(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルトース及び／又はガラクトース低資化性であり、原料利用率が良い有機酸高生産性新規酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｍ２０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８０）。
【請求項２】
有機酸がリンゴ酸である請求項１に記載の新規酵母。
【請求項３】
マルトース低資化性を指標とする有機酸高生産性新規酵母の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の糖に対して低資化性であり、原料利用率が良い有機酸高生産性新規酵母及びその取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
清酒酵母を馴養あるいは変異処理することにより、親株よりリンゴ酸を高生産する株を取得した例としては、以下の報告がある。親株の１．７〜２．１倍程度のリンゴ酸を高生産する酵母としては、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるテノイルトリフルオロアセトン又はオキシカルボキシン耐性酵母（特開平６−１２１６７０号公報）、アコニット酸ヒドラターゼの阻害剤感受性、基質耐性又は基質感受性酵母（特開平１１−４６７５７号公報）が知られている。親株の約３倍程度リンゴ酸を多く生産する酵母については、コハク酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるジメチルサクシネートの感受性酵母（特開平３−１７５９７５号公報）、爽快な酸味を生成する泡なし清酒酵母（特開平５−３１７０３６号公報）、メタ亜硫酸カリウムに対する馴養により取得した酵母（特開平７−２０３９５１号公報）がある。また、親株の約５〜６倍程度のリンゴ酸を生産するシクロヘキシミド耐性一倍体酵母（日本醸造協会誌、第８８巻、第８号、第６４５〜６４７頁、１９９３年）及び親株の約４〜６倍程度のリンゴ酸を生産するシクロヘキシミド耐性酵母（日本醸造協会誌、第９０巻、第１０号、第７５１〜７５８頁、１９９５年）が知られている。しかしながら、前者は一倍体酵母であり、また後者は変異、交雑を繰り返しているため増殖性が低く、いずれも日本酒度の切れ、つまり原料利用率が悪いものであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術にかんがみ、原料利用率の良い、有機酸を高生産する実用性の高い新規酵母、及びその取得方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はマルトース及び／又はガラクトース低資化性であり、原料利用率の良い有機酸高生産酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｍ２０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８０）に関し、第２の発明は、マルトース低資化性を指標とする有機酸高生産酵母の取得方法に関する。
【０００５】
本発明者らは、糖の資化性が変った酵母を選択することにより、有機酸生合成のバランスが変化し、有機酸生成量の変化した株が選択できるのではないかと考えた。特に、酵母のマルトース及び／又はガラクトース資化性に注目し、変異処理した酵母から、ＴＴＣ（トリフェニルテトラゾリウムクロリド）染色により、マルトース及び／又はガラクトース資化性の低下したコロニーを選択し、それらの有機酸生産性を調べた結果、マルトース及び／又はガラクトース資化性が低下したコロニーから有機酸生産性の高い株が高頻度に分離できることを見出した。
その中には、特にリンゴ酸を高生産する変異株が含まれていたが、この変異株は、従来知られているリンゴ酸高生産株と同等以上のリンゴ酸生産性を示し、しかも増殖性は親株と比べて遜色がなく、原料利用率も良かった。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
【０００７】
本発明における酵母のマルトース及び／又はガラクトース低資化性とは、酵母をマルトース含有培地又はガラクトース含有培地、例えば、ＳＭ液体培地（０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース、２ｗ／ｖ％マルトース）又はＳＧａｌ液体培地（０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース、２ｗ／ｖ％ガラクトース）にて３日間培養したとき、親株に比べて増殖しにくい、又は生育が悪いことを言う。
【０００８】
