(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2記載の塩基配列を含むヒト高親和性ＩｇＥ受容体（FcεRI）α鎖遺伝子の発現を活性化する遺伝子。
【請求項２】
配列番号２記載の塩基配列において、11番目から１５番目の塩基配列（TTCCA配列）を除いた塩基配列が１塩基ないし５塩基の塩基置換および／または塩基挿入および／または塩基欠失された塩基配列を含む遺伝子。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列、または請求項２記載の遺伝子に含まれる塩基配列を含んでなるベクター。
【請求項４】
プラスミドベクター、ウィルスベクター、およびリポソームベクターからなる群から選択される、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３または４に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
大腸菌、酵母、昆虫細胞、COS細胞、ミンク肺上皮細胞、血球系細胞、繊維芽細胞、及び腫瘍細胞からなる群から選択されるものである、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
配列番号２の塩基配列、または請求項２記載の遺伝子に含まれる塩基配列を利用して、この塩基配列を含むDNAをレポーター遺伝子上流に連結したプラスミドをα鎖発現細胞に導入した細胞株培養時に試験サンプルを添加し、レポーター遺伝子産物量を測定することからなる、ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖の発現阻害物質を探索する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖の新規遺伝子に関する。更に、新たに特定した転写活性化能を有する領域の利用に関する。詳しくは、転写調節領域を利用したα鎖発現抑制物質の探索系、動物細胞における物質生産系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高親和性IgE受容体（FcεRI）は、マスト細胞・好塩基球など特定の細胞表面に発現しIgE抗体を特異的に認識する受容体であり、抗原特異的アレルギー反応を細胞内に伝達する鍵となることが知られている。FcεRIを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の3種類の分子のうち、α鎖はFcεRI特異的に発現しIgEのFc領域と直接結合することからFcεRIの発現・機能を制御しうると考えられる。事実、FcεRIα鎖の遺伝子を破壊したノックアウトマウスにおいてアナフィラキシーショックが起こらず、FcεRIα鎖がアレルギー反応に必須であることが確認されている（Dombrowicz, D. et al: Cell，75，969（1993））。
【０００３】
ヒトFcεRIα鎖の遺伝子は、5つのエクソンよりなるとしてその塩基配列が既に報告されている（Pang, J. et al: J. Immunology，151， 6166（1993））。しかし、この遺伝子断片中にはヒトFcεRIα鎖cDNAとして報告されている塩基配列の5’末端側が一部含まれておらず（Kochan, J. P. et al: Nucleic. Acids. Res.，16，3584（1988)）、この第1エクソンの上流域にまだエクソンがあることが予想された。そこで我々は本第1エクソンの上流約20kbのDNAのクローニング、塩基配列決定を行った結果、新しい2つのエクソンを発見した（特開平10-099081号）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前述の通り、抗原特異的アレルギー反応に重要な役割を果たすと考えられている高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖の発現を制御することは、アレルギー反応を抑制する手段として期待される。しかし、ヒトFcεRIα鎖の転写調節領域に関する研究は、1993年にPangらが報告した遺伝子断片について我々が行った解析の報告が1件あるのみである（Nishiyama, C et al: J. Immunology，163，623（1999））。新たに発見された20kbを越える遺伝子領域内にプロモーターとして特定された部位はその活性が低かったことから、本プロモーターの転写活性化を担う未知の領域が存在することが予想された（特開平10-099081号））。
【０００５】
従って、本発明の目的は新たに発見された約20kbの遺伝子領域内に転写活性化を行う領域を特定し、その配列を利用したα鎖発現阻害物質の探索系や物質生産系を構築することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決すべく、新たに発見したヒトα鎖遺伝子より（特開平10-099081号））様々な長さの断片やその塩基置換体をレポーター遺伝子に連結したものを作製し、一過性発現系に供して転写活性化を有する領域を特定したことにより、本発明を完成するに至った。
【０００７】
