(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端側はケモカインＳＬＣを構成するアミノ酸配列からなり、かつＩＬ−２を構成するアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
【請求項２】
ケモカインＳＬＣおよびＩＬ−２がヒトまたはマウス由来である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ケモカインＳＬＣを構成するアミノ酸配列が配列番号：２の２４位のＳｅｒから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列であり、かつＩＬ−２を構成するアミノ酸配列が配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列である請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
配列番号：２の２４位のＳｅｒから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列を含む請求項１から３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
配列番号：２の２４位のＳｅｒから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号：２の１位のＭｅｔから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項５記載の融合タンパク質が、配列番号：６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項８】
請求項６記載の融合タンパク質が、配列番号：６の１位のＭｅｔから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項９】
請求項５記載の融合タンパク質が、配列番号：２６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項６記載の融合タンパク質が、配列番号：２６の１位のＭｅｔから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項３から１０のいずれかに記載された融合タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＣＣＲ７発現細胞Ｌ１．２−ＣＣＲ７に対する遊走活性およびＩＬ−２依存性細胞株の増殖活性を有する融合タンパク質。
【請求項１２】
ケモカインＳＬＣを構成するアミノ酸配列が配列番号：８の２４位のＳｅｒから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列であり、かつＩＬ−２を構成するアミノ酸配列が配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列である請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号：８の２４位のＳｅｒから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列を含む請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号：８の２４位のＳｅｒから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号：８の１位のＭｅｔから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１４記載の融合タンパク質が、配列番号：１２の２４位のＳｅｒから２８４位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１５記載の融合タンパク質が、配列番号：１２の１位のＭｅｔから２８４位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１２から１７のいずれかに記載された融合タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＣＣＲ７発現細胞Ｌ１．２−ＣＣＲ７に対する遊走活性およびＩＬ−２依存性細胞株の増殖活性を有する融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号：５に記載の７０位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む請求項１９記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号：５に記載の１位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む請求項２０記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
配列番号：２５に記載の７０位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む請求項１９記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
配列番号：２５に記載の１位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む請求項２２記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
配列番号：１１に記載の１位のａから８５２位のａまでの塩基配列を含む請求項１９記載のＤＮＡ。
【請求項２５】
配列番号：１１に記載の１位のａから８５２位のａまでの塩基配列を含む請求項２４記載のＤＮＡ。
【請求項２６】
請求項２０から２５のいずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒトＣＣＲ７発現細胞Ｌ１．２−ＣＣＲ７に対する遊走活性およびＩＬ−２依存性細胞株の増殖活性を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２７】
請求項１９から２６のいずれかに記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項２８】
請求項１９から２６のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項２９】
遺伝子治療用である請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項３１】
請求項３０に記載の形質転換体を培養する工程、および産生された請求項１から１８のいずれかに記載の融合タンパク質を培養培地から回収する工程を包含する、該融合タンパク質の製造方法。
【請求項３２】
請求項１から１８のいずれかに記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項３３】
癌治療薬を製造するための請求項３２記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ケモカインＳＬＣとＩＬ−２からなる融合タンパク質およびその製造方法、該融合タンパク質をコードする遺伝子、該融合タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子治療用発現ベクター及び該融合タンパク質を含む癌治療用医薬組成物に関する。
背景技術
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、主に活性化されたＴ細胞より産生されるサイトカインの一つである。その生理作用はＴ細胞の増殖・活性化、Ｂ細胞の増殖と抗体産生能の増強、ＮＫ細胞増殖と活性化、単球・マクロファージの活性化などである（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３１９−３３３，１９８４）。ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）は、１５３個のアミノ酸ならなる前駆体がまず作られ、Ｎ末端の２０個のシグナルペプチドがプロセッシングを受けて、１３３個のアミノ酸からなる成熟型のＩＬ−２となる。ｈＩＬ−２の直接的全身投与による抗腫瘍効果がいくつかの腫瘍で報告されている。また腫瘍細胞にｈＩＬ−２遺伝子を導入することによる腫瘍原性の低下は報告されているが、腫瘍免疫の誘導は弱いと考えられている（Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０，３５６９−３５４３，１９９３）。
ケモカインは内因性の白血球遊走・活性化作用を有するヘパリン結合性ポリペプチドの総称である。ケモカインは保存されている４つのシステイン残基のうちＮ末端の２つのシステイン残基が１つのアミノ酸で隔てられているか（ＣＸＣ）、隣り合っているか（ＣＣ）、例外的に１つのみであったり、三つのアミノ酸で隔てられているか（ＣＸ３Ｃ）によって、４つのサブファミリーに分類される。ＣＣ型ケモカインＳＬＣ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ−ｔｉｓｓｕｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ、別称  ６−Ｃ−ｋｉｎｅ、ＴＣＡ−４、Ｅｘｏｄｕｓ−２）はＣＣ型ケモカインの１つである。ヒトケモカインＳＬＣは、１３４個のアミノ酸からなる前駆体がまず作られ、Ｎ末端の２３個のシグナルペプチドがプロセッシングを受けて、１１１個のアミノ酸からなる成熟型のＳＬＣとなる。ケモカインＳＬＣに対する特異的受容体はＣＣＲ７であることが知られている（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：７１１８−７１２２，１９９８）。ケモカインＳＬＣは、ＣＣＲ７を発現するナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、Ｂ細胞に対する遊走活性を有している（Ｇｕｎｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：２５８−２６３，１９９８）。
発明の開示
ＩＬ−２はそのＮ末端に別のタンパク質を融合してもその生理活性を損なわない例が知られている。一方、ケモカインはそのＣ末端に別のタンパク質を融合させても其の活性が失われない事例が知られている。そこで、本発明者らは、停止コドンを含まないＣＣ型ケモカインＳＬＣのアミノ酸配列をコードする塩基配列とサイトカインＩＬ−２の成熟型蛋白をコードする塩基配列とを接続することにより、単一の遺伝子とし、ＣＣ型ケモカインＳＬＣとしての遊走活性およびサイトカインＩＬ−２としての生理活性を同一分子内に有する人工融合タンパク質をコードする人工融合遺伝子を構築し、この遺伝子に係る真核細胞発現ベクター、さらに該発現ベクター導入動物細胞株を樹立し、その培養上清中に人工融合タンパク質を生産することに成功した。
