(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤の存在下において胞子形成の間に非対称に分裂するようにバチルス株を誘導し、そして第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察することからなる、薬剤がバチルス種において細胞分裂を阻害するか否かを決定するための方法であって、但し、上記バチルス株は、活性なσFまたはσE因子に依存性のプロモーターを有する第１リポーター遺伝子、およびそのプロモーターがσFまたはσE因子をコードする遺伝子のプロモーターと同様に制御される第２リポーター遺伝子の２つの人工的に導入されたリポーター遺伝子を伴う染色体を有するバチルス株である、方法。
【請求項２】
第１リポーター遺伝子のプロモーターがgpr遺伝子のプロモーターであり、そして第２リポーター遺伝子のプロモーターがspoIIAA遺伝子のプロモーターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リポーター遺伝子の一方または両方が酵素をコードする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
リポーター遺伝子の一つがlacZである、請求項１ないし３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
リポーター遺伝子の一つがuidAである、請求項１ないし４の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
リポーター遺伝子がlacZおよびuidAである、請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
バチルス株がバチルスサチルス株である、請求項１ないし６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
２つのリポーター遺伝子が酵素として発現されて、それらの活性がフルオロメーターまたは分光分析機により観察される、請求項１ないし７の何れか１項記載の方法。
【請求項９】
バチルス株を誘導して胞子形成させて、非対称性細胞分裂の直前に薬剤と接触させる、請求項１ないし８の何れか１項記載の方法。
【請求項１０】
第２リポーター遺伝子に比して第１リポーター遺伝子の発現が低下したことが観察された場合に、正常なる非対称の隔壁が形成されたか否かを測定するように細胞を試験する、請求項１ないし９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
薬剤の存在下において請求項１ないし７の何れか１項にて定義されたバチルス株を誘導して胞子形成させ、第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察してそれによりバチルス種において薬剤が細胞分裂を阻害することを決定し、そして細菌を殺傷するかまたは細菌の細胞分裂を阻害するための抗生物質として薬剤を使用することからなる、方法。
【請求項１２】
可能性のある抗細菌剤のスクリーニングにおける使用のためのバチルス株を構築する方法であって、２つのリポーター遺伝子を人工的にバチルス株の染色体に導入することを含むが、リポーター遺伝子の各々は異なるプロモーターに連結され、但し、第１リポーター遺伝子は活性なσFまたはσE因子に依存性のプロモーターを有し、そして第２リポーター遺伝子はσFまたはσE因子の合成の測定を提供するプロモーターを有する、方法。
【請求項１３】
リポーター遺伝子が請求項１ないし６の何れか１項に記載されたとおりのものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
バチルス株がバチルスサチルス株である、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
リポーター遺伝子の一方または両方の発現を蛍光分析または質量分析により観察する、請求項１２ないし１４の何れか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本明細書に記載されるアッセイ法は、細胞分裂において機能する一群の関連する活性を標的とする。該アッセイは、いくつかの研究室において広く研究されてきた、胞子形成特異的転写因子σF（Errington, 1996, Trends in Genetics 12, 31-34により総評される）の活性化は、細胞分裂の完成を必要とするとの観察に基づく。
