(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５ｋＤのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、前記蛋白質又はその免疫原性断片は配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列であって、該核酸配列は１５ｋＤのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質の免疫原性断片をコードする少なくとも１８ヌクレオチドを有する核酸。
【請求項２】
３２ｋＤのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、前記蛋白質又はその免疫原性断片は配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列であって、該核酸配列は３２ｋＤのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質の免疫原性断片をコードする少なくとも１８ヌクレオチドを有する核酸。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の核酸を含むｃＤＮＡ断片。
【請求項４】
機能的に連結されたプロモーターの制御下で、請求項１又は２に記載の核酸又は請求項３に記載のｃＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項３に記載のｃＤＮＡ断片又は請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子を含む生組換え担体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の核酸、請求項３に記載のｃＤＮＡ断片、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子又は請求項５に記載の生組換え担体を含む宿主細胞。
【請求項７】
１５ｋＤの分子量を持ち、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質であって、該Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質は配列番号２で表される蛋白質に対する免疫応答を誘導することができるＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質。
【請求項８】
配列番号２で表される蛋白質のうち連続した少なくとも６つのアミノ酸からなる免疫原性断片であって、該免疫原性断片は配列番号２で表される蛋白質に対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片。
【請求項９】
３２ｋＤの分子量を持ち、配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質であって、該Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質は配列番号４で表される蛋白質に対する免疫応答を誘導することができる前記Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質。
【請求項１０】
配列番号４で表される蛋白質のうち連続した少なくとも６つのアミノ酸からなる免疫原性断片であって、該免疫原性断片は配列番号４で表される蛋白質に対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片。
【請求項１１】
ワクチンとして使用するための請求項７から１０に記載のＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質。
【請求項１２】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンの製造のための、請求項７から１０に記載のＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質の使用。
【請求項１３】
請求項１又は２に記載の核酸、請求項３に記載のｃＤＮＡ断片、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項５に記載の生組換え担体、請求項６に記載の宿主細胞又は請求項７から１０に記載の蛋白質、及び製薬上許容される担体を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチン。
【請求項１４】
アジュバントを含むことを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
イヌに対して病原性を有するウイルス又は微生物から得られる追加の抗原又はかかる抗原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする、請求項１３又は１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
イヌに対して病原性を有する前記ウイルス又は微生物が、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ、ｖｏｇｅｌｉ、ｒｏｓｓｉ、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌパルボウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、イヌジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒｖｉｒｕｓ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｃａｎｉｃｏｌａ、ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、ｐｏｍｏｎａ、ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、イヌ肝炎ウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）、イヌパラインフルエンザウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓ及びＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
請求項７から１０に記載の蛋白質又はその免疫原性断片に対する抗体を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチン。
【請求項１８】
請求項１又は２に記載の核酸、請求項３に記載のｃＤＮＡ断片、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子、請求項５に記載の生組換え担体、請求項６に記載の宿主細胞又は請求項７から１０に記載の蛋白質と、製薬上許容される担体を混合することを含む、請求項１３から１６に記載のワクチンを調製するための方法。
【請求項１９】
前記抗体と製薬上許容される担体を混合することを含む、請求項１７に記載のワクチンを調製するための方法。
【請求項２０】
請求項１又は２に記載の核酸の核酸配列又はかかる核酸配列に相補的な核酸配列、又は少なくとも１８のヌクレオチド長を有する配列番号１又は３で表される核酸配列からなる核酸の断片を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連ＲＮＡの検出のための診断検査ツール。
【請求項２１】
請求項７から１０で定義される蛋白質又はその免疫原性断片を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原物質に対する抗体の検出のための診断検査ツール。
【請求項２２】
請求項７から１０で定義される蛋白質又はその免疫原性断片に対する抗体を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原物質の検出のための診断検査ツール。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質をコードする核酸配列、これらの配列を含むｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子及び生組換え担体、ならびにかかる核酸配列、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子及び生組換え担体を含む宿主細胞に関する。さらに、本発明は、これらのヌクレオチド配列によってコードされる蛋白質、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンとその調製のための方法、ワクチンとして使用するためのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原物質、及びワクチンの製造におけるＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原物質の使用に関する。また、本発明は、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連核酸配列の検出、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原の検出及びＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原物質に対する抗体の検出のための診断ツールに関する。
【０００２】
バベシア症はマラリアのように限局特性を持つ疾患である。この理由は、病原体が、脊椎動物個体群に存在する寄生虫のリザーバーを餌とするマダニによって媒介されることによる。マダニが存在する場所においてのみバベシア症が発生する。どちらかといえば、特に在来の動物においては、寄生生物は重要な疾患を引き起こすことなく宿主と共存する。多くの場合バベシア症は、遺伝形質の近親交配及び／又はバベシア症が風土病である不慣れな環境に動物を輸送することを介して人間の活動が理由で問題となる（Ｃａｌｌｏｗ，Ｌ．Ｌ．とＤａｌｇｌｉｅｓｈ，Ｒ．Ｊ．，１９８２）。
【０００３】
イヌでは、この疾患はＢ．ｃａｎｉｓ（カクマダニ属（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）のダニによって媒介される）、Ｂ．ｒｏｓｓｉ（チマダニ属（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ）のダニによって媒介される）、Ｂ．ｖｏｇｅｌｉ（コイタマダニ属（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ）のダニによって媒介される）及びＢａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）チマダニ属及びコイタマダニ属のダニによって媒介される）によって引き起こされる。自然獲得されたバベシア症における疾患の徴候は、通常感染から７〜２１日後に始まる。これらの症状は次のものを含む：発熱、食欲不振、抑うつ、貧血、血色素尿症及び速やかに発現する衰弱。一般に涙液分泌の上昇、唾液分泌過多及び筋振せんが起こる。感染の末期には神経徴候が発現することがあり、疾患を処置せずに放置すると死に至る場合もある。汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に類似した重篤な凝固障害が急性Ｂ．ｃａｎｉｓ感染において報告されている。血栓症は一般的ではないが、巨核球と結合した小さなヒアリン血栓が報告されている。これらの凝固障害は赤血球の粘着性上昇を導くと思われる。その結果、微小血管系を通しての血液通過が妨げられ、内器官のうっ血や充填赤血球量（ＰＣＶ）の減少をもたらす。これは一部の組織への酸素供給を低下させ、その後酸素欠乏の結果として組織損傷を導くと考えられる。Ｂ．ｃａｎｉｓ感染におけるうっ血の証拠は、イヌを化学療法で処置した実験からのものである。これらの動物の一部は、脾の正常測定値への収縮を伴って、充填赤血球量が２日間で２５〜３５％回復した。
【０００４】
バベシア属の４つの種はその病原性が異なる。北アフリカＢ．ｖｏｇｅｌｉ菌株は軽度の疾患だけを誘発し、この疾患は通常治療を必要としない（オーストラリアＢ．ｃａｎｉｓ菌株と同様）。ヨーロッパＢ．ｃａｎｉｓ菌株は北アフリカ寄生生物よりも病原性が強い。Ｂ．ｃａｎｉｓ  Ａ菌株に関する我々の実験では、約半数の動物が感染後化学療法治療を必要とした。南アフリカＢ．ｒｏｓｓｉ菌株は最も病原性が強く、非常に早期から特徴が認められる。南アフリカＢ．ｒｏｓｓｉ菌株を使用すると、無傷のイヌは、寄生生物の指数増殖を特徴とする進行性疾患を発症した。これに対し、ヨーロッパＢ．ｃａｎｉｓに感染したイヌにおける寄生虫血症は通常限られている。後者では、うっ血が主要な疾病特徴であると思われる。
【０００５】
現在バベシア属のためのワクチンは、米国特許第４，７７７，０３６号に述べられているように、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの菌株の培養上清から調製される。しかし、そのようなワクチンはＢ．ｃａｎｉｓのこの特定種の菌株の抗原だけしか含まない。そのようなワクチンは一般に（野生型）Ｂ．ｃａｎｉｓによる感染に対してほとんど保護を与えない（Ｌｅｐｅｔｉｔ，Ｃ．，Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｏｓｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｅｔ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，Ｐｉｒｏｄｏｇ，Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｎａｎｔｅｓ，１９８８）。前記論文の著者は、この感染防御免疫の欠如について考えられる３つの原因を挙げている：
１．ワクチン接種に対するイヌの感受性；
２．ワクチン接種によって誘導される免疫エフェクター機序のタイプ
３．バベシア属の抗原多様性。
【０００６】
全弱毒化バベシア属寄生生物を含むワクチンは、寄生生物が再び有毒となり、その結果疾患を治癒する代わりに疾患を蔓延させる危険性を常にはらんでいる。それ故、サブユニットワクチンの使用が好ましい。そこで、感染力がなく、容易に生産することができて、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染に対して、好ましくはすべてのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ菌株に対して保護を与えるワクチンが所望されている。
【０００７】
各々単独に又は組み合わせたとき、イヌにおいてＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染防御を誘導することができるＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質を提供することが、中でも特に、本発明の目的である。意外にも、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓに特異的に関連するそのような２つの新規蛋白質が存在することが発見された；それらはバベシア種、Ｂ．ｒｏｓｓｉにおいては認められない。
【０００８】
新規蛋白質をＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓに関連すると称することは、これらの蛋白質がＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ寄生生物中に存在することが認められることを意味する。寄生生物の染色体上に遺伝情報が認められることを意味しない。新規蛋白質についての遺伝情報は、寄生生物中に認められるが、染色体外情報としても存在しうる。
【０００９】
新規蛋白質は、１５ｋＤ蛋白質（又はＢｃｖｉｒ１５）及び３２ｋＤ蛋白質（又はＢｃｖｉｒ３２）と称される。１５ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列を配列同定表の配列番号２に示す。この蛋白質をコードするｃＤＮＡを配列決定し、その核酸配列を配列同定表の配列番号１に示している。
【００１０】
３２ｋＤ蛋白質のアミノ酸配列を配列同定表の配列番号４に示す。この蛋白質をコードするｃＤＮＡを配列決定し、その核酸配列を配列同定表の配列番号３に示している。
【００１１】
