(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の機能的に重要な部位と修飾因子間の分子間相互作用のアロステリックな変調因子である小分子化合物を同定する方法であって：
ａ）前記標的タンパク質の機能的に重要な部位から１５ないし２０オングストロームの範囲内ににある標的タンパク質上のアロステリックな腔を同定し；
ｂ） 前記腔の寸法（dimension）を計算し、前記腔の化学的および／または静電的性質をマッピングし；
ｃ） 工程ｂ）において得られた計算された寸法、化学的および／または静電的性質を利用して前記腔によって収容されうる少なくとも一つの官能基を含む小分子化合物を同定し；
ｄ） インビトロでのアッセイで前記化合物を試験して、前記標的タンパク質と前記修飾因子の間の機能的に重要な部位における分子間相互作用を変調する小分子化合物を検出し；
それにより、前記標的タンパク質と前記修飾因子の間の機能的に重要な部位における分子間相互作用のアロステリック変調因子である小分子化合物を同定する
段階を含む方法。
【請求項２】
標的タンパク質が、膜結合タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、酵素、サイトカイン、リンホカイン、ケモキン、粘着性分子、成長因子、またはそれらのレセプターからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的タンパク質がレセプターである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
レセプターがＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバーが、ＴＮＦレセプター、ｆａｓ、ＣＤ４０、ｇｐ１２０、ｆａｓリガンド、ＴＮＦα、β−ラクタマーゼ、ｃ−ｅｒＢ２、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン、インスリンレセプター、インスリン、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−１、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−２、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、および表皮成長因子からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーがＴＮＦレセプターである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
標的タンパク質がイムノグロブリンスーパーファミリーのメンバーである、請求項２記載の方法。
【請求項８】
標的タンパク質がＣＤ４である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
標的タンパク質が酵素である、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
標的タンパク質がβ−ラクタマーゼである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的タンパク質の構造内の腔を同定することが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、結晶学分析、熱力学研究の比色値、またはコンピューターモデリングを用いることを含む、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府権利の承認
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈからのＧｒａｎｔ  １Ｒ２１ＲＲ１３３６０−０１のもとで行われた。
発明の領域
本発明は、分子間相互作用を持つタンパク質の機能上重要部位をアロステリックに修飾することによって、その細胞内相互作用を調節する、化合物の同定に関する。
発明の背景
本明細書は、本明細書と同一の名称を持つ、仮明細書Ｓ．Ｎ，６０／０９１，４３１、１９９８年７月１日出願、およびＳ．Ｎ．６０／１３３，４３５、１９９９年５月１１日出願、に優先権を主張し、その両方をここに参照として採用する。
【０００２】
治療用化合物の開発での挑戦の一つは、望ましい生物学的効果を仲介することのできる小分子を見つけだすことである。伝統的には、合成化学および天然生成物のスクリーニングが多くの薬剤生成を誘導する主な手段であった。
【０００３】
高処理ランダムスクリーニングは、リード化合物を発見するために、製薬会社によって採用されている標準的方法である。この方法は、天然／医療用生成物の大規模な化学データーベースの利用に頼っている。この方法は、病気の原因となる生物分子の主成分の知識を必要としない。要するに、それは、治療用リード化合物をスクリーニングするための盲目的方法である。この研究方法の長所は、大規模な医療用化学データベースの構築を容易にし、治療化合物をスクリーニングするために繰り返し利用できることである。残念なことに、ランダムスクリーニングは、退屈で、時には天然抽出物からの単離および特徴付けを必要とする。天然生成物は、複雑であり、それらの天然起源に固有の立体化学的複雑性を含む。
【０００４】
高処理ランダムスクリーニング法を用いて、いくつかの新規の治療用分子が同定されるが、そのような方法は、時として、大規模化学データベースの入手性によって制限される。コンピューター技術およびタンパク質−タンパク質相互作用の理解の進歩は、 高処理スクリーニング法をコンピューター−援助分析および新規分子の設計で置き換える試みを可能にする。そのような構造を基にした研究方法は、新規化合物を発見するための時間および労力を減らした。
【０００５】
構造を基にした研究方法を用いて、「基質類似体」または「アロステリック」インヒビターのいずれかである、さまざまなインヒビターが開発されている。アロステリック効果は、ある場合には：（１）天然リガンドと競合しない、（２）より低い濃度で効果的であり得る、（３）アロステリック結合部位は保存性が低く、それ故、特異性および選択性を強化することができる、そして（４）ある場合には、アロステリック効果は、標的分子を中間の非天然または溶融した球形状態にトラップすることによって、標的分子の機能を阻害することができる：と言う理由から、慣用の基質類似体に勝ると考えられる。
【０００６】
構造に基づく研究方法は、病気に応答する生物分子に対して治療薬剤を設計する標的化経路を示している。分子の姿に基づくリード治療用化合物の設計には、主に２つの研究方法がある。酵素に関しては、（活性部位の知識から）基質類似体および示されたペプチド疑似体の設計が、ある場合、有望である。
【０００７】
天然基質と競合し、活性部位を塞ぐように基質類似体を開発する。このように、有力な治療化合物は、高いアフィニティーを持ち、選択性を示し、そしてより長い保持時間を持たねばならない。レセプターおよびそれらのリガンドのような、数多くのレセプターおよびその他の非酵素分子は、はっきりした活性部位を持たないため、基質類似体は酵素によりよく適合するが、生物機能を変化させる。そのような場合、タンパク質の局所的構造形態をまねるペプチドの能力は、治療化合物を設計するために用いられる方法の一つである。基質類似体相互作用は、可逆でないときもある。
【０００８】
ペプチド疑似体は、治療用薬剤として、および理解されている生物機能に対するプローブとしての両方で開発されている。オピオイドおよびホルモンレセプターを標的とする天然生成物は、合理的設計で切願された多くの概念を有効と認めるので、それらはペプチド疑似体の歴史的例でもある。これらの化合物は、どのように構造的に異なる非ペプチドが（可動性、アミノ結合および明らかな薬物伝達類似性を欠く）それらのペプチド祖先からきたか、そしてそれらの修飾がペプチドおよび非ペプチドの両化合物に関するレセプターのサブタイプについて選択性の高いリガンドに導くか、の古典的例を提供する。
【０００９】
ペプチドコンフォメーションの解明は、それがレセプターに結合する構造的必要性についての見識を提供することができる（Ｂｏｔｅｊｕ，Ｌ．Ｗ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：４１２０−４；および、Ｃｈｏ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１５３−８；ここにその両方を参照として採用する）。しかしながら、直線ペプチドの構造−活性の研究における主な問題は、側鎖残基のみならずペプチド骨格の可動性の大きさである。個々のアミノ酸の置換、それに続く生物学的スクリーニングは、結合にかかわっていることを示す残基上よりむしろ構造上の感情的差異を反映する。結果的に、多数のコンフォメーション間で急速な平衡が起こりそうな、溶液の分光分析の研究は、直線ペプチド類似体の設計に殆ど影響を与えない。対照的に、抑制されたペプチドは、レセプター結合コンフォメーションとの関係に関する溶液コンフォメーションの輪郭を描く。タンパク質の認識エレメントを示す構造上抑制されたペプチド類似体を基にした生物活性化合物の設計は、疑似薬物設計への有効な研究方法を構築する。時折、特定のコンフォメーションに抑制するためにペプチド上に課された抑制は、タンパク質リガンドの三次構造によって課された抑制を真似ている。課された抑制は、両親媒性のらせん繰り返しのような特定の二次構造の傾向の一因となるアミノ酸を用いることによりもたらされうる。
【００１０】
ペプチド疑似体は種々の有用性を持つにもかかわらず、それらの生物生命力の乏しさ故に、ペプチド疑似体は生命力の弱い薬剤のままである。それにもかかわらず、修飾された結合または側鎖を持つ活性ペプチド類似体は、一般にタンパク質分解に対してより耐性であるため、生物活性を持つコンフォメーションをはっきりさせるもう一つの研究方法を提供し、また、価値ある薬力学的プローブでもある。
【００１１】
タンパク質の構造は、結晶学、ＮＭＲおよび分子モデル化を用いて、解明された。タンパク質の三次構造は、（１）分子の全体折り畳み構造（２）α−ヘリックス、β−シートのような骨格：二次構造の形態、（３）機能性ユニット；β−ターンおよびループ、および（４）それ自身上のアミノ酸鎖、および、ある場合には、それ自身およびその他のサブユニットのアミノ酸鎖上の多量体タンパク質複合体、の折り畳みによって形成される、腔、割れ目、ポケットおよびクレバス：を示す。腔、割れ目、ポケットおよびクレバスは、内部に水分子を収容できる。腔、割れ目、ポケットおよびクレバス分子を形成するアミノ酸の形態に依存して、これらの構造形態の内部は、特定の化学的静電的性質ならびに空間寸法（dimension）をもつ。
【００１２】
タンパク質／レセプターの結晶構造の決定は、タンパク質／レセプター機能の基本的理解を提供した。ＥＧＦレセプターのようなさまざまなレセプターは、リガンド、またはレセプターのその他のｅｒｂＢファミリーとの関係のいずれかによって、活性化される。仮説の一つは、リガンドまたはコレセプターのいずれかによって誘導されるコンフォメーション変化が、シグナル導入を促進することである。このように、アロステリックメカニズムを通して、レセプターは、シグナル導入を変調することができると考えられる。アロステリック操縦の生物機能もまた、酵素およびレセプターの両方で知られている（Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．，１９９７、Ｄｒｕｇ．Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，４０：１９３−２０４、およびＫｕｎｄｒｏｔ，Ｃ．Ｅ．ら、１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：１４７８−１４８４、ここにその両方を参照として採用する）。タンパク質／レセプターの機能を変調する試みが行われ、「アロステリック修飾またはアロステリック阻害」と呼ばれることもある。
【００１３】
アロステリック修飾は、さまざまな酵素（Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｆ．ら、１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６：９７１−９８２；Ｌａｄｊｉｍｉ，Ｍ．Ｍ．ら、１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６：７１５−７２４；Ｏｚａｉｔａ，Ａ．ら、１９９７，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１２１：９０１−９１２；Ｔａｎｇ，Ｊ．ら、１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌ．，４，４５３−４５９；および、Ｔｉｊａｎｅ，Ｍ．ら、１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２４５：３０−３４；ここにそのそれぞれを参照として採用する）、およびレセプター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｍ．ら、１９９７，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，Ｒｅｓ．，２２：１０２３−１０３１；Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．、１９９７，Ｄｒｕｇ．Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，４０：１９３−２０４；Ｋｏｌｌｉａｓｂａｋｅｒ，Ｃ．Ａ．ら、１９９７，Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２８１：７６１−７６８；および、Ｒｏｂｉｃｈｏｎ，Ｒ．ら、１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏ．，３２８：２５５−２６３；ここにそのそれぞれを参照として採用する）で研究された周知の技術である。今までの技術は、変異誘発、またはスクリーニングから同定されたまたは小分子を用いることがある。アロステリック修飾を酵素に用いると、酵素反応論が変化し、ある場合には、これを用いて阻害剤が開発された。
【００１４】
分子間相互作用のモジュレーターおよびそのようなモジュレーターを同定する方法が必要とされる。分子間相互作用の阻害剤およびそのような阻害剤を同定する方法も必要である。分子間相互作用のエンハンサーおよびそのようなエンハンサーを同定する方法も必要である。構造に基づくリガンド設計は、今日実施されているように、活性部位のような既知の機能の腔または高処理（リガンド結合）によって同定される腔、の知識が必要とされる。新規リガンドを設計するための機能的腔を同定する、一般的研究方法が必要である。
発明の要約
