(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の細胞膜に存在する酸化還元酵素の作用に対応してメディエーターを反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的に検出することによることを特徴とする細菌の検出方法において、前記細菌が海洋性脱窒細菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）であり、前記メディエーターがデュロヒドロキノンである、細菌の検出方法。
【請求項２】
細菌の細胞膜に存在する酸化還元酵素の作用に対応してメディエーターを反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的に検出することによることを特徴とする細菌の検出方法において、前記細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であり、前記メディエーターがベンゾキノンである、細菌の検出方法。
【請求項３】
細菌の細胞膜に存在する酸化還元酵素の作用に対応してメディエーターを反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的に検出することによることを特徴とする細菌の検出方法において、前記細菌が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）であり、前記メディエーターがメナンジオンである、細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌を検出する方法及びその検出に用いる装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌等の微生物はあらゆる環境に生存し、人間の生活と密接な関係を有する。微生物の中には病原性微生物として人間あるいは家畜に疾病をもたらすものがある。病原性微生物の中でも特に細菌は、増殖が速く、低温、高温、乾燥などの環境条件に影響を受けにくく、そのため人間の周りに持続的に存在し、一度好条件を得れば爆発的に数を増やして感染症の原因となる。食品や飲料水（水道水を含む）のように、人間の体内に直接摂取されるものについてはもちろんのこと、食品の製造工程で利用される水、食器等の洗浄に利用される水、河川、湖沼、海、プール、浴場等、人が身体を接触させる水、下水放流水など人と接触する機会がある水については、細菌に対する適正な管理が実施されることが望まれる。
【０００３】
ところで、このような食品、飲料水（水道水）、プール水、浴場等についての細菌の検出は、一般的には培養法により従来実施されている。このような従来行われている培養法では、例えば大腸菌や大腸菌群ではこれを他の一般細菌から区別するための工夫が必要であり、したがって、試験に際して用いる検出方法としては、大腸菌や大腸菌群が選択的に増殖する培地、あるいは増殖すると色調が変化したりコロニーの色に特殊な色が生じる工夫がされた培地を用いる場合が多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述した培養法では、培養によって菌が増殖するまでの時間に加えて、増殖した細菌が大腸菌あるいは大腸菌群であるかどうかの判定法が煩雑である。すなわち培養法は、大腸菌や大腸菌群による汚染の有無を推定するだけでも１日を要し、混入しているのが大腸菌、大腸菌群であるのか否かを確定するのに２日を要し、更に完全な試験をしようとすれば菌体の特殊染色などの試験を重ねる必要があって判定までに時間がかかる。
【０００５】
このように、培養法による細菌検出は時間を要し、結果が得られるより以前に被害が生じてこれが拡大してしまうケースが懸念される。以上のこととは別に、培養法は寒天培地上あるいはメンブレンフィルター上に形成した特殊な性状を示すコロニーを目で見て数えて定量するか、陽性を示す試料の最大希釈倍率から元の試料に含まれていた菌数を算定する方法が普通であるため、特殊な形状を示すコロニーの判定はあいまいな部分も多く、また最大希釈倍率から求める方法ではおおよその推定値が求められるにすぎず、定量性に乏しいという問題もある。
【０００６】
本発明者は、以上のような問題点を解消すべく鋭意研究し、細菌の細胞膜に存在する酵素の作用に対応してメディエーターを反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的に検出することにより、細菌を全体として、又は特定の細菌のみを検出し、また定量することが可能となり、簡易な操作、測定時間の短縮、効率の向上、検出精度の向上を飛躍的に高めることができることを見いだし本発明をなすに至ったものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
