(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物候補物に関連する１以上の感受面結合生体分子を有するバイオセンサーによる薬物候補物のアッセイのための方法であって、該方法が、以下の工程：
該薬物候補物と該バイオセンサーの１以上の感受面結合生体分子との間の結合相互作用を測定して、該薬物候補物の少なくとも１つの結合相互作用パラメータを得る工程；および、
該少なくとも１つの結合相互作用パラメータを、既知の薬物動態パラメータを有する既知の薬物化合物と関連する結合相互作用データから相関される少なくとも１つの数値式と比較して、該薬物候補物の少なくとも１つの薬物動態パラメータの推定を確定する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの薬物動態パラメータが、吸収パラメータ、分布パラメータ、代謝パラメータ、または、排泄パラメータである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの薬物動態パラメータが、分布容量、総クリアランス、タンパク質結合、組織結合、代謝クリアランス、腎クリアランス、肝クリアランス、胆汁クリアランス、腸吸収、バイオアベイラビリティー、相対的バイオアベイラビリティー、内因性クリアランス、平均滞在時間、最大代謝速度、ミカエリス−メンテン定数、組織と、血液または血漿間の分配係数、尿中不変排泄画分、全身的に代謝産物に変換される薬物画分、排出速度定数、半減期、あるいは、分泌クリアランスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織と、血液または血漿間の分配係数が、血液脳関門、血液胎盤関門、血液ヒト乳汁分配、血液脂肪組織分配、あるいは、血液筋肉分配に関連する分配係数である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬物候補物の少なくとも２つの薬物動態パラメータの推定が確定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、該方法が、前記薬物候補物の溶解度性質の推定を確定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
前記バイオセンサーが、質量感受技術を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記質量感受技術が、表面プラズモン共鳴を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
既知の薬物化合物と関連する結合相互作用データから相関される前記少なくとも１つの数値式が、デカルト座標系にプロットされる複数のデータポイントと相関される関数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の感受面結合生体分子が、リポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ  ４５０酵素、代謝酵素、または、輸送タンパク質から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記バイオセンサーが、センサーチップを利用し、該センサーチップは、以下：
該センサー表面に結合するヒドロゲルであって、ここで、該ヒドロゲルが、複数の官能基を有し、そして、前記１以上の感受面結合生体分子が、該ヒドロゲルに結合する、ヒドロゲル、
を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記センサーチップが、以下：
センサー表面を含む自由電子金属であって、ここで、該自由電子金属が、銅、銀、アルミニウム、および、金からなる群から選択される、自由電子金属、
をさらに含む、方法。
【請求項１３】
前記バイオセンサーが、前記自由電子金属に関連する表面プラズモン共鳴を検出し得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒドロゲルが、多糖または水膨潤可能な有機ポリマーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記多糖がデキストランである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記センサーチップのヒドロゲルの複数の官能基が、１つ以上の、ヒドロキシル官能基、カルボキシル官能基、アミノ官能基、アルデヒド官能基、カルボニル官能基、エポキシ官能基またはビニル官能基を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記測定工程が、反射光ビームに関連する信号を時間に関して検出する工程を包含し、ここで、該反射光ビームが、前記自由電子金属との表面プラズモン共鳴を確立する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記反射光ビームに関連する信号が、前記表面プラズモン共鳴の共鳴曲線を規定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記反射光ビームに関連する信号が、前記表面プラズモン共鳴の反射率最小値を規定する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、薬物候補物のアッセイのための方法および装置に関する。より具体的には、薬物候補物とバイオセンサーの感受面結合生体分子との間の結合相互作用を測定して、薬物候補物の結合相互作用パラメータを定め、次に、その結合相互作用パラメータを、所定の薬物相関グラフ（例えば、数値式）に対して比較して、少なくとも１つの薬物動態学的パラメータを推定する方法に関する。
（発明の背景）
様々な実験技術が、現在、特に薬物発見の面で、低分子量物質に関連する化学的性質、物理的性質および生物学的性質を定めるために用いられている。例えば、研究者達は、スクリーニング目的のために、薬物候補物に関連する種々の化学的、物理的および生物学的性質を定めることに関わる場合がしばしばある。このような性質の確定が、薬物開発およびスクリーニング工程において決定的役割を担う場合がしばしばある。
【０００２】
より具体的に言うと、ある全身作用性薬物の薬物動態効果の強度および持続は、その薬物の内因的活性ばかりでなく、ヒトの生体におけるその薬物の吸収、分布、代謝、および、排泄（ＡＤＭＥ）の特性の関数でもあることが従来から長く認められている。これらの所謂ＡＤＭＥ特性は皆「薬物動態学」として公知の科学分野と緊密に関連する。薬物動態学とは、普通、生きている生物体内における、薬物および／またはその代謝産物のＡＤＭＥの動的過程と関連する時間経過（すなわち、速度論）の研究を言い、生物薬剤学、薬理学および治療学の分野と相互に密接に関連する。
【０００３】
生体は、薬物分子の膜を横切る輸送を遅らせ、それらの分子を種々の分布区画に希釈し、それらの分子を代謝産物に変換し、そして最終的にはそれらの分子を排泄するので、有望な新規薬物候補物の薬理効果を正確に予測することが困難な場合がしばしばある。しかしながら、研究者達は、普通、生体内の作用部位における薬物の効力を予測するために、薬物動態学的ＡＤＭＥ研究を一つの方法として用いる。
【０００４】
伝統的に、臨床前ＡＤＭＥ研究に関わる研究者達は、血液（または血清または血漿）および／または尿から得られた実際の薬物濃度データ、ならびに各種組織から得られた濃度データと結合させた薬物動態／数学モデルを用いて、生きている生物内の薬物の振る舞いおよび「運命」を特徴付ける。当業者に明らかなように、薬物動態学と関連づけられる数式は、一般に、生体を、多数区画を有する生物と考えるモデルに基づく。このようなモデルでは、薬物および／またはその代謝産物は、その生物の１またはいくつかの流体／組織に平等に分散されると推定される。速度論的に同種であるかのように振る舞う流体または組織の任意の集合体は、「区画」と名づけ得る。各区画は、進入する薬物分子が均質に分散される等方性流体として作用し、ここで、動的薬物動態過程の速度論的依存性が、その中の薬物および代謝産物の量または濃度の関数として公式化され得る。少し別の言い方をすると、生体の概念的区画は、それら区画の間を薬物が自由に拡散するのを阻止する障壁によって隔てられており；その障壁は、次の点で速度論的に定義が可能である。すなわち、区画の間の膜障壁を横断する、薬物または代謝産物の輸送速度は、例えば、それら区画における薬物および代謝産物の量または濃度、各種膜の透過性、ならびに／あるいは、血漿タンパク質の結合量および一般組織の結合量の関数である、という点である。
【０００５】
より具体的に言うと、薬物動態／数学モデルは、普通、薬物動態学者によって、生体の各種組織および器官内部における、薬物の吸収、分布、代謝および排泄を、時間の関数として表わすのに用いられている。このようなモデルにおいては、投与された薬物の全身に渡る移動は、数学的な項で（例えば、一組の微分方程式として）簡潔に記述される。このようなモデルの予測能力は、考慮の対象である動的過程を支配する本質的な因子をパラメータ化する数学関数の適正な選択と開発にかかっている。
【０００６】
例えば、静注投与された薬物は、急速に、血流中に分布すると仮定し得る。この状況を記述する薬物動態／数学モデルは、その薬物で急速に平衡化されるある容量の流体を含むタンクとし得る。生体内における薬物の１画分は、時間の関数として連続的に除去されるので（例えば、腎臓によって排泄され、かつ、肝臓で代謝される）、この仮定のタンクにおける薬物の濃度は、２個のパラメータによって特徴付けられ得る：（１）薬物を希釈するタンク内の流体の容量、および（２）単位時間当りの薬物排出速度であって、これらの両方が、一般に、一定と考えられている。従って、タンクにおける、既知の一組の薬物濃度が、例えば、サンプリングによって、様々な時間間隔において確定されるならば、タンクにおける流体の容量および薬物排出速度を推定し得る。次に、この情報を順に用いて、人体における薬物の配置を予測し得る。
【０００７】
理論的には、人体の各種組織および器官内における、薬物吸収、分布、代謝、および、排泄の動的過程を記述するのに、無数のモデルを構築し得る。しかしながら、一般に、有用なモデルの数は、血液、組織、および／または、器官のサンプリングに関連する実際的配慮に起因して制限される。その結果、当業者には理解されるように、主要な二つのタイプのモデルが、薬物動態学者によって開発されている：（１）区画モデル；および（２）生理学的モデル。
【０００８】
薬物動態的区画モデルにおいては、生体は、相互に可逆的に連絡する一連の区画として表わされる。各区画は、実際の、生理学的または解剖学的領域ではない；むしろ各区画は、同様の血流および薬物親和性を有する全ての組織を含むものと解釈される。例えば、区画モデルは、血流を表わす１つの中央区画に接続される組織（単数または複数）を表わす１以上の末梢区画からなり得る。概念的には、薬物は動的に中央区画に出入りし、そして末梢区画の各々に出入りする。その場合、速度定数を用いて、各区画内の薬物配置に関する全体速度過程を表わし得る。区画モデルは、一般に、線形常微分方程式を用いる線形仮定に基づき、組織およびそれぞれの組織の薬物濃度に関して既知の情報がほとんど無い場合に特に有用である。
【０００９】
対照的に、薬物動態生理学的モデルは、既知の解剖学的および生理学的データに基づき、データは、薬物の生体の様々な部分への分布を担う実際の血流量という観点で、動的に記述される。生体には多くの組織器官があるので、各組織容量を推定し、かつ、その薬物濃度および変化速度を数学的に記述しなければならない（しかしながら、類似の血液灌流特性を有する組織は、典型的には共に分類される）。残念ながら、このような薬物動態生理学的モデルを十分記述するのに必要な情報の多くは、実験的に入手するのが極めて困難な場合が多い。にも拘わらず、このような生理学的ベースのモデルが、人体における薬物配置を予測するために、動物データおよび種間スケーリング技術と関連して一般に用いられている。
【００１０】
しかしながら、より重要なことは、薬物動態／数学モデル、および、それに関連するＡＤＭＥパラメータに関する知識が、薬物発見および開発において、極めて重要な役割を果たしているということである。典型的な例は、静注投与後では活性であるが、それと同等の経口投薬後では相当に活性が低くなる薬物である。適切な薬物動態情報を有することによって、（１）薬物の吸収が悪く、治療に達しない循環レベルを生じたのかどうか、または、（２）その薬物が、不活性な代謝産物への前全身性代謝を受けたのかどうかが明らかになり得る。このような情報はまた、その後の決定、例えば、（１）塩の形態または処方を変えて薬物吸収が改善されるかどうか、（２）プロドラッグを製造する可能性を研究するかどうか、あるいは（３）非経口的投与経路を考慮するかどうかのような決定のためのガイダンスを供給し得る。
【００１１】
前記に加えて、薬物動態／数学モデルはまた、数ある中でも、以下にとって極めて有用であると一般に考えられている：（１）任意の投薬レジメンを用いて、血漿、組織および尿の薬物レベルを予測すること；（２）個人患者について最適投薬レジメンを計算すること；（３）薬物および／または代謝産物の可能性のある蓄積を推定すること；（４）薬物濃度を、薬理学的および毒物学的活性と関連づけること（すなわち、薬力学）；（５）処方間におけるアベイラビリティーの速度または程度の差を評価すること（すなわち、生物的等価性）；（６）生理学または疾患における変化がどのようにして、薬物の吸収、分布、および／または、排出に影響を及ぼすのかを記述すること；ならびに（７）薬物−薬物相互作用、および食品−薬物相互作用を説明すること。
【００１２】
最後に、薬物動態ＡＤＭＥデータはまた、有望な新規薬物候補物の薬理学的特徴付け工程の肝要な部分となっている。米国食品医薬品局のような統制局は、現在、（１）フェーズＩ薬物研究における薬物動態的ＡＤＭＥデータの確定、および（２）新薬申請の一部として薬物動態ＡＤＭＥデータの提出を要求する。この情況において、このような薬物動態ＡＤＭＥデータは、人体内における薬物候補物の振る舞いおよび運命を予測するのに不可欠である。
【００１３】
従って、当該分野において、薬物候補物の吸収、分布、代謝および排泄に関連する１以上の薬物動態的パラメータを決定するための改良法に関する必要性が存在する。また、そのような方法を実行するのに有用な装置に対する必要性も存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、かつ、さらに関連する利点を供給する。
（発明の要旨）
簡単に言うと、本発明は、薬物候補物をアッセイするための方法および装置に関する。さらに具体的に言うと、本発明は、薬物候補物とバイオセンサーの感受面結合生体分子との間の結合相互作用を測定し、この薬物候補物の結合相互作用パラメータを定め、次に、この結合相互作用パラメータを、所定の薬物相関グラフと比較して、この薬物候補物の少なくとも１つの薬物動態的パラメータを推定するための方法を開示する。この少なくとも１つの薬物動態的パラメータは、例えば、１以上のＡＤＭＥであり得る。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、薬物候補物の少なくとも２つの薬物動態的パラメータが決定され、さらに別の実施形態では、薬物候補物の少なくとも１つの薬物動態的パラメータおよび薬物候補物の溶解度性質が定められる。このような薬物動態パラメータおよび／または溶解度性質は、前記１以上の感受面結合生体分子が、例えば、リポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ４５０酵素、代謝酵素、または、輸送タンパク質から選択される際に定められ得る。
【００１５】
本発明を実施するに当って使用されるバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴のような、質量感受技術（ｍａｓｓ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を利用し得る。さらに、このバイオセンサーは、センサーチップをさらに利用し得、ここで、このセンサーチップは、センサー表面を含む自由電子金属を含み、ここで、その自由電子金属は、銅、銀、アルミニウム、または、金である。このセンサーチップはさらに、センサー表面に結合するヒドロゲルを含み得、ここで、このヒドロゲルは、複数の官能基であり、ここで、１以上の感受面結合生体分子は、ヒドロゲルと共有結合する。
