(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌から成る共生菌において、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌であって、代謝によってカノクラビンを蓄積することを特徴とする共生菌。
【請求項２】
共生菌が天然に存在する植物中から分離されたＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌であることを特徴とする請求項１に記載の共生菌。
【請求項３】
共生菌が生工研寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４の内の何れか１種または２種以上の菌であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の共生菌。
【請求項４】
カノクラビンをマーカーとして、植物病原菌等に感染していない植物体から単離した共生菌であって、代謝によってカノクラビンを蓄積する共生菌をスクリーニングすることを特徴とする共生菌のスクリーニング方法。
【請求項５】
カノクラビンをマーカーとして、薄層クロマトグラフィによってスクリーニングすることを特徴とする請求項４に記載の共生菌のスクリーニング方法。
【請求項６】
カノクラビンをマーカーとして、液体クロマトグラフィによってスクリーニングすることを特徴とする請求項４に記載の共生菌のスクリーニング方法。
【請求項７】
代謝によってカノクラビンを蓄積するＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から成る共生菌を人工的に導入したイネ科植物。
【請求項８】
共生菌が天然に存在する植物中から分離されたＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌であることを特徴とする請求項７に記載のイネ科植物。
【請求項９】
共生菌を人工的に導入した植物がイネ科植物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの何れかであることを特徴とする請求項７または請求項８に記載のイネ科植物。
【請求項１０】
請求項７〜請求項９の何れかのイネ科植物から採取された後代種子。
【請求項１１】
請求項１０の種子から生育したイネ科植物。
【請求項１２】
天然に存在する植物体からＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から成る共生菌を分離する工程と、
分離された共生菌を人工培養する工程と、
培養された共生菌を対象とするイネ科植物に導入する工程と、
導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、
感染された共生菌が代謝によってカノクラビンを蓄積する植物体を選抜する工程と、
を具備する植物体への共生菌の導入方法。
【請求項１３】
天然に存在する植物体中からＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から成る共生菌を分離する工程と、
分離された共生菌を人工培養する工程と、
培養された共生菌が代謝によってカノクラビンを蓄積する共生菌を選抜する工程と、
選抜された共生菌を対象とするイネ科植物に導入する工程と、
導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、
を具備する植物体への共生菌の導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法に係るものである。とくに本発明は、カノクラビンを最終的な代謝物質とする共生菌、すなわちエンドファイトおよびこのようなエンドファイトを牧草等に利用可能な植物に感染・共生させるようにした植物とその方法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
例えば特開平５−３１７０９２号公報には、ペレニアルライグラスから誘導した植物体、例えばカルス中にエンドファイトが共生しているかどうかを検定し、エンドファイトが共生していないことを確認したカルスにエンドファイトを導入した後に、植物体を再生するようにしたペレニアルライグラスへのエンドファイトの人工導入方法が開示されている。
【０００３】
ここで共生菌、すなわちエンドファイトは植物組織内に共生する糸状菌であって、このような糸状菌が感染した植物体は、共生していない個体に比べて害虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速度、暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上することが知られている。このことから、エンドファイトの人工的な感染が、植物に対する形質の改善につながる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
