(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同組換えによって宿主細胞中に外来DNAを導入する方法であって、宿主細胞のゲノム中の標的配列に相同で、且つその内側に陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列が配置されている二つの隣接ヌクレオチド配列と、陰性選択マーカーをコードする、隣接配列の外側のヌクレオチド配列とを含み、これらのヌクレオチド配列がそれぞれ宿主細胞中で作用する発現調節配列に機能的に連結されている、組換えベクターで宿主細胞をトランスフェクトする、前記方法であり、
ここで、細胞のゲノム中にベクターが相同組換えによって組込まれた後には陰性選択マーカー遺伝子が発現されず、且つ細胞のゲノム中にベクターが無作為に組込まれた後には陰性選択マーカー遺伝子が発現され、その遺伝子産物が細胞表面に存在するように、細胞表面に位置するポリペプチドをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列を陰性選択マーカー遺伝子として用い、
ここで、該陽性選択マーカー遺伝子の存在についての選択段階が実施され、かつ該陰性選択マーカー遺伝子が存在しないことについてのさらなる選択段階が実施され、
ここで、該陰性選択マーカー遺伝子が存在しないことについての選択が、
（a）トランスフェクトされた細胞を陰性選択マーカー遺伝子の遺伝子産物に結合する結合分子と接触させる段階と、
（b）結合した結合分子を含む細胞を分離する段階とを含む、前記方法。
【請求項２】
LNGF、CD24、LDL、trk受容体もしくは膜受容体（membrane-based receptor）またはリガンド結合ドメインを含む膜受容体断片をコードする陰性選択マーカー遺伝子が用いられる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
陰性選択マーカー遺伝子の遺伝子産物を指向する抗体が結合分子として用いられる、請求項１または２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
陰性選択マーカーの本来の結合相手またはその類似体が結合分子として用いられる、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
固相に結合した結合分子が用いられる、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
固相として磁気マイクロビーズが用いられる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
マーカーまたは／および固相結合基を有する結合分子が用いられる、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
マーカーまたは／および固相結合基がビオチン、ビオチン誘導体、ハプテン、酵素および色素から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ビオチンまたはイミノビオチン、アミノビオチンおよびデスチオビオチンから選択されるビオチン誘導体が用いられる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
酵素としてアルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼが用いられる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
色素として蛍光色素が用いられる、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
蛍光色素としてフルオレセイン、フィコエリトリン、ローダミン、ペリジニンクロロフィル蛋白質またはテキサスレッドが用いられる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アビジンまたはストレプトアビジンでコートされた固相への結合によって陰性選択マーカーを発現する細胞が同定される、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
酵素が触媒する呈色反応によって陰性選択マーカーを発現する細胞が同定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
フローサイトメトリー分析によって陰性選択マーカーを発現する細胞が同定される、請求項１１または１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
細胞が真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、特に好ましくはヒト細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
