(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーで測定試料を測定した後、液体クロマトグラフィー用カラムに流し、カラム中の充填剤に非特異的に吸着した蛋白質又は脂質を洗浄する液体クロマトグラフィー用カラムの洗浄液において、
過塩素酸イオンを含み、かつ、ｐＨが２．０〜４．５、及び／又は、ｐＨが７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤を含むカラム洗浄液。
【請求項２】
液体クロマトグラフィーで測定試料を測定した後、少なくともカチオン交換基を有する充填剤からなる液体クロマトグラフィー用カラムに流し、カラム中の充填剤に非特異的に吸着した蛋白質又は脂質を洗浄する液体クロマトグラフィー用カラムの洗浄液において、
過塩素酸イオンを含み、かつ、ｐＨが７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤を含むカラム洗浄液。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーで測定試料を測定した後、少なくともアニオン交換基を有する充填剤からなる液体クロマトグラフィー用カラムに流し、カラム中の充填剤に非特異的に吸着した蛋白質又は脂質を洗浄する液体クロマトグラフィー用カラムの洗浄液において、
過塩素酸イオンを含み、かつ、ｐＨが２．０〜４．５で緩衝能を持つ緩衝剤を含むカラム洗浄液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば生体成分を分析対象とする液体クロマトグラフ用カラムの洗浄液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、液体クロマトグラフ（ＬＣ）は、臨床検査分野で広く用いられており、特に、血液試料中に含まれている夾雑成分の中から測定対象成分を分離したり、性質の似た複数の成分を相互に分離分析したり、特定の成分を分取するために用いられている。
【０００３】
液体クロマトグラフ装置では、上記のように各種成分を分離するための分離カラムに、試料含有溶離液が供給され、分離カラム内の充填剤と試料中の各種成分との相互作用の差により、各種成分が分離される。
【０００４】
試料中に含まれている成分は、相互作用の弱い成分から順に分離カラムから溶出される。従って、溶出液を吸光光度計などの検出手段により測定することにより、クロマトグラフ情報が得られる。このクロマトグラフ情報を解析することにより、測定対象成分の定性分析や定量分析を行うことができる。
【０００５】
一方、血液試料の中でも、糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は糖尿病診断の指標として広く利用されている。ＨｂＡ１ｃとは血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグロビンと不可逆的に結合して生成したものであり、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映する。
そして、このＨｂＡ１ｃの測定方法として、一般に上記、ＬＣ法や免疫法が用いられている。
【０００６】
液体クロマトグラフィー法によるＨｂＡ１ｃの測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という）などのピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、最近では、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、その割合は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００７】
しかしながら、上記血液試料中のＨｂＡ１ｃ値の測定を多数行うと、ＬＣの分離カラムが徐々に劣化する。そのため、ピークの保持時間（Ｒｔ）が速くなり、ピークの位置が移動したり、各ピークがブロード化し、クロマトグラムの形状が変化する。その結果、ＨｂＡ１ｃ値も変わり、ＨｂＡ１ｃ値のばらつきが大きくなるという問題があった。
【０００８】
さらに、血液試料中には、アルブミンなどの蛋白質、コレステロールなどの脂質などが多く含まれている。ＬＣで血液試料中の分析対象物を分析定量する場合、分離カラム中の充填剤に分析対象物以外の蛋白質や脂質が非特異的に吸着し、分離カラム内の充填剤と血液試料中の分析対象物との相互作用に変化（一般的には相互作用が小さくなる）が生じ分離パターンが悪化し正確な測定値を得ることが出来なくなる（カラムの劣化）。
