の有無という培地環境により化学物質に対する遺伝子の発現状態が変動することを発見し、それを基礎とするものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の化学物質検出方法を行うには、通常、被検試料について指標化された微生物応答に対して照合されるデータベースが用いられる。
Ｉ．データベース
本発明のデータベースを作成するには、
（１）種々のアミノ酸組成および種々の糖組成を有する培養培地それぞれに特定の毒性物質を、好ましくは、生育に最小限必要なアミノ酸を有する培地に１種またはそれ以上のアミノ酸および１種またはそれ以上の糖を補充し、得られた培地に特定の毒性物質を添加することにより複数の培養培地を調製し、
（２）個々の得られた培養培地において微生物を一定期間培養し、
（３）個々の培養培地における微生物が示す応答の差異をそれぞれ指標化し、そして
（４）得られた指標をデータとしてまとめる。
このようにして作成されるデータベースは以下の実施例に示す表の形成として、あるいは電子情報化された形式としてまとめることができる。電子情報化されたデータベースはコンピューター等に入力すれば、被検試料から得られるデータとの照合に当たり簡便に利用できる。この態様において、本発明は、本発明のデータベースが入力された装置をも提供する。
【０００８】
データベース作成に用いる「培養培地におけるアミノ酸組成および糖組成」は、天然に存在する野生株や恒常的な組換え体を微生物として用いる場合、生育速度の速い栄養豊富な一般的な培地の組成である。他方、ベクター、プラスミドを用いた一過的な組換え体を微生物として用いる場合、プラスミドを保持させるための選択圧として最小栄養培地を用いるのが普通である（Gupta JC, Mukherjee KJ.: Biotechnol Bioeng 2002 Jun 5;78(5):475-88）。
【０００９】
本発明に用いられる培地として次のものを挙げることができる：
１．YPD培地：  組成（１L中）酵母エキス10g  1%(w/v)、ポリペプトン20g  2%(w/v)、グルコース20g  2%(w/v)
これは、富栄養培地であり、通常の培養に用いられる。アミノ酸も豊富に入っている。
２．SD培地：  組成（１L中）：yeast nitrogen base without amino acids(Difco.0919-15-3)6.7g  0.67%(w/v)、グルコース20g  2%(w/v)
これは、合成選択培地であり、アミノ酸は含まれていない。菌株の栄養要求性をチェックしたり、形質転換体を選択する際に使用される。栄養要求性株の場合は必要に応じて１種以上のアミノ酸を添加して用いる。最小栄養培地と呼ぶ場合もある。
本発明ではＳＤ培地に表１に示す種類と濃度のアミノ酸を添加する、もしくは上記のＳＤ培地のグルコースの代わりとして他の種類の糖、例えばガラクトース、ラフィノースを加え、表１に示す種類と濃度のアミノ酸を添加する。
【表１】
0004501346.tif 000002
出典：酵母ラボマニュアル  酵母分子細胞生物学実験法  シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社 1998 pp.5-6
【００１０】
本発明では、微生物として酵母Saccharomyces cerevisiae W303株 (American Type Culture Collection  ATCC 2001239) にLEU2遺伝子を挿入しさらにURA3遺伝子を有するプラスミドで形質転換したものを用いる場合、SD培地にアデニン、ヒスチジン、トリプトファンを添加した培地を基本とし、これに種々のアミノ酸を添加するのが、好ましい。
この態様における、本発明に用いられる培地の具体例を以下に示す。
ａ）合成選択培地にアミノ酸を添加する例
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、ウラシル）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-アルギニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-アスパラギン酸）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-グルタミン酸）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-ロイシン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-リシン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-メチオニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-フェニルアラニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-セリン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-トレオニン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-トリプトファン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-チロシン）
・SD培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン、L-バリン）
ｂ）SD培地の糖組成としてグルコースの代わりにガラクトース、もしくはラフィノースを加えたもの
・SD培地＋ガラクトース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン）
・SD培地＋ラフィノース＋アミノ酸（アデニン、L-ヒスチジン、L-トリプトファン）
【００１１】
ｃ）  富栄養培地
・YPD培地
【００１２】
データベース作成に当たり、上記組成の培地のなかから、好ましくは５から１０個程度を選択する。
【００１３】
データベース作成に用いる培養培地に添加する「毒性物質」は、農薬、医薬品、染料、塗料、接着剤等の産業用途を有し環境に放出され可能性の高い化学物質および消毒・焼却の過程により非意図的に生成される化学物質であり、毒性を有することが懸念されるものである。これらの物質の毒性作用として、内分泌撹乱物作用、変異原性、発がん性、遺伝毒性、生態毒性、免疫毒性、細胞機能障害毒性等が知られている。
【００１４】
具体的な「毒性物質」としては例えば、表２に示すものが挙げられる。
【表２】
0004501346.tif 000003
【表３】
0004501346.tif 000004
【００１５】
他の具体例として、以下の表３に示すものが挙げられる。
【表４】
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【表５】
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【表６】
0004501346.tif 000007
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
0004501346.tif 000013
【表１３】
0004501346.tif 000014
【００１６】
データベース作成の際には、添加に際し選択する毒性物質は多ければ多い方が良いが、好ましくは２０から３０個程度、上記毒性物質のなかから選択する。
