(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上の１つまたはそれ以上の部位に金を析出させるための方法であって、
（ａ）前記１またはそれ以上の部位に核形成中心を結合、析出または形成する工程；
（ｂ）前記１またはそれ以上の部位に、金含有分子または錯体である可溶性金供給剤および試薬からなる処理組成物を接触する工程であって、基材上に核形成中心が存在しないかぎり、金が基材上に析出せず、前記１つまたはそれ以上の部位における核形成中心の存在下で、金原子が、前記金供給剤から放出され、前記核形成中心に析出して、前記１つまたはそれ以上の部位に金金属析出物が形成される工程からなり、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンである方法。
【請求項２】
（ａ）工程が：
（ａ１）金属粒子、金属原子含有クラスターおよび金属含有錯体からなる群の１つまたはそれ以上である少なくとも１つの核形成中心に結合する前記１つまたはそれ以上の部位に特異的な結合親和性を有する少なくとも１つの部分を有する核形成中心形成剤を供給する工程；および
（ａ２）前記１つまたはそれ以上の部位を前記核形成中心形成剤と接触させる工程
からなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記部分が、相互に特異的に結合する２つまたはそれ以上の分子または錯体からなる認識グループのメンバーであり、他のメンバーが前記１つまたはそれ以上の部位に含まれるか、または、部位を形成する請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記認識グループが、抗原および抗体または抗原結合領域を有する抗体誘導体；糖およびレクチン；レセプターおよびリガンド；ヌクレオチド配列および相補性を有するヌクレオチド配列；ヌクレオチド配列およびその結合タンパク質または他の特異的結合剤；ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；セルロースまたはキチンおよびセルロース結合領域からなる群のメンバーである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記核形成中心が金粒子または金原子含有クラスターである請求項２、３または４記載の方法。
【請求項６】
前記処理組成物が水溶液である請求項１、２、３、４または５記載の方法。
【請求項７】
基材上の部位における特定の物質の存在を分析するための方法であって、
（ａ）前記物質を有する部位に核形成中心を形成させる条件を付与する工程、
（ｂ）前記基材を、金含有分子または錯体である可溶性金供給剤および試薬からなる処理組成物と接触させる工程であって、そのように接触させることによって、核形成中心が基材上に存在しない限り、金金属が基材上に析出せず、前記部位に核形成中心が存在すると、金原子が前記金供給剤から放出され、前記核形成中心上に析出し、前記部位に金金属析出物が形成される工程；および
（ｃ）前記基材上の金属金析出物を検出する工程であって、基材上の部位における金析出物が前記部位における前記物質の存在を示す工程からなり、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンである方法。
【請求項８】
工程（ａ）が、
（ａ１）前記物質に対する特異的な結合親和性を有し、金属粒子、金属原子含有クラスターおよび金属含有錯体からなる群の１つまたはそれ以上である少なくとも１つの核形成中心に結合する少なくとも１つの部分を有する核形成中心形成剤を供給する工程；および
（ａ２）前記基材を前記核形成中心形成剤に接触させる工程からなる請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記部分が、相互に特異的に結合する２分子または錯体からなる認識対の一方のメンバーに含まれ、他方のメンバーが前記物質に含まれるか、または前記物質を構成する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記認識対が、抗原および抗体または抗原結合領域を有する抗体誘導体；糖およびレクチン；レセプターおよびリガンド；ヌクレオチド配列および相補性を有するヌクレオチド配列；ヌクレオチド配列およびその結合タンパク質または他の特異的結合剤；ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；セルロースまたはキチンおよびセルロース結合領域からなる群のメンバーであり、前記部分が前記認識対の一方であり、前記物質が他方であるかまたは他方を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
試料中の特定のターゲット配列を有する１またはそれ以上のターゲットオリゴヌクレオチドの存在を検出するための請求項７、８、９または１０記載の方法であって：
（ａ）それぞれ前記ターゲット配列に相補性を有するプローブ配列を有する１つまたはそれ以上のプローブヌクレオチドを担持する基材を供給する工程；
（ｂ）前記基材を試料と接触させ、ターゲットオリゴヌクレオチドがプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする核形成中心の形成を可能とする条件を付与する工程；
（ｃ）前記基材を、金含有分子または錯体である金供給剤および試薬からなる処理組成物と接触させる工程であって、そのように接触させることによって、核形成中心が基材上に存在しないかぎり、金金属が基材上に析出せず、前記部位における核形成中心の存在下で、金原子が前記金供給剤から放出され、前記核形成中心に析出し、前記部位に金金属析出物を形成する工程；および
（ｄ）前記基材上の金属金析出物を検出する工程であって、基材上の部位の金析出物が前記部位に前記物質が存在することを示す工程からなり、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンである方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）が
