(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、および配列番号：6に示される配列からなる群より選択される、花粉アレルゲンPhl p 7に由来する変異ポリペプチドであって、野生型Phl p 7と比較して低下したアレルゲン活性を有する、変異ポリペプチド。
【請求項２】
哺乳類においてIgG応答を誘導することができる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
野生型Phl p 7と比較して有意に減少しているヒスタミン放出を誘導する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項4記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミド。
【請求項６】
請求項5記載のベクターまたはプラスミドを形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項７】
請求項6記載の宿主細胞をポリペプチドが発現される条件下で培養する段階、および任意で該宿主細胞から該ポリペプチドを回収する段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドを化学合成する段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法。
【請求項９】
アレルギー障害を治療および／または予防する薬剤を製造するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１０】
アレルギー障害が2-EFハンド花粉アレルゲンに対するアレルギーである、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
アレルギー障害がPhl p 7に対するアレルギーである、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
アレルギー障害がBet v 4、Bra r 1、Aln g 4、Bra n 1、Cyn d 7、Ole e 3、Syr v 3、および／またはPhl p 7からなる群より選択されるアレルゲンに対するアレルギーである、請求項10記載の使用。
【請求項１３】
薬剤が予防的ワクチン接種のために用いられる、請求項9〜12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項14記載の薬学的組成物を含む、薬学的キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オオアワガエリ花粉アレルゲンPhl P 7に由来するポリペプチドに関する。ポリペプチドは、低下したアレルゲン活性を示し、感作アレルギー患者を治療するためおよび予防的ワクチン接種のためのアレルギーワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
集団の25％を超える人がIgE媒介アレルギーを有する。アレルギー（アレルギー性鼻結膜炎、喘息、皮膚炎、アナフィラキシーショック）の症状は、アレルゲンのIgE認識による。強いエフェクター細胞の活性化およびこのように炎症反応を誘導するため、アレルゲンは、エフェクター細胞結合IgE抗体に効率よくクロスリンクすることができなければならない。このプロセスは、アレルゲン表面において少なくとも二つのIgEエピトープの存在を必要とする。アレルギー患者のIgE抗体は、一列の構成的アミノ酸からなる「連続的なエピトープ」、または分子の襞によって近位となるアレルゲンの異なる部分からのアミノ酸からなる「不連続なエピトープ」のいずれかを認識する可能性がある。肥満細胞結合IgE抗体のアレルゲン誘発クロスリンクは、生物学的に活性なメディエータ（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン）の即時放出を誘導するが、T細胞に対するアレルゲンのIgE媒介提示は、T細胞活性化および前炎症性サイトカインの放出を引き起こす。
【０００３】
花粉アレルギーの人の約5〜20％が、カルシウムの二つの結合部位を含む最近発見された群のカルシウム結合タンパク質に感作されている。したがって、これらの花粉アレルゲンは、2-EFハンド花粉アレルゲンと呼ばれている。配列類似性のために、これらのタンパク質は交叉反応性IgEエピトープを含み、したがって感作された患者は、木、草、および雑草からの非常に多様な異なる花粉に接触すると、アレルギー症状を示す。
【０００４】
アレルゲン特異的免疫療法は、現在、IgE媒介アレルギーの治療のいくつかの治癒的な型の一つである。これは、現在、感作された人に対するアレルゲン含有抽出物を、ほとんどが注射によってしかし他の経路（例えば、舌下免疫療法）にもよって投与することによって行われている。木、草、および雑草からの花粉抽出物は特定の主要アレルゲンに関して標準化されているが、あまり頻繁に認識されていないが非常に交叉反応性のアレルゲン、例えば上記のカルシウム結合アレルゲンに関しては標準化が行われていない。
【０００５】
したがって、2-EFハンド花粉アレルゲンに対するアレルギーは、アレルゲン粗抽出物では十分に治療することができない。さらに、2-EFハンドアレルゲンは非常にアレルゲン性が強く、注射すると、重度のアレルギー副作用を誘導する可能性がある。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、2-EFハンド花粉アレルゲンに対するアレルギーの予防的または治療的治療のための手段を提供することを目的とする。オオアワガエリ花粉アレルゲンPhl p 7の変異体は、IgE結合の強い減少を示し、このように低アレルゲン物質として有用であることが判明している。Phl p 7のアミノ酸配列を配列番号：1に示す。本発明は、変異ポリペプチドが野生型Phl p 7と比較して低下したIgE活性を有する、以下からなる群より選択される花粉アレルゲンPhl p 7に由来する変異ポリペプチドに関する：
（a）配列番号：1に示すアミノ酸配列に関してアミノ酸残基1〜15個が欠失、置換、および／または付加されているアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）断片の長さが少なくともアミノ酸15個であり、断片のアミノ酸残基の少なくとも90％が配列番号：1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、（a）の断片を含むポリペプチド；
（c）断片の長さが少なくともアミノ酸15個である、配列番号：1に示すアミノ酸配列の断片を含むポリペプチド；
（d）断片の長さが少なくともアミノ酸10個であり、断片のアミノ酸残基の少なくとも80％が配列番号：1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である、（a）の断片を含むポリペプチド；および
（e）断片の長さが少なくともアミノ酸10個である、配列番号：1に示すアミノ酸配列の断片からなるポリペプチド。
【０００７】
本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結している少なくともアミノ酸7個を含む化合物を指す。ポリペプチドは、好ましくはアミノ酸のみを含むが、非タンパク質様成分を含んでもよい。ポリペプチドの長さは、好ましくは少なくともアミノ酸10個であり、より好ましくは少なくともアミノ酸15個である。ポリペプチドはまた、Phl p 7に由来する部分と融合パートナーとを含む融合タンパク質であってもよい。Phl p 7に由来する部分は、担体分子、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）にさらに連結してもよい。
