(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔サンプル中の乳酸および／または乳酸塩を用いて、う食の危険性を体外で測定する方法であって、
０．１ｍｌのサンプル量を有する唾液の場合は、０．００１単位から１００単位の乳酸脱水素酵素と、サンプル量０．１ｍｌ当たり０．００１μｍｏｌから５μｍｏｌの濃度のピルビン酸塩とを添加し、
０．０１ｃｍ２から２５ｃｍ２の口腔内表面から得られた舌の被膜の場合は、０．００１単位から１００単位の乳酸脱水素酵素を添加し、
上記双方の場合において、ＮＡＤが、被験混合物全体を基準として０．０１ｍｍｏｌ／ｌから１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在していた場合、
生成したＮＡＤＨ量を測定し、
測定したＮａＤＨ量が多いほど、う食の危険性が高いと判断する、方法。
【請求項２】
サンプル量は、口腔内の少なくとも１つの領域に対する機械的動作の結果として、唾液中に移動された微生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記口腔内の領域が舌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、乳酸および／または乳酸塩の形成を誘導または増加させる糖類に接触させられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
検出方法を実施する前に、少なくとも１種の緩衝液を添加する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
口腔内からサンプル量を取り出した後、ピルビン酸塩を該サンプルに添加する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
う食の危険性を位置特異的に測定する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載された方法が用いられ、次いで、膜形成性担体物質および診断物質を含む診断用印象化合物を用いて印象を取る方法。
【請求項８】
請求項１に記載のう食の危険性を測定する方法に用いるキットであって、
少なくとも１個のサンプルチューブと、
少なくとも１つの吸収手段と、
少なくとも１種の緩衝物質と、
サンプル量０．１ｍｌ当たり０．００１単位から１００単位を得る量の乳酸脱水素酵素と、
被験混合物全体を基準として０．０１ｍＭから１０ｍＭの濃度のＮＡＤと、
を含むキット。
【請求項９】
サンプル量０．１ｍｌ当たり０．００１μｍｏｌから５μｍｏｌの濃度を得る量のピルビン酸塩をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸および／または乳酸塩の測定により、う食の危険性を確認するための適切な試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
う食は感染症である。最もよく言及される原因生物としては、ストレプトコッカス属および乳酸桿菌が挙げられる。う食の原因微生物としての共通点は、とりわけ、それらが糖類、例えば飲食物に由来する糖類を摂取して醗酵し、代謝最終産物として酸を排泄するという点である。
【０００３】
原理的には、微生物による唾液中への酸放出と歯垢中への酸放出とは区別しなければならない。というのは、歯のう食病巣は、以後歯垢とも称される、歯の表面に付着している微生物により形成される酸によって生じるからである。歯表面環境中における局部的酸性化がヒドロキシアパタイトの溶解を生じさせ、その結果、う食の病巣形成の化学的原因となる。
【０００４】
歯垢が酸性となる速さおよび酸性の強度は、とりわけ、唾液の緩衝能力、歯垢液の緩衝能力、歯垢における微生物の増殖（Ｃｏｏｇａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｏｔｌｅｋａｒ，Ｈ．Ｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｎｔａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ  ５１，８２３−８２７（１９９６））および拡散過程（Ｄａｗｅｓ，Ｃ．，Ｄｉｂｄｉｎ，Ｇ．Ｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，８９−９４（１９８６））に依存する。
【０００５】
この生理学的、微生物学的および化学的要因の複雑な相互作用は、歯垢におけるう食の可能性を引き起こす。これらの要因は、患者１人１人によって異なった程度で存在する。
【０００６】
現代歯科医術の目的の１つは、患者を危険群に割り当てることである。う食病巣の発生前にう食の危険性を認識することは有益である。診断を達成するためには、多数の個人サンプルを取り、また分析しなければならないことから、歯垢分析によってう食の患者関連危険性を測定し、実際に確立することは不可能であった。このような試験は、手間がかかり、費用がかかりすぎ、かつその管理が複雑すぎる。
【０００７】
歯垢試験に替るものとして、う食の患者関連危険性の確認は、唾液試験により試みられている。したがって、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンスおよび／または乳酸桿菌の定量化可能な量が、歯垢中のストレプトコッカス・ミュータンスおよび／または乳酸桿菌の量と相関していること、そしてその結果、唾液試験を用いて患者に対するう食の危険性を推測することが可能であると推定される。
