(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な酵素をコードする単離されたDNAであって、該DNA配列が、
a) 配列番号37、44または84により示されるヌクレオチド配列を含む配列、
b) 配列番号37、44または84の全長にわたり配列番号37、44または84により示される配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む配列、および
c) 配列番号38または45により示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む配列
よりなる群から選ばれる、上記単離されたDNA。
【請求項２】
該核酸配列がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする、請求項１に記載の単離されたDNA。
【請求項３】
該酵素が構造化トリアシルグリセロールの合成に選択的である、請求項１に記載のDNA。
【請求項４】
該構造化トリアシルグリセロールが式：S-U-S（式中、Sは飽和脂肪酸を表し、Uは不飽和脂肪酸を表す）の構造を有する、請求項３に記載のDNA。
【請求項５】
配列番号38のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号45のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号37に記載のヌクレオチド配列にコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号44に記載のヌクレオチド配列にコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号84に記載のヌクレオチド配列にコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性であり、モルティエレラ（Mortierella）に固有の他のタンパク質から単離されているモルティエレラ（Mortierella）アシルトランスフェラーゼタンパク質であって、該タンパク質が、
a) 配列番号37、44または84により示されるヌクレオチド配列を含む配列、および
b) 配列番号37、44または84の全長にわたり配列番号37、44または84により示される配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクオチド配列を含む配列
よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列によりコードされるか、または配列番号38もしくは45により示される配列を含む、上記タンパク質。
【請求項１１】
転写開始領域と、ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを、5'から3'への転写方向の作動的結合成分として含んでなる核酸構築物であって、該ポリヌクレオチド配列が、
a) 配列番号37、44または84により示されるヌクレオチド配列を含む配列、
b) 配列番号37、44または84の全長にわたり配列番号37、44または84により示される配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む配列、および
c) 配列番号38または45により示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む配列
よりなる群から選ばれる、上記核酸構築物。
【請求項１２】
該酵素がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
請求項１１に記載のDNA構築物を含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
該宿主細胞が、細菌、昆虫、真菌、哺乳類および植物よりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞を含んでなる植物。
【請求項１６】
適当な培養条件下で宿主細胞がアシルトランスフェラーゼタンパク質を産生するよう、転写開始領域とジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含む核酸構築物で細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを含んでなる、組換え宿主細胞の製造方法であって、該ポリヌクレオチド配列が、
a) 配列番号37、44または84により示されるヌクレオチド配列を含む配列、
b) 配列番号37、44または84の全長にわたり配列番号37、44または84により示される配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む配列、および
c) 配列番号38または45により示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む配列
よりなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項１７】
該宿主細胞が植物細胞である、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
適当な培養条件下で宿主細胞がアシルトランスフェラーゼタンパク質を産生するよう、転写開始領域と配列番号37により示されるヌクレオチド配列および配列番号44により示されるヌクレオチド配列よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列とを含む核酸構築物で細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを含んでなる、組換え宿主細胞の製造方法。
【請求項１９】
該ポリヌクレオチド配列が配列番号37に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
該宿主細胞が植物細胞である、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２１】
転写開始領域とジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを含む核酸構築物で植物細胞を形質転換することを含んでなる、植物細胞におけるトリアシルグリセロール組成の修飾方法であって、該ポリヌクレオチド配列が、
a) 配列番号37、44または84により示されるヌクレオチド配列を含む配列、
b) 配列番号37、44または84の全長にわたり配列番号37、44または84により示される配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む配列、および
c) 配列番号38または45により示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む配列
よりなる群から選ばれる、上記方法。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチド配列がアンチセンス配向である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該ポリヌクレオチド配列がセンス配向である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
内因性ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質の活性が抑制される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
内因性ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質の活性が増強される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
適当な培養条件下で植物細胞がアシルトランスフェラーゼタンパク質を産生するよう、転写開始領域と配列番号37により示されるヌクレオチド配列および配列番号44により示されるヌクレオチド配列よりなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列とを含む核酸構築物で植物細胞を形質転換することを含んでなる、植物細胞における脂質組成の修飾方法。
【請求項２７】
該ポリヌクレオチド配列がアンチセンス配向であり、それにより、該配列から転写されたmRNAが、該内因性遺伝子から転写された対応mRNAに相補的であり、該植物細胞における該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質の活性が抑制される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該ポリヌクレオチド配列がセンス配向である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項５に記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
【請求項３０】
請求項６に記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
【請求項３１】
配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号45に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチドを含む組成物を候補化合物と接触させ、 該ポリペプチドと該候補化合物との相互作用を検出することを含んでなる、DAGATの発現または活性を刺激または抑制する化合物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、酵素、そのような酵素の精製および入手方法、それに関連したアミノ酸および核酸配列、ならびに遺伝子工学の用途におけるそのような組成物の使用方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
トリアシルグリセロール（TAG）は、細胞にとって最も重要なエネルギー貯蔵体であると考えられている。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、TAGの構造を調節しTAGの合成を導くと考えられる酵素である。DAGATにより触媒される反応は、グリセロ糖脂質の生合成における決定的な分岐点で生じる。そのような分岐点における酵素は代謝調節部位の主要な候補とみなされている。ジアシルグリセロール、TAGおよび膜脂質の合成に共通したいくつかの酵素が存在するが、DAGAT反応は油合成に特異的である。
【０００３】
植物においては、TAGは、種子発芽中に利用されるエネルギー貯蔵形態として種子により用いられる植物油の主要成分である。高等植物は、共通の代謝経路により油を合成するらしい。脂肪酸は、一括して脂肪酸合成酵素（FAS）として公知の酵素に触媒される一連の反応を介してアセチル-CoAから色素体内で産生される。色素体内で産生された脂肪酸は、細胞のサイトゾル画分に輸出され、補酵素Aに対してエステル化される。これらのアシルCoAは、小胞体（ER）内でのグリセロ脂質合成の基質である。グリセロ脂質合成自体は、まずホスファチジン酸（PA）およびジアシルグリセロール（DAG）に導く一連の反応である。これらの代謝中間体はいずれも、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルコリン（PC）などの膜リン脂質に導かれるか、または中性トリアシルグリセロール（TAG）の形成に導かれうる。
【０００４】
ジアシルグリセロール（DAG）は、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ（G3PAT）およびリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT）により逐次的に触媒されてPAを与える2工程、およびそれに続く、ホスファチジン酸ホスファターゼ（PAP）により触媒されてDAGを与える追加的な加水分解工程で、グリセロール-3-リン酸および脂肪酸アシル-CoAから合成される。ほとんどの細胞において、DAGは膜リン脂質を産生するのに用いられ、第1工程は、CTPホスホコリンシチジルトランスフェラーゼにより触媒されるPCの合成である。貯蔵油を産生する細胞において、DAGは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）により触媒される反応において第3の脂肪酸でアシル化される。総合すると、これらの反応は、ケネディー経路と一般に称されるものの一部を構成する。
【０００５】
TAGの構造は、脂肪酸の位置特異性に関しては、脂肪酸アシルCoAおよびグリセロールバックボーン基質に対する3つの各アシルトランスフェラーゼの特異性により定められる。したがって、例えば、多数の温帯種の種子に由来するアシルトランスフェラーゼは、sn-1またはsn-3位には飽和または不飽和脂肪酸を許容するが、sn-2には不飽和脂肪酸しか許容しない傾向がある。sn-2における不飽和脂肪酸に対する絶対的特異性はLPAAT酵素の基質優先性により定められる。ココアなどのいくつかの種においては、sn-1位が飽和脂肪酸にエステル化される場合にはsn-3位が飽和脂肪酸でアシル化される見掛け上の優先性が存在する点で、この傾向が更に保有されていることが、TAG組成から示唆される。例えば、SUS形態（S=飽和脂肪酸およびU=不飽和脂肪酸）の構造化（structured）TAGの割合は、sn-2位を不飽和脂肪酸に固定した場合の全脂肪酸組成に基づくランダムな分布から予想される割合より高い。このことはまた、DAGATが、TAGの合成の制御とまではいかなくともTAGの構造の調節において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【０００６】
油が産生されるよう脂肪酸がグリセロールバックボーン中に取込まれる際に表現型に影響を及ぼしうる核酸配列を得ることは、種々の障害にさらされる。そのような障害には、関心のある代謝因子の同定、有用な速度論的パラメーターを有するタンパク質源の選択および特徴づけ、アミノ酸配列決定を可能にするレベルまでの関心のあるタンパク質の精製、所望のDNA配列を回収するためのプローブとして使用しうる核酸配列を得るためのアミノ酸配列データの利用、および構築物の調製、形質転換および得られた植物の分析が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】
したがって、酵素標的の同定、および油の構造および量を修飾しうるそのような酵素標的の核酸配列の有用な組織源の同定が必要とされている。理想的には、酵素標的は、単独で又は他の核酸配列（これは、油産生の増加／減少、TAGの構造、脂肪酸プール中の不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比率、および／または該脂肪酸プールの修飾から生じた他の新規油組成物に関連したものである）と組合せて、1以上の用途に適用可能なものとなろう。
【０００８】
例えば、いくつかの場合には、種子荒粉に対する油の比率がより高い油料種子を得るのが、より低いコストで所望の油を得るために有用であろう。これは、高価な油製品に典型的なことであろう。あるいは、そのような油料種子は、より優れた動物用飼料となるかもしれない。いくつかの場合には、種子荒粉に対する油の比率がより低い油料種子を得るのが、カロリー含量を低下させるために有用であろう。他の用途においては、心臓血管の健康上の理由から、不飽和脂肪酸の比率がより高い食用植物油が望ましい。あるいは、ヤシ、ココナッツ、ココアなどの高不飽和熱帯油の温帯産代替物も、種々の産業的および食用用途において有用であろう。
【０００９】
哺乳動物においては、DAGATは、細胞ジアシルグリセロールの代謝において重要な役割を果たし、腸脂肪吸収、リポタンパク質集合、脂肪組織形成および乳汁分泌を含むトリアシルグリセロール代謝に関わる過程において重要である。そのため、DAGATタンパク質の及びポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の同定および単離が望まれている。
【００１０】
DAGATを単離するためのいくつかの推定的方法が公開されている。PolokoffおよびBell (1980) は、ラット肝臓ミクロソームからのDAGATの部分精製および可溶化を報告している。この調製物は、活性をもたらす特異的タンパク質因子を同定するのに十分なほどには純粋でなかった。KwanyuenおよびWilson (1986, 1990) は、ダイズ子葉からの該酵素の精製および特徴づけを報告している。しかしながら、その分子量（1843kDa）は、この調製物が十分には可溶化されず、それに含まれるDAGATタンパク質が多数のタンパク質の大きな凝集体の一部であったことを示唆している。Littleら (1993) は、菜種の小胞子由来の胚からのDAGATの可溶化を報告しているが、KwanyuenおよびWilsonの場合と同様、活性関連物質の分子量が大きすぎるため、完全な可溶化が生じたとは考えにくい。Anderssonら (1994) は、ラット肝臓からのDAGATの可溶化および415倍の精製（イムノアフィニティークロマトグラフィーを使用するもの）を報告している。しかしながら、彼らが使用した抗体がDAGATエピトープを認識するという証拠も、彼らが精製したタンパク質が本当にDAGATだという証拠も存在しない。実際のところ、KwanyuenおよびWilsonの場合と同様、彼らの調製物におけるDAGAT活性は、凝集した膜タンパク質に典型的な分子量を示した。最後に、Kamisakaら (1993, 1994, 1996, 1997) は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella rammaniana）からのDAGATの可溶化およびそれに続く、均質になるまでの精製を報告している。彼らは、この真菌種から可溶化されたDAGATがSDS-PAGEで53kDaの見掛け分子量を有すると示唆している。しかしながら、後記実施例4に示すとおり、Kamisakaらのプロトコールを用いて得られた画分は、DAGAT活性と相関する十分な量の53kDaポリペプチドを与えなかった。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）、特に、DAGATポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、植物、ヒトを含む哺乳類、線虫および真菌に由来するものを含む。
【００１２】
もう1つの態様において、本発明は、SDS-PAGE分析で約36kDaおよび37kDaの分子量、特に36kDaおよび36.5kDaの分子量を有するDAGATタンパク質を提供する。本発明の好ましいDAGATタンパク質はモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）から入手可能である。
【００１３】
もう1つの態様において、本発明は、DAGATタンパク質に由来するオリゴヌクレオチド、および部分的または完全なDAGATコード配列を含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００１４】
DAGATの転写または転写・翻訳（発現）に使用しうる組換えDNA構築物を提供することも、本発明の1つの態様である。特に、植物および哺乳類宿主細胞内で転写または転写・翻訳されうる構築物を提供する。特に、好ましい構築物は、植物細胞内で転写または転写・翻訳されうる構築物である。
【００１５】
本発明のもう1つの態様において、宿主細胞またはその子孫細胞内でのDAGATの製造方法を提供する。特に、宿主細胞を、DAGATの転写または転写・翻訳に使用しうるDNA構築物で形質転換またはトランスフェクトする。DAGATを含有する組換え細胞も本発明の一部である。
【００１６】
もう1つの態様において、本発明は、油以外の構成成分に対する油の比率を修飾するための、およびトリグリセリド分子の組成および／または構造（特に、油料種子作物の種子油におけるもの）を修飾するための、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の使用方法に関する。そのような修飾されたトリグリセリドを有する植物細胞も本発明に含まれる。
【００１７】
植物DAGATタンパク質の発現により得られた修飾植物、種子および油も、本発明の一部とみなされる。
【００１８】
もう1つの態様において、本発明は、哺乳動物におけるそのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する。そのような方法は、DAGAT活性に関連した疾患細胞、例えば、変化したジアシルグリセロール濃度またはプロテインキナーゼC活性に関連した疾患 [癌；糖尿病；心不全、アテローム性動脈硬化症など（これらに限定されるものではない）の心肺疾患；アジポサイトーシス（adipocytosis）；白血病および皮膚癌；線維芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常な脂質代謝に関連した疾患；異常な脂肪吸収、リポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない]を治療または改善することを含む。また、DAGAT活性のレベルを変化させるための方法を提供する。
【００１９】
本発明のもう1つの態様においては、DAGATのアゴニストおよびアンタゴニスト／インヒビターを同定するための方法、ならびにそのようなアゴニストまたはアンタゴニストで、DAGAT活性に関連した状態を治療し又はDAGAT活性のレベルを変化させるための方法を提供する。
【００２０】
DAGAT活性のレベルの変化を検出するための及びDAGAT活性に関連した状態を診断するための診断アッセイを提供することも、本発明の1つの態様である。
【００２１】
（図面の簡単な説明）
図1は、イエロー（Yellow）86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
図2Aは、ヘパリンセファロース（Heparin Sepharose）CL6Bのカラム上のイエロー86-アガロースカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図2Bは、ヘパリンセファロースCL6Bカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
図3Aは、75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロースカラム上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロース（Heparin Sepharose）CL6Bのカラムの第2活性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図3Bは、イエロー86-アガロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
図4は、イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
