(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット分子の核酸リガンドの製造法であって、核酸リガンドは、前記核酸リガンドの前記ターゲット分子への結合時に溶媒に条件付きで曝露される補欠分子族にコンジュゲートし：
ａ）前記補欠分子族にコンジュゲートした核酸の候補混合物を製造する工程；
ｂ）核酸の候補混合物を、前記補欠分子族のコグネイトリガンドにコンジュゲートした固形支持体と接触させる工程（ここで、補欠分子族が溶媒へ曝露される核酸が前記コグネイトリガンドへ結合する）；
ｃ）前記固形支持体上の前記コグネイトリガンドへ結合しない核酸リガンドを回収する工程；
ｄ）工程ｃ）で回収された核酸リガンドを前記ターゲットと接触させる工程（ここで、候補混合物に比べて前記ターゲットへの増加したアフィニティーを有する核酸が候補混合物の残りから分画され得る）；
ｅ）増加したアフィニティーの核酸を、候補混合物の残りから分画する工程；
ｆ）増加したアフィニティーの核酸リガンドを、前記コグネイトリガンドにコンジュゲートした前記固形支持体と接触させる工程；
ｇ）前記固形支持体へ結合する増加したアフィニティーの核酸リガンドを回収する工程；及び
ｈ）工程ｇ）で回収された増加したアフィニティーの核酸を増幅して：
（１）前記ターゲットへ結合するための相対的により高いアフィニティー及び特異性；及び
（２）前記ターゲットの存在下でのみ溶媒へ前記補欠分子族を曝露する条件付き反応を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
環境刺激に対して反応性の核酸リガンドの製造法であって、核酸リガンドは、前記核酸リガンドが前記環境刺激に遭遇するときに溶媒に条件付きで曝露される補欠分子族にコンジュゲートし：
ａ）前記補欠分子族にコンジュゲートした核酸の候補混合物を製造する工程；
ｂ）核酸の候補混合物を、前記補欠分子族のコグネイトリガンドにコンジュゲートした固形支持体と接触させる工程（ここで、補欠分子族が溶媒へ曝露される核酸が前記コグネイトリガンドへ結合する）；
ｃ）前記固形支持体上の前記コグネイトリガンドへ結合しない核酸リガンドを回収する工程；
ｄ）工程ｃ）で回収された核酸リガンドを、前記環境刺激の存在下で、前記コグネイトリガンドにコンジュゲートした前記固形支持体と接触させる工程；
ｅ）工程ｄ）において前記固形支持体へ結合する核酸リガンドを回収する工程；及び
ｆ）工程ｅ）で回収された核酸を増幅して、環境刺激の存在下でのみ溶媒へ前記補欠分子族を曝露する条件付き反応を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項３】
ターゲット分子の核酸リガンドの製造法であって、核酸リガンドは、前記核酸リガンドの前記ターゲット分子への結合時に溶媒から条件付きで封鎖される補欠分子族にコンジュゲートし：
ａ）前記補欠分子族にコンジュゲートした核酸の候補混合物を製造する工程；
ｂ）核酸の候補混合物を、前記補欠分子族のコグネイトリガンドにコンジュゲートした固形支持体と接触させる工程（ここで、補欠分子族が溶媒へ曝露される核酸が前記コグネイトリガンドへ結合する）；
ｃ）前記固形支持体上の前記コグネイトリガンドへ結合する核酸リガンドを回収する工程；
ｄ）工程ｃ）で回収された核酸リガンドを前記ターゲットと接触させる工程（ここで、候補混合物に比べて前記ターゲットへの増加したアフィニティーを有する核酸が候補混合物の残りから分画され得る）；
ｅ）増加したアフィニティーの核酸を、候補混合物の残りから分画する工程；
ｆ）増加したアフィニティーの核酸リガンドを、前記コグネイトリガンドにコンジュゲートした前記固形支持体と接触させる工程；
ｇ）前記固形支持体へ結合しない増加したアフィニティーの核酸リガンドを回収する工程；及び
ｈ）工程ｇ）で回収された増加したアフィニティーの核酸を増幅して：
（１）前記ターゲットへ結合するための相対的により高いアフィニティー及び特異性；及び
（２）前記ターゲットの存在下でのみ前記補欠分子族を溶媒から封鎖する条件付き反応を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項４】
環境刺激に対して反応性の核酸リガンドの製造法であって、核酸リガンドは、前記核酸リガンドが前記環境刺激に遭遇するときに溶媒から条件付きで封鎖される補欠分子族にコンジュゲートし：
ａ）前記補欠分子族にコンジュゲートした核酸の候補混合物を製造する工程；
ｂ）核酸の候補混合物を、前記補欠分子族のコグネイトリガンドにコンジュゲートした固形支持体と接触させる工程（ここで、補欠分子族が溶媒へ曝露される核酸が前記コグネイトリガンドへ結合する）；
ｃ）前記固形支持体上の前記コグネイトリガンドへ結合する核酸リガンドを回収する工程；
ｄ）工程ｃ）で回収された核酸リガンドを、前記環境刺激の存在下で、前記コグネイトリガンドにコンジュゲートした前記固形支持体と接触させる工程；
ｅ）工程ｄ）において前記固形支持体へ結合しない核酸リガンドを回収する工程；及び
ｆ）工程ｅ）で回収された核酸を増幅して、環境刺激の存在下でのみ前記補欠分子族を溶媒から封鎖する条件付き反応を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工程を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ターゲット分子に対して特定の機能を有する核酸リガンドを、ＳＥＬＥＸ法を使用して産生する方法に向けられている。本発明は、ある刺激の存在下で検出可能な変化を受ける核酸リガンドを提供する。本発明はまた、そのようなリガンドの単離についての方法を提供する。本発明の核酸リガンド及び方法は、あるターゲット分子の検出が必要とされる応用において有用である。
発明の背景
積年のドグマは、核酸が主に情報の役割を担っているということであった。「Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（指数的濃縮によるリガンドの系統進化法）」（ＳＥＬＥＸ法と呼ばれる）として知られる方法により、核酸にはタンパク質と異ならない三次元構造の多様性があることが明らかになった。ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット分子に対して高度に特異的に結合する核酸分子の in vitro 進化の方法であり、「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法」と題した米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在放棄された）、「核酸リガンド」と題した米国特許第５，４７５，０９６号）、及び「核酸リガンドの同定法」と題した米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３号も参照のこと）に記載されていて、これらはいずれも参照により特別に本明細書に組込まれる。本明細書でＳＥＬＥＸ特許出願と総称される、上記出願のそれぞれは、所望のターゲット分子に対する核酸リガンドをつくるための根本的に新しい方法を説明する。