【０００８】
う食の原因微生物、例えば、唾液中のストレプトコッカス・ミュータンスおよび／または乳酸桿菌の測定には種々の方法が利用できる。
【０００９】
１．う食の原因微生物の測定は、もともと存在する微生物数が、直接的結果を得るには十分でないため、通常適切な培養培地中で数日間サンプルをインキュベートした後で実施される。数時間から数日間の持続期間に亘って微生物を増殖させた後、コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントし、サンプルに存在する微生物数を推測する（Ｋｎｅｉｓｔ，Ｓ．；ｋｌｅｉｎ,Ｃ.；Ｒｕｐｆ，Ｓ．；Ｅｓｃｈｒｉｃｈ，Ｋ．Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｚ（１９９９）５０、３３〜４３）。
【００１０】
重要なのは微生物数ではなく、むしろ代謝活性であることから、唾液中のう食に係る微生物数とう食の危険性との間の相関性が不満足なものでしかなく、不都合である。さらに、サンプルのインキュベーションは、病原性微生物の培養を確立してしまうことになり、実施の際の危険性を最少化するために、適切な警戒対策をもって処理しなければならない。特別な廃棄処理が必要である。これらの不都合さに加えて、微生物学的診断を達成するために必要なインキュベーション法は、費用がかかり、かつ非常に時間がかかる。
【００１１】
２．唾液中のう食の原因微生物の測定へのさらなるアプローチは、免疫学的方法である。この場合、測定される微生物の表面構造に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体が使用される。
【００１２】
項目１によるインキュベーション法と比較すると、これらの免疫学的方法は、より特異的で、より迅速、より安価ではあるが、再現性に関して明らかな欠点を有している（Ｋｎｅｉｓｔ，Ｓ．；ｋｌｅｉｎ,Ｃ.；Ｒｕｐｆ，Ｓ．；Ｅｓｃｈｒｉｃｈ  Ｋ．Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｚ（１９９９）５０、３３〜４３）。例えば、唾液は、生存微生物のみならず、死滅微生物がかなりの量で含んでいる。死滅微生物と生存微生物の比率は、患者１人１人によって異なっていると考えられる。前記抗体が、生存微生物と死滅微生物とを識別できないという事実は、評価対象微生物に病原の可能性があることを推測する際に予測できない範囲の変動があることを意味する（Ａａｓｓ，Ａ．Ｍ．；Ｐｒｅｕｓ，Ｈ．Ｒ．，Ｚａｍｂｏｎ，Ｊ．Ｊ，Ｇｊｅｒｍｏ，Ｐ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ．Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ（１９９４）１０２，３５５〜３６０）。さらに、重要なのは微生物数ではなく、むしろ代謝活性であることから、唾液中のう食に係る微生物数とう食危険性との間の相関性が不満足なものでしかない、という限定がこの場合においても当てはまる。
【００１３】
３．最も高い感受性を有する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に基づく。微量の微生物を、高度の特異性によって検出することができる。ＰＣＲ法は、時間がかかり、複雑、高価でかつ習得が容易ではない（Ｒｕｐｆ，Ｓ．，Ｋｎｅｉｓｔ，Ｓ．，Ｍｅｒｔｅ，Ｋ．，Ｅｓｃｈｒｉｃｈ，Ｋ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｓｃｉ．（１９９９）１０７、７５〜８１）。この場合もまた、生存微生物と死滅微生物との区別がなされないという限定が付けられる。さらに、重要なのは微生物数ではなく、むしろ代謝活性であることから、唾液中のう食に係る微生物数と、う食危険性との間の相関性が不満足なものでしかないというさらなる追加の限定が、この場合においても当てはまる。
【００１４】
う食の危険性を確認するために唾液中のう食の原因微生物を定量するための全ての方法は、唾液中に存在するう食の原因微生物の量から、歯垢中のその微生物によるう食の可能性を推測できないことから、「う食の患者関連危険性」に関する所望の知見を得ることが不可能であるという深刻な不都合を有する。
【００１５】
唾液組成物は、患者１人１人によって異なり、かつ存在する微生物の代謝能力に影響を及ぼすことから（Ｍｉｎａｈ，Ｇ．Ｅ．，ＭｃＥｎｅｒｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｌｏｒｅｓ，Ｊ．Ａ．Ａｒｃｈｉｖｓ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８６）３１、６３３〜６３８）、う食の原因微生物の定量化に加えて、糖類によって生じ得る患者の唾液の酸性化をも調べることが推奨される。ｐＨ値の低下は、微生物の酸放出のためであり、唾液中の微生物代謝活性の尺度として見られる。しかしながら、唾液中のｐＨ値に観察される低下は、患者の唾液の緩衝能力レベルに依存する。したがって、う食の患者関連の危険性を測定するためには、唾液の緩衝能力を、唾液中のう食の原因微生物の定量化とｐＨ測定に組み合わせることもまた必要である。
