(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水溶液注射剤の貯蔵・流通時における品質保持方法であって、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有せしめたトロンボモジュリン水溶液のｐＨが５以上７．０以下であり、（ａ）該トロンボモジュリン水溶液は、さらに、非イオン性界面活性剤を含有し、容器に無菌充填されていること、又は、（ｂ）該トロンボモジュリン水溶液が、空隙部割合が１５％以下であるようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であること、のいずれかを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる方法。
【請求項２】
有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、非イオン性界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、容器に無菌充填されていることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、空隙部割合が１５％以下であるようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水溶液注射剤の貯蔵・流通時における品質保持方法であって、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、非イオン性界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、空隙部割合が１５％以下であるようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる方法。
【請求項５】
可溶性トロンボモジュリンが、分子量（非還元状態でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定）が６．６万±１万であり、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、且つ注射用蒸留水に少なくとも６ｍｇ／ｍｌの濃度として溶解可能な可溶性であるペプチドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
可溶性トロンボモジュリンが、
（ｉ）配列番号１の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、又は
（ｉｉ）上記アミノ酸配列の１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列からなり、且つトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する可溶性トロンボモジュリンのいずれかである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
可溶性トロンボモジュリンが、配列番号１の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号２の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリン、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリンのいずれかの可溶性トロンボモジュリンである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
緩衝液成分がリン酸塩緩衝液成分、又は酢酸塩緩衝液成分の少なくとも１つであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
トロンボモジュリン水溶液のｐＨが、５．５〜６．５であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
プレフィルドシリンジ製剤におけるシリンジ容器の内径が、８．６ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１、又は請求項３〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、非イオン性界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、容器に無菌充填されていることを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、液状で長期貯蔵・流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１２】
有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、空隙部割合が１５％以下であるようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、液状で長期貯蔵・流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１３】
有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、非イオン性界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、空隙部割合が１５％以下であるようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、液状で長期貯蔵・流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１４】
該プレフィルドシリンジ製剤が、皮下注用、又は筋肉注射用製剤である請求項１２〜１３のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１５】
可溶性トロンボモジュリンが、配列番号１の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号２の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリン、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリンのいずれかの可溶性トロンボモジュリンである請求項１１〜１４のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１６】
トロンボモジュリン水溶液のｐＨが、５．５〜６．５であることを特徴とする請求項１１〜１５のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１７】
シリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤が、シリンジ容器でのトロンボモジュリン水溶液の存在量が、空隙部割合として１０％以下であることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１８】
プレフィルドシリンジ製剤におけるシリンジ容器の内径が、８．６ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれかに記載のトロンボモジュリン水溶液注射剤。
【請求項１９】
該水溶液が無菌充填されたプレフィルドシリンジが、フィルム又は箱に包まれていることを特徴とする請求項１２〜１８のいずれかに記載の注射剤。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水溶液注射剤の貯蔵・流通時における品質保持方法、又は貯蔵・流通において安定なトロンボモジュリン水溶液注射剤に関する。
従来の技術
トロンボモジュリン（以下、ＴＭと略記することがある）は、トロンビンと特異的に結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を著しく促進する作用を有する物質である。プロテインＣは、血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性のたん白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性型プロテインＣとなる。この活性型プロテインＣは、生体内で血液凝固系因子の活性型第Ｖ因子、および活性型第ＶＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノーゲンアクチベーターの産生に関与していることが知られている〔鈴木宏治、医学のあゆみ、第１２５巻、９０１頁（１９８３年）〕。
したがって、トロンボモジュリンは、このトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固作用と血栓溶解作用を示す活性型プロテインＣを大量に生産せしめるものであり、抗血液凝固剤又は血栓溶解剤として有用であるとされている。また、従来トロンボモジュリンの用途としては、例えば、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ；ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（例えば、心筋梗塞、不安定狭心症、冠動脈血行再建術など）、血栓症（例えば、急性期又は慢性期の脳血栓症、動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢血栓症等）、塞栓症（例えば、急性期又は慢性期の脳塞栓症、動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢塞栓症等）、末梢血管閉塞症（例えば、バージャー病、レイノー病等）、閉塞性動脈硬化症、血管炎（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット病、川崎病等）、心臓手術に続発する機能性障害、移植臓器の合併症、血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症、糖尿病、肝ＶＯＤ（Ｌｉｖｅｒ  ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；劇症肝炎や骨髄移植後の肝静脈閉塞症）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ；Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）等の疾患の治療及び予防に用いられることが期待されている。
従来、トロンボモジュリンは、ヒトを始めとする種々の動物種の血管内皮細胞上に発現している糖蛋白質として発見取得されたが、発明者らのグループにより、始めてクローニングに成功した。即ち、遺伝子工学的手法を用いてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーから、シグナルペプチドを含むヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝子をクローニングし、そしてトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析し、１８アミノ酸残基のシグナルペプチドを含む５７５残基のアミノ酸配列が明らかにされている（特開昭６４−６２１９号公報）。シグナルペプチドが切断されたマチュアなトロンボモジュリンは、そのマチュアなペプチドのＮ末端側よりＮ末端領域（１−２２６番目）、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（２２７−４６２番目）、Ｏ型糖鎖付加領域（４６３−４９８番目）、膜貫通領域（４９９−５２１）、そして細胞質内領域（５２２−５５７番目）の５つの領域から構成されており、そして全長のトロンボモジュリンと同じ活性を有する部分（即ち、最小活性単位）は、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域のうちＮ末端側から４、５、６番目のＥＧＦ様構造からなる部分であることが知られている〔Ｍ．Ｚｕｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１０３５１−１０３５３（１９８９）〕。
少なくとも、膜貫通領域を含有しないように調製されたトロンボモジュリンにおいては、界面活性剤の非存在下でも綺麗に溶解することができる性質（以下、可溶性ということがある）を有し、例えば、Ｎ末端領域と６つのＥＧＦ様構造をもつ領域とＯ型糖鎖付加領域の３つの領域のみからなる（即ち、配列番号１の１９〜５１６位のアミノ酸配列からなる）トロンボモジュリンは、組換え技術の応用により取得できること、そしてその組換え体トロンボモジュリンは、天然のトロンボモジュリンの活性を有していることが確認されている（特開昭６４−６２１９号公報）。
因みに、遺伝子においては、自然の変異または取得時の変異により、多くのケースで認められる通り、ヒトにおいても多形性の変異が見つけられており、上述の５７５残基のアミノ酸配列からなるヒトトロンボモジュリン前駆体の第４７３位のアミノ酸においてＶａｌであるものと、Ａｌａであるものが現在確認されている。このアミノ酸をコードする塩基配列においては、第１４１８位において、それぞれＴとＣとの変異に相当する〔Ｗｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６，４３５０−４３５７（１９８７）〕。しかし、活性及び物性においては、全く相違なく、両者は実質的に同一と考えることができる。したがって、上述の配列番号１のアミノ酸配列からなるトロンボモジュリンは、配列番号２のアミノ酸配列からなるトロンボモジュリンの多形性のペプチドであり、実質的に同一と判断できる。
ところで、このトロンボモジュリンは、医薬組成物として広く安定的に供給する場合には、凍結乾燥製剤として供給することが行われている。この凍結乾燥の過程で、トロンボモジュリン含有溶液を凍結乾燥すると、微量ではあるが一部が変性によって高分子化し、トロンボモジュリン分子がいくつか会合した多量体が生成することが明らかとなった。この課題を解決するために、本発明者らは、鋭意検討した結果、アミノ酸またはその塩類を添加することにより、凍結乾燥時のトロンボモジュリンの変性が防止されることを確認し、先に出願した（特開平６−３２１８０５号公報）。
発明が解決しようとする課題
しかしながら、簡便に用いることができ、また製造費用の安価な、凍結乾燥製剤以外の、新たな製剤を提供することが求められている。
課題を解決するための手段
