(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５または６に示すアミノ酸配列からなる、MEF2D蛋白質の一部とDAZAP1蛋白質の一部が結合してなるキメラ蛋白質。
【請求項２】
請求の範囲第１項記載のキメラ蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号５に示すアミノ酸配列のキメラ蛋白質をコードする遺伝子が配列番号３に示す塩基配列の遺伝子である、請求の範囲第２項記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号６に示すアミノ酸配列のキメラ蛋白質をコードする遺伝子が配列番号４に示す塩基配列の遺伝子である、請求の範囲第２項記載の遺伝子。
【請求項５】
検体中の請求の範囲第１項に記載のキメラ蛋白質を検出することにより、当該検体提供者の前駆B細胞急性リンパ性白血病を判別する、キメラ蛋白質の検出方法。
【請求項６】
キメラ蛋白質の検出方法において、検体中の上記キメラ蛋白質を、エンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降/イムノブロット法、または、免疫細胞化学染色法を用いて検出する、請求の範囲第５項記載のキメラ蛋白質の検出方法。
【請求項７】
検体中の請求の範囲第１項に記載のキメラ蛋白質の検出を、MEF2D蛋白質の一部に対して特異的な抗体とDAZAP1蛋白質の一部に対して特異的な抗体のセット、を用いて行う、請求項第５項又は第６項に記載のキメラ蛋白質の検出方法。
【請求項８】
検体中の請求の範囲第２項に記載のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を検出することにより、当該検体提供者の前駆B細胞急性リンパ性白血病を判別する、遺伝子の検出方法。
【請求項９】
前記遺伝子が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または、mＲＮＡである、請求の範囲第８項記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
キメラ蛋白質をコードする遺伝子の検出方法において、検体中の当該遺伝子を、DNAチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムRT-PCR法、インベーダー法、FISH法、または、CGH法を用いて検出する、請求の範囲第８項記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
検体が血液検体である、請求の範囲第５項から第１０項のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
ａ）MEF2ファミリー蛋白質と請求の範囲第１項に記載のキメラ蛋白質を共存させて、当該両蛋白質の結合量を定量し、ｂ）前記ａ）の定量系において、MEF2ファミリー蛋白質と前記キメラ蛋白質が接触する際または事前に被験物質を共存させた場合の当該両蛋白質の結合量を定量し、ｃ）前記ａ）におけるMEF2ファミリー蛋白質と前記キメラ蛋白質の結合量よりも、前記ｂ）における当該結合量が減少している場合に、前記被験物質を抗白血病物質としてスクリーニングする、被験物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
MEF2ファミリー蛋白質が、MEF2D蛋白質またはHDAC４蛋白質である、請求の範囲第１２項記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
MEF2ファミリー蛋白質と前記キメラ蛋白質を細胞内で共存させ、被験物質を細胞外に添加する、請求の範囲第１１項または第１３項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
MEF2ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだベクター、および、請求の範囲第２項に記載のキメラ蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを含む、請求の範囲第１４項のスクリーニングに用いるためのスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ａｃｕｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＬＬともいう）の詳細な判別を可能とする新規のキメラ蛋白質と当該キメラ蛋白質をコードする遺伝子、さらには、当該キメラ蛋白質や遺伝子を用いるＡＬＬの判別を可能とする検出方法に関する発明である。
【背景技術】  急性白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ：Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、急性混合白血病、及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ：Ａｃｕｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）に分類される。ＡＬＬは前駆性（あるいはリンパ芽球性）悪性腫瘍である。前駆Ｂ細胞性ＡＬＬでは染色体転座に伴う遺伝子異常がその原因であり、これまでｔ（１；２２）；ＢＣＬ／ＡＢＬ、ｔ（ｖ；１１ｑ２３）；ＭＬＬ、ｔ（１；１９）；Ｅ２Ａ／ＰＢＸ１、並びにｔ（１２；２１）；ＴＥＬ／ＡＭＬ１等の転座が知られている。
最も一般的な小児白血病は、前駆Ｂ細胞の遺伝子異常に起因するＡＬＬであり、それは化学療法の予後が比較的良好である（Ｇｒｅａｖｅｓ，Ｍ．Ｆ．＆  Ｗｉｅｍｅｌｓ，Ｊ．：Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，３，６３９−６４９，２００３）。ＡＬＬの主なサブタイプは、１塩基変異及び欠失による遺伝子異常がその原因であるが、遺伝子のＨｙｐｅｒｄｉｐｏｉｄｙ及び染色体転座に伴う染色体全体の変化に起因するケースも多い。染色体転座は異なったクロモソーム上の遺伝子が近い位置に存在するようになり、しばしば両者のキメラ（或いは融合）遺伝子が再構成され、その結果、従来とは異なる転写制御下で融合ｍＲＮＡが発現し、異なった役割を有するハイブリッド蛋白質へと翻訳される。約２００以上の遺伝子が小児白血病の転座に関与していることが知られているが、その中である種の遺伝子は癌化に強く関与しているが、他の多くの遺伝子はまれにしか癌化に関与していない。
小児前駆Ｂ細胞ＡＬＬの最も一般的な共通した転座はｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）であり、通常クロモソーム１ｑ２３上のＰＢＸ１遺伝子とクロモソーム１９ｐ１３．３上のＥ２Ａ遺伝子間の融合が起こる。野生型Ｅ２Ａ遺伝子産物はＢ細胞の成熟に必須である。キメラ遺伝子Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１はＥ２Ａの転写活性化モチーフとＰＢＸ１のＤＮＡ結合ホメオドメインの融合蛋白質をコードしている。ＡＬＬの９５％以上のケースで同じＥ２Ａ−ＰＢＸ１融合遺伝子が検出されているが、まれな例ではあるが、該融合遺伝子が検出されない場合がある（Ｈｕｎｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．，Ｇａｌｉｌｉ，Ｎ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｃｒｉｓｔ，Ｗ．Ｍ．，Ｌｉｎｋ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｃｌｅａｒｙ，Ｍ．Ｌ：Ｔｈｅ  ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ２Ａ  ａｎｄ  ＰＢＸ１  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ，Ｂｌｏｏｄ，７７，６８７−６９３，１９９１；Ｉｚｒａｅｌｉ，Ｓ．，Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｊ．Ｗ．Ｇ．，Ｈａａｓ，Ｏ．Ａ．，Ｈａｒｂｏｔｔ，Ｊ．，Ｂｒｏｋ−Ｓｉｍｏｎｉ，Ｆ．，Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｊ．Ｕ．，Ｋｏｖａｒ，Ｈ．，Ｈｅｎｎ，Ｔ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｗ．Ｄ．，Ｒｅｉｔｅｒ，Ａ．，Ｒｅｃｈａｖｉ，Ｇ．，Ｂａｒｔｒａｍ，Ｃ．Ｒ．，Ｇａｄｎｅｒ，Ｈ．＆  Ｌｉｏｎ，Ｔ．：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，７，６７１−６７８，１９９３）。実際、初期の前駆Ｂ細胞ＡＬＬ、ＣＤ−３４陽性Ｂ細胞前駆ＡＬＬ、通常のＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、Ｂ細胞リンパ腫／白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で転座にＥ２Ａ遺伝子が関与していない例が報告されており、この事実はこれらの患者ではクロモソームｔ（１；１９）転座がＥ１Ａ遺伝子とＰＢＸ遺伝子の再配列に起因しないことを示している。
【発明の開示】
このように、ひとことでＡＬＬといっても、遺伝子レベルでは様々なタイプのものがあり得ることが判明しつつある。それにもかかわらず、一般的にＡＬＬに対して奏功率のよい治療法を画一的に行うのみでは、タイプの異なるＡＬＬの患者に対して奏功率の低い治療を行うことを黙認してしまうことになり、妥当とはいえない。
よって、本発明が解決すべき課題は、このようなタイプの異なるＡＬＬにおける遺伝子的な本質を明らかにし、本格的な治療前にＡＬＬの遺伝子レベルにおけるタイプを判別し得る検出手段を提供し、一人でも多くのＡＬＬ患者に対して、可能な限り適切な治療を施す機会を与えることにある。
本発明者は、この課題に応えるために、小児ＡＬＬの患者の末梢血から、常法を用いて樹立された前駆Ｂ細胞急性白血病細胞株（ただし、クロモソームｔ（１；１９）転座を有するが、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ融合遺伝子を生成しない：ＴＳ−２細胞）についての遺伝子レベルでの検討を行い、この細胞株において転座が起こっている場所を正確に突き止めた。すなわち、本発明者は、ＴＳ−２細胞では、クロモソーム１ｑ２２のＭＥＦ２Ｄ遺伝子と、クロモソーム１９ｐ１３．３のＤＡＺＡＰ１遺伝子の融合が起こっていることを解明した。さらに、このキメラ遺伝子のｍＲＮＡは、ＴＳ−２細胞と同様に、本細胞を分離した小児ＡＬＬ患者の骨髄細胞においても検出された。
よって、本発明者は、本キメラ遺伝子、または、これに基づいて産生されるキメラ蛋白質を指標にして、ＡＬＬの原因の詳細を分子レベルで判別することが可能であることを明らかにし、この知見を基とする本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部とＤＡＺＡＰ１蛋白質の一部が結合してなる、新規のキメラ蛋白質（以下、本キメラ蛋白質ともいう）を提供し、当該キメラ蛋白質をコードする新規のキメラ遺伝子（以下、本キメラ遺伝子ともいう）を提供する発明である。
