(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列セクションを有する核酸分子に標識を付けるための染料標識オリゴヌクレオチドであって、前記染料標識オリゴヌクレオチドには、次のような成分、
ａ）前記標的配列に対して本質的には相補的なループ配列を有するループ・セクションと、
ｂ）３個以上のヌクレオシドを持ち、前記ループ・セクションの一つの端部に配置された第１ステム・セクションであって、前記第１ステム・セクションの塩基配列内にグアノシンを含まない第１ステム・セクションと、
ｃ）３個以上のヌクレオシドを持ち、前記ループ・セクションのその他の端部に配置された、前記第１ステム・セクションと互いにハイブリッドを形成できるステム・セクションを有する第２ステム・セクションと、
ｄ）前記第１ステム・セクションの一つの位置に結合された発蛍光団と、が含まれ、
ｅ）前記第２ステム・セクションには、グアノシンまたは７−デアザグアノシンまたは７−デアザアデノシンである一つ以上の消光剤ヌクレオシドがあり、
ｆ）消光剤ヌクレオシドの位置は、２つのステム・セクションのハイブリッド形成状態において前記発蛍光団の結合部位から４塩基対以下離れ、
ｇ）前記第１と第２のステム・セクションの配列と、前記ループ・セクションの配列と、前記発蛍光団の位置および種類は、互いに関連して適切に選択されるので、
ｇ１）前記発蛍光団の２つのステム・セクションのハイブリッド形成状態において消光剤ヌクレオシドが蛍光を消光するのに十分空間的に接近し、そして
ｇ２）前記ループ・セクションが標的配列セクションとハイブリッドを形成中および前記ステム・セクションのハイブリッド形成を解体中に前記発蛍光団の蛍光の消光が起きない染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、
前記ループ・セクションが前記核酸分子の前記標的配列セクションとハイブリッドを形成する場合には、前記第１ステム・セクションが前記核酸分子のセクションともハイブリッドを形成するように、前記第１ステム・セクションが選択される染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２記載の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、
前記第１ステム・セクションが前記ループ・セクションの５’端部に配置され、
前記発蛍光団が前記第１ステム・セクションの末端ヌクレオシドに末端基として結合される染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２記載の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、
前記第１ステム・セクションが前記ループ・セクションの３’端部に配置され、
前記発蛍光団が前記第１ステム・セクションの末端ヌクレオシドに末端基として結合され、
前記第２ステム・セクションの５’端部が固定する機能を持つ染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４記載の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、
前記第２ステム・セクションの５’端部がアクリルアミド分子と反応する機能を持つ染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、
前記ループ・セクションには８〜５０個のヌクレオシドが含まれる染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、
前記第１ステム・セクションには８個以下のヌクレオシドが含まれる染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、
前記発蛍光団にはローダミンまたはフェノキサジン染料分子がある染料標識オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
標的配列セクションを有する核酸分子を溶液中で検出する方法であって、
請求項１〜８のいずれか記載の染料標識オリゴヌクレオチドが前記核酸分子とハイブリッドを形成し、
ハイブリッド形成後で且つ検出信号を記録する前に、前記溶液のｐＨを２〜４の間の値に調節する方法。