図5Aは、ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガロースカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図5Bは、ヒドロキシアパタイトカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
図6は、DAGAT精製プロトコールによるカラム画分におけるモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性の分析の結果を示す。図6Aは、タンデム（縦列）イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す。図6Bは、該タンデムクロマトグラフィーからのピーク画分のSDS-PAGE分析の結果を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
図7Aおよび7Bは、イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製した脂肪体画分の高塩および低塩調製物のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
図8Aは、イエロー86-アガロースおよびヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）上でのクロマトグラフィー後のヘパリンカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図8Bは、ヘパリンカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
図9は、イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
図10Aは、ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガロースカラムからプールしたモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図10Bは、ヒドロキシアパタイトカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
図11Aは、ヘパリンセファロースCL6Bのカラム上のヒドロキシアパタイトカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図11Bは、ヘパリンセファロースCL6Bカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
図12Aは、75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロースカラム上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロースCL6Bカラムの第1活性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図12Bは、イエロー86-アガロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
図13は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）において同定した2つのDAGATタンパク質のタンパク質アライメントを示す。36kDa候補体については完全長タンパク質配列が示されており、36.5kDaタンパク質については部分配列が示されている。
図14は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）において同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞から単離した膜上のDAGAT活性データを示す。
【００２２】
図15は、酵母およびシー・エレガンス（C. elegans）由来のDAGATホモログのDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞から単離した膜上のDAGAT活性データを示す；
図16は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）において同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞内の相対トリアシルグリセロール含量を示す。
【００２３】
（発明の詳細な記載）
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（本明細書においてはDAGATと称される）、特に、単離されたDAGATタンパク質、および該DAGATタンパク質をコードする核酸配列に関する。本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、酵素反応条件下で1,2-ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からトリアシルグリセロール産生を触媒する能力を示す、細胞源から入手可能な任意の核酸配列コード化アミノ酸（例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド）を含む。「酵素反応条件」は、該酵素が機能するのを可能にする環境（すなわち、温度、pH、阻害物質の欠如などの要因）において、任意の必要な条件が利用可能であることを意味する。
【００２４】
単離されたタンパク質、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明の第1の態様は、単離されたDAGATタンパク質に関する。本発明で用いる「単離（された）」なる語は、「人間の手により」その天然状態から改変されていることを意味する。例えば、それが天然に存在する場合には、それは、その元の環境から変化している若しくは取り出されている又はその両者に付されている。例えば、生きた生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。特に、SDS-PAGE分析で約36kDa〜約37kDaの分子量を有するDAGATタンパク質を同定した。特に、約36kDaおよび36.5kDaの分子量を有しモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）から入手可能なDAGATタンパク質を提供する。さらに、該DAGATタンパク質は可溶化されている。「可溶化」は、膜に結合していない酵素に典型的な様態で挙動するようDAGAT酵素を膜から抽出することを意味する。
【００２５】
本発明のDAGATタンパク質は、宿主細胞内の種々のアシル基質（脂肪酸アシル-CoAおよび脂肪酸アシル-ACP分子を含む）を利用しうる。また、DAGATは、ある種の分子に対して優先的な活性を示しうるが、DAGATが作用するアシル基質は種々の炭素鎖長および飽和度を有しうる。
【００２６】
本発明のもう1つの態様はDAGATポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、配列表に記載の単離されたポリペプチドならびにそれらのポリペプチドおよび断片、特に、DAGAT活性を示すポリペプチド、また、配列表に記載の配列の群から選ばれるポリペプチド配列に対して少なくとも50％、60％または70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドを含み、そのようなポリペプチドの一部（該ポリペプチドの一部は、好ましくは少なくとも30アミノ酸を含み、より好ましくは、少なくとも50アミノ酸を含む）も含む。
【００２７】
「同一性」は、当技術分野でよく知られているとおり、配列の比較により決定される2以上のポリペプチド配列または2以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。また、当技術分野においては、「同一性」は、一連のそのような配列間のマッチにより決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合を意味する。「同一性」は、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編, Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.およびDevereux, J.編, Stockton Press, New York (1991);ならびにCarillo, H.およびLipman, D., SIAM J Applied Math, 48:1073 (1988)に記載の方法を含む（これらに限定されるものではない）公知方法により容易に計算することができる。同一性の決定方法は、試験する配列間で最大のマッチを与えるように設計する。さらに、同一性の決定方法は、公的に利用可能なプログラムにおいてプログラミングされている。2つの配列間の同一性の決定に使用しうるコンピュータープログラムには、GCG（Devereux, Jら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984); 5つのBLASTプログラム1式 [そのうちの3つはヌクレオチド配列の照会用に設計されたものであり（BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX）、2つはタンパク質配列の照会用に設計されたものである（BLASTPおよびTBLASTN）]（Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80 (1994); Birrenら, Genome Analysis, 1:543-559 (1997)）が含まれるが、これらに限定されるものではない。BLAST Xプログラムは、NCBIおよび他の入手元から公的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, Sら, NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul, Sら, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)）。よく知られたSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
【００２８】
ポリペプチド配列の比較のためのパラメーターは、典型的には、以下のものを含む：
アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)
比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915-10919 (1992)からのBLOSSUM62
ギャップペナルティー：12
ギャップ長ペナルティー：4。
【００２９】
これらのパラメーターで使用しうるプログラムは、Genetics Computer Group, Madison Wisconsinからの「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。末端（end）ギャップに関するペナルティーを伴わない前記パラメーターは、ペプチドの比較のためのデフォールト・パラメーターである。
【００３０】
ポリヌクレオチド配列の比較のためのパラメーターは以下のものを含む：
アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)
比較マトリックス：マッチ＝+10；ミスマッチ＝0
ギャップペナルティー：50
ギャップ長ペナルティー：3。
【００３１】
これらのパラメーターで使用しうるプログラムは、Genetics Computer Group, Madison Wisconsinからの「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。前記パラメーターは、核酸の比較のためのデフォールト・パラメーターである。
【００３２】
本発明はまた、式：
X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y
（式中、アミノ末端のXは水素、カルボキシル末端のYは水素または金属、R1およびR3は任意のアミノ酸残基、nは1〜1000の整数、およびR2は本発明のアミノ酸配列、特に、配列表に記載の群、好ましくは配列番号38および45から選ばれるアミノ酸配列である）のポリペプチドを含む。該式中、R2は、そのアミノ末端残基が左側でR1に結合しそのカルボキシ末端残基が右側でR3に結合するように配向している。いずれかのR基（この場合、Rは1より大きい）で示されるアミノ酸残基のいずれの伸長も、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロポリマーである。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、配列番号37、44および46〜72に含まれる配列の群から選ばれる配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドを含む。
【００３４】
本発明のポリペプチドはDAGAT活性を有することが示されている。DAGATは、細胞グリセロ脂質の代謝に関与し、特に、1,2-ジアシルグリセロールと脂肪酸アシル-CoAとからのトリアシルグリセロールの形成を触媒するため、本発明のポリペプチドには関心が持たれる。DAGATは、トリアシルグリセロールの生合成経路に特有の唯一の酵素である（Coleman RA, (1992) Methods. Enzymol. 209:98-104）。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質であってもよく、あるいは融合タンパク質の一部であってもよい。
【００３６】
該ポリペプチドの断片および変異体も本発明の一部とみなされる。断片は、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではなくその一部と完全に同じアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドである。該断片は「独立（free-standing）」していてもよく、あるいはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい（この場合、該断片はその一部または一領域を形成し、最も好ましくは単一の連続領域としてそれを形成する）。好ましい断片は、本発明のポリペプチドの活性を媒介する断片（同様の活性もしくは改善された活性を有するもの又は減少した活性を有するものを含む）である生物学的に活性な断片である。また、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性である断片も含まれる。
【００３７】
また、該ポリペプチドの変異体は、同類アミノ酸置換、同様の特性を有する別の残基による残基の置換により配列表に記載の配列とは異なっているポリペプチドを含む。一般に、そのような置換は、Ala、Val、LeuおよびIle間；SerおよびThr間；AspおよびGlu間；AsnおよびGln間；LysおよびArg間；またはPheおよびTyr間のものである。5〜10；1〜5；1〜3または1個のアミノ酸が任意の組合せで置換され欠失しており又は付加されている変異体が、特に好ましい。
【００３８】
本発明のポリペプチドの断片である変異体は、対応する完全長ポリペプチドをペプチド合成により製造するために使用することができる。したがって、これらの変異体は、本発明の完全長ポリペプチドの製造用中間体として使用することができる。
【００３９】
本発明のもう1つの態様は、単離されたDAGATポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチド配列は、配列表に記載の配列の群から選ばれる推定アミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、およびそのような配列およびそれらの変異体と密接に関連した他のポリヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
本発明は、配列表に記載の各コード配列と全長にわたり同一であるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはその断片のコード配列、および他のコード配列（例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ-、プロ-またはプレプロ-タンパク質配列をコードする配列など）と共にリーディングフレームをなす成熟ポリペプチドまたはその断片のコード配列を提供する。また、該ポリヌクレオチドは、例えば、非コード5'および3'配列、例えば転写される非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、mRNAを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および追加的なアミノ酸をコードする追加的なコード配列を含む（これらに限定されるものではない）非コード配列を含みうる。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するためのマーカー配列が含まれうる。また、本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子と、遺伝子発現を制御する天然に結合している配列とを含むポリヌクレオチドを含む。
【００４１】
本発明はまた、式：
X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y
（式中、5'末端のXは水素、3'末端のYは水素または金属、R1およびR3は任意の核酸残基、nは1〜3000、好ましくは1〜1000の整数、およびR2は本発明の核酸配列、特に、配列表に記載の群、好ましくは配列番号37、44および46〜72から選ばれる核酸配列である）のポリヌクレオチドを含む。該式中、R2は、その5'末端残基が左側でR1に結合しその3’末端残基が右側でR3に結合するように配向している。いずれかのR基（この場合、Rは1より大きい）で示される核酸残基のいずれの伸長も、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロポリマーである。
【００４２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの変異体をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体に関する。本発明のポリヌクレオチドの断片である変異体を、本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に使用することができる。好ましい実施形態は、本発明のポリペプチド配列の5〜10、1〜5、1〜3、2、1または0個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換され付加され又は欠失しているポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの特性または活性を改変しないサイレントな置換、付加および欠失が特に好ましい。
【００４３】
本発明の更に好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわたり少なくとも50％、60％または70％同一であるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわたり少なくとも80％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれに相補的なポリヌクレオチドが、より好ましい。この点に関しては、全長にわたり少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも95％同一であるものが格別に好ましい。さらに、少なくとも97％の同一性を有するものが非常に好ましく、少なくとも98％および99％の同一性を有するものが更に好ましく、少なくとも99％の同一性を有するものがより一層好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態は、配列表に記載のポリヌクレオチドにコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４５】
本発明は更に、前記配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明で用いる「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」なる語は、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合にハイブリダイゼーションが一般に生じることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例として、50％ホルムアミド、5x SSC（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5xデンハルト液、10％硫酸デキストランおよび20マイクログラム/ミリリットルの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩のインキュベーション、およびそれに続く約65℃、0.1x SSC中でのハイブリダイゼーション支持体の洗浄が挙げられる。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, cold Spring Harbor, NY (1989), 特に第11章に例示されている。
【００４６】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、配列表に記載のポリヌクレオチド配列に関して、該ポリヌクレオチド配列またはその断片の配列を有するプローブで、完全な遺伝子を含有する適当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列を単離することにより入手可能なポリヌクレオチド配列より実質的になるポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドを得るのに有用な断片には、例えば、本明細書に記載のプローブおよびプライマーが含まれる。
【００４７】
例えば、本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中に説明するとおり、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする完全長cDNAまたはゲノムクローンを単離するための又は配列表に記載のポリヌクレオチドに対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAまたはゲノムクローンを単離するためのRNA、cDNAまたはゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。そのようなプローブは、一般には、少なくとも15塩基を含むであろう。好ましくは、そのようなプローブは、少なくとも30塩基を有し、少なくとも50塩基を有しうる。特に好ましいプローブは、30塩基〜50塩基を有するであろう。