さらに、本発明は、検体中の本キメラ遺伝子、または、本キメラ蛋白質を検出することにより、当該検体提供者の前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病を判別する、キメラ遺伝子及びキメラ蛋白質の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
１．本キメラ遺伝子とキメラ蛋白質
上述したように、本キメラ遺伝子は、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の一部とＤＡＺＡＰ１遺伝子の一部が融合してなるキメラ遺伝子である。ＭＥＦ２Ｄ遺伝子とＤＡＺＡＰ１遺伝子は、それぞれ公知のヒト遺伝子であり、その塩基配列等も登録されている（ＭＥＦ２Ｄ遺伝子：ＮＭ＿００５９２０（配列番号１）、ＤＡＺＡＰ１遺伝子：ＮＭ＿１７０７１１（配列番号２））。しかしながら、これらの遺伝子の融合遺伝子である、本キメラ遺伝子は、当該遺伝子を基に合成される本キメラ蛋白質の機能を含めて知られていない。
後述するように、本キメラ蛋白質は、細胞核に局在し、ＭＥＦ２ファミリーの蛋白質（ＨＤＡＣ４蛋白質等）とヘテロ２量体を形成することが判明した。本キメラ蛋白質はＭＥＦ２Ｄ蛋白質よりも強くＨＤＡＣ４蛋白質に結合する。本キメラ蛋白質はこの作用を介して標的とする遺伝子の転写活性化を促進させ、癌化を誘導していると推定される。
本キメラ遺伝子の具体的な配列は、１）配列番号３に示す塩基配列の本キメラ遺伝子（ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１融合遺伝子）と、これに対応する本キメラ蛋白質（配列番号５に示すアミノ酸配列）、並びに、２）配列番号４に示す塩基配列の本キメラ遺伝子（ＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ融合遺伝子）と、これに対応する本キメラ蛋白質（配列番号６に示すアミノ酸配列）を挙げることが可能である。
本キメラ蛋白質は、対象となるＡＬＬ患者の癌化細胞から単離精製して得ることも可能であるが、大量に必要な場合には、組換え体として得ることが極めて好適である。
かかる組換え本キメラ蛋白質を製造する基となる、本キメラ遺伝子は、上述のように、本発明により見いだされたキメラ遺伝子の塩基配列を用いて、常法により、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の遺伝子増幅法を、対象となるＡＬＬ患者の癌化細胞のｍＲＮＡを抽出して、これをＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）−ＰＣＲ法を用いて、所望する本キメラ遺伝子をｃＤＮＡとして得ることができる。
なお、対象となるＡＬＬ患者の白血病細胞は、常法を用いて容易に入手することができる。具体的には、例えば骨髄及び末梢血等より得ることができる。常法の表現型解析により、ＦＡＢ分類を用いて前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病細胞を同定する事ができる。Ｂ細胞系譜かどうかは表面マーカーのＣＤ１９の発現をモニタリングすることによりできる。詳細はＹｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｍ．，Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｅｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｍ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｙ．，Ｃｕｉ，Ｙ．，Ｓａｔｏ，．，Ｓａｉｓｈｏ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｎｏｈａｓａｍａ，Ｒ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｙ．，Ｋａｍａｄａ，Ｎ．＆  Ｉｉｎｕｍａ，Ｋ．：Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＴＳ−２）ｏｆ  ｐｒｅ−Ｂ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔ（１；１９）ｎｏｔ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅ２Ａ  ｇｅｎｅ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．，１０１，９５−１０２，１９９８に掲載されている。
さらに、ホスファイト−トリエステル法（Ｉｋｅｈａｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，５９５６（１９８４））等の通常公知の方法を用いて、本キメラ遺伝子を化学合成することも可能であり、これらの化学合成法を応用したＤＮＡシンセサイザーを用いて、本キメラ遺伝子を合成することもできる。この場合には、本キメラ遺伝子の１部分を有する複数のＤＮＡを合成し、それらをライゲーションにより繋ぎ合わせて、適当なベクターに挿入し、大腸菌をトランスフォームする事により本キメラ遺伝子を得る事ができる。
上述のようにして入手され得る本キメラ遺伝子を用いて、組換え本キメラ蛋白質を、一般的な遺伝子組換え技術に従って製造することができる。
より具体的には、本キメラ遺伝子が、発現可能な形態の遺伝子発現用ベクターに、本キメラ遺伝子を組み込み、この遺伝子発現用ベクターの性質に対応する宿主に、この組換えベクターを導入して、形質転換し、かかる形質転換体を培養等することにより、所望する本キメラ蛋白質を製造することができる。
ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通常、発現しようとする遺伝子の上流域に、プロモーター，エンハンサー等を、同下流域に転写終了配列等を保有するのが好適である。
また、本キメラ遺伝子の発現は、直接発現系に限らず、例えば、ヘキサヒスチジン遺伝子，グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子、マルトース結合蛋白質遺伝子や、チオレドキシン遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とすることも可能である。
遺伝子発現用ベクターとしては、例えば、宿主を大腸菌とするべきものとして、ｐＱＥ，ｐＧＥＸ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，ｐＮＴ２６ＣＩＩ等を例示することができる。また、宿主を枯草菌とするべきものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮＣ３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０等を例示することができる。
また、宿主を酵毋とするべきものとしては、ｐＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ１，ＹＥｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０等を例示することができる。
また、宿主を哺乳動物細胞又は昆虫細胞とするべきものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２ｄｈｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡＣＹＭ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡ１，ｐＶＬ１３９２／１３９３，ｐＡｃＨＬＴ−Ａ／Ｂ／Ｃ等を例示することができる。
なお、これらの既存の遺伝子発現用ベクターの他、目的に応じて適宜作出した遺伝子発現用ベクターを用いることも、勿論可能である。
本キメラ遺伝子を組み込んだ遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入及びこのベクターによる宿主の形質転換法としては、一般的な方法、例えば、宿主細胞が大腸菌や枯草菌である場合には、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等を；宿主細胞が哺乳動物細胞又は昆虫細胞である場合は、リン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法若しくはリポソーム法等を選択することができる。
このようにして得られる形質転換体を、常法に従い培養することにより、本キメラ蛋白質が培養系に蓄積される。
かかる培養において用いられる培地は、選択した宿主の種類に応じて適宜選択することが可能である。例えば、宿主が大腸菌である場合には、ＬＢ培地やＴＢ培地等が、宿主が哺乳動物細胞の場合には、ＲＰＭＩ１６４０培地等が適宜選択され得る。
上述のような形質転換体の培養によって得られる、培養物からの本キメラ蛋白質の単離及び精製は、常法に従って行うことが可能であり、例えば、培養物を、本キメラ蛋白質の物理的性質及び／又は化学的性質を利用した、各種の処理操作を用いて行うことができる。
具体的には、例えば、タンパク質沈澱剤による処理，限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラフィー，遠心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー，透析法等を、単独又は組み合わせて、本キメラ蛋白質の単離及び精製を行うことができる。
以上のようにして、本キメラ遺伝子と本キメラ蛋白質を得ることができる。本キメラ遺伝子は、本キメラ蛋白質を製造する基となる。また、本キメラ蛋白質は、本検出方法を行うために用いる抗体の免疫原として用いることも可能である。さらに、本キメラ遺伝子とキメラ蛋白質は、後述する、ＡＬＬに対する治療剤を開発するためのスクリーニング方法に用いることも可能である。
２．本キメラ蛋白質に対する抗体
本検出方法の態様によっては、本キメラ蛋白質に対する抗体を用いることが必要となる。
検出対象となる本キメラ蛋白質は、上述したように、ＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部と、ＤＡＺＡＰ１蛋白質の一部の融合蛋白質であり、本検出方法に用いることが可能な抗体としては、１）本キメラ蛋白質を構成する、ＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部およびＤＡＺＡＰ１蛋白質の一部に対して特異的な抗体、または、２）ＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部のみに対して特異的な抗体と、ＤＡＺＡＰ１の一部のみに対して特異的な抗体のセットが挙げられる。
これらの抗体は、本キメラ蛋白質を免疫原として製造した抗体から、所望する性質の抗体を選別することにより得ることができるが、予め、免疫原を特定の形態に限定して抗体を製造することが効率的である。
すなわち、ＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部のみに対して特異的な抗体と、ＤＡＺＡＰ１蛋白質の一部のみに対して特異的な抗体の免疫原は、それぞれ、当該キメラ蛋白質（ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１蛋白質とＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ蛋白質）を用いることが好適である。
