(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の成分Ａ及びＢ：
Ａ．油脂と３価以上の多価アルコールの混合物に、それらの和１モルに対して５０〜２５０モルのエチレンオキシド及びプロピレンオキシド（エチレンオキシド／プロピレンオキシド＝１／１〜１／４（モル比））を付加重合して得られる反応生成物；及び
Ｂ．次の（３）、（４）及び（７）から選ばれる少なくとも１種の化合物
（３）ポリオキシアルキレン多価アルコールエーテル類
（４）ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類
（７）ポリオキシアルキレンポリマー
を含有することを特徴とする発酵用消泡剤。
【請求項２】
Ａ成分が、油脂と３価以上の多価アルコールの和の１モルに対して８０〜２００モルのエチレンオキシド及びプロピレンオキシドを付加重合して得られたものである請求項１記載の発酵用消泡剤。
【請求項３】
Ａ成分におけるエチレンオキシド及びプロピレンオキシドのモル比が、エチレンオキシド／プロピレンオキシド＝１／１．５〜１／２．５である請求項１又は２記載の発酵用消泡剤。
【請求項４】
Ａ成分が、油脂と３価以上の多価アルコールとの混合モル比が１：０．２〜１：１である混合物にエチレンオキシド及びプロピレンオキシドを付加重合して得られたものである請求項１〜３のいずれか１項記載の発酵用消泡剤。
【請求項５】
Ｂ成分が、（７）ポリオキシアルキレンポリマーである請求項１〜４のいずれか１項記載の発酵用消泡剤。
【請求項６】
Ｂ成分が、平均分子量２，０００〜１０，０００のポリプロピレングリコール又はポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンコポリマーである請求項１〜４のいずれか１項記載の発酵用消泡剤。
【請求項７】
Ａ成分とＢ成分を５：９５〜９５：５の重量比で含有する請求項１〜６のいずれか１項記載の発酵用消泡剤。
【請求項８】
アミノ酸発酵、カルボン酸発酵、酵素発酵又は抗生物質発酵に用いられるものである請求項１〜７のいずれか１項記載の発酵用消泡剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載の発酵用消泡剤を、培地に対して０．０００１〜２重量％添加して微生物を培養することを特徴とするアミノ酸、カルボン酸、酵素又は抗生物質の発酵生産方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、発酵用消泡剤に関し、更に詳細には破泡作用及び抑泡作用の双方を併せ持ち消泡作用に優れ、かつ発酵生産に悪影響を及ぼすことのない発酵用消泡剤に関する。
背景技術
従来、発酵工業、例えば深部通気培養における有用物質の生産において多量の気泡が発生し、種々の問題が生じている。すなわち、発酵槽が気泡で満たされてしまうため、単位容積当たりの培養能力が低下し、また培養液が流出する等の問題が生じており、その解決が望まれている。
そこで、このような気泡の発生を抑制するために、培地への消泡剤の添加が行われている。かかる消泡剤としては、ポリオキシアルキレン多価アルコールエーテル類、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル脂肪酸エステル類（特開昭50-4282号公報、同50-121482号公報、同54-135298号公報、同56-169583号公報、特開平2-35073号公報）等が知られている。また、一方、発生した気泡を崩壊し、速やかに消泡作用を示す消泡剤も知られている（特開平６−５４６８０号公報）。
しかしながら、これら従来の発酵用消泡剤はいずれも、発生した泡を消す破泡作用及び液面からの泡の発生を抑える抑泡作用のどちらか一方のみの作用によるものであり、その消泡効果は十分ではなかった。また、破泡作用の優れた消泡剤と抑泡作用の優れた消泡剤とを併用した場合には、その作用が打ち消し合い逆効果となるという問題があった。更に、これらは微生物の生育や生産物の生成を阻害するなど、発酵生産に悪影響を及ぼすという欠点もあった。
