(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンベロープを有するウイルスのエンベロープ糖タンパク質に結合でき、前記ウイルスの感染性を中和又は低下できる、配列表の配列番号１、３又は、５−２７に示される核酸配列を有する核酸分子。
【請求項２】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ウイルスがＨＩＶ−１である、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記エンベロープ糖タンパク質がｇｐ１２０である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記修飾された塩基が以下の手段
（ｉ）Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＣＨ３によるピリミジンの６もしくは８位、又はプリンの５位の修飾、
（ｉｉ）ＮＨ３によるピリミジンの２位の修飾、
（ｉｉｉ）ピリミジンの修飾Ｏ６−ＣＨ３、Ｎ６−ＣＨ３及びＮ２−ＣＨ３、
（ｉｖ）糖部２′位の修飾、
（ｖ）３′位及び／又は５′位のキャッピング
の任意の１つ又は複数により修飾された、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子と、任意選択で１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項８】
ＨＩＶ感染症の治療に使用するための薬の製造における、請求項１から６のいずれか一項で記載された少なくとも１つの核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ウイルスエンベロープタンパク質と結合するアプタマー、さらに具体的にはＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０と結合するアプタマーに関する。
【０００２】
ウイルスは現在の抗ウイルス薬ならびに体液性及び細胞性適応免疫の選択圧に抵抗する戦略を展開することができる。例えば、侵入にＣＣＲ５補助受容体を使用しＨＩＶ−１の伝染とＡＩＤＳの病原性に優性のウイルス表現型であるＨＩＶ−１、Ｒ５株は、抗体による中和に比較的抵抗性である。
【０００３】
現在の抗ウイルス薬は、多くのＨＩＶ−１陽性患者の生活の質を延長したが、感染した患者からウイルスを除去しない（１、２）。組換えＨＩＶ−１表面エンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０に基づくワクチン抗原の候補が、ＨＩＶ−１の初代単離物（Ｐｌｓ）を中和する抗体を誘発しないことと、薬剤耐性ＨＩＶ−１株の迅速な出現は、現在使用されている抗ウイルス薬と異なる様式を有する新規な抗レトロウイルス薬を発見するための継続努力を促進した。一つの取り組みは、ウイルスが宿主細胞に感染する段階を標的とすることである。標的細胞へのＨＩＶ−１の侵入、その向細胞性及びＡＩＤＳの病原性はウイルス粒子の表面糖タンパク質ｇｐ１２０、具体的には超可変ループ（３〜５）の配列によりほとんど決定される。例えば、ｇｐ１２０の配列の１０個の外部部分における変動が、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４のようなケモカイン受容体との相互作用を左右することによりウイルスの向細胞性を決定している（６）。Ｒ５株として知られている、前者補助受容体に依存する株は宿主から宿主へと優先的に伝染し（７）、感染の無症候段階で優勢であり（８、９）、かつＡＩＤＳを引き起こすのに十分である（１０）。
【０００４】
ＨＩＶ−１には２つの主要な表現型クラス、すなわち不死化リンパ芽球細胞系に優先的に感染するもの（Ｔ向性）及び一次マクロファージに感染するもの（Ｍ向性）がある。Ｍ向性株は、ｉｎ  ｖｉｖｏ感染の全段階で優勢であり、抗体で中和することが特に困難である。
【０００５】
アプタマーは、概して２０から１２０個の核酸を有するリガンドであり、タンパク質の表面の機能的に保存された部位を規定するために使用することができる。アプタマーとウイルスとの結合の効果は、その結合部位が感染に必須であれば、細胞の感染を予防することができることである。ＨＩＶの場合、現在の市販されている薬剤は、その総てが、ウイルスの複製を防止するために、逆転写酵素やプロテアーゼなどの細胞内標的に作用する。従って、これらの薬剤はすでに感染を受けた細胞を処理するためにのみ使用できる。薬剤耐性ウイルスが現在出現しているため、抗ウイルス療法のための新薬を突き止めることがさらに重要になっている。細胞の感染を防止する治療が大いに望ましいであろう。これは、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を適当なアプタマーでターゲティングすることにより行うことができよう。
【０００６】
本発明の例示的なアプタマーは、一連のＨＩＶ−１株のｇｐ１２０糖タンパク質と結合でき、何桁も大きい強度でそれらの感染性を中和できる。一次白血球にのみ感染する臨床的に関連のある株の場合、アプタマーでみられる中和度は、抗体及び他のどんな特異的リガンドと比べて前例がない。
【０００７】
ＨＩＶのｇｐ−１２０分子と結合するアプタマーは以前に記載されている（Ｓａｙｅｒら  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９３  ９２４−３１）。しかし、これらのアプタマーはＴ向性株由来のｇｐ１２０に対して作製されたもので、ウイルスを中和できなかった。従って、それらは臨床的に有用とは思われない。本発明のアプタマーはＭ向性ｇｐ１２０と結合し、ウイルスを中和できる。
【０００８】
従って、第一の態様において、本発明はエンベロープを有するウイルスのエンベロープ糖タンパク質と結合でき、前記ウイルスを中和できる核酸分子を提供する。