Ａ．本発明にかかる細菌の検出方法は、試料中に存在する検出されるべき細菌（生菌を含む）の細胞膜に存在する酵素の作用に対応して反応するメディエーターと反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的手法により検出若しくは定量することにより、該細菌を検出若しくは定量することを特徴とする。図１にはかかる本発明の方法を模式的に示す。すなわち、細胞膜に存在する酵素の基質との反応に対し、直接又はリンクして外部に存在するメディエーター（Ｍox）が反応してＭredを生成し、かかるＭredが、電極表面に移動し、電気化学反応により再びＭoxへと変化する。この電気化学反応を高感度な電流測定により検出する。
【０００８】
さらに、本発明にかかる細菌の検出方法は、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素であることを特徴とする。かかる場合、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することができる。
【０００９】
Ｂ．本発明にかかる細菌の検出装置は、前記Ａ．の本発明にかかる細菌の検出方法を用いるものであり、試料液に前記酵素に対する基質を添加する手段と、前記試料液に前記メディエーターを添加する手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とする。なお、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素である場合、本発明にかかる装置は、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することができるものである。
【００１０】
さらに、本発明にかかる細菌の検出装置は、試料として空気又は液に含まれる細菌を膜上に捕捉する捕捉手段と、前記基質と前記メディエーターを該捕捉した細菌に接触させ反応させる手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えることを特徴とするものである。かかる捕捉された菌はそのまま、若しくは適当な処理をおこなった後検出することを可能とし、検出の感度、取り扱い易さに優れたものとなる。
【００１１】
さらに、本発明にかかる細菌の検出装置は、試料液中の細菌を濃縮する手段と、前記酵素に対する基質と前記メディエーターを該濃縮した細菌に接触させる手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とするものである。かかる濃縮手段により試料中の菌の濃度が低く、そのままでは本発明にかかる電気化学的手段による検出方法が難しい場合に有効となる。
【００１２】
また、本発明にかかる細菌の検出装置は、前記濃縮手段が、膜分離装置又は遠心分離装置であることを特徴とするものである。
【００１３】
また、本発明にかかる細菌の検出装置は前記濃縮手段が、試料液中の限定された狭い領域内に細菌誘因物質を供給する手段であることを特徴とするものである。かかる誘因物質により試料中の低い濃度の細菌の濃度を高くすることが可能となりそのままでは本発明にかかる電気化学的手段による検出方法が難しい場合に有効となる。
【００１４】
また、本発明にかかる細菌の検出装置は、細菌を濃厚に含む試料液を希釈する手段と、前記酵素に対する基質と前記メディエーターを該希釈した細菌に接触させる手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とするものである。細菌の濃度が高すぎる場合に、前処理として希釈手段により、本発明にかかる電気化学的手法に最適な細菌の濃度にするこが可能となる。
【００１５】
さらに、本発明にかかる細菌の検出装置は、試料液をフローセル中に連続的に通過させる通液手段と、細菌の細胞膜に存在する酵素の基質と、該酵素の作用に対応して反応するメディエーターとを、前記フローセルの前段において試料液に添加する手段と、反応した前記メディエーターをフローセルで検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とするものである。細菌の含まれる試料を連続的に、または任意の時間に選択して細菌を検出若しくは定量することが可能である。
【００１６】
さらに、本発明にかかる細菌測定の方法、および細菌測定装置で使用する電気化学的検出手段が、メディエーターの酸化還元反応に基づく定電位測定に基づいたものであることを特徴とするものである。従って、細菌の個数（濃度）に比例した電流値が得られ、その電流値を測定することで試料中の細菌の個数（濃度）が測定可能となる。
【００１７】
以下、本発明を実施の形態に即して詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
Ａ．細菌
本発明にかかる方法または装置により検出、定量可能な菌の種類については特に制限はない。検出されるべき菌がその細胞膜内に酵素を有し、該酵素が該酵素反応条件下で酵素反応を行い、該酵素反応により、さらに本発明にかかるメディエーターと反応するものであればよい。かかる菌は試料中で生きているものも含む。具体的には、本発明により検出可能な菌としては、Escherichia coli、 Pseudomonas denitrificans、 Gluconobacter industrius、 Serratia marcesens、 Lactobacillus casei、 Saccharomyces cerevisiae、Staphylococcus  aureus、  Lactobacillus  rhamnosusが挙げられる。