多くの異なる核酸配列が全く同一の蛋白質をコードしうることは周知技術である。この現象は、アミノ酸をコードする各トリプレットの２番目及び特に３番目の塩基におけるゆらぎとして一般に知られている。この現象は、やはり同じ蛋白質をコードする２つの異なる核酸配列について約３０％の非相同性をもたらしうる。それ故、約７０％の配列相同性を有する２つの核酸配列がそれでも全く同一の蛋白質をコードすることがありうる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態は、１５ｋＤのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関し、前記蛋白質又はその免疫原性断片は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ。９８％、さらには１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
【００１３】
本発明のもう１つの実施形態は、３２ｋＤのＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片をコードする核酸配列に関し、前記蛋白質又はその免疫原性断片は配列番号４に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ。９８％、さらには１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
【００１４】
言うまでもなく、本発明に基づいた蛋白質をコードする核酸配列は、当該蛋白質をコードするＲＮＡ及びこのＲＮＡの遺伝子暗号を担うｃＤＮＡ及びＤＮＡにも等しく適用されることは明白である。結果として、ある核酸配列又はその一部が、例えば配列番号１の核酸配列と一定レベルの相同性を持つと言われる場合、この相同性のレベルはｃＤＮＡ及びｃＤＮＡを作製するための鋳型として使われるＲＮＡについても等しく当てはまり、また逆に（ｃ）ＤＮＡ及びそのＤＮＡから転写されるＲＮＡについても同様である。
【００１５】
本発明が関連する蛋白質の免疫原性断片をコードする上記核酸配列の部分は非常に小さくてもよい。例えば４個のアミノ酸長の免疫原性断片が知られている。そのような免疫原性断片は１２個のヌクレオチドの核酸配列によってコードされる。そのような非常に短いアミノ酸配列は、しかしながら、それだけでは免疫原性を有しない：当該技術において既知である、ＫＨＬのような担体と結合する必要がある。より長い断片はそれ自体で免疫原性となりうる。それ故、免疫原性断片をコードする上記核酸配列の部分は少なくとも１２個のヌクレオチドを含む。１５個以上、より好ましくは１８個、２０個、２５個、さらには３０個以上のヌクレオチドを含む部分が、この順序で選択順位が上がってさらに一層好ましい。
【００１６】
本発明は、新規Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連の１５ｋＤ及び３２ｋＤ蛋白質をコードする核酸配列を開示し、これにより初めてこれらの蛋白質を十分な量で入手することが可能となる。これは、例えば当該蛋白質をコードする遺伝子を発現するような発現系を使用することによって実施できる。
【００１７】
それ故、もう１つの実施形態では、本発明は、本発明に基づいた核酸配列を含むｃＤＮＡ断片に関する。ｃＤＮＡは、本発明に基づいた蛋白質をコードするＲＮＡの、例えば逆転写酵素によって作製されたＤＮＡのコピーである。そのようなｃＤＮＡ断片の最も短い形態が、本発明に基づいた核酸配列の一部のＤＮＡコピーである。しかしそれらはまた、コード配列の上流及び下流に天然には存在しない隣接核酸配列も含みうる。
【００１８】
ｃＤＮＡの発現の必須条件は、ｃＤＮＡに機能的に連結された適切なプロモーターであり、それ故ｃＤＮＡはプロモーターの制御下にある。プロモーターの選択が、蛋白質発現のための宿主細胞として使用される細胞において遺伝子の転写を指令することができるあらゆる真核生物、原核生物又はウイルスプロモーターに及ぶことは当業者には明白である。それ故、本発明のもう１つの実施形態は、機能的に連結されたプロモーターの制御下にある、本発明に基づいたｃＤＮＡ断片又は核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。これは、例えば標準的な分子生物学手法によって入手することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）。
【００１９】
機能的に連結されたプロモーターとは、それらが連結されている核酸配列の転写を制御することができるプロモーターである。そのようなプロモーターは、そのプロモーターが発現に使用される細胞において機能的であることを条件として、バベシア属プロモーターでありうる。また非相同プロモーターであってもよい。宿主細胞が細菌であるとき、使用しうる有用な発現制御配列は、Ｔｒｐプロモーター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜蛋白質プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．とＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，７７１−７７５，１９８２）；バクテリオファージラムダプロモーター及びオペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））プロモーター及びオペレーター、終始配列及び選択した宿主細胞と適合性である他の発現促進及び制御配列を含む。
【００２０】
宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現制御配列は、例えばα−交配因子を含む。昆虫細胞については、バキュロウイルスのポリヘドリン又はｐ１０プロモーターが使用できる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳類由来であるときには、有用な発現制御配列の例は、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）又はメタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４２，１９８２）又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）を含む。
【００２１】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳類細胞発現系は非常に頻繁に使用される系である。そのような系は周知技術であり、一般に入手可能であって、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡを通して市販されている。これらの発現系に次いで、寄生生物に基づく発現系が非常に魅力的な発現系である。そのような系は、例えばフランス特許願公開番号２  ７１４  ０７４号及び米国ＮＴＩＳ公開番号ＵＳ０８／０４３１０９号（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．とＲｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開日１９９３年１２月１日）。
【００２２】
本発明のもう１つの実施形態は、本発明に基づいたｃＤＮＡ断片又は本発明に基づいた組換えＤＮＡ分子を含む生組換え担体（Ｌｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃａｒｒｉｅｒ、ＬＲＣ）に関する。そのような担体は、例えば細菌、寄生生物及びウイルスである。これらのＬＲＣは、付加的な遺伝情報、この場合には本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質をコードする核酸配列又はその免疫原性断片がクローニングされている微生物又はウイルスである。そのようなＬＲＣに感染した動物は、担体の免疫原に対してだけでなく、遺伝子コードがＬＲＣ内に付加的にクローニングされている蛋白質の免疫原性部分、例えば１５ｋＤ又は３２ｋＤのｃＤＮＡに対しても免疫原性応答を生じる。
【００２３】
細菌ＬＲＣの例として、当該技術において既知の弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌株が魅力的に使用できる。
【００２４】
生組換え担体寄生生物は、中でも特に、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９８））によって記述されている。
【００２５】
また、ＬＲＣウイルスは核酸配列を標的細胞内に輸送する手段としても使用しうる。生組換え担体ウイルスはベクターウイルスとも呼ばれる。ベクターとしてしばしば使用されるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７（１９８２））、ヘルペスウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０４７３２１０Ａ２号）、及び逆ウイルス（Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄ．ら、Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．及びＰｌｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．（編集）「実験的血液学の今−１９８８年（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ−１９８８）」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐ．９２−９９（１９８９）より）である。
【００２６】
当該技術では周知のｉｎ  ｖｉｖｏ相同的組換えの手法を使用して、組換え核酸配列を、宿主動物において本発明に基づいた挿入核酸配列の発現を誘導することができる、選択した細菌、寄生生物又はウイルスのゲノムに導入することができる。
【００２７】
最後に本発明のもう１つの実施形態は、本発明に基づいた核酸配列、本発明に基づいたｃＤＮＡ断片又は組換えＤＮＡ分子、又は本発明に基づいた生組換え担体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌ベースのプラスミド、又はｐＧＥＸのよな細菌発現ベクター、又はバクテリオファージと組み合わせた、細菌由来の細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞でありうる。宿主細胞はまた真核生物由来、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合わせた酵母細胞、又はベクター又は組換えバキュロウイルスと組み合わせた昆虫細胞のような高等真核細胞（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８）、例えばＴｉプラスミドベースのベクター又は植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ３２：１０３３（１９８３））、やはり適切なベクター又は組換えウイルスと組み合わせた、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はクランデルネコ腎細胞のような哺乳類細胞であってもよい。
【００２８】
本発明のもう１つの実施形態は、本発明に基づいた新規Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質である１５ｄＤ及び３２ｋＤ蛋白質及びその免疫原性断片に関する。
【００２９】
免疫原性断片の概念を下記に定義する。
【００３０】
ここに包含される個々の蛋白質に関して、個々のＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ菌株に関連する蛋白質間に天然の変異が存在しうることは明白であろう。これらの変異は、全体的配列内でのアミノ酸の相違によって、又はかかる配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加によって明らかにされうる。生物学的及び免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換が、例えばＮｅｕｒａｔｈらにより、「蛋白質（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）の中で述べられている。関連アミノ酸の間でのアミノ酸置換又は進化の過程でしばしば起こった置換は、中でも特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，「蛋白質の配列及び構造の図解（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９７８、第５巻、補遺３、参照）である。他のアミノ酸置換は、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕを含むこの情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは、迅速で感受性の高い蛋白質の比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５）及び相同蛋白質間の機能的類似性の決定のための方法を開発した。本発明の例示的実施形態のそのようなアミノ酸置換、ならびに欠失及び／又は挿入を有する変異は、生じる蛋白質が免疫反応性を保持しているかぎり本発明の範囲内である。
【００３１】
これにより、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質が、様々な野外分離株から単離したとき、まだ同じ免疫学的特性、すなわちＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染に対する免疫応答を誘導する能力を備えた同じ蛋白質でありながら、約８０％の相同性レベルを持ちうる理由が説明される。
【００３２】
まだＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓによる感染に対して又は少なくとも感染の臨床症状発現に対して免疫応答を誘導することができる蛋白質を提供する、本発明に基づいたある種の蛋白質アミノ酸配列の変異は、「免疫原性に本質的に影響を及ぼさない」とみなされる。
【００３３】
それ故、この実施形態の１つの形態は、中でも特に、１５ｋＤの分子量を持ち、配列番号２に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質及びかかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
【００３４】
好ましい形態では、実施形態は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ、そのようなＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質及びかかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
【００３５】
９８％、さらには１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
【００３６】
もう１つの実施形態は、中でも特に、３２ｋＤの分子量を持ち、配列番号４に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列を含むＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質及びかかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
【００３７】
この実施形態の好ましい形態は、配列番号４に示すようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を持つ、そのようなＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質及びかかる蛋白質の免疫原性断片に関する。
【００３８】
９８％、さらには１００％の相同性レベルがさらに一層好ましい。
【００３９】
蛋白質の相同性のレベルはコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」でサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択して決定することができ、このサブプログラムはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２，ｈｔｍｌ．でアクセスできる。
【００４０】
このプログラムについての参考文献は、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６２」。使用するパラメータはデフォルトパラメータである：オープンギャップ：１１、エクステンションギャップ：１、ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００４１】
