(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４４を含む、哺乳動物ＡＭＰＫα1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１記載のポリヌクレオチドによってコードされる組み換えポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）哺乳動物ＡＭＰＫα1をコードする核酸配列を発現させる条件下で、請求項３記載の細胞を培養する工程と；
（ｂ）発現されたＡＭＰＫα1を細胞から回収する工程と
を含む、哺乳動物ＡＭＰＫα1の製造方法。
【請求項６】
請求項４記載のポリペプチドに選択的に結合することができる抗体。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は新規なＡＭＰプロテインキナーゼサブユニットと、これらのサブユニットプロテインをコードするポリヌクレオチドと、これらのサブユニットに結合する抗体とに関する。
５’−ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は最初、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを調節するプロテインキナーゼとして同定された［Ｆｅｒｒｅｒ等（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３２，４９７〜５０４］。その後、ＡＭＰＫは肝臓アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ［Ｃａｒｌｉｎｇ等（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２３，２１７〜２２２］と、脂肪ホルモン感受性リパーゼ［Ｃａｒｔｏｎ等（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９，２４９〜２５４］とをリン酸化することが判明した。それ故、ＡＭＰＫは脂肪酸及びコレステロールの合成に重要な調節役割りを果たすと考えられる。
ＡＭＰＫは、細胞ＡＴＰレベルが欠失するとき及び５’−ＡＭＰが燃料制限及び／又は低酸素に反応して５’−ＡＭＰが生ずるときに生合成経路を切り換える代謝ストレス−感知（metabolic stress-sensing）プロテインキナーゼとして作用すると考えられる［Ｃｏｒｔｏｎ等（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，３１５〜３２４］。肝臓ＡＭＰＫの部分アミノ酸配列決定［Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２３６１〜２３６４；Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ等（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２９３４３〜２９３４６］は、これが３サブユニット、即ち、触媒サブユニットα（６３ｋＤａ）と、２種類の非触媒サブユニット、β（４０ｋＤａ）及びγ（３８ｋＤａ）とから成ることを明らかにした。
ＡＭＰＫは、植物、ネマトーダ及びヒトに存在するプロテインキナーゼを包含する酵母ＳＮＦ１プロテインキナーゼサブファミリーのメンバーである。ＡＭＰＫ触媒サブユニットαは、グルコース飢餓による栄養ストレス条件下でのインベルターゼ（ＳＵＣ２）の誘導に関与する酵母プロテインキナーゼＳＮＦ１の触媒ドメインに対して強度の配列同一性を有する（Ｃｅｌｅｎｚａ，Ｊ．Ｌ．とＣａｒｌｓｏｎ，Ｍ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３，１１７５〜１１８０）。ｓｎｆ１ｐとＡＭＰＫの両方は完全な活性のために活性化プロテインキナーゼによるリン酸化を必要とする。ｓｎｆ１ｐとＡＭＰＫとの配列関係は、これらの酵素が機能的類似性を共有し、両方が酵母アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをリン酸化し、不活化するという発見を生じた［Ｗｏｏｄｓ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９５０９〜１９５１６；Ｗｉｔｔｅｒｓ，Ｌ．Ａ．とＷａｔｔｓ，Ｔ．Ｄ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６９，３６９〜３７６］。ＡＭＰＫの非触媒β及びγサブユニットは転写調節因子（transcription regulator）のＳＩＰ１／ＳＩＰ２／ＧＡＬ８３ファミリーに関係し、γサブユニットはＳＮＦ４（ＣＡＴ−３とも呼ばれる）に関係する［Ｙａｎｇ等（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３，５８７８〜５８８６］。
