(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る腫瘍抗原ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項３】
腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ抗原と請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を提示させてなる抗原提示細胞。
【請求項４】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドをコードする遺伝子を、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞に取り込ませて作製される、ＨＬＡ抗原と当該腫瘍抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞。
【請求項５】
ＨＬＡ抗原と請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項６】
請求項３または４記載の抗原提示細胞に提示されたＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項７】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−６７２５である、細胞傷害性Ｔ細胞ＫＧ−ＣＴＬ。
【請求項８】
請求項７記載のＫＧ−ＣＴＬを用いることを特徴とする、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドの同定方法。
【請求項９】
請求項１記載の腫瘍抗原ペプチドを有効成分として含有する、腫瘍の診断薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、サイクロフィリン由来の新規な腫瘍抗原ペプチド等に関する。より具体的には、サイクロフィリンＢ由来の腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、さらにはこれらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体やサイクロフィリンＢポリペプチドまたはその遺伝子を、in vivoまたはin vitroで利用した腫瘍の治療剤、予防剤、または診断薬などに関する。
背景技術
生体による腫瘍の排除には、免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Arch.Surg.，126:200，1990）、メラノーマからは自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）が比較的容易に分離されている（Immunol.Today，8:385，1987、J.Immunol.，138:989，1987、Int.J.Cancer，52:52，1992等）。また、該CTLの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、腫瘍排除におけるＴ細胞の重要性が示唆されている（J.Natl.Cancer.Inst.，86:1159，1994）。
自己の腫瘍細胞を攻撃するCTLが標的とする分子については長い間不明であったが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになってきた。すなわちCTLは、Ｔ細胞受容体（TCR）を用いて、腫瘍抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（MHCクラスＩ抗原、ヒトの場合はHLA抗原と呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃していることが明らかとなった。
腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でMHCクラスＩ抗原（HLA抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なCTLが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質あるいは腫瘍抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、腫瘍患者の体内の腫瘍特異的CTLを増強させる治療法が可能となった。
腫瘍抗原タンパク質としては、1991年にT.Boonらが初めてMAGEと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（Science，254:1643，1991）。その後、いくつかの腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。メラノーマ抗原としては、メラノサイト組織特異的タンパク質であるgp100（J.Exp.Med.，179:1005，1994）、MART-1（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:3515，1994）、tyrosinase（J.Exp.Med.，178:489，1993）などのメラノソームタンパク質、メラノーマだけでなく各種癌細胞と正常精巣細胞に発現するMAGE関連タンパク質群（J.Exp.Med.，179:921，1994）、腫瘍特異的なアミノ酸変異を持つβ−catenin（J.Exp.Med.，183:1185，1996）、ＣＤＫ４（Science，269:1281，1995）などが同定されている。また、メラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては、HER2-neu（J.Exp.Med.，181:2109，1995）、p53（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93:14704，1996）などの癌遺伝子産物、CEA（J.Natl.Cancer.Inst.，87:982，1995）、PSA（J.Natl.Cancer.Inst.，89:293，1997）などの腫瘍マーカー、ＨＰＶ（J.Immunol.，154:5934，1995）、EBV（Int.Immunol.，7:653，1995）などのウイルスタンパク質などが同定されている。これらについては、総説（Immunol.Today，18:267，1997、J.Exp.Med.，183:725，1996、Curr.Opin.Immunol.，8:628，1996等）の記述に詳しい。
腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを腫瘍の治療や診断に応用するためには、メラノーマに比べて発生頻度が圧倒的に高い胃癌、肺癌などの上皮性腫瘍に広く適応可能な腫瘍抗原の同定が重要である。これに関して、本発明者らは食道癌由来の扁平上皮癌細胞から新規な腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを行い、HLAの型がHLA-A24またはHLA-A26であるHLA抗原に結合して提示されるいくつかの腫瘍抗原ペプチドを、メラノーマ以外の腫瘍細胞から初めて同定した（J.Exp.Med.，187:277，1998、国際公開公報WO97/46676）。
これらの腫瘍抗原ペプチドを実際に臨床に適用する際には、１種のみならず、複数の異なる腫瘍抗原ペプチドを使用することが望ましい。すなわち、全ての癌細胞が共通に同一の腫瘍抗原を発現しているとは限らず、また、一つの癌細胞上に2種以上の異なる腫瘍抗原ペプチドが提示されていることを考慮すると、複数の異なる腫瘍抗原ペプチドを用いた治療がより効果的であると考えられる。事実、メラノーマにおいては、単一の腫瘍抗原由来のペプチドのみでは効果が不十分であったことから、複数のペプチドのカクテル製剤の開発が試みられている（Int.J.Cancer,66:162,1996、Int.J.Cancer,67:54,1996）。このような背景から、発生頻度の高い胃癌、肺癌などの上皮性腫瘍において幅広く適用可能な、新たな腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドの同定が望まれている状況にある。
発明の開示
本発明は、サイクロフィリン由来の新規な腫瘍抗原ペプチド等を提供することを目的とする。より具体的には、サイクロフィリンＢ由来の腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、さらにはこれらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体やサイクロフィリンＢポリペプチドまたはその遺伝子を、in vivoまたはin vitroで利用した腫瘍の治療剤、予防剤または診断薬などを提供することを目的とする。
本発明のサイクロフィリンＢ由来腫瘍抗原ペプチドは、日本人や白人が高い確率で保有しているHLA抗原、すなわちHLA-A24およびHLA-A2に結合して提示される腫瘍抗原ペプチドを含むものであり、さらに肺癌、膀胱癌、骨肉腫等の上皮性腫瘍あるいは白血病といった幅広い腫瘍の治療あるいは予防に応用可能な腫瘍抗原ペプチドである。従って本発明の腫瘍抗原タンパクであるサイクロフィリンＢおよびその遺伝子、あるいは当該サイクロフィリンＢ由来の腫瘍抗原ペプチドは、新規な抗腫瘍剤としての有用性が予想される。
本発明者らは、新たな腫瘍抗原ペプチドおよびその由来となる腫瘍抗原タンパク質を得るために、以下の試みを行った。
まず本発明者らは、肺腺癌患者のリンパ球より、HLA-A24あるいはHLA-A2陽性の膀胱癌、肺癌、骨肉腫あるいは白血病細胞株等を認識するCTL株を樹立し、これをKG-CTL（受託番号:FERM BP-6725）と命名した。
つづいて、前記KG-CTLが強く反応する膀胱癌細胞株HT-1376からcDNAライブラリーを作製し、該ライブラリーの組換えプラスミドとHLA-A2402（HLA-A24の一種）cDNAの組換えプラスミドをCOS-７細胞にダブルトランスフェクトし、そのトランスフェクタントに先のKG-CTLを作用させ、KG-CTLが活性化されるか否かをIFN-γの産生量で測定するというスクリーニングを繰り返すことにより、最終的に、１つの腫瘍抗原タンパク質の遺伝子のクローニングに成功した。塩基配列決定の結果、該腫瘍抗原タンパク質は、サイクロフィリンＢという既知のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
サイクロフィリンＢは、免疫抑制剤であるサイクロスポリンＡの結合タンパク質であり、免疫細胞の活性化に関与することが知られている。しかし腫瘍抗原としての機能は、本発明以前には全く知られていなかった。
本発明者らは次に、該サイクロフィリンＢのアミノ酸配列において、HLA-A24およびHLA-A2に結合して提示される腫瘍抗原ペプチド部分を同定し、これらのペプチドおよび該ペプチドの誘導体に、腫瘍抗原ペプチドとしての活性の存することを明らかにした。
さらに本発明者らは、サイクロフィリンＢのホモログであるサイクロフィリンＡ、サイクロフィリンＣおよびサイクロフィリンＤも、サイクロフィリンＢと同様に腫瘍抗原タンパク質としての活性を有していることを明らかにした。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