例えばワクチン接種のため又は抗体を惹起するために蛋白質を使用するとき、全蛋白質を使用する必要はない。それ自体で又は例えばＫＬＨのような担体に結合して、その蛋白質に対する免疫応答を誘導することができるその蛋白質の断片、いわゆる免疫原性断片を使用することも可能である。「免疫原性断片」とは、宿主細胞において免疫応答を誘導する能力を依然として保持している、すなわちＢ又はＴ細胞エピトープを含む完全長蛋白質の断片であると理解される。現在、抗原断片（決定基）をコードするｃＤＮＡ断片を容易に同定するために様々な手法が使用可能である。Ｇｅｙｓｅｎらが述べた方法（特許願ＷＯ８４／０３６５４号、特許願ＷＯ８６／０６４８７号、米国特許第４，８３３，０９２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、蛋白質の免疫学的重要な領域であるエピトープを検出するための、容易に実施でき、迅速で十分に確立された方法である。かかる方法は世界中で使用されており、それ自体が当業者には周知である。この（経験的な）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適する。また、何らかの蛋白質をコードする遺伝子の配列が与えられれば、コンピュータアルゴリズムにより、現在既知であるエピトープとの順序及び／又は構造上の一致に基づいて特定の蛋白質断片を免疫学的に重要なエピトープとして選定することができる。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８−３８２８（１９８１））に従った親水性判定基準と、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５４，１０１号）に従った二次構造局面の組合せに基づく。Ｔ細胞エピトープは、同様にＢｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性判定基準（Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米国特許願ＮＴＩＳ  ＵＳ  ０７／００５，８８５号）を用いてコンピュータによって配列から予想することができる。簡潔な概要は次の文献中に認められる：一般的原理に関してはＳｈａｎ  Ｌｕ；Ｔｉｂｔｅｃｈ  ９：２３８−２４２（１９９１）、マラリアエピトープに関してはＧｏｏｄら；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１０５９−１０６２（１９８７）、総説についてはＬｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：３−７（１９９２），ＨＩＶエピトープについてはＢｅｒｚｏｗｓｋｙ；Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５：２４１２−２４１８（１９９１）。
【００４２】
そこで、本発明のもう１つの実施形態は、上述したような本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片を製薬上許容される担体と共に含む、Ｂａｂｅｓｉａｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
【００４３】
本発明に基づいたワクチンを作製する１つの方法は、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ寄生生物の増殖と、１５ｋＤ及び３２ｋＤ蛋白質の精製を含む。これは、しかしながら、非常に時間のかかるワクチン製造方法である。従って工業的規模でそのようなワクチンを製造することはあまり実用的ではないであろう。
【００４４】
本発明の利点の１つは初めて１５ｋＤ及び３２ｋＤ蛋白質をコードする核酸配列を提供することである。それ故、ワクチンとしてこれらの蛋白質又は本発明に基づいたその免疫原性断片をコードするｃＤＮＡの発現産物を使用することははるかに便利である。
【００４５】
これらのｃＤＮＡの発現産物に基づくワクチンは、本発明に基づいた一方又は両方の蛋白質又は本発明に基づいたその免疫原性断片を、下記に述べるような製薬上許容される担体と混合することによって容易に作製できる。本発明に基づいた一方又は両方の蛋白質又は本発明に基づいたその免疫原性断片が発現された宿主細胞と、製薬上許容される担体を直接混合することも可能である。
【００４６】
その代わりに、本発明に基づいたワクチンは、本発明に基づいた蛋白質又は本発明に基づいたその免疫原性断片を発現することができる、上述したような生組換え担体を含みうる。例えば細菌（例えばサルモネラ属）担体、寄生生物又はウイルス担体に基づくそのようなワクチンは、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの自然の感染方法をよりよく模倣することができるという点でサブユニットワクチンより有利である。さらに、免疫には少量の組換え担体しか必要としないので、それらの自己増殖は利点である。そこで、さらにもう１つの実施形態は、本発明に基づいた生組換え担体と製薬上許容される担体を含む、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
【００４７】
上述したすべてのワクチンが能動的ワクチン接種に寄与する、すなわち本発明に基づいた１つ又はそれ以上の蛋白質又はその免疫原性断片が引き金となって、宿主の免疫系がこれらの蛋白質又は断片に対する抗体を産生する又はこれらの蛋白質に関連するエピトープによって特異的に惹起されるレセプターでＴ細胞個体群を増殖させる。
【００４８】
あるいは、そのような抗体は、例えばウサギにおいて惹起する又は下記に述べるような抗体産生細胞系統から入手することができる。その後そのような抗体を宿主動物に投与することができる。このワクチン接種方法、すなわち受動的ワクチン接種は、動物が既に感染していて、自然の免疫応答を惹起する時間がないときに選択されるワクチン接種法である。また免疫無防備状態の動物にワクチン接種するための好ましい方法でもある。これらの場合には、投与したＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓに対する抗体は、本発明に基づいた蛋白質及びこれらの蛋白質に接触した寄生生物と細胞に直接結合することができる。これはＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの増殖を低下させる又は停止させるという利点を持つ。
【００４９】
それ故、本発明のこの実施形態からのもう１つの形態は、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質又はかかる蛋白質の免疫原性断片と、製薬上許容される担体を含む、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
【００５０】
もう１つの実施形態は、本発明に基づいた抗体と製薬上許容される担体を混合することを含む、本発明に基づいたワクチンの調製のための方法に関する。
【００５１】
ワクチンはまた、本発明に基づいた核酸配列、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子又は生組換え担体を含む、上述したような宿主細胞に基づくこともできる。
【００５２】
それ故、本発明のもう１つの実施形態は、本発明に基づいた宿主細胞と製薬上許容される担体を含む、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
【００５３】
ワクチン接種の代替的で効率的な方法は、関連抗原をコードするＤＮＡによる直接ワクチン接種である。蛋白質をコードするＤＮＡの直接ワクチン接種は多くの異なる蛋白質について成功を収めてきた（例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら、ＴｈｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：２０−２６（１９９３）において検討されているように）。
【００５４】
このワクチン接種の方法はＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染に対するイヌのワクチン接種にとっても魅力的である。
【００５５】
それ故、本発明のこの実施形態のさらなる他の形態は、本発明に基づいた核酸配列と製薬上許容される担体を含むワクチン、及び本発明に基づいたｃＤＮＡ断片と製薬上許容される担体を含むワクチンに関する。
【００５６】
この実施形態のさらにもう１つの形態は、本発明に基づいた組換えＤＮＡ分子と製薬上許容される担体を含むワクチンに関する。ＤＮＡワクチンは、例えば無針注射器を用いて、皮内適用を通して容易に投与することができる。この投与方法は、ワクチンを接種する動物の細胞内にＤＮＡを直接送達する。１〜１００μｇのマイクログラム範囲内の量のＤＮＡは非常に良好な成績を提供する。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明に基づいたワクチンは、イヌに対して病原性の微生物又はウイルスから誘導される付加的抗原、又はそのような抗原をコードする遺伝情報を含む。
【００５８】
そのようなイヌに対して病原性の生物及びウイルスは、好ましくはＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ、ｖｏｇｅｌｉ、ｒｏｓｓｉ、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌパルボウイルス、イヌジステンパーウイルス、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｃａｎｉｃｏｌａ、ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、ｐｏｍｏｎａ、ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、イヌ肝炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓ及びＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの群から選択される。
【００５９】
本発明に基づいたワクチンはすべて製薬上許容される担体を含む。製薬上許容される担体は、例えば滅菌水又は滅菌生理食塩水でありうる。より複雑な形態では、担体は例えば緩衝液でありうる。
【００６０】
ワクチンの調製のための方法は、本発明に基づいた核酸配列、ｃＤＮＡ断片、組換えＤＮＡ分子又は生組換え担体、本発明に基づいた宿主細胞、又は本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片と、製薬上許容される担体を混合することを含む。
【００６１】
そこで、本発明のもう１つの実施形態は、本発明に基づいた核酸配列、本発明に基づいたｃＤＮＡ断片、本発明に基づいた組換えＤＮＡ分子、本発明に基づいた生組換え担体又は本発明に基づいた宿主細胞又は本発明に基づいた蛋白質と、製薬上許容される担体を混合することを含む、本発明に基づいたワクチンの調製のための方法に関する。
【００６２】
本発明に基づいたワクチンは、好ましい形態として、同時にアジュバントを含みうる。一般にアジュバントは、非特異的に宿主の免疫応答を高める物質を含む。多くのアジュバントが当該技術において知られている。アジュバントの例は、フロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ  Ａ（登録商標）のようなサポン、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又はＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油、及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（ホモポリマー）、又はＤｉｌｕｖａｃ（登録商標）  Ｆｏｒｔｅである。
【００６３】
ワクチンはまた、いわゆる「賦形剤」を含みうる。賦形剤は、蛋白質がそれに供給結合することなく付着する化合物である。多用される賦形剤化合物としては、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、シリカ、カオリン、及びベントナイトである。
【００６４】
抗原が部分的に賦形剤中に包埋されているというような賦形剤の特殊な形態はいわゆるＩＳＣＯＭ（ＥＰ  １０９，９４２号、ＥＰ  １８０，５６４号、ＥＰ２４２，３８０号）である。
【００６５】
さらに、ワクチンは１つ又はそれ以上の適当な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ又はＴｗｅｅｎを含みうる。
【００６６】
しばしばワクチンは、例えば分解しやすい蛋白質を分解から保護するため、ワクチンの貯蔵寿命を高めるため、又は凍結乾燥効率を改善するために安定剤と混合される。有用な安定剤は、中でも特に、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ５９：５０９（１９５０））、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、アルブミン又はカゼインのような蛋白質又はその分解産物、及びアルカリ金属リン酸塩のような緩衝剤である。
【００６７】
さらに、ワクチンは生理的に許容される希釈剤に懸濁することができる。賦形剤化合物又は希釈剤を補助し、付加する他の方法、蛋白質を乳化又は安定化する他の方法も本発明において体現されることは言うまでもない。
【００６８】
そこで、この実施形態の好ましい形態は、アジュバントを含む、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンに関する。
【００６９】
本発明に基づいたワクチンは、１〜１００マイクログラムの範囲の量で非常に適切に投与しうるが、より低い用量も原則として使用できる。１００マイクログラムを越える用量は、免疫学的には非常に適切であるが、商業的理由からあまり魅力的ではないであろう。
【００７０】
上述したＬＲＣウイルス、寄生生物及び細菌のような生弱毒化組換え担体に基づくワクチンは、それらの感染中に自ら増殖するので、はるかに低い用量で投与することができる。それ故、適当量は、それぞれ細菌、寄生生物及びウイルスについて１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの間の範囲であろう。
【００７１】
多くの投与方法が適用できる。例えばワクチンの筋肉内適用による全身適用は適切な投与法である。この経路を使用する場合には、全身適用のための当該技術において既知の標準的手法が良好に適する。真皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、皮下及び皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与法も魅力的である。
【００７２】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、ワクチン使用のための本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質に関する。
【００７３】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染を防御するためのワクチンの製造のための、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質の使用に関する。
【００７４】
疾患予防の見地から、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染の迅速で正確な診断が重要である。
【００７５】
