(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生物学的物質の生成の助けとなる培地において菌類（fungus）宿主細胞を培養し、ここで前記菌類宿主細胞は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、８、10、11及び12から成る群から選択されたプロモーター変異体を含んで成る第２核酸配列に作用可能に結合された、ポリペプチドをコードする第１核酸配列を含んで成り；そして
（ｂ）前記培養培地からポリペプチドを単離する；
ことを含んで成る、ポリペプチドの生成方法。
【請求項２】
前記プロモーター変異体が、配列CGGCGTAATTTCGGCCの少なくとも２つのコピーを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーター変異体が、前記第１核酸配列の発現を高め、そして配列番号２、３、４及び５から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーター変異体が、前記第１核酸配列の発現を低め、そして配列番号６、７、８、９、10、11及び12から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記菌類宿主細胞が、前記第１核酸配列の１又は複数のコピーを含む請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記第１核酸配列によりコードされるポリペプチドが、抗原、酵素、成長因子、ホルモン、イムノジュレーター、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質及び転写因子からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、前記菌類宿主細胞に対して生来であるか又は外来性である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、10、11及び12から成る群から選択された核酸配列を含んで成るプロモーター変異体。
【請求項９】
前記プロモーター変異体が、配列CGGCGTAATTTCGGCCの少なくとも２つのコピーを含んで成る請求項８記載のプロモーター変異体。
【請求項１０】
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を高めるプロモーター変異体であって、ここで当該プロモーター変異体が配列番号２、３、４及び５から成る群から選択される、請求項８記載のプロモーター変異体。
【請求項１１】
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を低めるプロモーター変異体であって、ここで当該プロモーター変異体が配列番号６、７、８、９、10、11及び12から成る群から選択される、請求項８記載のプロモーター変異体。
【請求項１２】
請求項８〜11のいずれか１項記載のプロモーター変異体に作用可能に結合された、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体。
【請求項１３】
請求項12記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項12記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項１５】
（ａ）請求項８〜11のいずれか１項記載のプロモーター変異体、エキソン、及び/又はポリペプチドをコードする内因性核酸配列の第２エキソンに作用可能に結合されるスプライスドナー部位を含んで成る新規転写単位を組込んでいる相同組換え細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、生物学的物質の生成方法に関する。本発明はまた、単離されたプロモーター変異体、及び生物学的物質をコードする核酸配列に作用可能に結合されるプロモーター変異体を含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の記載：
細菌宿主細胞、特に糸状菌細胞、例えばアスペルギラスにおける生来又は異種生物学的物質の組換え生成が、前記物質を商業的に適切な量で生成するためのより所望するビークルを提供する。
【０００３】
生来の又は異種生物学的物質の組換え生成は、前記タンパク質をコードするDNAが、宿主細胞のために適切な、調節された遺伝子からの切除されたプロモーターの発現制御下に配置されている発現カセットを構成することによって達成される。発現カセットは、通常、プラスミド−介在性形質転換により宿主細胞中に導入される。次に、物質の生成は、発現カセット上に含まれるプロモーターの正しい機能のために必要な誘発条件下で、形質転換された宿主細胞を培養することにより達成される。
【０００４】
生物学的物質の組換え生成のための新規菌類宿主細胞の開発は一般的に、宿主細胞における物質の発現を制御するために適切であるプロモーターの入手可能性を必要とする。フサリウム・ベネナタムは、そのような発現のために新規宿主細胞として有用であることが知られている（WO96/00787号、WO97/26330号）。さらに、フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）宿主細胞において異種遺伝子を発現するために有用である、フサリウム・オキシスプラム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ遺伝子からのプロモーターが記載されている（アメリカ特許第5,837,847号）。アメリカ特許第6,361,973号は、フサリウム・ベネナタムからのグルコアミラーゼプロモーターを開示する。しかしながら、生来及び異種遺伝子の発現を制御するための新規プロモーターについての必要性が当業界において存在する。
【０００５】
菌類宿主細胞において生物学的物質を生成するための改良された方法、及びそのような生成のための新規プロモーター変異体を供給することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要約：
本発明は、（ａ）生物学的物質の生成の助けとなる培地において菌類宿主細胞を培養し、ここで前記菌類宿主細胞は、配列番号2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11及び12から成る群から選択された核酸配列；及びそれらの部分配列；並びにそれらのハイブリッド及びタンデムプロモーターを有するプロモーター変異体を含んで成る第２核酸配列に作用可能に結合される生成物学的物質をコードする第１核酸配列を含んで成り；そして（ｂ）前記培養培地から生物学的物質を単離することを含んで成る、生物学的物質の生成方法に関する。前記生物学的物質は、菌類宿主細胞に対して生来であるか又は異種であり得る。
【０００７】
本発明はまた、配列番号2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11及び12から選択された核酸配列；それらの部分配列；並びにそれらのハイブリッド及びタンデムプロモーターを含んで成る単離されたプロモーター変異体；及び生物学的物質をコードする核酸配列に作用可能に結合される１又は複数のプロモーター変異体を含んで成る、構造体、ベクター及び菌類宿主細胞に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の特定の記載：
本発明は、（ａ）生物学的物質の生成の助けとなる培地において菌類宿主細胞を培養し、ここで前記菌類宿主細胞は、配列番号2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11及び12；及びそれらの部分配列；並びにそれらのハイブリッド及びタンデムプロモーターから成る群から選択されたプロモーター変異体を含んで成る第２核酸配列に作用可能に結合される生成物学的物質をコードする第１核酸配列を含んで成り；そして（ｂ）前記培養培地から生物学的物質を単離することを含んで成る、生物学的物質の生成方法に関する。
【０００９】
本発明の生成方法においては、細胞は、当業界において知られている方法を用いて、生物学的物質の生来のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、適切な培地において行われる実験用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、すなわち小規模又は大規模発酵（例えば、連続、バッチ、供給−バッチ又は固体状態酵母）により、生物学的物質の発現及び/又は単離を可能にする条件下で培養され得る。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行われる。適切な培地は、市販されているか、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collectionのカタログにおける）に従って調製され得る。生物学的物質が栄養培地中に分泌される場合、物質は培地から直接的に回収され得る。生物学的物質が分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。
【００１０】
生物学的物質は、その生物学的物質に対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特異的抗体の使用、高性能液体クリマトグラフィー、細管クロマトグラフィー、酵素生成物の形成、酵素基質の消出、又はSDS−PAGEを包含する。例えば、酵素アッセイは、酵素の活性を決定するために使用され得る。酵素活性を決定するための方法は、多くの酵素ついて当業界において知られている（例えば、D. Schomburg and M. Salzmann (eds. ), Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York, 1990を参照のこと）。
【００１１】
得られる生物学的物質は、当業界において知られている方法により単離され得る。例えば、興味あるポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿により、培養培地から単離され得る。次に、単離されたポリペプチドは、さらに当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動（IEF））、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）。興味ある代謝物は、例えば抽出、沈殿、示差溶解性、又は当業界において知られているいずれか方法により、培養培地から単離され得る。単離された代謝物は、その代謝物のために適切な方法を用いて、さらに精製され得る。
【００１２】
プロモーター：
用語“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼを結合し、生物学的物質をコードする核酸配置の正しい下流の転写開始部位に前記ポリメラーゼの転写開始を方向づけるDNA配列として、本明細書において定義される。RNAポリメラーゼは、コード領域の適切なDNA鎖に対して相補的なメッセンジャーRNAのアセンブリーを効果的に触媒する。用語、“プロモーター”はまた、mRNAへの転写の後、翻訳のための5’非コード領域（プロモーターと翻訳開始との間）、シス−作用転写制御要素、例えばエンハンサー、及び転写因子と相互作用できる他のヌクレオチド配列を含むことが理解されるであろう。
【００１３】
用語“プロモーター変異体”は、親プロモーターの１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成るヌクレオチド配列を有するプロモーターとして定義され、ここで変異体プロモーターはその対応する親プロモーターよりも高いか又は低いプロモーター活性を有する。用語、“プロモーター変異体”はまた、天然の変異体、及び当業界において良く知られている方法、例えば従来の突然変異誘発、特定部位の突然変異誘発及びDNAシャフリングを用いて得られる、インビトロ生成された変異体を包含するであろう。
【００１４】
用語“ハイブリッドプロモーター”とは、コード配列に作用可能に結合される場合、mRNA中へのコード配列の転写に介在する。２又はそれより多くのプロモーターの融合体である配列を生成するために、一緒に融合される複数のプロモーターの一部として本明細書において定義される。
用語、“タンデムプロモーター”とは、コード配列に作用可能に結合され、そしてmRNA中へのコード配列の転写に介在する複数のプロモーター配列として本発明の細胞において定義される。
【００１５】
用語、“作用可能に結合される”とは、制御配列、例えばプロモーター配列が、コード配列によりコードされる生物学的物質の生成を方向づけるよう、そのコード配列に対する位置に適切に配列される配置として本明細書において定義される。
用語、“コード配列”とは、適切な制御配列の制御下に配置される場合、生物学的物質、例えばポリペプチドに翻訳されるmRNAに転写される核酸配列として本明細書において定義される。コード配列の境界は一般的に、mRNAの5’末端での読み取り枠のすぐ上流に位置するATG開始コドン、及びmRNAの3’末端での読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、ゲノムDNA, cDNA, 半合成、合成及び組換え核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００１６】
本発明のプロモーター変異体は、１又は複数の突然変異を有することができる。個々の突然変異は、ヌクレオチドの独立した置換、欠失、及び/又は挿入である。プロモーター中へのヌクレオチドの置換、欠失及び/又は挿入の導入は、当業界において知られている方法、例えば従来の突然変異誘発、特定部位の突然変異誘発、又はDNAシャフリングのいずれかを用いて達成され得る。興味ある挿入体、及び所望する突然変異を含む２種の合成プライマーと共に、スーパーコイルの二本鎖DNAベクターを用いる方法が特に有用である。ベクターの反対の鎖に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、Pfu DNAポリメラーゼにより温度サイクルの間、延長する。プライマーの組込みに基づいて、付着されたニックを含む、突然変異誘発されたプラスミドが生成される。温度サイクルに続いて、生成物は、メチル化され、そして突然変異−含有の合成されたDNAについて選択される。当業界において知られている他の方法もまた使用され得る。
【００１７】
本発明のプロモーター変異体の親プロモーターは、図１A及び１Bに示される配列番号１、又はE.コリNRRL B−30067に含まれるプラスミドpECO3に含まれる核酸配列である。
【００１８】
配列番号１の欠失、挿入又は置換のために選択される領域は、フサリウム・ベネナタム  グルコアミラーゼプロモーターのヌクレオチド配列に対して行われる観察に基づかれた。配列番号１の位置3792〜3807、3678〜3693及び3814〜3824で（アメリカ特許第6,361,973号）、他のスターチ誘発性菌類プロモーターに見出されるモチーフと相同性を共有する領域が存在する。それらの領域は、アスペルギラス  アミラーゼプロモーター（Minetoki など., 1996, Current Genetics 30: 432-438）に記載されされるIII a及びIII b領域に配列的に類似した。領域III aは、アスペルギラス・オリザエα−グルコシダーゼ、アミラーゼB及びグルコアミラーゼプロモーター、及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼプロモーターに見出された。
【００１９】
領域III bは、アスペルギラス・ニガー及びアスペルギラス・オリザエα−グルコシダーゼプロモーターにおいてのみ見出された。フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの3792〜3807及び3678〜3693領域は、領域III aコンセンサスに対していくらかの配列類似性を有し、そして3814〜3824領域はIII b配列に対する相同性を有する。Minetokiなどよる  アスペルギラスプロモーターの分析は、III a領域がスターチ又はマルトースの存在下で高レベルの発現のために必要とされ、そしてIII b領域が高レベルの発現のために必要とされるが、しかしスターチ誘発においては役割を演じないことを示唆した。
【００２０】
