(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン診断マーカーとして用いるためのエキソン３領域が欠失したＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ変異断片またはＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ変異断片。
【請求項２】
ガン診断マーカーとして用いるためのエキソン３領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質。
【請求項３】
（ａ）Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３ＤＮＡ断片及び（ｂ）Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン１、２、４及び５ＤＮＡ断片のうちの一つ以上の断片が結合したガン診断用マイクロアレイ。
【請求項４】
エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する抗体を有するガン診断剤。
【請求項５】
エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する抗体を有するガン診断用キット。
【請求項６】
エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する抗体が結合したガン診断用マイクロアレイ。
【請求項７】
（ａ）哺乳類の組織又は細胞試料からＧ−ＣＳＦ核酸試料を得る段階、（ｂ）得られたＧ−ＣＳＦ核酸試料を増幅する段階及び（ｃ）増幅した試料からＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の欠失を確認する段階を含むことを特徴とするエキソン３欠失Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の確認方法。
【請求項８】
哺乳類由来の組織又は細胞試料中から、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３に対応するアミノ酸配列の欠失を確認する段階を含むことを特徴とするＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の確認方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（granulocyte colony stimulating factor, G-CSF）遺伝子の変異特性を用いてガンを診断する方法に関するものである。具体的に、本発明はガン診断用マーカーであって、Ｇ−ＣＳＦであらわれるエキソン３の欠失について遺伝子又はタンパク質のレベルで分析することによって、ガンが発生するか否かを予測乃至診断する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現代社会において、各種事故を除いた成人の死亡原因の１、２位を争っている致死的疾患であるガンにおいて、その初期診断及び根源的治療法の開発が重要な課題となっている。一般的に末期状態のガンは治療がほとんど不可能であるのに対し、初期状態のガンは治療率が非常に高く、治療方法もかなり簡単であると知られている。従って、正確かつ迅速な診断方法の開発が切実に要求されている。
【０００３】
現在、一般的に行われているガンの診断は、（１）光学顕微鏡、電子顕微鏡などを用いて形態学的に分析する形態学的診断、（２）ガンの組織内で発現する特定のタンパク質を分析する免疫組織化学的診断（参考：Iran. Biomed. J. 3 (3 & 4):99〜101, 1999; Lancet 2:483〜6, 1986）、（３）ガンの組織内であらわれる遺伝子の突然変異のような分子生物学的異常を分析する分子生物学的診断などの方法を用いてなされている。これらの方法中、形態学的診断や免疫組織学的診断の場合、分子生物学的診断と比べて非常に多くの時間がかかり、経済的な負担も非常に高い。分子生物学的方法はその作業が相対的に単純であり、いくつかの場合には短時間に結果が分かるので、現在新しい診断方法の開発研究の中心になっている。最近、中国の上海数康生物科技有限公司（HealthDigit Co., Ltd., Shanghai, China）が多様なガン診断用タンパク質チップシステムを開発し、世界で最初に中国医薬品安全庁から臨床診断の許可を受けたと言う報告もあった（参考：www.health-digit.com）。しかし、これもまた一つのバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）によりすべてのガンを診断する形態でなく、１０個以上の多くのタンパク質を用いる形態である。
【０００４】
上記のような方法の効率的な適用において最も重要なことは、ガンの発生についてより正確かつ容易に確認することができるガン診断マーカー（ｍａｒｋｅｒ）の選択及び使用である。ガン診断マーカーとしていくつかの遺伝子（参考：Steve M. et al., J. Clin. Oncology 20:3165〜3175, 2002; Sridlhar R. et al., J. Clin. Oncology 20:1932〜1941, 2002)又はタンパク質(参考：Goessl et al., Urology 58:335〜338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res Treat 66:217〜224, 2001；金・チョルキン等、大韓民国公開特許公報第２００１−００６１１７３号）が報告されており、この中で実際に診断に用いられる場合もある。既に用いられているガンに対するマーカーの場合、臓器特異性の低いＣＥＡ、ＢＦＰ、ＴＰＡ、ＩＡＰなどのマーカーの場合は感度が落ちて偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のおそれがあるのに対し、臓器特異性の高いＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ ＩＩ、Ｅｓｔｅｒａｓｅ Ｉ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−１抗原、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ ２２５などのマーカーの場合は、当初から標的臓器を目的にして用いるときにのみ有用な短所があった。従って、ガンの診断において正確性だけでなく経済的であり、かつ簡単な診断のためにも多様な種類のガンを診断することができる新しいマーカーの開発が切実に要求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これによって、本発明者らは多様な種類のガンを診断することができるガン診断マーカーを開発するために鋭意研究した結果、ガン患者の場合、Ｇ−ＣＳＦの転写過程においてエキソン３の領域が欠失されていることを確認し、Ｇ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ変異断片又はタンパク質をガン診断マーカーとして用いることにより、多様なガン患者を簡単でかつ、経済的で、速く診断することができることを確認し、本発明を完成することになった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの観点で、本発明は、ガン診断マーカーとして用いるためのエキソン３の領域が欠失したＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ変異断片を提供する。
他の観点で、本発明は、ガン診断マーカーとして用いるためのエキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質を提供する。
また他の観点で、本発明は、（ａ）Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３ＤＮＡ断片及び（ｂ）Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン１、２、４及び５ＤＮＡ断片のうちの一つ以上の断片が結合したガン診断用マイクロアレイ又はメンブレンを提供する。
【０００７】
また他の観点で、本発明は、エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する抗体を含むガン診断剤を提供する。
また他の観点で、本発明は、エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する抗体を含むガン診断用キットを提供する。
また他の観点で、本発明は、エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する抗体が結合したガン診断用マイクロアレイ又はメンブレンを提供する。
【０００８】
また他の観点で、本発明は（ａ）哺乳類の組織又は細胞試料からＧ−ＣＳＦ核酸試料を得る段階、（ｂ）得られたＧ−ＣＳＦ核酸試料を増幅する段階及び（ｃ）増幅された試料でＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の欠失を確認する段階を含むことを特徴とするエキソン３欠失Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の確認方法を提供する。
また他の観点で、本発明は（ａ）哺乳類の組織又は細胞試料を得る段階及び（ｂ）得られた組織又は細胞試料中のエキソン３の領域のアミノ酸の欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質を確認する段階を含むことを特徴とするＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の確認方法を提供する。
また他の観点で、本発明は、哺乳類の組織又は細胞試料から得られたＧ−ＣＳＦ核酸試料を増幅するために用いられるプライマーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ガン診断用マーカーであって、Ｇ−ＣＳＦであらわれるエキソン３の欠失について遺伝子又はタンパク質のレベルで分析することにより、ガンが発生するか否かを予測乃至診断する方法に関するものである。
