(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全体として正味の電荷を個別的に有する分子から主としてなる燐脂質から本質的になる両親媒性物質を含有するガスの微細気泡の水性分散体であって、この燐脂質の少なくとも75％が、全体として正味の負電荷を個別的に有する分子からなる微細気泡の水性分散体を含む超音波造影剤。
【請求項２】
一つまたはそれ以上のホスファチジルセリンが燐脂質の少なくとも70％を占める請求項１記載の超音波造影剤。
【請求項３】
ガスが六弗化硫黄または過弗素化された低分子量の炭化水素を含む請求項１または２記載の超音波造影剤。
【請求項４】
ガスがパーフルオロブタンである請求項３記載の超音波造影剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微細気泡の分散体を注射可能な水性担持液体中に含む、診断用検査に使用するための超音波造影剤。
【請求項６】
ｉ）膜形成性の燐脂質を含有する水性媒体中にガスを分散して脂質で安定化させたガスの微細気泡の分散体をつくり；
ii）この分散体を低温からの保護剤および／または液からの保護剤の存在下で凍結乾燥して、膜形成性の脂質の１つまたはそれ以上の層によって取り囲まれている、ガスで満たされた空洞または小腔を含む、低温からの保護剤および／または液からの保護剤の基質からなる乾燥された生成物をつくり；そして
iii）注射可能な水性担持液体中でこの乾燥生成物を復元する
工程を包含する、請求項５記載の造影剤を製造するための方法。
【請求項７】
工程（ｉ）で使用するガスが六弗化硫黄または過弗素化された低分子量の炭化水素である請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）で使用する脂質を含有する水性媒体がアルコールおよびポリオールから選択される一つまたはそれ以上の添加剤をさらに含有する請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
工程（ii）に先立って、工程（ｉ）でつくられる脂質で安定化された分散体が洗浄され、微細気泡が寸法的に分画される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
低温からの保護剤および／または液からの保護剤が生理的に許容される糖である請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
低温からの保護剤および／または液からの保護剤が蔗糖である請求項10記載の方法。
【請求項１２】
全体として正味の電荷を個別的に有する分子から主としてなる燐脂質から本質的になる両親媒性物質の１つまたはそれ以上の層によって取り囲まれており、ガスで充満された多数の空洞または小腔を含む、低温からの保護剤および／または液からの保護剤からなる凍結乾燥された微細気泡を放出する基質であって、この燐脂質の少なくとも75％が、全体として正味の負電荷を個別的に有する分子からなる基質。
【請求項１３】
低温からの保護剤および／または液からの保護剤が炭水化物である請求項12記載の基質。
【請求項１４】
一つまたはそれ以上のホスファチジルセリンが燐脂質の少なくとも70％を占める請求項12記載の基質。
【請求項１５】
ガスが六弗化硫黄または過弗素化された低分子量の炭化水素を含む請求項12〜14のいずれか１項に記載の基質。
【請求項１６】
ガスがパーフルオロブタンである請求項15記載の基質。
【請求項１７】
第１の成分として、その低温からの保護剤および／または液からの保護剤が蔗糖であり、そしてガスがパーフルオロブタンである請求項14記載の基質を含み、また第２の成分として注射可能な水性担持液体を含み、これらの第１および第２の成分がそれぞれ二連チャンバー式保管手段の第１および第２のチャンバーに入っている超音波造影剤組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は診断のための画像形成に使用する新規なガスを含有する造影剤、一層特定的に燐脂質で安定化されたガスの微細気泡からなるこのような造影剤そしてこのガス含有造影剤を製造する方法に関する。
超音波画像形成は例えば血管系特に心搏記録での血管系の研究および組織の微少血管系の研究での潜在的な価値のある診断用具であることはよく知られている。このようにして得られる音響画像を強化するために、固体粒子の懸濁液、乳化された液滴、ガス気泡およびカプセル封入されたガスまたは液体を含めて種々の造影剤が提案されている。容易に圧縮されうる低密度の造影剤はそれが作り出す音響的後方散乱の点で特に効率的であることが一般に認められており、従ってガスを含む系およびガスを発生する系を製造するのにかなりの関心が示されている。
ガスを含有する造影媒体は、例えば、磁気共鳴（MR）信号の強度を減少するように働く磁化率造影剤（susceptibility contrast agents）として磁気共鳴画像形成に有効であることも知られている。酸素を含有する造影媒体もまた、有用でありうる常磁性MR造影剤を代表するものである。
さらにＸ線画像形成の分野では、二酸化炭素のようなガスが経口陰画造影剤または血管内造影剤として使用されうることが認められている。
放射性ガス例えばキセノンのような不活性ガスの放射性同位体もシンチオグラフィーにおいて血液プールの画像形成のために提案されている。
生理的に許容できる物質を心臓内注入することにより生体内で発生された遊離のガス気泡が関与する初期の研究では、このような気泡の超音波検査法での造影剤としての潜在的有効性が例証されている。このような技術はしかしながら遊離気泡の寿命が短いために実用するのに厳しい制限がある。従って、例えば乳化剤、油、増粘剤または蔗糖を使用することにより、または様々な系においてガスまたはその前駆体を例えばガスを含有する多孔性微細粒子としてまたはカプセル封入されたガスの微細気泡として同伴しまたはカプセル封入することによる、超音波心臓検査法および他の超音波検査のためのガス気泡を安定化する方法に関心が示されている。
ガス含有超音波造影剤の成分たる燐脂質として使用することに関して一連の先行技術がある。従って例えば、ガスまたはガス前駆体を含めて封じ込められた組成物を脂質の２重層が取り囲む燐脂質を超音波造影剤として使用することがUS−A−4900540に開示されている。カプセル封入される物質は典型的には重炭酸ナトリウム水溶液のようなガス前駆体であり、これは投与後に人体のpHに曝露されることにより二酸化炭素を発生するといわれている。従って得られるリポソームの核には、寸法が小さいため限られたエコー発生能しか示さない極めて小さい微細気泡を含有する液体からなる傾向があろう。
WO−A−9115244は液体で満たされたリポソームの懸濁液中で生成された空気または他のガスの微細気泡からなる超音波造影媒体を開示しており、リポソームは微細気泡を明らかに安定化させる。このような系は空気または他のガスがリポソーム中にある上記のUS−A−4900540と系とは異なる。
