(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１】
0004460153.tif 000041
〔前記式中、Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、ハロゲン（ここで、ハロゲンは臭素又は塩素に相当する）に相当し、
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素又は（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１｛ここで、Ｒ１０Ｒ１１は、次式
【化２】
0004460153.tif 000042
［前記式中、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素、ＣｎＨ２ｎ＋１又はＣｎＨ２ｎ−１、又はＯＲ７（ここで、Ｒ７は水素、ＣｎＨ２ｎ＋１又はＣｎＨ２ｎ−１に相当する）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８（ここで、Ｒ８は直鎖のもしくは分枝鎖の、置換されていてもよいアルキルもしくはアリール基に相当する）であり、ここでｎは１〜１２の整数に相当する］で表される基を経て結合している｝であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ９）−又は−Ｎ（Ｒ９’）−（ここで、Ｒ９及びＲ９’は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素又は前記意味を有するＣｎＨ２ｎ＋１もしくは（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１である）であり、ここで基Ｒ２、Ｒ３及びＲ４並びに原子Ｘ、Ｙ及びＺは一緒になってペントピラノシル−もしくはペントフラノシル−プリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン又はベンゾトリアゾールとして式（Ｉ）又は（ＩＩ）のリンカーヌクレオシドの構造によりそれらに指定された意味を有し、そして
Ｓｃ１及びＳｃ２は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素であるか又はアシル、トリチルもしくはアリルオキシカルボニル基から選択される保護基、又はホスホエステル（ＩＩＩ）、ホスホエステル（Ｖ）、チオホスフェート（Ｖ）、ホスホネートもしくはホスホロアミダイトである〕
又は次式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
【化３】
0004460153.tif 000043
〔前記式中、Ｒ１’は、水素、ヒドロキシル又はハロゲン（ここで、ハロゲンは、臭素又は塩素に相当する）に相当し、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ４’は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素又は（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０’Ｒ１１’（ここで、Ｒ１０’、Ｒ１１’は、互いに独立にＲ１０又はＲ１１の前記の意味を有する）であり、そして
Ｘ’は、各々の場合において＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ９’）−又は−Ｎ（Ｒ９”）−（ここで、Ｒ９’及びＲ９”は、互いに独立にＲ９及びＲ９’の前記の意味を有する）であり、ここで、基Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ４’並びに原子Ｘは一緒になってペントピラノシル−もしくはペントフラノシルピリジン、−ピリミジン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−ウラシルとして式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）のリンカーヌクレオシドの構造によりそれに指定された意味を有し、そして
Ｓｃ１’及びＳｃ２’は、Ｓｃ１及びＳｃ２の前記の意味を有する〕
で表されるリンカーヌクレオシドであって、
式（Ｉ）及び（ＩＩ）の基Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち少なくとも１つ、並びに式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の基Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’のうち少なくとも１つが、式（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１のフタルイミドアルキル基又はアリルオキシ基である、前記リンカーヌクレオシド。
【請求項２】
ペントピラノシルヌクレオシドが、リボ−、アラビノ−、リキソ−及び／又はキシロピラノシルヌクレオシドであることを特徴とする、請求項１記載のリンカ−ヌクレオシド。
【請求項３】
ペントピラノシル部分が、ＤもしくはＬ配置であることを特徴とする、請求項１又は２記載のリンカーヌクレオシド。
【請求項４】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２’、Ｒ３’及び／又はＲ４’が、２−フタルイミドエチル基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のリンカーヌクレオシド。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）（式中、Ｒ４’は、（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０’Ｒ１１’であり、そしてＲ１０’Ｒ１１’は、式（Ｖ）の基を経て請求項１で指定した意味に結合している）に係るリンカーの調製方法であって、以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）［ここで、Ｒ４’は、（ＣｎＨ２ｎ）ＯＳｃ３又は（ＣｎＨ２ｎ）Ｈａｌ（式中、ｎは前記の意味を有し、Ｓｃ３は、保護基であり、そしてＨａｌは塩素又は臭素である）に相当する］の化合物をアジドと反応させ、
（ｂ）（ａ）からの反応生成物を還元し、
（ｃ）（ｂ）からの反応生成物を適当なフタルイミドと反応させ、
（ｄ）（ｃ）からの反応生成物を適当な保護ペントースと反応させ、次いで
（ｅ）もしも適当ならば、保護基を除去する、
を特徴とする、前記リンカーの調製方法。
【請求項６】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）［式中、Ｘ及びＹは、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において＝Ｃ（Ｒ１６）（ここで、Ｒ１６は、水素又はＣｎＨ２ｎである）であり、そしてＺは＝Ｃ（Ｒ１６）（ここで、Ｒ１６は、請求項１で指定された意味を有する（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１に相当する）である］に係るリンカーの調製方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）対応するインドリンをペントースと反応させてヌクレオシドトリオールを得、
（ｂ）（ａ）からの生成物のペントース部分のヒドロキシル基を、アシル基で保護し、
（ｃ）（ｂ）からの生成物を酸化し、次いで
（ｄ）（ｃ）からの生成物のペントース部分のヒドロキシル保護基を除去する、
を特徴とする、前記リンカーの調製方法。
【請求項７】
４’−保護ペントピラノシルヌクレオシドを、更なる工程においてホスファイト化するか又は固相に結合させる、請求項５記載の方法。
【請求項８】
４’−保護ペントピラノシルヌクレオシドを、更なる工程においてホスファイト化するか又は固相に結合させる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
核酸の調製方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）第一の工程において、請求項１〜４のいずれか１項記載の保護されたヌクレオシド又は保護されたリンカーを、固相に結合させ、次いで
（ｂ）第二の工程において、工程（ａ）に従って固相に結合した３’−，４’−保護ヌクレオシドを、ホスファイト化３’−，４’−保護ヌクレオシドもしくはリンカーヌクレオシドにより伸長させ、そして酸化し、次いで
（ｃ）少なくとも１種の言及したリンカーヌクレオシドを含有する所望の核酸が存在するまで、工程（ｂ）を、同一の又は異なるヌクレオシド又はリンカーヌクレオシドを用いて繰り返す、
を特徴とする、前記核酸の調製方法。
【請求項１０】
ペントピラノシルヌクレオシドに加えて、工程（ａ）及び／又は（ｂ）において更にペントフラノシルヌクレオシドを導入する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
保護基及び形成した核酸を固相から除去する、更なる工程（ｄ）を特徴とする、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
除去が、塩の存在下ヒドラジン分解により行われる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
更なる工程において、次式：
【化４】
0004460153.tif 000044
（前記式中、Ｓｃ４及びＳｃ７は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合においてＦｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選択された保護基であり、Ｓｃ５及びＳｃ６は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合においてアリルオキシ及び／又はジイソプロピルアミノ基であり、そしてｎは請求項１で指定されたとおりである）
で表されるアリルオキシリンカーを導入する、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
次式：
【化５】
0004460153.tif 000045
（前記式中、Ｓｃ４及びＳｃ７は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合においてＦｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選択された保護基であり、Ｓｃ５及びＳｃ６は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合においてアリルオキシ及び／又はジイソプロピルアミノ基であり、そしてｎは請求項１で指定されたとおりである）
で表されるアリルオキシリンカー。
【請求項１５】
更なる工程において、次式：
【化６】
0004460153.tif 000046
で表されるリシンリンカーを導入する、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
次式：
【化７】
0004460153.tif 000047
で表されるリシンリンカー。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の少なくとも１種のリンカーヌクレオシド及び、請求項１４及び１６に記載の少なくとも１種のアリルオキシリンカー及び／又はリシンリンカーを含んで成る核酸。
【請求項１８】
対合及び／又は試験系における請求項１〜４のいずれか１項記載のリンカーヌクレオシド及び／又は請求項１７記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、リンカーヌクレオシド、その調製及びオリゴヌクレオチド、特にｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドに対する生体分子の共有結合のための使用に関する。
【０００２】