これに対して、本キメラ蛋白質を構成する、ＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部およびＤＡＺＡＰ１蛋白質の一部に対して特異的な抗体は、少なくとも免疫原として、本キメラ蛋白質を構成するＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部およびＤＡＺＡＰ１蛋白質の一部の結合部（例えば、配列番号５の本キメラ蛋白質に対する抗体であれば２２２番目のグリシン、配列番号６の本キメラ蛋白質に対する抗体であれば１５５番目のグリシン）を含むオリゴペプチドであることが好適である。当該オリゴペプチドの鎖長は、概ね、２０〜５０アミノ酸程度であることが好適である。
本キメラ蛋白質に対する抗体がポリクローナル抗体である場合は、上記の免疫原（必要に応じて傘貝ヘモシアニン等のハプテンに結合させたものを含む）で免疫した動物に由来する免疫血清から製造することができる。
また、免疫動物と同種・同系統の動物由来の細胞株を、本キメラ遺伝子、または、その一部をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入して形質転換して、この形質転換細胞をその免疫動物に移植することにより、目的とするポリクローナル抗体を調製することができる。すなわち、形質転換細胞を移植した動物の体内で、持続的に本キメラ蛋白質がその形質転換細胞で作られ、それに対する抗体が産生されて、これを目的とするポリクローナル抗体とすることもできる（Ｎｅｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５，３００１（１９９５））。
さらに、本キメラ遺伝子を発現する発現ベクターを直接動物に筋注や皮下注等の手段で投与することにより、その動物内で本キメラ蛋白質を継続的に産生させて、上記の形質転換細胞を移植した場合と同様に目的とするポリクローナル抗体を製造することができる（Ｒａｚ，Ｅ．，ｅｌ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，９５１９（１９９４））。
一方、本キメラ蛋白質に対するモノクローナル抗体は、上記のポリクローナル抗体の場合と同様の方法で、免疫した動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、これにより本キメラ蛋白質を認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより製造することができる。
本キメラ蛋白質に対する抗体を製造するために免疫される動物は、特に限定されるものではなく、マウス，ラット等を広く用いることができるが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，腹腔内注射等で投与することにより行うことができる。
より具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に２〜１４日毎に上記手段により数回投与し、ポリクローナル抗体製造のための免疫血清又はモノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができる。
モノクローナル抗体を製造する場合、この免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ１１−４５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等を用いることができる。
上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））等に準じて行うことができる。
より具体的には、この細胞融合は、通常公知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行い、ハイブリドーマを調製する。
所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行うことができる。このようにして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
目的とするモノクローナル抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，擬集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検索法に従い行うことができる。
このようにして得られる本キメラ蛋白質を認識する所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
このハイブリドーマからの目的とするモノクローナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いることができる。
なお、インビトロで免疫細胞を本キメラ蛋白質又はその一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることで所望するモノクローナル抗体を得ることもできる（Ｒｅａｄｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，５３，２６１（１９８２）；Ｐａｒｄｕｅ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９６，１１４９（１９８３））。
また、上記で得られるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。
このようにして得られるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、本キメラ蛋白質に特異反応性を有する抗体である。
このようにして得られる抗体を、上記したような、具体的に用いる検出手段における必要に応じて標識物質で標識して用いることができる。
かかる標識物質は、その標識物質単独で又はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキシダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、１２５１，１４Ｃ，３Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。
これらの標識物質による抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いることができる。
また、本キメラ蛋白質に対するモノクローナル抗体（標識されたものを含む）を、不溶性担体に固定化した、固定化モノクローナル抗体として、本検出方法に用いることもできる。
かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性担体として既に用いられている各種の不溶性担体を用いることができる。具体的には、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体等が挙げられる。
これらの不溶性担体におけるモノクローナル抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体において既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができる。
このようにして、本検出方法に用い得る、本キメラ蛋白質に対するモノクローナル抗体を調製することができる。
３．本検出方法
上述したように、本検出方法は、検体中の本キメラ遺伝子、または、本キメラ蛋白質を検出することにより、当該検体提供者の前駆Ｂ細胞ＡＬＬを判別する、キメラ蛋白質の検出方法である。いずれの態様の検出方法においても、検体中に本キメラ蛋白質が検出された検体提供者は、他種類の染色体転座を伴う前駆Ｂ細胞ＡＬＬと比較して、症状、治療経過、予後が異なる可能性が高い。
１）検体
本検出方法の検出対象となる検体は、ＡＬＬを判別すべき白血病患者に由来する検体である。具体的には、血液検体、バッフィーコート等を用いることができる。血液検体については、遠心分離処理等を施して調製した血球画分に公知の処理を施して、所望する血球画分検体を調製することができる。本検出方法では、白血球画分検体を用いることが好適である。
なお、この血球画分検体を得るための血液は、特に限定されず、動脈血であっても静脈血であってもよい。一般的には、その採取の容易性から、末梢血が用いられる。
２）本キメラ蛋白質を検出する態様
この態様は、主として上述した本キメラ蛋白質に対する抗体を用いて、検体中の本キメラ蛋白質を検出する態様である。具体的な検出手段としては、エンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、フローサイトメトリーによる解析、ウエスタンブロット法、免疫沈降／イムノブロット法、免疫細胞化学染色法等を例示することができる。
まず、エンザイムイムノアッセイ法は、酵素免疫定量法ともいい、標識イムノアッセイ法のうち酵素を標識物質として用いる検出方法である（放射性同位体を用いた検出方法がラジオイムノアッセイ法である）。エンザイムイムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とする“ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”と、このＢ／Ｆ分離を必要としない“ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”とに大別される。
本検出方法においては、これらのうち、一般的に測定感度が高いといわれる前者の“ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”を選択することがより好ましく、イムノソルベントを用いる“ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”を選択することがさらに好ましい。
より具体的な検出態様として、いわゆるサンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイ法（以下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができる。
かかるサンドイッチ法は、特に操作上の簡便性，経済上の利便性、とりわけ臨床検査としての汎用性を考慮すると、特に好ましい検出態様の一つである。
このサンドイッチ法を行うに際しては、本キメラ蛋白質に対する抗体が、９６穴マイクロプレートに代表されるような、多数のウエルを有するマイクロプレートに固定化された、固定化モノクローナル抗体と、上述した西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素又はビオチンにより標識された、本キメラ蛋白質に対する抗体を用いることが好ましい。
サンドイッチ法は、少なくとも、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法である。
（ａ）不溶性担体に本キメラ蛋白質に対する抗体を固定化した、固定化抗体に、血液検体より調製した顆粒球ライセート等を反応させる工程。
この工程（ａ）においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の検体は、固定化モノクローナル抗体から除去される。
（ｂ）固定化モノクローナル抗体と、試料中のＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質及びＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ融合蛋白質との結合により形成される、抗原抗体複合体に、西洋ワサビペルオキシダーゼやビオチン等により標識された本キメラ蛋白質に対する抗体を反応させる工程。
