(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト神経芽細胞腫の臨床組織から、予後不良なヒト神経芽細胞腫と比較して、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強される核酸を検出するための検出キットであって、配列表の配列番号３８の配列からなる核酸を増幅する一組のＰＣＲプライマーを含むことを特徴とする、検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト神経芽細胞腫において発現する遺伝子に由来する核酸類に関する。さらに詳しくは、本発明は、予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されている遺伝子に由来する核酸およびその断片、並びにヒト神経芽細胞腫の予後の診断への用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
個々の腫瘍にはそれぞれの個性があり、発癌の基本的な原理は同じであっても、その生物学的特性は必ずしも同じではない。近年、癌の分子生物学や分子遺伝学が急速に進歩し、発癌やいわゆる腫瘍細胞のバイオロジーが遺伝子レベルで説明できるようになってきた。
【０００３】
（神経芽細胞腫）
神経芽細胞腫は、末梢交感神経系細胞に由来する交感神経節細胞と副腎髄質細胞に発生する小児癌である。この交感神経系細胞は、発生初期の神経堤細胞が腹側へ遊走し、いわいる交感神経節が形成される場所で分化成熟したものである。その一部の細胞は、さらに副腎部へ遊走し、先に形成されつつある副腎皮質を貫通して髄質部に達し、そこで髄質を形成する。神経堤細胞は、ほかの末梢神経細胞の起源ともなっており、後根神経節（知覚神経）、皮膚の色素細胞、甲状腺Ｃ細胞、肺細胞の一部、腸管神経節細胞などへ分化する。
【０００４】
（神経芽細胞腫の予後）
神経芽細胞腫は多彩な臨床像を示すことが特徴である（中川原：神経芽腫の発生とその分子機構  小児内科  ３０，１４３，  １９９８）。例えば、１歳未満で発症する神経芽細胞腫は、非常に予後が良く、大部分が分化や細胞死を起こして自然退縮する。現在、広く実施されている生後６か月時の尿のマススクリーニングで陽性となる神経芽細胞腫の多くは、この自然退縮を起こしやすいものに属する。一方、１歳以上で発症する神経芽細胞腫は、悪性度が高く、多くの場合、患児を死に至らしめる。１歳以上の悪性度の高い神経芽細胞腫は、体細胞突然変異（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）が起こり、モノクローナルであるのに対し、自然退縮する神経芽細胞腫では、生殖細胞突然変異（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）のみの遺伝子変異でとどまっているとの仮説もある。Ｋｎｕｄｓｏｎ  ＡＧ等：Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａＩＶ-Ｓ：Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  ＪＭｅｄ  ３０２，  １２５４  （１９８０）を参照。
【０００５】
（神経芽細胞腫の予後診断を可能にする腫瘍マーカー）
最近の分子生物学的研究の進展により、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）の高親和性レセプターであるＴｒｋＡの発現が分化と細胞死の制御に深くかかわっていることが明らかとなってきた。Ｎａｋａｇａｗａｒａ  Ａ．，  Ｔｈｅ  ＮＧＦ  ｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，  Ｍｅｄ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｏｎｃｏｌ，  ３１，  １１３  （１９９８）を参照。Ｔｒｋは膜貫通型レセプターでもあり、Ｔｒｋ−Ａ、Ｂ、Ｃの３つが主なものである。これらＴｒｋファミリー・レセプターは、中枢神経および末梢神経系において、特異的な神経細胞の分化と生存維持に重要な役割を果たしている。中川原等：神経芽細胞腫におけるニューロトロフィン受容体の発現と予後  小児外科  ２９：４２５−４３２，１９９７を参照。ところで、腫瘍細胞の生存や分化は、ＴｒｋチロシンキナーゼやＲｅｔチロシンキナーゼからのシグナルで制御されている。なかでも、ＴｒｋＡレセプターの役割は最も重要で、予後良好な神経芽細胞腫ではＴｒｋＡの発現が著しく高く、これからのシグナルが腫瘍細胞の生存・分化、または細胞死（アポトーシス）を強く制御している。一方、予後不良な神経芽細胞腫では、ＴｒｋＡの発現が著しく抑えられており、これに代わってＴｒｋＢ或いはＲｅｔからのシグナルが生存の促進という形で腫瘍の進展を助長している。
【０００６】
また、神経の癌遺伝子であるＮ-ｍｙｃの増幅が神経芽細胞腫の予後に関連していることも明らかになってきた。中川原：脳・神経腫瘍の多段階発癌，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３６４，３６６  （１９９９）を参照。この遺伝子は神経芽細胞腫で初めてクローニングされたが、正常細胞や予後良好な神経芽細胞腫では通常１倍体当たり１つしか存在しないのに対し、予後不良の神経芽細胞腫においては数十倍に増幅されているのが見つかった。このようにＮ−ｍｙｃの増幅は、腫瘍の進行度に深く関係している。
【０００７】
しかしながら、現在までに、神経芽細胞腫に発現されている癌遺伝子は、Ｎ−ｍｙｃ以外知られておらず、その予後の良不良に関する遺伝子情報に関しても、Ｎ−ｍｙｃとＴｒＫＡ以外はほとんど知られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、神経芽細胞腫において発現する遺伝子の情報を明らかにし、さらに予後の良不良に関係する前記遺伝子の情報をも明らかにし、それらの遺伝子情報に基づいて、神経芽細胞腫の予後の良不良に関する診断を可能とすることを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記目的に従い、鋭意研究を重ねた結果、ヒト神経芽細胞腫の予後を検定し、予後良好および予後不良の臨床組織の各々からｃＤＮＡライブラリーを作製することに成功した。これらの２種類のｃＤＮＡライブラリーから各々約２４００クローンをクローニングし、神経芽細胞腫の予後の良悪によって分類した。
【００１０】
また、本発明者は、前記クローニングされた遺伝子の部分または全長をシークエンシングし、さらにホモロジー検索を行って、適当な遺伝子を選出した。
【００１１】
さらに、本発明者は、上記のように分類した遺伝子群を前記選出した遺伝子に着目して比較すると、かなりの数の遺伝子において、神経芽細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強していることを見いだした。
【００１２】