植物体に感染させて共生することが可能な共生菌は、図１に示すような代謝物質を順次生合成する。そしてこのような代謝の最終物質として、エルゴバリンやエルゴタミンのようなエルゴペプチンが生合成される。
【０００５】
またイネ科植物に感染共生するエンドファイトの場合には、感染した植物はエルゴットアルカロイドによって毒性を示すことが知られている。このような毒性は、畜産業の分野では家畜毒性として問題視されている。とくに牧草の分野において、ペレニアルライグラスやトールフェスク等のエンドファイトに感染した牧草が流通し、エルゴットアルカロイド等が原因とする中毒が報告されている。
【０００６】
ライグラススラッガーは１９０６年にニュージーランドで最初に報告され、ニュージーランドとオーストラリアのオセアニア２国で主に発生している。夏から秋にかけての乾燥の厳しさで枯れあがった状態のペレニアルライグラスにエンドファイトが感染している場合には、この牧草を羊等の家畜が摂食した場合にライグラススラッガーが発生する。
【０００７】
ライグラススラッガーの症状は、摂食した家畜が四肢を硬直させ、首や肩、さらには側腹部を震わせるようになる。すなわち一種の痙攣であって、この状態が続くとやがて家畜はその身体が衰弱していき、最悪の場合には動けなくなって餓死することがある。これまでにその原因物質が、ロリトレムアルカロイドであるロリトレムＢであることが判明している。
【０００８】
フェスクトキシコーシスは、主にアメリカ合衆国南東部で発生した。トールフェスクを摂食した牛の体重が著しく減少し、牧草を十分に食べなくなったり、産乳量が低下したり、受胎率が低下する症状を現わすことが特徴である。その原因として、牛が摂食した牧草にエンドファイトが感染しており、エンドファイト感染個体からエルゴットアルカロイドであるエルゴバリンが特異的に検出された。そしてエルゴバリンがフェスクトキシコーシスを引起す原因物質であることが明らかになった。
【０００９】
このように植物、とくに牧草として用いられる植物にエンドファイトを感染させることによって、害虫に対する抵抗性、病原菌に対する抵抗性、生育速度、暑さや乾燥等の環境ストレスに対する抵抗性が向上する反面、家畜に対して有毒な物質をエンドファイトが生合成し、ライグラススラッガーやフェスクトキシコーシス等の原因になるという問題がある。
【００１０】
本発明はこのような問題点に鑑みてなされたものであって、植物の形質が改善されるとともに、牧草に応用した場合において有毒物質を生合成することがないようにした共生菌、このような共生菌を人工的に導入した植物、および共生菌を人工的に導入するようにした共生菌の導入方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
共生菌それ自体に関する発明は、糸状菌から成る共生菌において、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌であって、代謝によってカノクラビン（ｃｈａｎｏｃｌａｖｉｎｅ）を蓄積する共生菌に関するものである。ここで天然に存在する植物中から分離された共生菌がＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌であってよい。また共生菌が生工研寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４の内の何れか１種または２種以上の菌であってよい。
【００１２】
共生菌のスクリーニング方法に関する発明は、カノクラビンをマーカーとして、植物病原菌等に感染していない植物体から単離した共生菌であって、代謝によってカノクラビンを蓄積する共生菌をスクリーニングするようにした共生菌のスクリーニング方法に関するものである。ここでカノクラビンをマーカーとして、薄層クロマトグラフィあるいは液体クロマトグラフィによってスクリーニングするようにしてよい。
【００１３】
植物に関する発明は、代謝によってカノクラビンを蓄積するＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から成る共生菌を人工的に導入したイネ科植物に関するものである。ここで共生菌が天然に存在する植物中から分離されたＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌であってよい。また共生菌を人工的に導入した植物がイネ科植物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍの何れかであってよい。またこのようなイネ科植物から採取される後代種子であってよい。また後代種子から生育したイネ科植物であってよい。
【００１４】
共生菌の導入方法に関する一発明は、天然に存在する植物体からＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から成る共生菌を分離する工程と、分離された共生菌を人工培養する工程と、培養された共生菌を対象とするイネ科植物に導入する工程と、導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、感染された共生菌が代謝によってカノクラビンを蓄積する植物体を選抜する工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に関するものである。
