(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁がムタノリシンの活性に感受性を有する非病原性乳酸菌を含有し、非急速眼球運動睡眠相の長さを増し、急速眼球運動睡眠相の長さを減じることにより哺乳動物の睡眠の質を改善するための組成物であって、ここで該非病原性乳酸菌は、ラクトバシラス  アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）９２２３（ＣＮＣＭＩ−２２７４）、ラクトバシラス  アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）９１７３（ＣＮＣＭＩ−２１３２）、ラクトバシラス  ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）９３４３（ＣＮＣＭＩ−２２７５）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）９３４０（ＣＮＣＭＩ−１５２０）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）１００９０（ＣＮＣＭＩ−２２７２）、およびそれらの混合物から成る群から選択される、組成物。
【請求項２】
哺乳動物の体重１キログラム当たり１ｍｇ〜１ｇの非病原性乳酸菌が投与されるように該非病原性乳酸菌を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
対象となる哺乳動物へ経口投与される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
医薬品である請求項１〜３何れかに記載の組成物。
【請求項５】
栄養補助食品である、請求項１〜４何れかに記載の組成物。
【請求項６】
ラクトバシラス  アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）９２２３（ＣＮＣＭＩ−２２７４）、ラクトバシラス  ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）９３４３（ＣＮＣＭＩ−２２７５）およびストレプトコッカス  サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）１００９０（ＣＮＣＭＩ−２２７２）から成る群から選択される、細胞壁がムタノリシンの活性に感受性を有する非病原性乳酸菌。
【請求項７】
ラクトバシラス  アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）９２２３（ＣＮＣＭＩ−２２７４）、ラクトバシラス  ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）９３４３（ＣＮＣＭＩ−２２７５）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）１００９０（ＣＮＣＭＩ−２２７２）およびこれらの混合物から成る群から選択される非病原性乳酸菌を含有する食品。
【請求項８】
乳製品である、請求項７記載の食品。
【請求項９】
発酵乳製品である、請求項８記載の食品。
【請求項１０】
ヨーグルトである、請求項９記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、非病原性乳酸菌および該細菌を含む食品に関する。これらの乳酸菌の細胞壁はムラミダーゼ型酵素の活性に影響を受ける。該酵素により、ムラミルペプチドと呼ばれる細胞壁フラグメントであって、摂取された場合に睡眠の質を改善する細胞壁フラグメントが生ずる。
【０００２】
技術水準
今日、多くの人々が睡眠困難を有するか、または不眠症などの睡眠障害に苦しんでいる。これらの問題を減じるために、ベンゾジアゼピンまたはバルビツレートを含む多くの医薬品が開発されている。しかし、これらの製品は薬物依存、昼間の眠気、記憶喪失、および他の物質、顕著にはアルコールとの相互作用などのその二次的作用のために、医師の管理下で投与されなければならない。
【０００３】