ウイルスは好ましくはＨＩＶ、さらに好ましくはＨＩＶ−１である。好ましい一実施形態では、糖タンパク質はｇｐ１２０である。
【０００９】
特に好ましい一実施形態では、アプタマーは表１に示されるものの１つから選択される。
「エンベロープを有する」ウイルスという用語は、当業者に十分公知のウイルスであり、例えばレトロウイルスのように、エンベロープを保有するウイルスファミリーのことを呼ぶ。
【００１０】
本明細書において、「中和する」という用語は、前記のエンベロープを有するウイルスの感染性を中和／低下させること、好ましくは少なくとも強度１桁、さらに好ましくは強度数桁中和／低下させることを呼ぶ。
【００１１】
第二の態様において、本発明は本発明のアプタマーを利用する潜在的治療標的のスクリーニング法を提供する。アプタマーとウイルスとの結合の効果は、細胞の感染を予防することであるため、ウイルスへの結合をアプタマーと競合する低分子を同定することが可能である。これらの分子は、ウイルス上の機能的に保存された同じ部位に結合するため、ウイルスの感染を阻害し、従って抗ウイルス治療の開発に有用であると思われる。ハイスループットスクリーニングにアプタマーを使用することが記載されている（ＧｒｅｅｎとＪａｎｊｉｃ  （２００１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０  １０９４−６，  １０９８，  １１００随所）。
【００１２】
本発明のアプタマーは、それ自体治療用分子として使用できる。このように、第三の態様において、任意選択で１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と共に、本発明の少なくとも１つの核酸分子を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
核酸はＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかとすることができ、一本鎖又は二本鎖のどちらかである。概して核酸分子は長さが２０〜１２０ヌクレオチドである。核酸を形成するヌクレオチドは、化学的に修飾して分子の安定性を増加させることができ、そのバイオアベイラビリティを改善するか、又は追加の活性を付与することができる。例えば、ピリミジン塩基の６又は８位、及びプリン塩基の５位をＣＨ３又はＩ、Ｂｒ、Ｃｌなどのハロゲンで修飾することもできる。ピリミジン塩基の修飾には、ＮＨ３、Ｏ６−ＣＨ３、Ｎ６−ＣＨ３及びＮ２−ＣＨ３で２位を修飾することも含む。２′位の修飾は糖の修飾であり、概してＮＨ２、Ｆ又はＯＣＨ３基を含む。修飾はキャッピングのような３′及び５′の修飾も含み得る。
アプタマーを当業者に十分公知の方法、例えば固相合成により調製できる。（Ｏｇｉｌｖｉｅ，  Ｋ．Ｋ．ら（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５（１６）５７６４〜８頁；Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１７  ３〜１８頁）又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ、０．、Ｗ．Ｐｅｉｋｅｎ及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９３）Ｆａｓｅｂ  Ｊ．７（１）９０〜６頁）。
【００１４】
本発明の組成物は１用量あたり各有効成分の予め決められた量を含む単位量形態で提示され得る。そのような単位は、化合物を１日あたり５〜１００ｍｇ、好ましくは５〜１５ｍｇ、１０〜３０ｍｇ、２５〜５０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、又は６０〜１００ｍｇのいずれかを提供するのに適する。式１の化合物について１日あたり１００〜１０００ｍｇの範囲の用量が提供され、１日あたり１００〜４００ｍｇ、３００〜６００ｍｇ、又は５００〜１０００ｍｇのいずれかを提供するのが好ましい。そのような用量を１回量又は多数の個々の用量として提供することもできる。極量はもちろん治療条件、投与経路、ならびに患者の年齢、体重及び状態に依存し、医師の判断である。
【００１５】
本発明の組成物は、任意の適当な経路、例えば、経口（口腔又は舌下を含む。）、直腸内、鼻腔内、局所（口腔、舌下又は経皮を含む。）、膣内又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、髄腔内、眼内、又は皮内）経路による投与に適する。そのような製剤は、薬学の技術分野で公知である任意の方法により調製でき、例えば有効成分を担体又は賦形剤と会合させることにより調製できる。
【００１６】
経口投与に適した医薬製剤は、カプセルもしくは錠剤、粉剤もしくは顆粒剤、水性の水溶液もしくは懸濁液又は非水性液体、食用の泡もしくはホイップ、又は水中油型乳液もしくは油中水型乳液のような個々の単位として提示することができる。
【００１７】
経皮投与に適した医薬製剤は、レシピエントの表皮と長時間密接な接触を保つことを意図した個々のパッチとして提示することができる。例えば、有効成分はＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３（６）、３１８（１９８６）に一般に記載されたようなイオン導入によりパッチから送達され得る。
【００１８】
局所投与に適した医薬製剤は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、粉剤、液剤、糊状剤、ゲル剤、噴霧剤、エアゾール剤又は油剤として製剤することができる。眼や他の外部組織、例えば口及び皮膚に適用するために、製剤は好ましくは局所用軟膏又はクリームとして適用される。軟膏に製剤された場合、有効成分をパラフィン軟膏基剤又は水混和性軟膏基剤と共に使用できる。代わりに、有効成分を水中油型クリームの基剤又は油中水型の基剤と共にクリームに製剤できる。