【０００８】
本明細書において用いられる「2-EFハンド花粉アレルゲン」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号：1に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％同一である、カルシウム結合ポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは、それぞれの天然に存在する花粉アレルゲンと同一のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明に従う「変異」ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が野生型または天然に存在する2-EFハンド花粉アレルゲンの配列とは異なるポリペプチドである。
【００１０】
アミノ酸置換は、一つのアミノ酸を異なるアミノ酸に置換することを指す。好ましくは、酸性残基を置換する。置換するアミノ酸は、任意のタイプであってもよく、好ましくは非酸性アミノ酸であり、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン等のような疎水性アミノ酸である。
【００１１】
一つの態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示されるアミノ酸配列に関してアミノ酸1〜15個の欠失、置換、および／または付加を含む。好ましくは、アミノ酸欠失、置換、および／または付加の数は1〜10個、より好ましくは1〜6個、最も好ましくは1〜4個である。この態様のポリペプチドは、長さが少なくともアミノ酸63個、好ましくは長さがアミノ酸約78個である。好ましいポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列に関してアミノ酸置換1、2、3または4個を有する。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ配列に関して24および59位のアミノ酸、より好ましくは17、24、および59位のアミノ酸、さらにより好ましくは17、24、52および59位のアミノ酸が置換されるアミノ酸配列を含む。最も好ましいポリペプチドは、配列番号：4、配列番号：5、または配列番号：6に示すアミノ酸配列を含む。配列番号：4によって示されるポリペプチドは、配列番号：1に示されるアミノ酸配列と比較して二つの変異、すなわちE24AおよびD59Aを有する。配列番号：5によって示されるポリペプチドは、配列番号：1と比較して変異D17A、E24A、D59Aを含む。配列番号：6によって示されるポリペプチドは、配列番号：1と比較して変異D17A、E24A、D52A、およびE59Aを有する。
【００１２】
本発明はさらに、上記の（a）に記述したポリペプチドの断片を含むポリペプチドに関する。断片の長さは少なくともアミノ酸15個であり、すなわち断片は、上記の（a）のポリペプチドの少なくとも15の連続したアミノ酸からなる。好ましくは、断片の長さは、少なくともアミノ酸20個、より好ましくは少なくともアミノ酸25個、さらにより好ましくは少なくともアミノ酸30個である。断片のアミノ酸残基の少なくとも90％、好ましくは少なくとも92％、最も好ましくは少なくとも95％は、配列番号：1に示されるアミノ酸配列の対応する残基と同一である。パーセント配列同一性は、通常の方法によって決定される。配列番号：1に対する断片のアミノ酸配列の同一性の程度は、プログラム「Blast 2 sequence version Blast p2.1.2」（Tatusovaら（1999）、FEMS Microbiol. Lett. 174、247〜250）を用いて、断片のアミノ酸配列と配列番号：1とを比較することによって決定してもよい。この意味において用いられるパラメータは以下の通りである：行列：BLOSUM 62；ギャップオープン：11；ギャップエクステンション：1；Xドロップオフ：50；期待値：10；ワードサイズ：3；フィルター：なし。
【００１３】
もう一つの態様において、本発明のポリペプチドは、長さが少なくともアミノ酸15個の配列番号：1に示すアミノ酸配列の断片を含む。断片は、配列番号：1に示すアミノ酸配列の少なくとも15連続アミノ酸、好ましくは少なくとも20連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも25連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも30連続アミノ酸からなる。
【００１４】
本発明のポリペプチドはまた、上記（a）のポリペプチドの断片からなってもよい。この断片は、上記の（a）のポリペプチドの少なくとも10連続アミノ酸からなり、好ましくは少なくとも15連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも20連続アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも25連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも30連続アミノ酸からなる。断片のアミノ酸配列は、配列番号：1に示すアミノ酸配列の対応する残基と少なくとも80％同一である。アミノ酸配列同一性の程度は、上記のように決定される。配列番号：1のアミノ酸配列に対する断片の配列同一性は、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％である。
【００１５】
もう一つの態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列の断片からなる。この断片は、配列番号：1に示すアミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸からなり、好ましくは少なくとも15連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも20連続アミノ酸、さらにより好ましくは25連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも30連続アミノ酸からなる。好ましいポリペプチドは、EFハンドモチーフ（配列番号：1に示されるアミノ酸D13〜L25、またはD48〜F60）の一つを形成するアミノ酸を少なくとも含む。例はそれぞれ、選択的にKLHのような担体分子に共役させた、実質的に配列番号：2（第一のEFハンドモチーフ）または配列番号：3（第二のEFハンドモチーフ）に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００１６】
