(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の結晶化に際し、粘土鉱物を用いて、その析出する結晶の形状・形態を変えるタンパク質の結晶形成制御方法であって、
上記粘土鉱物を、該粘土鉱物を分散させた溶液の形態で、溶液中に溶解したタンパク質と接触させることにより、タンパク質結晶の形成制御を行うこと、
上記粘土鉱物が、フィロケイ酸塩からなること、
上記フィロケイ酸塩が、カオリン（カオリナイト）、ハロイサイト、クリソタイル、タルク、スメクタイト、モンモリロナイト、バーミキュライト、ギョガン石、クロライト、パイロフィライト、アンチゴライト、エンデライト、サポナイトから選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、タンパク質の結晶形成制御方法。
【請求項２】
上記フィロケイ酸塩を、緩衝溶液中に溶解したタンパク質と接触させることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の結晶形成制御方法。
【請求項３】
上記緩衝溶液の溶媒蒸気をフィロケイ酸塩に浸透・拡散させることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質の結晶形成制御方法。
【請求項４】
上記緩衝溶液の溶媒が、水であることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質の結晶形成制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の結晶化方法に関するものであり、更に詳しくは、タンパク質の結晶化に際し、その速度を促進したり、あるいは抑制したり、及び／又はその析出する結晶の形状や形態に直接影響を与える、いわゆる結晶形成を支配・制御する能力を有する物質・材料を使用したタンパク質の結晶形成制御方法、及び該物質・材料を利用したタンパク質の精製や製造・生産技術に関するものである。本発明は、例えば、タンパク質の生化学品、医薬品製造の技術分野において、タンパク質結晶汚染の原因となる従来の沈殿剤を使う必要が無い上、従来法では、結晶生成が不可能であった低濃度領域並びにタンパク質種の結晶を得ることができると共に、その作用機作を知るために必須の、立体構造やイムノアッセイの決定を可能とする精製タンパク質結晶を効率良く製造することを可能とする新規タンパク質結晶化技術を提供するものであり、しかも、本発明で使用する結晶形成制御剤は、熱的にも化学的にも安定であり、かつ安価であるので、本発明は、タンパク質の製造・生産における中核技術の一つとなることが高く期待されるものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の立体構造とそれに伴って現れる機能の解析・解明は、例えば、病気の治療や創薬に直結するので、ポストゲノムの極めて大きな、かつ重要な課題となっている。タンパク質の立体構造の解明・決定は、通常、ＮＭＲ、ＩＲやＵＶなどのスペクトル解析やＸ線結晶構造解析によって行なわれるが、Ｘ線結晶構造解析が最も有力である。しかし、Ｘ線結晶構造解析では、Ｘ線回折を精度よく行なわせるために、抽出あるいは合成し、精製・単離したタンパク質を、適当な形状・形態へと結晶化させることが必要である。
【０００３】
タンパク質の入手可能な量は、通常、天然物からの抽出にしても、大腸菌などを用いる大量発現にしても、一般の化学合成のような量は到底得られず、ごく少量に過ぎない。したがって、タンパク質の精製・単離・結晶化は、通常の化学合成による物質のそれに比べ、遥かに困難と言っても過言ではない状況にある。このため、種々の結晶化方法が検討され、提案されてきている。しかし、突き詰めれば、いずれもタンパク質の溶解度を操作する、すなわち過飽和状態を作って結晶化させることを基本原理としている。この過飽和状態の作り方は、基本的には、高溶解度側から低溶解度側へ温度を移行させる方法、沈殿剤を加えて行きタンパク質を溶け難くさせる方法、及び溶媒のみを蒸発・拡散させる方法、の３種であるが、これらの方法は、とにかく、扱う量が少ないのが大きな問題であり、このために、３種の操作に細かな工夫が種々施され、多様な結晶化方法が提案されるに至っている。
【０００４】