この工程（ｂ）においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の標識された抗体は、固定化抗体から除去される。
また、この工程（ｂ）においては、反応させた第２抗体における標識物質の種類に応じた、標識シグナルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させることが必要である。例えば、標識物質としてビオチンを用いた場合には、アビジン等を用いて標識シグナルを顕在化させることができる。また、例えば、標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼを選択した場合には、その基質を必要に応じて発色物質と共に添加して、標識シグナルを顕在化することができる。
このようにして、顕在化させた発色シグナルを、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特定手段を用いて検出することで、所望する検体中の本キメラ蛋白質の検出を行うことができる。
免疫細胞化学染色法を用いて、本キメラ蛋白質を検出できる。細胞塗抹遠心器サイトフューズ２（日本ルフト株式会社）を用いて塗抹標本を作製する。塗抹標本を本キメラ蛋白質に対する抗体を用いて、常法により塗抹標本中の本キメラ蛋白質を染色することができる。
３）検体において発現しているｍＲＮＡの存在を検出する方法についての態様
この態様は、検体中の本キメラ蛋白質をコードする遺伝子を検出することにより、当該検体提供者の前駆Ｂ細胞ＡＬＬを判別する本検出方法の一態様である。具体的な検出手段としては、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法、Ｎｅｓｔｅｄ  Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＦＩＳＨ法、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）法等を例示できる。
代表的な態様は、検体における、本キメラ蛋白質のｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡを検出することにより、間接的に血球画分において存在するｍＲＮＡを検出して、本キメラ蛋白質の遺伝子が発現している程度を把握する検出方法である（以下、この態様の検出手段を、キメラｍＲＮＡ検出方法ともいう。この態様の検出方法には、上記のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が含まれる）。
キメラｍＲＮＡ検出方法は、典型的には、公知の方法（例えば、オリゴｄＴを用いる方法）に従い、検体の全ＲＮＡから、ｍＲＮＡを選別する。そして、得られたｍＲＮＡから、既知の本キメラ遺伝子の塩基配列に対応するヌクレオチド鎖を、増幅用プライマーとして用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる、ｍＲＮＡを鋳型として遺伝子を増幅することが可能な遺伝子増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法により、本キメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅し、かかる遺伝子増幅操作による増幅産物の有無や多少を検出することにより、検体における本キメラ蛋白質のｍＲＮＡの存在を、好適にはリアルタイムに検出することができる。
なお、上記のようにして増幅された本キメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを鋳型として、さらにＰＣＲ法等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる遺伝子増幅操作を施し、これによる遺伝子増幅産物の有無や多少を検出することにより、検体における本キメラ蛋白質のｍＲＮＡの存在を、一層正確に検出することができる（この２回目の遺伝子増幅操作において用いる遺伝子増幅用プライマーは、１回目の遺伝子増幅操作において用いられた遺伝子増幅用プライマーよりも、本キメラ遺伝子の内側に対応するヌクレオチド鎖を、遺伝子増幅用プライマーとして用いる必要がある）。
インベーダー・アッセイ法〔Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）〕は、鋳型ヌクレオチド鎖（検体から得たｃＤＮＡ）に、下記１，２の特徴を有する、第１のヌクレオチド鎖（１：Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｐｒｏｂｅ）をハイブリダイズさせた後に、第２のヌクレオチド鎖（２：Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｒｏｂｅ）をハイブリダイズさせ、次いで、ヌクレオチド鎖の部分的三重鎖構造を、その３’側で、特異的に切断するヌクレアーゼ（Ｃｌｅａｖａｓｅ）を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖の検出用部分を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖における、本キメラ蛋白質を構成するＭＥＦ２Ｄ  ｍＲＮＡの一部およびＤＡＺＡＰ１  ｍＲＮＡの一部から成る転座部位をコードするヌクレオチド鎖、を検出する方法に基づく反応を挙げることができる。
１．第１のヌクレオチド鎖：本キメラｍＲＮＡを構成するＭＥＦ２Ｄ蛋白質の一部およびＤＡＺＡＰ１蛋白質の一部から成る転座部位をコードするヌクレオチド鎖、に対する相補的なヌクレオチド鎖。
２．第２のヌクレオチド鎖：上記転座部位をコードするヌクレオチド鎖、に対して相補的な「相補的部分」が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチドに対して非相補的な「検出用部分」が、５’側にあり、「相補的部分」の最も５’側の塩基は、上記結合部をコードする塩基に対して相補的な塩基となっている、複合的ヌクレオチド鎖。鋳型ＤＮＡ、第１のヌクレオチド鎖と第２のヌクレオチド鎖で３重構造が形成され、この構造をＣｌｅａｖａｓｅが認識し、切断する。
ＤＮＡチップ法は、癌（白血病）細胞で発現しているｍＲＮＡを定量する方法である。例えば、基盤上に本キメラ遺伝子の上記結合部を有する合成オリゴヌクレオチドを固定し（ｃＤＮＡを固定することもできる）、検体から調製したＲＮＡをリバーストランスクリプターゼによりｃＤＮＡを合成する時に標識を行う。本標識ｃＤＮＡと基盤上の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、結合した標識の量をスキャンすることによりｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
サザンブロット法は検体から得られるゲノムＤＮＡを、ノーザンブロット法は同ｍＲＮＡを、分離して固定し、これと、本キメラ遺伝子の結合部とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の本キメラ遺伝子の存在を検出する方法である。
４）検体において存在するゲノムＤＮＡを検出する態様
この態様の代表的方法として、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ法［蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）：Ｙａｓｕｉ，Ｋ．，Ｉｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｙ．，Ｐｉｍｋａｈａｏｋｈａｍ，Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｎａｒｕｔｏ，Ｔ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｙ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｉｎａｚａｗａ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ａｔ  １４ｑ１２−ｑ１３  ｉｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，３２，１１２−１１８，２００１］を挙げることができる。この態様の本検出方法は、本キメラ遺伝子の転座部位を有するＢＡＣクローンであるＲＰ１１−９８Ｇ７を標識し、ＦＩＳＨを行うと相互転座部位であるクロモソーム１と１９の転座部分を検出することができる。
本検出方法においては、このようにして、検体における本キメラ遺伝子および蛋白質を検出することにより、ＡＬＬの病態の判別を行うことができる。なお、本検出方法と共に、既存のＡＬＬの病態の判別方法を組み合わせて行うことにより、より的確なＡＬＬの病態の判別を行うことができる。
４．抗白血病薬のスクリーニング方法
上述したように、本キメラ蛋白質は、ＭＥＦ２ファミリー蛋白質と強く相互作用をし、それが白血病の発症と関係する可能性が高い。このような相互作用の特異的阻害剤は、白血病の治療薬として期待することができる。
よって、本発明は、上記相互作用の特異的阻害効果を指標とした白血病治療薬の有効成分のスクリーニング方法（以下、本スクリーニング方法ともいう）を提供する発明である。
本スクリーニング方法は、具体的には、以下に示す方法として規定される。
ａ）ＭＥＦ２ファミリー蛋白質と本キメラ蛋白質（ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１蛋白質またはＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ蛋白質）と共存させて、当該両蛋白質の結合量を定量し、
ｂ）前記ａ）の定量系において、ＭＥＦ２ファミリー蛋白質と本キメラ蛋白質が接触する際または事前に被験物質を共存させた場合の当該両蛋白質の結合量を定量し、
ｃ）前記ａ）におけるＭＥＦ２ファミリー蛋白質と本キメラ蛋白質の結合量よりも、前記ｂ）における当該結合量が減少している場合に、前記被験物質を抗白血病物質としてスクリーニングする、被験物質のスクリーニング方法。
上記の本スクリーニング方法において、ＭＥＦ２ファミリー蛋白質としては、例えば、ＭＥＦ２Ｄ蛋白質、ＨＤＡＣ４蛋白質、ｐ３００蛋白質等を挙げることができる。これらの中でも、ＭＥＦ２Ｄ蛋白質、または、ＨＤＡＣ４蛋白質を用いることが好適である。なお、これらのＭＥＦ２ファミリー蛋白質は、上述した本融合蛋白質の製造方法に準じた常法を用いて製造することが可能である。
本スクリーニング方法においては、ＭＥＦ２ファミリー蛋白質と本キメラ蛋白質を細胞内で共存させ、被験物質を細胞外に添加する態様をとることが、生体内における現実のＭＥＦ２ファミリー蛋白質と本キメラ蛋白質の結合と、投薬による当該結合の阻害を検出することが可能であり好適である。この態様を用いる場合、被験細胞を、ＭＥＦ２ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだベクター、および、本キメラ遺伝子を組み込んだベクターで形質転換することが好適である。組み込み細胞は、特に限定されないが、好適には、ヒトの細胞、特に、子宮頚癌（Ｈｅｌａ）細胞、白血病（Ｋ５６２）細胞、大腸癌（ＨＴ−２９）細胞、腎臓癌（ＨＥＫ２９３）細胞を用いることが好適である。
