(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)tacプロモーター、
(b)ＤＮＡのgroＥＳ 遺伝子の終止コドンからgroＥＬ遺伝子の開始コドンまでの全ての塩基配列
(c)groＥＬ遺伝子配列の開始コドン、
(d)制限酵素部位および
(e)異種遺伝子配列
を含む発現ベクターであって、上記（a）、（b）、（c）および（e）の配列は５'から３'にこの順にて互いに作用可能に結合しており、groＥＬ遺伝子の最初の７個のコドンを超えて含むことはない、当該発現ベクター。
【請求項２】
groＥＳ ＤＮＡをさらに含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
groＥＬ遺伝子の最初の７個のコドンを含み、ＲsaＩ部位が修飾されてＲsaＩ制限部位とは異なる制限部位を含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項４】
上記制限酵素部位が上記groＥＬ遺伝子の開始コドンの直前に導入されている、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項５】
複製起点および選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項６】
上記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性を付与するタンパク質である、請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】
上記選択可能なマーカーがネオマイシン抵抗性を付与するタンパク質である、請求項５記載の発現ベクター。
【請求項８】
lacリプレッサーをコードする配列をさらに含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項９】
(a)tacプロモーター、
(b)ＤＮＡのgroＥＳ 遺伝子の終止コドンからgroＥＬ遺伝子の開始コドンまでの全ての塩基配列
(c)groＥＬ遺伝子配列の開始コドン、
(d)制限酵素部位および
(e)異種遺伝子配列
を含む発現ベクターであって、上記（a）、（b）、（c）および（e）の配列は５'から３'にこの順にて互いに作用可能に結合しており、groＥＬ遺伝子の最初の７個のコドンを超えて含むことはない、当該発現ベクターを含有する、原核生物宿主細胞。
【請求項１０】
上記発現ベクターがgroＥＳ ＤＮＡをさらに含む、請求項９記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１１】
Ｅ. coliである、請求項９記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１２】
上記発現ベクターが複製起点および選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１１記載のＥ. coli宿主細胞。
【請求項１３】
上記選択可能なマーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼである、請求項１２記載のＥ. coli宿主細胞。
【請求項１４】
Ｅ. coli株ＡＴＣＣ９８５６３。
【請求項１５】
原核生物宿主細胞中に異種タンパク質を発現する方法であって、
(a)tacプロモーター、
(b)ＤＮＡのgroＥＳ 遺伝子の終止コドンからgroＥＬ遺伝子の開始コドンまでの全ての塩基配列
(c)groＥＬ遺伝子配列の開始コドン、
(d)制限酵素部位および
(e)異種遺伝子配列
を含む発現ベクターであって、上記（a）、（b）、（c）および（e）の配列は５'から３'にこの順にて互いに作用可能に結合しており、groＥＬ遺伝子の最初の７個のコドンを超えて含むことはない、当該発現ベクターを含有する、原核生物宿主細胞を培養することを特徴とする、方法。
【請求項１６】
上記発現ベクターがgroＥＳ ＤＮＡをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記原核生物宿主細胞がＥ. coliである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
上記発現ベクターが複製起点および選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
上記選択可能なマーカーが硫酸ネオマイシンに対する抗生物質抵抗性を付与するタンパク質である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記異種タンパク質がグルタリルセファロスポリンアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼである、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
上記発現ベクターが、lacリプレッサーをコードする配列をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