【００１５】
共生菌の導入方法に関する別の発明は、天然に存在する植物体中からＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から成る共生菌を分離する工程と、分離された共生菌を人工培養する工程と、培養された共生菌が代謝によってカノクラビンを蓄積する共生菌を選抜する工程と、選抜された共生菌を対象とするイネ科植物に導入する工程と、導入された共生菌によって植物体に感染させる工程と、を具備する植物体への共生菌の導入方法に関するものである。
【００１６】
共生菌のアルカロイドの代謝は図１に示される。このような代謝の中間物質としてカノクラビン（ｃｈａｎｏｃｌａｖｉｎｅ）が存在する。カノクラビンは図２に示す化学構造を有するクラビンアルカロイドの一種で各種の薬理効果を示すことが知られている。そしてこのようなカノクラビンから、エルゴットアルカロイド等のエルゴバリンを生産する。ところが本願発明者等が探索した共生菌の中には、エルゴットアルカロイドを生合成せず、カノクラビンを最終的な代謝物質として生産するものが存在した。そして最終的な代謝物質がカノクラビンである共生菌は、エルゴバリン毒性を示さない。従ってこのような共生菌を植物に感染・共生せることによって、エルゴバリン毒性を示さない植物を提供できるようになる。
【００１７】
本願発明は、カノクラビンを最終的な代謝物質として生合成する共生菌に着目し、このような共生菌を植物体に導入前または導入後にスクリーニングし、植物体に感染させるようにしたものである。とくにイネ科植物に感染・共生する共生菌として、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌が挙げられる。
【００１８】
このような糸状菌を利用することによって、カノクラビンを最終代謝物質として生合成する糸状菌が植物に感染・共生されることになり、エルゴバリン毒性を示さないでしかも形質が改善された植物が作出される。またカノクラビンを最終代謝物質として生合成する糸状菌に感染した植物は、カノクラビンを生体内に大量に蓄積するために、またカノクラビンをマーカーとしてスクリーニングすることによって、エルゴバリンやロリトレムＢを生合成しない菌を提供することが可能になる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の実施の形態は、カノクラビンを特異に生合成するエンドファイト感染個体の提供と、カノクラビンをマーカーとして、エルゴットアルカロイドおよびロリトレムＢを生合成しないエンドファイトのスクリーニングとを含むものである。以下にこの実施の形態をその手順に従って説明する。
【００２０】
段階１      エンドファイトの存在の有無の検出と分離工程
（１）エンドファイトの検出工程
探索等によって採取した植物の葉および葉鞘部分の表皮を剥ぎ、アニリンブルー染色液に入れて染色し、組織内のエンドファイトを光学顕微鏡下において検出し、エンドファイトの存在の有無の確認を行なう。
【００２１】
（２）エンドファイトの分離・培養工程
エンドファイトが確認された植物片を滅菌処理後に、エンドファイト分離培地へ置床し、数ヵ月間培養を行なう。
【００２２】
（３）エンドファイトの分類工程
分離されたエンドファイトを宿主によって分類する。あるいはまた平板培養法を用いて環境条件を変化させた状態で培養を行ない、形態的な特徴で分類する。また液体培養を行ない、形態的な特徴で分類する。またスライドカルチャーを行ない、形態的な特徴で分類する。
【００２３】
段階２      エンドファイトの導入工程
分離したエンドファイトを目的あるいは対象とするイネ科植物であるＡｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｏａの何れかの属の植物へ人工的に導入する。エンドファイトの導入方法は、植物体に直接接種する方法、植物体を一度カルス等の未分化の細胞にした後に接種し、カルスから植物体を再生させる方法とがある。これらはエンドファイトの導入の対象となる植物の種類に応じて任意に選択されてよい。
【００２４】
段階３      導入確認工程
エンドファイトを導入した個体は、外植片を染色液にて染色し、光学顕微鏡下において顕鏡し、さらに酵素免疫測定法を用いてエンドファイトの存在あるいは感染の有無を検出する。
【００２５】
段階４      エンドファイト導入植物の検定工程
（１）カノクラビンの検出工程
エンドファイトを感染・共生させた植物体内で生合成されるアルカロイドを分析し、カノクラビン、エルゴットアルカロイドおよびロリトレムＢの検出を行なう。
【００２６】
（２）カノクラビンの同定工程
エンドファイトに感染共生させた植物体内で特異に大量に生合成されかつ蓄積されるアルカロイドがカノクラビンかどうかによって、最終的な代謝物質がカノクラビンであるかどうかの同定を行なう。
【００２７】
（３）耐虫性検定工程
エンドファイトを感染・共生させた植物を用いて、害虫の対象となる昆虫を飼育し、人工的に食害試験を行なう。