本発明者らは、凍結乾燥製剤以外の新たな製剤を開発する目的で、凍結乾燥工程を行わずに、用時溶解する必要のないトロンボモジュリンの水溶液注射用製剤の開発を検討した。トロンボモジュリンの水溶液注射用製剤に必要とされる品質としては、先ず第一に、５℃から室温での長期保存において残存力価が大きく下がらないこと（長期安定性）が必要であるが、調べてみると、必ずしもこの長期安定性を得ることは容易ではなかった。またさらに意外なことに、水溶液注射用製剤を振盪したときに、白濁を生ずる場合があることが確認された。輸送等の流通の過程において、程度の差はあっても、製剤が振盪されることは十分に予想され、粉体である従来の凍結乾燥製剤においては全く問題となることはなく、全く予想もされなかった振盪安定性に関する課題が、本発明者らにより新たに確認された。注射剤において、不溶物が存在することは、特に循環器疾患を有する患者にとって致命的な問題を引き起こす可能性があり、振盪により白濁して不溶物が生ずる振盪安定性に関する問題は極めて大きな障害である。
以上まとめると、水溶液注射剤は、凍結乾燥製剤に比べると使用時における注射用蒸留水への溶解の必要もなく簡便に投与でき、また製造工程で凍結乾燥操作を必要とせず製造上簡便且つ経済的であるなどの利点があるが、上述の通り、単純にトロンボモジュリンを溶液にするだけでは、長期安定性に劣り、振盪安定性についても満足のいくものは得られず、長期に貯蔵・流通せしめることのできる水溶液注射剤を作成することは困難であった。
本発明者らは、前記の問題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の条件によりこれらの問題点をことごとく解決できることを確認して、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水溶液注射剤の貯蔵・流通時における品質保持方法であって、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有せしめたトロンボモジュリン水溶液のｐＨが５以上７．０以下であり、（ａ）該トロンボモジュリン水溶液は、さらに、界面活性剤を含有し、容器に無菌充填されていること、又は、（ｂ）該トロンボモジュリン水溶液が実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であること、のいずれかを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる方法である。
したがって、本発明の貯蔵・流通時における品質保持方法の第一の態様は、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、容器に無菌充填されていることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる上記に記載の方法である。
また、本発明の第二の態様は、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる上記に記載の方法である。
また、好ましい本発明の第三の態様は、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる上記記載の方法である。
また、本発明の方法は、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有せしめたトロンボモジュリン水溶液のｐＨが５以上７．０以下であり、（ａ）該トロンボモジュリン水溶液は、さらに、界面活性剤を含有し、容器に無菌充填されていること、又は、（ｂ）該トロンボモジュリン水溶液が実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であること、のいずれかを特徴とする凍結又は凍結乾燥されていない液状のトロンボモジュリン水溶液の長期および振盪における安定化方法である。
本発明の方法に用いられるトロンボモジュリン水溶液注射剤は、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有せしめたトロンボモジュリン水溶液のｐＨが５以上、７．０以下であり、（ａ）該トロンボモジュリン水溶液は、さらに、界面活性剤を含有し、容器に無菌充填されていること、又は、（ｂ）該トロンボモジュリン水溶液が実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であること、のいずれかを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、液状で長期貯蔵・流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
即ち、トロンボモジュリン水溶液注射剤の第１の態様としては、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上、７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、容器に無菌充填されていることを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、液状で長期貯蔵・流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
また、トロンボモジュリン水溶液注射剤の第２の態様としては、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上、７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、液状で長期貯蔵・流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
また、トロンボモジュリン水溶液注射剤の第３の態様としては、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分と、界面活性剤とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上、７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルドシリンジ製剤であることを特徴とする長期安定性および振盪安定性において優れ、液状で長期貯蔵・流通せしめるための凍結又は凍結乾燥されていないトロンボモジュリン水溶液注射剤である。
本発明でトロンボモジュリンとは、トロンビンに結合し、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する物質であれば特に限定されない。可溶性トロンボモジュリンとは、上記のトロンボモジュリンとしての活性を有し、界面活性剤の非存在下でも容易に溶解し得る物質であり、例えば、注射用蒸留水に対して、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは３ｍｇ／ｍｌ以上、特に好ましくは６ｍｇ／ｍｌ以上の溶解性が得られるものが好ましい。また、可溶性トロンボモジュリンとしては、例えば、分子量（非還元状態でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定）が６．６万±１万であり、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、且つ注射用蒸留水に少なくとも６ｍｇ／ｍｌの濃度として溶解可能な可溶性であるペプチドが好ましい例として挙げられる。他の可溶性トロンボモジュリンとしては、配列番号１の１９−２９のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列からなり、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し、且つ可溶性であるペプチドである可溶性トロンボモジュリンが例示される。またさらに他の可溶性トロンボモジュリンとしては、（ｉ）配列番号１の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、又は（ｉｉ）上記アミノ酸配列の１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列からなり、且つトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有する可溶性トロンボモジュリンのいずれかも好ましい例として示される。
さらに、トロンボモジュリンとしては、通常、トロンボモジュリンの最小活性単位とされる、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうちのＮ末端側から４、５、６番目の構造（例えば、ヒト型のトロンボモジュリンとしては、配列番号１および配列番号２の３６７−４８０位）を少なくとも有するアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。このなかで特に好ましい可溶性トロンボモジュリンとしては、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターにより宿主細胞にトランスフェクトして調製される形質転換細胞が産生じ得るペプチドが挙げられる。この形質転換細胞が産生し得るペプチド（可溶性トロンボモジュリン）としては、配列番号１および配列番号２の１９−５１６位のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい例として挙げられる。その他に宿主細胞によっては、シグナル部分がそのままや、前記配列番号１および配列番号２の１７−５１６位のアミノ酸配列からなるペプチド、又はそれらの混合物であってもよい。勿論これらのペプチドは極めて溶解性が高いもので、前述の溶解性を十分に有するものである。さらに、これらのペプチドは、前記のアミノ酸配列を有すればよいのであって、糖鎖が付いていても、又付いていなくともよく、特に限定されるものではない。また、ヒト尿等から取得できる可溶性ペプチドも利用することができる。宿主細胞の種類により、糖鎖の種類や、付加位置や付加の程度は相違するものであり、いずれも用いることができる。配列番号１および配列番号２の３６７−４８０位からなるペプチド自体は、振盪安定性が高く、その点ではいずれにしても好ましい水溶液製剤となるが、上記の分子量（非還元状態で６．６万±１万）の可溶性トロンボモジュリン、例えば、前述の配列番号１の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号２の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリン、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリンのいずれかの可溶性トロンボモジュリンにおいては、本発明の構成により振盪安定性を高める必要があると理解される。
宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）細胞、ＢＨＫ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ハムスターＡＶ−１２−６６４細胞等が、またヒト由来細胞としてＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ヒト２９３細胞等が挙げられる。ＣＨＯ細胞においては、ＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞がさらに好ましい。
また、遺伝子操作の過程において、大腸菌等の微生物も多く使われ、それぞれに適した宿主−ベクター系を使用することが好ましく、上述の宿主細胞においても、適宜のベクター系を選択することができる。
遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジュリンの遺伝子は、クローニングされており、そしてトロンボモジュリンの遺伝子組換え技術を用いた製造例が開示されており、さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている（特開昭６４−６２１９号公報、特開平２−２５５６９９号公報、特開平５−２１３９９８号公報、特開平５−３１０７８７号公報、特開平７−１５５１７６号公報、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１０３５１−１０３５３，１９８９）。したがって本発明のトロンボモジュリンは、上記の報告に記載されている方法を用いることにより、あるいはそれらに記載の方法に準じることにより製造することができる。例えば特開昭６４−６２１９号公報では、全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐｓＶ２ＴＭＪ２を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｓｔｒａｉｎ  ＤＨ５（ＡＴＣＣ  寄託番号６７２８３号）を開示しているが、本出願人は、再度、同じ菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５／ｐｓＶ２ＴＭＪ２）を日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８年６月１９日に寄託した。受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−５５７０である。この全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを原料として、公知の遺伝子操作技術によって、本発明のトロンボモジュリンを調製することができる。
本発明に用いられる可溶性トロンボモジュリンは、従来公知の方法またはそれに準じて調製すればよいが、例えば、前記山本らの方法（特開昭６４−６２１９号公報、実施例参照）、又は特開平５−２１３９９８号公報を参考にすることができる。すなわちヒト由来のトロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により、例えば、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなし、さらに必要に応じた改変を行うことも可能である。この改変としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなすために、配列番号１のアミノ酸配列の第４７３位のアミノ酸をコードするコドン（特に、第１４１８位の塩基）に、メソッド  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１００巻、第４６８頁（１９８３年）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従って、部位特異的変異を行う。例えば、配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡ断片及び配列番号５に示された塩基配列を有する変異用合成ＤＮＡを用い、上記部位特異的変異を行い、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなすことができる。このようにして、調製したＤＮＡを、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで、形質転換細胞とし、適宜選択し、この細胞を培養して得た培養液から、公知の方法により精製された可溶性トロンボモジュリンが製造できる。前述の通り配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを前記宿主細胞にトランスフェクトすることが好ましい。本発明に用いられるトロンボモジュリンの生産方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば、トロンボモジュリン又は可溶性トロンボモジュリンを産生する組織または組織培養液やヒト尿等から抽出精製することも、又は必要によりさらに蛋白分解酵素により切断処理することも可能である。
