(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺特異抗原のラテックス凝集法による測定において、被検液中にα１−アンチキモトリプシン複合前立腺特異抗原とは反応しない遊離型前立腺特異抗原に対する抗体を添加し、次いで、前立腺特異抗原に対するポリクローナル抗体あるいは２種類以上のモノクローナル抗体、あるいはその組み合わせである抗体を感作したラテックスを添加することを特徴とする前立腺特異抗原の測定方法。
【請求項２】
α１−アンチキモトリプシン複合前立腺特異抗原とは反応しない遊離型前立腺特異抗原に対する抗体が、モノクロ−ナル抗体あるいはその抗原結合フラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
α１−アンチキモトリプシン複合前立腺特異抗原とは反応しない遊離型前立腺特異抗原に対する抗体を含む試薬と前立腺特異抗原に対するポリクローナル抗体あるいは２種類以上のモノクローナル抗体、あるいはその組み合わせである抗体を感作したラテックスとを含む試薬からなる前立腺特異抗原のラテックス凝集法用測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は免疫凝集法による前立腺特異抗原（以下ＰＳＡと略す。）の測定方法及びその試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
前立腺癌は男性にみられる悪性疾患であり、アメリカにおいては、もっとも患者数の多い固形腫瘍である。日本においてもその増加率は著しく、２０１５年には１９９５年の３．９倍に増加すると推定されており、この増加率は、すべての腫瘍のなかでトップである。前立腺癌は増殖の遅い腫瘍であることや抗男性ホルモン療法が奏効しやすいという特徴があり、転移や浸潤を伴わない早期に発見されれば、その根治の機会が得られることから早期発見が重要である。
前立腺癌の診断は、これまで、直腸内触診と経直腸エコー検査によって行われ、これらの検査で前立腺癌の疑いがあれば、針生検により確定診断が得られてきた。しかし、直腸内触診、経直腸エコーのいずれも経腸的な操作であるため患者の羞恥心を伴い、泌尿器科への受診を遅らせることが早期発見の遅れの一因となっていた。
前立腺上皮細胞から分泌され前立腺癌細胞によっても産生されるＰＳＡは、セリンプロテアーゼの一種で、分子量３３、０００〜３４、０００ダルトンの糖蛋白である。そのアミノ酸配列も報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3166 (1986)）。ＰＳＡは、血中では、プロテアーゼインヒビターとの結合型と、非結合の遊離型前立腺癌特異抗原（ｆＰＳＡと略す。）として存在する。血中のＰＳＡの多くは結合型であり、α１−アンチキモトリプシンと結合しているα１−アンチキモトリプシン複合前立腺特異抗原（以下ＡＣＴ−ＰＳＡと略す。）やα２マクログロブリンと結合しているα２マクログロブリン複合前立腺特異抗原等がある。このうち、α２マクログロブリン複合前立腺特異抗原は、ＰＳＡ分子全体がα２マクログロブリンで覆われるため、抗原活性が失われ免疫的には、測定できない。即ち、免疫法で測定できるＰＳＡは、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの２種類である。
ＰＳＡは血清中で早期前立腺癌症例においても陽性となり、直腸内触診や経直腸エコーでは無所見の場合でも前立腺癌が発見されることもあり、前立腺癌患者のスクリーニング用の指標としての性能は、直腸内触診や経直腸エコーよりも優れていることが認められている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、日本で上市されている２０種を超える血清中ＰＳＡの総量を測定するキットにおいて、被検液によってその測定値と真の値との乖離の程度が異なることが問題となっている。この主な原因は、個々のキットで、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡに対する測定試薬の反応性に違いがあることによるものと考えられる。ＰＳＡは一般的に５種類のエピトープが知られており、それぞれモノクローナルな抗体が得られている。抗原との反応を２段階で行う放射免疫測定や酵素免疫測定では、これらのモノクローナルな抗体を組み合わせてｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの反応性を等しくする試みがなされており、固相用や標識用に最適なのモノクローナル抗体が市販されている。ところが、ラテックス法等の凝集反応による測定法では、抗原抗体反応が１段階であるため、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの反応性を等しくすることが難しい。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討の結果、汎用自動分析装置にも応用可能な凝集法による総ＰＳＡ測定方法を見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１）ＰＳＡの凝集法による測定において、被検液中にＡＣＴ−ＰＳＡとは反応しないｆＰＳＡに対する抗体を添加し、次いでＰＳＡに対する抗体を感作した担体を添加することを特徴とする測定方法。
