(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化合物またはその医薬的に許容可能な塩である、PTH類似体：
【化１】
0004460157.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【０００１】
従来の技術
本発明は、PTH2レセプター類に選択的に結合し、そのため異常CNS作用；異常脾臓作用；正常な無機質代謝及びホメオスタシスからの逸脱(divergence)；男性不妊症；異常血圧の調整；及び視床下部(hypothalmic)の疾患の治療に有用で、幾つかの重要な用途を提案する、一連のPTH及びPTHrP類似体に関する。
【０００２】
PTH2レセプターと称される交互性ヒト副甲状腺ホルモン(alternate  human  parathyroid  hormone：PTH)レセプターは、ラット及びヒトの脳で確認されてきた。このレセプターは、PTH-(1-34)によって選択的に活性化されるが、PTH-(1-34)と同様のカルシウム-移動活性を持つPTH-関連蛋白質のPTHrP(1-34)によっては活性化されない。PTHもPTHrPもいずれも共通のG-蛋白質-結合レセプター(PTH/PTHrPレセプターと称される)を共有する。PTH作用に対して主な標的組織である骨及び腎臓に主に集中するPTH/PTHrPレセプターとは対照的に、PTH2レセプターは脳及び脾臓に主に集中している。副甲状腺ホルモン(PTH)は血中カルシウムレベルの主な生理学的調節剤である(Chorev,M.,  Rosenblatt,M.,  1994、Structure  function  analysis  of  parathyroid  hormone  and  parathyroid  hormone-related  protein、Bilezikian,J.P.,  Marcus,R.,  Levine,M.,(編)、The  Parathyroids；Basic  and  Clinical  Concepts.  Raven  Press、New  York、139-156頁；Juppner,H.,ら、1991、Science、254：1024-1026頁；及びMartin,T.J.,ら、1991、Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.  26：377-395頁)。PTH-関連蛋白質(PTHrP)は、もともと、悪性腫瘍の体液性高カルシウム血症の腫瘍随伴症候群の薬剤として確認されていた(Suva,L.J.,ら、1987、Science、237：893-896及びOrloff,J.J.,ら、1994、Endocrinol.Rev.  15：40-60)。PTHとPTHrPは、異なってはいるが、進化的に関連する遺伝子の産物である。PTHとPTHrPはN-末端の13個のアミノ酸でのみ配列の類似点を示し、そのうちの８個は同一である(Abou-Samra  AB,ら、1992、Proc.Natl.Sci.Acad.  USA,  89：2732-2736)。しかし、これらの二つの分子の発現パターンと生理学上の役割は大きく異なっている。PTHは非常に限定された発現パターンをもち、典型的な内分泌ホルモンとして作用するのに対し、PTHrPは広範囲の通常組織中で発現し、主にオートクリン／パラクリン方式で作用する(Urena,P.,ら、1993、Endocrinology、133：617-623；Lee,K.,ら、1995、Endocrinology、136：453-463；及びMartin,T.J.,ら、1995、Miner.Electrolyte  Metab.、21：123-128)。近年、PTHrPは骨及び軟骨の発達の胚体分化で基本的な役割を果たすことが示された。
【０００３】
PTH及びPTHrPは標的細胞の表面に集まった共通のレセプターを介して広範囲にわたって作用を与える(Juppner,H.,ら、1988,  J.Biol.Chem.,  263：1071-1078；Shigeno,C.,ら、1988、J.Biol.Chem.,  263：18369-18377)。PTH/PTHrPレセプターは、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、血管作用性小腸ペプチド(VIP)、グルカゴン-様ペプチド１(GLP-1)、胃腸抑制ポリペプチド(GIP)、セクレチン、下垂体アデニル酸シクラーゼ-活性化ポリペプチド(PACAP)、カルシトニン、及び副腎皮質刺激ホルモン-放出因子(CRF)に関するレセプターを含むG蛋白質-結合レセプタースーパーファミリーのサブファミリーの一員である(Segre,G.,ら、1993、Trends  Endocrinol.  Metab.  4：309-314)。PTH/PTHrPレセプターは両方のリガンドのN-末端の1-34領域を認識(Schipani,E.,ら、1993。Endocrinology、132：2157-2165)し、特に典型的なPTH標的組織、例えば、骨及び腎臓に豊富である(Urena,P.,ら、1993、Endocrinology、133：35-38)。PTH/PTHrPレセプターに結合するリガンドは、少なくとも二種類のシグナリング経路：アデニリルシクラーゼ-cAMP-プロテインキナーゼA経路 (Partridge,NC,ら、1981、Endocrinology  108：220-225)、及びイノシトールトリホスフェート-サイトゾルカルシウム-プロテインキナーゼC経路(Abou-Samra，A-B.,ら、1989、Endocrinology  124：1107-1113)を活性化することができる。
【０００４】
PTH2レセプターと称されるPTHに関する同族体レセプターが確認され、一部特徴付けされてきた(Behar,V.,ら、1996、Endocrinology、137：2748-2757；Gardella,T.J.,ら、1996、The  J.Biol.Chem.,  271：19888-19893；Behar,V.,ら、1996、Endocrinology、137：4217-4224；及びUsdin,T.B.,ら、1997、Endocrinology、138：831-834)。７種類の膜貫通性G蛋白質-結合レセプターのうちで、PTH2レセプターはPTH/PTHrPレセプターに配列が最もよく似ている(アミノ酸配列の51%が一致する)。面白いことに、PTH2レセプターmRNAは骨または骨肉腫細胞株では検出されないが、脾臓外分泌部、肺、心臓、脈管構造及び精巣上体などの多くの組織で発現し、脳に最も豊富である(Usdin,T.B.,ら、1996、Endocrinology、137：4285-4297)。PTH-(1-34)とPTHrP-(1-34)に結合し、これらによって活性化されるPTH/PTHrPレセプターと異なり、PTH2レセプターはPTH-(1-34)とだけ結合し、これによって活性化される。PTHrP(7-34)はPTH2レセプターを認識し、弱いがこれを活性化させることが知見された。さらに、PTHrP中にあるHis5は、PTH2レセプターの「特異性スイッチ」として認識された。PTHrP由来の一つのアミノ酸His5をPTH由来のIle5で置き換えると、PTHrP類似体Ile5-PTHrP-(1-34)NH2となり、これはPTH-2レセプターアゴニストとして作用する。故に、一個のアミノ酸の置換によって不活性PTHrPを重要なPTH2レセプターアゴニストに転換させるのである。しかし[Ile5]PTHrPがPTH/PTHrP及びPTH2のいずれのレセプターにも結合し、これらを活性化させても、[Ile5]PTHrPは選択的PTH2アゴニストではない。一時的な異種(種に関して)発現系では、Trp23がhPTH2レセプター選択性にさらに貢献することが知見された(Gardellaら、JBC1996、271：19888-19893)。PTH/PTHrPレセプターと同様に、PTH結合によってcAMP及び[Ca2+]細胞内シグナリング経路の両方のPTH2レセプター-介在活性化が引き起こされる。
【０００５】
脳の中に非常に豊富に存在し、分布しているため、PTH2レセプターの生理学的機能は、これが神経伝達物質受容体として機能し得ることを示唆する。PTHは中枢神経系(CNS)で知見されたため(Harvey,S.,ら、1993、J.Endocrinol.  139：353-361)、PTHとは異なる内因性PTH2レセプター特異的リガンドがCNS中に存在すると考えられる。近年、Usdinは、免疫学的にPTHとは異なる、視床下部から「PTH2レセプター結合活性」を単離することについて報告した。
【０００６】
PCT国際公開第WO98/04591号として発行されたPCT出願第PCT/US97/13360号は、PTH2レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストである特定のPTHrP類似体の使用について開示している。
【０００７】
1998年３月３日に発行された米国特許出願第5,723,577号は、特定のPTH及びPTHrP類似体について開示している。1997年１月７日及び1997年３月７日出願の米国特許出願第08/779,768号及び同第08/813,534号は、それぞれ、詳細なPTH及びPTHrP類似体について開示している。
【０００８】