【００４８】
配列表に記載のポリヌクレオチド配列を含む又はそれに含まれる各遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために配列表に記載のDNA配列を使用してスクリーニングすることにより単離することができる。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドを使用してcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニングして、該プローブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定する。例えば、DAGATペプチド配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを調製する。DAGAT遺伝子の部分DNA配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術におけるプライマーとして、該オリゴヌクレオチドを使用する。ついで、そのようにして得られた部分配列をプローブとして使用して、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）組織から調製した遺伝子ライブラリーからDAGATクローンを得る。あるいは、低い縮重のオリゴヌクレオチドが特定のDAGATペプチドから調製されうる場合には、DAGAT遺伝子配列に関して遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために、そのようなプローブを直接使用することができる。特に、ファージベクターにおけるcDNAライブラリーのスクリーニングは、バックグラウンドハイブリダイゼーションのレベルがより低いため、そのような方法において有用である。
【００４９】
典型的には、核酸プローブを使用して入手可能なDAGAT配列は、プローブとして使用するコード配列と標的DAGAT配列との間で60〜70％の配列同一性を示すであろう。しかしながら、僅か50〜60％の配列同一性しか有さない非常に長い配列も得られうる。該核酸プローブは、該核酸配列の非常に長い断片、またはより短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より長い核酸断片を（約100bp以上）プローブとして使用する場合には、プローブとして使用する配列からの20〜50％の偏差（すなわち、50〜80％の配列相同性）を有する標的サンプル由来の配列を得るために、より低いストリンジェンシーでスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、DAGAT酵素をコードする全核酸配列よりかなり短くてもよいが、少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドであるべきである。より長い領域に対して、より短い領域を使用する場合には、より高い配列同一性が望ましい。したがって、他の関連DAGAT遺伝子を検出し回収するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するためには、高度に保存されたアミノ酸配列の領域を同定することが望ましいかもしれない。より短いプローブは、しばしば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に特に有用である（特に、高度に保存された配列が同定されうる場合）（Gouldら, PNAS USA (1989) 86:1934-1938を参照されたい）。
【００５０】
本明細書中に更に詳しく説明するとおり、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、植物などの宿主細胞の形質転換において、研究用試薬として、および疾患の治療および診断の開発に使用することができる。
【００５１】
本発明はまた、成熟タンパク質＋追加的アミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸または該成熟ポリペプチド内のアミノ酸（例えば、該タンパク質の成熟形態が2以上のポリペプチド鎖を有する場合）であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。そのような配列は、例えば、前駆体から成熟形態へのタンパク質のプロセシングにおいて何らかの役割を果たし、タンパク質の輸送を可能にし、タンパク質の半減期を短縮または延長し、またはアッセイもしくは製造における該タンパク質の取扱いを容易にしうる。いずれかの追加的アミノ酸を成熟タンパク質から除去するために細胞酵素を使用することができると考えられる。
【００５２】
1以上のプロ配列と融合した該ポリペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポリペプチドの不活性形態でありうる。該不活性前駆体は、一般には、該プロ配列が除去されると活性化される。該プロ配列の一部または全部が、活性化前に除去されうる。そのような前駆体タンパク質は、一般には、プロタンパク質と称される。
【００５３】
植物構築物および使用方法
特に関心が持たれるのは、宿主植物細胞内での本発明のアシルトランスフェラーゼ配列の転写または転写・翻訳（発現）を指令するための組換えDNA構築物における該ヌクレオチド配列の使用である。該発現構築物は、一般には、本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に作動的に結合した宿主植物細胞内で機能的なプロモーターと宿主植物細胞内で機能的な転写終結領域とを含む。
【００５４】
当業者は、植物細胞内で機能的な文献記載の多数のプロモーターが存在すると認識するであろう。葉緑体および色素体に特異的なプロモーター、葉緑体または色素体において機能的なプロモーター、および葉緑体または色素体において作動的なプロモーターも予想される。
【００５５】
1組のプロモーターとして、ほとんどの植物器官内で高レベルの発現をもたらすCaMV35SまたはFMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターが挙げられる。CaMV35SまたはFMV35Sプロモーターの増強または重複形態は、本発明の実施に有用である（Odellら (1985) Nature 313:810-812; Rogers, 米国特許第5,378,619号）。また、植物の特定の組織（例えば、葉、幹、根、塊茎、種子、果実など）内でアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を引き起こさせることも好ましいかもしれない。選択するプロモーターは、所望の組織・発生特異性を有すべきである。
【００５６】
特に関心が持たれるのは、植物種子組織内で優先的に発現される転写開始領域からの本発明の核酸配列の発現である。そのような種子に優先的な転写開始配列の具体例には、植物貯蔵タンパク質遺伝子をコードする配列に由来する又は油料種子内の脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来する配列が含まれる。そのようなプロモーターの具体例には、ナピン（napin）（Kridlら, Seed Sci Res 1:209-219 (1991)）、ファセオリン、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター、ACP、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ、β-コングリシニンのダイズα'サブユニット遺伝子（soy 7s, (Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci, 83:8560-8564 (1986))）およびオレオシン（oleosin）などの遺伝子に由来する5'調節領域が含まれる。
【００５７】
特定の細胞下画分、例えばミトコンドリア、小胞体、液胞、葉緑体または他の色素体画分にDAGATを付与するタンパク質の局在化を指令することが好都合かもしれない。例えば、本発明の関心のある遺伝子を色素体（例えば、葉緑体）に標的化して発現させる場合には、該構築物において、該遺伝子を該色素体に導く配列を使用することになろう。そのような配列は、本発明では葉緑体輸送ペプチド（CTP）または色素体輸送ペプチド（PTP）と称される。このように、関心のある遺伝子が色素体内に直接的に導入されない場合には、該発現構築物は更に、関心のある遺伝子を色素体に導く輸送ペプチドをコードする遺伝子を含有するであろう。葉緑体輸送ペプチドは、関心のある遺伝子に由来するものであってもよく、あるいはCTPを有する異種配列に由来するものであってもよい。そのような輸送ペプチドは当技術分野で公知である。例えば、Von Heijneら (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clarkら (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; della-Cioppaら (1987) Plant Physiol 84:965-968; Romerら (1993) Biochem. Biophys. Res Commun. 196:1414-1421; およびShahら (1986) Science 233:478-481を参照されたい。
【００５８】
意図する用途に応じて、該構築物は、全DAGATタンパク質またはその一部をコードする核酸配列を含有していてもよい。例えば、与えられたDAGATタンパク質のアンチセンス阻害が望ましい場合には、全DAGAT配列は必ずしも必要でない。さらに、構築物中で使用するDAGAT配列をプローブとして使用することを意図する場合には、DAGATコード配列の特定の部分（例えば、高度に保存されたDAGAT領域をコードすることが判明している配列）だけを含有する構築物を調製することが好都合かもしれない。
【００５９】
当業者は、宿主細胞における内因性配列の発現の抑制のための種々の方法があることを認識するであろう。そのような方法には、アンチセンス抑制（Smithら (1988) Nature 334:724-726）、共発現（Napoliら (1989) Plant Cell 2:279-289）、リボザイム（PCT公開WO 97/10328）、センスおよびアンチセンスの組合せ（Waterhouseら (1998) Proc. Natl. Acad. USA 95:13959-13964）が含まれるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞における内因性配列の抑制のための方法は、典型的には、抑制しようとする配列の少なくとも一部の転写または転写・翻訳を用いる。そのような配列は、該内因性配列のコードおよび非コード領域と相同であってもよい。
【００６０】
また、本発明の植物発現構築物中に調節性転写終結領域を設けることができる。転写終結領域は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードするDNA配列、または異なる遺伝子由来の簡便な転写終結領域、例えば、転写開始領域に天然で付随する転写終結領域により与えられうる。当業者は、植物細胞において転写を終結しうる任意の簡便な転写終結領域を本発明の構築物中で使用することが可能であると認識するであろう。
【００６１】
あるいは、宿主植物細胞色素体から直接的にDAGAT配列の発現を指令する構築物を調製することができる。そのような構築物および方法は当技術分野で公知であり、例えば、Svabら (1990) Proc. Natl. Acad. USA 87:8526-8530ならびにSvabおよびMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917ならびに米国特許第5,693,507号に全般的に記載されている。
【００６２】
該発現構築物を含有する組換えDNA構築物が導入された植物細胞、組織、器官または植物は、形質転換もしくはトランスフェクトされている又はトランスジェニックであるとみなされる。また、トランスジェニックまたは形質転換細胞または植物は、該細胞または植物の後代、および交雑における親としてそのようなトランスジェニック植物を用いる育種計画から生産され、DAGAT核酸配列の存在から生じる改変した表現型を示す後代を含む。
【００６３】
関心のあるDNA配列として植物DAGATを有する、発現の増加または減少のための植物の発現または転写構築物は、多種多様な植物、例えば、食用または産業用の植物油の生産に関与する植物で用いることができる。最も好ましいのは、温帯油料種子作物である。関心のある植物には、ナタネ（カノラおよび高エルカ酸（High Erucic Acid）品種）、ヒマワリ、サフラワー、綿、ダイズ、ラッカセイ、ココナッツおよびギネアアブラヤシ、およびトウモロコシが含まれるが、これらに限定されるものではない。該組換え構築物を宿主細胞内に導入する方法によっては、他のDNA配列が必要かもしれない。重要なことは、本発明が双子葉植物種にも単子葉植物種にも等しく適用可能であり、新規のおよび／または改良された形質転換および調節技術に容易に適用可能なことである。
【００６４】
特に関心が持たれるのは、植物種子油中に特定の脂肪酸を生産するように遺伝的に操作された植物（その操作された種の未操作植物の種子中のTAGはその特定の脂肪酸を天然では含有しない）における植物DAGAT構築物の使用である。したがって、植物における新規DAGATの発現は、sn-3位への特有の脂肪酸アシル基の取込みに望ましいかもしれない。
【００６５】
本発明のDAGATタンパク質に関する更なる植物遺伝子操作用途には、TAG分子上の特定の位置に取込まれた所望の脂肪酸アシル基を有するTAG分子を含有する構造化植物脂質の製造におけるそれらの使用が含まれる。
【００６６】
植物にとって好ましい配列を付与するのが望ましい場合には特に、完全に又は部分的に遺伝子配列を合成しうることが意図される。したがって、所望の構造遺伝子（DAGATタンパク質をコードする遺伝子部分）の全部または一部を、選択した宿主にとって好ましいコドンを使用して合成することができる。宿主にとって好ましいコドンは、例えば、所望の宿主種内で発現されるタンパク質において最も頻繁に使用されるコドンから決定することができる。
【００６７】
当業者は、抗体調製物、核酸プローブ（DNAおよびRNA）などを調製し使用して種々の植物から「相同」または「関連」DAGATをスクリーニングし回収しうることを容易に認識するであろう。核酸もしくはアミノ酸の配列情報の比較の際に又は公知DAGATと候補源とのハイブリダイゼーション反応により決定されうる配列同一性が存在する場合に、相同配列が見出される。配列相同性の決定の際には、同類変化（例えば、Glu/Asp、Val/Ile、Ser/Thr、Arg/LysおよびGln/Asn）も考慮することができる。2つの完全な成熟タンパク質間の僅か25％の配列同一性により、アミノ酸配列は相同とみなされる（全般的には、Doolittle, R.F., OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986)を参照されたい）。
【００６８】
このように、例示されている特定のモルティエレラ（Mortierella）タンパク質調製物および本発明で提供する配列から、他のDAGATを得ることができる。さらに、例示されているDAGATから、およびそのような例示されている配列の使用により得られるDAGATから、合成タンパク質のモデル化のための出発物質、ならびに天然および合成DAGAT（修飾アミノ酸配列を含む）を得ることができることが明らかであろう。修飾アミノ酸配列は、そのような配列が部分的または全体的に合成されたものであるか否かに無関係に、突然変異、トランケート化、増強などを受けた配列を含む。植物調製物から実際に精製された配列、それと同一の配列、またはそれと同一のタンパク質をコードする配列は、該タンパク質または配列を得るために用いた方法に無関係に、等しく天然に由来するとみなされる。
【００６９】
免疫学的スクリーニングのために、精製されたタンパク質またはその一部をウサギまたはマウスに注射することによりDAGATタンパク質に対する抗体を製造することが可能であり、そのような抗体製造方法は当業者によく知られている。典型的には、ポリクローナル抗体が、遺伝子の単離には、より有用であるが、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれもが製造可能である。モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGATに対する抗体との交差反応による測定により所望の植物種の粗抽出物中に関連タンパク質が存在することを確認するために、ウエスタン分析を行うことができる。交差反応が認めらる場合には、該関連タンパク質をコードする遺伝子を、所望の植物種を表す発現ライブラリーをスクリーニングすることにより単離する。発現ライブラリーは、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）に記載のとおりラムダgt11などの商業的に入手可能な種々のベクター中で構築することができる。
【００７０】
多くの植物は、種子中の貯蔵TAGの産生においてDAGATタンパク質を利用する。したがって、そのような任意の植物種は追加的なDAGATタンパク質源とみなされうる。sn-1およびsn-3位にパルミチン酸またはステアリン酸アシル基を、sn-2位にオレイン酸またはリノレン酸を有する大量のTAGを有する植物は、S-U-S形態（式中、Sは飽和脂肪酸を表し、Uは不飽和脂肪酸を表す）の構造化TAGの合成に対して特別の選択性を示しTAGのsn-3位に飽和脂肪酸を取込みうる植物DAGATを得るための好ましい候補である。例えば、ココア、イリッペ（illipe）、サラノキ、シアバターノキ、およびコクム（kokum）などのガルシニア（Garcinia）を含むいくつかの熱帯植物に由来する油はこの形態の大量のTAGを蓄積することが示されている。
【００７１】
種子油中に有意な中鎖脂肪酸を有する植物は、TAGのsn-3位に中鎖脂肪酸を取込みうる植物DAGATを得るための好ましい候補である。クフェア属（Cuphea）のいくつかの種、例えば、プロキュンベンス（procumbens）、ルテア（lutea）、フーケリアナ（hookeriana）、ヒッソピフォリア（hyssopifolia）、リヒティ（wrightii）およびインフラタ（inflata）は、中鎖脂肪酸を含有するトリグリセリドをそれらの種子中に蓄積する。中鎖脂肪酸のもう1つの天然植物源は、クスノキ（Lauraceae）科の種子である。例示されているものに加えて、カリフォルニア・ベイ（California Bay）（Umbellularia californica）、ピサ（Pisa）（Actinodophne hookeri）、ゲッケイジュ（Laurus nobilis）およびシンナモムム・カムフォラ（Cinnamomum camphora）（ショウノウ）も中鎖脂肪酸を蓄積する。他の起源植物には、ニレ科（Ulmaceae）（ニレ）、ヤシ科（Palmae）、ニクズク科（Myristicaceae）、ニガキ科（Simarubaceae）、ボキシア科（Vochysiaceae）およびサルバドラ（Salvadoraceae）が含まれる。
【００７２】
また、貯蔵TAG中に異常な長鎖脂肪酸を取込む植物種に由来するDAGATには特に関心が持たれる。例えば、キンレンカおよびメドウフォーム（meadowfoam）は種子中に22:1アシル基を含有する。
【００７３】
また、多種多様なインビボ用途における植物脂質生合成のTAG生合成事象を研究するために、種々の起源に由来する植物DAGATを使用しうることに注目すべきである。すべての植物は共通の代謝経路を介して脂質を合成するらしいため、異種植物宿主に対する1つの植物DAGATの適用および／または研究は種々の種において容易に達成されうる。他の用途においては、産生を増強し及び／又はインビトロで産生もしくは合成されるTAGの組成を修飾するために、天然のDAGAT起源植物以外に由来する植物DAGATを使用することができる。
【００７４】
他のDAGATの単離に加えて、他の関連アシルトランスフェラーゼタンパク質の遺伝子も、DAGATおよび関連核酸配列からの配列情報を用いて得られうると考えられる。例えば、色素体DAGAT、ミトコンドリアDAGAT、リゾホスホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（LPCAT）、リゾホスホスファチジルセリンアシルトランスフェラーゼ（LPSAT）、リゾホスホスファチジルエタノールアミンアシルトランスフェラーゼ（LPEAT）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（PDAT）およびリゾホスホスファチジルイノシトールアシルトランスフェラーゼ（LPIAT）を含む他のアシルトランスフェラーゼ酵素が、植物脂質生合成に関与している。これらの酵素の多くは、リゾホスホ脂質のsn-2位が関与するアシルトランスフェラーゼ反応を触媒するが、これらの配列をコードする遺伝子は本発明の植物アシル-CoA DAGAT配列に関連づけることが可能であり、それより入手可能である。
【００７５】
ある関連遺伝子が、与えられた配列に対するハイブリダイゼーションにより単離されうるか否かを判定するために、該配列を標識して（典型的には、放射能を用いるが、他の方法も利用可能である）検出が可能となるようにする。該標識プローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、ノーザンまたはサザンブロットなどの所望の核酸を含有するフィルターまたはスクリーニングするcDNAまたはゲノムクローンを含有するフィルターと共にインキュベートする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、関心のある配列に対する該プローブのハイブリダイゼーションを最適化するために様々に変化させることができる。より低い温度およびより高い塩濃度は、より遠縁の配列のハイブリダイゼーションを可能にする（低いストリンジェンシー）。バックグラウンドハイブリダイゼーションが、低いストリンジェンシー条件下で問題となる場合には、ハイブリダイゼーションまたは洗浄工程において温度を上昇させ、および／または塩含量を低下させて、ハイブリダイズする特異的配列の検出を向上させることができる。Beltzら（Methods in Enzymology (1983) 100:266-285）に記載されているとおり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、該プローブの推定融解温度に基づいて調節することができる。有用なプローブならびに適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、前記のとおり同定したら、該標識配列および最適化条件を用いてcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする。
【００７６】
