(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２の配列もしくは該配列に対して少なくとも９０％のホモロジーを有する配列からなるブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントからなり、該免疫原性フラグメントが配列番号：３〜１４、１７または１８のいずれかの配列からなる、人間または動物の身体の治療または診断方法に用いられるブドウ球菌タンパク質。
【請求項２】
配列番号：２の配列に対して少なくとも９５％のホモロジーを有する、請求項１のブドウ球菌タンパク質。
【請求項３】
人間または動物の治療または診断方法に用いられる、請求項１または２記載のブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項４】
配列番号：１の配列からなる、請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
ブドウ球菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミヂス（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・ヘモリチクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・フィクス（S. hyicus）またはスタフィロコッカス・サプロフィチクス（S. saprophyticus）である、請求項１もしくは２記載のブドウ球菌タンパク質もしくはその免疫原性フラグメント、またはブドウ球菌タンパク質もしくはそれらの免疫原性フラグメントをコードする請求項３または４記載の核酸分子。
【請求項６】
ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造における、請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントの使用。
【請求項７】
ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造における、請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントに特異的な結合剤の使用。
【請求項８】
請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントを使用することを特徴とする、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントに特異的な結合剤を使用することを特徴とする、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法。
【請求項１０】
ブドウ球菌の診断テストキットの製造方法における、請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはこれらに特異的な結合剤の使用。
【請求項１１】
検出テストにおける、請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはこれらに特異的な結合剤の使用。
【請求項１２】
ブドウ球菌の診断のための診断テストキットの製造方法またはブドウ球菌の検出のための生体外検出テスト方法における、請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはこれらに特異的な結合剤の使用。
【請求項１３】
ブドウ球菌の生体外検出テスト方法であって、
ｉ）請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントをサンプルと反応させる工程；
ｉｉ）該抗原−抗体反応を検出する工程；および
ｉｉｉ）該抗原−抗体反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる工程を含む方法。
【請求項１４】
ブドウ球菌の生体外検出テスト方法であって、
ｉ）請求項１、２もしくは５記載のブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性フラグメントをサンプルと反応させる工程；
ｉｉ）結合剤−標的結合反応を検出する工程；および
ｉｉｉ）該結合剤−標的結合反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる工程を含む方法。
【請求項１５】
結合剤が抗体であり、標的が抗原である請求項１３または１４に記載の生体外検出テスト方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の生体外検出テスト方法であって、患者のブドウ球菌感染に用いられ、サンプルが患者由来のサンプルであり、患者のブドウ球菌感染との相関を判定する方法。
【請求項１７】
サンプルが患者由来の血漿、血清または抗血清である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の生体外検出テスト方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれかに記載のテスト方法を実施するための検出テストキット。
【請求項１９】
キットを使用して検出テストを行なうための使用説明を含む、請求項１８に記載の検出テストキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブドウ球菌（特に黄色ブドウ球菌）の感染（症）の治療および診断に関し、該ブドウ球菌のタンパク質、エピトープ、ならびにそれらの特異的な抗体およびその他の結合剤や中和剤を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
グラム陽性菌の多重薬剤耐性（ＭＤＲ）は、特に病院において、ますます問題視されている（Banergee, S.N. 他、1991, Am. J. Med. 91 : 865-895 ; Shaberg, D.R. 他、1991, Am. J. Med. Suppl., 88 : 72-75 ; Gaynes, R.P. 他、1994, Infect. Dis. Clin. Pract., 6 : 452-455）。特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス）（ＭＲＳＡ）およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）（特にメチシリン耐性ＣＮＳ）は、ペニシリンおよびセファロスポリン全てに対して耐性であり、問題であることが明らかにされている。キノロンのような他の薬剤に対する耐性も広まっている（Malabarta, A. 他、1997, Eur. J. Med. Chem., 32 : 459-478 ; Lewis, K., 1994, TIBS, 19 : 119-123 ; Traub, W.H. 他、1996, Chemotherapy, 42 : 118-132）。代表的な治療はバンコマイシンまたはテイコプラニンを使用するものである。しかしながら、これらの薬剤に対する耐性も拡大しつつあり、新しい治療法が要望されている。
【０００３】