（ｂ１）前記試料を処理して、試料中のオリゴヌクレオチドにラベルを結合する工程；
（ｂ２）前記試料を前記基材に接触させる工程；および
（ｂ３）前記基材に、前記ラベルに特異的に結合することができる核形成中心含有剤を接触させる工程からなる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｂ）が
（ｂ１）前記試料を処理してその中に存在するオリゴヌクレオチドに核形成中心を結合する工程；および
（ｂ２）前記試料を前記基材と接触させる工程からなる請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記核形成中心が金粒子または金原子含有クラスターである請求項７、８、９、１０、１１、１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
前記処理組成物が水溶液である請求項７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
前記基材が画像化技術における観察のための試験片である請求項７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
顕微鏡観察のための試験片を製造するための請求項１６記載の方法であって、
（ａ）前記試験片の選択的な部位に核形成中心を形成させる条件を付与する工程；および
（ｂ）前記試験片を、金含有分子または錯体である可溶性金供給剤および試薬からなる処理組成物と接触させる工程であって、試験片上に核形成中心が存在しないかぎり、金が該試験片上に析出せず、核形成中心がその上に存在する試験片上に析出しておらず、それによって、前記金供給剤から金原子が放出され、前記試験片上の選択的部位に析出する工程からなり、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンである方法。
【請求項１８】
前記基材が試料の分離されたフラクションを含有する請求項７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載の方法。
【請求項１９】
前記基材上における特定の分離生成物の位置を同定するための請求項１８記載の方法であって：
（ａ）前記特定の分離生成物を含有する前記基材上の部位に核形成中心を形成することのできる条件を付与し；
（ｂ）前記基材に、金含有分子または錯体である可溶性金供給剤および試薬からなる処理組成物を接触させる工程であって、金は核形成中心が存在する基材上に析出し、そのような接触によって前記金供給剤から金原子が放出され、前記核形成中心上に析出する工程；および
（ｃ）前記基材上に金が存在することを検出する工程であって、前記金が、金が検出された部位の基材上に前記特定の分離生成物が存在することを示す工程からなり、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンである方法。
【請求項２０】
試料中の検出体の存在を分析する方法であって
（ａ）前記検出体と結合する捕獲剤を担持する基材を供給する工程；
（ｂ）前記基材を前記試料と接触させる工程であって、前記検出体が前記捕獲剤と結合する工程；
（ｃ）前記検出体を有する前記基材の部位に核形成中心を形成させる条件を供与する工程；
（ｄ）前記基材を、可溶性金含有分子または錯体および試薬からなる処理組成物と接触させる工程であって、金が核形成中心を有する基材上の部位に析出する工程；
（ｅ）前記基材上の前記試料に前記検出体が存在することを示す金属金析出物を検出する工程からなり、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンである方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）が
（ｃ１）前記検出体に対する特異的な結合親和性を有し、金属粒子、金属原子のクラスターおよび金属含有錯体からなる群の１つまたはそれ以上である少なくとも１つの核形成中心と結合した少なくとも１つの部位を有する核形成中心形成剤を供給する工程；および
（ｃ２）前記基材を前記核形成中心形成剤と接触させる工程からなる請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記検出体が、抗原および抗体または抗原結合領域を有する抗体誘導体；糖およびレクチン；レセプターおよびリガンド；ヌクレオチド配列および相補性を有するヌクレオチド配列；ヌクレオチド配列およびその結合タンパク質または他の特異的結合剤；ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；セルロースまたはキチンおよびセルロース結合領域からなる結合対の一方であり、前記少なくとも１つの部位が前記結合対の他方である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｂ）が
（ｂ１）前記試料を核形成中心と接触させる工程であって、核形成中心が金属粒子、金属原子のクラスターおよび金属含有錯体からなる群の１つまたはそれ以上であり、試料が存在すると、前記核形成中心が検出体と結合する条件を付与する工程；および
（ｂ２）前記基材を前記捕獲剤と結合した修飾検出体と接触させる工程からなる請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
検出体が、抗原および抗体または抗原結合領域を有する抗体誘導体；糖およびレクチン；レセプターおよびリガンド；ヌクレオチド配列および相補性を有するヌクレオチド配列；ヌクレオチド配列およびその結合タンパク質または他の特異的結合剤；ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；セルロースまたはキチンおよびセルロース結合領域からなる結合対の一方であり、前記捕獲剤が前記結合対の他方である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記捕獲剤を電極間の基材上に担持さることによって、工程（ｄ）において前記核形成中心が前記電極間に電気的接点を形成するようにし；かつ
