(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーションプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドであって、位置３０〜３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）、または位置３０で開始する３８塩基対の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）の突然変異を検出するために使用する、以下の配列：
5'-AGACGATCCTGGGGGTGTGAACAAA（配列番号：５）-3'、及び
5'-ATCCTGGGGGTGTGA（配列番号：６）-3'
から成る群から選択される配列からなる、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
DNA を含有する生物試料におけるコネキシン26の同型接合および異型接合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出のための方法であって、
ａ）生物試料を
5'-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC（配列番号：１）-3'及び5'-TGAGCACGGGTTGCCTCATC （配列番号：２）-3'；
5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：９）-3'及び5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3'；並びに
5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：１４）-3'及び5'- ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA（配列番号：１０）-3'
からなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させて、試料中に含入されるDNA が、ハイブリダイゼーションのために、そして生物試料中に含有されるDNA とのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、利用可能にされ；
ｂ）DNA を増幅し；
ｃ）増幅生成物を明示し；そして
ｄ）適切な方法により、位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）、または位置３０で開始する３８塩基対の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を検出する；
工程を含んで成る方法。
【請求項３】
工程ｄ）において、以下の技法：
−一本鎖高次構造多型（SSCP）、または
−変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）、または
−シーケンシング、または
−温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）
のうちの１つにより、位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）、または位置３０で開始する３８塩基対の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）が検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）が、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて増幅生成物を検出することを包含する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
工程ｄ）が：
ａ）正常コネキシン26配列、および位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含む突然変異体配列の両方とハイブリダイズする標識検出プローブ、および前記正常コネキシン26配列とハイブリダイズするが前記位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含む突然変異体配列とはハイブリダイズしない一次捕捉プローブとともに増幅生成物をインキュベートし；
ｂ）前記標識化検出プローブ、および前記位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含む突然変異体配列とハイブリダイズするが前記正常コネキシン２６配列とはハイブリダイズしない二次捕捉プローブとともに増幅生成物をインキュベートし；
ｃ）前記検出プローブと、ならびに前記一次または二次捕捉プローブと増幅生成物をハイブリダイズし；そして
ｄ）前記一次捕捉プローブから得られるハイブリダイゼーションシグナルを前記二次捕捉プローブから得られるハイブリダイゼーションシグナルと比較する；
工程をさらに含んで成る、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出プローブが 5'-CAGCATTGGAAAGATCTGGCTCA （配列番号：１３）-3' である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出プローブが非放射性標識される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出プローブがビオチンで標識される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一次および二次捕捉プローブがマイクロプレートに結合される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）と工程ｃ）の間に、
既知の正常同型接合コネキシン26試料由来のヌクレオチド配列｛当該ヌクレオチド配列が配列番号１５からなる｝、または既知の突然変異体コネキシン26試料由来のヌクレオチド配列｛当該既知の突然変異体コネキシン２６試料由来の当該ヌクレオチド配列は、配列番号１５からなるコネキシン２６遺伝子の３０〜３５位に伸張する６のＧの配列における１のグアノシン（Ｇ）欠如を含む（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）か、または配列番号１５からなるコネキシン２６遺伝子の位置３０で開始する３８塩基対の欠失を含む｝とともに増幅ＤＮＡをインキュベートし；そして
増幅DNA を前記一次ヌクレオチド配列または前記二次ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる工程をさらに含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）が、前記既知の正常同型接合コネキシン26試料由来のヌクレオチド配列に、又は前記既知の突然変異コネキシン２６試料由来のヌクレオチド配列にハイブリダイズするものとして増幅されたＤＮＡを同定するためにハイブリダイズしたDNA を分析することを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項５に記載に方法において用いられる、以下の配列：
5'-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC（配列番号：１）-3'
5'-TGAGCACGGGTTGCCTCATC （配列番号：２）-3'
からなる一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項５に記載に方法において用いられる、以下の配列：
5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：９）-3'
5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3'