２５℃〜３７℃の温度および７.０〜７.２のpＨにて行われる、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明はエシェリキアコリ(Escherichia coli)などの細菌中の異種遺伝子の発現のための高発現ベクターに関する。
【０００２】
発明の背景技術
多量の組換タンパク質を発現する能力は多種類の産業における広い応用および経済的必要性から望ましい。特に安価な製品、利益の少ない製品、工業用酵素(例えば、洗剤用プロテアーゼおよびリパーゼ)およびインビボ診断剤のためのタンパク質(コレステロールオキシダーゼ、ペニシリン−Ｇアシラーゼ)に関しては真実である。異種遺伝子の発現に利用できる発現系は数種ある。しかし、異種タタンパク質の発現のための最も価値があり、用途が広くかつ最良の系はエシェリキアコリである。高濃度の異種タンパク質発現に必要な必須の要素について多くの報告がある。最も必要な要素の１つは異種遺伝子の発現に用いられるプロモーターである。用いられるプロモーターは強力でなければならない。異種遺伝子の発現のために最もよく用いられる強力なプロモーターは、ＰL、tac、trp、trc由来のプロモーターおよびスチュディエらに記載のＴ７プロモーターである。用いられるプロモーターは一般に調節可能である。発現される目的タンパク質が宿主にとって有毒である場合は、この特徴は必須である。一般にプロモーターが強ければ、強いほど、ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡの蓄積を誘導するＤＮＡからより多く転写される。強力な調節可能なプロモーター以外に、他の要素も異種遺伝子の発現に関与する。翻訳効率は異種遺伝子の発現の最大化に関係する。翻訳効率はｍＲＮＡ５'−末端配列およびｍＲＮＡの５'末端ヘアピン構造によって影響され得る。一般に、ＡＵＧ開始コドンに対して適当な位置にあるシャインダルガノ(ＳＤ)を含む機能的リポソーム結合部位が効率的翻訳にとって必須である。ＳＤ配列とＡＵＧコドン間の距離の変化がｍＲＮＡ翻訳に影響を与えることは公知である。ＳＤ配列またはＡＵＧ開始コドンがｍＲＮＡの二本鎖領域内に隔離されているときについても検討されており、リポソームへのこれらの配列の接近を妨害するので、翻訳の効率は良くない。異種遺伝子の効率的発現に影響を与えると報告されている他のいくつかの因子は、メッセンジャーＲＮＡの安定性、タンパク質の分解されやすさおよび宿主の遺伝学的背景の影響なである。プラスミドに基礎をおく発現系の全体的効率に影響を与える要素に関する大量の情報が存在するが、異種遺伝子の発現に関与しているかも知れないが未だ検討されていない他の要素が存在する。
【０００３】
発明の要約
本発明は、(a)tacプロモーター、
(b)ＤＮＡのgroＥＳＬの遺伝子間(intergenic)領域
(c) groＥＬ遺伝子配列の開始コドン
(d)制限酵素部位
を含む発現ベクターに関する。
【０００４】
より好ましい具体例において、本発明の発現ベクターはさらに、(e) groＥＳＤＮＡを含む。
【０００５】
別の観点では、本発明は、(a)tacプロモーター、
(b)ＤＮＡのgroＥＳＬの遺伝子間領域
(c) groＥＬ遺伝子配列の開始コドン
(d)制限酵素部位、および、所望により
(e) groＥＳ ＤＮＡ
を含む発現ベクターを含む原核生物宿主細胞に関する。
【０００６】
別の観点では、本発明はまた、タンパク質発現に適した条件下、本発明の宿主細胞を培養することを含む異種タンパク質の製造方法に関する。
【０００７】
発明の詳細な説明
エシェリキアコリＧroＥＳおよびＧroＥＬは、シャペロンタンパク質であり、これは凝集や誤ったおりたたみ構造を導き得る未成熟の内部分子内相互作用を阻害することによって、種々のポリペプチドの正確な折りたたみを仲介し、低重合タンパク質集合を容易にする。ＧroＥＳおよびＧroＥＬタンパク質は、同じｍＲＮＡから転写される。本発明の発現ベクターはＧroＥＳＬオペロンに基づいている。
【０００８】
本発明において有用な発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形をしており、環状２本鎖ＤＮＡループと称され、これはベクターの形態では、染色体に結合していない。しかし、本発明は、等しい機能を果たし当分野ではそれによって公知となる他の形態の発現ベクターを含む。
【０００９】
本発明のベクターはエシェリキアコリ中に多量の異種遺伝子を発現し得るベクターである。他の特徴に加えて、本発明のベクターは好ましくは複製開始点および選べるマーカーをコードする核酸配列を持っている。マーカーが形質転換宿主細胞内の表現型の選択が可能ならば、用いられる具体的な選択可能なマーカーは厳密でなくてもよい。より好ましい選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性のものである。抗生物質抵抗性マーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ゲンタマイシン、ナリジクス酸、リファムピシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどである。
【００１０】
