(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において４８２位のスレオニン残基がイソロイシン残基へ置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、又は、このタンパク質のアミノ酸配列において、４８２位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−イソプロピルマレートシンターゼ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が、配列番号２に示すアミノ酸配列において４８２位のスレオニン残基がイソロイシン残基へ置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質と同等に解除されているタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、３８６位のグルタミン酸残基がリジン残基へ置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、又は、このタンパク質のアミノ酸配列において、３８６位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−イソプロピルマレートシンターゼ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が、配列番号２に示すアミノ酸配列において３８６位のグルタミン酸残基がリジン残基へ置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質と同等に解除されているタンパク質。
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、４２８位のプロリン残基がロイシン残基へ置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、又は、このタンパク質のアミノ酸配列において、４２８位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−イソプロピルマレートシンターゼ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が、配列番号２に示すアミノ酸配列において４２８位のプロリン残基がロイシン残基へ置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質と同等に解除されているタンパク質。
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、４７９位のグリシン残基がシステイン残基へ置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、又は、このタンパク質のアミノ酸配列において、４７９位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−イソプロピルマレートシンターゼ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が、配列番号２に示すアミノ酸配列において４７９位のグリシン残基がシステイン残基へ置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質と同等に解除されているタンパク質。
（Ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、４６２位のグリシン残基がアスパラギン酸残基へ置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質、又は、このタンパク質のアミノ酸配列において、４６２位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α−イソプロピルマレートシンターゼ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が、配列番号２に示すアミノ酸配列において４６２位のグリシン残基がアスパラギン酸残基へ置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質と同等に解除されているタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示す塩基配列において下記（ｉ）〜（ｖ）から選ばれる変異を有する塩基配列を含み、それぞれ、前記の（Ａ）〜（Ｅ）のタンパク質をコードする請求項１記載のＤＮＡ。
（ｉ）1445位のシトシンのチミンへの変異。
（ii）1156位のグアニンのアデニンへの変異。
（iii）1283位のシトシンのチミンへの変異。
（iv）1435位のグアニンのチミンへの変異。
（ｖ）1385位のグアニンのアデニン残基への変異。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡにより形質転換され、かつＬ−ロイシン生産能を有する微生物。
【請求項４】
エシェリヒア属細菌である請求項３記載の微生物。
【請求項５】
エシェリヒア・コリである請求項４記載の微生物。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養し、該培地中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−ロイシンを採取することを特徴とするＬ−ロイシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異型α−イソプロピルマレートシンターゼをコードするＤＮＡに関する。また、本発明は、変異型α−イソプロピルマレートシンターゼを有するＬ−ロイシン生産性微生物およびそれを用いたＬ−ロイシンの製造法に関する。Ｌ−ロイシンは、食品及び飼料用の栄養添加物、医療、製薬及び化学工業における試薬、あるいはリジンのような他のアミノ酸の製造に用いられる微生物の成長因子として用いられる必須アミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−ロイシンは、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属に属するＬ−ロイシン生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年）。最も高いレベルでＬ−ロイシンを蓄積するのは、ブレビバクテリウム・フラバム VKPM B-2736である。この株は、研究用ファーメンターで、スクロース含有培地を用いた７２時間の醗酵で、Ｌ−ロイシンを２６ｇ／Ｌまで生産する（ＵＳＳＲ発明者証第１３９４７１１号）。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム３４株は、グルコースを含む培地でＬ−ロイシンを３４ｇ／Ｌまで生産する（Appl. Environ. Microbiol., 51, p.1024 (1986)）。
【０００３】
上記のように、微生物のＬ−ロイシンの生産性はかなり高まってはいるが、今後のＬ−ロイシンの需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求められている。