からなる一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項５に記載に方法において用いられる、以下の配列：
5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：１４）-3'
5'- ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA（配列番号：１０）-3'
からなる一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
コネキシン２６の同型接合および異型接合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出のためのキットであって、
ａ）請求項１、１２、１３、及び１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド；
ｂ）ＤＮＡ増幅の実行に必要な試薬；および
ｃ）以下の技術：一本鎖高次構造多型（SSCP）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）、シーケンシング、または温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）のうちの１つを行うことにより、増幅断片の長さの確定を可能にし、または位置３０〜３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）、または位置３０で開始する３８塩基対の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）の検出を可能にする構成成分；
を含んで成るキット。
【請求項１６】
配列番号１５からなる野生型コネキシン２６遺伝子の変異を含むヌクレオチド配列を含む、精製ポリヌクレオチドであって、前記変異がヌクレオチド位置３９でのＧからＴへのトランスバージョン（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初のヌクレオチドである）である、上記精製ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ＤＮＡを含有する生物試料において、配列番号１５からなるコネキシン２６遺伝子の位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）である突然変異を検出する方法であって、
ａ）前記生物試料に含有されるＤＮＡと、コネキシン２６遺伝子における位置３０〜３５を含むＤＮＡの領域を増幅できる前記１対のオリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、当該生物試料を当該一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ；
ｂ）前記ＤＮＡ領域を増幅し、それによりコネキシン２６遺伝子における位置３０〜３５を含む増幅されたＤＮＡを産生させ；
ｃ）前記欠失を検出する
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記ステップｃ）が以下のステップ：
ｄ）（ｉ）配列番号１５を含む野生型コネキシン２６遺伝子、及び位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含むコネキシン２６遺伝子とハイブリダイズする標識された検出プローブ、並びに（ｉｉ）野生型コネキシン２６遺伝子とハイブリダイズするが上記位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含むコネキシン２６遺伝子とハイブリダイズしない一次捕捉プローブと一緒に、前記増幅されたＤＮＡをインキュベートし；
ｅ）前記増幅されたＤＮＡを、上記標識された検出プローブ、及び上記位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含むコネキシン２６遺伝子とハイブリダイズするが野生型コネキシン２６遺伝子とハイブリダイズしない二次捕捉プローブと一緒にインキュベートし；そして
ｆ）ハイブリダイゼーションを検出する
を含む、ここで、ステップｄ）とｅ）は別々に実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出プローブが、
５’−ＣＡＧＣＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号１３）
である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出プローブが、非放射性標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出プローブが、ビオチンで標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記一次捕捉プローブ、及び二次捕捉プローブがマイクロプレートに結合される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップｃ）において、前記欠失が、一本鎖高次構造分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、シーケンシング、自動ＤＮＡ配列分析における蛍光検出、捕捉プローブに対するハイブリダイゼーション又は温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）により検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップｃ）が、以下の：
既知の野生型同型接合コネキシン２６試料由来のコネキシン２６遺伝子の位置３０を含む第１ヌクレオチド配列、又は位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含む既知の突然変異体同型接合コネキシン２６ＤＮＡ試料由来のコネキシン２６遺伝子の位置３０を含む第２ヌクレオチド配列のいずれかとハイブリダイゼーション可能な条件下、増幅されたＤＮＡをインキュベートし；
ハイブリダイゼーションを検出する、
を含み、ここで、前記増幅されたＤＮＡが野生型同型接合コネキシン２６遺伝子を含む試料由来であるならば、位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含む既知の突然変異体同型接合コネキシン２６ＤＮＡ試料と異型二重鎖を形成し、前記増幅されたＤＮＡが、位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含む突然変異体と同型接合するコネキシン２６遺伝子を含む試料由来であるならば、既知の野生型同型接合コネキシン２６ＤＮＡ試料と異型二重鎖を形成する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップｆ）が、以下の：
ｇ）前記検出プローブと第１捕捉プローブとのハイブリダイゼーションから第１シグナルを検出し、前記検出プローブと第２捕捉プローブとのハイブリダイゼーションから第２シグナルを検出する；
ｈ）前記第１シグナルと第２シグナルとの間の比を算出する、ここで、２以上の比は前記生物学的試料が野生型コネキシン２６遺伝子に関して同型接合するＤＮＡを含むことを示し、０．５以下の比は前記生物学的試料が、突然変異が位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）であるコネキシン２６遺伝子の突然変異体に関して同型接合するＤＮＡを含むことを示し、０．５より大きく２未満の比は前記生物学的試料が、突然変異が位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）であるコネキシン２６遺伝子の突然変異体に関して異型接合するＤＮＡを含むことを示す、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡを含有する生物試料において、配列番号１５からなる野生型コネキシン２６遺伝子の位置３０で始まる３８塩基対の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を検出する方法であって、