結合蛋白質量の定量は、微量蛋白質の定量に採用され得る常法を行うことが可能であり、具体例は後述する。
また、本スクリーニング方法を行う前提として、一次スクリーニングを行うことが好適である。具体的には、例えば、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１転座が起こっている白血病細胞（例えば、ＴＳ−２細胞）の増殖を阻害するが、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１転座が起こっている白血病細胞（例えば、ＴＨＰ４細胞）の増殖は阻害しないか或いは弱くしか阻害しない物質をスクリーニングすることが好適である。
さらに、本スクリーニング方法を行って、所望の白血病治療薬の有効成分としてスクリーニングされた物質を、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニング、例えば、上記のＴＳ−２細胞を植え付けたヌードマウスでのＴＳ−２細胞の増殖抑制効果と当該ヌードマウスの生存率の向上を指標とするスクリーニング方法にかけて、最終的な絞り込みを行うことが好適である。
本発明は、上述した本スクリーニング方法を行うためのスクリーニング用キットを提供する。当該キットは、最低限の構成要素として、ＭＥＦ２ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだベクター、および、本キメラ遺伝子を組み込んだベクターを含むものである。さらに、その他の本スクリーニング方法を行うために必要な要素、例えば、これらのベクターによる形質転換を行う対象となる細胞、当該細胞の培養液、希釈用緩衝液、細胞溶解用緩衝液、融合蛋白質および／またはフリーの蛋白質を検出するための要素（例えば、特異抗体、アフィニティクロマトグラフィーカラム等）等を加えることも可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、クロモソーム１ｑ２１−ｑ２３の領域における転座点のＦＩＳＨ法及びＳｏｕｔｈｅｒｎブロッティングによるマッピングを示す図面である。
（Ａ）クロモソーム１ｑ２１−ｑ２３の領域をカバーする１０種類のＢＡＣクローンを使用してＦＩＳＨ法による解析を行った。その中でＢＡＣクローンＲＰ１１−９８Ｇ７（白抜きバーで表示）がＴＳ−２細胞のｄｅｒ（１）とｄｅｒ（１９）のクロモソーム（右図の矢印で表示）及びクロモソーム１（右図の矢じりで表示）とハイブリダイズした。ＲＰ１１−９８Ｇ７はＭＥＦ２Ｄ配列のみを有するクローンである。
（Ｂ）転座点を狭めるために、ＲＰ１１−９８Ｇ７配列に基づいてデザインしＰＣＲによりプローブを作成し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット解析を行った。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ或いはＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化を行った後で、健常者ゲノムＤＮＡでは検出されないＤＮＡバンド（右パネルの矢印ｂと矢印ｄ）がＴＳ−２細胞由来のゲノムＤＮＡに見出された。このＤＮＡバンドはＴＨＰ−４細胞或いは正常末梢血白血球では見出されなかった。これらの結果と各酵素単独消化後のＳｏｕｔｈｅｒｎブロット解析の結果を総合的に判断すると、クロモソーム１ｑ２２の制限酵素マップより、転座点はクロモソーム１ｑ２２のＥｃｏＲＩ部位から約１．８Ｋｂの範囲内に存在する（左パネル）と判定できる。右パネルの黒塗り両矢印（ａとｃ）と灰色両矢印（ｂとｄ）が各々Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロットで検出されたａからｄまでのバンドと符合する。
図２は、転座点の遺伝子配列のクローニングを示す写真である。
（Ａ）転座点を同定するために使用したＩｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法のシェーマ。転座点領域の予想される制限酵素マップに基づいて、まずゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。自己結合により生成した環状ＤＮＡを精製し、予想される転座点に近い配列をＢＡＣ９８Ｇ７よりデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をサブクローニングし、その塩基配列を決定した。最初のＰＣＲにＡ１／Ａ２プライマーを、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにＢ１／Ｂ２プライマーを、コントロールＰＣＲにＣ１／Ｃ２プライマーを使用した。
（Ｂ）ＴＳ２細胞のゲノムを鋳型としたＮｅｓｔｅｄ  Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ後のアガロースゲル電気泳動により、Ｂ１／Ｂ２をプライマーとして用いた時に１．６Ｋｂのバンドが検出された。一方、健常者末梢血白血球のゲノム（Ｎと表示）を用いた場合にはこのバンドは検出されなかった。プライマーＣ１／Ｃ２を用いた場合には両ゲノムを鋳型として、０．９Ｋｂのバンドが検出されている（コントロール）。
（Ｃ）ウエブサイト「ＧｅｎＢａｎｋ」のＢＬＡＳＴ検索を行った所、Ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ産物の配列はＭＥＦ２Ｄのイントロン６を有するクロモソーム１ｑ２２、ＤＡＺＡＰ１のイントロン６を有するクロモソーム１９ｐ１３．３、及び転座点の配列であった。転座点周辺の部分配列を記載した。太字で記載した余分な５塩基はその由来が不明である。
図３は、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ転写産物の同定について示す写真である。
（Ａ）ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１及びＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄキメラ転写産物を同定するためのＲＴ−ＰＣＲ。鋳型はＴＳ−２細胞ゲノム（ＴＳ−２）、健常者末梢血白血球ゲノム（Ｎ）及びＴＨＰ−４細胞（ＴＨＰ−４）ゲノムを使用した。ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１及びＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄキメラ転写産物はＴＳ−２細胞にのみ検出された。Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１キメラ転写産物、野生型ＭＥＦ２Ｄ及び野生型ＤＡＺＡＰ１転写産物はＴＨＰ−４細胞に検出された。
（Ｂ）２人の白血病臨床例でのキメラ転写産物の検出。ＴＳ−２細胞ゲノムで見出されたサイズのＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＤＡＺＡＰ−ＭＥＦ２Ｄキメラ転写産物がＰａｔｉｅｎｔ  １由来のゲノムを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲで検出された。Ｐａｔｉｅｎｔ  １と同じクロモソーム転座ｔ（１；１９）を有する前駆Ｂ細胞ＡＬＬ  Ｐａｔｉｅｎｔ  ２ではＥ２Ａ−ＰＢＸ融合転写産物と同サイズのＲＴ−ＰＣＲ産物を検出した。
（Ｃ）野生型ＭＥＦ２Ｄ蛋白質、野生型ＤＡＺＡＰ１蛋白質並びに予想されるＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ融合蛋白質生成の予想図。ＭＥＦ２Ｄ蛋白質はＭＡＤＳドメインとＭＥＦ２ドメインをＮ末端に、転写活性化（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメインをＣ末に有する。ＤＡＺＡＰ１蛋白質は２ヶ所のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）をＮ末端に有する。キメラＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１蛋白質はＭＥＦ２Ｄ蛋白質のＭＡＤＳドメイン／ＭＥＦ２ドメインとＤＡＺＡＰ１蛋白質の２番目のＲＲＭドメインを一部有するＣ末領域から成る。もう一方のＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ融合蛋白質はＤＡＺＡＰ１の１個のＲＲＭドメインと不完全なもう１個のＲＲＭドメインを有するＮ末領域と転写活性化部位を有するＭＥＦ２ＤのＣ末領域から成る。
図４は、一過性に発現したエピトープタッグ蛋白質を用いて蛍光免疫化学法によるキメラ蛋白質の細胞内局在を示す写真である。
ＭＥＦ２Ｄ、ＤＡＺＡＰ１、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１及びＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄの全長を有するｃＤＮＡをＦＬＡＧタッグと融合して構築した発現プラスミドを一過性に細胞にトランスフェクションした。それぞれの蛋白質を抗−ＦＬＡＧ（Ｍ２）モノクローン抗体を用いて検出した。
ＦＬＡＧタッグＭＥＦ２ＤとＦＬＡＧタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１は核内で点在する染色パターンを示し、ＦＬＡＧタッグＤＡＺＡＰ１とＦＬＡＧタッグＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄは核内でより拡散した染色パターンを示した。
図５は、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＭＥＦ２Ｄ或いはＨＤＡＣ４との相互作用を示す写真である。
（Ａ）ＦＬＡＧタッグＭＥＦ２ＤとＭｙｃタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１を一過性のコトランスフェクションによりＨＥＫ２９３細胞に発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてその細胞溶解液からＭＥＦ２Ｄ蛋白質を免疫沈降させた。ＭＥＦ２Ｄ蛋白質とＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１蛋白質が共沈することを示した。
（Ｂ）ＦＬＡＧタッグＨＤＡＣ４とＭｙｃタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ或いはＭｙｃタッグＭＥＦ２ＤをＨＥＫ２９３細胞に一過性に発現させた。ＨＤＡＣ４蛋白質とＭＥＦ２Ｄ蛋白質並びにＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰキメラ蛋白質が抗体を用いて共沈した。ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＨＤＡＣ４の相互作用がＭＥＦ２ＤとＨＤＡＣ４の相互作用より強いことが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）によるクロモソーム１ｑ２２の転座部位の同定