【０００４】
ところで、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物は、その増殖速度の速さ並びに遺伝子解析の進み方、遺伝子材料の豊富さ等から優れたＬ−ロイシン生産菌として利用される可能性を有しているが、エシェリヒア属細菌によるＬ−ロイシン生産の報告は少ない。Ｌ−ロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌としては、β−チエニルアラニン耐性を有する微生物、β−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシロイシン耐性を有する微生物（以上、特公昭62-34397号公報）、４−アザロイシン耐性又は５，５，５−トリフルオロロイシン耐性を有する微生物（特開平8-70879号公報）が知られている。しかし、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシェリヒア属細菌及びエシェリヒア属細菌におけるＬ−ロイシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係については知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点から、Ｌ−ロイシン生産能に優れた微生物を提供し、そして、安価かつ効率的なＬ−ロイシンの製造法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、α−イソプロピルマレートシンターゼ（以下、ＩＰＭＳと略す）のＬ−ロイシンによる阻害の解除が、Ｌ−ロイシン生産性に寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡともいう）を提供する。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ａ）４８２位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｂ）３８６位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｃ）４２８位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｄ）４７９位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｅ）４６２位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。
（Ｂ）（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＩＰＭＳ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が（Ａ）のタンパク質と同等に解除されているタンパク質。
【０００８】
本発明のＤＮＡは、好ましくは、前記置換が下記（ａ’）〜（ｅ’）から選ばれる置換であるものである。
（ａ’）４８２位のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換。
（ｂ’）３８６位のグルタミン酸残基のリジン残基への置換。
（ｃ’）４２８位のプロリン残基のロイシン残基への置換。
（ｄ’）４７９位のグリシン残基のシステイン残基への置換。
（ｅ’）４６２位のグリシン残基のアスパラギン酸残基への置換。
【０００９】
本発明のＤＮＡの具体例としては、配列番号１に示す塩基配列において下記（ｉ）〜（ｖ）から選ばれる変異を有する塩基配列を有するものが挙げられる。
（ｉ）1445位のシトシンのチミンへの変異。
（ii）1156位のグアニンのアデニンへの変異。
（iii）1283位のシトシンのチミンへの変異。
（iv）1435位のグアニンのチミンへの変異。
（ｖ）1385位のグアニンのアデニン残基への変異。
【００１０】
本発明は、また、本発明のＤＮＡにより形質転換され、かつＬ−ロイシン生産能を有する微生物（以下、本発明の微生物ともいう）を提供する。また、本発明の微生物は、好ましくは、エシェリヒア属細菌であり、より好ましくは、エシェリヒア・コリ(E. coli)である。
【００１１】
本発明は、さらに、本発明の微生物を培地で培養し、該培地中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−ロイシンを採取することを特徴とするＬ−ロイシンの製造法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、野生型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＩＰＭＳのＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものである。
【００１４】
本発明において「Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除される」とは、そのフィードバック阻害の程度が低下していることを意味する。フィードバック阻害の程度の低下は、Ｌ−ロイシンの存在によるＩＰＭＳ活性の低下を測定し、野生株または親株と比較することによって評価することができる。
【００１５】
ＩＰＭＳとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のＩＰＭＳが挙げられる。また、ＩＰＭＳのＬ−ロイシンによるフィードバック阻害を解除する変異としては、配列番号２に記載されるＩＰＭＳのアミノ酸配列中の以下の置換が挙げられる。
（ａ）４８２位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｂ）３８６位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｃ）４２８位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｄ）４７９位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。
（ｅ）４６２位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換。
【００１６】
これらの置換は、好ましくは、以下の通りである。
（ａ’）４８２位のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換。
（ｂ’）３８６位のグルタミン酸残基のリジン残基への置換。
（ｃ’）４２８位のプロリン残基のロイシン残基への置換。
（ｄ’）４７９位のグリシン残基のシステイン残基への置換。
（ｅ’）４６２位のグリシン残基のアスパラギン酸残基への置換。
【００１７】
野生型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡとしては、エシェリヒア属細菌由来のＩＰＭＳをコードするものが挙げられ、より具体的には配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、さらに具体的には配列番号１に示す塩基配列が挙げられる。これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、本発明のＤＮＡに含まれる。なお、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。