工程（ｅ）における金析出物の検出を前記電極間の電流−電位の関係を測定することによって行なう請求項２０、２１、２２、２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの金属粒子、金属原子クラスターまたは金属含有錯体が金粒子または金原子含有クラスターである請求項２０、２１、２２、２３、２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
前記処理組成物が水溶液である請求項２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
前記試薬がヒドロキノンである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
【請求項３０】
金含有分子または錯体である可溶性金供給剤および試薬からなる処理組成物を含み、基材との接触によって、金が核形成中心を含有する基材の部位にのみ析出し、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンである請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
さらに、前記基材上の１つまたはそれ以上の部位に核形成中心を形成するための核形成中心形成剤を含み、前記核形成中心形成剤がそれぞれ少なくとも１つの核形成中心部分に結合した前記１つまたはそれ以上の部位に存在する物質に特異的な結合親和性を有する少なくとも１つの部分を有し、前記部分が金属粒子、金属原子のクラスターおよび金属含有錯体からなる群の１つまたはそれ以上である請求項２９または３０記載のキット。
【請求項３２】
試料中の検出体を分析するための請求項２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の方法において使用するためのキットであって：
（ｉ）前記検出体に結合する捕獲剤を担持した基材；
（ii）前記検出体が固定化される基材の部位にある核形成中心形成剤；
（iii）可溶性金含有分子または錯体および試薬からなり、金が基材上の核形成中心を有する部位においてのみ基材上に析出する処理組成物からなり、
前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であり、
前記試薬が、ヒドロキノンまたはナフトヒドロキノンであるキット。
【請求項３３】
前記核形成中心形成剤が、核形成中心および前記核形成中心を前記検出体に結合させるために必要な物質からなる請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
さらに、それぞれ、前記検出体に特異的な結合親和性を有する少なくとも１つの部分を有し、金属粒子、金属原子のクラスターおよび金属含有錯体からなる群の１つまたはそれ以上である少なくとも１つの核形成中心部分と結合する核形成中心形成剤を含む請求項３２記載のキット。
【請求項３５】
前記基材が、２つまたはそれ以上の電極からなり、前記捕獲剤が電極間の隙間に担持されている請求項３２、３３または３４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、基材への金メタルの化学析出に関する。
【０００２】
［発明の背景］
金属物質を基材に析出させる様々な技術や用途がある。このような様々な方法では、析出する金属は、たとえば水溶液に可溶な錯体または分子の形態で提供される。適当な条件下において、錯体または分子を減圧し、基材上に金属をさせる。
【０００３】
このとき、溶液から基材への金属の析出を確実にするために、基材に核形成中心（nucleation centers）を最初に供給することが好ましい。このような核形成中心は、たとえば表面に析出または付着した様々な金属錯体、クラスターまたは小さな金属粒子である。
【０００４】
金属析出を含む技術の具体例としては、写真、光学顕微鏡または電子顕微鏡に対する様々なイメージ形成法または潜在的なイメージコントラスト拡大技術である。金属錯体を基材上に析出させる実験室的な技術の他の具体例としては、たとえばタンパク質または核酸といった分離生成物のイメージングや、クロマトグラフィまたは電子泳動技術に存在する。
【０００５】
このような技術において最も一般的に使用される金属は銀である。しかしながら、銀析出における典型的な欠点は、析出は完全に特異的ではなく、核形成中心へのアプリオリな析出無しに、銀の自発的な析出もある程度進行するであろうことである。このように、イメージ拡大またはコントラスト拡大法で銀析出が使用される場合には、一般的に限られた信号−ノイズ比である。
【０００６】
［発明の記載］
本発明は、その目的のひとつとして、基材上の特異な部位へ金を析出させる方法を提供することである。本発明の他の目的は、このような方法に使用する組成物およびキットを提供することにある。
【０００７】
本発明にしたがえば、金含有分子、クラスターまたは錯体といった可溶な金供給剤に最初に含まれた金を、核形成中心に析出させる。ここで使用する用語“核形成中心”とは、金含有分子または錯体から金メタルへ金を変換する触媒的な特性を有する塩、錯体、クラスター、または粒子をいう。金属表面を有する粒子は、たとえばコロイド金属粒子、金属原子を有する様々な金属錯体、クラスターなどである。
【０００８】
本発明によれば、基材上の１つまたはそれ以上の部位に金を析出させる方法を提供するものであって、該方法は、
（ａ）前記１またはそれ以上の部位に核形成中心を結合、析出または形成する工程、
（ｂ）前記１またはそれ以上の部位に、前記金供給剤および試薬からなる処理組成物を接触する工程であって、前記組成物は速度論的に安定であって、核形成中心が基材上に存在しないかぎり、金メタルは本質的に基材には析出せず、および前記１またはそれ以上の部位における核形成中心の存在下で、金原子が、前記金供給剤から放出され、前記核形成中心に析出して、前記１またはそれ以上の部位に金メタル析出物が形成される工程
からなる。
【０００９】
