(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、及び6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、哺乳類における癌の成長を抑制するための薬剤組成物。
【請求項２】
該テトラサイクリン化合物が、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である、請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
癌が、癌腫である請求の範囲第１項の薬剤組成物。
【請求項４】
癌が、腺癌である請求の範囲第３項に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
癌が、肺、前立腺、乳房、卵巣、精巣、又は大腸の腺癌である請求の範囲第４項に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
癌が、メラノーマである請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
癌の細胞増殖を抑制する請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
癌の侵襲を抑制する請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
癌の転移を抑制する請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
癌の細胞によるマトリックスメタロプロテイナーゼの発現を抑制する請求の範囲第１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
該マトリックスメタロプロテイナーゼがゼラチナーゼである請求の範囲第１０項に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
該マトリックスメタロプロテイナーゼが、ゼラチナーゼＡ又はゼラチナーゼＢである請求の範囲第１１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、及び6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、哺乳類における癌の成長を抑制するための薬剤組成物。
【請求項１４】
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、及び4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、癌細胞の増殖を抑制するための薬剤組成物。
【請求項１５】
テトラサイクリン化合物が、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）又は、6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）である請求の範囲第１４項に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-シクロテトラサイクリン（CMT-4）、6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、及びテトラサイクリノニトリル（CMT-2）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、癌細胞の侵襲力を抑制するための薬剤組成物。
【請求項１７】
テトラサイクリン化合物が、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である請求の範囲第１６項に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）及び6-ジメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、癌細胞の転移力を抑制するための薬剤組成物。
【請求項１９】
ゼラチナーゼＡの過剰な活性で特徴づけられる癌の症状を治療するための薬剤組成物であって、4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-シクロテトラサイクリン（CMT-4）、及びテトラサイクリノニトリル（CMT-2）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、薬剤組成物。
【請求項２０】
テトラサイクリン化合物が、4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、又は6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である請求の範囲第１９項に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
ゼラチナーゼＢの過剰な活性で特徴づけられる癌の症状を治療するための薬剤組成物であって、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-シクロテトラサイクリン（CMT-4）、4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、及び4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、薬剤組成物。
【請求項２２】
テトラサイクリン化合物が、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）又は4-デ（ジメチルアミノ）-7-シクロテトラサイクリン（CMT-4）である請求の範囲第２１項に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、及び4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、及び6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、哺乳類における腫瘍発生を抑制するための薬剤組成物。
【請求項２４】
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）及び4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、哺乳類における癌の成長を抑制するための局所投与用薬剤組成物。
【請求項２５】
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、及び6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を含有する、差別的に癌細胞を殺すための薬剤組成物。
【請求項２６】
癌細胞が、肉腫、癌腫、又は腺癌の細胞である請求の範囲第２５項に記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
癌細胞が、前立腺、乳房、卵巣、精巣、肺、又は大腸の癌腫の細胞である請求の範囲第２６項に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
癌細胞が前立腺の癌腫の細胞であり、テトラサイクリン化合物が6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である、請求の範囲第２５項に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
本出願は、1997年1月15日提出の出願番号第08/783,655号の一部継続出願である。
本発明は、歯科研究所国民協会を通じて健康国民協会によって与えられた承認番号R37-DE03987及び健康国民協会によって与えられた承認番号R29-CA61038の下、政府の援助を受けてなされた。政府は、本発明に関し一定の権利を有する。
発明の背景
本発明は、生体系における癌の成長を減少させる方法に関する。さらに具体的には、本発明は、哺乳類における固形腫瘍の侵襲性及び転移の抑制に関する。
癌は、その種々の症状のすべてにおいて、人類に荒廃的な災難をもたらしている。特にホジキンのリンパ腫及び特定の他の形態に対する成功を含め、癌の予防及び治療は進歩してきたが、多くの種類の癌については、実質的には治療方法の普及には至っていない。通常、癌は、高毒性の化学物質を患者に与える化学療法、又は中毒量の放射線を患者に施す放射線療法によって治療される。これらの“毒性”治療は、一般に莫大な数の癌細胞を殺すのに有効であるが、かなりの数の健康な細胞をも殺し、吐き気、下痢、光に対する知覚過敏、毛髪損失等を含む激しく衰弱させる症状を患者に経験させることとなる。これらの毒性化合物の副作用は、患者に投与可能な回数及び量を制限する。このような障害のある副作用は、循環する細胞を選択的に攻撃し、すなわち、活発に再生されてい細胞内でDNAの複製又は他の成長プロセスを阻害する化合物を使用することで、ある程度は緩和される。癌細胞は、その異常な増殖性によって特徴づけられるので、このような方法は、健康細胞に比べ高率の癌細胞を優先的に殺すが、細胞障害性及び合併症の問題は残されている。
他の最近の進歩においては、発癌遺伝子に特異的なモノクローナル抗体又はHLAの特異化が進歩し、高精度に癌細胞を同定する努力がなされている。しかしながら、これらの方法は、非常に高価で、綿密に処理を施しても所望の効果が得られずに終わってしまう。実際、このような方法は、患者の小さい亜集団に於いてのみ有効であると報告されている。
腫瘍細胞の侵襲の機構に関する癌研究の分野では、Liotta及びその同僚らによって提案された概念的な枠組みから多大な貢献を受けている（例えば、Yamamotoら（1996）;Emmert-Buckら（1994）参照）。このモデルは、３つの認識可能な段階：腫瘍細胞の細胞外マトリックス（ECM）への結合、マトリックスのタンパク質分解性消化、及びタンパク質分解性退化障害による細胞の動きを含む現象の理論的な進行として侵襲プロセスを述べている。このプロセスにおけるキーとなる因子は、侵襲の際ECM分解における主な役割を果たすマトリックス メタロプロテイナーゼ（MMPs;ゼラチナーゼA及びB;それぞれ、MMP-2及びMMP-9、及びMMP-3（Lockeshwarら1993a））の制御である。
テトラサイクリン及びその多くの化学的関連物質は、特に抗生物質の成功した分類をなす。テトラサイクリン自体、及びスポロサイクリン等を包含する特定のテトラサイクリン化合物は、種々の細菌に有用な広範囲の抗生作用がある。親化合物、テトラサイクリンは、以下の一般構造を有する。
0004428727.tif 000002
多環核についての数体系は、以下の通りである。
0004428727.tif 000003
テトラサイクリン、並びに5-OH（テトラマイシン）及び7-Cl（オーレオマイシン）誘導体は、天然に存在し、すべて周知の抗生物質である。また、7-ジメチルアミノ-テトラサイクリン（ミノマイシン）及び6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-テトラサイクリン（ドキシサイクリン）のような半合成誘導体も公知の抗生物質である。天然のテトラサイクリンは、その抗生剤特性を失わずに修飾することができるが、構造の特定の成分を保持して修飾しなければならない。その修飾が基本のテトラサイクリン構造を形成できるか否かは、Mitscher（1978）によって報告されている。