ピラノシル核酸類（ｐ−ＮＡｓ）は、一般に天然のＲＮＡに対する異性体の構造であり、そしてそこにおいてペントース単位は、ピラノース形で存在しそしてホスホジエステル基により位置Ｃ−２’とＣ−４’の間で繰り返し結合される（図１）。“核酸塩基”は、ここでは標準的な核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、しかしまた対イソグアニン／イソシトシン及び２，６−ジアミノプリン／キサンチンそして本発明の意味において他のプリン及びピリミジンも意味するものと理解される。ｐ−ＮＡｓ、即ちリボースから誘導されるｐ−ＲＮＡｓは、最初にEschenmoser ら(Pitsch, S. ら Helv. Chim. Acta 1993, 76, 2161; Pitsch, S. ら. Helv. Chim Acta 1995, 78, 1621; Angew. Chem. 1996, 108, 1619-1623)により記載された。それらは、排他的に所謂ワトソン・クリックの対の、即ち、プリン−ピリミジン−及びプリン−プリン−対の、逆平行の、可逆的に“メルトする”、準線状及び安定な二重らせんを形成する。キラリティーの相対するセンスのホモキラルｐ−ＲＮＡ鎖は、同様に制御可能に対形成しそして形成した二重らせんにおいて厳格には非らせんである。超分子単位の合成に価値のあるこの特異性は、リボピラノースホスフェート骨格の比較的低い柔軟性そして更に鎖軸への塩基面の強い傾向及び生じる二重らせんにおいてインターカテナリー(intercatenary)塩基の積み重なりに対してこれから生じる傾向とも関係しそして最後に骨格の合成において２’，４’−シスージ置換リボピラノース環の関与に寄与できる。これらの著しくよりよい対合特性は、超分子単位の合成において使用するために、ＤＮＡ及びＲＮＡと比較してｐ−ＲＮＡを好ましい対合系にする。それらは、天然の核酸に直交する対合系を形成し、即ち、それらは天然形で生じるＤＮＡｓ及びＲＮＡｓと対形成せず、そしてこのことは診断分野において特に重要である。
【０００３】
Eschenmoser ら(1993, 上記)は、図２に示されそして下記に説明されるようにｐ−ＲＮＡを初めて調製した。
【０００４】
これに関連して、適当に保護された核酸塩基を、ビス（トリメチルシリル）アセトアミド及び例えばトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートのようなルイス酸の作用により、テトラベンゾイルリボピラノースのアノマー混合物と反応させた(H. Vorbueggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 1981, 114, 1234に同じように)。塩基（プリンの場合にはＴＨＦ／メタノール／水中の水酸化ナトリウム；ピリミジンの場合にはメタノール中の飽和アンモニア）の作用下で、アシル保護基を糖から除去し、次いで生成物を３’，４’−位において酸性触媒のもとｐ−アニスアルデヒドジメチルアセタールで保護した。ジアステレオマー混合物を、２’−位で単離し、３’，４’−メトキシベンジリデン保護２’−ベンゾエートを酸性処理により、例えばメタノール中でトリフルオロ酢酸で脱アセタール化し次いでジメトキシトリチルクロリドと反応させた。ベンゾエートの２’→３’移動は、ｐ−ニトロフェノール／４−（ジメチルアミノ）ピリジン／トリエチルアミン／ピリジン／ｎ−プロパノールで処理することにより開始された。殆ど全ての反応は、カラムクロマトグラフィー法により処理した。このようにして合成された重要な構造単位、リボピラノースの４’−ＤＭＴ−３’−ベンゾイル−１’−核酸塩基誘導体を、次いで部分的にホスファイト化し又はリンカーを経て固相に結合させた。
【０００５】
連続自動オリゴヌクレオチド合成において、４’−位の担体結合成分を繰り返し酸で脱保護し、ホスホロアミダイトをカップリング剤、例えばテトラゾール誘導体の作用下で結合させ、未だ遊離の４’−酸素原子をアセチル化し次いでリン原子を酸化してこのようにオリゴマー生成物を得た。次いで、残存する保護基を除去し、生成物を精製し次いでＨＰＬＣにより脱塩した。
【０００６】
既知のｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの欠点は、これらのオリゴヌクレオチドに他の生体分子を共有結合させる方法が知られていないことである。
【０００７】
従って、本発明の目的は、他の生体分子をオリゴヌクレオチド、特にｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドに共有結合させることを可能にする好適な構造物を入手可能にすることにある。
【０００８】
従って、本発明の主題は、次式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【０００９】
【化８】
0004460153.tif 000002
【００１０】
〔前記式中、Ｒ1は、水素、ヒドロキシ、ホスホロアミダイト、ハロゲン（ここで、ハロゲンは、好ましくは臭素又は塩素に相当する）に相当し、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において式（Ｉ）に対するＯＣnＨ2n-1又は式（Ｉ）及び（ＩＩ）に対する（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11｛ここで、Ｒ10Ｒ11は、次式
【００１１】
【化９】
0004460153.tif 000003
【００１２】
［前記式中、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14及びＲ15は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素、ＣnＨ2n+1又はＣnＨ2n-1、又はＯＲ7（ここで、Ｒ7は水素、ＣnＨ2n+1又はＣnＨ2n-1に相当する）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ8（ここで、Ｒ8は直鎖のもしくは枝分れ鎖の、所望により置換されたアルキルもしくはアリール基、好ましくはフェニル基である）であり、ここでｎは１〜１２，好ましくは１〜８，特に１〜４の整数に相当する］で表される基を経て結合している｝であり、
Ｘ、Ｙ及びＺは、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ9）−又は−Ｎ（Ｒ9'）−（ここで、Ｒ9及びＲ9’は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素又は前記意味を有するＣnＨ2n+1もしくは（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11である）であり、特定の態様において、基Ｒ2、Ｒ3及びＲ4並びに原子Ｘ、Ｙ及びＺは一緒になってペントピラノシル−もしくはペントフラノシル−プリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−アデノシン、―グアノシン、―イソグアノシン、―６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ―フタロイルトリプタミン、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン又はベンゾトリアゾールとして式（Ｉ）又は（ＩＩ）のリンカーヌクレオシドの構造によりそれらに指定された意味を有し、そして
Ｓc1及びＳc2は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において水素であるか又はアシル、トリチルもしくはアリルオキシカルボニル基、好ましくはベンゾイルもしくは４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基から選択される保護基、又はホスホエステル（ＩＩＩ），ホスホエステル（Ｖ）、チオホスフェート（Ｖ）、ホスホネートもしくはホスホロアミダイトである〕
又は次式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
【００１３】
【化１０】
0004460153.tif 000004
【００１４】
〔前記式中、Ｒ1'は、水素、ヒドロキシル、ホスホロアミダイト、ハロゲン（ここで、ハロゲンは、好ましくは臭素又は塩素に相当する）に相当し、
Ｒ2'、Ｒ3'及びＲ4'は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において式（ＩＩＩ）に対してはＯＣnＨ2n-1（ここで、ｎは１〜１２、好ましくは１〜８、特に１〜４の整数に相当する）又は式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に対しては（ＣnＨ2n）ＮＲ10'Ｒ11'（ここで、Ｒ10’、Ｒ11'は、互いに独立にＲ10又はＲ11の前記の意味を有する）であり、そして
Ｘ’は、各々の場合において＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ9'）−又は−Ｎ（Ｒ9''）−（ここで、Ｒ9'及びＲ9''は、互いに独立にＲ9及びＲ9'の前記の意味を有する）であり、特定の態様において、基Ｒ2'、Ｒ3'及びＲ4'並びに原子Ｘは一緒になってペントピラノシル−もしくはペントフラノシルピリジン、−ピリミジン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−ウラシルとして式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）のリンカーヌクレオシドの構造によりそれに指定された意味を有し、そして
Ｓc1'及びＳc2、'は、Ｓc1及びＳc2の前記の意味を有する〕
で表されるリンカーヌクレオシドである。
【００１５】
本発明に係るペントースは、一般にリボース、アラビノース、リキソース及び／又はキシロース、好ましくはリボピラノースであり、ここでペントピラノシル部分はＤ配置を有することができるが、Ｌ配置を有することもできる。
【００１６】
通例的に、本発明に係るリンカーヌクレオシドは、ペントピラノシル−もしくはペントフラノシルプリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、―ピリジン、−ピリミジン、―アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、ートリプタミン、―Ｎ―フタロイルトリプタミン、―ウラシル、―カフェイン、―テオブロミン、―テオフィリン、―ベンゾトリアゾール又はーアクリジン、特にーペントピラノシルプリン、−ピリミジン、−アデノシン、―グアノシン、―チミジン、―シトシン、−トリプタミン、―Ｎ―フタロイルトリプタミン又は―ウラシルである。
【００１７】
本発明に係るリンカーヌクレオシドは、従って生体分子を例えば、それらの天然形で生じる核酸又は修飾された核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、更にｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐＲＮＳｓに共有結合させることのできる官能基を有する化合物である。ｐ−ＮＡｓに対して、このことは特に有利である、何故ならばこの場合におけるリンカーは未だ知られていないからである。
【００１８】
例えば、これらの内で、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に対するＲ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ2'、Ｒ3'及び／又はＲ4'が２−フタルイミドエチルであるか又は式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）に対してアリルオキシ基であるペントピラノシルヌクレオシドが、存在する。本発明に係る好ましいウラシルをベースとするリンカーは、例えば、ウラシルの５−位が好ましく修飾されたもの、例えばＮ―フタロイルアミノエチルウラシルであり、更にインドールをベースとするリンカー、好ましくは、例えばＮ―フタロイルトリプタミンのようなトリプタミン誘導体である。
【００１９】
特定に実施態様において、例えば式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）（式中、Ｒ4'は、（ＣnＨ2n）ＮＲ10'Ｒ11'でありそしてＲ10'Ｒ11’は、式（Ｖ）の基を経て既に指定された意味に結合している）に係るリンカーは、以下の（ａ）〜（ｅ）の方法により好都合に調製される：
