(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む、物質の組成物としての、抗原。
【請求項２】
薬学的に受容可能な賦形剤中に、配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含有する、物質の組成物としての、組成物。
【請求項３】
細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激するための組成物であって、該組成物は、配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含む、組成物。
【請求項４】
前記細胞傷害性Ｔリンパ球がヒトの中に位置付けられる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記エピトープが、非経口的、局所的、または吸入による、エアロゾルもしくは噴霧として、投与するために処方される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
免疫応答を生じるための組成物であって、配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含む、組成物。
【請求項７】
個体中で腫瘍に対する免疫を誘導するための組成物であって、該組成物は、以下：
配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含み、該組成物は、癌ワクチンと組み合わせて個体に投与されるのに適している、組成物。
【請求項８】
前記癌ワクチンの投与の前に、投与されるのに適している、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記癌ワクチンの投与の後に、投与されるのに適している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記癌ワクチンの投与の前および後の両方で、投与されるのに適している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌ワクチンが、配列番号２６８（Ｅ３９）および配列番号２６９（Ｅ４１）からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
個体中の記憶細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するための組成物であって、該組成物は、配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含む、組成物。
【請求項１３】
前記個体が、癌の再発を実質的に受やすい、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
腫瘍に対する免疫を提供するための組成物であって、配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープワクチンを含む抗原を含む、組成物。
【請求項１５】
第１の癌ワクチンを含む、癌について個体を処置するための組成物であって、該組成物は、第２の癌ワクチンと組み合わせて投与されるのに適しており、該第２の癌ワクチンは、配列番号５のペプチドを含む、組成物。
【請求項１６】
前記第１の癌ワクチンが、前記第２の癌ワクチンに先行して投与されるのに適している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１の癌ワクチンが、前記第２の癌ワクチンの後に投与されるのに適している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
薬学的に受容可能な賦形剤中に、配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
ヒトにおける増殖性細胞障害を処置するための組成物あって、該組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤中に、配列番号５の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含む、組成物。
【請求項２０】
前記増殖性細胞障害が癌である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、ここで、前記癌が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、脳腫瘍、肉腫、またはそれらの組み合わせである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００１年３月９日出願の米国仮特許出願番号６０／２７４，６７６（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府は、米国陸軍助成金番号ＤＡＭＤ１７−９４−Ｊ−４３１３に従って、本発明において権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、癌および免疫学の分野に関する。具体的には、本発明は、腫瘍抗原に対する腫瘍ワクチンについての組成物および方法に関し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されるこれらの抗原上の特定のエピトープに関する。より具体的には、本発明は、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）の改変体についての組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
腫瘍反応性Ｔ細胞は、ヒト癌に対する治療的応答を媒介することが報告されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８８）。特定の例において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または腫瘍ワクチンを用いたヒト免疫治療試験において、これらの応答は、自己腫瘍に対するインビトロの細胞傷害性レベル（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、１９９１）または特定のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの遺伝子産物の発現（Ｍａｒｉｎｃｏｌａら、１９９２）のいずれかに相関した。現在の研究（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、１９９２）によれば、ウイルスにコードされた変異癌遺伝子に加えて、過剰発現された自己タンパク質が、種々の悪性腫瘍を有する患者において、腫瘍反応性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をある程度誘発し得ることが提唱されている（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、１９９２；Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、１９９３；Ｂｒｉｃｈａｒｄら、１９９３；Ｊｅｒｏｍｅら、１９９１）。自己腫瘍反応性ＣＴＬは、リンパ球浸潤卵巣悪性腹水（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、１９９１）から生成され得、そして過剰発現タンパク質（例えば、ＨＥＲ−２）は、ＣＴＬ認識についての標的であり得る（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、１９９２）。
【０００５】
Ｔ細胞は、ほとんどのマウス腫瘍モデルで、腫瘍退縮において重要な役割を果たす。独自の癌抗原を認識する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、多くのマウス腫瘍から単離され得る。インターロイキン−２に加えて、これらのＴＩＬの養子移入は、確立された肺および肝臓の転移物の退縮を媒介し得る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８６）。さらに、注射したＴＩＬによるＩＮＦ−γの分泌は、マウス腫瘍のインビボの退縮と有意に相関し、腫瘍抗原によるＴ細胞の活性化を示唆する（Ｂａｒｔｈら、１９９１）。転移性黒色腫を有する患者に養子移入された場合、黒色腫患者の３５〜４０％において転移性癌の退縮を媒介するＴＩＬの既知の能力は、認識される抗原の臨床的重要性を証明する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８８；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９９２）。
【０００６】
ヒトにおいて癌に対する免疫応答が存在するという強力な証拠は、黒色腫沈着内の腫瘍反応性リンパ球の存在によって提供される。単離される場合、これらのリンパ球は、ＭＨＣ拘束された様式で、自己および同種の黒色腫上の特定の腫瘍抗原を認識し得る（Ｉｔｏｈら、１９８６；Ｍｕｕｌら、１９８７；Ｔｏｐａｌｉａｎら、１９８９；Ｄａｒｒｏｗら、１９８９；Ｈｏｍら、１９９１；Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９２；Ｈｏｍら、１９９３；Ｏ’Ｎｅｉｌら、１９９３）。転移性黒色腫を有する患者由来のＴＩＬは、メラノサイト−黒色腫系統特異的組織抗原を含む共有される抗原を、インビトロで認識する（Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９３；Ａｎｉｃｈｉｎｉら、１９９３）。抗黒色腫Ｔ細胞は、おそらく、インビボの腫瘍部位でのクローン性増殖および蓄積の結果として、ＴＩＬに富むようである（Ｓｅｎｓｉら、１９９３）。種々の遺伝子（例えば、サイトカイン）を有するＴ細胞の形質導入が実証されている。Ｔ細胞は、外来遺伝子産物を発現することが示されている（Ｂｌａｅｓｅ、１９９３；Ｈｗｕら、１９９３；Ｃｕｌｖｅｒら、１９９１）。個体が腫瘍関連抗原に対して細胞性応答および体液性応答を生じるという事実は、さらなる腫瘍抗原の同定および特徴付けが、癌を有する患者の免疫治療に重要であることを示唆する。
【０００７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞レセプターは、抗原性ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２の９〜１０アミノ酸）、β２ミクログロブリン、およびクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）重鎖（ヒトにおけるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）からなる複合体を認識する。内因的に合成されたタンパク質の消化によって生成されるペプチドは、小胞体に輸送され、クラスＩ  ＭＨＣ重鎖およびβ２ミクログロブリンに結合し、そして最終的にはクラスＩ  ＭＨＣ分子の溝において細胞表面で発現される。
【０００８】
ヒトＣＴＬのインビトロでの初回免疫およびＡｇ特異的増殖をなし得るエピトープを同定するいくつかの試みにもかかわらず、ＭＨＣクラスＩ分子に関して、認識される自己タンパク質のエピトープについての情報は、限定されたままである。例えば、おそらく特定のＭＨＣクラスＩ  Ａｇに対する結合についての候補であるペプチドエピトープが提案されており（Ｆａｌｋら、１９９１）、そしていくつかの研究は、ＭＨＣクラスＩ抗原に結合するペプチドエピトープを規定するために試みられてきた。
【０００９】
合成ペプチドは、Ｔ細胞エピトープマッピングについての有用なツールであることが示されている。しかし、特定のＣＴＬのインビボおよびインビトロの初回免疫は、困難に遭遇している（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９１；Ｓｃｈｉｌｄら、１９９１；Ｃａｒｂｏｎｅら、１９８８）。一般に、インビトロでのＣＴＬ初回免疫は、ペプチド単独では必ずしも達成できないとみなされており、実際、高抗原密度が、ペプチド初回免疫に必要であると考えられている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９１）。特異的初回免疫が達成された限定された例においてさえ、ＡＰＣまたは刺激因子はまた、高密度で必要とされた（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９１）。
【００１０】
短い合成ペプチドは、エピトープマッピングのための標的抗原として、またはウイルスおよび寄生生物のＡｇに対するインビトロの一次ＣＴＬ応答および二次ＣＴＬ応答の誘導のためのいずれかに使用されてきた（Ｂｅｄｎａｒｅｋら、１９９１；Ｇａｍｍｏｎら、１９９２；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９２；ＫｏｓおよびＭｕｅｌｌｂａｃｈｅｒ、１９９２；Ｈｉｌｌら、１９９２）。不運なことに、これらの研究は、前癌遺伝子ペプチドアナログがインビトロのヒトＣＴＬを刺激して、これらの抗原を内因的に発現する腫瘍を溶解する能力を示せなかった。
【００１１】
腫瘍抗原（Ａｇ）の同定および細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識されるこれらのＡｇ上の特定のエピトープの同定は、腫瘍ワクチンの開発を可能にする（腫瘍抗原の概説について、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０００）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。腫瘍Ａｇは、低結合活性（低親和性）ＣＴＬの活性化についての、弱いかまたは部分的なアゴニストである。（アンカー残基中の改変によって）ＭＨＣへのペプチドの親和性を増加させることによってＣＴＬを活性化する試みは、強力なＡＰＣ（樹状細胞、ＤＣ）および加えられたＢ７同時刺激を用いてさえ、雑多な成功を生じた。得られた交差反応性ＣＴＬのいくつかは、野生型Ａｇによって誘導されるＣＴＬよりも低い親和性で腫瘍を認識した。
【００１２】
アンカー固定免疫原が、高親和性ＣＴＬを誘導および増殖する限定された能力は、ＣＴＬ誘導についての代替的アプローチの必要性を生じる。この問題に対する１つのアプローチは、レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）の既存のプールから、「高親和性」ＣＴＬを活性化する免疫原を設計することである。ヒト腫瘍免疫学において、このアプローチは、いくつかの例において成功してきた。しかし、高親和性ＣＴＬは、排除（すなわち、アポトーシス）またはアネルギー（特定の抗原に対する非応答性または減少した反応性）によるサイレンシングに、より感受性であることが予測される。
【００１３】
これらのプロセスは、Ａｇ（ヒトＡｇ）での反復刺激の結果として生じ、そして多数のサイトカインによって増幅される。活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）の一般的機構は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の存在下でＡｇで反復して刺激することが、細胞死経路を活性化することである。これは、ＡｇおよびＩＬ−２での刺激が、増殖を誘導するには強すぎ、そのかわり未成熟な老化を生じるシグナルを伝達するからである。代替的な死経路である、受動的細胞死（ＰＣＤ）は、生存に関与するサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７など）が取り除かれた場合に生じる。腫瘍Ａｇは自己Ａｇであるので、対応する応答細胞は、外来のＡｇに応答するＣＴＬよりも、欠失に対してより感受性であるにちがいない。なぜなら、身体の防御機構は、自己免疫を回避するようにプログラムされているからである。腫瘍Ａｇに対するレスポンダーの生存がどのように誘導され得るか、そしてＡＩＤＳまたはＰＣＤからどのように保護され得るかは、ほとんど知られていない。
【００１４】
前臨床試験および臨床試験は、黒色腫（Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉら、１９９９；Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、１９９８；Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９８；Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎら、１９９７；Ｚｅｎｇら、１９９７；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、１９９８；Ｎｅｓｔｌｅら、１９９８；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、１９９８；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９９８）；乳癌（例えば、ＭＵＣ１による（Ｇｅｎｄｌｅｒら、１９９８；Ｘｉｎｇら、１９８９；Ｘｉｎｇら、１９９０；Ｊｅｒｏｍｅら、１９９３；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９４；Ｄｉｎｇら、１９９３；Ｚｈａｎｇら、１９９６；Ａｃｒｅｓら、１９９３；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９８；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６；Ｓａｍｕｅｌら、１９９８；Ｇｏｎｇら、１９９７；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９５；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、１９９８；Ｌｏｆｔｈｏｕｓｅら、１９９７；Ｒｏｗｓｅら、１９９８；Ｇｏｎｇら、１９９８；Ａｃｒｅｓら、１９９９；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９８；Ｌｅｅｓら、１９９９；Ｘｉｎｇら、１９９５；Ｇｏｙｄｏｓら、１９９６；Ｒｅｄｄｉｓｈら、１９９８；Ｋａｒａｎｉｋａｓら、１９９７）、ｐ５３による（ＤｅＬｅｏ、１９９８；ＭｃＣａｒｔｙら、１９９８；Ｈｕｒｐｉｎら、１９９８；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、１９９６）、およびＨｅｒ−２／ｎｅｕによる（ＤｉｓｉｓおよびＣｈｅｅｖｅｒ、１９９８；Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、１９９３；Ｆｉｓｋら、１９９５；Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９９５；Ｋａｗａｓｈｉｍａら、１９９９；Ｄｉｓｉら、１９９６））；ならびに結腸癌（Ｋａｎｔｏｒら、１９９２；Ｋａｎｔｏｒら、１９９２；Ｔｓａｎｇら、１９９５；Ｈｏｄｇｅら、１９９７；Ｃｏｎｒｙら、１９９８；Ｋａｓｓら、１９９９；Ｚａｒｅｍｂａら、１９９７；Ｎｕｋａｙａら、１９９９）についての腫瘍特異的ペプチドエピトープの利用について進行中である。
【００１５】
最近、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）のペプチドが、腫瘍関連リンパ球によって認識された（Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９９８；Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９９９；Ｋｉｍら、１９９９）。ＦＢＰは、元々、胎盤および栄養膜細胞においてｍＡｂ規定Ａｇとして見出されたが、他の正常組織にはまれな、膜結合糖タンパク質である（Ｒｅｔｒｉｇら、１９８５；Ｅｌｗｏｏｄ、１９８９；Ｗｅｉｔｍａｎら、１９９２；Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａら、１９９３）。興味深いことに、このタンパク質は、９０％より多い卵巣および子宮内膜の癌腫において；乳房、結腸直腸、肺および腎臓細胞の癌腫の２０〜５０％において、そして複数の他の腫瘍型において見出されている。癌性組織に存在する場合、発現レベルは、通常、正常な組織発現の２０倍より高く、そして卵巣癌腫において８０〜９０倍の高さであることが報告されている（Ｌｉら、１９９６）。
【００１６】
米国特許第５，８４６，５３８号は、悪性腫瘍の処置についての、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のペプチドに対する免疫反応性に関する。
【００１７】
葉酸結合タンパク質は、組成物および腫瘍免疫に関する組成物を利用する方法について、当該分野での長年の必要性についての理想的な標的を提供し、この必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８の葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を、組成物として提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、薬学的に受容可能な賦形剤中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせの葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含有する組成物を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激する方法を提供することであり、この方法は、細胞傷害性Ｔリンパ球を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８およびこれらの組み合わせからなる群より選択される葉酸結合タンパク質エピトープを含む、ある量の抗原と接触させる工程を包含し、ここで、この量は、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激するに十分である。本発明の特定の実施形態において、この細胞傷害性Ｔリンパ球は、ヒトの内部に位置する。別の特定の実施形態において、この方法は、さらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８およびこれらの組み合わせからなる群より選択される葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原をヒトに投与する工程を包含する。本発明の別の特定の実施形態において、このエピトープは、非経口的、局所的な投与のために、または吸入剤、エアロゾルもしくはスプレーとして処方される。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、免疫応答を生じる方法を提供することであり、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせの葉酸結合エピトープを含む抗原を免疫学的に有効な量含有する組成物を含有する薬学的組成物をヒトに投与する工程を包含する。
【００２２】
本発明の別の目的は、個体において腫瘍に対する免疫を誘導する方法を提供することであり、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせの葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を個体に投与する工程；および個体に癌ワクチンを投与する工程を包含する。本発明の特定の実施形態において、葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原は、癌ワクチンの投与の前に投与される。本発明の特定の実施形態において、葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原は、癌ワクチンの投与後に投与される。本発明の別の特定の実施形態において、葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原は、癌ワクチンの投与の前および後の両方で投与される。さらなる特定の実施形態において、癌ワクチンは、配列番号２６８（Ｅ３９）および配列番号２６９（Ｅ４１）からなる群より選択されるポリペプチドを含む。
【００２３】
本発明の別の目的は、個体において記憶細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する方法を提供することであり、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせの葉酸結合エピトープを含む抗原を投与する工程を包含する。特定の実施形態において、この個体は、癌の再発に対して実質的に感受性である。
【００２４】
本発明の別の目的は、腫瘍に対する免疫を提供する方法を提供することであり、この方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせの葉酸結合エピトープワクチンを含む抗原を投与する工程を包含する。
【００２５】
本発明の別の目的は、癌について個体を処置する方法を提供することであり、この方法は、第一の癌ワクチンを個体に投与する工程；および配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるペプチドを含む第二の癌ワクチンを個体に投与する工程を包含する。特定の実施形態において、第一の癌ワクチンを投与する工程は、第二の癌ワクチンを投与する工程に先行する。別の特定の実施形態において、第一の癌ワクチンを投与する工程は、第二の癌ワクチンを投与する工程の後である。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、薬学的組成物を提供することであり、この薬学的組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせからなる群より選択される葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含有する。
【００２７】
本発明の別の目的は、ヒトにおいて増殖性細胞障害を処置する方法を提供することであり、この方法は、薬学的に受容可能な賦形剤中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８またはこれらの組み合わせからなる群より選択される葉酸結合タンパク質エピトープを含む抗原を含有する治療的有効量の薬学的組成物をヒトに投与する工程を包含する。特定の実施形態において、この増殖性細胞障害は癌である。さらに特定の実施形態において、この癌は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、脳の癌、肉腫、またはこれらの組み合わせである。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用する場合、「１つの（「ａ」または「ａｎ」）」は、１以上を意味し得る。本明細書中で請求項において、語「含む、包含する、含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用する場合、用語「ａ」または「ａｎ」は、１以上を意味し得る。本明細書中で使用する場合、「別の」は、少なくとも第二以上のものを意味し得る。
【００２９】
用語「抗原」は、本明細書中で使用する場合、免疫系の応答を誘発する実体として定義される。本明細書中でこの用語は、「Ａｇ」と省略され得る。
【００３０】
用語「癌」は、本明細書中で使用する場合、未制御に成長する組織または細胞の増殖（例えば、腫瘍）として定義される。特定の実施形態において、癌は、上皮癌である。特定の実施形態において、癌は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、脳の癌、肉腫、またはこれらの組み合わせである。特定の実施形態において、哺乳動物におけるこのような癌は、染色体異常、変性成長および／または発達障害、分裂促進剤、紫外線照射（ｕｖ）、ウイルス感染、遺伝子の不適切な組織発現、遺伝子発現の変更、発癌物質またはこれらの組み合わせによって引き起こされる。用語黒色腫には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：黒色腫、転移性黒色腫、メラノサイトまたはメラノサイト関連神経細胞のいずれかに由来する黒色腫、黒色癌、黒色上皮癌、黒色肉腫（ｍｅｌａｎｏｓａｒｃｏｍａ）、インサイチュ黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端部黒子黒色腫、浸潤黒色腫、または家族性非定型母斑および黒色腫（ＦＡＭ−Ｍ）症候群。上記癌は、本願に記載される方法によって処置され得る。
【００３１】
用語「エピトープ」は、本明細書中で使用する場合、ＭＨＣ分子に結合し、そして特定のＴ細胞によって認識されるタンパク質抗原由来の短いペプチドとして定義される。
【００３２】
用語「葉酸結合タンパク質改変体」は、本明細書中で使用する場合、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞によって優先的に認識され、そして天然由来であり得、合成的に生成され得、遺伝子操作され得る、葉酸結合タンパク質およびそのペプチドまたはそれらの機能的等価物（例えば、ここで、１以上のアミノ酸は、実質的に機能に影響しない他のアミノ酸または非アミノ酸によって置換され得る）として定義される。特定の実施形態において、これらのペプチドは、配列番号２６８（Ｅ３９）または配列番号２６９（Ｅ４１）と比較して、変更、改変または変化を含むエピトープである。さらなる特定の実施形態において、これらの改変体は、配列番号１〜配列番号８のものである。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫応答」は、Ｔリンパ球、マクロファージ、および／またはナチュラルキラー細胞の刺激を誘発することを含む細胞性免疫応答をいう。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫」は、葉酸結合タンパク質エピトープである抗原（例えば、本明細書中に記載される葉酸結合タンパク質改変体）への曝露から生じる腫瘍に対する抵抗性を与える能力としてが定義される。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「ワクチン」は、癌に対する免疫を生じるための組成物として定義される。特定の実施形態において、癌ワクチンは、葉酸結合タンパク質（例えば、Ｅ３９（ＦＢＰアミノ酸残基１９１〜１９９（配列番号２６８））またはＥ４１（ＦＢＰアミノ酸残基２４５〜２５３）（配列番号２６９））の野生型エピトープである。他の特定の実施形態において、癌ワクチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８、あるいはそれらの組み合わせを含む。好ましい実施形態において、ワクチンの投与は、Ｔ細胞レセプターによるシグナル伝達を変更し、それによってアポトーシスの可能性を減少させる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「改変体」は、野生型配列（例えば、葉酸結合タンパク質Ｅ３９エピトープ（配列番号２６８））の改変形態または変更形態として定義される。改変は、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含み得るか、または少なくとも１つのアミノ酸残基の変更された側鎖を含み得る。
【００３７】
（ＩＩ．本発明）
（Ａ．特定の実施形態）
本発明は、野生型葉酸結合タンパク質腫瘍Ａｇと比べて、Ｔ細胞レセプターによるシグナル伝達を弱めるように、特に、強力な抗原への反復する曝露に引き続いて生じるアポトーシスの可能性を減少させるように改変された葉酸結合タンパク質腫瘍Ａｇに関する。従って、Ｅ３９（配列番号２６８）およびＥ４１（配列番号２６９）のような葉酸結合タンパク質エピトープの改変体（これは「強力な」抗原である）は、「弱い」抗原として作用するように改変される。従って、本発明は、Ｔ細胞レセプターを介するシグナル伝達を弱めるための組成物および方法を利用する。
【００３８】
本発明は、（１）腫瘍Ａｇの前に投与されるべき前刺激プレワクチン；（２）腫瘍Ａｇの後に与えられるべきポストワクチンとして作用し；そして／または（３）特定の個体において、プライムワクチンとして作用する。状態（１）および（２）はさらに、腫瘍応答性ＣＴＬに対する配列番号６（Ｊ６５）およびそのアナログについての保護的役割に関連する。状態（３）は、特定の個体において生じ得、組織適合性Ａｇ結合ポケットにおける変異は、強力な免疫原中にアテニュエーターを形質転換させ得る。
【００３９】
本発明は、前駆体（代役（ｓｔａｎｄ−ｉｎ））または活性化エフェクターのいずれかのワクチン化の前および後に保護され得る。特定の実施形態において、葉酸結合タンパク質の改変体の投与は、標的化された記憶ＣＴＬの誘導を提供する。