【請求項１０】
標的配列セクションを有する核酸分子を溶液中で検出する方法であって、
請求項１〜８のいずれか記載の染料標識オリゴヌクレオチドが前記核酸分子とハイブリッドを形成し、
その後、前記発蛍光団の蛍光を励起し、次いで前記発蛍光団の蛍光減衰挙動を記録できるように検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的配列セクションを有する核酸分子に標識を付けるための染料標識オリゴヌクレオチドに関し、前記染料標識オリゴヌクレオチドには次のような成分が含まれている。すなわち、前記標的配列に対して本質的には相補的なループ配列を有するループ・セクションと、３個以上のヌクレオシドを持ち、このループ・セクションの一つの端部に配置された第１ステム・セクションと、３個以上のヌクレオシドを持ち、このループ・セクションのその他の端部に配置された第２ステム・セクションと分子内でハイブリッドを形成できる２つのステム・セクションと、および前記第１ステム・セクションの一つの位置に結合された発蛍光団が含まれている。
【０００２】
本発明は、さらに、標的配列セクションを有する核酸分子に溶液中で標識を付け、且つ標的配列セクションを有する核酸分子を溶液中で検出する２つの方法に関わる染料標識オリゴヌクレオチドの用途に関する。
【０００３】
【背景技術】
最初に述べた染料標識オリゴヌクレオチドは、”核酸プローブ”と呼ばれることが多い。これらは、分子生物学とバイオテクノロジーにおいて生物学的試料における特異的に知られた核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の迅速且つ感度のよい検出において中心的役割を果たす。特異的用途には、細菌やウイルス感染の医学的早期発見、法医学、ＰＣＲまたはその他の技法によるＤＮＡ／ＲＮＡの拡大遺伝子欠陥の早期診断および類似の生物やアレルの間の識別がある。
【０００４】
核酸を検出し且つ核酸を定量する種々の方法が知られている。偏在性サザン・ブロッティング法は時間がかかり、感度も低い。
【０００５】
特異的核酸分子を検出する比較的新しい洗練された方法は、”分子ビーコン”を用いている（Ｔｙａｇｉ他，１９９６年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，３０３〜３０８およびＫｏｓｔｒｉｋｉｓ他，１９９８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，１２２８〜１２２９）。分子ビーコンは染料標識オリゴヌクレオチドであり、これらには最初に述べたステム−ループ構造がある。発蛍光団が、ステム・セクションの２つの自由端部（３’および５’端部）の各々に結合している。一つの発蛍光団は蛍光染料として役立ち、もう一方は、空間的に十分近接している場合に、フェルスター・エネルギー移動を介して蛍光染料の蛍光を消光する消光染料として役立つ。
【０００６】
分子ビーコンの両端部におけるステム・セクションの配列は、分子ビーコンが折り重なる場合、ステム・セクションはオリゴヌクレオチドのその他のセクションとではなく、互いにのみハイブリッドを形成するように選ばれる。ハイブリッドを形成したステム・セクションの状態では、蛍光染料と消光染料の間の間隔は十分短いので、蛍光染料は適切に光励起された場合でも蛍光を発しない。
【０００７】
ループ・セクションには、標的配列セクションの配列に対して相補的な配列がある。分子ビーコンと標的配列を有するＤＮＡ／ＲＮＡの両分子が共に溶液中にある場合は、ループ・セクションと標的配列セクションがハイブリッドを形成することができる。ステム・セクションとループ・セクションの配列と長さは、分子ビーコンが（重なり）を開き２つのステム・セクションのハイブリッドの形成が解体されるように選択される。前記（重なり）の開きにより、蛍光染料と消光染料の間の空間的間隔は非常に大きくなる。そこで、蛍光染料は励起して蛍光を発する。
【０００８】
蛍光染料の蛍光強度を連続的に観察していると、分子ビーコンが核酸分子の標的配列セクションを検出しそれらとハイブリッドを形成する場合、増加を検出することができる。このようにして、核酸分子を定量的に検出することができる。
【０００９】