WO−A−9211873には、微細気泡を吸収しかつ安定化することにより超音波造影剤として役立つように目論まれた水性調合物が記載されており、この組成物はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンポリマーと負に荷電した燐脂質とを含む。ポリマーと燐脂質との重量比は典型的には約３：１である。
ガスで満たされたリポソーム、つまりその中に液体を実質的に含まないリポソームからなる超音波造影剤、およびこれの真空乾燥によるガス注入法による製造がWO−A−9222247に記載されている。ゲル状態での振動による注入法によるこのようなガスで満たされたリポソームの製造はWO−A−9428780中に記載されている。ジパルミトイルホスファチジルコリンからなる、超音波造影剤としてのガスで満たされた脂質二重層に関する報告が、Investigative Radiology 29，Supplement 2 S134−S136（1994）中にUngerらによりなされている。
WO−A−9409829には少なくとも一つの燐脂質安定剤を含む水性担持液中のガス微細気泡の注射可能な懸濁液を開示しており、担持体中の燐脂質の濃度は、0.01重量／重量％より小さいが、ガス微細気泡−液体の界面だけに燐脂質分子が存在する量に等しいかまたはそれより大きい。燐脂質の量は従ってガス微細気泡のまわりに界面活性剤の一つの単層を形成するのに必要な程度に少ないであろうし、得られるフィルム状構造はつぶれまたは合体（coalescence）に対して気泡を安定化する。このような低い燐脂質濃度を用いる場合、リポソーム様の界面活性剤二重層を有する微細気泡は得られないといわれている。
別な一連の先行技術は、造影媒体の安定性およびエコー発生効果の持続時間のような特性を強化するために、ガス微細気泡を含む超音波造影剤のためのガスの選定に関する。従って例えば、WO−A−9305819では、
Ｑ＝4.0×10-7×ρ／CsD
（ここでρはkg.m-3単位のガス密度であり、Csはモル.1-1単位の水溶性でありまたＤはcm3.秒-1単位の溶液中のガスの拡散率である）
であるとして係数Ｑが５より大きいガスの遊離微細気泡の使用が提案されている。この必要を満たすといわれているガスの長大なリストが示されている。
EP−A−0554213では、標準条件下にある水１リットルあたりのガスのリットル数をガスの分子量の平方根で除したもので表される水中の溶解度が0.003を越えない少なくとも一つのガスをガスで満たされている微細気泡に導入することにより、この微細気泡に加圧下のつぶれに対する抵抗力が与えられるであろうことが示唆されている。好ましいガスには六弗化硫黄、六弗化セレンおよび種々のFreon▲Ｒ▼があるといわれている。このようなガスは上記したWO−A−9215244中に記載されている種類の燐脂質を含む組成物中で特に使用されてよい。
SchneiderらはInvestigative Radiology 30（8）（1995年）の451〜457ページ中で、ポリエチレングリコール4000を、燐脂質ジステアロイルホスファチジルコリンとジパルミトイルホスファチジルグリセロールとの混合物と組み合わせることにより明らかに安定化される六弗化硫黄で満たされた微細気泡をベースとする新規な超音波ホログラフィー造影剤について記載している。空気でなく六弗化硫黄を使用すると心収縮期に左心内で起きるような圧力増加に対する抵抗力が改善されるといわれている。
WO−A−9503835はガス混合物を含む微細気泡の使用を提案しており、これの組成は、微細気泡寸法に対する浸透圧の影響をおりこむように微細気泡の内側および外側の双方でのガスの分圧を考慮することに基づいている。代表的な混合物は、低い蒸気圧を有しまた正常な血液中または血清中の溶解度に限界があるガス（例えばフロオロカーボン）を正常な血液中または血清中に存在するガスとよりすみやかに交換する別なガス（例えば窒素、酸素、二酸化炭素またはこれらの混合物）と組み合わせたものからなる。
WO−A−9516467は、ガスＡおよびＢの混合物を含有する超音波造影媒体であって、ガスＢが0.5〜41容積／容積％の量で存在し、80ダルトンより大きい分子量を有しまた標準条件下で水１mlあたり0.0283mlより少ない水溶性を有し、混合物の残りがＡであるものの使用を示唆している。代表的なガスＡには空気、酸素、窒素、二酸化炭素およびこれらの混合物がある。代表的なガスＢには六弗化硫黄のような弗素を含むガスおよび種々な過弗素化炭化水素がある。このような造影媒体中での好ましい安定化剤には燐脂質がある。
先行技術の造影剤中で有用であるといわれる燐脂質にはレシチン（つまりホスファチジルコリン）、例えば卵黄レシチンまたは大豆レシチンのような天然レシチン、およびジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスファチジルコリンのような合成的なまたは半合成的なレシチン；ホスファチジン酸；ホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；カルジオリピン；スフィンゴミエリン；以上のいずれかの混合物およびコレステロールのような別な脂質との混合物がある。レシチン誘導体は、おそらくは天然の源泉から容易に入手できることのため、一般に最も広く使用される燐脂質であるように思われる。コレステロールのような添加剤を50重量／重量％までの量で使用することは、WO−A−9115244およびWO−A−9409829に開示されているが、一方、安定性を強化するために負に荷電した脂質（例えばホスファチジルセリンまたは脂肪酸）を少なくとも少量（例えば約１モル％）含めることがWO−A−9222247中で示唆されている。WO−A−9428780の好ましい燐脂質組成物は、87：８：５のモル割合のジパルミトイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール5000で置換されたジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンおよびジパルミトイルホスファチジン酸からなる。WO−A−9409829およびWO−A−9516467の典型的な混合燐脂質組成物は重量割合が約100：４であるジアラキドイルホスファチジルコリンとジパルミトイルホスファチジン酸からなるが、ただし後者の明細書では等重量のジステアロイルホスファチジルコリンとジパルミトイルホスファチジルグリセロールとの使用も例示している。
造影媒体として使用するために提案されている現用の燐脂質を含有する微細気泡懸濁液では、含まれる燐脂質の少なくとも50％はレシチンのような天然の燐脂質からなることが、上記から明らかであろう。最も普通には、荷電した燐脂質は少割合例えば約５％しか存在しない。