【００１６】
より特異的な実施形態においては、バイオセンサーと共に使用されるよう採用されたセンサー表面が開示される。このセンサー表面は、このセンサー表面の上面と結合した、ヒドロゲルマトリックスコーティングを含み、ここで、ヒドロゲルマトリックスコーティングは、複数の官能基を有する。少なくとも２つの異なるリポソームが、センサー表面のヒドロゲルマトリックスコーティング上の、分離しかつ非接触的な位置において、複数の官能基に結合する。一つの実施形態では、センサー表面がセンサーチップであり、自由電子金属は、ヒドロゲルマトリックスとセンサー表面の上面との間に挿入される。
【００１７】
本発明の別の実施形態においては、薬物候補物をアッセイするための装置が開示され、ここで、装置は、バイオセンサーおよびコンピュータメモリーを含む。すなわち、バイオセンサーは、関連する１以上の感受面結合生体分子を有し、かつ、薬物候補物の少なくとも一つの結合相互作用パラメータを測定することが可能であり；コンピュータメモリーは、少なくとも１つの結合相互作用パラメータを、既知の薬物化合物と関連する結合相互作用データから相関された少なくとも一つの数値式と比較して、薬物候補物の少なくとも１つの薬物動態パラメータの推定値を定めるためのデータ構造を含む。
【００１８】
なおさらなる実施形態においては、本発明の方法に従って薬物候補物をアッセイする際に有用なデータ構造を含むコンピュータメモリーが開示される（および、同構造を伝達する生成データ信号）。このデータ構造は、薬物候補物の少なくとも薬物動態パラメータの推定値を定めるために使用され得る。
【００１９】
本発明の上記およびその他の局面は、下記の詳細な説明および関連する図面を参照することによって明らかとなる。
（発明の詳細な説明）
本発明は、薬物候補物のアッセイ方法に関する。より具体的には、薬物候補物の結合相互作用パラメータを定めるために、少なくとも１つの薬物候補物とバイオセンサーの感受面結合生体分子との間の結合相互作用を測定し、次に、その結合相互作用パラメータを、あらかじめ定められた薬物相関グラフ（例えば、一連の既知のデータ点に適合する数値式）と比較し、少なくとも１つの薬物動態学的パラメータの推定値を決定する方法および装置に関する。本発明の特定の実施形態について多くの特異的詳細が、下記の詳細な説明および添付の図面において示されるけれども、当業者は、本発明はさらなる実施形態を有し得るか、または本発明は、本明細書に記載されるいくつかの詳細なしに実行され得ることを認識する。
【００２０】
分かり易くするため、そして本発明の全範囲の理解を助けるために、薬物動態学に関連する術語について簡単な総覧を与えた。本発明の文脈において使用される場合、下記の薬物動態学用語は、広く解釈され、そして以下に示されるように、その一般的に受容される意味を有するはずである。（前述したように、「薬物動態学」とは、生体における薬物および／またはその代謝産物の、吸収、分布、代謝および排泄（ＡＤＭＥ）の動的過程に関連する速度論研究を指す。）
「吸収」とは、薬物化合物が、投与部位から体循環へ取り込まれる工程を指す。薬物の腸管腔横断輸送は、一般に、経口吸収と呼ばれ、一方、薬物の外部生理学的障壁を横断する輸送は、一般的吸収と呼ばれる。本明細書にて開示される場合、吸収の薬物動態パラメータは、例えば、複数の適切なリポソームをその上に固定させたセンサーチップに関連するバイオセンサーデータから推定が可能である。
【００２１】
「分布」とは、薬物化合物の、投与部位から体循環全体へ、次に、細胞外および細胞内の水および組織への輸送を指す。薬物分布とは通常、速やかかつ可逆的な過程である。本明細書に開示される場合、分布の薬物動態パラメータは、例えば、複数の適切な血漿タンパク質、リポソーム、および／または、輸送タンパク質をその上に固定させたセンサーチップに関連するバイオセンサーデータから推定が可能である。
【００２２】
「代謝」とは、生細胞内で起こる、内因性および外因性物質の生体変換のための全ての化学反応の総計を指す。本明細書で開示される場合、代謝の薬物動態パラメータは、例えば、複数の、適切な代謝酵素をその上に固定させたセンサーチップと関連するバイオセンサーデータから推定することが可能である。
【００２３】
「排泄」とは、薬物の生体からの最終的排出または喪失を指す。薬物排泄は、受動的拡散および比較的特異的なキャリア介在性排泄の両方を含む。薬物は、変化しないかまたは代謝産物として、腎臓を介して尿へ、あるいは、胆汁および／または腸を介して糞便に排泄され得る。揮発性化合物は、しばしば、肺によって呼気に排泄される。本明細書に開示される場合、排泄の薬物動態パラメータは、例えば、薬物を特異的に検出する抗体、およびその薬物候補物に対して高い親和性／特異性を有する他のタンパク質／レセプターをその上に固定させたセンサーチップに関連するバイオセンサーデータから推定が可能である。そのような抗体およびタンパク質／レセプターは、直接結合アッセイを用いて、各種体液（例えば、尿／糞便）および組織における薬物の濃度／量を定量するのに使用され得る。
【００２４】
これらＡＤＭＥパラメータに加えて、薬物の溶解度も、本発明の方法によって測定が可能な重要な性質である。「溶解度」とは、二つの物質が、相互に均質な溶液または混合物を形成する能力を指す。溶解度は、固体投薬形態として与えられる薬物の溶解にとって重要である。本明細書で開示される場合、薬物候補物の溶解度は、バイオセンサーデータの最小およびへこみ形の反射率に関連するセンサーグラム不規則性から推定が可能である。
【００２５】
さらに、本明細書で使用される場合、「パラメータ」という用語は、ある関数（例えば、数値式）において、その関数の特異的形態を決めるが、必ずしもその一般的性質を決めない、定数項または変数項を指す。例えば、ｆ（ｘ）＝ａｘという関数における定数項「ａ」は（この式では、「ａ」は、ｆ（ｘ）によって記述される直線の勾配しか決めない）、パラメータと呼ばれる。同様にして、用語「結合相互作用パラメータ」とは、薬物候補物と感受面結合生体分子との間の結合相互作用に関連する定数項または変数項を指し、例えば、会合および解離速度定数、ならびに最大結合能を含む。同様に、「薬物動態パラメータ」という用語は、薬物候補物の生体内における配置に関連する定数項および変数項を指し、例えば：分布の容量；総クリアランス；タンパク質結合；組織結合；代謝クリアランス；腎クリアランス；肝クリアランス；胆汁クリアランス；腸吸収；バイオアベイラビリティー；相対的バイオアベイラビリティー；内因性クリアランス；平均滞在時間；最大代謝速度；ミカエリス−メンテン定数；組織と血液（または血漿）間の分配係数（例えば、血液脳関門、血液胎盤障壁、血液ヒト乳汁分配、血液脂肪組織分配および血液筋肉分配に関連する分配係数）；尿中不変排泄画分；全身的に代謝産物に変換される薬物画分；排出速度定数；半減期；ならびに分泌クリアランスを含む。
【００２６】
本発明の方法は、親和性に基づくバイオセンサーの使用による実行を意図したものである。当業者に理解されるように、「バイオセンサー」とは、目的の分析物を有する微量のサンプル溶液を分析するための分析デバイスであり、ここで、分析物は、種々の検出法を利用し得る検出デバイスによって分析される。典型的には、そのような方法としては、圧電デバイス法、光学デバイス法、熱光学デバイス法および表面音波（ＳＡＷ）デバイス法のような質量検出法、ならびに電位差測定法、伝導度測定法、電流測定法およびキャパシタンス法のような電気化学的方法が挙げられるがそれらに限定されない。光学的検出法に関して言えば、代表的な方法として、角度、波長または位相を既知とした、内部反射法および外部反射法の両方を含む反射光学法のような、質量表面濃度を検出する方法で、例えば、楕円偏光法および短持続波長分光光度法（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＥＷＳ）があり、後者は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光光度法、ブルースター角度屈折法、臨界角度屈折法、減衰（ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ）全反射法（ＦＴＲ）、短持続波楕円偏光法、散乱全反射法（ＳＴＩＲ）、光学波ガイドセンサー、短持続波準拠画像法（例えば、臨界角度分解画像法、ブルースター角度分解画像法、ＳＰＲ角度分解画像法など）を含む。さらに、例えば、短持続蛍光（ＴＩＲＦ）およびリン光に基づく光度法もまた、導波管干渉計と同様に利用され得る。
【００２７】
下記の詳細な説明および実施例では、本発明は、ＳＰＲ分光光度法との関連において例示される。しかしながら、本発明は、この検出法に限定されるものではないことを理解しなければならない。むしろ、任意の親和性に基づく検出法（ここで分析物は、感受面において不動化されたリガンドに結合する）が、感受面の性質の変化を測定し、そして、表面に固定されたリガンドとの分析物の結合を定量的に示すものである限り利用され得る。ＳＰＲ分光光度法との関連で言えば、一つの例示のクラスのバイオセンサーが、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）という商品名（以後、「ＢＩＡＣＯＲＥ器具」と呼ぶ）で、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって販売されている。このようなバイオセンサーは、ＳＰＲベースの質量感受技術を用いて、表面結合リガンドと目的の分析物との間の「リアルタイム」結合相互作用分析を提供する。
【００２８】
ＢＩＡＣＯＲＥ器具は、発光ダイオード、金の薄層フィルムで被覆されたセンサーチップ、組み込み流体カートリッジおよび光検出器を含む。ダイオードからの入射光は、金のフィルムで反射され、光検出器によって検出される。ある入射角度（「ＳＰＲ角度」）において、表面プラズモン波が、金層に誘起され、これは、反射光における強度損失、または、「へこみ」として検出される。さらに詳細に言うと、当業者に理解されるように、ＢＩＡＣＯＲＥ器具に関連する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象は、金属薄層フィルムに入射する光の、その金属フィルム表面におけるプラズモンと呼ばれる導電性電子の振動に対する共鳴的結合に依存する。この振動は、表面からサンプル溶液へと延びる、短持続場（ｅｖａｎｓｃｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ）を生ずる。共鳴が起こると、反射光強度は、明確に定義される入射角度、すなわち、ＳＰＲ角度において、急落する。この角度は、金属表面近傍の、短持続場の到達範囲内における屈折率に依存する。
【００２９】
少し別の言い方をすると、表面プラズモン共鳴は、金属フィルム−液体界面における光の全反射（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）に関連して起こる光学現象である。通常、光学的に比較的密度の高い媒体（例えば、ガラスプリズム）を貫通して進む光は、光学的に比較的密度の低い媒体（例えば、緩衝液）との界面に達した場合、入射角が臨界角度よりも大きければ、プリズム中に全体として反射される。これは、全反射として公知である。光は全体として反射されるけれども、短持続波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅ）と呼ばれる、入射光モーメントの一成分は、１波長の桁の距離だけ、緩衝液中に侵入する。この短持続波を、界面近傍の分子を励起させるのに用いることが可能である。光が単色光で、かつ、ｐ−偏光型であって、そして媒体間の界面が、薄い（光の波長の画分）金属フィルムでコートされている場合、ある条件下では、短持続波は、金属フィルム表面の自由振動電子（プラズモン）と相互作用する。表面プラズモン共鳴が起こると、光のエネルギーは失われて、金属フィルムに移動し、従って、反射光強度は減少する。
【００３０】
この共鳴現象は、他の全てが定常に保たれている場合、明確に定義される角度で入射した光にのみ起こり、かつ、その角度は、表面近傍の流動緩衝液の屈折率に依存する。従って、共鳴角度を連続的に監視することで、金属フィルム表面から約１μｍまで屈折率変化を追求することが可能である。検出容量は、界面における照明面積サイズおよび短持続場の侵入深度によって規定される。いかなる光もこの検出容量を通過しないということに注意しなければならない（金属フィルムの一方側の光学デバイスが、他側の媒体の屈折率変化を検出する）。
【００３１】
前述したように、ＳＰＲ角度は、金層近傍の媒体の屈折率に依存する。ＢＩＡＣＯＲＥ器具においては、典型的には、デキストランが、金表面に結合し、リガンドがデキストラン層表面に結合する。（バイオセンサー感受面におけるマトリックスコーティングに関する詳細な議論が、米国特許第５，４３６，１６１号に提供され、これは、本明細書中においてその全体において参考として援用される。）目的の分析物を、溶液形態で、流体カートリッジを通じてセンサー表面に注入する。金フィルム近傍の屈折率は、（１）溶液の屈折率（これは一定である）および（２）表面に結合する物質の量に依存するため、結合したリガンドと分析物との間の結合相互作用は、ＳＰＲ角度の変化の関数として監視することが可能である。
【００３２】
ＢＩＡＣＯＲＥ器具からの典型的出力は「センサーグラム」である。これは、時間の関数としての応答プロット（「共鳴単位」または「ＲＵ」で測定したもの）である。１，０００ＲＵの増加は、センサー表面における、約１ｎｇ／ｍｍ2の質量増加に相当する。分析物を含むサンプルがセンサー表面に接触すると、センサー表面に結合するリガンドが、「会合」と呼ばれる工程において分析物と相互作用する。この工程は、センサーグラムにおいてはＲＵの増加で示され、この時、サンプルが始めてセンサー表面に接触させられる。逆に、「解離」は、通常、サンプル流が、例えば緩衝液流に置換される時に見られる。この工程は、センサーグラムにおいては、経時的なＲＵの低下によって示され、この時、分析物は、表面結合リガンドから解離する。ＢＩＡＣＯＲＥ器具の技術的局面およびＳＰＲ現象に関する詳細な議論は、米国特許第５，３１３，２６４号に見出され得、これは、本明細書中においてその全体において参考として援用される。
【００３３】
さらに、ＢＩＡＣＯＲＥ器具に関連して用いられるバイオセンサーのセンサーチップの技術的局面に関する詳細な議論は、米国特許第５，４９２，８４０号に見出され得、これは、本明細書中においてその全体において参考として援用される。この特許は、数ある中で特に、各センサーチップは、複数の感受面を有し得ること、およびそのような感受面は、流体カートリッジの流体サンプル経路に関して直列または並列に配置され得ること、を開示する。この特許はまた、単一のセンサーチップの複数の感受面の各々が、分析物と独自のやり方で相互作用し得る独自の型のリガンドを結合させ得ることを開示する。
【００３４】
例えば、本明細書で開示されるように、ＢＩＡＣＯＲＥ器具の４個の不連続な感受面の各々が、その上に、リポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ  ４５０酵素、その他の代謝酵素および／または輸送／輸出タンパク質のような生体分子を固定し得る。リポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ  ４５０酵素、その他の代謝酵素および／または輸送／輸出タンパク質の内の一つ、あるいはそれらの少なくとも二つの異なるものの選択された組み合わせを、センサーチップの１以上の不連続な感受面に固定化することによって、薬物候補物に関連する１以上の薬物動態パラメータを容易に定め得る。さらに具体的に言うと、本発明の一つの実施形態において、（１）薬物候補物と１以上の適切なリポソームの間の結合相互作用から、その薬物候補物の「吸収」パラメータの推定値を求めることが可能である；（２）薬物候補物と適切な一組の血漿タンパク質（例えば、特異的および非特異的な組織結合および組織透過性）の間の結合相互作用から、その薬物候補物の「分布」パラメータの推定値を求めることが可能である；（３）薬物候補物と適切な一組の代謝酵素の間の結合相互作用から、その薬物候補物の「代謝」パラメータの推定値を求めることが可能である；そして（４）薬物候補物と適切な一組の輸送タンパク質の間の結合相互作用から、その薬物候補物の「排泄」パラメータの推定値を求めることが可能である、ことが見出された。