哺乳動物ＡＭＰＫ触媒サブユニットのアイソフォームは既にクローン化されており［Ｃａｒｌｉｎｇ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１１４４２〜１１４４８］、これを本明細書ではＡＭＳＫα2と呼ぶ。ＡＭＰＫの配列はＷＯ９４／２８１１６に開示されている。ＡＭＰＫα2は酵母においてＳＮＦ１を相補せず、このことはこれらの機能の全範囲が同じではないことを意味する。哺乳動物ＡＭＰＫ触媒サブユニットの新規なアイソフォームはまだ同定されていず、本明細書ではこれをＡＭＰＫα1と呼ぶ。更に、哺乳動物ＡＭＰＫβサブユニットとＡＭＰＫγサブユニットとの全長ｃＤＮＡは現在クローン化され、それによってコード化されたポリペプチドは精製されている。
発明の概要
したがって、本発明の第１態様は哺乳動物ＡＭＰＫα1又は、それにハイブリダイズする配列（但し、この配列はＷＯ９４／２８１１６の表１又は表５で定義される哺乳動物ＡＭＰＫα2にはハイブリダイズしない）をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。好ましい実施態様では、このポリヌクレオチドは配列番号：４４を含む。このようなポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターによって形質転換された宿主細胞、及びこのようなポリヌクレオチドによってコードされる組み換えタンパク質をも提供する。
第２態様では、本発明は、哺乳動物ＡＭＰＫα1の製造方法であって、本発明の第１態様のポリヌクレオチドを包含する細胞をＡＭＰＫα1をコードするポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で培養し、発現されたＡＭＰＫα1を回収することを含む上記方法を提供する。
第３実施態様では、本発明は少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブであって、このプローブが本発明の第１態様のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするような配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。“選択的にハイブリダイズする”とは、プローブがＷＯ９４／２８１１６の表１又は表５で定義される哺乳動物ＡＭＰＫα2にハイブリダイズしないことを意味する。このオリゴヌクレオチドプローブは、アミノ酸３５２〜３６６をコードするポリヌクレオチド配列からの少なくとも約５個の隣接ヌクレオチドを包含することができる。本発明の第３態様によるオリゴヌクレオチドプローブを多くの方法に用いることができることは、当業者に理解されるであろう。これらは遺伝子調節要素の分析；ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子発現の分析；及び会合したキナーゼ−キナーゼを包含する相同な哺乳動物ｃＤＮＡと非哺乳動物ｃＤＮＡの同定を含む。第４態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる実質的に精製されたポリペプチド又はその生物学的に活性なフラグメント（但し、このフラグメントはＷＯ９４／２８１１６の図３Ａで定義される哺乳動物ＡＭＰＫα2中に存在しない）を提供する。好ましい実施態様では、精製されたポリペプチドは配列番号：１〜４３の少なくとも一部を含む。配列ＤＦＹＬＡＴＳＰＰＤＳＦＬＤＤＨＨＬＴＲ（配列番号：４５）からの少なくとも８隣接アミノ酸を含む生物学的に活性なフラグメントも好ましい。“生物学的に活性なフラグメント”とは、その活性が（‖）タンパク質分子のリン酸化を刺激する能力と；（‖）少なくとも１つの抗体若しくはリガンド分子へのネイティブＡＭＰＫα1の結合を模倣する能力を包含するネイティブＡＭＰＫα1の活性の少なくとも１つを保有するフラグメントを意味する。
本発明のポリペプチド及びフラグメントに対して、ポリペプチド及びフラグメントの生物学的活性に不利な影響を及ぼさずに、多くの修飾がなされうることは、当業者によって理解されるであろう。これは例えば硫酸化、リン酸化、ニトロ化及びハロゲン化のような種々な変化によって；又はペプチド配列における保存的若しくは非保存的な（例えば、Ｄ−アミノ酸、デスアミノ酸）アミノ酸挿入、欠失及び置換によって達成されることができ、この場合に、このような変化はペプチドの総生物学的活性を実質的に変化させない。保存的置換によって、予定される組合せは：Ｇ、Ａ；Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ；及びＰ、Ｎα−アルキルアミノ酸である。