【００１８】
本発明のＤＮＡの具体例としては、配列番号１に示す塩基配列において下記（ｉ）〜（ｖ）から選ばれる変異を有する塩基配列を有するものが挙げられる。
（ｉ）1445位のシトシンのチミンへの変異。
（ii）1156位のグアニンのアデニンへの変異。
（iii）1283位のシトシンのチミンへの変異。
（iv）1435位のグアニンのチミンへの変異。
（ｖ）1385位のグアニンのアデニン残基への変異。
【００１９】
また、菌種や菌株の違いにより保持するＩＰＭＳの配列がわずかに相異することが予想されるが、このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、上記変異型ＩＰＭＳのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＩＰＭＳ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が上記変異型ＩＰＭＳと同等に解除されているタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明の変異型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡに包含される。このようなＤＮＡには、上記のようなアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加には、ＩＰＭＳを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じ得る変異を有するもの（mutant又はvariant）も含まれる。
【００２０】
（１）野生型ＩＰＭＳ遺伝子の取得
野生型ＩＰＭＳ遺伝子あるいは他の変異を有するＩＰＭＳ遺伝子を含有するDNAの供与菌としては、好ましくはエシェリヒア属に属する微生物が挙げられる。
具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C. et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1）にあげられるものが利用できる。例えば、E. coli K-12株、JM109株、MC1061株などがあげられる。ＩＰＭＳ遺伝子を含有するDNAの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のＩＰＭＳ遺伝子を含むDNAが取得できる。
【００２１】
以下に、ＩＰＭＳ遺伝子を含有するDNAの調製例について述べる。まず、野生型のＩＰＭＳ遺伝子をもつE. coli例えばK-12株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆もしくは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した物が用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、６〜８に調整するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通気攪拌深部培養、振盪培養または静置培養等により行う。
【００２２】
このようにして得られた培養物を、例えば3,000 r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli K-12株の菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)）、K. S. Kirbyの方法（Biochem. J., 64,405, (1956)）等の方法により染色体DNAを得ることができる。
【００２３】
こうして得られた染色体ＤＮＡからＩＰＭＳ遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
【００２４】
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Sau3AＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは４〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００２５】
得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはJE7627 株（ponB704, dacB12, pfv+, tonA2, dapA, lysA, str, malA38, metB1, ilvH611, leuA371, proA3, lac-3, tsx-76）のようなＩＰＭＳ欠損変異株を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換は D. M. Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa,A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)）等により行うことができる。なお、JE7627株は国立遺伝学研究所（日本国静岡県三島市）より入手可能である。
【００２６】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、ＩＰＭＳ活性が増大した株あるいはＩＰＭＳ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株よりＩＰＭＳ遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、ＩＰＭＳ欠損変異株はＬ−ロイシン要求性であるので、ＩＰＭＳ欠損変異株を宿主に用いた場合は、Ｌ−ロイシンを含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ＩＰＭＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
ＩＰＭＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、実際に ＩＰＭＳ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してＩＰＭＳ活性が増大していることを確認することにより達成できる。ＩＰＭＳの酵素活性測定法は、Kohlhawらの方法（J. Biol. Chem., 244, 2218(1969)）により行うことができる。
【００２８】
そして、上記菌株より、ＩＰＭＳ遺伝子を含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤＮＡを、例えば P. Guerry らの方法（J. Bacteriol., 116, 1064, (1973)）、D. B. Clewell の方法（J. Bacteriol., 110, 667(1972)）などにより単離することができる。
【００２９】
