(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−もしくはＬ−リボース単位を含み、構造式：
【化１】
0004473445.tif 000022
［式中、Ｒ１はプリン−またはピリミジン−ファミリーの塩基またはかかる塩基の誘導体であり、
Ｒ２はプロトンまたはホスホン酸の置換された誘導体であり、
Ｒ３はプロトンまたは適当な保護基であり、
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、合計で６ないし３０個の炭素原子を含む３つのアルキル基である］
を有するリボヌクレオシド−誘導体。
【請求項２】
２’−Ｏ−位のシリルオキシメチル基のケイ素原子上の置換基（Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６）がイソプロピル基であることを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレオシド−誘導体。
【請求項３】
塩基（Ｒ１）がシトシン、グアニン、アデニン、ウラシルまたはチミンであることを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレオシド−誘導体。
【請求項４】
塩基（Ｒ１）がアシル−保護基を担持することを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレオシド−誘導体。
【請求項５】
ホスホン酸（Ｒ２）の置換された誘導体がＯ−およびＮ，Ｎ−置換されたアミノ−ホスフィノ基であることを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレオシド−誘導体。
【請求項６】
Ｏ−置換基が２−シアノエチル基であって、Ｎ−置換基がイソプロピル基であることを特徴とする請求項５に記載のリボヌクレオシド−誘導体。
【請求項７】
５’−位における酸素の保護基（Ｒ３）がモノメトキシトリチルまたはジメトキシトリチル基であることを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレオシド−誘導体。
【請求項８】
所定のヌクレオチド配列を持つＲＮＡ−オリゴヌクレオチドの化学合成のための請求項１に記載のリボヌクレオシド−誘導体の使用。
【請求項９】
５’−位における酸素が保護基によって保護されているリボヌクレオシド（ＩＩ）から、塩基の存在下で環状２’，３’−ジ−Ｏ−スタニル−誘導体を調製し、このスタニル−誘導体を、ケイ素原子上に３個のさらなる置換基を担持するシリルオキシメチルハロゲニドの添加によってリボヌクレオシド−誘導体に変換することを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレオシド−誘導体の製造方法。
【請求項１０】
さらに、ホスホン酸の誘導体を含む基で、リボヌクレオシド−誘導体を３’−位の酸素上で置換することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
式：
【化２】
0004473445.tif 000023
［式中、Ｙはハロゲンであって、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はイソプロピルである］
のシリルオキシメチルハロゲニド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸化学の分野に属し、リボヌクレオシド−誘導体およびリボヌクレオシド−誘導体の製造方法に関する。本発明のリボヌクレオシド誘導体はリボ核酸の機器合成に特に適する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明はリボ核酸（リボ−オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ）の化学合成、特に、かかるオリゴマーの機器合成ならびにかかるオリゴマーの構造的に関連する誘導体の合成に関する。
【０００３】
化学合成で調製された定義配列の純粋なオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｘ−線回折によるまたは核磁気共鳴分光法による単位結晶の構造解析の分野で使用される。この種類の研究は、分子レベルでの生物学的プロセスの理解に寄与し、とりわけ、新規治療概念の発展を可能にする。中枢的生物学的クラスの化合物（メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ）を構成するリボ核酸は、医療化学で興味ある対象である。この意味において、潜在的にＲＮＡと相互作用する化合物の迅速で信頼の置けるテストのためのアッセイの利用性は高度に望ましい。テストのためのかかるオリゴヌクレオチドの（酵素、生物等を用いる生産とは対照的に）化学的合成によって、目的的修飾の導入が可能となり、その修飾は、例えば、所望の相互作用の簡便な定量を可能とし、あるいは特異的相互作用を正確な調査に接近可能とする。
【０００４】
また、天然および修飾ＲＮＡ−オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ−およびＤＮＡ−オリゴヌクレオチド配列および他の化合物（アプタマーおよびリボザイム）の選択的認識および／または選択的修飾のためのツールとしての用途がある。かかる化合物の化学的合成で達成されるべき改良は、目的的修飾の導入を可能とし、かくして、医療診断および治療における前記タイプの化合物の適用の分野を大幅に拡大する。
【０００５】
ＲＮＡ−オリゴヌクレオチドおよびその誘導体の化学的合成のための全ての公知の方法は、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド（２’−位におけるヒドロキシ基を含むＲＮＡとは対照的に、２’−デオキシリボ核酸）の合成のために非常に首尾よく発展してきた概念に関連する。ＤＮＡ−およびＲＮＡ−オリゴヌクレオチドの機器合成は、通常、所望の長さの鎖が達成されるまで、各々１の合成サイクルの工程でさらに保護ヌクレオシド−誘導体がそれにカップリングされる固相に固定化された保護ヌクレオシド−誘導体に基づく。
【０００６】