本発明に従って、エピトープ形成におそらく関与する表面露出アミノ酸を置換または欠失してもよい。配列番号：1の高度に保存された残基リジン19位とフェニルアラニン54位が溶媒に露出することが判明している。したがって、アレルゲン活性が低下したポリペプチドを得るためにこれらの残基の置換または欠失を行ってもよい。提案される変異は、配列番号：1の15位のアスパラギン、16位のグリシン、および17位のアスパラギン酸である。これらの残基は、N-末端カルシウム結合ループの上部で、ある種の非荷電キャップを形成する。これらの残基を（例えば、荷電アミノ酸に）置換すると、この免疫学的に興味深いタンパク質領域の完全に異なる表面パターンが得られるであろう。もう一つの標的は、配列番号：1の50位のアスパラギン酸、52位のアスパラギン酸、および56位のアスパラギン酸の変異である。これらのアミノ酸は、C-末端カルシウム結合ループの表面上の異なる陰性荷電分布に関与する。C-末端カルシウム結合ループを形成するアミノ酸12個からなるペプチドは、免疫学的に活性であることが示された。このように、上記のアスパラギン酸残基の変異は、このエピトープに大きく影響を及ぼすであろう。さらに、非荷電隆起内のアミノ酸の少なくとも一つを置換または欠失してもよい。これらは、配列番号：1の57位のフェニルアラニン、58位のアスパラギン、61位のイソロイシン、62位のセリン、65位のアスパラギン、66位のアラニン、68位のプロリン、および5位のメチオニン（反対の単量体鎖から提供される）である。
【００１７】
さらに、天然に存在するPhl p 7に対応する組換え産生Phl p 7は、広がったコンフォメーションを有する新規二量体集合体として存在することがさらに判明している。二つのタンパク質単量体は、ドメイン交換EFハンドが対を形成して頭部と尾部が配置される形で集合する。絡み合った二量体は、筒状構造をとり、広がった疎水性の腔がリガンド結合部位を提供する。カルシウム結合は、Phl p 7の開口および閉鎖二量体型のコンフォメーションスイッチとして作用する。したがって、本発明に従って、二量体集合体を破壊することが考えられるであろう。この戦略は、エフェクター細胞結合IgE抗体上のPhl p 7の高いクロスリンク活性を標的とする。ドメイン交換の結果として、タンパク質は、非常に対称性の二量体へと集合する。これによって、（同一の）IgEエピトープの倍加が起こる。ドメイン交換二量体が対応する単量体へと変換すると、IgEエピトープを維持するが、アレルギー誘発クロスリンク活性を強く減少させると予想される。したがって、本発明に従って、N-およびC-末端カルシウム結合ドメインのあいだの広いリンカー領域を脱安定化させるヒンジループの変異が提唱される。異なる水素結合を提供し、このようにリンカー領域の堅固なコンフォメーションを安定化させるアミノ酸の少なくとも一つの第一の変異が提案される：これらは、（配列番号：1の）高度に保存された残基の30位のアルギニン、33位のグリシン、34位のセリン、35位のトレオニン、36位のセリン、および39位のグルタミン酸である。これらの残基を、水素結合を形成することができないアミノ酸（例えば、かさ高い非極性アミノ酸）に交換すると、ヒンジループコンフォメーションの安定性に強く影響を及ぼすであろう。さらに、本発明者らは、ヒンジループ形成残基（特に、33位のグリシン、34位のセリン、35位のトレオニン、36位のセリン）を、小さい柔軟なアミノ酸の枝によって一つずつ置換すること、またはより長い鎖を導入することによって置換して、ヒンジループを伸長させ、その柔軟性を同時に増加させることを示唆している。もう一つの可能性は、短い堅固なPhl p 7ヒンジループ（33位のグリシン、34位のセリン、35位のトレオニン、36位のセリン）の、ドメイン内の対形成されたEFハンドタンパク質からの既知の対応するループ形成配列との交換である。これらの変異は全て、分子内EFハンド対形成(pairing)を有する単量体Phl p 7の形成を可能にする。
【００１８】
さらに、二量体構造は、E-ヘリックスと、ドメイン交換二量体における反対の単量体におけるZ-ヘリックスのあいだの相互作用を提供する疎水性残基の少なくとも一つの変異によって破壊される可能性がある。これらのアミノ酸は、8位のイソロイシン、12位のフェニルアラニン（N-末端E-ヘリックスの一部）、35位のトレオニン、40位のバリン、43位のメチオニン、および47位のイソロイシン（C-末端E-ヘリックスの一部）であると共に配列番号：1の71位のメチオニン、74位のバリン、75位のアラニン、76位のリジン、77位のバリン、および78位のフェニルアラニン（Z-ヘリックスの一部）残基である。これらのアミノ酸の変異（例えば、荷電またはかさ高い残基による）は、対称な二量体集合体を強く脱安定化させるであろう。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、野生型Phl p 7と比較して低下したアレルゲン活性を有する。本発明に従って、試料のアレルゲン活性は、試料の適用時に試験動物において誘導されるIgE抗体を決定することによって決定される。アレルゲン活性は、好ましくは適したインビトロまたはインビボ試験において決定される。アレルゲン活性は、van Hage-Hamsten、J. Allergy Clin. Immunol. 1999、104、969〜977頁、またはPauliら、Clin. Exp. Allergy 2000、30、1076〜1084頁に記述された皮膚試験において決定してもよい。野生型Phl p 7のアレルゲン活性は配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなる組換えによって産生されたPhl p 7を用いて決定してもよい。
【００２０】
好ましくは、ポリペプチドのアレルゲン活性は、野生型Phl p 7のアレルゲン活性の50％未満である。より好ましくはポリペプチドのアレルゲン活性は野生型蛋白質の25％未満である。最も好ましい態様において、ポリペプチドは、実質的にアレルゲン活性を有しない。一般的に、本発明のポリペプチドによって誘導されるヒスタミンの放出は、Phl p 7によって誘導されるヒスタミンの放出と比較して有意に減少している。ヒスタミンの放出を決定する好ましいインビトロ試験は、Vrtalaら、J. Clin. Invest. 1997、99、1673〜1681頁に記述される好塩基球ヒスタミン放出アッセイである。好ましくは、ヒスタミン放出は、Phl p 7が最大のヒスタミン放出を示すアレルゲン濃度で決定すると、少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％減少する。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、野生型Phl p 7（配列番号：1）と比較してオオアワガエリ花粉アレルギー患者からのIgE抗体に対する結合の減少を示す。IgE結合活性は、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％減少する。実質的に配列番号：1に示すアミノ酸配列からなる組換え型Phl p 7を用いて、野生型Phl p 7のIgE結合活性を決定することができる。ポリペプチドのIgE結合は、オオアワガエリ花粉アレルギー患者からの血清を用いるウェスタンブロット分析またはドットブロット実験によって決定してもよい。オオアワガエリ花粉アレルギーは、オオアワガエリ花粉アレルギーを示す既往（すなわち、草の開花時期でのアレルギーの季節性の症状）、オオアワガエリ花粉アレルゲンに対する皮膚試験反応陽性および／または血清中のオオアワガエリ花粉アレルゲンに対する特異的IgE抗体の検出に従って診断する。ドットブロットは、記述のようにγ線計数によって125I-標識抗ヒトIgE抗体の量を測定することによって定量することができる（Niederbergerら、J. Allergy Clin. Immunol. 1998、102、579〜591）。
【００２２】