かかる知見に基づき、本発明者は、ヒト神経芽細胞腫の予後良好な臨床組織でのみ発現が増強している遺伝子を検出およびクローニングするための遺伝子情報（核酸配列情報等）を提供することを可能とした。さらに、前記核酸配列情報に基づき、予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカーを設計することを可能とし、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、下記１〜８に記載の核酸または核酸断片を提供する。さらに、本発明は、下記９〜１１に記載の該核酸または核酸断片の用途を提供する。
【００１４】
１．ヒト神経芽細胞腫において発現する遺伝子に由来する核酸であって、配列表の配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列からなる群より選ばれる１つの配列からなることを特徴とする核酸、またはそれに相補的な核酸。
【００１５】
２．前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記１に記載の核酸。
【００１６】
３．予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されている遺伝子に由来し、配列表の配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列からなる群より選ばれる１つの配列からなることを特徴とする核酸、またはそれに相補的な核酸。
【００１７】
４．前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記３に記載の核酸。
【００１８】
５．上記１〜４のいずれか１つに記載の核酸の断片。
【００１９】
６．上記１〜４のいずれか１つに記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする、単離された核酸。
【００２０】
７．前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする上記６に記載の単離された核酸。
【００２１】
８．上記７に記載の核酸からなることを特徴とするＰＣＲプライマー。
【００２２】
９．上記３に記載の核酸をヒト神経芽細胞腫の臨床組織から検出することを特徴とする、ヒト神経芽細胞腫の予後の診断方法。
【００２３】
１０．上記８に記載のＰＣＲプライマーの一組を含むことを特徴とするヒト神経芽細胞腫の予後の診断用キット。
【００２４】
従って、上記の好ましい核酸は、予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫でのみ発現が増強されている遺伝子に由来するものであり、該核酸の配列に関する情報はヒト神経芽細胞腫の予後の診断を可能にすることを特徴とする。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るヒト神経芽細胞腫に発現する遺伝子（以下、「本発明に係る遺伝子」という）に由来する核酸およびそれに関連する核酸断片について（以下、「本発明の核酸」および「本発明の核酸断片」というが、特に核酸とその断片を区別して、記載する必要のないとき、それらを集合的に「本発明の核酸」ともいう）、本発明の好適な実施の形態を参照して、詳細に説明する。
【００２６】
本発明の核酸は、上述のごとく本発明に係る遺伝子に由来するものであり、該遺伝子を構成するか或いは該遺伝子からインビボまたはインビトロの過程によって得られる。そこで、本明細書で使用する「核酸」という用語は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、或いはそれから誘導された活性なＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチドを指し、好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。特に好ましい核酸は、本明細書中に開示されるヒトｃＤＮＡ配列と同一か、または相補的な配列を有する。
【００２７】
また、本明細書で使用する「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸（または断片）が、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２および１１．４５−１１．６１に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
【００２８】
より具体的には、前記「ストリンジェントな条件」とは、約４５℃において６．０ｘＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃において２．０ｘＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０ｘＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２ｘＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることもできる。
【００２９】
また、本明細書で使用する「単離された核酸」という用語は、組換えＤＮＡ技術により作成された場合は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリヌクレオチドを指す。
【００３０】
また、本明細書で使用する「予後良好」とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍が限局して存在するか、または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指し、これはＮ−ｍｙｃその他の腫瘍マーカー（ＴｒｋＡ、染色体異常等）から判断して、悪性度が低いと医師によって判断される。本発明の好適な実施の形態では、病期１または２、発症年齢が１歳未満、手術後５年以上再発なく生存し、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められない症例を予後良好としたが、このような特定の例には限定されない。また、本明細書で使用する「予後不良」とは、ヒト神経芽細胞腫のうち、腫瘍の進行が認められる状態を指し、これはＮ−ｍｙｃその他の腫瘍マーカーから判断して、悪性度が高いと医師によって判断される。本発明の好適な実施の形態では、病期４、発症年齢が１歳以上、手術後３年以内に死亡、臨床組織中にＮ−ｍｙｃの増幅が認められた症例を予後不良としたが、このような特定の例には限定されない。
【００３１】
神経芽細胞腫は、ヒトでは２種類しか知られていない神経細胞そのものの腫瘍の１つであり、そこで発現している遺伝子を解析することは、神経細胞のバイオロジーを理解する上で非常に有用な知見をもたらすものと考えられる。すなわち、脳や末梢神経から、部位特異的な均質な組織を得ることは極めて困難で、事実上不可能である。一方、神経芽細胞腫は、末梢交感神経細胞に由来するほぼ均一な神経細胞集団（腫瘍化してはいるが）から成り、均質に発現している神経関連遺伝子が得られる可能性が高い。また、神経芽細胞腫は癌であるため、神経発生の未熟な段階で発現している重要な遺伝子が多いことも特徴として挙げられる。