用いる毒性物質の濃度は、用いる微生物の生育を阻害するが、死滅に至らない濃度であり、通常個々の毒性物質のＩＣ５０値を用いる。生物を用いた実験はその結果がばらつく。よって、ＩＣ５０値を求める場合も３回以上の実験を行いその平均値を算出する。そこで、生物由来の実験誤差を無くする為に、データーベース作成時に細胞の生育に影響を与える濃度条件を決定するという方法が考えられる。
微生物が酵母の場合、毒性物質の濃度は次のようにして決定することもできる。毒性物質の希釈系列を作成し、初期の対数増殖期にある細胞（OD660=0.2〜0.5）に負荷し、さらに25℃で４時間培養する。この時、毒性物質を負荷しない細胞も同様に培養し対照区とする。２時間後、各濃度の毒性物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、２日後にCFUを測定する（毒性物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料のCFUをCFU-contと呼ぶ）。試料の残りはデータベース作成用の計測に供し、事後に決定した最適条件のもののみをデータとして用いる。
毒性物質添加直前に培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種する。同様に、２時間後に各濃度の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、２日後にCFUを測定する（化学物質負荷直前の試料のCFUをCFU-before、毒性物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料のCFUをCFU-contと呼ぶ）。酵母の倍加時間（doubling time）は2時間程度なので、CFU-contは通常CFU-beforeの２倍程度になる。異なる濃度の毒性物質を負荷した場合、細胞の増殖に影響を与える程度のCFU、すなわちCFU-contの50%以上の濃度、望ましくは75.5%に近くなる濃度を毒性物質の濃度として選択する（細胞が死滅する濃度ではCFUは0%であり、生育に影響を与えない濃度ではCFUは対照区と等しく100%となる）。
【００１７】
データベース作成に用いる「培養培地」の調製は当業者に周知である。例えば、上記のとおり種々選択した組成の溶液を、121℃、20分間オートクレーブすることにより滅菌する。アミノ酸は個々に高濃度の水溶液を作成し滅菌したものを用意し、必要に応じて最終濃度が上記表１となるように添加する。毒性物質は水またはジメチルスルホキシドに溶解し、最終濃度は前述の様に希釈系列を作成して実験を行う、もしくは事前に測定したIC50濃度になるように培地に添加する。
【００１８】
データベース作成に用いる「微生物の培養」は通常、４時間、２５℃にて行う。
【００１９】
データベース作成に用いる「微生物」は、天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞、および大腸菌等の細菌細胞の何れであっても良い。ここに、野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物であり、例えばW303は栄養要求性等について組換えされているが、それ以上の組換えはされていない。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。
天然に存在する細胞もしくは樹立された細胞株を形質転換せずに用いた場合、データベース作成に用いる「微生物が示す応答」は毒性物質の存在下に変動する遺伝子のｍＲＮＡレベルである。ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック  改定第２版、羊土社、2000, pp299-301）、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊 Tipsシリーズ  改定PCR Tips, 秀潤社、1999, pp25-43）等によって測定できる。
ここに、「毒性物質の存在下に変動する遺伝子」は、酵母細胞の場合、公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されている酵母遺伝子の中から適宜選択し、これらはインターネットを介して知ることができる。好ましい遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子である。例えば、YKL071W、YCR102C、YOR382W、YLL057C、YLR303W等である。
【００２０】
データベース作成に用いる「微生物」はまた、上記天然に存在する細胞の組換え体、即ち形質転換体とすることができる。本発明に用いる形質転換体は、上記「毒性物質の存在下に変動する遺伝子」のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して得られるポリヌクレオチド構築物を含むベクターを上記天然に存在する細胞に導入することにより調製できる。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は周知である（例えばR.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp138-165, pp.234-263, 2000を参照）。
【００２１】
プロモーターの配列に関連し、例えば酵母を用いる場合、酵母の全DNA配列は明らかにされているので、公共のデータベース（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae）を用いることにより、プロモーターを含む酵母遺伝子配列を得ることができる。
マーカータンパク質の例としてはGFP（Green  Fluorescence  Protein）（Heim, R., Cubitt, A. B. and Tsien, R. Y.（1995） Nature 373, 663-664；Heim, R., Prasher DC. and Tsien, R. Y.（1994） Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504；Warg, S. and Hazerigg, T.（1994）Nature 639, 400-403；Youvan, D.C. and Michel-Beyerle, M.E.（1996）Nature Biotechnology 14 1219-1220；Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. and Prasher, D.C.（1994）Science 263, 802-805）、β-ガラクトシダーゼ（Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez-Duarte R. Endogenous beta-galactosidase activity in amphioxus: a useful histochemical marker for the digestive system.Dev Genes Evol 2001 Mar 211(3):154-6）、ルシフェラーゼ（Arch Toxicol 2002 Jun;76(5-6):257-61、Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg B.)、及びアセチルトランスフェラーゼ（J Recept Signal Transduct Res 2001 Feb;21(1):71-84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activity and its use in studies of steroids and steroid receptors.  Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M.)等が挙げられる。