プレＢ細胞ＡＬＬ細胞株であるＴＳ−２細胞は染色体転座ｔ（１；１９）（ｑ２３；１３）が癌化の原因である。しかし、これまで報告されているクロモソーム転座に起因するＥ１Ａ−ＰＢＸ１融合遺伝子が検出されない（Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，Ｍ．，Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｅｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｍ．，Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｙ．，Ｃｕｉ，Ｙ．，Ｓａｔｏ，Ａ．，Ｓａｉｓｈｏ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｎｏｈａｓａｍａ，Ｒ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｙ．，Ｋａｍａｄａ，Ｎ．＆  Ｉｉｎｕｍａ，Ｋ．：Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＴＳ−２）ｏｆ  ｐｒｅ−Ｂ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔ（１；ｌ９）ｎｏｔ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅ２Ａ  ｇｅｎｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．，１０１，９５−１０２，１９９８）。この問題点を解決するためには、正確な転座部位を決定し、転座に伴う融合遺伝子の同定を行うことが必要である。
まず転座部位を決定するために、クロモソーム１ｑ２２−ｑ２３領域を有する１０個のＢＡＣクローンをプローブに用いてＦＩＳＨ法により解析を行った。この１０個のＢＡＣクローンを米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ及びｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙデータベースを参照して選択した。ここで用いたＢＡＣクローンの中でＲＰ１１−９８Ｇ７（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＬ１３９４１２）をプローブに用いてＴＳ−２細胞のＦＩＳＨを行った結果、相互転座部位であるｄｅｒ（１）とｄｅｒ（１９）クロモソームにハイブリダイズした（図１Ａ右図）。詳細に解析した所、ＲＰ１１−９８Ｇ７はクロモソーム（１ｑ２２）に存在するＭＥＦ２Ｄゲノム遺伝子領域の一部から構成されており、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の転座点を含んでいることが判明した（図１Ａ左解説図）。さらに、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット解析法を用いて転座部位の領域を明らかにした。ＲＰ−９８Ｇ７配列中の１種類のプローブはＴＳ−２細胞の転座部位を検出しているが、通常のＡＬＬから分離したＴＨＰ−４細胞或いは正常末梢血白血球細胞では検出できなかった。さらに、制限酵素消化後のＳｏｕｔｈｅｒｎ解析、及びクロモソーム１ｑ２２のコンピュータを用いた制限酵素部位の解析により転座領域のマッピングを行うことができ、転座部位はクロモソーム１ｑ２２のＥｃｏＲＩ認識部位から約１．８Ｋｂの範囲内に存在することが判明した（図１Ｂ）。
【実施例２】Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によるクロモソーム１９ｐ１３の転座部位に局在する遺伝子の同定
転座部位を明らかにするために、クロモソーム１ｑ２２領域にデザインしたプライマーを用いて、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＴＳ−２細胞ゲノムＤＮＡのＳｅｌｆ−ｌｉｇａｔｅｄ環状ＤＮＡを鋳型としてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った（図２Ａ）。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行ったプロダクトは予想した大きさの１．６Ｋｂであり、ＴＳ−２細胞で特異的に検出された（図２Ｂ）。塩基配列を決定した所、このＰＣＲ産物は転座部位の配列と同時にクロモソーム１ｑ２２と１９ｐ１３．３の両配列を有することが判明した（図２Ｃ）。本塩基配列はクロモソーム１９ｐ転座部位のＤＡＺＡＰ１（１９ｐ１３．３）を含んでいた。転座部位はＭＥＦ２Ｄ遺伝子のイントロン６とＤＡＺＡＰ１遺伝子のイントロン６にまたがっていた。さらに、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子とＤＡＺＡＰ１部位に特異的なプライマーを用いてＴＳ−２細胞のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行うことにより再配列をしたゲノム塩基配列を決定した。
【実施例３】ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて転座に起因する融合転写産物の同定
リバーストランスクリプターゼを用いて、転座に起因する融合転写産物からｃＤＮＡを合成し、その塩基配列を決定した所、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子のエクソン６とＤＡＺＡＰ１遺伝子のエクソン７が融合しＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１融合ｍＲＮＡが生成することが判明した。２対の染色体の相互転座が起こっているので、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ融合産物が生成すると予測されるので、その検出を行った。ＴＳ−２細胞から調製したｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うと、野生型ＭＥＦ２Ｄ  ｍＲＮＡとＤＡＺＡＰ１  ｍＲＮＡに加えて２種類の融合ｍＲＮＡを検出できた（図３Ａ、ＴＳ−２で表示した列）。ここで検出された２種類のｃＤＮＡをｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングし、それらの塩基配列を決定した。塩基配列のデータより両キメラ蛋白質のアミノ酸配列を決定した。この結果、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号３）、同蛋白質のアミノ酸配列（配列番号５）、並びに、ＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ  ｃＤＮＡ配列（配列番号４）、同蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６）が確定した。一方、ＴＨＰ−４細胞からはこれらの融合ｍＲＮＡは検出されなかった（図３Ａ、ＴＨＰ−４と表示した列）。さらに、ＴＨＰ−４細胞で検出されるＥ２Ａ−ＰＢＸ１融合ｍＲＮＡはＴＳ−２細胞では検出されなかった。
次に、ＴＳ−２細胞を分離した患者（Ｐａｔｉｅｎｔ  １）の骨髄細胞からＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法で転座部位に由来する融合転写産物の検出を試みた結果、予想通り、２種類の融合ｍＲＮＡを検出することができた（図３Ｂ）。他のｔ（１；１９）転座を伴う１３人のＡＬＬ患者の骨髄細胞から分離したＲＮＡを用いた場合にはこの２種類の融合転写産物は検出されなかった。融合転写産物の塩基配列を決定した結果、融合はその下流遺伝子の蛋白質配列が翻訳されるように起こっていた。即ち、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子の２２２番目のコドンとＤＡＺＡＰ１の１５５番目のコドンは何れもグリシンをコードしており、アミノ酸翻訳フレームが合った状態で融合し、キメラ転写産物が生成することが判明した。
ＡＬＬ患者で（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）転座を伴うが、Ｅ２Ａとのキメラ遺伝子が検出されない多種類の血液癌症例が報告（Ｐｒｉｖｉｔｅｒａ，Ｅ．，Ｋａｍｐｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｉｎａｂａ，Ｔ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｌ．Ｈ．，Ｒａｉｍｏｎｄｉ，Ｓ．Ｃ．，Ｂｅｈｍ，Ｆ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｌ．，Ｃａｒｒｏｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．，＆  Ｌｏｏｋ，Ａ．Ｔ．：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １；１９  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．，Ｂｌｏｏｄ，７９，１７８１−１７８８，１９９２）されているが、これらはＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１融合産物がその原因となっている可能性が高い。
ＭＥＦ２Ｄ遺伝子は約３４Ｋｂを有し、１２エクソンから成る（Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ，Ｒ．Ｅ．，Ｌｉａｎｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｓｍｏｏｔ，Ｌ．Ｂ．，Ｌａｈｅｒｕ，Ｄ．Ａ．，Ｍａｈｄａｖｉ，Ｖ．＆  Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，Ｂ．：Ａｆｏｕｒｔｈ  ｈｕｍａｎ  ＭＥＦ２  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ｈＭＥＦ２Ｄ，ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１８，１０９５−１１０６，１９９３）。それは転写因子のＭＡＤＳ−ｂｏｘファミリー蛋白質をコードする（図３Ｃ）。本蛋白質はホモダマー或いはヘテロダイマーを形成して多数の筋特異的及び生育により誘導される遺伝子群の発現制御領域のコンセンサス配列に結合し、骨格筋遺伝子及び心筋の分化に関与する（Ｈｏｂｓｏｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｋｒａｈｅ，Ｒ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｅ．，Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ，Ｍ．Ｊ．，＆  Ｆｕｎａｎａｇｅ，Ｖ．Ｌ．：Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｆｏｕｒ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＡＤＳ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ２（ＭＥＦ２）ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  １５ｑ２６，１９ｐ１２，５ｑ１４  ａｎｄ  １ｑ１２−２３ｑ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９，７０４−７１１，１９９５；ＭｃＫｉｎｓｅｙ，Ｔ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｌ．＆  Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．：ＭＥＦ２：ａ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２７，４０−４７，２００２）。
