(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ。
【請求項２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列または該配列において１〜２０個のアミノ酸の欠失、置換、付加及び／または挿入を有するアミノ酸配列からなる２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ。
【請求項３】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列、または該配列において１〜１０個のアミノ酸の欠失、置換、付加及び／または挿入を有するアミノ酸配列からなる２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：１の塩基番号１４４〜１７１２のヌクレオチド配列からなる２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：１の塩基番号１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に対して８０％以上の相同性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：１の塩基番号１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に対して９０％以上の相同性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：１の塩基番号１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つ２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項９】
マメ科植物由来の２-ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードする請求項４〜８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
下記の配列の組み合わせからなる２-ヒドロキシイソフラバノンシンターゼのプライマーとして機能するプライマー対：配列番号：４及び配列番号：５または配列番号：１１及び配列番号：１２。
【請求項１１】
配列番号：１の塩基番号１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に対して８０％以上の相同性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列でコードされる２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ。
【請求項１２】
配列番号：１の塩基番号１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に対して９０％以上の相同性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列でコードされる２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ。
【請求項１３】
配列番号：１の塩基番号１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つ２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドでコードされる２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ。
【請求項１４】
マメ科植物由来の２-ヒドロキシイソフラバノンシンターゼであることを特徴とする請求項１〜３または１１〜１３のいずれか１項に記載の２-ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ。
【請求項１５】
宿主細胞中で、請求項４〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを発現し得る発現系を含む組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項１６】
適当な調節配列にセンス方向で発現できるように連結した請求項４〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含み、植物細胞に導入して２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼを生産するようにまたは過剰生産するように形質転換することができる組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項１７】
請求項１５または１６のいずれか１項に記載の組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１７記載の宿主細胞を培養することを含む請求項１〜３または１１〜１４のいずれか１項に記載の２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼの製造方法。
【請求項１９】
さらに、生産された２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼを回収することを含む請求の範囲第１８項記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５または１６のいずれか１項に記載の組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを植物細胞に導入することにより、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼが触媒する酵素反応の生成物またはその誘導体を生産するようにまたは生産量が変化するように形質転換されたトランスジェニック植物。
【請求項２１】
マメ科植物である請求項２０記載のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
技術の分野
本発明は、新たに同定された２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ及びこれをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドにより形質転換された形質転換体に関する。
背景技術
イソフラボン類は、イソフラボン骨格を有する化合物であり、特にマメ科植物に多く含まれる。植物において、イソフラボン類はファイトアレキシンとして作用することが知られている。ファイトアレキシンとは、微生物の感染等のストレスに対して、植物が産生する抗菌性物質である。
また、イソフラボン類、特にダイゼインやゲニステインは、エストロジェン様の作用を有する生理活性物質であり、乳ガンや骨粗鬆症の予防の機能を有するとして注目されている。
また、６，７，４’−トリヒドロキシイソフラボン、７，８，４’−トリヒドロキシイソフラボン等、強力な抗酸化物質として注目されている物質もある。
一方、イソフラボン類に富むマメ科植物を家畜の飼料として用いていたところ、家畜の不妊化という問題が生じたという実例もある。
従って、イソフラボン類の生産や、植物の食品としての機能を高める、植物の耐病性を高める、家畜の飼料として適当な植物を供給する等を目的とした植物におけるイソフラボン類の生産量の制御の可能性が注目を集めている。
ところで、イソフラボンの骨格は、図１に示すように、フラバノン類から２−ヒドロキシイソフラバノン類への酸化的アリール転位反応を経て生合成され、その反応を触媒する酵素、即ち２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼの存在が知られている。従って、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼは、イソフラボン類の合成において非常に重要な酵素である。
上記のような有用な活性を有するイソフラボン類の生産や、植物におけるそれらの生産量の制御のためには、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼの単離・精製や、そのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列の解明が重要であるにもかかわらず、これまでのところ、その単離・精製も、アミノ酸配列・ｃＤＮＡ配列の解明も実現されていなかった。
本発明者らは、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼのｃＤＮＡの単離とＤＮＡ及びアミノ酸配列の決定をなすべく、植物材料、培養条件、ｍＲＮＡ誘導等を、鋭意研究した結果、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ）のカルス培養物を、酵母抽出物によりエリシター処理した後、６〜１２時間経過した細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーから、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。
発明の開示
ポリペプチド