それ故、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染の検出に適した診断ツールを提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００７６】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの検出のための診断検査は、例えば検査する動物から単離したＲＮＡと特異的プローブとの反応に基づく、あるいは例えば１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質についてのコード配列に基づくＲＴ−ＰＣＲ検査又はかかるコード配列に相補的な核酸配列に基づくＲＴ−ＰＣＲ検査である。本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質に特異的な核酸分子が動物中に存在する場合、これらは、例えば特異的ＰＣＲプライマーに特異的に結合し、その後ＲＴ−ＰＣＲ反応において増幅される。次にＤＮＡゲル電気泳動においてＰＣＲ反応産物を容易に検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲ反応は周知技術である（下記の参考文献参照）。核酸分子は、試験する動物の赤血球（その中に存在する寄生生物）から最も容易に単離できる。標準的なＰＣＲテキストが、本発明に基づいたＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質に特異的な核酸分子との選択的ＰＣＲ反応のためのプライマー長を決定する方法を教示する。少なくとも１２個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を持つプライマーがしばしば使用されるが、１５個以上、より好ましくは１８個以上のヌクレオチドのプライマーは幾分より選択的である。特に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチド長を持つプライマーは極めて一般的に適用しうる。ＰＣＲ手法は（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５（１９９５））の中で広汎に記述されている。Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質をコードする核酸配列あるいは少なくとも１２個、好ましくは１５個、より好ましくは１８個、さらに一層好ましくは、選択順位が上がる順に２０個、２２個、２５個、３０個、３５個又は４０個以上のヌクレオチド長を持つそれらの核酸分子の部分であって、配列番号１又は３に示すような核酸配列又は配列番号１又は３に示すような核酸配列に相補的な核酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つ核酸分子又はその部分も、それ故、本発明の一部である。そのような核酸分子は、例えば本発明に基づいた蛋白質をコードする核酸の量を高めるために（ＲＴ−）ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用することができる。これは、例えば上記に示したような組織におけるＢａｂｅｓｉａの検出のための診断ツールとして使用するための特異的ヌクレオチド配列の迅速な増幅を可能にする。
【００７７】
蛋白質の相同性のレベルはコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」でサブプログラム「ＢＬＡＳＴＰ」を選択して決定することができ、このサブプログラムはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２，ｈｔｍｌ．でアクセスできる。
【００７８】
このプログラムについての参考文献は、Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．，Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７４：２４７−２５０（１９９９）である。使用するマトリックス：「ｂｌｏｓｕｍ６２」。使用するパラメータはデフォルトパラメータである：オープンギャップ：１１、エクステンションギャップ：１、ギャップｘ＿ドロップオフ：５０。
【００７９】
もう１つの核酸ベースの試験は、赤血球から得られた寄生生物材料の増殖、次いで古典的ＲＮＡ精製とそれに続くｃＤＮＡ合成及び／又は放射標識又は色素標識した１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質特異的なｃＤＮＡ断片との古典的ハイブリダイゼーションに基づく。ＰＣＲ反応とハイブリダイゼーション反応はいずれも周知技術であり、中でも特にＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６０に述べられている。
【００８０】
そこで、本発明のもう１つの実施形態は、試験が、配列番号１又は３に示すような核酸配列と少なくとも７０％の相同である核酸配列、又はかかる核酸配列に相補的なヌクレオチド配列、又は少なくとも１２個、好ましくは１５個、より好ましくは１８個のヌクレオチドの長さを持つその断片を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連ＲＮＡの検出のための診断検査に関する。
【００８１】
例えば血清、組織又は体液中のＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質に対する抗体の検出のための診断検査は、本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片がＥＬＩＳＡプレートの穴の壁に被覆されている簡単な標準ＥＬＩＳＡ試験でありうる。そのような抗体の検出のための方法としては、例えば１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片を被験哺乳類からの血清と共に反応させ、次いで関連哺乳類抗体に対する標識抗体と共に反応させることである。その後呈色反応によってＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連蛋白質に対する抗体の存在の可否を明らかにすることができる。診断検査系のもう１つの例は、本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片を被験哺乳類の血清と反応させ、その後ウエスタンブロット分析をすることである。
【００８２】
そこで、本発明のもう１つの実施形態は、試験が本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原物質に対する抗体の検出のための診断検査に関する。
【００８３】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原の特異的１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質の抗原物質の検出に基づく診断検査であって、それ故Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ感染の検出に適した診断検査は、例えば標準的サンドイッチＥＬＩＳＡ試験でありうる。そのような試験の一例としては、ＥＬＩＳＡプレート壁が１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその免疫原性断片に対する抗体で被覆されている。被験物質と共に反応させたあと、標識抗Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ抗体をウエルに加える。その後呈色反応によってＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの抗原物質の存在を明らかにする。
【００８４】
それ故、本発明のさらにもう１つの実施形態は、当該試験が本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片に対する抗体を含むことを特徴とする、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ関連抗原物質の検出のための診断検査に関する。
【００８５】
上述したようにして発現される本発明に基づいた蛋白質又はその免疫原性断片を使用して抗体を作製することができ、かかる抗体はポリクローナル、単一特異性又はモノクローナル（又はその誘導体）でありうる。ポリクローナル抗体を所望する場合、ポリクローナル血清を産生し、処理するための手法は周知技術である（例えばＭａｙｅｒとＷａｌｔｅｒ編集、「細胞及び分子生物学における免疫化学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。
【００８６】
本発明に基づいた蛋白質（又はその変異体又は断片）に対するモノクローナル抗体は、公知技術の手法により（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５  ４９７，１９７５）、近交系マウスを免疫することによって調製できる。
【００８７】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、当該方法が、血清、組織又は体液を本発明に基づいた１５ｋＤ又は３２ｋＤ蛋白質又はその抗原性断片に対する抗体と共に反応することを含む、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓからの抗原物質の検出のための方法に関する。
【００８８】
【実施例】
実施例１
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの分子的特定
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの増殖
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの分離菌（分離菌Ａ及びＢ）をフランスで自然感染したイヌから入手した。それらをＳｃｈｅｔｔｅｒｓら（１９９７、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１１５，４８５−４９３）に従って試験管内培養で継代した。
【００８９】
ｃＤＮＡライブラリーの構築、免疫学的スクリーニング及びプラスミドＤＮＡの単離
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）からのｃＤＮＡライブラリーを、Ｃａｒｒｅｔら（１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５−１０２１）がＢ．ｒｏｓｓｉについて述べたようにしてＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）  ｃＤＮＡ  Ｇｉｇａｐａｃｋ（登録商標）  ＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて構築した。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｐｆ６０多重遺伝子ファミリーの１つに対するポリクローナル抗体、抗ＧＳＴ６０．１（抗大腸菌抗体が除去されている）（Ｃａｒｃｙら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６８：２２１−２３３）を１：１００の希釈で使用して、Ｃａｒｒｅｔら（１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５−１０２１）が述べたようにしてライブラリーをスクリーニングした。４−クロロ−１−ナフチルを色素原として使用して（Ｓｉｇｍａ）、ペルオキシダーゼに複合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて陽性クローンを視覚化した。それらを精製し、ＢＣＶＩＲｃＤＮＡを担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドをＣａｒｒｅｔら（１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６５，１０１５−１０２１）が述べたようにして調製した。
【００９０】
ＤＮＡ配列決定
Ｔ３、Ｔ７万能プライマーと各々の鎖の確立された配列から誘導したオリゴヌクレオチドを用いて選択したプラスミドの両方の鎖に関して、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓ．Ａ．（Ｚｏｎｅ  Ａｓｔｅｃ，Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によりＳａｎｇｅｒら（１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４（１２）：５４６３−５４６７）に従ってアルカリ変性二本鎖鋳型からのジデオキシ法を使用してヌクレオチド配列決定を実施した。
【００９１】
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの５’末端のクローニング
完全長ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列を得るために、欠失している５’末端を次のようにして得た：ｃＤＮＡライブラリーを、ベクター配列（ＥｃｏＲＩクローニング部位の７０ｂｐ上流に位置する）から誘導したＴ３センス万能プライマー及びＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列（当該ｃＤＮＡの完全な配列においてＥｃｏＲＩクローニング部位の４７６−４９６下流のヌクレオチド位置、図１及び図２参照）から誘導したアンチセンスプライマーＰ２（５’−ＡＴＧＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧ−３’）を使用するＰＣＲ実験のためのＤＮＡ鋳型として用いた。ＰＣＲは、ｃＤＮＡライブラリー１μｌ（１０５ファージ）をＤＮＡ鋳型として用いて、下記に述べるように（ＰＣＲ増幅の章）実施した。生じた最大のＰＣＲ断片を（約５５０ｂｐの大きさ）ゲル抽出スピンカラム（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いてゲル抽出し、ｐＧＥＭ（登録商標）−ＴベクターシステムＩＩキットを用いてＰｒｏｍｅｇａの推奨する条件下でｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクターにクローニングし、Ｔ７及びＳＰ６万能プライマー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）を用いて下記に述べるように二本の鎖について配列決定した。
【００９２】
ＰＣＲ増幅
ＰＴＣ−１００（商標）  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）において、Ｃａｒｒｅｔら（１９９９、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．，４６（３），２９８−３０３）が述べたようにして次の条件下で増幅を行った：９４℃で３分間、９４℃で１分間の３０サイクル、５５℃で１分間及び７２℃で１分間、そしてさらに７２℃で５分間。プライマーＰ１（センス５’−ＧＡＣＧＴＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＡＧＧＧＡＡＧＣ−３’）、Ｐ５（センス５’−ＡＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＴ−３’）、Ｐ２（アンチセンス）及びＰ１５．２（アンチセンス５’−ＡＡＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡＧＣ−３’）はすべてＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列から誘導したものであり（それぞれの位置は図１に示されている）、この配列の分子分析に一般的に使用した。
【００９３】
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列のゲノムＤＮＡ分析
Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋが述べた標準的手法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ培養からのゲノムＤＮＡ抽出とサザンブロット実験を実施した。プローブは、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡをＤＮＡ鋳型として担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドを用いてＰ１／Ｐ１５．２又はＰ１／Ｐ２プライマーの組合せによるＰＣＲを実施して入手し、それらを製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の推奨する条件下でニックトランスレーションキットを用いて標識した。またこれらのプローブを、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により０．７％アガロース（ＩＣＮ）で分離し、ナイロン膜に移したＢ．ｃａｎｉｓの染色体に関しても試験した。
【００９４】
対照として、同じ膜上でＢ．ｃａｎｉｓ  ＡのＢｃｃ１２Ｄ３  ｃＤＮＡから誘導したプローブをＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列から誘導したプローブとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション実験を行った。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈが推奨するように脱ハイブリダイゼーションを実施した。
【００９５】
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列のＲＮＡ分析
