(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）共役リノール酸及び／又は共役リノール酸部分の少なくとも５０重量％はシス９トランス１１異性体として存在する、共役リノール酸及び／又は共役リノール酸誘導体；及び
（ｂ）皮膚科学的に許容されるキャリア
を含む局所組成物であり、前記共役リノール酸誘導体が、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、リン酸エステル、アミド、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩及びベータヒドロキシ誘導体よりなる群から選択される、前記組成物。
【請求項２】
上記共役リノール酸及び／又は誘導体を該組成物の０．００００１重量％乃至５０重量％で含むことを特徴とする請求項１に記載の局所組成物。
【請求項３】
上記共役リノール酸及び／又は誘導体を該組成物の０．０１重量％乃至１０重量％で含むことを特徴とする請求項１に記載の局所組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトの皮膚に適用するための局所組成物及び皮膚の状態及び外見を改善することにおけるその使用に関する。
【０００２】
背景及び従来技術
皮膚は、皮膚科学的疾患、環境的虐待（風、空調、セントラルヒーティング）を通して、又は太陽への皮膚の暴露（光老化）により促進され得る正常な老化プロセス（経時老化）を経て悪化を受ける。近年、皮膚の外見と状態を改善するための化粧品組成物及び美容方法の要求が非常に増大している。
【０００３】
消費者は、皺、筋、たるみ、色素過剰症及び加齢性斑のような経時老化及び光老化皮膚の目立つ徴候を治療又は進行を妨げる「抗老化」化粧品をますます探し求めている。
【０００４】
消費者は、抗老化に加えて化粧品からの他の利益もまたしばしば求めている。「敏感皮膚」の概念は、感受性、乾燥、荒れ及び／又は剥がれやすい皮膚の外見と状態を改善する及び赤み、炎症性及び／又は皮膚のかゆみを和らげる化粧品の消費者の要求をまた強くさせている。消費者は、しみ、面ぽう、斑点などを治療する化粧品もまた望んでいる。
【０００５】
ポリ不飽和必須脂肪酸の長鎖トリグリセリドエステル、遊離脂肪酸及びそのアルカリ又はアンモニウム塩を含んでいる皮膚の状態及び外見を改善するためのスキンケア化粧品及び皮膚科学組成物は、当該分野において良く知られる。例えば、ＧＢ  ２１８１３４９  Ａは、皮膚のなめらかさと弾力性を改善するためのリノール酸のトリグリセリドからなる組成物をとりわけ記載する。市販品「Ｌｉｎｏｌａ  Ｆｅｔｔ  ｎ」  ｅｘ  Ｄｒ．Ａｕｇｕｓｔ  Ｗｏｌｆｆ  Ｇｍｂｈは、とりわけ共役リノール酸の９，１１異性体の混合物を含む、乾燥皮膚疾患、及び皮膚病の治療のために利用される。
【０００６】
しかしながら、皺、筋、たるみ、色素過剰症及び加齢性斑のような老化及び光損傷皮膚の目立つ徴候を治療／進行を妨げるための皮膚への局所適用のための代替の有効な化粧品組成物が引き続き必要である。乾燥、荒れ、剥がれやすい皮膚の外見と状態を改善するため及び皮膚の刺激及びかゆみを和らげるためのような抗老化に加えて他のスキンケア効果を提供する組成物及び美容方法が特に望まれる。
【０００７】
我々は驚くべきことに、皺、筋、たるみ、色素過剰症及び加齢性斑、及び／又は感受性、乾燥、荒れ、剥がれやすい、赤い、かゆみのある、刺激された皮膚のような経時又は光老化による正常な皮膚上体の有効な治療及び予防が、共役リノール酸又はその誘導体の特有な異性体を特異的に富化した、皮膚に対する化粧品組成物の適用を経て得ることができることが、現在わかった。
【０００８】
発明の開示
本発明の第１の態様によると、
（ａ）共役リノール酸及び／又は共役リノール酸部分の少なくとも５０重量％はシス９トランス１１異性体として存在する、共役リノール酸及び／又は共役リノール酸部分を含む共役リノール酸誘導体；及び
（ｂ）皮膚科学的に許容される賦形剤
を含む局所組成物が提供される。
【０００９】
そのような組成物は、皺、たるみ、光損傷皮膚、敏感皮膚、乾燥皮膚、荒れた皮膚、剥がれやすい皮膚、赤い皮膚、刺激された皮膚、かゆみのある皮膚及び加齢性斑からなる群から選択される皮膚状態を美容的に治療／予防するためのヒトの皮膚への局所適用のために特に有用である。該組成物は、しみ、面ぽう及び斑のための美容トリートメントとして、又は皮膚再生を促進する及び／又は皮膚中のコラーゲン沈着を引き上げる化粧スキンケア製品として皮膚への適用のためにもまた有用である。
【００１０】
第２の態様によると、本発明は、皺、たるみ、光損傷皮膚、敏感皮膚、乾燥皮膚、荒れた皮膚、剥がれやすい皮膚、赤い皮膚、刺激された皮膚、かゆみのある皮膚及び加齢性斑からなる群から選択される皮膚状態を治療／予防する美容方法を提供し、該方法は上述した局所組成物を皮膚に適用することを含んでいる。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、皺、たるみ、光損傷皮膚、敏感皮膚、乾燥皮膚、荒れた皮膚、剥がれやすい皮膚、赤い皮膚、刺激された皮膚、かゆみのある皮膚及び加齢性斑からなる群から選択される皮膚状態を治療する／予防するための局所組成物における、共役リノール酸、及び／又は共役リノール酸部分を含むその誘導体の使用もまた提供し、該共役リノール酸及び／又は部分の少なくとも５０重量％はシス９トランス１１異性体として存在する。
【００１２】
本発明組成物及び方法は、このように、改善された弾力性を持った滑らか且つ柔軟な皮膚と改善された皮膚着色を持った皺と老化皮膚の減じられ又は進行が妨げられた外見の促進をもたらす抗老化効果を提供する。外見、テクスチャー及び状態における一般的な改善、特に輝き、明るさ、及び皮膚の全体的な若々しい外見が達成される。本発明組成物及び方法は、感受性、乾燥、荒れ、刺激、赤み、剥離及びかゆみのある皮膚を緩和及び鎮静するためにもまた有効である。このように本発明方法及び組成物は広範なスキンケア有益性を有利に提供する。