（a）細胞中の標的配列と相同である二つの隣接ヌクレオチド配列と、
（b）細胞中で作用する発現調節配列の調節下で陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列であって、（a）の二つの隣接配列の内側に位置するヌクレオチド配列と、
（c）細胞中で作用する発現調節配列の制御下で陰性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列であって、隣接相同ヌクレオチド配列の外側に位置し、発現産物が細胞表面に位置するポリペプチドであるヌクレオチド配列とを含む、哺乳類細胞における相同組換えのための組換えベクター。
【請求項１８】
隣接相同ヌクレオチド配列がEPO、tPA、G-CSF、GM-CSF、TPO、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、インスリンまたはインスリン様成長因子の遺伝子領域から選択される、請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列がネオマイシン、カナマイシン、ゲネチシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項１７または１８のいずれか一項記載のベクター。
【請求項２０】
陰性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列がLNGF、CD24、LDL、trk受容体もしくは膜受容体またはそのリガンド結合ドメインを含む膜受容体断片をコードする配列である、請求項１７〜１９のいずれか一項記載のベクター。
【請求項２１】
隣接配列の内側に非相同発現調節配列をさらに含む、請求項１７〜２０のいずれか一項記載のベクター。
【請求項２２】
発現調節配列がCMVプロモーターを含む、請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
隣接配列の内側に増幅遺伝子をさらに含む、請求項１７〜２２のいずれか一項記載のベクター。
【請求項２４】
隣接相同ヌクレオチド配列が標的遺伝子のコード領域またはその一部を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項記載のベクター。
【請求項２５】
相同組換えにおいて成熟標的ポリペプチドのコード領域内に変異が生じるように隣接相同ヌクレオチド配列が選択される、請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
相同組換え法における請求項１７〜２５のいずれか一項記載のベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、相同組換えにより標的細胞のゲノムに外来DNAを導入する方法、ならびに相同組換えに適したDNA構築物に関する。
【０００２】
相同組換えにより真核細胞のゲノムに外来DNAを導入する方法は公知である（例えば、国際公開公報第90/11354号、国際公開公報第91/09955号）。このプロセスにおいて、トランスフェクトしようとする細胞のゲノム領域に相同なDNA配列セクションを少なくとも一つ、好ましくは二つと、陽性選択マーカー遺伝子と、任意に陰性選択マーカー遺伝子とを含むDNA構築物で、出発細胞をトランスフェクトする。これに加えて、トランスフェクトされた細胞中で通常はサイレントな遺伝子を活性化することが意図される場合、DNA構築物は非相同の発現調節配列を含みうる。トランスフェクトされた細胞を、発現して選別可能な表現型を生じる陽性選択マーカー遺伝子の存在に関して選択が行われる条件下で培養する。
【０００３】
第二の選択段階は通常、相同組換えが起こった細胞と宿主細胞のゲノム中にベクターが無作為に組み込まれただけの細胞とを識別するために実施する。このために、選択因子、例えばガンシクロビルの存在下で細胞の破壊を引き起こすHSVチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）などの陰性選択マーカー遺伝子を用いる。相同組換えにおいて、細胞はHSVチミジンキナーゼ遺伝子を失い、その結果ガンシクロビルに対して耐性となる。ターゲティングベクターが無作為かつ非相同な組込みによって組込まれたゲノム中の細胞は、HSV-TK遺伝子を失わないため、ガンシクロビルに対して感受性である。HSV-TK/ガンシクロビルによるこの種の選択に対し、好ましくは、機能的チミジンキナーゼ遺伝子を含まない細胞を用いる（例えば、米国メリーランド州ロックビルのOgden Bioservices Corp.のCEM tk-、カタログ番号491）。
【０００４】