本発明は、タンパク質標的と修飾因子の間の分子間相互作用を変調する化合物を同定する方法に関する。モジュレーターは、インヒビター、即ち分子間相互作用を阻害する化合物、または、エンハンサー、例えば細胞内相互作用を強化する化合物、であることができる。本発明の方法に従うと、修飾因子との分子間相互作用に関与する標的タンパク質の機能的に重要な部位に対して近位のタンパク質標的内の腔、割れ目、ポケットまたはクレバスが同定され、触媒部位から遠位および近位であってよい。腔、割れ目、ポケットまたはクレバスの容量を計算し、その化学的静電的性質をマッピングする。腔、割れ目、ポケットまたはクレバスによって収容されうる官能基および化合物を同定する。そのような官能基および化合物を同定するためのパラメーターとしては、サイズ、チャージおよび疎水性／親水性特徴が含まれる。腔、割れ目、ポケットまたはクレバスによって完全に収容されうる化合物を含む、腔、割れ目、ポケットまたはクレバスによって収容されうる官能基を含む化合物は、次に、インビトロアッセイで試験され、それらが標的−修飾因子相互作用を変調するか否かについて決定される。
【００１５】
本発明は、炎症状態に苦しむ個人を治療するための医薬組成物および方法に関する。
本発明は、医薬組成物に関連し、非所望の免疫応答または免疫学的状態に苦しむ個人を治療するための方法を開示する。
【００１６】
本発明は、医薬組成物に関連し、細菌感染症に苦しむ個人を治療するための方法を開示する。
好ましい実施態様の詳細な説明
ここで用いられる、用語「標的タンパク質」は、修飾因子との分子間相互作用に含まれるタンパク質を指すつもりである。標的タンパク質は、細胞内タンパク質および細胞外に存在するタンパク質であることができる。標的タンパク質としては、例えば、限定するつもりはないが、膜結合タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、酵素、サイトカイン、リンホカイン、ケモキン、粘着性分子、成長因子、またはそのようなタンパク質のレセプターを挙げることができる。いくつかの実施態様では、標的タンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）(tumor necrosis factor) レセプターを含むＴＮＦレセプターファミリ、ｆａｓ、ＣＤ４０、ｇｐ３０、およびｆａｓリガンド、ＴＮＦα、ＣＤ４、β−ラクタマーゼ、ｃ−ｅｒＢ２  ｐ１８５翻訳生成物、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン、インスリンレセプター、インスリン、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−１、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−２、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）(epidermal growth factor receptor)、および表皮成長因子（ＥＧＦ）(epidermal growth factor) である。標的タンパク質は、その三次元構造の一部分として腔、クレバスの割れ目グローブポケットを持っていなければならない。
【００１７】
ここに用いられている、用語「修飾因子」は、標的タンパク質との分子間相互作用に関与する化合物を指すつもりである。修飾因子は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのようなタンパク様分子、または糖、多糖、核酸分子またはその他の非タンパク様有機あるいは非有機分子のような、非タンパク様分子であることができる。用語「修飾因子」は、本明細書中では、用語「リガンド」と交換して用いることができる。タンパク様修飾因子の例としては：膜結合タンパク質、サイトゾルタンパク質、および核タンパク質のようなタンパク質；および、タンパク様酵素基質、サイトカイン、リンホカイン、ケモキン、粘着性分子、成長因子またはそのような分子のレセプターのようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド：が含まれる。いくつかの実施態様では、「修飾因子」は、ＴＮＦレセプター、ｆａｓ、ＣＤ４０、ｇｐ３０、およびｆａｓリガンド、ＴＮＦα、ＣＤ４、β−ラクタマーゼ、ｃ−ｅｒｂＢ２  ｐ１８５翻訳生成物、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン、インスリンレセプター、インスリン、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−１、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−２、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）(epidermal growth factor receptor)および表皮成長因子（ＥＧＦ）(epidermal growth factor) を含む、ＴＮＦレセプターファミリーである。
【００１８】
ここに用いらている、用語「分子間相互作用」は、標的タンパク質とも呼ばれるタンパク質と、修飾因子とも呼ばれる第二の分子との間に起こる相互作用を指すつもりである。相互作用は、標的タンパク質：修飾因子相互作用部位と呼ばれる標的タンパク質上の部位で起こる。分子間相互作用には、例として、会合、オリゴマー化、結合および配座／構造混乱(conformational/structural perturbances)が含まれる。標的タンパク質と修飾因子の間の分子間相互作用は、結果として、ある環境で所望される、ある生物活性の強化または阻害を生じる。生物活性を生じる分子間相互作用の例としては、酵素による基質のプロセシング、リガンド誘導シグナル導入、アロステリックモジュレーター、オリゴマー化によるシグナル導入、および、タンパク質小分子結合（アンタゴニスト／アゴニスト）が含まれる。
【００１９】
ここに用いられている、用語「標的タンパク質：修飾因子相互作用部位」は、標的タンパク質と修飾因子との間で相互作用が起こる標的タンパク質上の位置を指すつもりである。標的タンパク質が酵素であり修飾因子が酵素基質である例では、例えば、標的タンパク質：修飾因子相互作用部位は、また、触媒部位とも呼ばれる。標的タンパク質がレセプターである例では、例えば、標的タンパク質：修飾因子相互作用部位は、また、結合部位とも呼ばれる。標的タンパク質がイムノグロブリンスーパーファミリーのメンバーであるようなある例では、標的タンパク質：修飾因子相互作用部位は、修飾因子と直接相互作用する標的タンパク質の部分を明確にする、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）(complementarity determining regions) またはループである。
【００２０】
ここで用いられる、用語「腔」「割れ目」、「ポケット」、「グローブ」および「クレバス」は、交換して用いることができ、例えば水分子のような少なくとも一つの溶媒を収容することのできる標的タンパク質上の分子表面または位置を指すつもりであるが、いくつかの腔は、溶媒和化されないかもしれない。同定方法には、水分子に近い半径１．４Åの球状プローブを用いて分子表面を探知する分子モデルを用いることが含まれる。腔は、水分子を収容することができる、即ち、水分子の等価な大きさであるプローブは、腔内に適合することができる。従って、腔は、測定されうる寸法（dimension）および容量を持つ。
【００２１】
ここで用いられる、用語「機能的に重要な部位」は、機能の変化または仲介、望ましい変調のいずれかに関与する標的タンパク質上の部位または領域または位置または二次構造エレメントを指すつもりである。本発明のいくつかの実施態様では、機能とは、酵素である標的タンパク質によって、酵素基質である修飾因子をプロセシングできることであり、機能的に重要な部位とは、触媒部位である標的タンパク質：修飾因子相互作用部位であり、望ましい変調とは、酵素によってプロセシングされる基質を阻害することである。本発明のいくつかの実施態様では、機能とは、標的タンパク質に修飾因子を結合させうることであり、機能的に重要な部位とは、結合部位である標的タンパク質：修飾因子相互作用であり、望ましい変調とは、標的タンパク質−修飾因子結合を阻害することである。機能的に重要な部位のその他の例としては、標的タンパク質の表面、オリゴマーとの界面、およびオリゴマーによって安定化されるループが含まれる。
【００２２】
ここに用いられている、用語「近位」("proximal")は、用語「隣接」と互換性があり、測定可能距離にある腔および機能的に重要な部位とは別の位置を指すつもりである。本発明では、腔は、機能的に重要な位置とは別の位置にある。２つの位置は、互いに別個であり、その故、化合物の官能基が腔を占拠する場合に起こる機能的に重要な位置の修飾は、アロステリック修飾である。もし、機能的に重要な部位を、標的タンパク質と腔に収容されうる化合物の少なくとも一つの官能基の間の分子相互作用によって変化させることができるならば、腔は機能的重要部位の近位にある。好ましい実施態様では、機能的重要部位に対して近位にある腔は、一般的には、機能的重要部位まで約１５−２０Åである。
【００２３】
ここに用いられている、用語「変調する」は、そのような分子間相互作用に関与する分子表面をアロステリック修飾する、本発明の化合物に起因する分子間相互作用上への影響を指すつもりである。そのような化合物は、「モジュレーター」と呼ばれる。ある実施態様では、モジュレータに起因する影響は、分子間相互作用の阻害であり、そのような場合のモジュレーターは、「インヒビター」である。ある実施態様では、モジュレーターに起因する影響は、分子間相互作用の強化であることができ、そのような場合のモジュレータは、「エンハンサー」である。
【００２４】
本発明によると、そのような分子間相互作用に含まれる分子表面をアロステリック修飾するために、分子間相互作用のインヒビターまたはエンハンサーのようなモジュレーターを同定または設計することができる。このように、結合部位または修飾部位のような機能的重要部位に近位の腔を持つ標的タンパク質と第二の分子、タンパク質であってもなくても良い修飾因子、の間の任意の分子間相互作用は、本発明に従って同定された化合物を用いて、影響されうる。
【００２５】
本発明は；１）機能的重要部位に近位の腔を同定し、２）腔の物理的パラメーターを測定し、３）腔によって収容されうる官能基を同定し、そして４）インビトロアッセイ内にそのような官能基を含む化合物を試験して、そのような化合物が活性であるか否かを決定する；ことを含む、一連の段階を含む。
【００２６】
本発明では、標的タンパク質は、修飾因子と相互作用しなくてはならず、機能性部位の近位に腔を持つ。日常実験で行うことのできる、機能的重要部位および標的タンパク質の腔または修飾因子を同定することによって、そのような腔は、もし機能的重要部位の近位にあるならば、修飾因子とのその相互作用について標的タンパク質の活性を修飾できる化合物の標的であることができることを発見した。修飾因子との相互作用は、標的タンパク質に帰する特異的生物機能を必要とするので、標的タンパク質：修飾因子−相互作用の阻害は、そのような相互作用と関連する生物機能を阻害する。同様に、標的タンパク質：修飾因子−相互作用の強化は、そのような相互作用と関連する生物学的機能を強化することができる。
【００２７】
標的タンパク質上の機能的重要部位を同定する手段は、数多くあり、変更でき、周知である。例えば、酵素の活性部位または触媒部位の同定、およびレセプターまたはリガンドの結合部位は、周知である。標的タンパク質の機能的重要部位は、限定するつもりはないが、結晶または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像を用いて、結晶構造からの標的タンパク質原子上の熱β−ファクターまたはＮＭＲシグナルから推論された可動性ループのいずれかによる画像診断、または、化合物の微量熱量測定分析または分子の変異分析として、標的タンパク質構造上のβ−ファクターを同定すること；イムノマッピングを含む標的タンパク質のタンパク質、ペプチドあるいはペプチド疑似体マッピング；および、標的タンパク質構造上のＣＤＲｓを同定すること；を含む、さまざまな異なる方法によって同定することができる。β−ファクターは、結晶学的研究から熱パラメーターのような可動性を明らかにするパラメーターである。熱β−ファクターは、Ｘ線回析によって決定された３Ｄ構造内の原子の無秩序な（可動性）特質を反映するパラメーターである。構造を、Ｘ線回析で決定した場合、β−ファクターを決定するために必要なデータは、屈折強度として測定される。これらのデータのフーリエ変換分析から、分子間の原子と関連するβ−ファクターが分かり、β−ファクターは常に結晶構造分析の部分として決定される。これらのβ−ファクターは、分子間での原子の無秩序性または可動性を反映している。また、熱力学研究からの熱量測定値を用いて、標的タンパク質の機能的重要部位を同定することもできる。また、可動領域の同定に有用なアルゴリズムもまた、記載されている。このアルゴリズムおよびその用途は、Ｄａｑｕｉｎｏ，Ｊ．Ａ．ら、１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２５：１４３−１５６；Ｇｏｍｅｚ，Ｊ．ら、１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５２：３３７−３５０；Ｈｉｌｓｅｒ，Ｖ．Ｊ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５２：７５６−７７２；およびＸｉｅ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３：２１７５−２１８４に記載されており、そのそれぞれをここに参照として採用する。
【００２８】
標的タンパク質の腔は、限定するつもりはないが、結晶構造分析、ＮＭＲおよびコンピューターモデルを含む、任意のさまざまな周知の技術によって同定できる。腔の大きさは、少なくとも１分子の水を収容することができるはずである。タンパク質表面上の腔を同定する技術は、周知であり、例として、”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、Ｄａｌｅ，Ｌ．編、Ｏｘｅｎｄｅｒ，Ｃ．Ｆｒｅｄ  Ｆｏｘ，Ｌｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７（結晶学およびＮＭＲ）および”Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｎ．Ｃｌａｕｄｅ  Ｃｏｈｅｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９９６（コンピューターモデリング）、に記載されており、ここにそのそれぞれを参照として採用する。表面が水を収容できるか否かを決定するために、タンパク質のコンピューターモデルを用いて、水分子の大きさと同様の大きさである半径１．４Åの小球体を用いて、表面を試験した。プローブ球体に触れる原子を、表面原子としてマークした。連続表面としての表面原子のマッピングは、表面の外面的形態を明らかにする。次に、外面的形態は、腔の分類を可能にする。腔に近位であることは、機能的重要部位と同一位置にあってはならないことである。
【００２９】
ひとたび、機能的重要部位に近位である腔が同定されるならば、ある種の物理的パラメーターが確かめられる。そのようなパラメーターには、少なくとも一つ、好ましくは１以上の以下のパラメーター：腔の容量および寸法が測定、さもなくば計算される；腔の静電的性質および／または腔の化学的性質、即ち、腔の疎水性／親水性をマッピングすることができる；が含まれる。このように、腔内部は、腔内部の容量および寸法および／または腔内部の静電的性質の地図および／または腔内部の化学的性質の地図、によって明らかにされる。