生産された融合タンパク質は、単一分子内にケモカインＳＬＣ、ＩＬ−２の両方の生理活性を示すすぐれた性質を有する融合タンパク質であることを確認し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ末端側にケモカインＳＬＣを構成するアミノ酸配列を有し、かつＩＬ−２を構成するアミノ酸配列を含む融合タンパク質；
（２）ケモカインＳＬＣおよびＩＬ−２がマウスまたはヒト由来である上記（１）に記載の融合タンパク質；
（３）ケモカインＳＬＣを構成するアミノ酸配列が配列番号：２の２４位のＳｅｒから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列であり、かつＩＬ−２を構成するアミノ酸配列が配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列である上記（１）または（２）に記載の融合タンパク質；
（４）配列番号：２の２４位のＳｅｒから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列を含む上記（１）から（３）のいずれかに記載の融合タンパク質；
（５）配列番号：２の２４位のＳｅｒから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる上記（４）に記載の融合タンパク質；
（６）配列番号：２の１位のＭｅｔから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる上記（４）に記載の融合タンパク質；
（７）上記（５）に記載の融合タンパク質が、配列番号：６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質；
（８）上記（６）に記載の融合タンパク質が、配列番号：６の１位のＭｅｔから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質；
（９）上記（５）記載の融合タンパク質が、配列番号：２６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質；
（１０）上記（６）記載の融合タンパク質が、配列番号：２６の１位のＭｅｔから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質；
（１１）上記（３）から（１０）のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有する融合タンパク質；
（１２）ケモカインＳＬＣを構成するアミノ酸配列が配列番号：８の２４位のＳｅｒから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列であり、かつＩＬ−２を構成するアミノ酸配列が配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列である上記（１）または（２）に記載の融合タンパク質；
（１３）配列番号：８の２４位のＳｅｒから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列を含む上記（１２）に記載の融合タンパク質；
（１４）配列番号：８の２４位のＳｅｒから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる上記（１３）記載の融合タンパク質；
（１５）配列番号：８の１位のＭｅｔから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列、リンカー及び配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる上記（１３）記載の融合タンパク質；
（１６）上記（１４）記載の融合タンパク質が、配列番号：１２の２４位のＳｅｒから２８４位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質；
（１７）上記（１５）記載の融合タンパク質が、配列番号：１２の１位のＭｅｔから２８４位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質；
（１８）上記（１２）から（１７）のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有する融合タンパク質；
（１９）上記（１）から（１８）のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ；
（２０）配列番号：５に記載の７０位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む上記（１９）記載のＤＮＡ；
（２１）配列番号：５に記載の１位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む上記（２０）記載のＤＮＡ；
（２２）配列番号：２５に記載の７０位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む上記（１９）記載のＤＮＡ；
（２３）配列番号：２５に記載の１位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含む上記（２２）記載のＤＮＡ；
（２４）配列番号：１１に記載の１位のａから８５２位のａまでの塩基配列を含む上記（１９）記載のＤＮＡ；
（２５）配列番号：１１に記載の１位のａから８５２位のａまでの塩基配列を含む上記（２４）記載のＤＮＡ；
（２６）上記（１９）から（２５）のいずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ；
（２７）上記（１９）から（２６）のいずれかに記載のＤＮＡを含むプラスミド；
（２８）上記（１９）から（２６）のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター；
（２９）遺伝子治療用である上記（２８）に記載の発現ベクター；
（３０）上記（２８）または（２９）に記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体；
（３１）上記（３０）に記載の形質転換体を培養する工程、および産生された上記（１）から（１８）のいずれかに記載の融合タンパク質を培養培地から回収する工程を包含する、該融合タンパク質の製造方法；
（３２）上記（１）から（１８）のいずれかに記載の融合タンパク質を含む医薬組成物；
（３３）上記（２９）記載のベクターを用いた癌の治療方法；
（３４）上記（３２）記載の医薬組成物を用いた癌の治療方法；および
（３５）癌治療薬を製造するための上記（３２）記載の医薬組成物の使用、
に関する。
本発明の融合タンパク質は、そのＮ末端側にケモカインＳＬＣを有し、かつＩＬ−２を含む融合タンパク質である。
「ケモカインＳＬＣ」の由来は特に限定されないが、好ましくはヒトまたはマウス由来のタンパク質である。成熟ヒトケモカインＳＬＣは、配列番号：２の２４位のＳｅｒから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。シグナル配列を含むヒトケモカインＳＬＣは、配列番号：２の１位のＭｅｔから１３４位のＰｒｏに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。成熟マウスケモカインＳＬＣは、配列番号：８の２４位のＳｅｒから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。シグナル配列を含むマウスケモカインＳＬＣは、配列番号：８の１位のＭｅｔから１３３位のＧｌｙに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。「ＩＬ−２」も、その由来は特に限定されないが、好ましくはヒトまたはマウス由来のタンパク質である。成熟ヒトＩＬ−２は、配列番号：４の２１位のＡｌａから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。シグナル配列を含むヒトＩＬ−２は、配列番号：４の１位のＭｅｔから１５３位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。成熟マウスＩＬ−２は、配列番号：１０の２１位のＡｌａから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。シグナル配列を含むマウスＩＬ−２は、配列番号：１０の１位のＭｅｔから１６９位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
本発明の融合タンパク質は、好ましくはＮ末端側にケモカインＳＬＣを有し、リンカー及びＩＬ−２を含む融合タンパク質であり、Ｎ末端側にシグナル配列を含んでいてもよい。本発明の融合タンパク質がヒト由来のケモカインＳＬＣとＩＬ−２を含む場合には、好ましくは、配列番号：６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質または配列番号：２６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。さらに好ましくは、配列番号：６の１位のＭｅｔから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質または配列番号：２６の１位のＭｅｔから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質がマウス由来のケモカインＳＬＣとＩＬ−２を含む場合には、配列番号：１２の２４位のＳｅｒから２８４位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。更に好ましくは、配列番号：１２の１位のＭｅｔから２８４位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。
「リンカー」とは、前後のタンパク質に対して立体障害を起さない１以上のアミノ酸残基であれば特に制限されないが、好ましくはアミノ酸数が２０以下のアミノ酸残基である。更に好ましくは、グリシン、セリンからなるアミノ酸残基である。