ａ）前記生物試料に含有されるＤＮＡと、コネキシン２６遺伝子における欠失領域に隣接するＤＮＡ領域を増幅できる１対のオリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、当該生物試料を当該一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ；
ｂ）前記ＤＮＡ領域を増幅し、それによりコネキシン２６遺伝子における前記欠失領域を含む増幅されたＤＮＡを産生させ；
ｃ）前記欠失を検出する、
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記ステップｃ）において、前記欠失が、一本鎖高次構造分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、シーケンシング、自動ＤＮＡ配列分析における蛍光検出、捕捉プローブに対するハイブリダイゼーション又は温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）の内の１つ技術により検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップｃ）が以下のステップ：
ｄ）（ｉ）配列番号１５を含む野生型コネキシン２６遺伝子、及び位置３０のヌクレオチドで始まる３８塩基対の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）を含むコネキシン２６遺伝子とハイブリダイズする標識された検出プローブ、並びに（ｉｉ）野生型コネキシン２６遺伝子とハイブリダイズするが上記欠失を含むコネキシン２６遺伝子とハイブリダイズしない一次捕捉プローブと一緒に、前記増幅されたＤＮＡをインキュベートし；
ｅ）前記増幅されたＤＮＡを、上記標識された検出プローブ、及び上記欠失を含むコネキシン２６遺伝子とハイブリダイズするが野生型コネキシン２６遺伝子とハイブリダイズしない二次捕捉プローブと一緒にインキュベートし；そして
ｆ）ハイブリダイゼーションを検出する
を含み、ここで、ステップｄ）とｅ）は別々に実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出プローブが、非放射性標識される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出プローブが、ビオチンで標識される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記一次捕捉プローブ、及び二次捕捉プローブがマイクロプレートに結合される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１５からなる野生型コネキシン２６遺伝子の変異を含むヌクレオチド配列を含む、精製ポリヌクレオチドであって、前記変異が位置３０〜３５のいずれかのグアノシン欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）である、上記精製ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号１５からなる野生型コネキシン２６遺伝子の変異を含むヌクレオチド配列を含む、精製ポリヌクレオチドであって、前記変異が位置３０で開始する３８塩基対の欠失（位置１は配列番号１５のイニシエーターコドンの最初の塩基である）である、上記精製ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、常染色体言語習得前非症候性難聴に関与する突然変異、ならびに同型接合および異型接合個体に関するこの遺伝性感覚障害の検出方法に関する。本発明は特に、コネキシン26(Cx26)遺伝子における、特にヌクレオチド２７および３２間の特に冨グアノシン領域における少なくとも１つのヌクレオチドの特異的欠失に関する。本発明は、例えば、Cx26遺伝子族に属する遺伝子の突然変異のin vitro検出に有用な道具としてのポリヌクレオチドまたはその断片の使用にも向けられる。
【０００２】
完全または重症言語習得前難聴は、開発途上国の千人に一人の小児が罹っている（Morton NE. Genetic epidemiology of hearing impaerment. In Genetics of hearing impairment. （The New York Acad Sci., New York 1991; 630:16-31））。それは、言語習得を妨げるので、大きなハンディキャップである。
【０００３】
米国の非症候性（隔離型）言語習得前難聴小児集団で実施され、明らかな環境的原因が排除された研究により、原因の３分の２までが遺伝的基礎を有すると見積もられている（Marazita ML, Ploughman LM, Rawlings B, Remington E, Arnos KS, Nance WE. Genetic epidemiological studies of early-onset deafness in the U.S. school-age population. Am J Med Genet 1993; 46:486-91 ）。これらの形態は主に、感覚神経性であり、ほとんど専ら、単一遺伝子性である。主な遺伝様式は常染色体劣性（DFNB）で、７２％〜８５％の症例を含み、完全難聴だけを考慮すると、この分数は９０％に増大する。
【０００４】
常染色体劣性言語習得前難聴は、遺伝的高異型接合性であることが知られている。DFNB遺伝子座の数の概算は、３０から１００まで変化する（In Genetics and Hearing Impairment, Martini A, Read AP, Stephens D, eds （Whurr, London ）1996; 197-212 ）。このうちの１４個がこれまでにヒト染色体にマッピングされている（Petit C. Genes responsible for human hereditary deafness:symphony of a thousand. Nature Genet 1996; 14:385-91 ）（Verhoeven K, Van Camp G, Govaerts PJ, et al., A gene for autosomal dominant non-syndromic hearin loss （DFNA12）maps to chromosome 11q22-24. Am J Hum Genet 1997; 60:1168-74およびCambell DA, McHale DP, Brown KA, et al. A new locus for non-syndromal autosomal recessive sensorineural hearing loss（DFNB16）maps to human chromosome 15q21-q22. J Med Genet 1997; 印刷中）。
【０００５】
遺伝カウンセリングクリニックに通っている家族の大多数は、傷害の再発の危険性を知りたい一人の難聴小児を有する正常聴覚両親で構成される。ほとんどの場合、言語習得前難聴の環境的原因の大きい役割が示されても、通常は聴覚損失が遺伝的原因を有するか否かを認識することさえできない。このような家族における遺伝カウンセリングは、ＤＦＮＢ突然変異を検出する能力により非常に改善され得る。この点で、症状の高遺伝子異質性は、大きな障害を示す。
【０００６】