本発明は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を実質的に含むアミノ酸配列を有する２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼに関する。
以下、「２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ」を「ＩＦＳ」と略す。
「配列番号：２で表されるアミノ酸配列を実質的に含む」とは、当該アミノ酸配列に、欠失、置換、付加、挿入等の変異があるものを含むことを意味する。即ち、本発明のＩＦＳは、上記酵素活性が保たれる限り、そのような変異を有するものをも含む。欠失、置換、付加、挿入されるアミノ酸の数は、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、特に１〜５個であり得る。例えば、アミノ酸残基を同様の特性の別のアミノ酸残基で置換したものであり得る。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間、ＳｅｒおよびＴｈｒ間、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間、ＡｓｎおよびＧｌｎ間、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間、または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換である。
さらに、本発明は、請求の範囲１記載のＩＦＳの抗原活性を有するポリペプチドをも含む。
ポリヌクレオチド
さらに、本発明は、上記２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に含むポリヌクレオチドに関する。
ここで、「２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に含むポリヌクレオチド」とは、当該ヌクレオチド配列からなる、上記ＩＦＳをコードする配列からなるポリヌクレオチドのほか、該配列と縮重による配列の相違を有しうるポリヌクレオチド、または５’側末端または３’側末端、またはその両方に用途に応じて適当な配列が付加されたポリヌクレオチドを含む意図である。
また、本発明は、配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列に対して５０％以上の相同性を有し、且つＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的な配列を実質的に含むポリヌクレオチドに関する。
「配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列」とは、配列番号：１のヌクレオチド配列またはその一部のヌクレオチド配列を意味する。
また、「実質的に含む」とは、配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列に対して５０％以上の相同性を有し、且つＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドのほか、これらの５’側末端または３’側末端、またはその両方に用途に応じて適当な配列が付加されたポリヌクレオチドを含む意図である。
上記相同性は、好ましくは７０％、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に９５％以上である。
従って、本発明は、配列番号：１の１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に対して７０％以上の相同性を有し、且つＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドにも関する。
さらに、本発明は、配列番号：１のヌクレオチド配列の少なくとも一部または配列番号：１の１４４〜１７１２のヌクレオチド配列またはこれらに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも一部にストリンジェントな条件下でまたは温和な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
これらのポリヌクレオチドには、配列番号：１のヌクレオチド配列または配列番号：１の１４４〜１７１２のヌクレオチド配列またはこれらに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でまたは温和な条件下でハイブリダイズするＩＦＳをコードするポリヌクレオチドのほか、これらのポリヌクレオチドの断片であって、プライマー又はプローブとして機能しうるものをも含む。
なお、温和なハイブリダイゼーションの条件及びストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている。
さらに、本発明は、カンゾウ、好ましくはＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａの細胞をエリシター処理し、１〜１２時間好ましくは、１〜８時間、特に３〜６時間後の細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーから、請求の範囲第６項、第８項，第９項記載のポリヌクレオチドをプローブとしてクローニングして得られる、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡにも関する。エリシター処理は、好ましくは酵母抽出物により行われる。
プローブ、プライマー
また、本発明は、ＩＦＳをコードするポリヌクレオチド又はＩＦＳのｃＤＮＡのプライマーまたはプローブとして機能し得るポリヌクレオチド（以下、本発明のプライマーまたはプローブと記す）に関する。これらは、例えば配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列に対して５０％以上、好ましくは７０％、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に９５％以上の相同性を有し、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするポリヌクレオチドのプローブまたはプライマーとして機能し得るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
好ましくは、本発明のプライマーまたはプローブは、配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドである。
また、本発明のプライマーまたはプローブは、配列番号：１の少なくとも１５個の連続した配列またはそれに相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるポリヌクレオチドであってもよい。例えば、本発明のプライマーまたはプローブは、配列番号：１中の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
ポリペプチド
また、本発明は、配列番号：１の１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に対して７０％以上の相同性を有し、且つＩＦＳをコードするヌクレオチド配列でコードされるＩＦＳ、並びに配列番号：１の１４４〜１７１２のヌクレオチド配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＩＦＳをコードするポリヌクレオチドでコードされるＩＦＳに関する。
組み換え体ＤＮＡ及びＲＮＡ
また、本発明は、（ａ）宿主細胞中で、配列番号２：で表されるアミノ酸配列を実質的に含むアミノ酸配列を有するＩＦＳをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に含むポリヌクレオチドを発現し得る発現系を含む組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｂ）宿主細胞中で、配列番号：１の１４４〜１７１２のヌクレオチド配列に対して７０％以上の相同性を有し、且つＩＦＳをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを発現し得る発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｃ）宿主細胞中で、配列番号：１の１４４〜１７１２のヌクレオチド配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＩＦＳをコードするポリヌクレオチドを発現し得る発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｄ）適当な調節配列にセンス方向で発現できるように連結した請求の範囲第４項のポリヌクレオチドを含み、植物細胞に導入してＩＦＳを生産するようにまたは過剰生産するように形質転換することができる組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｅ）適当な調節配列にセンス方向で発現できるように連結した請求の範囲第７項のポリヌクレオチドを含み、植物細胞に導入してＩＦＳを生産するようにまたは過剰生産するように形質転換することができる組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｆ）適当な調節配列にアンチセンス方向で発現できるように連結した請求の範囲第４項のポリヌクレオチドを含み、植物細胞に導入してＩＦＳ発現のアンチセンス阻害を起こし得る組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ；