PTH2レセプターを活性化するがPTH/PTHrPレセプターを活性化しない特異的なリガンドの開発は、PTH2レセプターの生理学的役割及び特定の病状でその重要な関与を明らかにするのに非常に重要である。本出願人は、ヒトPTH2レセプターと選択的に相互作用し、PTH/PTHrPレセプターの相互作用を実際には行わない、一連のPTH2レセプター-選択的PTH類似体を発見した。本発明の化合物はレセプターサブタイプに対して選択的であるだけでなく、[Ca2+]iトランジエントの刺激によって特異的に信号も出す。従って、本発明の化合物はレセプターサブタイプ及びシグナリング経路選択的である。
発明の概要
一態様において、本発明は、PTH2レセプターに選択的に結合するPTH類似体若しくは短縮型PTH類似体またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。好ましいPTH類似体若しくは短縮型PTH類似体またはその医薬的に許容可能な塩とは、前記類似体が選択的PTH2レセプターアゴニストであるものである。別の好ましいPTH類似体若しくは短縮型PTH類似体またはその医薬的に許容可能な塩とは、前記類似体が選択的PTH2レセプターアンタゴニストであるものである。
【０００９】
PTH2レセプターに選択的に結合するより好ましいPTH類似体は、式(I)：
【００１０】
【化１１】
0004460157.tif 000002
【００１１】
[式中、A1は、親水性または親油性のアミノ酸であり；
A2は、親油性アミノ酸であり；
A3は、親水性または親油性のアミノ酸であり；
A4は、親水性アミノ酸であり；
A5は、親水性または親油性のアミノ酸であり；
A6は、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A7は、親水性または親油性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A8は、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A9は、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A10は、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A11は、親水性または親油性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A12は、親水性または親油性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A13は、親水性アミノ酸であり；
A14は、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A15は、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A16は、親水性または親油性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A17は、親水性または親油性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A18は、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A19は、親水性または親油性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A20は、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A21は、親水性または親油性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A22は、親油性または親水性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A23は、親水性または親油性のアミノ酸であり；
A24は、親水性または親油性のアミノ酸であり；
A25は、親水性アミノ酸であり；
A26は、親水性アミノ酸であり；
A27は、親油性または親水性のアミノ酸であり；
A28は、親油性アミノ酸であり；
A29は、親油性または親水性のアミノ酸であり；
A30は、親水性または親油性のアミノ酸であり；
A31は、親油性または親水性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A32は、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A33は、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A34は、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A35は、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A36は、親油性または親水性のアミノ酸であるか、欠失しており；
A37は、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A38は、親油性または親水性のアミノ酸であるか、欠失しており；
R1及びR2は、それぞれ独立して、H、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルからなる群から選択されるか；
R1またはR2の一方がCOE1(但し、E1は、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルである)であり；及び
R3は、OH、NH2、(C1-30)アルコキシまたはNH-Y-CH2-Z(但し、Yは、(C1-30)炭化水素部分であり、ZはCO2H若しくはCONH2である)であり；
但し、化合物がPTH(1-34)R3、PTH(1-35)R3、PTH(1-36)R3、PTH(1-37)R3またはPTH(1-38)R3ではない]の類似体またはその医薬的に許容可能な塩である。
【００１２】
PTH2レセプターに選択的に結合するPTH類似体の別の好ましい群は、式(II)：
【００１３】
【化１２】
0004460157.tif 000003
【００１４】
[式中、A1は、Ser、Ala、Dap、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A2は、Val、Leu、Ile、Phe、Nle、β-Nal、Aib、p-X-Phe、Acc、Cha、Metであるか、欠失しており；
A3は、Ser、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A4は、Glu、Aspであるか、欠失しており；
A5は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A6は、Gln、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A7は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A8は、Met、Nva、Leu、Val、Ile、Cha、Acc、Nle、p-X-Phe、Phe、β-Nal、Bpa、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A9は、His、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A10は、Asn、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A11は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A12は、Gly、Acc、Aibであるか、欠失しており；
A13は、Lys、Arg、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であり；
A14は、Hisであるか、欠失しており；
A15は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A16は、Ser、Asn、Ala、Aibであるか、欠失しており；
A17は、Ser、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A18は、Met、Nva、Leu、Val、Ile、Nle、p-X-Phe、Phe、β-Nal、Acc、Cha、Aibであるか、欠失しており；
A19は、Glu、Aibであるか、欠失しており；
A20は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A21は、Val、Leu、Ile、Phe、Nle、β-Nal、Aib、p-X-Phe、Acc、Cha、Metであるか、欠失しており；
A22は、Acc、Aib、Gluであるか、欠失しており；
A23は、Trp、Acc、Phe、p-X-Phe、Aib、β-PheまたはChaであり；
A24は、Leu、Acc、Ile、Val、Phe、β-Nal、Nle、Aib、p-X-PheまたはChaであり；
A25は、Arg、LysまたはHN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であり；
A26は、Arg、LysまたはHN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であり；