【００３０】
いくつかの実施態様では、（１水分子に等しい）１．４Åのプローブ球体をローリングすることによって、腔内部の容量および寸法を測定し、表面を形成させることができる。次に、近づきやすい表面を、数多くのその他のプログラムの中から、自由に入手できるプログラムＭＳ（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）を用いて、計算する。ＭＳは、ＱＣＰＥ（ＱＣＰＥ，Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ａｒｔｓ  Ｂｌｄｇ．，１８１，Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ４７４０５）から入手可能であり、また、ＩＮＳＩＧＨＴおよびＱＵＡＮＴＡ（両方とも、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）の様なさまざまな図面用ソフトウェア内に組み込まれている。さらに、Ｋｌｅｙｗｅｇｔ，Ｇ．Ｊ．ら、１９９４、Ａｃｔａ，Ｄ５０，１７８−１８５（ここに参照として採用する）に記載されたプログラムを用いると、腔を検出し、測定し、特徴付けることもできる。
【００３１】
腔の静電的性質および化学的性質、即ち疎水性／親水性を、マッピングすることができる。プログラムＧＥＮＳＩＴＥＳを用いて、結合領域内の残基を、部位点（水素結合、疎水性相互作用を形成する能力を持つ原子）について分析する。ＤＯＣＫの部分であるＳＰＨＧＥＮのようなその他の等価なプログラムもまた、用いることができる。ＤＯＣＫプログラムは、Ｋｕｎｔｚ教授の研究室，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ．から入手できる。プログラムは、標的タンパク質の分子表面上を転がす異なる大きさの球体の表面への近づきやすさの差を基にして可能な位置を同定する。内部表面の寸法、チャージおよび化学的性質と関係する腔内部の三次元地図を作成する。
【００３２】
ひとたび、腔の物理的パラメーターが確認されると、腔に収容されうる官能基を同定する。そのような官能基は、それらが腔内部に適合できるような適当な大きさでなければならない。さらに、官能基は、腔内部と静電的および化学的に適合しなければならない。即ち、官能基は、結果として、腔内部を占領することにより官能基を阻害または妨げるであろう力を跳ね返すと言うよりはむしろ、腔内部に官能基が攻撃する力を生じるであろう、静電的性質および化学的性質を持つべきである。腔内に開かれた部位点を用い、可能な分子フラグメントを、プログラムＬＵＤＩを用いて同定する。ＬＵＤＩは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃから入手できるＩＮＳＩＧＨＴの一部分である。ＣＡＶＥＡＴとよがれるＱＵＡＮＴＡからのもう一つのプログラムもまた、Ｍｏｌｅｃｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，ＩＮＣ．から入手でき、これを用いると、腔に収容されうる官能基を同定することができる。
【００３３】
いくつかの好ましい実施態様では、形態相同性は、異なる部分を持つフラグメントを検出するための最初のスクリーニングとして用いられる。分子モデル化研究法は、部位が比較的硬直していること、および標的タンパク質／モジュレーター結合時の分子間エネルギー変化が標的タンパク質／修飾因子配座間の相互作用エネルギーと比較して小さいことを仮定する。それ故、結合様式は、モジュレーター上の（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ配位として表される）どの分子点が結合部位のどの部位点（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ配位）と結合するはずであるかを、明快に示している。フィッティング方法は、次にドッキングする相補的表面を持つ共通表面形態の同定と等価である。
【００３４】
２つの相補的表面間のドッキングは、既知の形態学でさえ、徹底的な方法であることができる。第一に、プローブ球体は、結合分子の原子によって占領することのできる可能な位置座として、結合表面上を転がされる。座のこの連続体は、それぞれの残基に位置する識別点のセットを減少させ、型を指定することができる。それぞれの部位点に関するさらなる型指定は、その３つの最も近い近隣残基を含むこの残基の比較形態学的記載に依存して、与えられる。これらの点は、ＬＵＤ１データベース内で同定された適合フラグメントについての領域を明らかにする。複合体は、相対配向を最適化し、複合体形成時に誘導される標的タンパク質内の配座変化をモニターするための、エネルギー最小化および分子動的計算に委ねられる。この方法は、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、１９９６，ここに参照として採用される）およびＬＩＧＩＮ（Ｓｏｂｏｌｅｖら、１９９６，ここに参照として採用される）またはドッキングアルゴリズムを用いる任意のその他の等価のプログラムを用いて行われる。これら２方法は、結合性を強化するための配座可動性および可能な化学修飾の両方の探究を可能にする。この研究方法は、近隣残基と作用することのできる可能性のある官能基を結合し同定することのできる分子の大きさの評価を提供し、部位点の配置に基づいた新規分子構造を開発する方法を提供する。
【００３５】
部位点を基にした新規の分子化合物は、合成での困難および生物学的アッセイでの適合性に遭遇するであろう。この障害を打ち負かすために、大規模三次元化学構造データベース（ＭＤＬ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）をサーチし、化合物を同定した（Ｇｏｏｄ，Ａ．Ｃ．ら、１９９５，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，９：１−２；Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１０７８−１０８２；および、Ｌｉ，Ｓ．ら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：７３−７８；ここにそのそれぞれを参照として採用する）。化学的データベースを用いる長所は：（１）より多き化合物内に容易に取り込まれうる小フラグメントに対する新規分子をサーチする唯一の好機を提供し、そして（２）それらの入手しやすさ、合成形路、毒性および溶解性等の知識から化学化合物の選択を容易にする、二点である。最近では、三次元構造化学データベースは、約２５０，０００の小分子を含む。医療的に有用な化合物を、ＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄ，Ａ．Ｃ．ら、１９９５，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，９：１−１２、およびＧｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．，９：１−５、ここにその両方を参照として採用する）アルゴリズムを用いて、化学データベース内で、同定することができる。腔は、疎水性、水素結合のような最大相互作用および配座サーチによる相補的静電的性質についてのデータベースからのそれぞれの小分子で調査する。結合エネルギーに基づいて、分子を分類し、例えばトップの２００化合物を選択する。さらに、改めてリガンド設計から構築された一つと類似した分子を、三次元的に窮屈なフラグメントサーチを用いて、データベース内で同定することができる。データベースサーチ（ＤＯＣＫ）およびフラグメントサーチの両方によって得られた列挙された短い分子を用いて、ＭＤＬ’ｓ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて小化学データベースライブラリーを作り出す。医薬化学および薬理学のＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎ（ＡＳＡＲ）分析は、オリジナルデータセットのそれらと化学的に類似している分子の断定に、有用に提供された。ＱＳＡＲに向けられた距離結合構造は、物理／化学パラメーターからのその非依存性によりより広いクラスの化合物を試験することを可能にする。ライブラリー内の分子を、共通モチーフについて比較し、３Ｄ−ＱＡＳＲに類似した分析を、ＡＳＰおよびＴＳＡＲ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて行い、最大結合エネルギーについての適当な官能基を見出す。
【００３６】
同定に次いで、さまざまな研究方法またはその組み合わせの一つによって選択された化合物を、インビトロアッセイで生物活性について評価し、それらが標的−修飾因子相互作用を変調するか否かについて決定する。結果として検出可能シグナルまたは表現型を生じる分子間相互作用を知るために、または分子間相互作用の阻害が、結果として検出可能シグナルまたは表現型を生じることを知るために、生物学的アッセイを用いる。そのようなアッセイを用いて、同定された化合物の存在下または不在下で比較アッセイを行い、化合物の生物活性を確かめる。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって同定された成分を含み、さらに、例えば、食塩水のような、医薬として許容しうるキャリヤーまたはベヒクルを含む。化合物の成功裡の配達を可能にする任意の媒質を用いることもできる。当業者らは、本発明に用いることのできる医薬として許容しうる多数の媒質を容易に理解するであろう。用語「医薬的に」は、当業者には、周知であり、広く理解されている。ここに用いられている「医薬組成物」または「注入しうる医薬組成物」、は、当業者らによって理解されている本来の意味を持つことを意味している。注入可能な医薬組成物のような医薬組成物は、無菌性、発熱物質、特定物質ならびに等張性、ｐＨ、即ち、なかんずく、無菌性、発熱物質非含有および特定物質非含有、に関して特定標準に合わせる必要がある。
【００３８】
当業者らは、医薬組成物を、選択された投与様式に依存して選択された組成物と共に、調合することができる。適当な医薬キャリヤーは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ，Ａ，（この分野での標準的参考書、ここに参照として採用する）に、記載されている。
【００３９】
本発明の医薬組成物を、活性薬剤が哺乳動物体内の薬剤作用部位に到達できるような任意の手段によって、投与することができる。医薬組成物を、非経口、即ち、腫瘍内、静脈内、皮下、細胞内、に投与することができる。静脈内および腫瘍内投与は、好ましい経路である。例えば、筋肉内注射が選択された投与様式である場合、等張調合物を用いることが望ましい。一般的に、等張のための付加物は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含むことができる。ある場合には、リン酸塩緩衝溶液のような等張溶液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
【００４０】
投与量は、特定薬剤の薬力学的性質のような既知の因子、および投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態および体重、症状の性質および範囲、同時治療の種類、治療頻度および所望される効果、に依存して変化する。
実施例
実施例１
本発明の一つの実施態様では、ＣＩＡＭ技術を用いて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターとＴＮＦα間の相互作用を阻害する化合物を同定する。
【００４１】
腫瘍壊死因子レセプターは、複合体および非複合ポリペプチドの両方としての原子を詳細に研究されている最初のレセプターの一つである。ＴＮＦレセプターンの複合形および非複合形の両方の結晶構造は、これらレセプターがそれらのリガンドと結合し（Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．ら、１９９３，Ｃｅｌｌ，７３：４３１−４５；Ｅｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７５９５−６０５；およびＥｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１１９−２２；ここにそのそれぞれを参照として採用する）、会合したリガンドは、配座変換を誘導する、という一般的理解を提供する。ＴＮＦレセプターファミリー内のシステインノットは、３つの鎖内ジスルフィド結合を形成する６システインを含む４２アミノ酸残基からなり、構造モチーフを作り出す。三次元構造は、長さ約３０Åのシステイン-ノット繰り返しがレセプターの片側にループを露出したｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ様式で配列されていることを、示している。これらのループは、オリゴマー化またはリガンド結合のいずれかに含まれる。非複合ＴＮＦレセプターは、ダイマーとして認められる。ダイマー形では、第一および最後のシステインドメインがダイマー接触に含まれる。膜近位ドメインは、多分、安定状態でこのドメインを正常に保つトランスメンブランの欠如により乱されている。ＴＮＦレセプターおよびＴＮＦβ複合体の結晶構造分析は、”ＷＰ５”、”ＷＰ８”および”ＷＰ９”と名付けられた、３つの明確な結合部位があることを示している。
【００４２】
最もエネルギッシュな適切な結合部位を理解するために、ペプチドをプローブとして用いて、いくつかの環状ペプチドを種に関して開発した。
ペプチド疑似体を、ＴＮＦレセプターの３つの表面ループ：ドメイン１のループ（５６−７３）；ドメイン２のループ（７６−８３）およびドメイン３のループ（１０７−１１４）（図１Ａ）：のすべてから開発し、試験した。ペプチド疑似体は、Ｔａｋａｓａｉら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：１２６６−１２７０（ここに参照として採用する）に詳細に記載されている。第三ドメインから設計されたペプチド疑似体（ＷＰ９ＱＹ）は、そのレセプターへのＴＮＦα結合を阻害した（ＩＣ50＝７５ｍＭ）。また、ペプチド疑似体は、ペプチドが特異的にＴＮＦαと結合すると考えられる７ｐｇのＴＮＦαでアポトーシスを誘導する場合、細胞死を誘導するＴＮＦαに対して細胞を防御した。ペプチド疑似体（ＷＰ９ＱＹ）は、抗−ＴＮＦα活性を示す第一ペプチドの一つである（図１Ｂ）。
【００４３】