【００１９】
さらに、試料中に菌がどのような態様で存在するのかについても特に制限はない。空気中に浮遊して存在する場合、水溶液中に均一に存在する場合、半固形若しくは固形の状態で存在する場合、膜等の固体上に付着して存在する場合等が挙げられる。また、該菌が単独で存在していても、他の菌と混合共存して存在していてもよい。さらに、試料中に存在する濃度についても特に制限はなく、適当な前処理を行うことにより好ましく検出可能となる。
【００２０】
Ｂ．細胞膜、酵素反応、酵素、基質
本発明にかかる検出方法の特徴は、検出されるべき菌の有する細胞膜内に存在する酵素反応を利用するものである。すなわち、検出されるべき菌に対し適当な基質を加えることにより、該酵素反応が進行し、該酵素反応の反応生成物がさらに、存在するメディエーターと反応するものである。この場合、細胞膜内での酵素反応を利用することから、細胞質内での種々の代謝反応を利用する場合に比較して、極めて迅速に応答を測定できるということとなる。かかる細胞膜内に存在する酵素は、検出されるべき菌に特異的に存在する酵素でもよいし、他の複数の菌に共通する酵素であってもよい。特定の菌のみを検出することを目的とする場合には、検出されるべき菌に特異的に存在する酵素を選択することができる。また、試料中に存在する複数の菌の総数を検出する目的においては、該菌に共通する酵素を選択することができる。かかる膜性の酵素の選択は、公知の菌の膜性酵素の知見に基づき当業者により容易に行うことが可能である。具体的には、「高分子錯体−機能と応用８，高分子機能電極、高分子錯体研究会編、学会出版センター、第７章生体分子と電極過程」、「高分子錯体  動的相互作用と電子過程、土田英俊偏  第４編  多電子移動過程の解析」等の記載を参考にすることができ、より具体的には、酵素としては膜結合性の酸化還元酵素の使用が好ましく、特にグルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００２１】
また、該酵素に対する基質についても特に制限はなく、前記選択した酵素の基質であればよい。該基質による該酵素反応と直接、またはそれとリンクしている反応系と、メディエーターと選択的にかつ効率よく反応するものであればよい。
【００２２】
具体的には、前記酵素が酸化還元酵素である場合、該基質による酸化還元反応によりメディエーターが該反応と直接あるいはリンクしている呼吸系と酸化還元反応を起こすものである。
【００２３】
従って、酵素、メディエーターとの組み合わせにより好ましい基質を選択することは当業者にとり容易である。具体的には、「高分子錯体−機能と応用８，高分子機能電極、高分子錯体研究会編、学会出版センター、第７章生体分子と電極過程」、「高分子錯体  動的相互作用と電子過程、土田英俊偏  第４編  多電子移動過程の解析」等を参考にすることができ、より具体的にはグルコース、フルクトース、グリセロール、エタノール等の使用が好ましい。
【００２４】
Ｃ．メディエーター
本発明において使用可能なメディエーターとしては、特に制限はなく、前記酵素反応と直接もしくはリンクして効率よく反応し、安定な反応生成物を与え、かつ該生成物が本発明にかかる電気化学的手法により検出可能であればよい。さらに、本発明においては、メディエーターの反応生成物が低電位で酸化還元反応をし、初めのメディエーターに戻るものであることから、かかる酸化還元電位があまり高くないものが好ましい。この場合、試料中に存在する他の電気化学的活性種によるバックグラウンドを抑制することとなる。さらに、メディエーターは酵素反応に基づく反応と、電気化学的手法による電気化学反応とにより繰り返し用いられるものであり、化学的に安定であるものが好ましい。従って、本発明において好ましく使用可能なメディエ−ターは上の特性を兼ね備えたものであり、具体的には、ベンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン、メトキシベンゾキノン、ビタミンＫ3（メナジオン）等が挙げられ、ベンゾキノン、ビタミンＫ3（メナジオン）がより好ましく使用可能である。
【００２５】
Ｄ．電気化学的検出装置
本発明においては、前記説明したメディエ−ターの酵素反応生成物との反応による生成物（以下メディエーター生成物）を電気化学的手法により、もとのメディエーターへ変換する際に生じる応答（例えば還元電流）を検出定量するものである。従って、かかる電気化学的反応を可能とする装置であれば特に制限はなく、通常公知の電気化学的検出装置が使用可能である。具体的には、「電気化学測定法（上）藤嶋昭、相澤益男、井上徹」に記載されている種々の電極、および反応装置、または測定系を使用することが可能である。特に好ましい電極の材料としてはグラッシーカーボン、金、銀、白金等が挙げられる。また、反応装置としてはポテンショスタット（高感度測定用）が挙げられる。また測定系としては、一定電圧を与え、当該電気化学的反応により応答する電流値を測定する定電位測定方法が好ましく使用可能である。