A27は、Lys、Aib、Leu、hArg、Gln、Acc、Arg、Cha、Nle、Ile、Val、Phe、β-Nalまたはp-X-Pheであり、ここで前記Lysはε-アミノ基上でアシル基により場合により置換されており；
A28は、Leu、Acc、Cha、Ile、Val、Phe、Nle、β-Nal、Aibまたはp-X-Pheであり；
A29は、Gln、AccまたはAibであり；
A30は、Asp、Lys、Argであるか、欠失しており；
A31は、Val、Leu、Nle、Acc、Cha、Phe、Ile、β-Nal、Aib、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A32は、Hisであるか、欠失しており；
A33は、Asnであるか、欠失しており；
A34は、Phe、Tyr、Amp、Aib、β-Nal、Cha、Nle、Leu、Ile、Acc、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A35は、Val、Leu、Nle、Acc、Cha、Phe、Ile、β-Nal、Aib、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A36は、Ala、Val、Aib、Acc、Nva、Abuであるか、欠失しており；
A37は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A38は、Gly、Acc、Aibであるか、欠失しており；
ここで、Xはそれぞれの場合において、独立してOH、ハロ及びCH3からなる群から選択され；
R1及びR2は、それぞれ独立して、H、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルからなる群から選択されるか；
R1またはR2の一方がCOE1(但し、E1は、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルである)であり；及び
R3は、OH、NH2、(C1-30)アルコキシまたはNH-Y-CH2-Z(但し、Yは、(C1-30)炭化水素部分であり、ZはCO2H若しくはCONH2である)であり；
nはそれぞれの場合において独立して１〜５の整数であり；及び
R4はそれぞれの場合において独立して、(C1-30)アルキル、(C1-30)アシルまたは-C((NH)(NH2))であり；
但し、化合物がPTH(1-34)R3、PTH(1-35)R3、PTH(1-36)R3、PTH(1-37)R3またはPTH(1-38)R3ではない]の類似体またはその医薬的に許容可能な塩である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、式(IV)：
【００１６】
【化１３】
0004460157.tif 000004
【００１７】
[式中、A1は、Ala、Ser、Dap、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A2は、Valであるか、欠失しており；
A3は、Ser、Aib、Thrであるか、欠失しており；
A4は、Glu、Aspであるか、欠失しており；
A5は、His、Ile、Acc、Val、Nle、Phe、Leu、p-X-Phe、β-Nal、Aib、Chaであるか、欠失しており；
A6は、Gln、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A7は、Leu、Val、Cha、Nle、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、Aib、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A8は、Leu、Met、Acc、Cha、Aib、Nle、Phe、Ile、Val、β-Nal、p-X-Phe、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A9は、His、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A10は、Asp、Asn、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A11は、Lys、Arg、Leu、Cha、Aib、p-X-Phe、Ile、Val、Nle、Acc、Phe、β-Nal、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)、親油性D-アミノ酸、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A12は、Gly、Acc、Aibであるか、欠失しており；
A13は、Lys、Arg、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A14は、Ser、Hisであるか、欠失しており；
A15は、Ile、Acc、Cha、Leu、Phe、Nle、β-Nal、Trp、p-X-Phe、Val、Aibであるか、欠失しており；
A16は、Gln、Aibであるか、欠失しており；
A17は、Asp、Aibであるか、欠失しており；
A18は、Leu、Aib、Acc、Cha、Phe、Ile、Nle、β-Nal、Val、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A19は、Arg、Lys、Aib、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A20は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A21は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A22は、Phe、Glu、Aib、Acc、p-X-Phe、β-Nal、Val、Leu、Ile、NleまたはChaであり；
A23は、Phe、Leu、Lys、Acc、Cha、β-Nal、Aib、Nle、Ile、p-X-Phe、ValまたはTrpであり；
A24は、Leu、Lys、Acc、Nle、Ile、Val、Phe、β-Nal、Aib、p-X-Phe、ArgまたはChaであり；
A25は、His、Lys、Aib、Acc、ArgまたはGluであり；
A26は、His、Aib、Acc、ArgまたはLysであり；
A27は、Leu、Lys、Acc、Arg、Ile、Val、Phe、Aib、Nle、β-Nal、p-X-PheまたはChaであり；
A28は、Ile、Leu、Lys、Acc、Cha、Val、Phe、p-X-Phe、Nle、β-Nal、Aibであるか、欠失しており；
A29は、Ala、Glu、Acc、Aibであるか、欠失しており；
A30は、Glu、Leu、Nle、Cha、Aib、Acc、Lys、Argであるか、欠失しており；
A31は、Ile、Leu、Cha、Lys、Acc、Phe、Val、Nle、β-Nal、Argであるか、欠失しており；
A32は、Hisであるか、欠失しており；
A33は、Thr、Serであるか、欠失しており；
A34は、Ala、Phe、Tyr、Cha、Val、Ile、Leu、Nle、β-Nal、Aib、Accであるか、欠失しており；
A35は、Glu、Aspであるか、欠失しており；
A36は、Ile、Acc、Cha、Leu、Phe、Nle、β-Nal、Trp、p-X-Phe、Val、Aibであるか、欠失しており；
A37は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A38は、Ala、Phe、Tyr、Cha、Val、Ile、Leu、Nle、β-Nal、Aib、Accであるか、欠失しており；
R1及びR2は、それぞれ独立して、H、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルからなる群から選択されるか；
R1またはR2の一方がCOE1(但し、E1は、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルである)であり；
R3は、OH、NH2、(C1-30)アルコキシまたはNH-Y-CH2-Z(但し、Yは、(C1-30)炭化水素部分であり、ZはCO2H若しくはCONH2である)であり；
それぞれの場合において、nは独立して１〜５の整数であり；及び
それぞれの場合において、R4は独立して、(C1-30)アルキル、(C1-30)アシルまたは-C((NH)(NH2))であり；
但し、化合物がPTHrP(1-34)R3、PTHrP(1-35)R3、PTHrP(1-36)R3、PTHrP(1-37)R3またはPTHrP(1-38)R3ではなく：