【００３５】
本発明の文脈において、薬物候補物の「吸収」パラメータを推定するための適切なリポソームは、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質およびスフィンゴ糖脂質のような天然または合成脂質分子由来の有機化合物、ならびにホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ａｃｉｄ）、ホスファチジルイノシトール、ガラクトピラノシド、ジガラクトピラノシド、セラミドホスファチジルコリン、セラミド−ホスファチジルエタノールアミン、セラミド−ホスファチジルセリン、セラミド−ホスファチジルグリセロール、セラミド−ホスファチジル酸、セラミド−ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン分子、グルコシルセラミド、グルコセレブロシド、ガラクトセラミド、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、モノアシルホスファチジルコリン、カルジオリピン分子のクラス由来の有機化合物を含み、これは、８から２４炭素長に渡る、飽和または不飽和の脂肪鎖または過フッ化炭化水素鎖に連結し得、ここで、先頭基に付着する脂肪鎖は、同一構造または別構造、脂質膜に取り込み可能な、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、シトステロールおよびそれらの誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−オクタデシル−１−オクタデカンアンモニウムクロリドまたはＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−オクタデシル−１−オクタデカンアンモニウムブロミド、（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ジアセチルホスフェート、Ｎ−［２，３−ジヘキサデシルオキシ）プロプ−１−イル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ボラアンフィフィル（ｂｏｌａａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）、ポリグリセロールモノアルキルエーテル、ポリエトキシモノアルキルエーテルならびに両親媒性ポリマー、アミノ酸、クラウンエーテル化合物およびジ（アシルオキシ）ジアルキルシランのクラス由来のリポソーム形成性分子であり得る。本発明のリポソーム等は、実施例１に開示される技術によって感受面に不動化され得る。
【００３６】
薬物候補物の「分布」パラメータを推定するのに適切な血漿タンパク質としては、タンパク質、例えば、免疫グロブリンＧ（７ｓ−ｙ−グロブリン）、ＩｇＧ；免疫グロブリンＡ、ＩｇＡ；分泌性ＩｇＡ、ｓＩｇＡ；免疫グロブリンＭ（１９ｓ−ｙ−グロブリン）ＩｇＭ；免疫グロブリンＤ、ＩｇＤ；免疫グロブリンＥ、ＩｇＥ；α１−アンチトリプシン、α１Ｐ１、α１Ａ；α１−アンチキモトリプシン（α１Ｘ−糖タンパク質）α１Ｘ；インター−α−トリプシンインヒビター、１αＴＩ；アンチトロンビンＩＩＩ（ヘパリンコファクター）ＡＴＩＩＩ；α−チオールプロテイナーゼインヒビター（ＬＭＷキニノゲン）αＴＰＩ；Ｃ１−不活性化因子、Ｃ１エステラーゼインヒビター（α２−ノイラミノ（ｎｅｕｒａｍｉｎｏ）糖タンパク質）Ｃ１  ＩＮＡ；α２−マクログロブリン、α２Ｍ；α２−アンチプラスミン、α２ＡＰ；シスタチンＣ（ポスト−ｙ−グロブリン；ｙ−トレース（Ｔｒａｃｅ）タンパク質）；Ｃ１ｑ（１１Ｓタンパク質）；Ｃ１ｒ；Ｃ１ｓ；Ｃ２；Ｃ３（β１Ｃ−グロブリン）、Ｃ４（β１Ｅ−グロブリン）；Ｃ５（β１Ｆ−グロブリン）；Ｃ６；Ｃ７；Ｃ８；Ｃ９；Ｂ因子、（Ｃ３−プロアクチベータ；β２−糖タンパク質ＩＩ、グリシンリッチβ−糖タンパク質）；Ｄ因子（Ｃ３−プロアクチベータコンバターゼ）；プロペルジン、Ｐ；Ｉ因子（Ｃ３ｂ不活性化因子）；Ｃ４−結合タンパク質；フィブリノーゲン、ＦＩ、プロトロンビン、ＦＩＩ；Ｖ因子（プロアクセレリン）；ＦＶ；ＶＩＩ因子、（プロコンベルチン）、Ｆ  ＶＩＩ；ＶＩＩＩ因子：Ｃ（抗血友病因子）Ｆ  ＶＩＩＩ：Ｃ；ＶＩＩＩ因子関連抗原；ＦＶ  ＩＩＩ：Ｒａｇ（フォンビルブラント因子）（ＶＷＦ）；ＩＸ因子（クリスマス因子）Ｆ  ＩＸ；Ｘ因子（スチュワート・プロワー（Ｐｏｗｅｒ）因子）Ｆ  Ｘ；ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｌｓｔｉｎ）前駆物質（ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ））Ｆ  ＸＩ；ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）Ｆ  ＸＩＩ；ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）Ｆ  ＸＩＩＩ；高分子量（ＨＭＷ）キニノゲン（フィッジェラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）因子）；プレカリクレイン（フレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）因子）；プラスミノゲン；タンパク質Ｃ；タンパク質Ｓ；アルブミン、ＡＬＢ；ハプトグロビン、ＨＰ、Ｈｐ１−１、Ｈｐ２−１、Ｈｐ２−２；プレアルブミン（トランスチレチン、チロキシン結合プレアルブミン）；レチノール結合タンパク質ＲＢＰ；チロキシン結合グロブリンＴＢＧ；トランスコルチン（コルチコステロイド結合グロブリン）ＣＢＧ；性ホルモン結合グロブリン（ステロイド結合βグロブリン）ＳＨＢＧ；ビタミンＤ結合タンパク質（Ｇｃ−グロブリン、群特異的成分）ＶＤＢＰ；トランスコバラミン（ｔｒａｎｃｏｂａｌａｍｉｎ）Ｉ、ＴＣＩ；トランスコバラミンＩＩ、ＴＣＩＩ；トランスフェリン（シデロフィリン）ＴＦ；フェリチン；ヘモペキシン、ＨＰＸ；アポリポタンパク質Ａ、Ａｐｏ  Ａ−１、Ａｐｏ  Ａ−ＩＩ；アポリポタンパク質Ｂ、Ａｐｏ  Ｂ−４８、Ａｐｏ  Ｂ−１００；アポリポタンパク質Ｃ、Ａｐｏ  Ｃ−Ｉ、Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩ、Ａｐｏ  Ｃ−ＩＩＩ；アポリポタンパク質Ｅ、Ａｐｏ  Ｅ；アポリポタンパク質（ａ）、ａｐｏ��ａ）；血清アミロイドＡ、ＳＡＡ；α−フェトプロテイン、ＡＦＰ；α１−酸性糖タンパク質（オロソムコイド）α１  ＡＧ；セルロプラスミン、ＣＰ；血清アミロイドＰタンパク質（９．５Ｓ  α１−糖タンパク質；α１−マクログロブリン）ＳＡＰ；α２−ＨＳ糖タンパク質、α２  ＨＳ；フィブロネクチン（冷時不溶性グロブリン）ＦＮ、Ｃ−反応性タンパク質、ＣＲＰ；β２−ミクログロブリン、β２  Ｍ；妊娠特異的β１−糖タンパク質、ＳＰ１；α１−ミクログロブリン、α１  Ｍ、がある。本発明の血漿タンパク質等は、当業者に理解されるような既知の固定化技術を用いて、感受面に固定化され得る。
【００３７】
薬物候補物の「代謝」パラメータおよび／または「排泄」パラメータを推定するのに適切な代謝酵素は、下記のチトクロームＰ４５０酵素のクラスから選択されるチトクロームＰ４５０酵素を含む。すなわち、チオール酸塩が、鉄に対して５番目のリガンドとなる、同酵素のシステイン由来のチオール酸塩（ｔｈｉｏｌａｔｅ）とのプロトポルフィリンＩＸ−鉄複合体によって特徴付けられる活性部位を有するチトクロームＰ４５０酵素である。適切なＣＹＰ４５０酵素としては、チトクロームＰ４５０、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ１、２Ａ２、２Ａ３、２Ａ４、２Ａ５、２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ１、２Ｂ２、２Ｂ３、２Ｂ４、２Ｂ５、２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ１、２Ｃ２、２Ｃ３、２Ｃ４、２Ｃ５、２Ｃ６、２Ｃ７、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１０、２Ｃ１１、２Ｃ１２、ＣＹＰ２Ｄ１、２Ｄ２、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｄ５、２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ１、３Ａ２、３Ａ３、３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７、ＣＹＰ４Ａ１、４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ  Ｐ４５０（ＴＸＡＳ）、ＣＹＰ  Ｐ４５０  １１Ａ（Ｐ４５０ｓｃｃ）、ＣＹＰ  Ｐ４５０  １７（Ｐ４５０１７ａ）、ＣＹＰ  Ｐ４５０  １９（Ｐ４５０ａｒｏｍ）、ＣＹＰ  Ｐ４５０  ５１（Ｐ４５０１４ａ）、ＣＹＰ  Ｐ４５０  １０５Ａ１、ＣＹＰ  Ｐ４５０  １０５Ｂ１が挙げられる。その他の重要な代謝酵素としては、グルタチオン−チオエーテル、ロイコトリエンＣ４、ブチリルコリンエステラーゼ、ヒト血清パラオキソナーゼ／アリールエステラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰＧＴ）アイソザイム、ＴＬ  ＰＳＴ、ＴＳ  ＰＳＴ、薬物グルコシド化結合体酵素、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（ＲＸ：グルタチオン−Ｒ−トランスフェラーゼ）、ＧＳＴ１、ＧＳＴ２、ＧＳＴ３、ＧＳＴ４、ＧＳＴ５、ＧＳＴ６、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＡＤＨ  Ｉ、ＡＤＨ  ＩＩ、ＡＤＨ  ＩＩＩ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、細胞質型アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ１）、ミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ２）、モノアミンオキシダーゼ、ＭＡＯ：Ｅｃ１．４．３．４、ＭＡＯＡ、ＭＡＯＢ、フラビン含有モノアミンオキシダーゼ、酵素スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、アミダーゼ、Ｎ１−モノグルタチオニルスペルミジン、Ｎ１，Ｎ８−ビス（グルタチオニル）スペルミジン、チオエステル、ＧＳ−ＳＧ、ＧＳ−Ｓ−システイン、ＧＳ−Ｓ−システイニルグリシン、ＧＳ−Ｓ−Ｏ３Ｈ、ＧＳ−Ｓ−ＣｏＡ、ＧＳ−Ｓ−タンパク質、Ｓ−カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ、Ｓ−アクチン、メルカプチド、ＧＳ−Ｃｕ（Ｉ）、ＧＳ−Ｃｕ（ＩＩ）−ＳＧ、ＧＳ−ＳｅＨ、ＧＳ−Ｓｅ−ＳＧ、ＧＳ−Ｚｎ−Ｒ、ＧＳ−Ｃｒ−Ｒ、コリンエステラーゼ、リソソーム性カルボキシペプチダーゼ、カルパイン、レチノールデヒドロゲナーゼ、レチニルレダクターゼ、アシル−ＣｏＡレチノールアシルトランデラーゼ（ｔｒｕｎｄｅｒａｓｅ）、葉酸ヒドロラーゼ、タンパク質ホスフェート（ｐｐ）４ｓｔ、ＰＰ−１、ＰＰ−２Ａ、ＰＰ−２Ｂｐｐ−２Ｃ、デアミダーゼ、カルボキシエステラーゼ、エンドペプチダーゼ、エンテロキナーゼ、中性エンドペプチダーゼＥ．Ｃ．３．４．２４．１１、中性エンドペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（これは、ペプチジル−ジペプチダーゼＡまたはアンギオテンシン−変換酵素（ＡＣＥ）Ｅ．Ｃ．３．４．１５．１とも呼ばれる）カルボキシペプチダーゼＭ、ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼＥ．Ｃ．２．３．２．２、カルボキシペプチダーゼＰ、葉酸コンジュガーゼＥ．Ｃ．３．４．１２．１０、ジペプチダーゼ、グルタチオンジペプチダーゼ、膜Ｇｌｙ−Ｌｅｕペプチダーゼ、亜鉛安定性Ａｓｐ−ｌｅｕジペプチダーゼ、腸細胞内（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｉｃ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）ペプチダーゼ、アミノトリペプチダーゼＥ．Ｃ．３．４．１１．４、アミノジペプチダーゼＥ．Ｃ．３．４．１３．２、プロジペプチダーゼ、Ａｒｇ−選択的エンドプロテイナーゼ；刷子縁ヒドロラーゼのファミリー、エンドペプチダーゼ−２４．１１、エンドペプチダーゼ−２（メプリン（ｍｅｐｒｉｎ））、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、膜ジペプチダーゼＧＰＩ、グリコシダーゼ、スクラーゼ−イソマルターゼ、ラクターゼ−グリコシル−セラミニダーゼ、グルコアミラーゼ−マルターゼ、トレハラーゼ、カルボヒドラーゼ酵素類、αアミラーゼ（膵臓性）、ジサッカリダーゼ（一般）、ラクターゼ−フロリジン（ｐｈｈｌｏｒｉｚｉｎ）ヒドロラーゼ、哺乳類カルボヒドラーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼ−イソマルターゼ、ラクターゼ−グリコシルセラミダーゼ、ＲＯＭの酵素供給源、キサンチンオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒト膵臓外分泌酵素、トリプシノーゲン１、トリプシノーゲン２、トリプシノーゲン３、キモトリプシノーゲン、プロエラスターゼ１、プロエラスターゼ２、プロトカーゼ（ｐｒｏｔｃａｓｅ）Ｅ、カリクレイノゲン、プロカルボキシペプチダーゼＡ１、プロカルボキシペプチダーゼＡ２、プロカルボキシペプチダーゼＢ１、プロカルボキシペプチダーゼＢ２、グリコシダーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃａｒｉｄｅ）リパーゼ、コリパーゼ、カルボキシルエステルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼＡ２、ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）、Ｗｉｓｔａｒラット外分泌性膵臓タンパク質、標識タンパク質ＩＥＰ、Ａ１アミラーゼ１、Ａ２アミラーゼ２、リパーゼ、ＣＥＬカルボキシル−エステルリパーゼ、ＰＬプロホスホリパーゼＡ、Ｔ１トリプシノーゲン１、Ｔ２トリプシノーゲン２、Ｔ３トリプシノーゲン３、Ｔ４トリプシノーゲン４、Ｃ１キモトリプシノーゲン１、Ｃ２キモトリプシノーゲン２、ＰＥ１プロエラスターゼ１、ＰＥ２プロエラスターゼ２、ＰＣＡプロカルボキシペプチダーゼＡ１、ＰＣＡ１プロカルボキシペプチダーゼＡ２、ＰＣＢ１プロカルボキシペプチダーゼＢ１、ＰＣＢ２プロカルボキシペプチダーゼＢ２、Ｒリボヌクレアーゼ、ＬＳリソスタチン（ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎ）、ラット肝から精製したＵＤＰＧＴアイソザイムの特徴、４−ニトロフェノールＵＤＰＧＴ、１７ｂ−ヒドロ��システロイド（ｓｔｅｒｉｏｄ）ＵＤＤＰＧＴ、３−ａ−ヒドロキシステロイドＵＤＰＧＴ、モルフィンＵＤＰＧＴ、ビリルビン（ｂｉｌｌｉｒｕｂｉｎ）ＵＤＰＧＴ、ビリルビンモノグルクロニド、フェノールＵＤＰＧＴ、５−ヒドロキシトリプタミンＵＤＰＧＴ、ジギトキシゲニンモノジギトキシドＵＤＰＧＴ、４−ヒドロキシビフェニルＵＤＰＧＴ、エストロンＵＤＰＧＴ、ペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＮ、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＰ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、ｂ−カソモルフィン（ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、アンギオテンシン変換酵素、カルボキシペプチダーゼＰ、アンギオテンシンＩＩ、エンドペプチダーゼ−２４．