大血縁チュニジア人家族における13q11 上のDFNB1 遺伝子座の最初の確認（Guilford P, Ben Arab S, Blanchard S, et al. A non-syndromic form of neurosensory, recessive deafness maps to the pericentormeric region of chromosome 13q. Nature Genet 1994; 6:24-8）後、ニュージーランド／オーストラリア人家族に関して（Maw MA, Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al. The contribution of the DFNB1 locus to neurosensory deafness in a Caucasian population. Am J Hum Genet 1995; 57:629-35 ）、そしてイタリア／スペイン人家族に関して（Gasparini P, Estivill X, Volpini V, et al. Linkage of DFNB1 to non-syndromic neurosensory autosomal-recessive deafness in Mediterranean families. Eur J Hum Genet 1997;5:83-8 ）実施された２つの試験は、この遺伝子座がこれらの集団における言語習得前難聴に多大に関与し得ることを示唆したが、しかしこれらの家族で得られた個々のロッド値は、これらの家族のサイズが小規模であるために有意でなかった。
【０００７】
近年、ギャップ結合タンパク質コネキシン２６をコードするCx26遺伝子は、DFNB1 難聴の基礎を成すことが示された。３つのＤＦＮＢ１連鎖血縁パキスタン人家族における早期終止コドンを生じる２つの異なるＧ−＞Ａ置換が報告された（Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature 1997;387:80-3 ）。これら２つの置換は、それぞれコドン７７およびコドン２４で同定された。この結果は、この仮説を直接査定する機会を提供した。
【０００８】
一人の難聴小児がいる家族における遺伝的難聴と非遺伝的難聴を区別することができないために言語習得前非症候性難聴に関する遺伝カウンセリングが遭遇する困難が、常染色体劣性言語習得前難聴を有する世界のいくつかの場所からの３５家族のCx26遺伝子に存在する突然変異の範囲および罹患率の特性化に本発明人等が着手した理由の１つであった。
【０００９】
発明の要約
Cx26遺伝子における突然変異の確定は、とりわけ、常染色体性言語習得前非症候性難聴の特異的形態の、特に、このような家族における新規に同定された30delG（位置３０でのＧ欠失；位置１はイニシエーターコドンの最初の塩基である）突然変異の有用な役割の同定のための道具として検出プローブの使用を可能にした。本発明は、DFNB1 遺伝子座の関与が主に、30delG突然変異に本質的に起因することを確定する。30delGは、すべての劣性DFNB1 突然変異の約４分の３を占める、と目下考えられる。
【００１０】
したがって、本発明は、野生形態で、遺伝的感覚障害に関連するポリペプチドをコードする突然変異化配列に対応するヌクレオチドの鎖を有する精製ポリヌクレオチドを提供するよう意図される。突然変異化精製ポリヌクレオチドは、言語習得前非症候性難聴に関与する突然変異を示す。
【００１１】
本発明は、プライマーとしてまたはプローブとして有用である突然変異化精製ポリヌクレオチドの１５〜５０連続ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドも提供する。
さらに、本発明は、同型接合および異型接合個体に関する遺伝性感覚障害の検出のための方法およびキットを供給するつもりである。
【００１２】
本発明によれば、野生形態で、遺伝的感覚障害に関連するポリペプチドをコードする突然変異化配列に対応するヌクレオチドの鎖を有する精製ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドの特異的欠失から成る群から選択される言語習得前非症候性難聴に関与する突然変異を示す。
突然変異とは、本発明によれば、少なくとも１つのヌクレオチドの特異的欠失を意味する。したがって、突然変異化配列は、少なくとも１つの突然変異を包含するポリヌクレオチド配列を意味する。
ヌクレオチドの鎖は、本発明によれば、ポリペプチドを必ずしもコードしないが、ともに連鎖した２７〜２３１１ヌクレオチドを示すポリヌクレオチドを意味する。
【００１３】
本発明は特に、特異的突然変異が染色体13q11 〜12のコネキシン２６をコードする領域に位置する、好ましくは、ヌクレオチド２７で、好ましくはヌクレオチド３０で開始し、ヌクレオチド３２またはヌクレオチド３５まで延びる冨グアノシン領域に位置する欠失である精製ポリヌクレオチドに関する（列挙したヌクレオチドはすべて含まれている）。特に本発明によれば、特異的欠失精製ポリヌクレオチドは切頭型ポリペプチドをコードする。
切頭型ポリペプチドとは、本発明によれば、長さ、アミノ酸組成または機能的特性において野生形態のポリペプチドの特性を示さないポリペプチドの断片を意味する。
【００１４】
特異的欠失の好ましい実施態様は、「30delG突然変異」とも呼ばれる、位置３０でのグアノシン欠失である。特異的欠失の別の好ましい実施態様は、位置３０で開始する38bp欠失である。
本発明は、以下の緊縮条件下で：23℃〜37℃の低温で、4xSSC 緩衝液、５ｘデンハート溶液、0.05%SDSおよび100 μg/mlのサケ精子ＤＮＡの存在下で(1xSSCは0.15M のNaClおよび0.05M のクエン酸ナトリウムに対応する；１ｘデンハート溶液は0.02% フィコール、0.02% ポリビニルピロリドンおよび0.02% ウシ血清アルブミンに対応する）、前記のポリヌクレオチドのいずれかと特異的にハイブリダイズする精製ポリヌクレオチドも含む。
【００１５】
本発明は、前記のポリヌクレオチドのいずれかによるポリヌクレオチドの１５〜５０連続ヌクレオチドを包含するプライマーとしてまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドにも関する。オリゴヌクレオチド配列は、以下の群から選択される：
−第一組：
5'-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC（配列番号：１）-3'
5'-TGAGCACGGGTTGCCTCATC （配列番号：２）-3'
PCR 生成物の長さは、285bp 長から得られた；
−読取り枠の他の部分の探査を可能にする第二組：
5'-GACACGAAGATCAGCTGCAG （配列番号：３）-3'
5'-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG （配列番号：４）-3'
【００１６】
−第三組：
5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：９）-3'
5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3'
−第四組
5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：１４）-3'
5'- ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA（配列番号：１０）-3'
【００１７】
プローブとして有用な別のオリゴヌクレオチドは、以下の群から選択される：
5'-AGACGATCCTGGGGGTGTGAACAAA（配列番号：５）-3'
5'-ATCCTGGGGGTGTGA（配列番号：６）-3'
5'-AGACGATCCTGGGGGCTCACCGTCCTC（配列番号：７）-3'
【００１８】
さらに、本発明は、DNA を含有する生物試料における同型接合および異型接合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出のための方法であって、
ａ）生物試料を前記のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、試料中に含入されるDNA が、ハイブリダイゼーションのために、そして生物試料中に含有されるDNA とのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、任意に利用可能にされ；
ｂ）DNA を増幅し；
ｃ）増幅生成物を明示し；そして
ｄ）突然変異を検出する；
工程を含んで成る方法に関する。
【００１９】