次いで上記により取得された培養上清、または培養物からのトロンボモジュリンの単離精製方法は、公知の手法〔堀尾武一編集；蛋白質・酵素の基礎実験法〕に準じて行なうことができる。例えば、トロンボモジュリンと逆の電荷を持つ官能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンの間の相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィーの使用も好ましい。また、トロンボモジュリンとの特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーも好ましい例として挙げられる。吸着体の好ましい例として、トロンボモジュリンのリガンドであるトロンビンやトロンボモジュリンの抗体を利用する例が挙げられる。これらの抗体としては、適宜の性質、或いは適宜のエピトープを認識するトロンボモジュリンの抗体を利用することができ、例えば、特公平５−４２９２０号公報、特開昭６４−４５３９８号公報、特開平６−２０５６９２号公報などに記載された例が挙げられる。また、トロンボモジュリンの分子量サイズを利用した、ゲル濾過クロマトグラフィーや限外濾過が挙げられる。そしてまた、疎水性基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンのもつ疎水性部位との間の疎水結合を利用した疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせることができる。精製の程度は、使用目的等により選択できるが、例えば電気泳動、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が単一バンドとして得られるか、もしくは単離精製品のゲル濾過ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣの結果が単一のピークになるまで純粋化することが望ましい。
精製法を具体的に例示すれば、トロンボモジュリン活性を指標に精製する方法が挙げられ、例えばイオン交換カラムのＱ−セファロースＦＦで培養上清または培養物を粗精製しトロンボモジュリン活性を有する画分を回収し、ついでアフィニティーカラムのＤＩＲ−ＴＢ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｏｒｙｌ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｇａｒｏｓｅ）で主精製しトロンボモジュリン活性が強い画分を回収し、回収画分を濃縮し、ゲルろ過にかけトロンボモジュリン活性画分を純品として取得する精製方法［五味ら；Ｂｌｏｏｄ、７５、１３９６−１３９９、１９９０］が挙げられる。指標とするトロンボモジュリン活性としては、例えばトロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性が挙げられる。その他に、好ましい精製法を例示すると以下の通りである。
トロンボモジュリンと良好な吸着条件を有する適当なイオン交換樹脂を選定し、イオン交換クロマト精製を行なう。特に好ましい例としては、０．１８Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−セファロースＦＦを用いる方法である。適宜洗浄後、例えば０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し粗精製品のトロンボモジュリンを得ることができる。
次に、例えばトロンボモジュリンと特異的親和性を持つ物質を樹脂に固定化しアフィニティークロマト精製を行なうことができる。好ましい例としてＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムの例と、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムの例が挙げられる。ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムは、予め、例えば、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化せしめ、上記の粗精製品をチャージして、適宜の洗浄を行い、例えば、１．０Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し精製品のトロンボモジュリンを取得することができる。また抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムにおいては、予めＣＮＢｒにより活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア社）に、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体を溶解した０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）に接触させ、セファロース４Ｂに抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体をカップリングさせた樹脂を充填したカラムを、予め例えば１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、適宜の洗浄の後、例えば、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出せしめる方法が例示される。
次に得られた上記精製可溶性トロンボモジュリン溶液を、塩濃度、ｐＨの測定精度及びＴＭの分子種にもよるが、通常例えば比伝導度２５〜３４ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３〜４の条件下にて平衡化せしめた、陽イオン交換体、好ましくは強陽イオン交換体であるＳＰ−セファロースＦＦ（ファルマシア社）にチャージする。上記の比伝導度としては、３０±３ｍｓ／ｃｍが、より好ましく、またｐＨは、ｐＨ３．０〜３．７が好ましく、さらに好ましくはｐＨ３．５±０．１の条件が例示される。これらの条件は、適当な濃度の塩を添加した緩衝液を使用することが好ましく、種々の態様が考えられるが、例えば０．２５〜０．３２Ｍ、好ましくは０．３±０．１ＭのＮａＣｌを含む５０〜１５０ｍＭのｐＨ３〜４の緩衝液が例示される。緩衝液の種類としては特に限定されないが、例えば、グリシン塩酸、クエン酸−クエン酸２ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸が例示される。上記の条件をさらに具体的に示せば、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）が例示される。比伝導度は、例えば、ポータブル伝導度計（東亜電波工業株式会社製、ＰシリーズＣＭ−１１Ｐ、換算基準温度２５度）により簡単に測定することができる。
上記のカラムを例えば３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５、比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ）で洗浄を開始し、素通り画分の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの素通り画分を得、適当な緩衝液で中和し、血清由来物及び抗体由来物を実質的に含有しない程度まで精製された可溶性ＴＭを高純度精製品として取得することができる。後記する通り、このカラムを使用すると血清由来物や抗体由来物を効率および再現性よく除去できることが確認される。勿論、これらは、適宜限外濾過により濃縮することができる。
さらに、ゲル濾過による緩衝液交換を行なうことも好ましい。例えば、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化せしめたＳｅｐａｈｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムもしくはＳ−２００カラムに、限外濾過により濃縮した高純度精製品をチャージし、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で展開分画し、トロンビンによるプロテインＣの活性化の促進活性の確認を行ない活性画分を回収し緩衝液交換した高純度精製品を取得することができる。
多くの精製工程においては、塩類を含有する溶出液等を用いることから、最終的に本発明に合致するｐＨや緩衝液成分や界面活性剤を含む溶液を用いることができれば、特に、最終的に添加や調製を必要とせず、本発明の水溶液注射用製剤となるが、通常は、可溶性トロンボモジュリンに本発明に必要な成分等を追加する方法が簡便であり好ましい。
また本発明における緩衝液成分は、ｐＨをｐＨ５以上、７．０以下に調整でき、同ｐＨの間において緩衝能を有するものであれば特に限定されない。さらに好ましくは、ｐＨ５．５〜６．５が例示される。例えば、リン酸や、カルボン酸及び／又はその水溶性塩からなる群から選ばれた一種以上の有効量が用いられる。カルボン酸及び／又はその水溶性塩としては、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸及び／又はその水溶性塩からなる群から選ばれた一種以上が挙げられ、特に好ましくはリン酸、酢酸及び／又はそれらの水溶性塩などが挙げられる。水溶性塩としては製剤学的に許容されるものであれば特に制限はなく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。
本発明における容器としては、無菌充填することに適した材料、形状であれば特に限定されないが、例えば、ガラス製シリンジ（さらに、ゴム製キャップおよびゴム製ストッパーにより無菌充填）や、ガラス製バイアル（および栓）、ガラス製アンプルが挙げられ、その他にそれぞれのプラスチック製品を用いることもできる。本発明において、シリンジ容器に封入せしめたプレフィルドシリンジ製剤として提供されることは最も好ましい態様である。プレフィルドシリンジ製剤は、予め水溶液注射剤がシリンジ容器に充填された状態で、貯蔵・流通される製剤であり、容器に注射針が予め付いていても付いていなくともよく、注射針が付いていない場合には、使用時には必要に応じて、注射針を付けて使用されることが通常である。また、注射針を使わずに、プレフィルドシリンジ内の水溶液注射剤自体の圧力を高め、皮膚を透過せしめる方法も挙げられる。この場合に、プレフィルドシリンジ前方の水溶液注射剤の射出口は、比較的狭くすることが好ましく、また圧力を高める手法としては、例えば、ガス（窒素ガス、ヘリウムガス、炭酸ガス等）やバネ等による圧力を利用する方法が挙げられる。
上記のｐＨにおいて緩衝能を有する緩衝液成分は、その種類の他、その濃度や無菌充填する容器の種類とも関係するが、例えば、使用を予定している容器に、検討する緩衝液を充填予定量（例えば１ｍｌ、或いは０．５ｍｌ等）を充填して、後記の測定法１に記載の５０℃９６時間の加熱処理を行った後のｐＨの変動が±０．３以内に抑制できる緩衝液成分の種類又はその濃度を選択することが好ましい。前述の代表的な緩衝液成分において、使用される濃度としては、通常０．１ｍＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上が例示され、上限としては、通常は、１０００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは２５ｍＭ以下又は２０ｍＭ以下が例示される。ガラス製品が予めサルファー処理されていることも好ましい。また、ガラス製シリンジの内壁はシリコンコートされていてもよい。
本願発明の水溶液注射用製剤のための緩衝液の作製方法の例としては、リン酸塩緩衝液の場合には、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４、又はその２水塩）の所定の濃度の水溶液とリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４、又はその１２水塩）の所定の濃度の水溶液とを、所定量ずつ混合して目的とするｐＨに調整する。またはリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４、又はその２水塩）の所定の濃度の水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、目的とするｐＨに調整してもよい。またｐＨの微調整のために、薄めた塩酸又はリン酸を滴下してもよい。酢酸塩緩衝液で代表されるカルボン酸塩緩衝液の場合には、酢酸の所定の濃度の水溶液と酢酸ナトリウムの所定の濃度の水溶液とを、所定量ずつ混合して目的とするｐＨに調整する。または酢酸の所定の濃度の水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、目的とするｐＨに調整してもよい。またｐＨの微調整のために、薄めた酢酸を滴下してもよい。
本発明の水溶液注射用製剤のｐＨは、通常ｐＨ５．０以上、７．０以下であり、好ましくはｐＨ５．５〜６．５である。特に好ましくは約ｐＨ６．０が挙げられる。また、ｐＨ５．５〜６．０が好ましい例として挙げられる。
リン酸塩緩衝液においては、その濃度を０．２〜２００ｍＭの広い濃度範囲で振ったところ、ｐＨ７．３ではリン酸塩緩衝液濃度による影響が大きく、リン酸塩緩衝液濃度が濃くなるほど力価の低下が見られ、例えば２００ｍＭでは大きく残存力価を減少させる。しかし、リン酸塩緩衝液を用いる場合であっても、ｐＨを５〜７．０の範囲にて厳密に管理すれば、熱安定性（長期安定性）において好ましい品質が得られる。ｐＨ５．５〜６．５、特には約ｐＨ６．０に設定すれば好ましく、余りｐＨ７．０に近い設定をした場合には、若干の変動でも熱安定性において影響があるので、避けることが好ましい。
酢酸塩緩衝液においては、その濃度を０．２〜２００ｍＭの広い濃度範囲で振っても、緩衝液濃度による影響はなく、またリン酸塩と酢酸塩を組み合わせた緩衝液においては、ｐＨ５．０〜７．０の範囲において熱安定性において好ましい品質となる。
また酢酸以外のカルボン酸塩緩衝液においても、酢酸塩緩衝液と同じ濃度、ｐＨ範囲で酢酸塩緩衝液と同等の熱安定性を示す。またリン酸塩緩衝液に更に酢酸塩緩衝液成分やカルボン酸塩緩衝液成分を添加しても、同等の熱安定性を示す。