野生型ＩＰＭＳ遺伝子の取得は、染色体上にＩＰＭＳ遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction； White, T.J. et al, Trends Genet., 5, 185(1989)参照）により、ＩＰＭＳ遺伝子を増幅することによっても行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＩＰＭＳ遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ＩＰＭＳ遺伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライマーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。ＩＰＭＳ遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅されたＩＰＭＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽出することによって ＩＰＭＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収できる。
【００３０】
ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知となっている配列（EMBL accession number No. D10483又はNo. AE000117）を基にして適宜作成すればよいが、具体的には、ＩＰＭＳ遺伝子をコードする1572塩基からなる領域を増幅できるプライマーが好ましい。プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)参照）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380B等）を用いて行うことができる。また、PCR反応は、市販のＰＣＲ反応装置（宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型等）を使用し、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
【００３１】
ＰＣＲ法により増幅されたＩＰＭＳ遺伝子は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導入することによって、ＩＰＭＳ遺伝子への変異の導入などの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと形質転換法、さらに ＩＰＭＳ遺伝子の存在の確認方法は上述した方法と同じである。
【００３２】
なお、ＩＰＭＳ遺伝子の単離に関する報告としては、Hertberg, K.M. et al., Gene, 8, 135-152(1980)、Davis, M.G. et al., J. Bacteriol., 129, 1078-1090(1977)などがある。
【００３３】
上記のＩＰＭＳ遺伝子の取得法は、野生型ＩＰＭＳを有する微生物を変異処理し、変異型ＩＰＭＳを生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得する場合の、変異型遺伝子の取得にも用いることができる。
【００３４】
（２）ＩＰＭＳ遺伝子への変異の導入
上記のようにして得られたＩＰＭＳ遺伝子に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法としては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi, R., 61, in PCR Technology (Erlich, H.A.Eds., Stockton press(1989))）、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)); Kunkel, T.A. et.al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)）などがある。これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こすことができる。
【００３５】
また、目的遺伝子を化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導入することができる。
【００３６】
さらに、染色体もしくはプラスミド上のＩＰＭＳ遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法（Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039(1984)）がある。また、ＩＰＭＳ遺伝子を保有する微生物を紫外線照射する方法またはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法によれば、ランダムに変異を導入できる。
【００３７】
変異型遺伝子の選択方法としては、まずＩＰＭＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡからなる組換えＤＮＡを、直接ヒドロキシルアミン等で変異処理し、これで例えば E. coli W3110 株を形質転換する。次にＬ−ロイシンのアナログである、４−アザ−Ｄ，Ｌ−ロイシンまたは３−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−ロイシンを含む最少培地、例えばM9に形質転換株を培養する。野生型のＩＰＭＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、その組換えＤＮＡにより発現されるＩＰＭＳがＬ−ロイシンのアナログにより阻害されるために、Ｌ−ロイシンの合成が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、Ｌ−ロイシンによる阻害の解除されたＩＰＭＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、同組換えＤＮＡ中のＩＰＭＳ遺伝子にコードされる変異酵素がＬ−ロイシンのアナログによる阻害を受けないので、Ｌ−ロイシンのアナログが添加された最少培地上での生育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−ロイシンのアナログに耐性となっている株、すなわち阻害の解除された変異型ＩＰＭＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株を選択することができる。
【００３８】
こうして得られた該変異型遺伝子を、組換えＤＮＡとして適当な宿主微生物に導入し、発現させることによりフィードバック阻害が解除されたＩＰＭＳを保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌（E. coli）が挙げられる。
【００３９】
また、組換えＤＮＡから変異型ＩＰＭＳ遺伝子断片を取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００４０】
さらに、変異型ＩＰＭＳ遺伝子の発現を効率的に実施するために、変異型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡ配列の上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ＩＰＭＳ遺伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いてもよい。