感染症に関する研究から、病原性細菌による感染により、感染した患者に少なくとも３つの生理反応：免疫反応、発熱、および睡眠変化が引き起こされることが示されている。宿主中でこれらの反応を媒介するのは、感染の原因である細菌細胞壁成分、詳細にはムラミルペプチド（およびさらに、グラム陰性細菌においてはリポポリサッカライド）である。研究により、スタフィロコッカス  アウレウス(Staphylococcus aureus)などの病原性細菌の細胞壁がマクロファージにより加水分解されて遊離ムラミルペプチドが生じることが示されている(Johannsen L. et al., 1994)。
【０００４】
ベンゾジアゼピンまたはバルビツレートを含む医薬の二次的作用を回避するため、Ｕ．Ｓ．特許４,６９８,３３０には、催眠活性を有する精製ムラミルペプチドに基づく組成物の使用が提案されている。これらのムラミルペプチドの投与により非急速眼球運動（ＮＲＥＭ）睡眠と呼ばれる深い睡眠が増すが、それは体温の上昇をも引き起こし、解熱性化合物の付随投与を必要とする。
【０００５】
特許出願ＣＨ６５４３３０Ａ、ＣＮ１１１４２１７ＡおよびＷＯ８８００４３８Ａには、睡眠を改善する細菌、特に乳酸菌を含む組成物が開示されている。しかし、これらの文献では、乳酸菌が睡眠の改善にどのように介入しているかは明らかにされていない。乳酸菌を含むそのような組成物の睡眠への影響ならびに請求項に記載されている他の利点（エネルギーが高いこと、食欲および消化が進むこと、リューマチが緩和することなど）は、開示された組成物中に含まれる栄養素と微量元素の独特のバランスから生じると記載されている。
【０００６】
発明の概要
発明者等は、乳酸菌などの、感染を引き起こさない非病原性細菌が、睡眠の相を変化させ得ること、例えばＮＲＥＭの深い睡眠の長さを増すことができることを見出した。発明者等は、ＮＲＥＭ相を増す乳酸菌は、その細胞壁がムラミダーゼ型酵素、例えばリソチームまたはムタノリシンなどの活性に感受性があるものであることを特に示した。
【０００７】
発明者等は、種々の乳酸菌の細胞壁、特にラクトバシラス  ガセリ(Lactobacillus gasseri)９２２１（ＣＮＣＭＩ−２１３１）、ラクトバシラス  アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)９２２３（ＣＮＣＭＩ−２２７４）、ラクトバシラス  アシドフィラス９１７３（ＣＮＣＭＩ−２１３２）、ラクトバシラス  ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)９３４３（ＣＮＣＭＩ−２２７５）、ストレプトコッカス  サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)９３４０（ＣＮＣＭＩ−１５２０）、およびストレプトコッカス  サーモフィラス１００９０（ＣＮＣＭＩ−２２７２）の細胞壁におけるムラミダーゼ、ムタノリシンの作用を研究した。発明者等は、ラクトバシラス  アシドフィラス９２２３（ＣＮＣＭＩ−２２７４）、ラクトバシラス  アシドフィラス９１７３（ＣＮＣＭＩ−２１３２）、ラクトバシラス  ヘルベティカス９３４３（ＣＮＣＭＩ−２２７５）、ストレプトコッカス  サーモフィラス９３４０（ＣＮＣＭＩ−１５２０）およびストレプトコッカス  サーモフィラス１００９０（ＣＮＣＭＩ−２２７２）の細胞壁がムタノリシンにより加水分解され、２のフラクション：ムラミルペプチドを含む溶解性フラクション、および不溶解性フラクションを生じることを示した。これに対し、ラクトバシラス  ガセリ９２２１（ＣＮＣＭＩ−２１３１）の細胞壁はムタノリシンにより加水分解されず、ムラミルペプチドは遊離しなかった。ラクトバシラス  ガセリ９２２１（ＣＮＣＭＩ−２１３１、２４／２／９９に寄託）をムタノリシンとインキュベートした後では、不溶解性のフラクションのみが回収された。
【０００８】
その細胞壁がムラミダーゼ型酵素により加水分解される乳酸菌の睡眠への影響が、２の実験系を試験することにより確認された。
