(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパーオキシドジスムターゼを含有するメロンの有効タンパク抽出物を含んでなる、アレルギーの予防または治療のための医薬組成物であって、該抽出物が脂肪性物質を基にした脂溶剤中でマイクロカプセル化されている、医薬組成物。
【請求項２】
上記抽出物が粉末形態のものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
メロンが細胞系統９５ＬＳ４４４または９５ＬＳ４４４に由来する雑種系統の後代である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
脂溶剤の融点が４０〜８０℃である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
脂溶剤の融点が５５〜６０℃である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
脂溶剤が硬化油；パーム油またはヤシの実の核から得られる油；水素化種子；ステアレート、特にステアリン、ステアリン酸およびその誘導体から選択されるもの；ワックス；脂肪酸モノジグリセリド；飽和Ｃ１４−Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドならびにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
脂溶剤が植物油を基にした硬化油である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
硬化油が硬化ココヤシ油、硬化パーム油、硬化ダイズ油、または硬化ナタネ油からなる群から選択されるものである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
脂溶剤が硬化パーム油である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
植物抽出物が組成物の全重量に対して２０〜５０重量％の濃度で存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の組成物とヒトまたは動物投与に向けた局所用に適当な賦形剤とを含んでなる、局所用途のための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載の組成物とヒトまたは動物投与に向けた経口用に適当な賦形剤とを含んでなる、経口用途のための医薬組成物。
【請求項１３】
さらに、ヨーグルトおよび／または繊維を含んでなる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヨーグルトおよび／または繊維を、請求項１〜１０に記載の組成物と均一な混合物を形成するように含んでなる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
アレルギーの治療もしくは予防、またはアレルギーからの皮膚の保護を意図した薬剤としての請求項１〜１０、１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
薬剤が局所用である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ローション、フォーム、ゲル、分散系、スプレー、シャンプー、漿液、マスク、ボディミルクまたはクリームの形態である、請求項１１に記載の局所用途のための医薬組成物。
【請求項１８】
水または、アルコール、エーテルおよびグリコールから選択される溶媒を基にした生理学上許容される媒体を含む、請求項１１または１７に記載の局所用途のための医薬組成物。
【請求項１９】
界面活性剤、保存料、安定剤、乳化剤、増粘剤、付加的または潜在的共同作用をもたらす他の有効成分、微量元素、エッセンシャルオイル、香料、着色料、コラーゲン、化学もしくは無機フィルター、保湿剤または温水、およびそれらの混合物から選択される少なくとも１種の化合物を含有する、請求項１１、１７または１８に記載の局所用途のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はスーパーオキシドジスムターゼを含有する有効植物抽出物、特にメロン(cucumis melo)のタンパク抽出物を含んでなる新規な組成物に関する。本発明は特に、脂肪性物質を基にした脂溶剤中でコーティングまたはマイクロカプセル化された活性植物抽出物に関し、それは経口または局所適用に有用であり得る。
【０００２】
酸素は我々の機能に不可欠なものであるが、酸素は我々の身体に負の作用を持つ有害な反応性酸素種を発生させる。
【０００３】
生物系において反応性酸素種はスーパーオキシドラジカル（Ｏ２・−）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）、一酸化窒素（ＮＯ・）または脂質起源のペルオキシルラジカル（Ｌ−ＯＯ・）などのフリーラジカルを含む。これらのフリーラジカルは、電子配置が不対電子が存在することを特徴とする原子または分子である。この特徴によってこれらは不安定となり、安定化するため、核酸（ＤＮＡ）、酵素タンパク質、または膜脂質、および特に多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）などの新たな生体分子を急速に酸化する。スーパーオキシドイオンは細胞において最も一般的かつ最も豊富に生成するフリーラジカルである。従ってそれは体にとって著しく危険である。その毒性は特に、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）などの他のより旺盛な反応物へと変換することによるものである。
【０００４】
我々の体は常にフリーラジカルの形成に対して作用しており、細胞を解毒するいくつかの防御線を考えている。
【０００５】
