(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸フラグメントのインビトロでのランダム組換え方法であって、
ａ）  ポリヌクレオチド配列の初期バンクをフラグメント化する段階、
ｂ）  単数又は複数のテンプレートに前記フラグメントをハイブリダイズさせる段階、
ｃ）  隣接末端を有する前記ハイブリダイズしたフラグメントをリガーゼで連結する段階、
ｄ）  テンプレートの連結したフラグメントを変性させる段階、そして、
ハイブリダイゼーション段階ｂ）、連結段階ｃ）および変性段階ｄ）を繰り返しランダム組換え体を形成すること、
を含んで成り、さらに段階ａ）〜段階ｄ）がポリメラーゼの存在なしに実行されることを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに単数又は複数の基準配列に対応する特性に比べて有利な特性を呈する組換えポリヌクレオチド配列を選択する段階ｅ）を含んで成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｅ）の前に単数又は複数のテンプレートから組換えポリヌクレオチド配列を分離する段階が含まれることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｅ）の前に２本鎖組換えポリヌクレオチド配列の増幅段階が含まれることを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｅ）の前に、単数又は複数のテンプレートから組換えストランドを分離し対応する２本鎖を得た後、組換えポリヌクレオチド配列をクローニングする段階を含んで成ることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）で生成されたフラグメントの末端は、段階（ｂ）における単数又は複数のテンプレート上での該フラグメントの末端に隣接してハイブリダイゼーション及び段階（ｃ）における該フラグメント相互の連結が起こりうるようなものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
初期バンクのポリヌクレオチド配列は、段階（ｂ）における単数又は複数のテンプレート上でのフラグメントの末端に隣接してハイブリダイゼーション及び段階（ｃ）における該フラグメント相互の連結を可能にするフラグメント末端を段階（ａ）で生成するように、相互のフラグメント間の又はテンプレートとの相同性を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｂ）及び（ｃ）が同時に実施されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
段階（ａ）でのポリヌクレオチド配列のフラグメント化が制御された形又はランダムな形で行なわれることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）が、初期バンクのポリヌクレオチド配列を、単数又は複数の制限酵素の作用による加水分解に付すことから成ることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ａ）のフラグメント化が制御された形で実施される場合、組換えポリヌクレオチド配列の組換え度及び組換え点の位置は、該フラグメント化によって決定されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ａ）におけるポリヌクレオチド配列のランダムフラグメント化が、酵素的又は機械的手段によって行なわれることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
フラグメントのハイブリダイズされていない末端が、同じテンプレートにハイブリダイズされたその他のフラグメントを覆っている場合、該末端を特異的に認識し切断する能力をもつ酵素を段階（ｂ）〜段階（ｄ）で添加することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｂ）〜段階（ｄ）において、Flapエンドヌクレアーゼ酵素を添加することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ｃ）で、高温で活性でありかつ熱安定性をもつリガーゼを使用することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｂ）〜段階（ｄ）で添加された、フラグメントのハイブリダイズされていない末端を特異的に認識し切断する能力をもつエンドヌクレアーゼが、段階（ｃ）で使用されるリガーゼと同じく耐熱性及び高温活性という特徴を有することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド配列の初期バンクが、遺伝子の突然変異又は、初期バンク内で同じ種又は異なる種の近い又は全く異なる系統群の遺伝子を組合せることにより、生成されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
初期バンクのポリヌクレオチド配列が、互いに相同性を有することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
２本鎖ポリヌクレオチド配列の初期バンクが、段階（ａ）でフラグメント化されることになる合成配列で構成されているか、又は段階（ａ）のフラグメントを構成できる合成配列で構成されていることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ａ）が、初期バンクのポリヌクレオチド配列に対する多数の切断部位をもつ制限酵素の作用によるか又は複数の制限酵素を組合わせることによる加水分解に初期バンクを付すことからなることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
段階（ａ）が、部分的に非相同な２本鎖ポリヌクレオチド配列の初期バンクのＤＮａseＩを用いたランダム処理からなることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｂ）又は段階（ｂ）と（ｃ）の同時の反応の間のハイブリダイゼーションのため、ランダム処理により段階（ａ）で生成されたフラグメントをテンプレートとして使用することを特徴とする請求項１２又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