１）ヒトの単球を用いるインビトロ実験により、その細胞壁がムタノリシンにより加水分解されてムラミルペプチドを含む溶解性フラクションを生じる乳酸菌により、単球が強く活性化されて、スーパーオキシドアニオンの産生の増加が誘発され、および、サイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦαの産生も誘発されることが示された。スーパーオキシドアニオンは、微生物の死滅に直接関与する、単球により産生される酸素ラジカルである。サイトカインは、睡眠の調節に関与することが知られているタンパク質炎症媒介因子の一ファミリーである。これらの単球の活性化の影響が、ラクトバシラス  アシドフィラス９２２３、ラクトバシラス  アシドフィラス９１７３、ラクトバシラス  ヘルベティカス９３４３、ストレプトコッカス  サーモフィラス９３４０およびストレプトコッカス  サーモフィラス１００９０を含むラクトバシラスおよびストレプトコッカスの両方を用いて確認された。
２）ウサギのインビボ実験により、その細胞壁がムタノリシンにより加水分解されてムラミルペプチドを含む溶解性フラクションを生じる乳酸菌が、睡眠相に影響を与えることが示された。睡眠は、脳波（ＥＥＧ）により分析された。注目すべきは、そのようなムラミルペプチドがＮＲＥＭ（非急速眼球運動）と呼ばれる睡眠相を増し、ＲＥＭ（急速眼球運動）と呼ばれる睡眠相を減じたことである。
【０００９】
本発明は、非急速眼球運動（ＮＲＥＭ）睡眠相の長さを増すことにより睡眠の質を改善するいくつかの細菌を開示する。該細菌の他の重要な特徴は、それらがヒトにとって非病原性であること、およびその細胞壁がムラミダーゼ型酵素の活性に、特にムタノリシンの活性に感受性があることである。
【００１０】
発明の詳細な記載
本発明に開示される乳酸菌は、ラクトバシラス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、およびビフィドバクテリウムから成る属の中から選択されることができる。細菌は、好ましくは以下の中から選択される乳酸菌である。
−ラクトバシラス  アシドフィラス９２２３（ＣＮＣＭＩ−２２７４、３／８／９９に寄託）；ＤＮ−１１２０８９
−ラクトバシラス  アシドフィラス９１７０（ＣＮＣＭＩ−２２７３、３／８／９９に寄託）；ＤＮ−１１２００１；
−ラクトバシラス  アシドフィラス９１７３（ＣＮＣＭＩ−２１３２、２４／２／９９に寄託）；
−ラクトバシラス  ヘルベティカス９３４３；（ＣＮＣＭＩ−２２７５、３／８／９９に寄託）；ＤＮ−１１９０２８
−ストレプトコッカス  サーモフィラス９３４０（ＣＮＣＭＩ−１５２０、３０／１２／９４に寄託）；
−ストレプトコッカス  サーモフィラス１００９０（ＣＮＣＭＩ−２２７２、３／８／９９に寄託）；ＤＮ−００１１４３。
【００１１】
他の株も一般的に公的に入手可能である。ＣＮＣＭＩ−２２７４、ＣＮＣＭＩ−２２７３、ＣＮＣＭＩ−２１３２、ＣＮＣＭＩ−２２７５、ＣＮＣＭＩ−１５２０、およびＣＮＣＭＩ−２２７２は、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Franceに寄託されている。これらの寄託は、ブダペスト条約の規定に従ってなされた。
【００１２】
本発明は、本発明において単一の株について記載されているが、２またはそれ以上の乳酸菌株を組み合わせた乳酸菌培養物も含む。
本発明は、睡眠の質を改善する乳酸菌を含む栄養補助食品または食品も開示する。栄養補助食品は、その細胞壁がムタノリシンの活性に感受性がある乳酸菌株を含む乳基剤、特に発酵乳から成る。そのような栄養補助食品または食品の摂取により、睡眠の質が改善される。
【００１３】
乳は、様々な動物種の乳から選択される。乳は部分的に、または完全に脱脂されていてもよい。乳基剤には、これらの乳の希釈または濃縮から生じる生成物、例えば超濾過または透析濾過の保持物などが含まれてよい。乳基剤には、乳食品のための基剤、またはヨーグルトもしくは発酵乳としての乳混合物など、乳に基づく媒質が含まれてよい。これらの乳には、ラクトース、ミネラル、ビタミン、脂肪、水溶性乳固形物、植物エキス、調味料などを追加することができる。
【００１４】
別法として、この栄養補助食品または食品は、植物性基質、例えば豆乳、ジュースまたはフルーツパルプなどから得られることもできる。