しかしながら、相同組換えに用いる他の宿主細胞はそれ自体のチミジンキナーゼ遺伝子を有する。しかし、この細胞性チミジンキナーゼ遺伝子は陰性選択においてバックグラウンドの問題を引き起こす。したがって、例えば相同的に組み換えられたクローンがスクリーニング中に失われることがある。トランスフェクションの後に発現を選別しなければならない遺伝子産物をコードする他の陰性選択マーカー遺伝子でも、同様の問題が起こる。
【０００５】
細胞表面に位置するポリペプチドの陽性トランスフェクションマーカーとしての使用が知られている。例えば、国際公開公報第95/06723号に、部分的に欠失した細胞表面受容体遺伝子を用いて細胞を標識する方法が記載されている。
【０００６】
以前に用いられた陰性選択マーカー遺伝子で生じる問題を避けるために、細胞表面に位置するポリペプチドをコードする陰性選択マーカー遺伝子を本発明にしたがって用いる。
【０００７】
したがって、本発明は、相同組換えによって宿主細胞中に外来DNAを導入する方法であって、宿主細胞のゲノム中の標的配列に相同で、且つその内側に陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列が配置されている二つの隣接ヌクレオチド配列と、隣接配列の外側の陰性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列とを含み、陽性および陰性選択マーカーをコードする各ヌクレオチド配列が宿主細胞中で作用する発現調節配列に機能的に連結されている組換えベクターで宿主細胞をトランスフェクトする方法であり、細胞のゲノム中にDNA構築物が相同組換えによって組込まれた後には陰性選択マーカー遺伝子が発現されず、且つ細胞のゲノム中にベクターが無作為に組込まれた後には陰性選択マーカー遺伝子が発現され、その遺伝子産物が細胞表面に提示されるように、細胞表面に位置するポリペプチドをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列を陰性選択マーカー遺伝子として用いる方法に関する。
【０００８】
したがって、本発明にしたがい、表面に位置するポリペプチドをコードする陰性選択マーカー遺伝子を、細胞に対して有毒な選択因子を用いた陰性選択法の使用を避けるために、ベクターの適当な位置での相同組換えに用いる。宿主細胞中で通常は発生しないポリペプチドをコードする陰性選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。
【０００９】
TK選択に関して記載されている毒性またはバックグラウンドシグナルの問題は、本発明の方法では起こらない。本発明の方法のさらなる利点は、標的遺伝子の発現について調べなければならないトランスフェクトされた細胞の数がかなり減少することである。
【００１０】
宿主細胞は好ましくは真核細胞であり、特に好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【００１１】
相同組換えが起こった細胞を同定および単離するために、陽性選択マーカー遺伝子の存在について本発明の選択段階を実施し、陰性選択マーカー遺伝子が存在しないことについてさらに選択段階を実施する。
【００１２】
陽性選択マーカー遺伝子の存在についての選択段階は通常の様式で実施することができる。その発現によって選別可能な表現型、例えば抗生物質耐性または栄養要求性を生じる、あらゆる選択マーカー遺伝子、特に真核細胞に適した遺伝子を、陽性選択マーカー遺伝子として用いることができる。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン、カナマイシン、ゲネチシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子を用いる。特に好ましい陽性選択マーカー遺伝子はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００１３】
本発明の方法に用いる陰性選択マーカー遺伝子は、宿主細胞の表面で提示される遺伝子産物、好ましくは膜ポリペプチド（membrane-based polypeptide）をコードする。このような膜ポリペプチドの好ましい例は、LNGF、CD24、LDLもしくはtrk受容体またはそれぞれの受容体のリガンド結合ドメインを含む膜受容体断片である。細胞内ドメインが完全に、もしくは部分的に欠失している、または表面で提示される受容体がシグナル伝達を起こすことができないように改変されている適当な受容体断片が、国際公開公報第95/06723号に記載されている。このような受容体断片の特に好ましい例は、細胞内およびシグナル伝達ドメインが欠失している神経成長因子のヒト低親和性受容体の断片である、LNGF受容体の欠失変異体（dLNGFR）である（国際公開公報第95/06723号）。
【００１４】