本発明のPhl p 7由来ポリペプチドは、インビボでIgG抗体反応を誘導することが判明している。したがって、上記のポリペプチドは、少なくとも一つのIgGエピトープを含む。ポリペプチドは、個体または試験動物においてIgG抗体反応を誘発することができれば、少なくとも一つのIgGエピトープを含む。IgG応答を決定するための対応する試験を実施例3に記述する。より好ましくは、これらのIgG抗体は、IgE抗体とPhl p 7との結合を防止する「ブロッキング抗体」または「保護抗体」である。アレルギー症状の有意な減少は、このようにして得られる可能性がある。
【００２３】
配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、または配列番号：6のアミノ酸配列によって示される変異に対応する変異を有する本発明のポリペプチドは、予想外に都合のよい特性を有することが判明している。これらのアミノ酸配列において標的とされるアミノ酸の位置を、他のEF-ハンド花粉アレルゲンにおいても同様に置換または欠失することができる。したがって、本発明は、2-EFハンド花粉アレルゲンの野生型配列に関して、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、または配列番号：6に関して置換または欠失しているアミノ酸残基に対応するアミノ酸の位置が、置換または欠失している、2-EFハンド花粉アレルゲンに由来する変異ポリペプチドに関する。配列番号：2〜6のいずれかにおいて変異しているアミノ酸の位置に対応する他の2-EFハンド花粉アレルゲンにおけるアミノ酸の位置の同定は、当業者のレベル内である。例えば、当業者は、上記のプログラムBlast 2配列を用いて所定の2-EFハンド花粉アレルゲンのアミノ酸配列と、配列番号：1〜6に示される配列のいずれかとを並置してもよい。アラインメントから、変異される対応するアミノ酸の位置を、容易に誘導することができる。一例として、図9は、Phl p 7およびAln g 4のアラインメントを示す。置換または欠失されるアミノ酸の位置は、配列番号：1のD17、E24、D52、および／またはE59に対応する。これらの位置は、Aln g 4（配列番号：7）のアミノ酸配列のD24、E31、D59、およびE66に対応する。2-EFハンド花粉アレルゲンに由来するポリペプチドは、より大きいポリペプチドに含まれてもよく、またはKLHのような適した担体タンパク質に共役させて含まれてもよい。それらはまた、そのそれぞれの野生型と比較して低下したアレルゲン活性およびIgE結合能を有し、下記のようにIgG応答を誘導することができる。いくつかの2-EFハンド花粉アレルゲンのアミノ酸配列が既知である：
Aln g 4（ハンノキ）（Hayekら、J. Immunol. 1998、161、7031〜7039）
Cyn d 7（バミューダグラス）（Suphiogluら、FEBS Lett. 1997、402、167〜172）
Bra r 1（セイヨウアブラナ）（Toriyamaら、FEBS Lett. 1998、424、234〜238）
Bet v 4（カバノキ）（Twardoszら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997、239、197〜204）
Ole e 3（オリーブ）（Ledesmaら、Eur. J. Biochem. 1998、258、454〜459）
【００２４】
Aln g 4、Cyn d 7、Ole e 3、Bet v 4およびBra r 1のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10，および配列番号：11に示す。配列番号：10の71位のアミノ酸も同様にアラニンであってもよい。
【００２５】
Phl p 7以外の2-EFハンドアレルゲンに由来するポリペプチドは、配列番号：2〜6と同じアミノ酸位置での置換または欠失を含む限り、請求の範囲に含まれることに注意すべきである。
【００２６】
本発明は、配列番号：7に示されるアミノ酸配列に関して、31位および66位のアミノ酸、好ましくは24位、31位、および66位、より好ましくは24位、31位、59位、および66位のアミノ酸が置換される、Aln g 4に由来する変異ポリペプチドに関する。本発明はさらに、KLHのような担体分子に選択的に共役させた、実質的に配列番号：7のアミノ酸2〜44位、または43〜85位からなるポリペプチドに関する。
【００２７】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：8に示されるアミノ酸配列に関して、26位および61位のアミノ酸、好ましくは19位、26位、および61位、より好ましくは19位、26位、54位、および61位のアミノ酸が置換される、Cyn d 7に由来する変異ポリペプチドである。もう一つの局面は、KLHのような担体分子に選択的に共役させた、実質的に配列番号：8に示すアミノ酸配列のアミノ酸2〜39位、または38〜80位からなるポリペプチドに関する。
【００２８】
さらにもう一つの局面において、本発明は、配列番号：9に示されるアミノ酸配列に関して、30位および65位のアミノ酸、好ましくは23、30、および65位、より好ましくは23位、30位、58位、および65位のアミノ酸が置換される、Ole e 3に由来する変異ポリペプチドに関する。本発明はまた、KLHのような担体分子に選択的に共役させた実質的に配列番号：9に示すアミノ酸配列ののアミノ酸2〜43位、または42〜84位からなるポリペプチドに関する。
【００２９】
さらにもう一つの局面において、本発明は、配列番号：10に示されるアミノ酸配列に関して、31位および66位のアミノ酸、好ましくは24、31、および66位、より好ましくは24位、31位、59位、および66位のアミノ酸が置換される、Bet v 4に由来する変異ポリペプチドに関する。本発明はまた、KLHのような担体分子に選択的に共役させた、実質的に配列番号：10に示すアミノ酸配列ののアミノ酸2〜44位、または43〜85位からなるポリペプチドに関する。
【００３０】
さらにもう一つの局面において、本発明は、配列番号：11に示されるアミノ酸配列に関して、25位および60位のアミノ酸、好ましくは18、25、および60位、より好ましくは18位、25位、53位、および60位のアミノ酸が置換される、Bar r 1に由来する変異ポリペプチドに関する。本発明はまた、KLHのような担体分子に選択的に共役させた、実質的に配列番号：11に示すアミノ酸配列のアミノ酸2〜38位、または37〜79位からなるポリペプチドに関する。
【００３１】
配列番号：1に示すアミノ酸配列によって示される野生型Phl p 7、および野生型Phl p 7を含むタンパク質は、本発明の範囲に含まれない。天然に存在する2-EFハンド花粉アレルゲンまたは同じアミノ酸からなる組換えタンパク質は、本出願において請求されない（例えば、Bet v 4、Bra r 1、Aln g 4、Cyn d 7等）。
【００３２】
本発明はまた、本明細書に開示のポリペプチドをコードするDNAおよびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重のために、これらのポリヌクレオチド分子においてかなりの配列変化が起こりうることを容易に認識するであろう。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明に従って、本明細書に記述されるポリヌクレオチドを請求する場合、センス鎖、アンチセンス鎖、およびセンス鎖とアンチセンス鎖がそのそれぞれの水素結合によって互いにアニールしている二本鎖としてのDNAが請求されると理解される。同様に、本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーRNA（mRNA）が請求の範囲に含まれる。メッセンジャーRNAは、それぞれのチミンヌクレオチド（T）がウラシルヌクレオチド（U）に置換されていることを例外として、DNAによって用いられるコドンと同じコドンを用いてポリペプチドをコードするであろう。