また本発明における界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤が好ましく、例えばポリソルベート類［ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）など］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類［ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（商品名：ＨＣＯ−６０、商品名：クレモフォールＲＨ６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（商品名：ＨＣＯ−５０、商品名：クレモフォールＲＨ５０）など］、ポリオキシエチレンヒマシ油類［商品名：ＣＯ−６０ＴＸ、商品名：ＣＯ−５０ＴＸ、商品名：クレモフォールＥＬなど］、エチレンオキサイドプロピレンオキサイド重合体［ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（商品名：プルロニックＦ６８）など］、セスキオレイン酸ソルビタンが挙げられる。これらの界面活性剤は、複数を混合して用いてもよく、上記の群から選ばれた一種以上を用いることができる。
振盪安定性において、ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）は少なくとも０．０１％で、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（商品名：ＨＣＯ−６０）及びポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（商品名：プルロニックＦ６８）は少なくとも０．１％で白濁防止効果を示す。ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）は０．０１％添加でも白濁防止効果を示し、特に好ましい例として挙げられる。
本発明で用いる界面活性剤の濃度は、通常０．００１％以上、好ましくは０．０１％以上が例示され、上限としては、通常１％以下、好ましくは０．１％以下が例示される。
上記添加物の他に本発明においては、第３成分として、等張化剤（例えば、塩化ナトリウムなど）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル類など）等を添加してもよい。
前述の通り、添加方法は特に限定されないが、例えば、添加物を直接トロンボモジュリン含有溶液に添加する方法、またはあらかじめ添加物を水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解して添加する方法などが挙げられる。
また、例えば製剤化工程においては、シリンジや、アンプルまたはバイアルに、水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液１ｍｌ当たりトロンボモジュリンを０．０５ｍｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ以上、特に好ましくは１ｍｇ以上添加することが好ましい例として挙げられる。トロンボモジュリンの添加量の上限としては特に限定されないが、例えば、１５ｍｇ以下、好適には１０ｍｇ以下、特に好ましくは６ｍｇ以下が例示される。これら濃度のトロンボモジュリン及び上記添加物を含有する溶液を、例えば０．３〜１０ｍｌ無菌状態において充填し、常法により水溶液注射用製剤として調製できる。先ず容器を滅菌するためには、常法、例えば、乾熱滅菌、オートクレーブ、γ線滅菌を考慮して採用すればよく、乾熱滅菌としては、例えば２５０℃以上で３０分間以上、オートクレーブとしては、例えば１２１℃２０分間以上、γ線滅菌としては、例えば２０〜６０ｋＧｙ（キログレー）の照射量のγ線を照射する方法が挙げられる。滅菌に際しては、ガラス製のアンプルやバイアルは、乾熱滅菌を採用することが普通であり、またバイアルのゴム栓については、オートクレーブを採用することが普通である。シリンジについてはオートクレーブを使用することもできるが、通常は、γ線滅菌を採用することが普通である。また、容器に充填するトロンボモジュリン水溶液は、通常、０．２２又は０．２ミクロンの濾過滅菌用のフィルターで濾過することが好ましい。滅菌した容器に滅菌濾過したトロンボモジュリン水溶液を無菌条件下で充填して、本発明の注射剤が調製される。この注射剤は、フィルムや箱に包装されていることも好ましい。
本願発明の水溶液注射用製剤としては、前述の通り、好ましくはプレフィルドシリンジが例示され、バイアルあるいはアンプルであってもよく、特にアンプルを用いる場合には、市販されているサルファ処理アンプルを用いることが好ましい。サルファ処理アンプルとは、ＳＯ２ガスを接触させるか、または好ましくは硫酸アンモニウム水溶液を吹きつけた後、加熱処理して作成される。通常、１〜１０％の硫酸アンモニウム水溶液を吹きつけた後、６３０〜７００℃で加熱処理する方法が例示される。通常、これらは使用する前に、アンプル洗浄機等により、水を付加した状態で超音波処理後水洗浄し、ついで、乾燥滅菌のために３００〜３５０℃程度で数分間加熱せしめることにより使用されるものである。
また、本発明の第二の態様である、有効量の可溶性トロンボモジュリンと、ｐＨ５以上、７．０以下の間において緩衝能を有する緩衝液成分とを含有し、ｐＨがｐＨ５以上７．０以下であるトロンボモジュリン水溶液が、実質的な空隙部を存在せしめないようにシリンジ容器に無菌充填されているプレフィルド製剤であることを特徴とするトロンボモジュリン水溶液注射剤を液状で長期に貯蔵・流通せしめることからなる方法に関して説明すると、以下の通りである。
可溶性トロンボモジュリンや緩衝液成分、およびトロンボモジュリン水溶液注射剤についての定義は、前述と同様である。
本発明におけるシリンジ容器としては、市販されている注射用シリンジを利用することが好ましいが、通常は、内径（直径）約８．６ｍｍ、約６．３ｍｍ、約４．６ｍｍ等のプレフィルドシリンジ用のシリンジ容器が例示される。トロンボモジュリン水溶液の充填量により選択されるが、振盪安定性の点からは、約４．６ｍｍのシリンジ容器が最も好ましく、約６．３ｍｍのシリンジ容器も十分に好ましい。約８．６ｍｍのシリンジ容器においては、空隙部割合を５０％以下とする配慮が必要となり、結局、約８．６ｍｍ以下のシリンジ容器においては、空隙部割合を５０％以下とすれば振盪安定性が確保される。
容器の形状や内径によっては、該トロンボモジュリン水溶液注射剤は、その表面張力により、実質的に振盪されないことがある。本発明で振盪可能部位とは、２５℃で振幅５ｃｍ、１８０往復／分の振盪条件において、振盪により該トロンボモジュリン水溶液注射剤が移動し、実質的に振盪され得る実質的な容器の部位を言い、空隙部割合とは、容器の振盪可能部位の容積から容器の振盪可能部位に存在するトロンボモジュリン水溶液の存在量を差引いた空隙容積を、容器の振盪可能部位の容積で除した百分率を意味する。振盪可能部位のトロンボモジュリン水溶液の存在量は、例えば、トロンボモジュリン水溶液を充填した容器を、上記の振盪条件にて２分間振盪後上下左右の種々の方向を鉛直線方向に保持したまま５秒静置後に容器の下方に移動している溶液量を確認、測定する実験を繰り返すことにより、振盪可能、即ち移動可能な溶液の存在量が確認できる。また同時に振盪可能部位の確認ができ、その容積を算出すればよい。勿論、容器の形状が単純なシリンジにおいては、振盪可能部位は、シリンジおよびストッパー（及びキャップ）により囲まれたスペース自体である。特に、約４．６ｍｍのシリンジ容器においては実質的な振盪がなされず、特に空隙部割合を考慮する必要はない。
通常は、キャップの付いたシリンジ容器に、通常の手法により水溶液注射剤を充填した後、ストッパーを打栓するが、打栓方法としては、真空打栓や、ベントチューブ方式（或いはスリーブ方式）を採用することができる。
上述の真空打栓等により打栓する際には、比較的容易に、空隙部割合を例えば１５％以下とすることができる。したがって、本発明において、実質的な空隙部を存在せしめないとは、典型的には空隙部割合が１５％以下の場合が好ましい例として理解される。また、空隙部割合が１０％以下である場合も好ましく、また５％以下である場合も好ましい。皮下注射や筋肉注射に適したプレフィルドシリンジ用のシリンジ容器（通常は数ｍｌ、好ましくは２ｍｌ以下、さらに好ましくは１ｍｌ以下、特に好ましくは０．５ｍｌ以下）、例えば少なくとも約８．６ｍｍ以下の内径を有するシリンジ容器においては、上述の空隙部割合とすれば、振盪安定性に優れたプレフィルドシリンジ製剤が容易に調製される。
また、上記のシリンジ容器の他に、界面活性剤の添加を考慮すると、バイアルやアンプルを容器として用いることができる。通常のバイアルやアンプルは、内径が比較的大きいものであり、空隙部割合を低下させたり、調整することが比較的困難であるため、空隙部割合を厳密に調節する必要がある場合には避ける方が無難である。
かくして得られる水溶液注射剤は、長期安定性として、５℃で少なくとも１２ヶ月、好ましくは１８ヶ月約８０％以上の力価を保持できるものであって、その他の条件が整えば場合によっては、２年間、好ましくは３年間まで貯蔵・流通できる場合も想定される。
また、２５℃で振幅５ｃｍ、１８０往復／分、１ヶ月間の振盪条件においても白濁を生ずることがないものである。これらの十分な安定性を有する本発明の水溶液注射剤は、液状において長期に貯蔵・流通することができる。
本発明の貯蔵・流通は、トロンボモジュリン水溶液注射剤が凍結しない温度以上、室温以下であり、具体的には、０℃より高く、２０℃以下であることが例示され、好ましくは５℃前後が例示される。期間は、温度等の条件によるが、通常１２ヶ月、好ましくは１８ヶ月、更に好ましくは２年間程度が例示される。
また、本発明においては、皮下投与又は筋肉注射に用いる用いる場合も提供される。すなわち、本発明の第四の態様としては、前述のプレフィルドシリンジ製剤を皮下投与用又は筋肉注射用に用いるものである。
また、本発明の第五の態様としては、可溶性トロンボモジュリンを有効成分とする水溶液注射剤であって、１回／２〜５日の間隔で皮下又は筋肉注射するための持続性製剤を用いことを特徴とする可溶性トロンボモジュリンの血中濃度を持続させる方法である。
また、本発明の第六の態様としては、可溶性トロンボモジュリンを有効成分とする水溶液注射剤であって、１回／２〜５日の間隔で皮下又は筋肉注射するための持続性製剤である。
トロンボモジュリンはもともと血管内皮細胞表面に存在するものであり、またその作用部位は血管内であることから、トロンボモジュリンを投与する場合には、静脈注射で行なうことが直接的であり、従来より最も好ましいと信じられていた。例えば、特開昭６４−６２１９号公報には点滴静注の例が記載されている。
しかしながら、患者の容体や利便に合わせた選択肢となり得る他の便利な従来にない製剤等の開発は必要である。
これまでの報告や発表では、トロンボモジュリンが静脈投与以外の投与により積極的に使用されることは必ずしも明確ではなかったが、本発明者らが確認したところ、配列番号１の１９−５１６位のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン（配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリン）を皮下投与すると、可溶性トロンボモジュリンの血中濃度が確認されるばかりでなく、特に配列番号１の３６７−４８０位のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリンに比べても、血中のこのトロンボモジュリン濃度が著しく持続することがはじめて確認された。
したがって、本発明によれば、好ましい持続性製剤が提供される。
この持続性製剤には、さらに、局部麻酔剤を含有せしめることも好ましい。または防腐剤を含有せしめることも好ましい。
この局部麻酔剤として、塩酸プロカインまたはベンジルアルコールが好ましい例として挙げられる。局部麻酔剤の添加量は、通常、注射液量の０．５〜１０％、好ましくは１〜５％が例示される。
さらに必要に応じて、特開平６−３２１８０５号公報、特開昭６４−６２１９号公報等に開示される通り、アミノ酸、塩類、糖質、界面活性剤、アルブミン、ゼラチン等を添加しても良いし、また、防腐剤を添加することも好ましく、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類が好ましい例として挙げられ、パラオキシ安息香酸エチルやパラオキシ安息香酸メチル、又はパラオキシ安息香酸エステル類の混合物が特に好ましい例として挙げられる。防腐剤の添加量は、通常０．０１〜１．０％が例示され、好ましくは０．１〜０．３％が挙げられる。
本発明の持続性製剤に用いる可溶性トロンボモジュリンとしては、可溶性トロンボモジュリンであれば全て使用可能であって、特に限定されないが、例えば、配列番号１の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号２の１９−５１６のアミノ酸配列からなる可溶性トロンボモジュリン、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリン、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして得られる可溶性トロンボモジュリンのいずれかの可溶性トロンボモジュリンが好ましい例として挙げられる。
本発明の持続性としては、例えば血中濃度半減期（Ｔ１／２）が１６時間以上であることや、平均血漿滞留時間（ＭＲＴ）が３６時間以上であることが好ましい例として挙げられる。
本発明の持続性製剤としては、注射液の形態で提供されることが好ましい。本発明の持続性製剤としては、凍結乾燥製剤を使用時に溶解して使用する形態で提供されることも考慮されるが、前述のトロンボモジュリン水溶液注射剤が無菌充填されたプレフィルドシリンジ製剤をそのまま皮下用、又は筋肉内注射剤として用いることが、極めて都合がよい。
本発明の持続性製剤を調製するに際して、これら添加物の添加方法は特に限定されない。添加物を直接トロンボモジュリン含有溶液に添加したり、またはあらかじめ添加物を水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解して互いに添加混合する方法にて溶液を調製する。例えば、シリンジ、またはバイアル、場合によってはアンプルに、水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液１ｍｌ当たり０．０５〜１５ｍｇ、好適には０．１〜６ｍｇのトロンボモジュリン及び上記添加物を含有する溶液を、例えば０．５〜１０ｍｌ充填し、そのままに水溶液注射用製剤として調製するか、バイアルやアンプルにおいては凍結乾燥することもできる。通常この持続性製剤には、可溶性トロンボモジュリンを０．０１〜１００ｍｇ含有させることが挙げられる。
本発明のトロンボモジュリン水溶液注射剤あるいは持続性製剤の投与回数は、通常の如く、１日１〜３回投与としてもよいが、例えば１回／２〜５日投与として投与することもできる。特に皮下注射や筋肉注射の場合には、持続性であるために、例えば１回／２〜５日投与として投与することが特に好ましい。血管注射の場合の１回の投与量としては、点滴静注で最大量を投与する例も挙げられるが、血管内へのワンショット投与における１回の投与量としては、通常は、可溶性トロンボモジュリンとして１ｍｇ／ｋｇ（体重）以下が例示される。最低量としては、通常、０．００１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、好ましくは０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が例示される。皮下注射や筋肉注射の場合の１回の投与量は、皮下注射や筋肉注射ができる液量に溶解し得る量が上限となる。皮下注射や筋肉注射に適した液量としては、通常は数ｍｌ、好ましくは２ｍｌ以下、さらに好ましくは１ｍｌ以下、特に好ましくは０．５ｍｌ以下が例示される。したがって、皮下注射や筋肉注射の場合の１回の投与量としては、可溶性トロンボモジュリンとして２０ｍｇ以下が通常であり、最低量は上記と同様に０．００１ｍｇ／ｋｇ（体重）以上、好ましくは０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）以上が例示される。