Mitscherによれば、テトラサイクリン環系の5-9位における修飾は、完全に抗生剤特性を失わずに行うことができる。
しかしながら、環系の基本構造の変更又は1-4或いは10-12位における置換基の交換は、通常、抗菌活性が実質的に少ない、或いは基本的に抗菌活性がない合成テトラサイクリンを誘導する。例えば、4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリンは、一般的に非抗菌性テトラサイクリンとみなされている。
さらに最近、迅速に吸収され長期の血漿内半減期を有するテトラサイクリンは、その抗菌活性とは別の生物学的な効果を発揮することが確認された（Golubら1991、Golubら1992、Uittoら1994）。このような効果は、コラゲナーゼ（MMP-1;MMP-8;MMP-13）及びゼラチナーゼ（MMP-2;MMP-9）を包含するメタロプロテイナーゼ（省略して“MMPs”）のマトリックスの抑制と共に、病理的な組織破壊の防止を含む（Golubら1991）。最近の研究は、いくつかの系において、特定のテトラサイクリン及びメタロプロテイナーゼ抑制剤は、腫瘍の進行（DeClerkら1994）又は血管形成（WIPO公開WO 92/12717;Maragoudakisら1994）を抑制することを提言した。Zuckerら（1985）は、ミノマイシンはメラノーマ細胞のインビトロ活性を抑制することを示した。ある種の腫瘍に細胞静止作用を示しうるテトラサイクリンもある（Kroonら1984;van den Bogertら1986）。
しかしながら、テトラサイクリン抗生物質の使用は、一般的に感染症の治療には有効であるが、望ましくない副作用を生じ得る。例えば、抗生物質テトラサイクリンを長期間投与すると、腸内フロラのような健康的な抗菌性フロラを減少或いは除去し、抗生物質抵抗性生物体を産生し、又はイースト及び菌類の過成長を導いてしまう。従って、化学的に修飾されたテトラサイクリンは、抗菌活性が弱められ、或いは除去され、膠原溶解活性を示す場合に適用され、好ましく使用できる。
上述の考察によれば、癌細胞の侵襲及び転移を抑制する現存の方法を補う必要があることは明かである。現在のアプローチは、患者を付属的な病気で衰弱させる高毒性化合物に依存し、又は高価で処理が難しく、予期できない方法論の使用に頼っている。
従って、本発明の目的の１つは、侵襲及び転移を抑制すると共に初期的な腫瘍の退化を誘発することを包含する癌細胞の特徴である成長プロセスを抑制する化合物及び方法を提供することである。具体的には、特異的かつ比較的高活性に、すなわち有害な副作用がほとんどない投与量で活性である、癌の成長を抑制する新規な抗癌剤化合物及び方法を同定することが望ましい。
発明の概要
特定の結果を達成するのに有効な量の化学的に修飾されたテトラサイクリンを哺乳類に与えることによって、哺乳類における癌の成長又は発生を抑制する方法を提供する本発明により、これら及び他の目的を達成できることを発見した。
一実施態様においては、本発明は、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、
テトラサイクリンピラゾール（CMT-5）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシアンヒドロテトラサイクリン（CMT-9）、
及び
4-デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン（CMT-10）
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物の癌抑制量を、哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類における癌の成長を抑制する方法である。
最も好ましいテトラサイクリン化合物は、6-ジメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である。
本方法は、癌腫、例えば、肺、前立腺、乳房、卵巣、精巣、又は大腸の癌腫及びメラノーマのような癌の成長を抑制するのに有効である。
本方法は、癌の細胞増殖を抑制すること、癌の侵襲性を抑制すること、及び／又は癌の転移を抑制することを含むことができる。
テトラサイクリン化合物は、特異的に細胞外マトリックス内の癌細胞又はその活性によるマトリックスメタロプロテイナーゼの発現を抑制するために有効な量投与することができる。
好ましい観点においては、本方法は、ゼラチナーゼA又はゼラチナーゼBのようなぜラチナーゼであるマトリックスメタロプロテイナーゼを抑制するために有用である。
本方法は、さらに、補助的な抗腫瘍性の様式で哺乳類を治療することを含むことができる。補助的な抗腫瘍性の様式としては、化学療法、手術、及び／又は放射線療法を含むことができる。
他の実施態様においては、本発明は、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、及び
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシアンヒドロテトラサイクリン（CMT-9）、
及び
4-デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン（CMT-10）
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物の癌抑制量を、哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類における癌の成長を抑制する方法である。
他の実施態様においては、本発明は、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を、殖抑制量で癌細胞に接触させることを含んでなる、癌細胞の増殖を抑制する方法である。
好ましいテトラサイクリン化合物は、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）又は、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）
である。
他の実施態様においては、本発明は、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
及び
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を、侵襲抑制量で癌細胞に接触させることを含んでなる、癌細胞の侵襲力を抑制する方法である。
好ましくは、テトラサイクリン化合物は、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である。、
さらに、他の実施態様においては、本発明は、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）及び
6-デメチル-6-デオキシ-4-（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物の転移抑制量で、癌細胞に接触させることを含んでなる、癌細胞の転移力を抑制する方法である。
さらにまた他の実施態様においては、本発明は、過剰なゼラチン分解活性を抑制するために有効な量のテトラサイクリン化合物を哺乳類に投与することを含んでなる、過剰なゼラチン分解活性によって特徴づけられる癌の症状を治療する方法である。
この実施態様においては、癌はゼラチナーゼAの過剰な活性を特徴とし、テトラサイクリン化合物は、
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、及び
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）
から成る群より選択される。
好ましいテトラサイクリン化合物は、
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、又は
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である。代替的に、この実施態様においては、癌はゼラチナーゼＢの過剰な活性を特徴とし、テトラサイクリン化合物は、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、及び
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）
から成る群より選択される。
この場合、さらに好ましくは、テトラサイクリン化合物は、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）又は
4-デ（ジメチルアミノ）-7-シクロテトラサイクリン（CMT-4）
である。
さらに他の実施態様においては、本発明は、
（a）何らかの癌性の病変を観察する前に、哺乳類の生体試料中の癌になる素因に関連する遺伝子生成物又は代謝物を検出すること、及び
（b）腫瘍発生抑制量の、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、
6-ジメチル-6デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-シクロテトラサイクリン（CMT-4）、及び
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシアンヒドロテトラサイクリン（CMT-9）、
及び
4-デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン（CMT-10）
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を哺乳類に投与すること
を含んでなる、哺乳類における腫瘍発生を抑制する方法である。
さらに他の実施態様においては、本発明は、ゼラチン分解活性を抑制するために有効な量のテトラサイクリン化合物を哺乳類に投与することを含んでなる、哺乳類における癌性腫瘍に関連するゼラチン分解活性を抑制する方法である。
ゼラチン分解活性は、癌性腫瘍から誘発され、或いは正常の組織から誘発され、又はその両方から誘発されてもよい。正常な組織が関係する場合は、その正常な組織は、上皮性組織又は間質性組織であってよい。
さらに他の実施態様においては、本発明は、
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）及び
４-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物を癌の抑制量だけ哺乳類に局所的に投与することを含んでなる、哺乳類における癌の成長を抑制する方法である。
さらに他の実施態様においては、本発明は、癌細胞に
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、
４-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシアンヒドロテトラサイクリン（CMT-9）、