【００２８】
（４）後代を用いた検定
エンドファイトが存在する種子を採取し、発芽させてエンドファイトの存在を確認後、上述の各検定を行なう。
【００２９】
段階５      エンドファイトの人工培地上でのカノクラビンの生合成工程
（１）エンドファイトの培養工程
分離されたエンドファイト菌単体を平板培養法あるいは液体培養法を用いて環境条件を変化させた状態で培養を行ない、アルカロイドを生合成させる。
【００３０】
（２）培養物からカノクラビンを検出する工程
菌単体を培養した培養物から生合成されたアルカロイドを分析し、カノクラビン、エルゴットアルカロイド、およびロリトレムＢの検出を行なう。
【００３１】
段階６      カノクラビンをマーカーとするエンドファイトのスクリーニング工程
菌単体もしくは植物体への感染・共生において、エルゴットアルカロイドおよびロリトレムＢを生合成せず、カノクラビンのみを生合成しているエンドファイトをスクリーニングする。
【００３２】
次に本発明の別の実施の形態について説明する。上記の段階１〜段階６の実施の形態においては、エンドファイトに感染・共生させた植物体内で生合成されるアルカロイドを分析することによって、感染された共生菌がカノクラビンを最終代謝物質として生合成する共生菌であるかどうかの同定を行なうようにしているが、このようなステップに代えて、共生菌が植物に人工的に導入される前に、上記の同定を行なうようにする。
【００３３】
すなわちこの実施の形態においては、探索等によって採取した植物から分離されたエンドファイトを培養した後に、このエンドファイトのアルカロイドを分析し、カノクラビンを最終的な代謝物質とする共生菌であるかどうかの同定を行なうものである。すなわち上記第１の実施の形態とは、カノクラビンによる同定の工程の順序が植物体への導入の前に行なわれる点で相違する。なおその他の手順は上記第１の実施例と同じである。
【００３４】
【実施例】
実施例１
（１）菌の分析
植物体からのエンドファイトの分離は、葉および葉鞘部分を水洗後、７０％エタノール水溶液に１０秒間浸漬し、次いで２．５％次亜塩素酸トリウム水溶液に１０分間浸漬した後に、滅菌水で３回洗滌し、エンドファイト分離培地上に置床し、２５℃暗条件下で培養を行なった。
【００３５】
分離培地は、ｐＨ５．６に調整したＰＤＡ（ポテト  デキストロース  アガー）培地を１２１℃、１５分間で滅菌後、ペニシリンとストレプトマイシンとをそれぞれ１００ｍｇ／ｌの濃度になるように添加し、直径が９ｃｍのプラスチックシャーレに２０ｍｌずつ分注して使用した。
【００３６】
置床後約３〜８週間後に、外植片から菌糸が分離され、形成されたコロニーを直径が５ｍｍのコルクボーラで取出し、同ＰＤＡ培地およびコーンミール寒天培地に移植して増殖を行なった。
【００３７】
（２）平板培養法による菌叢でのエンドファイトの分類同定
ＰＤＡ培地に移植した菌糸は、２５℃の暗条件下において培養し、形成される菌叢を調査した。調査の結果、培地上での菌叢の表面は総て白色の綿状であって、菌叢の裏面も白色であった。増殖速度は比較的遅く、コロニーは１カ月で半径が約３ｃｍ程度にまでしか増殖しなかった。コーンミール寒天培地では、ＰＤＡ培地と比べてさらに生育が著しく遅く、１カ月で半径が約１ｃｍ程度の増殖であった。コロニーの形態については、ＰＤＡ培地とほぼ同様であった。
【００３８】
分離したエンドファイトを工業技術院生命工学技術研究所へ寄託した。菌の表示および寄託番号は次の通りである。
【００３９】
ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２
ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３
ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４
（３）スライドカルチャーによる菌糸の状態
スライドガラス上に厚さが２〜３ｍｍのＰＤＡ培地を載せ、その上で菌糸を増殖させて菌糸の形態と分生子の形成とを調査した。なおこの培養は２５℃暗条件下において行なった。結果の１例を図３に示す。
【００４０】
調査の結果、菌糸は総て無色であって、幅が１〜２μｍ程度で総てに隔壁が観察された。分生子は、総てのエンドファイトで容易に形成することが可能であった。また分生子の菌糸の先端あるいは側方より直立した単生のフィアライドの先端に形成され、ほとんどが単生の分生子であった。
【００４１】
分生子の色は総て無色で、細胞も１細胞性であった。分生子の形状はほとんどが腎臓形の形状をなし、大きさは３〜８×１〜３μｍであった。また形成されたフィアライドは、総て円筒形で、先端に行くに従って細くなり、隔壁によって菌糸から区切られていた。
【００４２】
（４）エンドファト導入方法
接種は水に０．８％のＡｇａｒを添加したＷＡ培地（Ｗａｔｅｒ  Ａｇａｒ培地）に種子を滅菌して播種し、暗条件下で培養した。培養開始から３〜７日後に、植物体の生長点部分にメスで切込みを入れ、ＰＤＡ培地で培養した菌糸を挿入した。
【００４３】
これらを２５℃および３０℃の暗条件下で８日間培養した後に、１５℃、１６時間照明下に移して４日間培養し、さらに２５℃、１６時間照明下に移して２日以上培養し、緑色に生長してきた個体を鉢上げ馴化した。
