(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）M蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、気道粘膜上皮への感染により開裂される任意のF蛋白質を含む野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを含み、かつ（ｃ）該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質をさらに含む複合体であり、以下の性質を有する複合体。
（１）該複合体が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有する。
（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失している。
（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該RNAを導入する能力を有する。
【請求項２】
ウイルス粒子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
該パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
該プロテアーゼが、癌で特異的に発現するプロテアーゼである、請求項１から３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
該プロテアーゼが細胞外マトリクス分解酵素である、請求項１から４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
該プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１から５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
該プロテアーゼによって開裂される配列が、Pro-Leu-Gly、Pro-Gln-Gly、またはVal-Gly-Argを含む、請求項１から６のいずれかに記載の複合体。
【請求項８】
該改変F蛋白質において、野生型F蛋白質が持つ細胞質ドメインの一部が欠失している、請求項１から７のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
該改変F蛋白質がHN蛋白質と融合している、請求項１から８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
該改変F蛋白質および該HN蛋白質が、両方の蛋白質の膜貫通領域を持ち、細胞質側において互いの蛋白質が結合するように融合している、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）M蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、気道粘膜上皮への感染により開裂される任意のF蛋白質を含む野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを有し、かつ該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質をさらに有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムRNAを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムRNAを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（i）該パラミクソウイルスの野生型M蛋白質および野生型F蛋白質を発現する細胞において、該パラミクソウイルスのN、P、およびL蛋白質、および該ゲノムRNAを含むRNPを増幅させる工程、
（ii）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、
を含み、工程（i）〜（ii）の少なくともいずれかの時期に該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質を開裂するプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ii）において回収されたウイルス粒子を該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質を開裂するプロテアーゼで処理する工程を含む方法。
【請求項１２】
パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）条件的変異を有するM蛋白質をコードし、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、気道粘膜上皮への感染により開裂される任意のF蛋白質を含む野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを有し、かつ該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質をさらに有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムRNAを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムRNAを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（i）該M変異蛋白質の許容条件下、該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質を発現する細胞内で該パラミクソウイルスのN、P、およびL蛋白質、および該ゲノムRNAを含むRNPを増幅させる工程
（ii）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、
を含み、工程（i）〜（ii）の少なくともいずれかの時期に該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質を開裂するプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ii）において回収されたウイルス粒子を該パラミクソウイルスの野生型F蛋白質を開裂するプロテアーゼで処理する工程を含む方法。
【請求項１３】
該野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼが、癌で特異的に発現するプロテアーゼである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
該野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼが、細胞外マトリクス分解酵素である、請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
該プロテアーゼによって開裂される配列が、Pro-Leu-Gly、Pro-Gln-Gly、またはVal-Gly-Argを含む、請求項１１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該改変F蛋白質において、野生型F蛋白質が持つ細胞質ドメインの一部が欠失している、請求項１１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
該改変F蛋白質がHN蛋白質と融合している、請求項１１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
該改変F蛋白質および該HN蛋白質が、両方の蛋白質の膜貫通領域を持ち、細胞質側において互いの蛋白質が結合するように融合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（i）を35℃以下で行う、請求項１１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
工程（i）〜（ii）の少なくともいずれかの時期において該改変F蛋白質を開裂させるプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ii）において回収されたウイルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、請求項１１から２０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項４に記載の複合体および薬学的に許容される担体を含む癌の治療組成物。
【請求項２３】
請求項５に記載の複合体を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項６に記載の複合体を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
該配列が組織特異的プロテアーゼによって開裂される配列に置換された請求項１に記載の複合体からなる、該組織の細胞を除去するための剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された細胞融合型ベクターおよびその製造方法に関する。本発明のベクターは、癌特異的に感染する遺伝子治療ベクターとして有用である。
背景技術
近年、癌に対する遺伝子治療の開発が進展している。これまで本発明者らはセンダイウイルス（SeV）を用いて遺伝子治療ベクターの開発を行ってきた。SeVはパラミクソウイルス科ウイルスの一種で、非分節型ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウイルスのグループに属す。パラミクソウイルスベクターは、外来遺伝子の高導入率および高発現を可能とするベクターであり、癌の遺伝子治療用ベクターとしても期待されている。パラミスソウイルスによる癌治療の試みは多数なされている。例えば、BHK21細胞にMumps virusを感染させると、担癌ヌードマウスで抗癌効果を示すことが報告された（Minato,N.et al.（1979）J.Exp.Med.149,1117-1133）。また、その他のパラミクソウイルスでも同様に抗腫瘍効果が報告されている。最近、Fusogenic proteinの抗癌効果が注目されている。Galanisらは、measles virusのF,HN蛋白質を搭載したadenovirus vectorが、感染した癌細胞がシンシチウムを形成し、in vivoで抗癌効果を報告している（Galanis,E.et al.（2001）Hum.Gene Ther.12,811-821）。
言うまでもなく、転移しない癌はその部分を外科的に取り除けばよく、転移することと悪性の癌とは同義であるとされている。その浸潤転移する癌は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）および/またはプラスミノーゲンアクチベーター（uPA,tPA）を高発現することが知られている（Cox,G.,and O’Byrne,K.J.（2001）Anticancer Res.21,4207-4219;Andreasen,P.A.et al.（2000）Cell Mol.Life.Sci.57,25-40）。その理由として、癌細胞が転移浸潤する際、そのまわりにある細胞外マトリックス（ECM）が障壁となり細胞の移動ができないので、癌はそのECMを分解する酵素（MMP,uPA,tPA）を発現し、ECM分解することによってはじめて、浸潤、転移が可能になるためであると考えられている。
一方、癌遺伝子治療の問題点として３つのことがあげられている。第一に癌細胞への導入効率が低かったり、固形癌深部への導入ができないため、癌全体への導入ができず、残った癌が再び増殖を始め再発することである。第二に癌への導入と同時に正常細胞へも導入され、正常細胞にも傷害を与え、副作用が大きくなっていることである。第三にこれは癌治療全体の問題でもあるが、癌の悪性化にともなう浸潤転移である。これらの問題を解決するベクターは未だ開発されていない。
発明の開示
本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変され、特定のプロテアーゼ存在下でのみ周囲の細胞に浸潤する新たな細胞融合型ベクターおよびその製造方法を提供する。
センダイウイルスを含むパラミクソウイルス科ウイルスは、そのエンベロープに２つの蛋白を有している。F（fusion）蛋白質はウイルスとその宿主である細胞とを膜融合をさせ、ヌクレオカプシドを細胞質へ放出させる。HN（hemagglutinin-neuraminidase）蛋白質は赤血球凝集能とのノイラミナーゼ活性をもち、宿主レセプターへ結合する役割を果たす。F蛋白質およびHN蛋白質はスパイク蛋白質とも呼ばれ、ウイルスのエンベロープ表面に露出している。またM（matrix）蛋白質はエンベロープを裏打ちし、ウイルス粒子に強固さを付与している。このベクターの特徴は広範な細胞と動物組織に高効率で遺伝子導入可能で、かつ既存のベクターと比較し、高い発現量を実現していることである。
F蛋白質（F0）はそのままでは細胞融合活性を示さず、宿主由来のプロテアーゼにより開裂してF1とF2に分解されることによってはじめてその融合活性を示すようになる。従って、野生型のF蛋白質を持つウイルスの増殖は、この蛋白質を開裂できるtrypsin様のプロテアーゼを発現する気道粘膜上皮などの組織に制限されてしまう。パラミクソウイルスではFの改変による感染のトロピズムもしくは融合能の改変についての様々な研究がなされている。SeVでは、α-キモトリプシンでのみ開裂するFを持つ変異体がトリプシン感受性を失い、そのトロピズムがFの開裂配列特異的に変わることが示されている（Tashiro,M.et al.（1992）J.Gen.Virol.73（Pt 6）,1575-1579）。Newcastle disease virus、Measles virusでは、Fの開裂配列を改変し、そのシンシチウム形成能がトリプシン依存的に変わることを示している（Li,Z.et al.（1998）J.Virol.72,3789-3795;Maisner,A.et al.（2000）J.Gen.Virol.81,441-449）。
このように、Fの開裂配列を改変することにより、あるプロテアーゼを発現する特定の組織等にベクターを感染および増殖させることが可能となると考えられる。しかし、パラミクソウイルスベクターが持つ問題点の１つに、標的細胞へのベクター導入後に起こる細胞からのウィルスの２次放出がある。複製型ウィルスを感染させた細胞ではビリオンが形成され娘ウィルスが放出されるため、標的組織以外にもウイルス粒子が拡散する。上述のように野生型F蛋白質を持つウイルス粒子はトリプシン様酵素の非存在下では感染性を示さないものの、ウイルス粒子自身は細胞から放出される。生体内投与においては、血中に拡散したウイルスが全身に到達することも懸念される。さらに、複製能を持たないF遺伝子欠損SeV（Li,H.O.et al.（2000）J.Virol.74,6564-6569;WO00/70055;WO00/70070）を導入した細胞等からもウィルス様粒子（VLP:virus like particle）の放出が観察されている。このような２次放出粒子は、標的とする組織以外への感染や免疫反応を誘発することが懸念される。
本発明者らは、ウイルスエンベロープ遺伝子の中で、M遺伝子を欠損するパラミクソウイルスは、粒子形成が起こらないが感染細胞とそれに接した細胞が融合することによってシンシチウムを形成し、細胞融合型の感染をすることを見出している（WO00/09700）。これらのM欠損型ウイルスは、導入細胞において複製され、トリプシン存在下で隣接する細胞に伝達される。しかしながら、この現象はFが開裂して活性化する条件においてのみ起こる現象であり、野生型F蛋白質を持つウイルスではtrypsin様のプロテアーゼがない状態ではウイルスの伝達は起きない。本発明者らは、このM欠損型ウイルスにおいてF蛋白質のトロピズムを改変すれば、２次放出粒子を産生せず、特定の組織でのみ感染を広げられる新規なベクターを開発できるのではないかと考えた。特に浸潤転移癌においては、ECMを分解するMMP,uPA,tPAなどのプロテアーゼ活性が亢進しているものが多く知られている。そこで本発明者らは、このM欠失型SeVのプロテアーゼ依存的細胞融合型感染と癌におけるMMP,uPA,tPA高発現の現象を組み合わせて利用し、浸潤転移癌特異的に感染し広がってゆくSeVベクターを作製した。
M欠損型ウイルスは粒子形成に必要なM遺伝子を欠損しているため、通常ウイルス粒子は放出しないか極度に抑制されている。複製能を持つ組み換えウイルスの産生に用いる通常の再構成法（Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579）を用いた場合、M欠損型ウイルスのRNPを調製することはできるが感染性ウイルス粒子は製造できない（WO00/09700）。実際の癌治療薬としてM欠失型ベクターを利用するためには、M欠失型ウイルスを感染性ウイルス粒子として調製できれば極めて有用である。そこで本発明者らは、M欠失型ウイルスをウイルス粒子として調製するための新たな製造方法の開発を行った。
本発明者らはまず、VLP放出が抑制されたベクターを構築するための一つの解決法として、ウィルス遺伝子の温度感受性変異の利用を考えた。低温で生育するが高温では増殖できない幾つかの変異型ウィルスが報告されている。本発明者らは、特に高温でのビリオン形成が抑制されるような変異蛋白質、特にM蛋白に変異を有するものを利用すれば、低温で（例えば32℃）ウィルス生産を行い、遺伝子治療等の実応用時はそれよりは高温（例えば37℃）で行うことにより、VLP形成を抑制できる可能性があると考えた。この目的のために、本発明者らはM蛋白質およびHN蛋白質で報告されている、それぞれ３つ、計６つの温度感受性変異を持つ変異MおよびHN蛋白質をコードするF遺伝子欠損型の組み換えセンダイウィルスベクターを構築した。このウィルスのVLP放出を調べたところ、野生型ウィルスに比べ約1/10またはそれ以下であることが判明した。さらに、VLP放出が抑制されたセンダイウィルスベクターを導入した細胞におけるM蛋白質の局在を、抗M抗体を利用した免疫染色により解析した結果、野生型ウィルスを導入した細胞では見られる細胞表面のM蛋白質の凝集が、VLP放出抑制型ウィルスの場合は有意に減少しており、特に高温（38℃）においてM蛋白の濃縮像が極端に減少していた。温度感受性変異M遺伝子を含むこのSeVを感染させた細胞におけるM蛋白質およびHN蛋白質の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡により詳しく調べたところ、低温（32℃）においても細胞表面でのM蛋白の局在は有意に低下しており、微小管（microtubule）の形態に近い形で観察された。さらに、高温（37℃）ではM蛋白は微小管の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）に局在して存在していた。微小管脱重合剤を添加すると、温度感受性M遺伝子を持つSeVのみならず、野生型M遺伝子を持つSeVにおいても、M蛋白質の局在構造が破壊されたことから、M蛋白質は実際に微小管に沿って局在して機能している可能性が高いと判断された。以上の知見から、温度感受性変異導入ウィルスで二次放出粒子が減少しているのは、粒子形成の中心的な役割を担っていると考えられているM蛋白の細胞内局在の不全であると断定された。従って、M蛋白質の正常な細胞内局在を妨げることにより、VLPの形成を効果的に抑制することができると考えられる。また、M蛋白質の機能には微小管との相互作用が重要であり、例えばM蛋白質がゴルジ体から微小管に沿って細胞内移動することを阻害するような遺伝子変異や薬剤を開発することにより、M蛋白の細胞内局在の不具合を生じさせ、結果的に二次放出粒子の減少を達成することが可能と判断される。すなわち本発明者らは、M蛋白質の局在に欠陥を生じさせるような変異を有するウィルスベクターを調製することによって、粒子形成能が低下または消失した組み換えウィルスベクターを得ることができることを見出した。
また本発明者らは、M遺伝子をウィルスから欠失させることによって、ウィルスを導入した細胞におけるM蛋白質の細胞表面の凝集が完全に欠如したウィルスの構築を試みた。この目的のために、本発明者らはM遺伝子欠失型ウィルスの生産に利用可能な野生型M蛋白質を誘導的に発現させることができるヘルパー細胞を構築した。この細胞を利用することにより、野生型M蛋白質を含むエンベロープに、F改変型のM遺伝子欠損ウイルスのRNPが包まれたウイルス粒子を回収することに初めて成功した。本発明の方法により1×108PFU/ml以上の濃度でウイルス粒子を製造することが可能となり、臨床を含む実用に耐える組み換えウイルスを初めて提供することが可能となった。また本発明のウイルス製造系は、他のウィルスの混入を否定できる安全性の高い高タイターの遺伝子治療用ベクターの生産を可能にする。M発現細胞を利用してM蛋白質をトランスに供給する、本発明のM欠失型SeV生産システムにおいて初めて、実用に適したF改変型M欠失型のパラミクソウィルスが提供された。
本発明者らは、上記のように構築した感染性ウイルス粒子を用いて、実際の抗腫瘍効果をin vivoにおいて検証した。癌細胞を移植したマウスに対して、この癌で活性が亢進するマトリクスメタロプロテアーゼ（MMP）で活性化されるM欠失型ウイルスを投与したところ、細胞融合型の感染を通して癌組織内にウイルスが広がることが確認された。野生型ウイルスを投与した癌では、数日後でもウイルスは注入部位に限定されていたのに対し、本発明のベクターでは癌組織に対して強い浸透力を示し、癌全体にベクターの広がりが認められた。ウイルス未投与または野生型ウイルスを投与した対照に比べ、癌の増殖に対する抑制効果は明白であった。これまでにもレトロウイルスにおいてMMP発現細胞を標的とするベクターが作製されているが（Peng,K.-W.et al.,1997,Human Gene Therapy 8:729-738;Peng,K.-W.et al.,1999,Gene Therapy 6:1552-1557;Martin,F.et al.,1999,J.Virol.73:6923-6929）、本発明とは認識配列のデザインが全く異なっている。また、これらの報告は癌組織への特異的な感染、則ちターゲッティングのみを目的としたものであり、癌組織で特異的に（細胞間で）感染が広がり治療効果を発揮するベクターは本発明において初めて提供された。
さらに本発明者らは、ウイルス粒子産生時にプロテアーゼの添加を制御することにより、ウイルス表面のF蛋白質が開裂されていないウイルス粒子（F非開裂型ウイルス）を調製することに成功した。このウイルスは、そのままでは感染性を持たないが、ウイルス表面のF蛋白質を開裂するプロテアーゼで処理するか、あるいは該プロテアーゼ存在条件下で細胞に添加することにより、特異的に感染能を示すことができた。このような潜在感染型ウイルスベクターにより、特定のプロテアーゼを産生する癌細胞に特異的にベクターを感染させることが可能となった。
また本発明者らは、改変F遺伝子を持つベクターを、野生型F蛋白質を用いて作製することにより、ベクター作製時に野生型F蛋白質を開裂するプロテアーゼを用いてウイルス粒子を製造する方法を開発した。この方法によれば、野生型F蛋白質を発現するヘルパー細胞を用いて、トリプシン等の野生型F蛋白質を開裂する酵素によりウイルス増幅を行うことができる。得られたウイルス粒子は、開裂した野生型F蛋白質をエンベロープに含み感染性を有するが、ウイルスゲノムはF蛋白質の開裂部位が改変された改変F遺伝子をコードするため、特定のプロテアーゼの存在下でしか感染を広げられない。野生型F蛋白質を用いてウイルスを調製する方法は、ベクターゲノムに組み込む改変F遺伝子に依存せずにウイルス粒子を製造することが可能であるため有利である。
このように本発明は、癌などの特定の組織で発現するプロテアーゼ存在下でのみ感染を広げるベクターを提供する。本発明のベクターはウイルス様粒子を有意に産生せず、細胞融合により隣接する周囲の細胞にベクターを伝達する。特に癌で活性が亢進するプロテアーゼで感染性を獲得する本発明のベクターは、腫瘍増殖に対する強い抑制作用を持っており、このベクターを用いた癌の遺伝子治療は極めて有効と考えられる。
すなわち本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された細胞融合型ベクターおよびその製造方法等に関し、より具体的には
〔１〕パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）M蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを含む複合体であり、以下の性質を有する複合体、
（１）該複合体が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有する、
（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失している、
（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該RNAを導入する能力を有する、
〔２〕ウイルス粒子である、〔１〕に記載の複合体、
〔３〕野生型F蛋白質をさらに含む、〔２〕に記載の複合体、
〔４〕該パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の複合体、
〔５〕該プロテアーゼが、癌で活性が亢進するプロテアーゼである、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の複合体、
〔６〕該プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の複合体、
〔７〕該プロテアーゼによって開裂される配列が、Pro-Leu-Gly、Pro-Gln-Gly、またはVal-Gly-Argを含む、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の複合体、
〔８〕該改変F蛋白質において、野生型F蛋白質が持つ細胞質ドメインの一部が欠失している、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の複合体、
〔９〕該改変F蛋白質がHN蛋白質と融合している、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の複合体、
〔１０〕パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）M蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムRNAを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムRNAを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（i）パラミクソウイルスの野生型M蛋白質を発現する細胞において、該パラミクソウイルスのN、P、およびL蛋白質、および該ゲノムRNAを含むRNPを増幅させる工程、
（ii）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法、
〔１１〕パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）条件的変異を有するM蛋白質をコードし、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムRNAを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムRNAを導入する能力を有するウイルス粒子の製造方法であって、
（i）該M変異蛋白質の許容条件下、細胞内で該パラミクソウイルスのN、P、およびL蛋白質、および該ゲノムRNAを含むRNPを増幅させる工程
（ii）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法、
〔１２〕工程（i）を35℃以下で行う、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕工程（i）〜（ii）の少なくともいずれかの時期において該改変F蛋白質を開裂させるプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ii）において回収されたウイルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、〔１０〕または〔１１〕に記載の製造方法、
〔１４〕工程（i）において該細胞内でパラミクソウイルスの野生型F蛋白質を発現させ、工程（i）〜（ii）の少なくともいずれかの時期に該野生型F蛋白質を開裂するプロテアーゼを存在させるか、あるいは工程（ii）において回収されたウイルス粒子を該プロテアーゼで処理する工程を含む、〔１０〕または〔１１〕に記載の製造方法、
〔１５〕〔５〕に記載の複合体および薬学的に許容される担体を含む癌の治療組成物、
〔１６〕パラミクソウイルスF蛋白質の改変蛋白質であって、開裂部位にPro-Leu-Gly、Pro-Gln-Gly、またはVal-Gly-Argを含み、マトリックスメタロプロテアーゼまたはプラスミノーゲンアクチベーターの存在下で細胞融合能を示す組み換え蛋白質、
〔１７〕〔１６〕に記載の蛋白質をコードする核酸、
〔１８〕〔１６〕に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウイルス粒子、
〔１９〕パラミクソウイルスF蛋白質およびHN蛋白質の膜貫通領域を持ち、細胞質側において互いの蛋白質が結合している融合蛋白質であって、細胞融合活性を持つ蛋白質、
〔２０〕〔１９〕に記載の融合蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質、
〔２１〕〔１９〕に記載の蛋白質をコードする核酸、
〔２２〕〔２１〕に記載の核酸を含むベクター、
〔２３〕〔１９〕に記載の蛋白質または該蛋白質をコードする核酸を含むウイルス粒子、に関する。
本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Paramyxoviridae）に属するウィルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウィルスは、非分節型ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウィルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（パラミクソウイルス属（レスピロウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、具体的にはセンダイウィルス（Sendai virus）、ニューカッスル病ウィルス（Newcastle disease virus）、おたふくかぜウィルス（Mumps virus）、麻疹ウィルス（Measles virus）、RSウィルス（Respiratory syncytial virus）、牛疫ウィルス（rinderpest virus）、ジステンパーウィルス（distemper virus）、サルパラインフルエンザウィルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウィルス1,2,3型等が挙げられる。より具体的には、例えばSendai virus（SeV）、human parainfluenza virus-1（HPIV-1）、human parainfluenza virus-3（HPIV-3）、、phocine distemper virus（PDV）、canine distemper virus（CDV）、dolphin molbillivirus（DMV）、peste-des-petits-ruminants virus（PDPR）、measles virus（MV）、rinderpest virus（RPV）、Hendra virus（Hendra）、Nipah virus（Nipah）、human parainfluenza virus-2（HPIV-2）、simian parainfluenza virus 5（SV5）、human parainfluenza virus-4a（HPIV-4a）、human parainfluenza virus-4b（HPIV-4b）、mumps virus（Mumps）、およびNewcastle disease virus（NDV）などが含まれる。より好ましくは、Sendai virus（SeV）、human parainfluenza virus-1（HPIV-1）、human parainfluenza virus-3（HPIV-3）、phocine distemper virus（PDV）、canine distemper virus（CDV）、dolphin molbillivirus（DMV）、peste-des-petits-ruminants virus（PDPR）、measles virus（MV）、rinderpest virus（RPV）、Hendra virus（Hendra）、およびNipah virus（Nipah）からなる群より選択されるウイルスが例示できる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウィルス属（Respirovirus）（パラミクソウィルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウィルス3型（BPIV-3）、センダイウィルス（Sendai virus;マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス10型（SPIV-10）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
組み換え蛋白質および組み換えウイルスとは、それぞれ組み換えポリヌクレオチドを介して生成した蛋白質およびウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖がつなぎ替えられたり、あるいは合成されたポリヌクレオチドなどが含まれる。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換え蛋白質は、蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、RNAおよびDNA等の核酸が含まれる。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスRNAなどの機能的RNAをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするORFをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
本発明は、プロテアーゼ依存性トロピズムが改変された複製能を有する細胞融合型ベクターを提供する。このベクターは、宿主内環境において細胞への導入後にウイルス様粒子を有意に放出せず、特定のプロテアーゼ存在下でのみ周囲の細胞に浸潤するベクターである。本発明のベクターは、具体的には以下の複合体を言う。
パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）M蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを含む複合体であり、以下の性質を有する複合体。
（１）該複合体が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有する。
（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失している。
（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該複合体が導入された細胞と接触する細胞に、該RNAを導入する能力を有する。この複合体は、ゲノムRNAを複製しそれを隣接細胞に導入する働きを有することから、本発明においてベクターとも呼ぶ。ベクターとは、核酸を細胞に導入する担体を言う。
上記複合体は、具体的には該パラミクソウイルスのゲノムRNAとこれに結合するウイルス蛋白質を含む複合体である。本発明の複合体は、例えばパラミクソウイルスのゲノムRNAとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（RNP）であってよい。RNPは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このようなRNPは、具体的にはパラミクソウイルスのゲノムRNA、N蛋白質、P蛋白質、およびL蛋白質を含む複合体である。RNPは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムRNAからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘RNPが形成される。ゲノムRNAの複製は、該RNAのコピー数の増加をRT-PCRまたはノーザンハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。
また上記複合体は、より好ましくはパラミクソウイルスのウイルス粒子である。ウイルス粒子とは、ウイルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。ウイルス粒子の形状はウイルスの種類により球状、棍棒状など様々であってよいが、細胞より十分に小さく、その大きさは通常10nm〜800nm程度である。パラミクソウイルスのウイルス粒子は、ゲノムRNAとウイルス蛋白質を含む上記RNPが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。ウイルス粒子は、感染性を示すものでも示さないものでもよい（後述）。例えば、そのままでは感染性を示さないが、特定の処理により感染性を獲得するような潜在的に感染性を有するウイルス粒子であってもよい。
またパラミクソウイルスのゲノムRNAとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にRNPを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、該核酸が複製して娘RNPが形成される機能を持つRNAを言う。パラミクソウイルスは一本鎖ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウイルスであるので、このようなRNAは搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般にパラミクソウィルスのゲノムは、3’リーダー領域と5’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のORFの間には、転写終結配列（E配列）-介在配列（I配列）-転写開始配列（S配列）が存在し、これにより各遺伝子のORFをコードするRNAが別々のシストロンとして転写される。本発明のベクターに含まれるゲノムRNAは、該RNAにコードされる遺伝子群の発現およびRNA自身の自律的な複製に必要なウイルス蛋白質であるN（ヌクレオキャプシド）、P（ホスホ）、およびL（ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該RNAは、隣接細胞への該RNAの伝播に必要な細胞膜融合を起こす蛋白質であるF（フュージョン）蛋白質をアンチセンスにコードしている。好ましくは、ゲノムRNAはさらにHN（ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ）（またはH）蛋白質をアンチセンスにコードしている。但し、ある種の細胞では感染にHN蛋白質は必要なく（Markwell,M.A.et al.,Proc.Natil.Acad.Sci.USA 82（4）:978-982（1985））、F蛋白質のみで感染が成立する。また、細胞に結合し得るHN以外の蛋白質をF蛋白質と組み合わせてベクターを感染させることができる。従って、HN遺伝子をコードしないゲノムRNAを用いても、本発明のベクターを構築することは可能である。
例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、N遺伝子は″NP″と表記されることもある。
レスピロウィルス属    NP    P/C/V    M    F    HN  -     L
ルブラウィルス属      NP    P/V      M    F    HN  （SH）  L
モービリウィルス属    NP    P/C/V    M    F    H   -     L
例えばパラミクソウィルス科（Paramyxoviridae）のレスピロウィルス（Respirovirus）に分類されるセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、NP遺伝子についてはM29343、M30202,M30203,M30204,M51331,M55565,M69046,X17218、P遺伝子についてはM30202,M30203,M30204,M55565,M69046,X00583,X17007,X17008、M遺伝子についてはD11446,K02742,M30202,M30203,M30204,M69046,U31956,X00584,X53056、F遺伝子についてはD00152,D11446,D17334,D17335,M30202,M30203,M30204,M69046,X00152,X02131、HN遺伝子についてはD26475,M12397,M30202,M30203,M30204,M69046,X00586,X02808,X56131、L遺伝子についてはD00053,M30202,M30203,M30204,M69040,X00587,X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、N遺伝子については、CDV,AF014953;DMV,X75961;HPIV-1,D01070;HPIV-2,M55320;HPIV-3,D10025;Mapuera,X85128;Mumps,D86172;MV,K01711;NDV,AF064091;PDPR,X74443;PDV,X75717;RPV,X68311;SeV,X00087;SV5,M81442;およびTupaia,AF079780、P遺伝子については、CDV,X51869;DMV,Z47758;HPIV-1,M74081;HPIV-3,X04721;HPIV-4a,M55975;HPIV-4b,M55976;Mumps,D86173;MV,M89920;NDV,M20302;PDV,X75960;RPV,X68311;SeV,M30202;SV5,AF052755;およびTupaia,AF079780、C遺伝子についてはCDV,AF014953;DMV,Z47758;HPIV-1.M74081;HPIV-3,D00047;MV,AB016162;RPV,X68311;SeV,AB005796;およびTupaia,AF079780、M遺伝子についてはCDV,M12669;DMV Z30087;HPIV-1,S38067;HPIV-2,M62734;HPIV-3,D00130;HPIV-4a,D10241;HPIV-4b,D10242;Mumps,D86171;MV,AB012948;NDV,AF089819;PDPR,Z47977;PDV,X75717;RPV,M34018;SeV,U31956;およびSV5,M32248、F遺伝子についてはCDV,M21849;DMV,AJ224704;HPN-1.M22347;HPIV-2,M60182;HPIV-3.X05303,HPIV-4a,D49821;HPIV-4b,D49822;Mumps,D86169;MV,AB003178;NDV,AF048763;PDPR,Z37017;PDV,AJ224706;RPV,M21514;SeV,D17334;およびSV5,AB021962、HN（HまたはG）遺伝子についてはCDV,AF112189;DMV,AJ224705;HPIV-1,U709498;HPIV-2.D000865;HPIV-3,AB012132;HPIV-4A,M3403;HPIV-4B,AB006954;Mumps,X99040;MV,K01711;NDV,AF204872;PDPR,Z81358;PDV,Z36979;RPV,AF132934;SeV,U06433;およびSV-5,S76876が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
これらのウイルス蛋白質のORFは、ゲノムRNAにおいて上記のE-I-S配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムRNAにおいて最も3'に近いORFは、3'リーダー領域と該ORFとの間にS配列のみが必要であり、EおよびI配列は必要ない。またゲノムRNAにおいて最も5'に近いORFは、5'トレイラー領域と該ORFとの間にE配列のみが必要であり、IおよびS配列は必要ない。また２つのORFは、例えばIRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら2つのORFの間にはE-I-S配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なRNAゲノムは、3'リーダー領域に続き、N、P、M、F、HN、およびL蛋白質をアンチセンスにコードする６つのORFが順に並んでおり、それに続いて5’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムRNAにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、3'リーダー領域に続き、N、P、（M、）F、HN、およびL蛋白質をコードするORFが順に並び、それに続いて5'トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子は6つではないが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とするか、あるいは適宜変更することができる。M蛋白質のORFについては後述するが、本発明のベクターの１つの態様においては、このORFは存在しないか、あるいは変異M蛋白質をコードしている。また本発明のベクターの１つの態様においては、ゲノムにコードされるF蛋白質の開裂部位は、野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に改変されている（後述）。本発明のゲノムRNAは、1つまたはそれ以上の外来遺伝子をコードすることができる。外来遺伝子としては、標的とする細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子の導入位置は、例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位に挿入することができ、例えば3’リーダー領域と3'に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間、各ウイルス蛋白質ORFの間、および/または5'に最も近いウイルス蛋白質ORFと5'トレイラー領域の間に挿入することができる。M遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域に挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が6の倍数となるように挿入することが望ましい（Journal of Virology,Vol.67,No.8,4822-4830,1993）。挿入した外来遺伝子とウイルスORFとの間には、E-I-S配列が構成されるようにする。あるいは、IRESを介して外来遺伝子を挿入してもよい。
外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（ネガティブ鎖の3’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（WO01/18223）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、ネガティブ鎖の3’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、5’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子は高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、3’リーダー領域と3’に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間に挿入される。あるいは、3’に一番近いウイルス遺伝子と2番目の遺伝子のORFの間に挿入してもよい。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばベクターにおける挿入遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖ゲノムのなるべく5’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
また本発明のベクターは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはRNAの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウィルスベクターにおいては、複製因子であるN、P、およびL遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるHN蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（hemagglutinin）活性とノイラミニダーゼ（neuraminidase）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、F蛋白質も、開裂部位以外のドメインも改変することにより、膜融合能および/または粒子形成能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるF蛋白質やHN蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスベクターを作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばSeVのアクセサリー遺伝子の１つであるV遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するSeVの病原性が顕著に減少する（Kato,A,et al.,1997,J.Virol.71:7266-7272;Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587;Curran,J.et al.,WO01/04272,EP1067179）。このような弱毒化ベクターは、in vivoまたはex vivoにおける毒性のない遺伝子導入用ウィルスベクターとして有用である。
また好ましい態様において、本発明の複合体は実質的に均一な複合体である。実質的に均一な複合体とは、該複合体が、本発明の複合体ではないパラミクソウイルスのRNPまたはウイルス粒子から分離されていることを言う。すなわち実質的に均一な本発明の複合体は、粒子形成能を有する他のパラミクソウイルスRNPも該ウイルスのウイルス粒子も含んでいない。ここで粒子形成能とは、ウイルスベクターを感染させた細胞において、感染性ウイルス粒子および/または非感染性ウイルス粒子（これをウイルス様粒子という）を放出（これを２次放出という）するベクターの能力を言う。また、F蛋白質の開裂部位が改変された本発明の複合体においては、野生型F蛋白質またはこれと同等の融合活性を有するF蛋白質をコードする遺伝子をゲノムに含むウイルスRNPも該ゲノムを含むウイルス粒子も含んでいない。
本発明の一態様においては、上記ゲノムRNAにコードされるF蛋白質は、該蛋白質の開裂部位の配列が、他のプロテアーゼによって開裂される配列に置換されている。パラミクソウイルスのF蛋白質（F0）は、そのままでは細胞膜融合活性を示さないが、F0断片の細胞外ドメイン（またはウイルス粒子外ドメイン）が開裂することによってその融合活性を示すようになる。開裂により生じた２つのF蛋白質断片はN末側がF2、およびC末側がF1と呼ばれ両者はジスルフィド結合により結合している。F蛋白質を開裂するとは、このように膜上のF蛋白質を膜の外側のドメインにおいて切断し、細胞融合能を獲得させるような断片を生じさせることを言う。開裂部位の配列とは、プロテアーゼによる開裂のために必要なアミノ酸配列またはその中の本質的な残基を言う。パラミクソウイルスのF蛋白質の開裂部位は知られており、それらは細胞内のfurin等のトリプシン様プロテアーゼにより切断される。
furinは、ほとんどの細胞のゴルジ体に普遍的に存在する。furinの認識モチーフは、Arg-X-Lys/Arg-Arg（RXK/RR）（″/″で区切られた2つのアミノ酸はどちらかであることを表す）である。病原性の高い、Human PIV3（RTKR）、SV5（RRRR）、Mumps virus（RHKR）、NDV（virulent strain）強毒株（RQR/KR）、Measles virus（RHKR）、RS virus（RKRR）などは開裂部位にこれらのモチーフの配列を持っている。強毒株のFは、すべての細胞に存在するプロテアーゼに感受性をもち、どの臓器でもFの開裂を伴って多段階増殖するため、感染が致命的になってしまう。一方、病原性の低い、Sendai virus（PQSR）、Human PIV1（PQSR）、NDV（avirulent strain）弱毒株（K/RQG/SR）ではこのモチーフに当てはまらず、セリンプロテアーゼ認識配列であるArgのみ持っている。パラミクソウイルスのF蛋白質開裂部位の配列はよく解析されており、当業者であれば適宜文献を参照して知ることができる（例えばウイルス学，畑中正一編集，東京，朝倉書店，1997,pp.247-248を参照）。
また開裂部位は、当該パラミクソウイルスが増殖可能な細胞、組織、または個体等で増殖させたウイルスのF蛋白質、あるいは該細胞または個体等でF蛋白質を発現させ回収したF蛋白質の開裂部位を同定することにより確認することができる。また、細胞表面に発現するF蛋白質を、この蛋白質の開裂部位を開裂するトリプシン等のプロテアーゼで処理することにより、人為的にF蛋白質を開裂させ同定することもできる。本発明の一態様においてF蛋白質は、F蛋白質開裂部位のアミノ酸配列が改変され、他のプロテアーゼにより開裂されるような配列となっている。このためには、F蛋白質の生来の開裂配列を、１またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、および/または挿入により改変し、他のプロテアーゼにより開裂されるような配列に再構築する。アミノ酸配列の改変は、公知の部位特異的変異導入法により行うことができる。なお、改変F蛋白質は、野生型F蛋白質を開裂するプロテアーゼ（トリプシン等）により開裂される性質が維持されていてもよい（実施例参照）。このような改変F蛋白質をコードするベクターは、プロテアーゼ依存性トロピズムが野生型F蛋白質に比べて拡大される。
他のプロテアーゼにより開裂される配列としては、所望のプロテアーゼにより開裂される配列であってよく、例えばベクター導入の標的としたい所望の組織または細胞で発現されるプロテアーゼにより開裂される配列を用いることができる（WO01/20989）。このように標的組織で活性があるプロテアーゼで開裂される配列を持つF蛋白質遺伝子を用いてベクターを設計することにより、このプロテアーゼ活性が存在する環境下で特異的に周囲の細胞にベクターを増幅し伝達するという優れた性質を実現させることができる。例えば、ある組織で特異的に発現または活性化されるプロテアーゼの切断配列を利用すれば、該組織内でのみ特異的に浸潤するベクターを構築することができる。また、ある状態、例えばある疾患で特異的に発現または活性化するプロテアーゼの切断配列を利用すれば、その状態でのみ（例えば特定の疾患領域内でのみ）特異的に浸潤するベクターを構築することができる。プロテアーゼは細胞内または細胞外に存在するものであってよく、例えば細胞外に分泌されるプロテアーゼや、膜表面に発現する膜型プロテアーゼなどが好適である。また、F蛋白質が細胞内において翻訳され、細胞表面に分泌されるまでの輸送経路上に存在する所望のプロテアーゼであってよい。
プロテアーゼ遺伝子の発現異常によって生じる疾患の数は膨大で、代謝性疾患、循環障害、炎症・免疫疾患、感染症、悪性腫瘍など、病理学総論で扱われている全ての範疇に属する疾患を含んでいる。例えば、筋ジストロフィー症におけるカルパイン、自己免疫疾患や神経疾患におけるユビキチン・プロテアソームシステムの破綻、アルツハイマー病のネプリライシンの発現低下、癌の浸潤・転移におけるMMPの発現亢進、病原微生物による病原体由来プロテアーゼ、止血機構におけるセリンプロテアーゼ、胎盤におけるアミノペプチターゼなどがあげられる。
カルシウム依存性システインプロテアーゼであるカルパインは筋ジストロフィ症の筋蛋白質分解に関わる酵素として研究されてきた。カルパインはカルシウムとの結合によって活性化される特異的な活性化機構を有し、骨格筋の構造維持に重要なα-アクチニン、トロポニン、コネクチンなどの蛋白質を細胞内で限定分解し、筋蛋白質分解の引き金を引くと考えられている。カルパインの切断配列（Karlsson,J.O.et al.（2000）Cell Biol.Int.24,235-243）としては、例えばLeu-Leu-Val-Tyrが分解基質として用いられている。
ユビキチン・プロテアソームシステムは、細胞内における選択的かつ能動的な蛋白質分解機構であり、シグナル伝達や細胞周期などの重要な細胞機能制御システムである。76個のアミノ酸からなるユビキチンは、ユビキチン活性化酵素（E1），ユビキチン結合酵素（E2）およびユビキチンリガーゼ（E3）による連続的な触媒作用で蛋白質と共有結合し、ユビキチン化蛋白質は26Sプロテアソームにより分解される。数百種類存在するE3酵素はHECT型とRINGフィンガー型に大別され、これらの酵素活性の異常はきわめて多くの疾患に関与する。26Sプロテアソームに対する分解基質としては例えばLeu-Leu-Val-Tyrが用いられている（Reinheckel,T.et al.（2000）Arch.Biochem.Biophys.377,65-68）。
慢性関節リュウマチをはじめとする関節疾患は、関節軟骨の組織破壊により運動障害をきたす疾患である。関節軟骨の再生能はきわめて弱く、細胞外マトリックス分解による軟骨高次構造の崩壊は進行性の関節破壊へと導く。このような軟骨細胞外マトリックス分解には、MMPとその近縁遺伝子ファミリーのADAM（a disintegrin and metalloproteinase）分子の関わりが最近注目されている。特にADAMTS（ADAM with thrombospondin motif）分子は軟骨プロテオグリカン（アグリカン）の分解に必須の酵素と考えられている（Tortorella,M.D.et al.（1999）Science 284,1664-1666）。ADAMTSによってagricanが分解された配列が特定されている（Tortorella,M.D.et al.（2000）J.Biol.Chem.275,18566-18573）。
これらのプロテアーゼの認識配列を用いることにより、該プロテアーゼが発現する組織に特異的なベクターを調製することができる。
本発明において特に好ましいプロテアーゼ開裂配列は、癌で活性が亢進するプロテアーゼの切断配列である。このような配列を利用してベクターを構築することにより、癌特異的に感染を広げるベクターを構築することが可能となり、癌治療用の遺伝子送達ベクターとして極めて有用となる。癌で活性が亢進するプロテアーゼとは、ある癌組織または癌細胞において、その癌に対応する正常組織または正常細胞と比べ活性が亢進しているプロテアーゼを言う。ここで活性の亢進は、プロテアーゼの発現レベルの亢進および/または活性自体の亢進であってよい。プロテアーゼの発現レベルは、該プロテアーゼの遺伝子断片をプローブにしたノーザンハイブリダイゼーション、該プロテアーゼ遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いたRT-PCR、あるいは該プロテアーゼに対する抗体を用いたウェスタンブロット、ELISA、免疫沈降などにより測定することができる。またプロテアーゼの活性は、該プロテアーゼの基質を用いた分解アッセイにより知ることができる。生体内プロテアーゼは、種々の阻害因子により活性が調節されているものが数多く知られている。プロテアーゼの活性レベルは、これらの阻害因子の発現レベルを測定することによっても測定することができる。
例えば細胞外マトリックス（extracellular matrix;ECM）分解酵素の活性は、特に転移性の癌において活性が亢進している（Nakajima,M.and Chop,A.M.,Semin.Cancer Biol.2:115-127,1991;Duffy,M.J.,Clin.Exp.Metastasis 10:145-155,1992;中島元夫「細胞外マトリクス分解酵素」，清木元治編集「癌の悪性化と転移」，中外医学社，pp.124-136,1993年）。動物においては、細胞間の隙間に、コラーゲンやプロテオグリカンなどの蛋白からなるマトリックスが形成されている。細胞外マトリックスの成分としては、具体的には、コラーゲン・フィブロネクチン・ラミニン・テネイシン・エラスチン・プロテオグリカンなどが知られている。これらのECMは、細胞の接着、進展、または移動等の機能を調節したり、可溶性因子を結合してその分布や活性を調節する機能等を有している。癌転移にはECM分解酵素によるECMの浸潤が深く関わっており、実際ECM分解酵素の阻害剤による転移または基底膜浸潤の阻害が多数報告されている。ECM分解酵素による切断の認識配列を開裂部位に持つ改変F蛋白質をコードするベクターを設計することにより、癌特異的に感染および浸潤するベクターを構築することができる。
ECM分解酵素は、活性中心にある触媒残基の種類によってアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼに分類される。中でも生体内でのECM分解には中性プロテアーゼのセリンプロテアーゼとメタロプロテアーゼが中心的な役割を果たしている。セリンプロテアーゼは、微生物、動物、植物等に広く分布し、高等動物においては、食物の消化、血液の凝固、線溶、免疫補体反応、細胞増殖、発生、分化、老化、癌転移などきわめて多くの生体反応に関与している。また、セリンプロテアーゼの活性は、一般に血漿や組織内に存在するセリンプロテアーゼインヒビター（serpin）によって調節されており、この量的あるいは質的異常は炎症などの原因となる。
ECM分解性セリンプロテアーゼとしては、カテプシンG、エラスターゼ、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍トリプシン、キモトリプシン様中性プロテイナーゼ、トロンビンなどが挙げられる。プラスミンは、生体内で不活性な状態で存在するプラスミノーゲンが限定分解されて生じる。この限定分解をプラスミノーゲンアクチベーター（plasminogen activator;PA）とそのインヒビターであるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（plasminogen activator inhibitor;PAI）が制御している。PAには、血液凝固に関係する組織型PA（tPA）と、ECM分解に関係するウロキナーゼ型PA（uPA）とがある（Blasi,F.and Verde P.Semin.Cancer Bio.1:117-126,1990）。これらの2つのPAは、PAIと結合するとその作用が阻害される（Cajot,J.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6939-6943,1990;Baker,M.S.et al.,Cancer Res.50:4676-4684,1990）。uPAは細胞表面のuPAレセプター（uPAR）と結合した状態で作用することができる。プラスミンはフィブロネクチン、テネイシン、ラミニンなどを分解するが、コラーゲンは直接分解することができない。しかし、コラーゲン分解酵素の前駆体の一部を切断して活性化することにより、間接的にコラーゲンを分解する。これらが癌細胞においてしばしば活性が亢進しており、転移能ともよく相関している（Tanaka,N.et al.,Int.J.Cancer 48:481-484,1991;Boyd,D.et al.,Cancer Res.48:3112-3116,1988;Hollas,W.et al.,Cancer Res.51:3690-3695,1991;Correc,P.et al.,Int.J.Cancer 50:767-771,1992;Ohkoshi,M.et al.,J.Natl.Cancer Inst.71:1053-1057,1983;Sakaki,Y.et al.,現代医療17:1815-1821,1985）。
uPA,tPAの切断配列についての研究も多くなされている（Rijken,D.C.et al.（1982）J.Biol.Chem.257,2920-2925;Wallen,P.et al.（1982）Biochim.Biophys.Acta 719,318-328;Tate,K.M.et al.（1987）Biochemistry 26,338-343）。一般に用いられているsubstrate配列はVGR（Dooijewaard,G.,and KLUFT,C.（1983）Adv.Exp.Med.Biol.156,115-120）と、Substrate S-2288（Ile-Pro-Arg）（Matsuo,O.et al.（1983）Jpn.J.Physiol.33,1031-1037）である。Butenasは54種類の蛍光基質を用いて、tPAに対する特異性の高い配列を提示し（Butenas,S.et al.（1997）Biochemistry 36,2123-2131）、FPR,VPRが高いtPAに対する分解活性を示した。従って、これらの配列は特に好適に用いられる。
また、システインプロテアーゼまたはアスパルティックプロテアーゼに分類されるECM分解酵素も知られており、これらも癌の転移およに浸潤に関与している。具体的には、ラミニン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、コラーゲン、プロコラゲナーゼ（分解により活性化する）等を基質とするカテプシンB（Sloane,B.F.,Semin.Cancer Biol.1:137-152,1990）、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスターゼ（活性化）等を基質とするカテプシンL（Kane,S.E.and Gottesman,M.M.,Semin.Cancer Biol.1:127-136,1990）、並びに、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、カテプシンBおよびL（活性化）を基質とするカテプシンD（Rochefort,H.,Semin.Cancer Biol.1:153-160,1990）などが挙げられる。カテプシンBおよびLは特に乳癌組織（Spyratos,F.et al.,Lancet ii:1115-1118,1989;Lah,T.T.et al.,Int.J.Cancer 50:36-44,1992）、大腸癌カルシノーマ（Shuja,S.et al.,Int.J.Cancer 49:341-346,1991）に強く発現しており、阻害因子との均衡の破綻と癌の悪性化との関与も示唆されている（Sloane,B.F.,Semin.Cancer Biol.1:137-152,1990;Kane,S.E.and Gottesman,M.M.,Semin.Cancer Biol.1:127-136,1990）。
メタロプロテアーゼ（metalloproteinase）はZnなどの金属元素を含む金属酵素であり、カスパーゼ、アミノペプチダーゼ、アンギオテンシンI変換酵素、コラゲナーゼなどが報告されている。ECMを分解するメタロプロテアーゼとしては、16種類以上のマトリックスメタロプロテアーゼ（matrtix metalloproteinase;MMP）が報告されている。代表的なMMPとしては、コラゲナーゼ-1、2、3（MMP-1、8、13）、ゼラチナーゼA、B（MMP-2、9）、ストロメライシン1、2、3（MMP-3、10、11）、マトリライシン（MMP-7）、膜型メタロプロテアーゼ（MT1-MMP、MT2-MMP）などが挙げられる。一般にMMPは、活性中心にZn2+を有し、酵素活性にCa2+を必要とする。また潜在型酵素（latent MMPまたはProMMPという）として分泌され、細胞外で活性化を受け生体内に存在する種々のECMを分解する。またMMPは、共通のインヒビターであるtissue inhibitor of mettaloproteinases（TIMP）によって活性が阻害される。他に、ECM分解性のメタロプロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼが挙げられ、例えばECM構成蛋白質などを分解するアミノペプチダーゼN/CD13およびアミノペプチダーゼBなどが含まれる。阻害剤を用いた実験から、これらのプロテアーゼはいずれも癌と深く関与していることが報告されている。
その中でコラゲナーゼ（collagenase）（MMP-1,8,13）は、線維性コラーゲンであるI,II,III型コラーゲン分子を特異的部位で切断する。ゼラチナーゼ（gelatinase）は、ゼラチナーゼA（MMP-2）およびゼラチナーゼB（MMP-9）の２つのタイプが知られている。ゼラチナーゼはIV型コラゲナーゼともよばれ、基底膜の主成分であるIV型コラーゲンを分解するが、V型コラーゲンおよびエラスチンも分解する。また、MMP-2はI型コラーゲンをMMP-1と同じ部位で切断することが知られている。MMP-9はラミニンおよびフィブロネクチンを分解しないが、MMP-2はこれらを分解する。ストロメライシン（stromelysin）（MMP-3,10）は広い基質性を有し、プロテオグリカン、III、IV、IX型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどを分解する。マトリライシン（matrilysin）（MMP-7）は、ヘモペキシンドメインをもたない分子であり、基質特異性はMMP-3と共通し、特にプロテオグリカンおよびエラスチンに対する分解活性が高い。膜型メタロプロテアーゼ（membrane-type MMP;MT-MMP）（MT1,2,3,4,5,6-MMP）は膜貫通構造をもつMMPである。MT-MMPは、プロペプチドドメインと活性部位の間に挿入配列（約10アミノ酸）を有する。この挿入配列はArg-Xaa-Lys-Arg（Xaaは任意のアミノ酸）を含み、細胞膜上に輸送される過程で、細胞内プロセシング酵素であるfurinにより開裂され活性化される。MT-MMPとしては、MT1-MMP（MMP-14）、MT2-MMP（MMP-15）、MT3-MMP（MMP-16）、MT4-MMP（MMP-17）、MT5-MMP（MMP-23）、およびMT-6-MMP（MMP-25）などが知られ、例えばMT1-MMPはI,II,III型コラーゲンを、MT3-MMPはIII型コラーゲンを分解する。
MMPの過剰発現は癌細胞で広範囲に起こっていることがわかっている。それらは癌自身と癌間質細胞による発現に分けられる。例えば間質コラーゲンを分解するコラゲナーゼ（MMP-1）は癌細胞の浸潤に関与しており、大腸癌等でもその活性レベルは転移性と相関している（Wooley,D.E.,Cancer Metastasis Rev.3:361-372,1984;Tarin,D.et al.,Br.J.Cancer 46:266-278,1982）。また、タイプIVコラゲナーゼ（MMP-2、MMP-9）は様々な上皮性癌において活性と転移能との間に高い相関関係がある（Liotta,L.A.and Stetler-Stevenson,W.G.,Semin.Cancer Biol.1:99-106,1990;Nakajima,M.実験医学10:246-255,1992）。また、ストロメライシン（MMP-3）も皮膚の上皮性腫瘍の悪性化に相関していることが知られている（Matrisian,L.M.and Bowden,G.T.,Semi.Cancer Biol.1:107-115,1990）。ストロメライシン-3（MMP-11）は乳癌および大腸癌などにおいて高発現が観察されている（Basset,T.et al.,Nature 348:699-704,1990;Porte,H.et al.,Clin.Exp.Metastasis 10（Suppl.1）:114,1992）。
MMPの切断基質は、多数知られている。MMP全般を分解する基質配列としてPLGLWAR（Bickett,D.M.et al.（1993）Anal.Biochem.212,58-64）、GPLGMRGL（Deng,S.J.et al.（2000）J.Biol.Chem.275,31422-31427）、PQGLEAK（Beekman,B.et al.（1996）FEBS Lett.390,221-225）、RPKPVEWREAK（Beekman,B.et al.（1997）FEBS Lett.418,305-309）、PLALWAR（Jacobsen,E.J.et al.（1999）J.Med.Chem.42,1525-1536）がある。MMP-2,9の分解基質としてPLGMWS（Netzel-Arnett,S.et al.（1991）Anal.Biochem.195,86-92）とPLGLG（Weingarten,H.et al.（1985）Biochemistry 24,6730-6734）がある。
最近、phage-displayed peptide library screeningによって、MMP9（Kridel,S.J.et al.（2001）J.Biol.Chem.276,20572-20578）,MMP2（Chen,E.I.et al.（2002）J.Biol.Chem.277,4485-4491）,MT1-MMP（Kridel,S.J.et al.（2002）J.Biol.Chem.In JBC Papers in Press,April 16,2002,Manuscript M111574200）に対する分解基質配列が明らかにされている。これらの論文で、特定されたアミノ酸配列を３つのMMPに対する分解能の有無によって4つのグループに分類されている。Group IVがMT1-MMPに特異的に分解される配列で、Argのない配列としてVFSIPL,IKYHSの配列がMMP9,MMP2で分解できずMT-MMPでのみ分解できる基質としてしめされている。
例えば、MMP9の切断配列としては、Pro-X-X-Hy（Xは任意の残基，Hyは疎水性残基を表す）が挙げられ、特にPro-X-X-Hy-（Ser/Thr）が好ましい。より具体的には、Pro-Arg-（Ser/Thr）-Hy-（Ser/Thr）が例示できる（X-Hy間で切断が起きる）。Hy（疎水性残基）としては、これらに限定されないが、例えばLeu、Val、Tyr、Ile、Phe、Trp、Metが挙げられる。あるいは、これ以外の切断配列も同定されており（例えば以下の文献のGroup I,II,IIIA,IIIBを参照;Kridel,S.J.et al.（2001）J.Biol.Chem.276,20572-20578）、これらの所望の配列を用いることができる。またMMP2に関しても上記のPro-X-X-Hyであってよく、他にも、（Ile/Leu）-X-X-Hy、Hy-Ser-X-Leu、His-X-X-Hyなどが例示できる（例えば以下の文献のGroup I,II,III,IVを参照；Chen,E.I.et al.（2002）J.Biol.Chem.277,4485-4491）。MMP-7、MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-3、MT1-MMP（MMP-14）を含むMMPファミリーの切断配列は、例えば天然の基質蛋白質の配列を参考にしたり、あるいはペプチドライブラリーのスクリーニング等によって適宜選択することができる（Turk,B.E.et al.,Nature Biotech.19,661-667（2001）;Woessner,J.F.and Nagase,H.Matrix metalloproteinases and TIMPs.（Oxford Iniversity Press,Oxford,UK,2000）;Fernandez-Patron,C.et al.,Circ.Res.85:906-911,1999;Nakamura,H.et al.,J.Biol.Chem.275:38885-38890,2000;Mc Quibban,G.A.et al.,Science 289:1202-1206,2000;Sasaki,T.et al.,J.Biol.Chem.272:9237-9243,1997）。例えば切断部位の8アミノ酸P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’（P1-P1’間で切断される）を例示すれば、MMP-1はVPMS-MRGG、MMP-3はRPFS-MIMG、MMP-7はVPLS-LTMG、MT1-MMPはIPES-LRAGなどが挙げられるがこれらに制限されない。MMP-8には例えばPLAYWAR（Nezel-Amett,S.et al.,Anal.Biochem.195:86,1991）が挙げられる。MMPの合成基質は様々なものが入手可能であり、これらの配列を比較することもできる（例えばCalbiochem登録商標カタログ，Merk,の各MMP Substrate参照）。