【００１６】
しかし、臨床経験によると、ストレプトコッカス・ミュータンス／乳酸桿菌の定量化、ｐＨ測定および緩衝能力を組み合わせて、う食の患者関連の危険性に関して信頼できる所見を提供できないことが示されている（ＫｌｅｉｎｆｅｌｄｅｒおよびＫｉｒｃｈｎｅｒの「Ｄｉｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｓｃｈｅ  Ｓｉｃｈｅｒｈｅｉｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅｒ  ｚｕｒ  Ｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ  ｄｅｓ  ｉｎｄｉｖｉｄｕｅｌｌｅｎ  Ｋａｒｉｅｓｒｉｓｉｋｏ」［「Ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｌｉｖａ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃａｒｉｅｓ」］，Ｄｔｓｃｈ．Ｚａｈｎａｅｒｚｔｌｉｃｈｅ  Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ（１９９３）４８，６４６〜６４８）。
【００１７】
米国特許第３，３３２，７４３号明細書およびＥＰ−Ａ−０  ０９７  ９０４明細書には、唾液中の微生物代謝活性からう食の患者関連危険性を推測するさらなる試みを記載している。レサズリンをリソルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）に還元する唾液能力が観察されており、微生物の代謝活性が、リソルフィンの形成率に相関すると言われている。う食の患者関連危険性は、リソルフィンの形成率から推測される。レサズリンからリソルフィンへの還元は、微生物の脱水素酵素によってもたらされる。レサズリンからリソルフィンへ還元できる脱水素酵素を有するのはストレプトコッカス・ミュータンスと乳酸桿菌だけではない。この理由から、レサズリン／リソルフィン試験は、微生物の生存能力試験として一般に用いられ、それ故、酸の放出を介して口腔環境の酸性化に寄与するう食病原体には特異的ではなく、したがって、それは、う食の患者関連危険性の確認には使用できない。
【００１８】
歯の硬度物質を損傷するう食の原因微生物の代謝活性を確認するために文献で考察されたさらなる可能性は、酸類、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸および乳酸の遊離である。どの酸が、歯の硬度物質の損傷に決定的に関連するかは、例えば栄養物の供給に依存する。十分なグルコースが存在すると、ストレプトコッカス属が優先して乳酸を分泌するが、一方、グルコースの供給が制限されると、酢酸、プロピオン酸およびギ酸が優先的に形成される。
【００１９】
米国特許第４，３５１、８９９号特許明細書および米国特許第４，２５４，２２２号の特許明細書には、生体液、特に血中乳酸の酵素的測定法を記載している。脱水素酵素による乳酸の酵素的還元の結果、ピルビン酸塩の他にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が形成される。ＮＡＤＨは引続き、酸化還元指示薬、好ましくはテトラゾリウム誘導体およびフェナジン誘導体を用いて測定される。この方法を唾液に転用すると、う食原性微生物の代謝活性の測定と、その結果のう食の危険性の測定にとって迅速かつ簡便な方法を可能にすると思われる。しかしながら、これらの明細書に記載された方法は、唾液に生じる付随反応が、酸化還元指示薬によって生成されたシグナルを偽る（ｆａｌｓｉｆｙ）ことが決定的となるため、唾液の場合使用することができない。検出反応に必要な脱水素酵素を添加しない場合でも、酸化還元指示薬が、ＮＡＤと一緒になった唾液成分によって還元され、唾液中の乳酸塩存在に基づかないシグナルが生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の課題は、一般的なう食の危険性の評価を可能にする方法を提供することであり、その過程において先行技術の既知の不利益な点を避けることである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
驚くべきことに、う食の危険性が増大している患者を、本発明に従った方法に関連して用いる試験により見分けることができることを見出した。
【発明の効果】
【００２２】
本試験と、診断上の歯科用印象、例えば、ＤＥ−Ａ−１９９  ２６  ７２８によるものとの組合せもまた、本発明に準拠する。この方法によって、唾液中または舌にはう食の危険性を示しているにもかかわらず、歯には、う食の危険性を伴う歯垢がない患者と、実際に危険性がある患者とを区別することができる。
【００２３】
さらに、本発明の利点は、ある患者におけるう食の危険性を明瞭に確認して、適切な方向での薬物治療することが可能であり、かつ治療過剰および治療不十分を避けることができるという事実に見出される。
【００２４】
さらに、本発明の利点は、唾液試験を用いてさらなる調査、例えば、診断上の歯科用印象、実際の治療開始時、例えば学校や幼稚園における集団予防に関連する調査の必要性を確立することが可能であるという事実に見出される。また、治療経過が簡便にモニタできることも有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
