(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜５個の二重結合をもつ高度不飽和Ｃ１８−、Ｃ２０−またはＣ２２−脂肪酸の含量が増大した脂肪酸エステルの生産方法であって、脂肪酸エステルを産生する酵母または植物に、
ａ）配列番号１に示す核酸配列からなるポリヌクレオチド；
ｂ）遺伝暗号の縮重のため、配列番号２に示すアミノ酸配列を逆翻訳することによって得られる核酸配列からなるポリヌクレオチド；
ｃ）ポリペプチドのデサチュラーゼ活性を低減させることなく配列番号２に示すアミノ酸配列の全長に対してアミノ酸配列レベルで少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入し、該酵母または植物を生育させて、該酵母または植物内に存在する脂肪酸エステルを単離することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
Ｃ１８−、Ｃ２０−またはＣ２２−脂肪酸分子が油または脂質の形態で前記酵母または植物から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂肪酸エステルを産生する酵母または植物に、配列番号１、配列番号３および配列番号９の核酸配列からなるポリヌクレオチドの組合せを導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪酸エステルが、その脂肪酸エステル中に３個、４個または５個の二重結合をもつＣ１８−、Ｃ２０−またはＣ２２−脂肪酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記脂肪酸エステル中に含まれる高度不飽和脂肪酸を遊離させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
デサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号１に示す核酸配列からなるポリヌクレオチド；
ｂ）遺伝暗号の縮重のため、配列番号２に示すアミノ酸配列を逆翻訳することによって得られる核酸配列からなるポリヌクレオチド；
ｃ）ポリペプチドのデサチュラーゼ活性を低減させることなく配列番号２に示すアミノ酸配列の全長に対してアミノ酸配列レベルで少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
からなる群より選択される、上記ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１に示す配列によりコードされる、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが１以上の調節シグナ
ルに連結されている、核酸構築物。
【請求項１０】
脂肪酸または脂質代謝の別の生合成遺伝子が前記核酸構築物中に存在する、請求項９に
記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記核酸構築物中に存在する脂肪酸または脂質代謝の生合成遺伝子が、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシルＡＣＰ［＝アシルキャリアータンパク質］デサチュラーゼ、アシルＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、アシル補酵素Ａオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロペルオキシドリアーゼ、または脂肪酸エロンガーゼからなる群より選択される遺伝子である、請求項９または１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載の核酸構築物を含有するベクター。
【請求項１３】
請求項６に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、請求項９に記載の少なくとも１つの核酸構築物、または請求項１２に記載の少なくとも１つのベクターを含有する酵母または植物。
【請求項１４】
請求項６に記載の機能性のポリヌクレオチド、請求項９に記載の機能性の核酸構築物、または請求項１２に記載の機能性のベクターを含有するトランスジェニック植物。
【請求項１５】
トランスジェニック植物を作製するための請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載の核酸構築物の使用。
【請求項１６】
請求項６に記載のポリヌクレオチドの１つによりコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドの相補配列を含むアンチセンス核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２個の二重結合をもつ不飽和脂肪酸の生産方法、および／または、少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和脂肪酸の含量が増大したトリグリセリドの生産方法に関する。本発明はさらに、前記方法における、また、不飽和C18-、C20-またはC22-脂肪酸を含む脂肪酸、油もしくは脂質の含量が増大したトランスジェニック生物（好ましくは、トランスジェニック植物またはトランスジェニック微生物）を作製するための、配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号11に示す核酸配列の有利な使用に関する。
【０００２】
本発明はさらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号11に示す核酸配列を有する新規デサチュラーゼ、またはその相同体、誘導体もしくは類似体、および上記遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体を含む遺伝子構築物、ならびにそれらを単独でまたは高度不飽和脂肪酸の生合成遺伝子（有利には、配列番号７および配列番号９に示すもの）と組み合わせて使用することに関する。
【０００３】
さらに、本発明は、単離された核酸配列；該核酸配列を含む発現カセット；少なくとも１つの該核酸配列または発現カセットを含むベクターおよびトランスジェニック生物に関する。その上、本発明は、少なくとも２個の二重結合をもつ不飽和脂肪酸、および少なくとも２個の二重結合をもつ不飽和脂肪酸の含量が増大したトリグリセリドに関する。
【０００４】
さらに、本発明は、種子特異的発現のための多重発現カセット、ならびに該発現カセットを用いてデサチュラーゼ遺伝子を、単独でまたは配列番号７の配列を有する別のデサチュラーゼおよび／または配列番号９の配列を有するエロンガーゼ遺伝子またはその相同体、誘導体もしくは類似体と組み合わせて、含むベクターまたは生物に関する。
【背景技術】
【０００５】
微生物、動物細胞および植物細胞の天然の代謝過程で生じるいくつかの産物および副産物は、飼料産業、食品産業、化粧品産業、医薬品産業を含めて、様々な産業において利用されている。こうした分子は、まとめて「ファインケミカル」(fine chemicals)と呼ばれているが、例えば脂質および脂肪酸を含み、その代表的な１つのクラスが高度不飽和脂肪酸である。脂肪酸およびトリグリセリドは食品産業、動物栄養、化粧品および医薬品の分野で多様な用途を有している。それらが遊離の飽和または不飽和脂肪酸の形をとるのか、あるいは飽和または不飽和脂肪酸の含量が高いトリグリセリドの形をとるのかに応じて、それらは様々な用途に適している。例えば、高度不飽和脂肪酸(PUFA)は、小児用配合物にその栄養価を高める目的で添加される。また、PUFAはヒトの血中コレステロールレベルを下げるように作用し、したがって心臓病の予防に有用である。こうして、それらはいろいろな治療食や薬剤において用いられている。
【０００６】
PUFAの生産に特に適している微生物は、ヤブレツボカビ属(Thraustochytria)またはシゾキトリウム属(Schizochytria)の系統のような微生物、海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)またはクリプトコジニウム属(Crypthecodinium)のような藻類、スチロニキア属(Stylonychia)またはコルピディウム属(Colpidium)のような繊毛虫類、糸状菌モルティエレラ属(Mortierella)、疫病菌エントモフトラ属(Entomophthora)またはケカビ属(Mucor)のような真菌類である。PUFAをはじめとする一連の望ましい化合物を産生する対象の微生物の突然変異株が、菌株選別によって数多く開発されてきた。しかし、ある種の分子の向上した生産を示す菌株の選択には時間と手間がかかる。
【０００７】
代替法として、ファインケミカルは、PUFAを産生するように開発された植物を大規模栽培することにより便利に取得することができる。この目的に特によく適合する植物は、多量の脂質化合物を含有する油脂作物、例えば、アブラナ、キャノーラ、アマニ、ダイズ、ヒマワリ、ルリチシャ、マツヨイグサなどである。しかし、本発明の詳細な説明で述べるように、油または脂質と脂肪酸を含むその他の作物もよく適合する。通常の植物品種改良により、ある範囲の望ましい脂質と脂肪酸、または補因子と酵素を産生する一連の突然変異植物が開発されてきた。しかし、特定の分子の生産が向上している新規植物変種を選択するには時間と労力がかかり、そして高度不飽和C18-、C20-脂肪酸およびC22-脂肪酸、またはより長い炭素鎖をもつ脂肪酸の場合のように、その化合物が対象の植物中にもともと存在しない場合には実際不可能でさえある。
【０００８】
不飽和脂肪酸の好ましい性質のため、これまで、不飽和脂肪酸含量を変化させた油を各種生物に生産させるために、脂肪酸やトリグリセリドの合成に関与する遺伝子を利用可能にしようとする努力が続けられてきた。こうして、WO 91/13972およびそのUS対応物はΔ9-デサチュラーゼを開示している。Δ15-デサチュラーゼはWO 93/11245に特許請求されており、また、Δ12-デサチュラーゼはWO 94/11516に特許請求されている。Δ6-デサチュラーゼは、WO 93/06712、US 5,614,393、WO 96/21022およびWO 99/27111に記載されている。さらなるデサチュラーゼは、例えば、EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukeyら、J. Biol. Chem., 265, 1990: 21144-20149, Wadaら、Nature 347, 1990: 200-203またはHuangら、Lipids 34, 1999: 649-659に記載されている。Δ6-パルミトイルACPデサチュラーゼはWO 96/13591に記載され特許請求されている。しかし、各種のデサチュラーゼの生化学的特徴づけはまだ不十分である。なんとなれば、これらの酵素は膜結合型のタンパク質であるため、単離して特徴づけるのが非常に厄介だからである（McKeonら、Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wangら、Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792）。
【０００９】
酵母では、不飽和脂肪酸への脂肪酸スペクトルのシフトおよび生産性の向上が見出されている（Huangら、Lipids 34, 1999: 649-659, Napierら、Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614）。しかしながら、トランスジェニック植物で様々なデサチュラーゼを発現させることは望ましい成功を収めなかった。不飽和脂肪酸への脂肪酸スペクトルのシフトが認められたが、トランスジェニック植物の合成能が劇的に低下し、つまり、もとの植物と比べてほんの少量の油しか得られないという問題が持ち上がった。
【００１０】
酵母も植物も自然界では、アラキドン酸(ARA)、エイコサペンタエン酸(EPA)および／またはドコサヘキサエン酸(DHA)のような、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和C20-および／またはC22-脂肪酸を生産しない。
【００１１】
このような理由で、不飽和脂肪酸の生合成に関与しかつ工業的規模でのそれらの生産を可能にする酵素をコードする新規遺伝子の必要性が依然として大きい。従来のバイオテクノロジーによる高度不飽和脂肪酸の生産方法はどれも、上記脂肪酸を経済上有効な量で生産するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、高度不飽和脂肪酸の合成用の更なる酵素を提供することであり、また、高度不飽和脂肪酸の生産方法においてこれらの酵素を、他の酵素の存在下または不在下で、用いることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的は、少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和脂肪酸の含量が増大した脂肪酸エステルの新規生産方法により達成され、この方法は、脂肪酸エステルを産生する生物に、
a)  配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号11に示す配列を有する核酸配列；
b)  遺伝暗号の縮重のため、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号12に示すアミノ酸配列を逆翻訳することによって得られる核酸配列；
c)  配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号12に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ該ポリペプチドの酵素作用を実質的に低減させることなくアミノ酸レベルで少なくとも50％の相同性を有する、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号11に示す核酸配列の誘導体；
からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を導入し、該生物を生育させて、該生物内に存在する脂肪酸エステルを単離することを含んでなる。
【００１４】
本発明の方法で用いる核酸配列は、Δ5-、Δ6-またはΔ12-デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列である。
【００１５】
本発明の方法では、脂肪酸エステル中に少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和C18-、C20-および／またはC22-脂肪酸分子を有する脂肪酸エステルを生産することが有利である。これらの脂肪酸分子は３、４または５個の二重結合をもつことが好ましく、そしてアラキドン酸(ARA)、エイコサペンタエン酸(EPA)またはドコサヘキサエン酸(DHA)の合成をもたらすことが有利である。
【００１６】
高度不飽和C18-、C20-および／またはC22-脂肪酸分子を有する脂肪酸エステルは、かかる脂肪酸エステルを油または脂質の形で（例えば、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖脂質、リン脂質、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、または少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和脂肪酸を有する他の脂肪酸エステルのような化合物の形で）生産するために使用される生物から単離することができる。
【００１７】
本発明の方法による生産に適する生物は、原則として、あらゆる原核または真核生物であり、例えば、グラム陽性もしくはグラム陰性細菌、真菌、酵母、藻類、繊毛虫、動物もしくは植物の細胞、動物または植物（例えば、コケ類、双子葉植物、単子葉植物など）がある。本発明の方法では、油を産生する生物に属する生物、すなわち、油の生産に用いられる生物を用いることが有利であり、例えば以下の生物である：クリプトコジニウム属(Crypthecodinium)、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、フェオダクチルム属(Phaeodactylum)およびモルティエレラ属(Mortierella)のような微生物、エントモフトラ属(Entomophthora)、ケカビ属(Mucor)、その他の藻類や真菌、ならびに動物または植物、特に植物、好ましくは多量の脂質化合物を含む油脂作物、例えば、ダイズ、落花生、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、ベニバナ、マツヨイグサ、アマニ、ルリチシャ、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナッツ）、または穀物、例えば、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、ワタ、キャッサバ、コショウ、マンジュギク、ナス科植物（例：ジャガイモ、タバコ、ナス、トマト）、ソラマメ属(Vicia species)、エンドウ、アルファルファ、低木の植物（コーヒー、カカオ、チャ）、ヤナギ属(Salix species)、多年生植物および家畜のかいば作物。特に好ましい本発明に従う植物は油脂作物であり、例えば、ダイズ、落花生、アブラナ、キャノーラ、アマニ、マツヨイグサ、ヒマワリ、ベニバナ、または樹木（ギネアアブラヤシ、ココナッツ）が挙げられる。
【００１８】
本発明による方法は、適宜に配列番号７および／または配列番号９に示す配列と共に、配列番号１、３、５、もしくは11に示す本発明のヌクレオチド配列またはその相同体、誘導体もしくは類似体を単独で、または配列番号13〜17からの発現構築物の配列と組み合わせて含有するか、適宜に配列番号７および／または９の配列と共に、配列番号１、３、５、もしくは11の配列またはその相同体、誘導体もしくは類似体を含む遺伝子構築物を含有するか、あるいは上記ヌクレオチド配列または遺伝子構築物を含むベクターを含有する、適当なトランスジェニック生物、またはトランスジェニック微生物を生育させるか、あるいはトランスジェニック植物細胞、組織、器官もしくはインタクトな植物を生育させることにより、本発明の核酸分子の発現をもたらし、その結果としてファインケミカルを産生させることを含んでなる。好ましい実施形態において、本方法はさらに、本発明のデサチュラーゼ核酸の発現をもたらす、そのような本発明の核酸配列、遺伝子構築物またはベクターを単独でまたは組合せで含む細胞（細胞はデサチュラーゼ核酸配列で形質転換される）を取得するステップを含む。さらに好ましい実施形態では、本方法はさらに、そのような培養物からファインケミカルを取得するステップを含む。特に好ましい実施形態では、該細胞は繊毛虫綱、微生物（例えば、真菌）、植物界（特に、油脂作物）に属するものであり、微生物または油脂作物、例えば、落花生、アブラナ、キャノーラ、アマニ、ダイズ、ベニバナ（アザミ）、ヒマワリ、またはルリチシャが特に好ましい。
【００１９】
トランスジェニック／組換えとは、本発明の目的において、本発明による核酸が生物のゲノム中のその天然の位置に存在しないことを意味するものとして理解されるべきである。ここでは、核酸を同種または異種として発現させることが可能である。しかし、トランスジェニック／組換えはまた、本発明による核酸が生物のゲノム中のその天然の位置に存在するが、該配列が天然の配列に対して改変されており、かつ／または天然の配列の調節配列が改変されていることを意味する。トランスジェニック／組換えは、好ましくは、本発明の核酸をゲノム中のもとの位置ではない位置で発現させることを指し、すなわち、核酸の同種発現、好ましくは、異種発現が存在する。好適なトランスジェニック生物は上記のトランスジェニック植物、好ましくは、油脂作物である。
【００２０】
本発明の方法によって生産された脂肪酸エステル中に含まれる高度不飽和脂肪酸は、例えば、KOHまたはNaOHの水溶液のようなアルカリを用いて、有利にはメタノールやエタノールなどのアルコールの存在下で、処理することにより放出させることができ、そして相分離、続いて酸性化（例えば、H2SO4を用いる）を行うことにより単離することができる。
【００２１】
本発明のさらなる主題は、上記の本発明方法により生産された、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合（好ましくは、３、４、５または６個の二重結合）をもつ油、脂質および／または脂肪酸である。本発明の別の主題は、上記の油、脂質および／または脂肪酸を含む組成物、ならびに、飼料、食品、化粧品または医薬品における上記油、脂質および／または脂肪酸あるいは上記組成物の使用である。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、微生物による分子の生産をモジュレートする方法に関する。この方法は、細胞に、本発明によるデサチュラーゼ活性またはデサチュラーゼ核酸の発現をモジュレートする物質を単独でまたは組み合わせて接触させて、細胞に関連した活性が該物質の非存在下での該活性と比較して改変されるようにすることを含んでなる。好ましい実施形態では、脂質と脂肪酸、補因子と酵素のための細胞の１もしくは２代謝経路、または細胞膜を介した化合物の輸送が、該微生物による所望のファインケミカルの生産高または生産率を向上させるようにモジュレートされる。デサチュラーゼ活性をモジュレートする物質は、デサチュラーゼ活性またはデサチュラーゼ核酸の発現を刺激する物質、あるいは脂肪酸生合成における中間体として使用できる物質であり得る。デサチュラーゼ活性またはデサチュラーゼ核酸の発現を刺激する物質の例としては、とりわけ、小分子、活性デサチュラーゼおよび細胞に導入されているデサチュラーゼコード化核酸がある。デサチュラーゼ活性またはデサチュラーゼ発現を阻害する物質の例としては、とりわけ、小分子および／またはアンチセンスデサチュラーゼ核酸分子がある。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、細胞からの所望の化合物の生産高をモジュレートする方法に関し、この方法は、細胞に野生型または変異型デサチュラーゼ遺伝子（別個のプラスミド上に保持されるか、宿主細胞のゲノムに組み込まれる）を導入することを含んでなる。ゲノムへの組込みの場合には、その組込みは、ランダムであってもよいし、天然の遺伝子を導入されるコピーで置き換えて該細胞による所望の化合物の生産をモジュレートするような方法で組換えにより行ってもよいし、あるいは、遺伝子が機能的な発現単位（遺伝子の発現を確実にする少なくとも１つの配列と、機能的に転写された遺伝子のポリアデニル化を確実にする少なくとも１つの配列とを含む）に機能しうる形で連結されるように遺伝子をトランスで用いることにより行ってもよい。
【００２４】
好ましい実施形態においては、生産高（収率）が改変される。さらに好ましい実施形態では、所望のファインケミカルが増加する。また、マイナスの影響を及ぼす望ましくない化合物を減少させることも可能である。特に好ましい実施形態では、所望のファインケミカルは脂質または脂肪酸、補因子または酵素である。特に好ましい実施形態では、このファインケミカルは高度不飽和脂肪酸である。より好ましくは、アラキドン酸（ARA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、またはドコサヘキサエン酸（DHA）から選択される。
【００２５】
本発明は、PUFA生合成のデサチュラーゼを同定し単離するのに適しており、また、油、脂肪酸、脂質、脂質から誘導される化合物を改変するために、最も好ましくは高度不飽和脂肪酸を生産するために、使用することができる新規核酸分子を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、植物において組合せ遺伝子を多重平行して種子特異的に発現させるための多重発現カセットおよび構築物を提供する。
【００２７】
クリプトコジニウム属(Crypthecodinium)、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、フェオダクチルム属(Phaeodactylum)およびモルティエレラ属(Mortierella)のような微生物、エントモフトラ属(Entomophthora)およびケカビ属(Mucor)、その他の藻類や真菌、ならびに植物、特に油脂作物は、本発明による方法に適した生物である。
【００２８】
上記微生物および繊毛虫綱、藻類および関連生物（例えば、海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)）を遺伝子操作するためのクローニングベクターおよびクローニング技術が、WO 98/01572またはFalciatoreら, 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251、およびDunahayら, 1995, Genetic transformation of diatoms, J. Phycol. 31:1004-1012 およびそこに引用される文献に記載されている。こうして、上記核酸分子を本発明の方法においてこれらの生物の遺伝子工学的操作による改変に使用して、それらを１種以上のファインケミカルのより良好なまたはより効率的な生産体にすることができる。このファインケミカルの生産または生産効率の向上は、本発明遺伝子の操作の直接的結果により、またはこの操作の間接的結果によりもたらされる。本発明のためのファインケミカルは、少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和脂肪酸を含む脂肪酸エステル（例えば、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖脂質、リン脂質、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、または少なくとも２個の二重結合をもつ高度不飽和脂肪酸を含む他の脂肪酸エステル）として理解される。それらはさらに、ビタミン、例えば、ビタミンE、ビタミンC、ビタミンB2、ビタミンB6、パントラクトン、カロテノイド（例：アスタキサンチン、β-カロテン、ゼアキサンチンなど）のような化合物として理解される。
【００２９】
コケ類と藻類は、相当量の高度不飽和脂肪酸、例えば、アラキドン酸（ARA）、および／またはエイコサペンタエン酸（EPA）および／またはドコサヘキサエン酸（DHA）を産生する唯一知られた植物系である。コケ類は膜脂質中にPUFAを含有し、一方藻類、藻類に関連した生物、それに一部の真菌は、トリアシルグリセロール画分中に相当量のPUFAを蓄積する。したがって、トリアシルグリセロール画分中にPUFAを蓄積するこのような株から単離される核酸分子は、宿主、特に上記のような微生物、およびアブラナ、キャノーラ、アマニ、ダイズ、ヒマワリ、ルリチシャといった油脂作物のような植物において、脂質およびPUFA産生系を改変するのに特に適している。それゆえ、それらは本発明の方法において有利に使用することができる。したがって、本発明の核酸は、トリアシルグリセロール蓄積微生物由来の核酸を単離するために、また、対象の生物におけるPUFA前駆体分子の生合成を改変するのに適している、他の生物種においてそのようなDNA配列およびそれによりコードされる酵素を同定するために、使用することができる。
【００３０】
トリアシルグリセロール中にARA、EPA、DHAなどのPUFAを蓄積することができる微生物は、海洋渦鞭毛藻(Crypthecodinium cohnii)、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)およびフェオダクチルム属(Phaeodactylum)のような微生物である。ヤブレツボカビ属(Thraustochytria)は系統発生的にシゾキトリウム属(Schizochytria)とも近縁である。したがって、本発明の核酸を参照してデサチュラーゼを同定できること、例えば、酵素の基質特異性を予測できることは、非常に重要でありうる。さらに、これらの核酸分子は、関連ゲノムをマッピングするための、またはPCRプライマーを誘導するための基準配列としても役立ちうる。
【００３１】
本発明の核酸分子は、デサチュラーゼと呼ばれるタンパク質をコードしている。これらのデサチュラーゼは、例えば、脂質またはPUFAのような脂肪酸の合成に必要とされる化合物の代謝（例えば、生合成もしくは分解）に関係する機能を発揮することができ、また、１種以上の脂質／脂肪酸組成物の細胞内または細胞外への膜貫通輸送に参加することができる。
【００３２】
本発明の核酸配列は、長鎖の高度不飽和脂肪酸（好ましくは、脂肪酸の炭素骨格中に16、18または20個以上の炭素原子を有し、かつ／または炭素鎖中に少なくとも２個の二重結合を有するもの）を生産するのに適したデサチュラーゼをコードしており、本発明の核酸は、Δ5位に、別の場合にはΔ6位に、さらに別の場合にはΔ12位に、二重結合を導入することができる酵素をコードしている。これらの核酸を用いると、トリアシルグリセロール画分中に多量のPUFAを得ることができる。さらに、別のデサチュラーゼ類も単離されており、これらは、単独でまたはΔ4デサチュラーゼと一緒に、高度不飽和脂肪酸の生産方法に利用することが可能である。本出願において、単数の、すなわち、１種のデサチュラーゼ遺伝子もしくはタンパク質は、複数の、すなわち、２種以上のデサチュラーゼ遺伝子もしくはタンパク質を意味することもあると理解すべきである。
【００３３】
デサチュラーゼを用いたC18-炭素鎖を有するトリエン酸の生産がすでに示されている。しかし、文献に記載のこうした方法では、γ-リノレン酸の生産に関して特許請求されているが、非常に長鎖の高度不飽和脂肪酸（C20-またはそれより長い炭素鎖を有し、トリエン酸またはそれより高い不飽和度の脂肪酸）の生産はこれまで実証されたことがない。
【００３４】
本発明の長鎖PUFAを調製するには、最初に、高度不飽和C18-脂肪酸をエロンガーゼの酵素活性により２炭素原子以上伸長させる必要がある。１回の伸長サイクル後、この酵素活性はC20-脂肪酸をもたらし、２回、３回および４回の伸長サイクル後には、C22-、C24-またはC26-脂肪酸をもたらす。各種のデサチュラーゼをコードする本発明に開示した核酸配列は、エロンガーゼと協力して、非常に長鎖の高度不飽和脂肪酸をもたらす。本発明によるデサチュラーゼの活性は、好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合（好ましくは、脂肪酸分子中に３、４、５または６個の二重結合）があるC18-、C20-および／またはC22-脂肪酸をもたらし、特に好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合（好ましくは、脂肪酸分子中に３個、４個または５個の二重結合）があるC18-および／またはC20-脂肪酸をもたらす。脂肪酸の伸長は、本発明によるデサチュラーゼをエロンガーゼ活性と組み合わせることにより行うことができ、有利な様式では配列番号９によりコードされるエロンガーゼを使用することが可能である。本発明の酵素による伸長反応を行った後、さらなる脱飽和ステップ（例えば、Δ5位での脱飽和）を実施してもよい。WO 00/12720に開示されるようなC18-からC20-鎖への、またはC20-からC22-24-鎖への伸長をもたらすような他のエロンガーゼとの組合せを使用してもよく、かつ／または、Δ4位に対して活性を有するデサチュラーゼを有利に用いて高度に脱飽和された脂肪酸を得てもよい。したがって、デサチュラーゼ活性の産物および実施しうる更なる脱飽和の産物は、より高度に脱飽和されたPUFA類、例えば、ジホモ-γ-リノレン酸、ドコサジエン酸、アラキドン酸、ω6-エイコサトリエンジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ω3-エイコサトリエン酸、ω3-エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸をもたらす。本発明による酵素活性の基質は、例えば、タキソール酸、6,9-オクタデカジエン酸、リノール酸、リノレン酸、α-もしくはγ-リノレン酸、またはステアリドン酸であり、さらに、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸である。好ましい基質はリノール酸、γ-リノレン酸および／またはα-リノレン酸であり、さらに、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸である。本発明の方法の特に好ましい産物はアラキドン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸である。脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC18-脂肪酸は、本発明の酵素活性により、遊離脂肪酸の形でまたはエステル（例えば、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、またはトリアシルグリセロール）の形で伸長させることができる。
【００３５】
ヒトの栄養にとって特に重要なものは共役リノール酸(CLA)である。CLAは、特にC18:2 9 cis, 11 transまたはその異性体であるC18:2 10 trans, 12 cisのような脂肪酸を意味すると理解すべきである。こうした脂肪酸は、ひとたび体内に取り込まれると、ヒト酵素系により脱飽和または伸長されて健康増進作用に貢献しうる。また、本発明によるデサチュラーゼ（Δ12-デサチュラーゼ）は、分子中に少なくとも２個の二重結合がある共役脂肪酸を脱飽和させることが可能で、そのような健康増進用脂肪酸をヒトの栄養のために利用可能とする。共役脂肪酸のその他の例としては、α-パリナリン酸、プニカ酸、エレオステアリン酸、カレンドリン酸(calendulic acid)がある。
【００３６】
植物およびその形質転換体において使用しうるクローニングベクター、例えば、Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Kung & R. Wu編, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenesら, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Kung & R. Wu編, Academic Press, 1993, 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) に発表または引用されているクローニングベクターが与えられれば、本発明の核酸を広範囲の植物の組換え改変のために使用して、それらの植物を、PUFAなどの１種以上の脂質誘導産物のより良好な、より効率的な生産体とすることができる。こうしたPUFAなどの脂質誘導産物の改良された生産または生産効率はこの遺伝子操作の直接的作用または間接的作用によってもたらされる。
【００３７】
本発明によるデサチュラーゼタンパク質の改変が、その改変されたタンパク質のため、油脂作物または微生物からのファインケミカルの収率、生産および／または生産効率に直接的に影響を及ぼしうる一連の作用機構が存在する。デサチュラーゼタンパク質やデサチュラーゼ遺伝子の数または活性、およびデサチュラーゼとエロンガーゼを組み合わせた遺伝子の数または活性を増大させ、その結果として、より多量のこれらの化合物を新規に生産させることができる。なぜなら、デサチュラーゼタンパク質やデサチュラーゼ遺伝子の活性および生合成能は対象の遺伝子の導入前にはこれらの生物に備わっていないからである。同様に、このことは別のデサチュラーゼもしくはエロンガーゼまたは別の脂質代謝の酵素との組合せにも当てはまる。また、種々の分岐配列、すなわち、DNA配列レベルで相違する配列をこの目的に使用することも有利である。また、例えば、種子または油貯蔵組織の成熟度の関数として、異なる時間的遺伝子発現を可能にする遺伝子発現用プロモーターを使用することも有利である。