ペプチド疑似体分析によって同定されたＴＮＦレセプターの第３ドメイン内の小ループの効果を基にして、アロステリックインヒビターのドッキングに利用することのできる大きい割れ目を同定した。腔は：深さ８Å、長さ１７．６Åおよび幅１２．４Å：の浅さである（図２Ａ）。腔の壁は、ＴＮＦα結合を含む残基によって形成されている。一つの結合部位（ＷＰ９）の近くの大きな割れ目は、上記方法から設計された小分子を用いて、アロステリック効果によってこれらのループをかき乱すために用いられた（ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ，Ｒ．Ｌ．ら、１９８６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：２１４９−２１６３；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ，Ｒ．Ｌ．ら、１９８８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３：７２２−７２９；Ｇｏｏｄ，Ａ．Ｃ．ら、１９９５，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，９：１−１２；Ｇｓｃｈｗｅｎｄ，Ｄ．Ａ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．，９：１７５−１８６；Ｓｈｏｉｃｅｔ，Ｂ．Ｋ．ら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２１：３２７−３４６；Ｓｔｒｙｎａｄｋａ，Ｎ．Ｃ．ら、１９９６，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：２３３−２３９；およびＳｔｒｙｎａｄｋａ，Ｎ．Ｃ．ら、１９９６，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：２９０−２９７、ここにそのそれぞれを参照として採用する）。約２３２の構造適合分子を、約１００００の構造を含むＭＤＬ（ＭＤＬ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）構造化学データベースを用いて構築した小化学データベースの最初のスクリーニングから選択した。さらなる分析は、それらのすべてが溶解度および毒性に基づく生物学的実験に貢献するわけではないことを示した。試験の目的で、４化合物を生物活性について試験したが、特異性および反応速度論については試験しなかった。化合物を、標準ＭＴＴアッセイ（Ｈａｎｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．ら、１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１１９：２０３−２１０、ここに参照として採用する）を用いて、アポトーシスについて試験した。一つの化合物、結合エネルギー−４０Ｋｃａｌ／ｍｏｌ（図２Ｂ）を持つＳ７は、ＭＴＴアッセイで活性を示した（図２Ｃ）。これらの結果は、小分子を偽のアロステリックインヒビターとして開発できることを示している。
【００４４】
本発明は、標的タンパク質であるＴＮＦレセプターと修飾因子であるＴＮＦの間の腔誘導アロステリック修飾（ＣＩＡＭ）(cavity induced allosteric modification)とよばれるアプローチに於ける、特定ループの配座を修飾するための新規のストラテジーを提供する。このストラテジーは、ＴＮＦレセプターの既知の結晶構造を用いる。標的タンパク質の表面を、１．４Åのプローブ球体（水分子に等しい）をローリングすることによって、作成した。接近しやすい表面を、プログラムＭＳを用いて計算した（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．ら、１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ，１１，１３９−１４１およびＬａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｒ．ら、１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１１，６６１−６６６；ここにその両方を参照として採用する）。標的タンパク質の分子表面上をローリングする異なる大きさの球体の表面接近性の違いに基づいて可能な位置を同定するプログラムＧＥＮＳＩＴＥＳを用いて、結合領域内の残基を部位点（水素結合、疎水性相互作用を形成する能力を持つ原子）について分析した。腔内で開発された部位点を用いて、可能な分子フラグメントを、プログラムＬＵＤＩを用いて同定した（Ｂｏｈｍ，Ｌ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．，６，１３１−１３７、ここに参照として採用する）。形態相同性を、異なる部分を持つフラグメントを検出する最初のスクリーニングをして用いた。分子モデル化研究方法は、部位が比較的固定しており、リガンド／インヒビター結合時の分子間エネルギー変化がレセプター／タンパク質コンフォメーション間の相互作用エネルギーと比較して小さい、と仮定する。それ故、結合様式は、インヒビター上の（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ配位として明示された）どの分子点が、結合部位のどの部位点（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ配位）と結合すべきかを、明確にする。フィッティング方法は、次に相補的表面のドッキングを含む共通表面形態の同定と等価である。
【００４５】
２つの相補的表面間のドッキングは、既知のトポグラフィーを伴ってさえ、消耗的な方法でありうる。しかしながら、結合表面上の部位点をコンピューティングすることによって、問題の次元を一つ減らすことができる。第一に、プローブ球体を、結合分子の原子によって占領されうる可能な位置の座として、結合表面上をローリングさせる。この座の連続体は、それぞれの残基に位置し型を指定する１セットの識別点に縮小させることができる。それぞれの部位点についてのさらなる型指定は、この残基の３つの最も近位の近隣との相対的幾何学的作図に依存して与えられる。これらの点は、ＬＵＤＩデータベースで同定された適当なフラグメントについての領域を明らかにする。複合体を、エネルギー最小化および分子動力学計算に委ね、相対方向を最適化し、複合体形成時に誘導されるリガンドの配座変化をモニターする。この方法は、ＡＵＴＯＤＯＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．，９：１−５、ここに参照として採用する）およびＬＩＧＩＮ（Ｓｏｂｏｌｅｖら、１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２５：１２０−１２９、ここに参照として採用する）を用いて行われる。これらの２つの方法は、結合性を強化するための配座可動性および可能な化学修飾の両方の探究を可能にする。この研究方法は、結合できる分子サイズの評価を提供し、近隣残基と相互作用できる可能な官能基を同定し、そして、部位点の配置に基づいて新規の分子構造を開発する方法を提供する。時として、部位点に基づく新規の分子化合物は、合成の難しさと生物学的アッセイへの適合性に遭遇する。
【００４６】
この障害に打ち勝つために、大きい三次元化学構造データベース（ＭＤＬ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）をサーチして、化合物を同定する（Ｇｏｏｄ，Ａ．Ｃ．ら、１９９５，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，９：１−１２；Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１０７８−１０８２；および、Ｌｉ，Ｓ．ら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９４：７３−７８、ここにそのそれぞれを参照として採用する）。化学的データベースを用いる利点は：（１）より大きい化合物内に容易に取り込まれうる小フラグメントに対する新規分子をサーチするための唯一の機会を提供する、そして（２）化学化合物の選択を、それらの入手性、合成形路、毒性および溶解性等の知識から促進する：の２点である。最近では、三次元構造化学データベースは、約２５０，０００の小分子を含んでいる。治療上有用な化合物を、ＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄ，Ａ．Ｃ．ら、１９９５，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，９：１−１２、およびＧｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．，９：１−５、その両方をここに参照として採用する）アルゴリズムを用いて化学データベース内で同定することができる。腔を、疎水性、水素結合のような最大相互作用、および配座サーチによる相補的静電性について、データベースからの個々の小分子で探る。結合エネルギーに基づいて、分子を、ランク付けし、トップの２００化合物を選択した。さらに、改めてリガンド設計から構築された一つと類似した分子を、三次元的に束縛されたフラグメントサーチを用いて、データベース内で同定することができる。データベースサーチ（ＤＯＣＫ）およびフラグメントサーチの両方により得られた列挙された短い分子を用いて、ＭＤＬ’ｓプロジェクトライブラリーソフトウェアを用いて小さい化学的データベースを作る。臨床化学および薬理学での定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）(Quantitative structure activity Relation)分析は、オリジナルデータセットのそれらと化学的に類似ししている分子の予想に有用に提供された。ＱＳＡＲを直示した距離外面的形態は、物理／化学パラメーターからのその独立性故により、広範なクラスの化合物の試験を可能にする。ライブラリー内の分子を、共通のモチーフについて比較し、３Ｄ−ＱＳＡＲに類似した分析を、ＡＳＰおよびＴＳＡＲ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を順番に用いて行い、最大結合エネルギーについて適当な官能基を見出す。最終的に、異なる研究方法から選択された化合物を、生物活性を用いて評価する。
細胞毒性アッセイ
ネズミ繊維芽細胞系Ｌ９２９を、１０％ＦＣＳを加えたＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地内に維持し、アッセイのために細胞を接種する直前に、培地を無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で置き換える。Ｌ９２９細胞を９６穴のミクロタイタープレート上に接種（２ｘ１０4 細胞／穴）し、そして空気中５％のＣＯ2 下、３７゜Ｃで２０時間インキュベートした。アクチノマイシンＤ（ＡＣＴ−Ｄ）と、最終濃度１ｍｇ／ｍｌで、２時間プレインキュベーションした後、ＰＢＳ中、３７゜Ｃで１時間プレインキュベーションしたＴＮＦα（７ｐｇ）／インヒビター溶液（１００−８０ｍｌ）を穴に加えた。細胞を、５０ｐｇ／ｍｌに最終調整したＴＮＦαファミリーと共に、３７゜Ｃで７時間、５％ＣＯ2 下でインキュベートし、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）で染色する。簡単に言えば、１０ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液をそれぞれの穴に加え、３７゜Ｃで２時間インキュベーションの後、形成されたホルマザンを、１００ｍｌの抽出バッファー（２０％ ＳＤＳ／５０％ ＤＭＦ、ｐＨ４．７）と共に、３７゜Ｃで一晩インキュベーションすることにより発色させる。最終的に、発色ホルマザンの光学密度を６００ｎｍで測定する。
競合放射受容体アッセイ
ＰＢＳ（１００ｍｌ）中に希釈したＴＮＦ−レセプターキメラタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）を、Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｓｔ III 可動アッセイプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上、４゜Ｃで一晩インキュベーションすることにより、免疫化する。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで、２時間室温でブロックし、次に０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗ）で洗浄した後、ＰＢＳ中、３７゜Ｃで１時間、プレインキュベートした125 Ｉ−標識化−ＴＮＦα（１ｎｇ）／インヒビター溶液（１００ｍｌ）を、ＴＮＦ−レセプターでコートした穴上に加える。３７゜Ｃで２時間インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗで洗浄し、結合した放射能活性を、Ｃｏｂｒａ−γ カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）で測定する。
【００４７】
ある実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示した式Ｉを持つ化合物を含む。式Ｉ化合物中、Ｒ1およびＲ2は、独立的に、−Ｈ、−ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ｔ−ブチル、３−カルボキシ−４−クロロフェニルアミン、−Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2および−Ｏ（Ｏ）Ｃ−Ｐｈからなる群より選択される。Ｒ3は、−Ｈ、エチル、−ＯＣＨ3、−Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、３−カルボキシ−４−クロロフェニルアミン、−Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2、−ｔ−ブチルおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｐｈからなる群より選択され、結合されるフェニル環の任意の決まった位置に結合するとは限らない。好ましくは、Ｒ3 を、フェニル環の１または４位のいずれかに結合する。Ｒ4 は、−Ｂｒ、−Ｃｌおよび−Ｆからなる群より選択される。
【００４８】
式Ｉのある好ましい化合物では：
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は−ＯＣＨ3であり、Ｒ3は４位に結合しており、Ｒ4は−Ｃｌである；
Ｒ1およびＲ2はメチルであり、Ｒ3は４位に結合したエチルであり、Ｒ4は−Ｃｌである；
Ｒ1およびＲ2は−ＯＣＨ3であり、Ｒ3は２位に結合した−Ｃｌであり、Ｒ4は−Ｃｌである；
Ｒ1およびＲ2は−ＯＣＨ3であり、Ｒ3はＨであり、Ｒ4は−Ｃｌである；
Ｒ1はＨであり、Ｒ2およびＲ3 は３−カルボキシ−４−クロロフェニルアミノであり、Ｒ3は４位に結合しており、Ｒ4は−Ｃｌである；
Ｒ1およびＲ2は−Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）2であり、Ｒ3は４位に結合したＣｌであり，Ｒ4は−Ｃｌである；
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はｔ−ブチルであり、Ｒ3は４位に結合しており、Ｒ4は −Ｃｌである；
Ｒ1は−ＯＣＨ3であり、Ｒ2およびＲ3はＨであり、Ｒ4はＣｌである；または、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はベンゾエートであり、Ｒ3は４位に結合しており、Ｒ4 は−Ｂｒである。