（ａ）式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）［ここで、Ｒ4'は、（ＣnＨ2n）ＯＳc3又は（ＣnＨ2n）Ｈａｌ（式中、ｎは前記の意味を有し、Ｓc3は、保護基、好ましくはメシラート基であり、そしてＨａｌは塩素又は臭素である）に相当する］の化合物を好ましくはＤＭＦ中でアジドと反応させ、
（ｂ）（ａ）からの反応生成物を、例えばピリジン中でトリフェニルホスフィンを用いて還元し、
（ｃ）（ｂ）からの反応生成物を、適当なフタルイミド、例えばＮ−エトキシカルボニルフタルイミドと反応させ、
（ｄ）（ｃ）からの反応生成物を適当に保護されたペントース、例えばリボーステトラベンゾエートと反応させ、そして最後に
（ｅ）例えばメチラートを用いて保護基を除去し、次いで生成物を所望によりオリゴヌクレオチド合成に適したリン酸化単位に変換する。
【００２０】
加えて、リンカーとしてインドール誘導体は、蛍光発光することのできる能力の利点を有し、従って極めて少量の物質の検出に関するナノテクノロジー用途に対して特に好ましい。従って、インドール−１−リボンドは、既にN. N. Suvorov ら, Biol. Aktivn. Soedin., Akad. Nauk SSSR 1965, 60及びTetrahedron 1967, 23, 4653に記載されている。しかしながら、３−置換誘導体を調製するための類似の方法は存在しない。一般に、それらは、未保護糖成分のアミナル及びインドリンの形成を経て調製され、そしてそれは次いで酸化によりインドール−１−リボシドに変換される。例えば３−置換誘導体がフィールスマイヤー反応により通常調製されたインドール−１−グルコシド及び−１−アラビノシドは、記載されている（Y. V. Dobriynin ら, Khim.-Farm. Zh. 1978, 12, 33）。インドールの３−位にアミノエチル単位を導入するこの方法は、しかしながら工業的な適用には余りに複雑である。
【００２１】
更に特定の実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）［式中、Ｘ及びＹは、互いに独立して同一であるか又は異なっており、各々の場合において＝Ｃ（Ｒ16）（ここで、Ｒ16は、水素又はＣnＨ2nである）であり、そしてＺは＝Ｃ（Ｒ16）（ここで、Ｒ16は、（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11に相当する）である］に係るリンカーは、従って例えば以下の（ａ）〜（ｄ）の方法により好都合に調製される：
（ａ）対応するインドリン、例えばＮ−フタロイルトリプタミンをペントース、例えばＤ−リボピラノースと反応させてヌクレオシドトリオールを得、次いで
（ｂ）（ａ）からの生成物のペントース部分のヒドロキシル基を、好ましくはアシル基で、例えば無水酢酸により保護し、次いで
（ｃ）（ｂ）からの生成物を、例えば２，３−ジクロロー５，６−ジシアノパラキノンにより酸化し、次いで
（ｄ）もしも適当ならば、（ｃ）からの生成物のペントース部分のヒドロキシル保護基を、例えばメチラートにより除去し、次いで所望によりオリゴヌクレオチド合成に適したリン酸化単位に変換する。
【００２２】
しかしながら、記載された方法は、リボピラノースの場合において用いることができるのみならず、リボフラノース及び２’−デオキシリボフラノース又は２’−デオキシリボピラノースの場合においても用いることができ、そしてそれは特に有利である。糖のヌクレオシド化パートナーとして、トリプタミン、特にトリプタミンのＮ−アシル誘導体、特にＮ―フタロイルトリプタミンが、好ましく用いられる。残りのリンカーヌクレオシドは、類似の方法で又は当業者に既知の方法で調製できる。
【００２３】
更なる実施態様において、４’−保護、好ましくは３’−，４’−保護リンカーヌクレオシドは、更なる工程においてホスファイト化されるか又は固相に結合される。
【００２４】
ホスファイト化は、例えば、塩基例えばＮ−エチルジイソプロピルアミンの存在下、モノアルキルＮ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトにより行われる。固相、例えば“長鎖アルキルアミノ制御細孔ガラス”（CPG, Siguma Chemie, Munich）に対する、本発明に係る保護ペントピラノシルヌクレオシドの結合は、例えばEschenmoser ら.(1993)に記載されるように行うことができる。
【００２５】
得られる化合物は、例えば、本発明に係るリンカーの１つを含むペントピラノシル核酸の調製に対して役立つ。
【００２６】
従って、本発明の更なる主題は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を有する核酸の調製方法であり、その工程は次に通りである：
（ａ）第一の工程において、保護されたヌクレオシド又は保護されたリンカーを、固相に結合させ、次いで
（ｂ）第二の工程において、工程（ａ）に従って固相に結合した３’−，４’−保護ヌクレオシドを、ホスファイト化３’−，４’−ヌクレオシドもしくはリンカーヌクレオシドにより伸長させ、そして例えば沃素水溶液により酸化し、次いで
（ｃ）少なくとも１種の発明性のあるリンカーヌクレオシドを含有する所望の核酸が存在するまで、工程（ｂ）を、同一のもしくは異なるヌクレオシド又はリンカーヌクレオシドを用いて繰り返す。
【００２７】
好適なカップリング剤は、好ましくはアセトニトリル中で再結晶後そしてアセトニトリルに溶解後の、特にベンゾイミダゾリウムトリフレートである；何故ならばカップリング剤として５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールとは異なりカップリング剤系統の妨害及び生成物の汚染が起こらないからである。
【００２８】
更に、特にｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐ−ＲＮＡｓのオリゴヌクレオチドの保護基除去用ヒドラジン分解に塩化ナトリウムのような塩を添加することにより、ピリミジン塩基、特にウラシル及びチミンをオリゴヌクレオチドを破壊するであろう開環から保護することは、有利である。アリルオキシ基は、好ましくは例えばヒドラジン分解の前に、パラジウム[Ｐｄ(Ｏ)]錯体により除去できる。
【００２９】
更に特定の実施態様において、ペントピラノシルヌクレオシドに加えて、ペントフラノシルヌクレオシド、例えばそれらの天然形で生じるアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及び／又はウラシルを、工程（ａ）及び/又は（ｂ）において導入でき、そしてそれは例えば混合ｐ−ＮＡ−ＤＮＡ又はｐ−ＮＡ−ＲＮＡをもたらす。
【００３０】
もう１つの特定の実施態様において、更なる工程において次式：
【００３１】
【化１１】
0004460153.tif 000005
【００３２】
（前記式中、Ｓc4及びＳc7は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において特にＦｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選択された保護基であり、Ｓc5及びＳc6は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合においてアリルオキシ及び／又はジイソプロピルアミノ基でありそしてｎは前記した意味を有する）
で表されるアリルオキシリンカーを導入することができる。
【００３３】
従って、本発明は更に次式：
【００３４】
【化１２】
0004460153.tif 000006
【００３５】
（前記式中、Ｓc4及びＳc7は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合において特にＦｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選択された保護基であり、Ｓc5及びＳc6は、互いに独立に同一であるか又は異なっており、各々の場合においてアリルオキシ及び／又はジイソプロピルアミノ基でありそしてｎは前記に指定されたとおりである）
で表されるアリルオキシリンカーに拡大される。
【００３６】
特に好ましいアリルオキシリンカーは、（２−(Ｓ)−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ１−ＤＭＴ−Ｏ２−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノー１，２−ヘキサンジオール）である。
【００３７】
従って例えば、リシンから出発して活性化可能なリン化合物とＤＭＴのような酸に不安定な保護基の両方を有しそして従って自動化可能なオリゴヌクレオチド合成（例えば、P. S. Nelson ら, Nuculeic Acid Res. 1989,17,7179; L. J. Arnold ら., ＷＯ８９０２４３９を参照）において容易に使用できるアミノ末端リンカーを少ない反応工程で合成することが可能である。さもなければリン原子上の通常のシアノエチル基の代わりに、アリルオキシ基が導入され、そして従って野依(Noyori)オリゴヌクレオチド法(R. Noyori, J. Am. Chem. Soc. 1990,112,1691-6)において好都合に使用できるリシンをベースとするリンカーを用いてレパートリー(repertoire)を本発明において伸長した。
【００３８】
もう１つの特定の実施態様において、更なる工程において、次式：
【００３９】
【化１３】
0004460153.tif 000007
【００４０】
で表されるリシンリンカーを導入することができる。
従って、本発明は、次式：
【００４１】
【化１４】
0004460153.tif 000008
【００４２】
で表されるリシンリンカーにも拡大される。
従って、本発明の更なる主題は、また本発明に係る少なくとも１種のリンカーヌクレオシド及び所望により本発明に係る少なくとも１種のアリルオキシリンカーを含む核酸である。ペントピラノシル核酸は、特に好ましい；何故ならば、ｐ−ＮＡｓ及び特にＲＮＡｓは互いに安定な二重らせんを形成しそして一般にそれらの天然の形で生じるＤＮＡｓ及びＲＮＡｓとは対合しないからである。この性質のために、ｐ−ＮＡｓは好ましい対合系となる。
【００４３】
そのような対合系は、非共有相互作用の超分子系であり、そしてそれは選択性、安定性及び可逆性を特徴とし、そしてその性質は好ましくは熱力学的に、即ち温度、ｐＨ及び濃度により影響される。そのような対合系は、また例えば潜在的に新規な性質を有するクラスター会合体を与えるために異なる金属クラスターと一緒になるための“分子接着剤”としてのそれらの選択的性質のために使用できる[例えば、R. L. Letsingerら, Nature 1996,382, 607-9; P, G. Schultz et., Nature 1996, 382, 609-11を参照のこと]。従って、ｐ−ＮＡｓは、またナノテクノロジーの分野において、例えば新規物質、診断薬及び治療薬そしてまた超小型電子工業の、フォットニックのそして光電子工学のコンポーネントの調製のために使用に適しておりそして例えば、タンパク質アッセンブリーの（組み合わせ）合成のために超分子単位を得るために分子種を制御して一緒にするために使用に適している[例えば、A. Lombardi, J. W. Bryson, W. F. Degrado, Biopolymers (Pept. Sci.) 1997, 40, 495-504]；何故ならば、ｐ−ＮＡｓは、強力にかつ熱力学的に制御可能である対合系を形成するからである。従って更なる適用が、特に官能性の、好ましくは生物学的単位、例えばタンパク質又はＤＮＡ／ＲＮＡセクションに、天然の核酸を妨げないｐ−ＮＡコードを与える可能性のために診断薬及び医薬品の発見の分野において生じる（例えば、ＷＯ９３/２０２４２を参照）。
【００４４】
本発明の更なる主題は、本発明に係るリンカーヌクレオシド又は発明力のある核酸及び生体分子を含んで成る。
【００４５】
生体分子は、本発明に従って例えばペプチド又はタンパク質、例えばレセプター、抗体もしくはそれらの官能部分又は酵素、そして更に核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、又は細胞成分、例えば脂質、糖タンパク質、フィラメント成分、又はウイルス、ウイルス成分、例えばカプシド、ウイロイド、及びそれらの誘導体、例えばアセテートを意味するものと理解される。抗体の官能部分は、例えばＦｖフラグメント（Skerra & Plueckthun (1988) Science 240, 1038）、一本鎖Ｆｖフラグメント（scFv; Bird ら(1988), Science 242, 423; Huston ら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879）又はＦａｂフラグメント（Better ら (1988) Science 240, 1041）である。