dLNGFRによる陰性選択下での相同組換えの原理を、図1に図示している。この選択原理はもちろん、表面関連ポリペプチドをコードする他の選択マーカー遺伝子に適用することができる。所望の標的配列と相同な二つの隣接核酸セクション（HR1、HR2）と、その間の陽性選択マーカー遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子（NeoR）とを含むプラスミドを組換えベクターとして用いる。dLNGFRをコードするヌクレオチド配列は、二つの隣接相同ヌクレオチド配列の外側のプラスミド上に配列される。
【００１５】
標的遺伝子（HR）のエリア内の領域で相同組換えが起こるとき、領域HR1、NeoRおよびHR2がゲノムに組み込まれる。しかし、dLNGFRをコードする配列はゲノムに組み込まれない。反対に、プラスミドが宿主細胞のゲノムに無作為に組み込まれるとき、dLNGFR遺伝子は発現可能な形で保持される。
【００１６】
トランスフェクトされた宿主細胞において陰性選択マーカー遺伝子が存在しないことについての本発明の選択は、好ましくは下記の段階を含む：
（a）トランスフェクトされた細胞を陰性選択マーカー遺伝子の遺伝子産物に結合する結合分子と接触させる段階、および
（b）結合した結合分子を含む細胞を分離する段階。
【００１７】
陰性選択マーカーに特異的且つ、好ましくは高親和性で結合することができる物質を結合分子として用いる。好ましくは、宿主細胞の他の表面成分との妨害的交差反応性を持たない結合分子を用いる。結合分子の例は、陰性選択マーカー遺伝子の遺伝子産物を指向する抗体、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体断片などである。dLNGFRに対する適当な抗体は、例えば国際公開公報第95/06723号に記載されている。受容体を陰性選択マーカーとして用いる場合、受容体の本来の結合相手、例えば受容体リガンドまたはその類似体ももちろん結合分子として用いることができる。そのような受容体リガンドの一例はLNGFRのリガンドとしてのNGFである。
【００１８】
陰性選択マーカーで標識された細胞の分離を容易にするために、固相に結合した結合分子を用いることができ、この固相との結合は吸着、共有結合または高親和性結合対（例えばストレプトアビジン/ビオチン）によって達成されうる。固相のタイプは一般に、本発明の方法にとって重要ではなく、好ましくは陰性選択マーカーを提示する細胞を非標識細胞から容易に分離できるようにする固相を用いる。したがって、固相は例えばクロマトグラフィカラムの形でありうるが、特に簡単な分離を可能にするマイクロビーズ、特に磁気マイクロビーズなどの微粒子状固相が特に好ましい。
【００１９】
または、トランスフェクトされた細胞を遊離の結合分子と接触させることもできる。この場合、遊離の結合分子は好ましくはマーカーまたは／および固相結合基を有する。適当なマーカーまたは／および固相結合基の例は、ビオチン、ビオチン誘導体、例えばイミノビオチン、アミノビオチンもしくはデスチオビオチン、ハプテン、例えばジゴキシゲニン、フルオレセイン、酵素、例えばペルオキシダーゼもしくはアルカリ性ホスファターゼ、または色素、例えばフルオレセイン、フィコエリトリン、ローダミン、ペリジニン-クロロフィル蛋白質、テキサスレッドもしくはその誘導体といった蛍光色素である。
【００２０】
ビオチン、ビオチン誘導体、またはハプテンなどの固相結合基を有する結合分子を用いる場合、結合分子で標識された細胞は結合分子の固相結合基と反応しうる固相に結合することができる。ビオチン基を有する結合分子を用いる場合、例えば陰性選択マーカーを発現する細胞を同定し、これをアビジンまたはストレプトアビジンでコートされた固相に結合することによって、非標識細胞から分離することができる。
【００２１】
酵素マーカー基を有する結合分子を用いる場合、酵素の基質を加えた後、酵素が触媒する呈色反応によって陰性選択マーカーを発現する細胞を同定し、任意に非標識細胞から分離することができる。この同定は、例えば細胞をスライド上に置いた後、顕微鏡で解析することにより実施することができる。
【００２２】
蛍光色素を有する結合分子を用いる場合、フローサイトメトリー分析によって陰性選択マーカーを発現する細胞を同定し、非標識細胞から分離することができる。この分離法は迅速且つ単純で、蛍光ウィンドウの設定と細胞選別が可能な通常のFACS装置で実施することができる。
【００２３】
本発明のさらなる対象は、本発明の方法におけるトランスフェクションベクターとしての使用に適した組換えベクターである。本ベクターは、
（a）細胞中の標的配列と相同な二つの隣接ヌクレオチド配列と、
（b）細胞中で作用する発現調節配列の調節下で陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列であって、（a）の二つの隣接配列の内側に位置するヌクレオチド配列と、