【００４９】
いくつかの好ましい式Ｉ化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−Ｄ、Ｉ−Ｅ、Ｉ−Ｆ、Ｉ−Ｇ、Ｉ−ＨまたはＩ−Ｉを持つ。
【００５０】
これらの化合物は、以下の供給者より入手できる。
化合物      カタログ番号            供給者
Ｉ−Ａ      Ｆ３６，７００−１      Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
Ｉ−Ｂ      Ｓ１１，２４５−３      Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
Ｉ−Ｃ      ００５６９              Ryan Scientific，パーム島、Ｓ．Ｃ．
Ｉ−Ｄ      Ｆ１０，００１−３      Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
Ｉ−Ｅ      ００１２９              George UHE，パラマス、ＮＪ
Ｉ−Ｆ      Ｆ３７，１６６−１      Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
Ｉ−Ｇ      Ｓ−１１，２３９−９    Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
Ｉ−Ｈ      Ｆ−２７，７２１−５    Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
Ｉ−Ｉ      Ｆ１２，９２０−８      Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示した、式IIを持つ化合物を含む。式IIを持つ化合物中、Ｒ1 は、ージフェニルクロロメチル、ージ（４−クロロフェニル）クロロメチル、および４−（ジフェニルクロロメチル）フェニルからなる群より選択され；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4 は、独立的に、−Ｂｒ、−Ｃｌおよび−Ｆからなる群より選択され、好ましくは−Ｃｌである。
【００５１】
好ましい式II化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造II−Ａ、II−Ｂ、II−ＣおよびII−Ｄを持つ。これらの化合物は、以下の供給者らより入手できる。
化合物      カタログ番号            供給者
II−Ａ      Ｓ５，４７９−９        Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
II−Ｂ      Ｓ５，７５５−０        Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
II−Ｃ      Ｓ５，７４０−２        Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
II−Ｄ      Ｓ５，７５１−８        Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示した式III を持つ化合物を含む。式III 化合物では、Ｒ1 はＨまたはジエチルアミノであり；Ｒ2は−Ｏ−または−Ｎ（Ｃ6Ｈ6）−であり、そしてＲ3は−Ｂｒ、ＣｌまたはＦである。
【００５２】
好ましい式III 化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造III−ＡおよびIII−Ｂを持つ。
これらの化合物は、以下の供給者より入手できる。
化合物        カタログ番号            供給者
III−Ａ      Ｆ２１，８５５−５      Aldrich，ミルウオーキー、ＷＩ
III−Ｂ      Ｃ−３９０              Biosynth，ナパービル、ＩＬ
実施例２
医薬組成物を、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＩＣＮ、Ｒｙａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｕｈｅ（Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）およびＢｉｏｓｙｎｔｈ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）の様な化学供給会社から市販されている、式Ｉ、IIおよびIII の化合物を用いて調製する。医薬組成物は、ＴＮＦ−仲介疾病、障害および病状に苦しむ個体の治療に有用である。ＴＮＦ−仲介疾病、障害および状態の例としては、例えば、炎症性疾病および慢性関節リューマチ（ＲＡ）(Rheumatoid arthritis)、多発性硬化症（ＭＳ）(multiple sclerosis)、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）(insulin dependent diabetes mellitus) 、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節症、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病、潰瘍性大腸炎、狼瘡（ＳＬＥ）、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症(primary biliary sclerosis) および悪性貧血のような自己免疫病、を含む。本発明に従って、そのような疾病、障害および状態に苦しむ個人を、式Ｉ、IIおよびIII を持つ化合物を含む治療上有効量の医薬組成物を投与することにより治療することができる。
【００５３】
方法は、ＴＮＦ仲介疾病の阻害に効果的な治療上有効量の化合物を、哺乳動物、好ましくはヒトに、投与することを含むことができる。任意の特定の例で投与される量は、化合物の薬力学的性質、投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態および体重、症状の性質および範囲、同時治療の種類、治療頻度、所望する効果、の様な因子に依存するであろう。
【００５４】
本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約１μｇ−約１０ｇ／日の範囲であろうと考えられる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約１０ｍｇ−約１ｇ／日の範囲であろう。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約１００ｍｇ−約５００ｍｇ／日の範囲であろう。本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約１μｇ−約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、いくつかの実施態様では、約１μｇ−約４０ｍｇ／ｋｇ体重であり、ある実施態様では、約１０μｇ−約２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施態様では、１０μｇ−約１ｍｇ／ｋｇ体重である、と考えられる。
【００５５】
医薬組成物は、一回投与で、分割投与で、または放出持続で、投与されることができる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物は，１日当たり複数回の投与で投与されるであろう。ある好ましい実施態様では、化合物は，１日当たり３−４回投与で投与されるであろう。
【００５６】
当業者らは、投与形および投与量を、本発明の検討に基づく１回のみの日常実験で決定することができるであろう。
化合物投与法には、カプセル、錠剤および粉末の様な固体投与形、またはエレクシル、シロップおよび乳濁液のような液体投与形で、経口の医薬組成物としての投与を含む。また、化合物を、無菌液体投与形、非経口で、またはキャリヤー内で局所的に、投与することができる。化合物を、医薬調製物の分野で標準的な習慣に従って、投与形内に調合することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ここに参照として採用する）を参照のこと。
【００５７】
化合物を、ゼラチンカプセル内に挿入するため、または錠剤を形成するために、ラクトース、スクロース、マンニトール、スターチ、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸のような粉末状キャリヤーと混合することができる。錠剤およびカプセルは両方とも、１時間以上にわたって、薬剤を連続放出する持続性放出生成物として、製造することができる。
【００５８】
経口投与用の液体投与形は、水、バッファーまたは食塩水の様な医薬として許容しうる希釈剤に加えて、患者受けを増すための着色剤および香味剤を含むことができる。
【００５９】
非経口投与では、化合物を、水、油脂、食塩水、水性デキストロース（グルコース）および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、のようなキャリヤーまたは希釈液と混合することができる。非経口投与の溶液は、好ましくは、化合物の水溶性塩を含む。安定剤、抗酸化剤および保存剤もまた、加えることができる。適当な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸、クエン酸およびその塩、およびＥＤＴＡナトリウムを含む。適当な保存剤は、塩化ベンズアルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールを含む。
実施例３
本発明の一つの実施態様では、ＣＩＡＭ技術を用いて、ＣＤ４とＭＨＣ／抗原／ＴＣＲ複合体の間の相互作用を阻害する化合物を同定する。
【００６０】
ＣＤ４を阻害することによって、ＭＨＣ／抗原／ＴＣＲ複合体と関連するＴ細胞の活性化を減少させることができ、それ故に、免疫応答が抑制された。ＣＤ４複合体の結晶構造は、明確な結合部位を示している。
【００６１】
ペプチド疑似体を、ＣＤ４の表面ループから開発し試験した。ＣＤ４ドメインから工作されたペプチド疑似体は、ＭＨＣ／抗原／ＴＣＲ複合体と関連するＴ細胞の活性化を阻害した。
【００６２】
ペプチド疑似体を用いて同定した機能的に活性なアミノ酸配列の位置を用いて、ＣＤ４分子の表面を再検討し、偽りのアロステリックインヒビターをドッキングするための用いることのできた大きな割れ目を同定した。腔内部をマッピングし、化学データベースをサーチした。−３４Ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを持ち、式ＩＶを持つ化合物を同定した。Ｓａｌｏｒ／Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ＃Ｓ６９，２４６−８）から市販されているこの化合物は、インビトロでのＴ細胞活性化アッセイで活性を示した。
【００６３】
医薬組成物を、「式」と題した以下の節に示した式ＩＶ、ＶまたはＶＩの化合物を用いて調製した。医薬組成物は、ＣＤ４−仲介疾病、障害および状態に苦しむ個人の治療に有用である。ＣＤ４−仲介疾病、障害および状態の例としては、例えば、炎症性疾病、ならびに、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ） 、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節症、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病、潰瘍性大腸炎、狼瘡（ＳＬＥ）、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、ぜん息、クリオグロブリン血症、原発性胆管硬化症および悪性貧血のような自己免疫病、が含まれる。本発明に従って、そのような疾病、障害および状態に苦しむ個人を、式ＩＶ、Ｖ又はＶＩのいずれかを持つ化合物を含む治療上有効な量の医薬組成物を彼らに投与することにより、治療することができる。
【００６４】
方法には、哺乳動物、好ましくはヒトへの、ＣＤ４−仲介疾病の阻害に効果的な治療上有効な量の化合物の投与が含まれる。任意の特定の例で投与される投与量は、化合物の薬力学的特性、その投与様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および範囲；同時治療の種類；治療の頻度、および所望する効果、のような因子に依存するであろう。
【００６５】
本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約１μｇ−約１０ｇ／日の範囲であろうと考えられる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約１０ｍｇ−約１ｇ／日の範囲であろう。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約１００ｍｇ−約５００ｍｇ／日の範囲であろう。本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約１μｇ−約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、いくつかの実施態様では、約１μｇ−約４０ｍｇ／ｋｇ体重であり、ある実施態様では、約１０μｇ−約２０ｍｇ／ｋｇ／日であり、いくつかの実施態様では、１０μｇ−約１ｍｇ／ｋｇ／日であろう、と考えられる。
【００６６】
医薬組成物は、一回投与、分割投与または持続放出で、投与されることができる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物は、１日当たり複数回の投与で投与するであろう。ある好ましい実施態様では、化合物は１日当たり３−４回投与で投与される。
【００６７】
当業者らは、投与形および投与量を、本発明の検討に基づく１回のみの日常実験で決定することができるであろう。
化合物投与法には、カプセル、錠剤および粉末の様な固体投与形、またはエレクシル、シロップおよび乳濁液のような液体投与形で、経口の医薬組成物としての投与が含まれる。また、化合物を、無菌液体投与形、非経口で、またはキャリヤー内で局所的に、投与することができる。化合物を、医薬調製物の分野で標準的な習慣に従って、投与形内に調合することもできる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ここに参照として採用する）を参照のこと。
【００６８】
化合物を、ゼラチンカプセル内に挿入するため、または錠剤を形成するために、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸のような粉末状キャリヤーと混合することができる。錠剤およびカプセルは両方とも、１時間以上にわたって、薬剤を連続放出する持続性放出生成物として、製造することができる。
【００６９】
経口投与用の液体投与形は、水、バッファーまたは食塩水の様な医薬として許容しうる希釈剤に加えて、患者受けを増すために着色剤および香味剤を含むことができる。