【０００２】
ＳＥＬＥＸ法は核酸リガンド又はアプタマーと呼ばれる一群の産物を提供し、それぞれのリガンドは特有の配列を有し、所望のターゲット化合物又は分子と特異的に結合する特性を有する。ＳＥＬＥＸで同定されるそれぞれの核酸リガンドは、ある一定のターゲット化合物又は分子に特定のリガンドである。ＳＥＬＥＸ法は、核酸が多種多様な二次元及び三次元構造を形成するのに十分な能力と、モノマー又はポリマーのいずれであれ、ほとんどすべての化学化合物との（特異的な結合対を形成する）リガンドとして作用する、そのモノマー内部に供される十分な化学的融通性を有する、という独自の洞察に基づいている。任意のサイズ又は組成の分子がＳＥＬＥＸ法におけるターゲットとして役立ち得る。
【０００３】
高アフィニティー結合の用途に応用されるＳＥＬＥＸ法は、結合のアフィニティー及び選択性の所望される判定基準をほとんどすべて達成するために、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同一の一般選択スキームを使用して結合、分画及び増幅を段階的に反復することを含む。好ましくはランダム化配列のセグメントを含んでなる、核酸の混合物から出発するＳＥＬＥＸ法には、結合に好ましい条件下でこの混合物をターゲットと接触させる工程、ターゲット分子へ特異的に結合した核酸から非結合の核酸を分画する工程、この核酸−ターゲット複合体を解離させる工程、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて、リガンド濃縮した核酸の混合物を産生する工程、次いで、ターゲット分子へ高度に特異的な高アフィニティー核酸リガンドを産生するために、この結合、分画、解離及び増幅の工程を所望されるだけ多くのサイクルで繰り返す工程が含まれる。
【０００４】
化学化合物としての核酸が広範囲の形状、サイズ及び配置を形成し得ること、及び生物学的システムにある核酸により示されるものよりずっと広いレパートリーの結合及び他の機能が可能であることをＳＥＬＥＸ法が示すことは、本発明者により認識されている。
【０００５】
基本のＳＥＬＥＸ法は多数の特別な目的を達成するために変更されている。例えば、いずれも「構造に基づいた核酸の選択法」と題した米国特許出願第０７／９６０，０９３号（１９９２年１０月１４日出願、現在放棄された）と米国特許第５，７０７，７９６号は、ゲル電気泳動と組み合わせて、折れ曲がり（bent）ＤＮＡのような特定の構造特徴をもった核酸分子を選択するためのＳＥＬＥＸ法の使用を説明する。「核酸リガンドの光選択」と題した米国特許出願第０８／１２３，９３５号（１９９３年９月１７日出願、現在放棄された）と、いずれも「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，７６３，１７７号及び米国特許第６，０１１，５７７号は、ターゲット分子に結合する及び／又は光架橋結合する及び／又はそれを光不活性化することが可能な光反応基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸをベースとした方法を説明する。「テオフィリンとカフェインを判別する高アフィニティー核酸リガンド」と題した米国特許第５，５８０，７３７号は、非ペプチドであり得る近縁の分子を判別し得る、カウンターＳＥＬＥＸと命名された、高度に特異的な核酸リガンドを同定する方法を説明する。「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：溶液ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，５６７，５８８号は、ターゲット分子への高アフィニティーと低アフィニティーを有するオリゴヌクレオチドの高度に効率的な分画を達成する、ＳＥＬＥＸをベースとした方法を説明する。
【０００６】
ＳＥＬＥＸ法には、改善された in vivo 安定性又は改善されたデリバリー特性のような、改善された特徴をリガンドに与える修飾されたヌクレオチドを含有する高アフィニティー核酸リガンドの同定が含まれる。そのような修飾の例には、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基の位置での化学的な置換が含まれる。修飾されたヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸ法で同定された核酸リガンドが、「修飾ヌクレオチドを含有する高アフィニティー核酸リガンド」と題した米国特許第５，６６０，９８５号に記載されていて、これはピリミジンの５及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて説明する。米国特許第５，５８０，７３７号、同上は、２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ又はそれ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドについて説明する。「分子内求核置換による既知及び新規２’修飾ヌクレオシドの新規製造法」と題した米国特許出願第０８／２６４，０２９号（１９９４年６月２２日出願、現在放棄された）は、様々な２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドについて説明する。
【０００７】
ＳＥＬＥＸ法には、「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：キメラのＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，６３７，４５９号、及び「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：混合したＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，６８３，８６７号にそれぞれ記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチドの機能ユニットと複合させることが含まれる。上記の応用により、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状や他の特性、並びに効率的な増幅及び複製の特性を、他の分子の所望される特性と組み合わせることが可能になる。
【０００８】
ＳＥＬＥＸ法には、「核酸リガンド複合体」と題した米国特許出願第０８／４３４，４６５号（１９９５年５月４日出願）に記載されるように、選択された核酸リガンドを、診断又は治療の複合体において、親油性化合物又は非免疫原性の高分子量化合物と組み合わせることが含まれる。基本的なＳＥＬＥＸ法の様々な変更について説明する上記特許出願は、いずれもそのまま参照により本明細書に特別に組込まれる。
【０００９】