段階（ｂ）は、異なる制限酵素での処理により同じ初期バンクから段階（ａ）で別々に生成された全く異なる少なくとも２つのフラグメントバンクを組合わせることによって実施されることを特徴とする請求項１０又は２０に記載の方法。
【請求項２４】
段階（ｂ）又は段階（ｂ）と（ｃ）の同時の反応の間のハイブリダイゼーションのため、制限酵素での処理によって段階（ａ）で得られたフラグメントをテンプレートとして使用することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ａ）のフラグメントが、初期バンクのポリヌクレオチド配列について行なわれた増幅反応により得られることを特徴とする請求項１〜９，１１，１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
増幅反応は、テンプレート全体に沿ってその末端が隣接しているフラグメントを生成できるようにするプライマオリゴヌクレオチドを用いて実施されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
増幅反応は、段階（ｂ）のテンプレートとして役立っている共通配列をもつフラグメントの生成を可能にするプライマオリゴヌクレオチドを用いて実施されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
段階（ａ）において、初期バンクが、ｎ個のフラグメントへとフラグメント化され、ここでｎは３以上であることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
段階（ｂ）又は（ｃ）におけるテンプレートが、初期バンク由来のポリヌクレオチド配列であるか又は１本鎖又は２本鎖の前記バンクのコンセンサス配列であることを特徴とする請求項１〜２１、２３、２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
段階（ｂ）又は（ｃ）におけるテンプレートとして、フラグメントの３’末端及び隣接フラグメントの５’末端に相補的な１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする請求項１〜２１、２３、２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
段階（ｂ）又は（ｃ）において、テンプレートに加えて、可変的長さの１本鎖又は２本鎖のオリゴヌクレオチドを添加することを特徴とする請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
段階（ｅ）の前に、テンプレート上又は組換えポリヌクレオチド配列上に存在するマーカーによって、テンプレートから組換えポリヌクレオチド配列を分離することを特徴とする請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
段階（ｄ）で得られ、クローニングされた組換えポリヌクレオチド配列が、基準配列の対応する特性に比べて有利な特性を呈する組換えポリヌクレオチド配列又はクローンを選択するためにスクリーニングされることを特徴とする請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ポリヌクレオチド配列の初期バンクが、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法によって調製された、単数又は複数の基準配列に対応する特性に比べて有利な特性を呈する組換えポリヌクレオチド配列からなる単数又は複数の制限されたバンクにより構成されていることを特徴とする請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組換えポリヌクレオチド配列をin vitroで獲得する方法に関する。本発明は、特に、基準配列の対応する特性に比べ有利な単数又は複数の特性を呈する可能性があり従って改善された表現型を付与しかつ／又は改善されたタンパク質を産生する能力をもつポリヌクレオチド配列を生成し次に選択することを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
基準配列というのは、求められているものに近い特性をもつ配列のことを意味する。
【０００３】
異なるポリヌクレオチド配列の間でのin vitro組換えに有利に作用するためのさまざまな技術が開発されてきており、なかでも、共にＰＣＲの利に基づくものであるＤＮＡ−シャフリング（１２）及びＳｔＥＰ（１４）を挙げることができる。
【０００４】
ＤＮＡシャフリングには、ポリヌクレオチド配列のＤＮａseＩによるランダムなフラグメント化及び先に生成されたフラグメントがプライマとして役立つＰＣＲによる増幅という２つの段階が含まれている。各ハイブリダイゼーション段階において、マトリクス（テンプレート）の変更は、相同配列をもつ領域のレベルで組換えを誘発する。この方法の概略的表示は、補遺の図１Ａに示されている。
【０００５】
ＳｔＥＰは、一対のプライマの存在下でさまざまな突然変異を含む異なるポリヌクレオチド配列を混合することから成る。この混合物は、ハイブリダイゼーション段階と重合段階が持続時間の非常に短かい唯一の段階にまとめられているＰＣＲタイプの反応に付される。これらの条件によりプライマのハイブリダイゼーションが可能となるが、重合速度は低減し、かくして、部分的に合成されたフラグメントは異なる突然変異を支持するポリヌクレオチド配列上でランダムにハイブリッド形成され、こうして組換えが可能となる。この方法の概略的表示は、補遺の図１Ｂに示されている。
【０００６】
