(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様成長因子I受容体（IGF−IR）に結合し、そしてIGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合を阻害する抗体であって、前記抗体が、
ａ）IgG1イソタイプのものであり、
ｂ）１：３〜３：１のIGF−IRへのIGF−Iの結合の阻害：IGF−IRへのIGF−IIの結合の阻害の比を示し、
ｃ）10nM以下のIC50値を伴いIGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合を阻害し、
ｄ）100nMの前記抗体の濃度での24時間後、IGF−IR発現細胞の20％又はそれ以上の細胞の細胞死を抗体−依存性細胞毒性（ADCC）により誘発し、
ｅ）配列番号１のH鎖可変領域（VH）であって、
ここで、
アミノ酸位置30はアルギニンを示し、アミノ酸位置31はアスパラギンを示し、アミノ酸位置94はチロシンを示し、そしてアミノ酸位置104はアスパラギン酸を示す、
H鎖可変領域（VH）を含んで成り、
ｆ）配列番号２のL鎖可変領域（VL）であって、ここで
アミノ酸位置96はプロリンを示し、アミノ酸位置100はプロリンを示し、アミノ酸位置103はリシンを示し、アミノ酸位置104はバリンを示し、そしてアミノ酸位置105はアスパラギン酸を示す、
L鎖可変領域（VL）を含んで成り、そして
ｇ）ヒトH鎖定常領域（CH)及びヒトL鎖定常領域（CL)を含んで成ることを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記抗体が、100nMの前記抗体の抗体濃度での４時間後、IGF−IR発現細胞の20％又はそれ以上の細胞の死を補体−依存性細胞毒性（CDC）により誘発することを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ヒト又はヒト化抗体であることにより特徴づけられる請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
10-11〜10-8M(KD)の親和性により特徴づけられる請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマ細胞系< IGF-1R > HuMab クローン la (寄託番号DSM ACC 2586)から得ることができる請求項１記載の抗体。
【請求項６】
医薬組成物の製造のための請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体を、医薬的に有効な量で含む医薬組成物。
【請求項８】
ハイブリドーマ細胞系< IGF-1R > HuMab クローン la (寄託番号DSM ACC 2586), < IGF-1R > HuMab クローン 23 (寄託番号DSM ACC 2588) 又は < IGF-1R > HuMab クローン 8 (寄託番号DSM ACC 2589)。
【請求項９】
医薬的に有効量の請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体を含んで成る医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子I受容体（IGF−IR）に対する抗体類、それらの生成方法、前記抗体を含む医薬組成物、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトインスリン様成長因子I受容体（IGF−IR、EC2.7.112、CD221抗原）は、トランスメンブランタンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する（LeRoith, D., など. , Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; 及び Adams, T. E. , など., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063）。IGF−IRは、高い親和性でIGF−Iを結合し、そしてインビボでこのリガンドに対する生理学的応答を開始する。しかしながら、IGF−IRはまた、わずかに低い親和性で、IGF−IIに結合する。IGF―IR過剰発現は、細胞新生形質転換を促進し、そしてIGF−IRが細胞の悪性形質転換に関与する証拠が存在し、そして従って、癌の処理のための治療剤の開発のための有用な標的物である（Adams, T. E. , など., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063）。
【０００３】
IGF−IRに対する抗体は、当業界において良く知られており、そしてインビトロ及びインビボでそれらの抗腫瘍効果について研究されている（Benini, S. , など. , Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., etal., Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K. , など., Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A. , など. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218;  Prigent, S. A. , など. , J. Biol. Chem. 265  (1990)  9970-9977;  Li, S. L. , など., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243- 252; Pessino, A. , など., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K. H. , など., J. Biol. Chem. 277 (2002)16718-16725 ;  Soos, M. A. , など.,J. Biol. Chem. , 267 (1992) 12955-12963; Soos, M. A. , など. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221; O'Brien,R. M. , など. , EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R., など. , Biochem.J. 242 (1987) 123-129; Soos, M. A. , など. , Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S. L. , など. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98;Delafontaine, P. , など. , J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673;Kull, F. C.Jr., など. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D. O. , and Roth, R. A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J. R. , など. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 (1987) 3448-3451 ; Schaefer, E. M., など.,J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T. A. , and Rutter, W. J.,J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A., など., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A., など. , J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q. T. , など. , Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276- 281; and Kalebic, T. , など. , Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T. E. , など., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063; Dricu, A. , など.,Glycobiology 9 (1999)571-579; Kanter-Lewensohn,L., など.,Melanoma Res. 8 (1998) 389-397 ; Li, S. L. , など., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252）。IgF−IRに対する抗体もまた、多くのさらなる次の出版物に記載されている：Arteaga, C. L. , など., Breast Cancer Res. Treatment22 (1992) 101-106; 及び Hailey, J. , など. , Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353。
【０００４】
特に、αIR3と呼ばれるIGF−IRに対するモノクローナル抗体は、IGF−IR介在工程及びIGF−I介在性疾患、例えば癌の研究において広く使用されている。α−IR−3は、Kull, F. C.,J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566により記載されている。その間、αIR3の抗腫瘍効果に関して、αIR3の研究及び治療的使用を、単独で及び細胞性剤、例えばドキソルビシン及びビンクリスチンと一緒に対処する約100の出版物が公開されている。αIR3は、IGF受容体へのIGF−I結合を阻害するが、IGF−IRへのIGF−II結合を阻害しないことが知られているネズミモノクローナル抗体である。しかしながら、IGF−I結合よりも強くIGF−IRへのIGF−II結合を阻害する他の抗体（例えば、1H7, Li, S. L. ,など., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252）が存在する。抗体類及びそれらの性質及び技術状態の要約は、Adams, T. E. , など., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063により記載されている。
【０００５】
当業界において記載されるほとんどの抗体は、マウス起源のものである。そのような抗体は、当業界において良く知られているように、キメラ化又はヒト適合化のような追加の変更なしでは、ヒト患者の治療のために有用ではない。それらの欠点に基づいて、ヒト抗体は、ヒト患者の処理において治療剤として明らかに好ましい。ヒト抗体は、当業界において良く知られている（van Dijk, M. A. , and van de Winkel,J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001)368-374）。そのような技法に基づいて、種々の標的物に対するヒト抗体が生成され得る。IGF−IRに対するヒト抗体の例は、WO02/053596号に記載されている。
【０００６】
しかしながら、抗腫瘍治療の必要な患者のための納得の行く有益性を有する、IGF−IRに対する抗体についての必要性がまだ存在する。患者のための適切な有益性は、単純に言えば、腫瘍増殖の低下、及び抗腫瘍形成剤による処理により引き起こされる進行時間の有意な延長である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約：
本発明は、IGF−IRに結合し、そしてIGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合を阻害する抗体を含んで成り、ここで前記抗体は、IgG1イソタイプのものであり、１：３〜３：１のIGF−IRへのIGF−Iの結合の阻害：IGF−IRへのIGF−IIの結合の阻害の比を示し、そして100nMの前記抗体の濃度での24時間後、IGF−IR発現細胞の調製物の20％又はそれ以上の細胞の細胞死を抗体−依存性細胞毒性（ADCC）により誘発することを特徴とする。
【０００８】
本発明の抗体は、抗腫瘍治療の必要な患者のために有益性を示し、そして腫瘍増殖の低下、及び進行時間の有益な延長を提供する。本発明のの抗体は、IGF調節解除のために関連する疾病、特に腫瘍疾患を有する患者のために有益性を引起す新規且つ発明力のある性質を有する。本発明の抗体は、前記性質により特徴づけられる。従って、前記性質は特に、IgGIイソタイプのものであり、そしてADCCにおいてエフェクター機能を有する、前記比でIGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合を阻害する、IGF−IRへの特異的結合である。
好ましくは、さらに、本発明の抗体は、100nMの前記抗体の抗体濃度での４時間後、IGF−IR発現細胞の調製物の20％又はそれ以上の細胞の死をCDCにより誘発する。
好ましくは、50nMの濃度で、本発明の抗体は、腫瘍細胞においてIGF−IRのIGF−I介在性シグナルトランスダクションを完全に阻害する。
【０００９】
本発明はまた、抗体コードの核酸を含んで成る。コードされるポリペプチドは、下記に定義されるそれぞれ他の抗体鎖と一緒にアセンブルすることができる：
−配列番号１のCDR1（aa31-35）、CDR2（aa50-66）及びCDR3（aa98-108）（ここで、アミノ酸31はアスパラギン又はセリンであり、アミノ酸66はグリシンであるか又は欠失され得、そしてアミノ酸104はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり得る）を、CDRとして含んで成る抗体H鎖；
【００１０】
−配列番号２のCDR1（aa18-34又はaa24-34）、CDR2（aa50-56）及びCDR3（aa89-98）（ここで、アミノ酸96はプロリン又はイソロイシンであり得、そしてアミノ酸98はフェニルアラニンであるか又は欠失され得る）を、CDRとして含んで成る抗体L鎖。
好ましいCDRは、次のものである：（ａ）配列番号１のCDR1（aa31-35）、CDR2（aa50-65）及びCDR3（aa98-108）（ここで、アミノ酸31はアスパラギン又はセリンであり、そしてアミノ酸104はグルタミン酸又はアスパラギン酸である）、及び（ｂ）配列番号２のCDR1（aa24-34）、CDR2（aa50-56）及びCDR3（aa89-97）。
CDR番号付け及び定義は、Kabat, E. (例えば、 Johnson, G. , など. , Nucl. Acids Res. 28 (2000) 214-218)に従って提供される。
【００１１】
好ましくは、核酸は、
配列番号１の可変領域（VH）（ここで、アミノ酸（aa）30はセリン又はアルキニンを示し、aa31はアスパラギン又はセリンを示し、aa94はヒスチジン又はチロシンを示し、そしてaa104はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトH鎖不変領域（CH）から成るH鎖；及び