【００２６】
Ｅ．また、試料液に基質を添加する手段、メディエーターを添加する手段についても特に制限はなく、通常公知の溶液の定量的添加装置を用いることができる。具体的には、市販の低流量ポンプが挙げられる。
【００２７】
Ｆ．膜上に捕捉する捕捉手段
本発明においては、菌を捕捉する捕捉手段としては、特に制限はないが、活性炭や、中空糸膜，マイクロフィルター，ウルトラフィルター，逆浸透膜等の濾過膜が例示され、吸着手段としては、不織布，繊維状ろ過材，イオン交換樹脂，砂ろ過材など細菌を吸着できるものを用いることができる。これにより、例えば水処理装置中に設置したろ過用のフィルターに被処理水を通水させて細菌をフィルター上に捕捉することが可能となる。高精度で簡易な検出が求められる場合に好適に適用できる。さらに、上記のように試料液（被検水）中の細菌の検出に利用される他、空気中の浮遊細菌の検出にも利用することもできる。例えば細菌が浮遊している気体（空気）を、水中で散気（バブリング）して水中に細菌をトラップしてサンプル液としてもよいし、吸引空気をフィルターでろ過して上記と同様にフィルター上に捕捉し、フィルターに直接ファージ溶液を接触させるか、あるいはフィルターを生理食塩水等に浸漬して細菌を剥離することが可能となる。この方法によれば、例えばエアコンディショナーやその他の空気清浄設備内に設置したフィルターを検査することで、病院，食品工場等の細菌汚染が問題となる環境空間の状態を調べることに好適に適用することができる。
【００２８】
Ｇ．試料液中の細菌を濃縮、希釈等の前処理手段
また、本発明による検出方法において、検出しようとする細菌を希薄に含む試料液中で該細菌を濃縮し、基質、メディエーターと反応させ、電気化学的手段を用いて検出することを特徴とするものである。この濃縮には例えば膜を用いて行うことができ、被検体である細菌の通過を阻止する膜であれば、膜の種類，材質は特に限定されることなく使用できる。このような細菌の濃縮法を用いた装置の具体例としては、例えば、流れるサンプル水を一定時間毎に一定量づつ自動的に採水して膜のある槽に入れて自動的に濃縮し、濃縮したサンプル水を自動的に取出して自動計測するようにする場合を例示できる。試料液中に希薄に存在する細菌を濃縮して検出を有効に行うことができる。
【００２９】
また、細菌の濃縮は、液全体について細菌を濃縮する場合、あるいは液中で細菌を一部に偏在させて部分的に濃縮させる場合のいずれであってもよく、例えば膜分離又は遠心分離により細菌を濃縮することが可能である。
【００３０】
細菌を濃縮する他の方法としては、また、試料液中の狭い領域内に検出しようとする特定細菌の誘因物質を供給することができるし、細菌誘因物質をキャピラリ（毛細管）を用いて供給することもできる。前記誘因物質としては、例えばアミノ酸であればセリン，アスパラギン酸等、糖であればグルコース，ガラクトース，マルトース，リボース等、有機酸であればクエン酸，リンゴ酸等を挙げることができる。また上記有機物質以外にも呼吸鎖の電子受容体となる酸素，フマル酸，硝酸などを挙げることができる。
【００３１】
また、本発明にかかる方法は、検出しようとする細菌を濃厚に含む試料液を希釈し、基質、メディエーターと反応させ、電気化学的手段を用いて検出することを特徴とするものである。試料液の稀釈には、適宜の稀釈液注入装置を用いることができる。すなわち、細菌を濃厚に含む溶液中の活性のある細菌数を検出，測定することができるので、例えば有用細菌を用いた食品製造工程等において、細菌の活性管理などに利用できる。
【００３２】
以下、本発明を実施例に即して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。。
【００３３】
【実施例】
（実施例１）海洋性脱窒細菌の電気化学的計数
菌体はParacoccus denitrificans菌体を選定した。
【００３４】
グラッシーカーボン電極の表面を透析膜で被覆し、リン酸緩衝液（pH7.3、1mM KNO3含む）に浸してから、窒素ガスにより除酸素した。電極電位を-0.4V(Ag/AgCl)に設定した後、メディエーターとして0.5mMになるようにデュロヒドロキノン(DQH2)を添加した後、任意の濃度になるよう菌体懸濁液を添加して電流値を測定した。
【００３５】
脱窒細菌を溶液中に分散させて測定した場合（懸濁法）の菌体濃度と電極応答の関係を図２に示す。この方法では、1ml中106個が検出限界であることがわかった。
【００３６】
（実施例２）Saccharomyces cerevisiaeの電気化学的計数
菌体はSaccharomyces cerevisiae菌体を選定した。