１１、エンドペプチダーゼ−２４．１８、アンギオテンシンＩ、Ｐ物質（脱アミド化されたもの）、エキソペプチダーゼ、１．ＮＨ２末端アミノペプチダーゼＮ（ＥＣ３．４．１１．２）、アミノペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．１１．７）、アミノペプチダーゼＰ（ＥＣ３．４．１１．９）、アミノペプチダーゼＷ（ＥＣ３．４．１１．−）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＥＣ３．４．１４．５）、ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＥＣ２．３．２．２）、２．ＣＯＯＨ末端アンギオテンシン（ａｎｇｌｏｔｅｎｓｉｎ）変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１）、カルボキシペプチダーゼＰ（ＥＣ３．４．１７．−）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＥＣ３．４．１７．１２）、３．ジペプチダーゼ、ミクロソーム性ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１９）、Ｇｌｙ−Ｌｅｕペプチダーゼ、亜鉛安定性ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ−２４．１１（ＥＣ３．４．２４．１１）、エンドペプチダーゼ−２（ＥＣ３．４．２４．１８、ＰＡＢＡ−ペプチドヒドロラーゼ、メプリン、エンドペプチダーゼ−３、エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．９）、ＧＳＴ  Ａ１−１、α、ＧＳＴ  Ａ２−２α、ＧＳＴ  Ｍ１ａ−１ａ  Ｍｕ、ＧＳＴ  Ｍ１ｂ−１ｂ  Ｍｕ、ＧＳＴ  Ｍ２−２  Ｍｕ、ＧＳＴ  Ｍ３−３  Ｍｕ、ＧＳＴ  Ｍ４−４  Ｍｕ、ＧＳＴ  Ｍ５−５  Ｍｕ、ＧＳＴ  Ｐ１−１  Ｐｉ、ＧＳＴ  Ｔ１−１シータ、ＧＳＴ  Ｔ２−２シータ、ミクロソーム性ロイコトリエンＣ４シンターゼ、ＵＧＴアイソザイム、ＵＧＴ１．１、ＵＧＴ１．６、ＵＧＴ１．７、ＵＧＴ２．４、ＵＧＴ２．７、ＵＧＴ２．１１、膵臓酵素、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ（ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＩＶ））、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＡ、メチルトランスフェラーゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、Ｓ−メチルトランスフェラーゼ、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ＭＮ−メチルトランスフェラーゼ、Ｓ−スルホトランスフェラーゼ、Ｍｇ2+−ＡＴＰアーゼ、成長因子レセプターアルカリホスファターゼ、ＡＴＰアーゼ、Ｎａ，Ｋ+ＡＴＰアーゼ、Ｃａ2+−ＡＴＰアーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、Ｋ+チャンネルを含む。本発明の代謝酵素等は、当業者に認められるような既知の固定化技術を用いて、感受面に不動化され得る。
【００３８】
薬物候補物の「排泄」（および流出、吸収、分布）パラメータを評価するのに適切な輸送タンパク質としては、グルコースａ．Ｎａ+−グルコース共同輸送体ＧＬＵＴ１、ｂ．促進輸送体、ＧＬＵＴ１−５、ＧＬＵＴ−２、中性アミノ酸輸送体、Ｎａ+−独立系Ｌアミノ酸輸送体、陽イオンアミノ酸、Ｙ+陽イオン性Ｌ−アミノ酸輸送体、ジペプチドＨ+共同輸送、ヌクレオシドＮａ+−依存性および促進性共同輸送体、タウリンＮａ+およびＣｌ-依存性共同輸送体、胆汁酸Ｎａ+／胆汁酸共同輸送体、Ｎａ+−非依存性胆汁酸輸送体、ＡＢＣ輸送体、プロスタグランジン促進性輸送体、Ｎａ+／Ｈ+交換対向輸送体、リン酸Ｎａ+／Ｐｉ共同輸送体、硫酸Ｎａ+−共同輸送体、神経伝達物質輸送体、ノルエピネフリンＮａ+／Ｃｌ-共同輸送体、ドーパミンＮａ+／Ｃｌ-共同輸送体、セロトニンＮａ+／Ｃｌ-共同輸送体、ＧＡＢＡ、ＧＡＴ−１、Ｎａ+／Ｃｌ-依存性共同輸送体、グリシンＮａ+／Ｃｌ-依存性共同輸送体、グルタミン酸Ｎａ+共同輸送体、Ｋ+／ＯＨ-対向輸送体、ＡＢＣ輸送体、Ｐ−糖タンパク質（ＭＤＲ１、ＭＤＲ２またはＭＤＲ３）、Ｃｌ-チャンネル（ＣＦＴＲ）、抗原性ペプチド、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２ヘテロダイマー、肺抵抗タンパク質（ＬＲＰ）、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２またはｃＭＯＡＴ）、多剤耐性タンパク質３（ＭＲＰ３）、多剤耐性タンパク質４（ＭＲＰ４）、多剤耐性タンパク質５（ＭＲＰ５）、多剤耐性タンパク質６（ＭＲＰ６）、ｍｒｐ（マウス）、ＥＢＣＲ（ウサギ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｍｒｐｌ（線虫）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｍｒｐ２（線虫）、ＭＲＰ６（ヒト）、ＹＣＦ１（酵母）、ＡｔＭＲＰ１（シロイヌナズナ）、ＳＵＲ１（ヒト）、ｓｕｒ２（ラット、マウス）、ＹＯＲ１／ＹＲＳ１（酵母）、ＬｔｐｇｐＡ（リーシュマニア）、肝臓アミノ酸輸送系、中性アミノ酸輸送体、ＭｅＡＩＢ、ジカルボキシルアミノ酸、中性アミノ酸（分枝鎖）、ｂ−アミノ酸、長鎖脂肪酸、モノグリセリド、Ｌ−リソホスファチジルコリン、ビリルビン輸送タンパク質、ビリトランスロカーゼ（ｂｉｌｌｉｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ）（ＢＴＬ）、有機陰イオン結合タンパク質（ＯＡＢＰ）、ＢＳＰ／ビリルビン結合タンパク質、シグナルレセプターおよびトランスダクション−ヒドラーゼ、ＡＴＰアーゼ、Ｎａ+依存性／非依存性胆汁酸輸送、ビリルビン／ＢＳＰキャリア（Ｃｌ-依存性）、ＳＯ／ＯＨ交換体Ｃｌ-チャンネルＮａ+／Ｈ+交換体、Ｎａ+／ＨＣＯ3共同輸送、ＧＳＨ結合体キャリア、ＧＳＳＨ結合体キャリア、ＧＳ結合体キャリア、ＳＯ4／ＨＣＯ3交換体、Ｎａ+依存性アミノ酸輸送、双極性アミノ酸輸送体、塩基性アミノ酸、システイン、イミノ酸Ｃｌ-、ｂ−アミノ酸Ｃｌ-、ＸＡＧ酸性アミノ酸Ｋ+、Ａ双極性ａ−アミノ酸、３炭素および４炭素双極性アミノ酸、Ｌ嵩高疎水性双極性アミノ酸、ｙ＋塩基性アミノ酸、葉酸塩輸送体、ｃｂｌ輸送タンパク質、Ｎａ+−Ｋ-−ＡＴＰアーゼ、胆汁酸輸送体（ＢＡＴ）、タンパク質キナーゼＣ、Ｎａ+／Ｉ-共輸送体（ＮＩＳ）；胆汁塩輸出ポンプ（ＢＳＥＰ、ｃＢＡＴ、ＳＰＧＰ）；腸管の胆汁酸輸送体；プリン選択的Ｎａ+−依存性ヌクレオシド輸送体（ｈＳＰＮＴＩ）；ピリミジン選択的Ｎａ+−依存性ヌクレオシ���輸送体（ｃＮＴＩ）；ミトキサントロン輸送体（ＭＸＲ１およびＭＸＲ２）；腸管のオリゴペプチド輸送体（ＰｅｐＴ１）；腎オリゴペプチド輸送体（ＰｅｐＴ２）；乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）が挙げられる。本発明の輸送／流出タンパク質等は、当業者に認められるような既知の固定化技術を用いて、感受面に不動化され得る。
【００３９】
上述したように、薬物候補物の吸収、分布、代謝および排泄（ＡＤＭＥ）の薬物動態パラメータは、その薬物候補物と、バイオセンサーの適切な感受面結合生体分子（例えば、上に特定したような、各種リポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ４５０酵素、その他の代謝酵素および／または輸送／流出タンパク質）との間の結合相互作用から求めることが可能である。すなわち、薬物候補物と、リポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ４５０酵素、その他の代謝酵素および輸送／流出タンパク質から選択された、１以上の感受面結合生体分子との間の結合相互作用を、ＢＩＡＣＯＲＥ器具によって測定し、その薬物候補物の「結合相互作用パラメータ」を定めることが可能である。次に、推定された結合相互作用パラメータを、順にあらかじめ定められた薬物相関グラフと比較し、その薬物候補物の１以上の吸収、分布、代謝および排泄「薬物動態パラメータ」を推定することが可能である。さらに、薬物候補物の薬物動態パラメータは、例えば、分布容量；総クリアランス；タンパク質結合；組織結合；代謝クリアランス；腎クリアランス；肝クリアランス；胆汁クリアランス；腸吸収；バイオアベイラビリティー；相対的バイオアベイラビリティー；内因性クリアランス；平均滞在時間；最大代謝速度；ミカエリス−メンテン定数；組織と血液（または血漿）間の分配係数（例えば、血液脳関門、血液胎盤障壁、血液ヒト乳汁分配、血液脂肪組織分配および血液筋肉分配に関連する分配係数）；尿中不変排泄画分；全身的に代謝産物に変換される薬物画分；排出速度定数；半減期；ならびに分泌クリアランスからなる群から選択され得；これらのいずれも、選択薬物−生体分子相互作用の適切なセンサーグラムから定めることが可能である（あるいは、これらは、デジタル化相互作用プロフィールから、主要成分分析にてスコアベクトルを抽出して求め得、他の既知の多変量法を用いて求め得る）。
【００４０】
例えば、薬物候補物と選択された感受面結合生体分子との間の見かけの平衡定数を推定するために、下記の手順を利用することも可能である。先ず、薬物候補物の濃度系列（例えば、０、２０、５０、１００、５００および１０００μＭ）を調製し得、次に、動作的にセンサーチップを接続させたバイオセンサーに注入し得る。ここで、センサーチップは、参照感受面を有し、そして表面結合生体分子を備える少なくとも１つの感受面を有する。次に、各薬物濃度レベルについての定常結合レベルにおける相対応答を測定し得る。バイオセンサーの流動緩衝液中の溶媒添加物からのバルクの屈折率寄与があるので、補正係数を計算し（既知の較正手順を用いて）かつ適用して、補正相対応答を与え得る。次に、各薬物濃度についての補正相対応答を、当業者の理解するやり方で数学的に評価し、見かけの平衡定数を推定し得る。
【００４１】
さらに具体的に言うと、薬物候補物と選択された感受面結合生体分子との間の見かけの平衡定数（ＫＤ）は、測定された平衡（Ｒeq）データおよび既知の薬物濃度（Ｃ）データを、以下の方程式（１）：
Ｒeq＝Ｃ*Ｒmax／（Ｃ＋ＫＤ）＋オフセット  （１）
に適合させることによって計算が可能である。ここで、Ｒmaxは、感受面の最大結合能である。あるいは、見かけの平衡定数（ＫＤ）は、薬物候補物の、僅か２種の濃度（すなわちＣ１とＣ２）から以下の方程式（２）：
ＫＤ＝（ＲeqC1／Ｃ１−ＲeqC2／Ｃ２）（ＲeqC2−ＲeqC1）  （２）
を用いて計算することも可能である。次に、薬物の特定のモル濃度における推定の見かけの平衡定数（ＫＤ）または結合レベルを、順にあらかじめ定められた薬物相関グラフと比較して、薬物候補物の１以上の吸収、分布、代謝および排泄パラメータを推定し得る。
【００４２】
本発明の文脈において、あらかじめ定められた薬物相関グラフとは、既知の薬物化合物と関連する結合相互作用データから展開された数値式または関数を指す。例えば、既知の化合物についての既知の結合相互作用パラメータ（例えば、薬物の特定のモル濃度における見かけの平衡定数および／または結合レベル）が横軸（すなわち、ｘ−軸）にプロットされ、バイオセンサーを介して得られた、対応する測定された結合相互作用パラメータが縦軸（すなわち、ｙ−軸）にプロットされる（あるいは、その逆）相関グラフを構築することが可能である。少し別の言い方をすれば、この相関プロットは、既知の親和性データと測定された親和性データを相関させる数値式のグラフ表示である。
【００４３】
選択された、薬物−生体分子相互作用から得られた結合相互作用パラメータ推定値を、既知の親和性データおよび測定した親和性データから相関させた数値式（すなわち、相関グラフ）と比較することによって、驚くべきことに、薬物候補物に関連する薬物動態ＡＤＭＥパラメータの推定値が、正確に予測可能であることが発見された。さらに、少なくとも２種の異なるリポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ４５０酵素、その他の代謝酵素、および／または、輸送／流出タンパク質の選択された組み合わせを、センサーチップの１以上の不連続な感受面に不動化することによって、さらに驚くべきことに、薬物候補物に関連する少なくとも２つの薬物動態パラメータを容易に定めることが可能であることが発見された。その上、各種リポソーム、血漿タンパク質、ＣＹＰ４５０酵素、その他の代謝酵素、および／または、輸送／流出タンパク質の選択された組み合わせを、バイオセンサーの感受面上（例えば、生体分子の異なるスポットの所定の線で）に不動化することによって、薬物候補物特性マトリックスのようなＡＤＭＥパターンまたはプロフィールを容易に開発することが可能である。このようなＡＤＭＥプロフィールは、薬物スクリーングのために極めて有用である。
【００４４】
上に開示されるように、バイオセンサーの屈折率変化を監視することによって、１以上の薬物動態パラメータを定めることに加えて、薬物−生体分子相互作用信号の最小値、最大値、または、中心値を監視することによって（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／０９６１８号に開示されるように（これは、本明細書中においてその全体において参考として援用される））、薬物候補物の溶解度をも同時に（１以上の薬物動態パラメータと共に）定めることが可能である。より具体的に言うと、薬物候補物の溶解度は、薬物−生体分子相互作用のセンサーグラムに示されるように、反射最小値（Ｒmin）およびへこみ形データからばかりでなく、不規則性からも評価／同定が可能である。一般に、沈殿の起こる濃度を溶解度限界と言う；この性質は測定に重要な場合がある。なぜなら、これは、薬物候補物が、他のやり方で示されるよりも大きな親和性を有することを示す可能性があるからである。
【００４５】
薬物候補物の溶解度問題は検出が可能である。なぜなら、不溶粒子（すなわち、沈殿物）は、感受面結合生体分子に結合し、それによって、感受面を非均一にする傾向があるからである。（均一表面は、全体が同じ表面濃度を有するが、一方、非均一表面は、濃度混乱を有する）。実際、非均一感受面は、いくつかの屈折率を測定し、それらは皆バイオセンサー検出器において共に平均化される。単一ではあるが非均一な感受面から得られるこのような複数測定値は、反射最小値の増加とそれに関連するへこみの広がりをもたらす傾向がある。
【００４６】
どのようにしてセンサーグラム不規則性を使用して、溶解度問題（すなわち、沈殿物の存在）を同定するかを示す事例を、図１Ａ〜Ｃに示す。より具体的に言うと、ある選択された薬物−生体分子相互作用に関連する、定常状態結合レベルは、一般に、図１Ａに示される。定常状態結合を反映するセンサーグラムの頂上区域を拡大するかまたは「ズーム」することによって、センサーグラムの不規則性は、対応する図１Ｂに示すようにさらに明らかになる。このセンサーグラム不規則性は、対応する図１Ｃに示すように、参照差引データ（すなわち、バルクの屈折率効果を除去する）を用いることによってさらに明らかになる。
【００４７】
どのようにして反射最小値（Ｒmin）およびへこみ形データを使用して、溶解度問題（すなわち、沈殿物の存在）を同定するかを示す事例を、図２Ａ〜Ｃに示す。より具体的に言うと、均一表面は、全体が同じ表面濃度を有し、従って図２Ａに示すように、反射光強度に関して、単一の「へこみ」をもたらす。沈殿物が、感受面に結合すると、感受面は非均一になり、これは、それぞれ図２Ｂと２Ｃに示すように、反射最小値の増加およびそれに関連するへこみの広がりをもたらす傾向がある。
【００４８】
薬物候補物アッセイのための前記方法に基づいて、現在では、研究者達は、単一の分析器具を用いることによって、薬物候補物の異なるいくつかの薬物動態パラメータを同時に測定し、そしてその薬物候補物の溶解度をも測ることが可能である。本発明は、薬物発見および開発を単純化し、かつ、その速度を向上させる。なぜなら、重要な薬物動態データが今では、工程の比較的早期に簡単に入手可能となるからである。
【００４９】
