(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）分子量が１５万以下で、かつヒトアポリポ蛋白質Ａ−IIを持たないＨＤＬに存在するヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ、（２）脂質と結合していないヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ、並びに（３）ヒト健常者血漿を超遠心分離装置でＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３及びボトムの５つの画分に分離したとき、ＨＤＬ３及びボトム画分中のヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉと特異的に反応し、３７℃に加温後の血漿又は血清に対する反応性が、加温前の反応性に比べて低いモノクローナル抗体。
【請求項２】
（１）分子量が１５万以下で、かつヒトアポリポ蛋白質Ａ−IIを持たないＨＤＬが、ｐｒｅβ１−ＨＤＬである請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１又は２記載のモノクローナル抗体を検体に反応させることを特徴とするヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉの免疫学的測定法。
【請求項５】
検体加温前と加温後に測定し、加温後の減少量又は減少率を測定するものである請求項４記載の測定法。
【請求項６】
請求項１又は２記載のモノクローナル抗体を含有するヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉの測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のヒトアポリポ蛋白質Ａ−Ｉ（以下、「アポＡ−Ｉ」という）に対するモノクローナル抗体、これを用いた特定のアポＡ−Ｉの免疫学的測定方法及びこれを含有する免疫学的測定試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
アポＡ−ＩはＨＤＬを構成する主なアポタンパク質であり、ＨＤＬの末梢細胞から肝臓へのコレステロールを逆転送する機能において中心的な役割を果たしているものである。（Philips M. C. et al. Biochem. Biophys. Acta, 906:p. 223(1987) ）。このことから、動脈硬化症の診断にアポＡ−Ｉを測定することが行われている。
【０００３】
近年、アポリポ蛋白質Ａ−II（以下、「アポＡ−II」という）を持たないアポＡ−Ｉ含有ＨＤＬ（石塚ら：医学と薬学、３９巻５号、１０４１頁、１９８８）が、アポＡ−Ｉ及びアポＡ−II含有ＨＤＬより細胞からのコレステロール引き抜き作用が強いことや、脂質とは結合せずに存在するアポＡ−Ｉや小粒子で脂質含量の少ないｐｒｅβ１−ＨＤＬ（T. Miida. et al. Biochemistry, 29:p.10469(1990)）に存在するアポＡ−Ｉが細胞からのコレステロールの逆転送系において重要な役割を演じていることが判明したことから、これら特定のアポＡ−Ｉを測定することが重要となってきた。アポＡ−IIを持たないアポＡ−Ｉ含有ＨＤＬのうち、ｐｒｅβ１−ＨＤＬは、細胞表面との特異的な相互作用を介して末梢細胞からコレステロールを引き抜き（Fielding, C. et al, Lipid Res., 36: p211- 228(1995))、その作用はＨＤＬよりも効率的であることから、特に注目されている。
【０００４】
しかしながら、特定のアポＡ−Ｉと選択的に反応する抗体がなかったため目的とするアポＡ−Ｉを電気泳動法、免疫沈殿法等で他のアポＡ−Ｉと分離する必要があり、簡便に測定するのは不可能であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような実情において、本発明者は鋭意研究を行った結果、特定のアポＡ−Ｉに対し特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることに成功し、これを用いれば、前記の脂質とは結合せずに存在するアポＡ−Ｉやｐｒｅβ１−ＨＤＬを構成するアポＡ−Ｉ等のアポＡ−Ｉが正確かつ容易に測定でき、脂質代謝異常をより正確に診断できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（１）分子量が１５万以下で、かつアポＡ−IIを持たないＨＤＬに存在するアポＡ−Ｉ及び（２）脂質と結合していないアポＡ−Ｉと特異的に反応するモノクローナル抗体を提供するものである。
また本発明は、このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するものである。
また本発明はこのモノクローナル抗体を検体に反応させることを特徴とするアポＡ−Ｉの免疫学的測定法を提供するものである。
さらに本発明は、このモノクローナル抗体を含有するアポＡ−Ｉの測定試薬を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば次の方法で製造することができる。