【００１９】
眼への局所投与に適した医薬製剤には、有効成分が適当な担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁した点眼剤がある。
【００２０】
口への経口投与に適した医薬製剤には、トローチ剤、錠剤及び洗口剤がある。
【００２１】
直腸内投与に適した医薬製剤は、坐剤又は浣腸剤として提示できる。
【００２２】
鼻腔内投与に適した医薬製剤であって、担体が固体であるものには、粒子径が例えば２０から５００ミクロンの範囲である粗粉末があり、それを鼻から吸い込む、すなわち鼻の近くに保持した粉末容器から鼻の穴を経由して迅速に吸入することで投与する。担体が液体である鼻用噴霧剤又は点鼻薬としての投与に適した製剤には、有効成分の水溶液又は油溶液がある。
【００２３】
吸入による投与に適した医薬製剤には、さまざまな種類の定量加圧エアゾール、ネブライザー又は注入器により発生できる微粒子ダスト又はミストがある。
【００２４】
膣投与に適した医薬製剤は、膣坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、糊状剤、泡剤又は噴霧製剤として提示できる。
【００２５】
非経口投与に適した医薬製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を予定されたレシピエント血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の注射用滅菌液剤、ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁剤がある。製剤は単位量又は多回量容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルに入れて提示でき、滅菌した液体担体、例えば注射用水を使用直前に加えることだけが必要である凍結乾燥状態で貯蔵できる。即時注射溶液及び懸濁液を滅菌した粉末剤、顆粒剤及び錠剤から調製できる。
【００２６】
好ましい単位量製剤は、本明細書において先に述べたような有効成分の１日量又は半日量を含有する製剤であるか、又はその適当な一部分である。
【００２７】
特に先に述べた成分に加えて、製剤は当技術分野で通常である、当該製剤の種類を考慮した他の薬剤も含む場合があり、例えば経口投与に適した製剤は着香剤も含み得る。
【００２８】
追加の態様において、本発明は、
（ｉ）ＨＩＶ感染症の治療に使用するための薬物の製造に本発明の少なくとも１つの核酸分子を使用すること、及び
（ｉｉ）本発明の少なくとも１つの核酸分子の有効量を対象に投与することを含むＨＩＶ感染症の治療法
を提供する。
【００２９】
本発明を以下の実施例を参照して以下にさらに詳細に記述するが、それらの実施例が本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【００３０】
実施例は図を参照している。
【実施例】
【００３１】
材料と方法
保有ウイルス
本研究に使用した総てのＨＩＶ−１株は、米国のベセスダにあるＮＩＨ、ＮＩＡＩＤにおけるＡＩＤＳ研究及び基準試薬プログラムを通じて入手した。ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌは、Ｓ．  Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ  Ｐｏｐｏｖｉｃ及びＲ．  Ｇａｌｌｏ（１９）から、ＨＩＶ−ＩＡＤＡはＨ．  Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ（２０）から、ＨＩＶ−１１１１ＢはＲ．  Ｇａｌｌｏ（２１）から寄贈された。
【００３２】
モノクローナル抗体
抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体１７ｂ（２２）、４８ｄ（２３）、２Ｇ１２（２４）及びＩｇＧ１  ｂ１２（２５）、ならびにポリクローナルヒトＨＩＶ−Ｉｇ（２６）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム（ｗｗｗ．ａｉｄｓｒｅａｇｅｎｔ．ｏｒｇ）から入手した。ｍＡｂ  １９ｂは、米国のコネチカット州０６０３０、ファーミントンにあるコネチカット大学小児科のＪａｍｅｓ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎから親切に分与された。抗ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体モノクローナル抗体ＣＧ１０（２７）及び組換えＣＤ４−Ｉｇは、ＡＩＤＳ試薬のためのＮＩＢＳＣ中央施設から入手した。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２と抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰのモノクローナル抗体はＳｉｇｍａから入手した。
【００３３】
細胞
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞は、Ｉａｎ  Ｊｏｎｅｓ（レディング大学、イギリス）から親切に分与された。
ヒト白血球は、オックスフォード国立血液サービスを介してブリストル病院サービスにより供給されたバフィーコート画分から得た。
【００３４】
オリゴヌクレオチド（５′から３′方向で記載）
「ライブラリー」オリゴヌクレオチドは、以下の組成を有した。ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＴＣＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡ  （Ｎ）４９ＴＴＧＡＧＣＧＴＣＴＡＧＴＣＴＴＧＴＣＴ