本発明のベクターでは、tacプロモーター(すなわち、上流)の次にgroＥＳ遺伝子の完全な遺伝子配列が続き、ついで、groＥＳ遺伝子の終止コドンと、groＥＬ遺伝子の開始コドン (ここで「groＥＳＬ遺伝子間領域」が終わる)の間の遺伝子間領域が続き、制限酵素クローニング部位が続く。制限酵素クローニング部位は、groＥＬ遺伝子の開始コドンの直後またはgroＥＬ遺伝子のコード領域中のＲsaＩ部位の直後に導入することができる。前者の発現ベクター中にクローニングされた異種遺伝子は天然のタンパク質として発現されるが、後者の発現ベクター中にクローニングされた異種遺伝子は、groＥＬ遺伝子の最初の７個のアミノ酸との融合タンパク質として発現される。クローニング制限部位はコドンＡＴＧ、翻訳の開始に必要なコドンを供給する。
【００１１】
本発明のベクターは２種類に分類することができ、groＥＳ遺伝子を含むものとgroＥＳ遺伝子含まないものである。第１の種類のベクターは強力な調節可能なプロモーター、tac、ついで、遺伝子groＥＳをコードするコドンを含む。本発明のこのベクターにおいて、クローニング部位はgroＥＬをコードする遺伝子のＲsaＩ部位に導入されているか、またはクローニング部位がgroＥＬ遺伝子の開始コドンの直前に導入されている。上述のように、前者の場合、遺伝子生成物はアミノ末端にgroＥＬ遺伝子の約７個のアミノ酸を含む融合タンパク質であり、後者の場合は、遺伝子生成物はアミノ末端にアミノ酸メチオニンを含む天然のタンパク質である。両方の型の構築物において、導入された制限酵素部位の後のすべてのgroＥＬは好ましくは除去される。第２の種類のベクターにおいて、このベクターはtacプロモーター、ついでgroＥＳとgroＥＬ遺伝子間の種々の長さの遺伝子間配列および異種遺伝子のクローニングのための開始コドンを供給する制限酵素部位が続く。groＥＳ遺伝子は除去されてしまっている。
【００１２】
groＥＳ遺伝子配列の削除はいくつかの場合に有利にはたらく。多量のgroＥＳタンパク質の共発現は、下流のプロセシング、例えば、固体支持体への酵素の固定化などを妨害するかもしれない。しかし、他の例では、groＥＳ遺伝子(例えば、pＢＭＳ２０００)の遺伝子配列を含む発現ベクターを用いる場合は有利である。なぜなら、転写を安定化し、groＥＳの存在が発現された異種タンパク質を安定化し得るからである。
【００１３】
本発明のベクターはまた、所望により、lacプロモーターからの転写を制御するlacリプレッサーをコードする配列を含む；これはクローニングされた異種遺伝子の発現を可能にし、イソプロピル−β−D−チオガラクピラノシド(ＩＰＴＧ)またはラクトースによって制御される。
【００１４】
上記発現ベクターの変化において、ここに記載のベクターは所望により、構成的に(constitutively)異種遺伝子を発現する。これはプロモーター領域からオペレーター配列を除去することによって完成される。このようなベクターの例はプラスミドpＢＭＳ２０００Ｈである。構成的発現ベクターを用いる利点は異種遺伝子生成物を発現する系を導入するインデューサーを加える必要性を取り除くことである。このことによって、遺伝子生成物の最適発現を生じさせるためのインデューサーを付加するための最適ＩＰＴＧ濃度および最適時などを調べるために必要な発酵パラメーターの１つを省いて経費を削減し、発酵プロセスを単純化することができる。いくつかの場合には、構成的発現ベクター内の異種遺伝子のクローニングが、遺伝子生成物が細胞成長の非常に初期から蓄積されているようにより多くの異種遺伝子生成物を産生させることが可能である。
【００１５】
プロモーターおよびリプレッサーなどの本発明のベクターの制御ＤＮＡ配列は発現されるべき所望の異種遺伝子配列のすべてまたは一部をコードしているＤＮＡ配列に作用可能に結合している。この明細書で用いられる場合、用語「作用可能に結合している」とは、制御ＤＮＡ配列が、発現されるべき所望のタンパク質のすべてまたは一部をコードしているＤＮＡ配列の複製および／または発現を支配し得ることをいう。
【００１６】
本発明のベクターは種々の異種遺伝子を発現し得る。本発明のベクターを用いて発現され得る異種遺伝子の例としては、トリグノプシス・バリアビリス(Trignopsis variabilis)からのD−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子；Ｇ２８.５sＦv−ＰＥ４０およびＢＲ１１０sＦv−ＰＥ４０などの免疫毒をコードする遺伝子；ペニシリンＧアミダーゼをコードする遺伝子、グルタリル・セファロスポリン・アミダーゼ(ＧＣＡ)をコードする遺伝子などである。実施例の部に記載されているように、Ｔ−７ＲＮＡポリメラーゼベースのpＥＴベクターなどの当分野で公知の他のベクターと比較して、本発明のベクターは、高力価の発現酵素を産生する。
【００１７】
本発明の発現ベクターは当分野で公知の他のＤＮＡ配列も含むことができ、例えば、発現生成物に安定性を与える安定リーダー配列、発現生成物を分泌型にする分泌リーダー配列、プラスミドに有糸分裂安定性を与える安定要素、および制限エンドヌクレアーゼによる切断のための追加の部位などを供給する他の配列である。用いられる実際の発現ベクターの性質は採用される宿主細胞と適合するものでなければならない。