本発明のポリペプチド又はフラグメントに種々な基を加えて、ペプチドの総生物学的活性を実質的に変化させないで、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける延長された半減期の効力増強のような利益を与えることも可能である。
本発明の哺乳動物ＡＭＰＫα1ポリペプチドを用いて、このキナーゼの作用を調節する化合物を同定することができる。例えば、このような化合物を用いて、コレステロールと脂肪酸との生合成を減ずることができるので、このような化合物が望ましい。これらを用いて、ＨＳＬによる細胞内貯蔵からのこれらの放出を阻害することもできる。更に、これらを用いて、細胞のマロニルＣｏＡレベルを減じて、ミトコンドリアによる脂肪酸のβ−酸化を促進することができる。
本発明の哺乳動物ＡＭＰＫα1を化合物に暴露させ、哺乳動物ＡＭＰＫα1の活性を評価することによって、哺乳動物ＡＭＰＫα1アンタゴニスト又はアゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングすることができる。哺乳動物のＡＭＰＫα1の活性を調節する化合物を同定するための適当なスクリーニング方法は、このような効果を測定するための慣用的な分析系を包含する。例えば、ＡＭＰプロテインキナーゼによって排他的にリン酸化されるセリン残基を含有するペプチドを、ＡＭＰプロテインキナーゼの調製物（preparation）と、例えばγ32Ｐ［ＡＴＰ］のような放射性標識との存在下でインキュベートする。反応を約５分間進行させ、酸の添加によって便利に終了させる。リン酸化されたペプチドは洗浄後に帯電膜（charged membrane）に結合させることによって非結合放射性標識から便利に分離される。ペプチドのリン酸化度は哺乳動物ＡＭＰＫα1の活性の尺度である。
更に、本発明の第１態様のポリヌクレオチドによって形質転換された細胞を化合物に暴露させ、哺乳動物ＡＭＰＫα1をコードするポリヌクレオチドの発現度を評価することによって、細胞中の哺乳動物ＡＭＰＫα1の発現を調節する能力に関して化合物をスクリーニングすることができる。哺乳動物ＡＭＰＫα1の発現を調節する化合物を同定するための適当なスクリーニング方法は、哺乳動物ＡＭＰＫα1又は、哺乳動物ＡＭＰＫα1若しくはタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの量を関連試験化合物の存在下で検出及び／又は測定することを含む方法を包含する。
上述したように、哺乳動物ＡＭＰＫα1の活性を調節する化合物は、例えば高コレステロール血症、高脂質血症、肥満、低酸素若しくは虚血に関連した臨床症候群（例えば、心筋梗塞、発作）、栄養障害及び真性糖尿病の治療に可能に有用であると考えられる。
第５態様では、本発明は、本発明の第４態様によるポリペプチドに対して選択的に結合する抗体を提供する。“選択的に結合する”とは、抗体がＷＯ９４／２８１１６の図３Ａで定義されるような哺乳動物ＡＭＰＫα2に結合しないことを意味する。この抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。本発明の抗体が多くの方法に用いられうることは理解されよう。これらの方法には、細胞におけるタンパク質発現のモニターリング；キナーゼ活性を測定するための分析法の開発；及びこれらのタンパク質を特徴付けることができる、ＡＭＰプロテインキナーゼと会合タンパク質（associated protein）との沈殿を包含する。
哺乳動物ＡＭＰＫβとＡＭＰＫγサブユニットの全長鎖ｃＤＮＡが本発明によりクローン化された。これらのクローンを用いて、サブユニットｍＲＮＡの組織分布を特徴付け、細菌と哺乳動物細胞の両方でサブユニットタンパク質を発現させることができた。これらの完全な配列の同定は、これらの非触媒サブユニットの各々のタンパク質ファミリーの同定も行われたる。
したがって、第６態様では、本発明は哺乳動物ＡＭＰＫβをコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：６１の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターによって形質転換された宿主細胞、及びこのようなポリヌクレオチドによってコードされた組換えタンパク質をも提供する。