単球性大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、Ｔ−細胞及び繊維芽細胞のような細胞から生産されることが知られているコロニー刺激因子（colony stimulating factor, CSF）は正常に生体内で広範囲に分布されている。ＣＳＦは大きく顆粒性白血球のコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球性大食細胞のコロニー刺激因子及び顆粒性白血球−単球性大食細胞のコロニー刺激因子の３つに分けれ、このうち、Ｇ−ＣＳＦは、造血性肝細胞が増殖及び分化して生じるいろいろな血球生成に非常に重要な役割をするタンパク質である。これの主な作用は顆粒球、特に外部感染から生体を保護するのに重要な役割をする好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅ）の数的増加を促進させることである。増殖性腫瘍に対して最近広く用いられている化学的治療法は、腫瘍の成長を抑制すると同時に、好中球前駆体の成長も抑制するので、患者から好中球による保護作用の減少現象を起こして深刻な副作用を誘発する。Ｇ−ＣＳＦはこのような薬物治療患者に投与したときに好中球の数的増加を促進させて感染性疾患を予防し、治療するのに効果があると知られている。１９８６年、人間由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子がＮａｇａｔａ等によりその塩基配列がはじめて明らかになり、これのＣＯＳ細胞内における発現が報告された（参考：Nagata et al., Nature 319:415〜418, 1986）。
【００１０】
ヒトのＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）は３０個のアミノ酸で構成された分泌信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）と１７４個のアミノ酸で構成された糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。５つのシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）が存在し、このうちの４つのシステイン（Ｃｙｓ３６−Ｃｙｓ４２，Ｃｙｓ６４−Ｃｙｓ７４）が２つのジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成してタンパク質の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）及び活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）に重要に関与するものと知られている（参考：Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167〜5171, 1993）。図１に示したように、人間由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子は、人体のゲノムＤＮＡ上にすべて５つのエキソン及び４つのイントロンで構成されており、このゲノムＤＮＡから転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によりｍＲＮＡが作られ、再度スプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）過程を経て４つのイントロンが除去され、５つのエキソンのみで構成された成熟ｍＲＮＡが作られる。この後、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）により２０４個のアミノ酸で構成されたＧ−ＣＳＦ前駆体が作られ、再度Ｎ−端末に存在する３０個のアミノ酸で構成された分泌シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）が除去され、生物学的活性を有するＧ−ＣＳＦタンパク質（１７４個のアミノ酸）が生成される（参考：Nagata et al., EMBO J. 5:575〜581, 1986; Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167〜5171, 1993）。
本発明者らは、ヒトのＧ−ＣＳＦ遺伝子をクローニングしてこの遺伝子を生産するために研究を行う途中、ガン細胞から由来したＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡでエキソン３の部分（１０８ｂｐ）が 正確に欠失されていることを確認することができた。このような特定のエキソンの欠失はＧ−ＣＳＦ以外の他の遺伝子では少なくなく報告されていたが、人間由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子においてはまだ報告されたことがなかった。ヒトのＧ−ＣＳＦ遺伝子は、エキソン２末端の３つのアミノ酸がある場合とない場合があり、これら２つの場合はともに同じ活性を有していると報告されたことがある（参考：Nagata et al., EMBO J. 5:575〜581, 1986）。従って、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の欠失について測定してガンを診断する方法はＧ−ＣＳＦのすべての亜型に同一の原理により適用されることができる。また、他の哺乳動物から由来したＧ−ＣＳＦもほとんど同一の活性をあらわしているものと知られているので、当業者は本発明によるＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の欠失について測定してガンを診断する方法が他の動物から由来したＧ−ＣＳＦにも同一の原理により適用することができることを理解するだろう。
【００１１】
ガン細胞で特異的に発現する（又は抑制される）遺伝子及び遺伝的突然変異等を確認する分子生物学的方法を挙げると、（ａ）ポリメレース連鎖反応（参考：Bottema, C. D., Mutat Res. 233:93〜102, 1993; Nelson, D. L., Curr. Opin. Genet. Dev. 1:62〜68, 1991; Pourzand, C. and Cerutti, P., Mutat. Res. 288:113〜121, 1993; Holland P. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7276〜7280, 1991）、（ｂ）１本鎖高次構造多型（single-stranded conformation polymorphism, SSCP）（参考：Glavac D., Hum. Mutat. 19:384〜394, 2002; Strippoli, P. et al., Int. J. Mol. Med 8:567〜572, 2001; Methods Mol. Biol. 187:151〜63, 2002）、（ｃ）ＤＮＡ塩基配列分析（DNA sequencing analysis）（参考：Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463〜5467, 1997）、（ｄ）タンパク質切断テスト（protein truncation test, PTT）（参考：Hardy, C. A.,MethodsMol. Biol. 187:87〜108, 2002）、（ｅ）自動塩基配列分析法（参考：Boutin P. et al., Hum. Mutat. 15(2):201〜203, 2000）、（ｆ） ＬＯＨ（loss of heterozygosity）研究（参考：Yang Q. et al., Clin. Cancer Res. 8:2890〜2893, 2002）、（ｇ）ＭＳＩ（microsatellite instability）研究（参考：Furlan, D. et al., J. Pathol. 197:603〜609, 2002）、（ｈ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いた遺伝子検査（参考：Leushner J., Expert Rev. Mol. Diagn. 1:11〜18, 2001）、（ｉ）ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）による遺伝子検査（参考：Wetmur, J. G., Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol. 26:227〜259, 1991）、（ｊ）ＤＮＡチップによる遺伝子検査（参考：Goessl et al., Urology 58:335〜338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res. Treat. 66:217〜224, 2001；金・チョルクン等、大韓民国公開特許公報第２００１−００６１１７３号）、（ｋ）タンパク質チップを用いた検査（参考：Pharmacogenomics1:385〜393, 2000）等が診断に用いられる。当業者は上記列挙された方法を含んだ公知の分子生物学的方法を適切に応用してＧ−ＣＳＦ遺伝子又はタンパク質のエキソン３の領域の欠失を容易に確認することができることを理解するだろう。しかし、用いられる上記の多くの方法の中で、本発明によるＧ−ＣＳＦ遺伝子又はタンパク質エキソン３の領域の欠失はＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、ＤＮＡチップ、タンパク質チップ又は酵素免疫測定法を用いて確認することが望ましい。
【００１２】