【００３８】
１種または数種のデサチュラーゼ遺伝子を、単独でまたは細胞中の他の遺伝子と組み合わせて、生物に導入すると、最終産物へ向かう生合成の流れが増大するだけでなく、対応するトリアシルグリセロール組成物も増加するかまたは新規に合成される。同様に、１種以上のファインケミカル（例えば、脂肪酸、極性および中性脂質）の生合成に必要とされる栄養素の輸送に関与する他の遺伝子の数または活性を増大させ、その結果として、細胞または貯蔵コンパートメント内のこれらの前駆体、補因子または中間体の濃度を高めてもよく、こうして、以下で述べるように、細胞のPUFA産生能が増大する。ファインケミカルとしては脂肪酸と脂質それ自体が好ましいが、これらの化合物の生合成に関与する１種以上のデサチュラーゼの活性を最適化したり、その数を増加させたり、あるいはこれらの化合物の分解に関与する１種以上のデサチュラーゼの活性を破壊したりすることで、植物または微生物からの脂肪酸分子および脂質分子の収率、生産および／または生産効率を増加させることができる。
【００３９】
さらに、本発明によるデサチュラーゼ遺伝子の突然変異誘発は、１種以上の望ましいファインケミカルの生産に直接または間接的に影響を及ぼす、改変された活性を示すデサチュラーゼタンパク質をもたらす可能性がある。例えば、本発明によるデサチュラーゼ遺伝子の数または活性を増大させて、細胞の通常の代謝老廃物または副産物（おそらく、目的のファインケミカルの過剰生産のため、それらの量が増加する）を、それらが細胞内で他の分子またはプロセスを破壊する（細胞の生存能を低下させる）前、あるいはファインケミカルの生合成経路を妨害する（それゆえに、目的のファインケミカルの収率、生産もしくは生産効率を低下させる）前に、効率的に排出するようにすることができる。さらに、目的のファインケミカルそれ自体の比較的多い細胞内含量が細胞にとって毒性となることもあり、また、アロステリック調節のような酵素フィードバック機構を妨げることもある。例えば、PUFA経路の下流にある他の酵素または解毒酵素の活性または数を増大させることにより、トリアシルグリセロール画分へのPUFAの配分を増加させ、種子細胞の生存能を高め、ひいては培養下の細胞の良好な発生へ導くか、または目的のファインケミカルを産生する種子をもたらす。あるいはまた、種々の脂質分子および脂肪酸分子が対応する量で産生されるように、本発明によるデサチュラーゼ遺伝子を操作することができる。これは細胞膜の脂質組成に決定的な影響を及ぼし、新たに合成されたPUFAの存在に加えて新規な油をもたらす可能性がある。それぞれのタイプの脂質は異なる物理的特性を示すので、膜の脂質組成の変化は膜の流動性を大きく変更しうる。膜の流動性の変化は膜を経由する分子の輸送および細胞の完全性に影響を与え、これら双方ともファインケミカルの生産に決定的な影響を及ぼす。さらに、植物では、こうした変化が非生物的および生物的ストレス状況に対する耐性のような他の形質にも影響を及ぼすことがある。
【００４０】
生物的および非生物的ストレス耐性は、様々な植物に付与することが望ましい一般的形質であり、そのような植物として、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、落花生、ワタ、アマニ、アマ、アブラナおよびキャノーラ、キャッサバ、コショウ、ヒマワリおよびセンジュギク、ナス科植物（例：ジャガイモ、タバコ、ナス、トマト）、ソラマメ属(Vicia species)、エンドウ、アルファルファ、低木の植物（コーヒー、カカオ、チャ）、ヤナギ属(Salix species)、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）、多年生植物および家畜のかいば作物が挙げられる。本発明の別の実施形態として、これらの作物は遺伝子操作のための好適な標的植物でもある。本発明に従う特に好ましい植物は油脂作物であり、例えば、ダイズ、落花生、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、アマニ、ベニバナ、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）、またはトウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、アルファルファ、低木の植物（コーヒー、カカオ、チャ）などの作物がある。
【００４１】
したがって、本発明の一態様は、１種のデサチュラーゼまたは数種のデサチュラーゼまたはその生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列、あるいはデサチュラーゼコード化核酸（例えば、DNAまたはmRNA）を検出もしくは増幅するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適する核酸断片を含む、単離された核酸分子（例えば、cDNA）に関する。特に好ましい実施形態では、核酸分子は配列番号１、３、５または11に示したヌクレオチド配列のうちの１つ、またはこれらのヌクレオチド配列の１つのコード領域もしくは相補体を含む。他の特に好ましい実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５または11に示したヌクレオチド配列またはその一部とハイブリダイズするヌクレオチド配列、あるいは、これらに対して少なくとも50％の相同性、好ましくは少なくとも約60％の相同性、より好ましくは少なくとも約70％、80％または90％の相同性、より一層好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。他の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は配列番号２、４、６または12に示したアミノ酸配列のうちの１つをコードする。本発明の好適なデサチュラーゼ遺伝子は、本明細書に記載するデサチュラーゼ活性のうちの少なくとも１つをもつことが好ましい。
【００４２】
別の実施形態において、単離された核酸分子はタンパク質またはその一部をコードし、該タンパク質またはその一部は、配列番号２、４、６もしくは12のアミノ酸配列に対して十分な相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつデサチュラーゼ活性を保持するものである。好ましくは、該核酸分子によりコードされるタンパク質またはその一部は、植物の細胞膜の合成に必要とされる化合物の代謝に関与するか、または細胞膜を介した分子の輸送に関与する能力を保持する。一つの実施形態において、該核酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６もしくは12のアミノ酸配列に対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、80％または90％、最も好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性を有する。さらに好ましい実施形態においては、該タンパク質は完全長のタンパク質であり、各部分が配列番号２、４、６もしくは12の完全なアミノ酸配列（これは配列番号１、３、５もしくは11に示したオープンリーディングフレームから誘導される）に対して本質的に相同である。
【００４３】
他の実施形態において、単離されたデサチュラーゼは、配列番号２、４、６もしくは12のアミノ酸配列の１つに対して少なくとも約50％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ微生物または植物細胞における脂肪酸の合成に必要とされる化合物の代謝に関与するか、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与することができる。脱飽和されたC18-またはC20-22-炭素鎖は少なくとも２つの位置に二重結合があると理解すべきである。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)UTEX646に由来するものであり、配列番号２、４、６もしくは12のアミノ酸配列に対して少なくとも約50％またはそれ以上の相同性を有し、かつ植物の細胞膜の合成に必要とされる化合物の代謝またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与する能力を保持するか、あるいはGLA、ALA、ジホモ-γ-リノレン酸、ARA、EPA、DHAなどのPUFAまたはそれらの前駆体分子をもたらす脱飽和活性の少なくとも１つを有する、生物学的に活性なドメインを含むタンパク質（例えば、デサチュラーゼ融合タンパク質）をコードする。該核酸分子は異種ポリペプチドまたは調節タンパク質をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。
【００４５】
別の実施形態において、単離されたデサチュラーゼは、例えば、ストリンジェント条件下で、配列番号１、３、５もしくは11のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれに対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、80％または90％、最も好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。また同様に、好ましいデサチュラーゼの形態は本明細書に記載するデサチュラーゼ活性の１つをもつことが好適である。
【００４６】
別の実施形態において、単離された核酸分子は、長さが少なくとも15、25、50、100、250またはそれ以上のヌクレオチドであって、ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５もしくは11のヌクレオチド配列からなる核酸分子とハイブリダイズするものである。単離された核酸分子は、好ましくは、天然に存在する核酸分子に相当する。より好ましくは、単離された核酸分子は、天然に存在するフェオダクチルム属（Phaeodactylum）のデサチュラーゼまたはその生物学的に活性な部分をコードする。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号１、３、５または11に示す本発明の核酸の各種生物（例えば、細菌、真菌、酵母、繊毛虫、藻類、または動物もしくは植物細胞のような微生物、あるいは動物または植物）における発現を可能にする発現カセットである。
【００４８】
本発明の発現カセット（＝核酸構築物または断片）は、コード配列の宿主細胞における発現を支配する（遺伝子発現を有利に高めるための）１以上の調節シグナルに機能的に連結された、遺伝暗号の結果である配列番号１、３、５もしくは11に示す配列および／またはその機能的もしくは非機能的誘導体を意味する、と理解すべきである。こうした調節配列は遺伝子およびタンパク質の標的発現を可能にすることが意図される。宿主生物に応じて、このことは、例えば、遺伝子が最初に誘導され、その後にのみ発現および／または過剰発現されること、あるいは遺伝子が直ちに発現および／または過剰発現されること、を意味しうる。例えば、これらの調節配列は、インデューサーまたはリプレッサーと結合することにより核酸の発現を調節する配列である。こうした新規の調節配列に加えて、またはこれらの配列の代わりに、実際の構造遺伝子の前にある調節配列の天然の調節がなお存在してもよく、適宜に、その天然の調節を取り除くように遺伝的に改変しておいて、遺伝子発現を増加させてもよい。しかし、遺伝子構築物はより単純な構成のものであってもよく、すなわち、核酸配列またはその誘導体の前に追加の調節配列が一切挿入されず、天然のプロモーターがその調節と共に除去されていなくてもよい。むしろ、天然の調節配列は、調節がもはや起こらないように、かつ／または遺伝子発現が増加するように突然変異させる。これらの改変されたプロモーターは、活性を高めるために、部分-配列（＝本発明の核酸配列の一部を有するプロモーター）の形で、または単独で、天然の遺伝子の前に挿入することができる。さらに、遺伝子構築物は有利には、プロモーターに機能的に連結された、エンハンサー配列として知られる配列を１以上含むことができ、これらは核酸配列の増大した発現を可能にする。追加の有利な配列（例えば、別の調節エレメントやターミネーター）をDNA配列の3’末端に挿入してもよい。Δ5デサチュラーゼ／Δ6デサチュラーゼおよび／またはΔ12デサチュラーゼ遺伝子は発現カセット（＝遺伝子構築物）中に１以上のコピー数で存在しうる。
【００４９】
上述したように、調節配列または因子は、導入した遺伝子の発現にポジティブな効果を及ぼして、その発現を増大させることが好ましい。こうして、調節エレメントの増強は有利には、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いることにより、転写レベルで行われる。しかし、増強された翻訳もさらに可能であり、例えば、それはmRNAの安定性を改良することによる。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの本発明による核酸分子を含むベクター（例えば、組換え発現ベクター）、ならびに、これらのベクターが導入されている宿主細胞、特に、微生物、植物細胞、植物組織、植物器官、または完全な植物体に関する。一つの実施形態において、そのような宿主細胞はファインケミカル化合物（特に、PUFA）を蓄えることができ、所望の化合物を単離するために該細胞が回収される。その後、化合物（油、脂質、トリアシルグリセリド、脂肪酸）またはデサチュラーゼが、培地からまたは宿主細胞（植物の場合には、ファインケミカルを含有または貯蔵する細胞、最も好ましくは、種皮、塊茎などの貯蔵組織の細胞、表皮細胞および種子細胞）から単離され得る。
【００５１】
本発明のさらに別の態様は、遺伝的に改変されたトランスジェニック植物、好ましくはデサチュラーゼ遺伝子が導入されている上記の油脂作物、特に好ましくはアブラナまたはアマニ植物に関する。一つの実施形態においては、アブラナまたはアマニのゲノムが、野生型または変異型デサチュラーゼ配列をコードする本発明の核酸分子をトランスジーンとして導入することにより、改変されている。別の実施形態においては、ドナー生物としてのフェオダクチルム属(Phaeodactylum)のゲノム中の内在性デサチュラーゼ遺伝子が、DNA配列を用いた突然変異誘発および検出により機能的に破壊されているか、またはアンチセンス技術を用いて抑制されている。好ましい実施形態においては、アブラナまたはアマニを使って、脂質または脂肪酸（PUFAが特に好適である）のような所望の化合物を生産する。
【００５２】
さらに別の好ましい実施形態においては、コケであるヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)が本発明に記載の核酸に基づく相同的組換えを用いてデサチュラーゼの機能を実証するために使用される。
【００５３】
本発明のさらに別の態様は、単離されたデサチュラーゼ遺伝子またはその一部（例えば、生物学的に活性な部分）に関する。好ましい実施形態では、単離されたデサチュラーゼまたはその一部は、微生物もしくは植物細胞の細胞膜の合成に必要とされる化合物の代謝または細胞膜を介した分子の輸送に関与し得るものである。別の好ましい実施形態では、単離されたデサチュラーゼまたはその一部は、配列番号２、４、６もしくは12のアミノ酸配列に対して十分な相同性を有し、かつ、微生物もしくは植物細胞の細胞膜の合成に必要とされる化合物の代謝または細胞膜を介した分子の輸送に関与する能力を保持するものである。
【００５４】
本発明はまた、粗製抽出物の形のまたは純粋なタンパク質としてのデサチュラーゼの単離された調製物を提供する。デサチュラーゼポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、デサチュラーゼ以外の酵素活性（例えば、エロンガーゼ、アシルトランスフェラーゼ、または他の活性）を有する別のポリペプチドと機能的に連結させて融合タンパク質を形成させることができる。この融合タンパク質はデサチュラーゼ単独の活性とは異なる活性をもつことが有利である。他の好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、微生物もしくは植物における脂質と脂肪酸、補因子と酵素の合成に必要とされる化合物の代謝、または細胞膜を介した分子の輸送に関与する。特に好ましくは、宿主細胞へのこの融合タンパク質の導入が該細胞による所望の化合物の生産をモジュレートする。好ましい実施形態では、こうした融合タンパク質はまた、Δ4-、Δ5-、Δ6-、Δ8-、Δ15-、Δ17-、またはΔ19-デサチュラーゼ活性を単独でまたは組合せで含む。好ましい実施形態は、特に、配列番号７もしくは９、またはその一部、誘導体もしくは相同体の中から選択される遺伝子の組合せである。特に好適なものは、配列番号13、14、15、16および17に規定される多重発現カセットに挿入された、配列番号１、３、５または11に示すような完全なタンパク質活性を含み、植物の形質転換および植物内での発現に適する遺伝子の組合せである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明は、デサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関し、かかる配列は、
a)  配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号11に示す配列を有する核酸配列；
b)  遺伝暗号の縮重のため、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号12に示すアミノ酸配列を逆翻訳することによって得られる核酸配列；
c)  配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号12に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ該ポリペプチドの酵素作用を実質的に低減させることなくアミノ酸レベルで少なくとも50％の相同性を有する、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号11に示す核酸配列の誘導体；
からなる群より選択される。
【００５６】
本発明はさらに、上記の１以上の核酸配列によりコードされる１以上のアミノ酸配列に関する。特定すると、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号11に示す配列によりコードされるアミノ酸配列に関する。
【００５７】
本発明は、コケであるヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)における脂質と脂肪酸、PUFA補因子と酵素の代謝、あるいは、膜を介した親油性化合物の輸送に関与するデサチュラーゼ活性を有する核酸およびタンパク質分子を提供する。本発明に従う化合物は、生物、例えば、繊毛虫、真菌、酵母、細菌、藻類などの微生物、および／またはトウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、落花生、ワタ、アブラナ、キャノーラおよびカブのようなアブラナ属の種、コショウ、ヒマワリ、ルリヂサ、マツヨイグサおよびマンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナスおよびトマトのようなナス科の植物、ソラマメ属の種、エンドウ、タピオカ、ムラサキウマゴヤシ、低木植物（コーヒー、カカオ、チャ）、ヤナギ属の種、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）ならびに、多年生草および飼料穀物などの植物からのファインケミカルの生産を直接修飾する（例えば、脂肪酸生合成タンパク質の過剰発現または最適化が、改変された生物からの脂肪酸の収率、生産および／または生産効率に直接影響を及ぼす場合）か、あるいは、間接的に影響を及ぼすこともでき、間接的影響によっても、所望の化合物の収率、生産および／または生産効率を高めたり、不要な化合物を減少させたりすることができる（例えば、脂質と脂肪酸、補因子と酵素の代謝のモジュレーションによって、細胞内の所望化合物の収率、生産および／または生産効率を改変するか、もしくはその組成を改変して、これにより、１種以上のファインケミカルの生産に影響を与える場合）。以下に本発明の態様について、さらに詳しく説明する。
【００５８】
Ｉ．ファインケミカルおよびPUFA
「ファインケミカル」という用語は、当技術分野で公知であり、生物によって生産された分子であって、例えば、限定するものではないが、製薬産業、農産業、食品および化粧品産業などの様々な産業界で用いられている分子を包含する。これらの化合物は、脂質、脂肪酸、補因子および酵素など（例えば、Biotechnology 第６巻、Rehmら編：VCH Weinheim中のKuninaka, A.（1996）Nucleotides and related compounds, pp. 561-612およびそこに引用された参照文献に記載されている）、脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）、ビタミンおよび補因子（Ullmann’s Encyckopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, Vitamins, pp. 443-613（1996）：VCH Weinheimおよびそこに引用された参照文献；ならびに、Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L.（1995）Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia、1994年９月１〜３日、マレーシア、ペナンで開催、AOCS Press（1995））、ならびに、Gutcho（1983）により、Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN：0818805086およびそこに引用された参照文献に記載された酵素およびその他のあらゆる化学物質を包含する。特定のファインケミカルの代謝および使用について、以下にさらに詳しく説明する。
【００５９】
各種前駆体分子と生合成酵素との組合せにより、膜組成に決定的な影響を与える様々な脂肪酸分子が生産される。PUFAは、トリアシルグリセロールだけではなく、膜脂質にも組み込まれると想定することができる。
【００６０】
膜合成は、二分子膜の一部としての脂質を含めて、多数の構成要素が関与している十分に特徴づけされたプロセスである。従って、PUFAのような新規の脂肪酸の生産により、細胞または生物内に膜機能の新たな特性を生み出すことができる。
【００６１】
細胞膜は、細胞において非常に多くの機能を果たしている。最も重要なのは、膜が、環境から細胞の内容物の境界を定め、これによって、細胞に一体性を賦与することである。膜はまた、有害または不要な化合物の流入に対する、あるいは、所望の化合物の流出に対する障壁としての役割も果たしている。
【００６２】
膜の関与、および関連する機構についてさらに詳しくは、下記を参照にされたい：Bamberg, E.ら（1993）Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q. Rev. Biophys. 26:1-25；Gennis, R.B.（1989）Pores, Channels and Transporters, in： Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 270-322；およびNikaido, H.およびSaier, H.（1992）Transport proteins in bacteria：common themes in their design, Science 258:936-942、ならびに、これら参照文献に含まれる引用文献。
【００６３】
脂質合成は、２つの部分、すなわち、脂肪酸の合成およびそれらのsn-グリセロール-3-リン酸への結合と、極性ヘッド基（head group）の付加または修飾とに分けることができる。膜に用いられる通常の脂質としては、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ資質およびホスホグリセリドが挙げられる。脂肪酸合成は、アセチル-CoAの、アセチル-CoAカルボキシラーゼによるマロニル-CoAへの変換、もしくはアセチルトランスアシラーゼによるアセチル-ACPへの変換のいずれかで開始する。縮合反応の後、これら２つの生成物分子が一緒になって、アセトアセチル-ACPを形成し、これを縮合、還元および脱水の連続的反応により変換することによって、所望の鎖長を有する飽和脂肪酸分子が得られる。これら分子からの不飽和脂肪酸の生産は、分子状酸素を用いて好気的に、あるいは、嫌気的に、のいずれかで、特定のデサチュラーゼにより触媒される（微生物における脂肪酸合成については、F.C. Neidhardtら（1996）E. coli and Salmonella. ASM Press：Washington, D.C., pp. 612-636、およびそこに含まれる参照文献；Lengelerら（編）（1999）Biology of Procaryotes. Thieme:Stuttgart, New York、およびそこに含まれる参照文献、ならびに、Magnuson, K.ら（1993）Microbiological Reviews 57:522-542、およびそこに含まれる文献を参照されたい）。
【００６４】
PUFA生合成用の前駆体の例として、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸がある。これらのC18-炭素脂肪酸は、エイコサ鎖およびドコサ鎖タイプの脂肪酸を得るために、C20またはC22まで伸長させなければならない。Δ12-デサチュラーゼ、Δ15-デサチュラーゼ、Δ6-デサチュラーゼ、Δ5-およびΔ4-デサチュラーゼ活性を有する酵素などの様々なデサチュラーゼは、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸、ならびに、その他の各種長鎖PUFAへと導くことができ、これらは、抽出した後、食物および飼料、化粧品または医薬品用途の多様な目的に用いることができる。
【００６５】
長鎖PUFAを生産するためには、高度不飽和C18-またはC20-脂肪酸を前述のようにポリ脱飽和させなければならない。本発明に従う核酸配列は、トリアシルグリセロール画分にPUFAを含む微生物である海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)に由来する機能的に活性なデサチュラーゼを初めてコードするものである。本発明のデサチュラーゼを用いると、二重結合をΔ5、Δ6またはΔ12の位置に導入することができる。本発明のデサチュラーゼの活性は、好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも２個、３個、４個または５個の二重結合があるC18-またはC20-脂肪酸をもたらし、より好ましくは、脂肪酸分子中に３個、４個または５個の二重結合があるC20-脂肪酸をもたらす。脱飽和は対象の脂肪酸を伸長させる前または後に行うことができる。したがって、デサチュラーゼ活性の産物および実施しうる更なる脱飽和と伸長の産物は、C20-からC22-脂肪酸の、リノール酸、ドコサジエン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸、ω6-エイコサトリエンジホモ-γ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ω3-エイコサトリエン酸、ω3-エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸などの脂肪酸へのさらなる伸長を含めて、より高度に脱飽和された好適なPUFA類をもたらす。本発明に従うこの酵素の基質の例として、タキソール酸、6,9-オクタデカジエン酸、オレイン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、リノレン酸、ピノレン酸、α-リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸またはステアリドン酸が挙げられる。好ましい基質として、リノール酸、γ-リノレン酸および／またはα-リノレン酸、ジホモ-γ-リノレン酸もしくはアラキドン酸、エイコサテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸が挙げられる。脂肪酸中に少なくとも２個の二重結合があるC18-または C20-脂肪酸は、本発明に従う酵素活性により、遊離脂肪酸の形で、あるいは、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールなどのエステルの形で伸長させることができる。
【００６６】
さらに、脂肪酸は、様々な修飾の場所に輸送された後、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に組み込まれねばならない。脂質合成におけるもう１つの重要な段階は、例えば、グリセロール脂肪酸アシルトランスフェラーゼによる、極性ヘッド基への脂肪酸の転移である（Frentzen, 1998, Lipid, 100（4-5）:161-166を参照）。
【００６７】
植物の脂肪酸生合成、脱飽和、脂質代謝および脂肪化合物の膜輸送、β酸化、脂肪酸の修飾および補因子、トリアシルグリセロール貯蔵およびアセンブリに関する出版物（そこで引用される文献も含む）については、次の論文を参照されたい：Kinney, 1997, Genetic Engineering, JK Setlow編, 19:149-166；OhlroggeおよびBrowse, 1995, Plant Cell 7:957-970；ShanklinおよびCahoon, 1998, Annu, Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641；Voelker, 1996, Genetic Engineering, JK Setlow編, 18:111-13；Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417；Guhnemann-Schafer & Kindl. 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186；Kunauら、1995、Prog. Lipid Res. 34:267-342；Stymneら、1993, Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, MurataおよびSuomerville編, Rockville, Amecican Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1-16。
【００６８】
ビタミンや、補因子および機能性食品（例えばPUFA）は、細菌などの高等動物以外の生物により容易に合成される分子群であるが、高等動物はもはや合成することができないため、摂取しなければならない分子群、あるいは、高等動物がそれ自身で十分な程度までもはや合成することができないため、補助的に摂取しなければならない分子群を包含する。これら分子を生産することができる生物（例えば、細菌など）における上記分子の生合成については、多かれ少なかれ特性づけられている（Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, “Vitamins”, Vol. A27, pp. 443-613, VCH Weinheim, 1996；Michal, G.（1999）Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons；Ong, A.S., Niki, E., & Packer, L.（1995）”Nutrition, Lipids, Health and Disease” Proceedings of UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia、1994年９月１〜３日に、マレーシア、ペナンで開催、AOCS Press, Champaign, IL X, 374 pp.）。
【００６９】
前記分子は、それ自体が生物活性分子であるか、あるいは、電子担体としてまたは多数の代謝経路における中間体のいずれかとして作用する生物活性物質の前駆体である。上記化合物は、その栄養的価値以外にも、着色剤、酸化防止剤および触媒もしくはその他の処理加工用補助剤として重要な産業上の価値を有する（上記化合物の構造、活性および産業用途についての詳細は、例えば、Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, “Vitamins”, Vol. A27, pp. 443-613, VCH Weinheim, 1996を参照のこと）。高度不飽和脂肪酸は、例えば、冠動脈性心疾患、炎症機構、小児の栄養などの場合に、様々な機能および健康促進効果を有する。出版物および参照文献（そこに引用されている文献を含む）については、下記を参照されたい：Simopoulos, 1999, Am. J. Clin. Nutr. 70（3rd Suppl.）:560-569, Takahataら、Biosc. Biotechnol. Biochem, 1998, 62（11）:2079-2085, WillichおよびWinther, 1995, Deutsche Medizinische Wochenschrift 120（7）:229以下参照。
【００７０】
II．本発明のエレメントおよび方法
本発明は、とりわけ、本明細書でデサチュラーゼ核酸およびデサチュラーゼタンパク質分子と称する新規分子の発見に基づくものであり、該分子は、海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)における細胞膜および脂質の生産に影響を及ぼし、例えば、これらの膜を介した分子の移動に影響を与える。一実施形態では、デサチュラーゼ分子は、微生物および植物などの生物における細胞膜の合成に必要とされる化合物の代謝に関与したり、あるいは、これら膜を介した分子の輸送に間接的に影響したりする。好ましい実施形態では、膜成分の生産および膜輸送を調節する、本発明に従うデサチュラーゼ分子の活性は、この生物による所望のファインケミカルの生産に影響を与える。特に好ましい実施形態では、本発明に従うデサチュラーゼ分子の活性をモジュレートすることにより、本発明のデサチュラーゼを調節する微生物または植物の代謝経路の収率、生産高および／または生産効率がモジュレートされ、膜を介した化合物の輸送効率が改変され、これによって、微生物および植物による所望のファインケミカルの収率、生産高および／または生産効率を直接的または間接的のいずれかでモジュレートするようにする。
【００７１】