また、最近、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン、コレステロールを短時間に分析定量できる専用分離カラムも販売されているが、非常に高価であり、これらの分離カラムにおいても上記のように分析対象物以外の蛋白質や脂質が非特異的に吸着し、分離カラムの耐久性が悪い問題がある。
分離カラムの耐久性が向上すると測定に関わるコスト（ランニングコスト）も非常に安くなるメリットがある。
【０００９】
例えば、ＨｂＡ１ｃの測定において分離カラムが劣化する場合は、主として、血液検体中の充填剤に強く保持される成分が徐々に充填剤に蓄積し、充填剤中の有効なイオン交換基が少なくなる場合である。その結果、分離カラム内における各ヘモグロビン成分の保持挙動が変わることになるのである。
【００１０】
上記問題点を解決するために、従来行われているカラムの再生方法として、高速液体クロマトグラフ分析（改訂版）（日本分析化学会関東支部編，編者：社団法人，日本分析化学会関東支部，発行者：森田  勝久，昭和６０年５月３０日改訂版第２刷，ｐ１０４，７．５カラムの寿命と再生）には以下の方法１及び２が記載されている。
第１の方法では、非可逆吸着を起こし、充填剤の表面の性質が変わって、標準サンプルの溶離パターンが変化したような場合には、表面をコーティングしている物質を良く溶解するような溶媒を用いて洗浄するのみで回復する。
また、第２の方法では、イオン交換樹脂は、１Ｎ塩酸および１Ｎ水酸化ナトリウムで洗浄後、１〜２Ｎの食塩水で平衡にしたのち超音波洗浄器を用いて洗う。
通常はこの方法で良いが、蛋白質などが強く吸着されている場合には、１〜２Ｎの水酸化ナトリウムで処理するかプロテアーゼのような酵素を用いて分離溶出させる。もし以上のような処理を行っても回復しない場合には10％ぐらいの次亜塩素酸ソーダで処理するとほとんどの場合回復するが、交換容量が多少変わることがある。
【００１１】
また、上記以外にも以下に示すような方法でカラム耐久性を向上させる方法がある。
【００１２】
例えば、第３の方法として、ＨｂＡ１ｃの定量に際し、分離カラムを洗浄するために、測定時とは送液方法を逆方向とし、０．５％ＳＤＳ＋０．５ＭのＮａＯＨからなる洗浄液を通液する方法が知られている（ファルマシア社製、ＦＰＬＣ：アプリケーションファイルＮｏ．１３「ＨｂＡ１ｃの定量」、１９８５年３月発行）。
【００１３】
特開平５−２８１２２２号公報には、第４の方法として、血液試料中のヘモグロビン類をクロマトグラフィーにより分析するに際し、Ｓ−カルボキシアルキル−Ｌ−システインを１００ｍＭ以下の濃度で含むリン酸系緩衝液を、分析工程の途中において分離カラムを供給する方法が開示されている。この方法では、上記液体は、測定に際して溶離液として用いられてもよく、分離カラムを洗浄液として用いられてもよい旨が示されている。
【００１４】
第５の方法として、特開平６−９４６９号公報には、液体クロマトグラフ用分離カラムが、保存中または使用中に官能基の変化により劣化するのを防止するために、分離カラム中の充填剤の化学修飾基と同じ構造を分子中に有する成分を含む溶液を分離カラム洗浄液として用いる方法が開示されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記第１の方法では、洗浄した溶媒を完全に充填剤から取り除かないと分離パターンが変化してしまう。溶媒を取り除くためには、充填剤を乾燥しカラムに再充填する必要があるため作業が非常に煩雑である。
上記第２の方法の塩酸、水酸化ナトリウムで処理するだけでは、カラム再生が不十分である。また、プロテアーゼのような酵素を用いた後、その酵素を除く方法は非常に煩雑で、また、プロテーアゼ処理だけでは、脂質などの除去が不十分である。１０％ぐらいの次亜塩素酸ソーダで処理すると交換容量が多少変わることがある。
上記第３の方法では、洗浄液に界面活性剤を含むので、カラム内に気泡が入りカラム劣化の原因となる。
【００１６】
第４及び第５の方法では、洗浄効果を目的として上記有機化合物を添加した場合に、ヘモグロビン類の分離を短時間にかつ高分離能で行うことを可能とするように溶離液を設計することが困難となることがある。
【００１７】
本発明の目的は、上述した従来技術の諸欠点を解消し、カラムの洗浄能力が強く、カラムを充分に再生でき、カラムの耐久性を向上し得るカラム洗浄液を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明（以下、本発明１という）では、液体クロマトグラフィー用カラムの洗浄液において、カオトロピックイオンを含み、かつ、ｐＨが２．０〜４．５、及び／又は、ｐＨが７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤を含むカラム洗浄液（以下、洗浄液と略記する場合がある）を提供する。