Minetokiなどはさらに、プロモーター活性の有意な上昇が、アスペルギラス・オリザエα−グルコシダーゼプロモーター中に領域III aの複数コピーを導入することにより観察され得たことを示した。本発明においては、推定上のIII a及びIVｂ領域が発現のために重要であることを示したフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの変異体が構成された。さらに、3792〜3807領域の35bp下流へのIII a領域の付加は、プロモーターを改良した。しかしながら、アスペルギラスプロモーターに見出されるIII aコンセンサス（Minetokiなど., 1996, 前記）は、生来のフサリウム・ベネナタムIII aプロモーター配列ほど効果的ではなかった。
【００２１】
好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号２の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号３の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
【００２２】
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号４の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号５の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
【００２３】
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターにおける配列CGGCGTAATTTCGGCCの少なくとも２つのコピー、より好ましくは少なくとも３個のコピー及び最も好ましくは少なくとも４個のコピーを含んで成る。
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号６の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
【００２４】
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号７の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号８の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
【００２５】
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号９の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号10の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
【００２６】
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号11の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
もう１つの好ましい態様においては、プロモーター変異体は、配列番号12の核酸配列、又はその部分配列を有する。部分配列は好ましくは、少なくとも約1200個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約1500個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約1800個のヌクレオチドを含む。
【００２７】
本発明の方法の好ましい態様においては、生物学的物質をコードする核酸配列の発現を高めるプロモーター変異体は、配列番号2, 3,4及び５、及びそれらの部分配列から成る群から選択される。
本発明の方法のもう１つの好ましい態様においては、生物学的物質をコードする核酸配列の発現を低めるプロモーター変異体は、配列番号６, ７,８、９、10、11及び12、及びそれらの部分配列から成る群から選択される。
【００２８】
本発明の方法においては、プロモーター変異体はまた、本発明の１又は複数のプロモーターの一部；本発明のプロモーターの一部、及びもう１つのプロモーターの一部、例えば１つのプロモーターのリーダー配列及び他のプロモーターの転写開始部位；又は本発明の１又は複数のプロモーターの一部及び１又は複数の他のプロモーターの一部を含んで成るハイブリッドプロモーターであり得る。他のプロモーターは、選択の菌類宿主細胞において転写活性を示すいずれかのプロモーター配列、例えば変異体、切断された、及びハイブリッドプロモーターであり、そして宿主細胞に対して相同であるか又は非相同である、細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ。他のプロモーター配列は、生物学的物質をコードする核酸配列に対して生来であるか又は外来性であり、そして細胞に対して生来であるか又は外来であり得る。
【００２９】
本発明のプロモーター変体によるハイブリッドプロモーターの構成において有用な他のプロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ  アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエ  アルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ、フサリウム・ベネナチュムアミログルコシダーゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ（WA96/00787号）、
【００３０】
トリコダーマ・レセイセロビオヒドロラーゼI、トリコダーマ・レセイセロビオヒドロラーゼII、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼI、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼII、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼIII、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼIV、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼV、トリコダーマ・レセイキシラナーゼI、トリコダーマ・レセイキシラナーゼII、トリコダーマ・レセイβキシロシダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター、並びにNA2-tpiプロモーター（アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼのための遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、
【００３１】
フサリウム・ベネナタムDariaプロモーター、フサリウム・ベネナタムQuinnプロモーター、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO−１）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1、ADH2/GAP）、及びサッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ；及びそれらの変異体、切断された、及びハイブリッドプロモーターを包含する。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanosなど., 1992, Yeast 8: 423-488により記載される。
【００３２】
プロモーター変異体はまた、本発明の複数のプロモーター変異体、又は他方では、本発明の１又は複数のプロモーター変異体及び１又は複数の他のプロモーター、例えば上記に例示されるそれらのプロモーターを含んで成るタンデムプロモーターであり得る。タンデムプロモーターの複数のプロモーター配列は、核酸配列の転写を同時に促進することができる。他方では、タンデムプロモーターの１又は複数のプロモーター配列は、細胞の異なった成長段階で核酸配列の転写を促進することができる。
【００３３】
本発明の方法においては、本発明のハイブリッド又はタンデムプロモーターは、野生型プロモーターが核酸配列に対して生来である場合でさえ、生物学的物質をコードする核酸配列に対して外来性であることが理解されるであろう。例えば、少なくとも２種のプロモーターから成るタンデムプロモーターにおいては、プロモーターの１つは、生物学的物質をコードする核酸配列の野生型プロモーターであり得る。
【００３４】
本発明のプロモーター変異体は、配列番号１のプロモーターのプロモーター活性の少なくとも約20％、好ましくは少なくとも約40％、より好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約100％、さらにより好ましくは少なくとも約200％、最も好ましくは少なくとも約300％、及びさらに最も好ましくは少なくとも約400％を有する。
【００３５】
生物学的物質コードの核酸配列：
第１の核酸配列によりコードされる生物学的物質は、興味ある菌類宿主細胞に対して生来であるか又は異種であり得る。生物学的生物は、いずれかの生物ポリマー又は代謝物であり得る。生物学的物質は、生合成又は代謝路を構成する、単一の遺伝子又は一連の遺伝子によりコードされ得るか、又は単一遺伝子の生成物又は一連の遺伝子の生成物の直接的な結果であり得る。従って、用語、“生物学的物質をコードする第１の核酸配列”とは、生物学的物質の生成に包含される１又は複数の遺伝子を包含することが理解されるであろう。用語、“異種の生物学的物質”とは、宿主細胞に対して生来ではない生物学的物として；又は構造的修飾が生来の生物学的物質を変更するために行われている、生来の生物学的物質として本明細書において定義される。
【００３６】
本発明の方法においては、生物ポリマーはいずれの生物ポリマーででもあり得る。用語、“生物ポリマー”とは、同一の、類似する、又は類似しないサブユニット（モノマー）の鎖（又はポリマー）として本明細書において定義される。生物ポリマーは、核酸、ポリアミン、ポリオール、ポリペプチド（又はポリアミド）、又はポリサッカリドであり得るが、但しそれらだけには限定されない。
【００３７】
好ましい態様においては、生物ポリマーは、ポリペプチドである。ポリペプチドは、興味ある生物学的活性を有するいずれかのポリペプチドであり得る。用語、“ポリペプチド”とは、コードされる生成物の特定の長さを意味せず、そして従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。用語、“ポリペプチド”はまた、コードされる生成物を形成するために組み合わされる複数のポリペプチドを包含する。ポリペプチドはまた、少なくとも２種の異なったポリペプチド（１又は複数のポリペプチドは菌類細胞に対して異種であり得る）から得られた部分的又は完全なポリペプチド配列の組合せを含んで成るハイブリッドポリペプチドを包含する。ポリペプチドはさらに、上記ポリペプチド及びハイブリッドの天然に存在する対立遺伝子及び構築された変動体を包含する。
【００３８】
好ましい態様においては、ポリペプチドは、抗体、抗原、抗菌ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、イムノモジュレーター、神経伝達物質、受容体、レポータータンパク質、構造タンパク質及び転写因子である。
【００３９】
より好ましい態様においては、ポリペプチドは、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。最も好ましい態様においては、ポリペプチドは、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドロラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ウロキナーゼ又はキシラナーゼである。
【００４０】
もう１つの好ましい態様においては、ポリペプチドはコラーゲン又はゼラチンである。
もう１つの好ましい態様においては、生物ポリマーは、ポリサッカリドである。ポリサッカリドは、いずれかのポリサッカリド、例えばムコポリサッカリド（例えば、ヘパリン及びヒアルロン酸）及び窒素含有ポリサッカリド（例えば、キチン）であり得るが、但しそれらだけには限定されない。より好ましい態様においては、ポリサッカリドはヒアルロン酸である。
【００４１】
本発明の方法においては、代謝物はいずれの代謝物ででもあり得る。代謝物は、１又は複数の遺伝子、例えば生合成又は代謝路によりコードされ得る。用語、“代謝物”とは、一次及び二次代謝物の両者を包含する。一次代謝物は、エネルギー代謝、成長及び構造に関連する、細胞の一次又は一般代謝の生成物である。二次代謝物は、二次代謝の生成物である（R. B. Herbert, The Biosynthesis of Secondary Metabolites, Chapman and Hall, New York, 1981を参照のこと）。
一次代謝物は、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、トリグリセリド又はビタミンであり得るが、但しそれらだけには限定されない。
【００４２】
二次代謝物は、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニン、ステロイド、ペプチド又はテルペンであり得るが、但しそれらだけには限定されない。好ましい態様においては、二次代謝物は、抗生物質、摂食阻害剤、誘引剤、殺菌剤、抗菌剤、ホルモン、殺昆虫剤又は殺鼠薬である。
興味ある生物学的物質をコードする核酸配列は、いずれかの原核生物、真核生物、又は他の源から得られる。本発明のためには、一定の源に関して、用語、“〜から得られる”とは、本明細書において使用される場合、生物学的物質が、前記源により、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味するであろう。
【００４３】
興味ある生物学的物質をコードする核酸配列を単離するか又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組合せを包含する。そのようなゲノムDNAからの核酸配列のクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いることによりもたらされ得る。例えば、Innis nado., 1990, PCR Protocols : A Guide to Methods and Application, Academic Press, New Yorkを参照のこと。クローニング方法は、生物学的物質をコードする核酸配列を含んで成る所望する核酸フラグメントの切除及び単離、ベクター分子中へのフラグメントの挿入、及び変異体菌類細胞中への組換えベクターの組み込み包含することができ、ここで、核酸配列の複数コピー又はクローンが複製されるであろう。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成、合成起源のもの、又はそれらのいずれかの組合せのものであり得る。
【００４４】
核酸構造体：
本発明はまた、本発明の少なくとも１つのプロモーター変異体に作用可能に結合される生物学的物質をコードする核酸配列、及び制御配列と適合できる条件下で適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指図する１又は複数の制御配列を含んで成る核酸構造体にも関する。発現は、生物学的物質の生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾、及び分泌（但し、それらだけには限定されない）を包含することが理解されるであろう。
【００４５】
“核酸構造体”とは、本明細書においては、天然に存在する遺伝子から単離され、又は他方では、天然に存在しない態様で組み合わされ、そして並置される、核酸のセグメントを含むように修飾されている、一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義される。用語“核酸構造体”とは、核酸構造体が１つのコード配列、及び前記コード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味である。
【００４６】
生物学的物質をコードする単離された核酸配列は、生物学的物質の発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中へのその挿入の前、核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要とされる。組換えDNA方法を用いて核酸配列を修飾するための技法は、当業界において良く知られている。
本発明の方法においては、核酸配列は、１又は複数の生来の制御配列を含んで成ることができるか、又は１又は複数の生来の配列が、宿主細胞におけるコード配列の発現を改良するための核酸配列に、１又は複数の制御配列により置換され得る。
【００４７】