例えば本発明による栄養補助食品または食品は、以下の方法を実施することにより得られる。：乳基剤に１ｍｌ当たり１０６〜１０７のコロニー形成ユニットを含む少なくとも一の乳酸菌株を接種する。インキュベーション条件は、用いられる乳酸菌株またはその培養物によって異なる。例えば、培養物は、ストレプトコッカス  サーモフィラスの株、またはストレプトコッカス  サーモフィラスの少なくとも一の株を含む混合物からなり、最適培養条件は２５〜４４℃にて３時間〜２４時間行われるものである。培養物がラクトバシラス  アシドフィラスもしくはラクトバシラス  ヘルベティカスの株、またはラクトバシラス  アシドフィラスもしくはラクトバシラス  ヘルベティカスの少なくとも一の株を含む混合物から成る場合、最適培養条件は３７〜４４℃にて少なくとも８時間〜１６時間行われるものである。
【００１５】
培養物を接種した乳基剤には、ペプチドＮ３、酵母エキス、抗酸化剤、例えばシステインなど、ビタミン、可溶性繊維、例えばオリゴサッカライドなど、または用いられる乳酸菌株の生育を促進するのに一般に用いられている他の基質を追加することができる。
【００１６】
乳酸菌またはそれらを含む栄養補助食品により、ＮＲＥＭ相を増すことにより、および／またはＲＥＭ相を減らすことにより睡眠の質が改善される。睡眠のＮＲＥＭ相が増すことは、深い睡眠が増すことに対応する。深い睡眠相が増すことで、疲労が良好に回復し、昼間の注意力が増し、さらに他の利点が得られる。
【００１７】
さらに、非病原性微生物である乳酸菌を投与して、免疫系の過剰反応を誘発する危険を伴わずに睡眠の質を改善することができる。乳酸菌は免疫系とポジティブに相互作用するが、病原性細菌により誘発される反応のような、（サイトカインの過剰産生のような）病的反応を誘発することはない。
さらに、睡眠の質を改善するための乳酸菌の使用によっては、バルビツレートまたはベンゾジアゼピンを摂取することに伴う二次的作用は誘発されない。
本発明は、本発明による乳酸菌株の性質を示す無制限の例を提供するものである以下の追加的情報を用いてよりよく理解されるであろう。
【００１８】
インビトロ実験
種々の乳酸菌細胞壁のムタノリシンによる加水分解
細胞壁を、定常期の乳酸菌培養物から調製した。細菌細胞を、フレンチプレスで破壊した。この調製物をドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤およびトリプシンで処理し、タンパク質が除去された細胞壁粗抽出物を得た。乳酸菌からの細胞壁ペプチドグリカンを次いでストレプトマイセス  グロビスポラス(Streptomyces globisporus)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)由来のムタノリシンで消化した。ペプチドグリカン（５−１０ｍｇ／ｍｌ）は、リン酸バッファー、ｐＨ５．８中０．１〜０．２５ｍｇのムタノリシンと共に３７℃で２４時間インキュベートした。生じた加水分解生成物を遠心分離濃縮装置(Pall Filtron MicrosepTM, Northborough, MA)、および残存高分子量物質から低分子量分子を分けるための１０ｋＤａのカットオフを有する膜を用いて遠心分離により分離した。
【００１９】
試験された細菌は、ラクトバシラス  ガセリ９２２１、ラクトバシラス  アシドフィラス９２２３、ラクトバシラス  アシドフィラス９１７３、ラクトバシラス  ヘルベティカス９３４３、ストレプトコッカス  サーモフィラス９３４０およびストレプトコッカス  サーモフィラス１００９０であった。
試験された細菌中、５の細菌の細胞壁がムタノリシンにより部分的に加水分解され、ムラミルペプチドを含む溶解性フラクション、およびムタノリシンの活性に抵抗性のある不溶解性フラクションが回収された。
ラクトバシラス  ガセリ９２２１（ＣＮＣＭＩ−２１３１、２４／２／９９に寄託）の細胞壁だけはムタノリシンにより加水分解されず、ムラミルペプチドが遊離しなかった。
【００２０】
ヒト単球におけるスーパーオキシドアニオンおよびサイトカインの産生の、乳酸菌による誘導
