(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表から裏へ貫通した複数の細孔を有する多孔質膜と、前記多孔質膜の表裏に夫々形成された電極と、前記多孔質膜の裏面に担持されたグルコース脱水素酵素と、大気に開放され前記グルコース脱水素酵素に大気の酸素を供給する酸素供給口と、前記多孔質膜の表面に検体を供給する検体供給部とから構成されたバイオセンサ。
【請求項２】
多孔質膜は、ポリカーボネートフィルムであり、そのポリカーボネートフィルムの表面から裏面へ直線的な複数の細孔を有する多孔質である請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
グルコース脱水素酵素は、補酵素としてニコチンアミドアデニシンジヌクレオチドを使っていることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はグルコース濃度を計測するバイオセンサに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース濃度の計測は医療分野のみならず、農業分野、醸造分野等、種々の領域で利用されている。特に、人尿におけるブドウ糖（以下グルコースと記載）濃度計測については以下に述べる特徴がある。
尿は個人の健康状態に関する重要な情報源であり、尿成分を定量分析することで各種の機能障害を検査することができる。このニーズに対応するための手段として、健康診断や医療機関で用いられている尿検査紙がある。尿検査紙は糖、たんぱく、ウロビリノーゲン、潜血などが尿中に排出されていることを化学反応により検知し、試験紙の色調の変化により示すものである。試験紙は簡便でだれにでも扱えるという長所があるが、定性的または半定量てきであるため定量分析という観点からは問題がある。
【０００３】
そこで、尿の特定成分を迅速かつ容易に定量するものとして酵素反応を電極反応と結びつけるバイオセンサによる計測が実施されている。
【０００４】
図３は従来のバイオセンサの構成と動作を説明する説明図である。検体供給口６から進入した尿は、干渉物質除去膜８を通って酵素層９に達する。酵素層９はグルコースオキシダーゼを有しており、尿中のグルコースをグルコン酸と過酸化水素に分解する。この過酸化水素は、更に水酸基イオンと水素イオンに分解される。この水素イオンは直流電圧を印加すると陽イオン交換膜１０を流れて、電荷の移動が起こるものである。この電流の大きさは、尿中に含まれるグルコースの量に応じたものとなっている。したがって、この電流の大きさから被験者の尿中のグルコース量が求められるものである。（化１）はこの反応を示している。
【０００５】
【化１】
0004517527.tif 000002
【０００６】
すなわち（化１）に示している過酸化水素の分解反応で生ずる電子が電極間を伝達され、電極間に電流が流れるものである。この電流が流れる回路中に抵抗を配置して、抵抗の両端の電圧を測定することによって流れた電流を測定し、この電流を特定物質の濃度に換算しているものである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記、従来のバイオセンサは、干渉物質除去膜を介して酸素が尿中に溶解するため、酸素の溶解速度が遅いため反応が律速され、ブドウ糖濃度５００mg/dlを超えた濃度が反応系に侵入すると、グルコース濃度とその出力値、電流をグルコース濃度に換算したもの、の比例関係が成立しないので、測定範囲がグルコース濃度５００mg/dlまでの計測にとどまること、さらに、酵素反応により発生した電極活物質、一般的に過酸化水素であることが多い、が電極の正極、および負極表面に付着して、電極活物質の分解物と電極が導通するのを妨げるため、連続測定ができないという課題を有している。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明のバイオセンサは、表と裏を貫通する細孔を有しイオンを移動させる多孔質膜と、前記多孔質膜の表裏に夫々形成された電極と、前記多孔質膜の裏面に担持されたグルコース脱水素酵素と、前記グルコース脱水素酵素に酸素を供給する酸素供給部と、前記多孔質膜の表面に検体を供給する検体供給部とから構成されており、酸素が大気から直接供給され、酵素反応に必要な酸素が飽和濃度供給されるため、反応が律速されず、高濃度の被検体も計測することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