あるターゲットへの核酸リガンドを同定するための主要なＳＥＬＥＸ法は、（ａ）核酸の候補混合物をターゲットと接触させる工程；（ｂ）ターゲットへのアフィニティーに基づいて前記候補混合物のメンバーを分画する工程；及び（ｃ）選択された分子を増幅して、そのターゲットへの結合について相対的により高いアフィニティーを有する核酸配列について濃縮された核酸の混合物を産生する工程を含む。
【００１０】
ＳＥＬＥＸ法の典型的な態様では、核酸リガンドの候補混合物はＲＮＡ分子を含む。上記（ｂ）の分画工程の後で、ターゲットに対してより高いアフィニティーを有するＲＮＡ分子は、逆転写されてＤＮＡテンプレートを形成する。次いで、このＤＮＡテンプレートをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、増幅されたＤＮＡ分子を転写して、ＳＥＬＥＸ法の次のラウンドへの新たなＲＮＡ候補混合物を提供する。
【００１１】
ターゲットの存在下で物理特性において検出可能な変化を受ける核酸リガンドを提供することが、本発明の目的である。
発明の要約
本発明は、ターゲット分子に対する核酸リガンドを提供し、ここでターゲット又は他の刺激に対する核酸リガンドの反応には、核酸リガンドのある物理特性における検出可能な変化が伴う。好ましい態様では、核酸リガンドにコンジュゲートした補欠分子族の溶媒への接近可能性がターゲット分子の結合時に変化する、核酸リガンドが提供される。そのような溶媒接近可能性における変化は、ターゲット分子への結合による核酸リガンドのコンホメーションにおける変化から生じる。補欠分子族の溶媒接近可能性におけるこの変化により、ターゲットへの結合による補欠分子族の特性において測定可能な差異を生じる。ある態様では、補欠分子族は、その溶媒接近可能性が変化するときに物理特性（例えば、放射スペクトル又は量子収量）において変化を受けるフルオロホア（fluorophore）である。他の態様では、補欠分子族は、補欠分子族の溶媒接近可能性に依存するやり方でリガンドと相互作用する。例えば、補欠分子族はある酵素の阻害剤であり得て、ターゲットの核酸リガンドへの結合時にその酵素の活性が変化する。なお他の態様では、核酸リガンドは酵素にコンジュゲートし、ターゲット又は刺激の存在又は不在時に条件付きで酵素活性の阻害剤として作用する。
【００１２】
本発明はまた、上記の特性を有する核酸リガンドの選択についての方法を提供する。これらの方法は条件付きＳＥＬＥＸと総称される。好ましい態様では、条件付きＳＥＬＥＸは、補欠分子族の溶媒接近可能性における変化を利用して、補欠分子族がターゲットの存在下で溶媒接近可能になるか又は溶媒接近不能になるかのいずれかである核酸リガンドを選択する。溶媒接近可能であるとき、補欠分子族は、固形支持体に固定化されたリガンドへ結合することができる。従って、ターゲットの存在又は不在において補欠分子族を曝露する核酸リガンドは、固形支持体とのその相互作用によって容易に選択され得る。
発明の詳細な説明
定義
本発明の側面について述べるのに本明細書では様々な用語が使用される。本発明の構成内容に関する説明の明確化に役立てるために、以下の定義を提供する：  本明細書で使用されるように、「核酸リガンド」は、ターゲットに対して所望される作用を有する、非天然に存在する核酸である。核酸リガンドはしばしば「アプタマー」と呼ばれるが、「アプタマー」という用語は、本出願を通して「核酸リガンド」と相互交換可能的に使用される。所望される作用には、限定しないが、ターゲットに結合すること、ターゲットを触媒的に変化させること、ターゲット又はターゲットの機能活性を修飾／変化させるやり方でターゲットと反応すること、自殺阻害剤のようにターゲットへ共有結合すること、ターゲットと他の分子との反応を促進することが含まれる。好ましい態様では、この作用はターゲット分子に特異的な結合アフィニティーであり、そのようなターゲット分子は、ワトソン／クリック塩基対合や三重らせん結合に主に依拠する機序を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造体であり、ここで核酸リガンドはターゲット分子により結合される既知の生理学的機能を有する核酸ではない。核酸リガンドには、以下の工程を含んでなる方法により核酸の候補混合物から同定される核酸が含まれる（前記核酸リガンドはある一定のターゲットのリガンドである）：（ａ）この候補混合物をターゲットと接触させる工程（ここで、候補混合物に比べてターゲットに対して増加したアフィニティーを有する核酸が候補混合物の残りから分画され得る）；（ｂ）増加したアフィニティーの核酸を候補混合物の残りから分画する工程；及び（ｃ）増加したアフィニティーの核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸の混合物を産生する工程。
【００１３】
本明細書で使用されるように、「候補混合物」は、所望のアプタマーが選択される、様々な配列をもった核酸の混合物である。候補混合物の供給源は、天然に存在する核酸又はそのフラグメント、化学合成した核酸、酵素的に合成した核酸、又は上記技術の組み合わせにより作られる核酸に由来し得る。好ましい態様では、それぞれの核酸は、ランダム化領域の周囲に、増幅法を促進する固定配列を有する。本発明の好ましい態様では、候補混合物は、より小さいＲＮＡフラグメントから組立てられる合成ＲＮＡ分子からなる。
【００１４】
「ＳＥＬＥＸターゲット」又は「ターゲット」は、それに対するリガンドが所望される、関心対象の化合物又は分子を意味する。ターゲットは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ポリサッカリド、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子等であり得て、制限がない。
【００１５】
本明細書で使用されるように、「核酸」は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡのいずれか、及びその化学修飾物を意味する。修飾には、限定しないが、追加の電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、及び流動性を核酸リガンドの塩基又は核酸リガンド全体に取込む他の化学基を提供するものが含まれる。そのような修飾には、限定しないが、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換；骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンのような、稀な塩基対合の組み合わせ、等が含まれる。修飾には、キャッピングのような３’及び５’修飾も含まれる。本発明では、１つの好ましい修飾は、リボヌクレオチドの２’−酸素にメチル基を位置付けることである。
【００１６】