【００１８】
tacプロモーターのための配列は、例えば、Weissら、Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, p. 6019-6023, 1984に記載されている。
【００１９】
所望のコードおよび制御配列を含む適切な発現ベクターは、ここに記載または当分野で公知の標準的な組換ＤＮＡ技術を用いて構築することができ、これらの多くはT. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982に記載されている。
【００２０】
本発明はさらに、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。適当な宿主細胞は原核細胞であり、好ましくは生物学的に純粋なものである。適当な原核宿主細胞には、例えば、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilus)およびサルモネラ・チフィムルム(Salmonella typhimulum)を挙げることができる。本発明の最も好ましい宿主細胞は、Ｅ.coli ＤＨ５α mcrであり、これはＡＴＣＣ９８５６３と指定されている。Ｅ.coliＡＴＣＣ９８５６３はブダペスト条約の規定のもとに、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２、Ｕ.Ｓ.Ａ.に１９９７年１０月２８日寄託されており、Ｅ.coliＡＴＣＣ９８５６３はプラスミドpＢＭＳ２０００を含む。
【００２１】
発現ベクターは当分野で公知の種々の方法によって宿主細胞に導入することができる。例えば、発現ベクターを持った宿主細胞の形質移入はリン酸カルシウム沈澱法によって行うことができる。しかし、発現ベクターを宿主細胞に導入する他の方法、例えば、電気穿孔法、微粒子銃融合、リポソーム融合、核注入、ウイルスまたはファージ注入またはプロトプラスト融合も採用することができる。
【００２２】
ひとたび発現ベクターが適当な宿主細胞内に導入されたとき、宿主細胞を所望のタンパク質またはペプチドの発現を可能にする条件下で培養することができる。
【００２３】
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞は下記の６種の一般的な方法の１つまたはそれ以上で同定することができる：(a)ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成；(b)マーカー遺伝子機能の存在また不存在；(c)宿主細胞内のhＴＯＰＩmＲＮＡ転写物の産生により測定される転写濃度の測定；(d)遺伝子生成物の免疫学的検出；(e)相補性分析；および(f)酵素測定法であるが、同定方法としては酵素測定法が好ましい。
【００２４】
最初の方法としては、所望の異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列の存在は、ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成によって検出することができる。
【００２５】
第２の方法としては、組換発現ベクター宿主系はある種のマーカー遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質抵抗性、ウラシル原栄養株性など)の存在または不存在に基づいて同定または選択され得る。マーカー遺伝子は異種タンパク質産生を調節するために用いられるのと同一かまたは異なるプロモーターの調節のもとで異種遺伝子をコードするＤＮＡ配列と同一のプラスミド内に配置することができる。導入または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を示す。
【００２６】
第３の方法としては、異種遺伝子mＲＮＡ転写物の産生はハイブリッド形成法によって測定することができる。例えば、ＲＮＡ配列に相補的なプローブを用いてノーザーンブロット法またはヌクレアーゼ保護法によって分離または分析され得る。別法として、宿主細胞の総核酸は抽出され、検出されるかまたはそのようなプローブとハイブリダイズ形成する。
【００２７】
第４の方法として、異種遺伝子の発現は、例えば、ウエスターンブロット法によって免疫学的に測定され得る。
【００２８】
第５の方法としては、異種遺伝子の発現は、相補性分析によって測定し得る。例えば、当該酵素か欠乏していることが知られている細胞における酵素活性の発現が発育制限条件下で細胞の改良された発育によって推断することができる。
【００２９】
第６の方法としては、異種ＤＮＡの発現は公知の方法を用いて酵素活性の測定によつて判定することができる。例えば、Y. Pommier, J. Biol. Chem., 265, p.9418-9422, 1990に記載の方法を採用することができる。
【００３０】