（１）  サイクロフィリン由来の部分ペプチドであって、かつＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（２）  サイクロフィリンＢ由来の部分ペプチドであって、かつＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（３）  ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である前記（１）または（２）記載の腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（４）  配列番号：１〜配列番号：３６、または配列番号：４１〜配列番号：４３のいずれかに記載のアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（３）記載の腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（５）  配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（４）記載の腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（６）  配列番号：１〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（４）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（７）  配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（６）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（８）  配列番号：１〜配列番号：１１のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換され、および／またはＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（６）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（９）  配列番号：１２〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位がロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、および／またはＣ末端のアミノ酸残基がバリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（６）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（１０）  配列番号：３７または配列番号：３８に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（８）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（１１）  配列番号：３９または配列番号：４０に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含む配列より選択される、前記（１０）記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（１２）  前記（１）〜（１１）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体から選択される少なくとも１種を有効成分として含有してなる、腫瘍の治療剤または予防剤、
（１３）  サイクロフィリン、またはＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る腫瘍抗原ペプチド部分を含むサイクロフィリンの部分ポリペプチド、あるいはこれらサイクロフィリンまたはその部分ポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分として含有してなる、腫瘍の治療剤または予防剤、
（１４）  サイクロフィリンＢ、またはＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る腫瘍抗原ペプチド部分を含むサイクロフィリンＢの部分ポリペプチド、あるいはこれらサイクロフィリンＢまたはその部分ポリペプチドをコードする遺伝子を有効成分として含有してなる、腫瘍の治療剤または予防剤、
（１５）  前記（１）〜（１１）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体に特異的に結合する抗体、
（１６）  腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ抗原と前記（１）〜（１１）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を提示させてなる抗原提示細胞、
（１７）  サイクロフィリン、またはＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る腫瘍抗原ペプチド部分を含むサイクロフィリンの部分ポリペプチド、あるいはこれらサイクロフィリンまたはその部分ポリペプチドをコードする遺伝子を、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞に取り込ませて作製される、ＨＬＡ抗原と当該サイクロフィリン由来の腫瘍抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞、
（１８）  サイクロフィリンＢ、またはＨＬＡ抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る腫瘍抗原ペプチド部分を含むサイクロフィリンＢの部分ポリペプチド、あるいはこれらサイクロフィリンＢまたはその部分ポリペプチドをコードする遺伝子を、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞に取り込ませて作製される、ＨＬＡ抗原と当該サイクロフィリンＢ由来の腫瘍抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞、
（１９）  前記（１６）〜（１８）いずれか記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤、
（２０）  ＨＬＡ抗原と前記（１）〜（１１）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞、
（２１）  前記（１６）〜（１８）いずれか記載の抗原提示細胞に提示されたＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞、
（２２）  前記（２０）または（２１）記載の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤、
（２３）  受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−６７２５である、細胞傷害性Ｔ細胞ＫＧ−ＣＴＬ、
（２４）  前記（２３）記載のＫＧ−ＣＴＬを用いることを特徴とする、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドの同定方法、ならびに
（２５）前記（１）〜（１１）いずれか記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分として含有する腫瘍の診断薬、に関する。
本発明は、サイクロフィリンという物質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有することを初めて明らかにしたことに基づくものである。以下、本発明の実施態様としてサイクロフィリンＢに関して具体的に説明するが、以下の説明は、他の公知のサイクロフィリン、すなわちサイクロフィリンＡ、サイクロフィリンＣおよびサイクロフィリンＤ（Biochemistry,3，p8218,1994）にも当てはまるものであり、サイクロフィリンＢにのみ限定されるものではない。
本発明において腫瘍抗原ペプチドとは、サイクロフィリンＢの一部よりなる部分ペプチドであって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドである。すなわち、WWW Entrezデータベース検索においてGenbank Accession No.M60857として登録されており、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88:p1903-1907,1991に記載されているヒトサイクロフィリンＢのアミノ酸配列の一部よりなるペプチドであって、かつ、該ペプチドとＨＬＡ抗原との結合複合体がＣＴＬにより認識され得るようなペプチドであれば、当該サイクロフィリンＢのアミノ酸配列中の如何なる位置に存する如何なる長さのペプチドであっても、全て、本発明の腫瘍抗原ペプチドの範疇に含まれる。このような本発明の腫瘍抗原ペプチドは、サイクロフィリンＢの一部よりなる候補ペプチドを合成し、該候補ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体がＣＴＬにより認識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否かをアッセイすることにより、同定することができる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
次に、本発明の腫瘍抗原ペプチドの同定方法につき、以下に記述する。
HLA-A1，-A0201，-A0204，-A0205，-A0206，-A0207，-A11，-A24，-A31，-A6801，-B7，-B8，-B2705，-B37，-Cw0401，-Cw0602などのＨＬＡの型については、該ＨＬＡに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している（例えばImmunogenetics,41:p178,1995などを参照のこと）。例えばHLA-A24のモチーフとしては、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンとなることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994，Immunogenetics,41:p178,1995，J.Immunol.,155:p4307,1994）。またHLA-A2のモチーフについては、以下の表１に示したモチーフが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、J.Immunol.,155:p4749,1995）。
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ペプチドの長さとしては、各種HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Immunogenetics，41:178，1995）、通常8から14アミノ酸程度であることが明らかにされている（ただしHLA-DR、-DP、-DQについては、14アミノ酸以上の長さの抗原ペプチドも認められる）。
これらのモチーフに関わるペプチド部分を前記サイクロフィリンＢのアミノ酸配列中から選び出すのは容易である。すなわち、当該サイクロフィリンＢのアミノ酸配列を見れば、上記モチーフ構造に関わるペプチド部分を容易に選び出すことができる。選び出された候補ペプチドを前述の方法にて合成し、該候補ペプチドとＨＬＡ抗原との結合複合体がＣＴＬにより認識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否かを測定することにより、本発明の腫瘍抗原ペプチドを同定することができる。
本発明の腫瘍抗原ペプチドの具体的な同定法としては、例えばJ.Immunol.,154,p2257,1995に記載の方法が挙げられる。すなわち、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで該候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスしたHLA抗原提示細胞を特異的に認識するCTLが誘導された場合は、該候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドに成り得ることが示される。ここでCTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してCTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を、例えばELISA法などによって測定することにより、調べることができる。また51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法（51Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer，58:p317，1994）によっても調べることができる。
さらに、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原のｃＤＮＡを発現する発現プラスミドを、例えばCOS-7細胞（ATCC No.CRL1651）やVA-13細胞（理化学研究所細胞銀行）に導入した細胞に対して候補ペプチドをパルスし、この細胞に対して前記CTLを反応させ、該CTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を測定することによっても、調べることができる（J.Exp.Med.,187:277,1998）。