本発明は、微細気泡を含有する造影剤の本質的に唯一の両親媒性成分として優勢に荷電した燐脂質を使用すると、製品安定性および音響特性のようなパラメータに関して大きなそして予想外の利益をもたらすという発見に基づいている。理論的な考察によって練られることは本発明者らの望むところでないが、荷電した燐脂質の膜どおしの間の静電気の反揆力により、微細気泡−胆持液体の界面に安定でありまた安定化する単層の形成が促進され；このような薄膜の可撓性および変形性により、一つまたはそれ以上の脂質二重層からなるガスで満たされたりリポソームと比較して、本発明の製品のエコー発生能（echogenicity）が強化されるであろうと考えられる。
本発明者らは、荷電した燐脂質を使用すると、別な界面活性剤および（または）粘度増大剤のような添加剤に頼ることなく、例えば安定性、分散性および合体への抵抗力に関して有利な特性を有する微細粒子造影剤を提供することができ、これによって造影剤を注射する際に患者の体に投与される成分の数を最少に保つことが確実になるということも見出している。従って例えば、微細気泡の荷電した表面は、静電気の反撥力の結果、微細気泡の凝集を最少にしあるいは防止する。
従って本発明の一つの態様によれば、燐脂質を含む両親媒性物質によって安定化されたガスの微細気泡の水性担持液中の懸濁液からなる、診断的検査で使用するための造影剤であって、上記の両親媒性物質が主として正味の電荷（net charge）を有する分子からなる燐脂質から本質的になることを特徴とする造影剤が提供される。
本発明の造影剤中の燐脂質物質の少なくとも75％、望ましくは実質的にすべては製造および（または）使用の条件下で全体として正味の電荷を有する分子からなるのが好ましく、またこの電荷は正であってよいが、より望ましくは負でありうる。正に荷電した代表的な燐脂質には、ジパルミトイルホスファチジン酸またはジステアロイルホスファチジン酸のようなホスファチジン酸とヒドロキシエチレンジアミンのようなアミノアルコールとのエステルがある。負に荷電した燐脂質の例には天然産のもの（例えば大豆または卵黄から誘導されるもの）、半合成のもの（例えば部分的にまたは完全に水素化された）および合成されたホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびカルジオリピンが含まれる。このような燐脂質の脂肪アシル基は例えばパルミトイル基およびステアロイル基におけるように典型的には約14〜22個の炭素原子をそれぞれ含むであろう。このような荷電した燐脂質のリソ型のものは、本発明によればまた有用で、この「リソ」という用語はただ一つの脂肪族アシル基を含む燐脂質を指しこの基は、グリセリル部分の１位置の炭素原子にエステル結合しているのが好ましい。このようなリソ型の荷電した燐脂質は脂肪族アシル基を二つ含む荷電した燐脂質と混合して使用されるのが有利であろう。
ホスファチジルセリンは本発明の造影剤で使用するのに特に好ましい燐脂質でありまた造影剤が最初に含む燐脂質の実質的な部分、例えば少なくとも80％、例えば85〜92％を占めるのが好ましいが、ただしこれはついで加熱安定化のような後続する処理において、ある程度まで、例えば約70％まで、減少されうる。このような処理によっては遊離の脂肪酸のような燐脂質でない劣化生成物を例えば10％までの水準で生成するに至ることがわかるであろう。燐脂質から本質的になる両親媒性物質という場合、このような遊離な脂肪酸を含む燐脂質が包含される。本発明者らは理論的な考察に縛られることを好まないが、隣りあうセリン部分のカルボキシル基のアミノ基との間のイオン性の架橋は、例えば良好な圧力安定性により証明されるように、ホスファチジルセリンを含む系の安定性に貢献するであろう。好ましいホスファチジルセリンには飽和した（例えば水素化されたかまたは合成的な）天然のホスファチジルセリンおよび合成的なまたは半合成のジアルカノイルホスファシジルセリン例えばジステアロイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンおよびジアラシドイルホスファチジルセリンが含まれる。
このようなホスファチジルセリンをベースとする造影剤を使用することの重要な利点は、身体が、老化した赤血球および血小板をその表面上のホスファチジルセリンの濃度が高いことによって、これらを認識し、従って赤血球を除去するのに似た仕方でこのような造影剤を血流から除去するであろうことである。さらに、このような造影剤の表面は身体によって内生的であると記憶（registered）されるであろうから、造影剤は血液力学作用および、ある種のリポソーム調合物の投与に伴う別なアナフィラキシー反応のような不都合な全身的副作用を誘発するのを回避するであろう（例えばWO−A−9512386を参照）。このことを裏づけるように、血圧または心搏度数の変化のような急性の有害な作用は、画像形成のための通常の投与量の10倍までの投与量で本発明の造影剤の静脈内に大投与量（intravenous boluses）で注射されたイヌでの動物実験で何ら認められない。
本発明の造影剤には任意の生体適合性ガスが使用されてよく、本明細書で用いる場合、「ガス」という用語には人体の平熱37℃でほとんどまたは完全にガス（蒸気も含め）状の任意の物質（混合物も含めて）が包含される。従ってガスは空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトンのような不活性ガス；六弗化硫黄、十弗化二硫黄または五弗化トリフルオロメチル硫黄のような弗化硫黄；六弗化セレン；テトラメチルシランのような場合によってはハロゲン化されたシラン；低分子量炭化水素（例えば７個までの炭素原子を含む）例えばメタン、エタン、プロパン、ブタンまたはペンタンのようなアルカン、シクロブタンまたはシクロペンタンのようなシクロアルカン、プロパンまたはブテンのようなアルケンまたはアセチレンのようなアルキン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化された低分子量の炭化水素（例えば７個までの炭素原子を含む）；または上記したいずれかの混合物から例えばなる。ハロゲン化されたガスのハロゲンの少なくともいくつかは弗素原子であるのが有利である。かくして生体適合性のハロゲン化された炭化水素ガスは例えばブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびパーフルオロカーボン例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン（例えばパーフルオロ−ｎ−ブタン、場合によってはパーフルオロイソブタンのような別な異性体と混合されたもの）、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサンおよびパーフルオロヘプタンのようなパーフルオロアルカン；パーフルオロプロペン、パーフルオロブテン（例えばパーフルオロブタ−２−エン）およびパーフルオロブタジエンのようなパーフルオロアルケン；パーフルオロブタ−２−インのようなパーフルオロアルキン；およびパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルシクロブタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサンおよびパーフルオロシクロヘプタンのようなパーフルオロシクロアルカンから選ばれうる。ハロゲン化された別なガスには弗素化された例えば過弗素化されたケトン例えばパーフルオロアセトンおよび弗素化された例えば過弗素化されたエーテル例えばパーフルオロジエチルエーテルがある。