【００３２】
さらに、神経芽細胞腫は、予後の良好なものと予後の不良なものとが臨床的、生物学的にはっきり区別される。予後良好な神経芽細胞腫の癌細胞は、増殖速度が極めて遅く、ある時点から自然退縮を始めることが特徴である。これまでの知見から、この自然退縮では、神経細胞の分化およびアポトーシス（神経細胞死）が起こっており、正常神経細胞の成熟段階で起こる分化とプログラム細胞死と非常によく似た現象であることが分かってきた。従って、この腫瘍で発現している遺伝子を解析することによって、神経の分化やアポトーシスに関連した重要な遺伝子情報を入手できる可能性が極めて高い。
【００３３】
予後不良な神経芽細胞腫は、明らかに悪性増殖を続ける癌細胞からなる腫瘍である。従って、神経細胞の増殖に関連した重要な遺伝子や、未分化な神経細胞で発現している遺伝子が多数存在する可能性が高い。すなわち、予後良好な神経芽細胞腫で発現している遺伝子のプロファイルとは全く異なる遺伝子情報を入手できる可能性が極めて高い。
【００３４】
一般的に神経細胞は、他の臓器由来の細胞と比較して、発現している遺伝子の種類が多いと言われている。神経芽細胞腫の細胞株（セルライン）は、予後不良の臨床組織由来であり、腫瘍化に伴い遺伝子発現のプロファイルが正常神経細胞と大きく変化しているものと考えられる。
【００３５】
また、神経芽細胞腫は小児由来の腫瘍であることが１つの特徴であり、後天的な因子の影響が非常に少ない可能性が高く、癌発生のメカニズムの解析とともに発生学的な情報を入手できる可能性が高いことも予想される。さらに驚くべきことには、本発明の核酸の中に、ある特定の細胞周期にのみ発現が増強する遺伝子に由来する核酸が含まれており、このことからも癌発生のメカニズムの解析および発生、分化に関する非常に有用な遺伝子情報を入手できる可能性が高いことが予想される。
【００３６】
上記のような特徴を有し、有用な遺伝子情報を入手できる遺伝子に由来する核酸である本発明の核酸は、ヒト神経芽細胞腫の臨床組織より得られ、配列表の配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列のうちのいずれか１つ、またはその核酸配列の一部を有する。
【００３７】
さらに、ヒト神経芽細胞腫の予後良好なものと、不良なものとの臨床組織における本発明に係る遺伝子の発現量を比較した結果、配列番号１ないし１０４に記載の各核酸配列に対応する遺伝子の全てにおいて非常に顕著な差が認められた。すなわち、これらの遺伝子は、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されていた。従って、配列番号１ないし１０４に記載の核酸配列は、上記の有用な遺伝子情報以外に、それらの核酸配列のいずれかを有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出することによって神経芽細胞腫の良不良を診断する腫瘍マーカーの情報としても利用可能である。
【００３８】
すなわち、本発明は、ヒト神経芽細胞腫およびそれに関連する様々な遺伝子情報を以下の手段によりうることを可能とする。
【００３９】
（１） ハイブリダイゼーションに用いるプローブ
本発明の１つの実施の形態に従えば、本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用することによって、ヒト神経芽細胞腫で発現している遺伝子を検出することが可能である。さらに、本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用し、様々な腫瘍、正常組織における遺伝子発現を調べることによって、該遺伝子発現の分布を同定することも可能である。
【００４０】
本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション法自身については、特に限定はない。好適な方法として、例えば、ノザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーション、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）、ＤＮＡチップ法、マイクロアレイ法、等が挙げられる。
【００４１】
前記ハイブリダイゼーションの１つの応用例として、本発明の核酸またはその断片をノザンハイブリダイゼーションのプローブとして用い、検定したい試料中においてｍＲＮＡの長さを測定することや、遺伝子発現を定量的に検出することが可能である。
【００４２】
また別の応用例として、本発明の核酸またはその断片をサザンハイブリダイゼーションのプローブとして用い、検定したい試料のゲノムＤＮＡ中、該ＤＮＡ配列の有無を検出することが可能である。
【００４３】
さらに別の応用例として、本発明の核酸またはその断片をＦＩＳＨ法のプローブとして用い、遺伝子の染色体上の位置を同定することも可能である。
【００４４】
さらに別の応用例として、本発明の核酸またはその断片をＩＳＨ法のプローブとして用い、遺伝子の発現の組織分布を同定することも可能である。
【００４５】
本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーション用プローブとして使用する場合、少なくとも４０個の核酸残基長が必要であり、本発明の核酸またはその断片のうち、４０個以上の連続した残基があるものが好ましく用いられる。さらに好ましくは、６０個以上の残基を有するものが用いられる。
【００４６】
当業者にとって、上記各種のハイブリダイゼーションにおける核酸プローブ技法は周知であり、例えば、個々の長さの本発明に係る核酸プローブと、目的とするポリヌクレオチドとの適当なハイブリダイズ条件は容易に決定することができる。種々の長さを含むプローブに対し至適なハイブリダイズ条件を得るためのかかる操作は、当業者では周知であり、例えばサンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（前掲）を参照して、行えばよい。
【００４７】
好ましくは、本発明に係るプローブは、容易に検出されるように標識される。
検出可能な標識は、目視によって、または機器を用いるかのいずれかによって検出され得るいかなる種類、元素または化合物であってもよい。通常使用される検出可能な標識としては、放射性同位元素、アビジンまたはビオチン、蛍光物質（ＦＩＴＣまたはローダミン等）が挙げられる。前記放射性同位元素は、32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、35Ｓ等である。また、ビオチン標識ヌクレオチドは、ニックトランスレーション、化学的または酵素的手段によって、核酸に組み込むことができる。ビオチン標識されたプローブは、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光標識、酵素、金コロイド複合体等などの標識手段を使用したハイブリダイゼーションの後検出される。また、本発明に係るプローブは、タンパク質と結合させることによって標識されてもよい。その目的で、例えば放射性または蛍光ヒストン一本鎖結合タンパク質が使用される。