【００３３】
DNAおよびRNAを調製する方法は、当技術分野で周知である。Phl p 7をコードする完全長のクローンは、通常のクローニング技法によって得ることができる。Phl p 7をコードするDNAは、適した特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅してもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、ホスホアミダイト法を用いて化学合成してもよい。
【００３４】
本発明はさらに、上記のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。一般的に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、一般的に発現ベクター内に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現にとって必要な他の遺伝子要素に機能的に結合している。ベクターはまた一般的に、一つもしくは複数の選択マーカーまたは一つもしくは複数の複製開始点を含むが、当業者は、特定の系において選択マーカーを異なるベクターにおいて提供してもよいこと、および外因性のDNAの複製は宿主細胞ゲノムへの組込によって提供してもよいことを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他の要素の選択は、当業者のレベル内での日常的な設計に関する問題である。そのような要素の多くが文献に記載され、販売元から入手できる。
【００３５】
本発明のもう一つの局面は、本発明に従うベクターまたはプラスミドによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞である。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。大腸菌、バチルスおよび他の属の細菌株を含む原核宿主細胞は、本発明における有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換する、およびその中でクローニングされる外来DNA配列を発現させる技術は、当技術分野で周知である（例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning,  a Laboratory Manual」、コールドスプリングハーバー研究所、1989を参照されたい）。
【００３６】
本発明の宿主細胞を用いて、本発明のポリペプチドを産生してもよい。したがって、本発明のさらにもう一つの局面は、該ポリペプチドが発現される条件で上記の宿主細胞を培養すること、および選択的に宿主細胞から該ポリペプチドを回収することを含む、本発明に従うポリペプチドを調製する方法である。大腸菌のような細菌において本発明のポリペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは、おそらく不溶性の封入体として細胞質に保持されてもよい。この場合、細胞を溶解して、封入体を回収し、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性させる。次に、変性させたポリペプチドを、例えば尿素溶液および還元酸化グルタチオンの混合物に対する透析によって変性剤を希釈した後に、緩衝生理食塩液に対して透析することによって再生させることができる。
【００３７】
形質転換またはトランスフェクトさせた宿主細胞を、選択した宿主細胞の増殖に必要な栄養および他の成分を含む培養培地において通常の技法に従って培養する。合成培地および複合培地を含む多様な適した培地が当技術分野で既知であり、これには一般的に炭素源、窒素源および無機質が含まれる。本発明のペプチドを80％以上の純度まで、より好ましくは95％以上の純度まで精製することが好ましく、混入する生体高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して99.9％を超えて純粋であって、感染および発熱性ポリペプチドを含まない薬学的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、本発明の精製ポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に含まない。本発明の発現された組換え型ポリペプチドは、分画および／または通常の精製法および培地を用いて精製することができる。硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロピック剤抽出を、試料の分画のために用いてもよい。本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチドに対する抗体を用いてアフィニティクロマトグラフィーによって単離してもよい。より短いポリペプチドは、好ましくはHPLCを用いて精製される。タンパク質の精製法は、例えば、Methods in Enzymology、第182巻、「Guide to Protein Purification.」、アカデミック出版、ニューヨーク1990、およびScopes、「Protein Purification.」、スプリンガー出版、ハイデルベルグ、1994に記述されている。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、例えばMerryfield、J. Am. Chem. Soc. 85：2149、1963およびEthertonら、「Solid Phase Peptide Symthesis：A Practical Approach」、IRL出版、オックスフォード、1989によって記述されるように、化学合成を通して調製してもよい。
【００３９】
本発明はさらに、アレルギー障害を治療および／または予防するための薬剤を製造するために、本発明のポリペプチドを用いることに関する。障害は通常、一つまたは複数の2-EFハンド花粉アレルゲン、例えばPhl p 7に対するアレルギーである。Phl p 7は、2-EFハンド花粉アレルゲンファミリーの関連するIgEエピトープのほとんどを含むことが判明している。したがって、ポリペプチドは、ほぼ如何なる2-EFハンドアレルゲンに対するアレルギーの治療に用いてもよい。好ましくは、治療すべきアレルギー障害は、タンパク質Bet v 4、Bra r 1、Aln g 4、Bra n 1、Cyn d 7、Ole e 3、Syr v 3、および／またはPhl p 7の少なくとも一つに対するアレルギーである。薬剤は、アレルギー障害の治療的治療のため、または障害の発生を予防するための予防的ワクチン接種のために用いてもよい。
【００４０】
本発明はまた、本発明の少なくとも一つのポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。組成物はさらに薬学的に許容される担体または希釈剤を含んでもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは、KLHのような担体分子に共役している。
【００４１】