配列番号２の可変領域（VL）（ここで、aa96はプロリン又はイソロイシンを示し、aa100はプロリン又はグルタミンを示し、aa103はアルギニン又はリシンを示し、aa104はバリン又はロイシンを示し、そしてaa105はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトL鎖不変領域（CL）のいずれかであるポリペプチドをコードする。
【００１２】
抗体は好ましくは、モノクローナル抗体、及びさらに、キメラ抗体（ヒト不変鎖）、ヒト型化抗体、及び特に好ましくは、ヒト抗体である。
抗体は、配列番号１−６の可変鎖により特徴づけられる抗体との競争において、ヒトIGF-IR（EC2.7.112, SwissProto PO8069）に結合する。
抗体はさらに、10-8M(KD)又はそれ以下、好ましくは約10-8〜10-11Mの親和性により特徴づけられる。
【００１３】
好ましくは、本発明は、
−配列番号１のCDR1（aa31-35）、CDR2（aa50-66）及びCDR3（aa98-108）（ここで、アミノ酸31はアスパラギン又はセリンであり、アミノ酸66はグリシンであるか又は欠失され得、そしてアミノ酸104はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり得る）を、CDRとして含んで成る抗体H鎖；
−配列番号２のCDR1（aa18-34又はaa24-34）、CDR2（aa50-56）及びCDR3（aa89-98）（ここで、アミノ酸96はプロリン又はイソロイシンであり得、そしてアミノ酸98はフェニルアラニンであるか又は欠失され得る）を、CDRとして含んで成る抗体L鎖を有する相補性決定領域（CDR）を含んで成る抗体を提供する。
【００１４】
従って、本発明はまた、ポリペプチド、及び本発明のIGF-IR抗体のH鎖のCDR1, CDR2, CDR3, 及びL鎖のCDR1, CDR2, CDR3から成る群から選択されたコード核酸を含んで成る。
好ましくは、本発明は、
配列番号１の可変領域（VH）（ここで、アミノ酸（aa）30はセリン又はアルギニンを示し、aa31はアスパラギン又はセリンを示し、aa94はヒスチジン又はチロシンを示し、そしてaa104はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトH鎖不変領域（CH）から成るH鎖；及び
配列番号２の可変領域（VL）（ここで、aa96はプロリン又はイソロイシンを示し、aa100はプロリン又はグルタミンを示し、aa103はアルギニン又はリシンを示し、aa104はバリン又はロイシンを示し、そしてaa105はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトL鎖不変領域（CL）から成るL鎖により特徴づけられる抗体を含んで成る。
【００１５】
前記不変領域は、C1q補体結合を提供し、そして従って、好ましくはヒトIgG1型のものである。
H鎖における
aa 30 Arg, aa 31 Asn, aa 94 Tyr 及び aa 104 Asp（抗体１A）, 又は
aa 30 Arg, aa 31 Ser, aa 94 Tyr 及び aa 104 Asp（抗体8）, 又は
aa 30 Ser, aa 31 Asn, aa 94 His 及び aa 104 Glu（抗体23）の組合せが好ましい。
【００１６】
L鎖における
aa 96 Pro, aa 100 Pro, aa 103 Lys, aa 104 Val 及び aa 105 Asp（抗体１A及び8）, 又は
aa 96 Ile, aa 100Gln, aa 103 Arg, aa 104 Leu 及び aa 105 Glu（抗体23）の組合せが好ましい。
【００１７】
H鎖におけるaa 30 Arg, aa 31 Asn, aa 94 Tyr 及び aa 104 Asp及びL鎖におけるaa 96 Pro, aa 100 Pro, aa 103 Lys, aa 104 Val 及び aa 105 Aspの組合せが特に好ましい。
本発明の抗体は、ビークル処理された動物に比較して、適切な異種移植腫瘍モデルにおいて進行する時間を相当に延長し、そして腫瘍増殖を低める。抗体は、IGF−I及びIGF−IIについてのほぼ等しい態様で、インビトロ及びインビボにおいてIGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合を阻害する。
【００１８】
抗体はさらに、IgGFc受容体を結合し、そしてADCCを誘発し、そして好ましくは、補体成分C1qを結合し、そしてCDCを誘発する能力により特徴づけられる。
本発明はさらに、そのような本発明の拮抗性ポリクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系を提供する。
本発明の好ましいハイブリドーマ細胞系< IGF-1R > HuMab クローン la（抗体1A、Ab 1A又はAk 1A）, < IGF-1R > HuMab クローン 23（抗体23） 又は < IGF-1R > HuMab クローン 8（抗体8）は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託されている：
【００１９】
【表１】
0004473257.tif 000002
【００２０】
前記細胞系から得られる抗体は、本発明の好ましい態様である。
本発明はさらに、そのような抗体をコードする核酸、前記核酸を含む発現ベクター、及びそのような抗体の組換え生成のための宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、そのような抗体の組換え生成方法も提供する。
【００２１】
本発明はさらに、癌を有するものとして診断された（及び従って、抗腫瘍治療の必要な）患者に、有効量の本発明のIGF-IRに対する拮抗性抗体を投与することを含んで成る、癌を処理するための方法を提供する。前記抗体は、医薬組成物において、単独で、又は他方では、細胞毒性処理、例えば放射性療法又は細胞毒製剤又はそのプロドラッグと組合して投与され得る。
本発明はさらに、癌処理のためへの、及び本発明の医薬組成物の製造のためへの本発明の抗体の使用を包含する。さらに、本発明は、本発明の医薬組成物の製造方法を包含する。
【００２２】
本発明はさらに、医薬的有効量の本発明の抗体、及び任意には、医薬目的のための抗体の調製のために有用な緩衝液及び/又はアジュバントを含む医薬組成物を包含する。
本発明はさらに、医薬的に許容できるキャリヤーに、そのような抗体を含んで成る医薬組成物を提供する。１つの態様においては、医薬組成物は、製品又はキットに包含され得る。
本発明はさらに、原核又は真核宿主細胞において本発明の核酸を発現することができる、前記核酸を含むベクターを含んで成る。
【００２３】
本発明はさらに、本発明のベクターを含んで成る原核又は真核宿主細胞を包含する。
本発明はさらに、原核又は真核宿主細胞において本発明の核酸を発現し、そして前記細胞から前記抗体を回収することを特徴とする、本発明の組み換えヒト抗体の生成方法を包含する。本発明はさらに、そのような組み換え方法により得られる抗体を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な記載：
用語“抗体”とは、本発明の特徴的性質が維持される限り、種々の形の抗体、例えば完全な抗体、抗体フラグメント、ヒト抗体、ヒト型化抗体及び遺伝子的に構築された抗体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００２５】
“抗体フラグメント”は、十分な長さの抗体の一部、一般的に少なくとも抗原結合部分又はその可変領域を含んで成る。抗体フラグメントの例は、ジアボディー（diabody）、一本鎖抗体分子、イムノトキシン、及び抗体フラグメントから形成される多特異的抗体を包含する。さらに、抗体フラグメントは、VH鎖の特徴を有する、すなわちVL鎖と共にアセンブルできるか、又はIGH−IRへのVL鎖結合の特徴を有する、すなわち機能的抗原結合ポケットにVH鎖と共にアセンブルでき、そしてそれにより、IGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合を阻害する性質を提供する一本鎖ポリペプチドを含んで成る。
【００２６】
“抗体フラグメント”はまた、それ自体、エフェクター機能（ADCC/CDC）を提供できないが、しかし適切な抗体不変ドメインと組合された後、本発明の態様でこの機能を提供するそのようなフラグメントを含んで成る。
【００２７】
用語“モノクローナル抗体”又は“モノクローナル抗体組成物”とは、本明細書において使用される場合、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を言及する。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”とは、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び不変領域を有する単一の結合特徴性を示す抗体を言及する。１つの態様においては、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトH鎖トランスジーン及び不滅化された細胞に融合されるL鎖ヒトトランスジーンを含んで成るゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるB細胞を包含するハイブリドーマにより生成される。
【００２８】
用語“キメラ抗体”とは、１つの源又は種からの可変領域、すなわち結合領域、及び異なった源又は種に由来する不変領域の少なくとも一部を含んで成る、組換えDNA技法により通常調製されるモノクローナル抗体を言及する。ネズミ可変領域及びヒト不変領域を含んで成るキメラ抗体が特に好ましい。そのようなネズミ/ヒトキメラ抗体は、ネズミ免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメント、及びヒト免疫グロブリン不変領域をコードするDNAセグメントを含んで成る、発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。本発明により包含される他の形の“キメラ抗体”は、そのクラス又はサブクラスが元の抗体のそれから修飾されているか又は変更されているそれらの抗体である。そのような“キメラ”抗体はまた、“クラス−スイッチド抗体”としても言及される。キメラ抗体の生成方法は、当業界において良く知れられている従来の組換えDNA及び遺伝子トランスファー技法を包含する。Morrison, S. L. , など., Proc. Natl. Acad Sci.USA81(1984)6851-6855 ; アメリカ特許第5,202,238号 及び第5,204, 244号を参照のこと。
【００２９】
用語“ヒト型化抗体”とは、その骨格又は“相補性決定領域”（CDR）が、親免疫グロブリンのCDRに比較して、異なった特異性の免疫グロブリンのCDRを含むよう修飾されている抗体を包含する。好ましい態様においては、ネズミCDRは、“ヒト型化抗体”を調製するために、ヒト抗体の骨格領域中に異種移植される。例えば、Riechmann,L.,など., Nature 332(1988) 323-327; 及びNeuberger, M. S. , など.,Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ及び二官能価抗体について上記に示される抗体を認識する配列を表すそれらに対応する。
【００３０】
用語“ヒト抗体”とは、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び不変領域を有する抗体を包含する。前記可変H鎖は好ましくは、生殖系配列DP-61 (GenBank M99682) に由来し、そして可変L鎖は、生殖系配列L15（GenBank K01323）に由来する。抗体の不変領域は、ヒトIgG1型の不変領域である。そのような領域はアロタイプであり、そしてJohnson, G. , 及び Wu, T. T. , Nucleic Acids  Res. 28 (2000) 214-218 及びそこに言及されるデータベースにより記載され、そしてADCC及び好ましくは本発明のCDCの誘発の性質が保持される限り、有用である。
【００３１】
用語“組換えヒト抗体”は、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製され、発現され、創造されるか又は単離されるすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである生物（例えば、マウス）からのNS0又はCHO細胞から単離された抗体、又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を包含する。そのような組換えヒト抗体は、転位された形で、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び不変領域を有する。本発明の組み換えヒト抗体は、インビボ体細胞超突然変異誘発にゆだねられて来た。従って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VH及びVl配列に由来し、そして関連する場合、インビボでのヒト抗体生殖レパートリー内に、天然において存在できない配列である。
【００３２】
本明細書において使用される場合、“結合”とは、約10-11〜10-8M (KD), 好ましくは約10-11〜10-9Mの親和性でのIGF−IRへの抗体結合を言及する。
用語“核酸分子”とは、本明細において使用される場合、DNA分子及びRNA分子を包含する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、しかし好ましくは、二本鎖DNAである。
【００３３】
“不変ドメイン”とは、抗原に抗体を結合することに直接的に包含されないが、しかしエフェクター機能（ADCC, 補体結合及びCDC）に包含される。従って、本発明の抗体の不変ドメインは好ましくは、ヒトIgG1型のものである。それらの特徴を有するヒト不変ドメインは、Kabat など., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), 及びBruggemann, M. , など., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T. W. , など., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527により、詳細に記載されている。例は、配列番号７〜10で示される。他の有用な不変ドメインは、本発明のためにDSMZに寄託されたハイブリドーマ細胞系から得られる抗体の不変ドメインである。本発明において有用な不変ドメインは、補体結合を提供する。ADCC及び任意には、CDCは、可変及び不変ドメインの組合せにより提供される。
【００３４】
“可変領域”（１鎖の可変領域（VL）、H鎖の可変領域（VH））は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の結合において直接的に関与する１対のL鎖及びH鎖の個々を示す。ヒト可変L鎖及びH鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、そして個々のドメインは、４種の骨格（FR）領域を含んで成り、それらの配列は、３種の“超可変領域”（又は相補性決定領域、CDR）により広く保存され、連結される。骨格領域は、β−シートコンホメーションを採用し、そしてCDRはβ−シート構造を連結するループを形成できる。個々の鎖におけるCDRは、骨格領域によりそれらの立体構造で維持され、そして他の鎖におけるCDRは、骨格領域によりそれらの立体構造で維持され、そして他の鎖からのCDRと一緒に、抗原結合部位を形成する。抗体H鎖及びL鎖CDR３領域は、本発明の抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を演じる。
