(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＳ１００αβおよびＳ１００ββの総量を定量する方法であって、
ａ）サンプルの一部分取と、Ｓ１００ββに特異的でありＳ１００ααおよびＳ１００αβに０％以上５％未満の範囲で交差反応性を示すＳ１００のエピトープを認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを、該抗体のＳ１００ββへの結合およびそれとの複合体形成を可能とする条件下で接触させ；
ｂ）上記抗体に結合した抗原の量を測定し、それによりサンプル中のＳ１００ββの量を測定し；
ｃ）サンプルの一部分取と、Ｓ１００αβに特異的でありＳ１００ααおよびＳ１００ββに０％以上１０％未満の範囲で交差反応性を示すＳ１００のエピトープを認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを、該抗体のＳ１００αβへの結合およびそれとの複合体形成を可能とする条件下で接触させ；および
ｄ）上記抗体に結合した抗原の量を測定し、それによりサンプル中のＳ１００αβの量を測定することを含む、上記方法。
【請求項２】
請求項１のステップａ）およびｂ）を含む、サンプル中のＳ１００ββの量を定量する方法。
【請求項３】
Ｓ１００ββに特異的でありＳ１００ααおよびＳ１００αβに０％以上５％未満の範囲で交差反応性を示すＳ１００のエピトープを認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを含む、Ｓ１００ββの量をアッセイするためのキット。
【請求項４】
モノクローナル抗体が、ＥＣＡＣＣ寄託番号９８０８２６１９を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３により産生される抗体である、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
モノクローナル抗体が捕獲抗体で、キットはさらに検出抗体を含む、請求項３または４に記載のキット。
【請求項６】
検出抗体が、ＥＣＡＣＣ寄託番号９８０８２６１７を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ２３：２により産生される、抗体またはその抗原結合断片である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
請求項１に記載のステップｃ）およびｄ）を含む、サンプル中のＳ１００αβの量を定量する方法。
【請求項８】
Ｓ１００αβに特異的でありＳ１００ααおよびＳ１００ββに０％以上１０％未満の範囲で交差反応性を示すＳ１００のエピトープを認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを含む、Ｓ１００αβの量をアッセイするためのキット。
【請求項９】
モノクローナル抗体が、ＥＣＡＣＣ寄託番号９８０８２６１６を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ３５：２により産生される抗体である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
モノクローナル抗体が捕獲抗体で、キットはさらに検出抗体を含む、請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
検出抗体が、ＥＣＡＣＣ寄託番号９８０８２６１７を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ２３：２により産生される抗体またはその抗原結合断片である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ＥＣＡＣＣ寄託番号９８０８２６１９を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３。
【請求項１３】
ＥＣＡＣＣ寄託番号９８０８２６１６を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ３５：２。
【請求項１４】
ＥＣＡＣＣ寄託番号９８０８２６１７を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ２３：２。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００に対する新規モノクローナル抗体と、総Ｓ１００の測定のため、または血清、血漿、脳脊髄液および他の体液中のＳ１００の異なるアイソフォームの特異的測定用の、イムノアッセイの開発のためのこれら抗体の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｓ１００は、ＥＦ−ハンドカルシウム結合タンパク質のＳ１００／カルモジュリン／トロポニンＣスーパーファミリーに属する２１ｋＤａのタンパク質である（論評については、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ３７：４１７−４２９、１９９５参照）。Ｓ１００は初めＭｏｏｒｅおよび共同研究者らによりヒト脳から単離され、当初は脳特異的タンパク質と考えられていた（Ｍｏｏｒｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９：７３９−７４４、１９６５）。今日、アミノ酸配列および機能的類似性に基づきＳ１００ファミリーの１６のメンバーが同定されている（Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ３７：４１７−４２９、１９９５）。