本発明によるガン診断のために先行されなければならないことは、被検組織又は細胞からＧ−ＣＳＦ遺伝子又はタンパク質試料を得ることである。普通、組織又は細胞から分離される特定遺伝子の試料は微量であるので、ＰＣＲにより増幅しなければならず、このような増幅のためにはプライマーが考案されなければならない。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域の全体又は一部を増幅するためにエキソン３の領域の欠失を測定するためのプライマーであるＤＮＡ核酸断片が必要である。即ち、本発明に於いてプライマーというのは、エキソン３の一部又は全体を含むＧ−ＣＳＦ遺伝子の核酸配列を増幅することができるオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を意味する。このようなプライマーを考案することは当業者により容易になされる。従って、エキソン３の一部又は全体を含むＧ−ＣＳＦを増幅するために、当業者がデザインすることができるすべてのプライマーが本発明のプライマーの範囲に含まれる。本発明のプライマーの一例は、ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン２の一部からエキソン５まで（Ｔｈｒ１−Ｐｒｏ１７４）増幅することができる配列番号１と配列番号２で表示されるオリゴヌクレオチド、ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン２の一部からエキソン３（Ｉｌｅ２４−Ｌｅｕ７１）まで増幅することができる配列番号３と配列番号５で表示されたオリゴヌクレオタイド、ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３からエキソン４の一部（Ｃｙｓ３６−Ｓｅｒ８０）を増幅することができる配列番号４と配列番号６で表示されたオリゴヌクレオチドである。本発明者らは、８種の正常組織及び細胞と１７種のガン細胞株からｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを確保し、これらプライマー群からＧ−ＣＳＦ遺伝子及びエキソン３を確認することができた。
【００１３】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域を増幅してその欠失について測定するのに使用するプライマー対で、これらに限定されるのではないが、次のオリゴヌクレオチドを提供する。
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(配列番号2)；
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(配列番号5)；
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(配列番号6)；
センス5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(配列番号1)と
アンチセンス5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(配列番号9)；
センス5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(配列番号3)と
アンチセンス5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(配列番号2)；
センス5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(配列番号3)と
アンチセンス5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(配列番号5)；
センス5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(配列番号3)と
アンチセンス5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(配列番号6)；
センス5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(配列番号4)と
アンチセンス5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(配列番号2)；
センス5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(配列番号4)と
アンチセンス5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(配列番号5)；及び
センス5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(配列番号4)と
アンチセンス5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(配列番号6)。
上記核酸断片は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域を含まなくてもエキソン２又はエキソン４の領域に該当するプライマーを用いてエキソン３の領域の欠失を確認することができる核酸断片を含む。
【００１４】
本発明の一つの様態は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域の全体又は一部を含むＤＮＡ断片が結合しており、ガンを診断するのに有用な遺伝子のマイクロアレイ又はメンブレンを含む。遺伝子のマイクロアレイは一般的に特定の試薬により処理されたスライドガラス（ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）の表面上にオリゴヌクレオチドプローブを取り付け、ハイブリダイゼーション法でプローブに相補的な遺伝子を検出するのに用いられるもので、ＤＮＡチップなどがこれに含まれる。メンブレンは、ハイブリダイゼーションにおいてスライドガラスの代わりに使用することができるもので、特に限定されず、ＤＮＡ断片を固定化することができるものはすべて用いられる。望ましくは、ナイロン又はニトロセルロースメンブレンを用いることができる。
本発明によるマイクロアレイの表面にはプローブとして、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域に該当する核酸断片とともにエキソン１、２、４及び５からなる群から選択された一つ以上の核酸断片が取り付けられる。ここで、核酸断片プローブは、各エキソンの全体又は一部分の両方が可能である。本発明においてプローブとして使用されるエキソン３の領域の核酸断片としては、これらに限定されるのではないが、TGTGCCACCTACAAGCTGTG（配列番号１４）、GAGCTGGTGCTGCTCGGACA（配列番号１５）、GGACACTCTCTGGGCATCCC（配列番号１６）及びCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAが含まれる。エキソン１、２、４及び／又は５の核酸断片は対照用プローブとして使用され、この例としては、これらに限定されるのではないが、CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC（配列番号１０）、AGAAGCTGTGGTGCCAC（配列番号１２）、TGAGTGAGTGTGCCAC（配列番号１３）、GCAGGCTGCTTGAGCCAA（配列番号１８）、AGAAGCTGGCAGGCTG（配列番号１９）及びTGAGTGAGGCAGGCTG（配列番号２０）が含まれる。
スライドガラス、メンブレンの表面にプローブをスポティングすることは、当分野の公知の技術により容易に実施することができる。又、標的の準備及びハイブリダイゼーションとストリッピングも通常の技術により実施することができる。
【００１５】
本発明の他の特定の様態は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域の全体又は一部を含むＤＮＡ断片と診断学的に許容される通常の担体を含むガン診断用組成物を含む。本発明のまた他の特定の様態はＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域のアミノ酸が欠失したＧ−ＣＳＦ変異体とこの変異体に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いてガンを診断する方法を含む。ここで、“エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異体”は、成熟したタンパク質が翻訳する過程でエキソン１の領域乃至エキソン５の領域のうちのエキソン３の領域を含んで欠失が生じて生成されたＧ−ＣＳＦ変異タンパク質を言う。本発明のまた他の特定の様態は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域の全体又は一部を含むＤＮＡ断片とこれを用いたＤＮＡマイクロアレイを含む診断キットを含む。本発明のまた他の特定の様態として、本発明はＧ−ＣＳＦ変異体及びＧ−ＣＳＦ変異体に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いたタンパク質アレイを含む診断キットを含む。
本発明によるエキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異体及びこれに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、当分野の常法により生産することができる（参考：Harlow, E. and Lane, D., Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York:ColdSpring HarborLaboratory, 1988; Wilson, L. and Matsudaira, P. eds. Antibodies in Cell Biology (Methods in Cell Biology, Vol. 37), New York: Academic Press, 1933）。
【００１６】
本発明によれば、１７種のガン細胞株からｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを製造し、ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の部位を含む配列を増幅した後、その塩基配列を分析することにより胃ガン、乳房ガン、肉腫、腸ガン、肺ガン、子宮頸部ガン及び悪性黒色腫細胞から由来したｈＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡの場合、エキソン３の部位（１０８ｂｐ）が欠失されていることが明らかになった（図２及び図３参照）。１７種のガン細胞株から由来したｈＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡを鋳型にして前記本発明によるプライマーを用いてポリメレース連鎖反応を行った結果、１６種のガン細胞株から由来したＰＣＲの反応産物が正常細胞株から由来したＰＣＲの反応産物に比べてその大きさが小さいことを確認し、この遺伝子の塩基配列を確認した結果、正常のＧ−ＣＳＦ遺伝子を構成する５つのエキソンのうち、正確にエキソン３の部位が欠失されていることが確認された。