【００１３】
本明細書中で用いた用語「治療」には、皺、老化、光損傷、乾燥及び／又は刺激された皮膚のような上述した皮膚状態を減じ、進行を妨げ及び／又は予防する、および皮膚の質を全体的に高め、さらに皺を防ぎ又は減じ且つ皮膚の柔軟性、引き締め、滑らかさ、しなやかさ及び弾力性を増加することによってその外見とテクスチャーを改善する、等がその範囲内に含まれる。本発明に従う化粧品組成物、方法及び共役リノール酸の使用は、既に皺のある、老化した、光損傷した乾燥及び刺激された状態である皮膚の治療用、又は正常な老化／光老化プロセスによる上述した退化的な変化を防ぐ又は減じる、若々しい皮膚に治療するために有用となり得る。
【００１４】
発明の詳細な記述
シス９，トランス１１異性体富化共役リノール酸
共役リノール酸（以下、ＣＬＡと呼ぶ）は、位置（６，８）、（７，９）、（８，１０）、（９，１１）、（１０，１２）又は（１１，１３）でのシス及びトランス二重結合の各種の配置が可能であるリノール酸の位置及び幾何異性体のグループを含む。従ってＣＬＡの２４の異なる異性体が存在する。
【００１５】
本発明に従う組成物の必須の活性は、シス９，トランス１１（以下、ｃ９，ｔ１１と呼ぶ）異性体である。遊離酸のこの特有な異性体は、以下に示す構造式（Ｉ）を有する。
【００１６】
【化１】
0004460169.tif 000002
【００１７】
本発明は、このような共役リノール酸部分を含む遊離酸の誘導体もまた含む。好ましい誘導体は、エステル（例えばレチニルエステル、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、リン酸エステル）、アミド（例えばセラミド誘導体）、塩（例えばアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）のようなその酸のカルボキシ基の置換で得られるもの；及び／又はアルファヒドロキシ及び／又はベータヒドロキシ誘導体のような、Ｃ１８炭素鎖の置換で得られるものを含む。
【００１８】
トリグリセリドエステル誘導体のケースにおいて、グリセリン主鎖上のＣＬＡ置換体の全ての位置異性体が含まれる。該トリグリセリドは、少なくとも１つのＣＬＡ部分を含まなければならない。例えば、グリセリン主鎖上の３つのエステル化可能な位置の、１及び２位がＣＬＡで且つ位置３では別な脂質によってエステル化されて良く、また代替的に、そのグリセリン主鎖は、１及び３位置でＣＬＡによって且つ位置２で別な脂質でエステル化され得る。
【００１９】
本明細書中で用語「共役リノール酸」又は「ＣＬＡ」が用いられる場合、それはＣＬＡ部分を含むその誘導体もまた含まれると理解される。「ＣＬＡ部分」は、ＣＬＡ誘導体のＣＬＡ脂肪アシル部分をさす。
【００２０】
「ｃ９ｔ１１異性体富化ＣＬＡ」は、該組成物中にある全ＣＬＡ（及び／又はＣＬＡ）部分の少なくとも５０重量％がシス９，トランス１１異性体の形であることを意味する。好ましくは、該組成物中にある全ＣＬＡ及び／又はＣＬＡ部分の少なくとも７０重量％、最も好ましくは少なくとも９０％がシス９，トランス１１異性体の形である。
【００２１】
本発明に従ってＣＬＡ及び／又はＣＬＡ部分を含むその誘導体は（該組成物中にある全ＣＬＡ及び／又はＣＬＡ部分の少なくとも５０重量％がシス９，トランス１１異性体の形である）、ＷＯ９７／１８３２０中に開示された方法に従って製造し得る。好ましい製造方法は、後述の実施例１中に開示される。
【００２２】
本発明に従って利用される活性物質、ｃ９  ｔ１１異性体富化ＣＬＡは、有効量で該局所組成物中に存在する。通常、該活性物質の全量は、該組成物の０．００００１重量％と５０重量％の間の量で存在する。より好ましくは、その量は、最小限のコストで最大の有効性のために０．０１％から１０％まで、最も好ましくは０．１％から５％までである。
【００２３】
皮膚科学的に許容される賦形剤
本発明に従う組成物は、活性物質、ｃ９  ｔ１１異性体富化ＣＬＡのための希釈剤、分散剤又はキャリアとして作用する皮膚科学的／美容学的に許容される賦形剤をも含む。その賦形剤は、水、液状又は固体エモリエント、シリコーン油、乳化剤、溶剤、保湿剤、増粘剤、粉末、プロペラントなどのようなスキンケア製品において通常利用される材料を含み得る。
【００２４】
その賦形剤は、通常該組成物の５重量％から９９．９重量％、好ましくは２５重量％から８０重量％までを形成するであろうし、また他の化粧品付加物の不在において、該組成物のバランスを形成することができる。
【００２５】
任意の皮膚有効物質及び化粧品付加物
活性物質、ｃ９  ｔ１１異性体富化ＣＬＡと並んで、サンスクリーン、スキンライトニング剤、スキンタンニング剤のような他の特有な皮膚有効活性物質もまた含み得る。該賦形剤は、香料、抗酸化剤、不透明化剤、保存料、着色剤及び緩衝剤のような付加物をもさらに含み得る。
【００２６】
製品製造、形態、使用及び包装
本発明に従う局所組成物を製造するために、スキンケア製品を製造するための通常の手法を利用し得る。活性成分は、通常の手法において皮膚科学的に許容されるキャリア中に一般的に混合される。その活性成分は、好ましくは最初に、水又は別な溶剤又は該組成物中に配合される液体の一部の中に溶解又は分散させることができる。好ましい組成物は、水中油型又は油中水型エマルジョンである。
【００２７】