従って、本発明の第1はヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖遺伝子の転写調節を行う領域を含む遺伝子の同定法及び特定された遺伝子である。このDNAは配列表1の塩基配列を含む。本発明の第2は、前記DNAを異種遺伝子の上流に含有するプラスミドベクターである。本発明の第3は、前記DNAを用いて異種遺伝子の発現を行うDNAの使用方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
前述の通り、新たに発見したヒトα鎖遺伝子より（特開平10-099081号）制限酵素認識部位、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）、部位特異的変異法等を用いて様々な長さの断片やその塩基置換体をレポーター遺伝子に連結したものを作製した。これらを、一過性発現系に供してα鎖発現細胞特異的に機能する転写活性化領域を特定することを試みた。
【０００９】
▲１▼ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖遺伝子内転写活性化領域の特定
全長20kbp以上に及ぶヒトFcεRIα鎖遺伝子より、特開平10-09081号で開示された新規第1エクソン（Ex．1A）上流の約1.6kbpの塩基配列の３’−末端からPangらが1993年に報告した遺伝子断片（Pang, J. et al.; J. Immunology, 151, 6166 (1993)）の５’−末端までの未知の領域について転写活性化能を有する部位の検索を行った。当該領域の遺伝子配列を配列番号１に示す。
【００１０】
図1中Ex.1Aと示した本第1エクソンを含む様々な長さのDNA断片の調製には、例えば本染色体DNA上に存在している制限酵素部位を利用することが可能である。或いは、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）で目的領域のみ増幅したり、PCRや部位特異的変異法を用いて染色体DNA上目的の部位に制限酵素認識配列を導入した後、該制限酵素を用いて切り出す方法なども利用できる。PCR法、部位特異的変異法とも方法は特に限定されるものではなく、目的に応じて各種キットを用いることができる。これらの方法を利用して、例えば図2に示すような様々な長さの遺伝子断片をレポーター遺伝子上流に連結したが、用いる遺伝子領域は図に示す種類に限定されるものではない。また、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼをコードするプラスミドDNAが各メーカーより市販されているが、プラスミドの種類は特定されるものではない。更に、レポーター遺伝子についても、CAT、β-ガラクトシダーゼ、成長ホルモンなど該タンパク質量を直接定量、或いは活性を指標にして間接的に定量できるものは利用可能である。また、PCR法や利用した部位特異的変異法によっては目的外変異が導入されている場合もあり得るため、DNA塩基配列を確認する必要がある。塩基配列の決定法は限定されるものではなく、例えば各社より販売されているDNAシークエンサーなど公知の方法を利用することができる。
【００１１】
▲２▼ヒトFcεRIα鎖遺伝子内転写活性化配列の決定
先の方法を用いて新規第1エクソン（Ex.1A）周辺約3.8kbについてプロモーター活性化能を有する領域を検索した結果、α鎖発現細胞特異的に新規プロモーターを活性化する領域がEx.1A下流約400bpの位置50bp以内に存在することが示唆された（図2、3）。
この領域内に存在する活性化配列を特定するため、図4に示すような変異体プラスミドにおけるレポーター遺伝子発現量を測定・比較した。この時、変異体プラスミドの作製には公知の部位特異的変異法が利用可能であり、各社より市販されているキットも用いることができる。この実験から、転写活性化に必須な配列を限定することができた。転写活性化に必要な配列を配列番号２に示す。
【００１２】
▲３▼転写活性化配列を認識する核タンパク質
上述の方法で特定した配列に結合する核タンパク質の存在を、ゲルシフトアッセイ法を用いて確認することができる。
ゲルシフトアッセイに用いるDNAの標識はアイソトープの利用が一般的であるが、ローダミンをはじめとした蛍光物質など市販の機器で検出可能な物質が利用可能である。2本鎖オリゴDNAは合成したものをアニールして用いる方法の他、PCRを利用する方法なども可能である。
【００１３】
細胞より調製した核画分にプローブDNAを混ぜ、poly(dI-dC)など非特異的結合を阻害する適当な物質を添加した溶液中で反応させた後、アクリルアミドゲルに供する。プローブへのタンパク質の結合は移動度の小さいバンドの検出によって確認できる。
この方法を用いて、先の配列に結合し得るタンパク質がα鎖陽性細胞核内に存在していることが確認できた（図5）。
【００１４】
▲４▼転写活性化配列を利用したα鎖発現阻害物質の探索
特定した先の配列を利用して、α鎖発現阻害物質の探索を行うことが可能である。
先の配列を含む適当な長さのDNAをレポーター遺伝子上流に連結したプラスミド、例えば図3におけるwild typeのPB0.50などをα鎖発現細胞に導入した細胞株培養時に適当量の試験サンプルを添加し、レポーター遺伝子産物量を測定することでプロモーター活性阻害効果を示す物質の探索を行うことができる。
【００１５】
▲５▼転写活性化配列を利用した動物細胞における物質生産