また、ハイブリダイゼーションを用いてＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡのエキソン３の欠失について確認することができる。例えば、正常のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行うことによりエキソン３の部位のＤＮＡ断片とエキソン２の領域のＤＮＡ断片を獲得し、これをナイロンメンブレンに固定化した後、ガン細胞株のｃＤＮＡ標的とハイブリダイズさせた後、標的とエキソン３ＤＮＡ断片との結合関係を確認してエキソン３の欠失を容易に確認することができる。
【００１７】
また、ＤＮＡチップを用いてＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡのエキソン３の欠失を確認することができる。各エキソン領域のオリゴヌクレオチドをプローブでスライド上に固定化した後、ｈＧ−ＣＳＦエキソン領域の遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行ったものとプローブとを反応させることによって、エキソン３の領域の欠失を確認することができる。
また、エキソン３の領域の欠失が生じる変異塩基配列から変異Ｇ−ＣＳＦに対する組換えタンパク質を作り、これに対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を製作し、酵素免疫測定法により正常人と多様な患者間のＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の数値を測定することによって、エキソン３の領域の欠失を容易に確認することができる。
他の様態で、本発明は免疫クロマトグラフィー分析を含む。これの代表的なこととしてラテラルフローアッセイ（lateral flow assay）がある。このラテラルフローアッセイ型のキット構造を考察すると、試料が適用されるサンプルパッド（ｓａｍｐｌｅ ｐａｄ）、探知用抗体がコーティングされている放出パッド（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐａｄ）、試料が移動して分離されて、抗体抗原反応が生じる展開用膜（主にニトロセルロース）又はストリップ、及び試料が続けて移動するための吸収パッド（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐａｄ）からなっている。探知用抗体は、探知を表示するために、例えばコロイド性金粒子に固定されている。金粒子の代わりにラテックスビーズ（ｌａｔｅｘ ｂｅａｄ）又は炭素粒子を用いることもある。ラテラルフローアッセイの診断キッドはほとんどサンドイッチの形態で分析物を探知するように考案されている。試料内に入っている分析物がサンプルパッドに適用されて移動し始めながら、まず、放出パッドにコーティングされ、探知用抗体と反応して抗原−抗体結合体の形態で続けて展開される。移動しながら展開膜に固定されている捕獲抗体ともう一回反応してサンドイッチ形態の複合体を作る。捕獲抗体は展開膜に固定されているので、抗原−抗体反応が続けて生じると、複合体が捕獲抗体の固定面で蓄積される。タンパク質は肉眼では透明であるので、複合体の生成と相対的な量を、取り付けられている金粒子の量で判断する。
【００１８】
本発明のまた他の観点は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の部位の欠失を分析することによりガンを診断する方法を提供する。具体的には、本発明は人間又は動物の組織又は細胞試料から核酸試料を得た後、分子生物学的な方法を用いて前記核酸試料でＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の部位が欠失されたかを確認することによりガンを診断することができる。人間の組織又は細胞試料は、人間由来の液状試料、生検標本、組織培養のような固形組織試料又はこれらから由来した細胞及びその子孫が含まれる。又、前記試料は試薬処理、可溶化された試料又は培養細胞、細胞上澄液及び細胞溶解物も含む。更に詳しくは、本発明の目的上人間の組織又は細胞試料は、腫瘍組織又は腫瘍性と思われる組織を含み、例えば切除手術、生検、吸引法又は当業界に公知の他の方法により得られる。核酸試料は人間の組織又は細胞試料から当業界に公知の方法により分離することができる。
【００１９】
本発明によるガン診断方法は、前述のようにエキソン３の欠失を遺伝子の塩基配列分析により診断できるだけではなく、前記遺伝子が発現して作られたＧ−ＣＳＦタンパク質上のエキソン３に特異的なプローブ、例えばエキソン３のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異体に特異的な抗体を用いてその欠失を測定することにより可能になる。
本発明のガンの診断方法の対象ガンとしては、胃ガン、乳房ガン、肉腫、腸ガン、肺ガン、子宮頸部ガン、肝ガン、前立腺ガン、舌ガン、喉頭ガン、咽頭ガン、口腔ガン、甲状腺ガン、大腸ガン、食道ガン、睾丸ガン等を診断するのに有用に用いることができる。
以下、本発明を実施例により更に詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示することで、本発明の内容が実施例により限定されるのではない。
【実施例１】
【００２０】
ガン細胞株からｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの製造
８種の正常細胞及び組織と１７種のガン細胞株からｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを製造した。本発明の実施例で用いた正常細胞株とガン細胞株は下記の表１に示した通りである。
【表１】
0004413611.tif 000002
【００２１】
前記のすべてのガン細胞株は前記の表１に記載された機関から自由に分譲を受けて用いることができるものである。また、ヒトの正常リンパ球、単核球、表皮組織、真皮組織、毛嚢細胞、脂肪細胞、筋肉細胞等も延世大学校医科大学のガン転移研究センターから容易に分譲を受けることができる。延世大学校医科大学のガン転移研究センターから分譲されたガン細胞株ＹＣＣ−７は、次の方法により製作されたものである。進行性ガン患者から無菌的に腹水を得て細胞のクランピング（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）を防止するためにヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）１０ｕｎｉｔ／ｍＬを添加した後、４００ｘｇで１０分間遠心分離した。遠心分離して得た沈殿細胞を２５ｃｍ３のフラスコで培養した。赤血球が多量に含有された場合にはフィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）で８００ｘｇで比重遠心分離した後、単核球層だけを得て５％ＣＯ２、３７℃で培養した。培養一日（１６〜１８時間）後に培養液を再度４００ｘｇで１０分間遠心分離し、沈殿細胞を他の２５ｃｍ３のフラスコで培養した。培養液中の細胞状態を位相差顕微鏡で観察しながら週２〜３回新しい培地に交換した。細胞を観察する時ガン細胞の群落が確認されると、酵素であるトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）を処理するか、またはコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を得、またはスクレッパー（ｓｃｒａｐｅｒ）を用いてガン細胞の群落だけを獲得するか、または浮遊液に存在するガン細胞を再度遠心分離して正常細胞を除去し、純粋なガン細胞のみを得て継代（ｐａｓｓａｇｅ）毎に細胞凍結して保管した。
【００２２】
各ガン細胞株、正常細胞及び正常組織から総ＲＮＡはＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴ（Gibco/BRL製）を用いて分離した。液体窒素を用いて急速凍結して砕かれた組織サンプル（ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ）にトリゾル試薬（Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）１ｍＬを添加し、常温で５分間反応させた。ここに０．２ｍＬのクロロホルムを添加し、激しく１５秒間混ぜた後、常温で５分間反応させた。前記サンプルを１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、水溶性層（ａｑｕｅｏｕｓ ｐｈａｓｅ）を新しいチューブに移し、イソプロピルアルコール（ｉｓｏｐｒｏｐｌｙ ａｌｃｏｈｏｌ）を同量添加し、４℃で１０分間反応させた。反応液を１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離して沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）が落ちないように上層液は捨て、７０％エタノールで７５００ｘｇ、４℃で５分間沈殿物を洗浄した。ＲＮＡを十分に乾燥させた後、ＲＮＡｓｅフリーの蒸留水（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）で溶解した。
【００２３】