用語“制御配列”とは、本発明の生物学的物質の発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、生物学的物質をコードする核酸配列に対して生来であっても又は外来性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、本発明のプロモーター変異体、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、制御配列は、プロモーター、本発明の変異体及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、生物学的物質をコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。
【００４８】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、生物学的物質をコードする核酸配列の3’側末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが本発明において使用され得る。
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
【００４９】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエチトクロムC（CYC１）、及びサッカロミセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Romanosなど., 1992, 前記により記載される。
【００５０】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、生物学的物質をコードする核酸配列の5’末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼ、フサリウム・ベネナタムトリプシン、及びフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼについての遺伝子から得られる。
【００５１】
酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ（ENO−１）、サッカロミセル・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）についての遺伝子から得られる。
【００５２】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち核酸配列の3’末端に作用可能に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列でもあり得る。選択の菌類細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が，本発明において使用される。
【００５３】
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
【００５４】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そしてそのコードされたポリペプチドを細胞の分泌路中に方向づけるシグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’側末端は、本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。他方では、コード配列の5’側末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。そのコード配列が天然において、シグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。しかしながら、選択の菌類宿主細胞の分泌路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。
【００５５】
糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスペラギン酸プロテイナーゼ、ヒューミコラ・インソレンスセルラーゼ及びヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼについての遺伝子から得られたシグナルペプチドコート領域である。
【００５６】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセル・セレビシアエインバーターゼについての遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos など., 1992, 前記により記載される。
【００５７】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、サッカロミセス・セレビシアエα−因子、リゾムコル・ミエヘイ  アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、及びミセリオプソラ・サーモフィリア  ラッカーゼについての遺伝子から得られる（WO95/33836号）。
【００５８】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００５９】
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすそれらのシステムである。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが使用され得る。糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター、アスペルギラス・オリザエグルコアミラーゼプロモーター、及びフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターが、調節配列として使用さえ得る。調節配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にするそれらの配列である。真核システムにおいては、それらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、生物学的物質をコードする核酸配列が、調節配列により作用可能に連結される。
【００６０】
本発明はまた、宿主細胞に対して内因性である生物学的物質をコードする遺伝子の発現を変更するための核酸構造体にも関する。前記構造底は、前記内因性遺伝子の発現を変えるために必要な最少数の成分を含むことができる。１つの態様においては、核酸構造体は好ましくは、（a）標的化配列、（b）本発明のプロモーター変異体、（c）エキソン、及び（c）スプライス−ドナー部位を含む。細胞中への核酸構造体の導入に基づいて、その構造体は、相同組換えにより、内因性遺伝子部位で細胞ゲノム中に挿入する。標的化配列は、要素（b）−（d）が内因性遺伝子に作用可能に連結されるように、その内因性遺伝子中への前記要素（a）−（d）の組み込みを方向づける。
【００６１】
もう１つの態様においては、核酸構造体は、（a）標的化配列、（b）本発明のプロモーター変異体、（c）エキソン、（d）スプライス−ドナー部位、（e）イントロン、及び（f）スプライス−受容体部位を含み、ここで標的化配列が、要素（b）−（f）が内因性遺伝子に作用可能に連結されるように、要素（a）−（f）の組み込みを方向づける。しかしながら、前記構造体は、追加の成分、たとえば選択マーカーも含むことができる。
【００６２】
両態様においては、それらの成分の導入は、内因性遺伝子の発現が変更されている新規転写単位の生成をもたらす。本質的には、その新規転写単位は、標的化構造体及び内因性遺伝子により導入される配列の融合生成物である。内因性遺伝子が変更される１つの態様においては、核酸配列が活性化される。この態様においては、相同組換えが、対応する親細胞における現象によりも高いレベルでの核酸配列の発現を引き起こす調節配列の挿入を通して親細胞の内因性遺伝子に通常関係する調節領域を置換し、破壊し、又は無能化するために使用される。活性化された核酸配列はさらに、当業界においてよく知られている方法を用いて、構造体における増幅できる選択マーカー遺伝子の包含により増幅され得る（たとえば、アメリカ特許第5,641,670号を参照のこと）。内因性遺伝子が変更されているもう１つの態様においては、遺伝子の発現が低められる。
【００６３】
標的化配列は、内因性遺伝子内に、核酸配列に隣接して、上流の遺伝子内に、又は内因性遺伝子の上流及びその配列から一定の距離に存在することができる。１又は複数の標的化配列が使用され得る。たとえば、環状プラスミド又はそのDNAフラグメントは好ましくは、単一の標的化配列を使用し、そして線状プラスミド又はそのDNAフラグメントは好ましくは、２種の標的化配列を使用する。
【００６４】
構造体はさらに、内因性遺伝子の１又は複数のエキソンを含む。エキソンは、エキソン配列が内因性遺伝子のコード領域と整合して存在するように、RNAにコピーされ、そして成熟mRNA分子に存在するDNA配列として定義される。エキソンは、本来、１又は複数のアミノ酸をコードし、そして/又はアミノ酸を部分的にコードするDNAを含むことができる。他方では、エキソンは、5’側非コード領域に対応するDNAを含む。外因性エキソン又はエキソ類が１又は複数のアミノ酸及び/又はその一部をコードする場合、核酸構造体は、転写及びスプライシングに基づいて、読み取り枠が内因性遺伝子のコード領域と整合して存在し、その結果、第２エキソンに由来するmRNAの一部の適切な読み取り枠が変化していないように企画される。
【００６５】
構造体のスプライス−ドナー部位は、１つのエキソンのスプライシングをもう１つのエキソンに方向づける。典型的には、第１のエキソンは第２のエキソンの5’側に存在し、そしてその3’側上の第１のエキソンをオーバーラップし、そしてそれを端に有するスプライス−ドナー部位は、第２のエキソンの5’側上の第２のエキソンを端に有するスプライス−受容体部位を認識する。スプライス−ドナー部位のように、スプライス−受容体部位は、１つのエキソンのスプライシングをもう１つのエキソンに方向づける配列である。スプライス−ドナー部位に関連して作用する場合、スプライシング装置は、イントロンの除去をもたらすためにスプライス−受容体部位を使用する。
【００６６】
本発明はさらに、（ａ）本発明のプロモーター変異体、エキソン、及び/又は生物学的物質をコードする内因性核酸配列の第２エキソンに作用可能に結合されるスプライスドナーを含んで成る新規転写単位を、そこに組込んでいる相同組換え細胞を、生物学的物質の生成の助けと成る条件下で培養し；そして（ｂ）生物学的物質を回収することを含んで成る、生物学的物質の生成方法に関する。前記方法は、例えばアメリカ特許第5,641,670号に記載のように、遺伝子活性化技法の使用に基づかれている。
【００６７】
発現ベクター：
本発明はまた、本発明のプロモーター変異体、生物学的物質をコードする核酸配列、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配列は、１又は複数の便利な制限部位で生物学的物質をコードする核酸配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、核酸配列は、前記核酸配列、又は前記プロモーター変異体及び/又は配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は本発明のプロモーター変異体及び発現のための１又は複数の適切な制御配列により作用可能に連結される。
【００６８】
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そして核酸配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（たとえば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。
【００６９】
ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。ベクターは自己複製を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲノム中に導入される全DNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドが使用され得る。
【００７０】
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3である。
【００７１】
糸状菌宿主細胞に使用するための選択マーカーは、次の群から選択されるが、但しそれらだけには限定されない；amdS (アセトアミダーゼ)、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD (硝酸レダクターゼ)、pyrG (オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ) 及びtrpC (アントラニル酸シンターゼ)、並びにそれらの同等物。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子が、アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。bar、amdS、pyrG又はhygB遺伝子が、フサリウム細胞への使用のために好ましい。
【００７２】
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
【００７３】
宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリペプチド、又はいずれか他の要素をコードする核酸配列に依存する。他方では、ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるための追加の核酸配列を含むことができる。その追加の核酸配列は、染色体における正確な位置での宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込みを可能にする。
【００７４】
正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば100〜1,500個の塩基対、好ましくは400〜1,500個の塩基対、及び最も好ましくは800〜1,500個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【００７５】
自律複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてのベクターの自律的な複製を可能にする複製の起点を含んで成る。酵母細胞において有用なプラスミド複製開始部位の例は、複製の２ミクロン起点、ARS1, ARS4, ARS1及びCEN3の組合せ、及びARS4及びCEN6の組合せである。糸状菌細胞において有用なプラスミド複製開始部位の例は、AMA1及びAMS1である（Gems など., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen など., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883号）。AMA1遺伝子の単離、及び前記遺伝子を含んで成るプラスミド又はベクターの構成は、WO00/24883号に開示される方法に従って行われ得る。複製の起点は、宿主細胞においてその機能を感温性にする突然変異を有する起点である（例えば、Ehrlich, 1978, Procedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433を参照のこと）。
【００７６】
生物学的物質をコードする核酸配列の１以上のコピーが、遺伝子生成物の生成を高めるために宿主細胞中に挿入され得る。核酸配列のコピー数の上昇は、宿主細胞ゲノム中に配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、又は核酸配列と共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ、ここで細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、そしてそれにより、核酸配列の追加のコピーが、適切な選択剤の存在下で前記細胞を培養することによって選択され得る。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと）。
【００７７】
宿主細胞：