ＷＯ９８／０１１５４は、人間または動物の身体の治療および診断方法に、バクテリアおよび真菌のＡＢＣ輸送（トランスポーター）タンパク質ならびにそれらに特異的な中和剤を使用することを開示している。治療に有用なものとして、見かけの分子量が９７ｋＤａおよび５４ｋＤａの腸球菌ＡＢＣ輸送タンパク質が明らかにされ、さまざまのエピトープも明かにされている。バチルス・チューリンジエンシスのIstAおよびIstBタンパク質（Menou 他、1990, J. of Bacteriology, 173 : 6689-6696）に類似のブドウ球菌ホモログも明かにされており、該ホモログは６９および３７ｋDaのみかけの分子量を有し主要保存抗原である。それらのエピトープも明かにされている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このたび本発明者は、流行性のＭＲＳＡ株から６７ｋＤａのみかけの分子量を有するブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質の分離および精製に成功し、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１のコード配列および配列番号：２のアミノ酸配列としている。これらの配列の一部は、スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＴＣ８３２５ゲノム解読プロジェクトにより、コンティグ１１８４、コンティグ１１７７およびコンティグ１１５８（アミノ末端配列データを含有する）として明らかにされたものである。このタンパク質は、これまでＡＢＣ輸送タンパク質であると示されたことはなく、それを診断や治療に用いることもこれまで提示されたことはなかった。該タンパク質は計算による真の分子量は６０．１ｋＤａであるが、翻訳後修飾により６７ｋＤａのみかけの分子量を有するものとして実験的に明かにされた。
【０００５】
該タンパク質の機能は、ＷＯ９８／０１１５４のIstAおよびIstBホモログによって示唆されるものでなければ開示されているものでもない。それらは配列が異なり分子量が異なっているからである。さらに、そのIstAおよびIstBホモログが単離されたサンプルは、本発明について用いられたような血液や創傷培養物（後記）ではなく腹腔透析物であり、そのような精製法によっては本発明は導かれ得ない。該従来技術によって採用されている透析工程は、血清に比較すると、透析物中の抗体の相対的な割合を変化させてしまうからである。同様にして、その他の既知技術も、本発明に係る該タンパク質の機能について何らの示唆をしておらず、該タンパク質を診断または治療に用いることも示唆していない。
【０００６】
【発明の実施の形態】
かくして、本発明に従えば、配列番号：２またはその部分的な修飾形態またはその免疫原性フラグメントから成り、人間または動物の身体の治療または診断方法に用いられるブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質が提供される。
【０００７】
該タンパク質の免疫原性フラグメントとしては、免疫応答を起こすようなタンパク質フラグメントであればいずれでもよく、エピトープ（すなわちエピトープを有するペプチド）を含む。同様にして、エピトープのアナログ（ミモトープ）を簡単に作製することもでき、そのようなミモトープは配列は異なるが同じエピトープを有するものである。このようにして「免疫原性フラグメント」とは、該フラグメントの免疫原性アナログ（例えばミモトープ）も包含するものとする。エピトープの決定やミモトープの設計は容易に行うことができる（Geysen, H.M. 他、1987, Journal of Immunological Methods, 102 : 259-274 ; Geysen, H.M. 他、1988, J. Mol. Recognit., 1 (1) : 32-41 ; Jung, G. およびBeck-Sickinger, A.G., 1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31 : 367-486）。
【０００８】
本発明の範囲は、他の非ブドウ球菌のＡＢＣ輸送タンパク質、例えばＷＯ９８／０１１５４のタンパク質にまで及ぶものではない。しかし、本発明は、非実質的に修飾された（すなわち、部分的に修飾された）タンパク質形態、特に、当該タンパク質自身と同一の免疫原性を有するようなタンパク質形態を包含するものである。
【０００９】
「部分修飾」または「部分的に修飾された」とは、アミノ酸配列に関して用いられる場合、部分的に修飾された形態の分子が、それが誘導された元の分子の性質を実質的に保持している（勿論、追加の機能が生じることもある）ことを意味する。部分修飾は、例えば、アミノ酸残基の付加、削除または置換による。置換は保存的置換の場合もある。したがって、部分的に修飾された分子とは、例えば、それが誘導された元の分子のホモログ（相同体）である。例えば、誘導された元の分子に対して少なくとも７０％のホモロジーを有する。例えば、誘導された元の分子に対して少なくとも８０，９０または９５％のホモロジーを有するようなものである。ホモログの例は、アレル（対立遺伝子）変異体である。同様に、そのような分子またはアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が部分的に修飾されて、アミノ酸配列や分子の部分修飾をコードするようになることもある。勿論、ヌクレオチド配列の修飾には、同じアミノ酸をコードしながらヌクレオチド配列は異なるように修飾されることも含まれる。
【００１０】
ブドウ球菌は、例えば、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス：S. aureus）であり、あるいは、例えば、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミヂス（S. epidermidis）、スタフィロコッカス・ヘモリチクス（S. haemolyticus）、スタフィロコッカス・フィクス（S. hyicus）またはスタフィロコッカス・サプロフィチクス（S. saprophyticus）である。
【００１１】
免疫原性フラグメントは、例えば、ＡＴＰ結合サイトまたはその一部から成る。当該ＡＢＣ輸送タンパク質の多くのエピトープを保有する（発現する）ペプチドも明かにされており（後述）、したがって該タンパク質の免疫原性フラグメントは、例えば、配列番号：３，４，５，９，１０，１１または１２の配列を含むものである。配列番号：３，４および５のエピトープは、それぞれ、配列番号：６，７および７の配列を有するペプチドによって示され、したがって、免疫原性フラグメントは、例えば、配列番号：６，７または８の配列を含むものである。特に、実験によって示されるところによれば、配列番号：３および４を有するエピトープを示す配列番号：６および７を有するペプチドは特に治療用として適している。配列番号：１３および１４の配列を有するペプチドも、その抗体が動物モデルで治療効果を有する（後述の実験参照）ようなエピトープを保持しており、したがって、免疫原性はフラグメントは、例えば、配列番号：１３または１４の配列を含むものである。更なるエピトープとして配列番号：１７の配列を有するものも見出されており、該エピトープを保有し配列番号：１８の配列を有するペプチドは、６７ｋＤａの抗原に特異的なポリクローナル抗血清の産生を引き起こす。したがって、配列番号：１７または１８のいずれか一方の配列を有するものも免疫原性フラグメントの１例である。