免疫原としてはアポＡ−Ｉを含むリポタンパク質又は精製したアポＡ−Ｉを用いる。免疫に使用する動物としては特に限定されないが、一般的にはマウス、ラットなどが使用される。免疫方法は、一般的な手法に従って行うことができる。例えば、免疫原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁させたもの、あるいは、フロインド・コンプリート・アジュバンドなどの補液との混合物を、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う方法が挙げられる。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宜決定されるが、通常の投与量は、１回当たり１０μｇ〜１mg程度とするのが適当である。細胞融合に用いる免疫細胞は、最終免疫の３〜４日後に摘出した脾臓細胞が好適である。また、前記免疫細胞と融合させる他方の親細胞としての骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては既に確立されている公知の各種細胞株、例えば、マウスにおけるＮＳ１（Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ−Ａｇ４４４４−１）〔Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４〔Nature 276:269(1978)〕、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３〔J. Immunol. 123:1548(1979)〕、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１〔Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1(1978)〕等や、ラットにおけるＹ３−Ａｇ１．２．３〔Nature 277:131-133(1979)〕、ＹＢ２／Ｏ（YB2/3HL/P2.G11. 16Ag.20)〔Methods Enzymol. 73B:1(1981)〕等が挙げられ、これらは何れも使用することができる。細胞融合には通常用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。細胞融合は通常の方法と同様にすればよく、例えば免疫細胞は骨髄細胞に対して約１〜１０倍で、ポリエチレングリコールは平均分子量１０００〜６０００のものを３０〜６０％の濃度で使用し、免疫細胞と骨髄細胞の混合ペレットに滴下し混ぜ合わせる方法が挙げられる。ハイブリドーマの選択は、通常の選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）を用いて行えばよい。
【０００７】
ＨＡＴ培地で培養後、得られたハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行われる。目的とする抗体の産生株の検索には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等が利用でき、これによりある特定のアポＡ−Ｉに対してのみ特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体を選択するには、次のような方法が挙げられる。
まず、培養上清中のモノクローナル抗体を抗マウスＩｇＧ抗体等を介して固相化し、これに血漿などのリポタンパク質混合液を反応させる。次に、酵素などで標識した抗アポＡ−Ｉ抗体又は同じく標識したアポＡ−IIに対する抗体を反応させ、抗アポＡ−Ｉ抗体の系のみに反応し、且つ抗アポＡ−II抗体の系とは反応しないモノクローナル抗体を選択する。
【０００９】
このようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしては、本発明者が見出したハイブリドーマ５５２０１が挙げられ、このハイブリドーマ５５２０１は、工業技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ  ＢＰ−６９３８として寄託されている（原寄託日．１９９８年１１月１７日）。
【００１０】
かくして得られる抗体産生ハイブリドーマからの抗体の製造は、常法に従いハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、あるいは、前記ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により実施できる。
【００１１】
本発明のハイブリドーマ５５２０１が産生するモノクローナル抗体５５２０１は次の性質を有する。
【００１２】
（Ａ）（１）分子量が１５万以下で、かつアポＡ−IIを持たないＨＤＬに存在するアポＡ−Ｉ及び（２）脂質と結合していないアポＡ−Ｉに反応する。
（Ｂ）ヒト健常者血漿を超遠心分離装置でＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３及びボトム（Bottom）の５つの画分に分離したとき、ＨＤＬ３及びボトム画分中のアポＡ−Ｉに反応する。
【００１３】
上記（Ａ）における、（１）分子量が１５万以下で、かつアポＡ−IIを持たないＨＤＬとしては、ｐｒｅβ１−ＨＤＬが特に好ましい。
【００１４】
本発明の前記抗体を用いて、従来の任意の免疫学的測定方法により、ヒト検体中の特定のアポＡ−Ｉを測定することができる。検体としては血漿又は血清が用いられる。用いることのできる免疫学的測定方法としては、通常の競合法、サンドイッチ法によるＲＩＡ又はＥＩＡ等が挙げられる。これらの方法の実施にあたっては、本発明抗体の標識体を用いることもできる。ここで標識物質としては、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコアミラーゼ、β−ガラクトオキシダーゼ等の酵素；125Ｉ、131Ｉ、トリチウム等の放射性物質が挙げられる。また、抗体を固相化するための単体としては、各種プラスチックウェル、各種プラスチックビーズ等が挙げられる。
【００１５】
例えば、ＥＬＩＳＡ法で測定する場合には、精製したアポＡ−Ｉを標準品として次のような方法で定量することができる。即ち、本発明のモノクローナル抗体を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、希釈した試料を添加し反応させた後、酵素標識した抗アポＡ−Ｉポリクローナル抗体を反応させ、発色後吸光度の変化から試料中に存在するアポＡ−Ｉを定量する方法が挙げられる。