「ＳＥＬＥＸ」法には、所望されるやり方（例えばタンパク質への結合）でターゲットと相互作用する核酸リガンドを選択することを、この選択された核酸の増幅と組み合わせることが含まれる。この選択／増幅工程のサイクルを選択的に繰り返すことにより、ごく多数の核酸を含有するプールから、ターゲットと最も強く相互作用する１つ又は少数の核酸を選択することが可能になる。選択／増幅法のサイクルは選択される目標が達成されるまで続けられる。ＳＥＬＥＸ法については、「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法」と題した米国特許出願第０７／５３６，４２８号（現在放棄された）、「核酸リガンド」と題した米国特許第５，４７５，０９６号、及び「核酸リガンドの同定法」と題した米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３号も参照のこと）に説明されている。これらの特許及び出願は、いずれも参照により特別に本明細書に組込まれ、ＳＥＬＥＸ特許出願と総称される。
【００１７】
その最も基本的な形態では、ＳＥＬＥＸ法は以下の系列の工程により定義され得る：
１）様々な配列の核酸の候補混合物を製造する。一般に、この混合物には、固定配列の領域（即ち、候補混合物のメンバーのそれぞれが同じ位置に同一の配列を含有する）とランダム化配列の領域が含まれる。固定配列の領域は、（ａ）以下に記載の増幅工程を促進する；（ｂ）ターゲットに結合することが知られている配列を模倣する；又は（ｃ）一定の構造配置をした核酸の候補混合物における濃度を高めることのいずれかのために選択される。ランダム化配列は、全体にランダム化され得る（即ち、任意の位置にある塩基を見出す確率は１／４である）か、又は部分的にのみランダム化され得る（即ち、任意の位置にある塩基を見出す確率を０〜１００％の任意のレベルで選択し得る）。
【００１８】
２）この候補混合物を、ターゲットと候補混合物のメンバーとが結合するのに好ましい条件の下で、選択されたターゲットと接触させる。上記の状況下で、ターゲットと候補混合物の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲットへの最も強いアフィニティーを有する核酸との核酸−ターゲット対が形成されると考えられる。
【００１９】
３）ターゲットへの最も高いアフィニティーを有する核酸を、ターゲットへより低いアフィニティーを有する核酸から分画する。最高アフィニティーの核酸に相当する配列はごくわずかな数しか（１分子の核酸しかない可能性もある）候補混合物に存在しないので、候補混合物にある有意な量の核酸（約５〜５０％）が分画の間に保持されるように、分画の判定基準を設定することが概して望ましい。
【００２０】
４）次いで、ターゲットに対する相対的により高いアフィニティーを有するものとして分画の間に選択される核酸を増幅し、ターゲットへの相対的により高いアフィニティーを有する核酸が濃縮された新たな候補混合物を創出する。
【００２１】
５）上記の分画及び濃縮工程を繰り返すことによって、新たに形成される候補混合物に含まれるユニーク配列はどんどん少なくなり、ターゲットに対する核酸の平均アフィニティー強度は概して増加する。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は、元の候補混合物由来の核酸を代表する、ターゲット分子に対して最高のアフィニティーを有するユニーク核酸を１つ又は少数含有する候補混合物を産生する。
【００２２】
基本のＳＥＬＥＸ法は多数の特別な目的を達成するために変更されている。例えば、いずれも「構造に基づいた核酸の選択法」と題した米国特許出願第０７／９６０，０９３号（１９９２年１０月１４日出願、現在放棄された）と米国特許第５，７０７，７９６号は、ゲル電気泳動と組み合わせて、折れ曲がり（bent）ＤＮＡのような特定の構造特徴をもった核酸分子を選択するためのＳＥＬＥＸ法の使用を説明する。「核酸リガンドの光選択」と題した米国特許出願第０８／１２３，９３５号（１９９３年９月１７日出願、現在放棄された）と、いずれも「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，７６３，１７７号及び米国特許第６，０１１，５７７号は、ターゲット分子に結合する及び／又は光架橋結合する及び／又はそれを光不活性化することが可能な光反応基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸをベースとした方法を説明する。「テオフィリンとカフェインを判別する高アフィニティー核酸リガンド」と題した米国特許第５，５８０，７３７号は、近縁の分子を判別し得る、カウンターＳＥＬＥＸと命名された、高度に特異的な核酸リガンドを同定する方法を説明する。「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：溶液ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，５６７，５８８号は、ターゲット分子への高アフィニティーと低アフィニティーを有するオリゴヌクレオチドの高度に効率的な分画を達成する、ＳＥＬＥＸをベースとした方法を説明する。「ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−１  Ｒｅｖへの核酸リガンド」と題した米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸが実施された後で改善された核酸リガンドを入手する方法を説明する。「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：ケミ（Ｃｈｅｍｉ）−ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドをそのターゲットへ共有結合させる方法を説明する。
【００２３】
ＳＥＬＥＸ法には、改善された in vivo 安定性又は改善されたデリバリーの特徴のような、改善された特徴をリガンドに与える修飾されたヌクレオチドを含有する高アフィニティー核酸の同定が含まれる。そのような修飾の例には、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基の位置での化学的な置換が含まれる。修飾されたヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸで同定された核酸リガンドが、「修飾ヌクレオチドを含有する高アフィニティー核酸リガンド」と題した、米国特許第５，６６０，９８５号に説明されている。これは、ピリミジンの５−及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて説明する。米国特許５，６３７，４５９号、同上は、２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ又はそれ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的な核酸リガンドについて説明する。「分子内求核置換による既知及び新規２’修飾ヌクレオシドの新規製造法」と題した、米国特許出願第０８／２６４，０２９号（１９９４年６月２２日出願、現在放棄された）は、様々な２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドについて説明する。