この種の分子ビーコンの欠点は、５’と３’端部にある蛍光染料と消光染料の両方を用いてオリゴヌクレオチドを特異的に標識付けしなければならないので、合成が比較的複雑なことである。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、染料標識オリゴヌクレオチドを用いて核酸分子の検出を改良することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によると、本発明の目的は、請求項１記載の構成要素を有する染料標識オリゴヌクレオチド、請求項１０記載の染料標識オリゴヌクレオチドの使用、および請求項１１または１２記載の構成要素を有する方法により達成することができる。
【００１２】
本発明は、種々の発蛍光団の蛍光は光誘起電子移動を介したヌクレオシドにより消光することができるという発見に基づいている（Ｓａｕｅｒ他，１９９５年，Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．５，２４７〜２６１およびＳｅｉｄｅｌ他，１９９６年，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００，５５４１〜５５５３）。光誘起電子移動による蛍光の消光の効率は、発蛍光団とヌクレオシドの間の間隔に強く左右され、すなわち、顕著な蛍光の消光は発蛍光団と適切なヌクレオシド（シングルまたはダブル・ストランドにおいて）の間の間隔が短い場合にのみ起きる。たとえば、発蛍光団の結合部位から４塩基以上離れているグアノシンでは、発蛍光団が非常に短いスペーサを介してのみ対応するヌクレオシドに結合している限り前記発蛍光団の蛍光能力には目立った影響はないことが判明している。これは、グアノシンが発蛍光団と同じストランドにある場合も、反対側のストランドにある場合も言えることである。
【００１３】
本発明の染料標識オリゴヌクレオチドにおいて、第２のステム・セクションには、前記発蛍光団に対して空間的に十分近接している場合光誘起電子移動により発蛍光団の蛍光を消光する少なくとも一つの消光剤ヌクレオシドがある。第１ステム・セクションの配列および発蛍光団の位置は、２つのステム・セクションのハイブリッド形成状態において発蛍光団および消光剤ヌクレオシドが蛍光の消光について空間的に十分接近し、且つ標的配列セクションとのループ・セクションのハイブリッド形成の間に発蛍光団の消光が起きず且つステム・セクションのハイブリッド形成の解体が起きないように選択される。
【００１４】
この種の染料標識オリゴヌクレオチド（またはこの種の核酸プローブ）には、多数の利点がある。簡単な合成を得るには、ただ一つの発蛍光団が必要である。光誘起電子移動による蛍光の消光のメカニズムは、よく理解されているので、蛍光の消光を特異的に最適化することも可能である。
【００１５】
ヌクレオシドと発蛍光団は、効率的な消光について互いに適合しなければならない。自然に由来するヌクレオシドの中で、ローダミン染料の消光についてはグアノシンが最も有効である。消光効率は、ヌクレオシド消光剤として７−デアザグアノシンを用いることにより大きくすることができる。両方の場合に、第２ステム・セクションの他のすべてのヌクレオシドは、グアノシン類であることが可能である。したがって、第１ステム・セクションのヌクレオシド類としてシチジン類を選ぶことができる。
【００１６】
第１ステム・セクションの配列は、この第１ステム・セクションが、標的配列セクションに隣接している核酸分子のセクションとハイブリッドを形成できないように選択できる。さもないと、第１ステム・セクションの発蛍光団は消光剤として作用するグアノシンに接近する。
【００１７】
消光剤として使用できるもう一つのヌクレオシドは、７−デアザアデノシンである。消光剤として７−デアザアデノシンを用いると、未修飾グアノシンと比較して発蛍光団に対する消光効果を顕著に上げることができる。消光剤ヌクレオシドとして７−デアザアデノシンを用いると、発蛍光団はチミジン（ＤＮＡ分子の場合）またはウリジン（ＲＮＡ分子の場合）に有利に結合させることができる。これら２つのステム・セクションがハイブリッドを形成すると、これらのヌクレオシド類は７−デアザアデノシンと塩基対を形成する。
【００１８】