前記の方法の工程ｄ）は、一本鎖高次構造多型（SSCP）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）、シーケンシング（Smith, L.M., Sanders, J.Z., Kaiser, R.J., Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 1986; 321:674-9 ）；分子ハイブリダイゼーション捕捉プローブまたは温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）を包含し得る。前記の方法の工程ｃ）は、前記のようなオリゴヌクレオチドプローブを用いた増幅生成物の検出を包含し得る。
【００２０】
本発明によれば、生物試料は、以下のような任意の判定基準による任意の種類の難聴に罹患したヒトから抽出した血液試料であり得る：進行性のまたは非進行性の、任意の重症度の、家族性のまたは散発性の、神経感覚性または混合隔離型難聴、あるいは騒音に曝された個体、または低聴覚に罹患した個体、あるいは遺伝子の異常または出生前診断に関する胚からの異常を保有しやすい個体。
【００２１】
本発明の別の目的は、DNA を含有する生物試料における同型接合および異型接合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出のための方法であって、
ａ）生物試料を前記のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、試料中に含入されるＤＮＡが、ハイブリダイゼーションのために、そして生物試料中に含有されるＤＮＡとのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、任意に利用可能にされ；そして
ｂ）オリゴヌクレオチドプローブと生物試料中に含入されるＤＮＡとの間に形成されるハイブリッドを検出する；
工程を含んで成る方法を包含する。
【００２２】
前記の方法の工程ｂ）は、一本鎖高次構造多型（SSCP）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）または増幅およびシーケンシングにおいて存在し得る。
本発明は、同型接合および異型接合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出のためのキットであって、
ａ）本発明のオリゴヌクレオチド；
ｂ）DNA 増幅の実行に必要な試薬；および
ｃ）増幅断片の長さの確定を可能にし、または突然変異の検出を可能にする構成成分；
を含んで成るキットも含む。
【００２３】
発明の詳細な説明
言語習得前非症候性（隔離型）難聴は、小児における最も高頻度の遺伝性感覚障害である。遺伝は、ほとんどの場合、常染色体劣性である。数ダースの遺伝子が関与し得るが、そのうちの２つだけ、即ちDFNB1 とDFNB2 がこれまでに同定されている（Kelsell, D.F., et al., Caonnexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature 1997; 387:80-3; Liu, X-Z, et al., Mutations in the myosin VIIA gene cause non-syndromic recessive deafness, Nature Genet 1997; 16:188-90;およびWeil, D., et al., The autosomal recessive isolated deafness, DFNB2 and the Usher 1B syndrome are allelic defects of the myosin-VIIA, Nature Genet 1997; 16:191-3）。
【００２４】
DFNB1 に関与することが近年示されたコネキシン２６をコードする遺伝子Ｃｘ２６における突然変異に関する探索を実施した。Ｃｘ２６の分析は、ゲノムDNA に関するPCR 増幅および単一コードエキソンのシーケンシングにより実施した。
【００２５】
実施例１：患者
種々の地理的領域、主にフランス、ニュージーランドおよびオーストラリア、チュニジアおよびレバノンからの３５の罹患家族を調べた。それらを３類に分類した：（１）DFNB1 遺伝子座との有意の連鎖を各々有する血縁家族、（２）連鎖分析がDFNB1 の関与と適合した小規模非血縁家族、そして（３）連鎖分析が成されていない小規模家族。
【００２６】
第一類は、地理的に隔離された領域に住んでいる６つの大家族で構成される。５つはチュニジアからの家族で、そのうち２つは北から、そして３つは南からの家族であった。北方チュニジアからの２家族（家族２０および６０）におけるDFNB1 との連鎖は、以前に報告されていた（Guilford P, Ben Arab S, Blanchard S, et al. A non-syndromic form of neurosensory, recessive deafness maps to the pericentormeric region of chromosome 13q. Nature Genet 1994; 6:24-8）。
【００２７】
南方チュニジアからの３家族（Ｓ１５、Ｓ１９およびＳＴ）およびレバノンからの家族（ＬＨ）は総計３人、５人、２人および５人の難聴小児をそれぞれ包含し、難聴程度は重症または完全難聴であった。結婚は一次いとこ間(S15、STおよびLH）、ならびに一次および二次いとこ間(S19) であった。これら６家族の連鎖分析は、2.5 〜10の範囲の個々のロッド値を生じ、DFNB1 領域からの多型マーカー（D13S175 、D13S141 、D13S143 およびD13S115)を有した。
【００２８】
第二類の患者は、少なくとも２人の難聴同胞を有する７ニュージーランド家族（家族51、1160、1548、1608、1773、1873、1877）、および１オーストラリア家族（9670）を包含する。家族1608は、同一DFNB1 マーカーハプロタイプを共有する４人の同胞が軽度〜中等度の難聴（高頻度で重症）を有し、そのうちの１人が完全難聴であったという点で非定型であった。家族1873では、無関係な親（個体II.2およびII.3）が彼等の２人の子供と同様に難聴であり、したがって、我々はこれを２家族と考えて、別個の家族の総数を９とした。家族1608および1873を除いては、何らかの聴覚障害が認められる親はいなかった。これら９家族は、難聴とDFNB1 領域の多型マーカーとの間に共分離を示し、最大個別ロッド値は0.6 〜1.2 の範囲であった。
【００２９】
Maw 等（Maw MA, Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al., The contribution of the DFNB1 locus to neurosensory deafness in a Caucasian population. Am J Hum Genet 1995; 57:629-35）の元の試験における他の１０家族は、共分離を示さず、共分離した他の１家族はCx26突然変異に関して試験されなかった。ニュージーランド家族は、全員が白色人種起源で、既知のポリネシア人との混血は認められなかった。祖先の家族名によって、家族内の先祖の割合は一般的白人種ニュージーランド集団の先祖比率を反映し、高優勢はアングロ−ケルト形質であって、小分画が欧州大陸からの移住によるものであった。親血縁性、あるいは任意の家族間の連関はいずれも認められなかった。オーストラリア人の場合、父親は北アイルランドからで、母親は英国のヨークシャー出身であった。
【００３０】
第三類は、フランス在住の１９家族とニュージーランドの２家族で構成され、各々、重症〜完全難聴を示す少なくとも２人の小児を有した。何らかの聴覚障害が認められる親はいなかったが、但し、家族P16 の母親および家族P17 の父親は中等度および進行性の高頻度聴覚損失を有した。これらのうちの５家族は、レバノン（家族Ｐ３）、トルコ（家族Ｐ４）、ポルトガル（家族Ｐ９）、アルジェリア（家族Ｐ１４）およびポーランド（家族Ｐ１６の父親）出身の外人先祖を有した。２家族（Ｐ７およびＰ１４）では、両親は遠縁であった。
【００３１】
実施例２：Cx26のコードエキソンの増幅