それぞれの細胞株及びヒトの組織由来のガン細胞及び正常細胞から得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、次のような逆転写酵素ポリメレース連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。全体のＲＮＡ ２μｇとオリゴ（ｄＴ）１６−プライマー（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１６‐ｐｒｉｍｅｒ）１μｌにＲＮＡｓｅフリーの蒸留水（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）を添加して最終体積が１１μｌになるようにした後、９０℃で５分間反応させ、氷に早く移した。他のチューブに反応緩衝溶液４μｌ及び１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２μｌ、ＲＮＡａｓｅインヒビター（ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）１μｌ及びＲＴａｓｅ ２μｌを混合した後、この混合物をチューブ（ｐｒｅ−ｍｉｘｔｕｒｅ ｔｕｂｅ）に８．５μｌずつ分注し、室温で１０分間反応させた。前記反応物を４２℃で９０分間反応させて９５℃に移し、１５分間再度反応させてから迅速に氷に移して反応を終了してそれぞれのｃＤＮＡを製造した。
【実施例２】
【００２４】
ポリメレース連鎖反応によるｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の検索
それぞれのガン細胞で正常のｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の発現を確認するために、前記実施例１で製造したそれぞれのｃＤＮＡを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ）にしてポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは図２に示したように、ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン２の一部からエキソン５まで（Ｔｈｒ１−Ｐｒｏ１７４）を増幅したＰＣＲ１反応、エキソン２の一部からエキソン３まで（Ｉｌｅ２４−Ｌｅｕ７１）を増幅したＰＣＲ２反応及びエキソン３からエキソン４の一部分（Ｃｙｓ３６−Ｓｅｒ８０）を増幅したＰＣＲ３反応を行った。
【００２５】
ＰＣＲ１反応は、それぞれのガン細胞株ｃＤＮＡを鋳型にしてプライマー対5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(センス、配列番号1)と5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(アンチセンス、配列番号２)を用いて行った。ＰＣＲ２反応は、それぞれのガン細胞株ｃＤＮＡを鋳型にしてプライマー対5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(センス、配列番号３)と5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(アンチセンス、配列番号５)を用いて行った。ＰＣＲ３反応は、それぞれのガン細胞株ｃＤＮＡを鋳型にしてプライマー対5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(センス、配列番号４)と5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(アンチセンス、配列番号６)を用いて行った。ＰＣＲはハイフィデリティーＰＣＲシステム（High Fidelity PCR system, Boehringer Mannheim GmbH製）を用いて次のような条件で行った。一つ目の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）は９４℃で７分間一回行い、二つ目の変性は９４℃で４０秒間、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は５６℃で４０秒間、伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）は７２℃で１分間行い、これを３０回繰り返した。この後、７２℃で７分間最終伸長を１回行った。
【００２６】
ＰＣＲの結果から生成された産物をアガロースゲル電気泳動法（agarose gel electrophoresis）により確認した。電気泳動実験の結果、ＰＣＲ１の反応産物の場合、ガン細胞株から由来した大部分のＰＣＲ産物は正常のＧ−ＣＳＦ遺伝子より小さい大きさを有しており、Ｕ−８７ＭＧの場合にのみ正常のＧ−ＣＳＦ遺伝子の大きさを有していた（図３ａにおいて、Ｍ：サイズマーカ、レーン１：正常細胞株、レーン２：ＹＣＣ−７、レーン３：ＡＧＳ、レーン４：ＳＮＵ−１、レーン５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、レーン６：ＭＣＦ−７、レーン７：ＳＫ−ＢＲ−３、レーン８：ＨＴ−１０８０、レーン９：ＨＣＴ−１１６、レーン１０：ＣＯＬＯ２０５；図３ｂにおいて、Ｍ：サイズマーカ、レーン１：正常細胞株、レーン２：ＤＬＤ−１、レーン３：ＨＴ−２９、レーン４：Ａ５４９、レーン５：ＮＣＩ−Ｈ４６０、レーン６：ＨｅＬａ、レーン７：Ｃ−３３Ａ、レーン８：Ｂ１６、レーン９：Ｕ−８７ＭＧ）。ＰＣＲ２の反応産物とＰＣＲ３の反応産物を各々アガロースゲル電気泳動で分析した結果の場合は、前記ＰＣＲ１の反応産物で正常に確認されたＵ−８７ＭＧ細胞株でのみＰＣＲ産物を得ることができ、残りのガン細胞株ではＰＣＲ産物を得ることができなかった（図６及び図７参照）。また、前記ＰＣＲ２とＰＣＲ３により得たＵ−８７ＭＧ細胞株のＰＣＲ産物は、正常細胞から得たＰＣＲ産物と大きさが同一であることが分かった。
【００２７】
また、ＰＣＲ１の反応産物の遺伝子塩基配列を自動塩基配列分析機（automatic DNA sequencer, ABI Prism model 377, Perkin Elmer, Inc.製）で分析した。ＰＣＲ１の反応産物の塩基配列を分析した結果、Ｕ−８７ＭＧ細胞株から得たＰＣＲ産物は正常細胞のＧ−ＣＳＦ遺伝子と同一の配列（配列番号７）を有しているのに対し、残りのガン細胞株から得たＰＣＲ産物は正常細胞のＧ−ＣＳＦ遺伝子塩基配列と比較した時、中間に１０８ｂｐが欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）した配列（配列番号８）を有していることを確認した（図４及び図５参照）。欠失した部分を除いた残りの部分は正常細胞Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の塩基配列と完全に一致した。欠失した１０８ｂｐに相当するＧ−ＣＳＦ遺伝子の塩基配列を確認した結果、総５個のエキソンで構成されたＧ−ＣＳＦ遺伝子でエキソン３に該当する部分であることが分かった。
【００２８】
本発明者らは、正常人の組織でも正常細胞と同じＰＣＲの結果があらわれるのかを確認するために、正常人のリンパ球、単核球、表皮組織、真皮組織、毛嚢細胞、脂肪細胞、筋肉細胞などからＲＮＡを採取してＲＴ−ＰＣＲを実施した結果、正常組織ではエキソン３の欠失があらわれないことを確認した。これはガン細胞においてＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の欠失が単にＰＣＲの過程で発生できる結果でないことを示すものである。実際に、エキソン３の欠失によりガン細胞では正常のＧ−ＣＳＦではない変異Ｇ−ＣＳＦタンパク質が作られていることを確認した（図１１参照）。また、前記エキソン３が欠失した変異Ｇ−ＣＳＦタンパク質は、その元来の活性部位機能がなくなり、立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）も正常のＧ−ＣＳＦタンパク質とは異なって形成される可能性が多く、これによりガン細胞ではＧ−ＣＳＦタンパク質が正常的な役割を果たさないものと考えられる。
【実施例３】
【００２９】
ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法によるＧ−ＣＳＦ遺伝子の検索
ハイブリダイゼーション法によりガン細胞株でのＧ−ＣＳＦ ｃＤＮＡのエキソン３の欠失を確認した。正常細胞株から由来したＧ−ＣＳＦ遺伝子を鋳型にし、プライマー対5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(センス、配列番号４)と5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(アンチセンス、配列番号５)を用いてＰＣＲを行い、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の部位のＤＮＡ断片（１０８ｂｐ）を得た。
また、正常細胞株から由来したＧ−ＣＳＦ遺伝子を鋳型にし、プライマー対5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(センス、配列番号1)と5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(アンチセンス、配列番号９）を用いてＰＣＲを行うことによって、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン２の部位のＤＮＡ断片（１０５ｂｐ）を得た。
ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim GmbH製）にそれぞれの分離精製した各ＤＮＡ断片５０ｎｇ／μｌをスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した後、８０℃で２時間置いてから固定化した。
【００３０】
メンブレンのエキソン２及びエキソン３のハイブリダイゼーション用の各細胞株の標的（ｔａｒｇｅｔ）は、次のような方法により製作した。逆転写反応はまず、反応液Ａ［総ＲＮＡ ２μｇ、オリゴ（ｄＴ）１６−プライマー（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１６−ｐｒｉｍｅｒ）１μｌ、最終体積１５μｌ］のみを入れたチューブを９４℃で２分間放置して変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程を行い、この後、温度を４２℃に徐々に（２０分以内）低下した後、反応液Ｂ［ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ各々３３３μＭ、逆転写酵素緩衝溶液１ｘ、２０μＣｉ［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰ（２，０００〜３，０００Ｃｉ／ｍＭｏｌ）、ＡＭＶ逆転写酵素５０Ｕ、最終体積３０μｌ］を加えた後、４２℃で２時間逆転写反応を行った。逆転写反応後、重合反応に用いられない［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰとともにｄＮＴＰはQIAquick Nucleotide Removal Kit（Qiagen GmbH製）を用いて除去した。
