(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の３５７位〜３６２位のアミノ酸残基又は該アミノ酸残基と同一のアミノ酸配列を有する位置のアミノ酸残基を欠失させ、当該欠失部分にアラニン−グリシン−アラニン、アラニン−ヒスチジン−アラニン又はアラニン−アルギニン−アラニンを挿入した親アルカリセルラーゼより高い最適反応ｐＨを示す変異アルカリセルラーゼ。
【請求項２】
請求項１記載の変異アルカリセルラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
宿主が微生物である請求項４記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は衣料用洗剤等に配合可能な変異アルカリセルラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
衣料用洗剤使用時における洗濯液中のｐＨは、殆どがｐＨ１０〜１１までのアルカリ性領域にある。従って、衣料用洗剤に配合される酵素は、アルカリ性至適で且つアルカリ性環境下で安定なものが要求されてきた。
【０００３】
従来、衣料用洗剤等に配合可能なアルカリセルラーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  ＫＳＭ−６３５由来のアルカリセルラーゼ（特公昭６０−２３１５８号公報、特公平６−０３０５７８号公報、米国特許第４９４５０５３号明細書等）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  ＫＳＭ−６４由来のアルカリセルラーゼ（Shikata et al. Agric.Biol.Chem.,54,91-96,1990、Sumitomo et al.,Biosci. Biotechnol.Biochem.,56,872-877,1992）、中温性の好アルカリ性菌  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ． ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ−ＢＰ７８７５）により生産される耐熱性アルカリセルラーゼ（特開平１０−３１３８５９号公報）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  ＫＳＭ−Ｎ２５７由来のアルカリセルラーゼ（特願平１２−２８１３７８号）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ. ＫＳＭ−Ｎ１３１由来のアルカリセルラーゼ（特願平１２−３７３８５９号）等が知られているが、これらはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした場合の最適反応ｐＨがいずれも９付近であり、洗濯に対して最適なｐＨを有するものではない。
【０００４】
一方、糖質分解酵素において、その最適反応ｐＨを変化させるという研究としては、好アルカリ性Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のアルカリセルラーゼ（ＮＫ1）とＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の中性セルラーゼ（ＢＳＣ）のキメラタンパク質を構築し、そのｐＨ特性を変化させた例が報告されているが、これは、最適ｐＨをアルカリ性から中性にシフトさせたものである（Park et al.,Protein Eng.,6,921-926,1993）。
【０００５】
また最近では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセロビオヒドロラーゼ（Ｃｅｌ7Ａ）に関し、その活性中心近傍のアミノ酸を置換することで、野性型と比較してより最適ｐＨを上昇させた報告がなされているが（Beker et al,Biochem. J.,356,19-31,2001）、これは野生型酵素の最適ｐＨが酸性領域にあり、その変異体の最適ｐＨは１ｐＨユニット以内の上昇にすぎない。
このように、糖質分解酵素においては、その最適反応ｐＨをアルカリ性側にシフトさせた報告例は殆ど無いのが実情である。
【０００６】
本発明は、アルカリセルラーゼの遺伝子を改変することによって、洗剤用酵素として最適のｐＨを有する変異アルカリセルラーゼを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）について、その活性ドメインを中心に立体構造を予測し、部位特異的変異法により種々の変異を導入することにより目的の酵素を探索した結果、ループ構造の一部を構成する特定領域のアミノ酸残基を欠失させ、当該部位に新たなペプチド残基を挿入することで、ＣＭＣ分解活性における最適反応ｐＨを上昇できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の３４３位〜３７７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基から選ばれる１以上を欠失させ、当該欠失部分にアミノ酸残基数２〜１５のペプチド残基を挿入した変異アルカリセルラーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、該遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性を有するセルラーゼを変異の対象となるセルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の３４３位〜３７７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基から選ばれる１以上を欠失させ、当該欠失部分にアミノ酸残基数２〜１５のペプチド残基を挿入してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１１】
ここで、親アルカリセルラーゼである配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼとしては、当該アミノ酸配列と９５％以上の相同性を示すものがより好ましく、９８％以上の相同性を示すものがさらに好ましく、これらは野生型又は野生型の変異体であってもよい。尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）を用いて計算することができる。
【００１２】