単球を健康なヒトの成人から単離した。赤血球を高分子量デキストランを用いて沈降した。単核細胞をヒストパック勾配（Sigma-Aldrich)により好中球から分離した。単球およびリンパ球両方を含む単核細胞を、インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ２にて、変更されたEarleの塩溶液培地中、約０．５×１０６単球／ｍｌに対応する１．５×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。単球によるＴＮＦαの産生を測定するべく設計された実験では、単球を０．２％熱−不活性化（５６℃、３０分）タイプＡＢヒト血清の存在下で培養した。
【００２１】
細菌ラクトバシラス  ガセリ９２２１、ラクトバシラス  アシドフィラス９２２３、ラクトバシラス  アシドフィラス９１７３、ラクトバシラス  ヘルベティカス９３４３、ストレプトコッカス  サーモフィラス９３４０およびストレプトコッカス  サーモフィラス１００９０。乳酸菌のペレットを懸濁液に入れ、１ｍｇ／ｍｌ（Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイにより測定）の細菌タンパク質濃度とした。０．１〜３００ｎｇ／ｍｌの細菌タンパク質を含む希釈懸濁液を試験した。
【００２２】
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を用いて４０分間３７℃、インキュベーター中５％ＣＯ２にて単球を活性化させた後、単球によるスーパーオキシドアニオン（Ｏ２）の産生をシトクロムｃ法により測定した。スーパーオキシドアニオンによるシトクロムの還元を、分光光度計で５５０ｎｍにて測定した。０．０２１μＭ−１の吸光度を用いて、産生されたスーパーオキシドアニオンの量を産出した。
【００２３】
サイトカインの産生は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）により、単球培養培地のサンプルにおいて測定した。ＩＬ−１β用ＥＬＩＳＡキット（BioSource International, Carmarillo, CA)およびＴＮＦα用ＥＬＩＳＡキット(Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA)を用いた。
【００２４】
図１はラクトバシラス  アシドフィラス９２２３、ラクトバシラス  アシドフィラス９１７３、ラクトバシラス  ヘルベティカス９３４３、ストレプトコッカス  サーモフィラス９３４０、およびストレプトコッカス  サーモフィラス１００９０によりヒトの単球が強く活性化されて、スーパーオキシドアニオンおよびＩＬ−１βの産生が誘導され得たことを示す。これに対し、その細胞壁がムタノリシンの活性に感受性がないラクトバシラス  ガセリ９２２１によっては、ヒトの単球において弱い活性しか誘導されなかった。図２は、ＩＬ−１βの産生とＴＮＦαの産生が密接に関連したことを示す（Ｒ２＝０．９５）。
【００２５】
インビボ実験
ウサギにおける、乳酸菌細胞壁の睡眠改善作用
インビトロ試験でポジティブな感受性を示した乳酸菌株の一つ、ラクトバシラス  アシドフィラス９２２３と、インビトロ試験でネガティブであった一の乳酸菌株ラクトバシラス  ガセリ９２２１を用いて、ウサギを用いた睡眠実験を行った。試験される乳酸菌の細胞壁は静脈注射により投与した。
【００２６】
試験動物は、３．５〜４．５ｋｇの体重の大人のオスのニュージーランド白ウサギ(Myrtle Rabbitery, Thompson Station, TN)であった。
ウサギを手術して、その心電図（ＥＥＧ）を記録するシステムを埋め込んだ。該システムは、動物に自由に動くことを許容するものであった。別々の日に、ビヒクル、または試験されるべき物質の一つのいずれかを各動物に投与した。それゆえ、各動物はそれ自身が対照となる。末端の耳静脈を静脈内注射のために用いた。注射容積は０．１ｍｌ／ｋｇであった。
【００２７】
