(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子中の少なくとも２個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項２】
組成物が，少なくとも３個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも３個のオリゴヌクレオチドを含む，請求項１記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項３】
組成物が，少なくとも４個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも４個のオリゴヌクレオチドを含む，請求項１記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項４】
組成物が，少なくとも５個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも５個のオリゴヌクレオチドを含む，請求項１記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが少なくとも２５ヌクレオモノマーの長さである，請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが１０〜５０ヌクレオモノマーの長さである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが１５〜４０ヌクレオモノマーの長さである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが２０〜３０ヌクレオモノマーの長さである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが，少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む，請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが，少なくとも１つの修飾糖成分を含む，請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容しうる担体をさらに含む，請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１２】
細胞において蛋白質合成を阻害する方法であって，細胞を，標的遺伝子中の少なくとも２個の異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドとin vitroで接触させることを含む方法。
【請求項１３】
蛋白質をコードする遺伝子の機能を同定する方法であって，細胞を，標的遺伝子中の少なくとも２個の異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドとin vitroで接触させ，そして，細胞において蛋白質発現の阻害により生ずる検出可能な表現型の変化をアッセイし，このことにより遺伝子の機能を決定する，ことを含む方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチド組成物を製造する方法であって，標的遺伝子中の少なくとも２個の異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み合わせることを含み，ここで，個々のオリゴヌクレオチドを組成物中に組み込む前に蛋白質合成を阻害するそれらの能力について別々に試験しないことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は，米国特許仮出願６０／３５３，３８１（２００２年２月１日出願）に基づく優先権を主張する。本出願はまた，米国特許仮出願６０／３５３，２０３（２００２年２月１日出願），６０／４３６，２３８（２００２年１２月２３日出願），および６０／４３８，６０８（２００３年１月７日）に基づく優先権を主張する。上述の出願のすべての内容は明示的に本明細書の一部としてここに引用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アンチセンスおよび二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは有望な治療剤であり，遺伝子機能を解明するための有用な研究ツールである。しかし，そのような組成物を用いて蛋白質合成の効率的な阻害を達成することはしばしば困難である。その治療上の活性を最大限にするために，従来技術のアンチセンスおよび二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドが蛋白質合成を阻害する効率を増強することによりこれらを改良することは大きな利点があるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概要
本発明は，少なくとも部分的には，改良された遺伝子発現阻害を与えるアンチセンスおよび二本鎖オリゴヌクレオチド組成物の発見に基づく。特に，本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，アンチセンスまたは二本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを使用する。
【０００４】
１つの観点においては，本発明は，標的遺伝子中の少なくとも３つの異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも３つの異なるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物に関し，ここで，（ｉ）オリゴヌクレオチドはその標的ヌクレオチド配列に高い親和性をもって結合し，かつ，（ｉｉ）オリゴヌクレオチドはＧＣ含量が高められている。
【０００５】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０００６】
別の態様においては，オリゴヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【０００７】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチド組成物はその標的ヌクレオチド配列に少なくとも約６０℃のＴｍで結合する。
【０００８】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドは少なくとも約２０％のＧＣ含量を有する。
【０００９】
１つの態様においては，組成物は，少なくとも４個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも約４個のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。別の態様においては，組成物は，少なくとも５個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも約５個のオリゴヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては，組成物は，少なくとも６個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも約６個のオリゴヌクレオチドを含む。
【００１０】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドは少なくとも約２５ヌクレオモノマーの長さである。別の態様においては，オリゴヌクレオチドは約２５ヌクレオモノマーの長さより長い。
【００１１】
１つの態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは，その配列中がその標的ヌクレオチド配列に相補的である。別の態様においては，アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨを活性化する。
【００１２】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。
【００１３】
別の態様においては，オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは少なくとも１つの修飾糖成分を含む。
【００１４】
１つの態様においては，組成物はさらに薬学的に許容しうる担体を含む。
【００１５】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチド組成物は，組成物の最も有効な個々のオリゴヌクレオチドにより達成される阻害のレベルと同じかまたはこれより高いレベルの蛋白質合成の阻害を達成する。
【００１６】
１つの態様においては，個々のオリゴヌクレオチドは，組成物中に組み込まれる前に蛋白質合成を阻害するその能力について別々に試験されない。この点に関して，本発明は，従来技術と比較して，実質的なかつ認識されていない改良を意味する。
【００１７】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチド組成物により蛋白質合成が約８０％より大きく阻害される。
【００１８】
別の観点においては，本発明は，細胞において蛋白質合成を阻害する方法に関し，該方法は，細胞を標的遺伝子中の少なくとも３つの異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも３つの異なるオリゴヌクレオチドと接触させ，このことにより蛋白質合成を阻害することを含み，ここで，（ｉ）オリゴヌクレオチドはその標的ヌクレオチド配列に高い親和性をもって結合し，（ｉｉ）オリゴヌクレオチドはＧＣ含量が高められている。
【００１９】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様においては，オリゴヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００２０】
１つの態様においては，方法はハイスループットのフォーマットで行われる。
【００２１】
さらに別の観点においては，本発明は，蛋白質をコードする遺伝子の機能を同定する方法に関し，該方法は，細胞を，標的遺伝子中の少なくとも３つの異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも３つの異なるオリゴヌクレオチドと接触させ，ここで，（ｉ）オリゴヌクレオチドはその標的ヌクレオチド配列に高い親和性をもって結合し，（ｉｉ）オリゴヌクレオチドはＧＣ含量が高められており，そして，細胞において蛋白質発現の阻害により生ずる検出可能な表現型の変化をアッセイして，遺伝子の機能を決定する，ことを含む。
【００２２】
これらの異なるオリゴヌクレオチドの相対的な量は任意に異なっていてもよい。すなわち，３またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドは，等モル濃度で存在していてもよく，等モルではない濃度で存在していてもよい。
【００２３】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様においては，オリゴヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
１つの態様においては，この方法はハイスループットのフォーマットで行う。
【００２５】
別の観点においては，本発明は，オリゴヌクレオチド組成物を製造する方法に関し，該方法は，標的遺伝子中の少なくとも３つの異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも３つの異なるオリゴヌクレオチドを組み合わせることを含み，ここで，（ｉ）オリゴヌクレオチドは，高い親和性をもってその標的ヌクレオチド配列に結合し，（ｉｉ）オリゴヌクレオチドはＧＣ含量が高められており，かつ，個々のオリゴヌクレオチドは組成物中に組み込まれる前に蛋白質合成を阻害するその能力について別々に試験されないことを特徴とする。
【００２６】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の態様においては，オリゴヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
別の観点においては，本発明は，標的遺伝子中の少なくとも２個の異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物に関する。
【００２８】
さらに別の観点においては，本発明は，細胞において蛋白質合成を阻害する方法に関し，細胞（または細胞溶解物）を，標的遺伝子中の少なくとも２個の異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドとin vitroで接触させることを含む。
【００２９】
さらに別の観点においては，本発明は，蛋白質をコードする遺伝子の機能を同定する方法に関し，該方法は，細胞を標的遺伝子中の少なくとも２個の異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドとin vitroで接触させ，そして，細胞において蛋白質発現の阻害により生ずる検出可能な表現型の変化についてアッセイして，遺伝子の機能を決定する，ことを含む。
【００３０】
別の観点においては，本発明は，オリゴヌクレオチド組成物を製造する方法に関し，該方法は，標的遺伝子中の少なくとも２個の異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２個の異なる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み合わせることを含み，ここで，個々のオリゴヌクレオチドは，組成物中に組み込まれる前に蛋白質合成を阻害するその能力について別々に試験されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
従来のある種のアンチセンスおよび二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて蛋白質合成を阻害することは可能であったが，有効なオリゴヌクレオチドを同定するためには多数回のトランスフェクションが必要であった。本発明は，とりわけ，蛋白質合成を阻害する効力を増強させるオリゴヌクレオチド組成物およびこれらの改良されたオリゴヌクレオチド組成物を製造し使用する方法を提供することにより，従来技術を進歩させるものである。
【００３２】
相補的オリゴヌクレオチドとデュープレックスを形成させることにより，オリゴヌクレオチド，特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを安定化させる方法は，継続中の米国特許出願１０／３５７，５２９（本出願と同日に出願，代理人書類番号"ＳＲＩ−０２０"，標題"Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ"）に開示されている。この出願およびそのすべての教示を全体として明示的に本明細書の一部としてここに引用する。
【００３３】
アンチセンスおよび二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド組成物
本発明の組成物中に組み込むためのアンチセンスまたは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，標的遺伝子によりコードされる標的蛋白質の合成を阻害する。標的遺伝子は，細胞に対して内因性のものであっても外因性のもの（例えば，ウイルスによりまたは組換えＤＮＡ技術を用いて細胞内に導入される）であってもよい。本明細書において用いる場合，"標的遺伝子"との用語は，ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド，または複製，転写，翻訳，または標的蛋白質の発現に重要な他のプロセスを制御するポリヌクレオチド領域，または標的ポリペプチドをコードする領域および標的ポリペプチドの発現を制御する領域を含むポリヌクレオチドを含む。したがって，本明細書において用いる場合，"標的遺伝子"との用語は，例えば，目的とする遺伝子の転写により生成されるｍＲＮＡ分子を表す。さらに，"標的遺伝子配列に対応するオリゴマー"におけるような"対応する"との用語は，２つの配列が相補的であるか，相同的であるか，または生物学的に合理的な他の関係を互いに有する（例えば，ヌクレオモノマーの配列およびその塩基対形成特性に基づいて）ことを意味する。
【００３４】
本発明のＲＮＡ分子を向けさせる"標的遺伝子"は病原性状態と関連するものであってもよい。例えば，遺伝子は，病原体関連遺伝子，例えば，ウイルス遺伝子，腫瘍関連遺伝子，または自己免疫疾患関連遺伝子であってもよい。標的遺伝子はまた，組換え細胞または遺伝的に変更された生物中で発現される異種遺伝子であってもよい。そのような遺伝子の機能を決定するかまたは変更する（例えば阻害する）ことにより，医薬，動物医薬，および生物学において，価値のある情報および治療の恩恵を得ることができる。
【００３５】
"アンチセンス"との用語は，その正常な転写方向に対して反転したヌクレオチド配列を表し，したがって，宿主細胞中で発現される標的遺伝子のｍＲＮＡ分子に相補的なＲＮＡ転写産物を発現する（例えば，これはワトソン−クリック塩基対形成により標的遺伝子のｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる）。アンチセンス鎖は，これが標的遺伝子の発現を妨害することができるかぎり，多くの異なる方法で構築することができる。例えば，アンチセンス鎖は，標的遺伝子のコーディング領域（またはその一部）をその正常な転写方向に対して反転させてその相補体の転写を可能とすることにより構築することができる（例えば，アンチセンス遺伝子およびセンス遺伝子によりコードされるＲＮＡは相補的であってもよい）。さらに，アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は標的遺伝子と同じイントロンまたはエクソンのパターンを有する必要はなく，標的遺伝子の非コーディング領域は，標的遺伝子発現のアンチセンス抑制の達成において，コーディング領域と同等に有効であろう。
【００３６】
"オリゴヌクレオチド"との用語は，結合または置換結合により互いに共有結合している２またはそれ以上のヌクレオモノマーを含む。オリゴヌクレオチドは，例えば，数個（例えば，７，１０，１２，１５個）または数百個（例えば，１００，２００，３００，または４００個）のヌクレオモノマーを含むことができる。例えば，本発明のオリゴヌクレオチドは，好ましくは，約１０−約５０個のヌクレオモノマー，約１５−約４０個，または約２０−約３０個のヌクレオモノマーを含む。１つの態様においては，オリゴヌクレオチドは，約２５個のヌクレオモノマーを含む。別の態様においては，オリゴヌクレオチドは，約２５個より多くのヌクレオモノマーを含む。
【００３７】
オリゴヌクレオチドには，例えば，オリゴヌクレオチド，オリゴヌクレオシド，ポリデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）またはこれらの改変された形，例えば，ＤＮＡ，ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースまたはその改変された形または類似体を含む），ＲＮＡ，またはプリンまたはピリミジン塩基または修飾されたプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである他の任意の種類のポリヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドとの用語には，隣接するヌクレオモノマーがホスホロチオエート，アミドまたは他の結合を介して結合している組成物が含まれる（例えば，Ｎｅｉｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５４：１４９７）。一般に，"結合"との用語は，例えばリガーゼ等の酵素により触媒される２またはそれ以上の核酸成分の間の任意の物理学的接続，好ましくは共有結合を表す。
【００３８】
"オリゴヌクレオチド"との用語は，オリゴヌクレオチドの塩基の足場または支持体として働く任意の構造を含み，ここで，足場は標的核酸分子が配列依存的様式で結合することを可能とする。
【００３９】
"オーバーハング"とは，二本鎖オリゴヌクレオチド分子の５’−または３’−ヒドロキシル末端の比較的短い一本鎖ヌクレオチド配列を表す（"延長"，"突出末端，"または"粘着性末端"とも称される）。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは，単離されたものである。"単離された"との用語は，合成された核酸分子（例えば，化学的に，酵素的に，または組換え的に），または天然に生ずるが核酸の天然起源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子を含む。好ましくは，天然に生ずる"単離された"核酸分子は，その核酸分子が由来する生物において核酸分子中で天然に核酸分子を挟む配列（すなわち，核酸分子の５’および３’末端に位置する配列）を有しない。
【００４１】
"ヌクレオモノマー"との用語は，第２の成分に共有結合した塩基を含む。ヌクレオモノマーには，例えば，ヌクレオシドおよびヌクレオチドが含まれる。ヌクレオモノマーは連結されて，配列特異的様式で標的核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを形成することができる。本明細書において用いる場合，"第２の成分"との用語には，置換されているか置換されていないシクロアルキル成分，例えば，シクロヘキシルまたはシクロペンチル成分，および置換されているか置換されていない複素環成分，例えば，６員のモルホリノ成分，または好ましくは糖成分が含まれる。
【００４２】
糖成分には，天然の，未修飾糖，例えば，単糖類（例えばリボース等のペントース），修飾糖および糖類似体が含まれる。ヌクレオモノマーの可能な修飾には，例えば，ヒドロキシル基の１またはそれ以上をハロゲン，ヘテロ原子，脂肪族基で置き換えるか，またはこの基をエーテル，アミン，チオール等として官能化することが含まれる。例えば，修飾糖としては，Ｄ−リボース，２’−Ｏ−アルキル（例えば，２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチル），すなわち，２’−アルコキシ，２’−アミノ，２’−Ｓ−アルキル，２’−ハロ（例えば，２’−フルオロ），２’−メトキシエトキシ，２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2），２’−プロパルギル，２’−プロピル，エチニル，エテニル，プロペニル，およびシアノ等が挙げられる。１つの態様においては，糖成分はヘキソースであることができ，記載されるようにしてオリゴヌクレオチド中に取り込ませることができる（Ａｕｇｕｓｔｙｎｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９２．１８：４７１１）。ヌクレオモノマーの例は，例えば，米国特許５，８４９，９０２に見いだすことができる。
【００４３】
本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"との用語には，糖成分（ペントース），リン酸，および窒素性複素環塩基を含む，ＤＮＡまたはＲＮＡの任意のモノマー単位が含まれる。塩基は通常はグリコシド炭素を介して糖成分に結合しており（ペントースの１’炭素で），塩基と糖とのこの組み合わせは"ヌクレオシド"と称される。塩基はヌクレオチドを特徴づけるものであり，ＤＮＡの４つの慣用的な塩基はアデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）である。イノシン（Ｉ）は４つの天然に生ずる塩基（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）のいずれかと置き換えて用いることができる合成塩基の一例である。４つのＲＮＡ塩基はＡ，Ｇ，Ｃ，およびウラシル（Ｕ）である。したがって，オリゴヌクレオチドは，隣接するペントースの３’炭素と５’炭素との間のホスホジエステル結合により連結されている直線状のヌクレオチドのアレイを含むヌクレオチド配列であることができる。他の修飾ヌクレオシド／ヌクレオチドは本明細書に記載されており，これらも本発明のオリゴヌクレオチドにおいて用いることができる。
【００４４】
修飾ヌクレオモノマーの特に有用な群は，２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり，特に，２’−Ｏ−メチルヌクレオチドがヌクレオモノマーとしてオリゴマー末端で用いられる場合である。そのような２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは，"メチル化されている"と称され，対応するヌクレオチドは，メチル化されていないヌクレオチドからアルキル化により製造するか，またはメチル化ヌクレオチド試薬から直接製造することができる。修飾ヌクレオモノマーは，未修飾ヌクレオモノマーと組み合わせて用いてもよい。例えば，本発明のオリゴヌクレオチドは，メチル化されたおよびメチル化されていないヌクレオモノマーの両方を含んでいてもよい。