【００３１】
このようにして製作されたｃＤＮＡの標的を用いてＧ−ＣＳＦのエキソン２及びエキソン３の部分が固定化されているナイロンメンブレンでハイブリダイゼーションを行った。まず、ナイロンメンブレンを２Ｘ ＳＳＰＥ緩衝溶液［１ｘ ＳＳＰＥ：０．１８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に５分間入れた後、これを除去し、６５℃で予め温めたハイブリダイゼーション溶液［５ｘ ＳＳＰＥ、２％ ＳＤＳ、１ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、１００μｇ／ｍＬ音波変性された鮭の精子ＤＮＡ］２ｍＬを再度添加した。６５℃で１時間置いた後、ｃＤＮＡプローブ１０μｌをハイブリダイゼーション溶液０．５ｍＬに加えて１０分間沸かした。これをメンブレンが入っている密封されたビニールに入れて６５℃で１８時間ハイブリダイゼーション過程を行った。ハイブリダイゼーション過程が終わった後、洗浄溶液［０．５ｘ ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ］を用いて６５℃で３０分ずつ３回交換して行った。すべてのハイブリダイゼーション過程が終わった後、Ｘ線フィルムを用いてハイブリダイズされている放射能を読み出した。
【００３２】
実験の結果、図８に示したように、ガン細胞株（ＹＣＣ−７、ＡＧＳ、ＨＴ−２９、Ａ５４９、ＭＣＦ−７）から分離した標的の場合、エキソン２には結合しているが、エキソン３には結合しなかった（図８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ及び８ｅ参照）。反面に、正常の遺伝子を有しているＵ−８７ＭＧの場合、エキソン２とエキソン３の両方に結合していることが確認された（図８ｆ参照）。このように、ハイブリダイゼーション法を用いてエキソン３の欠失を容易に確認することができた。ハイブリダイゼーション法は最近急に発展しているＤＮＡマイクロアレイを用いた検索方法にも容易に適用可能であり、従って、これを用いた多様な用法が容易に開発でき、これによるガン診断が非常に容易かつ正確になされるものと思われる。
【実施例４】
【００３３】
エキソン３の欠失検索用ＤＮＡチップによるＧ−ＣＳＦ遺伝子の検査
Ｇ−ＣＳＦのエキソン３の部分の欠失を確認するための道具として、ＤＮＡチップを適用可能であるかを調査するためにガラス上に固定化すべきＤＮＡ断片のプローブを製作した。
プローブは、Ｇ−ＣＳＦのエキソン２の部分で一つのプローブを、エキソン３の部分に互いに重ならないように４つのプローブを、エキソン４の部分で一つのプローブを２０個のオリゴヌクレオチドで構成するようにデザインした。また、エキソン２からエキソン３にわたって一つのプローブを、エキソン３からエキソン４にわたって一つのプローブを、エキソン２からエキソン４にわたって一つのプローブを各エキソンの塩基配列を８つずつ有するようにデザインした。Ｇ−ＣＳＦのエキソン２の部分は選択的スプライシング（alternative splicing）機作により二つの種類（ヒトのＧ−ＣＳＦａ、ヒトのＧ−ＣＳＦｂ）を有しているので（参考：Tshuchiya M. et al., EMBO J 5:575〜581, 1986）、エキソン２の部分でデザインしたプローブはそれぞれ二つの種類をすべてデザインした。
ＤＮＡプローブを固定化するためにすべてのＤＮＡ断片のプローブを合成するとき、３’一番目の位置にアミノリンカーカラム（aminolinker column、Cruachem Ltd.製, Glasgrow, Scotland）を用いてアミン基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）を有する塩基を挿入し、スライドガラス（ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）はアルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）でコーディングされているもの（CEL Associates, Inc.製, Huston, Taxas, USA）を購入した。プローブを３×ＳＳＣ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）の緩衝溶液に溶解させた状態で、本実験室自体で製作したマイクロアレイヤ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）を用いて（参考：Yoon et al, J. Microbiol. Biotechnol. 10:21〜26, 2000）集積した後、５５％程度の湿度が維持される条件で１時間以上化学反応を誘導し、６時間以上放置してＤＮＡプローブを固定化した。菌検索用プローブは、１００μＭの濃度で全体プローブを２７５μｍの間隔で順序通り集積してマイクロアレイを製作した。
【００３４】
プローブのアミン基とガラス板上のアルデヒド基との反応が円滑になされて固定化が十分になされたかを確認するために、ＳＹＢＲＯ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Molecular Probe, Inc.製, Leiden, Netherlands）で染色して確認した。
それぞれの細胞株から抽出したＧ−ＣＳＦ遺伝子を鋳型にしてアシンメトリックＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ）を行って断片遺伝子を製作し、これをガラス板上に固定すべきプローブとして用いた。断片遺伝子は、プライマー対5'-CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC-3'(センス、配列番号１０)と5'-FITC-CTGCTGCCAGATGGTGGT-3'(アンチセンス、配列番号１１）の添加比率を１：５に差別化することによって、一回のポリメレース連鎖反応で得た。スライドガラス上に固定化したプローブは、下記の表２に収録されている。
【００３５】
【表２】
0004413611.tif 000003
非対称増幅方法のためのＰＣＲは、次のような条件で行った。一番目の変性は９４℃で５分間、二番目の変性は９４℃で１分間行った。アニーリングは５６℃で１分間、伸長は７２℃で３０秒間行い、これを１０回繰り返した。その後、再度三番目の変性は９４℃で１分間、アニーリングは５８℃で１分間、伸長は７２℃で３０秒間行い、これを３０回繰り返した。その後、７２℃で５分間最終伸長を１回行った。
【００３６】
ＰＣＲの結果から生成された産物はアガロースゲル電気泳動法により確認した。各菌に対して二本鎖のＤＮＡと一本鎖のＤＮＡが同時に合成されたことを確認した。Ｇ−ＣＳＦのエキソン３が欠失したプラスミドと欠失していないプラスミドを有し、Ｇ−ＣＳＦ部分をアシンメトリックＰＣＲにより増幅した後、ＤＮＡチップを用いて検査した。ハイブリダイゼーション緩衝溶液［６×ＳＳＰＥ、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド］にアシンメトリックＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ）により増幅させた遺伝子を１５μｌ入れ、総体積が２００μｌになるように製造した。製造された溶液をプローブが固定されているガラス板上に分注した後、プローブ−クリッププレスシール培養室（probe-clip press-seal incubation chamber, Sigma Co.製, St. Louis, MO.）の３０℃の恒温振盪培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で６時間反応させて相補的な結合を誘導した。時間が経過した後、３×ＳＳＰＥ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）、２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）、１×ＳＳＰＥ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）の順にそれぞれ５分間ずつ洗浄した。スキャンアレイ（Ｓｃａｎａｒｒａｙ）５０００（GSI Lumonics Inc.製, Bedford, MA.）を用いて検索した。
【００３７】
図９から分かるように、エキソン３が欠失されていないプラスミドの場合、すべてのプローブにシグナルがあらわれるのに対し、エキソン３が欠失したプラスミドの場合、エキソン２とエキソン４の部分にのみシグナルがあらわれることが分かった。このプラスミドはエキソン２のａ型の塩基配列を有している。
この結果により、前記提示したプライマーとプローブを用いてＧ−ＣＳＦのエキソン３の部分の欠失を検索することができるＤＮＡチップの開発が可能であることが分かった。
【実施例５】
【００３８】
流加式組換えＧ−ＣＳＦ変異体タンパク質の生産
組換え大腸菌を用いてＧ−ＣＳＦ変異タンパク質を多量生産するために、組換えプラスミドｐＥＤ−ＣＳＦ４ＢＬＩＩＥを有しているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen Inc.製, USA）の流加式発酵を行った。ｐＥＤ−ＣＳＦ４ＢＬＩＩＥはプラスミドｐＥＴ２１ｃ（Novagen Inc.製）にエキソン３の領域の塩基配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異体に対する塩基配列をクローニングしたものである。製造方法は次の通りである。まず、ヒトの乳房ガンｃＤＮＡライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）を鋳型にしてＥｃｏＲＩ部位を有しているフォーワードプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ １）5'-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3'とＢａｍＨＩ部位を有しているリバースプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ ２）5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3'を用いてポリメレース連鎖反応を実施した後、反応物にＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素で処理し、まず、ｐＵＣ１９（Stratagene製, USA）にクローニングしてｐ１９ＣＳＦプラスミドを作製した（図１２参照）。ｐＵＣ１９内にクローニングされたＣＳＦ遺伝子はエキソン３の領域がない状態である。