単一コードエキソンから成るCx26遺伝子の全コード配列の増幅を可能にする一組のプライマーを用いて、ゲノムDNA に関してPCR を実施した（Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, et al., Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature 1997; 387:80-3 ）。プライマー配列を以下に示す：
5'-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC（配列番号：１）-3' 、および
5'-TGAGCACGGGTTGCCTCATC （配列番号：２）-3'
PCR 条件：３５サイクル：９５℃、１分；５８℃１分；７２℃２分。得られたPCR 生成物は長さ777bp であった。
【００３２】
実施例３：DNA シーケンシング
蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いたApplied Biosystems DNAシーケンサーABI373でのジデオキシ鎖ターミネーター法を用いて、前記（Smith, L.M., Sanders, J.Z., Kaiser, R.J., Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 1986; 321:674-9 ）のようにPCR 生成物のシーケンシングを実施した。用いたプライマーは、PCR 増幅に関するものと同一のもの＋２つの内部プライマー：
5'-GACACGAAGATCAGCTGCAG （配列番号：３）-3' および
5'-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG （配列番号：４）-3'
であった。
【００３３】
実施例４：血縁チュニジア人およびレバノン人DFNB1 家族における突然変異
これらの家族において、DFNB1 遺伝子座の関連を、連鎖分析により実証し得た。チュニジア人５家族のうちの４家族(S15、S19 、20および60）およびレバノン人家族（ＬＨ）では、両Ｃｘ２６対立遺伝子に関して全罹患小児で同一突然変異が、即ち、位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠失が検出された（位置１はイニシエーターコドンの最初の塩基である）（表１）。この突然変異を、Beaudet とTsui（Beaudet AL, Tsui L-C. A suggested nomenclature for designating mutations, Hum Mutation 1993; 2:245-8）の提唱した命名法にしたがって、以後、３０ｄｅｌＧ突然変異と呼ぶ。
【００３４】
それは読取り枠を作り、これがヌクレオチド位置３８での早期終止コドンを生じる。チュニジア人の５番目の家族（ＳＴ）に分離する突然変異は、ヌクレオチド位置G39 でのＧからＴへのトランスバージョンとして同定されて、コドン４７での早期終止コドン(GAG→TAG)を生じ、これはＥ４７Ｘと命名された。各家族において、正常聴覚親は対応する突然変異に関して異型接合であることが判明した。
【００３５】
実施例５：DFNB1 連鎖と一致する小規模非血縁ニュージーランドおよびオース
トラリア人家族における突然変異
これらの家族においては、分離分析は、DFNB1 遺伝子座の関与と適合すると従来報告されている（ Maw MA, Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al. The contribution of the DFNB1 locus to neurosensory deafness in a Caucasian population. Am J Hum Genet 1995; 57:629-35）。９家族のうち５家族（51、1160、1608(III.20)、1873(II.3)および1877）からの難聴個体は、３０ｄｅｌＧ突然変異に関して同型接合であった。
【００３６】
家族1773からの難聴小児は、30delGに関して異型接合であった。家族1873からの難聴固体II.2（「被験者」および表１参照）は、30del38と呼ばれるヌクレオチド位置G30で開始する38bpの欠失に関して異型接合であった。家族1773の難聴小児および家族1873の難聴個体（II.2）では、その他の突然変異は検出されなかった。
【００３７】
それにもかかわらず、この最後の個体では、Cx26遺伝子に極近位の多型マーカーの欠失（遺伝子座D13S175)が従来観察されており（Maw MA, Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al., The contribution of the DFNB1 locus to neurosensory deafness in a Caucasian population. Am J Hum Genet 1995; 57:629-35）、これは、ＤＮＡ再配列が、シスの遺伝子の他のCx26対立遺伝子の機能を損傷したことを示す。家族９６７０では、ミスセンス突然変異(R184P) および枠内単一コドン欠失(delE138) に関する複合異型接合性が罹患同胞で観察された。Cx26突然変異が検出されなかったのは、１家族（1548）のみであった。結果を表１に要約する。
【００３８】
実施例６：フランスおよびニュージーランド在住のＤＦＮＢ１連鎖に関して特
性化されていない小規模家族における突然変異
フランス在住の１９家族（P1〜17、L14190およびL13131）およびニュージーランドの２家族（家族1885および2254）を調べた。これらの家族においては、難聴と多型マーカーとの共分離は分析されていなかった。２１家族のうち６家族（P1、P3、P5、P9、P10 およびP16)からの難聴小児は、突然変異30delGに関して同型接合であることが判明した。さらに別の５家族（P6、P11 、P14 、P17 および1885）では、難聴小児はこの突然変異に関して異型接合であった。これらの家族においては、その他の突然変異は検出されなかった。残りの１０家族では、Cx26遺伝子における突然変異は見出されなかった。
【００３９】
実施例７：対立遺伝子特異的捕捉プローブを用いた分子ハイブリダイゼーショ
ン
物質ハイブリダイゼーション捕捉プローブ（例えば、D. Chevrier et al. PCR product quantification by non-radioactive hybridization procedures using an oligonucleotide covalently bound to microwells. Molecular and Cellular Probes 1993; 7:187-197およびD. Chevrier et al. Rapid detection of Salmonella subspecies I by PCR combined with non-radioactive hybridization using covalently immobilized oligonucleotide on a microplate. FEMS Immunology and Medical Microbiology 1995; 10:245-252参照）（各記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、30delG突然変異の特異的欠失を可能にする。
【００４０】
本技法は、30delG突然変異により引き起こされる言語習得前非症候性難聴の迅速診断を可能にするために適応された。本技法は、安定な非放射性分子を用い、自動化が容易で、且つ大規模分析に十分適応されるために、臨床環境にある種の利点を提供する。
【００４１】
ＰＣＲ増幅のために設計されたプライマーを用いて、Cx26遺伝子の当該領域をゲノムＤＮＡ試料から増幅する。プライマー配列を以下に示す：
CNN3: 5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：９）-3'
CNN4: 5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3'
