(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の物理化学的特性：
ａ）分子量：１５０，０００±６，０００Ｄａまたは２３０，０００±９，０００Ｄａ（２または３つの相同的サブユニットからなり、その各々のサブユニットの分子量は７５，０００±３，０００Ｄａである）；
ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に対して活性；
ｃ）補因子：ピロロキノリンキノンおよびヘムｃ；
ｄ）最適ｐＨ：Ｌ−ソルボソンからビタミンＣの産生において６．４〜８．２；
ｅ）阻害剤：Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、モノヨードアセテートおよびエチレンジアミンテトラ酢酸；
を有する精製Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼに、Ｌ−ソルボソンを接触させるが、ここで、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣへの転換が、電子受容体の存在下で、精製Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼによって触媒されること、および得られるビタミンＣを反応混合物から単離することを含む、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣを産生する方法。
【請求項２】
Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼが、グルコノバクター  オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ  Ｎｏ．４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）株から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応を、６．４〜９．０のｐＨにて、２０℃〜６０℃の温度範囲で、０．５〜４８時間行なう、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
反応を、７．０〜８．２のｐＨにて、２０℃〜５０℃の温度範囲で、０．５〜２４時間行なう、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の細胞非含有抽出物から精製したアルデヒドデヒドロゲナーゼ、すなわちＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを利用して、Ｌ−ソルボソンからＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）を産生する方法に関する。
【０００２】
前記の酵素はＥＰ０９２２７５９Ａ２に開示され、Ｌ−ソルボソンから２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＧＡ）への酸化反応を触媒する。
【０００３】
ビタミンＣは非常に重要であり、ヒトにとって不可欠な栄養分である。それは「ライヒシュタイン法」により工業的に合成される。Ｄ−グルコソンおよびＬ−ソルボソンは、豆およびホウレンソウにおけるビタミンＣ生合成の推定的中間体であり、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣへの酸化反応を触媒しているニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）依存的酵素は部分的に精製されている。しかし、細菌源を起源とする酵素を使用することによるＬ−ソルボソンからビタミンＣへの変換に関する報告は全くない。驚くべきことに、この酵素は、Ｌ−ソルボソンを２−ＫＧＡに変換できるだけでなく、特定の反応下でビタミンＣにも変換できることが見い出された。
【０００４】
本発明は、以下の物理化学的特性：
ａ）分子量：１５０,０００±６,０００Ｄａまたは２３０,０００±９,０００Ｄａ（２または３つの相同的サブユニットからなり、その各々のサブユニットの分子量は７５,０００±３,０００Ｄａである）；
ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に対して活性；
ｃ）補因子：ピロロキノリンキノンおよびヘムｃ；
ｄ）最適ｐＨ：Ｌ−ソルボソンからビタミンＣの産生において６．４〜８．２；
ｅ）阻害剤：Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、モノヨードアセテートおよびエチレンジアミンテトラ酢酸；
を有する精製Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼに、Ｌ−ソルボソンを、電子受容体の存在下で接触させること、および得られるビタミンＣをその反応混合物から単離することを含む、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣを産生する方法を提供する。
【０００５】
本発明の目的では、「精製」なる用語はまた、その天然環境からの単離も含む。
【０００６】
電子受容体の存在下でのＬ−ソルボソンからビタミンＣへの酸化は、以下の反応式に従って起こる：
Ｌ−ソルボソン＋電子受容体→ビタミンＣ＋還元された電子受容体
【０００７】
この酵素は、電子受容体としての酸素と連携しない。さらに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）は適切な電子受容体ではない。しかし、他の慣用的な電子受容体を、本発明の方法に結合させて使用できる。２,６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）、フェリシアニド、およびチトクロムｃが好ましい電子受容体である。
【０００８】
酵素アッセイは以下のように実施してもよい：