植物DAGATタンパク質に関連する核酸配列は、多数の用途において有用であろう。例えば、プローブとして使用しうる組換え構築物を調製することができる。あるいは、直ぐに利用できるDAGAT酵素源を得るために、および／または、宿主細胞内で見出されるトリグリセリドの組成を修飾するために、宿主細胞内でDAGATタンパク質の発現をもたらす組換え構築物を調製することができる。宿主細胞が植物宿主細胞である場合、インビトロまたはインビボにおける他の有用な用途が見出されうる。例えば、植物TAG生合成経路に利用されうるそれぞれの中鎖を優先するDAGATを増加させることにより、TAG中の中鎖脂肪酸の比率の増加がもたらされうる。同様にして、いくつかの用途には、アンチセンス技術により、植物細胞内で内因的に発現されるDAGATの量を減少させるのが望ましいかもしれない。例えば、挿入された外来性DAGATが飽和アシル基または中鎖もしくは異常な長鎖脂肪酸アシル基をsn-3位に転移させる機会を増加させるために、天然アブラナ（Brassica）長鎖優先性DAGATの発現を減少させることが望ましいかもしれない。
【００７７】
前記のとおり、本発明の植物DAGATをコードする核酸配列は、ゲノム、cDNAまたはmRNA配列を含みうる。「コード（する）」は、該配列がセンスまたはアンチセンス配向で特定のアミノ酸配列に対応することを意味する。「染色体外」は、該配列が、それが天然で付随する植物ゲノムの外部に存在することを意味する。「組換え」は、該配列が、突然変異誘発、制限酵素などによる操作により遺伝的に操作された修飾を含有することを意味する。
【００７８】
所望の植物DAGATの核酸配列が得られたら、それを種々の方法で操作することができる。該配列が非コードフランキング領域を含む場合、該フランキング領域を制限酵素処理、突然変異誘発などに付すことができる。したがって、天然に存在する配列上でトランジション、トランスバージョン、欠失および挿入を施すことができる。また、該配列の全部または一部を合成することができる。構造遺伝子においては、修飾されたアミノ酸配列を得るために1以上のコドンを修飾したり、あるいは簡便な制限部位を得るために又は構築もしくは発現に関連した他の目的のために1以上のコドンの突然変異を導入することができる。1以上の簡便な制限部位を導入するための合成アダプター、リンカーなどを使用することにより、構造遺伝子を更に修飾することができる。
【００７９】
本発明の植物DAGATをコードする核酸またはアミノ酸配列は、様々な方法で他の非天然または「異種」配列と組合せることができる。「異種」配列は、植物DAGATと一緒になっていることが天然では見出されない任意の配列（例えば、一緒になっていることが天然では見出されない同一植物由来の核酸配列の組合せを含む）を意味する。
【００８０】
本発明の植物DAGATをコードするDNA配列は、DAGATに通常関連している遺伝子配列の全部または一部と共に使用することができる。その成分部分においては、宿主細胞内での転写および翻訳を促進しうる転写開始制御領域、植物DAGATをコードするDNA配列ならびに転写および翻訳終結領域を5'から3'への転写方向に有するDNA構築物中、DAGATをコードするDNA配列を合体させる。
【００８１】
潜在的宿主細胞には原核性および真核性細胞が含まれる。宿主細胞は、意図される用途に応じて、単細胞であってもよく、あるいは多細胞性の分化または未分化生物中に見出されうる。本発明の細胞は、野生型細胞にとって外来性である植物DAGATを有することにより、例えば、植物DAGATをコードする組換え核酸構築物DAGATを有することにより識別されうる。
【００８２】
宿主に応じて、調節領域は様々なもの、例えばウイルス、プラスミドまたは染色体遺伝子などに由来する領域を含むものとなろう。原核性または真核性微生物、特に単細胞宿主内での発現には、多種多様な構成的または調節可能プロモーターを使用することができる。微生物における発現は、すぐに利用できる植物酵素源を与えうる。既に記載されている転写開始領域としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの細菌および酵母宿主由来の領域（βガラクトシダーゼ、T7ポリメラーゼ、トリプトファンEなどの遺伝子を含む）が挙げられる。
【００８３】
宿主植物細胞の形質転換に用いる方法は、本発明にとって決定的なものではない。該植物の形質転換は、好ましくは恒久的なもの（すなわち、導入された構築物が連続的な植物世代に伝達されるよう、導入された発現構築物が宿主植物細胞のゲノム内に組込まれることによるもの）である。当業者は、当技術分野においては多種多様な形質転換技術が存在し、新規技術が絶えず利用可能になりつつあると認識するであろう。標的宿主植物に適した任意の技術を、本発明の範囲内で利用することができる。例えば、該構築物は、プラスミド中の又は人工染色体中のDNA鎖を含む（これらに限定されるものではない）種々の形態に導入することができる。標的植物細胞内への該構築物の導入は、リン酸カルシウムDNA共沈法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム（Agrobacterium）感染、リポソームまたは微粒子形質転換を含む（これらに限定されるものではない）種々の技術により達成されうる。当業者は、詳細については文献を参照し、本発明の方法に用いるのに適した技術を選択することができる。
【００８４】
通常、該DNA構築物と共に、宿主内での発現に必要な調節領域を有し形質転換細胞の選択をもたらす構造遺伝子が含まれるであろう。該遺伝子は、細胞傷害性因子、例えば、抗生物質、重金属、毒素などに対する抵抗性、栄養要求宿主に原栄養性を付与する相補性、ウイルス免疫などをもたらしうる。宿主によって異なる選択条件を用いる場合には、該発現構築物またはその成分が導入される異なる宿主種の数に応じて1以上のマーカーを使用することができる。
【００８５】
植物細胞の形質転換にアグロバクテリウム（Agrobacterium）を使用する場合には、T-DNAまたはTi-もしくはRi-プラスミド（該アグロバクテリウム宿主内に存在するもの）との相同組換えのためにアグロバクテリウム（Agrobacterium）宿主内に導入されうるベクターを使用することができる。組換え用のT-DNAを含有するTi-またはRi-プラスミドは武装（armed）（ゴール形成を引き起こす能力を有する）していても、武装解除（disarmed）（ゴール形成を引き起こす能力を有さない）されていてもよく、形質転換アグロバクテリウム（Agrobacterium）宿主内にvir遺伝子が存在する場合に限り後者が許容される。該武装プラスミドは、正常な植物細胞とゴールとの混合物を与えうる。
【００８６】
宿主植物細胞を形質転換するための運び屋としてアグロバクテリウム（Agrobacterium）を使用するいくつかの場合には、T-DNA境界領域に隣接する発現または転写構築物を、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）内で複製されうる広い宿主域のベクター内に挿入する。広い宿主域のベクターは文献に記載されている。pRK2またはその誘導体が一般に使用される。参照により本明細書に組み入れるDittaら（Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. (1980) 77:7347-7351）およびEPA 0 120 515を参照されたい。あるいは、植物細胞内で発現させる配列を、別々の複製配列（そのうちの一方は大腸菌内で、もう一方はアグロバクテリウム内で該ベクターを安定化する）を含有するベクター内に挿入することができる。例えば、pRiHRI（Jouaninら, Mol. Gen. Genet. (1985) 201:370-374）複製起点を使用して宿主アグロバクテリウム細胞内での該植物発現ベクターの付加的安定性を得ているMcBrideおよびSummerfelt（Plant Mol. Biol. (1990) 14:269-276）を参照されたい。
【００８７】
形質転換されたアグロバクテリウムおよび形質転換された植物細胞の選択を可能にする1以上のマーカーが、該発現構築物および該T-DNAと共に含まれるであろう。植物細胞に使用するための多数のマーカー（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドG418、ハイグロマイシンなどに対する耐性）が開発されている。使用する個々のマーカーは本発明に本質的なものではなく、個々の宿主および構築の様態に応じて、好ましいマーカーは様々となる。
【００８８】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）を使用する植物細胞の形質転換のためには、外植片を組合せて、形質転換に十分な時間、該形質転換アグロバクテリウムと共にインキュベートし、該細菌を殺し、該植物細胞を適当な選択培地内で培養することができる。カルスが形成したら、公知方法に従い適当な植物ホルモンを使用することによりシュート形成を促し、該シュートを発根培地に移して植物を再生させることができる。ついで該植物を種子にまで成長させ、該種子を使用して、反復発生を確立し、植物油を単離することができる。
【００８９】
複数の発現構築物を含有する本発明の植物細胞を得るためのいくつかの可能な方法がある。本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードするDNA配列を有する構築物を含む植物を生産するための任意の手段、および酵素をコードするもう1つのDNA配列を有する少なくとも1つの他の構築物が本発明に含まれる。例えば、単一の形質転換ベクター中に両発現構築物を含有させることにより又はそれぞれが所望の遺伝子を発現する別々のベクターを使用することにより第2構築物と同時に植物を形質転換するために、該発現構築物を使用することができる。DAGAT発現構築物で既に形質転換された植物内に該第2構築物を導入することが可能であり、あるいは、DAGAT構築物を発現する植物と第2構築物を発現する植物とからなる形質転換植物を交雑させて、それらの構築物を同一植物内で一緒にすることができる。
【００９０】
他の構築物および使用方法
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。本発明のDNA構築物由来のRNAを使用してそのようなタンパク質を製造するために、無細胞翻訳系を用いることができる。
【００９１】
組換え産生のためには、発現系もしくはその一部または本発明のポリヌクレオチドを組込むために、宿主細胞を遺伝的に操作することができる。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)およびSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)などの多数の標準的な実験マニュアルに記載の方法により行うことができる。そのような方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ（scrape）ローディング衝撃導入および感染が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
適当な宿主の代表例には、細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセスおよびバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細胞、例えばドロゾフィラ（Drosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞；動物細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293およびBowes黒色腫細胞；および前記の植物細胞が含まれる。
【００９３】
本発明のポリペプチドを製造するためには、種々の発現系を使用することができる。そのようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、例えばSB40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクター、およびそのようなウイルスの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素、例えばコスミドおよびファジミドに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。該発現系構築物は、発現を調節し発現を引き起こす制御領域を含有していてもよい。一般に、ポリヌクレオチドの維持、増殖または発現および／または宿主内でのポリペプチドの発現に適した任意の系またはベクターを発現に使用することができる。よく知られた常套的な種々の技術のいずれかにより、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (前掲)に記載の技術により、選択した発現系内に適当なDNA配列を挿入することができる。
【００９４】
小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境中への該タンパク質の分泌が可能となるよう、同種または異種の適当な分泌シグナルを該発現ポリペプチド内に組込むことができる。
【００９５】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む（これらに限定されるものではない）よく知られた多数の方法のいずれかにより、組換え細胞培養から回収し精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を精製に使用するのが最も好ましい。単離および／または精製中に該ポリペプチドが変性している場合には、活性なコンホメーションを再生させるために、タンパク質のリフォールディングのためのよく知られた公知技術のいずれかを用いることができる。
【００９６】
本発明はまた、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。遺伝子の突然変異形態の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または改変された発現から生じる疾患に対する感受性の又はそのような疾患の診断を助けるための診断手段として用いることができる。該遺伝子内に突然変異を有する個体のDNAレベルでの検出のためには、よく知られた種々の技術を用いることができる。
【００９７】
診断用の核酸は、感染個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚から得ることができる。ゲノムDNAを、検出のために直接使用したり、あるいはPCRまたは他の増幅技術を用いて分析前に増幅することができる。RNAまたはcDNAも同様にして使用することができる。欠失および挿入は、参照配列の遺伝子型と比較した場合の増幅産物のサイズの変化により検出することができる。点突然変異は、増幅されたDNAを本発明の標識ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることにより同定することができる。完全にマッチする配列は、RNアーゼ消化により又は融解温度の相違により、ミスマッチ二本鎖から識別することができる。配列の相違は、変性剤の存在下または不存在下のゲル内のDNA断片の電気泳動移動度を比較することにより、あるいは直接的なDNA配列決定により、DNAレベルで検出することができる（例えば、Myersら, Science 230:1242 (1985)を参照されたい）。また、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、例えばRNアーゼおよびS1プロテクションまたは化学的切断法（例えば、Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985)を参照されたい）を用いて、特定の位置での配列の変化を検出することができる。DAGATヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、特に遺伝子突然変異のスクリーニングに使用することができると予想される。アレイ技術の方法はよく知られており、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝的変異性分析に有用である（例えば、M. Cheeら, Science, 274:610-613 (1996)を参照されたい）。
【００９８】
本発明は更に、異常に変化したポリペプチドまたはmRNAのレベルをサンプルから決定することにより、DAGAT活性に関連した疾患、特に、変化した細胞ジアシルグリセロール濃度またはプロテインキナーゼC活性に関連した疾患 [癌；糖尿病；心不全、アテローム性動脈硬化症など（これらに限定されるものではない）の心肺疾患；アジポサイトーシス（adipocytosis）；白血病および皮膚癌；線維芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常な脂質代謝に関連した疾患；異常な脂肪吸収、リポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない]に対する感受性を診断または判定するための方法を提供する。ポリヌクレオチドの定量のための当技術分野でよく知られた技術（増幅、PCR、RT-PCR、RNアーゼプロテクション、ノーザンブロット法および他のハイブリダイゼーション法が含まれるが、これらに限定されるものではない）のいずれかにより、発現の変化をRNAレベルで測定することができる。タンパク質発現レベルを検出する診断アッセイ（ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない）も意図される。
【００９９】
本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも使用することができる。
【０１００】
本発明のポリペプチドもしくはその変異体またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに対して免疫特異的である抗体を産生させるための免疫原として使用することができる。「免疫特異的」は、該抗体が、他の関連ポリペプチドに対する該抗体のアフィニティーより実質的に大きな、本発明のポリペプチドに対するアフィニティーを有することを意味する。「抗体」は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体 [キメラ、一本鎖、シミアン化、ヒト化、再表面化（resurfaced）および他のタイプの相補性決定領域（CDR）置換抗体およびFabフラグメント、例えばFab免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む]を含む。
【０１０１】
該ポリペプチドまたはエピトープを保持する断片、類似体または細胞を、通常のプロトコールを用いて動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより、抗体を得ることができる。ハイブリドーマ技術（例えば、Kohler, G.およびMilstein, C., Nature 256:495-497 (1975)を参照されたい）；トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら, Immunology Today 4:72 (1983)）；およびEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77-96, (1985)）を含むよく知られた技術（連続的細胞培養技術）のいずれかを用いて、モノクローナル抗体を製造することができる。
【０１０２】
一本鎖、ヒト化、再表面化、シミアン化および他のタイプのCDR置換抗体は、当技術分野でよく知られた技術に従い製造することができる。
【０１０３】
該ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために又はアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために、記載されている抗体を使用することができる。また、該抗体は、DAGAT活性に関連した疾患、特に、変化した細胞ジアシルグリセロール濃度またはプロテインキナーゼC活性に関連した疾患 [癌；糖尿病；心不全、アテローム性動脈硬化症など（これらに限定されるものではない）の心肺疾患；アジポサイトーシス（adipocytosis）；白血病および皮膚癌；線維芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常な脂質代謝に関連した疾患；異常な脂肪吸収、リポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない]の治療に使用することができる。
【０１０４】
本発明はまた、種々のサブクラス（IgG、IgM、IgAおよびIgE）の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の部分に融合した本発明のポリペプチドまたはその断片を含む遺伝的に操作された可溶性融合タンパク質に関する。好ましくは、ヒトIgG（特にIgG1）の重鎖の定常部分をヒンジ領域における融合で使用する。特に好ましいのはFc部分の使用である（例えば、WO 94/29458およびWO 94/22914を参照されたい）。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドに結合する（特に、結合により該ポリペプチドの活性を阻害または刺激する）化合物の同定に使用することができる。小分子の基質およびリガンドの結合を、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然物混合物中で評価することができる。該アゴニストまたはアンタゴニスト／インヒビターは、天然の基質またはリガンドであってもよく、あるいはそれらの構造的または機能的模擬体であってもよい。例えば、Coliganら, Curr Prot in Immuno, 1(2):第5章 (1991)を参照されたい。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する化合物、特に、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物を同定するための、化合物のスクリーニング方法を提供する。ハイスループットのスクリーニング技術を用いることができる。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストに関するスクリーニングには、合成反応混合物、細胞画分、例えば膜、細胞エンベロープまたは細胞壁、またはこれらのいずれかの調製物（本発明のポリペプチドとそのようなポリペプチドの標識基質またはリガンドとを含むもの）を、スクリーニングされている候補化合物の存在下または不存在下でインキュベートする。該候補化合物が本発明のポリペプチドを作動させる又は拮抗する能力は、該標識リガンドの結合の減少または該基質からの産物の産生の減少により検出される。本発明のポリペプチドの作用を誘導することなく無償で結合する候補化合物が良好なアンタゴニストである可能性が高い。一方、十分に結合し基質からの産物の産生速度を増加させる化合物はアゴニストとみなされる。基質からの産物の産生の速度またはレベルの検出は、比色標識など（これに限定されるものではない）のレポーター系、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するレポーター遺伝子の組込み、および当技術分野で公知の結合アッセイを用いることにより増強されうる。