（ｇ）適当な調節配列にアンチセンス方向で発現できるように連結した請求の範囲第６項のポリヌクレオチドを含み、植物細胞に導入してＩＦＳ発現のアンチセンス阻害を起こし得る組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡに関する。。
また、本発明は、上記（ａ）〜（ｅ）の組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡの一つを含む宿主細胞に関する。
さらに、本発明は、該宿主細胞を培養することを含む２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼの製造方法にも関する。該製造方法は、さらに、生産されたポリペプチドを回収する工程を含んでいてもよい。
さらに、本発明は、上記組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡの一つを植物細胞に導入することにより、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼが触媒する酵素反応の生成物またはその誘導体を生産するようにまたは生産量が変化するように形質転換されたトランスジェニック植物に関する。このトランスジェニック植物は、天然の状態でＩＦＳを生産する植物または生産しない植物であり得る。
上記（ｆ）または（ｇ）の組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを植物細胞に導入することにより、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼが触媒する酵素反応の生成物またはその誘導体の生産量が低下するように形質転換されたトランスジェニック植物に関する。このトランスジェニック植物は、天然の状態でＩＦＳを生産する植物、例えばマメ科植物である。
天然の状態でＩＦＳを生産する植物を形質転換する場合には、ＩＦＳを生産しないように、またはＩＦＳの生産量を増加または減少するように形質転換することができ、天然の状態でＩＦＳを生産しない植物を形質転換する場合には、ＩＦＳを生産するように形質転換することができる。
また、本発明のポリペプチドのモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体は、当該分野においてよく知られらた方法により製造することができ、本発明はかかる抗体をも含む。
発明を実施するための最良の形態
１．定義
本明細書の理解を容易にするために、用語の定義を下記に示す。
本明細書において、「２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（以下、ＩＦＳと記す）」は、シトクロムＰ４５０の機能解析において通常使用される方法を用いると、フラバノン類を基質として、水酸化反応とアリール転位反応により２−ヒドロキシイソフラバノン類を合成する酵素活性を有するポリペプチドを意味する。
即ち、例えば、酵母等の真核細胞で発現させたときに、そのミクロソームが、ＮＡＤＰＨ補酵素等の存在下、好気的条件下で、かかる反応を触媒する活性を有するポリペプチドであること、またはＰ４５０還元酵素及びジラウリルホスファチジルコリン等のリン脂質と混合して電子伝達系を再構成すれば同条件下でかかる反応を触媒する活性を有するポリペプチドであることを意味する。
本発明のＩＦＳは、天然に存在するポリペプチドを単離したもの、遺伝子組換え技術により製造されたもの、または当該分野で知られた技術により合成されたもののいずれでもよい。
また、本発明のＩＦＳには、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ由来のものの他、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ属の他の種由来のポリペプチド、マメ科植物の他の属の植物由来のポリペプチド、または他の科の植物由来のポリペプチドも含まれる。
本明細書において「本発明のポリヌクレオチド」は、上記で説明した、請求の範囲第２項〜第９項のいずれか１項に記載されたポリヌクレオチドを意味し、ＩＦＳのｃＤＮＡ、ＩＦＳをコードするポリヌクレオチド、これらを得るためのプローブまたはプライマー等であり得る。
本発明のＩＦＳをコードするポリヌクレオチド（配列番号：１のｃＤＮＡ）を含むプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株の形質転換体ＣＹＰ  Ｇｅ−８は、平成１１年２月１日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１８９が付与されている。そして平成１２年１月３１日にブダペスト条約に基づく寄託への移管請求が当局により受領され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０１０が付与されている。本発明は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０１０のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株から常法により得られ、ＩＦＳをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにも関する。
「ポリヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。
本発明において、「ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態から単離されたものであり得る。また、本明細書において、「ポリヌクレオチド」の語は、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混在するＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の混在するＲＮＡ、１本鎖、２本鎖または１本鎖および２本鎖領域の混在するＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。
また、「ポリヌクレオチド」の語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
「修飾塩基」の語は、例えばトリチル化された塩基およびイノシンのような塩基を含む。従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、あるいは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドであり得る。
また、本明細書において、「ポリヌクレオチド」の語は、オリゴヌクレオチドをも含むものとする。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合した２個またはそれ以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」は、短鎖（いわゆるペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマー）および長鎖（タンパク質）の両方をいう。
「ポリペプチド」は、翻訳後修飾プロセッシングのごとき天然プロセスによってか、または当該分野でよく知られた化学的修飾法によって修飾されたアミノ酸配列を包含する。かかる修飾は、当該技術分野においてよく知られている。ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端およびカルボキシル末端を包含するポリペプチドのいずれの場所においても修飾が起こり得る。ポリペプチドは多くのタイプの修飾を含みうる。ユビキチネーションの結果としてポリペプチドは分岐されていてもよく、また、分岐を有してまたは有さずに環化されていてもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシレーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセッシング、ホスホリレーション、プレニレル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化のごときトランスファー−ＲＮＡにより媒介される蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがある。
「アンチセンス阻害」は、標的の一次転写産物またはｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的で、その一次転写産物またはｍＲＮＡのプロセッシング、移動、及び／または翻訳を妨げるアンチセンスＲＮＡにより、標的遺伝子の発現を阻止することをいう。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物のいかなる部分、すなわち、５’ノンコーディング配列、３’ノンコーディング配列、イントロン、またはコーディング配列、とでもよい。加えて、本明細書に用いられるアンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡの遺伝子発現を妨げる効力を増すリボザイム配列の領域を含むことができる。