【００４０】
特定の実施形態において、本明細書中に記載される改変体（配列番号６）は、反復刺激でシグナル伝達を弱めることが意図され、従って、アポトーシスによる活性化Ｔ細胞のＣＴＬ前駆体の保護を誘導し、それによって免疫応答を増大可能にし、そして好ましい実施形態において、記憶ＣＴＬの誘導に深いかかわりを有する。
【００４１】
免疫応答の主要な２つの部門が以下であることは周知である：（１）免疫Ｔ細胞での細胞媒介性免疫；および（２）抗体での体液性免疫。さらに、この免疫系は、通常、体内の任意の異物または異常細胞を認識し、かつ破壊するために機能する。ＦＢＰは、いくらかの正常細胞によって発現されるので、寛容性および／またはアレルギーが予測される。
【００４２】
癌のための分子治療の発展は、細胞性免疫エフェクターによるＡｇの特異的認識に歴史的に焦点を当ててきた。本発明は、ＣＴＬに対するペプチド標的の同定および特異的エピトープに対するＴ細胞免疫の生成のための新規ストラテジーを開示する（Ｔ細胞特異的免疫の総説について、例えば、Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、１９９２；Ｈｏｕｂｉｅｒｓら、１９９３を参照のこと）。
【００４３】
これを達成するために、本発明は、新規の天然に存在するペプチドおよび合成的に誘導したペプチド（これは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ重鎖に結合する）を提供する。インビボでのエピトープ選択についての適切な基準が規定され、そしてＦＢＰの免疫原エピトープに基づく合成ペプチドもまた、生成された。
【００４４】
ＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチドに対するドミナントアンカーは、Ｌｅｕ（Ｐ２）およびＶａｌ（Ｐ９）であるが、類似の電荷および側鎖を有する多くの残基（例えば、Ｉｌｅおよび／またはＭｅｔ）が、ウイルスタンパク質由来のＣＴＬエピトープにおいて同定された（Ｆａｌｋら、１９９１；Ｂｅｄｎａｒｅｋら、１９９１）。
【００４５】
（Ｂ．一般的な実施形態）
（１．ＣＴＬエピトープ）
現在までに報告されているＣＴＬエピトープは、主に異物（ウイルス）タンパク質（自己タンパク質に対する相同性を全く有さないか、またはほとんど有さない）に由来する。自己タンパク質に対するＣＴＬ応答に関して、自己ペプチドＭＨＣクラスＩ複合体に対して高い親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞は、発生中に胸腺において排除されることが予期される。種々の細胞株のＨＬＡ−Ａ２．１分子から溶出された自己ペプチドは、Ｐ３〜Ｐ５およびＰ７〜Ｐ８で、ヒトＣＴＬによって認識されるウイルスエピトープの配列と異なる残基を示す。これらの残基はＴＣＲと接触し、相互作用する可能性が高いので、自己Ｔ細胞がすでに寛容性／アレルギー性であるペプチドに影響し得る。
【００４６】
Ｔ細胞が、排除またはアレルギー化されるべき自己エピトープを認識するために、ペプチド−ＭＨＣ複合体は、十分な数のＴＣＲを従事させるのに十分安定であるか、または少なくとも他のＨＬＡ−Ａ２ペプチド複合体よりも安定であるという前提条件が存在する。ここで、このペプチドは他のペプチドによって容易に置換され得る。その結果、これは、より多くのＨＬＡ−Ａ２分子を従事させ得る適切な条件下（例えば、高いタンパク質濃度）で、ＦＢＰへの伸長を有する自己タンパク質について、発生中に高い親和性を有するＴＣＲに結合し得るのもが、低い親和性を有するＨＬＡ−Ａ２に結合するペプチドよりも、腫瘍のペプチドの他の標的上に発現される場合に、後に認識される可能性はほとんど無いことを示唆する。低い親和性について、ドミナントアンカー残基（例えば、（Ｐ９）Ｍ→Ｖ）との弱い置換によるペプチド−ＨＬＡ−Ａ２相互作用の安定化を生じるアンカーの改変は、このような抗原を発現する標的とのＣＴＬの反応性を促進させる。なぜなら、ＴＣＲは、主に配列Ｐ４〜Ｐ８と相互作用するからである。
【００４７】
腫瘍の発達および転移は、特異的な細胞性タンパク質の過剰発現としばしば関連がある。変異していない過剰発現したタンパク質のエピトープは、Ｔ細胞によって媒介される腫瘍に対する特異的細胞性免疫応答の標的となり得る。さらに、Ｔ細胞エピトープが存在する場合、腫瘍免疫／自己免疫間の区別および無感応性は、エピトープ供給の限定因子としてタンパク質濃度に対して意味され得る。
【００４８】
（２．エピトープコア配列）
本発明はまた、全細胞および他のペプチドとは無関係なタンパク質またはペプチド組成物に関し、これは、ＣＴＬによって免疫学的に認識されるエピトープを組み込む精製したタンパク質またはペプチドを含む。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＴＬによって免疫学的に認識されるエピトープの組み込み」は、ＥＢＰポリペプチド内に配置されるエピトープに類似する１次構造、２次構造、または３次構造を含むペプチドまたはペプチド抗原をいう。類似性のレベルは、概して、ＣＴＬの同一集団がまた、交差反応性ペプチドまたはタンパク質抗原に結合するか、これらと反応するか、あるいはそうでなければこれらを認識する程度である。
【００５０】
ワクチンにおける使用にとって適切なＣＴＬ刺激免疫ドミナントエピトープおよび／またはその機能的等価物の同定は、比較的簡単な問題である。例えば、米国特許第４，５５４，１０１号（これは、参考として本明細書中に援用される）（これは、親水性に基づいてアミノ酸配列由来のエピトープの同定および調製を教示する）における教示のように、Ｈｏｐｐの方法を使用し得る。いくつかの他の文献およびそれに基づくソフトウェアプログラムに記載される方法はまた、エピトープコア配列を同定するために使用され得る（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，１９８８；Ｗｏｌｆら、１９８８；米国特許第４，５５４，１０１号を参照のこと）。次いで、これら「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、ペプチド合成または組換え技術の応用のいずれかによってペプチド中に容易に組み込まれ得る。
【００５１】
本発明に従う使用のための好ましいペプチドは、一般的に、８〜２０アミノ酸長、より好ましくは、約８〜約１５アミノ酸長の程度である。より短い抗原性ＣＴＬ刺激ペプチドが、特定の環境（例えば、ワクチンの調製または免疫学的検出アッセイ）において利点を提供することが提案される。例示的な利点としては、調製および精製の容易さ、比較的低いコストならびに産生の改善された再現性、ならびに有利なバイオディストリビューションが挙げられる。
【００５２】
本発明の特定の利益は、合成ペプチド（改変および／または伸長したエピトープ／免疫原性コア配列を含む）の調製によって実現し得、ＦＢＰ配列に指向させた「普遍的な」エピトープペプチドを生じることが提案される。これらのエピトープコア配列は、ＦＢＰポリペプチド抗原の親水性領域として、本明細書中の特定の局面において同定される。これらの領域は、Ｔ細胞刺激またはＢ細胞刺激を促進させる可能性が最も高く、従って、特異的抗体産生を誘発することを示すことが提案される。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、エピトープコア配列は、「相補的」であるアミノ酸の比較的短いストレッチであり、それゆえ、ＣＴＬ上のレセプターに結合する。本発明の開示の文脈において、用語「相補的」は、互いに引力を示すアミノ酸またはペプチドをいうことが理解される。
【００５４】
概して、ポリペプチド抗原のサイズは、同定されたコア配列を有するために少なくとも十分な長さである限り、特に重要であるとは考えられない。本発明の開示によって見込まれる最小の有用なコア配列は、概して約８アミノ酸長の程度であり、９または１０の程度の配列を有することがより好ましい。従って、このサイズは、概して、本発明に従って調製された最小のペプチド抗原に対応する。しかし、抗原の大きさは、基本のエピトープコア配列を含む限り、所望される大きさであり得る。
【００５５】
当業者は、多くのコンピュータプログラムが、タンパク質の抗原部分の予測における使用のために利用可能であることを認識する（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ＆  Ｗｏｌｆ，１９８８；Ｗｏｌｆら、１９８８を参照のこと）。コンピュータ化ペプチド配列分析プログラム（例えば、ＤＮＡＳｔａｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ）はまた、本発明の開示に従う合成ペプチドを設計するのに有用であり得る。
【００５６】
配列の中に抗原エピトープを含むエピトープ配列またはペプチドの合成は、固相法のような慣用的な合成技術（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒのような市販のペプチド合成機の使用によって）を用いて容易に達成される。次いで、この様式において合成されたペプチド抗原は、所定の量にアリコートされ得、そして慣用的な様式（例えば、水溶液、またはなおより好ましくは、粉末もしくは使用まで凍結乾燥状態）において保存され得る。
【００５７】
概して、ペプチドの相対的安定性に起因して、感知可能な分解または抗原性活性の損傷を伴わない事実上任意の水溶液において、所望される時間のかなり長期間（例えば、６ヶ月までまたはそれ以上）、水溶液中に容易に保存され得る。しかし、延長した水溶液保存が意図される場合、約７．０〜約７．５のｐＨを維持するためのＴｒｉｓまたはリン酸緩衝液のような緩衝液を含む試薬を含むことが一般的所望される。さらに、微生物の増殖を阻害する試薬（例えば、アジ化ナトリウムまたはＭｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）を含むことが所望され得る。液体状態での延長した保存について、約４□℃またはより好ましくは冷凍で溶液に保存されることが所望される。もちろん、ペプチドが凍結乾燥または粉末状態で保存される場合、それらは、（例えば、所定量の水（好ましくは滅菌した）または緩衝液で、使用前に再水和され得る定量したアリコートにおいて）事実上無期限に保存され得る。
【００５８】
（３．Ｔリンパ球）
Ｔリンパ球は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）遺伝子座のクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子に結合するペプチドフラグメントの形態の抗原を認識する。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む異なる種において記載される組織適合性抗原系を含むことを意味する一般的名称である。抗原に対するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、少なくとも８個のポリペプチド鎖の複合体である（「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（１９９４）Ｓｔｉｔｅｓ，Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｓｌｏｗ（編）Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｇｅ，Ｎｅｎｍａｎｃｋ  Ｃｏｎｎ．）。これらの２つの鎖（α鎖およびβ鎖）は、ＭＨＣ分子に結合した抗原ペプチドを認識し、従って、ＴＣＲ内の実際のリガンド結合構造であるジスルフィド結合二量体を形成する。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、免疫グロブリンタンパク質に多くの点で類似する。α鎖およびβ鎖のアミノ末端領域は、非常に多形であり、その結果、全Ｔ細胞集団内に、多くの異なるＴＣＲα／β２量体（各々、抗原ペプチドおよびＭＨＣの特定の組み合わせを認識または結合し得る）が存在する。
【００５９】
概して、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、特定の抗原によって刺激される場合、リンホカインの放出によってヘルパー／インデューサとして機能することが考慮される；しかし、ＣＤ４＋細胞のサブセットは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）として作用し得る。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原標的を直接的に溶解することによって機能すると考えられ；しかし、種々の環境下で、ヘルパーまたはＤＴＨ機能を提供するためにリンホカインを分泌し得る。重複する機能の可能性にかかわらず、表現型ＣＤ４およびＣＤ８マーカーは、クラスＩＩまたはクラスＩ  ＭＨＣ抗原に結合するペプチドの認識のために連結される。クラスＩＩまたはクラスＩ  ＭＨＣの文脈において抗原の認識は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、異なる環境下で提示された異なる抗原または同一の抗原に応答することを指定する。クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原への免疫原性ペプチドの結合は、抗原提示細胞によって消化された抗原について最も共通に生じる。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、一般的に、腫瘍細胞に対して外部である抗原を認識する。対照的に、正常な環境下で、クラスＩ  ＨＭＣへのペプチドの結合は、細胞質に存在するタンパク質および標的自体によって合成されたタンパク質のみに生じ、外部環境におけるタンパク質は含まれない。これに対する例外は、高い濃度における細胞の外側に存在する正確なクラスＩ結合モチーフと外因性ペプチドとの結合である。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、広く異なる機能を有し、そして抗原が正常に存在する影響として、異なる抗原を認識する傾向を有する。
【００６０】
本発明に開示される場合、ＦＢＰによって発現されるタンパク質産生は、Ｔ細胞によって認識される。このようなタンパク質発現産物は、細胞内で「回転」する（すなわち、サイクルが変化する）。ここで合成されたタンパク質は機能し、ついで最終的に新規の合成された分子によって分解および置換される。タンパク質のライフサイクルの間に、タンパク質に由来するペプチドフラグメントは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原に結合する。細胞表面上のＭＨＣ抗原に結合するペプチドの表示、およびペプチドと自己ＭＨＣ抗原との組み合わせの宿主Ｔ細胞による認識によって、悪性細胞は、Ｔ細胞に対して免疫原性である。Ｔ細胞レセプターの申し分ない特異性は、個々のＴ細胞が、単一アミノ酸残基だけ異なるタンパク質フラグメント間を識別することを可能にする。
【００６１】
ペプチドに対する免疫応答の間、ペプチド−ＭＨＣ複合体の高い親和性結合を有するＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合し、それにより増殖を活性化および誘導する。ペプチドとの第一の接触において、免疫Ｔ細胞の少ないメンバーは、リンホカインを分泌し、増殖し、そしてエフェクターおよびメモリーＴ細胞に分化する。メモリーＴ細胞による同一抗原との接触の後、より速く、かつより激しい免疫応答を誘導する。
【００６２】
細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるインタクトな葉酸結合タンパク質またはそのペプチドは、本発明において使用され得る。ペプチドは、同定された配列に基づいて天然に誘導または生成され得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するペプチド（葉酸結合タンパク質クラスＩ  ＭＨＣ分子により提示されたペプチドによって誘発される）は、一般的に約８〜１０アミノ酸長である。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するペプチドは、各個々のクラスＩ  ＭＨＣ分子によって変化する。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する本発明に適切なペプチドの例としては、配列番号１〜配列番号８を含むかまたは配列番号１〜配列番号８からなるペプチドが挙げられる。
【００６３】
当業者は、クラスＩ  ＭＨＣ分子およびクラスＩＩ分子の両方について、他のペプチドが本発明で使用のために生成され得ることを理解する。種々の技術が、ペプチドの単離または構築について周知である。適切なペプチドは、本明細書中に提供される開示に基づいて容易に同定される。さらに適切なペプチドは、より長い鎖のペプチドを含む。このようなペプチドは、伸長（例えば、１つ以上のアミノ酸残基の付加により）および／または切断（例えば、カルボキシル末端からの１つ以上のアミノ酸残基の欠失により）され得る。あるいは、適切なペプチドは、本明細書中に開示される他の好ましいペプチドのバリエーションであり得る。この特定のペプチドバリエーションは、総アミノ酸（例えば９）の同数のペプチドを生じ得るが、好ましいペプチドのペプチドバリエーションは同じ長さを必要としない。実質的に同一の所望の生物学的活性を有するペプチドを生じるアミノ酸配列におけるバリエーションは、本発明の範囲内である。
【００６４】
ＦＢＰペプチド（すなわち、ワクチンとして）を用いる個々の免疫化は、ＦＢＰが結合する腫瘍に対する治療的攻撃のために必要なＴ細胞の数における持続的拡大を誘導し得る。代表的に、約０．０１μｇ／ｋｇ重〜約１００ｍｇ／ｋｇ重が皮内経路、皮下経路または静脈内経路によって投与され得る。好ましい投薬量は、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは、約５μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇである。当業者は、投与の回数および頻度は、患者の応答に依存することを理解している。ＦＢＰペプチドを繰り返し投与することが所望され得る。１つより多いＦＢＰペプチドが、同時かまたは連続的のいずれかで投与され得ることが当業者に理解される。例えば、約８〜１５ペプチドの組み合わせが、免疫化のために使用され得る。免疫化に対する好ましいペプチドは、少なくとも１つのＦＢＰアミノ酸配列番号１〜配列番号６８の全てまたは一部、あるいはそれらの改変体を含む。配列番号１〜配列番号６８に示されるアミノ酸配列の他の部分由来の１つ以上のペプチドは、好ましいペプチドの１つ以上に添加され得る。
【００６５】
ＦＢＰペプチド（抗原として機能する）に加えて、ワクチンにおける他の成分（例えば、患者の免疫原性を増強するように設計された抗原送達および免疫刺激物質のためのビヒクル）を含むことが所望され得る。抗原送達のためのビヒクルの例としては、アルミニウム塩、水中油型エマルジョン、生分解性ビヒクル、油水中型エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、およびリポソームが挙げられる。免疫刺激物質（アジュバント）の例としては、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポポリ−多糖類（ＬＰＳ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γインターフェロンおよびＩＬ−１５が挙げられる。当業者は、ＦＢＰペプチドは合成的に調製され得るか、またはタンパク質部分（天然に誘導されるかまたは合成）は使用され得ることを理解する。ペプチドがさらなる配列なしで使用される場合、キャリア物質（例えば、キーホールリンペットヘモシニアン）にペプチドハプテンを結合することが所望され得る。
【００６６】
本発明の方法および組成物は、慣用的な癌治療に対する耐性を生じるか、あるいは治療後の再発を生じる高い可能性を有する患者に免疫応答を誘導するのに特に十分に適している。当業者は、癌細胞が免疫系をうまく逃れるか、または免疫応答を効果的にうまく逃れ得ることを認識する。なぜなら、癌細胞は自己と似ており、自己と腫瘍との間を本質的に区別し得る任意の抗原に対して免疫系を積極的にアレルギー化し、そして免疫抑制因子を分泌することによって、そして／または攻撃的な腫瘍抗原特異的殺傷細胞のアポトーシスを誘導し得る因子を発現することによって、免疫抑制環境を作製し得るからである。
【００６７】
当業者は、癌ワクチンおよび抗原腫瘍ペプチドに対する細胞性免疫応答の生成に関する複数の総説を把握している（Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、２０００；Ｐａｒｄｏｌｌ，２０００；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０００；Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ，２０００（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）。
【００６８】
当業者は、抗原が、組換え技術によって、真核生物系において可溶性分子として、または細菌系において融合タンパク質としてのいずれかで大量に産生させ得ることを認識する。特定の実施形態において、合成ペプチドは腫瘍抗原から作製される。さらに、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体は、同定および精製において有用である。
【００６９】
腫瘍免疫治療に対するペプチドアプローチにおいて、ペプチド（例えば、約８〜９マー）は、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示され、ＣＴＬおよびサイトカインの分泌（たいていＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの形態）を含むＣＤ８＋媒介性細胞性応答の生成を誘導する。
【００７０】
当業者は、樹状細胞が、クラスＩ提示に続くＣＤ８＋ＣＴＬの生成において重要であることを理解する。Ｅｓｃｈｅら（１９９９）は、樹状細胞を患者から獲得し、単離し、インビトロで拡大させ、ペプチドに暴露し、そして患者に再導入する技術を実証した。他は、移動前にインビトロで特異的に活性化したＴ細胞の生成のために同様に試験した樹状細胞を利用する。
【００７１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞生成における重要な開始工程は、抗原提示細胞によるＭＨＣ分子によるペプチドの取り込みおよび提示である。３つのサブユニットからなるＭＨＣクラスＩタンパク質の全ては、安定な複合体形成において重要である。ＭＨＣクラスＩ分子のＸ線結晶解析は、ＭＣＨクラスＩグルーブを有するペプチドの相互作用は、ＭＨＣグルーブ（これは、互いに由来する固定したスペーシングを有する）のポケットと相互作用する別個のアミノ酸を有するペプチド配列によって決定され、そしてアミノ酸側鎖を固定する特異性もまた有することを実証した。例外はあるが、ペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端は、グルーブのいずれかの末端（しばしば２位もしくは３位、５位もしくは７位において）に固定される（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９７ａ；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９７ｂ）。ペプチドはまた、Ｔ細胞レセプターと相互作用し、ペプチドのわずかな量だけが露出される（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９８）。
【００７２】
本発明の特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープの特徴付けに加えて、複数のペプチド腫瘍抗原（例えば、葉酸結合タンパク質）が同定されていることを考慮すると、ペプチド抗原は、免疫のために合成によって作製される。低分子ペプチドの免疫原性は、キャリアに結合することでペプチドの大きさを増大させることによって、そしてまたアジュバントを用いてマクロファージおよび他の免疫系因子を活性化することによって、改善され得る。当業者は、合成ペプチドの免疫原性を増大させるために用いられる組換えサイトカイン（ＴａｏおよびＬｅｖｙ，１９９３）を認識しており、さらにサイトカインがまた、ペプチドに直接融合され得ること（Ｎａｋａｏら，１９９４；Ｄｉｓｉｓら，１９９６；Ｃｈｅｎら，１９９４）ことを認識している。
【００７３】
本発明の特定の実施形態では、別々のペプチドの混合物は、ワクチンとして投与される。あるいは、複数のエピトープは、当該分野で周知の組換え技術によって、同じ分子中に組み込まれ得る（Ｍａｔｅｏら，１９９９；ＡｓｔｏｒｉおよびＫｒａｃｈｅｎｂｕｈｌ，１９９６）。別の実施形態では、コンビナトリアルペプチドライブラリーを用い、少なくとも１つのアンカー位置で異なるアミノ酸を利用することによって、結合ペプチドを増加させる。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、ペプチドの天然アミノ酸は、非天然のＤアミノ酸で置換される；あるいは、ペプチド残基は、逆の順序でアセンブリされ、このことは、このペプチドをプロテアーゼに対して耐性にする（Ｂｒｉａｎｄら，１９９７；Ｈｅｒｖｅら，１９９７；Ｂａｒｔｎｅｓら，１９９７；Ｇｕｉｃｈａｒｄら，１９９６）。別の実施形態では、非天然の改変アミノ酸（例えば、α−アミノイソ酪酸またはＮ−メチルセリン）は、ペプチド中に組み込まれる。
【００７５】
当業者は、ＭＨＣ複合体に対する８マーまたは９マーの結合強度、続いてＴ細胞レセプターによる認識によって、ＣＴＬペプチドの免疫原性が決定されることを認識している。Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｂｕｒｇら（１９９３）は、ペプチドがＭＨＣ複合体に結合したままである時間が長いほど、Ｔ細胞応答を誘導する機会が増えることを決定した。当業者はまた、外因性ペプチドを細胞の細胞質に直接導入して、クラスＩ拘束細胞免疫応答の生成を可能にするための方法が存在することを認識している。一例としては、微生物毒素が挙げられ、これは、レセプター媒介エンドサイトーシスによって細胞に侵入し、それによって細胞性毒素を細胞質中に沈積させるので、送達のためにこれらの細胞質中にペプチドを保有し得る。特定の例としては、以下が挙げられる：志賀毒素（Ｌｅｅら，１９９８）、炭疽毒素（Ｇｏｌｅｔｚら，１９９７）、ジフテリア毒素（Ｓｔｅｎｍａｒｋら，１９９１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，１９９３）およびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（Ｆａｙｏｌｌｅら，１９９６）。
【００７６】
代替の実施形態では、ペプチドは、膜融合を介して細胞に侵入し、そして腫瘍または他のペプチド（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ｄｅｒｏｓｓｉら，１９９４；Ｄｅｒｏｓｓｉら，１９９６；Ｓｃｈｕｔｚｅ−Ｒｅｄｅｌｍｅｉｅｒら，１９９６）、Ｔａｔタンパク質（Ｋｉｍら，１９９７）および麻疹ウイルス融合ペプチド（Ｐａｒｔｉｄｏｓら，１９９７）を含む）を細胞の細胞質内に送達するために有益である。
【００７７】
他の実施形態では、ペプチドは、親油性細胞膜への直接挿入によって、リポペプチド（これは、脂質およびペプチドの両方を含む）を介して細胞質中に導入される（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，１９９７；Ｏｂｅｒｔら，１９９８；Ｄｅｐｒｅｚら，１９９６；Ｂｅｅｋｍａｎら，１９９７）。代替の実施形態では、ペプチドは、リポソーム（例えば、Ｎａｋａｎｉｓｈｉら，１９９７；Ｎｏｇｕｃｈｉら，１９９１；Ｆｕｋａｓａｗａら，１９９８；Ｇｕａｎら，１９９８を参照のこと）中で送達され、それにより、免疫原性は、リポソーム自体のサイズ、電荷、脂質組成、および抗原がリポソームの表面に存在するか否か、その内側に存在するか否かに依存する。
【００７８】
当業者はまた、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）（これは、Ｑｕｉｌｌ  Ａ（サポニンの混合物）、コレステロール、リン脂質およびタンパク質を含む）が、天然の疎水性抗原、またはミリスチン酸もしくはパルミチン酸テイルの付加によって疎水性にされた抗原を送達するために有用であることを認識する（例えば、Ｈｓｕら，１９９６；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら，１９９７；Ｖｉｌｌａｃｒｅｓ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，１９９５；Ｔａｒｐｅｙら，１９９６；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら，１９９７を参照のこと）。ＩＳＣＯＭは、細胞膜との融合、エンドサイトーシスまたは食作用によって、細胞内への浸透を容易にする。
【００７９】
抗原はまた、組換え技術による抗原への選別シグナル（クラスＩＩ  ＬＡＭＰ−Ｉ（Ｒｏｗｅｌｌら，１９９５；Ｗｕら，１９９５）、ＥＲ標的化ペプチド（Ｍｉｎｅｖら，１９９４）；ＣＬＩＰ（Ｍａｌｃｈｅｒｉｋら，１９９８）および熱ショックタンパク質（ＵｄｏｎｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，１９９３；Ｈｅｉｋｅら，１９９６；Ｚｈｕら，１９９６；Ｓｕｚｕｅら，１９９７；Ｃｉｕｐｉｔｕら，１９９８）を含む）の組み込みを介して、特定の細胞内区画へと指向され得る。
【００８０】
当業者は、本発明が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答について指示された種々のペプチド（配列番号１〜配列番号８、またはそれらの組合せを含む）を含む抗癌治療組成物を提供することを認識している。当業者はまた、本発明が、配列番号１〜配列番号８、またはそれらの組合せから本質的になる、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答について指示された種々のペプチドを含む抗癌治療組成物を提供することを認識している。
【００８１】
当業者は、ＡｂｒａｍｓおよびＳｃｈｌｏｍ（２０００）のような参考文献が、合理的Ａｇ改変についての近年の概要をまとめていることを認識している。２種類のペプチドが記載されている：（１）Ａｇ特異的応答をアップレギュレートするアゴニストペプチド；（２）同じ応答をダウンレギュレートするアンタゴニスト／部分的アゴニストペプチド。しかし、活性化誘発性細胞死または無視による死を同時に誘発せずに、Ａｇ特異的免疫応答を刺激する治療を提供することが本発明の目的である。
【００８２】
当業者は、腫瘍免疫の誘導のための葉酸結合タンパク質エピトープをコードする配列が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｎｎａｔｉｏｎｓのＧｅｎＢａｎｋデータベースまたは市販のデータベース（例えば、Ｃｅｌｅｒａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のデータベース）のようなデータベースから入手され得ることを認識している。エピトープを含み得るかまたはエピトープを含むように改変され得る葉酸結合タンパク質配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって示される以下が挙げられる：Ｐ１４２０７（配列番号９）；Ｐ１５３２８（配列番号１０）；Ｐ１３２５５（配列番号１１）；ＮＰ＿０００７９３（配列番号１２）；ＡＡＢ０５８２７（配列番号１３）；ＡＡＧ３６８７７（配列番号１４）；Ｓ４２６２７（配列番号１５）；Ｓ００１１２（配列番号１６）；ＢＦＢＯ（配列番号１７）；Ｓ６２６７０（配列番号１８）；Ｓ６２６６９（配列番号１９）；Ａ５５９６８（配列番号２０）；Ａ４５７５３（配列番号２１）；Ａ３３４１７（配列番号２２）；Ｂ４０９６９（配列番号２３）；Ａ４０９６９（配列番号２４）；ＮＰ＿０５７９４３（配列番号２５）；ＮＰ＿０５７９４２（配列番号２６）；ＮＰ＿０５７９４１（配列番号２７）；ＮＰ＿０５７９３７（配列番号２８）；ＮＰ＿０５７９３６（配列番号２９）；ＮＰ＿０３７４３９（配列番号３０）；ＮＰ＿０３２０６１（配列番号３１）；ＮＰ＿０３２０６０（配列番号３２）；ＮＰ＿０００７９５（配列番号３３）；ＮＰ＿０００７９４（配列番号３４）；ＡＡＦ６６２２５（配列番号３５）；ＢＡＡ３７１２５（配列番号３６）；Ｐ０２７５２（配列番号３７）；Ｑ０５６８５（配列番号３８）；Ｐ３５８４６（配列番号３９）；Ｐ０２７０２（配列番号４０）；ＡＡＤ５３００１（配列番号４１）；ＡＡＤ３３７４１（配列番号４２）；ＡＡＤ３３７４０（配列番号４３）；ＡＡＤ１９３５４（配列番号４４）；ＡＡＤ１９３５３（配列番号４５）；ＡＡＣ９８３０３（配列番号４６）；ＡＡＢ８１９３８（配列番号４７）；ＡＡＢ８１９３７（配列番号４８）；ＡＡＢ４９７０３（配列番号４９）；ＡＡＢ３５９３２（配列番号５０）；１０１１１８４Ａ（配列番号５１）；０９０８２１２Ａ（配列番号５２）；ＣＡＡ４４６１０（配列番号５３）；ＣＡＡ８３５５３（配列番号５４）；ＡＡＡ７４８９６（配列番号５５）；ＡＡＡ４９０５６（配列番号５６）；ＡＡＡ３７５９９（配列番号５７）；ＡＡＡ３７５９８（配列番号５８）；ＡＡＡ３７５９７（配列番号５９）；ＡＡＡ３７５９４（配列番号６０）；ＡＡＡ３７５９６（配列番号６１）；ＡＡＡ３７５９５（配列番号６２）；ＡＡＡ３５８２４（配列番号６３）；ＡＡＡ３５８２３（配列番号６４）；ＡＡＡ３５８２２（配列番号６５）；ＡＡＡ３５８２１（配列番号６６）；ＡＡＡ１８３８２（配列番号６７）；およびＡＡＡ１７３７０（配列番号６８）。