【０１０７】
本発明のポリペプチドおよび潜在的アンタゴニストを、該ポリペプチド、天然基質もしくはリガンドまたは基質もしくはリガンド模擬体に結合する化合物と組合せる競合アッセイも、アンタゴニスト化合物に関するスクリーニングに用いることができる。該潜在的アンタゴニストの有効性の評価のために、該結合分子に結合し産物に変換された該ポリペプチド分子の数が測定されうるよう、本発明のポリペプチドを例えば放射能または比色性化合物により標識することができる。
【０１０８】
潜在的アンタゴニストには、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合してその活性を阻害し又は部分的もしくは完全に遮断する小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれうるが、これらに限定されるものではない。また、アンタゴニストには、本発明のポリペプチドにより誘導される活性を誘導することなく結合分子上の同一部位に結合して該ポリペプチドの作用をその結合の阻止により妨げる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれうる。また、潜在的アンタゴニストには、該ポリペプチドの結合部位に結合しそれを占拠して細胞結合分子に対する該ポリペプチドの結合を妨げて該ポリペプチドの正常な生物学的活性を妨げ又は減少させる小分子が含まれる。そのような小分子の具体例には、小有機分子、ペプチドおよびペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の潜在的アンタゴニストには、アンチセンス分子（例えば、Okano, J. Neurochem, 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)を参照されたい）が含まれる。
【０１０９】
DAGATは小腸内のキロミクロン、肝臓内のVLDLの形成および脂肪組織内のトリアシルグリセロールとしてのエネルギーの貯蔵に重要であるため、DAGAT活性のアンタゴニストおよびアゴニストは特に有用である。したがって、小腸、肝臓および脂肪組織内のDAGAT活性の阻害は脂質吸収および血漿トリグリセリドレベルを減少させ、脂肪生成を減少させるであろう。さらに、高トリグリセリド血症はアテローム性動脈硬化症の独立したリスクファクターであることが示されており（Kugiyama, K.ら, (1998) Circulation 97:2519-2526）、冠状動脈疾患のリスクの増大に関するマーカーであり、いくつかのじゅく腫形成因子に関するマーカーとして働きうる（Grundy, S.M., (1998) Am. J. Cardiol, 81:18B-25B）。また、DAGAT活性を阻害する化合物は、腸脂肪吸収の制御、TAGに富むリポ蛋白分泌の改変、血清TAGの制御および脂肪生成の減少において有用である（Owen MRら (1997) Biochem J 323:17-21, Jamdar SCおよびCao WF (1995) Biochem Biophys Acta 1255:237-243）。さらに、DAGATのジアシルグリセロール基質は細胞内のシグナル伝達分子であり、プロテインキナーゼC活性の公知モジュレーターである。変化した細胞ジアシルグリセロール濃度およびプロテインキナーゼC活性は癌（da Costaら (1993) J. Biol. Chem. 268:2100-2105）、糖尿病（Koya DおよびKing GL (1998) Diabetes 47:859-866）、心不全（Okumuraら, (1991) J. Mol. Cell. Cardiol. 23:409-416）、脂肪細胞（Baldoら, (1995) J. Lipid Res., 36:1415-1426）、白血病および皮膚癌細胞（Goldkorn T.およびDing, T. (1997) Adv. Exp. Med. Biol., 400A:461-472）およびラット繊維芽細胞（Paiら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., 88:598-602）に関連している。本発明のアゴニストおよびアンタゴニストはそれ自体が、DAGAT活性に関連した疾患、例えば、変化した細胞ジアシルグリセロール濃度またはプロテインキナーゼC活性に関連した疾患 [癌；糖尿病；心不全、アテローム性動脈硬化症など（これらに限定されるものではない）の心肺疾患；アジポサイトーシス（adipocytosis）；白血病および皮膚癌；線維芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常な脂質代謝に関連した疾患；異常な脂肪吸収、リポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない]の治療または改善に特に有用である。
【０１１０】
本発明はまた、該ポリヌクレオチドもしくは該ポリペプチドまたはそれらの変異体、アゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物に関する。本発明のポリペプチドは、細胞、組織または生物での使用のための無菌または非無菌担体（例えば、対象に対する投与に適した医薬担体）と組合せて使用することができる。そのような組成物は、例えば、治療的に有効な量の本発明のポリペプチドまたは他の化合物と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む。そのような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。該製剤は投与様式に適合したものであるべきである。本発明は更に、本発明の前記組成物の1以上の成分で満たされた1以上の容器を含む診断および医薬パックまたはキットに関する。
【０１１１】
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独で又は他の化合物と組合せて投与することができる。
【０１１２】
該医薬組成物は、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路を含む（これらに限定されるものではない）有効で簡便な任意の方法で投与することができる。
【０１１３】
必要な投与量の範囲は、使用する本発明のペプチドまたは他の化合物、投与経路、該製剤の性質、対象の状態の性質および診療医の判断に左右されるであろう。適当な投与量は、一般には、約0.1〜100μg/kgの範囲となるであろう。化合物の多様性および投与の有効性の相違による大きなばらつきが予想される。例えば、経口投与は静脈内投与より大きな投与量を要すると予想される。熟練した診療医は、標準的な経験的方法を用いて適当な投与量を決定することができる。
【０１１４】
また、ポリペプチドを対象において内因的に生成させることが可能であり、これは一般には「遺伝子治療」と称される。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNAまたはRNA）で、およびレトロウイルスプラスミドベクターの使用により、対象からの細胞をex vivoで操作することができる。ついで該細胞を該対象に導入する。
【０１１５】
また、本発明の配列と相同な追加的な配列を同定するために、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を使用することができる。最も好ましく簡便な方法は、コンピューターにより読取り可能な媒体（例えば、フロッピーディスク、CD ROM、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブおよびDVD）中に配列を記憶させ、ついでその記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段で配列データベースを検索することである。公的なデータベースの具体例には、DNA Database of Japan（DDBJ）(http://www.ddbj.nig.ac.jp/); Genebank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/web/Genebank/Index.htlm); およびthe European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL)（http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html）が含まれる。多数の種々の検索アルゴリズムが当業者に利用可能であり、その一例として、BLASTプログラムと称されるプログラム1式が挙げられる。5つのBLAST手段があり、そのうちの3つはヌクレオチド配列の照会用に設計されたものであり（BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX）、2つはタンパク質配列の照会用に設計されたものである（BLASTPおよびTBLASTN）（Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80 (1994); Birrenら, Genome Analysis, 1:543-559 (1997)）。追加的なプログラム、例えば、配列アライメントプログラム、より遠縁の配列の同定のためのプログラムなどが、同定された配列の分析のために当技術分野において利用可能であり、当業者によく知られている。
【０１１６】
以上、本発明を全般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単なる例示目的として記載されており、本発明を限定するものではない。
【０１１７】
（実施例）
実施例1：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）アッセイ
未可溶化または可溶化タンパク質調製物におけるDAGAT活性に関するアッセイ方法を、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）に関して説明する。
【０１１８】
A．未可溶化サンプル
Kamisakaら (1993) 前掲およびKamisakaら (1994) 前掲に記載されているのと同様にして、10mMリン酸カリウム（pH7.0）、100〜150mM KClおよび0.1％ TX-100(w/v)を全容積100μl中に含有するバッファー中の3.67μM 1-14C-18:1-補酵素A（53.5〜54.5 Ci/モル, New England Nuclear, Boston, MA）および1.5mM 1,2-18:1ジアシルグリセロール（DAG）（Sigma D-013、2-メトキシエタノール中の150mMストックとして調製）で、DAGAT活性をアッセイする。アッセイを30℃で5分間行い、1.5mlのヘプタン:イソプロパノール: 0.5M H2SO4（10:40:1, v/v/v）の添加により終了させる。必要に応じて、該アッセイ中の産物生成の直線的な速度を維持するためにアッセイの前にサンプルをバッファーで希釈することができる。
【０１１９】
B．可溶化サンプル
以下の変更以外は未可溶化サンプルに関する記載のとおりに該アッセイを行う：1,2-18:1 DAGの量を0.5mMに減少させ、Triton X-100の量を0.2％に増加させ、KCl濃度を100〜125mMに維持する。また、プロトコールの以下の変更以外はKamisakaら (1996および1997) 前掲に記載のとおりに界面活性剤での可溶化後に活性を回復させるためにL-α-ホスファチジン酸（Sigma P-9511、1％ Triton X-100 (w/v)中の50mMストックとして調製）を加える必要がある。500μMの代わりに300μMのホスファチジン酸を使用することにより、Triton X-100による処理後に、DAGAT活性の、より高い刺激を得る。また、該DAGAT活性は、該アッセイに導入されるKClの量に感受性であり、最適レベルは100〜125mMである。アッセイを30℃で5〜30分間行い、未可溶化サンプルに関して記載したとおりに終了させる。
【０１２０】
C．サンプルアッセイの加工
アッセイを終了した後、該サンプルを、後日行う加工のために4℃で保存するか、または0.1mlの1M NaHCO3およびそれに続く、抽出用担体として15nmol/mlトリオレインを含有する1mlの1Mヘプタンの添加により、直ちに加工することができる。該サンプルをボルテックスし、水相と有機相とを分離した後、上側の有機相を取り出して新たなガラスバイアル内に入れ、1mlの1M NaClで洗浄する。該最終有機相の40％を液体シンチレーション計数のために取り出し、残りの有機相を清潔なバイアルに移し、窒素ガス下で蒸発乾固させる。該残渣を45μlのヘキサンに再懸濁させ、前吸着（pre-adsorbent）ローディングゾーンを有するシリカゲル-Gガラス薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（Analtech #31011, Newark, Delaware）上にスポットする。該TLCプレートをヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸（50:50:1, v/v/v）中で最上部まで展開し、ついで乾燥させ、ラジオイメージアナライザー（AMBIS 3000, San Diego, CA）によりスキャンしてトリアシルグリセロール中に取込まれた放射能部分を測定する。活性をpmol/分の単位で表す。
【０１２１】
実施例2：モルティエレラ・ラマンニアナ培養条件
1リットルの規定グルコース培地（Defined Glucose Media） [逆浸透により精製した1Lの水（pH5.7）中の30gのグルコース、1.5gの(NH4)2SO4、3gのK2HPO4、0.3gのMgSO4・7H2O、0.1gのNaCl、5gのCH3COONa・3H2O、10mgのFeSO4・7H2O、1.2mgのCaCl2・2H2O、0.2mgのCuSO4・5H2O、1.0mgのZnSO4・7H2O、1.0mgのMnCl2・4H2O、2mgのチアミン-HClおよび0.02mgのビオチン]に1.5〜3 x 106個の胞子を接種し、200rpmで振とうしながら30℃で9〜11日間インキュベートすることにより、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）を培養する。1層のMiracloth（Calbiochem, La Jolla, CA）に通す濾過により、培養を収穫する。過剰の液体を、手で搾ることにより除去する。収穫された1リットル当たりの充填細胞の平均収量は22.5gである。
【０１２２】
実施例3：SDS-PAGE分析
カラム画分からのサンプルをSDS-PAGEサンプルバッファー（1xバッファー=2％ SDS w/v、250mM β-メルカプトエタノール、0.0025％ブロモフェノールブルー）中で希釈し、電気泳動により分析する。ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動（10〜13％）を、Delepelaire (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:111-115の改変の一部を伴うLaemmli（(1970) Nature 227:680-685）の方法に従い行う。ドデシル硫酸ナトリウムは、0.1％で上部貯蔵バッファー中には使用するが、下部貯蔵バッファー、濃縮用ゲルおよび分離用ゲルには使用しない。該濃縮用ゲルは30％アクリルアミドストック（アクリルアミド:N,N'-メチレンアクリルアミド、37.5:1、Bio-Rad、Hercules, CA）の5％、0.06％過硫酸アンモニウムおよび0.1％ TEMED（v/v）を含有する。該分離用ゲルは、0〜10％ショ糖直線勾配により安定化された10〜13％直線勾配のアクリルアミドストックを含有する。電気泳動を室温、150Vの定電圧で7〜9時間行う。タンパク質を、Blumら (1987) Electrophoresis 8:93-99に従う銀染色またはクーマシーブルー（0.1％ クーマシーブルーR-250、50％メタノール(v/v)、10％酢酸(v/v)）染色により可視化する。
【０１２３】
実施例4：DAGATの精製においてKamisakaら (1997)らが用いたクロマトグラフィーの評価
A．脂肪体画分の調製
以下の工程を4℃で行う。
【０１２４】
典型的には、70〜75gの湿潤充填（wet packed）モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）細胞（-70℃で保存）を各脂肪体調製に使用する。使用直前に、細胞を氷上で融解し、150mlのバッファーA（10mMリン酸カリウム (pH7.0)、0.15M KCl、0.5Mショ糖および1mM EDTA）に再懸濁させる。タンパク質分解を減少させるために、以下のプロテアーゼ阻害剤を加える：0.1μMアプロチニン、1μMロイペプチンおよび100μMペファブロック（Pefabloc）（すべてBoehringer Mannheim, Germanyから入手）。細胞を5本の管内に分割し、直径1cmのプローブによる設定#7のポリトロン組織ホモジナイザー（Polytron Tissue Homogenizer）（Kinematic GmbH, Brinkman Instruments, Switzerland）で7 x 1分間溶解する。得られたスラリーを遠心管（29 x 104mm）に移し、固体残渣を1500 x g、4℃で10分間の遠心分離（Beckman Instruments, J2-21、JA-20ローター、3500rpm）によりペレット化する。該上清を除去し、該ペレットを更に5mlのバッファーAで洗浄する。遠心分離後、それらの上清容積を合わせる。この画分を「S1」と称することにする。S1を6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments, Fullerton, CA）内に分割し、それぞれに5mlのバッファーB（10mMリン酸カリウム、pH7.0、0.15M KCl、0.3Mショ糖および1mM EDTA）で重層する。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。該重層上に浮遊する脂肪体画分（LBF）をスパーテルで回収し、ガラスホモジナイザー（Potter-Elvehjem）に移す。該遠心管内に残っている少量のLBFをピペットで、4mlのバッファーB重層物を取り出しそれを該ホモジナイザー内のLBFと一緒にすることにより回収する。最終的なLBFを40mlのバッファーB中でホモジナイズする。残りの画分を以下のとおりに集める：界面画分（0.3Mショ糖バッファーと0.5Mショ糖バッファーとの間の界面）、可溶性画分（該界面下の液体容積）および膜画分（各管の底の褐色／茶色のペレット）。可溶化および更なる精製のために、すべてを-70℃で凍結保存する。
【０１２５】
B．DAGAT活性の可溶化
LBFを氷上で融解し、Triton X-100（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）を10％（w/v）ストックから1.3％（w/v）の最終濃度になるまで加えることにより可溶化を行う。固体ショ糖（Mallinckrodt, Paris, Kentucky）を加えて0.5Mの最終濃度にする。界面活性剤で処理したサンプルを4℃で1時間振とうし、ついで6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments）内に分割する。各管に5mlのバッファーBを重層する。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。細い管を該重層物を経由して各遠心管の底から1cm以内にまで挿入し、穏やかな吸引により下側の0.5Mショ糖層を取り出し、一方、上側の0.3Mショ糖重層（浮遊脂肪層を含む）および該ペレットを後に残すことにより、「Triton X-100抽出物」と称される可溶化物質を回収する。
【０１２６】
Kamisakaら (1997) 前掲に記載されているプロトコールにおいては、脂肪体画分が0.1％ (w/v) Triton X-100で可溶化され、さらに100,000 x gで遠心分離または0.2μmフィルターで濾過されている。Kamisakaら (1997) 前掲に記載されているとおり、DAGAT活性が第1カラムに結合するためには、Triton X-100濃度を1.5％にまで増加させる必要があった。
【０１２７】
C．DAGATの精製に用いたクロマトグラフィー
クロマトグラフィーに使用するバッファーCは、10mMリン酸カリウム(pH7.0)、0.1％ Triton X-100（w/v）（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）、10％グリセロール（w/v）、0.1μMアプロチニン、1μMロイペプチン、100μMペファブロック（すべてBoehringer Mannheim, Mannheim, Germanyから入手）および種々の量の塩化カリウム（75〜500mM）を含有する。このバッファーは、エチレングリコールの代わりにグリセロールが使用され、EDTA、DTTおよびPMSFを使用せずにアプロチニン、ロイペプチンおよびペファブロックが加えられている点で、Kamisakaら (1997) 前掲で使用された対応カラムバッファーとは異なる。Kamisakaら (1997) 前掲によるプロトコールに従い、イエロー86-アガロース（Sigma R-8504, St. Louis, MO）カラム（1.5cm x 5.8cm）を調製し、バッファーC中の150mM KClで平衡化する。Triton X-100抽出物中に存在するDAGAT活性の大部分は該イエロー86-アガロースカラムに結合しなかった。しかしながら、アプライしたサンプルのKCl濃度を等容積のバッファーC（KClを含まない）で75mMまで希釈することにより、該DAGATの有意な部分がカラムに結合した。それに応じて、該イエロー86-アガロースカラムをバッファーC中の75mM KCl中で平衡化する。該サンプルを0.56ml/分でアプライした後、該カラムを4カラム体積の平衡バッファーで洗浄する。該カラムに結合したDAGAT活性およびタンパク質をバッファーC中の500mM KClで溶出する（図1）。
【０１２８】
イエロー86-アガロースカラム（画分17〜20）から溶出したDAGAT活性をバッファーCで1:3.33に希釈してKCl濃度を150mMまで減少させる。該希釈化プール（103ml）を、0.2ml/分でバッファーC中で150mM KClで平衡化したヘパリン-セファロースCL-6Bカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden, 0.5cm x 4.8cm）にアプライする。該カラムを5容積の平衡バッファーで洗浄し、DAGAT活性およびタンパク質をバッファーC中の150〜500mM KClの直線勾配（15ml）中で溶出する。DAGAT活性は、2つの重複したピークとして溶出する。第1ピークは、Kamisakaら (1997) 前掲により見出されているとおり該勾配中に溶出する。第2ピークは、それよりはるかに少量のタンパク質と共に該勾配の終了時に溶出し（図2A）、このことはKamisakaらにより見出されていない。
【０１２９】