【００２４】
ＳＥＬＥＸ法には、「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：キメラのＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，６３７，４５９号と「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：混合したＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，６８３，８６７号にそれぞれ記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチドの機能ユニットと複合させることが含まれる。上記の応用により、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状や他の特性、並びに効率的な増幅や複製の特性を、他の分子の所望される特性と組み合わせることが可能になる。
【００２５】
米国特許第５，４９６，９３８号には、ＳＥＬＥＸが実施された後で改善された核酸リガンドを入手する方法が説明されている。「ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−１  Ｒｅｖへの核酸リガンド」と題したこの特許は、参照により特別に本明細書へ組み込まれる。
【００２６】
ＳＥＬＥＸ法は、核酸分子であり、それぞれユニーク配列を有し、及びそのそれぞれが所望のターゲット化合物又は分子へ特異的に結合する特性を有する、一群の産物を提供する。ターゲット分子は、好ましくはタンパク質であるが、特に、炭水化物、ペプチドグリカン、及び多種多様な低分子を包含し得る。ＳＥＬＥＸ法はまた、細胞表面又はウイルスのような生物学的構造体を、その生物学的構造体の必須部分である分子との特異的な相互作用を介してターゲットとするためにも使用され得る。
【００２７】
核酸の診断用の使用において遭遇する１つの潜在的な問題は、オリゴヌクレオチドがそのホスホジエステル形態では、所望の効果が発露されないうちに、エンドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外の酵素により体液中で速やかに分解され得るということである。核酸リガンドの in vivo 安定性を高めるか、又は核酸リガンドのデリバリーを強めるか又は仲介するために核酸リガンドのある種の化学修飾をなし得る。例えば、「修飾ヌクレオチドを含有する高アフィニティー核酸リガンド」といずれも題する、米国特許出願第０８／１１７，９９１号（１９９３年９月８日出願、現在放棄された）、及び米国特許第５，６６０，９８５号を参照のこと。これらは参照により特別に本明細書に組込まれる。本発明において考慮される核酸リガンドの修飾には、限定しないが、核酸リガンドの塩基又は核酸リガンド全体に対して、追加の電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電相互作用、及び流動性を取込む他の化学基を提供するものが含まれる。そのような修飾には、限定しないが、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエート又はリン酸アルキルの修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンのような、稀な塩基対合の組み合わせ、等が含まれる。修飾には、キャッピングのような３’及び５’修飾も含まれる。
【００２８】
修飾はＳＥＬＥＸの前か又は後の修飾であり得る。ＳＥＬＥＸ法の前修飾は、そのＳＥＬＥＸターゲットへの特異性と改善された in vivo 安定性の両方を有する核酸リガンドを産生する。２’−ＯＨ核酸リガンドに対してなされるＳＥＬＥＸ後修飾は、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、改善された in vivo 安定性をもたらし得る。
【００２９】
他の修飾も当業者に知られている。そのような修飾は、ＳＥＬＥＸ法の後（すでに同定された非修飾リガンドの修飾）でか、又はＳＥＬＥＸ法への組込みによりなされ得る。
【００３０】
ある態様では、選択された波長を有する光で核酸リガンドに照射すると、核酸リガンドがそのターゲットと共有結合するようになる。そのような核酸リガンドを入手するための方法が「核酸リガンドの光選択」と題した米国特許出願第０８／１２３，９３５号（１９９３年９月１７日出願、現在放棄された）と、いずれも「指数的濃縮によるリガンドの系統進化法：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，７６３，１７７号及び米国特許第６，０１１，５７７号に詳しく説明されている。それらはいずれも参照により特別に本明細書に組込まれる。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「固形支持体」は、共有結合か非共有結合のいずれかを介して分子が結合され得る任意の表面として定義される。これには、限定しないが、膜、カラム、プラスチック、常磁性ビーズ、帯電紙、ナイロン、ラングミュア・ブロジェット膜、機能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ＰＴＦＥ、ポリスチレン、ガリウム砒素、金、及び銀が含まれる。アミノ、カルボキシル、チオール又はヒドロキシルのような官能基をその表面に取込んで有することが可能である、当技術分野で知られている他の材料も考慮される。これには、限定しないが、球状の表面、溝入りの表面、及びシリンダー表面を含む、任意のトポロジーを有する表面が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「補欠分子族（prosthetic groups）」は、核酸リガンドへコンジュゲートされ得る任意の分子、又は分子の群を意味する。補欠分子族は、限定しなければ、タンパク質、酵素阻害剤、酵素活性化剤、フルオロホア、フルオジェニック化合物、及び抗原であり得る。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「コグネイトリガンド」という用語は、補欠分子族と相互作用し得る任意の分子を意味する。このように、コグネイトリガンドと補欠分子族は、相互作用する対を形成する。限定しなければ、補欠分子族−コグネイトリガンドの対には、抗原−抗体の対、酵素−酵素基質の対、及びビオチン−ストレプトアビジンの対が含まれる。
【００３４】
本発明は、実験的に規定される条件に対して検出のシグナルを産生するような仕方で反応するアプタマーを選択する方法を提供する。この条件は、アプタマーのコンホメーション又は物理特性における変化を引き起こし得る、アプタマーの環境における任意の変化で有り得る。そのような条件の例には、限定しないが、アプタマーが結合するターゲット分子の存在、ｐＨ、イオン強度、光の強度又は波長、温度、電磁場、溶媒の誘電率、酸化還元電位、又は粘度における変化が含まれる。アプタマーは核酸だけであるか、又は核酸と、環境変化へアプタマーを感作し得る他の分子とのキメラであり得る。