本発明の発現ベクター、ブラスミドまたはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列を当分野で公知の方法によって決定することができる。例えば、Sanger et al., Proc. Natl. Sci. USA, 74, p. 5463-5467, 1977に記載のジデオキシ鎖終止法、またはProc. Natl. Sci. USA, 74, p. 560-564, 1977に記載のマキサム−ギルバート法を用いることができる。
【００３１】
すべての発現ベクターおよびＤＮＡ制御配列が本発明のＤＮＡ配列を十分に等しく発現するように機能するものでないことが理解されなければならない。すべての宿主細胞が同じ発現系で十分等しく機能するものでもない。しかし、当業者は不当な実験を行うことなく、また本発明の範囲からはずれることなく、ここに示された指針を用いて発現ベクター、ＤＮＡ制御配列および宿主細胞から選択することができる。
【００３２】
本発明はまた、本発明のタンパク質の発現に適した条件下本発明の宿主細胞を培養する異種タンパク質ま産生方法に関する。
【００３３】
当業者は宿主細胞の増殖を適当な培地を用いて行うことができる。宿主細胞の増殖のための適当な培地は細胞の発育に必要な栄養素を与えるものである。増殖用の典型的な培地は炭素源、窒素源および痕跡量の必須要素を含む。誘導物質も添加することができる。用語「誘導物質」は、この明細書で用いる場合は所望のタンパク質またはペプチドの生成を増大させる化合物である。炭素源は、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、ラフィノースなどの糖を挙げることができる；窒素源としては、酵母抽出物、カザミノ酸、Ｎ−Ｚアミン、バクト−チプトーンなどをあげることができる。好ましくは培地は２.４％酵母抽出物、１.２％バクトトリプトン、０.４％グリセリン、０.７２Ｍリン酸水素二カリウムおよび０.１７Ｍリン酸二水素カリウムを含む。培地のpＨは好ましくは約６.８〜７.５、より好ましくは７.５に調整する。
【００３４】
本発明の方法は所望のペプチドの発現に適切な条件下で行う。培地のpＨは、宿主細胞の増殖中は、好ましくは７.０から７.５、最も好ましくは７.０から７.２の間に保つ。本発明の方法の適当な温度範囲は約２５℃〜約３７℃である。圧力は本発明の実施に当たっては厳密とはされていないが、好都合であるから、典型的にはほぼ常圧が採用される。本発明の方法は好気的条件下で行うのが好ましい。
【００３５】
下記の実施例は本発明を具体的に説明するものであって、これを制限するものと解釈されるべきではない。
【００３６】
実施例
菌株およびプラスミド
プラスミドおよびエシェリキアコリ株をＴable  １に挙げた。
【００３７】
【表１】
0004446600.tif 000002
【００３８】
緩衝液および培地
ローリア・ブロス：１％ディフコ・バクト・トリプトン、０.５％ディフコ・バクト・酵母抽出物、０.５％塩化ナトリウム
ローリア寒天：１.５％ディフコ・バクト・寒天を補足したローリア・ブロス
Ｔブロス：１.２％ディフコ・バクト・トリプトン、２.４％ディフコ・バクト酵母抽出物、０.７２Ｍリン酸水素二カリウムおよび０.１７Ｍリン酸二水素カリウム、０.４％グリセリン
【００３９】
プロモーターなしのgroＥＳおよびgroＥＬのＰＣＲ増幅
正(forward)および逆(reverse)ＰＣＲプライマーをＡＢＩ ３９１ ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成した。正のプライマー：
【数１】
0004446600.tif 000003
はgroＥＳ遺伝子の開始コドンにＮcoＩ制限酵素部位を導入するために設計された。逆のプライマー：
【数２】
0004446600.tif 000004
は天然のＳmaＩ部位を含むgroＥＬ翻訳終止コドンからの約２３個の塩基のために設計された。エシェリキアコリＸＧ４４からのＤＮＡを標準のＰＣＲ緩衝液を含む５０μl反応で増幅させた。この反応は、０.２５mlマイクロテューブを用いてＧeneＡmpRＰＣＲＳystem２４００ＤＮＡ  Ｔhermal  Ｃycler(Ｐerkin−Ｅlmer)ＤＮＡ  Ｔhermal  Ｃycleで行われた。ＰＣＲ条件は９５℃４分間の最初の変性段階ついで、９５℃４５秒の３２サイクルの変性、５８℃１分間のプライマーアニーリングおよび７２℃３分間のプライマー伸長からなる。サイクリング工程の最終伸長において、７２℃２０分間の最終伸長が反応物が４℃にて保存される前に行われる。得られたＰＣＲ生成物は制限酵素ＮcoＩおよびＳmaＩで消化され、０.７％アガロースゲル上で分離された。所望の２.０Ｋb  ＤＮＡフラグメントはゲルから切り出され、電気泳動分離され(electroelute)、エタノールで沈澱させた。精製ＤＮＡを次のクローニングに用いた。
【００４０】
ペニシリンＧアミダーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅
ペニシリンＧアミダーゼ遺伝子は、ＢspＨＩ制限酵素部位を導入する特定の正のプライマー：
【数３】
0004446600.tif 000005
および、ＢamＨＩ制限酵素部位を導入する逆のプライマー：
【数４】
0004446600.tif 000006