第１の発明は、表から裏へ貫通した複数の細孔を有する多孔質膜と、前記多孔質膜の表裏に夫々形成された電極と、前記多孔質膜の裏面に担持されたグルコース脱水素酵素と、大気に開放され前記グルコース脱水素酵素に大気の酸素を供給する酸素供給口と、前記多孔質膜の表面に検体を供給する検体供給部とから構成されたバイオセンサとし、酵素と被分解物およびその分解に必要な酸素が飽和濃度供給され、高濃度の被分解物も計測できることができる。
【００１１】
第２の発明は、特に第１の発明の多孔質膜をポリカーボネートフィルムとし、そのポリカーボネートフィルムはその表面から裏面へ直線的な細孔を有する多孔質であるため、水素イオンが移動しやすいという利点がある。
【００１４】
第３の発明は、特に第１または第２の発明のグルコース脱水素酵素は、補酵素としてニコチンアミドアデニシンジヌクレオチドを使っていることを特徴とする。その補酵素は酸素を供給することにより、高濃度まで反応を持続することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明する。図１は本実施例のバイオセンサの構成を示す断面図である。本実施例のバイオセンサは、ベース３ａとベース３ｂの上に設けている負電極４ａ、４ｂと、負電極４ａ、４ｂと導通するように設けている電荷移動体２と、電荷移動体２の上に設けている正電極５、その上にベース３ｃ〜３ｄがある。電荷移動体２の上下は検体供給口６と酸素供給口７ならびに酵素１によって構成されている。
【００１７】
前記ベース３ａ〜３ｂは、構造を維持できる強度を備えているものであれば特に、材質についての制限は必要ないが、本実施例ではポリエチレンテレフタレートの成型品を使用している。また、最上層のベース３ｃとベース３ｄとの間は、適当な間隔を有したものとなっておりこの間隔は検体を採取する検体供給口６となっている。また、最下層のベース３ａとベース３ｂとの間は、適当な間隔を有したものとなっておりこの間隔は酸素を採取する酸素供給口７となっている。
【００１８】
前記負極４ａ、４ｂはベース３ａ〜３ｂ上に設けてあり、正極５ａ、５ｂは電荷移動体２上に設け、ベース３ｃ〜３ｄで押さえられている。また正極５ａ、５ｂは、負極４ａ、４ｂともにその一部は大気中に開放しているものである。
【００１９】
図２には電荷移動体２の模式図を示す。電荷移動体２はポリカーボネートフィルム２１によって構成している。ポリカーボネートフィルム２１は、極小径の孔を有する表から裏へダイレクトに孔が開いた構成となっており、その孔には導通を確保する材料と、絶縁を確保する材料が含浸されている。本実施例では、導通を確保する材料として、ポリアクリルアミド２２、絶縁材料として、パラフィン２３を含浸している。この膜は被験物であるグルコースの選択透過を行うとともにグルコース以外の巨大な固形成分、例えば、尿タンパク（アルブミンが主成分）などが除去される。また、この膜はすべての酸素を透過することができる。さらに、電荷移動体２は酵素１を保持する役割を有し、その位置は酸素供給口７にある。酵素はポリアクリルアミド２２が含浸された場所に、かつ酸素供給口７の全体に塗布されるのではなく、電荷移動体２上のグルコースと酵素１の反応面に直接、酸素が供給される構成になっている。
【００２０】
ここで、図２を得るに際しその製作法について述べる。絶縁部と導通部が混在したポリカーボネートフィルムを作成するに際し、まず、絶縁部を確保することから始めた。ポリアクリルアミドを含浸させる部位を前もってプレコートし絶縁材料が、ポリアクリルアミドを加工する部位に侵入することを防止した。水溶性の材料として可溶性でんぷんを用いた。この加工を行った後、絶縁材料にポリカーボネートフィルムを含浸した。この加工により、でんぷんが付着している部位を除き、細孔全体に絶縁材料が行き渡る。なお、絶縁性材料はパラフィンを使用した。精製水にて可溶性でんぷんを溶解すると、無加工のポリカーボネートフィルムが現れる。そこに４倍架橋したポリアクリルアミドを染みこませ、４５℃で加熱重合し、電荷移動体を得た。