【００１２】
かくして、上述のようなエピトープを保有するブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質は治療や診断に有用であり、該タンパク質およびその免疫原性フラグメントは、ブドウ球菌感染の治療および予防（例えば、ワクチンのような免疫刺激剤として）に用いられることができる。
【００１３】
さらに、該ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメントまたはその部分的に修飾された形態に特異的な結合剤および中和剤（例えば抗体）も、診断および治療に用いられることができる。結合剤には、それが特異的な標的があり、結合剤が抗体である場合には標的は抗原である。治療用薬剤の例は、該ＡＢＣ輸送タンパク質に特異的な抗体であり、これは、免疫治療（例えば、受動免疫治療）に採用することができる。抗体とその製法および使用法は周知であり（Harlow, E.およびLane, D., "Antibodies・A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New Youk, 1988 ; Harlow, E.およびLane, D., "Using Antibodies : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998）、したがって、抗体およびその抗原結合性フラグメントについては当業者には自明であろう。
【００１４】
該タンパク質またはその免疫原性フラグメントのヌクレオチド配列も治療用途の基礎を与えるものである。例えば、該タンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡワクチンの製法に用いられることができる（Montgomery, D.L.他、1997, Pharmacol. Ther., 74 (2) : 195-205 ; Donnelly, J.J,他、1997, Annu. Rev. Immunol., 15 : 617-648 ; Manickan, E.他、1997, Crit, Rev. Immunol., 17 (2) : 139-154）。リボザイムやアンチセンスオリゴヌクレオチドのような他の中和剤も当業者には自明であろう。
【００１５】
このようにして、本発明は、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法において、ブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質、その免疫原性フラグメント、ならびに、それらに特異的な結合剤および中和剤を使用することも提供する。また、それらを使用することを特徴とする、ブドウ球菌感染治療用薬剤の製造方法も提供する。さらに、それらを使用することから成る、人間または動物の身体の治療方法も提供する。薬剤の用量は、標準的な用量（服量）−反応実験により容易に決定することができる。薬剤上許容できるキャリア、稀釈剤または賦形剤を含むこともできる（Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA参照）。
【００１６】
上述したように、本発明の該ＡＢＣ輸送タンパク質、その免疫原性フラグメント、それらに特異的な結合剤および結合剤は診断にも有用であり、したがって、本発明は、ブドウ球菌に対する診断テストキットの製造におけるそれらの使用にも関する。さらに、ブドウ球菌の診断テスト方法におけるそれらの使用も提供する。
【００１７】
本発明に従えば、さらに、ブドウ球菌感染の診断テスト方法であって、
ｉ）ブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質またはその免疫原性フラグメントをサンプルと反応させる工程；
ｉｉ）抗原−抗体反応を検出する工程；および
ｉｉｉ）該抗原−抗体反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる工程を含む方法が提供される。
【００１８】
さらに、本発明に従えば、ブドウ球菌感染の診断テスト方法であって、
ｉ）本発明に従うＡＢＣ輸送タンパク質に対する抗体またはその他の結合剤をサンプルと反応させる工程；
ｉｉ）結合剤−標的結合反応を検出する工程；および
ｉｉｉ）結合剤−標的結合反応の検出結果をブドウ球菌の存在と相関させる工程を含む方法が提供される。
【００１９】
サンプルは、例えば、患者の血漿またそれらのフラクション（画分）、例えば血清もしくは抗血清である。上記の診断テスト方法は、例えば、患者のブドウ球菌感染を調べるためのものであり、サンプルとして患者サンプルを用い、上記の相関を調べることにより患者のブドウ球菌感染を判定する。
【００２０】
さらに、本発明に従えば、本発明に従う診断テスト方法を実施するための診断テストキットが提供される。この診断テストキットは該キットを用いる診断テストを行うための使用説明（書）を含むこともある。
【００２１】
本発明に従えば、さらに、本発明に従うブドウ球菌ＡＢＣ輸送タンパク質、その免疫原性フラグメント、結合剤または中和剤を使用することを含むブドウ球菌感染の治療方法または診断方法が提供される。
本発明は、ブドウ球菌感染の診断および治療を示す以下の記述から更に明らかになるであろうが、それらの記述は単に例示のためのものである。
【００２２】
【実施例】
各種グループの患者の血液および創傷培養物由来のＭＲＳＡ血清を用いて実験を行なった。各グループから抗原抽出物を調製し、患者の抗血清によりスクリーニングを行なった。これによって６７ｋＤａの抗原を取得し、さらに、ＥＲＳＡの流行株から構築された発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、目的のタンパク質を取得した。次いで、エピトープマッピングにより該タンパク質の抗原領域を確認し、さらに実験を行なうことにより治療効果の可能性のあるエピトープおよび該エピトープを有するペプチドを明かにした。
【００２３】
イムノブロッティング
バクテリア株  ＥＲＳＡの流行株（ＥＭＲＳＡ）は、Manchester Royal Infimary (MRI)のClinical Microbiology Laboratoryから入手した。この菌株は、バンコマイシンおよびリファンピシンに感受性であるので、ＥＭＲＳＡ（ＶＳＲＳ）と呼ぶ。リファンピシン投与によりインビボでリファンピシン耐性が誘起された患者から、このクローンの単離物を得た（ＶＳＳＲ）。
【００２４】
血清グループ
グループ１：バンコマイシンおよびリファンピシンによる全身治療を必要とする感染患者由来（痰または創傷）（ｎ＝３）。単離物は常にリファンピシン感受性。
グループ２：バンコマイシンおよびリファンピシンによる全身治療を必要とする患者由来（陽性血液培養物）（ｎ＝３）。単離物は常にリファンピシン感受性。
グループ３：リファンピシン耐性クローンを持つ糖尿病患者の脚潰瘍コロニー由来（ｎ＝３）。全身治療なし。
グループ４：バンコマイシンおよびリファンピシンで治療された敗血症患者由来（陽性血液培養物）（ｎ＝３）。菌は治療中にリファンピシン耐性となった。
【００２５】
バンコマイシン耐性ＥＭＲＳＡの調製