以上のような種々の活性測定の具体例は、後述の実施例７、実施例１０および実施例１２に記載されている。
なお、サイクロフィリンＢはHLA-A24やHLA-A2に拘束性の腫瘍抗原ペプチド部分を有している。HLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合には、前記HLA抗原をコードするｃＤＮＡとしてはHLA-A24のcＤＮＡ（Cancer Res.，55:4248-4252（1995）、Genbank Accession No.M64740）を用い、前記CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製される場合の他、KG-CTL（FERM BP-6725）などのCTLを用いることにより、前記の腫瘍抗原ペプチドの同定を行うことができる。また、HLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合には、HLA-A2のcＤＮＡ（Genbank Accession No.M84379）を用いる以外は前記と同様の手法により、当該腫瘍抗原ペプチドを同定することができる。
以上のような腫瘍抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している場合と異なり、例えばHLA-A26のようにそのペプチドのモチーフが明らかでない場合は、該HLA-A26と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するCTL株が存在する場合には、例えばWO97/46676に記載の方法に準じて本発明の腫瘍抗原ペプチドを同定することができる。
なお、以上述べたような腫瘍抗原ペプチドの同定法を、以下、“腫瘍抗原ペプチドのアッセイ法”と総称することもある。
前記したように、HLA-A24に結合して提示される腫瘍抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、具体的には、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンとなることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994,Immunogenetics,41:p178,1995，J.Immunol.,155:p4307,1994）。また、HLA-A2に結合して提示される腫瘍抗原ペプチドの配列にも同様の規則性（モチーフ）があり、具体的には前記表１に示したモチーフが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、J.Immunol.,155:p4749,1995）。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドのうち、HLA-A24およびHLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチドとしては、サイクロフィリンＢのアミノ酸配列上、以上のようなモチーフ構造に関わる部分ペプチドであって、かつ各HLA抗原と結合してCTLにより認識され得るような腫瘍抗原ペプチドが例示される。
前記HLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドとしては、具体的には、例えば配列番号：１〜配列番号：１１のいずれかに記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むペプチドであって、かつHLA-A24抗原と結合してCTLにより認識され得るような腫瘍抗原ペプチドが例示される。また、HLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチドとしては、具体的には、例えば配列番号：１２〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むペプチドであって、かつHLA-A2抗原と結合してCTLにより認識され得るような腫瘍抗原ペプチドが例示される。
すなわち、
１）配列番号：１〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列よりなるペプチド、
２）配列番号：１〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の全長を含み、該アミノ酸配列よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に長いペプチド、または配列番号：１〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の連続した一部分よりなるペプチド、
であって、かつ各HLA抗原と結合してCTLにより認識され得るような腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。ここで、前記２）のペプチドの長さとしては、各HLA抗原に結合して提示されるという観点から、8〜11アミノ酸程度のものが挙げられる。
本発明のHLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドの好適なものとしては、配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつHLA-A24抗原と結合してCTLにより認識され得るような腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。すなわち、
１）配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列よりなるペプチド、
２）配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列の全長を含み、該アミノ酸配列よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に長いペプチド、または配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列の連続した一部分よりなるペプチド、
であって、かつHLA-A24抗原と結合してCTLにより認識され得るような腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。ここで、前記２）のペプチドの長さとしては、HLA-A24抗原に結合して提示されるという観点から、8〜11アミノ酸程度のものが挙げられる。
本発明において「腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有する誘導体」（以下、腫瘍抗原ペプチド誘導体と略す場合がある）とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列に対し、１又はそれ以上、好ましくは１〜数個のアミノ酸残基の改変を施した改変体であって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識され得るという腫瘍抗原ペプチドとしての特性を有するものを指す。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列に対して１又はそれ以上のアミノ酸残基の改変を施した改変体であって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識され得るという腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものは、全て、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の範疇に含まれる。
ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り、任意であるが、前記したように通常、腫瘍抗原ペプチドの長さが８〜１４アミノ酸程度であることから、１個から数個の範囲が好ましい。
本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の長さとしては、前記腫瘍抗原ペプチドと同様に８〜１４アミノ酸程度が好ましい（ただしHLA-DR、-DP、-DQについては、14アミノ酸以上の長さの場合もある。）
以上のような本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体は、本発明の腫瘍抗原ペプチドの一部を改変した改変体を前記ペプチド合成法に基づき合成し、これを前記腫瘍抗原ペプチドのアッセイ法に供することにより、同定することができる。
先に記載したように、HLA-A1，-A0201，-A0204，-A0205，-A0206，-A0207，-A11，-A24，-A31，-A6801，-B7，-B8，-B2705，-B37，-Cw0401，-Cw0602などのＨＬＡの型については、該ＨＬＡに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している。従って、該モチーフに基づき、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸を改変した腫瘍抗原ペプチド誘導体を作製することが可能である。
例えばHLA-A24に結合して提示される抗原ペプチドのモチーフとしては、前記したように、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンであることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994，Immunogenetics,41:p178,1995，J.Immunol.,155:p4307,1994）。またHLA-A2の場合は、前記の表１に記載のモチーフが知られている。また、該モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸残基も、許容される可能性がある。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の例として、これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置（HLA-A24、HLA-A2においては第2位とＣ末端）にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列の全部又は一部を含むものであって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるという活性を持つペプチド誘導体が挙げられる。好ましくは、該位置において、前記モチーフ上知られたアミノ酸残基の中から置換するアミノ酸残基を選択したアミノ酸配列の全部または一部を含むペプチドであって、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。なお「全部又は一部」の長さとしては、８〜１４アミノ酸程度の長さが好ましい（ただしHLA-DR，-DP,-DQについては、14アミノ酸以上の長さの場合もある）。
ここで、HLA-A24またはHLA-A2に拘束性の腫瘍抗原ペプチドの誘導体としては、例えばサイクロフィリンＢのアミノ酸配列上HLA-A24またはHLA-A2の結合モチーフを有するペプチドに対して、前記モチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置、すなわち第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられ、好ましくは、第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基を前記モチーフ上知られたアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。該HLA-A24またはHLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチド誘導体において「全部又は一部」の長さとしては、８〜11アミノ酸程度が好ましい。