第一の防御線はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）と呼ばれる酵素により提供される。ＳＯＤには、銅および亜鉛を含有するもの（すなわち、Ｃｕ／Ｚｎ  ＳＯＤ；マンガンを含有するもの（Ｍｎ  ＳＯＤ）、そして最後に鉄を含有するＳＯＤ（Ｆｅ  ＳＯＤ°）の３つの形態が存在する。ＳＯＤはスーパーオキシドイオンを消去するのでフリーラジカルに対抗する重要な役割を果たす。スーパーオキシドジスムターゼは反応式：
２Ｏ２＋２Ｈ＋  →  Ｈ２Ｏ２  ＋  Ｏ２
に従い、スーパーオキシドイオンの不均化を誘導し得る酵素である。このスーパーオキシドイオンの消去はやはり過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の形成をもたらし、これもまた細胞にとって有毒である。従ってＳＯＤの作用はＨ２Ｏ２を消去する第二の防御線によって補れるべきである。
【０００６】
第二の防御線はＨ２Ｏ２を破壊する二つの酵素カタラーゼおよびセレニウム依存性グルタチオンペルオキシダーゼ（ＳｅＧＰｘ）によって提供される。
【０００７】
通常の生体条件下では、ヒトの体は少量ではあるが常にフリーラジカルを生じ、これはらはすぐさま存在している防御系により中和される。ある場合に、フリーラジカルの産生が高まれば（煙草、ストレス、汚染、太陽光など）、かつ／または抗酸化物質が不足すれば、酸化体／抗酸化剤が不均衡となる。この不均衡は多くの病状および多くの不均衡にますます密接に関係する。このため抗酸化物質を探し出すことが美容術、農産食品または医薬の分野で常に注目を浴びている課題である。
【０００８】
例えば、仏国特許ＦＲ２２８７８９９には、スーパーオキシドジスムターゼ酵素の美容術における適用、特にスキンケアおよびヘアケア用化粧組成物の製造におけるこれら酵素の使用が記載されている。
【０００９】
ＳＯＤはフリーラジカルにより引き起こされる病状、特に例えばクローン病の治療(Emerit et al., 1991, Free Rad. Res. Comms, 12-13, 563-569)などの慢性炎症の場合、または放射線により引き起こされる繊維症の場合(Delanian et al., 1994, Radiotherapy and Oncology, 32, 12-20)に用いられている。
【００１０】
これらのスーパーオキシドジスムターゼは特にウシ赤血球から(Markovitz, J. Biol. Chem., 234, p. 40, 1959)、大腸菌(Escherichia Coli)から(Keele and Fridovitch, J. Biol., 245, p. 6176, 1970)から、また海洋バクテリア株から（仏国特許ＦＲ２２２５４４３およびＦＲ２２４０２７７）抽出されている。
【００１１】
しかしながらこれらの材料が含んでいる可能性がある特に感染性物質に関連する理由のために、現在は、より健康によいとされている植物界に由来する物質に置き換える傾向がある。これらの抗酸化酵素は実際、いくつかの植物では様々な量で存在している。
【００１２】
このように仏国特許出願ＦＲ２７１６８８４には、スーパーオキシドジスムターゼ酵素活性の向上したメロンのタンパク抽出物、その製造方法および外用局所用医薬または化粧組成物におけるその使用が記載されている。しかし、かかるタンパク抽出物は、それが含む酵素（特にスーパーオキシドジスムターゼ）は外的攻撃（特に紫外線）の存在下、あるいは経口用配合物の摂取中（胃液）は不活性化されるので、使用が難しい。従って、このような防御を付与して抗酸化活性剤の作用を至適化する特異な配合物を開発することが望ましい。
【００１３】
遊離型ＳＯＤ（Ｃｕ／Ｚｎ、ＦｅまたはＭｎ）の血漿半減期を高めるため、種々の非経口投与用改良型が提案されており、ポリエチレングリコールと結合したＳＯＤ（ＳＯＤ−ＰＥＧ）、ヘパリンと結合したＳＯＤ（ＳＯＤ−ヘパリン）、アルブミンと結合したＳＯＤ（ＳＯＤ−アルブミン）、ＳＯＤの重合体または共重合体およびリポソームＳＯＤが挙げられる。しかし、これら種々のＳＯＤは経口投与した場合、極めてわずかしか吸収されないという大きな欠点がある。
【００１４】
また、仏国特許出願ＦＲ２７２９２９６には、スパーオキシドジスムターゼと、セラミド、プロラミンおよび該プロラミンを基にしたポリマーフィルムからなる群から選択される化合物とを実質的に組み合わせて含むスーパーオキシドジスムターゼの経口投与に十分適した特定の医薬組成物も記載されている。しかし、かかる組成物は局所用途には適しておらず、しかもグルテンにアレルギーのある人は使用できない。
【００１５】
本発明者らは驚くべきことに、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を含有する有効植物抽出物を脂肪性物質を基にした脂溶剤中でコーティングおよび／またはマイクロカプセル化した場合に、これが局所または経口により使用でき、かつ、その活性剤、特にＳＯＤが外的攻撃（例えば紫外線または胃液）から保護されることを見出した。
【００１６】
従って本発明は、スーパーオキシドジスムターゼを含有する有効植物抽出物を含んでなる組成物に関するものであり、該抽出物は脂肪性物質を基にした脂溶剤中でコーティングおよび／またはマイクロカプセル化されている。
【００１７】
本発明に向けて「スーパーオキシドジスムターゼを含有する有効植物抽出物」とは、スーパーオキシドジスムターゼ酵素活性を有する植物から得た任意の抽出物を意味するものとする。メロン（cucumis melo）特に粉末状、有利には凍結乾燥形態のメロンのタンパク抽出物であることが有利である。メロンが細胞系統９５ＬＳ４４４または９５ＬＳ４４４に由来する雑種系統の一つの後代であることが、なおいっそう有利である。
【００１８】
特定の具体例では、この植物抽出物のスーパーオキシドジスムターゼ酵素活性は少なくとも５酵素単位／抽出物ｍｇに相当し、有利には少なくとも５０酵素単位／抽出物ｍｇに相当する。
【００１９】