上記のＶＲＲＳおよびＶＳＲＲの単一コロニーを、１０ｍｌの栄養培地ナンバー２（英国Oxoid製）にバンコマイシン１μｇ／ｍｌとともに接種し、振盪下に３７℃でインキュベートした。培地が濁状を呈したときに、４滴（１２０μｌ）を、2μｇ／ｍｌのバンコマイシンを含有する別の培地１０ｍｌに接種した。この培地が濁状を呈したら、該培養物１２０ｍｌを３μｇ／ｍｌのバンコマイシンを含有する別の培地に接種した。この操作を繰り返すことにより、バンコマイシン濃度を４，５，６，７，８μｇ／ｍｌという具合に漸次増加させ、最後に、ＥＭＲＳＡ１５については２２μｇ／ｍｌ、そしてリランピシン耐性ＥＭＲＳＡについては１６μｇ／ｍｌとなるようにした。これらの新しいクローンをそれぞれ、ＶＳＲＲおよびＶＲＲＲと指称した。
４ヶの１リットルフラスコ（それぞれ、５００ｍｌの栄養培地ナンバー２を含有する）に、バンコマイシンに対して高い耐性を有する培養物を接種した。リファンピシン感受性菌株については３０μｇ／ｍｌとし、また、リファンピシン耐性単離物については２０μｇ／ｍｌとなるようにした。
【００２６】
バンコマイシン分析用培地サンプルの採集
殺菌処理した５ｍｌピペットを用いて、上記培地にバンコマイシンを添加した後、フラスコを静かに振盪した。殺菌処理した新しいピペットで培地サンプル（１ｍｌ）を取り出した後、フラスコにテスト用バクテリアを接種した。該サンプルはバンコマイシンを分析するためにClinical Microbioloy Laboratoryに送った。
各フラスコは、培地が濁状を呈するまで、振盪下に３７℃でインキュベートした。殺菌処理したピペットを用いて安全キャビネット内で培地サンプル（２ｍｌ）を取得した後、細胞をハーベストした。該サンプルは、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈渣はHibitaneに廃棄し、上清はMillipore０．２２μｍフィルターを用いてろ過してからバンコマイシンの分析のために送った。リンファピシン感受性菌株の値は、接種の開始時には２７．１μｇ／ｍｌであり終了時には８．１μｇ／ｍｌであった。リンファピシン耐性クローンのそれらの値は、２０．７μｇ／ｍｌおよび７μｇ／ｍｌであった。
【００２７】
細胞のハーベスト
安全キャビネット内で次の工程を実施した。ハーベスト時に各培養物からの血液寒天純度のプレートを調製して培養物が汚染されていないことを確認した。３５００ｒｐｍで１５分間遠心を行なうことによりインキュベート後、細胞をハーベストした。上清はHibitaneに廃棄した。沈降物を無菌塩水で２回洗浄し、各洗浄後３５００ｒｐｍで１５分間遠心した。
【００２８】
バイオＸ−プレス細胞分解装置を用いる細胞の溶解
使い捨て用プラスチックピペットを使用して、組み立て式バイオＸ−Press分解装置（Bio X-Press disintegrator：スウェーデンのBrommaにあるLKB Instruments製）の空のシリンダー内にハーベスト後の細胞を投入し、二次プランジャーをその平面側が下方を向くように配置した。ピストンを僅かな抵抗が感知されるまで押入した。次に、これら全体をプラスチック製ラップで覆い、横にして細胞を含有するシリンダーの液位を上昇させ、−２０℃で一晩放置した。油圧プレスに手動式の油圧ポンプを取り付けネジ付きのカラーを指で締めた。凍結した分解装置からラップを外して、プレス上で垂直に配置して分解装置のピストンがプレスの上面を向くようにした。ピストンの上面にプラスチック製サポートを配置して該サポートがピストンの中央にあるようにし、プラスチック製サポートが上昇してプレスの上面に到達するまでハンドルをゆっくりと押し、多数の「破裂音」が聞こえるようになるまでこれを続け（但し、圧力計の針が赤色領域に入らないようにした）、ピストンが全距離を移動したときにポンプのレバーを回して圧力を解放した。
分解装置を取り外し、スパチュラを用いて分解した細胞をすくい殺菌処理した容器に入れた。この細胞を３５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を取り出し、ペレット分は廃棄した。上清は後に適当な濃度でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に使用した。
【００２９】
ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用装置とゲルの調製
この手法を利用するのに以下の器具を用いて２つのゲルを作製した：サイドクランプ４個、短ガラスプレート２個、長ガラスプレート２個、プレートセパレータ４個、ゴム製基板２個および基板クランプ１個。
各ゲルを調製するため、ガラスプレート対（短ガラスプレートおよび長ガラスプレート）の側部をクランプで止めた。２つのプレートの間にプレートセパレーターにより隙間をつくった。これらのプレートをゴム製基板シール上に配置し基板クランプ内に固定した。サイドクランプの矢印の少し上のレベルまで蒸留水を注入した。この水位をフェルトペンでマークを付けておき、数分間放置して漏れが無いことを確認した。その後、傾けて水を捨てた。
【００３０】
短ガラスプレートの頂部から４ｃｍ下方にマークを付けた。この高さになるまで解離用ゲル混合物を注入した。プラスチック製ピペットを用いて該ゲル混合物の上部に蒸留水の層を添加し、室温下に６０分間放置して硬化させた。硬化後、解離用ゲルの上にある蒸留水層を流し出し、１０ウエルのコームを２つのガラスプレーと間に４５度の角度で挿入した。気泡が発生しないように注意しながらピペットを用いて約５ｍｌのスタッキングゲル混合物を添加し、コームを挿入し中央に動かし、さらにゲル混合物を添加してプレートの上部からあふれるように満たし、３０分間放置して硬化させた。このようにして得られたゲルは同じ日に使用するか、または、解離用ゲルの頂部とコームをプラスチック製のラップで覆い冷室で貯蔵する。
ゲルの使用に当たってはコームを静かに取り除き、ウエルを電気泳動用バッファーで３回洗浄した。ウエルの底に残っている電気泳動用バッファを注射器で取り除いた。ゲルを含有しているガラスプレートを基板クランプから取り外し、タンクホルダーに締結して電気泳動タンクに沈めた。
【００３１】
試料の調製と装入
試料の調製は１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管内で行った。ゲルに通す各サンプルの合計量２５μｌ（抗原滴定の結果に従い蒸留水で希釈したもの）をクラッキングバッファー２５μｌと混合した。さらに、２０μｌのレインボー（ＲＴＭ）着色タンパク質分子量マーカー（英国BuckighamshireのAmersham International製）に合計２０μｌのクラッキングバッファーを添加した。
クラッキングバッファー中の試料およびマーカーを適当な容器内で２〜３分間煮沸した。次にギルソンピペットを用いて、２５ｍｌのマーカーを１つのウエルに、また、５０μｌの各サンプルをそれぞれ適当なウエルに注意深く装入した。
【００３２】
試料が別の試料内に流入しないように注意しながら、プラスチック製ピペットを用いてサンプル上に電気泳動バッファーを積層した。ガラスプレート間に残存するスペースに電気泳動バッファーを満たし、中央タンクはタンクの頂部から約２ｍｍ下方になるように該バッファーを満たし、冷却水を流し始めた。タンクのふたを交換し、装置のスイッチを入れてゲル当たり４０〜５０ｍＡの定常電流を流し、中央タンクに発生する気泡をチェックした。
ゲルの実験は、３時間または青いラインがプレートの底から約１ｃｍ上方になるまで行なった。