リボ核酸の化学合成における適用のためのリボヌクレオシド−誘導体はＤ−もしくはＬ−リボース単位を含み、以下の構造式：
0004473445.tif 000002
【０００７】
［式中、Ｒ1はプリン−またはピリミジン−ファミリーの塩基またはかかる塩基の誘導体であり、
Ｒ2はプロトンまたはホスホン酸の置換された誘導体であり、
Ｒ3はプロトンまたは５’−位の酸素原子のための適当な保護基であり、
Ｘは２’−位の酸素原子のための保護基である］
を有する。
【０００８】
２’−位における酸素原子のための保護基Ｘは、以下の条件を実質的に満たすものである。
−  保護基の導入は出来る限り単純なものでなければならず、出来る限り異性化生成物がない均一な化合物を生じなければならない。
−  保護基はカップリング条件下で絶対的に安定なものでなければならない。
−  保護基は高いカップリング収率を可能とする構造を有しなければならない。
−  保護基は調製すべき化合物の分解または化学的変化なくして完全に除去できるものでなければならない。
【０００９】
２’−位のためにこれまで使用されてきた保護基は、３つの以下のタイプに実質的に属している。多数のさらなるかかる保護基タイプが存在する。しかしながら、それらは、種々の理由で、完全に成功したものではなかった。
【００１０】
ａ）酸感受性２’−Ｏ−アセチル−保護基［１］：
例：Ｘ＝
0004473445.tif 000003
【００１１】
このタイプの保護基は容易に導入され、かかる保護基ならびにそれらを担持するヌクレオシドを確立するのに要する化学品は商業的に入手可能である。保護のタイプの不利は、保護基が鎖の合成で完全には安定ではない、かかる保護されたヌクレオシド−誘導体を用いると、中程度のカップリング収率が達成できるに過ぎない、および脱保護に際しての異性化が可能であるという事実である。
【００１２】
ｂ）光感受性２’−Ｏ−オルト−ニトロフェベンジルオキシメチル−保護基［２］：
例：Ｘ＝
0004473445.tif 000004
【００１３】
このタイプの保護基は容易に導入でき、脱保護は完全に直交し、良好なカップリング収率が達成できる。このタイプの保護基の不利は、完全な脱保護が時々可能ではなく、保護基を確立するのに要する化学品は市場では入手できないという事実である。
【００１４】
ｃ）フッ化物感受性２’−Ｏ−シリル−保護基［３］：
例：Ｘ＝
0004473445.tif 000005
【００１５】
このタイプの保護基は最も成功したものである。それは産業界において十分に確立されている。というのは、初期の８０年代には、必要な化学品は市場で入手できたからである。このタイプの保護基は容易かつ完全に除去でき（脱保護）、９８％までのカップリング収率が、１０ないし２０分のオーダーのカップリング時間にて達成することができる。この結果、約３５単位までのオリゴヌクレオチドについては、５０％以上のオーダーの商業的に合理的な収率がもたらされる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
鎖形成の収率は、鎖に含まれる単位の数のパワーに至る各カップリング工程の収率に対応する。これは、カップリング収率の増加は経済的理由で有利であるのみならず、より長い鎖を形成するのを可能にする。カップリング収率を増加させるための過去および現在の努力はカップリングパラメーターに集中しており、その結果、前記した９８％の最大が得られた。
【００１７】
本発明の目的は、確立された器具および確立された方法工程が依然として適用できるように、鎖形成化学に対する重要な変化無くして、ＲＮＡ−鎖形成工程（カップリング収率）の収率の実質的増加である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
この目的は、２’−Ｏ−位が保護されたリボヌクレオシド誘導体を新規保護基とカップリングさせることによって達成される。実施例に示されるように、新規リボヌクレオシドを用い、９９％を超える、恐らくは９９．５％を超えるカップリング収率が達成することができる。さらに、このカップリング収率は、より短いカップリング時間で達成され、これは本発明のリボヌクレオシド−誘導体のさらなる利点を構成する。
【００１９】
本発明のリボヌクレオシド誘導体を用いることによって達成される少なくとも１パーセントのオーダーのカップリング収率増加の結果、５０単位の鎖では６０ないし７０％のオーダーの鎖形成収率が（公知の方法では：約３５％）、１００単位の鎖では４０ないし６０％のオーダーの鎖形成収率（公知の方法では：約１３％）が得られる。
【００２０】
本発明のヌクレオシド−誘導体は、ｂ）およびｃ）の下で前記した公知の保護基を持つヌクレオシド−誘導体の利点を統合する（保護基の良好な導入性、保護基の良好な安定性、簡便な脱保護）が、脱保護条件下での異性化および鎖切断である、特にｃ）下で言及した保護基の既知の不利を示さない。
【００２１】
本発明のリボヌクレオシド−誘導体は、２’−Ｏ−シリルオキシメチル保護基（構造式５）を含有し、それにより、シリルオキシメチル基のケイ素原子はさらに３つの同一または異なる置換基を含む。これらの３つの置換基は、有利には、アルキル−またはアリール−置換基である。該３つのアルキル−またはアリール−基はアリール−アルキル組合せでもあり得、ヘテロ原子で置換することができおよび／または環形態で相互に結合することができる。それは、２’−Ｏ−シリルオキシメチル基の３つの置換基が一緒に６ないし３０個の間のＣ−原子を含むことができることを示す。
【００２２】
Ｘ＝
0004473445.tif 000006
【００２３】
例として、２’−Ｏ−シリルオキシメチル保護基におけるケイ素原子の３つの置換基は３つのイソプロピル基である（構造式６）。
【００２４】
Ｘ＝
0004473445.tif 000007
【００２５】
ＲＮＡ鎖形成のために本発明リボヌクレオシド誘導体を用いることによって達成される利点は、以下のように説明することができる。
−  本発明の２’−Ｏ−保護リボヌクレオシド誘導体におけるヌクレオシドおよび保護基の間の結合のアセタール性質のため、リボヌクレオシド−誘導体内部の異なる位置への保護基の移動は起こり得ず、特に隣接３’−Ｏ−位への移動は起こり得ない。かかる異性化は、通常の２’−Ｏ−シリル置換ＲＮＡ単位（保護基ｃのタイプ、前記参照）の合成における重要なよく知られて問題であり［６，７］、この問題は新しい保護基による本発明のリボヌクレオシド−誘導体で解決される。