また、斯かる配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼは、ホモロジーモデリングの手法を用い、３Ｄ−１Ｄ、ＸＰＬＯＲＥ及びＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムによりセルラーゼの分子構造を予測した場合に、配列番号１において４２番目のロイシンから４０４番目のバリンまでの活性ドメイン領域と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、且つ配列番号１における３４３番目のアスパラギンから３７７番目のロイシンに相当するアミノ酸配列がセルラーゼ分子内においてループ構造を有しているものが好ましい。尚、この場合のアミノ酸配列の相同性は、例えばＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等に準じて計算することができる。
【００１３】
また親アルカリセルラーゼは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法あるいはゲル濾過法により得られる分子量が８６，０００±２，０００である、カルボキシメチルセルロースを基質とした場合の最適反応ｐＨが７．５〜９．０の間にある、最適反応温度が４０〜５０℃の範囲にある、等の性質を有しているのが好ましく、更にカルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解することが好ましく、ｐＨ９で５０℃、１０分間の処理においても充分に安定であることが好ましい。
特に、分子量が８６，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはSephacryl Ｓ２００カラムによるゲル濾過法）、最適反応ｐＨが８．６〜９．０、最適反応温度が５０℃、カルボキシメチルセルロースのほかにリケナンを良好に分解し、ｐＨ９、５ｍＭ塩化カルシウム存在下で５０℃、１０分間の処理を行った場合９５％以上（３０℃、１０分間処理時の残存活性を１００％とする）の残存活性を認めるような性質を有するものが好ましい。
【００１４】
以上より、本発明における親アルカリセルラーゼとしては、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの他、上記段落〔００１２〕で示したアミ酸配列上の特徴を有するもの及び／又は段落〔００１３〕で示した酵素学的性質を有するもの、特に段落〔００１２〕で示したアミ酸配列上の特徴を有し且つ段落〔００１３〕で示した酵素学的性質を有するものであり、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を示すものが好ましい。
【００１５】
具体的には、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ」であるＥｇｌ−２３７［バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］、バチルス  エスピー  １１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen, Microbiol, 132, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７号）（相同性９５．０％）等が挙げられる。
【００１６】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、上記親アルカリセルラーゼにおいて、配列番号１の３４３位〜３７７位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基から選ばれる１以上を欠失させ、当該欠失部分にアミノ酸残基数２〜１５のペプチド残基を挿入してなるものである。
欠失させるアミノ酸残基は、配列番号１の３４３位〜３７７位における任意の連続又は非連続の１〜３５個のアノ酸残基であればよく、好ましくは３５０位〜３７７位中、より好ましくは３５５位〜３６５位中、更に好ましくは３５７位〜３６２位中のアノ酸残基である。
特に、３４３位〜３７７位中の任意の１〜２７残基、２〜１５残基又は３〜１０残基、３５５位〜３７７位中の任意の１〜８残基、３〜６残基又は全てのアミノ酸残基、３５７位〜３６２位中の任意の２残基、２〜５残基又は全てのアミノ酸残基が好ましい。
【００１７】
斯かる配列番号１の３４３位〜３７７位のアミノ酸領域は、ホモロジーモデリングによる立体構造解析（Ozawa et al.,Protein Eng.,14,501-504,2001）によれば、Ｅｇｌ−２３７の活性中心から比較的離れた位置に存在し、自由度が高く、且つセルラーゼ構造の維持に深く関与している考えられるループ構造の一部を形成する領域であると推定される。
【００１８】
尚、「配列番号１の３４３位〜３７７位に相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。セルラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）の３５７位〜３６２位に相当する位置を、前述したＥｇｌ−１１３９、Ｅｇｌ−６４、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂについて示せば、下記表１のとおりである。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
斯かる欠失部位に挿入すべきペプチド残基としては、２０種類の必須アミノ酸のいずれから構成されていていもよいが、アラニン、グリシン、ヒスチジン、アルギニンを含むものが好ましく、特にアラニンとグリシン、アラニンとヒスチジン、アラニンとアルギニンを含むものが好ましい。
また、ペプチド残基を構成するアミノ酸残基の数としては、２〜１５個であるのが好ましく、酵素活性の点から、２〜１０個、更には２〜６個であるのが好ましく、特に３個であるのが好ましい。
【００２１】
斯かるペプチド残基の好適な例としては、例えばアスパラギン−スレオニン−アラニン−バリン−グリシン−イソロイシン、アラニン−セリン−メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン−グルタミン酸、システイン−ロイシン−グリシン−ヒスチジン−セリン、チロシン−グルタミン−リジン−アラニン−アラニン、アスパラギン酸−メチオニン−イソロイシン−バリン、イソロイシン−スレオニン−プロリン−リジン、グリシン−ロイシン−システイン、セリン−バリン−フェニルアラニンが挙げられるが、中でも両末端にアラニン残基を有する３〜６残基のぺプチド残基が好ましく、アラニン−任意の１個のアミノ酸−アラニンがより好ましく、アラニン−グリシン−アラニン、アラニン−ヒスチジン−アラニン又はアラニン−アルギニン−アラニンが特に好ましい。
【００２２】
また、本発明の変異アルカリセルラーゼには、アルカリセルラーゼ活性並びに改変された特性を失わない限り、上記の変異とは別に、アミノ酸配列中において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものも包含する。