【００４４】
植物の葉および葉鞘部分の表皮を剥ぎ、光学顕微鏡下において組織内のエンドファイトの有無の確認を行なった。この確認は、スライドガラスに乳酸５ｍｌ、グリセリン１０ｍｌ、水５ｍｌ、アニリンブルー水溶液０．０２ｇの染色液を数滴滴下する。そして葉鞘部分を剥がし、裏面表皮をピンセットで葉脈方向に向って剥いだ。剥ぎ取った表皮をスライドガラスの上に置き、カバーガラスで覆い、ガスバーナの炎で沸騰させ、光学顕微鏡下において組織を観察した。この条件でエンドファイトが存在すれば菌糸が青色に呈色するために、これによってエンドファイトの検出が行なわれる。
【００４５】
検出の結果、イネ科植物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍのそれぞれの属の植物からエンドファイトが検出された。そして菌のライフサイクルから、植物体外へ出ることがない無性世代のみのＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ型エンドファイトであることが判明した。
【００４６】
接種したエンドファイトの内、生工研寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４の菌株がイネ科植物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍのそれぞれの属の植物に感染・共生することが明らかであることが確認されている。
【００４７】
（５）カルスを用いた人工接種
人工接種用の試料として、イネ科植物であって、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍのそれぞれのカルスの誘導を行なった。ＭＳ基本培地に２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシン酢酸）と０．２ｍｇ／ｌのＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン）を添加し、これらの植物のカルス誘導培地とした。
【００４８】
ＭＳ培地において発芽直後の種子をカルス誘導培地へ移植し、２５℃の暗条件下において２カ月間培養することにより、再分化能を有するカルスを得た。各カルスは上記の誘導培地で誘導したものであって、得られたカルスを植物ホルモン無添加のＭＳ基本培地へ移植した。
【００４９】
これらの植物のカルスに対して、生工研寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４のそれぞれの菌を人工接種した。人工接種はメスの先に微量の菌糸を取り、カルスの中央に置床した。
【００５０】
カルスは２５℃および３０℃の暗条件下においてそれぞれ数週間培養した後に、１６時間照明下に移すか、あるいは直ちに１６時間証明下に移して培養し、再生したできた個体をフレッシュなＭＳ培地に移植し、１カ月間培養した。これらを上記（１）項の方法を用いてエンドファイトの導入を確認した結果、導入が確認された。
【００５１】
（６）植物体内でカノクラビンを特異的に生合成する菌のスクリーニング方法生工研寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４のそれぞれの菌を人工的に感染・共生させた植物およびそれ以外の菌が感染・共生させた植物の葉および葉鞘をフリーズドライ処理したものを、クロロホルム／メタノール／２５％アンモニア水＝７５／２５／０．５溶液で室温で一昼夜撹拌抽出し、その後瀘紙にて瀘過してエバポレートした。これをＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）分析を行なうことによってカノクラビンの存在を確認した。
【００５２】
シリカゲル６０プレート、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝２０／１０／１／１の展開溶液により展開した後に、Ｒｆ値が０．５〜０．６付近にＵＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色（青紫色に呈色）で検出されるスポットが図４に示すＴＬＣ分析によって確認されている。このスポットはカノクラビンと全く同じＲｆ値を示し、また図５に示すように、エンドファイト感染植物抽出物とカノクラビンを重打ちしたＴＬＣ分析でも全く同じＲｆ値にスポットが確認された。
【００５３】
しかしながら図５中のレーン２およびレーン１５に見られるように、寄託菌以外のエンドファイト感染植物においては、カノクラビンのスポットは確認されなかった。同図においてレーン３およびレーン１６のように、レーン２およびレーン１５の抽出物にカノクラビンを重打ちしたものには、カノクラビンが検出されたレーンと同様に、カノクラビンのスポットが確認された。
【００５４】