【００４８】
（２）ＰＣＲに用いるプライマー
目的遺伝子（例えば、本発明に係る遺伝子）を検出するには上記のハイブリダイゼーション法の他に、本発明の核酸またはその断片に含まれる任意の核酸（ＤＮＡ）配列をプライマーとして、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法を用いることにより可能である。例えば、検定したい臨床組織試料からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を半定量的に測定することが可能である。このような方法は、当業者にとって周知の方法に従って行われるが、例えば、サンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（前掲）、および遺伝子病入門（高久史麿著：南江堂）が参照される。
【００４９】
本発明の核酸またはその断片をＰＣＲ用プライマーとして使用する場合、１０ないし６０個の核酸残基長が必要であり、本発明の核酸またはその断片のうち、１０ないし６０個の連続した残基があるものが好ましく用いられる。さらに好ましくは、１５ないし３０個の残基を有するものが用いられる。また一般的には、プライマー配列中のＧＣ含量が４０ないし６０％のものが好ましい。さらに、増幅に用いる２つのプライマー間のＴｍ値に差がないことが望まれる。また、プライマーの３’末端でアニールせず、プライマー内で２次構造をとらないことも望ましい。
【００５０】
（３）遺伝子のスクリーニング
本発明の核酸またはその断片を使用することによって、様々な組織や細胞で発現している目的遺伝子の発現分布を検出することが可能である。これは例えば、本発明の核酸またはその断片を上記のようにハイブリダイゼーションのプローブ、またはＰＣＲのプライマーとして使用することによって、可能となる。
【００５１】
また、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等を用いても目的遺伝子の発現分布を検出することが可能である。すなわち、本発明の核酸またはその断片を直接、前記チップ、アレイ上に張り付けことが出来る。そこに被検体試料から抽出したｍＲＮＡを蛍光物質などで標識し、ハイブリダイズさせ、遺伝子がどの様な組織の細胞で高発現しているかを解析することが可能である。またチップ、アレイ上に張り付けるＤＮＡは、本発明の核酸またはその断片をプローブとして用いたＰＣＲの反応産物であってもよい。
【００５２】
（４） 遺伝子のクローニング
本発明の核酸またはその断片を使用することによってヒト神経芽細胞腫において発現している遺伝子をクローニングすることが可能である。例えば、本発明の核酸またはその断片をノザンハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションのプローブ、或いはＰＣＲのプライマーとして使用し、本発明の核酸またはその断片を含む遺伝子をクローニングすることが可能である。このようなクローニングの対象となる遺伝子としては、特に予後良好な神経芽細胞腫と予後不良な神経芽細胞腫との間で発現量に差がある遺伝子、他の組織や癌細胞での発現様式とは異なって発現している遺伝子、細胞周期依存的に発現している遺伝子、神経分化に伴って誘導される遺伝子、癌遺伝子または癌抑制遺伝子によって発現が制御される遺伝子等が挙げられる。クローニングは、通常の遺伝子組換え技術に従い、本発明の核酸（ＤＮＡ）またはその断片を適当なプラスミド、バクテリオファージに組み込み、発現ベクターを構築し、これを宿主細胞に導入して形質転換（導入）し、形質転換体を培養することによって行われる。かかる個々の操作は、例えば、サンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（前掲）その他、周知の文献に詳述されている。
【００５３】
（５）腫瘍の予後同定の方法およびそのために使用可能な腫瘍マーカー
上述のように本発明の核酸に関連する遺伝子は、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されていた。そこで、本発明の核酸またはその断片をハイブリダイゼーションのプローブ或いはＰＣＲのプライマーとして使用し、被験者から採取した、臨床組織を含む試料中で、前記遺伝子の発現の増強の有無を調べることにより予後の同定が行える。遺伝子の検出方法としては、前述のノーザンブロットハイブリダイゼーション法、インサイチュハイブリダイゼーション法、およびＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。
【００５４】
ハイブリダイゼーション法を用いるとき、試料中で前記プローブとハイブリダイズする核酸の量が増強する場合、予後が良好であると診断できる。また、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いるとき、試料からｍＲＮＡを抽出し、これをＤＮＡに逆転写して、前記プライマーにより増幅し、遺伝子発現を半定量的に測定する。このようにして遺伝子発現の増強が認められる場合、予後が良好であると診断できる。この特定の診断目的のためには、該プライマーを必須成分として一組含有する診断用キットを用いることが好ましい。該診断用キットは、プライマー成分以外に、ＰＣＲ用の緩衝液、洗浄液、および酵素等の公知の成分を含む。
【００５５】
（６）アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明の別の実施の形態に従えば、本発明の核酸に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の核酸にハイブリダイズすることが可能であり、アンチセンスＤＮＡとアンチセンスＲＮＡとを含む。アンチセンスＤＮＡは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を阻害し、アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然型であれば自動合成機を使用して、または本発明の核酸を鋳型とするＰＣＲ法により合成できる。さらに、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的ＤＮＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性が高められたアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体をも包含する。このような誘導体は、公知のアンチセンス技術を用いて、合成することができる。
【００５６】
ｍＲＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、該ＲＮＡの合成を阻止することができ、特に遺伝子の発現抑制効果が高い。従って、本発明は、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを好適に包含する。