及び
4-デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン（CMT-10）
から成る群より選択されるテトラサイクリン化合物の細胞障害性量を接触させること
を含んでなる、癌細胞を殺す方法である。
この実施態様においては、癌細胞は肉腫の細胞、又は腺癌のような癌腫の細胞であり得る。例えば、本方法は、前立腺、乳房、卵巣、精巣、肺、大腸、又は乳房の癌腫の細胞を殺すのに使用できる。好ましくは、癌細胞は、前立腺の癌腫であり、テトラサイクリン化合物は、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である。
さらに他の実施態様においては、本発明は、癌細胞を有する哺乳類に、その癌細胞中に差別的な細胞障害性を誘発するのに十分な量のテトラサイクリン化合物を投与することを含んでなる、哺乳類における癌の成長を抑制する方法であり、このテトラサイクリン化合物は、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、及び
4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシアンヒドロテトラサイクリン（CMT-9）、
及び
4-デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン（CMT-10）
から成る群より選択される。
本発明により、癌細胞を殺す或いは癌の成長又は転移を抑制し、さらに、通常、抗腫瘍性の化学療法的治療に伴う副作用を避け或いは和らげる方法が提供される。本発明のこれらの利点及び他の利点は、後述する詳細な説明及び実施例から明らかになるだろう。詳細な説明及び実施例は、本発明の理解を助けるものであるが、本発明の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
本発明を例証し、説明するための好適な実施例を選択したが、いかなる場合も本発明の範囲を制限するものではない。本発明の特定の観点の好適な実施態様を図面と共に示す。ここで、
図1A〜1Dは、MMP活性におけるCMT-3及びドキシサイクリンの効果を示す、インビトロ前立腺癌細胞から得られた培養上清の酵素電気泳動分析を描写する４枚の電気泳動図：CMT-3（図1A）又はドキシサイクリン（図1B）で処理したTSU PR1前立腺腫瘍細胞；CMT-3（図1C）又はドキシサイクリン（図1D）で処理したMAT LyLu前立腺腫瘍細胞である。
図2A及び図2Bは、LNCaP腫瘍細胞（図2A）;TSU PR1腫瘍細胞（図2B）中でのテトラサイクリン誘導体によるインビトロ用量依存性細胞増殖抑制を示すグラフであり、図2Cは、MAT LyLu腫瘍細胞中である。
図3A〜3Dは、DU-145腫瘍細胞（図3A）;PC-3腫瘍細胞（図3B）;BPH-1非腫瘍化前立腺の上皮細胞（図3C）;及びFHS733正常のヒト線維芽細胞（図3D）中でのテトラサイクリン誘導体によるインビトロ用量依存性細胞増殖抑制を示すグラフである。
図4A及び4Bは、ダニングMAT LyLu腫瘍細胞（ラットの前立腺癌モデル）中でのテトラサイクリン誘導体による細胞障害性のインビトロ用量依存性誘発を示すグラフで、24時間曝露（図4A）;及び48時間曝露（図4B）である。
図5Aは、CMT化合物のインビトロTSU PR1腫瘍細胞（ヒト前立腺癌細胞系）の侵襲性を抑制する能力を比較例証する棒グラフであり、図5Bは、CMT化合物のインビトロMAT LyLu腫瘍細胞の侵襲性を抑制する能力を比較例証する棒グラフである。
図6は、テトラサイクリン化合物によるMAT LyLu腫瘍の転移の抑制を示す棒グラフである。
図7Aは、試験動物へのMAT LyLu腫瘍細胞の移植後の腫瘍発生率を減少させるCMT-3の能力を示す棒グラフ；図7Bは、テトラサイクリン化合物によるMAT LyLu腫瘍転移の抑制を示す棒グラフである。
図8は、メラノーマ細胞の侵襲性の抑制と化学的に修飾されたテトラサイクリンの投与量との関係を示す棒グラフである。
図9A〜図9Dは、正常な前立腺間質性細胞（図9A）;LNCaP腫瘍細胞（図9B）;PC-3腫瘍細胞（図9C）;及びDU-145腫瘍細胞（図9D）中でのCMT-3の用量依存性細胞障害性を示すグラフである。
図10Aは、MAT LyLu細胞によるヌクレオソームの用量依存性テトラサイクリン誘発発生を示す棒グラフであり；図10Bは、MAT LyLu細胞によるヌクレオソームの時間依存性CMT-3誘発発生を示す。
好適な実施態様の詳細な説明
一実施態様においては、本発明は、生体系における細胞増殖、侵襲性及び転移を含む癌の成長を抑制する方法に関する。本方法は、癌の成長の抑制剤としてのテトラサイクリン化合物の使用を含む。本方法は、哺乳類のような生きた動物における癌細胞の増殖、侵襲、転移又は腫瘍の発生を抑制し或いは減少させるように用いることが好ましい。また、本方法は、例えば癌細胞の成長及びその特性をアッセイするアッセイ系での使用にも容易に適用できる。
本発明による有用な化合物は、望ましいが、活性、生物学的利用能、溶解性、及び副作用の減少化を含む独特な組合せの物理化学的特性を有する。これらの特性が、癌の治療に特に望ましい化合物を与える。
例えば、このような化合物は、例えば、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、
４-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）、
4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシアンヒドロテトラサイクリン（CMT-9）、
4-デ（ジメチルアミノ）-5-オキシテトラサイクリン、
5α,6-アンヒドロ-4-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン、
4-デ（ジメチルアミノ）-11-ヒドロキシ-12α-デオキシテトラサイクリン、
12α-デオキシ-4-デオキシ-4-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン、及び
12α,4α-アンヒドロ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン
のような、テトラサイクリン環構造の4位でジメチルアミノ基を欠失した化合物を含む。
抗菌活性を減じるために修飾された他の実施例としては、6-α-ベンジルチオメチレンテトラサイクリン、テトラサイクリンのモノ-N-アルキル化アミド、6-フルオロ-6-デメチルテトラサイクリン、11α-クロロテトラサイクリン、テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、及びテトラサイクリンピラゾール（CMT-5）がある。
好ましいテトラサイクリン化合物は、
4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、
6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、
4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、及び
6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）
を含む。
最も好ましいテトラサイクリン化合物は、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）である。これらの化合物の組合せも使用できる。ドキシサイクリンは、本発明には含まれない。
これらの化合物は、公知の化学療法的薬剤よりも副作用が少ないような濃度で癌抑制特性を示し、副作用が実質的にない場合もある。例えば、化合物の有効な濃度は、いかなる有意な抗菌活性を示さない。これらテトラサイクリン化合物は、他の化合物では望ましくない副作用を示すであろう長期的な治療法に使用できる。さらに、これらの化合物においては、親水性と疎水性がよく均衡がとれ、インビトロ及び特にインビボの両方での使用を促すと考えられる。一方、そのような均衡を欠く他の化合物は、実質的にほとんど利用できない。特に、これら化合物は、水溶性媒体での適度な溶解性を有し、体内での吸収及び生物学的利用能を高めながら、脂質に対しても溶解性を有し、推定作用部位へ向けて細胞膜を横断することができる。これら化合物は腫瘍部位に運ばれると、最大の効果を示し、腫瘍細胞に入ることができる。
特定の局在化された癌の治療においては、非抗菌性テトラサイクリン化合物の親水性の度合いは、それほど重要でない。テトラサイクリノニトリル（CMT-2）及び４-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）のような水溶液系では低い溶解度の化合物は、例えばメラノーマ或いは基礎細胞癌腫のような皮膚癌の直接的又は局所的治療に使用でき、又は脳に移植して脳腫瘍の局所的な治療に使用できる。成熟したラットにこれらの２つのCMTを経口的に胃管栄養法で施す動物実験では、これら化合物の血中レベルは検出されず、全身性の吸収の欠如及び／又は異常に速い排泄を示した。
本発明のこの実施態様は、化学的に修飾されて本質的にすべての抗菌性を除去した特定のテトラサイクリン化合物は、インビトロのみならずインビボでも癌細胞の増殖、侵襲性、又は転移を抑制する効果があるという出願人らの予想外の観察に基づく。これらのうち、特に好ましいCMT、すなわち6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（“CMT-3”ともいわれる）は、癌細胞の増殖、侵襲性又は転移を含む癌の成長を抑制する異常に強い活性を有することが示されるという点では、すばらしく均衡のとれた特性を有するようである。CMT-3の他の利点は、予想外に長い血漿内半減期（約28時間）を有することである。従って、CMT-3は、周期的な投与、例えば１週間に1、2回だけ必要とされる。
他の実施態様においては、本発明の方法は、哺乳類における癌性腫瘍に伴うコラゲナーゼ及びゼラチナーゼのようなマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素活性の抑制に有効である。抑制可能なゼラチン分解活性は、癌性腫瘍によるゼラチナーゼ発現又は、正常な、すなわち非癌性の組織由来でもよい。特に、ゼラチナーゼ活性は、上皮組織又は間質性組織由来でもよい。さらに好ましくは、本方法を使用して、このような腫瘍に伴う過剰なゼラチン分解活性を抑制することができる。抑制可能なゼラチナーゼは、ゼラチナーゼA（72kDa型ゼラチナーゼ；MMP-2;型IVコラゲナーゼとしても知られる）；及びゼラチナーゼB（92kDa型ゼラチナーゼ；MMP-9;型Vコラゲナーゼとしても知られる）を包含する。ゼラチン分解活性に見られるこの抑制は、MMP活性、MMP発現の下方制御、又は酵素、プロ-ゼラチナーゼ（又はプロ-MMP）の前駆体型の活性化の抑制のようなこれらゼラチナーゼに伴う他の生理機能の妨害の抑制によるかもしれない。