以上の結果から、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２を含む寄託菌が、感染・共生した植物体内でカノクラビンを特異に生合成するとともに蓄積していることが明らかになった。またこのことから、カノクラビンの生合成および蓄積の有無をマーカーとして、植物に感染・共生している菌をスクリーニングすることが可能であることが証明された。
【００５５】
またＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２を含む寄託菌を感染・共生させた植物の後代種子から生育した植物であって、エンドファイトの伝播が確認されたものについても、カノクラビンの有無をＴＬＣ分析で確認した。その結果後代の植物体においても、もとの植物体と同様にカノクラビンの生合成が行なわれていることが示された。
【００５６】
（７）人工培地上でカノクラビンを特異に生合成する菌のスクリーニング方法。
【００５７】
エンドファイト感染植物体内でカノクラビンが生合成された植物体からエンドファイト、例えばＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２を分離した。分離はエンドファイト感染植物の葉および葉鞘組織を７０％エタノール水溶液に１０秒間浸漬し、次いで２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸漬した後に、滅菌水で３回洗滌し、５ｍｍ角の大きさに切断し、エンドファイト分離培地上に置床し、２５℃暗条件下で培養を行なった。
【００５８】
分離培地は、ＰＤＡ（ポテト  デキストロース  アガー）にペニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ１００ｍｇ／ｌを添加し、直径が９ｃｍのプラスチックシャーレに２０ｍｌずつ分注して使用した。
【００５９】
培養開始後３〜８週間で植物組織から菌糸が分離された。さらに増殖させるために液体培地により培養した。使用した培地は例えばＰＤ（ポテト  デキストロース）培地、Ｍ１０２培地、エルゴットアルカロイド生産培地としても知られているＳＭ培地等である。上述の培地１００ｍｌにＰＤＡ培地で分離した菌糸塊５ｍｍ角を入れ、２週間から長いもので６カ月間培養した。
【００６０】
カノクラビンの生合成を確認するために、植物体と同様に培養物をフリーズドライ処理し、クロロホルム／メタノール／２５％アンモニア水＝７５／２５／０．５の溶液に入れ、室温で一昼夜撹拌抽出し、その後瀘紙にて瀘過してエバポレートし、ＴＬＣ分析を行なった。
【００６１】
また上記の試験と同様にシリカゲル６０プレート、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝２０／１０／１／１の展開溶液により展開した後に、Ｒｆ値が０．５〜０．６付近にＵＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色（青紫色に呈色）で検出されるスポットが上記と同様に、ＴＬＣ分析によって確認され、カノクラビンを生合成していることが証明された。
【００６２】
（８）カノクラビンの同定
フリーズドライ処理したエンドファイト感染植物体、例えば生工研寄託菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４感染・共生植物、および非感染個体の葉および葉鞘部分を８０％メタノール水溶液を用いて室温で３０分以上振とう抽出した。抽出液を瀘紙にて瀘過し、その瀘液を８０％メタノール水溶液でサスペンドした陰イオン交換樹脂（ＡＧ２×８  ２００〜４００ｍｅｓｈ）を充填し、２５％アンモニア水で置換したＶＡＲＩＡＮ  ＢＯＮＤ  ＥＬＵＴ  ＣＢＡカラムに載せ、純水で洗滌した。そして５％ぎ酸溶液によって溶出し、得られた分画をＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）分析およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）分析に供した。
【００６３】
得られた分画をＣ１８カラム（５μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ、１００×８ｍｍ）、ＵＶ２８０ｎｍ  検出を用いたＨＰＬＣで分析した結果、エンドファイト感染植物から得られた分画のみに、図７に示すようにリテンションタイム１２分付近に特異的に顕著なピークが確認されている。なおエンドファイトに感染していない植物の場合は、図６に示すようにこのようなピークが確認されていない。
【００６４】
またシリカゲル６０プレート、クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝２０／１０／１／１の展開溶液により展開した後に、Ｒｆ値０．５〜０．６付近にＵＶおよびＥｈｅｒｌｉｃｈ呈色（青紫色に呈色）で検出されるスポットがＴＬＣ分析によって確認された。ＴＬＣで確認されたスポットもエンドファイト感染植物体特異なものであって、非感染個体にはこのスポットは見られなかった。
【００６５】