「５′プライマー」は、ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＴＣＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡで、
「３′プライマー」は、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＣＴＡＧＡＣＧＣＴＣＡＡであった。
「Ｅｎｖ６３０９＋」プライマーは、ＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣであった。
「Ｅｎｖ８０２３−」プライマーは、ＴＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣであった。
【００３５】
ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌｇｐ１２０の発現
Ｓｆ９細胞は、ＳＦ９００ＩＩ昆虫用無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中、２８℃で、１×１０６細胞／ｍｌ未満のサスペンションカルチャーで培養した。標準法に従って組換えウイルスを発生させるために、ＨＩＶ−１Ｂａ−ＬのＳＵ糖タンパク質（ｇｐ１２０）をコードするｐ２ＢａＣ−ｇｐ１２０（２８）と線状化ｐＡｃＢＡＫ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物５００ｎｇでＳｆ９細胞をトランスフェクトした（２９）。細胞を５ｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、２８℃で４日間培養すると、その時に培地へのｇｐ１２０の分泌が最適であった。ｇｐ１２０は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）アフィニティクロマトグラフィーを用いて、清澄な培養上清から精製され、画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより評価した。タンパク質は、高次凝集物を除くために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたＦＰＬＣゲルろ過によってさらに精製し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、チェスター、イギリス）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って定量した。
【００３６】
Iｎ  ｖｉｔｒｏでの転写
１ｍＭの２′Ｆ  ＵＴＰ、１ｍＭの２′Ｆ  ＣＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ、米国）、１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのスペルミジン及び１５００ユニットのＴ７  ＲＮＡ１５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を含む転写反応液に２２５ｐｍｏｌのＤＮＡテンプレートを加えて終体積５００μｌとし、３７℃で１６時間インキュベートした。ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を、用いたＤＮＡテンプレート１ｎｇあたり１ユニット添加することにより転写を終了させ、反応液を３７℃で１５〜３０分間インキュベートし、引き続きフェノール／クロロホルム抽出を行った。ＲＮＡをエタノールで沈殿させ、水に再溶解させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０ニックスピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて低分子量の混入物と分離し、Ａ２６０の測定により定量した。ＲＮＡは、９５℃で３分間、水中で加熱し、１０分間室温まで冷却することにより再フォールディングさせ、その温度で１／５体積の５×ＨＢＳ緩衝液を添加し（最終濃度：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）、室温での放置を５分間続けた。
【００３７】
アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択
ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ、イギリス）２０００バイオセンサー装置を使用した。２００００ＲＵのＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０は、標準プロトコル（３０）に従って、リシン残基を介したアミン結合を用いてＣＭ５バイオセンサーチップ（研究用等級、ＢＩＡｃｏｒｅ）のカルボキシメチル化デキストラン表面に直接結合させた。ＲＮＡは、上記のようにＨＢＳに溶かして調製した。１回目の選択では、２０μｇのＲＮＡプール（理論的な多様性は１０１４分子）が、ｇｐ１２０を固定化したフローセルに、３７℃で１μｌ／ｍｉｎの流速で注入された。非特異的に結合したＲＮＡは、１００μｌのＨＢＳ緩衝液を５μｌ／ｍｉｎの速度で注入することにより除いた。結合したＲＮＡは、５μｌ／ｍｉｎの速度で、１００μｌの７Ｍの尿素を用いて溶離させ、フェノール／クロロホルム抽出により除タンパクした後、エタノールで沈殿させた。回収したＲＮＡは、逆転写してｃＤＮＡにし、わずかな変異誘発条件下で、すでに記載した３′及び５′プライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。ＲＮＡ：タンパク質の比は、選択のストリンジェンシーを上げるために各回で約４まで上昇させた。総ての選択回で、ＲＮＡは対照としての機能する２つの未結合のセンサーチップフローセルを先に通過させ、これは、チップマトリックスに結合することによるアプタマーの偶発的な選択を避けるためでもあった。