「デサチュラーゼ」または「デサチュラーゼポリペプチド」という用語は、脂肪酸の脱飽和に関与するタンパク質を意味する。デサチュラーゼの例として、配列番号１、３、５、もしくは11に示したもの、あるいは、その相同体、誘導体もしくは類似体が挙げられる。「デサチュラーゼ」または「デサチュラーゼ核酸配列」という用語は、デサチュラーゼをコードする核酸配列を意味し、その一部は、コード領域と、さらに対応する5’-および3’-非翻訳配列領域であってもよい。デサチュラーゼ遺伝子の例として、配列番号１、３、５または11に示した配列が挙げられる。生産および生産高という用語は、当業者には公知であり、所定期間内に、所定発酵容量において形成される発酵産物（例えば、所望のファインケミカル）の濃度（例えば、産物のkg／時／リットル）を包含する。生産効率という用語は、特定の生産量を達成するのに要する時間（例えば、細胞が、ファインケミカルの特定の処理量を確立するのに要する時間）を意味する。収率または生成物／炭素収率という用語は、当業者には公知であり、炭素源が生成物（すなわち、ファインケミカル）に変換される効率を意味する。これは、通常、炭素源１kg当たりの生成物のkg数として表される。化合物の収率または生産高が増加すると、得られる分子（すなわち、一定期間にわたる特定量の培養物中に得られる上記化合物の好適な分子）の量が増加する。生合成または生合成経路という用語は、当業者には公知であり、例えば、強力な調節を受ける多段階工程における、中間体からの細胞による化合物（好ましくは、有機化合物）の合成を意味する。異化作用もしくは異化作用経路という用語は、当業者には公知であり、例えば、強力な調節を受ける多段階工程における、細胞による化合物（好ましくは、有機化合物）の異化代謝産物（一般には、比較的小さい複雑な分子）への開裂を意味する。代謝という用語は、当業者には公知であり、生物において起こる生化学反応のすべてを包含する。特定の化合物の代謝（例えば、脂肪酸の代謝）は、従って、この化合物に関係する、細胞内での該化合物の生合成、修飾および異化経路のすべてを包含する。
【００７２】
別の実施形態では、デサチュラーゼ分子をコードする本発明の核酸配列は、微生物または植物におけるファインケミカルのような所望の分子の生産をモジュレートすることができる。本発明に従う配列の修飾が、この修飾タンパク質を含む微生物株または植物株からのファインケミカルの収率、生産高および／または生産効率に直接影響を与えうる、一連の作用機構が存在する。細胞内で、または細胞からの、ファインケミカル分子の輸送に関与するデサチュラーゼの数または活性を増加させることにより、膜を介して輸送される上記化合物の量を増加させ、これから、該化合物を容易に取得して、相互に変換することができる。さらに、脂肪酸、トリアシルグリセロールおよび／または脂質は、それ自体が望ましいファインケミカルであり、これら化合物の生合成に関与する本発明の１種以上のデサチュラーゼの活性を最適化するか、もしくはその数を増加するか、あるいは、上記化合物の異化作用に関与する１種以上のデサチュラーゼの活性を妨害することにより、微生物または植物などの生物からの脂肪酸分子および脂質分子の収率、生産高および／または生産効率を高めることができる。
【００７３】
本発明に従う核酸配列の突然変異誘発によって、活性が改変されたデサチュラーゼを生じさせることができ、この改変された活性は、微生物または植物からの１種以上の所望のファインケミカルの生産に間接的な影響を与える。例えば、廃棄物の輸送に関与する本発明のデサチュラーゼは、これまでより多くのまたは高い活性を示すことができるため、細胞の正常代謝廃棄物（その量は、所望のファインケミカルの過剰生産のため増加する恐れがある）が、細胞内の分子を損なう（これにより、細胞の生存能力が低下する）前に、あるいは、ファインケミカルの生合成経路を妨害する（これにより、所望のファインケミカルの収率、生産高または生産効率を低下させる）前に、該廃棄物を効率的に輸送することができる。所望のファインケミカル自体の細胞内量が比較的多い場合には、細胞にさらに有毒となる恐れがあるため、上記化合物を細胞から送り出すことができる輸送体の活性または数を増加させることによって、培養物中の細胞の生存能力を高め、ひいては、所望のファインケミカルを生産する培養物中の細胞数を増加させることが可能である。また、本発明のデサチュラーゼは、対応する量の様々な脂質分子および脂肪酸分子が生産されるような方法で、操作することも可能である。これは細胞膜の脂質濃度に大きな影響を与えることがある。脂質は、種類によって、異なる物理的特性を有することから、膜の脂質組成の改変により、膜の流動性を有意に改変することができる。膜流動性の改変は、膜を介した分子の輸送および細胞の完全性に影響を与えることができ、それらの各々が、大規模発酵培養における微生物および植物からのファインケミカルの生産に実質的な影響を及ぼす。植物の膜は、高温および低温、塩分、渇水に対する耐性、ならびに、細菌や真菌のような病原体に対する耐性などの特定の特性を賦与する。従って、膜成分のモジュレーションは、植物が、前述のストレスパラメーターの下で生存する能力に決定的な影響を与え得る。これは、シグナルカスケードの変化を介して、または、改変された膜組成（例えば、Chapman, 1998, Trends in Plant Science, 3(11):419-426を参照）とシグナルカスケード（Wang 1999, Plant Physiology, 120:645-651を参照）を介して直接起こるか、あるいは、WO 95/18222に開示されているように、低温の耐性に影響を与え得る。
【００７４】
本発明の単離された核酸配列は、例えば、テキサス大学（Austin）の藻類コレクションから入手可能な海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)UTEX646株のゲノムに存在する。
【００７５】
海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)cDNAのヌクレオチド配列ならびにデサチュラーゼの推定アミノ酸配列を配列番号１〜６および11および12に示す。コンピュータ解析を実施することにより、これらのヌクレオチド配列を、細胞膜成分の代謝に関与するタンパク質をコードする配列、または細胞膜を介した化合物の輸送もしくはPUFA生合成に関与する配列として分類および／または同定した。本発明者らによるデータベースの入力番号 PT001070010RおよびPT001078032Rを有するESTは、配列番号１および３に示した本発明の配列を構成する。EST PT001070010Rの断片の配列が決定され、配列番号５に示される。同様に、クローン PT001078032Rの配列が配列番号１に示される。このクローンには遺伝子名を割り当てた。略語：Pp＝ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)、Pt＝海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)。配列番号５のPT001070010RはΔ12-デサチュラーゼに相同な新規遺伝子をコードし、また、PT001078032Rは新規Δ5-デサチュラーゼをコードする。Pt des6は、実施例5aに従って、縮重オリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる。この方法で得られた断片を単離して海洋性珪藻(Phaeodactylum tricornutum)cDNAライブラリーをスクリーニングし、海洋性珪藻 (Phaeodactylum tricornutum)Δ6-デサチュラーゼのコード領域を得ることができる。こうして単離された遺伝子は、表１においてPt des6と命名されており、配列番号３に示される。対応するアミノ酸配列は配列番号１、３および５の遺伝暗号を翻訳することにより得られ、配列番号２、４および６に示される（表１も参照のこと）。Δ12-デサチュラーゼをコードする別の核酸配列も表１に見出せる。これはクローン名 PT001072031Rを有する。
【表１】
0004490039.tif 000002
【００７６】
本発明はまた、配列番号２、４、６または12のアミノ酸配列と本質的に相同のアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。本明細書で用いる場合、所定のアミノ酸配列と本質的に相同のアミノ酸配列を有するタンパク質は、所定のアミノ酸配列（例えば、所定の完全なアミノ酸配列）と少なくとも約50％の相同性を有する。また、所定のアミノ酸配列と本質的に相同のアミノ酸配列を有するタンパク質は、所定のアミノ酸配列と少なくとも約50〜60％の相同性、好ましくは、少なくとも約60〜70％の相同性、さらに好ましくは、少なくとも約70〜80％、80〜90％または90〜95％、最も好ましくは、少なくとも約96％、97％、98％、99％またはそれ以上の相同性を有するものでよい。
【００７７】
本発明のデサチュラーゼ、またはそれらの生物学的に活性な部分もしくは断片は、微生物における膜または貯蔵脂質の合成に必要とされる脂質の代謝に関与しており、また、他の遺伝子（特に、エロンガーゼ活性をもつもの）と共に、C18-またはC20-22-PUFAの伸長に必要な活性に寄与しているため、C18-、C20-、C22-またはC24-PUFAおよび近縁のPUFAが得られる。これに関連して、本発明のデサチュラーゼは本発明による発現カセット中にエロンガーゼや他のデサチュラーゼと共にクローニングすることができ、これはアグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いた植物の形質転換に用いることができる。
【００７８】
本発明の様々な実施形態について以下の項でさらに詳しく説明する。
【００７９】
Ａ．単離された核酸分子
本発明の一実施形態は、PUFA産生微生物から誘導され、脂肪酸中に少なくとも１、２、３または４個の二重結合があるC18-またはC20−22-脂肪酸を脱飽和する、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含んでなる。
【００８０】
本発明のさらに別の実施形態は、脂肪酸中に少なくとも１、２、３または４個の二重結合があるC18-またはC20-脂肪酸を脱飽和するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含し、
a）配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号11に示した配列を含む核酸配列、
b）遺伝子コードの縮重に従って、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号12に示したアミノ酸配列を逆翻訳することにより得られる核酸配列、または、
c）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号12に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号11に示した核酸配列の誘導体であって、該ポリペプチドの酵素作用を実質的に低下させることなく、アミノ酸レベルで少なくとも50％の相同性を有する該誘導体、
からなる群より選択される、単離された核酸である。
【００８１】
本発明に従う前記核酸は、PUFAを合成することができる繊毛虫、真菌、藻類または渦（双）鞭毛虫のような生物、好ましくは、海洋性珪藻フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）、あるいは近縁の生物から誘導される。
【００８２】
本発明の一実施形態は、デサチュラーゼポリペプチドもしくはその生物学的に活性の部分をコードする単離された核酸分子、ならびに、デサチュラーゼコード核酸（例えば、デサチュラーゼDNA）を同定または増幅するハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用するのに十分な核酸断片に関連する。本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）およびRNA分子（例えば、mRNA）、ならびに、ヌクレオチド類似体により作製されるDNAまたはRNA類似体を包含するものとする。この用語はさらに、コード遺伝子領域の3’および5’末端での非翻訳配列、すなわち、コード領域の5’末端の上流にある少なくとも500、好ましくは200、特に好ましくは100ヌクレオチドの配列と、コード遺伝子領域の3’末端の下流にある少なくとも100、好ましくは50、特に好ましくは20ヌクレオチドの配列とを包含する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれでもよいが、好ましくは、二本鎖DNAである。「単離された」核酸分子とは、天然の核酸源に存在するその他の核酸分子から分離されたものである。「単離された」核酸分子は、好ましくは、この核酸が誘導される生物のゲノムDNA内で、該核酸と本来隣接する配列（例えば、該核酸の5’および3’末端に位置する配列）を一切持っていない。様々な実施形態では、単離されたデサチュラーゼ核酸分子は、例えば、核酸が誘導される細胞（例えば、ヒメツリガネゴケ細胞）のゲノムDNA内で本来隣接する、例えば、約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、0.5 kbまたは0.1 kbより小さいヌクレオチド配列を含んでいてもよい。CDNA分子のような「単離された」核酸分子は、それが、組換え法により産生された場合には、他の細胞材料もしくは培地をほとんど含まないか、あるいは、それが化学的に合成されたものであれば、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を含まないと考えられる。
【００８３】
本発明に従う核酸分子、例えば、配列番号１もしくはその部分のヌクレオチド配列を含む核酸配列は、分子生物学の標準的技法、ならびに、本明細書に記載する配列情報を用いて、単離することができる。また、例えば、相同配列、または相同的な保存配列領域も、アラインメントアルゴリズムを用いてDNAもしくはアミノ酸レベルで同定することができる。例えば、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）cDNAは、完全な配列番号１、３、５または11もしくはそれらの一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用い、標準的ハイブリダイゼーション技法（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているものなど）により、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）ライブラリーから単離することができる。さらに、配列番号１、３、５または11の完全配列もしくはそれらの一部分を包含する核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応により単離することができ、その際、この配列またはその一部分、特に、実施例５ａのモチーフ周辺の領域、もしくは個々の既定アミノ酸中の同一物の修飾体に基づき作製したオリゴヌクレオチドプライマーを用いる（例えば、配列番号：１、３、５または11の完全配列もしくはそれらの一部分を包含する核酸分子は、配列番号：１、３、５または11の同じ配列に基づいて作製しておいたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる）。例えば、mRNAは細胞から単離することができ（例えば、Chirgwinら（1979）Biochemistry 18：5294-5299によるグアニジウムチオシアネート抽出法による）、また、cDNAは逆転写酵素（例えば、メリーランド州ベセスダのGibco/BRLから入手可能なモロニーMLV逆転写酵素、フロリダ州セントピーターズバーグのSeikagaku America, Inc.から入手可能なAMV逆転写酵素）を用いて作製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅用の合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１、３、５または11および図５ａに示した配列の１つに基づき、あるいは、配列番号２、４、６または12に示したアミノ酸配列を用いて、作製することができる。本発明の核酸は、標準的PCR増幅法に従い、cDNAを用いて、あるいは、鋳型としてのゲノムDNAおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅することができる。このようにして増幅した核酸は、適当なベクターにクローニングした後、DNA配列分析により特性決定することができる。デサチュラーゼヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置を用いて、標準的合成方法により作製することができる。
【００８４】
配列番号１、３、５または11に示したcDNAは、デサチュラーゼ（すなわち、「コード領域」）をコードする配列、さらには、5’-非翻訳配列および3’-非翻訳配列をコードする配列を包含する。この他にも、上記核酸は、配列番号１、３、５または11に示したうちの１配列のコード領域を包含するだけの場合もあるし、あるいは、ゲノムDNAから単離した完全なゲノム断片を含む場合もある。
【００８５】
さらに好ましい実施形態では、本発明に従う単離された核酸分子は、配列番号１、３、５または11に示すヌクレオチド配列のうち１配列の相補体である核酸分子、またはその一部分を包含する。配列番号１、３、５または11に示すヌクレオチド配列の１つに相補的な核酸は、それが、配列番号１、３、５または11に示した配列番号の１つとハイブリダイズして、安定な二本鎖を作ることができれば、十分に相補的である。
【００８６】
配列番号１、３、５または11の配列を有する新規デサチュラーゼ核酸配列の相同体とは、例えば、配列番号１、３、５または11に示したヌクレオチド配列の１つと、少なくとも約50〜60％、好ましくは少なくとも約60〜70％、さらに好ましくは少なくとも約70〜80％、約80〜90％または90〜95％、またさらに好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％以上の相同性を有する対立遺伝子変異体、あるいは、その相同体、誘導体または類似体もしくは一部分を意味する。さらに好ましい実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５または11に示すヌクレオチド配列もしくはその一部分の１つとハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。対立遺伝子変異体は、特に、配列番号１、３、５または11に示した配列からおよび／または該配列へのヌクレオチドの欠失、挿入または置換によって得ることができる機能的変異体を包含するが、ここでは、合成して得られたタンパク質の酵素活性が１個以上の遺伝子の挿入のために有利に保持されることを目的とする。デサチュラーゼの酵素活性を保持するタンパク質とは、配列番号２、４、６または12によりコードされたタンパク質と比較して、本来の酵素活性の少なくとも10％、好ましくは20％、特に好ましくは30％、さらに好ましくは40％を有するタンパク質を意味する。このような活性を有するデサチュラーゼは、酵素活性が実質的に低下していないデサチュラーゼである。
また、配列番号１、３、５または11の相同体とは、例えば、コードおよび非コードDNA配列の細菌、真菌および植物の相同体、トランケート型配列、一本鎖DNAまたはRNAも意味する。
【００８７】
配列番号１、３、５または11の相同体はまた、例えば、プロモーター変異体のような誘導体も意味する。前記ヌクレオチド配列の上流にあるプロモーターは、１以上のヌクレオチド置換、挿入および／または欠失により修飾することができるが、その際、プロモーターの機能性または活性は妨害されない。さらに、プロモーターの活性を、その配列の改変により増加するか、あるいは、さらに活性の高いプロモーター（異種生物由来のものでもよい）によってこれらのプロモーターを完全に置換することも可能である。
【００８８】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、５または11に示した１配列のコード領域の部分、例えば、プローブまたはプライマーとして用いることができる断片、またはデサチュラーゼの生物学的に活性なセグメントをコードする断片を包含するだけの場合もある。フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）デサチュラーゼ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列によって、プローブおよびプライマーの作製が可能になり、これらは、他の細胞タイプおよび生物におけるデサチュラーゼ相同体ならびに、他の微小藻類または関連種由来のデサチュラーゼ相同体を同定および／またはクローニングするために設計される。プローブ／プライマーは、通常、本質的に精製されたオリゴヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、通常、配列番号１、３、５または11に示したうちの１配列のセンス鎖、あるいは、配列番号１、３、５または11の１配列のアンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは約16、さらに好ましくは25、40、50または75個の連続したヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域、またはその相同体、誘導体および類似体、もしくはそれらの天然の突然変異体を包含する。配列番号１、３、５または11のヌクレオチド配列に基づくプライマーをPCR反応で用いることにより、デサチュラーゼ相同体をクローニングすることができる。デサチュラーゼヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、同一または同種タンパク質をコードする転写産物もしくはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では、上記プローブは、さらに、そこに結合した標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子も包含する。これらのプローブは、例えば、細胞サンプル中のデサチュラーゼコード核酸の量を測定することにより、例えば、デサチュラーゼmRNAレベルを測定することにより、デサチュラーゼを誤って発現する細胞を同定するための、あるいは、ゲノムデサチュラーゼ遺伝子が突然変異を起こしているかまたは欠失されているかを決定するための、ゲノムマーカー用の試験キットの一部として用いることができる。
【００８９】
一実施形態では、本発明の核酸分子は、タンパク質もしくはその一部分が微生物または植物内で細胞膜の合成に必要な化合物の代謝またはこれら膜を介した分子の輸送に関与する能力を保持するのに十分な、配列番号２、４、６または12のアミノ酸配列との相同性を有するアミノ酸配列を含む上記タンパク質もしくはその一部分をコードする。本明細書で用いる用語「十分な相同性」は、そのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列と同一であるかまたは同等である最小数のアミノ酸残基（例えば、配列番号２の配列の１つに含まれるアミノ酸残基のような、類似した側鎖を有するアミノ酸残基）を有し、これによって、微生物もしくは植物内で細胞膜の合成に必要な化合物の代謝またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与できるタンパク質またはその一部分に関係する。本明細書に記載するように、膜成分のこれら代謝経路または膜輸送系のタンパク質成分は、ファインケミカルの生産および分泌に役立つことができる。これら活性の例も本明細書に記載する。従って、「デサチュラーゼの機能」は、１以上のファインケミカルの収率、生産および／または生産効率に直接的もしくは間接的に貢献している。この触媒活性のデサチュラーゼ基質特異性の例を表５および６に示す。
【００９０】
さらに別の実施形態では、本発明に従う核酸分子の誘導体は、配列番号２の完全アミノ酸配列と、少なくとも約50〜60％、少なくとも好ましくは約60〜70％、さらに好ましくは少なくとも約70〜80％、80〜90％、90〜95％、最も好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％以上の相同性を有するタンパク質をコードする。アミノ酸配列の相同性は、プログラムPileUp（J. Mol. Evolution,. 25, 351-360, 1987, Higginsら、CABIOS, 5, 1989:151-153）またはBESTFITもしくはGAP（Henikoff, S.およびHenikoff, J. G.（1922）Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-10919）を用いて、全配列領域にわたって決定することができる。
【００９１】
本発明のデサチュラーゼ核酸分子によってコードされるタンパク質部分は、好ましくはいくつかのデサチュラーゼのうちの１つの生物学的に活性な部分である。本明細書で用いる用語「デサチュラーゼの生物学的に活性な部分」とは、微生物または植物における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与することができるか、あるいは表５および６に記載した活性を有する、デサチュラーゼのセグメント、例えば、ドメイン／モチーフを包含するものとする。酵素活性のアッセイを実施することにより、デサチュラーゼまたはその生物学的に活性な部分が、微生物または植物における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、またはこれらの膜を介した分子の輸送に関与できるか否かを決定することができる。これらのアッセイ方法は、実施例の項の実施例８で詳しく説明するが、当業者には公知である。
【００９２】
デサチュラーゼの生物学的に活性なセグメントをコードするその他の核酸断片は、配列番号１、３、５または11に示した上記配列のうち１配列の一部分を単離し、デサチュラーゼまたはペプチドのコード化セグメントを発現させた（例えば、in vitroでの組換え発現による）後、デサチュラーゼまたはペプチドのコード化部分の活性を確認することにより作製することができる。
【００９３】
さらに、本発明は、遺伝子コードの縮重によって、配列番号１、３、５または11に示すヌクレオチド配列（およびその部分）の１つとは異なり、配列番号１、３、５または11に示すヌクレオチド配列によってコードされた１配列と同じデサチュラーゼをコードする核酸分子を包含する。別の実施形態では、本発明に従う単離された核酸分子は、配列番号２、４、６または12に示したアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。別の実施形態では、本発明に従う核酸分子は、配列番号２、４、６または12のアミノ酸配列（配列番号１、３、５または11に示すオープンリーディングフレームによってコードされる）と本質的に相同であり、かつ、通常の方法により同定および単離することができる全長デサチュラーゼタンパク質をコードする。
【００９４】
配列番号１、３、５または11に示したデサチュラーゼヌクレオチド配列以外にも、当業者であれば、DNA配列多型が存在することを認識するだろう。これは、集団（例えば、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）集団）内のデサチュラーゼのアミノ酸配列を変化させる。デサチュラーゼ遺伝子におけるこれらの遺伝的多型は、自然突然変異により、集団内の個体間に存在しうる。本明細書で用いる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、デサチュラーゼ、好ましくは、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレームを有する核酸分子を意味する。これらの自然突然変異体は、通常、デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の分散を生じさせる。これらヌクレオチド変異、ならびに、その結果起こったデサチュラーゼ中のアミノ酸多型はすべて、自然突然変異の結果であり、デサチュラーゼの機能活性を改変せず、これらも本発明の範囲に含まれるものとする。
【００９５】
フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）cDNAの自然突然変異体および非フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）相同体、誘導体および類似体に対応する核酸分子は、本明細書に開示したフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）デサチュラーゼ核酸とのその相同性のために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション法に従って、ハイブリダイゼーションプローブとしてフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）cDNAもしくはその一部分を用いて、単離することができる。別の実施形態では、本発明に従う単離された核酸分子は、15ヌクレオチドの最小長さを有し、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５または11のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする。
【００９６】
別の実施形態では、核酸は、25、50、100、250以上のヌクレオチドの最小長さを有する。本明細書で用いる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、互いに少なくとも60％の相同性を有するヌクレオチド配列が、通常、互いにハイブリダイズしたままの状態で残っているハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を表すものとする。このような条件は、好ましくは互いに少なくとも約65％、さらに好ましくは約70％、さらにまた好ましくは少なくとも75％以上の相同性を有する配列が、通常、互いにハイブリダイズされたままの状態で残っているような条件である。これらのストリンジェントな条件は、当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. N.Y.（1989）、6.3.1-6.3.6にみいだすことができる。限定するものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例は、約45℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（＝SSC）中でハイブリダイズさせた後、50〜65℃で、0.2×SSC、0.1% SDS中で１回以上洗浄する段階からなる。当業者には、これらのハイブリダイゼーション条件が、核酸の種類に応じて、また、例えば、有機溶剤が存在する場合には、バッファーの温度と濃度に関して違ってくることは公知である。例えば、温度は、「標準的ハイブリダイゼーション条件」下で、核酸の種類によって、0.1〜５×SSC（pH 7.2）の水性バッファー中、42℃〜58℃の範囲で変動する。有機溶剤（例えば、50％ホルムアミド）が前記バッファー中に存在する場合には、標準条件下での温度は約42℃である。DNA：DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば、0.1×SSCおよび20〜45℃（好ましくは、30℃〜45℃）である。DNA：RNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは0.1×SSCおよび30℃〜55℃（好ましくは、45℃〜55℃）である。これらのハイブリダイゼーション温度は、例えば、長さが約100 bp（＝塩基対）で、ホルムアミドの非存在下でG+C含有率が50％の核酸について決定されたものである。当業者であれば、既述の文献、もしくは下記文献などの文献を参照
にして、必要なハイブリダイゼーション条件をどのようにして決定できるかがわかるであろう：Sambrookら、”Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；HamesおよびHiggins（編）1985, “Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press、オックスフォード；Brown（編）1991、”Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press、オックスフォード。
【００９７】
好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５または11の配列とハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書で用いる「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列（例えば、天然タンパク質をコードするもの）を有するRNAまたはDNA分子を意味する。一実施形態では、核酸は、天然に存在するフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutumデサチュラーゼ）をコードする。
【００９８】
集団に存在し得るデサチュラーゼ配列の天然に存在する変異体の他に、当業者であれば、さらに、突然変異による変化を、配列番号１、３、５または11のヌクレオチド配列に導入することにより、デサチュラーゼタンパク質の機能性に悪影響を与えることなく、コードされたデサチュラーゼのアミノ酸配列に変化を起こすことができることがわかるであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基上にアミノ酸置換を起こすヌクレオチド置換を、配列番号２、４、６または12の配列に生じさせることができる。「非必須」アミノ酸残基は、デサチュラーゼの活性を改変することなく、すなわち、ほとんど低下させずに、デサチュラーゼ（配列番号２、４、６または12）のうちの１つの野生型配列において改変することができる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は、デサチュラーゼ活性に必要である。しかし、その他のアミノ酸残基（例えば、デサチュラーゼ活性を有するドメインに、保存されていないもの、または半保存しかされていないもの）は、上記活性に必須ではないと考えられることから、デサチュラーゼ活性を変えずに、改変することができるであろう。
【００９９】
従って、本発明のさらに別の態様は、デサチュラーゼ活性に必須ではない、改変されたアミノ酸残基を含むデサチュラーゼをコードする核酸分子に関する。これらのデサチュラーゼは、アミノ酸配列に関して、配列番号２、４、６または12の配列とは異なるが、本明細書に記載したデサチュラーゼ活性の少なくとも１つは保持している。一実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含し、該タンパク質は、配列番号２、４、６または12のアミノ酸配列と少なくとも約50％の相同性を有するアミノ酸配列を包含し、かつ、フェオダクチルム・トリコルヌーツムトリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、もしくはこれらの膜を介した分子の輸送に関与することができる。上記核酸分子によりコードされるタンパク質は、好ましくは、配列番号２、４、６または12の配列の１つと少なくとも約50〜60％の相同性を有し、さらに好ましくは、配列番号２、４、６または12の配列の１つと少なくとも約60〜70％の相同性を有し、さらにまた好ましくは、配列番号２、４、６または12の配列の１つと少なくとも約70〜80％、80〜90％、90〜95％の相同性を有し、最も好ましくは、配列番号２、４、６または12の配列の１つと少なくとも約96％、97％、98％もしくは99％の相同性を有する。
【０１００】
２つのアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６または12の配列の１つと、それらの突然変異した形態のうちの１つ）間または２つの核酸間の相同性％を決定するためには、最適な比較（例えば、一方のタンパク質または核酸の配列にギャップを導入することにより、他方のタンパク質または核酸との最適なアラインメントを達成するなど）が可能なように、両配列を重ねて表記する。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置に存在するアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。一方の配列（例えば、配列番号：２、４、６または12の配列の１つ）内の位置に、他方の配列（例えば、配列番号２、４、６または12から選択された配列の突然変異した形態）内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが存在する場合、該分子は、この位置で相同である（すなわち、本明細書で用いるアミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」に相当する）。両配列間の相同性％は、両配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×100）。従って、相同性および同一性という２つの用語は、類義語であると考えるべきである。
【０１０１】
配列番号２、４、６または12のタンパク質配列と相同であるデサチュラーゼをコードする、単離された核酸分子は、配列番号１、３、５または11のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入し、これにより、１以上のアミノ酸置換、付加または欠失を、コードされたタンパク質に導入させて、作製することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発のような標準的技法により、配列番号１、３、５または11の配列の１つに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、１つ以上の推定上の非必須アミノ酸残基で生じさせるのが好ましい。「保存的アミノ酸置換」では、上記アミノ酸残基を、類似側鎖を有するアミノ酸残基に交換する。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、専門分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖（例えば、トリオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。従って、デサチュラーゼにおける推定上の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基に交換するのが好ましい。これ以外にも、別の実施形態では、例えば、飽和突然変異誘発により、デサチュラーゼコード配列の全部または部分にわたって、ランダムに突然変異を導入した後、得られた突然変異体を、前記デサチュラーゼ活性についてスクリーニングすることによって、デサチュラーゼ活性を保持する突然変異体を同定することができる。配列番号１、３、５または11の配列の１つに突然変異誘発を起こした後、コードされたタンパク質を組換えにより発現させ、例えば、本明細書に記載するアッセイ（実施例の節を参照）を用いて、該タンパク質の活性を決定することができる。
【０１０２】
前記デサチュラーゼをコードする核酸分子の他に、本発明のさらに別の態様は、本発明の核酸配列に対して「アンチセンス」である、単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸分子は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的な、あるいは、mRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を包含する。従って、アンチセンス核酸は、水素結合を介してセンス核酸に結合することができる。このアンチセンス核酸は、完全なデサチュラーゼコード鎖、またはその一部分だけに相補的であってもよい。一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対して、「アンチセンス」である。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを包含するヌクレオチド配列の領域（例えば、停止コドンで開始および終結する全コード領域、すなわち、停止コドン直前の最後のコドン）を意味する。さらに別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対して「アンチセンス」である。「非コード領域」という用語は、コード領域と隣接し、かつ、アミノ酸に翻訳されない5’および3’配列（従って、5’-および3’-非翻訳配列とも呼ばれる）を意味する。
【０１０３】
上記コード鎖の、本明細書に開示したデサチュラーゼコード配列（例えば、配列番号１、３、５または11に示した配列）を仮定すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン−クリック塩基対合の法則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、デサチュラーゼmRNAのコード領域の全部に相補的であってもよいが、デサチュラーゼmRNAのコード領域または非コード領域の一部分だけに「アンチセンス」であるオリゴヌクレオチドの方が好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デサチュラーゼmRNAの翻訳始点周辺の領域に相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが、例えば、約５、10、15、20、25、30、35、40、45または50以上のヌクレオチドを有するものとすることができる。本発明のアンチセンス核酸は、化学的合成および酵素の結合反応を用いて、当業者には公知の方法により構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチドまたは様々な修飾ヌクレオチドを用いて、化学的に合成することができる。修飾ヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を高める、あるいは、アンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二重らせんの物理的安定性を高めるものであり、例えば、ホスホロチオエート誘導体や、アクリジン−置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生成するのに用いることができる修飾ヌクレオチドの例としては、中でも、下記のものを挙げることができる：5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシン、イオシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクエオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンチルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、メチルウラシル-5-オキシアセテート、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)wおよび2,6-ジアミノプリン。あるいは、核酸をアンチセンス配向にサブクローニングした発現ベクターを用いて、アンチセンス核酸を生物学的に産生させることができる（すなわち、導入した核酸により転写されるRNAは、目的とする標的核酸に対してアンチセンス配向にあり、これについては、以下の項でさらに詳しく説明する）。
【０１０４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、通常、細胞に投与するか、またはin situで産生することにより、これら分子が、デサチュラーゼをコードする細胞mRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズするかまたは結合し、その結果、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、当該タンパク質の発現を阻害するようにする。ハイブリダイゼーションは、安定な二重らせんを形成する通常のヌクレオチドの相補性により、あるいは、例えば、DNA二重らせんと結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの大きな間隙内での特異的相互作用によって行われる。例えば、上記アンチセンス核酸分子をペプチドまたは抗体に結合させ、それらの各々を細胞表面受容体または抗原に結合させることにより、該分子が、受容体または選択された細胞表面で発現する抗原と特異的に結合するように、該アンチセンス分子を修飾することもできる。また、本明細書に記載するベクターを用いて、上記細胞にアンチセンス核酸分子を与えることも可能である。上記アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、該アンチセンス核酸分子が、強力な原核性、ウイルス性または真核性プロモーター（植物プロモーターを含む）の制御下にあるベクター構築物が好ましい。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、その鎖は、通常のβユニットとは対照的に、互いに平行である（Gaultierら（1987）Nucleic Acids Res. 15:6625-6641）。さらに、アンチセンス核酸分子は、2’-o-メチルリボヌクレオチド（Inoueら（1987）Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoueら（1987）FEBS Lett. 215:327-330）を包含し得る。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それに対し相補的な領域を有する一本鎖核酸（mRNAなど）を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNA分子である。従って、リボザイム、例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（HaselhoffおよびGerlach（1988）Nature 334：585-591）をデサチュラーゼmRNA転写物の触媒切断に用いて、デサチュラーゼmRNAの翻訳を阻害することができる。デサチュラーゼをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、配列番号１、３、５または11に開示したデサチュラーゼcDNAの１つのヌクレオチド配列に基づいて（すなわち、または本発明に教示する方法に従って単離される異種配列に基づいて）設計することができる。例えば、テトラヒメナ-L-19-IVS RNAの誘導体を構築することができ、その際、活性部位のヌクレオチド配列は、デサチュラーゼをコードするmRNAにおいて切断しようとするヌクレオチド配列と相補的である。例えば、Cechら、米国特許第4,987,071号およびCechら、米国特許第5,116,742号を参照されたい。この他に、デサチュラーゼmRNAを用いて、RNA分子のプールの中から、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択することができる。例えば、Bartel, D.およびSzostak, J.W.（1993）Science 261：1411-1418を参照。
【０１０７】
この他に、デサチュラーゼヌクレオチド配列の調節領域（例えば、デサチュラーゼプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を指令して、三重らせん構造を形成させ、これによって、標的細胞におけるデサチュラーゼ遺伝子の転写を阻害させることにより、デサチュラーゼ遺伝子発現を阻害することができる。概要については、Helene, C.（1991）Anticancer Drug Res. 6（6） 569-84；Helene, C.ら（1992）Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36；およびMaher. L.J.（1992）Bioassays 14（12）：807-815を参照。
【０１０８】
Ｂ．遺伝子構築物（＝核酸構築物、核酸断片または発現カセット）
本発明に従う発現カセットは、遺伝コードの結果である配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号11に示す配列、および／またはそれらの機能的もしくは非機能的誘導体を意味するものとし、これらは、遺伝子発現を高めるために１以上の調節シグナルに機能的に連結されているのが好ましく、かつ、宿主細胞におけるコード配列の発現を制御するのが好ましい。これらの調節配列は、遺伝子の標的発現およびタンパク質発現を可能にすることを意図する。宿主生物に応じて、これは、例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現および／または過剰発現されること、あるいは、直ちに発現および／または過剰発現されることを意味すると考えられる。例えば、これらの調節配列は、誘発剤またはリプレッサーが結合する配列の形態をしており、これによって、核酸の発現を調節する。これらの新規の調節配列に加えて、あるいは、これらの配列に代わって、これらの配列の天然の調節が実際の構造遺伝子の前に存在してもよく、また、必要に応じて、遺伝子的に改変しておくことにより、天然の調節を排除し、遺伝子の発現を高めておいてもよい。しかし、遺伝子構築物は、これより単純な構造をしていてもよい。すなわち、核酸配列またはその誘導体の前に追加の調節シグナルが一切挿入されておらず、かつ、天然プロモーターがその調節と共に除去されていない。これに代わり、天然の調節配列に突然変異を起こして、調節がこれ以上起こらないように、かつ／または遺伝子発現が増加するようにする。これらの修飾されたプロモーターは、天然遺伝子の前に単独で部分配列の形態（＝本発明の核酸配列の部分を含むプロモーター）に配置することにより、活性を高めることもできる。さらに、遺伝子構築物は、プロモーターに機能的に連結したエンハンサー配列として知られる１以上のものを含んでいれば有利であり、これらは、核酸の発現増加を可能にする。また、DNA配列の3’末端に、別の有利な配列、例えば、別の調節エレメントまたはターミネーターなどを挿入することも可能である。Δ5-デサチュラーゼ／Δ6-デサチュラーゼおよび／またはΔ12-デサチュラーゼ遺伝子は、発現カセット（＝遺伝子構築物）において１以上のコピーで存在することができる。
【０１０９】
本発明では、調節配列または因子は、前述したように、導入した遺伝子の発現にプラスの効果を有する、すなわち、該発現を増加することができる。調節エレメントの増強は、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用いることにより、転写レベルで起こすのが有利である。加えて、例えば、mRNAの安定性を高めることにより、翻訳を増強することもできる。
【０１１０】
本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１、３、５、７、９または11に示した配列で、かつ、配列番号２、４、６、８、10または12に従うポリペプチドをコードする１以上の該配列を含む１以上の遺伝子構築物である。配列番号１、３、５、７および11がデサチュラーゼから誘導されるのに対し、配列番号９は、エロンガーゼをコードする。デサチュラーゼは、Δ５、Δ６またはΔ12位置で二重結合を導入する酵素をコードし、その際、基質は、１、２、３または４つの二重結合を有する。配列番号９に示す配列は、脂肪酸を２炭素原子以上伸長させる酵素活性、あるいは、１以上の調節シグナルに機能的に連結して、有利に遺伝子発現を高める相同体、誘導体または類似体をコードする。これら調節配列の例として、インデューサーまたはリプレッサーが結合し、これによって、核酸の発現を調節する配列がある。これら新規の調節配列以外にも、実際の構造遺伝子の前に、これらの配列の天然調節がまだ存在する可能性もあり、必要であれば、遺伝子的に改変され、天然調節が排除され、遺伝子の発現が増強されるようにする。しかし、遺伝子構築物は、これより単純な構造を有するものであってもよい。すなわち、配列番号１、３、５または11の配列またはその相同体の前には、追加調節シグナルを挿入していないため、その調節を有する天然プロモーターは欠失されていない。これに代わり、天然調節配列を突然変異させることにより、調節がそれ以上起きないようにし、遺伝子発現を増強する。有利なことに、上記遺伝子構築物はさらに、プロモーターに機能的に連結され、核酸配列の発現を高めることができる１以上のいわゆるエンハンサー配列を包含してもよい。また、DNA配列、例えば、さらに別の調節エレメントまたはターミネーターの3’末端で、有利な配列を挿入することも可能である。デサチュラーゼ遺伝子およびエロンガーゼ遺伝子は、遺伝子構築物中に１以上のコピーで存在することができる。これらは、１つの遺伝子構築物または２以上の遺伝子構築物中に存在してもよい。この（またはこれらの）遺伝子構築物は、宿主生物において一緒に発現させることができる。このことから、遺伝子構築物は、１以上のベクターに挿入することができ、また、遊離形態で細胞に存在したり、あるいは、ゲノムに挿入することもできる。さらなる遺伝子が上記遺伝子構築物に存在する場合には、生物にさらなる遺伝子を挿入するのが有利である。
【０１１１】
上記新規の方法に有利な調節配列は、例えば、下記のようなプロモーター：cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRまたはλ-PLプロモーターに存在し、グラム陰性菌で用いるのが有利である。さらに有利な調節配列は、例えば、下記のプロモーターに存在する：グラム陽性プロモーターamyおよびSPO2；酵母もしくは真菌プロモーターADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH；または植物プロモーターCaMV 35S［Franckら、Cell 21（1980）285-294］、PRP1［Wardら、Plant. Mol. Biol. 22（1993）］、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos、または、ユビキチンもしくはファセオリンプロモーター。本発明では、下記のような誘導プロモーターも有利である：例えば、EP-A-0 388 186（ベンジルスルホンアミド誘導性）、Plant J. 2、1992:397-404（Gatzら、テトラサイクリン−誘導性）、EP-A-0 335 528（アブシジン酸誘導性）またはWO 93/21334（エタノールまたはシクロヘキセノール誘導性）に記載されている各種プロモーター。その他の適切な植物プロモーターは、細胞質ゾルのFBPアーゼまたはジャガイモST-LSIプロモーター（Stockhausら、EMBO J. 8, 1989, 2445）、ダイズ（Glysine max）ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼプロモーター（GenBank登録番号U87999）または、EP-A-0 249 676に記載されたノード特異的プロモーター。特に有利なプロモーターは、脂肪酸生合成に関与する組織で発現を可能にするプロモーターである。非常に有利なものは、実施例に従うUSPプロモーターのような種子特異的プロモーター、ならびに、LEB4（Baeumleinら、Plant J., 1992, 2(2):233-239）、DC3（Thomas, Plant Cell 1996, 263:359-368）、ファセオリンまたはナピンプロモーターなど、その他のプロモーターである。さらに有利なプロモーターは、単子葉植物または双子葉植物に用いることができる種子特異的プロモーターであり、米国特許第5,608,152号（アブラナナピンプロモーター）、WO 98/45461（シロイヌナズナオレオシンプロモーター）、米国特許第5,504,200号（インゲンマメファセオリンプロモーター）、WO 91/13980（アブラナ属Bce4-プロモーター）、Baeumleinら、Plant J., 1992, 2(2):233-239（マメ科由来のLeB4プロモーター）に記載されているが、これらのプロモーターは、双子葉植物に適している。下記のプロモーターは、例えば、単子葉植物に適している：オオムギlpt-2またはlpt-1プロモーター（WO 95/15389およびWO 95/23230）、オオムギホルデインプロモーター、ならびに、WO 99/16890に記載されたその他の適したプロモーター。
【０１１２】
原則として、新規の方法には、前記のような調節配列を有するすべての天然プロモーターを使用することができる。また、さらに、合成プロモーターを用いることも可能であり、有利である。
【０１１３】
前述のように、遺伝子構築物は、生物に導入しようとする別の遺伝子も包含することができる。酵素活性を有するために、１以上の生合成経路遺伝子の調節に関与するインデューサー、リプレッサーまたは酵素の遺伝子のような調節遺伝子を宿主生物に導入し、そこで発現させることが可能であり、しかも有利である。これらの遺伝子は、異種または同種いずれの供給源に由来するものでよい。さらに、核酸構築物または遺伝子構築物は、脂肪酸または脂質代謝の生合成遺伝子を含んでいるのが有利であり、あるいは、これらの遺伝子は、１以上の別の核酸構築物上に存在してもよい。脂肪酸または脂質代謝の生合成遺伝子は、下記のものからなる群より選択される遺伝子であれば有利である：アシルCoAデヒドロゲナーゼ、アシルACP［＝アシルキャリアータンパク質］デサチュラーゼ、アシルACPチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、アシル補酵素Ａオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロペルオキシドリアーゼまたは脂肪酸エロンガーゼ、もしくはこれらの組合せ。
【０１１４】
存在するその他の遺伝子を発現させるために、遺伝子構築物は、発現を増強する3’-および／または5’-末端調節配列をさらに包含するのが有利であり、これらは、選択した宿主生物および遺伝子の機能に応じて、最適な発現のために選択される。前述のように、これらの調節配列は、遺伝子およびタンパク質発現の特異的発現を可能にすることを意図するものである。宿主生物によって、これは、例えば、遺伝子が誘導後に初めて発現または過剰発現するか、あるいは、直ちに発現および／または過剰発現することを意味する場合もある。
【０１１５】
さらに、調節配列または調節因子は、好ましくは、導入された遺伝子の発現に有利な作用を及ぼし、これによって発現を増強することができる。このように、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いて、調節エレメントを転写レベルで有利に増強することが可能である。しかし、例えば、mRNA安定性を高めることにより、翻訳を増強することも可能である。
【０１１６】
Ｃ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のさらに別の態様は、デサチュラーゼ（またはその一部）だけをコードする核酸、または、本発明の核酸が単独で存在するか、またはデサチュラーゼもしくはエロンガーゼなどの脂肪酸または脂質代謝の生合成遺伝子と一緒に存在する、項Ｂに記載した核酸構築物を含む、ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で用いられる用語「ベクター」とは、別の核酸に結合し、これを輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの一タイプとして、「プラスミド」があり、これは、環状の二本鎖DNAループの形態をしており、そこに、別のDNAセグメントを連結することができる。ベクターのさらに別のタイプは、ウイルスベクターであり、別のDNAセグメントを該ウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、ならびに、エピソーム性哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込むことにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。加えて、特定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を制御することができる。本明細書では、このようなベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。通常、組換えDNA技法に適した発現ベクターは、プラスミドの形態をしている。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、置き換え可能に用いる場合もある。というのは、プラスミドは、ベクターの形態で最も頻繁に用いられるものであるからである。しかし、本発明は、同様の機能を有するウイルスベクター（例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ近縁ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも包含するものとする。さらに、用語「ベクター」は、ファージ、ウイルス、例えばSV40、CMV、バキュロウイルス、アデノウイルス、トランスポソン、ISエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、線状または環状DNAなどの、当業者には公知のその他のベクターを包含するものとする。
【０１１７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸を発現するのに適した形態をした、本発明の核酸、または本発明の遺伝子構築物を包含する。すなわち、上記組換え発現ベクターは、発現に用いようとする宿主細胞に基づいて選択され、発現させようとする核酸配列に機能的に連結した１以上の調節配列を包含する。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結した」とは、目的とするヌクレオチド配列が、調節配列に結合し、これによって、ヌクレオチド配列の発現が可能になり、相互に結合することにより、両配列が、それぞれに特有とみなされる推定機能を果たすようにすることを意味する（例えば、ベクターを宿主細胞に導入する場合には、in vitro転写／翻訳系または宿主細胞において機能を果たす）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。これらの調節配列は、例えば、Goeddel：Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）に記載されている。また、下記文献も参照されたい：GruberおよびCrosby、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton、Florida編：GlickおよびThompson、第７章、89-108（その中の参照文献も含む）。調節配列は、多種の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を制御するもの、ならびに、特定の条件下で、特定の宿主細胞でしか、ヌクレオチド配列の直接発現を制御しないものを包含する。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質を発現させる範囲などの因子によって違ってくることがわかるだろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載した核酸（例えば、デサチュラーゼ、変異型デサチュラーゼ、融合タンパク質など）によりコードされる、融合タンパク質もしくは融合ペプチドなどのタンパク質またはペプチドを生産することができる。
【０１１８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核生物細胞においてデサチュラーゼおよびエロンガーゼを発現させるために設計することができる。例えば、デサチュラーゼ遺伝子は、C.グルタミクム（C. glutamicum）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母およびその他の真菌細胞（Romanos, M. A.ら、（1992）”Foreign gene expression in yeast：a review”, Yeast 8:423-488；van den Hondel, C.A.M.J.J.ら（1991）”Heterologous gene expression in filamentous fungi”：More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure編, pp. 396-428：Academic Press：San Diego；およびvan den Hondel, C.A.M.J.J.およびPunt, P. J.（1991）”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”：Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F.ら、編、pp. 1-28、Cambridge University Press：ケンブリッジ）、藻類（Falciatoreら、1999、Marine Biotechnology. 1, 3:239-251）、下記タイプの繊毛虫：全毛亜綱（Holotrichia）、周毛亜綱（Peritrichia）、旋毛亜綱（Spirotrichia）、吸滴虫綱（Suctoria）、テトラヒメナ属（Tetrahymena）、ゾウリムシ属（Paramecium）、コルピディウム属（Colpidium）、グラウコマ属（Glaucoma）、フクロミズケムシ属（Platyophrya）、ポトマカス（Potomacus）、シュードコニレンバス属（Pseudocohnilembus）、ユープロテス属（Euprotes）、エンゲルマニエラ属（Engelmaniella）およびアンフィシエラ目（Stychotrichia）、特に、スティロニキア・レムネ（Stylonychia lemnae）属の繊毛虫、多細胞植物の細胞（Schmidt, R.およびWillmitzer, L.（1988）”High efficiency Agrobacterium tumefacians-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell Rep.：583-586；Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton、Florida、第6／7章、pp.71-119（1993）；F.F. White, B. Jenesら、Techniques for Gene Transfer：Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, KungおよびR. Wu編, Academic Press（1993）、128-43；Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42（1991）、205-225（およびその中の参照文献）を参照）の細胞または哺乳動物細胞において、ベクターを用い、WO 98/01572に記載されているような形質転換方法に従って、発現させることができる。適した宿主細胞については、Goeddel, Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）にさらに詳しく記載されている。この他に、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、組換え発現ベクターをin vitroで転写および翻訳させることもできる。
【０１１９】
原核生物においては、通常、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を制御する構成または誘導プロモーターを含むベクターを用いて、タンパク質を発現させる。融合ベクターは、一連のアミノ酸を、そこにコードされているタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に付加するが、C末端で付加することもあれば、タンパク質中の適した領域内に融合することもある。これらの融合ベクターは、３つの働き、すなわち、1）組換えタンパク質の発現を増強すること；2）組換えタンパク質の溶解性を高めること；3）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を容易にすること、を有する。融合発現ベクターの場合には、タンパク質加水分解による切断部位は、融合単位と組換えタンパク質が連結された部位で、導入されることが多く、これにより、組換えタンパク質を融合タンパク質の精製後に融合単位から分離することができる。これら酵素とそれに対応する認識配列は、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。
【０１２０】
典型的な融合発現ベクターとしては、中でも、pGEX（Pharmacia Biotech Inc； Smith, D. B.およびJohnson, K. S. （1988）Gene 67:31-40）、pMAL（New England Biolabs、マサチューセッツ州バーバーリー）およびpRIT5（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が挙げられ、これらのベクターでは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース-E-結合タンパク質またはプロテインＡが、組換え標的タンパク質に融合される。一実施形態では、デサチュラーゼコード配列をpGEX発現ベクターにクローニングすることにより、融合タンパク質をコードするベクターを作製する。ここで、該融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端で、GST-トロンビン切断部位-X-タンパク質を包含する。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。GSTと融合していない組換えデサチュラーゼは、トロンビンを用いて融合タンパク質を切断することによって得ることができる。
【０１２１】
好適な誘導非融合大腸菌発現ベクターの例として、中でも、pTrc（Amannら（1988）Gene 69：301-315）およびpET 11d（Studierら、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）60-89）が挙げられる。pTrcベクターの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼによる転写に基づいて起こる。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、T7-gn10-lac融合プロモーターからの転写に基づき、この転写は、共発現したウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）によって媒介される。上記ウイルスポリメラーゼは、lacUV 5プロモーターの転写制御下でT7 gn1遺伝子を保有する常在性λプロファージによって、宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）により提供される。
【０１２２】