このフラクションをＨＰＴＬＣで分取を行なった。その結果、フリーズドライサンプルから平均して０．０６〜０．０８％の回収率で回収することができた。このフラクションはＨＰＬＣの蛍光検出による分析でも陽性を示し、インドール構造を持つことが示唆された。そこでＮＭＲ、ＭＳおよびＩＲ（赤外線分析法）を測定した。
【００６６】
ＦＤ−ＭＳ（電界脱離イオン化分子量測定法）の結果、Ｍ＋  ２５６が観測され、ＥＩ−ＭＳによるフラグメントイオンは分子ピークの２５６の他に、−Ｈ３Ｏ＋  のｍ／ｚ２３７、ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｏｎ  に起因するｍ／ｚ１５５、１５４等クラビンアルカロイドに特徴的な解裂パターンを示した。またＥＩ−ＨＲ−ＭＳから示唆された分子式から検索を行なったところ、カノクラビンが分子式、ＥＩによるフラグメンテーションパターンともによく一致することが解った。さらにＮＭＲ測定結果を図２のように帰属し、単離したフラクションはカノクラビンと同定した。ＩＲでは３４００（−ＯＨ）、１６０５（Ｃ＝Ｃ）、１４２０、１３８０ｃｍ−１に吸収を示した。
【００６７】
（９）エルゴバリンの同定
ここでは、エンドファイトに感染した植物中の共生菌であるエンドファイトがエルゴバリンを生産するかどうかを確認するものである。まずフリーズドライ処理したエンドファイト感染・共生植物体の葉および葉鞘部分、または穂の部分を０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液：クロロホルム＝１：９の混合液を用い、室温で３０分以上振とう抽出した。抽出液を瀘紙にて瀘過した。ここでクロロホルムでコンディショニングしたシリカゲルカラム（Ｗａｔｅｒ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌａｓ  Ｓｉｌｉｃａ）に瀘液を載せ、クロロホルムで洗滌した。そしてアセトン：クロロホルム：酢酸＝８０：２０：０．０５の混合液で溶出した。その溶出液を濃縮乾燥固化させ、０．１％アスコルビン酸含有３３％メタノール水溶液に再溶出し、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）分析に供した。
【００６８】
ＨＰＬＣ分析は、Ｃ１８カラム（３μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ，  ４．６Ｘ７５ｍｍ）、Ｅｘ（励起波長）３１０ｎｍ、Ｅｍ（蛍光波長）４１５ｎｍ蛍光検出を用いた。エルゴバリンの標品である酒石酸エルゴバリンをＨＰＬＣ分析した結果、図８に示すように、リテンションタイム１２分付近にエルゴバリンのピークが確認された。すなわち標品エルゴバリンの場合には、リテンションタイム１２．３５のピークを示すことになる。
【００６９】
エンドファイト感染植物体のエルゴバリン生合成の有無は、エンドファイト感染植物から上記の方法で得られた溶出液に、ＨＰＬＣ分析で標品と同様なリテンションタイム１２分付近にピークが確認されるかどうかで判断した。その結果、寄託菌以外のエンドファイト感染植物では、図９に示すように、リテンションタイム１２分付近にエルゴバリンが約１ｐｐｍ（乾燥重量当り）オーダーで検出された。すなわち寄託菌以外のエンドファイト感染植物においては、標品エルゴバリンと同様なリテンションタイム付近、すなわち１２．５１にピークがあり、これがエルゴバリンであることを確認した。なおここで濃度は乾燥重量当り約１ｐｐｍであった。
【００７０】
これに対して生工研寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２の寄託菌が感染したエンドファイト感染植物を用い、上記と同様の方法によってＨＰＬＣ分析を行なったところ、図１０に示すようにエルゴバリンが検出されなかった。すなわちＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２の寄託菌が感染した感染植物体においては、リテンションタイム１２分付近に全くピークがなく、エルゴバリンが生産されないことが確認された。よって以上の結果から、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２に感染した植物体は、家畜毒性物質であるエルゴバリンを生合成していないことが明白になった。ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４においても同様の結果が得られた。
【００７１】
（１０）耐虫性による他の菌との比較検証
例えばＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２を上述の方法で感染・共生させたＰｏａ属植物および寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物を用いて、芝草の主要害虫であるスジキリヨトウに対する耐虫性検定を行なった。
【００７２】