−  ２’−Ｏ−シリルオキシメチル保護基はより小さい。何故ならば、それは、比較的小さく立体的に要求されないメテン単位を介してリボースに結合するからである。２’−酸素原子に直接的に結合した公知のかなり大きいトリアルキルシリル基を持つ単位（保護基ｃ）のタイプ、前記参照）とは対照的に、これは、カップリング反応のための反応中心（３’−Ｏ−リン原子）の立体障害を減少させ、かくして、カップリング収率を増加させる。
【００２６】
立体障害によって引き起こされた鎖形成の困難は本発明のリボ核酸単位の保護基のメトキシ−スペーサーによって大いに減少されるので、立体効果は、ケイ素原子の３つの置換基を選択する場合に実質的に無視することができる。その代わり、さらなる基準、特に酸および／または塩基に対する安定性を考慮することができる。さらに、保護基をより高度な特異的ケースの要件に適合させることができる。
【００２７】
２’−Ｏ−シリルオキシメチル保護基の分離（脱保護）は、実質的に、通常の２’−Ｏ−シリル−保護基の分離と同一条件下で、すなわち、フッ化物イオンまたはフルオロケイ酸での処理によって行うことができる。この脱保護反応は、よく確立され問題のない反応としてリボ核酸単位の使用者に知られており、この反応が本発明単位を脱保護するのに模倣することができるという事実はこれらの単位のさらなる利点である。
【００２８】
本発明の化合物を調製するには、効果的で安くかつ簡便な合成方法が使用され、その方法は、望まない異性体が実質的に無い生成物を生じる（純度＞９９．８％）。本発明のリボヌクレオシド−誘導体を用いることによって、従前に可能であったよりも長い（４０ヌクレオシド単位よりも大）鎖を持つ合成により調製されたオリゴ−核酸が利用可能となり、より多い量（個々の合成当たり１−２０ｍｇ）で均一で化学的に純粋な形態（所望の構造を持つ化合物の９０重量％を超える）のＲＮＡ−オリゴヌクレオチドが、多くの興味深い適用で利用できるようになる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
0004473445.tif 000008
【００３０】
反応７→８→９は、本発明による化合物の合成の例を示す。この合成は、既に部分的に保護されたヌクレオシド７から出発する。環状２’，３’−ジ−Ｏ−ジアルキル−（またはジアリール）スタニル誘導体（例えば、ジブチル−スタニル−誘導体）は、過剰の第三級アミン塩基の存在下、アルカリ性条件下で合成され、その誘導体はトリ（アルキル−および／またはアリール）−置換シリルオキシメチルクロリド（または他のハロゲニド）と反応して、リボヌクレオシド−誘導体８を形成する。次いで、これを、確立された条件［４］下で対応するホスホルアミダイト９に変換する。
【００３１】
前記したごとく、２’−Ｏ−シリルオキシメチル保護基（この保護基は本発明のヌクレオシド−誘導体を区別する）の置換基Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は同一または異なるアルキル−またはアリール−置換基またはそれらの組合せであり、ヘテロ原子で置換することもできおよび／または各他の形成性環構造に結合することができる。３つの置換基は、一緒になって、有利には、６ないし３０の間の炭素原子を含む。それらは、例えば、３つのイソプロピル基である。
【００３２】
２’−Ｏ−位において未だ保護されていない初期生成物の、保護された生成物の成分および他の置換基は、保護されたリボヌクレオシド−誘導体を調製する通常の合成方法で使用される成分および置換基に正確に対応する。
【００３３】
５’−Ｏ−位における保護基Ｒ3は、例えば、モノメトキシトリチル−もしくはジメトキシトリチル−基または鎖形成の間に成長する配列から除去される異なる適当な基であり、それは鎖に付加されるべき次の単位をカップリングさせるための結合位置を供給する。
【００３４】
リボヌクレオシド−誘導体の塩基−成分Ｒ1はプリン−もしくはピリミジンファミリーの塩基、例えば、５種のヌクレオ塩基アデニン、シトシン、チミン、ウラシル、グアニンまたはその誘導体のうちの１つである。それは、鎖生成後に除去することができるアシル−置換基によって保護することができる。
【００３５】
３’−Ｏ−位におけるホスホン酸の誘導体はＮ，Ｎ−およびＯ−置換ホスホルアミダイト基であり、それにより、Ｎ−置換基Ｒ7およびＲ8はアルキル−またはアリール−基であり、これは、さらに置換することができおよび／または相互に環状に結合することができる。Ｒ7およびＲ8は、例えば、イソプロピル基である。二置換アミノ基の窒素を活性化することによって、リン中心を、該単位を成長する鎖にカップリングさせるために活性化する。
【００３６】
ホスホルアミダイト基のＯ−置換基Ｒ9は、アルキル−またはアリール−置換基（ヘテロ原子によって置換される場合あり）であり、これは鎖生成後に除去される。
【００３７】
オリゴヌクレオチド−合成の分野の当業者は、本発明のリボヌクレオシド−誘導体の合成およびオリゴヌクレオチドを形成するためのそれらのカップリングの原理を知っている。リボ核酸の合成用の本発明単位の合成の単純性および優秀性のさらなる説明のために、いくつかの実施例は以下の通りである。
【００３８】
実施例１
0004473445.tif 000009
【００３９】
ウリジン単位１−｛３’−Ｏ−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−［４，４’−ジメトキシトリチル］−２’−Ｏ−［トリイソプロピル−シリルオキシメチル］−β−Ｄ−リボフラノシル｝−ウラシル１２の合成は、１−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−ウリジン１０から出発して行い、中間体生成物１１：１−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（トリイソプロピルシリルオキシメチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］−ウラシルを介して行った。
【００４０】
保護されたリボヌクレオシド−誘導体１１は、シリカゲル上の単純なクロマトグラフィーによって異性体的に純粋な形態に精製した。
【００４１】
実施例２
0004473445.tif 000010
【００４２】