出願人らは、本発明について何らかの特定の機構に結びつけたくはないが、出願人らは、CMTが、とりわけ、癌の状況で基本的に未知の機構で作用することを見いだし驚いた。出願人らは、化学的に修飾されたテトラサイクリンは、通常癌に伴うメタロプロテイナーゼの発現のレベルを減少させる（“下方制御”）することを発見した。例えば、CMT-3はヒトの結腸直腸癌細胞によるゼラチナーゼAの発現を減少させ、ヒトの乳癌細胞によるゼラチナーゼBの発現を抑制する。出願人らは、この観察は癌の治療に療法的関係をもたらすと考える。また、出願人らは、CMT及び他の化学的及び機能的に関連する化合物は過剰なゼラチナーゼの発現又は活性の特徴がある他の疾病の結果を抑制するために有用であると考える。
本発明は、癌細胞中に細胞障害活性（細胞致死）を誘発し又は癌細胞の生存力を減少させる方法を包含する。テトラサイクリン化合物の細胞障害性は、好ましくは肉腫又は癌腫、例えば腺癌の細胞に対して利用できる。例えば、本発明を使用して、前立腺、乳房、卵巣、精巣、肺、又は乳房の癌腫の細胞に細胞障害性を誘発することができる。この細胞障害性が生じる機構は完全には分からないが、癌細胞を選択的に殺すことは、アポトーシス、壊死、他の機構、又は組み合わされた機構により生じうる。
癌細胞の致死は、従来の細胞障害性治療におけるよりも正常の細胞或いは組織には細胞障害性が小さく、好ましくは、実質的に正常の細胞或いは組織には細胞障害性でなく生じ得る。例えば、予期せずに、テトラサイクリン、例えばCMT-3は、癌細胞内では細胞障害性を誘発するが、正常な細胞又は組織内では実質的にほとんど細胞障害性を生じないことがわかった。このように、従来の細胞障害性抗癌療法が通常すべての成長細胞を殺すのとは異なり、CMT-3は差別的に細胞障害性（正常な細胞は容赦される一方、選択的に腫瘍細胞が殺される）を引き起こす。従って、他の実施態様においては、本発明は、正常な細胞又は組織内に比し、癌細胞において差別的な細胞障害性を誘発する方法である。このテトラサイクリン化合物による予期しない差別的な細胞障害性は、アポトーシス、壊死、他の機構、又は組み合わされた機構の結果として生じる。
以下の実施例で示すデータは、これら化合物で処理すると、癌細胞は細胞外のゼラチン分解活性を減少させ、投与量に応じて細胞のインビトロ侵襲力を減少させ、かつ、細胞のインビボ転移活性を減少させることを示している。さらに、化合物は、腫瘍細胞の致死を誘発し、かつ、正常な組織にはほとんど細胞障害性でなくそうすることができる。従って、これらの化学的に修飾されたテトラサイクリンを使用して特定の癌に伴う転移の形成及び規模を抑制でき、他の治療方法に加えて使用することができ、かつ、転移性癌の治療に多大な効果をもたらすことができる。
本発明によって治療できる癌は哺乳類に生じる。哺乳類には、例えば、ヒトのみならずイヌ及びネコのようなペット動物、ラット及びマウスのような実験動物、及びウマ及びウシのような農場動物も含まれる。
腫瘍或いは新生物には、細胞の多分化が制御されずに進行的である組織の新しい成長が包含される。このような成長には良性のものもあるが、他は生物体を死に至らしめる“悪性”と言われる。悪性新生物或いは“癌”は、進行的な細胞増殖を示す点で良性の成長とは区別され、それらは周囲に侵入して転移する。さらに、悪性新生物は、差別化の著しい欠如（より“比差別化”）、及び良性腫瘍及び周囲の組織に比べ組織化の著しい欠失を示す特徴がある。この特性は、“退形成”とも呼ばれる。
本発明で治療可能な新生物は、すべての固体腫瘍、すなわち、癌腫及び肉腫を含む。癌腫は、周囲の組織に浸潤して（侵入して）て転移を起こし易い上皮細胞に由来する悪性新生物を含む。腺癌は、腺組織由来の、或いは腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫である。肉腫は、細胞が胚結合組織のような原繊維体の或いは均質体に包埋された腫瘍を広く含む。
ここで、本発明を実験的に確認された癌の特定タイプの治療に関して説明する。これらの実例となる治療は、標準的な最新のインビトロ及びインビボモデルを使用した。これらのモデルを使用してインビボ治療法において有効であると考えられる薬剤を同定することができる。しかしながら、本発明の方法は、これらの腫瘍タイプの治療に限定されず、いかなる器官系由来のいかなる固体腫瘍にも拡張できるものである。侵襲性又は転移性がMMP発現、特にゼラチナーゼ発現に関連する癌は、本発明により、特に抑制され或いは消失さえされやすい。
そして、治療可能な癌には、例えば、大腸癌、膀胱癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は肺癌、及び他の種々の癌をも包含する。本発明は、例えば、前立腺、乳房、腎臓、卵巣、精巣、及び大腸の腺癌を包含する腺癌における癌の成長の抑制に特に有効である。さらに本発明は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞由来のメラノーマに対しても有効である。
本発明は、哺乳類における癌細胞の成長、すなわち細胞の増殖、侵襲、転移、又は腫瘍の発生を減少させるために有効な量のテトラサイクリン化合物部を与え或いは投与することを包含する。抑制は、MMP活性の抑制、MMP発現の下方制御、他の機構、又は組合せ機構によってなされる。例えば、出願人は、CMT-3がインビトロ癌細胞中のMMP-2及びMMP-9の発現を抑制することを見いだした。MMPsを発現し、又は侵襲性或いは転移性を示すすべての固体癌のタイプは、本発明の方法で治療できると考えられる。時には、腫瘍の病巣の発生或いは発展を抑制し、或いは実質的に発生を防ぐことができる。従って、本方法は、例えば、癌になる素因に伴う遺伝子生成物又は代謝物が検出されたが、何らかの特定の癌性の病変が検出される前に、哺乳類にテトラサイクリン化合物を投与することによって、予防的治療として使用できる。代替的に、例えば、手術による切除又は放射線療法の後に残りの癌を処理することで、テトラサイクリン化合物は癌の再発予防に利用できる。本発明に使用できるテトラサイクリン化合物は、他の癌治療に比し、実質的に無害なので、特に有利である。
効果は、非常に低濃度を含め、広範囲の濃度で生じる。本発明に使用されるテトラサイクリン化合物の量は、癌の成長を効率的に抑制できる量である。テトラサイクリン化合物の量は、細胞の増殖又は侵襲力或いは転移力をかなり減少させる場合に、癌の成長の抑制に有効である。増殖は、通常“倍増速度”で測定される腫瘍の体積を細胞分裂によって増加させる腫瘍の能力を指す。本発明の方法による細胞増殖の抑制は、成長速度の減少を意味する。時には、本方法は、細胞分裂による腫瘍細胞の補充速度が細胞の死滅速度を超えた場合に、実際に腫瘍の質量の退化或いは減少を促すことができる。侵襲性は、他の組織に侵入して通常はその組織の細胞外マトリックスを破壊する腫瘍或いは腫瘍細胞の能力を指す。転移は、腫瘍或いは腫瘍細胞が最初に生じた部位からは離れた部位に新しい病巣を定着させる能力を指す。一般的に、転移は個々の細胞或いは細胞の集団が初期の腫瘍から裂け、例えば血液或いはリンパ液を通じて移動して他の組織或いは器官に新しい腫瘍の病巣を定着させることで進行する。腫瘍転移における通常の一座位は、肺中にあり、肺組織の極微細血管は循環する腫瘍細胞をよく捕らえ、その中に腫瘍の病巣を定着させる。あるタイプの腫瘍は、特異的なタイプの組織に転移する。例えば、前立腺癌は、非常に特異的に骨に転移しうる。本明細書で示したデータにより、これらのパラメータのいずれか或いはすべてによって示されるように、本発明の方法は癌の成長及び再発を抑制することができることが明らかになる。
テトラサイクリン化合物は、抗菌活性が少なく或いは無いような量で与えられることが好ましい。テトラサイクリン化合物は、細菌の成長をほとんど妨害しない場合に、抗菌効力がない。従って、本方法は、化学的に修飾してその抗菌特性を減少或いは除去したテトラサイクリン化合物を有利に使用できる。このような化学的に修飾されたテトラサイクリンの使用は、抗菌性のテトラサイクリンよりも高レベルで使用できるので、本発明においては好ましく、抗菌性量のこのような化合物を長期間にわたり使用するとよく起こる有益な細菌を無差別的に殺してしまい、細菌抵抗性が生じてしまうというような特有の欠点を避けることができる。
本発明の方法に有用なテトラサイクリンは、投与量に依存した形で有利な効果を示す。従って、広い範囲で、多量のテトラサイクリン化合物を投与すると、少量の投与におけるよりも高い割合で癌細胞の成長或いは侵襲性を抑制することが認められた。さらに、効果は、毒性が正常な細胞中では観察されないレベル又は有機体レベル以下の投与でも認められた。従って、本発明の利点の１つは、従来の細胞障害的癌治療においては通常付随していた副作用を弱め、好ましくは避けることである。
被験者に対する最大投与量は、望ましくない或いは耐えられない副作用が生じない最大の投与量である。例えば、テトラサイクリン化合物は、約0.1mg/kg/日〜約30mg/kg/日、好ましくは、約1mg/kg/日〜約18mg/kg/日の量で投与できる。本発明の目的のため、副作用には、毒性効果のみならず、臨床的に有意な抗菌性或いは抗菌活性を含む。例えば、約50mg/kg/日を超える投与量は、ヒトを含むほとんどの哺乳類に副作用を生じるようである。いずれにしても、熟練家は本分野における技術及び知識によって導かれるように、本発明は、限定するわけではないはないが、記載した現象を達成できる有効量を含む。
また、本発明は、テトラサイクリン化合物と共に、いずれの化学療法剤のような１種以上の他の抗癌化学療法剤を含んでもよい。このような他の薬剤と組み合わせると、化学療法手順を効率化できる。熟練家にとっては、本発明の方法に取り込み可能な多数の化学療法手順が考えられるだろう。アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン及びアンタゴニスト、放射性同位体、並びに天然物を含めいずれの化学療法手順も使用できる。例えば、非抗菌性のテトラサイクリン化合物は、ドキソルビシン及び他のアントラサイクリン類似体、シクロフォスファミドのようなナイトロジェンマスタード、5-フルオロウラシルのようなピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシウレア、タキソール及びその天然の或いは合成誘導体等と共に使用できる。他の実施例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性の細胞を含む乳房及び前立腺の腺癌のように腫瘍が混合されている場合は、テトラサイクリンは、ロイプロリド（leuprolide）又はゴセリン（LH-RHの合成ペプチド類似体）と共に投与できる。他の抗腫瘍性手順は、他の治療方法、例えば、手術、放射線照射、他の化学療法剤等（ここで、“付属的抗腫瘍性方法”という。）と共にテトラサイクリン化合物を使用することを含む。このように、本発明の方法は、このような従来の方法と共に用いて副作用を減少させ、効果を高める利点がある。
本発明の方法に使用する好ましい薬剤組成物は、当業者には理解されるように、適切な薬剤キャリヤー（媒介物）中のテトラサイクリン化合物の配合又は賦形剤を含む。
経腸的な投与が、好ましいテトラサイクリンの供給経路であり、テトラサイクリン化合物含有組成物は、適切な希釈液、キャリヤー等と共に容易に調剤できる。液体又は固体（例えば、錠剤、ゼラチンカプセル）の剤形が使用できる。多くの場合に、テトラサイクリン化合物は、従来の化学療法剤で通常要求される非経口的な供給（例えば、注射、注入）に対して経口的に供給できることは本発明の利点に含まれる。
また、非経口的使用（例えば、静脈内、筋肉内、皮下注射）も考えられ、当業者には公知の従来の希釈液、キャリヤー等を用いる製剤を使用して化合物を供給できる。