【００１６】
なお、これらの測定は、通常の免疫学的測定法と同様に０〜４０℃のいずれの温度で行うこともできる。
【００１７】
前記のように本発明のモノクローナル抗体を用いれば、血漿又は血清中の前記（Ａ）のアポＡ−Ｉ（１）及び／又は（２）が測定できるが、加温前の検体の測定値に比べて３７℃加温後の検体の測定値は著しく低下する。このことから、血漿又は血清中に存在する前記（Ａ）のアポＡ−Ｉは３７℃に加温したときに減少することが判明した。従って、この性質を利用することによっても検体中の前記（Ａ）のアポＡ−Ｉを定量することができる。すなわち、検体加温前と加温後に上記の免疫学的測定法により前記（Ａ）のアポＡ−Ｉ量を測定し、加温による測定値の減少量又は減少率を測定すればよい。かくすることによっても前記（Ａ）のアポＡ−Ｉの定量が可能となる。ここで、検体の加温前の温度は０〜２５℃、加温の温度は３０〜４０℃とするのが好ましい。また、加温前の検体には、０〜１０℃に低温保存した検体も含まれる。
これらの測定法により、血漿又は血清中の前記（Ａ）のアポ−Ｉ（１）及び／又は（２）が正確かつ容易に測定できる。
【００１８】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１（モノクローナル抗体の調製）
（１）ハイブリドーマの調製
ヒト健常者プール血清から超遠心分離法によりＨＤＬを分離し、これをエタノールとエーテルの混合液及びエーテルにて脱脂した。つづいて窒素ガスにてエーテルを完全に除去後、８Ｍ尿素溶液にて再溶解し、セファクリル  Ｓ２００カラム（Pharmacia社製）を用いゲル濾過を行った。分離した各フラクションからアポＡ−Ｉを含むフラクションをプールし、ＰＢＳで透析後免疫原とした。この免疫原と完全フロイントアジュバンド（GIBCO社製）とを１対１で混和乳化し、０．１mg／０．１mL（エマルジョン）で６週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に１週間間隔で６回投与後、最終免疫の２日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４とを６対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０（和光純薬社製）存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として２．５×１０6／mLになるようにＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレート（CORNING社製）に０．２mLづつ分注した。これを５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて培養し、おおよそ２週間後に、ハイブリドーマの生育してきたウェルの培養上清について、次に示すＥＬＩＳＡ法にしたがって有望抗体産生株を選択した。即ち、まず、マイクロプレート（NUNC社製）にヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（JACKSON社製）を介し、各培養上清中のＩｇＧを固相化した。これにヒト健常者血漿希釈液を添加し、アポＡ−Ｉを含むリポタンパク質（主にＨＤＬ）を反応させた。つづいて、アポＡ−Ｉを山羊に免疫して得たヤギ抗アポＡ−Ｉ抗体をビオチン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ZYMED社製）を用いビオチン化したビオチン標識抗アポＡ−Ｉ抗体、もしくはアポＡ−IIを山羊に免疫して得たヤギ抗アポＡ−II抗体を同様にビオチン化したビオチン標識抗アポＡ−IIを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ZYMED社製）を反応後、オルトフェニレンジアミン（東京化成社製）を含む基質溶液で発色させた。これをマイクロプレートリーダー（Ａ．４９２）で測定し、ビオチン標識抗アポＡ−Ｉ抗体を用いた系で高い反応性を示し、且つビオチン標識抗アポＡ−II抗体を用いた系では反応性を示さなかった株を選択した。このハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化を行い、モノクローナル抗体ハイブリドーマ５５２０１を作製した。
【００２０】
（２）モノクローナル抗体の調製
あらかじめ２週間前にプリスタン０．５mLを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ハイブリドーマ５５２０１を細胞数０．５×１０6個の量で腹腔内に投与した。約１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３Ｍ  ＮａＣｌ−１．５Ｍ  グリシン−ＮａＯＨ, pH８．５）と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（ファルマシア）に通して抗体をカラムに吸着させた後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH３．０）で溶出させてモノクローナル抗体５５２０１を精製した。
【００２１】
実施例２（モノクローナル抗体の特異性）
（１）ウェスタンブロット法
実施例１で得た抗体が、アポＡ−Ｉに対する抗体であることを確認するため、ウェスタンブロット法により解析した。即ち、ヒト健常者血清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に電気的に転写し、３％−スキムミルクを含むＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１時間ブロッキング後、一次抗体としてモノクローナル抗体５５２０１を、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（AMERICAN QUALEX社製）を反応させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、ジアミノベンジジンを基質として加え、発色させた。図１に示す如く、モノクローナル抗体５５２０１は分子量２８０００のアポＡ−Ｉに対するバンドのみ認められ、アポＡ−Ｉに対する特異抗体であることが確認された。