従って、本発明は、破泡作用及び抑泡作用の双方を併せ持ち、消泡効果に優れ、かつ発酵生産に悪影響を及ぼすことのない発酵用消泡剤を提供することを目的とする。
発明の開示
かかる実情において本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、油脂と多価アルコールの混合物に特定量のエチレンオキシド及びプロピレンオキシドを付加して得られた反応生成物と特定の化合物を組み合わせて用いることにより、破泡作用及び抑泡作用の双方に優れるとともに発酵生産に悪影響を与えないことを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、次の成分Ａ及びＢ：
Ａ．油脂と３価以上の多価アルコールの混合物に、それらの和１モルに対して50〜250モルのエチレンオキシド及びプロピレンオキシド（エチレンオキシド／プロピレンオキシド＝1/1〜1/4（モル比））を付加重合して得られる反応生成物；及び
Ｂ．次の（1）〜（7）から選ばれる少なくとも１種の化合物
（1）脂肪酸
（2）アルコール
（3）ポリオキシアルキレン多価アルコールエーテル類
（4）ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類
（5）ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル類
（6）ポリオキシアルキレンアルキルエーテル脂肪酸エステル類
（7）ポリオキシアルキレンポリマー
を含有することを特徴とする発酵用消泡剤を提供するものである。
また、本発明はこの成分Ａ及びＢを含有する発酵用消泡剤を、培地に対して0.0001〜２重量％添加して微生物を培養することを特徴とするアミノ酸、カルボン酸、酵素又は抗生物質の発酵生産方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
まず、Ａ成分について説明する。
Ａ成分の反応生成物の製造に用いられる油脂としては、ヤシ油、パーム油、オリーブ油、大豆油、菜種油、アマニ油、ヒマシ油等の植物油、豚脂、牛脂、骨油等の動物油、魚油及びこれらの硬化油、半硬化油、更にはこれら油脂の精製工程で得られる回収油等が挙げられる。
３価以上の多価アルコールとしては、一般に公知のものは何れも使用できるが、その中でも、グリセリン、ソルビトール、グルコース、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタン、1,2,4-ブタントリオール、1,2,6-ヘキサントリオール、1,1,1-トリメチロールヘキサン、ペンタエリスリトール、エリトロース、テトラメチロール、シクロヘキサトリオール、ジグリセリン、ポリグリセリン等の炭素数３〜15の３〜６価の多価アルコールが好ましい。これらの中でもグリセリンが特に好ましい。
油脂と多価アルコールの混合割合は、モル比で１：0.05〜１：６、特に１：0.2〜１：１が好ましい。
上記油脂と多価アルコールの混合物に付加させるエチレンオキシド及びプロピレンオキシドのモル比は、特にエチレンオキシド／プロピレンオキシド＝1/1〜1/4であるが、エチレンオキシド／プロピレンオキシド＝1/1.5〜1/2.5がより好ましい。またエチレンオキシドとプロピレンオキシドの総付加モル数は、消泡効果の点から、油脂と多価アルコールの和の１モルに対して50〜250モルであるが、特に80〜200モルが好ましい。
エチレンオキシド及びプロピレンオキシドの付加反応の条件は、特に限定されるものではなく、一般に行われている活性水素を有する化合物へのアルキレンオキシド付加反応条件で行うことができる。すなわち、上記モル比で仕込んだ油脂と多価アルコールとの混合物に、触媒量のアルカリ性物質を加え、これに約100〜200℃、１〜３kg/cm2でエチレンオキシド及びプロピレンオキシドを数時間反応させることによって行われる。この際、エチレンオキシドとプロピレンオキシドは、これらを混合して付加させても（ランダム付加）、順次付加させても（ブロック付加）よい。