通常、組織内のMMP活性は、潜在型酵素の産生、その潜在型酵素の活性化、および活性型酵素のインヒビターによる阻害の過程で調節されており、発生排卵、受精、子宮内膜への着床、および創傷治癒などの様々な生理現象に関与している。MMP活性の調節の障害は、癌細胞の浸潤・転移、関節炎、歯肉炎、動脈硬化、腫瘍、線維症などの様々な病態に寄与する。例えば、癌の転移には基底膜成分を分解するゼラチナーゼ（MMP-2、-9）が重要であることが知られている。MMP-2は、MT1-MMPによるpro-MMP-2の切断により活性化される。またMMP-9の活性化には、uPAによりまずプラスミノーゲンからプラスミンがつくられ、proMMP-3を活性化し、active MMP-3がproMMP-9を活性化する経路が存在し、この経路は癌の転移に関与している。本発明のベクターを癌標的ベクターとして開発するためには、F蛋白質の開裂部位にこれらの癌転移に関与するプロテアーゼで切断される配列を導入することが特に有用である。このようなプロテアーゼとしては、例えばMMP-2、MMP-9、uPA、MMP-3、およびMT1-MMPが挙げられ、特にMMP-2、MMP-9、およびuPAが挙げられる。
プロテアーゼ切断配列をF蛋白質に組み込む場合は、F蛋白質の開裂部位に目的のプロテアーゼ切断配列を挿入し、もともとあるTrypsin様プロテアーゼによる切断部位をデジェネレートさせることが好ましい。このためにはもともとのTrypsin様プロテアーゼによる切断部位周辺のアミノ酸配列を、目的のプロテアーゼ切断配列（認識配列）に置換すればよい。改変F蛋白質は、細胞で発現したときに目的のプロテアーゼで切断され、かつF蛋白質の細胞膜融合作用を維持されている蛋白質である。F蛋白質が開裂して生じるF1断片のN末端付近のアミノ酸は、細胞膜融合に重要な機能を有していると考えられる。従って、切断が阻害されない限り、切断後のF1断片のN末端が、野生型F蛋白質のF1断片のN末端と同一となるように切断配列を設計することが好ましい。また効率的な切断反応を起こすために切断部位にリンカーを挿入する場合には、切断後のF1断片のN末端に、野生型F1と比べ最小限のアミノ酸が付加されるように設計することが望ましい。例えば、切断後のN末端には、野生型F1に比べ5アミノ酸以内、好ましくは4アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内（例えば1、2、または3アミノ酸）が付加されるようにする。例えば本発明において、改変F蛋白質のF1断片のN末端にMet-Thr-Ser（配列番号：１）を付加しても、MMPによる切断反応および切断後の細胞膜融合反応が障害されないことが判明した。従って、切断後のF1のN末端にMet-Thr-Serまたはその保存的置換配列、あるいはそれらの部分配列からなるアミノ酸が付加されるように開裂配列を設計することは好ましい。保存的置換とは、アミノ酸の側鎖の化学的性質が類似したアミノ酸間での置換を言う。具体的には、Metに関してはIleまたはValへの置換、Thrに関してはSerまたはAlaへの置換、Serに関してはAla、Asn、またはThrへの置換が挙げられる。各位置のアミノ酸の置換は独立に行ってよい。
具体的には、好ましい切断配列として、例えばMMP-2および-9の切断配列としてはPro-Leu/Gln-Gly（配列番号：２）を含む配列を挙げることができる。この配列は、基質として利用されている合成基質（Netzel-Arnett,S.et al.,Anal.Biochem.195,86-92（1991））に共通の配列であり、この配列が、改変したF蛋白質を切断後のF2断片のC末端に来るようにF蛋白質を設計する。このためには、野生型F蛋白質の切断後のF2断片のC末端のアミノ酸を含む配列を、Pro-Leu/Gln-Glyを含む配列に置換すればよい。もともとのF蛋白質のF2断片のC末端の１または数アミノ酸に相当する配列を適宜欠失させ、Pro-Leu/Gln-Glyを挿入する（すなわち置換する）。欠失させるアミノ酸は、例えば挿入するアミノ酸数を同じ（例えば3アミノ酸）とするか、0〜10アミノ酸程度の範囲で選択することができる。プロテアーゼによる開裂および膜融合の過程が障害されない限り、Pro-Leu/Gln-Glyの下流にF1のN末端が直接連結するようにF蛋白質を調製することができるが、センダイウイルスのF蛋白質などにおいては、開裂配列とF1断片は適当なスペーサーを介して連結されることが好ましい。このようなスペーサーを含む開裂配列としては、特に好ましくは、Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser（配列番号：３）、またはPro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr（配列番号：４）を含む配列が挙げられる。Met、Thr、およびSerは、他のアミノ酸に保存的置換してもよい。より好ましくは、開裂後のF2においてC末端となるアミノ酸からN末方向に連続する1〜10残基、例えば1、2、3、4、5、または6残基が、Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser、またはPro-Leu/Gln-Gly-Met-Thrからなる配列に置換された改変F蛋白質を好ましい蛋白質として挙げることができる。例えば、センダイウイルスF蛋白質を例に挙げれば、野生型F蛋白質においてF2断片のC末４アミノ酸に相当する配列（株によるが典型的には113Pro-Gln-Ser-Arg116↓）（配列番号：５）をPro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Serなどに置換したF蛋白質を例示することができる。
また、MMPの切断配列としては他にも、例えば本明細書に記載した所望の配列を用いることができる。各種MMPの基質特異性に関してはペプチドライブラリーを利用して解析が行われている（Turk,B.E.et al.,Nature Biotech.19,661-667（2001））。また、着目しているMMP-2（Chen,E.I.et al.,J.Biol.Chem.277（6）4485-4491（2002））及びMMP-9（Kridel,S.J.et al.,J.Biol.Chem.276（8）20572-20578（2001））についても詳細な解析が行われ、特にMMP-9について、Pro-X-X-Hy-（Ser/Thr）のP3からP2’（P3-P2-P1-P1’-P2'；切断はP1-P1'間で起こる）までのコンセンサス配列（X=全ての残基，Hy=疎水性残基）が提唱されている。このコンセンサス配列は、MMP-2について提唱されているものの一つ（Pro-X-X-Hy）にも合致するので、MMP-2及びMMP-9について特異性を出すためには良いデザインの一つであると考えられる。この点からも、上記例示した配列（Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-SerまたはPro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr）は好ましい例として支持される。すなわち、F蛋白質開裂部位はPro-X-X-Hy-Thr/Ser、さらに好ましくはPro-X-X-Hy-Thr/Ser-Thr/Serを含む配列が好ましい（“Thr/Ser”はThrまたはSerのどちらかを表す）。例えば、Pro-X-X-Hy-Thr/Serに当てはまらないPro-Leu-Gly-Leu-Trp-AlaおよびPro-Gln-Gly-Leu-Tyr-Alaは好ましくない（図４４）。Pro-X-X-Hy-Thr/Ser配列に合致するペプチドをF蛋白質開裂部位に組み込めば、MMP存在下で高い浸潤力を示すベクターを製造することができる。
また、好ましい切断配列としては他に、プラスミノーゲンアクチベーターにより切断される配列が挙げられる。具体的には、uPAおよびtPAの切断配列としてVal-Gly-Argを含む配列が挙げられる。この配列が、改変したF蛋白質を切断後のF2断片のC末端に来るようにF蛋白質を設計する。このためには、野生型F蛋白質の切断後のF2断片のC末端のアミノ酸を含む配列を、Val-Gly-Arg（配列番号：６）を含む配列に置換すればよい。より好ましくは、開裂後のF2のC末端となるアミノ酸からN末方向に連続する1〜10残基、例えば1、2、3、4、5、または6残基をVal-Gly-Argまたはこれを含む配列に置換された改変F蛋白質を好ましい蛋白質として挙げることができる。例えば、センダイウイルスF蛋白質を例に挙げれば、野生型F蛋白質においてF2断片のC末3アミノ酸に相当する配列（株によるが典型的には114Gln-Ser-Arg116↓）（配列番号：７）をVal-Gly-Argに置換したF蛋白質を例示することができる。
特定のプロテアーゼ存在下で融合能を発揮する改変F蛋白質を効率良く同定するために、プラスミドベクターを用いたアッセイ系を利用することができる（実施例３１）。すなわち、改変F蛋白質を発現するプラスミドベクターを細胞のトランスフェクションし、プロテアーゼ存在下で培養してシンシチウム形成を検出する。シンシチウムを形成させるプラスミドにコードされる改変F蛋白質は、プロテアーゼにより開裂し融合能を示すを判断される。例えばMMPにより開裂するF蛋白質をアッセイするには、MMPを発現するHT1080細胞を用いることができる。あるいは、培養系にMMPを添加してもよい。本発明において開発されたこのアッセイ系を用いれば、融合能を持った改変F蛋白質を容易に取得することが可能である。
改変F蛋白質をコードするベクターは、該改変F蛋白質を開裂するプロテアーゼの存在に依存して、該ベクターが導入された細胞と接触する細胞に、ベクターに含まれるゲノムRNAを導入することができる。開裂したF蛋白質の働きにより、接触する細胞同士が細胞融合を起こし、融合した細胞にRNPが拡散する。すなわち、本発明のベクターは、ウイルス粒子は形成しないが、このように接触する細胞にベクターが浸潤するために、限局した領域にベクターを伝達することができる。プロテアーゼは、細胞内または細胞外に発現するものであってもよく、あるいは外来的に添加されたものであってもよい。
本発明により提供される改変F蛋白質は、特定のプロテアーゼに依存的に細胞融合能を示す能力を有する。この蛋白質を利用して、そのプロテアーゼ存在下でのみ細胞融合を生じさせる或いは特異的に感染するウィルスベクター、あるいはリポソームなどの薬剤・遺伝子送達ベクターを作り出すことができる。例えば、F,HN遺伝子を搭載したadenovirus vector（Galanis,E.et al.,Hum.Gene Ther.12,811-821（2001））のF遺伝子に癌で発現するプロテアーゼで開裂する改変F蛋白質の遺伝子を搭載することにより、特定のプロテアーゼ存在下で細胞融合を生じさせるベクターを開発することが可能である。更には、例えばレトロウィルスをF,HN蛋白でシュードタイプ化する場合に（Spiegel,M.et al.,J Virol.72（6）5296-5302（1998））、その製造過程において、癌で発現するプロテアーゼで開裂する改変F蛋白質を利用すれば、癌で特異的に感染する癌細胞標的化ベクターを開発することが可能かも知れない。このように、本発明により提供される改変F蛋白質およびこれをコードする核酸は、本発明のベクター以外にも、プロテアーゼに依存する種々のベクターの開発に利用することができる。
また本発明は、細胞質ドメインの欠失により細胞融合能が高められた改変F蛋白質を含むパラミクソウイルスベクターを提供する。この改変F蛋白質は、細胞質ドメインに0個〜28個、より好ましくは1〜27個、より好ましくは4〜27個のアミノ酸を有するように、細胞質ドメインの一部のアミノ酸を欠失させたF蛋白質である。細胞質ドメインとは、膜蛋白質の細胞質側のドメインであり、F蛋白質においては膜貫通（TM）領域のC末側領域である（図４２参照）。例えば、細胞質ドメインとして6〜20個、より好ましくは10〜16個、より好ましくは13〜15個のアミノ酸を有するF蛋白質は、野生型F蛋白質に比べ有意に高い細胞融合能を示す。従って、約14アミノ酸の細胞質ドメインを有するように改変されたF蛋白質を含むパラミクソウイルスベクターを調製すれば、野生型F蛋白質を用いるよりも高い細胞融合能を持つベクターを得ることができる。好ましくは、この欠失F蛋白質は、野生型F蛋白質のC末端の10アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは15アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは20アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは25アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは28アミノ酸またはそれ以上を欠失している。最も好ましい態様では、細胞質ドメイン欠失型のF蛋白質は野生型F蛋白質のC末端の約28アミノ酸を欠失している。これらの細胞質ドメイン欠失型のF蛋白質をコードする遺伝子をゲノムに含むパラミクソウイルスベクターは、通常のベクターに比べ細胞融合能が高いことから、周囲の細胞へより強く浸潤することができる。このF蛋白質の開裂部位を本明細書に記載したように改変すれば、特定のプロテアーゼの存在下でのみ、高い浸潤力を発揮するベクターを得ることができる。
さらに本発明は、パラミクソウイルスが持つ2種のスパイク蛋白質の融合蛋白質に関する。パラミクソウイルスには細胞融合を機能すると考えられる蛋白質（これをF蛋白質と呼ばれる）と、細胞への接着に機能すると考えられる蛋白質（HNまたはHなどと呼ばれる）を有している。本明細書において、前者をF蛋白質、後者をHN蛋白質を総称する。この２つの蛋白質を融合蛋白質として発現させると、別々に発現させる場合に比べ非常に強い融合能を発揮することができる。この融合蛋白質は、互いの細胞質ドメインの部分で両者の蛋白質が結合されている。具体的には、融合蛋白質のN末端側にF蛋白質を、C末端側にHN（またはH）蛋白質を含んでいる。両者の蛋白質を融合させる場合、全長蛋白質同士を融合させてもよいが、F蛋白質の細胞質ドメインの一部または全部を欠失させた蛋白質をHN（またはH）蛋白質に融合させてもよい。この場合、F蛋白質のTM領域の下流からHN（またはH）蛋白質までの長さを5残基以上、より好ましくは10残基以上、より好ましくは14残基以上、より好ましくは20残基以上とする。例えば、F蛋白質の細胞質ドメインを欠失させた蛋白質をHN（またはH）蛋白質に融合させる場合、F蛋白質部分のC末に適当な長さのリンカーペプチドを付加して長さを調節することは好ましい。具体的には、14残基のF蛋白質の細胞質ドメインを持つ細胞質ドメイン欠失型のF蛋白質に、任意のリンカーペプチドを介してHNまたはH）蛋白質に融合させた蛋白質を好適に用いることができる。リンカーペプチドの長さは、例えば約50残基とすることができる。リンカーペプチドのアミノ酸配列に特に制限はないが、有意な生理活性を持たないポリペプチドが好ましく、例えば図４３（配列番号：８０）に例示したようなポリペプチドを用いることができる。
また本発明は、これらの融合蛋白質をコードする核酸、および該核酸を搭載する発現ベクターに関する。この発現ベクターを導入した細胞は、強い融合能を示し周囲の細胞と融合してシンシチウムを形成する。発現ベクターとしては特に制限はなく、プラスミドベクターおよびウイルスベクターなどが例示できる。DNAベクターの場合は、例えばCAGプロモーター（ニワトリβアクチンプロモーターとCMVエンハンサーとのキメラプロモーター）（Niwa,H.et al.（1991）Gene.108:193-199）などの強力なプロモーターを組み合わせることが好ましい。また、この蛋白質を発現するウイルスベクターは、導入細胞で強い融合を引き起こす。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、マイナス鎖RNAウイルスベクター、純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、フォウルポックスウイルスベクター、その他の所望のウイルスベクターが例示できる。特にこの蛋白質を発現するパラミクソウイルスベクターは、様々な組織に対して高い浸潤力を発揮することができる。特に、本明細書に記載したF開裂部位を改変した融合蛋白質をコードする、M遺伝子欠失型のパラミクソウイルスベクターを用いれば、特定の組織で強い細胞融合を引き起こすベクターを製造することが可能である。
これらの組み換えウイルスベクターは当業者に周知の方法に従って調製することができる。例えば、遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウイルスベクターの作製は、斎藤らの方法および他（Miyakeら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93巻、1320-24頁；Kanegaeら、1996、Acta Paediatr.Jpn、38巻、182-188頁；鐘ヶ江ら、バイオマニュアルシリーズ4-遺伝子導入と発現・解析法、1994、43-58頁、羊土社；鐘ヶ江ら、1994、細胞工学、13巻、8号、757-763頁）に従って製造することができる。また、例えばレトロウイルスベクター（脇本ら、1995、蛋白質核酸酵素、40巻、2508-2513頁）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（玉寄ら、1995、蛋白質核酸酵素、40巻、2532-2538頁）なども、公知の方法により調製することができる。哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のウイルスベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウイルスを製造する方法としては、特表平6-502069、特公平6-95937、特公平6-71429が知られている。組換えパピローマウイルスを製造する方法としては特公平6-34727、特表平6-505626が知られている。組換えアデノ随伴ウイルスを製造する方法としては、特開平5-308975が知られている。組換えアデノウイルスを製造する方法としては、特表平6-508039が知られている。
本発明の一態様において提供されるベクターに含まれるRNAゲノムにおいては、M（マトリックス）蛋白質をコードする遺伝子（M遺伝子）が変異または欠損している。本発明において、F蛋白質の開裂部位を他のプロテアーゼで切断される配列に改変し、さらにM遺伝子を変異または欠失させて粒子形成能を抑制することによって、ウイルス粒子を放出せず、特定のプロテアーゼを発現する細胞集団内でのみベクターを浸潤させる全く新しい性質を持ったベクターが開発された。M遺伝子の変異は、宿主内環境における粒子形成活性を消失または有意に低下させる変異である。このような変異は、このM蛋白質を発現する細胞において、該蛋白質の細胞表面の凝集が低下することにより同定することができる（実施例参照）。
本発明により、２次放出粒子、即ちVLP放出の抑制を目的とした改変を行う場合、M蛋白を欠失させることが最も効果的であることが実証された。このことは、ビリオン形成におけるM蛋白の役割に関するセンダイウィルス（SeV）や他のマイナス鎖RNAウィルスにおける報告によっても支持される。例えば、vesicular stomatitis virus（VSV）ではM蛋白の強発現のみでウィルス様粒子（VLP:virus like particle）の発芽が観察されており（Justice,P.A.et al.,J.Virol.69;3156-3160（1995））、またParainfluenza virusの場合もM蛋白のみの強発現でVLPが生じることが報告されている（Coronel,E.C.et al.,J.Virol.73;7035-7038（1999））。このようなM蛋白単独でのVLP形成に関しては、全てのマイナス鎖RNAウィルスで観察されているわけではないが、M蛋白がビリオン形成のcoreになっていることは、マイナス鎖RNAウィルスで共通していると認識することができる（Garoff,H.et al.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62;1171-1190（1998））。
ビリオン形成に対するM蛋白の具体的な役割に関して主に以下のようにまとめることができる。ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のリピッドラフト（Lipid rafts）と呼ばれている場（Simons,K.and Ikonen,E.Nature 387;569-572（1997））であり、元々はTriton X-100のような非イオン性界面活性剤に不溶性の脂質画分として同定された（Brown,D.A.and Rose,J.K.Cell 68;533-544（1992））。インフルエンザウィルス（Ali,A.et al.,J.Virol.74;8709-8719（2000））、麻疹ウィルス（Measles virus;MeV:Manie,S.N.et al.,J.Virol.74;305-311（2000））及びSeV（Ali,A.and Nayak,D.P.Virology 276;289-303（2000））等でリピッドラフト（Lipid rafts）でのビリオン形成が証明されており、そこでM蛋白はエンベロープ蛋白（spike蛋白とも表記される）やribonucleoprotein（RNP）を濃縮しビリオン形成を促進する、即ちウィルスアセンブリと出芽（budding）の駆動力となっていると考えられる（Cathomen,T.et al.,EMBO J.17;3899-3908（1998）,Mebatsion,T.et al.,J.Virol.73;242-250（1999））。実際に、M蛋白はspike蛋白のcytoplasmic tailと結合することが、インフルエンザウィルス（Zhang,J.et al.,J.Virol.74;4634-4644（2000））及びSeV（Sanderson,C.M.et al.,J.Virol.67;651-663（1993））等で示されており、またRNPとの結合もインフルエンザウィルス（Ruigrok,R.W.et al.,Virology 173;311-316（1989））や、パラインフルエンザウィルス及びSeV（Coronel,E.C.et al.,J.Virol.75;1117-1123（2001））等で示されている。更に、M蛋白自身のオリゴマー形成への関与がSeV（Heggeness,M.H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79;6232-6236（1982）及び水疱性口内炎ウィルス（Vesicular Stomatitis Virus;VSV:Gaudin,Y.et al.,Virology 206;28-37（1995）,Gaudin,Y.et al.,J.Mol.Biol.274;816-825（1997））等で報告され、これら多くのウィルスコンポーネント及び脂質との結合能がウィルスアセンブリと出芽の駆動力としての役割を担わせていると考えることができる。
また、エンベロープ蛋白（spike蛋白）に関しても改変によりVLP放出抑制に繋がる可能性も既に幾つか示唆されている。ビリオン形成が実際に減少した具体的な報告として以下の実験例がある。狂犬病ウィルス（Rabies virus;RV）の場合、G蛋白欠失型においてVLP形成が1/30に減少し（Mebatsion,T.et al.,Cell 84;941-951（1996））、M蛋白欠失型においては1/500,000以下に減少したと報告されている（Mebatsion,T.et al.,J.Virol.73;242-250（1999））。また、麻疹ウィルス（MeV）の場合、M蛋白欠失型においてcell-to-cellの融合が亢進し（Cathomen,T.et al.,EMBO J.17;3899-3908（1998））、これはビリオン形成が抑制された為であると考えることができる（Li,Z.et al.,J.Virol.72（5）,3789-3795（1998））。また、同様の融合亢進がF或いはH蛋白のcytoplasmic tail（細胞質側のテール）の変異によっても生じている（Cathomen,T.et al.,J.Virol.72;1224-1234（1998））。従って、Fおよび/またはHN蛋白のcytoplasmic tailのみを欠失させる変異を導入することにより、粒子形成を抑制することも考えられる。但し、特にSeVにおいてはF欠失型（WO00/70070）或いはHN欠失型（Stricker,R.and Roux,L.,J.Gen.Virol.72;1703-1707（1991））において多くのVLPが存在することが報告されており、これらのスパイク蛋白質の改変による効果は限定されることが予想される。さらにSeVにおいては以下の点も明らかになっている。SeVのF及びHNが分泌経路に載っている間（即ちゴルジ体等に存在している間）、それぞれ（F及びHN）のCytoplasmic tailがM蛋白と結合していることが示されている（Sanderson,C.M.et al.,J.Virol.67;651-663（1993）,Sanderson,C.M.et al.,J.Virol.68;69-76（1994））。即ち、ビリオン形成の場である細胞膜上のリピッドラフト（Lipid Rafts）へM蛋白が効率的に運搬されるためには、F及びHNのCytoplasmic tailとの結合が重要であり、M蛋白は細胞質に存在しながらF及びHNと結合することで、F及びHNの分泌経路に乗った形で細胞膜へ運搬されていると予想される。このように、M蛋白質はウイルス粒子の形成に本質的な役割を果たしており、M蛋白質の細胞膜上の凝集を失わせるような変異M蛋白質遺伝子を用いることにより、粒子形成能を持たないベクターを作り出すことが可能となる。
細胞におけるM蛋白質の局在の検出は、細胞分画による方法、および免疫染色によりM蛋白質の局在を直接検出する方法などで実施することができる。免疫染色では、例えば蛍光標識された抗体を用いてM蛋白質を染色し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察することができる。また、細胞を溶解後、公知の細胞分画法により細胞画分を得て、M蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降またはウェスタンブロッティング等によりM蛋白質が含まれる画分を同定することにより局在を調べることができる。ビリオン形成の場となるのは細胞膜上のリピッドラフト（Lipid rafts）と呼ばれている場であり、Triton X-100のような非イオン性界面活性剤に不溶性の脂質画分である。M蛋白質はspike蛋白、RNP及びM蛋白自身更には脂質との結合能により、このリピッドラフトでウィルスコンポーネントを凝集すると考えられていることから、リピッドラフト分画後、電気泳動等で検出されるM蛋白は凝集したM蛋白質を反映していると捉えることができる。すなわち、検出されるM蛋白質量が低下していれば、細胞表面のM蛋白質の凝集が低下していると判断される。一方、本発明者らが利用した細胞免疫染色により細胞内局在を検出する方法では、細胞膜上のM蛋白の凝集を直接観察することが可能である。この場合、細胞免疫染色に利用可能な抗M抗体を利用する。この方法で検出した場合、M蛋白質が凝集していれば、細胞膜近傍に強い濃縮像が観察され、M蛋白の凝集がなければ濃縮像はなく細胞膜の輪郭が明確でなくなり、細胞質全体が薄く染色される。このように濃縮像が少ない或いは濃縮像がなく、細胞膜の輪郭がぼやけて観察され、細胞質全体が薄く染色された場合に、細胞表面のM蛋白質の凝集が低下していると判断される。
野生型M蛋白質に比べ、細胞表面における凝集が有意に低下する変異M蛋白質は、粒子形成能が有意に低下していると判断される。ウイルスの粒子形成能の低下は、例えば統計学的に有意（例えば有意水準5%またはそれ以下の%値）に低下している。統計学的な検定は、例えばスチューデントのt検定またはマンホイットニーU検定などにより行うことができる。変異M遺伝子を持つウイルスベクターは、宿主内環境における粒子形成能が好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/30以下、より好ましくは1/50以下、より好ましくは1/100以下、より好ましくは1/300以下、より好ましくは1/500以下に低下している。本発明のベクターは、最も好ましくは宿主内環境におけるウイルス粒子の産生能が実質的に喪失している。実質的に喪失するとは、宿主内環境におけるウイルス粒子の産生が検出されないことを言う。このような場合、ウイルス粒子は103/ml以下、好ましくは102/ml以下、より好ましくは101/ml以下である。
ウイルス粒子の存在は、電子顕微鏡等で直接確認することができる。あるいは、ウイルスに含まれる核酸または蛋白質を指標に検出および定量することが可能である。例えば、ウイルス粒子中に含まれるゲノム核酸をPCR等の一般的な核酸検出法で検出および定量してもよい。あるいは、外来遺伝子を持つウイルス粒子は、これを細胞に感染させ該遺伝子の発現を検出することにより定量することができる。感染性を持たないウイルス粒子は、トランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入し、遺伝子発現を検出することにより定量することができる。本発明においてウイルス粒子は、感染能を持たない粒子も含まれ、例えばVLPを含む。
また、ウイルスの力価は、例えばCIU（Cell-Infected Unit）測定または赤血球凝集活性（HA）の測定することにより決定することができる（WO00/70070;Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579;Yonemitus,Y.& Kaneda,Y.,Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells.Ed.by Baker AH.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine:Humana Press:pp.295-306,1999）。また、実施例に記載したように、GFPなどのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーの指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばGFP-CIUとして）。このようにして測定した力価は、CIUと同等に扱うことができる（WO00/70070）。例えばウイルス粒子が含まれる可能性のある試料を細胞にトランスフェクションしても検出可能な感染価を示さないことにより、ウイルス粒子の生産能の喪失を確認することができる。感染能を持たないウイルス粒子（VLP等）の検出は、例えばリポフェクション試薬を用いたトランスフェクションにより行うことができる。具体的には、例えばDOSPER Liposomal Transfection Reagent（Roche,Basel,Switzerland;Cat No.1811169）を用いて行うことができる。ウイルス粒子を含むあるいは含まない溶液100μlにDOSPER 12.5μlを混合し、室温で10分放置後、6 wellプレートにコンフルエントに培養した細胞に15分毎に振盪しながらトランスフェクションする。2日後に感染細胞の有無を検出することでVLPの検出が可能である。
宿主内環境とは、対象とするベクターが由来するパラミクソウイルスの野生型が自然界において通常増殖する宿主内の環境またはそれと同等のウイルス増殖をもたらす環境を言う。宿主内環境は例えば該ウイルスの至適増殖条件であってよい。哺乳動物を宿主とするパラミクソウイルスであれば、哺乳動物生体内あるいはそれと同等の環境を言う。その温度は、哺乳動物体内に相当する約37〜38℃（例えば37℃）である。インビトロであれば、通常の細胞培養条件、具体的には血清含有または非含有培地中（pH6.5〜7.5）、37℃、5%CO2、湿環境下の培養環境が挙げられる。
環境条件による変異M蛋白質の活性の違いは、M蛋白質の温度感受性変異などの条件的変異において意味を持っている。条件的変異とは、宿主内環境では機能欠失型（loss of function）の変異形質を示すが、ある環境において活性を示す変異を言う。例えば37℃では機能がほとんどまたは全く失われるが、低温条件においては機能が回復する温度感受性変異M蛋白質をコードする遺伝子を好適に用いることができる。温度感受性変異とは、低温（例えば32℃）に比べ、高温（例えば37℃）において有意に活性が低下する変異を言う。本発明者らは、M蛋白質の温度感受性変異体を用いて、宿主内環境に相当する37℃において粒子形成能が劇的に低下したウイルス粒子を製造することに成功した。この変異M蛋白質は、低温条件下（例えば32℃）では細胞表面への凝集を示し、ウイルス粒子を形成させるが、通常の宿主体内の温度（37℃）では凝集性が失われウイルス粒子を形成することができない。このような温度感受性変異M蛋白質をコードする核酸をゲノムに持つベクターは、本発明のベクターとして好適である。条件的変異M蛋白質をコードするウイルスベクターは、M蛋白質が機能できる条件、すなわち許容条件でベクターを複製させることによりM蛋白質が機能してウイルス粒子が形成される。このようにして製造したウイルス粒子は、通常環境下で感染させるとM蛋白質が機能できずに粒子を形成しない。
M遺伝子の温度感受性変異としては特に限定されるものではないが、例えばセンダイウィルスのM蛋白質のG69、T116、およびA183からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは任意に選択される２つ、さらに好ましくは３つすべてのアミノ酸部位、あるいは他の（-）鎖RNAウィルスM蛋白質のそれらと相同な部位に変異を含むものを好適に用いることができる。ここでG69とはM蛋白質の69番目のアミノ酸Gly、T116とはM蛋白質の116番目のアミノ酸Thr、A183とはM蛋白質の183番目のアミノ酸Alaを指す。
M蛋白質をコードする遺伝子（M遺伝子）は、（-）鎖RNAウイルスで広く保存されており、ウイルスのヌクレオカプシッドとエンベロープの両者に相互作用する機能を有することが知られている（Garoff,H.et al.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:117-190（1998））。また、SeV M蛋白質においてamphiphilic α-helixと予想されている104-119（104-KACTDLRITVRRTVRA-119／配列番号：４５）は粒子形成に重要な領域として同定されている（Genevieve Mottet et al.,J.Gen.Virol.80:2977-2986（1999））が、当該領域は（-）鎖RNAウイルス間で良く保存されている。M蛋白質のアミノ酸配列は（-）鎖RNAウイルスで類似しており、特にパラミクソウイルス亜科においては既知のM蛋白質は共通して全長約330〜380アミノ酸からなる塩基性蛋白質であり、全領域にわたって類似性があるが、特にC端側半分での類似性が高い（Gould,A.R.Virus Res.43:17-31（1996）、Harcourt,B.H.et al.,Virology 271:334-349（2000））。従って、例えばSeV M蛋白質のG69、T116、及びA183と相同なアミノ酸は容易に同定することが可能である。
SeV M蛋白質のG69、T116、及びA183と対応する他の（−）鎖RNAウィルスM蛋白質の相同な部位のアミノ酸は、当業者であれば、例えばBLASTなどのアミノ酸配列のホモロジー検索プログラム（アライメント作成機能を持つもの）またはCLUSTAL Wなどのアライメント作成プログラムを用いてSeV M蛋白質のアミノ酸と整列化することにより同定することができる。例えばSeV M蛋白質のG69に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1（HPIV-1）（括弧は略称）であればG69、human parainfluenza virus-3（HPIV-3）であればG73、phocine distemper virus（PDV）およびcanine distemper virus（CDV）であればG70、doLphin molbillivirus（DMV）であればG71、peste-des-petits-ruminants virus（PDPR）、measles virus（MV）、およびrinderpest virus（RPV）であればG70、Hendra virus（Hendra）およびNipah virus（Nipah）であればG81、human parainfluenza virus-2（HPIV-2）であればG70、human parainfluenza virus-4a（HPIV-4a）およびhuman parainfluenza virus-4b（HPIV-4b）であればE47、mumps virus（Mumps）であればE72が挙げられる（文字と番号はアミノ酸とその位置を表す）。また、SeV M蛋白質のT116に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1（HPIV-1）であればT116、human parainfluenza virus-3（HPIV-3）でればT120、phocine distemper virus（PDV）およびcanine distemper virus（CDV）であればT104、dolphin molbillivirus（DMV）であれはT105、peste-des-petits-ruminants virus（PDPR）、measles virus（MV）およびrinderpest virus（RPV）であればT104、Hendra virus（Hendra）およびNipah virus（Nipah）であればT120、human parainfluenza virus-2（HPIV-2）およびsimian parainfluenza virus 5（SV5）であればT117、human parainfluenza virus-4a（HPIV-4a）およびhuman parainfluenza virus-4b（HPIV-4b）であればT121、mumps virus（Mumps）であればT119、Newcastle disease virus（NDV）であればS120が挙げられる。SeV M蛋白質のA183に相当する各M蛋白質の相同部位としては、human parainfluenza virus-1（HPIV-1）であればA183、human parainfluenza virus-3（HPIV-3）であれなF187、phocine distemper virus（PDV）およびcanine distemper virus（CDV）であればY171、dolphin molbillivirus（DMV）であればY172、peste-des-petits-ruminants virus（PDPR）、measles virus（MV）およびrinderpest virus（RPV）であれはY171、Hendra virus（Hendra）およびNipah virus（Nipah）であればY187、human parainfluenza virus-2（HPIV-2）であれはY184、simian parainfluenza virus 5（SV5）であればF184、human parainfluenza virus-4a（HPIV-4a）およびhuman parainfluenza virus-4b（HPIV-4b）であれはF188、mumps virus（Mumps）であればF186、Newcastle disease virus（NDV）であればY187が挙げられる。ここに挙げたウイルスにおいて、それぞれのM蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の2部位の組み合わせ、さらに好ましくは3つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適である。
アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。例えばセンダイウィルスM蛋白質におけるG69E、T116A、およびA183Sからなる群より選択される変異あるいはそれらと相同な位置に変異を含む他のパラミクソウイルスのM蛋白質を用いることができる。ここでG69Eとは、M蛋白質の69番目のアミノ酸GlyがGluに置換された変異、T116Aとは、M蛋白質の116番目のアミノ酸ThrがAlaに置換された変異、A183Sとは、M蛋白質の183番目のアミノ酸AlaがSerに置換された変異を言う。すなわち、センダイウィルスM蛋白質のG69、T116、およびA183あるいは他のウイルスM蛋白質の相同部位を、それぞれGlu（E）、Ala（A）、およびSer（S）へ置換することができる。これらの変異は組み合わせて有していることが好ましく、特に上記３変異の全てを保持していることがより好ましい。M遺伝子への変異の導入は、公知の変異導入方法に従って実施することができる。例えば実施例に記載のように目的の変異を入れたオリゴヌクレオチドを用いて導入することが可能である。
また、例えば麻疹ウィルスにおいては、M蛋白のモノクローナル抗体に対するエピトープが変化している温度感受性株のP253-505（Morikawa,Y.et al.,Kitasa to Arch.Exp.Med.,64;15-30（1991））のM遺伝子配列を用いてもよい。また、SeV M蛋白質の116番目のThrに対応する麻疹ウィルスM蛋白質の104番目のThr、またはムンプスウィルスのM蛋白質の119番目のThrを他のアミノ酸（例えばAla）に置換してもよい。
本発明のベクターは、さらに好ましい態様においてはM遺伝子を欠損している。M遺伝子の欠損とは、M遺伝子の機能が失われていることを言い、機能欠失型の変異を有するM遺伝子を持つ場合およびM遺伝子を欠失する場合を含む。M遺伝子の機能欠失型変異は、例えばM遺伝子の蛋白質コード配列を欠失させたり、他の配列を挿入することにより作製することができる。例えば、M蛋白質コード配列の途中に停止コドンを設計することができる（WO00/09700）。本発明のベクターは、最も好ましくはM蛋白質のコード配列を完全に欠失している。M蛋白質のORFを欠失したベクターは、条件的変異M蛋白質をコードするベクターとは違い、任意の条件においてウイルス粒子を形成する能力を失っている。
本発明のベクターを製造するには、パラミクソウイルスのゲノムRNAを含むRNPの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちN、P、およびL蛋白質の存在下、パラミクソウイルスのゲノムRNAをコードするcDNAを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウイルスRNPを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。RNA末端は、天然のウイルスゲノムと同様に3’リーダー配列と5’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の5'端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてT7 RNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該RNAポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の3'端を制御するには、例えば転写産物の3’端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に3’が切り出されるようにすることができる（Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997、Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587及びYu,D.et al.,1997,Genes Cells 2:457-466）。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、ゲノムRNAをコードするcDNA中に外来遺伝子を挿入するためのクローニングサイトを設計することができる。その部位は、例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の位置であってよく、具体的には3’リーダー領域と3’に最も近いウイルス蛋白質ORFとの間、各ウイルス蛋白質ORFの間、および/または5'に最も近いウイルス蛋白質ORFと5'トレイラー領域の間に挿入することができる。M遺伝子を欠失するゲノムでは、その欠失領域にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。複数の外来遺伝子をゲノム中の別々の位置に挿入できるように、クローニングサイトは、ゲノム中の複数箇所に存在してもよい。
例えば粒子形成能を持たない組み換えウィルスRNPは、Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997、Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587及びYu,D.et al.,1997,Genes Cells 2:457-466の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
外来遺伝子を組み込む場合は、まず目的の外来遺伝子のcDNA塩基配列を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/μl以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、NotI部位を利用してウィルスゲノムRNAをコードするDNAに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をPCRにより増幅し回収する。2つのプライマーの5’部分にNotI部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をNotI部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のORFとその両側のウイルス遺伝子のORFとの間にE-I-S配列が配置されるように、プライマー中にE-I-S配列またはその部分を含めるようにする。
例えば、フォワード側合成DNA配列は、NotIによる切断を保証するために5’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3’側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその3'側に所望のcDNAの開始コドンATGからこれを含めてORFの約25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はGまたはCとなるように該所望のcDNAから約25塩基を選択してフォワード側合成オリゴDNAの3’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成DNA配列は5’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはGCGおよびGCCなどのNotI認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはACTT）を選択し、その3'側にNotI認識部位gcggccgcを付加し、さらにその3’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴDNAを付加する。このオリゴDNAの長さは、E-I-S配列を含む最終的なPCR増幅産物のNotI断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「6のルール（rule of six）」；Kolakofski,D.et al.,J.Virol.72:891-899,1998;Calain,P.and Roux,L.,J.Virol.67:4822-4830,1993;Calain,P.and Roux,L.,J.Virol.67:4822-4830,1993）。このプライマーにE-I-S配列を付加する場合には、挿入断片ののオリゴDNA3'側にセンダイウィルスのS配列の相補鎖配列、好ましくは5’-CTTTCACCCT-3'（配列番号：８）、I配列の相補鎖配列、好ましくは5’-AAG-3'、E配列の相補鎖配列、好ましくは5’-TTTTTCTTACTACGG-3'（配列番号：９）、さらにその3’側に所望のcDNA配列の終始コドンから逆に数えて約25塩基相当の相補鎖の最後の塩基がGまたはCになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成DNAの3’の末端とする。
PCRは、Taqポリメラーゼまたはその他のDNAポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はNotIで消化した後、プラスミドベクターpBluescriptのNotI部位に挿入する。得られたPCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をNotIで切り出し、ゲノムcDNAを含むプラスミドのNotI部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにNotI部位に直接挿入し、組み換えセンダイウィルスcDNAを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウィルスゲノムcDNAであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Yu,D.et al.,Genes Cells 2:457-466,1997;Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997）。例えば、NotI制限部位を有する18bpのスペーサー配列（5’-（G）-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’）（配列番号：１０）を、クローニングされたセンダイウィルスゲノムcDNA（pSeV（+））のリーダー配列とN蛋白質のORFとの間に挿入し、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand）由来の自己開裂リポザイム部位を含むプラスミドpSeV18+b（+）を得る（Hasan,M.K.et al.,1997,J.General Virology 78:2813-2820）。
さらに、例えばM遺伝子を欠損させたり、あるいは温度感受性変異を導入する場合、ゲノムRNAをコードするcDNAを制限酵素で消化して、M遺伝子を含むフラグメントを回収し、適当なプラスミドにクローニングする。M遺伝子の変異またはM遺伝子欠損部位の構築はこのプラスミド上で行う。変異導入には、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）などを利用してKitに記載の方法に従って実施することができる。M遺伝子の欠損または欠失のためには、例えばPCR-ライゲーション方法の組み合わせで行い、M遺伝子のORF全部または一部を欠失させ、適宜適当なスペーサー配列で連結することができる。M遺伝子の変異体または欠失体が得られたら、これを含むフラグメントを回収し、もとの全長ゲノムcDNAのM遺伝子と置換することにより、M遺伝子に変異を持つウィルスゲノムcDNAを調製することができる。同様の方法で、例えばFおよび/またはHN遺伝子等に変異を導入することができる。
ゲノムRNAをコードするDNAを、上記のウイルス蛋白質存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウィルスゲノムRNAをコードするDNAを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムRNAをコードするDNAの使用に関する。マイナス鎖RNAウィルスのゲノムcDNAからのウィルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（WO97/16539;WO97/16538;Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235:323-332;Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392;Schnell.M.J.et al.,1994,EMBO J.13:4195-4203;Radecke,F.et al.,1995,EMBO J.14:5773-5784;Lawson,N.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481;Garcin,D.et al.,1995,EMBO J.14:6087-6094;Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579;Baron,M.D.and Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271;Bridgen,A.and Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15400-15404）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダーペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖RNAウィルスまたはウイルス成分となるRNPをDNAから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。
具体的な手順は、（ａ）上記パラミクソウィルスゲノムRNA（ネガティブ鎖RNA）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするcDNAを、N、P、およびL蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞またはその培養上清から該ゲノムRNAを含む複合体を回収する工程、により製造することができる。転写されたゲノムRNAはN、L、およびP蛋白質の存在下で複製されRNP複合体を形成する。工程（ａ）を、該ゲノムがコードする改変Ｆ蛋白質を開裂するプロテアーゼの存在下で実施することにより、形成されたRNPが該細胞に接触する細胞へ伝達され、感染が広がりベクターが増幅する。この方法により、機能的なM蛋白質が存在しなくても、RNPの形態で本発明のベクターを製造することができる。
DNAからの最初のゲノムRNAの転写に必要なT7 RNAポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドやウイルスベクターの導入によって実施することができるし、または、例えば細胞の染色体にこの遺伝子の発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムRNA、およびベクター再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを用いることもできるが、これらのウイルスの混入を招くため好ましくない。
ゲノムRNAを発現するDNAを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなDNA沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つDNAを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Roche）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったDNAは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のDNAが入ることが知られている（Graham,F.L.and Van Der Eb,J.,1973,Virology 52:456;Wigler,M.and Silverstein,S.,1977,Cell 11:223）。ChenおよびOkayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、1）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を2〜4％ CO2、35℃、15〜24時間、2）DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、3）沈殿混液中のDNA濃度が20〜30μg/mlのとき最適な沈殿が得られると報告している（Chen,C.and Okayama,H.,1987,Mol.Cell.Biol.7:2745）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはDEAE-デキストラン（Sigma #D-9885 M.W.5×105）混液を所望のDNA濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Calos,M.P.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのDNAの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはSuperfect Transfection Ragent（QIAGEN,Cat No.301305）、またはDOSPER Liposomal Transfection Reagent（Roche,Cat No.1811169）が用いられるが、これらに制限されない。
cDNAからのウイルスベクターの再構成は具体的には例えば次のようにして行うことができる。
24穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは100mmペトリ皿等で、10％ウシ胎児血清（FCS）および抗生物質（100units/mlペニシリンGおよび100μg/mlストレプトマイシン）を含む最少必須培地（MEM）を用いてサル腎臓由来細胞株LLC-MK2をほぼ100％コンフルエントになるまで培養し、例えば1μg/ml psoralen（ソラレン）存在下UV照射処理を20分処理で不活化した、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスvTF7-3（Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8122-8126,1986、Kato,A.et al.,Genes Cells 1:569-579,1996）を2PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびUV照射時間は適宜調整することができる。感染1時間後、2〜60μg、より好ましくは3〜20μgの組換えセンダイウィルスのゲノムRNAをコードするDNAを、ウィルスRNPの生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド（0.5〜24μgのpGEM-N、0.25〜12μgのpGEM-P、および0.5〜24μgのpGEM-L）（Kato,A.et al.,Genes Cells 1:569-579,1996）と共にSuperfect（QIAGEN社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。N、P、およびLをコードする発現ベクターの量比は2:1:2とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば1〜4μgのpGEM-N、0.5〜2μgのpGEM-P、および1〜4μgのpGEM-L程度で適宜調整する。
トランスフェクションを行った細胞は、所望により100μg/mlのリファンピシン（Sigma）及びシトシンアラビノシド（AraC）、より好ましくは40μg/mlのシトシンアラビノシド（AraC）（Sigma）のみを含む血清不含のMEMで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579）。トランスフェクションから48〜72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、RNPを含む破砕物をLLC-MK2細胞に再度トランスフェクションして培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、DOTMA（Roche）、Superfect（QIAGEN #301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Calos,M.P.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015）。RNPが導入された細胞では、RNPからのウイルス遺伝子の発現およびRNPの複製の過程が遂行しベクターが増幅する。得られた細胞溶解物を希釈して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウィルスvTF7-3は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回上繰り返す。得られたRNPは-80℃で保存することができる。
ウィルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウィルスベクター等の再構成においては、サル腎由来LLC MK2細胞およびCV-1細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウィルス粒子を得ることもできる。
ウイルスゲノム中のM遺伝子が欠損または欠失していると、このウイルスが感染した細胞からはウイルス粒子が形成されないため、上記のような方法ではRNPまたはRNPを含む細胞として本発明のベクターを調製することはできても、ウイルス粒子としてベクターを調製することはできない。また、RNPのトランスフェクションを行った後は、細胞内で増殖したRNPは接触している細胞へのみ伝達されるため感染の拡大が遅く、高タイターのウイルスベクターを大量に調製するのは難しい。本発明は、本発明のベクターをウイルス粒子として産生するための方法を提供する。ウイルス粒子はRNPに比べ溶液中で安定であり、さらに感染性を持たせることによりトランスフェクション試薬などを必要とせず細胞に接触させるだけでベクターを標的細胞に導入することができるため、産業上の利用に特に優れている。本発明のベクターをウイルス粒子として産生する方法の１つは、条件的変異を有するM遺伝子を持つウイルスゲノムを用いて、許容条件下でウイルスを再構成させる方法である。すなわち、上記の工程（ａ）、あるいは上記工程（ａ）および（ｂ）により得られた複合体を導入した細胞を培養する際に、許容条件下で行うことにより、M蛋白質を機能させ粒子を形成させることができる。条件的変異を有するM変異蛋白質をコードするゲノムRNAを含むウイルス粒子を製造する方法は、（i）該M変異蛋白質の許容条件下、細胞内でパラミクソウイルスのN、P、およびL蛋白質、および該ゲノムRNAを含むRNPを増幅させる工程、および（ii）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、を含む方法である。例えば温度感受性M変異蛋白質であれば、許容温度で培養する。
また、本発明のベクターをウイルス粒子として製造するもう1つの方法は、M蛋白質を発現するヘルパー細胞を用いる方法である。本発明者らは、Mヘルパー細胞を用いることによって、F蛋白質の開裂部位が他のプロテアーゼで切断される配列に改変されており、さらにM遺伝子を変異または欠失するベクターをウイルス粒子として産生させた。本発明の方法は野生型パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを必要としないため、M遺伝子を含んだ粒子形成能を持つウイルスが混入することがなく、本発明のベクターを純粋に調製することが可能である。本発明は、（i）パラミクソウイルスのゲノムRNAであって、（ａ）M蛋白質をコードする核酸が変異または欠失しており、かつ（ｂ）改変F蛋白質であって、該蛋白質の開裂部位の配列が、野生型F蛋白質を開裂しないプロテアーゼによって開裂される配列に置換された蛋白質をコードするゲノムRNAを有するウイルス粒子であって、（１）該ウイルス粒子が導入された細胞内で該ゲノムRNAを複製する能力を有し、（２）宿主内環境においてウイルス粒子の産生が有意に低下または喪失しており、（３）該プロテアーゼの存在に依存して、該ゲノムRNAを有するウイルス粒子が導入された細胞と接触する細胞に、該ゲノムRNAを導入する能力を有するウイルス粒子を提供する。好ましい態様では、このウイルス粒子はウイルス粒子を産生しない。
機能的M蛋白質を発現する細胞中で本発明のウイルス粒子を製造する方法は、
（i）パラミクソウイルスの野生型M蛋白質またはそれと同等の蛋白質を発現する細胞において、該パラミクソウイルスのN、P、およびL蛋白質、および該ゲノムRNAを含むRNPを増幅させる工程、
（ii）該細胞の培養上清に放出されたウイルス粒子を回収する工程、
を含む方法である。野生型M蛋白質はウイルス粒子を形成させる活性を有する限り、ゲノムRNAと違うパラミクソウイルスに由来していてもよい。また、タグペプチド等が付加されていてもよいし、適当な発現ベクターから発現される際に、ベクター由来のリンカーペプチドが付加されていてもよい。このように野生型M蛋白質そのものでなくても、それと同等のウイルス粒子形成能を有する蛋白質を用いることができる。M発現細胞から産生されたウイルス粒子は、この細胞で発現させたM蛋白質をエンベロープに含んでいるが、この蛋白質をコードする遺伝子は含んでいない。従って、このウイルスが感染した細胞では、もはや野生型M蛋白質は発現せず、ウイルス粒子を形成できない。
M蛋白を発現するヘルパー細胞の作製は、以下のように行うことができる。例えばM遺伝子の誘導的な発現が可能なベクターを構築するため、誘導性プロモーターまたはCre/loxPなどの組み換えによる発現制御系などを利用する。Cre/loxP誘導型発現プラスミドの構築には、例えば、Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドpCALNdlw（Arai,T.et al.,J.Virology 72,1998,p1115-1121）等を利用することができる。M蛋白質を発現できる細胞として、M遺伝子が染色体に組み込まれ、誘導によりM蛋白質を持続的に高発現可能なヘルパー細胞株を樹立することが好ましい。細胞は、例えばサル腎臓由来細胞株LLC-MK2細胞等を用いることができる。LLC-MK2細胞は、10％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリンGナトリウム50単位/ml、およびストレプトマイシン50μg/mlを添加したMEMで37℃、5％ CO2で培養する。Cre DNAリコンビナーゼによりM遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドを、リン酸カルシウム法（mammalian transfection kit（Stratagene））により、周知のプロトコールに従ってLLC-MK2細胞に遺伝子導入を行う。
例えば、10cmプレートを用い、40％コンフルエントまで生育したLLC-MK2細胞に10μgのM発現プラスミドを導入後、10mlの10% FBSを含むMEM培地にて、37℃の５％CO2インキュベーター中で24時間培養する。24時間後に細胞をはがし、10ml培地に懸濁後、10cmシャーレ５枚を用い、5ml 1枚、2ml 2枚、0.2ml 2枚に蒔き、G418（GIBCO-BRL）を1200μg/mlを含む10mlの10%FBSを含むMEM培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたG418に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは10cmプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
ヘルパー細胞においてM蛋白質が高発現することが、高力価のウイルスを回収するために重要である。そのためには、例えば上記のM発現細胞の選択を２回またはそれ以上行うことが好ましい。例えばある薬剤耐性マーカー遺伝子を持つM発現プラスミドをトランスフェクションし、その薬剤を用いてM遺伝子を保持する細胞を選択した後、別の薬剤耐性マーカー遺伝子を持つM発現プラスミドを再度、この細胞にトランスフェクションしこの別の薬剤耐性マーカーで細胞を選択することにより、１回目のトランスフェクションで選択された細胞よりも、さらにM蛋白質を高発現できる細胞を選択することが可能である。このように、2回のトランスフェクションを経て構築されたMヘルパー細胞を好適に用いることができる。Mヘルパー細胞は、同時にF遺伝子も発現することにより、FおよびM遺伝子の両方を欠損する感染性ウイルス粒子を産生させることができる（WO03/025570）。この場合、F遺伝子の発現プラスミドも2回以上トランスフェクションし、F蛋白質の発現誘導レベルをより高めることが好ましい。F遺伝子としては、本明細書に記載したような改変F蛋白質の遺伝子の用いることができる。
M蛋白質の発現誘導は、細胞を6cmシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、例えば、アデノウィルスAxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al.,Nucl.Acids Res.23:3816-3821（1995）;Arai,T.et al.,J.Virol.72,1115-1121（1998））により、好ましくはmoi=3程度で感染させて行う。
野生型M蛋白質またはそれと同等の蛋白質を発現する細胞（Mヘルパー細胞）を用いて本発明のウイルス粒子を産生させるには、この細胞に上述した本発明のRNPを導入して培養すればよい。RNPの導入は、例えばRNPを含む細胞溶解物などをMヘルパー細胞にトランスフェクションしてもよいし、あるいはRNPを産生する細胞とMヘルパー細胞とを共培養することによっても、細胞融合によりMヘルパー細胞にRNPを導入することができる。あるいは、Mヘルパー細胞内で、ゲノムRNAを転写させ、N、P、およびL蛋白質の存在下でRNPを新規に形成させてもよい。
本発明においては、上記の工程（i）（Mヘルパー細胞でRNPを増幅させる工程）を低温で行うことが好ましい。温度感受性変異M蛋白質を用いたベクター産生では、ウイルス粒子産生過程を許容温度以下で行うことが必要であるが、驚くべきことに、野生型M蛋白質を用いた本方法においても、ウイルス粒子を形成させる過程を低温で行うことで効率的な粒子形成を行わせることが可能であることが判明した。低温とは、具体的には35℃以下、より好ましくは34℃以下、さらに好ましくは33℃以下、最も好ましくは32℃またはそれ以下である。
本発明の方法によれば、本発明のウイルス粒子は、例えば1×105CIU/mL以上、好ましくは1×106CIU/mL以上、より好ましくは5×106CIU/mL以上、より好ましくは1×107CIU/mL以上、より好ましくは5×107CIU/mL以上、より好ましくは1×108CIU/mL以上、より好ましくは5×108CIU/mL以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Kiyotani,K.et al.,Virology 177（1）,65-74（1990）;WO00/70070）。
M欠失型のウィルスゲノムcDNAから組み換えウィルスベクターを再構成させるためのより好ましい一態様としては、以下のような方法が挙げられる。すなわち、（ａ）ゲノムRNA（ポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよい）をコードするDNAを、感染性ウィルス粒子の形成に必要なウィルス蛋白質群（すなわちNP、P、L、M、F、およびHN蛋白質）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞と、染色体に組み込まれたM遺伝子が発現する細胞（Mヘルパー細胞）を共培養する工程、（ｃ）該培養から細胞抽出物を調製する工程、（ｄ）該抽出物を染色体に組み込まれたM遺伝子が発現する細胞（Mヘルパー細胞）にトランスフェクションして培養する工程、および（ｅ）該培養上清からウィルス粒子を回収する工程、を含む方法である。工程（ｄ）は上記の低温条件にて行うことが好ましい。得られたウイルス粒子は、再度Mヘルパー細胞に感染させて（好ましくは低温で）増幅することができる。具体的には、実施例の記載に従ってウィルスを再構成させることができる。回収したウイルス粒子は、希釈後、再度Mヘルパー細胞に感染させて増幅することができる。この増幅過程は例えば2または3回またはそれ以上行うことができる。得られたウィルスストックは-80℃で保存することができる。ウィルス力価は赤血球凝集活性（HA）を測定することにより決定することができる。HAは「endo-point希釈法」により決定することができる。
具体的には、まずLLC-MK2細胞を5×106cells/dishで100mmのシャーレに播く。T7 RNAポリメラーゼによりゲノムRNAの転写を行わせる場合には、細胞培養24時間後、ソラレン（psoralen）と長波長紫外線（365nm）で20分間処理したT7ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（PLWUV-VacT7:Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126（1986））をMOI 2程度で室温で１時間感染させる。細胞を無血清のMEMで洗浄した後、ゲノムRNAを発現するプラスミド、およびパラミクソウイルスのそれぞれN、P、L、F、およびHN蛋白質を発現する発現プラスミド適当なリポフェクション試薬と用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、例えば順に6:2:1:2:2:2とすることができるがこれに限定されない。5時間培養後血清を含まないMEMで２回洗浄し、40μg/mLのCytosine β-D-arabinofuranoside（AraC:Sigma,St.Louis,MO）及び7.5μg/mLのTrypsin（Gibco-BRL,Rockville,MD）を含むMEMで培養する。24時間培養後、約8.5×106cells／dishあたりにM蛋白を持続発現する細胞（Mヘルパー細胞）を重層し、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含むMEMで更に２日間37℃で培養する（P0）。これらの細胞を回収し、ペレットを2mL／dishあたりのOpti-MEMに懸濁する。凍結融解を３回繰り換えした後、ライゼートをそのままMヘルパー細胞にトランスフェクションし、40μg/mLのAraC、およびF蛋白質を開裂できるプロテアーゼを含み血清を含まないMEMを用い32℃で培養する（P1）。３〜１４日後培養上清の一部をとり、新たに調製したMヘルパー細胞に感染させ、40μg/mLのAraCおよび該プロテアーゼを含み血清を含まないMEMを用い32℃で培養する（P2）。３〜１４日後に新たに調製したMヘルパー細胞に再度感染させ、該プロテアーゼの存在下（F開裂型ウイルスを調製する場合）または非存在下（F非開裂型ウイルス粒子を調製する場合）、血清を含まないMEMを用い32℃で３〜７日間培養する（P3）。このように再増幅を３回以上繰り返すことにより、最初に用いたワクシニアウィルスは完全に除去することができる。回収した培養上清に終濃度1%になるようにBSAを添加し-80℃にて保存する。