第２ステム・セクションについて消光剤ヌクレオシドとして７−デアザアデノシンを用い且つ発蛍光団がチミジンまたはウリジンに結合すると、第１ステム・セクションが核酸分子のセクションとハイブリッドを形成すると、発蛍光団はダブル・ストランドにおいて天然の未修飾アデノシンと対面する。これは発蛍光団の蛍光を残し、本質的には影響を受けない。したがって、標的配列セクションに隣接している核酸分子のセクションとの第１ステム・セクションのハイブリッド形成は、第１ステム・セクションおよび標的配列セクションの配列と同じ長さにすることができ且つ発蛍光団に近接したグアノシンがないように選択できる。核酸分子のセクションへの第１ステム・セクションのハイブリッド形成は、発蛍光団を明確に定義された環境に置き、その結果、溶液中のその他の核酸分子との制御不能なハイブリッド形成を回避する。
【００１９】
グアノシン，７−デアザグアノシンおよび７−デアザアデノシンは、第２ステム・セクションにおいて混合して使用することもできる。
【００２０】
第１ステム・セクションがループ・セクションの５’端部に配置され、且つ発蛍光団が末端ヌクレオシドに対して末端基として結合すると、染料標識オリゴヌクレオチドがとくに簡単に合成される。
【００２１】
第１ステム・セクションがループ・セクションの３’端部に配置され、且つ発蛍光団が第１ステム・セクションの末端ヌクレオシドに対して末端基として結合し、さらに、第２ステム・セクションの５’端部が固定のために機能すると、別の利点が生じる可能性がある。このようにして、核酸プローブを、たとえば、ＤＮＡチップに固定することができる。後者は、蛍光信号を介してハイブリッド形成を示すことができる。
【００２２】
第２ステム・セクションの５’端部は、アクリルアミド分子と反応する機能がある。このようにして機能化された核酸プローブは、ポリアクリルアミド・ゲルの調製中に共重合により固定することができる。これは、板状ゲルや毛細管の中などの特殊な場所で起きる。様々な配列を有する核酸分子が含まれている、調査対象の試料は、次いで、非変性条件下でゲル中で分別する。標的配列セクションを有する核酸分子の存在は、ゲル中の固定化された核酸プローブの位置における対応する信号により表示される。次いで、標的配列セクションを有する核酸分子は、たとえば、板状ゲルからの切除により、特異的に単離されうる。
【００２３】
ループ・セクションは、標的配列セクションとのハイブリッド形成が起きた場合に、２つのステム・セクションのハイブリッド形成を解体することができるように十分長くなければならない。一方、標的配列セクションがはっきりと識別されるためには単に十分長ければよい。したがって、ループ・セクションには、８〜５０個のヌクレオシドが含まれるのが好ましい。
【００２４】
これら２つのステム・セクションの最小限の長さは、信頼できるハイブリッド形成がなれるような長さであればよい。しかしながら、一方では、これら２つのステム・セクションのハイブリッド形成は標的配列セクションとのループ・セクションのハイブリッド形成の場合には解体される必要がある。ハイブリッドを形成する強度は、これら２つのステム・セクションの長さによる影響を受ける。有利なことに、第１ステム・セクションには、したがって、３〜８個のヌクレオシドが含まれ、第２のステム・セクションには第１ステム・セクションと少なくとも同じ程度の数のヌクレオシドが含まれている。
【００２５】
適切な発蛍光団は、原理的には、すべての既知の染料分子であるが、とくにローダミンまたはフェノキサジン染料である。後者は容易に結合させることができ、且つ光安定性である。ローダミンまたはフェノキサジン染料を用いるもう一つの利点は、蛍光検出用励起光源として小さく且つ安価なダイオード・レーザを使用できることである。
【００２６】
本発明の染料標識オリゴヌクレオチドは、染料標識オリゴヌクレオチドを核酸分子とのハイブリッド形成に用いて、標的配列セクションを有する核酸分子に溶液中で標識を付ける場合に有利に使用することができる。
【００２７】
その上、本発明の染料標識オリゴヌクレオチドは、溶液中で、標的配列セクションを有する核酸分子を検出する場合に、とくに、適している。このために、核酸分子は、本発明の染料標識オリゴヌクレオチドを用いて標識を付ける。プローブや核酸分子のダブル・ストランドは、安定化され、且つ消光剤と発蛍光団の間の消光効率は、溶液のｐＨをハイブリッド形成後および検出信号を記録する前に２〜４の値に調節して改良される。測定結果に影響を及ぼす、たとえば、溶液の不均一性による、強度の変動を避けるために、それらの蛍光減衰挙動が記録されるように発蛍光団の蛍光を励起し且つ検出することができる。
【００２８】