を用いてＰＣＲによって、Ｅ.コリＸＧ４４ゲノムＤＮＡから増幅された。ＰＣＲ条件は、９５℃２分間の最初の変性段階ついで、９４℃１分間の３３サイクルの変性、５５℃１分間のプライマーアニーリングおよび７２℃２０分間のプライマー伸長からなる。サイクリング工程の最終伸長において、７２℃５分間の最終伸長が反応物が４℃にて保存される前に行われた。
【００４１】
異種遺伝子の発現のための細菌培養の導入
組換遺伝子をもつ細胞は硫酸ネオマイシン３０μg／mlの存在下Ｔ−ブロス中で一夜増殖させた。翌日、培養物を適当な抗生物質を補足したＴ−ブロスで１：１０に希釈した。細胞を３０℃にて回転インキュベーター中で４時間および／または６００nmにおける光学密度２.０まで増殖させ、その時点で適当な濃度のイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を培養物に添加した。培養物はＩＰＴＧの存在下３０℃にてさらに４時間インキュベートを継続した。
【００４２】
グルタリルセファロスポリンアミダーゼ(ＧＣＡ)の測定
グルタリルセファロスポリンアミダーゼ(ＧＣＡ)の検出はグルタリル−７−アミノアジピルセファロスポラン酸(グルタリル−７ＡＤＣＡ)から７−アミノアジピルセファロスポラン酸(７−ＡＤＣＡ)への変換に基づいている。グルタリルセファロスポリンアミダーゼを発現する細胞は遠心分離によって回収した。細胞のペレットを水に再懸濁させ、超音波処理によって粉砕した。細胞の残骸は遠心分離によって除去し、得られた澄明な上清を試験に用いた。容量２５０μlの適当な濃度に希釈した上清液を、同量のあらかじめ暖めた０.３Ｍトリス緩衝液pＨ８.０中グルタリル−７ＡＤＣＡ２０mg／mlに添加した。反応混合物を回転インキュベーター中３７℃、３３０rpmにて３０分間インキュベートした。反応を２５ｍＭ  Ｈ2ＳＯ4４mlを添加して止めた。反応混合物を遠心分離によって澄明にし、その試料の５μlを５ミクロンフェノスフィアＣ１８カラムに注入し、生成物を９５％６０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび５％アセトニトリルで溶出させた。
【００４３】
ペニシリンＧアミダーゼ活性の測定
ペニシリンＧアミダーゼを発現する細胞を遠心分離によって回収し、細胞のペレットは水に再懸濁させた。細胞を超音波処理によって粉砕し、細胞溶解物をペニシリンＧアミダーゼ活性について試験した。適当に希釈した上清液１mlを、同量のあらかじめ暖めた２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液pＨ７.５中で調製された４.５％ペニシリンＧカリウム１mlに添加した。反応混合物を回転インキュベーター中３７℃にて１５分間インキュベートした。反応を９９.０％ＣＨ3ＣＮおよび１.０％ＨＯＡＣの１mlを添加、混合して反応を止め、遠心分離によって澄明にした。その反応混合物の１mlをp−ジメチルアミノベンズアルデヒド(ＰＤＡＢ)試液(メタノール中１％ＰＤＡＢ  １部および酢酸ナトリウム緩衝液６部(氷酢酸１０００ml、脱塩水４７５mlおよび１Ｎ水酸化ナトリウム２５ml))０.３３mlと混合した。４分間室温にてインキュベートした後、４１５nmにおける吸光度を測定し、それからモル変換を計算した。
【００４４】
pＢＭＳ１０００の構築
プラスミドpＢＭ１１Ｍ５をＰvuＩおよびＣlaＩで消化した。３'−オーバーハングおよび５'−オーバーハング塩基をそれぞれＴ４ポリメラーゼおよびクレノウフラグメントで処理して除去した。４.４Ｋbフラグメントを電気泳動分離させ、結合させた。得られたプラスミドを、pＢＭ１１Ｍ５(Ｃla／Ｐvu)と命名し、部分的Ｈind III消化を行った。直線化したフラグメントを電気泳動分離させ、５'−オーバーハングをクレノウフラグメントで充填し、結合させた。正しい位置で排出されたＨind IIIを有するプラスミドを選択するために、制限酵素分析を行った。得られたプラスミドをpＢＭ１１Ｍ５(Ｃla／Ｐvu／Ｈ３)と命名し、Ｈind IIIおよびＢamＨＩで消化した。３.３５Ｋbフラグメントを溶出させ、pＤＲ５４０をＨind IIIおよびＢamＨＩで消化して得られた９０bp  tacプロモーターに結合した。得られたプラスミドをpＢＭ１１tacと命名し、ＥcoＲＩおよびＨind IIIで消化し、２.９Ｋbフラグメントを得、これをＥcoＲＩおよびＨind IIIでpＵＣ１９laciQを消化して得られた１.３Ｋb laciQフラグメントに結合した。異種遺伝子のクローニングを容易にするために、プラスミドpＢＭ１１taclacのＢamＨＩ部位へのアダプター：
【数５】
0004446600.tif 000007
を挿入することによって、tacプロモーターのＢamＨＩの直後に、ＮcoＩクローニング部位を導入した。得られた４.２ＫbプラスミドをpＢＭＳ１０００と命名した。
【００４５】
pＢＭＳ１０００ＧroＥＳＬの構築
pＢＭＳ１０００ＧroＥＳＬを制限酵素、ＮcoＩおよびＳmaＩで消化した。得られた４.２Ｋbフラグメントを、ＰＣＲ増幅を経由し、上記と同様にＮcoＩおよびＳmaＩで消化して得られたＧroＥＬＳ遺伝子に結合した。得られた６.２ＫbプラスミドをpＢＭＳ１０００ＧroＥＳＬと命名した。
【００４６】
pＢＭＳ１９９９ＧＣＡの構築