また、請求項２記載の本発明（以下、本発明２という）では、液体クロマトグラフィー用カラムの洗浄液において、カオトロピックイオンを含み、かつ、ｐＨが７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤を含み、少なくともカチオン交換基を有する充填剤からなるカラムの洗浄に用いることを特徴とするカラム洗浄液を提供する。
また、請求項３記載の本発明（以下、本発明３という）では、液体クロマトグラフィー用カラムの洗浄液において、カオトロピックイオンを含み、かつ、ｐＨが２．０〜４．５で緩衝能を持つ緩衝剤を含み、少なくともアニオン交換基を有する充填剤からなるカラムの洗浄に用いることを特徴とするカラム洗浄液を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
［カラム洗浄液］
（カオトロピックイオン）
本発明におけるカオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じたイオンであり、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するものである。
【００２１】
上記カオトロピックイオンとしては、過塩素酸イオンが用いられる。
【００２２】
上記洗浄液中のカオトロピックイオンの濃度が、１ｍＭより低いとカラム洗浄効果が小さい、また、３０００ｍＭよりも高くてもカラム洗浄効果が期待できない。洗浄液中のカオトロピックイオンの濃度は１ｍＭ〜３０００ｍＭが好ましく、１０ｍＭ〜１０００ｍＭがより好ましく、更に、５０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましい。
また、上記カオトロピックイオンは複数種混合して用いても良い。
本発明のカラム洗浄液のｐＨは、２．０〜４．５又は、７．０〜１２．０であるのが好ましい。
【００２３】
（緩衝剤）
本発明におけるｐＨが２．０〜４．５、または、ｐＨが７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤とは以下のものがある。
【００２４】
ｐＨ２．０〜４．５で緩衝能を有する物質として、無機酸、有機酸またはこれらの塩が含まれる。
上記無機酸としては、例えば、リン酸等が挙げられる。上記有機酸としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、ピロリン酸等が挙げられる。
【００２５】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等が挙げられる。
上記ジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β、β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸、アミノ酪酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン等が挙げられる。
【００２６】
上記ｐＨ２．０〜４．５で緩衝能を有する物質とは、少なくとも一つのｐＫａ（酸解離定数）が１．５〜５．２であるものが好ましく、より好ましくは１．８〜５．０のものが好ましい。
【００２７】
上記無機酸または有機酸の塩としては、公知のもので良く、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００２８】
上記無機酸、有機酸またはこれらの塩は、複数種混合して用いても良く、無機酸と有機酸を混合して用いても良い。
【００２９】
ｐＨ７．０〜１２．０で緩衝能を有する物質として、例えば、無機物としてリン酸、ホウ酸、炭酸等が挙げられ、有機物として、例えば、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等が挙げられる。
【００３０】
上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、マレイン酸等が挙げられる。
上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β’−ジメチルグルタル酸、５，５−ジエチルバルビツール酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸等が挙げられる。
上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、ヒスチジン、セリン、ロイシン等が挙げられる。
上記アミン類としては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジエタノールアミン等が挙げられる。上記イミダゾール類としては、例えば、イミダゾール、５（４）−ヒドロキシイミダゾール、５（４）−メチルイミダゾール、２，５（４）−ジメチルイミダゾール等が挙げられる。