【００３８】
ＳＰＲバイオセンサーによるアプタマー−ｇｐ１２０相互作用の分析
親和性の測定は、３７℃で行った。５０００〜７５００ＲＵのＨＩＶ−１ｇｐ１２０は、上記のようにチップ上に共有結合的に固定化された。アプタマー又は対照核酸は、一連の濃度（５ｎＭから３２００ｎＭ）で調製され、５μｌ／ｍｉｎの速度で注入し（ＫＩＮＩＮＪＥＣＴ法）、６０分経過後に解離させた。可溶性ＣＤ４と結合するｇｐ１２０の能力に影響を与えることなく、まだ結合している総てのＲＮＡを解離させるために、新鮮調製した１００ｍＭのＮａＯＨ１〜５μｌを注入してリガンドを再生させた。データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０（ＢＩＡｃｏｒｅ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ３．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、米国）を用いて解析し、ＫＤはｋｏｆｆ及びｋｏｎの比から計算した。
【００３９】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の培養
正常なＨＩＶ陰性ドナーのヘパリン処理バフィーコートからＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリス）密度勾配遠心分離によりこれらの細胞を単離した。希釈した自己血漿は、貯蔵し、熱不活性化し、清澄化して、白血球培養用の自己血清（ＡＳ）の補充に供した。ＰＢＭＣは、４℃のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で６回洗浄し、血小板及び顆粒球を本質的に含まないようにした。ＰＢＭＣの培養は、マイトジェンによる活性化をすることなく、ＩＬ−２のような特異的増殖因子の添加をすることなく行い、２％のＡＳを含有するＸ−ＶＩＶＯ−１０（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で維持した。この方法は、ゆっくりと増殖するリンパ球とマクロファージの混合培養を生成し、マイトジェンで処理されサイトカインを補充された培養よりも初代単離物の高レベルの複製を我々の手で補助するものである。
【００４０】
ウイルスの感染性と中和アッセイ
第７日目のＰＢＭＣに、１００ｎＭの抗ｇｐ１２０モノクローナルアプタマー又は対照アプタマーＳＡ１９（１７）とインキュベートしたウイルスを段階希釈して感染させた。８個のレプリケートが、各１０倍希釈して使われた。感染の１６時間後、接種したウイルス及びアプタマーを含有する培地は、新鮮培地と交換した。培養を１４日間維持してから、以前に記載された（３１）ようにＬＴＲ−ＰＣＲ用のＤＮＡを調製した。
【００４１】
アプタマーからのエスケープ突然変異体の選択
アプタマーＢ４ブレークスルー変異株を発生させるために、第７日目のヒトＰＢＭＣ（１０７）に、アプタマーＢ４（１ｎＭ）と予めインキュベートしたＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ（１０５ＩＵ）を感染させた。細胞変性作用が現れるまで、細胞上清試料を２日毎に集めた。最高の感染力価を有する試料が、アプタマーの非存在下で新たに分化したＰＢＭＣに感染するために使用され、これによりウイルスを約１０５ＩＵ／ｍｌまで増幅させることができる。同じプロトコルに従って、選択と増幅をさらに４回繰り返し、各選択では使用するアプタマーＢ４の濃度を上げていった（すなわち  ５、１５、５０及び１００ｎＭ）。最終回の選択を行った後に、新鮮ＰＢＭＣ中で限界希釈することでウイルスをクローニングした。Ｅｎｖ６３０９＋及びＥｎｖ８０２３−プライマー対及び高フィデリティーＰＣＲシステムキット（ロシュ、ドイツ）を用いて、ウイルス陽性のウェルからｅｎｖ遺伝子をＰＣＲ増幅させた。起源となるＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの種ウイルスのｅｎｖ遺伝子についても同様に得た。
【００４２】
抗体での阻害による結合部位のマッピング
以前に記載された（３２）ものを以下のように修正して、主として競合ＥＬＩＳＡによりこれを行った。簡潔には、Ｄ７３２４抗ｇｐ１２０  ＣＯＯＨペプチド抗血清（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｐｌｃ．）を用いて、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）にｇｐ１２０を捕捉した。洗浄後、結合したｇｐ１２０は、ＨＢＳ緩衝液又はＨＢＳ緩衝液で溶解した１０μＭの可溶性ヒトＣＤ４溶液５０μｌと共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＢＳ結合緩衝液で溶解したアプタマーＢ４溶液５０μｌを、一連の濃度で３回の反復として加え、１時間放置した。抗ｇｐ１２０ｍＡｂを、予め直線範囲であると決定した濃度で添加した。洗浄後、結合した抗体をＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ増幅キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて検出した。
【００４３】
結果
ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０に対するアプタマーの選択