耐虫性検定は上述のそれぞれの切葉片を静置した９ｃｍシャーレに、ふ化直後のスジキリヨトウの幼虫を約２００匹放ち、２５℃の室内に静置し、２４時間後、４８時間後にそれぞれ摂食程度を調査した。４８時間後には寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体はほとんど食害されたのに対して、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２を感染・共生させた植物体は、ほとんど葉が残って強い抵抗性を示していた。ＰｏａおよびＬｏｌｉｕｍについての結果が図１１および図１２にそれぞれ示される。
【００７３】
また例えばＮｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２を上記の方法で感染・共生させたＬｏｌｉｕｍ属植物および寄託菌以外の菌株を感染・共生させた同じ植物を用いて、芝草の主要害虫であるスジキリヨトウに対する耐虫性検定を上述のＰｏａ属の植物と同様に行なった。
【００７４】
検定開始から２４時間後のスジキリヨトウの摂食程度を調査したところ、上記Ｐｏａ属植物と全く同様に、寄託菌以外の菌株を感染・共生させた植物体はほとんど食害されたのに対して、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２を感染・共生させた植物体は、ほとんど葉が残り、強い抵抗性を示した。
【００７５】
このような結果は、その他の寄託菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４を用いた場合も同様であった。
【００７６】
以上の結果から、生工研寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７４は感染・共生させた植物体に強度な耐虫性を付与する特性があることが表１に示すように確認された。
【００７７】
【表１】
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実施例２
この実施例は、植物体に感染・共生する前のエンドファイトを上記実施例１の（７）項のスクリーニング方法によってスクリーニングし、カノクラビンが生合成され、しかも最終的な代謝物質がカノクラビンであるエンドファイトを選抜している。そしてこのようにしてスクリーニングされた共生菌を上記実施例１の（４）項の方法によって上記実施例１と同様の植物、すなわちイネ科のＡｇｒｏｓｔｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｐｏａ、Ｌｏｌｉｕｍのそれぞれの植物に感染させたものである。感染させた植物について、実施例１の（６）項の方法によってスクリーニングを行なったところ、カノクラビンを最終的な代謝物質とする共生菌が感染・共生されていることが確認された。またこのような植物について、実施例１の（１０）項の方法によって耐虫性の検定を行なったところ、実施例１とほぼ同様の結果が得られている。
【００７８】
以上のように本発明は、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属の糸状菌から成る共生菌であって、代謝によってカノクラビンを蓄積する共生菌、およびこのような共生菌が人工的に導入されたイネ科植物、およびイネ科植物に対する共生菌の導入方法に関するものである。
【００７９】
従ってこのような発明によれば、共生菌が人工的に感染・共生された植物がエルゴバリン等のエルゴットアルカロイドおよびロリトレムＢ等の毒性物質を生合成することがなく、このために牧草に応用した場合に家畜毒性を生ずることがなくなる。従ってライグラススラッガーやフェスクトキシコーシスの発生を未然に防止することが可能になる。しかも感染・共生されたエンドファイトによってとくに虫に対して強度な抵抗性を示すことになり、耐虫性に優れるとともに家畜毒性をもたない植物体が提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】共生菌のアルカロイドの代謝を示すフローチャートである。
【図２】カノクラビンの化学構造を示す構造図である。
【図３】糸状菌の形態を示す写真である。
【図４】薄層クロマトグラフィのデータを示す写真および解析図である。
【図５】薄層クロマトグラフィのデータを示す写真および解析図である。
【図６】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグラフである。
【図７】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグラフである。
【図８】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグラフである。
【図９】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグラフである。
【図１０】高速液体クロマトグラフィによる結果を示すグラフである。
【図１１】耐虫性の検定を示す写真である。
【図１２】耐虫性の検定を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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