プラスミドpＢＭ１１taclacλＮ２０３ＧＣＡは、２０３グルタリルセファアミダーゼ遺伝子(２０３ＧＣＡ)のアミノ末端に融合させたファージλＮタンパク質の最初の３３個のアミノ酸をコードするＤＮＡを含有するpＢＭＳ１０００から誘導した融合発現プラスミドである。λＮタンパク質融合部分は、ＮcoＩ(５'末端)およびＢspＨＩ(３'末端)で消化させて除去した。プラスミドpＢＭ１１taclacλＮ２０３ＧＣＡをＢspＨＩで消化し、５'−オーバーハングをクレノウフラグメントで充填し、その後ＮcoＩで消化した。６.１Ｋbフラグメントを電気泳動分離させ、groＥＳ遺伝子の完全な遺伝子配列およびgroＥＬ遺伝子の最初の７個のアミノ酸を含む４０３塩基対フラグメントに結合させた。すなわち、ＧＣＡタンパク質はgroＥＬ遺伝子の融合生成物である。このフラグメントは、制限酵素ＮcoＩおよびＲsaＩでプラスミドpＢＭ１１taclacＧroＥＳＬを消化し、ついで電気泳動分離させた。得られた６.５ＫbプラスミドをpＢＭＳ１９９９ＧＣＡと命名した。
【００４７】
pＢＭＳ２０００ＧＣＡおよびpＥＴ９dＧＣＡの構築
プラスミドpＢＭＳ１９９９をＭfeＩおよびＢspＨＩで消化した。６.４３Ｋbフラグメントを電気泳動分離によってゲルから精製し、下記の合成アダプター：
【数６】
0004446600.tif 000008
に結合させた。
【００４８】
得られたプラスミドをpＢＭＳ２０００ＧＣＡと命名した。このプラスミドは無傷のgroＥＳ遺伝子、groＥＳおよびgroＥＬの遺伝子間領域、ついで２０３グルタリルセファアミダーゼ遺伝子コードする配列を持っている。
【００４９】
プラスミドpＥＴ９d(Ｎovogenから購入)を制限酵素、ＮcoＩおよびＢamＨＩで消化した。線状化した４.３ＫbプラスミドＤＮＡを電気泳動分離によってアガロースゲルから精製し、ＢspＨＩおよびＢamＨＩでＧＣＡ２０３を消化して得られた２Ｋbグルタリルセファロスポリンアミダーゼ遺伝子に結合させた。得られたプラスミドをpＥＴ９dＧＣＡと命名した。
【００５０】
プラスミドpＢＭＳ２０００の構築
プラスミドpＢＭＳ２０００はプラスミドpＢＭＳ２０００ＧＣＡから誘導した。プラスミドpＢＭＳ２０００ＧＣＡを制限酵素、ＭfeＩおよびＢamＨＩで消化し、ＧＣＡ遺伝子を除いた。得られた４.５３Ｋbフラグメントを下記のオリゴマー：
【数７】
0004446600.tif 000009
に結合させた。
【００５１】
得られたプラスミドをpＢＭＳ２０００と命名した。このプラスミドは無傷のgroＥＳ遺伝子、groＥＳおよびgroＥＬの遺伝子間領域、および遺伝子クローニングのためのＢspＨＩおよびＢamＨＩ制限酵素部位を含有している。
【００５２】
pＢＭＳ２００１の構築
プラスミドpＢＭＳ２００１はプラスミドpＢＭＳ２０００から誘導された。プラスミドpＢＭＳ２０００を制限酵素、ＭfeＩおよびＢamＨＩで消化した。得られた４.５３Ｋbフラグメントを下記のオリゴマー：
【数８】
0004446600.tif 000010
に結合させた。
【００５３】
得られたプラスミドをpＢＭＳ２００１と命名した。このプラスミドは、無傷のgroＥＳ遺伝子、groＥＳおよびＧroＥＬの遺伝子間領域、その後に遺伝子クローニングのための制限酵素部位ＮcoＩおよびＢamＨＩを含有している。
【００５４】
pＢＭＳ２００２の構築
プラスミドpＢＭＳ２００２はプラスミドpＢＭＳ２０００から誘導された。プラスミドpＢＭＳ２０００を制限酵素、ＭfeＩおよびＢamＨＩで消化した。得られた４.５３Ｋbフラグメントを下記のオリゴマー：
【数９】
0004446600.tif 000011
に結合させた。
【００５５】
得られた４.６ＫbプラスミドをpＢＭＳ２００２と命名した。このプラスミドは、無傷のgroＥＳ遺伝子、groＥＳおよびgroＥＬの遺伝子間領域、その後に遺伝子クローニングのための制限酵素部位ＮdeＩおよびＢamＨＩを含有している。
【００５６】
pＢＭＳ２０００.１０３の構築
プラスミドpＢＭＳ２０００.１０３はプラスミドpＢＭＳ２０００から誘導された。このプラスミドはgroＥＳをコードする配列を欠いているが、groＥＳ／groＥＬ遺伝子間の遺伝子間領域は保持している。プラスミドpＢＭＳ２０００を制限酵素、Ｈind IIIおよびＢspＨＩで消化した。この工程はtacプロモーター、lacオペレーター、groＥＳ遺伝子およびgroＥＳ／groＥＬの遺伝子間領域を除去する。得られた４.１２Ｋbフラグメントを、tacプロモーター、lacオペレーター、groＥＳ遺伝子およびgroＥＳ／groＥＬの遺伝子間領域を含む化学的に合成したオリゴマーに結合させた。
【００５７】
【数１０】
0004446600.tif 000012
得られた４.２ＫbプラスミドをpＢＭＳ２０００.１０３と命名した。
【００５８】
プラスミドpＢＭＳ２０００.７５の構築
プラスミドpＢＭＳ２０００.７５は、pＢＭＳ２０００.１０３に似ている。これは、プラスミドpＢＭＳ２０００.１０３におけるような完全な遺伝子間配列ではなく、部分的groＥＳ／groＥＬの遺伝子間領域のみを含んでいる。プラスミドpＢＭＳ２０００を、制限酵素、Ｈind IIIおよびＢspＨＩで消化した。この工程はtacプロモーター、groＥＳ遺伝子およびgroＥＳ／groＥＬの遺伝子間領域を除去する。得られた４.１Ｋbフラグメントを、tacプロモーター、lacオペレーターおよび部分的groＥＳ／groＥＬ遺伝子間領域を含む化学的に合成したオリゴマーに結合させた。