【００８３】
当業者はまた、葉酸結合タンパク質のエピトープ、核酸配列が、例えば、以下のうちの１つによってコードされるかまたは以下のうちの１つの改変体をコードするように改変されることを認識している：Ｕ０２７１５（配列番号６９）；ＢＥ５１８５０６（配列番号７０）；ＢＧ０５８２４７（配列番号７１）；ＢＧ０１７４６０（配列番号７２）；ＮＭ＿０００８０２（配列番号７３）；Ｕ２０３９１（配列番号７４）；ＮＭ＿０１６７３１（配列番号７５）；ＮＭ＿０１６７３０（配列番号７６）；ＮＭ＿０１６７２９（配列番号７７）；ＮＭ＿０１６７２５（配列番号７８）；ＮＭ＿０１６７２４（配列番号７９）；ＮＭ＿０１３３０７（配列番号８０）；ＮＭ＿００８０３５（配列番号８１）；ＮＭ＿００８０３４（配列番号８２）；ＢＦ１５３２９２（配列番号８３）；ＢＦ１１４５１８（配列番号８４）；ＢＥ９４０８０６（配列番号８５）；ＢＥ８５８９９６（配列番号８６）；ＡＦ２１９９０６（配列番号８７）；ＡＦ２１９９０５（配列番号８８）；ＡＦ２１９９０４（配列番号８９）；ＢＥ６８７１７７（配列番号９０）；ＢＥ６３６６２２（配列番号９１）；ＢＥ６２７２３０（配列番号９２）；ＢＥ５０６５６１（配列番号９３）；ＢＥ５０５０４８（配列番号９４）；ＢＥ４９６７５４（配列番号９５）；ＢＢ１１４０１０（配列番号９６）；ＢＢ１０９５２７（配列番号９７）；ＢＢ１０７２１９（配列番号９８）；ＢＥ２０６３２４（配列番号９９）；ＢＥ４４８３９２（配列番号１００）；ＢＥ２０７５９６（配列番号１０１）；ＢＥ２０６６３５（配列番号１０２）；ＢＥ２４０９９８（配列番号１０３）；ＢＥ２２８２２１（配列番号１０４）；ＢＥ２２５４１６（配列番号１０５）；ＢＥ２２５４０４（配列番号１０６）；ＢＢ２１４０４０（配列番号１０７）；ＢＥ１９９６１９（配列番号１０８）；ＢＥ１９９５９７（配列番号１０９）；ＢＥ１９８６１０（配列番号１１０）；ＢＥ１９８５７１（配列番号１１１）；ＢＥ１８８０５５（配列番号１１２）；ＢＥ１８７８０４（配列番号１１３）；ＢＢ０３２６４６（配列番号１１４）；ＢＥ０３７２７８（配列番号１１５）；ＢＥ０３７１２５（配列番号１１６）；ＢＥ０３７１１０（配列番号１１７）；ＢＥ０３７００９（配列番号１１８）；ＢＥ０３６０２４（配列番号１１９）；ＢＥ０３５８２８（配列番号１２０）；ＢＥ０３５７５１（配列番号１２１）；ＢＥ０１９７２４（配列番号１２２）；ＡＷ９１３２９１（配列番号１２３）；ＡＷ９１２４４５（配列番号１２４）；ＡＷ８２３９１２（配列番号１２５）；ＡＷ８２３４１８（配列番号１２６）；ＡＢ０２３８０３（配列番号１２７）；ＡＢ０２２３４４（配列番号１２８）；ＡＷ４７５３８５（配列番号１２９）；ＡＷ３２３５８６（配列番号１３０）；ＡＷ３１９３０８（配列番号１３１）；ＡＷ２３９６６８（配列番号１３２）；ＡＶ２５３１３６（配列番号１３３）；ＡＷ０１３７１６（配列番号１３４）；ＡＷ０１３７０４（配列番号１３５）；ＡＷ０１３７０２（配列番号１３６）；ＡＷ０１３６９６（配列番号１３７）；ＡＷ０１３６６９（配列番号１３８）；ＡＷ０１３６４７（配列番号１３９）；ＡＷ０１３５０１（配列番号１４０）；ＡＷ０１３４８４（配列番号１４１）；ＡＷ０１３４２８（配列番号１４２）；ＡＷ０１３４０４（配列番号１４３）；ＡＷ０１３３８６（配列番号１４４）；ＡＷ０１３２８４（配列番号１４５）；ＡＷ０１３１８３（配列番号１４６）；ＡＦ０６１２５６（配列番号１４７）；ＡＩ９５６５７２（配列番号１４８）；ＡＩ８８２５５０（配列番号１４９）；ＡＩ８２２９３２（配列番号１５０）；ＡＩ７８５９８８（配列番号１５１）；ＡＩ７４４２７３（配列番号１５２）；ＡＩ７２７３０２（配列番号１５３）；ＡＩ７２５７１４（配列番号１５４）；ＡＦ１３７３７５（配列番号１５５）；ＡＦ１３７３７４（配列番号１５６）；ＡＦ１３７３７３（配列番号１５７）；ＡＦ０９６３２０（配列番号１５８）；ＡＦ０９６３１９（配列番号１５９）；ＡＩ６６３８５７（配列番号１６０）；ＡＩ６４７８４１（配列番号１６１）；ＡＩ６４６９５０（配列番号１６２）；ＡＩ６０７９１０（配列番号１６３）；ＡＩ５２９１７３（配列番号１６４）；ＡＩ５０９７３４（配列番号１６５）；ＡＩ５０６２６７（配列番号１６６）；ＡＩ４９８２６９（配列番号１６７）；ＡＩ０００４４４（配列番号１６８）；ＡＡ９５６３３７（配列番号１６９）；ＡＡ９５５０４２（配列番号１７０）；ＡＡ８９９８３８（配列番号１７１）；ＡＡ８９９７１８（配列番号１７２）；ＡＡ８５８７５６（配列番号１７３）；ＡＩ３１１５６１（配列番号１７４）；ＡＩ３８５９５１（配列番号１７５）；ＡＩ３５２４０６（配列番号１７６）；ＡＦ１００１６１（配列番号１７７）；ＡＩ３２６５０３（配列番号１７８）；ＡＩ３２５５１７（配列番号１７９）；ＡＩ３２５４５３（配列番号１８０）；ＡＩ３２５３８２（配列番号１８１）；ＡＩ３２３７００（配列番号１８２）；ＡＩ３２３３７４（配列番号１８３）；ＡＩ３１３９７３（配列番号１８４）；ＡＩ１９６９２８（配列番号１８５）；ＡＦ０９１０４１（配列番号１８６）；ＡＩ１５６２１２（配列番号１８７）；ＡＩ１２０３７４（配列番号１８８）；ＡＩ１１９０００（配列番号１８９）；ＡＡ４０８６７０（配列番号１９０）；ＡＡ４０８０７２（配列番号１９１）；ＡＡ４０７６１５（配列番号１９２）；ＡＡ９９５２７２（配列番号１９３）；Ｃ７８５９３（配列番号１９４）；ＡＡ９９９９１０（配列番号１９５）；ＡＡ９９１４９１（配列番号１９６）；Ｘ９９９９４（配列番号１９７）；Ｘ９９９９３（配列番号１９８）；Ｘ９９９９２（配列番号１９９）；Ｘ９９９９１（配列番号２００）；Ｘ９９９９０（配列番号２０１）；ＡＡ９５８９８５（配列番号２０２）；ＡＡ８７３２２２（配列番号２０３）；ＡＡ９３００５１（配列番号２０４）；ＡＡ８９５３３４（配列番号２０５）；ＡＡ７９６１４２（配列番号２０６）；ＡＡ７９８２２３（配列番号２０７）；ＡＡ７３４３２５（配列番号２０８）；ＡＡ６９０８７１（配列番号２０９）；ＡＡ６７４９８８（配列番号２１０）；ＡＡ６７４８６３（配列番号２１１）；ＡＡ６７４８２１（配列番号２１２）；ＡＡ６７４７４４（配列番号２１３）；ＡＡ６７１５５８（配列番号２１４）；ＡＦ０００３８１（配列番号２１５）；ＡＦ０００３８０（配列番号２１６）；ＡＡ６３７０７１（配列番号２１７）；ＡＡ６１６３１４（配列番号２１８）；ＡＡ１０９６８７（配列番号２１９）；ＡＡ６０８２３５（配列番号２２０）；ＡＡ５８９０５０（配列番号２２１）；ＡＡ５４４７８２（配列番号２２２）；ＡＡ５２２０９５（配列番号２２３）；ＡＡ３８６８２１（配列番号２２４）；ＡＡ３８６８１８（配列番号２２５）；ＡＡ３８６４９５（配列番号２２６）；ＡＡ２８９２７８（配列番号２２７）；ＡＡ２８６３４２（配列番号２２８）；ＡＡ２７６３０２（配列番号２２９）；ＡＡ２７６１２３（配列番号２３０）；ＡＡ２７７２８０（配列番号２３１）；ＡＡ２７３５４３（配列番号２３２）；Ｕ８９９４９（配列番号２３３）；ＡＡ２０８３０６（配列番号２３４）；ＡＡ２０８０８９（配列番号２３５）；ＡＡ２４２２８５（配列番号２３６）；ＡＡ１３９７１５（配列番号２３７）；ＡＡ１３９７０９（配列番号２３８）；ＡＡ１３９６７５（配列番号２３９）；ＡＡ１３９５９３（配列番号２４０）；ＡＡ１２４０１０（配列番号２４１）；ＡＡ１０８７９０（配列番号２４２）；ＡＡ１０８３５０（配列番号２４３）；ＡＡ０２８８３１（配列番号２４４）；ＡＡ０６１２７５（配列番号２４５）；Ｗ８２９３３（配列番号２４６）；ＡＡ０１５５７１（配列番号２４７）；Ｗ７１７１５（配列番号２４８）；Ｗ５９１６５（配列番号２４９）；Ｘ６２７５３（配列番号２５０）；Ｚ３２５６４（配列番号２５１）；Ｔ２９２７９（配列番号２５２）；Ｍ２５３１７（配列番号２５３）；Ｍ８６４３８（配列番号２５４）；Ｊ０３９２２（配列番号２５５）；Ｍ６４８１７（配列番号２５６）；Ｌ２５３３８（配列番号２５７）；Ｍ９７７０１（配列番号２５８）；Ｍ９７７００（配列番号２５９）；Ｍ６４７８２（配列番号２６０）；Ｍ３５０６９（配列番号２６１）；Ｊ０５０１３（配列番号２６２）；Ｍ２８０９９（配列番号２６３）；Ｊ０２８７６（配列番号２６４）；Ｕ０８４７１（配列番号２６５）；Ｕ０２７１４（配列番号２６６）；およびＵ０２７１６（配列番号２６７）。
【００８４】
当業者はまた、本発明の範囲が、配列番号１〜配列番号８に記載される特定のノナペプチドに限定されないことを認識している。ＦＢＰエピトープを含む抗原は、少なくとも約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または約３０までであり得る。任意のアミノ酸が、本明細書中に提供される特定の改変体配列に加えて、配列の残部への付加またはフィルインのために用いられ得ることが意図される。しかし、これらは、ＦＢＰの基礎配列を維持するものであることが好ましい。
【００８５】
（ＩＩＩ．合理的ワクチン設計）
合理的ワクチン設計の目標は、生物学的に活性な化合物の構造アナログを生成することである。このようなアナログを作製することによって、変更に対して異なる感受性を有するか、または種々の他の分子の機能に影響を与え得る、天然分子よりも活性が高いかまたは安定であるワクチンを形成することが可能である。１つのアプローチでは、当業者は、本発明の葉酸結合タンパク質改変体またはそのフラグメントについての三次元構造を作製する。これは、Ｘ線結晶学、コンピュータモデリングまたは両方のアプローチの組合せによって達成され得る。代替的アプローチは、葉酸結合タンパク質改変体全体の官能基のランダム置換を含み、そして機能に対する得られる影響が決定される。
【００８６】
機能的アッセイによって選択された葉酸結合タンパク質改変体特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解明することもまた可能である。原則として、このアプローチは、ファルマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生じ、その後のワクチン設計はこのファルマコアに基づき得る。機能的な、薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製することによって、タンパク質結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、元の抗原のアナログであると予想される。次いで、抗イディオタイプを用いて、化学産生ペプチドまたは生物学的産生ペプチドのバンクからペプチドを同定および単離し得る。次いで、選択されたペプチドは、ワクチンとして役立つ。
【００８７】
従って、本発明の出発葉酸結合タンパク質改変体と比較して増強かつ改善された生物学的活性（例えば、抗腫瘍活性）を有するワクチンを設計し得る。標準的な化学単離手順および本明細書中の他の説明によって、充分な量の本発明の葉酸結合タンパク質改変体を産生して、結晶学研究を実施し得る。さらに、これらの化合物の化学的特徴の知識によって、構造−機能の関係のコンピュータ利用推定が可能である。
【００８８】
（ＩＶ．免疫学的試薬）
特定の免疫原組成物の免疫原性が、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増強され得ることが当該分野で周知である。適切なアジュバントとしては、受容可能な全ての免疫刺激化合物（例えば、サイトカイン、ケモカイン、補因子、毒素、マラリア原虫、合成組成物またはこのようなアジュバントをコードするＬＥＥもしくはＣＥＥ）が挙げられる。
【００８９】
用いられ得るアジュバントとしては、以下が挙げられる：ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ＭＤＰ化合物（例えば、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰ）、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡおよびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）。２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分、ＭＰＬ、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩもまた意図される。ＭＨＣ抗原でさえ用いられ得る。例示的な、しばしば好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（殺傷したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む、免疫応答の非特異的刺激因子）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００９０】
アジュバントに加えて、Ｔ細胞免疫をアップレギュレートすることまたはサプレッサー細胞活性をダウンレギュレートすることが示されている、生物学的応答の変更因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＢＲＭ）を同時投与することもまた所望され得る。このようなＢＲＭとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ，ＰＡ）；低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ，ＮＪ）、サイトカイン（例えば、ｇ−インターフェロン、ＩＬ−２またはＩＬ−１２）または免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ−７）。
【００９１】
皮下、筋肉内、皮内、表皮内、静脈内および腹腔内を含むがこれらに限定されない種々の経路を用いて、ワクチンを投与し得る。
【００９２】
患者のような個体には一般に、上記のようなワクチンが注射される。抗原は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）と混合され得る。同じワクチンまたはこれをコードするＤＮＡの追加抗原投与は、ほぼ２週間の間隔で行われ得る。
【００９３】
（Ｖ．免疫治療剤）
免疫治療剤は一般に、免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に依存して、癌細胞を標的化および破壊する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞抗原であるかまたは腫瘍細胞抗原に類似した、葉酸結合タンパク質改変体であり得る。改変体単独は、治療のエフェクターとして役立ち得るか、または他の細胞を補充して、実際に細胞殺傷をもたらし得る。改変体はまた、薬物または毒素（例えば、化学治療剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、そして標的化剤として単に役立ち得る。このような抗体結合体は免疫毒素と呼ばれ、そして当該分野で周知である（各々本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，６８６，０７２号、米国特許第５，５７８，７０６号、米国特許第４，７９２，４４７号、米国特許第５，０４５，４５１号、米国特許第４，６６４，９１１号および米国特許第５，７６７，０７２号を参照のこと）。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的のいずれかで腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を保有するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【００９４】
免疫治療の１つの局面では、腫瘍細胞は、標的化され得る、すなわち、大部分の他の細胞に存在しない、いくつかのマーカーを保有しなければならない。本明細書中に記載される葉酸結合タンパク質に加えて、多くの腫瘍マーカーが存在し、そしてこれらのうちのいずれもが、本発明の状況において標的化のために適切であり得る。通常の腫瘍マーカーとしては、以下が挙げられる：癌胎児抗原、前立腺特異抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５。
【００９５】
本明細書中に提示した開示は、ヒトの疾患および障害（癌を含む）の免疫治療に対して顕著な関連を有する。本発明の抗原から誘導された免疫治療組成物を処置方法において使用する際に、他の標準的な処置（例えば、放射線治療または化学療法）もまた用いられ得る。しかし、有効性が容易に評価され得るように、免疫治療が最初に単独で用いられることが好ましい。癌の免疫治療は、以下の節に記載したように、養子、受動および能動に広範に分類され得、そして本発明の葉酸結合タンパク質改変体抗原を用いて使用または生成され得る。
【００９６】
（Ａ．免疫刺激因子）
特定の局面の免疫治療は、免疫刺激分子を因子として、またはより好ましくは例えば以下のような別の因子と関連して使用することである：サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子）；インターフェロンα、βおよびγ；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８）；または増殖因子（例えば、ＦＬＴ３リガンド）。
【００９７】
本発明における使用が意図される１つの特定のサイトカインは、腫瘍壊死因子である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；カケクチン）は、ある種の癌細胞を殺傷し、サイトカイン産生を活性化し、マクロファージおよび内皮細胞を活性化し、コラーゲンおよびコラゲナーゼの産生を促進し、炎症メディエーターであり、そしてまた敗血症性ショックのメディエーターでさえあり、そして異化、発熱および睡眠を促進する、糖タンパク質である。いくつかの感染性因子は、ＴＮＦ産生の刺激を介して腫瘍後退を引き起こす。ＴＮＦは、有効用量で単独で用いた場合、極めて毒性であり得、その結果、最適なレジメンはおそらく、他の薬物との組合せで、より低い用量でＴＮＦを用いる。その免疫抑制作用は、γ−インターフェロンによって増強され、その結果、組合せが潜在的に危険である。ＴＮＦとインターフェロン−ａとのハイブリッドもまた、抗癌活性を保有することが見出されている。
【００９８】
特に意図される別のサイトカインは、インターフェロンαである。インターフェロンαは、毛様細胞性白血病、カポージ肉腫、黒色腫、カルチノイド、腎臓細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、非ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、多発性骨髄腫および慢性顆粒球性白血病の処置において用いられている。
【００９９】
（Ｂ．受動免疫治療）
癌の受動免疫治療のための多数の異なるアプローチが存在する。これらは、以下のように広範に分類され得る：ワクチン単独の注射；毒素または化学療法剤にカップリングしたワクチンの注射；放射性同位体にカップリングしたワクチンの注射；抗イディオタイプワクチンの注射；および最後に、骨髄における腫瘍細胞のパージング。
【０１００】
２つの異なる抗原に関連した１より多くのワクチンまたはさらには複数の抗原特異性を有するワクチンを投与することが好適であり得る。処置プロトコルはまた、リンホカインまたは他の免疫エンハンサーの投与を含み得る（Ｂａｊｏｒｉｎら、１９８８）。
【０１０１】
（Ｃ．能動免疫治療）
本発明のいくつかの実施形態では、能動免疫治療が用いられ得る。能動免疫治療では、葉酸結合タンパク質改変体（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、葉酸結合タンパク質改変体をコードする核酸、および／またはさらなるワクチン成分（例えば、葉酸結合タンパク質改変体を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞と融合した樹状細胞、またはこの抗原を発現する、自己もしくは同種異系の腫瘍細胞組成物）、アジュバント、組換えタンパク質、免疫調節因子など）が投与される（ＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈおよびＭｏｒｔｏｎ，１９９１；ＭｏｒｔｏｎおよびＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，１９９６；Ｍｏｒｔｏｎら，１９９２；Ｏｋａｍｏｔｏら，１９９７；Ｋｕｇｌｅｒら，２０００；Ｔｒｅｆｚｅｒら，２０００；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，１９９０；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，１９９３）。
【０１０２】
抗原性ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または自己もしくは同種異系の腫瘍細胞組成物または「ワクチン」は一般に、別の細菌アジュバントとともに投与される（ＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈおよびＭｏｒｔｏｎ，１９９１；ＭｏｒｔｏｎおよびＲａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，１９９６；Ｍｏｒｔｏｎら，１９９２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，１９９０；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，１９９３）。黒色腫の免疫治療では、高ＩｇＭ応答を惹起する患者はしばしば、ＩｇＭ抗体を惹起しないかまたは少量惹起する患者よりも、長く生存する（Ｍｏｒｔｏｎら，１９９２）。ＩｇＭ抗体はしばしば、一過性の抗体であり、この法則の例外は、抗ガングリオシド抗体または抗糖質抗体であるようである。
【０１０３】
（Ｄ．養子免疫治療）
養子免疫治療では、患者の循環リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球は、インビトロで単離されるか、リンホカイン（例えば、ＩＬ−２）によって活性化されるか、または腫瘍壊死についての遺伝子を用いて形質導入され、そして再度投与される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９８８；１９８９）。これを達成するために、本明細書中に記載のように、アジュバントを取り込んだ抗原性ペプチド組成物と組合せた免疫学的有効量の活性化リンパ球を動物（またはヒト患者）に投与する。活性化リンパ球は、最も好ましくは、血液または腫瘍サンプルから以前に単離し、そしてインビトロで活性化（または「増大」）させた、患者自身の細胞である。特定の実施形態では、患者のリンパ球は、培養されるかまたは数が増大されるかまたは活性（例えば、抗原に対する免疫反応性）に関して選択される。この形態の免疫治療は、黒色腫および腎臓癌の後退のいくつかの例を生じた。
【０１０４】
（ＶＩ．ワクチン）
本発明は、能動免疫および受動免疫の両方の実施形態において使用するためのワクチンを意図する。ワクチンとして使用することが好適であると提案されている免疫原性組成物は、本明細書中に開示した様式において調製した、免疫原性ＣＴＬ刺激ペプチドから最も容易に直接的に調製され得る。好ましくは、抗原性物質は、充分に透析されて、所望でない低分子量分子が除去され、そして／または所望のビヒクル中へのより容易な処方のために凍結乾燥される。
【０１０５】
活性成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製は、米国特許第４，６０８，２５１号；同第４，６０１，９０３号；同第４，５９９，２３１号；同第４，５９９，２３０号；同第４，５９６，７９２号；および同第４，５７８，７７０号（すべて、本明細書中に参考として援用される）により例示されるように、一般的に当該分野で十分に理解されている。代表的には、そのようなワクチンは、注射可能物質として調製される。液体溶液または液体懸濁物のいずれかとして、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁物に適切な固体形態もまた、調製され得る。その調製物はまた、乳化され得る。その免疫原性活性成分は、薬学的に受容可能でありかつその活性成分と適合性である、賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせである。さらに、望ましい場合は、そのワクチンは、微量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、またはそのワクチンの有効性を増強するアジュバント）を含み得る。
【０１０６】
ワクチンは、非経口的に、注射（例えば、皮下注射または筋肉内注射のいずれか）によって、従来のように投与され得る。他の投与様式に適したさらなる処方物としては、坐剤、およびいくつかの場合においては、経口処方物が挙げられる。坐剤について、従来の結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得、そのような坐剤は、約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲で活性成分を含む、混合物から形成され得る。経口処方物は、通常そのように使用される賦形剤（例えば、薬剤グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放処方物または散剤の形態を採り、そして約１０％〜約９５％の活性成分、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を含む。
【０１０７】
本発明のペプチドは、中性形態または塩形態として、ワクチンへ中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（そのペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）、ならびに無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成された塩が挙げられる。その遊離カルボキシル基を用いて形成された塩もまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【０１０８】
そのワクチンは、その投薬処方物と適合する様式で、そして治療上有効かつ免疫原性である量で、投与される。投与される量は、処置されるべき被験体（例えば、その個体の免疫系が抗体を合成する能力を含む）、および所望される防御の程度に依存する。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、実務家の判断に依存する。しかし、適切な投薬範囲は、ワクチン投与一回当たり約数百マイクログラムの活性成分である。最初の投与およびブースター投与に適したレジメンもまた変化し得るが、代表的には、最初の投与の後に、接種または他の投与が続く。
【０１０９】
適用様式は、広範に変動し得る。従来の任意のワクチン投与法が、適用可能である。これらは、生理学的に受容可能な固体ベースでかもしくは生理学的に受容可能な分散物での経口適用、非経口的適用、注射などを含むと考えられる。そのワクチンの投与量は、投与経路に依存し、そして宿主の大きさに応じて変化する。
【０１１０】
そのワクチンのためのアジュバント効果を達成する種々の方法としては、一般的にリン酸緩衝化生理食塩水中の約０．０５〜約０．１％溶液として使用される薬剤（例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン））の使用、約０．２５％溶液として使用される糖の合成ポリマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合、約７０℃〜約１０１℃の間の範囲の温度でそれぞれ３０秒〜２分間熱処理することによるそのワクチン中のタンパク質の凝集が、挙げられる。ペプシン処理した抗アルブミン（Ｆａｂ）抗体で再活性化することによる凝集、細菌細胞（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）またはグラム陰性細菌の内毒素成分もしくはリポ多糖類成分との混合物、生理学的に受容可能な油状ビヒクル（例えば、マンニドモノオレエート（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）中の乳濁液、またはブロック置換物として使用されるペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ（登録商標））の２０％溶液との乳濁液もまた、使用され得る。
【０１１１】
多くの場合、そのワクチンの多数回投与（通常は、６回ワクチン接種を超えず、より通常は、４回ワクチン接種を超えず、好ましくは、１回以上であり通常は少なくとも約３回のワクチン接種）を有することが、望ましい。そのワクチン接種は、通常は、２〜１２週間隔であり、より通常は、３〜５週間隔である。１〜５年間隔（通常は３年間隔）の定期的ブースターが、その抗体の防御レベルを維持するために望ましい。免疫経過の後に、上清抗原に対する抗体についてのアッセイが行われ得る。そのアッセイは、従来の標識（例えば、放射性核種、酵素、蛍光物質など）で標識することによって、実施され得る。これらの技術は、周知であり、そして、これらのアッセイ型の例示として、広範な種々の特許（例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第４，１７４，３８４号；および同第３，９４９，０６４号）に見出され得る。
【０１１２】
ワクチンとして有用である抗原性組成物について、抗原性組成物は、細胞、組織または動物（例えば、ヒト）において、その抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。本明細書中で使用される場合、「抗原性組成物」は、抗原（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば、抗原発現ベクター）、または抗原を発現するかもしくは提示する細胞を含み得る。特定の実施形態において、その抗原性組成物は、葉酸結合タンパク質改変体またはその免疫学的に機能性の等価物を、含むかまたはコードする。他の実施形態において、その抗原性組成物は、さらなる免疫刺激剤またはそのような薬剤をコードする核酸を含む、混合物の状態である。免疫刺激剤としては、さらなる抗原、免疫調節剤、抗原提示細胞、またはアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、そのさらなる薬剤のうちの１つ以上が、その抗原または免疫刺激剤と、任意の組み合わせで共有結合される。特定の実施形態において、その抗原性組成物は、ＨＬＡアンカーモチーフアミノ酸と結合体化されるか、またはＨＬＡアンカーモチーフアミノ酸を含む。
【０１１３】
特定の実施形態において、抗原性組成物または免疫学的に機能性の等価物が、動物における抗葉酸結合タンパク質改変体の体液媒介性免疫応答および／または細胞媒介性免疫応答を誘導する際の、有効なワクチンとして使用され得る。本発明は、能動免疫実施形態および受動免疫実施形態の両方における使用のための、１つ以上の抗原性組成物またはワクチンを企図する。
【０１１４】
本発明のワクチンは、タンパク質様成分、核酸成分、および／または細胞性成分のその組成が、変動し得る。非限定的例において、抗原をコードする核酸はまた、タンパク質様アジュバントを用いて処方され得る。当然、本明細書中に記載される種々の組成物が、さらなる成分をさらに含み得ることが理解される。例えば、１つ以上のワクチン成分が、脂質またはリポソーム中に含まれ得る。別の非限定的例において、ワクチンは、１つ以上のアジュバントを含み得る。本発明のワクチンおよびその種々の成分は、本明細書中に開示される任意の方法によってか、または本発明の開示を考慮して当業者に公知であるように、調製および／または投与され得る。
【０１１５】
（Ａ．タンパク質様抗原）
本発明の抗原性組成物が、当該分野で周知である方法により生成され得、そのような方法としては、固相合成により化学合成し、そしてその化学反応物質をＨＰＬＣによって他の生成物から精製すること；または本発明の抗原を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を、インビトロ翻訳系もしくは生細胞中で発現させることによる生成が、挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、その抗原性組成物は、単離され、そして望ましくない１つ以上の低分子量分子を除去するために徹底的に透析され、そして／または所望のビヒクル中により容易に処方するために凍結乾燥される。ワクチン成分においてなされるさらなるアミノ酸、変異、化学的改変などは、もし存在する場合は、好ましくは、そのエピトープ配列の抗体認識を実質的に妨害しないことが、さらに理解される。