代替的に、テトラサイクリン化合物の供給は局所的用途を含むことができる。このような局所的使用に好適と考えられる組成物は、ゲル、軟膏、ローション、軟膏剤等として含まれる。脳腫瘍のような体内に病巣を有する腫瘍の場合は、テトラサイクリン化合物は、例えば重合物質のようなゆっくり運ぶ媒介物を経て、外科的にその障害部位に或いはその近傍に移植して供給することができる。
本発明の開発においては、数種の化学的に修飾されたテトラサイクリン（CMTs）の癌の成長を抑制する効果について（市販されている抗菌性のテトラサイクリン、ドキシサイクリンと比較して）試験した。この試験で、前立腺癌細胞についてのインビトロ増殖及び侵襲力、及びインビボ腫瘍モデル、ラットダニングMAT LyLuの腫瘍の成長及び／又は肺のコロニー形成についてのこれらの化合物の効果を調べた。インビトロ実験の際、抗菌性ドキシサイクリン及び特定の非抗菌性CMTsが、ヒトの前立腺腫瘍細胞系（PC-3、DU-145、TSU PR1、及びLNCaP）、及びダニング前立腺腫瘍細胞の細胞増殖を抑制した（IC50=3-120μg/mL）。また、ドキシサイクリン及びCMTsは、化合物により、10％〜90％で侵襲力を抑制した。CMT-3（6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン）は、最も強力なテトラサイクリン類似体であり、経口投与によってインビボで容易に達成できる投与量、5μg/mLで90％の侵襲力を抑制する。初期的な部位（s.c.）でのダニング腫瘍の成長は、腫瘍の移植後21日間毎日経口的胃管栄養法でドキシサイクリン又はCMT-3で処理したラットにおいては、ほとんど変化しなかった。しかしながら、肺転移の数は非常に減少し：CMT-3処理されたグループにおける28.9±15.4部位／動物に対して、対照（p＜0.01）における59.5±13.9部位／動物、同様に経口投与したドキシサイクリンでは2倍の効果を示した。腫瘍の移植の前に7日間予備的に投与したラットは、腫瘍の成長が著しく遅れ（46±9.3％、p＜0.05）、転移も減少した。さらに、CMT-3（40mg/kg）で処理したグループでは、腫瘍の緩解（腫瘍発生の抑制）が起こった。しかし、ドキシサイクリンによる処理では、腫瘍の緩解はなかった。さらに、CMT-3で処理したグループでは肺転移の数が58±8％減少したのに対し、、ドキシサイクリンのグループでは33±7.0％の減少であった。ここで述べたいずれの実験においても、薬物の導入による罹患はほとんど観察されなかった。これらの結果は、腫瘍の進行を制御し、転移を妨げるための化学療法におけるCMT-3の有用性をさらに実証するものである。
後述する他の実験では、非常に侵襲性で転移性のヒトメラノーマ細胞系C8161からのゼラチナーゼA及びB活性の細胞外レベルにおけるドキシサイクリン及びCMTsの効果を調べ、インビトロ侵襲性アッセイ及びインビボSCIDマウスモデルでの細胞の生物学的挙動における変化に関する観察と関連づけた。その結果、ゼラチナーゼ活性の細胞外レベルを差別的に抑制するこれらの化合物の効力と一致し、ドキシサイクリン及びCMT-1、CMT-3及びCMT-6で処理したC8161は、投与量に依存して（3-50μg/mL）、インビトロ侵襲性が小さかった。さらに、インビボモデルから導びかれたデータは、CMT-1及びCMT-3を経口的に投与されたSCIDマウスは、尾静脈注射によりC8161細胞の静脈内注入後の肺転移の数が減少することを示している。
以下の実施例は、本発明の理解をさらに助けるために示す。使用される特定の物質及び条件は、本発明をさらに説明するためのもので、それらの妥当な範囲を制限するものではない。
実施例1A
癌細胞における酵素発現の抑制
２つのヒト癌由来の細胞系は、Rockville,MDのAmerican Type Culture Collection（ATCC）から得た。細胞系は、COLO 205、すなわちMMP-2又はゼラチナーゼAを発現するヒト大腸癌由来の誘導細胞系、及びE-10、すなわちMMP-9又はゼラチナーゼBを発現するヒト乳癌由来の細胞系を含む。
各細胞系の細胞を、75cm2のT-フラスコ内で、100ユニット/mLのペニシリン及び100μg/mLのストレプトマイシンを含有する10％の熱不活性化胎性ウシ血清（FBS）を有するRPMI-1640（Gibco）中に培養した。細胞を２日ごとに供給し、１週間ごとに継代させた。細胞が80-90％集密に成長したら、FBS含有培地を無血清培地（SFM）に置き換えた。CMT-3（CollaGenex Pharmaceuticals,Inc.,Newtown,PA）をSFM中の細胞に数種の濃度で添加した。24時間後に培養上清を収集し、遠心分離で細胞デブリを除去し、常法でウエスタンブロットにより、MMPタンパク質の発現についてアッセイし、レーザー濃度計でブロットをスキャンした。得られたデータを下表１にまとめた。
0004428727.tif 000004
これらのデータは、２つの異なるタイプの癌細胞についての２つの異なるMMPの発現の抑制におけるCMT-3の用量依存活性を明かに示している。MMP発現の抑制は、これらの癌細胞の効力を抑制して健康な組織の細胞外マトリックスを分解し、そのためそのような健康な組織を侵襲する癌の効力を制限すると考えられる。癌細胞のインビトロ増殖及びインビボ癌転移の抑制に関し、以下に数例を示す。
実施例1B
癌細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ活性の抑制
前立腺癌細胞によるゼラチナーゼの活性又は発現についてのCMT-3及びドキシサイクリンの効力を試験した。まず、培地へのMMP分泌を抑制するCMT-3及びドキシサイクリンの能力を調べた。ゼラチナーゼ活性は、Dean及びWoessner（1985）の方法に適応した方法で測定した。培養上清を、２日間CMT-3又はドキシサイクリンで処理したMAT LyLu及びTSU PR1細胞から収集した。無血清培地は、インシュリン（5μg/mL）、トランスフェリン（5μg/mL）、亜セレン酸（5ng/mL）、及びゲンタマイシン（2ng/mL,）を含有するPRMI 1640基本培地を含む。これらの培養上清の初期的アッセイにより、MMPアッセイと干渉するTIMPの存在がわかった。そこで、培養上清を化学的に減少させ（1mMジチオスレイトール）、37℃で30分間ごとにアルキル化し（1mMヨードアセトアミド）、そして透析して内在性のTIMPを破壊した。（Deanら、1987;Woessner 1991）。透析された培地を37℃で30分間1mMのp-アミノフェニル酢酸水銀（APMA）で潜在性のMMPsの活性化の後、ゼラチナーゼの活性についてアッセイした。アッセイ混合物は、25μg 3H-ゼラチン（3H-アセチル化酸溶解性コラーゲンを熱変性して調製）、0.1mLの処理された培養上清、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、全体積0.5mLのアッセイバッファー（20mM Tris-HCl、pH7.4、30mM NaCl、0.005％ Brij 35、10mM CaCl2、2μM ZnSO4、及び0.02％ NaN3）である。時には、1mM CaCl2（10mMの代わりに）を使用した。ブランクは、1mM 1,10-フェナントロリンを加えて得た。潜在性MMPの活性化後、基質3H-ゼラチンを添加する直前にドキシサイクリン又はCMT-3をアッセイ混合物に添加した。
さらに、ドキシサイクリン又はCMT-3のMMPのAPMA活性化抑制力を試験した。処理された培養上清を薬剤と共に1時間インキュベートし、1mM APMAを添加し、さらに2時間インキュベーションを続けた。そして、3H-ゼラチンを加え、4時間アッセイを続けた。すべてのアッセイは、二組の管で行い、少なくとも２回繰り返した。
MMPの活性を、アッセイバッファー中の［Zn2+］に変化のない1mM及び10mM CaCl2で調べた。生理的濃度に近い濃度である1mM CaCl2、及びインビトロアッセイでの最適濃度と報告されている（Woessner 1991）10mM CaCl2を使用した。表2に示されるように、CMT-3及びドキシサイクリンの両方ともインビトロ活性化ゼラチナーゼを抑制した。1mM CaCl2におけるCMT-3の50％抑制投与量（IC50）は0.5μMであり、10mM CaCl2におけるCMT-3のIC50は、〜1.5μMであった。対照的に、．10mM CaCl2におけるドキシサイクリンのIC50は5.0μM.であった。さらに、これら両薬剤は、ｐ-アミノフェニル酢酸水銀によって、MMPsの活性化を強く抑制した；10mM CaCl2．におけるCMT-3のIC50は1.0μg/mL（2.2μM）、ドキシサイクリンについては2.5μg/mL（5μM）であった。
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次に、CMT-3及びドキシサイクリンが、ゼラチナーゼの２主分類：ゼラチナーゼA（MMP-2）及びゼラチナーゼB（MMP-9）の産生に差別的に影響するかどうかを調べた。TSU PR1及びMAT LyLu細胞の集密的な培養を、種々の濃度のドキシサイクリン及びCMT-3と共に無血清培地中で48時間インキュベートした。そして、後述するように、培養上清をザイモグラフィーでMMPについて分析した。
培養上清を２日間ドキシサイクリン及びCMT-3で処理した培養から収集した。そして、培地をSDS-ゲル電気泳動試料バッファーと共に３０分間室温でインキュベートし、ゼラチン（1mg/mL）含有のSDS-ポリアクリルアミドゲル（8％）上でゲル電気泳動によって分析した。電気泳動に続き、ゲルを0.25％ TRITON▲Ｒ▼ X100で２回それぞれ30分間洗浄し、30mM NaCl、1mM PMSF、10mM CaCl2、2μM ZnSO4、0.005％ Brij35、及び0.02NaN3（Lokeshwar 1993a）を含有する20mM Tris-HCl、pH7.4を含むMMP消化バッファー中で18時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、ゲルを蒸留水で簡単にすすぎ、1時間、40％イソプロパノール溶液中で調製した0.25％クーマシーブリリアントブルーR250で染色した。ゲルを7％酢酸で脱色した。ゲル中のMMPsの位置が、消化されたゼラチンを示すブルー背景上のはっきりした領域として見えた。
その結果を図1A〜1Dに示した。両細胞系から得られた培養上清は、主にMMP-2及びMMP-9を含んでいた。TSU PR1培地は、主にこれら２つの酵素の潜在型を含み（図1A及び1B）、一方MAT LyLu培地は活性化MMP-2を含むが、ほとんどMMP-9は含んでいなかった（図1C及び1D）。
両薬剤は、MMP-2レベルにおいて用量依存的な減少を引き起こした。しかしながら、CMT-3は、ドキシサイクリンよりも低濃度でMMP-2及びMMP-9レベルを減少させた。さらに、MMP-9レベルはドキシサイクリンの濃度を高めてもほとんど減少しなかった。すべての系が同一タンパク質総量で装填されたので、２つのテトラサイクリン化合物の濃度増加によるMMPレベルの減少は、MMPに特異的であった。
実施例2-6
以下、実施例2-6では、次の物質及び方法を用いた。