本発明のマルトース及び／又はガラクトース低資化性酵母の取得方法に特に限定はないが、一般的には、次のように行う。まず、前培養して集菌した親株を適当な変異剤で変異処理する。次いで、変異処理した酵母をマルトース及び／又はガラクトースを含む培地で数時間培養し、これにナイスタチンを添加して更に培養し、マルトース及び／又はガラクトース資化性を有する酵母を死滅させる（以下、ナイスタチン濃縮という）。ナイスタチン濃縮を繰り返して生き残った酵母をグルコースを含む寒天培地に接種して培養後、マルトース及び／又はガラクトースとＴＴＣを含む寒天培地を重層して、ピンク色を呈するコロニー、すなわち、マルトース及び／又はガラクトース低資化性のコロニーを選択する。これらのコロニーの有機酸生産性の評価方法は任意であるが、例えば、各コロニーを麹汁培地で培養した後、上澄液を有機酸分析装置等により、有機酸生産性を評価することができる。
【０００９】
本発明におけるマルトース及び／又はガラクトース低資化性酵母の取得に使用する親株としては、特に限定はないが、サッカロミセス・セレビシエに属する酵母（清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母又はパン酵母等）が挙げられる。また、親株としては、変異処理株の他に野性株、馴養株、交雑株、細胞融合株及びプラスミド等による形質転換株をも含む。変異処理方法としては、酵母に公知の変異誘導方法、例えば紫外線、放射線を照射させる方法、又はＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチメタンスルホネート（以下、ＥＭＳと称す）等の薬剤を適宜用いることにより行えばよく、有効な変異処理としてはＥＭＳ処理が好ましい。
【００１０】
本発明における原料利用率が良いとは、一般的な培養条件においては、残存するグルコース濃度が対照（例えば、Ｋ−７０１株やＮｏ．２８株）に比べて低いことをいい、また、小仕込試験においては、残存グルコース濃度及び日本酒度が対照に比べて、それぞれ低い及び高いことをいう。
【００１１】
本発明における有機酸高生産性酵母とは、後述する実施例１に記載の仕込条件において、リンゴ酸の濃度及びコハク酸の濃度の総和が２５００ｐｐｍ以上、より好ましくは２８００ｐｐｍ以上で、かつリンゴ酸の濃度が１５００ｐｐｍ以上、より好ましくは２１１０ｐｐｍ以上である酵母のことをいう。
【００１２】
本発明にて得られる酵母は、マルトース及び／又はガラクトース低資化性で、有機酸、特にリンゴ酸を高生産する新規酵母であり、グルコースを炭素源とする培地での生育が親株に比べて遜色がないので、清酒、焼酎、ワイン、ビール等の酒類、又はパン等の食品を製造すれば、爽快な口当りで、香気に優れ、酸味が向上した、原料利用率の良い製品を製造することができる。これらの酒類、又は食品の原料は特に限定するものではなく、例えば、精白及び／又は未精白の粳米、糯米、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、ヒエ、アワ、コウリャン、ソバ、トウモロコシ、モロコシ、マイロ等の穀類が挙げられるが、一般的な原料を適宜用いることができる。また、本発明の新規酵母は１種類単独又は２種類以上併用してもよく、該新規酵母にＫ−７０１株等の公知酵母を組合せて使用してもよい。更に、該新規酵母又は該公知酵母を用いて製造した酒類・食品を混合して新規の酒類・食品も製造できる。
【００１３】
本発明により、酸度が高く、有機酸、特に、リンゴ酸並びに高級アルコールを高生産し、しかも親株に比べて遜色のない増殖性を示す、原料利用率の良い、従って実用性の高い酵母が提供される。また、本発明により有機酸高生産性酵母の効率的な取得方法が提供される。
【００１４】
本発明の代表的菌株であるＭ２０株は、Saccharomyces cerevisiae Ｍ２０と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８０として寄託されている。
【００１５】
本発明の代表的菌株であるＭ２０株は、Ｋ−７０１株の変異株であり、それらの菌学的性質を以下に示す。
（菌学的性質）
１．形態学的性質
ＹＰＤ培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）で３０℃、２日間培養した後、顕微鏡で観察した。
ａ）形：卵円形
ｂ）大きさ：長さ４．７〜７．９μｍ、幅３．８〜５．５μｍ
２．増殖の形態：出芽
３．生化学的観察
ａ）糖の発酵性
０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース（ディフコ社製）、下記記載の糖（２ｗ／ｖ％）をダーラム管入り試験管に分注して、当該菌株を接種し、３０℃で５日間培養して、その炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース    （＋）                  ガラクトース  （±）
スクロース    （＋）                  マルトース    （±）
ラクトース    （−）                  メリビオース  （−）