植物抽出物は当業者に周知の方法により、特には仏国特許出願ＦＲ２７１６８８４に記載の方法により得られる。またこれはBIONOV社からＥＸＴＲＡＭＥＬＲの商標で商業的に入手できる。
【００２０】
有利には、本発明の植物抽出物はカタラーゼ酵素活性をさらに有してもよい。また、補酵素Ｑ１０、ビタミン類、リポ酸、グルタチオン、植物に存在するカリウム、マグネシウム、カルシウムおよびセレニウムのような無機元素などを含んでもよい。
【００２１】
本発明に向けて「脂肪性物質を基にした脂溶剤」とは、少なくとも一種の脂肪性物質を含有し、かつ、分子の親水部分と親油部分間のバランス指数（ＨＬＢ）が１０未満である任意の物質を意味するものとする。
【００２２】
有利には、本発明の脂溶剤は約４０〜約８０℃、なおいっそう有利には約５５〜約６０℃の融点を有する。
【００２３】
特定の具体例では、本発明の脂溶剤は植物起源のものである。有利には、これは硬化油；パーム油またはヤシの実の核(heart)から得られる油；水素化種子；ステアレート、特にステアリン、ステアリン酸およびその誘導体から選択されるもの；ワックス；脂肪酸モノジグリセリド；飽和Ｃ１４−Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドならびにそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２４】
有利には、本発明の脂溶剤は植物油を基にした硬化油、特に硬化ココヤシ油、硬化パーム油、硬化ダイズ油、または硬化ナタネ油およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである。なおいっそう有利には、それは硬化パーム油である。
【００２５】
また、この脂溶剤は糖またはポリオール型の水溶性物質を含むこともできる。
特定の具体例では、本発明の植物抽出物は組成物の全重量に対して１〜９０重量％、有利には組成物の全重量に対して２０〜５０重量％の濃度で存在する。
【００２６】
本発明はまた、以下の工程：
ａ）脂溶剤を融解し、
ｂ）工程ａ）で得られた液体をスーパーオキシドジスムターゼを含有する有効植物抽出物に挿入する（depositing）
ことを含んでなる、本発明の組成物の製造方法に関する。
有利には、植物抽出物は粉末状で存在し、かつ、工程ｂ）は流動層にて、さらに有利には低温および低水分含量で行われる。
【００２７】
特定の具体例では、工程ｂ）の温度は脂溶剤の融点より低く、有利には約４０℃である。
【００２８】
本発明はまた、本発明の組成物とヒトまたは動物投与に向けた経口または局所用に適当な賦形剤とを含んでなる医薬または化粧用組成物に関する。これらの組成物はヒトをはじめとする哺乳類への投与向けに処方してもよい。用量は治療法に応じ、また対象となる症状に応じて異なる。
【００２９】
特定の具体例では、本発明の医薬または化粧組成物は経口投与用に処方してもよい。有効成分は動物またはヒトに対し、通常の医薬担体と混合して単位投与形で投与してもよい。適当な単位投与形は錠剤、ゼラチンカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口溶液または懸濁液などの形態を含む。それはヨーグルトおよび／または繊維をさらに含んでなり、なおさらに有利にはスーパーオキシドジスムターゼを含有する有効植物抽出物を含んでなる組成物（なお、該抽出物は本発明の脂肪性物質を基にした脂溶剤中でコーティングおよび／またはマイクロカプセル化されている）と均一な混合物を形成するように含んでなることが有利である。
【００３０】
本発明のもう一つの特定の具体例では、この医薬または化粧組成物はまた局所投与用に処方してもよい。それらはこの種の投与に関して通常に知られている形態、すなわち特には、有効成分の特性および利用度を高めるために特に皮膚浸透性とする賦形剤を伴う、例えばローション、フォーム（foams）、ゲル、分散系、スプレー、シャンプー、漿液、マスク、ボディーミルクまたはクリームの形態で提供してもよい。これらの組成物は一般に、本発明の組成物に加えて、一般に水または溶媒（例えばアルコール、エーテルまたはグリコール）を基にした生理学上許容される媒体を含む。それらはまた、界面活性剤、保存料、安定剤、乳化剤、増粘剤、その他付加的または潜在的共同作用をもたらす有効成分、微量元素、エッセンシャルオイル、香料、着色料、コラーゲン、化学もしくは無機フィルター、保湿剤または温水を含んでもよい。
【００３１】
本発明はまた、薬剤としての本発明の組成物に関する。
【００３２】
有利には、本発明は、アレルギーの治療もしくは予防、または紫外線からの表皮の保護を意図した薬剤としての本発明の組成物に関する。
【００３３】
本発明はまた、アレルギー、湿疹、白斑、乾癬、狼瘡、皮膚繊維症の治療、黒色腫の除去、移植片の瘢痕化の改善、アレルギーの予防、または紫外線からの表皮の保護を意図した局所用薬剤の製造のための本発明の組成物の使用に関する。
【００３４】
本発明はまた、紫外線からの表皮の保護、アレルギーの治療もしくは予防、喘息、貧血、雄性不妊、炎症性疾患（特にクローン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、結腸直腸癌、種々の起源の繊維症、エイズもしくはＣ型肝炎などの感染性病原体による変性、または薬剤の使用に関連した変性からなる群から選択される細胞性および／または器質性変性による関節症または変性疾患など）の治療を意図した薬剤の製造のための本発明の組成物の使用に関する。
【００３５】
本発明はまた、エネルギー源としての、強壮源としての、または回復および健康回復の補助としての本発明の組成物を含んでなる食品組成物の使用に関する。
【００３６】
さらに本発明は、アレルギーの治療または予防、有利にはアレルギーからの表皮の保護を意図した、特に局所用の薬剤としての本発明の組成物に関する。
【００３７】
最後に本発明は、アレルギーの治療または予防、有利にはアレルギーからの表皮の保護を意図した、特に局所用の薬剤の製造のための本発明の組成物の使用に関する。