シグマ因子の合成は胞子形成の開始に際して始まるが、その産物は抗シグマ因子であるspoIIABの作用により最初に不活性化状態に保たれる。阻害からの解放は、今よく特徴付けられている一連の生化学相互作用を通して少なくとも２つの他の蛋白質、spoIIAAおよびspoIIEの協調した作用を必要とする（Errington, 1996）。これらの蛋白質は、胞子形成細胞が非対称細胞分裂を経た後にのみσF活性の解放を可能にするように、そしてσF活性をより小さな前胞子細胞種に制限するように機能する。この機構は、σF活性化を隔壁形成依存性にする様式で働く。即ち、必須細胞分裂遺伝子産物、例えばftsZ（Beall and Lutkenhaus, 1991, Genes Devel. 5, 447-455）、divlC（Levin and Losick, 1994, J. Bacteriol. 176, 716-722）、またはftsL（Daniel, R.A. and Errington, J.,未公開の結果）の不在のために隔壁形成を経ることを妨げるバチルスサチルスの変異体または遺伝子工学操作された株はσFを合成するが活性化しない。隔壁形成に対するσFの依存性が、本明細書において使用されるとおり、細胞分裂の阻害剤に関する感度アッセイの基礎である。アッセイは胞子形成の開始において生じる特別の非対称細胞分裂に基づくが、この過程は機能上は休止期の細胞の細胞分裂に極めて類似しているとの十分な証拠がある。
一つの側面において、本発明は、２つの人工的に導入されたリポーター遺伝子を伴う染色体を有するバチルス株を提供するが、第１のリポーター遺伝子は活性なσF（またはσE）に依存性のプロモーターを有し、そして第２リポーター遺伝子は（不活性な）σF（またはσE）因子の合成の測定を提供する。
別の側面において、本発明は、薬剤がバチルス種にける細胞分裂を阻害するか否かを測定する方法を提供するが、該方法は、前記のとおりにバチルス株を誘導することにより薬剤存在下で胞子形成させ、そして第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察することからなる。細胞分裂の阻害の特性は薬剤の実際のまたは潜在的な抗微生物特性の指標であると考えられる。即ち、該方法は可能性の有る抗殺菌剤のスクリーニングに有用であると期待される。
別の側面において、本発明は、前記のとおりにバチルス株を誘導することにより薬剤存在下で胞子形成させ、第１および第２リポーター遺伝子の発現を観察して、それにより薬剤がバチルス種において細胞分裂を阻害することを測定し、そして細菌を殺傷するかまたは細菌の成長を阻害するために該薬剤を抗生物質として用いることからなる方法を提供する。
以下に記載されるアッセイは、σFの活性化の使用に基づくが、非対称隔壁形成に依存する別の胞子形成特異的シグマ因子であるσEも使用できた（Stragier et al., 1988, Cell, 52, 697-704）。隔壁形成に対するσEの依存性は、今、σF活性化に対するσEの依存性により引き起こされる間接の効果であると考えられている（Errington, 1996を参照）。σE依存性リポーター遺伝子はσFよりも非特異的な阻害剤を検出する可能性が有るので、その使用は望ましさが少ないはずである。
適切な条件下並びに遺伝的構築物が作成可能な条件下で胞子形成できる、あらゆるバチルス種を使用してよい。バチルスサチルスは便利に入手できてよく特徴付けされており、好ましい。
構築されたバチルス株は異なるプロモーターにそれぞれ連結された２つのリポーター遺伝子を有する染色体を有する。リポーター遺伝子は、発現時に容易に検出されるかまたは観察される表現型を生じるものである。例えば、発現された蛋白質は、発色するか、化学発光または蛍光であるために容易に観察される産物を生成する物質に対して機能する酵素であってよい。バチルス種にて発現可能なリポーター遺伝子は良く知られており、文献に記載されている。２つのリポーター遺伝子は好ましく選択されることにより、それらの産物は同時に容易にアッセイできる。lacZは１０年以上使用されており、バチルスサチルスにおいて大いに成功している。β−ガラクトシダーゼによる加水分解に際して発色産物または蛍光産物を生成する有用なある範囲の基質がある。大腸菌のuidA遺伝子もgusA遺伝子として知られており、同様な目的で最近利用されており、そして遺伝子産物β−グルクロニダーゼに関して利用可能な範囲の基質はβ−ガラクトシダーゼと類似している。
好ましい形態において、アッセイは２つのリポーター遺伝子を含むバチルスサチルスの特定の株を用いる。第１（gpr-uidA）はσF（またはσE）活性を監視する手段を提供し：そのプロモーターはσF（またはσE）依存性であり且つ、その活性が分光光度計または分光蛍光計により容易に測定可能な酵素であるβ−グルクロニダーゼの生産を指示する。第２のリポーター遺伝子（spoIIA-lacZ）はσF（またはσE）をコードする遺伝子の発現を、例えばシグマ因子をコードする遺伝子と同様に制御されるプロモーターを有することにより監視し、胞子形成に対する非特異的効果のチェックまたは遺伝子発現の一般的な阻害剤を提供する。再び、リポーター遺伝子の産物は、容易に測定可能な酵素β−ガラクトシダーゼである。適切な（酵素）基質を用いることにより、２つの酵素活性を同時に測定することができる。