【００４５】
いくつかの例示的修飾ヌクレオモノマーには，糖修飾または骨格修飾リボヌクレオチドが含まれる。修飾リボヌクレオチドは，天然に生じない塩基（天然に生ずる塩基の代わりに），例えば，５位で修飾されたウリジンまたはシチジン，例えば，５−（２−アミノ）プロピルウリジンおよび５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン，例えば，８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド，例えば，７−デアザ−アデノシン；およびＮ−アルキル化ヌクレオチド，例えば，Ｎ６−メチルアデノシンを含んでいてもよい。また，糖修飾リボヌクレオチドは，２’−ＯＨ基がＨ，アルコキシ（またはＯＲ），Ｒまたはアルキル，ハロゲン，ＳＨ，ＳＲ，アミノ（例えば，ＮＨ2，ＮＨＲ，ＮＲ2,），またはＣＮ基（ここで，Ｒは低級アルキル，アルケニル，またはアルキニルである）で置き換えられていてもよい。
【００４６】
修飾リボヌクレオチドはまた，隣接するリボヌクレオチドを連結するホスホエステル基が修飾基，例えば，ホスホロチオエート基で置き換えられていてもよい。より一般的には，種々のヌクレオチド修飾を組み合わせることができる。
【００４７】
“アルキル”という用語には飽和脂肪族基が含まれ，それらには直鎖アルキル基（例えばメチル，エチル，プロピル，ブチル，ペンチル，ヘキシル，ヘプチル，オクチル，ノニル，デシルなど），分子鎖アルキル基（イソプロピル，tert-ブチル，イソブチルなど），シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチル，シクロオクチル)，アルキル置換型シクロアルキル基，およびシクロアルキル置換型アルキル基がある。１つの態様においては，直鎖または分枝鎖アルキルはその骨格に６個以下の炭素原子を有し（例えば直鎖ではC1-C6，分枝鎖ではC3-C6），好ましくは４個以下である。同様に，好ましいシクロアルキルはその環構造中に３-８個の炭素原子を有し，好ましくは環構造中に５または６個の炭素原子を有する。C1-C6という用語は１から６個の炭素原子を含有するアルキル基を含む。
【００４８】
更に，特に記載しない限り，アルキルという用語は“未置換型アルキル”および“置換型アルキル”の両方を含み，後者は炭化水素骨格の１個以上の炭素上に水素に代わる置換基を有するアルキル部分をいう。それらの置換基には例えば以下がある：アルケニル，アルキニル，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ （アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む），アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む），アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。シクロアルキルは，例えば上記の置換基で，更に置換することができる。“アルキルアリール”または“アリールアルキル”部分は，アリール（例えばフェニルメチル（ベンジル））で置換されたアルキルである。“アルキル”という用語は天然および非天然アミノ酸の側鎖も含む。“n-アルキル”という用語は未置換の直鎖（すなわち分枝鎖でない）アルキル基を意味する。
【００４９】
“アルケニル”という用語は，長さおよび可能な置換は上記のアルキルと類似しているが，少なくとも１つの二重結合を含有する不飽和脂肪族基を含む。例えば“アルケニル”という用語は以下を含む：直鎖アルケニル基（例えばエチレニル，プロペニル，ブテニル，ペンテニル，ヘキセニル，ヘプテニル，オクテニル，ノネニル，デセニルなど），分枝鎖アルケニル基，シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル，シクロペンテニル，シクロヘキセニル，シクロヘプテニル，シクロオクテニル），アルキルまたはアルケニル置換型シクロアルケニル基，およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換型アルケニル基。１つの態様においては，直鎖または分枝鎖アルケニル基はその骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば直鎖ではC2-C6，分枝鎖ではC3-C6）。同様に，シクロアルケニル基はその環構造中に３-８個の炭素原子を有してもよく，好ましくは環構造中に５または６個の炭素を有する。C2-C6という用語は２から６個の炭素原子を含有するアルケニル基を含む。
【００５０】
更に，特に記載しない限り，アルケニルという用語は“未置換型アルケニル”および“置換型アルケニル”の両方を含み，後者は炭化水素骨格の１個以上の炭素上に水素に代わる置換基を有するアルケニル部分をいう。それらの置換基には例えば以下がある：アルキル基，アルキニル基，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ（アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む)，アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む），アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。
【００５１】
“アルキニル”という用語は，長さおよび可能な置換は上記のアルキルと類似しているが，少なくとも１つの三重結合を含有する不飽和脂肪族基を含む。例えば“アルキニル”という用語は以下を含む：直鎖アルキニル基（例えばエチニル，プロピニル，ブチニル，ペンチニル，ヘキシニル，へプチニル，オクチニル，ノニニル，デシニルなど），分枝鎖アルキニル基，およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換型アルキニル基。１つの態様においては，直鎖または分枝鎖アルキニル基はその骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば直鎖ではC2-C6，分枝鎖ではC3-C6）。C2-C6という用語は２から６個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。
【００５２】
更に，特に記載しない限り，アルキニルという用語は“未置換型アルキニル”および“置換型アルキニル”の両方を含み，後者は炭化水素骨格の１個以上の炭素上に水素に代わる置換基を有するアルキニル部分をいう。それらの置換基には例えば以下がある：アルキル基，アルキニル基，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ（アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む），アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む)，アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。
【００５３】
炭素数を特に記載しない限り，ここで使用する“低級アルキル”は，上記の通りであるがその骨格構造に１から５個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。“低級アルケニル”および“低級アルキニル”は，例えば２-５個の炭素原子の鎖長を有する。
【００５４】
“アルコキシ”という用語は，酸素原子に共有結合した置換型および未置換型アルキル，アルケニル，およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例にはメトキシ，エトキシ，イソプロピルオキシ，プロポキシ，ブトキシ，およびペントキシ基がある。置換型アルコキシ基の例にはハロゲン化アルコキシ基がある。アルコキシ基は以下のような基で置換できる：アルケニル，アルキニル，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ（アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む)，アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む)，アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。ハロゲン置換型アルコキシ基の例には，限定されるわけではないがフルオロメトキシ，ジフルオロメトキシ，トリフルオロメトキシ，クロロメトキシ，ジクロロメトキシ，トリクロロメトキシなどがある。
【００５５】
“ヘテロ原子”という用語は，炭素または水素以外の元素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は窒素，酸素，硫黄，およびリンである。
【００５６】
“ヒドロキシ”または“ヒドロキシル”という用語は-OHまたは-O-（好適なカウンターイオンと共に）を有する基を含む。
【００５７】
“ハロゲン”という用語はフッ素，臭素，塩素，ヨウ素などを含む。“ペルハロゲン化”という用語は，全ての水素がハロゲン原子で置換されている部分をいう。
【００５８】
“置換された”という用語は，部分に配して分子がその意図する機能をするようにできる置換基を含む。置換基の例には以下がある：アルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，(CR'R’)0-3NR'R’，(CR'R’)0-3CN，NO2，ハロゲン，(CR'R’)0-3C(ハロゲン)3，(CR'R’)0-3CH(ハロゲン)2，(CR'R’)0-3CH2(ハロゲン)，(CR'R’)0-3CONR'R’，(CR'R’)0-3S(O)1-2NR'R’，(CR'R’)0-3CHO，(CR'R’)0-3O(CR'R’)0-3H，(CR'R’)0-3S(O)0-2R'，(CR'R’)0-3O(CR'R’)0-3H，(CR'R’)0-3COR'，(CR'R’)0-3CO2R'，または(CR'R’)0-3OR'基；ここで，R'およびR’はそれぞれ独立して水素，C1-C5アルキル，C2-C5アルケニル，C2-C5アルキニル，もしくはアリール基であるか，またはR'およびR’は合わさってベンジリデン基もしくは-(CH2)2O(CH2)2-基である。
【００５９】
“アミン”または“アミノ”という用語は，窒素原子が少なくとも１個の炭素またはヘテロ原子に共有結合した化合物または部分を含む。“アルキルアミノ”という用語は，窒素が少なくとも１個の更なるアルキル基に結合した基および化合物を含む。“ジアルキルアミノ”という用語は，窒素原子が少なくとも２個の更なるアルキル基に結合した基を含む。
【００６０】
“エーテル”という用語は，２つの異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含有する化合物または部分を含む。例えば用語は“アルコキシアルキル”を含むが，これはアルキル，アルケニル，またはアルキニル基が，別のアルキル基に共有結合した酸素原子に共有結合したものをいう。
【００６１】
"エステル"という用語は，カルボニル基の炭素に結合した酸素原子に結合した炭素原子またはヘテロ原子を含む化合物および成分を含む。"エステル"との用語は，メトキシカルボニル，エトキシカルボニル，プロポキシカルボニル，ブトキシカルボニル，ペントキシカルボニル等のアルコキシカルボキシ基を含む。
【００６２】
“塩基”という用語には，既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環塩基，デアザプリン，並びにそれらの類似体（ヘテロ環置換型類似体，例えばアミノエチルオキシフェノキサジン），誘導体（例えば１-アルケニル-，１-アルキニル-，ヘテロ芳香環-，および１-アルキニル誘導体），および互変異性体が含まれる。プリンの例にはアデニン，グアニン，イノシン，ジアミノプリン，およびキサンチン，並びにそれらの類似体（例えば８-オキソ-N6-メチルアデニンまたは７-ジアザキサンチン）および誘導体がある。ピリミジンには，例えばチミン，ウラシル，およびシトシン，並びにそれらの類似体（例えば５-メチルシトシン，５-メチルウラシル，５-（１-プロピニル）ウラシル，５-（１-プロピニル）シトシン，および４,４-エタノシトシン）がある。好適な塩基の他の例には非プリン系および非ピリミジン系塩基，例えば２-アミノピリジンおよびトリアジンがある。
【００６３】
“ヌクレオシド”という用語は，糖部分，好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有結合した塩基を含む。好ましいヌクレオシドの例にはリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドがある。また，ヌクレオシドにはアミノ酸またはアミノ酸類似体に結合した塩基が含まれ，これは遊離カルボキシル基，遊離アミノ基，または保護基を含んでもよい。好適な保護基は当該分野で十分知られている（例えばP.G.M. WutsおよびT.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 第２版, Wiley-Interscience, New York, 1999参照）。
【００６４】
“ヌクレオチド”という用語は，リン酸基またはリン酸類似体を更に含むヌクレオシドを含む。
【００６５】
好ましい態様では，本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーはRNAヌクレオチドである。別の好ましい態様では，本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは修飾型RNAヌクレオチドである。
【００６６】
ここで使用する“結合”という用語は，隣接するヌクレオモノマーに共有結合している天然に存在する未修飾のホスホジエステル部分（-O-(PO2-)-O-）を含む。ここで使用する“置換結合”という用語は，隣接ヌクレオモノマーに共有結合する天然のホスホジエステル基の任意の類似体または誘導体を含む。好適な結合にはホスホジエステル類似体，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，およびP-エチルオキシホスホジエステル，P-エトキシホスホジエステル，P-アルキルオキシホスホトリエステル，メチルホスホネート，およびリン以外を含む結合（例えばアセタールおよびアミド）がある。それらの置換結合は当該分野で知られている（例えばBjergardeら, 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843；Caruthersら, 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47）。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチドは3'および5'末端を含む（環状オリゴヌクレオチドの場合は除く）。オリゴヌクレオチドの3'および5'末端は，例えば3'または5'結合の修飾によって，ヌクレアーゼから実質的に保護できる（例えば米国特許第5,849,902号および国際特許公開WO98/13526号）。例えばオリゴヌクレオチドは“ブロッキング基”を含有させることによって耐性を持たせることができる。ここで使用する“ブロッキング基”という用語は，合成のための保護基またはカップリング基のいずれかとしてオリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに結合させることができる置換基（例えばOH基以外）をいう（例えば，ハロゲンホスフェート，ホスホルアミダイトまたはPO32-）。また“ブロッキング基”はオリゴヌクレオチドの5'および3'末端を保護する“末端ブロッキング基”または“エキソヌクレアーゼブロッキング基”も含み，それらには修飾型ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造がある。
【００６８】
代表的な末端ブロッキング基にはキャップ構造（例えば7-メチルグアノシンキャップ），反転ヌクレオモノマー（例えば3'-3'または5'-5'末端反転）（例えばOrtiagaoら, 1992.  Antisense Res. Dev. 2:129参照），メチルホスホネート，ホスホルアミダイト，非ヌクレオチド基（例えば非ヌクレオチドリンカー，アミノリンカー，コンジュゲート）などがある。3'末端ヌクレオモノマーは修飾された糖部分を含むこともできる。3'末端ヌクレオモノマーは3'-Oを含み，これは場合によりオリゴヌクレオチドの3'-エキソヌクレアーゼ分解を阻害するブロッキング基で置換されていてもよい。例えば3'-ヒドロキシルは3'→3'ヌクレオチド間結合を介してヌクレオチドにエステル結合させることができる。例えば，アルキルオキシラジカルはメトキシ，エトキシ，またはイソプロポキシであってもよく，好ましくはエトキシである。場合により，3'末端で3'→3'結合したヌクレオチドは置換結合によって結合させることができる。ヌクレアーゼ分解を低下させるために，最も5' 側の3'→5'結合は修飾型結合，例えばホスホロチオエートまたはP-アルキルオキシホスホトリエステル結合であってもよい。好ましくは，２つの最も5' 側の 3'→5'結合は修飾型結合である。場合により，5'末端ヒドロキシ部分を，リンを含有する部分とエステル化させることができる（例えばホスフェート，ホスホロチオエート，またはP-エトキシホスフェート）。
【００６９】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドは，５’リン酸基またはリン酸基より大きい基を含むことができる。
【００７０】
１つの態様においては，組成物に含有されるオリゴヌクレオチドは高親和性オリゴヌクレオチドである。ここで使用する“高親和性”という用語は，Tm（融点）が約60℃より高い，約65℃より高い，約70℃より高い，約75℃より高い，約80℃より高い，または約85℃より高いオリゴヌクレオチドを含む。Tmは，オリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列から分離する温度範囲の中間温度である。この温度では，コイル（ハイブリダイズしていない）に対して50%のらせん（ハイブリダイズした）型が存在する。UVスペクトルを使用してTmを測定し，ハイブリダイゼーションの生成および崩壊（溶解）を測定する。ハイブリダイゼーションの際，塩基のスタッキングが起こり，これによってUV吸収は低下する。Tmは２つの核酸分子のGC含量および配列相補性の程度に依存する。Tmは当該分野で知られる技術を使用して測定することができる（例えばMoniaら. 1993. J. Biol. Chem. 268:145；Chiangら. 1991. J. Biol. Chem. 266:18162；Gagnorら. 1987. Nucleic Acids Res. 15:10419；Moniaら. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:15481；PublisisおよびTinoco. 1989. Methods in Enzymology 180:304；Thuongら. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5129参照）。
【００７１】
当業者は，ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの長さはアンチセンス鎖中の標的に相補的な領域に対応すること，および，例えばＲＮＡｉがヘアピン型の設計である場合，ＲＮＡｉはより長くてもよいことを理解するであろう。
【００７２】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドに，その標的配列へのオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる物質を含有させることができる。“親和性増強剤”という用語は，その標的へのオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる物質を含む。それらの物質には，例えばインターカレート剤および高親和性ヌクレオモノマーがある。インターカレート剤は核酸と強く，非特異的に相互作用する。インターカレート剤はRNA-DNAデュープレックスを安定化させ，それによってその標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる役割を果たす。インターカレート剤は最も一般的にはオリゴヌクレオチドの3'または5'末端に結合させる。インターカレート剤の例にはアクリジン，クロラムブシル，ベンゾピリドキノキサリン，ベンゾピリドインドール，ベンゾフェナントリジン，およびフェナジニウムがある。物質はオリゴヌクレオチドに他の特質を与えるものであってもよく，それらには例えばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼへの耐性の増加がある。
【００７３】
１つの態様においては，高親和性ヌクレオモノマーをオリゴヌクレオチド内に導入する。ここで使用する“高親和性ヌクレオモノマー”という用語は，標的核酸分子中の相補塩基に，例えば相補塩基とより多くの水素結合を形成することによって，例えば相補塩基とより好性の強い相互作用を持つことによって，未修飾塩基より高い親和性で結合する修飾型塩基または塩基類似体を含む。例えば高親和性ヌクレオモノマー類似体，例えばアミノエトキシフェノキサジン（Gクランプとも呼ばれる。グアニンと４つの水素結合を形成する）は“高親和性ヌクレオモノマー”に含まれる。高親和性ヌクレオモノマーを以下に例証する（例えばFlanaganら, 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:3513参照）。
【化１】
0004527984.tif 000002
（すなわちグアニンおよびアミノエチオキシフェノキサジン）
【００７４】
他の代表的な高親和性ヌクレオモノマーは当該分野で知られているが，それらには7-アルケニル，7-アルキニル，7-ヘテロ芳香族，もしくは7-アルキニルヘテロ芳香族で置換された塩基などがあり，これはオリゴヌクレオチド中でアデノシンもしくはグアノシンの代わりに用いることができる（例えば米国特許第5,594,121号参照）。また，7-置換型デアザプリンはオリゴヌクレオチドへの結合性が向上されていることが発見されており，これはすなわち，未修飾のオリゴヌクレオチドに比べて高い親和性で相補的標的核酸分子に結合できることによる。高親和性ヌクレオモノマーは標準的な技術を使用して本発明のオリゴヌクレオチドに導入できる。
【００７５】
別の態様においては，標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる物質はインターカレート剤を含有する。ここで使用する“インターカレート剤”という用語は，DNA二重らせんに結合できる物質を含む。本発明のオリゴヌクレオチドに共有結合させると，インターカレート剤はオリゴヌクレオチドの相補的ゲノムDNA標的配列への結合を向上する。インターカレート剤はエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼへの耐性も向上しうる。代表的なインターカレート剤はHeleneおよびThuong（1989. Genome 31:413）に記載されており，例えば以下がある：アクリジン誘導体（Lacosteら. 1997. Nucleic Acids Research. 25:1991; Kukretiら. 1997. Nucleic Acids Research. 25:4264）；キノリン誘導体（Wilsonら. 1993. Biochemistry 32:10614）；ベンゾ［f］キノ［3,4-b］キノキサリン誘導体（Marchandら. 1996. Biochemistry. 35:5022; Escudeら. 1998.  Proc. Natl. Acad. Sci. 95:3591）。インターカレート剤はいずれの慣用的な結合を使用してオリゴヌクレオチドに導入してもよい。例えば，アクリジンまたはソラレンを，いずれかの可能な-OHまたは-SH基を介して，例えばオリゴヌクレオチドの末端5'位，糖部分の2'位，またはピリミジンの5位に導入したOH，NH2，COOH，もしくはSHに，標準的な方法によって結合させることができる。
【００７６】
１つの態様においては，RNaseH活性化アンチセンスオリゴヌクレオチド中に含まれる場合，オリゴヌクレオチドの標的への親和性を増加させる物質はオリゴヌクレオチドのRNase活性化領域に隣接させず，例えば非RNase活性化領域に隣接させる。好ましくは，オリゴヌクレオチドの標的への親和性を増加させる物質をキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase活性化ドメインからできるだけ離れた位置に配し，キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性が，インターカレート化合物がないキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性に比較して変化を受けないようにする。１つの態様においては，これはこの物質を非RNase活性化領域に隣接して配置することによって行うことができる。オリゴヌクレオチドの特異性の試験は，非標的配列，好ましくは標的と構造的に類似した非標的配列（例えば標的配列とある程度の配列相同性または同一性を有するが，標的と同じ配列ではない）の転写が，標的を対象とするが親和性増強剤を含有しないオリゴヌクレオチドによる場合と比較して，親和性増強剤を含有する標的に対するオリゴヌクレオチドによるほうがより大きく阻害されるということがないことを確認することによって行うことができる。