【００２２】
（２）ＥＬＩＳＡ法
実施例１で得たモノクローナル抗体（５５２０１）を２０mMリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；pH７．２）で３μｇ／mLの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に５０μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、ブロッキング液にて希釈したヒト健常者血漿希釈液を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング液で３回洗浄した後、ビオチン標識ヤギ抗アポＡ−Ｉ抗体、もしくはビオチン標識抗アポＡ−II抗体を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。同様にブロッキング液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加え、室温で３０分間インキュベートした。再びブロッキング液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を５０μＬ／ウェル加えた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェル加え、４９２nmにおける吸光度を測定した。
【００２３】
この結果を図２に示す。図２より、モノクローナル抗体５５２０１はアポＡ−IIを含むＨＤＬとは反応せず、アポＡ−Ｉのみを含むＨＤＬと特異的に反応することが示された。
【００２４】
（３）ゲル濾過分離画分に対する反応性
実施例１で得た抗体の特異性を検討するため、ヒト健常者血漿をゲル濾過にて分離し、その分離した各画分に対する反応性を調べた。即ち、ヒト健常者血漿をゲル濾過用カラム４本（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷ、７．５ｍｍＩＤ×６０ｃｍ  ２本、同Ｇ３０００ＳＷ、７．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ  １本、ファルマシア  スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０）を接続させたファルマシア  ＦＰＬＣシステムにて分離し、各フラクションのアポタンパク濃度を測定するとともに、以下に示すＥＬＩＳＡ法にて各モノクローナル抗体の反応性を比較した。実施例１で得たモノクローナル抗体５５２０１を２０mMリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；pH７．２）で３μｇ／mLの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製）に５０μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、ブロッキング液にて希釈した各フラクション又は精製アポＡ−Ｉを５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング液で３回洗浄した後、アポＡ−Ｉを山羊に免疫して得たヤギ抗アポＡ−Ｉ抗体を過ヨウ素酸法にてペルオキシダーゼ標識したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗アポＡ−Ｉ抗体を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。同様にブロッキング液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を５０μＬ／ウェル加えた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェル加え、４９２nmにおける吸光度を測定し、精製アポＡ−Ｉを標準品として、各フラクションのアポＡ−Ｉ量を算出した。この結果を図３（下）に示す。尚、アポＡ−Ｉ、Ａ−II、Ｅの各アポタンパク質は、各精製アポタンパクを山羊に免疫して得たポリクローナル抗体及びこれを過ヨウ素酸法によりペルオキシダーゼ標識した標識抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。この結果を図３（上）に示す。図３（下）より、モノクローナル抗体５５２０１は主に血漿中に存在する分子量６．７万以下のＨＤＬに存在するアポＡ−Ｉ、もしくは脂質と結合せずに存在するアポＡ−Ｉに対して反応することが示された。
【００２５】
（４）超遠心分離画分に対する反応性
実施例１で得たモノクローナル抗体５５２０１の特異性を検討するため、ヒト健常者血漿３０mLを超遠心分離装置（日立）でＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３、及びボトムの５つの画分に分離し、５５２０１抗体と反応する粒子がどの画分に存在するか調べた。即ち、実施例２（３）と同様のＥＬＩＳＡ法で精製アポＡ−Ｉを標準品として分離した画分中のアポＡ−Ｉ量を測定した。この結果を表１に示す。表１より、モノクローナル抗体５５２０１と反応する血漿中の成分はＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬ２の中にはほとんど存在せず、ＨＤＬ３とボトム中に存在することが判明した。このことから、５５２０１抗体がＨＤＬ２のような比重の低い画分に存在するアポＡ−Ｉとは反応せず、比重の高いＨＤＬ３及びボトムに存在するアポＡ−Ｉと反応することが示された。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