試薬：化学的に修飾されたテトラサイクリンは、公知の方法で調製した。種々のCMTsの合成は、広範に文書化されている。例えば、Mitscher（1978）を参照せよ。以下のCMTsを調べた：4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-1）、テトラサイクリノニトリル（CMT-2）、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-3）、4-デ（ジメチルアミノ）-7-クロロテトラサイクリン（CMT-4）、４-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-6）、4-デ（ジメチルアミノ）-12α-デオキシテトラサイクリン（CMT-7）、6α-デオキシ-5-ヒドロキシ-4-デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン（CMT-8）。動物の研究に用いられる高純度のCMT-3（93-98％）は、CollaGenex,Inc.,Newtown,PA.から得た。ドキシサイクリンは、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MOから購入した。腫瘍基底膜の可溶性標本であるMatrigelは、Collaborative Research,Bedford,MAから得た。Borden Chemotaxisアッセイチャンバー（Transwells）は、Costar/Corning Corp.,Boston,MAから得た。すべての他の試薬は、Sigma Chemical Co.から得た。
細胞及び腫瘍系：ヒト前立腺癌細胞系：PC-3、DU-145、及びLNCaPは、American Type Culture Collection,Rockville,MDから得た。また、TSU PR1及びALVA 101、ヒトの転移性前立腺癌細胞系、及びBPH-1、非腫瘍化前立腺細胞系も使用した（Lokeshwar 1995b,1996;Hayward（1995）。培養は、10％ウシ胎性血清及び10μg/mLゲンタマイシンを有するRPMI-1640培地からなる完全培地中で維持した。ダニングMAT LyLuラット腫瘍系は、コペンハーゲンラットのリンパ節及び肺に転移するアンドロゲンゲン-非感受性の前立腺腫瘍モデルである。MAT LyLu細胞を、250nMデキサメサゾンが添加された完全培地中で維持した。
腫瘍の発生及び処理  ダニングMAT LyLu細胞を培養フラスコから収獲し、2×105〜2×106細胞/mL含有の0.5mL懸濁液を、成熟コペンハーゲンラット（Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN）の背側に接種した。ラットは、体重250-300g、90-100日齢であった。腫瘍細胞の移植後、最初の3日で注入した部位の周りの皮膚を触診して、腫瘍を検出した（Lokeshwar et al.1995a）。
インビボ薬剤処理  可溶型カルボキシメチルセルロース（Sigma Cat.No.C-5678）の2％水溶液にドキシサイクリン及びCMT-3を溶解し、毎日新鮮な溶液を調製した。毎日ラットに胃管栄養法により1mLの薬剤溶液（以下の特定濃度）、又は媒体（2％カルボキシメチルセルロース）与えた。週３回、腫瘍の成長を記録し、毎週、ラットの体重を測定した。腫瘍の成長に対する種々の処理の効果をノギスを用いて観察し、体積を楕円体（すなわち、体積＝長さ×幅×高さ×0.5236）（Lokeshwar et al.1993b）に近似した。腫瘍の成長速度は、おのおのの腫瘍担持ラットについて、腫瘍体積対時間による回帰分析で決定した。各処理グループについての腫瘍成長平均速度（体積が固定するまでの時間）を用いて、INSTAT統計プログラム（Ravitz Software,San Diego,CA）により処理効率の統計的有意性を評価した。腫瘍の体積が≧10cm3になったらすぐにラットを安楽死させた。そして、動物を剖検し、腫瘍及び肺を除去してブアン固定液中に固定した。肺上の肉眼的腫瘍病巣を解剖顕微鏡下で数えた。
実施例2
インビボ前立腺癌細胞増殖におけるCMTsの効果
前立腺癌細胞系におけるCMTsの細胞障害性を測定するために、TSU-PR1細胞（及び他の腫瘍細胞系）を種々のCMTs又はドキシサイクリンに、完全培地中に24時間又は48時間曝した。細胞の生存度（生きた細胞のパーセント）は、リパンブルー染色後に細胞を数えて評価した。また、細胞の生存度は、テトラゾリウム色素還元アッセイ（MTT assay）（Lokeshwar et al.1995b）によっても評価した。癌細胞の攻撃的な増殖力のため、生細胞は活発に増殖すると想定される。従って、生存度の測定は、増殖の評価として使用した。結果を３つの別の実験の平均±SEMとして表した。
ドキシサイクリン及びいくつかのCMTsは、細胞の生存度を減少させたので、インビトロ細胞増殖を抑制することがわかった。細胞増殖の抑制は、薬剤の濃度及び曝露の持続期間に比例するが、化合物を変えるとかなり変化した。特に、CMT-2及びCMT-3は、ドキシサイクリンよりかなり細胞障害性が高かった。２つのヒト前立腺癌細胞系DU-145及びTSU-PR1に対する種々のCMTsについての50％抑制用量（IC50）は、2.7μg/mL（CMT-3、48時間曝露）から120μg/mL（CMT-6）の範囲であった。CMT-5は抑制性でなかった。代表的な結果を細胞系LNCaP、TSU PR1及びMAT LyLuについて示す。ここで、CMTsのパネルは、ドキシサイクリン（図2A-2C）;及び細胞系DU-145、PC-3、BPH-1及びFHS733（正常なヒト線維芽細胞系）について（図3A-3D）である。
実施例3A
インビトロMAT LyLu細胞におけるCMTsの細胞障害性効果
ドキシサイクリン及びいくつかのCMTs（CMT-2、CMT-3、及びCMT-6）をインビトロダニングMAT LyLu細胞について調べ、同様の結果を得た。ダニングMAT LyLu細胞を24時間又は48時間薬剤に曝し、細胞の生存度を評価した。細胞の生存度は、薬剤への曝露後トリパンブルー染色によって評価した。これらの研究の結果を図4A（24時間）及び図4B（48時間）．にまとめた。データは、３つの別の実験による平均±SEMとして示した。このアッセイでは、CMT-3及びCMT-2が最も有効な細胞増殖抑制剤であった。
実施例3B
インビトロ前立腺癌細胞におけるCMT-3の効果
上述のデータにより、CMT-3が、すべてのCMTsのインビトロ試験の中で最も強力（最も細胞障害性）であると思われる。この観測を確かめるため、正常なヒトの前立腺細胞系のパネルに対するCMT-3とドキシサイクリンの細胞障害性を比較した。細胞障害性は、MTTアッセイ（上記参照）及びLokeshwarら（1995a）に記載されている細胞性チミジン取り込みアッセイを使用して測定した。両アッセイを用いて得られた50％成長抑制（GI50）値は等しかった。下表3にまとめられデータに示されるように、CMT-3は、ドキシサイクリンより2〜８ホールド細胞障害性であった。
0004428727.tif 000006
成長抑制は、各実験に対して生成された用量反応曲線の直線回帰から、対数（用量）対細胞増殖（対照の％）を使用して計算した。相関係数（r）は常に≧0.95（負）であった。結果は、各実験により計算された少なくとも３つのGI50値の平均±SEMとして表した。
実施例4
前立腺癌細胞の侵襲／転移力についてのCMTsの効果
特定のCMTsで処理した前立腺癌細胞は、腫瘍基底膜の形成物に侵入する細胞の能力をかなり抑制した（Lokeshwar et al.1996）。この方法では、4×105腫瘍細胞をボイデン化学走性アッセイチャンバー（Costar Transwellプレート）の頂部チャンバー上にプレートした。チャンバーの底側は、Matrigelの0.5mm薄層で層化された12μm-細孔ポリカーボネートフィルターである。底部ウェルは、化学遊走物質、FHS 733細胞系、すなわちヒトの胎性肺線維芽細胞（ATCC番号HTB-157）からの無血清培養培地を含む。チャンバーセル（4×105）をプレートの頂部ウェルにプレートした。ドキシサイクリン又はCMTsを無血清培地中で5μg/mLに希釈し、チャンバーの頂部と底部に添加した。対照ウェルは、0.1％ジメチルスルホキシド（DMSO、希釈剤）のみを含む。48時間のインキュベーション後、頂部ウェルと底部ウェルの両方にMTTを添加し（0.5mg/mL）、インキュベーションを4時間続けた。そして、ウェルを空にし、フィルターの裏面から細胞をフィルターチップで底部ウェルにプールした。頂部及び底部のウェルから還元されたMTT（ホルマザン）をDMSOで一昼夜溶解し、515nmでの吸光度（O.D.）を測定した。侵襲力として、底部からのO.D.の全O.D.（すなわち、頂部ウェルO.D.プラス底部ウェルのO.D.）に対する比率を取った。この手順は、初期の報告で用いた方法（Albiniら、1987）、ここでは、フィルターの底部の細胞をいくつかのランダムに選択された光フィールドから数えていた、より確実に優れる。また、MTTアッセイ法は、調査中の薬剤の細胞障害効力に起因する同一の抑制を規準化した。結果は、３つの独立した実験から示された。
TSU-PR1及びダニングMAT LyLu細胞の侵襲力に対するCMT-3及び他のテトラサイクリン化合物の効果を、Matrigelアッセイで評価した。図5に示されるように、これら化合物の侵襲活性の抑制は非常に変化した。CMT-3は最も強く、CMT-7は最も弱い、TSU-PR1細胞の侵襲／転移力の抑制剤であった。CMTsは、通常のテトラサイクリン、ドキシサイクリンに比し、驚くべき効力で、TSU-PR1細胞のMatrigel侵襲性の適度な（8±1.8％）抑制のみを引き起こした。特に、種々のCMTsから計算された50％抑制容量（IC50）は、CMT-3についての1.7±0.31μg/mLからCMT-7についての>100μg/mLに変化した。ドキシサイクリンは、TSU PR1細胞内ではあまり抑制しなかった（IC50＝27±4.3μg/mL）。３つの他の侵襲性ヒト前立腺癌細胞系（DU 145、PC-3、及びALVA 101）に関するCMT-3及びドキシサイクリンについてのIC50値は、TSU PR1（データは示さず）についてと同様の濃度範囲であった。
ダニング細胞中で、CMT-2とCMT-3の両方がMatrigel侵襲を等しく抑制した。図5Bを参照せよ。さらに、ドキシサイクリンも、48時間にわたり、ダニングMAT LyLu細胞の侵襲／転移力をかなり抑制した（68±4.2％）。侵襲力の有意な抑制を達成するためには、継続的に薬剤が存在する必要があった。CMT-3で48時間の予備処理後、侵襲チャンバー中の薬剤を除去すると、侵襲力について適度な効果のみを有していた。
48時間の侵襲性アッセイは、対照ウェル（0.1％ DMSO）内で以下の侵襲指数を示した：TSU-PR1細胞について22±8.3及びMAT LyLu細胞について17±4.2％。
実施例5
MAT LyLu腫瘍の成長及び肺転移についてのCMT-3の効果
インビボ抗腫瘍活性について、CMT-3及びドキシサイクリンを試験した。実験のこのシリーズにおいては、薬剤の毎日の胃管栄養法は、腫瘍細胞を試験動物に移植した同じ日に開始した。腫瘍の成長は、1×106腫瘍細胞の皮下注射によって開始された。