【００７７】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドはＧＣ含量が高められている。本明細書において用いる場合，"ＧＣ含量が高められている"との用語は，比較的高いパーセントのＧＣ含量を有するオリゴヌクレオチドを含む。例えば，１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも約２０％，少なくとも約３０％，少なくとも約４０％のＧＣ含量を有する。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，少なくとも約５０％，少なくとも約６０％，または少なくとも約７０％のＧＣ含量を有する。
【００７８】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，少なくとも約２５ヌクレオモノマーの長さである。１つの態様においては，本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは約２５ヌクレオモノマーより長い。１つの態様においては，本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも約３０，少なくとも約４０，少なくとも約５０，または少なくとも約６０，少なくとも約７０，少なくとも約８０，または少なくとも約９０ヌクレオモノマーの長さである。
【００７９】
二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド
二本鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡｉ（二本鎖ＲＮＡ干渉））とは，細胞において蛋白質合成を阻害するために用いることができる二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである（例えば，ＷＯ０１／３６６４６Ａ１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｏｌｐｍｅｎｔ  １５：１８８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１  ＥＭＢＯ．２０：６８７７を参照）。二本鎖ＲＮＡは，１つの自己相補的鎖または２つの別々の相補的鎖から形成することができる。デュープレックス形成は，標的遺伝子を含む細胞の内部で生じても外部で生じてもよい。
【００８０】
ここで使用する“二本鎖”という用語は，少なくとも一部のヌクレオモノマーが相補的であり，水素結合によってデュープレックスを生成する分子領域を含む１つ以上の核酸分子を含む。
【００８１】
ここで使用する“デュープレックス”という用語は，相補配列に水素結合した二本鎖核酸分子の領域を含む。
【００８２】
したがって，本発明の１つの観点は，ＲＮＡｉ薬剤のｄｓＲＮＡ成分が遺伝子を標的とするようにＲＮＡｉ薬剤を細胞内に導入することにより標的遺伝子の活性を阻害する方法である。１つの態様においては，ＲＮＡオリゴヌクレオチド分子は，修飾ヌクレオチド類似体である少なくとも１つのヌクレオモノマーを含んでいてもよい。ヌクレオチド類似体は，標的特異的活性，例えばＲＮＡｉ媒介性活性が実質的に影響を受けない位置に，例えば，二本鎖分子の５’末端または３’末端の領域中に存在することができ，ここでは，修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことによりオーバーハングを安定化させることができる。
【００８３】
別の観点においては，当該技術分野において知られる二本鎖ＲＮＡ分子を本発明の方法において用いることができる。当該技術分野において知られる二本鎖ＲＮＡ分子はまた，本明細書の教示にしたがって，例えば，修飾ヌクレオモノマーを用いることにより，そのような方法と組み合わせて修飾することができる。例えば，米国特許６，５０６，５５９；米国特許２００２／０，１７３，４７８Ａ１；米国特許２００２／０，０８６，３５６Ａ１；Ｓｈｕｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，"ＲＮＡｉ：ｇｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．"Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ２００２  Ｏｃｔ  １５；７（２０）：１０４０−６；Ａｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３  Ｊａｎ；３０（１−２）：９６−１０２；Ｃｉｏｃａ，ｅｔ  ａｌ．，"ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３  Ｆｅｂ；１０（２）：１２５−３３を参照。
【００８４】
二本鎖ＲＮＡ分子のさらに別の例には，以下の参考文献に開示されるものが含まれる：Ｋａｗａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｄｓＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔＲＮＡ（Ｖａｌ）  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．"Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｊａｎ  １５；３１（２）：７００−７；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｉｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｎｄｓ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．"Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３  Ｊａｎ；１１（１）：３７−４３；Ｌｉｎｋｓ，"Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＲＮＡｉ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｓｓｅｓ．"Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２００３  Ｊａｎ；１９（１）：９−１２；Ｈａｍａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＲＮＡｉ）  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ３’−ｅｎｄｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．"Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．２００２  Ｏｃｔ；１２（５）：３０１−９；Ｌｉｎｋｓ，"ＲＮＡｉ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｕｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００２  Ｄｅｃ；６（６）：８２９−３４；Ｋａｗａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｄｓＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔＲＮＡ（Ｖａｌ）  ｐｕｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．"Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｊａｎ  １５；３１（２）：７００−７）。
【００８５】
二本鎖ＲＮＡ分子は，標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては，二本鎖ＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部と少なくとも約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖ＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部と少なくとも約９５％同一のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖ＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部と少なくとも約９０％同一のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖ＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部と少なくとも約８０％同一のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖ＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部と少なくとも約６０％同一のヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖ＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部と少なくとも約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するためには，配列を最適な比較の目的のためにアラインメントする（例えば，最適なアラインメントのためには第１のおよび第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ，比較の目的のためには同一ではない配列を無視することができる）。好ましい態様においては，比較の目的のためにアラインメントされる標的遺伝子配列の長さは，少なくとも約２５ヌクレオチド残基，少なくとも約５０，少なくとも約１００，少なくとも約１５０，少なくとも約２００，または少なくとも約３００またはそれ以上のヌクレオチド残基である。次に，対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合，分子はその位置において同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は，２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数，および各ギャップの長さを考慮して，配列の間で共通する同一の位置の数の関数である。
【００８７】
配列の比較および２つの配列間の同一性（％）の確認は数学的なアルゴリズムを使用して行うことができる。好ましい態様では，２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）の測定を，例えばGCGソフトウェアパッケージの中のGAPプログラムを用い，例えばNWSgapdnaを使用して行う。CMP マトリクスおよびギャップ重みは，40, 50, 60, 70, または80 であり，長さ重みは1, 2, 3, 4, 5, または6である。別の態様においては，２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）の測定を，E. MeyersおよびW. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを使用して行うが，これはALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれており，PAM120重み残基表，ギャプ長ペナルティー12，およびギャップペナルティー4を用いる。
【００８８】
更に本発明の核酸配列を“クエリー配列”として使用し，公共のデータベース中の配列に対してアラインメントを行うことができる。それらの検索はAltschulら, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）を使用して行うことができる。BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラム（スコア＝100，ワード長＝12）を使用して実施できる。比較のためのギャップを有するアラインメントを得るために，Gapped BLASTをAltschulら, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるように使用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合，それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えばXBLASTおよびNBLAST）を使用できる。例えばNIHのインターネットウェブサイトを参照されたい。
【００８９】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたり，標的核酸配列と同一である。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０−９５％にわたり，標的核酸配列と同一である。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの長さ全体にわたり，標的核酸配列と同一である。
【００９０】
さらに別の態様においては，本発明の二本鎖ＲＮＡ分子の配列は，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で，標的遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする。本明細書において用いる場合，"ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする"との用語は，互いに少なくとも６０％相補的なヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイズしたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図する。好ましくは，条件は，互いに少なくとも約７０％，より好ましくは少なくとも約８０％，さらにより好ましくは少なくとも約８５％または９０％相補的な配列が典型的に互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。そのようなストリンジェントな条件は当業者に知られており，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見られる。非制限的な好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下である：6X塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）（約45℃）でハイブリダイゼーション，次いで0.2 X SSC，0.1% SDSで１回以上洗浄（50℃，好ましくは55℃，より好ましくは60℃，更に好ましくは65℃）。上記の数値の中間の範囲，例えば60-65℃または55-60℃も本発明の範囲に含まれることを意図する。あるいはまた，当該分野で周知の方法および条件を使用してホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に含有させることができる。
【００９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書において用いる場合，"アンチセンスオリゴヌクレオチド"との用語は，標的ポリペプチドの合成を特異的に妨害するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。一般に，本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的遺伝子（例えば，ポリヌクレオチド，例えば，ＤＮＡ，ｍＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡを含む））分子）のヌクレオチド配列の"センス"鎖に結合する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが核酸分子に結合する場合，これらは核酸分子の任意の領域，例えば，イントロン，エクソン，５’または３’非翻訳領域に結合することができる。例えば，立体的傷害として作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは，核酸標的分子のスプライシングジャンクション，５’非翻訳領域，または開始領域に優先的に結合する。ＲＮａｓｅＨを活性化することにより作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは，好ましくは核酸標的分子のイントロン，エクソン，５’非翻訳領域，または３’非翻訳領域中に結合する。
【００９２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，その標的配列に相補的であっても相補的でなくてもよい。いかなる特定の作用メカニズムにも限定されるものではないが，本発明のオリゴヌクレオチド組成物において用いられる，標的遺伝子中のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズしうる（すなわち，標的遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的である）アンチセンスオリゴヌクレオチドは，例えば，以下に基づいてその効果を達成することができる：（１）標的ｍＲＮＡに結合して，リボソーム複合体がｍＲＮＡを翻訳することを立体的に妨害する；（２）標的ｍＲＮＡに結合して，ＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡの切断を誘発する；（３）核内で二本鎖ＤＮＡに結合して，トリプルヘリックスを形成する；（４）ＲＮＡポリメラーゼにより生成するオープンＤＮＡループにハイブリダイズする；（５）ｍＲＮＡスプライシングを妨害する；（６）ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送を妨害する；または（７）開始因子の結合またはリボソームサブユニットの組立を阻害することにより翻訳を妨害する（すなわち，開始コドンにおいて）。
【００９３】
いかなる特定の作用メカニズムにも限定されるものではないが，本発明のオリゴヌクレオチド組成物において用いられる，標的遺伝子中のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることができない（標的遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的ではない）アンチセンスオリゴヌクレオチドは，例えば，（１）オリゴヌクレオチドの二次構造；（２）異なるヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーション；（３）標的遺伝子に影響を及ぼすかもしれない蛋白質または他の分子への結合；または（４）それ自体細胞の機能に影響を及ぼしうるオリゴヌクレオチド分解産物の調節に基づいてその効果を及ぼすことができる。
【００９４】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは同じメカニズムで蛋白質合成を阻害する。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは異なるメカニズムで蛋白質合成を阻害する。さらに別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中に存在するすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは同じメカニズムで蛋白質合成を阻害する。本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，これらの作用モードのいくつかに同時に依存するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドはいかなるタイプのものであってもよく，例えば，モルホリノオリゴヌクレオチド，ＲＮａｓｅＨ活性化オリゴヌクレオチド，またはリボザイムでありうる。
【００９６】
１つの態様においては，本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的核酸配列に実質的に相補的である。パーセント相補性は，パーセント同一性と同様に決定する。例えば，試験ヌクレオチド配列中の位置が参照配列中の対応する位置に相補的なヌクレオチドで占められている場合，分子はその位置において相補的である。１つの態様においては，アンチセンスＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部に少なくとも約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部に少なくとも約９０％相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部に少なくとも約８０％相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部に少なくとも約６０％相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスＲＮＡ分子は，標的遺伝子の一部に少なくとも約１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。好ましくは，オリゴヌクレオチドと標的との間で非相補性の領域によって約８ヌクレオチドより長いループが形成されない。
【００９７】
１つの態様においては，本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたり標的核酸配列と相補的である。別の態様においては，本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０−９５％にわたり標的核酸配列と相補的である。別の態様においては，本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドの長さ全体にわたり標的核酸配列と相補的である。
【００９８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはRNA様およびDNA様領域を含む“キメラオリゴヌクレオチド”であってもよい。“RNaseH活性化領域”という用語は，RNaseHをリクルートしてオリゴヌクレオチドが結合する標的RNA鎖を切断する能力があるオリゴヌクレオチド，例えばキメラオリゴヌクレオチドの領域を含む。一般に，RNase活性化領域はDNAまたはDNA様ヌクレオモノマーの最小限のコア（少なくとも約3-5，一般に約3-12，更に一般的には約5-12，そしてより好ましくは約5-10の連続するヌクレオモノマー）を含有する（例えば米国特許第5,849,902号参照）。より好ましくは，RNaseH活性化領域は，約9つの連続するデオキシリボース含有ヌクレオモノマーを含む。好ましくは，連続するヌクレオモノマーは置換結合，例えばホスホロチオエート結合によって結合する。
【００９９】
“非活性化領域”という用語は，RNaseHをリクルートまたは活性化しないアンチセンスオリゴヌクレオチド，例えばキメラオリゴヌクレオチドの領域を含む。好ましくは，非活性化領域はホスホロチオエートDNAを含まない。本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの非活性化領域を含む。１つの態様においては，非活性化領域を標的に相補的であるようにして，オリゴヌクレオチドが結合すべき標的核酸分子と水素結合を形成させることによって，ヌクレアーゼに対して安定化させるか，または標的への特異性を提供することができる。
【０１００】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは“モルホリノオリゴヌクレオチド”を含んでもよい。モルホリノオリゴヌクレオチドは非イオン性であり，RNaseH依存的機構により機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの４つの遺伝子塩基（アデニン，シトシン，グアニン，およびチミン／ウラシル）はそれぞれ６員モルホリン環に結合する。モルホリノオリゴヌクレオチドは，非イオン性ホスホロジアミダイトサブユニット間結合によって，４つの異なる型のサブユニットを結合させることによって生成する。２サブユニットのモルホリノオリゴヌクレオチドの例を以下に示す。