本発明のウイルス粒子は、ウイルス粒子が持つ改変F蛋白質が開裂された感染性を有する粒子、あるいは、そのままでは感染性を有さないが、該改変F蛋白質を開裂するプロテアーゼの処理により感染性を示す潜在的感染能を有するウイルス粒子であってよい。ウイルス粒子のエンベロープには、ゲノムがコードする改変F蛋白質が存在しているが、該蛋白質が開裂されていない場合は、そのままでは感染性を有さない。このようなウイルスは、この改変F蛋白質の開裂配列を切断できるプロテアーゼで処理するか、あるいは該プロテアーゼの存在下で細胞または組織に接触させることにより、該F蛋白質が開裂し感染性を獲得する。改変F蛋白質が開裂していないウイルス粒子を得るには、上記のウイルス産生細胞においてウイルスを製造する際に、その最終段階におけるウイルス増幅を改変F蛋白質を開裂するプロテアーゼの非存在下で行うことにより実施することができる。逆に該プロテアーゼの存在下でウイルスを調製することによりF蛋白質が開裂した感染性ウイルス粒子を調製することができる。
またウイルス粒子の製造過程において、細胞においてウイルスゲノムがコードしていないエンベロープ蛋白質を発現させ、この蛋白質をエンベロープに含むウイルス粒子を産生させることができる。このようなエンベロープ蛋白質としては例えば野生型F蛋白質が挙げられる。このようにして産生したウイルス粒子は、ゲノムRNAには改変F蛋白質をコードしているが、エンベロープにはこの蛋白質に加え野生型F蛋白質も有する。ウイルス粒子の製造段階において野生型F蛋白質をトランスに供給し、これを開裂するトリプシン存在下で増幅させることにより、ウイルス粒子の野生型F蛋白質を開裂して感染性を獲得させることができる。この方法によれば、改変F蛋白質を開裂するプロテアーゼを用いなくても感染性ウイルス粒子を高タイターで調製することが可能となる。このように本発明のウイルス粒子としては、パラミクソウイルスの野生型F蛋白質を含むウイルス粒子であってよい。野生型F蛋白質は、ウイルスゲノムと同一種に由来しなくても、他のパラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質であってよい。
また野生型F蛋白質でなくても、所望のウイルスエンベロープ蛋白質をエンベロープに有するウイルス粒子を作製してよい。すわなちウィルス再構成の際に、所望のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、このエンベロープ蛋白質を有するウィルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば水疱性口内炎ウィルス（VSV）のG蛋白質（VSV-G）などは好適である。本発明のウイルス粒子には、VSV-G蛋白質などのように、ゲノムRNAが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウィルスベクターが含まれる。この場合も上記野生型F蛋白質の場合と同様、ウイルスのゲノムRNAにはこのエンベロープ蛋白質はコードされないため、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。
また、本発明のウィルス粒子は、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的として感染するベクターを作り出すこともできる。これらはウィルスベクターの再構成時に、細胞内で発現させることによりトランスに供給することができる。具体的には、例えばサイトカインなどの可溶性因子の受容体結合ドメインを含む断片、または細胞表面蛋白質に対する抗体断片などが挙げられる（WO01/20989）。
なお、ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウィルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウィルス遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
また、大量にウィルスベクターを得るために、上記の方法で得られたウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる可能性もある。例えばニワトリを使ってM遺伝子のトランスジェニック体を作製し、この鶏卵にベクターを接種して増幅させればよい。鶏卵を使ったウィルスベクターの製造の基本的な方法は既に開発されている（中西ら編，（1993），「神経科学研究の先端技術プロトコールIII,分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウィルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、増幅する組み換えウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのウィルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，pp.68-73（1995））。
回収したウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウィルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクター由来の蛋白質の割合が10%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができる。
F開裂部位が改変されたM遺伝子欠失型のベクターは、特定のプロテアーゼが存在する環境下でのみ、細胞融合型の感染によりベクターを細胞間に伝達する。従って、本発明のベクターは、あるプロテアーゼを発現する組織を標的にした遺伝子治療に有用である。通常のベクターでは、標的組織の表層に遺伝子導入することはできても、組織内部にまでベクターを浸透させることは難しい。しかし本発明のベクターは、標的とするプロテアーゼ活性が亢進している組織内にベクターを深く浸潤させる能力を持っている。例えば正常組織の深部まで浸潤した癌細胞に対しても、本発明のベクターを用いることにより、癌細胞の一部のベクター感染可能な表層部分にそのベクターを感染させることによって、標的細胞の内部までベクターを伝達する事が可能である。
疾患への適用としては、癌、動脈硬化、および慢性関節リウマチ（RA）をはじめとする関節疾患などが挙げられる。例えばRA等の関節疾患では、上記のように細胞外マトリックス分解による軟骨高次構造の崩壊が進行し関節が破壊される。本発明のベクターによりECM分解酵素活性が亢進した細胞を取り除くことにより、関節破壊を低下させることが期待される。また、動脈硬化においては、マクロファージ由来泡沫細胞の集簇が進行する。泡沫細胞はメタロプロテアーゼを大量に分泌し、その結果線維性肥厚を破壊しプラーク破綻を引き起こす。本発明のベクターを用いてMMPを発現するマクロファージを殺すことにより、このような動脈硬化の治療を行うことが可能と考えられる。また後述のように、癌においては種々のプロテアーゼが活性化している。本発明のベクターは、癌特異的に感染・浸潤する治療ベクターとして有用である。
ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（PBS）などで適宜希釈して組成物とすることができる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与されるベクター量は好ましくは約105CIU/mlから約1011CIU/ml、より好ましくは約107CIU/mlから約109CIU/ml、最も好ましくは約1×108CIU/mlから約5×108CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。癌組織等に投与する場合、ベクターの投与は標的部位に均等に行きわたるよう複数箇所に投与することができる。ヒトにおいては１回当たりの投与量は2×105CIU〜2×1010CIUが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
特に本発明のベクターは癌の治療に有用である。本発明のベクターが感染した細胞では、プロテアーゼ存在下で細胞融合によりシンシチウムを形成させる。この性質を利用して、本発明のベクターを特定のプロテアーゼの活性が亢進している癌の治療に用いることが可能である。本発明は、癌で活性が亢進するプロテアーゼにより開裂するF蛋白質をコードする本発明のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む癌の治療組成物を提供する。また本発明は、該ベクターの癌治療組成物の製造における使用に関する。また本発明は、該ベクターを癌に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。浸潤転移する悪性の癌ではECM分解酵素の活性が亢進していることから、ECM分解酵素により開裂するF蛋白質遺伝子を有するベクターを用いれば、悪性の癌に特異的にベクターを感染させ癌組織を死滅させることができる。
ベクターには、外来遺伝子を搭載させることができる。外来遺伝子は、ベクターの感染をモニターするためのマーカー遺伝子であってもよく、あるいは癌の治療用遺伝子を用いてもよい。治療用遺伝子としては、例えばアポトーシス等の細胞誘導性遺伝子、細胞毒性を持つ蛋白質をコードする遺伝子、サイトカイン、ホルモン、その他が挙げられる。本発明のベクターは、癌への直接（in vivo）投与、および患者由来細胞またはそれ以外の細胞に本発明のベクターを導入し、その細胞を癌に注入する間接（ex vivo）投与により癌に投与することができる。
対象となる癌は特定のプロテアーゼ活性が亢進する所望の癌であってよく、癌種としてはほとんどの浸潤転移する悪性の腫瘍（肺癌、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌など）が挙げられる。しかし、悪性癌においてもMMP,uPA,tPAなどのプロテアーゼの発現の低いものもあるため、プロテアーゼ活性の亢進の有無によって適用を判断する。食道癌における粘膜下層への浸潤癌、大腸癌における固有筋層へのIII,IV期の進行癌や、浸潤性のメラノーマの深部に進入した外科的にとりきれない癌への適用に、本発明のベクターは特に優れている。
【図面の簡単な説明】
図１は、M遺伝子に温度感受性変異を導入したF欠失型SeVゲノムcDNAの構築スキームを示す図である。
図２は、M遺伝子への温度感受性変異導入による２次放出粒子抑制を目的として構築したウィルス遺伝子及びその変異導入の効果を比較検討する為に構築した或いは使用したウィルス遺伝子の構造を示す図である。
図３は、SeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPを、F蛋白を持続発現する細胞（LLC-MK2/F7/A）に感染し、それぞれ32℃及び37℃で６日間培養後のGFP発現を示す顕微鏡像を示す写真である。
図４は、SeV-F蛋白を持続発現する細胞（LLC-MK2/F7/A）について、32℃或いは37℃でtrypsin及び血清を含まないMEMで培養し経時的にF蛋白の発現量をWestern-blottingで半定量的に観測した結果を示す写真である。
図５は、LLC-MK2細胞にSeV18+GFP,SeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.3で感染し32℃，37℃或いは38℃で培養し３日後のGFP発現を示す顕微鏡像を示す写真である。
図６は、LLC-MK2細胞にSeV18+GFP,SeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.3で感染し32℃，37℃或いは38℃で培養し経時的にサンプリング（同時に新しい培地に交換）した培養上清の赤血球凝集活性（HA活性）を示す図である。
図７は、LLC-MK2細胞にSeV18+GFP,SeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.3で感染し、37℃で培養２日後の培養上清及び細胞を回収して、1lane当り6well plate培養1well分の1/10相当量を用いて、抗M抗体を利用したWestern-blottingにより求めた、細胞内とウィルス様パーティクル（VLP）間のM蛋白の存在比率を示す写真である。
図８は、LLC-MK2細胞にSeV18+SEAP/ΔF-GFP或いはSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.3で感染し、培養12,18,24,50,120時間後にサンプリングした培養上清を用いて測定したSEAP活性を示す図である。
図９は、LLC-MK2細胞にSeV18+SEAP/ΔF-GFP或いはSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.3で感染し、培養24,50,120時間後にサンプリングした培養上清のHA活性を示す図である。
図１０は、LLC-MK2細胞にSeV18+SEAP/ΔF-GFP或いはSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.3で感染し、培養5日後にサンプリングした培養上清について遠心後ウィルスを回収し、1lane当り6well plate培養1well分の1/10相当量を用いて、抗M抗体を利用したWestern-blottingにより求めたウィルス様パーティクル量を示す写真である。
図１１は、LLC-MK2,BEAS-2B或いはCV-1細胞にSeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10で感染し、血清を含まない或いは10%  FBSを含む培地で培養し、血清を含まない培地の場合は感染３日後に、10% FBSを含む培地の場合は感染６日後に、培地中に放出されたLDH量から見積った細胞障害性を示す図である。同じ細胞数の細胞を細胞変性剤（Triton）を用いて100％ lysisした時の値を100％とした相対値で表した。
図１２は、LLC-MK2細胞にSeV18+GFP,SeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.1で感染し、32℃，37℃或いは38℃で培養し、培養２日後に抗M抗体を利用して免疫染色を行うことにより求めたM蛋白の細胞内局在を示す写真である。
図１３は、A-10細胞にSeV18+SEAP/ΔF-GFP或いはSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.1で感染し、32℃或いは37℃で培養し、10%血清を含む培地で培養1日後に抗M抗体および抗HN抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したM蛋白及びHN蛋白の細胞内局在を示す写真である。ステレオ立体画像で示した。
図１４は、A-10細胞にSeV18+SEAP/ΔF-GFP或いはSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.1で感染し、32℃或いは37℃で培養し、10%血清を含む培地で培養2日後に抗M抗体および抗HN抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したM蛋白及びHN蛋白の細胞内局在を示す写真である。ステレオ立体画像で示した。
図１５は、M蛋白及びHN蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示す写真である。A-10細胞にSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.1で感染し、直後に微小管の脱重合試薬であるコルヒチン（colchicine）或いはコルセミド（colcemide）を終濃度1μMになるように添加し、32℃で培養した。10%血清を含む培地で培養2日後に抗M抗体及び抗HN抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したM蛋白及びHN蛋白の細胞内局在を観察した。ステレオ立体画像で示した。
図１６は、M蛋白及びHN蛋白の細胞内局在に及ぼす微小管脱重合試薬の効果を示す写真である。A-10細胞にSeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPをm.o.i.1で感染し、直後に微小管の脱重合試薬であるcolchicineを終濃度1μMになるように添加し、32℃或いは37℃で培養した。10%血清を含む培地で培養2日後に抗M抗体及び抗HN抗体を利用して免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を利用して観察したM蛋白及びHN蛋白の細胞内局在を観察した。ステレオ立体画像で示した。
図１７は、EGFP遺伝子を有するM欠失型SeVゲノムcDNAの構築スキームを示す図である。
図１８は、F及びM両欠失型SeVゲノムcDNAの構築スキームを示す図である。
図１９は、構築したFおよび/またはM欠失型SeV遺伝子の構造を示す図である。
図２０は、hygromycin耐性遺伝子を有するM遺伝子発現プラスミドの構築スキームを示す図である。
図２１は、クローニングしたM（及びF）蛋白を誘導発現する細胞について、Cre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（AcCANCre）を感染後、Western-blottingによるM及びF蛋白の半定量的な発現比較を示す写真である。
図２２は、ヘルパー細胞（LLC-MK2/F7/M）クローン#18及び#62を用いたM欠失型SeV（SeV18+/ΔM-GFP）のウィルス再構成を示す写真である。
図２３は、SeV18+/ΔM-GFPのウィルス生産性（CIUとHAUの経時変化）を示す図である。
図２４は、SeV18+/ΔM-GFPのビリオン中の遺伝子構造確認の為のRT-PCRの結果を示す写真および図である。
図２５は、SeV18+/ΔM-GFPのウィルス構造を蛋白の視点から確認する為に、LLC-MK2細胞に感染後の細胞及び培養上清中のウィルス蛋白についてWestern-blottingを行い、SeV18+GFP及びSeV18+/ΔF-GFPとの比較結果を示す写真である。
図２６は、SeV18+/ΔM-GFP及びSeV18+/ΔF-GFP感染LLC-MK2細胞培養上清中のウィルス由来蛋白の定量比較（希釈系列を作製してWestern-blotting）を示す写真である。抗SeV抗体（DN-1）を用いた。
図２７は、SeV18+/ΔM-GFP或いはSeV18+/ΔF-GFPをLLC-MK2にm.o.i.3で感染し、経時的に回収した培養上清中のHA活性を示す図である。
図２８は、SeV18+/ΔM-GFP或いはSeV18+/ΔF-GFPをLLC-MK2にm.o.i.3で感染し、感染５日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
図２９は、SeV18+/ΔM-GFP或いはSeV18+/ΔF-GFPをLLC-MK2にm.o.i.3で感染し、感染５日後に回収した培養上清について、カチオニックリポソーム（Dosper）を用いてLLC-MK2にトランスフェクションした２日後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
図３０は、F1/F2の開裂部位（F蛋白質の活性化部位）のアミノ酸配列のデザインを示す図である。癌細胞で高発現しているプロテアーゼ（MMP或いはuPA）の認識配列を合成基質の配列を元にデザインした。上から順に配列番号：４０〜４４。
図３１は、Fの活性化部位を変換したM欠失型SeVベクターのcDNA構築スキームを示す図である。
図３２は、F改変M欠失型センダイウイルスベクターによるプロテアーゼ依存的細胞融合型感染を示す写真である。
LLC-MK2を用いて、Fの改変によってそのプロテアーゼ依存的に細胞融合型感染が成立しているかを確かめた。SeV/ΔM-GFP（A,B,C,J,K,L）、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFP（D,E,F,M,N,O）、SeV/F（uPA）ΔM-GFP（G,H,I,P,O,R）の各M欠失型のSeVを細胞に感染させ、同時に0.1μg/ml collagenase（Clostridium）（B,E,H）,MMP2（C,F,I）,MMP9（J,M,P）,uPA（K,N,Q）,7.5μg/ml Trypsin（L,Q,R）を加えた。4日後、蛍光顕微鏡で観察した。Fを改変していないSeV/ΔM-GFPは、trypsinを加えたLLC-MK2でのみ、感染した細胞の周りの細胞と細胞融合をおこし、細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるsynthitiumを形成した（L）。MMP分解配列をFに組み込んだSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPは、collagenase,MMP2,MMP9を加えたLLC-MK2で、細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるsynthitiumを形成した（E,F,M）。一方、urokinase-type plasminogen activator（uPA）,tissue-type PA（tPA）分解配列をFに組み込んだSeV/F（uPA）ΔM-GFPでは、trypsinで細胞融合型感染がみられ、さらに改変したことによってuPAで多核細胞であるsynthitiumを形成した（Q,R）。
図３３は、F改変M欠失型センダイウイルスベクターによる癌細胞のプロテアーゼ依存的細胞融合型感染を示す写真である。
MMP発現癌細胞株であるHT1080（A,D,G）,tPA発現株であるMKN28（B,E,H），どちらのプロテアーゼも発現していない細胞株SW620（C,F,I）を用いて、内在性のプロテアーゼ選択的に細胞融合型感染がみられるかどうか実験をおこなった。HT1080ではSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPのみ10倍以上その感染がひろがっていて（D）、tPA発現株MKN28ではSeV/F（uPA）ΔM-GFPのみが細胞融合型感染のひろがりがみられる（H）。どちらのプロテアーゼの発現もないSW620では全く感染のひろがりはみられない。
図３４は、Phorbol EsterによるMMP誘導とF改変M欠失型センダイウイルスベクターの細胞融合型感染の誘導を示す写真である。
MMP2,9の発現をgelatin分解活性がある部分が白くぬけるgelatin zymography法によって確認した（A）。レーンCが対照（control）,Tが20nM PMAによって誘導された上澄みを用いたもので、HT1080とPanc IでMMP9のバンドが確認され、MMP9が誘導されていることがわかる。MMP2は、Panc Ｉで誘導前に潜在型（latent）のMMP2が検出されているがそれは潜在型であるため活性がほとんどない。Bが示すように、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPは、MMP9誘導によって細胞融合型感染がみられることが示された。
図３５は、in vivoにおけるF改変M欠失型センダイウイルスベクターの細胞融合型感染を示す写真である。
HT1080の担癌ヌードマウスを作製した。皮下に注射後、7〜9日後に長径3mmを越えた個体を用いた。50μlのSeVを１度だけ注入した。２日後、蛍光顕微鏡にて観察した。A,D,G,Jが明視野、B,E,H,Kがそれに対応するGFPの蛍光像、C,F,I,Lはその拡大像である。SeV-GFP、SeV/ΔM-GFPは注入したまわりのみ蛍光がみられることが確認できる（パネルE,H）。それに対してSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPでは癌全体に広がることが観察された（パネルK）。拡大したものでは、SeV-GFP、SeV/ΔM-GFPが細胞１つ１つの蛍光が確認されるのに対して、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPでは細胞の形がはっきりせず細胞融合していることが示唆された。
図３６は、in vivoにおけるF改変M欠失型センダイウイルスベクターの細胞融合型感染を示す図である。図３５の写真像におけるGFPの癌全体に対する割合をNIH imageによって面積から測定した。その結果、図に示すようにSeV-GFPが10%、SeV/ΔM-GFPが20%であるのに対してSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPでは90%の感染がみられ、明らかな感染の広がりが確認された。
図３７は、担癌ヌードマウスによるF改変M欠失型SeVベクターの抗腫瘍効果を示す図である。図３５の腫瘍体積の大きさを計測した。3mm以上に発達した癌に4群のSeVを注入した。２日後、再度注入し、癌の大きさを計測した。PBS,SeV-GFP,SeV/ΔM-GFPは急速に癌が大きくなるのに対して、図３６で示したように癌全体に広がっていたSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPを注入した癌は明らかに増殖せず小さいままであった。ｔ検定によりP<0.05で有意に他の３群と比較して抗癌効果がみられた。
図３８は、F非開裂型F改変M欠失型SeVベクターの癌細胞へのプロテアーゼ発現選択的感染を示す写真である。
MMP発現株HT1080,tPA発現株MKN28,プロテアーゼをほとんど発現していないSW620で、プロテアーゼ発現による選択的感染が可能かどうか調べた。SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPはMMP発現株HT1080で感染がみられるが、tPA発現株MKN28では、感染がみられない。SeV/F（uPA）ΔM-GFPは、tPA発現株MKN28では感染がみられるが、MMP発現株HT1080では感染がみられない。
図３９は、F非開裂F改変M欠失型SeVベクターのfibroblastによるMMP3,7の誘導による感染能の獲得を示す写真である。
SW480およびWiDrを使ってin vitroでfibroblastによるMMPの誘導でF改変M欠失型SeVベクターの感染が変化するかどうか調べた。SW480,WiDrともにhuman fibroblast（hFB）をco-cultureすることによって、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPが感染するようになった（B,D）。誘導のかからないSW620ではその現象はみられない（F）。
図４０は、ヒト大動脈平滑筋細胞へのF改変M欠失型SeVベクターのMMP選択的感染を示す写真である。SeV/ΔM-GFPではtrypsinを加えることによってのみ感染が亢進するのに対して、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPではcollagenase,MMP2,MMP3,およびMMP9でその感染が亢進する。
図４１は、F改変M欠失型SeVベクターのプロテアーゼ依存的Fの開裂を示す写真である。
プロテアーゼ依存的なセンダイウイルスのF0からF1への開裂をウェスターンブロッティングによって確認した。レーン1,4,7,10がFを改変していないM欠失型SeVベクター、レーン2,5,8,11がFにMMP#2配列を挿入したM欠失型SeVベクター、レーン3,6,9,12がFにuPA配列を挿入したM欠失型SeVベクターを上記のプロテアーゼ（未処理，レーン1,2,3;0.1ng/ml MMP9,レーン4,5,6;0.1ng/ml uPA,レーン7,8,9;7.5μg/ml trypsin,レーン10,11,12）で37℃、30分間処理した。その結果、trypsinがFを改変していないM欠失型SeVベクターを、MMP9がFにMMP#2配列を挿入したM欠失型SeVベクターを、uPAがFにuPA配列を挿入したM欠失型SeVベクターをそれぞれ挿入したプロテアーゼ基質に従って、F1へ開裂させた。
図４２は、Fの細胞質ドメイン欠失変異体（cytoplasmic domain deletion mutant）の作製とHNとの同時発現による融合能の比較を示す図である。
A;センダイウイルスFタンパク質の細胞質ドメイン欠失変異体構築図。上から順に配列番号：７６〜７９。
B;Fの細胞質ドメイン欠失変異体の作製とHNとの同時発現による融合能の比較。7.5μg/ml trypsin添加LLCMK2細胞へセンダイウイルスFタンパク質のそれぞれのcytoplasmic domain deletion mutantとHNを同時発現した後、４日後、hematoxylinによって核染色し、シンシチウム形成した核の数をカウントした。
図４３は、F/HNキメラタンパクは融合能を飛躍的に上昇させることを示す図である。
A:F/HNキメラタンパク構造図。図中のリンカー配列は配列番号：８０とした。
B:F/HNキメラタンパクはLinkerの挿入によって融合能が上昇する。7.5μg/ml trypsin添加したLLCMK2細胞へそれぞれのセンダイウイルスF/HNキメラタンパクとHNを同時発現させた。
図４４は、F/HNキメラタンパクのF開裂部位へのMMP基質配列の挿入の概略を示す図および写真である。
A:MMP基質配列を挿入したF改変F/HNキメラタンパクの構築図。上から順に配列番号：８１〜８９。
B;MMP発現細胞HT1080へのF改変F/HNの発現によるシンシチウム形成。
図４５は、Fペプチド（Fusion peptide）改変と濃度依存的シンシチウム形成への影響を示す図である。
A:Fusion peptide改変構築図。上から順に配列番号：９０〜９３。
B:MMP#2,#6,#6G12Aのcollagenase（Clastridium）添加濃度による融合能。
図４６は、改良型F改変M欠失型センダイウイルスのゲノム構造を示す図である。
図４７は、MMP発現量の低い癌においての改良型F改変M欠失型センダイウイルスの広がりを示す写真である。改良型F改変M欠失型センダイウイルス感染２日後の細胞融合のひろがりを示す。
図４８は、癌細胞株におけるMMP2およびMMP9の発現を示す写真である。癌細胞株の上清のGelatin zymographyを示す。
図４９は、MMP発現量の低い癌においての改良型F改変M欠失型センダイウイルスの広がりを示す図である。感染２日後の0.3cm2あたりのシンシチウム数の比較を示す。「ΔM」はSeV18+/ΔM-GFP、「#2」はSeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFP、「#6」はSeV/F（MMP#6）ΔM-GFP、「#6ct14」はSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）ΔM-GFP、「F/HNキメラ」はSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HNΔM-GFPを表す。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は全て本明細書の一部として組み込まれる。
１．粒子形成能を低下または欠損させたSeVベクターの構築
［実施例１］温度感受性変異導入SeVゲノムcDNAの構築
M遺伝子に温度感受性変異を導入したSeVゲノムcDNAの構築を行った。下記記載のcDNA構築のスキームを図１に表した。F欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したF欠失型センダイウィルス全長ゲノムcDNA（pSeV18+/ΔF-GFP：Li,H.-O.et al.,J.Virology 74,6564-6569（2000）,WO00/70070）をNaeIで消化し、M遺伝子を含む断片（4922bp）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、QIAEXII Gel Extraction System（QIAGEN,Bothell,WA）で回収し、pBluescript II（Stratagene,La Jolla,CA）のEcoRVサイトにサブクローニングした（pBlueNaeIfrg-ΔFGFPの構築）。M遺伝子への温度感受性変異導入はこのpBlueNaeIfrg-ΔFGFP上で、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）を利用してKitに記載の方法に従って行った。M遺伝子上への変異導入の種類はKondoらが報告しているCl.151 strain（Kondo,T.et al.,J.Biol.Chem.268:21924-21930（1993））の配列を利用し、G69E,T116A及びA183Sの３箇所の変異導入を行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、G69E（5’-gaaacaaacaaccaatctagagagcgtatctgacttgac-3'／配列番号：１１，5'-gtcaagtcagatacgctctctagattggttgtttgtttc-3'／配列番号：１２）、T116A（5’-attacggtgaggagggctgttcgagcaggag-3'／配列番号：１３，5'-ctcctgctcgaacagccctcctcaccgtaat-3'／配列番号：１４）及びA183S（5'-ggggcaatcaccatatccaagatcccaaagacc-3'／配列番号：１５，5'-ggtctttgggatcttggatatggtgattgcccc-3'／配列番号：１６）である。
M遺伝子上に３箇所の変異を有するpBlueNaeIfrg-ΔFGFPをSalIで消化後ApaLIで部分消化を行い、全M遺伝子を含むフラグメント（2644bp）を回収した。一方でpSeV18+/ΔF-GFPをApaLI/NheIで消化してHN遺伝子を含む断片（6287bp）を回収し、この２種の断片をLitmus38（New England Biolabs,Beverly,MA）のSalI/NheIサイトにサブクローニングした（LitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFPの構築）。HN遺伝子への温度感受性変異導入はこのLitmusSalI/NheIfrg-MtsΔFGFP上で、M遺伝子への変異導入時と同様にQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kitを利用してKitに記載の方法に従って行った。HN遺伝子上への変異導入の種類はThompsonらが報告しているts271 strain（Thompson,S.D.et al.,Virology 160:1-8（1987））の配列を利用し、A262T,G264R及びK461Gの３箇所の変異導入を行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、A262T/G264R（5'-catgctctgtggtgacaacccggactaggggttatca-3'／配列番号：１７，5'-tgataacccctagtccgggttgtcaccacagagcatg-3’／配列番号：１８）、及びK461G（5'-cttgtctagaccaggaaatgaagagtgcaattggtacaata-3'／配列番号：１９，5’-tattgtaccaattgcactcttcatttcctggtctagacaag-3'／配列番号：２０）である。今回はM或いはHN遺伝子への変異導入を別々のベクター上で行ったが、pSeV18+/ΔF-GFPをSalI/NheIで消化し得られるM及びHN遺伝子を含むフラグメント（8931bp）をLitmus38のSalI/NheIサイトにサブクローニングして得られるプラスミド（LitmusSalI/NheIfrg-ΔFGFP）を利用して、M及びHN遺伝子への全変異を導入することは可能である。このようにして順次変異導入を行い、M遺伝子上に３箇所、HN遺伝子上に３箇所の計６箇所の温度感受性変異を導入した（LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFPの構築）。
LitmusSalI/NheIfrg-MtsHNtsΔFGFPをSalI/NheIで消化して回収したフラグメント（8931bp）と、またpSeV18+/ΔF-GFPをSalI/NheIで消化して回収したM及びHN等遺伝子を含まないフラグメント（8294bp）をライゲーションして、M及びHN遺伝子に６箇所の温度感受性変異を有し、F欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したF欠失型センダイウィルス全長ゲノムcDNA（pSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP）を構築した（図２）。
更に、搭載遺伝子発現量の定量を行う為に、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を搭載したcDNAの構築も行った。即ち、SEAP遺伝子の下流に終止シグナル-介在配列-開始シグナルを有するSEAP断片（WO00/70070）をNotIで切り出し（1638bp）、電気泳動後回収・精製し、pSeV18+/ΔF-GFP及びpSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPのNotIサイトに組み込んだ。それぞれ、pSeV18+SEAP/ΔF-GFP及びpSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPとした（図２）。
［実施例２］温度感受性変異導入ウィルスの再構成と増幅
ウィルスの再構成はLiらの報告（Li,H.-O.et al.,J.Virology 74.6564-6569（2000）,WO00/70070）に従って行った。F欠失型ウイルスを再構成させるため、F蛋白のヘルパー細胞を利用した。当該ヘルパー細胞作製にはCre/loxP発現誘導システムを利用している。当該システムはCre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドpCALNdLw（Arai,T.et al.,J.Virol.72:1115-1121（1988））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにCre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（AxCANCre）をSaitoらの方法（Saito,I.et al.,Nucl.Acid.Res.23,3816-3821（1995）,Arai,T.et al.,J.Virol.72,1115-1121（1998））で感染させて挿入遺伝子を発現させる。SeV-F蛋白の場合、F遺伝子を有する同トランスフォーマント細胞をLLC-MK2/F7と記載し、AxCANCreで誘導後F蛋白を持続発現している細胞をLLC-MK2/F7/Aと記載することにする。