【００３９】
ｐ１９ＣＳＦプラスミドを鋳型にしてＮｄｅＩを有しているフォーワードプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ ４）5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3'とＢａｍＨＩ部位を有しているリバースプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ ２）5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3'を用いてポリメレース連鎖反応を実施した後、得られたＤＮＡにＮｄｅＩとＢａｍＨＩの制限酵素で処理してｐＥＴ２１ｃプラスミドにクローニングした。ここで、一番目のアミノ酸が翻訳される時点の塩基配列をバクテリアに最適の塩基配列に変えるために、前記フォーワードプライマーを5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3'の代わりに5'-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3'に変えて同様にポリメレース連鎖反応を実施した後、得られたＤＮＡにＮｄｅＩとＢａｍＨＩの制限酵素で処理してｐＥＴ２１ｃプラスミドにクローニングし、最終的にｐＥＤ−ＣＳＦ４ＢＬＩＩＥを製作した（図１３参照）。流加式培養で用いた培地及び供給基質は表３に示した。
【００４０】
【表３】
0004413611.tif 000004
種培養は、回転振盪器（ｒｏｔａｒｙ ｓｈａｋｅｒ）で２５０ｍＬのフラスコを用いて３７℃で８時間培養した。２００ｍＬの種培養物を１．８Ｌの発酵液を含む５．０Ｌの発酵器（５．０Ｌ、ＮＢＳ発酵器）に接種した。温度とｐＨはそれぞれ３７℃と６．８に制御した。ｐＨは２８％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて維持した。必要な場合に純粋な酸素も供給した。基質の供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）戦略としてｐＨ−ｓｔａｔを使用したが、ｐＨが６．８８に増加すると、グルコース２．０〜３．０ｇ、酵母抽出物０．３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１ｇを培養液に自動的に添加した。流加式培養のうち、培養液中のグルコースの濃度は５ｇ／Ｌ以下に維持し、ＯＤ６００＝３０で１ｍＭ ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を用いて誘導し、微生物の濃度がＯＤ６００＝９０まで達する高濃度の培養がなされた。生産されたＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の量は密度測定器（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて染色したタンパク質バンドの強度を測定して定量化した（図１０参照）。成熟したＧ−ＣＳＦの分子量は１８．７ｋＤａ程度であったが、エキソン３の領域が欠失した塩基から翻訳したＧ−ＣＳＦ変異体タンパク質の分子量は約１３ｋＤａ程度となった。
【実施例６】
【００４１】
Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質特異的ポリクローナル抗体の製造
本実施例では、組換えＧ−ＣＳＦ変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得た後に、抗ウサギ変異のヒトのＧ−ＣＳＦを得るための抗原として用いた。抗原特異的ポリクローナル抗体を生成するために、１ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝溶液中に溶解された突然変異ヒトのＧ−ＣＳＦ精製溶液４００μｌを同量のフロイントアジュバント（Freund’s adjuvant, BRL社で市販）で乳化した後、１０週のウサギに１１日の間隔で４回筋肉に注射した。４回筋肉注射した１０日後に心臓穿孔法で血液を採取した。採取した血液を常温で３０分間、また、４℃で一晩放置して完全凝固させた後、２，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄液を取ることにより血清を得た。これに最終濃度が４０％となるように硫酸アンモニウムを添加して沈殿させ、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に一晩透析した後、ＤＥＡＥ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ ｇｅｌ（Bio-Rad社で市販）で抗体を精製した（参考：Smith, C. P., Jensen, D., Allen, T. and Kreger, M. (Eds.) Information Resources for Adjuvants and Antibody Production. U. S.Dept. of Agriculture, 1997; Hanly W. C. et al., ILAR Journal 37:93〜118, 1995）。
【実施例７】
【００４２】
Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質特異的モノクローナル抗体の製造
１ｍｇ／ｍＬ濃度の精製されたヒトのＧ−ＣＳＦ変異タンパク質１００μｌを同量のフロイントアジュバントで乳化した後、生後６〜８週のＢＡＬＢ／ｃマウスに２週の間隔で３回腹腔内に注入した。最後の注入後、抗Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する抗体の生成を確認し、２週後に１００μｇのヒトのＧ−ＣＳＦ変異タンパク質で最後に免疫させ、３日後にマウスから脾臓細胞を抽出し、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞と１０：１の比率で混合し、この混合液を５０％ポリエチレングリコール１５００の溶液に３分間放置して細胞融合を実行した。これを１，２００ｒｐｍで８分間遠心分離して細胞沈殿物を得た後、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を含むＨＡＴ ＲＰＭＩ−１６４０培地で１ｍＬ当り３．５×１０６細胞となるように浮遊させて９６−ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にウェル当り０．１ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２の培養器で培養した。３日後、１０％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ ＲＰＭＩ−１６４０培地をウェル当り０．１ｍＬずつ添加し、４日毎に培地の半分を新鮮な培地に取り替えた（参考：Amyx, H. L., JAVMA 191:1287〜1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135:2589〜2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989）。
【００４３】
ＨＡＴ選択培養後、ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞の抗体生産を酵素免疫測定法により確認する。即ち、上記で免疫に用いたヒトのＧ−ＣＳＦ変異タンパク質を０．０１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩（ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝液（ｐＨ９．６）で０．１μｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに５０μｌずつ入れ、４℃で一晩コーティングした。その後、ＰＢＳＴ（phosphate buffer saline,１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、０．１％アルブミンで３７℃で３０分間反応（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた。細胞の培養上澄液は各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で２時間反応させた後にＰＢＳＴで４回洗浄した。ビオチンが付している２次抗体である抗マウスの免疫グロブリン抗体（Biotin conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody）を１μｇ／ｍｌとなるように０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈した後に、各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で１時間反応させた。再度、ＰＢＳＴで４回洗浄した後にストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Streptavidin-Horseradish Peroxidase）を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１０００倍希釈し、各ウェルに５０μｌずつ入れ、３７℃で３０分間反応させた後に再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。