（c）細胞中で作用する発現調節配列の調節下で陰性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列であって、隣接相同ヌクレオチド配列の外側に位置し、発現産物が細胞表面に位置するポリペプチドであるヌクレオチド配列とを含む。
【００２４】
宿主細胞中の内因性遺伝子を活性化するために組換えベクターを用いようとする場合、二つの隣接相同ヌクレオチド配列の間に、宿主細胞中で作用する別の非相同発現調節配列を含む。この発現調節配列は、プロモーターおよび好ましくはさらに発現改善配列、例えばエンハンサーを含む。プロモーターは調節可能または構成的プロモーターでありうる。プロモーターは好ましくは強力なウイルスプロモーター、例えばSV40またはCMVプロモーターである。CMVプロモーター/エンハンサーが特に好ましい。
【００２５】
トランスフェクトされた宿主細胞における標的遺伝子の増幅が望まれる場合、組換えベクターは二つの隣接配列の間に増幅遺伝子を含む。適当な増幅遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。特に好ましい増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、特に選択的薬剤（メトトレキセート）に対する感受性が野生型ポリペプチドに比べて低いジヒドロ葉酸レダクターゼアルギニン変異体をコードする遺伝子である（Simonsenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983)、2495）。
【００２６】
陰性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、前述のとおり、好ましくは膜受容体またはそれぞれの受容体のリガンド結合ドメインを含む膜受容体断片から選択することができる。
【００２７】
標的配列に相同な隣接ヌクレオチド配列は、好ましくは真核細胞、特に好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞である、トランスフェクトしようとする細胞のゲノムのいかなる染色体領域からでも選択することができる。ヒト細胞の場合、隣接相同ヌクレオチド配列は、好ましくはヒト因子、例えばEPO、tPA、G-CSF、GM-CSF、TPO、インターロイキン、インターフェロン、成長因子、インスリン、インスリン様成長因子などの遺伝子領域由来である。
【００２８】
隣接相同ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード領域またはその一部を含みうる。この部分において、それらの配列が相同組換え中に、細胞中に存在する内因性配列と比較して成熟標的ポリペプチドのコード領域で変異を引き起こすように選択することができる。この変異は個々のアミノ酸またはアミノ酸セクション全体の置換、欠失および挿入を含みうる。
【００２９】
本発明のさらなる対象は、相同組換え法における陰性選択マーカーとしての膜表面受容体の使用である。
【００３０】
本発明を下記の実施例および図によってさらに説明する。
【００３１】
実施例
方法
組換えDNA法
DNAの操作には、Sambrook, J.ら（1989）の「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、Cold Spring Horbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに記載の標準的方法を用いた。分子生物学用の試薬は、製造業者の指示にしたがって用いた。
【００３２】
ヒト細胞系統のトランスフェクション、培養およびクローニング
ベクターは二重蒸留水中1μg/μlの濃度で溶解しておいた。高いトランスフェクション効率を確保するために、以前に最適であることが調べられている条件（960μF/260MV/18〜22μs）下で、電気穿孔法（BioRad、Genepulser(登録商標)）を用いて細胞をトランスフェクトした。付着性で増殖するヒト線維肉腫細胞株HT1080（ATCC CCL 121）を、適当な細胞株として107細胞/0.8mlの濃度で用いた。細胞膜を再構成するために、トランスフェクションの前後に細胞を氷上に約10分間置いた。
【００３３】
トランスフェクトした細胞をT-175培養フラスコに播種し、インキュベーター中37℃、7%CO2で培養した。24時間後、G418（0.8μg/ml）を加えることによって選択圧をかけた。
【００３４】
培養14日後、培養皿に耐性クローンが現れた。より大きい巣が増殖した後、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、単一細胞の浮遊液として染色した。
【００３５】
FACS解析