また、本発明の融合タンパク質には、「配列番号：６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有する融合タンパク質」、「配列番号：２６の２４位のＳｅｒから２６９位のＴｈｒに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有する融合タンパク質」、「配列番号：１２の２４位のＳｅｒから２８４位のＧｌｎに記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、かつケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有する融合タンパク質」も含まれる。「アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加」の程度及びそれらの位置等は、改変されたタンパク質が、配列番号：６、２６または１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同様にケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有するタンパク質であれば特に制限されない。なお、これらアミノ酸配列の変異等は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じる場合もあるが、本発明ＤＮＡに基づいて人為的に改変することもできる。本発明のタンパク質は、このような改変・変異の原因・手段を等を問わず、上記特性を有する全ての改変ＤＮＡによりコードされるタンパク質を含む。
本発明において「ケモカインＳＬＣ活性」とは、「ケモカインＳＬＣ特異的受容体であるＣＣＲ７（Ｍａｒｋ  Ｂｉｒｋｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：２２０９−２２２０，１９９３）を発現する細胞の遊走能」を意味する。「遊走能」とは、好中球、顆粒球、リンパ球あるいはマクロファージなどの炎症性細胞や免疫担当細胞の血管内皮細胞への吸着、血管外への移動、障害を受けた組織や抗原の存在する組織への集積を意味する。「ＩＬ−２活性」とは、「ＩＬ−２依存性細胞株の増殖能」を意味する。
本発明のＤＮＡとは、「本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ」を指す。本発明のＤＮＡとして、好ましくは、配列番号：６、２６または１２に記載のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡであり、更に好ましくは、配列番号：５に記載の７０位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号：２５に記載の７０位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含むＤＮＡが例示される。配列番号：５に記載の１位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号：２５に記載の１位のａから８０８位のｔまでの塩基配列を含むＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。更に、配列番号：１１に記載の１位のａから８５２位のａまでの塩基配列を含む上記のＤＮＡおよび配列番号：１１に記載の１位のａから８５２位のａまでの塩基配列を含む上記のＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつかつケモカインＳＬＣ活性およびＩＬ−２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。「ＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」は、コード領域のＤＮＡをプローブとして用いることにより得ることが出来る。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、例えば、６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表す。
本発明のＤＮＡを用いて、組換えタンパク質を生産するには、例えば、前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ等の多くの教科書や文献に基づいて実施することができる。具体的には、発現させたいＤＮＡの上流に翻訳開始コドンを付加し、下流には翻訳終止コドンを付加する。さらに、転写を制御するプロモーター配列（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター）等の制御遺伝子を付加し、適当なベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１など）に組み込むことにより、宿主細胞内で複製し、機能する発現プラスミドを作製する。本発明のＤＮＡを組み込んだプラスミドも本発明に含まれる。
本発明のＤＮＡのベクターとしては、本発明のＤＮＡを組み込んだレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターなども含まれる。本発明のベクターをヒトに投与することにより、本発明のＤＮＡがヒト体細胞に導入され、該体細胞は本発明の融合タンパク質を産生する。融合タンパク質は、ＩＬ−２の免疫活性化作用と共にケモカインＳＬＣのＴ細胞遊走活性を有するため、抗癌剤として有用である。従って、本発明のベクターは、これら疾患の治療を目的とした遺伝子治療に用いることができる。
本発明の形質転換体は、本発明のベクターを適当な宿主に導入することにより得ることができる。融合タンパク質の製造を目的として形質転換体を作製する場合には、宿主としては、大腸菌などの原核細胞、酵母のような単細胞真核細胞、昆虫、哺乳類などの多細胞生物の細胞などが挙げられる。遺伝子治療を目的として形質転換体を作製する場合には、宿主としては、ヒト体細胞を用いる。ヒト体細胞としては、患者由来の骨髄細胞、肝細胞、線維芽細胞、表皮細胞、筋肉細胞などが挙げられる。
本発明により調製された融合タンパク質は、治療目的のためにヒトに投与しえる。融合タンパク質を緩衝剤、安定剤、静菌剤ならびに医薬の非経口投与形態に使用される慣用的な賦形剤および添加剤に混合することにより、医薬組成物として調製することができる。従って、本発明は、本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物をも提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、おもに新規融合タンパク質に関する。
以下に本発明ＤＮＡの調製、本発明融合タンパク質の調製、活性の測定方法、遺伝子治療用ベクター、医薬組成物について説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現したタンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。
本発明融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
本発明において用いられるヒトＣＣ型ケモカインＳＬＣ及びヒトサイトカインＩＬ−２をコードする塩基配列を有する遺伝子は、本発明により教示された配列情報（配列番号：１及び配列番号：２）に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等参照）。具体的にはケモカインＳＬＣやＩＬ−２が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから本発明ＤＮＡに特有の適当なプローブや抗体を用いて所望のクローンを選択することにより実施できる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７８，６６１３（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２，７７８（１９８３）等参照）。ｃＤＮＡの起源としては、本発明のＤＮＡを発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示される。これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離・精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されており、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社より市販の各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーとしては、ヒトひ臓節由来のｃＤＮＡライブラリーが例示できる。
また、ＩＬ−２およびケモカインＳＬＣをコードする塩基配列を有する遺伝子は、慣用の化学的方法、例えばリン酸三エステル法（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８，９０−１０８（１９７９））またはリン酸二エステル法（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８，１０９−１５１（１９７９））により合成され得る。
上記のケモカインＳＬＣをコードする塩基配列とＩＬ２の成熟型タンパク質をコードする塩基配列を通常の方法により接続し、単一の遺伝子とする。これにより、ＣＣ型ケモカインＳＬＣの有するＣＣＲ７発現細胞株に対する遊走活性およびサイトカインＩＬ２の有するＴ細胞の増殖・活性化能等を同一分子内に有する人工融合タンパク質遺伝子を構築される。該遺伝子は、ＳＬＣをコードする遺伝子とＩＬ−２をコードする遺伝子との間にリンカーをコードする遺伝子を有していてもよい。
本発明融合タンパク質の調製
（１）融合タンパク質の発現
本発明のタンパク質は、本発明のＤＮＡ配列情報に従って、遺伝子工学的手法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，５９９０（１９８３）等）により得ることができる。より詳細には、所望のタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込む。このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作成する。該形質転換体を培養することにより組換えタンパク質を得ることができる。
ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｃｅｌｌ，２３，１７５（１９８１））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞等がよく利用される。
発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していても良い。該発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４（１９８１））等を例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を利用できる。該酵母の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，１（１９８３））等を利用できる。