本明細書に用いられる「適当な調節配列」は、本発明のポリヌクレオチドの上流（５’）、内部、及び／または下流（３’）に位置し、本発明のポリヌクレオチドの発現を制御する、天然またはキメラのヌクレオチド配列をいう。
「３’ノンコーディング配列」は、ポリアデニレーションシグナル、及びｍＲＮＡのプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことのできる他のあらゆる調節シグナルを含む、遺伝子のＤＮＡ配列部分をいう。ポリアデニレーションシグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸部分の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
「植物」は、真核生物及び原核生物の両方の光合成生物をいう。
本明細書において、種々の表現方法により、本発明のポリヌクレオチドを説明したが、本発明のポリヌクレオチドには、本発明において明らかとなったｃＤＮＡ配列の情報に基づき、当業者が当該分野で知られている方法により得ることができ且つＩＦＳ活性を確認することのできる全てのヌクレオチド配列と、該情報に基づき、ＩＦＳを得るために使用されるプローブまたはプライマーとして利用される得る全てのヌクレオチド配列が含まれ、本発明はこれらの全てを包含する意図である。
２．形質転換体の作製及びＩＦＳの生産
本発明の形質転換体は、本発明の組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを、該組み換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを作製する際に用いた発現ベクターに適合する宿主中に導入することにより得られる。精製されたポリヌクレオチドを、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを作製し、当該組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、宿主細胞を形質転換する。
ＤＮＡ断片を挿入するためのベクターＤＮＡは、宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えばプラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、例えばＭ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用いることができるが、好ましくは真核細胞を用いる。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞などが挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡが該宿主中で自立複製可能であり、プロモーター、本発明のポリヌクレオチド、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。例えば、大腸菌としてはＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ＪＭ１０９（宝酒造社製）等が挙げられ、発現ベクターとしては、例えばｐＢＴｒｐ２等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。形質転換は、例えばＨａｎａｈａｎの方法［Ｔｅｃｈｎｉｇｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．）ｐｐ１０９−１３６，ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８５）］により行うことができる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９−１９３３（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３−１６８（１９８３））等が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）等が用いられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
ベクターＤＮＡとしてプラスミドＤＮＡを用いる場合、例えばＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片を挿入する際、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社製）を用いて消化しておく。次いで、ＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡとを混合し、これに、例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を作用させて組換え体ＤＮＡを得る。
上記形質転換株のスクリーニングは、目的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーション、あるいは、目的の遺伝子の塩基配列に基づいた５’プライマーを合成し、次いで、相補鎖ＤＮＡの塩基配列に基づいた３’プライマーを合成し、これらのプライマーを用いたＰＣＲ法により、目的とする遺伝子を含むコロニーを選択することができる。
前記のようにして得られた組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを保有する形質転換体を培養すれば、本発明のポリペプチドを生産することができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。
形質転換体を培養する培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス等から選ばれる１種以上の窒素源に、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、抗生物質、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。また、必要により培地にＩＰＴＧ等を添加して、遺伝子の発現を誘導してもよい。培養開始時の培地のｐＨは７．２〜７．４に調節し、培養は通常３６〜３８℃、好ましくは３７℃前後で１４〜２０時間、通気撹拌培養、振盪培養等により行う。
培養終了後、培養物より本発明のＩＦＳを採取するには、通常のタンパク質精製手段を用いることができる。すなわち、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により、界面活性剤の存在下で、菌体を破壊し、ＩＦＳを可溶化させた後、菌体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗ポリペプチド溶液を得る。
上記粗ポリペプチド溶液から、ＩＦＳをさらに精製するには、界面活性剤を適宜用いながら、通常のタンパク質精製法を使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。
上記方法により得られたＩＦＳは、Ｐ４５０還元酵素及びジラウリルホスファチジルコリン等のリン脂質と共にミセル系を形成後、ＮＡＤＰＨと酸素分子の存在下で、フラバノン類を基質として、水酸化反応とアリール転位反応により２−ヒドロキシイソフラバノン類を合成することができる。また、形質転換体が真核細胞である場合、形質転換後、培養して得られた細胞を破砕し、遠心分離を行うことにより得られるミクロソームは、同様の反応により２−ヒドロキシイソフラバノン類を合成することができる。本発明は、本発明の酵素の反応により得られる化合物またはその誘導体の製造のための本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。かかる化合物またはその誘導体としては、例えばダイゼイン、ゲニステイン、６，７，４’−トリヒドロキシイソフラボン、７，８，４’−トリヒドロキシイソフラボン、フォルモノネチン、２’−ヒドロキシフォルモノネチン、メディカルピン等が挙げられる。
３．トランスジェニック植物
本発明のＩＦＳをコードするポリヌクレオチドを、適当なプロモーター、ターミネータ等、植物細胞で発現可能な転写制御領域と共に植物細胞に導入することにより、ＩＦＳ、ＩＦＳが触媒する酵素反応の生成物またはその誘導体を生産するように形質転換されたトランスジェニック植物を得ることができる。これにより、本来はＩＦＳを発現しない種の植物において、ＩＦＳを発現させ、さらにこれにより触媒される反応の反応生成物である２−ヒドロキシイソフラバノン類、ひいてはその誘導体であるイソフラボン類を生産させることが可能になる。イソフラボン類としては、上記で例示したものが挙げられる。従って、本発明はこれらの物質を生産する植物を得るためのポリヌクレオチドの使用にも関する。この方法は、本来イソフラボン類を含まない植物にイソフラボン類を発現させ、耐病性を高めたり、イソフラボン類を多く含む食品として提供される植物を提供するのに有用である。