語句「う食の危険性」は、本発明に関連した、患者がう食を患う基本的危険性並びに時刻および食習慣に依存する危険性の双方のものとして解する。口腔フローラの基本的構成により支配される基礎的危険性を決定する目的で、本発明による方法を使用する前に、患者は、例えばうがいおよび／または歯の洗浄、好ましくは歯の洗浄のような簡単な洗浄処置を施すと都合がよい。時刻および食習慣に依存する危険性を測定する際には、洗浄処置を必ずしも実施する必要はないが、本発明による方法の好適な実施形態においては、実施すべきである。
【００２６】
本明細書において「含む」および「含有する」という語句は、構成要件を他に備えてもよい意味で用いられる。
【００２７】
本発明に従って用いられる唾液試験は、適切な予備的条件を満たせば、一般的なう食の患者関連危険性を測定するための、唾液中における微生物代謝活性の指標として、乳酸の形成が著しく適しており、乳酸の定量化または半定量化により確認できるという驚くべき効果に基づいている。
【００２８】
本発明に関連して、語句「乳酸塩」は、Ｌ（＋）−乳酸塩として解され、語句「乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）」は、Ｌ（＋）−乳酸脱水素酵素として解する。
【００２９】
乳酸の検出には、原則として検出可能なシグナルを発生させる化学的、生化学的または物理的反応に関連し得る。
【００３０】
驚くべきことに、酸化還元阻害剤と唾液成分との間の望ましくない付随反応は、乳酸脱水素酵素、唾液と、阻害剤、すなわちピルビン酸塩との間で、量について特定の比率を維持することにより抑制できることを見出した。この知見に驚くべき理由は、ピルビン酸が乳酸脱水素酵素の知られた阻害剤であることである（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ａ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．２３６、７２１〜７２７（１９８６）；Ｏｂａ，Ｋ．，ＭｕｒａＫａｍｉ，Ｓ．，Ｕｒｉｔａｎｉ，Ｉ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９３〜１２０１（１９７７）を参照）。技術的教示に反して、乳酸脱水素酵素と酸化還元阻害剤による乳酸の酵素的測定が可能となる程度まで、唾液の不特定の付随反応を抑制するために、測定酵素（この場合は乳酸脱水素酵素）を、既知の阻害剤の存在下で使用する必要があることは当業者にとって予測できない解決策である。ピルビン酸塩という語句は、ここではピルビン酸またはその塩、特にそのＮａ塩またはＫ塩として解する。
【００３１】
乳酸脱水素酵素（例えば、バクテリア、好ましくは乳酸桿菌、ストレプトコッカス属またはスタフィロコッカス属から、動物、好ましくはブタ、ウシ、ニワトリまたはウサギから、植物から、またはヒト組織、例えば胎盤から得ることができる）による唾液中の乳酸の酵素的測定では、唾液と乳酸脱水素酵素との間の量について適切な比率を維持しなければならない。唾液０．１ｍｌ当たり、０．００１単位から１００単位の間の乳酸脱水素酵素、好ましくは０．０１単位から１０単位の間の乳酸脱水素酵素、非常に好ましくは０．０５単位から１単位の間の乳酸脱水素酵素を使用する必要がある。さらに、ピルビン酸塩は、唾液０．１ｍｌ当たり、０．００１μｍｏｌから５μｍｏｌの間の濃度、好ましくは唾液０．１ｍｌ当たり、０．０１μｍｏｌから２．５μｍｏｌの間の濃度、非常に好ましくは唾液０．１ｍｌ当たり、０．０１μｍｏｌから１μｍｏｌの間の濃度を使用する必要がある。
【００３２】
１単位の乳酸脱水素酵素は、蛋白質１ｍｇ当たりで、１分に１μｍｏｌのピルビン酸を変換する量として解する。
【００３３】
例として、以下の群から選択される酸化還元指示薬を本発明に従って使用することができる：メチレンブルー、塩化５−シアノ−２，３−ジトリル−テトラゾリウム（ＣＴＣ）、塩化２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム（ＩＮＴ）、８−ジメチルアミノ−２，３−ベンゾフェノキサジン（メルドラブルー）、メト硫酸１−メトキシーフェナジン（ＭＰＭＳ）、５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４，５−ジメチルチアゾリル）−３−（４−スルホフェニル）−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）、塩化３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス［２−（４−ニトロフェニル−５−フェニル）］−２Ｈ−テトラゾリウム（ＮＢＴ）、ニトロ−テトラゾリウムバイオレット（ＮＴＶ）、メト硫酸フェナジン（ＰＭＳ）、３’−［１−［（フェニルアミノ）カルボニル］−３，４−テトラゾリウム］ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＸＴＴ）、エト硫酸フェナジン（ＰＥＳ、ＷＳＴ−１）。
【００３４】
これらのうち、メルドラブルー、ＰＥＳ、ＰＭＳ、ＭＴＳ、ＭＴＴおよびＸＴＴが好ましく；ＰＥＳ、ＰＭＳ、ＭＴＳおよびＭＴＴが特に好ましい。
【００３５】
被験混合物中における酸化還元指示薬の濃度は、０．００１ｍｍｏｌ／ｌから１０ｍｍｏｌ／ｌの間であり、０．０１ｍｍｏｌ／ｌから５ｍｍｏｌ／ｌの間が好ましく、０．０５ｍｍｏｌ／ｌから２ｍｍｏｌ／ｌの間が非常に好ましい。