理解されるように、一度金が基材上に析出すると、さらなる金析出に対する核形成中心として機能する。金析出（いくつかは、後で略述する）に影響する他の条件とともに、加温放置時間（incubation time）を適切に制御することによって、析出部位へ析出する金の量を制御できる。さらに、初期の金析出は、基材上の別個の部位で行なわれるが、金析出物を析出させ、つづいてさらに成長させることによって、別個の部位は結合し、そのような結合部位を包み込むようなひとつのより大きな金析出物を形成する。
【００１０】
用語「実質的に析出しない」とは、溶液からの金の分離がないことを意味し、金原子は可溶分子または錯体中にとどまり、基材への金メタル析出は無視できて、全くまたはほとんど観察および観測できない程度であって、高いシグナル対ノイズ比を示すことを意味する。
【００１１】
第1の態様によれば、核形成中心は、１つまたはそれ以上の部位への核形成中心形成剤の化学的または物理的析出によって形成される。他の態様によれば、このような核形成中心は、前記１つまたはそれ以上の部位に、金属イオン、とくに銀イオンが金属銀へ酸化されるレドックス反応によって、化学的に形成されるであろう。このような核形成中心の化学的形成は、それ自体公知である（たとえば、ＷＯ９９／０４４０２およびＰＣＴ／ＩＬ９９／００２３２参照）。
【００１２】
他の態様によれば、核形成中心は、前記１つまたはそれ以上の部位に、核形成中心形成剤を結合することによって、形成する。このような薬剤は、前記１つまたはそれ以上の部位に対して結合親和性（特異的または非特異的であることができる）を有する１種以上の結合部分からなり、その部分は１種以上の核形成中心部分と結合している。核形成中心部分は、金メタル析出に対して触媒として作用する種であって、たとえば金属原子または金属含有錯体の塩、金属粒子、クラスターである。結合部分は、たとえば認識グループの他のメンバーが形成し、前記１つまたはそれ以上の部位に含まれる認識グループの１メンバーである。認識グループ、典型的には認識カップルは、一方から他方へ結合親和性を有する２つまたはそれ以上の物質からなる。認識グループは、以下のカップルのいずれであってもよいが、これらに限定されない。すなわち、抗原と抗体または抗原の結合ドメインと相補性を有する抗体誘導体；砂糖とレクチン；レセプターとリガンド；ヌクレオチドシーケンスと相補性を有するヌクレオチドシーケンス；ヌクレオチドシーケンスとその結合タンパク質または合成結合剤；ビオチンおよびアビジン（avidin）またはストレプトアビジン（streptavidin）；セルロースまたはキチンおよびセルロース結合ドメイン。
【００１３】
核形成中心部分は、金粒子または金原子を含むクラスターであることが好ましく、たとえばＡｕ11、Ａｕ55またはＡｕ147（それぞれ１１、５５または１４７金原子を含む金クラスター）である。処理組成物は、典型的には水溶液である。前記金供給剤は、ＡｕI（ＳＣＮ）2-などの金錯体であることが好ましく、通常アルカリ金属（たとえばＮａ+、またはＫ+）またはアンモニウム塩の形態である。
【００１４】
処理組成物における試薬は、還元剤であってもよい。前記金供給剤がＡｕI（ＳＣＮ）2-であれば、試薬はキノン、たとえばハイドロキノン（ＨＱ）またはナフトハイドロキノン（ＮＨＱ）であることが好ましい。しかしながら、金含有分子または錯体を還元し金メタルを得る他の試薬も用いることができるが、速度論的な制限（たとえば高い活性化エネルギーおよび低いプレエクスポネンシャル因子）のため、核形成中心が存在しないと、無視できる速度で、核形成中心が存在すると、意味ある速度（すなわち、長すぎない時間間隔で観測できる結果を生じる速度）で起こるであろう。
【００１５】
酸性媒体中でＡｕI（ＳＣＮ）2-およびＨＱからなる処理組成物は安定であり、これは金が溶液に可溶な種として存在し、固体金属のような沈殿物を核形成中心以外の固体基材に堆積させないことを意味する。このような処理組成物のｐＨが約６以下であれば、処理組成物は特に安定である。核形成中心と接触させることによって、金メタルは核形成中心からなる基材の部位に堆積される。
【００１６】
金メタルの析出速度は、たとえば処理組成物のｐＨの制御によって制御でき、ｐＨの増加によって金析出の速度は増加し、ｐＨの減少によって析出速度は減少するであろう。さらに、析出の速度は様々な他の手段によっても制御できるであろう。たとえば、処理組成物のフローパラメータの制御（早いフローによって、たとえば金析出の速度を減少させるＣＮ-などの副生成物による汚染を防止する）；析出速度を増加または減少させることができる界面活性剤を添加する（たとえばポリアミン、ポリ酸またはポリアルコール、および他の界面活性剤が金析出の速度を変える効果を有するであろう）。さらに、たとえば前述したような物などの種々の添加物の使用によって、堆積した金の表面の粗さが変化する（このような変化によって堆積した金の色調および電気特性が変化するであろう）。
【００１７】
本発明の方法は、基材上の部位における特定の物質の存在と濃度を評価するために使用できる。このような方法は以下の工程からなる。
（ａ）前記基材を有する部位に核形成中心を形成させる条件を供給する工程、
（ｂ）前記基材を、前記金供給剤および試薬からなる処理組成物と接触させる工程であって、前記組成物は速度論的に安定であって、このような露出において、核形成中心が基材上に存在しない限り、金メタルは本質的に基材上に堆積せず、前記部位に核形成中心が存在すると、金原子は前記金供給剤から放出され、前記核形成中心上に堆積し、前記部位に金メタルが形成される工程、；および
（ｃ）前記基材上の金析出物を検出する工程であって、基材上の部位における金析出物が前記部位における前記物質の存在を示す工程
【００１８】
この分析方法は、たとえば（光学または電子顕微鏡であることができる）顕微鏡による試料の視覚化を含む技術、もしくはあらゆるＳＰＭ（ ）技術などの様々な分析技術に、または基材上の特定の分離生成物（たとえば、ゲル中またはＤＮＡチップなどの固体基材上に含まれる電気泳動またはクロマトグラフィーの分離生成物）の同定に適用できる。このような分析においては、特定の結合親和性を有する部分が認識グループのひとつのメンバーである前記核形成中心形成剤の使用によって、核形成中心が形成される。この認識グループは前述のものであって、分析される試薬は、そのグループの他方のメンバーである。