【化２】
0004527984.tif 000003
【０１０１】
モルホリノオリゴヌクレオチドは以下のような多くの利点を有する：ヌクレアーゼに対する完全な耐性（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1996. 6:267）；予測可能なターゲティング（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；細胞内での確実な活性（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:63）；優れた配列特異性（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:151）；最低限の非アンチセンス活性（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；および容易な浸透または摩擦（scrape）運搬（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:291）。モルホリノオリゴヌクレオチドは高用量でも無毒性であるという理由からも好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドの調製についての検討はAntisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:187に見られる。
【０１０２】
異なる長さの種々のヌクレオチドを用いることができる。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，約２５ヌクレオモノマーより長い。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，少なくとも約１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２７，２８，２９，３０，少なくとも約４０，少なくとも約５０，または少なくとも約６０，少なくとも約７０，少なくとも約８０，または少なくとも約９０ヌクレオモノマーの長さである。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，約２５ヌクレオモノマーの長さより短く，特に，約２１−２３ヌクレオモノマーの長さである。さらに別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，約１０，１２，１４，１６，１８，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，または３０ヌクレオモノマーの長さである。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，最大で約２６，２７，２８，２９，３０，最大で約４０，最大で約５０，または最大で約６０，最大で約７０，最大で約８０，または最大で約９０ヌクレオモノマーの長さである。
【０１０３】
ある観点においては，好ましいヌクレオモノマーはリボヌクレオチド，例えば，２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよび他の２’修飾ＲＮＡ分子である。
【０１０４】
本発明のオリゴマーはまた，ＤＮＡギャップまたはホスホロチオエートＤＮＡギャップを含んでいてもよい。
【０１０５】
ある観点においては，本発明は，少なくとも４，５，６，７，８，９または１０個の異なる核酸配列を標的とする少なくとも約４，５，６，７，８，９，または１０個のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物および方法に関する。
【０１０６】
オリゴヌクレオチド配列の選択
標的蛋白質を選択し，これをコードするヌクレオチド配列を決定した後，本発明の組成物に含めるオリゴヌクレオチドの配列を決定する。標的遺伝子の配列を分析し，排除工程と選択工程の両方を含む方法によりオリゴヌクレオチドを選択する。１つの態様においては，オリゴヌクレオチド中で連続していずれかのヌクレオチド（Ａ，Ｕ，Ｃ，またはＧ）が４以上生ずるオリゴヌクレオチドを除く。別の態様においては，ジヌクレオチド反復（例えば，ＡＵＡＵ，ＡＣＡＣ，ＡＧＡＧ，ＵＣＵＣ，ＵＧＵＧ，またはＣＧＣＧ）を有するオリゴヌクレオチドを除く。別の態様においては，好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチド離れている標的遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするオリゴヌクレオチドを選択する。別の態様においては，オリゴヌクレオチドの塩基組成が類似するように，４−１０個の各塩基を含むオリゴヌクレオチドを選択する。別の態様においては，オリゴヌクレオチド中のＧまたはＣである塩基のパーセントは５０％より大きい。１つの態様においては，選択された標的配列に相補的であるようにオリゴヌクレオチドを設計する場合，好ましくは，これらは標的配列に１００％相補的である。別の態様においては，オリゴヌクレオチドは好ましくは他の非標的遺伝子に対して３以上のミスマッチを有する。当業者は，利用可能なアラインメントプログラムおよび公共データベース，例えば，ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのインターネットウエブサイトを用いて，これを調べることができる。
【０１０７】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物
本発明は，２以上の個々のオリゴヌクレオチド分子を含むオリゴヌクレオチド組成物に関する。組成物の個々のオリゴヌクレオチド分子は，１つの標的遺伝子の少なくとも１つの標的ヌクレオチド配列を標的とする。例えば，１つの態様においては，組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは同じ標的遺伝子中の同じヌクレオチド配列を標的とする。例えば，オリゴヌクレオチドは，異なる化学を含むが標的核酸分子中の塩基の同じ配列を標的とする（例えば，これに特異的にハイブリダイズする）。別の態様においては，組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは，同じ標的遺伝子中の異なるヌクレオチド配列を標的とする（例えば，オリゴヌクレオチド組成物は遺伝子のプロモーター中のヌクレオチド配列を標的とする１つのオリゴヌクレオチド，および標的核酸分子のコーディング配列の一部のヌクレオチド配列を標的とする別のオリゴヌクレオチドを含むか，あるいは，オリゴヌクレオチド組成物は，標的核酸分子のコーディング領域中の２つの異なるヌクレオチド配列を標的とする少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを含む）。
【０１０８】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物中において用いられるオリゴヌクレオチドの数は，約２オリゴヌクレオチド程度の少ない数から約２０オリゴヌクレオチドより多い数まで様々でありうる。１つの態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中で少なくとも約３−４個の異なるオリゴヌクレオチドが用いられる。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中で少なくとも約５−６個の異なるオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中で少なくとも約７−８個の異なるオリゴヌクレオチドが用いられる。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物中で約８より多い異なるオリゴヌクレオチドが用いられる。好ましい態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中の異なるオリゴヌクレオチドの数は，標的蛋白質の合成を有効に阻害する最小数の異なるオリゴヌクレオチドを使用するように選択する。
【０１０９】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物中で用いられる異なるオリゴヌクレオチドは，それぞれ同じ濃度で存在していてもよく，異なる濃度で存在していてもよい。例えば，より望ましいオリゴヌクレオチド（例えば，より低価格であるか，または合成が容易であるもの）が，より望ましくないオリゴヌクレオチドより高い濃度で存在していてもよい。
【０１１０】
好ましくは，組成物中のオリゴヌクレオチドは，全て二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであるか，または全てアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１１１】
本発明の個々のオリゴヌクレオチドは，異なる化学を含むよう合成することができることが理解されるであろう。例えば，１つの態様においては，本発明の組成物は，任意にＧＣ含量が高められていてもよい少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことができる。別の態様においては，本発明の組成物は，その標的に高い親和性をもって結合する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。別の例示的態様においては，本発明の組成物は，少なくとも約２５ヌクレオモノマーの長さである少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，ＧＣ含量が高められておりその標的に高い親和性をもって結合するオリゴヌクレオチドを含む。すなわち，この例により示されるように，当業者は，本明細書の教示が与えられれば，本発明の改良されたオリゴヌクレオチド組成物中に存在する個々のオリゴヌクレオチドの多くの改変をなしうることを認識するであろう。
【０１１２】
オリゴヌクレオチド組成物の製造
１つの態様においては，個々のオリゴヌクレオチドは，本発明の組成物に含有させる前に蛋白質合成を阻害する能力について個別に試験しない。
【０１１３】
別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中に含有させるための個々のオリゴヌクレオチドは個別に試験したとき蛋白質合成を約２０％阻害する。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中に含有させるための個々のオリゴヌクレオチドは個別に試験したとき遺伝子発現を約３０％阻害する。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中に含有させるための個々のオリゴヌクレオチドは，個別に試験したとき遺伝子発現を約４０％阻害する。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中に含有させるための個々のオリゴヌクレオチドは，個別に試験したとき遺伝子発現を約５０％阻害する。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物中に含有させるための個々のオリゴヌクレオチドは，個別に試験したとき遺伝子発現を約６０％阻害する。好ましくは，オリゴヌクレオチド組成物中に含有させるための個々のオリゴヌクレオチドは，個別に試験したとき遺伝子発現を約４０％未満で阻害する。
【０１１４】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，オリゴヌクレオチド組成物の個々のオリゴヌクレオチドのいずれかが単独で作用して達成するレベルの遺伝子発現の阻害より高い程度で，遺伝子発現を阻害する。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物は，組成物の最も有効な個々のオリゴヌクレオチドにより達成される阻害のレベルと同じであるかこれより高いレベルの蛋白質合成の阻害を達成する。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，遺伝子発現の阻害について少なくとも約８０％有効である。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，遺伝子発現の阻害について少なくとも約９０％−９５％有効である。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，遺伝子発現の阻害について少なくとも約９９％有効である。
【０１１５】
本発明の組成物は，本発明のオリゴヌクレオチド組成物に含有させる前に個々のオリゴヌクレオチドが蛋白質合成を阻害する能力を試験する必要がないため，蛋白質合成の阻害の効力を著しく増加させる。したがって，蛋白質合成を有効に阻害するためには１回だけしかトランスフェクションを行う必要がない。すなわち，１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，組成物の個々のオリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害する能力を試験する前に，細胞または細胞の集団と接触させる。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，組成物の個々のオリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害する能力を試験した後に，細胞または細胞の集団と接触させる。
【０１１６】
遺伝子発現の阻害を行うために，本発明のオリゴヌクレオチド組成物を細胞（または細胞溶解物）と接触させる。１つの態様においては，オリゴヌクレオチド組成物のオリゴヌクレオチドを同時に細胞と接触させる。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物のオリゴヌクレオチドを異なる時間に細胞と接触させることができる。例えば，オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを他のオリゴヌクレオチドとは異なる時間に細胞と接触させることができる。さらに別の例においては，オリゴヌクレオチド組成物のそれぞれのオリゴヌクレオチドを順番に細胞と接触させ，オリゴヌクレオチド組成物のそれぞれのオリゴヌクレオチドが異なる時間に細胞と接触するようにする。そのようにして，オリゴヌクレオチドを別々に投与するよう本発明の組成物を処方することができる。好ましくは，蛋白質合成の阻害のレベル（例えば，直接測定することにより（生成する標的蛋白質の量の減少を測定することにより），または，例えば，標的蛋白質の存在と関連する表現型の消失を測定することにより，標的遺伝子から生成されるｍＲＮＡの量の減少を測定することにより，またはｍＲＮＡの分解のレベルの増加を測定することにより）が，本発明の個々のヌクレオチドを別々に試験したときに観察されるより高いように，細胞を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させる。
【０１１７】
細胞と接触させるために用いられるオリゴヌクレオチドの数は，２オリゴヌクレオチド程度の少ない数から約２０オリゴヌクレオチドより多い数まで様々でありうる。１つの態様においては，少なくとも約２−３個の異なるオリゴヌクレオチドを細胞と接触させる。別の態様においては，少なくとも約４−５個の異なるオリゴヌクレオチドを用いて細胞と接触させる。さらに別の態様においては，少なくとも約６−７個の異なるオリゴヌクレオチドを細胞と接触させる。
【０１１８】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物が蛋白質合成を阻害する能力は，当該技術分野において知られる手法を用いて，例えば，遺伝子転写または蛋白質合成の阻害を検出することにより，測定することができる。例えば，ヌクレアーゼＳ１マッピングを行うことができる。別の例においては，ノザンブロット分析を用いて，特定の蛋白質をコードするＲＮＡの存在を測定することができる。例えば，塩化セシウムのクッションで総ＲＮＡを調製することができる（例えば，Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９８７．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照）。次に，ＲＮＡを用いてノザンブロットを作成し，探索することができる（例えば，上掲を参照）。別の例においては，標的蛋白質により産生される特定のｍＲＮＡのレベルは，例えば，ＰＣＲを用いて測定することができる。さらに別の例においては，ウエスタンブロットを用いて存在する標的蛋白質の量を測定することができる。さらに別の態様においては，蛋白質の量により影響を受ける表現型を検出することができる。ウエスタンブロットを行う手法は当該技術分野においてよく知られている。例えば，Ｃｈｅｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２５９）を参照。
【０１１９】
別の例においては，標的遺伝子のプロモーター配列をレポーター遺伝子と連結させ，レポーター遺伝子の転写をモニターすることができる（例えば，以下により詳細に記載されるように）。あるいは，レポーター遺伝子が転写されるように標的核酸分子の一部をレポーター遺伝子と融合させることにより，プロモーターを標的としないオリゴヌクレオチド組成物を同定することができる。オリゴヌクレオチド組成物の存在下でレポーター遺伝子の発現の変化をモニターすることにより，オリゴヌクレオチド組成物がレポーター遺伝子の発現を阻害する効力を判定することが可能である。例えば，１つの態様においては，有効なオリゴヌクレオチド組成物はレポーター遺伝子の発現を減少させるであろう。オリゴヌクレオチド組成物中のオリゴヌクレオチドの濃度および種類が漸増するよう調節し，得られるレポーター遺伝子発現の変化をモニターすることにより，オリゴヌクレオチド組成物を最適化することが可能である。
【０１２０】
"レポーター遺伝子"とは，検出可能な遺伝子産物を発現する核酸であり，遺伝子産物はＲＮＡであっても蛋白質であってもよい。ｍＲＮＡ発現の検出はノザンブロッティングにより行うことができ，蛋白質の検出は蛋白質に特異的な抗体を用いる染色により行うことができる。好ましいレポーター遺伝子は，容易に検出可能な産物を産生する。レポーター遺伝子は，レポーター遺伝子産物の検出が制御配列の転写活性の測定値を与えるように，制御ＤＮＡ配列に動作可能なように連結することができる。好ましい態様においては，レポーター遺伝子の遺伝子産物は，その産物に伴う固有の活性により検出される。例えば，レポーター遺伝子は，酵素活性により，色，蛍光，または発光に基づく検出可能なシグナルを生ずる遺伝子産物をコードすることができる。レポーター遺伝子の例には，限定されないが，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ），ルシフェラーゼ，β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼをコードするものが含まれる。
【０１２１】
当業者は，本発明において用いるのに適した多くのレポーター遺伝子を容易に認識するであろう。これらには，限定されないが，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ），ルシフェラーゼ，ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ），およびベータ−ガラクトシダーゼが含まれる。そのようなレポーター遺伝子の例は，Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９））に見いだすことができる。検出可能な産物，例えば，検出可能な酵素活性を有するか，これに対して特異的抗体を生成することができる任意の産物をコードする任意の遺伝子を，本発明の方法においてレポーター遺伝子として用いることができる。
【０１２２】
１つのレポーター遺伝子システムは蛍ルシフェラーゼレポーターシステムである（Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．１９８８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７：４０４−４０８；本明細書の一部としてここに引用する）。ルシフェラーゼアッセイは迅速であり感度が高い。このアッセイにおいては，試験細胞の溶解物を調製し，ＡＴＰおよび基質であるルシフェリンと混合する。コードされる酵素ルシフェラーゼは，速やかにＡＴＰ依存的に基質を酸化する反応を触媒して，光を放出する産物を生成する。総光出力を測定し，これは広範な酵素濃度の範囲で，存在するルシフェラーゼの量に比例する。
【０１２３】
ＣＡＴは，頻繁に用いられる別のレポーター遺伝子システムである。このシステムの主な利点は，プロモーター活性の尺度として広範囲に評価され，広く受け入れられていることである（Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ．Ｍ．，Ｍｏｆｆａｔ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．１９８２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１０４４−１０５１）。このシステムにおいては，試験細胞をＣＡＴ発現ベクターでトランスフェクトし，最初のトランスフェクションから２−３日間候補物質とともにインキュベートする。その後，細胞抽出物を調製する。抽出物をアセチルＣｏＡおよび放射活性クロラムフェニコールとともにインキュベートする。インキュベーション後，薄層クロマトグラフィーによりアセチル化されたクロラムフェニコールをアセチル化されていないものから分離する。このアッセイにおいては，アセチル化の程度が特定のプロモーターによるＣＡＴ遺伝子活性を反映する。
【０１２４】
別の適当なレポーター遺伝子システムは，ｈＧＨの免疫学的検出に基づくものである。このシステムもまた，迅速であり使用が容易である（Ｓｅｌｄｅｎ，Ｒ．，Ｂｕｒｋｅ−Ｈｏｗｉｅ，Ｋ．Ｒｏｗｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，６：３１７３−３１７９；本明細書の一部としてここに引用する）。ｈＧＨシステムは，発現されたｈＧＨポリペプチドを細胞抽出物ではなく培地中でアッセイしうるという利点を有する。すなわち，このシステムは，試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子システムの原理はｈＧＨに限定されるものではなく，これに対して許容しうる特異性を有する抗体が入手可能であるか製造可能である任意のポリペプチドの使用に適合しうることが理解されるであろう。
【０１２５】
細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物を１またはそれ以上の細胞と接触させ（すなわち，接触するようにする，本明細書においては投与する，またはデリバリーするとも称される），これに取り込ませる。"細胞"との用語には，原核生物細胞および真核生物細胞，好ましくは脊椎動物細胞，およびより好ましくは，哺乳動物細胞が含まれる。好ましい態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物はヒト細胞と接触させる。
【０１２６】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，インビトロまたはインビボで細胞と接触させることができる。オリゴヌクレオチドはエンドサイトーシスによりゆっくりと細胞に取り込まれるが，エンドサイトーシスされたオリゴヌクレオチドは一般に隔離されており，例えば，標的核酸分子とのハイブリダイゼーションには利用可能ではない。１つの態様においては，細胞取り込みは，エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿により促進させることができる。しかし，これらの方法はインビトロまたはエクスビボの態様でのみ有用であり，便利ではなく，場合によっては細胞毒性を伴う。
【０１２７】
別の態様においては，オリゴヌクレオチドの細胞内へのデリバリーは，当該技術分野において認識されている適当な方法，例えば，リン酸カルシウム，ＤＭＳＯ，グリセロールまたはデキストラン，エレクトロポレーションにより，またはトランスフェクション，例えば，カチオン性，アニオン性または中性の脂質組成物またはリポソームを用いて当該技術分野において知られる方法により増強することができる（例えば，ＷＯ９０／１４０７４；ＷＯ９１／１６０２４；ＷＯ９１／１７４２４；米国特許４，８９７，３５５；Ｂｅｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２１：３５６７を参照）。オリゴヌクレオチドの増強されたデリバリーはまた，ウイルス，ポリアミン，またはポリリジン，プロタミン，またはＮ１，Ｎ１２−ビス（エチル）スペルミン等の化合物を用いるポリカチオンコンジュゲートにより媒介することができる（例えば，Ｂａｒｔｚａｔｔ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１３３；Ｗａｇｎｅｒ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：４２５５を参照）。