ＤＡＺＡＰ１遺伝子は約２９Ｋｂに及び１１エクソンから構成される（Ｔｓｕｉ，Ｓ．Ｄａｉ，Ｔ．，Ｒｏｅｔｔｇｅｒ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｍｐｐ，Ｗ．，Ｓａｌｉｄｏ，Ｅ．Ｃ．＆  Ｙｅｎ，Ｐ．Ｈ．：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｇｅｒｍ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＤＡＺ  ａｎｄ  ＤＡＺＬ１，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６５，２６６−２７３，２０００）。ＤＡＺＡＰ１蛋白質は２個のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）とプロリンに富むＣ末領域を有し（図３Ｃ）、ＤＡＺリピート配列を介してＤＡＺ並びにＤＡＺＬ１蛋白質と結合する（Ｄａｉ，Ｔ．，Ｖｅｒａ，Ｙ．，Ｓａｌｉｄｏ，Ｅ．Ｃ．＆  Ｙｅｎ，Ｐ．Ｈ．：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｄａｚａｐ  １  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＤＡＺ  ａｎｄ  ＤＡＺＬ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２，６，２００１）。ＤＡＺＡＰ１は精巣で多量発現しているので精子形成に重要な役割を果たしていることが期待される（Ｖｅｒａ，Ｔ．，Ｄａｉ，Ｔ．，Ｈｉｋｉｍ，Ａ．Ｐ．，Ｌｕｅ，Ｙ．，Ｓａｌｉｄｏ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｗｅｒｄｌｏｆｆ，Ｒ．Ｓ．＆  Ｙｅｎ，Ｐ．Ｈ．：Ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｓｈｕｔｔｌｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．，２３，６２２−６２８，２００２）。本発明で見出したＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質はＭＥＦ２Ｄ蛋白質のＮ末領域（２量体形成に必要なＭＡＤＳドメインとＭＥＦ２ドメインを有する）とＤＡＺＡＰ１蛋白質の２番目のＲＲＭを一部含むＣ末領域とが融合している。一方、ＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄキメラ蛋白質はＤＡＺＡＰ１蛋白質の１番目のＲＲＭと２番目のＲＲＭを一部含むＮ末領域とＭＥＦ２Ｄ蛋白質の転写活性化領域を含むＣ末領域とが融合している（図３Ｃ）。
【実施例４】キメラ転写産物の細胞内局在部位
ＭＥＦ２Ｄ蛋白質はＤＮＡ結合部位と転写活性化部位を有する転写因子（Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ，Ｒ．Ｅ．，Ｌｉａｎｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｓｍｏｏｔ，Ｌ．Ｂ．，Ｌａｈｅｒｕ，Ｄ．Ａ．，Ｍａｈｄａｖｉ，Ｖ．＆  Ｎａｄａｋ−Ｇｉｎａｒｄ，Ｂ．：Ａ  ｆｏｕｒｔｈ  ｈｕｍａｎ  ＭＥＦ２  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ｈＭＥＦ２Ｄ，ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１８，１０９５−１１０６，１９９３）で、ＤＡＺＡＰ１はＲＮＡ結合蛋白質である（Ｔｓｕｉ，Ｓ．，Ｄａｉ，Ｔ．，Ｒｏｅｔｔｅｒ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｍｐｐ，Ｗ．，Ｓａｌｉｄｏ，Ｅ．Ｃ．＆  Ｙｅｎ，Ｐ．Ｈ．：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｇｅｒｍ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＤＡＺ  ａｎｄ  ＤＡＺ１，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６５，２６６−２７３，２０００）。キメラ転写産物の細胞内局在部位を決定し、野生型ＭＥＦ２Ｄ蛋白質並びに野生型ＤＡＺＡＰ１蛋白質の局在と比較した。融合蛋白質産物であるＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１のアミノ酸配列を配列２に、ＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄのアミノ酸配列を配列２に記載した。ＦＬＡＧ抗体を用いて検出を行うために、各蛋白質のＮ末端にＦＬＡＧのタッグをつけた発現プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、一過性に発現させた。ＦＬＡＧに対する抗体を用いて蛍光免疫細胞染色を行った結果、ＦＬＡＧタッグＭＥＦ２ＤとＦＬＡＧタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１は核に局在し、点在する染色を示した。一方、ＦＬＡＧタッグＤＡＺＡＰ１及びＦＬＡＧタッグＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄも又核に局在したが、より拡散した染色像を示した（図４）。
【実施例５】ＭＥＦ２Ｄ蛋白質とＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質とのヘテロ２量体の形成
ＭＥＦ２Ｄは、ＨＤＡＣ４及びｐ３００蛋白質等のＭＥＦ２ファミリー蛋白質の１つで、ホモ２量体及びヘテロ２量体形成に必要なＭＡＤＳドメインとＭＥＦ２ドメインを含んでいる（図３Ｃ）。キメラ蛋白質ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１はＭＡＤＳとＭＥＦ２ドメインを含んでいるので、それはＭＥＦ２Ｄ自身、或いはＭＥＦ２Ｄと相互作用する他の蛋白質と２量体を形成すると考えられる。
この可能性を証明するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＬＡＧタッグＭＥＦ２Ｄと、ＭｙｃタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１を発現するプラスミドと共にコトランスフェクションを行い、細胞抽出液を調製し免疫沈降した。その結果、ＭＥＦ２Ｄとキメラ蛋白質が共沈した（図５Ａ）ので、その両者が細胞内で複合体を形成していると結論される。逆の組み合わせ、すなわち、ＭｙｃタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＦＬＡＧタッグＭＥＦ２Ｄ発現プラスミドをコトランスフェクションした場合にも同様の結果が得られた。さらに、ＭｙｃタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＦＬＡＧタッグＨＤＡＣ４発現プラスミドをコトランスフェクションした場合にも同様に両蛋白質は共沈した。
共沈した時のバンドの濃さから判定すると、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１融合蛋白質は、ＭＥＦ２Ｄよりも強くＨＤＡＣ４と結合する（図５Ｂ）。ＭｙｃタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＦＬＡＧタッグＨＤＡＣ４発現プラスミドをＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションすると、両蛋白質は核に点在する状態で同一部位に存在することが蛍光免疫細胞染色の結果より明らかになった。この結果はＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質が、おそらくＭＥＦ２Ｄとヘテロ２量体を形成することにより、ＭＥＦ２Ｄの機能を抑制していると推定される。
これまで、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１とＤＡＺＡＰ１−ＭＥＦ２Ｄ融合蛋白質において、細胞をトランスフォームする性質は明らかではない。しかし、両融合蛋白質の細胞内局在部位とヘテロ２量体を形成することは、本キメラ蛋白質が、ＭＥＦ２ファミリー蛋白質（ＭＥＦ２ＤあるいはＨＤＡＣ４等）と相互作用する可能性が強く示唆される。
ＭＥＦ２蛋白質の役割は通常筋組織に限定される（Ｙｕ，Ｙ．Ｔ．，Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ，Ｒ．，Ｓｍｏｏｔ，Ｌ．Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｙ．，Ｍａｈｄａｖｉ，Ｖ．＆  Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ，Ｂ．：Ｈｕｍａｎ  ｍｙｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ａ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＡＤＳ  ｂｏｘ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，６，１７８３−１７９８，１９９２）と考えらているが、ＭＥＦ２Ｄは血清存在下で増殖するＨｅＬａ細胞のｃ−ｊｕｎプロモーターを制御しており（Ｈａｎ，Ｔ．Ｈ．＆  Ｐｒｙｗｅｓ，Ｒ．：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＭＥＦ２Ｄ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−ｊｕｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５，２９０７−２９１５，１９９５）、他の組織或いは細胞の分化、増殖に関与する可能性も高い。
全骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０がモノサイトに分化する過程でＭＥＦ２ＡとＭＥＦ２Ｄの発現が顕著に増大した（Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｈ．，Ｓｅｏｈ，Ｊ．Ｙ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｈａｈｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｓ．＆  Ｈａｎ，Ｔ．Ｈ．：Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＥＦ２Ｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬ６０  ｐｒｏｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，１２０９−１２１４，１９９９）。さらに、ＨＬ−６０細胞がＭＥＦ２Ｄの転写活性領域を含んでいないドミナントネガティブ体を発現したときに、モノサイトへの分化が抑制された。これらのことは、ＭＥＦ２蛋白質の制御的役割は広範囲に渡り、ＭＥＦ２Ｄは、筋組織よりむしろ細胞系譜の分化過程に必要であると考えられる。