本発明の有利な発展は従属の請求項において具体的に述べられる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本発明は、代表的な実施の形態に基づいて以下でより詳細に説明される。これらの実施の形態は、図面において図を用いて説明されている。個々の図の同一の参照番号は同じ要素を表している。
【００３０】
図中において、文字Ａ，Ｃ，ＧおよびＴは、それぞれ、ヌクレオシドであるアデノシン，シチジン，グアノシンおよびチミジンを表している。
【００３１】
光誘起電子移動は、図７に基づいて以下に簡単に説明している。図７では、励起染料分子Ｆ* のヌクレオシドＮによる蛍光の消光が描かれている。黒い円は電子を表す。各々の場合、ＨＯＭＯ（最高被占分子軌道）およびＬＵＭＯ（最低非被占分子軌道）が描かれている。ＨＯＭＯは電子基底状態における最高エネルギー・レベルに関する被占分子軌道である。ＬＵＭＯは電子基底状態における最低エネルギー・レベルに関する非被占分子軌道であり、通常は、第１励起状態において被占される分子軌道である。
【００３２】
光誘起電子移動による蛍光の消光については、原理的に２つの可能性がある。図７の左の図では、ヌクレオシドＮは電子供与体として作用する。発蛍光団Ｆ* の励起後、電子はヌクレオシドの二個の電子で占有されたＨＯＭＯから一つに占有された発蛍光団Ｆ* （１）のＨＯＭＯに移動する。その結果、励起された発蛍光団Ｆ* はヌクレオシドＮにより還元される。発蛍光団のＬＵＭＯにある電子は、次いで、ヌクレオシドＮ（２）の一つの電子が占有したＨＯＭＯに移される。グアノシンとローダミン分子の間の相互作用が、このケースに相当する。
【００３３】
図７の右の図の場合、ヌクレオシドＮは電子受容体として作用する。励起された発蛍光団Ｆ* の一つの電子が占有したＬＵＭＯに存在する電子は、ヌクレオシドＮ（３）の非占有ＬＵＭＯに移動する。その結果、励起された発蛍光団Ｆ* はヌクレオシドＮにより酸化される。このヌクレオシドのＬＵＭＯの電子は、次いで、発蛍光団（４）のＨＯＭＯに戻すことができる。
【００３４】
両方の場合、電子移動後、もはや電子は励起された発蛍光団Ｆ* のＬＵＭＯから光子を放射してＨＯＭＯに戻ることはできない。第１励起状態は放射性エミッションなしに失活し、この蛍光は消光された。
【００３５】
図１には、オリゴヌクレオチド１０が示され、その一端部には、発蛍光団１２が結合している。オリゴヌクレオチド１０は、第１ステム・セクション１４，第２ステム・セクション１６およびループ・セクション１８からなっている。第１ステム・セクション１４の配列は、６個のヌクレオシドからなり、これらはすべてシチジンである。第２ステム・セクション１６の配列は、６個以上のグアノシンから構成されている。これにより、第１ステム・セクション１４と第２ステム・セクション１６が互いにハイブリッドを形成して、オリゴヌクレオチド１０をステム−ループ構造の中に折り重ねることができるようになる。第２ステム・セクションの長さは重要ではなく、少なくとも第１ステム・セクションのヌクレオシドの数と同じ程度の長さがあればよい。
【００３６】
以下、図２について説明する。ループ・セクション１８の配列は、オリゴヌクレオチド１０が特異的核酸分子２０のプローブとして役立つように選択することができる。通常、ループ配列は、核酸分子２０の標的セクションの配列に対して相補的である。オリゴヌクレオチド１０と核酸分子２０が共に溶液に導入されるとループ・セクション１８は核酸分子２０の標的配列セクションに対してハイブリッドを形成する。その結果、２つのステム・セクション１４，１６の間のハイブリッド形成は解体される。結果として、発蛍光団１２と第２ステム・セクション１６のグアノシンの間の間隔が拡大する。後者はもはや発蛍光団１２に対する蛍光消光剤として作用せず、したがって、その蛍光は観察できる。したがって、発蛍光団１２の蛍光の増加により、核酸分子２０の存在について定性的にも且つ定量的にも述べることができる。
【００３７】
この実施の形態では、核酸分子２０に関する標的配列セクションは、ループ・セクション１８のハイブリッド形成中に、第１ステム・セクション１４が核酸分子２０とハイブリッドを形成しないように選択できる。原理的には、これは核酸分子２０のこのセクションにおけるあらゆるグアノシンへの接近を回避する。しかし、図２には、たとえば、第２ステム・セクション１６は部分的に核酸分子に対してハイブリッドを形成できることが示されている。
【００３８】