【０１２８】
コンジュゲート化剤
コンジュゲート化剤はオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合する。１つの態様においては，オリゴヌクレオチドをコンジュゲート化剤に結合させることにより誘導化するかまたは化学的に修飾して，細胞取り込みを容易にすることができる。例えば，コレステロール成分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることにより，細胞取り込みを５から１０倍改良し，これは次に，ＤＮＡ結合を約１０倍改良することができる（Ｂｏｕｔｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５４：１２９−１３２）。オクチル，ドデシル，およびオクタデシル残基のコンジュゲーションは，未修飾オリゴヌクレオチドと比較して，細胞取り込みを３，４，および１０倍増強させる（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。同様に，オリゴヌクレオチドをポリ−Ｌ−リジンで誘導化すると，細胞によるオリゴヌクレオチド取り込みを助けることができる（Ｓｃｈｅｌｌ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ３４０：３２３，およびＬｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔａ  ｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６４８）。
【０１２９】
ある種の蛋白質担体もまたオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを容易にすることができ，これには，例えば，血清アルブミン，核への輸送のシグナルを有する核蛋白質，および細胞膜を浸透しうるウイルスまたは細菌蛋白質が含まれる。したがって，蛋白質担体は，オリゴヌクレオチドと会合させるか連結させたときに有用である。したがって，本発明は，細胞取り込みを容易にすることができる基，例えば，炭化水素および非極性基，コレステロール，長鎖アルコール（すなわち，ヘキサノール），ポリ−Ｌ−リジンおよび蛋白質，ならびに同様の有益な効果を有する他のアリールまたはステロイド基およびポリカチオン，例えば，フェニルまたはナフチル基，キノリン，アントラセンまたはフェナントラセン基，脂肪酸，脂肪酸アルコールおよびセスキテルペン，ジテルペンおよびステロイドによるオリゴヌクレオチドの誘導化を提供する。コンジュゲート化剤を用いることの主な利点は，最初の膜との相互作用を増加させることであり，これはオリゴヌクレオチドの細胞内蓄積を高めることにつながる。
【０１３０】
カプセル化剤
カプセル化剤は，オリゴヌクレオチドをベヒクル中に封入する。別の態様においては，オリゴヌクレオチドは，担体またはベヒクル，例えば，リポソームまたはミセルと結合させることができるが，当業者により理解されるように，他の担体を用いてもよい。リポソームは，生物学的膜と類似する構造を有する脂質二重層から構成されるベヒクルである。そのような担体を用いて，オリゴヌクレオチドの細胞取り込みまたはターゲティングを容易にすることができ，またはオリゴヌクレオチドの薬物動力学または毒性学的特性を改良することができる。
【０１３１】
例えば，本発明のオリゴヌクレオチドはまた，リポソーム中にカプセル化して，活性成分が脂質層に付着した水性の同心の層から構成されるカプセル中に分散されているかまたは様々に存在する医薬組成物として投与することができる。オリゴヌクレオチドは，その溶解性に依存して，水性層および脂質層の両方に，あるいは，一般にリポソーム性懸濁液と称されるものの中に存在することができる。疎水性層は，限定されないが，一般にリン脂質，例えばレクチンおよびスフィンゴミエリン，ステロイド，例えば，コレステロール，幾分イオン性の界面活性剤，例えば，ジアセチルリン酸，ステアリルアミン，またはホスファチジン酸，または疎水性の性質を有する他の物質を含む。リポソームの直径は，一般に約１５ｎｍ−約５ミクロンの範囲内である。
【０１３２】
リポソームを薬剤デリバリーベヒクルとして使用することにより，いくつかの利点が得られる。リポソームは，細胞内安定性を増加し，取り込み効率を高め，生物学的活性を改良する。リポソームは，細胞膜を構成する脂質と同様の様式で配置されている脂質からなる中空の球形の小胞である。これらは，水溶性化合物を封入するための内部水性空間を有し，直径０．０５−数ミクロンの範囲のサイズである。いくつかの研究により，リポソームは核酸を細胞にデリバリーしうること，および核酸が生物学的に活性なままであることが示されている。例えば，元々研究ツールとして設計されたリポソームデリバリーベヒクル，例えばリポフェクチンは，無傷の核酸分子を細胞にデリバリーすることができる。
【０１３３】
リポソームを使用することの特定の利点には，以下のものが含まれる：組成物中で非毒性であり生分解性である；長い循環半減期を示す；および組織へのターゲティングのために認識分子を容易にその表面に結合させることができる。最後に，リポソーム系医薬品を液体懸濁液または凍結乾燥製品として製造する費用対効果の優れた方法は，許容しうる薬剤デリバリーシステムとしてのこの技術の価値を示す。
【０１３４】
複合体化剤
複合体化剤は，強いが非共有結合的な力（例えば，静電的，ファンデルワールス，パイスタッキング相互作用等）でオリゴヌクレオチドに結合する。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドを複合体化剤を用いて複合体化させて，オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増加させることができる。複合体化剤の例には，カチオン性脂質が含まれる。カチオン性脂質は，オリゴヌクレオチドを細胞にデリバリーするために用いることができる。
【０１３５】
"カチオン性脂質"との用語は，極性と非極性の両方のドメインを有し，生理学的ｐＨまたはその周辺で正に荷電することができ，核酸等のポリアニオンに結合し，核酸の細胞内へのデリバリーを容易にする脂質および合成脂質を含む。一般に，カチオン性脂質には，飽和および不飽和アルキルおよび脂環式エーテルおよびアミンのエステル，アミド，またはこれらの誘導体が含まれる。カチオン性脂質の直鎖または分枝鎖のアルキルおよびアルケニル基は，例えば，１−約２５個の炭素原子を含むことができる。好ましい直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアルケン基は，６またはそれ以上の炭素原子を有する。非環状基には，コレステロールおよび他のステロイド基が含まれる。カチオン性脂質は，種々のカウンターイオン（アニオン），例えば，Ｃｌ-，Ｂｒ-，Ｉ-，Ｆ-，アセテート，トリフルオロアセテート，硫酸，亜硝酸，および硝酸とともに調製することができる。
【０１３６】
カチオン性脂質の例としては，以下のものが挙げられる：ポリエチレンイミン，ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）星形デンドリマー，リポフェクチン（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとの組み合わせ），リポフェクターゼ，リポフェクタミン，ＤＯＰＥ，サイトフェクチン（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ），およびユーフェクチン（ＪＢＬ，ＳａｎＬｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）。カチオン性リポソームは，以下のものを含んでいてもよい：塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオールオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ），硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル（ＤＯＴＡＰ），３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ），２，３，−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ），臭化１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）。例えば，カチオン性脂質である塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）は，ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を１０００倍増加させることが見いだされている（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。オリゴヌクレオチドはまた，ポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合体化してもよく，この混合物には，脂質が含まれていても含まれていなくてもよい（例えば，ステリル−ポリ（Ｌ−リジン）。
【０１３７】
カチオン性脂質は，当該技術分野において，オリゴヌクレオチドを細胞にデリバリーするために用いられている（例えば，米国特許５，８５５，９１０；５，８５１，５４８；５，８３０，４３０；５，７８０，０５３；５，７６７，０９９；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３１７６；Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１５：１を参照）。本発明のオリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために用いることができる他の脂質組成物を本発明の方法と関連して用いることができる。上述したものに加えて，他の脂質組成物も当該技術分野において知られており，例えば，米国特許４，２３５，８７１；米国特許４，５０１，７２８；４，８３７，０２８；４，７３７，３２３に教示されている。
【０１３８】
１つの態様においては，脂質組成物は，オリゴヌクレオチドの脂質媒介性トランスフェクションを促進するために，ウイルス蛋白質等の試薬をさらに含むことができる（Ｋａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：５３６）。別の態様においては，例えば米国特許５，７３６，３９２に教示されるように，オリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチド，ペプチド，および脂質を含む組成物の一部として細胞と接触させる。血清に対する耐性を有する改良された脂質も記載されている（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：３１７６）。カチオン性脂質および他の複合体形成試薬は，エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれるオリゴヌクレオチドの数を増加させるよう作用する。
【０１３９】
別の態様においてはＮ−置換グリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）を用いて，オリゴヌクレオチドの取り込みを最適化することができる。ペプトイドは，トランスフェクション用のカチオン性脂質様化合物を作成するために用いられている（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１５１７）。ペプトイドは，標準的な方法を用いて合成することができる（例えば，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０：４９７）。また，カチオン性脂質と，ペプトイド，リプトイドとの組み合わせを用いて，対象とするオリゴヌクレオチドの取り込みを最適化することができる（Ｈｕｎａｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．５：３４５）。リプトイドはペプトイドオリゴヌクレオチドを合成し，アミノ末端サブモノマーをそのアミノ基を介して脂質にカップリングさせることにより，合成することができる（Ｈｕｎａｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．５：３４５）。
【０１４０】
当該技術分野においては，正に荷電したアミノ酸を用いて非常に活性の高いカチオン性脂質を作成しうることが知られている（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３１７６）。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドをデリバリーするための組成物は，親油性成分に結合した多くのアルギニン，リジン，ヒスタジンまたはオルニチン残基を含む（例えば，米国特許５，７７７，１５３を参照）。
【０１４１】
別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドをデリバリーするための組成物は，約１−約４個の塩基性残基を有するペプチドを含む。これらの塩基性残基は，例えば，ペプチドのアミノ末端，Ｃ末端，または内部領域に存在することができる。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において明確に定められている。これらのファミリーには，塩基性側鎖（例えば，リジン，アルギニン，ヒスチジン），酸性側鎖（例えば，アスパラギン酸，グルタミン酸），非荷電極性側鎖（例えば，グリシン（これはまた非極性であるとも考えられる），アスパラギン，グルタミン，セリン，トレオニン，チロシン，システイン），非極性側鎖（例えば，アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，プロリン，フェニルアラニン，メチオニン，トリプトファン），ベータ分枝側鎖（例えば，トレオニン，バリン，イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば，チロシン，フェニルアラニン，トリプトファン，ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。塩基性アミノ酸とは別に，ペプチドの他の残基の大部分またはすべてを非塩基性アミノ酸，例えば，リジン，アルギニン，またはヒスチジン以外のアミノ酸から選択することができる。好ましくは，長い中性側鎖を有する多数の中性アミノ酸を用いる。例えば，（Ｎ−末端）Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−（Ｃ−末端）（配列番号１）等のペプチドを用いることができる。１つの態様においては，そのような組成物は，当該技術分野においてよく知られるように，融合誘導性脂質ＤＯＰＥと混合することができる。
【０１４２】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチド組成物と接触させるべき細胞を，オリゴヌクレオチドと脂質（例えば上述の脂質または脂質組成物の１つ）を含む混合物とを含む混合物と約１から約５日間接触させる。１つの態様においては，細胞を，脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と約３日間から約３０日間程度の長い期間まで接触させる。別の態様においては，脂質を含む混合物を，少なくとも約５−約２０日間細胞と接触させたままにする。別の態様においては，脂質を含む混合物を少なくとも約７−約１５日間細胞と接触させたままにする。
【０１４３】
例えば，１つの態様においては，本明細書に記載されるようなより長いインキュベーション期間のために，オリゴヌクレオチド組成物を脂質，例えばサイトフェクチンＣＳまたはＧＳＶ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから入手可能），ＧＳ３８１５，ＧＳ２８８８の存在下で細胞と接触させることができる。
【０１４４】
１つの態様においては，細胞と脂質およびオリゴヌクレオチド組成物を含む混合物とのインキュベーションは，細胞の生存率を低下させない。好ましくは，トランスフェクション期間の後，細胞は実質的に生存可能である。１つの態様においては，トランスフェクション後，細胞は少なくとも約７０から少なくとも約１００パーセント生存可能である。別の態様においては，細胞は少なくとも約８０から少なくとも約９５％生存可能である。さらに別の態様においては，細胞は少なくとも約８５％から少なくとも約９０％生存可能である。
【０１４５】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドを，本明細書において"輸送ペプチド"と称される，オリゴヌクレオチドを細胞内に輸送するペプチド配列を結合させることにより修飾する。１つの態様においては，組成物は，蛋白質をコードする標的核酸分子に相補的な，輸送ペプチドに共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。
【０１４６】
"輸送ペプチド"との用語には，オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするアミノ酸配列が含まれる。これらと連結している成分を細胞内に輸送することを容易にするペプチドの例は当該技術分野において知られており，例えば，ＨＩＶ  ＴＡＴ転写因子，ラクトフェリン，ヘルペスＶＰ２２蛋白質，および線維芽細胞成長因子２が挙げられる（Ｐｏｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１６：８５７；およびＤｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．８：８４；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ．１９９７．Ｃｅｌｌ８８：２２３）。
【０１４７】
例えば，１つの態様においては，輸送ペプチドは，アンテナペディア蛋白質に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは，ペプチドは，アンテナペディア蛋白質のアミノ酸４３−５８（Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号２），またはオリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするその一部または変種を含む（例えば，ＷＯ９１／１８９８；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：８４を参照）。変種の例は，Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（上掲）に記載される。
【０１４８】
１つの態様においては，輸送ペプチドは，トランスポータン，ガラニン（１−１２）−Ｌｙｓ−マストパラン（１−１４）アミド，蛋白質に由来するアミノ酸配列を含む（Ｐｏｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：８５７）。好ましくは，ペプチドは，配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３）で示されるトランスポータン蛋白質のアミノ酸，またはオリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするその一部または変種を含む。
【０１４９】
１つの態様においては，輸送ペプチドは，ＨＩＶ  ＴＡＴ蛋白質に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは，ペプチドは，ＨＩＶ  ＴＡＴ蛋白質のアミノ酸３７−７２，例えば，Ｃ（Ａｃｍ）ＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号４）（ＴＡＴ３７−６０；式中，Ｃ（Ａｃｍ）はＣｙｓ−アセトアミドメチルである）で示される配列またはその一部または変種，例えば，オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするＣ（Ａｃｍ）ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号５）（ＴＡＴ４８−４０）またはＣ（Ａｃｍ）ＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＰＰＱＣ（配列番号６）（ＴＡＴ４３−６０）を含む（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０）。別の態様においては，ペプチド（Ｇ）ＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱ（配列番号７）を用いることができる。
【０１５０】
輸送ペプチドの一部または変種を試験して，これらの活性，例えば，蛍光標識したオリゴヌクレオチドを細胞に輸送する能力を，天然のペプチドの活性と比較することにより，これらのペプチド部分と同等であるか否かを容易に判定することができる。天然の輸送ペプチドがオリゴヌクレオチドを細胞内に輸送する能力を維持しているフラグメントまたは変種は，機能的に同等であり，天然のペプチドの代わりに用いることができる。
【０１５１】
オリゴヌクレオチドは，既知の手法を用いて輸送ペプチドに結合させることができる（例えば，Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ａ．１９９６．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：６２９；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：８４；Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：２５３），Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０）。例えば，１つの態様においては，活性化されたチオール基を有するオリゴヌクレオチドは，そのチオール基を介して輸送ペプチド中に存在するシステイン（例えば，Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：８４；Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ．１９９６に教示されるような，アンテナペディアホメオドメインの第２ヘリックスと第３ヘリックスとの間のβターンに存在するシステイン）に結合させる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：６２９；Ａｌｌｉｎｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２８：９１９）。別の態様においては，Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｎｐｙｓ）ＯＨ基を輸送ペプチドに最後（Ｎ末端）のアミノ酸として結合させ，ＳＨ基を有するオリゴヌクレオチドをこのペプチドに結合させることができる（Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：２５３）。
【０１５２】
１つの態様においては，連結基をヌクレオモノマーに結合させることができ，輸送ペプチドをリンカーに共有結合させることができる。１つの態様においては，リンカーは，輸送ペプチドのための結合部位として機能することができ，ヌクレアーゼに対する安定性を与えることができる。抵当なリンカーの例としては，置換または未置換のＣ1−Ｃ20アルキル鎖，Ｃ1−Ｃ20アルケニル鎖，Ｃ1−Ｃ20アルキニル鎖，ペプチドおよびヘテロ原子（例えば，Ｓ，Ｏ，ＮＨ，等．）が挙げられる。他の例示的リンカーには，二官能性架橋剤，例えば，スルホスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）（例えば，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９１．２７６：４１７−２を参照）が含まれる。
【０１５３】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，遺伝子を細胞内にデリバリーするためにレセプター媒介性エンドサイトーシスメカニズムを利用する分子コンジュゲートとして合成する（例えば，Ｂｕｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１８：５５９およびこの中に引用されている文献を参照）。
【０１５４】
ターゲティング剤
オリゴヌクレオチドのデリバリーはまた，オリゴヌクレオチドを細胞レセプターにターゲティングすることにより改良することができる。ターゲティング成分をオリゴヌクレオチドにコンジュゲート化するか，またはオリゴヌクレオチドに結合した担体基（すなわち，ポリ（Ｌ−リジン）またはリポソーム）に結合させることができる。この方法は，特定のレセプター媒介性エンドサイトーシスを示す細胞によく適している。