【００３６】
必要に応じて、酸化還元指示薬は、固体、例えば粉末状、顆粒状または錠剤形で試験に使用できる。
【００３７】
本発明に従って、ＮＡＤは非限定的であるだけでなく、非阻害的な量で用いることが好ましく、例えば被験混合物全体を基準として０．０１ｍｍｏｌ／ｌから１０ｍｍｏｌ／ｌの間、好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／ｌから５ｍｍｏｌ／ｌの間、非常に好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｌから１ｍｍｏｌ／ｌの間の濃度で使用する。
【００３８】
必要に応じて、ＮＡＤは、固形、例えば粉末、顆粒または錠剤形で試験に使用できる。
【００３９】
バクテリア、動物および植物に由来する乳酸脱水素酵素は、至適ｐＨを４．０から１０．０の間に有する。使用される乳酸脱水素酵素に依って、種々のｐＨ値を有する適切な緩衝液を使用しなければならない。適切な緩衝剤は、特に以下の群の構成物が緩衝剤として適切である：
リン酸塩類、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、ピロリン酸塩；
炭酸塩類、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム；
酢酸／酢酸塩；クエン酸／クエン酸塩、ジエチルバルビツール酸、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）、グリシン、グリシルグリシン（Ｇｌｙｇｌｙ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノ−エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジアセテート（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ＢＩＣＩＮＥ）、２，２−ビス（ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ）、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジン）］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジニル）］−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）。
【００４０】
特に、リン酸緩衝剤、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｇｌｙｇｌｙ緩衝剤および酢酸／酢酸塩緩衝剤が好ましい。
【００４１】
検出反応に応じて、１から１２のｐＨ値が必要とされ得る。条件に応じて、緩衝液の濃度は、０．００１ｍｏｌ／ｌから５．０ｍｏｌ／ｌの間、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌから１．０ｍｏｌ／ｌの間、非常に好ましくは０．１ｍｏｌ／ｌから０．５ｍｏｌ／ｌの間とされる。
【００４２】
反応溶液のｐＨ調整はまた、条件に応じて、固体、例えば粉末状または錠剤形などの緩衝剤を決められた量試験に用いることにより達成できる。必要ならば、緩衝剤はまた、液体形態で試験に使用できる。
【００４３】
緩衝物質、酸化還元指示薬、ＮＡＤおよび乳酸脱水素酵素および他の産生アジュバントは、固体同士の組合せ、または固体と液体形態の組合せとして添加することができ、例えば、１ｍｇから２０ｇ、好ましくは１０ｍｇから１０ｇ、より好ましくは５０ｍｇから５ｇ、非常に好ましくは１００ｍｇから１ｇの範囲の粉末として、または例えば、１錠から２０錠、好ましくは２錠から１０錠、非常に好ましくは３錠から５錠の錠剤形として添加できる。錠剤の重量は、例えば、１ｍｇから２ｇの間、好ましくは１０ｍｇから１．５ｇの間、非常に好ましくは１００ｍｇから１ｇの間であり得る。
【００４４】
産生アジュバントは、例えば、ガレヌス製剤化学、例えばデキストラン類、糖類、酸化アルミニウム、ガラス、石英、セルロース誘導体、ワックス類、脂肪類および塩類からの既知の補助物質として解する。
【００４５】
緩衝物質、酸化還元指示薬、ＮＡＤおよび乳酸脱水素酵素は、液体形態で唾液サンプルに添加することもでき、この場合、それらが液体であれば直接添加できるか、または水、エタノールまたはプロパノールなどの溶媒に予め溶解して添加できる。０．００１ｍｌから２０ｍｌ、好ましくは０．０１ｍｌから１０ｍｌ、非常に好ましくは０．１ｍｌから１ｍｌの容量が使用できる。
【００４６】
乳酸および検出できるシグナルの形成は、並行して進む連続的な工程で検出でき、この場合、例えば、０．０１分から６０分、好ましくは０．１分から３０分、非常に好ましくは１分から１０分の間の決められた間隔後、検出できるシグナルを評価するか、または検出すべき代謝物の形成および／または検出できるシグナルの形成を終了させる。
【００４７】
終了目的のために、例えば、例えばリン酸塩のような阻害剤などの中止剤、または塩酸または水酸化ナトリウム液により開始されるｐＨの急激な変化、またはプロテアーゼまたは界面活性剤の添加、などが考慮される。
【００４８】