【０００３】
脳組織のＳ１００は、αおよびβサブユニットのホモおよびヘテロダイマーからなる。αおよびβサブユニットは、高度の配列および種相同性を示す（Ｉｓｏｂｅら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８９：３７９−３８８、１９７８；Ｉｓｏｂｅら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：７９−８６、１９８１）。Ｓ１００ββは、高濃度でグリア細胞およびシュワン細胞に存在し、一方、Ｓ１００αβは、グリア細胞に発現されるが、シュワン細胞には発現されない（Ｉｓｏｂｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ４３：１４９４−１４９６、１９８４）。Ｓ１００ααは、神経細胞に存在するが、主に骨格筋、腎臓および心臓などの脳外組織に発現される（ＫａｔｏおよびＫｉｍｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８４２：１４６−１５２、１９８５）。少量のＳ１００が、異なる正常なヒト組織：皮膚、軟骨細胞、脾臓、脂肪組織、腎臓、心臓、骨格筋、並びに、異なる悪性組織；悪性黒色腫、神経膠腫、および軟組織腫瘍に存在する（Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ３７：４１７−４２９、１９９５）。
【０００４】
血清および脳脊髄液中のＳ１００の測定は、脳外傷患者の管理に、および心肺バイパス手術後の神経学的合併症の評価に有用であることが示された（Ｍｉｃｈｅｔｔｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．４４：７３１−７４３  １９８０；Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｓｔｒｏｋｅ  １８：９１１−９１８、１９８７；Ｉｎｇｅｂｒｉｇｈｔｓｅｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．５９：１０３−１０４、１９９５；Ｗｅｓｔａｂｙら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６１：８８−９２、１９９６）。Ｓ１００の血清学的測定も、追跡調査や、悪性黒色腫の患者の予後情報を得るのに有用であることが示された（Ｈｅｎｚｅら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １９４：２０８−２１２、１９９７；Ｂｕｅｒら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、７５：１３７３−１３７６、１９９７）。様々な障害が、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの総量の変化またはＳ１００の異なるアイソフォーム間の比の変化に関連し得る。それ故、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの総量の測定、並びに、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの相異なるアイソフォームの測定のための、正確な方法が必要である。
【０００５】
ＷＯ９８／０１４７１は、Ｓ１００の総量を測定する方法を開示する。この方法は、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの個々のアイソフォームの量の情報は得られないという大きな欠点をもつ１ステップを含み、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββに対する応答は同一ではなく、従って本発明に記載のアッセイにより総Ｓ１００（すなわちＳ１００αβとＳ１００ββの合計）がより正確に測定される。本発明に記載の方法により、Ｓ１００の総量はより正確に測定される。なぜなら、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββは、２つの別々のステップで定量され、個々のステップでアイソフォームＳ１００αβおよびＳ１００ββの特異的定量がなされるからである。本発明に記載の方法により、２つのアイソフォームＳ１００αβおよびＳ１００ββの濃度の正確な情報が得られる。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、Ｓ１００に対するモノクローナル抗体、並びに、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの総量の測定およびＳ１００の異なるアイソフォームの特異的測定（すなわちＳ１００αβまたはＳ１００ββのいずれかに特異的）のためのイムノアッセイの設計を提供する。
【０００７】
本発明は、脳傷害患者の対応、神経変性疾患、並びに、悪性黒色腫、神経膠腫およびある軟組織腫瘍の患者の追跡調査における、総Ｓ１００の血清学的測定およびＳ１００の異なるアイソフォームの測定に有用である。
【０００８】
（具体的な実施例の説明）