【００３５】
シグナル産生には、アプタマーの１つ又はそれ以上の物理特性における変化が必ず関わる。この物理変化は、本発明では、有用なアプタマーが選択されることを可能にする分画の基礎として使用される。刺激の存在下での物理変化についての選択を同じ刺激の不在下での不変状態についての選択と組み合わせることによって、ある条件に対して特異的に反応するアプタマーを選択し得る。この選択法は条件付きＳＥＬＥＸと呼ばれる。
補欠分子族の条件付き利用可能性
本発明の１つの態様では、１つ又はそれ以上の補欠分子族が、コグネイトリガンドと相互作用するその能力が候補アプタマーのターゲットへの結合時に変化するような仕方で、ＳＥＬＥＸ候補混合物へ取込まれる。単一の理論により束縛されずに言えば、補欠分子族のそのコグネイトリガンドへの利用可能性におけるこの差異は、補欠分子族の溶媒接近可能性が、アプタマーがそのターゲットへ結合するときのコンホメーションにおける変化により変化するとき、しばしば生じる。補欠分子族がアプタマーの内部に埋没される場合、それは溶媒へ曝露されず、そのコグネイトリガンドと相互作用し得ない。このことにより、結合性アプタマーと非結合性アプタマーとのアッセイ可能な差異が生じる。つまり、補欠分子族の利用可能性はアプタマーのコンホメーションに依存し、アプタマーの条件付き反応になる。
【００３６】
そのコグネイトリガンドとアッセイ可能な仕方で相互作用する任意の補欠分子族が本発明において考慮される。例えば、補欠分子族は、溶媒へ曝露される場合にのみ抗体により検出され得る抗原であり得る。他のやり方では、補欠分子族は、溶媒へ曝露されるときにだけ酵素を阻害する酵素の阻害剤であり得る。ある態様では、補欠分子族は、アプタマーがターゲットへ結合しているときだけ溶媒へ曝露され、他の態様では、補欠分子族はアプタマーがターゲットへ結合して「いない」ときだけ溶媒へ曝露される。すべての場合において、補欠分子族の存在についてアッセイすることは、ターゲット分子の濃度を明らかにし得る。
【００３７】
補欠分子族をそのコグネイトリガンドへ曝露することの条件付き反応は、条件付きＳＥＬＥＸ法により容易に選択され得る。一般に、このことは、ターゲットの存在又は不在下での補欠分子族のコグネイトリガンドへの結合に基づいてアプタマーを分画することによって達成され得る。例えば、条件付きＳＥＬＥＸ法の１つの態様では、単一のビオチン部分がそれぞれの候補核酸リガンドへ取込まれているＳＥＬＥＸ候補混合物が合成される。このプールにおける核酸は、ビオチンがストレプトアビジンへの結合のために曝露されて利用可能になるか、又はフォールディングによりビオチンが埋没され、利用不能になるかのどちらかの仕方でフォールドする。これら２種のクラスは、ストレプトアビジンカラムを通過させることによって分割され得る。例えば、ターゲットの不在下でビオチンが溶媒へ曝露されるクラスのアプタマーは、候補混合物をターゲットの不在下でストレプトアビジンカラムへ通過させることによって選択され得る。このカラムへ結合しないアプタマーを回収し、次いでこれらのアプタマーをターゲットの存在下でストレプトアビジンカラムへ通過させることが可能であり、このカラムへ結合するアプタマーを回収する。このようにして、ターゲットの存在下でのみビオチンを溶媒へ曝露し、それによりストレプトアビジンへ結合するアプタマーについて選択することが可能である。これらの選択は、ＳＥＬＥＸ法の一部として、所望のアフィニティーと条件付き反応が得られるまで繰り返すことが可能である。ここでは、ビオチンの利用可能性が条件付き反応となるので、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼのような試薬の使用を介して容易に検出され得る。
【００３８】
ある態様では、上記のアプタマーを使用するアッセイが、アプタマーを固形支持体へコンジュゲートすることによって実施され得る。固形支持体を、ターゲット分子を含有すると推測される試験混合物とともにインキュベートして、次いで、固形支持体を洗浄し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートとともにインキュベートすることができる。アルカリホスファターゼシグナルのレベルは試験混合物に存在するターゲットの濃度に比例している。
【００３９】
当業者には、上記の方法が、ターゲット分子の不在下でのみ補欠分子族を曝露するアプタマーについて選択するように適用し得ることを理解されよう。ビオチンの例では、ターゲットの不在下でストレプトアビジンカラムへ結合するアプタマーが回収され、次いでこれらのアプタマーをターゲットの存在下でストレプトアビジンカラムに通過させる。ターゲットの存在下ではこのカラムへ結合しないアプタマーを回収して、ターゲットの不在下でのみストレプトアビジンと相互作用するのにビオチン分子が利用可能になるアプタマーの集合を生じる。そのような場合、例えば、補欠分子族がビオチンであればストレプトアビジンアルカリホスファターゼ法により測定される、溶媒へ曝露される補欠分子族のレベルは、存在するターゲット分子の濃度に反比例する。
条件付き蛍光放射シフトについての選択
本発明の他の態様では、補欠分子族はフルオロホアである。当技術分野では、フルオロホアの量子収量及び放射スペクトルがその直近の環境の誘電率により影響を受けることがよく知られている。臭化エチジウムは馴染みの例である。その蛍光の量子収量は、ＤＮＡの二重らせんの塩基間にインターカレート（挿入）されて、水性溶媒の極性環境からきわめて非極性の環境へ移動するとき、１００倍増加し、その放射スペクトルは１５ｎｍブルーシフトする。フルオレセインはもう１つの例である。それは、抗体結合により水性溶媒から遮蔽されると、蛍光が１６倍減少する。同様に、ナフタレインフルオロホアは、核酸へのインターカレーションにより溶媒から遮蔽されると蛍光が７倍まで増加する。このように、ターゲットへの結合の間にフルオロホアが量子収量及び／又は放射スペクトルにおいて変化を受けるようにフルオロホアにコンジュゲートしているアプタマーは、きわめて有用な試薬となる。
【００４０】
フルオロホアがアプタマーの非極性の内部へ移動すると、その溶媒への接近不能性により、同時に、それに対して向けられた抗体のような、潜在的なコグネイトリガンドへ接近できなくなる。この接近不能性を、条件付きＳＥＬＥＸ法の基礎として使用し得る。
【００４１】
本発明の１つの態様では、フルオロホアを取込む候補混合物（図１Ａ）が、フルオロホアに対して向けられた固定化抗体へ曝露される（図１Ｂ）。結合するターゲット、又は他の刺激は存在していない。フルオロホアが抗体に（従って、その溶媒に）接近可能であるようにフォールドするアプタマーがすべて保持される。フルオロホアを抗体から封鎖するアプタマーをすべて捨てる（図１Ｂ）。
【００４２】