ａ）Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性の産物（ビタミンＣ）のアッセイ
水を含む最終容量１００μｌ中において１．０ｍＭ  ＰＭＳ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．０μＭピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭのＬ−ソルボソンおよび酵素溶液からなる反応混合物を、アッセイの直前に調製する。反応は、特記しない限り、３０℃で６０分間行なう。産生するビタミンＣの量を２６４ｎｍの波長で、ＵＶ検出器（ＴＯＳＯＨ  ＵＢ８０００；ＴＯＳＯＨ  株式会社  日本東京中央区京橋３−２−４）、デュアルポンプ（ＴＯＳＯＨ  ＣＣＰＥ；ＴＯＳＯＨ  株式会社）、積分器（Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｃ−Ｒ６Ａ；島津製作所、日本京都中京区西京桑原町１）およびカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋポリアミン−ＩＩ、ＹＭＣ,Ｉｎｃ．３２３３  Ｂｕｒｎｔ  Ｍｉｌｌ  Ｄｒｉｖｅ  Ｗｉｌｉｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ２８４０３、米国）に結合させた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定する。生じる２−ＫＧＡの量をＨＰＬＣにより測定する。１単位の酵素活性は、反応混合物中に６０分以内に１ｍｇのビタミンＣまたは２−ＫＧＡを生じる酵素の量として定義する。
【０００９】
ｂ）Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ活性の光学的アッセイ
水を含む最終容量１００μｌ中において０．１ｍＭのＤＣＩＰ、１．０ｍＭ  ＰＭＳ、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．０μＭのＰＱＱ、２．０ｍＭのＬ−ソルボソンおよび酵素溶液からなる反応混合物を、アッセイ直前に調製する。反応をＬ−ソルボソンを用いて２５℃で開始し、酵素活性を、６００ｎｍでのＤＣＩＰの初期減少速度として測定する。１単位の酵素活性は、１分間に１μモルのＤＣＩＰの減少を触媒する酵素の量として定義される。ｐＨ７．０におけるＤＣＩＰの吸光係数は、１４．２ｍＭ−１と捉える。対照キュベットには、Ｌ−ソルボソンを除く前記の全ての構成成分を含む。
【００１０】
本発明のＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼは、ＥＰ０９２２７５９Ａ２に記載の方法に従って、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の細胞非含有抽出液から単離することができる。
【００１１】
従って、本発明は、前記したようなＬ−ソルボソンからビタミンＣを産生する方法であって、ここで、Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼが、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）株、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特徴を有するＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物、またはそれらの変異体から得られる、方法を提供する。
【００１２】
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５は、１９８７年３月１７日にＤＳＭ  Ｎｏ．４０２５で、ブダペスト条約の規約に基づいて、ゲッティンゲン（ドイツ）のドイツ微生物及び培養細胞収集局〔Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）〕に寄託された。寄託者は、中国科学院（Academia Sinica）微生物研究所東方科学器機進出口公司（中華人民共和国北京市三里河５２号）であった。有効な寄託者は前記の研究所であり、その全アドレスは、中華人民共和国、１０００８０、北京市、海淀区中関村、中国科学アカデミー微生物研究所である。
【００１３】
菌株の継代培養はまた、１９９２年３月３０日の寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２の下で、ブダペスト条約の規約にここでも基づいて、産業技術総合研究所（ＡＩＳＴ）（日本国３０５−８５６６、茨城県、つくば市東１−１−１、つくば中央第６）にも寄託された。寄託者は日本ロシュK.K.（日本国１０５−８５３２東京都港区芝２丁目６−１）である。この継代培養もまた最も好ましくは本発明に使用する。
【００１４】
この酵素を、以下のように、微生物Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の培養後に単離し精製してもよい：
（１）細胞を遠心分離またはろ過により液体培養ブロスから収集する。
（２）収集した細胞を、水、生理的食塩水、または適切なｐＨを有する緩衝溶液で洗浄する。
（３）洗浄した細胞をその緩衝溶液中に懸濁し、ホモジナイザー、ソニケーター、もしくはフレンチプレスにより、またはリゾチームなどでの処理により破壊して、破壊細胞溶液を得る。
（４）前記酵素を、破壊細胞の細胞非含有抽出液から、好ましくは微生物のサイトゾル画分から単離し精製する。
【００１５】
本発明により提供される方法に適用した酵素は、Ｌ−ソルボソンからビタミンＣを産生するための触媒として有用である。反応を、ｐＨで、６０℃で、約０．５〜４８時間、電子受容体、例えばＤＣＩＰおよびＰＭＳなどの存在下で、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液などの溶媒中で行ってもよい。約７．０〜８．２のｐＨおよび約２０℃〜５０℃の範囲の温度で約０．５〜２４時間が、Ｌ−ソルボソンを効率的にビタミンＣに変換する条件である。