これら２つの方法の各々において、重合段階は、組換えプロセスに不可欠なものである。かくして、選択されたポリメラーゼに応じて、この重合段階は、望ましくない補足的突然変異を発生させる可能性がある。その上、一定のサイクル数からは、ＤＮＡ−シャフリング及びＳｔＥＰは１つのテンプレート上の「メガプライマ」のハイブリダイゼーション（６）の原理に基づいており、このため恐らく、サイズが１.５Ｋｐｂを上回るポリヌクレオチド配列についての利用には問題が伴う（１１）。最後に、組換えは連続的重合段階の間にランダムに行なわれることから、これら２つの技術は組換え率を制御できない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はまさに、基準配列の対応する特性に比べ有利な特性を呈する可能性があり従って改善された表現型を付与しかつ/又は改善されたタンパク質を産生する能力をもつポリヌクレオチド配列を生成することを可能にする組換えポリヌクレオチド配列の単純な調製方法を提供することによって、前述の欠点を補正することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この目的は、以下初期バンクとも呼ばれているポリヌクレオチド配列バンクから組換えポリヌクレオチド配列をin vitroで得る方法において、
ａ）  ２本鎖ポリヌクレオチド配列バンクをフラグメント化する段階、
ｂ）  場合によって、単数又は複数の集合マトリクス（テンプレート）の存在下でフラグメントを変性させる段階、
ｃ）  単数又は複数のテンプレートが段階（ｂ）で存在しない場合、これと前記フラグメントをハイブリッド形成させる段階、
ｄ）  組換えポリヌクレオチド配列を得るために前記フラグメントを連結する段階、
ｅ）  単数又は複数の基準配列に対応する特性に比べて有利な特性を呈する組換えポリヌクレオチド配列を選択する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法によって達成される。
【０００９】
本発明の方法は、段階（ｄ）の後でしかも段階（ｅ）の前に、段階（ａ）のフラグメントではなく段階（ｄ）の産物を用いて段階（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）を反復する段階を含むこともできる。
【００１０】
この実施形態は、段階（ｄ）の後で全てのフラグメントが連結されていない場合に特に有用である。この場合、本発明の方法はさらに、段階（ｄ）の終りでかつ段階（ｅ）の前に、以下の反応を単数又は複数サイクル含んで成る：
−  場合によっては単数又は複数のテンプレートの存在下での、段階（ｄ）に由来する連結された及び連結されていないフラグメントの変性、
−  変性の際に単数又は複数のテンプレートが存在しない場合の、これらを用いた前記フラグメントのハイブリダイゼーション、
−  前記フラグメントの連結。
【００１１】
これらの変性、ハイブリダイゼーション及び連結反応は、段階（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）と同等であるが、段階（ａ）のフラグメントを用いてではなく、段階（ｄ）に由来する連結された及び連結されないフラグメントを用いて実施される。
【００１２】
本発明の方法はさらに以下の段階のうちの単数又は複数のものを含むことができる：
−  段階（ｅ）の前に単数又は複数のテンプレートから組換えポリヌクレオチド配列を分離する段階、
−  段階（ｅ）の前に２本鎖組換えポリヌクレオチド配列を増幅させる段階、
−  段階（ｅ）の前に、場合によって単数又は複数のテンプレートから組換えストランドを分離し対応する２本鎖を得た後、組換えポリヌクレオチド配列をクローニングする段階。
【００１３】
段階（ａ）で生成されたフラグメントの末端は、段階（ｃ）における単数又は複数のテンプレート上でのこれらの末端に隣接したハイブリダイゼーション及び段階（ｄ）におけるこれらのフラグメント相互の連結が存在しうるようなものである。本発明の方法が実施されるバンクのポリヌクレオチド配列は、相互の又はテンプレートとの相同性ゾーンを提示し、かくして上述のようなフラグメント末端を生成できるようになっていなくてはならない。
【００１４】
本発明の方法の有利な一実施形態は、「Recombining Ligation Reaction（組換え型連結反応）」という英語の表現の省略形であるＲＬＲと呼ばれる反応に従って、段階（ｃ）及び（ｄ）を同時に実施することから成る。
【００１５】
以上に記された利点の他に、本発明の方法は、遺伝子でありうるポリヌクレオチド配列のin vitroでのランダム組換えに有利に作用しこれを加速するという点において目覚しいものである。遺伝子というのは、１つの生物学的機能に結びつけられたＤＮＡ配列又はフラグメントのことを意味する。遺伝子は、核酸供給源からのこの遺伝子の抽出又は重合による合成又は化学的合成を含むさまざまな要領で得ることができる。
【００１６】
従って、本発明の方法による初期バンクのポリヌクレオチド配列のin vitro組換えは、先行するバンクの配列の単数又は複数の特徴を獲得した配列を含む新しいバンクを得ることを可能にする。従って、本発明の方法は、in vitroでの進化技術を構成している。
【００１７】
本発明の方法は、組換えに到達するためにin vitroでの重合段階を必要としないことからＤＮＡシャフリング（１２）又はＳｔＥＰ（１４）の技術において利用されるような組換えＰＣＲに対する１つの代替案を構成するものである。これと反対に、本発明の方法の要となる段階は、テンプレート上での連結の段階（ｄ）であり、これが組換え事象の間の非常に高い忠実度を保証する。
【００１８】
本発明の方法は、連結させるべきフラグメントの再集合の効率を著しく増大させることができるという点において目覚しいものである。実際、ｎ個のフラグメントに切断された配列の場合、従来の連結方法を用いたフラグメントの再会合の可能性（連結を方向づけるテンプレートは利用しない）はｎｎ個存在しており、そのうち唯一つの形態だけが有利である。本発明の方法の場合、連結は、テンプレートにより方向づけられ、このため、有利な唯一の形態を直接得ることが可能である。
【００１９】
段階（ａ）におけるこれらのポリヌクレオチド配列のフラグメント化は、制御された形か又はランダムな形で行なわれ得る。
【００２０】
制御された形で実施されるフラグメント化の場合、フラグメントは、望ましい組換え度及び組換え点の位置を精確に制御することを可能にする。本発明の方法の好ましい実施形態に従うと、段階（ａ）は、単数又は複数の制限酵素の作用による加水分解にバンクのポリヌクレオチド配列を付すことから成る。かくして本発明の方法の特定の一実施形態においては、組換えポリヌクレオチド配列の組換え度及び組換え点の位置は、段階（ａ）のフラグメント化によって決定される。