上記アルコール類としては、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
【００３１】
また、上記緩衝剤としては、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミドジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ）プロパン（Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（Ｔｒｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、グリシン、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものを組成する物質も使用できる。これらの物質のｐＫａを表１・２に示す（引用文献：堀尾武一・山下仁平  蛋白質・酵素の基礎実験法  南江堂  １９８５年）。
【００３２】
【表１】
0004473999.tif 000002
【００３３】
【表２】
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【００３４】
ｐＨ７．０〜１２．０で緩衝能を有する物質とは、少なくとも一つのｐＫａ（酸解離定数）が５．３〜１１．５であるものが好ましく、より好ましくは５．５〜１１．０のものが好ましい。
【００３５】
上記緩衝剤の洗浄液中の濃度、及びこれら緩衝剤を複数種用いる場合には、これら複数種の合計の濃度は、洗浄液のｐＨを２．０〜４．５、または、７．０〜１２．０にする緩衝作用があれば良く、その濃度としては、１〜１０００ｍＭが好ましく、更には１０〜５００ｍＭが好ましい。
【００３６】
また、上記洗浄液には、以下の物質を添加しても良い。
【００３７】
（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等）を添加しても良い。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
【００３８】
（２）ｐＨ調節剤として、公知の酸、塩基を加えても良い。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．００１〜５００ｍＭである。
【００３９】
（３）メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を混合しても良い。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％（ｖ／ｖ）であり、カオトロピックイオン、無機酸、有機酸、これらの塩等が析出しない程度であって、かつ、分離パターンに悪影響を与えない範囲で用いるのが好ましい。
【００４０】
（４）アジ化ナトリウム、チモール等の防腐剤を添加しても良い。
上記のｐＨ２．０〜４．５で緩衝能を持つ緩衝剤とｐＨ７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤を同一洗浄液中に添加して用いると同一洗浄液のｐＨを酸性側、または、アルカリ側に変えるだけで２種類の洗浄液を調製出来るメリットがある。
また、本発明の洗浄液を１検体測定後のカラム洗浄液としても用いても良い。その場合、勾配溶出法、あるいは段階溶出法によって送液しても良い。
【００４１】
また、本発明におけるカラム洗浄液は、従来公知のカラム再生方法に用いるカラム洗浄液として用いて良い。
【００４２】
発明におけるカラム洗浄液は、液体クロマトグラフ装置の特定の局面で、少なくとも１種の溶離液としても用いて良い。
【００４３】
［充填剤］
本発明において充填剤は、公知のものでよく特に制限はない。  このような、充填剤としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
但し、上記シリカ等は、アルカリで溶解するので、上記カラム洗浄液のｐＨは、これらが溶解しない範囲で設定することが好ましい。
【００４４】
また、ＬＣの分離は、充填剤の表面官能基と測定対象試料との相互作用により決まるため、充填剤表面の官能基種は、適用するＬＣの分離モードによって、以下のように選択され、これらの官能基を持つ充填剤が使用される。
【００４５】
（イオン交換クロマトグラフィー用充填剤）
上記充填剤には、イオン交換基として、カチオン交換基又は、アニオン交換基を含有するものを用いるのが好ましい。
【００４６】
上記カチオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基等が挙げられる。また、このカチオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００４７】