【００１９】
他の実施の形態によれば、本発明の金析出方法は、試料中の検出体の存在を検出することを意図する分析に使用される。とくに、本発明は、基材上に保持された捕獲剤が用いられ、捕獲剤に特異的に結合した試料中の検出体を検出するような方法に適用することができる。このような捕獲剤は認識グループのメンバーであって、検出体はそのグループの他のメンバーである。特定の具体例としては、試料中のターゲットオリゴヌクレオチドの存在を分析する場合であって、捕獲剤はそれらと相補性を有するシーケンスを有するオリゴヌクレオチドである。核形成中心形成部分は、試料中に存在する検出体、たとえば試料中のヌクレオチドに結合することができ、そして試料を基材と反応させた後で、前述の金析出反応を実行し、金析出物の形成によって試料中に検出体が存在することが示される。
【００２０】
本発明である顕微鏡でのイメージ化のための試料の作成方法は、以下の工程からなる。
（ａ）試料の選択的部位に核形成中心を形成させるための条件を提供する工程、
（ｂ）前記試料を、前記金供給剤および試薬からなる処理組成物と接触させる工程からなり、前記組成物は速度論的に安定であって、核形成中心が基材上に存在しないかぎり、金が本質的には試料に析出せず、それによって前記金供給剤から金原子は放出され、前記選択的部位の前記試料上に堆積する工程
【００２１】
本発明である試料中の検出体の存在を検出する方法は、以下の工程からなる。
（ａ）もし、試料中に存在するのであれば、試料を処理し、核形成中心形成部分を検出体に結合させる工程、
（ｂ）基材と試料を反応させ、前記検出体に特異的に結合した捕捉剤を保持し、さらに非結合試料部分を取り除く工程、
（ｃ）前記基材を、前記金供給剤および試薬からなる処理組成物と接触させる工程であって、前記組成物は速度論的に安定であって、核形成中心が基材上に存在しないかぎり、このような処理によって金メタルが本質的には基材には析出せず、前記部位における核形成中心の存在下で、金原子は前記金供給剤から放出され、前記核形成中心に堆積し、前記部位に金メタルを形成する工程；および
（ｄ）前記基材上の金堆積物を検出する工程であって、金堆積物が試料中に存在する検出体の存在を示す工程
【００２２】
この方法は、具体的にはオリゴヌクレオチドチップ内で使用される。オリゴヌクレオチドチップは、チップ上の別の部位に置かれた、別の捕獲されたオリゴヌクレオチドを有している。前記方法を使うと、試料内の別のオリゴヌクレオチドの多数を同時に分析することができる。
【００２３】
そのように調製した試料では、前記選択的な部位が、それおらを視覚化する金の被膜を有する。前記選択的な部位は、通常、特定の物質を持っており、そして、核形成中心が、前記特定の物質と特異的な結合親和力のある部分を持つ核形成中心形成剤により、前記部位において形成される。この方法により、例えば、特定のセル、細胞器官、特性の物質に富んだ部分などを、はっきりと視覚化することができる。
【００２４】
特定の分離生成物の配置を同定する本発明による方法は、次のステップを有している：
（ａ）前記特定の分離生成物を含有する前記基材上にある部位で、核形成中心を形成することのできる条件を提供し；
（ｂ）前記金供給剤と試薬からなる処理組成物と前記基材とを接触する（この組成物は動的に安定であり、金は主に、核形成中心がある基材のうえに析出し、それにより、そのような接触によって前記金供給剤からの金原子は解放され、金の金属を形成するために、前記核形成中心上に析出する）
（ｃ）基材上に金が存在することを検出する（この金は、金が見つかった部位の基材上に前記特定の分離生成物があることを示している）
【００２５】
試料を、適用条件下の培地（通常、ゲルまたは固体）を通して、異なった基材の異なった移動速度により様々なフラクションにわける分離技術、例えば電気泳動、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などにおいて、核形成中心形成剤は、分離の前に試料と混合される。これは、通常好ましい。このように核形成中心形成剤を最初に追加することは、必要な物質が少ないので、より経済的であろう。さらに、このような薬剤は、分離の後で基材に適用され、培地の中に位置している分離した基材に到達するために、培地を通して拡散されなければならない；そのような拡散は、分離したフラクションの特有の金着色（gold-staining）での限界因子（limiting factor）である。しかしながら、すぐに認識されるので、分離の後に核形成中心形成剤を時々加えることも、可能である。
【００２６】
本発明はまた、試料内の検出体の存在を分析する方法も提供する。そのような方法は、以下のステップを有している：
（ａ）前記検出体と結合する捕獲剤を担持する基材の提供；
（ｂ）前記検出体を前記捕獲剤と結合することによる前記基材と前記試料の接触；
（ｃ）前記検出体を有する前記基材の部位に核形成中心を形成させる条件の供与；
（ｄ）前記基材と前記金供給剤を含む処理組成物の接触。この組成物は動的に安定であり、金は主に、その上の部位に核形成中心がある基材のうえに析出する；
（ｅ）前記基材上にある金属の金の被膜（前記試料に前記検出体が存在することを示す）の検出。
【００２７】
試料内の検出体の存在を分析する方法のステップ（ｅ）の検出は、基材上の金被膜の出現を試みることで達成するだろう（金被膜は、サイズやラフさによるが、黄色からオレンジ、赤色の範囲の色を有しているだろう）。
【００２８】
本発明の一形態のとおりに、ステップ（ｅ）での検出は、金被膜の電気伝導度に基づく。この形態において、捕獲剤は、基材上の電極の間に担持され、または１つ、あるいはそれ以上の電極上に担持される。そしてステップ（ｄ）の核形成中心上の金被膜は、電極間の電気的接触をもたらす。ステップ（ｅ）での金被膜の検出は、電極間の電気的接触の存在を明らかにすること、たとえば、電極間の電流−電位の関係を測定することにより、達成される。電流電位の関係の大きさは、試料の試薬濃度の基準として使用することができる。あるいはまた、電極対の間、または上に担持された同じ捕獲剤をもつ類似した電極対の大きな配列における接続の数を明らかにすることで、検出体濃度の定量的な測定も得られるだろう。