【００２１】
酵素１として本実施例ではグルコースオキシダーゼを使用しており、本実施例では電荷移動体２に直接吸着させて設けている。従って、電荷移動体２のフリーの炭素原子と酵素１の炭素原子とは、直接結合されている、あるいは、酵素分子を介する結合がなされている。このため、電荷移動体２の表面に吸着した酵素１は、決して層構造を取らず、ポーラスな構造をなしているものである。
【００２２】
本実施例の動作について図１、図２をもとに説明する。検体には何千もの化学物質が含まれている。本実施例のバイオセンサはその中から、人体の健康情報を示す指標の一つである糖分の含有量を計測するものである。糖分はグルコースで代表して計測している。
【００２３】
負電極４ａ、４ｂと正電極５ａ、５ｂ間に、図示していない直流電源から１Ｖ以下程度の直流電圧を印加した状態で、検体を検体供給口６に供給する。検体供給口６に供給された検体は、電荷移動体２に進入する。図２に示したように、電荷移動体２は、表から裏へのストレート状の微小な孔の連続体となった多孔質膜である。この孔を絶縁体として、パラフィン２３が、導電体としてポリアクリルアミド２２が含浸している。ポリアクリルアミドが含浸された孔は分子篩効果があり、グルコース以外の大きな固形成分、分子量にして２万以上のもの、例えば、タンパク、アルブミンが主成分、などは除去され、孔を通してグルコースが反応系にまた、電荷移動体２全体では、フィルム全面から、さらに酸素が通過できる。従って、電荷移動体２に進入できる成分は比較的低分子のものと酸素に限定されるものである。
【００２４】
また、電極をろ過する前の検体と接することにより、検体の陰イオン性物質のみならず、酵素反応により生成される酸素等の副生成物も正極方向へ誘導し、検体供給口６を介して簡単に大気中へ放出することができる。
【００２５】
また、電荷移動体２の下部に酵素１を配置している。酵素１は、グルコースのみと選択的に反応し、他の成分と反応することはない。
【００２６】
こうして、グルコースは、酵素１によって分解される。このとき本実施例では前記したように、酵素１としてグルコースオキシダーゼを使用している。グルコースオキシダーゼは従来例の（化１）で説明したように、検体中のグルコースをグルコン酸と過酸化水素に分解する、この過酸化水素は、更に水酸基イオンと水素イオンに分解される。この水素イオンは、負電極４と正電極５間に直流電圧を印加すると電荷移動体２を流れて、負電極４と正電極５の間を流れるものである。
【００２７】
すなわち、発生した水素イオンが、電荷移動体２中に伝達され、水素イオンと交換され、水素イオンが負電極４の方に誘導される。こうして、正電極５と負電極４との間に電流が流れるものである。
【００２８】
この電流が流れる回路中に抵抗を配置して、抵抗の両端の電圧を測定することによって流れた電流を測定して、この電流値をグルコース濃度に換算しているものである。この電流の大きさは、検体中に含まれるグルコースの量に応じたものとなっている。従って、この電流の大きさから検体のグルコース濃度が求められる。
【００２９】
なおこのとき、負電極４と正電極５との間に印加する直流電圧は、前記したように１Ｖ程度以下がこのましいものである。この理由は印加する直流電圧が大きくなると、尿中の水が電気分解されることによって流れる電流がグルコースの量に応じたものとはならないためである。
【００３０】
また、本実施例では、正電極５を検体と直接接触する位置に設けているものである。このため、前記反応の結果生じた正電極５の近傍に付着した泡が簡単に大気中に放出されるものである。泡が電極に付着した状態で、電荷の伝達能力が低下することはなく、従って、検体の糖分の含有量を連続的に測定することが可能になる。
【００３１】
また本実施例によれば、酵素１は検体供給口６と直接接触することがなく、電荷移動体２と酸素供給口７に面した部位に塗布されており徐放性が確保されているため、内部に浸透した検体成分は大気中に放散されるものである。このため本実施例のバイオセンサは、１回使用するごとに使い捨てる必要はなくなり繰り返し使うことができるものである。
【００３２】
さらに、電荷移動体２は負極４および正極５と密着すると、検体が電荷移動体と電極により構成されているところの空隙に溜まることがなくなり、導通が確保されるとともにに検体の全量が電荷移動体内に侵入し、反応に供される。