植物細胞で発現可能な転写制御領域としては、前述したような、植物全体で発現するＣａＭＶ  ３５ＳＲＮＡプロモーター、ＣａＭＶ  １９ＳＲＮＡプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター等、緑色組織で発現するＲｕｂｉｓＣＯ小サブユニットプロモーター等、種子などの部位特異的に発現するナピン（ｎａｐｉｎ）、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）等の遺伝子のプロモーター領域等が挙げられる。また、３’末端に、ノパリン合成酵素ターミネーター、ＲｕｂｉｓＣＯ小サブユニット３’側部位等のターミネーターが連結されてもよい。
また、プロモーター領域に、エンハンサーを導入することにより、発現の増加をもたらすことができる。「エンハンサー」は、プロモーター活性を高めることのできるＤＮＡ配列である。エンハンサーは、プロモーターの本来の要素、あるいは、プロモーターのレベル及び／または組織特異性を高めるために挿入した異種要素であってもよい。エンハンサーとしては、３５Ｓプロモーターに見出されるようなウイルスのエンハンサー（Ｏｄｅｌｌ等、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）１０：２６３−２７２）、オピン遺伝子からのエンハンサー（Ｆｒｏｍｍ等、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：９７７−９８４）が挙げられ、本発明のポリヌクレオチドに作動できるように連結されたプロモーターに配置すると増加した転写をもたらす、あらゆる他の種類のエンハンサーが含まれる。これにより、イソフラボン類の含有量の高いトランスジェニック植物を得ることができる。イソフラボン類としては、上記で例示したものが挙げられる。従って、本発明は、イソフラボン類の生産量の増大した植物を提供するための本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。そのような方法は、例えば耐病性の高められた植物、イソフラボン類を多く含む食品として提供されるための植物の提供に有用である。
さらに、本発明においては、アンチセンス阻害により植物におけるＩＦＳの発現を抑制することができる。即ち、本発明のポリペプチドのアンチセンスＲＮＡを、プロモーター等の発現調節配列と共に含むベクターを植物細胞に導入することにより、ＩＦＳの発現を阻害することもできる。これにより、イソフラボン類を含まないか、低下した量で含有するトランスジェニック植物を得ることができる。イソフラボン類としては、上記で例示したものが挙げられる。
従って、本発明はこれらの物質の生産が抑制された植物を得るためのポリヌクレオチドの使用にも関する。この方法は、例えば家畜の不妊化を起こさせない飼料の提供に有用である。
トランスジェニック植物は、当該分野において広く知られている方法、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法等により得ることができ、宿主細胞に適する方法が選択される。
アグロバクテリウム法としては、例えばバイナリーベクターを用いる方法がある。これは、Ｔｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡ、大腸菌などの微生物で機能可能な複製起点、及びベクターを保持する植物細胞または微生物細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含むベクターを植物に感染させ、この植物から採取した種子を生育させ、マーカー遺伝子の発現を指標としてベクターが導入された植物を選択する方法である。得られた植物について、ＩＦＳ活性を測定するか、ＩＦＳにより触媒される反応の生成物またはその誘導体としてのイソフラボン類等の含量が変化したものを選択することによって、目的とする形質転換植物を取得することができる（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１，１２１２（１９８９）、ＷＯ９４／０２６２０、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９，１３５（１９８７）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９１５（１９８８））。
また、パーティクルガン法は、例えば下記の文献に記載されている方法により行われる。Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１４５（１９８９）、ＴＩＢＴＥＣＨ，８，１４５（１９９０）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，９２３（１９８８）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８７，６７１（１９８８）、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，２８９（１９９０）、Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＆  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，３３，２２７（１９９３））。
エレクトロポレーション法は、例えば下記の文献に記載された方法により行うことができる。Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９９，８１（１９９２）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８４，８５６（１９８９）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０，９７（１９９１）。
実施例
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。別に記載しない限り、全ての割合及びパーセンテージは重量によるものである。これらの実施例は、例示であって、本発明を限定するものではない。当該技術分野の技術者は、本発明の記載及び当該分野で知られている情報により様々な改良及び修正を行い得る。
１．植物材料及び培養方法
Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ（以下、カンゾウと記す）の葉及び葉柄からカルス培養物を形成した。α−ナフタレン酢酸（１ｍｇ／ｌ）及びＮ６−ベンジルアデニン（１ｍｇ／ｌ）を含有する１／２濃度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ’ｓ培地（０．３％（ｗ／ｖ）ゲランガムで固化）中、１２時間光照射して（６，０００ルクス）、１２時間暗所にて培養した。この培養物を、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（０．１ｍｇ／ｌ）及びカイネチン（１ｍｇ／ｌ）を添加したＭＳ培地に懸濁し、培養した。この培養液に対して、０．２％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物（ＹＥ，Ｄｉｆｃｏ社製）を添加することによりエリシター処理を行った。その後、培養細胞を減圧濾過により集め、すぐに液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
２．ｃＤＮＡライブラリー及びスクリーニング
上記エリシター処理から６時間後及び１２時間後の上記カンゾウの培養細胞から、Ｓｔｒａｉｇｈｔ  Ａ’ｓ  ｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、ポリ（Ａ）を有するＲＮＡを単離した。これらのポリ（Ａ）を有するＲＮＡ（各２．５μｇ）を混合し、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、これに対するｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーのプラーク（２×１０５）をハイボンド−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、ＥＣＬダイレクト核酸標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと記す）で標識した配列番号：３の配列を有するポリヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングした。このポリヌクレオチドは、上記と同様のエリシター処理から８時間後のカンゾウの培養細胞から、プライマーとして５’−（Ｔ／Ｃ／Ａ）ＴＩ（Ｃ／Ｇ）ＣＩＴＴ（Ｔ／Ｃ）（Ｇ／Ａ）ＧＩＩＩＩＧＧＩ（Ａ／Ｃ）（Ｇ／Ｃ）Ｉ（Ａ／Ｃ）Ｇ−３’（Ｉはイノシンである）（配列番号：８）及び５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号：９）の合成ポリヌクレオチドを用いたＰＣＲ（９５℃で３分、その後９５℃で１分間、４５℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクル、最後に７２℃で１０分間）により増幅して得られる断片の一つである。ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ及び５％（ｗ／ｖ）のブロッキング試薬を含有するＥＣＬハイブリダイゼーションバッファーを用い、４２℃で６時間行った。膜の洗浄を、０．４％ＳＤＳを含有する５５℃の１×ＳＳＣで１０分間×２回、及び室温の２×ＳＳＣで１０分間を２回で行った。ＨＲＰ標識ハイブリッド複合体を検出するために，ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を膜に添加した。この膜をＫｏｄａｋ  ＸＡＲ−５フィルムに１分間暴露した。可能性のあるクローンを製造者のプロトコルによるｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ファージミドに挿入した。挿入したＤＮＡの長さを、Ｔ３（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’）（配列番号：１０）及びＴ７（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）（配列番号：９）プライマーを用いてのＰＣＲにより調べ、約２０００塩基の長さを有する完全長のヌクレオチド配列を有するクローンを得た。このうちの一つが、配列番号：１の配列を有するｃＤＮＡであり、以下の実験によりＩＦＳであることが確認された（以下、この完全長のｃＤＮＡをＣＹＰ  Ｇｅ−８と記す）。