【００２９】
分析された検出体は、上述の評価カップルのいずれかのメンバーとなるだろう。カップルの他のメンバーは、捕獲剤の一部分として含まれている。ステップ（ｃ）の核形成中心の形成は、金属粒子、金属原子を含んだクラスター、あるいは金属含有錯体、金を含んだ分子種を金のメタルにする触媒作用特性をもつ他の種などの核を形成する部分と結合された捕獲剤によって基材上に捕獲された検出体と特定の結合親和力をもつ結合部分を有する薬剤の提供である。例えば、検出体は結合対のメンバーであるが、その結合部分はもう一方のメンバーだろう（たとえば、検出体が抗原である場合、その核形成中心形成剤は、捕獲剤として使用される抗体として同じ、あるいは違う抗体であることができる）。本発明は、上記方法で使用するキットもまた提供する。そのようなキットは、通常、処理組成物より構成されている。加えて、そのようなキットはまた、基材の特定の部位に核形成中心形成剤を含んでいる。例えば、上記の結合対のいずれかのメンバーである特定の結合部分を有している。加えて、上記分析方法で使用するキットはまた、いくつかの形態によると、核形成中心を形成する部分を持つ試料の検出体にしるしをつけるための試薬システムを含むことができる。さらには、発明のいくつかの形態にある通り、このキットは、電極の間、および／または上に配置された捕獲剤をもつ電極を有する基材を含むことができる。
【００３０】
発明を理解するため、実施においてどのように達成されるかを見るために、限定されない例として、時折図面を参照しながら、好ましい態様を記載する。
【００３１】
［好ましい実施の形態による詳細な説明］
処理組成物の調製と通常の金析出のスキーム
本発明の好ましい実施の形態に関する処理組成物は、金を含有する錯体−ＡｕIＳＣＮ-を含む。この処理組成物を調製するために、最初の段階では、ＫＡｕIIIＣｌ4とＫＳＣＮを含む溶液を、２つのストック溶液（通常は、金を含む錯体を含有するものとＫＳＣＮを含むもの）を混合することにより、調製する。たとえば、そのような溶液は、約０．５ＭのＫＳＣＮを含む第１の溶液と０．０５ＭのＫＡｕIIIＣｌ4を含む第２の溶液を同じ量混合することで、形成される。混合の結果、ＫＡｕ（ＳＣＮ）4の錯体が形成される（図１のスキーム（ａ））。この錯体は、沈殿するが、自然にＫＡｕI（ＳＣＮ）2錯体を形成する。通常、ＫＡｕIII（ＳＣＮ）4が沈殿した後、洗浄し、再び水、あるいは緩衝液中に件濁させると、上記したように自発的に反応する（図１のスキーム（ｂ））。
【００３２】
ＫＡｕI（ＳＣＮ）2溶液は、例えば、約０．０５５Ｍのヒドロキノン（ＨＱ）などの還元剤と混合される。ヒドロキノンによる金を含有する錯体の還元は、好ましくは熱を発生するが、大きな活性化エネルギーと低い前指数（pre-exponential）因子のために、速度はとても低い。ｐＨが約６より低いと、自発的な還元は事実上ゼロである。したがって、溶液は安定しており、金のメタルは、自発的に析出しない。
【００３３】
しかしながら、図１のスキーム（ｃ）のように、核形成中心（ＮＣ）にさらすことにより、触媒として作用し、例えば金コロイドや、他の金属コロイド、金属原子のクラスター、金属含有錯体、金属イオンなどであることができ、ベンゾキノン（ＢＱ）の形成とともに、金メタル（Ａｕ）は核形成中心の表面に析出する。
【００３４】
ｐＨレベルは、金の析出速度をコントロールする。溶液の酸性化、すなわちｐＨの低下は、金属の析出をおそくし、一方、塩基を加えると、すなわちｐＨの向上は、金属の析出速度を早める。
【００３５】
塩基性のｐＨ下では、金の自発的な析出は、核形成中心がなくても起こることを特筆しておかなければならない。
【００３６】
処理溶液に最初から加わっていたり、析出の過程で加えられた様々な添加物は、金の析出過程の速度や金被膜のパターン（被膜のサイズや、表面の粗さ、色など）に影響を与えうる。例えば、処理組成物にハロゲンイオンを加えると、成長する金属中心の表面に害をおよぼす。これは、金の析出過程の速度を減少させ、ついには停止させてしまう。このような添加物を使用すると、析出した金の結晶性、粒子サイズ、金の析出速度、析出した金の表面粗さ、電気的特性などをコントロールすることができる。金の析出過程は、様々な他のパラメータ、たとえば、温度、酸素濃度、光束（light flux）、溶液の攪拌速度などの変化によってもコントロールされうる。
【００３７】
本発明の金の析出過程は、以下で説明するいくつかの例とは別にも様々に応用することができる。
【００３８】
試料の検出体の検出
発明の１形態に関する分析は、図２に示されている。この形態では、装置２０は、電気伝導性の電極２３を担持する非伝導性の基材２２を備えている。基材２２は、電極間の隙間に、捕獲剤２４を備えている。捕獲剤２４は、分析されるべき検出体２６と特定の結合親和力を有している。
【００３９】
検出体２６を含む試料Ｓは、核形成中心２８を加えられ、核形成中心が、共有結合、あるいは非共有結合により検出体と結合されて、修飾検出体３０が生成する方法で処理されることにより前処理されている。オリゴヌクレオチド検出体の場合、このような結合は、例えば、シス−プラチナ−ビオチンの存在下で試料を加熱し、適切に誘導されたクラスター、例えば、Ａｕ55（Ｐｈ3Ｐ）12Ｃｌ6−ストレプトアビジン（streptavidin）クラスターを加えることにより生じるだろう。シス−プラチナ−ビオチンは、オリゴヌクレオチドと結合し、Ａｕ55（Ｐｈ3Ｐ）12Ｃｌ6−ストレプトアビジンは前記ヌクレオチド上のビオチン部分と結合する。そして核部分が検出体と結合する。非ヌクレオチド検出体の場合は、例えばアミノ誘導したクラスターまたはコロイドが検出体のカルボキシ部分と結合すること；カルボキシ誘導したクラスターまたはコロイドを検出体のアミノ部分に結合すること；またマレイミド誘導したクラスターやコロイドを検出体のチオール部分と結合することなどによって、結合されうる。試料のほかの基材もまた、この過程の核形成中心によりしるしが付されうる。しかしながら、それらは捕獲剤２４とは結合しない。さらにそれらに結合した核形成中心は、処理後に基材上に残っていない（下記参照）。