【００４６】
もしも可逆的に超分子アッセンブリーが合成されなければならない場合、それらの作用、例えば結合、阻害、生理学的効果の誘導は、個々のエフェクター分子の作用と異なるが、エフェクター分子及び好ましくはペプチド、しかしＰＮＡと対比して、選択的及び制御可能な対合系の本発明に係る接合体（conjugate）は、好都合である。
【００４７】
ホモ−もしくはヘテロ二量体アッセンブリーの形成のためにペプチド“接着剤”単位を使用する試みは、例えばＷＯ９４／２８１７３に記載されている。
【００４８】
固定化された配列の会合ペプチド（ヘキサ−もしくはヘプタペプチド）は、例えばタンパク質のようなエフェクター単位と一緒になり超分子単位を与える。
そのような方法は、この会合法の制御可能性によりより高い柔軟性を維持でき、そしてそれは一般に会合ペプチドでは実現できないが、本発明の対合系で好都合に実現できる。
【００４９】
従って、例えばＷＯ９６／１３６１３は、物質Ｉ（その物質はタンパク質に結合している）を試験により最初に測定し、次いで第二のタンパク質に結合する第二の物質ＩＩを測定し次いで二種のタンパク質の二量体化が誘発されるようにリンカーを経て二種の物質Ｉ及びＩＩを共有的に結合させることによってタンパク質の多量体化に起因する生物学的作用を誘発する物質を見出す方法を記載する。次いで、この二量体化は所望の生物学的効果をもたらす。もしも二種の物質Ｉ及びＩＩの結合が共有的に起こらずに、本発明に係るオリゴマーもしくは接合体のような対合系により起こる場合、そのような方法はより大きな柔軟性を維持できる。例えば温度又はｐＨにより、この対合の制御可能性の結果、タンパク質の二量体化方法が観察でき、又はその程度を制御できる。本発明に係る対合系は、例えば、ＷＯ９６／１３５２２からの系と比較して、それらがヌクレアーゼに安定であるという利点を有する。
【００５０】
生体分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡは、もしも両方の生体分子が核酸塩基の相補的配列の結果として水素橋の形成により互いに結合できる部分を有するならば、もう１つの生体分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡに非共有結合するために使用できる。このタイプの生体分子は、例えば、シグナル増幅ユニットに対する分析系において見出され、そしてそこでその配列が分析されるべきＤＮＡ分子は、一方ではそのような非共有ＤＮＡリンカーにより固体担体上に固定化され、そして他方ではシグナル増幅性分枝ＤＮＡ分子（ｂＤＮＡ）に結合されるべきである（例えば、S. Urdea, Bio/Technol. 1994, 12, 926又は米国特許第５，６２４，８０２号を参照のこと）。最後に記載した系の著しく不利な点は、それらが感受性に関してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸診断に対する方法に時代遅れになりがちであることである（K. Mullis, Methods Enzymol. 1987, 155, 335）。このことは、特に以下の事実に起因する；即ち、固体担体が分析されるべきＤＮＡに非共有結合することは、丁度分析すべきＤＮＡ分子の非共有結合と同様に、かならずしも特異的に起こらない、その結果機能“配列認識”及び“非共有結合”の混合が起こる。ＤＮＡ又はＲＮＡ対合プロセスにおいて介在しない直交の対合系としてのｐ−ＮＡｓの使用は、この問題を有利に解決し、その結果記載した分析方法の感受性を、著しく増大することができる。
【００５１】
好ましい実施態様において、ここで関係のあるものは、ｐ−ＲＮＡ／ＤＮＡ又はｐ−ＲＮＡ／ＲＮＡ接合体である。
【００５２】
もしも、機能“配列認識”及び“非共有結合”が、１つの分子で実現されなければならない場合、接合体は好ましく用いられる；何故ならば、本発明に係る接合体は互いに直交する２つの対合系を含むからである。
【００５３】
連続方法(sequential process)及び収束方法（convergent process）の両方とも接合体の調製に適している。
【００５４】
連続方法では、例えば試薬及びカップリングプロトコルの再調整後、ｐ−ＲＮＡオリゴマーの自動合成が同じ合成装置で直接起こった後に、例えばＤＮＡオリゴヌクレオチドを更に合成する。この方法は、逆の順序で行うこともできる。
【００５５】
収束方法では、例えばアミノ末端リンカーを有するｐ−ＲＮＡオリゴマー及び、例えばＤＮＡオリゴマーは、例えばチオールリンカーを用いて別個の方法で合成される。次いでｐ−ＲＮＡオリゴマーのヨードアセチル化及び文献から既知のプロトコルに従って二種の単位のカップリングを、好ましく行う（T. Zhu ら, Bioconjug. Chem. 1994, 5, 312）。
【００５６】
収束方法は、それらの柔軟性のため特に好ましいことが判明した。
本発明の意味において語句接合体は、所謂アレイ（arrays）の意味としても理解される。アレイは、特に分析及び診断において被検体の同時測定で重要な役割を果たす固定化された認識種である。例としては、ペプチドアレイ（Fodor ら, Nature 1993, 364, 555）及び核酸アレイ（Southern ら. Genomics 1992, 13, 1008; Heller, 米国特許第５，６３２，９５７号）がある。これらのアレイのより高い柔軟性は、認識種をコーディングオリゴヌクレオチドに結合すること及び会合した相補的鎖を固体担体上の一定の位置に結合することにより達成できる。コードされた認識種を“アンチ−コードされた”固体担体に適用し次いでハイブリッド形成条件の調節により、認識種は所望の位置に非共有結合される。その結果、種々のタイプの認識種、例えばＤＮＡセクション、抗体はハイブリッド形成条件を用いてのみ固体担体上に同時に配列できる（図４参照）。しかしながら、このための先行条件として、コドン及びアンチコドンはコーディングセクションを可能な限り短く保つために、極めて強く、選択的でありそして天然の核酸を妨げないことが必要である。ｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐ−ＲＮＡｓは、これに対して特に好都合に適している。
【００５７】
従って、本発明のもう１つの主題は、本発明に係る少なくとも１種のヌクレオシド、本発明に係る少なくとも１種の核酸及び／又は本発明に係る少なくとも１種の接合体が固定化される担体である。
【００５８】
語句“固定化される”は、本発明の意味において二種又はそれ以上の分子種、例えば線状構造の分子、特にペプチド、ペプトイド、タンパク質、線状オリゴ糖もしくは多糖類、核酸及びそれらの類似体、又はモノマー、例えばヘテロ環、特に窒素ヘテロ環、又は非線状構造の分子、例えば分枝オリゴ糖もしくは多糖類又は抗体並びにそれらの官能部分、例えばＦｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ＳｃＦｖ）又はＦａｂフラグメントにより共有結合、準共有結合又は超分子結合の形成を意味するものと理解される。
【００５９】
適当な担体物質は、例えばセラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチック、結晶性物質又は担体、特に前記物質の担体の薄層、又は（生体）分子フィラメント、例えばセルロース、構造タンパク質である。
【００６０】
本発明の更なる主題は、既に詳しく前記したような本発明に係るリンカーヌクレオシド、本発明に係る核酸又は本発明に係る接合体を含んで成る診断薬にも関する。
【００６１】
従って、本発明のもう１つの主題は、医薬品、例えば治療薬、診断薬及び／又は電子コンポーネントの調製のために、本発明に係るリンカーヌクレオシド、本発明に係る核酸、本発明に係る接合体及び／又は本発明に係る担体を使用することである。
【００６２】
本発明は、また例えばＷＯ９４／２８１７３、ＷＯ９６／１３５２２、ＷＯ９６／１３６１３、R. L. Letsinger, ら., Nature, 1996, 382, 607-9; P. G. Schultz ら., Nature, 1996, 382, 609-11又はA. Lombardi, J. W. Bryson, W. F. DeGrado, Biopolymers(Pet. Sci.) 1997, 40, 495-504及び先に一般的に説明したような対合及び／又は試験系において、本発明に係るリンカーヌクレオシド、本発明に係る核酸、本発明に係る接合体及び／又は本発明に係る担体を使用することでもある。
【００６３】
以下の図面及び実施例は、本発明を制限することなく本発明をより詳しく説明するためのものである。
【００６４】
実施例
ｐ−ＲＮＡリンカーシステムの合成
以下、官能基単位を結合するために使用することのできるアミノ末端を有するリンカーの提供を可能とする3つの方法を記載する。
【００６５】
実施例  １
ウラシル基体リンカー
ウラシルの５−位の修飾に基づく
ヒドロキシエチルウラシル２８の製造は、公知の方法（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，  Ａ．Ｍｙｌｅｓ，  Ｇ．Ｂ．Ｂｒｏｗｎ，  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９６４，  ２９，  ２６７０）に従い、ラージスケールで可能である。ｇ−ブチロラクトン２５をメチルホルメートでホルミル化し、そのナトリウム塩２６を反応させて、尿素誘導体２７を生成させ、これを環化させ、ヒドロキシエチルウラシル２８とした（スキーム１）。
スキーム１：ヒドロキシエチルウラシル２８の合成
【００６６】
【化１５】
0004460153.tif 000009
【００６７】
スキーム２：Ｎ−フタロイルアミノエチルウラシル３２の合成
【００６８】
【化１６】
0004460153.tif 000010
【００６９】
ヒドロキシエチルウラシル２８をピリジン中メタンスルホニルクロライドでメチル化して化合物２９を生成させた（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，  Ｆ．Ｓｗｅｅｔ，  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９７３，  ３８，  ２６４）。
【００７０】
続く工程は、新しく工夫した：ＤＭＦ中ナトリウムアジドを使用し、化合物２９を反応させて、アジド３０を生成させ、ピリジン中トリフェニルホスフィンで還元して、アミノエチルウラシル３１を生成させた。化合物３１中のアミノ官能基をＮ−エトキシカルボニルフタルイミドで最終的に保護した（スキーム２）。リボーステトラベンゾエート３３をＮ−フタロイルアミノエチルウラシル３２でヌクレオシド化すると、良好な収率でリボーストリベンゾエート３４を生成した。ピラノース環のアノメリック中心（ａｎｏｍｅｒｉｃ  ｃｅｎｔｅｒ）は、Ｈ−Ｃ（１’）およびＨ−（Ｃ２’）間のカップリング定数Ｊ＝９．５Ｈｚより明らかなように、β−配置である。続いて、ＭｅＯＨ中ＮａＯＭｅを使用してベンゾエート保護基を除去すると、リンカートリオール３５を生成した。化合物３５は、ＤＭＡＰの存在で、ピリジン／ジクロロメタン１：１０中、−７８℃で、ベンゾイルクロライドと反応させた。この工程においては、所望される２’−ベンゾエート３６（６４％）以外に、２’，４’−ジベンゾイレート化された生成物（２２％）も得られ、これは、収集して、化合物３４の化合物３５へのメタノーリシスと類似的にトリオール３５へと転化させた。２’−ベンゾエート３６は、ジクロロメタン中、Ｈｕｎｉｇの塩基の存在で、９０％より高い収率で、その４’−位をジメトキシトリチルクロライドでトリチレート化した。４’−ＤＭＴ−２’−ベンゾエート３７の４’−ＤＭＴ−３’−ベンゾエート３８への転位は、ｎ−プロパノール／ピリジン５：２中、ＤＭＡＰ、ｐ−ニトロフェノールおよびＨｕｎｉｇの塩基の存在で行った。クロマトグラフィーの後、化合物３８が得られる。４’−ＤＭＴ−３’−ベンゾエート３８は、最終的に、Ｈｕｎｉｇの塩基の存在で、ＣＩＰ（ＯＡｌｌ）Ｎ（ｉＰｒ）2と反応させて、ホスホルアミダイト３８を生成させる（スキーム３）。これは、合成プロトコールの変更なしで、自動オリゴヌクレオチド合成に使用することができる。
スキーム３：リンカーホスホルアミダイト３９の合成
【００７１】
【化１７】