このアッセイを用いるためには、このバチルスサチルス株を誘導して再懸濁法により胞子形成させる（Sterlini and Mandelstam, 1969, Biochem. J. 113, 29-37；Partridge and Errington, 1993, Mol Microbiol 8, 945-955）。培養物は非対称性細胞分裂の開始直前にマイクロタイタープレートのウエルに分配される（例えば、１時間37℃）。個々のウエルは一つまたは複数の可能性のある阻害剤を含む。spoIIAオペロンの誘導並びにσF（またはσE）の活性化に十分なインキュベーション時間の後、マイクロタイタープレート培養物を標準法により２つのリポーター遺伝子活性についてアッセイする。有力な「ヒット」は、β−グルクロニダーゼ活性の阻害を示すが正常なβ−ガラクトシダーゼ活性を示す（σF（またはσE）の合成を示唆するが活性化を示唆しない）。
別法としては、試験化合物を固相表面（例えば、寒天）上の芝生状の胞子形成細胞に滴下することができる。この場合、リポーター遺伝子活性に対する試験化合物の効果は、固体媒体中に取り込まれた発色性または蛍光性基質の加水分解により生成される色または蛍光により評価される。
２種類の化合物がこのアッセイにより検出されることが期待されるかもしれない。第１に、非対称性細胞分裂を阻害する所望の化合物。第２に、蛋白質−蛋白質相互作用、またはσF（またはσE）の制御に関与することが知られているキナーゼまたはホスファターゼ活性を、ある点で干渉する化合物。これらは、純粋に学術上重要なはずである（少なくとも短期間は）。該２つのクラスは、光学顕微鏡により区別できたが、なぜなら後者のクラスは通常の非対称性隔壁を形成すべきだからである。
スクリーンにおいて影響される特定の生物分子にも拘わらず、同定されるあらゆる化合物が抗細菌剤としての開発のための良好な能力のある候補となるはずであるが、なぜなら細胞分裂は中心的な標的のようなものだからである。さらに、細胞分裂蛋白質は細菌において高度に保存される傾向にあるから、広いスペクトルの阻害剤を得ることができるらしい。
添付の図面に言及すると、
図１は、spoIIAA-lacZおよびgpr-uidAの発現に対するFtsZの欠失の効果を示すグラフであり；
図２は、細胞壁合成または細胞分裂に影響する抗生物質の検出を示す４つのグラフＡ，Ｂ，ＣおよびＤのセットであり；
図３は、高い処理量のスクリーニングに適したフォーマットにおいて胞子形成およびリポーター遺伝子発現を誘導するための９６ウエルマイクロタイタープレートの使用を示すグラフである。
以下の実施例は本発明を例示する。
実施例１
アッセイの有用性を例示するために、上記の２つのリポーター遺伝子（即ち、gpr-uidAおよびspoIIAA-lacZ）を含むが、加えて、必須細胞分裂遺伝子ftsZを、誘導物質である試薬ＩＰＴＧ依存性にする遺伝学上の挿入物を含む株を構築した（Beall and Lutkenhaus, 1991）。この株は、誘導物質が存在するかまたは不在の何れか、そして２つのリポーター活性が測定されるような条件下において胞子形成するように誘導された。図１は、spoIIAA-lacZ（丸）およびgpr-uidA（四角）の発現に対するFtsZの欠失の効果を示す。黒の記号はFtsZ存在下のリポーター酵素活性を示し、白の記号は誘導物質ＩＰＴＧの除去により空にされた培養物中を示す。示されるとおり、誘導物質存在下においては、両方のリポーター遺伝子は胞子形成開始から１−２時間後に強く誘導され、一方誘導物質不在下においては細胞分裂の阻害をもたらし、spoIIAA-lacZリポーターのみがβ−ガラクトシダーゼを生成し活性化された。胞子形成の間σF活性は正常にそれ自身の遺伝子の抑制を導くため、spoIIAA-lacZの発現は活性なσFの不在下では実際には増強される。胞子形成の開始から約180分後に採取されてβ−ガラクトシダーゼ並びにβ−グルクロニダーゼに関してアッセイされたサンプルは、即ち、σF活性の特異的な阻害を容易に検出するはずである。機能するFtsZの不在下ではgpr-uidA活性は壊滅され（σFは活性にならないことを示す）、一方spoIIAA-lacZ発現（σF合成を導く）は増強されることは注目すべきであるが、おそらくは胞子形成の後期にσF活性が正常にそれ自身の遺伝子の抑制を導くからであろう。
実施例２