本発明の持続性製剤は、皮下に投与しても、筋肉内に投与しても、同様に持続性が発揮されるが、特に皮下投与が好ましい。
本発明によれば、著しく血中濃度持続時間を延長させることが可能であり、投与回数を減少させることができるとともに、静脈注射剤に比べて少量で有効な可溶性トロンボモジュリン製剤を提供することが可能となる。患者の注射時の痛みを軽減させ、場合によれば、自己注射も可能となるものであり、患者の通院等の利便が著しく貢献するものである。
さて、本発明の可溶性トロンボモジュリン水溶液注射剤の急性毒性を調べたところ、各群５匹の雌雄ＳＤラットを用いて、トロンボモジュリン量として１８０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与しても死亡例は１例も見られなかった。また１８０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射を行なった際も死亡例は１例も見られなかった。
配列表フリーテキスト
配列番号１の他の情報は、ヒトトロンボモジュリンの部分的なアミノ酸配列である。
配列番号２の他の情報は、ヒトトロンボモジュリンの部分的なアミノ酸配列である。
配列番号３の他の情報は、ヒトトロンボモジュリン遺伝子の部分的な塩基配列である。
配列番号４の他の情報は、ヒトトロンボモジュリン遺伝子の部分的な塩基配列である。
配列番号５の他の情報は、変異用の合成ＤＮＡである。
実施例
以下、実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
参考例１
実施例に用いる可溶性トロンボモジュリンは、前記山本らの方法（特開昭６４−６２１９号公報の実施例１０に記載の方法）に従って行った。すなわち配列番号３のＤＮＡを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで、形質転換細胞とし、この細胞の培養により可溶性トロンボモジュリンの生産を行った。
参考例２
強陰イオン交換樹脂カラムによる粗精製
参考例１で取得した−２０℃凍結培養上清１１Ｌを溶解し、０．２μｍのメンブレンフィルター（ミリポア社、ミリパック２０）で濾過した。
濾過した培養上清については、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社）カラム（直径９０ｍｍ、高さ６．５ｃｍ）に供した。次に１８０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸塩緩衝液で洗浄し、更に１８０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄を行ない、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりからの０．５カラムボリューム容量の溶出液を粗精製品として取得した。
参考例３
アフィニティーカラム（トロンビンカラム）による主精製
参考例２で得られた溶出画分４００ｍｌを１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析した。透析後、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロース（ＰＡＥＳＥ  ＬＯＲＥＩ社、０６−１４８−１０３５、直径５０ｍｍ、高さ６ｃｍ）に供した。２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、１．０Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を主精製品として取得した。
参考例４
アフィニティーカラム（抗体Ｂ）による主精製
アフィニティーカラムは以下のように作製した。即ち、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体Ｂは、その抗体を産生するハイブリドーマを培養することにより得た培養上清、あるいは、ハイブリドーマを組織適合性動物、ヌードマウス等の腹腔内にて増殖させて得た腹水より、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラム等の分離精製操作により精製した。次に、ファルマシア社のマニュアル（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｍｅｔｈｏｄｓ）に従い、精製抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体Ｂを０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ファルマシア社、５２−１１５３−００−ＡＩ）と接触反応させ、セファロース４Ｂに抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体Ｂをカップリングし、抗トロンボモジュリンモノクローナル（抗体Ｂ）結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを作製した。次いでこの抗トロンボモジュリンモノクローナル（抗体Ｂ）結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂをカラムに充填しモノクローナル（抗体Ｂ）カラムを作製した。
参考例２で得られた溶出画分４００ｍｌを、１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したモノクローナル抗体（抗体Ｂ）カラム（直径５０ｍｍ、高さ６ｃｍ）に供した。１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）を流し、更に１００ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）を流し洗浄し、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を主精製品として取得した。
参考例５
強陽イオン交換樹脂カラムによる高純度精製
１．トロンビンカラム溶出液の精製（ＳＰ非吸着画分）
参考例３で得られた溶出液２００ｍｌに１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を加え希釈した液を、次に１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）でｐＨ３．５に調製した。この希釈ｐＨ調製した溶出液を３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３．５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社）カラム（直径２６ｍｍ、高さ３ｃｍ）に供した。３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（同上）で洗浄を開始し、洗浄液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの洗浄液を得、直ちに５００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、中和した洗浄液を高純度精製品として取得した。
２．モノクローナル抗体カラム溶出液の精製（ＳＰ非吸着画分）
参考例４で得られた溶出液１８０ｍｌを１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）にてｐＨ３．５に調製した液を、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（同上）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社）カラム（直径２６ｍｍ、高さ３ｃｍ）に供した。３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（同上）で洗浄を開始し、洗浄液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの洗浄液を得、直ちに５００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、中和した洗浄液を高純度精製品として取得した。
３．トロンビンカラム溶出液の精製（ＳＰ吸着画分）
参考例３で得られた溶出液２００ｍｌに１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を加え希釈した液を、次に１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）でｐＨ３．５に調製した。この希釈、ｐＨ調製した液を、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社）カラム（直径２６ｍｍ、高さ３ｃｍ）に供した。１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で洗浄し、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を得、直ちに５００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、中和した溶出液を高純度精製品として取得した。
４．抗体カラム溶出液の精製（ＳＰ吸着画分）
参考例４で得られた溶出液１８０ｍｌに１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を加え希釈した液を、次に１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）でｐＨ３．５に調製した。この希釈、ｐＨ調製した液を、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社）カラム（直径２６ｍｍ、高さ３ｃｍ）に供した。１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で洗浄し、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリジン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を得、直ちに５００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、中和した溶出液を高純度精製品として取得した。
参考例６
ポリスルフォン中空糸による高純度精製品の濃縮
参考例５で得られた高純度精製品をそれぞれ、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で湿潤化した１ｍのポリスルフォン中空糸（旭化成工業社製）を用い濃縮し、それぞれ５ｍｌの濃縮液を取得した。
参考例７
ゲル濾過カラムによる高純度精製品の緩衝液交換
参考例６で得られたそれぞれの濃縮液５ｍｌを、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したそれぞれのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（ファルマシア社、直径１６ｍｍ、高さ９０ｃｍ）に供した。５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で展開し分画した。各画分は測定法１のトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する活性の測定法方により活性の確認を行ない活性画分を回収し緩衝液交換した高純度精製品を取得した。
以下の実施例及び比較例では、参考例２、４、５の２、６、７の順により精製したトロンボモジュリン高純度精製品を用いた。また、緩衝液成分の濃度を調整する場合やリン酸ナトリウム緩衝液以外の緩衝液成分を用いる場合には、上記で得られた高純度精製品を各緩衝液に対して透析して緩衝液成分を交換した。さらに、適当な濃度の緩衝液を添加することでトロンボモジュリン濃度を調整した。ｐＨの調整は薄めた塩酸あるいは水酸化ナトリウム水溶液を適量添加することで行った。
取得されたトロンボモジュリンは、注射用蒸留水に少なくとも６ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶であることが確認された。また、以下の分子量の測定により、６．６万±１万（非還元状態）であることが確認された。
分子量の測定
電気泳動用グラジエントゲル（ＳＤＳポリアクリルアミド濃度勾配ゲル、商品名：パジェル  ５／２０％、アトー社製、ゲルサイズ  ９０×７３×１．０ｍｍ）にて、非還元状態において、２５℃、２０ｍＡの定電流で約９０分間泳動を行い、分子量標準物質〔ファルマシア社製、低分子電気泳動用キット：１バイアル中に、フォスフォリラーゼｂ（分子量９４，０００）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００）、卵白アルブミン（分子量４３，０００）、カルボニルアンヒドラーゼ（分子量３０，０００）、トリプシンインヒビター（分子量２０，１００）、α−ラクトアルブミン（分子量１４，４００）及びショ糖を含む〕との比較により、トロンボモジュリンの分子量を測定した。染色はクマシーブリリアントブルー染色による。
参考例８
配列番号１の３６７−４８０位のアミノ酸からなる可溶性トロンボモジュリンを以下のように取得した。すなわち特開平５−２１３９９８号公報の実施例１−（１）−（ｂ）に記載の方法で取得したプラスミドを、実施例１−（２）に記載の方法に従って細胞へトランスフェクションし、実施例３−（３）に記載の方法に従って精製し、更に緩衝液交換して高純度精製品を取得した。
取得されたトロンボモジュリンは、注射用蒸留水に少なくとも６ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶であることが確認された。また、上記の分子量の測定により、２．５万±０．５万（非還元状態）であることが確認された。
緩衝液成分の濃度を調整する場合やリン酸ナトリウム緩衝液以外の緩衝液成分を用いる場合には、上記で得られた高純度精製品を各緩衝液に対して透析して緩衝液成分を交換した。さらに、適当な濃度の緩衝液を添加することでトロンボモジュリン濃度を調整した。ｐＨの調整は薄めた塩酸あるいは水酸化ナトリウム水溶液を適量添加することで行った。
参考例９