保持された抗体−接近可能アプタマーのプールを回収し、結合ターゲットと混合するか、又は他の方法で関心対象の刺激へ曝露する。この混合物を固定化抗−フルオロホア抗体で再びチャレンジする。この場合には、フルオロホアを条件付きで封鎖したアプタマーは抗体により捕捉されないので、この分画をさらなる増幅及び選択のために保持する（図１Ｃ）。
【００４３】
十分数のこれら対サイクルの後で、候補混合物には、ターゲット又は刺激の不在下で溶媒へフルオロホアを曝露し、ターゲット又は刺激の存在下でフルオロホアを封鎖するアプタマーが濃縮されるだろう。このように、ターゲット又は刺激が、その検出のシグナルとして使用され得る、フルオロホアの量子収量及び放射スペクトルにおける変化を引き起こすのである。
【００４４】
当業者には、ターゲット又は刺激の存在下で溶媒へフルオロホアを曝露するアプタマーも選択され得るように、上記のスキームを逆転させ得ることが理解されよう。
条件付きフルオロジェニック（蛍光産生）反応についての選択
当技術分野では、それ自身は蛍光性でないが、結合の切り離しや再配置のような共有反応の後で蛍光性になる検出試薬が数多く知られている（図２Ａ）。蛍光性の誘導体には結合するが、その非蛍光性の前駆体には結合しない抗体を分画試薬として使用することによって、フルオロジェニック反応を条件付きで行なうアプタマーが選択され得る。このように、一般に、フルオロジェニック基は、そのコグネイトリガンドとは相互作用し得ないように修飾される補欠分子族として作用する。この修飾された補欠分子族は、分子結合の切り離しか又は分子の再配置のいずれかによりその修飾が除去されるときにのみ、そのコグネイトリガンド（抗体）と相互作用し得る。
【００４５】
本発明の１つの態様では、フルオロジェニック前駆体を取込む候補混合物が創出される。この候補混合物をターゲットの不在下でインキュベートすると、フルオロジェニック反応を自発的に促進するアプタマーがそうすることが可能になる。次いで、この候補混合物を、フルオロホアに対して向けられた固定化抗体へ曝露する。この固定化抗体はそのフルオロホアだけを認識し、そのフルオロジェニック前駆体は認識しない。フルオロジェニック反応を促進するアプタマーは抗体へ結合し、捨てられる（図２Ｂ）。
【００４６】
次いで、残る候補混合物をターゲットと混合するか、又は刺激へ曝露し、次いで抗フルオロホア抗体を用いて分画する。ターゲット又は刺激の存在下でフルオロジェニック反応を促進するアプタマーは抗体に結合し、捕捉される。これらのアプタマーは所望の条件付き反応を与え、さらなる増幅及び選択のために保持される。このことにより、ターゲット又は刺激に応じてフルオロジェニック反応を促進するアプタマーの選択を生じる。従って、ターゲットの存在下では、そのようなアプタマーは、そのフルオロホアについて期待される波長での蛍光放射において大きな増加を受ける。
【００４７】
上記のスキームは、フルオロジェニック分子以外の補欠分子族へ拡張され得る。補欠分子族が不活性誘導体（例えば、そのコグネイトリガンドと相互作用し得ない補欠分子族）として候補混合物の核酸へコンジュゲートしていれば、条件付きＳＥＬＥＸは、ターゲットのアプタマーへの結合時にのみその誘導体が活性になるアプタマーについて選択するように実施され得る。例えば、１つの態様では、修飾されたビオチンが候補混合物へ取込まれる。この修飾ビオチンは、ストレプトアビジンのようなビオチン結合性コグネイトリガンドによっては認識されない。ターゲット又は刺激の存在下でビオチンからその修飾を切り離すアプタマーが選択される。次いで、これらのアプタマーは、ストレプトアビジンフルオレセイン、又はストレプトアビジン酵素コンジュゲートにより結合され得て、これが検出シグナルを産生するのに使用される。
【００４８】
このスキームは、シグナルを大きく増幅させるポジティブ・フィードバックを産生するのに適用され得る。この例では、補欠分子族が関心対象のターゲット分子により修飾される。ターゲット分子へ結合し、次いで補欠分子族へ結合しているターゲット分子の切り離しを受けるアプタマーについて選択するために条件付きＳＥＬＥＸが実施される。ターゲットの補欠分子族からの切り離しにより、補欠分子族が検出されることが可能になり、さらに、遊離されたターゲット分子は、そのターゲットにまだ結合していない別のアプタマーのターゲットとして役立ち得る。例えば、グルコースの検出用にポジティブ・フィードバック系が設計され得る。この態様では、補欠分子族は、グルコース基により共有的に修飾されて非蛍光誘導体を形成するフルオロホアである。次いでこの非蛍光誘導体を候補化合物へ取込むことが可能であり、グルコースへ結合し、次いで、グルコース修飾されたフルオロホアの条件付き切り離しを受けて、もう１つのグルコース分子を溶液へ放出するアプタマーについて選択する、条件付きＳＥＬＥＸを実施し得る。このグルコース分子は別のアプタマーと自由に結合するので、この反応を繰り返すと、シグナルの時間についての線形増幅に至る。２個又はそれ以上のグルコース分子を放出するアプタマーが選択されると、この増幅は指数的になるだろう。
【００４９】
上記の例では、検出するように系が設計されているターゲット分子と増幅分子が同じである必要はない。アプタマーの集合は２種のアプタマー、感知するものと増幅するものの混合物であり得る。上記パラグラフの例を拡張すれば、感知するアプタマーは、イオン強度における変化に応じてグルコースを放出するものであり、増幅アプタマーは、グルコースに応じてグルコースを放出するものであろう。このスキームにより、単一のフルオロジェニック反応が任意の実験条件を検出するのに使用されることが可能になる。
シグナル産生分子の条件付きカップリング
他の態様では、シグナルを産生する分子を条件付きで捕捉するアプタマーが選択される。先ず、ターゲット又は刺激の不在下で、固定化されたシグナル分子へ候補混合物が曝露される。ターゲット又は刺激の不在下でシグナル産生分子を捕捉するアプタマーが固定化され、捨てられる（図３Ａ）。光活性化架橋形成による捕捉を含む、共有捕捉が所望される場合、ライブラリーは変性条件下で溶出される。
【００５０】
次いで、候補混合物がターゲット又は刺激へ曝露され、固定化シグナル産生分子で再びチャレンジされる。シグナル産生分子と条件付きで結合するか又は反応するアプタマーが保持され、さらなる選択及び増幅のために回収される（図３Ｂ）。このようにして、ターゲットの存在又は不在下のいずれかでシグナル分子へ結合するアプタマーについて選択することが可能である。
分子ビーコンの条件付き産生
１つのフルオロホア（ドナー）の蛍光放射は、その第一の放射スペクトルを吸収する第二のフルオロホア（アクセプター）により消光され得る。この特性は当技術分野でよく知られていて、核酸ハイブリダイゼーションアッセイやＰＣＲアッセイにおいて利用されてきた。これらのアッセイでは、（消光を可能にする）近接位置にあるフルオロホアを一本鎖の非ハイブリダイズ状態に保つようにフォールドし、ハイブリダイズ時に二本鎖ヘリックスを形成するとアンフォールドして（広がって）、フルオロホアを遠くへ動かし、その消光を解放するプローブが設計される。条件付きＳＥＬＥＸは、ターゲットの存在下で消光フルオロホアを切り離すアプタマーを産生するために使用され得る。
【００５１】