本発明は、Ｓ１００に対する新規モノクローナル抗体、並びに、血清、血漿、脳脊髄液または他の体液中のＳ１００を定量するためのイムノアッセイの設計を提供する。
【０００９】
該方法は、Ｓ１００の特異的エピトープに対するモノクローナル抗体の確立、総Ｓ１００の定量のためのイムノアッセイ、Ｓ１００αβに特異的なイムノアッセイ、およびＳ１００ββに特異的なイムノアッセイの設計におけるこれらの抗体の使用を含む。
【００１０】
イムノアッセイは、免疫（非競合的）アッセイフォーマット用に設計されるが、これに限定されない。本発明に記載の抗体は、競合的アッセイフォーマットにも使用し得る。該イムノアッセイは、Ｓ１００の捕獲および検出に、Ｓ１００βの特異的エピトープに対するモノクローナル抗体を使用するが、これに限定されない。本発明では、モノクローナル抗体が好ましいが、本発明に記載のアッセイに、ポリクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、本発明により提供されるモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性をもつタンパク質またはＤＮＡ断片を使用してもよい。
【００１１】
さらに、該イムノアッセイは、サンプル中のＳ１００を吸着させるための、Ｓ１００モノクローナル抗体を含む固相を使用するが、これに限定されない。固相は、マイクロタイタープレートのウェル、プラスチックチューブ、ビーズ、磁気粒子またはその他であり得る。固相は、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン等から製造し得る。捕獲抗体は、物理的吸着、共有結合またはビオチン−アビジン橋を介して、またはその他により（これに限定されない）、当業者に一般的な既知の方法を使用して、固相に結合させ得る。
【００１２】
本発明では、多種多様の標識が、Ｓ１００の検出に適している。特に関心が高い酵素としては、加水分解酵素、特にエステラーゼおよびグリコシダーゼ、並びに酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼを含む。また、放射性標識（例えば１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ等）、蛍光化合物（例えばフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ランタニド誘導体等）並びに化学発光剤（例えばルシフェリン、ルミノール、アクリジニウムエステル等）も適している。
【００１３】
本発明に記載のアッセイは、任意の２エピトープアッセイ型式；２ステップのフォワードサンドイッチアッセイ、１ステップのサンドイッチアッセイまたはバックワードサンドイッチアッセイで実施できる。
【００１４】
本発明に記載のアッセイの実施において、サンプル（好ましくは１〜１０００μＬ）を、捕獲抗Ｓ１００ＭＡｂを含む試験容器中でインキュベートする。好ましい構成では、サンプルは、血清、血漿または脳脊髄液からなる。本発明に従って、サンプルおよびＳ１００ＭＡｂを、Ｓ１００抗原の捕獲Ｓ１００ＭＡｂへの結合が可能な条件下でインキュベートする。好ましい構成では、捕獲抗体をビオチン−ストレプトアビジン橋を介して固相に固定させる。固相に結合した抗体に吸着したＳ１００抗原の検出のため、Ｓ１００の独立的エピトープに対して指向させた標識モノクローナル抗体を加え、抗体のＳ１００抗体複合体への結合が可能な条件下で試験容器中でインキュベートする。洗浄後、標識を、使用する標識に適切な系で検出する。
【００１５】
本発明は、捕獲抗体として使用するＳ１００の異なるアイソフォームに特異的な抗体、並びに、検出抗体として使用する、エピトープが、該捕獲抗体のエピトープと重複していない抗体を提供する（実施例２．３ｂ参照）。捕獲および検出抗体の選択に応じて、好ましい特異性をもつイムノアッセイ、すなわち、Ｓ１００αβを特異的に定量するアッセイ、およびＳ１００ββを特異的に定量するアッセイを設計し得る。
【００１６】
本発明に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３、Ｓ２１：４、Ｓ２３：２、およびＳ３５：２は、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ソールズベリー、ウィルトシャー州ＳＰ４  ０ＪＧ、英国）に寄託され、ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１９、９８０８２６１８、９８０８２６１７および９８０８２６１６をそれぞれ割当てられた。これらの寄託は、１９９８年８月２６日になされた。また本発明は、実施例２．３ｂに概略を示した阻害試験により測定したところ問題の抗体の結合を＞７５％阻害することから示されるように、ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３、Ｓ３５：２、Ｓ２３：２、およびＳ２１：４により産生される抗体と同じ結合特異性をもつ、抗体、抗体断片またはペプチドも含んでいる。
【００１７】
本発明を、ここで以下の非制限的な実施例および添付の図面を参照してより詳細に記載する。
【００１８】
（実施例１）
ハイブリドーマの確立およびＳ１００特異的モノクローナル抗体の産生