特定した先の配列を、動物細胞での物質生産へ利用することも可能である。
【００１６】
本配列をプロモーター上流或いはプロモーター内に1つ或いは複数含む動物発現用プラスミドを調製し、本配列を活性化することができる動物細胞株に導入することによって、本生産系における物質生産量を向上させることが可能である。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例につき説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
▲１▼ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖遺伝子内転写活性化領域の特定
全長20kbp以上に及ぶヒトFcεRIα鎖遺伝子より、特開平10-09081号で開示された新規第1エクソン（Ex．1A）上流の約1.6kbpの塩基配列の３’−末端からPangらが1993年に報告した遺伝子断片（Pang, J. et al.; J. Immunology, 151, 6166 (1993)）の５’−末端までの未知の領域について転写活性化能を有する部位の検索を行った。当該領域の遺伝子配列を配列番号１に示す。
【００１９】
まず図1中Ex.1Aと示した本第1エクソンを含む領域について、図2に示す通りのDNA断片を調製し、pGV-B2（東洋インキ）に挿入した。DNA断片の切り出しには主に制限酵素部位を利用した。EB3.3の調製にはキロシークエンス・ディリーションキット（宝酒造）を用い、PH0.3についてはPCR法にて新たに導入したHindIII部位を利用した。各プラスミドDNAは、プラスミド・ミディ・キット（キアゲン）を用いて精製し、細胞株の導入に用いた。細胞株への導入は、先に報告した方法の通り（Nishiyama, C. et al: J. Immunology，163，623（1999））である。
【００２０】
すなわち、各プラスミドDNA５μgを25mgの内標用プラスミドｐRL−CMV（プロメガ）と共に、１×107のヒト好塩基球細胞RBL-2H3、マウスマストサイトーマPT18へ、ジンパルサーII（バイオ・ラッド）を用いてエレクトロポーレーション法（950μF、300V）で取り込ませた後、24時間培養を行い、細胞を回収して細胞中に発現しているルシフェラーゼの活性をルミノメーターLumat LB9501（ベルフォールド）にて測定した。活性測定の際、基質としてDual Luciferase assay kit（東洋インキまたはプロメガ）を用い、方法はプロトコールに従った。
【００２１】
結果は図2に示すとおり、α鎖陽性細胞であるRBL-2H3、PT18において、EB3.3、EB3.8、PB2.5、PPv2.2、PNd0.9で示すDNA断片に転写活性化能が認められた。ここに示すEN1.6(+)は新たなプロモーター領域として先の特許明細書（特開平10-099081号）にて配列を示した部位である。EN1.6(+)は逆向きのNE1.6(-)に比べて強い転写活性化能を持っているものの、上述のPNd0.9などに比べるとその値は小さい。また、本領域の活性化能はα鎖非発現細胞株であるJurkatには認められない。即ち、Ex.1A上流のプロモーター活性を細胞特異的にアップレギュレートする領域がイントロンA’（図1）中に存在することが示唆された。
【００２２】
図2の結果からエンハンサー領域はEx.1A直下のNheIとNdeI間の約600bp中に存在すると予想されたため、次に、この600bpを段階的に欠失したプラスミドを調製して図2の場合と同様にα鎖発現細胞内に導入し、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの活性を測定した。プラスミドの作製にはPCR法を用いた制限酵素部位（HindIIIまたはBamHI）の導入法を用いた。
【００２３】
結果は図3に示すとおり。RBL-2H3の場合、PB0.50以上の長さのDNA断片に認められた活性がPB0.45以下では著しく低下している。この傾向は、同じくα鎖陽性ヒト細胞株であるKU812においても確認された。このことから、α鎖発現細胞株にて機能するエンハンサー配列はPB0.50中に存在しPB0.45に含まれない約50bp中に存在すると予想された。
【００２４】
▲２▼ヒトFcεRIα鎖遺伝子内転写活性化配列の決定
上述の通り、新規第1エクソン（Ex.1A）周辺約3.8kbについてプロモーター活性化能を有する領域を検索した結果、α鎖発現細胞特異的に新規プロモーターを活性化する領域がEx.1A下流約400bpの位置50bp以内に存在することが示唆された（図2、3）。
この領域内に存在する活性化配列を特定するため、図4に示すような変異体プラスミドを作製し、α鎖発現細胞株に導入し、細胞内に発現しているルシフェラーゼの活性を測定・比較した。変異体プラスミドは図3でエンハンサー活性があると判断されたPB0.50を鋳型として、サイト・ディレクティド・ミュータジェネシス・キット（ストラタジーン）を用いて作製した。細胞の形質転換、活性測定等は図2、3の場合と同様に行った。
【００２５】
その結果、図4に示すとおり、本領域内5塩基のTTCCA配列に変異を導入した場合にのみ著しい活性の低下が認められた。その効果は用いたα鎖陽性細胞、RBL-2H3、PT18、KU812全てに共通であった。この実験から、エンハンサー配列はTTCCAを含む1つの領域（配列番号２）に限定された。