該組成物は、クリーム、ゲル又はローションなどのような通常のスキンケア製品の形態とし得る。該組成物は、濯ぎの間に皮膚への付着を促進する該活性物質のためのデリバリーシステムを含むことが可能な、例えばバス又はシャワーゲルのような、いわゆる「洗い流し（ｗａｓｈ−ｏｆｆ）」製品の形態とすることもできる。より好ましくは、該製品は「付着（ｌｅａｖｅ−ｏｎ）」製品；皮膚にそれを適用した直後の意図的な濯ぎ工程なしに皮膚に適用される製品、である。
【００２８】
該組成物は、通常の手法において、ジャー、ボトル、チューブ、ロールボールなどのような好ましいいずれかの手法で包装し得る。
【００２９】
本発明の方法は、治療が要求される皮膚に毎日１回以上実行し得る。皮膚外見における改善は、皮膚の状態、本発明方法において用いる活性成分の濃度、使用した組成物の量及びそれが適用される頻度に基づいて、３乃至６ヶ月後に大抵目に見えるようになるであろう。一般に、少量の組成物、例えば０．１乃至５ｍｌが、適当な容器又はアプリケータから皮膚に塗布され、且つ手又は指又は好ましい道具を用いて皮膚に広げられ及び／又はすりこまれる。濯ぎの工程が、その組成物が「付着」又は「洗い流し」製品として処方されたかどうかに基づいて任意に続けられる。
【００３０】
本発明がより容易に理解できる目的で、以下の実施例が、説明のためだけに与えられる。
【００３１】
実施例
実施例１
この実施例は、（１）ｃ９，ｔ１１異性体と、ｔ１０，ｃ１２異性体の１：１の割合の混合物；（２）本発明の組成物に含まれる化合物、全ＣＬＡ部分の９３重量％ｃ９  ｔ１１異性体；（３）本発明の範囲を外れる化合物、全ＣＬＡ部分の８０．５重量％ｔ１０  ｃ１２異性体、を含むＣＬＡの合成を説明する。
【００３２】
ＣＬＡの混合異性体は、サフラワー油の高温アルカリ処理によって製造し、ｃ９，ｔ１１とｔ１０，ｃ１２ＣＬＡ異性体の等量を生じる。ｃ９，ｔ１１ＣＬＡ富化ＣＬＡは、触媒としてゲオトリクム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  Ｃａｎｄｉｄｕｍ）を用いてラウリルアルコールとの選択エステル化によってその混合物から単離される。ｃ９ｔ１１富化ＣＬＡは加水分解され、且つトリグリセリドに変換される。エステル化及び単離後、残余のＣＬＡ遊離酸はｔ１０，ｃ１２ＣＬＡ富化される。
【００３３】
１．ＣＬＡの混合異性体の製造
「アナラー試薬」（ＡＲ）水酸化ナトリウム（０．６ｋｇ）を薬学用グレードのプロピレングリコールの６ｋｇ中に、撹拌し、８０−８５℃に加熱することによって溶解した。そのサンプルを冷却し、２ｋｇのサフラワー油を加えた。標準パイロットスケール装置を用い、その混合物を１７０℃で高速撹拌しながら３時間還流した。その反応混合物は約９５℃に冷却し、撹拌を中間速に減じ、さらにその混合物を９０℃の温度を維持しながら、脱塩水（８リットル）中に溶かした３５．５％塩酸の１．２８０リットルを用いて中性化した。その反応混合物を静置させ、その水相を流し出した。その油相を９０℃で５％ＡＲ塩溶液の２×１リットル及び脱塩水の２×１リットルで洗い、石鹸様物質を捨てた。ＣＬＡ富化油は、約５０℃で排水前に真空下１００℃で乾燥し、さらにワットマンフィルター及びセライト−ハイフロ−フィルター助剤の薄層を含むブーフナーシステムを通して濾過した。混合異性体ＣＬＡ油は、要求されるまで−２５℃で窒素下に保存した。この方法により製造された油の組成は、以下の表１中に記載される：
【００３４】
【表１】
0004460169.tif 000003
【００３５】
２．ｃ９  ｔ１１異性体富化ＣＬＡの製造
（Ｉ）ラウリルエステルの製造
サフラワー（２．０ｋｇ）から製造したＣＬＡを、脱塩水の５．９６ｋｇと一緒にラウリルアルコール（１−デカノール；９８％  Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から）の２モル当量に加えた。温度を２５℃に調節し、ゲオトリクム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  Ｃａｎｄｉｄｕｍ）（日本の天野製薬社から）の１％を加え、１リットルの水と予備混合し、さらに活発に混合した。反応は４４時間で停止した。その容器を８０−９０℃に加熱し、水相を排出し、油相を脱塩水で洗浄し、３０分間真空下１００℃で乾燥した。その油は５０℃に冷却し、ワットマンフィルター及びセライト−ハイフロ−フィルター助剤の薄層を含むブーフナーシステムを通して濾過した。
【００３６】
（ＩＩ）ｃ９，ｔ１１富化ＣＬＡエステルの分離：
残余のラウリルアルコールは分子蒸留によって毎分２５−３５ｍｌで１３０℃で除去した。残分は、毎分２５−３５ｍｌの流速で１５８℃での濃縮によってラウリルエステル（ｃ９，ｔ１１ＣＬＡ中に富化された）及び遊離酸（ｔ１０，ｃ１２ＣＬＡ中で富化された）に粗く分離した。ラウリルエステル残分中の残余の遊離酸は、毎分３０−４０ｍｌの流速で１７１℃でのさらなる蒸留によって減少させた。２７９０ｇのラウリルエステル残分は、４ＭのＡＲ水酸化ナトリウムの３３０ｍｌを用いて９０℃で中性化し、続いて水相からの油の分離を行い、脱塩温水中で油を３回、さらに０．１Ｍアルカリ洗浄及び２度の温水洗浄をした。富化されたラウリルエステル油サンプルは、前の通り乾燥した。
【００３７】
（ＩＩＩ）ｃ９，ｔ１１富化ＣＬＡラウリルエステルの鹸化：
ｃ９，ｔ１１富化ＣＬＡのラウリルエステルは、ＡＲ水酸化ナトリウム／９６％食品用グレードエタノールを用いて鹸化し、さらにＡＲ濃塩酸を用いて再−酸性化した。富化ＣＬＡ遊離脂肪酸を含む反応混合物は１００℃で乾燥し、前の通り約５０℃で濾過した。ラウリルアルコールは、毎分２５−３０ｍｌで１３２℃で留去した。残余のラウリルアルコールを除去するために、遊離のアルコールをＳＰ３９２  ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（５％、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社からのＢａｔｃｈ  ｌｕｘ  ０１１０）を用いて、その反応混合物中にある脂肪酸とエステル化した。脂肪酸を含んでいる富化したｃ９ｔ１１ＣＬＡは、毎分１５−２０ｍｌで１５５℃で真空下分子蒸留を用いてラウリルエステルから分離した。上記方法によって製造したｃ９ｔ１１富化ＣＬＡの組成を以下の表２中に記載した：