特に安定な微細気泡懸濁液（例えば前記したSchneiderらの文献参照）を形成することの知られた弗化硫黄またはフルオロカーボン（例えばパーフルオロカーボン）のような弗素化されたガスを本発明の造影剤中に使用するのが有利であろう。微細気泡の内部および外部の双方での分圧を、そして結果としての微細気泡寸法への浸透圧の影響を考察することに基づいたガス混合物、例えば窒素または空気のような血液中に比較的可溶であるガスとパーフルオロカーボンのような血液中に比較的可溶でないガスとの混合物が、例えばWO−A−9503835に記載のように、所望なら使用されてよい。
しかしながら本発明者らは、例えばホスファチジルセリンによって安定化されたパーフルオロブタンのようなパーフルオロアルカンの微細気泡からなる本発明の造影剤は、患者への静脈内投与の後に寸法が驚くほど安定しており、また酸素、窒素および二酸化炭素のような血液ガスが、それ以上の増大が認められない最大寸法に急速に到達することなく、内側に拡散する結果、上記のようなガスの微細気泡がすでに述べたように制御不能に大きくなるという傾向を示さないことを見出している。血管の毛細管の好ましくないそして極めて危険であるおそれのある閉塞を生じうる際限のない寸法の増大をこのように回避することは、本発明の造影剤の主な利点である。
パーフルオロブタンのようなパーフルオロアルカンからなる本発明の造影剤は、生体内で典型的に遭遇する圧力と同様の圧力下で驚くべき高い安定性を示すことも見出されており、例えば、300mmHgまでの過剰圧（例えば空気の）に90秒曝露された後、正常な寸法分布およびエコー発生特性（echogenic properties）をほとんど完全に（例えば少なくとも90％）回復することが示される。
本発明の造影剤はシンチグラフィー、光画像形成、超音波画像形成、MR画像形成およびＸ線（軟Ｘ線を含めて）画像形成を含む各種の診断用画像形成技術で使用されてよい。診断用超音波画像形成およびMR画像形成において本発明の造影剤を例えば磁化率造影剤として使用することは本発明の好ましい特質をなす。超音波による応用においては、例えば、基本波および高調波のＢモード画像形成ならびに基本波および高調波のドップラー画像形成を含めて各種の画像形成技術が用いられてよく、所望ならば三次元画像形成技術を用いうる。造影剤は例えばUS−A−5601085および国際特許出願No．PCT／GB96／02413に記載されているように相関技術を基礎におく超音波画像形成法で使用されてもよい。
イヌでの生体超音波試験では、本発明の造影剤は、体重１kgあたり１〜20nlという少ない投与量の微細気泡を静脈内注射をした後、心筋からの後方散乱の信号強度が15〜25dB増大させるであろう。色彩ドップラー技術またはドップラーから誘導される技術のような感受性の一層大きい技術、例えばLancet（1968年）の1253ページにTuckerらにより、Ultrasonics（1981年）の217〜224ページにMillerにより、J．Acoust．Soc．Am．75巻（1984年）の1473〜1477ページにNewhouseらにより述べられているような振巾をベースとするドップラー技術または非線型の技術を用いることにより、より低い投与量でさえ信号を観察することができよう。このように低い投与量では、心室のような血液で満たされた区画内での減衰が、心筋の脈管構造内の関心ある領域の視覚化を可能とするのに十分に少ないことが判かっている。試験によると、静脈内に注射されるこのような造影剤が、血管プール全体にわたって分配されることにより脈管構造化されたすべての組織のエコー発生能を強化し、また循環されることも示されている。この造影剤は一般的なドップラー信号の強化助剤として有用なことも見出されており、また超音波によって算出される断層撮影法および生理学的に誘発されるあるいは断続的な画像形成に追加的に有用でありえよう。
肺組織を通っての自由流通を許容しまた約0.1〜15MHzの好ましい画像形成周波数で共鳴を惹起するために、エコー心搏記録法のような超音波的応用に関して、平均寸法が0.1〜10μm例えば１〜７μmである微細気泡を使用するのが便利であろう。本発明者らはエコー心搏記録法にとって好ましい範囲内にある、微細気泡分散体の極めて狭い寸法分布を有する造影剤が本発明により得られることと、このことによって造影剤のエコー発生能および生体中の安全性が著しく強化されまた造影剤の血圧測定、血流の追跡および超音波断層撮影法のような応用で特に有利になることを見出している。かくして例えば、微細気泡の90％超（例えば少なくとも95％、望ましくは少なくとも98％）が１〜７μmの範囲の直径を有しそして微細気泡の５％未満（例えば３％以下、望ましくは２％以下）が７μmを超える直径を有する製品が容易に製造されうる。
超音波的応用において本発明の造影剤は例えば、注射される燐脂質の量が基本波Ｂ−モード画像形成の場合、体重１kgあたり0.1〜10μg、例えば１〜５μgの範囲にあるような投与量で投与されうる。このような低水準で燐脂質を使用することはありうる有害な副作用を最少にするのに実質的に有利であることが認められるであろう。さらに、有効な投与量で存在する低水準の燐脂質は、有害な作用なしに観測時間を延長するように投与量を増大させうる。
本発明の造影剤の注射の可能な形の燐脂質の全体の濃度は0.01〜２重量／重量％、例えば0.2〜0.8重量／重量％、望ましくは約0.5重量／重量％の範囲にあるのが便利である。
本発明者らは、現存の多くの造影剤処方物中で普通に使用される、乳化剤および（または）粘度増加剤のような添加剤を本発明の造影剤中に含ませることは一般に不必要であることを見出している。上記したように、このことは患者の身体に投与される成分の数を最少に保ちまた造影剤の粘度ができるだけ低いことを確実にするのに有利である。しかしながら、以下に一層詳細に論じるように、この造影剤を製造するのに凍結乾燥工程が関与するので、低温から保護するそして（あるいは）液から保護する作用を有する一つまたはそれ以上の薬剤および（または）一つまたはそれ以上のバルキング剤例としてはアルコール、例えばｔ−ブタノールのような脂肪族アルコール；グリセロールのようなポリオール；グリシンのようなアミノ酸；炭水化物例えば蔗糖、マンニトール、トレハロース、ぶどう糖、乳糖またはシクロデキストリンのような糖、あるいはデキストランのような多糖類；またはポリエチレングリコールのようなポリグリコールを含ませるのが有利であろう。低温から保護するそして（あるいは）液から保護する作用を有する薬剤の有力な一覧表は、Acta Pharm．Technol．34（3）（1988年）の129〜139ページに示されており、その内容を参照によって本記載に加入する。蔗糖のように生理学的に十分に許容される糖を、製品を等張性またはある程度高張性にするような量で使用するのが好ましい。