電気泳動の電源と水を停止した後、ガラスプレートを保有するホルダーをタンクから取り出し、過剰の電気泳動バッファーを捨てた。ガラスプレートのセッティングを外し、プラスチック製サイドピース（プレートセパレーター）をてこにしてゆっくりとガラスプレートを互いに分離した。スタッキングゲルを除去した後、分離用ゲルを取り外して銀染色またはトランスブロッティングに供した。
【００３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色
ポリアクリロアミド（解離用）ゲル内で分離されたタンパク質に、Daiichi Silver Stain-IIキット（日本のIntegrated Separation Systems製）を用いて染色を行なった。抗原調製物の滴定で用いられたゲル、および、いろいろなインキュベーション条件下で成長した生物中のタンパク質発現を比較するために使用したゲルをメーカーの指図書に従いこの方法で染色した。
【００３４】
イムノブロッティング
抗体応答を調べるために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニトロセルロース膜に転写された生物タンパク質に対して血清のブロッティングを行なった。抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭコンジュゲートを添加した後、適当な基質を添加することによって、血清中に存在するＩｇＧまたはＩｇＭ抗体が結合した該タンパク質のバンドを可視化することができた。
【００３５】
トランスブロッティング
各ゲルについて必要とした材料は、プラスチック製ゲルホルダー（１対）、スコッチブライト２枚、ブロッティングペーパー４枚およびニトロセルロース膜１枚である。
トランスファータンクをトランスブロッティングバッファーで部分的に満たし、プラスチックホルダーのハンドルサイドをタンク内に配置した。回転運動を利用して気泡をトラップしないように注意しながら２枚のスコッチブライトをホルダーに載せた。同様にして、スコッチブライトの上方に２枚のろ紙を配置した。１５×１６．５ｃｍの大きさにカットされた1枚のニトロセルロース膜を一番上に載せ、２０分間浸潤させた。
【００３６】
電気泳動電源および水（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）を停止した後、ガラスプレートを含有するホルダーを電気泳動タンクから取り出した。ガラスプレートのセットを外し、プラスチック製サイドピースをてこにしてガラスプレートを互いに分離した。スタッキングゲルを除去した後、解離用ゲルをガラスプレートからゆっくりと取り除いて残りのスタッキングゲルを除去した。浸潤後のニトロセルロース膜の一番上に解離用ゲルを配置し、さらに、このゲルの上に２枚のブロッティングペーパーを配置した。プラスチック製ホルダーの片方をクリップで止め、このホルダー全体をトランスブロッティングタンク（米国San FranciscoのHoefer Scientific Instruments製Transport Power Lid）に沈めた。タンクの蓋を交換し冷却水を開始した。この装置を最大出力で４５分間運転した。
トランスブロッティングが終了したら、電流のスイッチを切り冷却水を停止した。ホルダーを取り外しゲルとニトロセルロース膜を取り出した。膜を鋭利なメスでゲルの大きさに切り、３％のＢＳＡ（米国セントルイスのSigma Chemical社製）１００ｍｌに入れ４℃で一晩放置した。
【００３７】
抗体のプロービング、コンジュゲーションおよび染色
ガイドとして１０ウエルのコームを用いてニトロセルロースの頂部および底部にマークをつけた。メスと定規を用いて膜を幾つかのストリップに切断した。それらのストリップをストリップボックスに配置し、各ストリップを３％ＢＳＡ（一晩ニトロセルロース膜を貯蔵した３％ＢＳＡを用いた）３．８ｍｌで被覆した。各ストリップについて、イムノブロッティングを行なう血清２００ｍｌ（全量）を添加し、血清を２０倍に希釈した。これらのストリップをロータリーシェーカー上で室温下に２時間インキュベートした。
【００３８】
洗浄液を用いストリップを５回洗浄（各回６分間）した。ストリップに、１０００倍希釈（３％ＢＳＡで希釈）抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭアルカリホスフェートコンジュゲートを添加し、室温下に１時間振盪した。前記と同様に各ストリップを５回洗浄した。一方、ＮＢＴ（ニトロ−ブル−テトラゾリウム）およびＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）粉末のそれぞれ０．０５ｇに１ｍｌのＤＭＦ（ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド）を添加することによりＮＢＴおよびＢＣＩＰを調製した。使用の直前に６６０μｌのＮＢＴおよび３３０μｌのＢＣＩＰを１００ｍｌのアルカリホスフェート基質バッファーに添加した。この溶液５ｍｌを各ストリップに添加して充分に染色が行なわれるようにした（約５〜１５分間）。次に、それぞれのストリップを蒸留水で洗浄することにより反応を停止させ、ブロッティングペーパー上に配置して乾燥させた。
【００３９】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のゲノムライブラリーの調製およびスクリーニング
YoungおよびDaviesらの記述（1983, PNAS USA, 80 : 1194-1198）に従い、発現／クローニングベクター、ラムダＺＡＰエクスプレス内にゲノムライブラリーを構築した。臨床単離物由来の染色体ＤＮＡをＳａｕ３ａにより部分分解し、２〜９ｋｂｐのサイズ範囲にあるフラグメントを上記ベクターに挿入して、βガラクトシダーゼ融合タンパク質を得た。ＩｇＧ抗体で各ライブラリーをスクリーニングし、血液培養物陽性の敗血症から回復した患者由来のＥＭＲＳＡ（１００倍希釈）の６７ｋＤａのバンドに陽性なものを検出した。陽性クローンの検出はアルカリホスフェートとコンジュゲート（複合化）したヤギ抗ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）（５０００倍希釈）（英国PooleのSigma製）を用いて行なった。Huynh, YoungおよびDavies ( 1985, DNA cloning vol 1, a practical approach, IRL Press Oxford, p49-78, Ed. D.M. Glover)に従い、大腸菌Y１０８９での陽性クローンからリソゲンを調製した。Lyonらの記述（1986, PNAS USA, 83 : 2989-2993）に従い抗原選択により、各陽性クローンによって発現されたエピトープを同定した。このために、陽性の組換えラムダプラークでハイブリダイズすることにより）血清をアフィニティ精製した。次に、結合した抗体をグリシンバッファー（ｐH２．８）で溶出させ、関連するバクテリアのライゼートをイムノブロッティングするのに用いた。
【００４０】
ＤＮＡ配列決定
Ｔ３およびＴ７をフォワードプライマーおよびバックプライマーとするＰＣＲを用いて、血清陽性クローン由来のインサートＤＮＡを増幅した。これをＴＡクローニングシステム（バージョン１．３、英国Oxong Invitrogen社製）にサブクローニングした後、ジデオキシターミネーション法（シーケンスバージョン２．０キット、英国CambridgeのUnited States Biochemical社製）を用いてＤＮＡシークエンシングを行なった。当初のシークエンス反応はユニバーサルプライマーを用いて行い、残りの配列は、プライマー歩行法を用いシークエンスプライマーを逐次合成して新しい配列データを得ることにより決定した。