【００１６】
従って、本発明の方法において、反応を、約６．４〜約９．０のｐＨにて、約２０℃〜約６０℃の温度で、約０．５〜約４８時間で行なう。好ましくは反応を約７．０〜約８．２のｐＨにて、約２０℃〜約５０℃の温度で、約０．５〜約２４時間行なう。
【００１７】
反応混合物中のＬ−ソルボソンの濃度は、他の反応条件に応じて変更できるが、一般に、約０．５〜約５０ｇ/Ｌ、好ましくは約１〜約３０ｇ/Ｌである。
【００１８】
本発明によれば、触媒反応を、水中、またはメタノール、エタノール、アセトンなどの水性溶媒もしくはこれらの溶媒のいずれか１つと水との混合物中で行うが、経済的にも取り扱いの容易さの観点からも水が好ましい。
【００１９】
本発明の方法において、この酵素をまた、適切な担体を用いて固定した状態で使用してもよい。当分野で一般的に知られている酵素を固定化する任意の手段を使用してもよい。例えば、この酵素を、１つ以上の官能基を有するレジンの膜もしくは顆粒などに直接結合させてもよいし、または１つ以上の官能基を有する架橋化合物、例えばグルタルアルデヒドを介してレジンに結合させてもよい。
【００２０】
反応混合物中に生じたビタミンＣを、当分野で知られている慣用的な方法により単離してもよく、塩として、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、またはアンモニウム塩などとして分離してもよい。この塩を、当分野で知られている慣用的な方法により遊離酸に変換してもよい。特に、分離を、以下の工程の任意の適切な組合せまたは反復により実施してもよい：生成物と周囲の不純物の間の特性の差異、例えば溶解度、吸収性、および溶媒間の分配係数、および例えばイオン交換樹脂などに対する吸着の差異を使用することによる塩の形成。これらの手順のいずれかの１つまたは組合せが、生成物を単離するための慣用的な手段を構成する。このようにして得られた生成物を、慣用的な方法で、例えば、再結晶またはクロマトグラフィーによりさらに精製してもよい。
【００２１】
以下の実施例は本発明をさらに説明する。
【００２２】
Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼの調製
全ての操作は８℃で実施し、緩衝液は、特記しない限り、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）であった。
（１）Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の培養：
Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）を、５．０％Ｄ−マンニトール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー（Corn steep liquor）、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３、および２．０％寒天を含む寒天プレート上で２７℃で４日間増殖させた。１白金耳の細胞を、５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中に２％Ｌ−ソルボース、０．２％酵母抽出液、０．０５％グリセロール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープリカー、０．５％尿素、および１．５％ＣａＣＯ３を含む５０ｍｌの種培養培地に接種し、３０℃で回転振とう器で１８０ｒｐｍで１日培養した。
【００２３】
培養ブロス（１０ｍｌ）を、１００ｍｌの同じ種培養培地を含む５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコに移し、前記したのと同じように培養した。このようにして調製した種培養液を、３０Ｌのジャーファーメンター中での、８．０％Ｌ−ソルボース、０．０５％グリセロール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０％コーンスティープリカー、０．４％酵母抽出液、および０．１５％消泡剤を含む、１５リットルの培地への接種に使用した。発酵パラメータは、攪拌速度については８００ｒｐｍであり、３０℃の温度での通気については０．５ｖｖｍ（空気の容量／培地の容量／分）であった。ｐＨを、発酵中は水酸化ナトリウムを用いて７．０に維持した。４８時間の培養後、２セットの発酵槽を使用することによる、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の細胞を含む３０リットルの培養ブロスを、連続的遠心分離により収集した。細胞を含むペレットを回収し、適切な容量の生理的食塩水に懸濁した。
【００２４】
懸濁液を２,５００ｒｐｍ（１,０００×ｇ）で遠心分離した後、細胞を含む上清を回収して、培地中の成分であるコーンスティープリカーおよび酵母抽出物に由来する不溶性物質を除去した。その後、上清を８,０００ｒｐｍ（１０,０００×ｇ）で遠心分離し細胞ペレットを得た。結果として、１２３ｇのＧ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）細胞（湿重量）を、３０リットルのブロスから得た。
【００２５】
（２）サイトゾル画分の調製：
細胞ペレット（６４．２ｇ）を２８０ｍｌの緩衝液に懸濁し、フレンチ圧力細胞プレスに通した。遠心分離して無傷細胞を除去した後、上清を細胞非含有抽出液と称し、細胞非含有抽出液を１００,０００×ｇで６０分間遠心分離した。得られた上清（２２７ｍｌ）をＧ．ｏｘｙｄａｎｓＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の可溶性画分と称した。この画分を緩衝液に対して透析した後、０．１０７単位/ｍｇタンパク質の比活性を有する１５０ｍｌの透析画分を次の精製ステップに使用した。
【００２６】
（３）ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムクロマトグラフィー：