【００３８】
【表２】
0004460169.tif 000004
【００３９】
３．ｔ１０，ｃ１２異性体富化ＣＬＡの単離
上記工程（ＩＩ）からのＣＬＡ遊離酸は、エステル含量を減じるために１６０−１６５℃及び２０−３０ｍｌ／分で再度蒸留した。残余のラウリルアルコールは、１３１℃及び２０−３０ｍｌ／分の流速での蒸留によってさらに減じた。残りのラウリルアルコールは、Ｐ３９２  ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼを用いて、ｃ９，ｔ１１異性体用の上記工程（ＩＩＩ）に記載した通り再エステル化により減じた。生成されたラウリルエステルは、ｃ９，ｔ１１異性体のために記載した通りの蒸留によって除去し、ｔ１０，ｃ１２富化ＣＬＡを精製し、その組成は以下の表３中に記載した：
【００４０】
【表３】
0004460169.tif 000005
【００４１】
実施例２
ｃ９，ｔ１１ＣＬＡトリグリセリドの製造
実施例１に従って製造したｃ９，ｔ１１富化ＣＬＡ（５５ｇ）をグリセリン（Ｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖｅｒａｒｄｓ社からのＰｒｉｃｅｒｉｎｅ  ９０８３  ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ  ＣＰ）の５．５５ｇ（１０．１％）と混合し、Ｐ３９２  Ｍｕｃｏｒ  Ｍｅｉｈｉｅ非特異的リパーゼ（Ｍｕｃｏｒ  Ｍｅｉｈｉｅ  Ｅｘ  Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｂａｔｃｈ  Ｌｕｘ  ０１１０）の３ｇを加えた。混合した材料は、僅かな窒素放出とともに６０℃でロータリーエバポレータ中、真空下で撹拌した。
【００４２】
２４時間後、その遊離脂肪酸レベルは１２．７％にまで減じ、さらに０．１５ｇのグリセリンを加えた。４８時間後、遊離脂肪酸レベルは３．４％に減じ、その反応はブーフナーフィルター上にセライトスーパーセルフィルター助剤の薄層を通してその混合物を濾過することにより停止し、ＣＬＡトリグリセリド油相を採取し、その組成を以下の表４に記載した：
【００４３】
【表４】
0004460169.tif 000006
【００４４】
実施例３
本実施例は、ｃ９  ｔ１１異性体富化ＣＬＡの抗老化効果を実証する。
【００４５】
比較目的用の局所レチン酸処理に従うインビボでの皮膚におけるプロコラーゲン−Ｉとデコリン（Ｄｅｃｏｒｉｎ）アップレギュレーションの同定
優勢なマトリックス皮膚タンパク質、コラーゲンが皮膚に対する引っ張り強度を与えることは知られている。デコリンは皮膚の細胞外マトリックス中のコラーゲンの制御された及び正確な沈着のために重要であることが知られるプロテオグリカンである。皮膚中のコラーゲンとデコリンのレベルが、老化した及び／又は光損傷した皮膚において顕著に減じられることもまた、当該分野で公知である。多くの研究が、皮膚におけるＩ型コラーゲンのレベルが加齢によって及び／又は増加した光損傷によって減少したことを示している（例えばＬａｖｋｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍ．，（１９７９），７３，７９−６６；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｍｅｄ．（１９９３）  ３２９，５３０−５３５）。デコリンのケースにおいて、ｍＲＮＡ発現とプロテオグリカンの発現が、インビトロで光損傷した皮膚において非常に減じられることが示されている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｌａｂ，Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９５）  ７２，６６２−６６９）。これらの皮膚タンパク質のレベルの減少は、皺及びたるみの原因となる皮膚の引っ張り強度の減少に相応に関連付けられる。
【００４６】
レチン酸は有力な抗老化活性があり且つ光損傷を受けた皮膚の皮膚再生を誘導することは当該分野において周知である。レチン酸による皮膚の局所処理に従う皺の消去及び皮膚再生は、皮膚における新たなコラーゲン沈着と合成を経て生じることが示されている。（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｍｅｄ．（１９９３）  ３２９，５３０−５３５）。レチン酸を用いて皮膚中のコラーゲンのレベルを高めることによる皮膚マトリックスの強化ＧＡ、抗老化／皮膚再生効果を提供することは広く受け入れられている。プロコラーゲンＩはコラーゲンの前駆体である。試験化合物の適用に応じたプロコラーゲンＩの増加した生産は、増加したコラーゲンレベルのマーカーである。
【００４７】
それぞれの外側前腕上に同一又はほぼ同一の度合の軽度乃至中程度の光損傷をもった女性の２つのグループを募った。それらに保湿剤ベース中０．０５％レチン酸（Ｒｅｔｉｎｏｖａ（登録商標））、及びプラシーボコントロールとして類似の感覚の特性を持つが、活性成分のない色調和保湿剤クリーム（Ｄｅｒｍａｃａｒｅ（登録商標）ローション）を与えた。２つのグループのそれぞれの協力者は、一方の外側前腕にＲｅｔｉｎｏｖａ（登録商標）を、他方の外側前腕にプラシーボ（Ｄｅｒｍａｃａｒｅ（登録商標））を塗布した。グループ１は１４週間、その外側前腕に毎日その製品を塗布し、グループ２は２８週間、その外側前腕にその製品を塗布した。その実験の終了時点で、２つの完全な厚さ４ｍｍパンチバイオプシーをそれぞれの前腕の処理したエリアから採取した。協力者から採取したバイオプシー組織の免疫組織化学分析は、プラシーボ処理した前腕との比較として、皮膚細胞外マトリックス成分デコリン及びコラーゲン−Ｉの発現についてのレチン酸処理の効果を同定するために実行した。次の手順に従った：