酵素反応用基質としてはＴＭＢ（Tetra-Methylbenzidine, TMB）溶液を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で反応させた後に２Ｎ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍ波長でＥＬＩＳＡリーダーで吸光度を測定した。抗ヒトのＧ−ＣＳＦ変異タンパク質抗体の生成を確認して陽性を示すウェルから得た細胞は限界希釈法（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）でウェル当り０．３細胞となるように３回サブクリーニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）して培養することによって、モノクローナル化して抗ヒトのＧ−ＣＳＦ変異体モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを得た。ハイブリドーマから抗ヒトのＧ−ＣＳＦ変異体モノクローナル抗体を得た（参考：Amyx, H. L., JAVMA 191:1287〜1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135:2589〜2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989）。
【実施例８】
【００４４】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の数値を用いた診断
上記で免疫で用いた組換えＧ−ＣＳＦ変異体に対する抗ウサギ変異のヒトのＧ−ＣＳＦ又は抗マウス変異のヒトのＧ−ＣＳＦを、セルロプラスミンを０．０１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ウェルで希釈して入れ、４℃で一晩コーティングした。その後、ＰＢＳＴ（０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、０．１％アルブミンで３７℃で１時間反応（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた。同じ方法で洗浄した後、標準希釈緩衝液（standard diluent buffer）５０μｌとサンプルを入れ、徐々に混ぜながら、３７℃で２時間反応させた後にＰＢＳＴで４回洗浄した。ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付している２次抗体である抗免疫グロブリン抗体（Peroxidaseconjugated anti-human immunoglobulin antibody）を２．５μｇ／ウェルとなるように、０．１５Ｎ ＮａＣｌが入っている１０ｍＭリン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液に希釈した後に各ウェルに入れ、３０分間室温で反応させた。再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。酵素反応用基質としてはＴＭＢ溶液を各ウェルに５０μｌずつ入れ、室温で暗反応させた後に２．５Ｎ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍ波長でＥＬＩＳＡリーダーで吸光度を測定した。
図１１から分かるように、ヒトのＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の数値はガン患者において非常に上昇する結果を示した。各ガン患者別に数値を比較したとき、特に乳房ガンの場合、ヒトのＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の数値が非常に上昇することが分かった。
【００４５】
以上の実施例に詳しく例示されているように、Ｇ−ＣＳＦエキソン３の領域の欠失をＰＣＲやＤＮＡチップで、あるいはＧ−ＣＳＦ変異タンパク質に対する酵素免疫測定法を用いることによって、ガンの診断が容易になるだろう。既に用いられているガンに対するマーカーの場合、臓器特異性が低いＣＥＡ、ＢＦＰ、ＴＰＡ、ＩＡＰなどのマーカーの場合は感度が落ちて偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のおそれがあり、反面に臓器特異性が高いＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ ＩＩ、エステラーゼＩ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−１抗原、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ ２２５等のマーカーの場合は、当初から標的臓器を目的にして用いる時にのみ有用な短所がある。本発明者らが発見したＧ−ＣＳＦエキソン３の領域の欠失に対するガン診断マーカーは、免疫化学的療法及び分子生物学的方法で検索に用いれば簡単かつ容易にガン診断が可能である。この新規なガン診断マーカーの開発及び使用により今後ガンの初期発見が容易になり、ガンの診断に大きく寄与するだろう。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の欠失を判別して腫瘍を診断することができる方法を提供する。本発明によるガン診断の方法は一つの特定のガンでなくいろいろな種類のガン診断に広く用いることができ、ポリメレース連鎖反応又はハイブリダイゼーションとＤＮＡチップによる分子生物学的方法またはＥＬＩＳＡのような比較的簡単な免疫化学的方法を用いてガンを容易に診断することができる効果がある。また、Ｇ−ＣＳＦエキソン３の欠失確認用ＤＮＡチップは一つの遺伝子をもってすべてのガンを診断することができるという長所と、既存の方法より更に簡便で、迅速かつ正確なガン診断が可能であり、一度に多数の臨床検体を適用することができるので、人類医学の開発発展と福祉向上に資することはもちろん、ＤＮＡチップに関する技術にも大きく貢献するものと期待される。
また、本発明者らが発明したエキソン３の領域のアミノ酸が欠失したＧ−ＣＳＦ変異体に対する抗体としてＧ−ＣＳＦ変異体タンパク質を測定することにより正常人とガン患者を容易に区分することができる。これもまた、Ｇ−ＣＳＦ変異体に関する確認のみで正確にガンを診断することができることを示唆しており、一度に多数の臨床検体を適用することができ、ひいてはタンパク質アレイに関する技術にも大きく貢献するようになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】人間由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子の正常の転写、スプライシング及び翻訳過程を示す。
【図２】ポリメレース連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）で使用したそれぞれのプライマー位置を示す。
【図３ａ】ＰＣＲ１の反応産物をアガロースゲル電気泳動法により分析した結果を示す（Ｍ：サイズマーカー、レーン１：正常細胞株、レーン２：ＹＣＣ−７、レーン３：ＡＧＳ、レーン４：ＳＮＵ−１、レーン５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、レーン６：ＭＣＦ−７、レーン７：ＳＫ−ＢＲ−３、レーン８：ＨＴ−１０８０、レーン９：ＨＣＴ−１１６、レーン１０：ＣＯＬＯ２０５）。
【図３ｂ】ＰＣＲ１の反応産物をアガロースゲル電気泳動法により分析した結果を示す（Ｍ：サイズマーカー、レーン１：正常細胞株、レーン２：ＤＬＤ−１、レーン３：ＨＴ−２９、レーン４：Ａ５４９、レーン５：ＮＣＩ−Ｈ４６０、レーン６：ＨｅＬａ、レーン７：Ｃ−３３Ａ、レーン８：Ｂ１６、レーン９：Ｕ−８７ＭＧ）。
【図４】正常細胞から由来したＰＣＲ１の反応産物の遺伝子塩基配列を分析した結果を示す。
【図５】ガン細胞から由来したＰＣＲ１の反応産物の遺伝子塩基配列の分析結果を示す。
【図６ａ】ＰＣＲ２の反応産物をアガロースゲル電気泳動法により分析した結果を示す（各レーンは図３ａに示したものと同一である）。
【図６ｂ】ＰＣＲ２の反応産物をアガロースゲル電気泳動法により分析した結果を示す（各レーンは図３ｂに示したものと同一である）。
【図７ａ】ＰＣＲ３の反応産物をアガロースゲル電気泳動法により分析した結果を示す（各レーンは図３ａに示したものと同一である）。
【図７ｂ】ＰＣＲ３の反応産物をアガロースゲル電気泳動法により分析した結果を示す（各レーンは図３ｂに示したものと同一である）。
【図８】正常細胞のエキソン２ＤＮＡ断片とエキソン３ＤＮＡ断片が固定されたナイロンメンブレンとガン細胞から由来した標的をハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）した後、Ｘ−線により分析した結果を示す（Ａ：ＹＣＣ−７、Ｂ：ＡＧＣ、Ｃ：ＨＴ−２９、Ｄ：Ａ５４９、Ｅ：ＭＣＦ−７、Ｆ：Ｕ−８７ＭＧ）。
【図９】Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン３の領域の欠失についてＤＮＡチップにより分析した結果を示す。
【図１０】図１０は、エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失した組換えＧ−ＣＳＦ変異体タンパク質を生産し、分離した結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥで示したものである。
【図１１】エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質の数値を変異タンパク質に対する抗体を用いて正常人とガン患者から測定した結果である。
【図１２】プラスミドｐ１９ＣＳＦの作製図である。
【図１３】エキソン３の領域のアミノ酸配列が欠失したＧ−ＣＳＦ変異タンパク質を発現する組換えプラスミドｐＥＤ−ＣＳＦ４ＢＬＩＩＥの作製図である。
【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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