【００７０】
非経口投与では、化合物を、水、油脂、食塩水、水性デキストロース（グルコース）および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、のようなキャリヤーまたは希釈液と混合することができる。非経口の投与溶液は、好ましくは、化合物の水溶性塩を含む。安定剤、抗酸化剤および保存剤もまた、加えることができる。適当な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸、クエン酸およびその塩、およびＥＤＴＡナトリウムを含む。適当な保存剤は、塩化ベンズアルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールを含む。
実施例４
本発明の一つの実施態様では、ＣＩＡＭ技術を用いて、β−ラクタマーゼを阻害する化合物を同定する。酵素β−ラクタマーゼの阻害は、細菌のペニシリン耐性株をペニシリン感受性にするために有用である。β−ラクタマーゼの活性部位から近い上記の診断基準を持つ腔を、β−ファクターおよび薬効分析によって同定した。
【００７１】
β−ラクタマーゼ分子の表面を再調査し、アロステリックインヒビターのドッキングに利用することのできる近位の適当な割れ目を同定した。腔をマッピングし、化学データベースをサーチした。一連の化合物を同定した。これらの化合物を、「式」と題した以下の節に、式ＶII−ＸＩＸとして示した。それらは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ；ｗｗｗ，ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，ｃｏｍ．）、Ｓｉｇｍａ（ｗｗｗ，ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，ｃｏｍ．）、Ｆｌｕｋａ（ｗｗｗ，ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，ｃｏｍ）、ＩＣＮ（ｗｗｗ．ｉｃｎｐｈａｒｍ，ｃｏｍ）、Ｒｙａｎ  Ｓｃｉｅｎｉｆｉｃ（Ｉｓｌｅ  ｏｆ  Ｐａｌｍｓ，ＳＣ）、ＳｙｎＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢａｙｅｒ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ｗｗｗ，ｂａｙｅｒ，ｃｏｍ）を含むさまざまな供給会社から市販されている。
【００７２】
医薬組成物を、式ＶII−ＸＩＸの群より選択された化合物の一つを用いて、調製する。医薬組成物は、細菌感染症、特に、ペニシリン耐性であるそれら、に苦しむ個人の治療に有用である。本発明に従って、そのような感染症に苦しむ個人を、ペニシリン−誘導抗生物質と組み合わせて、式ＶII、ＶIII 、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸII、ＸIII、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶII、ＸＶIIIまたはＸＩＸを持つ化合物を含む治療上有効量の医薬組成物を、かれらに投与することによって治療することができる。
【００７３】
方法は、細菌のペニシリン耐性株をペニシリン感受性にするために、β−ラクタマーゼの阻害に有用な治療上有効量の化合物を、哺乳動物、好ましくはヒト、に投与することを含むことができる。任意の特定の例で投与される投与量は、化合物の薬効特性、その投与様式および経路、レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および範囲；同時治療の種類、治療頻度、および所望する効果、の様な因子に依存するであろう。
【００７４】
発明の方法に用いられる化合物の毎日投与量は、約１μｇ−約１０ｇ／日の範囲であろうと考えられる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約１０ｍｇ−約１ｇ／日の範囲であろう。いくつかの好ましい実施態様では、化合物の毎日の投与量は、約１００ｍｇ−約５００ｍｇ／日の範囲であろう。本発明の方法に用いられる化合物の毎日の投与量は、約１μｇ−約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、いくつかの実施態様では、約１μｇ−約４０ｍｇ／ｋｇ体重であり、ある実施態様では、約１０μｇ−約２０ｍｇ／ｋｇ／日であり、いくつかの実施態様では、１０μｇ−約１ｍｇ／ｋｇ／日である、と考えられる。
【００７５】
医薬組成物は、一回投与で、分割投与で、または持続放出で、投与することができる。いくつかの好ましい実施態様では、化合物を１日当たり複数回の投与で投与するであろう。ある好ましい実施態様では、化合物は、１日当たり３−４回投与で投与されるであろう。
【００７６】
当業者らは、投与形および投与量を、本発明の検討に基づく１回のみの日常実験で決定することができるであろう。
化合物投与法には、カプセル、錠剤および粉末の様な固体投与形、またはエレクシル、シロップおよび乳濁液のような液体投与形で、経口の医薬組成物としての投与を含む。また、化合物を、無菌液体投与形、非経口で、またはキャリヤー内で局所的に、投与することができる。化合物を、医薬調製物の分野で標準的な習慣に従って、投与形内に調合することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（ここに参照として採用する）を参照のこと。
【００７７】
化合物を、ゼラチンカプセル内に挿入するため、または錠剤を形成するために、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸のような粉末状キャリヤーと混合することができる。錠剤およびカプセルは両方とも、１時間以上にわたって、薬剤を連続放出する持続性放出生成物として、製造することができる。
【００７８】
経口投与用の液体投与形は、水、バッファーまたは食塩水の様な医薬として許容しうる希釈剤に加えて、患者受けを増すための着色剤および香味剤を含むことができる。
【００７９】
非経口投与では、化合物を、水、油脂、食塩水、水性デキストロース（グルコース）および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール、のようなキャリヤーまたは希釈液と混合することができる。非経口投与用溶液は、好ましくは、化合物の水溶性塩を含む。安定剤、抗酸化剤および保存剤もまた、加えることができる。適当な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、およびアスコルビン酸、クエン酸およびその塩、およびＥＤＴＡナトリウムが含まれる。適当な保存剤には、塩化ベンズアルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールが含まれる。
【００８０】
いくつかの実施態様では、本発明の方法に用いられる本発明の医薬組成物は、式ＶII−ＸＶＩを持つ式を含む。
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＶIIを持つ化合物を含む。
【００８１】
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＶIIIを持つ化合物を含む。
式ＶIII の化合物は、Ｒ1 位に、「式」と題した以下の節に示す、式８−１−１、８−１−２、９−１−３、８−１−４、８−１−５、８−１−６、８−１−７、８−１−８、８−１−９および８−１−１０を持つ基を持つことができる。
【００８２】
式ＶIII の化合物は、Ｒ2位とＲ2位に、独立的に、−Ｈ、−Ｃ1、−Ｃ2、−Ｃ3直鎖または分枝鎖、−Ｃ4直鎖または分枝鎖、−Ｃ5 直鎖または分枝鎖、−Ｃ6直鎖または分枝鎖、−Ｃ7直鎖または分枝鎖、−Ｃ8 直鎖または分枝鎖を持つことができる。Ｒ2とＲ3は、好ましくは、互いに同一である。Ｒ2とＲ3は、好ましくは、−Ｈまたは−Ｃ8分枝４−ｔｅｒｔ−オクチルである。
【００８３】
式ＶIII のいくつかの好ましい化合物には、
Ｒ1は８−１−１であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−１であり、Ｒ2は４−ｔｅｒｔ−オクチルであり、そしてＲ3 は４−ｔｅｒｔ−オクチルである；
Ｒ1は８−１−２であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−３であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−４であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−５であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−６であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−７であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−８であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
Ｒ1は８−１−９であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；そして、
Ｒ1は８−１−１０であり、Ｒ2は−Ｈであり、そしてＲ3は−Ｈである；
化合物が含まれる。
【００８４】
いくつかの好ましい式ＶIII 化合物は、「式」と題された以下の節に示す、構造ＶIII−Ａ、ＶIII−Ｂ、ＢIII−Ｃ、ＶIII−Ｄ、ＶIII−Ｅ、ＢIII−Ｆ、ＶIII−Ｇ、ＶIII−Ｈ、ＢIII−Ｉ、ＶIII−ＪまたはＶIII−Ｋを含む。
化合物      源                    カタログ番号
VIII-A      ALDRICH              Ｆ２８，１６８−９
VIII-B      ALDRICH              ２５，７６２−１
VIII-C      SIGMA-ALDRICH        Ｓ６８，０７３−７
VIII-D      SIGMA-ALDRICH        Ｓ１５，４９０−３
VIII-E      SIGMA-ALDRICH        Ｓ１５，４９５−４
VIII-F      SIGMA-ALDRICH        Ｓ１５，４９８−９
VIII-G      SIGMA-ALDRICH        Ｓ１５，５０４−０
VIII-H      SIGMA-ALDRICH        Ｓ１５，５０５−５
VIII-I      SIGMA-ALDRICH        Ｒ１７，７１２−１
VIII-J      SIGMA-ALDRICH        Ｒ１７，２７１−５
VIII-K      SIGMA-ALDRICH        Ｒ１７，７０３−２
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＩＸを持つ化合物を含む。
【００８５】
式ＩＸは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4位に、独立的に、−Ｈ、０Ｃ6Ｈ5Ｃｌ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3、−ＯＨまたは−ハロゲン、を持ち、もしハロゲンであれば、Ｃｌが好ましい。いくつかの実施態様では、Ｒ1は−ＯＣＨ3、−ＯＨまたはハロゲンであり、もしハロゲンであれば、−Ｃｌが好ましい。いくつかの実施態様では、Ｒ2は−Ｈ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3または−ハロゲンであり、もしハロゲンであれば−Ｃｌが好ましい。いくつかの実施態様では、Ｒ3 は、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3、−ＯＨまたは−ハロゲンであり、もしハロゲンであれば、好ましくは−Ｃｌである。いくつかの実施態様では、Ｒ4 は、−ＯＣ6Ｈ5Ｃｌ、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3または−ＯＨである。
【００８６】
いくつかの好ましい式ＩＸ化合物は：
Ｒ1が−Ｃｌであり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−Ｃｌであり、Ｒ4がＯＣ6Ｈ5Ｃｌである；
Ｒ1が−Ｎ（ＣＨ3）2であり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−Ｃｌであり、Ｒ4が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−ＯＣＨ3であり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−ＯＣＨ3であり、Ｒ4が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−Ｃｌであり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−Ｃｌであり、Ｒ4が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−Ｃｌであり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−ＣＨ3 であり、Ｒ4が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−ＯＣＨ3 であり、Ｒ2が−Ｃｌであり、Ｒ3が−Ｈであり、Ｒ4が−ＯＨである；
Ｒ1が−０Ｈであり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−Ｃｌであり、Ｒ4が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−ＯＣＨ3であり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−ＣＨ3であり、Ｒ4が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−Ｃｌであり、Ｒ2が−Ｃｌであり、Ｒ3が−ＯＣＨ3であり、Ｒ4 が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−Ｃｌであり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−ＯＣＨ3であり、Ｒ4 が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−ＯＣＨ3であり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−ＯＣＨ3であり、Ｒ4が−ＯＣＨ3である；
Ｒ1が−ＯＣＨ3であり、Ｒ2が−ＣＨ3であり、Ｒ3が−Ｃｌであり、Ｒ4が−Ｈである；
Ｒ1が−０Ｈであり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−Ｃｌであり、Ｒ4 が−ＣＨ3である；
Ｒ1が−ＯＣＨ3であり、Ｒ2が−ＯＣＨ3であり、Ｒ3が−ＯＨであり、Ｒ4が−Ｈである：
化合物を含む。
【００８７】