我々はＲ５株であるＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０に対する２′−フルオロピリミジン含有ＲＮＡ（２′−Ｆ−ＲＮＡ）アプタマーを選択した。標的タンパク質は、以前に記載されたように産生させ（２８）、アプタマーの選択は、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップ上に標的を固定化し、濃縮が標的からのアプタマーの解離速度が遅いことに基づいたＳＥＬＥＸプロトコルの変法（３３，３４）を使用して行った（図１Ａ）。２′Ｆ−ＲＮＡアプタマーは、ヌクレアーゼに耐性であるばかりでなく、潜在的な四次コンホメーションのスペクトルを広げ（１６）、未修飾ＲＮＡ又はＮＨ２置換ＲＮＡアプタマーと比べて高い親和性を有する、よりコンパクトで頑健なリガンドを生じることから、我々は２′Ｆ−ＲＮＡアプタマーを使用した（３５）。
【００４４】
固定化ｇｐ１２０は、1回目では、アプライされたＲＮＡの０．１％未満と結合したが、２回目では１．５％に、３回目では１６％に、４回目では６０％に、５回目では７５％に増加した。５回目の選択物をＰＣＲで増幅したＤＮＡプールは、ＴＡクローニングした。各クローンは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によりをスクリーニングし、ＢＩＡｃｏｒｅ分析で決定したようにｇｐ１２０と高親和性（Ｋｄ５〜１００ｎＭ）で結合したクローンは少なくとも異なる２５個の配列ファミリーに属することが分かった（表１）。モノクローナルアプタマーのほとんどがＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０と選択的に結合したが、Ｂ１９のようないくつかはＸ４ウイルスであるＨＩＶ−１ＩＩＩＢ由来ｇｐ１２０と顕著な結合を示した（図１Ｃ）。まとめると、これらのデータは多数の異なる配列がフォールドしてｇｐ１２０結合性アプタマーを生じさせることができ、これらのアプタマーのいくつかはこれら２つのＲ５株とＸ４株との間で構造的に保存されたｇｐ１２０上の部位を認識できるであろうことを意味している。
【００４５】
アプタマーによるＨＩＶ−１の中和
ＨＩＶ−１による自然感染時に誘発された抗体は、一般に中和作用に乏しく、感染後期に発生する（３６）。さらに、単離されたｇｐ１２０の形で提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、集合したビリオンとの関係では、通常同じエピトープと結合しない（３７）。ｍＡｂによる中和に対するＨＩＶ−１の相対的な抵抗性はこれによるものであって、初代単離物では特にはっきりしている。従って、本研究では、ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０に対して単離されたアプタマーが標的細胞のＨＩＶ−１感染性を防止又は制限できるかどうかについて我々は尋ねた。終点希釈及びＰＣＲに基づくＴＣＩＤ５０アッセイ（３１、３８）を用いて、我々はアッセイされたアプタマークローン２７個のうち２５個がＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌホモログを中和することを示した（図２Ａ及びＢ）。これらのアプタマーのほとんどが１０００倍を超えてＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌを中和し、１つのアプタマー（Ｂ４）は５ｌｏｇ１０でウイルスを中和した。Ｂ４はヒトＰＢＭＣ中で１ｎＭ未満の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の値でＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの侵入を阻害した（図２Ｃ）。Ｂ４を含めてこれまでに試験されたＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌを中和するアプタマーは総て、別のＲ５株であるＨＩＶ−１ＡＤＡも交差中和した（図２Ｄ）。これらの２つの株のｇｐ１２０は８４％しか同一でなく、マクロファージ向性の程度が異なる（３８）。従って、少なくとも２つのＨＩＶ−１株を中和するための少なくとも５つのアプタマーの能力は、それらが少なくともこのクレードＢサブタイプのＲ５メンバーの間で保存されているｇｐ１２０の機能的に重要な部位を認識する可能性があることを示唆している。
【００４６】
ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌは、アプタマーＢ４による中和をエスケープするために突然変異しない。
ＨＩＶ−１は、淘汰圧に応じて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの感染時に容易に突然変異し、これにより、免疫による認識をエスケープでき抗ウイルス薬に耐性になることができる変異体を増殖させる（３９）。ＨＩＶ−１の突然変異体は、代替補助受容体の使用に頼ることなく、ＣＣＲ５拮抗薬の阻害作用に抵抗することができ（４０）、類似のエスケープ変異体が病原性を増加させたかもしれないという可能性がそのような薬物の使用への関心を起こす（４１）ことが最近示された。従って、我々はＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌが、突然変異してアプタマーＢ４による中和をエスケープできるかどうかを、方法の項に記載したように、アプタマーでチャレンジした後にヒトＰＢＭＣ中で増殖できる変異体を選択することにより試験した。アプタマー濃度を段階的に上げた５回の選択を行った後で、ウイルスの４つのブレークスルークローンを単離した。ｅｎｖ遺伝子のうちｇｐ１２０をコードする部分を各クローンについて決定し、親ウイルスのその部分と比較した（図３Ａ）。データベース上の他のいかなるＨＩＶ−１株の配列に比べて公式のＢａ−Ｌ配列とより密接に関係していたが、親配列がデータベースにおける配列と１．９％異なっていることを我々は観察した（分析を示さず）。４つのブレークスルークローンの総てが、Ｖ３ループの先端の推定上の中和エピトープ内を含めて、ｇｐ１２０にいくつかの追加のアミノ酸置換を有していた。次に、我々は、これらの突然変異がＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ由来クローンを増殖させることによりアプタマーＢ４による中和抵抗性を付与したかどうかについて試験し、増殖したウイルスにアプタマーＢ４を再チャレンジさせ、ヒトＰＢＭＣに感染させた。アプタマーＢ４は総てのブレークスルークローンを１０５倍まで中和した（図３Ｂ及び３Ｃ）。このことは、突然変異がＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌに選択的な利点を何ら付与しなかったことを示している。これらの結果は、アプタマーＢ４がＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの機能に重大なｇｐ１２０の領域と結合し、従ってウイルスに対する有害作用を及ぼすことなしに突然変異できないことを示唆している。