【００３８】
当業者には下記の例示的図面を参照することで本発明のその他の目的および利点が明らかとなる。
【００３９】
図１は、本発明の組成物の製造方法の概略図を示す。
【００４０】
図２は、照射２４時間前に投与した本発明の組成物の照射７２時間後に評価した、紫外線により引き起こされるケラチノサイトアポトーシスに対する作用をそのＳＯＤ濃度の関数として示す。
【００４１】
図３は、３０単位／ｍｌのＳＯＤを含有する本発明の組成物の照射７２時間後に評価した、紫外線により引き起こされるケラチノサイトアポトーシスに対する作用をその投与時間の関数として示す。
【００４２】
図４は、非コーティング有効植物抽出物（Ａ）と比較した本発明の組成物（Ｂ）の胃液媒体中の分解時間を示す。
【００４３】
図５は、繊維（Ｃ）またはヨーグルト（Ｄ）と均一に混合した本発明の組成物と比較した本発明の組成物（Ｂ）の胃液媒体中での分解時間を示す。
【００４４】
図６は、マウスに経口摂取された本発明の組成物（Ｂ）の照射４８時間後にin vivoで評価した、非コーティング有効植物抽出物（Ａ）および対照（Ｅ）と比較した紫外線により引き起こされる炎症に対する作用を示す。
【００４５】
図７は、繊維（Ｃ）またはヨーグルト（Ｄ）と均一に混合した本発明の組成物と、また対照（Ｅ）と比較した、経口摂取された本発明の組成物（Ｂ）の照射４８時間後にin vivoで評価した、紫外線により引き起こされる炎症に対する作用を示す。
【００４６】
図８は、本発明の組成物を含有する局所適用用半固体製剤の、塗布したクリームの量に応じた、また対照と比較した紫外線により引き起こされる炎症に対する作用を示す。
【００４７】
以下の実施例は一つの指針として示されるものであって、限定されるものではない。
【００４８】
実施例１：本発明の組成物の製造
有効植物抽出物の製造（仏国特許出願ＦＲ２７１６８８４に記載）
細胞系統９５ＬＳ４４４（国際出願ＷＯ９２／０２６２２に記載）に由来する雑種メロン（cucumis melo）からのパルプ５ｇを乳鉢にて冷却状態で摩砕する。植物塊の３倍に相当する容量の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ：７．５；５ＥＤＴＡ  １ｍＭ；グリセロール５％）を加える。ホモジナイズした後、懸濁物を５０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離する。次ぎに上清を回収して濾過する。この粗抽出物をスーパーオキシドジスムターゼ活性の測定に用いた。Bioxytech社により提供されるＳＯＤ５２５アッセイキットによりこれを測定する。この方法により、McCord and Fridovitch法によって得られたもの（キサンチン−キサンチンオキシダーゼによるシトクロムＣ還元がＳＯＤによって阻害）に匹敵する結果が得られる。
【００４９】
本発明の組成物の製造
上記で製造した凍結乾燥粉末状の有効植物抽出物（BIONOV社により商標ＥＸＴＲＡＭＥＬＲとしても販売）を用いる。この抽出物はコーティングした後、抽出物１ｍｇ当たり１４単位のＳＯＤ活性を有し、またカタラーゼおよび補酵素Ｑ１０も含んでいる。
【００５０】
用いる脂溶剤は硬化パーム油である。
【００５１】
この物質の融解は加熱により容器（１）（図１）で行う。このようにして得られた液剤を、低温（４０℃より低い「皮膚」温度）および低水分量にて、二液Ｓｃｈｌｉｃｋノズル（２）によって、流動層（７）中に懸濁させた有効植物抽出物粉末上にスプレーすることで付着させる（deposited）。低融点のこの被覆剤（５８〜６１℃）により、有効植物抽出物が燃焼せずに即座に材料を固化することができる。図１によれば、換気扇（３）、ヒーター（４）、脱飽和装置（５）およびフィルター（６）を用いる。
【００５２】
このようにして得られた組成物は２０重量％の有効植物抽出物と８０重量％の脂溶剤を含有する。
【００５３】
実施例２：本発明の組成物を含んでなる半固体局所適用製剤の製造
この製剤（水中油エマルション）は表１に示されている成分および割合を用い、当業者に周知の方法で製造する。
【００５４】
【表１】
0004401617.tif 000002
【００５５】
以下の表２に示されている特徴を持つ半固体局所適用製剤が得られる。
【００５６】
【表２】
0004401617.tif 000003
【００５７】
実施例３：紫外線に関しての実施例１の組成物の保護活性の評価
in vitroにおける正常ヒトケラチノサイトに関して
この研究の目的は、表皮における根本的な結果として、アポトーシスによるケラチノサイト（日焼け細胞）の早期死滅の誘導、ならびに局所炎症の発展の原因である可溶性メディエーターの放出を有する紫外線に関しての実施例１の組成物の保護作用を評価することである。
【００５８】
その産生が紫外線によって（低線量であっても）刺激されると考えられるこれらの前炎症性メディエーターとしては、ＩＬ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびフリーラジカルＮＯが挙げられる。後者は実際には、酸素の存在下、紫外線ストレスの後に発現される誘導性ＮＯシンターゼによってアルギニンからシトルリンへの酸化変換によって生じる。主要な前炎症性メディエーターであるＮＯは炎症状態と関連した組織崩壊の一因である主要な作用因子であると考えられる。
【００５９】
BIONOV社によりＥＸＴＲＡＭＥＬの商標で販売されている有効植物抽出物および実施例１の組成物の保護作用を、細胞のアポトーシスならびに紫外線照射後の前炎症性メディエーターの産生を測定することが可能なin vitroモデルを基にした実験的アプローチで評価した。
【００６０】
この研究では、第一の例として、ＵＶＢに曝されたケラチノサイトによる前炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生、ならびにＮＯラジカルの産生を研究するために選択されたものである。