原核生物での使用に適したその他のベクターは、当業者には公知であり、このようなベクターは、例えば、下記のものに存在する：大腸菌pLG338、pACYC184、pBR322のようなpBRシリーズ、pUC18またはpUC19のようなpUCシリーズ、M113mpシリーズ、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11またはpBdCI；ストレプトミセス属pIJ101、pIJ364、pIJ702またはpIJ361；バチルス属pUB110、pC194またはpBD214、コリネバクテリウム属pSA77またはpAJ667。組換えタンパク質の発現を最大限にする戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解により切断する能力が破壊されている宿主細菌においてタンパク質を発現させるというものである（Gottesman, S.、Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ（1990）119-128）。さらに別の戦略によれば、発現ベクターに挿入しようとする核酸の核酸配列を改変することにより、各アミノ酸の個々のコドンが、C.グルタミクム（C. glutamicum）のように、発現のために選択した細菌で優先的に用いられるようにする（Wadaら（1992）Nucleic Acids Res. 20:2111-2118）。本発明のこれらの核酸配列の改変は、標準的DNA合成方法により実施される。
【０１２３】
さらに別の実施形態では、デサチュラーゼ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母菌サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）における発現のためのベクターの例として、pYeデサチュラーゼc1（Baldariら（1987）Embo J.6:229-234）、pMFa（KurjanおよびHerskowitz（1982）Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultzら（1987）Gene 54:113-123）およびpYES2（Invitrogen Corporation、カリフォルニア州サンディエゴ）が挙げられる。糸状菌のようなその他の真菌で用いるのに適したベクターを構築するためのベクターおよび方法として、下記に詳しく記載されたものが挙げられる：van den Hondel, C.A.M.J.J.およびPunt, P.J.（1991）”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi：Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdyら編、pp. 1-28、Cambridge University Press：ケンブリッジ、もしくは：More Gene Manipulations in Fungi［J.W. Bennet & L.L. Lasure編、pp. 396-428：Academic Press：サンディエゴ］。さらに適した酵母ベクターとして、例えば、pAG-1、YEp6、YEp13またはpEMBLYe23が挙げられる。
【０１２４】
上記以外に、本発明のデサチュラーゼは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞で発現させてもよい。培養した昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）においてタンパク質を発現させるために使用可能なバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ（Smithら（1983）Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）およびpVLシリーズ（LucklowおよびSummers（1989）Virology 170:31-39）が挙げられる。
【０１２５】
前記ベクターは、考えられる好適なベクターのほんの一部を挙げたものにすぎない。その他のプラスミドは、当業者には公知であり、例えば、下記に記載されている：Cloning Vectors（Pouwels, P.H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018）。
【０１２６】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞において発現させる。本発明を目的として用いられる哺乳動物は、ヒト以外のあらゆる哺乳動物と理解すべきである。哺乳動物発現ベクターの例として、pCDM8（Seed, B.（1987）Nature 329:840）およびpMT2PC（Kaufmanら（1987）EMBO J. 6:187-195）が挙げられる。哺乳動物細胞に用いる場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントにより賦与されることが多い。通常用いられるプロモーターは、例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来するものである。原核および真核生物細胞に適したその他の発現系は、下記の文献中にみいだすことができる：Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T., Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版の第16および17章、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、1989）。
【０１２７】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、好ましくは特定の細胞型において、核酸の発現を制御することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを用いて核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは、当業者には公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、中でも、下記のものが挙げられる：アルブミン（albumen）プロモーター（肝特異的；Pinkertら（1987）Gene Dev. 1：268-277）、リンパ球特異的プロモーター（CalameおよびEaton（1988）Adv. Immunol. 43：235-275）、特に、T-細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore（1989）EMBO J. 8:729-733）およびイムノグロビン（Banerjiら（1983）Cell 33:729-740；QueenおよびBaltimore（1983）Cell 33:741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle（1989）PNAS 86:5473-5477）、膵特異的プロモーター（Edlundら（1985）Science 230:912-916）および哺乳動物特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第4, 873, 316号および欧州特許出願第264,166号）。また、発生調節プロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター（KesselおよびGruss（1990）Science 249:374-379）およびフェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman（1989）Genes Dev. 3:537-546）も含まれる。
【０１２８】
さらに別の実施形態では、本発明のデサチュラーゼは、単細胞植物細胞（藻類など）（Falciatoreら、1999、Marine Biotechnology 1(3)：239-251およびそこで引用される参照文献を参照）、ならびに、それより高等の植物（例えば、穀物のような種子植物）由来の植物細胞において発現させることができる。植物発現ベクターの例として、下記の文献に詳しく記載されているものが挙げられる：Becker, D., Kemper, E., Schell, J.およびMasterson, R.（1992）”New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20：1195-1197；ならびに、Bevan, M.W.（1984）”Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12:8711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants：Transgenic Plants、第１巻、Engineering and Utilization、KungおよびR. Wu編、Academic Press, 1993, pp. 15-38。
【０１２９】
植物発現カセットは、好ましくは、植物細胞における遺伝子発現を制御することができ、かつ、機能的に連結された調節配列を含み、これによって、各配列は、転写終結、例えば、ポリアデニル化シグナルなどの機能を果たすことができる。好ましいポリアデニル化シグナルは、オクトピンシンターゼ（Gielenら、EMBO J. 3（1984）835以下参照）またはその機能的同等物として知られるTi プラスミドpTiACH5の遺伝子３のようなアグロバクテリウムツメファシエンスT-DNAから誘導されたものであるが、その他、植物において機能的に活性なターミネーターもすべて適している。
【０１３０】
非常に多くの場合、植物遺伝子発現は、転写レベルに限定されないことから、植物発現カセットは、翻訳エンハンサー、例えば、オーバードライブ配列のような機能的に連結された別の配列を含むのが好ましい。このオーバードライブ配列は、5’-非翻訳タバコモザイクウイルスリーダー配列を含み、この配列が、タンパク質／RNA比を高める（Gallieら、1987、Nucl. Acids Research 15:8693-8711）。
【０１３１】
植物遺伝子発現は、適したプロモーターに機能的に連結させて、このプロモーターが、細胞または組織特異的に、適正なタイミングで、遺伝子発現をもたらすようにしなければならない。好ましいプロモーターは、構成的発現を起こすもの（Benfeyら、EMBO J. 8（1989）2195-2202）であり、例えば、35S CAMV（Franckら、Cell 21（1980）285-294）、19S CaMV（米国特許第5,352,605号およびWO 84/02913も参照）のような植物ウイルスから誘導されるもの、または、米国特許第4,962,028号に記載されているRubisco小サブユニットプロモーターのような植物プロモーターがある。
【０１３２】
植物遺伝子発現カセットにおける機能的連結のために用いるのに好ましいその他の配列は、ターゲッティング配列であり、これは、遺伝子産物を、その対応する細胞小器官（詳しくは、Kermode、Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4（1996）285-423およびそこに引用された参照文献を参照）、例えば、液胞、核や、アミロプラスト、葉緑体および有色体のようなあらゆる種類の色素体、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、エライオプラスト、ペロキシソームおよびその他の植物細胞小器官へとターゲッティングするのに必要である。
【０１３３】
植物遺伝子発現はまた、化学的に誘導可能なプロモーター（詳しくは、Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108を参照）を介して促進することも可能である。遺伝子発現が、タイミングに関して特異的に起こるようにしたい場合には、化学的に誘導可能なプロモーターが特に適している。このようなプロモーターの例として、サリチル酸誘導プロモーター（WO 95/19443）、テトラサイクリン−誘導プロモーター（Gatzら（1992）Plant J. 2, 397-404）およびエタノール誘導性プロモーターが挙げられる。
【０１３４】
その他の適したプロモーターは、生物または非生物的ストレス条件に応答するプロモーター、例えば、病原体誘導性PRP1遺伝子プロモーター（Wardら、Plant. Mol. Biol. 22（1993）361-366）、熱誘導性トマトhsp80プロモーター（米国特許第5,187,267号）、低温誘導性ジャガイモαアミラーゼプロモーター（WO 96/12814）または損傷誘導性pinIIプロモーター（EP-A-0 375 091）である。
【０１３５】
特に好ましいプロモーターは、脂質および油生合成が行われる組織および器官において、内乳細胞のような種子細胞において、そして発育中の胚の細胞において、遺伝子発現を引き起こすものである。好適なプロモーターとして、下記を挙げることができる：アブラナナピン（napin）遺伝子プロモーター（米国特許第5,608,152号）、ビシア・ファーバ（Vicia faba）USPプロモーター（Baeumleinら、Mol Gen Genet, 1991, 225(3)：459-67）、シロイヌナズナオレオシンプロモーター（WO 98/45461）、インゲンマメファセオリンプロモーター（米国特許第5,504,200号）、アブラナBce4プロモーター（WO 91/13980）またはレグミンB4プロモーター（LeB4；Baeumleinら、1992、Plant Journal, 2(2)：233-9）、ならびに、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、コメなどの単子葉植物に種子特異的発現を起こすプロモーター。特に好適なプロモーターとして、オオムギlpt2もしくはlpt1遺伝子プロモーター（WO 95/15389およびWO 95/23230）、または、WO 99/16890に記載されたプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、コメグルテリン遺伝子、コメオリジン（oryzin）遺伝子、コメプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカジリン遺伝子、およびライムギセカリン遺伝子に由来するプロモーター）がある。
【０１３６】
本発明に従うデサチュラーゼの、単独でのまたは他のデサチュラーゼもしくはエロンガーゼと組み合わせた、多重平行（multiparallel）発現が特に望ましい。このような発現カセットの導入は、複数の個別発現構築物の同時形質転換、または１つの構築物に対し複数の発現カセットを組み合わせることにより、実施することができる。また、複数のベクターを各々、複数の発現カセットで形質転換した後、宿主細胞に導入してもよい。
【０１３７】
また、色素体特異的発現を起こすプロモーターも特に適している。というのは、色素体は、脂質生合成の前駆体、およびいくつかの最終産物が合成される細胞小器官だからである。ウイルスRNAポリメラーゼプロモーターのような好適なプロモーターは、WO 95/16783およびWO 97/06250に、また、シロイヌナズナclpPプロモーターについては、WO 99/46394に記載されている。
【０１３８】
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングした、本発明のDNA分子を包含する組換え発現ベクターを提供する。すなわち、上記DNA分子を調節配列に機能的に連結することにより、デサチュラーゼmRNAに対して「アンチセンス」のRNA分子の発現（DNA分子の転写により発現される）が可能になる。調節配列は、アンチセンス配向でクローニングされた核酸に機能的に連結され、かつ、多数の細胞型においてアンチセンスRNA分子の連続的発現を制御するもの、例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーから選択するか、あるいは、アンチセンスRNAの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を制御する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が、非常に効果的な調節領域の制御下で生産される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態で存在することができ、該領域の活性は、ベクターが導入された細胞型により決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節について詳しくは、Weintraub, H.ら、Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics、第１巻(1) 1986を参照されたい。
【０１３９】
本発明のさらに別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では置き換え可能に用いる。もちろん、これらの用語は、特定の標的細胞だけを指すのではなく、この細胞の子孫または潜在的子孫も意味する。特定の改変は、突然変異または環境影響により、後の世代で起こる可能性もあるため、この子孫は、必ずしも母細胞と同じわけではないが、本明細書で用いる用語が意味する範囲に含まれる。
【０１４０】
組換え体またはトランスジーンという用語、例えば、組換え発現ベクターまたは組換え宿主もしくは宿主細胞とは、本発明の目的に従い、本発明の核酸および／または、該核酸の5’および3’位置におけるそれらの天然調節配列が、その自然環境にない、すなわち、もともとの生物における配列の位置が改変されたか、あるいは、核酸配列および／または調節配列が、生物内で突然変異を起こした、もしくは本発明の核酸配列が、もともとの生物以外の生物、またはその調節配列に転移されたことを意味すると理解されたい。自然環境とは、核酸配列が天然に存在する生物における位置を意味すると理解されたい。
【０１４１】
宿主細胞は、原核または真核生物いずれの細胞でもよい。例えば、デサチュラーゼは、C.グルタミクム（C. glutamicum）のような細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）またはCOS細胞など）、藻類、繊毛虫、植物細胞、真菌またはC.グルタミクム（C. glutamicum）のようなその他の微生物において発現させることができる。その他の好適な宿主細胞は、当業者には公知である。
【０１４２】
ベクターDNAは、通常の形質転換またはトランスフェクション方法により、原核または真核生物細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」、「接合」および「形質導入」は、宿主細胞に外来核酸（例えば、DNA）を導入するための、当業者には公知の多数の方法を包含し、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、自然受容能、化学的媒介導入、エレクトロポレーションまたは粒子ボンバードメントなどが挙げられる。植物細胞を含む、宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに適した方法は、下記の文献にみいだすことができる：Sambrookら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual.、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、1989）およびその他の研究室テキスト、例えば、Methods in Molecular Biology, 1995、第44巻、Agrobacterium protocols、GartlandおよびDavey編、Humana Press、ニュージャージー州トトワ。
【０１４３】
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションについては、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション方法によっては、少数の細胞しか、外来DNAをそのゲノムに組み込めないことが知られている。これらの組込み体（integrants）を同定および選択するためには、通常、選択マーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質に対する耐性）を、目的とする遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーは、G418、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に耐性を賦与するもの、あるいは、植物では、グリホセート（glyphosate）またはグルホシネート（glufosinate）のような除草剤に対する耐性を賦与するものを包含する。さらに好適なマーカーは、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ura3またはilv2のような糖またはアミノ酸の生合成経路に関与する遺伝子をコードするマーカーである。ルシフェラーゼ、gfpまたはその他の蛍光遺伝子などの遺伝子をコードするマーカーも適している。これらのマーカーは、これらの遺伝子が機能的ではない突然変異体で用いることができる。何故なら、上記遺伝子は、例えば、通常の方法によって、欠失されているからである。さらに、選択マーカーをコードする核酸をコードするマーカーを、デサチュラーゼをコードするのと同じベクター上で宿主細胞に導入する、あるいは、別のベクター上で導入することもできる。導入した核酸により安定してトランスフェクションされた細胞は、例えば、薬剤選択（例えば、選択マーカーを組み込んだ細胞は生存するのに対し、他の細胞は死滅する）によって同定することができる。
【０１４４】
相同的な組換え微生物を生産するためには、デサチュラーゼ遺伝子の少なくとも１セグメントを含むベクターを産生する。尚、この遺伝子に、欠失、付加または置換を導入することにより、デサチュラーゼ遺伝子を修飾する、例えば、該遺伝子を機能的に破壊しておく。このデサチュラーゼ遺伝子は、好ましくは、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）デサチュラーゼ遺伝子であるが、その他の生物、哺乳動物、真菌もしくは昆虫細胞由来の相同体または類似体も用いることもできる。好ましい実施形態では、相同的組換え時に、内在性デサチュラーゼ遺伝子が機能的に破壊されるようにベクター（すなわち、機能タンパク質をそれ以上コードしない：ノックアウトベクターともよばれる）を設計する。これ以外にも、相同的組換え時に、内在性デサチュラーゼ遺伝子が突然変異する、あるいは、改変されるものの、依然として機能タンパク質をコードする（例えば、上流調節領域を改変することにより、内在性デサチュラーゼの発現を改変する）ように、ベクターを設計することもできる。相同的組換えによって点突然変異を発生させるためには、キメラ形成法としても知られ、Cole-Straussら、1999、Nucleic Acids Research 27(5)：1323-1330およびKmiec, Gene Therapy, 1999, American Scientist, 87(3)：240-247に記載されているDNA-RNAハイブリッドを用いることもできる。
【０１４５】
相同的組換え用のベクターでは、デサチュラーゼ遺伝子の改変セグメントには、デサチュラーゼ遺伝子の別の核酸が、その5’および3’末端に隣接しているため、ベクター上に存在する外因性デサチュラーゼ遺伝子と、微生物または植物中の内在性デサチュラーゼ遺伝子との間で、相同的組換えが可能である。隣接する別のデサチュラーゼ核酸は、内在性遺伝子との相同的組換えを達成するのに十分な長さを有する。通常、数百塩基対からキロベースの隣接DNA（5’および3’末端の両方で）が、ベクター上に存在する（相同的組換えのためのベクターについては、例えば、Thomas, K. R.およびCapecchi, M. R.（1987）Cell 51:503を、また、cDNAに基づくヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）における組換えに関しては、Streppら、1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(8)：4368-4373を参照）。上記ベクターは、微生物または植物細胞に導入し（例えば、ポリエチレングリコール媒介DNAにより行う）、次に、導入されたデサチュラーゼ遺伝子が、内在性デサチュラーゼ遺伝子との相同的組換えを受けた細胞を、当業者には公知の方法を用いて選択する。
【０１４６】
別の実施形態では、導入された遺伝子の調節発現を可能にする選択された系を含む、微生物などの組換え生物を産生することができる。lacオペロンの制御下に置かれたベクターへのデサチュラーゼ遺伝子の組込みにより、例えば、IPTGの存在下でのみデサチュラーゼ遺伝子の発現が可能となる。これらの調節系は、当業者には公知である。
【０１４７】
培養もしくは野生のいずれかで生育する、原核または真核宿主細胞などの、本発明の宿主細胞を用いて、デサチュラーゼを生産する（すなわち、発現させる）ことができる。植物では、エレクトロポレーションまたはアグロバクテリウム媒介遺伝子導入により、発育中の花にDNAを直接導入することからなる、さらに別の方法を用いることができる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてデサチュラーゼを生産する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、本発明の宿主細胞（そこに、デサチュラーゼをコードする組換え発現ベクターが導入されているか、または、そのゲノムに、野生型もしくは改変型デサチュラーゼが導入されている）を適当な培地で生育し、デサチュラーゼを生産することからなる。さらに別の実施形態では、この方法は、培地または宿主細胞からデサチュラーゼを単離することを包含する。
【０１４８】
本発明の核酸を取り込むのに一般的に適した宿主細胞、本発明の遺伝子産物、または本発明のベクターは、いずれの原核または真核生物であってもよい。有利に用いられる宿主生物は、細菌、真菌、酵母などの生物、動物細胞または植物細胞である。さらに有利な生物は、動物、あるいは、好ましくは、植物またはそれらの一部分である。真菌、酵母または植物を用いるのが好ましいが、特に、多量の脂質化合物を含有する油穀物などの植物、例えば、アブラナ、マツヨイグサ、キャノーラ、ラッカセイ、アマニ、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、ルリヂサ；あるいは、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、コメ、オオムギ、ワタ、キャッサバ、コショウ、マンジュギクなどの植物；ジャガイモ、タバコ、ナスおよびトマトなどのナス科植物；ソラマメ属種、エンドウ、ムラサキウマヤゴシ、低木（コーヒー、カカオ、茶）、ヤナギ属種、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）ならびに、多年生草および飼料穀物が非常に好ましい。本発明において、特に好ましい植物は、ダイズ、ラッカセイ、アブラナ、キャノーラ、アマニ、マツヨイグサ、ヒマワリ、ベニバナ、樹木（ギネアアブラヤシ、ココナツ）などの油穀物である。
【０１４９】
Ｄ．単離されたデサチュラーゼ
本発明のさらに別の態様は、単離されたデサチュラーゼおよびその生物学的に活性な部分に関する。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分とは、組換えDNA方法により生産された場合には細胞材料を本質的に含まず、また、化学的に合成された場合には化学的前駆体またはその他の化学物質を本質的に含まない。「細胞材料を本質的に含まない」という用語は、タンパク質が、それが天然にもしくは組換えにより生産される細胞の細胞成分から分離されたデサチュラーゼ調製物を意味する。一実施形態では、用語「細胞材料を本質的に含まない」は、非デサチュラーゼ（本明細書では、「汚染タンパク質」とも呼ぶ）の含有率が、約30％（乾量に基づく）より少ない、さらに好ましくは約20％より少ない、さらにまた好ましくは約10％より少ない、最も好ましくは約５％より少ないデサチュラーゼ調製物を意味する。デサチュラーゼまたはその生物学的に活性な部分が、組換え方法によって生産される場合には、これも、培養培地をほとんど含まない、すなわち、培養培地の量が、タンパク質調製物の量の約20％より少ない、さらに好ましくは約10％より少ない、最も好ましくは約５％より少ない。用語「化学的前駆体またはその他の化学物質を本質的に含まない」とは、タンパク質が、その合成に関与する化学的前駆体またはその他の化学物質から分離されたデサチュラーゼ調製物を意味する。一実施形態では、用語「化学的前駆体またはその他の化学物質を本質的に含まない」とは、化学的前駆体または非デサチュラーゼ化学物質の含有率が、約30％（乾量に基づく）より少ない、さらに好ましくは約20％より少ない、さらにまた好ましくは約10％より少ない、最も好ましくは約５％より少ないデサチュラーゼ調製物を意味する。好ましい実施形態では、単離されたタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、デサチュラーゼが由来する同じ生物からの汚染タンパク質を一切呈示しない。これらのタンパク質は、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）もしくは前述の微生物：例えば、大腸菌、枯草菌、C.グルタミクム（C. glutamicum）などの細菌、モルチェレラのような真菌、サッカロミセス属のような酵母、あるいは、コルピジウム（Colpidium）のような繊毛虫もしくはフェオダクチルム（Phaeodactylum）のような藻類において、通常、組換え発現により生産される。
【０１５０】
本発明の単離されたデサチュラーゼまたはその一部分は、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、あるいは、これら膜を介した分子の輸送にも関与している可能性がある。好ましい実施形態では、上記タンパク質またはその一部分は、これらが、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、あるいは、これら膜を介した分子の輸送に関与する能力を保持する上で、配列番号２、４、６または12のアミノ酸配列と十分な相同性を有するアミノ酸配列を含む。上記タンパク質の一部分は、好ましくは、本明細書に記載されている生物学的に活性な部分である。さらに好ましい実施形態では、本発明のデサチュラーゼは、配列番号２、４、６または12に示すアミノ酸配列の１つを有する。さらに好ましい実施形態では、上記デサチュラーゼは、例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５または11のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する。さらに別の好ましい実施形態では、上記デサチュラーゼは、配列番号２、４、６または18のアミノ酸配列の１つと、少なくとも約50〜60％、好ましくは少なくとも約60〜70％、より好ましくは少なくとも約70〜80％、80〜90％、90％〜95％、さらに好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％以上の相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有する。また、本発明の好ましいデサチュラーゼは、本明細書に記載したデサチュラーゼ活性の少なくとも１つを有するのが好ましい。例えば、本発明の好ましいデサチュラーゼは、例えば、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５または11のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつ、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）における細胞膜の合成に必要な化合物の代謝、あるいは、これら膜を介した分子の輸送に関与すると共に、１、２、３または４つの二重結合と、C18、C20またはC22の鎖長を有する脂肪酸に二重結合を導入することができるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
別の実施形態では、デサチュラーゼは、配列番号２、４または６のアミノ酸配列と本質的に相同であり、配列番号２、４または６の配列のうち１配列のタンパク質の機能的活性を保持するが、それらのアミノ酸配列は、前記の第Ｉ項で詳しく記載したように、自然突然変異または突然変異誘発によって異なる。さらに別の実施形態では、上記デサチュラーゼは、従って、配列番号２、４または６の完全アミノ酸配列と、少なくとも約50〜60％、好ましくは少なくとも約60〜70％、さらに好ましくは少なくとも約70〜80％、80〜90％、90％〜95％、最も好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％以上の相同性を有し、かつ、本明細書に記載したデサチュラーゼ活性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。別の実施形態では、本発明は、配列番号２、４または６の完全アミノ酸配列と本質的に相同的な、完全なフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）タンパク質に関する。
【０１５２】
デサチュラーゼの生物学的に活性な部分とは、デサチュラーゼのアミノ酸配列、例えば、配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列、あるいは、デサチュラーゼと相同的なタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。尚、上記ペプチドは、アミノ酸が、全長デサチュラーゼまたはデサチュラーゼと相同の全長タンパク質より少なく、かつ、デサチュラーゼの少なくとも１つの活性を有する。生物学的に活性な部分（ペプチド、例えば、長さが、例えば、５、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100以上のアミノ酸を有するペプチド）は、通常、デサチュラーゼの少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを包含する。さらに、これ以外にも、上記タンパク質のその他の領域が欠失した、生物学的に活性な他の部分を、組換え方法により産生し、前記活性の１以上に関して実験することができる。デサチュラーゼの生物学的に活性な部分は、好ましくは、生物学的活性を有する１以上の選択されたドメイン／モチーフまたはそれらの一部分を包含する。
【０１５３】
デサチュラーゼは、組換えDNA方法により生産されるのが好ましい。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターにクローニングした（前記のように行う）後、発現ベクターを宿主細胞に導入し（前記のように行う）、デサチュラーゼを宿主細胞で発現させる。次に、適切な精製スキームにより、タンパク質精製の標準的方法を用いて、その細胞からデサチュラーゼを単離することができる。組換え発現の別の方法として、ペプチド合成の標準的方法により、デサチュラーゼ、デサチュラーゼポリペプチドまたはデサチュラーゼペプチドを化学的に合成することができる。さらに、例えば、本発明のデサチュラーゼまたはその断片を用いて、標準的技法により作製することができる抗デサチュラーゼ抗体を用いて、天然デサチュラーゼを細胞（例えば、内皮細胞）から単離することができる。
【０１５４】