本発明はまた、生物学的物質の組換え生成において都合良く使用される、生物学的物質をコードする核酸配列に作用可能に結合される本発明のプロモーター変異体を含んで成る組換え宿主にも関する。生物学的物質をコードする核酸配列に作用可能に結合される本発明のプロモーター変異体を含んで成るベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、生物学的物質をコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
【００７８】
宿主細胞は、本発明の方法において有用ないずれかの菌類細胞であり得る。宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及びオーミコタ（Oomycota）（Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。
【００７９】
好ましい態様においては、菌類宿主細胞は酵母細胞である“酵母”とは、本明細書において使用される場合、子嚢胞子酵母（Endomycetals）、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。酵母の分類は未来において変化し得るので、本発明のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds. Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) に記載のようにして定義されるであろう。
【００８０】
さらに好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hunsenula）、クレベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowia）である。
【００８１】
最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyses cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイビリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensisi）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、来るべろミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）である。もう１つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
【００８２】
もう１つの好ましい態様においては、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”とは、ユーミコタ（Eumycota）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）。糸状菌は一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合ポリサッカリドから構成される菌子体壁により特徴づけられる。成長増殖は、菌子拡張によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシアエによる成長増殖は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素代謝は発酵性である。
【００８３】
より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネウロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（Penicilium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコダーマ（Trichoderma）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
【００８４】
最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ、アスペルギラス・ホエチダス、アスペルギラス・ジャポニカ、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエ細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・クロックウェレンズ 、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチキュラタム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サムブシウム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・ソラニ、フサリウム・スポロトリキオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコセシオイデス又はフサリウム・ベネナタム細胞である。
【００８５】
さらに最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、ヒューミコラ・インソレンス、ヒューミコラ・ラヌギノサ、ムコル・ミエヘイ、ミセリオプソラ・サーモフィリア、ネウロスポラ・クラサ、ペニシリウム・プルプロゲナム、チエラビア・テレストリス、トリコダーマ・ハルジアナム、トリコダーマ・コニンギ、トリコダーマ・ロンジブラキアタム、トリコダーマ・レセイ又はトリコダーマ・ビリデ細胞である。
【００８６】
より好ましい態様においては、フサリウム・ベネナタム細胞は、フサリウム・グラミネアラムATCC20334として最初に寄託され、そして最近、Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80及びO’Donnell など., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67 によりフサリウム・ベネナタムとして再分類されている、フサリウム・ベネナタムA3/5；及び現在知られている種名称にもかかわらず、フサリウム・ベネナタムの分類学的同等物である。もう１つの好ましい態様においては、フサリウム・ベネナタム細胞は、WO97/26330号に記載されるように、フサリウム・ベネナタムA3/5又はフサリウム・ベネナタムATCC20334の形態学的変異体である。
【００８７】
菌類細胞は、プロトプラスト形質転換、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023号及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81; 1470-1474に記載される。フラリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene 78: 147-156, 及びWO96/00787号により記載される。酵母は、Becker and Guarente. In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito など, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnen など, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75; 1920により記載される方法を用いて形質転換され得る。
【００８８】
本発明は、次の例によりさらに記載されるが、それらは、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００８９】
緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬用の市販の製品であった。
菌株及び材料：
本発明に使用される菌類株は、フサリウム・ベネナタム野生型株MLY3（アメリカ特許第6,066,493号及び第6,180,366号を参照のこと）、及びpyrG変異体株、フサリウム・ベネナタムDLM15であった。プラスミドを生成するために使用される細胞株は、E.コリ Top 10 (lnvitrogen, Carlsbad, CA), E.コリ XL1 Blue コンピテント及び スーパーコンピテント細胞 (Stratagene, La Jolla, Ca. ), 及び E.コリ SEDM1 HKA702 (Stratagene, La Jolla, CA)であった。
【００９０】
RA培地は、1L当たり、50gの琥珀酸、4.9gのウレア、1gのグルコース及び20mlの50×Vogels塩から成った。
50X Vogelの塩は、１L当たり、150 gのクエン酸ナトリウム, 250 g の KH2PO4, 10 g の MgS04・7H20, 20mlの25% CaCl2・2H2O, 5.0mlのビオチン(100 ml の 50%エタノール当たり5mg),及び5 ml の Vogels 微量元素 (フィルター滅菌された)から成る。
Vogelの微量元素 溶液は、１L当たり、 50 g のクエン酸, 50 gのZnS04・7H20, 10 gの Fe (NH4) 2 (SO4) 2・6H20, 2.5 g のCuS04 ・5H20, 0.5 gのMnS04・H20, 0.5 g の H3BO3, 及び 0.5 g のNa2MoO4 ・2H2Oから成る。
【００９１】
最少培地トランスファー及び形質転換プレート (pH 6.5)は、１L当たり、6 g の NaN03, 0.52 g のKCL, 1.52 g の KH2PO4, 1mlのCove 微量元素, オートクレーブ処理の後、20 mlの 50% グルコース, 2.5 mlの20% MgS04・7H20 及び20 mlの0.02%ビオチンを有する20ｇのNoble 寒天から成る。形質転換プレートは、すべての上記成分＋0.8Mの最終濃度でのスクロースを含んだ。
Cove 微量元素溶液は、１L当たり、0.04 g の Na2B4O7・10H2O, 0.4 g のCuSO4・5H2O, 1.2 g のFeS04・7H20, 0.7 g のMnS04・H20, 0.8 g のNa2MoO2・2H2O,及び10 g の ZnS04・7H20から成った。
【００９２】
Vogels NH4H2PO4 プレートは、１L当たり、 20 ml の 50X Vogels 塩, 15 g のスクロース, オートクレーブ処理の後、 50mlの NH4H2PO4 (1 M 、pH 6)を有する25 gの Noble寒天から成った。
M400 培地(pH 6) は、１L当たり、50 g のマルトデキストリン, 2 gのMgS04・7H20, 2 g のKH2PO4, 4 g のクエン酸, 8 gの酵母抽出物, 2 gのウレア, 0.5 mlのAMG微量元素, 及び 0.5 gのCaCl2から成った。
AMG微量元素溶液は、１L当たり、14.3 g のZnS04・7H20, 2.5 g の CuSO4・5H2O, 0.5 g のNiC12・6H20, 13.8 gのFeS04・7H20, 8.5 g のMnSO4 ・H20,及び3 g のクエン酸から成った。 
【００９３】
Chlorateプレートは、１L当たり、20mlのof Cove塩溶液, 61.28 g の塩素酸カリウム, 0.3 g のウレア, 及び25 gのNoble寒天から成った。
Cove塩溶液は、１L当たり、 26 g の KCI, 26 g のMgS04・7H20, 76 gのKH2PO4, 及び 50 ml のCove 微量元素溶液から成った。
LB ＋アンピシリンブイヨンは、１L当たり、10 g のトリプトン, 5 gの酵母抽出物, 5 g の塩化ナトリウム,及び100 mgのアンピシリンから成った。 
LB ＋アンピシリンプレートは、1 Lの LB ＋15 gの bacto寒天を有するアンピシリンブイヨンから成った。
【００９４】
YP-5%グルコースブイヨンは、１L当たり、10 g の酵母抽出物, bacto ペプトン, 及び5% グルコースから成った。 
2XYT ＋アンピシリンは、１L当たり、16 g のトリプトン, 10 g の酵母抽出物, 5 g of 塩化ナトリウム, 及び100 mgのアンピシリンから成った。
2XYT ＋アンピシリンはプレートは、１L当たり、2XYT + アンピシリンブイヨン＋15 gのbacto 寒天から成った。
NYZ＋ブイヨン(pH 7.5)は、１L当たり、5 gの NaCl, 2 gの MgS04・7H20, 5 g の酵母抽出物, 10 g のNZアミン (カゼイン加水分解物), 12.5 mlの1 M MgCl2, 12.5 mlの1 M MgS04, 及び20 mlの20% グルコースから成った。
NZY top 寒天は、１L当たり、5 g のNaCl, 2 g のMgS04・7H20, 5 g の酵母抽出物, 10gのNZ アミン(カゼイン加水分解物), 及び7 g のグルコースから成った。
【００９５】
DNA配列決定：
DNA配列決定を、色素−ターミネーター化学（Gieseckeなど., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60）及び逆方向又は前方向lac配列決定プライマー又は配列特異的プライマーを用いて、Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 3700 Automatic DNA Sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)により行った。
【００９６】
例１：pDM237の構成：
pDM237（図２）を、pBluescript SK (-) (Stratagene, La Jolla, CA)中にクロン化される4.4 kbの EcoRl/Hindlll フサリウム・ベネナタムniaDフラグメントを含むよう構成した。niaD挿入体は、クローンFからの1.8kbのKpnI/EcoRIフラグメント（ゲノムniaDクローン）及びpDM201からの2.6kbのKpnI/HindIII フラグメント（niaDからのゲノムクローン）から構成された。
【００９７】
niaDゲノムクローンを、前述のLambda ZipLoxフサリウム・ベネナタムゲノムライブラリーから単離した（アメリカ特許第6,361,973号）。クローンpDM201を、1.1kbのフサリウム・オキシスポラムniaDフラグメントによりライブラリーをプローブすることにより単離した（Diolezなど., 1993, Gene 131, Gene 131: 61-67）。フサリウム・オキシスポラムプローブを、次のプライマーを用いて、フサリウム・オキシスポラムゲノムDNAから増幅した：
5'-ATCGAGGGTGCCAATGTG-3' (foxy. nia1) (配列番号13)；
5'-GCCATTTACGACCTCAGC-3' (foxy. nia2) (配列番号14)。
【００９８】
100μlのPCR反応は、10μgのゲノムDNA、50pモルの個々のプライマー、１× Taq緩衝液（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）、200μmの個々のdATP, dCTP, dGTP及び５単位のPwo DNA ポリメラーゼ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を含んだ。使用されるPCR条件は、次の通りであった：95℃で３分、続いて95℃で30秒、50℃で１分及び72℃で１分（30サイクル）。最終拡張サイクルは、72℃で５分であった。PCR生成物を、Invitrogen（Carlsbad, CA）からのTAクローニングキットを用いてサブクローン化した。サブクローンを、EcoRIによる制限消化により調べ、そしてM13 普遍的前方向及び逆方向プライマーを用いて、ヌクレオチド配列決定により確めた。クローンの１つは、1.1kbのniaD挿入体を含むことが確認され、そしてpDM197と命名された。
【００９９】
フサリウム・オキシスポライムniaDフラグメントのDIG−ラベルされたプローブを調製するために、pDM197をEcoRIにより消化し、そして1.1kbのフラグメントを、40mMのトリス−アセテート、1mMの二ナトリウムEDTA緩衝液（TAE）を用いての0.8％アガロースゲル上でのゲル電気泳動、及びQlAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)を用いてのゲルからのDNAの抽出に続いて単離した。プローブを、上記プライマーfoxy. nia1及びfoxy.nia2を用いてのPCRにより調製した。
【０１００】