３．発現ベクターの構築、酵母細胞での発現及びミクロソームでの製造
ＣＹＰ  Ｇｅ−８のコード領域を、ＫＯＤポリメラーゼおよび鋳型としてＣＹＰ  ＧＥ−８  ｃＤＮＡクローンを用い、センスプライマーとして、下記のプライマー：Ｇｅ−８Ｓ１（配列番号：４）、アンチセンスプライマーとして下記のプライマー：Ｇｅ−８Ａ１（配列番号：５）を用いたＰＣＲにより増幅した。
Ｇｅ−８Ｓ１：５’−ＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣ−３’
Ｇｅ−８Ａ１：５’−ＣＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＴ−３’
センスプライマーは開始コドン（ＡＴＧ）の上流にＫｐｎＩ認識部位（ＧＧＴＡＣＣ）を有し、アンチセンスプライマーは終止コドン（ＴＡＡ）の下流にＥｃｏＲＩ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を有する。ＰＣＲ生成物をＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで処理して得られた断片を、ＵＲＡ３選択マーカーを有するｐＹＥＳ２発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の同じ制限酵素認識部位にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＹＥＳ  Ｇｅ−８でプロテアーゼ欠損酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＪ２１６８株（ａ；ｐｒｃ１−４０７，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−５２：ニッポンジーン社製）を酢酸リチウム法により形質転換した。形質転換体は、ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社製）６．７ｍｇ／ｍｌ、グルコース２０ｍｇ／ｍｌ、ロイシン３０μｇ／ｍｌ、トリプトファン２０μｇ／ｍｌ、及びカザミノ酸５ｍｇ／ｍｌを含有する培地で選択した。
Ｐ４５０タンパク質の誘導のために形質転換酵母を上記培地（２５ｍｌ）で１０時間液体培養し、細胞を遠心分離（３，０００×ｇ）で回収した。細胞をグルコースを含まない４０倍量（１０００ｍｌ）のＹＰＧＥ培地（１０ｇ／ｌ酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌバクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、２０ｇ／ｌガラクトース、３％（ｗ／ｖ）エタノール、２ｍｇ／ｌヘミンを含有する）に移し、２４時間から３６時間培養した。集菌して得られた酵母細胞を、１０％のスクロース及び１４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．５）にガラスビーズ（０．３５〜０．６ｍｍ径）と共に懸濁し、ボルテックスミキサーで１０分間細胞を激しく攪拌して破壊した。これを、１０，０００×ｇ及び１５，０００×ｇで各々１０分間遠心分離し、得られた上清を１６０，０００×ｇ９０分間の超遠心にかけミクロソームを製造した。ｐＹＥＳ２で形質転換した酵母細胞を対照として使用した。
４．酵素アッセー
ａ）基質の調製
酵素アッセーの放射性標識基質として（２Ｓ）−［１４Ｃ］リキリチゲニン（７，４’−ジヒドロキシフラバノン）及び（２Ｓ）−［１４Ｃ］ナリンゲニン（５，７，４’−トリヒドロキシフラバノン）を合成した。［１４Ｃ］マロニルＣｏＡ及び４−クマロイルＣｏＡを、エリシター処理後１２時間のカンゾウ培養細胞の細胞フリー抽出液及びＮＡＤＰＨと３０℃で３時間インキュベートすることにより、（２Ｓ）−［１４Ｃ］リキリチゲニン（７，４’−ジヒドロキシフラバノン）を製造した。
また、ＮＡＤＰＨを添加しない以外は上記と同様の方法により（２Ｓ）−［１４Ｃ］ナリンゲニン（５，７，４’−トリヒドロキシフラバノン）を合成した。  これにより得られた（２Ｓ）−［１４Ｃ］リキリチゲニン（以下標識リキリチゲニンと記す）及び（２Ｓ）−［１４Ｃ］ナリンゲニン（以下、標識ナリンゲニンと記す）をＴＬＣにより精製した。（各々６．４ｋＢｇ／ｎｍｏｌ，０．０８ｎｍｏｌ）
ｂ）標識リキリチゲニンとの反応
上記の精製した標識リキリチゲニンを２−メトキシエタノール３０μｌ中に溶解し、１ｍｌの上記酵母ミクロソームに加え、１ｍＭのＮＡＤＰＨの存在下、３０℃で２時間インキュベートした。
３０μｌの酢酸で反応を終結させた後、混合物中の酢酸エチル抽出物を、ＴＬＣラジオクロマトスキャナーで分析した。ＴＬＣはセルロース（フナコシ（株）製フナセルＳＦ）を用い、１５％酢酸で展開した。結果を図２Ａに示す。図より、未反応基質（Ｒｆ０．５１）の他に、三つの放射活性化合物［Ｐ１（Ｒｆ０．７４），Ｐ２（Ｒｆ０．６４），Ｐ３（Ｒｆ０．３８）］の存在が認められる。Ｒｆ値から、Ｐ３がイソフラボン、ダイゼイン（７，４’−ジヒドロキシイソフラボン）である可能性が高いとされた。
反応生成物のイソフラボンへの酸触媒転化のために、濃縮された酢酸エチル抽出物を、メタノール中の１０％ＨＣｌ  ５００μｌに溶解し、室温で１時間、５０℃で１０分間攪拌した。得られた反応混合物を酢酸エチルで抽出し、同条件でＴＬＣを行った後、ＴＬＣラジオクロマトスキャナーで分析した。結果を図２Ｂに示す。図に示されるように、Ｐ１のＲｆにおける相対的放射活性が減少し、Ｐ３の放射活性が増加した。これにより、Ｐ１は容易に脱水してダイゼインを生じさせる２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンである可能性が高い。
さらに、放射活性Ｐ１を図３Ａにオートラジオグラムを示したＴＬＣ板から単離して、ＨＣｌと反応させ、ＴＬＣオートラジオグラフィーで分析したところ、図３Ｂに示すように、純粋な放射活性生成物Ｐ３（ダイゼイン）が生じた。
さらに、ＣＹＰ  Ｇｅ−８がＩＦＳであることを示すために、１ｍｌの上記ミクロソームに、非標識リキリチゲニン１０μｇを添加し、１ｍＭのＮＡＤＰＨの存在下、３０℃で２時間インキュベートした。反応液を酢酸エチルで抽出後、酢酸エチル層をＨＰＬＣ（カラム，Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＣＬＣ−ＯＤＳ（６．０×１５０ｍｍ；島津社製）；溶媒，Ｈ２Ｏ中４０％メタノール）で分析した。溶出液を２８５ｎｍでモニターした。結果を図４Ａに示す。予想通り、ダイゼインのピーク（Ｒｔ２１．０ｍｉｎ）及び二つの別のピーク（Ｒｔ５．５，７．９ｍｉｎ）が見られた。酢酸エチル抽出物を酸で処理すると、図４Ｂに示すように、ダイゼインの強いピークが現れた。図４ＡのＲｔ５．５ｍｉｎの生成物はＰ１であることが、ＴＬＣ分析により確認された。
質量スペクトル分析のために、上記酵母ミクロソームとリキリチゲニンとのインキュベーションをさらに大規模に（上記規模の２００倍）行った。反応混合物の酢酸エチル抽出物をＫｉｅｓｅｌｇｅｌ  Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ社製）で、溶媒としてトルエン／酢酸エチル／メタノール／石油ベンジン（６：４：１：３）を用いて、分離用ＴＬＣを行った。Ｐ１（Ｒｆ０．２）及びＰ３（Ｒｆ０．３）のスポットを集め、さらにＨＰＬＣで精製し、その質量スペクトルをＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＡＸ５０５Ｈ質量分析計により、電子衝撃（ＥＩ）モードで、イオン化電圧７０ｅＶで記録した。
Ｐ１の質量スペクトルを図５に、Ｐ３の質量スペクトルを図６に示す。これにより、Ｐ１が２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンであり、Ｐ３がダイゼインであることが確認された。
ｃ）標識ナリンゲニンとの反応
基質として、標識リキリチゲニンの代わりに標識ナリンゲニンを用いること以外は、上記と同じ方法により、酵母ミクロソームとのインキュベーション及びＴＬＣ分析を行った。図７Ａに示すように、放射性スポットとしてＰ４（Ｒｆ０．６９）及びＰ５（Ｒｆ０．６４）が確認された。その後、Ｐ４のスポットを集め、ＨＣｌ処理したところ、図７Ｂに示すように新たなスポットが得られた。このスポットはゲニステインのサンプルと同じ移動度を示した。従って、Ｐ４は２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラボンであることが確認された。