材料
ワックス切片用の抗体希釈緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．０５％アジ化ナトリウムから構成した。プロコラーゲン−Ｉ用の一次抗体（アミノ末端）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社から購入し（ｃａｔ＃  ＭＡＢ  １９１２，ラットＩｇＧ１）、切片をトリプシン（０．５ｍｇ／ｍｌ、２５分間、３７℃）で予備処理した後、４℃で一晩、１：８００の希釈でワックス切片に用いた。デコリン用の一次抗体は、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社（ウサギポリクローナル）から購入し、４℃で一晩、１：８００の希釈でワックス切片に用いた。抗−ラットビオチン化二次抗体は、ＤＡＫＯ社から購入し（ｃａｔ＃  Ｅ０４６８，ウサギポリクローナル）、１：４００の希釈でワックス切片に適用した。抗−ウサギビオチン化二次抗体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ社から購入し（ｃａｔ＃  ＲＰＮ  １００４，ロバポリクローナル）、１：４００の希釈でワックス切片に適用した。ストレプタビジン共役アルカリホスファターゼは、Ｚｙｍｅｄ社から購入し（ｃａｔ＃  ４３−４３２２）、１：２５００の濃度で用いた。ファストレッドクロモゲンはＤＡＫＯ社から購入した（ｃａｔ＃  Ｋ５９７）。Ｇｉｌｌｓ  ＃３  Ｈａｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ核対比染色は、Ｓｉｇｍａ社から購入し（ｃａｔ＃  ＧＨＳ−３）、濾過して希釈なしで用いた。トリプシンはＳｉｇｍａ社から購入し（ｃａｔ＃  Ｔ−７１８６）、さらにスライドガラスはＤＡＫＯ社（ｃａｔ＃  Ｃ５６３）からのＧｌｙｃｅｒｇｅｌで搭載した。
【００４８】
方法
バイオプシー組織のワックス切片は、シラン被覆スライドガラス上に搭載し、５５℃で１８時間焼成した。そのスライドはキシレンとアルコールを通して脱ワックスし、水に戻し、次いでＴＢＳに移した。ＤＡＫＯ（登録商標）ペンを切片を丸く囲むために用いた。該切片は、それぞれの抗体のために示したように、必要な場合、トリプシンを用いて抗原回復のため加工した。抗原回復が必要な場合、スライドガラスを０．５ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃  Ｔ−７１８６）とともに３５℃で２５分間インキュベートした。該プロテアーゼは、ＴＢＳで連続的に濯いだ（２×２分）。抗原回復に続いて、もし必要なら、又はさもなければ、該切片の濯ぎ直後に、非特異的抗体結合を、湿ったチャンバー中、室温で少なくとも２０分間、ブロッキング溶液としてＴＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナトリウム中、二次抗体宿主血清の５％溶液でブロックした。過剰のブロッキング溶液を排出したが、該切片は乾燥させなかった。該切片は、次いで湿ったチャンバー中、４℃で一晩、一次抗体（上記の通り丁度良く希釈した）とインキュベートした。抗体は、続いて該切片から、それを乾燥させることなく排出した。スライドガラスは、未結合一次抗体を取り除くためＴＢＳで洗い−１分間濯いだ後、５分間３回洗った−次いで湿ったチャンバー中、室温で１時間、適当な二次抗体（上記の通り丁度良く希釈した）とインキュベートした。抗体溶液は、該切片を乾燥させることなしに、スライドガラスから続けて排出した。スライドガラスは、未結合二次抗体を除去するため、ＴＢＳ中で１分間濯ぎ、続いて４×５分間洗浄した。ビオチン化二次抗体のために、該切片は続いて３７℃で４５分間、ストレプタビジン接合体とインキュベートし、次いで未結合ストレプタビジン接合体を除去するためにＴＢＳ中で洗った。クロモゲンを加え、さらに過剰染色を避けるよう観察しながら着色現像した。該切片は、対比染色し且つ搭載した。
【００４９】
レチン酸（Ｒｅｔｉｎｏｖａ（登録商標））とプラシーボ（Ｄｅｒｍａｃａｒｅ（登録商標））処理した部位の間のプロコラーゲン−Ｉとデコリンの発現における相違は、光学顕微鏡を用いて免疫組織化学的に染色した切片の目視観測によって測定した。
【００５０】
この分析は、以下の表５中に記載した通り、レチン酸（Ｒｅｔｉｎｏｖａ（登録商標））の局所適用に従い光損傷した皮膚中のプロコラーゲン−Ｉとデコリンの両方の顕著なアップレギュレーションを同定した。
【００５１】
【表５】
0004460169.tif 000007
【００５２】
細胞外マトリックス成分プロコラーゲンＩとデコリンは、皮膚再生を誘導したレチン酸の明瞭な同定可能マーカーである。
【００５３】
ヒトの皮膚繊維芽細胞中のデコリン合成の測定方法
皮膚繊維芽細胞馴化培地の製造