前記の方法に加えて、本発明はまた、そのような方法を実行するのに適応した装置にも向けられる。より具体的に言うと、本発明の装置は、関連する感受面を有するバイオセンサー、および本明細書に開示される方法と関連する工程の実施を容易にするコンピュータシステムを含む。このコンピュータは、薬物候補物のアッセイに有用なデータ構造を含むコンピュータメモリーを含み；このデータ構造は、既知の薬物化合物に関連する結合相互作用データを含み、その結果、そのデータ構造を用いて、薬物候補物の少なくとも薬物動態パラメータの推定値を定める。
【００５０】
薬物候補物のアッセイに有用なデータ構造を含むコンピュータメモリーに関連する本発明の局面は、図３に示すハイレベルコンピュータのブロックダイアグラムとの関連においてさらに十分に例示され得る。
【００５１】
示されるように、このようなコンピュータシステム３００は、１以上の中央処理ユニット（ＣＰＵ）３１０、入力／出力デバイス３２０および薬物候補物アッセイに有用なデータ構造を含むコンピュータメモリー（メモリー）３３０を含む。入力／出力デバイスの中には、ハードディスクドライブのような記憶装置デバイス３２１およびソフトウェア製品をインストールするのに使用され得るコンピュータ読み取り可能なメディアドライブ３２２がある。このメディアドライブでは、ソフトウェア製品が、ＣＤ−ＲＯＭのようなコンピュータ読み取り可能な媒体で提供される。入力／出力デバイスはまた、コンピュータシステム３００が、ネットワークのような、その他の接続コンピュータシステムと通信し得るネットワーク接続３２３を含む。入力／出力デバイスはまた、ディスプレイ３２４およびデータ入力デバイス３２５とを含んでもよい。
【００５２】
メモリー３３０は、好ましくは、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）のようなオペレーティングシステム３３１を含み、それによって、他のプログラムに、コンピュータシステムのリソースへのアクセスを供給する。メモリー３３０は、好ましくはさらにソフトウェア３３２を含む。薬物候補物のアッセイに有用なデータ構造を含むコンピュータメモリーは、前述のように構成されるコンピュータシステムで好ましくは実行される一方で、当業者は、同メモリーはまた、異なる構成を有するコンピュータシステムでも実行され得ることを理解する。
【００５３】
関連局面において、本発明はまた、薬物候補物のアッセイに有用なデータ構造を伝達する生成データ信号にも向けられる。前述したように、このデータ構造は、既知の薬物化合物に関連する結合相互作用データを含み、その結果、そのデータ構造を用いて、薬物候補物の少なくとも薬物動態パラメータの推定値を定め得る。
【００５４】
なおさらなる実施形態において、バイオセンサーとの使用に適応したセンサー表面が開示される。このセンサー表面は、センサー表面の頂上面に結合したヒドロゲルマトリックスコーティングを有する。ここで、ヒドロゲルマトリックスコーティングは、複数の官能基を有し、そして異なる少なくとも２種のリポソームが、センサー表面のヒドロゲルマトリックスコーティング上の、不連続かつ非接触性の部位において、複数の官能基に結合する（実施例１に開示されるように）。前述のＢＩＯＣＯＲＥ装置との関連で言うと、センサー表面は、好ましくは、センサーチップの形態であり、ここで、センサーチップは、ヒドロゲルマトリックスとセンサーチップの頂上面との間に介在した自由電子金属を有する。この点で、適切な自由電子金属としては、銅、銀、アルミニウムおよび金が挙げられる。
【００５５】
センサー表面は、異なる型のリポソームと複数の官能基との間に介在した脂肪親和性物質を有し得、ここで、この脂肪親和性物質は、その複数の官能基に共有的に結合する。代表的な脂肪親和性物質は、ステアリルアミンのような、１２から２４個の炭素原子を有するアルキル鎖を含む。同様に、代表的なリポソームは、１，２−ジミリストール−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）および１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）を含む。本発明のセンサー表面はまた、関連した非リポソーム性生体分子を有し得る。例えば、ヒト血清アルブミン、ＣＹＰ４５０酵素、代謝酵素および／または輸送タンパク質を、センサー表面のヒドロゲルマトリックスコーティング上の、不連続かつ非接触性の部位において、複数の官能基に結合させてもよい。
【００５６】
限定目的ではなく例示のために、下記の実施例が、本発明の様々な局面をさらに具体的に開示する。
【００５７】
（実施例）
（実施例１）
（３種の薬物候補物Ａ〜Ｃについての溶解度、血漿タンパク質結合、脂肪親和性および腸吸収の同時測定）
本実施例は、バイオセンサーの、四つの異なるフローセルそれぞれから得られた情報の組み合わせが、特徴分析マトリックス（ｃｈｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）においていかに表示され得るかを開示する。このマトリックスでは、前記三つの薬物候補物Ａ−Ｃの各々が、リード薬物化合物の選択にとって有用な、品質パターン（すなわち、ＨＳＡ結合％、脂肪親和性予測値、溶解度、および、ＦＡ％予測値）を具体的に示す。
【００５８】
（センサーチップの調製）
ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の、４個の不連続な感受面の内３個を、ＣＭ５センサーチップが、下の表１に示すような、表面結合生体分子を持つように修飾した。
【００５９】
【表１】
0004543187.tif 000002
より具体的に言うと、ステアリルアミンの、表面／セル番号３および４に対する共有結合的付着を実現するために、下記の手順を利用した。先ず、ＣＭ５センサーチップを、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）内に挿入した。２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む流動緩衝液流（等張リン酸緩衝液、ｐＨ７．０（９．６ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4−２Ｈ2Ｏ、１．７ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、４．１ｇ  ＮａＣｌを合わせて１リットルに））を、適切なソフトウェア指令を用いてフローセル３および４に向けた。次に、水に溶解させた、０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミドと５０ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの混合物を、フローセル３と４の上を１０分間流れるよう、バイオセンサーに注入した。次に、ＣＭ５センサーチップを、流動緩衝液で洗浄し、バイオセンサーから取り出し、あらかじめエタノールで湿らせた数層のティッシューペーパー上のペトリ皿に移した。次に、露出した感受面を、９９％エタノールに溶解させた１０ｍＭステアリルアミン３０μｌで処理した。さらに４５分後、ＣＭ５センサーチップをエタノールで、次に水で穏やかに洗浄した。次に、この露出感受面をさらに、ｐＨ８．５の１Ｍエタノールアミン液５０μｌにて処理した。最後に、さらに１０分後に、感受面をＨＢＳ緩衝液にて洗浄した。
【００６０】
ステアリルアミンを、表面／セル番号３および４に共有結合的に付着させた後、そしてＨＢＳ緩衝液で洗浄したばかりのＣＭ５センサーチップを窒素で送風乾燥し、バイオセンサーに再度挿入した後で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＤＭＰＣ−リポソーム、および、ＰＯＰＣ−リポソーム（Ｓｉｇｍａから市販される）を、それぞれ、表面／セル番号２、３および４に捕捉させた。これらの生体分子を捕捉するには、下記の手順を用いた。
【００６１】
ヒト血清アルブミンを捕捉するには、最初、適切なソフトウェア指令を用いて、流れを、フローセル２に向けた。次に、フローセル２の感受面を、ＥＤＣ／ＮＨＳにて、７分間活性化した。次に、１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．２に１５μｇ／ｍｌで溶解させたヒト血清アルブミンを７分間注入し；次に、１ＭエタノールアミンｐＨ８．５をさらに７分間注入した。この工程によって、９−１２ｋＲＵのヒト血清アルブミンの、表面／セル番号２の感受面に対する不動化がもたらされた。
【００６２】
２種の異なるリポソームを捕捉するために、流れを、先ず、フローセル３に向け、５−７ｋＲＵのＤＭＰＣリポソームを捕捉するまで、０．５−１ｍＭ  ＤＭＰＣリポソームを注入した。次に、流れをフローセル４に向け、５−７ｋＲＵのＰＯＰＣリポソームを捕捉するまで、０．５−１ｍＭ  ＰＯＰＣリポソームを注入した。最後に、バイオセンサーのフローシステムを１００ｍＭ  ＮａＯＨで洗浄し、自動注入器の管状材料を、０．５％ＳＤＳおよび５０ｎＭグリシンｐＨ９．５で洗浄し、微量脂質を除去した。
【００６３】
（較正手順）
ＤＭＳＯ溶媒添加物によるバルクの屈折率寄与を下げることによってデータ品質を向上させるために、較正手順を用いた。（較正手順では、各種ＤＭＳＯ濃度が必要とされることに注意。）流動緩衝液は２％ＤＭＳＯを含むので、１．５％から３．０％の範囲に渡る各種ＤＭＳＯ濃度を持つ、一連の８から１０種の較正液を調製した。各較正液を、バイオセンサーの連続注入モードを用い、４個の感受面のそれぞれの上に順々に注入し、それぞれの定常状態結合レベルを測定した。次に、フローセル１の参照感受面の相対的応答（ＦＣ１は、参照面として、未修飾ＣＭ５を有する）を、それぞれフローセル２、３および４の標的感受面の対応較正応答から差引き、相対的応答の関数としてプロットした。このプロットから、各感受面について、較正関数が計算された。
【００６４】
次に、この較正関数を用いて、三つの薬物候補物Ａ−Ｃを含むサンプルについて、適切な補正係数を計算した。すなわち、薬物候補物を含むサンプルについて、参照感受面の定常状態結合レベルの相対的応答（すなわち、フローセル１からの信号）を測定し、かつ、それぞれの較正関数を用いて、各薬物候補物について適切な補正係数を計算した。次に、この補正係数を、参照応答とサンプル応答との間の差に適用して（すなわち、差引きして）、ＤＭＳＯ溶媒添加物からの、バルクの屈折率寄与が取り除かれた応答を得た。
【００６５】
（薬物候補物Ａ−Ｃの補正相対応答）
修飾されたＣＭ５センサーチップ（前記表１で示したように表面結合生体分子を有するもの）を用いて、三つの薬物候補物Ａ−Ｃの結合相互作用を測定した。各薬物候補物についての濃度系列（すなわち、０、２０、５０、１００、５００および１，０００μＭ）を調製し、各フローセルに対応する４個のセンサーグラムが展開するように、連続モードにて、順番にバイオセンサーに注入した。各薬物濃度についての定常状態結合レベルにおける補正相対応答を、各々の標的の感受面／フローセルについて求めた；このようなデータを、下記の表２−４に示す。
【００６６】
【表２】
0004543187.tif 000003
【００６７】
【表３】
0004543187.tif 000004
【００６８】
【表４】
0004543187.tif 000005
（データ分析）
上表２−４に示す、各薬物濃度の補正相対応答を、特にそれら薬物候補物の分子量差について調整し、ならびにその他の性質との相関を増すために変換を行った。例えば、各標的感受面／フローセルについて、見かけの平衡定数（ＫＤ）を、測定された平衡（Ｒeq）データおよび既知の薬物濃度（Ｃ）データを式（３）に適合させて計算した。すなわち、
Ｒeq＝Ｃ*Ｒmax／（Ｃ＋ＫＤ）＋オフセット  （３）
であり、ここで、Ｒmaxは、感受面の最大結合能である。この適合手順において、Ｒmax、ＫＤおよびオフセットを計算した。
【００６９】
あるいは、見かけの平衡定数（ＫＤ）は、薬物候補物の二つの濃度Ｃ１およびＣ２から、式（４）を用いて計算してもよい。すなわち、
ＫＤ＝（ＲeqC1／Ｃ１−ＲeqC2／Ｃ２）／（ＲeqC2−ＲeqC1）  （４）
いずれの場合も、バイオセンサーを介して得たＫＤ値は、その後、報告されたヒト血清アルブミン結合パーセント（すなわち、既知の薬物化合物について報告されている、報告された結合パーセント）から計算された既知のＫＤ値と相関させ、それによって、三つの薬物候補物Ａ−Ｃのそれぞれについて、タンパク質結合度に関する予測を可能とした。言いかえれば、既知の化合物の既知のＫＤ値を横軸（すなわち、ｘ−軸）にプロットし、バイオセンサーにて得たＫＤの対応測定値を縦軸（すなわち、ｙ−軸）にプロットして、図４に示すような相関グラフを構築した。次に、この相関グラフを用いて、３個の薬物候補物Ａ−Ｃそれぞれについて、血漿タンパク質結合度を予測した（下記参照）。
【００７０】
さらに、各標的感受面／フローセルについて、単一濃度レベルにおける分子量調整応答を、薬物候補物Ａ−Ｃをランク付けするための閾値として用いた。より具体的に言うと、図５に示す相関グラフを構築し、ここで、既知の薬物化合物の分子量で割った１００μＭ（Ｒ１００μＭ）におけるそれぞれの結合レベルを横軸（すなわち、ｘ−軸）にプロットし、平衡透析法で測定した対応するヒト血清アルブミン結合パーセントを縦軸（すなわち、ｙ−軸）にプロットした。次に、この相関グラフを用いて、三つの薬物候補物Ａ−Ｃそれぞれについて、ヒト血清アルブミンに対する強い結合剤と弱い結合剤を区別した。
【００７１】
さらに、各標的感受面／フローセルについて、参照差引きセンサーグラムトレース（例えば、ＦＣ２マイナスＦＣ１）を展開して、沈殿物の存在（低溶解度によってもたらされる）を検出した。より具体的に言うと、図６に示すような、参照差引きセンサーグラムトレースを、３個の薬物候補物Ａ−Ｃの各々について構築した。（沈殿物が形成され、感受面に結合／会合すると、応答信号は、非連続的に減少することに注意。）３個の薬物候補物Ａ−Ｃの各々について、その濃度系列を分析することによって（図６に示すように）、薬物候補物Ａが沈殿し、従って、比較的低い溶解度を有するが、一方、薬物候補物Ｂ−Ｃは沈殿せず、従って比較的高い溶解度を有することが確定された。
【００７２】
最後に、表５に示すように、各標的感受面／フローセルから得られた情報の組み合わせを表にまとめ、還元性（ｒｅｄｕｃｅｄ）特性分析マトリックスとした。このマトリックスにおいて、各薬物候補物Ａ−Ｃは、リード薬物化合物の選択に有用な品質パターンを与えられた。（脂肪親和性予測および吸収分画は予測であることに注意。）
【００７３】
【表５】
0004543187.tif 000006
前記特性分析マトリックスに基づいて、薬物候補物Ｂが、血漿タンパク質結合レベルが低いこと（ＨＳＡ結合％＜９０）、脂肪親和性が中等であること（脂肪親和性予測値＝２）、特定される溶解度問題を持たないこと（溶解度＝ＯＫ）および腸吸収が受容可能であること（吸収画分予測値＞９０）に起因して、好ましい化合物であると決定された。
【００７４】
（実施例２）
（バイオセンサーデータとヒトにおける吸収画分（ＦＡ％）との間の実証された相関）
本実施例は、多くの異なる薬物について、ＢＩＡＣＯＲＥ器具（すなわち、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００）から得られたバイオセンサーデータと、ヒトにおける吸収分画（ＦＡ％）に関する既知のデータとの相関を開示する。ここで、相関グラフは、薬物候補物の吸収度予測に有用となる。より具体的に言うと、ヒトにおける既知の吸収画分（ＦＡ％）を縦軸（すなわちｙ−軸）にプロットし、各薬物の５００μＭにおける、対応較正（すなわち、参照差引き）定常状態結合レベルを、１０ｌｏｇスケールで横軸（すなわち、ｘ−軸）にプロットした図７に示す相関グラフを構築した。本実施例では、標的フローセルの感受面はそれぞれ、ステアリルアミンのタイルに、６，０００ＲＵのＰＯＰＣ−ＧＭ３ガングリオシド（Ｓｉｇｍａ社から市販される）を捕捉させた。（ＣＭ５センサーチップの非修飾の感受面を参照として使用したことに注意。）図７に示すように、各種データポイントに適合させられた数値式／関数によって証拠付けられるように、バイオセンサーデータと、ヒトにおける既知の吸収画分（ＦＡ％）データとの間には高度の相関がある。
【００７５】