【００４１】
また、上記のように、変異型遺伝子を自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００４２】
＜２＞本発明の微生物
本発明の微生物は、本発明のＤＮＡにより形質転換され、かつＬ−ロイシン生産能を有する微生物である。
【００４３】
本発明のＤＮＡによる形質転換は、公知の方法により行うことができる。例えば、本発明ＤＮＡを含む断片を、宿主（形質転換される微生物）で機能するベクターと連結して組換えＤＮＡを作成し、これを宿主に導入することによって行うことができる。ベクターは、宿主に合わせて適切に選択される。組換えＤＮＡの導入は、これまでに報告されている方法に従って行うことができる。例えば、エシェリヒア・コリK-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）も使用できる。この導入法は、宿主に合わせて適切に選択される。具体的には、上記＜１＞（２）において説明したようなベクター及び方法が挙げられる。
【００４４】
本明細書において、「Ｌ−ロイシン生産能を有する」とは、培地中にＬ−ロイシンを蓄積することを意味し、好ましくは、培地からのＬ−ロイシンの採取が容易な量で蓄積することを意味する。
【００４５】
本発明の微生物は、好ましくはエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具体的には、エシェリヒア・コリが挙げられる。Ｌ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば特公昭62-34397号公報、特開平8-70879号公報に記載されるようなβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン及び５，５，５−トリフルオロロイシン等のロイシンアナログに対する耐性を有するものや、WO96/06926号国際公開パンフレットに記載されるような遺伝子組換え技術によって育種されるもの等が挙げられる。
【００４６】
エシェリヒア属細菌において、Ｌ−ロイシンは、Ｌ−バリン生合成系の最終中間体（２−ケトイソ吉草酸）から分岐するＬ−ロイシン固有の生合成経路を通って生合成される。エシェリヒア属細菌では、Ｌ−バリン生合成の最終段階の反応はｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンによってコードされている酵素群によって、Ｌ−ロイシン固有の生合成反応はｌｅｕＡＢＣＤオペロンによってコードされている酵素群によって、それぞれ行われている。
【００４７】
ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤの各遺伝子を有しており、ｌｅｕＡがＩＰＭＳ、ｌｅｕＢがβ−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤがα−イソプロピルマレートイソメラーゼをコードしている。これらの酵素のうち、ＩＰＭＳはα−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応を、α−イソプロピルマレートイソメラーゼはα−イソプロピルリンゴ酸からβ−イソプロピルリンゴ酸への異性化反応を、β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼはβ−イソプロピルリンゴ酸からＬ−ロイシン生合成の最終中間体であるα−ケトイソカプロン酸への脱水素反応を、各々触媒する。
【００４８】
上記のＬ−ロイシン生合成経路の反応のうち律速段階であるのは、α−ケトイソ吉草酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応であり、この反応を触媒するＩＰＭＳは、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害を受ける。従って、このフィードバック阻害が解除されたＩＰＭＳをコードするＤＮＡによる形質転換により、微生物にＬ−ロイシン生産能を付与したり、微生物のＬ−ロイシン生産能を向上できる。
【００４９】
本発明のエシェリヒア属細菌は、さらに、通常の突然変異処理又は遺伝子工学的手法により、Ｌ−ロイシン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素の活性の増強は、例えば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン又は／及びｌｅｕＡＢＣＤオペロン、又はこれらの一部を有するＤＮＡ断片をプラスミド、ファージ又はトランスポゾンに挿入し、得られる組換えＤＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することによって行うことができる。
【００５０】
ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの塩基配列解析については、Nucleic Acid Res., 20, 3305-3308 (1992)に記載されており、全塩基配列はデータベース（DDBJ accession no. D10483、DDBJのインターネットアドレス：http://www.ddbj.nig.ac.jp）に登録されている。ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、White, T.J. et al.; Trends Genet., 5, 185 (1989)参照）によって、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを含むＤＮＡ断片を増幅することによって取得できる。また、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、前記文献に記載されている配列を基に作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりエシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても、取得することができる。
【００５１】
また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基配列及び該オペロンの上流域の塩基配列は、それぞれ Nucleic Acid Res., 15, 2137-2155 (1987)及び Gene, 97, 21-27 (1991)に記載されている。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、これらに記載されている配列を基に作製したプローブ又はプライマーを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによって取得することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得にエシェリヒア・コリK-12株又はその誘導体を用いる場合には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が回復するように、ｉｌｖＧ遺伝子の復帰変異株を用いることが好ましい。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得法及びトランスポゾンを用いて該オペロンをエシェリヒア属細菌細胞内で増幅する方法は、それぞれWO96/06926国際公開パンフレット、フランス特許公開第2627508号に詳細に記載されている。