100μlのPCR反応は、6ngの1.1kbのEcoRI niaDフラグメント、50pモルの個々のプライマー、１×Taq緩衝液（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）、10μlの10×DIGラベリング混合物（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）、及び５単位のTaq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含んだ。使用されるPCR条件は次の通りであった：95℃で３分、続いて95℃で30秒、50℃で１分、及び72℃で１分（30サイクル）。最終拡張サイクルは、72℃で５分であった。
【０１０１】
フサリウム・ベネナタムゲノムDNAライブラリーからの約90.000個のプラークを、培養緊縮条件［すなわち、DIG Easy hyb (Boehringher Mannheim, Germany)において37℃でのハイブリダイゼーション；室温で５分間の２×SSC及び0.1％SDSによる２度、続いて同じ温度で15分間の0.2×SSC及び0.1％SDSによる２度のフィルター洗浄］を用いて、DIG−ラベルされたプローブによるハイブリダイゼーション（Davis など., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York）によりスクリーンした。
【０１０２】
DIG−ラベルされたプローブの検出のために、Biehringer Mannheimからの標準のGeniusプロトコールを、その製造業者のプロトコールに従って、基質としてCPD Starを用いて行った。ハイブリダイゼーションシグナルを提供するプラークを、E. コリY1090ZL細胞上で２度、精製し、そして続いて、個々のクローンを、pZL1−誘導体としてλZipLoxベクターから切り出した（D'Alessio など., 1992, Focus&commat; 14: 76）。DNA配列分析は、pDM201と称するプラスミドを含む、それらのクローンの１つが、niaD遺伝子を含むが、しかし読み取り枠の5’末端で約400bpを欠失していることを示した。
【０１０３】
完全なniaD読み取り枠及びプロモーターを含むゲノムクローンを得るために、ゲノムクローンpDM201を用いて、読取枠からの5’末端側での0.46kbのフラグメントに対するプローブを創造した。前記プローブを、次のプライマーを用いて、PCRにより調製した：
5'CCCCGATAAAGATGGCTGTA 3' (niaprobe. plus) (配列番号15)；
5'TCGCTAGGCTCTTGGGTGAC 3' (niaprobe. minus) (配列番号16)。
【０１０４】
50μlのPCR反応は、6ngのpDM201、50pモルの個々のプライマー、１×Taq緩衝液（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）、5μlの10× DIGラベリング混合物（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）及び５単位のTaq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含んだ。使用されるPCR条件は、次の通りであった：95℃で３分、続いて95℃で30秒、50℃で１分、及び72℃で1.5分（30サイクル）。最終拡張サイクルは、72℃で５分であった。
【０１０５】
フサリウム・ベネナタムゲノムDNAライブラリーからの約80,000個のプラークを、高い緊縮条件（すなわち、DIG Easy hybにおける65℃でのハイブリダイゼーション；室温で５分間、２× SSC及び0.1％SDSによる２度、続く65℃で15分間、0.1×SSC及び0.1％SDSによる２度のフィルター洗浄）を用いて、DIF−ラベルされたプローブによるハイブリダイゼーションによりスクリーンした（Davisなど., 1986、前記）。DIG−ラベルされたプローブの検出のために、Boehringher Mannheimからの標準のGeniusプロトコールを、その製造業者のプロトコールに従って、基質としてCPE Starを用いて行った。
【０１０６】
ハイブリダイゼーションシグナルを生成するプラークを、E. コリY1090ZL上で２度、精製し、そして続いて、個々のクローンを、pZL1−誘導体としてλZipLoxベクターから切除した。DNA配列分析は、クローンFと称するプラスミドを含む、それらのクローンの１つが、niaD遺伝子及び1.6kbのプロモーターを含むことを示した。しかしながら、そのクローンは、読取枠の3’末端で450bpを欠失していた。
【０１０７】
完全なniaD読取枠、並びにプロモーター及びターミネーターを含むプラスミドpDM237（図２）を創造した。pDM237は、下記のようにして構成されるpBluescript SK (-) (Stratagene, La Jolla, CA)中にクローン化される、4.4kbのEcoRI/Hind型フサリウム・ベネナタムniaDフラグメントから成った。niaD挿入体は、クローンFからの1.8kbのKpnI/EcoRIフラグメント、及びpCM201からの2.6kbのKpnI/HindIII フラグメントから成った。それぞれKpnl/Hindlll 及び Kpnl/EcoRlによるpDM201及びクローンFの制限消化、及びTAE緩衝液を用いてのアガロースゲル上での電気泳動に従って、所望するフラグメントを、QIAクイックゲル抽出キットを用いて単離した。
【０１０８】
プラスミドpBluescript SK（-) を、EcoRI/HindIII により消化し、続いて上記のようにして電気泳動及び単離を行った。2.9kbのpBluescript SK(-) プラスミドを、14℃で３時間、1.8 kbの Kpnl/EcoRl及び2.6 kb のKpnI/HindIIIフラグメントにより連結し、続いてStratagene（La Jolla, CA）からのSUREコンピテント細胞の形質転換を行い、２XYTアンピシリンプレート上で選択した。プラスミドDNAを、クローンから単離し、そして制限分析を用いて、クローンpDM237が所望する挿入体を含むことを確認した。
【０１０９】
例２：pJRoy72の構成：
pJRoy72（図３）を、サーモミセス・ラヌギノサスリパーゼ遺伝子を含む、0.9kbのPCR生成物、2.1 kbの pRaMB62-int1からのStul/BspLUIlI (アメリカ特許第6,361, 973号) 及び Pmel/Pacl 消化されたpRamB60 (アメリカ特許第6,361,973号)を連結することにより構成した。リパーゼフラグメントを、次のプライマーを用いて、pDM194(アメリカ特許第6,361,973号)から増幅した：
5'-GACTCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTC-3'（配列番号17)；
5'-TGATTAATTAACCTAAAGACATGTCCCAATTAAC-3' (配列番号18)。
【０１１０】
100μlのPCR反応は、15 ng のpDM194、50 pモルの個々のプライマー、 1X PCR緩衝液 (Perkin-Elmer Corp. , Branchburg, NJ)、 250 μMの個々のdATP, dCTP, dGTP, 及び dTTP, 及び 5 単位のPwo DNA ポリメラーゼ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を含んだ。使用されるPCR条件は次の通りである：94℃で２分（１サイクル）、94℃で30秒、55℃で45秒、及び72℃で２分（10サイクル）、続いて94℃で30秒、55℃で45秒、及び72℃で２分（17サイクル）、及び個々のサイクルについて20秒の拡張。最終サイクルは72℃で10分であった。0.9kbのPCR生成物を、エタノール沈殿し、続いてPacI及びBspHIにより消化した。
【０１１１】
Pmel/Pacl 消化されたpRaMB60、 Stul/BspLU111 消化されたpRaMB62-int1及び0.9 kb PCR 生成物を、TAE緩衝液を用いて、1％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてDNAを、Qiaquickキットを用いて、その製造業者のプロトコールに従って、切除されたバンドから精製した。
pJRoy72を構成するために、pRaMB60の5.8kbのPmeI/RacIフラグメントを、0.9kbのPacI/BspHIリパーゼフラグメント及びpRaMB62-int1からの2.1 kb Stul/BspLU11 Iフラグメントにより連絡した。得られるベクターpJRoy72（図３）は、フサリウム−ベネナタムグルコアミラーゼプロモーター（配列番号１）の制御下でのサーモミセス・ラヌキソサスリパーゼ遺伝子を含んだ。
【０１１２】
例３：pNham1の構成：
プラスミドpNham1（図４）を、次の方法を用いて構成した：niaDプロモーターを含む1.6kbのフラグメントを、BamHI/EcoRIによりpDM237を消化することにより単離し、そしてniaD末端領域を含む760bpのフラグメントを、BamHI/HindIII により例５のpNham3を消化することにより単離した。アスペルギラス・オリザエpyrG遺伝子を含む約1.6kbのフラグメントを、BamHIによりpSMO122（アメリカ特許第5,985,727号）を消化することにより得た。2.9kbのバックボーンベクターフラグメントを、EcoRI及びHindIII によるpBluescript SK(-) の消化、続いて、自己−連結を防ぐためにエビアルカリホスファターゼ（Boehringer-Mannheim, Germany）による処理により生成した。
【０１１３】
消化の後、すべてのフラグメントを、TAEを用いての0.7％アガロースゲル上での電気泳動により単離し、続いて、所望するフラグメントを含むバンドの切除、及びQiaquik Gel Extraction Kitを用いて、その構造業者のプロトコールに従ってのゲルからのDNAの単離を行った。すべてのゲル−精製されたフラグメントを、次の連結混合物を共に、Rapid DNA Ligation Kit (Boehringer Mannheim, Germany)を用いて、pNham1を構成するために一緒に連結した：pNham3からの2μlの BamHI/HionIII フラグメント、pDM237からの2μlの BamHl/EcoRlフラグメント、pSMO122からの2μlの  BamHI、 １μlの pBluescript SK (-)、10μl の2X T4 DNA 希釈緩衝液, 2μlの5X DNA希釈緩衝液, 及び1μlのT4リガーゼ。
【０１１４】
連結反応を、室温で30分間インキュベートした。Epicurian E.コリ XL Blue コンピテント細胞(Stratagene, La Jolla, Ca. )を形質転換し、そして形質転換体を、２×YTアンピシリンプレート上で選択した。プラスミドDNAを、アンピシリン（100μg/ml）により補充されたLB培地2.5ml中にコロニーを接種することにより、いくつかの形質転換体コロニーから単離した。管を、250rpmで振盪しながら、37℃で一晩インキュベートした。プラスミドDNAを、Qiagen BioRobotを用いて、その製造業者のプロトコールに従って単離した。プラスミドを、制限酵素消化により分析し、正しい挿入体を確認した。
【０１１５】
例４：pNham2の構成：
切断されたフサリウム・ベネナタムniaD遺伝子及び発現カセット（ここで、サーモミセス・ラヌギソサスリパーゼ遺伝子がフサリウム・ヘネナタムグルコアミラーゼプロモーターとフサリウム・オキシストリプシンターミネーターとの間に存在する）を含むプラスミドpNham2（図５）を構成した。フサリウム・オキシスポラムトリプシン遺伝子のターミネーターを含む1.1kbのフラグメント、及びサーモミセス・ラウヌクノサスリパーゼ/グルコアミラーゼプロモーター領域を含む3.6kbのフラグメントを、それぞれPacI/NotIによりpJRoy72を消化することにより単離した。
【０１１６】
切断されたniaDフラグメントを含む3.6kbのフラグメントを、XbaI/ClaIによりpDM237を消化することにより得た。バックボーンベクターを含む3.9kbのフラグメントを、XbaI及びNotIによるpCR2.1（商標）-TOPO（商標）(Invitrogen, Carlsbad, CA)の消化、続いて、自己−連結を防ぐためにエビアルカリホスファターゼ（Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN）による処理により調製した。消化の後、すべてのフラグメントを、TAEを用いての0.7％アガロースゲル上での電気泳動により単離し、続いて、所望するフラグメントを含むバンドの切除、及びQiaquik Gel Extraction Kitを用いて、その構造業者のプロトコールに従ってのゲルからのDNAの単離を行った。
【０１１７】
pNham2を、Rapid DNA Ligation Kit (Boehringer Mannheim, Germany)を用いて、pJRoy72からの2 μlの Pacl/Clal フラグメント、pJRoy72からの2 μlの  Pacl/Notlフラグメント、pDM237からの2 μlのXballClal フラグメント、pCR2.1（商標）-TOPO（商標）からの1μlの Xbal/Notlフラグメント, 1μlの10X 連結緩衝液, 及び1μlのT4 DNAリガーゼの連結により得た。連結反応を、14℃で24時間インキュベートした。Epicurian E.コリ XL Blue コンピテント細胞(Stratagene, La Jolla, Ca. )を形質転換し、そして形質転換体を、１L当たり50mgのアンピシリンにより補充されたLBプレート上で選択した。プラスミドDNAを、いくつかの形質転換体コロニーから単離し、そしてグルコアミラーゼプロモーターの配列を確めるために、エンドヌクレアーゼ消化により及びpNham2の配列決定により分析した。
【０１１８】
例５：pNham3の構成：
pDM237からのBamHI/HindIII  niaDターミネーターの760bpフラグメントを、次のプライマーを用いてのPCRにより増幅した：
5'-GGATCCTTGAATAAGCGTAAATAGGG-3' （配列番号19)； 
5'-AAGCTTGCTGAGCATTTGACTGCC-3' (配列番号20)。
【０１１９】
PCR反応は、pDM237の1μlの1: 10希釈溶液(0. 3μg/μl-0.35μg/μl), 5 μlの 10x Taq 緩衝液 (Perkin Elmer Corp. , Branchburg, NJ), 1μl の25 mM dNTPs (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 1μl の 50 pモル プライマー1, 1 μl of 50 pモルプライマー2、0. 5 μlの 5単位/μ1 のTaq ポリメラーゼ (Perkin Elmer), 及び40. 5 μl の 蒸留水を含んだ。PCR反応を、次のサイクルのパラメーター及び条件を用いて、Ericomp TwinBlock Thermal Cyclerにおいて行った：95℃で３分（１サイクル）、続いて95℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で１分（25サイクル）、続いて72℃で10分（１サイクル）。PCR反応のアリコートを、１％アガロース−TAEゲル上で電気泳動し、760bpのフラグメントの増幅を確めた。
【０１２０】
フサリウム・ベネナタムniaDターミネーターの760bpのPCR生成物を、Topo TA cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、クローニング及び形質転換についての製造業者のプロトコールに従って、pCRII中にクローン化した。プラスミドDNAを、いくつかの形質転換体から単離し、そして配列分析を行い、760bpの挿入体を含むクローンを確めた。
【０１２１】
例６：フサリウム・ベネナタムpyrG変異体DLM15の構成：
ニューロスポラ・クラサpyr-４遺伝子の0.78kbのフラグメントを、下記プライマーを用いて、ジコキシゲニン（DIG）−ラベルされたデオキシウリジン−三リン酸（dUTP）を含むPCR反応においてラベルした：
プライマー94−885（センス）：5'-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3' (配列番号21)、
プライマー94−959（アンチセンス）：5'-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3' (配列番号22)。
【０１２２】