温度感受性変異導入ウィルスの再構成は以下のように行った。LLC-MK2細胞を5×106cells/dishで100mmのシャーレに播き、24時間培養後、ソラレン（psoralen）と長波長紫外線（365nm）で20分間処理したT7ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（PLWUV-VacT7：Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126（1986））を室温で１時間感染させた（m.o.i.2）。細胞を血清を含まないMEMで洗浄した後、プラスミドpSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP,pGEM/NP,pGEM/P,pGEM/L及びpGEM/F-HN（Kato,A.et al.,Genes Cells 1,569-579（1996））をそれぞれ12μg,4μg,2μg,4μg及び4μg/dishの量比でOpti-MEM（Gibco-BRL,Rockville,MD）に懸濁し、1μg DNA/5μL相当のSuperFect transfection reagent（Qiagen,Bothell,WA）を入れて混合し、室温で15分間放置後、最終的に3% FBSを含むOpti-MEM 3mLに入れ、細胞に添加して培養した。5時間培養後血清を含まないMEMで２回洗浄し、40μg/mLのCytosine β-D-arabinofuranoside（AraC：Sigma,St.Louis,MO）及び7.5μg/mLのTrypsin（Gibco-BRL,Rockville,MD）を含むMEMで培養した。24時間培養後、8.5×106cells/dishあたりにF蛋白を持続発現する細胞（LLC-MK2/F7/A：Li,H.-O.et al.,J.Virology 74.6564-6569（2000）,WO00/70070）を重層し、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含むMEMで更に２日間37℃で培養した（P0）。これらの細胞を回収し、ペレットを2mL/dishあたりのOpti-MEMに懸濁した。凍結融解を３回繰り返した後、ライゼートをそのままLLC-MK2/F7/Aにトランスフェクションし、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含み血清を含まないMEMを用い32℃で培養した（P1）。５〜７日後培養上清の一部をとり、新たに調製したLLC-MK2/F7/Aに感染させ、同40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含み血清を含まないMEMを用い32℃で培養した（P2）。３〜５日後に新たに調製したLLC-MK2/F7/Aに再度感染させ、7.5μg/mLのTrypsinのみを含み血清を含まないMEMを用い32℃で３〜５日間培養した（P3）。回収した培養上清に終濃度1%になるようにBSAを添加し-80℃にて保存した。保存ウィルス液を解凍し、その後の実験に供した。
この方法で調製した各ウィルス溶液のタイターはSeV18+/ΔF-GFP,SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP,SeV18+SEAP/ΔF-GFP及びSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPでそれぞれ、3×108,7×107,1.8×108及び8.9×107GFP-CIU/mL（GFP-CIUの定義はWO00/70070に記載）であった。なお、GFPを搭載したベクターについては、GFPの蛍光で直接的にカウントして定量したCIUがGFP-CIUと定義される。GFP-CIUは、CIUと実質的に同じ値を示すことが確認されている（WO00/70070）。これらのタイターを測定する際、SeV18+/ΔF-GFP及びSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPについて、F蛋白を持続発現する細胞（LLC-MK2/F7/A）に感染後のプラークの広がりを32℃及び37℃で饒察した。感染６日後の写真を図３に示したが、SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPは32℃ではある程度プラークの広がりがあるものの37℃では激減しており、ビリオン形成の減少が示唆された。
［実施例３］ウィルス再構成における培養温度（32℃）の効果
実施例２で示した温度感受性導入ウィルスの再構成実験において、P1以降の温度を32℃で行った。これは温度感受性変異を導入するにあたって変異の参考にしたウィルスが32℃での生育が良い（Kondo,T.et al.,J.Biol.Chem.268:21924-21930（1993）,Thompson,S.D.et al.,Virology 160:1-8（1987））ことから試みたものであるが、当該実験条件を詳細に観察することで、SeV再構成にあたっては（温度感受性変異導入ウィルス以外でも）、P1以降で32℃で行うことで再構成効率が上昇し、従来取れ難かったものでも回収できるようになる可能性が高いことが明らかになった。
32℃でウィルス再構成効率が上昇する理由として２点考えられる。まず、ワクシニアウィルスの増幅を抑制する為に添加しているAraCによる細胞毒性が、32℃での培養の方が抑制されていると考えられる点である。再構成時の条件である、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含み血清を含まないMEMを用いてLLC-MK2/F7/Aを培養した場合、37℃では3-4日後で既に細胞障害が惹起され剥がれた細胞が増えてくるのに対し、32℃で培養した場合は7-10日は十分に培養継続が可能であり細胞が維持されている。転写複製効率の良くない或いは感染性ビリオン形成効率の良くないSeVを再構成する場合、培養継続期間は再構成の可否に直接反映されると考えられる。２点目は32℃で培養した場合にはLLC-MK2/F7/AにおけるF蛋白の発現が維持されている点である。F蛋白を持続発現する細胞（LLC-MK2/F7/A）を6wellプレートに10% FBSを含むMEMでコンフルエントになるまで37℃で培養後、7.5μg/mLのTrypsinを含み血清を含まないMEMに置換し32℃或いは37℃で培養し、経時的にセルスクレーパーで細胞を回収した後、抗F抗体（マウスモノクローナル）を利用したWestern-blottingを行うことで、細胞内のF蛋白質を半定量的に解析した。37℃では２日間は発現が維持されているもののそれ以降は減少していたが、32℃では少なくとも８日間はF蛋白の発現が維持されていた（図４）。この点からも32℃での再構成（P1以降）の有効性が確認された。
上記Western-blottingは以下の方法で行った。6wellプレートの1wellから回収した細胞を-80℃で凍結保存後、1xに希釈したSDS-PAGE用サンプルバッファー（Red Loading Buffer Pack;New England Biolabs,Beverly,MA）100μLで溶解し、98℃で10分間加熱した。遠心後、上清10μLをSDS-PAGEゲル（マルチゲル10/20；Daiichi Pure Chemicals Co.,Ltd,Tokyo,Japan）にロードした。15mMで2.5時間泳動後、PVDF膜（Immobilon PVDF transfer membrane;Millipore,Bedford,MA）にセミドライ法にて100mAで１時間転写した。転写膜をブロッキング溶液（Block Ace;Snow Brand Milk Products Co.,Ltd,Sapporo,Japan）で4℃１時間以上放置した後、10% Block Aceを含み抗F抗体を1/1000容量添加した一次抗体溶液に浸し、4℃で一晩放置した。0.05% Tween20を含むTBS（TBST）で３回、更にTBSで3回洗浄した後、10% Block Aceを含みHRPを結合した抗マウスIgG+IgM抗体（Goat F（ab'）2 Anti-Mouse IgG+IgM,HRP;BioSource Int.,Camarillo,CA）を1/5000容量添加した二次抗体溶液に浸し、室温で１時間振盪した。TBSTで３回、TBSで3回洗浄した後、化学発光法（ECL western blotting detection reagents;Amersham pharmacia biotech,Uppsala,Sweden）により検出した。
［実施例４］温度感受性変異導入ウィルスの２次放出粒子定量（HA assay,Western-Blotting）
SeV18+/ΔF-GFP,SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPと共に、全てのウィルス蛋白を有する自律複製型でNotI部位にGFP遺伝子とその下流に終止シグナル-介在配列-開始シグナルを有するGFP断片（780bp）を搭載したSeV（SeV18+GFP：図２）を用いて比較を行った。
6well plateにおいてコンフルエントに増殖させたLLC-MK2細胞に、3×107CIU/mLの各ウィルス溶液を1wellあたり100μLを添加して（m.o.i.3）１時間感染し、MEMで洗浄後、1wellあたり1mLの血清を含まないMEMを添加して32℃，37℃及び38℃の各温度で培養した。1日毎にサンプリングし、サンプリング後直ぐに血清を含まない新しいMEM1mLを添加して経時的に培養・サンプリングを行った。感染３日後に蛍光顕微鏡下でGFP発現の観察を行った所３種のウィルス共に、また32℃，37℃及び38℃の全ての条件において、ほぼ同程度に感染し、また類似したGFPの発現があると予想された（図５）。
２次放出粒子は赤血球凝集活性（HA活性）で定量し、Katoらの方法（Kato,A.et al.,Genes Cell 1,569-579（1996））に倣って行った。即ち、丸底の96穴プレートを使用し、ウィルス液を段階的にPBSで希釈し各well 50μLの2倍希釈系列を作製した。その50μLに1%濃度にPBSで希釈したニワトリ保存血（コスモバイオ，Tokyo,Japan）50μLを混合し、4℃で1時間放置し赤血球の凝集を観察し、凝集したもののうち最もウィルス希釈率の高いものの希釈率をHA活性として判定した。また、1HAUを1×106ウィルスと換算して、ウィルス数で表した（図６）。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPで２次放出粒子がかなり減少し、37℃でSeV18+/ΔF-GFPの約1/10に減少していると判断された。また、SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPは、32℃でもウィルス粒子形成は減少しているが、少ないながらもある程度は粒子がでるので、生産が可能になっていると考えられた。
別の観点からの２次放出粒子の定量として、Western-Blottingによる定量を行った。上記と同じようにLLC-MK2細胞にm.o.i.3で感染後、感染２日後に培養上清と細胞を回収し、培養上清は48,000gで45分間遠心しウィルス蛋白を回収した。SDS-PAGE後、Western-Blottingを行い、抗M抗体で検出した。抗M抗体は新たに調製したポリクローナル抗体であり、SeV-M蛋白質の1-13（MADIYRFPKFSYE+Cys／配列番号：２１），23-35（LRTGPDKKAIPH+Cys／配列番号：２２）及び336-348（Cys+NVVAKNIGRIRKL／配列番号：２３）の合成ペプチドを３種混合して免疫したウサギ血清から調製したものである。Western-Blottingは実施例３に記載の方法で行い、一次抗体の抗M抗体は1/4000希釈、二次抗体のHRPを結合した抗ラビットIgG抗体（Anti-rabbit IgG（Goat）H+L conj.;ICN P.,Aurola,OH）は1/5000容量に希釈したものを使用した。SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPでは、細胞中にはM蛋白が同程度に多く発現しているのに対しvirusの蛋白量が減少しており（図７）、Western-Blottingの手法によっても、当該ウィルスに於いて２次放出粒子が減少していることが確認された。
［実施例５］温度感受性変異導入ウィルスの搭載遺伝子発現量（SEAP assay）
SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPにおいて２次放出粒子が減少しているが、それと同時に搭載遺伝子の発現量が減少していては遺伝子発現ベクターとしては意味のない改変になってしまうので、その発現量について検証を行った。SeV18+SEAP/ΔF-GFP及びSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをLLC-MK2細胞にm.o.i.3で感染後、経時的に（感染12,18,24,50,120時間後）培養上清を回収し、上清中のSEAP活性をReporter Assay Kit-SEAP（TOYOBO,Osaka,Japan）を利用してkitに記載の方法に従って行った。SEAP活性は両者間での差が殆どなかった（図８）。また同サンプルについて赤血球凝集活性（HA活性）を測定したが、HA活性はSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPでやはり約1/10に減少していた（図９）。また、同サンプルのウィルスを48,000gで45分間遠心しウィルス蛋白を回収した後、Western-Blottingで抗M抗体を利用して半定量的に解析した。この場合も、上清中のウィルス蛋白の減少が確認された（図１０）。温度感受性変異の導入によって、搭載遺伝子の発現量を殆ど減少することなく、２次放出粒子を約1/10に減少できたと判断された。
［実施例６］温度感受性変異導入ウィルスの細胞障害性（LDH assay）
SeV感染によって細胞が障害を受ける場合も多い。この点に関して、変異導入による影響を調べた。LLC-MK2,BEAS-2B及びCV-1細胞をそれぞれ2.5×104cells/well（100μL/well）で96well plateに播き培養した。培養にはLLC-MK2及びCV-1には10% FBSを含むMEMを、BEAS-2Bには10% FBSを含むD-MEM及びRPMI（Gibco-BRL,Rockville,MD）の１：１混合液を使用した。24時間培養後、1% BSAを含むMEMで希釈したSeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP溶液を5μL/wellで添加し感染させ、6時間後ウィルス液を含む培地を除き、10% FBSを含む或いは含まない各培地に置き換えた。FBSを含まない培地の場合は感染３日後に、FBSを含む培地の場合は感染６日後に培養上清をサンプリングし、Cytotoxicity Detection Kit（Roche,Basel,Switzerland）を利用してKitに記載の方法に従って細胞障害性の定量を行った。LLC-MK2では両者ともに細胞障害は観察されなかった。またCV-1及びBEAS-2Bにおいては、SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPの細胞障害性はSeV18+/ΔF-GFPと同等以下であると判断された（図１１）。即ち、温度感受性変異導入での２次放出粒子の抑制による細胞障害性の惹起はないと結論した。
［実施例７］２次放出粒子抑制メカニズムの検討
温度感受性変異導入によって２次粒子抑制が可能となったメカニズムの一端を調べる為に、M蛋白の細胞内局在について調べた。各SeV（SeV18+GFP,SeV18+/ΔF-GFP,SeV18+/MtsHNtsΔF-GFP）をLLC-MK2細胞にそれぞれ感染し、32℃、37℃或いは38℃で培養し2日後に抗M抗体を利用して免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法で行った。培養細胞をPBSで1回洗浄した後、-20℃に冷却したメタノールを添加し4℃で15分間固定した。PBSで3回洗浄後、2% Goat Serum及び0.1% Tritonを含むPBS溶液で室温1時間Blockingを行った。再度PBSで3回洗浄後、2% Goat Serumを含む一次抗体溶液（10μg/mL抗M抗体）で37℃30分間反応した。PBSで3回洗浄後、2% Goat Serumを含む二次抗体溶液（10μg/mL Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG（H+L）conjugate：Molecular Plobes,Eugene,OR）で37℃15分間反応した。最後にPBSで3回洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察した。自律複製型でF,HN両蛋白を有するSeV18+GFPでは、検討した何れの温度においても細胞表面でのM蛋白の濃縮像が観察された（図１２）。このようなM蛋白の濃縮像に関しては既に報告されており（Yoshida,T.et al.,Virology 71:143-161（1976））、ビリオン形成の場所を反映していると考えられている。即ちSeV18+GFPにおいては、何れの温度においてもM蛋白の細胞表面への局在が正常であり、十分量のビリオンが形成していることを示していると考えられる。一方SeV18+/ΔF-GFPでは、38℃においてM蛋白の濃縮像が極端に減少した。M蛋白はF及びHN蛋白のそれぞれのCytoplasmic tailに結合して、細胞表面へ局在すると考えられており（Sanderson,C.M.et al.,J.Virology 68:69-76（1994）、Ali,A.et al.,Virology 276:289-303（2000））、SeV18+/ΔF-GFPではその一方のF蛋白を欠失している為、M蛋白の局在に影響していると考えられる。また、SeV18+/MtsHNtsΔF-GFPではその影響が強く出て、37℃でさえM蛋白の局在に支障が出て、結果的に２次放出粒子減少に繋がったものと予想された。
［実施例８］２次放出粒子抑制メカニズムの検討（２）
細胞内におけるSeV蛋白の細胞内局在をより詳細に調べるために、共焦点レーザー顕微鏡（MRC1024;Bio-Rad Laboratories Inc.,Hercules,CA）による解析を実施した。SeV18+SEAP/ΔF-GFP及びSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをA-10細胞（ratmyoblast）にそれぞれ感染し（m.o.i.1）、32℃或いは37℃で10%血清を含むMEMで培養し、1日後及び2日後に抗M抗体及び抗HN抗体を利用して免疫染色を行った。免疫染色は以下の方法で行った。培養感染細胞をPBSで1回洗浄した後、-20℃に冷却したメタノールを添加し4℃で15分間固定した。PBSで3回洗浄後、2% Goat Serum,1% BSA及び0.1% Tritonを含むPBS溶液で室温1時間ブロッキングを行った。2% Goat Serumを含むMの一次抗体溶液（10μg/mL抗M抗体）で37℃30分間反応し、更にHNの一次抗体溶液（1μg/mL抗HN抗体（IL4-1））で37℃30分間反応した。PBSで3回洗浄後、2% Goat Serumを含む二次抗体溶液（10μg/mL Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG（H+L）conjugate及び10μg/mL Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG（H+L）conjugate：Molecular Plobes,Eugene,OR）で37℃15分間反応した。PBSで3回洗浄後、核を染色するために1/4000に希釈したTO_PRO3（Molecular Plobes,Eugene,OR）を添加後室温で15分間放置し、最後に消光を抑えるために、Slow Fade Antifade Kit（Molecular Plobes,Eugene,OR）の溶液に置換し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。感染1日後の結果を図１３に示したが、赤色がM蛋白、緑色がHN蛋白の局在を示し、共存している場合には黄色に表される。また遠赤色を色変換しているので青色が核である。SeV18+SEAP/ΔF-GFPの場合は、32℃，37℃何れの温度においても各蛋白の局在に大きな違いはなく、細胞表面へのM蛋白及びHN蛋白の局在が観察されている。一方SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPの場合は、両温度ともに各蛋白質の局在にSeV18+SEAP/ΔF-GFPの場合と比べ違いがあり、細胞表面でのM蛋白の局在がほとんどない。特に37℃の場合は、M蛋白とHN蛋白がほぼ完全に分離し、M蛋白は微小管（microtubule）の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）とも予想される部分に局在して存在している。感染後2日間培養した場合も同様の結果が得られており、特にSeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染細胞においては、M蛋白の細胞内局在に感染1日後と変化がなく（図１４）、それぞれの位置で移動が止まっているように見える。この結果によっても、温度感受性変異導入ウィルスで二次放出粒子が減少しているのは、粒子形成の中心的な役割を担っていると考えられているM蛋白の局在不全であると断定された。
また、SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染後32℃で培養した場合、M蛋白が微小管の形態に近い形で染色されている（図１３）。実際に微小管の関与を証明するために、微小管の脱重合を促進する薬剤を添加し、M蛋白（及びHN蛋白）の局在の変化を調べた。SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFPをA-10にm.o.i.１で感染後、直後に脱重合試薬であるcolchicine（Nakarai Tesque,Kyoto,Japan）或いはcolcemide（Nakarai Tesque,Kyoto,Japan）を終濃度1μM添加し、32℃で培養した。感染2日後に上述と同じ方法で、M蛋白、HN蛋白の細胞内局在を観察した。脱重合試薬を添加しない場合は、M蛋白は微小管様形態に似た分布を示した（図１３）のに対し、脱重合試薬を添加することで、その構造が壊れ、大きな繊維状構造体として検出された（図１５）。この構造は、M蛋白そのもが凝集したものか或いは脱重合した微小管の残骸にM蛋白が結合している可能性があるが、何れにしても図１３に見られる、SeV18+SEAP/MtsHNtsΔF-GFP感染後32℃で培養した場合のM蛋白は、微小管に沿って局在している可能性が高いと判断された。
上記の微小管へのM蛋白の局在が温度感受性ウィルスの特有のものか否かを調べるために、SeV18+/ΔF-GFP及びSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPの両ウィルスについて、感染後のM蛋白（及びHN蛋白）の局在変化に対する微小管脱重合試薬（colchicine）の影響を調べた。SeV18+/ΔF-GFP或いはSeV18+/MtsHNtsΔF-GFPをA-10にm.o.i.1で感染後、直後に脱重合試薬であるcolchicineを終濃度1μM添加し、32℃或いは37℃で培養した。感染2日後に上述と同じ方法で、M蛋白（及びHN蛋白）の細胞内局在を観察した。結果を図１６に示すが、両ウィルス感染細胞共に類似の現象を示した。即ち、感染後32℃で培養した場合は図１５と同様に大きな繊維状構造体として観察された。SeV18+/ΔF-GFPの場合もM蛋白は微小管と共存している可能性が示唆された。更に、37℃においては特にSeV18+/MtsHNtsΔF-GFP感染細胞において、ゴルジ体付近と予想される部位に局在して観察された。
以上の結果から、以下のことが推察される。M蛋白はゴルジ体付近で合成され、主にF及びHN蛋白のそれぞれのCytoplasmic tailに結合した状態（Sanderson,C.M.et al.,J.Virology 68:69-76（1994）、Ali,A.et al.,Virology 276:289-303（2000））で微小管に沿って（例えばキネシンのようなモーター蛋白に結合して）細胞内を移動し、細胞表面へ局在し粒子形成が達成される。温度感受性変異を導入したウィルスにおいては、32℃においては微小管に沿った細胞内移動までは正常であるが、微小管から細胞表面へ局在する段階で不具合が生じ、微小管に沿っての局在が観察されていると考えることができる。37℃においては微小管に沿った細胞内移動さえ不具合が生じ、ゴルジ体付近で局在が観察されていると捉えることができる。M蛋白質の合成の場としては、ゴルジ体付近と予想されるが、凝集が観察されるのがその付近ということであって、合成の場そのものは別である可能性がある。但し、過去の報告例によると、微小管のコンポーネントであるtubulinはSeVの転写・複製活性に関与し、転写・複製を促進することが報告されており（Moyer,S.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5405-5409（1986）;Ogino,T.et all.J.Biol.Chem.274,35999-36008（1999））、またゴルジ体は、そのtubulinが多く存在すると予想される中心体付近に局在することから微小管の中心体付近（すなわちゴルジ体付近）で合成されると予想できる。更に、SeVの変異株であるF1-R strainはM遺伝子に変異を有しているが、感染後微小管を変化させて、F1-R strainの細胞の極性に依存しない粒子形成を可能にしていると考えられている（Tashiro,M.et al.,J.Virol.67,5902-5910（1993））。即ち、tubulinに沿ったM蛋白の細胞内移動を想定することで、本実施例の結果も説明できる。このように予想されるメカニズムにおいて、M及びHN遺伝子へ当該温度感受性変異を導入することで、M蛋白の細胞内局在の不具合を生じ、結果的に二次放出粒子の減少が達成されていると判断された。
［実施例９］EGFP遺伝子を有するM欠失型SeVゲノムcDNAの構築
cDNAの構築にはM遺伝子を欠失したM欠失型センダイウィルス全長ゲノムcDNA（pSeV18+/ΔM:WO00/09700）を利用した。構築のスキームを図１７に表した。pSeV18+/ΔMのM欠失部位を含むBstEII断片（2098bp）を、予めSalI/XhoIで消化後ライゲーションしてEcoRV認識部位を欠失させたpSE280（Invitrogen,Groningen,Netherlands）のBstEIIサイトにサブクローニングした（pSE-BstEIIfrgの構築）。GFP遺伝子を有するpEGFP（TOYOBO,Osaka,Japan）をAcc65I及びEcoRIで消化しDNA blunting Kit（Takara,Kyoto,Japan）での5'末端のfill inにより末端の平滑化を行い、EcoRVで消化後BAP（TOYOBO,Osaka,Japan）処理を行ったpSE-BstEIIfrgにサブクローニングした。このEGFP遺伝子を含むBstEIIフラグメントをもとのpSeV18+/ΔMに戻し、M欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したM欠失型SeVゲノムcDNA（pSeV18+/ΔM-GFP）を構築した。
［実施例１０］M欠失複製能欠失型SeVゲノムcDNAの構築
MおよびF遺伝子の両方を欠失するSeVゲノムcDNAを構築した。下記記載の構築のスキームを図１８に表した。F欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したF欠失型センダイウィルス全長ゲノムcDNA（pSeV18+/ΔF-GFP：Li,H.-O.et al.,J.Virology 74,6564-6569（2000）,WO00/70070）のNaeI断片（4922bp）をpBluescript II（Stratagene,La Jolla,CA）のEcoRVサイトにサブクローニングして構築したpBlueNaeIfrg-ΔFGFPを用いてM遺伝子の欠失を行った。M遺伝子直後のApaLIサイトを利用してM遺伝子を切り出すようにデザインした。即ち、切り出すfragmentが6nとなるようにP遺伝子直後にApaLI認識配列を導入した。変異導入はQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）を利用してKitに記載の方法に従って行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は5’-agagtcactgaccaactagatcgtgcacgaggcatcctaccatcctca-3’／配列番号：２４，5’-tgaggatggtaggatgcctcgtgcacgatctagttggtcagtgactct-3’／配列番号：２５）である。変異導入後、ApaLIで部分消化し（37℃，5分）、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN,Bothell,WA）で回収した後そのままライゲーションを行った。再度、QIAquick PCR Purification KitでDNAを回収し、BsmI及びStuIで消化後DH5αへ形質転換してM遺伝子（及びF遺伝子）を欠失したDNA（pBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFP）を調製した。
M（及びF遺伝子）を欠失したpBlueNaeIfrg-ΔMΔFGFPをSalI及びApaLIで消化を行い、M欠失部位を含むフラグメント（1480bp）を回収した。一方でpSeV18+/ΔF-GFPをApaLI/NheIで消化してHN遺伝子を含む断片（6287bp）を回収し、この２種の断片をLitmus38（New England Biolabs,Beverly,MA）のSalI/NheIサイトにサブクローニングした（LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFPの構築）。LitmusSalI/NheIfrg-ΔMΔFGFPをSalI/NheIで消化して回収したフラグメント（7767bp）と、またpSeV18+/ΔF-GFPをSalI/NheIで消化して回収したM及びHN等遺伝子を含まないフラグメント（8294bp）をライゲーションして、M及びF遺伝子を欠失しその欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したM及びF欠失型センダイウィルス全長ゲノムcDNA（pSeV18+/ΔMΔF-GFP）を構築した。構築したM欠失型（及びM及びF欠失型）ウィルスの構造を図１９に表した。このゲノムcDNAは、所望の改変F蛋白質を含むM及びF欠失型SeVの作製に有用である。
［実施例１１］SeV-M蛋白を発現するヘルパー細胞の作製
M蛋白を発現するヘルパー細胞作製の為にCre/loxP発現誘導システムを利用した。当該システム構築のため、F蛋白のヘルパー細胞（LLC-MK2/F7細胞）作製（Li,H.-O.et al.,J.Virology 74,6564-6569（2000）,WO00/70070）において採用したCre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドpCALNdLw（Arai,T.et al.,J.Virol.72:1115-1121（1988））を利用した。
〈１〉M発現プラスミドの構築
M蛋白を発現誘導するヘルパー細胞の作出の為に、既に作製している上記LLC-MK2/F7細胞を利用し、この細胞に同システムでのM遺伝子導入を行うこととした。但し、F遺伝子導入時に使用したpCALNdLw/Fはneomycin耐性遺伝子を有している為、同細胞を利用する為には別の耐性遺伝子の導入が必須であり、まず図２０に記載のスキームでM遺伝子搭載プラスミド（pCALNdLw/M：pCALNdLwのSwaIサイトにM遺伝子導入）のneomycin耐性遺伝子をhygromycin耐性遺伝子に置き換えた。即ち、pCALNdLw/MをHincII及びEcoT22Iで消化しM遺伝子を含む断片（4737bp）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、QIAEXII Gel Extraction Systemで回収した。同時に、同pCALNdLw/MをXhoIで切断、neomycin耐性遺伝子を含まない断片（5941bp）を回収後、更にHincIIで切断し1779bpの断片を回収した。Hygromycin耐性遺伝子はpcDNA3.1hygro（+）（Invitrogen,Groningen,Netherlands）をテンプレートにhygro-5’（5’-tctcgagtcgctcggtacgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgag-3’／配列番号：２６）及びhygro-3’（5’-aatgcatgatcagtaaattacaatgaacatcgaaccccagagtcccgcctattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtc-3’／配列番号：２７）の２種のプライマーを用いてPCRを行い、QIAquick PCR Purification Kitで回収した後XhoI及びEcoT22Iで消化して調製した。これら３種の断片をライゲーションしpCALNdLw-hygroMを作製した。
〈２〉SeV-M及びF蛋白を誘導発現するヘルパー細胞のクローニング
トランスフェクションにはSuperfect Transfection Reagentを用いプロトコールに記載の方法で行った。即ち以下の方法をとった。LLC-MK2/F7細胞を5×105cells/dishで60mmシャーレに播き、10% FBSを含むD-MEMで24時間培養した。pCALNdLw-hygroMの5μgをFBS及び抗生物質を含まないD-MEMに希釈し（総量で150μL）、撹拌後Superfect Transfection Reagent 30μLを添加、再度撹拌し室温で10分間放置した。放置後、10%FBSを含むD-MEMを1mL添加し撹拌後、PBSで１回洗浄したLLC-MK2/F7細胞へこのトランスフェクション混合液を添加した。37℃，5% CO2インキュベーターで３時間培養後、トランスフェクション混合液を除去し、PBSで３回洗浄、10% FBSを含むD-MEMを5mL添加し24時間培養した。培養後、トリプシンで細胞を剥がし、96wellプレートに約5cells/wellの割り合いで希釈し、150μg/mLのhygromycin（Gibco-BRL,Rockville,MD）を10% FBS入りのD-MEMで約２週間培養した。単一の細胞から広がったクローンを6wellプレートまで拡大培養した。このようにして調製した合計130クローンについて以下解析を行った。
〈３〉SeV-M及びF蛋白を誘導発現するヘルパー細胞クローンの解析
得られた130種のクローンについて、M蛋白の発現量をWestern-blottingで半定量的に解析した。各クローンを6wellプレートに播き、ほぼコンフルエントの状態で、5% FBSを含むMEMで希釈したCre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（AxCANCre）をSaitoらの方法（Saito,I.et al.,Nucl.Acid.Res.23,3816-3821（1995）,Arai,T.et al.,J.Virol.72,1115-1121（1998））でm.o.i.5で感染させた。32℃で２日間培養後、培養上清を除去しPBSで１回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がして細胞を回収した。1laneあたりこの1/10量をアプライしてSDS-PAGEを行った後、抗M抗体を利用して実施例３及び４に記載の方法でWestern-blottingを行った。130クローンの中で比較的M蛋白の発現量の多かったものに関して、抗F抗体（f236：Segawa,H.et al.,J.Biochem.123,1064-1072（1998））を利用したWestern-blottingの結果と併せて図２１に記載した。
［実施例１２］SeV-M蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の評価
実施例１１でクローニングしたSeV-M蛋白を誘導発現するヘルパー細胞を用いてM欠失型SeV（SeV18+/ΔM-GFP）のウィルス再構成を実施し、これらの細胞クローンのウイルス産生能を評価した。SeV18+/ΔM-GFPのP0 lysateを各クローンに添加し、GFP蛋白の広がりが観測されるか（M蛋白のトランス供給が達成されるか）否かについて検証した。P0 lysateの調製は以下のように行った。LLC-MK2細胞を5×106cells/dishで100mmのシャーレに播き、24時間培養後、PLWUV-VacT7を室温で１時間感染させた（m.o.i.2）。細胞を血清を含まないMEMで洗浄した後、プラスミドpSeV18+/ΔM-GFP,pGEM/NP,pGEM/P,pGEM/L,pGEM/F-HN及びpGEM/Mをそれぞれ12μg,4μg,2μg,4μg,4μg及び4μg／dishの量比でOpti-MEMに懸濁し、1μg DNA／5μL相当のSuperFect transfection reagentを入れて混合し、室温で15分間放置後、最終的に3% FBSを含むOpti-MEM 3mLに入れ、細胞に添加して培養した。5時間培養後血清を含まないMEMで２回洗浄し、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含むMEMで培養した。24時間培養後、8.5×106cells／dishあたりにLLC-MK2/F7/Aを重層し、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含むMEMで更に２日間37℃で培養した（P0）。これらの細胞を回収し、ペレットを2mL／dishあたりのOpti-MEMに懸濁、凍結融解を３回繰り返えしてP0 lysateを調製した。一方で10種のクローンを24wellプレートに播き、ほぼコンフルエントの時にAxCANCreをm.o.i.5で感染し、感染後32℃で２日間培養した細胞を準備した。この細胞にSeV18+/ΔM-GFPのP0 lysateを各200μL/wellでトランスフェクションし、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含み血清を含まないMEMを用い32℃で培養した。#18及び#62のクローンでSeV18+/ΔM-GFPによるGFP蛋白の広がりが観察された（図２２）。特に、#62の方で広がりが早く、以下の実験にはこの#62を使用した。当該細胞についてAxCANCre誘導前のものをLLC-MK2/F7/M62と記載し、誘導後のものでF及びM蛋白を持続発現しているものをLLC-MK2/F7/M62/Aと記載することにする。LLC-MK2/F7/M62/Aを利用してSeV18+/ΔM-GFPの調製を継続し、P2の感染６日後に9.5×107,P4の感染５日後に3.7×107 GFP-CIUのウィルスを調製した。