さらに、但し、化合物が[Ile5、Trp23]PTHrP(1-36)または[Trp23]PTHrP(1-36)ではない]のPTH2レセプターに選択的結合するPTHrP類似体またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、PTH2レセプターに選択的に結合するPTH類似体若しくは短縮型PTH類似体またはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、投与を必要とする患者に投与することを含む、PTH2レセプターを選択的に結合させる方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、選択的PTH2レセプターアゴニストであるPTH類似体若しくは短縮型PTH類似体またはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、投与を必要とする患者に投与することを含む、PTH2レセプターからアゴニスト応答を選択的に導出する方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、選択的PTH2レセプターアンタゴニストであるPTH類似体若しくは短縮型PTH類似体またはその医薬的に許容可能な塩の有効量を、投与を必要とする患者に投与することを含む、PTH2レセプターからアンタゴニスト応答を選択的に導出する方法を提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、式(III)：
【００２２】
【化１４】
0004460157.tif 000005
【００２３】
[式中、A1は、Ser、Ala、Dap、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A2は、Val、Leu、Ile、Phe、Nle、β-Nal、Aib、p-X-Phe、Acc、Cha、Metであるか、欠失しており；
A3は、Ser、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A4は、Glu、Aspであるか、欠失しており；
A5は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A6は、Gln、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A7は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A8は、Met、Nva、Leu、Val、Ile、Cha、Acc、Nle、p-X-Phe、Phe、β-Nal、Bpa、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A9は、His、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A10は、Asn、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A11は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A12は、Gly、Acc、Aibであるか、欠失しており；
A13は、Lys、Arg、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であり；
A14は、Hisであるか、欠失しており；
A15は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A16は、Ser、Asn、Ala、Aibであるか、欠失しており；
A17は、Ser、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A18は、Met、Nva、Leu、Val、Ile、Nle、p-X-Phe、Phe、β-Nal、Acc、Cha、Aibであるか、欠失しており；
A19は、Glu、Aibであるか、欠失しており；
A20は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A21は、Val、Leu、Ile、Phe、Nle、β-Nal、Aib、p-X-Phe、Acc、Cha、Metであるか、欠失しており；
A22は、Acc、Aib、Gluであるか、欠失しており；
A23は、Trp、Acc、Phe、p-X-Phe、Aib、β-NalまたはChaであり；
A24は、Leu、Acc、Ile、Val、Phe、β-Nal、Nle、Aib、p-X-PheまたはChaであり；
A25は、Arg、LysまたはHN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であり；
A26は、Arg、LysまたはHN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であり；
A27は、Lys、Aib、Leu、hArg、Gln、Acc、Arg、Cha、Nle、Ile、Val、Phe、β-Nalまたはp-X-Pheであり、ここで前記Lysはε-アミノ基上でアシル基により場合により置換されており；
A28は、Leu、Acc、Cha、Ile、Val、Phe、Nle、β-Nal、Aibまたはp-X-Pheであり；
A29は、Gln、AccまたはAibであり；
A30は、Asp、Lys、Argであるか、欠失しており；
A31は、Val、Leu、Nle、Acc、Cha、Phe、Ile、β-Nal、Aib、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A32は、Hisであるか、欠失しており；
A33は、Asnであるか、欠失しており；
A34は、Phe、Tyr、Amp、Aib、β-Nal、Cha、Nle、Leu、Ile、Acc、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A35は、Val、Leu、Nle、Acc、Cha、Phe、Ile、β-Nal、Aib、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A36は、Ala、Val、Aib、Acc、Nva、Abuであるか、欠失しており；
A37は、Leu、Val、Nle、Ile、Cha、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A38は、Gly、Acc、Aibであるか、欠失しており；
ここで、Xはそれぞれの場合において、独立してOH、ハロ及びCH3からなる群から選択され；
R1及びR2は、それぞれ独立して、H、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルからなる群から選択されるか；
R1またはR2の一方がCOE1(但し、E1は、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルである)であり；及び
R3は、OH、NH2、(C1-30)アルコキシまたはNH-Y-CH2-Z(但し、Yは、(C1-30)炭化水素部分であり、ZはCO2H若しくはCONH2である)であり；
nはそれぞれの場合において独立して１〜５の整数であり；及び
R4はそれぞれの場合において独立して、(C1-30)アルキル、(C1-30)アシルまたは-C((NH)(NH2))であり；
但し、A8が親油性D-アミノ酸でないか、欠失していないとき、A6、A7、A9、A10、A11及びA12の少なくとも一つはD-アミノ酸であるか、A6、A7、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20、A21及びA22の少なくとも一つは欠失しており；かつ
但し、化合物がD-アミノ酸を含むとき、A36は欠失している]の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００２４】
式(III)の化合物の好ましい群は、以下に示す実施例１〜７３に列記した化合物である。実施例１〜７３に列記した化合物の中でも、以下の化合物が好ましい：
【００２５】
【化１５】
0004460157.tif 000006
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、式(V)：
【００２７】
【化１６】
0004460157.tif 000007
【００２８】
[式中、A1は、Ala、Ser、Dap、Thr、Aibであるか、欠失しており；
A2は、Valであるか、欠失しており；
A3は、Ser、Aib、Thrであるか、欠失しており；
A4は、Glu、Aspであるか、欠失しており；
A5は、His、Ile、Acc、Val、Nle、Phe、Leu、p-X-Phe、β-Nal、Aib、Chaであるか、欠失しており；
A6は、Gln、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A7は、Leu、Val、Cha、Nle、β-Nal、Trp、Pal、Acc、Phe、p-X-Phe、Aib、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A8は、Leu、Met、Acc、Cha、Aib、Nle、Phe、Ile、Val、β-Nal、p-X-Phe、親油性アミノ酸であるか、欠失しており；
A9は、His、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A10は、Asp、Asn、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A11は、Lys、Arg、Leu、Cha、Aib、p-X-Phe、Ile、Val、Nle、Acc、Phe、β-Nal、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)、親油性D-アミノ酸、親水性アミノ酸であるか、欠失しており；
A12は、Gly、Acc、Aibであるか、欠失しており；