本発明のもう一つの局面は、本発明の少なくとも一つのポリペプチドを含む薬学的キットである。キットは、本発明に従う二つまたはそれ以上の異なるポリペプチドを含んでもよい。一つの態様において、キットは、Phl p 7に由来する少なくとも一つの変異ポリペプチドと、もう一つの2-EFハンド花粉アレルゲンに由来する少なくとも一つの変異ポリペプチドとを含む。オオアワガエリの花粉または他の花粉からの他のアレルゲンおよびそれらのエピトープが含まれてもよい。もう一つの局面において、Phl p 7に由来する変異ポリペプチドは、異なるアレルゲン源（ダニ、ネコ、花粉、キノコ）からの最も重要なアレルゲンを含むワクチン接種のための予防的薬学的組成物における一つの成分であってもよい。
【００４２】
薬学的に用いるために、本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って経口または非経口、特に皮下輸送のために製剤化される。一般的に、薬学的製剤には、生理食塩液、緩衝生理食塩液、5％デキストロース水溶液等のような薬学的に許容される溶媒と配合して本発明のポリペプチドが含まれるであろう。製剤にはさらに、一つまたは複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質の損失を防止するためにアルブミンが含まれてもよい。製剤化法は当技術分野で周知であり、例えば、Remington：「The Science and Practice of Pharmacy」、Gennaro編、Mack出版社、イーストン、ペンシルバニア州、第19版、1995に開示されている。治療的または予防的用量は、一般的に100〜200 μlの容量において0.1〜100 μg/注射の範囲であり、正確な用量は、治療すべき病態の特性および重症度、患者の形質等を考慮に入れて、容認された標準に従って医師が決定するであろう。用量の決定は当業者のレベル内である。量は、治療様式に応じて変化してもよい。免疫治療のあいだ、約25 μg〜75 μgの治療の1回用量を、注射1回あたり約100 μlの容量で投与することができる。経口投与の場合、用量0.1 μg〜50 mgを想像することができる。ワクチン接種の場合、患者は通常、「急速減感作療法(rush immunotherapy)」の場合に限って1日に数回治療される。一般的な免疫療法には、1〜2週間の間隔で投与される約8回の季節前ワクチン接種が含まれ、これを2〜3年のあいだ継続する。好ましくは、3〜5年のあいだに3ヶ月の間隔で1年に4回の注射が適用される。特定の態様において、一つより多いポリペプチドが薬学的組成物に含まれる。
【００４３】
本発明を、以下の非制限的な実施例によってさらに説明する。
【００４４】
実施例1
Phl p 7ならびに第一および第二のEF-ハンドにおいてアミノ酸交換を有するPhl p 7由来変異体の完全なN-末端またはC-末端カルシウム結合ドメインを含む二つのペプチドの特徴付け
【００４５】
ペプチド合成：
ペプチドは、HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-イル)1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファト）-活性化（0.1 mmol小規模サイクル）を行うFmoc（9-フルオレニルメトキシカルボニル）-戦略を用いて、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）ペプチドシンセサイザーモデル433A（フォスターシティ、カリフォルニア州）において合成した。予めローディングしたPEG-PS（ポリエチレングリコールポリスチレン）樹脂（0.15〜0.2 mmol/gローディング）（パーセティブバイオシステムズ、ワリントン、イギリス）をペプチドを構築するための固相として用いた。化学物質は、アプライドバイオシステムズから購入した。アミノ酸の共役は、フィードバック制御システムにおける伝導率のモニタリングによって確認した。システイン残基1個を各ペプチドに付加して、担体に対するペプチドの共役を容易にした。ペプチドは、蒸留水250 μl、トリイソプロピルシラン（フルカ（Fluka）、ブクス、スイス）250 μl、TFA 9.5 mlの混合物によって2時間樹脂から切断して、t-ブチルメチルエーテル（フルカ、ブクス、スイス）において沈殿させた。ペプチドの同一性は、質量分析によってチェックして、それらを調整的HPLC（ピケム（PiChem）、グラツ、オーストリア）によって純度＞90％となるまで精製した。
【００４６】
Phl p 7由来変異体の産生、発現および精製
キャメロン二本鎖部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン（Stratagene）、イーストキュー、オーストラリア）を用いて、Phl p 7のcDNAに点突然変異を導入して、発現ベクターpET17bにおいてクローニングした。特定の部位でPhl p 7を変異させる特異的プライマーを設計した。以下の変異を作製した：変異体1.6（配列番号：4）：24E→24A（第一のEF-ハンド）、59E→59A（第二のEF-ハンド）。変異体2A（配列番号：5）：17D→A、24E→24A（第一のEF-ハンド）；59E→59A（第二のEF-ハンド）。変異体4（配列番号：6）：17D→A、24E→24A（第一のEF-ハンド）；52D→52A、59E→59A（第二のEF-ハンド）。組換え型Phl p 7由来変異体を大腸菌BL21（DE3）において発現させた。大腸菌を、100 mg/mlアンピシリンを含むLB-培地においてOD600が0.4となるまで増殖させた。組換え型蛋白質の発現は、イソプロピルβ-チオガラクトピラノシドを最終濃度1 mMとなるように添加して、37℃でさらに4時間培養することによって誘導した。500 ml培養物からの大腸菌細胞を遠心によって回収して、PBS 10 mlに再浮遊させて、ウルトラチュラックス（アイカ（Ika）、ハイデルベルグ、ドイツ）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを10,000 rpm（ソルバル（Sorval）、RC5C、SS34ローター）で4℃で30分間遠心後、可溶性タンパク質を含む画分を得た。可溶性画分におけるタンパク質の濃縮および混入タンパク質の除去は、70 ％w/v硫酸アンモニウムを可溶性大腸菌画分に加えて遠心（18,000 rpm、ソルバルSS34、4℃、30分）することによって得た。可溶性のPhl p 7-由来変異体画分を水に対して透析して、凍結乾燥し、緩衝液A（25 mlイミダゾール、1 mMβ-メルカプトエタノール、pH 7.4）50 mlにおいて再浮遊させて、DEAE陰イオン交換カラム（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ、スウェーデン）に適用した。変異体を、〜200 mM NaClでNaCl勾配（500 mM NaClを含む緩衝液A）によって溶出した。純粋なPhl p 7由来変異体を含む画分をプールして、水に対して透析し、凍結乾燥した。タンパク質試料をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）およびタンパク質染色によって純度に関して分析した。
【００４７】
ペプチドおよび変異体（M4）のKLHへの共役
HPLC精製ペプチドまたはPhl p 7由来変異体と共にPhl p 7野生型を、製造元の説明書に従ってKLH（キーホールリンペットヘモシアニン、分子量4.5×103〜1.3×107、ピアス（Pierce）、ロックフォード、イリノイ州）に共役させて、結合キット（シグマ（Sigma）、セントルイス）を用いて精製した。
【００４８】
二次構造の分析（CD）