本発明は、キメラデサチュラーゼタンパク質またはデサチュラーゼ融合タンパク質も提供する。本明細書で用いる「キメラデサチュラーゼタンパク質」または「デサチュラーゼ融合タンパク質」とは、非デサチュラーゼポリペプチドと機能的に結合されたデサチュラーゼポリペプチドを包含する。「デサチュラーゼポリペプチド」とは、デサチュラーゼに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味するのに対し、「非デサチュラーゼポリペプチド」は、デサチュラーゼと本質的に相同的でないタンパク質（例えば、デサチュラーゼとは異なり、かつ、同じまたは別の生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。融合タンパク質の範囲内で、「機能的に結合された」という用語は、デサチュラーゼポリペプチドと非デサチュラーゼポリペプチドが、互いに融合し、これによって、両配列が、使用した配列に特有とみなされる推定機能を果たす、という意味であることを理解すべきである。非デサチュラーゼポリペプチドは、デサチュラーゼポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。一実施形態では、融合タンパク質は、例えば、デサチュラーゼ配列がGST配列のＣ末端に融合したEST-デサチュラーゼ融合タンパク質である。これらの融合タンパク質は、組換えデサチュラーゼの精製を促進することができる。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列（Ｎ末端）を有するデサチュラーゼである。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）では、異種シグナル配列を用いることにより、デサチュラーゼの発現および／または分泌を高めることができる。
【０１５５】
本発明のキメラデサチュラーゼタンパク質またはデサチュラーゼ融合タンパク質は標準的組換えDNA法により生産される。例えば、様々なポリペプチド配列をコードするDNA断片は、通常の技法を用いて、フレーム内で互いに連結させる。このような技法には、例えば、平滑末端または突出末端を用いた連結、制限酵素切断による適切な末端の賦与、付着末端の充填、必要に応じて、アルカリホスファターゼを用いた処理による不要な連結の除去、ならびに、酵素連結などがある。さらに別の実施形態では、融合遺伝子は、DNA合成装置などの通常の技法により、合成することができる。この他にも、アンカープライマーを用いて、遺伝子断片のPCR増幅を実施することができる。このアンカープライマーは、連続する遺伝子断片の間に、相補的突出部を形成した後、これを互いにハイブリダイズさせ、再増幅することにより、キメラ遺伝子配列を産生する（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons：1992を参照）。さらに、融合単位（例えば、GSTポリペプチド）をすでにコードする多数の発現ベクターが市販されている。デサチュラーゼをコードする核酸をこのような発現ベクターにクローニングすることにより、融合単位をフレーム内でデサチュラーゼタンパク質に連結させることができる。
【０１５６】
デサチュラーゼ相同体は、突然変異誘発、例えば、特異的点突然変異、あるいは、デサチュラーゼの切断により産生することができる。本明細書で用いる用語「相同体」とは、デサチュラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するデサチュラーゼの変異型を意味する。デサチュラーゼアゴニストは、デサチュラーゼと同じ活性、もしくはデサチュラーゼの生物学的活性のいくつかを本質的に保持することができる。デサチュラーゼアンタゴニストは、例えば、デサチュラーゼなどの細胞膜成分の代謝カスケードの上流または下流エレメントとの競合的結合により、あるいは、細胞膜を介した化合物の輸送を媒介するデサチュラーゼと結合し、これによってトランスロケーションを阻害することにより、天然に存在するデサチュラーゼ形態の１以上の活性を阻害することができる。別の実施形態では、デサチュラーゼ相同体は、デサチュラーゼアゴニストまたはデサチュラーゼアンタゴニスト活性に関して、デサチュラーゼの突然変異体、例えば、トランケート型突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、同定することができる。一実施形態では、コンビナトリアル突然変異誘発により核酸レベルでデサチュラーゼ変異体の多様性ライブラリーを産生した後、これを多様性遺伝子ライブラリーによりコードする。デサチュラーゼ変異型の多様性ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素連結することにより、潜在的デサチュラーゼ配列の縮重セットを個々のポリペプチドとして、あるいは、このデサチュラーゼ配列セットを含むさらに大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として、発現させることができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的デサチュラーゼ相同体のライブラリーを産生するのに用いることができる多数の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成をDNA合成装置において実施した後、合成遺伝子を、適した発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットを用いることにより、潜在的デサチュラーゼ配列の所望のセットをコードする全配列を混合物中に提供することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業者には公知である（例えば、Narang, S.A.（1983）Tetrahedron 39：3；Itakuraら（1984）Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakuraら（1984）Science 198:1056；Ikeら（1983）Nucleic Acids Res.11：477を参照）。
【０１５７】
さらに、デサチュラーゼ断片のライブラリーを用いて、デサチュラーゼ断片の多様性集団を産生し、デサチュラーゼの相同体のスクリーニングおよび後の選択に使用することができる。一実施形態では、二本鎖の切断が、１分子につき約1回しか発生しない条件下で、ヌクレアーゼでデサチュラーゼコード配列の二本鎖PCR断片を処理し、二本鎖DNAを変性し、二本鎖DNA（二本鎖切断を有する様々な産物のセンス／アンチセンス対を包含する）の形成で、上記DNAを再生し、新しく形成された二重らせんから、S1ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去した後、得られた断片ライブラリーを発現ベクターと連結することにより、コード配列の断片のライブラリーを産生することができる。この方法を用いて、様々な大きさのデサチュラーゼのＮ末端、Ｃ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【０１５８】
点突然変異または切断により産生されたコンビナトリアルライブラリー中の遺伝子産物をスクリーニングする技法、ならびに、選択した特性を有する遺伝子産物のcDNAライブラリーをスクリーニングする技法は、当業者には多数知られている。これらの技法は、デサチュラーゼ相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により産生した遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適応させることができる。ハイスループット分析に付すことができる、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに、最もよく用いられる技法は、通常、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換した後、所望の活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現することを含んでなる。逐次全体突然変異誘発（REM：recursive ensemble mutagenese）、すなわち、ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を増加させる新規の技法を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用いることにより、デサチュラーゼ相同体を同定することができる（ArkinおよびYourvan（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7811-7815；Delgraveら（1993）Protein Engineering 6（3）：327-331）。
【０１５９】
酵素、またはそれらをコードする遺伝子の触媒特性を修飾するのに知られている、別の技法は、遺伝子シャッフリング（例えば、Stemmer, PNAS 1994, 91：10747-10751, WO 97/20078またはWO 98/13487を参照）であり、これは、遺伝子断片の組合せであり、その際、この新しい組合せを、誤ったポリメラーゼ連鎖反応により変異させ、これにより、検定しようとする高い配列多様性を生み出すことができる。しかし、このような手法を用いるための必要条件は、得られた遺伝子多様性を、機能性について試験するのに適したスクリーニング系である。
【０１６０】
PUFA依存性酵素活性を同定するスクリーニング方法は、特に、デサチュラーゼ活性をスクリーニングするための必要条件である。PUFAに対する特異性を有するデサチュラーゼ活性については、毒性代謝物（ここでは、サリチル酸またはサリチル酸誘導体）の存在下でアラキドン酸の毒性をケカビ属（Mucor）種に用いて、これを、公知の形質転換方法（Eroshinら、Mikrobiologiya、Vol. 65, No. 1, 1996, pp. 31-36）により、所望の遺伝子構築物で形質転換することにより、増殖に基づく一次スクリーニングを実施することができる。こうして得られたクローンを、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析法により、脂質成分について分析し、出発材料および産物の種類および量を同定することができる。
【０１６１】
さらに別の実施形態では、細胞に基づくアッセイを用いて、当業者には公知のさらに別の方法により、多様性デサチュラーゼライブラリーを分析することも可能である。
【０１６２】
Ｅ．本発明に従う使用およびプロセス／方法
本明細書に記載する核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、融合タンパク質、プライマー、ベクターおよび宿主細胞は、以下に挙げる方法の１つ以上に用いることができる：フェオダクチルム（Phaeodactylum）および関連する生物の同定、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）と関連する生物のゲノムマッピング、目的とするフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）配列の同定および局在化、進化研究、当該機能に必要なデサチュラーゼタンパク質領域の決定、デサチュラーゼ活性のモジュレーション；１以上の細胞膜成分の代謝のモジュレーション；１以上の化合物の膜透過輸送のモジュレーション、ならびに、ファインケミカルのような所望の化合物の細胞による生産のモジュレーション。本発明のデサチュラーゼ核酸分子は、多様な用途を有する。上記デサチュラーゼ核酸分子はまず、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）またはこれらに近縁の系統として、生物を同定するのに用いることができる。また、上記核酸分子を用いて、微生物の混合集団におけるフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）もしくはこれらの近縁系統の存在を同定することができる。本発明は、一連のフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）遺伝子の核酸配列を提供する。この生物の存在または非存在は、ストリンジェントな条件下で、微生物の均質または混合集団の培養物の抽出ゲノムDNAをスクリーニングすることにより、決定することができ、その際、上記生物に特有のフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）遺伝子の領域、またはこの遺伝子の一部分の領域を覆うプローブを用いる。高度不飽和酸の商業的生産のためには、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）自体が用いられており、さらには、特に、得られたPUFAをトリアシルグリセロール画分に組み込もうとする場合、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）は、PUFAの生産に、また他の生物においても適している。
【０１６３】
さらに、本発明の核酸およびタンパク質分子は、ゲノムの特定領域についてのマーカーとして働くことができる。これら分子は、ゲノムをマッピングするのに適しているだけではなく、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）タンパク質の機能研究にも適している。フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）の特定のDNA結合タンパク質が結合するゲノム領域を同定するためには、例えば、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）ゲノムを断片化した後、得られた断片をDNA結合タンパク質と一緒にインキュベートすることができる。このタンパク質と結合するものは、さらに、本発明の核酸分子、好ましくは、容易に検出可能なマーカーを用いて、スクリーニングすることができる。このような核酸分子とゲノム断片との結合により、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）のゲノムマップでの断片の局在化が可能になり、これを様々な酵素で繰り返し実施すれば、タンパク質が結合する核酸配列の迅速な決定が容易に行なわれる。さらに、本発明の核酸分子は、これら核酸分子が、関連する真菌または藻類におけるゲノムマップの構築用のマーカーとして働くのに、近縁種の配列と十分な相同性を有することができる。
【０１６４】
本発明のデサチュラーゼ核酸分子は、進化研究、ならびに、タンパク質構造の研究にも適している。本発明の分子が関与する代謝および輸送工程は、多数の原核および真核生物細胞によって使用されている。近縁にある生物の進化度は、本発明の核酸分子の配列と、他の生物由来の類似酵素をコードする配列とを比較することにより決定することができる。従って、このような比較により、配列領域が保存されているもの、保存されてないものの決定が可能になり、酵素機能に必須のタンパク質の領域を決定する上で役立つと思われる。このタイプの決定は、タンパク質工学研究に有用であり、タンパク質が、その機能を欠失せずに、どの程度の突然変異誘発を許容できるのかを知る手がかりを提供することになるだろう。
【０１６５】
本発明のデサチュラーゼ核酸分子の操作により、野生型デサチュラーゼに対して、機能が異なるデサチュラーゼの生産が可能になる。これらタンパク質の効力または活性を高める；これらを通常より多数、細胞に存在させる；あるいは、それらの効力または活性を低下させることが可能である。「効力または活性が高められる」とは、例えば、上記酵素が、本来の酵素より、高い選択性および／または活性、好ましくは、少なくとも10％高い活性、特に好ましくは、少なくとも20％高い活性、極めて好ましくは、少なくとも30％高い活性を有することを意味する。
【０１６６】
本発明のデサチュラーゼの修飾が、このような修飾タンパク質を含むファインケミカルの収率、生産および／または生産効率に直接影響を与え得る一連の機構が存在する。ラージスケールでの繊毛虫、藻類または真菌の培養物からのファインケミカルの取得は、細胞が所望の化合物を分泌する場合、有意に改善される。なぜならば、これらの化合物は、培養培地から容易に単離することができるからである（培養細胞のバイオマスからの抽出とは対照的に）。あるいは、細胞が、一種の濃縮機構を備えた特別の細胞小器官中にin vivoで化合物を貯蔵する場合には、精製を改善することができる。デサチュラーゼを発現する植物では、輸送が増加すると、植物組織および植物器官内での分布が改善されると考えられる。細胞からファインケミカルを膜外へ輸送する輸送体分子の数または活性が増加すると、生産されるファインケミカル（細胞外培地に存在する）の量を増加させることができ、従って、回収および精製を容易にし、また、植物の場合には、分布がより効率的になる。対照的に、１以上のファインケミカルの効率的な過剰生産のためには、好適な生合成経路用の補因子、前駆体分子および中間体量の増加が必要である。炭素源（すなわち、糖）、窒素源（すなわち、アミノ酸、アンモニウム塩）、リン酸塩および硫黄などの栄養素の膜内への輸送に関与する輸送体タンパク質の数および／または活性が増加すると、生合成工程で利用可能な栄養素のあらゆる制限事項が排除されるため、ファインケミカルの生産を改善することができる。PUFAのような脂肪酸や、PUFAを含む脂質は、それ自体が望ましいファインケミカルである。これら化合物の生合成に関与する本発明の１以上のデサチュラーゼの活性を最適化する、またはその数を増加する、あるいは、これら化合物の異化作用に関与する１以上のデサチュラーゼの活性を破壊することにより、繊毛虫、藻類、植物、真菌、酵母またはその他の微生物における脂肪酸および脂質分子の収率、生産および／または生産効率を改善することができる。
【０１６７】
同様に、本発明に従う１以上のデサチュラーゼ遺伝子の操作によっても、活性が修飾されたデサチュラーゼが得られ、この修飾された活性は、藻類、植物、繊毛虫または真菌に由来する１以上の所望のファインケミカルの生産に間接的に影響を与える。正常な生化学代謝工程により、例えば、多数の老廃物（例えば、過酸化水素およびその他の反応性酸素種）が生産され、これら老廃物は、上記代謝工程を活発に破壊しうる（例えば、パーオキシナイトライトは、チロシン側鎖を硝化し、これによって、活性中心にチロシンを含むいくつかの酵素を不活性化することが知られている（Groves, J.T.（1999）Curr. Opin. Chem. Biol. 3（2）；226-235））。これらの老廃物は、通常排泄されるが、ラージスケールでの発酵生産に用いられる細胞は、１以上のファインケミカルの過剰生産のために最適化されていることから、野生型細胞が通常生産するより、多くの老廃物を生産する。老廃物分子の細胞外への輸送に関与する本発明の１以上のデサチュラーゼの活性を最適化することにより、細胞の生存能力を改善すると同時に、効率的な代謝活性を維持することが可能になる。また、所望のファインケミカルが細胞内に多量に存在すると、実際に細胞に対して有毒となる恐れがあるため、該細胞がこれら化合物を分泌する能力を高めることにより、細胞の生存能力を改善することができる。
【０１６８】
さらに、本発明のデサチュラーゼを操作して、様々な脂質および脂肪酸分子の相対量を改変することもできる。このことにより、細胞膜の脂質組成に決定的な影響を及ぼしうる。脂質は種類に応じて、それぞれ異なる物理的特性を有するため、膜の脂質組成の改変は、膜の流動性を有意に改変することができる。膜の流動性における変化は、膜を介した分子の輸送に影響を与え、これによって、既に説明したように、老廃物や、生産されたファインケミカルの膜外への輸送、または必要な栄養素の膜内への輸送を改変することができる。このような膜の流動性の変化はまた、細胞統合性にも決定的な影響を及ぼし、比較的弱い膜を有する細胞は、非生物性および生物性ストレス状態を被りやすくなり、これによって、細胞は損傷もしくは死滅することもある。膜合成用の脂肪酸および脂質の生産に関与し、得られた膜が、ファインケミカルの生産に用いられる培養物を占める環境状態を被りやすい膜組成になるようなデサチュラーゼの場合には、このデサチュラーゼを操作することによって、より多くの細胞が、生存および増殖できるようにしなければならない。生産細胞の数が多いほど、培養物からのファインケミカルの収率、生産または生産効率が高くなるはずである。
【０１６９】
ファインケミカルの収率を高くすることを目的とする、デサチュラーゼに対する上記突然変異誘発戦略は、制限的と解釈すべきではなく、これら戦略の変種は、当業者には容易に明らかである。これら機構を用いて、かつ、本明細書に開示した機構を補助的に使用し、本発明の核酸およびタンパク質分子を用いて、突然変異したデサチュラーゼ核酸分子およびタンパク質分子を発現する、藻類、繊毛虫、植物、動物、真菌もしくは、C.グルタミクム（C. glutamicum）などその他の微生物を産生し、これにより、所望の化合物の収率、生産および／または生産効率を高くすることができる。この所望の化合物は、藻類、繊毛虫、植物、動物、真菌または細菌由来のあらゆる天然産物でよく、生合成経路の最終産物、ならびに、天然に存在する代謝経路の中間体、さらには、これら細胞の代謝では天然に存在しないが、本発明の細胞により生産される分子も包含される。
【０１７０】
本発明のさらに別の実施形態は、PUFAの生産方法であり、この方法は、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合があるC18-、C20-またはC22-脂肪酸を２炭素原子以上伸長させるポリペプチドをコードする、本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物、または本発明のベクターを含有する生物を、PUFAが該生物において産生される条件下で培養することを含んでなる。この方法により生産したPUFAは、これらが成長する培養物、または野生のいずれかに由来する生物を採取し、採取した材料を有機溶剤で破壊および／または抽出することにより、単離することができる。脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、トリアシルグリセロールおよび／またはPUFAをより高い含量で含む遊離脂肪酸を含有する油を、この溶剤から単離することができる。PUFAをより高い含量で含む遊離脂肪酸は、脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質およびトリアシルグリセロールの塩基性または酸性加水分解により単離することができる。より高いPUFA含量とは、本発明のデサチュラーゼをコードする追加核酸を含まないもともとの生物と比較して、PUFAが少なくとも５％、好ましくは、10％、特に好ましくは、20％、極めて好ましくは、40％多いことを意味する。
【０１７１】
この方法により生産されるPUFAは、好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合、好ましくは、３、４個、さらにはエロンガーゼおよびΔ4−デサチュラーゼと組み合わせて、５または６個の二重結合を有する、C18-、またはC20-22-脂肪酸分子である。これらのC18-、またはC20-22-脂肪酸分子は、油、脂質または遊離脂肪酸の形態で、生物から単離することができる。好適な生物の例は、前述の通りである。好ましい生物は、トランスジェニック植物である。
【０１７２】
本発明の実施形態は、前記方法により調製された油、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの画分であり、特に好ましくは、PUFAを含み、かつ、トランスジェニック植物に由来する油、脂質または脂肪酸組成物である。
【０１７３】
本発明のさらに別の実施形態は、飼料、食物、化粧品または医薬品における上記油、脂質または脂肪酸組成物の使用である。
【０１７４】
本発明はさらに、デサチュラーゼのアンタゴニストまたはアゴニストを同定する方法であって、
a）本発明のポリペプチドを発現する細胞に候補物質を接触させ；
b）デサチュラーゼ活性を試験し；
c）そのデサチュラーゼ活性を、候補物質の非存在下での標準活性と比較する、
ことを含んでなり、その際、標準より高いデサチュラーゼ活性は、その候補物質がアゴニストであることを示し、標準活性より低いデサチュラーゼ活性は、候補物質がアンタゴニストであることを示す、上記方法に関する。
【０１７５】
前記候補物質は、化学的に合成される、または微生物によって生産される物質でよく、例えば、植物、動物もしくは微生物の、例えば、細胞抽出物に存在するものでよい。さらに、前記物質は当業者には公知であるが、デサチュラーゼの活性を増加または逆転させることは知られていないであろう。反応混合物は、無細胞抽出物でもよいし、細胞または細胞培養物を含んでいてもよい。好適な方法は、当業者には公知であり、例えば、Alberts, Molecular Biology of the cell、第３版（1994）の例えば、第17章に概要が記載されている。前記物質は、例えば、反応混合物もしくは培養培地に添加することが、または、細胞に注入することが、あるいは、植物に噴霧することができる。
【０１７６】
本発明の方法により、活性な物質を含むサンプルが同定された場合には、もともとのサンプルから該物質を直接単離する、または、例えば、それが多数の異なる成分から構成されているときは、サンプルを様々なグループに分けて、１サンプル当たりの異なる物質の数を減らした後、もともとのサンプルのこのような「サブセット」を用いて、本発明の方法を繰り返す。サンプルの複雑さに応じて、上記段階を複数回繰り返すが、本発明の方法により同定されるサンプルが、少数の物質または１種の物質しか含まなくなるまで、繰り返すのが好ましい。好ましくは、本発明の方法により同定される物質、またはその誘導体をさらに配合することにより、それらを、植物栽培または植物細胞もしくは組織培養における使用に適したものにする。
【０１７７】
本発明の方法により同定および試験することができる物質として、下記のものが挙げられる：発現ライブラリー、例えば、cDNA発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さい有機物質、ホルモン、PNAなど（Milner, Nature Medicin 1（1995）、879-880；Hupp, Cell. 83（1995）、237-245；Gibbs, Cell. 79（1994）、193-198およびそこで引用された文献）。これらの物質は、公知の阻害剤またはアクチベーターの機能的誘導体もしくは類似体であってもよい。化学的誘導体もしくは類似体を生産する方法は、当業者には公知である。従来の方法を用いて、既述の誘導体もしくは類似体を試験することができる。さらに、コンピュータ援用設計またはペプチド模擬物を用いて、好適な誘導体もしくは類似体を生産することも可能である。本発明の方法に用いられる細胞または組織は、前記実施形態で説明したように、本発明の宿主細胞、植物細胞または植物組織であるのが好ましい。
【０１７８】
従って、本発明はまた、前述した本発明の方法により同定された物質にも関する。この物質は、例えば、本発明のデサチュラーゼの相同体である。デサチュラーゼの相同体は、例えば、デサチュラーゼの点突然変異または欠失により、産生することができる。ここで用いる用語「相同体」とは、デサチュラーゼ活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして働くデサチュラーゼの変異形態を意味する。アゴニストは、デサチュラーゼの生物学的活性と実質的に同じもの、もしくはその一部分を有していてもよい。デサチュラーゼのアンタゴニストは、天然に存在するデサチュラーゼの形態をした１以上の活性を阻害し、例えば、脂肪酸合成の代謝経路の下流または上流メンバー（デサチュラーゼを含む）と競合的に結合する、あるいは、デサチュラーゼと結合して、該活性を低減または阻害することができる。
【０１７９】
さらに、本発明はまた、抗体またはそのフラグメントに関し、この抗体またはそのフラグメントは、本明細書に記載したように、本発明のデサチュラーゼの活性を阻害する。
【０１８０】
本発明の一態様において、本発明は、本発明の前記アゴニストもしくはアンタゴニストを特異的に認識する、またはこれと結合する抗体に関する。
【０１８１】
さらに別の態様は、本発明の方法により同定された上記抗体、停止、またはアンチセンス分子を含む組成物に関する。
【０１８２】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物、本発明のアミノ酸配列、本発明のアンチセンス核酸分子、本発明の抗体および／または組成物、本発明の方法により産生されたアンタゴニストもしくはアゴニスト、および/または、本発明の油、脂質および／もしくは脂肪酸、あるいはそれらの画分を含む、キットに関する。このキットはまた、本発明の宿主細胞、生物もしくは植物、またはそれらの部分、採取することができる本発明の植物部分、または増殖物質、あるいは、本発明のアンタゴニストまたはアゴニストを含んでもよい。本発明のキットの成分は、例えば、バッファーもしくはその他の溶液と一緒に、またはそこに導入して、適当な容器に充填することができる。１以上の前記成分を同一の容器に充填してもよい。さらに、あるいは、上記に代わり、１以上の前記成分を固体表面、例えば、ニトロセルロースフィルター、ガラスプレート、チップ、ナイロン膜またはマイクロプレート上に吸収させてもよい。このキットは、本明細書に記載した方法および実施形態のすべてに用いることができ、例えば、宿主細胞、トランスジェニック植物の生産、相同的配列の検出、アンタゴニストまたはアゴニストの同定などに用いることができる。さらに、このキットは、上記用途の１つに関し、該キットの使用方法についての指示を含んでいてもよい。
【０１８３】
以下に示す実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、これらを制限的なものと解釈するべきではない。本明細書に引用する参照文献、特許出願、特許および公開特許出願のすべての内容は、本明細書に参照として組み込むものとする。
【実施例】
【０１８４】
実施例１：  一般的方法
a）一般的クローニング方法
例えば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の転写、DNA断片の連結、大腸菌および酵母細胞の形質転換、細菌の培養、ならびに、組換えDNAの配列分析などのクローニング方法は、Sambrookら（1989）（Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6）またはKaiser, MichaelisおよびMitchell（1994）”Methods in Yeast Genetics”（Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-451-3）に記載されているように実施した。クロレラ（Chlorella）またフェオダクチルム（Phaeodactylum）などの藻類の形質転換および培養は、El-Sheekh（1999）、Biologia Plantarum 42:209-216；Aptら（1996）Molecular and General Genetics 252（5）：872-9によって記載されているように実施する。
【０１８５】
b）化学物質
本明細書に特に記載のない限り、用いられる化学物質は、Fluka（Neu-Ulm）、Merck（Darmstadt）、Roth（Karlsruhe）、Serva（Heidelberg）およびSigma（Deisenhofen）から、分析グレードの品質のものを取得した。溶液は、Milli-Q水システム水精製ユニット（Millipore、Eschborn）から得た発熱物質を含まない純粋な水（本書では以後H2Oと称する）を用いて、調製した。制限エンドヌクレアーゼ、DNA修飾酵素および分子生物学キットは、AGS（Heidelberg）、Amersham（Braunschweick）、Biometra（Gottingen）、Boehringer（Mannheim）、Genomed（Bad Oeynhausen）、New England Biolabs（Schwalbach/Taunus）、Novagen（Madison, Wisconsin, USA）、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Pharmacia(Freiburg)、Qiagen（Hilden）およびStratagene（Amsterdam, the Netherlands）から取得した。特に記載のない限り、これらは、製造者の指示に従って使用した。
【０１８６】
ｃ）細胞材料
本発明に従う単離された核酸は、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）UTEX646株のゲノムに存在するものであるが、このゲノムは、テキサス大学（オースチン）の藻類コレクションから入手可能である。
【０１８７】
フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）を、22℃および35マイクロアインシュタイン（microEinstein）（１平方メートルおよび１秒当たりの１マイクロモルの光子に相当する）の14：10時間の明／暗光周期で、ガラス管において25℃で培養し、そこに、底部から空気を通過させた。
【０１８８】
フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）に用いた培養培地は、Guillard, R.R.L.の10％有機媒質を補充したf／2培養培地であった（1975：Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates：Smith, W.L.およびChanley, M.H.（編）Culture of marine Invertebrate animals, NY Plenum Press, pp. 29-60）。これは、下記を含む：
995.5 mlの（人工）海水、
１mlのNaNO3（75ｇ／ｌ）、１mlのNaH2PO4（５ｇ／ｌ）、１mlの微量金属溶液、
１mlのTris／Cl （pH 8.0）、0.5 mlのf／2ビタミン溶液、
微量金属溶液：Na2EDTA（4.36ｇ／ｌ）、FeCl3（3.15ｇ／ｌ）、
主要微量金属：CuSO4（10ｇ／ｌ）、ZnSO4（22ｇ／ｌ）、CoCl2（10ｇ／ｌ）、MnCl2（18ｇ／ｌ）、NaMoO4（6.3ｇ／ｌ）、
f／2ビタミン溶液：ビオチン：10 mg／ｌ、チアミン200 mg／ｌ、ビタミンB12 0.1 mg／ｌ、
有機媒質：酢酸ナトリウム（1ｇ／ｌ）、グルコース（６ｇ／ｌ）、コハク酸ナトリウム（３ｇ／ｌ）、バクト−トリプトン（４ｇ／ｌ）、酵母エキス（２ｇ／ｌ）
【０１８９】
実施例２：  ハイブリダイゼーション実験用のフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）UTEX646からの全DNAの単離
全DNAの単離に関する詳細は、新鮮重量が１グラムの植物材料の調製（work-up）を参照されたい。
【０１９０】
CTABバッファー：２％（w／v）臭化N-アセチル-N,N,N-トリメチルアンモニウム（CTAB）；100 mM Tris-HCl、pH 8.0；1.4 M NaCl；20 mM EDTA。
N-ラウリルサルコシンバッファー：10％（w／v）N-ラウリルサルコシン；100 mM Tris-HCl、pH 8.0；20 mM EDTA。
【０１９１】
フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）細胞材料を、乳鉢内の液体窒素下において粉砕することにより、微粉を取得し、これを２mlエッペンドルフ容器に移した。次に、凍結植物材料を１mlの分解バッファー層（１ml CTABバッファー、100 ml N-ラウリルサルコシンバッファー、20 ml βメルカプトエタノールおよび10 ml プロテイナーゼＫ溶液、10 mg／ml）に浸し、連続的に振盪しながら、60℃で１時間インキュベートした。得られたホモジネートを２つのエッペンドルフ容器（２ml）に分配し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を用いて、振盪しながら２回抽出した。相分離のために、それぞれについて、8,000 x gおよびRT（＝室温＝約23℃）で、遠心分離を15分実施した。次に、氷冷イソプロパノールを用いて、DNAを−70℃で30分沈殿させた。沈殿したDNAを４℃および10,000 ｇで30分沈降させた後、180 mlのTEバッファー中で再懸濁させた（Sambrookら、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6）。さらに精製するため、DNAをNaCl（1.2 M最終濃度）で処理した後、２倍量の無水エタノールを用いて、−70℃で30分再度沈殿させた。70％濃度のエタノールを用いた洗浄段階の後、DNAを乾燥させてから、50 mlのH2O＋RNase（50 mg／ml最終濃度）中に入れた。DNAを４℃で一晩溶解させた後、RNase切断を37℃で１時間実施した。こうして得られたDNAを4℃で保存した。
【０１９２】
実施例３：  植物およびフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）からの全RNAおよびポリ(A)+RNAの単離
Logemannら（1987, Anal. Biochem. 163, 21）により記載された方法で、全RNAをアマニおよびアブラナなどの植物から単離した。コケからの全RNAを原糸体組織からGTC法を利用して取得した（Reskiら、1994、Mol. Gen. Genet.、244：352-359）。
【０１９３】
フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）からのRNAの単離：
藻類の凍結サンプル（−70℃）を液体窒素下の氷冷乳鉢中で粉砕することにより微粉を取得する。２容量の均質化培地（12.024 gのソルビトール、40.0 ml の1M Tris-HCl、PH 9（0.2 M）；12.0 mlの5 M NaCl（0.3 M）、8.0 mlの250 mM EDTA、761.0 mgの EGTA、40.0 mlの10％ SDSをH2Oと一緒に、200 mlになるまで調製し、pHを8.5にする）と、0.2％メルカプトエタノールを含む４容量のフェノールとを十分に混合しながら、40〜50℃で、上記凍結細胞粉末に添加する。次に、２容量のクロロホルムを添加し、混合物を15分激しく攪拌した。得られた混合物を10,000 gで10分遠心分離した後、フェノール／クロロホルム（２容量）、次に、クロロホルムを用いて、水相を抽出する。
【０１９４】
こうして得られた水相の全量を、１／20容量の4 M酢酸ナトリウム（pH 6）と１容量の（氷冷）イソプロパノールで処理した後、核酸を−20℃で沈降させる。混合物を10,000 gで30分遠心分離し、上清を吸入により除去する。この後、70％濃度のEtOHでの洗浄段階と、もう１回の遠心分離段階が続く。沈殿物をトリスホウ酸バッファー（80 mM トリスホウ酸バッファー、10 mM EDTA、pH 7.0）中に溶解させる。次に、上清を１／３容量の8 M LiClで処理し、混合した後、４℃で30分インキュベートする。遠心分離の後、沈降物を70％濃度のエタノールで洗浄し、遠心分離に付してから、沈殿物を、RNaseを含まない水に溶解させる。
【０１９５】
ポリ(A)+RNAは、Dyna Beads（登録商標）（Dynal, Oslo, Norway）を用いて、製造者のプロトコルにある指示に従って単離する。
【０１９６】
RNAまたはポリ(A)+RNA濃度を決定した後、１／10容量の3 M酢酸ナトリウム（pH 4.6）と２容量のエタノールを添加することにより、RNAを沈降させ、−70℃で保存する。
【０１９７】
分析のために、ホルムアルデヒドを含有する1.5％濃度アガロースゲル中で、20μg部のRNAを分離し、ナイロン膜（Hybond, Amersham）に転写する。Amasino（（1986）Anal. Biochem. 152, 304）の記載に従い、特定の転写物を検出する。
【０１９８】
実施例４：  cDNAライブラリーの構築
フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）からcDNAライブラリーを構築するために、マウス白血病ウイルス逆転写酵素（Roche, Mannheim, Germany）と、オリゴ-d(T)プライマーを用いて、第１鎖合成を実施すると同時に、DNAポリメラーゼＩ、すなわち、クレノウ酵素と一緒にインキュベートした後、RNase Hを用いて、12℃で２時間、16℃で１時間および22℃で１時間切断することにより、第２鎖合成を実施した。65℃でのインキュベーション（10分）により、反応を停止した後、氷に移した。37℃で（30分）、T4 DNAポリメラーゼ（Roche, Mannheim）を用いて、二本鎖DNA分子を平滑末端にした。フェノール／クロロホルム、およびSephadex G50スピンカラムを用いた抽出により、ヌクレオチドを除去した。T4 DNAリガーゼ（Roche、12℃、一晩）を用いて、EcoRI／XhoIアダプター（Pharmacia, Freiburg, Germany）をcDNA末端に連結した後、XhoIで再切断し、ポリヌクレオチドキナーゼ（Roche、37℃、30分）を用いたインキュベーションによりリン酸化した。この混合物を低融点アガロースゲル上で分離に付した。300を超える塩基対からなるDNA分子をゲルから溶離し、フェノールで抽出し、Elutip Dカラム（SchleicherおよびSchull, Dassel, Germany）で濃縮させ、ベクターアームに連結した後、ギガパックゴールド（Gigapack Gold）キット（Stratagene, Amsterdam, the Netherlands）を用いて、製造者の材料を使用し、かつ、製造者の指示に従い、λ-ZAP-発現ファージにパッケージングした。
【０１９９】
実施例５：  DNA配列決定およびコンピュータ解析
実施例４に記載したcDNAライブラリーを用いて、標準的方法、特に、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer, Weiterstadt, Germany）を用いた連鎖終止反応法により、DNAの配列決定を実施した。cDNAライブラリーからプラスミドを調製した後、in vivo大量除去に続き、寒天プレート上でのDH10Bの再形質転換により、個々のランダムクローンの配列決定を実施した（材料およびプロトコルについての詳細：Stratagene, Amsterdam, the Netherlands）。Qiagen DNA調製ロボット（Qiagen, Hilden）を用いて、製造者のプロトコルに従い、アンピシリンを補充したルリア（Luria）培地（Sambrookら（1989）（Cold Spring Harbor Laboratory Press：ISBN 0-87969-309-6）を参照）中で一晩生育した大腸菌培養物から、プラスミドDNAを調製した。下記のヌクレオチド配列を有する配列決定用プライマーを用いた：
5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’
5’-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3’
5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’
配列をプロセシングし、Bio-Max（Munich, Germany）から市販されているEST-MAX標準ソフトウエアパッケージを用いて、記録した。比較アルゴリズムを利用し、配列番号８に示した検索用配列を用いて、相同遺伝子を検索し、BLASTプログラム（Altschulら（1997）”Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を使用した。フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum patens）の検索用配列と相同性を有するフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）からの２配列をさらに詳しく分析した。
【０２００】
実施例５a:  変性オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）デサチュラーゼの単離
公開されたデサチュラーゼにより、Δ5-およびΔ6-デサチュラーゼに特有のモチーフを同定することができる。考えられる変異を有するオリゴヌクレオチド配列を以下に示す。オリゴヌクレオチド配列の下に、塩基組合せを誘導することができるアミノ酸を一文字表記で示す。例えば、A/Gとは、対応するアミノ酸から誘導される塩基トリプレットは、AAAまたはAAGのいずれかであると考えられるため、単位（unit）を合成したとき、ＡまたはＧのいずれかが、この位置でオリゴヌクレオチドにランダムに組み込まれていることを意味する。上記DNA配列は、この位置での塩基を決定することにより、遺伝コードによる３または４個の異なる塩基が可能になれば、イノシン（i）を含む可能性がある。以下の配列およびプライマーを用いることができる：
0004490039.tif 000003
0004490039.tif 000004
【０２０１】
多様な変異の可能性があるため、多数の誘導オリゴヌクレオチドが可能であるが、驚いたことに、示したオリゴヌクレオチドは、デサチュレートを単離するのに特に適していることがわかった。
【０２０２】
プライマーは、あらゆる組合せでポリメラーゼ連鎖反応に用いることができる。下記の条件を考慮して、個々の組合せにより、デサチュラーゼ断片を単離することができた：PCR反応については、各ケースで、10 nMolのプライマーと、in vivo切除により得られた10 ngのプラスミドライブラリーを用いた。製造者（Stratagene）のプロトコルに従い、ファージライブラリーからプラスミドライブラリーを単離することができた。Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、サーモサイクラー（Biometra）においてPCR反応を実施した。その際の温度プログラムは次の通りである：96℃で３分の後に、96℃で30秒、55℃で30秒、72℃で１分を35サイクル。55℃での第１段階の後、アニーリング温度をそれぞれ、３℃ずつ段階的に下げ、第５サイクル以後は、アニーリング温度を40℃に維持した。最後に、72℃で10分のサイクルを１回実施し、４℃まで冷却することにより、反応を停止させた。
【０２０３】
プライマーの組合せF6aおよびR4a2は、本文中に下線をつけて示し、これらを利用してデサチュラーゼ断片の単離を達成することができた。配列決定により、得られた断片を確認した。その結果、該断片は、Genbank登録番号T36617のストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）デサチュラーゼとの相同性を示した。相同性は、BLASTPプログラムを援用して取得した。アラインメントを図４に示す。34％の同一性と、43％の相同性が明らかになった。ハイブリダイゼーション実験における実施例７に示すように、本発明に従い、DNA断片を用いて、標準的条件下で全長遺伝子を単離した。
【０２０４】
このようにして単離されたDNA配列のコード領域を、ポリペプチド配列への遺伝コードを翻訳することにより取得した。配列番号３は、前記方法により単離した、長さが1434塩基対の配列を示す。この配列は、位置１〜３に開始コドンを、また、位置1432〜1434に停止コドンを有し、長さが477アミノ酸のポリペプチドに該配列を翻訳することができた。WO 98/46763に記載されている遺伝子配列とのアラインメントから、同一ではないが、相同である87アミノ酸をコードするフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）断片は、すでに記載されていたことがわかった。しかし、WO 98/46763は、完全な、機能的に活性なデサチュラーゼも、位置または基質特異性のいずれも開示していない。これはまた、特定の機能を示さずに、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）由来のΔ5-およびΔ6-デサチュラーゼの両方との相同性が報告されていることから、明らかである。これに対し、本発明の配列は、機能的に活性なΔ6-アシル脂質デサチュラーゼをコードする。
【０２０５】
実施例６：フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）デサチュラーゼをコードするDNA配列の同定
TBLASTN検索アルゴリズム援用の配列アラインメントには、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）由来のΔ6-アシル脂質デサチュラーゼPp des6 AJ222980（NCBI Genbank登録番号）の全長配列（表１を参照）およびモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）AF110509 （AF110509 NCBI Genbank 登録番号）由来のΔ12-アシル脂質デサチュラーゼ配列を用いた。
【０２０６】
ヒメツリガネゴケおよびモルティエレラ由来の検索用配列との相同性が低かったことから、候補遺伝子の中でも、EST配列 PT0010070010R、PT001072031RおよびPT001078032Rをまず標的遺伝子とみなした。図１、２および２aは、みいだされた２つのEST配列の結果を示す。みいだされた配列は、配列番号１（遺伝子名：Pt des5、発明者のデータベースNo. PT001078032R）、配列番号５（遺伝子名：Pt des12、発明者のデータベースNo. PT0010070010R）および配列番号11（遺伝子名：Pt des12.2、発明者のデータベースNo. PT001072031R）の本発明に従う核酸の部分である。文字は、同一のアミノ酸を示すのに対し、＋の記号は、化学的に類似したアミノ酸を表している。本発明に従ってみいだされた配列すべての同一性および相同性については、表２に概要を示す。
【０２０７】
デサチュラーゼは、シトクロムb5ドメインを有することがあるが、これは、デサチュラーゼをコードしない他の遺伝子でも起こる。従って、シトクロムb5ドメインは、遺伝子機能が違っていても、高い相同性を示す。弱い保存領域内で、デサチュラーゼだけを推定候補遺伝子として同定することができ、酵素活性および酵素機能の位置特異性について試験しなければならない。例えば、デサチュラーゼのような様々なヒドロキシラーゼ、アセチレナーゼおよびエポキシゲナーゼは、ヒスチジンボックスモチーフも示すことから、実験によって特定の機能を証明しなければならないが、二重結合の確認でしか、デサチュラーゼの酵素活性および位置特異性を証明することはできない。驚いたことに、本発明のΔ6-およびΔ5-デサチュラーゼは、特に好適な基質特異性を有し、かつ、ヒメツリガネゴケΔ6-エロンガーゼと組み合わせて、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサン酸のような高度不飽和脂肪酸を生産するのに用いる上で特に適していることがわかった。
【０２０８】
クローンPT001078032R由来の全cDNA断片の配列決定により、長さが1652塩基対の配列であることが明らかにされた。この配列は、配列番号２に示す469アミノ酸のポリペプチドをコードする。この配列は、塩基対位置115〜117に開始コドンを、また、塩基対位置1522〜1524に停止コドンを有する配列番号１の遺伝コードを翻訳することにより取得した。このクローンは、図３の配列アラインメントからわかるように、完全なデサチュラーゼポリペプチドを含む。線は、同一のアミノ酸を示し、また、コロンおよび点は、化学的に交換可能な、すなわち、化学的に同等のアミノ酸を表す。アラインメントは、Heinkoff & Heinkoff’s BLOSUM62置換マトリックス(（1992）Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-10919)を用いて実施した。用いたパラメーターは次の通りである：ギャップ加重が８；平均マッチが2.912、長さ加重が２、平均ミスマッチが−2.003。図６および図７に、みいだされた配列を有するMA des12ペプチド配列のアラインメントを示す。
【０２０９】
クローンPT0010070010R由来の全cDNA断片の配列決定により、長さが1651塩基対の、配列番号５に示す配列であることが明らかにされ、塩基対位置67〜69に開始コドンを、また、塩基対位置1552〜1554に停止コドンを有する。本発明のポリペプチド配列を配列番号６に示す。
【０２１０】
クローンPT0010072031Rから同定された全cDNA断片の配列決定により、長さが1526塩基対の配列であることが明らかにされ、この配列は、塩基対位置92〜94に開始コドンを、また、塩基対位置1400〜1402に停止コドンを有する配列番号11に示す。本発明のポリペプチド配列を配列番号12に示す。
【０２１１】
表２は、本発明のデサチュラーゼ同士の、ならびに、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)およびモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）デサチュラーゼとの、同一性および相同性を示す。データは、ソフトウエア：Wisconsin Package Version 10.0（Genetics Computer Group（GCG）, Madison, Wisc., USA）のサブプログラムとして、以下に示す所与のパラメーターに従い、ベストフィット（Bestfit）プログラムを援用して得られた。Henikoff, S.およびHenikoff, J.G.（1992）. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919。
【０２１２】
さらに、図５はヒメツリガネゴケΔ6-アシル脂質デサチュラーゼとクローンPt des6のポリペプチド配列とのアラインメントを示す。
【表２】
0004490039.tif 000005
【０２１３】
アルゴリズムTBLASTN 2.0.10（Alschulら、1997, ”Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res.25:3389-3402）を用いて、最も高い配列相同性を有する配列を局部データベースアラインメントにより同定した。結果を以下の表２Aに示す。
【表２Ａ】
0004490039.tif 000006
【０２１４】
実施例７：  ハイブリダイゼーションによる遺伝子の同定
遺伝子配列を用いて、cDNAまたはゲノムライブラリーから、相同または異種遺伝子を同定することができる。
【０２１５】
相同遺伝子（すなわち、相同的または相同体である全長cDNAクローン）は、例えば、cDNAライブラリーを用いた核酸ハイブリダイゼーションにより単離することができる。尚、この方法を用いて、特に、配列番号３に示す配列の、機能的に活性な全長遺伝子を単離することができる。目的とする遺伝子の頻度に応じて、100,000から1,000,000組換えバクテリオファージを培養し、ナイロン膜に移す。アルカリによる変性の後、例えば、UV架橋によりDNAを膜の上に固定化する。高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施する。イオン強度が1 M NaCl、温度68℃の水溶液中でハイブリダイゼーションおよび洗浄段階を実施する。例えば、放射性（32P-）ニック転写を用いた標識付け（High Prime, Roche、ドイツ、マンハイム）により、ハイブリダイゼーションプローブを産生した。オートラジオグラフィーによりシグナルを検出した。
【０２１６】
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いて、前記方法と同様に、近縁ではあるが、同一ではない、部分的に相同または異種の遺伝子を同定できる。水性ハイブリダイゼーションのために、イオン強度を通常1 M NaClに維持し、温度を68℃から42℃へと徐々に下げた。
【０２１７】
例えば、10〜20アミノ酸の個々のドメインに関する相同性しか示さない遺伝子配列の単離は、合成、放射性同位元素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、実施することができる。放射性同位元素標識オリゴヌクレオチドは、T4ポリヌクレオチドキナーゼで、２つの相補的オリゴヌクレオチドの5’末端をリン酸化することにより、産生する。相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、互いに連結することにより、コンカテマーを産生する。二本鎖コンカテマーを例えば、ニック転写により、放射性同位元素標識する。ハイブリダイゼーションは、通常、オリゴヌクレオチド高濃縮物を用いて、低ストリンジェンシー条件下で実施する。
【０２１８】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション溶液：
６×SSC
0.01 Mリン酸ナトリウム
１mM EDTA（pH 8）
5% SDS
100μg／ml変性サケ精子DNA
0.1％低脂肪粉ミルク
【０２１９】
ハイブリダイゼーションの間、温度を、計算されたオリゴヌクレオチド温度より５〜10℃低い温度または室温（特に記載のない限り、すべての実験で、室温＝23℃前後）まで段階的に下げた後、洗浄段階およびオートラジオグラフィーを実施する。洗浄は、極めて低いストリンジェンシーで実施され、例えば、４×SSCを用いて、３回実施する。さらに詳しくは、下記に記載さている：Sambrook, J.ら（1989）“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratoy Press、もしくはAusubel, F.M.ら（1994）”Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons。
【０２２０】
実施例８：  抗体を用いた発現ライブラリーのスクリーニングによる標的遺伝子の同定
cDNA配列を用いて（例えば、Qiagen QIAexpress pQE系）、例えば、大腸菌において、組換えタンパク質を産生する。次に、通常、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）により、組換えタンパク質をアフィニティー精製する。そして、組換えタンパク質を用いて、例えば、ウサギを免疫する標準的技法に従い、特定の抗体を誘導する。次に、Guらにより、（1994）BioTechniques 17：257-262に記載されているように、組換え抗原で予め脱飽和させたNi-NTAカラムを用いて、抗体をアフィニティー精製する。得られた抗体を用いて、免疫スクリーニングにより、発現cDNAライブラリーをスクリーニングできる（Sambrook, J.ら（1989）, “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratoy Press、もしくはAusubel, F.M.ら（1994）”Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons）。
【０２２１】
実施例９：  アグロバクテリウムの形質転換
アグロバクテリウム媒介による植物形質転換は、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株GV3101-(pMP90-)（KonczおよびSchell, Mol. Gen. Genet. 204（1986）838-396）またはLBA4404-（Clontech）もしくはC58C1 pGV2260（Delblaereら、1984, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788）を用いて、達成することができる。形質転換は、標準的方法（Delblaereら、1984, 同上）を用いて達成することができる。
【０２２２】
実施例10：  植物形質転換
アグロバクテリウム媒介による植物形質転換は、標準的形質転換方法および再生方法を用いて、実施することができる。（Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual,第２版、Dordrecht: Kluwer Academic Pulb., 1995, Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick, Bernard R., Thompson, Jhon E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 pp., ISBN 0-8493-5164-2）。
【０２２３】
例えば、子葉または胚軸形質転換（Moloneyら、Plant Cell Report 8（1989）238-242；De Blockら、Plant Physiol. 91（1989）694-701）により、アブラナを形質転換することができる。アグロバクテリウムおよび植物の選択のための抗生物質の使用は、形質転換に用いるバイナリーベクターおよびアグロバクテリウム株に応じて違ってくる。アブラナの選択は、通常、選択植物マーカーとしてカナマイシンを用いて実施する。
【０２２４】
アマニ（Linum usitatissimum）におけるアグロバクテリウム媒介による遺伝子導入は、例えば、Mlynarovaら（1994）Plant Cell Report 13：282-285により記載された技法を用いて、実施することができる。
【０２２５】
ダイズの形質転換は、例えば、EP-A-0 0424 047（Pioneer Hi-Bred International）またはEP-A-0 0397 687、米国特許第5,376,543号、米国特許第5,169,770号（トレド大学）に記載された技法を用いて、実施することができる。
【０２２６】
粒子ボンバードメント、ポリエチレン−グリコール媒介DNA取込みを用いた、あるいは、シリコンカーボネートファイバー技法による植物形質転換については、例えば、FreelingおよびWalbot （“The maize handbook”（1993）ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York）により記載されている。
【０２２７】
実施例11：  植物形質転換用のプラスミド
植物形質転換には、pBinAR（HofgenおよびWillmitzer, Plant Science 66（1990）221-230）またはpGPTV（Beckerら、1992, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197）のようなバイナリーベクター、もしくはそれらの誘導体を用いることができる。バイナリーベクターは、センスまたはアンチセンス配向のcDNAをT-DNAに連結することにより構築することができる。cDNAの5’側の植物プロモーターは、cDNA転写を活性化する。ポリアデニル化配列は、cDNAの3’側に位置する。バイナリーベクターは、様々なマーカー遺伝子を含むことができる。特に、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼにより媒介されるカナマイシン耐性をコードするnptIIマーカー遺伝子は、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（略語：AHASまたはALS）の除草剤抵抗形態と交換することができる。ALS遺伝子は、Ottら、J. Mol. Biol. 1996, 263:359-360に記載されている。v-ATPアーゼ-c1プロモーターをプラスミドpBin19またはpGPTVにクローン化してから、これをALSコード領域の前にクローニングすることにより、マーカー遺伝子発現に利用することができる。前記プロモーターは、ベータブルガリス（Beta vulgaris）由来の1153塩基対断片に対応する（Plant Mol. Biol., 1999, 39：463-475）。選択のための代謝拮抗物質として、イマズエタピル(imazethapyr)またはスルホニル尿素などのスルホニル尿素およびイミダゾリノンのいずれを用いてもよい。
【０２２８】
組織特異的発現は、組織特異的プロモーターを用いて達成することができる。例えば、種子特異的発現は、cDNAの5’側のDC3もしくはLeB4またはUSPプロモーターあるいはファセオリンプロモーターのクローニングにより達成することができる。その他のどんな種子特異的プロモーターエレメントを用いてもよく、例えば、ナピンまたはアルセリンプロモーターが挙げられる（Goossensら、1999, Plant Phys. 120(4):1095-1103およびGerhardtら、2000, Biochimica et Biophysica Acta 1490(1-2):87-98）。インタクトな植物における構成的発現には、CaMV-35Sプロモーターまたはv-ATPase C1プロモーターを用いることができる。
【０２２９】
特に、デサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードする遺伝子は、複数の発現カセットを構築し、植物における代謝経路を模擬することにより、バイナリーベクターに逐次クローニングすることができる。
【０２３０】
発現カセット内で、発現させようとするタンパク質は、例えば、色素体、ミトコンドリアまたは小胞体用のシグナルペプチドを用いて、細胞小器官にターゲッティングすることができる（Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4（1996）285-423）。シグナルペプチドをcDNAとインフレームで5’側にクローニングすることにより、融合タンパク質の細胞下局在を達成する。
【０２３１】
多重発現カセットの例を以下に挙げる。
【０２３２】
I）プロモーター−ターミネーターカセット
発現カセットは、プロモーターおよびターミネーターのような、少なくとも２つの機能単位から構成される。これ以外に、ターゲッティング配列、遺伝子のコード領域またはその部分など、さらなる所望の遺伝子をプロモーターとターミネーターの間に挿入することができる。発現カセットを構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、プロモーターおよびターミネーター（USPプロモーター：Baemleinら、Mol. Gen. Genet., 1991, 225(3):459-67）；OCSターミネーター：Gielenら、EMBO J. 3(1984)835以下参照）を単離した後、合成オリゴヌクレオチドに基づくフランキング配列を用いて、所望のようにテーラーメードする。
【０２３３】
用いることができるオリゴヌクレオチドの例として、下記のものがある：
USP1 前方：CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA
USP2 前方：CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA
USP3 前方：CCGGAATTCGGCGCGCCGAGCTCCTCGAGCAAATTTACACATTGCCA
USP1 後方：AAAACTGCAGGCGGCCGCCCACCGCGGTGGGCTGGCTATGAAGAAATT
USP2 後方：CGCGGATCCGCTGGCTATGAAGAAATT
USP3 後方：TCCCCCGGGATCGATGCCGGCAGATCTGCTGGCTATGAAGAAATT
OCS1 前方：AAAACTGCAGTCTAGAAGGCCTCCTGCTTTAATGAGATAT
OCS2 前方：CGCGGATCCGATATCGGGCCCGCTAGCGTTAACCCTGCTTTAATGAGATAT
OCS3 前方：TCCCCCGGGCCATGGCCTGCTTTAATGAGATAT
OCS1 前方：CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
OCS2 後方：CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGAATTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
OCS3 後方：CCCAAGCTTGGCGCGCCGAGCTCGTCGACGGACAATCAGTAAATTGA
【０２３４】
上記方法は、当業者には公知であり、概要は文献に記載されている。
【０２３５】
第１段階では、プロモーターおよびターミネーターをPCRにより増幅する。次に、ターミネーターを受容プラスミドにクローニングし、第２段階で、プロモーターをターミネーターの前に挿入する。これにより、担体プラスミド上に発現カセットが形成される。プラスミドpUT1、pUT2およびpUT3は、プラスミドpUC19に基づいて作製される。
【０２３６】
構築物は、本発明に従い、配列番号13、14および15に示す。pUC19に基づき、これらは、USPプロモーターとOCSターミネーターを含む。これらのプラスミドに基づき構築物pUT12を作製するために、SalI/ScaIでpUT1を切断し、XhoI/ScaIでpUT2を切断する。発現カセット中の断片を連結し、大腸菌XLI blue MRFに形質転換する。アンピシリン耐性コロニーを単離した後、DNAを調製し、２つの発現カセットを含むクローンを制限分析により同定する。適合性末端のXhoI/ScaI連結により、発現カセット間の２つの切断部位XhoIとScaIが排除された。これにより、プラスミドpUT12が得られるが、これを配列番号16に示す。次に、pUT12をSalI/ScaIで、また、pUT3をXhoI/ScaIで再度切断する。発現カセットを含む断片を連結して大腸菌XLI blue MRFに形質転換する。アンピシリン耐性コロニーを単離した後、DNAを調製し、３つの発現カセットを含むクローンを制限分析により同定する。このようにして、所望のDNAの挿入に用いることができる多重発現カセットのセットが形成され、これを表３に記載するが、さらに追加の発現カセットを組み込むことも可能である。
【０２３７】
上記発現カセットは以下のエレメントを含む：
【表３】
0004490039.tif 000007
【０２３８】
さらに、前述し、かつ表４に詳細を示すように、下記のものを用いて、追加の多重発現カセットを作製し、種子特異的遺伝子発現に用いることができる：
i）USPプロモーター、または
ii）LeB4プロモーターの3’側の約700塩基対断片、または
iii）DC3プロモーター。
【０２３９】
DC3プロモーターは、Thomas, Plant Cell 1996, 263:359-368に記載されており、領域-117〜+27から構成されているにすぎない。そのため、該プロモーターは、知られている最も小さい種子特異的プロモーターの１つとなっている。発現カセットは、同じプロモーターを数コピーで含んでいてもよいし、あるいは、３種の異なるプロモーターにより構築されてもよい。
【表４】
0004490039.tif 000008
【０２４０】
これ以外にも、多重遺伝子構築物のプロモーターを同様に作製することができ、その際、下記のものを用いる：
a）LeB4プロモーターの2.7 kb断片、または
b）ファセオリンプロモーター、または
c）構成v-ATPase c1プロモーター。
【０２４１】
例えば、ナピンプロモーターまたはアルセリン-5プロモーターなど、種子特異的多重発現カセットを構築するのに特に好適なプロモーターを用いることが望ましい。
【０２４２】
II）植物発現カセットにおけるPUFA遺伝子発現を目的とする、プロモーターおよびターミネーターを受け、かつ、所望の遺伝子配列と組み合わせて構成されるpUC19誘導体またはpGPTV誘導体での発現構築物の作製