（２）ＡＣＴ−ＰＳＡとは反応しないｆＰＳＡに対する抗体が、モノクロ−ナル抗体あるいはその抗原結合フラグメントであることを特徴とする上記（１）に記載の測定方法。
（３）ＰＳＡに対する抗体を感作した担体がラテックスである上記（１）または（２）に記載の測定方法。
【０００６】
（４）担体に感作するＰＳＡに対する抗体が、ポリクローナル抗体あるいは２種類以上のモノクローナル抗体、あるいはその組み合わせであることを特徴とする上記（１）乃至（３）いずれかに記載の測定方法。
（５）ＡＣＴ−ＰＳＡとは反応しないｆＰＳＡに対する抗体を含む試薬とＰＳＡに対する抗体を感作した担体とを含む試薬からなるＰＳＡの測定試薬。
（６）ＰＳＡに対する抗体を感作した担体がラテックスである上記（５）に記載の測定試薬。
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のＰＳＡの凝集法による測定方法は、被検液中にＡＣＴ−ＰＳＡとは反応しないｆＰＳＡに対する抗体を添加し、次いでＰＳＡに対する抗体を感作した担体を添加することによる。
本発明では、ｆＰＳＡのα１−アンチキモトリプシンと結合可能な領域をある程度大きな分子量の蛋白、具体的には抗体を結合させる事により、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの分子量を近づけ、エピトープの数を揃えることでＰＳＡに対する抗体に対するｆＰＳＡの反応性とＡＣＴ−ＰＳＡの反応性を近づけ、ＰＳＡに対する抗体を感作した担体と両者とを等モル対応で測定することを可能にした。
本発明で使用するｆＰＳＡに対する抗体は、ＡＣＴ−ＰＳＡとは反応しない抗体であり、α１−アンチキモトリプシンとＰＳＡが結合する部位を認識する抗体である。この抗体は、ＰＳＡで動物を免疫して得られるポリクローナルな抗体からＡＣＴ−ＰＳＡと反応する抗体を除いたものでもよく、市販のものでもよく，好ましくは、α１−アンチキモトリプシンとＰＳＡが結合する部位を認識するモノクローナルな抗体が挙げられる。また、この抗体は、抗体全体でもかまわないが、その抗体をペプシンやパパイン等の酵素で切断した抗原結合フラグメントであるＦ（ａｂ'）２ フラグメントあるいはＦａｂフラグメントであってもよい。Ｆ（ａｂ'）２ フラグメントの−ＳＳ−結合を切断し安定化処理したＦａｂ'フラグメントでも良い。その抗体の使用濃度はｆＰＳＡとの反応時の溶液中０．０５〜１０μｇ／ｍＬでよいが、０．２５〜２．５μｇ／ｍＬの濃度が好ましく、被検液中のｆＰＳＡよりも過剰に存在することが必要である。
本発明で使用する被検液は、ＰＳＡを含む試料であれば特に限定されないが、好ましくは血液、血漿、血清等が挙げられ、血清が特に好ましい。
【０００８】
本発明で担体に感作して使用するＰＳＡに対する抗体は、ＡＣＴ−ＰＳＡにもｆＰＳＡにも反応する抗体であり、通常抗体を得る際に用いられる動物に免疫して得られるポリクローナルな抗体が本発明に使用される凝集反応に効果的である。免疫に用いる動物種は、一般的に用いられているウサギ、ヒツジ、ヤギ等で良い。また、ＡＣＴ−ＰＳＡに反応する抗ＰＳＡモノクローナル抗体の２種類以上の組み合わせ、あるいはポリクローナルな抗体とモノクローナルな抗体の組み合わせでも良い。また、抗体全体でもかまわないが、定法に従い前記の酵素で切断したＦ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂフラグメントあるいはチオール基安定化Ｆａｂ'フラグメントであってもよい。
【０００９】
本発明で使用する、ＰＳＡに対する抗体を感作する担体は、特に限定されないが、ラテックスが好ましい。ラテックスとしては、免疫学的測定法で用いられる物理的吸着法で使用されるポリスチレンからなる一般的なラテックスが使用可能であり、材質は感作方法に適したものなら特にこだわらない。その粒径は、高感度測定を可能にする粒径５０〜１０００ｎｍが好ましく、４００〜７００ｎｍがさらに好ましい。また、粒径の揃った単分散のラテックスではなく分布の広いラテックス、あるいは異なる粒子径を混合したラテックスでも使用することができる。
【００１０】
ラテックスに抗体を感作する方法は一般的に使用されている物理的吸着法が採用できるが、化学結合法も採用できる。物理的吸着法を例示すると、粒子径４５０ｎｍのポリスチレン系ラテックスを適当な緩衝液に１％の濃度で分散し、ペプシンで切断した抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した同緩衝液に溶解したものを同量混合し、一夜冷蔵庫中で感作し、更に１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を同量添加し、更に一夜冷蔵庫で緩やかな振とうをしながら放置した。これを遠心分離器により上清を１％ＢＳＡ含有緩衝液に交換して感作ラテックスを得ることができる。
感作ラテックスは０．０５〜０．２％程度の濃度に調製して反応に使用される。
【００１１】