ヘパリンカラムからのそれらの2つのピーク画分の一部（250μl）を、バッファーC中の150mM KClで平衡化されたSuperdex-200カラム（1 x 30cm, Bio-Rad, Hercules, CA）上のサイズ排除クロマトグラフィー（0.2ml/分）により更に精製する。専ら校正のために、該カラムを、Triton X-100がTriton X-100 R（Calbiochem, La Jolla, CA）で置換された修飾バッファーC中の150mM KClで平衡化する。該カラムを、Bio-Rad Gel Filtration Standardsを使用して校正する。ヘパリン-セファロースCL-6Bからのそれらの2つのピークのそれぞれからのDAGAT活性は99kDaの推定分子量で溶出する。
【０１３０】
より後にヘパリンカラムから溶出するピークについて、追加的なクロマトグラフィーを行う。それは、より高い特異的活性にてDAGATを含有していた。この場合、ヘパリンカラムからの第2ピーク（画分36〜41）をバッファーCで1:6.6に希釈して46.7mlとする。該サンプルを、0.5ml/分でバッファーC中の75mM KClで平衡化されたイエロー86アガロースカラム（1.0cm x 64cm）にアプライする。5カラム容積の平衡バッファーで洗浄した後、結合タンパク質およびすべてのDAGAT活性はバッファーC中の75〜500mM KCl直線勾配（40ml）中で溶出する。DAGAT活性は単一のピークとして溶出する（図3A）。
【０１３１】
ヘパリンおよび第2イエロー86カラムからのDAGAT活性を含有する画分のタンパク質組成を、実施例3のプロトコールに従い勾配SDS-PAGEにより分析する。タンパク質のバンドを銀染色により検出する。これらのカラムから溶出するバンドのパターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する。DAGAT活性の存在と相関する多数のタンパク質候補が存在する。この精製プロトコールは、DAGAT活性に関連した特定のタンパク質候補を同定するには不十分である（図2B、3B）。
【０１３２】
実施例5：DAGATタンパク質候補の同定のための新規精製プロトコール
A．脂肪体画分の調製
以下の工程は4℃で行う。
【０１３３】
典型的には、70〜75gの湿潤充填（wet packed）モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）細胞（-70℃で保存）を各脂肪体調製に使用する。使用直前に、細胞を氷上で融解し、150mlのバッファーA（10mMリン酸カリウム (pH7.0)、0.15M KCl、0.5Mショ糖および1mM EDTA）に再懸濁させる。タンパク質分解を減少させるために、以下のプロテアーゼ阻害剤を加える：0.1μMアプロチニン、1μMロイペプチンおよび100μMペファブロック（Pefabloc）（すべてBoehringer Mannheim, Germanyから入手）。サンプルを、0.5mmガラスビーズを使用する細胞破壊機（Bead-Beater, Biospec Products, Bartlesville, OK）で溶解する。該サンプルチャンバを180mlのガラスビーズで満たす。湿潤充填細胞を氷上で融解し、150mlのバッファーAに再懸濁させる。該細胞スラリーを該ガラスビーズ上に注ぐ。一般には、適切に機能するよう該チャンバを満たすためには、さらに40〜50mlのバッファーAが必要である。この容積を用いて、その元の容器からの細胞スラリーの残りをリンスし、それを該サンプルの残りと一緒にする。細胞を、該サンプルの粘度に応じて45〜90秒間粉砕する（「ホモジナイズ」設定）。ガラスビーズを含有する細胞スラリーを何本かの管（29 x 104mm）内に分割し、500 x g、4℃で遠心分離（Beckman Instruments, GP遠心機、GH3.7 Horizontalローター、1500rpm）する。該上清を除去し、該ペレットを更に5mlのバッファーAで洗浄する。遠心分離後、それらの上清容積を合わせる。この画分を「S1」と称することにする。S1を6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments）内に分割し、それぞれに5mlの修飾バッファーB（10mMリン酸カリウム、pH7.0、0.15M KClおよび0.3Mショ糖）で重層する。EDTAは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを妨げるため、バッファーBからEDTAを除く（実施例4を参照されたい）。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。該重層上に浮遊する脂肪体画分（LBF）をスパーテルで回収し、ガラスホモジナイザーに移す。該遠心管内に残っている少量のLBFをピペットで、4mlのバッファーB重層物を取り出しそれを該ホモジナイザー内のLBFと一緒にすることにより回収する。最終的なLBFを40mlのバッファーB中でホモジナイズする。残りの画分を以下のとおりに集める：界面画分（0.3Mショ糖バッファーと0.5Mショ糖バッファーとの間の界面）、可溶性画分（該界面下の液体容積）および膜画分（各管の底の褐色／茶色のペレット）。可溶化および更なる精製のために、すべてを-70℃で凍結保存する。
【０１３４】
B．脂肪体画分からのDAGAT活性の可溶化
可溶化の前に、ウシ血清アルブミンを標準物として使用するBradford（Bio-Rad Reagent, Hercules, CA）の方法により脂肪体画分のアリコートでタンパク質の測定を行う。LBFを氷上で融解し、タンパク質1mg/mlの濃度になるまで希釈し、界面活性剤:タンパク質の比が15:1（w/w、1.3％ Triton X-100と等価）になるまでTriton X-100で処理する。固体ショ糖（Mallinckrodt, Paris, Kentucky）を加えて0.5Mの最終濃度にする。界面活性剤で処理したサンプルを4℃で1時間振とうし、ついで6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments）内に分割する。各管に5mlの修飾バッファーBを重層する。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。細い管を該重層物を経由して各遠心管の底から1cm以内にまで挿入し、穏やかな吸引により下側の0.5Mショ糖層を取り出し、一方、上側の0.3Mショ糖重層（浮遊脂肪層を含む）および該ペレットを後に残すことにより、「Triton X-100抽出物」と称される可溶化物質を回収する。
【０１３５】
C．DAGATカラムクロマトグラフィー
該タンパク質を更に精製するために、イエロー86-アガロースおよびそれに続くヒドロキシアパタイトによりクロマトグラフィーの精製方法を用いる。該方法を2通りに行う。プロトコールAでは、活性を第1カラムに結合させ、溶出後、画分を活性に関してアッセイする。ついで該活性画分をプールし、第2カラムにアプライする（連続的実施（sequential run）とも称される）。プロトコールBでは、活性を第1カラムに結合させ、ついで第2カラム上に直接的に溶出および流出させ、それらの間にプールしたりアッセイしたりしない（タンデム実施とも称される）。
【０１３６】
プロトコールAにおいては、Triton X-100抽出物を、2ml/分でバッファーC（実施例4．C）中の75mM KClで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（2.5cm x 6.4cm）にアプライする。該カラムを5カラム容積の平衡バッファーで洗浄し、ついでバッファーC中の500mM KClで0.5ml/分で溶出する（図4）。溶出した活性の93％を含有する最も活性な2つの画分（64および65）をプールし、5ml/分でバッファーC中の500mM KClで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（Bio-Gel HT, Bio-Rad, 1cm x 25.5cm）上にローディングする。DAGAT活性体はカラムを通って流れるが、該タンパク質の大部分は該カラムに結合する。該カラムを3容積の平衡バッファーで洗浄する。結合タンパク質をバッファーC中の100mMリン酸二カリウムおよび500mM KClで0.5ml/分で溶出する（図5A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を、実施例9に記載のとおりに勾配ゲルSDS-PAGE上で泳動させる。該タンパク質を銀染色し、該バンドのパターンを画分ごとに該活性プロフィールと比較する（図5B）。いくつかのDAGATタンパク質候補が活性と相関する。特に、43kD、36.5kD、33kDa、29kD、28kDおよび27kDにほぼ対応する位置に移動するバンドに注意すべきである。活性と相関する53kDの領域内の候補タンパク質は存在しないらしい。
【０１３７】
プロトコールBにおいては、Triton X-100抽出物を、1ml/分でバッファーC中の75mM KClで平衡化しイエロー86-アガロースカラム（1.5cm x 5.8cm）にアプライする。該カラムを5カラム容積の平衡バッファーで洗浄する。ついで、イエロー86-アガロースカラムからの出口を、バッファーC中の500mM KClで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（1.0cm x 26.2cm, Bio-Gel HT, Bio-Rad, Hercules, CA）の入口に接続する。イエロー86カラムに結合したDAGAT活性を、500mM KClを含有する110mlのバッファーCで溶出し、0.2ml/分でヒドロキシアパタイトカラムに直接通す。最後に、該ヒドロキシアパタイトカラムを該イエロー86-アガロースカラムから取り外し、該ヒドロキシアパタイトカラムに結合したタンパク質をバッファーC中の100mMリン酸二カリウムおよび500mM KClで溶出する。DAGAT活性は、500mM KClを含有するバッファーCでの110mlの洗浄中に集めたヒドロキシアパタイトカラムからの画分内に見出される。
【０１３８】
Triton X-100抽出物中のタンパク質の大部分はイエロー86-アガロースカラムに結合しない。それを廃棄する。DAGATを含む小さなタンパク質サブセットはイエロー86-アガロースカラムに結合し、それを、バッファーC中の500mM KClで溶出する。この溶出物を該ヒドロキシアパタイトカラムにアプライした場合、DAGAT活性は流出し、一方、残留タンパク質のほとんどは該カラムに結合し、分離される（図6A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を勾配ゲルSDS-PAGE上で泳動させ、銀染色する。これらのカラムから溶出するバンドのパターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する。染色されたタンパク質バンドを調べてみると、約33kDaにおけるタンパク質がDAGAT活性と最も良く相関することが示される（図6B）。
【０１３９】
図5Bに示される36.5kDa候補体および図6Bに示される33kDa候補体からのタンパク質配列は実施例8および9に記載のとおりに得、該ペプチドを使用して該データベースを検索する。36.5kDa候補体から得たペプチドはグリセルアルデヒド-3-リン酸（GAP）デヒドロゲナーゼとマッチした。該33kDa候補体からのペプチドに対する最良のマッチ体はRNAヘリカーゼである。
【０１４０】
実施例6：DAGATを同定するための修飾プロトコール
A．脂肪体画分の調製
以下の工程は4℃で行う。
【０１４１】
典型的には、70〜75gの湿潤モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）充填細胞（-70℃で保存）を各脂肪体調製に使用する。使用直前に、細胞を氷上で融解し、150mlのバッファーA（10mMリン酸カリウム (pH7.0)、1M KCl、0.5Mショ糖、1mM EDTA）に再懸濁させる。可溶性タンパク質の非特異的結合を減少させるために、KCl濃度を0.15Mから1Mに増加させる。タンパク質分解を減少させるために、以下のプロテアーゼ阻害剤を加える：0.1μMアプロチニン、1μMロイペプチンおよび100μMペファブロック（Pefabloc）（すべてBoehringer Mannheim, Germanyから入手）。サンプルを、0.5mmガラスビーズを使用する細胞破壊機（Bead-Beater, Biospec Products, Bartlesville, OK）で溶解する。該サンプルチャンバを180mlのガラスビーズで満たす。湿潤充填細胞を氷上で融解し、150mlのバッファーAに再懸濁させる。該細胞スラリーを該ガラスビーズ上に注ぐ。一般には、適切に機能するよう該チャンバを満たすためには、さらに40〜50mlのバッファーAが必要である。この容積を用いて、その元の容器からの細胞スラリーの残りをリンスし、それを該サンプルの残りと一緒にする。溶解中に該サンプルを冷却温度に維持するために、該チャンバを氷で包囲する。細胞を15秒間粉砕し（「ホモジナイズ」設定）、ついで1分間冷却し、この操作を2回繰返す。ガラスビーズを含有する細胞スラリーを何本かの管（29 x 104mm）内に分割し、1500 x g、4℃で10分間遠心分離（Beckman Instruments, GP遠心機、GH3.7 Horizontalローター、2460rpm）する。該上清を除去し、該ペレットを更に5mlのバッファーAで洗浄する。遠心分離後、それらの上清容積を合わせる。この画分を「S1」と称することにする。S1を6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments）内に分割し、それぞれに5mlの修飾バッファーB（10mMリン酸カリウム、pH7.0、1M KClおよび0.3Mショ糖）で重層する。EDTAはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを妨げるため、バッファーBからEDTAを除く（実施例4を参照されたい）。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。該重層上に浮遊する脂肪体画分（LBF）をスパーテルで回収し、可溶化のためにガラスホモジナイザーに移す。残りの画分を以下のとおりに集める：可溶性画分（該脂肪体画分の下の液体容積）、および膜画分（各管の底の褐色／茶色のペレット）を各管からプールし、アッセイのために取っておく。膜画分を3.8〜4mlの修飾バッファーA（KCl濃度は75mM KClにまで減少している）に再懸濁させる。
【０１４２】
B．脂肪体画分からのDAGAT活性の可溶化
同じ日に、最終的なLBFを50mlの可溶化バッファー（10mMリン酸カリウム （pH7.0）、75mM KCl、0.5Mショ糖、1.5％ Triton X-100）中でホモジナイズし、該ホモジネートを90,000 xg、で1.8時間遠心分離（SW-28、27k rpm）する。遠心分離後、浮遊している脂質層を捨て、可溶化層（Triton X-100抽出物）をプールし、さらなる精製のために-70℃で保存する。該Triton X-100抽出物は、さらに希釈することなくそのまま第1カラムにローディングできる。
【０１４３】
C．イエロー86-アガロースおよびHAをタンデム方式（プロトコールB）で使用するDAGATカラムクロマトグラフィー
実施例5に記載のプロトコールと比較するために、1つの脂肪体画分を実施例5Bに記載のとおりに調製し（低塩）、もう1つの脂肪体画分を実施例6Bに記載のとおりに調製する（高塩）。各調製物をTriton X-100で可溶化する。該Triton X-100抽出物を、実施例5C、プロトコールBに記載のイエロー86-アガロースおよびヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィーに付す。図7A（高塩）および7B（低塩）に示すとおり、該高塩調製物において回収されたタンパク質の量は、低塩調製物において回収された量より多い。後続のすべての調製は、実施例6A/Bに記載の高塩プロトコールを用いて行う。
【０１４４】
また、これらの2つの比較用調製物は、SDS-PAGE分析後、特に高塩プロトコールを用いた場合に、これまでに認められていない追加的なDAGATタンパク質候補を示している。それらの2つの精製物から活性画分を、HA実施例8Bに記載のとおりにカラムからの画分を沈殿させることによりゲル内消化用に調製し、実施例8Cに記載のとおりに勾配ゲルSDS-PAGEにより分離する。約55、50、39、36.5、36、33、32.5、32、29および27kDaのサイズのクーマシー染色タンパク質を、該高塩調製物から作製したゲルから切り出す（図7A）。約39、36.5、36、35、32、31、29および27kDaのサイズのクーマシー染色タンパク質を、低塩調製物から作製したゲルから切り出す（図7B）。これらの候補を、後にタンパク質配列決定に使用するために-70℃で保存する。該高塩調製物からの36kDaのバンドをMr18と命名した。該低塩調製物からの36kDaのバンドをMr19と命名した。
【０１４５】
D．イエロー86-アガロース、ヒドロキシアパタイトおよびヘパリンを使用するDAGATカラムクロマトグラフィー
実施例6Bに記載のTriton X-100を融解し、2ml/分でバッファーC（10mMリン酸カリウム (pH7.0)、0.1％ (w/v) Tx-100、10％ (w/v)グリセロール）中の75mM KClで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（2.5cm x 64cm）にアプライする。該タンパク質のほとんどは該カラムに結合しないが、該タンパク質およびDAGAT活性の一部は該カラムに結合する。該カラムを5カラム容積の平衡バッファーで洗浄し、ついで結合タンパク質およびDAGAT活性をバッファーC中の75〜500mM KClの直線勾配120mlで2ml/分で溶出する。画分を直ちにアッセイし、活性画分をプールし、YM-30膜を備えた加圧攪拌セル（Amicon）を使用する限外濾過により8倍濃縮する。該濃縮物を、0.5ml/分でバッファーC中の500mM KClで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（約1.0cm x 26cm、Bio-Gel HT、Bio-Rad、Hercules、CA）上にローディングし、該カラムを40mlの平衡バッファーで洗浄する。DAGAT活性は該流動液および洗液中に見出されるため、結合タンパク質はこの実験では溶出しない。活性画分をプールし、1:3.3に希釈して、KCl濃度を500から150mMに減少させる。該希釈サンプルを、0.5ml/分でバッファーC中の150mM KClで平衡化したヘパリンカラム（0.55 x 4.7cm）にアプライする。該カラムを5容積の平衡バッファーで洗浄し、結合タンパク質をバッファーC中の150〜500mM KClの直線勾配10ml中で0.25ml/分で溶出する。該勾配の後、該カラムをバッファーC中の15容積の500mM KClで0.25ml/分で洗浄する。DAGAT活性は2つのピークとして溶出し、そのうちの1つは該勾配中に、1つは該勾配後の500mM KCl洗浄中に溶出する。該カラムプロフィールにわたる画分（DAGAT活性を含有する画分を含む）を、実施例8と同様の沈殿により濃縮する。該沈殿サンプルを勾配ゲルSDS-PAGEにより分離し、該ゲルを銀染色する（実施例3に記載のとおり）。該カラムから溶出するバンドのパターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する（実施例8A）。該染色タンパク質バンドの検査は、約36kDa〜約37kDaのサイズ範囲のタンパク質が、500mM KClでの洗浄中に溶出するピーク中に見出されるDAGAT活性と最も良く相関することを示している（図8B）。この情報に基づき、実施例6Cに記載の2つのゲルから切り出した36〜約37kDaのタンパク質のバンドをゲル内消化およびタンパク質配列決定に送る。
【０１４６】
実施例7：モルティエレラ・ラマンニアナからのDAGATタンパク質候補を同定するための精製プロトコールの大規模化
実施例6Dに記載の精製プロトコールは、2つの可能なDAGAT形態がこの調製物中に存在しうることを示しているが、精製の最終工程においては、タンパク質の配列決定に進めるには不十分なタンパク質しか存在していない。したがって、該プロトコールの大規模化を行った。
【０１４７】
A．イエロー86-アガロースによる大規模化
実施例6Aおよび6Bに記載のTriton X-100抽出物を融解し、2ml/分でバッファーC（10mMリン酸カリウム (pH7.0)、0.1％ (w/v) Tx-100、10％ (w/v)グリセロール）中の75mM KClで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（25cm x 6.4cm）にアプライする。該タンパク質のほとんどは該カラムに結合しないが、該タンパク質およびDAGAT活性の一部は該カラムに結合する。該カラムを5カラム容積の平衡バッファーで洗浄し、ついで結合タンパク質およびDAGAT活性をバッファーC中の500mM KClで2ml/分で溶出する（図9）。該DAGAT活性は精製のこの段階の凍結／融解に安定であるため、この段階では溶出画分を典型的には-70℃で保存する。また、実施例1Bに従い、溶出画分をDAGAT活性に関してアッセイする。
【０１４８】
B．ヒドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィー
4つの調製物をイエロー86-アガロースで精製した後、最も活性な画分をプールし、限外濾過（Amicon攪拌セル、YM-30膜）により12〜14倍濃縮し、バッファーC中の500ml KClで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（Bio-Gel HT、Bio-Rad、1cm x 25.5cm）にアプライ（0.5ml/分）する。サンプルのローディングに要する時間を短縮するために、HAクロマトグラフィーの前に該サンプルの濃縮を行う。DAGAT活性は該カラム内を流れるが、残りのタンパク質の大部分は該カラムに結合し分離される。該カラムを3容積の平衡バッファーで洗浄する。結合タンパク質をバッファーC中の100mMリン酸二カリウムおよび500mM KClで0.5ml/分で溶出する（図10A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を、実施例3に記載のとおりに勾配ゲルSDS-PAGE上で泳動させる。該タンパク質を銀染色し、該バンドのパターンを画分ごとに、該活性プロフィールと比較する（図10B）。いくつかのDAGATタンパク質候補は活性と相関する。特に、約36.5kD、36kD、35kDa、34kD、33kD、33kDおよび31kDに対応する位置に泳動するバンドに注目すべきである。この場合もまた、活性と相関する既に記載されている53kDの領域内には候補タンパク質は存在しないらしい。
【０１４９】