さらに、この相関グラフはまた、種々の物質の分類を示し、ここで、受動輸送細胞横断経路を用いて腸を通過する物質吸収は、ｈ＝高度、ｍ＝中等、および、ｌ＝低度で示され、能動輸送を用いる吸収は、ｈ−ａｃｔ＝高度で示され、そして傍細胞経路を用いる分子量２００未満の物質の吸収は、それぞれｈ−ｐａｒａ＝高度およびｍ−ｐａｒａ＝中等で示される。（スルファサラジンは、腸で急速に分解する薬物前駆物質（ｐｒｅ−ｄｒｕｇ）であって、その性質が比較的ずれているのはそのせいかもしれない；ピロキシカムの溶解度は極めて低く（＜＜＜＜５００μＭ）、相関が欠如しているのはそのせいかもしれないことに注意。）
（実施例３）
（ＨＳＡ予測のための、不動化ヒト血清アルブミンと薬物化合物との間の相互作用に関するバイオセンサー分析）
多くの化合物が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）およびその他の血清成分に可逆的に結合する。ある薬物の血漿タンパク質に対する親和性は、その薬物の総合的薬物動態プロフィールを定める場合重要な問題である。高いタンパク質結合レベルは、遊離濃度を下げ、従って、その薬物の生理活性を下げる。循環するタンパク質−薬物複合体はまた、遊離の薬物が様々な除去工程によって体から除去された場合に、遊離薬物濃度を再補給するのに貢献し、それによって薬物作用の持続時間を引き延ばす。このために、タンパク質結合レベルは、その薬物の意図された生理活性と可能性のある副作用との間の微妙なバランスにとって重要な因子である。理想的には、各薬物候補物の遊離濃度は、その薬物が適応される患者から得た血液において評価されるべきである。タンパク質結合レベル、および、その他のＡＤＭＥパラメータに関する早期の推定値は、現在では、薬物発見工程において益々重要性を帯びている。従って、タンパク質結合決定のための簡便なアプローチが考慮されている。広範な種々の方法および実験条件がこの目的のために使用されている。方法としては、Ｏｒａｖｃｏｖａ（Ｏｒａｖｃｏｖａら，「Ｄｒｕｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，」Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６７７：１−２８（１９９６））およびＨａｇｅ（Ｈａｇｅら，「Ｒｅｖｉｅｗ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６９９：４９９−５２５（１９９７））に概説されているような、平衡透析、限外濾過、超遠心、分光光度法、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、ならびに電気泳動法が挙げられる。これらの方法は、結合または遊離した、薬物またはタンパク質の分離、あるいはタンパク質の移動度または薬物−タンパク質複合体の分光的性質のような内因性パラメータの変化のいずれかに依拠する。薬物、タンパク質相互作用の研究を単純化するために、血液または血漿の代わりに、単一のタンパク質、ＨＳＡおよび／またはα１−酸性糖タンパク質を用いることも通常行われる。このアプローチは、多くの化合物をタンパク質結合についてスクリーニングしなければならない場合に特に有用である。さらにまた、従来から、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）における不動化ＨＳＡの使用はまた、薬物の遊離ＨＳＡに対する結合を正確に反映することが証明されている。（Ｄｏｍｅｎｉｃｉら，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｒａｐｉｄ  ＨＰＬＣ  Ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ  ２：２６３−２６８（１９９０）およびＤｏｍｅｎｉｃｉら，「Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ���ｈａｓｅ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｗａｒｆａｒｉｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ，」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８０，１６４−１６９（１９９１））。
【００７６】
これらの結果によって、親和性分析のために、そして表面不動化ＨＳＡに対する薬物化合物の結合度のランキングのために、本発明者らは、バイオセンサー技術を用いた研究を促進された。バイオセンサー技術の主要な利点（ここでは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサー）は、標識を用いることなく結合を直接監視できること、サンプル消費が低いこと、および分析が迅速かつ自動化されていることである。（（Ｊｏｅｎｓｓｏｎら．，「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｉｎｔｏ  ｏｎｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，２：２９１−３３６（１９９２）およびＳｚａｂｏら．，「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，」（ＢＩＡ）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５（１９９５））。本実施例において本発明者らは、化合物の単一濃度での注入に基づいた、それらの結合レベルを選択された参照化合物のレベルと比較することによって、それらの化合物を高度、中等度または低度のＨＳＡ結合剤として分類するための新規の方法を提示する。
【００７７】
（材料および方法）
器具類：Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンから供給されたＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００を用いた。（図８）相互作用分析は２５°Ｃにて実行した。緩衝液：５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ｐＨ７．４を含む６７ｍＭ等張リン酸緩衝液（９．６ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、１．７ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、４．１ｇ  ＮａＣｌを合わせて１リットルとしたもの）を、アッセイの間、流動緩衝液として使用した。ＨＳＡの不動化：分析にはセンサーチップＣＭ５を用いた。センサーチップは、カルボキシメチル修飾デキストランポリマーを、金被覆ガラス支持体に連結させたものからなる（Ｊｏｈｎｓｓｏｎら．，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ａ  Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｏｌｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ，」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８：２６８−２７７（１９９１））。１  ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ、本質的に脂肪酸およびグロブリンを含まない、Ａ３７８２）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２にて１５μｇ／ｍｌまで希釈し、アミン結合を用いてセンサーチップに不動化した。不動化の間、ＤＭＳＯ無しの流動緩衝液を用いた。この表面を、０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）および５０ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む溶液を７分間注入して活性化した。ＨＳＡを７分注入し、次に表面を、１Ｍエタノールアミン（ｅｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）をｐＨ８．５にて７分間注入してブロックした。５０ｍＭ  ＮａＯＨを、３回の３０秒パルスにて注入し、共有結合していないＨＳＡを洗い流し、ベースラインを安定させた。最終的な不動化レベルは、９５００と１１０００ＲＵ（共鳴単位）の間にあった。この不動化手順の後、緩衝液によるいくつかの洗浄を行い、ＨＳＡ表面をＤＭＳＯ流動緩衝液に平衡化させた。未修飾デキストランを、参照表面として用いた。最高感度を確保するために、ＳＰＲ検出器応答を、アッセイを実行する前に、検出器を全反射条件下に各種光強度で較正することによって正規化した（自動化手順）。化合物：ナプロキセン、スルファジメトキシン、ワルファリン、ジギトキシン、ジアゼパム、ナプロキセン、ピリメタミン、クマリン、サリチル酸、リファンピシン、フェニトイン、プレドニゾン、キニン、サルブタモール、ジピリダモール、チモロール、アセブトロール、アテノロール、アルプレノロール、ピンドロール、メトプロロールおよびプロプラノロールをＳｉｇｍａより購入した。ケタンセリンは、Ｆｌｕｋａより購入した。リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）は、Ｂｊｏｅｒｎ  Ｃｌａｅｓｏｎからの贈与により、メジビル（ｍｅｄｉｖｉｒ）、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）、トルテロジン（ｔｏｌｔｅｒｏｄｉｎｅ）、５−ＨＭおよびチプラニビル（ｔｉｐｒａｎｉｖｉｒ）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎからの贈与であった。化合物を以下のように選択した：ａ）ＨＳＡに対して広い親和性範囲をカバーするように、ｂ）主要結合部位に対する結合剤を含むように、ｃ）異なるクラスの化合物を含むように、ｄ）ある範囲の分子量を示すように、ｅ）できれば市販されるように。表７も参照のこと。化合物は、２０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液から、流動緩衝液中で最終濃度に希釈した。希釈は、サンプルおよび流動緩衝液中のＤＭＳＯおよび緩衝液物質の両方のｐＨおよび濃度を注意深く適合するようなやり方で行われた。
【００７８】
（参照フローセルとＨＳＡフローセルとの間のＤＭＳＯバルク差の較正）
ＳＰＲ信号は、センサー表面における屈折率（ＲＩ）変化を反映する。ＲＩは、センサー表面近傍の結合事象の結果として変化し、表面における質量増加に関連する（Ｓｔｅｎｂｅｒｇら．，「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，」Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，１４３：５１３−５２６（１９９１））。注入されたサンプルが、流動緩衝液とは異なるＲＩを有するならば、さらなる信号が得られる。この信号は溶媒効果と呼ばれる。この溶媒効果が小さい場合（１００のＲＵの桁）、通常は、参照表面から得られる同信号を全体信号から差し引くことによって除去が可能である。（Ｋａｒｌｓｓｏｎら．，「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ，」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２８：２７４−２８０（１９９５））。しかしながら、ＤＭＳＯのような高い屈折率の溶媒を導入することは、注入の間に大きな屈折率変位を生ずる可能性があるので、単に、参照フローセルから得られたデータを差し引くだけでは十分ではない。この効果の補正を行うために、ＤＭＳＯ較正手順を利用した（図９ｃ）。種々の濃度のＤＭＳＯ（４．５−６％）を含む緩衝液溶液を、順に参照表面およびＨＳＡ表面に注入した。これを、各実験の開始時と終了時に、アッセイ時と同じ流速を用いて行った。参照表面から得られた較正液の応答は、ベースラインに対して、−５００以下から＋１０００ＲＵの範囲をカバーしていた。ＤＭＳＯ較正曲線は、ＨＳＡフローセルと参照フローセル間の応答対参照フローセルの応答差をプロットして作成した。この曲線を、サンプル注入の間に得られた応答レベルの補正に用いた。
【００７９】
（アッセイ設計）化合物を、３０μｌ／分の流速で１分間参照フローセルおよびＨＳＡフローセル上に注入した。各サイクルは、ベースラインの安定性を監視するための１分間の待ち時間、化合物の１分間の注入、３５秒間の静置解離相、およびセンサー面を除く、ＤＭＳＯと水の１：１混合物によるフローシステムの洗浄からなる。参照フローセル中の化合物応答は、ＤＭＳＯ較正曲線の範囲内にあるので、較正曲線の外挿は用いなかった。各サンプルの間に流動緩衝液の注入を行い、持ち越し効果を阻止した。８個のＤＭＳＯ較正液を順に、各実験の開始時と終了時に、各３０秒間注入した。
【００８０】
（データ評価）参照フローセルから得られたデータを、ＨＳＡフローセルから得られたデータから差し引いた。薬物化合物および較正液注入による応答を、注入開始１０秒前と、注入終了１０秒前に設定された報告点の間で抽出した。これらの応答をさらに、較正曲線を用いて、ＤＭＳＯ効果について補正し（図９）、最終的な応答値を、ＫＤ確定およびランキング実験に用いた。飽和部位におけるＫＤおよび応答値の推定値を得るために、化合物の各種濃度（Ｃ）で得られた応答測定値（Ｒeq）を下式に適合させた：
Ｒeq／ｍｗ＝Ｃ×Ｒmax／（Ｃ＋ＫＤ）  （５）
この式は、以前に、分析物が、不動化された相手に結合するという一般的な場合に由来するもので（Ｋａｒｌｓｓｏｎら．，「Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５：２２９−２４０（１９９１））、ここでは、不動化されたアルブミンの単一部位と相互作用を持つ化合物の、親和性および飽和応答を与える。様々な分子量の化合物で得られた応答の比較を容易にするために、適合工程では、Ｒeqの代わりに、Ｒeq／ｍｗ、すなわち、定常状態応答をその化合物の分子量で割った値を用いた。この比を用いることによって、飽和レベルＲmaxは、アルブミン単一部位に結合する全ての化合物について同一と考えられ、従って、いくつかの化合物から得られる用量反応曲線を、Ｒmaxを汎用パラメータ（すなわち、全ての化合物に共通）とし、ＫＤを局部パラメータ（すなわち、各化合物について独特）として、同時に分析した。
【００８１】
この方法によって計算されたＫＤを、報告された％結合レベルと比較するために、下記の平衡式を用いた：すなわち、［ＨＳＡ］［薬物］／［ＨＳＡ−薬物複合体］＝ＫＤ。血清におけるＨＳＡの濃度は０．６８ｍＭを仮定した。化合物の全濃度をｘとし、結合部分をｐとすると、（０．６８−ｘ×ｐ）×（ｘ−ｘ×ｐ）／ｘ×ｐ＝ＫＤ。ｐの代入後（ｐは％結合／１００に等しい）、０．１ｎＭから１ｍＭの範囲の、全薬物濃度についてＫＤ値を計算した。計算されたＫＤ値は、ほとんど、全体薬物濃度から独立していた。選択された化合物の数値を表６に示す。
【００８２】
ランキング実験では、８０μＭ濃度で得られた応答を、その化合物の分子量で割って、結合レベルの比較を可能とした。
【００８３】
（結果）
（溶媒効果のセンサーグラムおよび較正）
試験した化合物は全て、不動化ＨＳＡに可逆的に結合した。注入時、定常状態応答は、数秒以内に得られた。注入の終了時、薬物化合物は極めて速やかに解離して、信号は、ほとんど瞬間的にベースラインに戻った（図９ａおよび９ｂ）。試験した化合物の内、チプラニビルのみが、２分を越えてＨＳＡ表面に結合していた。
【００８４】
参照差引きにおける誤差を下げるために、ＤＭＳＯ較正手順を適用して溶媒効果を補償させた（図９ｃ）。サンプルの溶媒効果は、典型的には、−１００および５００ＲＵの範囲に渡っており、これは、−２０から１０ＲＵの補正係数をもたらす。以前の研究において、残余溶媒に関連する誤差は、溶媒効果が２０００ＲＵもある場合に、低くそして＋／−３ＲＵの間にあることが示されている（Ｋａｒｌｓｓｏｎら．，「ＢＩＡＣＯＲＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７８：１−１３（２０００））。
【００８５】
（不動化ＨＳＡの活性および安定性）