【００２１】
かくして、配列によって生成されるフラグメント数が多くなればなるほど、１つの配列を再構成するのに必要なフラグメントの数は多くなり、組換え率は高くなる。その上、本発明の方法のこの実施形態において生成されたフラグメントの末端の性質及び位置は、既知でかつ制御されたものであり得、そのため
−  組換えが起こるゾーンを精確に制御すること、又は
−  フラグメント末端がポリヌクレオチド配列の間の相同性ゾーン内又はこれらの配列と単数又は複数のテンプレートの間の相同性ゾーン内に作り出された場合には、ポリヌクレオチド配列例えば遺伝子の間の組換えを誘発すること、
が可能となる。
【００２２】
ランダムフラグメント化の場合には、例えば DnaseＩによる消化又は音波処理といったように、２本鎖ＤＮＡをランダムに切断する能力をもつ、当業者にとっては既知のあらゆる酵素による又は機械的手段を利用することができる。
【００２３】
本発明の方法は、連結すべきフラグメントの再集合効率を著しく増大できるものであることから、これを平滑末端多分子連結の配向に応用することもできる。この利用分野においては、段階（ｂ）又は（ｃ）におけるテンプレートとして、１つのフラグメントの３’末端及び隣接フラグメントの５’末端のちょうど相補的な１本鎖又は２本鎖のオリゴヌクレオチドが利用され、こうして変性段階の後に同じテンプレート上でこれら２つの末端の隣接ハイブリダイゼーションが可能となる。ひとたびハイブリッド形成されたならば、フラグメントの末端は、平滑末端フラグメント連結の向きを配向するような形で、互いに連結され得る。同じアプローチは、付着末端フラグメント連結の配向のためにも考慮することができる。
【００２４】
本発明の方法の最も好ましい実施形態は、段階（ｃ）及び／又は段階（ｄ）において、フラグメントのハイブリッド形成されていない末端が同じテンプレート上のハイブリッド形成されたその他のフラグメントを覆っている場合にこれらを特異的に認識し切断する能力をもつ酵素を添加することから成る。このタイプの酵素の好ましい一例は Flap エンドヌクレアーゼ酵素（１０）である。
【００２５】
従って本発明の方法の特定の実施形態は、段階（ａ）で生成されたフラグメントが段階（ｃ）におけるテンプレート上のハイブリダイゼーションに際して互いに覆い合う可能性がある場合に、Flapエンドヌクレアーゼタイプの酵素を利用することから成る。
【００２６】
かくして、テンプレート上での１本鎖ＤＮＡフラグメントのハイブリダイゼーションの際に、これらの酵素は、これらのフラグメントのハイブリッド形成されていない末端が同じテンプレート上でハイブリッド形成されたその他のフラグメントを覆っている場合にこれらの末端を特異的に認識し切断するという特性をもつ。従ってハイブリダイゼーション段階（ｃ）の間、これらの酵素は、段階（ｄ）で連結され得る隣接末端の数を増大させることができ、このことは、ランダム切断により得られたフラグメントの場合、それらがテンプレート上でハイブリッド形成する際に互いに覆い合うゾーンを呈することから、特に重要である。
【００２７】
段階（ｄ）で高温で活性であり好ましくは熱安定性をもつリガーゼを利用する本発明の方法の特殊な実施形態においては、段階（ｃ）及び／又は段階（ｄ）で添加された、Flapのようなフラグメントのハイブリッド形成されていない末端を特異的に認識し切断する能力をもつエンドンクレアーゼは、前記リガーゼと同じ耐熱性及び高温活性という特性を有することになる。
【００２８】
本発明の方法が実施されるポリヌクレオチド配列バンクは、当業者にとって既知のあらゆる方法により、例えば野生型遺伝子から、連続的な定方向突然変異誘発段階、「エラープローン」ＰＣＲ（２）、化学的ランダム突然変異誘発、in vivo でのランダム突然変異誘発によって、又は、前記バンク内でさまざまなポリヌクレオチド配列が利用できるようにするような形で同じ種又は異なる種の内部の近い又は全く異なる系統群の遺伝子を組合せることにより、生成可能である。
【００２９】
これらの技術の中でも、本発明はより特定的に言うと、ランダム点突然変異を作り出すことを可能にする条件下で実施される連鎖重合反応によって２本鎖ポリヌクレオチド配列バンクが得られる方法を考慮している。
【００３０】
２本鎖ポリヌクレオチド配列の初期バンクは、段階（ａ）でフラグメント化されることになる又は段階（ａ）のフラグメントを構成できる合成配列で構成されている。
【００３１】
本発明の方法の好ましい実施形態に従うと、段階（ａ）は、単数又は複数の制限酵素の作用による加水分解にバンクのポリヌクレオチド配列を付すことから成る。
【００３２】
本発明の方法により生成される組換え度を増大させるためには、バンクのポリヌクレオチド配列上に多数の切断部位をもつ制限酵素を利用することによるか又は複数の制限酵素を組合わせることによって制限フラグメント数を増大させるだけでよい。熱安定性でかつ熱活性のリガーゼを利用する場合には、かくして生成される最も小さなフラグメントのサイズは、一般に約６５℃である連結段階（ｄ）の温度と相容性あるハイブリダイゼーション温度を保つべく、有利には４０ｐｂ以上となる。
【００３３】
段階（ａ）はさらに、酵素的又は機械的なランダム処理によりフラグメントバンクを生成することによって実施されうる。特に、段階（ａ）は、部分的に非相同な２本鎖ポリヌクレオチド配列バンクのＤＮａseＩでのランダム処理で構成されていてよい。段階（ａ）で、ランダムな酵素的又は機械的フラグメント化が利用される場合には、本発明の方法のこの実施形態は、段階（ｃ）の間又は段階（ｃ）と（ｄ）の同時のＲＬＲの反応の間のハイブリダイゼーションのため、この処理によって生成されたフラグメントを互いのためのテンプレートとして利用することを可能にするという特色をもつ。
【００３４】
段階（ｂ）は、例えば異なる制限酵素を用いて異なる処理により同じ初期バンクから段階（ａ）で別々に生成された全く異なる少なくとも２つのフラグメントバンクを組合わせることによって実施可能である。かかるバンクの実施形態の場合、段階（ｃ）又は段階（ｃ）と（ｄ）の同時のＲＬＲ反応の間のハイブリダイゼーションのため、段階（ａ）で得たフラグメントを、互いのためのテンプレートとして利用する。
【００３５】