CONN3(配列番号：９）およびCONN4(配列番号：１０）プライマー（各々１μＭ）、分析されるDNA のアリコート(2μl 、100 〜300ng)、1.5mM のMgCl2 、200 μM のdNTPおよびTaq ポリメラーゼを用いて、PCR を実施する。増幅プログラムは以下の工程から成る：１）９５℃、５分；２）酵素付加、95℃、1 分;3)60 ℃、１分（ランプ率＝0.25℃/s);4)72℃、1 分；５）工程２〜４を４０サイクル反復；そして６）７２℃、１０分。迅速ゲル電気泳動により、PCR 生成物を立証する。
【００４２】
増幅PCR 生成物は、正常または突然変異Cx26配列を含有する。正常配列と突然変異体配列とを区別するために、２つの捕捉プローブを設計する。これら２つの捕捉プローブの配列を以下に示す：
正常配列の検出のためには：
CNN6: 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGGTGTG （配列番号：１１）-3'
突然変異体配列の検出のためには：
CNN7: 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGTGTGA （配列番号：１２）-3'
【００４３】
各捕捉プローブは２２ヌクレオチド長でなければならない。さらに、有効であるために、捕捉プローブはその５‘末端でＡ７スペーサーを、そして１５塩基のハイブリダイゼーション領域を含有しなければならない。このような捕捉プローブは、突然変異体配列を正常配列から特異的に区別できる。したがって、ＣＯＮＮ６（配列番号：１１）は、正常配列と特異的にハイブリダイズするよう設計され、一方ＣＯＮＮ７（配列番号：１２）は突然変異体配列と特異的にハイブリダイズするよう設計される。
【００４４】
微小滴定プレートに捕捉プローブを付着させる前に、それらはその５‘末端でリン酸化される。リン酸化は、２００μｌの緩衝液（50mMのトリス−HCl 、pH7.4;10mMのMgCl2;5mM のジチオトレイトール；および１ｍＭのスペルミジン）中で、20nmolのCONN6(配列番号：１１）またはCONN7(配列番号：１２）オリゴヌクレオチド、100 μM のATP 、10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で、３７℃で１時間実行する。
【００４５】
混合物を６８℃で１０分間加熱してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化し、次に、１０ＭのCH3COONa 145μl 、H2O 15μl および氷冷アルコール800 μl を付加して、オリゴヌクレオチドを沈澱させる。氷中で３０分間インキュベーション後、混合物を４℃で２０分間、12,000g で遠心分離する。その結果生じたペレットを500 μl の氷冷アルコール（７０％）で洗浄し、800 μl のＴＥ緩衝液中に溶解する。２６０ｎｍでの光学密度により、リン酸化オリゴヌクレオチド濃度を確定する。
【００４６】
リン酸化オリゴヌクレオチドをマイクロプレートに付着させる前に、９５℃で１０分間加熱してそれらを変性させ、氷中で急冷して二次構造が生じないようにする。５００ｎｇのリン酸化CONN6(配列番号：１１）またはCONN7(配列番号：１２）および１μｌの1M 1- メチルイミダゾール、ｐＨ７をマイクロプレートの各ウエルに付加して、これを氷上で保持する。各ウエルの総容量を蒸留水で７０μｌに調整した後、30μl の冷１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド溶液（１６７ｍＭ）を付加する。
【００４７】
マイクロプレートを覆い、インキュベーター（Thermomix(r), Labsystems）中で５０℃で５時間インキュベートする。５時間インキュベーション後、マイクロプレートを0.25%SDSを含有する0.4NNaOHの温溶液（50℃）で３回洗浄する。マイクロプレートを同一温溶液で５分間インキュベートして、温NaOH/SDS（50℃）で再び洗浄する。最後に、マイクロプレートをＴＥ緩衝液で５回洗浄する。被覆マイクロプレートは、ウエルがＴＥ緩衝液で満たされている場合には、４℃で数ヶ月間保持し得る。
【００４８】
ゲノムDNA 試料からの増幅配列を、被覆マイクロプレート中でビオチニル化検出プローブとともにインキュベートする。対立遺伝子特異性である捕捉プローブとは異なり、検出プローブは正常および突然変異体配列の両方とハイブリダイズし得る。検出プローブの配列を以下に示す：
CNN12: 5'-CAGCATTGGAAAGATCTGGCTCA （配列番号：１３）-3'
【００４９】
増幅配列およびその５‘末端でビオチニル化される検出プローブは、各ウエル：水95μl 、PCR 反応物5 μl 、水中に希釈した22nMのビオチニル化プローブ（配列番号：13) 40μl および1NのNaOH 14 μl 中に連続的に付加することによりマイクロプレート中で直ちに変性される。１０分後、1MのNaH2PO4 および１％サルコシル21μl を各ウエルに付加して、総容量を175 μl/ウエルとする。検出プローブの最終濃度は５ｎＭである。マイクロプレートを被覆し、インキュベーター（Thermomix(r), Labsystems）中で４０℃で一夜インキュベートし、次にTBS-トゥイーンで大々的に洗浄して（５回）、余分のビオチニル化プローブ（配列番号：１３）を除去する。
【００５０】
免疫酵素法を用いてハイブリダイズ化プローブを検出する。各ウエルは、TBS-BSA-トゥイーン中に1/4000希釈した100 μl の接合体（エキストラビジン−アルカリ性ホスファターゼ、シグマＥ−２６３６）を受容する。マイクロプレートを被覆し、２５℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、マイクロプレートをＴＢＳ−トゥイーンで５回洗浄する。次に200 μl の予熱（３７℃）基質（下記の緩衝液：1mM のMgCl2 を含有する１ＭのジエタノールアミンpH9.8:20ml中の7.5mg のパラ−ニトロ−フェニルホスフェート）を各ウエルに付加する。マイクロプレートを被覆し、３７℃で３時間インキュベートする。405nm で吸光度を測定して、特異的シグナルを確定し、630nm でバックグラウンドノイズを確定する。
【００５１】
CONN6(配列番号：１１）プローブ（正常配列）を用いて得られたシグナルとCONN7(配列番号：１２）プローブ（突然変異体配列）を用いて得られたシグナルとの間のハイブリダイゼーション比（Ｒ）を算出する。算出Ｒ値を用いて、試料DNA の遺伝子型を以下のように確定する：正常Ｃｘ２６配列に関して同型接合（Ｒ≧２）、30delG突然変異に関して異型接合(0.5<R<2) 、そして30delG突然変異に関して同型接合(R≦0.5)。ハイブリダイゼーション比（Ｒ）の範囲は、試料数が増大すると、わずかに修正され得る。下表は、３９の試料に関して得られた結果の一例を示す。
【００５２】
【表１】
0004418587.tif 000002
【００５３】
実施例８：温度勾配ゲル電気泳動
温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）は、遺伝子の所望の領域内にある任意の種類の突然変異、例えば欠失、挿入および置換の検出を可能にする（例えば、D. Reiner et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: Analysis of conformation transitions, sequence variations and protein-nucleic acid interactions, Electrophoresis 1989; 10: 377-389; E.P. Lessa and G. Applebaum Screen techniques for detecting allelic variation in DNA sequences. Molecular Ecology 1993; 2: 119-129およびA.L. Borresen-Dale et al. Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis on the D code(tm) System. Bio-Rad US/EG Bulletin 2133 参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【００５４】