【０１１６】
本発明の葉酸結合タンパク質改変体の１つ以上の抗原決定基に対応するペプチドまたはポリペプチドは、一般的には、少なくとも５アミノ酸残基長または６アミノ酸残基長であり、そして約１０アミノ酸残基長、約１５アミノ酸残基長、約２０アミノ酸残基長、またはそれ以上までを含み得る。ペプチド配列は、当業者に公知の方法（例えば、自動ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能な合成機）を使用するペプチド合成）によって、合成され得る。
【０１１７】
より長いペプチドまたはポリペプチドもまた、例えば、組換え手段によって調製され得る。特定の実施形態において、本明細書中に記載される抗原性組成物および／または抗原性成分をコードする核酸が、例えば、本発明の種々の組成物および方法のために、インビトロまたはインビボで抗原性組成物を生成するために使用され得る。例えば、特定の実施形態において、抗原をコードする核酸が、例えば、組換え細胞中のベクター中に含まれる。その核酸は、抗原性配列を含むペプチドまたはポリペプチドを生成するように発現され得る。そのペプチドまたはポリペプチドは、その細胞から分泌され得るか、またはその細胞の一部としてかその細胞内に含まれ得る。
【０１１８】
（Ｂ．遺伝子ワクチン抗原）
特定の実施形態において、免疫応答が、抗原をコードする核酸で動物をトランスフェクトすること、または抗原をコードする核酸を動物に接種することによって、促進され得る。その後、標的動物内に含まれる１つ以上の細胞は、その動物へのその核酸の投与後に、その核酸によりコードされる配列を発現する。従って、そのワクチンは、免疫プロトコルに有用な「遺伝子ワクチン」を包含し得る。ワクチンはまた、例えば、抗原のペプチド配列またはポリペプチド配列のすべてもしくは一部をコードする、核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）の形態であり得る。その核酸によるインビボでの発現は、例えば、プラスミド型ベクター、ウイルスベクター、またはウイルス構築物ベクター／プラスミド構築物ベクターにより得る。
【０１１９】
好ましい局面において、その核酸は、配列番号１〜配列番号９として開示される配列のすべてもしくは一部、またはその免疫学的に機能性の等価物をコードする、コード領域を含む。当然、その核酸は、さらなる配列（１つ以上の免疫刺激剤またはアジュバントを含む配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得、そして／またはその配列をコードし得る。種々の遺伝子の配列をコードするヌクレオチド、ならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドが、以前に開示されており、そしてそれらは、コンピュータ化された当業者に公知のデータベースにて見出され得る。そのような１つのデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  ＧｅｎｂａｎｋデータベースおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）である。これらの公知の遺伝子のコード領域は、増幅され得、本明細書中に開示される葉酸結合タンパク質改変体をコードする核酸配列と合わされ（例えば、連結）され得、そして／または本明細書中に開示される技術を使用してかもしくは当業者に公知である任意の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８７）によって、発現され得る。核酸は、インビトロ発現系において発現され得るが、好ましい実施形態において、その核酸は、インビボ複製および／またはインビボ発現のためのベクターを含む。
【０１２０】
（Ｃ．細胞性ワクチン抗原）
別の実施形態において、その抗原を発現する細胞が、そのワクチンを含み得る。その細胞は、培養物、組織、器官、または生物から単離され得、そして細胞性ワクチンとして動物に投与され得る。従って、本発明は、「細胞性ワクチン」を企図する。その細胞は、抗原をコードする核酸で、その抗原の発現を増強するためにトランスフェクトされ得る。当然、その細胞はまた、１つ以上のさらなるワクチン成分（例えば、免疫調節剤またはアジュバント）を発現し得る。ワクチンは、その細胞のすべてまたは一部を包含し得る。
【０１２１】
（Ｄ．免疫学的に機能性の等価物）
改変および変化が、本発明のペプチドおよびそのペプチドをコードするＤＮＡセグメントの構造においてなされ得、望ましい特徴を備えたタンパク質またはペプチドをコードする機能性分子をなお入手し得る。以下は、等価であるかまたは改善さえされている第２世代分子を生成するためにタンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。そのアミノ酸変化は、そのＤＮＡ配列のコドンを、以下のコドン表に従って変化させることによって達成され得る。
【０１２２】
（表１）
【０１２３】
【表１】
0004401075.tif 000002
0004401075.tif 000003
例えば、特定のアミノ酸が、構造（例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位）との相互作用性結合能力を感知可能には損失することなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸に代えて置換され得る。タンパク質の生物学的機能的活性を規定するのは、タンパク質の相互作用性能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列において、そして当然その基礎となるＤＮＡコード配列においてなされ得、それにも関わらず、同様の特性を備えたタンパク質を入手し得る。従って、種々の変化が、開示される組成物のペプチド配列においてかまたはそのペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列において、その生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴うことなくなされ得ることが、本発明者らによって企図される。アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換物の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づき得る。上記の種々の特徴を考慮する例示的な置換物は、当業者に周知である。
【０１２４】
多数の科学刊行物もまた、アミノ酸配列分析からの、二次構造の予測およびエピトープの同定を示している（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ，１９７４ａ，ｂ；１９７８ａ，ｂ，１９７９）。これらのいずれも、望まれる場合は、米国特許第４，５４４，１０１号の教示を補うために使用され得る。
【０１２５】
さらに、コンピュータプログラムが、１つ以上のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの抗原性部分およびエピトープコア領域を予測するのを補助するために、現在利用可能である。例としては、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析（ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ、１９９８；Ｗｏｌｆら、１９８８）に基づくプログラム、プログラムＰｅｐＰｌｏｔ（登録商標）（Ｂｒｕｔｌａｇら、１９９０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５）、およびタンパク質三次構造予測のための他の新規なプログラム（ＦｅｔｒｏｗおよびＢｒｙａｎｔ，１９９３）が、挙げられる。そのような分析を実行可能である別の市販のソフトウェアプログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）である。
【０１２６】
改変および変化が、本発明の抗原性組成物（例えば、葉酸結合タンパク質改変体）の構造においてなされ得、そしてなお、同様の特徴または他の様式で望ましい特徴を有する分子を入手し得るので、そのような免疫学的に機能性の等価物もまた、本発明に包含される。
【０１２７】
例えば、特定のアミノ酸が、構造（例えば、抗体の抗原結合領域、基質分子またはレセプター上の結合部位、ＤＮＡ結合部位など）との相互作用性結合能力を感知可能には損失することなく、ペプチド構造、ポリペプチド構造、またはタンパク質構造中の他のアミノ酸に代えて置換され得る。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の生物学的（例えば、免疫学的）機能的活性を規定するのは、そのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の相互作用性能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換が、アミノ酸配列において（すなわち、当然その基礎となるＤＮＡコード配列において）なされ得、それにも関わらず、同様の（アゴニスト）特性を備えたペプチドまたはポリペプチドを入手し得る。従って、種々の変化が、抗原性組成物（例えば、葉酸結合タンパク質改変体のペプチドまたはポリペプチド）の配列（または基礎となるＤＮＡ配列）において、その生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴うことなくなされ得ることが、本発明者らによって企図される。
【０１２８】
従って、本明細書中に開示される配列の抗原性組成物（特に、免疫学的に機能性の等価物）は、天然に合成されるタンパク質中の一般的な２０個のアミノ酸のうちの少なくとも１つ、または少なくとも１つの改変アミノ酸もしくは非天然アミノ酸（下記表２に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない）を含む、アミノ分子配列を包含し得る。
【０１２９】
（表２）
（改変アミノ酸、非天然アミノ酸、または希少なアミノ酸）
【０１３０】
【表２】
0004401075.tif 000004
0004401075.tif 000005
免疫学的に機能性の等価物に関して、その分子の規定部分内でなされ得、なおかつ受容可能なレベルの等価な免疫学的活性を備える分子を生じ得る変化の数に限界が存在するという概念が、この定義において固有であることが、当業者により十分に理解される。従って、免疫学的に機能性の等価なペプチドまたはポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸のうちの特定のもの（大部分でもすべてでもない）が置換され得るペプチドまたはポリペプチドとして、規定される。
【０１３１】
詳細には、より短い長さのペプチドが関係する場合、より少ないアミノ酸置換が、所定のペプチド内でなされるべきであることが、企図される。より長いポリペプチドは、中程度の数の変化を有し得る。全長タンパク質は、より多数の変化について最も許容性を有する。当然、異なる置換を有する複数の個々のポリペプチド／ペプチドが、本発明に従って容易に作製され得そして使用され得る。
【０１３２】
特定の残基が、タンパク質またはペプチドの免疫学的特性または構造特性にとって特に重要であることが示された場合（例えば、結合領域または活性部位中の残基）、そのような残基は、一般的には交換されないかもしれないこともまた、十分に理解される。このことは、葉酸結合タンパク質改変体の抗原性部位中の変化が、慎重に考慮され、免疫学的機能の維持が望ましい場合にその後試験されて免疫学的機能（例えば、抗原性）の維持が確認されるべき場合に、本発明における重要な考慮事項である。この様式において、機能的等価物は、本明細書中で、十分量のネイティブの免疫学的活性を維持するペプチドまたはポリペプチドとして規定される。
【０１３３】
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなど）の相対的類似性に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状、および型の分析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは、全て正に荷電した残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンは、全て類似のサイズであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、全て一般に類似の形状を有することが明らかになる。タンパク質とは対照的に、ペプチドについての特定のアミノ酸置換の注意深い選択を、ペプチドとタンパク質との間のサイズの差異を考えると、考慮に入れられなければならない。
【０１３４】
さらなる実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドの主要な抗原決定基は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の一部が、組み換え宿主細胞において発現される経験的なアプローチにより同定され得、得られたペプチドまたはポリペプチドは、免疫応答を誘発するそれらの能力について試験され得る。例えば、ＰＣＲＴＭは、そのアミノ酸配列のＣ末端の連続してより長いフラグメントを欠くペプチドまたはポリペプチドの範囲を調製するために使用され得る。これらペプチドまたはポリペプチド各々の免疫活性は、免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）であるフラグメントまたはドメインを同定するために決定される。次いで、ごく少数のアミノ酸が各反復して除去されるさらなる研究により、ペプチドまたはポリペプチドの抗原決定基の位置をより正確に決定することが可能になる。
【０１３５】
ペプチドまたはポリペプチドの主要な抗原決定基を決定するための別の方法は、ＳＰＯＴｓＴＭシステム（Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）である。この方法において、重複するペプチドをセルロース膜上で合成する。これを、合成および脱保護の後、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用してスクリーニングする。最初に同定されるペプチドまたはポリペプチドの抗原決定基は、より多く重複するより小さなペプチドの連続的な合成を行い、最終的には、免疫反応性の配列に沿って、各位置にて個々のアミノ酸を置換することによりさらに位置決めされ得る。
【０１３６】
１回以上のこのような分析が一旦完了すると、１以上の抗原決定基の少なくとも本質的特徴を含む抗原性組成物（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）が調製される。次いで、抗原性組成物は、組成物（好ましくは、抗原決定基）に対する抗血清の生成において使用される。
【０１３７】
アミノ酸変化から生じる機能的に等価なポリペプチドに議論の焦点が当てられてきたが、これらの変化がコードＤＮＡの改変によりもたらされ得ること；遺伝コードの縮重、および２以上のコドンが同じアミノ酸をコードし得ることを考慮に入れることもまた理解される。これらの抗原性組成物をコードする核酸もまた構築され得、例えば、ＰＣＲＴＭクローニング方法論を使用して、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８７）により、１以上の発現ベクターに挿入され得る。
【０１３８】
本明細書中に記載されるペプチジル化合物に加えて、本発明はまた、他の立体的に類似の化合物が、ペプチド構造もしくはポリペプチド構造の重要な部分を模倣するかまたは例えば、抗体と特異的に相互作用するように処方され得ることを企図する。このような化合物（ペプチド模倣物といわれうる）は、本発明のペプチドまたはポリペプチドと同じ様式にて使用され得、従って、このような化合物はまた、免疫学的に機能的な等価物である。
【０１３９】
タンパク質二次構造のエレメントを模倣する特定の模倣物は、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）において記載される。ペプチド模倣物の使用の根底にある原理は、タンパク質のペプチド骨格が、主に、分子相互作用（例えば、抗体と抗原の相互作用）を容易にするような様式でアミノ酸側鎖を配向することにあることである。従って、ペプチド模倣物は、天然分子に類似の分子相互作用を可能にするように設計される。
【０１４０】
（Ｅ．抗原の変異誘発）
特定の実施形態において、抗原性組成物は、例えば、その免疫原性を増強させるか、または免疫学的に機能が等価な配列を生成もしくは同定する目的で変異される。変異誘発の方法は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８７）。
【０１４１】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、その最初の濃度に対して特定の核酸分子の濃度の増加を生じるかまたは検出可能なシグナル（例えば、増幅）の濃度の増加を生じる、テンプレート依存性プロセスおよびベクター媒介性増殖をいう。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子のテンプレート依存性伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語テンプレート依存性プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいう。ここで、新たに合成された核酸鎖の配列は、相補的塩基対の周知の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，１９８７を参照のこと）により決まる。代表的には、ベクター媒介性変異誘発方法論は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増殖、および増幅した核酸フラグメントの回収を含む。このような方法論の例は、米国特許第４，２３７，２２４号（その全体が本明細書中に具体的に援用される）により提供される。
【０１４２】
好ましい実施形態において、部位特異的変異誘発が使用される。部位特異的変異誘発は、基本となるＤＮＡの特異的変異誘発を介する、抗原性組成物（例えば、葉酸結合タンパク質改変体を含むペプチドもしくはポリペプチド、または免疫学的に機能が等価なタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド）の調製において有用な技術である。一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知である。この技術は、１以上の前述の考慮事項を具体化すると、１以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することにより、配列改変体を調製および試験する便利な能力をさらに提供する。部位特異的変異誘発により、所望の変異、ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドのＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列の使用を通じて、変異体を生成して、変異される位置の両側で安定な二重鎖を形成するに十分なサイズのプライマー配列および配列相補性を提供することが可能になる。代表的には、約１７〜約７５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、その位置の両側の約１０〜約２５以上の残基が変異される一方、約１７〜約２５ヌクレオチド長のプライマーがより好ましく、その位置の両側で約５〜１０残基が変異される。
【０１４３】
一般に、部位特異的変異誘発は、まず、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを最初に得るかまたは二本鎖ベクターの２つの鎖を融解することにより行われる。当業者により理解されるように、その技術は、代表的には、一本鎖および二本鎖形態の両方にて存在するバクテリオファージベクターを使用する。部位特異的変異誘発において有用な代表的ベクターとしては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージベクターは市販されており、それらの使用は、一般に、当業者に周知である。二本鎖プラスミドはまた、ファージからプラスミドへと目的の遺伝子を移入する工程を排除する、部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
【０１４４】
次いで、この変異誘発プライマーは、変異を有する鎖の合成を完了させるために、一本鎖ＤＮＡ調製物とアニールされ、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウフラグメント）に供される。従って、ヘテロ二重鎖は、１つの鎖が、本来の変異していない配列をコードし、第２の鎖が所望の変異を有する場合に形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、変異した配列配置を有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０１４５】
あるいは、一対のプライマーが、二本鎖ベクターの２つの別個の鎖にアニールされて、ＰＣＲＴＭ反応において所望の変異を有する両方の対応する相補鎖が同時に合成され得る。変異原性オリゴヌクレオチドを組み込むクローンを富化するための遺伝子選択スキームが考案された（Ｋｕｎｋｅｌら，１９８７）。あるいは、市販の熱安定性酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を用いたＰＣＲＴＭの使用は、変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを、増幅ＤＮＡフラグメント（これは、適切なクローニングベクターまたは発現ベクターへクローニングされうる）に組み込むために使用され得る（Ｔｏｍｉｃら，１９９０；Ｕｐｅｎｄｅｒら，１９９５）。熱安定性ポリメラーゼに加えて、熱安定性リガーゼを使用するＰＣＲＴＭもまた、リン酸化変異原性オリゴヌクレオチドを、増幅ＤＮＡフラグメント（これは、次いで、適切なクローニングベクターまたは発現ベクターへクローニングされ得る）に組み込むために使用され得る（Ｍｉｃｈａｅｌ  １９９４）。
【０１４６】
部位特異的変異誘発を使用して、選択した遺伝子の配列改変体を調製することは、潜在的に有用な種を生成する手段として提供され、遺伝子の配列改変体が得られ得る他の方法が存在し得るので、限定することを意味しない。例えば、所望の遺伝子をコードする組換えベクターを変異誘発剤（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理して、配列改変体を入手し得る。
【０１４７】
さらに、１つの特に有用な変異誘発技術は、アラニンスキャニング変異誘発である。ここで、タンパク質コンホメーションにおける大規模な混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）の危険性を最小すると同時に、失われた側鎖の相互作用の効果を決定しうるように、多くの残基が、アミノ酸アラニンで個々に置換される（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，１９８９）。
【０１４８】
（Ｆ．ベクター）
核酸の複製、発現または変異誘発をもたらすために、その核酸を、細胞に送達（「移入」）し得る。細胞のトランスフェクションは、特定の実施形態において、その後の薬学的ワクチンへの精製および調製のために、１以上のワクチン成分を組換え生成するために使用され得る。他の実施形態において、核酸は、動物に投与される遺伝子ワクチンとして構成され得る。他の実施形態において、この核酸は、細部へトランスフェクトされ、この細胞が、細胞ワクチン成分として動物に投与される。その核酸は、裸の組換えＤＮＡのみからなってもよいし、例えば、核酸を保護し、そして／または特定の細胞型へこれを標的化する補助するためのさらなる材料を含んでいてもよい。
【０１４９】
用語「ベクター」は、核酸配列が、細胞（ここで核酸配列が複製されうる）へ導入するために挿入され得るキャリア核酸分子をいうために使用される。核酸配列は、「外因性」であり得る。外因性は、この核酸が、ベクターが導入され、その配列ベクターが導入される細胞に対して外来であるか、またはその配列が細胞中の配列に対して同種であるが、その配列が通常は見出されない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準的な組換え技術を介してベクターを構築するために十分知識を身につけている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８８およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９４（ともに本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１５０】
用語「発現ベクター」とは、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む、任意の型の遺伝子構築物をいう。いくつかの場合において、次いで、ＲＮＡ分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムが生成されて、翻訳されない。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含みうる。この制御配列は、特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列をいう。
【０１５１】
抗原性組成物または他のワクチン成分をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよいし、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞中に安定に維持されてもよい。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期内の同期化とは無関係にまたはこの宿主細胞周期と同期化して、維持および複製を可能にするに十分な配列をコードする。ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を提供し、そして本明細書中に以下に記載される核酸配列を含み得る。発現構築物が細胞にどのように送達され、細胞中のどこに、この核酸が維持されるかは、使用される発現構築物の型に依存する。
【０１５２】
（１．プロモーターおよびエンハンサー）
「プロモーター」は、核酸配列の領域にある制御配列であり、この核酸配列において転写の開始および転写速度を制御する。プロモーターは、調節タンパク質および調節分子が、例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子を結合して、核酸配列の特定の転写を開始し得る遺伝子エレメントを含み得る。句「作動可能に配置される」、「作動可能に連結される」、「制御下」、および「転写制御下」とは、転写開始および／またはその配列の発現の制御に対する核酸配列と関連して、プロモーターが正確な機能位置および／または方向にあることを意味する。
【０１５３】
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のために開始部位を位置づけるように機能する配列を含む。これについて最もよく知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、例えば、ＴＡＴＡボックスを欠いたいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーター、およびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーター）、それ自体が開始位置を固定するように補助する開始部位と重なる別個のエレメントがある。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーターの「制御下で」コード配列をもたらすために、選択したプロモーターの「下流」（すなわち、３’側）にある転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端に位置させる。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるＲＮＡの発現を促進する。
【０１５４】
プロモーターエレメント間の間隔は、頻繁に融通が利き、その結果、プロモーター機能は、エレメントが互いに逆にされるかまたは動かされる場合に保存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が減少し始める前の５０ｂｐ離れたところまで増大され得る。プロモーターに依存して、転写を活性化するために、協同してまたは独立してかのいずれかで個々のエレメントが機能し得るようである。プロモーターは、「エンハンサー」とともに使用されてもよいし、使用されなくてもよい。このエンハンサーとは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列をいう。
【０１５５】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得られる得ように、核酸配列と天然に関連し得る。このようなプロモーターは、「内因性」といわれ得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置して、核酸配列と天然に関連し得る。あるいは、特定の利点は、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下で、コード核酸セグメントを配置することにより増大される。この組換えプロモーターまたは異種プロモーターとは、その天然の環境において核酸配列と通常は関連しないプロモーターをいう。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーはとはまた、天然の環境において核酸配列と通常関連しないエンハンサーをいう。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他のウイルス、原核生物細胞もしくは真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および天然に存在しない（すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含む）プロモーターまたはエンハンサーが挙げられ得る。例えば、組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生成することに加えて、配列は、本明細書中に開示される組成物とともに、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術（ＰＣＲＴＭ）を使用して生成され得る（米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，９２８，９０６号（各々が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、核でないオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）内の配列の転写および／または発現を方向付ける制御配列もまた使用され得ることが企図される。
【０１５６】
当然のことながら、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官または生物中のＤＮＡセグメントの発現を効率的に方向付けるプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することは重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のために、プロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせを使用することをわかっている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  １９８９（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成性であってもよいし、組織特異的であってもよいし、誘導性であってもよいし、そして／または挿入されるＤＮＡセグメントの高レベル発現を方向付けるに適切な条件下で有用であってもよい。例えば、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生成において有利である。プロモーターは、異種であってもよいし、内因性であってもよい。
【０１５７】