アッセイ方法が細胞分裂の実際の阻害剤を検出できることを示すために、図２に示す実験を実施した。用いられた細菌株は以下の遺伝マーカー：trpC2Ω（amyE::gpr-uidA aphA-3）（φ105J19）spoIIAA-lacZ catを有した。即ち、β−ガラクトシダーゼ（lacZ遺伝子から）はσF合成の示唆を提供し、そしてβ−グルクロニダーゼ（uidA遺伝子から）はσFの活性化（細胞分裂依存性）の度合いを提供する。該株は、胞子形成するように標準法により誘導された（Partridge and Errington, 1993, Mol. Microbiol, 8, 945-955）。誘導直後、培養物をいくつかの部分に分けて、異なる公知の抗生物質で処理した。対照（非処理）培養物（パネルＡ）では、β−ガラクトシダーゼ（黒い四角）およびβ−グルクロニダーゼ（白い四角）活性が２つのリポーター遺伝子から生じ、次いでそれらの正常な動力学を生じた（Errington and Mandelstam, 1986, J. Gen. Microbiol, 132, 2967-2976；Partridge and Errington, 1993）（図１も参照）。細胞壁合成または細胞分裂に影響する抗生物質（バシトラシン［50μg/ml；パネルＢ］およびカルベニシリン［110μg/ml；パネルＣ］）の存在下では、ほとんど正常な動力学を伴ったβ−ガラクトシダーゼの蓄積により示されるとおりσFの合成が起こったが、β−グルクロニダーゼ活性の排除により示されるとおりσFの活性化はブロックされた。対照的に、蛋白質合成の一般的な阻害剤エリスロマイシン（50μg/ml）を用いると、両リポーター遺伝子はブロックされた（パネルＤ）。
一般に細胞壁合成に影響するバシトラシン（およびバンコマイシン、データは示さず）の場合、示された濃度における阻害剤の添加が、spoIIAA-lacZリポーターの発現の穏やかな低下（並びにgpr-uidA発現のブロック）を引き起こしたことは、注目すべきである。そのような発現の低下は隔壁形成に特異的に必要とされる蛋白質の阻害剤を用いては生じないらしい（但し、そのような阻害剤は現在入手できない）。即ち、gpr-uidA発現をブロックする試験試薬のうち、もっとも高いレベルのspoIIAA-lacZ発現を与えるものが隔壁形成に特異的に必要とされる標的におそらくは影響するはずである。にもかかわらず、細胞壁合成に関与する機能が、良好な抗生物質に要求される必然の選択的毒性を概して提供するらしいとおり、spoIIAA-lacZ発現の部分的な低下を与える化合物はそれでもなお商業上は興味があるかもしれない。
カルベニシリンの場合、培養物中の光学密度（ＯＤ600）の低下により示されるとおりの細胞溶解が胞子形成開始の約２−３時間後に始まったことも注目すべきである。この溶解はおそらくリポーター活性の大きな差異を説明するには遅く生じるが、アッセイを実施する場合に現れるかもしれない「偽陽性」の結果の可能な源の示唆を提供する。gpr-uidAリポーターはspoIIAA-lacZリポーターの約１時間後に変わる（turn）ので、ゆっくりとした細胞殺傷を示す薬剤は、初期および後期のリポーター遺伝子の発現に対して異なる効果を有するはずでありうる。細胞溶解を通してこの効果を有する薬剤は、必要であれば、胞子形成の開始から約３または４時間後に培養物の光学密度を測定することにより検出および排除できる。
実施例３
バッチで生育させたバチルスサチルスを用いた上記結果がマイクロタイタープレートフォーマットにおいて細胞の成長に関して得ることができるかを確認するために、株846の細胞（上記参照）を、飢餓培地中の懸濁を含む標準法により胞子形成するように誘導した（Partridge and Errington, 1993）。懸濁直後、培養物を２つの部分に分けた。一方の部分は、いつもどおりガラスフラスコ中において継続して胞子形成させた（図３中の黒い記号）。培養物の他方の半分は50μlアリコートにて、360ウエルを有する12マイクロタイタープレートによるスタンダード８のウエルに注いだ（白い記号）。マイクロタイタープレートはガラスフラスコのそばで、37℃において撹拌しながらインキュベートした。ときどき、プレートの１ウエルの内容物とフラスコ培養物の50μlを取り出してβ−ガラクトシダーゼ（丸）とβ−グルクロニダーゼ（四角）に関してアッセイした。図３に示すとおり、時間の進行はマイクロタイタープレートの胞子形成した培養物の両リポーター酵素の良好な指標を示したが、フラスコ培養物からのぞれらの時間進行におけるマイナーな質的差異があった。マイクロタイタープレート中で胞子形成するように誘導された細胞も、フラスコ中のそれらと同様な効率で胞子を形成することが観察された。我々は、高い処理量の様式において稼動させるアッセイに必要な胞子形成実験は容易に利用可能なマイクロタイタープレート中で実施できることを結論する。
【図１】
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【図３】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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