0004460153.tif 000011
【００７２】
方法：
ウラシルリンカー単位の合成
５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）
【００７３】
【化１８】
0004460153.tif 000012
【００７４】
１．  処方
内部温度計および還流冷却器を備えた５００ｍｌの３径フラスコ内のＤＭＦ２５０ｍｌに化合物２９の２６．０ｇ（０．１１ｍｏｌ）を溶解させ、ナトリウムアジド１０．８ｇ（０．１６６ｍｏｌ）で処理した。続いて、懸濁液を６０℃で４時間攪拌した（ＴＬＣチェック、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ９：１）。ＤＭＦを留去し、残渣を水１５０ｍｌとともに攪拌した。固体を濾去し、水約５０ｍｌで洗浄し、デシケーター内五酸化リン上で減圧で一晩乾燥した。化合物３０の１４．２ｇ（７１％）が（分解することなく）ｍ．ｐ．２３０−２３５℃の無色の固体の形で得られた。
【００７５】
２．  分析データ
５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）：
【００７６】
【化１９】
0004460153.tif 000013
【００７７】
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）
【００７８】
【化２０】
0004460153.tif 000014
【００７９】
１．  処方
内部温度計および還流冷却器を備えた２５０ｍｌの３径フラスコ内のピリジン１７５ｍｌに１４．２ｇ（７８．０ｍｍｏｌ）の化合物３０を懸濁させ、トリフェニルホスフィン2)の６１．４ｇ（２３４ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を６０℃に５時間加熱し、室温で一晩攪拌した（ＴＬＣチェック、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ５：１）。２５％強のアンモニア溶液４０ｍｌを溶液に加えると、それは、ついで、透明となった。ロータリーエバポレーター内減圧で溶剤を除去した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ１：１の２００ｍｌ中、室温で、３０分間攪拌し、沈殿を濾去し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した。デシケーター内五酸化リン上、減圧で、乾燥させた後、ｍ．ｐ．２１４−２２０℃の化合物３１の１０．０ｇ（８５％）が得られた。
【００８０】
２．  分析データ
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）：
【００８１】
【化２１】
0004460153.tif 000015
【００８２】
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）
【００８３】
【化２２】
0004460153.tif 000016
【００８４】
１．  処方
２５０ｍｌの丸底フラスコ内の水１００ｍｌに化合物３１の９．６ｇ（６１．８ｍｍｏｌ）を懸濁させ、Ｎａ2ＣＯ3６．６４ｇ（６２．６ｍｍｏｌ）で処理した。室温で１５分間攪拌後、Ｎ−エトキシカルボニルフタルイミド１４．３ｇ（６５ｍｍｏｌ）を小分けして加え、混合物を室温で３時間攪拌した（ＴＬＣチェック、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ５：１）。濃塩酸を使用して、この粘稠な白色懸濁液を注意深く1)ｐＨ４に調整し、白色沈殿を濾去した。水で洗浄後、デシケーター内五酸化リン上で固体を乾燥させた。これにより、ｍ．ｐ．３２４−３２７℃の化合物３２が１６．０ｇ（９１％）生成した。
【００８５】
２．  分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）：
【００８６】
【化２３】
0004460153.tif 000017
【００８７】
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）
【００８８】
【化２４】
0004460153.tif 000018
【００８９】
１．  処方
アルゴン導入部、内部温度計および隔膜を備えた２５０ｍｌの３径フラスコ内のアセトニトリル１２０ｍｌに、化合物３２の７．００ｇ（２４ｍｍｏｌ）および化合物３３の１３．６ｇ（２４ｍｍｏｌ）を懸濁させた。最初に、１２．２ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）のＢＳＡを加え、３０分間攪拌後、さらに７ｍｌ（２８ｍｍｏｌ）のＢＳＡをシリンジにより加えた。４０℃まで短時間加熱した後、反応混合物は、透明となった。１３ｍｌ（７２ｍｍｏｌ）のＴＭＳＯＴｆを室温でシリンジにより加えた。１時間後、生成物の形成は、なお、見られなかった（ＴＬＣチェック、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン１：１）。したがって、さらに１３ｍｌ（７２ｍｍｏｌ）のＴＭＳＯＴｆを加えた。続いて、反応混合物を５０℃まで加熱した。５０℃で２．５時間攪拌後（ＴＬＣチェック）、混合物を室温まで冷却し、ＡｃＯＥｔ２５０ｍｌとＮａＨＣＯ3飽和溶液１９０ｍｌとの氷冷混合物に注ぎ、１０分間激しく攪拌することによって抽出した。それを再度１００ｍｌのＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、水相を再度１００ｍｌのＡｃＯＥｔで抽出した。ＭｇＳＯ4を使用して希釈した有機相を乾燥させ、ロータリーエバポレーター内減圧で溶剤を除去した。オイルポンプで減圧乾燥後、２０．９ｇの粗製の生成物が得られた。シリカゲル上クロマトグラフィー（ｈ＝２５ｃｍ、φ＝５ｃｍ、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン１：１）にかけると、ＴＬＣ−均一な発泡生成物を生成し、Ｅｔ2Ｏを使用して、これを温浸した。濾過し、オイルポンプで減圧で乾燥すると、１５ｇ（８６％）の化合物３４を与えた。
【００９０】
２．  分析データ
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）
【００９１】
【化２５】
0004460153.tif 000019
【００９２】
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）
【００９３】
【化２６】
0004460153.tif 000020
【００９４】
１．  処方
１リットルの丸底フラスコ内のＭｅＯＨ５００ｍｌに化合物３４の１５ｇ（２０ｍｍｏｌ）を溶解させ、ＮａＯＭｅ３２４ｍｇ（６ｍｍｏｌ）で処理し、水を排除しつつ室温で一晩攪拌した（ＴＬＣチェック、ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン１：１）。ｐＨ＜７となるまで生成する懸濁液に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０を加えた。熱をかけて個体を溶解し、イオン交換樹脂から高温で濾去し、ＭｅＯＨで洗浄した。溶剤除去後、各回１５０ｍｌの水を使用し、残渣を２回同時蒸発（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ)させた。これにより、粗製の生成物９ｇを生成し、これをＭｅＯＨ９０ｍｌで還流下１０分間加熱した。室温まで冷却後、混合物を６０ｍｌのＥｔ2Ｏで処理し、４℃で一晩貯蔵した。濾過し、Ｅｔ2Ｏで洗浄後、オイルポンプで減圧で乾燥させると、７．８ｇ（９３％）の化合物３５を生成した。
【００９５】
２．  分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）
【００９６】
【化２７】
0004460153.tif 000021
【００９７】
１−（２’−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
加熱したアルゴンフラッシュ１リットル４径フラスコ内のピリジン２０ｍｌに５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシルの１０．６ｇ（０．０２５ｍｏｌ）を溶解させ、ジクロロメタン２００ｍｌと混合した。混合物を−７０℃まで冷却し、ピリジン５ｍｌ中ベンゾイルクロライド３．８２ｍｌ（０．３３ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン２０ｍｌを、冷却しつつ、緩やかに滴下し、混合物を−７０℃で３５分間攪拌した。反応混合物を冷アンモニウムクロライド溶液６００ｍｌに注ぎ、水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、乾燥させ、減圧で濃縮乾固させた。シリカゲル上のクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン１：１）にかけると、１−（２’−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル７．９ｇ（６０％）を生成した。
【００９８】
【化２８】
0004460153.tif 000022
【００９９】
１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
５．６ｇ（１０．７３ｍｍｏｌ）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルをジクロロメタン６０ｍｌに溶解させ、４．７２ｇ（１３．９５ｍｍｏｌ）の４，４’−ジメトキシトリチルクロライドおよび２．４ｍｌ（１３．９５ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンで処理し、室温で２０分間攪拌した。反応混合物を１００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム溶液および２０％クエン酸溶液で洗浄し、乾燥し、減圧で濃縮乾固させた。シリカゲル上クロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン１：１＋２％トリエチルアミン）にかけると、７．７ｇ（８７％）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを生成した。
【０１００】
【化２９】
0004460153.tif 000023
【０１０１】
１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
３ｇ（３．６３ｍｍｏｌ）の１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル、１ｇ（７．２６ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェノール、０．４４ｇ（３．６３ｍｍｏｌ）の４−（ジメチルアミノ）ピリジンおよび３．７５ｍｌ（２１．７８ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンを５．６ｍｌのイソプロパノールおよび２５ｍｌのピリジンに溶解させ、６５℃まで加熱し、６５℃で３日間攪拌した。溶液を減圧で濃縮乾固し、残渣を１５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させた。２０％クエン酸溶液および炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄後、溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥した。シリカゲル上クロマトグラフィー（酢酸エチル／ジクロロメタン／イソヘキサン２：１：１）にかけると、２．２７ｇ（７６％）の１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを生成した。
【０１０２】
【化３０】
0004460153.tif 000024
【０１０３】
１−[２’−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３’Ｏ−ベンゾイル−４’−Ｏ−［（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル]−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