プラスミドpFB6 (Fungal Genetics Stock Center)から精製された、1.1kbのHindIII フラグメントを、鋳型として使用した。Taqポリメラーゼ反応のためのPCR条件は次の通りであった：95℃で３分、続いて95℃で30秒、55℃で１分及び72℃で１分（35サイクル）。最終拡張は、72℃で5分間、行われた。DIG−ラベルされたプローブを用いて、λベクターEMBL4中にクローン化されたフサリウム・ベネナタム株ATCC20334 DNAのゲノムライブラリーを、Royer など., 1995, Bio/Technology 13: 1479-1483に記載される同じ方法を用いてスクリーンした。λファージを、NZY上部アガロースを有するLBプレート上に、E. コリ K802細胞(Clonetech, Palo Alto, CA)と共にプレートした。
【０１２３】
プラークリフトを、標準の技法を用いて、ナイロン膜（HybondTM 膜, Amersham Pharmacia Biotech, UK）に対して行った。フィルターを、上記0.78kbのDIG−ラベルされたプローブによりハイブリダイズした。pyrGクローンのハイブリダイゼーション及び検出を、Boehringer Mannheim Genius System User's Guideに記載される技法を用いて行った。ハイブリダイゼーションを、5X SSC, 35%ホルムアミド, 0. 1% L- ラウロイルサルコシン, 0.02% SDS, 核酸ハイブリダイゼーション1 % ブロック試薬 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)において42℃で行った。
【０１２４】
使用されるDIG−ラベルされたプローブの濃度は、ハイブリダイゼーション溶液1m当たり2.5ngであった。ハイブリダイズするDNAを、アルカリ−ホスファターゼ接合された抗−ジゴキシゲニン抗体により免疫検出し、そしてLumiphas530、すなわち化学発光基質（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）により可視化した。DNA調製を、Qiagen Lambda Midi Kit (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)を用いて、特定上の陽性λクローンから行った。
【０１２５】
3.9kbのゲノムEcoRI pyrGフラグメントを、λクローンの１つからゲル精製し、そしてpUC118のEcoRI部位中にクローン化し、プラスミドpDM156.2 (図６)を生成した。pyrGフラグメントは、完全なコード領域＋1.3kbのプロモーター及び1.5kbのターミネーターを含んだ。
【０１２６】
プラスミドpDM222A（図７）を構成し、pyrG遺伝子座で2.7kbの欠失を創造した。プラスミドpJRoy47.1から取られた末端のアスペルギラス・オリザエpyrG反復（Royer, など, 1999, Fungal Genetics and Biology 28: 68-78）を有する、3.2kbのPmeI/SwaIアスペルギラス・ニジュランスandSフラグメントを、pDM156.2中にクローン化し、pyrG遺伝子座生成pDM222Aの2.7kbのStuI/EcoRV部分を置換した。この欠失は、0.78kbのプロモーター、完全なpyrGコード領域及び0.8kbのターミネーター領域を含んだ。amdS挿入体を端に有するpyrG領域は、5’末端での0.5kb及び3’末端での0.7kbであった。4.4kbのEcoRIフラグメントを、pyrG欠失プラスミドpDM222Aからゲル精製し、そしてそれを用いて、フサリウム・ベネナタム株MLY3を形質転換した。
【０１２７】
胞子を生成するために、新鮮なフサリウム・ベネナタムMLY3株（７〜14日）の10〜15の寒天プラグを、150rpmで振盪しながら、26℃で約40時間、500mlのRA培地に接種した。胞子を、無菌Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA)を通しての濾過により収穫し、そしてSorvall RC-5B遠心分離機により7974xgで20分間、回転せしめた。ペレットを、40mlの蒸留水により２度すすぎ、続いて、Sorvall RT6000Dにより20分間、1877xgで遠心分離した。細胞計数チャンバー（VWR Scientific, West Chester, PA）を用いて、胞子の数を決定した。
【０１２８】
形質転換のためのプロトプラストを、下記のようにして生成した。1mlの新鮮な胞子（２×108/ml）を、100mlのYP−5％グルコースブイヨンを含む500mlのそらせ板付振盪フラスコ中に接種し、そして150rpmで16時間、23.5℃でインキュベートした。培養物を、無菌Miraclothを通して濾過し、続いて、50mlの蒸留水により２度すすぎ、そして１MのMgSO4・7H2O (0.2μm濾過された) 50mlにより1度すすいだ。胚種状物（Germling）を、無菌のヘラを用いて集め、そして20mlのMgSO4・7H2O中、100mgのNOVOZYME 234TM (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)により再懸濁した。再懸濁後、管を90rpmで１時間、29℃でインキュベートした。1Mのソルビトール30mlを管に添加し、続いて470xgで10分間、遠心分離した。
【０１２９】
上清液を捨て、そしてペレットを1Mのソルビトール1mlに再懸濁し、続いて1Mのソルビトール30mlを添加した。管を469xgで５分間、遠心分離した。上清液を捨て、そしてペレットを1Mのソルビトール1mlの再懸濁し、続いてのソルビトール30mlを添加した。470xgでの５分間の遠心分離の前、100μlのアリコートを、900μlのSTC（0.8Mのソルビトール、25mMのトリス、pH8.0、50mMのCaCl2）を含むEppendort管に移し、プロトプラストの数を決定した。上清液を捨て、そしてペレットを、STC：SPTC（40％PEG、0.8Mのソルビトール、25mMのトリス、pH8.0、50mMのCaCl2）：DMSO（9：1：0.1）に再懸濁し、５×107個のプロトプラスト/mlの最終濃度にした。プロトプラストを、使用まで、−80℃で貯蔵した。
【０１３０】
形質転換のために、形質転換するDNAを、50mlのFalcon管において2mlのプロトプラスト（５×107/ml）と共に混合し、続いて50μlのヘパリン（STC中、5mg/ml）及び100μgのDNAを添加した。含有物を回転により軽く混合し、そして管を氷上で30分間インキュベートした。200μlの体積のSPTCを管にゆっくりと添加し、続いて室温で10分間インキュベートした。追加の20mlの体積のSPTCを反応に添加し、そして軽く混合し、続いて室温で10分間インキュベートした。2mlの形質転換反応を、25mlのCOVE上部アガロース＋10mMのウリジンを含むFalcon管に添加し、そして内容物を、管を軽く逆にすることにより混合した。次に、混合物を、COVE培地を含むアンダーレイ上にプレートした。
【０１３１】
形質転換体を、10mMのウリジンを含むか又は含まないVogelのアセトアミド寒天に移した。ウリジンを含まない培地上で劣って成長する形質転換体を、10mMのウリジンを有する液体最少培地及び10mMのウリジンを有さない培地に移した。菌糸体を、ウリジン補充された培地において良く増殖するが、しかしウリジを含まない培地においては増殖しない株から集めた。ゲノムDNAを、興味ある菌類株を含む、ウリジンにより補充された最少培地プレートからの３個の寒天プラグを、25mlのM400培地を含む125mlのフラスコに接種することにより調製した。フラスコを、150rpmで振盪しながら、３日間、26℃でインキュベートした。
【０１３２】
菌類の菌子体を、Miraclothを通しての濾過により培地から収穫し、続いてTE（IL当たり1Mのトリス−HCl, pH8, 0.5MのEDTA, pH8）により２度、洗浄した。菌糸体を、15mlのFalcon管に配置し、そして液体窒素において凍結した。乳鉢及び乳棒を用いて、凍結された菌子体を、細かな粉末に粉砕した。微粉末をすばやく、15mlのFalcon管に移し、そしてQiagen DNeasy Plant キット (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)を用いて、製造業者のプロトコールに従ってゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAを、EcoRIにより消化した。サザンブロットを調製し、そして3.2kbのフルオロセイン−ラベルされたpyrGフラグメントによりプローブした。
【０１３３】
そのpyrGフラグメントは、完全なコード領域＋1.3kbのプロモーター及び1.5kbのターミネーターを含んだ。Amersham Life Science からのVistra 蛍光キット RPN 5751をラベリングのために使用し、そして製造業者の説明書に従って、ブロットをハイブリダイズし、そして洗浄した。しかしながら、CDP-star (Roche Molecular Biochemicals)を、シグナル検出のために使用し、そしてブロットを、STORM Fluorlmagerを用いて代わりに、X−線フィルムに照射した。明白な二重交差現象の特徴的な予測される4.4kbのハイブリダイズするバンドを生成する形質転換を、液体最少培地＋10mMのウリジンにおいて、200rpm, 28℃で63時間、増殖した。胞子を、10mMのウリジンにより補充されたVogelのアセトアミド培地上で単離した。１つの胞子単離物を、RA胞子形成培地＋ウリジンにおいて、30℃、150rpmで30時間、増殖した。胞子を、無菌Miraclothを通しての濾過により、菌子体から分離した。
【０１３４】
胞子ストック（9.5×105個の胞子）のアリコート100μlを、10mMのウリジンを有する、５個のフルオロアセトアミド寒天プレートの個々上に広げた。フルオロアセトアミドプレート上で増殖するコロニーを、フルオロアセトアミド及びCOVE寒天の両者に移した。フルオロアセトアミド上で良く増殖するが、COVE上で良好に増殖しないか又はまったく増殖しないコロニーを、さらに分析した。それらの株の３種からの胞子単離物を、サザンブロット分析にゆだねた。ゲノムDNAを上記のようにして単離し、EcoRIにより消化し、そして上記のようなpyrGプローブによりプローブした。いくつかの胞子単位物は、andS “ループ−アウト”を示す、1.4kbのハイブリダイズするバンドを生成した。１つの胞子単離物を選択し、そしてフサリウム・バネナタム株DLM15と命名した。
【０１３５】
例７：サザン分析のためのniaD, pyrG, フサリウム・オキシスポラムトリプシン遺伝子及びサーモミセス・ラヌギノサスリパーゼ遺伝子のためDIG−ラベルされたプローブの構成：
niaD, pyrG, フサリウム・オキシスポラムトリプシン遺伝子及びサーモミセス・ラヌギノサスリパーゼ遺伝子のためのDIG−ラベルされたプローブを、PCR DIG Probe Synthesis Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を用いて、その製造業者の説明書に従って構成した。下記に列挙されるプライマーを、サザン分析のためのDIG−ラベルされたプローブを生成するために使用した：
【０１３６】
プライマー3: 5-ACAATGTTATCAATCCTCTTA-3' (配列番号23)
プライマー4: 5'-TGTCCCATGTTCTCGGTGCTA-3' (配列番号24)
プライマー5: 5'-GCCGACGTGACAACCACCAAAGA-3' (配列番号25)
プライマー6: 5'-CCACGGGATCAGGAGCAGCATAAA-3' (配列番号26)
プライマー7: 5'-GAAGCGTCGAGATGTTCCTTG-3' (配列番号27)
プライマー8: 5'-GGCAGACCGATGACTTTGG-3' (配列番号28)
プライマー9: 5'-GTTCTTTGTCTCTGCGTGGAC-3' (配列番号29)
プライマー10: 5'-GGATATCCGGAATGTTAGGC-3' (配列番号30)。
【０１３７】
プライマー３及び４を用いて、pDM237のniaD遺伝子に由来する3.5kbのniaDフラグメントを生成した。プライマー５及び６を用いて、pNham1からの719bpのpyrGを生成した。プライマー７及び８を用いて、pNham2からの756kbのフサリウム・オキシスポラムトリプシン遺伝子フラグメントを生成した。プライマー９及び10を用いて、pNham2からの811bpのサーモミセス・ラウギノサスリパーゼフラグメントを生成した。
【０１３８】
次の生成を、PCR反応に添加し、サザン分析のためのDIG−ラベルされたプローブを生成した：5 μl のPCR 10x 緩衝液, 5 μlのDIG Synthesis Mix (vial 2), 1μlの上方プライマー (50 pモル/μl), 1μl の下方プライマー(50 pモル/ μl), 0.75μl の ExpandTM High Fidelity 酵素混合物 (vial 1), 1μl の pDM237 又はpNham1又は pNham2 (50- 100 ng/μl), 及び35.25 μlの蒸留水。
【０１３９】
PCR反応を、予測されるDIGプローブにより示されるように、次のサイクルパラメーター及び条件を用いて、Eppendorf MasterCyclerにおいて行った：
niaDプローブに関しては、95℃で３分（１サイクル）、続いて、95℃で１分、52.9℃で１分及び72℃で3.5分（30サイクル）、続いて72℃で10分（１サイクル）。
pryGプローブに関しては、95℃で３分（１サイクル）、続いて、95℃で１分、60.1℃で１分及び72℃で１分（30サイクル）、続いて72℃で10分（１サイクル）。
フサリウム・オキシスポラムトリプシンプローブに関しては、95℃で３分（１サイクル）、続いて、95℃で１分、54.9℃で１分及び72℃で１分（30サイクル）、続いて72℃で10分（１サイクル）。
【０１４０】
サーモミセス・ラウヌギノサスリパーゼプローブに関しては、95℃で３分（１サイクル）、続いて、95℃で１分、56.8℃で１分及び72℃で１分（30サイクル）、続いて72℃で10分（１サイクル）。
PCR生成物を、１×TAE運転緩衝液中、0.75％アガロースゲル上で分解した。増幅されたDNAフラグメントをゲルから切除し、そしてQiaquick Gel Extractionを用いて、その製造業者のプロトコールに従って精製した。
【０１４１】
例８：フサリウム・ペネナタムniaD変異体の構成：
プラスミドpNham1（例３）を用いて、フサリウム・ペネナタムniaD変異体を構成した。pNham1を、XhoI及びEcoRIにより線状化し、そしてフサリウム・ベネナタムpyrG変異体株DLM15（例６）を形質転換した。形質転換に関しては、50μgの線状化されたpNham1を、例７に記載のような形質転換反応当たりに使用した。Vogels NH4H2PO4プレート上で増殖された114個の形質転換体、及び50個の形質転換を、塩素酸塩プレート上での増殖について試験した。塩素酸塩上での増殖について試験された50個の形質転換体の40は、niaD変異体について予測されるように、塩素酸塩に対して耐性であった。それらの40個の塩素酸塩耐性形質転換体をさらに、最少培地上での単独の窒素源として硝酸塩よりもむしろ亜硝酸塩を用いるそれらの能力について評価した。すべての塩素酸塩耐性形質転換体は、niaD変異体の特徴的な表現型である、単独の窒素源としての亜硝酸塩上で増殖した。
【０１４２】
６個の推定上のniaD変異体株を、分析のために選択し、そしてサザン分析により確めた。ゲノムDNAを、次の通りに、すべての６種の株から単離した。３個の寒天プラグを、興味ある菌類株を含む最少培地プレートから除き、そして25mlのM400培地を含む、125mlのフラスコに配置した。フラスコを、150rpmで振盪しながら、26℃で３日間インキュベートした。次に、菌糸体を、Miraclocthを通しての濾過により培養物から収穫し、続いてTE（1L当たり、1Mのトリス−HCl, pH8, 0.5MのEDTA、pH8）により２度、洗浄した。菌糸体を、15mlのFalcon管に配置し、そして液体窒素において凍結した。乳鉢及び乳棒を用いて、凍結された菌糸体を微粉砕した。その微粉末をすばやく、15mlのFalcon管に移し、そしてQiagen DNeasy Plant kit (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)を用いて、製造業者のプロトコールに従って、ゲノムDNAを抽出した。
【０１４３】
サザン分析のために、６個の推定上のniaD粉砕された株からのゲノムDNAを、Pstl, Nsil, 及び EcoRVにより消化し、pDM337からの3.6kbのniaDフラグメント（例８）及びpNham1からの780bpのpyrGフラグメント（例８）のいずれかによりプローブした。niaD変異体及び形質転換されていないDLM15株からのゲノムDNAを、37℃で一晩、NsiI及び PstI, EcoRV, 及び BamHIにより消化した（11μlの蒸留水、5μlのゲノムDNA（3μg）、2μlの10×緩衝液及び2μlの制限エンドヌクレアーゼ）。消化の後、個々の反応を、2μlの臭化エチジウムを含むTAE緩衝液を用いて、1％アガロースゲル上で分解した。