１つの態様では、ドナー−アクセプターの対を含有する候補混合物が構築される。このことは、そのような対を含有する合成プライマーを使用することによって容易になされる。ターゲット又は刺激の不在下で、アクセプターに対して向けられた固定化抗体とともに候補混合物を混合すると、アクセプターを自発的に切り離すアプタマーを捨てることができる（図４Ａ）。候補混合物を回収し、ターゲット又は刺激へ曝露し、アクセプターに対して向けられた固定化抗体と再び混合する。この場合には、依然として抗体へ結合する（従って、アクセプターを保持する）アプタマーが捨てられる（図４Ｂ）。アクセプターを放出する条件付き自己切り離しを受けたアプタマーは抗体による捕捉を逃れ、さらなる増幅及び選択のために回収される。
条件付き酵素連結シグナル増幅
ある態様では、それらにコンジュゲートしている酵素の活性を条件付きで阻害するアプタマーが選択される。酵素は、化学発光、比色、蛍光、又は診断アッセイに好適な他のシグナルを産生するものである。酵素系は増幅されたシグナルを提供する（１つの活性酵素分子は、多くの検出可能な反応生成物の産生を触媒し得る）ので、そのような系は高感度の一工程アッセイを提供する。一般に、酵素は補欠分子族として作用し、基質は酵素のコグネイトリガンドとして作用する。条件付きＳＥＬＥＸは、基質と相互作用する酵素の能力がターゲットの存在又は不在に条件付けられるアプタマーについて選択するために実施される。
【００５２】
好ましい態様では、まず、酵素−アプタマーのキメラ候補混合物が、酵素の活性部位へ緊密に結合する固定化試薬へ曝露される。この試薬は、酵素生成物、切り離し不能の基質類似体、又はある機序に基づいた阻害剤で有り得る。ターゲット又は刺激の不在下では、活性部位試薬により保持されず、従ってアプタマーが活性部位に結合しているために酵素が不活性であると推測されるキメラが回収される（図５Ａ）。次いで、この回収されたプールを刺激又はターゲットにさらし、固定化された活性部位試薬と再び混合する。今回は、この試薬へ結合して、従って酵素が刺激又はターゲットの存在下で活性であるキメラが、さらなる選択及び増幅のために保持される（図５Ｂ）。この選択の結果は、条件付き酵素活性を有するアプタマー−酵素キメラとなるだろう。
【００５３】
本発明の他の態様では、アプタマーの候補混合物の各メンバーが酵素分子と酵素の阻害剤の両方へコンジュゲートされる。この酵素及び阻害剤の対は、阻害剤の基質に対するアフィニティーが十分高くて候補混合物のほとんどが自己阻害されるが、そのアフィニティーは阻害剤が決して酵素から離れないほど高くてはならないように、選択される。そのような阻害剤を付着させたカラムを使用して、条件付きＳＥＬＥＸが実施される。ターゲットの不在下で、カラム結合性の阻害剤へ結合しないアプタマーが回収される。これらのアプタマーはいずれも自己阻害される。ターゲットの存在下で、カラム結合性の阻害剤へ結合するアプタマーが回収される。これらのアプタマーは、そのターゲットとの結合が阻害剤を酵素から引き離すものである。このＳＥＬＥＸの結果は、酵素がターゲットの不在下では阻害され、その存在下では活性になるアプタマーを産生することである。例えば、酵素のアルカリホスファターゼとその阻害剤のグアニリル（α，βメチレン）ジホスホネートを使用してこのスキームを実施し得る。アルカリホスファターゼは、例えば、先ずそれを断片（splint）オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせ、次いでこの断片オリゴヌクレオチドを候補混合物中の核酸へアニールすることによって、候補混合物にある核酸の１つの末端へ付けることができる。阻害剤のグアニリル（α，βメチレン）ジホスホネートは、酵素とは反対の末端で、候補混合物中の核酸に直接コンジュゲートされ得る。上記の条件付きＳＥＬＥＸ法の後で、アプタマーがターゲットへ結合しているときだけにアルカリホスファターゼ活性が存在するアプタマーが選択され得る。
環境刺激又は他の条件を使用する条件付きＳＥＬＥＸ
上記のすべての態様において、ｐＨ、イオン強度、光の強度又は波長、温度、電磁場、溶媒の誘電率、酸化還元電位、又は粘度における変化が限定せずに含まれる、環境刺激又は他の条件に対する条件付き反応を有するアプタマーを選択することが可能であることに留意すべきである。当業者には、条件付き反応を有するターゲット結合性の核酸リガンドを産生するための本明細書に記載のすべての方法が、環境刺激又は他の条件に対する条件付き反応を有する核酸リガンドを産生するために容易に適用され得ることが理解されよう。一般に、ターゲット結合性の核酸リガンドについて濃縮する工程が省略され、核酸リガンドの条件付き反応（補欠分子族を曝露すること、等）が、ターゲットの存在又は不在下ではなく、環境刺激又は条件の存在又は不在下で選択される。例えば、環境刺激の存在下で溶媒へ補欠分子族を条件付きで曝露する核酸リガンドについて選択するには、以下の工程が起こり得る：
ａ）前記補欠分子族にコンジュゲートした核酸の候補混合物を製造する工程；
ｂ）核酸の候補混合物を、前記補欠分子族のコグネイトリガンドにコンジュゲートした固形支持体と接触させる工程（ここで、補欠分子族が溶媒へ曝露される核酸が前記コグネイトリガンドへ結合する）；
ｃ）前記固形支持体上の前記コグネイトリガンドへ結合しない核酸リガンドを回収する工程；
ｄ）工程ｃ）で回収された核酸リガンドを、前記環境刺激の存在下で、前記コグネイトリガンドにコンジュゲートした前記固形支持体と接触させる工程；
ｅ）工程ｄ）において前記固形支持体へ結合する核酸リガンドを回収する工程；及び
ｆ）工程ｅ）で回収された核酸を増幅して、環境刺激の存在下でのみ溶媒へ前記補欠分子族を曝露する条件付き反応を有する核酸について濃縮された核酸の混合物を産生する工程。
【００５４】
上記の工程は、所望の反応性を有する核酸リガンドが得られるまで所望により繰り返し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ターゲットの存在下で溶媒からフルオロホアを封鎖する核酸リガンドを産生するための条件付きＳＥＬＥＸのスキームを示す。
【図２】  図２は、ターゲットの存在下でフルオロホアを産生する核酸リガンドを産生するための条件付きＳＥＬＥＸのスキームを示す。
【図３】  図３は、シグナルを産生する分子を条件付きで捕捉する核酸リガンドを産生するための条件付きＳＥＬＥＸのスキームを示す。この例では、核酸リガンドは、ターゲットへ結合したときにのみシグナル分子を捕捉する。
【図４】  図４は、ターゲットへ結合したときにそれ自身から蛍光アクセプター分子を切り離す核酸リガンドを産生するための条件付きＳＥＬＥＸのスキームを示す。
【図５】  図５は、核酸リガンド−酵素キメラを産生するための条件付きＳＥＬＥＸを示す。ここで酵素の活性部位はターゲットの不在下で封鎖されるが、ターゲットの存在下では曝露される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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