染色段階を105細胞/試料を用いて氷上で実施した。一次抗体として用いたマウス由来抗dLNGFR抗体を、ヤギ由来二次抗体（a-mlgG-FITC、1：25、Caltag）を加えることによって検出した。非特異的結合の対照として、細胞を二次抗体だけで染色した。死細胞をヨウ化プロピジウム（10μg/ml）を加えることによって検出した。解析をFACS-Vantage（Becton Dickinson Co.）上で製造業者の指示にしたがって実施した。dLNGFRを発現する細胞の特異的蛍光をFL-1チャンネルに記録し、死細胞をFL-3チャンネルに記録した。
【００３６】
実施例1
dLNGFRの発現構築物の調製
965bpを含むdLNGFRの遺伝子（国際公開公報第95/06723号、Boehringer Mannheim GmbH）をPCR法を用いて増幅した。用いたプライマーによって酵素EcoRIおよびSalIの切断部位が両端に導入された。増幅後、PCR断片を両酵素で切断した。
【００３７】
初期SV40プロモーターおよびSV40ポリAシグナルを含むベクターpSV1（OkayamaおよびBerg、Mol. Cell. Biol. 3（1983）、280〜289、MuliganおよびBerg、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78（1981）、2072〜2076）もEcoRIおよびSalIで切断した。
【００３８】
単離したベクターのサイズは3490bpである。dLNGFR断片をベクターpSV1にライゲートする。dLNGFRの遺伝子は初期SV40プロモーターおよびSV40ポリシグナルの発現制御下にあった。完全な発現カセットは1900bpを含む。得られたベクターpSV-DLNGFRを図2に示す。
【００３９】
実施例2
発現カセットの機能性試験
HT1080系統の細胞を、前述のとおりプラスミドpSV-DLNGFRで一過的にトランスフェクトした。2日間の増殖後、モノクローナル抗dLNGFR抗体を用いて細胞のdLNGFR発現を解析した。結果を図3に示しており、これはdLNGFR発現および非発現細胞をFACS分析によって区別できることを示している。また、抗dLNGFR抗体の反応はトランスフェクトされた細胞に特異的であることも明らかにされている。
【００４０】
実施例3
dLNGFR発現カセットのジーンターゲティングベクターへのクローニング
dLNGFR発現カセットをpSV-DLNGFRから制限酵素NotIおよびPvuIIを用いて単離した。ヒトEPO遺伝子に対するターゲティングベクター「p187」（欧州特許第97 112 649.5号および欧州特許第97 112 640.5号に記載、図4b参照）をNotIおよびEcoRVで切断した。14551bpの大きいベクター断片を単離し、dLNGFR発現カセットとライゲートした（図4）。得られたプラスミド「p187-DLNGFR」を大腸菌に移し、その中で増殖させた。
【００４１】
実施例4
FACSスキャンにおける陰性選択の試験
HT1080細胞をp187-DLNGFRでトランスフェクトし、安定な組込みについて選択する、すなわちトランスフェクションの24時間後にG418を培地に加えた。最初のFACS解析を約3週間の増殖後、すなわち細胞がプールされた最初の増殖巣形成後に実施した。図5に示すとおり、dLNGFR陰性細胞は、この場合細胞集団の14%であったが、この時点でFACS解析によりdLNGFR発現細胞と区別することができる。
【００４２】
相同組換えのまれに起こる事象に加え、この細胞集団は表面受容体密度が非常に低く、そのため検出システムで認識されない細胞も含む。しかし、このようにして、標的遺伝子の発現について続いて試験しなければならないクローンの数をかなり減少させることができる（この場合100分の14%）。
【００４３】
トランスフェクション調製物中に相同に組み換えられたターゲティングベクターを含むクローンが存在しない場合、通常のスクリーニングに比べてはるかに少ない作業でこの状況を示すことができる。抗dLNGFR抗体と100%反応する細胞集団が出現すれば、相同に組み換えられたクローンが存在しないことを示している。この場合、標的遺伝子の発現についてさらにスクリーニングする必要はない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のdLNGFRによる陰性選択を用いた相同組換えの原理を示す図である。
【図２】  プラスミドpSV-dLNGFRの制限酵素地図を示す図である。
【図３ＡおよびＢ】  dLNGFR発現細胞および非発現細胞のFACS解析結果を示す図である。
【図４】  プラスミドp187-dLNGFRの制限酵素地図を示す図である。
【図５】  dLNGFR陰性細胞と陽性細胞とを区別するためのFACS解析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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