具体的には、例えば配列番号：１〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が例示される。好ましくは、配列番号：１〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基を前記モチーフ上知られたアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。すなわちHLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチド誘導体に関しては、配列番号：１〜配列番号：１１のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸残基をチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンに置換し、および／またはＣ末端のアミノ酸残基をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンに置換したアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が例示される。またHLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチド誘導体に関しては、配列番号：１２〜配列番号：３６のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸残基をロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換し、および／またはＣ末端のアミノ酸残基をバリンまたはロイシンに置換したアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が例示される。
本発明のHLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチド誘導体の好適なものとしては、配列番号：１または配列番号：２に記載のアミノ酸配列の第２位および／またはＣ末端のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。より好ましくは、前記モチーフに基づきアミノ酸を置換したもの、すなわち配列番号：３７または配列番号：３８に記載のアミノ酸配列の全部または一部を含み、かつ前記活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。このような腫瘍抗原ペプチド誘導体の好適な例を、配列番号：３９〜配列番号：４０に示す。
さらに、最初に記載したように前記のようなサイクロフィリンＢの他、サイクロフィリンＢのホモローグであるサイクロフィリンＡ、サイクロフィリンＣおよびサイクロフィリンＤも同様に腫瘍抗原ペプチドを生ずる腫瘍抗原タンパク質である。これら腫瘍抗原ペプチドの具体例としては、配列番号：４１（サイクロフィリンＡ）、配列番号：４２（サイクロフィリンＣ）および配列番号：４３（サイクロフィリンＤ）などのHLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。
本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体は、以下のように腫瘍の治療剤または予防剤として使用することができる。
すなわち、腫瘍の治療又は予防を目的とする使用に際しては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体の少なくとも１種または２種以上を組み合わせ、要すれば他の腫瘍抗原ペプチド等と組み合わせて患者に投与する。本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を有効成分とする腫瘍の治療剤または予防剤をサイクロフィリンＢ陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原に腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体が高密度に提示され、提示されたＨＬＡ抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、患者の腫瘍を治療し、又は腫瘍の増殖・転移を予防することができる。さらに、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分とする腫瘍の治療剤又は予防剤は、従来の化学療法や放射線療法と併用することにより、治療効果を上げることも可能である。
本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分とする腫瘍の治療剤または予防剤は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin．Microbiol.Rev.，7:277-289，1994）に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μmのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体の投与量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
さらに、本発明の腫瘍抗原ペプチドの由来であるサイクロフィリンＢタンパク質あるいは該サイクロフィリンＢをコードする遺伝子もまた、腫瘍の治療剤または予防剤として使用することができる。ここで、サイクロフィリンＢおよびその遺伝子は全長のみならず、その一部分であっても、また当該一部分が連結したものであっても、さらにはその塩基配列又はアミノ酸配列に改変の施されたものであっても、HLA抗原と結合してCTLにより認識され得るペプチド部分を少なくとも一つ含んでさえいれば、目的とする腫瘍の治療または予防を達成することができる。ここで、この「ＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識され得るペプチド部分を少なくとも１つ含む」ものを、本発明においては「部分ポリペプチド」と称する。
サイクロフィリンＢタンパクまたはその部分ポリペプチドを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、前記腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体と同様の投与形態、投与方法および投与量により、投与することができる。サイクロフィリンＢタンパクまたはその部分ポリペプチドを腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。
また、サイクロフィリンＢまたはその部分ポリペプチドをコードする遺伝子を腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明の遺伝子を投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，1994年4月号，20-45頁、月刊薬事，36（1），23-48（1994）、実験医学増刊，12（15），（1994）、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明の遺伝子を実際に医薬として作用させるには、当該遺伝子を直接体内に導入するin vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス，1994年4月号，20-45頁、月刊薬事，36（1）,23-48（1994）、実験医学増刊，12（15），（1994）、およびこれらの引用文献等）。in vivo法がより好ましい。
in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明の遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の遺伝子の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の遺伝子を、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
以上のような本発明の遺伝子の腫瘍患者への投与により、抗原提示細胞内で腫瘍抗原タンパク質が高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は腫瘍の増殖・転移の予防が達成される。
なお、以上のように治療剤として使用され得るサイクロフィリンＢおよびその部分ポリペプチド、およびこれらの物質をコードする遺伝子は、以下のようにして製造することができる。すなわち、サイクロフィリンＢをコードする遺伝子は、WWW Entrezデータベース検索においてGenbank Accession No.M60857として登録されているヒトサイクロフィリンＢのｃＤＮＡの塩基配列をもとに適当なPCRプライマーを作製し、例えばMolecular Cloning 2nd Edt．Co1d Spring Harbor Laboratory Press（1989）等の基本書に従ってPCR反応を行うことなどにより、容易にクローニングできる。その際、当該サイクロフィリンＢのクローニングに関する文献であるProc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.88:p1903,1991も参考にすることができる。さらに、市販のサイクロフィリンＢcＤＮＡクローン（ATCC No．107758、Designations：ＨＴＮＡＱ１０）も使用できる。また、改変を施す場合は前記Molecular Cloning等の基本書を参考にして容易に行うことができる。さらに、このようにしてクローニングされたヒトサイクロフィリンＢをコードする遺伝子を用いてサイクロフィリンＢタンパクを発現させる方法としては、例えば、前述のMolecular Cloning等の多くの成書や文献に基づいて実施することができる。発現させたいＤＮＡの上流に、場合によっては転写を制御するプロモーター配列（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター）等の制御遺伝子を付加し、適当なベクター（例えばｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１など）に組み込むことにより、宿主細胞内で複製し、機能する発現プラスミドを作製する。次に発現プラスミドを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を得る。宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。形質転換体は、適当な培地で培養することによって目的とするタンパク質を生産する。以上のようにして得られた腫瘍抗原タンパク質は一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
以上のようにして作製されたサイクロフィリンＢタンパクおよびその部分ポリペプチド、およびこれらの物質をコードする遺伝子が腫瘍抗原としての活性を有しているか否か、すなわち当該タンパクの細胞内分解により、ＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かは、例えば以下のように遺伝子発現を利用した方法により測定することができる。
すなわちまず、アフリカミドリザル腎臓由来のCOS-7（ATCC CRL1651）や繊維芽細胞VA-13（理化学研究所細胞開発銀行）といった腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞に対し、候補となる遺伝子又は遺伝子断片を有する発現プラスミドと、HAL抗原をコードするＤＮＡを有する発現プラスミドとをダブルトランスフェクトする。該トランスフェクトは、例えばリポフェクトアミン試薬（GIBCOBRL社製）を用いたリポフェクチン法などにより行うことができる。その後、用いたHLA抗原に拘束性の腫瘍反応性のＣＴＬを加えて作用させ、該ＣＴＬが反応して産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などで測定することによって、候補遺伝子が腫瘍抗原タンパク質をコードするＤＮＡであるか否かを調べることができる。なお、サイクロフィリンＢはHLA-A24やHLA-A2に拘束性の腫瘍抗原ペプチド部分を有しているため、前記HLA抗原をコードするＤＮＡとしてはHLA-A24のcＤＮＡ（Caner Res.，55:4248-4252（1995）、Genbank Accession No.M64740）やHLA-A2のcＤＮＡ（Genbank Accession No.M84379）が挙げられ、前記ＣＴＬとしては、ヒトの末梢血リンパ球より調製される場合の他、ＫＧ−ＣＴＬ（FERM BP-6725）などのＣＴＬが挙げられる。