A13は、Lys、Arg、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A14は、Ser、Hisであるか、欠失しており；
A15は、Ile、Acc、Cha、Leu、Phe、Nle、β-Nal、Trp、p-X-Phe、Val、Aibであるか、欠失しており；
A16は、Gln、Aibであるか、欠失しており；
A17は、Asp、Aibであるか、欠失しており；
A18は、Leu、Aib、Acc、Cha、Phe、Ile、Nle、β-Nal、Val、p-X-Pheであるか、欠失しており；
A19は、Arg、Lys、Aib、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A20は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A21は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A22は、Phe、Glu、Aib、Acc、p-X-Phe、β-Nal、Val、Leu、Ile、NleまたはChaであり；
A23は、Phe、Leu、Lys、Acc、Cha、β-Nal、Aib、Nle、Ile、p-X-Phe、ValまたはTrpであり；
A24は、Leu、Lys、Acc、Nle、Ile、Val、Phe、β-Nal、Aib、p-X-Phe、ArgまたはChaであり；
A25は、His、Lys、Aib、Acc、ArgまたはGluであり；
A26は、His、Aib、Acc、ArgまたはLysであり；
A27は、Leu、Lys、Acc、Arg、Ile、Val、Phe、Aib、Nle、β-Nal、p-X-PheまたはChaであり；
A28は、Ile、Leu、Lys、Acc、Cha、Val、Phe、p-X-Phe、Nle、β-Nal、Aibであるか、欠失しており；
A29は、Ala、Glu、Acc、Aibであるか、欠失しており；
A30は、Glu、Leu、Nle、Cha、Aib、Acc、Lys、Argであるか、欠失しており；
A31は、Ile、Leu、Cha、Lys、Acc、Phe、Val、Nle、β-Nal、Argであるか、欠失しており；
A32は、Hisであるか、欠失しており；
A33は、Thr、Serであるか、欠失しており；
A34は、Ala、Phe、Tyr、Cha、Val、Ile、Leu、Nle、β-Nal、Aib、Accであるか、欠失しており；
A35は、Glu、Aspであるか、欠失しており；
A36は、Ile、Acc、Cha、Leu、Phe、Nle、β-Nal、Trp、p-X-Phe、Val、Aibであるか、欠失しており；
A37は、Arg、Lys、HN-CH((CH2)nNH-R4)-C(O)であるか、欠失しており；
A38は、Ala、Phe、Tyr、Cha、Val、Ile、Leu、Nle、β-Nal、Aib、Accであるか、欠失しており；
R1及びR2は、それぞれ独立して、H、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルからなる群から選択されるか；
R1またはR2の一方がCOE1(但し、E1は、(C1-30)アルキル、(C2-30)アルケニル、フェニル-(C1-30)アルキル、ナフチル(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C1-30)アルキル、ヒドロキシ(C2-30)アルケニル、ヒドロキシ-フェニル(C1-30)アルキルまたはヒドロキシ-ナフチル(C1-30)アルキルである)であり；
R3は、OH、NH2、(C1-30)アルコキシまたはNH-Y-CH2-Z(但し、Yは、(C1-30)炭化水素部分であり、ZはCO2H若しくはCONH2である)であり；
それぞれの場合において、nは独立して１〜５の整数であり；及び
それぞれの場合において、R4は独立して、(C1-30)アルキル、(C1-30)アシルまたは-C((NH)(NH2))であり；
但し、A8が親油性D-アミノ酸でないか、欠失していないとき、A6、A7、A9、A10、A11及びA12の少なくとも一つはD-アミノ酸であるか、A6、A7、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20、A21及びA22の少なくとも一つは欠失している]の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００２９】
式(V)の化合物の好ましい群は、以下に示す実施例７４〜８６に列記した化合物である。
さらに別の態様では、本発明は、式(I)、(II)若しくは(III)の類似体またはその医薬的に許容可能な塩を、投与を必要とする患者に投与することを含む、PTH2レセプターを選択的に結合させる方法を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、式(III)若しくは(V)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、投与を必要とする患者に投与することを含む、PTH2レセプターを選択的に結合させる方法を提供する。上記方法の好ましいものは、該化合物が実施例１〜７３または実施例７４〜８６から選択されるものである。
【００３１】
別の態様では、本発明は、式(I)、(II)若しくは(III)の類似体またはその医薬的に許容可能な塩と医薬的に許容可能なキャリヤとを含む医薬組成物に関する。さらに別の態様では、本発明は、式(III)若しくは(V)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と医薬的に許容可能なキャリヤとを含む医薬組成物に関する。実施例１〜７３または実施例７４〜８６から選択される化合物を含む医薬組成物が好ましい。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、PTH2レセプターの改変または過剰作用により生じた内科的疾患の治療方法であって、投与を必要とする患者のPTH2レセプターの活性化を阻害するのに十分な、PTH2レセプターに選択的に結合するPTH類似体若しくは短縮型PTH類似体またはその医薬的に許容可能な塩の有効量を該患者に投与することを含む、該方法に関する。前記内科的疾患が、異常CNS作用、異常脾臓作用、正常な無機質代謝及びホメオスタシスからの逸脱、男性不妊症、異常血圧または視床下部疾患である場合の上記方法が好ましい。前記類似体がPTH2アゴニストまたはPTH2アンタゴニストである場合のそれぞれの上記方法が好ましい。
【００３３】
別の態様では、本発明は、PTH2レセプターの改変または過剰作用により生じた内科的疾患の治療方法であって、投与を必要とする患者のPTH2レセプターの活性化を阻害するのに十分な、式(I)、(II)または(III)の類似体の有効量を該患者に投与することを含む、該方法を提供する。前記内科的疾患が、異常CNS作用、異常脾臓作用、正常な無機質代謝及びホメオスタシスからの逸脱、男性不妊症、異常血圧または視床下部疾患である場合の上記方法が好ましい。
【００３４】
別の態様では、本発明は、PTH2レセプターの改変または過剰作用により生じた内科的疾患の治療方法であって、投与の必要な患者のPTH2レセプターの活性化を阻害するのに十分な、式(III)または(V)の化合物の有効量を該患者に投与することを含む、該方法を提供する。前記内科的疾患が、異常CNS作用、異常脾臓作用、正常な無機質代謝及びホメオスタシスからの逸脱、男性不妊症、異常血圧または視床下部疾患である場合の上記方法が好ましい。該化合物が実施例１〜７３または実施例７４〜８６から選択される場合の上記方法が好ましい。
詳細な説明
N-末端アミノ酸を除いて、本開示におけるアミノ酸の全ての略号(例えば、AlaまたはA1)は、-NH-CH(R)-CO-(式中、Rはアミノ酸の側鎖、例えば、AlaのCH3である)の構造を表す。N-末端アミノ酸に関しては、略号は(R1R2)-N-CH(R)-CO-(式中、Rはアミノ酸の側鎖であり、R1及びR2は、上記定義通りである)の構造を表す。Bpaはp-ベンゾイルフェニルアラニンである。β-Nal、Nle、Dap、Cha、Nva、Amp、Pal、及びAibは、以下のα-アミノ酸：β-(2-ナフチル)アラニン、ノルロイシン、α,β-ジアミノプロピオン酸、シクロヘキシルアラニン、ノルバリン、4-アミノ-フェニルアラニン、β-(3-ピリジニル)アラニン及びα-アミノイソ酪酸のそれぞれの略号である。Accにより表されるものは、1-アミノ-1-シクロプロパンカルボン酸；1-アミノ-1-シクロブタンカルボン酸；1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸；1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸；1-アミノ-1-シクロヘプタンカルボン酸；1-アミノ-1-シクロオクタンカルボン酸；及び1-アミノ-1-シクロノナンカルボン酸の群から選択されるアミノ酸である。上記式において、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシフェニルアルキル、及びヒドロキシナフチルアルキルは、１〜４個のヒドロキシ置換基を含み得る。COE1は-C=O・E1を表す。-C=O・E1の例としては、アセチル及びフェニルプロピオニルが挙げられるが、これらに限定されない。「(C1-12)炭化水素部分」とは、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を表す。