２分のカップリング時間にて、商業的に入手可能な鎖形成器具に形成されたジトリチル化アッセイによって示されるカップリング収率は以下のようであることが判明した：
0004473445.tif 000011
この結果、９９．３％の平均カップリング収率となる。
【００４３】
実施例３：（［８］による）（クロロメトキシ）（トリイソプロピル）シランの調製のための手法
0004473445.tif 000012
【００４４】
０．１モルのエタンチオール中の０．１モルのパラホルムアルデヒドの懸濁液を１滴の１０ＮのＮａＯＨ水溶液で処理し、清澄な溶液が得られるまで、室温で撹拌した。５０℃で１時間撹拌した後、５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2および０．２モルのイミダゾール、続いて０．０９モルの（ｉ−Ｐｒｏｐ）3ＳｉＣｌを添加した。得られた懸濁液を室温で一晩撹拌し、４００ｍｌのヘキサンで希釈した。２５０ｍｌの２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4水溶液の添加、撹拌および相分離の後、有機相を蒸発させた。残渣を２５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2に溶解させ、０．０９モルの塩化スルフリルで処理し、室温で１時間撹拌し、蒸発させ、真空中で蒸留した。生成物は無色粘性油として得られた（収率：９０％）。
【００４５】
沸点：５０℃（０．１トル）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．０８−１．１０（ｍ，２１Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；５．６６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2Ｃｌ）。
【００４６】
イソプロピル以外の他の置換基を持つ塩化シリルオキシメチルを調製するには、ならびに他のシリルオキシメチルハロゲナイドを調製するには、前記で与えた手法を対応して適合させる。
【００４７】
実施例４：２’−Ｏ−［（ｉ−Ｐｒｏｐ）3ＳｉＯＣＨ2］−保護ヌクレオシド５−８の調製のための手法
0004473445.tif 000013
【００４８】
0004473445.tif 000014
４０ｍｌの１，２−ジクロロエタン中の１０ミリモルの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル化、結局は塩基保護されたヌクレオシド１−４の溶液（［９］による調製）を室温にてまず５０ミリモルのＮ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンで、次いで、１１ミリモルの二塩化ジブチルスズで処理した。室温で１５分間撹拌した後、反応混合物を８０℃まで加熱し、１３ミリモルの（クロロメトキシ）（トリイソプピル）−シランで処理し、痕跡量の出発物質しか薄層クロノトグラフィーによって検出できなくなるまで、８０℃で３０分ないし９０分撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物を２００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、２００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3水溶液を添加し、得られた混合物を２０分間撹拌した。相分離の後に得られた曇った有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥し、セライト（Ｃｅｌｉｔｅ、登録商標）のパッドを通して濾過した。濃縮後に得られた残渣を、溶離剤として、２％ＮＥｔ3を含有するヘキサン／酢酸エチル混合液を用いる１００ｇのシリカゲル上のカラム−クロマトグラフィーに付した。生成物は無色フォームとして得られた。
【００４９】
Ｎ6−ベンゾイル−９−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（５）：
収率：４５−５５％
ＴＬＣ：Ｒf０．６０（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  ７：３）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．０３−１．１５（ｍ，２１Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；３．０８（ｄ，Ｊ＝３．７，１Ｈ，ＨＯ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）；３．４０（ｄ×ｄ，Ｊ＝１０．２，４．１，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（５’））；３．６２（ｄ×ｄ，Ｊ＝１０．２，３．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ’−Ｃ（５’））；３．７８（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3Ｏ−Ａｒ）；４．３１（ｑ，Ｊ＝４．０，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’））；４．５７（ｂｒ．ｑ，ＪÅ４，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際してｔに変化）；４．９８（ｂｒ，ｔ，ＪÅ５，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’））；４．９８および５．１６（２つのｄ，Ｊ＝４．７，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；６．２４（ｄ，Ｊ＝５．６，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．７９−６．８３（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２１−７．６５（ｍ，１２Ｈ，芳香族Ｈ）；８．０１−８．０４（ｍ，２Ｈ，芳香族Ｈ）；８．２１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２））；８．７３（ｓ，Ｈ−Ｃ（８））；８．９７（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ−Ｃ（６），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）。