８８ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）の１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、７５μｌ（０．４４ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび７０μｌ（０．３ｍｍｏｌ）のアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンで処理し、室温で３時間攪拌した。さらに３５μｌ（０．１５ｍｍｏｌ）のアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンを加えて反応を完了させた後、それを室温でさらに１時間攪拌し、反応混合物を減圧で濃縮した。シリカゲル上クロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン：勾配１：２〜１：１〜２：１で各場合２％トリエチルアミンを含む）にかけると、８５ｍｇ（７６％）の１−[２’−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３’Ｏ−ベンゾイル−４’−Ｏ−［４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル]−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシルを生成した。
【０１０４】
【化３１】
0004460153.tif 000025
【０１０５】
実施例  ２
インドール基体リンカー
Ｎ−フタロイルトリプタミンは、文献（Ｋｕｅｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  ４３，  １３，  １９７８，  ２７３３−２７３５）記載のようにして、無水フタル酸およびトリプタミンから得られる。これをボラン−ＴＨＦで還元すると、（Ａ．Ｇｉａｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．  １９８９，  １０１，  ２２０と類似的に）インドリンを与える。
【０１０６】
３置換インドリンを最初にリボースと反応させて、ヌクレオシドトリオールを得、ついで、無水酢酸と反応させて、トリアセテートを得る。混合物を２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで酸化して、アセテートをナトリウムメトキシドで開裂し、２’−位で選択的にベンゾレート化し、４’−位で選択的にＤＭ−トリチレート化し、転位反応を行うと、３’−ベンゾエートを与える。慣用的な方法で、ホスホルアミダイトの形成を行う。これは、合成プロトコールを変更することなく、自動オリゴヌクレオチド合成に使用することができる。
【０１０７】
処方
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドリン
【０１０８】
【化３２】
0004460153.tif 000026
【０１０９】
５１．４ｇ（１７７ｍｍｏｌ）のフタロイルトリプタミンＡを窒素雰囲気下１Ｍのボラン−ＴＨＦ溶液（２当量）の３５４ｍｌに溶解させ；０℃まで冷却した。３５４ｍｌのトリフルオロ酢酸を０℃で緩やかに滴下し（注意：ガスの発生）、混合物を３０分間攪拌した（ＴＬＣチェック、ＥｔＯＡｃ）。ついで、水１７．３ｍｌを加え、混合物を１０分間攪拌し、減圧で濃縮した。残渣を１０％のＮａＯＨ溶液／ジクロロメタンに溶解させ、有機相を分離し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、減圧で濃縮した。残渣（５０．９ｇ）を高温エタノール（３リットル）から再結晶した。４１．４ｇの化合物Ｂが得られ、ｍ．ｐ．１６１−１６２℃であった。母液を減圧で濃縮し、残渣を再度エタノールから再結晶した。さらに３．２ｇの化合物Ｂが得られ、ｍ．ｐ．１５８−１５９℃であった。
合計収率：４４．６ｇ（１５３ｍｍｏｌ）の化合物Ｂ、すなわち、８６％。
【０１１０】
【化３３】
0004460153.tif 000027
【０１１１】
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−（２’，３’，４’−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボピラノシル）インドール
【０１１２】
【化３４】
0004460153.tif 000028
【０１１３】
４５．２ｇ（１５５ｍｍｏｌ）の化合物Ａと２３．２ｇ（１５５ｍｍｏｌ；１．０当量）のＤ−リボースとを７５０ｍｌの乾燥エタノールに懸濁させ、窒素雰囲気下、４時間加熱還流させた（ＴＬＣチェック：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ１０：１）。室温まで冷却後、混合物を減圧で濃縮した。残渣をピリジン３００ｍｌに溶解させ、氷冷しつつ、無水酢酸１５５ｍｌで処理した。１５分後、氷浴を取り除き、混合物を室温で１８時間攪拌した（ＴＬＣチェック；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン１：１）。この溶液を減圧濃縮し、各回３００ｍｌのトルエンで３回同時蒸発させた。得られるオイルを９００ｍｌのジクロロメタンに溶解させ；氷冷しつつ、３８．８ｇ（１７１ｍｍｏｌ；１．１当量）の２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで処理した。１５分後、氷浴を取り除き、混合物を室温で１．５時間攪拌した（ＴＬＣチェック：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン１：１）。析出した沈殿を吸引濾去し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。濾液をＮａＨＣＯ3飽和溶液６００ｍｌで洗浄した。この過程で析出した沈殿を再度吸引濾去し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。合わせた有機抽出物をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、減圧で濃縮した。残渣（９０．９ｇ）をシリカゲル６０上フラッシュクロマトグラフィー（１０×２５ｃｍ；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン２：３）により精製した。以下のものが得られた：純粋な化合物Ｂ２１．５ｇおよび混合画分４６．８３ｇであり、これは、フラッシュクロマトグラフィー後、さらに２０．４ｇの化合物Ｂを生成した。
合計収率：化合物Ｂ４１．９ｇ（７６ｍｍｏｌ）、すなわち、４９％。
【０１１４】
【化３５】
0004460153.tif 000029
【０１１５】
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−β−Ｄ−リボピラノシルインドール
【０１１６】
【化３６】
0004460153.tif 000030
【０１１７】
４４．１ｇ（８０ｍｍｏｌ）の化合物Ａを窒素雰囲気下無水のメタノール４００ｍｌに溶解させた。氷冷しつつ、混合物を３０％強のナトリウムメトキシド溶液４．０ｍｌで処理し、ついで、室温で１８時間攪拌した。析出した沈殿を吸引濾去し、冷エタノールで洗浄した。濾液を減圧で濃縮した。残渣をジクロロメタンに採取した。この溶液をＮａＨＣＯ3飽和溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、減圧で濃縮した。得られた残渣を反応溶液から析出する沈殿とともに、高温エタノールから再結晶した。２２．６ｇの化合物Ｂが得られ、ｍ．ｐ．１９６−１９８℃であった。母液を減圧で濃縮し、残渣を再度エタノールから再結晶した。さらに９．２ｇの化合物Ｂが得られ、ｍ．ｐ．１８８−１９４℃であった。
合計収率：２５．８ｇの化合物Ｂ、すなわち、７６％。
【０１１８】
【化３７】
0004460153.tif 000031
【０１１９】
１−（２’−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１２０】
【化３８】
0004460153.tif 000032
【０１２１】
１０．６ｇ（２５ｍｍｏｌ）の化合物Ａを窒素雰囲気下２５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに採取した。混合物を３０５ｍｇのＤＭＡＰ（２．５ｍｍｏｌ）と２０ｍｌのピリジンとで処理した。全てが溶液となるまでそれを加熱し、ついで、−７８℃まで冷却した。８ｍｌのジクロロメタンに溶解させた３．３５ｍｌのベンゾイルクロライド（２８．８ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下した。さらに３０分後のＴＬＣチェック（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１）は、反応が完了したことを示した。４５分後、冷却溶液を直接２００ｍｌのＮＨ4Ｃｌ飽和溶液に折りたたんだフィルターを通して加え、フィルターの残渣をジクロロメタンで洗浄した。有機相を水で１回洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濃縮した。残渣をトルエンとともに２回同時蒸発させ、１０×２０ｃｍのシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーにかけ、ＥｔＯＡｃ/ヘキサン３：１を使用して精製した。８．１ｇの化合物Ｂ（６４％）が得られた。
【０１２２】
【化３９】
0004460153.tif 000033
【０１２３】
１−[３’−Ｏ−ベンゾイル−４’−Ｏ−〔（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル〕−β−Ｄ−リボピラノシル]−３−（Ｎ−ナフタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１２４】
【化４０】
0004460153.tif 000034
【０１２５】
８．９ｇ（１６．ｍｍｏｌ）の化合物Ａを窒素雰囲気下１３５ｍｌの乾燥ジクロロメタンに懸濁させた。混合物を２０６ｍｇのＤＭＡＰ（１．６８ｍｍｏｌ）、５．８ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（３３．７ｍｍｏｌ）および約１２ｍｌのピリジンで（完全に溶液となるまで）処理した。それをモレキュラーシーブ４Åの３４ｇで処理し、３０分間攪拌した。０℃まで冷却した後、それを１１．４ｇのＤＭＴＣｌ（３３．７ｍｍｏｌ）で処理し、冷却浴を取り除いた後、７５分間攪拌した。さらに、１．９４ｇ（０．３４当量）、さらに４０分後、１．１４ｇ、さらに６５分後、１．１４ｇのＤＭＴＣｌ（０．２当量）をついで加えた。４．２５時間後、反応は完了した。ついで、混合物を２５．３ｍｌのｎ−プロパノール（２０当量）で処理し、さらに３０分間攪拌し、ついで、注意深く濃縮した（発泡体形成）。残渣を１００ｍｌのピリジンに溶解した。それを１．８５ｇのＤＭＡＰ（１５．１ｍｍｏｌ；０．９当量）、１３．０５ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（１０１ｍｍｏｌ；６．０当量）、７１ｍｌのｎ−プロパノール（９４０ｍｍｏｌ；５６当量）および３．７４ｇのｐ−ニトロフェノール（２６．９ｍｍｏｌ：１．６当量）で処理した。この混合物を窒素下７５−８０℃で９６時間攪拌した。室温まで冷却後、Ｃｅｌｉｔｅを介して、混合物を濾過し、濃縮した。トルエン／ジエチルエーテル／トリエチルアミン９０：１０：１を使用し、９×１７ｃｍのシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーにより、残渣を精製した。生成物含有画分（９．２５ｇ）を最初にＥｔＯＡｃから再結晶し、ついで、トルエン／メタノールから再度沈殿させた。５．８６ｇの化合物Ｂ（４２％）が得られた。
【０１２６】
【化４１】
0004460153.tif 000035
【０１２７】
１−[２’Ｏ−（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−３’Ｏ−ベンゾイル−４’Ｏ−〔（４，４’−ジメトキシトリフェニル）メチル〕−β−Ｄ−リボピラノシル]−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール（２ジアステレオマー）