【００４１】
結果
イムノブロッティング
銀染色した抗原抽出物（ＶＳＲＳ、ＶＲＲＳ、ＶＳＲＲおよびＶＲＲＲ）は、４つとも同じパターを生じた。イムノブロッティングによって、見かけの分子量が２７から１４０ＫＤａの抗原バンドが確認された（表１および２）。
【００４２】
４つのグループのいずれの患者も６７ＫＤａの抗原に対する抗体を生じた。特に、血液培養物が陽性の感染を示してバンコマイシンによる治療が必要とする患者についてこのことが該当した。グループ４においては、さらに、２人の患者から続発性血清も入手され、いずれも回復時には該抗原に対する抗体レベルが増大していた。この抗原は、４種類の抗原抽出物のいずれにも存在していた。ＩｇＧは、リファンピシン耐性株のいずれにも存在していた。ＩｇＧは、リファンピシン耐性株に因る敗血症からの生存患者の血清中には存在したが、リファンピシン感受性敗血症から回復した患者の血清中には存在しなかった。
【００４３】
次に、６７ＫＤａの抗原に陽性の血清を用いて、ＥＭＲＳＡ由来の発現ライブラリーのスクリーニングを行なった。２つの陽性クローンが得られた。ＥＭＲＳＡ流行株の保存６７ｋＤａに反応した両クローンは１つのエピトープを有することが抗原選択により示された。配列分析により、βガラクトシダーゼ遺伝子とのフレーム内に部分配列が示された。挿入サイズの全長は４．５Ｋｂであった。このようにして得られたアミノ酸配列は、３つのＡＴＰ結合性ドメインを有するタンパク質を産生し、また、ＡＢＣ輸送タンパク質に属するタンパク質群にホモロジーを有していた（FathおよびKilter, 1993, Microbiological Reviews 37, 995-1017）。これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の１３３位のアミノ酸から始まるタンパク質のＣ末端であった。黄色ブドウ球菌ＮＴＣＣゲノム配列プロジェクトデータベースでこの配列を検索したところ、コンティグ1184、1177および1158にマッチングし、配列が部分的にオーバーラップしていた。これによって、該タンパク質をコードする全遺伝子をクローニングするためのＰＣＲプライマーを合成することができた。
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５およびＮＯ：１６を有するＰＣＲプライマー（それぞれ、フォワードプライマーおよびバックプライマー）を用いて、精製後のＥＭＲＳＡ  ＤＮＡから全長のＡＢＣ輸送タンパク質が得られた。
【００４５】
ｐＢＡＤ−ＴＡ−ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen製）によりｐＢＡＤベクターに上記の全遺伝子をクローニングし、大腸菌内で発現させた。発現後、アフィニティクロマトグラフィーを用いて該タンパク質を精製し、生の（ネーティブ）構造のタンパク質を得た。Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（Qiagenから入手）を用いてカラムを作製し、タンパク質のN末端のＨｉｓタグを結合するようにした。２５０ｍＭのイミダゾールによりカラムからタンパク質を溶出させ、最終タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。
ウサギに該ＡＢＣ輸送タンパク質を注射（０．５ｇをフロイントの完全アジュバントに溶かしたものを注射、１４日後に再注射し、その後、フロイントの不完全アジュバントに溶かしたものを２週間毎に注射）することによりポリクローナル抗血清を調製した。出血前および出血後血清（２８日後に入手）を１００倍希釈したＥＭＲＳＡ流行株由来のプレゼートにイムノブロッティングした。この結果、みかけの分子量６７および３３ｋＤａの抗原に血清転換していることが示された。
このことからも、６７ｋＤａのブドウ球菌抗原の存在が確認された。
【００４６】
エピトープマッピング
Geysen H. M.他による記述に従い（Journal of Immunological Methods, 102 : 259-274）、エピトープスキャンニングキット（英国CambridgeのCambridge Research Biochemicals製）の試薬を用いポリエチレンピン上に、上記のように得られたアミノ酸配列の残基１３５〜５３３をカバーし互いにオーバーラップする一連のノナペプチドを合成した。すなわち、ペプチド１は残基１から９から成り、ペプチド２は残基２から１０から成るという具合にした。ＥＬＩＳＡにより、患者血清（２００倍希釈）に対する各ペプチドの反応性（ＩｇＧ）を測定した。データは、３０分のインキュベーション後のＡ４０５として示した。調べたのは、重要な臨床部位のＥＭＲＳＡコロニー形成を伴う患者由来の血清〔慢性の外来患者透析液、感染後（ｎ＝２）；感染した断端、感染後（ｎ＝３）、血液培養物は陰性だが全身的なバンコマイシン治療を要したもの；バンコマイシンおよびリファンピシンによる治療に成功したＥＭＲＳＡに因る敗血症（感染後、ｎ＝３）；ＥＭＲＳＡに因る致命的敗血症（ｎ＝４）〕および存院患者によるコントロール血清（ｎ＝２）である。
【００４７】
間接ＥＬＩＳＡ
上述のようにして得られた３つのエピトープを選び（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜ＮＯ：５）、それらを表わすペプチドをＢＴ７４００マルチプルペプチドシンセサイザー（英国LutonのBiotech Instruments製）により合成し、間接ＥＬＩＳＡに用いた。
【００４８】
血清
グループＡ：ＥＭＲＳＡコロニー形成または感染が認められない（ｎ＝１２）。
グループＢ：臨床的に重要な部位においてＥＭＲＳＡによりコロニー形成した患者。慢性の外来患者透析液（ｎ＝２）または断端部位（ｎ＝２）で、全身的なバンコマイシン治療が必要とするもの。
グループＣ：バンコマイシン治療されたＥＭＲＳＡに因る敗血症から生存した患者（ｎ＝３）。
グループＤ：ＥＭＲＳＡに因る敗血症で死亡した患者（ｎ＝３）。
【００４９】
マイクロタイタープレートにペプチドを単純吸着させることにより各ペプチドについて以下の操作を実施した。０．０１Ｍのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）２ｍｌ、ｐＨ７．２にペプチドを溶かし、同じバッファーで濃度１０μｇ／ｍｌ（１／１００）に希釈した。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３およびＮＯ：１３を有するペプチド４およびペプチド５については間接ＥＬＩＳＡも実施した。異なる臨床歴を有する全部で３９の血清を用いた。
【００５０】
血清
グループＥ：ブドウ球菌の感染またはコロニー形成が認められない１２人の患者由来の１２の血清。
グループＦ：リファンピシン耐性クローンによりコロニー形成が認められた糖尿病および脚潰瘍患者３人由来の３つの血清。
グループＧ：バンコマイシンおよびリファンピシンの全身治療を必要とし、静脈線、唾液または創傷スワブの培養物が陽性であった１４人の患者由来の１４の血清。
グループＨ：血液培養物陽性の敗血症から回復した患者由来の７つの血清。