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく利用される。これらを宿主とする場合、例えば該宿主菌中で複製が可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に所望の遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドンを付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。更に、大腸菌等で発現される場合、シグナル配列は認識されないので、Ｎ末端の配列に保持された成熟型配列を得る為の工夫が必要である。その例としては、開始コドンと該遺伝子の成熟型配列のコード領域との間にエンテロカイネースの認識配列Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ（配列番号：２１）を、成熟型配列の直前にＬｙｓが続くように挿入し、得られた組換えタンパク質をエンテロカイネース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて消化することによってＮ末端の配列の配列の保持された該融合タンパク質を得ることができる。上記宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株等が利用される。ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく利用されるが、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターも利用できる。プロモーターとしては、例えばｔｒｐプロモーター、Ｉｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーター等を使用できる。
所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のタンパク質が産生される。該培養に用いられる培地としては、宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞に適した条件下で実施できる。例えば、ｐＳＶＬ  ＳＶ４０後期プロモーターの下流に本発明融合タンパク質の遺伝子を含むベクターを、サル由来細胞ＣＯＳ−７に導入することによって形質転換体を作成し、この形質転換体を５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間培養することにより、本発明の融合タンパク質が産生され得る。
タンパク質は、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３（１９８７）等）により分離・精製できる。該方法としては、塩析法、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組み合わせ等を例示できる。
（２）変異体の作製
アミノ酸配列は、任意のアミノ酸配列を欠失させ、所望のアミノ酸、ないしはアミノ酸配列を導入することによって置換される。アミノ酸配列の置換処理には、プロテインエンジニアリングとして知られる方法が広く利用できるが、例えば、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｄｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ（部位指定削除）法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１６４５，１９８３）Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（部位特異的変異）法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１００，４６８，１９８３、Ｋｕｎｋｅｌ．Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７−３８２，１９８７）、ＰＣＲ突然変異生成法、制限酵素処理と合成遺伝子の利用による方法等がある。
部位特異的変異法であれば、例えばＭｏｌｅｃｕａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第１−３巻Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９年に記載の部位特異的変異誘発法やＰＣＲ法などの方法を用い、本発明のＤＮＡ配列に変異を導入する。
これら方法により変異が導入されたＤＮＡ配列は、適当なベクターおよび宿主系を用いて、例えばＭｏｌｅｃｕａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第１−３巻Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９年に記載の方法により、遺伝子工学的に発現させればよい。例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫｍ、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造社製）、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）といったキットが使用できる。
一般に、部位特異的変異法は、まず、タンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを得ることによって実施することができる。所望の突然変異した配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーを、一般的には合成によって、例えばクレア等（Ｃｒｅａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５７６５，１９７８）の方法によって製造する。次に、このプライマーを一本鎖の本ＤＮＡ配列含有ベクターとアニーリングし、大腸菌ポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素を作用させて、突然変異含有鎖の合成を完成する。このようにして、第一の鎖は元の非突然変異配列をコードしており、第二の鎖は所望の突然変異を有しているヘテロ二本鎖が形成される。次いで、この二本鎖ベクターを用いて、適当な細菌、または細胞を形質転換し、３２Ｐ−標識突然変異生成プライマーから成る放射性プローブへのハイブリダイゼーションを介してクローンを選択する（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，３６４７，１９８１）。選択されたクローンには、突然変異した配列を有する組換えベクターを含んでいる。このようなクローンを選択した後、突然変異した本タンパク質の領域を形質転換に使用される型の発現ベクターに入れることができる。
以降、（１）で示した組換えタンパク質の調整方法に従い、変異体を宿主細胞に産生させることができる。
ケモカインＳＬＣ活性の測定
ケモカインＳＬＣは、Ｔ細胞およびＢ細胞に対して遊走活性を有する。従って、これら細胞を遊走アッセイ用緩衝液に懸濁し、遺伝子産物の添加により生じる遊走細胞の数を測定することにより、ケモカインＳＬＣ活性を測定することができる。
具体的には、遺伝子産物を遊走アッセイ用緩衝液に添加する。細胞数測定後のＴ細胞またはＢ細胞、このましくは、ケモカインＳＬＣ受容体（ＣＣＲ７）を発現するＴ細胞またはＢ細胞を緩衝液に懸濁する。
トランスウェルチャンバーの上部のウェルに細胞を含んだ緩衝液を接種し、下部のウェルには、細胞を含まない遊走アッセイ用緩衝液を加え、３７℃  ５％ＣＯ２下で４時間培養する。
下部のウェルに遊走した細胞を回収し、細胞数を測定することにより遺伝子産物の遊走活性を測定することが可能である。
ＩＬ−２活性の測定
ＩＬ−２活性は通常、ＩＬ−２依存的に増殖するＴ細胞を用いるバイオアッセイでおこなわれる。ヒトＩＬ−２の生物活性を測定するシステムは確立している（基礎と臨床  佐々木緊らＶｏｌ．２２，Ｎｏ．１７，２９−４２  １９８８）。従って、該システムによって遺伝子産物のＩＬ−２生物活性の測定することができる。
本発明の遺伝子治療用ベクターの作成
本発明融合タンパク質を遺伝子治療に使用するためのベクターとしては、レトロウイルスベクター（ＭｕＭＬＶ骨格の物、ＨＩＶ骨格の物）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等が考えられる。遺伝子銃やインビボ・エレクトロポレーション法を用いれば本発明ＤＮＡを組み込んだプラスミドを用いて遺伝子治療を行うことも可能である。
動物細胞内で発現させるためのプロモーターとしては、通常の動物培養細胞発現系において用いられるプロモーターであれば特に制限されるものではないが、たとえばサイトメガロウイルス初期プロモーター（以下ＣＭＶプロモーターと記す。）、ＭｕＭＬＶ  ＬＴＲ等を上げることが出来る。なお、ＣＭＶプロモーターは、例えばｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）から、通常の遺伝子操作により調製することができる。
上記の動物細胞内で発現させるためのプロモーターおよび前記の人工融合タンパク質遺伝子を含むプラスミドは通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することが出来る。例えば、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子をＣＭＶプロモーターとウシ成長ホルモンのポリＡシグナル、ネオマイシン耐性遺伝子を保有するｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することにより構築する方法等をあげることができる。
本発明遺伝子治療用ベクターを用いた遺伝子治療は、ヒト体細胞に本発明ＤＮＡを獲得させ、この組換え細胞を患者に戻すことにより、あるいは本発明遺伝子治療用ベクターを直接患者の患部に投与することができる。
遺伝子治療用ベクターをヒト体細胞に導入する方法としては、ベクターがプラスミドの場合には、遺伝子銃、マイクロインジェクション、トランスフェクションまたはトランスダクションによりベクターを体細胞へ導入することができる。ベクターがウイルスの場合には、体細胞に本発明遺伝子を組み込んだウイルスを感染させることで本発明ＤＮＡを導入することができる。
体細胞としては、患者由来の骨髄細胞、肝細胞、線維芽細胞、表皮細胞、筋肉細胞などが挙げられる。
本発明の医薬組成物
本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−２の免疫活性化作用と共にケモカインＳＬＣのＴ細胞遊走活性を有するため、抗癌剤として有用である。
該タンパク質には、医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、周知の方法により調整される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩等が包含される。