【００２６】
▲３▼転写活性化配列を認識する核タンパク質
上述の方法で特定した配列に結合する核タンパク質の存在を、ゲルシフトアッセイ法を用いて確認した。
ゲルシフトアッセイには、TTCCA配列を含むAGCCCTACTTTTCCATTTAGGGAGAT配列と相補配列を合成し、5’末端にローダミンラベルしたもの（日本製粉）をアニールして用いた。核画分の調製、プローブDNAと核タンパク質の反応、アクリルアミドゲルでの泳動などは既に報告した方法に従った（Nishiyama, C. et al: J. Immunology，163，623（1999））。
【００２７】
すなわち、KU812またはPT18を回収後、リン酸緩衝液で洗浄し、バッファーA（10mM HEPES、ｐH7.9、10mM KCl、0.1mM EDTA、１ｍM DTT、１mM PMSF、１μg/mlロイペプチン及び１μg/mlアプロプチニン）に懸濁後、4℃で10分間放置した。続いてNonidet P-40を0.5％となるように添加して更に15分間放置した後、6000×ｇで１分間遠心操作を行った。得られた沈殿画分を抽出バッファー（20mM HEPES、pH7.9、400mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、1mM DTT、1mM PMSF、１μg/mlロイペプチン及び１μg/ml アプロプチニン）に懸濁後、さらに1時間放置したものを10000×ｇにて5分間遠心して、その上清画分を核抽出画分とした。標識プローブ５pmolと10μgの核抽出タンパク質を500ngのポリ（ｄI-ｄC）、1mM MgCl2、30mM KCl、10mM HEPES、pH7.9、1mM DTT、５％グリセロールを含む15μlの溶液中で20分間反応させた後、４％ポリアクリルアミドゲルに供し、0.5×TBE緩衝液（45mM トリスボレート、ｐH8.0、45mMホウ酸、1mM EDTA）を用いて、120V、2時間半、電気泳動を行った。ローダミンの検出にはFMBIO（宝酒造）を用いた。
【００２８】
結果は図5に示すとおり。プローブDNAに核抽出物を添加することによりPT18、KU812とも複数のバンドの検出が認められた（レーン2）。プローブDNAと核タンパク質の結合を阻害する非標識コンペティターとしてコンペティター1、2を用いた。コンペティター1は標識プローブと全く同じ配列、コンペティター2は標識プローブの配列のうち、図4の実験において特定されたTTCCA配列に変異を導入したものである。図5のレーン3、4とレーン5、6の比較から、野生型で結合が阻害され変異型で阻害されないタンパク質の存在が示唆された。即ち、先のTTCCA配列に結合し得るタンパク質がα鎖陽性細胞核内に存在していることが確認できた。
【００２９】
▲４▼転写活性化配列を利用したα鎖発現阻害物質の探索
特定した先の配列を利用して、α鎖発現阻害物質の探索系を構築した。
【００３０】
図3におけるwild typeのPB0.50をα鎖発現細胞株、RBL-2H3やPT18に導入した後、96穴プレートに分注する。その後、適当量の試験サンプルを添加して更に一晩培養した後、各ウェルのルシフェラーゼ活性を測定した。試験サンプルとしては、放線菌培養物や化合物ライブラリーを用いた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明にて示したヒトFcεRIα鎖由来DNA塩基配列、及びそれを利用した探索系より得られるα鎖発現阻害物質は、新しいアレルギーの治療方法や抗アレルギー剤を提供することができる。また、この塩基配列は遺伝子組換えに用いるベクターに導入することにより組換え体における目的物質の生産性を向上させることができる。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖遺伝子構造を示す図。
【符号の説明】
B; BamHI, E; EcoRI, H; HindIII, S; Sau3AI認識部位
【図２】ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖細胞特異的転写活性化領域の検索を示す図。
【符号の説明】
N. T.;無試験
【図３】ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖細胞特異的転写活性化領域の特定図。
【符号の説明】
Ｎ. T.; 無試験
【図４】ヒト高親和性IgE受容体（FcεRI）α鎖転写活性化配列の特定図。
【図５】ゲルシフトアッセイによるα鎖転写活性化配列に結合する核タンパク質の検出を示す図。
【符号の説明】
レーン1；プローブのみ、レーン2〜6；各抽出画分を含む。レーン2；competitorなし、レーン3、4；プローブと同配列のcompetitorを含む、レーン5、6；プローブ中に図4のM2と同変異を導入したcompetitorを含む。competitorはプローブの30倍分子数（レーン3、5）、60倍分子数（レーン2、4）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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