AscIを用いて、AscI切断部位を介して、表３のpUC19誘導体からベクターpGPTV+AscIに多重発現カセットを直接挿入することができ（IIIを参照）、これらのカセットは、標的遺伝子の挿入に利用可能である。当該遺伝子構築物（pBUT1は配列番号20に、pBUT2は配列番号21に、pBUT3は配列番号22に、pBUT12は配列番号23に、また、pBUT123は配列番号24に示す）は、本発明に従い、キットの形態で利用可能である。これに代わり、遺伝子配列を、pUC19に基づく発現カセットに挿入し、AscI断片の形態でpGPTV+AscIに挿入することもできる。
【０２４３】
pUT12の場合には、BstXIおよびXbaIを介してΔ6-エロンガーゼPp PSE1をまず第１カセットに挿入する。次に、BamHI/NaeIを介してコケΔ6-デサチュラーゼ（Pp des6）を第２カセットに挿入する。これにより、構築物pUT-EDが得られる。プラスミドpUT-ED由来のAscI断片をAscI切断ベクターpGPTV+AscIに挿入した後、挿入断片の配向を制限分析または配列決定により決定する。これにより、プラスミドpB-DHGLAが得られるが、その完全配列を配列番号25に示す。ヒメツリガネゴケΔ6-エロンガーゼのコード領域を配列番号26に示し、ヒメツリガネゴケΔ6-デサチュラーゼのコード領域を配列番号27に示す。
【０２４４】
pUT123の場合には、BstXIおよびXbaIを介してΔ6-エロンガーゼPp PSE1をまず第１カセットに挿入する。次に、BamHI/NaeIを介してコケΔ6-デサチュラーゼ（Pp des6）を第２カセットに挿入し、最後に、BglIIを介してフェオダクチルム（Paheodactylum）Δ5-デサチュラーゼ（Pt des5）を第３カセットに挿入する。この三重構築物は、pARA1と称する。配列特異的な制限切断部位を考慮して、表５に示すように、これ以外に、pARA2、pARA3およびpARA4と称する発現カセットを作製することができる。
【０２４５】
プラスミドpARA1由来のAscI断片をAscI切断ベクターpGPTV+AscIに挿入した後、挿入断片の配向を制限分析または配列決定により決定する。これにより得られたプラスミドpBARA1の完全配列を配列番号28に示す。ヒメツリガネゴケΔ6-エロンガーゼのコード領域を配列番号29に、ヒメツリガネゴケΔ6-デサチュラーゼのコード領域を配列番号30に、また、フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Paheodactylum tricornutum）Δ5-デサチュラーゼのコード領域を配列番号31にそれぞれ示す。
【表５】
0004490039.tif 000009
プラスミド１〜５はpUC誘導体であり、プラスミド６〜７はバイナリー植物形質転換ベクターである。  
Pp＝ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）
Pt＝フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Paheodactylum tricornutum）
Pp PSE1は、配列番号９の配列に対応する。
PSE＝PUFA特異的Δ6-エロンガーゼ
Ce des5＝セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）Δ5-デサチュラーゼ（Genbank登録番号AF078796）
Ce des6＝セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）Δ6-デサチュラーゼ（Genbank登録番号AF031477、塩基11-1342）
Ce PSE1＝セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）Δ6-エロンガーゼ（Genbank登録番号AF244356、塩基1-867）
【０２４６】
さらなるデサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子配列、例えば、Genbank登録番号AF231981、NM 013402、AF206662、AF268031、AF226273、AF110510またはAF110509などを、前記タイプの発現カセットに挿入することもできる。
【０２４７】
III）アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換および植物の形質転換を目的とする、ベクターへの発現カセットの転移
AscIを用いて、pUC19に記載したものに基づくキメラ遺伝子構築物をバイナリーベクターpGPTVに挿入することができる。このために、AscI切断部位により多重クローニング配列を伸長する。そのためには、２つの二本鎖オリゴヌクレオチドとしてポリリンカーを新しく合成し、別のAscI DNA配列を挿入する。EcoRIおよびHindIIIを用いて、オリゴヌクレオチドをベクターpGPTVに挿入する。これにより、プラスミドpGPTV+AscIが得られる。必要なクローニング方法は、当業者には公知であり、実施例１に記載されるとおりである。
【０２４８】
実施例12：  in vivo突然変異誘発
微生物のin vivo突然変異誘発は、大腸菌またはその他の微生物（例えば、バチルス属、もしくはサッカロミセス・セレビシエのような酵母）を用いて、プラスミドDNA（またはその他のベクターDNA）を継代し、そこで、それらの遺伝情報の全体性を保持する能力を破壊することにより、実施することができる。通常のミューテーター株は、DNA修復系用の遺伝子に突然変異を有する（例えば、mutHLS、mutD、mutTなど；参照として、Rupp, W.D.（1996）DNA repair mechanism：Escherichia coli and Salmonella, pp. 2277-2294, ASM：ワシントンを参照）。これらの株は、当業者には公知である。これらの株の使用については、例えば、Greener, A.およびCallahan, M.（1994）Strategies 7：32-34に説明されている。突然変異したDNA分子は、微生物を選択および試験した後、植物に転移するのが好ましい。本明細書の実施例の節にある様々な実施例に従って、トランスジェニック植物を産生する。
【０２４９】
実施例13：  形質転換した生物における組換え遺伝子産物の発現の研究
形質転換した宿主生物における組換え遺伝子産物の活性を、転写および／または翻訳レベルで測定した。
【０２５０】
遺伝子の転写量（これは、遺伝子産物の翻訳に使用可能なRNAの量を意味する）を決定するのに適した方法は、以下に記載するようなノーザンブロットを実施することである（参照として、Ausubelら（1988）Current Protocols in Molecular Biology, Wiley：ニューヨーク、または前記の実施例の項を参照）。その際、プライマーは、目的とする遺伝子と結合して、検出可能な標識（通常、放射能または化学発光）で標識されるように設計されており、これにより、生物の培養物の全RNAを抽出し、ゲル上で分離し、安定マトリックスに移行させた後、このプローブと一緒にインキュベートする。上記プローブの結合および結合範囲が、上記遺伝子のmRNAの存在および量を示す。この情報から、形質転換した遺伝子の転写度がわかる。全細胞RNAは、細胞、組織または器官から、多数の方法によって調製することができ、これら方法のすべては、当業者には公知であり、例えば、Bormann, E.R.ら（1992, Mol. Microbiol. 6：317-326）の方法がある。
【０２５１】
ノーザンハイブリダイゼーション：
RNAハイブリダイゼーションのために、Amasino（1986, Anal. Biochem. 152, 304）により記載されるようにホルムアルデヒドを用いて、1.25％強度アガロースゲルにおけるゲル電気泳動により、20μgの全RNAまたは１μgのポリ(A)+-RNAを分離し、10×SSCを用いた毛管吸引により、正に荷電したナイロン膜（Hybond N+、Amersham、ブランスウィック）に移行させ、紫外線で固定化した後、ハイブリダイゼーションバッファー（10％硫酸デキストランw/v、1 M NaCl、１％SDS、100 mgニシン精子DNA）を用いて、68℃で３時間、プレハイブリダイズした。DNAプローブは、α-32P-dCTP（Amersham、ドイツ、ブランスウィック）を用いて、プレハイブリダイゼーション段階中に、ハイプライム（Highprime）DNA標識キット（Roche、ドイツ、マンハイム）で標識しておいた。標識したDNAプローブを同じバッファー中に68℃で一晩添加した後、ハイブリダイゼーションを実施した。68℃で、２×SSCを用いて15分を２回、１×SSC、１％SDSを用いて30分を２回の洗浄段階を実施した。密封されたフィルターを−70℃で１〜14日の間露光させた。
【０２５２】
ウェスタンブロット（例えば、Ausubelら（1988）Current Protocols in Molecular Biology, Wiley：ニューヨークを参照）のような標準的方法を用いて、このmRNAにより翻訳されたタンパク質の存在または相対量を調べることができる。この方法では、全細胞タンパク質を抽出し、ゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースのようなマトリックスに移した後、所望のタンパク質と特異的に結合する抗体のようなプローブと一緒にインキュベートする。このプローブには、通常、容易に検出が可能な化学発光または比色分析標識を施す。観察された標識の存在および量は、細胞に存在する所望の突然変異タンパク質の存在および量を示す。
【０２５３】
実施例14：  所望の産物の生産に及ぼす組換えタンパク質の影響の分析
植物、真菌、藻類、繊毛虫における、または所望の化合物（脂肪酸など）の生産に対する遺伝子改変の影響は、適した条件（前述したものなど）下で、改変微生物または改変植物を生育させ、所望の産物（すなわち、脂質または脂肪酸）の生産増加について培地および／または細胞成分を分析することにより、決定することができる。これらの分析方法は、当業者には公知であり、分光学、薄層クロマトグラフィー、各種染色方法、酵素および微生物学的方法、ならびに、高性能液体クロマトグラフィーのような分析クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp.89-90およびpp.443-613, VCH Weinheim（1985）；Fallon, A.ら（1987）”Applications of HPLC in Biochemistry”：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17；Rehmら（1993）Biotechnology、第３巻、第III章、”Product recovery and purification”, pp. 469-714, VCH Weinheim；Belter, P.A.ら（1988）Bioseparations：downstream processing for Biotechnology, John Wiely and Sons；Kennedy, J.F.、ならびに、Cabral, J.M.S.（1992）Recovery processes for biological Materials, John Wiely and Sons；Shaeiwitz, J.A.およびHenry, J.D. （1988）Biochemical Separations：Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3；第11章、pp. 1-27、VCH Weinheim；ならびに、Dechow, F.J.（1989）Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications）。
【０２５４】
前記の方法の他に、Cahoonら（1999）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96（22）：12935-12940、ならびに、Browseら（1986）Analytic Biochemistry 152:141-145に記載されているように、植物材料から植物脂質を抽出する。定量および定性脂質または脂肪酸分析については、下記に記載されている：Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/スコットランド：Oily Press（Oily Press Lipid Library；２）；Christie, William W., Gas Choromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, スコットランド：Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S.（Oily Press Lipid Library；１）；”Progress in Lipid Research, Oxford：Pergamon Press, 1（1952）-16（1977）題名：Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN。
【０２５５】
発酵の最終産物を測定する以外に、所望の化合物を生産するのに用いられる代謝経路の他の成分（中間体および副産物など）を分析することにより、化合物の全体生産効率を決定することも可能である。分析方法としては、培地の栄養素量（例えば、糖、炭化水素、窒素源、リン酸イオンおよびその他のイオン）の測定、バイオマス濃度および成長測定、生合成経路の通常代謝物の生産の分析、ならびに、発酵中に発生したガスの測定などが挙げられる。これら測定の標準的方法については、下記に記載されている：Applied Microbial Physiology；A Practical Approach, P.M. Rhodes およびP.F. Stanbury編、IRL Press, S. 103-129；131-163および165-192（ISBN：0199635773）ならびに、そこに引用されている参照文献。
【０２５６】
一例は、脂肪酸の分析である（略語：FAME、脂肪酸メチルエステル；GC-MS、気液クロマトグラフィー／質量分析法；TAG、トリアシルグリセロール；TLC、薄層クロマトグラフィー）。
【０２５７】
脂肪酸産物の存在の明白な検出は、標準的分析方法：GC、GC-MSまたはTLCにより、組換え生物を分析することにより、達成することができ、これらの方法は、Christieにより、またその引用参照文献に、幾度も記載されている（1997：Advances on Lipid Methodology、第４版：Christie, Oily Press, Dundee, 119-169；1998, gas chromatography/mass spectrometry methods, Lipide 33:343-353）。
【０２５８】
分析しようとする材料は、音波破砕、ガラスミルでの磨砕、液体窒素および粉砕、あるいは、その他の適用可能な方法により破砕することができる。破砕後、材料を遠心分離しなければならない。沈降物を蒸留水中に再懸濁させ、100℃で10分加熱し、氷冷して再遠心分離させた後、２％ジメトキシプロパンを含むメタノール中の0.5 M硫酸において90℃で１時間抽出する。これにより、加水分解された油および脂質化合物が得られ、これは、メチル基転移脂質をもたらす。これらの脂肪酸メチルエステルを石油エーテルで抽出し、最終的に、毛管カラム（Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25μm、0.32 mm）を用いて、170℃から240℃まで20分の温度勾配および240℃で５分のGC分析を実施する。得られた脂肪酸メチルエステルの正体は、市販されている標準溶液（すなわち、Sigma）を用いて、決定しなければならない。
【０２５９】
使用できる標準溶液がない脂肪酸については、誘導体化の後、GC/MS分析を実施することにより、その正体を証明しなければならない。例えば、三重結合を有する脂肪酸の局在化は、4,4-ジメトキシオキサゾリン誘導体（Christie, 1998, 前記参照）を用いた誘導体化の後GC/MSにより証明しなければならない。
【０２６０】
異種微生物系における発現構築物
株、生育条件およびプラスミド
大腸菌株XL1 Blue MRF’ kan（Stratagene）を用いて、新規のヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）デサチュラーゼであるpPDesaturase１をサブクローニングする。この遺伝子を機能的に発現するため、サッカロミセス・セレビシエ菌株INVSc 1（Invitrogen Co.）を用いた。ルリア−ベルティニブロス（LB、Duchefa、オランダ、ハールレム）において、大腸菌を37℃で培養する。必要であれば、アンピシリン（100 mg／リットル）を添加し、1.5％の寒天（w/v）を添加して、固体LB培地を得る。サッカロミセス・セレビシエ菌を、YPG培地、またはウラシルを含まない完全最少培地（CMdum；Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.B., Coen, D.M.およびVarki, A.（1995）Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、ニューヨーク）のいずれかにおいて、２％（w/v）のラフィノースまたはグルコースのいずれかと一緒に、30℃で増殖させる。固体培地を得るために、２％（w/v）のBacto（商標）寒天（Difco）を添加する。発現をクローニングするのに用いるプラスミドは、pUC18（Pharmacia）およびｐYES2（Invitrogen Co.）である。
【０２６１】
実施例16：  PUFA特異的フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Paheodactylum tricornutum）デサチュラーゼのクローニングおよび発現
酵母における発現のために、配列番号１、３、５または11からのフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Paheodactylum tricornutum）cDNAクローン、あるいは、配列番号７または９からの配列、もしくはその他の所望の配列を、２つのオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、コード領域だけが増幅するようにまず改変した。ここで、効率的な翻訳のために、開始コドンの共通配列が保持されるよう注意した。このため、塩基配列ATAまたはAAAのいずれかをを選択し、ATGの前の配列に挿入した（Kozak, M.（1986）Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes, Cell 44, 283-292）。さらに制限切断部位をこの共通トリプレットの前に導入したが、この制限切断部位は、断片をクローニングすることになっており、かつ微生物または植物において遺伝子発現を起こさせるために用いることになっている標的ベクターの切断部位と適合性でなければならない。
【０２６２】
サーモサイクラー（Biometra）中で、鋳型としてプラスミドDNAを用いて、Pfu DNA（Stratagene）ポリメラーゼおよび下記の温度プログラムで、PCR反応を実施した：96℃で３分、次に、96℃で30秒、55℃で30秒および72℃で２分を30サイクル、そして72℃で10分を１サイクルの後、４℃で停止。アニーリング温度は、選択したオリゴヌクレオチドによって変化させた。DNAのキロ塩基対あたり約１分の合成時間を想定することができる。例えば、マグネシウムイオン、塩、DNAポリメラーゼなど、PCRに影響を与えるその他のパラメーターは当業者には公知であり、必要に応じて変動しうる。
【０２６３】
適正サイズの増幅DNA断片をアガロースTBEゲル電気泳動により確認した。QIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）を用いて、増幅DNAをゲルから抽出した後、シュアクローン連結キット（Sure Clone Ligation Kit）（Pharmacia）を用いて、脱リン酸化ベクターpUC18のSmaI制限部位に連結して、pUC誘導体を作製した。大腸菌XL1 Blue MRF’ kanの形質転換の後、アンピシリン耐性形質転換体に対してDNAミニプレップ（Riggs, M.G.およびMcLachlan, A.（1986）A simplified screening procedure for large numbers of plasmid mini-preparation. BioTechniques 4, 310-313）を実施し、陽性クローンをBamHI制限分析により同定した。ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer、Weiterstadt）を用いた再配列決定により、クローン化PCR産物の配列を確認した。
【０２６４】
Δ5アシル脂質デサチュラーゼ、Pt des5
プライマー１  GAG CTC ACA TAA TGG CTC CGG ATG CGG ATA AGC
プライマー２  CTC GAG TTA CGC CCG TCC GGT CAA GGG
シュアクローン連結キット（Sure Clone Ligation Kit）（Pharmacia）を用いて、PCR断片（1428 bp）をpUC18にクローニングし、挿入した断片をSacI/XhoIで消化した後、その断片を、好適な制限切断部位を用いてpYES2またはpYES6に挿入した。
【０２６５】
Δ6アシル脂質デサチュラーゼ、Pt des6
プライマー３  GGA TCC ACA TAA TGG GCA AAG GAG GGG ACG CTC GGG
プライマー４  CTC GAG TTA CAT GGC GGG TCC ATC GGG
シュアクローン連結キット（Sure Clone Ligation Kit）（Pharmacia）を用いて、PCR断片（1451 bp）をpUC18にクローニングし、挿入した断片をBamHI/XhoIで消化した後、その断片を好適な制限切断部位を用いてpYES2またはpYES6に挿入した。
【０２６６】
Δ12アシル脂質デサチュラーゼ、Pt des12
プライマー５  GGA TCC ACA TAA TGG TTC GCT TTT CAA CAG CC
プライマー６  CTC GAG TTA TTC GCT CGA TAA TTT GC
Δ12アシル脂質デサチュラーゼ、Pt des12.2
プライマー７  GGA TCC ACA TAA TGG GTA AGG GAG GTC AAC G
プライマー８  CTC GAG TCA TGC GGC TTT GTT TCG C
シュアクローン連結キット（Sure Clone Ligation Kit）（Pharmacia）を用いて、PCR断片（1505 bp）をpUC18にクローニングし、挿入した断片をBamHI/XhoIで消化した後、その断片を、好適な制限切断部位を用いてpYES2またはpYES6に挿入した。
【０２６７】
プラスミドDNAをまず制限酵素で切断することにより、プライマー配列の導入される切断部位とマッチさせ、得られた断片を脱リン酸化酵母／大腸菌シャトルベクターpYES2またはpYES6の適合性制限部位に連結し、pYES誘導体を作製した。大腸菌の形質転換および形質転換体からのDNAミニプレップに続き、ベクターにおけるDNA断片の配向を、好適な制限切断または配列決定により確認した。１つのクローンを用いて、Nucleobond（登録商標）AX 500プラスミドDNA抽出キット（Macherey-Nagel, Duringen）によるDNAマキシプレップ（maxiprepation）を実施した。
【０２６８】
PEG／酢酸リチウムプロトコル（Ausubelら、1995）を用いて、サッカロミセス・セレビシエINVSc1をpYES誘導体およびpYESブランクベクターで形質転換した。２％グルコースを含むCMdum-寒天プレート上での選択後、さらなる培養および機能発現のためにpYES誘導体形質転換体と１つのpYES2形質転換体を選択した。pYES6誘導体については、ブラスチシジンを代謝拮抗物質として用いた。pYES2およびpYES6に基づく共発現の場合には、最少培地上のブラスチシジンを用いて、選択を実施した。
【０２６９】
酵母におけるデサチュラーゼ活性の機能的発現
前培養：
２％（w/v）ラフィノースを含む、20 mlのCMdumドロップアウト（dropout）ウラシル液体培地にトランスジェニック酵母クローン（pYES2）を接種し、600 nm（OD600）での光学濃度が1.5〜２に達するまで、30℃および200 rpmで３日間培養した。pYES6をベクターとして用いた場合には、代謝拮抗物質としてのブラスチシジンに関する選択をさらに行なった。
【０２７０】
主培養：
発現のために、２％ラフィノースと１％（v/v）Tergitol NP-40を含む20 mlのCMdumドロップアウト（dropout）ウラシル液体培地に、脂肪酸基質を補充して、最終濃度を0.003％（w/v）とした。この培地に、上記の前培養物を0.05のOD600まで接種した。２％（w/v）ガラクトースを用いて、0.2のOD600で16時間発現を誘導し、その直後に、該培養物を0.8〜1.2のOD600で回収した。
【０２７１】
脂肪酸分析：
脂肪酸全体を酵母培養物から抽出し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。このため、５ mlの培養物の細胞を遠心分離（1,000×g、10分、4℃）により回収し、100 mM NaHCO3、pH 8.0で１回洗浄して、残留培地および脂肪酸を除去した。脂肪酸メチルエステル（FAME）を調製するために、細胞沈降物を、1 Mメタノール性H2SO4および２％（v/v）ジメトキシプロパンで、80℃にて１時間処理した。このFAMEを２mlの石油エーテルで２回抽出し、100 mM NaHCO3、pH 8.0で１回洗浄し、蒸留水で1回洗浄した後、Na2SO4で乾燥した。アルゴン流の下で、有機溶剤を蒸発させ、上記FAMEを50μlの石油エーテルに溶解させた。フレームイオン化検出器を備えたヒューレットパッカード6850ガスクロマトグラフ内のZEBRON ZB Wax毛管カラム（30ｍ、0.32 mm、0.25μm；Phenomenex）上で、上記サンプルを分離した。オーブン温度は、20℃／分の昇温速度で、70℃（１分間保持する）から200℃まで、次に、５℃／分の速度で、250℃（５分間保持する）まで、最後に、５℃／分の速度で、260℃までプログラムした。窒素をキャリアーガス（70℃で4.5 ml／分）として用いた。脂肪酸は、FAME標準物（SIGMA）の保持時間との比較により同定した。
【０２７２】
発現分析
添加して取り込まれた脂肪酸基質の割合を決定することにより、デサチュラーゼ反応の量および質を表６および表７および表８に従って記録した。
【０２７３】
酵母におけるフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Paheodactylum tricornutum）Δ6-アシル脂質デサチュラーゼの発現の結果：
【表６】
0004490039.tif 000010
データは、対応するシス脂肪酸のモル％を示す。
【０２７４】
酵母におけるフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）Δ5-アシル脂質デサチュラーゼの発現の結果：
【表７】
0004490039.tif 000011
データは、対応するシス脂肪酸のモル％脂肪酸を示す。
【０２７５】
その他の供給実験から、C18：1Δ9は、C18：2Δ9,11またはC18：3Δ9,12,15もしくはC20：1Δ8脂肪酸の存在下では脱飽和されないのに対し、C18：1は、C20：1Δ11、C20：2Δ11,14およびC20：3Δ8,11,14の存在下でも脱飽和されることが明らかになった。また、C20：3Δ8,11,14の存在下では脱飽和が起こらなかった。
【０２７６】
ブラスチシジンを含む完全培地でフェオダクチルム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）Δ5-デサチュラーゼを発現させるために、プロテアーゼ欠損酵母株C13BYS86（Kunze I. ら、Biochemica et Biophysica Acta（1999）1410:287-298）を用いた場合、Δ5-デサチュラーゼの基質としてのC20：4Δ8,11,14,17は20％の変換率を与え、これは、C20：3Δ8,11,14と同様によく変換されたことがわかった。これに代わり、栄養要求性マーカーleu2、ura3またはhisを遺伝子発現に用いてもよい。
【０２７７】
これ以外に、フェオダクチルムΔ5-デサチュラーゼおよびヒメツリガネゴケΔ6-エロンガーゼの共発現実験では、使用した株は、UTL7A（Warnechkeら、J. Biol. Chem. (1999) 274(19):13048-13059）であり、Δ5-デサチュラーゼは、約10％のC20：3Δ8,11,14をC20：4Δ5,8,11,14に変換した。
【０２７８】
非常に多様なその他の脂肪酸（例えば、リノール酸、C20：3Δ5,11,14-脂肪酸、α-またはγ-リノレン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸など）を単独で、または組み合わせて用いた供給実験を実施して、これらののデサチュラーゼの基質選択性をさらに詳細に確認することができる。
【表８】
0004490039.tif 000012
【０２７９】
基質変換から、使用したフェオダクチルムΔ5-デサチュラーゼおよびヒメツリガネゴケΔ6-エロンガーゼは、本発明の配列を用いて、基質活性に関して、特に、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸を生産する基質特異性に関して、適していることが明らかにされた。
【０２８０】
標準物のDMOX誘導体の断片化パターンおよび質量スペクトル、ならびに、表６、７および８に示し、かつGCにより確認した脂肪酸のピーク画分は、比較すると、同じ結果を示していることから、単純なGC検出ではわからない二重結合のそれぞれの位置が確認される。
【０２８１】
実施例17：  形質転換生物からの所望の産物の精製
当業者には公知の各種方法により、植物材料または真菌、藻類、繊毛虫、動物細胞、または前記培養物の上清から、所望の産物を回収することができる。所望の産物が細胞から分泌されない場合には、低速遠心分離により、培養物から細胞を回収し、機械力または音波破砕などの標準的技法により、細胞を溶解させことができる。植物の器官を他の組織または他の器官から機械的に分離することができる。ホモゲナイズの後、遠心分離により、細胞破壊屑を除去し、可溶性タンパク質を含む上清画分を残して、所望の化合物をさらに精製する。産物が所望の細胞から分泌される場合には、低速遠心分離により、培養物から細胞を除去し、上清画分を残して、さらなる精製を実施する。
【０２８２】
各精製方法から得た上清画分は、適当な樹脂を含むクロマトグラフィーに付す。所望の分子は、クロマトグラフィー樹脂に残るのに対し、サンプル中の不純物の多くは残らないか、あるいは、樹脂上に不純物は残るが、サンプルは残らないかのいずれかである。これらのクロマトグラフィー段階は、必要に応じ、同じまたは他のクロマトグラフィー樹脂のいずれかを用いて、繰り返すことができる。当業者であれば、好適なクロマトグラフィー樹脂の選択や、精製しようとする特定の分子の最も効果的な使用について、熟知している。精製された産物は、ろ過または限外ろ過により濃縮し、産物の安定性が最も高い温度で保存することができる。
【０２８３】
非常に多様な精製方法が当業者には知られており、前述した精製方法は、制限を意図するものではない。これらの精製方法は、例えば、Bailey, J.E.およびOllis, D.F.、Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill：ニューヨーク（1986）に記載されている。
【０２８４】
単離した化合物の正体（素性）および純度は、当業者には公知の標準的技法により決定することができる。このような技法として、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、分光法、染色法、薄層クロマトグラフィー、特に薄層クロマトグラフィーおよびフレームイオン化検出法（IATROSCAN, Itaron, 日本国東京）、NIR、酵素アッセイまたは微生物試験法が挙げられる。これらの分析方法については、下記を参照されたい：Patekら（1994）Appl. Environ. Microbiol. 60：133-140；Malakhovaら（1996）Biotekhnologiya 11：27-32；ならびに、Schmidtら（1998）Bioprocess Engineer. 19：67-70. Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry（1996）Vol. A27, VCH Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, pp. 575-581およびpp.581-587；Michal, G（1999）Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons；Fallon, A.ら（1987）Applications of HPLC in Biochemistry：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17。
【０２８５】
均等物
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書中にこれまで述べてきた本発明の特定の使用形態についての多数の均等物を認識しているか、あるいは、確かめることができる。これらの均等物は、本発明の特許請求の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】Pp des6のコード領域（上列）とPT001078032RのEST配列（下列）とのポリペプチドアラインメントを示す。
【図２】Ma des12のコード領域（上の配列）とPT0010070010Rとのポリペプチドアラインメントを示す。
【図２ａ】Ma des12のコード領域（上の配列）とPT001072031Rとのポリペプチドアラインメントを示す。
【図３】フェオダクチルム（Paeodactylum）デサチュラーゼ断片をコードするプライマー対F6aおよびR4a2のPCR産物のコード領域（上列）とストレプトミセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）配列T36617（下列）とのポリペプチドアラインメントを示す。
【図４】Pp des6のコード領域（上列）とPt des6（下列）とを比較したポリペプチドアラインメントを示す。
【図５】Pp des6のコード領域（上列）とPt des5（下列）とを比較したポリペプチドアラインメントを示す。
【図６】モルティエレラ・アルピナΔ12-デサチュラーゼ（Ma des12）のコード領域（上列）と相同フェオダクチルム・トリコルヌーツム配列（Pt des12）（下列）とのポリペプチドアラインメントを示す。
【図７】モルティエレラ・アルピナΔ12-デサチュラーゼ（Ma des12）のコード領域（上列）とフェオダクチルム・トリコルヌーツムクローンPT001072031R（Pt des12.2）（下列）とのポリペプチドアラインメントを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図２ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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