本実験において、実施例３に示すように、P1以降を32℃などの低温で培養することがSeV18+/ΔM-GFPのウィルス回収にとって非常に重要と考えられた。SeV18+/ΔM-GFPにおいてM蛋白を発現細胞（LLC-MK2/F7/M62/A）からトランスに供給していることが原因と考えられるが、感染の広がりが非常に遅くP1の感染７日後でようやく広がりが見られた（図２２）。即ち、当該ウィルスの再構成実験においても、「P1以降を32℃で培養する」ことが転写複製効率の良くない或いは感染性ビリオン形成効率の良くないSeVを再構成する場合に非常に有効であることを支持している。
［実施例１３］SeV-M蛋白を誘導発現するヘルパー細胞を用いたウイルス生産条件の検討
上記のウィルスの生産性の面での検討も行った。LLC-MK2/F7/M62/Aを6well plateに播き37℃で培養した。ほぼコンフルエントの状態で32℃に移行させ、１日後にSeV18+/ΔM-GFPをm.o.i.0.5で感染し、経時的に培養上清を回収し新たな培地を添加した。回収した上清についてCIUとHAUを求めた。感染４〜６日後で最も多くのウィルスが回収された（図２３）。HAUは感染６日後以降も維持されているが、この時点では細胞障害性が強く出ており、ウィルスパーティクル由来では無く、細胞断片に結合している或いは遊離しているHA蛋白による活性が出ているものと予想された。即ち、ウィルスを回収するには感染５日後までの培養上清を回収することが好ましいと考えられる。
［実施例１４］M欠失型SeVのウィルスの構造確認
SeV18+/ΔM-GFPのウィルス遺伝子をRT-PCRで、ウィルス蛋白をWestern-blottingで確認した。RT-PCRはP2の感染６日後のウィルスを利用した。ウィルス溶液からのRNAの回収はQIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN,Bothell,WA）を利用し、またcDNA調製はThermoscript RT-PCR System（Gibco-BRL,Rockville,MD）を利用して、両システムともに添付のプロトコールに記載の方法で行った。cDNA調製時のプライマーにはキットに添付のrandom hexamerを使用した。また、RNAからの産物であることの確認として、reverse transcriptaseの有無で同反応を行った。調製したcDNAをテンプレートとしてP遺伝子上のF3593（5’-ccaatctaccatcagcatcagc-3'／配列番号：２８）とF遺伝子上のR4993（5’-ttcccttcatcgactatgacc-3’／配列番号：２９）の組み合わせと、同じくP遺伝子上のF3208（5’-agagaacaagactaaggctacc-3'／配列番号：３０）とR4993の組み合わせの２種でPCRを行った。SeV18+/ΔM-GFPの遺伝子構造から予想されたように、前者及び後者からそれぞれ1073bp及び1458bpの増幅が観察された（図２４）。reverse transcriptase無し（RT-）の場合は当該遺伝子の増幅はなく、またGFP遺伝子ではなくM遺伝子が挿入している場合（pSeV18+GFP）はそれぞれ1400bp及び1785bpなので明らかに大きさが異なり、本ウィルスはM欠失型の遺伝子構造であることを支持した。
Western-blottingにより蛋白側からの確認を行った。SeV18+/ΔM-GFP（図中ΔM），SeV18+/ΔF-GFP（図中ΔF）及びSeV18+GFP（図中18+）をm.o.i.3でLLC-MK2に感染し、感染３日後に培養上清と細胞を回収し、培養上清は48,000gで45分間遠心しウィルス蛋白を回収した。SDS-PAGE後、Western-Blottingを行い、抗M抗体、抗F抗体及び主にNP蛋白を認識するDN-1抗体（ラビットポリクローナル）で検出した。実施例３及び実施例４に記載の方法で行った。SeV18+/ΔM-GFP感染細胞ではM蛋白が観測されずF或いはNPは観測されたことから、蛋白側からもSeV18+/ΔM-GFPの構造であることが確認された（図２５）。この時、SeV18+/ΔF-GFP感染細胞ではF蛋白が観測されず、SeV18+GFPでは調べた全てのウィルス蛋白質が観測された。また、培養上清のウィルス蛋白に関しては、SeV18+/ΔM-GFPにおいてはNPの観測量が非常に少なく、二次放出粒子が無いか或いは非常に少ないと予想された。
［実施例１５］M欠失型SeVの２次放出粒子の有無に関する定量的解析
実施例１４記載のようにSeV18+/ΔM-GFPをm.o.i.3でLLC-MK2に感染し、感染３日後に培養上清を回収し、0.45μm径のフィルターを通した後48,000gで45分間遠心し、回収したウィルス蛋白を用いてWestern-blottingを行い、半定量的に培養上清中のウィルス蛋白を検出した。対照としてSeV18+/ΔF-GFPを同様に感染して調製したサンプルを使用した。それぞれの希釈系列を作製しWestern-blottingを行いDN-1抗体（主にNP蛋白認識）で検出した。SeV18+/ΔM-GFP感染細胞上清中のウィルス蛋白はSeV18+/ΔF-GFP感染細胞のものの約1/100であると判断された（図２６）。また、同サンプルのHA活性はSeV18+/ΔF-GFP（64HAU）なのに対しSeV18+/ΔM-GFP（<2HAU）であった。
同実験を再度経時的に行った。即ち、SeV18+/ΔM-GFPをm.o.i.3でLLC-MK2に感染し、経時的に（一日毎に）培養上清を回収し、HA活性を測定した（図２７）。感染４日後以降に少ないながらもHA活性が観測された。但し、同サンプルについて細胞障害性の指標となるLDH活性を測定した所、SeV18+/ΔM-GFP感染細胞では感染４日後以降明らかな細胞障害性が惹起しており（図２８）、HA活性の上昇はウィルス様パーティクルに起因するのでは無く、細胞断片に結合している或いは遊離しているHA蛋白による活性が出ている可能性が高いと予想された。更に、感染５日後の培養上清について、カチオニックリポソームであるDosper Liposomal Transfection Reagent（Roche,Basel,Switzerland）を用いて検証した。即ち、培養上清100μLとDosper 12.5μLを混合し室温で10分放置後、6wellプレートにコンフルエントに培養したLLC-MK2細胞にトランスフェクションした。２日後に蛍光顕微鏡下で観察した所、二次放出粒子の存在するSeV18+/ΔF-GFP感染細胞の培養上清では、多くのGFP陽性細胞が観察されるのに対し、SeV18+/ΔM-GFP感染細胞の培養上清ではGFP陽性細胞は僅かには存在したが殆ど観察されなかった（図２９）。以上の結果より、M蛋白を欠失することで、二次放出粒子はほとんど抑制可能であると結論できた。
２．プロテアーゼ依存性トロピズムを変換した、粒子形成能を低下または欠損させたSeVベクターの構築
上記で構築したM欠損SeVの再構成系を利用して、以下のようにF蛋白質の開裂部位を改変したSeVの構築を行った。
［実施例１６］F蛋白質の活性化部位を変換したM欠失型SeVゲノムcDNAの構築
FのF1/F2の開裂部位（Fの活性化部位）に癌細胞で高発現しているプロテアーゼの認識配列を導入したM欠失型SeVゲノムcDNAを構築した。MMP-2及びMMP-9の合成基質として利用されている配列を元にした様々な配列、及びuPAの基質を元にした配列をデザインした。図３０には、MMP-2及びMMP-9の基質として利用されている合成基質の配列（Netzel-Arnett,S.et al.,Anal.Biochem.195,86-92（1991））を元にし、または新たに修正を加えてデザインした２種の配列［PLG↓MTS（配列番号：３）およびPLG↓LGL（配列番号：３１）；以下、これらの配列を有するF蛋白をそれぞれF（MMP#2）及びF（MMP#3）と表す］、MMPの合成基質に共通の３アミノ酸配列PLGのみを導入した配列（以下、同配列を有するF蛋白をF（MMP#4）と表す）及びuPAの基質VGR（配列番号：６）を元にした配列（以下、同配列を有するF蛋白をF（uPA）と表す）の４種の配列のデザインが示されている。
着目しているMMP（MMP-2及びMMP-9）に、より選択的に作用するように実際のデザインを行う場合、市販されている合成基質の配列とともに基質特異性を詳細に検討した報告（Turk,B.E.et al.,Nature Biotech.19（7）661-667（2001）;Chen,E.I.et al.,J.Biol.Chem.277（6）4485-4491（2002））を参考にすることが出来る。特にMMP-9に関しては、Pro-X-X-Hy-（Ser/Thr）のP3からP2’までのコンセンサス配列（X=全ての残基，Hy=疎水性残基）が提唱されている（Kridel,S.J.et al.,J.Biol.Chem.276（23）20572-20578（2001））。そこで、F（MMP#2）については、このコンセンサス配列に合致するように、元の合成基質の配列PLG↓MWSから本デザインのPLG↓MTSに新たにデザインを行っている。
遺伝子構築のスキームを図３１に示した。M欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したM欠失型センダイウイルス全長ゲノムcDNA（pSeV18+/ΔM-GFP）をSalI及びNheIで消化し、F遺伝子を含む断片（9634bp）をアガロース電気泳動で分離、該当するバンドを切り出し、QIAEXII Gel Extraction System（QIAGEN,Bothell,WA）で回収し、LITMUS38（New England Biolabs,Beverly,MA）のSalI/NheIサイトにサブクローニングした（LitmusSalI/NheIfrgΔM-GFPの構築）。F遺伝子への変異導入はこのLitmusSalI/NheIfrgΔM-GFP上で、QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）を利用してKitに記載の方法に従って行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、F（MMP#2）への変換のためには5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'（配列番号：３２）および5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'（配列番号：３３）、F（MMP#3）への変換には5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3'（配列番号：３４）および5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'（配列番号：３５）、F（MMP#4）への変換には5’-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3'（配列番号：３６）および5’-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3'（配列番号：３７）、及びF（uPA）への変換には5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCCCgtGggGAGATTCTTCGGTGCTGTGATTG-3'（配列番号：３８）および5’-CAATCACAGCACCGAAGAATCTCccCacGGGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3'（配列番号：３９）である。小文字表記が変異導入塩基を示している。
F遺伝子上に目的の変異を有するLitmusSalI/NheIfrgΔM-GFPをSalI/NheIで消化して、F遺伝子を含むフラグメント（9634bp）を回収した。一方で、F欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したF欠失型センダイウイルス全長ゲノムcDNA（pSeV18+/ΔF-GFP：Li,H.-O.et al.,J.Virol.74,6564-6569（2000）,WO00/70070）をSalI及びNheIで消化しNP遺伝子を含む断片（8294bp）に、合成オリゴDNAを利用してマルチクローニングサイトを導入したプラスミド（pSeV/ΔSalINheIfrg-MCS：PCT/JP00/06051）を、SalI及びNheIで消化してフラグメント（8294bp）を回収した。この両フラグメントをライゲーションし、F（MMP#2）、F（MMP#3）或いはF（MMP#4）の遺伝子（MMPで活性化されるようにデザインしたF遺伝子）を有するM欠失型SeV cDNA（pSeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFP、pSeV18+/F（MMP#3）ΔM-GFP或いはpSeV18+/F（MMP#4）ΔM-GFP）、及びF（uPA）の遺伝子（uPAで活性化されるようにデザインしたF遺伝子）を有するM欠失型SeV cDNA（pSeV18+/F（uPA）ΔM-GFP）を構築した。
［実施例１７］Fの活性化部位を変換したM欠失型SeVベクターの再構成と増幅ウイルスの再構成はLiらの報告（Li,H.-O.et al.,J.Virol.74.6564-6569（2000）,WO00/70070）に従って行った。M欠失型であるので、M蛋白をトランスに供給することが可能な上記のヘルパー細胞（実施例１１）を利用した。当該ヘルパー細胞作製にはCre/loxP発現誘導システムを利用している。当該システムはCre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドpCALNdLw（Arai,T.et al.,J.Virol.72:1115-1121（1988））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにCre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルス（AxCANCre）をSaitoらの方法（Saito,I.et al.,Nucl.Acid.Res.23,3816-3821（1995）,Arai,T.et al.,J.Virol.72,1115-1121（1998））で感染させて挿入遺伝子を発現させた（実施例１１および１２参照）。
Fの活性化部位を変換したM欠失型SeVの再構成は以下のように行った。LLC-MK2細胞を5×106cells/dishで100mmのシャーレに播き、24時間培養後、ソラレン（psoralen）と長波長紫外線（365nm）で20分間処理したT7ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（PLWUV-VacT7：Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126（1986））を室温で１時間感染させた（MOI 2）。細胞を無血清のMEMで洗浄した後、プラスミドpSeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFP（或いはpSeV18+/F（MMP#3）ΔM-GFP、pSeV18+/F（MMP#4）ΔM-GFP、またはpSeV18+/F（uPA）ΔM-GFP）,pGEM/NP,pGEM/P,pGEM/L（Kato,A.et al.,Genes cells 1,569-579（1996））及びpGEM/F-HN（Li,H.-O.et al.,J.Virology 74.6564-6569（2000）,WO00/70070）をそれぞれ12μg,4μg,2μg,4μg及び4μg／dishの量比でOpti-MEM（Gibco-BRL,Rockville,MD）に懸濁し、1μg DNA／5μL相当のSuperFect transfection reagent（Qiagen,Bothell,WA）を入れて混合し、室温で15分間放置後、最終的に3% FBSを含むOpti-MEM 3mLに入れ、細胞に添加して培養した。5時間培養後血清を含まないMEMで２回洗浄し、40μg/mLのCytosine β-D-arabinofuranoside（AraC：Sigma,St.Louis,MO）及び7.5μg/mLのTrypsin（Gibco-BRL,Rockville,MD）を含むMEMで培養した。24時間培養後、8.5×106cells／dishあたりにM蛋白質を持続発現する細胞（LLC-MK2/F7/M62/A）を重層し、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含むMEMで更に２日間37℃で培養した（P0）。これらの細胞を回収し、ペレットを2mL／dishあたりのOpti-MEMに懸濁した。凍結融解を３回繰り換えした後、ライゼートをそのままLLC-MK2/F7/M62/Aにトランスフェクションし、40μg/mLのAraC、7.5μg/mLのTrypsin及び50U/mLのcollagenase type IV（ICN,Aurola,OH）を含み血清を含まないMEMを用い32℃で培養した（P1）。３〜１４日後培養上清の一部をとり、新たに調製したLLC-MK2/F7/Aに感染させ、40μg/mLのAraC、7.5μg/mLのTrypsin及び50U/mLのcollagenase type IVを含み血清を含まないMEMを用い32℃で培養した（P2）。３〜１４日後に新たに調製したLLC-MK2/F7/M62/Aに再度感染させ、7.5μg/mLのTrypsin及び50U/mLのcollagenase type IVを含み血清を含まないMEMを用い32℃で３〜７日間培養した（P3）。回収した培養上清に終濃度1%になるようにBSAを添加し-80℃にて保存した。保存ウイルス液を解凍し、その後の生産及びin vitro実験に供した。
また、M蛋白をトランスに供給するヘルパー細胞として、LLC-MK2/F7/M62に、更に同システム（pCALNdLw：Arai,T.et al.,J.Virol.72:1115-1121（1988））のSeV-M遺伝子（及びSeV-F遺伝子）を導入し、細胞のクローニングを継続することで、より高いタイターでのM欠失型SeVベクターを調製可能なヘルパー細胞（LLC-MK2/F7/M62-#33）の作出に成功した。この細胞を用いて調製した場合、F遺伝子に変異を導入していないM欠失型SeVベクター（SeV18+/ΔM-GFP）を1×108GFP-CIU/mL（GFP-CIUの定義はWO00/70070に記載）以上のタイターで調製することが可能となった。尚、同細胞を利用した場合、SeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFP及びSeV18+/F（uPA）ΔM-GFPの場合もともに1×108GFP-CIU/mL以上のタイターでの調製が可能であった。
同様の方法で再構成を行った場合、SeV18+/F（MMP#3）ΔM-GFP及びSeV18+/F（MMP#4）ΔM-GFPについてはウィルス粒子を回収することが出来なかった。これらのものについてもウィルス粒子を回収するには、更に再構成の条件を検討しなければならないが、同じ条件で回収出来なかったことから、F（MMP#3）及びF（MMP#4）においては、F1/F2開裂部位（F蛋白の活性化部位）のデザイン上に問題があり、例えば開裂効率が悪い、或いは開裂後のF蛋白の活性が弱い等の影響が出ている可能性がある。逆に、F（MMP#2）のデザインで高タイターのウィルス粒子が回収できたことから、このデザインであれば、開裂効率が良く、開裂後のF蛋白の活性にも影響しない良いデザインであると考えられた。
［実施例１８］Fの活性化部位を変換したM欠失型SeVベクターのin vivo用サンプル調製
in vivo検討用各種M欠失型SeVベクターの調製は、超遠心でウイルス粒子をpellet downする簡易精製法で行った。LLC-MK2/F7/M62-#33を6well plateでほぼコンフルエントに増殖した後、AxCANCreをMOI 5で感染し、感染後32℃で２日間培養した。この細胞にSeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFP或いはSeV18+/ΔM-GFPをMOI 0.5で感染し、SeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFPの場合は7.5μg/mLのTrypsin及び50U/mLのcollagenase type IVを含み血清を含まないMEM（1mL/well）で、SeV18+/ΔM-GFPの場合は7.5μg/mLのTrypsinのみを含み血清を含まないMEM（1mL/well）中で、３日間32℃で培養した。各6well分をまとめて上清を回収後、2,190gで15分間遠心し、回収した上清を内径0.45μmフィルターでろ過し、更に40,000gで30分間遠心した。pelletをPBS 500μLで懸濁し精製ウイルス溶液とした。このようにして調製したM欠失型SeVベクターのタイターは、SeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFP及びSeV18+/ΔM-GFPでそれぞれ、1.3×109及び4.5×109GFP-CIU/mLであった。実施例１７および１８で作製したウイルスはF蛋白質が開裂されており感染性を有する。このようなSeVをF開裂型SeVまたは感染型SeVと呼ぶ。また、以下SeV18+/ΔM-GFP、SeV18+/F（MMP#2）ΔM-GFP、及びSeV18+/F（uPA）ΔM-GFPを、それぞれSeV/ΔM-GFP、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFP、SeV/F（uPA）ΔM-GFPとも略記する。
［実施例１９］F改変M欠失型SeVベクターのプロテアーゼ依存的感染および細胞融合型感染の評価方法
Exogenous experiment
細胞系に外からプロテアーゼを添加する感染手順をExogenous experimentと呼ぶ。以下の実施例において行ったexogenous experimentの基本的な手順を示す。これと異なる条件で行った場合はそれぞれの実施例において記載した。96well plateにLLC-MK2をconfluent（5×105cell/well）になるように培養した。MEMで２回洗浄後、SeV［F開裂型:1×105CIU/mlもしくはF非開裂型:1×107particles/ml（HA換算；実施例２５参照）］含有MEMを50μl加え、感染させた。同時に同量50μlのプロテアーゼ含有MEMを加えた。37℃で培養した。４日後、蛍光顕微鏡にて感染のひろがりを観察した。また、1mm2の細胞あたりのGFPの発現している細胞をカウントした。プロテアーゼは、collagenase（collagenase type IV）はICN Biomedicals Inc社、MMP2（active MMP2）,MMP3,MMP7,MMP9（active MMP9）、およびプラスミンは、コスモバイオ社より購入して使用した。
Endogenous experiment
細胞系に外からプロテアーゼを添加せず、細胞が発現するプロテアーゼにより感染を成立させる感染手順をEndogenous experimentと呼ぶ。以下の実施例において行ったendogenous experimentの基本的な手順を示す。これと異なる条件で行った場合はそれぞれの実施例において記載した。96well plateに各癌細胞をconfluent（5×105cell/well）になるように培養した。MEMで２回洗浄後、SeV［F開裂型:1×105CIU/mlもしくはF非開裂型:1×107HAU/ml（実施例２５参照）］含有MEMを50μl加え、感染させた。この時、培地には終濃度１％となるようにFBSを添加した。４日後、蛍光顕微鏡にて感染のひろがりを観察した。また、1mm2の細胞あたりのGFPの発現している細胞をカウントした。
［実施例２０］F改変M欠失型センダイウイルスベクターによるプロテアーゼ依存的細胞融合型感染（Exogenous experiment）
プロテアーゼをほとんど発現していないLLC-MK2細胞を用いて、Fの改変によってそのプロテアーゼ依存的に細胞融合型感染が成立しているかを上記のExogeneous experimentにより確かめた（図３２）。SeV/ΔM-GFP、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFP、SeV/F（uPA）ΔM-GFPの３種類のM欠失型のSeV（実施例１７）を細胞に感染させ、同時にそれぞれ0.1μg/mlのcollagenase type IV（Clostridium histolyticum）,active MMP2,active MMP9,またはuPA,あるいは7.5μg/ml Trypsinを加えた。4日後、蛍光顕微鏡で観察した。Fを改変していないSeV/ΔM-GFPは、trypsinを加えたLLC-MK2でのみ、感染した細胞の周りの細胞と細胞融合をおこし、細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるsynthitiumを形成した（図３２L）。MMP分解配列をF蛋白質に組み込んだSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPは、collagenase,active MMP2,active MMP9を加えたLLC-MK2で細胞融合型感染がみられ、多核細胞であるsynthitiumを形成した（図３２E,F,M）。一方、urokinase-type plasminogen activator（uPA）,tissue-type PA（tPA）分解配列をF蛋白質に組み込んだSeV/F（uPA）ΔM-GFPでは、trypsin存在下で細胞融合型感染がみられ、さらにF蛋白質を改変したことによってuPAで多核細胞であるsynthitiumを形成した（図３２Q,R）。これは、それぞれのプロテアーゼ分解基質配列をF蛋白質に組み込むことによって、M欠失型SeVは、その分解基質配列依存的に細胞融合型感染をして、接している細胞に感染が広がっていくことを示している。
［実施例２１］癌細胞株のMMP発現特異的な細胞融合型感染（Endogenous experiment）
MMP発現癌細胞株であるHT1080（ヒト線維芽肉腫）（Morodomi,T.et al.（1992）Biochem.J.285（Pt 2）,603-611），tPA発現株であるMKN28（ヒト胃癌細胞株）（Koshikawa,N.et al.（1992）Cancer Res.52,5046-5053），どちらのプロテアーゼも発現していない細胞株SW620（ヒト大腸癌株）を用いて、内在性のプロテアーゼ選択的に細胞融合型感染がみられるかどうか、実施例１７で作製したSeVを用いてEndogenous experimentにより実験を行った。これらの癌細胞のうち、MKN28は理化学研究所（Cell No.RCB1000）より、またHT1080（ATCC No.CCL-121），およびSW620（ATCC No.CCL-227），並びに以下の実施例で使用するSW480（ATCC No.CCL-228）,WiDr（ATCC No.CCL-218）,Panc-1（ATCC No.CRL-1469）は、ATCC（American type culture collection）より分与されたものを用いた。培地はそれぞれ分与先で用いられている培地を用いた。この時、全ての培地に終濃度１％となるようにFBSを添加した。図３３で示すように、MMP発現株HT1080ではSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPのみ10倍以上その感染がひろがっていて、tPA発現株MKN28ではSeV/F（uPA）ΔM-GFPのみが細胞融合型感染のひろがりがみられる。どちらのプロテアーゼの発現もないSW620では全く感染のひろがりはみられない。
［実施例２２］Phorbol EsterでのMMP誘導による細胞融合型感染
癌細胞はその周りに存在する増殖因子などによって生体内ではMMPが誘導されていることが報告されている。その現象はPhorbol Esterであるphorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）によってin vitroで再現することが可能である。このMMP発現の誘導が再現された条件における感染を調べるために、PMAによってMMP2の活性化とMMP9の誘導が知られているPanc I（膵臓癌株）を用いて、F改変M欠失型SeVベクターの細胞融合型感染の有無を調べた（Zervos,E.E.et al.（1999）J.Surg.Res.84,162-167）。96well plateにPancIおよび他の癌細胞株をconfluent（5×105cell/well）になるように培養した。実施例１７で作製したSeVを用いてEndogenous experimentにより実験を行った。MEMで２回洗浄後、Moi=0.01になるように1×105CIU/mlのSeV含有MEMを50μl加え、感染させた。同量50μlの40nM phobol 12-myristate 13-acetate（Sigma）を含むMEMを加えた。この時、培地に終濃度１％となるようにFBSを添加した。
MMP2,9の誘導発現はgelatin分解活性がある部分が白くぬけるgelatin zymography法（Johansson,S.,and Smedsrod,B.（1986）J.Biol.Chem.261,4363-4366）によって確認した。具体的には、それぞれの培養の上澄みをとり、Sample bufferで溶解した。最終濃度が1mg/ml gelatinとなるようアクリルアミドに混合し、8% acrylamide gelを作製した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、10mM Tris pH 8.0,2.5% Triton X-100で洗浄した。Gelatinase活性化バッファー（50mM Tris,0.5mM CaCl2,10-6M ZnCl2）で37℃１日培養後、1%クマジプルーR-250、5%酢酸、10%メタノールで染色した（図３４上パネル）。Cが対照（control），Tが20nM PMAによって誘導された上澄みを用いたもので、HT1080とPano IでMMP9が誘導されていることがわかる。Panc Iで誘導前に潜在型のMMP2が検出されているがそれは潜在型でgelatin分解活性はほとんどないことが知られている。図３４（下パネル）が示すように、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPに感染したPanc Iは、MMP誘導によって細胞融合型感染がみられるようになることが示された。
［実施例２３］In vivoにおけるHT1080細胞株感染SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPのひろがり
HT1080の担癌ヌードマウスを作製した。BALB/c nude mouse（charles river）の右背部の皮下にヒト線維芽腫HT1080を5×106cell（1×108cell/mlを50μl）注入した。7〜9日後に長径が3mmを越えた個体を用いた。癌を楕円形とみなした体積は30〜100mm3となり、そこに以下のF開裂型SeVを50μl癌部位に１度だけ注入した:MEM（対照）（N=5）,SeV-GFP（1×108CIU/ml）を含むMEM（N=5）,SeV/ΔM-GFP（1×108CIU/ml）を含むMEM（N=7）,SeV/F（MMP#2）ΔM-GFP（1×108CIU/ml）を含むMEM（N=7）。２日後、蛍光顕微鏡にて観察した（図３５）。SeV-GFP、SeV/ΔM-GFPは注入したまわりのみ蛍光がみられることが確認できる（図３５E,H）。それに対してSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPでは癌全体に広がることが観察された（図３５K）。拡大したものでは、SeV-GFP、SeV/ΔM-GFPが細胞１つ１つの蛍光が確認されるのに対して、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPでは細胞の形がはっきりせず細胞融合していることを示唆している。また、上部から写真の像における癌全体およびGFPの発現の面積をNIH imageによってもとめた。癌全体に対するGFP発現領域の割合は、SeV-GFPが10%、SeV/ΔM-GFPが20%であるのに対してSeV/F（MMP#2）ΔM-GFP投与では90%の感染がみられ、明らかな感染の広がりが確認された（図３６）。癌以外の組織に関しては、癌細胞との境界に存在する筋膜及び皮下の結合組織に対して細胞融合型感染はほとんど観察されず、この条件では癌以外の正常組織には感染は広がらないと判断された。
［実施例２４］担癌ヌードマウスによるF改変M欠失型SeVベクターの抗腫瘍効果
図３５と同様にHT1080担癌マウスを作製した。8または9日後、腫瘍径が3mm以上の個体を選択し、以下の４群のF開裂型SeVを50μl癌部位に注入した:MEM（N=5）,SeV-GFP（1×108CIU/ml）を含むMEM（N=5）,SeV/ΔM-GFP（1×108CIU/mlを含むMEM（N=7）,SeV/F（MMP#2）ΔM-GFP（1×108CIU/ml）を含むMEM（N=7）。２日後、もう一度同量のSeVを癌部位に注入した。癌部位の大きさの長径（a）、短径（b）、厚み（c）を１日おきに計測した。腫瘍体積は、楕円形とみなし、腫瘍体積V=π/6×abcで計算した。PBS,SeV-GFP,SeV/ΔM-GFPは急速に癌が大きくなるのに対して、図３７で示したようにベクターが癌全体に広がっていたSeV/F（MMP#2）ΔM-GFP投与癌は明らかに増殖せず小さいままであった。t検定による有意差検定でもP<0.05で有意に他の３群と比較して小さいことが判明した。これは治療遺伝子を搭載していないにもかかわらず、その抗癌効果があることが示している。
［実施例２５］F非開裂/F改変M欠失型SeVベクターの作製と選択的感染
上記で用いた通常のSeVベクターの作製にはFの開裂を起こさせるために7.5μg/mlの高い濃度のトリプシンおよび50U/mlのcollagenaseがはいった培地で培養、回収し、F開裂型SeVベクターとした（実施例１７および１８参照）。ここでは、感染時のプロテアーゼ依存的な選択を実現するため、作製時にプロテアーゼを加えずにSeVを回収し、F非開裂型SeVを作製した。
具体的には、10cm dishにLLC-MK2/F7/M62/A細胞をconfluentに培養した。実施例１７で調製した各F改変M欠失型SeVをMoi=5になるように感染させた。１時間後、上澄みを取り2回MEM培地で洗浄した。4ml MEMを加え32℃で培養した。５日後、上澄みを回収し、最終濃度が1%になるようにBovine Serum Albumin（BSA）を加えた。HAU titerを測定後、使用まで-70℃で保存した。それぞれのF改変M欠失型SeVは27〜210HAU/ml（1HAU = 1×106particles/mlのウイルス粒子に換算されるので1×108〜1×109particles/mlに相当する）の間で回収され、希釈により1×108particles/mlにあわせた。
Exogeneous experimentの結果、LLC-MK2への感染が、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPは、MMP依存的に、SeV/F（uPA）ΔM-GFPは、uPAまたはtPA依存的に感染するベクターが作製できたことが確認された（exogeneous proteaseのデータは示さない）。MMP発現株HT1080，tPA発現株MKN28，プロテアーゼをほとんど発現していないSW620で、プロテアーゼ発現による選択的感染が可能かどうかをendogenous experimentにより試みた（図３８）。SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPはMMP発現株HT1080で感染がみられるが、tPA発現株MKN28では、感染がみられない。SeV/F（uPA）ΔM-GFPは、tPA発現株MKN28では感染がみられるが、MMP発現株HT1080では感染がみられない。このようにプロテアーゼ発現依存的にそれぞれのSeVが感染の選択性が示された。
［実施例２６］Human fibroblastによるMMP3,MMP7誘導によるF改変M欠失型SeVベクターの感染
SW480およびWiDrはfibroblastと共培養、もしくはin vivoでの培養によってそれぞれMMP3,MMP7が誘導されることが示されている（Kataoka,H.et al.（1997）Oncol.Res.9,101-109;Mc Donnell,S.et al.（1999）Clin.Exp.Metastasis.17,341-349）。これらの細胞を使ってin vivoでF改変M欠失型SeVベクターの感染が変化するかどうか調べた。96well plateにそれぞれの癌細胞株をconfluent（5×104cell/well）になるように培養した。MEMで２回洗浄後、1HAU/ml（1HAU=1×106particles/mlのウイルス粒子に換算して1×106particles/ml）のF非開裂型SeV含有MEMを50μl加え、感染させた。5×104cell/wellになるようにNormal human lung fibroblast（TAKARA）を加え、4日間37℃で培養した（図３９）。SW480およびWiDrは、ともにhuman fibroblastをco-cultureすることによって、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPが感染するようになった。誘導のかからないSW620ではその現象はみられない。