この抗原抗体反応によるＰＳＡの測定の際には、ＢＳＡ等の免疫的に不活性な蛋白を添加して安定性を向上させることが好ましい。更には、凝集反応を促進する水溶性ポリマーの添加が好ましい。具体的には、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセトアミド、ポリビニルホルムアミド等であり、その添加量は分子量により異なるが、測定液中の０．２％〜２．０％程度で、添加の効果を示す量を用いる。
【００１２】
本発明における抗原抗体反応は緩衝液中で行われる。その緩衝液は、担体に感作するとき、凝集反応するとき、それぞれ最適の種類、濃度、ｐＨが選択され、一般的に用いられるリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液等を適宜用いる事ができる。その測定液中の緩衝剤の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭ程度で用いられる。また、そのｐＨは中性域から塩基性域で用いられることが多く、通常７．０〜９．５の範囲で用いられる。例えば、１％ＢＳＡ含有緩衝液ではｐＨ７．２〜８．５の範囲で用いられることが多い。
【００１３】
例えば、本発明のＰＳＡの測定方法は、次の様に行われる。被検液中のｆＰＳＡを、第一の反応としてＡＣＴ−ＰＳＡとは反応しない抗ｆＰＳＡモノクローナル抗体と反応させ抗体結合ｆＰＳＡとし、ＡＣＴ−ＰＳＡはそのまま残存させる。第二の反応として抗体結合ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡをＰＳＡに対する抗体感作ラテックスと抗原抗体反応をさせ、ラテックス粒子を凝集させる。その凝集の程度を測定し、ＰＳＡ濃度の分かっている標準液の凝集の程度と比較することで、被検液中のＰＳＡ濃度を定量する。
【００１４】
この際、凝集の程度を測定するには、種々の方法があるが、汎用の生化学分析装置を用いる方法が便利である。例えば、第一の反応を５分、第二の反応も５分で、この間の吸光度を３０〜５０回測定し、吸光度の変化量を検出し、標準液の検量線から被検液の濃度を算出する。ラテックス凝集法では、通常５００〜９００ｎｍの波長の吸光度が用いられ、第二の反応の吸光度の変化量を定量に用いるのが一般的であり、本発明の方法もこの方法で測定可能である。
【００１５】
また、本発明であるＰＳＡの測定試薬は、ＡＣＴ−ＰＳＡとは反応しないｆＰＳＡに対する抗体とＰＳＡに対する抗体を感作した担体とを含むことを特徴とする。本発明に使用されるＰＳＡに対する抗体についても前記のものが使用可能である。ＰＳＡに対する抗体を感作した担体はラテックスが好ましく、具体的には前記のものが用いられる。
【００１６】
【実施例】
以下、比較例及び実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１７】
比較例  抗ＰＳＡヤギ抗体を用いたＰＳＡの測定
下記組成からなる試薬を調整し、０、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０及び１００．０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＡＣＴ−ＰＳＡを測定しその結果を図1に、ＰＳＡ含有ヒト血清３検体を測定しその結果を表１に示した。尚、ヒト血清はｆＰＳＡを検量線として濃度を求めた。測定は、自動分析装置７１５０形（（株）日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。
分析法              ２ポイントエンド
測定ポイント              ２７−５０
検体量                      ２０μＬ
第１試薬                  ２００μＬ
第２試薬                    ４０μＬ
温度                          ３７℃
測定波長（一波長）        ７５０ｎｍ
【００１８】
試薬組成
第１試薬  トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                ５００ｍＭ
ＢＳＡ                                    ０．５％
ＮａＣｌ                                  ５００ｍＭ
ポリビニルピロリドンＫ−９０              ０．５％
【００１９】
第２試薬  以下のように調製した。
平均粒径４８０ｎｍのラテックス（１０％（Ｗ／Ｖ））１ｍＬを５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）９ｍＬに分散し、抗ＰＳＡヤギ抗体（ＩｇＧ分画、１０ｍｇ／ｍＬ）（BiosPacific社製）１ｍＬを加え室温で１時間ゆるやかに振とうした。その後、１％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）１０ｍＬを加え室温で１時間振とうし、遠心分離操作により、ラテックスと上清を分離し、上清を廃棄し、１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ＰＨ７．５）５０ｍＬでラテックス粒子を分散し第２試薬とした。
【００２０】
測定