該タンパク質の薬学的有効量を活性成分として、医薬製剤が調整される。該医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の個体投与形態や、液剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に、投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形もしくは調製することができる。
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤等の個体投与形態や、液剤、懸濁液剤、乳剤は経口投与される。注射剤は単独又はブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液と混合して静脈投与される。更に注射剤は、必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。
上記医薬製剤中に含有されるべき本発明化合物の有効成分量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件に応じて適宜選択される。一般的には、該投与量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり、約１〜１０ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回に分けて投与することができる。
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例１
マウスＳＬＣ−マウスＩＬ−２融合タンパク質遺伝子の構築
マウスＳＬＣ（ｍＳＬＣ）遺伝子（配列番号：７）の終止コドンを含まず３’末端にＸｂａＩ部位を有するようなマウスＳＬＣ遺伝子断片を得るために、プラスミドｐＴ７−Ｔ３−Ｄ−Ｐａｃ−ｍＳＬＣ（ＥＳＴ：クローン番号Ｗ６７０４６、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社より購入）を鋳型として、図１（１）に示したプライマー（ｍＳＬＣ−Ｓａｌ１−Ｆ（配列番号：１３）及びｍＳＬＣ−Ｘｂａ１−Ｒ（配列番号：１４））を用いて、約０．４ｋｂの断片をＰＣＲ法により増幅した。得られた断片を、ＳａｌＩ及びＸｂａＩで同時切断して、Ｂｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳａｌＩ、ＸｂａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＢＳ−ｍＳＬＣ（Ｓ／Ｘ）を構築した。サブクローン化したものの塩基配列を決定し、ＰＣＲ法による変異のないことを確認した。
マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の成熟型配列（配列番号：１０）をコードする遺伝子断片を得るために、ｍＩＬ−２のｃＤＮＡ（配列番号：９）を有しているプラスミドＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ−ＭｕＩＬ２を鋳型として、図１（２）に示したプライマー（ｍＩＬ２−Ｘｂａ１−Ｆ（配列番号：１５）及びｍＩＬ２−Ｎｏｔ１−Ｒ（配列番号１６））を用いて、約０．４５ｋｂの断片をＰＣＲ法により増幅した。得られた断片はＸｂａＩ及びＮｏｔＩで同時消化し、市販のベクターＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＸｂａＩ、ＮｏｔＩ部位にサブクローン化し、プラスミドｐＢＳ−ｍＩＬ２（Ｘ／Ｎ）を構築した。クローン化したものの塩基配列を決定し、ＰＣＲ法による変異のないことを確認した。
ｐＢＳ−ｍＳＬＣ（Ｓ／Ｘ）をＳａｌＩ及びＸｂａＩで同時切断して、得られる０．４ｋｂの断片を、ｐＢＳ−ｍＩＬ２（Ｘ／Ｎ）のＳａｌＩ、ＸｂａＩ部位に挿入し、結果としてマウスＳＬＣ−マウスＩＬ−２融合タンパク質遺伝子をＳａｌＩとＮｏｔＩサイトの間に持つ、プラスミドｐＢＳ−ｍＳＬＣ−ＩＬ２が得られた（図２）。人工融合タンパク質遺伝子（ｍＳＬＣ−ＩＬ−２）は、８５５塩基対からなり、その構造は５’末端からマウスＳＬＣをコードする３９９塩基、リンカーをコードする配列６塩基、マウスＩＬ−２のＮ末端２１番目からＣ末端までの１４９アミノ酸残基をコードする４４７塩基と終止コドンからなる（配列番号：１１）。
実施例２
レトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｍＳＬＣ−ＩＬ２（ｐＬＸＩＥ−ｍＳＬＣ−ＩＬ２）の構築
プラスミドｐＢＳ−ｍＳＬＣ−ＩＬ２を制限酵素ＳａｌＩ、ＮｏｔＩで同時消化して、マウスＳＬＣ−マウスＩＬ−２融合タンパク質遺伝子のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を得た。この断片を、レトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ部位に組み込むことにより目的とするマウスＳＬＣ−マウスＩＬ−２融合遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｍＳＬＣ−ＩＬ２を得た（図２）。
レトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、レトロウイルスベクターｐＬＨＤＣＸ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ６４７５４）のＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社）マルチクローニングサイトＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を連結し、その中のＮｏｔ１−ＢａｍＨ１部位に脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）の内部リボソーム認識部位ＩＲＥＳ断片（Ｎｏｖａｇｅｎ社）−増強型緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰ断片（クロンテック社）を組み込んだものである（図３）。
比較対照実験に使用するためにマウスＳＬＣ遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｍＳＬＣ、及び、マウスＩＬ−２遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｍＩＬ２をレトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのマルチクローニングサイトにマウスＳＬＣ遺伝子断片（ｐＴ７−Ｔ３−Ｄ−Ｐａｃ−ｍＳＬＣを鋳型にして、図１の（３）のプライマー（ｍＳＬＣ−ＥｃｏＲ１−Ｆ（配列番号：１７）及びｍＳＬＣ−Ｎｏｔ１−Ｒ（配列番号：１８））で増幅して得られた断片）、マウスＩＬ−２遺伝子断片（ｐＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ−ＭｕＩＬ２を鋳型にして、図１の（４）のプライマー（ｍＩＬ２−ＥｃｏＲ１−Ｆ（配列番号：１９）及びｍＩＬ２−Ｎｏｔ１−Ｒ（配列番号：２０））で増幅して得られた断片）をそれぞれ挿入することにより作製した。
実施例３
非増殖型レトロウイルスの産生及び遺伝子導入線維芽細胞の樹立
組換えレトロウイルスの産生系として、レトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡを一過性にトランスフェクションする事によりエコトロピックなウイルスが産生可能なパッケージングＢｏｓｃ２３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１５５４）を用いた。トランスフェクションの２４時間前に、Ｂｏｓｃ２３細胞を培養用シャーレ（直径３５ｍｍ）に１×１０６個を通常の培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）２ｍｌに懸濁して撒き、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ  ＴＭ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いて行い、試薬の指示書に従ってレトロウイルスベクタープラスミドｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｍＳＬＣ−ＩＬ２のＤＮＡ２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ  ６μｌと共にＢｏｓｃ２３細胞に導入した。
対照実験に使用するためにｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、ｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｍＳＬＣ、ｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｍＩＬ−２についても同様にトランスフェクションを行った。
４８時間後、培養上清を回収し、細胞片等を除去するために孔径０．４５μｍのフィルターにて、ろ過した液体を感染ウイルス含有液として以下の感染実験に使用した。ウイルス感染の２４時間前に感染させるＢａｌｂ／Ｃマウス由来の繊維芽組胞ＣＬ．７細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ８０）を培養用シャーレ（直径３５ｍｍ）に１×１０５個を通常の培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）２ｍｌに懸濁して撒き、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。感染時、培養シャーレより培養液を除去し、代わりに上記の感染ウイルス含有液７４２．５μｌにウイルス感染促進を目的としてポリブレン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を７．５μｌを混合したものを加えて３７℃、５％ＣＯ２下で約８時間感染を行った。その後、感染ウイルス含有液を取り除き新鮮な培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）を２ｍｌ加えて、さらに３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間培養した。
こうして得られた細胞集団ではレトロウイルスベクターＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの感染により感染細胞のみＥＧＦＰの発現による緑色蛍光（励起波長４８８ｎｍ，蛍光波長５０７ｎｍ）が見られるためＦＡＣＳにより感染細胞の識別、選択が可能である。この事を利用して実際に上記の感染させた細胞集団よりの感染細胞のみ濃縮を行うために、ＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ社）を用いてＧＦＰ陽性の細胞の濃縮を行った。各ウイルスに関して９０％以上のＧＦＰ陽性の細胞群（ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２、ＣＬ．７−Ｖｅｃｔｏｒ、ＣＬ．７−ｍＳＬＣ、ＣＬ．７−ｍＩＬ２）が得られた。