ｂ）糖の資化性
０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース（ディフコ社製）、下記記載の糖（２ｗ／ｖ％）を用いて、オキザノグラフ法により、３０℃で１４日間の生育を観察した。
グルコース  （＋）                  ガラクトース  （±）
スクロース  （＋）                  マルトース    （±）
ラクトース  （−）
ｃ）硝酸塩の同化性：（−）
硝酸塩は硝酸カリウムとしてウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地（ディフコ社製）を用いて、オキザノグラフ法により生育を観察した。
ｄ）ＴＴＣ染色性：ピンク色
ｅ）β−アラニン培地、３５℃、３日間培養での生育：（−）
４．高泡の形成
清酒の小仕込みを行ったところ、高泡の形成は観察されなかった。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母であることを示すものである。また、β−アラニン培地、３５℃での生育が陰性、及び清酒の小仕込試験において、高泡の形成も認められないことから、該菌株はＫ−７０１株の変異株であることを示すものである。
【００１６】
５．薬剤に対する感受性
ジメチルサクシネート（１．５ｖ／ｖ％）を含むＹＭ培地（０．３ｗ／ｖ％酵母エキス、０．３ｗ／ｖ％麦芽エキス、０．５ｗ／ｖ％ペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）を用いて、３０℃で７日間培養した。親株（Ｋ−７０１株）と同様に生育してきた株を＋で表した。ジメチルサクシネートに対する感受性の結果を表１に示す。親株であるＫ−７０１株、その変異株であるＭ２０株及び醸造協会から市販されている多酸酵母のＮｏ．２８は生育し、感受性を示さなかったが、醸造協会から市販されている多酸酵母のＮｏ．７７は、生育せず、感受性を示した。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
６．薬剤に対する耐性
シクロヘキシミド（０．５μｇ／ｍｌ）含有ＹＭ培地、テノイルトリフルオロアセトン（０．１ｍｇ／ｍｌ）含有ＹＮＢＣ培地、５０ｗ／ｖ％オキシカルボキシンを含有する農薬プラントバックス〔５０ｗ／ｖ％オキシカルボキシンが３．２ｍｇ／ｍｌ：日本曹達（株）製〕含有ＹＮＢＣ培地（０．６７ｗ／ｖ％ディフコ社イーストニトロゲンベース、２ｗ／ｖ％クエン酸、２ｗ／ｖ％寒天、ｐＨ６．０）、メタ亜硫酸カリウム（０．２ｍｇ／ｍｌ）含有ＳＤ培地（０．６７ｗ／ｖ％ディフコ社イーストニトロゲンベース、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天）を用いて３０℃で７日間培養した。生育してこなかった株を−で示した。
薬剤含有培地での生育の結果を表２に示す。Ｍ２０株はいずれの薬剤に対しても生育せず、耐性を示さなかった。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
８．増殖性
１０ｍｌのＹＰＭ培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、２ｗ／ｖ％マルトース）にＭ２０株を１０7個接種し、３０℃にて培養を行い、経時的に培養液のＯＤ６６０を測定した。対照として、Ｋ−７０１株と多酸酵母のＮｏ．２８を用いた。その結果を図１に示す。マルトースを炭素源に用いた場合、Ｍ２０株は対照株（Ｋ−７０１株、Ｎｏ．２８）と比較し、増殖性は低かった。図１において、縦軸はＯＤ６６０の値、横軸は時間（ｈｒ．）を示す。また白丸印はＮｏ．２８、白三角印はＫ−７０１、白四角印はＭ２０を示す。
なお、一般培地であるＹＰＤ培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）を用いて、上記の条件にてＭ２０株及び親株であるＫ−７０１株増殖性を検討した結果、Ｍ２０株は親株であるＫ−７０１株と同程度の増殖性を示した。
【００２１】
９．多酸性酵母の比較
上記の結果より、マルトース及びガラクトースの資化性、シクロヘキシミド（以下、ＣＨＹと称す）耐性及びジメチルサクシネート（以下、ＤＭＳと称す）感受性の比較データを表３に示す。参考株として、特願平１１−２９０３８７号明細書にて取得した多酸性酵母（リンゴ酸及びコハク酸を高生産）である２ＯＧ−Ｒ３９株（工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７０として寄託済み）のデータも記載した。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１  マルトース低資化性有機酸高生産株の取得