例えばWO-A-9409829中に記載されているような先行技術の微細気泡を含む造影剤は、粉末化された界面活性剤、例えば凍結乾燥された予めつくられたリポソーム、凍結乾燥または噴霧乾燥された燐脂質溶液を、空気または他のガスと、次いで水性担持体と接触させ、微細気泡の懸濁液を生成するように撹拌することにより典型的に製造され、この懸濁液は製造の直後に投与されなければならない。しかしながらこのような方法は、所要の分散体を生成するのにかなりの追加的エネルギーが付与されねばならずまた微細気泡の寸法および寸法分布が供給されるエネルギーの量に依存し、従って実際には制御できないという欠点をもつ。
本発明者らは、所望なら予めオートクレーブ処理されあるいは別な仕方で殺菌されていてよい燐脂質を含有する適当な水性媒体中でガスの微細気泡の分散体を生成した後、この分散体を凍結乾燥にかけて、乾燥された復元（reconstitutable）可能な製品を生成することによって本発明の造影剤が有利に製造できることを今般見出したのである。両親媒性物質が正味の電荷を有する分子から主としてなる燐脂質から本質的になる両親媒性物質を含有する水性媒体中のガスの微細気泡の懸濁液の凍結乾燥された残留物から例えばなるこのような製品は、本発明の更なる特徴をなす。乾燥された製品が、低温から保護するそして（あるいは）液から保護する薬剤を一つまたはそれ以上含有する場合、この製品は両親媒性物質の一つまたはそれ以上の層によって取り囲まれている、ガスで満たされた実質的に球形の空洞または小腔を含み、低温から保護するそして（あるいは）液から保護する（例えば炭水化物の）、微細気泡を放出する基質から例えばなってよい。
一層特定的に本発明者らは、上記のように製造される乾燥された製品は、水、塩水のような水溶液（注射用の最終製品が高張性でないようにバランスがとられるのが有利であろう）、または塩（例えば生理的に許容できる対向イオンを有するプラズマ陽イオンの塩）、または糖、糖アルコール、グリコールおよび例えばゆっくりと手で振盪することによって得られるような最少の撹乱のみを必要とする非イオン性の他のポリオール物質（例えばぶどう糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）のような張性を調節する一つまたはそれ以上の物質の水溶液のような水性媒体中で特に容易に復元可能であることを見出している。このようにしてつくられる微細気泡の寸法は常に再現性があり、また実際には最初の微細気泡分散体中で形成される微細気泡の寸法によって決まり、加えられる撹乱エネルギーの量とは無関係である。驚くべきことにこの寸法パラメータは、凍結乾燥された製品および復元された製品で実質的に保持されるのである。かくして最初の分散体中の微細気泡の寸法は、方法、撹拌速度および撹拌時間のようなプロセスパラメータによって容易に制御されうるので、微細気泡の最終的寸法は容易に制御されうるのである。
本発明の凍結乾燥された製品は周囲条件下で数カ月にわたる保存安定性を有することが証明されている。水中または水溶液中での復元で生成された微細気泡の分散体は少なくとも12時間安定でありうるもので、注射に先立って乾燥製品がいつ復元されるかについてかなりの融通性が与えられる。
本発明の造影剤を製造するための上記した方法は、中性のおよび荷電した脂質（例えば燐脂質）の双方ならびにこれらの混合物を含めて膜形成性脂質によって安定化されたガスの微細気泡の注射可能な水性担持液体中の懸濁液からなる造影剤を製造するのに一般に適用できる。このような方法は、
ｉ）膜形成性液体を含有する水性媒体中のガス微細気泡の分散体を形成させ、
ii）このようにして得た脂質で安定化されたガス分散体を凍結乾燥して脂質を含有する乾燥生成物を得、そして、
iii）この乾燥生成物を注射可能な水性担持液体中で復元する
工程からなり、この方法の工程（ｉ）および（ii）に従って得ることのできる復元可能な乾燥生成物、例えば膜形成性脂質物質の層によって取り囲まれ、ガスで満たされている実質的に球形の空洞または小腔を含む微細気泡を放出する基質（例えば低温からの保護／液体からの保護を行う）からなる製品とともに、本発明の更なる特徴点をなす。
例えば工程（ｉ）は、選択したガスの存在下で脂質を含有する水性媒体を、適当な何らかの乳濁液を形成する技術例えば超音波処理、振盪、高圧均質化、高速撹拌または高剪断混合、例えば回転子−固定子ホモジナイザーを使用するもので処理することにより実施されてよい。所望なら水性媒体は、粘度増加剤としてそして（あるいは）アルコールまたはポリオール例えばグリセロールおよび（または）プロピレングリコールのような、脂質のための溶解助剤として役立つ添加剤を含有してよい。
乳化工程で使用されるガスは、最終製品で所望とするものである必要はない。従って含まれるこのガスのほとんどは後続する凍結乾燥工程に際して除去されてよくまた残留するガスは乾燥製品を排気することによって除去され、続いてこの乾燥製品が所望の最終製品のガスの雰囲気下におかれることができる。従って乳化ガスは、最終製品を考慮にいれることなく、乳化工程パラメータを最適化することに絞って選定されうる。本発明者らは、六弗化硫黄のような弗化硫黄または望ましくは４個または５個の炭素を含むパーフルオロアルカンもしくはパーフルオロシクロアルカンのような弗素化炭化水素ガスの存在下での乳化は、微細気泡の寸法が一定でありまた狭く分布している最終製品を究極的に得るという点で特に有利であることを見出している。
乳化はおおよそ周囲温度例えば約25±10℃で実施されるのが便利である。燐脂質の水和、従って分散を容易にするために最初水性媒体を加熱し、次いで乳化に先立って放置して周囲温度に平衡させることが必要かも知れない。
工程（ｉ）で得られるガス分散体、特に、正味の電荷を有する分子を主として含む燐脂質から本質的になる両親媒性物質によって安定化されたガスの微細気泡の水性分散体は本発明の特徴をなす。このような分散体のあるものは、脂質の親水性部分で架橋されているまたは重合されている一つまたはそれ以上の膜形成脂質によって安定化されたガスの微細気泡からなる診断用造影剤を製造するのに使用するための中間体として、本発明者らの国際特許公開No．WO−A−9640275中で開示されている。両親媒性物質がジパルミトイルホスファチジルセリン、一層特定的には単独のまたはジパルミトイルホスファチジルコリンと組み合わされたジパルミトイルホスファチジルセリンのナトリウム塩の形のものからなり、またガスが空気とパーフルオロペンタンとの混合物、空気とパーフルオロヘキサンとの混合物またパーフルオロブタンとパーフルオロヘキサンとの混合物であるこの中間体的分散体はここでは特許請求されない。
中間体であるため、これら分散体は無菌で、生理的に許容できる形で製造されてはいないであろうが、本発明の工程（ｉ）に従って得ることのできるガス分散体はそれ自体を造影剤として使用しようとするならば、無菌で、物理的に許容できる形で（水性担持液体として無菌で、発熱物質を含まない水または塩水を例えば使用することにより）製造されるであろうことは認識されよう。