次に図３について説明する。図３には、染料標識オリゴヌクレオチド１０の第２の実施の形態が示されている。このオリゴヌクレオチドは図１のオリゴヌクレオチドと本質的には同一である。しかし、図３のオリゴヌクレオチドには、第１ステム・セクション１４に、端部からカウントして第５のヌクレオシドとしてチミジンがある。第２ステム・セクションには、やはり端部からカウントして第９のヌクレオシドとしてアデノシンがある。ハイブリッドを形成したダブル・ストランドにおいて、前記アデノシンとチミジンは塩基対を形成する。したがって、シチジンとグアノシンが互いに向かってジグザグな位置でハイブリッドを形成することはできない。その結果、これにより一端部には発蛍光団の消光を促進するグアノシンの張り出しがあることが保証される。
【００３９】
図４には、図３に示すように、核酸分子２０にハイブリッドを形成しているオリゴヌクレオチド１０が図示され、この核酸分子にはその配列がループ配列に対して相補的な標的配列セクションがある。
【００４０】
次に図５について説明する。図５には、第１ステム・セクション２４と第２ステム・セクション２６を有する染料標識オリゴヌクレオチド２２の第２の実施の形態が示されている。第２ステム・セクション２６には、正確に６個のヌクレオシドがあり、その内末端ヌクレオシドは修飾アデノシン、すなわち、７−デアザアデノシンであり、これは図５と６ではＡ’で示されている。したがって、２つのステム・セクション２４，２６のハイブリッド形成状態において７−デアザアデノシンの反対側に位置している第１ステム・セクション２４の部位は、発蛍光団１２が結合するチミジンにより占められている。
【００４１】
図６には、図２に示す核酸分子２０が示され、この分子にはプローブとして役立つ図５に示す染料標識オリゴヌクレオチド２２がハイブリッドを形成している。図２と６は、ステム・セクション１４，１６および２４，２６がそれぞれ異なる配列を有することのみに違いがある。図５と６において、第１ステム・セクション２４には、前記第１ステム・セクション２４が、標的配列セクションに隣接している核酸分子２０のセクションとハイブリッドを形成できるようにする配列がある。
【００４２】
標的配列セクションとオリゴヌクレオチド２２の対応する配列は、次のようにして決めることができる。
ａ）核酸分子２０はアデノシンについて選別する。アデノシンについては、シチジンもグアノシンも各ケースにおいて４つのヌクレオシドが前記アデノシンの左と右に隣接していない。
ｂ）前記アデノシンの拡大された近隣区域、たとえば、核酸分子２０の５’方向において９個以上のヌクレオチドについて、核酸分子２０の特性をはっきりと表す配列についてサーチする。
ｃ）オリゴヌクレオチド配列２２が前記配列に対して相補的に形成される。この関係で、オリゴヌクレオチド配列の５’端部について第１の３〜６個のヌクレオシドが第１ステム・セクション２４を形成する。
ｄ）第２ステム・セクション２６は次のようにして得られる。すなわち、オリゴヌクレオチド配列の３’端部に
ｄａ）分子内で第１ステム配列に対してのみ相補的な３〜６個のヌクレオシドが含まれているか否か
ｄｂ）３’末端ヌクレオシドがアデノシンであるか否かをチェックする。
【００４３】
そのケースであれば、これら６個のヌクレオシドが第２ステム・セクション２６を形成する。
【００４４】
そのケースでなければ、オリゴヌクレオチド配列は、その結果が、第１のステム配列に対してのみ分子内で相補的であり且つ３’末端アデノシンを持つ３〜６個のヌクレオシドであるように３〜６個のヌクレオシドの分だけ延長される。（たとえば、第１ステム・セクションの配列が標的配列内で繰り返されるので、これが不可能であれば、ステップａ）に従って別のアデノシンについてサーチしなければならない。）
【００４５】
オリゴヌクレオチドの合成では、７−デアザアデノシンは３’末端アデノシンを置換する。
【００４６】
（ステップｂ）における９個というヌクレオシドの最小数は、２つのステム・セクション２４，２６の３個のヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドの折り重ねセクションの４個以上のヌクレオシドからなるオリゴヌクレオチド配列の最小長さから生じる。）
【００４７】
この例は、ループ・セクションとステム・セクションはオーバーラップすることもでき、且つ染料標識オリゴヌクレオチド２２も核酸分子２０に対して完全にハイブリッドを形成できることも示している。