【０１５５】
例えば，６−ホスホマンノシル化蛋白質とコンジュゲート化させたオリゴヌクレオチドは，マンノース６−リン酸特異的レセプターを発現する細胞により，遊離オリゴヌクレオチドより２０倍高い効率で内在化される。オリゴヌクレオチドはまた，生分解性リンカーを用いて細胞レセプターのリガンドに結合させることができる。別の例においては，デリバリーコンストラクトはマンノシル化ストレプトアビジンであり，これはビオチニル化オリゴヌクレオチドと密接な複合体を形成する。マンノシル化ストレプトアビジンは，ビオチニル化オリゴヌクレオチドの内在化を２０倍増加させることが見いだされた（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。
【０１５６】
さらに，特定のリガンドをポリリジン系デリバリーシステムのポリリジン成分にコンジュゲート化することができる。例えば，トランスフェリン−ポリリジン，アデノウイルス−ポリリジン，およびインフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ−２Ｎ末端融合誘導性ペプチド−ポリリジンコンジュゲートは，真核生物細胞においてレセプター媒介性ＤＮＡデリバリーを非常に増強する。アベオラーマクロファージにおいてオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強するためにポリ（Ｌ−リジン）にコンジュゲート化したマンノシル化糖蛋白質が用いられている（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ５４：５５９−５６６）。
【０１５７】
悪性細胞は必須栄養素，例えば葉酸およびトランスフェリンの必要性が増加しているため，これらの栄養を用いてオリゴヌクレオチドを癌性細胞にターゲティングすることができる。例えば，葉酸をポリ（Ｌ−リジン）に結合させると，前骨髄球白血病（ＨＬ−６０）細胞およびヒト黒色腫（Ｍ−１４）細胞において，増強されたオリゴヌクレオチド取り込みが見られる（Ｇｉｎｏｂｂｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：２９）。別の例においては，マレイル化ウシ血清アルブミン，葉酸，またはプロトポルフィリンＩＸ第二鉄でコーティングしたリポソームは，ネズミマクロファージであるＫＢ細胞，および２．２．１５ヒト肝癌細胞におけるオリゴヌクレオチドの細胞取り込みの増強を示す（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ５４：５５９−５６６）。
【０１５８】
リポソームは自然には肝臓，脾臓，および細網内皮系を標的とする。リポソームを種々のリガンド，例えば，抗体またはプロテインＡと結合させることにより，これらを特定の細胞集団にターゲティングすることができる。例えば，プロテインＡ含有リポソームを，Ｌ細胞で発現されるマウス主要組織適合性複合体をコードするＨ−２Ｋ蛋白質を標的とするＨ−２Ｋ特異的抗体で前処理することができる（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。
【０１５９】
オリゴヌクレオチド安定性のアッセイ
好ましくは，本発明のオリゴヌクレオチドを安定化する。すなわち，エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性とする。オリゴヌクレオチドは，内因性細胞ヌクレアーゼによる攻撃に対して対応する未修飾オリゴヌクレオチドより少なくとも約３倍耐性が高い場合，ヌクレアーゼに対して実質的に耐性であり，少なくとも約６倍耐性が高い場合，高度にヌクレアーゼ耐性であると定義される。これは，当該技術分野において知られる手法を用いて，本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して実質的に耐性であることを示すことにより示すことができる。
【０１６０】
実質的な安定性を示すことができる１つの方法は，蛋白質レベルを測定することにより，またはｍＲＮＡの切断を測定することにより，本発明のオリゴヌクレオチドが細胞にデリバリーされたときに機能すること，例えば，標的核酸分子の転写または翻訳を低下させることを示すことである。標的ＲＮＡの安定性を測定するアッセイは，トランスフェクションの約２４時間後に行うことができる（例えば，当該技術分野において知られるノザンブロット手法，ＲＮａｓｅ保護アッセイ，またはＱＣ−ＰＣＲアッセイを用いて）。あるいは，標的蛋白質のレベルを測定することができる。好ましくは，目的とするＲＮＡまたは蛋白質レベルを試験することに加えて，特異性の対照として対照である非標的遺伝子（例えば，アクチン，または好ましくは標的に類似する配列を有する対照）のＲＮＡまたは蛋白質レベルを測定する。ＲＮＡまたは蛋白質の測定は，当該技術分野において認められている任意の手法を用いて行うことができる。好ましくは，測定はトランスフェクションの約１６−２４時間後から始める（Ｍ．Ｙ．Ｃｈｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６６：１８１６２−７１；Ｔ．Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２１  ３８５７）。
【０１６１】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物が蛋白質合成を阻害する能力は，当該技術分野において知られる手法を用いて，例えば遺伝子転写または蛋白質合成の阻害を検出することにより，測定することができる。例えば，ヌクレアーゼＳ１マッピングを行うことができる。別の例においては，ノザンブロット分析を用いて，特定の蛋白質をコードするＲＮＡの存在を測定することができる。例えば，塩化カルシウムのクッション上で総ＲＮＡを調製することができる（例えば，Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照）。次に，ＲＮＡを用いてノザンブロットを行い，探索することができる（例えば，上掲を参照）。別の例においては，標的蛋白質により生成される特定のｍＲＮＡのレベルを，例えばＰＣＲを用いて測定することができる。さらに別の例においては，ウエスタンブロットを用いて，存在する標的蛋白質の量を測定することができる。さらに別の態様においては，蛋白質の量によって影響を受ける表現型を検出することができる。ウエスタンブロットを行う手法は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２５９を参照）。
【０１６２】
別の例においては，標的遺伝子のプロモーター配列をレポーター遺伝子と連結し，レポーター遺伝子の転写をモニターすることができる（例えば，以下により詳細に記載されるように）。あるいは，標的核酸分子の一部をレポーター遺伝子と融合させて，レポーター遺伝子が転写されるようにすることにより，プロモーターを標的としないオリゴヌクレオチド組成物を同定することができる。オリゴヌクレオチド組成物の存在下でレポーター遺伝子の発現の変化をモニターすることにより，オリゴヌクレオチド組成物がレポーター遺伝子の発現を阻害する有効性を判定することが可能である。例えば，１つの態様においては，有効なオリゴヌクレオチド組成物は，レポーター遺伝子の発現を低下させるであろう。
【０１６３】
"レポーター遺伝子"とは，検出可能な遺伝子産物を発現する核酸であり，遺伝子産物はＲＮＡであっても蛋白質であってもよい。ｍＲＮＡ発現の検出はノザンブロッティングにより行うことができ，蛋白質の検出は蛋白質に特異的な抗体を用いる染色により行うことができる。好ましいレポーター遺伝子は，容易に検出可能な産物を産生する。レポーター遺伝子は，レポーター遺伝子産物の検出が制御配列の転写活性の測定値を与えるように，制御ＤＮＡ配列に動作可能なように連結させることができる。好ましい態様においては，レポーター遺伝子の遺伝子産物は，その産物に伴う固有の活性により検出される。例えば，レポーター遺伝子は酵素活性により色，蛍光，または発光に基づく検出可能なシグナルを生じる遺伝子産物をコードすることができる。レポーター遺伝子の例としては，限定されないが，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ），ルシフェラーゼ，β−ガラクトシダーゼ，およびアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。  
【０１６４】
当業者は，本発明において用いるのに適した多くのレポーター遺伝子を容易に認識するであろう。これらには，限定されないが、，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ），ルシフェラーゼ，ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ），およびベータ−ガラクトシダーゼが含まれる。そのようなレポーター遺伝子の例は，Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９））に見いだすことができる。検出可能な産物，例えば，検出可能な酵素活性を有するか，これに対して特異的な抗体を生成することができる任意の産物をコードする任意の遺伝子を，本発明の方法においてレポーター遺伝子として用いることができる。
【０１６５】
１つのレポーター遺伝子システムは，蛍ルシフェラーゼレポーターシステムである（Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．１９８８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７：４０４−４０８；本明細書の一部としてここに引用する）。ルシフェラーゼアッセイは迅速であり感度が高い。このアッセイにおいては，試験細胞の溶解物を調製し，ＡＴＰおよび基質であるルシフェリンと混合する。コードされる酵素ルシフェラーゼは，基質の急速なＡＴＰ依存性酸化を触媒して，発光性の生成物を生成する。総光出力を測定し，これは広範な酵素濃度の範囲で，存在するルシフェラーゼの量に比例する。
【０１６６】
ＣＡＴはしばしば用いられる別のレポーター遺伝子システムである。このシステムの主な利点は，これが広範囲に確認されプロモーター活性の尺度として広く受け入れられていることである（Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ．Ｍ．，Ｍｏｆｆａｔ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．１９８２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１０４４−１０５１）。この系においては，試験細胞をＣＡＴ発現ベクターでトランスフェクトし，最初のトランスフェクションから２−３日間，候補物質とともにインキュベートする。その後，細胞抽出物を調製する。抽出物をアセチルＣｏＡおよび放射活性クロラムフェニコールとともにインキュベートする。インキュベーションの後，薄層クロマトグラフィーにより，アセチル化されたクロラムフェニコールをアセチル化されていない形から分離する。このアッセイにおいては，アセチル化の程度は特定のプロモーターによるＣＡＴ遺伝子活性を反映する。
【０１６７】
別の適当なレポーター遺伝子システムは，ｈＧＨの免疫学的検出に基づくものである。このシステムもまた迅速であり使用が容易である（Ｓｅｌｄｅｎ，Ｒ．，Ｂｕｒｋｅ−Ｈｏｗｉｅ，Ｋ．Ｒｏｗｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，６：３１７３−３１７９；本明細書の一部としてここに引用する）。ｈＧＨシステムは，発現されたｈＧＨポリペプチドを細胞抽出物ではなく培地中でアッセイしうるという利点を有する。すなわち，このシステムは，試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子システムの原理はｈＧＨに限定されるものではなく，これに対して許容しうる特異性を有する抗体が入手可能であるかまたは製造可能である任意のポリペプチドの使用に適合しうることが理解されるであろう。
【０１６８】
オリゴヌクレオチドの合成
本発明のオリゴヌクレオチドは，当該技術分野において知られる任意の方法により，例えば，酵素的合成および化学合成を用いて製造することができる。オリゴヌクレオチドは，インビトロ（例えば，酵素合成および化学合成を用いて），またはインビボ（当該技術分野においてよく知られる組換えＤＮＡ技術を用いて）で合成してもよい。
【０１６９】
好ましい態様においては，化学合成を用いる。直鎖状オリゴヌクレオチドの化学合成は当該技術分野においてよく知られており，溶液相または固相手法により行うことができる。好ましくは，合成は固相法により行う。オリゴヌクレオチドは，いくつかの異なる合成方法，例えば，ホスホルアミダイト，ホスファイトトリエステル，Ｈ−ホスホネート，およびホスホトリエステル方法のいずれを用いて製造してもよく，典型的には自動化合成法により製造する。
【０１７０】
オリゴヌクレオチド合成のプロトコルは当該技術分野においてよく知られており，例えば，米国特許５，８３０，６５３；ＷＯ９８／１３５２６；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．１９８４．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．１９８５．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：３９０８；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．１９８５．３２６：２６３；ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９８６．１４：９０８１；ＦａｓｍａｎＧ．Ｄ．，１９８９．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９８９．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｌａｍｏｎｅ．１９９３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：１；米国特許５，０１３，８３０；米国特許５，２１４，１３５；米国特許５，５２５，７１９；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：８３１；ＷＯ９２／０３５６８；米国特許５，２７６，０１９；米国特許５，２６４，４２３に見いだすことができる。
【０１７１】
選択される合成方法は，所望のオリゴヌクレオチドの長さによって異なり，そのような選択は当業者の能力の範囲内である。例えば，ホスホルアミダイトおよびホスファイトトリエステル法により，１７５またはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを製造することができ，一方，Ｈ−ホスホネート法は１００ヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドについてよく作用する。修飾塩基をオリゴヌクレオチド中に取り込む場合，特に修飾ホスホジエステル結合を用いる場合には，既知の方法にしたがって必要に応じて合成方法を変更する。この点に関して，Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４）は，修飾塩基および修飾ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを製造する方法の参考文献および概要を提供する。オリゴヌクレオチドを製造する他の例示的方法は，Ｓｏｎｖｅａｕｘ（１９９４．"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"；Ａｇｒａｗａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６：１）に教示されている。例示的合成方法は，"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ"（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．１９８４）にも教示されている。さらに，規定された配列の直鎖状オリゴヌクレオチドは商業的に購入することができる。
【０１７２】
オリゴヌクレオチドは，ポリアクリルアミドゲル電気泳動により，または多くのクロマトグラフィー法，例えば，ゲルクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーのいずれかにより精製することができる。ヌクレオチド配列を確認するためには，オリゴヌクレオチドを，既知の方法のいずれか，例えば，マキサム−ギルバートシークエンシング，サンガーシークエンシング，キャピラリー電気泳動シークエンシング，ワンダリングスポットシークエンシング法により，またはハイボンド紙に結合したオリゴヌクレオチドの選択的化学分解を用いることにより，ＤＮＡシークエンシングに供することができる。また，短いオリゴヌクレオチドの配列は，レーザー脱着質量分析または高速原子衝撃により分析することができる（ＭｃＮｅａｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：９７６；Ｖｉａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：８３；Ｇｒｏｔｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１０：４６７１）。シークエンシング法はＲＮＡオリゴヌクレオチドについても利用可能である。
【０１７３】
合成したオリゴヌクレオチドの質は，キャピラリー電気泳動および変性強アニオンＨＰＬＣ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）で，ＢｅｒｇｏｔおよびＥｇａｎの方法（１９９２．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．５９９：３５）を用いてオリゴヌクレオチドを試験することにより確認することができる。
【０１７４】
他の例示的合成手法は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（ＤＮＧｌｏｖｅｒＥｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪＧａｉｔＥｄ，１９８４；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  ＳＪ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；または，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照）。
【０１７５】
オリゴヌクレオチドの使用
本発明はまた，細胞を上述のオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含む，細胞において蛋白質の発現を阻害する方法を特徴とする。
【０１７６】
本発明のオリゴヌクレオチドを，種々のインビトロおよびインビボ状況で用いて，蛋白質発現を特異的に阻害することができる。本発明の方法および組成物は，インビトロおよびインビボの両方の用途に適している。
【０１７７】
１つの態様においては，遺伝子の機能を同定する方法において，本発明のオリゴヌクレオチドを用いて，インビトロで遺伝子機能を阻害することができる。このようにして，同定されているがその機能が示されていない遺伝子の転写を阻害して，遺伝子が転写されないとき細胞の表現型がどのように変化するかを決定することができる。そのような方法は，例えば，オリゴヌクレオチドを用いるかまたは他の療法を用いる臨床治療の標的として遺伝子を評価するのに有用である。
【０１７８】
本発明の組成物の効力を決定するためには，種々のエンドポイントを用いることができる。上述したアッセイに加えて，例えば，核酸プローブ（例えば，アレイの形で）を用いて，細胞により生成する転写パターンを評価することができる。また，プローブはペプチド，蛋白質，または蛋白質ドメインに向けてもよく，例えば，特定の蛋白質の発現を検出するために抗体を用いることができる。さらに別の態様においては，蛋白質の機能（例えば酵素活性）を測定することができる。さらに別の態様においては，細胞の表現型を評価して，標的蛋白質が発現されているか否かを判定することができる。例えば，組成物が癌に関連する細胞の表現型に影響を及ぼす能力を試験することができる。
【０１７９】
１つの態様においては，１またはそれ以上の追加の薬剤（例えば，活性化剤，誘導剤，増殖促進剤，腫瘍プロモーター）を細胞に加えることができる。
【０１８０】
別の態様においては，本発明の組成物を用いて，生化学反応，例えば，蛋白質，核酸，小分子等の間の相互作用をモニターすることができる（例えば，抗原と抗体との間；またはレセプター（例えば，精製されたレセプターまたは細胞膜に結合しているレセプター）とそのリガンド，アゴニストまたはアンタゴニストとの間；または酵素（例えば，プロテアーゼまたはキナーゼ）とその基質との間の相互作用の効力または特異性，または生成物に変換された基質の量の増加または減少；ならびに他の多くのもの）。そのような生化学的アッセイは，プローブまたは標的の特性を特徴決定するために，またはスクリーニングアッセイの基礎として用いることができる。例えば，特定のプロテアーゼ（例えば，血液凝固に関与するプロテアーゼ，例えばプロテアーゼＸａおよびＶＩＩａ）の存在についてサンプルをスクリーニングするためには，例えば，目的とする各プロテアーゼに特異的な蛍光発生性基質であるプローブを用いてサンプルをアッセイすることができる。標的プロテアーゼが基質に結合してこれを切断すれば，通常は２つのエネルギー転移対の間の切断および分離の結果として基質から蛍光が発生し，シグナルを検出することができる。別の例においては特定のキナーゼ（例えば，チロシンキナーゼ）の存在についてサンプルをスクリーニングするためには，目的とするキナーゼの１つにより選択的にリン酸化されることができるペプチドをプローブとして用いることにより，目的とする１またはそれ以上のキナーゼを含むサンプルをアッセイすることができる。当該技術分野において認められ日常的に測定可能な条件を用いて，サンプルを必要な補因子を含む適当な緩衝液中で基質のアレイとともに，経験的に決定される時間インキュベートする。必要ならば洗浄等により反応を停止し，例えば，これらを検出可能な試薬，例えば，フルオレセイン標識抗ホスホチロシンまたは抗ホスホセリン抗体とともにインキュベートしてシグナルを検出することにより，リン酸化された基質を検出することができる。
【０１８１】
別の態様においては，本発明の組成物を用いて，遺伝子発現のパターンを調節する試薬をスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドのアレイを用いて，例えば，１組の遺伝子からのその発現のパターンが特定の生理学的状態または発生段階，または疾病状態と相関するｍＲＮＡ種を同定することができる（"相関的"遺伝子，ＲＮＡｓ，または発現パターン）。"相関する"または"相関的"との用語は，ＲＮＡの合成パターンが細胞の生理学的状態と関連していることを意味するが，所与のＲＮＡの発現が特定の生理学的状態の原因であるかまたはこれを引き起こすことは必要ではない。例えば，特定の疾病状態のモデルとして働く細胞中で調節される（例えば，アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされる）ｍＲＮＡの小さい集合を同定することができる。病原的表現型を示さない正常細胞におけるものと比較して変更しているこの発現のパターンは，疾病状態の指標として働くことができる（"指標"または"相関的"遺伝子，ＲＮＡ，または発現パターン）。
【０１８２】
本発明はまた，本明細書に記載される多くのオリゴマー（例えば，約１０−２０からコンビナトリアルライブラリに見られるような非常に多い数まで）をスクリーニングする方法のためにオリゴヌクレオチドを選択することに関する。次に，より有効なオリゴマーを選択し，組み合わせて，本発明の組成物を製造する。すなわち，９５％，９０％，８５％，８０％，７０％，または６０％より高い阻害を達成することができる。
【０１８３】
選択された指示体の発現パターンを調節する（例えば，オリゴヌクレオチドと逆のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド，またはミスマッチ塩基を含む対照組成物と比較して）組成物は，特定の標的遺伝子が治療的介在の潜在的標的であることを示すことができる。さらに，そのような組成物は，インビトロ発現系でまたはインビボ療法において，細胞の発現パターンを調節する治療剤として有用でありうる。本明細書において用いる場合，"調節する"とは，測定可能な反応に関与する分子等の量または活性の増加または減少を引き起こすことを意味する。１つの態様においては，一連の細胞（例えば疾病モデルから）を一連の薬剤と接触させ（例えば，約１０分間−約４８時間またはそれ以上の時間），日常的な当該技術分野において認められている方法（例えば市販のキット）を用いて，総ＲＮＡまたはｍＲＮＡ抽出物を作成することができる。ＲＮＡの量を増幅することが望ましい場合には，標準的な方法，例えば，ＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いることができる（例えば，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（１９９６）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。抽出物（またはこれから増幅された生成物）は，適当な指示体ＲＮＡ用のプローブと接触させて（例えば共にインキュベートして），指示体の発現パターンの変化に関連する薬剤を同定することができる。