C．ヘパリン上でのクロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後は、DAGAT活性は凍結／融解に適さないため、画分を直ちにアッセイし、活性画分を更なるクロマトグラフィーのためにプールする。該プールをバッファーCで希釈して、KCl濃度を500mMから150mM KClに減少させる。該希釈化プールを、バッファーC中の150mM KClで平衡化したヘパリンカラム（0.55 x 4.7cm）にローディングする。タンパク質およびDAGAT活性は、バッファーC中の150〜500mM KClの勾配（10ml）およびそれに続くバッファーC中の500mM KClでの10mlの洗浄中に溶出する。DAGAT活性は2つのピーク中に溶出する。鋭いピークは該KCl勾配中に、よりブロードなもう1つのピークは該洗浄中に見出される（図11A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を勾配ゲルSDS-PAGE上で移動させ、銀染色する。該カラムから溶出するバンドのパターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する。それらの染色タンパク質バンドを検討することにより、36kDaにおけるタンパク質が、該ブロードピークにおいて見出されるDAGAT活性と最も良く相関することが示される（図11B）。いくつかのタンパク質（約36.5kDa、35kDa、34kDaのタンパク質）は、その鋭いピークにおいて見出される活性に関連している。約33kDaおよび約31kDaにおける候補体はDAGAT活性と相関していないらしい。表1は、ヘパリンによる該1500 x g画分からの精製倍率を示す。
【０１５０】
【表１】
0004514952.tif 000002
【０１５１】
同定した4つの候補（約36.5kDa、36kDa、35kDaおよび34kDaにおけるもの）を、実施例8Bに記載のヘパリンカラムからの画分の沈殿によりゲル内消化のために準備し、実施例8Cに記載のとおり勾配ゲルSDS-PAGEにより分離する。このようにして、DAGAT候補のそれぞれからペプチドマップを得、個々のペプチドをタンパク質配列決定用に選択する。
【０１５２】
D．勾配溶出によるイエロー86-アガロース上でのクロマトグラフィー
もう1つの精製プロトコールを検討するために、DAGATを実施例6Aに記載のとおりにヒドロキシアパタイトにより精製し、75mM KClにまで希釈し、ついで、バッファーC中の75mM KClで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（1.3cm x 6.3cm）にアプライする。該カラムを25mlの平衡バッファーで洗浄し、結合タンパク質をバッファーC中の75〜500ml KClの40mlの勾配にわたり溶出する。実施例1Bに記載のとおり、画分をDAGAT活性に関してアッセイする。DAGAT活性は該勾配の中央部分に単一のピークとして出現する。DAGAT活性を含有する画分を、実施例8Bと同様の沈殿により濃縮し、実施例8Cと同様のSDS-PAGEにより分離する。該カラムから溶出するバンドのパターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する（図12A）。該34kDa候補体は該勾配の初期に溶出し、DAGAT活性とは相関しないらしい（図12B）。それぞれMr21、Mr22、Mr23と称される残りの3つのタンパク質候補体（約36.5kDa、36kDaおよび35kDa）はDAGAT活性と相関する。
【０１５３】
実施例8：ゲル内消化のためのタンパク質の調製
タンパク質候補を同定した後、配列決定に十分な量を調製する必要がある。タンパク質配列決定は、当技術分野で公知の多種多様な方法により行うことができる。1つの技術は、SDS-ポリアクリルアミドゲル中でもなお、トリプシンなどの酵素を使用する該タンパク質の消化を行うことを含む。いくつかの商業的企業が、このようにしてペプチドを得るためのプロトコールを確立している。ペプチドの生成後、標準的な技術を用いてそれらを分離し配列決定する。
【０１５４】
タンパク質候補をゲル精製するためには、液体サンプルが該ゲル上にローディングされうるよう該液体サンプルをまず濃縮することが必要となることが多い。大量の界面活性剤を含有するサンプルは特別な問題を引き起こしうる。該界面活性剤のミセルサイズに応じて、それは限外濾過中に濃縮され、電気泳動中に問題を引き起こしうる。したがって、タンパク質サンプルを濃縮する別の方法を用いる必要がある。
【０１５５】
A．濃縮によるSDS-PAGE用サンプルの調製
画分を、適当な分子量保持限界の膜を備えた加圧セル内で濃縮することができる。あるいは、個々のユニット [例えばCentricon-30（Amicon, Inc., Beverly, MA）などの製品] 内での遠心分離による濾過により該サンプルを約50μlの容積にまで濃縮することができる。濃縮後、サンプルをローディングバッファー（例えば、Laemmli）で処理することができる。
【０１５６】
B．沈殿によるSDS-PAGE用サンプルの調製
サンプルを沈殿により濃縮することが望ましいこともある。これは、酸および／またはアセトンを使用して達成されうる。典型的なプロトコールは、トリクロロ酢酸（TCA）を濃縮ストック（40％〜50％ (w/v)）から7〜10％ (w/v)の最終濃度になるまで加えることであろう。氷上で約10分後、該サンプルを遠心分離（12,000 x g、4℃で15分間）して、沈殿したタンパク質をペレット化させる。該上清を除去し、沈殿した界面活性剤を除去するために、該ペレットを氷冷アセトンで洗浄し、再遠心分離する。沈殿物をサンプルローディングバッファー（すなわち、実施例3と同様のLaemmliまたはSDS-PAGEサンプルバッファー）と共に再懸濁させる。実施例3に記載のとおり実験室内で成型したゲルまたは業者により調製されたゲルを使用してSDS-PAGEを行うことができる。
【０１５７】
C．SDS-PAGE
ゲルをローディングする前のサンプルの加熱は行っても行わなくてもよい。いくつかの膜タンパク質は加熱の際に凝集する傾向があることが認められている。この場合、サンプルを、一般には、室温で15分間放置した後のゲルにアプライする。アクリルアミドゲルは商業的に購入するか、あるいは実験室内で調製することができる。10〜13％ (w/v)アクリルアミドゲルを調製するための1つのプロトコールは実施例3に記載されている。電気泳動後、該ゲルを50％ (v/v)メタノール、10％ (v/v)酢酸中の0.1％ (w/v)クーマシーブルーで染色し、ついで脱染することができる。脱染は、Gel-Clear（Novex, San Diego, Ca）などの市販品を使用して、あるいは50％ (v/v)メタノール、10％ (v/v)酢酸中で行うことができる。ついでタンパク質候補を該ゲルから切り出し、さらに脱染を行って又は行うことなくゲル内消化に送ることができる。
【０１５８】
実施例9：アミノ酸配列の決定
タンパク質の配列決定をサービスとして提供する商業的施設が設立されている。利用可能な技術のなかでは、トリプシンなどのエンドペプチダーゼを使用するゲル内消化によるペプチドの生成およびそれに続くHPLC精製が最も有用であることが判明している。PVDF上でのN末端配列決定、およびそれより低度ではあるがPVDFタンパク質の限定臭化シアン処理によるペプチドの生成も、成功につながることが判明している。ゲル内消化のための方法は、定量およびアミノ酸組成に関するゲル切片の一部（10〜15％）のアミノ酸分析、タンパク質分解酵素（トリプシンまたはリシルエンドペプチダーゼ）の1つによるタンパク質の消化、および逆相HPLCによる該産物の分画を含みうる。タンパク質配列決定の前に該ペプチドの存在、量および質量を測定するために、吸光ピークをHPLCの実施から選択し、レーザー脱離質量分析法に付すことができる。マイクロシークエンシング（microsequencing）には最長のペプチドを選択する。特に、DAGAT候補をゲル精製し、ゲル内消化およびマイクロシークエンシングのためにArgo Bioanalytica（商業的サービス）に送る。
【０１５９】
実施例10：トリプシンにより生成したペプチドのアミノ酸配列
実施例9に記載のとおりのトリプシン消化により約36kDaのタンパク質から生成したペプチド（MR1とも称される）（実施例6Cおよび6Dを参照されたい）のアミノ酸配列は、以下のとおりである（配列の番号の最初の2つの数字は、実施例6Cおよび7Cに記載のMrバンドを示す）。
【０１６０】
【表２】
0004514952.tif 000003
【０１６１】
実施例9に記載のとおりにトリプシン消化により約36.5kDaのタンパク質から生成したペプチド（MR2とも称される）（実施例7Bを参照されたい）のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
【０１６２】
【表３】
0004514952.tif 000004
【０１６３】
該アミノ酸配列は、1文字のコードを用いて表されている。小文字で表されたアミノ酸は、より低い信頼度で同定された残基を表す。該35kDa候補体（実施例7CにおけるMr23）のペプチドマップは、該36.5候補体（実施例7CにおけるMr21）のペプチドマップに実質的に類似している。
【０１６４】
前記ペプチドのアミノ酸配列を公的および私的データベース中の公知タンパク質配列と比較する。DAGATペプチドと、既知機能の酵素をコードするいずれの配列（例えば、SDS-PAGEにおいて約36kDaに泳動するグリセルアルデヒド3-リン酸（GAP）デヒドロゲナーゼのいずれの部分）との間にも、有意な相同性は見出されない。
【０１６５】
実施例11：モルティエレラ・ラマンニアナDAGAT核酸配列の同定
一般に、mRNAから逆転写された一本鎖DNA鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーとして使用するために、DAGATペプチドをコードする配列に対応するセンス配向の配列を含有するオリゴヌクレオチドを調製する。該コードDNA鎖の増幅の「リバース」反応のために、DAGATペプチドをコードする配列に相補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドを設計することができる。
【０１６６】
あるいは、PCR用のDNA鋳型の調製に使用するプライマーの一部と同一となるよう、オリゴヌクレオチドを設計することができる。このオリゴヌクレオチドは「フォワード」または「リバース」プライマー（前記のとおり）として使用することができる。
【０１６７】
DAGATペプチド配列が、多数の異なるコドンにコードされうるアミノ酸を含有する場合には、フォワードまたはリバースプライマーは「縮重」オリゴヌクレオチド（すなわち、ある特定のペプチド領域に関する可能なコード配列の全部または一部の混合物を含有するもの）であってもよい。そのような混合物中に存在する異なるオリゴヌクレオチドの数を減少させるために、PCRプライマー用の合成オリゴヌクレオチドを調製する際には最小数の可能なコード配列を有するペプチド領域を選択することが好ましい。
【０１６８】
A．DAGAT MR1の同定
モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR1の核酸配列を同定するために、ペプチド18-151を使用して縮重プライマー5'-CACTGCAGACRAAYTCNARYTCYTTNAC-3'（配列番号25）を設計し、ペプチド18-208を使用してプライマー5'-CCAAGCTTGGNGTNTTYAAYTAYGAYTTYG-3'（配列番号26）および5'-CACTGCAGCRAARTCRTARTTRAANACNCC-3'（配列番号27）を設計し、ペプチド18-164を使用してプライマー5'-CACTGCAGCYTGNACNGCNGCRTGCATRTA-3'（配列番号28）を設計し、ペプチド18-219-1を使用してプライマー5'-CCAAGCTTATHGCNGTNCARACNGGNGC-3'（配列番号29）を設計し、ペプチド19-181を使用してプライマー5'-CCAAGCTTAARCAYCCNATHTAYACNAT-3'（配列番号30）および5'-CACTGCAGACDATNGTRTADATNGGRTG-3'（配列番号31）を設計し、ペプチド19-169を使用してプライマー5'-CCAAGCTTGCNYTNGGNTTYACNATGCC-3'（配列番号32）、5'-CCAAGCTTTTYACNATGCCNYTNTTYCA-3'（配列番号33）および5'-CACTGCAGAARTGRAANARNGGCATNGT-3'（配列番号34）を設計する。
【０１６９】
PCRにより得たDNA断片を、実施例10のペプチド中に見出されるアミノ酸配列をコードする核酸配列に関して分析する。モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR1タンパク質に対応する全コード領域を得るために、MR1配列を含有する部分cDNAクローンの5'および3'末端を増幅するよう合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。プライマーをモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR1配列に従い設計し、それをRACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）反応（Frohmanら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002）において使用する。cDNAクローンからのフランキング配列の増幅を、Marathon cDNA Amplificationキット（Clontech, CA）を使用して行う。例えば、3'RACEプライマー RACE5'-GGTTTGCTCCCCCATCGCCATCCTATC-3'（配列番号35）および5'RACEプライマー5'-GATAGGATGGCGATGGGGGAGCAAACC-3'（配列番号36）でPCR反応を行うことができる。このようにして、1065ヌクレオチドの完全なMR1コード配列を決定する（配列番号37）。MR1 DAGATの推定タンパク質配列も決定する（配列番号38）。核酸配列に関して分析し原核性および真核性の両方の種々の宿主内でのDAGATの発現に使用しうるDAGAT核酸配列を得る。
【０１７０】
製造業者のプロトコール（Clonetech）に従い作製したモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）Marathon cDNAライブラリーからのオープンリーディングフレーム（ORF）をPCR増幅するために、プライマー5-AATTCGCGGCCGCATGGCCAGCAAGGATCAACATTTACAGC-3'（配列番号39）および5'-TGCTGCAGCTATTCGACGAATTCTAGTTCTTTTACCCGATCC-3'（配列番号40）を使用する。これらのプライマーは、該ORFの5'および3'末端にそれぞれNotIおよびPstI制限部位を導入する。該PCR産物を、製造業者のプロトコール（Invitrogen）に従いプラスミドpCR2.1内にクローニングして、プラスミドpCGN8707を得る。PCR増幅により誤りが導入されていないことを確認するために、二本鎖cDNA配列を得る。バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞内でエム・ラマンニアナ（M. ramanniana）DAGAT MR1タンパク質を発現させるために、pCGN8707のNotI-PstI断片を、NotI-PstIで消化されたプラスミドpFASTBAC1（Gibco）内にクローニングし、得られたプラスミドpCGN8708を大腸菌（E. coli）DH10BAC（Gibco）内に形質転換する。バクミド（bacmid）DNAを使用して昆虫細胞をトランスフェクトする。植物内でモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR1配列を発現させるために、pCGN8708のNotI-Pst1断片を、NotI-PstIで消化されたバイナリーベクターpCGN8622内にクローニングして、ナピン（napin）プロモーターの制御下のプラスミドpCGN8709を得る。プラスミドpCGN8709をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）EHA105内に導入する。
【０１７１】
B．DAGAT MR-2の同定
モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR2の核酸配列を同定するために、ペプチド21-221を使用して縮重プライマー5'-GGCACNGCDATNGGYTTNCCNAC-3'（配列番号41）を設計し、ペプチド21-218を使用してプライマー5'-CCNGCRTTRTARTTRAADATNCC-3'（配列番号42）を設計する。これらを、製造業者の説明書に従いMarathon cDNA増幅キット（Clontech）で構築したcDNAライブラリーを使用するRACE（Rapid Amplification of DNA Ends）反応（Frohmanら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002）におけるアンチセンスプライマーとしてネスティドPCRにおいて使用する。
【０１７２】
製造業者の説明書に従いMarathon cDNA Amplificationキット（Clontech）で構築したcDNAライブラリーを使用して、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR2タンパク質に対応する5'領域のRACE増幅をプライマー5'-TGCCTAGTGACATCATGAAATCTCG-3'（配列番号43）で行う。このようにして、ヌクレオチドの部分コード配列が決定される（配列番号44）。MR2タンパク質の部分アミノ酸配列も推定される（配列番号45）。
【０１７３】
当業者は、さらなるRACE反応が、原核性および真核性の両方の種々の宿主内でのDAGATの発現に使用されうる完全な核酸配列のクローニングにつながると認識するであろう。
【０１７４】
C．MR1およびMR2配列の比較
モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT配列MR1（配列番号38）およびMR2（配列番号45）（図13）のタンパク質配列間のタンパク質配列アライメントの分析は、それらが55％の類似性を有することを示している。
【０１７５】
実施例12：DAGAT関連配列の同定
植物DAGATは当技術分野で知られていないため、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT核酸およびタンパク質配列を使用して公的および私的ESTデータベースならびに公的ゲノムデータベースを検索して、他のDAGAT様配列を同定する。
【０１７６】
トウモロコシ私的データベースにおいてtblastnにより3つのEST配列を同定することができる。それは、GCG集合プログラムを使用して2つのコンティグに集合する（配列番号46〜47）。西洋アブラナ（Brassica napus）（配列番号48）およびダイズ私的データベース（配列番号49）のそれぞれにおいて、1つのESTを同定することができる。2つのEST配列をシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）私的データベース（配列番号50〜51）、および1つの私的ゲノム配列（配列番号52）において同定することができる。
【０１７７】
MR1タンパク質配列を使用して私的マウスおよびヒトデータベースを検索する。この検索の結果は、GCG集合プログラムを使用して5個のコンティグ（配列番号53〜57）に集合するヒト由来の約45個のEST配列、およびGCG集合プログラムを使用して3個のコンティグ（配列番号58〜60）に集合するマウス由来の12個のEST配列を同定した。私的アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）（配列番号61および62）、アスペルギルス・オラセウス（Aspergillus oraceus）（配列番号63）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（配列番号64）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）（配列番号65）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）（配列番号66）およびシゾキトリウム・アグレガツム（Schizochytrium aggregatum）（配列番号67）は追加的なEST配列を与える。
【０１７８】
これらのEST配列と共に、シー・エレガンス（C. elegans）のゲノムおよびアミノ酸配列データベース由来の公的推定タンパク質のデータベース検索は、類似した4個の配列W01A11.2（配列番号68）、K07B1.4（配列番号69）、F59A1.10（配列番号70）およびタンパク質配列y53G8B_93.B（配列番号71）を与える。公的エス・セレビシエ（S. cerevisae）推定タンパク質データベースの同様の検索は、1つの配列YOR245c（配列番号72）を与える。
【０１７９】
これらの2つの生物から全RNAを集め、Marathon cDNAライブラリーキット（Clontech）を使用して第1鎖cDNAライブラリーを作製した。プライマー5'-GCGCGGCCGCCTGCAGTCACTGGAAGATGAG-3'（配列番号73）および5'-GCGCGGCCGCATGAGACTCCGGCTGAGCTCG-3'（配列番号74）を使用して、シー・エレガンス（C. elegans）cDNAライブラリーからW01A11.2を増幅する。プライマー5'-GAGCGGCCGCATGCCACATCTACTAGGAGTTGA-3'（配列番号75）および5'-CGGCGGCCGCCTGCAGTTAATTGATAACAAGTTGT-3'（配列番号76）を使用して、シー・エレガンス（C. elegans）cDNAライブラリーからCEK07B1.4 2をPCR増幅する。5'-GCGCGGCCGCATGCTAAACTACCAAATTCACA-3'（配列番号77）および5'-TGGCGGCCGCCTGCAGTCACTGAAAAACGAGCC-3'（配列番号78）を使用して、シー・エレガンス（C. elegans）cDNAライブラリーからCEF59A1.10 2をPCR増幅する。5'-CAGCGGCCGCATGTCAGGAACATTC-3'（配列番号79）および5'-CACTGCAGTTACCCAACTATCTTCAA-3'（配列番号80）を使用して、エス・セレビシエ（S. cerevisae）cDNAライブラリーからYOR245CをPCR増幅する。該PCR産物を製造業者のプロトコール（Invitrogen）に従いpCR2.1 TOPO内にクローニングし、これらの配列を確認した。
【０１８０】
実施例13：配列の比較
いくつかの異なる起源からのDAGAT様配列の間の配列アライメントを比較して、これらの配列間の類似性を同定する。
【０１８１】
DNASTARにおけるClustal Algorithmを用いて、より長い配列をアラインさせる。MR1配列との比較により、以下の類似性の値（％）が得られる。
【０１８２】
【表４】
0004514952.tif 000005
【０１８３】
MR1の塩基355〜796に対応する保存領域を含有するタンパク質配列をアラインさせ、この領域までトランケート化し、以下の類似性（％）を得る。
【０１８４】
【表５】
0004514952.tif 000006
【０１８５】
実施例14：発現構築物
A．バキュロウイルス発現構築物