【００３５】
「親水性アミノ酸」とは、ペプチド結合形成に必要なものに加えて少なくとも一つの親水性官能基を有するアミノ酸であり、例えば、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Orn(オルニチン)、Ser、Thr、β-Ala、Ala、Aad(α-アミノアジピン酸)、β-Aad(β-アミノアジピン酸)、Apm(α-アミノピモリン酸：α-aminopmolic  acid)、Cit(シトルリン)、Gla(γ-カルボキシ-グルタミン酸)、hArg(ホモ-Arg)、hCit(ホモ-Cit)、hSer(ホモ-Ser)、Dba(α,γ-ジアミノ-酪酸)、Dpa(α,β-ジアミノプロピオン酸)、Amp(p-アミノ-フェニルアラニン)、Pal及びそれらの同族体がある。
【００３６】
「親油性アミノ酸」とは、非荷電の、脂肪族または芳香族のアミノ酸であり、例えば、Val、Leu、Ile、Pro、Cys、Phe、Met、Trp、Tyr、Cha、β-Nal、Aib、Acc、Ala、Abu(α-アミノ酪酸)、Nle、Nva(ノルバリン)、Bpa(p-ベンゾイル-フェニルアラニン)、hPhe(ホモ-Phe)、hPro(ホモ-Pro)、1-Nal(β-(1-ナフチル)アラニン)、2-Nal(β-(2-ナフチル)アラニン)、Oic(オクタヒドロインドデ-2-カルボン酸)、Tic(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸)、Pen(ペニシラミン)、Phg(フェニルグリシン)、Tle(t-ロイシン)、p-X-Phe(X=Br、F、I、Cl、CH、フェニル、CN、NO2)、Tal(β-(2-チエニル)-アラニン)及びそれらの同族体がある。
【００３７】
アラニン、β-アラニン及びサルコシン(Sar)は、親水性または親油性のアミノ酸のいずれかとしてみなすことができる。
「PTHの生理学的に活性な短縮型(truncated)同族体または類似体」は、PTHに知見されるアミノ酸の完全数よりも少ない配列を持つポリペプチドを指す。
【００３８】
本明細書中で使用する他の略号のフルネームは、以下の通りである：Bocとはt-ブチルオキシカルボニルであり、HFはフッ化水素であり、Fmはホルミルであり、Xanはキサンチルであり、Bzlとはベンジルであり、Tosはトシルであり、DNPは2,4-ジニトロフェニルであり、DMFはジメチルホルムアミドであり、DCMはジクロロメタンであり、HBTUは2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、DIEAはジイソプロピルエチルアミンであり、HOAcは酢酸であり、TFAはトリフルオロ酢酸であり、2ClZは2-クロロベンジルオキシカルボニルであり、及びOcHexはo-シクロヘキシルである。
【００３９】
本発明のペプチドは別の書式、例えば、[D-Nle8]hPTH(1-34)NH2によっても表され、天然配列からの置換アミノ酸は一組の括弧内に入っている(例えば、hPTH中のMet8の代わりのD-Nle8)。hPTHの略号はヒトPTHを示し、hPTHrPはヒトPTHrPを示す。括弧の間の数字は、ペプチド内にあるアミノ酸の数を示す[例えば、hPTH(1-34)は、ヒトPTHのペプチド配列のアミノ酸１〜３４である]。hPTH(1-34)及びhPTHrP(1-34)の配列は、Nissensonら、Receptor、3：193(1993)に列記されている。PTH(1-34)NH2中の「NH2」の表示は、ペプチドのC-末端がアミド化されていることを示す。PTH(1-34)は、C-末端が遊離酸であることを意味する。
【００４０】
本発明のペプチドは、標準固相ペプチド合成により製造することができる。例えば、Stewart,J.M.ら、Solid  State  Synthesis(Pierce  Chemical  Co.,第二版、1984)を参照されたい。上記一般式の置換基R1及びR2は、当業界で公知の標準法によりN-末端アミノ酸の遊離酸に結合することができる。例えば、アルキル基、例えば、(C1-12)アルキルは、還元的アルキル化を使用して結合させることができる。ヒドロキシアルキル基、例えば、(C1-12)ヒドロキシアルキルは、遊離ヒドロキシ基がt-ブチルエステルにより保護されている、還元的アルキル化を使用して結合させることができる。アシル基、例えば、COE1は、塩化メチレン中、遊離酸とジイソプロピルカルボジイミドの両方の３モル当量と完成樹脂とを１時間混合することによって、遊離酸、例えば、E1COOHをN-末端アミノ酸の遊離アミンにカップリングによって結合させることができる。遊離酸が遊離ヒドロキシル基、例えば、p-ヒドロキシフェニルプロオン酸を含有する場合、カップリングはさらに３モル当量のHOBTで実施しなければならない。
【００４１】
R3がNH-Y-CH2-CONH2(Z=CONH2)である場合、ペプチド合成はBocHN-Y-CH2-COOHで開始し、これを樹脂に結合させる。R3がNH-Y-CH2-COOH(Z=COOH)である場合、ペプチド合成はBoc-HN-Y-CH2-COOHで開始し、これをPAM樹脂と結合させる。R3がOHである場合、最初のアミノ酸をPAM樹脂と結合させる。
以下に記載したアッセイにより、本発明の化合物のアデニル酸シクラーゼおよび／または細胞内カルシウムトランジェントを刺激する能力について、ヒトＰＴＨ２（ｈＰＴＨ２）受容体への結合を試験することができる。
材料および方法：  組織培養培地および血清はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ    Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入し、すべての組織培養プラスチック製品はＣｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から得た。アデノシンおよび３‐イソブチル‐１‐メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）から購入した。フラ‐２アセトキシルメチルエステル（ｆｕｒａ‐２／ＡＭ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得、そしてｈＰＴＨｒＰはＢａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から購入した。［3Ｈ］‐アデニンはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。Ｎａ125ＩはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から得た。他のすべての分析用等級試薬はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
細胞培養：  ヒト骨肉腫Ｓａｏｓ‐２／Ｂ‐細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ８５）は１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および２ｍＭグルタミンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、空気中５％ＣＯ2の加湿大気中に３７℃で維持した。培地は３または４日毎に交換し、細胞はトリプシン処理により毎週継代培養する。ｈＴＰＨ２受容体を発現する、安定的にトランスフェクトされた（１６０，０００受容体／細胞）ＨＥＫ‐２９３／ＢＰ‐１６細胞（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ‐Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ    Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびｈＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体を発現する安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ‐２９３／Ｃ‐２１細胞（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ‐Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ    Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）は１０％ＦＢＳで補足したＤＭＥＭ中で、９５％空気／５％ＣＯ2の加湿大気中に３７℃で維持する。培地はコンフルエントになる前は２日毎に、そしてコンフルエントになった後は毎日交換した。細胞は週に１回１：１０で継代培養する。