Ｓ１００ββは、例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、英国；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、米国；ＨｙＴｅｓｔ、フィンランド、などのいくつかの業者から市販で入手できる。市販で入手できるＳ１００ββは、モノクローナル抗体の確立のために免疫原として使用し得る。Ｓ１００ββはまた、文献で入手できる方法に従って、ヒトまたはウシ脳から単離してもよい（Ｍｏｏｒｅ、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：５３−７４、１９８２）。
【００１９】
好ましい手順では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、リビアジュバント中１０〜５０μｇのＳ１００ββを用いて腹腔内免疫化した。免疫化と、同抗原またはＳ１００ββ／Ｓ１００αβの混合物を用いた６０〜９０日間中の３〜４回の追加免疫の後に、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、記載のようにＰ３×６３Ａｇ８骨髄腫細胞と融合させた（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７１：１７８−１８１、１９８３）。
【００２０】
マウスＩｇＧ＋Ｍに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗血清で被膜したマイクロタイターウェル中で、ハイブリドーマ上清をスクリーニングすることにより、Ｓ１００と反応する抗体を産生するハイブリドーマを選抜した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓ  Ｌａｂ、米国）。次いで、ウェルをＳ１００ββ抗原と共にインキュベートし、洗浄後、結合したＳ１００抗原をポリクローナルウサギ抗Ｓ１００およびＨＲＰ標識ブタ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ  ＡＳ、デンマーク）と共にインキュベートすることにより検出した。
【００２１】
Ｓ１００ββおよびＳ１００αβとは反応性を示すが、Ｓ１００ααには陰性である抗体を産生するクローンを、限界希釈により２回クローン化した。モノクローナル抗体は、ローラーボトル中、ＤＭＥＭ、５％ウシ胎児血清中１０４細胞／ｍＬの接種による、ハイブリドーマクローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養により産生し、１０〜１４日間増殖させた。次いで、モノクローナル抗体を、製造業者の薦めによりプロテインＡ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｔｄ、ダラム、英国）アフィニティークロマトグラフィーにより培養培地から精製した。
【００２２】
ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３、Ｓ２１：４、Ｓ２３：２、およびＳ３５：２によりそれぞれ産生されるＳ１０、Ｓ２１、Ｓ２３およびＳ３５モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、本発明に記載のイムノアッセイの設計用に選抜した。
【００２３】
（実施例２）
抗体の性質決定
２．１  アイソタイプの定量
抗体のアイソタイプは、マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ、カリフォルニア州、米国）に対する抗体で被膜したマイクロタイタープレートに、確立された抗体を吸着させた後に測定した。次に、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、マウスＩｇＡおよびマウスＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ、カリフォルニア州、米国）に特異的なＨＲＰ標識抗体と共にインキュベートすることと、ＯＰＤ基質と共にインキュベートすることと、４５０ｎｍのＯＤを測定することにより、アイソタイプを検出した。本発明に記載の全抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプであることが判明した。
【００２４】
２．２  Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααとの反応性
確立されたＳ１００ＭＡｂ：ｓのＳ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααとの反応性は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で、マイクロタイタープレートのウェルに吸着させたＳ１００ＭＡｂを用いて、精製Ｓ１００抗原と共にインキュベートし、結合したＳ１００をポリクローナルウサギ抗Ｓ１００次いでＨＲＰブタ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ  ＡＳ、デンマーク）で検出することにより測定した。
【００２５】
Ｓ１００ＭＡｂ溶液を室温で一晩インキュベートすることにより、Ｓ１００ＭＡｂをヌンク・マキシソープ・イムノプレート（Ｎｕｎｃ  ＡＳ、デンマーク）のウェル内に被膜させた（２００μＬ／ウェル、０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４中１０μｇ  ＭＡｂ／ｍＬ）。洗浄後、３００μＬ／ウェルの５０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、０．１ｇ／Ｌ  ＢＳＡ、６０ｇ／Ｌソルビトールと共にインキュベートすることにより、非特異的結合を遮断した。