第７態様では、本発明は本発明の第６態様のポリヌクレオチドを含む細胞を、ＡＭＰＫβをコードするポリヌクレオチドを発現させる条件下で培養し、発現されるＡＭＰＫβを回収することを含む、哺乳動物ＡＭＰＫβの製造方法を提供する。
第８態様では、本発明は、配列番号：６２のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
第９態様では、本発明は、哺乳動物ＡＭＰＫγをコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号：６３の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターによって形質転換された宿主細胞、及びこのようなポリヌクレオチドによってコードされる組換えタンパク質をも提供する。
第１０態様では、本発明は本発明の第９態様のポリヌクレオチドを含む細胞を、ＡＭＰＫγをコードするポリヌクレオチドを発現させる条件下で培養し、発現されるＡＭＰＫγを回収することを含む、哺乳動物ＡＭＰＫγの製造方法を提供する。
第１１態様では、本発明は、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
発明の詳細な説明
ラット及びブタの肝臓から単離された哺乳動物ＡＭＰＫは、ＡＭＰＫα、ＡＭＰＫβ及びＡＭＰＫγと名付けられた、３種類のポリペプチドサブユニットを含有する。αサブユニットはキナーゼ触媒ドメイン配列を含有し、ＳＮＦ１キナーゼファミリーの幾つかのメンバーに非常に相同である。αサブユニットの複数のアイソフォームが現在同定されており、α1は肝臓抽出物中に検出されるＡＭＰＫ活性の約９０％の原因である。更に、全長ＡＭＰＫβ及びＡＭＰＫγサブユニットがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の２クラスのタンパク質に対して同様に相同であることが、現在確認されている。このことは、限定されたペプチド配列分析とＰＣＲ由来の小さいｃＤＮＡとから既に得られた情報を拡大する［Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２９３４３〜２９３４６〕。更に、ｃＤＮＡクローニングと直接のペプチド配列決定とによって、ＡＭＰＫβ及びＡＭＰＫγサブユニットのどのアイソフォームが肝臓においてα1触媒サブユニットと相互作用するかが実証されている。したがって、これらの非触媒サブユニットが、αサブユニットアイソフォームと同様に、幾つかのラット組織のｍＲＮＡ含量によって実証されるところでは、Ｇａｏ等（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２００，７３〜８２及びＤａｖｉｅｓ等（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，１２３〜１２８によって既に報告されたＡＭＰＫ活性分布から予想されるよりも広範囲な組織分布を有することが現在判明した。
哺乳動物ＡＭＰＫ触媒サブユニットの新規なアイソフォームが同定され、これを本明細書ではＡＭＰＫα1と呼ぶ。ＡＭＰＫのα1（５４８残基）アイソフォームとα2（５５２残基）アイソフォームは、触媒コア内に９０％アミノ酸配列同一性を有し、その他の所には６１％しか有しない。α1配列とα2配列との主な差異はそれらのＣＯＯＨ−末端尾部（terminal tail）において生じ、このことはこれらがこの領域において異なるタンパク質と相互作用しうることを示唆する。
α2の８．５ｋｂ  ｍＲＮＡが骨格筋中に最も多く含まれ、肝臓、心臓及び腎臓中には低レベルであることが現在判明している。これに反して、α1の６ｋｂ  ｍＲＮＡの非常に低レベルが精巣以外の全ての組織中で検出され、精巣では低レベルの未同定の２．４ｋｂ  ｍＲＮＡが観察された。この低レベルのα1ｍＲＮＡは、α1アイソフォームがα2アイソフォームよりもクローン化が困難である理由を説明する。しかし、ＡＭＲＫ触媒サブユニットのα1アイソフォームはラット肝臓のＳＡＭＳペプチドホスホトランスフェラーゼ活性の約９４％以上の原因となるので、主要な活性発現肝臓アイソフォームである。