次にＢ成分について説明する。
Ｂ（1）成分の脂肪酸としては、炭素数２〜23の直鎖又は分岐の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられ、なかでも炭素数10〜18のものが好ましい。
Ｂ（2）のアルコールとしては、炭素数１〜22の直鎖又は分岐の飽和又は不飽和の脂肪族アルコールが挙げられ、なかでも炭素数12〜20の直鎖飽和脂肪族アルコールが好ましい。
Ｂ（3）のポリオキシアルキレン多価アルコールエーテル類としては、少なくともオキシプロピレン又はオキシブチレンを有するものが好ましく、例えば一般式
Ｒ1［（ＡＯ）x1Ｈ］y
〔式中、Ｒ1はヒドロキシル基を２〜８個有する脂肪族多価アルコール又は糖類の全てのヒドロキシル基の水素原子を除いてできる残基を示す。ｘ1個のＡＯはそれぞれオキシエチレン、オキシプロピレン及びオキシブチレンから選ばれるオキシアルキレン基を示し少なくとも１個はオキシプロピレン又はオキシブチレンである。ＡＯの付加はランダム付加及びブロック付加のいずれでもよい。ｘ1は１〜250の数、ｙはＲ1のヒドロキシル基由来酸素原子の数を示す。〕
で表されるものが挙げられる。このうち、次の一般式
Ｒ1［（Ｃ3Ｈ6Ｏ）l1（Ａ1ＯＡ2Ｏ）m1（Ｃ3Ｈ6Ｏ）n1Ｈ］y
〔式中、Ｒ1及びｙは前記と同じ意味を示す。Ａ1及びＡ2のうち一方はエチレン基であり、他方は炭素数２〜４のアルキレン基を示す。ｌ1は０〜20、ｍ1は３〜40、ｎ1は３〜30の数を示す。〕
で表される化合物であって、オキシエチレン基の割合が総分子量中の５〜30重量％を占めるものが好ましく、特に〔グリセリン〕−〔（ポリ）オキシプロピレン〕−〔（ポリ）オキシエチレン〕−〔（ポリ）オキシプロピレン〕の連鎖を有するブロックポリマーが好ましい。
Ｂ（4）のポリオキシアルキレンアルキルエーテル類としては、少なくともオキシプロピレン又はオキシブチレンを有するものが好ましく、例えば一般式
Ｒ2-Ｏ-（ＡＯ）x2-Ｈ
〔式中、ＡＯは前記と同じ意味を示し、Ｒ2は炭素数１〜24の直鎖又は分岐のアルキル基又はアルケニル基を示し、ｘ2は１〜200の数を示し、ＡＯの付加はランダム付加及びブロック付加のいずれでもよい。〕
で表されるものが挙げられる。このうち、次の一般式
Ｒ2-Ｏ-（Ｃ2Ｈ4Ｏ）l2（Ａ3Ｏ）m2（Ｃ2Ｈ4Ｏ）n2-Ｈ
〔式中、Ｒ2は前記と同じ意味を示し、ｍ2個のＡ3はそれぞれプロピレン基又はブチレン基を示し、ｌ2は１〜10、ｍ2は10〜80、ｎ2は０〜20の数を示す。〕
で表される化合物が好ましく、特に〔ステアリルアルコール〕−〔（ポリ）オキシエチレン〕−〔（ポリ）オキシプロピレン〕−〔（ポリ）オキシエチレン〕の連鎖を有するブロックポリマーが好ましい。
Ｂ（5）のポリオキシアルキレン脂肪酸エステル類としては、少なくともオキシプロピレン又はオキシブチレンを有するものが好ましく、例えば一般式
Ｒ2-ＣＯＯ-（ＡＯ）x2-Ｈ
〔式中、Ｒ2、ＡＯ及びｘ2は前記と同じ意味を示す。〕
で表されるものが挙げられる。このうち次の一般式
Ｒ3-ＣＯＯ-（Ｃ2Ｈ4Ｏ）l2（Ｃ3Ｈ6Ｏ）m2（Ｃ2Ｈ4Ｏ）n2-Ｈ
〔式中、ｌ2、ｍ2及びｎ2は前記と同じ意味を示し、Ｒ3は炭素数１〜24の直鎖又は分岐のアルキル基又はアルケニル基を示す。〕
で表される化合物が好ましく、特に〔オレイン酸〕−〔（ポリ）オキシエチレン〕−〔（ポリ）オキシプロピレン〕の連鎖を有するものが好ましい
Ｂ（6）のポリオキシアルキレンアルキルエーテル脂肪酸エステル類としては、前記のポリオキシアルキレンアルキルエーテルと炭素数２〜21の飽和又は不飽和脂肪酸とのエステルが挙げられる。
Ｂ（7）のポリオキシアルキレンポリマーとしては、少なくともオキシプロピレン又はオキシブチレンを有するものが好ましく、またブロックポリマーでもランダムポリマーでもよい。このうち、ポリプロピレングリコール又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンコポリマーがより好ましい。その平均分子量は2,000〜10,000が特に好ましい。具体的には一般式