透析液（１５０ｍｌ）を、緩衝液で平衡化し洗浄し微量のタンパク質を溶出したＤＥＡＥ−セルロース（ホワットマンＤＥ−５２、３×５０ｃｍ）のカラムにのせた。その後、レジンに結合したタンパク質を、緩衝液中０．２８、０．３２、０．３６ＭのＮａＣｌで段階的に溶出した。主な酵素活性は、０．３６ＭのＮａＣｌ時に溶出された。活性画分（１４３ｍｌ）を回収した。
【００２７】
（４）カルボキシメチルセルロースカラムクロマトグラフィー：
前のステップからの活性画分の一部（１２７ｍｌ）を、限外ろ過器（Centriprep-10、アミコン）によりろ過し濃縮した。濃縮した試料（２８ｍｌ）を緩衝液に対して透析した後、２８ｍｌの透析画分（３１ｍｌ）を、緩衝液で平衡化したカルボキシメチル−セルロース（ホワットマンＣＭ−５２、３×２３ｃｍ）のカラムにのせた。レジンに結合することなくカラムを通過したタンパク質を回収した。
【００２８】
（５）Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィー（＃１）：
プールした活性画分（４３ｍｌ）を限外ろ過器（Centriprep-10）により濃縮した。前のステップからの濃縮画分（１０ｍｌ）の一部（９．５ｍｌ）を、緩衝液で平衡化したＱ−セファロース（ファルマシア、１．５×５０ｃｍ）にのせた。カラムを、０．３ＭのＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄した後、０．３〜０．６Ｍの線形勾配のＮａＣｌを緩衝液に加えた。活性画分を、０．５５〜０．５７Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度で溶出した。
【００２９】
（６）Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィー（＃２）：
前のステップからのプールした活性画分（２２ｍｌ）を、限外ろ過器（Centriprep-10）により濃縮した。濃縮液（３．０ｍｌ）を緩衝液に対して透析した。透析した試料（３．５ｍｌ）を、緩衝液で平衡化したＱ−セファロース（ファルマシア、１．５×５０ｃｍ）カラムにのせた。カラムを０．３５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄した後、０．３５〜０．７Ｍの線形勾配のＮａＣｌを緩衝液に加えた。活性画分を、０．５１〜０．５３Ｍの範囲のＮａＣｌ濃度で溶出した。
【００３０】
（７）ゲルろ過（セファクリルＳ−３００高分解能）カラムクロマトグラフィー：
前のステップからのプールした活性画分（２０ｍｌ）を、限外ろ過器（Centriprep-10）により濃縮した。１．５ｍｌ部の濃縮し脱塩（０．１ＭのＮａＣｌより低く）した試料（２．０ｍｌ）を、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３００高分解能カラム（ファルマシア、１．５×１２０ｃｍ）にのせた。活性画分（１２ｍｌ）を回収し、緩衝液に対して透析した。
【００３１】
（８）疎水性カラム（RESOURCE ISO）クロマトグラフィー：
前のステップからの透析した活性画分を、限外ろ過器（Centriprep-10）により濃縮した。濃縮した試料（１．７５ｍｌ）の一部（１．５ｍｌ）を、３Ｍ硫酸アンモニウム（最終濃度１．５Ｍ）を含む等容量（１．５ｍｌ）の緩衝液に加えた。試料を遠心分離（１５,０００×ｇ）した後、上清を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化したカラムRESOURCE ISO（ファルマシア、１．０ｍｌ）にのせた。カラムを、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した後、１．５〜０．７５Ｍの線形勾配の硫酸アンモニウムを含む緩衝液でタンパク質を溶出した。Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼに対応する活性画分を、１．１２〜１．１０Ｍの範囲の硫酸アンモニウム濃度で溶出した。活性画分を、透析カップ（Dialysis-cup透析カップＭＷＣＯ８０００、Daiichi pure chemicals）を使用して緩衝液に対して透析した。その後、画分を回収し、−２０℃で保存した。酵素の精製工程の要約を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0004566000.tif 000002
【００３３】
実施例２：Ｌ−ソルボソンからの反応生成物に対するｐＨの影響
１００μｌの１００ｍＭの種々の緩衝液中において精製酵素（０．４２μｇ）、Ｌ−ソルボソン（５０ｍＭ）、ＰＭＳ（１ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１ｍＭ）、およびＰＱＱ（１μＭ）からなる反応混合物を、１時間、３０℃でインキュベートした。反応生成物を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０Ｆ２５４、メルク）およびＨＰＬＣにより分析した。ビタミンＣ生成は、６．４から約８．０のｐＨ範囲で検出した。一方、２−ＫＧＡ生成は、表２に示したように、５．４から約９．０のｐＨ範囲で検出した。
【００３４】
【表２】
0004566000.tif 000003
【００３５】
活性に対する温度の効果
２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に０．４２μｇの精製Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ、５０ｍＭのＬ−ソルボソン、１μＭのＰＱＱ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＰＭＳを含む反応混合物を、６０分間、種々の温度でインキュベートした。Ｌ−ソルボソンを、表３に示したように、ビタミンＣおよび２−ＫＧＡに変換した。
【００３６】
【表３】
0004566000.tif 000004