【００６１】
ａ）材料および方法
細胞
包皮の一次培養物からケラチノサイトを得て、使用前２週間、調節培地（ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ））で増殖させる。密集したら、純粋なケラチノサイトを２４ウェルプレートにて、供試製品の存在または不在下、増殖因子のない培地中１０６細胞／ｍｌで２４時間培養し、その後、紫外線で刺激する。
【００６２】
製品の作用を評価する培地
製品を評価する際、抗生物質（１００ＳＯＤ単位（Ｕ）／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）およびウシ胎児血清（５％）を添加したＩｓｃｏｖｅ培地で細胞を培養し、種々の濃度（０．１〜１０００μｇ／ｍｌ）で実施例１の組成物と接触させた後、紫外線により刺激する。
【００６３】
紫外線刺激
細胞は”１／４ｍ  Ｏｒｉｅｌモノクロメーター、通過帯域５ｎｍの１ＫＷ水銀−キセノンアークランプで照射し、発光液ガイド（５ｎｍ×１ｍ）で集束させた。３１０ｎｍにて１４．４Ｋｊ／ｍ２、１０分間照射を行うが、このタイプの照射はＵＶＢ型の照射に相当する。
【００６４】
前炎症性メディエーターＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＮＯの産生の測定は照射４８時間後に行う。
【００６５】
アポトーシス細胞のパーセンテージは照射７２時間後に評価する。
【００６６】
アポトーシスの測定
培養が終了したら、ＤＮＡの破断を蛍光放出により視覚化するＡｐｏｐｔａｇＲキットを用いてアポトーシスによる死を評価する。
【００６７】
アポトーシスを受けている細胞の数を、全２００細胞のうちの蛍光細胞の数を計数することで評価する。
【００６８】
炎症性メディエーターＩＬ−６、ＴＮ−αおよびＮＯのアッセイ
サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のアッセイはＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて培養上清に対して行う（なお、検出限界は各回１０ｐｇ／ｍｌ未満）。ＮＯの産生については実際には、安定な誘導体、すなわち亜硝酸塩の産生であり、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を用いて比色法により測定する。
【００６９】
ｂ）結果
アポトーシス
以下の表３に示されているように、ケラチノサイトのアポトーシスは紫外線照射７２時間後に著しく増加すると考えられる。
【００７０】
【表３】
0004401617.tif 000004
【００７１】
従ってこれらの結果から、このモデルを、「保護」活性プロフィールを有する製品を評価するモデルとすることが可能である。
【００７２】
抗アポトーシス力に対する実施例１の組成物の濃度の影響
実施例１の組成物は１〜３０ＳＯＤ単位の濃度範囲で試験し、照射２４時間前に加える。試験は各々３回行う。
【００７３】
これらの作用を照射７２時間後に評価し、アポトーシスを受けている細胞の割合％を、ＡｐｏｐｔａｇＲキットを用いた後蛍光顕微鏡により評価する（図２）。
【００７４】
これらの実験は、本発明の組成物を予防的に（すなわち、照射現象の前に）加えた場合、紫外線照射後にアポトーシスが誘導されるという現象に対して保護活性を有することを明らかに証明する。これらの試験の際、有効植物抽出物ＥｘｔｒａｍｅｌＲを３０ＳＯＤ単位の用量での使用は、実施例１の組成物０．３ＳＯＤ単位に相当する作用をもたらすが、このことは、有効植物抽出物が、本発明の脂溶剤によるコーティングの形態でこの保護を用いることにより細胞内に送達される場合に遊離型の有効植物抽出物より１００倍効果が高いことを示唆している。
【００７５】
実施例１の組成物の培地への添加条件の影響
これを検討するために選択する実施例１の組成物の濃度は３０ＳＯＤ単位／ｍｌである（図３）。
【００７６】
照射前、照射時および照射後の紫外線により誘導されるアポトーシスに対するこの組成物の作用力を調べるため、これをそれぞれ照射２４時間前、照射の開始時および照射２４時間後に加えた。
【００７７】
この検討条件の下、組成物を照射２４時間前（Ｔ−２４Ｈ）に加えた場合に著しいアポトーシスの減少が見られる。
【００７８】
照射の開始時（Ｔ０）に加えた場合、実施例１の組成物の抗アポトーシス作用は低下するものと思われ、この効果はこの組成物を照射２４時間後（Ｔ＋２４Ｈ）に加えた場合にさらに低下する。
【００７９】
従ってこの製品は予防上、極めて効果的であると考えられる。
【００８０】
サイトカインおよびＮＯの産生
ヒト・ケラチノサイトの紫外線による刺激（表４）はこれらの試験に用いる条件下で、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生、ならびにこれらの細胞内での誘導性ＮＯシンターゼの活性化を介してＮＯの産生を誘導する。
【００８１】
前炎症性メディエーターの産生に対する、実施例１の組成物の培地への添加条件の影響
本発明の組成物の前炎症性メディエーターの産生を調節する能力を、以下の試験条件に従って評価した：照射２４時間前、照射開始時または照射２４時間後に実施例１の組成物を導入。
【００８２】
実施例１の組成物は３０ＳＯＤ単位／ｍｌで試験する。メディエーターのアッセイは３回行う。結果は表４に示されている。
【００８３】
【表４】
0004401617.tif 000005
【００８４】
実施例１の組成物（３０Ｕ／ｍｌ）を予防的に添加（Ｔ−２４ｈ）した場合には前炎症性サイトカインの産生およびニトロ誘導体の減少が見られるが、この作用は添加が即座に行った場合（Ｔ０）には低下し、製品を紫外線刺激２４時間後（Ｔ＋２４ｈ）に添加した場合ではほとんど効果がない。
【００８５】
ｃ）結論
前炎症性メディエーターの産生ならびにアポトーシスによる細胞死は紫外線と酸素Ｏ２の間の相互作用に由来する酸素フリーラジカル（ＲＯＳ）の顕著な産生と関連した現象である。これらのフリーラジカルは紫外線によって起こる酸化ストレスの原因である。