実施例４
融合タンパク質ｍＳＬＣ−ＩＬ２のＩＬ−２生物活性の測定
ＩＬ−２活性は通常、ＩＬ−２依存的に増殖するＴ細胞を用いるバイオアッセイでおこなわれる。ヒトＩＬ−２の生物活性を測定するシステムは確立しており（文献；基礎と臨床  佐々木緊らＶｏｌ．２２  Ｎｏ．１７Ｄｅｃ．１９８８）、それに従って上記の遺伝子導入培養細胞ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ−２が培地中に産生する人工融合タンパク質ｍＳＬＣ−ＩＬ−２（配列番号：１２）のＩＬ２生物活性の測定した。
比較のため、ＣＬ．７−ｍＩＬ−２の培養上清についても測定を行った。各培養上清については、ｍＩＬ−２ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）によりＩＬ−２濃度を測定し、それを基に測定に適当な濃度（約２〜３ｎｇ／ｍｌ）になるように力価測定培地１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０１にてあらかじめ希釈した。
９６穴平底マイクロプレート（住友ベークライト製）の２列め以降の穴に、力価測定培地１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０１を５０μｌを分注した。第１列目の穴には、最大ＯＤ値対照（ＯＤｍａｘ）としてヒトＩＬ−２  ２００ＪＲＵ／ｍｌを加えた力価測定培地、５０μｌを分注した。第２列目にはＩＬ−２を加えず、最小ＯＤ値対照（ＯＤｍｉｎ）とした。標準品、測定試料とも各希釈率デュプリケイトとなるように３列目と４列目の一番上の穴には標準としてｒＨｕＩＬ−２（シオノギ製薬製。商品名：イムネース）を力価測定培地に５０ＪＲＵ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔｓ）／ｍｌに溶解したものを５０μｌ、５列目以降は２列ずつの一番上の穴にあらかじめ希釈済みの各培養上清を５０μｌをそれぞれ加えた。次にマルチチャネルピペットを用いて３列目以降の一番上のウェルからピペッティングを繰り返しよく混和した後、５０μｌずつすぐしたのウェルに移し、２倍段階希釈を一番下のウェルまで８段階行った。
増殖培地中で培養したＮＫ−７細胞液を遠心し、上澄みを除去した。力価測定培地に２０，０００ｃｅｌｌｓ／５０μｌに再懸濁し、この細胞浮遊液５０μｌずつをマイクロプレートの全穴に接種した。３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養後、ＭＴＴ試薬（ＰＢＳ（−）（日水製薬）に、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｉｌ−２Ｈｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ社）、０．３％を溶解しミリポアフィルター（０．４５μｍ）でろ過滅菌したもの）２５μｌを全穴に分注し、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間培養した。マイクロプレート内の培養液を、マルチチャネルピペットを用いて空のマイクロプレートに移しかえた。
培養液の抜き取られた全穴に、溶出液（０．０４Ｎ塩酸−イソプロパノール液）１００μｌを加えマイクロミキサー（三光純薬）で５分間振とうし、産生されたＭＴＴフォルマザンを充分に溶出させた。次に移しかえた各穴の培養液を、マルチチャネルピペットで元の各穴に戻した後、マイクロプレート用分光光度計マルチスキャンＭＣ（Ｆｌｏｗ社）を使用し、吸光度（ＯＤ５６０ｎｍ）を測定した。光度計に接続したパーソナルコンピューターに測定値を入力し、力価計算を行った。各試料の希釈シリーズは２列からなっているので各々の平均値を求め、横軸にサンプルの希釈倍率、縦軸にＯＤ値をとったグラフ上にプロットし、濃度依存曲線を描く。各々の試料について、プレート内の最大ＯＤ値対照（ＯＤｍａｘ）、最小ＯＤ値対照（ＯＤｍｉｎ）の吸光度の中間値と一致する希釈倍率をグラフより読み取った。次に標準品の測定係数（表示力値／実測力値）を算出し、この係数を各試料の実行力価に乗じ、各試料の換算力値を決定した。今回測定したＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２の培養上清のＩＬ−２力価は２４２ＪＲＵ／ｍｌであった。ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２の培養上清のＥＬＩＳＡによるＩＬ−２濃度は１０ｎｇ／ｍｌであったので、１ｎｇあたりのＩＬ−２力価は２４．２ＪＲＵである。同様にして測定したＣＬ．７−ｍＩＬ２の培養上清については１ｎｇあたりのＩＬ−２力価は１８．４ＪＲＵであったので、マウスＳＬＣ−マウスＩＬ−２融合タンパク質（ｍＳＬＣ−ＩＬ−２）はマウスＩＬ−２タンパク質と同等以上のＩＬ−２力価を有することが判明した。
実施例５
融合タンパク質のケモカインＳＬＣとしての遊走活性の確認
実施例３によって得られた各種遺伝子導入細胞を３×１０５個を３ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）に懸濁して、直径３５ｍｍ培養シャーレに接種し、３７℃、５％ＣＯ２下にて４８時間培養した。得られた各種遺伝子産物を含む培養上清を回収し、ミリポアフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。これを遊走アッセイ用緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１％ＢＳＡ含有）にて、体積比で２倍（培養上清５０％含有）、１０倍（培養上清１０％含有）に希釈し、以下の遊走アッセイに使用した。ケモカインＳＬＣとしての活性を測定するためにマウスＳＬＣの特異的受容体であるマウスＣＣＲ７を安定発現する前駆Ｂ細胞株  Ｂ３００−１９細胞（Ｂ３００−１９−ｍＣＣＲ７）を用いた。これは発現プラスミドｐＣＡＧＧＳｎｅｏにマウスＣＣＲ７遺伝子を挿入したマウスＣＣＲ７発現プラスミドｐＣＡＧＧＳｎｅｏ−ｍＣＣＲ７を前駆Ｂ細胞株Ｂ３００−１９細胞にエレクトロポレーション法により導入し、薬剤Ｇ４１８にて薬剤選択することにより得られたマウスＣＣＲ７発現細胞である。
Ｂ３００−１９−ｍＣＣＲ７を血球計算盤にて細胞数測定後、遠心により細胞を回収し、１×１０７Ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように遊走アッセイ用緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ含有）で再懸濁し、１００μｌずつ、トランスウェルチャンバー（３μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、Ｃｏａｓｔｅｒ社製）の上部のウェルに接種した。下部のウェルには、６００μｌの希釈後の培養上清あるいは対照としての遊走アッセイ用緩衝液を加え、３７℃  ５％ＣＯ２下で４時間培養した。上部のウェルを取り外し、下部のウェルに遊走した細胞を回収し、ＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｔｏｎ社）を用いて細胞数を測定した。その結果を図４に示す。
ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２の培養上清では２倍希釈液で、接種細胞の１６％、１０倍希釈液で３．５％の遊走細胞が見られた。ＣＬ．７−ｍＳＬＣの培養上清では、２倍希釈液で接種細胞の８％の遊走細胞が見られた。ＣＬ．７−ｍＩＬ２、ＣＬ．７−Ｖｅｃｔｏｒの培養上清ではどちらの希釈倍率でも、遊走細胞数は測定限界（０．１６６％）以下であった。マウスＳＬＣ−マウスＩＬ−２融合タンパク質（ｍＳＬＣ−ＩＬ−２）はマウスＣＣＲ７発現細胞Ｂ３００−１９−ｍＣＣＲ７に対する遊走活性を有していることが判明した。
実施例６
融合タンパク質のイムノブロットによる分子量の同定
実施例３によって得られたｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２、対照としてＣＬ．７−Ｖｅｃｔｏｒをそれぞれについて５×１０５個を２ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）に懸濁して、直径３５ｍｍ培養シャーレに接種し、３７℃、５％ＣＯ２下にて２４時間培養後培地を除き、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）３ｍｌに置き換えてさらに３７℃、５％ＣＯ２下にて２４時間培養した。
得られた各種遺伝子産物を含む培養上清を回収し、ミリポアフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。培地内蛋白を濃縮するために以下のようにＴＣＡ沈殿を行った。１ｍｌの培養上清を１００μｌの１００％ＴＣＡを加えて混合し、氷上に１時間静置し、１２Ｋｒｐｍで５分間遠心した。沈殿したペレットを氷冷アセトンにて、洗浄し、２５μｌの３×ＳＤＳサンプルバッファーに溶解し、２．５μｌの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌと２．５μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を加えて１００℃の熱を５分間加えて変性させた。各々１０μｌのライセートを１５％−２５％グラジエントＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行った。その際、隣接するレーンにＰｒｅｓｔａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｋｅｒ、Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｉｎｃ．）を泳動した。
泳動後のゲル上のタンパク質はニトロセルロース膜（ｉｍｏｂｉｌｏｎＰ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社）に移した。トランスファー後のニトロセルロース膜は５％（重量／容積）スキムミルク容液（Ｄｉｆｃｏ社製スキムミルクをＴ−ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳ溶液）にて溶解したもの）に３０分間、室温にて浸す事により非特異的な蛋白吸着を阻害した。ニトロセルロース膜は、やぎ抗マウスＩＬ−２抗体（Ｔ−ＰＢＳにて１０００倍に希釈して使用。）に約２時間反応させた。その後、Ｔ−ＰＢＳにて３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗やぎＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製、２０００倍に希釈して使用）で約３０分間反応し、その後Ｔ−ＰＢＳにて３回洗浄したのちに、ＥＣＬ試薬（アマシャム社）にて、ペルオキシダーゼ標識を発光させ、それをＸ線フィルムで感光させた。その結果、対照であるＣＬ．７−Ｖｅｃｔｏｒのレーンにはバンドは見られないがＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２のレーンには、約３２ｋＤの位置にのみ特異的なバンドが見られた。これは一次構造から予測される分子量とほぼ一致することが判明した。