【００２６】
ＥＩＡでは、５０μＬのＳ１００ββ、Ｓ１００αβ、またはＳ１００αα（５０μｇ／Ｌ）、（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．英国）、および１００μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ  ＢＳＡ、０．５ｇ／ＬウシＩｇ、０．１ｇ／Ｌメチルイソチアゾロン、ｐＨ７．７５）を、二回繰り返しで、Ｓ１００ＭＡｂ被膜マイクロタイターウェル内でインキュベートした。常に振盪しながら１時間インキュベートした後、ウェルを２回洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１／３０００に希釈した、１００μＬのウサギ抗ヒトＳ１００（Ｄａｋｏ  ＡＳ、デンマーク）を加え、１時間インキュベートを続けた。さらに洗浄した後、結合ウサギ抗Ｓ１００を、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で１／５００に希釈したＨＲＰブタ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ  ＡＳ）と共に１時間インキュベートし、洗浄後、１００μＬの３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｅｌｉｓａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、レキシントン、ケンタッキー州、米国）と共にインキュベートした後にＯＤ６２０ｎｍを測定することにより決定した。
【００２７】
免疫測定法型式での選択Ｓ１００ＭＡｂ：ｓの反応性を、図１に示す。これらの結果は以下の通りである：
Ａ群のＳ３５ＭＡｂ（実施例２．４参照）は、Ｓ１００αβでは到達可能だが、Ｓ１００ααおよびＳ１００ββでは到達できないエピトープを認識する。
【００２８】
Ｂ群のＳ２１ＭＡｂは、Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの両方では到達可能だが、Ｓ１００ααでは到達できないエピトープを認識する。
【００２９】
Ｃ群のＳ２３ＭＡｂは、Ｓ１００ββおよびＳ１００αβでは等価に到達可能だが、Ｓ１００ααでは到達できないエピトープを認識する。
【００３０】
Ｅ群のＳ１０ＭＡｂは、Ｓ１００ββのみでは到達可能だが、Ｓ１００ααおよびＳ１００αβでは到達できないエピトープを認識する。
【００３１】
２．３  エピトープ性質決定
可能なサンドイッチ組合せの決定（実施例２．３ａ）、並びにＳ１００ββおよびＳ１００αβの結合の阻害（実施例２．３ｂ）により、異なるＳ１００ＭＡｂの抗原性ドメイン間の構造的関係が性質決定された。
【００３２】
２．３ａ  異種Ｓ１００ＥＩＡの用量反応曲線
Ｓ１００ＥＩＡ：ｓは、上記のようにマイクロタイターウェルに被膜させたＳ１００ＭＡｂ、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識Ｓ１００ＭＡｂを用いて設計した。Ｓ１００ＭＡｂ：ｓは、Ｎａｋｏｎｅ（ＮａｋｏｎｅおよびＫａｗａｏｉ、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、２２：１０８４−１０８９、１９７４）の手順に従って、ＨＲＰ（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、米国）で標識した。
【００３３】
Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの用量反応曲線は、以下のように決定した：５０μＬのＳ１００ββまたはＳ１００αβ（０〜１００μｇ／Ｌ）＋１００μＬのアッセイ緩衝液を、二回繰り返し、ＭＡｂ被膜ウェル中で１時間、常に振盪しながらインキュベートした。洗浄後、１００μＬのＨＲＰ  Ｓ１００ＭＡｂ（２μｇ／ｍＬ）を加え、１時間インキュベートし続けた。洗浄し、１００μＬ  ＴＭＢ基質と共にインキュベートした後、ＯＤを、ＥＬＩＳＡ解読器で６２０ｎｍで測定した。
【００３４】
２．３ｂ  Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの結合の阻害
本発明に記載の異なる抗体のエピトープ間の３次元関係を推定するため、阻害試験を実施した。第二抗体の、第一抗体と抗原間の複合体への結合が阻害される場合、２つの抗体のエピトープは、三次元構造で重複しているか、または近接している。第二抗体の、第一抗体と抗原間の複合体への結合が影響を受けない場合、２つの抗体のエピトープは互いに異なる。
【００３５】
Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの、Ｓ１００ＭＡｂへの結合の阻害は、マイクロタイタープレート中、５０μＬ  Ｓ１００ββまたはＳ１００αβ（５０μｇ／Ｌ）＋１００μＬのＳ１００ＭＡｂ（５μｇ／ｍＬ）を３０分間インキュベートすることにより試験し、対照として、５０μＬ  Ｓ１００抗原＋１００μＬ  ＰＢＳ−１％ＢＳＡを、同じように事前にインキュベートした。事前にインキュベートした後、１００μＬを、試験するＳ１００ＭＡｂで被膜した別のマイクロタイタープレートに移し、１時間インキュベートした。洗浄後、結合したＳ１００抗原を、ウサギ抗ヒトＳ１００およびＨＲＰ  ＳｗＡＲと共にインキュベートすることにより検出した。