さらに任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／による）はまた、発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３細胞質発現系、Ｔ７細胞質発現系またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核生物細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが提供されると、送達複合体の一部としてまたはさらなる遺伝子発現構築物としてのいずれかで特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。
【０１５８】
表３は、ＲＮＡ発現を調節するために、本発明の状況において使用され得るエレメント／プロモーターの非限定的な例を列挙する。表４は、誘導性エレメント（特定の刺激に応答して活性化され得る核酸配列の領域である）の非限定的な例を提供する。
【０１５９】
【表３】
0004401075.tif 000006
0004401075.tif 000007
【０１６０】
【表４】
0004401075.tif 000008
組織特異的プロモーターまたはエレメントの正体、ならびにそれらの活性を特徴づけるアッセイは、当業者に周知である。このような領域の非限定的な例としては、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏら．１９９９）、ソマトスタチンレセプター２遺伝子（Ｋｒａｕｓら，１９９８）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅら，１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔら，１９９８）、マウスα２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉら，１９９８）、Ｄ１Ａドパミンレセプター遺伝子（Ｌｅｅら，１９９７）、インスリン様増殖因子ＩＩ（Ｗｕら，１９９７）、およびヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏら，１９９６）が挙げられる。
【０１６１】
（２．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位）
特定の開始シグナルがまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が挙げられる。外因性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供されることが必要とされ得る。当業者は容易にこれを決定し得、そして必要なシグナルを提供し得る。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列の読み取り枠と「インフレーム」でなければならないことが周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれでもあり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含ませることによって増強され得る。
【０１６２】
本発明の特定の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの効用を使用して、多重遺伝子またはポリシストロン性メッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソーム走査モデルをバイパスし得、そして内部部位での翻訳を開始させ得る（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、同様に哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも記載されている（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲＥＳによって隔てられてポリシストロン性メッセージをなしている、複数のオープンリーディングフレームは一緒に転写され得る。ＩＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能となる。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して、効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号（各々が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１６３】
（３．マルチクローニング部位）
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含み得、その複数の制限酵素部位はいずれも、ベクターを消化するための標準的な組換え技術と組み合わせて使用され得る（例えば、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉら，１９９９，Ｌｅｖｅｎｓｏｎら，１９９８，およびＣｏｃｅａ，１９９７（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた、核酸分子の触媒性切断をいう。多くのこれらの制限酵素が市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。頻繁には、ベクターは、外因性配列がそのベクターに連結されるのを可能とするために、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて直鎖化または断片化される。「連結」は、２つの核酸フラグメント（これらは、互いに隣接していても隣接していなくてもよい）の間でホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう。制限酵素および連結反応に関する技術は、組換え技術の分野の当業者に周知である。
【０１６４】
（４．スプライシング部位）
最も転写される真核生物ＲＮＡ分子は、ＲＮＡスプライシングを受けて、一次転写物からイントロンを取り除く。真核生物ゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のために転写物の適切なプロセシングを保証するために、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら，１９９７（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１６５】
（５．終止シグナル）
本発明のベクターまたは構築物は、一般的に、少なくとも１つの終止シグナルを含む。「終止シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特定の終止に関与するＤＮＡ配列から構成される。従って、特定の実施形態では、ＲＮＡ転写物の生成を終了させる終止シグナルが意図される。ターミネーターは、所望されるメッセージレベルを達成するためにインビボで必要とされ得る。
【０１６６】
真核生物系では、ターミネーター領域はまた、新しい転写物の部位特異的切断を可能とする特定のＤＮＡ配列を含んで、ポリアデニル化部位を露出させ得る。これは、特殊化した内因性ポリメラーゼをシグナル伝達して、転写物の３’末端に約２００個のＡ残基のストレッチ（ポリＡ）を付加する。このポリＡテイルで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であるようであり、そしてより効率的に翻訳される。従って、真核生物に関する他の実施形態では、ターミネーターがＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、そしてこのターミネーターのシグナルが、メッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位のエレメントは、メッセージのレベルを増強するため、およびカセットから他の配列に読み過ごすことを最少にするために役立ち得る。
【０１６７】
本発明において使用を意図されるターミネーターは、本明細書中に記載されるかまたは当業者に公知の転写の任意の公知のターミネーターを含み、これには例えば、遺伝子の終止配列（例えば、ウシ成長ホルモンターミネーターなど）またはウイルスのターミネーター配列（例えば、ＳＶ４０ターミネーターなど）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、終止シグナルは、例えば、配列の短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）に起因して、転写可能な配列または翻訳可能な配列を欠失し得る。
【０１６８】
（６．ポリアデニル化シグナル）
発現、特に、真核生物での発現では、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすために、ポリアデニル化シグナルが代表的に含まれ得る。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実施に対して重要であるとは考えられず、任意のこのような配列が使用され得る。好ましい実施形態としては、種々の標的細胞において都合が良くそして良好に機能することが知られている、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増加させ得るか、または細胞質輸送を容易にし得る。
【０１６９】
（７．複製起点）
宿主細胞中においてベクターを増殖させるために、このベクターは、複製を開始させる特定の核酸配列である複製起点部位（しばしば、「ｏｒｉ」と称される）を１つ以上含み得る。あるいは、宿主細胞が酵母である場合には、自律複製配列（ＡＲＳ）が使用され得る。
【０１７０】
（８．選択マーカーおよびスクリーニングマーカー）
本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含ませることによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。このようなマーカーは、その発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能とする同定可能な変化を、細胞に付与する。一般的には、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を許容するマーカーであり、一方、ネガティブ選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるマーカーである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
【０１７１】
通常、薬物選択マーカーを含ませることは、クローニングおよび形質転換体の同定を補助し、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、ＧＦＰ（これは比色分析に基づく）のようなスクリーニングマーカーを含む、他の型のマーカーもまた意図される。あるいは、スクリーニング可能な酵素（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が利用され得る。当業者はまた、おそらくＦＡＣＳ分析と組み合わせて、免疫学的マーカーを使用する方法を知る。使用されるマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要であるとは考えられない。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【０１７２】
（９．プラスミドベクター）
特定の実施形態では、プラスミドベクターが、宿主細胞を形質転換するための使用に意図される。一般的に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主と関連して使用される。ベクターは通常、複製部位、ならびに形質転換された細胞において表現型選択を提供し得るマーキング配列を保有する。非制限的な例において、Ｅ．ｃｏｌｉはしばしば、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミド）の誘導体で形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含み、これにより、形質転換された細胞を容易に同定するための手段を提供する。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドもしくはファージはまた、例えば、それ自体のタンパク質の発現のためにその微生物によって使用され得るプロモーターを含まなければならないか、または含むように改変されなければならない。
【０１７３】
さらに、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターが、これらの宿主と関連して、形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ファージλＧＥＭＴＭλ１１は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２のような宿主を形質転換するために使用され得る組換えファージベクターを作製するにおいて利用され得る。
【０１７４】
さらに有用なプラスミドベクターとしては、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら，１９８５）；および、後の精製および分離または切断のためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質を生成するにおいて使用するための、ｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適切な融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを有するタンパク質である。
【０１７５】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、多くの任意の適切な培地（例えば、ＬＢ）において増殖される。特定のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当業者に理解されるように、特定のプロモーターに特異的な因子と宿主細胞を接触させることによって（例えば、ＩＰＴＧを培地に添加することによってか、またはインキュベーションをより高温に切り替えることによって）、誘導され得る。さらなる期間（一般的に、２時間と２４時間との間）にわたって細菌を培養した後、その細胞を、遠心分離によって収集し、そして洗浄して残留培地を取り除く。
【０１７６】
（１０．ウイルスベクター）
特定のウイルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に感染または細胞に侵入する能力、および安定かつ効率的にウイルス遺伝子を宿主細胞ゲノムに組込みそして発現する能力は、それらのウイルスを、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に外来核酸を転移させるための魅力的な候補とする。本発明のワクチン成分は、１つ以上の葉酸結合タンパク質改変体の抗原性組成物または他の成分（例えば、葉酸結合タンパク質改変体の免疫調節物質またはアジュバントなど）をコードするウイルスベクターであり得る。本発明の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非制限的な例を、以下に記載する。
【０１７７】
（ａ．アデノウイルスベクター）
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡへの組込みについて低い能力を有することが公知であるが、この特徴は、これらのベクターによって付与される遺伝子転移効率の高さによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）その中にクローン化された組織特異的または細胞特異的な構築物を最終的に発現させるために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。アデノウイルスの遺伝子構成（３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルス）についての見識により、アデノウイルスＤＮＡの大片を、７ｋｂまでの外来配列で置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。
【０１７８】
（ｂ．ＡＡＶベクター）
アデノウイルスに補助されるトランスフェクションを使用して、核酸を細胞に導入し得る。トランスフェクション効率の増加が、アデノウイルスと組み合わせた系を使用する細胞系において報告された（ＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＶｏｓ，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎら，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，１９９４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明の葉酸結合タンパク質改変体ワクチンにおいて使用するために魅力的なベクター系である。なぜなら、ＡＡＶは高頻度の組込みを有し、そして非分裂細胞に感染し得、それによりＡＡＶを、例えば、組織培養において（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）またはインビボにおいて哺乳動物細胞に遺伝子を送達するために有用とするからである。ＡＡＶは、感染性について、広範な宿主範囲を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎら，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号（各々が、本明細書中で参考として援用される）において記載されている。
【０１７９】
（ｃ．レトロウイルスベクター）
レトロウイルスは、宿主ゲノムにその遺伝子を組み込むその能力、大量の外来遺伝物質を転移させる点、広範なスペクトルの種および細胞型に感染する点、ならびに特別な細胞株にパッケージングされる点（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）に起因して、ワクチンにおいて葉酸結合タンパク質改変体抗原を送達するベクターとして有望である。
【０１８０】
葉酸結合タンパク質改変体ワクチンのレトロウイルスベクターを構築するために、核酸（例えば、目的の葉酸結合タンパク質改変体抗原をコードする核酸）は、複製欠損性のウイルスを生成するための特定のウイルス配列の位置で、ウイルスゲノム中に挿入される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら，１９８３）。レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを、特定の細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウム沈降などによって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子中にパッケージングされるのを可能にし、これは次いで、培養培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地が収集され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子転移のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかし、組込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら，１９７５）。
【０１８１】
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、これは、共通したレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節機能または構造的機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒら，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照のこと）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶのビルレンス遺伝子を複合的に弱毒化することによって生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させて、そのベクターを生物学的に安全なものとする。
【０１８２】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染し得、そして核酸配列のインビボおよびエキソビボの両方での遺伝子の転移および核酸配列の発現のために使用され得る。例えば、非分裂細胞に感染し得る組換えレンチウイルスが、米国特許第５，９９４，１３６号（本明細書中で参考として援用される）に記載されており、ここでは、適切な宿主細胞を、パッケージング機能を有する２つ以上のベクター（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔ）でトランスフェクトしている。エンベロープタンパク質を抗体と連結することによってか、標的化のための特定のリガンドを特定の細胞型のレセプターに連結することによって、組換えウイルスを標的化し得る。例えば、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする別の遺伝子と共に、目的の配列（調節領域を含む）をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターは、ここに標的特異的となる。
【０１８３】
（ｄ．他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターが、本発明においてワクチン構築物として使用され得る。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，１９８８）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターが使用され得る。これらは、種々の哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を与える（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら，１９９０）。
【０１８４】
（ｅ．改変されたウイルスを使用したワクチン送達）
送達される核酸は、特定の結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルスの中に収容され得る。従って、ウイルス粒子は、標的細胞の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）レセプターに特異的に結合し、そしてその細胞に成分を送達する。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新規なアプローチが、近年、ウイルスのエンベロープにラクトース残渣を化学的に付加することによるレトロウイルスの化学的改変に基づいて開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞の特異的感染を可能にし得る。
【０１８５】
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用する、組換えレトロウイルスの標的化に対する別のアプローチが設計された。これらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによって、ビオチン成分を介して連結された（Ｒｏｕｘら，１９８９）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、インビトロでのエコトロピックウイルスによる、これらの表面抗原を有する種々のヒト細胞の感染が実証された（Ｒｏｕｘら，１９８９）。従って、抗体、特異的結合リガンド、および／または他の標的化部分が、ＡＰＣ型を特異的にトランスフェクトするために使用され得ることが意図される。
【０１８６】
（１１．ベクターの送達および細胞の形質転換）
本発明で使用するためのオルガネラ、細胞、組織または生物体の形質転換のために核酸を送達する適切な方法は、本明細書中に記載されるか、または当業者に公知であるような、核酸（例えば、ＤＮＡ）をオルガネラ、細胞、組織または生物体に導入し得る実質的に任意の方法を含むと考えられる。このような方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：注入によるような、ＤＮＡの直接的送達（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９（各々が、本明細書中で参考として援用される））であって、これはマイクロインジェクションを含む（ＨａｒｌａｎおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号（本明細書中で参考として援用される））；エレクトロポレーションによる（米国特許第５，３８４，２５３号（本明細書中で参考として援用される）；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら，１９８４）；リン酸カルシウム沈降による（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅら，１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストランと、次いでポリエチレングリコールを使用することによる（Ｇｏｐａｌ，１９８５）；直接的な音波負荷（ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）による（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら，１９８７）；リポソーム媒介性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら，１９８７；Ｗｏｎｇら，１９８０；Ｋａｎｅｄａら，１９８９；Ｋａｔｏら，１９９１）およびレセプター媒介性トランスフェクションによる（ＷｕおよびＷｕ，１９８７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８）；マイクロプロジェクタイルボンバードメントによる（ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９４／０９６９９および同９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号；同第５，３２２，７８３号；同第５，５６３，０５５号；同第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８７７号；および同第５，５３８，８８０（各々が、本明細書中で参考として援用される））；炭化ケイ素繊維での撹拌による（Ｋａｅｐｐｌｅｒら，１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号（各々が、本明細書中で参考として援用される））；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換による（米国特許第５，５９１，６１６号および同第５，５６３，０５５号（各々が、本明細書中で参考として援用される））；またはプロトプラストのＰＥＧ−媒介性形質転換による（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら，１９９３；米国特許第４，６８４，６１１号および同第４，９５２，５００号（各々が、本明細書中で参考として援用される））；乾燥／阻害（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）媒介性ＤＮＡ取り込みによる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，１９８５）、およびこれらの方法の任意の組み合わせ。これらのような技術の適用を通して、オルガネラ、細胞、組織または生物体を、安定的または一過的に形質転換し得る。
【０１８７】
（ａ．注入）
特定の実施形態では、１つ以上の注入（すなわち、針での注入）を介して、核酸を、オルガネラ、細胞、組織または生物体に送達し得る。核酸の注入方法は、本明細書中に記載されており、そして当業者に周知である。本発明のさらなる実施形態は、細胞への直接的なマイクロインジェクションによる核酸の導入を含む。直接的なマイクロインジェクションを使用して、Ｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞に核酸構築物が導入されている（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５）。使用される葉酸結合タンパク質改変体の量は、抗原の性質、ならびに使用されるオルガネラ、細胞、組織または生物体に応じて変動し得る。
【０１８８】
（ｂ．エレクトロポレーション）
本発明の特定の実施形態では、エレクトロポレーションを介して、核酸を、オルガネラ、細胞、組織または生物体に導入する。エレクトロポレーションは、高電圧の電気的放電に対して、細胞およびＤＮＡの懸濁物を曝露させることを含む。この方法のいくつかの改変では、特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的のレシピエント細胞を、未処理細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に感受性にさせる（米国特許第５，３８４，２５３号（本明細書中で参考として援用される））。あるいは、レシピエント細胞は、機械的傷害によって、形質転換により感受性になされ得る。
【０１８９】
エレクトロポレーションを使用する真核生物細胞のトランスフェクションは、非常に首尾よかった。マウスプレＢリンパ球は、ヒトκ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、そしてラット肝細胞は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子で、この様式にてトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６）。
【０１９０】
細胞（例えば、植物細胞）へのエレクトロポレーションによる形質転換をもたらすために、もろい組織（例えば、細胞の懸濁培養物）または胚形成性カルスのいずれかが使用され得るか、あるいは、未成熟胚または他の組織化された組織が直接形質転換され得る。この技術において、選択された細胞の細胞壁が、ペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）に曝露されることによって、または制御された様式で機械的に傷付けられることによって部分的に分解される。インタクトな細胞のエレクトロポレーションによって形質転換されたいくつかの種の例としては、トウモロコシ（米国特許第５，３８４，２５３号；Ｒｈｏｄｅｓら、１９９５；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、１９９２）、コムギ（Ｚｈｏｕら、１９９３）、トマト（ＨｏｕおよびＬｉｎ、１９９６）、ダイズ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９８７）およびタバコ（Ｌｅｅら、１９８９）が挙げられる。
【０１９１】
植物細胞のエレクトロポレーション形質転換のために、プロトプラストがまた使用され得る（Ｂａｔｅｓ、１９９４；Ｌａｚｚｅｒｉ、１９９５）。例えば、子葉由来プロトプラストのエレクトロポレーションによるトランスジェニックダイズ植物の生成は、ＤｈｉｒおよびＷｉｄｈｏｌｍによって、国際特許出願番号ＷＯ９２１７５９８（本明細書中に参考として援用される）に記載されている。プロトプラスト形質転換が記載されてきた種の他の例としては、大麦（Ｌａｚｅｒｒｉ、１９９５）、サトウモロコシ（Ｂａｔｔｒａｗら、１９９１）、トウモロコシ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら、１９９７）、コムギ（Ｈｅら、１９９４）およびトマト（Ｔｓｕｋａｂａ、１９８９）が挙げられる。
【０１９２】
（ｃ．リン酸カルシウム）
本発明の他の実施形態において、リン酸カルシウム沈殿を使用して、核酸が、細胞に導入される。ヒトＫＢ細胞は、この技術を使用して、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３）。またこの様式で、マウスＬ（Ａ９）細胞、マウスＣ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＨｅＬａ細胞は、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７）、ラット肝細胞は、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、１９９０）。