乳酸形成はまた、独立したインキュベーションステップにおいて実施することもでき、この場合、例えば、０．０１分から６０分、好ましくは０．１分から３０分、非常に好ましくは１分から１０分の決められた間隔後、乳酸形成を終了させる。
【００４９】
終了目的のために、例えば、上記の中止剤、またはサンプルを５０℃から１００℃の間の温度に加熱すること、または中止剤と温度上昇の組合せが考慮される。
【００５０】
微生物による乳酸形成の終了目的のためには、多種多様な方法を用いることができ、例えば：
ＵＶのような高エネルギー光の照射、
放射性処理、
熱処理、
例えば酸類または塩基類の添加によるｐＨ変化、
界面活性剤の添加、
重金属塩、アルキル化剤などの阻害剤添加、
リゾチーム、トリクロサン、クロルヘキシジン、タウロリジンなどの微生物破壊物質の添加、
例えば、限外濾過、除菌フィルタミクロ濾過、遠心分離などによる調査対象の唾液サンプルからの微生物除去、またはこれら方法のうち２つ以上の適切な組合せなどが挙げられる。
【００５１】
本発明による試験を実施するために、例えば、０．００１ｍｌから２０ｍｌ、好ましくは０．０１ｍｌから１０ｍｌ、非常に好ましくは０．１ｍｌから１ｍｌの唾液を反応容器に移す。一般に、使用される唾液量は、少なくともシグナル生成添加物の結果としての乳酸塩測定のために得られるシグナルが検出可能であるよう、十分に多くなければならない。
【００５２】
また、微生物を、機械的動作により口腔領域から唾液中に移動させてから、唾液サンプルを反応容器に移すと好都合である。例えば、舌用スパチュラまたはスクレーパなどの適切な器具を用いて、舌から舌の被膜を脱離し、その直後にサンプルを取ることができる。
【００５３】
直接的唾液サンプルの替りに、適切なサンプル採取装置によって口腔中の適切な位置から微生物サンプルを取り、唾液の替りにそのサンプルを、本発明による基本的な方法に供することができる。この場合、綿毛チップ、綿棒または他の吸湿性材料および用具によって、０．０１ｃｍ2から２５ｃｍ2、好ましくは０．１ｃｍ2から１０ｃｍ2、さらに好ましくは１ｃｍ2から５ｃｍ2の舌領域から舌の被膜を脱離することが好ましい。一般に、舌被膜は、少なくともシグナル生成添加物の結果としての乳酸塩測定のために得られるシグナルが検出可能であるよう、十分に大きい舌領域から取らなければならない。
【００５４】
患者関連の患者唾液中の検出可能シグナルを標準化する目的のために、最大限の乳酸形成を可能にする物質、例えば糖類、好ましくはショ糖およびグルコースを唾液に加えることが有利となり得る。これらの物質は、固体若しくは液体形態、または固体と液体形態の組合せのいずれかで導入できる。
【００５５】
例えば、唾液サンプルの採取または舌被膜の脱離前に、口腔を、０．１％から７０％、好ましくは１％から５０％、非常に好ましくは５％から３０％の糖を含有する、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ショ糖およびマルトースの水溶液などの糖溶液で濯ぐことが可能である。
【００５６】
同様に、０．１％から７０％、好ましくは１％から６０％、非常に好ましくは１０％から５０％飽和のグルコース、フルクトース、ガラクトース、ショ糖、マルトースなどの糖類を、唾液サンプル自体に添加することも有利となり得る。
【００５７】
また、唾液サンプルの採取または舌被膜の脱離前に、例えば、角砂糖、粉糖または糖錠の形態で０．１ｇから１０ｇ、好ましくは０．５ｇから５ｇ、非常に好ましくは１ｇから２ｇの間の糖を口腔で溶解させることも有利となり得る。
【００５８】
使用される綿毛チップ、綿棒または他の吸収材によって舌被膜を脱離させるために、０．１％から７０％、好ましくは１％から５０％、非常に好ましくは５％から３０％の糖含有溶液にそれらを浸し、乾燥後それらを使用することが有利となり得る。
【００５９】
同様に、本発明に従った方法の１つの好適な形態において、例えば、舌被膜の脱離のために用いられる綿毛チップ、綿棒または他の吸収材は、例えば、前記のショ糖、ＮＡＤ、ＭＴＰ、ＰＭＳ、ＬＤＨまたはピルビン酸塩などの１種以上の診断用構成要素を含むことができる。この中でもとりわけＮＡＤが好ましい。
【００６０】
特に好適な実施形態において、例えば、舌被膜の脱離のために用いられる綿毛チップ、綿棒または他の吸収材は、上記の少なくとも１種の糖溶液および、例えばＮＡＤなどの少なくとも１種の診断用構成要素の双方を含む。
【００６１】
本発明は、例えば、ＤＥ  ２９７  １４２  ４６  Ｕに記載されているブリスタパックの形態で実際に利用可能となる。本提示態様は、本発明による方法を特に簡便な様式で実施することが可能となる。
【００６２】
本発明はまた、診断用印象化合物を用いた、う食の患者関連危険性の位置特異的測定法に関するものである。
【００６３】
この場合、う食の患者関連危険性を、先ず上記の本発明に従った方法によって測定し、危険性が陽性の場合、診断用印象化合物を用いて少なくとも１つの顎領域、例えば上顎および／または下顎から印象を取る。
【００６４】
適切な診断用印象化合物は、例えばＤＥ−Ａ−１９９  ２６  ７２８からのもの、特にアルギン酸塩、ポリエーテル、シリコーンまたはポリエーテル・シリコーンをベースとした化合物である。このような化合物は、０．０００１重量％から１０重量％の好適な量で位置特異的および物質特異的な口腔内診断のための診断的に有用な添加物を含有する硬化性または被膜形成担体物質である。その明細書によれば適切な診断用添加物としては、診断検査システムの開発に精通している当業者によく知られている色素指示薬、抗体、酵素および他の任意の物質がある。