【００８６】
生理学的な抗酸化剤のプールがもはやそれらを制御できなくなったとき、炎症反応を伴う細胞変性の現象が生じる。
【００８７】
本発明の組成物は紫外線ストレスの前に加えると前炎症性メディエーターの発現を阻害し、同時に細胞がアポトーシスへ入るのを減らす。
【００８８】
従ってこの研究では、本発明の組成物が細胞の代謝に保護作用を発揮することが明らかである。
【００８９】
実際、本発明の組成物の存在下では、紫外線照射によって引き起こされるケラチノサイトのアポトーシスが著しく減少するものと思われる。同様に、紫外線照射によって引き起こされる前炎症性メディエーターの産生の上昇は著しく軽減されるようである（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＮＯ）。
【００９０】
結果として、本発明の組成物は、物理的であろうが（紫外線）、化学的であろうが（オゾン、一酸化炭素、または重金属などの環境汚染物質）その起源にかかわらず、特に予防的に投与した場合に酸化ストレスによって起こる変性現象から皮膚組織を保護する。
【００９１】
in vivoにおけるヒト皮膚の「ヌード」マウスへの移植について
この研究の目的は、経口経路による有効植物抽出物（ＥｘｔｒａｍｅｌＲ）単独、またはＳＯＤを含有する本発明の組成物でコーティングしたものの、紫外線により皮膚に引き起こされる炎症（表皮におけるその主要な結果は、局所炎症の発生の一因である可溶性メディエーターの放出が誘導されることである）に対する作用を評価することである。
【００９２】
その産生が紫外線によって（非常に低量であっても）刺激されると考えられるこれらの前炎症性メディエーターとしては、ＴＮＦ−αおよびフリーラジカルＮＯが挙げられる。後者は実際には、酸素の存在下、紫外線ストレスの後に発現される誘導性ＮＯシンターゼによってアルギニンからシトルリンへの酸化変換によって生じる。主要な前炎症性メディエーターであるＮＯは炎症状態と関連した組織分解の原因である主要な作用因子であると考えられる。
【００９３】
実施例１の組成物（あるいは食物繊維および／またはヨーグルトと混合）の保護作用は以下のモデルを基に実験的アプローチで評価した：
in vivoにてヌードマウスに移植されＵＶＢを照射される正常なヒトの皮膚の外植片で、照射および生じた効果の評価においてヒト皮膚の部分にのみ考慮。
【００９４】
ａ）材料および方法
紫外線刺激
ヒト皮膚を有するマウスを”１／４ｍ  Ｏｒｉｅｌモノクロメーター、通過帯域５ｎｍの１ＫＷ水銀−キセノンアークランプで照射し、発光液ガイド（５ｎｍ×１ｍ）で集束させた。３１０ｎｍにて１４．４Ｋｊ／ｍ２、１０分間照射を行うが、このタイプの照射はＵＶＢ型の照射に相当する。
【００９５】
前炎症性メディエーターＴＮＦαおよびＮＯの産生の測定は皮膚外植片への照射４８時間後に行う。
【００９６】
炎症メディエーターＴＮＦ−αおよびＮＯのアッセイ
サイトカインＴＮＦ−αのアッセイはＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて培養上清に対して行う（なお、検出限界は１０ｐｇ／ｍｌ未満）。ＮＯの産生については実際には、安定な誘導体、すなわち亜硝酸塩であり、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を用いて比色法により測定する。
【００９７】
ｂ）in vivoでの予備結果
BIONOV社によりＥＸＴＲＡＭＥＬの商標で市販されている有効植物抽出物（Ａ）と実施例１の組成物（Ｂ）（すなわち、同じ有効植物抽出物であるが、この場合は脂溶剤を用いてコーティングすることで保護してある）の間の分解を比較した（図４）。有効植物抽出物が、胃液（ｐＨ１、トリプシンおよびペプスタチン）を模した媒質に導入した後数分で分解されれば、実施例１の組成物は耐性が高まっている。実際には、この組成物は５〜３０分の間に徐々にＳＯＤを放出する（図４）。しかしながら、この組成物は消化過程に対して絶対的な保護を示さないが、特に繊維（Ｃ）および／またはヨーグルト（Ｄ）に食品添加物として用いることができ、この場合にはＳＯＤ活性の保護が最適となる（図５）。
【００９８】
これらの結果より、有効植物抽出物に含まれるＳＯＤ活性は、本発明の組成物において経口摂取でき、これはいくつかの食品生成物（ヨーグルトおよび／または繊維など）とさらに混合して従ってＳＯＤ活性を保護することができることが証明される。従ってこの経口送達様式により、機能性食品におけるこのＳＯＤ活性の機能的活性を証明することが可能となる。
【００９９】
その後の処理の形態は以下の通りである：動物を、紫外線の照射前２週間の間毎日１０ＳＯＤ単位／マウスで処理する。
【０１００】
「ヌード」マウスへのヒト皮膚移植モデルで、本発明の組成物の経口摂取により紫外線により引き起こされる皮膚の損傷が保護されることが証明される。このように「ヌード」マウスへ移植したヒト皮膚の紫外線照射はＴＮＦ−αなどの炎症性メディエーターの産生を誘導する。遊離の有効植物抽出物（ＥＸＴＲＡＭＥＬ（Ａ）の経口摂取には全く効果はないが、実施例１の組成物（Ｂ）の摂取はわずかな効果がある（図６）。実施例１の組成物を食物繊維（Ｃ）および／またはヨーグルト（Ｄ）と均一に混合した場合には、より大きな保護効果がまた証明され（図７）、対照（Ｅ）と比較した繊維／実施例１の組成物製品（Ｃ）は３５％阻害、そしてヨーグルト／実施例１の組成物製品（Ｄ）は２５％阻害である。
【０１０１】
これらの予備結果は、他の食品生成物（繊維およびヨーグルト）に配合した本発明の組成物を摂取すると、in vivoにおいて紫外線により引き起こされる皮膚炎症の発展に対して保護効果をもたらすことを証明する。これらの結果は、食物有効剤を分解から保護する食事原理の開発による機能性食品の概念を強くするものであり、このように本発明の組成物は他の食品と組み合わせた際に最大の保護活性を有する（本発明の組成物単独の経口摂取でもこのような活性を存在するが）ので、それ自体機能性食品添加物として位置づけられる。