継代２（Ｐ２）での一次ヒト包皮繊維芽細胞を、１００００細胞／ｃｍ２で１２−ウェルプレートに播種し、１０％胎児子ウシ血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏｓ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％二酸化炭素と４％酸素の雰囲気中で２４時間維持した。この時間経過後、細胞を血清フリーのＤＭＥＭで洗い、さらに６０時間、新たな血清フリーのＤＭＥＭ中でインキュベートした。該繊維芽細胞単層は、血清フリーＤＭＥＭで再度洗った。試験試薬と賦形剤コントロールを、三回に分けて最終容量０．４ｍｌ／ウェルの新鮮な血清フリーＤＭＥＭを細胞に加え、さらに２４時間インキュベートした。この繊維芽細胞馴化培地は、直ちに又は液体窒素中で即座の凍結のいずれかで分析し、更なる分析のため−７０℃で保存した。その細胞は、次いで計測し、ドット−ブロット分析からのデータを細胞数に対してその後に標準化した。
【００５４】
皮膚繊維芽細胞馴化培地中のデコリンタンパク質用のドットブロットアッセイ
賦形剤（コントロールとして）又は試験試薬で処理した皮膚繊維芽細胞からの馴化培地のサンプルは、２０ｍＭジチオトレイトール（２００ｍＭ保存溶液の１：１０希釈）と０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（１０％保存溶液の１：１００希釈）を補充し、よく混合し、２分間７５℃でインキュベートした。アッセイ用の標準品は、１７５ｃｍ２フラスコ中に１０００細胞／ｃｍ２で播種した繊維芽細胞から適切な繊維芽細胞馴化培地の連続希釈によって作製し、上述した通りの血清フリーＤＭＥＭ中に保持した。アッセイサンプルは、製造元の指針中に記載された通り、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社からの９６−ウェルのＢｉｏ−Ｄｏｔ  装置を用い、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜の予め湿らせたシートに三回に分けて続いて適用した。ほぼ２００μｌの培地をウェル当たりに適用した。その培地は、重力下で膜を通して濾過し（３０分）、後で膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗った。これらのＰＢＳ洗浄は、重力下でその膜を通して濾過させた（２×１５分間）。次いで該Ｂｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホールドに接続し、第３及び最終のＰＢＳ洗浄は吸引下で実行した。該装置を分解し、その膜を取り外し、４℃で一晩ブロッキング緩衝液に配される前に必要に応じて敏速に切断した。デコリン分析用に作製した膜は、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０でブロックした。その翌日、その膜は室温で２時間、ヒトデコリンに対する一次抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）の１：１００００希釈液によってプローブした。その膜は続いてＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗い（３×５分間）、次いで室温で１時間、抗−ウサギＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の１：１０００希釈液とインキュベートした。この後該インモビロンストリップ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ｓｔｒｉｐｓ）は、室温で空気中乾燥させる前にＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した（３×５分間）。乾燥した膜はセロハンで包み、１６−１８時間、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｔｒａｇｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎにさらした。この時間の終了時点で、暴露したスクリーンをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェアを用いてリン光測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＦ）によってスキャンした。ドット強度は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（登録商標）中の定量ツールを用いたコンピュータ−補助イメージ分析によって評価し、細胞数に対して標準化し且つデコリン合成についての各種試験試薬の効果を１００任意単位の賦形剤処理コントロール値と比較して決定した。
【００５５】
試験
以下の表６は、ヒト皮膚繊維芽細胞中のデコリン合成に関してその効果が評価された試薬、及びそれらを適用した量を示す。その結果を標準化するために、試験物質の効果は、１００任意単位の賦形剤処理コントロール値と比較して決定した。
該表中の「ＣＬＡ  ｃ９，ｔ１１」は、全ＣＬＡの９３重量％がｃ９，ｔ１１異性体であるＣＬＡ、すなわち本発明の範囲内である活性薬をさす。これは上記実施例１に記載され製造された。
【００５６】
該表中の「ＣＬＡ  ｔ１０，ｃ１２」は、全ＣＬＡの８０．５％が、以下の構造式２を有しているｔ１０，ｃ１２異性体であるＣＬＡをさす：
【００５７】
【化２】
0004460169.tif 000008
【００５８】
この薬は、従って本発明の範囲外である。それは実施例１に記載した通り製造した。
【００５９】
該表中の「ＣＬＡ混合物」は、全ＣＬＡの各異性体の４７重量％が存在する、１：１の比率でのｃ９，ｔ１１異性体とｔ１０，ｃ１２異性体の混合物をさす。この薬は、従って本発明の範囲外である。それは実施例１に記載した通り製造した。
【００６０】
「ＣＬＡ  ｔ１０，ｃ１２」と「ＣＬＡ混合物」によって実施した試験は、比較目的のため行った。
【００６１】