（５）ｐｒｅβ１−ＨＤＬとの反応
実施例１で得たモノクローナル抗体５５２０１の特異性を検討するため、非変性二次元電気泳動法による解析を行った。即ち、ヒト健常者の血漿にモノクローナル抗体５５２０１もしくはノーマルマウスＩｇＧを添加後、まず、０．７５％のアガロース電気泳動を行い、そのアガロース切片を切り出しポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。これをニトロセルロース膜（ミリポア社）に電気的に転写し、125Ｉ標識したヤギ抗アポＡ−Ｉ抗体を反応させ、オートラジオグラフィーを用いＨＤＬ亜分画の変化を比較した。この結果を図４に示す。コントロールとして用いたノーマルマウスＩｇＧの系に比べ、モノクローナル抗体５５２０１を加えた系はｐｒｅβ１−ＨＤＬのスポットが消失するとともにＩｇＧとｐｒｅβ１−ＨＤＬとのコンプレックスと考えられるスポットが認められた。一方、ｐｒｅβ１−ＨＤＬ以外のＨＤＬのスポットには変化が見られなかった。このことから、モノクローナル抗体５５２０１がｐｒｅβ１−ＨＤＬに対して特異的に反応することが判明した。
【００２８】
（６）３７℃加温後のｐｒｅβ１−ＨＤＬ値
実施例１で得たモノクローナル抗体５５２０１の特異性を検討するため、４℃で保存しておいたヒト健常者血漿０．２mLをマイクロチューブに分注後、３７℃で２時間インキュベートし、抗体との反応性に与える影響を調べた。即ち、実施例２（３）と同様のＥＬＩＳＡ法で精製アポＡ−Ｉを標準品としてインキュベート前とインキュベート後の血漿中のｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度を測定した。この結果を表２に示す。表２より、３７℃でのインキュベート後、反応性が著しく低下することから、血中のｐｒｅβ１−ＨＤＬは加温により減少することが判明した。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
実施例３（測定方法）
実施例１で得た抗体を用い、ヒト血漿中のｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度を測定した。即ち、精製アポＡ−Ｉを標準品としてヒト健常者血漿３検体を実施例２（３）と同様のＥＬＩＳＡ法で測定した結果、図５に示す如く、３検体とも良好な希釈直線性を示し、ｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度を測定できることが示された。
【００３１】
実施例４（臨床検体の測定）
実施例３で確認されたｐｒｅβ１−ＨＤＬ測定系の臨床的意義について検討するため、４℃で保存しておいた高脂血症患者の血漿３９検体及び健常者の血漿１１検体について、３７℃加温前後の血漿中のｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度を実施例２（３）と同様のＥＬＩＳＡ法で測定した。また、対照として従来の技術である血漿中の全アポＡ−Ｉ濃度を、３７℃加温前の血漿を用いて免疫比濁法により測定した。
【００３２】
加温前血漿中の、全アポＡ−Ｉ濃度及びｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度を図６に示す。全アポＡ−Ｉ濃度は患者と健常者で明確な差は認められなかったのに対し、ｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度では患者と健常者で著しい差が認められた。
加温後のｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度を図７に示す。健常者での加温後のｐｒｅβ１−ＨＤＬ値は平均で３．８μｇ／mLに対し、患者では平均で１２．２μｇ／mLとなり、患者と健常者で著しい差が認められた。
加温前後でのｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度の減少率を図８に示す。健常者での加温による減少率は平均で、７９．１％に対し、患者では平均で６８．５％となり、患者と健常者で著しい差が認められた。
以上の結果は、加温処理前後のｐｒｅβ１−ＨＤＬ濃度及び、加温後の減少量又は減少率の測定が脂質代謝異常を示す指標として有用であることを示す。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の特定のアポＡ−Ｉに特異的に反応する抗体を使用することにより、ヒト体液中の特定のアポＡ−Ｉを測定することが可能となり、脂質代謝異常等の新たな指標がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウェスタンブロット法（電気泳動）による本発明抗体の特異性を示す図である。
【図２】ＥＬＩＳＡ法による本発明抗体の特異性を示す図である。
【図３】ゲル濾過分離した分画に対する本発明抗体の反応性を示す図である。
【図４】二次元電気泳動法による本発明抗体の特異性を示す図（電気泳動像）である。
【図５】本発明抗体を用いたＥＬＩＳＡ法での希釈直線性を示す図である。
【図６】臨床検体のｐｒｅβ１−ＨＤＬ値の測定結果を示す図である。
【図７】臨床検体の加温後のｐｒｅβ１−ＨＤＬ値を示す図である。
【図８】臨床検体の加温によるｐｒｅβ１−ＨＤＬ値の減少率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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