【００３５】
用語“抗体の超可変領域”又は“抗体−結合部分”とは、本明細書において使用される場合、抗原−結合を担当する、抗体のアミノ酸残基を言及する。超可変領域は、“相補性決定領域”又は“CDR”からのアミノ酸残基を含んで成る。“骨格”又は“FR”領域は、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体のL鎖及びH鎖は、N−末端からC−末端側に、ドメインFR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 及びFR4を含んで成る。特に、H鎖のCDR3は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。CDR及びFR領域は、Kabat など., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) and/or those residues from a"hypervariable loop"の標準定義、及び/又は“超可変ループ”からのそれらの残基に従って決定される。
【００３６】
用語“IGF-IRへの結合”とは、本明細書において使用される場合、インビトロアッセイにおいて、好ましくは抗体が表面に結合され、そしてIGF-IRの結合が表面プラスミン共鳴（SPR）により測定される結合アッセイにおいて、IGF−IRへの抗体の結合を意味する。結合とは、10-8M又はそれ以下、好ましくは10-11〜10-8Mの結合親和性（KD）を意味する。
IGF−IRへの結合は、BIAcore アッセイ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)により調べられ得る。結合の親和性は、ka（抗体/抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数）、kd（解離定数）、及びKD（kd/ka）により定義される。本発明の抗体は好ましくは、10-9M又はそれ以下のKDを示す。
【００３７】
IGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合はまた、本発明の抗体により阻害される。阻害は、腫瘍細胞上のIGF-IRへのIGF−I/IGF−IIの結合についてのアッセイにおいてIC50として測定される。そのようなアッセイは、例７に記載される。そのようなアッセイについては、前記腫瘍細胞（例えば、HT29）の表面で提供されるIGF−IRに結合される放射性ラベルされたIGF−I又はIGF−II、又はそのIGF−IR結合フラグメントの量が、抗体の上昇する濃度を伴わないで、及びその上昇する濃度を伴って測定される。IGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合についての本発明の抗体のIC50値は、10nM以下であり、そしてIGF−IRへのIGF−I/IGF−IIの結合についてのIC50値の比は、約１：３〜３：１である。
【００３８】
用語“IGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合の阻害”とは、本明細書において使用される場合、インビトロアッセイにおいてHT29（ATCC HTB-38）腫瘍細胞の表面上に表されるIGF−IRへのI125−ラベルされたIGF−I又はIGF−IIの結合の阻害として言及される。阻害は、10nM又はそれよりも低いIC50値を意味する。
用語“IGF−IR発現細胞”とは、IGF−I受容体を、少なくとも約20,000個の受容体/細胞、過剰発現するそのような細胞を言及する。そのような細胞は、腫瘍細胞系、例えばNCI H322M、又はIGF−IRについての発現ベクターによるトランスフェクションの後、IGF−IRを過剰発言する細胞系（例えば、3T3）である。
【００３９】
用語“抗体−依存性細胞毒性（ADCC）”とは、エフェクター細胞の存在下で本発明の抗体によるヒト腫瘍的細胞の溶解を言及する。ADCCは好ましくは、エフェクター細胞、例えば新しく単離されたPBMC又は軟膜からの精製されたエフェクター細胞、例えば単球又はNK細胞の存在下で本発明の抗体によるIGF−IR発現細胞の調製物の処理により測定される。ADCCは、抗体が、24時間の後、100nMの濃度で、20％又はそれ以上の腫瘍細胞の溶解（細胞死）を誘発する場合、見出される。アッセイは好ましくは51Crラベルされた腫瘍細胞、及び特異的に解放された51Crの測定により行われる。対照は、エフェクター細胞と共に、但し抗体を伴わないで、腫瘍標的細胞インキュベートすることを包含する。
【００４０】
用語“補体−依存性細胞毒性（CDC）”とは、補体の存在下での本発明の抗体によるヒト腫瘍標的細胞の溶解を言及する。CDCは好ましくは、補体の存在下での本発明の抗体によるIGF−IR発現細胞の調製物の処理により測定される。CDCは、抗体が、４時間後、100nMの濃度で、20％又はそれ以上の腫瘍細胞の溶解（細胞死）を誘発する場合、見出される。アッセイは好ましくは、51Crラベルされた腫瘍細胞、及び開放された51Crの測定により行われる。対照は、補体と共に、但し抗体を伴わないで、腫瘍標的細胞のインキュベーションを包含する。
【００４１】
用語“IGF−I介在性シグナルトランスダクションの完全な阻害”とは、IGF−IRのIGF-I−介在性リン酸化の阻害を言及する。そのようなアッセイに関しては、IGF−IR発現細胞、好ましくはH322M細胞が、IGF−Iにより刺激され、そして本発明の抗体により処理される（10nM又はそれ以下の抗体濃度（IC50）が有用である）。続いて、SDS PAGEが行われ、そしてIGF−Iのリン酸化が、リン酸化されたチロシンに対して特異的な抗体によるウェスターンブロット分析により測定される。シグナルトランスダクションの完全な阻害は、ウェスターンブロット上で、リン酸化されたIGF−IRを言及する、バンドが可視的に検出されない場合、見出される。
【００４２】
本発明の抗体は、抗体１Aと同じIGF−IRのエピトープへの結合を示すか、又は抗体１Aによる結合の立体的阻害のために、IGF−IRへの結合において阻害される。結合阻害は、20〜50nMの濃度での固定された抗体１A及びIGF−IR、及び100nMの濃度で検出される抗体を用いて、SPRアッセイにより検出され得る。50％又はそれ以上のシグナル低下は、抗体が抗体１Aと競争することを示す。そのようなアッセイは、固定された抗体として抗体８又は23を用いることにより、同じ態様で行われ得る。
【００４３】
用語“エピトープ”とは、抗体に特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の化学的活性表面グループ群から成り、そして通常、特定の立体構造特徴、及び特定の荷電特徴を有する。コンホメーション及び非コンホメーションエピトープは、前者への結合（但し、後者への結合ではない）が、変性溶媒の存在下で失われることにおいて区別される。
【００４４】
本発明の抗体は、さらに、“保存性配列修飾”、本発明の抗体の上記特徴に影響を及ぼさないか又は変更しない、ヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾を有するそのような抗体を包含する。修飾は、当業界において知られている標準技法、例えば特定部位の突然変異誘発及びPCR−介在性突然変異誘発により導入され得る。保存性アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換を包含する。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において定義されている。
【００４５】
それらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−枝分かれ側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。従って、ヒト抗−IGF−IR抗体における予測される非必須アミノ酸残基は好ましくは、同じ側鎖ファミリーからのもう１つのアミノ酸残基により置換され得る。
【００４６】
アミノ酸置換は、Riechmann, L. , など., Nature 332 (1988) 323-327 及び Queen,C., など. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 (1989) 10029-10033により記載されるような分子モデリングに基づいて突然変異誘発により行われ得る。
【００４７】
本発明の好ましい態様においては、本発明の抗体はさらに、結合パラメーターKa, kd及びKD、抗体1A, 8及び23が結合する同じエピトープへの結合、腫瘍細胞上のIGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合の阻害についてのIC50値、及び腫瘍細胞におけるIGF−Iの刺激に基づいてのIGF−IRのリン酸化の阻害についてのIC50値から成る群から選択された１又は複数の特徴により特徴づけられる。IGF−IRのリン酸化の阻害は、下流の要素、例えばPkBのリン酸化の阻害、腫瘍細胞におけるIGF−Iのダウンレギュレーション、及びインビトロでの腫瘍細胞の立体的増殖に対する影響を導く。抗体はさらに、好ましくは、他の種のそれらの薬物動力学及び薬力学値、及び交差反応性により特徴づけられる。
【００４８】
本発明の抗体は好ましくは、IGF−IRチロシンリン酸化を阻害する。
本発明の抗体は好ましくは、腫瘍細胞におけるIGF−IRタンパク質レベルをダウンレギュレーションする。
本発明の抗体は好ましくは、コロニー形成アッセイにおける腫瘍細胞の立体的増殖、及びIGF−IR発現細胞（例えば、NIH3T3細胞）の増殖を阻害する。
【００４９】
本発明の抗体は好ましくは、マーモセット（Callithrix jacchus）及びカニクイザル（Macaca fascicularis）からのIGF−IRとの交差反応性を示したが、しかしラット及びマウスからのIGF−IRとの交差反応性は示さない。健康なカニクイザルの２週間の処理の後、副作用の徴候は検出され得なかった（200mg/kg/週）。
本発明の抗体は好ましくは、200nモル/l又はそれ以上の濃度での抗体を用いて、インスリン受容体過剰発現3T3細胞に対する結合競争アッセイにおいて、インスリン受容体へのインスリンの結合を阻害しない。
【００５０】
本発明の抗体は好ましくは、インビボ（ヌードマウス、例えばNMRIマウスにおいて）で、約10〜18日の血清半減期を示す。
本発明の抗体は好ましくは、組み換え手段により生成される。そのような方法は、当業界において広く知られており、そして原核及び真核細胞におけるタンパク質発現、及び抗体ポリペプチドの続く単離、及び医薬的に許容できる純度への精製を包含する。タンパク質発現に関しては、L及びH鎖又はそのフラグメントをコードする核酸が、標準方法により発現ベクター中に挿入される。発現は、適切な原核又は真核宿主細胞、例えばCHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母、又はE. コリ細胞において行われ、そして抗体が前記細胞（溶解の後の上清液又は細胞）から回収される。
【００５１】
抗体の組換え生成は、当業界において良く知られており、そして例えば、Makrides, S. C. , Protein Expr.Purif. 17 (1999)183-202 ; Geisse, S. , など., Protein Expr. Purif.8 (1996) 271-282 ; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R. G. , Drug Res. 48 (1998)870-880の再考文献において記載されている。
【００５２】
抗体は、完全な細胞において、細胞溶解物において、又は部分的に精製された又は実質的に純粋な形で存在することができる。精製は、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を、標準技法、例えばアルカリ/SDS細胞、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当業界において良く知られている他の技法により、除去するために行われる。Ausubel, F. , など., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【００５３】
NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L. M. , など. , Cytotechnology 32 (2000) 109-123; 及び Barnes, L. M., など. , Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。過渡的発現は、例えばDurocher,Y., など. , Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R. , など. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA86(1989) 3833-3837; Carter, P. , など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 及び Norderhaug, L. ,など. , J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。好ましい過渡的発現システム（HEK293）は、Schlaeger, E. -J., and Christensen, K. , in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 ；及びSchlaeger, E. -J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により記載されている。
【００５４】
原核細胞のために適切である制御配列は例えば、プロモーター、任意にはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。原核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００５５】
核酸は、それがもう１つの核酸配列と機能的関係で配置される場合、“操作可能的に連結される”。例えば、前配列又は分泌リーダーについてのDNAは、それがポリペプチドの分泌において沈殿する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためにDNAに操作可能的に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能的に連結され；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するために位置決定される場合、コード配列に操作可能的に連結される。一般的に、“操作可能的に連結される”とは、連結されるDNA配列が連続的であり、そして分泌リーダーの場合、及び読取枠において、連続的であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的であるべきではない。連結は、便利な制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の実施に従って使用される。
【００５６】
モノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製方法、例えばプロテインA−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーにより、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNA及びRNAは、従来の方法を用いて、容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNA及びRNAの源として作用することができる。単離されると、DNAが発現ベクター中に挿入され、次に、免疫グロブリンタンパク質を生成しない宿主細胞、例えばHEK293細胞、CHO細胞、又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。
【００５７】
ヒトIGF−IR抗体のアミノ酸変異体は、抗体DNA中に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、上記に記載されるように、非常に制限された範囲で行われ得る。例えば、修飾は、上記抗体特徴、例えばIgGイソタイプ及びエピトープ結合を変更しないが、しかし組換え生成の収率、タンパク質安定性を改良するか、又は精製を促進することができる。
【００５８】
抗−IGF−IR抗体の適切なコンホメーションの維持に関係しないいずれかのシステイン残基がまた、一般的にセリンにより置換され得、分子の酸化安定性が改良され、そして異常架橋が妨げられる。逆に言えば、システイン結合が、その安定性を改良するために、抗体に付加され得る（特に、抗体が抗体フラグメント、例えばFvフラグメントである場合）。
【００５９】
抗体のもう１つの型のアミノ酸変異体は、抗体の元の糖化パターンを変更する。変更するとは、抗体に見出される１又は複数の炭水化物成分の欠失、及び/又は抗体に存在しない１又は複数の糖化部位の付加を意味する。抗体の糖化は典型的には、N−結合される。N−結合されるとは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の結合を言及する。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリン及びアスパラギン−X−トレオニン（Xは、プロリンを除く、いずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物成分の酵素結合のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるそれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が、有能な糖化部位を創造する。抗体への糖化部位の付加は便利には、それが１又は複数の上記トリペプチド配列（N−連結された糖化部位のための）を含むより、アミノ酸配列を変更することにより達成される。
【００６０】
抗−IGF−IR抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、当業界において知られている種々の方法により調製される。それらの方法は、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、又は初期調製された変異体又は非変異体バージョンのヒト適合された抗−IGF−IR抗体のオリゴヌクレオチド介在性（又は特定部位の）突然変異誘発、PCR突然変異誘発及びカセット突然変異誘発による調製を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００６１】
本発明はまた、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、トキシン（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性トキシン、又はそのフラグメント）、放射性同位体（すなわち、放射性接合体）、又は細胞毒性剤のプロドラッグに接合される本発明の抗体を含んで成る免疫接合体にも関する。使用され得る酵素的活性トキシン及びそのフラグメントは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素A（シュードモナス・アエルギノサからの）、シリンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、Aleuritesfordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytoloca americanaタンパク質（PAPI, PAPII、及びPAP−S）、Momordica charantiaインヒビター、クルシン、クロチン、Sapaonaria officinalisインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。
【００６２】
抗体及び細胞毒性剤の接合体は、種々の二官能価タンパク質カップリング剤、例えば次の化合物を用いて製造される：N−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能価誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート（HCL））、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（p−アジドベンゾイル）−エチレンジアトニン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性弗素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta, E. S. ,など., Science 238 (1987)1098-1104に記載のようにして調製され得る。14C−ラベルされた１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミノ五酢酸（MX−DTPA）は、抗体への放射性ヌクレオチドの接合のための典型的なキレート化剤である。WO94/11026号を参照のこと。
【００６３】
もう１つのタイプの共有修飾は、抗体へのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングを包含する。それらの方法は、それらがN−又はO−連結された糖化能力を有する宿主細胞における抗体の生成を必要としないことにおいて好都合である。使用されるカップリングモードに依存して、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのそれらの基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、トレオニン又はヒドロキシ、プロリンのそれらの基、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのそれらの基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。それらの方法は、WO87/05330号、及びAplin, J. D. , and Wriston, J. C. Jr. , CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306に記載されている。
【００６４】
抗体上に存在するいずれかの炭水化物成分の除去は、化学的に又は酵素的に達成され得る。化学的解糖は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は同等の化合物への抗体の暴露を要する。この処理は、ほとんどの又はすべての糖の分解をもたらし（但し、連結糖（N−アセチルグルコサミン又はN−アセチルガラクトサミン）を除く）、そして抗体を損なわないで脱離する。化学的解糖は、Sojahr, H. T., and Bahl, O. P. , Arch. Biochem. Biophys. 259(1987) 52-57 ；及びEdge, A. S. , など. Anal. Biochem. 118(1981) 131-137により記載されている。抗体上の炭水化物成分の酵素的分解は、Thotakura, N. R. , and Bahl, O. P. , Meth. Enzymol. 138 (1987) 350- 359により記載されるように種々のエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用により達成され得る。
【００６５】
抗体のもう１つのタイプの共有修飾は、種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの１つへの抗体のアメリカ特許第4,640,835号; 第4,496, 689号; 第4,301,144号; 第 4,670, 417号; 第4,791,192号又は第4,179,337号に示される態様での連結を包含する。
【００６６】
さらにもう１つの観点においては、本発明は、本発明のヒト抗−IGF−IR抗体を発現するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスからの単離されたB−細胞を提供する。好ましくは、単離されたB細胞は、IGF−IR抗原の精製された又は冨化された調製物により免疫化されているトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウス、及び/又はIGF−IRを発現する細胞から得られる。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスは、ヒトH鎖トランスジーン、及び本発明の抗体のすべて又は一部をコードするヒトL鎖トランスジーンを含んで成るゲノムを有する。
【００６７】
次に、単離されたB−細胞は、ヒト−抗−IGF−IR抗体の源（例えば、ハイブリドーマ）を提供するために不滅化される。従って、本発明はまた、本発明のヒトモノクローナル抗体を生成できるハイブリドーマも提供する。１つの態様においては、ハイブリドーマは、トランスジェニック非ヒト動物、例えばヒトH鎖トランスジーン、及び不滅化された細胞に融合される本発明の抗体のすべて又は一部をコードするヒトL鎖トランスジーンを含んで成るゲノムを有するトランスジェニックマウスから得られるB細胞を包含する。
【００６８】
特定の態様においては、トランスジェニック非ヒト動物は、ヒトH鎖トランスジーン、及び本発明の抗体のすべて又は一部をコードするヒトL鎖トランスジーンを含んで成るゲノムを有するトランスジェニックマウスである。トランスジェニック非ヒト動物は、IGF−IR抗体の精製され、又は冨化された調製物、及び/又はIGF-IRを発現する細胞により免疫化され得る。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスは、IGF−IRに対するIgG1イソタイプのヒトモノクローナル抗体を生成できる。
【００６９】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒトH鎖トランスジーン、及び本発明の抗体のすべて又は一部をコードするヒトL鎖トランスジーンを含んで成るゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスを、IGF−IR抗体の精製され、又は冨化された調製物及び/又はIGF−IRを発現する細胞により免疫化することにより生成され得る。次に、動物中のB細胞（例えば、脾臓B細胞）が得られ、そして骨髄細胞により融合され、IGF−IRに対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不滅のハイブリドーマ細胞が形成される。
【００７０】
好ましい態様においては、IGF−IRに対して指図されたヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもむしろヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。“HuMab”マウスとして本明細書において言及されるそれらのトランスジェニックマウスは、H鎖（μ及びγ）及びκL鎖（不変領域遺伝子）を含む転位されていないヒト免疫グロブリン遺伝子をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座、及び内因性μ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された突然変異を含む（Lonberg,N., など., Nature368 (1994)856-859）。
【００７１】
従って、マウスは、マウスIgM又はκの低められた発現を示し、そして免疫化に応答して、導入されたヒトH鎖及びL鎖トランスジーンはクラススイッチ及び体細胞突然変異を受け、高い、親和性のヒトIgGモノクローナル抗体が生成される（Lonberg,N., など., Nature368 (1994)856-859 ;Lonberg, N., Handbook ofExperimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; 及びHarding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci. 764 (1995) 536-546）。
【００７２】
HuMabマウスの調製は、Taylor,L., など., Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295 ; Chen,J., など., International Immunology 5(1993)647-656 ; Tuaillon,N., など. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 90(1993) 3720-3724; Choi, T.K., など., Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J. , など. , EMBO J. 12 (1993)821-830 ; Tuaillon, N. , など. , Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg,N., など. , Nature 368 (1994) 856-859 ; Lonberg,N., Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994) 49-101; Taylor, L., など., Int. Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonberg,N., and Huszar, D. , Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; Harding, F., 及び Lonberg ; N. , Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546; Fishwild, D. M. , など. , Nat. Biotechnol. 14 (1996)845-851（それらは、引用により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【００７３】