受容体結合アッセイ：リガンド結合は放射リガンドとしてＨＰＬＣにより精製した［125Ｉ］［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34］ｂＰＴＨ‐（１‐３４）ＮＨ2（125Ｉ‐ＰＴＨ）を用い，Ｓａｏｓ‐２／Ｂ‐１０、ＨＥＫ／Ｃ‐２１細胞またはＨＥＫ／ＢＰ‐１６細胞を使用して行った。Ｓａｏｓ‐２細胞はコンフルエントに達するまで４日間維持する。培地は５％ＦＢＳで補足したＲＰＭＩと交換し、１０―11‐１０―4Ｍの間の異なる濃度の本発明の競合的ペプチド存在下で、１０ｘ１０4ｃｐｍ  モノ‐125Ｉ‐［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34（３‐125Ｉ）］ｂＰＴＨ（１‐３４）ＮＨ2と共に約２時間、室温でインキュベートする。細胞は氷冷ＰＢＳで４回洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＯＨで溶解し、細胞に関連した放射活性はシンチレーションカウンターで計数する。モノ‐125Ｉ‐［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34（３‐125Ｉ）］ｂＰＴＨ（１‐３４）ＮＨ2の合成はＧｏｌｄｍａｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２３：１４６８（１９８８）に記載した方法で行う。
結合アッセイは本発明の各種ペプチドで行い、各ペプチドのＫｄ値（モノ‐125Ｉ‐［Ｎｌｅ8,18，Ｔｙｒ34（３‐125Ｉ）］ｂＰＴＨ（１‐３４）ＮＨ2結合の半最大阻害）を計算する。
アデニル酸シクラーゼアッセイ：アデニル酸シクラーゼアッセイはＳａｏｓ‐２／Ｂ‐１０細胞、ＨＥＫ／Ｃ‐２１細胞、およびＨＥＫ／ＢＰ‐１６細胞で行う。本発明のペプチドがＳａｏｓ‐２／Ｂ‐１０細胞に生物学的反応を誘導する能力を測定する。より具体的には、先にＲｏｄａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２：１５１１（１９８３）およびＧｏｌｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２３：１４６８（１９８８）が記載した方法で、アデニル酸シクラーゼのどんな刺激もｃＡＭＰ（アデノシン３'，５'‐一燐酸）合成レベル測定により測定する。２４ウェルプレートでＳａｏｓ‐２／Ｂ‐１０細胞は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に、４ｘ１０4細胞／ウェルでコンフルエントになるまで培養する。細胞はＣａ2+およびＭｇ2+を含まないハンクスの平衡塩類溶液で２回洗浄し、新鮮な培地で０．５μＣｉ［3Ｈ］アデニン（２６．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）と共に３７℃で約２時間インキュベートし、ハンクスの平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で２回洗浄する。細胞は新鮮な培地中で１ｍＭ  ＩＢＭＸ（イソブチルメチル‐キサンチン，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により１５分間処理し、試験ペプチドを培地に添加し、５分間インキュベートする。反応は１．２Ｍ  三塩化酢酸（ＴＣＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ）の添加、および４Ｎ  ＫＯＨによるサンプル中和により停止する。ｃＡＭＰは２‐カラムクロマトグラフィー（Ｓａｌｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，５４１）により単離する。放射活性はシンチレーションカウンター（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ２２００ＣＡ，ＰＡＣＫＡＲＤ，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で計数する。
［Ｃａ2+］iの測定：細胞内Ｃａ2+（［Ｃａ2+］i）の測定はＳａｏｓ‐２／Ｂ‐１０細胞、ＨＥＫ／Ｃ‐２１細胞およびＨＥＫ／ＢＰ‐１６細胞で行う。［Ｃａ2+］iの測定のために、細胞は０．０２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＥＤＴＡを含む、ＨＥＰＥＳでｐＨを調整した平衡塩類溶液を用いて、１５０‐ｃｍ2フラスコから採取する。細胞懸濁液はハンクスの平衡塩類溶液（１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ｄ‐グルコース、および２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、細胞にフラ‐２／ＡＭ（１μＭ）を約３７℃で約４０分間、負荷する。細胞懸濁液はハンクスの平衡塩類溶液で３回洗浄し、ＳＰＥＸ  ＡＲ‐ＣＭ  系分光蛍光計（ＳＰＥＸ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）で測定する。二波長測定を行う（励起波長、３４０および３８０ｎｍ；放出波長、５０５ｎｍ）。
［Ｃａ2+］iは以下の方程式：［Ｃａ2+］i＝Ｋ（Ｒ−Ｒmin）／（Ｒmax−Ｒ）によりフラ‐２比（Ｒ）から計算する。ここでＲminおよびＲmaxはそれぞれ最小および最大カルシウム濃度に対する比（例えば３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）である。Ｋは生成物Ｋd（Ｆo／Ｆs）、ここでＫdは有効解離定数（２２４ｎＭ）であり、Ｆoはカルシウム非存在下での３８０‐ｎｍ励起シグナルの強度であり、そしてＦsは飽和カルシウム濃度における３８０‐ｎｍ励起シグナルの強度である。最大蛍光強度は、１ｍＭ  ＣａＣｌ2存在下で５０μＭジギトニンにより細胞を透過性にすることにより得、最小蛍光強度は１６．６ｍＭ  ＥＧＴＡ（１Ｍ  トリス‐（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩基でｐＨを８．３に調整）でカルシウムをキレートすることにより得る。ベヒクルのみ（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ）を添加しても［Ｃａ2+］iレベルは変化しなかった。
本発明のペプチドは薬剤的に受容できる塩の形状で提供できる。そのような塩の例として有機酸（例えば、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはパモ酸）、無機酸、（例えば、塩酸、硫酸、または燐酸）、および重合酸（例えば、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸‐グリコール酸のコポリマー）と共に形成する塩があるが、これに限定されない。
本発明のペプチドの治療的有効量および薬剤的に受容できる担体物質（例えば、炭酸マグネシウム、ラクトース、または治療用化合物がそれらと共にミセルを形成できる燐脂質）は一緒になって患者に投与（例えば、経口、静脈内、経皮、肺、膣、皮下、鼻、イオン泳動的、または気管内）するための治療用組成物（例えば、丸剤、錠剤、カプセル、または液体）を形成する。経口的に投与する丸剤、錠剤、またはカプセルは、消化されずに胃を通過して小腸に達するために十分な時間、胃酸または腸酵素から活性組成物を保護するための物質で被覆できる。治療用組成物はまた、皮下または筋肉内投与のための生分解性または非生分解性持続放出製剤であってもよい。例えば、米国特許３，７７３，９１９号および４，７６７，６２８号およびＰＣＴ出願  ＷＯ９４／１５５８７を参照されたい。植え込み型または体外ポンプ（例えば、ＩＮＦＵＳＡＩＤTMポンプ）を使用して持続投与ができる。投与はまた、例えば１日１回の注射のように間欠的に、または例えば持続放出製剤のように、低用量で持続的に行うことができる。
経口投与のための液体投与形態は、水のような、当技術分野で一般に使用する不活性希釈剤を含む薬剤的に受容できる乳剤、溶液、懸濁剤、シロップ、エリキシルを含む。そのような不活性な希釈剤のほかに、組成物は湿潤剤、乳化剤、懸濁剤のようなアジュバント、甘味剤、香味剤、および芳香剤を含んでいてもよい。非経口的投与のための本発明に従った製剤は滅菌水性または非水性溶液、懸濁剤、または乳剤を含む。非水性溶媒またはベヒクルの例としてプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーン油のような植物油、ゼラチン、およびエチルオレイン酸のような有機エステル注射剤がある。そのような剤型はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のようなアジュバントを含んでいてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターによるろ過、組成物への滅菌剤の取り込み、組成物の照射、または組成物の加熱により滅菌してもよい。それらはまた、滅菌水または他の注射用滅菌媒質で使用前に速やかに溶解できる滅菌固体組成物の形状で製造してもよい。
直腸または膣投与のための組成物は、好ましくは、活性物質のほかに、ココアバターまたは座剤ワックスのような賦形剤を含んでいてもよい座剤である。
鼻または舌下投与のための組成物もまた、当該技術分野で周知の標準賦形剤と共に製造する。