配列番号２の１９−５１６位のアミノ酸からなる可溶性トロンボモジュリンを以下のように取得した。すなわち、メソッド  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１００巻、第４６８頁（１９８３年）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従って、配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡ断片を、配列番号５に示された塩基配列を有する変異用合成ＤＮＡを用いて部位特異的変異を行い、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなし、以下参考例１〜７に準じて、上記のトロンボモジュリンを取得した。
取得されたトロンボモジュリンは、注射用蒸留水に少なくとも６ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶であることが確認された。また、上記の分子量の測定により、６．６万±１万（非還元状態）であることが確認された。
緩衝液成分の濃度を調整する場合やリン酸ナトリウム緩衝液以外の緩衝液成分を用いる場合には、上記で得られた高純度精製品を各緩衝液に対して透析して緩衝液成分を交換した。さらに、適当な濃度の緩衝液を添加することでトロンボモジュリン濃度を調整した。ｐＨの調整は薄めた塩酸あるいは水酸化ナトリウム水溶液を適量添加することで行った。
実施例１
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を０．２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプル（内径１２ｍｍ）に２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。このときの振盪可能部位における空隙部割合は約３５％であった。
実施例２
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を０．２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（商品名：ＨＣＯ−６０）を０．１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例４
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、更にＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）を０．１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例５
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２００ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例６
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらに、ＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．５に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例７
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらに、ＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例８
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例９
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．５に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１０
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１１
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を０．２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１２
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を０．２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．５に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１３
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を０．２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１４
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２００ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１５
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２００ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１６
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１７
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１８
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例１９
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２０
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを７．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２１
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を６．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．５に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２２
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２３
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．５に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２４
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２５
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、マロン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２６
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、コハク酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２７
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、グルタル酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２８
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酒石酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例２９
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、フマル酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３０
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リンゴ酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３１
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、プロピオン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３２
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、クエン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３３
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、プロピオン酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３４
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、グルタル酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３５
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、コハク酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３６
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酒石酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３７
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、フマル酸ナトリウム緩衝液が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３８
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、リンゴ酸ナトリウム緩衝液が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例３９
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例４０
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）を１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例４１
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、更にＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）を０．１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例４２
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（商品名：プルロニックＦ６８）を１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例４３
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）を０．１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例４４
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例４５
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例４６
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例４７
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例４８
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が２５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例４９
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５０
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５１
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５２
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が２５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５３
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５４
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５５
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が３０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５６
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が４０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５７
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が４０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５８
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が５０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例５９
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径４．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、０．５ｍｌシリンジ、針付）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６０
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径４．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、０．５ｍｌシリンジ、針付）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６１