【０１０２】
実施例３：アレルギー現象に伴う炎症に関する、遊離型有効植物抽出物または本発明の組成物における保護活性の評価
この研究の目的は、アレルギー物質である任意の性質を持つ化学化合物によって引き起こされる炎症について、有効植物抽出物単独、または本発明の組成物において保護されたものの保護効果を評価することである。
【０１０３】
複数の生化学機構の共同作用から生じる炎症応答は、攻撃を受ける部位のレベルで多くの前炎症性メディエーター（ＴＮＦ−α、ＮＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６など）が放出されることで誘発され、ＮＯのようにそのうちのいくつかはアポトーシスによる細胞死を増やすことに寄与する。後者は主要な前炎症性メディエーターであり、また、炎症状態に関連した組織破壊の原因となる主要な作用因子である。
【０１０４】
従って、アレルギーストレスに対するこの抽出物の保護効果を評価するため、本発明者らは細胞のアポトーシスならびに前炎症性メディエーターの産生を調べることができるin vitroモデルを基にした実験的アプローチを採用した。
【０１０５】
この研究では、発明者らはまず、前炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生、ならびにＮＯラジカルの産生を検討することにした。
【０１０６】
材料および方法
ａ）製品の検討
用いた製品は、実施例１の組成物とBIONOV社から入手したメロンの有効植物抽出物（ＥＸＴＲＡＭＥＬ）である。従ってこれは、遊離型抽出物と本発明の脂溶剤でコーティングすることで保護された抽出物である。
【０１０７】
ｂ）研究手順
細胞
包皮の一次培養物からケラチノサイトを得、使用前２週間、調節培地（ＫＧＭ培地）で増殖させる。密集（confluence）したら、純粋なケラチノサイトを２４ウェルプレートにて、供試製品の存在または不在下、増殖培地中１０６細胞／ｍｌで２４時間培養し、その後、刺激を行う。
【０１０８】
供試品の作用を評価する培地
製品を評価する際、抗生物質（１００ＳＯＤ単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）およびウシ胎児血清（５％）を添加したＩｓｃｏｖｅ培地で細胞を培養し、種々の濃度（０．０１〜１００μｇ／ｍｌ）の供試品と接触させた後、以下に示される条件下で刺激する。
【０１０９】
「アレルギー」刺激
アレルギー源の炎症応答の発展を模倣するため、細胞をＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で４８時間予め活性化させてＣＤ２３（ＩｇＥに対して親和性が低い受容体）を誘導し、その後、ＩｇＥ（ＩｇＥ／抗ＩｇＥ）免疫複合体で抗原刺激を行う。次ぎに、このようにして活性化した細胞を、上清回収の前４８時間培養維持してメディエーターＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＮＯをアッセイする。アポトーシス細胞のパーセンテージは刺激７２時間後に評価する。
【０１１０】
アポトーシスの測定
培養が終了したら、ＤＮＡの破断を蛍光放出により視覚化するＡｐｏｐｔａｇＲキットを用いてアポトーシスによる死を評価する。アポトーシスを受けている細胞の数を、全２００細胞のうちの蛍光細胞の数を計数することで評価する。
【０１１１】
炎症性メディエーターＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＮＯのアッセイ
サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のアッセイはＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて培養上清に対して行う（なお、検出限界は各回１０ｐｇ／ｍｌ未満）。ＮＯの産生については実際には、安定な誘導体、すなわち亜硝酸塩であり、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を用いて比色法により測定する。
【０１１２】
結果
アポトーシス
細胞をＩｇＥ／抗ＩｇＥ複合体で活性化させてから７２時間後、著しいアポトーシスが見られる。結果は表５に示されている。
【０１１３】
【表５】
0004401617.tif 000006
【０１１４】
これらの結果から、アレルギー源の炎症反応の誘導は、刺激されたケラチノサイトのアポトーシスによる死滅の有意な増加をもたらすことが証明される。従って、このモデルを、「保護」活性プロフィールを有する製品を評価するモデルとすることが可能である。
【０１１５】
ｂ）有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬの抗アポトーシス作用：添加条件の影響
有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬの、ストレス前、ストレス中またはストレス後にアレルギーストレスにより引き起こされるアポトーシスを調節する能力を調べるため、この抽出物をそれぞれ刺激２４時間前、刺激時、最後に刺激２４時間後に加えた。
【０１１６】
有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬは１０μｇ／ｍｌで導入する。この試験を３回行った。結果は表６に示されている。
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
この試験条件下では、有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬを照射２４時間前に加えた場合に著しいアポトーシスの減少が見られる。従って有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬＲは保護活性を発揮するといえる。