ＨＯ-（Ｃ2Ｈ4Ｏ）l3（Ｃ3Ｈ6Ｏ）m3（Ｃ2Ｈ4Ｏ）n3-Ｈ
〔式中、ｌ3及びｎ3はそれぞれ０〜20、ｍ3は10〜80の数を示す。〕
で表されるものが挙げられる。このうちｌ3及びｎ3が０、ｍ3が10〜80である化合物、特にｌ3及びｎ3が０、ｍ3が40〜70である化合物が好ましい。
以上のＢ成分のうち、Ｂ（7）がより好ましい。
以上のＢ成分は、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができるが、組み合わせて用いる場合の好ましい例として脂肪酸とポリオキシアルキレン多価アルコールエーテルとの組み合わせが挙げられ、その場合の配合比率は10：90〜90：10が好ましい。
本発明の発酵用消泡剤は、Ａ成分とＢ成分を５：95〜95：５、好ましくは20：80〜70：30の割合で配合することにより得られる。
本発明の発酵用消泡剤には、Ａ成分とＢ成分のほかに、発酵生産を阻害しない範囲で通常発酵生産に使用される各種界面活性剤を配合することができる。
かかる界面活性剤としては、ノニオン界面活性剤としてポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミド等が；アニオン界面活性剤として脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸塩、アルキルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩等が；カチオン界面活性剤としてアルキルアミン塩、第４級アンモニウム塩、アルキルベタイン、アミンオキサイド等が挙げられる。
本発明の発酵用消泡剤は、微生物の培養開始前又は培養中に、Ａ成分とＢ成分の合計量として培地に対して0.0001〜２重量％、特に0.001〜１重量％添加することにより使用することができる。
本発明の発酵用消泡剤は、種々の物質の発酵生産に適用でき、例えばアミノ酸、カルボン酸、酵素、抗生物質等の発酵生産に好適に使用することができる。具体的には、アミノ酸発酵としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、シトルリン、ヒスチジン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、リジン、オルニチン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、バリン等の発酵生産が挙げられ、特にグルタミン酸及びリジンの発酵生産に好適である。カルボン酸発酵としては、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、フマル酸、酒石酸、イタコン酸、α-ケトグルタル酸、アスコルビン酸、グルコン酸、リンゴ酸、コウジ酸等の発酵生産が挙げられ、特にクエン酸及びアスコルビン酸の発酵生産に好適である。酵素発酵としては、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、グルコアミラーゼ等の発酵生産が挙げられ、特にセルラーゼの発酵生産に好適である。抗生物質発酵としては、ペニシリン等のβ-ラクタム系、カナマイシン等のアミノグルコシド系、クロラムフェニコール系、クロロテトラサイクリン等のテトラサイクリン系、エリスロマイシン等のマクロライド系、グラミシジンＳ等のペプチド系のほかミカマイシン、ノボビオシン、リンコマイシン等の抗菌性抗生物質、アクチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ3等の抗癌性抗生物質、アザロマイシン等の抗カビ性抗生物質の発酵生産が挙げられる。これらのなかでも、特にグルタミン酸発酵及びクエン酸発酵に好適である。