グループＩ：抗体治療にもかかわらずＭＲＳＡ感染（血液培養物が恒常的に陽性であったことから証明）で死亡した患者由来の３つの血清。
【００５１】
（１）ペプチド（０．０１ＭのＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌ）の１５０μｌのアリコートをピペットでFalcon３９１２ミクロプレートアッセイプレートのウエル内に注入し、４℃で一晩インキュベートした。
（２）０．０１MのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶かした０．０５％Tween２０で４回（４×１０分）洗浄することにより非結合ペプチドを除去した。
（３）２％スキムミルク−１０％ＦＣＳ（０．０１ＭのＰＢＳ中）を用い１時間、３７℃でプレートのブロッキングを行なった。
（４）０．０５％Tween２０（０．０１MのＰＢＳ中）でプレートを４回（４×１０分）洗浄し、ミクロアッセイプレートのウエルに被検血清（ブロッキング溶液で１００倍希釈）を添加し（各血清について３ヶのウエルを使用）、３７℃で２時間インキュベートした。
（５）０．０１ＭのＰＢＳに溶かした０．０５％Tween２０でプレートを４回（４×１０分）洗浄し、二次抗体である抗ヒトＩｇＭ（またはＩｇＧ）ペルオキシダーゼコンジゲート（ブロッキング溶液で１０００倍希釈）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（６）０．０５％Tween２０（０．０１MのＰＢＳ中）でプレートを４回（４×１０分）洗浄し、さらに、０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗った。次に、０．０１％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含有するｐＨ４．０クエン酸に溶かした０．５ｍｇ／ｍｌの新たに調製した２．２−アジノ−ビス[３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸]ジアンモニウム（ＡＢＴＳタブレット）中で該プレートを室温下に攪拌しながら４５分間インキュベートした。
（７）各プレートにコントロール（対照）ウエルを用いた。ＡＢＴＳ溶液のみを有する３ヶのウエル、およびＡＢＴＳに加えて抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジゲートのみを有する3ヶのウエルを用いた。
（８）ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Titertek Multiscan）を用い波長４０５ｎｍにおける光学密度（O.D.）測定を行った。
（９）１つの患者血清に対して３ヶのウエルの示値の平均値を求めた。
上述のプロトコールに従い、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の配列を有するペプチド６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）に対するポリクローナルウサギ抗血清を作製することにより該ペプチド６の免疫原性を試験した。クローニングし発現された上記のＡＢＣ輸送タンパク質について出血前および出血後血清を用いてイムノブロッティングを行ったところ、６７ｋＤａ抗原への血清転換が示された。
【００５２】
ファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびＳｃＦｖの調製
Matthews, R. C.他による記述（1995, J. Infect. Dis., 171 : 1668-1671）に従って、ファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびＳｃＦｖを作製した。略述すると、Ficoll上でヘパリン処理した血液２０ｍｌを分離することにより、ＥＭＲＳＡから回復した患者から末梢血リンパ球を入手した。チオシアン酸グアニジニウムによりＭＲＮＡを抽出し、次いで、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム（Quick Prep mRNA；英国St. AlbansのPharmacia製）で精製した。トリ骨髄芽細胞症ウイルス逆転写酵素（英国CambridgeのBiotechnology製）を用い、ヒトＩｇＧのＨ鎖（HulgG1-4）（Matthews, R.C.他、1994, Serodiagn. Immnother. Infect. Dis., 6 : 213-217）の４つのサブクラス全てについて不変部による１stストランドｃＤＮＡ合成を行なった。ファミリー分析に基づくフォワードプライマー（ＨｕＪＨ１−６）およびバックプライマー（ＨｕＶＨ１ａから６ａ）を用いて一次ＰＣＲによりＨ鎖可変ドメイン遺伝子を増幅した。ＶＨ３ａを用いて逆方向に調製した生成物の上流にＳｆｉ１制限部位を導入した後、軽鎖可変ドメイン遺伝子のプールに組み入れた。更にリンカーフラグメント（Ｇｌｙ4  ＳＥＲ3）および下流にＮｏｔ１部位を導入したＳｆｉ１およびＮｏｔ１制限酵素部位を利用して、生成物をファージミドベクターに一方向クローニングした。このようにライゲーションしたベクターをエレクトロポーレションにより大腸菌ＴＧ１内に導入し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Pharmacia）を用いてファージをレスキューした。抗原特異的なＳｃＦｖを増幅するため、エピトープマッピングで示されるエピトープの２つを表わすペプチド、すなわちペプチド１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）およびペプチド２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）についてファージライブラリーのパンニングを行なった。このパンニングは、それぞれのペプチドが被覆されたイムノチューブ内で実施した。ｌｏｇ相大腸菌ＴＧ１を用いて、結合したファージを溶出させた。Ｍ１３Ｋ０７によるレスキュー後、ファージを更に３回、ペプチドについて再パンニングした。ＢｓｔＮ１（英国HiychenのNew England Labs製）を用いるＤＮＡフィンガープリント法により、各パンニング後の特異的ＳｃＦｖの増幅を確認した。
【００５３】
動物実験
実験１
３０匹のメスのＣＤ１マウスに、ＩＶ注射により、２×１０6ｃｆｕ（コロニー形成単位）のＥＭＲＳＡ丸剤を投与した。２時間後、Ｍ１３Ｋ０７（１２．２×１０8ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）、ファージ１２（２×１０8ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）またはファージ１６（３．１６×１０6ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）を投与した。注射日を１日目としたときの注射後３日目および７日目に、腎臓、肝臓および脾臓のコロニー数を測定した。
【００５４】
実験２