培養昆虫細胞内でモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGATタンパク質の発現を指令する構築物を調製する。pCGN8707のNotI-PstI断片を、NotI-PstIで消化されたプラスミドpFASTBAC1（Gibco）内にクローニングし、得られたプラスミドpCGN8708を大腸菌（E. coli）DH10BAC（Gibco）内に形質転換する。バクミド（bacmid）DNAを使用して昆虫細胞をトランスフェクトする。
【０１８６】
B．植物発現構築物の調製
植物細胞内でのDAGAT配列の発現をもたらす構築物を以下のとおりに調製することができる。
【０１８７】
pCGN3223由来のナピン（napin）カセットを含有するプラスミド（全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,639,790号に記載されている）を修飾して、それが、複数の制限部位を含有する大きなDNA断片のクローニングに、より有用となるようにし、かつ、植物バイナリー形質転換ベクター内への複数のナピン融合遺伝子のクローニングが可能となるようにした。配列5'-CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTTAAAT-3'（配列番号81）の自己アニーリング化オリゴヌクレオチドを含むアダプターを、制限エンドヌクレアーゼBssHIIでの消化後にクローニングベクターpBC SK+（Stratagene）内に連結して、ベクターpCGN7765を構築する。プラスミドpCGN3223およびpCGN7765をNotIで消化し、互いに連結する。得られたベクターpCGN7770は、pCGN3223由来のナピン種子特異的発現カセットと共にpCGN7765バックボーンを含有する。
【０１８８】
オリゴヌクレオチド5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3'（配列番号82）および5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3'（配列番号83）を、SalI/XhoIで消化されたpCGN7770内に連結することにより、プラスミドpCGN8618を構築する。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナピン3'領域を含有する断片をAsp718Iでの消化によりpCGN8618から切り出す。該断片を、クレノウ断片で5'突出部分を埋めることにより平滑末端化し、ついで、Asp718IおよびHindIIIで消化され5'突出部分がクレノウ断片で埋められて平滑末端化されたpCGN5139内に連結する。該ナピンプロモーターがpCGN5139の平滑末端化Asp718I部位に最も近く該ナピン3'が該平滑末端化HindIII部位に最も近くなるように配向しているインサートを含有するプラスミドを配列分析に付して、インサートの配向およびクローニング結合部の完全性の両方を確認する。得られたプラスミドをpCGN8622と命名する。
【０１８９】
全DAGATコード領域を含有するpCGN8708のNot1/Pst1断片を、Not1/Pst1で消化されたpCGN8622内に連結して、該ナピンプロモーターの調節下にセンス配列の転写のために配置されたモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGATコード配列を有する発現構築物pCGN8709を得る。
【０１９０】
また、MR1核酸配列を、植物に好ましいコドン使用頻度に関して再合成し（配列番号84）、宿主植物細胞内への形質転換用の発現構築物の作製に使用する。
【０１９１】
バイナリーベクター構築物を、Holstersら（Mol. Gen. Genet. (1978) 163:181-187）の方法によりEHA105株（Hoodら, Transgenic Research (1993) 2:208-218）などのアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞内に形質転換し、それを、後記のとおりの植物形質転換方法において使用する。
【０１９２】
実施例15：昆虫細胞培養内でのDAGATの発現
推定DAGATをコードする完全長36kDaモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）cDNAを培養昆虫細胞内で発現させるために、バキュロウイルス発現系を使用する。
【０１９３】
組換えウイルスの収穫をトランスフェクションの5日後に行った以外は製造業者の指示書に従いBAC-to-BACバキュロウイルス発現系（Baculovirus Expression System）（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）を使用して、バキュロウイルス発現構築物pCGN8708（実施例14Aを参照されたい）を形質転換し発現させる。アッセイで用いるSf9細胞の感染に使用するウイルスストックを作製するために、該トランスフェクション混合物からの上清を使用する。
【０１９４】
A．昆虫細胞培養膜におけるDAGAT酵素活性のアッセイ
該形質転換昆虫細胞を、本明細書に記載の方法を用いてDAGATまたは他のアシルトランスフェラーゼ活性に関してアッセイすることができる。昆虫細胞を遠心分離し、得られたペレット化細胞を直ちに使用するか、あるいは後の分析のために-70℃で保存することができる。細胞を培地I（100mMトリシン/NaOH、pH7.8、10％ (w/v)グリセロール、280mM NaCl）に0.1μMアプロチニン、1μMロイペプチンおよび100μMペファブロック（すべてBoehringer Mannheim, Germany）と共に再懸濁させ、超音波処理（2 x 10秒）により溶解する。細胞壁および他の残渣を遠心分離（14,000 x g、10分間、4℃）によりペレット化する。該上清を新たなバイアルに移し、膜を遠心分離（100,000 x g、Ti 70.1ローター、46,000rpm、4℃で1時間）によりペレット化する。全膜を培地Iに再懸濁させる。DAGAT活性を、30mMトリシン/NaOH（pH7.8）、56mM NaCl、10mM MgCl2、0.2mM 1,2-ジオレイン（2-メトキシエタノール中）、25mM 1-14C-パルミトイル-CoA（17,600dpm/nmol）および0.2〜30mgの膜タンパク質を含有する0.1mlの反応混合物中でアッセイする。その5分間の反応を、イソプロパノール:ヘプタン:0.5M硫酸（80:20:2, v/v/v）の1.5ml溶液の添加により終結させる。該反応混合物を4℃で保存するか、実施例1Cに記載のとおりに直ちに加工することができる。
【０１９５】
36kDaのモルティエレラ（Mortierella）候補は、昆虫細胞内で発現された場合、空ベクターに感染した昆虫細胞から単離した対照膜より94倍大きなDAGAT活性を示す（図14）。DAGAT活性アッセイの結果は、このモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DNA配列が、DAGAT活性を有するタンパク質をコードすることを示している。
【０１９６】
同様に、酵母（SCYOR245c）およびシー・エレガンス（C. elegans）（CEK07B1.4、CEF59A1.10およびCEWOLA11.2）から同定したDAGATのホモログもpFASTBAC1（Gibco）ベクター内にクローニングして、それぞれバキュロウイルス発現構築物pCGN8821、pCGN8822、pCGN8823およびpCGN8824を作製した。DAGAT酵素活性アッセイの結果は、昆虫細胞内で発現させた場合、対照ベクターに対してDAGAT酵素活性の有意な増加を示している（図15）。例えば、酵母ホモログ配列の発現用のベクターに感染した昆虫細胞から単離した膜は、空ベクターに感染した昆虫細胞から単離した対照膜と比較してDAGAT酵素活性における95倍の増加を示す（図15）。さらに、シー・エレガンス（C. elegans）ホモログ配列の発現用のベクター（pCGN8823）に感染した昆虫細胞から単離した膜は、DAGAT酵素活性における約15倍の増加を示す（図15）。このように、本発明の配列を使用して、追加的なDAGATコード配列を容易に同定することが可能となった。
【０１９７】
B．昆虫細胞培養内でのトリアシルグリセロール産生
該形質転換昆虫細胞を、本明細書に記載の方法によりトリアシルグリセロール、ホスホチジルコリンまたは他の脂質クラスに関してアッセイすることができる。昆虫細胞培養懸濁液を、吸光度600nmで0.3〜0.6の標準光学濃度になるまで培地で希釈する。培地内の4.5mlの培養懸濁液のサンプルを200μlの氷酢酸、12.5μgのc17:0 TAGおよび25μgのc15:0 PCよりなる内部標準、および10mlのクロロホルム:メタノール（1:1、v/v）に加える。ボルテックスした後、遠心分離（約500 x g、5分間）により相を分離する。下側の有機相（OP1）は取っておく。上側の水相を200μlの氷酢酸、10mlのクロロホルム:メタノール（1:1、v/v）および4.5mlの水の混合物の下側有機相で再抽出する。該サンプルを再びボルテックスし、遠心分離して相を分離する。下側の有機相（OP2）は取っておく。OP1を0.45μmフィルターで濾過し、該フィルターをOP2でリンスする。該濾液を合わせ、窒素ガス下で最終容積0.4mlまで濃縮する。該最終容積の25％を、無機結合剤（Alltech Associates, Inc., Newark, Delaware）を含む硬層シリカゲルGHL TLCプレート上にスポットする。該TLCプレートを、抗酸化剤として20mg/100mlの没食子酸プロピルを含有するヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸（80:20:2, v/v/v）中で30分間展開させる。該プレートを乾燥した後、それに80％アセトン中の0.001％プリムリンを噴霧し、脂質バンドをUV光下で同定する。TAGおよびリン脂質バンドをTLCプレートからガラスバイアル内に剥ぎ取る。該サンプルを、メタノール中のH2SO4の2ml中、90℃で2時間メタノール分解する。サンプルを冷却した後、2mlの0.9％NaClおよび0.50mlのヘキサンを加える。該サンプルをボルテックスし、遠心分離して相を分離した後、当技術分野でよく知られた方法を用いるガスクロマトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル（FAME）の分析のために上部へキサン層を取っておく。
【０１９８】
該36kDaモルティエレラ（Mortierella）候補は、昆虫細胞内で発現させた場合、空ベクターに感染した昆虫細胞の対照培養と比較してトリアシルグリセロール含量における3.15倍の増加を示す（図16）。比較のために、該アッセイを細胞リン脂質含量に関して正規化した。トリアシルグリセロール分析の結果は、このモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DNA配列が、トリアシルグリセロール産生をもたらすタンパク質をコードすることを示している。
【０１９９】
実施例16：植物の形質転換
表現型の変化を引き起こす配列の転写または転写・翻訳を達成するために対象DNA配列を植物宿主のゲノム内に挿入するための種々の方法が開発されている。
【０２００】
Radkeら（Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (1992) 11:499-505）に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換により、トランスジェニックアブラナ（Brassica）植物を得る。トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物は、Valverkensら（Proc. Natl. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540）またはBentら（(1994) Science 265:1856-1860）またはBechtoldら（(1993), C.R.Acad. Sci. Life Sciences 316:1194-1199）に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換により得ることができる。関連技術を用いて、他の植物種を同様に形質転換することができる。
【０２０１】
別法として、核形質転換植物を得るために、例えばKleinら（Bio/Technology 10:286-291）に記載の微粒子射撃法を用いることもできる。
【０２０２】
実施例1および7に記載のDAGATアッセイ方法を用いて、形質転換植物からの種子または他の植物物質をDAGAT活性に関して分析することができる。
【０２０３】
前記の結果は、脂肪酸アシルおよびジアシルグリセロール基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な部分精製されたDAGATタンパク質が入手可能であることを示している。DAGATタンパク質の入手方法およびそのアミノ酸配列を提供する。また、本発明で提供するPCRおよびライブラリースクリーニング方法を用いて、該アミノ酸配列からDAGAT核酸配列も得ることができる。そのような核酸配列を操作して、該配列の転写および／または宿主細胞内でのDAGATタンパク質の発現をもたらすことができ、それらのタンパク質は種々の用途に使用することができる。そのような用途には、宿主細胞内のトリアシルグリセロールのレベルおよび組成の修飾が含まれる。
【０２０４】
各個の刊行物または特許出願が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別的に記載されているのと同程度に、本明細書中に引用したすべての刊行物および特許出願を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０２０５】
前記の発明は、理解を明瞭にする目的で例示および具体例として相当詳しく説明されているが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくそれに或る種の変更および修飾を施しうることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  イエロー（Yellow）86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２Ａ】  ヘパリンセファロースCL6Bのカラム上のイエロー86-アガロースカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す
【図２Ｂ】  ヘパリンセファロースCL6Bカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
【図３Ａ】  75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロースカラム上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロースCL6Bのカラムの第2活性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図３Ｂ】  イエロー86-アガロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
【図４】  図4は、イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナ）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図５Ａ】  ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガロースカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図５Ｂ】  ヒドロキシアパタイトカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
【図６Ａ】DAGAT精製プロトコールによるカラム画分におけるモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性の分析の結果を示し、タンデム（縦列）イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す。
【図６Ｂ】  DAGAT精製プロトコールによるカラム画分におけるモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性の分析の結果を示し、該タンデムクロマトグラフィーからのピーク画分のSDS-PAGE分析の結果を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
【図７Ａ】  イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製した脂肪体画分の高塩および低塩調製物のSDS-PAGE分析を示す。
【図７Ｂ】  イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製した脂肪体画分の高塩および低塩調製物のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
【図８Ａ】  イエロー86-アガロースおよびヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）上でのクロマトグラフィー後のヘパリンカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図８Ｂ】  ヘパリンカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
【図９】  イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図１０Ａ】  ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガロースカラムからプールしたモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図１０Ｂ】  ヒドロキシアパタイトカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されている。
【図１１Ａ】  ヘパリンセファロースCL6Bのカラム上のヒドロキシアパタイトカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図１１Ｂ】  ヘパリンセファロースCL6Bカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
【図１２Ａ】  75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロースカラム上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロースCL6Bカラムの第1活性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図１２Ｂ】  イエロー86-アガロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
【図１３】  モルティエレラ・ラマンニアナにおいて同定した2つのDAGATタンパク質のタンパク質アライメントを示す。36kDa候補体については完全長タンパク質配列が示されており、36.5kDaタンパク質については部分配列が示されている。
【図１４】  モルティエレラ・ラマンニアナにおいて同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞から単離した膜上のDAGAT活性データを示す。
【図１５】  酵母およびシー・エレガンス由来のDAGATホモログのDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞から単離した膜上のDAGAT活性データを示す。
【図１６】  モルティエレラ・ラマンニアナにおいて同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞内の相対トリアシルグリセロール含量を示す。
【配列表】
0004514952.tif 000007
0004514952.tif 000008
0004514952.tif 000009
0004514952.tif 000010
0004514952.tif 000011
0004514952.tif 000012
0004514952.tif 000013
0004514952.tif 000014
0004514952.tif 000015
0004514952.tif 000016
0004514952.tif 000017
0004514952.tif 000018
0004514952.tif 000019
0004514952.tif 000020
0004514952.tif 000021
0004514952.tif 000022
0004514952.tif 000023
0004514952.tif 000024
0004514952.tif 000025
0004514952.tif 000026
0004514952.tif 000027
0004514952.tif 000028
0004514952.tif 000029
0004514952.tif 000030
0004514952.tif 000031
0004514952.tif 000032
0004514952.tif 000033
0004514952.tif 000034
【図１】
0004514952.tif 000035
【図２Ａ】
0004514952.tif 000036
【図２Ｂ】
0004514952.tif 000037
【図３Ａ】
0004514952.tif 000038
【図３Ｂ】
0004514952.tif 000039
【図４】
0004514952.tif 000040
【図５Ａ】
0004514952.tif 000041
【図５Ｂ】
0004514952.tif 000042
【図６Ａ】
0004514952.tif 000043
【図６Ｂ】
0004514952.tif 000044
【図７Ａ】
0004514952.tif 000045
【図７Ｂ】
0004514952.tif 000046
【図８Ａ】
0004514952.tif 000047
【図８Ｂ】
0004514952.tif 000048
【図９】
0004514952.tif 000049
【図１０Ａ】
0004514952.tif 000050
【図１０Ｂ】
0004514952.tif 000051
【図１１Ａ】
0004514952.tif 000052
【図１１Ｂ】
0004514952.tif 000053
【図１２Ａ】
0004514952.tif 000054
【図１２Ｂ】
0004514952.tif 000055
【図１３】
0004514952.tif 000056
【図１４】
0004514952.tif 000057
【図１５】
0004514952.tif 000058
【図１６】
0004514952.tif 000059