【００２２】
ベクターの調製は、例えば酵母細胞の場合、酵母において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し、次いでプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをマーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより行うことができる。
形質転換体は周知の手法により調製できる。例えば、酵母細胞を形質転換する方法は、Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) pp.133-134,1994に記載されている。
形質転換体を用いた場合、本発明のデータベース作成に用いる「微生物が示す応答」はマーカータンパク質の発現レベルである。マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定することにより得られる。例えばマーカータンパク質がＧＦＰの場合、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しなくても直接、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による画像処理、フローサイトメトリーによる計測、エバネッセント光による計測、さらに比色計などを用いた検出方法により、細胞の蛍光（GFP）もしくは発色（β-gal）を測定できる場合もある。
【００２３】
好ましい形質転換体は、酵母遺伝子のプロモーターをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されている酵母、または染色体のORFをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドで置換するように形質転換されている酵母であり、さらに好ましくは、その酵母遺伝子がミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子のなかから選ばれるものである。
【００２４】
データベース作成に用いる「微生物が示す応答の差異の指標化」を、マーカータンパク質としてGFPを用いた場合を例として以下に説明する。
毒性物質と接触後、マーカータンパク質の発現レベルを上記のようにして測定する。酵母細胞を生理食塩水で洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行い、フローサイトメトリー（例えばEPICS XL：ベックマンコールター）を用いて一回の実験につき10000個の酵母細胞の蛍光を計測し、これらの細胞の蛍光強度の平均値を得る。対照区の蛍光強度の平均値との比を求め、例えばその比が１．５以下であれば「−」、１．５−２．０であれば「＋」、２以上であれば「＋＋」などと指標化する。
【００２５】
上記の通り、得られたデータは、表または電子情報化された形式としてまとめ、データベースとすることができる。
【００２６】
本発明は、上記のようにして作成された本発明データベースの使用方法であって、微生物を生育させる培養培地におけるアミノ酸組成および／または糖組成の違いにより、微生物が化学物質に対して示す応答の差異を指標に用いることを特徴とする化学物質を検出するための方法において、指標化された応答に対して照合する、該データベースの使用方法をも提供する。
【００２７】
２）化学物質の検出方法
本発明はさらに、微生物を生育させる培養培地におけるアミノ酸組成および／または糖組成の違いにより、微生物が化学物質に対して示す応答の差異を指標に用いることを特徴とする、化学物質を検出するための方法に関する。詳細には、被検試料中の化学物質を検出するための微生物を用いる方法であって、
（１）本発明のデータベースを作成するのに用いた培養培地におけるアミノ酸組成および糖組成と同じ組成を有する複数の培養培地にて、該被検試料の存在下、微生物を培養し、
（２）個々の培養培地における微生物が示す応答の差異をそれぞれ指標化し、
（３）指標化された応答の差異を、該データベースの指標と照合し、
それにより、該データベースにおける指標と同じ指標を示す該被検試料中の化学物質を検出する方法に関する。
【００２８】
本発明はまた、被検試料中の化学物質を検出するための微生物を用いる方法であって、
（１）種々のアミノ酸組成および種々の糖組成を有する培養培地それぞれに特定の毒性物質を添加した複数の培養培地を調製し、
（２）個々の得られた培養培地にて、該被検試料の存在下、微生物を一定期間培養し、
（３）個々の培養培地における微生物が示す応答の差異をそれぞれ指標化し、
（４）指標化された応答の差異を基準として、該被検試料中の化学物質を検出する、ことを特徴とする方法に関する。
【００２９】
本発明の化学物質の検出方法において「培養培地のアミノ酸組成および調製」、「毒性物質」、「微生物およびその培養」、「微生物が示す応答の差異およびその指標化」は、上記本発明のデータベース作成の説明と同様である。
【００３０】
上記の通り、本発明は、微生物の生育に用いる培養培地の組成の違いにより化学物質に対する微生物の応答が異なるという発見を基本とする。本発明の化学物質検出方法は、培養培地の組成を変えることにより、検出可能な化学物質の種類を増やすことが可能である。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３２】
参考例１
レポーター・ジーン・アッセイ
酵母遺伝子YBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiaeにて開示）をPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，SequencherIマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は、
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCA      （配列番号１）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
GGGGTACCCCGTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG       （配列番号２）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い、試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat no:V825-20, Invitrogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ 遺伝子操作の原理 原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチドはベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分（配列番号３）を用いた。まず、ｐYES2の多重クローニング部位（multiple cloning site）の中にＧＦＰのポリヌクレオチドを挿入したベクターを作成した。次いで、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を酵母遺伝子であるYBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドと置換し、目的とするプラスミドベクターを得た。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの挿入操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【００３３】
次に、このプラスミドベクターで酵母Saccharomyces cerevisiae W303（American Type Culture Collection  ATCC 2001239）を形質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
１）酵母細胞Saccharomyces cerevisiae W303をYPD培地200mlにてOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferに懸濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250μLを添加する。
４）300μｌずつ分注し10μlの上記プラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700μｌの５０％PEG4000を添加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビトールで２回洗浄する。
８）最小栄養培地（SD培地に必要なアミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）を加えたもの）で作成した寒天プレートに播種する。
【００３４】
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
得られた形質転換体はＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）上にて４８時間まで安定に当該プラスミドを保持していることを確認した。
【００３５】
実施例１
化学物質負荷実験
参考例１にて調製した形質転換体を以下の表４に示す濃度の各化合物と、下記の培養条件下にて接触させる。
【表１４】
表４
酵母Ｗ３０３の生育能に対する化学物質の効果（ＩＣ５０）
化学物質                                    濃度      
（１）２−アミノアントラセン                            33.3 mM
（２）ベンゾ（ａ）ピレン                                 0.2 mM
（３）ビスフェノールＡ                                   0.4 mM
（４）フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）                  83.3 mM
（５）２，４−ジクロロフェノール                         0.3 mM
（６）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸                     0.3 mM
（７）ホルムアルデヒド                                   0.2 mM
（８）塩化メチル水銀                                     0.2 μM
（９）４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド                 0.6 μM
（１０）ｐ−ノニルフェノール                            10 μM
（１１）ペンタクロロフェノール                          50 μM
（１２）亜ヒ酸ナトリウム                                 0.3 mM
（１３）チウラム                                        20 μM
（１４）トリブチルスズクロライド                         0.4 μM
（１５）２，４，５−トリクロロフェノール                30 mM
（１６）Ｔｒｐ−Ｐ−２（酢酸塩）                         0.2 mM
（１７）パラコート                                      16.7 mM
（１８）塩化カドミウム                                  40 μM
（１９）リンダン                                         6.7 mM
（２０）マラチオン                                      22.2 mM
（２１）マネブ                                           0.8 mM
（２２）塩化ニッケル（ＩＩ）                             3.3 mM
（２３）重クロム酸カリウム（ＶＩ）                       0.3 mM
（２４）トリフェニルスズクロライド（ＩＶ）              10 μM
（２５）フェノール                                       5.6 mM
（２６）チオベンカルブ                                   0.7 mM
（２７）ヘキサクロロフェン                              30 μM
（２８）トリクロサン                                   730 μM
（２９）塩化水銀（ＩＩ）                                50 μM
（３０）硫酸銅（ＩＩ）                                   3.3 mM
（３１）シアン化カリウム                                16.7 mM
（３２）ジメチルスルホキシド                             3.7 %    
ＩＣ５０はYPD培地およびSD培地にて測定し、それらはほとんど等しいことを確認した。
【００３６】
培養条件
培養培地の組成
１．ＳＤ培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15)）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）；
２．ＳＤ培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル）
３．ＳＤ培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）