３０匹のメスのＣＤ１マウスのそれぞれに、３×１０7ｃｆｕのＥＭＲＳＡ丸剤１００μｌを投与した。２時間後、陰性ファージスーパーライブラリー（７×１０10ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）、ファージ１２（９×１０7ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）またはファージ１６（５×１０6ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１０）を投与した。１日目および２日目に、腎臓、肝臓および脾臓のコロニー数を測定した。
【００５５】
実験３
４８匹のメスのＣＤ１マウスのそれぞれに、２×１０6ｃｆｕのＥＭＲＳＡ丸剤１００μｌを投与した。２時間後、陰性ファージ（１０8ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１２）、ファージ１２（１０8ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１２）またはファージＸ（１０7ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１２）またはファージ（１０6ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１２）。マウスの半分を殺し第２回目のファージ投与を行なった。残りのマウスは２日目に殺した。
【００５６】
実験４
４５匹のメスのＣＤ１マウスに、２×１０7ｃｆｕのＥＭＲＳＡ丸剤１００μｌを投与した。２時間後、陰性ファージ（２．５×１０7ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１５）、ファージＸ（３．３×１０6ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１５）またはファージ１６（１．３×１０6ファージ、２００μｌ丸剤、ｎ＝１５）を投与した。各グループについて５匹のマウスを殺し２回目にコロニーの数を測定し、また、各グループについて残りの１０匹を殺し3日目にコロニー数を測定した。
【００５７】
結果
エピトープマッピング
ＡＢＣ輸送タンパク質の１３５〜５３３位の残基の中から、ＥＭＲＳＡ敗血症に対して患者を治療するのに有効な７つの領域がエピトープマッピングにより確認された。３つ以上の連続したウエルの平均光学密度が在院コントロールの値および死亡した敗血症患者の値よりも大きい（標準偏差で少なくとも２）ときに、その領域がエピトープを有するものとした。オーバーラップするアミノ酸配列の誘導は、最初のペプチド配列および最後のペプチド配列を比較することにより行なった。コロニー形成した患者由来の血清は、それらのエピトープの幾つかについても陽性であった。
【００５８】
間接ＥＬＩＳＡ
ペプチド１〜３についての結果は表４に示されている。ペプチド４および５についての結果は表１０に示されている。
【００５９】
結論
コロニー形成した患者（グループＢ）は、ペプチド２よりもペプチド１および３を認識した。ペプチド３は最も免疫原性が低かった。ペプチド２に対するＩｇＧは、敗血症から生存した患者（グループＣ）に見出されたが、コロニー形成した患者（グループＢ）および死亡した患者（グループＤ）には見出されなかった。ペプチド４および５について得られた結果は、ペプチド４および５の両方に対する抗体と全身性感染からの生存との間に明らかな相関があることを示している。
【００６０】
組換えヒト抗体
これらのペプチド類を用いてファージ抗体ディスプレイライブラリー（上述）のパンニングを行なった。Ｈ鎖可変ドメイン遺伝子のファミリーを一次ＰＣＲで増幅したところ、ＶＨ３ａのみが増幅され、軽鎖可変ドメイン遺伝子ライブラリーに組み込まれた３３０ｂｐの生成物を生じた。パンニング前のＰＣＲ増幅ＳｃＦｖインサートのＢｓｔＮフィンガープリントは、きわめて雑多なライブラリーを示した。ペプチド１に対してパンニングした後は２種類のＢｓｔＮ１フィンガープリント（ＸおよびＹ）が優勢となり、ペプチド２についてパンニングした後は、さらに２種類のＢｓｔＮ１フィンガープリント（１２および１６）が優勢となった。これらを動物実験に選択した。
【００６１】
動物実験
実験１：コロニー数は表５にまとめている。クローン１２を投与したグループで２匹のマウス、また、クローン１６を投与したグループで１匹のマウスが１日目に自然死した。
結論：３日目におけるＭ１３Ｋ０７（陰性コントロール）は腎臓については類似の結果を与えたが、肝臓および脾臓はクローン１２および１６によって活性を示した。７日目においてＭ１３Ｋ０７およびクローン１６は類似の結果を与えたが、クローン１２はＭ１３Ｋ０７よりも腎臓、肝臓および脾臓について少ないコロニー数を示した。
【００６２】
実験２：コロニー数は表６にまとめている。
結論：スーパーライブラリー（陰性コントロール）はクローン１６に対しては類似の結果を与えた。クローン１２のコロニー数は、腎臓および脾臓（１日目）また、脾臓および肝臓（２日目）について低くなっている。
【００６３】
実験３：コロニー数は、表７および表８にまとめられている。
結論：陰性ファージは、１日目においてファージ１２（腎臓、肝臓）およびファージＸ（肝臓、脾臓）に、また、２日目においてファージＸ（肝臓、脾臓）に類似のコロニー数を示した。ファージＹは、恒常的に陽性であり、また、２日目の腎臓におけるコロニー数を除きファージ１２よりも陽性であった。
【００６４】
実験４：コロニー数は表９にまとめている。
結論：陰性ファージは、３日目においてファージＸ（腎臓、脾臓）に、また、２日目においてファージＹ（腎臓）に類似のコロニー数を生じた。その他のパラメータは、ファージＸおよびファージＹの治療効果についてはファージＹの方が２日目および３日目のいずれにおいても活性が高い（但し、２日目の腎臓の場合を除く）ことを示した。
【００６５】
まとめ
ファージ１２、ＸおよびＹはいずれも治療活性を示し、ペプチド１〜５で表わされるエピトープが抗体治療用の標的として有用であることが確認された。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
【表２】
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【００６８】
【表３】
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【００６９】
【表４】
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【００７０】
【表５】
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【００７１】
【表６】
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【００７２】
【表７】
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【００７３】
【表８】
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【００７４】
【表９】
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【００７５】
【表１０】
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【配列表】
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