ＨＳＡにおける主要薬物結合部位は、ＨＳＡがアミノ基を介してセンサー面に固定化された後にも利用可能なままであった。これは、ワルファリンのＩ部（ワルファリン部）への結合（Ｚａｔｏｎら．，「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｕｍａｒｉｎｓ  ｔｏ  Ｓｉｔｅ  Ｉ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，」Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．９７：１６９−１７４（１９９５））、ナプロキセンのＩＩ部（ベンゾジアゼピン部位）への結合（Ｃｈｅｒｕｖａｌｌａｔｈら．，「Ａ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ  ａｎｄ  Ｎａｐｒｏｘｅｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ，」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１５：１７１９−１７２４（１９９７））、および、ジギトキシンの、その結合部位に対する結合（図１０ａ−１０ｃ）（Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｕ．，「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ，」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２５：６２９−６３８（１９８５））によって証明された。予想通り、飽和レベルは、化合物の分子量に関連していた。７６５Ｄａの分子量を持つジギトキシン、３０８Ｄａの分子量を持つワルファリン、および、２３０Ｄａの分子量を持つナプロキセンは、それぞれ、７０、３５および１５ＲＵに近い飽和レベルに近づいた。これらの値は、これらの濃度では主に単一部位が占有されることを示す。ただし、リトナビルは例外で、この場合は、応答は、ＨＳＡ１分子当り、リトナビル１分子以上の化学量論を示した（図１０ｄ）。
【００８６】
ランキング実験では、ワルファリンを、ＨＳＡ活性のポジティブコントロールとして用いた。ワルファリンを、各実験において、早期、中期および晩期に注入した。ＨＳＡ不動化の日に行われた実験および同じＨＳＡ表面について、７日後に行われた実験で得られたワルファリンの、参照差引き応答および較正応答とを表７に示す。ワルファリン応答は安定で、この表面では、応答レベルは、３７．１から４１．８ＲＵの範囲に渡っており、標準偏差は１．６ＲＵであった。
【００８７】
（ＫＤ測定）
ワルファリン、ナプロキセン、ジギトキシン、リトナビル、キニンおよびリファンピシンについて得られた用量反応曲線を図１０に示す。ワルファリンとナプロキセンについては、結合は単一相のようであり、低い濃度で飽和レベルに近づいた。リトナビル、およびある程度のジギトキシンについては、応答レベルは、二相性相互作用を示した。キニンとリファンピシンは、広い濃度範囲に渡って、直線的用量反応曲線を与えたが、飽和レベルを推定することはできなかった。
【００８８】
図１０の用量反応曲線の場合、ＫＤ分析は問題であった。親和性の推定値を得るために、分析を下記のように仮定して単純化した。すなわち、１）ＨＳＡ結合部位は等しく利用可能である、２）４０μＭ未満の濃度では、高親和性部位のみが占有される、および、３）応答レベルを、測定応答（ｇ／ｍ2に比例するＲＵ）を、分子量で割って（モル／ｍ2に比例するＲＵ／ｍｗ）正規化する、である。これらの仮定に基づき得られた（式１から）ＫＤデータは、ＨＳＡに対して低および中等度の結合度を持つ化合物は、ＨＳＡに対して高い結合レベルを持つ化合物よりも、遥かに高いＫＤ値を示すことを明らかにし、かつ、報告された％結合とＫＤとの間の良好な相関を示唆したが、９７％結合を越える結合レベルを持つ化合物に対してその分解能は限られていた（表８）。
【００８９】
（結合レベルのランキング、バイオセンサーデータと従来技術との比較）化合物のランク付けを行うために、本発明者らは、標準的信号を与えるには十分なほど高い濃度ではあるが、いくつかの結合部位に結合する化合物を誤って解釈する危険を避けるには十分なほど低い濃度で結合度を測定することによる、さらに単純なアプローチを用いた。分子量が１３８と８２３Ｄａの間にあり、報告されたＨＳＡ結合レベルが８と９９．９％の間にある、１９個の薬物の結合レベルを、各薬物につき、単一濃度（８０μＭ）の２重注入によって調べた。同一実験を、ＨＳＡ不動化の日に実施し、同じＨＳＡ表面について１週間後に実施した。図１１は、ＨＳＡ不動化の日に得られた結合レベルと、報告されたＨＳＡ結合度との相関を示す。高親和性化合物に対する解像度を増すために、数値を対数スケールに取り、２−ｌｏｇ１０（１００−％結合）を、バイオセンサーデータの関数としてプロットした。
【００９０】
スクリーニング状況では、中等および高レベル結合剤用にマーカーとして化合物を含めるのが有用であり得る。次に、図１１に示されるデータを、バイオセンサーデータのみを用いて再プロットした（図１２）。報告された結合レベル８６．１％を持つジアゼパムおよび報告された結合レベル９８％を持つワルファリンをマーカー化合物として用い、薬物を、低、中、および、高レベル結合剤に分割することができた。
【００９１】
同じＨＳＡ表面について１週間後に試験して見ると、１９個の化合物は、サリチル酸を除き、皆同じ群に分類された。サリチル酸は、第二の分析では、中から低に変化した。高レベル結合剤の群内の個々のランキングは、不動化の日のものと同じであった。中および低群内では、いくつかの化合物が地位を移動したが、中から低へ群を変えたのはサリチル酸のみであった。
【００９２】
（議論）
薬物動態的性質に関する早期の推定は、化合物とその薬理学的標的との間の相互作用に関して見出されたデータを補足するために使用され得る。組み合わせたデータは、その化合物の機能的局面についてさらに広い理解を供給し得、それが、その化合物を薬物候補物に開発するに当って有用であり得る。タンパク質結合に関して言えば、血漿タンパク質に対して高度に結合する化合物を特定することは特別興味をひく。本発明者らは、バイオセンサー技術に基づいて、不動化ＨＳＡに対する化合物の結合をランク付けするスクリーニング法を開発した。
【００９３】
ＨＳＡ結合レベルの測定のため使用される種々の方法および実験条件は相当に変動し、本実施例で使用したいくつかの化合物についても、報告された結合データは、場合によって矛盾し、公正な相関研究を困難にする。報告された結合レベルにおける変動の実例として、ワルファリンの９８．０％−９９．６％（Ｆｅｒｒｅｒら．，「Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎｅｓ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ．Ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｔｕｄｙ，」Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１７：１１５−１１９（１９９８）；およびＶｅｓｔｂｅｒｇら．，「Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｗａｒｆａｒｉｎ，Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  ａｎｄ  Ｄｉａｚｅｐａｍ  ｔｏ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｅｎｄ，」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４：１５１５−１５２１（１９９２））、ジアゼパムの８６．１％−９８．２％（ＭｃＮａｍａｒａら．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ，Ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ，Ｄｉａｚｅｐａｍ  ａｎｄ  ＡＬ０１５７６（ａｎ  Ａｌｄｏｓｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｒａｔ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｓｅｒｕｍ，」Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：２６１−２６５（１９８８）；およびＶｉａｎｉら．，「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｉａｚｅｐａｍ，Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｉｇｉｔｏｘｉｎ  ｔｏ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｅｒｕｍ，」Ｄｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７：１００−１０８（１９９１））、ならびにサリチル酸の８１．７％−９０．５％（Ｇａｈｒａｍａｎｉら．，「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ａｓｐｉｒｉｎ  ａｎｄ  Ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，」Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６３：２８５−２９５（１９９８）；およびＶｉａｎｉら．，「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｉａｚｅｐａｍ，Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｄｉｇｉｔｏｘｉｎ  ｔｏ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｅｒｕｍ，」Ｄｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１００−１０８（１９９１））が挙げられる。他の化合物については、ただ一つの文献値しか見つからなかったが、これらの化合物をいくつかの方法でアッセイしたならば、同様の変動が見られるに違いない。それにも拘わらず、バイオセンサーデータを、他の技術で求められたＨＳＡ結合レベルと相関させるのは可能であった。
【００９４】
全親和性範囲にわたる化合物のランキングを立証する目的で、ランキング実験では濃度８０μＭを選択した。この濃度では、６０％未満の結合レベルを持つ化合物から得られる応答は依然として小さいが、多くの化合物の溶解度は限定されている可能性があるし、そして、二次結合部位の影響を下げることが所望されたので、これより高い濃度は使用しなかった。本明細書を準備中に、本発明者らは、高レベル結合剤の同定に主眼を置く場合には、濃度は１０−４０μＭに下げることも可能であるという示唆を得た。低親和性結合剤同士を区別するためには、ＨＳＡ溶液および不動化した薬物標的とによる阻害研究に基づく別のアプローチも使用され得る。
【００９５】
用量反応曲線同士を比較し、かつ、数ＲＵの実験誤差を考慮に入れると、異なる部位に結合する化合物について得られた分子量調整Ｒmax値は類似していた。これは、結合部位は等しく利用可能であるという仮定に導かれた。部位利用性が大きく異なるならば、結合レベルの誤ったランキングをもたらすことになる。ワルファリンとジアゼパムを参照化合物として用いることによって、高レベル結合（＞９５％）または低レベル結合（＜８０％）への分類が簡単になった。図１２を注視すると、報告された高レベル結合剤の内、スルファジメトキシンとリトナビルは中レベル結合剤として分類され、ジギトキシンは、中レベルと高レベル結合剤の境界にあることが明らかである。リトナビルについて９９％結合として報告される値は、血漿において得られたものであり（Ｖａｃｃａ，Ｊ．およびＣｏｎｄｒａ，Ｊ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ＨＩＶ−１  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，」ＤＤＴ，２：２６１−２７２（１９９７））、さらに、ＡＧＰ（α１−酸性糖タンパク質）を添加すると、血漿結合が１０−２０倍減少することが報告されており、これは、血漿結合の有意な部分がＡＧＰに対するものであることを示す（Ｌａｚｄｉｎｓら．，「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ１−Ａｃｉｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＣＧＰ  ６１７５５：  Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｌｅｖａｎｔ  ＨＩＶ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７５：１０６３−１０７０（１９９７））。従って、この点で、スルファジメトキシンのみがアウトライアーであると論じ得る。本発明者らのケタンセリンの低レベル結合剤とのランク付けは、報告された９３．２％という値と矛盾する（Ｍｅｕｌｄｅｒｍａｎｓら．，「Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ，」Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，３８：７９４−８００（１９８８））。他の研究者は、血漿に対してより低い結合を、すなわち、９０．６％を報告している（Ｔｒｅｎｋら．，「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５−ＨＴ２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ  ｉｎ  Ｍａｎ，」Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍ．，５：１０３４−１０３９（１９８３））。これは、ＨＳＡに対する結合レベルがさらに低いことを示唆するが、現時点で、この食い違いの理由はいまだ未知である。
【００９６】
これらの結果に加えて、ワルファリンデータの優れた再現性およびＨＳＡ表面の安定性によって、バイオセンサー法は、タンパク質結合レベルの予測に使用するのに好適である。本発明の方法の特別の利点は、化合物の単一注入によって得られる結合レベルを、相関について使用し得るということであった。１つの９６ウェルプレートの化合物を、２４時間でアッセイし得る。この方法は実際的であり、必要な情報を供給し、かつ、複雑な分析は回避される。さらに、ランキング実験は、部位特異性を定めるために、競合研究によって補足することが可能である。そのような試験では、既知の部位特異性を持つ化合物を、別の分子に結合体化し、その質量を（従って、信号も）増す。このマーカーを他の化合物と混合し、結合部位に対する競合を実現する（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，「Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２１：１４２−１５１（１９９４））。
【００９７】
バイオセンサーデータからＫＤ値を決定するという最初の試みから、ＨＳＡに対する結合部位数に関していくつかの情報が得られることが示された。濃度がＫＤ濃度より遥かに下にある場合の、低親和性結合剤についてデータを計算するために、適合手順において、Ｒeq／ｍｗを用いた。次に、Ｒmaxを、その適合を限定するための汎用パラメータとして用いた。これによって、各化合物について個々にＲmax値を計算する場合よりも、ＫＤ値がより一貫するようになった。しかし、複数結合部位を有する化合物に対するＫＤ確定に困難があるために、分析はやはり複雑であった。親和性確定に複雑さがあるにも拘わらず、高親和性結合剤の用量反応曲線に対する解釈は、化学量論的情報を入手するに当って相当に有力である可能性がある。
【００９８】