【００５７】
（７）遺伝子治療
本発明の別の実施の形態に従えば、遺伝子治療に用いられる治療用遺伝子をコードする核酸配列が提供される。そこで、本発明の核酸を遺伝子運搬に使用されるベクターに導入して、任意の発現プロモーターにより導入遺伝子（本発明に係る遺伝子）を発現させ、例えば癌の遺伝子治療に用いることができる。
【００５８】
１．ベクター
導入されうるウイルスベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであってもよい。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち一部を異種ウイルスの核酸配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる［Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ等：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２  ２６３−（１９９６）］。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。さらに遺伝子導入系としてはエレクトロポレーション、遺伝子銃等も使用可能である。
【００５９】
２．発現プロモーター
さらに、治療用遺伝子に用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなくいかなるものでも用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【００６０】
以下、本発明により見いだされた予後良好なヒト神経芽細胞腫において発現が増強する遺伝子群について、実施例に即してさらに詳しく説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例に限定されるものではない。
【００６１】
【実施例】
（製造例１）ヒト神経芽細胞腫からのｃＤＮＡライブラリーの構築
１．試料入手
ヒト神経芽細胞腫の臨床組織試料を手術摘出直後に準無菌的に凍結し、その後−８０℃に保存した。
【００６２】
２．予後良好な試料の選別
１で得られた試料について予後の検定を以下の指標をもとに行った。
予後良好：                                          予後不良：
・病期１または２                                    ・病期４
・発症年齢が１歳未満                                ・発症年齢が１歳以上・手術後５年以上再発なく生存                        ・手術後３年以内に死亡
・Ｎ-ｍｙｃの増幅なし                                ・Ｎ-ｍｙｃ増幅あり
上記２つの試料において、Ｎ-ｍｙｃ増幅は下記のようにして確認した。
【００６３】
上記１で得られた試料を剃刀で細かく切断し、５ｍｌのＴＥＮバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣＬ（ｐＨ＝８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えよくホモジナイズした。この混合液に７５０μｌのＳＤＳ（１０％）、１２５μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、軽く混和し、５０℃で８時間放置した。その後、フェノール・クロロホルム処理を行い、最後にエタノール沈殿により、ゲノムＤＮＡを精製した。５μｇの得られたゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社製）で完全に消化し、Ｎ-ｍｙｃのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションによりＮ-ｍｙｃ増幅を調べた。
【００６４】
３．予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織からｍＲＮＡの調製
上記２において予後良好であると判定されたヒト神経芽細胞腫の臨床組織２〜３ｇをＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＧＥＮ社製）用いて処理し、トータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースカラム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ社製）を用いて、ｐｏｌｙＡ構造を有するｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６５】
４．ｍＲＮＡの脱リン酸化
上記３において調製した１００〜２００μｇのｍＲＮＡのプールを６７．３μｌの０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を含む蒸留滅菌水に溶解させ、２０μｌの５＊ＢＡＰバッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５００ｍＭ、ｐＨ＝７．０）／メルカプトエタノール（５０ｍＭ）］、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、１０μｌのＢＡＰ（０．２５ｕｎｉｔ／μｌ、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ：宝酒造社製）を加えた。この混合液を３７℃で１時間反応させ、ｍＲＮＡの５’末端の脱リン酸化処理を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理を２回行い、最後にエタノール沈殿により、脱リン酸化ｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６６】
５．脱リン酸化ｍＲＮＡの脱キャップ処理
上記４において調製した脱リン酸化ｍＲＮＡのプールの全量を７５．３μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水に溶解させ、２０μｌの５＊ＴＡＰバッファー［酢酸ナトリウム（２５０ｍＭ、ｐＨ＝５．５）／メルカプトエタノール（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ、ｐＨ＝８．０））、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２μｌのＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ  ａｃｉｄ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：２０ｕｎｉｔ／μｌ）］を加えた。この混合液を３７℃で１時間反応させ、脱リン酸化ｍＲＮＡの５’末端の脱キャップ処理を行った。この際、キャップ構造を持たない不完全長の脱リン酸化ｍＲＮＡは脱キャップ処理されず５’末端は脱リン酸化された状態に留まる。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により、脱キャップｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６７】