【０１４４】
ゲルを、250mMのHClに、軽く攪拌しながら、室温で10分間、浸した。ゲルを水により5分間すすぎ、そして次に、変性緩衝液（0.5MのNaOH、1.5MのNaCl）中に配置し、そして室温で15分間、２度、軽く攪拌し、続いて、水により５分間すすいだ。次に、ゲルを中和緩衝液（1Mのトリス、pH8、1.5MのNaCl）に浸し、そして室温で15分間、軽く２度、攪拌した。DNAを、Schleicher & Schuell Turblotter (Schleicher & Schuell Inc. Keene, N. H. )及び10×SSC（1.5MのNaCl及び1.5Mのクエン酸ナトリウム）を用いて、一晩、HybondTM 膜に移した。
【０１４５】
２日目、膜を２×SSCにより５分間、軽くすすぎ、そして次に、120,000ジュール/cm2でUV StratalinkerTM (Stratagene, La Jolla, Ca.)において架橋した。次に、乾燥されたブロットを、30mlのDIG Easy Hybを含むガラス管において42℃で少なくとも2時間プレハイブリダイズした。その後、プレハイブリダイゼーション溶液を捨て、そして煮沸水浴において10分間、変性された、PCRにより生成される、40μlのゲル精製されたGIG−ラベルされたプローブを含む、7.5mlの新鮮なDIG Easy Hybにより置換した。ハイブリダイゼーション管を、Hybaid (National Labnet Company Woodbridge, NJ)オーブンにおいて42℃で一晩インキュベートした。
【０１４６】
ハイブリダイゼーションの後、個々のブロットを、300mlの２× SCC、0.1％SDS溶液により室温で５分間２度、同じハイブリダイゼーション管に置いて軽く回転しながら洗浄し、そして300mlの0.2× SSC、0.1％SDS溶液により65℃で15分間、２回以上洗浄した。次に、個々のブロットを、室温で１分間、軽く攪拌しながら、150mlの１×洗浄緩衝液（15mlの10×洗浄緩衝液［Roche Mannheim, Germany］及び135mlの蒸留水）により平衡化した。洗浄緩衝液を捨て、そして100mlの１×ブロック溶液（10mlの10×ブロック［Roche Mannheim, Germany］、10mlの10×マレイン酸［Roche Mannheim, Germany］及び80mlの蒸留水）を、個々のブロットに添加し、続いて室温で少なくとも60分間、軽く攪拌した。
【０１４７】
ブロット溶液を捨て、そして個々のブロットを、30mlの抗−ジゴキシゲニン−AP溶液（１×ブロック溶液により1：20,000に希釈された）において、軽く攪拌しながら15分間インキュベートした。個々のブロットを、130mlの１×洗浄緩衝液において、室温で軽く攪拌しながら２度、洗浄した。次に、ブロットを、40mlの１×検出緩衝液（４mlの10×検出（Roche）及び36mlの蒸留水）により、それぞれ５分間、室温で攪拌しながら平衡化した。個々のブロットを、酢酸塩シート上に置き、そして1mlの化学発光基質（１×検出緩衝液により1：100に希釈されたCDP−StaTM）を、個々のブロット上に適用した。ブロットを、第２酢酸塩シートにより被覆し、そして室温で５分間インキュベートした。ブロットを、金属カセットにおいて10〜15分間、又は所望する照射が得られるまで、X−線フィルムに照射した。
【０１４８】
サザン分析は、６個の形質転換体のうち３個がniaD遺伝子座で予測される遺伝子置換を有することを示した。３個の形質転換体は、niaD遺伝子を破壊するために二重クロスオーバー現象により組込まれたpyrG遺伝子を含んだ。niaD形質転換体からのPstI消化されたDNAは、869bp及び1.6kbのバンド、並びに8.5kb以上の第３バンドを生成した。形質転換されていないフサリウム・ベネナタム株DLM15は、niaDフラグメントによりプローブされる場合、3.3kbのバンド及び8.5kb以上のバンドを生成した。NsiI消化されたゲノムDNAは、687bp及び1.7kbのバンド、及び8.5kb以上の第３バンドを生成した。
【０１４９】
形質転換されていないフサリウム・ベネナタム株DLM15は、同一のniaDフラグメントによりプローブされる場合、680bp及び8.5kb以上のバンドを生成した。さらに、３個のniaD形質転換体を、EcoRVにより消化し、naiDフラグメント又はpyrGフラグメントのいずれかによりプローブされる場合、4.5kb及び1.9kbのバンドを生成した。形質転換されていないフサリウム−ベネナタム株DLM15のEcoRV消化されたDNAは、niaDフラグメントによりプローブされる場合、1.2kb, 1.5kb及び4.2kbの３種のバンドを生成し、そしてpyrGフラグメントによりプローブされる場合、バンドは観察されなかった。
【０１５０】
胞子精製についての次の方法を、精製された菌株を得るために２度、行った。３個の寒天プラグを、菌株を含む最少培地プレートから除き、そして25mlのRA培地を含む125mlのフラスコに配置した。フラスコを、150rpmで振盪しながら、26℃で40時間インキュベートした。菌類胞子を、Miraclothを通しての濾過により培養物から収穫し、そしてSorvall RT 6000D遠心分離機を用いて、1877xgで10分間、遠心分離した。ペレットを、40mlの蒸留水により２度、洗浄し、続いて1877xgで20分間、遠心分離した。胞子の適切な希釈溶液を、最少培地プレート上にプレートし、単離されたコロニーを得た。個々のコロニーを、最少培地プレートに移し、そして５〜７日間、増殖し、そして続く胞子精製工程を反復した。
【０１５１】
フサリウム・ベネナタムniaD変異体＃３を、プロトプラスト、及び次の３種の形質転換体について得られたリパーゼ収率に従って選択した：niaD変異体＃３は、niaD変異体＃２に比較して、わずかに高い観察されるリパーゼ収率をもたらし、そしてniaD変異体＃３は、niaD変異体＃４に比較して、より多くのプロトプラストを生成した。従って、niaD変異体＃３は、pNham2及びpNham2変異体の分析のための宿主として使用される、選択された株であった。
【０１５２】
例10：pNham2プロモーター変異体の構成：
pNham2の13のプロモーター変異体を、Stratagene QuikChange Site- Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA)及び下記に列挙されるプライマーを用いて、その製造業者の説明書に従って、ヌクレオチド配列の欠失、置換、及び挿入により生成した：
【０１５３】
プライマー15:5'-CACGAACGCCTGCTCTATAGCGCCAATGAGG-3' (配列番号31) 
プライマー16:5'-CCTCATTGGCGCTATAGAGCAGGCGTTCGTG-3' (配列番号32) 
プライマー17:5'-CGACCAGACTAAACCATGCGGGGGATTGGGG-3'(配列番号33) 
プライマー18:5'-CCCCAATCCCCCGCATGGTTTAGTCTGGTCG-3'(配列番号34) 
プライマー19:5'-GGCGTAATTTATACCATAGCGGGAAACTCCTGTTTTGTCAAG-3' (配列番号35) 
プライマー20:5’-CTTGACAAAACAGGAGTTTCCCGCTATGGTATAAATTACGCC-3' (配列番号36) 
プライマー21:5'-CGAACGCCTGCTCTCGTAATTTATACC-3' (配列番号37) 
プライマー22:5'-GGTATAAATTACGAGAGCAGGCGTTCG-3' (配列番号38) 
【０１５４】
プライマー23:5'-CTCGGCGTAATTTCGGCCATAGCGCCAATG-3' (配列番号39) 
プライマー24:5'-CATTGGCGCTATGGCCGAAATTACGCCGAG-3' (配列番号40) 
プライマー25:5'-CGCCTGCTCTCGGAAATTTAAATACCATAGCGCC-3' (配列番号41) 
プライマー26:5'-GGCGCTATGGTATTTAAATTTCCGAGAGCAGGCG-3' (配列番号42) 
プライマー27:5'-CGCCTGCTCTCGGAAATTTAACGGCCATAGCGCCAATG-3' (配列番号43) 
プライマー28:5'-CATTGGCGCTATGGCCGTTAAATTTCCGAGAGCAGGCG-3' (配列番号44) 
プライマー29:5'-GCCTGCTCTCGGAAATTTAAAAATTTAACGGCCATAGCGCCAATG-3' (配列番号45) 
プライマー30:5'-ATTGGCGCTATGGCCGTTAAATTTTTAAATTTCCGAGAGCAGGCG-3' (配列番号46) 
【０１５５】
プライマー31:5'-CGAACGCCTGCTCTTATATGCCGGGCGCAAATAGCGCCAATGAG-3' (配列番号47) 
プライマー32:5'-CTCATTGGCGCTATTTGCGCCCGGCATATAAGAGCAGGCGTTCG-3' (配列番号48) 
プライマー33:5'-CGAACGCCTGCTCTATTCGTAATTTATACC-3' (配列番号49) 
プライマー34:5'-GGTATAAATTACGAATAGAGCAGGCGTTCG-3' (配列番号50) 
プライマー35:5'-CGTAATTTATACCATAGCGAAGGGTCTTTAGGAAACTCCTGTTTTGTC-3'(配列番号51) プライマー36:5'-GACAAAACAGGAGTTTCCTAAAGACCCTTCGCTATGGTATAAATTACG-3'(配列番号52) プライマー37:5'-CTCCTGTTTTGTCGGCGTAATTTCGGCCGTTGGGTCATG-3' (配列番号53) 
プライマー38:5'-CATGACCCAACGGCCGAAATTACGCCGACAAAACAGGAG-3' (配列番号54)。
【０１５６】
プライマー15及び16を用いて、配列番号１のヌクレオチド1952〜1967（配列番号68）に対応する、フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの上流の位置−158〜−143でのCGGCGTAATTTATACCのヌクレオチド配列に及ぶ欠失を含むpNham2-Del. 1を創造した。
プライマー17及び18を用いて、配列番号１のヌクレオチド1838〜1853（配列番号２）に対応する、フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの上流の位置−272〜−257でのCGGGAGAGTGTCAAATのヌクレオチド配列に及ぶ欠失を含むpNham2-Del.2を創造した。
【０１５７】
プライマー19及び20を用いて、配列番号１のヌクレオチド1974〜1984（配列番号６）に対応する、フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの上流の位置−134〜−124でのCCAATGAGGGCのヌクレオチド配列に及ぶ欠失を含むpNham2-Del.3を創造した。
プライマー21及び22を用いて、配列番号１のヌクレオチド1952〜1954（配列番号７）に対応する、フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの上流の位置−158〜−156でのCGGCGTAATTTATACCのヌクレオチド配列に及ぶ欠失を含むpNham2-Del.4を創造した。
【０１５８】
プライマー23及び24を用いて、配列番号１のヌクレオチド1963〜1965に対応する、フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼの上流の位置−147〜−145に位置するCGGトリプレットによるATAの置換を含むpNham2-Sub.1を創造した。この置換は、CGGCGTAATTTCGGCC（配列番号３）の配列を含んで成るプロモーター変異体を生成した。
プライマー25及び26を用いて、CGGCGTAATTTATACCの配列内のAAATTTAAのコンセンサスを含むpNham2-Sub.2を創造した。この置換は、配列番号１のヌクレオチド1955〜1962に対応するフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの位置−155〜−148（配列番号８）でのCGGAAATTTAAATACCの配列を含むプロモーター変異体を生成した。
【０１５９】
プライマー27及び28を用いて、開始コドンからの位置−155〜−145で置換される配列CGGAAATTTAACGGCCを含むpNham2-Sub.3を創造した。この置換は、配列番号１のヌクレオチド1955〜1965（配列番号９）に対応する。
プライマー29及び30を用いて、配列番号１のヌクレオチド1962〜1963（配列番号10）に対応する、−148〜−147に位置するpNham2-Sub.３変異体内のAAATTTAAのコンセンサスの挿入を含むpNham2-lns.1を創造した。この挿入は、CGGAAATTTAAAAATTTAACGGの配列を含んで成る変異体を生成した。
【０１６０】
プライマー31及び32を用いて、配列番号１のヌクレオチド1952〜1967（配列番号69）に対応するフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの位置−158〜−143に位置するTATATGCCGGGCGCAAの置換された配列を含むpNham2-Sub.4を創造した。
プライマー33及び34を用いて、配列番号１のヌクレオチド1952〜1954（配列番号11）に対応するフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの位置−158〜−156でのCGGにより置換される配列ATTを含むpNham2-Sub.5を創造した。この置換は、ATTCGTAATTTATACCの配列を含んで成る変異体を生成した。
【０１６１】
プライマー35及び36を用いて、配列番号１のヌクレオチド1974〜1984（配列番号12）に対応するフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの位置−134〜−124に位置するAAGGGTCTTTAの置換された配列を含むpNham2-Sub.6を創造した。
pNham2-Sub.7を、配列番号１のヌクレオチド1963〜1965（配列番号４）に対応するフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの上流の位置−147〜−145に位置するCGGトリプレットによりATAを置換するために、プライマー23及び24と共にpNham2-Del.2を用いて創造した。
【０１６２】
プライマー37及び38を、配列番号１のヌクレオチド2002〜2017（配列番号５）に対応する、フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの位置−108〜−93で置換される配列CGGCGTAATTTCGGCCの追加のコピーを含むpNham2-Sub.8 (pNham2-Sub.1からの)を創造した。
【０１６３】
特定の部位の突然変異誘発により生成されるすべてのpNham2フサリウムグルコアミラーゼプロモーター変異体を、配列決定により確めた。配列分析を、pNham2変異体におけるフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーター、サーモミセス・ラヌギノサスリパーゼ遺伝子、及びフサリウム・オキシスプラムトリプシンターミネーターの一部に対して行った。次のプライマーを用いて、変異体の配列を確めた：
【０１６４】
プライマー39. 5'-CGAACAGACGCCTCCGAAGAG-3' (配列番号55) 
プライマー40.5'-GTGACATCGCCCACTCCAGAG-3' (配列番号56) 
プライマー41.5'-GATGTTACGACGTGGGCCTGA-3' (配列番号57) 
プライマー42.5'-ACGCCGCAGCCGAGAC-3' (配列番号58) 
プライマー43.5'-CTGGTTATTGCCGCCG-3' (配列番号59) 
プライマー44. 5'-TACCGCATTACCCACACCAAT-3' (配列番号60) 
プライマー45. 5'-TGTTCGGCAGACAGATAACTG-3' (配列番号61) 
プライマー46. 5'-GCCCAAGACGACAGAGACGAC-3' (配列番号62) 
プライマー47. 5'-ATGACCTCAACATCTACCCGG-3' (配列番号63)。
【０１６５】
例11：フサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーター変異体の分析：