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径４．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、０．５ｍｌシリンジ、針付）に０．３ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６２
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径４．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、０．５ｍｌシリンジ、針付）に０．３ｍｌ分注し、空隙部割合が３５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６３
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径４．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、０．５ｍｌシリンジ、針付）に０．３ｍｌ分注し、空隙部割合が５０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６４
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを５．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６５
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを５．５に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６６
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．５に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６７
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを７．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６８
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例６９
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２００ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７０
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７１
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７２
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２００ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７３
参考例７のトロンボモジュリン濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７４
参考例７のトロンボモジュリン濃度を０．３ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７５
参考例７のトロンボモジュリン濃度を３ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を６ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７６
参考例７のトロンボモジュリン濃度を６ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７７
参考例７のトロンボモジュリン濃度を３ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を６ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７８
参考例７のトロンボモジュリン濃度を６ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例７９
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８０
参考例７のトロンボモジュリン濃度を３ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を６ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８１
参考例７のトロンボモジュリン濃度を６ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８２
参考例７のトロンボモジュリン濃度を６ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリオキシエチレンヒマシ油（クレモフォールＥＬ）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８３
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８４
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、プロピオン酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８５
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、グルタル酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８６
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、コハク酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８７
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酒石酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８８
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、フマル酸ナトリウム緩衝液が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例８９
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、リンゴ酸ナトリウム緩衝液が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例９０
参考例９のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
実施例９１
参考例９のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
実施例９２
参考例８のトロンボモジュリン（配列番号１の３６７−４８０位のアミノ酸からなる）の濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例１
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例２
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例３
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を０．２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例４
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例５
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度が２００ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例６
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例７
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例８
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに、酢酸ナトリウム緩衝液濃度が２０ｍＭとなるように調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例９
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。このときの振盪可能部位における空隙部割合は３５％であった。
比較例１０
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
比較例１１
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が６０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
比較例１２
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径８．６ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌスタンダードタイプシリンジ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が７０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
比較例１３
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを７．３に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。
比較例１４
参考例９のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
比較例１５
参考例８のトロンボモジュリンの濃度を１ｍｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を２ｍｌ用アンプルに２ｍｌ分注して熔閉し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤を調製した。（空隙部割合：３５％）
試験例１
実施例１〜４及び比較例１〜４の水溶液注射用製剤を、下記測定法１により熱安定性に関する力価の残存率（残存力価％）を測定した。測定法１では、５０℃９６時間の保存後の力価が６６％以上であるものを適と判定した。なおアレニウスプロットによる予測から、５０℃９６時間の保存後の力価が６６％以上であるものは、５℃保存で８０％以上力価を保持している期間が３年と推定される。また、測定法２により振盪安定性試験に関する評価を行った。そして、測定法１と測定法２の測定結果のいずれにおいても満足すべき結果を得たものに対して、総合評価として、適、不適を判断した。その結果は、第１表に示した。
0004460762.tif 000002
即ち、リン酸ナトリウム緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液のいずれにおいても、ｐＨ６．０においては、熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であったが、ｐＨ７．３の比較例１では６６％以下であった。また、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、又は０．１％ＨＣＯ−６０の界面活性剤が併存した場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調製された。
＜測定法１＞    熱安定性試験（５０℃で９６時間加熱処理）
測定する水溶液注射用製剤を、５０℃で９６時間加熱処理を行い、以下の手順でトロンボモジュリン力価を測定し、熱処理せずに凍結保存していた試料の力価を１００％として、熱処理した試料の力価の残存率（残存力価％）を比較する。
トロンボモジュリン力価の測定は、トロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用（ＡＰＣアッセイ法）で測定する。すなわち、１００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭの塩化カルシウム、０．１％のウシ血清アルブミン（シグマ社）、０．２２５ＮＩＨＵのヒトトロンビン（シグマ社）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）３７．５μＬに、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用製剤から適宜調製した試料溶液５μＬ（但し、試料溶液５μＬ中のトロンボモジュリン量を、０．３５〜１．４ｎｇの範囲となるように適宜の希釈率で希釈する）を加えて３７℃で１５分静置し、約３００μｇ／ｍｌのウシプロテインＣ（ライフテクノロジーズ社）を７．５μＬ添加して３７℃で更に３０分静置し、プロテインＣを活性化させる。次に約１００μｇ／ｍｌのヘパリン（和光純薬工業社）と約６μｇ／ｍｌのアンチトロンビンＩＩＩ（ライフテクノロジーズ社）を含む液７．５μＬを添加して反応を停止させる。次に、合成基質（ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）１００μｇ／ｍｌを含む基質反応液５００μＬを添加し、３７℃で２０分間静置する。酢酸５０μＬを添加して基質切断反応を停止させる。反応液を蛍光光度計を用いて、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍで蛍光強度を測定し、生成した活性型プロテインＣ量を求め、更にトロンボモジュリン力価標準品との比較からトロンボモジュリン力価を計算する。
＜測定法２＞    振盪安定性試験（１８０往復／分の振盪処理）
測定する水溶液注射用製剤を、２５℃の恒温振盪機中にて、振幅５ｃｍ、１分間に１８０往復の条件で１ヵ月間振盪処理を行い、処理前後の外観変化を観察する。必要に応じて濁度（６５０ｎｍにおける吸光度）及びトロンボモジュリン力価の残存率を測定する。なお、振盪方向は、容器の長軸と平行方向とする。トロンボモジュリン力価の測定法は、測定法１と同一の測定法による。
試験例２
実施例３、５〜１３、及び比較例１の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１および測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第２表に示した。
0004460762.tif 000003