本発明の発酵生産方法が適用できる培養手段としては特に限定されないが、特に気泡の発生の多い通気培養、撹拌培養、振とう培養等に好適に適用することができる。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例において消泡剤として使用した化合物を表１に示す。
0004446456.tif 000002
実施例１
廃糖蜜10重量％（糖換算）、尿素0.5重量％及びコーンスティープリカー0.3重量％を含有する培地にコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を植菌し、坂口フラスコで31.5℃で培養した。対数増殖期前期にポリオキシエチレンモノパルミテートを培地に0.15重量％添加し、33℃で10時間培養した。
その培養液100mlを500ml容メスシリンダーに採り、５リットル／分の空気を送り込み、泡が300mlに達した時点で本発明品又は比較品の10重量％水溶液を0.01ｇずつ添加し、30分間通気した後の泡高（ml）を測定した。この結果を表２に示す。
0004446456.tif 000003
表２から明らかなように、本発明品はいずれも、抑泡性、破泡性共に優れるものであった。なお、比較品５、６又は７を添加したものについては、泡が300mlに達する度に消泡剤を添加したが、５回添加しても泡高抑制効果は認められなかった。
実施例２
0004446456.tif 000004
上記組成のクエン酸発酵用培地１リットルを３リットル容ジャーファーメンターに入れ、121℃で15分間滅菌処理した。別に種菌として直径９cmのポテトデキストロースシャーレ２枚に植菌したAspergillus niger菌を各々５ccの滅菌水に懸濁し、上記培地に植菌した。ジャー上部から５cmのところに泡センサーを取付け、培養中に泡がセンサーに接触した時点で本発明品又は比較品の15重量％水溶液が自動滴下するようにしながら、30℃、600rpm、１vvmにて６日間培養した。
その際のクエン酸の生産量及び消泡剤の使用量を表３に示した。
0004446456.tif 000005
表３から明らかなように、本発明品は比較品に比べ少量で消泡効果を発揮し、また生産収量の増加に優れた効果を示した。
実施例３
0004446456.tif 000006
上記組成の酵素生産培地を用いてBacillus sp.菌を600nmにおける吸光度が1.0になるように植菌し、33℃で36時間実施例２と同様に消泡剤を加えながら培養した。その際のセルラーゼ生産量及び消泡剤の使用量を表４に示した。
0004446456.tif 000007
表４から明らかなように、本発明品は比較品に比べ少量で消泡効果を発揮し、また生産収量の増加に優れた効果を示した。
実施例４
0004446456.tif 000008
直径９cmのシャーレ１枚を用い、Streptmyces sp.菌を上記培地組成に1.5％寒天を加えた寒天培地で予備培養し、10ccの滅菌水に懸濁した。これを上記組成の抗生物質培地１リットルに植菌し、35℃で72時間実施例２と同様に消泡剤を加えながら培養した。その際の消泡剤の使用量を表５に示した。
0004446456.tif 000009
表５から明らかなように、本発明品は比較品に比べ少量で優れた消泡効果を発揮した。
実施例５
0004446456.tif 000010
上記組成の培地1200mlを３リットル容ジャーファーメンターに入れ、同培地で予備培養したBrevibacterium flavum（O.D.=30,100ml）を植菌し、32℃で培養した。対数増殖期前期にポリオキシエチレンモノパルミテート0.20重量％を添加し、30時間培養した。培養中はアンモニア水にてpHを7.5に調整し、糖濃度は３％を下限として添加した。消泡剤の添加は実施例２に準じて行った。その際の消泡剤量とL-グルタミン酸（L-GA）生産量を表６に示す。
0004446456.tif 000011
表６から明らかなように、本発明品は比較品に比べ少量で優れた消泡効果を発揮し、L-GA生産性を示した。
産業上の利用可能性
本発明の発酵用消泡剤は、破泡作用及び抑泡作用の双方を併せ持ち、消泡効果に優れ、かつ発酵生産に悪影響を及ぼすことのないものである。