上記アニオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、３級アミノ基や４級アミノ基などのアニオン交換基等が挙げられる。また、このアニオン交換基は、複数種導入しても良い。
【００４８】
（ゲル浸透クロマトグラフィー用充填剤）
上記充填剤には、水酸基、エポキシ基等の非イオン性親水基を含有するものを用いるのが好ましい。
【００４９】
（逆相クロマトグラフィー用充填剤）
上記充填剤には、オクチル基やオクタデシル基などのアルキル基、あるいはフェニル基等の疎水性基を含有するものを用いるのが好ましい。
【００５０】
上記充填剤は、単独に、あるいは複数種の充填剤を組み合わせたものに、本カラム洗浄液は用いることができる。
【００５１】
上記粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。
また、粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均直径×１００（％））として、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。
【００５２】
［カラム］
上記充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。カラムのサイズは、内径０．１〜５０ｍｍ、長さ１〜３００ｍｍのものが好ましく、より好ましくは、内径０．２〜３０ｍｍ、長さ５〜２００ｍｍである。
【００５３】
上記カラムの素材としては、特に限定されず、公知のステンレス製等の金属、ガラス製、ＰＥＥＫ等の樹脂製などが用いられる。
また、カラムの充填剤とカラム本体が接する部位を、不活性な素材で被覆してもよく、その素材としては、例えばＰＥＥＫ、ポリエチレン、テフロン、チタン化合物、珪素化合物、シリコン膜等が挙げられる。
【００５４】
［装置］
本発明に使用されるＬＣ装置は、公知のもので良く、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器等から構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置等）が適宜付加されても良い。
【００５５】
また、本発明の測定方法における溶出方法は、公知の方法でよく、段階溶出法、勾配溶出、ステップアップグラディエント溶出を行ってもよい。
【００５６】
上記測定方法における、他の測定条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．２〜３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μｌ程度である。
【００５７】
［溶離液］
本発明の溶離液は、液体クロマトグラフ装置において測定対象成分に応じて用いられている適宜の溶離液により構成されていることが好ましい。
【００５８】
（ヘモグロビン類の分析の場合）
特にヘモグロビン類の分析の場合、ＨｂＡ０の溶出に際し、すなわち、ＨｂＡ１ｃより強く充填剤に保持されたＨｂＡ等から成る「ＨｂＡ０成分」を溶出するためには、カラムに流入する際のｐＨをヘモグロビンの等電点よりアルカリ側になるように設定した溶離液を用いるのが好ましい。この条件を実現するには、ｐＨがヘモグロビンの等電点よりアルカリ側であるひとつの溶離液を送液する方法や、ｐＨの異なる２種以上の溶離液を用いる方法がある。
【００５９】
ヘモグロビンはｐＨが等電点より酸性側からアルカリ側になると、総荷電がプラスからマイナスに変わるため、充填剤の陽イオン交換基との「電気的反発力によってＨｂＡ０成分を溶出」させることができる。
【００６０】
なお、理化学辞典（第４版、１９８７年９月、岩波書店、久保亮五ら編集）、１１７８頁に記載されているように、ヘモグロビンの等電点はｐＨ６．８〜７．０である。そのため、ＨｂＡ０成分を溶出するために、カラムに流入する際の溶離液のｐＨを６．８以上にすることがより好ましい。
【００６１】
この条件を満たすため、測定に用いる溶離液の内、少なくともひとつの溶離液のｐＨが６．８以上であることが必要である。本溶離液のｐＨは望ましくは７．０〜１２．０であり、７．５〜１１．０がより好ましく、更には８．０〜９．５が好ましい。溶離液のｐＨが６．８未満になるとＨｂＡ０成分の溶出が不十分となる。溶離液のｐＨは、用いる充填剤の分解が起こらない範囲に設定すれば良い。
【００６２】