本発明の方法の段階（ａ）のフラグメントは、バンクのポリヌクレオチド配列上で行なわれるＰＣＲといったような増幅反応によっても生成可能である。２つの解決法を考慮することができる。第１のケースでは、プライマオリゴヌクレオチドを、テンプレートに沿ってその端末が隣接しているフラグメントを生成するような形で設計することができる。第２のケースでは、プライマオリゴヌクレオチドは、段階（ｂ）又は段階（ｃ）において互いのためのテンプレートとして役立つことのできる共通配列をもつフラグメントを生成するような形で設計される。本発明の方法は、段階（ａ）で得られた異なるフラグメントをランダムな形で組合せ、ポリヌクレオチド配列の内部で段階（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の間にこれらを再集合させることを可能にする。従ってこの方法は、in vivo で発生しうる組換え現象を、これに有利に働きかけることでin vitroで再現させる。従って、本発明の方法は、基準配列の対応する特性と比べて有利な特性をもつ新しいポリヌクレオチド配列を生成するべくポリヌクレオチド配列を互いに組換えるために特に有利である。
【００３６】
本発明の方法の組換え効率は、段階（ａ）でポリヌクレオチド配列によって生成されたフラグメントの数の関数である。従って、本発明の方法は、ｎを有利には３以上であるとして、ｎ個のフラグメントにフラグメント化されたポリヌクレオチド配列を利用することになる。
【００３７】
段階（ｂ）又は（ｃ）におけるテンプレートは、例えば、初期バンク由来のポリヌクレオチド配列であるか又は１本鎖又は２本鎖の前記バンクのコンセンサス配列である。テンプレートが直接本発明の段階（ｃ）に内含されている場合、このテンプレートは１本鎖形態でなくてはならない。
【００３８】
本発明の方法の１変形形態に従うと、段階（ｂ）又は（ｃ）のテンプレートは１本鎖又は２本鎖のオリゴヌクレオチドで構成されている。
【００３９】
本発明の方法の特定の１実施形態に従うと、可変的長さの１本鎖又は２本鎖のオリゴヌクレオチドが、段階（ｂ）又は（ｃ）でテンプレートに加えて添加される。これらのオリゴヌクレオチドは、段階（ｃ）でフラグメントの一部分に置換できるように設計されており、実際、その配列は、
−  それらが置換するフラグメントの配列と完全に相同である場合、或る種の組合せに有利に作用し、又そうでなければ、
−  それらが置換するフラグメントの配列と部分的に非相同である場合、補足的な単数又は複数の定方向突然変異を導入する、
ようなものである。
【００４０】
本発明の段階（ｅ）の前に、テンプレート上又は組換えポリヌクレオチド配列上に存在するマーカーによって、テンプレートから組換えポリヌクレオチド配列を分離することが可能である。実際、当業者にとって既知の技術に従ってテンプレートの各ストランドに標識づけすることが可能である。例えば、テンプレートのマーカーはハプテンであってよく、ハプテンがビオチンマーカーである場合、例えば支持体上に固定された抗ハプテン抗体又はビオチン−ストレプトアビジン反応などのような、当業者にとって既知の技術により、テンプレートから組換えポリヌクレオチド配列を分離する。
【００４１】
テンプレートから組換えポリヌクレオチド配列を分離するためには、その他の技術を利用することができる。本発明の方法の終りに容易に除去できるようにするような形で、テンプレートを特異的に調製することもできる。かくしてメチル化されたｄＡＴＰを用いたＰＣＲ増幅によってテンプレートを合成することができ、こうして制限エンドヌクレアーゼＤpnＩによるその分解が可能となる。この場合、組換えポリヌクレオチド配列は、メチル化されたｄＡＴＰを含有していてはならない。テンプレートは、同時に、ｄＵＴＰを利用することによりＰＣＲ増幅により調製されていてよく、こうしてウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼでの処理によるその分解が可能となる。逆に、組換えポリヌクレオチド配列を５’にホスホロチオエート原子団を支持するオリゴヌクレオチドを用いた選択的ＰＣＲにより増幅させることによって、組換えポリヌクレオチド配列を保護することが可能である。このとき、エキソヌクレアーゼでの処理がテンプレートを特異的に分解することを可能にする。
【００４２】
本発明の方法は、段階（ｅ）の場合によってのクローニングの前に、組換えポリヌクレオチド配列の増幅段階を含むことかできる。特にＰＣＲによる増幅といったあらゆる増幅技術が受け入れられる。そのうち最も単純なものの１つは、組換え配列の末端上でのみハイブリッド形成することのできるプライマのおかげで、組換えポリヌクレオチド配列を特異的に増幅することのできるＰＣＲを実施することから成る。その後ＰＣＲ産物は、特徴づけされるようにクローニングされ、基準配列の対応する特性に比べて有利な特性を呈するポリヌクレオチド配列が選択される。
【００４３】
本発明の目的は、基準配列の対応する特性に比べて有利な特性を呈する可能性のあるポリヌクレオチド配列を生成することにある。段階（ｄ）で得られ場合によってクローニングされた組換えポリヌクレオチド配列は、基準配列の対応する特性に比べて有利な特性を呈する組換えポリヌクレオチド配列又はクローンを選択するための適切なあらゆる手段によってスクリーニングされる。例えば、有利な特性というのは、１つの酵素の熱安定性又は、酵素方法のために通常利用される対照タンパク質に比べ酵素方法により適合した塩分濃度又はｐＨ又は温度条件下で機能できるその酵素の性質を意味する。かかる方法の一例として、織物繊維の糊付け除去又はパルプの漂白又は乳製品産業におけるアロマ製造の工業的方法、新規の治療用分子の酵素による合成のための生体触媒作用方法などを挙げることができる。
【００４４】
従って本発明の方法の有利な実施形態に従うと、ポリヌクレオチド配列バンクは、対照配列と比べて有利な特性を呈するポリヌクレオチド配列を適切なあらゆる手段により選択することを可能にしたスクリーンの結果であると考えられる。かくして選択された配列は、制限されたバンクを構成する。
【００４５】
しかしながら、制限されていない１つのバンクから出発してこのバンク内に含まれた特性の代表性を保つことも可能である。
【００４６】