自動分析装置７１５０形を用い、サンプル２０μＬを３７℃の反応セルに入れ、直ちに第１試薬２００μＬを加え混合する。５分後第２試薬４０μを投入撹拌混合する。７１５０形分析装置は第一反応開始から第二反応終了までの１０分間、１２秒毎に７５０ｎｍの波長の吸光度を測定する。第二反応開始後の２７ポイントから５０ポイントまでの吸光度増加量を測定し、標準液の吸光度増加量と比較して濃度を算出する。
【００２１】
実施例１  抗ｆＰＳＡマウス抗体（ＩｇＧ分画）及び抗ＰＳＡヤギ抗体を用いたＰＳＡの測定
下記組成からなる試薬を調整し、０、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０及び１００．０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＡＣＴ−ＰＳＡを測定しその結果を図２に、ＰＳＡ含有ヒト血清３検体を測定しその結果を表１に示した。尚、ヒト血清はｆＰＳＡを検量線として濃度を求めた。測定は、自動分析装置７１５０形（（株）日立製作所製）を用い、比較例と同じパラメーターを用いた。
【００２２】
試薬組成
第１試薬  トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                ５００ｍＭ
ＢＳＡ                                    ０．５％
ＮａＣｌ                                  ５００ｍＭ
ポリビニルピロリドンＫ−９０              ０．５％
抗ｆＰＳＡ特異的マウスモノクローナル抗体
（ＩｇＧ分画）（BiosPacific社製）         ０．２μｇ／ｍＬ
【００２３】
第２試薬  以下のように調製した。
平均粒径４８０ｎｍのラテックス（１０％（Ｗ／Ｖ））１ｍＬを５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）９ｍＬに分散し、抗ＰＳＡヤギ抗体（ＩｇＧ分画、１０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え室温で１時間ゆるやかに振とうした。その後、１％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）１０ｍＬを加え室温で１時間振とうし、遠心分離操作により、ラテックスと上清を分離し、上清を廃棄し、１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ＰＨ７．５）５０ｍＬでラテックス粒子を分散し第２試薬とした。
測定
上記の第１試薬と第２試薬を用いて、比較例と同様に測定を行った。
【００２４】
実施例２  抗ｆＰＳＡマウス抗体（Ｆ（ａｂ'）２分画）及び抗ＰＳＡヤギ抗体を用いたＰＳＡの測定
下記組成からなる試薬を調整し、０、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０及び１００．０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＡＣＴ−ＰＳＡを測定しその結果を図３に、ＰＳＡ含有ヒト血清３検体を測定しその結果を表１に示した。尚、ヒト血清はｆＰＳＡを検量線として濃度を求めた。測定は、自動分析装置７１５０形（（株）日立製作所製）を用い、比較例と同じパラメーターを用いた。
【００２５】
試薬組成
第１試薬  トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                  ５００ｍＭ
ＢＳＡ                                      ０．５％
ＮａＣｌ                                    ５００ｍＭ
ポリビニルピロリドンＫ−９０                ０．５％
抗ｆＰＳＡ特異的マウスモノクローナル抗体
（Ｆ（ａｂ'）２分画）                       ２．０μｇ／ｍＬ
【００２６】
第２試薬  以下のように調製した。
平均粒径４８０ｎｍのラテックス（１０％（Ｗ／Ｖ））１ｍＬを５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）９ｍＬに分散し、抗ＰＳＡヤギ抗体（ＩｇＧ分画、１０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え室温で１時間ゆるやかに振とうした。その後、１％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）１０ｍＬを加え室温で１時間振とうし、遠心分離操作により、ラテックスと上清を分離し、上清を廃棄し、１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ＰＨ７．５）５０ｍＬでラテックス粒子を分散し第２試薬とした。
測定
上記の第１試薬と第２試薬を用いて、比較例と同様に測定を行った。
【００２７】
実施例３  抗ｆＰＳＡマウス抗体（Ｆａｂ分画）及び抗ＰＳＡヤギ抗体を用いたＰＳＡの測定