Ｐｒｏｍｅｇａに従ってＲＮＡｇｅｎｔｓＲ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ／ＰＣＲ及びノーザンブロット実験のための出発物質として使用した。
【００９６】
ＲＴ−ＰＣＲ。Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｖｉａｎ  ＲＴ−ＰＣＲキットの２段階プロトコールを使用して製造者（Ｓｉｇｍａ）が述べているようにＲＴ−ＰＣＲを実施した。簡単に述べると、全ＲＮＡ  ２５０ｐｇを鋳型として、特異的ｃＤＮＡプライマー（センスＰ１、センスＰ５（５’−ＡＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＴ−３’）又はアンチセンスＰ１５．２）１μＭを使用して４２℃で５０分間第一段階（逆転写）を実施し、第一段階の反応物の５分の１を鋳型として使用して、上述したように（ＰＣＲ増幅の章）５０℃のアニーリング温度で第二段階を実施した。対照として、ＤＮＡ汚染について試験した各々のプライマーに関してｅＡＭＶ−ＲＴなしで第一段階を実施し、Ｂ．ｃａｎｉｓ  ＡのＢｃｃ１２Ｄ３  ｃＤＮＡから誘導した特異的プライマー（センスＢｃｃ１２Ｄ３．１及びアンチセンスＢｃｃ１２Ｄ３．２）に関しても実験を行った。
【００９７】
ノーザンブロット分析。ノーザンブロット実験のために、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋが述べたようにして（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）、ホルムアルデヒドを含むゲルを通して全ＲＮＡを電気泳動し、ナイロン膜に移した。ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列に関して増幅し、ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ｄＵＴＰで標識したＰ１／Ｐ２  ＰＣＲ断片から誘導したプローブでハイブリダイゼーションを実施した。ｍＲＮＡを欠く全ＲＮＡサンプルもハイブリダイゼーション実験のために使用し、ＰｏｌｙＡ  Ｔｒａｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）  ＩＩＩキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｍＲＮＡ除去を行った。
【００９８】
結果
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの分離と配列
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＰｆ６０多重遺伝子ファミリーの１つに対する抗ＧＳＴ６０．１抗血清（Ｃａｒｃｙら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６８：２２１−２３３）を使用したＢ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）のｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングによって、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡを分離し、配列決定した。ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列は１１３５個のヌクレオチドを含み（ＥｃｏＲＩからＸｈｏＩクローニング制限部位の間）、ポリ（Ａ）２２テールを有していた（図１Ａ及び図２）。このｃＤＮＡの興味深い特徴は、２つの重複オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が推定されることである（図１Ａ）：ヌクレオチド７５（ＡＴＧ、メチオニンについての開始コドン）と５００（ＴＡＡ、停止コドン）の間のＯＲＦ１及びヌクレオチド４４８（イソロイシンについてのＡＴＴコドン）と９３３（ＴＧＡ、停止コドン）の間のＯＲＦ２。これら２つのＯＲＦは５２個のヌクレオチド（４４８−５００の位置）が重複し、＋１シフトしている（図１Ａ）。ＯＲＦ１は、メチオニンから始まり、１５．７ｋＤａの予想分子量と１０．９の等電点を持つ１４１個の残基の推定ポリペプチド（Ｂｃｖｉｒ１５と称される）をコードする（図２）。ＯＲＦ２はコンセンサス翻訳開始配列を含まず、Ｉｌｅによって開始される（図１Ａ）。１５．２ｋＤａの予想分子量を持つ１３３個の残基の推定ポリペプチドをコードする。ＯＲＦ１とＯＲＦ２間の＋１シフトにより、これら２つのＯＲＦは重複領域において異なるアミノ酸配列を示す（図１Ｂ）。ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの重複領域の配列分析は、その領域におけるそのような＋１リボソームフレームシフトが、８５９個のヌクレオチド配列の翻訳から生じる、２８５個の残基のＯＲＦ１−ＯＲＦ２融合蛋白質（Ｂｃｖｉｒ３２と称される）を産生したと考えられることを示唆した（図３）。Ｂｃｖｉｒ３２は３２．３ｋＤａの推定分子量と１０．５の等電点を持つと考えられる。
【００９９】
ＤＮＡ分析
Ｂ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ及びＢ）のゲノムにおけるＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列の存在を、これらの分離菌からのＤＮＡ（サザンブロット）又は染色体（ＰＦＧＥ）の両方に関してＰＣＲとハイブリダイゼーション実験によって分析した。
【０１００】
ＰＣＲ実験
これらは、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列からの特異的プライマーの３つの組合せを使用して実施した：ＯＲＦ１をカバーするＰ１／Ｐ２とＰ５／Ｐ２（それぞれ図４Ａと４Ｂ）、及びＯＲＦ２及びｃＤＮＡのこれら２つのＯＲＦ間の重複領域をカバーするＰ５／Ｐ１５．２（図４Ｃ）。対照として、これらのプライマーの組合せによってｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドが担うｃＤＮＡ  ＢＣＶＩＲ上の約３６０、１６０及び６３０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し（図４Ａ−Ｃ、レーン５）、非感染イヌから調製したゲノムＤＮＡに関して陰性であった（図４Ａ−Ｃ、レーン４）。これらのプライマーの組合せは、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａ及びＢからのゲノムＤＮＡに関して試験したときゲノムＤＮＡ断片を増幅できなかった（図４、それぞれレーン１及び２）のに対し、ＤＮＡ試料についての対照として、Ｂ．ｃａｎｉｓのＢｃｃ１２Ｄ３  ｃＤＮＡから誘導した特異的プライマーは、これらの試料に関して予想される１２００ｂｐのゲノムＤＮＡ断片を特異的に増幅することができた（図４Ｄ、それぞれレーン１及び２）。さらに、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列からのプライマーは、Ｂｃｃ１２Ｄ３  ｃＤＮＡから誘導したものと同様に、Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌ＦからのゲノムＤＮＡに関するＰＣＲにおいて陰性であった（図４、レーン３）。
【０１０１】
ハイブリダイゼーション実験
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列からのＰＣＲ断片Ｐ１／Ｐ２及びＰ５／Ｐ１５．２を用いて合成したプローブとのハイブリダイゼーションを、様々な制限酵素によって消化して（サザンブロット）又は染色体上で（ＰＦＧＥによって分離して）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌ＡとＢ及びＢ．ｒｏｓｓｉの分離菌ＦのゲノムＤＮＡに関して実施した。いずれのハイブリダイゼーション実験を実施した場合も、これらのプローブはＢ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡ上のＢＣＶＩＲ配列を検出することができなかったのに対し、これらのプローブを膜から脱ハイブリダイゼーションした後、Ｂｃｃ１２Ｄ３  ｃＤＮＡ配列から誘導したプローブはＢ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡ上のその配列を検出することができた（データは示していない）。
【０１０２】
ＲＮＡ分析
Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａから抽出した全ＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ（図５、Ａ−Ｃ）及びハイブリダイゼーション実験（ノーザンブロット）（図６）によってＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列の分析を実施した。
【０１０３】
ＲＴ−ＰＣＲ実験。ＢＣＶＩＲ配列のＲＴ−ＰＣＲ分析のため、Ｂｃｃ１２Ｄ３  ｃＤＮＡ配列の分析を対照として使用した（図５Ｄ及び５Ｅ）。この対照に関して予想されたように、Ｂｃｃ１２Ｄ３からの１２００ｂｐのＤＮＡ断片は、アンチセンスプライマーＢｃｃ２Ｄ３．２で第一の逆転写段階を実施したときにはプライマーＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂｃｃ１２Ｄ３．２の組合せでのＰＣＲによって増幅されたが（図５Ｅ、レーン５）、センスプライマーＢｃｃ１２Ｄ３．１で実施したときには増幅されなかった（図５Ｄ、レーン４）。ＢＣＶＩＲ配列の分析については、予想される６３０ｂｐのＤＮＡ断片は、アンチセンスプライマーＰ１５．２で逆転写の第一段階を実施したときプライマーＰ５／Ｐ１５．２の組合せでのＰＣＲによって増幅された（図５Ｃ、レーン３）。しかし意外にも、６３０ｂｐのこのＤＮＡ断片は、センスプライマーＰ５で逆転写の第一段階を実施したときこのＰ５／Ｐ１５．２プライマーの組合せでのＰＣＲによっても増幅された（図５Ｂ、レーン２）。同じように、センスプライマーＰ１で逆転写の第一段階を実施したときＰ１／Ｐ２プライマーの組合せでのＰＣＲによって予想外の３６０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された（図５Ａ、レーン１）。逆転写段階でｅ−ＡＭＰ逆転写酵素を除いて同じ実験を実施したとき、これらのプライマーの組合せでのＰＣＲによってＤＮＡ断片を増幅することはできず（図５、レーン１’−５’）、逆転写段階でセンスプライマーＰ１又はＰ５を用いて増幅された３６０及び６３０ｂｐのＤＮＡ断片は、先に認められたように（ＤＮＡ分析の章）、ゲノムＤＮＡ由来ではないことを明らかにした。さらに、それらの配列決定及び全体的ＢＣＶＩＲ  ｃＤＡＮ配列から誘導したプローブとのハイブリダイゼーション（図５、ＩＩＩ）によってそれらの特異性が確認された。
【０１０４】
ノーザンブロット実験
ＢＣＶＩＲのＯＲＦ１配列に対応するプローブによるＢ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）から抽出した全ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって３つの異なるＲＮＡバンドを検出した：約１４００塩基の濃いバンドと約１２００及び２８００塩基の２つの薄いバンドであった（図６、レーン２）。開始時には同量の全ＲＮＡを使用し、ｍＲＮＡを除去してハイブリダイゼーションを実施したとき、１２００塩基のバンドは消失し（図６、レーン３）、ｃＤＮＡの大きさと一致して、このＲＮＡバンドがｍＲＮＡであることを示唆した。またこれは、センスプライマーで逆転写段階を実施したときＲＴ−ＰＣＲによって得られた結果と一致し、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列が非メッセンジャーＲＮＡ（１４００及び２８００塩基の長さのバンド）によって担われることが確認された。
【０１０５】
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列でＢ．ｒｏｓｓｉ（図６、レーン４）又はウシ種であるＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（図６、レーン１）からの全ＲＮＡにハイブリダイズしたときシグナルは認められなかった。
【０１０６】
結論
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列の分子的な特定としては、それがＢ．ｃａｎｉｓゲノムＤＮＡ由来ではないことが示された。かかる配列が、ｍＲＮＡだけでなく１．４ｋｂと３ｋｂの非メッセンジャーＲＮＡによっても担われることを明らかにしている。また、このｃＤＮＡからの配列はＢ．ｃａｎｉｓのヨーロッパ分離株において特異的に認められ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｒｏｓｓｉでは認められないことを明らかになった。
【０１０７】
実施例２
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の生化学的な特定
大腸菌におけるＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２組換え蛋白質の発現と精製
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡからのＯＲＦ１とＯＲＦ２によってコードされる産物を組換え蛋白質として発現し、それらに対する特異的抗血清を作製するために、２つのＯＲＦをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）により、インフレームでＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ切断脱リン酸化ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にサブクローニングした。ＯＲＦ１によってコードされるＢｃｖｉｒ１５蛋白質（ａａＭ１−Ｉ１４１、図２）を産生するため、１０４１ｂｐのｃＤＮＡ配列（ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの５’末端が失われている）を含むＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片をｐＢＫ−ＣＭＶ組換えプラスミドから切り出し、ベクターにサブクローニングした。ＯＲＦ２配列から推定されるアミノ酸配列（ａａ配列Ｎ１５４−Ｃ２８５、図３）、すなわち２つのＯＲＦ間の５２ｂｐの重複領域（図１におけるヌクレオチド位置４４８−５００）を除外したアミノ酸配列に対して特異的な抗血清を得るため、ＰＣＲ実験によってＯＲＦ２配列内にＥｃｏＲＩ制限部位を設けた。そこで、ｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドが担う１０４１ｂｐのＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列を、センスプライマーＰＥＣＯ（５’−ＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＧＡＣＴＡ−３’；完全なＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列上のヌクレオチド位置５２９−５４９に位置する、図１及び図２）及びベクター配列から誘導したアンチセンスＴ７万能プライマー（ＸｈｏＩクローニング部位の７５ｂｐ下流に位置する）によるＰＣＲ実験のための鋳型ＤＮＡとして使用した。増幅した断片を、ｐＧＥＭ（登録商標）−ＴベクターＳｙｓｔｅｍ  ＩＩキットを使用してＰｒｏｍｅｇａの推奨条件下でｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクターにクローニングした。ＯＲＦ２からの約６００ｂｐのＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を組換えプラスミドから遊離し、その後ベクターにサブクローニングした。どちらのクローニングについても、大腸菌ＢＬ２１細胞内へのライゲーション混合物による形質転換を実施し、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列からの特異的プライマーでのＰＣＲを用いて陽性クローンを選択した。
【０１０８】
ｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターからの組換えＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５蛋白質及び非組換えＧＳＴの発現と精製をＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８、Ｇｅｎｅ，６７（１）：３１−４０）に従って実施した。しかし、ＧＳＴ−ＰＲＦ２は封入体内で凝集するため、この標準手法を用いて精製することができなかった。それ故、ＮａｇａｉとＴｈｏｇｅｒｓｅｎのプロトコール（１９８７、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」より（Ｒ．ＷｕとＬ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ編集）、１５３、４６１−４８１）に従って、最初に全細胞抽出物から封入体を分離した。次にそれらを解離し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した（Ｌａｅｍｍｌｉ  ＵＫ，１９７４，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２８７：６８０−６８５）。最後に、組換えＧＳＴ−ＯＲＦ２をゲルから電気溶出し、下記に述べるようにウサギを免疫するために使用した。
【０１０９】
ＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２蛋白質に対する抗体の作製
ポリクローナル抗血清。Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅ（「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」、ＩＳＢＮ２−９０７５１６−１５−９）に従って、ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対して惹起したポリクローナル抗血清をマウスとウサギにおいて作製し、ＧＳＴ−ＯＲＦ２に対して惹起したポリクローナル抗血清をウサギにおいて作製した。ウサギ（ニュージーランド白色）を、１回目の注射についてはフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（Ｓｉｇｍａ）中に乳化した精製ＧＳＴ組換え蛋白質５０μｇにより皮下経路で、またその後の２回についてはフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて筋肉内注射によって免疫した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、１回目の注射についてはＦＣＡ中、またその後の２回についてはＦＩＡ中に乳化したＧＳＴ−ＯＲＦ１  １５μｇで腹腔内免疫した。動物の注射は３週間の間隔で実施し、各免疫の８日前に採血を行った。
【０１１０】
モノクローナル抗体の作製とスクリーニング
組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１で免疫したマウスからの脾細胞をＸ−６３  Ａｇ８−６５３骨髄種と融合する４８時間前に、ＧＳＴ−ＯＲＦ１  １５μｇの最後の注射を実施した。モノクローナル抗体を単離するための融合過程と限界希釈によるクローニングをＢｒｏｗｎら（１９７９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１：２０１−２０９）に従って実施した。ハイブリドーマ上清を下記に述べるような間接免疫蛍光アッセイによってスクリーニングした。
【０１１１】
免疫学的方法
免疫ブロット法
次のようにして調製した精製Ｂ．ｃａｎｉｓメロゾイトに関して免疫ブロット法を実施した：インビトロ培養からの寄生赤血球（２０％の血中寄生虫レベル）を滅菌ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で十分に洗った。ペレットを３７℃で３０分間、最終濃度３６Ｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ）からのα−溶血素で溶解した。遊離メロゾイトと残りの非溶解細胞を遠心分離（３５００ｇ、３０分間）によってペレット化し、上清を廃棄した。ペレットをＴＢＳで１回洗い、ＴＢＳ  ２ｍｌに懸濁して、１．０９密度の低層と１．０２密度の上層によって形成したサッカロース勾配での遠心分離（３５００ｇ、３０分間）によってメロゾイトを精製した。遊離メロゾイトを界面で採集し、それらを遠心分離（１５０００ｇ、１０分間）によってペレット化し、ＴＢＳで３回洗った。次に電気泳動用に処理して、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で蛋白質を分離した。ＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２蛋白質に対するポリクローナル抗血清について１：１００希釈を用いて、Ｃａｒｃｙら（１９９１、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７２，９３−１０２）がＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓに関して述べたようにして免疫ブロット法を実施した。
【０１１２】
感染免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
ＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２蛋白質に対するポリクローナル抗血清について１：２００希釈を用いて、Ｇｒｅｌｌｉｅｒら（１９９４、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，８２，１２９−１３８）がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに関して述べたようにしてＢ．ｃａｎｉｓ寄生赤血球（５％の血清寄生虫レベル）に関してＩＦＡ及び二重ＩＦＡを実施した。二重ＩＦＡについては、スライドガラスを最初は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギ抗血清と共に、次いでＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するマウスポリクローナル又はモノクローナル抗体と共にインキュベートした。制限吸光蛍光のためにスライドガラスをＣｉｔｉｆｌｕｏｒ溶液（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）で封入し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ，Ｚｅｉｓｓ）を用いて蛍光を検出した。
【０１１３】
Ｂ．ｃａｎｉｓ培養の［３５Ｓ］−メチオニン放射標識と免疫沈降法。
【０１１４】
５０μＣｉ／ｍｌ（１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び５％の出発血中寄生虫レベルでのＢ．ｃａｎｉｓのインビトロ培養の［３５Ｓ］−メチオニン放射標識、及び免疫沈降アッセイを、Ｃａｒｃｙら（１９９１、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，７２，９３−１０２）がＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓについて述べたようにして実施した。
【０１１５】
ＴＸ−１１４処理による蛋白質相分離
Ｂ．ｃａｎｉｓの蛋白質を、［３５Ｓ］−メチオニン放射標識寄生赤血球（２０％の血中寄生虫レベル）２００μｌを出発物質として使用して、Ｐｒｅｃｉｇｏｕｔら（１９９１、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９（８）２７９９−２８０５）がＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓについて述べたようにしてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ）で相分離した。
【０１１６】
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列のインビトロ翻訳
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡのフレームシフト誘導能をインビトロ翻訳系において検討した。インビトロ翻訳のためにその５’末端にＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列全体、コザック配列及びＴ７プロモーター配列を含むＰＣＲ  ＤＮＡ断片に関して、ＴＮＴ（登録商標）  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてインビトロ翻訳産物を合成した。そのようなｄｎａ断片を増幅するために、次の２つのプライマーを使用して不完全な１０４１ｂｐのＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡをＤＮＡ鋳型として担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドに関してＰＣＲを実施した：コザック配列とＴ７プロモーター配列だけでなく、ＯＲＦ１の開始ＡＴＧコドンを含む全体的ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列の失われた５’末端（プライマー配列の太字部分；完全なｃＤＮＡ配列のヌクレオチド位置７５−１３０；図１及び図２参照）も含む、９０ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチド（プライマーＰ０：５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧ−３’）、及びＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列からのアンチセンスプライマーＰ１５．２。環状組換えｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド１００ｎｇを使用してＰＣＲを次の増幅条件を用いて行った：９４℃で３分間の１サイクル；９４℃で１分間、３７℃で１分間及び７２℃で１分間の５サイクル；９４℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で１分間の２５サイクル。純度を確保するためにＰＣＲ産物を２回ゲル抽出し、ヌクレアーゼ非含有水に１００ｎｇ／μｌの濃度で懸濁した。次にそれらを、ＴＮＴＲ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）が述べているように使用して、翻訳する網状赤血球溶解産物に加えた。対照として、反応物からＰＣＲ断片を除いて同じ実験を実施した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２又は抗ＧＳＴ抗血清及び免疫前ウサギ血清に関する総放射標識翻訳産物（５μｌの反応物）及び免疫沈降産物（２０μｌの反応物から）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【０１１７】
結果
ＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２の精製。ＯＲＦ１又はＯＲＦ２によってコードされるポリペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体を作製するために、ＯＲＦ１の１４１残基（１Ｍ−１４１Ｉ）（７５ＡＴＧから停止コドンＴＡＡ５００までをコードする）（図２）及びＯＲＦ２の１３２残基（１５４Ｎ−２８５Ｃ）（ヌクレオチド位置５３３ＡＴＴから停止コドンＴＧＡ９３３までをコードする）（図３）を、ＧＳＴ配列とインフレームでｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターにクローニングした。ＢＬ２１大腸菌株においてＧＳＴ−ＯＲＦ１とＧＳＴ−ＯＲＦ２の過剰発現を実施した（図７）。発現試験によって、ＩＰＴＧ誘導後、組換えｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＯＲＦ１を含む大腸菌培養によって、超音波破砕した細菌の溶解物中にＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質が可溶性蛋白質として発現されたことが明らかになった（図７Ａ、レーン１）。溶出後、可溶性ＧＳＴ−ＯＲＦ１を精製したが、これはの予想分子量として４０ｋＤａを示した（図７Ａ、レーン２）。これに対し、ＧＳＴ−ＯＲＦ２は、組換えｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＯＲＦ２を含む大腸菌培養において不溶性であり、３９ｋＤａの分子量を持つ組換え蛋白質が主として封入体中に認められた（図７Ｂ、レーン５）。精製ＧＳＴ−ＯＲＦ２でウサギを免疫するため、１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離した精製封入体抽出物からゲルで切り出した（図７Ｂ、レーン４）。
【０１１８】
対照として、天然ｐＧＥＸ  ４Ｔ３を含む大腸菌培養のＩＰＴＧ誘導後にＧＳＴを精製した（図７Ｂ、レーン３）。
【０１１９】
免疫学的試験
ｃＤＮＡがコードするポリペプチドの免疫学的試験を実施するため、マウスとウサギを免疫することにより、ＧＳＴ−ＯＲＦ１又はＧＳＴ−ＯＲＦ２又はＧＳＴに対するポリクローナル抗血清を作製した。ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対する２つのモノクローナル抗体も試験した。
【０１２０】
免疫沈降実験
最初の実験では、Ｂ．ｃａｎｉｓ培養（分離菌Ａ）の全培養（図８Ａ）及び外部抗原（図８Ｂ）放射標識分画に関して実験を行った。全抗原分画においては、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１は１５ｋＤａの主要産物（Ｂｃｖｉｒ１５、星印で示す）及び約３２ｋＤａの少量産物（推定Ｂｃｖｉｒ３２、矢印で示す）を強く認識する（図８Ａ、レーン３）。外部抗原分画では、約３２ｋＤａの少量産物だけがかすかに検出された（図８Ｂ、レーン３）。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２は、全及び外部抗原分画上の３２ｋＤａ蛋白質に対して反応がないことが認められた（図８、レーン４）。免疫前ウサギ及び抗ＧＳＴ抗血清は、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清で認識される抗原に反応がなかった（図８、それぞれレーン１及び２）。２番目の実験では、ＴＸ−１１４処理後に得られたＢ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）抗原の親水性及び疎水性分画を、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１との免疫沈降法によって分析した（図９）。親水性分画において１５ｋＤａ蛋白質が検出され（図９Ａ、レーン２、星印で示す）、疎水性分画では反応が認められなかった（図９Ｂ、レーン２）。対照として、免疫前ウサギ血清に関して免疫沈降法を実施したとき、１５ｋＤａ蛋白質に対する反応性は認められなかった（図９、レーン１）。ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するＭＡｂは免疫沈降実験において反応性を示さなかった。
【０１２１】
ウエスタンブロット法
Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａからの精製メロゾイトに関してウエスタンブロット法を実施した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１は１５ｋＤａ蛋白質を特異的に認識したが（図１０Ａ、レーン２、星印で示す）、免疫沈降実験と異なって、少量の３２ｋＤａ産物は認識しなかった。しかし、ウエスタンブロット実験において種々の蛋白質を認識した抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２は、そのような３２ｋＤａ抗原を検出することができた（図１０Ｂ、レーン２、矢印で示す）。約１５ｋＤａの蛋白質（ＯＲＦ２の予想１５．２ｋＤａポリペプチドに対応すると考えられる）は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２によって認識されなかった。対照として、各々の抗血清からの免疫前ウサギ血清はウエスタンブロット法において反応性ではなかった（図１０、レーン１）。ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するＭＡｂはウエスタンブロット法において反応性ではなかった。
【０１２２】
免疫蛍光アッセイ