従って、本キメラ蛋白質は癌化に関連する融合蛋白質であると結論づけることができる。
【実施例６】 ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質阻害剤のスクリーニング系の例示
（ａ）１次スクリーニング：
１次スクリーニングとして、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１転座が起こっている白血病（ＴＳ−２）細胞の増殖を阻害するが、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１転座が起こっている白血病（ＴＨＰ４）細胞の増殖は阻害しないか或いは弱くしか阻害しない物質をスクリーニングする。方法は９６穴マイクロタイタープレートを用いて、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地存在下でＴＳ−２細胞とＴＨＰ４細胞を３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で培養する。培養時に１０μＭ濃度の化合物を添加し、２〜３日間培養する。培養後、細胞増殖をＭＴＴアッセイにより測定する。ＭＴＴアッセイ試薬の１例として、株式会社同仁化学研究所（熊本）からＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８として市販されている。ＴＳ−２細胞の増殖に対するＩＣ５０がＴＨＰ４細胞のＩＣ５０と比較し、１／４以下の化合物を選択する。
（ｂ）２次スクリーニング（本スクリーニング方法）：
次に、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、本キメラ蛋白質とＭＥＦ２Ｄ蛋白質との結合を阻害する物質を検索する。
（１）全長を有するＭｙｃタッグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１遺伝子と野生型ＦＬＡＧタッグＭＥＦ２Ｄ遺伝子をｐＣＭＶ−Ｔａｇ２或いはｐＣＭＶ−Ｔａｇ３発現プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に翻訳フレームが合うように挿入する。大腸菌ＤＨ−５株を形質転換後、プラスミドを調製し、制限酵素マッピングと塩基配列の決定により、目的とするクローンを選択する。
（２）ＦＬＡＧタッグＭＥＦ２Ｄ発現プラスミドとＭｙｃタグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションする。トランスフェクション試薬としてＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ、東京）を使用し、マニュアルに従って実験を行うことができる。上記培地で３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で１日培養後、１次スクリーニングで選択された化合物を１０μＭ濃度で添加し、さらに１日培養する。
（３）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、東京）を含むＴＮＥ緩衝液（キシダ化学、大阪）で処理を行い、ＨＥＫ２９３細胞ライセートを調製する。次に、抗Ｍｙｃ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファロースビーズと共に２時間４℃でインキュベートする。ビーズを遠心分離により分離した後、プロテアーゼ阻害剤を含むＴＮＥ緩衝液で２回洗浄し、ローディングバッファーにサスペンドする。その試料を５分間１００℃に加熱処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う。それをニトロセルロース膜に移し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び５％  ｎｏｎｆａｔ  ｄｒｙ  ｍｉｌｋを含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅでブロッキング処理を行い、抗ＦＬＡＧモノクローン抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）とインキュベートした。ＦＬＡＧタッグＭＥＦ２Ｄ蛋白質をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｗｅｓｔｅｒｎブロティングキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＯ．、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて検出する。
この結果、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質とＭＥＦ２Ｄ蛋白質との結合を阻害する物質を選択することができる。
次に、同様にしてＦＬＡＧタッグＨＤＡＣ４発現プラスミドを調製する。上記と同様の方法で、ＦＬＡＧタッグＨＤＡＣ４発現プラスミドとＭｙｃタグＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションする。上記と同様の方法を用いてＨＤＡＣ４とＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１の結合を阻害する物質を同定する。
（ｃ）３次スクリーニング：
かくして得られた化合物はＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質の阻害剤であり、次のステップとしてヌードマウスを用いた白血病（ＴＳ−２）細胞移植実験でその阻害剤が有効かどうかを試験できる。
【実施例７】 Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅアッセイ法を用いたＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質阻害剤のスクリーニング法
常法を用いて組換蛋白質として、ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質、ＧＳＴ−ＭＥＦ２Ｄ蛋白質、ＧＳＴ−ＨＤＡＣ蛋白質を調製する。常法を用いてＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質をビオチン標識する。ビオチン標識（Ｂｉｏ−）ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質とＧＳＴ−ＭＥＦ２Ｄ蛋白質を緩衝液中で或いは適当に希釈したＨＥＫ２９３抽出液を加えて室温或いは３７℃で３０分間インキュベートする。両蛋白質の結合をＥｕｒｏｐｉｕｍ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ（ＥｕＫ）標識ＧＳＴ抗体（Ｐａｃｋａｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）とＳｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎｅ（ＳＡ）標識ＸＬ６６５蛋白質（Ｐａｃｋａｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）を加えて検出する。検出はＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＴＲＦ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｎａｚｙｚｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて行う。３３７ｎｍのレーザー光を照射するとＥｕｒｏｐｉｕｍ  Ｃｒｙｐｔａｔｅはこの波長の光を吸収し、吸収したエネルギーをＸＬ６６５蛋白質（アクセプター）にトランスファーする。ＸＬ６６５蛋白質は６６５ｎｍのエミッション光を放出し、短時間でこの蛍光強度が減衰する。この反応ではＤｏｎｅｒ  ＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅはＥｕＫであり、アクセプターが安定化したＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ蛋白質であるＸＬ６６５である。両物質により触媒されるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）は両者が９．５ｎｍの距離に存在する場合に５０％の効率でエネルギートランスファーが起こる。
ＥｕＫ−ＧＳＴ抗体−ＧＳＴ−ＭＥＦ２Ｄ−ＢｉｏＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１−ＳＡ−ＸＬ６６５の複合体が形成され、ＥｕＫとＸＬ６６５とのＦＲＥＴを利用してＧＳＴ−ＭＥＦ２ＤとＢｉｏＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１キメラ蛋白質の結合を測定する。
９６穴或いは３８４穴マイクロタイタープレートを用いて、１０μＭ化合物存在下で、ビオチン標識ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１融合蛋白質とＧＳＴ−ＭＥＦ２Ｄ蛋白質をインキュベーションする事によりＨｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔでかつ簡便に両蛋白質の複合体形成を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。本法はホモジニアスな方法で、Ｂ／Ｆ分離を必要としない所に大きい特徴がある。ここで得られた化合物について、ビオチン標識ＭＥＦ２Ｄ−ＤＡＺＡＰ１融合蛋白質とＧＳＴ−ＨＤＡＣ４蛋白質の結合を阻害するかどうかさらにチェックをする。
ここで選択された化合物を（実施例６）の２次スクリーニングさらに、３次スクリーニングへと進め、目的とする薬剤を発見する事ができる。
【産業上の利用可能性】  本発明により、白血病に関連する有用な新規のキメラ蛋白質とこれをコードする遺伝子が提供された。そして、本発明により、前駆Ｂ細胞ＡＬＬでこれまで不明であった転座を分子診断することが可能となった。すなわち、本患者がｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）のクロモソーム転座が起こっている場合、これまではＥ２Ａ−ＰＢＸ１の融合遺伝子の生成しか検出できなかったが、本発明により、本キメラ遺伝子の生成のモニタリングが初めて可能となった。かかる本検出方法は、患者の血液から調製した白血球、ゲノムＤＮＡ、細胞ライセート、ＲＮＡ等を用いてゲノム上での融合遺伝子、融合ｍＲＮＡ、融合蛋白質の検出等により行うことが可能である。さらに、本キメラ蛋白質を用いて、新規の白血病のスクリーニング方法が提供された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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