【００６５】
このような印象化合物は、完全に硬化した印象物質において、う食の危険性が増加している位置に検出可能なシグナル（例えば着色）を示す。このため、う食促進微生物の代謝物が、使用される検出法における活性種として選択的に用いられる。
【００６６】
これに関連して、例えば、予め調製された診断用印象化合物を使用することが可能である。しかしながら同様に、従来の印象化合物を使用することも可能で、治療を行う者が診断上効果的な物質を添加して診断的機能性を有する印象化合物に変換することができる。
【００６７】
本発明を、以下の実施例によってより詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
実施例
適用例１
シグナル生成溶液を混合するために、０．１ｍｌのＮＡＤ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の３０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮＡＤの保存液、ｐＨ９．０）、０．１ｍｌのＭＴＴ（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＭＴＴの保存液、ｐＨ９．０）、０．１ｍｌのＰＭＳ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の１．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＭＳの保存液、ｐＨ９．０）、０．１ｍｌのＬＤＨ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の６０単位／ｍｌ乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の保存液、ｐＨ９．０）および０．１ｍｌのピルビン酸塩溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の２５ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸塩の保存液、ｐＨ９．０）を、ピペットを用いてねじ栓を有するプラスチック製試験管（２．５ｍｌ）に移し、ねじ栓を閉じて５秒間振とうする。
【００６９】
患者の口腔から唾液を採取し、少なくとも１ｍｌの唾液を、ねじ栓を有する５ｍｌプラスチック製試験管に移す。ピペットを用いて０．６ｍｌを、既に０．２５ｇのショ糖が入っている反応容器に移す。前記反応容器をねじ栓により閉じて５秒間振とうする。
【００７０】
３分後、シグナル生成溶液を、反応容器中の唾液サンプルに加える。閉じた反応容器を５秒間振とうする。３分後、検出可能なシグナル形成を終了させるために、０．４ｍｌの酢酸溶液（水中酢酸１ｍｏｌ／ｌの保存液）を反応容器に加える。反応経過は、黄色から青色への色変化により追跡できる。黄色は、う食の危険性を示さず、青色着色が強くなるにつれて、う食の危険性が高くなる。
【００７１】
１ｍｌ容量を有するプラスチック製セルを用いたＵＶＩＫＯＮ９３０分光光度計を用いて、入射光５７０ｎｍの波長で、吸光度０．９５７ΔＥ／分と測定された。
比較例１ａ
比較例１ａは、適用例１と同様に実施したが、ピルビン酸塩を加えなかった。吸光度３．３と測定された。
比較例１ｂ
比較例１ｂは、適用例１と同様に実施したが、ピルビン酸塩もＬＤＨも加えなかった。吸光度０．８１５と測定された。
比較例１ｃ
比較例１ｃは、適用例１と同様に実施したが、ＬＤＨを加えなかった。吸光度０．１５６と測定された。
【００７２】
適用例１と共に比較例１ａから１ｃは、たとえピルビン酸塩がＬＤＨを阻害するとしても（１ａと比較）、ピルビン酸塩による阻害は、ＬＤＨの添加を増量することにより（１ｂと比較）過剰に補われるが、それにもかかわらず、１つ以上の未知の付随反応が抑制される（１ｃと比較）、ということを示している。
適用例２
シグナル生成溶液を混合するために、０．１ｍｌのＮＡＤ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の３ｍｍｏｌ／ｌ  ＮＡＤの保存液、ｐＨ９．０）、０．１ｍｌのＭＴＴ（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の０．１５ｍｍｏｌ／ｌ  ＭＴＴの保存液、ｐＨ９．０）、０．１ｍｌのＰＭＳ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の０．１ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＭＳの保存液、ｐＨ９．０）、０．１ｍｌのＬＤＨ溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の４０単位／ｍｌ乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の保存液、ｐＨ９．０）および０．１ｍｌのピルビン酸塩溶液（５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｇｌｙｇｌｙ緩衝液中の２．５ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸塩の保存液、ｐＨ９．０）を、ピペットを用いてねじ栓を有するプラスチック製試験管（２．５ｍｌ）に移し、ねじ栓を閉じて５秒間振とうする。