それらの典型は、透析法、蒸気拡散法、バッチ法、自由界面拡散法、濃縮法、温度勾配法など（非特許文献１−３参照）であり、これらの結晶化操作を円滑に行なうための装置や溶液セット（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社やＥｍｅｒａｌｄ  ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  社製など）が市販されている（非特許文献３参照）。しかしながら、どんなタンパク質にでも適用可能な万能な方法は無く、試行錯誤的に、対象とするタンパク質に応じ、用いる方法を変えたり、幾つかの方法を組み合わせたりし、多大な時間と労力を浪費して、ようやく結晶化させているのが実情である。このため、当技術分野では、タンパク質の結晶化に効果的な物質・材料並びにそれを用いる結晶化法は、改良であれ、全くの新規であれ、常に切望されている状況にあり、特に、簡便で汎用性の高い結晶化方法には大きな需要がある。
【０００５】
【非特許文献１】「ＰＮＥモノグラフ  タンパク質のＸ線解析」、共立出版（株）、３０−３５（１９９８）
【非特許文献２】「これならわかるＸ線結晶解析」、（株）化学同人、６６−６９（２０００）
【非特許文献３】「ポストシークエンス  タンパク質実験法３  構造・機能解析の基礎」、東京化学同人、２−７（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、より簡便で、より効果的なタンパク質の結晶化方法を探索している過程で、粘土鉱物がタンパク質をよく吸着し、それゆえに、近年、タンパク質を吸着・除去する洗顔用化粧品に利用されていることや、無機酸化物結晶表面がしばしば有機分子の自己組織化を誘引する場として極めて効果的に働くことなどを基に、粘土鉱物をタンパク質の結晶化に用いることを着想し、鋭意研究を重ねた結果、粘土鉱物を始めとするケイ酸塩化合物が、タンパク質の結晶化に際し、その速度を促進したり、あるいは抑制したり、及び／又は晶出する結晶の形状や形態に直接影響を与える、いわゆる結晶形成を支配・制御する能力を有することを認め、特に、フィロケイ酸塩によって、手軽で、一般性、普遍性の高い、しかも微少量にも対応可能なタンパク質の結晶形成制御方法に係る発明を完成するに到った。本発明は、新規タンパク質結晶形成制御方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）タンパク質の結晶化に際し、粘土鉱物を用いて、その析出する結晶の形状・形態を変えるタンパク質の結晶形成制御方法であって、
上記粘土鉱物を、該粘土鉱物を分散させた溶液の形態で、溶液中に溶解したタンパク質と接触させることにより、タンパク質結晶の形成制御を行うこと、
上記粘土鉱物が、フィロケイ酸塩からなること、
上記フィロケイ酸塩が、カオリン（カオリナイト）、ハロイサイト、クリソタイル、タルク、スメクタイト、モンモリロナイト、バーミキュライト、ギョガン石、クロライト、パイロフィライト、アンチゴライト、エンデライト、サポナイトから選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、タンパク質の結晶形成制御方法。
（２）上記フィロケイ酸塩を、緩衝溶液中に溶解したタンパク質と接触させることを特徴とする、前記（１）に記載のタンパク質の結晶形成制御方法。
（３）上記緩衝溶液の溶媒蒸気をフィロケイ酸塩に浸透・拡散させることを特徴とする、前記（２）に記載のタンパク質の結晶形成制御方法。
（４）上記緩衝溶液の溶媒が、水であることを特徴とする、前記（２）に記載のタンパク質の結晶形成制御方法。
【０００８】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明のフィロケイ酸塩を用いるタンパク質の結晶形成制御方法は、既知、未知に係りなく、全てのタンパク質に対して、その結晶化に際し、使用され得るものである。本発明のタンパク質結晶形成制御方法は、原理的には、フィロケイ酸塩が、それに吸着したタンパク質の結晶核形成を誘引・支配し、タンパク質の結晶の成長と形状・形態の形成過程を支配・制御する過程からなるが、この過程は、次のような操作で達成される。すなわち、次のような操作でタンパク質の結晶形成が起こる。それは、まず、対象とするタンパク質が溶解した溶液をフィロケイ酸塩と混合、あるいはその上に滴下し、その後、一定時間放置する、という極めて簡便、かつ手軽な操作・手順からなるものである。この放置の間に、フィロケイ酸塩のシリケート層間に溶媒が徐々に浸透・拡散し、溶液中のタンパク質の濃度が高まる。したがって、このタンパク質の濃度上昇効果とフィロケイ酸塩表面の結晶核形成誘引・支配作用とが相乗的に作用して、タンパク質が結晶化することになる。