溶液は0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0)を用いた。この酵母菌をニトロセルロース膜（1.0μmポアーサイズ、150μm厚さ）にトラップし、5mm直径のグラファイトカーボン電極（図３（ｂ）参照）上にのせて電極を構築した（図３（ａ）参照）。電極電位をポテンショスタットにより0.2V(Ag/AgCl)に設定した。電極電流が安定になるまでまち、後0.25mMになるようにメディエーター水溶液を添加し、つづいて0.4mMになるようにグルコース水溶液を添加する。ここでメディエーターはベンゾキノンを使用した。図４に示した応答カーブが得られ、電流応答は菌体の固定量に比例することがわかった。
【００３７】
（実施例３）E.coliの電気化学的計数
菌体はE.coli菌体を選定した。溶液は0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0)を用いた。
3mm直径のグラファイトカーボン電極を用いて、電極電位をポテンショスタットにより0.5V(Ag/AgCl)に設定した。電極電流が安定になるまでまち、後1mMになるように各種メディエーター水溶液を添加した。つづいて大腸菌を含んだ溶液を添加した。
【００３８】
その結果、図５に示すレスポンスカーブが得られた。また、図５に示すように電流応答は106〜107の菌体数範囲で比例する（この場合、メディエーターをベンゾキノンとし、10mM濃度に設定した）。
【００３９】
（実施例４）Escherichia  coli、  Staphylococcus  aureus、  Lactobacillus  rhamnosus、  Saccharomyces  cerevisiaeの電気化学的計数
菌体としてEscherichia  coli（IAM1264）、Staphylococcus  aureus（IAM1011）、Lactobacillus  rhamnosus（ATCC7469）の細菌3株と、酵母菌Saccharomyces  cerevisiae(IFO0203)を選定した。
（実施例４−１）細菌を電気化学的に検出する方法
電気化学測定には、３電極方式ボルタンメトリーシステム（ＢＡＳ社製：１００ＢＷ）を用いた。参照電極にはAg／AgCl（飽和KCl溶液）を用いた。測定セルには自作のアクリル製容器（1cm3容積）に円盤状の白金対極（直径５mm）を底部に埋め込んだもの用いた。作用電極には金電極（ＢＡＳ社製：直径２mm）にポリカーボネート膜（ミリポア社製：ポアーサイズ0.45μｍ）で被覆したものを用いた。溶液は、全て1／15Mりん酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
【００４０】
細菌数の計測は、以下の方法で行った。
すなわち、測定セルに5mMベンゾキノンあるいはメナジオンりん酸緩衝液1cm3を注入し、電極電位を0.5Vに設定した。電極応答が安定するのを待った後、菌体数既知の各種微生物を含んだ懸濁液0.05cm3を添加した。測定中は常時窒素ガス通気により除酸素を行い、溶液はスターラーにより攪拌した。
また、計数盤による直接計数法として、酵母菌についてはThomaの血球計算盤を、細菌についてはPetroff‐Hauser計数盤を用いた。均一な菌体懸濁液を適当に希釈し、これを計数盤上に滴下しカバーグラスをかけ、４００倍にて４区画中の細菌数を数えた。４区画の容積はそれぞれ2.5×10-7cm3、5×10-8cm3である。
さらに、平板培養法による計数法として、各菌体に対する平板寒天選択培地を用いて、３５℃、一昼夜培養後、生じたコロニー数から生菌数を見積もった。
【００４１】
（実施例４−２）電気化学的検出におけるメディエーターの選択とその特性
菌体数を顕微鏡による直接計数法と平板培養法により測定した。その結果、Escherichia  coli（IAM1264）菌体懸濁液（OD660＝1）は直接計数法により1cm3あたり1010個、平板培養法では109個であることが分かった。以後、菌体培養液の濁度から各手法により測定された菌体数とを対応させることができることとなった。Staphylococcus  aureus（IAM1011）、Lactobacillus  rhamnosus（ATCC7469）菌体についてもEscherichia  coli（IAM1264）菌体とほぼ同様の対応関係が得られた。Saccharomyces  cerevisiae(IFO0203)については、菌体懸濁液（OD660＝1）に対して、直接計数法、平板培養法共に1cm3あたり108個であることが分かった。
【００４２】
メディエーターとしてベンゾキノンを用いて、セルに菌体数既知のEscherichia  coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus  aureus（IAM1011）菌体懸濁液を添加したときの電流―時間応答曲線を図６に示す。
一方、メナジオンを用いた場合の、Escherichia  coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus  aureus（IAM1011）菌体懸濁液に対する電流―時間応答曲線を図７に示す。ベンゾキノンを用いた場合に比較して、Escherichia  coli（IAM1264）菌体よりStaphylococcus  aureus（IAM1011）に対する応答が高くなった。Escherichia  coliのメディエーターとしてベンゾキノンが、Staphylococcus  aureusのメディエーターとしてメナジオンが有効であることが示された。