【００７３】
ピペットを用いて１００μｌを、２ｃｍ×０．６ｃｍ×０．７８ｍｍの吸収性綿棒に吸わせ、凍結乾燥する。前記乾燥綿棒を、ポリエステル製の細片（７ｃｍ×０．６ｃｍ×０．２５ｍｍ）の一端上に面と面で貼り付ける。適用例１の２段落目に記載されたとおり、唾液サンプルを前もって反応容器に調製した。検査用細片上の綿棒を、完全に唾液サンプルに導入する。３分後、前記検査用細片綿棒を、ｐＨ７．５の５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸水素ナトリウム溶液からなる中止剤を２ｍｌ入れてある容器に浸漬する。検査用細片上の綿棒の青色着色強度が増すにつれて、う食の危険性が高くなる。
適用例３
シグナル生成溶液を、適用例２の１段落目に記載のとおり調製する。患者の口腔に、角砂糖を溶解させ、口腔から唾液を採取する。綿毛チップ（例えば、Ｑチップ）を口腔に導入し、唾液を浸すために５秒間そこに置く。チップの唾液の浸漬した綿毛領域を、シグナル生成溶液に浸漬し、３分間そこに置く。青色着色が強くなるにつれて、う食の危険性が高くなる。
適用例４
検査用細片を、適用例２の１段落目に記載のとおり調製する。患者の口腔に、角砂糖を溶解させる。検査用細片を口腔に導入し、吸収性綿棒を舌の中央に置き、舌の被膜を取り出すためにこする。検査用細片をの吸収性綿棒を、シグナル生成溶液に浸漬し、３分間そこに置く。次に綿棒に生じた青色着色を評価する。青色着色が強くなるにつれて、う食の危険性が高くなる。
適用例５
唾液試験を実施するために適用例１から４に記載された成分を、このキットに含ませる。２０ｇのアルギン酸塩（ＥＳＰＥ社のＰａｌｇａｔ）を診断印象用バッグに入れる。前記アルギン酸塩を混合用ボール（２５０ｍｌ）に移す。ＤＥ−Ａ−１９９２６７２８に従って調製され、０．２６ｇのグリシルグリシン、０．２４ｇのトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３６ｍｇのＮＡＤ、０．９ｍｇのメト硫酸フェナジン、３ｍｇの臭化３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）および１８５０単位の乳酸脱水素酵素を含有するシグナル生成溶液（それによって歯垢中のう食原因微生物により乳酸遊離が観察できる）を容器に入れて用意する。前記シグナル生成溶液をアルギン酸塩に加える。速やかに、均一になるまでハンドスパチュラで混合する（約３０秒）。印象化合物を調製している間、患者の口腔に角砂糖を溶解させる。印象化合物を、印象トレイに導入する。印象を取るために、印象トレイを、上顎または下顎のいずれかに対して押し付け、３分間そこに置く。印象を口から外す。代謝活性があり、う食原因微生物を有する歯の位置が、印象化合物上の点および領域により示される。青色着色が強くなるにつれて、う食の局所危険性が高くなる。唾液試験により測定されたう食の危険性と、歯に存在するう食の危険性とが比較できる。
適用例６
ＤＥ２９７１４２４６Ｕに従ったブリスタが使用される。綿毛チップ（例えば、Ｑチップ）を、５０重量％糖溶液に浸漬する。前記綿毛チップを口腔内に導入し、舌の被膜を取り出すために舌の中央でこすり回転させる。前記綿毛チップをブリスタの第１の貯蔵所に導入する。第２の貯蔵所を押すことにより、適用例２の１段落目に従って調製されたシグナル生成溶液を、第１の貯蔵所へと送る。綿毛チップを回転することにより、唾液サンプルを有する領域を、シグナル生成溶液でぬらす。綿毛チップは、３分後ブリスタから除去できる。
比較例１
米国特許第４，３５１，８９９号特許明細書および米国特許第４，２５４，２２２号特許明細書の教示が、う食の患者関連危険性を測定するために適切でないことを示すために、比較例１および比較例２が調製された。
【００７４】
米国特許第４，３５１，８９９号特許明細書および米国特許第４，２５４，２２２号特許明細書の教示に従って、０．６μｍｏｌの乳酸塩、０．６μｍｏｌのＮＡＤ、０．０３μｍｏｌのＭＴＴ、０．０２μｍｏｌのＰＭＳおよび０．６単位の乳酸脱水素酵素を含有する０．１ｍｌのｐＨ９．０のＧｌｙｇｌｙ緩衝液を１００μｌの唾液に加え、完全に混合した。マイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス社）を用いて、５７０ｎｍで反応経過を追跡した。０．６／分の吸光度増加を測定した。唾液なしの対照実験においては、１．１／分の吸光度変化を測定した。結果：唾液は、シグナル生成に必要である酵素の乳酸脱水素酵素を４５％阻害する。
比較例２
米国特許第４，３５１，８９９号特許明細書および米国特許第４，２５４，２２２号特許明細書の教示に従って、０．６μｍｏｌの乳酸塩、０．６μｍｏｌのＮＡＤ、０．０３μｍｏｌのＭＴＴおよび０．０２μｍｏｌのＰＭＳを含有する０．１ｍｌのｐＨ９．０のＧｌｙｇｌｙ緩衝液を１００μｌの唾液に加え、完全に混合した。マイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス社）を用いて、５７０ｎｍで反応経過を追跡した。乳酸脱水素酵素が存在しなくても、０．４／分の吸光度増加を測定した。０．３単位の乳酸脱水素酵素の存在下における比較試験においては、１．２／分の吸光度変化を測定した。結果：唾液は、酸化還元指示薬ＰＭＳ／ＭＴＴをそれ自体で還元できる成分を含み、その結果、測定シグナルを５０％偽って伝える。