【０１９３】
（ｄ．ＤＥＡＥ−デキストラン）
別の実施形態において、ＤＥＡＥ−デキストラン後にポリエチレングリコールを使用して、核酸が、細胞に送達される。この様式で、レポータープラスミドは、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５）。
【０１９４】
（ｅ．リポソーム媒介トランスフェクション）
本発明のさらなる実施形態において、１つ以上のワクチン成分または核酸が、脂質複合体（例えば、リポソーム）中に内包され得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離される複数の脂質層を有する。多重膜リポソームは、リン脂質が過剰な水溶液に懸濁される場合に、自然に形成する。脂質成分は、閉鎖した構造の形成ならびに水および溶解した溶質の脂質二重膜間での内包の前に、自己再構成を行う（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。また、核酸が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されることが企図される。
【０１９５】
リポソーム媒介核酸送達および外来ＤＮＡのインビトロでの発現は、非常に首尾よかった（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞および肝癌細胞でのリポソーム媒介送達および外来ＤＮＡの発現の可能性がまた、実証された（Ｗｏｎｇら、１９８０）。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態において、リポソームは、血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）とともに複合体化され得る。これにより、細胞膜との融合を容易にし、リポソームに内包されたＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示された（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態において、リポソームは、複合体化されても、または核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と組合わせて使用されてもよい（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる実施形態において、リポソームは、複合体化されても、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と組合わせて使用されてもよい。他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。
【０１９７】
（ｆ．レセプター媒介トランスフェクション）
レセプター媒介送達ビヒクルを使用して送達するために、１つ以上のワクチン成分または核酸が、使用され得る。このワクチン成分または核酸は、標的細胞に生じるレセプター媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布を考慮して、この送達法は、別の程度の特異性を本発明に加える。別の哺乳動物細胞型に関して特異的な送達が記載されている（ＷｕおよびＷｕ、１９９３（本明細書中に参考として援用される））。
【０１９８】
特定のレセプター媒介遺伝子ターゲティングビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよび核酸結合因子を含む。他のレセプター媒介遺伝子ターゲティングビヒクルは、送達されるべき核酸が作動可能に付着されている細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介遺伝子移入に使用され（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４；Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ  ０２７３０８５）、これは、この技術の作動性を達成する。別の哺乳動物細胞型に関して特異的な送達が記載されている（ＷｕおよびＷｕ、１９９３（本明細書中に参考として援用される））。本発明の特定の局面において、リガンドは、標的細胞集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するように選択される。
【０１９９】
他の実施形態において、細胞特異的核酸ターゲティングビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、リポソームと組合わせた、特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべき核酸は、リポソーム内に収容され、そして特異的結合リガンドは、リポソーム膜中に機能的に組み込まれる。よって、リポソームは、標的細胞のレセプターに特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。このような系は、系（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞に、核酸をレセプター媒介送達する際に使用される）を使用して機能的であることが示されている。
【０２００】
なおさらなる実施形態において、標的送達ビヒクルの核酸送達ビヒクル成分は、細胞特異的結合を指向する１つ以上の脂質または糖タンパク質を好ましく含むリポソーム自体であり得る。例えば、ラクトシルセラミド、ガラクトース終末アシルガングリオシドは、リポソーム中に組み込まれ、そして肝細胞によるインスリン遺伝子取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。本発明の組織特異的形質転換構築物が同様の様式で標的細胞へ特異的に送達され得ることが、企図される。
【０２０１】
（ｇ．微粒子ボンバードメント）
微粒子ボンバードメント技術を使用して、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に核酸を導入し得る（米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；同第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９（これらの各々が本明細書中に参考として援用される）。この方法は、ＤＮＡ被覆微粒子を高速に加速して細胞膜を貫通させ、そして細胞を殺傷することなくこの微粒子を細胞内に侵入させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。当該分野において公知の、種々の広範な微粒子ボンバードメント技術が存在し、これらの多くは、本発明に適用可能である。
【０２０２】
微粒子ボンバードメントを使用して、種々の細胞、組織または生物（例えば、任意の植物種）を形質転換し得る。微粒子ボンバードメントによって形質転換される種の例としては、単子葉植物種（例えば、トウモロコシ（ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８）、オオムギ（Ｒｉｔａｌａら、１９９４；Ｈｅｎｓｇｅｎｓら、１９９３）、コムギ（米国特許第５，５６３，０５５号（本明細書中に参考として援用される））、コメ（Ｈｅｎｓｇｅｎｓら、１９９３）、エンバク（Ｔｏｒｂｅｔら、１９９５；Ｔｏｒｂｅｔら、１９９８）、ライムギ（Ｈｅｎｓｇｅｎｓら、１９９３）、サトウキビ（Ｂｏｗｅｒら、１９９２）およびモロコシ（Ｃａｓｅｓら、１９９３；Ｈａｇｉｏら、１９９１））；ならびに多くの双子葉植物（タバコ（Ｔｏｍｅｓら、１９９０；ＢｕｉｓｉｎｇおよびＢｅｎｂｏｗ、１９９４）、ダイズ（米国特許第５，３２２，７８３号（本明細書中に参考として援用される））、ヒマワリ（Ｋｎｉｔｔｅｌら、１９９４）、ピーナッツ（Ｓｉｎｇｓｉｔら、１９９７）、ワタ（ＭｃＣａｂｅおよびＭａｒｔｉｎｅｌｌ、１９９３）、トマト（ＶａｎＥｃｋら、１９９５）および一般的なマメ科植物（ｌｅｇｕｍｅ）（米国特許第５，５６３，０５５号（本明細書中に参考として援用される））が挙げられる）が挙げられる。
【０２０３】
微粒子ボンバードメントにおいて、１つ以上の粒子が、少なくとも１つの核酸で被覆され得、そして推進力によって細胞内に送達され得る。小粒子を加速させるためのいくつかのデバイスが開発されている。このようなデバイスの１つは、順々に原動力を提供する電流を生成するための高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用される微粒子は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステン粒子もしくは金粒子またはビーズ）から構成される。例示的な粒子としては、タングステン、白金、好ましくは、金から構成される粒子が挙げられる。いくつかの例において、金属粒子上のＤＮＡ沈殿物は、微粒子ボンバードメントを使用してレシピエント細胞に送達されるＤＮＡに必要ではないことが、企図される。しかし、粒子がＤＮＡで被覆される以外にＤＮＡを含み得ることが、企図される。ＤＮＡ被覆粒子は、粒子ボンバードメントを介するＤＮＡ送達レベルを増加し得るが、それ自体必要ではない。
【０２０４】
ボンバードメントについて、懸濁物中の細胞は、フィルターまたは固体培養培地上で濃縮される。あるいは、未成熟胚または他の標的細胞は、固体培養培地上で配置され得る。ボンバードメントされる細胞は、微粒子停止板より下の適切な距離で位置付けられる。
【０２０５】
（１２．宿主細胞）
本明細書中で使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語の全てはまた、引き続く世代のいずれかまたは全てである、これらの子孫を含む。故意の変異または偶然の変異に起因して、全ての子孫が同一でなくてもよいことが、理解される。異種核酸配列を発現する点で、「宿主細胞」は、原核生物細胞または真核生物細胞をいい、そしてベクターを複製し得るおよび／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現し得る、任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターについてのレシピエントとして使用され得、そして使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」されても、「形質転換」されてもよく、このトランスフェクトまたは形質転換は、外因性核酸が宿主細胞に移入されるかまたは導入されるプロセスをいう。形質転換された細胞は、目的の初代細胞およびその子孫を含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「操作される（操作された）」細胞または「操作される（操作された）」宿主細胞、および「組換え」細胞または「組換え」宿主細胞は、外因性核酸配列（例えば、ベクター）が導入された細胞をいうことが、意図される。よって、組換え細胞は、組換え的に導入された核酸を含まない天然に存在する細胞と区別可能である。
【０２０６】
特定の実施形態において、ＲＮＡ配列またはタンパク質配列は、他の選択されたＲＮＡ配列またはタンパク質配列とともに、同一宿主細胞に同時発現され得ることが企図される。同時発現は、２つ以上の異なる組換えベクターで宿主細胞を同時トランスフェクトすることによって達成され得る。あるいは、単一の組換えベクターを構築して、複数の異なるＲＮＡコード領域を含ませ得、次いで、このＲＮＡコード領域は、単一のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に発現され得る。
【０２０７】
組織は、葉酸結合タンパク質改変体で形質転換される宿主細胞を含み得る。組織は、生物の一部でも生物から分離されてもよい。特定の実施形態において組織としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：脂肪細胞、歯槽（ａｌｖｅｏｌａｒ）、エナメル芽細胞、軸索、基底細胞、血液（例えば、リンパ球）、血管、骨、骨髄、脳、乳房、軟骨、頸、結腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、顔面（ｆａｃｉａ）、繊維芽細胞、小胞、神経節細胞、グリア細胞、杯細胞、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、ニューロン、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、皮膚、小腸、脾臓、幹細胞、胃、精巣、葯、腹水組織、コブ（ｃｏｂ）、耳、花、穀皮、穀粒、葉、分裂組織細胞、花粉、根端、根、絹、茎およびこれら全ての癌。
【０２０８】
特定の実施形態において、宿主細胞または組織は、少なくとも１つの生物に含まれ得る。特定の実施形態において、生物としては、当業者に理解されるように、原核生物（例えば、真正細菌、始原細菌（ａｒｃｈａｅａ））または真核生物が挙げられ得るがこれらに限定されない（例えば、ウェブページ  ｈｔｔｐ：／／ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｔｒｅｅ／ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０２０９】
宿主細胞としての使用のために、多くの細胞株および培養物が利用可能であり、これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（生きた培養物および遺伝物質のアーカイブとして機能する組織（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ））を介して入手可能である。適切な宿主は、ベクター骨格および所望の結果に基づいて当業者によって決定され得る。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現に利用可能な細胞型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｆ’、λ、原栄養菌、ＡＴＣＣ番号２７３３２５）））、桿菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；ならびに他の腸内細菌科（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（ＤＨ５ａ、ＪＭ１０９およびＫＣ８）および多くの市販の細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫａｅ  Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）。特定の実施形態において、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２）は、ファージウイルスについての宿主細胞として特に企図される。
【０２１０】
ベクターの複製および／または発現のための真核生物宿主細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＨｅＬａ、ＨＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２。種々の細胞型および生物由来の多くの宿主細胞が利用可能であり、そして当業者に公知である。同様に、ウイルスベクターが、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれか（特にベクターの複製または発現を許容する宿主細胞）と組合わせて使用され得る。
【０２１１】
いくつかのベクターは、このベクターが原核生物細胞および真核生物細胞の両方で複製および／または発現することを可能にする制御配列を使用し得る。当業者はさらに、上記の宿主細胞のすべてをインキュベートしてベクターを維持しそしてベクターの複製を可能にする条件を理解する。ベクターの大規模産生、ならびに、ベクターによってコードされる核酸、および同族のポリペプチド、タンパク質またはペプチドの産生を可能にする技術および条件もまた、理解され、そして公知である。
【０２１２】
（１３．発現系）
上記の組成物の少なくとも一部または全てを含む多くの発現系が、存在する。原核生物ベースの系および／または真核生物ベースの系が、本発明を用いて核酸配列、またはその同族のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生する用途のために使用され得る。多くのこのような系は、市販されており、そして広範に利用可能である。
【０２１３】
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、米国特許第５，８７１，９８６号、同第４，８７９，２３６号（両方が本明細書中に参考として援用される）に記載されるような異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を産生し得、これらは、例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）からのＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０およびＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）からのＢＡＣＰＡＣＫＴＭ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭの名称でもたらされ得る。
【０２１４】
発現系の他の例としては、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬａｅ誘導性哺乳動物発現系（これは、合成エクジソン誘導性レセプターを含む）またはそのｐＥＴ発現系、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系が挙げられる。誘導性発現系の別の例は、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手可能であり、これは、Ｔ−ＲＥＸＴＭ（テトラサイクリン調節発現）系（全長ＣＭＶプロモーターを使用する誘導性哺乳動物発現系）を保有する。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）はまた、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ発現系と呼ばれる酵母発現系を提供し、これは、メチル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組換えタンパク質の高レベル産生のために設計される。当業者は、ベクター（例えば、発現構築物）をどのように発現し、核酸配列またはその同族のポリペプチド、タンパク質またはペプチドをどのように産生するかを知っている。
【０２１５】
本発明の方法によって産生されるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが「過剰発現され」得る、すなわち、細胞中でのその天然の発現と比較して増加したレベルで発現され得ることが、企図される。このような過剰発現は、種々の方法（放射標識および／またはタンパク質精製を含む）によって評価され得る。しかし、単純かつ直接的な方法（例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびタンパク質染色またはウエスタンブロッティング後の定量的分析（例えば、生じたゲルまたはブロットのデンシトメトリー走査を含む））が好ましい。宿主細胞によって産生される他のタンパク質に関して特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが比較的多い場合、天然の細胞中のレベルと比較した、組換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのレベルにおける特定の増加は、過剰発現を示し、そして例えば、ゲル上で可視である。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、発現したタンパク質配列は、宿主細胞中に封入体を形成し、そしてこの宿主細胞を、例えば、細胞ホモゲナイザー中での崩壊によって溶解し、洗浄および／または遠心分離し、可溶性細胞成分から濃い封入体および細胞膜を分離する。この遠心分離は、糖（例えば、スクロース）を緩衝液に組み込みそして選択的速度で遠心分離することによってこの濃い封入体が選択的に富化される条件下で行われ得る。封入体は、高濃度の尿素（例えば、８Ｍ）、または還元剤（例えば、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴ（ジチオトレイトール））の存在下でのカオトロピック剤（例えば、グアニジン塩酸）を含有する溶液中に可溶化され得、そして当業者に公知であるようにより所望のコンフォーメーションにリフォールディングされ得る。
【０２１７】
（Ｇ．ワクチン成分精製）
任意の場合において、ワクチン成分（例えば、抗原性のペプチドまたはポリペプチド、あるいは、タンパク質組成をコードする核酸）は、化学合成試薬、細胞または細胞成分から単離および／または精製され得る。ワクチン成分を産生する方法において、精製は、任意の適切な技術（本明細書中に記載されるかまたは当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８７））によって達成される。特定の実施形態における用途のために好ましいが、本発明の抗原性組成物または他のワクチン成分が常に最も精製された状態で提供されることは、一般に必要とされない。さらに、天然の状態と比較して所望の化合物中に富化されるにもかかわらず、ほとんど実質的に精製されていないワクチン成分が、特定の実施形態（例えば、タンパク質産物の回収）において、または発現したタンパク質の活性を維持する際に、有用性を有することが、企図される。しかし、不活性な産物もまた特定の実施形態（例えば、抗体生成を介する抗原性の決定）における有用性をまた有することが、企図される。
【０２１８】
本発明はまた、精製された（好ましい実施形態において、実質的に精製された）ワクチンまたはワクチン成分を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「精製されたワクチン成分」は、少なくとも１つのワクチン成分（例えば、細胞から単離可能なタンパク質組成）をいうことが意図され、ここで、この成分は、天然に取得可能な状態（例えば、細胞抽出物または化学合成の試薬中でのその純度）に関して、任意の程度に精製される。ワクチン成分がタンパク質組成である特定の局面において、精製されたワクチン成分はまた、野生型タンパク質、またはその天然に存在する環境から離れた変異体タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをいう。
【０２１９】
用語「実質的に精製された」が使用される場合、この用語は、特定の化合物（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド）が組成物の主要な成分を形成する（例えば、組成物中約５０％以上の化合物を構成する）その組成物をいう。好ましい実施形態において、実質的に精製されたワクチン成分は、組成物中の約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％以上の化合物を構成する。
【０２２０】
特定の実施形態において、ワクチン成分は、均質にまで精製され得る。本発明に適用される場合、「均質にまで精製される」は、ワクチン成分がある純度レベルを有することを意味し、ここで、この化合物は、他の化学物質、生体分子または細胞を実質的に含まない。例えば、精製されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はしばしば、他のタンパク質成分を実質的に含まず、その結果、分解性配列決定が首尾よく行われ得る。ワクチン成分の精製の程度を定量化するための種々の方法は、本発明の開示の観点から当業者に公知である。これらの方法は、例えば、画分の特定のタンパク質活性（例えば、抗原性）を決定する工程、またはゲル電気泳動による画分内のポリペプチドの数を評価する工程を含む。
【０２２１】
当業者に周知である、化学的精製、生体分子精製または生物学的精製における用途に適切な種々の技術は、本発明のワクチン成分の精製に適用可能であり得る。これらの技術としては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いるかまたは熱変性による沈殿後の遠心分離；分画、クロマトグラフィー手順（以下が挙げられるがこれらに限定されない：分配クロマトグラフィー（例えば、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ガス−液体クロマトグラフィーおよびゲルクロマトグラフィー）、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィーイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、レクチンアフィニティ；等電点電気泳動およびゲル電気泳動（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；およびＦｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、２３８−２４６頁（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）が挙げられる。
【０２２２】
多くのＤＮＡおよびタンパク質が公知であるか（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｎｄ  ＧｅｎＰｅｎｔ  ｄａｔａｂａｓｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照のこと）、または本明細書中に記載される方法を使用して同定および増幅され得る場合、当業者に公知の組換え発現された核酸または蛋白様配列のための任意の精製方法が、ここで用いられ得る。特定の局面において、核酸は、ポリアクリルアミドゲルおよび／または塩化セシウム遠心分離勾配で精製され得るか、または当業者に公知の任意の他の手段により精製され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。さらなる局面において、蛋白様配列の精製は、この配列を融合タンパク質として組換え発現することによって、実施され得る。このような精製方法は、当該分野で慣用的である。これは、特定のタンパク質−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の生成、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現、およびグルタチオン−アガロースのアフィニティークロマトグラフィーを使用しての均一になるまでの単離、またはこのタンパク質のＮ末端またはＣ末端上のポリヒスチジンタグの生成、およびその後に続く、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーを使用する精製により例示される。特定の局面において、ワクチンの細胞または他の成分は、フローサイトメトリーによって精製され得る。フローサイトメトリーは、液体サンプル中の細胞または他の粒子の分離を含み、そして当該分野で公知である（例えば、米国特許第３，８２６，３６４号、同第４，２８４，４１２号、同第４，９８９，９７７号、４，４９８，７６６号、同第５，４７８，７２２号、同第４，８５７，４５１号、同第４，７７４，１８９号、同第４，７６７，２０６号、同第４，７１４，６８２号、同第５，１６０，９７４号および同第４，６６１，９１３号を参照のこと）。本明細書中に記載されるこれらの技術のいずれかおよびこれらの組み合わせおよび、ならびに当業者に公知の任意の他の技術を使用して、本発明のワクチンを構成し得る種々の化学物質、蛋白様化合物、核酸、細胞物質および／または細胞を精製し、そして／またはこれらの純度をアッセイし得る。当該分野で一般的に公知なように、種々の精製工程を実施する順序は、変えられ得ること、または特定の工程が省かれ得、実質的に精製された抗原または他のワクチン成分の調製に適切な方法を、なお生じることが考えられる。
【０２２３】
（Ｈ．さらなるワクチン成分）
本発明の抗原性組成物は、より有効なワクチンを形成するために１つ以上のさらなる成分と組み合わされ得ることが、意図される。さらなる成分の非限定的な例としては、例えば、本発明の抗原性組成物および／またはさらなる成分に対する免疫応答を刺激する、１つ以上のさらなる抗原、免疫調節因子、またはアジュバントが挙げられる。
【０２２４】
（１．免疫調節因子）
例えば、免疫調節因子が、細胞の応答または患者（例えば、動物）の応答を増大するワクチン中に含まれ得ることが意図される。免疫調節因子は、精製タンパク質、免疫調節因子をコードする核酸、および／または免疫調節因子を発現する細胞として、ワクチン組成物中に含まれ得る。以下の節は、目的の免疫調節因子の非限定的な例を列挙し、そして免疫調節因子の種々の組み合わせが、特定の実施形態で使用され得ることが意図される（例えば、サイトカインおよびケモカイン）。
【０２２５】
本発明の別の局面において、葉酸結合タンパク質改変体組成物が、免疫調節因子の治療的に有効な組成物をさらに含み得ることが意図される。免疫調節因子は、サイトカイン、造血素、コロニー刺激因子、インターロイキン、インターフェロン、増殖因子またはそれらの組み合わせを構築することが、想定される。本明細書中の特定の実施形態で使用される場合、用語「サイトカイン」は、関連部分を読むと、米国特許第５，８５１，９８４号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されるものと同じである。
【０２２６】
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエータとして別の細胞に作用する１つの細胞集団により放出されるタンパク質に関する一般的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、増殖因子および従来のポリペプチドホルモンである。中でも、サイトカインとしては、以下が挙げられる：成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖蛋白ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ））；肝臓増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ミューラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板増殖因子；トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））；顆粒球マクロファージコロニー−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｋｉｔリガンドまたはＦＬＴ−３）。本明細書中で使用する場合、用語、サイトカインは、天然の供給源または組換え細胞培養物由来のタンパク質、およびネイティブ配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０２２７】
（ａ．β−インターフェロン）
βインターフェロン（ＩＦＮ−ｂ）は、多くの細胞型（上皮細胞、線維芽細胞およびマクロファージを含む）により産生される低分子量タンパク質である。内因性ＩＦＮ−βを発現する細胞は、ウイルスの感染および複製に耐性である。マウス由来のβ−インターフェロン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１４４５５，Ｘ１４０２９）およびヒト由来のβ−インターフェロン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００２１８，Ｋ００６１６およびＭ１１０２９）が、単離および配列決定されている。ＩＦＮ−βは、細胞複製を抑制し、そして分化またはアポトーシスを誘導することによって直接的に、およびマクロファージおよびＮＫ細胞の殺腫瘍性を活性化し、腫瘍新脈管形成を抑制し、そして特定の免疫応答を刺激することにより間接的にの両方で、腫瘍増殖を阻害し得る多機能性糖タンパク質である。
【０２２８】
（ｂ．インターロイキン−２）
インターロイキン−２（ＩＬ−２）（最初はＴ細胞増殖因子Ｉと命名された）は、Ｔ細胞増殖の非常に熟達した誘発因子であり、Ｔリンパ球の全ての亜集団についての増殖因子である。ＩＬ−２は、休止細胞における細胞周期の進行を誘発し、従って、活性化Ｔリンパ球のクローン増殖を可能にする抗原非依存性増殖因子である。新しく単離された白血病細胞もまた、ＩＬ２を分泌し、これに応答するので、ＩＬ２は、ＡＴＬを悪化させ得るこれらの細胞についてのオートクライン増殖モジュレーターとして機能し得る。ＩＬ２はまた、活性化Ｂ細胞の増殖を促進するが、これは、さらなる因子（例えば、ＩＬ４）の存在を必要とする。インビトロのＩＬ２はまた、乏突起膠細胞の増殖を刺激する。Ｔ細胞およびＢ細胞に対するこの効果に起因して、ＩＬ−２は、免疫応答の中心的調節因子である。これはまた、抗炎症反応、造血および腫瘍監視において役割を果たす。ＩＬ２は、周辺白血球におけるＩＦＮ−γの合成を刺激し、そしてまたＩＬ−１、ＴＮＦ−ａおよびＴＮＦ−ｂの分泌を誘導する。ＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）の増殖における活性とは別に、殺腫瘍性サイトカインの分泌の誘導は、おそらく、ＩＬ２の抗腫瘍活性を担う主な因子である。