さらに、アメリカ特許第5,545, 806号; 第 5,569,825号; 第 5,625, 126号; 第5,633, 425号; 第5,789, 650号; 第5,877, 397号; 第5,661, 016号; 第 5,814, 318号; 第5,874, 299号; 第5,545, 807号; 第5,770, 429号; WO98/24884号; WO94/25585号; WO 93/1227号; WO 92/22645号; 及び WO 92/03918号を参照のこと。
【００７４】
IGF−IRに対するヒトモノクローナル抗体を十分に生成するために、HuMabマウスは、IGF−IR抗原の精製され又は冨化された調製物及び/又はIGF−IRを発現する細胞により、Lonberg, N. , など., Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D. M. , など. , Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 及び WO98/24884号により記載されるようにして、一般的方法に従って免疫化され得る。好ましくは、マウスは、最初の免疫化の後、６〜16週間目である。例えば、可溶性IGF−IR抗原（IGF−IR−発現細胞から精製された）の精製され又は冨化された調製物が、HuMabマウスを腹膜内免疫化するために使用され得る。IGF−IR抗原の精製され又は冨化された調製物を用いての免疫化が抗体をもたらさない場合、マウスはまた、免疫応答を促進するために、IGF−IRを発現する細胞、例えば腫瘍細胞系により免疫化され得る。
【００７５】
種々の抗原による累積的経験は、HuMabトランスジェニックマウスが、完全フロントアジュバント中、抗原により、まず腹膜内（i.p.）免疫化され、続いて、不完全フロイントアジュベント中、抗原により、１週ごとにi.p.免疫化（例えば、合計６回まで）される場合、最良に応答することを示した。免疫応答は、眼窩後放血により得られる血漿サンプルによる免疫化プロトコールの間、モニターされた。血漿がELISAによりスクリーンされ、そして十分な力価の抗−IGF−IRヒト免疫グロブリンを有するマウスが、対応するB細胞の免疫化のために使用され得る。マウスは、殺害する３〜４日前、抗原により静脈内追加免疫化され、そして脾臓及びリンパ節が除かれる。個々の抗原について２〜３回の融合が行われる必要があることが予測される。何匹かのマウスが個々の抗原について免疫化されるであろう。例えば、HCo7及びHCo12株の合計12のHuMabマウスが免疫化され得る。
【００７６】
HCo7マウスは、それらの内因性L鎖（κ）遺伝子にJKD破壊（Chen, J. , など., EMBO J. 12 (1993)821-830）に記載のような）、それらの内因性H鎖遺伝子にCHD破壊（WO01/14424号の例１に記載のような）、KCo5ヒトκL鎖トランスジーン（Fishwild, D. M., など., Nat. Biotechnol. 14 (1996)845-851に記載のような）、及びHCo7ヒトH鎖トランスジーン（アメリカ特許第5,770,429号に記載のような）を有する。
【００７７】
HCol2マウスは、それらの内因性L鎖（κ）遺伝子にJKD破壊（Chen, J. , など., EMBO J. 12 (1993)821-830）に記載のような）、それらの内因性H鎖遺伝子にCHD破壊（WO01/14424号の例１に記載のような）、KCo5ヒトκL鎖トランスジーン（Fishwild, D. M., など., Nat. Biotechnol. 14 (1996)845-851に記載のような）、及びHCol2ヒトH鎖トランスジーン（WO 01/14424号の例２に記載のような）を有する。
【００７８】
マウスリンパ球が単離され、そして標準プロトコールに基づいてのPEGを用いて、マウス骨髄腫細胞系により融合され、ハイブリドーマが生成され得る。得られるハイブリドーマが、抗原−特異的抗体の生成のためにスクリーンされる。例えば、免疫化されたマウスからの脾臓及びリンパ節−由来のリンパ球の単一細胞懸濁液が、50％PEGにより、SP210非分泌性マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL1581）の数の1/6に融合される。細胞が、平底マイクロタイタープレートに、約２×105でプレートされ、続いて約２週間、選択培地においてインキュベートされる。
【００７９】
次に、個々のウェルが、ヒト抗−IGF−IRモノクローナルIgM及びIgG抗体についてELISAによりスクリーンされる。集中的なハイブリドーマ増殖が生じると、培地は、通常、10〜14日後、分析される。抗体分泌ハイブリドーマが再プレート化され、再びスクリーンされ、そしてヒトIgGについてまだ陽性である場合、抗−IGF−IRモノクローナル抗体が、制限希釈法により少なくとも２度、サブクローン化され得る。次に、安定したサブクローンがインビトロで培養され、特徴化のために組織培養培地において抗体が生成される。
【００８０】
CDR配列は抗体−抗原相互作用を担当するので、異なったヒト抗体からの骨格配列上に本発明のCDR配列を含む発現ベクターを構成することにより、本発明の組み換え抗体を発現することは可能である（例えば、Riechmann,L.,など., Nature 332(1998) 323-327; Jones, P. , など., Nature 321(1986) 522-525; 及びQueen, C. , など. , Proc. Natl. Acad. See. U. S. A. 86(1989) 10029- 10033を参照のこと）。そのような骨格配列は、生殖系ヒト抗体遺伝子配列を含む公開されたDNAデータベースから得られる。それらの生殖系配列は、それらがB細胞成熟の間、V(D)J連結により形成される完全にアセンブルされた可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。生殖系遺伝子配列はまた、可変領域の向こう側の個々で高親和性第２レパートリー抗体の配列とは異なるであろう。
【００８１】
本発明は好ましくは、IGF−IRに結合するポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含んで成り、それにより下記から成る群から選択された前記ポリペプチドは、IGF−IRへのIGF−I及びIGF−IIの結合を阻害する：
配列番号１の可変領域（VH）（ここで、アミノ酸（aa）30はセリン又はアルギニンを示し、aa31はアスパラギン又はセリンを示し、aa94はヒスチジン又はチロシンを示し、そしてaa104はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトH鎖不変領域（CH）から成るH鎖又はそのフラグメント；及び
配列番号２の可変領域（VL）（ここで、aa96はプロリン又はイソロイシンを示し、aa100はプロリン又はグルタミンを示し、aa103はアルギニン又はリシンを示し、aa104はバリン又はロイシンを示し、そしてaa105はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトL鎖不変領域（CL）から成るL鎖又はそのフラグメント。
【００８２】
本発明の特に好ましい核酸フラグメントは、下記のものを、CDR領域として含んで成る本発明のポリペプチドをコードする核酸フラグメントである：
配列番号１のCDR1（aa31-35）、CDR2（aa50-66）及びCDR3（aa98-108）（ここで、アミノ酸31はアスパラギン又はセリンであり、アミノ酸66はグリシンであるか又は欠失され得、そしてアミノ酸104はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり得る）を、CDRとして含んで成る抗体H鎖；又は
配列番号２のCDR1（aa18-34又はaa24-34）、CDR2（aa50-56）及びCDR3（aa89-98）（ここで、アミノ酸96はプロリン又はイソロイシンであり得、そしてアミノ酸98はフェニルアラニンであるか又は欠失され得る）を、CDRとして含んで成る抗体L鎖。
【００８３】
再構成されたH及びL鎖可変領域は、プロモーター、翻訳開始、不変領域、3’未翻訳、ポリアデニル化、及び転写終結と組合され、発現ベクター構成体が形成される。H及びL鎖発現構成体は、単一ベクター中に組合され、宿主細胞中の同時−トランスフェクトされ、連続的にトランスフェクトされ、又は別々にトランスフェクトされ、次に、融合され、両鎖を発現する単一宿主細胞が形成される。
【００８４】
従って、本発明は、下記鎖をコードする核酸を、原核又は真核宿主細胞において発現し、そして前記細胞から前記抗体を回収することを特徴とする、本発明の組み換えヒト抗体の生成方法を提供する：
配列番号１の可変領域（VH）（ここで、アミノ酸（aa）30はセリン又はアルギニンを示し、aa31はアスパラギン又はセリンを示し、aa94はヒスチジン又はチロシンを示し、そしてaa104はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトH鎖不変領域（CH）から成るH鎖；及び
配列番号２の可変領域（VL）（ここで、aa96はプロリン又はイソロイシンを示し、aa100はプロリン又はグルタミンを示し、aa103はアルギニン又はリシンを示し、aa104はバリン又はロイシンを示し、そしてaa105はアスパラギン酸又はグルタミン酸を示す）、及びヒトL鎖不変領域（CL）から成るL鎖。
【００８５】
不変領域は、C1q補体結合を提供し、そして従って、好ましくは、ヒトIgG1型のものである。好ましくは、H鎖可変領域は、下記のアミノ酸組合せを含む：
aa 30 Arg, aa 31 Asn, aa 94 Tyr 及び aa 104 Asp, 又は
aa 30 Arg, aa 31 Ser, aa 94 Tyr 及び aa 104 Asp, 又は
aa 30 Ser, aa 31 Asn, aa 94 His 及び aa 104 Glu。
好ましくは、L鎖可変領域は、下記のアミノ酸組合せを含む：
aa 96 Pro, aa 100 Pro, aa 103 Lys, aa 104 Val 及び aa 105 Asp（抗体１A及び8）, 又は
aa 96 Ile, aa 100Gln, aa 103 Arg, aa 104 Leu 及び aa 105 Glu（抗体23）。
【００８６】
H鎖におけるaa 30 Arg, aa 31 Asn, aa 94 Tyr 及び aa 104 Asp及びL鎖におけるaa 96 Pro, aa 100 Pro, aa 103 Lys, aa 104 Val 及び aa 105 Aspの組合せが特に好ましい。
本発明はさらに、好ましくはサンプルのIGF−IRと本発明の抗体との間の結合を決定する免疫学的アッセイにより、インビトロでのIGF−IRの診断のためへの本発明の抗体の使用を包含する。
【００８７】
もう１つの観点においては、本発明は、医薬的に許容できるキャリヤーと共に配合される、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原−結合部位の１つ又は組合せを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物はまた、他の剤と共に組合せ療法において投与され得る。例えば、組合せ療法は、本発明の組成物、及び少なくとも１つの抗−腫瘍剤又は他の従来の療法を包含する。
【００８８】
“化学療法剤”とは、癌の処理において有用な化合物である。化学療法剤の例は、次のものを包含する：アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシン  アラビノシド（“Ara-C”）、シクロホスファミド、チオテパ（Thiotepa）、タキソテレ（Taxotere）（ドセタキセル）、ブスルファン（Busulfan）、シトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラスチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド（Ifosfamide）、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクレイスチン、ビンオレルビン、カルボプラチン、テニポシド（Teniposide）、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、ミトマイシン、エスペラミシン（アメリカ特許第4,675,187号を参照のこと）、メルファラン及び他の関連するナイトロジエンマスタード。
【００８９】
用語“細胞毒性剤”とは、本明細書において使用される場合、細胞の機能を阻害するか、又は防げ、そして/又は細胞の破壊を引起す物質を言及する。この用語は、放射性同位体、化学療法剤、及びトキシン、例えば細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性のトキシン、又はそのフラグメントを包含する。
【００９０】
用語“プロドラッグ”とは、本出願において使用される場合、親薬剤に比較して、腫瘍細胞に対して低い細胞毒性であり、そしてより活性的な親形に酵素的に活性化又は転換され得る医薬的活性物質の前駆体又は誘導体形を言及する。例えば、Wilman,"Prodrugs in CancerChemotherapy"Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th MeetingBelfast(1986), 及び Stella など. ,"Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted DrugDelivery,"Directed Drug Delivery, Borchardt et al. , (ed. ), pp. 247-267, Humana Press(1985)を参照のこと。
【００９１】
本発明のプロドラッグは、より活性的な細胞毒性遊離薬剤に転換され得る、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D−アミノ酸−修飾されたプロドラッグ、グリコシル化されたプロドラッグ、β−ラクタム環プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本発明への使用のためのプロドラッグ形に誘導体化され得る細胞毒性薬剤の例示は、上記のそれらの化学療法剤を包含するが、但し、それらだけには限定されない。
【００９２】
本明細書において使用される場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”とは、生理学的に適合できる、いずれかの及びすべての溶媒、分散媒体、被膜、殺菌剤及び抗菌剤、等張及び吸収遅延剤、及び同様のものを包含する。好ましくは、キャリヤーは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）のために適切である。
【００９３】
“医薬的に許容できる塩”とは、抗体の所望する生物学的活性を保持し、そしていずれの所望しない毒物学的効果も付与しない塩を言及する（例えば、Berge, S. M. , など. , J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19を参照のこと）。そのような塩が本発明に包含される。そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を包含する。酸付加塩は、非毒性無機塩から誘導されるそれら、例えば塩酸塩を包含する。
本発明の組成物は、当業界において知られている種々の方法により投与され得る。当業者により理解されるように、投与の経路及び/又は形は、所望する結果に依存して変化するであろう。
【００９４】