また比較のために、試験はヒト皮膚繊維芽細胞中のデコリン合成についてのその効果を評価するため、レチン酸と共に実施した。該試験で用いた試薬の濃度は、細胞生存度に影響を及ぼしていなかった。
【００６２】
【表６】
0004460169.tif 000009
【００６３】
表６中の結果は、ｃ９，ｔ１１異性体がコントロールと比較して及びｔ１０，ｃ１２ＣＬＡ及びＣＬＡと比較してヒト皮膚繊維芽細胞中のデコリン合成を顕著にアップレギュレートすることを示す。
【００６４】
皮膚中のデコリンのレベルは、皮膚の改善された状態と外見に結び付けられる。皮膚中のデコリンのレベル増加は、皺の消去及び光損傷した皮膚の皮膚再生のような多くの皮膚の有益性に関係付けられる皮膚中のコラーゲンの制御された及び正しい沈着のために重要である。
【００６５】
レチン酸（１μｍ）による比較試験は、１００任意単位の賦形剤処理したコントロール値に比較して決定した、１３８±１４．０（ｐ＝０．０３５，ｎ＝４）のデコリンのアップレギュレーションを示した。意外にも、そのデータは、ヒト皮膚繊維芽細胞におけるデコリン合成のアップレギュレーションの大きさは、抗−老化皮膚再生活性物質の基準であるレチン酸のそれよりも、共役リノール酸のｃ９，ｔ１１異性体が上回っていることをさらに示す。
【００６６】
実施例４
この実施例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のケラチノサイト毒性に関する各種の試験化合物の効果を測定する。
【００６７】
ケラチノサイトＳＤＳ生存度アッセイ
方法論
ケラチノサイトは、ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ）中で８０％集密度まで９６ウェルプレート中で培養し、２４−４８時間ヒドロコルチゾンなしのＫＧＭに移した。次いでその細胞をほぼ５０％の細胞生存度を作るであろうドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度（５μ／ｍｌ）で処理した。次いで該細胞に、以下の表３中に示した濃度で用いられる試験化合物を投与した。表７中の試験化合物「ｃ９  ｔ１１  ＣＬＡ」と「ｔ１０  ｃ１２  ＣＬＡ」は、実施例３において上述した試薬と同じである。コントロールは何れの試験化合物も含まない。２４時間のインキュベート後、その培地を取り出し、その生存度をニュートラルレッド法によって測定した。この方法に関して、細胞は２５μｇ／ｍｌニュートラルレッドを含むＫＧＭ中で３時間インキュベートし、その培地を取り出した後、その細胞を３０分単位で１％（ｖ／ｖ）酢酸、５０％（ｖ／ｖ）エタノールの１ｍｌで抽出した。５６２ｎｍで該抽出物の吸光度を測定し、そして生存度を、ＳＤＳも試験化合物も何れも含まないウェルの参照によって評価した。得られた結果を以下の表７中にまとめた：
【００６８】
【表７】
0004460169.tif 000010
結果は５μｇ／ｍｌＳＤＳ生存度の値の％として表した。
【００６９】
ｃ９，ｔ１１  ＣＬＡ（本発明の範囲内の試薬）は、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ多重比較、ｐ＜０．０５による１ウェイＡＮＯＶＡによって決定した５μｇ／ｍｌＳＤＳ値と比較して生存度が有意に増加した。ｔ１０  ｃ１２  ＣＬＡ（本発明の範囲外の試薬）は、ＳＤＳコントロールに比較して細胞生存度が上昇しない。
【００７０】
この方法論は、刺激剤のケラチノサイト毒性がインビボでのその試薬の刺激効果に関係することを示している（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＪＮ，Ｓｔａｒｋｅｙ，Ｓ．，Ｄｉｃｋｓｏｎ，ＦＭ  ＆  Ｂｅｎｆｏｒｄ，ＤＪ．皮膚刺激能を評価するためヒト及びラットケラチノサイト培養物の使用。Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．１０，３３１−３４０（１９９６））。このように、ここに我々は、「ｃ９  ｔ１１  ＣＬＡ」による処理が、ケラチノサイトにおけるＳＤＳの毒性作用を顕著に減じること、及びそれが抗−刺激剤機能を有し、一方「ｔ１０  ｃ１２  ＣＬＡ」はこれらの細胞におけるＳＤＳの毒性を顕著に変化させず、従って抗−刺激剤効果を有していないことを示す。
【００７１】
実施例５
この実施例は、ケラチノサイトにおける分化を誘導する試験化合物の能力を示し、分化は成熟角質層の形成の基礎となる、そのプロセスの一部をなしている。成熟角質層は、皮膚のバリア機能のために、及び皮膚が乾燥及び荒れるのを防ぐ補助のために重要である。角化エンベロープ（ＣＥ）形成及びトランスグルタミナーゼ酵素の活性を、分化の指標として測定した。角化エンベロープは角質層の中の角質細胞の形状、強度及び構造的緻密性の源であり、またトランスグルタミナーゼ酵素は、角化エンベロープの正しい形成にとって必須である。
【００７２】
ケラチノサイト分化アッセイ
方法論
細胞培養
ヒトの表皮を通常の技法を用いて若年者の包皮から単離し、血清フリーのケラチノサイト増殖培地（「ＫＧＭ」；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）中で培養した。９６ウェルプレートにおいて４０００細胞／ウェルで播種した第３継代ケラチノサイトを、全ての実験に用いた。ケラチノサイトは、３０μＭ  Ｃａ２＋を含むＫＧＭ中で処理する前に３７℃で３日間培養した。細胞は、採集の前の４８時間、試験化合物又は賦形剤単独（ジメチルスルホキシド）のいずれかで処理した。表８中の試験化合物「ｃ９  ｔ１１  ＣＬＡ」と「ｔ１０  ｃ１２  ＣＬＡ」は、実施例３中の上述した試薬と同じである。
【００７３】
ＤＮＡ定量化