【００５０】
Ｎ4−ベンゾイル−１−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン（６）：
収率：５０−６０％
ＴＬＣ：Ｒf０．６５（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン７：３）。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．０２−１．１８（ｍ，２１Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；３．３４（ｄ，Ｊ＝８．３，１Ｈ，ＨＯ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）；３．５５（ｄ×ｄ，Ｊ＝１１．６，３．０，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（５’））；３．６２（ｄ×ｄ，Ｊ＝１１．６，３．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ’−Ｃ（５’））；３．８３（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3Ｏ−Ａｒ）；４．１２（ｄ×ｔ，Ｊ＝８．３，３．０，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’））；４．２８（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’））；４．４１（ｔ×ｄ，Ｊ＝８．３，５．４，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際してｄ×ｄに変化）；５．１９および５．３０（２つのｄ，Ｊ＝４．６，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；６．０１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．８４−６．９２（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２３−７．６２（ｍ，１３Ｈ，１２芳香族ＨおよびＨ−Ｃ（５））；７．８５−７．９２（ｍ，２Ｈ，芳香族Ｈ）；８．５４（ｄ，Ｊ＝６．５，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（６））；８．５５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＨＮ−Ｃ（４），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）。
【００５１】
Ｎ3−イソブチリル−９−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル））−β−Ｄ−リボフラノシル］グアニン（７）：
収率：８０−９０％
ＴＬＣ：Ｒf０．５０（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン７：３）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：０．６６，０．８７（２ｄ，Ｊ＝６．９，６Ｈ，ＣＨ（ＣＨ3）2）；１．０２−１．１１（ｍ，２１Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；１．４９（ｈｅｐｔ，Ｊ＝６．９，１Ｈ，ＣＨ（ＣＨ3）2）；３．０２（ｄ，Ｊ＝１．９，１Ｈ，ＨＯ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）；３．００（ｄｄ，Ｊ＝３．１，１０．６，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（５’））；３．５４（ｄｄ，Ｊ＝２．１，１０．６，１Ｈ，Ｈ’−Ｃ（５’））；３．７６，３．７７（２ｓ，２×３Ｈ，ＯＣＨ3）；４．２２（ｂｒ．ｑ，ＪÅ２，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’））；４．５７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際してｄ×ｄへ変化）；４．９５，５．１４（２ｄ，Ｊ＝４．７，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；５．０８（ｄｄ，Ｊ＝５．１，７．２，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’））；５．８９（ｄ，Ｊ＝７．２，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．７７−６．８２（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２１−７．５７（ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ）；７．７７（ｂｒ．ｓ，ＮＨ−Ｃ（２））；７．７９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（８））；１１．９５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｎ（１），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）。
【００５２】
１−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（８）：
収率：４５−５５％