以上のような活性測定の具体例は、後述の実施例２に記載されている。
本発明においては、本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体に特異的に結合する抗体も含まれる。該抗体は、例えば、Antibodies;A Laboratory Manual，Lane，H，D.ら編，Cold Spring Harber Laboratory Press出版New York 1989などに記載の方法により容易に作製される。即ち、本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体を用いて常法により適宜動物を免疫することにより、腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体を認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。
該抗体を用いて前記免疫学的診断を行うには、まず前記抗体を必要に応じて適宜標識し、これを用いて腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍組織など）中の抗原の存在を検出することにより、腫瘍の有無を診断することができる。具体的には、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。
本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは腫瘍抗原タンパク質（サイクロフィリンＢ）またはその遺伝子は、腫瘍患者の治療において、以下のようにin vitroで利用することも可能である。
すなわち、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、または腫瘍抗原タンパク質またはその遺伝子を腫瘍の治療に用いる場合、患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬを誘導することの可能な投与法が重要になる。そのための手段のひとつとして、本発明は、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞の表面に、ＨＬＡ抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を提示させた抗原提示細胞、および該抗原提示細胞を有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤を提供するものである。
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を提示することの可能なＨＬＡ抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体のみならず、腫瘍抗原タンパク質であるサイクロフィリンＢまたはその遺伝子であっても良い。ここでサイクロフィリンＢおよびその遺伝子は、全長のみならず、その部分ポリペプチドおよびその遺伝子であっても、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。その際、タンパクまたは遺伝子の形態で使用する場合には細胞内に取り込まれる必要がある。これについては、前記遺伝子およびタンパク質を有効成分とする腫瘍の治療剤または予防剤の項を参照されたい。
本発明の抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは腫瘍抗原タンパク質またはその部分ポリペプチドを体外でパルスしてＨＬＡ抗原と前記腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を作製することにより得られる（Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158:p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明の腫瘍抗原ペプチドまたは腫瘍抗原タンパク質等と共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。詳しくは実施例１３を参照されたい。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の腫瘍抗原タンパクまたはその部分ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該遺伝子は、ＤＮＡの形態であっても、ＲＮＡの形態であっても良い。具体的には、ＤＮＡの場合はCancer Res.,56:p5672,1996やJ.Immunol.,161:p5607,1998などを参考にして行うことができ、またＲＮＡの場合はJ.Exp.Med.，184:p465,1996などを参考にして行うことができる。
前記抗原提示細胞を有効成分として含有する腫瘍の治療剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤を患者の体内に戻すことにより、サイクロフィリンＢ陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、腫瘍を治療することができる。なお、HLA-A24に陽性の腫瘍患者に対してはHLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体を使用するといった、患者と使用するペプチドとでHLAの型を合わせる必要のあることは言うまでもない。
さらに、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは腫瘍抗原タンパク質またはその遺伝子のイン・ビトロでの利用法として、以下の養子免疫療法における利用が挙げられる。
すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは腫瘍抗原タンパク質またはその遺伝子を用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
すなわち本発明は、前記ＨＬＡ抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識するＣＴＬ、および、該ＣＴＬを有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤をも提供するものである。該治療剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このようなＣＴＬを有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤を患者の体内に戻すことにより、サイクロフィリンＢ陽性の患者の体内でＣＴＬによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。
本発明の腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体はまた、腫瘍を診断するための診断薬の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体そのものを診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍組織など）中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することが可能である。また本発明の腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチドなどを有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択にも利用できる。具体的には、イムノブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光または発光測定法などを用いることにより、当該診断を行うことができる。
さらに近年、抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を用いて抗原特異的ＣＴＬを検出する新しい検出方法が確立された（Science,274:p94,1996）。本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体とＨＬＡ抗原との複合体を前記検出方法に供し、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することができる。また本発明の腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。すなわち本発明においては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分の一部として含有する、腫瘍の診断薬をも提供するものである。
具体的には、文献（Science,274:p94,1996）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体の４量体を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより、前記診断を行うことができる。
本発明はまた、肺腺癌由来の腫瘍内浸潤リンパ球から樹立されたＣＴＬである、ＫＧ−ＣＴＬ（受託番号  FERM BP-6725）をも提供するものである。当該ＫＧ−ＣＴＬは、HLA-A24およびHLA-A2陽性の癌細胞株に反応することが明らかとなっており、本発明のサイクロフィリンＢも、当該ＫＧ−ＣＴＬへの反応性を指標として見出された腫瘍抗原タンパク質である。従って、ＫＧ−ＣＴＬを利用することにより、サイクロフィリンＢと同様に、新たな腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドを見出すことができる。具体的には、後述の実施例２を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
図１は、HLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドあるいはHLA-A2601 cDNAの組換えプラスミドを導入したCOS-7細胞に対して本発明の腫瘍抗原ペプチド「84-92（配列番号：1）」を添加した後、KG-CTLと共に培養し、KG-CTLが産生したIFN-γ量を測定した結果を示すグラフである。横軸は添加したペプチド濃度を、縦軸はKG-CTLが産生したIFN-γ量を示す。
図２は、HLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドあるいはHLA-A2601 cDNAの組換えプラスミドを導入したCOS-7細胞に対して本発明の腫瘍抗原ペプチド「91-99（配列番号：2）」を添加した後、KG-CTLと共に培養し、KG-CTLが産生したIFN-γ量を測定した結果を示すグラフである。横軸は添加したペプチド濃度を、縦軸はKG-CTLが産生したIFN-γ量を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
肺腺癌由来の腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）株の樹立