【０２２９】
（ｃ．ＧＭ−ＣＳＦ）
ＧＭ−ＣＳＦは、好中球系統、好酸球系統および単球系統の増殖および分化を刺激する。これはまた、対応する成熟形態を機能的に活性化し、例えば、特定の細胞表面接着タンパク質（ＣＤ−１１Ａ、ＣＤ−１１Ｃ）の発現を増加する。これらのタンパク質の過剰発現は、炎症部位における顆粒球の観察される局所的蓄積に対する１つの説明であり得る。さらに、ＧＭ−ＣＳＦはまた、好中球活性の刺激因子であるｆＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）に対するレセプターの発現を増加する。
【０２３０】
（ｄ．サイトカイン）
インターロイキン、サイトカイン、インターロイキンもしくはサイトカインをコードする核酸、および／またはこのような化合物を発現する細胞は、可能なワクチン成分として意図される。インターロイキンおよびサイトカインとしては、以下が挙げられるが、これらに現地得されない：インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、β−インターフェロン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、腫瘍壊死因子、ＴＧＦｂ、ＬＴおよびそれらの組み合わせ。
【０２３１】
（ｅ．ケモカイン）
ケモカイン、ケモカインをコードする核酸および／またはケモカインを発現する細胞もまた、ワクチン成分として使用され得る。ケモカインは一般に、化学誘引物質として働き、ケモカイン発現の部位に免疫エフェクター細胞を補充する。例えば、サイトカインコード配列と組み合わせて、特定のケモカインコード配列を発現し、処置部位への他の免疫系成分の補充を増加することが有益であり得る。このようなケモカインとしては、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＩＰ−１０およびそれらの組み合わせが挙げられる。当業者は、特定のサイトカインもまた、化学誘引効果を有することが知られており、そしてまたケモカインという用語で分類され得ることを認識する。
【０２３２】
（ｆ．免疫原性キャリアタンパク質）
特定の実施形態において、抗原性組成物は、免疫応答を増加するために、キャリアに化学的に結合され得るか、または免疫原性キャリアペプチドまたはポリペプチド（例えば、抗原キャリア融合ペプチドまたはポリペプチド）を用いて組換え発現され得る。代表的な好ましい免疫原性キャリアアミノ酸配列は、Ｂ型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。他のアルブミン（例えば、オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミン）もまた、免疫原性キャリアタンパク質として使用され得る。ポリペプチドまたはペプチドを免疫原性キャリアタンパク質に結合体化するための手段は、当該分野で周知であり、そして例えば、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボイミドおよびビス−ビアゾ化ベンジジンが挙げられる。
【０２３３】
（ｇ．生物学的応答変更因子）
生物学的応答変更因子（ＢＲＭ）（これは、Ｔ細胞免疫性を上方制御するか、またはサプレッサ細胞活性を下方制御することが示されている）を同時投与することが、望まれ得る。このようなＢＲＭとしては、シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ，ＰＡ）；低用量のシクロホスファミド（ＣＹＰ；３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ，ＮＪ）、または１つ以上の免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質（例えば、Ｂ−７）をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
（２．アジュバント）
免疫プロトコルは、何年もの間、応答を刺激するためにアジュバントを使用しており、このようなアジュバントは、当業者に周知である。いくつかのアジュバントは、抗原が提示される様式に影響を及ぼす。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原がミョウバンにより沈殿された場合に、増加する。抗原の乳化はまた、抗原発現の持続時間を延長する。
【０２３５】
１つの局面において、アジュバント効果は、リン酸緩衝化生理食塩水中約０．０５〜約０．１％の溶液中で使用される薬剤（例えば、ミョウバン）の使用によって、達成される。あるいは、この抗原は、約０．２５％の溶液として使用される糖の合成ポリマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物として作製される。アジュバント効果はまた、約７０℃〜約１０１℃の間の範囲の温度で、それぞれ、３０秒〜２分の間熱処理することにより、ワクチン中の抗原を凝集することにより、もたらされ得る。アルブミンに対するペプシン処理した（Ｆａｂ）抗体、細菌細胞（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）またはグラム陰性細菌の内毒素もしくはリポ多糖体成分との混合物、生理学的に受容可能な油ビヒクル（例えば、マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）モノオレアート（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）中のエマルジョン、あるいはブロック物質として使用されるペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ（登録商標））の２０％溶液を含むエマルジョンを用いる再活性化による凝集もまた、用いられ得る。
【０２３６】
いくつかのアジュバントは、例えば、細菌から得られる特定の有機分子であり、抗原よりむしろ宿主に作用する。例は、ムラミールジペプチド（Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン［ＭＤＰ］）、細菌ペプチドグリカンである。ＭＤＰの効果は、ほとんどのアジュバントと同様、十分には理解されていない。ＭＤＰは、マクロファージを刺激するが、Ｂ細胞もまた直接刺激するようである。従って、アジュバントの効果は、抗原特異的ではない。しかし、これらが、精製された抗原と共に投与される場合、これらは、抗原に対する応答を選択的に増大するために使用され得る。
【０２３７】
アジュバントは、未知の抗原に対する免疫性における一般化された増加を促進するために、実験的に使用されている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。これは、特に、癌の処置において試みられてきた。多くの癌について、免疫系は、腫瘍細胞に対する宿主の防御に関与するという強力な証拠があるが、おそらく腫瘍特異的抗原の総数の一部のみしか現在までに同定されていないと考えられる。しかし、本発明を使用して、適切なアジュバントを照射した腫瘍細胞の膜に封入することは、隆起抗原の分子の同定とは無関係に、抗腫瘍応答を増加するようである。このことは、本発明の特に重要な時間節約の特徴である。
【０２３８】
特定の実施形態において、ヘモシアニンおよびヘモエリスリン（ｈｅｍｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）もまた、本発明で使用され得る。キーホールリンペット由来のヘモシアニン（ＫＬＨ）の使用は、特定の実施形態において好ましいが、他の軟体動物および節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリスリンが用いられ得る。
【０２３９】
種々の多糖類アジュバントもまた使用され得る。例えば、マウス抗体応答における種々の肺炎球菌多糖類アジュバントの使用が、記載されている（Ｙｉｎら、１９８９）。最適な応答を生じるか、またはそうでなければ抑制を生じない用量が、示されるように（Ｙｉｎら、１９８９）、用いられるべきである。ポリアミン種の多糖類（例えば、キチンおよびキトサン（脱アセチル化キチンを含む））が、特に好ましい。
【０２４０】
別の群のアジュバントは、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）群の細菌ペプチドグリカンである。ムラミールジペプチドの誘導体（例えば、アミノ酸誘導体のスレオニル−ＭＤＰおよび脂肪酸誘導体のＭＴＰＰＥ）もまた、企図される。
【０２４１】
米国特許第４，９５０，６４５号は、ムラミルジペプチドの親油性ジサッカリド−トリペプチド誘導体を記載し、これは、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成される人工リポソームにおける使用について記載される。これは、ヒト単球の活性化および腫瘍細胞の破壊において効果的であるが、一般に高い用量で非毒性である。米国特許第４，９５０，６４５号およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１６３４７の化合物は、細胞キャリアと共に使用することが意図され、そして本発明の他の実施形態である。
【０２４２】
本発明で使用することが意図される別のアジュバントは、ＢＣＧである。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの弱毒化株）およびＢＣＧ細胞壁骨格（ＣＷＳ）はまた、トレハロースジミコレートと共にかまたはこれを伴わずに、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。トレハロースジミコレートが単独で使用されても良い。トレハロースジミコレートの投与は、マウスにおいて、インフルエンザウイルス感染に対する増大した耐性と相関することが示されている（Ａｚｕｍａら、１９８８）。トレハロースジミコレートは、米国特許第４，５７９，９４５号に記載されるようにして調製され得る。
【０２４３】
ＢＣＧは、その免疫刺激特性に起因して、重要な臨床的ツールである。ＢＣＧは、細網内皮系を刺激し、ナチュラルキラー細胞を活性化し、そして造血肝細胞の増殖を増大するように働く。ＢＣＧの細胞壁抽出物は、優れた免疫アジュバント活性を有することが証明されている。ミコバクテリアについての分子遺伝学的ツールおよび方法は、異種遺伝子をＢＣＧに導入するための手段を提供した（Ｊａｃｏｂｓら、１９８７；Ｓｎａｐｐｅｒら、１９８８；Ｈｕｓｓｏｎら、１９９０；Ｍａｒｔｉｎら、１９９０）。
【０２４４】
生のＢＣＧは、結核を予防するための世界的に使用される有効かつ安全なワクチンである。ＢＣＧおよび他のミコバクテリアは、非常に有効なアジュバントであり、ミコバクテリアに対する免疫応答は、広範に研究されている。ＢＣＧは、約２０億回の免疫という、ヒトにおける安全な使用の長い記録を有する（Ｌｕｅｌｍｏ，１９８２；Ｌｏｔｔｅら、１９８４）。これは、出生時に与えられ得る数種のワクチンのうちの１つであり、これは単回用量のみで長期の免疫応答を引き起こし、そしてＢＣＧワクチン接種の経験との世界的分布ネットワークが存在する。例示的なＢＣＧワクチンは、ＴＩＣＥＴＭ  ＢＣＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｏｒａｎｇｅ，ＮＪ）として販売されている。
【０２４５】
本発明の代表的な実施において、ウシ型結核菌ＢＣＧの細胞を、当該分野で公知の方法によって増殖および収集する。例えば、この細胞を、Ｓａｕｔｏｎ培地上、またはＤｕｂｏｓ培地中の分散培養物を含有する発酵容器中で、表面皮膜として増殖し得る（Ｄｕｂｏｓら、１９４７；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，１９３７）。全ての培養物を、約３７℃で１４日間インキュベートした後に、収集する。被膜として増殖した細胞を、白金ループを使用することにより収集し、一方、発酵槽由来の細胞を、遠心分離または接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ−ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により収集する。この収集された細胞を、水性滅菌緩衝液培地に再懸濁する。代表的な懸濁液は、約２×１０１０細胞／ｍｌ〜約２×１０１２細胞／ｍｌを含む。この細菌懸濁液に、ＢＣＧ細胞被覆物質を分解する選択した酵素を含有する滅菌溶液を添加する。この得られた懸濁液を、例えば、撹拌によって混合し、ＢＣＧ生物の最大の分散を保証する。この後に、より高濃度の細胞懸濁液を調製し、そしてこの濃縮物中の酵素を、代表的には、水性緩衝液で洗浄することによって、接線流濾過のような公知の技術を用いて、除去する。この酵素を含まない細胞を、凍結保護溶液を用いて最適案免疫学的濃度に調整し、その後、この細胞をバイアル、アンプルなどに濾過し、そして凍結乾燥して、ＢＣＧワクチンを得、このワクチンは、水で再構成すると、免疫化の準備ができる。
【０２４６】
両親媒性かつ表面活性な薬剤（例えば、サポニンおよびＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような誘導体）は、本発明の免疫原と共に使用するためのさらに別の群のアジュバントを形成する。非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９４；Ｈｕｎｔｅｒら、１９９１）もまた、用いられ得る。オリゴヌクレオチドは、別の有用な群のアジュバントである（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８８）。Ｑｕｉｌ  Ａおよびレンチネン（ｌｅｎｔｉｎｅｎ）は、本発明の特定の実施形態において使用され得る他のアジュバントである。
【０２４７】
本発明における使用に好ましい１つの群のアジュバントは、解毒内毒素（例えば、米国特許第４，８６６，０３４号の精製解毒内毒素）である。これらの精製解毒内毒素は、哺乳動物においてアジュバント応答を生成する際に有効である。もちろん、この解毒内毒素を、他のアジュバントと組み合わせて、マルチアジュバント組込み細胞を調製し得る。例えば、解毒内毒素とトレハロースジミコレートとの組み合わせは、米国特許第４，４３５，３８６号に記載されるように、特に意図される。解毒内毒素とトレハロースジミコレートおよび内毒素糖脂質との組み合わせもまた、意図され（米国特許第４，５０５，８９９）、同様に、解毒内毒素と細胞壁骨格（ＣＷＳ）またはＣＷＳおよびトレハロースジミコレートとの組み合わせも、米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，４３６，７２８号および同第４，５０５，９００号に記載されるように、意図される。解毒内毒素を含まない、ＣＷＳ単独およびトレハロースジミコレートの組み合わせもまた、米国特許第４，５２０，０１９号に記載されるように、有用であることが予測される。
【０２４８】
他の実施形態において、本発明は、種々のアジュバントが細胞膜において用いられ得、その結果、免疫原性組成物を生成すること企図する。唯一の要件は、一般に、アジュバントが、問題の細胞の細胞膜に組み込まれ得るか、この細胞膜と物理的に会合し得るか、またはこの細胞膜に結合体化し得ることである。当業者は、本発明に従って、細胞ワクチンに結合体化し得る異なる種類のアジュバントを知っており、これには、とりわけ、アルキルリゾリン脂質（ＡＬＰ）；ＢＣＧ；およびビオチン（ビオチン化誘導体を含む）が挙げられる。特に使用が意図される特定のアジュバントは、グラム陽性細胞由来のテイコ酸である。これには、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、リビトールテイコ酸（ＲＴＡ）およびグリセロールテイコ酸（ＧＴＡ）が挙げられる。これらの合成対応物の活性形態もまた、本発明と関連して用いられ得る（Ｔａｋａｄａら、１９９５ａ）。
【０２４９】
種々のアジュバントは、ヒトにおいて一般的に使用されないアジュバントでさえ、例えば、抗体を惹起するかまたは活性化Ｔ細胞を後に得ることが望まれる動物においてなお用いられ得る。例えば、非照射腫瘍細胞を使用して生じ得るのと同様に、アジュバントまたは細胞のいずれかから生じ得る毒性または他の有害な影響は、このような状況において無関係である。
【０２５０】
本発明のいくつかの実施形態における使用に好ましい１の群のアジュバントは、核酸によりコードされ得るアジュバント（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。このようなアジュバントは、抗原をコードする核酸（例えば、発現ベクター）、または別個のベクターもしくは他の構築物中でコードされ得ることが意図される。アジュバントをコードするこれらの核酸は、例えば、脂質またはリポソームを用いて、直接送達され得る。
【０２５１】
（３．賦形剤、塩および補助物質）
本発明の抗原性組成物は、薬学的に受容可能であり、活少なくとも１つの活性成分（例えば、抗原）と適合性である１つ以上のさらなる成分（例えば、賦形剤、塩など）と混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせである。
【０２５２】
本発明の抗原性組成物は、中性形態または塩形態としてワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、有機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミンエタノール、ヒスチジン、プロカインおよびこれらの組み合わせ）から誘導され得る。
【０２５３】
さらに、所望の場合、抗原性組成物は、抗原性組成物またはワクチンの有効性を増大する、少量の１つ以上の補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化剤など）を含み得る。
【０２５４】
（Ｉ．ワクチンの調製）
一旦、産生、合成および／または精製されると、抗原または他のワクチン成分は、患者への投与のためのワクチンとして調製され得る。ワクチンの調製は、一般に、米国特許第４，６０８，２５１号、同第４，６０１，９０３号、同第４，５９９，２３１号、同第４，５９９，２３０号および同第４，５９６，７９２号（本明細書中で全体が参考として援用されている）によって例示されるように、当該分野で十分理解されている。本発明の開示を参照すると、このような方法を使用して、抗原性組成物（活性成分として、葉酸結合タンパク質のエピトープおよび／または改変体を含む）を含むワクチンを調製し得る。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、薬理学的に受容可能なワクチンとなるように調製される。
【０２５５】
本発明の薬学的ワクチン組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に溶解または分散された、有効量の１種以上の葉酸結合タンパク質のエピトープおよび／または改変体あるいはさらなる薬剤を含む。句「薬学的または薬理学的に受容可能な」とは、適切に、例えば、ヒトのような動物に投与される場合、不利な反応、アレルギー性の反応または他の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。少なくとも１種の葉酸結合タンパク質のエピトープまたはさらなる活性成分を含む、薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（本明細書中で参考として援用されている）に例示されるように、本開示を照らし合わせて、当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）の投与のために、調製物は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＳｔａｎｄａｒｄｓのＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅによって必要とされるような、無菌性、発熱性、一般的な安全性、および精製基準を満たすべきことが理解される。
【０２５６】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、当業者に公知であるように、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定薬、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、このような物質およびそれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，第１２８９〜１３２９頁（本明細書中で参考として援用されている））。この葉酸結合タンパク質の改変体は、それが、固体形態、液体形態、もしくはエアロゾル形態で投与されるか否か、そして注入としての投与法のために滅菌される必要があるか否かに依存して、異なる型のキャリアを含み得る。任意の従来のキャリアが活性成分と不適合性である範囲を除いて、治療組成物または薬学的組成物中でのその使用が、意図される。
【０２５７】
任意の場合において、この組成物は、１種以上の成分の酸化を遅延させるために、種々の抗酸化剤を含み得る。さらに、微生物の活性の阻害は、保存剤（例えば、種々の抗菌剤および抗真菌剤）によってもたらされ得、これらには、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
葉酸結合タンパク質の改変体は、遊離塩基形態、天然形態または塩形態で組成物中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基により形成される塩）が挙げられ、この酸付加塩は、無機酸（例えば、塩化水素酸もしくはリン酸）または有機酸（酢酸、臭酸、酒石酸、もしくはマンデル酸）より形成される。遊離カルボキシル基より形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化鉄（ＩＩＩ））；または有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカイン）から誘導され得る。
【０２５９】
この組成物が液体形態である実施形態において、キャリアは、溶媒または分散媒であり得、このキャリアとしては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。適切な流動性が、例えば、コーティング剤の使用（例えば、レシチン）によって；キャリア（例えば、液体ポリオールもしくは脂質）中に分散することによる、必要とされる粒径の維持によって；界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）の使用によって；またはこれらの方法の組み合わせによって、維持され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム、またはそれらの組み合わせ）を含むことが、好ましい。
【０２６０】
他の実施形態において、本発明の、鼻用溶液もしくはスプレー、エアロゾル、または吸入剤を使用し得る。このような組成物は、一般に、標的組織の型に適合可能なように設計される。非制限例において、鼻用溶液は、通常、滴またはスプレーで鼻の通路に投与されるように設計された水溶液である。鼻用溶液は、鼻の分泌物と多くの点で類似するように調製され、正常な線毛の作用が維持される。従って、好ましい実施形態において、水性鼻用溶液は、通常、等張性であるか、または約５．５〜約６．５のｐＨを維持するようにわずかに緩衝化される。さらに、抗菌保存剤（眼用の調製物、薬物、または適切な薬物安定剤に使用される抗菌保存剤と類似している）は、必要な場合、この処方物中に含まれ得る。例えば、種々の市販の鼻用調製物は、公知であり、そして抗生物質または抗ヒスタミン薬のような薬物を含む。
【０２６１】
特定の実施形態において、この葉酸結合タンパク質の改変体は、経口接種のような経路による投与のために、経口摂取として調製される。これらの実施形態において、この固体組成物が、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル（例えば、ハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンカプセル）、徐放処方物、バッカル組成物、トローチ、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート、またはそれらの組み合わせを含み得る。経口組成物は、食事の食物に直接含まれ得る。経口投与のための好ましいキャリアは、不活性希釈剤、吸収可能な食用キャリアまたはそれらの組み合わせを含む。本発明の他の局面において、この経口組成物は、シロップまたはエリキシルとして調製され得る。シロップまたはエリキシルは、例えば、少なくとも１種の活性剤、甘味剤、保存剤、香味剤、色素、保存剤、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０２６２】
特定の好ましい実施形態において、経口組成物は、１種以上の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤、およびそれらの組み合わせを含み得る。特定の実施形態において、組成物は、以下の１種以上を含み得る：結合剤（例えば、ガムトラガカント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組み合わせ）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組み合わせ）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸またはそれらの組み合わせ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組み合わせ）；香味剤（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、チェリーフレーバー、オレンジフレーバーなど）；あるいはそれらの組み合わせなど。投薬単位形態が、カプセルである場合、上記の型の材料に加えて、キャリア（例えば、液体キャリア）を含み得る。種々の他の材料は、コーティング剤としてそうでなければ、投薬単位の物理学的形態を改変するためにあり得る。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルが、シェラック、糖またはその両方によりコーティングされ得る。
【０２６３】
投与の他の形態に適切なさらなる処方物としては、坐薬が挙げられる。坐薬は、種々の重量および形状の固体投薬形態であり、通常、直腸、膣または尿道に挿入するために投薬される。挿入後に、坐薬は、腔の流体中で軟化、融解または溶解する。一般に、坐薬のために、従来のキャリアとしては、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせが挙げられ得る。特定の実施形態において、坐薬は、例えば、活性成分（約０．５％〜約１０％、そして好ましくは、約１％〜約２％の範囲）を含む混合物から処方され得る。
【０２６４】
滅菌注入溶液は、上に列挙された種々の他の成分とともに、適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を取り込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を滅菌ビヒクルに取り込むことによって調製され、このビヒクルは、塩基性の分散媒体および／または他の成分を含む。注射可能な滅菌溶液、懸濁液またはエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、真空乾燥技術または凍結乾燥技術であり、これらの技術により、それらの予め滅菌濾過した液体媒体から、活性成分およびさらなる任意の所望の成分の粉末が得られる。この液体媒体は、必要な場合、適切に緩衝化されるべきであり、そしてこの液体希釈物は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースでの注入前に等張性にされる。直接注入するための高度に濃縮された組成物の調製により、高濃度の活性成分を小領域に送達させる、非常に迅速な浸透を生じるために、溶媒としてＤＭＳＯの使用が想定される場合も意図される。
【０２６５】
この組成物は、製造および保存の条件下で安定であり、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。内毒素の汚染が、例えば、１ｍｇのタンパク質あたり０．５ｎｇ未満の安全なレベルで最小に保たれなければならないことが理解され得る。
【０２６６】
特定の実施形態において、注入可能な組成物の延長した吸収は、吸収を遅延させる試薬（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組み合わせ）を組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【０２６７】
（Ｊ．ワクチンの投与）
ワクチンの投与の様式は、広範に変化され得る。ワクチンの投与のための従来の方法のいずれかが、適用可能である。例えば、ワクチンは、以下により好都合に投与される：静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、腟内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、嚢内、粘膜、心膜内、経口的、直腸に、経鼻的、全身的、点眼、局所的、エアロゾルの使用、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接的に入れる局在化された灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリーム、脂質組成物（例えば、リポソーム）、あるいは当業者に公知であるような、他の方法または上記の任意の組み合わせ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｔｉｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【０２６８】
ワクチン摂取のスケジュールおよび投薬量は、例えば、因子（例えば、患者の体重および年齢）、処置される疾患の型、疾患状態の重篤度、以前または現在の治療的介入、投与の様式などを考慮して、患者間の基準を基に変動され得、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【０２６９】
ワクチンは、投薬処方物と適合可能な様式および治療学的に有効である量および免疫原性である量で投与される。例えば、筋肉内経路が、インビボにおいて、短い半減期を有するトキシンの場合に好まれ得る。投与される量は、処置される被験体に依存し、この量としては、例えば、個体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される保護の程度が挙げられる。ワクチンの投薬は、投与の経路に依存し、そして宿主のサイズに従って変化する。投与される、必要とされる活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存する。特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態において、活性化合物は、例えば、そのユニットの約２重量％〜約７５重量％の間、または約２５重量％〜約６０重量％の間、および本明細書中で誘導可能な任意の範囲を含み得る。しかし、適切な投薬範囲は、例えば、１回のワクチン摂取あたり、数百μｇの活性成分のオーダーであり得る。他の非制限例において、用量はまた、１回のワクチン摂取あたり、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上、および本明細書中で誘導可能な任意の範囲を含み得る。本明細書中に列挙される数から誘導可能な範囲の非制限的な例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数に基づいて投与され得る。最初の投与およびブースター投与（例えば、接種）のための適切なレジームはまた可変性であるが、最初の投与、引き続く接種または他の投与に代表される。
【０２７０】
多くの場合において、複数回のワクチンの投与（通常、６回のワクチン接種を超えず、より通常、４回のワクチン接種を超えず、そして好ましくは、１回以上、通常、少なくとも約３回のワクチン接種）が所望される。ワクチン接種は、通常、２〜１２週間隔、より通常、３〜５週間隔である。１〜５年、通常３年間隔の周期的なブースターが、抗体の保護レベルを維持するために所望される。
【０２７１】