上記の実験により、ＣＹＰ  Ｇｅ−８によりコードされるタンパク質が、リキリチゲニンにもナリンゲニンにも作用し、各々酸処理によりダイゼイン、ゲニステインを生成し得る２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン及び２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノンを生成すること、即ちＩＦＳであることが証明された。なお、上記実施例においては、ＨＣｌ処理により脱水皮応を行っているが、カンゾウの細胞においては、デヒドラターゼの作用により脱水反応が進むと考えられる。
５．Ｐ４５０抗血清及びイムノブロット分析
植物シトクロムＰ４５０のアミノ酸配列についての共通配列を調べ、鋭意研究の後、抗原として、下記の二つのオリゴペプチド配列（Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ（配列番号：６）及びＴｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号：７））を設計した。これらの配列を各々ベースとして、化学的に合成されたＮ−アセチル化アミノ末端を持つ多抗原性ペプチドを、二羽のウサギに皮下注射した。血中の抗ペプチド抗体力価をＥＬＩＳＡにより調べたところ、Ｐ４５０酵素に対する抗体が産生されていることがわかった。このＰ４５０抗血清を用いてイムノブロッティングを行った。
まず、上記酵母のミクロソームをＳＤＳ／１０％ＰＡＧＥで分離し、ハイボンド−Ｃ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し（約１０μｇタンパク質）、Ｐ４５０抗血清の１：２０００希釈液と、室温で１時間インキュベートした。免疫反応性のタンパク質を、製造者のプロトコルに従いＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で検出した。
図８Ａに示すように、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにおいて、分子量約５９ｋＤａの新しいバンドが検出された。これはアミノ酸配列に基づいて計算された分子量５９，４２８Ｄａと合致する。
図８Ｂに示すように、ＣＹＰＧｅ−８を発現していると予測される細胞のミクロソームを用いたイムノブロットでは、同じく５９ｋＤａに顕著なシグナルが示された。
６．ノーザンブロット分析
「１．植物材料及び培養方法」の欄で記載したのと同じ培養条件で培養したカンゾウの懸濁培養細胞を、エリシター処理の後、３，６，１２，２４，４８時間に収穫した。ｍＲＮＡをＳｔｒａｉｇｈｔ  Ａ’ｓ  ｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。ノーザンブロット分析のために、ｍＲＮＡ（９００ｎｇ）を１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ハイボンド−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写した。電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色することにより、ＲＮＡ量を確認した。ＣＹＰ  Ｇｅ−８のコード嶺域を前記のＧｅ−８Ｓ１、Ｇｅ−８Ａ１プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。これを化学発光用のＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてアルカリホスファターゼ標識し、ハイブリダイゼーション用のプローブとした。ブロットを５００ｍＭのＮａＣｌ及び４％のブロック試薬を含むハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃で１２時間、プローブとハイブリダイズさせた。製造者のプロトコルに従い、膜を一次洗浄バッファーにより５５℃で１０分間２回洗浄し、膜を二次洗浄バッファーにより室温で５分間２回洗浄した。
図９に示すように、エリシター処理後、３〜６時間経過時の細胞におけるｍＲＮＡの蓄積が多いことがわかる。
７．タバコへのカンゾウＩＦＳ  ｃＤＮＡの導入
ａ．ＩＦＳを組み込んだバイナリーベクターの作成（植物発現用ベクターの構築）
ｐＢＩ１２１プラスミド（図１０（Ａ）参照）のＧＵＳ遺伝子をＩＦＳ  ｃＤＮＡに置き換えたバイナリーベクターを作成するために、以下の手順で実験を行なった。
ａ−１）  ＧＵＳ遺伝子を取り除いたｐＢＩ１２１（ｐＢＩ−ＧＵＳ）の作成
ＰＢＩ１２１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＳａｃＩ，ＳｍａＩ（宝酒造社製）処理し、ＧＵＳ遺伝子を除去した。次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）により末端を平滑化、ベクターをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）によりセルフライゲーションさせた。その後大腸菌ＤＨ５  αへ形質転換し、得られたコロニーをｐＢＩ１２１３５Ｓ，ｐＢＩ１２１  Ａｎｔｉプライマーを用いてインサートチェックした。その結果、ｐＢＩ１２１プラスミドのＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターとＮｏｓ−ターミネーターとの間にＧＵＳ遺伝子を持たないプラスミド、ｐＢＩ−ＧＵＳプラスミドが得られた。
ａ−２）  両端にＢａｍＨＩ部位を組み込んだＩＦＳ  ｃＤＮＡの作成
ＩＦＳ  ｃＤＮＡのＣＤＳ（コード領域）の両端（５’末端、３’末端）にＢａｍＨＩ部位を組み込んだプライマー、Ｇｅ−８Ｓ１（ＢａｍＨＩ）プライマー（配列番号：１１）とＧｅ−８ＡＳ１（ＢａｍＨＩ）プライマー（配列番号：１２）を作成した。
Ｇｅ−８Ｓ１（ＢａｍＨＩ）プライマー
５’−ＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧ−３’
Ｇｅ−８ＡＳ１（ＢａｍＨＩ）プライマー
５’−ＧＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＧＡＧ−３’
そしてＧｅ−８プラスミド（配列番号：１のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを組み込んだプラスミド）をテンプレートとし、前述のプライマー、Ｇｅ−８Ｓ１（ＢａｍＨＩ）プライマーとＧｅ−８ＡＳ１（ＢａｍＨＩ）プライマーを用いてＰＣＲを行なった。反応は９８℃１分間を１サイクル、９８℃１５秒間、５５℃１０秒間、７４℃３０秒間を２０サイクル、７４℃５分間を１サイクルで行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用した。このようにして５’末端と３’末端（両端）にＢａｍＨＩ部位を持つＩＦＳ  ｃＤＮＡを得た。
次に、得られたＩＦＳ  ｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）処理し、５’末端をリン酸化した。そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングし、シーケンスで配列が正しいか、即ちＫＯＤで増幅した時に変異が起きていないかを確認した。シーケンスの結果、変異の起きていない、５’，３’両末端にＢａｍＨＩ部位を持つＩＦＳプラスミドが得られた。
ａ−３）  ａ−１）で作成したｐＢＩ−ＧＵＳプラスミドとａ−２）で作成したＩＦＳ  ｃＤＮＡとのライゲーション
ａ−１）で作成したｐＢＩ−ＧＵＳプラスミドをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）処理し、さらにＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｉｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；宝酒造社製）処理し、これを、ａ−２）で作成したＩＦＳプラスミド（ＢａｍＨＩ部位を両端に持つ）をＢａｍＨＩ処理して得た５’，３’両末端にＢａｍＨＩの突出末端を持つＩＦＳ  ｃＤＮＡと、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製）によりライゲーションし、これにより大腸菌ＤＨ５  αを形質転換し、得られたコロニーのインサートチェックを行なった（図１１（Ａ）〜（Ｄ）参照）。インサートチェックには、下記のプライマーを利用した。
ｐＢＩ１２１  ３５Ｓプライマー（配列番号：１３）
５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧ−３’
ｐＢＩ１２１  Ａｎｔｉプライマー（配列番号：１４）
５’−ＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＴＣＴＴＡＡＧ−３’
Ｇｅ−８Ｓ１プライマー（配列番号：４）
５’−ＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣ−３’