【００４８】
原理的には、染料はオリゴヌクレオチドの３’端部および５’端部の両方に結合することができる。このために、以下の可能性を利用できる。
（ａ）たとえば、Ｃ６−アミノ結合基によるアミン官能基を用いたオリゴヌクレオチドの一つの端部の周知の修飾とそれに続く活性化されたカルボキシル基を介した修飾端部への染料の結合。
（ｂ）オリゴヌクレオチドの合成中、たとえば、合成器におけるアミノ修飾ヌクレオシドの合成への組み込み、およびそれに続く活性化されたカルボキシル基を介したアミノ修飾ヌクレオチドへの染料の結合。
（Ｃ）オリゴヌクレオチド合成中のホスホールアミダイトとして染料の合成的組み込み。
【００４９】
消光効率を最適化するために、まず、ハイブリッド形成により形成されたダブル・ストランドはできるだけ安定していなければならない。これは、適当な塩濃度に調節することにより周知の方法で達成される。しかしながら、第２に、たとえば、フリーのカルボキシル基を有するローダミン染料、たとえば、テトラメチルローダミンを用いる場合は、ｐＨが消光効率に劇的な影響がある。フリーなカルボキシル基を酸性媒体中でプロトン化すると、ヌクレオチドのホスフェート基と染料の間の反撥が低減する。この反撥の低減により、ヌクレオチドまたはヌクレオシドと染料の間の間隔が短くなり、したがって、蛍光の消光を強化する。適切な染料を用いると、検出信号を記録する前のｐＨを約３に調節することができる。
【００５０】
核酸分子は、好適には時間相関性の光子計数（Ｄ．Ｖ．Ｏ’ＣｏｎｎｏｒおよびＤ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，「時間相関性の光子計数」（”Ｔｉｍｅ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ”），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８４年）を用いて、発蛍光団の蛍光を検出することにより検出される。特別に高い感度は別にしても、この分光学的技法には、この方法を用いると発蛍光団１２の蛍光の減衰を観察できるという利点がある。この方法は、単純な強度測定よりも発蛍光団１２、したがって、核酸分子２０の蛍光を検出する信頼性の高い基準であることが証明された。たとえば、溶液の不均一による強度の変動は、したがって、測定結果に影響はなかった。
【００５１】
本発明の範囲内で、説明した実施の形態の多数の修飾と発展を実現することができる。たとえば、発蛍光団１２は、ハイブリッドを形成した状態にある消光剤ヌクレオシドの反対側にある特別なヌクレオシドに直接結合させる必要はない。最初に述べたヌクレオシドに対する間隔は、消光剤ヌクレオシドによる蛍光の消光を役立つ程度に十分小さく生じさせる必要があるだけである。同様に、ループ・セクション１８とステム・セクション１４，１６，２４，２６は、互いに隣接させる必要はないが、その他の短い配列セクションにより互いに分離すればよい。標的セクションの配列、および、したがって、ループ・セクション１８の相補的配列は、原理的には、どのような配列でもよい。その上、核酸分子２０は標的配列セクションのみからなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ステム・セクションが互いにハイブリッドを形成する染料標識オリゴヌクレオチドを示している。
【図２】  ループ・セクションが核酸分子に対してハイブリッドを形成する図１に示す染料標識オリゴヌクレオチドを示している。
【図３】  ステム・セクションが互いにハイブリッドを形成する染料標識オリゴヌクレオチドの第２の実施の形態を示している。
【図４】  ループ・セクションが核酸分子に対してハイブリッドを形成する図３に示す染料標識オリゴヌクレオチドを示している。
【図５】  ステム・セクションが互いにハイブリッドを形成する染料標識オリゴヌクレオチドの第３の実施の形態を示している。
【図６】  ループ・セクションが核酸分子に対してハイブリッドを形成する図５に示す染料標識オリゴヌクレオチドを示している。
【図７】  光誘起電子移動の状態変化の可能性を描写した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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