CD測定は、20℃で平衡にした光路長0.1 cmのセルを用いてジャスコ（Jasco）J-715分光偏光計において行った。スペクトルを、スキャン速度100 nm/分で解像力0.5 nmで記録し、平均で3回のスキャンから結果を得た。最終的なスペクトルは同一の条件で得た対応するミリQスペクトルを差し引くことによって基準値補正した。結果を二次構造推定プログラムJ-700に適合させた。
【００４９】
遠紫外線スペクトルは、点突然変異が、かなりの量のα-ヘリックス構造を含むことを示している。スペクトルは、224および208 nmでの最小値、ならびに200 nm未満の強い最大値を特徴とする。α-ヘリックス含有量は、様々な点突然変異に関して同一である。未変性組換え型Phl p 7は、有意により大きいα-ヘリックスシグナルを示した。Phl p 7と点突然変異体-4とを比較する第二の分析から、rPhl p 7の標準化したスペクトルとは対照的に、変異体-4のシグナルは、約20％有意に減少することが判明した。さらに、208 nmでの最小値は、より小さい波長にわずかにシフトして、曲線のゼロ交点は200 nm未満であった。これらの知見は、変異体-4タンパク質におけるランダムコイル二次構造の増加した部分を示している。
【００５０】
N-末端ペプチドは、ランダムコイル二次構造を示し、200および225 nmでの最小値を特徴とした。このことは、無傷のrPhl p 7タンパク質の切断によって全体的な集合体が破壊されるるのみならず、さらに単一のEF-ハンドドメインの襞に影響を及ぼすという事実を指摘している。このタンパク質は変性するのみならず、さらに溶解度および沈殿の有意な低下を示したことから、これはまた、対応するC-末端ペプチドについても認められうるであろう。
【００５１】
実施例2
Phl p 7の特異的部位での断片化によって、IgE結合能が失われ、カルシウム結合ドメインの特異的部位でのPhl p 7の変異によって、IgE結合能の低下が起こる。
【００５２】
a）Phl p 7-由来変異体およびPhl p 7由来ペプチドはIgE結合の低下を示す。
精製Phl p 7由来ペプチド（M1.6、M2A、M4）のIgE結合能を、オオアワガエリ花粉アレルギー患者からの血清を用いるウェスタンブロット分析（図2A）のみならず、オオアワガエリ花粉アレルギー患者10人からの血清を用いるドットブロット分析（図2B）によって、Phl p 7野生型の結合能と比較した。ウェスタンブロット分析により、Phl p 7と比較して全ての変異体に関してIgE結合能の低下が示された。最も強い低下は、変異体M4（図2A）に関して検出された。この知見は、ドットブロット分析によって確認した：患者10人中4人のみが、M4に対する弱いIgE結合を示し、10人中5人がM2Aと反応し、10人中6人がM1.6に反応した（図2B）。したがって、二重変異体（M4）は、IgE結合能の最大の低下を示した。
【００５３】
Phl p 7由来ペプチドのIgE結合能を、オオアワガエリ花粉アレルギー患者10人からの血清を用いてドットブロット分析によってPhl p 7野生型と比較した（図2B）。それぞれのペプチドに関して、オオアワガエリ花粉アレルギー患者10人からの血清について調べたところ、IgE結合能は完全に消失した。
【００５４】
b）Phl p 7変異体およびペプチドによる好塩基球ヒスタミン放出の減少
次に、Phl p 7由来ペプチドおよびPhl p 7由来変異体を、オオアワガエリ花粉アレルギー患者の好塩基球からのヒスタミン放出の誘導能に関してPhl p 7野生型と比較した。
【００５５】
オオアワガエリの花粉アレルギー患者のヘパリン化血液試料から、顆粒球をデキストラン沈降によって単離した。細胞を漸増濃度（10-6〜10 μg/ml）の各ペプチドまたは変異体と共に、および対照目的でrPhl p 7野生型と共にインキュベートした。無細胞培養上清において放出されたヒスタミンを、ラジオイムノアッセイ（イムノテック（Immunotech）、マルセイユ、フランス）によって測定した。細胞の凍結融解を行って総ヒスタミンを決定した。結果は、1試料あたり3回測定の平均値として示す。
【００５６】
図3に示すように、いずれのペプチド（共役または非共役）も10-3 μg/mlまでの濃度でヒスタミン放出を誘導しないことが判明した。Phl p 7由来変異体M4は、用量依存的な放出を誘導し、濃度10-3 μg/mlで最大放出を示したが、Phl p 7野生型は、濃度10-4 μg/mlで既にヒスタミンの最大放出を誘導した。KLHとの共役は、変異体およびペプチドのアレルゲン活性を増加させなかった（図3B）。
【００５７】
c）変異体およびペプチドのインビボアレルゲン活性の低下
オオアワガエリ花粉アレルギー患者におけるインビボ試験から、Phl p 7由来ペプチドのアレルゲン活性の消失およびPhl p 7由来変異体M4のアレルゲン活性の低下が確認された。
【００５８】
ペプチドおよび変異体のインビボアレルゲン活性を、オオアワガエリ花粉アレルギー患者3人と非アトピー患者1人において皮膚穿刺試験（SPT）によって調べた。SPTsを患者の前腕について行った。完全なPhl p 7またはPhl p 7由来変異体M4の二つの濃度（2 μg/ml、8 μg/ml）と共にPhl p 7由来ペプチドの二つの濃度（1 μg/ml、4 μg/ml）を含む20 μlの少量を適用した。さらに、標準化皮膚穿刺溶液（オオアワガエリ花粉抽出物およびヒスタミン）（アレルゴファーマ（Allergopharma）、ラインベック、ドイツ）を調べた。SPT後20分での写真撮影、およびボールペンで取り囲んだ膨疹領域をスコッチテープによって記録紙に移すことによって、反応を記録した。膨疹の平均直径（Dm）は、縦方向の最大直径および横方向の直径を測定して、それらの合計を2で割ることによって計算した。
【００５９】
皮膚穿刺試験は、オオアワガエリ花粉アレルギー患者3人と非アレルギー患者1人において、rPhl p 7、Phl p 7由来ペプチドおよびPhl p 7由来変異体M4について行った（表3）。いずれのペプチドも、濃度4μg/mlで適用した場合には、即時型皮膚反応を誘導しなかったが、Phl p 7野生型は濃度2 μg/mlで既に即時型皮膚反応を誘導した。M4は、即時型皮膚反応を誘導したが、これはPhl p 7野生型によって誘導された反応より中等度に弱かった（濃度8 μg/mlのPhl p 7によって誘導された膨疹の平均直径：9.3 mm；濃度8 μg/mlのM4によって誘導された膨疹の平均直径：7 mm）。オオアワガエリ花粉アレルギー患者は全員がオオアワガエリ花粉抽出物に対して即時型皮膚反応を示した。非アレルギー患者は、オオアワガエリ花粉抽出物、rPhl p 7、Phl p 7由来ペプチド、またはPhl p 7由来変異体に対して反応を示さなかった（表3：#4）。全ての人は、陽性対照として用いたヒスタミンによる試験後に反応した（表3）。
【００６０】
実施例3
Phl p 7由来ペプチドおよびPhl p 7由来変異体による免疫によって、rPhl p 7野生型のみならずハンノキの交叉反応性アレルゲンAln g 4を認識するIgG抗体が誘導される。
【００６１】
Phl p 7由来ペプチドまたはPhl p 7-由来変異体M4による免疫が、完全なPhl p 7分子およびPhl p 7交叉反応性アレルゲンに反応するIgG抗体を誘導するか否かを調べるために、フロイントのアジュバントを用いて、ウサギをPhl p 7野生型、ペプチド、またはPhl p 7変異体と共にKLH共役ペプチド／タンパク質によって免疫した。ウサギ8羽を、フロイントの完全および不完全アジュバント（チャールスリバー（Charles River）、キシュレッグ、ドイツ）を用いて、ペプチド-KLH共役体、変異体-KLH共役体、Phl p 7-KLH共役体、非共役ペプチド、変異体、およびPhl p 7野生型によってそれぞれ免疫した。血清試料を4週間の間隔で得た。分析するまで血清を-20℃で保存した。