ＡＭＰＫの基質であると知られていないタンパク質の類似体を包含する一連の合成ペプチドを部分精製酵素（ＤＥ−５２段階まで精製）によってスクリーニングした。これらはミオシンＬ鎖（light chain）、ＡＤＲ１、グリコーゲンシンターゼ及びホスホールマン（phospholemman）を包含した。試験したホスホールマンペプチドは不良な基質であり、もはや研究されなかった。グリコーゲンシンターゼペプチド、ＰＬＳＲＴＬＳＶＡＡＫＫ（配列番号：４６）はＳＡＭＳペプチドの率の約４０％でＡＭＰ依存的にリン酸化されたが、このペプチドは、プロテインキナーゼＣとカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩとを包含する多くのプロテインキナーゼの優れた基質である［Ｋｅｍｐ，Ｂ．Ｅ．とＰｅａｒｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．（１９９１）「タンパク質リン酸化」，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．とＳｅｆｔｏｎ，Ｂ．Ｍ．（編集），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２００，１２１〜１３４］。試験したミオシンＬ鎖はＳＡＭＳペプチドの約１５％の率でリン酸化された。ＡＤＲ１ペプチド、ＡＤＲ１（２２５〜２３４）とＡＤＲ１（２２２〜２３４）P229とはＳＡＭＳペプチドの約５０％の率でリン酸化された。これらの実験からの結果は、ＡＤＲ１（２２２〜２３４）P229ペプチドがＳＡＭＳペプチドの３３μＭに比べて約３μＭの見かけのＫｍによってリン酸化されることを実証する。
ＡＭＰＫの基質としてのＡＤＲ１（２２２〜２３４）P229ペプチドの低いＫｍを考慮して、このペプチドによる酵素のアフィニティ精製を試みた。最初に、このペプチドをＣＮＢｒ活性化セファロースに結合させた。このペプチド結合セファロースはＡＭＰＫ含有フラクションに結合したが、この酵素を汚染タンパク質から塩勾配（salt gradients）によって分別的に溶離することはできなかった。これに反して、ＡＤＲ１（２２２〜２３４）P229ペプチドをＰｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＴｒａｐカラムに結合させた場合には、ＡＭＰＫは非常に緊密に結合して、それを溶離するために２Ｍ  ＮａＣｌプラス３０％エチレングリコールを要した。酵素はこの基質アフィニティカラムにこのように緊密に結合したので、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝剤中で酵素を吸着させることが可能であった。得られた精製ＡＭＰＫは６３ｋＤａ触媒サブユニットと、それぞれｓｉｐ２及びｓｎｆ４と呼ばれる、４０ｋＤａ及び３８ｋＤａサブユニットとから構成された。幾つかの調製物では、ＡＭＰＫは、トリプシン消化ペプチド配列決定によって評価すると非筋肉ミオシンに相当する高分子量物質に会合した。１５％の収率による３８，０００までの見かけの精製（apparent purification）と９０μｇの酵素の回収が得られた。この精製倍率は早期フラクション中の未同定の阻害物質の存在のために過大評価であると考えられる。精製の最終段階までＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に酵素が識別されなかった。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＴｒａｐ樹脂に結合したペプチドに対する酵素の親和力（avidity）は、この酵素への遊離ペプチド結合（Ｋｍ  ３μＭ）から予想されうるよりも大きかった。セファロースに結合したペプチドは酵素に緊密に結合しなかったので、結合の強化は、一部は、ペプチドと樹脂との間のアミノヘキサン酸リンカーによることが妥当に思われる。ＣＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの場合には、ＤヘリックスとＧヘリックスとの間に疎水性ポケットが存在し、これがペプチド阻害剤ＰＫＩの高アフィニティ結合の原因である。ＡＤＲ１（２２２〜２３４）Ｐ２２９ペプチド、ＬＫＫＬＴＬＲＡＳＦＳＡＱ（配列番号：４７）はそのＮ末端のアミノ残基又はｌＹＳ残基を介して結合するので、疎水性リンカー基がＡＭＰＫ上の疎水性ポケットに偶発的に並置されていることが考えられる。
ブタＡＭＰＫの配列決定の過程では、ブタ肝臓ＡＭＰＫαサブユニットに由来する幾つかのペプチドのアミノ酸配列がラット肝臓ｃＤＮＡ配列から演繹されたアミノ酸配列に適合しないことが発見された［Ｃａｒｌｉｎｇ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１１４４２〜１１４４８；Ｇａｏ等（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２００，７３〜８２］。それ故、ラット肝臓ＡＭＰＫ触媒サブユニットαを精製して、このタンパク質の４０％を占めるペプチドを配列決定した［２２２／５４８残基、配列番号：２７〜４３］。１６ペプチドのうちの８ペプチドは報告されたＡＭＰＫｃＤＮＡ配列と不適正な残基を含有したが、ブタの肝臓酵素配列（配列番号：１３〜２６）には適合した。