一定の投与経路により本発明の化合物を投与するためには、その不活性化を妨げるための材料と共に化合物を被覆するか、又はそれと共に化合物を同時投与する必要がある。例えば、化合物は、適切なキャリヤー、例えばリポソーム又は希釈剤において、対象に投与され得る。医薬的に許容できる希釈剤は、塩溶液及び緩衝水溶液を包含する。
医薬的に許容できるキャリヤーは、無菌の注射用溶液又は分散液の即座の調製のための無菌水溶液又は分散液及び無菌粉末を包含する。医薬的活性物質のためへのそのような媒体及び剤の使用は、当業界において知られている。
【００９５】
用語“非経口投与”及び“非経口投与される”とは、本明細書において使用される場合、腸内及び局部投与以外の投与の態様、通常、注射を意味し、そして静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹膜内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜下及び胸骨内注射及び注入を包含する。
【００９６】
それらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含むことができる。微生物の存在の予防は、上記殺菌工程により、及び種々の殺菌剤及び抗菌剤、例えばパラベン、クロロブラノール、フェノール、ソルビン酸及び同様のものの注入により確保され得る。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム及び同様のものを包含することがまた、所望される。さらに、注射用医薬形の延長された吸収が、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの包含によりもたらされ得る。
【００９７】
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和された形で使用され得る本発明の化合物、及び/又は本発明の医薬組成物は、当業界に知られている従来の方法により、医薬的に許容できる用量形に配合される。
【００９８】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者のための所望する治療応答を達成するために効果的である量の活性成分、組成物、及び投与の態様を得るために変更され得る。選択される用量レベルは、種々の薬物動力学的因子、例えば使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩又はアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定化合物の排泄の経路、処理の持続期間、他の薬物、使用される特定組成物と組合して使用される化合物及び/又は材料、年齢、性別、体重、状態、一般的な健康及び処理される患者の病歴、及び当業者において良く知られている同様の因子に依存するであろう。
【００９９】
組成物は、その組成物が注射器により供給される程度まで、無菌であり、且つ流体であるべきである。水の他に、キャリヤーは、等張緩衝溶液、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール及び同様のもの）、及びそれらの適切な混合物であり得る。
【０１００】
適切な流動性は例えば、被膜、例えばレシチンの使用により、分散体の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、組成物の等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール又はソルビトール及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを、組成物に含むことによりもたらされ得る。
【０１０１】
上記のように、活性化合物が適切に保護される場合、化合物は例えば、不活性希釈剤又は同化できる食用キャリヤーと共に経口投与され得る。
本発明の抗体は、腫瘍疾患を有する患者の処理、及び抗腫瘍治療の必要のために使用され得る。従って、本発明は、腫瘍患者、好ましくは癌、特に結腸癌、乳癌、前立腺癌、及び肺癌を有する患者の処理方法を包含する。
本発明はさらに、有効量の本発明の抗体、及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物の製造方法、及びそのような方法への本発明の抗体の使用を提供する。
【０１０２】
本発明はさらに、処理方法、製造方法、及び本発明の抗体及び化学療法剤、好ましくは細胞毒性剤又はそのプロドラッグの医薬組成物を提供する。
さらに、抗体は、細胞毒性放射療法と組合して使用され得る。
次の例及び配列の列挙は、本発明の理解を助けるために提供され、それらの真の範囲は請求項に示される。修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは理解されている。
【実施例】
【０１０３】
例１．抗−IGF−IR抗体を生成するハイブリドーマ細胞系の生成：
ハイブリドーマの培養物：
生成されたHuMabハイブリドーマを、37℃及び5％CO2下で、2 mM L-グルタミン (BioWhittaker) 及び4% Origen Cloning Factor (Igen, France)により補充されたHybridoma Express Medium (PAA Laboratories GmbH, Austria)において、又は37℃及び5％CO2下で、胎児クローン血清(50 ml: Hyclone, Utah), 及び Origen Hybridoma Cloning Factor (30 ml: Igen, Gaithersburg MD)により補充されたIscoves 変性ダルベッコ 培地(500 ml: BioWhittaker Europe, Belgium)において培養した。
【０１０４】
トランスジェニックマウスの免疫化方法：
10匹のHCo7トランスジェニックマウス（４匹の雄及び６匹の雌）（GG2201株；Medarex, San Jose, CA, USA）を、IGF−IRのための発現ベクター及び20μgのIGF−IRの可溶性細胞外ドメインによりトランスフェクトされた、１×106個のNIH3T3細胞により免疫化した。合計６回の免疫化、すなわちIGF−IR発現細胞による３回の腹膜内（IP）免疫化及び組換えタンパク質による尾基部での３回の皮下（SC）免疫化を行った。最初の免疫化に関しては、100μlの１×106個のNIH3T3 IGF−IR細胞を、100μlの完全フロイントアジュバント（CFA ; Difco Laboratories, Detroit, USA）と共に混合した。他のすべての免疫化に関しては、PBS中、100μlの細胞を使用し、又は組換えタンパク質を、100μlの不完全フロイントアジュバント（ICFA；Difco）と共に混合した。
【０１０５】
抗原特異的ELISA：
免疫化されたマウスの血清における抗−IGF−IR力価を、抗原特異的ELISAにより決定した。PBS中、１μg/mlの濃度でのIGF−IR可溶性細胞ドメインを、96ウェルプレートに、４℃で一晩、又は37℃で２時間、被覆した。その後、ウェルを、PBSTC（0.05％ Tween(商標)-20及び20％鶏血清により補充されたPBS（Gibco BRL））により、室温で１時間、ブロックした。第１の流れの血清を、PBSTCにより1/50に希釈し、すべての他の流れからの血清をPBSTCにより1/100に予備希釈し、そして連続的に、1/6400まで希釈した。希釈された血清を、ウェルに添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。予備の流れの血清を負の対照として使用した。
【０１０６】
200ng/mlのヤギ抗−ヒトIGF−IR（100μg/ml）を、正の対照として使用した。続いて、プレートをPBSTにより２度、洗浄し、そしてPBSTCにより1/2000希釈されたホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）−接合されたラット抗−ヒトIgG F(ab’)2 (DAKO)と共に、37℃で１時間インキュベートした。ウェルをPBSTにより２度、洗浄し、そしてアッセイを、暗室において室温で30分間、新しく調製されたABTS(商標)溶液（1mg/ml）(ABT: 2, 2’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）により展開した。吸光度を405nmで測定した。
【０１０７】
FACS分析：
抗原特異的ESISAによる決定の他に、免疫化されたマウスの血清における抗−IGF−IR力価を、FACS分析により決定した。NIH3T3 TGF−IR細胞及び親NIH3T3細胞を、希釈された血清と共に4℃で30分間インキュベートした。交互のIP及びSC免疫化を、IP免疫化から出発して、２週の間隔で行った。予備の流れの血清（親NIH3T2細胞）を、負の対照として使用した。最初に、200ng/mlのヤギ抗−ヒトIGF−IRを、正の対照として使用した。細胞を、１％ウシ血清アルブミン及び0.01％アジドにより補充されたPBSにより３度、洗浄した。従って、細胞を、FACS緩衝液により1/100に希釈されたラット抗−ヒトIgGのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）−接合された抗原結合フラグメント（F(ab’)2フラグメント）と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液により２度、洗浄し、そしてサンプルをACSCalibur (BectonI) icliinson, Erembodegem-Aalst, Belgium)上で分析した。
【０１０８】
マウスの追加免疫化：
抗−IGF−IRの血清力価が十分であることが見出された場合、マウスをさらに、200μlのPBS中、15μgのIGF−IR細胞外ドメインにより、注入の４及び３日前、２度、静脈内（i.v.）追加免疫化した。
【０１０９】
ハイブリドーマの生成：
マウスを殺害し、そして腹部大動脈及び大静脈を有する脾臓及びリンパ節を集めた。融合パートナーSP2.0細胞との脾臓細胞及びリンパ節の融合を、標準の操作方法に従って行った。
【０１１０】
κ−ELISA：
融合体に起因するハイブリドーマがヒト抗体を生成するかどうかを決定するために、κ−ELISAを行った。ELISAプレートを、PBSにより1/10000希釈されたラット抗−ヒトIgGκ−L鎖抗体（DAKO）により、4℃での一晩のインキュベーションにより被覆した。ウェルを捨てた後、プレートを、PBSTC共に室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。その後、ウェルを、PBSTCにより1/2に希釈されたハイブリドーマ培養物上清液と共にインキュベートした。
【０１１１】
PBSTCにより1/2に希釈された培養培地は負の対照として作用し、PBSTCにより1/100に希釈されたκ−L鎖マウス血清は正の対照として作用した。続いて、ウェルを３度、洗浄し、そしてPBSTCにより1/2000に希釈された、HRP−接合されたラット抗−ヒトIgG F(ab’)2 (DAKO)と共に37℃で１時間インキュベートした。ウェルを３度、洗浄し、そしてアッセイを、暗室において室温（RT）で30分間、新しく調製されたABTS(商標)溶液（1mg/ml）により展開した。吸光度を、EL25Aプレートリーダーにより405nmで測定した。
【０１１２】
次の３種のモノクローナル抗体を調製した：
抗体１A：配列番号１及び２
抗体８：配列番号３及び４
抗体23：配列番号５及び６
【０１１３】
例２．IGF−IRへの抗−IGF−IR抗体の親和性の決定：
装置：BLACORE(商標)3000
チップ：CM5
カップリング：アミンカップリング
緩衝液：HBS (HEPES,NaCl), pH 7.4,25℃。
親和性測定のために、抗ヒトFcγ抗体（ウサギからの）を、IGF−IRに対する抗体の保存のためにチップ表面にカップリングした。IGF−IR細胞外ドメインを、溶液中、種々の濃度で添加した。会合を、３分のIGF−IR−注入により測定し；解離を、チップ表面を緩衝液により５分間、洗浄することにより測定した。抗体1A、８及び23についての親和性データが表２に示される。
【０１１４】
【表２】
0004473257.tif 000003
【０１１５】
例３．WST増殖アッセイ：
IGF−IR発現細胞系のIGF−I−誘発された増殖を阻害するHuMab抗体の能力を評価するために、WST−１増殖アッセイを行った。IGF−IR発現細胞系NIH3T3を、飢餓培地（すなわち、10％FCSの代わりに0.5％FCSを含む通常の培養培地）において２日間、培養し、96ウェル組織培養プレートにおいてウェル当たり９×103個の細胞を得、代謝システムを基礎レベルに戻した。その後、培地を除き、そしてウェルを、次の成分を含む100μlの飢餓培地により再充填した：１）10-9MのIGF−I：２）10-9MのIGF-I＋10μg/mlのプロテインA精製されたHuMab抗体；３）10-9MのIGF−I＋10μg/mlのαIR3。
【０１１６】
負の対照として、細胞を飢餓培地によりインキュベートし、正の対照として、細胞を培養培地のみによりインキュベートした。細胞を、さらに２日間、培養した。続いて、10μlのWST−１試薬（Roche Diagnostics GmbH）を、ウェルに添加し、生存細胞を検出した。２−３時間後、吸光度を、ELISAプレートリーダーにより450nmで測定した。増殖の阻害率（％）を、次の式に従って計算した：  OD100%増殖＝ODIGF-I−OD飢餓培地
増殖の阻害率：（１−ODサンプル/OD100%増殖）×100％
【０１１７】
例４．細胞−細胞−接触（3D培養）での腫瘍の立体増殖及びIGF−I受容体の過剰発現：
材料及び方法：
NCI H322M細胞を、低密度又は超集密性のいずれかで、光学品種のカバーガラス上でのRPMI培地において培養し、IGF−IR表面発現に対する結果を研究した。同時に、対照グループ（処理されていないマウス）から単離されたH322M異種移植組織をイソペンタンにおいてショック凍結し、そして低温断片を５μmの厚さで切断した。免疫蛍光ラベリングを、マウス−抗IGF−IRモノクローナル抗体（αIR3、5μg/ml）又は本発明の抗体を用いて行い、続いて、ヤギ抗マウス−抗体又はCy3によりラベルされたヤギ抗マウス抗体を用いて行った。検体を、Leica SP2共焦顕微鏡上で映像化し、又はFACSにより分析した。
【０１１８】
結果：
高密度で培養されたH322M細胞が共焦顕微鏡により映像化される場合、IGF−IRが細胞−細胞接触の側で特異的にクラスター化したことが明らかになった。インビボで増殖するH322M細胞、すなわち異種移植組織に比較される場合、表面IGF−I受容体の機構が関与する限り、密にパックされたインビトロ培養物に著しい類似性が存在した。
H322M細胞の超集密的培養物における表面IGF−I受容体のアップレギュレーションをまた、FACSにより定量化した。IGF−I受容体表面発現は、細胞が、有意な細胞−細胞接触を伴わない低密度に比較して、高密度条件下で増殖される場合、10倍以上、上昇した。
【０１１９】
他の腫瘍細胞、例えばHT29、MDA231及びMCF−７は類似する挙動性を示し、このことは、細胞−細胞接触部位の確立に基づいての細胞表面上のIGF−I受容体のアップレギュレーションがH322M細胞のユニーク特徴でないが、しかしインビボでまた見出される機構のような組織の一般的な性質であるように思えることを示唆する（図１）。
【０１２０】
抗体１Aによる処理下で３D培養におけるIGF−IRを発現するH322M腫瘍細胞の増殖阻害：
材料及び方法：