【００２３】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、親アルカリセルラーゼに対し目的の変異を導入すればよく、例えば以下の方法により行われる。
すなわち、親アルカリセルラーゼを培養して得られた培養液から遠心分離により菌体を分離し、該菌体からのアルカリセルラーゼ遺伝子を含んだ染色体ＤＮＡを調製［例えば、マーマーの方法（J.Mol.Biol.,3,208-212,1961）や斎藤と三浦の方法（Biochim.Biophys.Acta,72,619-629,1963）］し、ショットガンクローニング法やＰＣＲ法を用いて親アルカリセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子（配列番号２）をクローニングすることができる。クローニングされた遺伝子に対し変異を導入し、変異遺伝子を含むプラスミドを用いて適当な宿主菌を形質転換し、形質転換株を培養することによってその培養物から本発明の変異アルカリセルラーゼを得ることができる。
【００２４】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子に変異を導入する方法としては、部位特異的変異法等を用いることができる。例えばＴａｋａｒａ社のＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  ｋｉｔ等を使用することができる。変異が導入されたアルカリセルラーゼ遺伝子は適当なベクターに組込むことができる。
【００２５】
ここで使用可能なベクターとしては、宿主菌内で複製維持可能であり、アルカリセルラーゼ遺伝子を発現させることができ、組込まれた該遺伝子を安定に保持できれば如何なるものも使用可能である。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌を宿主とする場合、ｐＵＢ１１０やｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２或いはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００２６】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがＢａｃｉｌｌｕｓ属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）等のグラム陰性菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属（放線菌）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（酵母）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（カビ）等の真菌が挙げられる。
【００２７】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００２８】
かくして得られる変異アルカリセルラーゼの最適反応ｐＨは、親アルカリセルラーゼの値よりも高く、好ましくは、ｐＨ９．０〜９．５、より好ましくはｐＨ９．５〜１０．０まで高アルカリ側にシフトしているものである。さらに変異アルカリセルラーゼの最適反応ｐＨ以外の諸性質は、段落〔００１３〕に示した親アルカリセルラーゼの諸性質を保持していることが好ましい。
【００２９】
【実施例】
実施例１  Ｅｇｌ−２３７のループ領域の改変
Ｅｇｌ−２３７の分子モデルは、既に結晶構造が解析されているＣｅｌＫの解析データを基にホモロジーモデリングにより構築し、モデル構造の精密化は、３Ｄ−１Ｄ、ＸＰＬＯＲＥ及びＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムにより行った。次いで、得られた情報を基にループ構造内の一部のアミノ酸（３５７番グリシンから３６２番スレオニン）を欠失させると同時にアラニン−グリシン−アラニン、アラニン−ヒスチジン−アラニン及びアラニン−アルギニン−アラニンを新たに導入した。このループ領域の変異には、それぞれ変異導入プライマー１、２及び３（配列番号３、４及び５）を用い、アンチセンスプライマーには変異導入プライマー４（配列番号６）を用いた。アラニン−グリシン−アラニン変異導入においては鋳型ＤＮＡとしてｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＥｇｌ−２３７遺伝子を用いた。アラニン−ヒスチジン−アラニン及びアラニン−アルギニン−アラニン変異導入には鋳型ＤＮＡにｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたアラニン−グリシン−アラニン変異体プラスミドを用いた。具体的には、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μＭ）、アンチセンスプライマー２０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ ｍＭ デオキシヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μL、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ ｕｎｉｔｓ、タカラ)及び脱イオン水３９．５μＬを混合した後、ｇｅｎｅ ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（アマシャムファルマシア）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃１．５分間（３０サイクル）及び７２℃３分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｅｌ ｂａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア）で精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った後、精製した。リン酸化されたＰＣＲ産物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ ｍＭ ｄＮＴＰ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ１μＬ(５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５８℃１分間、７２℃６分間（３０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。得られたＰＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った。エタノール沈澱により回収された１０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラ）を用いて１６℃で１８時間ライゲーション反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿によりＤＮＡ混液を回収した。