【００４７】
ｇｐ１２０へのアプタマーＢ４の結合は、保存されたＣＣＲ５結合表面に影響を与える
アプタマーによる中和のメカニズムと思われるものは、ウイルス受容体の相互作用の阻害によるものである。しかしながら、ＳＰＲバイオセンサー分析を用いて、単量体の固定化したｇｐ１２０に対するｓＣＤ４の結合を、Ｂ４が妨害しないことを発見した。我々は次に、ｇｐ１２０上のエピトープを以前にマッピングしたモノクローナル抗体の結合をＢ４が妨害するかどうかについて試験した。我々は、非中和エピトープよりもむしろ保存された中和エピトープ近くでＢ４が結合するようであると仮定したように、我々が選んだｍＡｂは総て中和した。試験した１０個のｍＡｂのうちの１つ、１７ｂだけがＣＤ４の非存在下でアプタマーにより説得力をもって阻害された（図４Ａ参照）。阻害レベルは有意であったが、最高濃度のアプタマーでも５０％だけであり、このことは２つの分子の一方が空間的に関係しているが異なる面に結合したか、又はＢ４の結合が１７ｂのエピトープにおけるわずかなアロステリック変化を引き起こし、抗体の結合を打ち消すことなくその結合レベルを減少させたことを示唆している。１７ｂエピトープは、ｇｐ１２０のＶ１及びＶ２超可変ループによって、ＣＤ４結合の非存在下で抗体から部分的に隠され（２３、４２）、ウイルスの主要補助受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４の結合部位と重複している（４３）。１７ｂのように「ＣＤ４ｉ」エピトープに位置する２番目の抗体４８ｄの結合は、ＣＤ４の非存在下で高濃度のアプタマーにより阻害されたが、ＣＤ４の存在下ではナノモル濃度で阻害された（図４ｂ参照）。３番目のＣＤ４ｉ結合抗体であるＣＧ１０はアプタマーＢ４により全く阻害されなかった。
【００４８】
考察
我々は、潜在的な治療剤によりターゲティングできるＨＩＶ−１の一次単離物のエンベロープの保存領域を同定するための新規な戦略を提示する。アプタマーのサイズが小さいこと及び生物物理学的性質により、我々はＨＩＶ−１のｇｐ１２０の保存された部位をターゲティングすることができ、その部位への結合は感染性に対して高度に有効な中和をもたらした。補助受容体の利用が異なるＨＩＶ株由来のｇｐ１２０複合体の構造についての研究は、ｇｐ１２０の表面ループが可変配列で可変トポロジーであるが、主要な受容体相互作用を行う表面を含むタンパク質のコアは、三次構造において顕著に保存されていることを示している（１２）。ｇｐ１２０単量体の可変表面ループ間の四次相互作用は、ウイルスが抗体による中和をエスケープするように進化したものと思われるが、批判的に言えば、アプタマーのような比較的小さなリガンドによる妨害に対してｇｐ１２０の保存されたコアを露出している。
【００４９】
アプタマーによる中和の２つの性質、すなわち効力とエスケープに対する抵抗性は、詳細な解説に値する。Ｂ４のようなアプタマーがＲ５ウイルスの感染性を低下させる能力は、ＩｇＧ１−ｂ１２や２Ｇ１２などの最も効力の高い抗体と比較した場合に顕著である。これらの抗体は、概して、約３００ｎＭの濃度でＲ５株の感染性を１オーダの強度まで減少させる（４４）。一方、アプタマーＢ４は、１００ｎＭで４オーダを超える強度まで感染性を減少させる。実施可能な最高濃度でさえ、抗体によるＰＩ  ＨＩＶ−１の特異的中和は滅多に２オーダの強度を超えない。第二に、抗体を介した中和はｉｎ  ｖｉｔｒｏ（４５）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（４６）の両方でのウイルスの進化によって迅速に克服される。
【００５０】
ＨＩＶの侵入を妨害するために設計された他の治療戦略には、ｇｐ４１分断ペプチドアナログ（４７〜４９）及びＣＣＲ５の低分子リガンド（４０）が含まれる。Ｃ３４（５０）及びＴ−２０（５１）のような最も有望なものは、本明細書で記載されたアプタマーとほとんど匹敵するＩＣ５０値（〜２ｎＭ）を有する。しかし、Ｔ−２０ペプチドによる阻害に耐性のウイルス変異体が、今や臨床試験で同定された（５２）。
【００５１】
我々の結果は、アプタマーによる中和メカニズムの手がかりをいくつかもたらしている。アプタマーＢ４は、ＣＤ４とｇｐ１２０との相互作用及びｇｐ１２０上のエピトープがＶ３ループ、Ｖ１Ｖ２ループ及び「静止」面上の糖質を有する抗体の結合を阻害しなかった。強力な中和作用を示すアプタマーＢ４が有するｍＡｂ１７ｂ及び４８ｄの結合を部分的に阻害する能力は、その中和のメカニズムがｇｐ１２０とその補助受容体ＣＣＲ５との相互作用を妨害することによるものであることを示唆している。ＣＤ４がｇｐ１２０に結合しない場合には、１７ｂ／４８ｄエピトープは単量体のｇｐ１２０上で部分的に閉塞され、機能的な三量体のｇｐ１２０上で完全に閉塞されるが、仮にそうなったとしても、感染時にごく一時的に体液性免疫応答による抗ウイルス作用に対してさらされるだけであることを保証している。対照的に、その小さなサイズ又は生物物理学的性質がおそらく原因で、アプタマーＢ４はＣＤ４の結合がない状態で中和部位に結合する。抗体４８ｄのＣＤ４依存的なｇｐ１２０への結合は、ＣＤ４の存在下でアプタマーＢ４によってより強力に阻害され、このことは、アプタマーＢ４の４８ｄエピトープへの接近が、複合体を形成していないｇｐ１２０では部分的に遮断されているかもしれないことを示している。興味深いことに、「ＣＤ４ｉ」領域に位置する第三の抗体であるＣＧ１０は、アプタマーＢ４により全く阻害されないことを我々は発見した。このことは、そのエピトープの位置がＶ１Ｖ２ループの基部に最も近いことと矛盾せず、従って、これらの３つのエピトープのうちで最も閉塞しているものである（１５、５３）。Ｂ４結合部位が高度に保存されているという事実と合わせると、我々が期待したように、アプタマーを用いたアプローチは、以前に抗体を用いて可能とされたものよりも、より限局性があって機能的に重要なｇｐ１２０上の中和標的を同定したことを示唆している。