ＴＬＣ：Ｒf０．７５（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン  ３：２）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．０２−１．１８（ｍ，２１Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；３．１７（ｄ，Ｊ＝５．５，１Ｈ，ＨＯ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）；３．５１（ｄ，Ｊ＝２．５，２Ｈ，Ｈ−Ｃ（５’）およびＨ’−Ｃ（５’））；３．８０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3Ｏ−Ａｒ）；４．１２（ｄ×ｔ，Ｊ＝５．５，２．５，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’））；４．２８（ｄ×ｄ，Ｊ＝３．２，５．５，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’））；４．４７（ｑ，Ｊ＝５．５，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（３’），Ｄ2Ｏでの処理に際してｔに変化）；５．０４および５．２３（２つのｄ，Ｊ＝５．０，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；５．３０（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（５））；６．０３（ｄ，Ｊ＝３．２，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．８０−６．８８（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２４−７．４２（ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ）；７．９４（ｄ，Ｊ＝７．９，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（６））；８．５６（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｎ（３），Ｄ2Ｏでの処理に際して消失）。
【００５３】
実施例５：ホスホルアミダイト９−１２の調製の手法
0004473445.tif 000015
【００５４】
0004473445.tif 000016
３０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中の１０ミリモルの保護されたヌクレオシド５−８の溶液を２０ミリモルのＮ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジソプロピルアミンおよび２０ミリモルのクロロ（２−シアノエトキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン［４］で連続的に処理した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を、溶離剤として２％ＮＥｔ3を含有するヘキサン／酢酸エチル混合液を用いる１５０ｇのシリカゲル上のカラム−クロマトグラフィーに付した。生成物は無色フォーム（ジアステレオマーの混合物）として得られた。
【００５５】
Ｎ6−ベンゾイル−９−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル））−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン  ３’−（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト］（９）：
収率：９０−９５％
ＴＬＣ：Ｒf＝０．３０（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ７：３）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：０．８９−１．２２（ｍ，３３Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ3；（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；２．３９（ｔ，Ｊ＝６．５，１Ｈ，ＣＨ2ＣＮ）；２．６５（ｄｔ，Ｊ＝１．２，６．２，１Ｈ，ＣＨ2ＣＮ）；３．３６（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ3）；３．５１−３．７３（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ2，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ），Ｈ−Ｃ（５’）；３．７７，３．７８（２ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ2）；３．８４−３．９９（ｍ，１Ｈ，Ｈ’−Ｃ（５’））；４．３７，４．４２（２ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’））；４．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（３’））；４．９４−５．０２（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；５．２４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’））；６．２０，６．２３（２ｄ，Ｊ＝５．６，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．７５−６．８１（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２１−７．６１（ｍ，１２Ｈ，芳香族Ｈ）；７．９９−８．０４（ｍ，２Ｈ，芳香族Ｈ）；８．１８，８．２０（２ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２））；８．６９，８．７２（２ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（８））；９．０１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ−Ｃ（６））。31Ｐ−ＮＭＲ（１２０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１５０．８，１５１．６。