４．ＳＤ培地＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン）
５．ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）；および
６．ＳＤ培地＋ガラクトース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン）；
【００３７】
必要なアミノ酸を加えたSD培地10mlに凍結保存した形質転換体を白金耳で掻き取り、２５℃で振とう培養し、フルグロース（(定常状態まで増殖されそれ以上細胞数が増えない状態）させる。各培地１０mlにフルグロースさせた細胞けん濁液を50ul加え、２５℃で振とう培養し、OD660が0.2から0.5になった時点で化学物質を負荷する。化学物質負荷から４時間後、酵母細胞を生理食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行いフローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）を用いて一回の実験につき10000個の酵母細胞の蛍光を計測し、これらの細胞の蛍光強度の平均値を得た。対照区の蛍光強度の平均値との比を求め、指標化した。
得られた結果を表５に示す。表中、対照区に対し、蛍光強度が1.5倍以下を−、1.5倍以上2.0倍未満を＋、2.0倍以上を＋＋と表記した。
【００３８】
【表１５】
0004501346.tif 000015
【表１６】
0004501346.tif 000016
【００３９】
上記により、同じ形質転換体を用いても培養する培地の組成に応じて個々の化学物質に対する形質転換体の生育状態が変動することが証明された。本発明は、実施例記載のようにして作成される上記表５のデータを、データベースの一態様として提供する。
【００４０】
実施例２
被検試料中の化学物質検出
被検試料について、実施例１と同様、各組成を有する培養培地に添加し、同形質転換体を培養し、そしてその生育状態を上記基準に従って指標化することで指標のパターンを得る。それにより、同じパターンを示す化学物質が特定でき、被検試料中に存在し得る化学物質が推定される。
被検試料中に複数の化学物質が含まれる場合、毒性の種類の組合わせによって微生物が示す応答は相加もしくは相乗されることがある。しかし、実際的には同じ影響濃度の複数の化学物質という条件は非常に稀であるため、一番毒性の強い状態の化学物質が検出されると考えられる。
被検試料中に存在する化学物質の濃度が薄いと遺伝子発現は対照区と変化無いし、濃いと細胞が死滅するので遺伝子が発現しない。よって、IC50付近が本発明にとって好適な濃度である。
【００４１】
被検試料について好適な濃度を決定する方法
１．事前に濃度を決定しておく方法
被検試料が低濃度の場合は濃縮し、希釈系列を作り、高濃度の場合は希釈系列を作り、実験を行う。
希釈系列の試料を作成し、フルグロースの細胞を最小栄養培地で200倍に希釈した溶液に負荷する。２時間置きに４８時間までOD660を測定する。このとき、細胞の生育に影響を与えるが死滅しない濃度で、細胞の生育を５０％程度阻害する濃度を選択してIC50とする。
【００４２】
２．化学物質検出と同時に濃度を決定する方法
また、以下の様にしてＣＦＵを計測することで、好適な濃度を選ぶことができる。
化学物質添加直前に培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種する。同様に、２時間後に各濃度の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りYPD寒天培地に播種し、２日後にCFUを測定する（化学物質負荷直前の試料のCFUをCFU-before、化学物質負荷試料のCFUをCFU-chem、および対照区の試料のCFUをCFU-contと呼ぶ）。酵母のdoubling timeは2時間程度なので、CFU-contは通常CFU-beforeの２倍程度になる。異なる濃度の化学物質負荷した場合、細胞の増殖に影響を与える程度のCFU、すなわちCFU-contの50%以上95%以下の濃度、望ましくは75.5%に近くなる濃度を化学物質の濃度として選択する（細胞が死滅する濃度ではCFUは0%であり、生育に影響を与えない濃度ではCFUは対照区と等しく100%となる）。各濃度の化学物質を添加した細胞は、化学物質添加４時間後に生食塩水で１回洗浄し、その後５％ホルマリンを含む生理食塩水で固定を行い冷蔵保存しておき、上記の手順で適当な濃度を選択した後にデータを収集する。CFUを測定する替わりに、生細胞のみを染色する染色法を用いて、生細胞をカウントするという方法も考えられる。
【００４３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> DAIKIN INDUSTRIES, LTD.
<120> Method for Detecting Chemical Substance with Microorganism
<130> 187131
<160> 3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcagtcaacg aggagcgaat ca                                              22
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggggtacccc gttaatttgt ttagtttgtt tg                                   32
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> Aequorea victoria
<400> 3
atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat     60
ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac    120
ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca    180
ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa    240
cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc    300
ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt    360
gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggcaacat tctgggacac    420
aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat    480
ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca    540
gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat    600
tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc    660
cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga    720