【０００９】
この操作で用いるタンパク質の溶解溶媒としては、タンパク質は、生体内では水に溶け、作用するのが本来の姿であるので、基本的には、水を用いることが最も多く、この使用が好ましい。更に言えば、タンパク質は、溶液のｐＨに敏感であるので、タンパク質の溶解溶液を緩衝液としておくのが望ましい。緩衝溶液には、特に規定は無く、タンパク質に悪影響を及ぼさないものであれば、ｐＨ調整機能のあるもの全てが利用可能であり、一例を挙げれば、少量の、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、イミダゾールなどの水溶液が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
上述のように、タンパク質溶解溶媒は、通常は水であるが、基本的には、タンパク質に悪影響を及ぼさないものであれば、いかなる溶媒、具体的には有機溶媒もその使用を排除するものではなく、それらの溶媒は単独あるいは水と混合して用いることも可能である。この種の有機溶媒としては、例えば、エタノール、アセトン、メタノール、ジオキサン、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、エチレングリコールなどを始めとする一価及び多価のアルコールやエーテル類、ケトン類が典型的なものとして例示されるが、これらに限定されるものではなく、変性などのタンパク質に悪影響を及ぼさないものであれば、あるいは悪作用を起こさない使い方が可能なものであれば、いかなるものも使用可能である。特に、適量であれば、具体的には、水溶媒に有機溶媒を加えることなどは、溶解度を操作し結晶化を促進することにもなるので、むしろ歓迎されることとなる。
【００１１】
前述の有機溶媒の添加と同様に、目的とするタンパク質の結晶化の際に、その溶解度を下げるために、従来、沈殿剤が用いられてきたが、本発明では、フィロケイ酸塩とこの種の沈殿剤とを併用することも可能である。例えば、従来と同様に、沈殿剤をタンパク質溶液に加え、更に、この溶液をフィロケイ酸塩と混合・接触させることにより、タンパク質結晶の生成や形状を支配・制御することができる。このような沈殿剤としては、典型的には、硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の４００、４０００、６０００及び８０００、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、対象とするタンパク質の立体構造や活性など、その本質に悪影響を及ぼさず、単にその溶解度のみを低下させるものであれば、無機塩、有機塩、界面活性剤など、いずれも沈殿剤として使用可能である。これらの使用量は、対象とするタンパク質の種類と溶液中のその溶解量に応じて適宜決められる。
【００１２】
更に言えば、フィロケイ酸塩と共に、有機溶媒（添加剤）と沈殿剤とを組み合わせて用いることも可能である。しかしながら、有機溶媒及び／又は沈殿剤の多用は、それらによるタンパク質への不本意な汚染の原因にもなるので、できればフィロケイ酸塩と併用しないほうが望ましいことは言を待たないし、好ましいことに、フィロケイ酸塩には、それらの沈殿剤等との併用を必ずしも必要としないと言う大きな利点がある。したがって、本発明のタンパク質の結晶形成制御方法は、沈殿剤を使用した場合のように、透析や脱塩などと言う煩わしい精製操作を必要としないタンパク質精製法を提供できる。
【００１３】
以上述べてきた本発明のタンパク質の結晶形成制御方法に用いる粘土鉱物には、大まかには、非晶質（アロフェンやイモゴライト）、結晶質鎖状構造（セピオライトやパリゴルスカイト）及び結晶質層状構造の三種があり、これらは、いずれも、単独あるいは混合体として本発明のタンパク質の結晶形成制御方法に利用することができる。
【００１４】