腫瘍は、６日までに、注入された動物の50％以上で容易に知覚でき（≧0.1cm3）、12日までに動物の100％で知覚できた。腫瘍は、体積が急速に増加し、移植後15日までに、>10cm3に達した。体積が3cm3に達する時間として決定した腫瘍の成長速度は、20mg/kg又は40mg/kgの濃度のドキシサイクリン又はCMT-3で処理したラットと、媒体（カルボキシメチルセルロースの2％溶液）のみを与えたラットとの間でほとんど変化がなかった。腫瘍の体積についての回帰分析により、対照グループと、ドキシサイクリン及びCMT-3処理グループとの間の初期腫瘍成長には有意な差がないことがわかった。特に、注入から3cm3の腫瘍の成長までの時間は、対照グループでは13.57±2.12日、CMT-3-処理グループでは14.0±1.9日であった。対照グループ及び薬剤処理グループからの腫瘍のすべては、腫瘍が10cm3又はそれ以上に成長するにつれて、壊死中心を大きく発展させた。
転移性腫瘍病巣（MTF）は、ブアン固定液中で固定された肺内で可視可能であった。MTFの多くは、すべての処理グループにおいて直径1mm未満であった。図6は、肺中の転移性病巣の数を示す（平均±SEM）。図6に示されるように、対照グループは、59.5±13.9MTF/ラット（平均±SD）及び低投与量（20mg/kg）及び高投与量（40mg/kg）のドキシサイクリンではそれぞれ、単に、39.7±17.2又は43.6±18.8MTF/ラットを示した。高投与量のCMT-3 group（10mg/ラット、すなわち40mg/kg）は、MTFの最も高い減少、28.9±15.4MTF/ラットを示し、対照グループ（p<0.01、Tukey Kramer Multiple比較試験）に比べ、MTFが51％減少した。肺部分の組織検査によって、種々の処理グループで腫瘍病巣における差異は何ら見いだされなかった。
実施例６
腫瘍増殖及び転移に対する前処理の効果
別のシリーズの実験において、薬剤による宿主動物の前投薬が腫瘍増殖及び転移に影響を及ぼすかどうかを試験した。対照及び薬剤（ドキシサイクリン又はＣＭＴ−３；４０mg/kg）の毎日の胃管栄養法（gavage）を、ＭＡＴ LyLu腫瘍細胞（２×１０5細胞／動物）の注射の７日前に始めて、全体で２１日間続けた。
このスケジュールを用いて、腫瘍発生率及び腫瘍増殖率の減少を見出した。腫瘍増殖率は、対数−変換容積測定の直線回帰分析（Dudakら、1996）による腫瘍容積の週３回の測定から計算した。この方法によって測定された腫瘍増殖率はその後、ターキー−クラマー（Tukey-Kramer）の多重比較試験によって試験され、対照群からの有意な差異を見出した。
図７Ａに示されるように、３つの独立した実験において、腫瘍発生率は対照及びドキシサイクリン−処理群では９０％より多かった。しかしながら驚いたことに、４つの別個の実験において、ＣＭＴ−３-処理ラットにおける腫瘍発生率は、２８％（2/7）から８５％（6/7）で変動した。このように、腫瘍発生率は、対照群又はドキシサイクリン−処理群よりも有意に低かった（５５％±１８まで）。原発性腫瘍発生率のないラットは、６ヶ月まで腫瘍のない状態を維持し、その時に安楽死させた。注射部位又は肺にも、組織学的に確認できる腫瘍病巣は観察されなかった。さらに、より純度の高いＣＭＴ−３の調製物は、腫瘍発生率を４３％まで減少させた（図示していない）。このように、市販で入手可能なテトラサイクリン、ドキシサイクリンではなく、ＣＭＴ−３のみが原発性腫瘍発生率の有意な阻害を創り出すことができた。
加えて、測定可能な腫瘍（≦５０％）が進行したＣＭＴ−３-処理群のラットの中で、腫瘍増殖率（腫瘍体積が３cm3に達する時間）は、対照群（15.9±2.0日）あるいはドキシサイクリン-処理群（16.7±1.9日）よりも有意に遅い（20.2±3.5日）。この腫瘍増殖率は、腫瘍が測定可能な動物の下位集合から計算されたものであることが強調されるべきである。このように、腫瘍増殖に対するＣＭＴ−３の全体的な効果はこれらのデータにより示唆されるよりも大きい。
出願人は特に、２つの別個の実験においてＣＭＴ−３（３０％）又はドキシサイクリン（２０％）で処理されたラットにおける触知できる腫瘍の明らかな寛解（腫瘍再吸収；腫瘍サイズの減少）により驚いた。これらの動物において、腫瘍は原発部位に注射後８〜１０日までは触知できるが、腫瘍は体積において増加せず、４〜７日後には消失した。原発性腫瘍発生のないこれらのラットは、腫瘍のない状態を維持し、及び８ヶ月まで健康であって、その後安楽死させた。
ＣＭＴ−３はまた、ＣＭＴ−３で動物を前投薬することによって腫瘍転移を阻止した。図７Ｂを参照されたい。この効果は前投薬のなしで観察されるのと比較できる。処理された動物におけるＭＴＦは、対照群で74.2±6.4であるのに対して、ＣＭＴ−３処理群で46.3±6.7であり、37.5％の減少であった。示されたデータは、腫瘍が≧１０cm3のサイズに成長しているすべての動物からの平均±ＳＤとして表現した。腫瘍のない動物からの除去された肺は、組織学的に認識できる転移がなかった。
上記したテトラサイクリン処理に伴って、被刺激性、光過敏症、脱毛症、又は下痢といった従来の化学療法的薬剤処理の副作用のいずれも観察されなかった。ドキシサイクリン又はＣＭＴ−３によって引き起こされるらしい正常な組織への損傷の全体的程度として、動物を処理前、処理中及び処理後に計測し、すべての変化を検査した。すべての実験において、いずれの動物も有意な体重減少を示さず、実験が終了した時点で（処理観察期間後６ヶ月）、３％（対照群）〜１２％（ＣＭＴ−３処理群）の体重の増加があった。このように、本発明の方法は、従来の抗ガン療法を超えて実質的な利点を有し、それは、正常な組織に対してガン−阻害テトラサイリン投与量において毒性が少ないか、たぶん実質的に毒性がないからである。
実施例７〜１０
以下の実施例７〜１０では、次の材料及び方法が採用された：
細胞培養及び保管：Ｃ８１６１細胞、メラノーマ細胞系を、１０％熱−不活性化胎児牛血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ）及び及び0.1％ゲンタマイシンスルフェートを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ，グランドアイスランド、ＮＹ）で保持した。これらの細胞を決まりきった方法で、GenProve Rapid Detectionシステム（Fisher Scientific;Chicago,IL）を使用して、マイコプラズマコンタミネーションについてスクリーニングした。
化学的に修飾したテトラサイクリン：化学的に修飾したテトラサイクリン化合物の新鮮なストック溶液（２mg/ml）を、２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／水pH１０中で水和し、次いで1.0Ｍ ＨＣｌを使用してpH7.4に調節することによって各実験用に調製した。
実施例７
細胞の増殖に対する化学的に修飾したテトラサイクリンの効果
３つの２４ウェル培養皿の各々に１ウェル当たり、１０万個（１×１０5）のＣ８１６１細胞を、ＤＭＳＯ（0.05％；Sigma Chem.Co.;対照）又は５０μg/mlのドキシサイクリン又は他のＣＭＴの存在下（各化合物につき１つのプレート上で３ウェル）で播種した。細胞を２４時間後、最初のプレートから２mM EDTAのリン酸塩バッファー生理食塩水（PBS、マイナス二価のカチオン）中に集め、４８時間後に第２のプレートから、及び７２時間後に第３のプレートから集めた。その後、各化合物の存在下でのＣ８１６１の倍加時間を測定し、ＤＭＳＯ処理細胞（対照）と比較した。
プラッスチック上のＣ８１６１細胞の増殖に対するＣＭＴの効果を下記の表４に報告する。
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示されているように、CMT−4及びドキシサイクリンは、プラスチック上のＣ８１６１細胞の倍加時間に影響せず；CMT−1、CMT−6及びCMT−7は僅かに細胞の倍加時間を増加させ、CMT−8及びCMT−3はそれぞれ、約１８％及び２７％まで倍加時間を増加させた。
実施例８
ゼラチン−混合ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気永動（ザイモグラフィー）
ＤＭＥＭプラスMito+及び0.1％ゲンタマイシンスルフェート中のラミニン／コラーゲン IV/ゼラチンマトリックスでコートした１２ウェル皿の１ウェル当たり、６０万個（６×１０5）のＣ８１６１細胞を播種した。細胞が付着するように約１時間のインキュベーションの後、ドキシサイクリン又は他のＣＭＴの１つのそれぞれ５０μg/mを１ウェル当たり添加して、次いで該皿を３７℃、加湿して５％ＣＯ2インキュベーターに置いた。２４時間後、上澄みを除去し、遠心分離して如何なる細胞又は細片をも除いた。還元剤のないレムリ（Laemmli）サンプルバッファーの１容量を、培地の２容量に加え、このサンプルを、先に熱をかけないで、又は沸騰させることなく、0.1％ゼラチンを含む１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気永動した（サンプルはインキュベーション時間つき培地の容量当たりの細胞の同数に基づいて標準化した）。電気永動後、ゲルを室温で３０分間、2.5%トリトン（登録商標）X100をプラスし、元の処理に使用した対応のＣＭＴ50μg/mlを加えた５０mMトリス-HCl（pH7.5）中でゆるやかな震盪で洗浄した。そのゲルを次いで、50μg/mLの対応するＣＭＴを含むインキュベーションバッファー（50mMトリス-Cl/10mM CaCl2/150mM NaCl/0.05% NaN3）中に置き、３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。ゲルをクマシーBBR-250で染色し、ついで水中１０％メタノール／１０％酢酸で洗浄液が透明になるまで脱染した。該ゲルの写真ネガをビデオカメラ及びSnappy Video Snapshot system（Play Inc.,Rancho Cordova,CA）を使用してデジタル化した。積算密度を、ソフトウェアImagePC8αを使用してタンパク分解の各透明ゾーンについて測定し、ゼラチン質分解の活性における相当する変化を、値を1.0に標準化したコントロールサンプルと比較した。
これらの化合物で処理したＣ８１６１細胞からの、条件つき培地におけるゼラチン質分解酵素活性の相対量をザイモグラフィーによって測定し（データは示さない）、デンシトメトリー分析によってコントロールサンプルでの活性量に対して数量化し、下記表５に示した。
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これらの化合物の各々についてのＣ８１６１細胞の処理は、ゼラチナーゼＡの細胞外レベルの減少をもたらし（表５）、１１％から９３％の範囲であった（CMT−2＜CMT−4＜CMT−8＜ドキシサイクリン＜CMT−1＜CMT−4＜CMT−３）。５つの化合物で処理した細胞はまたゼラチナーゼＢの細胞外レベルの減少をもたらし、４９％から９７％であった（CMT-6＜ドキシサイクリン＜CMT−1＜CMT−4＜CMT−３）。３種のＣＭＴでの処理は、ゼラチナーゼＢの細胞外レベルの増加をもたらした（５〜５０％；CMT−８＜CMT−７＜CMT−２）。
実施例９
In Vitor侵襲アッセイ