【００３６】
阻害は、ＰＢＳ−１％ＢＳＡと共に事前にインキュベートしたＳ１００抗原と比較した、Ｓ１００ＭＡｂで事前にインキュベートしたＳ１００抗原の結合の減少％として計算した。
【００３７】
阻害は、捕獲および阻害抗体として全ての抗体を用いて実施した。選択したＭＡｂ：ｓの阻害のいくつかの結果を、図２に示す。Ｓ３５ＭＡｂ（図２Ａ）は、それ自体、Ｓ３４、およびＳ７２によってのみ阻害された。ＭＡｂ（図２Ｂ）は、それ自体、Ｓ５、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｓ２１、Ｓ４９、Ｓ５０、Ｓ５３、Ｓ５４、Ｓ５５、Ｓ５９、Ｓ６０、Ｓ６２、Ｓ６７、Ｓ６６、Ｓ７７、およびＳ８３により阻害された。Ｓ２３ＭＡｂ（図２Ｃ）は、それ自体によってのみ阻害され、すなわち独特なエピトープは認識するが、任意の他の確立されたＭＡｂ：ｓによっては認識されない。Ｓ２５  ＭＡｂ（図２Ｄ）は、それ自体、Ｓ１１、Ｓ２５、Ｓ２８、Ｓ３６、Ｓ４３、Ｓ４４、Ｓ５８、およびＳ６５により阻害された。Ｓ３６  ＭＡｂ（図２Ｅ）は、それ自体、Ｓ２８、Ｓ３６、Ｓ４３、Ｓ５８、およびＳ６５により阻害された。さらに、Ｓ３６ＭＡｂは、部分的に、Ｓ１１、Ｓ２５およびＳ４４により阻害された。Ｓ１０ＭＡｂ（図２Ｆ）は、それ自体、Ｓ１２およびＳ１３によってのみ阻害された。
【００３８】
２．４  抗原ドメイン
精製Ｓ１００アイソフォームとの反応性（実施例２．２）、Ｓ１００の結合の阻害（実施例２．３ｂ）、および異なる抗体組合せの用量反応（実施例２．３ａ）に基づいて、異なるエピトープ群のＡ〜Ｅ群（表１）に抗体を区分した。同じエピトープ群に属する抗体、すなわち、重複したエピトープを有する抗体は、互いに＞７５％阻害した。異なるエピトープ群に属する抗体、すなわち互いに別々のエピトープをもつ抗体は互いに＜４０％阻害した。異なる亜群への分離は、どの抗体が抗原と最初に反応するか、およびどの抗体が形成された抗原−抗体複合体と反応するかに応じて阻害が異なる場合、すなわち部分的な阻害（４０〜７５％）が起こる場合に実施した。
【００３９】
【表１】
0004527286.tif 000002
【００４０】
（実施例３）
アッセイの特異性は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ、英国から得た、精製Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααを用いた用量反応曲線の決定により確認した。
【００４１】
凍結乾燥抗原を、蒸留水で復元し、１μｇ／μＬの濃度とした。
【００４２】
抗原の純度は、製造業者の指示に従って、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｐｈａｓｔ  ｓｙｓｔｅｍを使用して８〜２５％ポリアクリルアミドゲル上での還元および非還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。染色の評価を基に、抗原の純度は＞９５％純粋と推定された。
【００４３】
３．１  Ｓ１００ββを特異的測定のためのアッセイ
Ｓ１００αβおよびＳ１００ααと有意な反応性を示さずＳ１００ββに特異的なアッセイを、Ｃ群またはＢ１群の抗体と組合せた、Ｅ群の抗体を使用して設計した。好ましい構成では、Ｓ１０ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、Ｓ２３ＭＡｂまたはＳ２１ＭＡｂを検出抗体として使用した。
【００４４】
実施例３．１  Ｓ１００ββに特異的なＥＩＡの開発
Ｓ１０ＭＡｂを、標準的な手順を使用して、ビオチンＮＨＲＳカプロン酸エステル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、米国）でビオチン標識し、捕獲抗体として使用した。
【００４５】
Ｓ２３ＭＡｂまたはＳ２１ＭＡｂを、Ｎａｋｏｎｅ手順の修飾形に従って、ＨＲＰ，Ｖ型（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、米国）と結合させた。
【００４６】
ビオチン標識Ｓ１０ＭＡｂおよびＨＲＰ結合Ｓ２３またはＳ２１ＭＡｂを、以下のプロトコルに従って２部位ＥＩＡに使用した。
【００４７】
アッセイ手順：
１．  ストレプトアビジン被膜マイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ、ヘルシンキ、フィンランド）に、５０μＬのＳ１００標準物質（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．２）＋１００μＬのビオチンＳ１０ＭＡｂ（アッセイ緩衝液中２μｇ／Ｌ）を加える。
【００４８】
２．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００４９】
３．  ３回、５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５）で洗浄する。
【００５０】
４．  １００μＬ  ＨＲＰ  Ｓ２３ＭＡｂ（または１００μＬ  ＨＲＰ  Ｓ２１ＭＡｂ）（アッセイ緩衝液中２μｇ／ｍＬ）を加える。
【００５１】
５．  振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００５２】