【０１２８】
【化４２】
0004460153.tif 000036
【０１２９】
１６５８ｍｇのアルコールＡ（２．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下１０ｍｌのジクロロメタン１０ｍｌに溶解させた。溶液を１．０３ｍｌのＮ−エチルジイソプロピルアミン（６．０ｍｍｏｌ）および０．６３ｍｌのモノアリルｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２．８ｍｍｏｌ）で処理し、室温で１時間攪拌した。ついで、６１μｌ（０．８ｍｍｏｌ）のイソプロパノールの添加によって、過剰のホスホリレーション試薬を分解した。１０分後、混合物を減圧で濃縮し、３．３×２１ｃｍのシリカゲル上ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＮＥｔ3（７５：２５：１）を使用し、残渣を精製した。生成物含有画分を濃縮し、ＣＣｌ4に取り、再度濃縮した。２．０４ｇのほとんど無色の発泡体(定量的）が得られ、これは、直接、オリゴマー化に使用することができ、数週間−２０℃に保つことができる。
シリカゲル上ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＮＥｔ3３３：６６：１）：０．４１
【０１３０】
【化４３】
0004460153.tif 000037
【０１３１】
実施例  ３
リシン基体のリンカー
合成をスキーム４に示し、以下、詳細に説明する。
スキーム４：リシンリンカーの合成
【０１３２】
【化４４】
0004460153.tif 000038
【０１３３】
６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（１）は、文献記載の公知の方法で、ジアゾ化および続く加水分解によってＬ−リシンより製造した（Ｋ．Ｉ．Ａｋｅｔａ，  Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９７６，  ２４，  ６２１）。
【０１３４】
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（２）
３．４ｇのＬｉＢＨ4（１５６ｍｍｏｌ、４当量）をアルゴン下１００ｍｌの絶対ＴＨＦに溶解させる（発熱的）。約３０℃まで冷却後、３９．６ｍｌのＴＭＳＣｌ（３１２ｍｍｏｌ、８当量）を緩やかに滴下すると（ガス発生）、沈殿が形成される。５．７４ｇの６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（１）（３９ｍｍｏｌ）をアルゴン向流分配中小分けして加え、ＴＬＣ（シリカゲル；ｉ−ＰｒＯＨ／濃ＮＨ4ＯＨ／水７：２：１；ニンヒドリンで検出）がもはやいずれの出発物質も示さなくなるまで(約３時間）、混合物を６５℃まで加熱する。混合物を、氷冷しつつ、１２０ｍｌのメタノールで注意深く処理する（ガスの強い発生）。溶剤を減圧で濃縮し、残渣を各回２００ｍｌのメタノールとともに３回同時蒸発させ、ついで、１００ｍｌの絶対ＤＭＦに溶解させる。１６ｍｌのエチルジイソプロピルアミン（９３．６ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加した後、混合物を０℃まで冷却し、１２．１ｇのＦｍｏｃＣｌ（４６．８ｍｍｏｌ、１．２当量）で小分けして処理する。１５分後、冷却浴を取り除き、出発物質が消費されるまで（約３時間；ＴＬＣチェック：シリカゲル；ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ／水６０：３０：３：５）、混合物を室温で攪拌する。反応溶液を６００ｍｌのＮａＨＣＯ3飽和溶液に加える。沈殿を濾去し、２００ｍｌの水で洗浄し、恒量となるまで(約６時間）、高減圧、５０℃で乾燥した。１３．９ｇの無色の固体が得られ、これを酢酸エチル（４０ｍｌ）／ｎ−ヘキサン（３５ｍｌ）から再結晶する。収率：９．０５ｇ（６５％）。
【０１３５】
【化４５】
0004460153.tif 000039
【０１３６】
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（３）をＷＯ８９／０２４３９に従いＤＭ−トリチレート化した。
【０１３７】
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−Ｏ2−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（４）
０．５１ｍｌのエチルジイソプロピルアミン（３．０ｍｍｏｌ、３当量）および０．３３ｍｌのクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノアリルオキシホスフィン（１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）をアルゴン下６７０ｍｇのアルコール（３）（１．０２当量）の１０ｍｌ絶対ジクロロメタン溶液に加える。混合物を室温で２時間攪拌し、溶液を減圧で抜き取り、得られる残渣を３．２×１６ｃｍシリカゲル上フラッシュクロマトグラフイー（ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ3２０：３０：１）により精製する。８３９ｍｇ（９７％）の幾分黄色のオイルが得られる。
【０１３８】
【化４６】
0004460153.tif 000040
【０１３９】
実施例  ４
カップリング剤としてベンズイミダゾリウムトリフレートを使用する配列４’−インドールリンカーＡ８−２’のｐ−ＲＮＡオリゴの合成
１０８ｇのインドールリンカーホスホルアミダイトおよび２４４ｍｇのＡホスホルアミダイトをシンセサイザーバイアルに秤取し、Ａ単位を入れたＣＰＧ支持体２８．１ｍｇを充填したカラムとともに、デシケーター内のＫＯＨ上で３時間高減圧とした。ホスホルアミダイトを１ｍｌ（インドールリンカー）または２．５ｍｌ（Ａホスホルアミダイトの）アセトニトリルに溶解させ、数個のモレキュラーシーブビーズを加え、デシケータ内のＫＯＨ上に置いて閉じる。２００ｍｇのヨウ素を、激しく攪拌しつつ、５０ｍｌのアセトニトリルに溶解する。（目視調節で）、全ての物質が溶解した後、２３ｍｌの水と４．６ｍｌのシムコリジン（ｓｙｍｃｏｌｌｉｄｉｎｅ）とを加え、溶液を一度完全に混合する。脱トリチル化（Ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）のために、ジクロロ酢酸のジクロロメタン６％強溶液を使用する。キャッピング試薬(無水酢酸＋塩基）を購入し、オリゴヌクレオチド合成のために従来通りに使用する。
【０１４０】
高温アセトニトリルからベンズイミダゾリウムトリフレートを再結晶し、乾燥する。ほとんど無色の結晶を使用して、無水アセトニトリル中０．１Ｍ溶液をカップリング試薬として調製する。合成の間、この溶液は、終始、透明なままであり、シンセサイザーのチューブ押出の障害は生じない。
エッペンドルフエコシン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｃｏｓｙｎ）３００＋（ＤＭＴ上）の改良ＤＮＡカップリングサイクル：
脱トリチル化                ７分
カップリング                １時間
キャッピング                １．５分
酸化                        １分
２０ｍｇのテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムを１．５ｍｌのジクロロメタン、２０ｍｇの炭酸水素ジエチルアンモニウム、２０ｍｇのトリフェニルホスフィン；および、オリゴヌクレオチドを支持するガラス支持体を加え、（Ｐａｒａｆｉｌｍで）緊密にシールし、バイアルを室温で５時間攪拌する。ついで、分析用吸引フィルターによってガラス支持体を吸引濾去し、ジクロロメタンで、アセトンで、および、水で洗浄する。
【０１４１】
０．１モルのナトリウムジエチルジチオカルバメート水溶液を使用して、支持体を懸濁させ、室温に４５分間放置する。それを吸引濾去し、水、アセトン、エタノールおよびジクロロメタンで洗浄する。支持体を１．５ｍｌの２４％強ヒドラジン水和物溶液に懸濁させ、４℃で２４〜３６時間振盪し、０．１モルの炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ緩衝液）で７ｍｌに希釈する。それをＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジによりヒドラジンを含まなくなるまで洗浄する。それを８０％強のギ酸溶液５ｍｌで処理し、３０分後、濃縮乾固する。残渣を１０ｍｌの水に取り、ジクロロメタンで抽出し、水相を濃縮し、ついで、ＨＰＬクロマトグラフィーにかける（ｔＲ＝３３分、アセトニトリルの０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液勾配）。慣用的な脱塩（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ）により、オリゴヌクレオチドを生成する。
収率：１７．６ＯＤ
物質の同定は、ＥＳＩ質量分光法によって立証される：
Ｍ（計算値）＝３０８２Ｄ、（Ｍ＋２Ｈ）2+（測定値）＝１５４１．９Ｄ
実施例  ５
共役体の製造
１．  逐次プロセス
配列Ａ8のｐ−ＲＮＡオリゴマー、すなわち、オクタマーを実施例２に記載したように、エッペンドルフエコシン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｃｏｓｙｎ）Ｄ３００＋上で最初に製造し、ついで、以下の試薬を交換する：２％強のトリクロロ酢酸について６％強のジクロロ酢酸、ピリジン中のヨウ素についてコリジン（ｃｏｌｌｉｄｉｎｅ）中のヨウ素、テトラゾール溶液についてベンズイミダゾリウムトリフレート溶液。合成プログラムを変更した後、配列ＧＡＴＴＣのＤＮＡオリゴマーを公知の方法（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ  １９８４）に従いさらに合成する。脱アリル化、ヒドラジノリシス、ＨＰＬクロマトグラフィーおよび脱塩をｐ−ＲＮＡオリゴマーについて記載したように行い（上記参照）、所望される共役体を生成させる。
【０１４２】
２．  収束プロセス
実施例２に記載したように、配列４’−インドールリンカー−Ａ8−２’を有するｐ−ＲＮＡオリゴマーを製造、精製およびヨードアセチル化する。配列ＧＡＴＴＣ−チオールリンカーのＤＮＡオリゴマーを公知の方法（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ  １９８４）に従い合成し、精製する（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからの３’−チオールリンカー：Ｎｏ．２０−２９３３）。２つのフラグメントを緩衝溶液中に放置すると（Ｔ．Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４，  ５，  ３１２）、共役体が生成し、これは、最終的に、ＨＰＬＣによって精製する。
【０１４３】
実施例  ６
式４’ＡＧＧＣＡＩｎｄ２’を有するリンカーによるリンカーを含むｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成
１．１  オリゴヌクレオチドの固相合成
Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔは、ヌクレオ塩基アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンを表し、Ｉｎｄは、ヌクレオ塩基の形のリンカーとしてのアミノエチルインドール（インドールＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2）である。
【０１４４】
各場合、１５μｍｏｌを使用して、十分な自動固相合成を行った。１回の合成は、以下の工程からなる：
（ａ）  脱トリチレート化（Ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）：  ＣＨ2Ｃｌ2（７９ｍｌ）中６％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）で５分；