６．オリゴキャップｍＲＮＡの調製
上記５において調製した脱キャップｍＲＮＡのプールの全量を１１μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水に溶解させ、４μｌの５’−オリゴＲＮＡ（５’−ＡＧＣＡＵＣＧＡＧＵＣＧＧＣＣＵＵＧＧＣＣＵＡＣＵＧＧ−３’：１００ｎｇ／μｌ）、１０μｌの１０＊ｌｉｇａｔｉｏｎバッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５００ｍＭ、ｐＨ＝７．０）／メルカプトエタノール（１００ｍＭ）］、１０μｌの塩化マグネシウム（５０ｍＭ）、２．５μｌのＡＴＰ（２４ｍＭ）、２．５μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、１０μｌのＴ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（２５ｕｎｉｔ／μｌ：宝酒造社製）、５０μｌのポリエチレングリコール（５０％ｗ／ｖ、ＰＥＧ８０００：シグマ社製）を加えた。この混合液を２０℃で３時間反応させ、脱キャップｍＲＮＡの５’末端に５’−オリゴＲＮＡを連結した。この際、キャップ構造を持たない不完全長の脱リン酸化ｍＲＮＡは、５’−オリゴＲＮＡが連結されない。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により、オリゴキャップｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６８】
７．オリゴキャップｍＲＮＡからのＤＮＡ除去
上記６において調製したオリゴキャップｍＲＮＡのプールを７０．３μｌの０．１％ＤＥＰＣを含む蒸留滅菌水に溶解させ、４μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ＝７．０）、５．０μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１６μｌの塩化マグネシウム（５０ｍＭ）、２．７μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２μｌのＤＮａｓｅＩ（５ｕｎｉｔ／μｌ：宝酒造社製）を加えた。この混合液を３７℃で１０分間反応させ、余分なＤＮＡを分解した。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿、カラム精製（Ｓ−４００ＨＲ：ファルマシアバイオテック社製）により、ＤＮＡ（−）オリゴキャップｍＲＮＡのプールを精製した。
【００６９】
８．１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの調製
上記７において調製したＤＮＡ（−）オリゴキャップｍＲＮＡのプールをＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ライフテックオリエンタル社製キット）を用いて逆転写し、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡのプールを得た。ＤＮＡ（−）オリゴキャップｍＲＮＡのプールを２１μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、１０μｌの１０＊Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄバッファー（キット付属品）、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ（５ｍＭ、キット付属品）、６μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ、キット付属品）、２．５μｌのオリゴーｄＴアダプタープライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ、５’−ＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＧＴＧＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）、２．０μｌのＲＮａｓｉｎ（４０ｕｎｉｔ／μｌ）、２μｌのＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴａｓｅ（キット付属品）を加えた。この混合液を４２℃で３時間反応させ、逆転写反応を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理、アルカリ処理、中和処理にて全てのＲＮＡを分解し、エタノール沈殿で精製した。
【００７０】
９．２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの調製
上記８において調製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡのプールをＧｅｎｅＡｍｐ（パーキンエルマー社製キット）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡのプールを５２．４μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、３０μｌの３．３＊Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー（キット付属品）、８μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（２．５ｍＭ、キット付属品）、４．４μｌの酢酸マグネシウム（２５ｍＭ、キット付属品）、１．６μｌのプライマーＦ（１０ｐｍｏｌ／μｌ、５’−ＡＧＣＡＴＣＧＡＧＴＣＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧ−３’）、１．６μｌのプライマーＲ（１０ｐｍｏｌ／μｌ、５’−ＧＣＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＧＴ−３’）、２μｌのｒＴｔｈ（キット付属品）を加えた。この混合液に、１００μｌのミネラルオイルを静かに加え重層した。この反応液を９４℃で５分間変性させた後、９４℃、１分間・５２℃、１分間・７２℃、１０分間を１サイクルとして１２サイクル繰り返し、さらに７２℃で１０分間放置しＰＣＲ反応を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製し、２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡのプールを得た。
【００７１】
１０．２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡのＳｆｉＩ処理