実施例７
Ｔ細胞の組織免疫染色による同定
融合タンパク質ＳＬＣ−ＩＬ２が実際に生体内でＴ細胞を遊走させる能力を有するのかを調べるために、実施例３で得られたｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２をその親株である線維芽細胞ＣＬ．７の由来であるマウスＢａｌｂ／Ｃストレインに皮内投与し、そこにＴ細胞が浸潤してくるかを調べた。実施例３で得られたｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞（ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２）、対照としてＶｅｃｔｏｒ、ｍＳＬＣ、ｍＩＬ２遺伝子導入細胞それぞれについて１ｍｌあたり１×１０８細胞数となるようにＨＡＮＫＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社製）に懸濁した。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの雌、７週齢（日本チャールス・リバー社より購入）の背中に上記の細胞懸濁液５０μｌ（細胞数５×１０６）を皮内接種した（各細胞群で２匹ずつ）。５日後には移植部位は５ｍｍぐらいの膨らみとなっているので、それをマウスを安楽死させたあとに摘出し、ＯＴＣ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）に浸してドライアイス上にて凍結させた。
これを、クライオスタットを用いて８μｍの厚さの切片を作製し、スライドガラス上に乗せ風乾させた。その後、マイナス２０℃に冷やしておいた固定液（４０％アセトン、６０％メタノール、容積比）に１５分間浸して固定し、ＰＢＳ（−）溶液にて２回洗浄後、ブロッキング液（２０％正常ウサギ血清、８０％ＰＢＳ（−）溶液、容積比）に３０分間反応させ非特異的吸着を阻止した。それから、ＰＢＳ（−）溶液にて２回洗浄後、ラット抗マウスＣＤ４単クローン抗体（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）及びラット抗マウスＣＤ８単クローン抗体（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）にて約６０分間、室温にて反応させた。反応後、ＰＢＳ（−）溶液にて３回洗浄後、ウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ社製）に３０分間、室温で反応させた。ＰＢＳ（−）溶液にて２回洗浄後、１％過酸化水素液（３０％過酸化水素水を容積比１に対してメタノールを容積比２９の割合で混合したもの）に３０分間反応させた。ＰＢＳ（−）溶液にて３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識をＥｌｉｔｅＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、ＤＡＢ基質キットを使用して発色させた。メチレンブルーにて対比染色もおこなった。染色した切片は日本光学社光学顕微鏡ＯＰＴＩＰＨＯＴで得られた拡大画像をフジフィルム社デジタルカメラＨＣ−２０００でパーソナルコンピューターに取り込んで、各サンプルについて任意の３視野について染色陽性の細胞数の同定し、各群２匹ずつなので計６視野の平均値（±標準偏差）を図５及び図６に表した。
Ｖｅｃｔｏｒ遺伝子導入細胞移植群はＣＤ４、ＣＤ８に関しても浸潤細胞は僅かに見られた。ｍＳＬＣ、ｍＩＬ２遺伝子導入細胞移植群共にＣＤ４、ＣＤ８陽性細胞の明らかな増加が見られた。さらにｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞移植群ではｍＳＬＣ、ｍＩＬ２遺伝子導入細胞移植群と比較してもよりさらに多くの浸潤細胞が見られた。
実施例８
生体内投与のモデル実験
融合タンパク質ＳＬＣ−ＩＬ２が実際に生体内で腫瘍形成を抑制する能力を有するのかを調べるために、実施例３で得られたｍＳＬＣ−ＩＬ−２遺伝子導入細胞ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２をその親株である線維芽細胞ＣＬ．７の由来動物であるマウスＢａｌｂ／Ｃストレインに、マウスＢａｌｂ／Ｃ由来の大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６と混合した後に皮内投与し、腫瘍形成の程度をしてくるかをＶｅｃｔｏｒ、ｍＩＬ２遺伝子導入細胞を対照群として調べた。
２度の実験を行い実験１ではＶｅｃｔｏｒ、ｍＳＬＣ遺伝子導入細胞間で比較を、実験２ではＶｅｃｔｏｒ、ｍＩＬ２、ｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞間で比較を行った。どちらの実験も同じプロトコールで行った。実施例３で得られたそれぞれの遺伝子導入線維芽細胞が１×１０７細胞数と、Ｃｏｌｏｎ２６が５×１０６細胞数が１ｍｌに混合した細胞液となるようにＨＡＮＫＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社製）に懸濁した。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの雌、７週齢（日本チャールス・リバー社より購入）の背中に上記の細胞懸濁液１００μｌ（細胞数は遺伝子導入線維芽細胞５×１０５個、Ｃｏｌｏｎ２６は１×１０６個）を皮内接種した（実験１では各細胞群で５匹ずつ、実験２では各群マウス８匹）。その後、通常の環境下で飼育を続けた。腫瘍の測定は、腫瘍の長径と、その直角方向の長さ（短径）をノギスにて測定し、その値より近似値（長径×短径×短径÷２）を腫瘍体積とした。図７及び図８は各実験での各群の平均腫瘍体積（±標準偏差）をグラフに表したものである。
実験１では腫瘍接種後２８日目の結果であるが、ｍＳＬＣ群ではＶｅｃｔｏｒ群と比べて平均腫瘍体積は１０５％であり、腫瘍形成を抑制する効果が見られなかった。実験２では腫瘍接種後２３日目の結果であるが、ｍＩＬ２群ではベクター群と比べて平均腫瘍体積は７７％であり、ある程度腫瘍の体積増加を遅らせることが分かる。ｍＳＬＣ−ＩＬ２群ではさらに腫瘍体積は小さくなっていて、ベクター群と比べて平均腫瘍体積は４５％であり、ｍＩＬ２群と比べても平均腫瘍体積は５９％であった。
これらの結果から、この腫瘍形成モデルでは対照群であるＶｅｃｔｏｒ遺伝子導入細胞と同様にｍＳＬＣ遺伝子導入細胞は腫瘍抑制効果が見られないこと、ｍＩＬ２、ｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞ともに腫瘍抑制効果は見られるがその程度はｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞の方が有意に強いことが分かった。
実施例９
ヒトＳＬＣ−ヒトＩＬ−２融合蛋白質遺伝子の構築
ヒトＳＬＣ（ｈＳＬＣ）遺伝子（配列番号：１）の終止コドンを含まず３’末端にＸｂａＩ部位を有するようなヒトＳＬＣ遺伝子断片はアルカリフォスファターゼ融合タンパク発現用ベクターｐＤＲＥＦ−ＳＬＣ−ＡＰ（Ｎａｇｉｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３１，１９５１８−１９５２４，１９９７）をＳａｌＩ及びＸｂａＩで同時切断して切り出される約０．４ｋｂの断片を利用した。
ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の成熟型配列（配列番号：４）をコードする遺伝子断片を得るために、ヒトＩＬ２のｃＤＮＡ（配列番号：３）を有しているプラスミドｐＩＬ２−５０Ａを鋳型として、プライマー（５’−ｈＩＬ２−ＳｐｅＩ（配列番号：２２）及び３’−ｈＩＬ２−ＮｏｔＩ（配列番号：２３））を用いて、約０．４ｋｂの断片をＰＣＲ法により増幅した。得られた断片はＳｐｅＩ及びＮｏｔＩで同時消化し、市販のベクターＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ部位にサブクローン化し、プラスミドｐＢＳ−ｈＩＬ−２（ＳｐｅＩ／Ｎ）を構築した。クローン化したものの塩基配列を決定し、ＰＣＲ法により変異のないことを確認した。
制限酵素ＳｐｅＩとＸｂａＩは切断後の付着端の配列が同じであり、結合可能である。ｐＤＲＥＦ−ＳＬＣ−ＡＰをＳａｌＩ及びＸｂａＩで同時切断して得られる０．４ｋｂの断片をｐＢＳ−ｈＩＬ−２（ＳｐｅＩ／Ｎ）のＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ部位に挿入し、結果としてヒトＳＬＣ−ヒトＩＬ−２融合蛋白質遺伝子をＳａｌＩとＮｏｔＩサイトの間に持つ、プラスミドｐＢＳ−ｈＳＬＣ−ＩＬ２が得られた（図９）。人工融合蛋白質遺伝子（ｈＳＬＣ−ＩＬ−２）は、８１０塩基対からなり、その構造は５’末端からヒトＳＬＣ遺伝子をコードする４０２塩基、リンカーをコードする配列６塩基、ヒトＩＬ−２のＮ末端２１番目からＣ末端までの１３３アミノ酸残基をコードする３９９塩基と終止コドンからなる（配列番号：２５）。
実施例１０
レトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｈＳＬＣ−ＩＬ２（ｐＬＸＩＥ−ｈＳＬＣ−ＩＬ２）の構築
プラスミドｐＢＳ−ｈＳＬＣ−ＩＬ２を制限酵素ＳａｌＩ、ＮｏｔＩで同時消化して、ヒトＳＬＣ−ヒトＩＬ−２融合蛋白質遺伝子のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を得た。この断片を、レトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ部位に組み込むことにより目的とするヒトＳＬＣ−ヒトＩＬ−２融合遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｈＳＬＣ−ＩＬ２を得た（図９）。
比較対照実験に使用するためにヒトＩＬ２遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｈＩＬ−２をレトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのマルチクローニングサイトにヒトＩＬ−２遺伝子断片（ｐＩＬ２−５０Ａを鋳型にして、図１の（３）のプライマー（５’−ｈＩＬ２−ＳａｌＩ（配列番号：２４）及び３’−ｈＩＬ２−ＮｏｔＩ（配列番号：２３））でＰＣＲ法で増幅して得られた断片）を挿入することにより作製した。