【００３０】
実施例２  形質転換法
実施例１で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換体を取得した（Chang and Cohen,Mol.Gen.Gent.,168,111,1979）。この方法により得られたプロトプラストをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、シグマ）を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬）、０．３Ｍ コハク酸二ナトリウム６水和物、０．５％ カザミノ酸テクニカル（ディフコ）、０．５％ 酵母エキス、０．３５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１５％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．５％ グルコース、０．４％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１％ 牛血清アルブミン（シグマ）、０．５％ ＣＭＣ（関東科学）、０．００５％ トリパンブルー（メルク）及びアミノ酸混液 (ロイシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗抹し、３０℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培地（３％ ポリペプトンＳ、３％ マルトース、０．５％ 魚肉エキス（和光純薬）、０．１％ 酵母エキス、０．１％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）で、３０℃、１５時間振とう培養を行い、集菌後、ｍｉｃｒｏ ｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア）によりプラスミドを回収、精製した。取得したプラスミド中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の変異配列の確認は、３７７ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステム）を用いて行なった。変異導入近辺の領域を解読できるような適当なシークエンス用プライマーを用いて塩基配列解析を行い、目的の変異が導入されているプラスミドを選別した。
【００３１】
実施例３  セルラーゼ変異体の生産
宿主菌Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＳＷ１２１４株の培養は、３％ ポリペプトン S（日本製薬製）、０．５％ 魚肉エキス、０．０５％ 酵母エキス、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０２ ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）及び５％ マルトースを含んだ培地を用いて、３０℃で７２時間行った。
各種変異体を培養した結果、ループ領域変異体アラニン−グリシン−アラニンのセルラーゼ活性量は３６８００Ｕ／Ｌ、アラニン−ヒスチジン−アラニンの活性量は３４７００Ｕ／Ｌ及びアラニン−アルギニン−アラニンの活性量は３２４００Ｕ／Ｌであった。
【００３２】
尚、セルラーゼ活性は、３，５-ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法により測定した。
即ち、０．２ｍＬの０．５Ｍ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃、２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ ジニトロサリチル酸、３０％ ロッシェル塩、１．６％ 水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００３３】
実施例４  組換えセルラーゼループ改変体の精製
組換えセルラーゼループ改変体の培養上清液を脱イオン水にて１０倍に希釈した後、予め、１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー）カラム（２．５ｃｍ×５ｃｍ）に添着した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、同緩衝液中０〜０．４Ｍの塩化ナトリウム４００ｍＬによる直線濃度勾配によりタンパク質を溶出させた。目的の組換えセルラーゼループ改変体は、塩化ナトリウム濃度０．２５Ｍ付近で、電気泳動的にほぼ単一な成分として溶出された。脱塩濃縮は、限外濾過膜（ＰＭ１０、ミリポア）を用いて行った。
【００３４】
実施例５  組換えセルラーゼループ改変体の最適反応ｐＨ
実施例４の如く調製して得られた組換えセルラーゼループ改変体の精製標品を用いて、最適反応ｐＨを調べた。グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２〜１０．９）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、組換え野生型セルラーゼの最適反応ｐＨは、ｐＨ９．０であるのに対し、アラニン−グリシン−アラニン変異体のセルラーゼの最適反応ｐＨは、ｐＨ１０と１ｐＨユニット高アルカリ性側にシフトすることが判った（図１）。また、アラニン−ヒスチジン−アラニン変異体及びアラニン−アルギニン−アラニン変異体の最適反応ｐＨは、９．６付近であり、さらにｐＨ８．８からｐＨ９．９の活性は最適ｐＨ９．６での活性を１００％とした場合、相対値９５％以上と親セルラーゼやアラニン−グリシン−アラニン変異体に比べ高くなっていることも判った（図２、３）。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、洗濯液中のｐＨ（ｐＨ１０．５付近）に近い最適ｐＨを有し、洗剤用酵素として有用である。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。
【図２】アラニン−グリシン−アラニン変異体の最適反応ｐＨを示す図である。
【図３】アラニン−ヒスチジン−アラニン変異体の最適反応ｐＨを示す図である。
【図４】アラニン−アルギニン−アラニン変異体の最適反応ｐＨを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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