【００５９】
【数１１】
0004446600.tif 000013
得られた４.２ＫbプラスミドをpＢＭＳ２０００.７５と命名した。
【００６０】
pＢＭＳ２０００Ｈの構築
pＢＭＳ１０００を制限酵素、Ｈind IIIおよびＮcoＩで消化した。４.１Ｋbフラグメントを分離し、電気泳動分離し、下記のオリゴマー：。
【数１２】
0004446600.tif 000014
に結合させた
【００６１】
得られたpＢＭＳ２０００Ｈと命名された４.２Ｋbプラスミドは、tacプロモーター、その後にgroＥＳおよびgroＥＬ遺伝子間空領域を含む。これは構造的に発現されるこのベクター中にクローニングされる異種遺伝子に関与するオペレーター配列を含まない。
【００６２】
pＢＭＳ１０００ＰＧＡ、pＥＴ９dおよびpＢＭＳ２０００ＰＧＡの構築
ＰＧＡ遺伝子の増幅から得られたＰＣＲ生成物を、制限酵素、ＢspＨＩおよびＢamＨＩで消化し、pＢＭＳ１０００のＮcoＩおよびＢamＨＩ部位の間、pＥＴ９d(Ｎovogenから購入)のＮcoＩおよびＢamＨＩ部位の間、pＢＭＳ２０００のＢspＨＩおよびＢamＨＩの部位の間にクローニングし、それぞれ、pＢＭＳ１０００ＰＧＡ、pＥＴ９dおよびpＢＭＳ２０００ＰＧＡを得た。
【００６３】
pＢＭＳ２０００ＨＧＣＡの構築
プラスミドpＢＭＳ２０００Ｈを制限酵素、ＮcoＩおよびＢamＨＩで消化した。電気泳動分離によって、４.２Ｋbを分離し、ＧＣＡ２０３遺伝子を含むプラスミドをＢspＨＩおよびＢamＨＩで消化して得られた２Ｋbグルタリルセファロスポリンアミダーゼ遺伝子に結合させた。
【００６４】
pＢＭＳ２０００.１０３ＧＣＡおよびpＢＭＳ２０００.７５ＧＣＡの構築
プラスミドpＢＭＳ２０００.１０３およびpＢＭＳ２０００.７５を制限酵素、ＢspＨＩおよびＢamＨＩで消化した。４.２Ｋbフラグメントを電気泳動分離させ、ＧＣＡ２０３遺伝子を含むプラスミドをＢspＨＩおよびＢamＨＩで消化して得られた２Ｋbグルタリルセファロスポリンアミダーゼ遺伝子に結合させた。得られた６.２Ｋbプラスミドを、pＢＭＳ２０００.１０３ＧＣＡおよびpＢＭＳ２０００.７５ＧＣＡと命名した。
【００６５】
【表２】
0004446600.tif 000015
【００６６】
ＧＣＡ２０３を持っているＥ. coliを一夜培養し、硫酸ネオマイシン３０μg／mlを補足したＴ−ブロスで１：１０で希釈した。培養物を３０℃にて３００rpmで４時間またはＯＤ550＝２.０まで増殖させた。その時点でＩＰＴＧ６０μＭを培養物に添加し、ＧＣＡの発現を誘発させた。
【００６７】
【表３】
0004446600.tif 000016
【００６８】
【表４】
0004446600.tif 000017
【００６９】
【表５】
0004446600.tif 000018
【００７０】
ペニシリンＧアミダーゼを持っているＥ. coliを一夜培養し、硫酸ネオマイシン３０μg／mlを補足したＴ−ブロスで１：１０で希釈した。培養物を３０℃にて３００rpmで４時間またはＯＤ550＝２.０まで増殖させた。その時点でＩＰＴＧ６０μＭを培養物に添加し、ペニシリンＧアミダーゼの発現を誘発させた
【００７１】
【表６】
0004446600.tif 000019
【００７２】
ＧＣＡ２０３を持っているＥ. coliを一夜培養し、硫酸ネオマイシン３０μg／mlを補足したＴ−ブロスで１：１０で希釈した。培養物を３０℃にて３００rpmで４時間またはＯＤ550＝２.０まで増殖させた。その時点でＩＰＴＧ６０μＭを培養物に添加し、ＧＣＡの発現を誘発させた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび図１Ｂ】  pＢＭＳ１０００の構築。
【図２】  pＢＭＳ１０００ＧroＥＳＬの構築。
【図３】  pＢＭＳ２０００Ｈの構築。
【図４】  pＢＭＳ２０００、pＢＭＳ２００１、pＢＭＳ２００２の構築。
【図５】  pＢＭＳ２０００.１０３およびpＢＭＳ２０００.７５の構築。
【図６】  pＢＭＳ１９９９ＧＣＡおよびpＢＭＳ２０００ＧＣＡの構築。
【図７Ａおよび図７Ｂ】  pＢＭＳ２０００.１０３ＧＣＡおよびpＢＭＳ２０００.７５ＧＣＡおよびpＢＭＳ２０００Ｈ ＧＣＡの構築。
【図８Ａおよび図８Ｂ】  pＢＭＳ１０００ＰＧＡ、pＥＴ９dＰＧＡおよびpＢＭＳ２０００ＰＧＡの構築。
【図１Ａ】
0004446600.tif 000020
【図１Ｂ】
0004446600.tif 000021
【図２】
0004446600.tif 000022
【図３】
0004446600.tif 000023
【図４】
0004446600.tif 000024
【図５】
0004446600.tif 000025
【図６】
0004446600.tif 000026
【図７Ａ】
0004446600.tif 000027
【図７Ｂ】
0004446600.tif 000028
【図８Ａ】
0004446600.tif 000029
【図８Ｂ】
0004446600.tif 000030