Ｋ−７０１株をＹＰＤ液体培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、２ｗ／ｖ％グルコース）５ｍｌで３０℃にて一夜振とう培養後、遠心分離で集菌し、滅菌水で洗浄した。洗浄菌体を４．３５ｍｌの０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０ｗ／ｖ％グルコース溶液を０．５ｍｌ添加してかくはんした後、エチルメタンスルホネートを０．１５ｍｌ添加して、３０℃にて１時間穏やかに振とうした。振とう後、そのうちの１ｍｌを４９ｍｌの６ｗ／ｖ％チオ硫酸ナトリウム溶液に加えて、室温で１０〜１５分放置後、遠心分離で集菌し、５ｍｌのＹＰＤ液体培地に懸濁し、３０℃、６時間静置培養した。次に以下のようにナイスタチン濃縮を実施した。集菌、滅菌水で洗浄後、０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース含有滅菌水１０ｍｌに懸濁し３０℃で一夜静置した。集菌後、ＳＭ液体培地（０．６７ｗ／ｖ％イーストニトロゲンベース、２ｗ／ｖ％マルトース）１０ｍｌに懸濁、３０℃、４時間振とう培養した後、５μｇ／ｍｌになるようにナイスタチンを添加し、３０℃、１時間振とうしマルトースを資化する株を死滅させた。この操作を３回繰り返した後、３０枚のＳＤ平板培地に、１枚当りの生菌数が約１０００個になるように植菌した。ＳＤ平板培地で適当な大きさにコロニーが生育した時、ＴＴＣ（０．０５ｗ／ｖ％ＴＴＣ、０．５ｗ／ｖ％マルトース、１．５ｗ／ｖ％寒天）寒天培地を重層し、ピンク色を呈するコロニーを６６株選択し、以下に示す麹汁培養試験を実施した。すなわち、各株を５ｍｌのＹＰＤ（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、５ｗ／ｖ％グルコース）液体培地に懸濁し、３０℃、一晩、振とう培養した。次に各培養液３ｍｌを集菌し、１ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁した後、３０ｍｌの麹汁培地（Ｂｒｉｘ  １０．０）に植菌し、１５℃、１３日間発酵させた。次に、発酵させた培養液を遠心（３０００ｒｐｍ，５分間）処理後、上澄を０．４５μｍのフィルターにてろ過し、島津高速液体クロマトグラフ有機酸分析システム〔島津（株）製〕にて有機酸分析を行った。その結果、これら選択株すべてが親株であるＫ−７０１株よりも有機酸を高生産する株であった。これらのうち顕著に酸度が高い１４株を表４に示す仕込条件にて小仕込試験を実施した。表４に示す仕込配合において、掛米は７７％精白のα化米を使用した。麹は、精米歩合７５％の白米を使用して製造した。酵母は、５．０ｍｌ中に１０9個含むものを用いた。発酵温度は１５℃一定で仕込後１５日目で上槽した。
【００２５】
【表４】
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【００２６】
Ｍ２０株及び親株のＫ−７０１株を用いた上槽液の分析結果を表５に示す。
【表５】
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【００２７】
表５に示すように、Ｍ２０株は、親株のＫ−７０１株に比べて、酸度が２倍と高く、爽快な酸味を呈するリンゴ酸が約６．７倍高生産であり、高級アルコールであるイソブタノール及びイソアミルアルコールが親株と比較して各々約２．６倍、１．４倍であった。また、残存グルコース濃度は、親株の約５８％であり、原料利用率が良くなっていた。これを反映して日本酒度も親株に比べて高くなっていた。
なお、醸造協会より販売されているリンゴ酸高生産酵母のＮｏ．２８及びＮｏ．７７は、Ｋ−７０１株と比較してリンゴ酸をそれぞれ約６．８倍及び約４．６倍生産しているが、親株と比較して増殖が悪く、使用するのに大量の酵母を必要としており、日本酒度の切れも良くない（日本醸造協会誌、第９０巻、第１０号、ｐ７５１−７５８、１９９５年）。本発明で得られたＭ２０株は、親株であるＫ−７０１株と比較してリンゴ酸を約６．７倍生産しており、しかも増殖性が親株と同程度であり、日本酒度の切れ及び原料利用率も良く、実用性に優れていることが示された。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、有機酸、特にリンゴ酸並びに高級アルコールを高生産し、親株と遜色のない増殖性を示す、原料利用率の良い新規酵母を提供することができる。これらの酵母は実用性が高く、従来の酒類、食品に比べ酸味が強い酒類、食品を製造できる。これらの特性を生かして、貴醸酒への応用や、割り水しても味が薄くならず幅のある爽やかな酸味を有する低アルコール酒類等の製造への応用も可能となる。また、本発明により、有機酸高生産性酵母の効率的な取得方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＹＰＭ培地（１ｗ／ｖ％酵母エキス、２ｗ／ｖ％ポリペプトン、２ｗ／ｖ％マルトース）での各酵母の増殖性を示す図である。
【図１】
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