［実施例２７］ヒト大動脈平滑筋細胞へのF改変M欠失型SeVベクターのMMP選択的感染
MMPの発現異常の疾病は癌以外にも動脈硬化、リュウマチ、創傷治癒などで報告されている（Galis,Z.S.,and Khatri,J.J.（2002）Circ.Res.90,251-262;Martel-Pelletier,J.et al.（2001）Best Pract.Res.Clin.Rheumatol.15,805-829）。
これらの疾患への応用の可能性を示すため、ヒト大動脈平滑筋細胞へのF改変M欠失型SeVベクターのMMP選択的感染を試みた。96well plateにhuman smooth muscle cell（TAKARA）をconfluent（5×105cell/well）になるように培養した。MEMで２回洗浄後、SeV（F非開裂型:1HAU/ml（1×106particle/ml）含有MEMを50μl加え、感染させた。同量50μlのプロテアーゼ含有MEMを加え、4日間37℃で培養した。1mm2の細胞あたりのGFPの発現している細胞をカウントした（図４０）。SeV/ΔM-GFPではtrypsinを加えることによってのみ感染が亢進したのに対して、SeV/F（MMP#2）ΔM-GFPではcollagenase,MMP2,MMP3,MMP9でその感染が亢進した。
［実施例２８］F改変M欠失型SeVベクターのプロテアーゼ依存的Fの開裂
実施例２０でF改変M欠失型SeVベクターは、それぞれのプロテアーゼ分解配列をFタンパク質に組み込むことによって、M欠失型SeVは、その分解配列依存的に細胞融合型感染をすることを示した。さらに改変後にプロテアーゼ依存的にF0の開裂が起こっているかどうかウエスターンブロッティングによって確かめた。ウイルスのサンプリングは以下の方法で行った。SeV/ΔM,SeV/F（MMP#2）ΔM,SeV/F（uPA）ΔMの３種類のウイルス粒子をMOI=3でMタンパク誘導したヘルパー細胞に感染させた。感染２日後、上澄みを回収し、x18500gで３時間遠心し、その沈殿物をPBSで再けん濁した。それぞれのウイルス懸濁液に7.5μg/mlトリプシン、0.1ng/ml MMP9，0.1ng/ml uPAの最終濃度になるようにプロテアーゼを添加し、37℃、30min処理後、サンプルバッファーを加え、SDS-PAGEサンプルとした。SDS-PAGE及びウェスターンブロッティングは定法に従って行った（Kido,H.et al.Isolation and characterization of a novel trypsin-like protease found in rat bronchiolar epithelial Clara cells.A possible activator of the viral fusion glycoprotein.J Biol Chem 267,13573-9（1992））。抗F1ウサギ抗体は3つの混合合成ペプチド（FFGAVIGT+Cys:117-124,EAREAKRDIALIK:143-155,CGTGRRPISQDRS:401-413;それぞれ配列番号：４６、４７、４８）を免疫し抗血清を得た。２次抗体にはHRP標識抗ウサギIgG抗体（ICN,Aurola,OH）を用い、発色の検出には化学蛍光法（ECL Western blotting detection reagents;Amersham Biosciences.Uppsala,Sweden）を用いた。図４１には、Fを改変していないM欠失型SeVベクター（1,4,7,10），FにMMP#2配列を挿入したM欠失型SeVベクター（2,5,8,11）、FにuPA配列を挿入したM欠失型SeVベクター（3,6,9,12）を上記のプロテアーゼで37℃、30分間処理したときの結果が示されている。
図４１から分かるように、トリプシン存在下ではFを改変していないM欠失型SeVベクターで、MMP存在下ではFにMMP#2配列を挿入したM欠失型SeVベクターで、uPA存在下ではFにuPA配列を挿入したM欠失型SeVベクターで、それぞれ挿入したプロテアーゼ基質に従って、F1への開裂が起こっていた。ここには示さないがuPA配列を挿入したM欠失型SeVベクターにおいてはトリプシン存在下で、その分解時間を４時間にするとF1への開列が見られた。これは実施例２０の結果と合致し、Fの開裂依存的にシンシチウムの形成がおきていることが示された。
［実施例２９］Fの細胞質ドメイン欠失による融合能の上昇
パラミクソウイルスによる宿主への侵入はウイルスの膜と宿主側の細胞膜の融合によって成立する。その侵入機構はセンダイウイルスのHNタンパクが宿主側のシアル酸に結合し、Fタンパクが細胞膜の融合を起こす。その際、HNの結合によってFのコンフォメーションが変わることが重要であるとされている（Russell,C.J.,Jardetzky,T.S.& Lamb,R.A.Membrane fusion machines of paramyxoviruses:capture of intermediates of fusion.Embo J 20,4024-34（2001））。そのため、ほとんどのパラミクソウイルスのFタンパクは単独で細胞に発現させても細胞同士の融合能がなく、HNを同時に発現した細胞のみ融合能を持つ。パラミクソウイルスにおいてFおよびHNの細胞質ドメイン（cytoplasmic domain）を削るとその融合能が上昇する事が知られている（Cathomen,T.,Naim,H.Y.& Cattaneo,R.Measles viruses with altered envelope protein cytoplasmic tails gain cell fusion competence.J Virol 72,1224-34（1998））。センダイウイルスにおいて、どのFの細胞質ドメインの欠失変異体が融合能を最もよく上昇させるかを、欠失変異体を作製し、pCAGGS発現ベクター（Niwa,H.et al.（1991）Gene.108:193-199）に搭載した後、pCAGGS搭載HNを同時にトランスフェクションし、その融合能をシンシチウムの数によって確認した。
Fのcytoplasmic domainを削った変異体遺伝子は、以下のプライマーによって、それぞれPCRを行い、断片をXho I,Not I処理後、pCAGGSベクターにライゲーションした。Fct27 primer（5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/配列番号：４９，5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3’/配列番号：５０），Fct14 primer（5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/配列番号：５１，5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’/配列番号：５２），Fct4 primer（5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’/配列番号：５３，5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’/配列番号：５４）（Kobayashi M et al.J.Viol.,vol 77:2607,2003）。
細胞融合能の測定のため、LLCMK2もしくはHT1080細胞を24ウェルプレートへconfluentになるようにまいた。50μl Opti-MEMに対して3μl Fugene6を混合した。各pCAGGS発現プラスミドを2μgと等量のpCAGGS/EGFPを混合後、Opti-MEMとFugen6の混合液に加えた。室温で15分間放置後、500μl MEM培地に培地交換した24ウェルプレートへ添加した。37℃，5%CO2で3時間培養後、HT1080の場合1% FBS添加MEM,LLCMK2の場合7.5μg/ml Trypsinもしくは指定された濃度のcollagenase type IV（Clostridium）を添加したMEM培地へ置換した。48時間培養後、倒立顕微鏡の100倍視野あたり（0.3cm2）の融合したシンシチウムの数をカウントした。もしくは4% Paraformaldehyde固定を２時間後、70%エタノール，蒸留水置換後、５分間hematoxylin染色を行った後、水洗し、シンシチウムを形成している0.3cm2当たりの核の数をカウントした。
３種類のFの細胞質ドメインの欠失させたアミノ酸配列を図４２（A）に，その融合活性を図４２（B）に示す。図４２（B）で示すように、F単独では融合した細胞はないが、HNを共トランスフェクションすることによって融合能を示した。また、細胞質ドメインが14アミノ酸になるように28アミノ酸を削った配列のFタンパク質（Fct14）が最もその融合能が高いことが明らかになった。
［実施例３０］F/HNキメラタンパクは融合能を飛躍的に上昇させる
パラミクソウイルスのエンベロープタンパクは、細胞膜上でFは３量体で、HNは４量体を形成しており、お互いの外部ドメイン（Ectodomain）およびMタンパク質を介して相互作用していることが明らかになっている（Plemper,R.K.,Hammond,A.L.& Cattaneo,R.Measles virus envelope glycoproteins hetero-oligomerize in the endoplasmic reticulum.J Biol Chem 276,44239-46（2001））。図４２で示したようにFは単独では融合能をもたず、HNが必須である。このことよりFとHNのキメラタンパクを作製し、同じ細胞膜上に同時に融合タンパクとしてFとHNを発現させることによって、より融合能の高いベクターの作製を試みた。FはII型の膜タンパクであり、HNはI型の膜タンパクであることより、図４３（A）で示すように、２つの膜貫通ドメインを持つ細胞膜上でU字型を形成するようなキメラタンパクを作製した（Fct14/HN）。Fタンパクは融合能の高かったFct14を用いた。同時にその２つのタンパクの間に50アミノ酸からなるリンカー配列を挿入した（Fct14/Linker/HN）。このリンカー配列は現在の検索ではどのタンパクにもホモロジーを持たない配列である。（Simian immunodeficiency virus（SIVagm）のenvのcytoplasmic domainのアミノ酸配列のN末端とC末端を逆にして合成したnon-senseな配列を用いた。）
F/HNキメラタンパク遺伝子の発現プラスミドの調製方法の詳細を以下に示す。F/HNキメラタンパク遺伝子をpCAGGSベクターに搭載した。F遺伝子及びHN遺伝子についてそれぞれPCRを行い、２つの断片をpCAGGSにライゲーションした。この時、F/HN遺伝子間に150bpのリンカー遺伝子（50amino acid）を挿入したもの、しないものを作製した。以下にプライマーの配列を示す。F遺伝子プライマー（F-F:5’-ATCCGAATTCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG-3’/配列番号：５５；Fct14-R:5’-ATCCGCGGCCGCCGGTCATCTGGATTACCCATTAGC-3’/配列番号：５６）、Linker/HN遺伝子プライマー（Linker-HN-F:5’-ATCCGCGGCCGCAATCGAGGGAAGGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGAGGACGCCAACGACCCACGGGGAAAGGGGTGAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGAGGGTTAGG-3’/配列番号：５７，HN-R:5’-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCATAA-3’/配列番号：５８），HN遺伝子プライマ（5’-ATCCGCGGCCGCAATGGATGGTGATAGGGGCA-3’/配列番号：５９，5’-ATCCGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCA-3’/配列番号：６０）。
図４３（B）で示すようにリンカー配列のないキメラタンパクでは低い融合能を示すのに対してリンカーを挿入することによってFとHNを同時にトランスフェクションすることに比べて約５倍その融合活性が飛躍的に上昇することが判明した。
［実施例３１］融合能の機能維持と基質特異性
Fタンパク質が融合能を獲得するためには、HNが同時に発現するだけではなく、プロテアーゼによってFタンパク質が２つのサブユニット（F1,F2）に開裂することが不可欠である。図４２および４３ではトリプシン存在下での融合能を測定しており、トリプシンがない状態では全く融合能がない。図４３で示したFct14/Linker/HNキメラタンパクがMMP依存的に融合能を獲得するように、Fの開裂配列の改変を試みた。MMPの分解基質の配列については多くの報告があり、その中から８種類の配列に対して改変を試みた。QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）によって図４４（A）のように開裂部位のアミノ酸配列を改変した。この改変で考慮したことは、プロテアーゼによる切断後のFusion peptideの配列である。パラミクソウイルスのFタンパク質のF1のN末端領域はFusion peptideと呼ばれ、その融合活性に重要であり、その領域のアミノ酸の変異が、Fタンパク質の融合能を消失する場合があることが報告されている（Bagai,S.& Lamb,R.A.A glycine to alanine substitution in the paramyxovirus SV5 fusion peptide increases the initial rate of fusion.Virology 238,283-90（1997））。そのため重要性が指摘されているF1のN末端領域配列はそのまま残存させることにした。その場合も、MMPの分解基質として一般的な６残基配列を導入する場合には、MMPによる分解後にF1のN末端に３残基が付加されるデザインとなり、MMPによる分解は起こったとしても、F蛋白の融合能に影響を与える可能性があると推測された。則ち、MMP依存的に開裂し活性化するF蛋白のデザインを行うには、MMPによる基質特異性と共に、開裂後のF蛋白の融合能の保持という２点を考慮してデザインを行うことが必須である。
MMP#1は最もMMPの合成基質としてよく知られている配列である。この配列はその他のMMPによるターゲッティングにも用いられている配列である。MMP#3および#8も合成基質として市販されている配列である。MMP#2,6は、MMP2,9の分解基質PLGMWSの配列をファージディスプレイ（phage display）で明らかになったMMP9に対するコンセンサス配列Pro-X-X-Hy-（Ser/Thr）にしたがってPLGMTS,PQGMTSと改変した（それぞれ配列番号：６１および６２）。MMP#5はShneiderらの報告（American Society of Gene therapy,Annual meeting No.1163 2002,Boston）よりPQGLYA（配列番号：６３）とした。MMP#4は分解後のFusion peptideの配列が改変されない。MMP#7はMMP2に対するphage displayで明らかになった配列である。
以下に、F/HM融合遺伝子のFの活性化部位を改変した発現プラスミドの調製の詳細を示した。F/HN融合遺伝子を構築後、pBluscript F/HN上で、Fの活性化部位の変異を導入した。変異の導入には、QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,La Jolla,CA）を利用してKitに記載の方法に従って行った。変異導入に使用した合成オリゴの配列は、
F（MMP#1）:（5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGT GCTGTGATTGGTACTATCG-3'/配列番号：６４，5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaa CccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/配列番号：６５）、
F（MMP#2）:（5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/配列番号：３２，5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAaCTCGtCatGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/配列番号：３３）、
F（MMP#3）:（5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCCtGggGttATTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATCG-3'/配列番号：３４，5’-CGATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAATaaCccCaGGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/配列番号：３５），
F（MMP#4）:（5’-CAAAATGCCGGTGCTCCCCcGTtGgGATTCTTCGGTGCTGTGATT-3'/配列番号：３６，5’-AATCACAGCACCGAAGAATCcCaACgGGGGAGCACCGGCATTTTG-3'/配列番号：３７），
F（MMP#5）:（5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcagggCttGtatgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/配列番号：６６，5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcataCaaGccctgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/配列番号：６７）
F（MMP#6）:（5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTcaaggCatGaCGAGtTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/配列番号：６８，5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAA aCTCGtCatGccttgAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/配列番号：６９）
F（MMP#7）:（5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCctTgcTtaCtataCGgctTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/配列番号：７０，5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAagcCGtataGtaAgcAagGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/配列番号：７１）
F（MMP#8）:（5’-CTGTCACCAATGATACGACACAAAATGCCccTctTggCttGgCGAGaTTCTTCGGTGCTGTGATTGGTACTATC-3'/配列番号：７２，5’-GATAGTACCAATCACAGCACCGAAGAAtCTCGcCaaGccAagAggGGCATTTTGTGTCGTATCATTGGTGACAG-3'/配列番号：７３）
小文字表記が変異導入塩基を示している。改変後、EcoRIで切り出し、pCAGGSへライゲーションを行った。
それぞれの配列を有するベクターとEGFP遺伝子を有するベクター（pCAGGS/EGFP）を等量混合し、MMPを高発現しているHT1080にトランスフェクションした。その結果、MMP#2及び#6の配列の遺伝子を導入した時のみ細胞融合が生じ、シンシチウムを形成した（図４（B））。これらの配列に共通であるのは、プロテアーゼによる切断後、F1タンパクのN末端にHy-S/T-S/T配列（MTS）が付加されることである。このことよりHy-S/T-S/T配列（特にMTS配列）の付加であれば、HT1080由来のMMPによるF蛋白の切断と共に、開裂後のF蛋白の融合能が保持されており、これら両者の必要条件を満たしている可能性が高いと考えられる。一方、MMP#1,#3,#4,#5,,#7,および#8の場合、細胞融合が全く見られなかった。MMP#4を除くすべての配列はMMPの合成基質由来の配列なのでproteaseによる切断は生じていると予想されることから、F1に付加された３アミノ酸のペプチドが切断後のFタンパクの活性を限定している可能性が示唆された。また、MMP#4についてはこの条件ではプロテアーゼによる切断そのものが生じていない可能性が高い。その根拠として、データは示さないが、HT1080のPhorbol esterによるMMPの誘導によってMMP#4がシンシチウムの形成がみられるようになることでも明らかである。
さらにこのMMP#2,#6の配列の融合能の比較とともに#6のFusion peptide配列のN末端側から７番目と12番目の配列をGからAへ改変した配列についてMMP濃度依存的な細胞融合能を測定した（図４５）。このF/HN融合遺伝子の変異導入に使用した合成オリゴの配列は、5'-CTTCGGTGCTGTGATTGcTACTATCGCACTTGcAGTGGCGACATCAGCAC-3'（配列番号：７４）および5'-GTGCTGATGTCGCCACTgCAAGTGCGATAGTAgCAATCACAGCACCGAAG-3'（配列番号：７５）である。小文字表記が変異導入塩基を示している。発現プラスミドの調製は上記と同様に、変異を導入後にEcoRIで切り出し、pCAGGSへライゲーションすることにより行なった。
その結果、MMP#6の方がMMP#2に比較して、2-3倍融合能が高いことがわかった。重要な点はMMP#6の場合、低濃度のプロテアーゼ濃度条件下でも細胞融合が生じ、低濃度でのFタンパクの活性化が実現していることである。しかしながら、Fタンパクの融合能の上昇する変異として報告されているGからAへの変異（Peisajovich,S.G.,Epand,R.F.,Epand,R.M.& Shai,Y.Sendai virus N-terminal fusion peptide consists of two similar repeats,both of which contribute to membrane fusion.Eur J Biochem 269,4342-50（2002））をさらに導入した場合（#6G12A）、融合能が１０分の１以下に減少してしまった。これらの結果より、プロテアーゼによるトロピズムの改変のためプロテアーゼ分解配列を単に挿入するだけではFタンパクの活性を維持することができずFusion能を失う場合が多いことが明らかになった。目的とする分解配列を導入する場合、この系を用いて融合能の確認を行いウイルスを構築することが可能である。また、このpCAGGSに搭載したFct14/Linker/HNのキメラ遺伝子のみで顕著な融合活性を示すことより、このプラスミド導入による抗癌効果があること推測される。さらに、このキメラタンパクをM欠失型センダイウイルスへ搭載することによってさらなる抗癌効果の上昇が期待される。
［実施例３２］融合能を上昇させた改良型F改変M欠失型SeVゲノムcDNAの構築
実施例２９および３０においてpCAGGSベクターに搭載したFを改変することによって融合能が上昇することを示したが、同様の改変をM欠失型センダイウイルスベクターに行うことによって、融合能を上昇させた改良型F改変ΔM SeVの作製を試みた。改良型F改変M欠失型SeVゲノムcDNAの遺伝子構築を以下の方法で行った。SeV/F（MMP#6）ΔM-GFPに関しては、実施例１６と同様の方法で行った。F遺伝子への変異導入は配列番号：69のオリゴヌクレオチドを用い、LITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFP上でQuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene,LaJolla,CA）を利用してKitに記載の方法に従って行った。変異を導入したLITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFPのSal I,Nhe Ｉ消化後のフラグメントとF欠失部位にEGFP遺伝子を搭載したF欠失型センダイウイルス全長ゲノムcDNA（pSeV+18/F-GFP:Li,H et al J.Viol.74,6564-6569（2000）,WO000/70070）のSal I及びNhe Iで消化したNP遺伝子を含むフラグメントをライゲーションし、SeV/F（MMP#6）ΔM-GFPのcDNAを構築した（図４６）。Fタンパク質の細胞質ドメインの28アミノ酸を欠失させたM欠失型センダイウイルス（SeV（TDK）/Fct14（MMP#6）ΔM-GFP）およびF/HNキメラタンパクを搭載したM欠失型センダイウイルス（SeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HN ΔM-GFP）の構築はマルチクローニングサイトセンダイウイルスcDNA（pSeV（TDK）と称す）（特開2002-272465）を基本骨格とした。Fタンパク質の細胞質ドメインをtrancateしたM欠失型センダイウイルスSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）ΔM-GFPは以下のように構築した。TDKを骨格にするため、まずpSeV（TDK）/ΔM-GFPを作製した。LITMUSSalI/NheIfrgΔM-GFPを鋳型にして合成プライマー（Nhe-GFP-F:ATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG（配列番号：94）とGFP-EIS-BssHII：ATCCGCGCGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC（配列番号：95））を使ってPCRによって増幅したGFP/EIS（転写開始終結シグナルをコードするEIS配列を付加したGFP）とマルチクローニングサイトセンダイウイルスcDNAをNheI,BssHII処理をし、フラグメントをライゲーションすることによってMタンパクをGFPに置換し、pSeV（TDK）/ΔM-GFPを作製した。
さらに実施例31で作製したpCAGGS/Fct14（MMP#6）/Linker/HNを鋳型にして合成プライマーMlv-F:ATCCACGCGTCATGACAGCATATATCCAGAG（配列番号：96）、及びFct14-EIS-Sal I:ATCCGTCGACACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTAACGGTCATCT GGATTACC（配列番号：97）を使ってPCRによって増幅したFct14（MMP#6）をF遺伝子のかわりにFの位置に挿入、置換し、pSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）ΔM-GFPを構築した（図４６）。次に、F/HNキメラタンパクを搭載したM欠失型センダイウイルス（pSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HN ΔM-GFP）の構築を行った。GFPを鋳型にして合成プライマー（Nhe-GFP-F:ATCCGCTAGCCCGTACGGCCATGGTGAGCAAG（配列番号：98）とGFP-EIS-Sal I：ATCCGCTAGCCCGTACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGAGCTTTACTTGTACAGCTCGTC（配列番号：99））を使ってPCRによって増幅したGFP/EISとマルチクローニングサイトセンダイウイルスcDNAをNhe I,Sal I処理をし、フラグメントをライゲーションすることによってM遺伝子およびF遺伝子を欠失させ、GFPに置換した、pSeV（TDK）/ΔMΔF-GFPを作製した。さらに実施例31で作製したFct14（MMP#6）/Linker/HNを鋳型にして、合成プライマー（F/HN5’Nhe-F:ATCCGCTAGCAGTTCAATGACAGCATATATCCAGAG（配列番号：100），F/HN3’Nhe-EIS-R:ATCCGCTAGCACGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACTTTTAAGACTCGGCCTTGCATAA（配列番号：101））を使ってPCRによって増幅したFct14（MMP#6）/Linker/HNを上記のpSeV（TDK）/ΔMΔF-GFPのNhe I部位にライゲーションすることによってpSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HNΔM-GFPを構築した。
［実施例３３］改良型F改変M欠失型センダイウイルスの再構成と増幅
実施例３２で構築したcDNAからのウィルスの再構成はLiらの報告（Li,H.-O.et al.,J.Virology 74.6564-6569（2000）,WO00/70070）に従って行った。しかし、実施例１７と同様にM欠失型であるので、M蛋白をトランスに供給することが可能なヘルパー細胞（実施例１１）を利用した。ヘルパー細胞作製にはCre/loxP発現誘導システムを利用している。当該システムはCre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドpCALNdLw（Arai,T.et al.,J.Virol.72:1115-1121（1988））を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにCre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（AxCANCre）をSaitoらの方法（Saito,I.et al.,Nucl.Acid.Res.23,3816-3821（1995）,Arai,T.et al.,J.Virol.72,1115-1121（1998））で感染させて挿入遺伝子を発現させる。Fの活性化部位を変換したM欠失型SeVの再構成は以下のように行った。LLC-MK2細胞を5×106cells/dishで100mmのシャーレに播き、24時間培養後、ソラレン（psoralen）と長波長紫外線（365nm）で20分間処理したT7ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス（PLWUV-VacT7:Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126（1986））を室温で１時間感染させた（MOI 2）。細胞を無血清のMEMで洗浄した後、プラスミドpSeV/F（MMP#6）ΔM-GFP（或いはpSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）ΔM-GFP,pSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HN ΔM-GFP）,pGEM/NP,pGEM/P,pGEM/L（Kato,A.et al.,Genes cells 1,569-579（1996））pGEM/M及びpGEM/F-HN（Li,H.-O.et al.,J.Virology 74.6564-6569（2000）,WO00/70070）をそれぞれ12μg,4μg,2μg,4μg,4μg及び4μg／dishの量比でOpti-MEM（Gibco-BRL.Rockville,MD）に懸濁し、1μg DNA／5μL相当のSuperFect transfection reagent（Qiagen,Bothell,WA）を入れて混合し、室温で15分間放置後、最終的に3% FBSを含むOpti-MEM 3mLに入れ、細胞に添加して培養した。5時間培養後血清を含まないMEMで２回洗浄し、40μg/mLのCytosine β-D-arabinofuranoside（AraC：Sigma,St.Louis,MO）及び7.5μg/mLのTrypsin（Gibco-BRL,Rockville,MD）を含むMEMで培養した。24時間培養後、8.5×106cells／dishあたりにF蛋白を持続発現する細胞（LLC-MK2/F7/M62/A:実施例１２）を重層し、40μg/mLのAraC及び7.5μg/mLのTrypsinを含むMEMで更に２日間37℃で培養した（P0）。これらの細胞を回収し、ペレットを2mL／dishあたりのOpti-MEMに懸濁した。凍結融解を３回繰り換えした後、ライゼートをそのままLLC-MK2/F7/M62/Aにトランスフェクションし、40μg/mLのAraC、7.5μg/mLのTrypsin及び50U/mLのtype IV collagenase（ICN,Aurola,OH）を含み（pSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HN ΔM-GFPの場合trypsinのみ）血清を含まないMEMを用い32℃で培養した（P1）。３〜１４日後培養上清の一部をとり、新たに調整したLLC-MK2/F7/M62/Aに感染させ、40μg/mLのAraC、7.5μg/mLのTrypsin及び50U/mLのtype IV collagenaseを含み（pSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HN ΔM-GFPの場合trypsinのみ）血清を含まないMEMを用い32℃で培養した（P2）。３〜１４日後に新たに調整したLLC-MK2/F7/M62/Aに再度感染させ、7.5μg/mLのTrypsin及び50U/mLのtype IV collagenaseを含み（pSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HN ΔM-GFPの場合trypsinのみ）血清を含まないMEMを用い32℃で３〜７日間培養した（P3）。回収した培養上清に終濃度1%になるようにBSAを添加-80℃にて保存した。保存ウィルス液を解凍し、その後の生産及びin vitro実験に供した。
以上のように、F蛋白質開裂部位をPLGMTS（配列番号：61）からPQGMTS（配列番号：62）にしたSeV/F（MMP#6）ΔM-GFP、cytoplasmic domainを28アミノ酸削ったSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）ΔM-GFP、およびF/HNのキメラタンパクを搭載したSeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HNΔM-GFPの作製に成功した。
［実施例３４］改良型F改変M欠失型センダイウイルスベクターの融合活性の上昇
実施例３３で製造したウィルスの性能を調べるため、以下のようにMMP2およびMMP9の発現量の違う様々な癌細胞株とMMPの発現が検出されないLLCMK2へ感染させ細胞融合能を測定した（図４７）。各種癌細胞（HT1080,U87MG,A172,U251,SW480,LLCMK2）を供与先より指示された培地で24well plateへconfluentになるようにまいた。U87MG（ATCC NO.HTB-14）,A172（ATCC No.CRL-1620）はATCCより購入した。U251（IFO50288）はJCRB cell bankより購入した。MEM培地で２回洗浄後、それぞれのM欠失型センダイウイルスベクター（SeV/ΔM-GFP）をMOI=0.1で感染させた。室温で１時間放置後、MEM培地で洗浄し、0.5mlの1%FBS添加MEMを24well plateに加えた。48時間培養後、倒立顕微鏡の100倍視野あたり（0.3cm2）の融合したシンシチウムの数をカウントした。もしくは4%Paraformaldehydeを使用して2時間固定処理を行なった後、70%エタノール、蒸留水置換後、５分間hematoxylin染色を行い、水洗後、シンシチウムを形成している0.3cm2当たりの核の数をカウントした。結果を図４９に示した。
MMP2,9の発現は実施例２２で行ったgelatin zymographyによって確かめた（図４８）。その結果、HT1080,U87MG,A172でMMP2の発現が確認された。またU251とSW480で低いMMP9の発現が確認された。LLCMK2でMMP2の発現があるようにみえるのは1%血清を含んでいるため、血清中のMMP2の活性が見えている。それぞれの癌細胞株に感染後２日後、GFPの広がりを観察した。その結果、従来型のSeV/F（MMP#2）ΔM-GFPでは広がらなかったU251,SW480において改良型F改変M欠失型センダイウイルスベクターにおいて、特にF/HNキメラタンパクを搭載したM欠失型センダイウイルスベクター（SeV（TDK）/Fct14（MMP#6）/Linker/HNΔM-GFP）で融合活性がみられるようになった。データでは示さないが、マウス肺癌Lewis lung carcinoma，およびマウス大腸癌colon 26においても、同様に改良型にすることによって、M欠失型センダイウイルスベクター感染後、融合活性が見られるようになり、改良型にすることによってさらなる効果の増大と低い濃度のMMP量の癌にも効果が期待される。
産業上の利用の可能性
本発明により、所望のプロテアーゼ存在下で特異的に感染を広げるベクターが提供された。本発明のベクターはウイルス様粒子を有意に産生せず、細胞融合により隣接する周囲の細胞にベクターを伝達する。従って、本発明のベクターは、目的とする組織の局所に限局してベクターを感染させるために有用である。特に本発明により癌特異的に感染を広げるベクターが提供された。このベクターは、腫瘍増殖に対する強い抑制作用を持っている。本発明のベクターを用いた癌の遺伝子治療は、副作用の少ない新たな癌治療として高い可能性を持っている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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