【００６２】
ペプチド誘導IgG抗体およびPhl p 7変異体誘導IgG抗体のrPhl p 7野生型および交叉反応性アレルゲンに対する反応性を、ドットブロット実験によって調べた。Phl p 7野生型と共に対応する免疫原（ペプチド1、ペプチド2、Mut-4）を、ニトロセルロース片（1 μg/ドット）にドットした。小片を異なる希釈液のウサギ抗血清（1：500、1：1000、1：2000）に曝露した。
【００６３】
同様に、ハンノキからのPhl p 7交叉反応性カルシウム結合アレルゲンである組換え型Aln g 4を、ニトロセルロース片にドットして、小片を1000倍希釈したウサギ抗血清に曝露した。結合したウサギ抗体を、1000倍希釈した125I-標識ロバ抗ウサギ抗血清（アマシャムファルマシアバイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））によって検出した。
【００６４】
KLHに共役させたペプチドは、Phl p 7誘導変異体（M4、共役および非共役）と同様にIgG抗Phl p 7抗体反応を誘導した（図4）。同様に、M4、M4-KLHおよび共役ペプチドに対するウサギ抗血清は、Phl p 7交叉反応性アレルゲン、Aln g 4を認識した（図5）。
【００６５】
実施例4
抗ペプチドおよび抗変異体抗血清は、完全なPhl p 7に対する草花粉アレルギー患者からの血清IgEの結合を阻害する。
【００６６】
抗Phl p 7ペプチドおよび抗Phl p 7変異体抗体が完全なPhl p 7に対するアレルギー患者の血清IgEの結合を阻害するか否かを、草花粉アレルギー患者4人からの血清を用いるELISA競合によって調べた（表3）。
【００６７】
ペプチドまたは変異体誘導ウサギIgGが完全なPhl p 7に対するアレルギー患者のIgEの結合を阻害できるか否かを、ELISA競合アッセイによって調べた。ELISAプレート（ヌンクマキシソルプ（Nunc Mazisorp）、ロクスライド、デンマーク）をrPhl p 7（1 μg/ml）によってコーティングして、抗ペプチド抗血清（抗P1-KLH、抗P2-KLH）、抗変異体抗血清（抗M4-KLH）の250倍希釈液、および対照目的のために対応する免疫前血清と共にプレインキュベートした。洗浄後、プレートをPhl p 7感作草アレルギー患者からの1：3希釈した血清と共にインキュベートして、結合したIgE抗体を、1000倍希釈したモノクローナルラット抗ヒトIgE抗体（ファーミンゲン（Pharmingen）、サンディエゴ、カリフォルニア州）の後に2000倍希釈したHRP-結合ヒツジ抗ラットIg抗血清（アマシャムファルマシアバイオテック、ウプサラ、スウェーデン）によって検出した。抗ペプチドまたは抗変異体抗血清と共にプレインキュベートすることによって得られたIgE結合の阻害百分率は、以下のように計算した：IgE結合の％阻害＝100−ODI/ODP×100。ODIおよびODPはそれぞれ、ウサギ免疫および免疫前血清と共にプレインキュベートした後の吸光度を表す。
【００６８】
抗ペプチド2と共にプレインキュベートした後に、IgE結合の最も強い阻害が認められた（平均阻害47％）。抗変異体-KLH共役抗体は、Phl p 7に対する血清IgE結合のより低い阻害能を示した（平均阻害23.4％）。抗変異体とプレインキュベートした後の血清IgE結合の阻害は、血清4例中2例において検出でき（平均阻害5.6％）、抗ペプチド1と共にプレインキュベートした後では血清4例中1例に検出できたに過ぎなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Phl p 7、Phl p 7由来ペプチド、およびPhl p 7由来変異体（M1.6、M2A、M4）のCDスペクトル。
【図２】Phl p 7由来変異体およびPhl p 7由来ペプチドのIgE結合能の減少。ニトロセルロースブロッティングしたrPhl p 7（レーンPhl p 7）およびrPhl p 7由来変異体（レーンM1.6、M2A、M4）を、Phl p 7によって感作した草花粉アレルギー患者からの血清によってプロービングした。結合したIgE抗体は、125I標識抗ヒトIgE抗体によって検出した（Ａ）。ニトロセルロースブロッティングしたPhl p 7およびPhl p 7由来変異体（M1.6、M2A、M4）と共にPhl p 7由来ペプチドを、Phl p 7によって感作した草花粉アレルギー患者10人からの血清によってプロービングした。結合したIgE抗体を125I標識抗ヒトIgE抗体によって検出した（Ｂ）。
【図３】図3AおよびBはオオアワガエリ花粉アレルギー患者の好塩基球からのヒスタミン放出の誘導。オオアワガエリ花粉アレルギー患者からの顆粒球を、様々な濃度（x-軸）のrPhl p 7野生型（P7）、Phl p 7由来ペプチド（P1、P2）、Phl p 7由来変異体（M4）または他の抗原（Hom s 4）と共にインキュベートした（Ａ）。同じ患者の顆粒球をまた、様々な濃度（x-軸）のKLH共役rPhl p 7野生型（P7-K）、Phl p 7由来ペプチド（P1-K、P2-K）、またはPhl p 7由来変異体（M4-K）と共にインキュベートした（Ｂ）。無細胞培養上清に放出されたヒスタミンの百分率をy-軸に示す。
【図４】KLH共役ペプチドまたは共役および非共役Phl p 7変異体に対するウサギ抗血清は、完全なPhl p 7野生型と反応する。ニトロセルロースドットしたPhl p 7およびPhl p 7由来ペプチドまたは変異体を、異なる濃度（1：500、1：1000、1：2000）の対応するウサギ抗血清によってプロービングした。結合したウサギ抗体を125I-ロバ抗ウサギ抗体によって検出した。
【図５】）KLH共役ペプチドまたは共役もしくは非共役Phl p 7変異体に対するウサギ抗血清は、ハンノキの花粉からのPhl p 7交叉反応性カルシウム結合タンパク質Aln g 4と反応する。ニトロセルロースドットしたAln g 4を、ウサギ抗血清（抗-M4、抗M4-KLH、抗P1-KLH、抗P2-KLH）によってプロービングした。結合したウサギ抗体を125I-ロバ抗ウサギ抗体によって検出した。
【図６】（表1）。非アレルギー性Phl p 7由来合成ペプチド2個とアレルゲン性が低下したPhl p 7由来変異体3個の特徴。位置、配列、長さ、分子量、等電点、および襞を示す。変異したアミノ酸を太字で示す。
【図７】（表2）。完全なrPhl p 7、Phl p 7由来ペプチド、およびPhl p 7由来変異体（M4）に対する即時型皮膚反応。オオアワガエリ花粉アレルギー患者3人（#1〜3）および非アレルギー者1人（#4）を調べた。rPhl p 7の異なる二つの濃度、オオアワガエリ花粉抽出物、ヒスタミン、および二つのペプチドの異なる二つの濃度に関する膨疹の平均直径（mm）を示す。
【図８】（表3）。rPhl p 7に対する草花粉アレルギー患者の血清IgE結合に対するウサギ抗Phl p 7ペプチドおよびウサギ抗Phl p 7変異体抗血清の阻害。
【図９】Phl p 7およびAln g 4のアミノ酸配列のアラインメント。2-EFハンド花粉アレルゲンにおいて好ましくは置換または欠失しているアミノ酸残基を太字で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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