【００５６】
Ｎ4−ベンゾイル−９−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン  ３’−［（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト］（１０）：
収率：９０−９５％
ＴＬＣ：Ｒf０．５０／０．４５（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ７：３）1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：０．９９−１．２３（ｍ，３３Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ3；（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；２．３９（ｔ，Ｊ＝６．３，１Ｈ，ＣＨ2ＣＮ）；２．６１（ｄｔ，Ｊ＝２．５，６．２，１Ｈ，ＣＨ2ＣＮ）； ３．４３−３．９７（ｍ，１２Ｈ，ＯＣＨ2，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ，ＨおよびＨ’−Ｃ（５’），ＯＣＨ3）；４．２９−４．５６（ｍ，３Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’，３’，４’））；５．２０（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；６．１８，６．１９（２ｄ，Ｊ＝２．０，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．８４−６．８９（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２６−７．６３（ｍ，１３Ｈ，芳香族Ｈ，Ｈ−Ｃ（５））；７．８８（ｍ，２Ｈ，芳香族Ｈ）；８．４１，８．５１（２ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（６））；８．４０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ−Ｃ（４））。31Ｐ−ＮＭＲ（１２０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１５０．７，１５０．９。
【００５７】
Ｎ2−ベンゾイル−９−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル））−β−Ｄ−リボフラノシル］グアニン  ３’−［（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト］（１１）：
収率：９０−９５％
ＴＬＣ：Ｒf＝０．５５（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  １：１）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：０．７５−１．２９（ｍ，３９Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ3および（ｉ−Ｐｒｏｐ）2ＣＨＣＯＯ−；（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−）からのＣＨ3およびＣＨ；１．６２，１．９１（２ｈｅｐｔ，Ｊ＝６．９，１Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2ＣＨＣＯＯ−からのＣＨ）；２．２６（ｔ，Ｊ＝６．６，１Ｈ，ＣＨ2ＣＮ）；２．７４（ｄｔ，Ｊ＝１．１，６．８，１Ｈ；ＣＨ2ＣＮ）；３．１９（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ2）；３．４５−３．６９（ｍ，３Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ，ＯＣＨ2）；３．７５６，３．７６１，３．７６５（３ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ3）；３．８８−４．１７（ｍ，２Ｈ，Ｈ，Ｈ’−Ｃ（５’））；４．２２，４．３２（２ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’））；４．５８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（３’））；４．８９−４．９８（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；５．０７，５．１６（２ｄｄ，Ｊ＝４．７，７．６，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’））；５．８４，５．９６（２ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．７６−６．８１（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２１−７．５５（ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ）；７．７４，７．７９（２ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（８））；７．８７，８．２６（２ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ−Ｃ（２））；１１．９７（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｎ（１））。31Ｐ−ＮＭＲ（１２０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１５０．４，１５０．７。