ＳＰＲ技術は、屈折率を測定するものであるから、将来の実験は、化合物の屈折率の違いが、分析にどのように影響するかという点の探求を含むとするのは当然である。ハロゲンの中のあるものは、高い屈折率を持つことが知られおり、本発明者らは、例えば、臭素を含む化合物は、分子量から期待されるよりも高い応答値を与える可能性のあることに気付いた。従って、この線に沿ったさらなる研究を用いて、ＨＳＡ結合データは細かく調整され得る。
【００９９】
ＡＧＰのような他の血漿タンパク質との類似の様式の相互作用における研究の可能性は、現在、本発明者らの研究室で進行中である。そのような研究の最初の結果を図１３に示す。バイオセンサーデータを、下記の化合物の、公開されたＡＧＰ結合レベルと相関させた：トルテロジン（Ｐａｈｌｍａｎら．，「Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｏｌｔｅｒｏｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，」Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓ．，２０：９１−９９（１９９９））、キニン（Ｗａｎｗｉｍｏｌｒｕｋら．，「Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｑｕｉｎｉｎｅ：  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ，Ａｌｐｈａ１−Ａｃｉｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍａｌａｒｉａ，」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４４：８０６−８１１（１９９２））、７種のβ−アドレノセプターブロッカー（ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｄｒｕｇ）（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら．，「Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／Ｆｒｏｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，」Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９：４４８−４５４（１９８８）；およびＢｅｌｐａｉｒら．，「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂ−Ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ，ｔｏ  ａ１−Ａｃｉｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ，」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２２：２５３−２５６（１９８２））ならびにジピリダモール（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｔ．およびＳａｒｄｉ，Ｅ．，「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ，」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８０：１１９−１２０（１９９１））である。他の技術と比較して、高い結合レベルを得たキニンを例外として、結合について良好な相関が得られた。実験条件は、ＡＧＰの不動化化学を別として、全てＨＳＡ相関実験の場合と同様とした（図１３）。従って、ＨＳＡおよびＡＧＰを、二つの異なるフローセルに不動化し、化合物を注入し、両方のタンパク質に対する結合データを同時に入手することも可能である。
【０１００】
【表６】
0004543187.tif 000007
【０１０１】
【表７】
0004543187.tif 000008
【０１０２】
【表８】
0004543187.tif 000009
（実施例４）
（試験物質の結合に関与するチトクロームＰ４５０アイソザイム同定の可能性）
（実験手順）
実験は、ＣＭ５センサーチップを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００器具にて行った。流動緩衝液は、０．１Ｍ  Ｎａ／Ｋ−リン酸塩（ｐＨ７．５）、２０％グリセロール、および、０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいた。温度は、実験を通じて、１５°Ｃに維持した。
【０１０３】
（表面調製）
チップ表面を、５．７５ｇ／ｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド、および、３７．５ｇ／ｌのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を含む溶液３５μｌを注入して活性化した。次に、これらのタンパク質を、５ｍＭ  Ｋ−リン酸塩（ｐＨ６．８），２０％グリセロール、０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および、０．１％Ｅｍｕｌｇｅｎ９１３を含む緩衝液に溶解した１０μｇ／ｍｌ溶液３５μｌを注入して不動化した。次に、未反応の表面基を、５０μｌ  ０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ  ＫＣｌ、および、２０％グリセロールを注入して脱活性化した。表面調製時の流速は、５μｌ／分であった。参照セルの表面は活性化しなかった。
【０１０４】
（分析）
物質を、表示の濃度で流動緩衝液に溶解し、３０μｌ／分の流速で注入した。
【０１０５】
（図１４）ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９を、それぞれ、フローセル３および２に不動化して、１３０００ＲＵおよび１１０００ＲＵとした。フローセル１は参照として用いた。
【０１０６】
（図１５）ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４を、それぞれ、フローセル２および３に不動化して、８５００ＲＵおよび７３００ＲＵとした。フローセル１は参照として用いた。チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）は、多くの薬物物質の代謝に関与する１群の酵素である。実験は、試験物質の結合に関与するチトクロームＰ４５０アイソザイム同定の可能性を示す。これは、重要な薬物動態パラメータである。なぜなら、それは、（ｉ）その物質が、同じアイソザイムによって代謝されることが既知の他の薬物の薬物動態に影響を及ぼす可能性があるという結論、および（ｉｉ）その物質そのものが、そのアイソザイムによって代謝される可能性があるという結論を可能にする。記載した実験で使用した物質は、ケトコナゾールとキニジンであり、これらは、それぞれ、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｄ６に対する特異的インヒビターであることが知られている。得られた結果は、ＢＩＡアッセイは、これらの物質が、特異的なやり方で、その標的と持つ相互作用を検出することが可能であることを証明する。
【０１０７】
本発明は、本明細書に例示され、記載された実施形態との関連において記載されてきたけれども、本発明は、その精神または本質的特性から逸脱することなく、他の特異的やり方または他の特異的形態に体現され得る。従って、記載した実施形態は、全ての点で、例示として考慮すべきであって、制限的と考慮すべきではない。故に、本発明の範囲は、前記記載によってではなく、添付の請求の範囲によって示され、かつ、この請求の範囲と等価的意味および範囲内に生ずる変化は全て、この範囲に包摂されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、選択された薬物−生体分子相互作用と関連する、定常状態結合レベルを反映するセンサーグラムを示す。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、図１Ａのセンサーグラムの拡大部分を例示し、センサーグラムの不規則性を示す。
【図１Ｃ】  図１Ｃは、バルクの屈折率効果を取り除いた、図１Ａのセンサーグラムの拡大部分を示す。
【図２Ａ】  図２Ａは、均一センサー表面と関連する反射光強度を表わす、単一の「へこみ」を示す。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、非均一センサー表面と関連する非平均化反射光強度を表わす、数個の「へこみ」を示す。
【図２Ｃ】  図２Ｃは、非均一センサー表面と関連する平均化反射光強度を表わす、「へこみ」の拡張を示す。
【図３】  図３は、本発明の方法に従って薬物候補物をアッセイするための例示のコンピュータシステムの高度ブロックダイアグラムを示す。
【図４】  図４は、血漿タンパク質結合レベルが既知の９種の薬物について、既知の化合物についての既知のＫＤ値を横軸（すなわち、ｘ−軸）にプロットし、バイオセンサーによって得た対応するＫＤ測定値を縦軸（すなわち、ｙ−軸）にプロットした相関グラフを示す。
【図５】  図５は、既知の薬物化合物それぞれの、１００μＭ（Ｒ１００μＭ）における結合レベルを、その分子量で割った値を横軸（すなわち、ｘ−軸）にプロットし、平衡透析法で測定した、対応するヒト血清アルブミン結合の割合を縦軸（すなわち、ｙ−軸）にプロットした相関グラフを示す。
【図６】  図６は、３種の薬物候補物Ａ〜Ｃのそれぞれについての参照値差引きセンサーグラムトレースを示す。
【図７】  図７は、ヒトにおける既知の吸収画分（ＦＡ％）を縦軸（すなわち、ｙ−軸）にプロットし、５００μＭにおける各薬物の対応する較正（すなわち、参照値差引き）定常結合レベルを横軸（すなわち、ｘ−軸）に、１０−ｌｏｇスケールでプロットした相関グラフを示す。
【図８】  図８は、相互作用分析の一般原理を示す。センサーチップ表面を、ＩＦＣ（液性集積カートリッジ）と検出ユニットに接触して配置する。緩衝液の連続流が、ＩＦＣを貫通して、かつ、表面上を流れる。サンプルを、自動注入器を用いて表面上に注入し、屈折率変化を検出ユニットで検出する。
【図９Ａ】  図９Ａは、参照およびＨＳＡフローセルへのデラビルジンの注入を示す。サンプルとアッセイ緩衝液のＤＭＳＯ濃度がサンプル調製時に正確に適合されていないために、高い応答レベルが得られた。
【図９Ｂ】  図９Ｂは、ＨＳＡデータから差し引いた参照データを示す。
【図９Ｃ】  図９Ｃは、一連の８種の較正液（異なるＤＭＳＯ濃度を含むラニング緩衝液）を、各実験の開始時と終了時に流した図を示す。参照表面から得られた較正液の応答は、ベースラインに対して、−５００から＋１０００ＲＵの範囲に渡っていた。ＨＳＡと参照フローセルとの応答差（ＤＭＳＯ補正係数）対参照フローセルの応答をプロットして、ＤＭＳＯ較正曲線を作成した。
【図９Ｄ】  図９Ｄは、化合物の応答を、較正曲線によりＤＭＳＯバルク差について補正した図を示す。
【図１０Ａ】  図１０Ａは、ＨＳＡに結合する６種の化合物の用量反応曲線を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて、ワルファリンおよびナプロキセンは、データを定常状態モデルに適合させた時に得られる単相結合曲線を示す。
【図１０Ｂ】  図１０Ｂは、ＨＳＡに結合する６種の化合物の用量反応曲線を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて、ワルファリンおよびナプロキセンは、データを定常状態モデルに適合させた時に得られる単相結合曲線を示す。
【図１０Ｃ】  図１０Ｃは、ＨＳＡに結合する６種の化合物の用量反応曲線を示す。図１０Ｃおよび図１０Ｄにおいて、ジギトキシンおよびリトナビルの結合は、二相性の外見を呈する。図１０Ｃ〜図１０Ｆの曲線は、４パラメータ適合によって得られたもので、ＫＤ適合を表わさない。
【図１０Ｄ】  図１０Ｄは、ＨＳＡに結合する６種の化合物の用量反応曲線を示す。図１０Ｃおよび図１０Ｄにおいて、ジギトキシンおよびリトナビルの結合は、二相性の外見を呈する。図１０Ｃ〜図１０Ｆの曲線は、４パラメータ適合によって得られたもので、ＫＤ適合を表わさない。
【図１０Ｅ】  図１０Ｅは、ＨＳＡに結合する６種の化合物の用量反応曲線を示す。図１０Ｅおよび図１０Ｆのように、キニンおよびリファンピシンは、直線性結合曲線を示す。図１０Ｃ〜図１０Ｆの曲線は、４パラメータ適合によって得られたもので、ＫＤ適合を表わさない。
【図１０Ｆ】  図１０Ｆは、ＨＳＡに結合する６種の化合物の用量反応曲線を示す。図１０Ｅおよび図１０Ｆのように、キニンおよびリファンピシンは、直線性結合曲線を示す。図１０Ｃ〜図１０Ｆの曲線は、４パラメータ適合によって得られたもので、ＫＤ適合を表わさない。
【図１１】  図１１は、他の技法によって得られたデータ、すなわち、表７の参照値に相関させた、ＨＳＡに結合する化合物のバイオセンサーデータを表わす。
【図１２】  図１２は、１９個の化合物の結合レベルのランキングを示す。同じ一組の化合物について、同じセンサー表面において、二重でＨＳＡ不動化の日（図示）と、二重で１週間後（図示せず）に、ランク付けを行った。ジアゼパムおよびワルファリンを、マーカー化合物として用い、ＨＳＡ結合レベルを、低、中、または、高にグループ分けした。ワルファリンを、ＨＳＡ結合活性のコントロールとして、各アッセイの早期、中期および晩期に注入した。Ｌ、ＭおよびＨは、文献に報告された％結合レベルに基づく、低（Ｌ）、中（Ｍ）または高（Ｈ）レベル結合剤への分類を表わす。
【図１３】  図１３は、他の技術で得られたデータ、すなわち、最後の「考察」に見られる参照値と相関させた、ＡＧＰ結合に関するバイオセンサーデータを示す。不動化の前に、ＡＧＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−９８８５）は、ＰＤＥＡ（２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン塩酸（ｈｙｄｒｏｃｌｏｒｉｄｅ）、Ｂｉａｃｏｒｅから購入）にて修飾した。次いで、ＡＧＰ（１０ｍＭ  Ｎａ−クエン酸塩  ｐＨ３．６中２００μｇ／ｍｌ）を、チオール結合を用いて７０００ＲＵのレベルに不動化した（Ｌｏｅｆａｓら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｅｎｓｏｒｓ，」Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１０：８１３〜８２２（１９９５））。他の実験条件は全て、図１０のＨＳＡ相関研究の場合と同じであった。
【図１４】  図１４は、それぞれ、フローセル３と２に、１３０００と１１０００ＲＵに不動化されたＣＹＰ２Ｄ６とＣＹＰ２Ｃ１９とを示す。
【図１５】  図１５は、それぞれ、フローセル２と３に、８５００と７３００ＲＵに不動化されたＣＹＰ２Ｅ１とＣＹＰ３Ａ４とを示す。
【図１Ａ】
0004543187.tif 000010
【図１Ｂ】
0004543187.tif 000011
【図１Ｃ】
0004543187.tif 000012
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
0004543187.tif 000016
【図４】
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【図５】
0004543187.tif 000018
【図６】
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【図７】
0004543187.tif 000020
【図８】
0004543187.tif 000021
【図９Ａ】
0004543187.tif 000022
【図９Ｂ】
0004543187.tif 000023
【図９Ｃ】
0004543187.tif 000024
【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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