上記９において調製した２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡのプールを８７μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、１０×ＮＥＢバッファー（ＮＥＢ社製）、１００＊ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＮＥＢ社製）、２μｌのＳｆｉＩ（制限酵素、２０ｕｎｉｔ／μｌ、ＮＥＢ社製）を加えた。この混合液を５０℃で一晩反応させ、ＳｆｉＩによる制限酵素処理を行った。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製し、両末端がＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡのプールを得た。
【００７２】
１１．ＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡのサイズ分画
上記１０において調製したＳｆｉＩ処理されたｃＤＮＡのプールを１％のアガロースゲルで電気泳動し、２ｋｂ以上の分画をＧｅｎｅ  ｃｌｅａｎ  ＩＩ（Ｂｉｏ  １０１社製）を用いて精製した。精製したｃＤＮＡのプールは１００μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、３７℃で６時間放置した。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製し、長鎖ｃＤＮＡのプールを得た。
【００７３】
１２．ｃＤＮＡライブラリー
上記１１において調製した長鎖ｃＤＮＡのプールをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ  ｖｅｒ．１（宝酒造社製キット）を用いてクローニングベクターであるｐＭＥ１８Ｓ―ＦＬ３（東京大学医科学研究所  菅野純夫教授より供与）にライゲーションを行った。長鎖ｃＤＮＡのプールを８μｌの滅菌蒸留水に溶解させ、あらかじめ制限酵素ＤｒａＩＩＩで処理された１μｌのｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３、８０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（キット付属品）、１０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（キット付属品）を加え、１６℃で３時間反応させた。その後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿で精製しｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００７４】
（実施例２）大腸菌へのトランスフォーメーション
１．クローニング
実施例１の１２で調製したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（ＴＯＰ−１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にトランスフォーメーションした。ｃＤＮＡライブラリーを１０μｌの滅菌蒸留水に溶解し、ＴＯＰ−１０に混合した。その後、氷上にて３０分間、４０℃で１分間、氷上で５分間インキュベートした。５００μｌのＳＯＢ培地を加え、３７℃で６０分間振盪培養した。アンピシリンを含む寒天培地上に適量づつ播種し、３７℃で一昼夜培養して、大腸菌クローンを得た。
【００７５】
２．大腸菌クローンの保存（グリセロールストックの調製）
上記１において得られた寒天培地上の大腸菌クローンを、爪楊枝にて拾い上げ、９６穴プレートに準備した１２０μｌのＬＢ培地中に懸濁させた。この９６穴プレートを３７℃で一晩静置し大腸菌の培養を行った。その後６０％グリセロール溶液を７２μｌ加え、−２０℃で保存した（グリセロールストック）。
【００７６】
（実施例３）核酸配列決定
１．プラスミドの調製
実施例２の２で調製した１０μｌのグリセロールストックを１５ｍｌの遠心チューブに移し、３ｍｌのＬＢ培地、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加え、３７℃で一晩振盪し、大腸菌の培養を行った。その後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出、精製した。
【００７７】
２．両末端シークエンスの解析
上記１において調製したプラスミドＤＮＡをＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製キット）を用いて両末端のシークエンスを決定した。６００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、８μｌのプレミックス（キット付属品）、３．２ｐｍｏｌのプライマーを混合し、滅菌蒸留水で合計２０μｌになるように調製した。この混合液を９６℃で２分間変性させた後、９６℃、１０秒間・５０℃、５秒間・６０℃、４分間を１サイクルとして２５サイクル繰り返し反応を行った。その後エタノール沈殿で精製した。変性条件下でポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、ＡＢＩ３７７（ＡＢＩ社製）を用いて配列決定を行った。
【００７８】
（実施例４）データベースを用いたホモロジー検索
実施例３において両末端シークエンスを解析して得られた試料の核酸配列情報についてインターネットを介したＤＮＡ配列のホモロジー検索を行った。検索にはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）のＢＬＡＳＴを用いた。
【００７９】
（実施例５）半定量的ＰＣＲによる予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量の比較
実施例４において得られた、遺伝子群の一部から得られた核酸の配列に基づき、ＰＣＲプライマーを合成し、ヒト神経芽細胞腫の予後良好・不良の臨床組織で発現量を比較定量した。実施例１〜３に示した方法（ＲＴ−ＰＣＲ）で前記ヒト神経芽細胞腫の臨床組織からｍＲＮＡを抽出し、ｒＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。具体的には、５μｌの滅菌蒸留水、２μｌのｍＲＮＡ、１μｌの１０＊ｒＴａｑバッファー、１μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴａｑを混合した。この混合液を９５℃で２分間変性させた後、９５℃、１５秒間・５５℃、１５秒間・７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で６分間放置し、ＰＣＲ反応を行った。この反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、配列表の配列番号１〜１０４に記載する核酸配列に基づくＰＣＲプライマーにより増幅すると、予後良好なヒト神経芽細胞腫でのみ発現量が増強する遺伝子が確認された。実施例４に示すホモロジー検索の結果（１０４個の核酸配列のうち７３個がホモロジー無しであった。）を含め、配列番号１〜１０４に記載する核酸配列および核酸の情報を表１〜２に示す。