【０１８４】
同様に，特定の生理学的状態または発生段階に関連する発現パターンを調節する薬剤を同定することができる。そのような薬剤は，人工的なまたは天然に生ずる物質，例えば，胚発生または生理学的反応の制御に関与する物質等の環境因子でありうる。
【０１８５】
１つの態様においては，本明細書に記載される方法は，多数の標的遺伝子（例えば，用いる特定のフォーマットにより，約１０００またはそれ以上の数）を迅速に同時にアッセイする"ハイスループット"の様式で実施することができる。さらに，多くのアッセイフォーマット（例えば，プレートまたは表面）を一度に加工することができる。例えば，本発明のオリゴヌクレオチドは，これらを組成物中に組み込む前に個々に試験する必要がないため，容易に合成することができ，多数の標的遺伝子を一度に試験することができる。例えば，それぞれが標的核酸分子を含む生物学的サンプル（例えば細胞）を含む多数のサンプルおよび本発明の組成物をアッセイフォーマットの別々の領域に加えて，各サンプルについてアッセイを行うことができる。
【０１８６】
オリゴヌクレオチド組成物の投与
オリゴヌクレオチドの投与またはデリバリーの最適な経路は，所望の結果および／または治療すべき被験者によって様々である。本明細書において用いる場合，"投与"とは，細胞をオリゴヌクレオチドと接触させることを表し，これはインビトロで行ってもよく，インビボで行ってもよい。オリゴヌクレオチドの投与量は，標的核酸分子から翻訳される蛋白質の発現，例えば，過度の実験を行うことなくＲＮＡ安定性の読み出しによりまたは治療上の応答により測定される発現を，最適に減少させるように調節することができる。
【０１８７】
例えば，核酸標的によりコードされる蛋白質の発現を測定して，これにしたがって投与計画を調節する必要があるか否かを判定することができる。さらに，細胞中のまたは細胞により産生されるＲＮＡまたは蛋白質のレベルの増加または減少は，当該技術分野において認められている任意の手法を用いて測定することができる。転写が減少したか否かを判定することにより，オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの切断を誘導する効力を判定することができる。
【０１８８】
上述のいずれのオリゴヌクレオチド組成物も，単独で用いてもよく，薬学的に許容しうる担体と組み合わせて用いてもよい。本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる担体"には，適当な溶媒，分散媒体，コーティング剤，抗菌剤および抗真菌剤，等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および薬剤を用いることは，当該技術分野においてよく知られている。活性成分と適合性でない場合を除き，任意の慣用の媒体または薬剤を治療用組成物において用いることができる。補充的活性成分もまた組成物中に含有させることができる。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドは，非経口投与用に，リポソームまたはポリエチレングリコールで修飾したリポソーム中に取り込むか，またはカチオン性脂質と混合することができる。追加の物質，例えば，特定の標的細胞上に見いだされる膜蛋白質に対して反応性の抗体をリポソーム中に取り込み，特定のタイプの細胞へのオリゴヌクレオチドのターゲティングを助けることができる。
【０１９０】
さらに，本発明は，オリゴヌクレオチドを連続的に注入する浸透圧ポンプ，例えば，Ｒａｔａｉｃｚａｋら（１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１８２３−１１８２７）に記載されるものを用いて，被験者にオリゴヌクレオチドを投与することを提供する。そのような浸透圧ポンプは，例えば，Ａｌｚｅｔ  Ｉｎｃ．（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。カチオン性脂質担体中での局所投与および非経口投与が好ましい。
【０１９１】
インビボ用途に関しては，本発明の処方は，選択された投与経路に適合した種々の形態で，例えば，非経口的に，経口的に，または腹膜内に，患者に投与することができる。非経口投与（これが好ましい）には，以下の経路による投与が含まれる：静脈内；筋肉内；間質；動脈内；皮下；眼内；滑液包内；経上皮，例えば経皮；吸入により肺に；眼；舌下および頬；局所的に，例えば，眼；皮膚；眼球；直腸；および吸入剤による鼻吸入。
【０１９２】
非経口投与用の医薬製剤には，水溶性または水分散性の形の活性化合物の水性溶液が含まれる。さらに，活性化合物の懸濁液を適当な油性注射用懸濁液として投与することができる。適当な親油性溶媒，またはベヒクルには，脂肪油，例えば，ゴマ油，または合成脂肪酸エステル，例えば，エチルオレエートまたはトリグリセリドが含まれる。水性注射用懸濁液は，懸濁液の粘度を高める物質，例えば，ナトリウムカルボキシメチルセルロース，ソルビトール，またはデキストランを含んでいてもよく，懸濁液はまた任意に安定化剤を含んでいてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは，液体溶液，好ましくは生理学的に適合性の緩衝液，例えばハンクス溶液またはリンゲル溶液中に処方することができる。さらに，オリゴヌクレオチドは，固体形に処方して使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥形もまた本発明に含まれる。
【０１９３】
局所投与用の医薬製剤には，経皮パッチ，軟膏，ローション剤，クリーム，ゲル，滴剤，噴霧剤，坐剤，液体および粉剤が含まれる。さらに，局所投与用の医薬製剤においては，慣用的な医薬担体，水性，粉体または油性の基剤，または増粘剤を用いることができる。
【０１９４】
経口投与用の医薬製剤には，粉末剤または顆粒剤，水または非水性媒体中の懸濁液または溶液，カプセル，サシェ剤または錠剤が含まれる。さらに，経口投与用の医薬製剤においては，増粘剤，香味剤，希釈剤，乳化剤，分散補助剤，または結合剤を用いることができる。
【０１９５】
経粘膜または経皮投与のためには，浸透すべきバリアに適した浸透剤を処方中で用いる。そのような浸透剤は当該技術分野において知られており，例えば，経粘膜投与用には胆汁酸およびフシジン酸誘導体および界面活性剤が挙げられる。経粘膜投与は鼻腔噴霧剤によりまたは坐剤を用いて行うことができる。経口投与用には，オリゴヌクレオチドを慣用の経口投与形，例えば，カプセル，錠剤およびトニック剤として処方する。局所投与用には，本発明のオリゴヌクレオチドを当該技術分野において知られる軟膏，塗剤，ゲル，またはクリームとして処方する。
【０１９６】
薬剤デリバリーベヒクルは，例えば，インビトロ投与用に，全身投与用に，または局所投与用に選択することができる。これらのベヒクルは，徐放リザーバーとして働くように，またはその内容物を標的細胞に直接デリバリーするように，設計することができる。ある種の直接デリバリー薬剤ベヒクルを用いることの利点は，１回の取り込みあたり多くの分子がデリバリーされることである。そのようなベヒクルは，さもなくば血流から急速に除かれるであろう薬剤の循環半減期を長くすることが示されている。このカテゴリーに属するそのような専門の薬剤デリバリーベヒクルのいくつかの例は，リポソーム，ハイドロゲル，シクロデキストリン，生分解性ナノカプセル，および生物接着性マイクロスフェアである。
【０１９７】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは，被験者に全身投与することができる。全身吸収とは，薬剤が血流中に入り，次に身体全体にわたって分配されることを表す。全身吸収につながる投与経路には，静脈内，皮下，腹膜内，および鼻腔内がある。これらの投与経路はそれぞれオリゴヌクレオチドをアクセス可能な疾病細胞にデリバリーする。皮下治療剤は，投与の後，局所リンパ節に排出され，リンパネットワークを通って進み，循環中に入る。循環中に入る速度は分子量またはサイズの関数であることが示されている。リポソームまたは他の薬剤担体を用いることにより，オリゴヌクレオチドをリンパ節に局在化させることができる。細胞内に拡散するようオリゴヌクレオチドを修飾することができ，またはリポソームを用いて，未修飾または修飾オリゴヌクレオチドのいずれかを直接細胞内にデリバリーすることができる。
【０１９８】
選択されたデリバリー法により，細胞内への侵入が生ずる。好ましいデリバリー法としては，リポソーム（１０−４００ｎｍ），ハイドロゲル，制御放出ポリマー，および他の薬学的に許容しうるベヒクル，およびマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーション（エクスビボ処置用）が挙げられる。
【０１９９】
本発明の医薬製剤はエマルジョンとして調製し処方してもよい。エマルジョンは，通常は，一方の液体が通常は直径０．１μｍを越える液滴の形で他方の液体中に分散している不均一系である。
【０２００】
本発明のエマルジョンは，賦形剤，例えば，乳化剤，安定化剤，染料，油脂，油，ワックス，脂肪酸，脂肪酸アルコール，脂肪酸エステル，湿潤剤，親水性コロイド，保存剤を含んでいてもよく，必要に応じてエマルジョン中に抗酸化剤が存在していてもよい。これらの賦形剤は水性相，油性相のいずれかの中の溶液として，またはそれ自身別の相として存在することができる。
【０２０１】
本発明のエマルジョン処方において用いることができる天然に生ずる乳化剤の例としては，ラノリン，蜜蝋，ホスファチド，レシチンおよびアラビアゴムが挙げられる。細かく分割された固体はまた，特に界面活性剤と組み合わせた場合および粘稠な製剤において，優れた乳化剤として用いられている。乳化剤として用いることができる微細分割固体の例としては，極性無機固体，例えば重金属水酸化物，非膨潤性粘土，例えば，ベントナイト，アタパルガイト，ヘクトライト，カオリン，モンモリロナイト，コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウム，顔料および非極性固体，例えば，炭素またはグリセリルトリステアレートが挙げられる。
【０２０２】
エマルジョン処方中に含めることができる保存剤の例としては，メチルパラベン，プロピルパラベン，４級アンモニウム塩，塩化ベンズアルコニウム，ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル，およびホウ酸が挙げられる。エマルジョン処方中に含めることができる抗酸化剤の例としては，フリーラジカルスカベンジャー，例えば，トコフェロール，没食子酸アルキル，ブチル化ヒドロキシアニソール，ブチル化ヒドロキシトルエン，または還元剤，例えば，アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム，および抗酸化剤共同薬，例えば，クエン酸，酒石酸およびレシチンが挙げられる。
【０２０３】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドの組成物は，マイクロエマルジョンとして処方される。マイクロエマルジョンは水，油および両親媒性化合物の系であり，これは光学的に等方性かつ熱力学的に安定な単一の液体溶液である。典型的には，マイクロエマルジョンは，まず油を水性界面活性剤溶液中に分散させ，次に十分な量の第４の成分，一般に中間鎖長のアルコールを加えて，透明系を形成することにより製造される。
【０２０４】
マイクロエマルジョンの製剤において用いることができる界面活性剤としては，限定されないが，イオン性界面活性剤，非イオン性界面活性剤，Ｂｒｉｊ９６，ポリオキシエチレンオレイルエーテル，ポリグリセロール脂肪酸エステル，テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０），テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０），ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０），ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００），デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０），デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０），デカグリセロールセキオレエート（Ｓ０７５０），デカグリセロールデカオレエート（ＤＡ０７５０）が挙げられ，これらは単独でも共界面活性剤と組み合わせてもよい。共界面活性剤（通常は短鎖アルコール，例えば，エタノール，１−プロパノール，および１−ブタノール）は，界面活性剤フィルム中に浸透し，次に界面活性剤分子の間に生ずる空隙のために乱れたフィルムを形成することにより，界面流動性を増加させるように働く。
【０２０５】
しかし，マイクロエマルジョンは，共界面活性剤を用いずに製造することができる。無アルコール自己乳化マイクロエマルジョン系が当該技術分野において知られている。水性相は，典型的には，限定されないが，水，薬剤の水性溶液，グリセロール，ＰＥＧ３００，ＰＥＧ４００，ポリグリセロール，プロピレングリコール，およびエチレングリコールの誘導体である。油性相としては，限定されないが，Ｃａｐｔｅｘ３００，Ｃａｐｔｅｘ３５５，Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ，脂肪酸エステル，中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ，ジ，およびトリグリセリド，ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル，脂肪酸アルコール，ポリグリコール化グリセリド，飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド，植物油およびシリコーン油等の物質が挙げられる。
【０２０６】
マイクロエマルジョンは，薬剤溶解性および増強された薬剤吸収の観点から特に興味深い。脂質系マイクロエマルジョン（油／水および水／油の両方）は，薬剤の経口での生物学的利用性を増強すると提唱されている。
【０２０７】
マイクロエマルジョンは，薬剤溶解性を改良し，薬剤を酵素的加水分解から保護し，界面活性剤により誘導される膜流動性および透過性の変化により薬剤吸収を増強させる可能性があり，製造が容易であり，固体投与形態より経口投与が容易であり，臨床的効力が改良され，毒性が低下する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１：１３８５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５：１３８−１４３）。マイクロエマルジョンはまた，化粧品および医薬品の両方の用途における活性成分の経皮デリバリーにおいて有用である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および処方は，胃腸管からのオリゴヌクレオチドの全身吸収の増加を促進し，ならびに胃腸管，膣，口腔および他の投与部位におけるオリゴヌクレオチドの局所的細胞取り込みを改良すると予測される。
【０２０８】
１つの態様においては，本発明は，核酸，特にオリゴヌクレオチドを動物の皮膚に効率よくデリバリーするために種々の浸透促進剤を用いる。横切るべき膜を浸透促進剤で処置すると，非親油性薬剤であっても細胞膜を横切ることができる。浸透剤は，非親油性薬剤の細胞膜を越える拡散を増加させることに加え，親油性薬剤の透過性を増強するようにも作用する。
【０２０９】
本発明において用いることができる浸透促進剤の５つのカテゴリーには，界面活性剤，脂肪酸，胆汁酸，キレート剤，および非キレート性非界面活性剤が含まれる。投与されたオリゴヌクレオチドの浸透を促進するために使用することができる他の薬剤には，エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール，２−１５ピロール等のピロール，アゾン，およびリモネンおよびメントン等のテルペンが含まれる。
【０２１０】
オリゴヌクレオチド，特に脂質処方中のオリゴヌクレオチドは，医療器具，例えば，血管形成用バルーンカテーテル等のカテーテルをカチオン性脂質処方でコーティングすることにより投与してもよい。コーティングは，例えば，医療器具を脂質処方または脂質処方と適当な溶媒（水性緩衝液，水性溶媒，エタノール，塩化メチレン，クロロホルム等）との混合物に浸漬することにより行うことができる。ある量の処方が器具の表面に自然に接着し，その後これは患者に適切に投与される。あるいは，脂質処方の凍結乾燥混合物は，器具の表面に特異的に結合するかもしれない。そのような結合手法は，例えば，Ｋ．Ｉｓｈｉｈａｒａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１３０９−１３１４（１９９３）；この開示の全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【０２１１】
投与すべき有用な投与量および投与の特定の様式は，当業者には明らかなように，細胞のタイプ，またはインビボ用途の場合には，年齢，体重および処置すべき特定の動物および領域，用いる特定のオリゴヌクレオチドおよびデリバリー方法，企図される治療または診断用途，および処方形態，例えば，懸濁液，乳濁液，ミセルまたはリポソーム等の因子によって異なる。典型的には，より低いレベルの投与量で投与し，所望の効果が達成されるまで増加させる。オリゴヌクレオチドをデリバリーするために脂質を用いる場合には，投与する脂質化合物の量は様々であることができ，一般に，投与するオリゴヌクレオチド薬剤の量によって異なる。例えば，脂質化合物とオリゴヌクレオチド薬剤との重量比は，好ましくは，約１：１−約１５：１であり，約５：１−約１０：１の比率がより好ましい。一般に，投与されるカチオン性脂質化合物の量は，約０．１ミリグラム（ｍｇ）から約１グラム（ｇ）まで様々であろう。一般的指標として，典型的には約０．１ｍｇ−約１０ｍｇの特定のオリゴヌクレオチド薬剤，および約１ｍｇ−約１００ｍｇの脂質組成物（それぞれ患者の体重１ｋｇあたり）を投与するが，より高いまたはより低い量を用いることも可能である。
【０２１２】
本発明の薬剤は，薬剤の投与に適した生物学的に適合性の形で被験者に投与するか，または細胞と接触させる。"投与に適した生物学的に適合性の形"とは，オリゴヌクレオチドの治療効果が毒性効果よりまさる形でオリゴヌクレオチドを投与することを意味する。１つの態様においては，オリゴヌクレオチドを被験者に投与することができる。被験者の例としては，哺乳動物，例えば，ヒト，ウシ，ブタ，ウマ，イヌ，ネコ，マウス，ラット，およびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。
【０２１３】
活性量の本発明のオリゴヌクレオチドの投与とは，所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効である量として定義される。例えば，オリゴヌクレオチドの活性量は，細胞のタイプ，用いるオリゴヌクレオチド，およびインビボ用途の場合には，個体の疾病状態，年齢，性別，および体重，およびオリゴヌクレオチドが個体の所望の応答を引き出す能力等の因子によって様々であろう。細胞内における治療レベルのオリゴヌクレオチドの確立は，取り込みおよび流出または分解の速度に依存する。分解の程度を減少させれば，オリゴヌクレオチドの細胞内半減期が長くなる。すなわち，化学的に修飾したオリゴヌクレオチド，例えば，リン酸骨格に修飾を有するものは，異なる投与量を必要とするであろう。
【０２１４】
オリゴヌクレオチドの正確な投与量および投与する回数は，実験的におよび臨床試験において得られたデータによって異なるであろう。いくつかの因子，例えば，所望の効果，デリバリーベヒクル，疾病適応症，および投与の経路が投与量に影響を与えるであろう。当業者は投与量を容易に決定することができ，本発明の医薬組成物として処方することができる。好ましくは，治療の期間は少なくとも疾病症状の経過期間にわたる。
【０２１５】
投与計画は，最適な治療応答を与えるように調節することができる。例えば，オリゴヌクレオチドは，繰り返し投与することができる，例えば，毎日数回投与してもよく，治療状況の緊急性により示されるものに比例して投与量が減少してもよい。当業者は，オリゴヌクレオチドを細胞に投与する場合でも被験者に投与する場合でも，目的のオリゴヌクレオチドの適当な投与量および投与のスケジュールを容易に決定することができる。
【０２１６】
疾病または疾患の治療
本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，遺伝子の発現を阻害することにより，蛋白質の発現が関与する任意の疾病を治療するために用いることができる。オリゴヌクレオチド組成物により治療することができる疾病の例には以下のものが含まれる：癌，網膜症，自己免疫疾患，炎症性疾病（例えば，ＩＣＡＭ−１関連疾患，乾癬，潰瘍性大腸炎，クローン病），ウイルス性疾病（例えば，ＨＩＶ，Ｃ型肝炎），および心臓血管疾病。
【０２１７】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドによる細胞のインビトロでの処置を，被験者から取り出した細胞のエクスビボ療法に（例えば，白血病またはウイルス感染の治療），または被験者に由来するものではないが被験者に投与されるべき細胞の治療に（例えば，被験者に移植されるべき細胞上の移植抗原発現を排除するため），用いることができる。さらに，細胞のインビトロ処置は，治療以外の状況において，例えば，遺伝子機能を評価するため，遺伝子制御および蛋白質合成を研究するため，または遺伝子発現または蛋白質合成を調節するよう設計されたオリゴヌクレオチドに加えられた改良を評価するために用いることができる。細胞のインビボ治療は，蛋白質の発現を阻害することが望ましいある種の臨床状況において有用でありうる。アンチセンス療法が適していると報告されている多くの医学的状態（例えば，米国特許５，８３０，６５３を参照），ならびにＲＳウイルス感染（ＷＯ９５／２２５５３），インフルエンザウイルス（ＷＯ９４／２３０２８），および悪性疾患（ＷＯ９４／０８００３）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的使用の他の例は，例えば，Ｇｌａｓｅｒ．１９９６．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ１６：１に概説されている。オリゴヌクレオチドによる切断の標的の例には，例えば，蛋白質キナーゼＣａ，ＩＣＡＭ−１，ｃ−ｒａｆキナーゼ，ｐ５３，ｃ−ｍｙｂ，および慢性骨髄性白血病において見いだされるｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子が含まれる。
【０２１８】
本発明の実施には，特に断らない限り，細胞生物学，細胞培養，分子生物学，微生物学，組換えＤＮＡ，および免疫学の慣用の手法を用い，これらは当業者の技術の範囲内である。そのような手法は，文献に完全に説明されている。例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（Ｗｉｌｅｙ，ＮＹ（１９９５））；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．（１９８４））；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．（１９８４））；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７））；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．（１９８６））；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９７２））を参照。
【０２１９】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが，これは本発明を限定するものと解釈してはならない。
【０２２０】
実施例
実施例１．オリゴヌクレオチド組成物がＡ５４９細胞においてＣＤＫ２を阻害する能力
この実施例においては，５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドが個々にＡ５４９細胞においてＣＤＫ２の発現を阻害する能力を，５つすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドを一度にトランスフェクションした場合の能力と比較した。用いた５つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである：