このとき、基準タンパク質に比べて有利な特性の１つを呈する単数又は複数のタンパク質についてコードする配列は、in vivo又はin vitroでのスクリーニングにより選択され、本発明の方法を場合によって反復するための新しいバンクを構成するのに役立つことができる。従って、本発明の方法の有利な実施形態は、場合によってその他のポリヌクレオチド配列と混合された、本発明の方法の第１の実施の後に選択された複数のポリヌクレオチド配列をバンクとして利用することから成る。段階（ｅ）のクローンの各々に適用可能なスクリーニング技術の中でも、in vitroでのスクリーニング技術は、細胞生理学的問題及びin vivo での発現クローニングに関連する全ての欠点から免がれるという利点を呈している。さらに、このタイプのスクリーニングは容易に自動化可能であり、このため、多くの組換えポリヌクレオチド配列をスクリーニングすることが可能になる。
【００４７】
本発明は同様に、本発明に従った方法により得られる組換えポリヌクレオチド配列ならびにかかる組換えポリヌクレオチド配列を含有するベクター、本発明の組換えポリヌクレオチド配列又はベクターによって形質転換された細胞宿主、ならびにこの組換えポリヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質にも関する。本発明は同様に、組換えポリヌクレオチド配列、ベクター、宿主又はタンパク質の対応するバンクをも含んで成る。
【００４８】
本発明のその他の利点及び特徴は添付図面を参考にした以下の本発明の実施例から明らかになることだろう。
【００４９】
【実施例】
Ｉ−例
本発明の方法は、E.coli（１）のＰＢＰ１bについてコードする ponＢ遺伝子の突然変異体パンクから実施された。この遺伝子の１０個の突然変異体が利用された。各突然変異体の遺伝子の配列は、野生型遺伝子のものと比べ、Lefeure et al.（８）によって記述された技術に従って５つの初期コドンを５つのアラニンコドンで置換することにより構成された１３〜１６塩基という長さの相同でないゾーンによって異なっている。
【００５０】
各突然変異体が支持する置換は、突然変異体を制限酵素ＰvuIIでのその消化プロフィルにより互いに識別できるようにしているＰstＩ酵素の２つの部位によってとり囲まれたこの制限酵素のユニーク部位が存在するということをその特徴としている。図３は、各突然変異体が支持する１０個の突然変異ゾーン（ＰvuII及びＰstＩ）の位置を表わしている。
【００５１】
１０個の突然変異体の遺伝子のＰＣＲによる増幅の後、ＰＣＲ産物を精製し、バンクを構成するため等モル量で混合した。このバンクのポリヌクレオチド配列を、制限フラグメントバンクを生成するような形で、制限酵素ＨinｆＩ及びＢsaＩにより消化させた。このとき、熱安定性リガーゼの存在下で異なる量で、野生型テンプレートと共に制限フラグメントをインキュベートした。変性／ハイブリダイゼーション／連結を数サイクル行なった後、突然変異体の遺伝子の５’及び３’末端に特異的でかつ野生型テンプレートの５’及び３’末端に非特異的なプライマ対と共にＰＣＲ増幅を実施するため、この反応混合物の１分画を利用した。増幅産物をクローニングし、制限エンドヌクレアーゼＰvuII又はＰstＩでのその消化プロフィールについて、得られたクローンを分析した。得られたプロフィールにより、突然変異体のどのフラグメントがその他のものと組換えられ完全な遺伝子を再構成することができたかを見極めることができた。
【００５２】
II−材料
１）菌株とプラスミド
菌株ＭＣ１０６１（Ｆ− araD１３９，Δ（ara-leu)７６９６，galE１５，galK１６；Δ（lac)Ｘ７４，rpsL（StrＲ），mcrA mcrB１，hsdR２（rk−mk＋））は、Escherichia coli Ｋ１２から誘導される。
【００５３】
ベクターＰＡＲＡＰＯＮＢは、トロンビン切断部位（９）を支持する ponＢ遺伝子が、制限部位ＮcoＩ及びＮarＩの間に導入されたベクターｐＡＲＡ１３（３）に由来するものである。ベクターｐＥＴ２６ｂ＋は、Studier 及び Moffatt（１３）によって開発されNOVAGEN社により商品化されたｐＥＴベクター系統群の一員である。
【００５４】
２）オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、ISOPRIM社（Toulouse) により合成された。オリゴヌクレオチドの配列は下表Ｉに報告されている。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
３）試薬
下表II内に挙げられている制限及び修飾酵素が供給業者の推奨事項に従って利用された。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
利用される緩衝液は、以下の表III に報告されている。
【００５９】
【表３】
0004448619.tif 000004
【００６０】
III−テンプレートの調製
野生型ｐｏｎＢ遺伝子は、プライマとしてオリゴヌクレオチドＭ１及びＭ２を利用することにより一回のＰＣＲ反応段階により増幅された（図４）。最終体積１００μＬ中１０μＬの重合緩衝液、１０μＬの２ｍＭｄＮＴＰ，２０pmolの各オリゴヌクレオチドＭ１及びＭ２そして５ＵのＴaqＤＮＡポリメラーゼを含む混合物に対して野生型遺伝子（７）を支持するｐＰＯＮＢＰＢＲプラスミド５０ngを添加することにより、５つのＰＣＲ反応を調製した。これらの混合物をPerkin-Elmer９６００サーモサイクラーの中で、（９４℃−２分）−（９４℃１５秒−６０℃３０秒−７２℃１分）×２９サイクル−（７２℃−３分）というプログラムに従ってインキュベートした。
【００６１】
５回のＰＣＲの産物を混合し、ＴＢＥアガロースゲル１％上に被着させた。ゲルの移動及び臭化エチジウムでの染色の後、それぞれ２６ｐｂ及び９０ｐｂの２つのフラグメントによってとり囲まれたｐｏｎＢ遺伝子の増幅産物に対応する２６５１ｐｂのバンドを、紫外線での徹照により視覚化させ、Qiaquick系（ＱＩＡＧＥＮ）で精製されるためメスを用いて切断した。かくして精製されたＤＮＡ全てを緩衝液Ｔ１２０μＬ中に溶出させた。このＤＮＡの濃度を２６０ｎｍの分光光度計による秤量によって１００ng／μＬと評価した。
【００６２】
IV−バンクの調製
１）突然変異体遺伝子の増幅
１０個の突然変異体の遺伝子を、オリゴヌクレオチドＮ及びＥを利用したＰＣＲ反応を介して別々に増幅した。これらのオリゴヌクレオチドはそれぞれ制限部位ＮcoＩ及びＥcoＲＩを導入し、これら２つの部位で得られた産物のクローニングを可能にする。
【００６３】