一般には、入手の容易さ、品質、価格、使いやすさ、結晶形成制御への効果などの総合的見地から、基本骨格鎖−Ｓｉ−Ｏ−を二次元的に広げ、層状構造を取る、いわゆるフィロケイ酸塩、より具体的には、例えば、カオリン（カオリナイト）、ハロイサイト、クリソタイル、タルク、スメクタイト、モンモリロナイト、バーミキュライト、ギョガン石、クロライト、パイロフィライト、アンチゴライト、エンデライトなどの１種又は２種以上を用いることが、より好ましい。しかしながら、これらの具体例に限定されるものではなく、骨格鎖−Ｓｉ−Ｏ−が二次元的に広がったシリケートの積層からなるものはいずれも望ましく、骨格鎖のケイ素の一部がアルミニウムなど他の金属に置換したものでも本発明での利用に何ら問題はなく、むしろ付加的効果の期待できる場合すらある。
【００１５】
本発明の結晶形成制御方法で用いる前記フィロケイ酸塩の層間には、シリケート層の負電荷を中和するために、ナトリウムやカリウム、マグネシウム、カルシウムなどがあるのが通常であり、これらの陽イオンは、層間隔の調節のみならず、タンパク質溶解溶媒の層間への選択的な浸透・拡散を、それら陽イオンへの溶媒分子の優先的な配位により助けることができる。かくして、フィロケイ酸塩は、シリケート層表面でタンパク質を吸着させ、その結晶化への核発生を調節し、結晶成長、すなわち結晶の形状や形態を支配・制御し、そして、シリケート層間の微小空間は、溶媒分子の収納庫となって、溶液中のタンパク質の濃度を調節するのでフィロケイ酸塩は、タンパク質の結晶化用に最適な機構を備えたものとなっている。この機構ゆえに、フィロケイ酸塩を用いる本発明の結晶形成制御方法は、高濃度のタンパク質溶液は言うに及ばず、低濃度の溶液からのタンパク質の結晶化にも顕著な効力を発揮すると言う特徴を備えている。
【００１６】
本発明のタンパク質結晶形成制御に使われるフィロケイ酸塩は、熱安定性、化学安定性に優れており、しかも量も豊富で安価であるので、本発明のタンパク質の結晶化方法は、タンパク質の立体構造や性質・機能の解明のための試料を与えるためのみならず、タンパク質の手軽な精製法として、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとって極めて有用であり、その効果は、計り知れないものがある。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、タンパク質の結晶化に際し、その速度を促進したり、あるいは抑制したり、及び／又は晶出する結晶の形状や形態に直接影響を与える、いわゆる結晶形成を支配・制御する能力を有する物質・材料を使用したタンパク質の結晶形成制御方法、及び該物質・材料を利用したタンパク質の精製や製造・生産技術に関するものである。本発明によって、１）種類を問わず広範なタンパク質に対して、それらの結晶を得るための万能的物質・材料、すなわちフィロケイ酸塩を選定できる、２）このフィロケイ酸塩に、対象とするタンパク質溶液を、その濃度を問わず、接触させることにより、それらの結晶を得ることができる、３）本結晶形成制御方法は、沈殿剤の併用を必須としないので、煩わしい透析や脱塩操作を必要としない、手軽な、種々のタンパク質の効率的な精製法としても有用である、４）本発明の方法は、タンパク質を構成するアミノ酸の鎖長・配列を問わず種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも結晶化率の高い効率的方法である、５）本結晶形成制御方法に用いるフィロケイ酸塩は、低コストである、６）本発明の結晶形成制御方法は、沈殿剤を用いる方法を始めとする従来法ではタンパク質の結晶化が困難であった低濃度の溶液からもタンパク質結晶を生成させることができる、７）例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと本発明のタンパク質結晶化法とを組み合わせることにより、タンパク質を精製し、生産する新規のタンパク質製造プロセスを提案・確立することができる、という格別の効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に、参考例、実施例及び比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例等によって何ら制約を受けるものではない。
【００１９】
参考例１
本参考例では、タンパク質の結晶化に際して、従来から盛んに使われている蒸気拡散法のシッテイングドロップ（非特許文献２参照）操作に、本結晶形成制御方法を適用することにより、タンパク質の結晶化を試みた。
【００２０】