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２を用いてＢ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａのインビトロ培養からの固定血液スメアに関するＩＦＡ試験を実施した（図１１）。ポリクローナルウサギ抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で得られた蛍光は、多数の寄生生物内小胞に結びついており、寄生生物の核を除いて寄生生物の細胞質全体に分散していた（図１１、写真Ａ）。同じパターンの蛍光がＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するｍＡｂでも認められた。さらに、ＧＳＴ−ＯＲＦ１に対するｍＡｂ及びポリクローナルウサギ抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２に関して実施した二重ＩＦＡは、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２によって認識される抗原は（図１１、写真Ｂ）、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって認識される抗原と同時に局在することを示唆した。対照として、抗ＧＳＴ及び免疫前ウサギ抗血清はＩＦＡ試験において反応性ではなかった。Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ｂからの感染赤血球に関してＩＦＡ試験を実施したとき、同じプロフィールの蛍光が認められた（データは示していない）。
【０１２３】
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡのインビトロ翻訳
免疫沈降実験によって発現産物を分析するために、網状赤血球溶解産物においてＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ全配列のインビトロ翻訳を実施した（図１２、レーン３−４）。総発現産物の分析は、ｃＤＮＡを用いて実験を行ったときには主要な１５ｋＤａ蛋白質が発現されるが（図１２、レーン４；星印で示す）、対照としてｃＤＮＡを除いて実験を行ったときには発現されない（図１２、レーン１）ことを明らかにした。この主要１５ｋＤａ蛋白質は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって特異的に免疫沈降するが、約３２ｋＤａの少量蛋白質も同様であった（図１２、レーン３；矢印で示す）。対照として、免疫前ウサギ血清及び抗ＧＳＴ抗血清はこれらの産物に関して反応性ではなかった（データは示していない）。それ故、そのような少量の３２ｋＤａ産物が予想された＋１フレームシフト機序から生じたと考えられることを示唆している。先に述べた免疫沈降アッセイの場合と同じように、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２はこの少量産物に対して反応性ではなかった（データは示していない）。
【０１２４】
結論
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清は、１５ｋＤａの親水性主要蛋白質と３２ｋＤａの少量蛋白質の２つの蛋白質を検出することができ、後者はＢ．ｃａｎｉｓのインビトロ培養の上清中で検出される。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清も３２ｋＤａ蛋白質を検出することができるが、１５ｋＤａ産物は検出することができなかった。これは、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡのＯＲＦ１が１５ｋＤａ蛋白質（予想１５．７ｋＤａ産物、Ｂｃｖｉｒ１５と称する）をコードすること、そしてＯＲＦ２が予想１５．２ｋＤａ産物を合成できないことを示している。さらに、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１と抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清によって共通して認識された３２ｋＤａ蛋白質の検出は、それが＋１フレームシフト機序から生じ、融合ＯＲＦ１−ＯＲＦ２蛋白質（Ｂｃｖｉｒ３２と称する）を産生することができる予想３２．３ｋＤａ産物に対応するであろうことを示唆する。ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列のインビトロ翻訳は、そのような機序がｃＤＮＡ配列内で起こりうることを示した。Ｂｃｖｉｒ１５蛋白質の高い発現レベルと比較して、３２ｋＤａ蛋白質の低いレベルの発現はそのような機序と一致する。さらに、寄生生物内小胞における、２つの抗血清によって認識される蛋白質の同時局在は、２つの抗血清によって認識される３２ｋＤａ蛋白質が同じものであることを示唆しており、そのようなフレームシフト機序と合致する。
【０１２５】
実施例３
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ増殖阻害試験
抗血清による阻害試験
実験の前に、２％ヘマトクリットで血中寄生虫レベルを１％に調整した（Ｄ０日）。Ｂ．ｃａｎｉｓ寄生生物を（「Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖」の中で先に述べた条件下で）、２４穴プレートで実施した実験については１ｍｌ又は６穴プレートで実施した実験については２ｍｌでインビトロ培養した。抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１と抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清の試験管内でのＢ．ｃａｎｉｓ増殖阻害能を、各々の抗血清を種々の濃度で（１〜８％）培地に加えて測定した。対照は次のとおりであった：ｉ）同じ濃度のウサギ免疫前血清又はウサギ抗ＧＳＴ血清又は関連性のないウサギ抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３血清との反応；ｉｉ）無処置でのＢ．ｃａｎｉｓインビトロ培養。
【０１２６】
各濃度での抗血清のＢ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ及びＢ）試験管内増殖阻害能を、反応時間をそれぞれ約３及び６周期のＢ．ｃａｎｉｓ生活環に相当する２４時間（Ｄ１日）と４８時間（Ｄ２日）にした後、ギームザ染色したスメアについての血中寄生虫レベルによって、又は水溶液中５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ヒポキサンチン（ＩＣＮ）での代謝標識によって測定し、３点検討した。Ｄ１後、ウエル容量の半量を採取し、培地を完全に除去して、Ｄ０に使用したのと同じ濃度で抗血清（及び標識実験については［３Ｈ］−ヒポキサンチン）を補足した新鮮培地と交換した。採集した感染赤血球（２４穴と６穴プレートでそれぞれ５及び２０μｌ）を１８００ｇで５分間遠心分離してペレット化し、ＴＢＳ中で５回洗った。放射能の取込みを測定するため、それらをＲＩＰＡ緩衝液５００μｌに溶解し、１時間氷上に置いた。溶解産物を１５０００ｇで遠心分離し（１５分間、４℃）、次に上清２μｌをＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒ−Ｓａｆｅ（Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）に加えて、取込まれた放射能を測定した。
【０１２７】
精製免疫グロブリンによる試験管内阻害アッセイ
各々の実験の前に、２％ヘマトクリットで血中寄生虫レベルを１％に調整した（Ｄ０日）。Ｂ．ｃａｎｉｓ及びＢ．ｒｏｓｓｉ寄生生物を９６穴プレートにおいて培地１００μｌ中でインビトロ培養した。阻害アッセイに使用する抗血清（抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５、抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５免疫前、抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清及び抗ＧＳＴ（図１７ではそれぞれＢｃｖｉｒ１５、Ｔ０、ＣＯＮＴ、ｏｒｆ２、ＧＳＴとして示す））を最初にＨＩＴｒａｐ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのＦＰＬＣによって精製した。次に精製免疫グロブリンをＰＢＳ  １Ｘ緩衝液に対して４℃で一晩透析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を用いて総免疫グロブリンを滴定した。ＥＬＩＳＡを使用して、天然ＧＳＴ蛋白質又はＧＳＴに融合した各々の組換え蛋白質に対する免疫グロブリンの比率を、非組換えＧＳＴ  ０．１μｇ又はウエルに被覆した組換え蛋白質０．１μｇへの精製免疫グロブリンの反応性の比較によって評価した。次にすべての免疫グロブリンサンプルを、ＲＰＭＩで特異的抗ＧＳＴ免疫グロブリンの同じ濃度に調整した。各々のサンプルがＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ又はＢａｂｅｓｉａ  ｒｏｓｓｉのインビトロ培養阻害能を、抗血清を得るために使用した組換え蛋白質の非ＧＳＴ部分に対する特異的免疫グロブリン１、２、４、８及び１０μｇに関して３回測定した。２４時間（Ｂ．ｃａｎｉｓ生活環の約３周期）、水溶液中５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ヒポキサンチン（ＩＣＮ）での代謝標識によって増殖阻害を評価した。次に、フィルターで赤血球を遮断し、Ｓｃａｔｒｏｎ装置を用いて洗浄した。その後、各々のウエルに結合した放射能を、シンチグラフィーによりＳｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ（Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ  Ｓａｆｅ（商標）  Ｐａｃｋａｒｄ，ＵＳＡ）２ｍｌ中で読み取った。
【０１２８】
組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質による阻害の回復
組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１が、Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖に対する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害作用回復能を、上述したように継代したインビトロ培養に関して試験した。８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１を含む培地中の種々の濃度の組換え蛋白質を試験した：２０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌ。４つの対照を使用した：ｉ）処置なしでのＢ．ｃａｎｉｓインビトロ培養；ｉｉ）組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１  ２０μｇ／ｍｌ又は４０μｇ／ｍｌを含む培養；ｉｉｉ）８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清を含む培養。
【０１２９】
各濃度のＧＳＴ−ＯＲＦ１が抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清の阻害作用回復能を３点で試験し、上述したようにＤ０、Ｄ１及びＤ２にギームザ染色したスメアに関する血中寄生虫濃度によって測定した。
【０１３０】
結果
抗血清による阻害試験
最初の実験では、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清からの種々の血液サンプル（図１３ではＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶとして示す）がＢ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）の試験管内増殖阻害能を、種々の濃度の各血液サンプル（１〜８％、図１３ではそれぞれＡ−Ｄとして示す）を培地に加えて試験した。対照培養では２日間の実験で血中寄生虫レベルが１％から３５％に上昇したのに対し（図１３Ｅ）、８％濃度の抗血清の第二及び第三のサンプルに関しては、Ｄ２にＢ．ｃａｎｉｓの試験管内増殖に対する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の有意の阻害作用が認められ、これらの処理培養ではＤ２に血中寄生虫レベルが約１５％であった（図１３Ｄ、それぞれＩＩＩ及びＩＶ）。対照として、免疫前ウサギ血清については使用した濃度にかかわらず阻害作用が認められなかった（図１３、Ｉ）。
【０１３１】
もう１つの実験は、Ｂ．ｃａｎｉｓの増殖に対する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清の阻害作用を分析するために実施した（図１４）。阻害作用を試験し、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清と比較して、免疫前又は抗ＧＳＴ又は関連性のない抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３ウサギ抗血清を対照として使用した（図１４）。すべての抗血清を抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害濃度（８５）で試験した。この実験では、Ｄ２に血中寄生虫レベルが対照培養では３５％であったのに対し、処理培養では２２％であり、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２の有意の阻害作用が認められた。さらに、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２の阻害作用は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１に関して認められたもの（Ｄ２に血中寄生虫レベルが約１５％である）よりも低かった。培養を８％の免疫前又は抗ＧＳＴ又は抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３ウサギ抗血清で処置しても阻害作用は認められなかった。
【０１３２】
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清の８％阻害作用を、処理及び未処理培養を代謝標識した後の［３Ｈ］−ヒポキサンチンの取込みを測定することによっても検討し、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌ＡとＢに関して実験を行った（図１５、それぞれＡ及びＢ）。両方の分離菌について、対照培養と比較して、Ｄ２に未処理培養では放射能が約２０００ｃｐｍであり、分離菌ＡとＢではそれぞれ２５０と３５０ｃｐｍであったことから、有意の阻害作用が認められた。血中寄生虫定量ではＤ１には抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害作用を検出できなかったのに対し、この阻害作用は放射能測定によって同日に視覚化された。実際に、対照培養における放射能は１０００ｃｐｍであったのに対し、処理培養では分離菌ＡとＢにおいてそれぞれ２００と２５０ｃｐｍであった。
【０１３３】
精製免疫グロブリンに関する試験管内阻害
可能性のある増殖阻害の非特異的原因として非免疫グロブリン血清成分を排除するため、上述した実験を精製免疫グロブリンに関して再度実施した。図１７に示すように、精製免疫グロブリンはＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａ及びＢの両方試験管内増殖を阻害することができる。意外にも、これは、本発明に基づいた１つ又は両方の蛋白質を含むワクチンが、血液型亜型にかかわらず、一般的にＢ．ｃａｎｉｓの寄生増殖を阻害しうることを意味する。予想されたように、Ｂ．ｒｏｓｓｉ  Ｍの試験管内増殖は阻害されない。
【０１３４】
阻害の回復