（ｂ）  ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）、アセトニトリル（２０ｍｌ）で洗浄し、アルゴンでフラッシュ；
（ｃ）  カップリング：  樹脂を活性剤（ＣＨ2Ｃｌ2（０．２ｍｌ）中０．５Ｍピリジン・ＨＣｌ）で洗浄し、ついで、活性剤（０．７６ｍｌ）および対応するヌクレオ塩基のホスホルアミダイト（０．７６ｍｌ：８当量；アセトニトリル中０．１Ｍ）の１対１の比で３０分処理；
（ｄ）  キャッピング：  ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｅｘａｓ，  ＵＳＡ製の５０％ＣａｐＡ（１０．５ｍｌ）および５０％ＣａｐＢ（１０．５ｍｌ）での2分間の処理（ＣａｐＡ：ＴＨＦ，ルチジン，無水酢酸；ＣａｐＢ：１−メチルイミダゾール，ＴＨＦ，ピリジン）；
（ｅ）  酸化：１２０ｍｌのヨウ素溶液での１分間の処理（アセトニトリル１００ｍｌ中４００ｍｇのヨウ素，４６ｍｌのＨ2Ｏおよび９．２ｍｌのｓｙｍ−コリジン）；および、
（ｆ）  アセトニトリル（２２ｍｌ）での洗浄。
【０１４５】
続くオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製を促進するために、最後のＤＭＴ（ジメトキシトリチル）基は、開裂しなかった。修飾ホスホルアミダイトとの最後のカップリングを検出するために、合成後、ＵＶ（５０３ｎｍ）でのトリチルカチオンの吸収を１％の樹脂で行った。
【０１４６】
１．２  オリゴヌクレオチドのワークアップ
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２７２ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（２７２ｍｇ）および炭酸水素ジエチルアンモニウムのＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）溶液で室温で５時間後アリルエーテル保護基を除去した。ついで、ガラス支持体をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）、アセトン（３０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）で洗浄した。パラジウム錯体残渣を除去するために、樹脂を０．１Ｍのナトリウムジエチルジチオカルバメート水和物水溶液で濯いだ。上記洗浄操作を逆の順序でさらに１回行った。ついで、樹脂を高減圧で１０分間乾燥させた。同時に脱ベンゾイル化するガラス支持体からの除去工程を、ＲＰ１８でのＨＰＬＣチェック後（１８−２５時間）、２４％ヒドラジン水和物溶液（６ｍｌ）中４℃で行い、オリゴヌクレオチド“Ｔｒｉｔｙｌ  ＯＮ”を活性化した（アセトニトリル、２０ｍｌ）Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジによりヒドラジンから遊離させた。ヒドラジンをＴＥＡＢ，０．１Ｍ（３０ｍｌ）で洗浄した。ついで、オリゴヌクレオチドをアセトニトリル／ＴＥＡＢ，０．１Ｍ（１０ｍｌ）で溶離させた。ついで、混合物をフラグメント配列の分離用のＨＰＬＣによって精製し、ＤＭＴ脱保護（８０％強のギ酸水溶液３０ｍｌ）を行った。最終的に脱塩すると（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  カートリッジにより、ＴＥＡＢ緩衝液０．１Ｍ／アセトニトリル：１／１）、純粋なオリゴヌクレオチドを生成した。
【０１４７】
実施例  ７
ｐ−ＲＮＡのＮ−（ヨードアセチルオキシ）コハク酸イミドによるヨードアセチル化
ｐ−ＲＮＡ配列：４’ＡＧＧＣＡＩｎｄ２’Ｍw＝２２６６．５６ｇ／ｍｏｌ、実施例１に従い製造した。
【０１４８】
１当量のｐ−ＲＮＡを０．１モルの炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．４）に溶解させ（３５０ｎｍ当たり１ｍｌ）、Ｎ−（ヨードアセチルオキシ）コハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液で処理した（１ｍｇ当たり４０μｌ）。バッチをアルミニウムフィルムで暗くし、それを室温で３０−９０分放置させた。
【０１４９】
反応の進行を分析用のＨＰＬＣによってモニターした。その標準条件は：
緩衝液Ａ：０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝水溶液
緩衝液Ｂ：０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝水：アセトニトリル１：４液
勾配：１０％Ｂから出発して、５０％Ｂまで４０分
カラム材料：Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  ＧｍｂＨからの１０μＭ登録商標ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  １００ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ
出発物質の保持時間：１８．４分
この場合の生成物の保持時間：２３．１分
反応が完了した後、バッチを水で４倍の体積に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  カートリッジＲＰ−１８（１５  ＯＤ  ２ｇ充填）を２×１０ｍｌのアセトニトリルおよび２×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴヌクレオチドを適用およびしみ込ませ、反応容器を２×１０ｍｌの水で洗浄し、塩と試薬とを除去するために、３×１０ｍｌの水で再度洗浄し、５０：１の水：アセトニトリル５×１ｍｌで最初に溶離させ、ついで、１：１の水：アセトニトリルで溶離させた。生成物は、１：１の画分で非常に良好な純度で溶離された。この画分を冷却および暗くして濃縮し、合わせ、再度濃縮した。
【０１５０】
収率は、ＵＶ吸収分光法により２６０ｎｍで測定した。
質量分析：
配列：４’ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−Ｉ）Ｔ２’
計算質量：２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ
ＭＨ22+の測定質量：１２１７．９ｇ／ｍｏｌ＝２４３３
実施例  ８
ｐ−ＲＮＡの限られたペプチド（ＣＹＳＫＶＧ）に対する共役
ヨードアセチル化したｐ−ＲＮＡ（Ｍw＝２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ）を緩衝システム（１１４ｎｍｏｌ当たり１０００μｌ）に溶解させ、ついで、ペプチドの緩衝溶液（２ｍｏｌ当量のＣＹＳＫＶＧペプチド；Ｍw＝６５５．７７３ｇ／ｍｏｌ；２２８ｎｍｏｌの２０μｌ緩衝液）で処理した。緩衝システム：Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ製のＢｏｒａｘ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０をＥＤＴＡジナトリウム塩の１０ミリモル溶液と１：１の比で混合し、ＨＣｌを使用し、ｐＨ６．３に調整した。この方法により、５ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡを含有する溶液が得られた。
【０１５１】
転化が完了するまで、バッチを暗くして室温に放置した。反応をＨＰＬＣ分析によってモニターした。その標準条件は：
緩衝液Ａ：０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝水溶液
緩衝液Ｂ：０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝水：アセトニトリル１：４液
勾配：１０％Ｂから出発して、５０％Ｂまで４０分
カラム材料：Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  ＧｍｂＨからの１０μＭ登録商標ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ  １００ＲＰ−１８；２５０×４
出発物質の保持時間：１７．６分
生成物の保持時間：１５．５分
反応が完了した後、ＲＰ−ＨＰＬＣによりバッチを直接精製した（標準条件は、上記参照。）
画分を冷却および暗くして濃縮し、合わせ、再度、濃縮した。残渣を水に取り、脱塩した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  カートリッジＲＰ−１８（１５  ＯＤ  ２ｇ充填）を２×１０ｍｌのアセトニトリルおよび２×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴを適用およびしみ込ませ、反応容器を２×１０ｍｌの水で洗浄し、塩を除去するために、３×１０ｍｌの水で再度洗浄し、１：１の水：アセトニトリルで溶離させた。生成物画分を濃縮し、合わせ、再度濃縮した。収率は、ＵＶ吸収分光法により２６０ｎｍで測定した。それらは、理論収率の７０−９５％に達した。
質量分析：
配列：４’ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−ＣＹＳＫＶＧ）Ｔ２’
ＭＨ22+計算質量：２９６２．３６ｇ／ｍｏｌ
ＭＨ22+の測定質量：１４８２．０ｇ／ｍｏｌ
実施例  ９
ｐ−ＲＮＡのペプチドライブラリーに対する共役
ヨードアセチル化したｐ−ＲＮＡ（Ｍw＝２４３４．５０ｇ／ｍｏｌ）を緩衝システムに溶解し（８３２ｎｍｏｌ当たり１３００μｌ）、ついで、緩衝液（８ｍｏｌ当量；平均分子量Ｍm＝６７７．８２ｇ／ｍｏｌ；４．５ｍｇ＝緩衝液２００μｌ中６．６６μｍｏｌ）中ペプチドライブラリー（ＣＫＲ−ＸＸ−ＯＨ；Ｘ＝Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）の溶液で処理した。緩衝システム：Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ製のＢｏｒａｘ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０をＥＤＴＡジナトリウム塩の１０ミリモル溶液と１：１の比で混合し、ＨＣｌを使用して、ｐＨ６．６に調整した。この方法により、５ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡを含有する溶液が得られた。
【０１５２】
転化が完了するまで、バッチを暗闇室温に放置した。反応をＨＰＬＣ分析によってモニターした。この場合に、出発物質は、７０時間後、消えた。分析用ＨＰＬＣの標準条件は：
緩衝液Ａ：０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝水溶液
緩衝液Ｂ：０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝水：アセトニトリル１：４液
勾配：１０％Ｂから出発して、５０％Ｂまで４０分
カラム材料：Ｍｅｒｃｋからの１０μＭ登録商標ＬｉＣｈｒｏｓｐｅｒｅ  １００ＲＰ−１８；２５０×４
出発物質の保持時間：１８．８分
生成物の保持時間：１３．９−３６．２分に数個のピーク
反応が完了した後、水を使用しバッチを４倍の体積に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  カートリッジＲＰ−１８（１５  ＯＤ  ２ｇ充填）を３×１０ｍｌのアセトニトリルおよび３×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴヌクレオチドを適用およびしみ込ませ、反応容器を２×１０ｍｌの水で再洗浄し、塩と過剰のペプチドとを除去するために、３×１０ｍｌの水で洗浄し、ＵＶ分光法によって生成物がもはや溶離されなくなるまで、１：１の水：アセトニトリルで溶離させた。画分を冷却および暗くして濃縮し、合わせ、再度濃縮した。
【図面の簡単な説明】
図１は、その天然形のＲＮＡ（左）及びｐ−ＮＡの形（右）の構造物ｍのセクションを示す。
図２は、Eschenmoser ら (1993)に従った、ｐ−Ｒｉｂｏ（Ａ，Ｕ）−オリゴヌクレオチドの合成を模式的に示す。
図３は、固体担体上に固定化された認識構造物（アレイ）の配列を模式的に示す。
【図１】
0004460153.tif 000048
【図２】
0004460153.tif 000049
0004460153.tif 000050
【図３】
0004460153.tif 000051