対照（DMSOのみ）及び化学的修飾テトラサイクリン処理細胞のin vitro侵襲性を修飾Boydenチャンバーを使用して、先に記載したように測定した（Membrane Invasion Culture System,MICS）。ヒト ラミニン/コラーゲン IV/ゼラチンの規定マトリックスでコートした10μｍ孔を含むポリカーボネートフィルターからなる介在バリヤー（Osmonics,Livermore,CA）をこれらの研究にしようした。Ｃ８１６１ヒトメラノーマ細胞を、Mito+を含むDMEM（Collaborative Biomedical,Bedford,MA;無血清培地）中にチャンバーの上部ウェル中に播種し、３７℃で加湿５％ＣＯ2インキュベーターにて付着するようにした。次いで、ドキシサイクリン又は個々のＣＭＴを、アッセイの間、播種後２時間、1日、３、20又は50μg/mlで、チャンバーの異なるウェルへ添加した。４８時間後、細胞を低い方のウェルから除去して、侵襲細胞の数を測定し、上方のウェルへ播種した細胞の元の数と比較した。適当であれば、in vitroアッセイの期間中の増殖についてデータを集めた。
Ｃ８１６１細胞のin vitro侵襲性に対する３つの異なる濃度（範囲：３μg/ml;20μg/ml;50μg/ml）でのドキシサイクリン及びＣＭＴの効果を図８に示す。これらのデータを下記の表６に纏める。
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実施例１０
In vivo転移アッセイ
免疫抑制マウス（Harlan Sprague Dawleyからの胸腺欠損ヌード／ヌードSCID雌）を、ミクロアイソレーターのトップを有するオートクレーブケージに入れて、及び動物の全ての処置をＡＢＱ滅菌剤でフード、グローブ及びケージを共に拭いた後、層状の流れるフード（laminar flow hood）で実施した。、マウスを滅菌したPico Lab Chow（Purina）及びオートクレーブをかけたSt.Louisタップ水で給餌した。ドキシサイクリン又はＣＭＴをマウスに、滅菌した使い捨ての動物給餌用ニードル（Poper & Sons Cat #9921;20g×1.5”）を介して２％カルボキシメチルセルロースを含む滅菌水で、毎日、週７日間、午前７：００から８：００に胃内に投与した。化合物及びコントロール（２％カルボキシメチルセルロースを加えた滅菌水）をアルミニウムホイルで包んで−８０℃に保存して、光に誘導される変化を防ぎ、及び使用する前に各日の供給分を解凍した。
４つの化合物を、尾部血管を介した静脈内注射したC8161細胞の転移潜在性へのそれらの効果について試験した：40及び100μg/mlのCMT-1 CMT-3 CMT-7をコントロールと比較した。１００mg/kgの薬量を与えるように使用されるバイアル中の化合物濃度は、４０mg/kg薬量の2.５倍であって、ほぼ同容量が同じケースで使用され、約0.５ml/動物であった。実験は、１群９動物で４日前から開始した。０日の時点で、冷Hank’s Balanced Salt溶液（HBSS）中の２×１０5 C8161細胞を尾血管を介して静脈内注射で接種した。実験を更に24時間続けて、その時点で動物を犠牲にして、それらの肺を除去して、ボーインズ/ホルムアルデヒド（５部：１部）中に固定した。腫瘍を、肺を回転させて６×拡大鏡を使用して各葉についての腫瘍をカウントして、肺全体的の表面について定量化した。統計的な分析をマイクロソフト エクセル スプレッドシートソフトウェアの統計パッケージを使用して実施した。
ＳＣＩＤマウスにおけるC8161の転移潜在性への、２つの異なる濃度でのCMT−１、CMT−３、CMT−７及びCMT−８の効果は、下記表７に示される。
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CMT−１又はCMT−３での経口胃管栄養は、日に40mg/kgで投与したときに（p<0.05）SCIDマウスにおける有意に肺転移の数を減少させたが、100mg/kgの投与量のときは有意に肺転移の数を減少させなかった。CMT−７及びCMT−８の化合物はいずれの投与量でも肺転移の数を有意に減少させなかった（p<0.05）。
実施例１１
ガン細胞に対するテトラサイクリン化合物の特異な細胞障害性
幾つかのガン細胞系及び正常な細胞をin vitroで試験し、テトラサイクリン化合物が細胞障害（細胞死滅）効果を創り出すかどうか決定した。細胞のレドックス活性に基づく培養細胞の生存度のための慣用のアッセイを採用した（Pageら、1993）。そのアッセイはレドックス染料アルマーブルーを使用し、それは、細胞が電子輸送活性、即ち生存力の広範に受容される判定基準を発揮したときにのみ、蛍光性の赤色化合物に変換する蛍光インディケーターである。
３種の腫瘍細胞系からの培養細胞、LNCAP、DU-145及びPC-3、及び36齢の男性のバイオプシーによって得られた正常な前立腺間質細胞を成長させて、多重ウェルマイクロプレートにコンフルエンスにして、試験化合物に暴露するときに細胞型の中で増殖性活性における差異が最小となるようにした。CMT−３を10μM及び20μMの濃度で（DU-145の場合は50μMも）ウェルに添加した。この実験の開始時に、及び再度１、２及び３日目に選択したウェルをインディケーター染料とともに３時間インキュベートし、その蛍光をCytofluor 2300蛍光マイクロプレートリーダーで測定した。その結果を図９Ａから９Ｄに纏める。
正常の前立腺間質細胞は、CMT-3投与についてはとにかく、３日間にわたって蛍光の実質的な変化を示さなかった（図９Ａ）。CMT-3に暴露していない間質細胞における１日目のわずかな増加は、本発明をサポートし、研究した種々の細胞の中での増殖活性の顕著な差異の複雑な状況の導入を回避する。LNCAP細胞は、制限された増殖活性のこれらの条件下でさえCMT-3に対して強く感受性があると証明された；細胞障害性は20μMで24時間で完了し、10μM CMT-3におけるその時間でほぼ完了する（図９Ｂ）。ＰＣ−３腫瘍細胞はCMT-3に対する感受性が幾分低く、２４時間で約25％の細胞障害性、４８時間で50％、72時間で75％を誘導する（図９Ｃ）。DU-145腫瘍細胞は、20μMで７２時間後に表れるいくらかの細胞障害性とともに、感受性が低い（図９Ｄ）。DU-145細胞は50μMで有意な脂肪障害性を示し、それは72時間の試験期間中に徐々に進行する。50μMのCMT-3に暴露された正常な細胞は匹敵する細胞障害性を示さない（データは示さない）。
正常な間質細胞と腫瘍細胞の間に細胞の形態学的な顕著な差異が、CMT-3へ暴露した後、観察される：顕著で有意な変化は正常な間質細胞には見られないが、腫瘍細胞の型のすべては漸進的に空胞化した。
実施例１２
ガン細胞に対するテトラサイクリン化合物の細胞障害性
化学的に修飾されたテトラサイクリン化合物及びドキシサイクリンのパネルを、２つの悪性腫瘍：COLO 205（ヒト 結腸ガン-誘導細胞系）及びMDA-MB-231のE-10クローン（ヒト乳ガン-誘導細胞系）に対する細胞障害性について試験した。テトラゾリウム塩（MTS）での生存度についての慣用のアッセイを使用して細胞障害性を試験した。５μM〜100μMの範囲の濃度でCMTを含む培地で、細胞を２日間、生育させた。細胞をその後、生存している細胞のみによって発生するフォルマザンを測定するために、培地の上澄みを除去する前に数時間、MTSとともにインキュベートした。その結果を下記の表８Ａ及び表８に示す。結果は細胞障害％として示され、それは単純に、サンプルとなった培地中のフォルマザンの測定濃度におけるな％低下である。CMT-3の２つの異なるロットが試験され、それらは“Ａ”及び“Ｂ”と示される。
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上記のデータは、CMT-3が試験した化合物で最も有力であって、CMT-1、CMT-4、及びCMT-8は有意な細胞障害性を創り出すことを示す。ドキシサイクリンもまた、幾らかの細胞障害を表した。
実施例１３
ガン細胞に対するテトラサイクリン化合物の細胞障害性
ガン細胞への、化学的に修飾されたテトラサイクリン化合物の細胞障害性の調査は、プログラムされた細胞の死（アポトーシス）の関与を決定するのに行われた（Dukeら、1986）。MAT LyLu細胞を種々の濃度のCMT-3及びドキシサイクリンとともにインキュベートした。製造元の指示に従ってベーリンガー マンハイムGmbHからの細胞死滅検出ELISAプラスキット（カタログNo.1774425）を使用して、ヌクレオソーム間DNA鎖切断から得られた可溶性ヌクレオソームについて、条件付き培地をアッセイした。用量依存試験において、細胞をテトラサイクリン化合物で48時間インキュベートし、その後培養液を集めた。タイムトライアルで、細胞を０〜48時間の特定の時間、テトラサイクリン化合物に暴露し、もし適当であれば、新鮮な培地に、実験開始から培養液を集める48時間まで保持した。実験は３回実施し、典型的なデータを図１０Ａ及び１０Ｂに示す。
図１０Ａに示すように、可溶性ヌクレオソームの用量依存増加は、CMT-3で処理したMAT LyLu細胞において観察されたが、ドキシサイクリンで処理した細胞ではみられなかった。事実、プラグラムされた細胞死誘導は、上記の増殖アッセイによって測定されたように、５０％成長阻止量（ＧＩ50）を超えるドキシサイクリン濃度でさえ微々たるものであった。培養液へ放出された可溶性ヌクレオソームの量は、選択されたケースの顕微鏡観察にて測定されて、アポトーシス細胞のフラクションに直接的に比例していた。さらに、図１０Ｂに示されるように、CMT-3への短時間の暴露（５μg/ml又は10μg/mlで４時間）は、MAT LyLu細胞において推定されるプログラムされた細胞死反応を顕在化するのに十分であったが、ドキシサイクリン−処理細胞についてはそのような反応は観察されなかった（データは示されていない）。
このように、目下、本発明の好ましい実施態様と信じられることを記載しているが、当業者は、他の及び更なる実施態様が本発明の精神から逸脱することなく、なされる得ることを了解するであろうし、そのような更なる変形及び変更のすべてがここに挙げた請求の範囲の真の範疇に含まれると解される。
参考書目
次の出版物は、先の明細書中に述べられており、それらが開示するすべてについてここに参考として組み込まれている。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0004428727.tif 000022
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
0004428727.tif 000024
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
0004428727.tif 000030
【図７Ｂ】
0004428727.tif 000031
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
0004428727.tif 000034
【図９Ｃ】
0004428727.tif 000035
【図９Ｄ】
0004428727.tif 000036
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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