各々のＰＣＲ反応を、最終体積１００μＬ中１０μＬの重合緩衝液、１０μＬの２ｍＭｄＮＴＰ，２０pmolの各オリゴヌクレオチドＮ及びＥ及び５ＵのＴaqＤＮＡポリメラーゼを含む混合物に対し突然変異体遺伝子を支持する５０ｎｇのプラスミドを添加することによって調製した。この混合物を、Perkin-Elmer９６００サーモサイクラーの中で、（９４℃−２分）−（９４℃ １５秒−６０℃ ３０秒−７２℃ １分）×２９サイクル−（７２℃−３分）というプログラムに従ってインキュベートした。
【００６４】
最終体積３０μＬ中３μＬの制限緩衝液Ａ及び５Ｕの酵素ＰvuIIを含む混合物中で３７℃で各ＰＣＲ産物５μＬを１時間インキュベートすることによって、エンドヌクレアーゼＰvuIIを用いた制限プロフィールにより、遺伝子増幅の特異性を確認した。この消化反応１５μＬをアガロースゲルＴＢＥ１％上に被着させた。移動及び臭化エチジウムでの染色の後、ゲルを紫外線に露呈した。制限フラグメントの視覚化により、各々の突然変異体遺伝子の遺伝子増幅の特異性を確認することができた。
【００６５】
並行して、各ＰＣＲ反応３μＬずつをＴＢＥ１％アガロースゲル上に被着させた。移動後、ゲルを上述のとおりに処理した。各バンドの強度から、遺伝子増幅が同じ収量を有していたと推定することができた。
【００６６】
２）制限フラグメントバンクの作製
１０個のＰＣＲ各々を５０μＬずつ混合し、ＴＢＥ１％アガロースゲル上に被着させた。移動そして臭化エチジウムでの染色の後、１０個の突然変異体の遺伝子の増幅産物に対応する２５７２ｐｂのバンドをメスを用いて切断し、Quiaquick 系（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。このように精製したＤＮＡ全体を緩衝液Ｔ１２０μＬ中に溶出させた。このＤＮＡの濃度を、２６０ｎｍでの分光光度計秤量により１００ng/μＬと評価した。
【００６７】
制限フラグメントバンクを生成するため、このＤＮＡ１００μＬを、１２μＬの制限緩衝液Ｂ、１.２μＬのＢＳＡ（１０mg/mL）、２５Ｕの酵素ＢsaＩ及び４μＬの水を含む混合物中で５０℃で１時間インキュベートさせた。その後、制限緩衝液Ｂ２μＬ，ＢＳＡ２μＬ（１mg/mL)、酵素ＨinｆＩ５０Ｕ及び水１１.５μＬを混合物に再度添加し、これを３７℃で１時間インキュベートさせた。消化混合物全体をＱＩＡquick カラム（ＱＩＡＧＥＮ）上で精製し、緩衝液Ｔ３０μＬを用いて溶出させた。１μＬのこの溶出物をＴＢＥ１％アガロースゲル上に被着させ、消化が完全であったことそして消化が６つの制限フラグメントひいては５９０ｐｂ，５００ｐｂ，４７２ｐｂ，４３８ｐｂ，２９８ｐｂ及び２７４ｐｂの６つのフラグメントバンクを生成したことを確認した。このＤＮＡの濃度は（２６０ｎｍでの分光光度計秤量により）２５０ｎｇ/μＬと評価された。
【００６８】
Ｖ−ＲＬＲ（Recombinating Ligation Reaction)
ＲＬＲ（組換え型連結反応）は、熱安定性ＤＮＡリガーゼの存在下で完全テンプレート（すなわち野生型ｐｏｎＢ遺伝子）における１０個の突然変異体の遺伝子の制限フラグメント HinｆＩ−ＢsaＩの規定量をインキュベートすることによって実施された。下表IVは、ＲＬＲの混合物の組成を報告している。
【００６９】
【表４】
0004448619.tif 000005
【００７０】
負の対照はＲＬＲ４の反応と同一であるが、熱安定性リガーゼＤＮＡを含有していない。これらの異なる混合物は、鉱油１滴で被覆され、（９４℃ ５分）−（９４℃ １分−６５℃ ４分）×３５サイクルというプログラムに従って２００μＬの微小管内でPerkin-Elmer９６００サーモサイクラの中でインキュベートされた。
【００７１】
このとき、１０μＬの各反応を、最終体積１００μＬ中１０μＬの重合緩衝液、１０μＬの２ｍＭのｄＮＴＰs，４０pmoLの各オリゴヌクレオチドＡ１及びＡ２，及び５ＵのＴaqＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物に添加した。この混合物を、（９４℃  ５分）−（９４℃ ３０秒−４６℃ ３０秒−７２℃  １分）×２９サイクル−（７２℃  ２分）というプログラムに沿ってPerkin-Elmer９６００サーモサイクラの中でインキュベートさせた。図４に示されているように、オリゴヌクレオチドＡ１及びＡ２はテンプレート上でハイブリッド形成できないことから、このＰＣＲ反応は、テンプレートを増幅させることなく、ＲＬＲ反応中に形成された連結産物を特異的に増幅させることができた。
【００７２】
ＴＢＥ１％ アガロースゲル上に５μＬの各々のＲＬＲ反応と１０μＬの各々の先行するＰＣＲ反応を被着させた。臭化エチジウムでの染色の後、ゲルを、図５に示されているように、紫外線に露呈させた。
【００７３】
このゲルを分析することにより、ＲＬＲ４の反応のみが、負の対照として、なお可視的な制限フラグメント（レーン４及び５）を含有していることが判明した。
【００７４】
負の対照についてＰＣＲ産物が不在であったこと（レーン１０）は、ＰＣＲ反応が特異的である（完全テンプレートの増幅なし）ことだけでなく、混合物中に存在する制限フラグメントが選択された条件下で汚染性あるＰＣＲ産物を生成するべくプライマと置換できないということも明らかにしている。並行して、レーン６，７及び８上に約２５００ｐｂでユニークなバンドが存在することは、ＲＬＲ反応１，２及び３についてＲＬＲ産物がＰＣＲにより増幅され得たことを実証している。従ってこれら３つのＲＬＲ反応により、制約フラグメントの６つのバンクから単数又は複数の完全な遺伝子を再構築することが可能となった。
【００７５】
VI−ＲＬＲ反応の増幅産物の分析
１）クローニング
ＲＬＲ反応１、２及び３のＰＣＲ増幅産物をWizard ＰＣＲ Preps系（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて精製し、緩衝液Ｔ４５μＬ中で溶出させた。精製した各ＰＣＲ６μＬを、制限緩衝液Ｃ３μＬ、ＢＳＡ３μＬ（１mg/mL)、酵素ＥcoＲＩ ２０Ｕ、酵素ＮcoＩ １０Ｕ及び水１５μＬを含む混合物中で３７℃で１時間インキュベートした。
【００７６】