【００５８】
１−［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル  ３’−［（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト］（１２）：
収率：９０−９５％
ＴＬＣ：Ｒf０．５０（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  ７：３）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１．０２−１．１８（ｍ，３３Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ3；（ｉ−Ｐｒｏｐ）3Ｓｉ−からのＣＨ3およびＣＨ）；２．３９（ｔ，Ｊ＝６．６，１Ｈ，ＣＨ2ＣＮ）；２．５３（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ2）；２．６４（ｄｔ，Ｊ＝１．５，６．２，１Ｈ，ＣＨ2ＣＮ）；３．３９（ｍ，１Ｈ，ＯＣＨ2）；３．５２−３．６９（ｍ，３．５Ｈ，（ｉ−Ｐｒｏｐ）2Ｎ−からのＣＨ，Ｈ，Ｈ’−Ｃ（５’））；３．７８，３．７９，３．８０（３ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ3）；３．８２−３．９６（ｍ，０．５Ｈ，Ｈ’−Ｃ（５’））；４．１９，４．２７（２ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’））；４．３９−４．４９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−Ｃ（２’，３’））；４．９８−５．０７（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ2Ｏ）；５．３２，５．３６（２ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（５））；６．１２（ｄ，Ｊ＝４．４，０．５Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．１３（ｄ，Ｊ＝４．２，０．５Ｈ，Ｈ−Ｃ（１’））；６．８１−６．８６（ｍ，４Ｈ，芳香族Ｈ）；７．２３−７．４３（ｍ，９Ｈ，芳香族Ｈ）；７．８１，７．８６（２ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（６））；８．７５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｎ（２））。31Ｐ−ＮＭＲ（１２０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：１５０．９，１５１．３。
【００５９】
実施例６：ホスホルアミダイト９−１２でのリボ核酸の合成の手法
典型的な合成において、２μモルの適当に保護された（Sigmaからの）リボヌクレオシドを負荷した商業的に入手可能な「Controlled Pore Glass（制御孔ガラス)」支持体をＤＮＡ−合成器（Pharmacia Gene Assembler）で用いた。１．３μモルスケールのＤＮＡ−オリゴヌクレオチドの合成のために開発された製造業者のオリジナルのプロトコル［１０］を以下の例外において用いた：各カップリングでは、０．１６ｍｌの０．０８Ｍ（＝１．２８μモル）のホスホルアミダイト溶液を使用し、カップリング時間を１２分に調整した。ビルトイン脱トリチル化アッセイによって測定したカップリング収率は、９９．９％までの個々のカップリング収率にて平均９９％を超えた。
【００６０】
ホスホルアミダイト９−１２から得られた粗製オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ追跡を以下の図１および２に示す。調製で使用したパラメーターは以下の通りであつた：
１  Ｈ2Ｏ／ＥｔＯＨ  １：１中の１０Ｍ  ＣＨ3ＮＨ2；２５℃、５時間
２  ＴＨＦ中の１Ｍテトラブチルアンモニウムフッ化物；２５℃、５時間
３  逆相カラム上でのクロトグラフィー
配列ｒ（ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ）は８７％の全カップリング収率にて製造され、配列ｒ（ＧＣＵＣＧＵＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＧＡＣＣＧＵ）は７４％の全カップリング収率にて製造された。
【００６１】
実施例７
以下の鎖は実施例２に示した方法にて、脱トリチル化アッセイによって示された以下の平均カップリング収率で合成した。
0004473445.tif 000017
実施例１８
本発明のリボヌクレオシド誘導体を用いるＲＮＡ−鎖形成および２’−位の酸素原子上のシリル−保護基を持つ公知のリボヌクレオシド誘導体の間の比較には、種々の鎖を、ホスホルアミダイトＡまたはＢいずれかを用いて合成した。
0004473445.tif 000018
【００６２】
１．５μモルの固体支持体、１２０μｌ（０．１Ｍ）のホスホルアミダイト溶液（モル−当量：８）および３６０μｌの０．２５Ｍ−ベンジルチオテトラゾールを用いるＲＮＡ−合成では、以下の平均カップリング収率（脱トリチル化アッセイによる）が見いだされた：
0004473445.tif 000019
結果は、２つのホスホルアミダイトを用いる合成の間のカップリング時間に対する異なる依存性を明瞭に示す。
【００６３】
塩基脱保護（アンモノリシス）では、ホスホルアミダイトＡからの鎖形成をエタノール／水（１：１）中の８Ｍメチルアミンで２時間処理した。２４時間までのアンモノリシスでの分解は見いだされなかった。ホスホルアミダイトＢからの鎖形成を、３０分間の間、技術水準に従って、水中の４Ｍメチルアミンおよび７Ｍアンモニアで処理した。
【００６４】
２’−Ｏ−位の脱保護では、水中のテトラブチルアンモニウムフッ化物で、テホスホルアミダイトＡからの鎖形成を３時間処理し、ホスホルアミダイトＢからの鎖形成を１４ないし２６時間処理した。４８時間までのホスホルアミダイトＡからの鎖形成のさらなる処理は、いずれの鎖切断も生じなかった。
文献
0004473445.tif 000020
0004473445.tif 000021