【００５２】
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【００５３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｒ５向性ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０と結合するアプタマーの単離を示す図である。（Ａ）選別を４回繰り返した後に、２′Ｆ−ＲＮＡのポリクローナルなプールはＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０と強い特異的な結合を示し、その結合はさらなる選別サイクルにより強化された。（Ｂ）アプタマーＢ１９はＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ及びＨＩＶ−１ＩＩＩＢの両者のｇｐ１２０と結合した。全ての実験でアプタマーの濃度は１００ｎＭとした。
【図２】モノクローナルアプタマーによるＨＩＶ−１のＲ５株の中和を示す図である。ウイルス力価は、表示したアプタマー１００ｎＭの存在下で、ＰＢＭＣで限外希釈することにより検定した。白抜きカラムでは感染性の減少が示されず、シェーディッドカラムでは感染性が１０分の１から１００分の１への減少、ハッチドカラムでは感染性の１０３〜１０４分の１への減少、黒べたカラムは感染性の＞１０４分の減少が示された。Ａ及びＢは、アプタマーを作製したＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ株について、その中和を示す。１７種類のアプタマーは、３〜４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌでウイルスを中和し、２種類のアプタマーＢ４及びＢ８４はＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの侵入を４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌを超える濃度で阻害した。（Ｃ）アプタマーＢ４は、濃度依存的にＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの侵入を阻害し、ＩＣ５０値は１ｎＭ未満であった。（Ｄ）これまでに試験した５つのアプタマーは、別のＲ５株であるＨＩＶ−１ＡＤＡについても交差して中和した。
【図３】ＨＩＶ−１Ｂａ−ＬがアプタマーＢ４による中和をエスケープできないことを示す図である。（Ａ）アプタマーＢ４の存在下、ＰＢＭＣ中でＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの選別と継代を５回繰り返すことにより得た４つのブレークスルークローンから増幅したｅｎｖの配列決定より推定されたｇｐ１２０の予測配列。その配列は、接種したウイルス（ＮＩＨ５１０＊）及びＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ（Ｍ６８８９３）のデータベース配列に対して配置される。点線は配列決定を行っていない部分を示す。「Ｘ」は不確実な残基を示す。点はデータベース配列と同一であることを示す。（Ｂ）ＴＣＩＤ５０でアッセイした場合における、ヒトＰＢＭＣ中での１００ｎＭのアプタマーＢ４によるクローン性ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ由来ブレークスルーストックの完全な中和。（Ｃ）対照アプタマーと比較して、４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌを超えるとＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌのブレークスルークローンの中和を示す、ＩＤ５０ソフトウェアで統計的に解析されたＴＣＩＤ５０の図による描写。結果は、総てのクローンを代表するものであり、４つのブレークスルークローンの総てが等しく中和される。
【図４】ｇｐ１２０に対するｍＡｂの結合に及ぼすアプタマーＢ４の効果を示す図である。組換えＢａ−Ｌのｇｐ１２０は、ポリクローナル抗体によってマイクロタイタープレートの表面上に捕捉された。指示のある場合には、結合したｇｐ１２０は、引き続いて可溶性ＣＤ４と相互作用した。結合したｇｐ１２０又はｇｐ１２０／ＣＤ４複合体は、その後、３回の反復として、様々な濃度のアプタマーＢ４と共にインキュベートした。ｇｐ１２０／アプタマー又はｇｐ１２０／ＣＤ４／アプタマー複合体は、その後、それぞれの直線検出範囲にあることが以前に決定された濃度で、指示された抗ｇｐ１２０  ｍＡｂと共にインキュベートした。結合したｍＡｂは、その後、抗Ｉｇ−ＨＲＰシステムを用いて検出した。その結果は、アプタマーを含まない対照値±標準誤差からの減少％として示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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