工程（ｉ）によってつくられる分散体は、粘度増加剤および溶解助剤のような添加剤、そしてガスでないものを含有するコロイド粒子および望ましくないそして（あるいは）寸法が過大な微細気泡のような好ましくない物質を分離しそして除去するために、造影剤を使用するのに先立ちあるいは凍結乾燥工程の前に一つまたはそれ以上の洗浄工程にかけるのが有利であろう。このようにして得られる洗浄された微細気泡分散体は本発明の特徴点をなす。このような洗浄はそれ自体知られた方法で実施されてよく、微細気泡は浮選または遠心分離のような技術を用いて分離される。このようにして添加剤を除去しそして寸法分布が特に狭い微細気泡分散体もまた得る能力は、特に上記に示したように得られる寸法分布が凍結乾燥および復元の工程の後にほとんど保持されるので、本発明の方法の重要な利点である。従ってガス分散体、洗浄／分離、凍結乾燥および復元の工程からなる工程を用いるのが好ましい。
微細気泡の少なくとも90％が２μmの範囲の寸法を有する寸法的に分画された微細気泡分散体が製造でき、微細気泡は２〜５μmの範囲の体積平均直径を有するのが好ましい。このような分散体およびこれから誘導される、例えば以下に記載するような凍結されたおよび凍結乾燥された製品は本発明の別な特徴をなす。
一つまたはそれ以上の低温から保護するそして（あるいは）液から保護する一つまたはそれ以上の薬剤を使用する場合、これは洗浄工程の後、凍結乾燥の前に添加するのが有利でありうる。
ガス分散体の凍結乾燥は例えば、それを最初に凍結しそして凍結されたガス分散体を例えばそれ自体一般に知られた方法で凍結乾燥することにより実施されてよい。このような凍結されたガス分散体つまり、全体として正味の電荷をそれぞれ有する分子を主として含む燐脂質から本質的になる両親媒性物質によって安定化されるガスの微細気泡からなる、微細気泡を放出する凍結された水性分散体が、本発明の更なる特徴をなす。微細気泡は凍結に先立って望ましくは寸法的に分画されてよく、放出される微細気泡は２〜５μmの範囲の体積平均寸法を有するのが好ましい。このような生成物は凍結保存され、そして所望する時に例えば単に温めることそして（あるいは）担持液体を添加することにより融解されてよく、本発明の造影剤として有用な微細気泡の分散体が形成される。
所望の製品は投与に先立って前記の工程（iii）に従って通常復元されるであろうから、ガス分散体を、凍結乾燥に先立って密封可能なガラス瓶中に満たし、注射可能な形に復元するのに適当な量の、例えば一投与単位の凍結乾燥された製品がそれぞれ入ったガラス瓶を得るのが有利であろう。ガス分散体を大量にでなく個々のガラス瓶中で凍結乾燥することにより、凍結乾燥された製品の微妙なハニカム状構造の取り扱いおよびこの構造を少なくとも部分的に劣化する危険を回避しうる。凍結乾燥しそして場合によってはガスをさらに排気しそして最終的に処方される造影剤中で微細気泡として存在することの望ましいガスをヘッドスペースに導入した後、適当な栓によってガラス瓶は密封されうる。最終製品が含むガスを選定することができることは、最初の分散工程および後続する任意の洗浄／分離工程に際してプロセスパラメータを適当に選定することによって最終製品の微細気泡寸法を独立に制御できることと相俟って、微細気泡の寸法およびガスの含有率を独立に選ぶことを可能とし、これによって製品を特定の応用に適合させることができる。
凍結されたガス分散体または工程（ii）からの乾燥された生成物は一般に、例えば、含まれるガスを必要なままにそして（あるいは）所望のままに補給しあるいは交換した後、無菌で発熱物質を含まない注射用の水のような適当な無菌の注射可能な水性担持液体、塩水のような水溶液（注射用の最終製品が高張性でないようにバランスされるのが有利であろう）または張性を調整する一つまたはそれ以上の物質（例えば前述したようなもの）を添加することにより復元されうる。乾燥された生成物がガラス瓶に納められる場合、瓶は隔壁によって密封され、これを通じて担持液体が場合によっては予め充満された注射器を使用して注入されてよく；あるいは乾燥された生成物と担持液体とが二連チャンバー注射器のような二連チャンバーのある手段中で一緒に供給されてよい。復元に続いて製品を混合しあるいはゆるく振盪するのが有利であろう。しかしながら前記に示したように、本発明の安定化された造影剤では、ガスの微細気泡の寸法は、復元された乾燥生成物に加えられる撹乱エネルギーの量とはほとんど無関係であろう。従って微細気泡の寸法が一定した再現性のある製品を与えるためにゆっくりと手で振盪すること以上は必要でないであろう。
以下の非限定的な実施例は本発明を例示するためのものである。
【図面の簡単な説明】
添付の図面において、図１は実施例１の造影剤の膜中の荷電した燐脂質の相対的な量に対して、凍結乾燥および復元の後に残存する容積濃度の百分率をプロットしたものを表す。
図２は実施例２（ａ）の造影剤の、ａ）圧力試験以前に、ｂ）圧力試験の最中に、そしてｃ）圧力試験後に実施例６に記載のように測定した1.5〜８MHzの周波数範囲に対する減衰スペクトルのプロットを示す。
図３は実施例６に記載するように90秒間０〜300mmHgの過剰圧をかけた後に、実施例２（ａ）の造影剤の3.5MHzでの減衰の回復百分率を示す。
図４は実施例６に記載するように、ａ）過剰圧をかけずに（◆）、ｂ）90秒間150mmHgの過剰圧をかけた後（△）、そしてｃ）90秒間300mmHgの過剰圧をかけた後（■）Coulter分析によって測定した実施例２（ａ）の造影剤の体積寸法分布を示す。
実施例１
荷電した燐脂質の相対量の影響
後記する表１.１に示すプロセスパラメータを用い、以下に記す一般的手順に従って、異なる燐脂質または燐脂質混合物によって安定化された微細気泡の分散体をつくった。
プロピレングリコールとグリセロールとの（重量／重量比３：10の）混合物を5.4（重量／重量）％含有する水中の選定された燐脂質または燐脂質混合物の、２〜５mg／mlの燐脂質濃度を与える溶液を調製し（ホスファチジルエタノールアミンの場合、水酸化ナトリウムによって水をpH10.5に調整した）、超音波処理および（または）表１.１に記載する時間にわたって約80℃に加熱することにより燐脂質を水和しそして使用に先立って室温に冷却した。クロマトグラフィーの２mlのガラス瓶あたりの溶液の使用量を0.8〜１mlとし所定の体積の上記の溶液を２mlのガラス瓶のいくつかに分割した。各ガラス瓶のヘッドスペースをパーフルオロブタンガスで充満し、そしてこれらのガラス瓶をキャップで固く閉じそしてEspe CapMix▲Ｒ▼（歯科材料用の混合機）を使用して45秒間振盪した。得られる微細気泡の分散液をより大きなガラス瓶に移し入れそして2000rpmで５分間遠心分離し、微細気泡の浮遊層の下方に濁った下方液を得た。この下方液を注射器で除去しそしてpHが中性の等体積の水でおきかえた。洗浄工程を反復したが、今度は下方液を10（重量／重量）％の蔗糖でおきかえた。洗浄した分散体のそれぞれ２mlの部分を、凍結乾燥のために特別に設計されたいくつかの平底の10mlのガラス瓶に入れ、そしてこれらの瓶を−47℃に冷却しそして約48時間凍結乾燥して綿毛状の白色固形物質を得た。これらの瓶を真空チャンバーに移し、そして真空ポンプにより空気を除去しまたパーフルオロブタンガスによっておきかえた。使用に先立って水を添加しそしてこれらのガラス瓶を手でゆっくりと数秒間振盪し、超音波造影剤として好適な微細気泡の分散体を得た。