免疫の過程は、続いて、上清の抗原に対する抗体についてのアッセイにより行われ得る。このアッセイは、従来の標識を用いた標識化（例えば、放射性核種、酵素、蛍光など）により実施され得る。これらの技術は、周知であり、これらのアッセイの型の例示として、広範な種々の特許（例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第４，１７４，３８４号および同第３，９４９，０６４号）において見出され得る。他の免疫アッセイが、実施され得、そして葉酸結合タンパク質の改変体を用いたチャレンジからの保護アッセイが、免疫後に実施され得る。
【０２７２】
（Ｋ．免疫応答の増強）
本発明は、被験体の免疫応答を増強させる方法を含み、この方法は、１種以上のリンパ球を葉酸結合タンパク質の改変体の抗原組成物と接触させる工程を包含し、ここで、この抗原は、その配列の一部として、配列番号１〜配列番号８に従う配列；またはその免疫学的機能性等価物を含む。特定の実施形態において、１以上のリンパ球は、動物（例えば、ヒト）中に含まれる。他の実施形態において、このリンパ球は、動物またはその動物の組織（例えば、血液）から単離され得る。特定の好ましい実施形態において、このリンパ球は、末梢血のリンパ球である。特定の実施形態において、１種以上のリンパ球が、Ｔリンパ球またはＢリンパ球を含む。特に好ましい局面において、Ｔリンパ球は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。
【０２７３】
増強された免疫応答は、活性または受動的な免疫応答であり得る。あるいは、この応答は、リンパ球が、動物（例えば、患者）から得られ、次いで免疫性組成物を含む組成物でパルスされる養子免疫治療アプローチの一部であり得る。好ましい実施形態において、このリンパ球は、同一の動物または異なる動物（例えば、同一のドナーまたは異なるドナー）に投与され得る。
【０２７４】
（１．細胞傷害性Ｔリンパ球）
特定の実施形態において、Ｔリンパ球は、本発明の抗原性組成物と接触させることによって特異的に活性化される。特定の実施形態において、Ｔリンパ球は、本発明の抗原性組成物と接触する（または接触されている）抗原提示細胞と接触することによって、活性化される。
【０２７５】
Ｔ細胞は、独特な抗原結合レセプター（Ｔ細胞レセプター）をこの細胞の膜上で発現し、これは、他の細胞の表面上で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と会合する抗原のみを認識し得る。Ｔ細胞（例えば、Ｔヘルパー細胞およびＴ細胞傷害性細胞）のいくつかの群が存在する。Ｔヘルパー細胞およびＴ細胞傷害性細胞は、膜結合糖タンパクＣＤ４およびＣＤ８のそれぞれの表示によって主に分別される。Ｔヘルパー細胞は、種々のリンフォカインを分泌し、これらのリンフォカインは、Ｂ細胞、Ｔ細胞傷害性細胞、マクロファージおよびこの免疫系の他の細胞の活性化のために必須である。対照的に、抗原−ＭＨＣ複合体を認識するＴ細胞傷害性細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞に増殖および分化する。ＣＴＬは、細胞溶解を生じる物質を産生することによって抗原を提示する体細胞の細胞を排除する。
【０２７６】
ＣＴＬ活性は、当業者に公知であるように、本明細書中に記載される方法によって評価され得る。例えば、ＣＴＬは、以下：新しく単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中、ＰＢＭＣ（Ｂｅｒｎａｒｄら、１９９８）から確立されたフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激ＩＬ−２拡大細胞株中、または以前に免疫した被験体から単離し、そして抗原を含むアデノウイルスベクターで感染したＤＣを用いて、６日間際刺激したＴ細胞（標準的な４時間の５１Ｃｒ放出ミクロ毒性アッセイを使用する）により、評価され得る。細胞媒介細胞傷害性を検出するために開発された別の蛍光アッセイにおいて、使用した発光団は、無毒の分子であるａｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｎｏｃｉａｒｉら、１９９８）である。このａｌａｍａｒＢｌｕｅは、ミトコンドリアの還元が生じるまで、蛍光的にクエンチされ（すなわち、量子収率の減少）、次いで、ａｌａｍａｒＢｌｕｅの蛍光強度において劇的な増加を生じる（すなわち量子収率の増加）。このアッセイは、非常に高感度であり、特異的であると報告されており、そして標準的な５１Ｃｒ放出アッセイよりも有意に少ない数のエフェクター細胞を必要とする。
【０２７７】
特定の局面において、Ｔヘルパー細胞の応答は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とインビトロアッセイまたはインビボアッセイによって測定され得る。インビトロアッセイは、酵素、ラジオアイソトープ、発光団、または蛍光アッセイによる、特異的なサイトカイン放出の測定を含む。インビトロアッセイとしては、当業者に公知であるように、皮膚試験と呼ばれる遅延型過敏性応答が挙げられる。
【０２７８】
（２．抗原提示細胞）
一般に、用語「抗原提示細胞」は、抗原（例えば、葉酸結合タンパク質の改変体もしくは免疫学的機能性等価物）または本発明の抗原組成物に対する、免疫応答（すなわち、免疫系のＴ細胞アームもしくはＢ細胞アームからの免疫応答）の増強を補助することによって本発明の目的を達成する任意の細胞であり得る。このような細胞は、本明細書に開示される方法および当該分野の方法を使用して、当業者によって定義され得る。当業者によって理解され（例えば、Ｋｕｂｙ，１９９３（本明細書中で参考として援用されている）を参照）そして本明細書の特定の実施形態で使用されるように、正常にまたは優先的にクラスＩＩ主要組織適合遺伝子分子または複合体を有する抗原を免疫細胞に表示または提示する細胞は、「抗原提示細胞」である。特定の局面において、細胞（例えば、ＡＰＣ細胞）は、別の細胞（例えば、所望の抗原を発現する組換え細胞または腫瘍細胞）と融合され得る。２種以上の細胞の融合物を調製するための方法（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，第６５〜６６頁，７１〜７４  １９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，第７５〜８３頁，１９８４；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，Ｇｅｆｔｅｒら，１９７７（いずれも本明細書中で参考として援用されている）に開示される方法）は、当該分野で周知である。いくつかの場合において、抗原提示細胞が、抗原を表示または提示する免疫細胞は、ＣＤ４＋ＴＨ細胞である。ＡＰＣまたは他の免疫細胞上で発現されるさらなる分子は、免疫応答の増強を補助または改善し得る。分泌分子または可溶性分子（例えば、免疫調節物質およびアジュバンド）はまた、抗原に対する免疫応答性を補助または増強し得る。このような分子は、当業者に周知であり、そして種々の例が、本明細書中に記載されている。
【０２７９】
（ＶＩＩ．ペプチドの形成）
本明細書中に記載されるエピトープモチーフを含有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２システム中で、ＣＴＬに対する汎用ＦＢＰ標的および抗原を提供するために、治療における使用が意図される。これらの新規な配列に基づく治療の開発は、合成腫瘍ワクチンの形成を介したインビボにおける腫瘍応答性免疫細胞の誘導、およびペプチド媒介（例えば，リポペプチド）または細胞媒介（例えば、自己形質導入体またはＨＬＡ−Ａ２形質導入体のいずれかを使用するＥＢＶ−Ｂ株（ここで、目的のペプチドに関する遺伝子が導入され、そしてこのペプチドは表面上でＨＬＡ−Ａ２と会合して発現される））のいずれかを介したインビトロにおける腫瘍応答性Ｔ細胞の誘導を提供する。癌の増殖の機会を防止または減少させるためのワクチン成分としてのこれらの新規なペプチドの使用がまた、意図される。
【０２８０】
使用が意図される他の組成物よりも小さいペプチド（例えば、エンベロープタンパク質）は、改善されたバイオアベイラビリティーおよび半減期を有する。所望される場合、安定性実験が、これらのペプチドについて実施され得る（この実験としては、例えば、ヒトの血清または血漿中でのプレインキュベーション；種々のプロテアーゼを用いた処理；ならびにまた、温度安定性分析およびｐＨ安定性分析が挙げられる）。必要であることが見出される場合、合成ペプチドの安定性は、種々の方法（例えば、ペプチド合成のために、Ｌ−アミノ酸の代わりにＤアミノ酸を使用すること；ｔ−ｂｏｃなどのような保護基を使用すること；またはリポソーム内のペプチドをカプセル化すること）のいずれか１つにより増強され得る。ペプチドの選択混合物のバイオアベイラビリティーがまた、放射線標識したペプチドを実験動物（例えば、マウスおよび／またはアカゲザル）に注射し、引き続いてそれらの組織分布を分析することによって決定され得る。
【０２８１】
安定性の増強が所望される場合、右旋性のアミノ酸（Ｄアミノ酸）の使用が、これらの型の構造にプロテアーゼが攻撃し得ないことに起因して、さらに長いバイオアベイラビリティーを生じるのに有用であることが意図される。本発明のペプチドはまた、例えば、Ｎ末端またはＣ末端に基を付加すること（例えば、アシル化またはアミノ化）によってさらに安定化され得る。所望される場合、これらのペプチドは、さらに脂質−尾状ペプチドの形態であり得、界面活性剤様ミセルまたは他のペプチドマルチマーに処方され得る。ペプチドマルチマーおよび界面活性剤様ミセルの調製は、米国出願番号０７／９４５，８６５号（本明細書中で参考として援用されている）に詳細に記載されている。本発明の組成物は、経済的でかつ安全な抗腫瘍治療／抗癌治療に使用するのに特に有用であることが意図され、そして特定の治療処方物が、必要とされる投薬形態をより正確に決定するために，実験動物モデル（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、ヤギ、アカゲザル、チンパンジーなど）において試験され得る。
【０２８２】
本明細書中に記載されるペプチジル化合物に加えて、本発明者らはまた、他の立体的に類似する化合物が、ペプチド構造の重要な部分を模倣するように定式化され得ること、およびこのような化合物がまた、本発明のペプチドと同じ様式で使用され得ることを企図する。これは、当業者に公知のモデリングおよび化学設計の技術によって達成され得る。例えば、エステル化および他のアルキル化は、特定の末端モチーフ構造を模倣するためにペプチドの末端を改変するために使用され得る。全てのこのような立体的に類似な構築物が本発明の範囲内に入ることが理解される。
【０２８３】
本発明の治療組成物または薬学的組成物は、一般的に、薬学的に受容可能な媒体中に溶解または分散された、有効量のＣＴＬ刺激ペプチドを含む。成句「薬学的に受容可能」とは、ヒトに投与された場合、アレルギー反応、毒性反応、またはその他の有害な反応を生じない分子実体および組成物をいう。薬学的に受容可能な媒体またはキャリアとしては、全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。
【０２８４】
補助的な活性成分はまた、本発明の治療組成物に組み込まれ得る。例えば、刺激性ペプチドはまた、免疫および処置のためのペプチドカクテルを作製するために、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはＴ−ヘルパー細胞誘導エピトープを含むペプチドと組み合わされ得る（米国特許第０７／９４５，８６５号に開示される；本明細書中において参考として援用される）。
【０２８５】
活性成分として、ＣＴＬ刺激ペプチド（右旋性ペプチドを含む）を含む薬学的または薬理学的組成物の調製は、本発明を考慮して、当業者に公知である。代表的には、このような組成物は、液体溶液としてまたは懸濁液としてのいずれかで注射可能であるとして；注射前に、液体中で溶液にまたは懸濁液に適する固体形態として；経口投与のための錠剤または他の固体として；時間放出カプセルとして；または現在使用される任意の他の形態（クリーム、ローション、うがい薬、吸入剤など）として、調製され得る。
【０２８６】
遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにその混合物中で、オイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を予防するための保存剤を含む。
【０２８７】
静脈内投与に適する滅菌溶液は、特定の実施形態において好ましく、ＣＴＬを刺激する際および／または動物において免疫応答を生成する際に特に有効であることが企図される。注射可能な使用に適する薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌水性分散物、および滅菌注射可能な溶液または分散物の体外調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、この形態は、滅菌でなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度まで流体でなければならない。製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用に対して保存されなければならない。
【０２８８】
ペプチドは、中性形態または塩の形態で組成物に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）あるいは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【０２８９】
キャリアはまた、溶媒または分散媒体であり得、これには、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）、適切なこれらの混合物、ならびに植物オイルが挙げられる。適切な流動性は、特に、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合では必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、特に、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合において、等張性剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物での使用によってもたらされ得る。
【０２９０】
滅菌注射可能な溶液は、上記の種々の列挙された他の成分とともに適切な溶媒中で必要な量で活性化合物を混ぜ、必要に応じて、引き続き、濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散物は、種々の滅菌活性成分を、基礎となる分散媒体および上記の列挙からの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに混ぜることによって調製される。滅菌注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、減圧乾燥および凍結乾燥技術であり、これは、活性成分および先に滅菌濾過された溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０２９１】
筋肉内注射のための、よりまたは高度に濃縮された溶液の調製もまた、企図される。これは、動物またはさらにヒトに対する針突き刺し損傷の処置を容易にする際に特に有用性を有することが想定される。これに関して、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、これが、非常に迅速な透過を生じ、高濃度の活性ペプチドまたは薬剤を小さな領域に送達するので、好ましい。
【０２９２】
作業現場における特定の領域を洗浄するために、獣医師、技術者、外科医、医師または保健医療作業者によって、滅菌処方物（例えば、生理食塩水ベースの洗浄液）を使用することもまた、特に有用であり得る。本発明に従う治療処方物はまた、うがい薬の形態で再構成され得、ペプチド単独または抗真菌剤との組み合わせを含む。吸入形態もまた想定され、これはまた、活性ペプチドもしくは薬剤を単独でまたは他の薬剤（例えば、ペンタミジン）とともに含み得る。本発明の治療処方物はまた、局所投与に適切な形態（例えば、クリームおよびローション）で調製され得る。
【０２９３】
このような溶液での使用のための適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。適切な緩衝液は、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、重リン酸ナトリウムなどを、約ｐＨ６とｐＨ８との間、好ましくは、約ｐＨ７とｐＨ７．５との間のｐＨに維持するのに十分な量で含む。適切な張性の薬剤は、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどであり、その結果、眼科用溶液の塩化ナトリウム当量は、０．９±０．２％の範囲である。適切な酸化防止剤および安定化剤としては、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオウレアなどが挙げられる。適切な湿潤剤および清澄化剤としては、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールが挙げられる。適切な粘度増加剤としては、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
【０２９４】
処方において、治療剤は、投薬処方と適合性の様式で、そして薬理学的に有効な量で投与される。処方物は、種々の投薬形態（例えば、上記の注射可能な溶液の型）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた使用され得る。本明細書中で使用される場合、「薬学的有効量」とは、動物においてＣＴＬを有意に刺激するかまたは免疫応答を生成するのに十分な量のペプチドを含む組成物の量が使用されることを意味する。
【０２９５】
この文脈において、投与されるペプチドの量および組成物の容量は、処置される宿主動物、例えば、宿主動物の免疫系が免疫応答を生じる能力に依存する。投与されるのに必要な活性ペプチドの正確な量は、開業医の判断に依存し、そして各個体に対して特有である。
【０２９６】
ペプチドを分散するのに必要とされる組成物の最小容量が、代表的に利用される。投与に適切なレジメンもまた、可変であるが、最初にこの化合物を投与し、そして結果をモニタリングし、次いで、さらなる間隔でさらに制御された用量を与えることによって類型化される。例えば、非経口投与について、適切に緩衝化され、そして必要な場合、等張性の水溶液を調製し、そして静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または腹腔内投与のために使用される。１投薬量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加されるか、または注入の計画された部位に注入されるかのいずれかであり得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５−１０３８頁および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。
【０２９７】
特定の実施形態において、活性化合物は、経口的に投与され得る。これは、消化性酵素によるタンパク質分解に対して、一般的に耐性であるか、または耐性にされた薬剤について企図される。このような化合物は、ペプチダーゼ、プロテアーゼおよび／またはリパーゼによる分解を避けるために、タイミングを合わせた放出（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）カプセル中の、化学的に設計された薬剤または改変剤；右旋性ペプチド；およびリポソーム処方物を含むことが企図される。
【０２９８】
経口処方物は、不活性な希釈剤または同化され得る食用キャリアとともに化合物を含み得；硬質ゼラチンカプセルまたは軟質ゼラチンカプセルに囲まれたもの；錠剤に圧縮されたもの；または食事の食物に直接混ぜられたものが挙げられる。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤と混ぜられ得、そして摂取可能な錠剤、頬錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラートなどの形態で使用され得る。このような組成物および調製物は、一般的に、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。この組成物および調製物の割合は、もちろん、変動し得、簡便には、約２〜約６０％の間の重量の単位であり得る。このような治療的に有用な組成物中での活性化合物の量は、適切な投薬が得られるような量である。
【０２９９】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下を含み得る：結合剤（例えば、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；ならびに甘味剤（例えば、投与され得る、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）あるいは矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油またはチェリー香味料）。投薬単位形態がカプセルである場合、これは、上記型の物質に加えて、液体キャリアを含み得る。種々の他の物質は、コーティングとして、または、投薬単位の物理的形態をそれ以外で改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、シェラック、糖、またはその両方でコーティングされ得る。エリキシル剤のシロップは、甘味剤としての活性化合物スクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素および香味料（例えば、チェリーまたはオレンジの風味）を含み得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用されるいずれの物質も、薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放調製物および処方物に混ぜられ得る。
【０３００】
ペプチドは、動物において免疫応答を生じるのに有効な量を投与することによって、それらの免疫能力において使用され得る。この意味において、このような「免疫応答を生じるのに有効な量」とは、抗原性応答を動物において有意に生じるのに十分な、ペプチドまたはペプチド混合物を含む組成物の量を意味する。
【実施例】
【０３０１】
（ＶＩＩＩ．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために含まれる。以下に続く実施例に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するように本発明者らによって見出された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本発明の開示を考慮して、多くの変更が、開示される特定の実施形態においてなされ得、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様なまたは類似の結果を依然として得ることを理解する。
【０３０２】
（実施例１）
（改変体設計のための原理）
胸腺におけるリンパ球発達に関する実験モデルにおける研究は、弱いかまたはヌルな（ｎｕｌｌ）（見かけの効果がない）アゴニストと胸腺細胞の相互作用が、特定のＡｇに対するレスポンダーのポジティブ選択（すなわち、生存）を導くが、一方、強力なアゴニストを用いる刺激は、ネガティブ選択（反応性ＣＴＬの欠失）を導くことを示す。同様に、末梢血からのＣＤ８＋細胞応答についての最近の研究は、ヌルのまたは弱いアゴニスト活性を有するＡｇ改変体が、モデルＡｇに応答するＣＴＬの前駆体の増殖を誘導したが、エフェクター機能を誘導しなかったことを示す。これらの結果は、トランスジェニック動物を用いて得られ、そしてＣＴＬに対するレシピエントは、大量に照射された。腫瘍に対するレスポンダー、および／またはそれらの前駆体が、健常な個体または疾患の証拠のない患者においてどのように維持され得、そして除去を避け得るかに関する情報がほとんどない。しかし、このような前駆体の存在、または活性化ＣＴＬ認識腫瘍Ａｇの存在（Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９９８；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９８；Ｐｅｏｐｌｅｓら、１９９８；Ｋｉｍら、１９９９；Ｌｅｅら、２０００）は、このようなレスポンダーが末梢血に存在するという証拠である。それらの生存、増殖および細胞溶解形成の誘導を促進するアプローチは、患者に対して利益がある。生存について標的化されたレスポンダーが低い親和性ＣＴＬである場合、弱い親和性は、エフェクター数の有意な増加によって補われることが予期される。レスポンダーが高い親和性である場合、ＡＩＣＤからの保護がまたそれらの増殖を可能にする。
【０３０３】
「生存誘導」Ａｇを設計するために、本発明は、ＦＢＰエピトープＥ３９：ＥＩＷＴＨＳＹＫＶ（配列番号２６８）に焦点を合わせる。このエピトープは、低い親和性を有するが、卵巣および乳房腫瘍反応性ＣＴＬによって認識される。野生型Ａｇと反応する細胞数における正味の利得（ｇａｉｎ）の点で改善された免疫原性は、位置５におけるアミノ酸（ヒスチジン）の正電荷を減少し、そしてヒスチジンのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）での置換によって達成される。Ｐｈｅは、荷電されていないが、そのベンゼン芳香族環が、ヒスチジンのイミダゾール環に対する密接な置換である。ペプチドの残基のより良い可撓性を確実にするために、チロシンのフェノール構造は、トレオニン（Ｔｈｒ）の脂肪性コアで置換された。ＴｙｒおよびＴｈｒの両方がＯＨ（ヒドロキシル）側鎖を含む。従って、位置５の正電荷およびＴｙｒの剛性構造が、排除された。特定の実施形態において、これは、ペプチドにおける残基５〜９（ＳＹＫＶ（配列番号２７０））の可撓性を増加し、そしてペプチドＭＨＣ複合体とＴＣＲのより良い適合を可能にする。改変体：ＥＩＷＴＦＳＴＫＶ（配列番号５）は、Ｊ６５と指定された。Ｊ６５のさらなる改変体は、位置７（Ｔｙｒ）→Ｔｈｒのみでの変化（Ｊ７７と指定される）、位置５でのＰｈｅ→Ｈｉｓのみの変化（Ｊ７８と指定される）、および位置１および位置６での変化を伴って作製された。これらのアナログ／改変体は、表５に列挙される。
【０３０４】
【表５】
0004401075.tif 000009
これらのＡｇ改変体の選択は、シグナル伝達を交代する目的のＡｇ変更の原理に基づい
てなされた。置換Ｈ→Ｆ（位置５）およびＹ→Ｔ（位置７）に加えて、置換は、他の位置
Ｓ→Ａ（位置６）およびＧｌｕ（Ｂ）→ＦおよびＥ→Ｇｌｙ（Ｇ）（位置１）で導入され
た。これらの置換の目的は、ＴＣＲと潜在的に反応性の基を除去することである。置換Ｓ
→Ａ（位置Ａ）において、この変化は、側鎖ＯＨを除去する。位置１において、置換Ｅ（
グルタミン酸）→グリシンは、脂肪酸側鎖全体および荷電されたＣＯＯ基を除去する。位
置１においてもまた、置換Ｅ→Ｆは、荷電された基ＣＯＯを除去するが、芳香族環を導入
する。これらの置換は、ＴＣＲとペプチドの反応性を減少させることを目的とする。
【０３０５】
（実施例２）
（ＩＦＮ−γ誘導およびＣＴＬ活性）
改変体ペプチドのＨＬＡ−Ａ２安定化能力もまた、決定される（図１）。結果は、Ｊ６５の安定化能力が、Ｅ３９の安定化能力のほぼ半分であることを示す。対照的に、位置１での置換は、ペプチドの結合親和性を増加する。図２の結果は、Ｅ３９誘導ＣＴＬと比較したＪ６５誘導ＣＴＬの細胞溶解活性を示す。結果は、Ｊ６５が、Ｊ７７およびＥ３９よりも弱い、３×Ｊ６５刺激培養物由来のＩＦＮ−ｙの誘導因子であったことを示し、これは、配列における変化が、ＩＦＮ−ｙの誘導を減少する際に蓄積的な効果を有したことを示唆する。
【０３０６】
ＣＴＬ活性の誘導に対するＦＢＰ改変体の効果を取り扱うために、Ｊ６５で３回刺激した健常なドナー由来のＰＢＭＣ培養物を、３つに分け、そしてＥ３９またはＪ６５またはＪ７７のいずれかで再刺激した。コントロール培養物を、Ｅ３９で３回刺激した同じＰＢＭＣから作製し、そして４回目についてＥ３９で再刺激した。Ｅ３９で３回（３×Ｅ３９）刺激し、続いてＥ３９で刺激されたＰＢＭＣは、Ｅ３９の中程度の弱い認識を示した。対照的に、３×Ｊ６５刺激したＣＴＬは、Ｅ３９での刺激後、Ｅ３９の有意により高い認識を示した。類似の特徴は、Ｊ６５で再刺激された３×Ｊ６５細胞を用いて観測され、一方、Ｊ７７で再刺激された３×Ｊ６５細胞は、他のペプチドを用いて刺激された３×Ｊ６５細胞よりも有意に低いＣＴＬ活性を示した。ＦＢＰのような腫瘍Ａｇと反応する記憶ＣＴＬが、健常な個体の血液に存在することが最近報告された（Ｌｅｅら、２０００）。これらの細胞は、樹状細胞に提示された対応するペプチドを用いる刺激によって容易に活性化され得る（Ｋｉｍら、１９９９）。アナログＪ６５およびＪ７７の刺激能力を評価するために、応答するドナーからのＰＢＭＣは、Ｅ３９、Ｊ６５およびＪ７７を用いて刺激された。これらの結果は、レスポンダー増殖および細胞傷害におけるＪ６５の増強の役割が、野生型Ａｇと比較した、増加したＩＬ−２および／またはＩＦＮ−ｙ分泌を反映しないが、そのより弱いサイトカイン誘導活性が、過剰刺激を避けることによってアポトーシスからのより高い親和性のＣＴＬを保護するようである。
【０３０７】
（実施例３）
（ＦＢＰ改変体を用いてプライミングすることによる特異的ＩＬ−２誘導）
Ｊ６５プライムされたＣＴＬにおいて、より高いＣＴＬ活性およびＩＦＮ−ｙ分泌が、野生型エピトープＥ３９によって誘発され得、これは、先の刺激の保護効果を示唆する。図３において、結果は、Ｊ６５およびＪ７７が、野生型ペプチドＥ３９と比較してこのドナーのＰＢＭＣにおいてより低いレベルのＩＬ−２を誘導したことを示す。どのＥ３９改変体がより高い細胞増殖を誘導したかを同定するために、同じドナー由来のＰＢＭＣを、対応するペプチドを用いて３回刺激し、そして得られた生細胞を、各刺激の１週間後に、数えた。図４において、結果は、Ｅ３９で刺激した培養物が、最初に、他の培養物よりも速く増殖した；しかし、第３の刺激後、Ｊ６５で刺激された培養物は、数においてより速く増加した。対照的に、Ｊ７８（Ｈ→Ｆ）およびＪ７７（Ｙ→Ｔ）で刺激した培養物は、ペプチドで刺激されなかったコントロール培養物よりもゆっくり増殖した。同様な結果は、別のドナーにおいてＪ６５を用いて得られた（図５）。このドナーにおいて、Ｅ３９で刺激された細胞は、第３刺激の後に死滅したが、Ｊ６５によって刺激された細胞は、より迅速に増殖した。Ｊ７７およびＪ７８で刺激された細胞もまた、増殖したが、より遅い速度であった。
【０３０８】
（参考文献）
以下の参考文献は，これらの参考文献が例示的な手順または本明細書中で示された手順を補完する他の詳細を提供する程度に、具体的に、本明細書中で参考として援用される。
【０３０９】
【数１】
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本明細書中で開示され、そして請求される、組成物および方法の全ては、本発明開示の知見のもと、過度な実験を伴わずに、作製され、そして実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されるが、バリエーションが、これらの組成物あるいは方法に適用され得、そして、本明細書中に記載の、方法の工程もしくは一連の工程において、本発明の概念、精神、および範囲を逸脱しないこと当業者に明らかである。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤は、本明細書中に記載の薬剤にとって代わられ得るが、同一または類似の結果が達成されることは明らかである。当業者にとって明らかである、このような代替物および改変物全ては、本明細書中に記載の本発明の精神、範囲、および概念のうちにあると判断される。
【図面の簡単な説明】
【０３１０】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】図１は、ＦＢＰエピトープＥ３９改変体による、ＨＬＡ−Ａ２の安定化を実証する。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｊ６５またはＥ３９での複数の刺激を用いる、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−γ誘導を例示する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｊ６５またはＥ３９での複数の刺激を用いる、ＰＢＭＣにおけるＣＴＬ活性を例示する。
【図３】図３は、Ｅ３９改変体での初回免疫による、ＰＢＭＣにおける特異的インターロイキン２（ＩＬ−２）誘導を例示する。
【図４】図４は、ＦＢＰペプチドＥ３９およびその改変体で刺激したＰＢＭＣの増殖を例示する。
【図５】図５は、ＦＢＰペプチドＥ３９の改変体で刺激したＰＢＭＣの増殖を実証する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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