【００４３】
各細菌を懸濁状態（pH7.0りん酸緩衝液中）で室温下に放置したときの６日間にわたる電極応答の変化を測定した。各測定値は試料添加５００秒後に得られた電流値である。ベンゾキノンを用いた場合（図８（ａ））、Escherichia  coli（IAM1264）、Saccharomyces  cerevisiae(IFO0203)については、４日目以降から応答が減少を示し、Lactobacillus  rhamnosus（ATCC7469）、Staphylococcus  aureus（IAM1011）については、６日間にわたりほぼ一定の応答を示した。一方、メナジオンを用いた場合（図８（ｂ））、各菌体とも電極応答は経時的に減少の傾向を示した。
【００４４】
（実施例４−３）電気化学的検出方法による細菌の計数
Escherichia  coli（IAM1264）について、ベンゾキノンを用いて菌体数―電流曲線を測定した（図９）。各測定値は試料添加５００秒後に得られる電流値であり、109から5×1010個／cm3の範囲で直線性が得られた。これにより該電気化学的検出方法の有用性が示された。また、Escherichia  coliに対するメディエーターとしてベンゾキノンが有効であることが示された。
【発明の効果】
本発明にかかる細菌の検出方法は、試料中に存在する検出されるべき細菌（生菌を含む）の細胞膜に存在する酵素の作用に対応して反応するメディエーターと反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的手法により検出若しくは定量することに基づき、該細菌を検出若しくは定量することが可能とするものであることを特徴とする。また、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素であることを特徴とする。かかる場合、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することを可能とするものである。
【００４５】
本発明にかかる細菌の検出装置は、前記本発明にかかる細菌の検出方法を用いるものであり、試料液に前記酵素に対する基質を添加する手段と、前記試料液に前記メディエーターを添加する手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とする。なお、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素である場合、本発明にかかる装置は、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することができるものである。
【００４６】
以上の構成による本発明の方法によれば、上下水、環境水、食品の細菌検査を迅速にかつ効率的におこなうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を模式的に示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。Paracoccus denitrificans菌体懸濁液を電気化学法により計測した、菌体数―電流曲線を示すグラフである。
【図３】実施例２で用いた電気化学的検出系を示す図である。
【図４】実施例２の結果を示す図である。Saccharomyces  cerevisiae菌体懸濁液を電気化学法により計測した、電流―時間応答曲線を示すグラフである。
【図５】実施例３の結果を示す図である。ここで、ＢＱはベンゾキノンの略である。
【図６】実施例４の結果を示す図である。ベンゾキノンを用いてEscherichia  coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus  aureus（IAM1011）菌体懸濁液を電気化学法により計測した、電流―時間応答曲線を示すグラフである。
【図７】実施例４の結果を示す図である。メナジオンを用いてEscherichia  coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus  aureus（IAM1011）菌体懸濁液を電気化学法により計測した、電流―時間応答曲線を示すグラフである。
【図８】実施例４の結果を示す図である。各細菌を懸濁状態で室温に放置した際の6日間にわたる電極応答の変化をプロットしたものである。（ａ）はメディエーターにベンゾキノンを、（ｂ）はメナジオンを用いたグラフである。
【図９】実施例４の結果を示す図である。ベンゾキノンを用いて電気化学法により計測した、菌体数―電流曲線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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