記録を解析し、目覚めの３段階：覚醒相、ＮＲＥＭ相（低周波脳電図、高振幅脳電図、および非常に深い眠りを特徴付ける体の不動）、およびＲＥＭ相（高周波脳電図、低振幅脳電図、および浅い眠りを特徴付ける時折の体の動き）により分類した。各相の長さは、記録された時間を１時間当たりの割合として表した。
【００２８】
図３は、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの投与量にて投与されたラクトバシラス  アシドフィラス９２２３の細胞壁が、ＮＲＥＭ相を増すことにより、およびＲＥＭ相を減らすことにより睡眠に影響することを示す。ＮＲＥＭ相の増加は注射後２時間の間に始まり、試験中持続した。これに対し、図４はラクトバシラス  ガセリ９２２１の細胞壁が睡眠に有意に影響しなかったことを示す。
【００２９】
治療のための投与
本発明の対象である物質は、ヒトを含む哺乳動物に経口で有効に投与される。有効量は個人、個人の状態または状況、所望される効果などにより大きく異なるであろう。乳酸菌の細胞壁のムラミダーゼ型酵素による消化は、口腔から始まって胃および腸へと続く消化管を通じて自然に起こるので、経口投与はヒトを含む哺乳動物に有効である。別法として、予め消化されたムラミルペプチドが、経口にて、注射により、または坐薬により投与されてよい。注射はＩＶまたはＩＭのいずれであってもよい。好ましくは、投与の簡便のために、および患者の快適のために、投与は経口経路によるものである。
【００３０】
活性因子、ムラミルペプチドは水溶性である。乳酸菌そのものが投与される場合、乳酸菌はいずれかの医薬上許容されるキャリア中に提供されてよく、好ましくは乳または発酵乳製品を含む食品に対する成分または添加物として提供される。一の好ましい具体例では、乳酸菌または予め消化されたムラミルペプチドがヨーグルト製品中に提供される。ヨーグルトは調味されていてもされていなくてもよく、本明細書中に提供される活性因子を除き、ヨーグルトそのものの性質は本発明の態様を構成しない。乳酸菌は、１日当たり１ミリグラム−１グラム／キログラムの範囲の量で都合よく経口投与される。睡眠の改善は複雑な機構であり、処置される患者の状況が有効投与量に大きく影響するであろう。投与のためのビヒクルは、投与が経口である場合、ムラニルペプチド消化酵素を含まない限り、またはさもなくば、単球によるスーパーオキシドアニオンの産生ならびにサイトカインの産生を刺激する本発明の活性因子の活性を妨げない限り、実質上制限されない。
【００３１】
有効量の決定に関する別法として、１ｍｇ／ｍｌ乳酸菌タンパク質懸濁液の有効投与量は、０．０１−１００ｍｌ／ｋｇの範囲である。
本発明は一般的に、かつ、特定の具体例を引用して開示されている。実施例は、特に示さない限り、制限を意図するものではなく、またそのように解釈されるべきではない。特に非病原性乳酸菌、ビヒクルまたはキャリア、濃度または懸濁、または調製に関する他の態様の同定に関して、当業者には別法が考えられるであろう。これらの別法は、前記の請求の範囲の記載により除外されない限り、本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
本明細書中の図を参考にして本発明の理解を深めることができるが、これらの図は本発明の理解に欠かせないものではない。
【図１】  図１は、本発明による細菌懸濁液と接触させた後の単球培養物上清において測定されたスーパーオキシドアニオンおよびＩＬ−１βの量を図示したものである。
【図２】  図２は、単球を細菌細胞に曝した後で測定されたＩＬ−１βの濃度とＴＮＦαの濃度の間の相関を示す図である。
【図３】  図３は、２の異なるレベルの濃度の本発明による細胞壁物質を注射した後の各時間における、ＮＲＥＭ相およびＲＥＭ相に関して費やされた時間の割合についての図表を示す。
【図４】  図４は、図３で図示したものと類似する図表を示すが、ここでは、細菌細胞壁物質は、ムラミルペプチドを含む溶解性フラクションを提供するムラミダーゼタイプの酵素による消化に影響を受けないものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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