実施例１１
非増殖型レトロウイルスの産生及び遺伝子導入線維芽細胞の樹立
プラスミドｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｈＩＬ−２及びｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｈＳＬＣ−ＩＬ２を用いて、実施例３と同様の方法によってレトロウイルスを産生し、ＣＬ．７への遺伝子導入を行いｈＩＬ−２遺伝子導入細胞（ＣＬ．７−ｈＩＬ２）及びｈＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞（ＣＬ．７−ｈＳＬＣ−ＩＬ２）を得た。得られたｈＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入培養細胞（ＣＬ．７−ｈＳＬＣ−ＩＬ２）及びｈＩＬ２遺伝子導入培養細胞（ＣＬ．７−ｈＩＬ２）をそれぞれ３×１０５個を３ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）に懸濁して、直径３５ｍｍ培養シャーレに接種し、３７℃、５％ＣＯ２下にて４８時間培養した。得られた各種遺伝子産物を含む培養上清を回収し、ミリポアフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。この培養上清中のＩＬ２含量をヒトＩＬ２  ＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  ＩＬ２  ＡＮ｀ＡＬＹＺＡ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ．Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＴＥＣＨＮＥ社）を用いて測定したところＣＬ．７−ｈＳＬＣ−ＩＬ２の培養上清のＩＬ２濃度は２５ｎｇ／ｍｌで、ＣＬ．７−ｈＩＬ２の培養上清のＩＬ２濃度は５０ｎｇ／ｍｌであり、それぞれ導入遺伝子産物の発現が確認された。これらのサンプルを実施例１２、１３の生物活性測定実験使用した。
実施例１２
融合蛋白質ｈＳＬＣ−ＩＬ−２のＩＬ−２生物活性の測定
実施例１１によって得られた各種遺伝子導入細胞（ＣＬ．７−ｈＳＬＣ−ＩＬ２、ＣＬ．７−ｈＩＬ２）の培養上清を、実施例４と同様の方法を用いてＩＬ−２の生物活性を測定した。
ＣＬ．７−ｈＳＬＣ−ＩＬ２の培養上清のＩＬ２力価は３７８ＪＲＵ／ｍｌで、ＣＬ．７−ｈＩＬ２の培養上清のＩＬ２力価は９０１ＪＲＵ／ｍｌであった。１ｎｇのＩＬ２あたりのＩＬ２力価はｈＳＬＣ−ＩＬ２で１５．１ＪＲＵであり、ｈＩＬ２で１８ＪＲＵであったので、ヒトＳＬＣ−ヒトＩＬ−２融合蛋白質はヒトＩＬ−２蛋白質と遜色ないＩＬ２力価を有することが判明した。
実施例１３
融合蛋白質のケモカインＳＬＣとしての遊走活性の確認
実施例１１によって得られた各種遺伝子導入細胞（ＣＬ．７−ｈＳＬＣ−ＩＬ２、ＣＬ．７−ｈＩＬ２）および対照として実施例３に記載のベクター導入細胞（ＣＬ．７−Ｖｅｃｔｏｒ）の培養上清をそのまま、あるいは遊走アッセイ用緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１％ＢＳＡ含有）にて、体積比で２倍（培養上清５０％含有）、１０倍（培養上清１０％含有）に希釈し、以下の遊走アッセイに使用した。ケモカインＳＬＣとしての活性を測定するためにヒトＳＬＣの特異的受容体であるヒトＣＣＲ７を安定発現する前駆Ｂ細胞株Ｌ１．２細胞（Ｌ１．２−ＣＣＲ７）を用いた。これは発現プラスミドｐＣＡＧＧＳｎｅｏにヒトＣＣＲ７遺伝子を挿入したヒトＣＣＲ７発現プラスミドｐＣＡＧＧＳｎｅｏ−ＣＣＲ７を前駆Ｂ細胞株Ｌ１．２細胞にエレクトロポレーション法により導入し、薬剤Ｇ４１８にて薬剤選択することにより得られたヒトＣＣＲ７発現細胞である。（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：７１１８−７１２２，１９９８）
Ｌ１．２−ＣＣＲ７を血球計算盤にて細胞数測定後、遠心により細胞を回収し、１×１０７Ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように遊走アッセイ用緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ含有）で再懸濁し、１００μｌずつ、トランスウェルチャンバー（３μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、Ｃｏａｓｔｅｒ社製）の上部のウェルに接種した。下部のウェルには、６００μｌの希釈後の培養上清あるいは対照としての遊走アッセイ用緩衝液を加え、３７℃  ５％ＣＯ２下で４時間培養した。上部のウェルを取り外し、下部のウェルに遊走した細胞を回収し、Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて細胞数を測定した。
ＣＬ．７−ｈＳＬＣ−ＩＬ２の培養上清では原液で接種細胞の１６．６％、２倍希釈液で９％、１０倍希釈液で１．１％の遊走細胞が見られた。一方ＣＬ．７−ｈＩＬ２、ＣＬ．７−Ｖｅｃｔｏｒの培養上清ではどの希釈倍率でも、遊走細胞数は０．３％以下であった。この結果よりヒトＳＬＣ−ヒトＩＬ−２融合蛋白質はヒトＣＣＲ７発現細胞Ｌ１．２−ＣＣＲ７に対する遊走活性すなわちケモカインＳＬＣとしての生物活性を保持していることが判明した。
実施例１４
生体内投与のモデル実験（併用との比較）
ｍＳＬＣ、ｍＩＬ２遺伝子導入細胞を同時に投与する場合と、ｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞を単独で投与する場合とでの抗腫瘍効果を比較するために以下の実験を行った。
実施例８と同様に各遺伝子を導入した繊維芽細胞ＣＬ．７細胞（マウスＢａｌｂ／Ｃストレイン由来）と大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６（マウスＢａｌｂ／Ｃ由来）とを混合した後に皮内投与し、腫瘍形成の程度を比較することにより抗腫瘍効果を調べた。
実験群としては、下記５種類の細胞群を用いた。
▲１▼Ｖｅｃｔｏｒ導入細胞（ＣＬ．７−Ｖｅｃｔｏｒ）５×１０５個
▲２▼ｍＳＬＣ導入細胞（ＣＬ．７−ｍＳＬＣ）５×１０５個
▲３▼ｍＩＬ２導入細胞（ＣＬ．７−ｍＩＬ２）５×１０５個
▲４▼ｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞（ＣＬ．７−ｍＳＬＣ−ＩＬ２）５×１０５個
▲５▼ｍＳＬＣ導入細胞（ＣＬ．７−ｍＳＬＣ）５×１０５個とｍＩＬ２導入細胞（ＣＬ．７−ｍＩＬ２）５×１０５個
▲１▼から▲５▼の遺伝子導入ＣＬ．７とＣｏｌｏｎ２６細胞１×１０５個とそれぞれを混合してマウスの背中皮内に移植して比較を行った。
具体的には、それぞれの遺伝子導入線維芽細胞が５×１０６個（▲５▼の場合は計１×１０７個）と、Ｃｏｌｏｎ２６が１×１０６個が１ｍｌに混合した細胞液となるようにＨＡＮＫＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社製）に懸濁した。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの雌、７週齢（日本チャールス・リバー社より購入）の背中に上記の細胞懸濁液１００μｌ（細胞数は遺伝子導入線維芽細胞５×１０５個（▲５▼の場合は計１×１０６個）、Ｃｏｌｏｎ２６は１×１０５個）を皮内接種した（各群マウス８匹）。その後、通常の環境下で飼育を続けた。腫瘍の測定は、腫瘍の長径と、その直角方向の長さ（短径）をノギスにて測定し、その値より近似値（長径×短径×短径÷２）を腫瘍体積とした。図１０は移植後２４日目の各群の平均腫瘍体積（±標準偏差）をグラフに表したものである。
ｍＳＬＣ群ではＶｅｃｔｏｒ群と比べて平均腫瘍体積は１０２％であり、腫瘍形成を抑制する効果が見られなかった。ｍＩＬ２群ではＶｅｃｔｏｒ群と比べて平均腫瘍体積は６０％であり、ある程度腫瘍の体積増加を遅らせることが分かる。ｍＳＬＣ−ＩＬ２群ではさらに腫瘍体積は小さくなっていて、ｍＩＬ２群と比べても平均腫瘍体積は２６％であり、ｍＩＬ２群よりも有意に強い抗腫瘍効果が見られた。一方ｍＳＬＣ、ｍＩＬ２遺伝子導入細胞を同時に投与した場合、ｍＩＬ２群よりも高い抗腫瘍効果が得られたが、ｍＳＬＣ−ＩＬ２群と比較すると抗腫瘍効果は低く、ばらつきも大きく、ｍＳＬＣ、ｍＩＬ２遺伝子導入細胞を同時に投与するより、ｍＳＬＣ−ＩＬ２遺伝子導入細胞を単独で投与する方がより高い抗腫瘍効果が得られることが分かった。
産業上の利用可能性
本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−２としての免疫活性化作用に加えて、ケモカインＳＬＣとしてのＴ細胞走化作用を具備することにより、ＩＬ−２を免疫賦活を必要とする治療で投与された際に投与部位により多くのＴ細胞を呼び寄せることにより、より多くのＴ細胞に作用が可能であり、その結果、より高い治療効果が得られる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、マウスＳＬＣ（ｍＳＬＣ）またはマウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）断片増幅用プライマーセットを示す図である。
図２は、ｍＳＬＣ−ｍＩＬ−２融合遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの作製方法を示した図である。
図３は、レトロウイルスベクターｐＬＨＤＣＸからレトロウイルスベクターｐＬＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの作製方法を示した図である。
図４は、遊走細胞数を示した図である。
図５は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増加数を示した図である。
図６は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増加数を示した図である。
図７は、ｍＳＬＣによる腫瘍形成抑制効果を示した図である。
図８は、ｍＩＬ２及びｍＳＬＣ−ＩＬ２による腫瘍形成抑制効果を示した図である。
図９は、ヒトＳＬＣ（ｈＳＬＣ）−ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）融合遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの作製方法を示した図である。
図１０は、ｍＳＬＣ、ｍＩＬ−２及びｍＳＬＣ−ｍＩＬ−２の単独、またはｍＳＬＣとｍＩＬ−２の併用による腫瘍形成抑制効果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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