【００４０】
デバイス２０に接触して、改質検出体３０が捕獲剤と結合し、基材２２上に固定化された核形成中心形成錯体３２を生成する。基材の洗浄は、結合されていない物質（ＮＢ）を取り除く。
【００４１】
デバイス２０は、そののち、ＫＡｕI（ＳＣＮ）2などの金含有錯体およびヒドロキノン（ＨＱ）などの還元剤からなる処理溶液３４と接触してもよく、結果的に核形成中心２８と接触して、金は核形成中心上に堆積し、電極２３間を繋ぐ連続的な金塊３６を形成する。電極２３が核形成中心として働くのを防ぐために、それらは、触媒性能に欠ける伝導性材料、たとえば、長鎖のアルキルを有しシリカで不活性化した、または、不活性材料でコーティングして不活性化したシリコンからなってもよく、電極が金属からなる場合、金堆積触媒として不活性にするために、たとえば、１−オクタデシル−チオールなどの長鎖のアルカンチオールを含む溶液でインキュベートすることによって、それらを前処理してもよい。
【００４２】
電流−電圧の関係を、測定装置４０を用いて測定することによって、その存在が分析される試料中の検出体の存在を示す電極２３間の電気接点の存在を決定することができる。
【００４３】
一般に当業者によって予測されるように、捕獲剤の基材への結合は、多くの方法によって達成することができる。たとえば、酸化物表面を（ＣＨ3ＣＨ2Ｏ）3Ｓｉ−Ｒ−Ｘなどのシリコン試薬で誘導することができる。ここで、Ｒは、アルキル、アリールまたは他のスペーサーであることができ、Ｘは次の捕獲剤の部位Ｙとの結合のための活性部位であることができる。ＸとＹの性質は、その組み合わせにより、当業者によく知られ、明らかなように、酸とアミン、ヒドロキシと酸、付加環化反応、ラジカル反応、求核置換、非共有結合などからなる組み合わせから選択することができる。基材が高分子材料からなる場合、結合は、前記の型の反応またはそのほかのもののいずれによっても、捕獲剤と高分子材料の側鎖との間でも達成できる。
【００４４】
デバイス２０は２つまたはそれより多い電極、典型的には配列された複数の電極を有することができる。その配列は、異なる幾何学的配置と仮定することができる。同じ捕獲剤を異なる電極対の間に担持させることができ、および／または、異なる捕獲剤を異なる電極間に堆積することができる。後者の種類のデバイスは、多くの検出体を同時決定するための多重分析に使用することができる。さらに、同じ捕獲剤を異なる電極対の間に担持させる場合は、検出体濃度の定量分析を実行することが可能となりうる。たとえば、濃度は、異なる電極対の間に形成される電気接点の数に基づいて分析することができる。多くの電気接点は高い濃度を示し、少しのものは低い濃度に対応する。
【００４５】
電極配列は、また、様々な部品、たとえば、ダイオード、トランジスタ、コンダクタ、コンデンサなどからなるより複雑な電気的配置の一部とすることができる。
【００４６】
また別の本発明に係わる分析の実施の形態を、図３に見ることができる。図３の実施の形態の場合における図２に記載されたものとの主な違いは、核形成中心２８を検出体２６に結合して改質検出体３０を得るために扱う試料Ｓよりも、むしろ図３の実施の形態の場合では、核形成中心形成剤１５０が供給されることにある。この検出体の他の成分は、図２のものと非常に類似しており、したがって、図２で使用したものを１００（すなわち“１”プリフィックス）で移行した同じ参照番号を、３図において、同じような成分を示すために利用した。
【００４７】
デバイス１２０を試料と接触させたのち、検出体１２６を捕獲剤１２４と結合させ、そして試料に含まれる遊離した（結合していない（ＮＢ））検出体分子および他の物質を洗浄したのち、デバイスを、今は捕獲剤１２４と結合している検出体１２６に対して特異的な結合親和性を有する部位１５２を含み、核形成中心１５４に結合した核形成中心形成剤１５０と接触させる。このように、固定化核形成中心１３２が、電極１２３間の隙間の基材に形成される。つぎに、結合されていない薬剤１５０（ＮＢ）を除去し、処理組成物１３４を添加したのち、電極間に、図２に示されるのと同様にして決定することのできる電気接点を与える金塊１３６を形成する。
【００４８】
さらに別の本発明に係わる分析の実施の形態は、図４に見られる。図４では、図２および３と同様の要素を、１００（すなわち“２”プリフィックス）で移行された図２で使用したものと同じ参照番号で特徴付けた。検出体２２６を含む試料Ｓをビオチン２２７と反応させ、検出体ビオチン錯体２３１を有する処理試料Ｓ’を生成させる。これらを、つぎに、電極２２３間に取り付けられた捕獲剤２２４を有する基材２２２に接触させて、基材２２２上に改質捕獲錯体２３３を生成させる。
【００４９】
金のコロイド粒子２４０をアビジンまたはストレプトアビジン２４２と反応させ、核形成中心形成剤２４３を生成させる。薬剤２４３を改質基材２２２と接触させて固定化核形成中心２３５を生成させる。つぎに、その対象物を図２および３と同様に処理溶液２３４と接触させて、金を堆積させ、電極２２３間に連続的な金塊２３６を形成することができる。
【００５０】
当業者によって予測されることが疑いもないように、前記に示された実施の形態に様々な変更を施すことが可能である。
【００５１】
分離生成物の視覚化
本発明の方法は、ゲル電気泳動、ゲルろ過技術、サイズ排除クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、および他のものなどの多くの分離技術において得られた分離生成物を視覚化するために用いることができる。これは概念的に図５に図示されている。
【００５２】
基材２００は、様々なレーン２０２を有するゲルまたは固体基材であることができ、各レーンは複数のバンド２０４を含み、各バンドは各レーンで分離された試料の特定のフラクションである。前記基材２００は、前述したいずれの技術によっても得ることができる。
【００５３】