H322M細胞を、プラスチック表面への付着を妨げるために、ポリ−HEMA（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）被覆された皿上のRPMI1640/10％NCS培地において培養した。それらの条件下で、H322M細胞は、立体的に増殖する密集した長球を形成する（足場独立性と呼ばれる性質）。それらの長球は、固形腫瘍の立体組織構造及び構成を表す。長球培養物を、０〜10μg/mlの上昇する量の抗体の存在下で9日間インキュベートした。２種の非特異的抗体（HBV及びE25に対する抗体）を、負の対照として使用した。WST転換アッセイを用いて、増殖阻害を測定した。
【０１２１】
結果：
H322M長球培養物が異なった濃度の抗体1A（0.32〜10μg/ml）により処理される場合、増殖における用量依存性阻害が観察されたが、ところがHBV及びE25に対する対照抗体（抗−IgE）はほとんどか又はまったく効果を有さなかった。従って、抗体１AについてのWSTにおける低下は主に、細胞の低められた増殖のためである（図２）。
【０１２２】
例５．薬物動力学的性質の決定：
抗体１Aを、２種の異なった薬物動力学的研究において投与した。第１の研究に関しては、抗体を、リン酸カリウム緩衝溶液として配合し、投与した。第２の研究に関しては、抗体を、塩化ナトリウム/ヒスチジン溶液として配合して、投与した。
【０１２３】
5a)第１の動物研究：
雌のNMRIマウスを使用した（18〜23gの体重）。抗体１Aを、i.v. 及びi.p.投与路のために溶媒（KPO4）として与えた。
用量：
10mg/kg i.v. 薬剤濃度：1mg/ml．投与される体積：10ml/kg。
10mg/kg i.p. 薬剤濃度：1mg/ml．投与される体積：10ml/kg。
単一用量での投与。
続いて、血漿サンプルを、ヒトIgG−ELISA方法を用いて、化合物の血症レベルについて分析した。
【０１２４】
試薬：
抗体：捕獲抗体：ヒトκ−L鎖IgGに対するポリクローナルウサギ抗体（Dako, コード番号A0191）。
検出抗体：ホースラディシュペルオキシダーゼにより接合される、ヒトIgGに対するポリクローナルウサギ抗体（DAKO、コード番号P0214）。
アッセイ方法：
マイクロタイタープレートの被覆：
【０１２５】
段階：
−100mMの炭酸ナトリウム（pH9.6）により捕獲抗体を１：10000に希釈する、
−個々のウェルに、この溶液（段階１）100μlを添加する、
−プレートを4℃で一晩（12時間）インキュベートする、
−個々のウェルの溶媒を除去する、
−ウェル当たり300μlのPBSTにより３度、洗浄する。
【０１２６】
動物サンプル及び検量サンプルを添加し、それぞれ動物サンプル（１：10〜１：200000）及び検量サンプル（濃度0.625 ; 1. 25 ; 2.5 ; 5; 10; 20及び40ng/mlのヒトIgG）を、3%BSA/PBSTにより希釈する：
−個々のウェルに100μlの動物/検量サンプルを添加し、
−室温（22℃）で１時間インキュベートし、
−ウェル当たり300μlのPBSTにより３度、洗浄する。
【０１２７】
検出：
−検出抗体を３％BSA/PBSTにより1：2000に希釈し、
−個々のウェルにその100μlを添加し、
−室温（22℃）で１時間インキュベートし、
−ウェル当たり300μlのPBSTにより３度、洗浄し、
−個々のウェルに、100μlのABTS(商標)−溶液を添加し、
−約10分後、ウェル当たり50μlの0.5Mシュウ酸により色彩応答を停止、
−405nmで吸光度を測定する。
【０１２８】
PKパラメーター：
【表３】
0004473257.tif 000004
【０１２９】
5b）第２の動物研究：
動物：
雌のNMRIマウスを使用した（21〜28gの体重）。抗体１Aを、i.v. 及びi.p.投与路のために溶媒（ヒスチジン/塩化ナトリウム）として与えた。
用量：
10mg/kg i.v. 薬剤濃度：1mg/ml．投与される体積：10ml/kg。
2mg/kg i.p. 薬剤濃度：0.2mg/ml．投与される体積：10ml/kg。
20mg/kg i.p. 薬剤濃度：2mg/ml．投与される体積：10ml/kg。
単一用量での投与。
【０１３０】
続いて、血漿サンプルを、ヒトIgG−ELISA方法を用いて、化合物の血症レベルについて分析した。検量を、検量サンプルを調製するために抗体１Aを用いて行った。
試薬及びアッセイ方法：例5aを参照のこと。
【０１３１】
PKパラメーター：
【表４】
0004473257.tif 000005
【０１３２】
【表５】
0004473257.tif 000006
【０１３３】
例６．組換え抗−IGF−IR抗体１Aの薬力学的試験：
抗体の効果を、インビボで調べた。腫瘍を、確立された方法に従って、無胸腺ヌードマウスにおいて誘発した。ヒトH322M細胞を、生後６〜７週の無胸腺ヌードマウス（nu/nu）中に、Matrigelと共に皮下注射した。このためには、５×106個のH322M細胞を、100μlの培養培地において濃縮し、そして100μlのMatrigel(商標)と共に混合した。200μlのこの混合物を、マウスの右側腹部に注射した。処理を、誘発された腫瘍が125mgの平均体積に達した場合に開始した。腫瘍体積を、下記式に従って、Vernierカリパスにより腫瘍直径を週２度、測定することにより計算した：
腫瘍体積［mg］＝長さ×(幅)2
(Gallicchio, M. A. , など., Int. J. Cancer 94 (2001) 645-651)。
【０１３４】
すべての抗体を、10ml/kgで腹膜内（i.p.）投与した。
腫瘍が100mgの平均体積に増殖した後、抗体を、処理の最初の日、２倍の用量による１度の処理から出発して、12回、20mg/kg、7mg/kg及び2mg/kgで週２度、i.p.投与した。すべての３回の用量の抗体が、一次腫瘍体積に対して効果を有した。図３は、時間に対する種々の処理に関しての腫瘍サイズを示す。この実験は、抗体１AによるIGF−IR軸のブロックが良好な抗腫瘍効果をもたらすことを示す。
【０１３５】
例７．IGF−IRを発現する腫瘍細胞へのIGF−I及びIGF−II結合の阻害：
IGF−I受容体（IGF−IR）へのリガンドIGF−I及びIGF−IIの結合を阻止する本発明の抗体の能力を決定するために、放射性ラベルされたリガンドペプチドとの競争実験を行った。
ヒト腫瘍細胞（HT29 NCI H322M, 0.1〜1×105/ml）を、2mMのL−グルタミン、１×非必須アミノ酸（Gibco、カタログ番号11140−035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、カタログ番号11360−039）及び10％の熱不活性化されたFCS（PAA、カタログ番号A15−771）により補充されたRPMI1640培地（PAA、カタログ番号E15−039）にプレートした。T175形での６本のボトルを、個々の実験についてのそれぞれの培地中、20mlの細胞により接種し、そして37℃及び5％CO2下で２日間、培養し、そして集密的細胞単層を得た。
【０１３６】
個々の細胞を集めるために、T175フラスコ当たり2mlの１×トリプシン/EDTA（Gibco,カタログ番号25300−054）を添加し、そして細胞の分離をZeiss Axiovert25顕微鏡によりモニターした。細胞を集め、そして前記のような10％FCSを含む培地を添加し、50mlの合計体積にした。細胞を、1000rpmで10分間、遠心分離により再単離し（Heraeus sepatech, Omnifuge, 2.0 RS）、そして50mlの結合緩衝液（120mMのNaCl、5mlのKCl、1.2mMのMgSO4、1mMのEDTA、10mMのD(＋)−グルコース、15mMのNaAc、100mMのHepes、pH7.6、１％BSA）に再懸濁した。細胞を計数し、遠心分離により再単離し、そして結合緩衝液により、１×106細胞/mlに調節した。
【０１３７】
0.1％のCH3COOHに溶解された、I125−ラベルされたIGF−I及びIGF−IIペプチド（Amersham, 約2000Ci/mモル、カタログ番号IM172及びIM238）を、結合緩衝液に希釈し、４×105個の計数/（分×ml）の最終活性にした。特定された濃度での抗体75μl及び25μlの予備希釈されたI125−ラベルされたIGF−I又はIGF−IIペプチドを、200μlの細胞懸濁液に添加し、そして４℃で3.5時間インキュベートした。細胞を、2000rpmでの５分間の遠心分離（Eppendorf, 5415C）により再単離し、そして上清液を除去した。1mlの結合緩衝液により２度、洗浄した後、細胞を1mlの結合緩衝液に再懸濁し、そしてシンチレーション管に移した。細胞表面受容体に結合される放射性ペプチドの量を、シンチレーションカウンター上で測定した。
【０１３８】
IGF−I受容体へのIGF−I及びIGF−IIペプチドの結合を阻害する抗体の能力を示す、得られるIC50曲線が、図４，５及び６に示される。抗体αIR3についての結果は、図５及び７に示される。
【０１３９】
例８．IGF−IR結合についての抗体競争アッセイ：
抗体−EGF−IRモノクローナル抗体のエピトープマッピングのために、親和性測定（例２）に関する類似する形式を選択した。抗体1aを、チップ表面にアミン−カップリングされた抗−ヒトFcr抗体（ウサギからの）に接合した。もう１つの抗体が抗体1aにより認識されるエピトープとオーバーラップするIGF−IRエピトープに対して方向づけられるかどうか決定するために、IGF−IRを、溶液において飽和条件下でのこの抗体と共にプレインキュベートした。
【０１４０】
RTでの少なくとも30分のインキュベーションの後、予備結合された抗体と共にIGF−IRを、流動細胞に注入し、そしてチップ表面での対照抗体1aへの結合をモニターした。試験抗体及び対照抗体のオーバーラップ認識の場合、IGF−IRの結合を、50nMの標準濃度でのIGF−IRのみの結合シグナル（100％の結合シグナル）に比較して、少なくとも10％阻害した。追加の抗体結合の場合、IGF−IR結合シグナルは、少なくとも10％高められ、このことは、試験抗体によるIGF−IR上の独立した結合エピトープの認識を示す。
【０１４１】
例９．IGF−IR及びAkt/PKBのIGF−I介在性リン酸化の阻害：
IGF−I受容体（IGF−IR）の活性化及びリン酸化を阻害する本発明の抗体の能力を決定するために、競争実験を、IGF−Iペプチドにより行い、そしてリン酸化されたチロシンに対して特異的な抗体を用いての続くウェスターンブロット分析を行った。
【０１４２】
ヒト腫瘍細胞（HT29 NCI H322M, ５×104/ml）を、2mMのL−グルタミン、１×非必須アミノ酸（Gibco、カタログ番号11140−035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、カタログ番号11360−039）及び0.5％の熱不活性化されたFCS（PAA、カタログ番号A15−771）により補充されたRPMI1640培地（PAA、カタログ番号E15−039）にプレートした。IG50値の決定のために、12のウェルプレートを、個々の実験についてのそれぞれの培地において、1mlの細胞により接種し、そして37℃及び５％のCO2下で２時間、培養した。
【０１４３】
低血清培地による48時間の培養の後、培地を注意して除き、そしてそれぞれの培地において希釈された異なった濃度の抗体により置換した。37℃及び５％CO2下での５分間のインキュベーションの後、IGF−Iペプチドを、2nMの最終濃度で添加し、そして細胞を再び、上記条件下で10分間インキュベートした。培地を注意して、アスピレーションにより除去し、そして100μlの冷溶解緩衝液（50mMの Hepes、 pH 7.2, 150 mMの NaCl,1mM のEGTA, 10% グリセロール, 1%Triton(商標)-X100,100mMの NaF, 10 mMのNa4P207, Complete(商標)プロテアーゼインヒビター）をウェル当たり添加した。細胞を、細胞スクレーパー（Cornig、カタログ番号3010）を用いて剥離し、そしてウェルの内容物を、Eppendorf反応管に移した。細胞フラグメントを、13000rpm及び４℃での10分間の遠心分離により除去し、そして上清液の半分を、１：１（v/v）の比で２×Laemmliサンプル緩衝液に添加した。
【０１４４】
IGF−IRの免疫沈澱のために、１μlの一次抗体の添加の直前、清浄回転（13000rpm及び４℃で10分）を受けた細胞溶解物の残りの上清液を添加した（C-20, Santa Cruz Biotechnologies, mAb 24-55, GroPep）。回転Eppendorf反応管における34℃での２時間のインキュベーションの後、25μlのプロテインGセファロース(商標)ビーズ（Amercham Biosciences, カタログ番号17−0618−01）を添加し、続いて4℃で１時間、さらにインキュベーションした。結合された抗体−タンパク質−複合体を有するビーズを、遠心分離し（2000rpm及び4℃で１分）、そして洗浄緩衝液（0.1％のTriton(商標)-x100のみを含む溶解緩衝液）により３度、洗浄した。Laenmliサンプル緩衝液においてビーズを煮沸した後、細胞タンパク質を、SDS−PAGEにより分離し、そして半−乾燥ウェスタンブロットにより、ニトロセルロース膜（PROTRAN(商標)BA 85,Schleicher & Schuell）に移した。
【０１４５】
ホスホチロシン特異的抗体（＜P-Tyr＞、Upstate, クローン4G10、カタログ番号05−321）を用いて、免疫精製されたIGF−IRのリン酸化状態を決定した。リン酸化されたAkt/PKBの検出のために、リン酸化されたSer473についての特異性を有する抗体（＜P-PKB＞, Cell Signalling, カタログ番号9271）を適用した。
IGF−IR及びAkt/PKBの両者のIGF−I誘発されたリン酸化の観察される妨害が図８に示されている。
【０１４６】
例10．インビトロでのIGF−IRの抗体介在性ダウンレギュレーションの誘発：
腫瘍細胞におけるIGF−I受容体（IGF−IR）の量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、時間−経過実験及びIGF−IR特異的抗体による続くウェルターンブロット分析を行った。
【０１４７】
ヒト腫瘍細胞（H460, QG56, MCF-7, ５×104/ml）を、2mMのL−グルタミン、１×非必須アミノ酸（Gibco、カタログ番号11140−035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、カタログ番号11360−039）及び10％の熱不活性化されたFCS（PAA、カタログ番号A15−771）により補充されたRPMI1640培地（PAA、カタログ番号E15−039）にプレートした。個々のインキュベーション期間、１つの12ウェルプレートを、個々の実験についてのそれぞれの培地における1mlの細胞により接種し、そして37℃及び5％CO2下で24時間、培養した。
【０１４８】
培地を注意して除去し、そしてそれぞれの培地により希釈された、異なった濃度の抗体により置換した。２つの対照ウェルにおいては、培地を、抗体を有さない培地、又は対照抗体を有する培地（AB-1、Oncogene, カタログ番号GR11）のいずれかにより置換した。細胞を、37℃及び5％CO2下でインキュベートし、そして個々のプレートを、15分、24時間及び48時間後、さらなる処理のために除外した。
【０１４９】