いくつかの好ましい式ＩＸ化合物は、「式」と題された以下の節に示す、構造ＩＸ−Ａ、ＩＸ−Ｂ、ＩＸ−Ｃ、ＩＸ−Ｄ、ＩＸ−Ｅ、ＩＸ−Ｆ、ＩＸ−Ｇ、ＩＸ−Ｈ、ＩＸ−Ｉ、ＩＸ−Ｊ、ＩＸ−Ｋ、ＩＸ−Ｌ、ＩＸ−ＭまたはＩＸ−Ｎを含む。
化合物      源                    カタログ番号
IX-A        SIGMA-ALDRICH        Ｓ５０，８７２−１
IX-B        SIGMA-ALDRICH        Ｓ６９，０４４−９
IX-C        SIGMA-ALDRICH        Ｓ６９，６１３−７
IX-D        SIGMA-ALDRICH        Ｓ６９，５１６−５
IX-E        SIGMA-ALDRICH        Ｓ１２，９３１−３
IX-F        SIGMA-ALDRICH        Ｓ７２，３１５−０
IX-G        SIGMA-ALDRICH        Ｓ６９，０５５−４
IX-H        SIGMA-ALDRICH        Ｓ７６，８７２−３
IX-I        SIGMA-ALDRICH        Ｓ９０，３６９−８
IX-J        SIGMA-ALDRICH        Ｓ９０，３７０−１
IX-K        SIGMA-ALDRICH        Ｓ７４，２９９−６
IX-L        SIGMA-ALDRICH        Ｓ７２，９５６−６
IX-M        SIGMA-ALDRICH        Ｓ９１，７２８−１
IX-N        SIGMA-ALDRICH        Ｓ９１，７３０−３
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式Ｘを持つ化合物を含む。
【００８８】
式Ｘに従った化合物は、Ｒ1 位に、「式」と題した以下の節に示す、式１０−１−１、１０−１−２または１０−１−３を持つ基を持つことができる。
式Ｘに従った化合物は、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4位に、独立的に、−Ｈ、−ＮＯ2、−ＮＨ2または−ＣＨ3を持ち、Ｒ2は好ましくは−Ｈまたは−ＮＨ2である。Ｒ3 は、好ましくは、−ＮＯ2または−ＮＨ2である。Ｒ4 は、好ましくは、−Ｈまたは−ＣＨ3である。
【００８９】
いくつかの好ましい式Ｘ化合物は：
Ｒ1が１０−１−１であり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−ＮＯ2であり、Ｒ4 が−Ｈである；
Ｒ1が１０−１−２であり、Ｒ2が−Ｈであり、Ｒ3が−ＮＯ2であり、Ｒ4 が−Ｈである；および、
Ｒ1が１０−１−３であり、Ｒ2が−ＮＨ2であり、Ｒ3が−ＮＨ2であり、Ｒ4が−ＣＨ3である：
化合物を含む。
【００９０】
いくつかの好ましい式Ｘ化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造Ｘ−Ａ、Ｘ−ＢまたはＸ−Ｃを含む。
化合物      源                  カタログ番号
Ｘ-Ａ      RYAN SCIENTIFIC      ＮＲＢ０１１５０
Ｘ-Ｂ      SIGMA                Ｓ９３，０５６−３
Ｘ-Ｃ      ALDRICH              ２１，２２２−９
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸＩを持つ化合物を含む。
【００９１】
式ＸＩに従った化合物は、Ｒ1およびＲ2位に、独立的に、「式」と題した以下の節に示す、式１１−１／２−１、１１−１／２−２、１１−１／２−３、１１−１／２−４、または−Ｈ、−ＮＯ2 あるいは−ＯＨを持つ基を持つことができる。
【００９２】
式ＸＩに従った化合物は、Ｒ3位に、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨまたはハロゲンのいずれかを持つことができ、Ｒ3 がハロゲンである場合には、−Ｃｌまたは−Ｂｒが好ましい。
【００９３】
式ＸＩに従った化合物は、Ｒ3位に、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨまたはハロゲンのいずれかを持つことができ、Ｒ3がハロゲンである場合、−Ｃｌまたは−Ｂｒが好ましい。
【００９４】
式ＸＩに従った化合物は、Ｒ4位に、−Ｈまたは−ＣＨ（ＣＨ3）3のいずれかを持つことができる。
いくつかの好ましい式ＸＩ化合物は：
Ｒ1は１１−１／２−１であり、Ｒ2は１１−１／２−１であり、Ｒ3 は−Ｈであり、Ｒ4は−Ｈである；
Ｒ1は１１−１／２−２であり、Ｒ2は１１−１／２−２であり、Ｒ3 は−ＮＨ2であり、Ｒ4は−Ｈである；
Ｒ1は１１−１／２−３であり、Ｒ2は１１−１／２−３であり、Ｒ3 は−Ｃｌであり、Ｒ4は−Ｈである；
Ｒ1は１１−１／２−４であり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3 は−ＮＯ2であり、Ｒ4は−Ｈである；
Ｒ1は−ＮＯ2であり、Ｒ2は−ＯＨであり、Ｒ3が−ＯＨであり、Ｒ4 が−Ｈである：
化合物を含む。
【００９５】
いくつかの好ましい式ＸＩ化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造ＸＩ−Ａ、ＸＩ−Ｂ、ＸＩ−Ｃ、ＸＩ−ＤまたはＸＩ−Ｅを含む。
化合物      源                    カタログ番号
XI-A        SIGMA-ALDRICH        Ｓ１８，９８２−０
XI-B        SIGMA-ALDRICH        Ｓ１８，６１１−２
XI-C        SIGMA                Ｓ３，６３４−０
XI-D        SIGMA                Ｓ８６，９２７−９
XI-E        SIGMA                Ｓ５３，６２２−９
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸIIを持つ化合物を含む。
【００９６】
式ＸIIに従った化合物は、Ｒ1 位に、「式」と題した以下の節に示したＮ−ピリジニウム、４−メチル−Ｎ−ピリジニウム、４−ジメチルアミノ−Ｎ−ピリジニウム、３−メチル−Ｎ−ピリジニウム、Ｎ−ピリジニウム、２，６ジメチル−Ｎ−ピリジニウム、３，５ジメチル−Ｎ−ピリジニウム、３−エチル−Ｎ−ピリジニウム、１２−１−１、１２−１−２、または、４−エチル−Ｎ−ピリジニウム、４−ベンジル−Ｎ−ピリジニウム、Ｎ−キノリニルあるいはＣＨ3 を持つことができる。
【００９７】
いくつかの好ましい式ＸII化合物には：
Ｒ1はＮ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は４−メチル−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は４−ジメチルアミノ−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は３−メチル−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1はＮ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は２，６ジメチル−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は３，５ジメチル−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は３−エチル−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は１２−１−１であり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は１２−１−２であり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は４−エチル−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1は４−ベンジル−Ｎ−ピリジニウムであり、Ｒ2はＮＯ2である；
Ｒ1はＮ−キノリニルであり、Ｒ2はＮＯ2である；そして、
Ｒ1はＣＨ3であり、Ｒ2はＨである：
化合物が含まれる。
【００９８】
いくつかの好ましい式ＸII化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造ＸII−Ａ、ＸII−Ｂ、ＸII−Ｃ、ＸII−Ｄ、ＸII−Ｅ、ＸII−Ｆ、ＸII−Ｇ、ＸII−Ｈ、ＸII−Ｉ、ＸII−Ｊ、ＸII−Ｋ、ＸII−Ｌ、ＸII−ＭまたはＸII−Ｎを含む。
化合物      源                  カタログ番号
XII-A      SIGMA                Ｓ１４，３１８−９
XII-B      SIGMA                Ｓ９６，６７６−２
XII-C      SIGMA                Ｓ１４，４４０−１
XII-D      SIGMA                Ｓ９６，６６４−９
XII-E      SIGMA                Ｓ９６，６６８−１
XII-F      SIGMA                Ｓ９６，６７０−３
XII-G      SIGMA                Ｓ１４，３８６−３
XII-H      SIGMA                Ｓ９６，６７４−６
XII-I      SIGMA                Ｓ９６，６８２−７
XII-J      SIGMA                Ｓ９６，６７７−０
XII-K      SIGMA                Ｓ９６，６７９−７
XII-L      SIGMA                Ｓ９６，６８５−１
XII-M      SIGMA                Ｓ１４，６７５−７
XII-N      SIGMA-ALDRICH        Ｓ６７，９５４−２
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、「式」と題した以下の節に示す、式ＸIII を持つ化合物を含む。式ＸIII を持つ化合物は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログ番号Ｓ４２，５９１−５、から入手可能である。
【００９９】
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸＩＶを持つ化合物を含む。
式ＸＩＶに従った化合物は、Ｒ1 位に、−ＯＣＨ3、−ＮＯ2または−ハロゲンのいずれかを持つことができ、もし−ハロゲンであるならば、−Ｃｌが好ましい。
【０１００】
式ＸＩＶに従った化合物は、Ｒ2位に、−Ｈ、−ＮＯ2または−ハロゲンのいずれかを持つことができ、もし−ハロゲンであるならば、−Ｃｌが好ましい。
いくつかの好ましい式ＸＩＶ化合物は：
Ｒ1は−Ｃｌであり、Ｒ2は−Ｃｌである；
Ｒ1は−ＯＣＨ3であり、Ｒ2は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｃｌであり、Ｒ2は−Ｈである；そして、
Ｒ1は−ＮＯ2であり、Ｒ2は−ＮＯ2である：
化合物を含む。
【０１０１】
いくつかの好ましい式ＸＩＶ化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造ＸＩＶ−Ａ、ＸＩＶ−Ｂ、ＸＩＶ−ＣまたはＸＩＶ−Ｄを含む。
化合物      源                          カタログ番号
XIV-A      SIGMA                      Ｓ６，８８６−２
XIV-B      SIGMA                      Ｓ１２，７０３−５
XIV-C      SIGMA                      Ｓ６２，３２１−０
XIV-D      SIGMA                      Ｓ２４，２３２−２
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸＶを持つ化合物を含む。
【０１０２】
式ＸＶに従った化合物は、Ｒ1 位に、「式」と題した以下の節に示す、−Ｈ、−ＮＯ2、−ＦＳＯ2、−ＣＨ3、−ＯＣＨ3、−ＳＯ2ＣＨ3、１５−１−１、１５−１−２または１５−１−３のいずれかを持つことができる。
【０１０３】
式ＸＶに従った化合物は、Ｒ2位に、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＮＯ2のいずれかを持つことができる。
式ＸＶに従った化合物は、Ｒ3 位に、−Ｈまたは−ＯＨのいずれかを持つことができる。
【０１０４】
式ＸＶに従った化合物は、Ｒ4 位に、「式」と題した以下の節に示す、−Ｈ、１５−４−１、１５−４−２、１５−４−３、１５−４−４、１５−４−５、１５−４−６、１５−４−７、１５−４−８、１５−４−９、１５−４−１０、１５−４−１１、１５−４−１２またはハロゲンを持つことができ、Ｒ4 がハロゲンである場合−Ｃｌが好ましい。
【０１０５】
いくつかの好ましい式ＸＶ化合物は：
Ｒ1は−ＮＯ2であり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4 は−Ｃｌである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＯＨであり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4は１５−４−１である；
Ｒ1は−ＦＳＯ2であり、Ｒ2は−ＮＯ2であり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4は−Ｈである；
Ｒ1は１５−１−１であり、Ｒ2は−ＮＯ2であり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4 は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4は１５−４−２である；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4は１５−４−３である；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4は１５−４−５である；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＯＨであり、Ｒ3は−ＯＣＨ3であり、Ｒ4 は１５−４−６である；
Ｒ1は−ＯＣＨ3であり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4 は１５−４−７である；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4は１５−４−８である；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4は１５−４−９である；
Ｒ1は−ＯＣＨ3であり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4 は１５−４−１０である；