特定の物質の存在を視覚化し、そのバンドの位置を突き止めるために、核形成中心２１０においてその物質に特異的に結合する部位２０８を有する核形成中心形成剤２０６を、基材２００に接触させ、接触（アクセス）ののち、薬剤２０６を洗い流し、基材を処理溶液２１２と接触させ、結果的に金の堆積物２１４がその物質を含むバンド上に形成される（他のバンドは見えず、図示する目的のためだけに描かれている）。しかしながら、後で添加された核形成中心形成剤の拡散は、これらの薬剤が分離された物質に結合するのを達成する制限因子となりうるので、好ましくは、核形成中心形成剤２０６は、分離過程の始まる前に基材に添加する。
【００５４】
とりわけ堆積された金塊の表面の粗さを決定することになる厳密な堆積条件によれば、バンドの色は黄色から黒の間で変化しうる。様々な視覚化技術を用いれば、バンドの吸光度または透過率の測定に基づいて、分離された物質の定量を行なうことができる。
【００５５】
一方、光学的技術よりも、むしろ金の堆積をさまざまな電気検出技術によって検出することもできる。これは、たとえば、自動電気検出を可能にする分離マトリックスを挟む２つの平行配列の電極を付与することによって達成することができる。
【００５６】
画像技術におけるコントラストの促進
ある構成要素を見るためにコントラスト剤を必要とする多くの画像技術がある。そのようなものは、原子力顕微鏡などの他の画像技術と同様に、光学顕微鏡、電子顕微鏡（透過電子顕微鏡、走査電子顕微鏡）における場合である。これまで、前記画像技術には、銀金属堆積や炭素堆積および他のいくつかがあった。
【００５７】
生物学的な試料の場合は、コントラスト促進剤が特定の組織、細胞、細胞器官などの視覚化を可能にするために必要とされる。
【００５８】
本発明に合わせて、図６に図示されるように、目に見えない細胞器官３０４を有する細胞３０２からなる生物学的試料３００を、細胞器官３０４に含まれる物質に特異的な結合部位３０８、および核形成中心３１０を有する核形成中心形成剤３０６に連続してさらすことにより、本発明に沿って処理し、処理組成物３１２で処理すると、細胞器官３０４は、暗いまたは不透明な堆積物３１４として目に見える。
【００５９】
オリゴヌクレオチドハイブリッドの画像化
特定配列のオリゴヌクレオチドの存在と濃度を分析することは、現在では、物質のわかった位置に結合させた相補性のシークエンスからなるオリゴヌクレオチドプローブを使用して、典型的に行なわれている。特別な、そして広く用いられている前記システムの例は、いわゆるＤＮＡ−チップである。前記チップは、表面のわかった、そして、考慮した位置に、複数のオリゴヌクレオチドプローブ配列を担持する表面である。試料は、チップ上のプローブ配列と相補性を有するターゲット配列を含んでもそうでなくてもよいが、すべてのＤＮＡフラグメントが（通常、蛍光ラベルによって）ラベルされるように処理する。試料をチップの表面と適切な条件のもとで接触させると、ターゲットオリゴヌクレオチドは、表面に相補性配列を担持している位置において結合する。ハイブリッド生成物の検出は、通常、ラベルされた重複部位の蛍光に続けて行なわれる。ハイブリッド生成物の位置はプローブの配列を示し、蛍光強度は表面の濃度を示す。
【００６０】
今、光学的技術（吸収、反射）、非光学的視覚化技術（ＡＭＦ、ＳＴＭなど）などの様々な可能な視覚化技術を用いて、ハイブリッド生成物をＤＮＡ−チップ上で視覚化するのに、本発明の金の堆積方法を応用することを示す図７について言及する。疑いなく予測されるように、これは、一般にプローブのターゲットへの視覚化結合、たとえば、ｃ−ＤＮＡストランドの相補性ストランドへの結合、抗体の抗原への結合、他の種類の知られている組み合わせのために、本発明の方法を使用する一例に過ぎない。
【００６１】
ＤＮＡ−チップ基材４００は、複数のＤＮＡプローブサイトを担持するが、３つ４０２、４０４および４０６が例示されており、それぞれが異なるヌクレオチド配列を有している。ターゲットオリゴヌクレオチド４１０を含むことのできる試料Ｓを、溶液中のすべてのＤＮＡ種がラベル４１２によってラベルされるような方法で処理し、（もし検出体がＳ中に存在するならば）改質検出体を含むことのできる改質試料Ｓ’を得る。改質試料Ｓ’をＤＮＡ−チップ物質４００と適切な条件下で接触させると、もし改質試料Ｓ’に存在するならば、ターゲットオリゴヌクレオチドに、チップ上のＤＮＡプローブが選択的にハイブリッドすることが可能となる。チップを洗浄したのち、もしチップの異なる部位に存在するならば、ラベルされたオリゴヌクレオチドのラベル４１２に結合することができるように、核形成中心形成剤４３０をシステムに導入する。洗浄ののち、核形成中心は、チップ上のプローブと溶液からのターゲットとの間でハイブリッド化が起こる位置にのみ存在する。ハイブリッドの視覚化は、本発明の金堆積方法を適用することによって達成され、チップ上の核形成中心から金の粒子が成長し、光学的技術、ＳＰＭ技術（ＡＦＭ、ＳＴＭなど）などの様々な技術を用いて金４４０の粒子を検出する。
【００６２】
別の実施の形態では、ラベルは、それ自体で核形成中心として働く。そのような場合、核形成中心をラベルに結合させる工程は省略される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施の形態による処理組成物の合成方法の反応スキーム（スキーム（ａ）とスキーム（ｂ））と、核形成中心にある金被膜の反応スキーム（スキーム（ｃ））を示す図である。
【図２】  本発明の実施の形態による試料上の検出体の分析の概念を示した図である。
【図３】  本発明の別の実施の形態による検出体の分析の概念を示した図である。
【図４】  本発明のさらに別の実施の形態による検出体の分析の概念を示した図である。
【図５】  クロマトグラフィーまたは電気泳動により分離された、固体またはゲルの基材上にある特定の結合を強調する方法の概念を図解した図である。
【図６】  マイクロスコープ試料の特定の部分の像のための本発明の実施の形態による方法の概念を図解した図である。
【図７】  ある試料のこの特定の例において、検出体、すなわち、特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの検出のシステムの使用を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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