【０１１９】
ｃ）サイトカインおよびＮＯの産生
有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬＲの、増感したケラチノサイトによる前炎症性メディエーターの産生を調節する能力は、以下の試験条件に従って評価した：有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬは刺激２４時間前、刺激直前、または照射２４時間後に導入。
【０１２０】
有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬ（は１０ｇ／ｍｌで導入する。この試験を３回行った。結果は表７に示されている。
【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
これらの試験に用いた条件下で、アレルギーストレスは、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生、ならびにこれらの細胞の誘導性ＮＯシンターゼの活性化を介してＮＯの産生を刺激する。
【０１２３】
また、有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬ（１０μｇ／ｍｌ）を予め添加した場合（Ｔ−２４ｈ）には前炎症性サイトカインおよびニトロ誘導体の産生の減少が見られるが、刺激時（Ｔ０）または刺激２４時間後（Ｔ＋２４ｈ）に加えた場合にはこれらのメディエーターの産生に対する効果ははるかに低い。
【０１２４】
ｄ）有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬＲと実施例１の組成物の効果の比較
実施例１の組成物を上記の試験条件下で試験したところ、同様の量で、有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬより良好な効力を示した。結果は表８に示されている。
【０１２５】
【表８】
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【０１２６】
結論
この研究において、有効植物抽出物単独ＥＸＴＲＡＭＥＬはアレルギー応答と関連した炎症現象に対して保護効果を示し、本発明の組成物、すなわち、本発明の脂溶剤を用いてコーティングすることでこの抽出物を保護したものは、この有効植物抽出物単独よりも効果的であることが明らかである。
【０１２７】
本発明の組成物はアレルギーストレスにより引き起こされる細胞のアポトーシスを著しく減少させる。
【０１２８】
本発明の組成物は増感したケラチノサイトによるＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＮＯの産生を有意に減少させることから、この効果はアレルギーに関連した炎症現象の調節に関連しているものと考えられる。
【０１２９】
アレルギー現象に関連した炎症を軽減し得る有効剤である本発明の組成物は、アレルギー化合物である、日用品ならびに環境汚染物質中に存在するいずれの性質の化学物質（ニッケル、タンパク性物質、化粧品賦形剤など）によって引き起こされる炎症からも皮膚組織を保護する。
【０１３０】
実施例４：紫外線に対する実施例２のクリームの保護活性の評価
紫外線（Ａ＋Ｂ）照射した、または照射しない正常な皮膚外植片を評価モデルとする。
【０１３１】
炎症マーカーとしてはＴＮＦの産生を選択した。
【０１３２】
供試品は実施例２の、すなわち実施例１の組成物を含有する局所適用用半固体製剤である。
【０１３３】
紫外線（UV radiation）に曝す前の皮膚への供試量は、
ＳＯＤ１：１ｍｇ／皮膚ｃｍ２
ＳＯＤ２：０．５ｍｇ／皮膚ｃｍ２
ＳＯＤ３：０．１ｍｇ／皮膚ｃｍ２および
ＳＯＤ４：０．０５ｍｇ／皮膚ｃｍ２
である。
【０１３４】
紫外線に曝した後、ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いてＴＮＦを測定する。
結果（図８）から、紫外線照射により引き起こされる炎症に対して、特に０．０５ｍｇ／皮膚ｃｍ２を超える用量で局所適用向けに処方された本発明の組成物の皮膚保護活性が証明される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組成物の製造方法の概略図を示す。
【図２】照射２４時間前に投与した本発明の組成物の照射７２時間後に評価した、紫外線により引き起こされるケラチノサイトアポトーシスに対する作用をそのＳＯＤ濃度の関数として示す。
【図３】３０単位／ｍｌのＳＯＤを含有する本発明の組成物の照射７２時間後に評価した、紫外線により引き起こされるケラチノサイトアポトーシスに対する作用をその投与時間の関数として示す。
【図４】非コーティング有効植物抽出物（Ａ）と比較した本発明の組成物（Ｂ）の胃液媒体中の分解時間を示す。
【図５】繊維（Ｃ）またはヨーグルト（Ｄ）と均一に混合した本発明の組成物と比較した本発明の組成物（Ｂ）の胃液媒体中での分解時間を示す。
【図６】マウスに経口摂取された本発明の組成物（Ｂ）の照射４８時間後にin vivoで評価した、非コーティング有効植物抽出物（Ａ）および対照（Ｅ）と比較した紫外線により引き起こされる炎症に対する作用を示す。
【図７】繊維（Ｃ）またはヨーグルト（Ｄ）と均一に混合した本発明の組成物と、また対照（Ｅ）と比較した、経口摂取された本発明の組成物（Ｂ）の照射４８時間後にin vivoで評価した、紫外線により引き起こされる炎症に対する作用を示す。
【図８】本発明の組成物を含有する局所適用用半固体製剤の、塗布したクリームの量に応じた、また対照と比較した紫外線により引き起こされる炎症に対する作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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