Ｂ．ｃａｎｉｓの試験管内増殖に対する抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１の阻害作用を確認するため、異なる濃度の精製組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１を培養液に加えることによってこの作用を回復させる実験を行った（図１６）。使用した２つの濃度は、２０及び４０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＯＲＦ１であった。この実験は、８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で処理した培地にＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質を加えることにより、２０及び４０μｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ５０及び１００％の阻害の回復が可能となることを示した（図１６、それぞれＣ及びＤ）。未処理培養にそのような濃度のＧＳＴ−ＯＲＦ１を加えたときには、寄生生物の増殖に影響を及ぼさなかった（図１６、それぞれＡ及びＢ）。未処理培養及び８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で処理した培養をこの実験の対照として使用した（図１６、それぞれＥ及びＦ）。
【０１３５】
結論
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１と抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２の両方が、８％の濃度で、Ｂ．ｃａｎｉｓ分離菌の試験管内増殖を有意且つ特異的に阻害することができた。この作用はＤ１で既に認められた。４０μｇ／ｍｌの濃度の組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１はこの阻害作用を完全に回復させることができた。さらに、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ抗血清の濾過によって、各々の抗血清の８％が１００及び５０μｇ／ｍｌの培養の免疫グロブリンのそれぞれの濃度であることが示された（データは示していない）。被覆した組換えＧＳＴに関して実施したＥＬＩＳＡ試験は、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１からの免疫グロブリンの半分が組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１のＧＳＴ部分に対するものであることを示し（データは示していない）、これは、８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１で認められたＢ．ｃａｎｉｓの試験管内増殖に対する阻害作用が、蛋白質Ｂｃｖｉｒ１５に対して特異的な５０μｇ／ｍｌの免疫グロブリンによって得られたことを意味する。少なくともこれは、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１抗血清の阻害作用を回復させるために４０μｇの組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１が必要であることと合致する。
【０１３６】
それ故、これらのデータによって、遺伝情報がＢ．ｃａｎｉｓ内に存在するが、Ｂ．ｃａｎｉｓゲノムＤＮＡによってはコードされない、Ｂｃｖｉｒ１５及びＢｃｖｉｒ３２（ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの産物）が、アピコンプレクサ門寄生生物、Ｂ．ｃａｎｉｓの毒性において重要な役割を果たすことを示唆した。これらの蛋白質又はこれらの蛋白質をコードする核酸配列に基づくワクチンは、血液型亜型にかかわりなく、Ｂ．ｃａｎｉｓ寄生生物増殖阻害において重要な役割を果たすことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの図式的提示
Ａ：矢印で示したボックス及び配列誘導プライマーで表わしたＯＲＦのＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ全体の図式的提示。
Ｂ：予想重複配列とそれから推定されるアミノ酸配列の提示
【図２】完全なＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの核酸配列とＢｃｖｉｒ１５の推定されるアミノ酸列
Ｂｃｖｉｒ１５と推定Ｂｃｖｉｒ３２間の共通アミノ酸配列を普通の大文字で示す。グラム陰性固定ヘキサペプチドを上部の線で示す。ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの２つの予想されるＯＲＦの重複配列を太字のイタリック体で示す。クローニング制現部位は太字である。
【図３】完全なＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡの核酸配列と推定されるＢｃｖｉｒ３２蛋白質の推定されるアミノ酸配列
ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡのＯＲＦ１とＯＲＦ２の重複領域を太字のイタリック体で示す。クローニング制現部位は太字である。
【図４】Ｂ．ｃａｎｉｓのゲノムＤＮＡに関するＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ分析
分析したゲノムＤＮＡは、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａ（レーン１）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ｂ（レーン２）、Ｂ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆ（レーン３）及び非感染イヌ血液サンプル（レーン４）から抽出した。ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列を担うｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドを陽性対照として使用した（レーン５）。プライマー、Ｐ１／Ｐ２（Ａ）、Ｐ５／Ｐ２（Ｂ）、Ｐ５／Ｐ１５．２（Ｃ）及びＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂｃｃ１２Ｄ３．２（Ｄ）の組合せを使用してＰＣＲを実施した。
【図５】ＢＣＶＩＲ配列のＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｂ．ｃａｎｉｓ（分離菌Ａ）から単離した全ＲＮＡに関して実験を行った。Ｐ１（レーン１）、Ｐ５（レーン２）、Ｐ１５．２（レーン３）；ＢＣＶＩＲ配列及びＢｃｃ１２Ｄ３配列のＢｃｃ１２Ｄ３．１（レーン４）又はＢｃｃ１２Ｄ３．２（レーン５）を逆転写の開始プライマーとして使用した。逆転写の第一段階は、ｅＡＭＶ−ＲＴ酵素と共に（レーン１−５）又は対照としてｅＡＭＶ−ＲＴ酵素なしで（レーン１’−５’）実施した。増幅の第二段階は、プライマー、Ｐ１／Ｐ２（Ａ）、Ｐ５／Ｐ１５．２（Ｂ、Ｃ）及びＢｃｃ１２Ｄ３．１／Ｂｃｃ１２Ｄ３．２（Ｄ）の組合せでのＰＣＲによって実施した。増幅したＰＣＲ産物の特異性を調べるために、増幅産物を０．８％アガロースゲルで分離し、紫外線下にＢｅｔ染色によって視覚化するか（Ｉ）、若しくはニトロセルロース膜に移して、プローブとして使用したＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ全配列とハイブリダイズした（ＩＩ）。
【図６】ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列のノーザンブロット分析
Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓの分離菌Ｒｏｕｅｎ  １９８７からの全ＲＮＡ（レーン１）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａからの全ＲＮＡ（レーン２）、Ｂ．ｃａｎｉｓの分離菌Ａからの非メッセンジャーＲＮＡ（レーン３）及びＢ．ｒｏｓｓｉの分離菌Ｆからの全ＲＮＡ（レーン４）に関して、ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡ配列のＰＣＲ誘導Ｐ１／Ｐ２プローブを使用してハイブリダイゼーションを実施した。
【図７】大腸菌からのＧＳＴ−ＯＲＦ１及びＧＳＴ−ＯＲＦ２組換え蛋白質の過剰発現と精製
上述したようにＩＰＴＧで３時間誘導したあと、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から蛋白質を精製し、ＳＤＳ／１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離して、クマシーブリリアントブルーで染色した。
レーン１Ａ、ＧＳＴ−ＯＲＦ１溶解産物を発現する大腸菌；２Ａ、精製ＧＳＴ−ＯＲＦ１；３Ｂ、対照精製天然ＧＳＴ；４Ｂ、精製ＧＳＴ−ＯＲＦ２；ＧＳＴ−ＯＲＦ２を発現する大腸菌からの封入体溶解産物。
【図８】［３５Ｓ］メチオニン標識Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ分離菌Ａ抗原の免疫沈降法
放射標識全抗原（Ａ）又は外抗原（Ｂ）を、ウサギ免疫前血清（１）、抗ＧＳＴウサギポリクローナル血清（２）、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清（３）及び抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギポリクローナル血清（４）によってそれぞれ免疫沈降した。矢印と星印はそれぞれＢｃｖｉｒ１５と推定Ｂｃｖｉｒ３２の位置を示す。
【図９】［３５Ｓ］メチオニン標識Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａ菌株のＴＸ−１１４分配抗原の免疫沈降法
［３５Ｓ］メチオニン標識したＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａ分離菌のインビトロ培養をＴＸ−１１４に溶解し、相分離後、水相において親水性抗原を回収し、界面活性剤相において両親媒性抗原を回収した。免疫前ウサギ血清（１）又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清（２）を使用して、水相蛋白質（Ａ）又は界面活性剤相蛋白質（Ｂ）のいずれかを免疫沈降した。矢印はＢｃｖｉｒ１５の位置を示す。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離したＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓメロゾイト抗原の免疫ブロット分析
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの分離菌Ａの精製メロゾイトに関して実験を行った。抗原を１２％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースシートに移した。免疫前ウサギ血清（１Ａ及び１Ｂ）、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清（２Ａ）又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２ウサギポリクローナル血清（２Ｂ）と共に１：１００希釈でインキュベーションを行った。Ｂｃｖｉｒ１５とＢｃｖｉｒ３２の位置をそれぞれ星印と矢印で示す。
【図１１】ＢＣＶＩＲ配列発現産物の局在
Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓの分離菌Ａに関してＩＦＡ試験を実施した。
（Ａ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１に結合した蛍光
（Ｂ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２に結合した蛍光
【図１２】インビトロ翻訳産物の分析
ｐＢＫ−ＣＭＶ  ＢＣＶＩＲ  ｃＤＮＡに関するＰ０／Ｐ１５．２  ＰＣＲ増幅から翻訳した放射標識インビトロ産物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。産物全体（４）又は抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１によって免疫沈降した産物（３）を分析した。ＤＮＡなしの網状赤血球溶解産物の総発現産物（１）又はＤＮＡなしの網状赤血球溶解産物からの免疫沈降産物（２）を対照として使用した。星印はＢｃｖｉｒ１５の位置を示し、矢印はＢｃｖｉｒ３２の位置を示す。
【図１３】種々の濃度で抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清のＢａｂｅｓｉａ
ｃａｎｉｓ  Ａ菌株のインビトロ培養での阻害能の評価
種々の血液サンプル（それぞれ第一（ＩＩ）、第二（ＩＩＩ）及び第三（ＩＶ）抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清）を１％（Ａ）、２％（Ｂ）、４％（Ｃ）及び８％（Ｄ）の最終濃度でＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａのインビトロ培養に加えた。免疫前血清（Ｉ）を、標準条件に保持した培養（Ｅ）と共に対照として使用した。
【図１４】種々のウサギポリクローナル血清によるＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａ菌株インビトロ培養の阻害
血清を、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａ菌株インビトロ培養に８％の割合で加えたときの寄生生物増殖阻害能について試験した。Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２はそれぞれ試験開始時、培養増殖の２４時間後及び培養増殖の４８時間後の血中寄生虫レベルの値を示す。試験した血清はウサギポリクローナル抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２であり、対照血清はウサギ免疫前血清、ウサギポリクローナル抗ＧＳＴ及びウサギポリクローナル抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３であった。対照レーンは、ウサギ血清を加えない標準条件下での培養を示す。
【図１５】［３Ｈ］−ヒポキサンチン代謝標識によって評価したＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓインビトロ培養の阻害試験
抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１及び対照の免疫前ウサギ血清を、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａ菌株（Ｉ）及びＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ｂ菌株（ＩＩ）に関して、すべて８％の最終濃度で試験した。対照レーンは標準条件下で増殖した双方の寄生生物を示す。
【図１６】ＧＳＴ−ＯＲＦ１組換え蛋白質に対する阻害試験
組換えＧＳＴ−ＯＲＦ１蛋白質を、ウサギポリクローナル抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１血清がＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ  Ａ菌株のインビトロ増殖阻害能を回復させる能力に関して試験した。蛋白質を、８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清に対して２０μｇ／ｍｌ（Ｃ）又は４０μｇ／ｍｌ（Ｄ）で試験した。対照は、２０μｇ／ｍｌ（Ａ）又は４０μｇ／ｍｌ（Ｂ）の割合で培養に加えた蛋白質単独、標準条件下での培養（Ｅ）及び８％の抗ＧＳＴ−ＯＲＦ１ウサギポリクローナル血清との培養（Ｆ）であった。
【図１７】［３Ｈ］−ヒポキサンチン代謝標識によって評価した、精製免疫グロブリンによるＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓインビトロ培養阻害試験
精製免疫グロブリン（抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５、抗ＧＳＴ−Ｂｃｖｉｒ１５免疫前、抗ＧＳＴ−Ｂｃｃ１２Ｄ３、抗ＧＳＴ−ＯＲＦ２抗血清及び抗ＧＳＴ（図１７ではそれぞれＢｃｖｉｒ１５、Ｔ０、ＣＯＮＴ、ｏｒｆ２、ＧＳＴとして示す））がＢａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ又はＢａｂｅｓｉａ  ｒｏｓｓｉのインビトロ培養阻害能を、１、２、４、８及び１０μｇの特異的免疫グロブリンに関して３点で試験した。５０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−ヒポキサンチンでの代謝標識による増殖阻害を評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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