50μmの開口を備え測定範囲が１〜30μmであるCoulter Counter Mark II装置を移使用することにより微細気泡の寸法分布および体積濃度を測定した。20μlのいくつかの試料を室温下で空気によって飽和された200mlの塩水中に稀釈しそして測定に先立って３分間平衡させた。凍結乾燥の前の微細気泡の分散体（洗浄された気泡の分散体）および凍結乾燥の後の微細気泡の分散体（凍結乾燥の前と同じ体積となるまで水によって復元されたもの）に対して測定を行った。データを下記の表１.２に示す。
燐脂質で安定化された微細気泡の分散体の凍結乾燥の効率を、凍結乾燥および復元の後の体積濃度の残存百分率として算出した。図１のプロットはこのパラメータが膜中の荷電した燐脂質の相対量とともにいかに変化するかを示す。これから知り得るように、凍結乾燥の効率は膜中の荷電した燐脂質の量が増大すると増加し、荷電した燐脂質のみを含む膜について最大である。
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実施例２
ａ）パーフルオロブタンの微細気泡分散体の振盪による製造
プロピレリグリコールとグリセロールとの混合物（重量／重量比は３：10）を5.4（重量／重量）％含有する12.5mlの水に25.3mgの水素化卵黄ホスファチジルセリンを添加した。燐脂質物質を70℃に約30分加熱し、次いで室温に冷却することによって水和した。11mlの分散体を２mlのガラス瓶11個に１mlづつ分け入れ、そしてガラス瓶のヘッドスペースにパーフルオロ−ｎ−ブタンガスを充満した。ガラス瓶にしっかり栓をしそしてEspe CapMix▲Ｒ▼（歯科材料用の混合機）を使用して45秒間振盪した。得られる微細気泡の分散体をより大きい４つのガラス瓶の中に一緒にしそして2000rpmで５分間遠心分離し、微細気泡の浮遊層の下方に濁った下方液を得た。この下方液を注射器で除去しそしてpHが中性の等体積の水でおきかえた。洗浄工程を反復したが、今度は下方液を10（重量／重量）％の蔗糖でおきかえた。得られる分散体のそれぞれ２mlの部分を、凍結乾燥のために特別に設計されたいくつかの平底の10mlのガラス瓶に分け入れ、そしてこれらの瓶を−47℃に冷却しそして約48時間凍結乾燥して綿毛状の白色固形物質を得た。これらの瓶を真空チャンバーに移し、そして真空ポンプにより空気を除去しまたパーフルオロ−ｎ−ブタンガスによっておきかえた。使用に先立って水を添加しそしてこれらのガラス瓶を手でゆっくりと数秒間振盪し、超音波造影剤として好適な微細気泡の分散体を得た。
ｂ）回転子固定子混合によるパーフルオロブタン微細気泡分散体の製造
プロピレリグリコールとグリセロールとの混合物（重量／重量比は３：10）を5.4（重量／重量）％含有する100mlの水に500.4mgの水素化卵黄ホスファチジルセリンを添加した。混合物を振盪しそして80℃に５分間加熱し、室温に放冷し、再び振盪しそして使用に先立って１晩静置した。
得られる溶液を、首部が円錐状の丸底フラスコに50ml移し入れた。フラスコには25℃に保たれる水浴に接続する温度制御用流入口および流出口を有するガラス製ジャケットを装着した。回転子固定子混合シャフトを溶液中に入れそしてガスの漏洩を避けるために、首部の壁と混合シャフトとの間のすき間を、ガスの含有率を調節しまた圧力を制御するためのガス流入口／流出口を備えた特別に設計された金属製の栓で密封した。ガス流出口を真空ポンプに接続しそして溶液を１分間脱ガスした。次にガス流入口を通じてパーフルオロ−ｎ−ブタンガスの雰囲気を装入した。
開口部が液体表面の僅かに上方にあるように回転子固定子混合シャフトを保持して、溶液を23000rpmで10分間均質化した。白色のクリーム状分散体を得、これを密封可能な容器に入れそしてパーフルオロ−ｎ−ブタンでフラッシュした。次に分散体を分液漏斗に移しそして12000rpmで30分遠心分離し、上方にあるクリーム状の泡沫の層と濁った下方液とを得た。下方液を取り出しそして水でおきかえた。次に遠心分離を２回反復したが、この場合は12000rpmで15分間とした。最後の遠心分離の後、上澄み液を10（重量／重量）％の蔗糖でおきかえた。得られる分散体のそれぞれ２mlの部分を凍結乾燥のために特別に設計した10mlの平底のいくつかのガラス瓶に入れ、それらを−47℃に冷却しそして約48時間凍結乾燥し、綿毛状の白色の固形物質を得た。これらの瓶を次に真空チャンバーに移し、そして真空ポンプにより空気を除去しまたパーフルオロ−ｎ−ブタンガスによっておきかえた。使用に先立って水を添加しそしてこれらのガラス瓶を手でゆっくりと数秒間振盪し、超音波造影剤として好適な微細気泡の分散体を得た。
ｃ）超音波処理によるパーフルオロブタン微細気泡分散体の製造
プロピレングリコールとグリセロールとの混合物（重量／重量比は３：10）を5.4（重量／重量）％含有する100mlの水に500.4mgの水素化卵黄ホスファチジルセリンを添加した。混合物を振盪しそして80℃に５分間加熱し、室温い放冷し、再び振盪しそして使用に先立って１晩静置した。
この溶液を４mlのソニケータ（sonicator）流通セルを通過するようにポンプ送入して振巾90μmの20kHzの超音波に曝露した。ソニケータのホーンの直径は1.3cmであり、セルの内径は2.1cmでありまたホーンとセルの底部との間隔は１cmであった。脂質溶液は、それがソニケータセルに流入する前に体積／体積比１：２でパーフルオロ−ｎ−ブタンと混合した（20ml／分の脂質溶液と40ml／分のパーフルオロ−ｎ−ブタンガス）。温度を33℃に保った。白色でクリーム状の分散体を得、これを容器に満たしそしてパーフルオロ−ｎ−ブタンでフラッシュした。
特性把握
50μmの開口を有し測定範囲が１〜30μmであるCoulter Counter Mark II装置を使用して微細気泡の寸法分布および体積濃度を測定した。室温の空気で飽和された200mlの塩水中で20μlの試料を稀釈しそして測定に先立って３分間放置して平衡させた。
超音波での特性把握は、「Ultrasound scattering properties of Albunex microspheres」、Ultrasonics 31（3）（1993年）、175〜181に記載されているde Jong，N．およびHoff，Lのものから僅かに変更された実験装置で実施した。この計測器で造影剤の稀薄な懸濁液の２〜８MHzの周波数範囲での超音波減衰効率が測定される。減衰の測定に際して、試料を120mmHgの過剰圧下に90秒おくことにより圧力安定試験を行った。典型的には２〜３μlの試料を55mlのIsoton II中で稀釈しそして稀釈した懸濁液試料を分析に先立って３分間撹拌した。過剰圧解除後の3.5MHzでの回復減衰値とともに、3.5MHzでの減衰を一次応答パラメータとして用いた。
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実施例３