さらに、本発明の化合物は以下の特許に記載されているような持続放出組成物として投与できる。米国特許５，６７２，６５９号は、生物活性剤およびポリエステルを含む持続放出組成物について教示する。米国特許５，５９５，７６０号は、ゲルに適した形状の生物活性剤を含む持続放出組成物について教示する。１９９７年、９月９日に出願された、米国特許出願第０８／９２９，３６３号は生物活性剤およびキトサンを含む重合持続放出組成物について教示する。１９９６年、１１月１日に出願された米国特許出願第０８／７４０，７７８号は生物活性剤およびデキストリンを含む持続放出組成物について教示する。１９９８年１月２９日に出願された、米国特許出願第０９／０１５，３９４号は生物活性剤の吸収性持続放出組成物について教示する。前記の特許および出願に記載された内容は参照としてここに包含される。
本発明の組成物の活性成分投与量は変化してもよい；しかし、活性成分の量は、適切な剤型が得られるような量であることが必要である。選択した投与量は所望する治療効果、投与経路、および治療期間に依存する。一般に、１日に０．０００１‐１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の投与量を投与する。
１回量または複数の量に分割して投与できる好ましい投与量の範囲は、０．００１‐０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
本発明の化合物を以下の実施例で説明するが、その記載に限定されるものではない。
【００４２】
【実施例】
実施例１
[Cha7,11、D-Nle8、Nle18、Tyr34]hPTH(1-34)NH2
ペプチド[Cha7,11、D-Nle8、Nle18、Tyr34]hPTH(1-34)NH2を、Boc-化学固相ペプチド合成を加速させるために変形したApplied  Biosystem(Foster  City,  CA)モデル430Aシンセサイザー上で合成した。Schnoizeら、Int.J.Peptide  Protein  Res.,90：180(1992)を参照されたい。0.93mmol/gの置換度の4-メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂(Peninsula  Belmont、CA)を使用した。Bocアミノ酸(Bachem、CA,  Torrance、CA；Nova  Biochem.,  LaJolla、CA)を以下の側鎖保護：Boc-Asn(キサンチル)、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Asp(OcHex)-OH、Boc-Glu(OcHex)-OH、Boc-His(DNP)-OH、Boc-Cha-OH、Boc-D-Nle-OH、Boc-Nle-OH、Boc-Val-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Lys(2ClZ)-OH、Boc-Ser(Bzl)-OH、Boc-Trp(ホルミル)-OH及びBoc-Tyr(Br-Z)-OH(但し、Zはベンジルオキシカルボニルである)と一緒に使用した。合成は、0.14mmolスケールで実施した。Boc基は、100%TFAで２×１分の処理により外した。Bocアミノ酸(2.5mmol)をDMF４mL中、HBTU(2.0mmol)とDIEA(1.0mL)で予備活性化し、ペプチド-樹脂TFA塩を前中性化せずに結合した。カップリング時間は約５分であった。
【００４３】
ペプチド鎖の組立終了時、樹脂をDMF中20%メルカプトエタノール/10%DIEAの溶液で２×30分間処理して、His側鎖上のDNP基を外した。樹脂をDMFで洗浄した。次いでN-末端Boc基を、100%TFAで２×２分間処理して外した。樹脂をDMFで洗浄し、エタノールアミン：H2O：DMF/15：15：70で２×２分間処理して、Trp残基上のホルミル保護基を外した。部分的に脱保護したペプチド-樹脂をDMF及びDCMで洗浄し、真空乾燥した。アニソール１mLとジチオスレイトール(24mg)を含有するHF(10mL)中、0℃で約75分間撹拌することによって、最終的に開裂させた。HFは窒素フローにより除去した。残渣をエーテル(6×10mL)で洗浄し、4N  HOAc(6×10mL)で抽出した。
【００４４】
水性抽出液中のペプチド混合物を、逆相VYDAC(商標)C18カラム(Nest  Group、Southborough、MA)を使用する分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)上で精製した。カラムは、一次勾配液(溶液A中の溶液B10%〜45%で130分)、流速10mL/分(溶液A=0.1%TFAを含有する水；溶液B=0.1%TFAを含有するアセトニトリル)で溶出した。画分を集め、分析HPLCにより調べた。純粋な生成物を含有する画分を集め、凍結乾燥した。白色固体114mgが得られた。純度は分析HPLCベースで＞98%であった。電気噴霧マススペクトル分析により、分子量は4176.4であった(計算値の分子量4176.9と一致)。
実施例２
[D-Nle8、Nle18、Tyr34]hPTH(1-34)NH2
Boc-保護化アミノ酸、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及びp-メチルベンズヒドロキシルアミン樹脂は、Applied  Biosystems(Foster  City、CA)より入手した。Boc-(3-ヨード)チロシン[O-(3-BrBz)]は、Peninsula  Laboratories(Belmont、CA)より購入した。Ｂ＆Ｊブランドのジクロロメタン、N-メチルピロリドン(NMP)及びアセトニトリルは、Baxter(McGraw  Park、IL)より入手した。他の全ての試薬は、例えば、Sigma(St.  Louis、MO)から市販されている。表記ペプチドを、ソフトウェアバージョン1.40を使用する自動化アプライドバイオシステムズ(Applied  Biosystems)430Aペプチドシンセサイザー上で固相Boc/HOBt/NMP化学により合成した。以下の側鎖保護化N-α-Bocアミノ誘導体を、自動化固相ペプチド合成：Arg(NG-トシル)、Asp(O-cHex)、Glu(O-Bzl)、His(Nn-Bom)、Lys(Nε-2-Cl-Z)、Ser(O-Bzl)、Thr(O-Bzl)、及びTyr(2-Br-Z)の最中で使用した。0.5mmolスケールで合成を開始し、Glu22を取り込んだ後、二分した。以下の残基：Arg25、Leu24、Val21、Arg20、Glu19、Leu15、His14、Lys13、His9、Phe7、Gln6及びIle5を二重カップリングサイクルにより取り込んだ。位置18と8のNleを予め溶解させたＮＭＰ溶液の形態で導入し、アクチベーターサイクルを変えた。ρMBHA樹脂由来のペプチドの開裂では液体フッ化水素を使用し、「低-高(Low-High)」方法に従った。「低-HF(Low-HF)」段階は、60%ジメチルスルフィド、5%ρ-チオクレゾール、5%ρ-クレゾール、5%エタンジチオール、及び25%HF(%容積)を含有する混合物(20mL/樹脂-結合ペプチドg)中の樹脂-結合ペプチドの懸濁液を約0℃で約２時間混合することを含んでいた。真空下で揮発性成分を除去し、連続して石油-エーテル及びエーテルで樹脂-結合ペプチドを洗浄した後、「高-HF(High-HF)」段階用の反応容器に戻した。樹脂-結合ペプチドを、5%ブタンジチオール、5%ρ-クレゾール、及び90%HF(%容積)を含有する混合物(20mL/樹脂-結合ペプチドg)中に、約0℃で１時間、再懸濁させた。既に記載したように試薬を除去した後、粗なペプチドを50%(v/v)酢酸中に溶解し、溶液を水で希釈して、凍結乾燥させた。ペプチドを分取逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)(PrePack  VYDAC:登録商標  C18、300Åカートリッジ、15μm、5.5×35 cm)で精製した。使用した溶媒系は、二種類の溶媒系：A：水中0.1%(v/v)TFA及びB：アセトニトリル中0.1%(v/v)TFAを含んでおり、以下の一次勾配液(最初の10分間は、A中0〜15%B、続いて次の120分間はA中15〜45%B)で、流速70mL/分で、220nmでモニターした。画分を流速1ml/分で30分間、A中20〜50%Bの一次勾配液を使用する分析RP-HPLC(VYDAC:登録商標、C18、300Å、5μm、4.6×150 cm)系で分析し、220nmでモニターした。保持時間は18.24分であった。純粋な画分をプールし、真空下でアセトニトリルを除去した。残渣を凍結乾燥させると、白色粉末が得られた。ペプチドの純度及び構造を分析RP-HPLC、アミノ酸分析、及び高速原子衝撃質量分析法、マススペクトル＝4097.0により確認した。
実施例３〜５
実施例３〜４では、好適な保護化アミノ酸を使用して、実施例１の方法に実質的に従って合成し、実施例５では好適な保護化アミノ酸を使用して実施例2の方法に実質的に従って合成した。
【００４５】
【表１】
0004460157.tif 000008
【００４６】
実施例６〜８６
実施例６〜８６では、好適な保護化アミノ酸を使用して、実施例１の方法に実質的に従って合成することができる。
【００４７】
【化１７】
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【００４８】
【化１８】
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【００４９】
【化１９】
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