２４ウェルプレートに、シリコナイズ処理を施したガラスロッド（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を置き、ウェル内に、リザーバーとして、０．２モル酢酸ナトリウムの緩衝液（ｐＨ４．７）に沈殿剤である塩化ナトリウムを加えその濃度が６％になるように調整した溶液１ｍｌを置いた。次いで、塩化ナトリウムを含まない０．２モル酢酸ナトリウム緩衝液を用い、卵白リゾチームの５０ｍｇ／ｍｌ溶液を調整し、この調整タンパク質溶液１０μｌと、前記のリザーバーと同じ組成の溶液に、層状ケイ酸塩の一種であるマイカを分散させた溶液１０μｌとを、ロッド上で混合した（マイカ濃度は１０％  ｗ／ｖ）後、プレートをプレートシールで密封し、２４℃に保ち、放置した。その結果、放置後、６時間で微結晶が現れ、１２時間で、従来法の１日後に得られる大きさの結晶となった。
【００２１】
比較例１
マイカのみを除き、実施例１と全く同様な実験を行なった。その結果、結晶の成長速度は、参考例１の約半分であった。
【００２２】
実施例１
層状ケイ酸塩を、スメクタイト及びタルクに変えた以外は、実施例１と全く同様にして実験を行なった。いずれの場合も、リゾチーム結晶化促進効果が認められた。
【００２３】
実施例２
クロライトを用いた以外は、全く実施例１と同じにして、結晶化を行なった。１日の放置では、結晶は現れず、２日目に、従来の沈殿剤を用いる（コントロール）方法と同じ程度の大きさと質の結晶が得られた。クロライトは、結晶生成に対し、遅延効果があることが分かる。したがって、良質の適度の大きさの結晶を得るのに好適とも言える。
【００２４】
比較例２
卵白リゾチーム初期濃度を、２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌとし、層状ケイ酸塩を用いなかったこと以外は、全く実施例１と同様（いわゆるコントロール）にして、結晶化を行なった。その結果、最も濃度の高い時に、二日にしてようやく結晶が認められたが、濃度の低い後二者では結晶生成が起きなかった。
【００２５】
実施例３
参考例１において、モンモリロナイト、サポナイト、タルク、カオリン及びクロライトを用い、タンパク質溶液と混合する際に、その分散溶液として、沈殿剤を含まない緩衝液を用いた以外は、参考例１と同様な操作で、リゾチームの結晶化を行なった。その結果を図１に示す。モンモリロナイト、サポナイト、タルク、及びカオリンでは、１日後に得られた結晶であり、クロライトでは三日後に得られたものである。図から分かるように、いずれの場合においても、リゾチーム結晶の形成・制御効果が認められた。
【００２６】
上述の実施例に示されるように、フィロケイ酸塩は、タンパク質の結晶形成を支配・制御する能力を有し、所望の大きさ・形状のタンパク質結晶が得られる。本発明の結晶形成制御方法は、既知並びに未知の種々のタンパク質に適用できる、一般性、普遍性の高い結晶形成制御方法として有用であり、その適用は、実施例に示されたタンパク質に限定されるものではなく、任意のタンパク質に適用し得るものである。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、タンパク質の結晶形成を支配・制御する能力を有する物質・材料を使用したタンパク質の結晶形成制御方法、及びそれを利用したタンパク質の精製や製造・生産技術に関するものである。本発明によって、タンパク質を構成するアミノ酸の鎖長・配列を問わず広範なタンパク質に対して、それらの結晶を得ることができる。すなわち、本発明によって、一般性、普遍性のある、しかも結晶化率の高い効率的方法が提供され、低コストで効率的な、すなわち経済的なタンパク質の結晶化・精製法が提供される。煩わしい透析や脱塩の操作を必要としない、手軽で作業性の良いタンパク質の結晶化・精製法を提供できる。従来法では、タンパク質結晶が得られなかった低濃度のタンパク質溶液からもタンパク質を結晶化させることができる。例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと本発明のタンパク質結晶化法とを組み合わせることが可能となり、タンパク質を精製し生産する新規のタンパク質製造プロセスが提案・確立される。したがって、本発明は、特に、生化学品製造、医薬品製造分野において、新規タンパク質の精製、生産技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】各種フィロケイ酸塩によるリゾチームの結晶を示す。
【図１】
0004543150.tif 000002