下記組成からなる試薬を調整し、０、６．２５、１２．５、２５．０、５０．０及び１００．０ｎｇ／ｍＬのｆＰＳＡおよびＡＣＴ−ＰＳＡを測定しその結果を図４に、ＰＳＡ含有ヒト血清３検体を測定しその結果を表１に示した。尚、ヒト血清はｆＰＳＡを検量線として濃度を求めた。測定は、自動分析装置７１５０形（（株）日立製作所製）を用い、比較例と同じパラメーターを用いた。
【００２８】
試薬組成
第１試薬  トリス緩衝液（ｐＨ７．５）                  ５００ｍＭ
ＢＳＡ                                      ０．５％
ＮａＣｌ                                    ５００ｍＭ
ポリビニルピロリドンＫ−９０                ０．５％
抗ｆＰＳＡ特異的マウスモノクローナル抗体
（Ｆａｂ分画）                              １．２μｇ／ｍＬ
【００２９】
第２試薬  以下のように調製した。
平均粒径４８０ｎｍのラテックス（１０％（Ｗ／Ｖ））１ｍＬを５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）９ｍＬに分散し、抗ＰＳＡヤギ抗体（ＩｇＧ分画、１０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを加え室温で１時間ゆるやかに振とうした。その後、１％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍＭグリシン緩衝液（ＰＨ９．５）１０ｍＬを加え室温で１時間振とうし、遠心分離操作により、ラテックスと上清を分離し、上清を廃棄し、１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ＰＨ７．５）５０ｍＬでラテックス粒子を分散し第２試薬とした。
測定
上記の第１試薬と第２試薬を用いて、比較例と同様に測定を行った。
【００３０】
ＰＳＡ含有ヒト血清の測定結果
0004413371.tif 000002
なお、ＰＳＡ測定キットは「タンデム−Ｒ」（ハブリテック社製）を用いた。タンデム−Ｒは免疫放射定量法（ＩＲＭＡ）によりＰＳＡの濃度を測定するものである。
【００３１】
表１の結果から実施例ではいずれも標準的なＰＳＡ測定キットの「タンデム−Ｒ」の測定値とよい一致を示し、比較例ではサンプルＡ、Ｂ、Ｃのいずれも標準的なＰＳＡ測定キットの「タンデム−Ｒ」と乖離した測定値を示し、本発明の有効性が証明された。
また、図１（比較例）では検量曲線がｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡで大きくずれているため、トータルのＰＳＡの測定値は、被検液中のｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの存在比により大きく変化することが分かる。一方、図２〜４（実施例）ではｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの反応性が一致しているため、ｆＰＳＡを標準物質として用いた検量曲線の測定値がトータルＰＳＡの測定値となる。
従って、本発明によれば被検液中のｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの反応性が等しくなるため、ｆＰＳＡを標準物質とした検量曲線を用いて被検液中のｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの存在比が異なっていても一定の総ＰＳＡの定量値が得られる。この結果、前立腺癌の信頼性の高いスクリーニング、診断ができるようになった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明により、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの反応性を等しくして、試料中の総ＰＳＡを迅速・簡便に測定でき、また、大量の被検液を短時間で測定でき、得られた測定値は本発明の原理からｆＰＳＡもＡＣＴ−ＰＳＡも同じ濃度で測定することができるため、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの比の異なる被検液でも同じ定量値が得られ、前立腺癌のスクリーニングを効率良く進めることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は比較例の、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの検量曲線を示す
【図２】図２は実施例１の、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの検量曲線を示す
【図３】図３は実施例２の、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの検量曲線を示す
【図４】図４は実施例３の、ｆＰＳＡとＡＣＴ−ＰＳＡの検量曲線を示す
【図１】
0004413371.tif 000003
【図２】
0004413371.tif 000004
【図３】
0004413371.tif 000005
【図４】
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