肺腺癌患者の手術検体を培養液中で細切した後、コラゲナーゼ及びDNAaseを含む培養液中で攪拌して細胞を分散させた。細胞分散液からFicoll Conray溶液を用いて、比重遠心法によりリンパ球を分離した。リンパ球は、24穴プレートを用い、45％RPMI-1640、45％AIM-Ｖ（GIBCO BRL社）、10％FCSに、100U/mlインターロイキン−２、0.1mM NEAA（GIBCO BRL社製）を添加した培養液（以下、リンパ球培養液と呼ぶ）で培養した。培養開始から2日間は、培養液中に抗CD3抗体のNU-T3（ニチレイ社製）を1μg/ml添加した。30日以上培養を続け、HLA-A24またはHLA-A2陽性の何種類かの癌細胞株に反応するCTL株を樹立し、KG-CTLと命名して以下の実験に使用した。各種癌細胞株に対するKG-CTLの反応性は、96穴プレートに癌細胞株を1×104個／穴植え込み、翌日にKG-CTLを1×105個／穴添加して、更に18時間培養した後、培養液を回収してKG-CTLが産生したインターフェロン-γ（IFN-γ）量を測定することにより調べた。IFN-γの定量は、エンザイムイムノアッセイ（ELISA）により行った。すなわち、96穴プレートに固相化抗体として抗ヒトIFN-γマウスモノクローナル抗体を吸着させ、ウシ血清アルブミンで非特異的結合をブロックした後、検体中のIFN-γを抗体に結合させた。次に検出抗体として抗ヒトIFN-γウサギポリクローナル抗体を結合させ、さらにアルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギイムノグロブリンヤギ抗体（アマシャム社製）を結合した後、ペルオキシダーゼ発色キットＴ（住友ベークライト社製）を用いて発色させた後、吸光度（405nm）を測定した。これをスタンダードのIFN-γで得られた値と比較することにより定量した。表２に、各種腺癌細胞株に対するKG-CTLの反応性を示す。また、表３にリンパ球系細胞株に対するKG-CTLの反応性を示す。
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表２の結果より、KG-CTLは、表中のHLA-A2402陽性の癌細胞（HT-1376、11-18、PC-9）に強く反応してIFN-γを産生すること、HLA-A2陽性の癌細胞（143B）にも反応してIFN-γを産生することが示された。また表３の結果より、KG-CTLは、HLA-A2402陽性のEBウイルスでトランスフォームしたＢ細胞株や白血病細胞株（SSB、MT-2）に強く反応すること、HLA-A2陽性の白血病細胞（HPB-MLT）に対しても反応することが明らかになった。
樹立されたKG-CTLは、茨城県つくば市東１丁目1番３号、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（微生物の表示：KG-CTL；受領日：平成10年6月19日；受託番号：FERM P-16854）（国際寄託への変更日：平成11年5月20日；受託番号：FERM BP-6725）。なお、中尾ら著、Cancer Res.,55:4248-4252（1995）記載の方法に従い、KG-CTLのHLA分子のタイピングを行った結果（塩野義製薬（株）により実施）、AローカスはA0206及びA2402であることが確認された。
実施例２
腫瘍抗原タンパク質の同定
実施例１でKG-CTLが強く反応した膀胱癌細胞株HT-1376（ATCC番号CRL1472）から以下の方法によりcDNAライブラリーを作製した。
まず、HT-1376からmRNA精製システム（ファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のプロトコールに従い、全RNA画分の分離およびoligo（dT）カラムによるpoly（A）+ｍＲＮＡの調製を行った。ｍＲＮＡよりスーパースクリプトプラスミドシステム（GIBCO BRL社製）を用い添付のプロトコールに従い、両端にNotIアダプターとSalIアダプターを連結したｃＤＮＡを作製した後、このｃＤＮＡを発現ベクターのプラスミドpSV-SPORT1（GIBCO BRL社製）の制限酵素NotIおよびSalIの切断部位にライゲーションにより連結して組換えプラスミドを得た。この組換えプラスミドをジーンパルサー（Bio-Rad社製）を用いて電気パルスにより大腸菌のエレクトロマックスDH10BTMセル（GIBCO BRL社製）に導入し、アンピシリン（50μg/ml）を含むLB培地（1％バクトトリプトン、0.5％イーストエキス、0.5％NaCl、pH7.3）で組換プラスミドが導入されている形質転換体を選択した。
この形質転換体の100個のプールからの組換えプラスミドDNAの回収は以下のように行った。すなわち、アンピシリン（50μg/ml）を含むLB培地の入った96ウェルＵ底マイクロプレートにウェルあたり100個の形質転換体を加え培養後、その一部をウェル当たり0.25mlのTYGPN培地（F.M.Ausubelら編、CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，Inc.）の入った別の96ウェルＵ底マイクロプレートに移して37℃で48時間培養し、残りのLB培地のマイクロプレートは凍結保存した。TYGPN培地で培養した形質転換体の組換えプラスミドＤＮＡは、マイクロプレートでアルカリ溶解法（F.M．Ausubelら編、CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，Inc.）により調製した。イソプロパノール沈澱で回収した組換えプラスミドＤＮＡは、50μlの20ng/ml RNaseを含む10mM Tris，1mM EDTA，pH7.4溶液で懸濁した。
一方、茨城県つくば市東１丁目１番３号、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている食道癌細胞株KE-４（受領日：平成９年５月２３日；受託番号：FERM BP-5955）から、中尾ら著、Cancer Res.,55:４２４８-４２５２（１９９５）の記載に従い、HLA-A2402（Genbank Accession No.M64740）およびHLA-A2601のcDNAを、発現ベクターpCR3（INVITROGEN社製）に組み込んだ組換えプラスミドを作製した。
次に、アフリカミドリザルの腎臓由来の細胞株COS-7（ATCC番号CRL1651）へ、リポフェクチン法により以下のようにHT-1376ｃＤＮＡの組換えプラスミドとHLA-A2402ｃＤＮＡの組換えプラスミドをダブルトランスフェクトした。すなわち、COS-7を96ウェル平底マイクロプレートにウェル当たり8000個を加えて、100μlの10％ FCSを含むRPMI1640培養液で1日間培養した。リポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL社製）を用い、形質転換体約100個分のHT-1376ｃＤＮＡの組換えプラスミド25μlとHLA-A2402ｃＤＮＡの組換えプラスミド10μl（200ng）と約50倍に希釈したリポフェクチン試薬35μlの混合液70μlのうち、30μlをCOS-7に加えてダブルトランスフェクトした。トランスフェクタントは2点ずつ用意した。5時間後、このトランスフェクタントに200μlの10% FCSを含む培養液を加え、更に48時間、37℃で培養した後、培養液を除去し、ウェル当たり1.5×105個のKG-CTLを加えて100μlの10％FCSと25U/mlのIL-2を含む培養液で37℃で24時間培養した。培養後、培養液を回収し、実施例１に記載のELISA法にてIFN-γ量を測定した。
高いIFN-γ産生が認められた群については、該当する凍結保存してあったHT-1376ｃＤＮＡの組み換えプラスミドによる形質転換体約100個のプールを用いてさらに以下のようにスクリーニングを行った。すなわち、形質転換体のプールをアンピシリン（50μg/ml）を含むLB寒天培地のプレートにまいてコロニーを得て、各群400コロニーについてウェル当たりの形質転換体が１種類となる条件で上記と同様の方法で培養し、HT-1376ｃＤＮＡの組換えプラスミドＤＮＡを調製した。さらに上記と同様な方法で、COS-7へのHT-1376ｃＤＮＡの組換えプラスミドとHLA-A2402ｃＤＮＡの組換えプラスミドのダブルトランスフェクトを行い、引き続いてKG-CTLとの混合培養を行い、KG-CTLが反応して産生した培養液中のIFN-γの定量を行って陽性のプラスミドを選択した。この操作によりHT-1376ｃＤＮＡ組換えプラスミドクローンが選択され、これを4F2と命名した。4F2については、さらにもう一度、同様な操作を繰り返してKG-CTLによるIFN-γの産生量を測定した。その結果を以下の表４に示す。
0004413429.tif 000005
KG-CTLは、COS-７にHLA-A2402のみをトランスフェクトした細胞に対してよりも、COS-７にHLA-A2402と4F2とをダブルトランスフェクトした細胞に対して、より強く反応してIFN-γを産生した。この結果から4F2がコードするタンパク質は、腫瘍抗原タンパク質であることが示された。
実施例３
腫瘍抗原タンパク質遺伝子の塩基配列の決定
実施例２で得られた腫瘍抗原タンパク質をコードするプラスミドクローン4F2についてDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencingキット（パーキンエルマー社製）を使用して、その塩基配列を決定した。決定した塩基配列及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を、WWW Entrezデータベースを使用して既知の配列と比較した結果、プラスミドクローン4F2の塩基配列は、Genbank Accession No.60857に登録されているHuman cyclophilin B（ヒトサイクロフィリンＢ）のアミノ酸配列と同一であった。なお、該サイクロフィリンＢの配列は、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:p1903,1991にも記載されている。該サイクロフィリンＢは免疫抑制剤であるサイクロスポリンＡの結合タンパク質であり、生体内において免疫細胞の活性化に関与することが知られている。上記実施例２により、これまで免疫細胞の活性化への関与のみが知られていたサイクロフィリンＢに、腫瘍抗原タンパク質としての機能の存することが初めて明らかとなった。
実施例４
候補ペプチドの選択
HLA分子に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、HLA-A24の場合、8〜11アミノ酸よりなるペプチドの第2位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンあるいはトリプトファン、またC末端がフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシンあるいはメチオニンがモチーフとなることが知られている（Immunogenetics，41:178，1995、J.Immunol.，152:3913，1994、J.Immunol.,155:4307，1994）。またHLA-A2の場合、8〜11アミノ酸よりなるペプチドであり、HLA-A0201においては第２位がロイシンあるいはメチオニンであり、Ｃ末端がバリンあるいはロイシンであること、HLA-A0204においては第2位がロイシンでありＣ末端がロイシンであること、HLA-A0205においては第2位がバリン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンであり、Ｃ末端がロイシンであること、HLA-A0206においては第2位がバリンあるいはグルタミンであり、Ｃ末端がバリンあるいはロイシンであること、さらにHLA-A0207においては第2位がロイシンでありＣ末端がロイシンであることが知られている（Immunogenetics,41:p178,1995、J.Immunol.,155:p4749,1995、表１参照）。
このようなモチーフに従い、本発明者らが腫瘍抗原タンパク質として機能していることを見出したサイクロフィリンＢのアミノ酸配列（Genbank Accession No.M60857）から、上記モチーフを有する8〜11アミノ酸よりなるペプチド部分を選択した。選択したHLA-A24の結合モチーフを有するペプチドを配列番号：1〜配列番号：11に、またHLA-A2の結合モチーフを有するペプチドを配列番号：12〜配列番号：36に示す。これらのペプチドは（株）バイオロジカに依頼し、Fmoc法にて合成を行った。
次にHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドを文献（J.Exp.Med.，187:277，1998）の記載に従い、104個のCOS-７細胞にリポフェクチン法にてトランスフェクションしてHLA-A2402を発現させた。この細胞に対し、先に合成したHLA-A24の結合モチーフを有する各種ペプチドをそれぞれ10μMで2時間添加してパルスした後、2×104個のKG-CTLとともに18時間培養し、KG-CTLが産生した培養上清中のIFN-γ量をELISA法にて測定した。その後、2種のペプチド、すなわちサイクロフィリンＢのアミノ酸配列の第84位から第92位の配列よりなるペプチド（配列番号：１、以下、該ペプチドを単に「84-92」と称することもある）、及び第91位から第99位の配列よりなるペプチド（配列番号：2、以下、該ペプチドを単に「91-99」と称することもある）を以下の実験に供した。