Ｒ1は−ＦＳＯ2であり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4 は１５−４−１である；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4は１５−４−１２である；
Ｒ1は−ＳＯ2ＣＨ3であり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4は−Ｈである；
Ｒ1は１５−１−２であり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4は−Ｈである；そして、
Ｒ1は１５−１−３であり、Ｒ2は−ＮＯ2であり、Ｒ3は−ＯＨであり、Ｒ4 は−Ｈである：
化合物を含む。
【０１０６】
いくつかの好ましい式ＸＶ化合物は、「式」と題した以下の節に示した、構造ＸＶ−Ａ、ＸＶ−Ｂ、ＸＶ−Ｃ、ＸＶ−Ｄ、ＸＶ−Ｅ、ＸＶ−Ｆ、ＸＶ−Ｇ、ＸＶ−Ｈ、ＸＶ−Ｉ、ＸＶ−Ｊ、ＸＶ−Ｋ、ＸＶ−Ｌ、ＸＶ−Ｍ、ＸＶ−Ｎ、ＸＶ−Ｏ、ＸＶ−Ｐ、ＸＶ−ＱまたはＸＶ−Ｒを含む。
化合物      源                          カタログ番号
XV-A        SIGMA                      Ｓ７２，７６７−９
XV-B        SIGMA                      Ｓ７２，７７２−５
XV-C        SIGMA                      Ｓ７３，６８９−９
XV-D        BAYER CORP.                ２５／０８
XV-E        SIGMA                      Ｓ５０，２４５−６
XV-F        SIGMA                      Ｓ６５，５０７−４
XV-G        SIGMA                      Ｓ７８，０７２−３
XV-H        SIGMA                      Ｓ７９，４２６−０
XV-I        SIGMA                      Ｓ７９，４５３−８
XV-J        SIGMA                      Ｓ８０，０１２−０
XV-K        SIGMA                      Ｓ８４，４８６−１
XV-L        RYAN                       ＮＲＢ０１４２９
XV-M        SIGMA                      Ｓ９２，４０７−５
XV-N        SIGMA                      Ｓ７２，７８１−４
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸＶＩを持つ化合物を含む。
【０１０７】
式ＸＶＩに従った化合物は、Ｒ1位に、−Ｈ、−ＳＯ3またはハロゲンのいずれかを持つことができ、ハロゲンである場合−Ｃｌが好ましい。
式ＸＶＩに従った化合物は、Ｒ2位に、−Ｈまたは−ＣＨ3のいずれかを持つことができる。
【０１０８】
式ＸＶＩに従った化合物は、Ｒ3 位に、「式」と題した以下の節に示した、−Ｈ、−ＯＣＨ3、−ＮＳＯ2、−ＮＯ2、１６−３−１またはハロゲンのいずれかを持ち、Ｒ3がハロゲンである場合、−Ｃｌが好ましい。
【０１０９】
式ＸＶＩに従った化合物は、Ｒ4 位に、−Ｈ、−ＯＣＨ3、−ＳＯ3、またはハロゲンのいずれかを持ち、Ｒ4がハロゲンである場合、−Ｃｌが好ましい。
式ＸＶＩに従った化合物は、Ｒ5位に、−Ｈ、−ＮＯ2またはハロゲンのいずれかを持ち、Ｒ5がハロゲンである場合、−Ｃｌが好ましい。
【０１１０】
式ＸＶＩに従った化合物は、Ｒ6位に、−Ｈ、−Ｏ（ＣＨ3）2またはフェニルのいずれかを持つ。
いくつかの好ましい式ＸＶＩ化合物は：
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は−ＯＣＨ3であり、Ｒ4は−ＯＣＨ3であり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は−ＮＳＯ2であり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は−０ＣＨ2であり、Ｒ4は−Ｃｌであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−ＮＳＯ3であり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は−ＯＣＨ３であり、Ｒ4は−ＳＯ3であり、Ｒ5は−ＮＯ２であり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−Ｃｌであり、Ｒ4は−Ｃｌであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は−Ｆであり、Ｒ4 は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3 であり、Ｒ3は１６−３−１であり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3 であり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｃ（ＣＨ3）2である；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は−ＯＣＨ3であり、Ｒ4は−ＯＣＨ3であり、Ｒ5は−Ｃｌであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3 であり、Ｒ3は−Ｆであり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｃｌであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；
Ｒ1は−Ｃｌであり、Ｒ2は−Ｈであり、Ｒ3は−ＯＣＨ3 であり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6は−Ｈである；または
Ｒ1は−Ｈであり、Ｒ2は−ＣＨ3であり、Ｒ3は−Ｈであり、Ｒ4は−Ｈであり、Ｒ5は−Ｈであり、Ｒ6はフェニルである；
化合物を含む。
【０１１１】
いくつかの好ましい式ＸＶＩ化合物は、「式」と題した以下の節に示す、構造ＸＶＩ−Ａ、ＸＶＩ−Ｂ、ＸＶＩ−Ｃ、ＸＶＩ−Ｄ、ＸＶＩ−Ｅ、ＸＶＩ−Ｆ、ＸＶＩ−Ｇ、ＸＶＩ−Ｈ、ＸＶＩ−Ｉ、ＸＶＩ−Ｊ、ＸＶＩ−Ｋ、ＸＶＩ−Ｌ、ＸＶＩ−ＭまたはＸＶＩ−Ｎを含む。
化合物      源                          カタログ番号
XVI-A      SIGMA                      Ｓ５３，０６５−４
XVI-B      SYNTEC，ドイツ             ＳＴ  ５８／４
XVI-C      SIGMA                      Ｓ６２，９３７−５
XVI-D      SIGMA                      Ｓ５０，１９１−３
XVI-E      SIGMA                      Ｓ２１，２１０−５
XVI-F      SIGMA                      Ｓ２１，２１２−１
XVI-G      SIGMA                      Ｓ６，９６５−６
XVI-H      SIGMA                      Ｓ６，９７１−０
XVI-I      SIGMA                      Ｓ７，００２−６
XVI-J      SIGMA                      Ｓ２１，２２５−３
XVI-K      SIGMA                      Ｓ２１，２３４−２
XVI-L      SIGMA                      Ｓ２１，２４１−５
XVI-M      SIGMA                      Ｓ２１，２４３−１
XVI-N      SIGMA                      Ｓ６３，２６３−５
XVI-O      SIGMA                      Ｓ２１，２１２−１
XVI-P      SIGMA                      Ｓ３８，９１６−１
XVI-Q      SIGMA                      Ｓ５０，２４２−０
XVI-R      SIGMA                      Ｓ６２，９７９−０
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸＶIIを持つ化合物（ＳＩＧＭＡ  Ｓ８６，９２７−９）を含む。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸＶIIIを持つ化合物（ＲＹＡＮ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  Ｅ１９１Ｂ）を含む。
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、式ＸＩＸを持つ化合物（ＳＩＧＭＡ  Ｓ１２，９６２−３）を含む。
【０１１３】
【表１】
0004401025.tif 000002
【０１１４】
【表２】
0004401025.tif 000003
【０１１５】
【表３】
0004401025.tif 000004
【０１１６】
【表４】
0004401025.tif 000005
【０１１７】
【表５】
0004401025.tif 000006
【０１１８】
【表６】
0004401025.tif 000007
【０１１９】
【表７】
0004401025.tif 000008
【０１２０】
【表８】
0004401025.tif 000009
【０１２１】
【表９】
0004401025.tif 000010
【０１２２】
【表１０】
0004401025.tif 000011
【０１２３】
【表１１】
0004401025.tif 000012
【０１２４】
【表１２】
0004401025.tif 000013
【０１２５】
【表１３】
0004401025.tif 000014
【０１２６】
【表１４】
0004401025.tif 000015
【０１２７】
【表１５】
0004401025.tif 000016
【０１２８】
【表１６】
0004401025.tif 000017
【０１２９】
【表１７】
0004401025.tif 000018
【０１３０】
【表１８】
0004401025.tif 000019
【０１３１】
【表１９】
0004401025.tif 000020
【０１３２】
【表２０】
0004401025.tif 000021
【０１３３】
【表２１】
0004401025.tif 000022
【０１３４】
【表２２】
0004401025.tif 000023
【０１３５】
【表２３】
0004401025.tif 000024
【０１３６】
【表２４】
0004401025.tif 000025
【０１３７】
【表２５】
0004401025.tif 000026
【０１３８】
【表２６】
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【０１３９】
【表２７】
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【０１４０】
【表２８】
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【０１４１】
【表２９】
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【０１４２】
【表３０】
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【０１４３】
【表３１】
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【０１４４】
【表３２】
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【０１４５】
【表３３】
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【０１４６】
【表３４】
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【０１４７】
【表３５】
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【０１４８】
【表３６】
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【０１４９】
【表３７】
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【０１５０】
【表３８】
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【０１５１】
【表３９】
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【０１５２】
【表４０】
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【０１５３】
【表４１】
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【０１５４】
【表４２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＡおよびＢは、ＴＮＦレセプターの第三ドメインの構造を示している。Ａは、結合部位付近のシステイン−ノットループ（ＷＰ９）および腔の位置を示している。矢印で示された分子部分は、ペプチド疑似体を設計するための鋳型として用いられたループを示している。Ｂは、アンタゴニストペプチドによるＬ９２９細胞のＴＮＦ−α誘導による細胞溶解の阻害を示している。１ｍｇ／ｍｌのＡＣＴ−Ｄのみ、およびＡＣＴ−Ｄ＋５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦαで得られた吸光度を、それぞれ１００％生存および１００％細胞毒性と考えた。結果は、３回の独立実験から誘導された平均および標準偏差を示している。
【図２】  Ａ、ＢおよびＣは、ＴＮＦレセプターの第三ドメインの小データベースサーチから得られた予備結果を示している。鮮明さのために、レセプタードメインのみを示す。Ａは、ＴＮＦレセプターのＷＰ９腔を示している。Ｂは、分子ｓ７が、如何なる化学的最適化も行わずに−４０Ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーを持つ複合体を形成することを示している。この化合物はリガンドの最大結合を化学的に変化させないので、リガンドの反応速度論は行わなかった。Ｃは、ペプチド疑似体に類似したアポトーシスアッセイで試験した場合の結果、例えば、３００μＭ濃度で約２０％保護、を示している。
【図１】
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【図２】
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