続いて処理細胞は、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、次いでＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０μＭ  ペプスタチンと２０μＭ  ロイペプチンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／塩酸  ｐＨ８．０の１００μｌ中で抽出した。（ＤＮＡ抽出緩衝液）この抽出物の１５μｌを、正確に製造元によって記載された通り、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，４８４９  Ｐｉｃｈｆｏｒｄ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を用いてＤＮＡ含量をアッセイした。
【００７４】
微粒子トランスグルタミナーゼ（ｔｇａｓｅ）活性
ＤＮＡ抽出緩衝液による処理に続いて、その細胞を新鮮な緩衝液中で簡単に洗浄し、蛍光ｔｇａｓｅ基質テキサスレッドカダベリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。細胞は、５ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／塩酸  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、１５μＭのテキサスレッドカダベリン中、３７℃で１６時間処理し、蒸留水中で２回洗浄し、その蛍光は５９０ｎｍで励起して６４５ｎｍでの放射をＣｙｔｏｆｌｕｏｒ蛍光光度計を用いて測定した。
【００７５】
Ｔｇａｓｅ活性は、蛍光単位／ＤＮＡのｎｇとして表した。
【００７６】
角化エンベロープ形成
角化エンベロープ（ＣＥ）形成は、２４ウェルプレート  ケラチノサイトカルチャーのウェル中に残るＳＤＳ不溶性タンパク質を定量することにより評価した。Ｔｒｉｔｏｎ抽出緩衝液（上述した）の除去後、そのウェルを炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ社）ｐＨ９．６で洗浄した。各ウェルは、０．１ｍｇ／ｍｌ（２００μｌ／ウェル）で該炭酸塩炭酸水素塩緩衝液中、ビオチンと結合したＮ−ヒドロキシスクシンアミド（保存品はＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌで溶かした）とインキュベートした。そのプレートは、室温で６０分間、撹拌しながらインキュベートした。１０％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＤＴＴの５０μｌ／ウェルを加え、該プレートをさらに６０分間、６０℃でインキュベートした。エンベロープは、ドットブロット装置を用い、（ＴＢＳ  ０．５％  Ｔｗｅｅｎ中で予備ブロックした）ＰＶＤＦ膜上で（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中での洗浄と共に）濾過した。その膜は室温で６０分間、１／１０００希釈したストレプタビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ社）によりプローブし、洗浄し（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）、さらに２分間、ＥＣＬ基質（Ｐｉｅｒｃｅ社）と共にインキュベートした。その膜を「ｃｌｉｎｇ−ｆｉｌｍ」に包み、タンパク質を可視化するためにＸ線フィルムにさらした。そのスポット強度はスキャニングとＰｈｏｒｅｔｉｘ分析により定量化した。その結果は以下の表８中にまとめた。その結果は測定した各パラメータ用のコントロール値のパーセンテージとして表した。
【００７７】
【表８】
0004460169.tif 000011
「ｃ９  ｔ１１  ＣＬＡ」（本発明の範囲内の試薬）は、コントロール（ＤＭＳＯ処理のみ）に比較してトランスグルタミナーゼ活性とＣＥ形成が有意に（ｐ＜０．０１）増加した。「ｔ１０  ｃ１２  ＣＬＡ」（本発明の範囲外の試薬）は、コントロールに比較してケラチノサイト分化のこれら２つのパラメータのいずれも上昇しなかった。
【００７８】
このように我々は、「ｃ９  ｔ１１  ＣＬＡ」での処理がインビトロでのケラチノサイトの分化を顕著に増加すること、また従ってそれが分化増強機能を有している一方、「ｔ１０  ｃ１２  ＣＬＡ」はケラチノサイトの分化状態を顕著に変化させず、従って分化増強効果を有していないことを示す。「ｃ９  ｔ１１  ＣＬＡ」は、従って乾燥及び荒れた皮膚状態の予防のために、且つ既に乾燥及び荒れた状態の皮膚を滑らかにし及び保湿するために有用である。
【００７９】
実施例６
以下の処方は、本発明に従う方法及び使用に好適である本発明組成物を組み込んだ水中油型クリームを記載する。記載したパーセンテージは、他に記載がない限り該組成物の重量である。
【００８０】
【表９】
0004460169.tif 000012
【００８１】
実施例７
以下の処方は、本発明に従い方法及び事例に好適である本発明組成物を配合した油中水型エマルジョンを記載する。表示したパーセンテージは他に記載がない限りは組成物の重量である。
【００８２】
【表１０】
0004460169.tif 000013
【００８３】
実施例６と７の上記局所組成物の両方は、老化又は光老化を経て悪化している皮膚に適用した際、又はそのような悪化を防ぐ又は進行を妨げるのを促進するため若々しい皮膚に適用した場合、皺になった、老化した、光損傷した、及び／又は刺激された皮膚の外見を改善するために有効な美容トリートメントを提供する。該組成物は、通常の手法において加工することができる。