Ｇｅ−８Ａ１プライマー（配列番号：５）
５’−ＣＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＧＡＧＴＴ−３’  その結果、図１２（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、ｐＢＩ１２１のＧＵＳ部分にセンス方向のＩＦＳ  ｃＤＮＡが導入されたものが４クローン（ｐＢＩＧｅ−８Ｓ８，ｐＢＩＧｅ−８Ｓ９，ｐＢＩＧｅ−８Ｓ１１，ｐＢＩＧｅ−８Ｓ１３）（図１０（Ｂ）参照）、アンチセンス方向のＩＦＳ  ｃＤＮＡが導入されたものが２クローン（ｐＢＩＧｅ−８Ａ４，ｐＢＩＧｅ−８Ａ１０）（図１０（Ｃ）参照）得られた。なお、図１２の（Ａ）〜（Ｄ）の写真は、各々図１１の（Ａ）〜（Ｄ）で示されるインサートチェックの結果を示している。また、図中、ｐＢＩＧｅ−８Ｓ８，ｐＢＩＧｅ−８Ｓ９，ｐＢＩＧｅ−８Ｓ１１，ｐＢＩＧｅ−８Ｓ１３，ｐＢＩＧｅ−８Ａ４，ｐＢＩＧｅ−８Ａ１０を、各々８，９，１１，１３，４，１０として示した。
ｂ．バイナリーベクターのアグロバクテリウムへの組み込み
ａ．で作成したバイナリーベクターをアグロバクテリウムへ導入するのには、ｔｒｉ−ｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ法（Ａ．Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０３，１７９（１９８３）；Ｍ．Ｂｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，８７１１（１９８４）参照）を用いた。（なお、接合伝達能を供給するのにはヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１を用いた。）センス方向にＩＦＳ  ｃＤＮＡを組み込んだバイナリーベクターｐＢＩＧｅ−８  Ｓ８（図１０（Ｂ）参照）、及びアンチセンス方向にＩＦＳ  ｃＤＮＡを組み込んだバイナリーベクターｐＢＩＧｅ−８  Ａ４（図１０（Ｃ）参照）をそれぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４に導入した。
ｃ．植物の形質転換
（１日目）
ｃ−１）リーフディスクの作成
約３週間培養したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＳＲ１）無菌植物体から上部２−３枚の葉を切り出し、０．５ｃｍＸ１ｃｍ四方のリーフディスクを作成した。作成したリーフディスクをＭＳ−ＮＢ培地に置き、２５℃，光照射の条件で一晩培養した。
ｃ−２）アグロバクテリウムの培養
ｂ．で得られた２種類のアグロバクテリウムをＬＢ＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）液体培地１０ｍｌに植菌し、２８℃で一晩振とう培養した。
（２日目）
ｃ−３）リーフディスクへのアグロバクテリウムの感染及び共存培養
一晩培養したｃ−２）のアグロバクテリウム培養液に、ｃ−１で作成したリーフディスクを約２分間浸した。その後リーフディスクを取り出し、滅菌ペーパータオルで余分な菌液をぬぐい、共存培養用培地（滅菌濾紙をひいたもの）に置いた。この状態で２日間２５℃ｄａｒｋの条件で培養した。
（４日目以降）
ｃ−４）再分化培地での培養
２日間の共存培養後、リーフディスクを再分化培地に移した。２５℃、１６時間ｌｉｇｈｔ／８時間ｄａｒｋの条件で培養した。２−３週間後にリーフディスクが部分的にカルス化した。さらに１−２週間後にはシュートの再分化が観察された。再分化してきたシュートを切り出し、発根培地へ移植した。
本実施例で用いた培地組成を下記に示す：
ＭＳ−ＮＢ培地：（ＭＳ培地、１ｍｇ／ｌベンジルアデニン，０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸，３ｇ／ｌゲルライト（和光純薬工業製）
共存培養培地：（ＭＳ培地，３ｇ／ｌゲルライト）
再分化培地：（ＭＳ培地，１ｍｇ／ｌベンジルアデニン，０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸，３ｇ／ｌ  Ｇｅｌｒｉｔｅ，１００ｍｇ／ｌカナマイシン，４００ｍｇ／ｌカルベニシリン）
発根培地：
最初の３週間：（ＭＳ培地，３ｇ／ｌゲルライト，１００ｍｇ／ｌカナマイシン，２００ｍｇ／ｌカルベニシリン）
３週間以降：（１／２ＭＳ培地，３ｇ／ｌゲルライト，１００ｍｇ／ｌカナマイシン，２００ｍｇ／ｌカルベニシリン）
ｃ−６）ゲノミックＰＣＲによる導入遺伝子の確認
発根培地で約３週間培養した株のうち、センスＩＦＳ  ｃＤＮＡを導入した４株（Ｓ−１，Ｓ−２，Ｓ−３，Ｓ−５）について図１４に示すようにゲノミックＰＣＲを行い、導入遺伝子の確認を行った。なおｃｏｎｔｒｏｌとして、遺伝子を導入していないタバコ無菌植物体を使用した。
まずそれぞれの株、上部２−３枚の葉を切り出し、Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によるＤＮＡ抽出を行った。このＤＮＡ１００ｎｇをテンプレートにして、９５℃１０分間を１サイクル、９５℃１分間、５７℃１分間、７２℃１分３０秒間を４５サイクル、７２℃５分間を１サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＡｍｐｌｉ  ｔａｇ  ＧｏｌｄＴＭ（パーキンエルマー社製）を使用した。
プライマーとしては、ａ−１）でインサートチェックに使用したプライマーを使用した。
また、用いたプライマーの組み合わせは下記の通りである。
（１）Ｇｅ−８Ｓ１  ＋ｐＢＩ１２１Ａｎｔｉ
（２）Ｇｅ−８Ｓ１＋Ｇｅ−８Ａ１
（３）ＰＢＩ１２１３５Ｓ＋ｐＢＩ１２１Ａｎｔｉ
なお、（３）のｐＢＩ１２１３５Ｓ，ｐＢＩ１２１  Ａｎｔｉのプライマーペアにおいてはアニーリング温度を５０℃に設定した。
結果を図１３に示す。図１３は、ゲノミックＰＣＲ（１）（２）（３）の結果を示す写真である。これにより、Ｓ−１，Ｓ−２，Ｓ−３，Ｓ−５株の全てにおいて、天然のタバコ植物体（図中，Ｃ）にはないバンドが見られ、ＩＦＳ  ｃＤＮＡがセンス方向に導入されていることが分かった。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明により、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を実質的に含むポリヌクレオチドが提供される。このポリヌクレオチドを用いて、ＩＦＳを発現する形質転換体を得ることができる。これは、イソフラボン類の生産、イソフラボン類に富む食品材料の提供、植物の耐病性の強化等の点で有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼが関与する反応を示す反応式である。
図２は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換した酵母ミクロソームの酵素アッセーの結果を示す図である。
図３は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換した酵母ミクロソームの酵素アッセーの結果を示す写真である。
図４は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換した酵母ミクロソームの酵素アッセーの結果を示す図である。
図５は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換した酵母ミクロソームによる反応生成物の質量スペクトル分析の結果を示す図である。
図６は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換した酵母ミクロソームによる反応生成物の質量スペクトル分析の結果を示す図である。
図７は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換した酵母ミクロソームの酵素アッセーの結果を示す写真である。
図８は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換した酵母ミクロソームのＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析の結果を示す写真である。
図９は、本発明により得られたｍＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す写真である。
図１０は、本発明のポリヌクレオチドを用いたタバコの形質転換に使用したバイナリーベクターを示す説明図である。
図１１は、本発明のポリヌクレオチドを用いたタバコの形質転換におけるインサートチェックの方法を示す説明図である。
図１２は、図１１のインサートチェックの結果を示す写真である。
図１３は、本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換したタバコのゲノミックＰＣＲの結果を示す写真である。
図１４は、本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換したタバコのゲノミックＰＣＲの方法を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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