実施例５
Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（配列番号：１）の合成
樹脂はＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌｋｏ Ｒｅｓｉｎ（０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、１００−２００ｍｅｓｈ）を用いた。この樹脂１００ｍｇを用いて、後記スケジュール１に従って合成を開始し、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを順次カップリングさせた。カップリングの後、以下の表５に示したスケジュール１の工程３まで行い、その結果、ペプチド樹脂が得られた。
このペプチド樹脂にＲｅａｇｅｎｔＫ（５％フェノール、５％チオアニソール、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール／ＴＦＡ溶液）２ｍｌを加え、室温で２．５時間反応させた。氷冷下反応液にジエチルエーテル１０ｍｌを加え１０分攪拌し、濾過しジエチルエーテル１０ｍｌで洗浄した。濾上物に１０％酢酸水溶液（以下酢酸水という）１０ｍｌを加えて３０分間攪拌後、樹脂を濾別し、酢酸水４ｍｌで洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペプチドを酢酸水に溶解し、予め０．１％ＴＦＡ水で平衡化させた逆相系充填剤ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲカラム（２５φ×２５０ｍｍ）に注入し、カラムを０．１％ＴＦＡ水で洗浄後、アセトニトリル濃度を２６０分で２５％まで増加させ、流速７ｍｌ／ｍｉｎ．で溶出した。溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターし、目的物を含む画分を集め、凍結乾燥し、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ １１．７ｍｇを得た。
得られたＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭカラム（４．６φ×２５０ｍｍ）を用いた、０％から６０％までの０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析において保持時間２３．９分を示し、そのアミノ酸分析値および質量分析値は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解：１％フェノール／６Ｎ塩酸水溶液、１１０℃、２４時間
分析法：ニンヒドリン法
＊基準アミノ酸     （）内理論値
Ａｓｘ：１．０１  （１）
＊Ｖａｌ：１．００  （１）
Ｉｌｅ：０．８５  （１）
Ｐｈｅ：１．９４  （２）
Ｌｙｓ：１．７４  （２）
Ｈｉｓ：０．９５  （１）
Ａｒｇ：０．８６  （１）
質量分析（ＦＡＢ）
［Ｍ＋Ｈ］+：１１９０
0004413429.tif 000006
実施例６
Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（配列番号：2）の合成
実施例５と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌｋｏ Ｒｅｓｉｎ  １００ｍｇを用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを順次カップリングさせ、その後脱保護を行った。得られた粗ペプチドを酢酸水に溶解し、予め０．１％ＴＦＡ水で平衡化させた逆相系充填剤ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲカラム（２５φ×２５０ｍｍ）に注入し、カラムを０．１％ＴＦＡ水で洗浄後、アセトニトリル濃度を２６０分で３１％まで増加させ、流速７ｍｌ／ｍｉｎ．で溶出した。溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターし、目的物を含む画分を集め、凍結乾燥し、Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ ３．６ｍｇを得た。
得られたＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭカラム（４．６φ×２５０ｍｍ）を用いた、０％から６０％までの０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析において保持時間２５．８分を示し、そのアミノ酸分析値（ただし、Ｍｅｔは検出せず）および質量分析値は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解：１％フェノール／６Ｎ塩酸水溶液、１１０℃、２４時間
分析法：ニンヒドリン法
＊基準アミノ酸     （）内理論値
Ａｓｘ：２．０２  （２）
Ｇｌｘ：１．０４  （１）
Ｇｌｙ：２．０４  （２）
＊Ｉｌｅ：１．００  （１）
Ｐｈｅ：１．９７  （２）
質量分析（ＦＡＢ）
［Ｍ＋Ｈ］+：１０２９
実施例７
腫瘍抗原ペプチドの同定
先の実施例５および６で合成した2種のペプチドについて、実施例４と同様の実験をペプチド濃度を0.001〜1000μg/mlの範囲で行った結果、これらのペプチドが腫瘍抗原ペプチドとして機能していることが明らかになった。その結果を図１及び図２に示す。図中横軸はペプチド濃度（pg/ml）を、縦軸はKG-CTLが産生したIFN-γ量（pg/ml）を示す。「84-92」及び「91-99」を、HLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドをトランスフェクトしたCOS-7細胞にパルスした場合に、濃度依存的にKG-CTLの反応性が増加した。また、HLA-A2601 cDNAの組換えプラスミドをトランスフェクトしたCOS-7細胞にパルスした場合よりも、前記HLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドをトランスフェクトした場合のほうが、KG-CTLは高い反応性を示した。以上の結果より、「84-92」及び「91-99」の２つのペプチドは、HLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドとして機能していることが示された。
実施例８
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（配列番号：39）の合成
実施例７により、「84-92」及び「91-99」が腫瘍抗原ペプチドとして機能していることが明らかとなったため、HLA-A24の結合モチーフ上置換可能なアミノ酸の範囲内から、第2位のフェニルアラニンをチロシンに置換した誘導体、「84-92・2F-Y」（配列番号：39）および、「91-99・2F-Y」（配列番号：40）を、それぞれ合成した。
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（配列番号：39）については、実施例５と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌｋｏ Ｒｅｓｉｎ １００ｍｇを用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを順次カップリングさせ、その後脱保護を行った。得られた粗ペプチドを酢酸水に溶解し、予め０．１％ＴＦＡ水で平衡化させた逆相系充填剤ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲカラム（２５φ×２５０ｍｍ）に注入し、カラムを０．１％ＴＦＡ水で洗浄後、アセトニトリル濃度を２００分で２５％まで増加させ、流速７ｍｌ／ｍｉｎ．で溶出した。溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターし、目的物を含む画分を集め、凍結乾燥し、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ ４４．９ｍｇを得た。
得られたＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭカラム（４．６φ×２５０ｍｍ）を用いた、０％から６０％までの０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析において保持時間１７．７分を示し、そのアミノ酸分析値および質量分析値は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解：１％フェノール／６Ｎ塩酸水溶液、１１０℃、２４時間
分析法：ニンヒドリン法
＊基準アミノ酸     （）内理論値
Ａｓｘ：１．０６  （１）
＊Ｖａｌ：１．００  （１）
Ｉｌｅ：０．８５  （１）
Ｔｙｒ：０．８９  （１）
Ｐｈｅ：０．９５  （１）
Ｌｙｓ：１．８５  （２）
Ｈｉｓ：０．９８  （１）
Ａｒｇ：０．９１  （１）
質量分析（ＦＡＢ）
［Ｍ＋Ｈ］+：１２０６
実施例９
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（配列番号：40）の合成
実施例５と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌｋｏ Ｒｅｓｉｎ  １００ｍｇを用いて、Ｐｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを順次カップリングさせ、その後脱保護を行った。得られた粗ペプチドを酢酸水に溶解し、予め０．１％ＴＦＡ水で平衡化させた逆相系充填剤ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲカラム（２５φ×２５０ｍｍ）に注入し、カラムを０．１％ＴＦＡ水で洗浄後、アセトニトリル濃度を２００分で２７％まで増加させ、流速７ｍｌ／ｍｉｎ．で溶出した。溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターし、目的物を含む画分を集め、凍結乾燥し、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ １２．８ｍｇを得た。
得られたＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭカラム（４．６φ×２５０ｍｍ）を用いた、０％から６０％までの０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析において保持時間２４．７分を示し、そのアミノ酸分析値（ただし、Ｍｅｔは検出せず）および質量分析値は理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解：１％フェノール／６Ｎ塩酸水溶液、１１０℃、２４時間
分析法：ニンヒドリン法
＊基準アミノ酸     （）内理論値
Ａｓｘ：２．０４  （２）
Ｇｌｘ：１．０２  （１）
Ｇｌｙ：２．０６  （２）
＊Ｉｌｅ：１．００  （１）
Ｔｙｒ：０．８２  （１）
Ｐｈｅ：０．９８  （１）
質量分析（ＦＡＢ）
［Ｍ＋Ｈ］+：１０４５
実施例１０
腫瘍抗原ペプチド及びその誘導体による末梢血リンパ球からのCTL誘導
実施例５で合成した「84-92」（配列番号：1）及び実施例８で合成した「84-92・2F-Y」（配列番号：39）のペプチドを用いて、末梢血リンパ球から抗原特異的なCTLが誘導できるか検討した。
HLA-AローカスがA24のヘテロである白血病患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離した。２４穴プレートに２×１０6細胞／穴となるようにリンパ球を加え、リンパ球培養液で培養した。培養液に前記腫瘍抗原ペプチドを１０μＭになるように加え、末梢血リンパ球を刺激した。１週間後、Ｘ線照射（５０Ｇｙ）した約２×１０5個の末梢血リンパ球とともに前記腫瘍抗原ペプチドを１０μＭになるように加えて、２回目の刺激を行った。さらに１週間後、３回目の刺激を同様に繰り返した。３回目の刺激から１週間後、培養したリンパ球を回収した。本発明の腫瘍抗原タンパク質（サイクロフィリンＢ）を発現しておりHLA-A2402陽性のEBウイルスでトランスフォームしたＢ細胞株であるBEC-2、及び本発明の腫瘍抗原タンパク質を発現しているがHLA-A2402陰性のEBウイルスでトランスフォームしたＢ細胞株であるBan-B1をそれぞれ標的細胞（1×１０4個）として、前記のリンパ球（8×104個）が反応して産生する培養上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡで測定した。結果を表６に示す。