【００３３】
次に、本発明の他方の酵素、グルコース脱水素酵素を用いた場合の反応について述べる。
【００３４】
【化２】
0004517527.tif 000003
【００３５】
グルコース脱水素酵素によるブドウ糖の分解はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）補酵素の酸化、還元により反応が進む。
【００３６】
ブドウ糖（グルコース）が酵素、グルコースオキシダーゼにより分解され、グルコン酸と副生成物として、過酸化水素に分解される。この過酸化水素が水酸基イオンと水素イオンに分解される。水素イオンが電子伝達体となり、電荷移動体２に含浸されたポリアクリルアミド部を泳動され、電極の負極のほうに誘導される。そのときに、電流が流れるしくみである。電子伝達体が泳動可能なフリーの陰イオンを持った電解質をゲル状にしたものであれば、ポリアクリルアミドでなくても電子伝達が行われ、電流が流れるしくみとなっている。グルコースデヒドロゲナーゼを利用した反応においても、水素イオンが生成され、上述のようなメカニズムをへて導通が確保される。
【００３７】
ポリアクリルアミドの重合と電流の流れ方およびその耐久性について記載する。基本的にポリアクリルアミドの重合と電流の流れ方には相関はない。これは１倍架橋のもので水素イオンの伝達に必要なイオンが多寡状態であるため、その相関は得られないほど、多くイオンが存在している。重合の割合が大きいほど、分子篩の編み目が小さくなり、透過できる分子の大きさが小さくなる。
【００３８】
（表１）に本実施例と従来例の特性について示した。従来例は図３に記載された構成のバイオセンサを用いた。計測はグルコースを溶解した人工尿を用いた。連続測定回数計測は自動計測器を用い、上記人工尿にグルコース濃度０、２０００、７５０、１５００、１００、２５００mg/dlとし、この順で連続的に計測するサイクルを廻し、そのサイクル数から計測回数を求めた。
【００３９】
【表１】
0004517527.tif 000004
【００４０】
（表１）は、計測範囲が本実施例と従来例の発明について大きく異なることを示す。これは酵素とグルコースが反応する反応系が従来例は液層と固層であるが、本発明は液層、気層および固層の３層界面となり、酵素反応に不可欠の酸素が充分供給されることによる。健康な人を対象としたバイオセンサではグルコース濃度５００mg/dlまで計測できれば、その変化から体調管理をするには十分な計測範囲である。一方、糖尿病患者の尿から排泄されるグルコース濃度を計測するには、十分な計測範囲であるとはいえない。糖尿病患者尿からグルコース濃度を計測するには２０００mg/dlまで計測する能力が求められる。本発明はこのニーズを充分満足するものである。
【００４１】
【表２】
0004517527.tif 000005
【００４２】
（表１）の条件で得られた電流値を（表２）に示した。グルコース濃度２５００mg/dlまで直線性、かつ正比例の関係が得られた。実施例には示さないが、酵素１をグルコースデヒドロゲナーゼにしたものについても、同様に２５００mg/dlまで直線性かつ正比例の関係および２４０回の繰り返し計測ができた。
【００４３】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、酵素と被分解物およびその分解に必要な酸素が飽和濃度供給され、酵素の定量精度を増加した高濃度測定が可能なセンサのしくみを提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例におけるバイオセンサの構成図
【図２】電荷移動体における絶縁部と導通部の構成を示す模式図
【図３】従来のバイオセンサの構成図
【符号の説明】
１  酵素
２  電荷移動体
２１  ポリカーボネートフィルム
２２  ポリアクリルアミド
２３  パラフィン
３ａ〜３ｄ  ベース
４ａ〜４ｂ  負極
５ａ〜５ｂ  正極
６  検体供給口
７  酸素供給口
８  干渉物質除去膜
９  酵素層
１０  陽イオン交換膜
１１  電極
【図１】
0004517527.tif 000006
【図２】
0004517527.tif 000007
【図３】
0004517527.tif 000008