オリゴヌクレオチド１ＧＣＡＧＵＡＵＡＣＣＵＣＵＣＧＣＵ−ＣＵＵＧＵＣＡＡ（配列番号８）；
オリゴヌクレオチド２ＵＵＵＧＧＡＡＧＵＵＣＵＣＣＡＵＧＡＡ−ＧＣＧＣＣＡ（配列番号９）；
オリゴヌクレオチド３ＧＵＣＣＡＡＡＧＵＣＵＧＣＵＡ−ＧＣＵＵＧＡＵＧＧＣ（配列番号１０）；
オリゴヌクレオチド４ＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＵＵＵ−ＣＡＧＧＡＧＣＵＣＧＧＵ（配列番号１１）；
オリゴヌクレオチド５ＵＡＧＡＡＧＵＡＡＣＵＣＣＵ−ＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣ（配列番号１２）；
リバース対照ＡＡＣＵＧＵＵＣＵＣＧＣＵＣ−ＵＣＣＡＵＡＵＧＡＣＧ（配列番号１３）
【０２２１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションのためには，Ａ５４９細胞を，１０％ウシ胎児血清，２ｍＭのＬ−グルタミン，および１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを補充した高グルコースを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で維持した。
【０２２２】
トランスフェクションの前日に，２４ウエルプレートに３０，０００個／ウエルのＡ５４９細胞を播種した。細胞はトランスフェクションの開始時に約６０％コンフルエントであり，プレートの全体に均一に分布していた。トランスフェクションの日に，Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（無血清培地，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１０Ｘストックを調製した。希釈した脂質を室温で１５分間放置した。Ａ５４９細胞のトランスフェクションの最適条件は，１μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化した２５ｎＭのオリゴヌクレオチドであると決定された。トランスフェクションにおいて用いるべき各オリゴヌクレオチドの１０Ｘストックも，Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で調製した（オリゴヌクレオチドの１０Ｘ濃度は０．２５μＭである）。等量の１０Ｘリポフェクタミン２０００ストックおよび１０Ｘオリゴヌクレオチド溶液をよく混合し，室温で１５分間インキュベートして，オリゴヌクレオチドと脂質とを複合体化させた。得られた混合物は５Ｘであった。１５分間の複合体形成の後，４倍容量の完全成長培地をオリゴヌクレオチド／脂質複合体に加えて，１Ｘ溶液を作製した。培地を細胞から吸引し，０．５ｍＬの１Ｘオリゴヌクレオチド／脂質複合体を各ウエルに加えた。培地交換の間，細胞が乾燥しないようにした。細胞を湿潤ＣＯ2インキュベータで３７℃で１６−２４時間インキュベートした。細胞ペレットを回収して，蛋白質の決定またはＲＮＡ単離を行った。以下の表に実験の結果を示す。
【０２２３】
【表１】
0004527984.tif 000004
【０２２４】
【表２】
0004527984.tif 000005
【０２２５】
ＣＤＫ２の発現のレベルはＧＡＰＤＨのレベルに対して標準化した。トランスフェクションなしまたは蛍光対照オリゴヌクレオチド（ルシフェラーゼを標的とする）によるトランスフェクションは，１またはそれより高いレベルを示した。リバース配列対照オリゴヌクレオチドは約０．８のレベルを与えた。個々のオリゴヌクレオチドのそれぞれ（１−５）は，ＣＤＫ２発現の阻害を示した（オリゴヌクレオチド番号５の場合，そのレベルは，約０．２（リバース対照と比較して約７０％の阻害）から０．６５（リバース対照と比較して１０％の阻害）の範囲であった）。５つすべてのオリゴヌクレオチドを一度にトランスフェクションした場合，約０．２未満，すなわちリバース対照と比較して約８２％の阻害のレベルが得られた。すなわち，１回のトランスフェクションを用いるのみで，５つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物を用いて，蛋白質合成を有効に阻害することができる。
【０２２６】
実施例２．オリゴヌクレオチド組成物を３０種の異なる遺伝子について試験した実験の結果の概要
図１は，培養細胞中の約３０種の異なる遺伝子に対する約３０回のアンチセンス阻害実験の結果の概要を示す。アンチセンスを実施例１に記載されるようにしてトランスフェクトし，標準的な方法を用いて，ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲで阻害を分析した。それぞれの場合において，標的遺伝子に対してアンチセンスではない同じ化学の対照オリゴヌクレオチドとの比較によりアンチセンス阻害を決定した。アンチセンス組成物は，各遺伝子に対して設計した５−８個のアンチセンスオリゴヌクレオチドから構成され，個々のオリゴヌクレオチドを５またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物と比較した。３つの標的遺伝子については，混合物はよく作用せず，これらのデータは混合物の分析から排除した。顕著なことに，混合物は，最も良い個々のオリゴヌクレオチドとほぼ同等に（８１−対８４％）阻害した。すべての個々のオリゴヌクレオチドの平均阻害ははるかに低く（５６％），変動ははるかに大きかった。すなわち，混合物を用いることにより，ほとんどの場合（標的遺伝子の約９０％）に，最初に個々のオリゴヌクレオチドでスクリーニングして最も良く作用するオリゴヌクレオチドを選択することなく，高い阻害を得ることができる。また，個々のオリゴヌクレオチドを用いた場合に得られる結果の変動が増加することにより示されるように，多くの場合，混合物は最も良い個々のオリゴヌクレオチドより優れていた。
【０２２７】
実施例３．ｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物のウルトラマーデータ
ＨｅＬａ細胞を，１μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化した５０ｎＭのｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクションした。２４時間後，細胞を溶解させ，ＲＮＡを単離してＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ｐ５３遺伝子のユニーク部位を標的とする７つのｓｉＲＮＡ複合体でトランスフェクションした。７つすべてのｓｉＲＮＡの混合物（それぞれ等濃度）は"ｓｉＲＮＡウルトラマー"と称される。対照の平均と比較して，最も良いｓｉＲＮＡ複合体は標的を８７％阻害し，ウルトラマーは６９％阻害した。
【０２２８】
Ｐ５３配列（アンチセンス，センス）：
ｓｉＲＮＡ１：
ＣＵＧＡＣＵＧＣＧＧＣＵＣＣＵＣＣＡＵＴＴ  （配列番号１４）
ＡＵＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＵＣＡＧＴＴ  （配列番号１５）
ｓｉＲＮＡ２：
ＣＵＣＡＣＡＡＣＣＵＣＣＧＵＣＡＵＧＵＴＴ  （配列番号１６）
ＡＣＡＵＧＡＣＧＧＡＧＧＵＵＧＵＧＡＧＴＴ  （配列番号１７）
ｓｉＲＮＡ３：
ＧＡＣＣＡＵＣＧＣＵＡＵＣＵＧＡＧＣＡＴＴ  （配列番号１８）
ＵＧＣＵＣＡＧＡＵＡＧＣＧＡＵＧＧＵＣＴＴ  （配列番号１９）
ｓｉＲＮＡ４：
ＧＵＡＣＡＧＵＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＵＴＴ  （配列番号２０）
ＡＧＧＵＵＧＧＣＵＣＵＧＡＣＵＧＵＡＣＴＴ  （配列番号２１）
ｓｉＲＮＡ５：
ＡＣＣＵＣＡＡＡＧＣＵＧＵＵＣＣＧＵＣＴＴ  （配列番号２２）
ＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＵＵＵＧＡＧＧＵＴＴ  （配列番号２３）
ｓｉＲＮＡ６：
ＣＣＵＣＡＵＵＣＡＧＣＵＣＵＣＧＧＡＡＴＴ  （配列番号２４）
ＵＵＣＣＧＡＧＡＧＣＵＧＡＡＵＧＡＧＧＴＴ  （配列番号２５）
ｓｉＲＮＡ７：
ＣＣＣＵＵＣＵＧＵＣＵＵＧＡＡＣＡＵＧＴＴ  （配列番号２６）
ＣＡＵＧＵＵＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴ  （配列番号２７）
【０２２９】
実施例４．ＧＴＰ２０を標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータ
ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）を，４００ｎＭ（合計濃度，明確化のため，混合物中で各個別のオリゴマーは８０ｎＭであった）のｓｉＲＮＡと複合体化した２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００でトランスフェクトした。ＧＴＰ２０（ＴＤ）を標的とする５つのｓｉＲＮＡデュープレックス，マッチした対照デュープレックス（ＣＤ）の１つの組成物，および５つの各オリゴの等モル混合物（"混合物"）を２４時間連続してトランスフェクションし，ＲＮＡ  Ｃａｔｃｈｅｒ（Ｓｅｑｕｉｔｕｒ，Ｉｎｃ．Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いてＲＮＡを回収した。ＧＴＰ２０  ｍＲＮＡの発現はＴａｑｍａｎにより定量し，ＧＡＰＤＨに対して標準化した。ＴＤ５（７０％）およびウルトラマー（７６％）を用いて，対照デュープレックスに対して７０％またはそれ以上の阻害が得られた。
【０２３０】
ヒト間葉幹細胞を４８ウエルディッシュに１５，０００／ウエルで播種し，２４時間後にトランスフェクションを行った。リポフェクタミン２０００をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で１０Ｘ濃度の２０μｇ／ｍＬに希釈し，１５分間インキュベートした。インキュベーション後，１０Ｘ脂質を等量の１０Ｘ（４μＭ）ｓｉＲＮＡに加え，１５分間インキュベートすることにより，脂質をｓｉＲＮＡデュープレックスと複合体化させた。ＭＳＣ分化培地を加えることにより，５Ｘ脂質／ｓｉＲＮＡ複合体を１Ｘに希釈した。２５０μｌの各１ＸｓｉＲＮＡ処理を４８ウエルのディッシュの各ウエルに加えた。各処理を三重のウエルに適用した。トランスフェクションの約４時間後にＭＳＣの骨芽細胞への分化を誘導した。細胞を４日間分化させた後，ＲＮＡを単離した。
【０２３１】
実施例５．Ｃｂｆａ−１を標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物のウルトラマーのデータ
ヒトメサンギウム幹細胞（ｈＭＳＣ）を４００ｎＭのｓｉＲＮＡ（合計濃度，混合物中で各個別のデュープレックスは８０ｎＭである）と複合体化した２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００でトランスフェクトした。５つの標的化デュープレックス（ＴＤ），５つの対照デュープレックス（ＣＤ），１つの５デュープレックス等モル混合物（"混合物"）および１つの対照混合物（ＵＣ）を連続的に７２時間トランスフェクションした。トランスフェクションの９６時間後にＲＮＡ  Ｃａｔｃｈｅｒを用いてＲＮＡを回収した。Ｃｂｆａ−１  ｍＲＮＡの発現はＴａｑｍａｎにより定量し，ＧＡＰＤＨに対して標準化した。ＴＤ４を用いて対照デュープレックスの平均に対して７０％またはそれ以上の阻害が得られた（７４％）。混合物は，混合物対照と比較して７０％阻害した。
【０２３２】
ヒト間葉幹細胞を４８ウエルディッシュに１５，０００／ウエルで播種し，２４時間後にトランスフェクションした。リポフェクタミン２０００をＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で１０Ｘ濃度の２０μｇ／ｍＬに希釈し，１５分間インキュベートした。インキュベーション後，１０Ｘ脂質を等量の１０Ｘ（４μＭ）ｓｉＲＮＡに加えて１５分間インキュベートすることにより脂質をｓｉＲＮＡデュープレックスと複合体化させた。ＭＳＣ分化培地を加えて５Ｘ脂質／ｓｉＲＮＡ複合体を１Ｘに希釈した。４８ウエルディッシュのウエルあたり２５０μｌの各１ＸｓｉＲＮＡ処理を加えた。各処理は３重のウエルに適用した。トランスフェクションの約４時間後にＭＳＣの骨芽細胞への分化を誘導した。細胞を４日間分化させた後にＲＮＡを単離した。以下のアンチセンス配列のＣｂｆａ−１  ｓｉＲＮＡデュープレックスを用いた（対応するセンス配列は２ヌクレオチドのＴＴ３’オーバーハングを有する相補的配列であり，ＴはＤＮＡであり，他のすべてのヌクレオチドはＲＮＡである）：
ＴＤ１（ｓ１８８８３）：ＡＵＵＵＡＡＵＡＧＣＧＵＧＣＵＧＣＣＡＴＴ  （配列番号２８）
ＴＤ２（ｓ１８８８５）：ＣＵＧＵＡＡＵＣＵＧＡＣＵＣＵＧＵＣＣＴＴ  （配列番号２９）
ＴＤ３（ｓ１８８８７）：ＡＡＵＡＵＧＧＵＣＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴ  （配列番号３０）
ＴＤ４（ｓ１８８８９）：ＧＵＣＡＡＣＡＣＣＡＵＣＡＵＵＣＵＧＧＴＴ  （配列番号３１）
ＴＤ５（ｓ１８８９１）：ＡＧＧＵＵＵＡＧＡＧＵＣＡＵＣＡＡＧＣＴＴ  （配列番号３２）
ＣＤ１（ｓ１８８８４）：ＡＣＣＧＵＣＧＵＧＣＧＡＵＡＡＵＵＵＡＴＴ  （配列番号３３）
ＣＤ２（ｓ１８８８６）：ＣＣＵＧＵＣＵＣＡＧＵＣＵＡＡＵＧＵＣＴＴ  （配列番号３４）
ＣＤ３（ｓ１８８８８）：ＡＧＡＣＡＡＡＣＣＧＣＵＧＧＵＡＵＡＡＴＴ  （配列番号３５）
ＣＤ４（ｓ１８８９０）：ＧＧＵＣＵＵＡＣＵＡＣＣＡＣＡＡＣＵＧＴＴ  （配列番号３６）
ＣＤ５（ｓ１８８９２）：ＣＧＡＡＣＵＡＣＵＧＡＧＡＵＵＵＧＧＡＴＴ  （配列番号３７）
【０２３３】
実施例６．ＰＴＰミューを標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータ
ＰＴＰミューｍＲＮＡを標的とする全ホスホロチオエートＤＮＡ２５ｎｔアンチセンスオリゴヌクレオチドのヒト肺癌腫（Ａ５４９）細胞における効力。Ａ５４９細胞を２５ｎＭのオリゴで１６時間トランスフェクションした後，ｍＲＮＡの強力な阻害が得られた。ＡＳ：アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＲＣ：リバース対照；ＭＩＸ：個々のＡＳオリゴマーの混合物（総オリゴマー濃度２５ｎＭ）。標的ｍＲＮＡの量はＧＡＰＤＨに対して標準化した。
【０２３４】
３代継代のＡ５４９細胞を４８ウエルプレートに２５，０００細胞／ウエルで播種し，湿潤５％ＣＯ2チャンバ（３７℃）で一晩インキュベートした。ＡＳオリゴマーのＯｐｔｉｍｅｍ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中の２５０ｎＭ溶液をＯｐｔｉｍｅｍ−Ｉ中の等量の１０μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した（脂質溶液は２５℃で１５分間プレインキュベートした）。室温で１５分間インキュベーションすることによりオリゴマー−脂質複合体を形成させた。４倍容量のＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清培地を複合体に加え，２５０μｌの希釈懸濁液を細胞に加えた。オリゴマーの最終濃度は２５ｎＭであった。１６時間のトランスフェクションの後，細胞をＰＢＳで洗浄し，Ｓｅｑｕｉｔｕｒ  ｍＲＮＡ  Ｃａｔｃｈｅｒを用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）により定量した；ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ（登録商標）配列検出システムを用いて自動化データ収集を行った。データはＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対して標準化した。オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである：ＡＳ１，ＣＡＵＵＣＡ−ＣＣＡＧＣＡＵＧＡＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡ（配列番号３８）；ＡＳ２，ＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴ−ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧ（配列番号３９）；ＡＳ３，ＵＣＣＡＧＡＵＡＧＧＡＵＵＣＣＣ−ＣＡＧＵＧＧＣＣＣ（配列番号４０）；ＡＳ４，ＣＵＧＧＵＣＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＵＡＡＵＣＵＣＡＵ（配列番号４１）；ＡＳ５，ＡＧＵＣＡＡＧＧＵＧＵＵＣＡＣＵＵＧＣＵＣＣＣＡＡ（配列番号４２）；ＡＳ６，ＡＡＧＵＡＣＵＡＡＵＧＧＣＣＡＧＵＵＣＵＧＣＣＣ（配列番号４３）；ＡＳ７，ＣＣＣＵＧＵＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＵＧＵＣＵＣＣＵＧ（配列番号４４）；ＡＳ８，ＧＡＧＣＵＧＧ−ＵＣＡＣＣＵＵＧＡＵＵＵＣＣＵＵＣＡ（配列番号４５）；ＡＳ９，ＣＣＡＧＧＣＡＡＧＵＣＣＣＡＡＧＵ−ＧＵＣＣＵＣＡＵ（配列番号４６）；ＡＳ１０，ＧＡＵＧＵＣＣＵＡＡＣＡＣＣＵＵＣＡＣＣＵＣＡＵＣ（配列番号４７）；ＭＩＸ，ＡＳ１−ＡＳ１０の等モル溶液
【０２３５】
実施例７．ＰＴＰ−ＰＥＳＴを標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータ
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）中のＰＴＰ−ＰＥＳＴ  ｍＲＮＡを標的とする２５ｎｔホスホロチオエートＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力。ｍＲＮＡの阻害は，２００ｎＭのオリゴで細胞を４時間無血清トランスフェクションした後，血清含有培地中で１４時間インキュベートした後に得た。ＡＳ：アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＲＣ：リバース対照；混合物：個々のＡＳオリゴマーの混合物（総オリゴ濃度２００ｎＭ）。標的ｍＲＮＡの量はＧＡＰＤＨに対して標準化した。
【０２３６】
３代継代のＨｕＶＥＣ細胞を２５，０００細胞／ウエルで４８ウエルプレートに播種し，湿潤５％ＣＯ2チャンバ（３７℃）で一晩インキュベートした。ＡＳオリゴマーのＯｐｔｉｍｅｍ−Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中の２０００ｎＭ溶液を等量のＯｐｔｉｍｅｍ−Ｉ中の１００μｇ／ｍＬのリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と混合した（脂質溶液は２５℃で３０分間プレインキュベートした）。室温で３０分間インキュベーションすることにより，オリゴマー−脂質複合体を形成させた。４倍容量のＯｐｔｉｍｅｍ−Ｉ（無血清）を複合体に加え，２５０μｌの希釈懸濁液を細胞に加えた。４時間後，トランスフェクション複合体を吸引し，２５０μｌのＥＧＭ−２完全培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で置き換えた。１６時間のトランスフェクションの後，細胞をＰＢＳで洗浄し，ｍＲＮＡ  Ｃａｔｃｈｅｒ（Ｓｅｑｕｉｔｕｒ，Ｉｎｃ．）を用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは，リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）で定量し，自動化データ収集はＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ（登録商標）配列検出システムで行った。データはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対して標準化した。ＡＳ１，ＣＣＣＡＵＵＧＵＧＧＵＣＡＧＧＡＣ−ＵＣＵＵＣＡＵＧＵ（配列番号４８）；ＡＳ２，ＵＵＣＣＣＡＵＣＵＣＡＡＡＵＵＣＵ−ＣＧＧＣＡＧＧＣＵ（配列番号４９）；ＡＳ３，ＵＧＧＣＡＣＡＡＡＵＧＧＣＡＣＣＵＧＵＵＣＵＵＣＣＵ（配列番号５０）；ＲＣ，ＧＡＣＵＣＣＵＵＵＡＡＧＵＡＧＧＵＣＵＣＣＣＡＧＧＵ（配列番号５１）；ＭＩＸ，ＡＳ１，ＡＳ２，およびＡＳ３の等モル溶液
【０２３７】
実施例８．ＰＴＰ−イータを標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータ
正常ラット腎臓（ＮＲＫ）細胞におけるＰＴＰ−イータｍＲＮＡを標的とする全ホスホロチオエートＤＮＡの２５ｎｔアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力。細胞を２５ｎＭのオリゴで一晩トランスフェクションした後にｍＲＮＡの阻害を測定した。ＡＳ：アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＲＣ：リバース対照；Ｍｉｘ：個々のＡＳオリゴマーの混合物（総オリゴマー濃度２５ｎＭ）。標的ｍＲＮＡの量はＧＡＰＤＨに対して標準化した。
【０２３８】
５代継代のＮＲＫ細胞を２５，０００細胞／ウエルで４８ウエルプレートに播種し，湿潤５％ＣＯ２チャンバ（３７℃）で一晩インキュベートした。Ｏｐｔｉｍｅｍ−Ｉ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中のＡＳオリゴマーの２５０ｎＭ溶液を等量のＯｐｔｉｍｅｍ−Ｉ中１０μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した（脂質溶液は２５℃で３０分間プレインキュベートした）。室温で１５分間インキュベーションすることによりオリゴマー−脂質複合体を形成させた。４倍容量の完全ＤＭＥＭ＋５％子ウシ血清を複合体に加え，２５０μｌの希釈懸濁液を細胞に重層した。最終オリゴマー濃度は２５ｎＭであった。１６時間インキュベーションした後，細胞をＰＢＳで洗浄し，Ｓｅｑｕｉｔｕｒ  ｍＲＮＡ  Ｃａｔｃｈｅｒ（登録商標）を用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））で定量した；自動化データ収集はＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ（登録商標）配列検出システムを用いて行った。
【０２３９】
データはＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対して標準化した。ＡＳ１，ＡＣＣＵＧＵＧＣＡＣＡＣＡＡＣＣＵＧＧＣ−ＣＣＵＧＧＵ（配列番号５２）；ＡＳ２，ＡＣＡＧＵＡＵＡＣＣＧＣＡＧＣＧＵＧＵＵＵＣＣＣＵＵ（配列番号５３）；ＡＳ３，ＧＵＣＵＣＡＵＵＧＡＣＵＧＵＵＣＣＣＡＡＧＧＵＧＡＵ（配列番号５４）；ＡＳ４，ＧＣＵＣＵＡＣＡＡＵＣＵＧＣＡＵＣＣＧＧＵＡＡＧＡＵ（配列番号５５）；ＡＳ５，ＵＣＵＧＵＧＣＣＡＵＣＵＧＣＵＧＣＵＵＧＡＧＡＡＵＵ（配列番号５６）；ＡＳ６，ＵＧＵＵＣＡＣ−ＡＧＣＵＣＧＧＡＵＧＵＣＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号５７）；ＲＣ，ＵＡＡＧＡＧＵＵＣＧＵＣＧＵ−ＣＵＡＣＣＧＵＧＵＣＵＵ（配列番号５８）；ＭＩＸ，ＡＳ１−ＡＳ６の等モル溶液
【０２４０】
均等物
当業者は，日常的な実験を越えるものを使用せずに，本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を理解するかまたは確認することができる。そのような均等物は添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１は，培養細胞中の約３０の異なる遺伝子に対する約３０のアンチセンス阻害実験の結果のまとめを示す。オリゴヌクレオチドの混合物を含むオリゴヌクレオチド組成物（標的遺伝子の下から１０％が除かれている）を，観察されたパーセント阻害において，最良の個別のオリゴヌクレオチドおよびすべての個別のオリゴヌクレオチドについてのデータと比較した。
【図２】図２は，ｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータを示す。
【図３】図３は，ＧＴＰ２０を標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータを示す。
【図４】図４は，Ｃｂｆａ−１を標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータを示す。
【図５】図５は，ＰＴＰｍｕを標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータを示す。
【図６】図６は，ＰＴＰ−ＰＥＳＴを標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータを示す。
【図７】図７は，ＰＴＰｅｔａを標的とするｓｉＲＮＡ複合体の混合物についてのウルトラマーのデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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