ＨｂＡ０成分の溶出に好適に用いられる、ｐＨが６．８以上で緩衝能をもつ溶離液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機酸または、その塩；クエン酸等のヒドロキシカルボン酸、β、β−ジメチルグルタル酸等のカルボン酸誘導体、マレイン酸等のジカルボン酸、カコジル酸、等の有機酸または、その塩からなる緩衝液が挙げられる。その他、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものも使用できる。また、ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの緩衝液；ＧＴＡ緩衝液も使用できる。また、イミダゾール等のイミダゾール類；エチレンジアミン、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類；グリシン、β−アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン等のアミノ酸類；等の有機物も使用できる。
【００６３】
また、無機酸；有機酸；無機酸または有機酸の塩；有機物は、複数混合して用いても良く、また、有機酸、無機酸及び有機物を混合しても良い。
【００６４】
（作用）
本発明１のカラム洗浄液は、カオトロピックイオンを含み、かつ、ｐＨが２．０〜４．５及び／又は、ｐＨが７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤からなるため、カラム中の充填剤に非特異的に吸着した蛋白質・脂質を十分に洗浄する効果があるので、カラム再生及び洗浄において容易に用いることができるばかりでなく、幅広いカラムに使用できる汎用性の高いものである。
【００６５】
【実施例】
次に、実施例、比較例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００６６】
（実施例１）
カチオン交換クロマトグラフィーにより、ヒト血液中のＨｂ類の測定を行った。
（充填剤の調製）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学製）４００ｇ、メタクリル酸（和光純薬）１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学製）水溶液２５００ｍＬに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μm の粒子を得た（充填剤１）。
（カラムの充填）
得られた充填剤１を以下の方法でカラムに充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（内径４．６×３５mm）を接続したパッカー（梅谷精機製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００６７】
0004473999.tif 000004
【００６８】
（測定試料の調整）
健常人血をフッ化ナトリウム採血した全血検体を溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
（測定結果）
上記測定条件により、試料を測定して得られたクロマトグラムを図１に示した。ピーク１はＨｂＡ１ａおよびＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０を示す。図から解るように、いずれのピークも良好に分離された。
（カラム耐久性の評価）
測定試料を２００検体測定する毎に、本発明のカラム洗浄液を１分間流し、溶離液Ａ（専用溶離液５０Ａ）を２分間流し、測定試料を４０００検体測定した。
上記測定試料を１０００検体、２０００検体、３０００検体、４０００検体測定したときのヘモグロビンＡ１ｃ値の変動を図２に示した。これより実施例１は、測定試料を４０００検体測定してもＨｂＡ１ｃ値の変動は、初期に比べて測定値の３％以内と測定値の変化がなく良好な耐久性を有する。
【００６９】
（比較例１）
カラム洗浄液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１２．０）を用いた以外は、実施例１と同様にしてカラム耐久性を評価した。
（カラム耐久性評価結果）
結果を図２に示した。比較例１では、ＨｂＡ１ｃの保持時間が早くなり、ＨｂＡ１ｃ値の変動が次第に大きくなりカラム耐久性が悪い。
【００７０】
（実施例２）
ゲル浸透クロマトグラフィーによりリポ蛋白の測定を行った。
（カラム）
リポ蛋白専用カラム（ＬＩＰＯＰＲＯＰＫ, 内径７．５ｍｍ長さ３０ｃｍ：東ソー社製）
0004473999.tif 000005
上記システムにより、血清５μＬを注入し、カラムからの溶出液に酵素液を送り込み４５℃で反応（テフロンチューブ内径０．４ｍｍ、長さ７．５ｍｍ）させた後、吸光度５５０ｎｍで検出した。
【００７１】
（測定試料）
健常人血の血清を用いた。
（カラム耐久性の評価）
測定試料を５０検体測定する毎に、本発明のカラム洗浄液を１分間流し、専用溶離液を２分間流し、測定試料を１０００検体測定した。結果を図３に示した。
上記測定試料を３００検体、６００検体、１０００検体測定したときのリポタンパク値（ＨＤＬ値）の変動の度合で評価した。