【００５２】
＜３＞Ｌ−ロイシンの製造法
上記のようにして得られるエシェリヒア属細菌を培地で培養し、該培地中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−ロイシンを採取することにより、Ｌ−ロイシンを効率よく製造することができる。
【００５３】
本発明の製造法におけるエシェリヒア属細菌の培養および培養液からのＬ−ロイシンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するするものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００５４】
培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐＨは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中にＬ−ロイシンが蓄積する。
【００５５】
培養終了後、培養液から菌体などの固形物を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法等によってＬ−ロイシンを採取、精製することが出来る。
【００５６】
以上に説明したように、本発明の、Ｌ−ロイシンによる阻害が解除されたＩＰＭＳをコードするＤＮＡは、Ｌ−ロイシン生産微生物育種に利用することができる。このＤＮＡで形質転換された微生物を用いることによって、効率よくＬ−ロイシンを製造することができる。
【００５７】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５８】
【実施例１】
変異型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡの取得
＜１＞Ｌ−ロイシン生産株の取得
エシェリヒア・コリ(E. coli)のＬ−ロイシン生産株を、標準的な研究用野生株E. coli K-12から以下のような選択により得た。E. coli K-12の細胞を、2 mg/mlのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを含む変異原溶液により、37℃で30分間処理した。次いで、細胞を0.8% NaCl溶液で２回洗浄し、1 mg/mlのＬ−ロイシンアナログ(４−アザロイシン)を含むＭ９寒天培地ディッシュに塗沫した。37℃でのインキュベーションで５日後に生じたコロニーを選び取り、そしてそれらのロイシン生産能を評価した。Ｎｏ．９、Ｎｏ．６８、Ｎｏ．５８、Ｎｏ．５５及びＮｏ．１５の株がＬ−ロイシンを生産した。
【００５９】
＜２＞Ｌ−ロイシン生産株からのｌｅｕＡ遺伝子の取得
得られたロイシン生産性変異株Ｎｏ．５５及び野生株E. coli K-12のleuA遺伝子を、欠陥バクテリオファージMu d5005を用いるin vivoクローニング法（Groisman, E.A. et al., J. Bactriol., 168, 357(1986)）によりクローニングした。次いで、クローニングしたleuA遺伝子の、オーバーラップする複数の断片を、表１に示すＤＮＡプライマー（LeuA1及びLeuA2、LeuA3及びLeuA4、LeuA5及びLeuA6、LeuA7及びLeuA8、LeuA9及びLeuA10）を用いるＰＣＲによって増幅した。
【００６０】
【表１】
表１  ＰＣＲに用いたプライマー
─────────────────────────
プライマー名  配列(5'->3')            配列番号
─────────────────────────
LeuA1         ccaataccgtcccccggc         3
LeuA2         ggtgaaatacagcctgacc        4
LeuA3         gtgatgcggttaattgcctg       5
LeuA4         tgacctctcgttcggggcgt       6
LeuA5         gattcagctggatttggttc       7
LeuA6         cgacgatttgggcctggcg        8
LeuA7         ggcatgtaccgccgccagtga      9
LeuA8         gaagccttccgtattcatacc      10
LeuA9         cagcttggtggcgatgtgc        11
LeuA10        gcccgaagcgaggcgctct        12
─────────────────────────
【００６１】
同じＤＮＡプライマーを、予備的クローニングなしで、Ｎｏ．９、Ｎｏ．６８、Ｎｏ．５８およびＮｏ．１５の各株の染色体からのleuA遺伝子の増幅に用いた。断片の塩基配列はジデオキシチェーンターミネーション法で決定した。
【００６２】
Ｎｏ．９、Ｎｏ．６８、Ｎｏ．５８、Ｎｏ.５５およびＮｏ．１５の各株由来のleuA遺伝子は、表２に示す変異を有していた。
【００６３】
各株の細胞を、6%グルコース、1.5%硫酸アンモニウム、0.2%リン酸二水素カリウム、0.1%硫酸マグネシウム、2.5%チョークおよび0.1 mg/mlチアミンを含む培地中32℃で10時間増殖させた。超音波処理および硫安沈殿により無細胞抽出液を得、これを酵素調製物として用いた。ＩＰＭＳ比活性は、Kohlhawらの方法（J. Biol. Chem., 244, 2218(1969)）により測定した。Ｉ50は、酵素活性の５０％阻害を生じるロイシン濃度である。Ｌ−ロイシン生産は、上記の培地中で４８時間培養した後に測定した。
【００６４】
以上の結果をまとめて表２に示す。
【００６５】
【表２】
0004501014.tif 000002
【００６６】
【実施例２】
形質転換体によるＬ−ロイシンの製造
C600株（leu-）(Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452 (1954))に対して、ロイシン生産株Ｎｏ．９、Ｎｏ．６８、Ｎｏ．５８、Ｎｏ．５５およびＮｏ．１５並びにE. coli K-12で増殖させたＰ１ファージにより形質導入を行った。leu+形質導入体が得られ、Ｌ−ロイシン生産能について試験した。結果を表３に示す。
【００６７】
【表３】
0004501014.tif 000003
【００６８】
【発明の効果】
Ｌ−ロイシン生産能に優れた微生物が提供され、また、安価かつ効率的なＬ−ロイシンの製造法が提供される。
【００６９】
【配列表】
0004501014.tif 000004
0004501014.tif 000005
0004501014.tif 000006
0004501014.tif 000007
0004501014.tif 000008
0004501014.tif 000009
0004501014.tif 000010
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