0004413429.tif 000007
さらに、前記「84-92」（配列番号：１）及び「84-92・2F-Y」（配列番号：39）と共に、実施例６で合成した「91-99」（配列番号：２）及び実施例９で合成した「91-99・2F-Y」（配列番号:40）についても前記と同様の実験を行った。結果を表７に示す。
0004413429.tif 000008
「84-92」、「84-92・2F-Y」、「91-99」及び「91-99・2F-Y」のペプチドで刺激した末梢血リンパ球は、HLA-A24陽性のBEC-2に反応したが、HLA-A24陰性のBan-B1には反応しなかったことから、HLA-A24拘束性の抗原ペプチド特異的なCTLが誘導されていることが示された。また、「84-92・2F-Y」及び「91-99・2F-Y」のペプチドで刺激した末梢血リンパ球は、「84-92」及び「91-99」のペプチドで刺激した末梢血リンパ球と同様にBEC-2に反応したことから、ペプチドを置換した誘導体は、オリジナルのペプチドと同様のＣＴＬ誘導能を有することが示された。
なお本実験で用いたBEC-2の代わりに、HLA-A2402のcDNA（Genbank Accession No．M64740）発現プラスミドをCOS-7細胞（ATCC No.CRL1651）やVA-13細胞（理化学研究所細胞銀行）に導入して前記ペプチドをパルスした細胞を用い、また本実験で用いたBan-B1の代わりに、前記HLA-A2402のcDNA発現プラスミドを前記COS-7細胞やVA-13細胞に導入して前記ペプチドをパルスしない細胞を用いることによっても、同様の実験を行うことが可能である（J.Exp.Med.,187:277,1998）。
実施例１１
サイクロフィリン由来ペプチドの合成
前記実施例１〜１０によりサイクロフィリンＢが腫瘍抗原タンパク質であることが明らかとなったため、次に、サイクロフィリンＢのホモローグとして知られているサイクロフィリンＡ、サイクロフィリンＣ及びサイクロフィリンＤについても同様の活性が存するか否かを検討した。
サイクロフィリンＡ、サイクロフィリンＣ及びサイクロフィリンＤについてもそのアミノ酸配列が明らかにされているため（Biochemistry,3:p8218,1994）、この文献をもとに、HLA-A24の結合モチーフを有するサイクロフィリンAのアミノ酸配列の第59位から第67位の配列よりなるペプチド（配列番号：41、以下、該ペプチドをCyp-A「59-67」と称することもある）、サイクロフィリンCのアミノ酸配列の第89位から第97位の配列よりなるペプチド（配列番号：42、以下、該ペプチドをCyp-C「89-97」と称することもある）及びサイクロフィリンDのアミノ酸配列の第94位から第102位の配列よりなるペプチド（配列番号：43、以下、該ペプチドをCyp-D「94-102」と称することもある）を選択し、Fmoc法にてペプチドを合成した。一例として以下にCyp-A「59-67」（配列番号：41）の合成方法および結果を記載する。
樹脂はＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＡｌｋｏＲｅｓｉｎ（０．６７ｍｍｏｌ／ｇ，１００−２００ｍｅｓｈ）を用いた。この樹脂５０ｍｇを用いて、後記スケジュール１（表８）に従って合成を開始し、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを順次カップリングさせた。カップリングの後スケジュール１（表８）の工程３まで行い、その結果、ペプチド樹脂が得られた。
このペプチド樹脂にＲｅａｇｅｎｔＫ（５％フェノール、５％チオアニソール、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール／ＴＦＡ溶液）１ｍｌを加え、室温で２．５時間反応させた。氷冷下反応液にジエチルエーテル１０ｍｌを加え１０分間攪拌し、濾過しジエチルエーテル１０ｍｌで洗浄した。濾上物に酢酸水１０ｍｌを加えて３０分間攪拌後、樹脂を濾別し、酢酸水４ｍｌで洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得られた租ペプチドを酢酸水に溶解し、予め０．１％ＴＦＡ水で平衡化させた逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ａ ＳＨ−３６３−５（３０Φ×２５０ｍｍ）に注入し、カラムを０．１％ＴＦＡ水で洗浄後、アセトニトリル濃度を０％から１５％まで６０分、１５％から３０％まで２４０分かけて増加させ、流速７ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。溶出液を２２０ｎｍでモニターし、目的物を含む画分を集め、凍結乾燥し、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅを９．７ｍｇ得た。
得られたＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅを、逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＫ ＯＤＳ−ＡＭ ＡＭ３０３（４．６Φ×２５０ｍｍ）を用い分析した結果、１８％から４８％までの０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法において、保持時間１８．８分を示し、そのアミノ酸分析値（Ｃｙｓは検出できず）および質量分析値は、理論値と一致した。
アミノ酸分析
加水分解：１％フェノール／６Ｎ塩酸水溶液、１１０℃、１０時間
分析法：ニンヒドリン法
＊基準アミノ酸     （）内理論値
Ａｓｘ：０．９９  （１）
Ｇｌｘ：１．０６  （１）
Ｇｌｙ：２．９６  （３）
Ｍｅｔ：０．９９  （１）
＊Ｐｈｅ：２．００  （２）
質量分析（ＦＡＢ）
［Ｍ＋Ｈ］+：９６１
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実施例１２
サイクロフィリン由来ペプチドによる末梢血リンパ球からのＣＴＬ誘導
実施例１１で合成した3種のペプチドを用いて、末梢血リンパ球から抗原特異的なCTLが誘導できるか検討した。HLA-AローカスがA24のホモである健常人の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離した。実施例１０と同様の方法によりリンパ球を前記ペプチドで３回刺激した。3回目の刺激から１週間後、リンパ球を回収し、D.D.Kharkevitchら著、Int.J.Cancer，58:317（1994）に記載の方法に従って、51Crで標識されたHLA-A24陽性のＴ細胞リンパ腫由来細胞株KOPT-K1及びHLA-A24陰性のＴ細胞白血病細胞株RPMI8402を標的細胞として細胞傷害活性を測定した。結果を表９に示す。
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Cyp-A「59-67」、Cyp-C「89-97」及びCyp-D「94-102」のペプチドで刺激したリンパ球は、HLA-A24陽性のKOPT-K1に反応したが、HLA-A24陰性のRPMI8402には反応しなかったことから、HLA-A24拘束性の抗原ペプチド特異的なCTLが誘導されていることが示された。以上の結果から、サイクロフィリンB以外のサイクロフィリンも腫瘍抗原として機能することが明らかとなった。
なお、本実験で用いたKOPT-K1およびRPMI8402の代わりに、実施例１０の最後に記載した組換え細胞を用いた手法によっても、同様の実験を行うことが可能である。
実施例１３
サイクロフィリンタンパク質による末梢血リンパ球からのＣＴＬ誘導
文献（J.Immunol.,158:1796,1997、Cancer Res.,59:1184,1999等）に記載の方法を参考にして、本発明のサイクロフィリン又はその部分ポリペプチド、あるいは本発明のサイクロフィリン由来腫瘍抗原ペプチドなどをパルスすることにより、ＨＬＡ抗原とサイクロフィリン由来腫瘍抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞を作製することができる。また、所望の抗原提示細胞が作製されたか否かは、当該抗原提示細胞により末梢血リンパ球から抗原特異的CTLが誘導されるか否かを指標として調べることができる。以下、健常人末梢血を用いた一例を述べるが、腫瘍患者の末梢血を用いても同様の手法により抗原提示細胞が調製できることは言うまでもない。
まず、HLA-A24陽性の健常人末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離する。リンパ球を培養フラスコで37℃、3時間静置した後、非付着細胞を除く。付着細胞をGM-CSF（2000U/ml）、IL-4（2000U/ml）存在下で７日間培養し、抗原提示能が高い細胞として知られている樹状細胞を誘導する。回収した樹状細胞は、10μg/mlの本発明の腫瘍抗原ペプチド、または100μg/mlの本発明の腫瘍抗原タンパク質（サイクロフィリン）又はその部分ポリペプチドと共に、37℃、2時間培養してパルスした後、X線照射（5000rad）する。前記の健常人の末梢血リンパ球からバイオマグネティックセパレーションビーズ（Dynal社）を用いて調製したCD8+のＴ細胞と、前記ペプチドまたはタンパク質をパルスした樹状細胞とを24穴プレートで混合培養し、抗原刺激を行う。刺激の翌日にIL-2（100U/ml）を添加する。約1週ごとに、同様に前記のペプチドあるいはタンパク質をパルスした樹状細胞を用いてＴ細胞の刺激をする（２〜４回）。最後の刺激から1週間後、培養したＴ細胞を回収する。本発明の腫瘍抗原タンパク質を発現しておりHLA-A24陽性のEBウイルスでトランスフォームしたB細胞株であるBEC-2、及び本発明の腫瘍抗原タンパク質を発現しているがHLA-A24陰性のEBウイルスでトランスフォームしたB細胞株であるBan-B1をそれぞれ標的細胞として、前記のＴ細胞の反応性を実施例１０と同様に培養上清中のIFN-γ量をELISAで測定するか、または実施例１２と同様に51Crで標識した標的細胞に対する傷害活性を測定する。抗原特異的なCTLが誘導されている場合は、BEC-2に対してのみ反応が認められる。以上の実験を行うことにより、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたは腫瘍抗原タンパク質等をパルスした抗原提示細胞（樹状細胞）が抗原特異的なCTL誘導活性を有するか否かを測定することができる。
なお本実験で用いたBEC-2の代わりに、HLA-A2402のcDNA（Genbank Accession No．M64740）発現プラスミドをCOS-7細胞（ATCC No.CRL1651）やVA-13細胞（理化学研究所細胞銀行）に導入して本発明の腫瘍抗原ペプチドまたは腫瘍抗原タンパク質をパルスした細胞を用い、また本実験で用いたBan-B1の代わりに、前記HLA-A2402のcDNA発現プラスミドを前記COS-7細胞やVA-13細胞に導入して前記ペプチド等をパルスしない細胞を用いることによっても、同様の実験を行うことが可能である（J.Exp.Med.,187:277,1998）。
配列表フリーテキスト
配列番号：３７に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
配列番号：３８に記載のアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第９番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
産業上の利用の可能性
本発明により、サイクロフィリン由来の腫瘍抗原ペプチドおよび機能的に同等の特性を有するその誘導体、さらにはこれらの腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体やサイクロフィリンポリペプチドまたはその遺伝子を、in vivoまたはin vitroで利用した腫瘍の治療剤、予防剤または診断薬などを提供することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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