６．  ６回、５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５）で洗浄する。
【００５３】
７．  １００μＬ  ＴＭＢ（ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を加える。
【００５４】
８．  ３０分間±５分間インキュベートする。
【００５５】
９．  ＥＬＩＳＡ解読器でＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５６】
Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααの用量反応曲線を図３に示す。用量反応曲線に基づくと、本実施例に記載のアッセイは、Ｓ１００ββに特異的であり、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααに対してそれぞれ＜５％および＜２％の交差反応性を示す。
【００５７】
３．２  Ｓ１００αβを特異的測定のためのアッセイ
Ｓ１００ββおよびＳ１００ααと有意な反応性を示さずＳ１００αβに特異的なアッセイを、Ｃ群またはＢ１群の抗体と組合せたＡ群の抗体を使用して設計した。好ましい構成では、Ｓ３５ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、Ｓ２３ＭＡｂまたはＳ２１ＭＡｂを検出抗体として使用した。
【００５８】
実施例３．２  Ｓ１００αβに特異的なＥＩＡの開発
Ｓ３５ＭＡｂは、標準的な手順を使用し、ビオチンＮＨＲＳカプロン酸エステル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、米国）でビオチン標識して、捕獲抗体として使用した。Ｓ２３ＭＡｂまたはＳ２１ＭＡｂは、Ｎａｋｏｎｅ手順の改変法を使用し、ＨＲＰ（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、米国）と結合させた。
【００５９】
ビオチン標識Ｓ３５ＭＡｂおよびＨＲＰ結合Ｓ２３またはＳ２１ＭＡｂを、以下のプロトコルに従って２部位ＥＩＡに使用した：
１．ストレプトアビジン被膜マイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ、ヘルシンキ、フィンランド）に、５０μＬのＳ１００標準物質（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．２）＋１００μＬのビオチンＳ３５ＭＡｂ（アッセイ緩衝液中２μｇ／Ｌ）を加える。
【００６０】
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００６１】
３．３回、５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５）で洗浄する。
【００６２】
４．１００μＬ  ＨＲＰ  Ｓ２３ＭＡｂ（または１００μＬ  ＨＲＰ  Ｓ２１ＭＡｂ）を、アッセイ緩衝液中で２μｇ／ｍＬだけ加える。
【００６３】
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００６４】
６．５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５）で６回洗浄する。
【００６５】
７．１００μＬ  ＴＭＢ（ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を加える。
【００６６】
８．３０分間±５分間インキュベートする。
【００６７】
９．ＥＬＩＳＡ解読器でＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００６８】
Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααの用量反応曲線を図４に示す。３．３に記載の抗体に基づき、Ｓ１００αβに特異的で、Ｓ１００ββおよびＳ１００ααにそれぞれ＜１０％および＜２％の交差反応性を示すイムノアッセイを設計し得る。
【００６９】
実施例３．１および３．２のアッセイの結果を要約すると、総Ｓ１００、すなわちＳ１００αβおよびＳ１００ββの合計が得られる。
【００７０】
（文献）
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は免疫測定法における、選択されたＳ１００ＭＡｂの、精製Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβ、およびＳ１００ααとの反応性を示す。この反応性は実施例２．２に記載のように測定される。
【図２】  図２は、実施例２．３ｂに記載の、選択されたＳ１００ＭＡｂ：ｓの阻害を示す。
【図３】  図３は、実施例３．１に記載のように設計された、捕獲抗体としてビオチンＳ１０ＭＡｂを、検出抗体としてＨＲＰＳ２３ＭＡｂを使用した、Ｓ１００ββに特異的なアッセイのステップを示す。
【図４】  図４は、実施例３．２に記載のように設計された、捕獲抗体としてビオチンＳ３５ＭＡｂを、検出抗体としてＨＲＰＳ２３ＭＡｂを使用した、Ｓ１００αβに特異的なアッセイのステップを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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