【００８０】
また、半定量的ＰＣＲによる予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量の測定結果の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１０６、ｎｂｌａ−００２１９、ｎｂｌａ−０３１４５について）を図１〜３に示す。
【００８１】
【表１】
0004565702.tif 000002
【表２】
0004565702.tif 000003
【００８２】
（実施例６）半定量的ＰＣＲによる細胞周期依存的遺伝子発現量の測定
実施例４において得られた、遺伝子群の一部から得られた核酸の配列に基づき、ＰＣＲプライマーを合成し、ＨｅＬａ細胞を用いて、細胞周期特異的な遺伝子発現量を比較定量した。ＨｅＬａ細胞はそれぞれ以下のように処理を行った。
【００８３】
（１）無処理
（２）４００μＭのｍｉｍｏｓｉｎｅで１８時間処理し、６５％の細胞がＧ１期の状態
（３）２ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅで２０時間処理し、１００％の細胞がＳ期の状態
（４）０．６μｇ／ｍｌのＮｏｃｏｄａｚｏｌｅで１８時間処理し、８５％の細胞がＧ２／Ｍ期の状態
以上４種類のＨｅＬａ細胞から実施例１〜３に示した方法でｍＲＮＡを抽出し、ｒＴａｑ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。５μｌの滅菌蒸留水、２μｌのｍＲＮＡ、１μｌの１０×ｒＴａｑバッファー、１μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、各々０．５μｌの合成プライマーセット、０．５μｌのｒＴａｑを混合した。この混合液を９５℃で２分間変性させた後、９５℃、１５秒間・５５℃、１５秒間・７２℃、２０秒間を１サイクルとして３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で６分間放置しＰＣＲ反応を行った。この反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動した。この結果、配列表の配列番号１〜１０４に記載する核酸配列に基づくＰＣＲプライマーにより増幅すると、そのうち３１の核酸配列において遺伝子発現が細胞周期に特異的であることを見い出した。電気泳動の結果の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１００について）を図４に示す。また、このようにして見出された細胞周期特異性と個別の核酸配列の一覧を表１〜２に示した。
【００８４】
【発明の効果】
本発明の核酸は、神経芽細胞腫において発現する遺伝子の情報を明らかにする。
【００８５】
本発明の核酸またはその断片は、プローブ或いはプライマーとして、各種ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法に使用でき、前記遺伝子の他組織、細胞での発現の検出や、その構造および機能の解析を可能とする。また、該遺伝子がコードするヒト蛋白の遺伝子工学的製造も可能となる。
【００８６】
また、本発明の核酸は、予後良好なヒト神経芽細胞腫と、予後不良なヒト神経芽細胞腫とを比較したとき、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強されている遺伝子に由来する核酸であり、従って、これらの核酸に基づく遺伝子情報により神経芽細胞腫の予後の診断が可能となる。該遺伝子は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子が予後不良因子であるのに対して、ＴｒｋＡ遺伝子と同様に予後良好因子と見なされるので、神経芽細胞腫の悪性度および抗癌剤に対しての感受性の指標（腫瘍マーカー）となり得る。
【００８７】
【配列表】
0004565702.tif 000004
0004565702.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】  予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量を半定量的ＰＣＲで調べた結果、予後良好なヒト神経芽細胞腫での発現の増強が認められた遺伝子の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１０６からの結果）を示す電気泳動写真である。図中、レーン１〜１６は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。一方、レーン１７〜３２は、予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。
【図２】  予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量を半定量的ＰＣＲで調べた結果、予後良好なヒト神経芽細胞腫での発現の増強が認められた遺伝子の別の例（核酸配列ｎｂｌａ−００２１９からの結果）を示す電気泳動写真である。図中、レーン１〜１６は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。一方、レーン１７〜３２は、予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。
【図３】  予後良好・不良ヒト神経芽細胞腫での遺伝子発現量を半定量的ＰＣＲで調べた結果、予後良好なヒト神経芽細胞腫での発現の増強が認められた遺伝子のさらに別の例（核酸配列ｎｂｌａ−０３１４５からの結果）を示す電気泳動写真である。図中、レーン１〜１６は、予後良好なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。一方、レーン１７〜３２は、予後不良なヒト神経芽細胞腫の臨床組織の試料である。
【図４】  細胞周期特異的な遺伝子発現を半定量的ＰＣＲで調べた結果、該発現が認められた遺伝子の一例（核酸配列ｎｂｌａ−００１００からの結果）を示す電気泳動写真である。
図中、レーン１は、無処理ＨｅＬａ細胞（６０〜７０％コンフルエント）である。レーン２は、４００μＭのｍｉｍｏｓｉｎｅで１８時間処理し、６５％がＧ１期の状態のＨｅＬａ細胞である。レーン３は、２ｍＭのｔｈｙｍｉｄｉｎｅで２０時間処理し、１００％がＳ期の状態のＨｅＬａ細胞である。レーン４は、０．６μｇ／ｍｌのＮｏｃｏｄａｚｏｌｅで１８時間処理し、８５％がＧ２／Ｍ期の状態のＨｅＬａ細胞である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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