ガス交換の影響
上記の実施例２（ｂ）でつくった５つの試料が含むガスを空気、パーフルオロブタン、六弗化硫黄、五弗化トリフルオロメチル硫黄およびテトラメチルシランによってそれぞれ以下の手順に従って置き換えた。
実施例２（ｂ）の凍結乾燥した生成物を含む二つの試料をガス流入口およびガス流出口を有するデシケータに入れた。デシケータを
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に接続することにより、試料の排気および選定したガスの流入を制御するのを可能とした。約10ミリバールで５分間試料を排気した後、選定したガスを流入させることにより圧力を１気圧まで上げ、続いてガラス瓶に注意深く栓をした。選定したそれぞれのガスについて別な試料の組を用いてこの手順を反復した。
各々のガラス瓶に２mlの蒸留水を加えそして使用に先立ってガラス瓶をゆっくりと手で振盪した。得られる微細気泡の分散体を実施例２に述べたようにして寸法分布測定によって特性把握した。結果を表３.１に要約する。
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上記の結果から知れるように、ガス交換に際して寸法分布に著しい変化はなかった。
生体内での結果
５つのガスのそれぞれを用いて調製した一つのバッチを10MHzでのドップラー増強特性に関して生体内で評価した。分散体をチンチラウサギに耳の静脈から注射しそしてドップラー技術を用いて測定した。この際、超音波プローブを頸動脈上に直接置いた。信号の強度および継続時間を記録しまたドップラー曲線の積分値を算出した。得られる結果（下記の表３.２参照）は、パーフルオロブタンを含む微細気泡が最も強いドップラー強度の増強を生むことを示した。六弗化硫黄、五弗化トリフルオロメチル硫黄またはテトラメチルシランを含む微細気泡は、パーフルオロブタンを含むものと比較して効果が僅かに低く、パーフルオロブタンに関する積分値の60〜80％の範囲の値を与えた。
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実施例４
凍結された分散体および凍結乾燥された生成物
プロピレングリコールとグリセロールとの混合物（重量／重量比は７：20）を5.4（重量／重量）％含有する50mlの水に250mgの水素化卵黄ホスファチジルセリンを添加した。混合物を振盪しそして80℃に５分間加熱し、室温に放冷し、再び振盪しそして使用に先立って１晩静置した。
得られる溶液を、首部が円錐状の丸底フラスコに100ml移し入れ、そして実施例２（ｂ）に記載の手順に従って処理した。白色のクリーム状分散体が生成した。この分散体を分液漏斗に移しそして12000rpmで30分遠心分離し、上方にあるクリーム状の微細気泡の層と濁った下方液とを得た。下方液を取り出しそして注射用水でおきかえた。次に遠心分離を２回反復したがこの場合は12000rpmで15分間とした。得られる分散体の６mlに30（重量／重量）％のトレハロースを添加し；この分散体のそれぞれ２mlの部分を凍結乾燥のために特別に設計された平底のそれぞれ10mlのガラス瓶に分け入れ、そしてこれらのガラス瓶を−47℃に冷却しそしてこの温度で１日保存した。
−47℃で１日おいた後、ガラス瓶の半分を融解し、超音波造影剤として好適なガスの微細気泡の均質でクリーム状の白色分散体を得た。融解した分散体を上記の実施例２に記載したように寸法分布を測定することにより特性把握した（表４.１参照）。残りのガラス瓶を約48時間凍結乾燥し、綿毛状の白色固形物質を得た。これらの瓶を真空チャンバーに移し、そして真空ポンプにより空気を除去しまたパーフルオロ−ｎ−ブタンガスによっておきかえた。使用に先立って水を添加しそしてこれらのガラス瓶を手でゆっくり数秒間振盪し、超音波造影剤として好適な微細気泡の分散体を得た。実施例２に記載の方法を用いて寸法分布および音響減衰を測定することにより、再構成した生成物の特性把握を行った。結果を表４．１に示す。
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実施例５
空気で飽和した流体へのパーフルオロブタン微細気泡の曝露
凍結乾燥された物質を１気圧のパーフルオロブタンの下に含むガラス瓶を実施例２（ｂ）に記載のように用意した。使用の直前に瓶に水を加えて微細気泡の分散液を得た。
200mlのIsoton II液体を室温で数日間空気に曝露して、空気を十分に飽和した溶液を得た。別の200mlの液体を真空フラスコ内で１時間脱ガスしそして真空を保持しつつ室温に冷却した。使用の直前に空気をフラスコに導入した。
微細気泡の懸濁液のそれぞれ10μlの部分をそれぞれの液体に加えそして得られる混合物を寸法の特性把握（Coulter Multisizer Mark II）に先立って５分間定温放置した。
流体から微細気泡への拡散が期待できないであろう脱ガスされた環境では、微細気泡の平均直径は1.77μmでありまた微細気泡の0.25％は５μmより大きかった。空気で飽和した液体の対応する値は2.43μmおよび0.67％であった。さらに５分した後に反復して行った測定により、微細気泡の寸法が定常値に近づいたことが示された。
以上のように判ったことから、微細気泡が動脈血に似た空気で飽和した液体に曝露される時まで、微細気泡の平均直径がただの37％しか増大せず、極めて少量の微細気泡が毛細血管の閉塞を惹起するかも知れない寸法に達することが示される。このことはWO−A−9503835の実施例IIに記載されている類似の環境での空気／パーフルオロヘキサンを含む微細気泡（つまり空気を溶解して含む水中で著しく稀釈した分散液）の寸法が２倍になることと対比されることができよう。
実施例６
パーフルオロブタン微細気泡分散体の圧力安定性
凍結乾燥された物質を１気圧のパーフルオロブタンの下に含むガラス瓶を実施例２（ａ）に記載するように用意した。使用の直前に水（２ml）を加えて微細気泡の分散体を得た。
300mmHgの空気過剰圧をかける前、かける際およびかけた後の、1.5〜８MHzの減衰スベクトルを記録し、90秒後に圧力を解除した。結果を図２に示す。この結果は４MHzでの減衰（加圧されない造影剤に関するピーク）は加圧下で1/3以下に低下したのに、圧力を解除すると、減衰はほとんど完全に（85〜95％）回復することを示す。
300mmHgまでの空気過剰圧で90秒間加圧しそして3.5MHzでの減衰を測定した。結果を図３に示す。これは加えた過剰圧をすべて解除した後、減衰の回復が良好である（少なくとも約95％）ことを示す。
加圧されていない試料および90秒間150mmHgおよび300mmHgの空気過剰圧下においた試料に関して、Coulter分析によって寸法分布を測定した。結果を図４に示す。これは１〜10μmの範囲で分布曲線の間に著しい差異がないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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