並行して、２つのベクター（ｐＡＲＡＰＯＮＢ及びｐＥＴ２６ｂ＋）をクローニングのために調製した。これらのベクターは、制限緩衝液Ｃ３μＬ、ＢＳＡ３μＬ（１mg/mL)、酵素ＥcoＲＩ ２０Ｕ，酵素ＮcoＩ １０Ｕ及び水１９μＬを含有する混合物中で、３７℃で２時間これらのプラスミドをインキュベートすることによって線状化された。
【００７７】
線状化されたベクターならびに消化されたＰＣＲを、ＱＩＡ quick系（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いてＴＢＥ１％アガロースゲル上で精製した。各ベクター又は各消化済みＰＣＲを緩衝液Ｔ３０μＬ中で溶出させた。
【００７８】
いずれかのベクターと各々の消化済みＰＣＲとの連結は、下表Ｖの中で記述された条件に従って実施され、１６時間１６℃でインキュベートされた。
【００７９】
【表５】
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【００８０】
熱衝撃（５）により、各連結物１０μＬを用いて２００μＬの化学コンピテント細胞ＭＣ１０６１（４）を形質転換させ、かくして形質転換した細胞を選択培地上に展延させた。
【００８１】
連結対照ＴＬｐＡＲ及びＴＬｐＥＴの形質転換後、いかなるクローンも得られず、かくしてＮcoＩ−ＥcoＲＩ線状化済みベクターｐＡＲＡＰＯＮＢ及びｐＥＴ２６ｂ＋が分子内連結を受けることができないということを表わしている。
【００８２】
２）ＰＣＲによるスクリーニング
ベクターｐＡＲＡＰＯＮＢでの連結物の形質転換の後に得られたクローンの最初のスクリーニングをＰＣＲにより実施した。最終体積５０μＬ中に重合緩衝液５μＬ，各ＯＮＦＡ１及びＡ２ ４０pmｏL，２ｍＭのｄＮＴＰ ５μＬ及びＴaqＤＮＡポリメラーゼ５Ｕを含むＰＣＲ混合物の中で、各連結物ＬｐＡＲ１，ＬｐＡＲ２及びＬｐＡＲ３から１４ずつの計４２のコロニーを個別に再懸濁させた。１つのコロニーの代わりにプラスミドｐＢＲ３２２ ５０ｎｇをＰＣＲ混合物に添加することにより、負の対照を構成した。これら４３本の試験管を、（９４℃ ５分）−（９４℃ ３０秒−４６℃ ３０秒−７２℃ １分）×２９サイクル−（７２℃ ２分）というプログラムに従ってPerkin-Elmer９６００サーモサイクラの中でインキュベートさせた。これらのＰＣＲ反応各々５μＬずつを次に、最終体積２０μＬ中制限緩衝液２μＬ，ＢＳＡ２μＬ（１mg/mL)及び制限酵素ＰvuII ５Ｕを含む混合物の中で３７℃で一時間インキュベートした。
【００８３】
これらの消化物各々１０μＬずつを、消化されていない各ＰＣＲ ５μＬと並行して、ＴＢＥ１％アガロースゲル上に被着させた（かくして、制限消化により得られたフラグメントを、ＰＣＲの場合によって非特異的なバンドと混合しないようにすることができる）。このゲルを移動させ臭化エチジウムで染色した後、酵素ＰvuIIによる消化に由来するバンドを分析し、初期突然変異体のどのフラグメントがその他のフラグメントと会合して全遺伝子を再構成したかを見極めた。このスクリーニングは、１つの突然変異を支持する２７の遺伝子、２つの突然変異を支持する７つの遺伝子そしてもはや突然変異を支持しない８個の遺伝子を明らかにする。
【００８４】
３）プラスミドＤＮＡのミニ調製によるスクリーニング
第２のスクリーニングは、ベクターｐＥＴ２６ｂ＋での連結物形質転換に由来する２１のクローン（各連結物から７つずつのクローン）のプラスミドＤＮＡ（５）の抽出を実施することにより、行なわれた。各クローンについてかくして得られた５μＬのプラスミドＤＮＡを、最終体積１０μＬ中制限緩衝液Ｃ１μＬ，酵素ＰstＩ ６Ｕ，酵素ＮcoＩ ３Ｕ，酵素ＥcoＲＩ ６Ｕを含む混合物の存在下で３７℃で１時間インキュベートさせた。これらの消化物の各々５μＬをＴＢＥ１％アガロースゲル上に被着させた。このゲルを移動させ臭化エチジウムで染色した後、酵素ＰstＩによる消化に由来するバンドを分析し、初期突然変異体のどのフラグメントがその他のフラグメントと会合して全遺伝子の両構成したかを見極めた。このスクリーニングは、１つの突然変異を支持する１３の遺伝子、２つの突然変異を支持する５つの遺伝子そして突然変異をもはや支持しない３つの遺伝子を明らかにする。
【００８５】
４）組換えの統計学的分析
図６に表わされているように、酵素HinfＩ及びＢsaＩの切断部位との関係における各突然変異の位置に応じて、初期遺伝子の突然変異を０，１，２，３又は４個支持する遺伝子の作製をＲＬＲ反応中に得る確率を計算することが可能である。
【００８６】
かくして、ＲＬＲ反応が完全にランダムであることを考慮すると、確率Ｐは以下の通りである：
【００８７】
【数１】
0004448619.tif 000007
【００８８】
実施された２回のスクリーニングは、下表VIの中に報告されているように、これらの統計学的予想に近い結果を示し、かくしてＲＬＲ反応が偽似ランダムであることを表わしている。突然変異を全く支持しない遺伝子を犠牲にして１つの突然変異を支持する遺伝子のわずかに高くなった割合が観察される。この現象は、すでに観察されたｐｏｎＢ遺伝子の弱い毒性及び、不活性化突然変異を支持する遺伝子の選択に有利に作用することになる発現ベクターｐＡＲＡＰＯＮＢ及びｐＥＴ２６ｂ＋のわずかな漏洩に起因する可能性がある。
【００８９】
【表６】
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【００９０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  ＤＮＡシャフリングに対応する先行技術の方法の概略的表示である。
【図１Ｂ】  ＳｔＥＰに対応する先行技術の方法の概略的表示である。
【図２】  本発明の方法及びそのいくつかの変形形態及び応用の実施例の概略的表示である。
【図３】  本発明の実施例のために利用されたｐｏｎＢ遺伝子の各突然変異体により支持された１０個の突然変異ゾーン（ＰvuII及びＰstＩ）の位置を表わす。
【図４】   ponＢ遺伝子の配列との関係における利用されるプライマの位置を表わす。
【図５】  ＲＬＲ反応産物及びこれらのＲＬＲ反応の産物のＰＣＲ産物のアガロースゲル上での移動を表わしている。
【図６】  制限フラグメントとの関係における突然変異の位置を表わす。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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