しかしながら、TGGEにより、突然変異の種類およびその位置を正確に確定することはできない。
従来記載されている分子ハイブリダイゼーション法の場合と同様に、PCR により、ゲノムDNA 試料からCx26遺伝子中の当該領域を先ず増幅する。プライマー配列を以下に示す：
CONN2: 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC （配列番号：１４）-3'
CONN4: 5'- ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3'
【００５５】
その５‘末端にＧＣクランプを有する１μＭのCONN2(配列番号：１４）プライマーおよび１μＭのCONN4(配列番号：１０）プライマー、分析されるDNA のアリコート(2μl 、100 〜300ng)、1.5mM のMgCl2 、200 μM のdNTP、ならびにTaq ポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを実施する。増幅プログラムは以下の工程から成る：１）９５℃、５分；２）酵素付加、９５℃、１分；３）６０℃、１分（ランプ率＝0.25℃/s);4)72℃、1 分;5) 工程２〜４を４０サイクル反復；そして６）７２℃、１０分。
【００５６】
TGGEによるこれらのPCR 増幅断片の分析は、ゲル上に単一バンドを生じる同型接合（正常または突然変異体）試料と、３つのバンドを生じる異型接合試料とを区別し得る。しかしながら、正常配列に関して同型接合であるゲノム試料と30delG突然変異体に関して異型接合であるゲノム試料との区別には、さらなる工程を要する。
【００５７】
正常同型接合試料と突然変異体同型接合試料を区別するために、増幅PCR 生成物のアリコートを既知の正常同型接合試料または既知の30delG突然変異体同型接合試料と混合して、異型二重鎖形成に関して分析する。増幅PCR 生成物が正常同型接合試料から得られる場合、それは既知の30delG突然変異体同型接合試料と異型二重鎖を形成する。一方、増幅ＰＣＲ生成物が突然変異体同型接合試料から得られる場合、それは既知の正常同型接合試料と異型二重鎖を形成する。これらの混合物中での異型二重鎖形成を促すために、それらを９５℃で５分間変性し、その後６５℃で４５分間再生する。
【００５８】
初期増幅からのPCR 断片および異型二重鎖形成を可能にするために付加的加熱工程を施されたモノを、７Ｍ尿素を含有する１０％ポリアクリルアミドゲル上で分析する。実施例により、30mlゲルを以下の成分を併合することにより調製する：
−12.6g の尿素
−0.75mlの50xTAE
−7.5ml のアクリルアミド：ビスアクリルアミド(37.5:1)(40%で）
−容量を30mlとするための水
−30μl のTemed(臨機的に付加）
−300 μl の10% 過硫酸アンモニウム（臨機的に付加）
【００５９】
Temed および過硫酸アンモニウム付加後、ゲルを２つのガラス板（Dcode Universal Mutation Detection System(r), BIORAD）間に注ぎ、１時間重合させる。
PCR 混合物のアリコート(7.5μl)を7.5 μl の２ｘ試料溶液(2mMのEDTA、pH8;70% グリセロール；0.05% キシレンシアノール；0.05% ブロモフェノールブルー）と混合し、ゲルウエル中に導入する。0.2 ℃／時間の比率で、61℃〜62℃の範囲の温度勾配で、１．２５ｘＴＡＥ緩衝液中で150Vで４〜５時間、電気泳動を実施する。電気泳動処理後、25μg/mlの臭化エチジウムを含有する1.25xTAE中で６分間、ゲルをインキュベートする。1.25xTAE中で２０分間洗浄して、余分の臭化エチジウムを除去し、ＵＶ透視器を用いてDNA 断片を可視化する。
【００６０】
典型的TGGE結果を、図１に示す。同型接合患者（正常または突然変異体）からの増幅ＤＮＡは、１つのバンドのみを生じる。異型接合患者からの増幅DNA は、ポリアクリルアミドゲル中に３つの異なる断片を生じる。より迅速に移動するより濃いバンドは、両同型二重鎖に対応するが、これはこのゲル中では分離され得ない。よりゆっくり移動する他の２つのバンドは、両方の種類の異型二重鎖に対応する。
【００６１】
正常同型接合患者のDNA は、異型二重鎖形成を可能にした条件を施されたPCR 断片を分析することにより、突然変異体同型接合患者のDNA と区別され得る。異型二重鎖は、正常同型接合ゲノムからのPCR 増幅断片が既知の突然変異体同型接合ゲノムからの配列と混合された場合に、または突然変異体同型接合ゲノムからのPCR 増幅断片が既知の正常同型接合ゲノムからの配列と混合された場合に、生成する。これらの異型二重鎖は、TGGE分析により可視化される。その結果、正常および突然変異体同型接合患者のＤＮＡは、本試験に記載したプライマーを用いて、この技法により、容易に区別され得る。
【００６２】
既知のDFNB1 家族（６／６）のすべて、推定上のDFNB1-連関家族の１家族以外のすべて、およびDFNB1 連鎖に関して試験されなかった家族の半数(11/21) において、Cx26における突然変異が検出された。さらに、Cx26突然変異体対立遺伝子が同定されるかまたは推定されることと無関係であるとみなされる４４の染色体のうち、33(75%) の染色体が位置３０でのグアノシンＧの同一の欠失（30delG）を保有することが判明した。
【００６３】
Ｃｘ２６突然変異は、劣性遺伝する言語習得前難聴の主因を示し、検査した集団における原因の約半数に関連すると考えられる。さらに、特異的一突然変異、30delGは、Cx26突然変異体対立遺伝子の大部分を占める。
LEE S.W. et al. （1992）J. Cell Biol. 118:1213-1221 に発表された野生型コネキシン２６遺伝子は、以下の配列を有する：
【００６４】
【化１】
0004418587.tif 000003
【００６５】
【化２】
0004418587.tif 000004
【００６６】
Kiang, D.T. et al.（1997）Gene 199（1-2 ）:165-171に発表された野生型コネキシン２６遺伝子は、以下の配列を有する：
【化３】
0004418587.tif 000005
【００６７】
【化４】
0004418587.tif 000006
【００６８】
（配列番号：８）。配列表の下線を施したＡＴＧは、開始コドンに対応する。
【００６９】
【表３】
0004418587.tif 000007
【００７０】
ここに報告した分析は、家族1873以外の種々の家族の難聴小児に関する（患者および方法を参照）。
＊  一方の耳は中等度の、他方は重症の難聴。
＊＊  母親における中等度の聴覚損失（高頻度で重症）、＊＊＊  30delG突然変異に関して異型接合保有者である父親における軽度聴覚損失。
出身地：(Alg) アルジェリア、（Aust）オーストラリア、（Fr）フランス、(Leb) レバノン、（NZ）ニュージーランド、(Pol) ポーランド、(Por) ポルトガル、(nTu) 北チュニジア、(sTu) 南チュニジア、(Tur) トルコ。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、突然変異の検出のための温度勾配ゲル電気泳動の結果を示す：
レーン１および２：正常患者からのDNA 。
レーン３および4:30delG突然変異を有する同型接合患者からのＤＮＡ。
レーン５および６：異型接合患者からのDNA 。
レーン７：DNA を含有しないPCR 対照。
レーン８：正常DNA から増幅され、30delG突然変異を保有する標準DNA 断片とハイブリダイズさせたPCR 断片。
レーン９：突然変異体異型接合DNA から増幅され、グアニン３０を保有する正常標準DNA 断片とハイブリダイズさせたPCR 断片。
【図１】
0004418587.tif 000008