これより実施例２は、測定試料を１０００検体測定してもＨＤＬ値の変動は、初期に比べて測定値の３％以内と測定値の変化がなく良好な耐久性を有する。
【００７２】
（比較例２）
カラム洗浄液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１２．０）を用いた以外は、実施例２と同様にしてカラム耐久性を評価した。
（カラム耐久性評価結果）
結果を図３に示した。比較例２では、ＨＤＬ値の変動が次第に大きくなりカラム耐久性が悪い。
【００７３】
（実施例３）
陰イオン交換クロマトグラフィーにより蛋白アルブミンの測定を行った。
（カラム）
Ｓｈｏｄｅｘ  ＩＥＣ  ＤＥＡＤ−４２０Ｎ, 内径４．６ｍｍ長さ３５ｃｍ：昭和電工社製）
0004473999.tif 000006
【００７４】
（測定試料）
卵白アルブンミン水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）
（カラム耐久性の評価）
測定試料を５０検体測定する毎に、本発明のカラム洗浄液を１分間流し、溶離液Ａを２分間流し、測定試料を１０００検体測定した。結果を図４に示した。  上記測定試料を３００検体、６００検体、１０００検体測定したときのアルブミン値の変動で評価した。
これより実施例３は、測定試料を１０００検体測定してもアルブミン値の変動は、初期に比べて測定値の３％以内と測定値の変化がなく良好な耐久性を有する。
【００７５】
（比較例３）
カラム洗浄液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）を用いた以外は、実施例３と同様にしてカラム耐久性を評価した。
（カラム耐久性評価結果）
結果を図４に示した。比較例３では、アルブミン値の変動は、次第に大きくなりカラム耐久性が悪かった。
【００７６】
（実施例４）
逆相クロマトグラフィーにより、リボヌクレアーゼの測定を行った。
（カラム）
ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ，内径６．０ｍｍ長さ１５０ｍｍ：昭和電工社製）
0004473999.tif 000007
【００７７】
（測定試料）
リボヌクレアーゼ水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）
（カラム耐久性の評価）
測定試料を５０検体測定する毎に、本発明のカラム洗浄液を１分間流し、溶離液Ａを２分間流し、測定試料を１０００検体測定した。結果を図５に示した。  上記測定試料を３００検体、６００検体、１０００検体測定したときのリボヌクレアーゼの値の変動で評価した。
これより実施例４は、測定試料を１０００検体測定してもリボヌクレアーゼ値の変動は、測定値の３％以内と測定値の変化がなく良好な耐久性を有する。
【００７８】
（比較例４）
カラム洗浄液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）を用いた以外は、実施例４と同様にしてカラム耐久性を評価した。
（カラム耐久性評価結果）
結果を図５に示した。比較例４では、リボヌクレアーゼ値の変動は、次第に大きくなりカラム耐久性が悪かった。
【００７９】
（実施例５）
液体クロマトグラフ装置の自動洗浄を行い測定を行った。
（装置類）
高速液体クロマトグラフ装置（京都第一科学社製、自動グリコヘモグロビン測定装置ＨＡ−８１３１）を改良し、図６に示した液体クロマトグラフ装置を構成した。分離カラム１３としては、上記液体クロマトグラフ装置専用のカラム（積水化学工業社製、カラムユニット−ＨＳIII ）を用いた。ここでは、検体の測定回数が、予め決められた基準回数になった場合に、カラムの洗浄操作を行うように改良したクロマトグラフ装置を用いた。
【００８０】
図６に示した液体クロマトグラフ装置の動作説明に従って複数の検体を測定した。この場合、段階溶出法を用い、溶離液１を１０８秒、溶離液２を１２秒、溶離液１を６０秒送液することにより１回の測定に際しての送液を行った。
【００８１】
（溶離液）
溶離液１，２としては、上記液体クロマトグラフ装置専用溶離液である積水化学工業社製溶離液１（５０ｍＭの過塩素酸を含有するリン酸緩衝液、ｐＨ＝５．３）及び溶離液２（３００ｍＭの過塩素酸を含有するリン酸緩衝液、ｐＨ＝８．５）を用いた。なお、洗浄液としては、上記溶離液１，溶離液２を下記の方法で用いた。
（洗浄液）
すなわち、洗浄液の代わりに溶離液１，２を以下のように送液した。すなわち、洗浄液として溶離液１，２を用い、溶離液２を１０８秒送液し、次に溶離液１を７２秒送液することにより洗浄操作を行った。
【００８２】
血液試料を調製するのに、赤血球を溶血し希釈するため溶血洗浄液（上記液体クロマトグラフ装置専用溶血洗浄液）を用いた。
測定及び洗浄に際しての測定流路を流れる溶離液１，２の流速はいずれも２ｍｌ／分とした。