即ち、酢酸ナトリウム緩衝液の濃度を０．２〜２００ｍＭの広い濃度範囲で振ったが、緩衝液濃度による影響はなく、ｐＨを５．０〜６．０の範囲にすれば、熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であった。また、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が併存した場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調製された。
試験例３
実施例１４〜１９及び比較例５〜７の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１および測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第３表に示した。
0004460762.tif 000004
即ち、リン酸ナトリウム緩衝液の濃度を２〜２００ｍＭの広い濃度範囲で振ったところ、ｐＨ７．３では緩衝液濃度による影響があり、濃度が濃くなるほど力価の低下が見られて６６％を下回ったが（比較例５〜７）、ｐＨを５．０〜６．０の範囲にすれば、熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であった。また、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が併存した場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調製された。
試験例４
実施例２０〜２４及び比較例１、８の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１および測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第４表に示した。
0004460762.tif 000005
即ち、リン酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液の濃度を共に２０ｍＭに調整し、ｐＨを５．０〜７．３で振ったところ、ｐＨが５．０〜７．０の範囲では、熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であった。ｐＨを５．５〜６．５の範囲にすれば、熱安定性における残存力価は７３％以上であり、これは５℃保存で８０％以上力価を保持している期間が４年と推定された。特にｐＨ５．５及び６．０での残存力価は８０％以上と高かった。一方ｐＨ７．３では６６％を下回った（比較例１、８）。また、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が併存した場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調製された。
試験例５
実施例２５〜３２及び比較例１、２の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１および測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第５表に示した。
0004460762.tif 000006
即ち、緩衝液成分を２０ｍＭの各種カルボン酸塩に変えても、ｐＨを６．０に調整すれば、熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であった。また、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が併存した場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調製された。
試験例６
実施例３３〜３８及び比較例１、２の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１および測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第６表に示した。
0004460762.tif 000007
即ち、リン酸ナトリウム緩衝液に、各種カルボン酸塩の緩衝液成分を加えても、ｐＨを６．０に調整すれば、熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であった。また、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が併存した場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調製された。
試験例７
実施例１８、３９〜４３、４４及び比較例９の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１および測定法２の測定を行った。その結果は、第７表に示した。
0004460762.tif 000008
即ち、界面活性剤の種類と濃度を振って振盪安定性を測定したところ、界面活性剤なしでは外観が白濁した（比較例９）のに対し、界面活性剤入りでは、白濁が防止された。界面活性剤濃度は、商品名：Ｔｗｅｅｎ８０は０．１％で、商品名：ＨＣＯ−６０及び商品名：プルロニックＦ６８は０．１％で充分効果があった。また食塩の影響はなかった。
試験例８
実施例４５〜６３及び比較例１０〜１２の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１及び測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第８表に示した。
0004460762.tif 000009
即ち、振盪可能部位における空隙部割合を５０％以下とした場合には、振盪安定性において白濁を生ずることがなかったが、６０％の比較例１１、７０％の比較例１２では振盪によって白濁が生じた。また、ｐＨを６．０とした場合には、熱安定性における残存力価は６６％以上となり、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調整された。
試験例９
実施例４６、６４〜７２及び比較例１０の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１及び測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第９表に示した。
0004460762.tif 000010
即ち、リン酸ナトリウム緩衝液あるいは酢酸ナトリウム緩衝液の濃度を２〜２００ｍＭの広い濃度範囲で緩衝液濃度による影響はなく、ｐＨが５．０〜７．０の範囲にすれば、熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であった。また、空隙部割合を１０％とした場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射用製剤が調製された。
試験例１０
実施例４６、７３〜８２、９０〜９２及び比較例１３〜１５の水溶液注射用製剤について、前述の測定法１及び測定法２の測定を行い、同様に総合評価を行った。その結果は、第１０表に示した。
0004460762.tif 000011
即ち、少なくとも０．１〜６ｍｇ／ｍｌの範囲で、トロンボモジュリン濃度による影響はなく、ｐＨを６．０に調整すれば熱安定性における残存力価はすべて６６％以上であった。また、空隙部割合を１０〜１５％とした場合に、振盪安定性において白濁を生ずることがなく、総合評価が「適」である水溶液注射剤が調製された。
比較例１４によれば、参考例９の可溶性トロンボモジュリンにおいても振盪安定性の問題が存在することが確認され、実施例９０、９１の結果によれば、参考例９の可溶性トロンボモジュリンにおいても、本発明の構成により、熱安定性および振盪安定性に優れた水溶液注射剤が調製されることが確認された。
参考例８の可溶性トロンボモジュリンを用いた実施例９２において、熱安定性および振盪安定性に優れた水溶液注射剤が調製された。
試験例１１
実施例１、３、７９〜８２及び比較例６、１３の水溶液注射用製剤について、下記測定法３により加速安定性（２０℃保存）に関する残存力価を測定した。その結果は、第１１表に示した。
0004460762.tif 000012
即ち、２０℃６ヵ月保存後、比較例６では５２．４％まで、比較例１３では６３．２％まで力価が低下したが、実施例１、３、７９〜８２は有意に安定であった。
＜測定法３＞    加速安定性試験（２０℃で６ヵ月間保存）
測定する水溶液注射用製剤を、２０℃で６ヵ月間保存し、トロンボモジュリン力価の残存率を測定する。トロンボモジュリン力価は、測定法１と同様に測定する。
試験例１２
実施例１、３の水溶液注射用製剤について、下記測定法４により長期安定性（５℃保存）に関する残存力価を測定する。トロンボモジュリン力価は測定法１と同様に測定する。その測定結果は、第１２表に示した。
0004460762.tif 000013
実施例１、３は５℃、９ヵ月保存後も力価の低下見られなかった。
＜測定法４＞    長期安定性試験（５℃で９ヵ月間保存）
測定する水溶液注射用製剤を、５℃で９ヵ月間保存し、トロンボモジュリン力価の残存率を測定する。トロンボモジュリン力価は試験例１と同様に測定する。
試験例１３
９〜１０週齢のＳＤ系雄性ラット（日本チャールス・リバー社）の尾静脈あるいは背部皮下に、下記被験液または製剤を投与し、経時的に採血を行った。
１．静脈内注射用被検液：
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌの各濃度に、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを７．４に調整し、静脈内注射用被検液とした。投与量は第１３表に示した通りである。
２．皮下注射用被検液Ａ：
参考例７のトロンボモジュリンの濃度を１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌの各濃度に、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１０ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％、局方ベンジルアルコールを４０ｍｇ／ｍｌ、パラオキシ安息香酸メチルを０．３％となるように添加した後、ｐＨを７．４に調整し、皮下注射用被検液Ａとした。投与量は第１３表に示した通りである。
３．皮下注射用被検液Ｂ：
参考例７のトロンボモジュリン濃度を１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌの各濃度に、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を１０ｍＭに調整し、更にＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％、局方塩酸プロカインを４０ｍｇ／ｍｌ、パラオキシ安息香酸メチルを０．３％となるように添加した後、ｐＨを７．４に調整し、皮下注射用被検液Ｂとした。
４．皮下注射用投与製剤Ｃ：
参考例７のトロンボモジュリン濃度を２５０μｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭとなるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ、針なし）に１ｍｌ分注し、空隙部割合が１０％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。この製剤に、プランジャーロッド（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ用、組成：ポリプロピレン）と注射針（テルモ社製、２６Ｇ×１／２”）を装着し、皮下注射用投与製剤Ｃとした。
５．皮下注射用投与製剤Ｄ：
参考例７のトロンボモジュリン濃度を２５０μｇ／ｍｌに、リン酸ナトリウム緩衝液濃度を２ｍＭに調整し、さらにＮａＣｌを１５０ｍＭ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）を０．０１％となるように添加した後、ｐＨを６．０に調整した。この薬液を、先端部にキャップ（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を装着した内径６．３ｍｍのガラス製シリンジ（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプ、針なし）に０．５ｍｌ分注し、空隙部割合が１５％となるように真空度を調整してストッパー（ウエスト社製、基本組成：ブロモブチルゴム）を真空打栓し、トロンボモジュリンを含有する水溶液注射用プレフィルドシリンジ製剤を調製した。この製剤に、プランジャーロッド（ベクトン・ディッキンソン社製、１ｍｌロングタイプシリンジ用、組成：ポリプロピレン）と注射針（テルモ社製、２６Ｇ×１／２”）を装着し、皮下注射用投与製剤Ｄとした。
0004460762.tif 000014
各時点の血漿中の可溶性トロンボモジュリン濃度を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にて測定し、その値を第１図に示した。本測定法としては、固相化抗体としてＲ４Ｂ６を、標識抗体としてＲ４Ｄ１を組み合わせたＥＬＩＳＡによる公知の濃度測定法を実施して行なった（特開平６−２０５６９２号公報）。血漿中濃度推移より求めた薬物速度論的パラメータを第１４表に示した。
0004460762.tif 000015
第１４表に示すように、皮下注射用被検液Ａでは、いずれの投与量においてもＭＲＴ（平均滞留時間）は皮下投与の方が静脈内投与よりも大きく、加えて第１図から明らかなように、皮下投与が静脈内投与に比べて著しく血中濃度持続時間が長いことが判明した。また皮下投与によりＴ１／２が１６時間以上に持続され得ることが確認された。
皮下注射用被検液Ｂ、および皮下注射用投与製剤Ｃ、Ｄの各投与群においても、皮下注射用被検液Ａとほぼ同じ結果が得られた。これらのことより皮下投与経路は従来の静脈内投与経路に比べて有効な治療レベルを維持するための血中濃度の維持がなされることが確認された。また、皮下投与時のＢＡ（生物学的利用率）値はいずれの用量においても５０％以上であり、良好な吸収が認められた。
皮下投与する薬剤のｐＨを３．０〜７．４としたが、特に血中濃度に変化は見られなかった。また、薬剤のイオン強度を変化させた（ＮａＣｌ濃度を０〜４．８％）が、特に血中濃度に変化は見られなかった。
【配列表】
0004460762.tif 000016
0004460762.tif 000017
0004460762.tif 000018
0004460762.tif 000019
0004460762.tif 000020
0004460762.tif 000021
0004460762.tif 000022
0004460762.tif 000023
0004460762.tif 000024
【図面の簡単な説明】
第１図はラットへ可溶性トロンボモジュリンを投与した場合の血漿中可溶性トロンボモジュリン濃度の経時変化を示すものである。なお、ＩＶは静脈注射を示し、ＳＣは皮下注射を示すものである。
【図１】
0004460762.tif 000025