フサリウム・ベネナタムniaD変異体を、例10に記載される野生型pNham2及びその変異体により形質転換し、構成体の単一のコピーがniaD遺伝子座で組込まれる場合に得られるリパーゼ収率の差異を評価した。例７に記載される形質転換についての方法に従って、そして個々の変異体についてのDNA100μgを、反応当たりに使用し、続いて亜硝酸塩源を有する最少プレート上で選択した。形質転換体を、単一の窒素源としての亜硝酸塩を含む最少培地プレート上で選択した。機能的niaD遺伝子を含むそれらの形質転換のみが、発現プラスミドの組込みのために増殖することができた。
【０１６６】
サザン分析を、pNham2のいくつかの形質転換体又はそのグルコアミラーゼプロモーター変異体に対して行い、例８に記載のようにして、niaD遺伝子座で組込まれるコピー数を決定した。個々の変異体についてのいくつかの形質転換体のゲノムDNAを、例８に記載のようにして単離し、そしてNheI及びMunIにより消化した。niaD遺伝子座で組みこまれる、Nham2の単一のコピーを含む機能的niaD形質転換体は、例７に記載されるトリプシン遺伝子フラグメントによりプローブされる場合、4.5kb及び9.5kbのバンドを生成した。前記プラスミドの複数コピーを有する形質転換体は、4.5kb及び9.5kbのバンド、及びpNham2のサイズに対応する11.5kbの第３バンドを生成した。
【０１６７】
形質転換されていないniaD変異体株は、フサリウム・オキシスポラムトリプシン遺伝子フラグメントによりプローブされる場合、いずれのバンドも含まない。さらに、サザンブロットを、リパーゼフラグメントによりプローブした（例７）。pNham2の単一組み込み体は、リパーゼフラグメントプローブによりプローブされる場合、9.5kbバンドのみを含むべきである。複数の組み込み体は、9.6kbのバンド、及び11.5kbの第２バンドを含むべきである。形質転換されていないniaD株は、リパーゼフラグメントによりプローブされる場合、いずれのバンドも生成しなかった。
【０１６８】
pNham2又は変異体の単一コピーを含む機能的niaD形質転換体を、リパーゼ収率を評価する前、２度、胞子精製した（例９に記載のようにして）。組込まれる単一コピーを有する個々の変異体についての最少５個の形質転換体を、リパーゼ活性の比較のために選択した。個々の形質転換体を、３個の別々の振盪フラスコにおいて増殖し、そしてリパーゼ活性について３度アッセイした。125mlのフラスコ中、25mlの体積のM400培地を、５〜７日目のプレートに由来する２又は４個のプラグにより接種した。すべてのフラスコを、200rpmで振盪しながら、28℃で７日間インキュベートした。４及び７日目、個々の培養物のサンプル1.5mlを取り、そしてSorvall MC 12Vテーブル遠心分離機により13,720xgで30分間、回転せしめた。上清液を、遠心分離管中に移し、そしてリパーゼアッセイを行うまで、−20℃で貯蔵した。
【０１６９】
リパーゼ活性を、次の方法を用いて行った。分析に使用される基質は、ｐ−ニトロフェニルブチレート（990μlのDMSO, 0.1MのMOPS及び10μlのp−ニトロフェニルブチレート溶液4ml）であった。100μlの体積の基質を、96ウェルマイクロタイタープレートにおける100μlの酵素（0.1MのMOPS, pH7.5、4μMのCaCl2において希釈される）に添加した。リパーゼ活性を、0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 0.9及び1Lu/mlでのLIPOLASETM (サーモミセス ・ラヌギノサス リパーゼ, Novozymes, A/S, Bagsvaerd, Denmark)を用いて生成される標準曲線を用いることにより決定した。マイクロプレートリーダーを用いて、リパーゼ活性を、25℃で５分間、405nmで測定した。
【０１７０】
野生型pNham2及びそのプロモーター変異体について得られる相対的リパーゼ活性が表１に示される。個々の変異体に関して、リパーゼ活性の相対的平均が示され、そして与えられる変異体についてのリパーゼ収率が野生型pNham2についてのその収率と同じである確立を決定するために、ｔ−試験からのp値が示される。低いp値ほど、集団が異なっている確立が高い。
【０１７１】
【表１】
0004490284.tif 000002
【０１７２】
欠失された推定状の領域III aを含むプラスミドpNham2-Del.1は、野生型プラスミドpNham2に比較して、リパーゼ活性の有意な変化を示さなかった。pNham2−Del.2は、リパーゼ活性のわずかな上昇を示した。pNham2-Del.4の両者は、野生型に比較して、リパーゼ活性を有意な低下を示した。
pNham2−Sub.1は、CGGトリプレットがフサリウム・ベネナタムグルコアミラーゼプロモーターの位置−147〜−145で置換される場合、約３倍のリパーゼ活性の有意な上昇を示した。
pNham2-Sub. (2-3) 及びpNham2k-Ins.4は、リパーゼ活性の有意な低下を示した。
【０１７３】
pNham2-Sub.4-6の置換分析を行い、pNham2-Del.1, 3及び4により得られるリパーゼ収率が位置効果か又は重要なプロモーター要素の欠失のためであるかどうかを決定した。pNham2-Sub.4を、pNham2-Del.1及び野生型pNham2に比較する場合、リパーゼ活性についての有意な差異は存在しなかった。従って、pNham2-Sub.4は、pNham2-Del.1変異体の結果が位置効果により引き起こされないことを具体化する。pNham2-Sub.5及び6の発見は、pNham2-Dal.3及び4の結果を具体化する。従って、欠失されたヌクレオチドが、グルコアミラーゼプロモーターの高レベル発現を担当することができるプロモーターの要素であることが示唆される。
【０１７４】
pNham2-Sub.7変異体を、発現レベルにおける付加効果について試験するために創造した。pNham2-Sub.7変異体を、pNham2-Del.2及びpNham2-Sub.1における突然変異を組合すことにより構成した。リパーゼ活性に関して、pNham2-Sub.7により示される付加効果は存在しなかった。実際、pNham2-Sub.7とpNham2-Sub.1との間に観察される発現の有意な変化は存在しなかった。
【０１７５】
グルコアミラーゼプロモーターの位置−108〜−93で付加CGGCGTAATTTCGGを含むpNham2-Sub.8に関して、リパーゼ収率の６倍の上昇が、pNHam2に比較して観察された。この発見は、グルコアミラーゼプロモーター活性の改良性が、開始コドンの上流のCGG-TAATTT-CGGの複数コピーの挿入により達成され得ることを示唆する。
【０１７６】
例12：ノザン分析のためのDIG−ラベルされたヒストン/リパーゼハイブリッドプローブの構成：
ヒストン/リパーゼハイブリッドプローブを、次のプライマー組を用いて生成した：
プライマー11: 5'-TCTGGAGTGGGCGATGTCA-3' (配列番号64) 
プライマー12: 5'-ACCAGTGGACTTGCGGGCGTACCCATTTCCACGCAGGTC-3' (配列番号65) 
プライマー13: 5'-GACCTGCGTGGAAATGGGTACGCCCGCAAGTCCACTGGT-3' (配列番号66) 
プライマー14: 5'-GGATGGCGCAGAGGTTGGTG-3' (配列番号67)。
【０１７７】
プライマー11及び12を用いて、cDNA H3ヒストンフラグメントに由来する320bpのヒストンフラグメントを生成した（WO2000/56762号）。プライマー13及び14を用いて、pNham2からの320bpのリパーゼフラグメントを生成した。プライマー11及び14を用いて、ヒストン及びリパーゼ反応のPCR生成物からの620bpのヒストン/リパーゼフラグメントを生成した。
【０１７８】
ヒストン及びリパーゼフラグメントを生成するために使用されるPCR成分は次の通りであった：ヒストン又はリパーゼフラグメント；1μlの DNA (ヒストン cDNA 又はpNham2) 約50 ng, 5 μlの10x Taq 緩衝液(Roche), 1μl の25 mM dNTPs (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 1μlの50 pモルの プライマー 11 又は12、1μlの50 pモルのプライマー 13 又は 14、1μl5 単位/μl Taq ポリメラーゼ (Roche), 及び 40 μl の 蒸留水。PCRのためのサイクルパラメーター及び条件は次の通りであった：ヒストン又はリパーゼフラグメント； 95℃で３分（１サイクル）、続いて 95℃で 30秒, 60℃で 30秒,及び72 ℃で1 分（25サイクル）、続いて72℃で10 分（１サイクル）。
【０１７９】
PCR Dig Probe Synthesis Kitを用いて、次の成分を有するヒストン/リパーゼハイブリッドプローブを生成した：５μlのPCR 10x 緩衝液, 5μlのDig Synthesis Mix, 1μlの プライマー11 (50 pモル/ μl), 1μlのプライマー14 (50 pモル/μl), 1μlのExpandTM High Fidelity酵素混合物, 1μlのヒストンPCR 生成物, 1μlのリパーゼPCR 生成物,及び35μlの蒸留水。
【０１８０】
PCR反応を、次のサイクルパラメーター及び条件下でEppendorf MasterCyclerにおいて行った：95℃で３分（１サイクル）、続いて 95℃で １分, 60℃で １分,及び72 ℃で1 分（30サイクル）、続いて72℃で10 分（１サイクル）。640bpのPCR生成物を、TAE運転緩衝液を用いての0.75％アガロースゲル上で分解し、ゲルから切除し、そしてQiaquick Gel Extractionキットを用いて、その製造業者のプロトコールに従って精製した。
【０１８１】
例13：pNham2変異体構造体の単一コピーを含む形質転換体のノザン分析：
ノザン分析を、形質転換体間に観察されるリパーゼ収率の差異が細胞に存在するリパーゼmRNA転写体の量の差異のためであるかどうかを決定するために、多くのpNham2プロモーター変異体に対して行った。２つの形質転換体を、６個のpNham2変異体の個々のために選択した。
【０１８２】
３個の寒天プラグを、興味ある菌類株を含む最少培地プレートから除去し、そして25mlのM400 培地を含む125mlのフラスコに配置した。フラスコを、200rpmで振盪しながら、28℃で３日間インキュベートした。次に、菌糸体を、培養物から除き、そしてRNA抽出のために使用した。Bio 101 FastRNA Kit RED (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA)を用いて、その製造業者のプロトコールに従って、菌糸体からRNAを抽出した。
【０１８３】
個々の形質転換体からの全RNA10μgを、微小遠心分離管中にアリコートを、そして内容物を、その体積が約5μlになるまで、中位の熱を伴って真空下で乾燥した。15μlの体積のNorthernMAXTMGel Loading Solution (AMBION, Austin, TX)を、個々のサンプルに添加し、そしてかき混ぜ、再懸濁した。サンプルを、煮沸水下で2分間、加熱し、次にすばやく、微小遠心分離により回転し、そして氷上で急冷した。
【０１８４】
サンプルを、MOPS 緩衝液 (Amersco Solon, OH)中、1.5％ホルムアルデヒドアガロースゲル上に負荷し、そしてゲルを、ブロモフェノール青色色素がゲルの長さの約3/4まで移動するまで、100ボルトで運転した。ホルムアルデヒドゲルを、ビーカーにおいて、1.5gのアガロース、10mlの10×MOPS緩衝液及び85mlの水を混合することにより調製した。アガロースを、加熱することにより溶解し、そして次に、5μlのEtBr及び5.4mlの37％ホルムアルデヒドの添加を伴って、50℃に冷却した。ゲルを、DEPC−処理された水によりすすぎ、ホルムアルデヒドを除去し、次に、HyBond N＋膜に、4℃で一晩、Schleicher & Schuell Turboblotter (Schleicher & Schuell, Keene, NH) 及び10X SSC 緩衝液を用いて移した。
【０１８５】
移行の後、膜を、80℃で10分間、真空オーブンにおいて乾燥した。膜を、1000PMTボルトで、青色蛍光モードを伴ってSTORM 860 Phosphoimager (Molecular Dynamics Piscataway, NJ)を用いて走査し、続く定量化のために膜にRNAを映像化した。次に、膜を、２×SSC緩衝液により、軽く攪拌しながら５分間、２度すすぎ、そしてUV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA)において架橋した。
【０１８６】
ノザン分析のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション方法を、サザン分析（例８）について記載されるようにして行った。しかしながら、ブロットを、検出の前、緩衝液A（0.3AのNaCl、0.1Mのトリス−HCl、pH7.5）において平衡化した。検出に続いて、膜を、ECF基質（(Amersham Pharmacia Biotech. , Buckinghamshire, England）に一晩、暴露した。ヒストン及びリパーゼmRNAレベルの定量化を、STORM 860 Phosphoimager and Image Quant (version 5.0)プログラムを用いることにより決定した。その結果は、表２に示される。
【０１８７】
【表２】
0004490284.tif 000003
【０１８８】
表２は、観察される比較的同等のリパーゼと一致する、野生型とpNham2-Del.1との間のリパーゼ：ヒストンmRNA比の差異は存在しなかったことを示す。対照的に、野生型pNham2に比較される場合、他のpNham2変異体の間での有意な差異は存在しなかった。pNham2-Del.2 及び pNham2-Sub.1における高められたリパーゼmRNA転写体レベルは、pNham2に比較される場合、観察される高められたリパーゼ収率と十分に相互関係した。この相互関係は、グルコアミラーゼプロモーターの転写効率がリパーゼ収率における上昇の原因であることを示した。pNham2-Del.3-Del.4 及び pNham2-Sub.2に観察されるリパーゼmRNAレベルの低下は、低められたリパーゼ収率と十分に相互関係した。それらの発見は、転写制御がCGG及びCCAATGAGGGCの欠失のために、低められたリパーゼ収率の原因であり、そしてAAATTTAAコンセンサス配列の付加が発現の上昇を導かなかったことを示した。
【０１８９】
生物学的材料の寄託：
次の生物学的材料を、Agriculture Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL),1815 University Street,  Peoria, Illinois に、ブタペスト条件に基づいて寄託し、そして次の受託番号を付与された：
寄託物：E. coli TOP10 (pEC03) 
受託番号：NRRL B-30067
寄託日：１９９８年10月27日
前記株は、培養物への接近が、37 C.F.R.§1.14.及び35 U.S.C.§122下で特許及び商標局長により決定される本特許出願の係属の間、利用できることを保証する条件下で寄託された。寄託物は、寄託された株の実質的に純粋な培養物を示す。寄託物は、本出願の対応物又はその子孫が出願される国々における外国特許法により要求される場合、利用できる。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の指令により許される特許権の低下において本発明を実施する許可を構成しないことが理解されるべきである。
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１A及びBは、フサリウム・ベネナタムの生来のグルコアミラーゼ遺伝子プロモーター配列のDNA配列を示す。
【図２】図２は、pDM237の制限地図を示す。
【図３】図３は、pJRoy72の制限地図を示す。
【図４】図４は、pNham1の制限地図を示す。
【図５】図５は、pNham2の制限地図を示す。
【図６】図６は、pDM156.2の制限地図を示す。
【図７】図７は、pDM222Aの制限地図を示す。
【図１Ａ】
0004490284.tif 000004
【図１Ｂ】
0004490284.tif 000005
【図２】
0004490284.tif 000006
【図３】
0004490284.tif 000007
【図４】
0004490284.tif 000008
【図５】
0004490284.tif 000009
【図６】
0004490284.tif 000010
【図７】
0004490284.tif 000011
【配列表】
0004490284000001.app