【００８３】
（測定試料）
検体としては、抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｋが収容された採血管（積水化学工業社製、商品名：インセパック−Ｅ）で採血した全血を検体とした。本液体クロマトグラフ装置では、採血管から全血が採取され、この全血が上記溶血洗浄液により溶血されて自動的に溶血希釈試料が調製される。
【００８４】
（カラム耐久性評価結果）
洗浄操作を行う基準回数を３００とし、１５００回の測定を行った。この場合、分離カラム１３の初期状態のＨｂＡ１ｃの保持時間を１００とし、各測定回数ごとに測定されたＨｂＡ１ｃの保持時間を記録した。結果を図７に実線Ａで示す。実線Ａから明らかなように、１５００回測定した場合であっても、ＨｂＡ１ｃの保持時間はほとんど変動しなかった。なお、洗浄に際しての分離カラム流入部の溶離液ｐＨを測定したところ、８．２であった。
【００８５】
（比較例５）
洗浄操作を行わなかったことを除いては、実施例５と同様にして測定を行った。結果を図７に破線で示す。
図７から明らかなように、洗浄操作を行わなかった場合には、ＨｂＡ１ｃの保持時間は、測定回数が増加するにつれて早くなることがわかる。
【００８６】
（実施例６）
測定カウンタを使用しないこと及びＨｂＡ１ｃの保持時間が、定められた範囲からはずれている場合に、カラムの洗浄操作を行うように改良したことを除いては、実施例５と同じ装置を用い、実施例５と同様にして溶離液１，２を送液した。すなわち、分離カラム１３の初期状態のＨｂＡ１ｃの保持時間を１００とし、該保持時間が９５以上を設定範囲とした。従って、保持時間が９５未満になった場合に、洗浄操作を開始することとした。
【００８７】
また、洗浄に際しては、段階溶出法に従って、溶離液２を１０８秒送液し、次に溶離液１を７２秒送液した。すなわち洗浄液は用いなかった。
実施例５と同様にして実施例５で用いたのと同じ試料を２５００回測定した。結果を図８に示す。図８から明らかなように、約４５０回測定した後、保持時間が速くなり、約８００回測定したところで基準値を下回ったので自動洗浄が開始された。自動洗浄後には保持時間はもとにレベルに復帰した。従って、最終的に２５００回測定したところ、自動洗浄が３回行われ、２５００回の測定まで、高精度にＨｂＡ１ｃを測定し得ることが確かめられた。
【００８８】
【発明の効果】
本発明のカラム洗浄液は、カオトロピックイオンを含み、かつ、ｐＨが２．０〜４．５、及び／又は、ｐＨが７．０〜１２．０で緩衝能を持つ緩衝剤からなるので、カラム中の充填剤に非特異的に吸着した蛋白質・脂質を十分に洗浄する効果があり、カラム再生及び洗浄において容易に用いることができるばかりでなく、幅広いカラムに使用できる汎用性の高いものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の測定条件により、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】実施例１及び比較例１における測定回数の増加にともなうＨｂＡ１ｃ値の変動を示す図。
【図３】実施例２及び比較例２における測定回数の増加にともなうＨＤＬ値の変動を示す図。
【図４】実施例３及び比較例３における測定回数の増加にともなうアルブミンの変動を示す図。
【図５】実施例４及び比較例４における測定回数の増加にともなうリボヌクレアーゼの変動を示す図。
【図６】実施例５に係る液体クロマトグラフ装置の概略ブロック図。
【図７】実施例５及び比較例５における測定回数の増加にともなうＨｂＡ１ｃの保持時間の変化を示す図。
【図８】実施例６において、測定回数の増加によるＨｂＡ１ｃの保持時間の変化を示す図。
【符号の説明】
１  ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
２  ＨｂＦのピーク
３  不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４  安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５  ＨｂＡ０のピーク
１１  送液手段
１２  制御手段
１３  分離カラム
１４  検出手段
１５  試料注入手段
１６  検体検知手段
１７  測定カウンタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004473999.tif 000012
【図６】
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【図７】
0004473999.tif 000014
【図８】
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