培地を注意して、アスピレーションにより除去し、そして100μlの冷溶解緩衝液（50mMの Hepes、 pH 7.2, 150 mMの NaCl, 1mM のEGTA, 10% グリセロール, 1%Triton(商標)-X100, 100mMの NaF, 10 mMのNa4P207,Complete(商標)プロテアーゼインヒビター）をウェル当たり添加した。細胞を、細胞スクレーパー（Cornig、カタログ番号3010）を用いて剥離し、そしてウェルの内容物を、Eppendorf反応管に移した。細胞フラグメントを、13000rpmでの10分間の遠心分離により除去し、そして上清液の半分を、１：１（v/v）の比で２×Laemmliサンプル緩衝液に添加した。細胞タンパク質をSDS−PAGEにより分離し、そして半−乾燥ウェルターンブロットにより、ニトロセルロース膜（PROTRAN(商標)BA 85, Schleicher & Schuell, カタログ番号10 401196）に移した。
【０１５０】
IGF−IRに対して特異的な抗体（< IGF-IR > , C-20, Santa Cruz Biotechnologies, カタログ番号sc-713）を用いて、IGF−IRのタンパク質レベルを決定した。
抗体の添加の24時間以下の後、本発明の抗体により誘発されたIGF−IRのダウンレギュレーションが観察された。その結果は図９に示される。
【０１５１】
例11．ヒトインスリン受容体を発現する3T3−細胞へのインスリン結合の阻害：
本発明の抗体がまた、インスリン受容体（IR）へのインスリンの結合を阻止するかどうかを決定するために、競争実験を、放射性ラベルされたリガンドペプチドにより行った。
高い数（105以上）のヒトIRを組換え的に発現するNIH−3T3細胞（１×105/ml）を、2mMのL−グルタミン（Gibco、カタログ番号25030−024）及び10％熱不活性化されたFCS（PAA、カタログ番号A15−771）ににより補充された、高いグルコース（PAA、カタログ番号E15-009）を含むMEMダルベッコ培地（DMEM）にプレートした。T175形での６本のボトルを、個々の実験についてのそれぞれの培地中、20mlの細胞により接種し、そして37℃及び5％CO2下で２日間、培養し、そして集密的細胞単層を得た。
【０１５２】
個々の細胞を集めるために、T175フラスコ当たり2mlの１×トリプシン/EDTA（Gibco,カタログ番号25300−054）を添加し、そして細胞の分離を顕微鏡によりモニターした。細胞を集め、そして前記のような10％FCSを含む培地を添加し、50mlの合計体積にした。細胞を、1000rpmで10分間、遠心分離により再単離し、そして50mlの結合緩衝液（120mMのNaCl、5mlのKCl、1.2mMのMgSO4、1mMのEDTA、10mMのD(＋)−グルコース、15mMのNaAc、100mMのHepes、pH7.6、１％BSA）に再懸濁した。細胞を計数し、遠心分離により再単離し、そして結合緩衝液により、１×106細胞/mlに調節した。
【０１５３】
0.1％のCH3COOHに溶解された、I125−ラベルされたインスリンペプチド（Amersham, 約2000Ci/mモル、カタログ番号IM166）を、結合緩衝液に希釈し、４×105個の計数/（分×ml）の最終活性にした。75μlの抗体及び25μlの予備希釈されたI125−ラベルされたインスリンペプチドを、200μlの細胞懸濁液（最終抗体濃度200nM）に添加し、そして４℃で3.5時間インキュベートした。細胞を、2000rpmでの５分間の遠心分離により再単離し、そして上清液を除去した。1mlの結合緩衝液により２度、洗浄した後、細胞を1mlの結合緩衝液に再懸濁し、そしてシンチレーション管に移した。細胞表面受容体に結合される放射性ペプチドの量を、シンチレーションカウンター上で測定した。
結果は、本発明の抗体が、インスリン受容体へのインスリンリガンドの結合を妨げないことを示す（図10）。
【０１５４】
例12．異なった腫瘍型での受容体ダウン−レギュレーションの誘発：
ヒト腫瘍（NCI H322M又はNCI H460）を、ヌードマウスにおいて誘発し、そして例６に記載のようにして、本発明の抗体により処理した。実験の終結後、腫瘍を抽出し、そして液体窒素下で均質化した。冷溶解緩衝液（50mM のHepes pH 7.2, 150 mMの NaCl,1mM のEGTA, 10% グリセロール, 1%Triton-X100,100mM のNaF, 1 mMのNa3V04, 10 mMのNa4P207, Complete(商標)プロテアーゼインヒビター,1mMの PMSF）を、３：１の緩衝液−体積：腫瘍重量比で添加し、そして融解腫瘍均質物と共に十分に混合した。氷上で15分間、組織を溶解した後、不溶性フラグメントを、13000rpm及び4℃での10分間の遠心分離により除去した。
【０１５５】
サンプルのタンパク質濃度を、Micro BCA(商標)試薬（Pierce）により決定し、そして溶解緩衝液を添加し、濃度を等しく調節した。上清液の一部を、２×Laemmliサンプル緩衝液に、１：１（v/v）の比で添加した。細胞タンパク質を、SDS−PAGEにより分離し、そして半−乾燥ウェスターンブロットにより、ニトロセルロース膜（PROTRANe BA 85, Schleicher & Schuell,カタログ番号10 401196）に移した。IGF−IR特異的抗体（C-20, Santa Cruz Biotechnologies, カタログ番号sc-713）を用いて、IGF−IRを検出した。
インビトロダウンレギュレーションの実験の結果に対応する、本発明の抗体により処理されたすべての腫瘍におけるIGF−IRレベルの劇的な低下（図11）が観察された。
【０１５６】
例13．ラット、マウス、キヌザル及びカニクイザルからのIGF−IRとの抗体交差反応性：
本発明の抗体を、他の種のIGF−I受容体に結合するその能力について試験した。免疫沈澱実験を、本発明の抗体、及び異なった動物からの組織又は細胞溶解物により行った。
【０１５７】
凍結された動物組織を、液体窒素下で均質化した。冷溶解緩衝液（50mM のHepes pH 7.2, 150 mMの NaCl,1mM のEGTA, 10% グリセロール, 1%Triton-X100,100mM のNaF, 1 mMのNa3V04, 10 mMのNa4P207, Complete(商標)プロテアーゼインヒビター,1mMの PMSF）を、３：１の緩衝液−体積：腫瘍重量比で添加し、そして融解腫瘍均質物と共に十分に混合した。氷上で15分間、組織を溶解した後、不溶性フラグメントを、13000rpm及び4℃での10分間の遠心分離により除去した。サンプルのタンパク質濃度を、Micro BCA(商標)試薬（Pierce）により決定し、そして溶解緩衝液を添加し、濃度を等しく調節した。動物細胞を、腫瘍細胞系のためのプロトコールに従って溶解した（例10）。
【０１５８】
IGF−IRの免疫沈澱のために、細胞及び組織溶解物（1mgの全タンパク質）は、２μgの一次抗体１Aが添加される直前、清浄回転（13000rpm及び4℃で10分間）を受けた。同じ実験をまた、非特異的結合のための測定としてB型肝炎ウィルスタンパク質（HBV）に対して向けられた非関連のヒト対照抗体を用いて行った。回転Eppendorf反応管における34℃での２時間のインキュベーションの後、25μlのプロテインGセファロース(商標)ビーズ（Amercham Biosciences, カタログ番号17−0618−01）を添加し、続いて4℃で１時間、さらにインキュベーションした。結合された抗体−タンパク質−複合体を有するビーズを、遠心分離し（2000rpm及び4℃で１分）、そして洗浄緩衝液（0.1％のTriton(商標)-x100のみを含む溶解緩衝液）により３度、洗浄した。Laenmliサンプル緩衝液においてビーズを煮沸した後、細胞タンパク質を、SDS−PAGEにより分離し、そして半−乾燥ウェスタンブロットにより、ニトロセルロース膜（PROTRAN(商標)BA 85,Schleicher & Schuell）に移した。
【０１５９】
広い種交差反応性を有するIGF−IR特異的抗体（C-20, Santa Cruz Biotechnologies,カタログ番号 sc-713）を用いて、本発明の抗体により免疫沈澱されたIGF−IRのレベルを決定した。
カニクイザル及びキヌザルからのIGF−IRとの交差反応性（図12）が観察されたが、しかしラット又はマウスIGF−I受容体への交差反応性は観察されなかった。
【０１６０】
例14．Clq結合ELISA：
概論：
Clqを固定する本発明の抗体の能力を決定するために、ELISAアプローチを使用した。Clqは、適応免疫システムの一部であり、そして免疫複合体への結合に基づいて、いくつかのチモーゲンの連続的活性化を誘発する。前記酵素は、C3分子の切断を引起こし、炎症反応ン開始、外来性又は異常粒子のオプソニン作用、及び細胞膜の溶解をもたらす。
原則として、ELISAプレートを、濃度範囲の抗体により被覆し、これに、ヒトClqを添加する。Clq結合を、ヒトClqに対して向けられた抗体、続いてペルオキシダーゼラベルされた接合体により検出する。
【０１６１】
材料及び方法：
抗体１A、８及び23、及び対照抗体を、10, 5, 1及び0.5μg/mlの濃度で試験した。表１は、試験されるサンプルの特異性を示す。負の対照として、Clqを非常に弱く結合するヒトIgG4（CLB, 0.5μg/ml）を使用した。ヒトIgG１を、負の対照として導入する。２μ/mlの濃度のヒトClq原液を使用した。Clqの検出のために、Clqに対して向けられたウサギ抗体（Dako）、及びホースラディシュペルオキシダーゼにより接合される抗−ウサギIgG抗体（Sigma）を使用した。
【０１６２】
計算及び曲線適合；
試験されるHuMabの最大結合（Bmax）に関する計算を、Graphpad Prismソフトウェアを用いて、非直線回帰曲線適合（１つの部位結合）により決定した。
【０１６３】
結果：
本発明の抗体は、ヒトClqタンパク質の用量依存性結合を示す。405nmでの光学密度（OD405nm）を、HuMab濃度に対してプロットし、そしてその曲線を非直線回帰を用いて適合した。最大結合（Bmax）のための最良の適合値が、曲線（R2）の相関係数及び個々の標準偏差と共に、表６に列挙される。最小の相関係数は、0.950の値を有した（IgG4）。0.279の最大結合に関して、ヒトIgG4（負の対照）は、Clqの最小結合を示す。正の対照IgG1及びIgG3の両者は、それぞれ1.729及び2.223の最大結合により示されるように、Clqを結合する。
【０１６４】
【表６】
0004473257.tif 000007
【０１６５】
相関係数（R2）及び標準偏差もまた列挙される。
ヒトIgG4（負の対照、0.279のO.D.を有する）のClq結合に比較して、試験されるすべての抗体はClqを平等に固定することができる。
【０１６６】
例15．抗−IGF−IR HuMabによる抗体介在性エフェクター機能の決定：
免疫エフェクター機構を誘発する、生成されるHuMab抗体の能力を決定するために、補体依存性細胞毒性（CDC）及び抗体依存性細胞毒性（ADCC）研究を行った。
CDC（National Cancer Institute, 肺腺癌細胞系）を研究するために、H322M、H460及びNIH 3T3細胞（２〜６×106）を、100μCiの51Crにより45〜120分間ラベリングした（Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJS11）。ラベリングの後、細胞を40mlのPBSにより２度、洗浄し、そして1500rpmで３分間、回転した。
【０１６７】
次に、細胞を、50μlの体積で、丸底プレートにウェル当たり5,000個プレートした。抗体を、50μlの細胞培養培地の体積中、25〜0.1μg/mlの範囲の最終濃度で、50μlの細胞懸濁液に添加し、そして30〜60分間インキュベートした。インキュベーションの後、過剰の抗体を、PBSによる２回の洗浄により除去した。1/3〜1/30に希釈された、100μlの活性又は不活性（56℃で30分）のプールされたヒト血清、テンジュクネズミ、ウサギ又はヌードマウス血清を添加し、そして細胞を３時間インキュベートし、その後、細胞を1500rpmで３分間、回転沈降した。100μlの上清液を収穫し、ポリプロピレン管に移し、そしてγ−カウンターで計数した。
【０１６８】
ADCCにおける抗体の効果を研究するために、H322M、H460及びNIH3T3、又は他の適切なIGF−IR発現細胞（２〜６×106）を、100μCiの51Crにより45〜120分間ラベリングし（Amersham Pharmacia Biotech, UK, CatCJS11）、40mlのPBSにより２度、洗浄し、そして1500rpmで３分間、回転した。細胞を、50μlの体積で、丸底プレートにウェル当たり5,000個プレートした。HuMab抗体を、50μlの細胞培養培地の体積中、25〜0.1μg/mlの範囲の最終濃度で、50μlの細胞懸濁液に添加し、そして15分間インキュベートした。
【０１６９】
続いて、50μlのエフェクター細胞、新しく単離されたPBMC、又は淡黄褐色の被膜からの精製されたエフェクター細胞を、100：１〜５：１の範囲のE：T比で添加した。プレートを500〜700rpmで２分間、遠心分離し、そして37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を1500rpmで３分間、回転沈降し、そして100μlの上清液を収穫し、ポリプロピレン管に移し、そしてγ−カウンターにより計数した。
CDC又はADCCによる細胞溶解の大きさを、それぞれの標的細胞からの放射能の自発的放出のために補正された、界面活性剤により溶解される標的細胞からの放射能の最大放出の％として表す。
【０１７０】
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【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、低及び高密度細胞培養物におけるIGF−IR表面発現を示す。
【図２】図２は、３D培養物における増殖阻害のためのWSTアッセイを示す。
【図３】図３は、55日目までの処理の間、測定される一次腫瘍体積を示す；ビークル：１；抗体1A 20mg/kg：2；2：抗体1A 7mg/kg：３；抗体１A 2mg/kg：４。
【図４】図４は、抗体1A、８及び23によるHT29細胞へのI125−IGF−I結合の阻害を示す。
【図５】図５は、hIGF-IRに対する種々のヒト腫瘍細胞系へのI125−IGF−I結合の阻害を示す。
【図６】図６は、抗体1AによるHT29細胞へのI125−IGF−II結合の阻害を示す。
【図７】図７は、抗体のαLR3によるHT29細胞へのI125−IGF−II結合の阻害を示す。
【図８】図８は、IGF−IR及びAKT/PkBの両者のIGF−I誘発リン酸化の阻止を示す。
【図９】図９は、腫瘍細胞に対するIGF−IRタンパク質のダウンレギュレートを示す。
【図１０】図10は、抗−hIGF-IR抗体による3T3−IR細胞へのI125−インスリン結合の阻害が存在しないことを示す。（MAX w/o Ab: I125−インスリンの最大結合；MIN：１μMのインスリンとの競争の後の最小結合）。
【図１１】図11は、インビボでのIGF−IRのダウンレギュレーションの誘発を示す。
【図１２】図12は、他の種からのIGF−IRとの抗体の交差反応性を示す。
【図１】
0004473257.tif 000008
【図２】
0004473257.tif 000009
【図３】
0004473257.tif 000010
【図４】
0004473257.tif 000011
【図５】
0004473257.tif 000012
【図６】
0004473257.tif 000013
【図７】
0004473257.tif 000014
【図８】
0004473257.tif 000015
【図９】
0004473257.tif 000016
【図１０】
0004473257.tif 000017
【図１１】
0004473257.tif 000018
【図１２】
0004473257.tif 000019
【配列表】
0004473257000001.app