ＲＴ−ＰＣＲとｃＤＮＡライブラリースクリーニングとを用いてラット視床下部酵素のｃＤＮＡ配列が得られ、その結果、精製ラット肝臓ＡＭＰＫ触媒サブユニットのペプチド配列の全てがミスマッチ（mismatches）を含有していた。このＡＭＰＫ触媒サブユニットのｃＤＮＡ配列は、精製酵素に一致し、既にクローン化された配列（現在、α2と呼ばれる）とは異なる遺伝子に明らかに由来するので、α1と名付けられている。ＡＭＰＫ触媒サブユニットのα1アイソフォームはラット肝臓のＳＡＭＳペプチド  ホスホトランスフェラーゼ活性の約９４％以上の原因であるので、主要な活性発現肝臓アイソフォームである。ブタとラットの両方の肝臓からのＡＭＰＫ触媒サブユニットの多数の調製物の配列決定（それぞれ、配列番号：１３〜２６と２７〜４３）にも拘わらず、α2アイソフォーム配列に適合したペプチドは得られなかった。
α1アイソフォームとα2アイソフォームとの触媒コア内には、９０％アミノ酸同一性が存在するが、触媒コア外には６１％同一性しか存在しない。位置Ｐ-5〜Ｐ+5に関するプロテインキナーゼ結晶構造から推論された、基質結合溝（binding groove）付近でのα1配列とα2配列との間の強い相同性は、基質特異性に関連があることを示唆する。基質固定ループ（リップ又は活性化ループとも呼ばれる）はα1、α2及びｓｎｆｌｐのためのインサートＦＬ170を含有し、これはペプチド基質中のＰ+3又はＰ+4疎水性残基のための疎水性アンカーを提供することができる。α1、α2とｓｎｆ１ｐの両方のためのＰ-3塩基残基特異的決定因子としての、Ｅ100（ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ中のＥ127）及びＤ103も存在する。両方のアイソフォームは、リン酸化される可能性があり、最適活性のために必要である、ｃＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ中のＴｈｒ−１９７と同等なＴｈｒ−１７２残基を含有する。α1配列とα2配列との主な差異はそれらのＣＯＯＨ−末端尾部において存在するので、これらはこの領域において異なるタンパク質と相互作用するのであろう。
βサブユニットとγサブユニットとのノザンブロット分析は複雑な発現パターンを明らかにした。βサブユニットｍＲＮＡは脳以外の組織の全範囲にわたって同じようなレベルで最低に含有され、γサブユニットｍＲＮＡは心臓、肺、骨格筋、肝臓及び腎臓中に多く含有された。ＡＭＰＫ活性の組織分布に関する従来の報告は、これが主として肝臓酵素であると主張している［Ｄａｖｉｅｓ等（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，１２３〜１２８］。α1サブユニットとβサブユニットとのｍＲＮＡ分布を考慮して、ＡＭＰＫ活性の組織分布を再評価した。腎臓は最高の比活性を含有し、肝臓、肺及び心臓では同様なレベルであり、骨格筋中には存在するとしてもごく僅かな活性であった。ＡＭＰＫ活性が今まで認識されていたよりも広い組織分布を有し、α1ｍＲＮＡの分布と密接に平行するが、α2ｍＲＮＡの分布とは平行しないことは明らかである。α1（残基３３９〜３５８）とα2（残基３５２〜３６６）とに対してペプチド特異的抗血清を用いて、最高濃度のα2ｍＲＮＡも存在する、心臓、肝臓及び骨格筋にα2免疫反応性が支配的であることが判明した。これに反して、α1免疫反応性は、量の少ないα1ｍＲＮＡと同様に広く分布している。α2に対する抗体は精製α1調製物中の微量成分を認識したが、これがα1の形態との弱い交差反応性を表すのか、ＡＭＰＫの別のアイソフォームであるのか、又はα1調製物中のα2アイソフォームによる低レベル汚染物質との交差反応性を表すのかを判定するほど、これの充分な量は得られていない。α2に対するこの抗体はアフィニティ精製されたα1ＡＭＰＫからα1活性を免疫沈降させない。α1とα2の両方はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約６３ｋＤａに移動する。肝臓α2免疫反応性がペプチド基質アフィニティカラムによって結合されないことも判明した。このカラムはα1アイソフォームと特異的に結合する。ペプチド基質アフィニティカラムからの流出液のα2特異的抗体による免疫沈降を用いて、α2アイソザイムがβサブユニット及びγサブユニットを含有し、ＳＡＭＳペプチドのリン酸化を触媒することが判明した。α1とα2との免疫沈降は、それぞれ２〜３倍と３〜４倍の範囲の５’−ＡＭＰによる可変な活性化を示した。心臓及び肺からの組織抽出物中にはα1特異的抗体によって認識される約６０ｋＤａバンドも存在した。このバンドは精製された肝臓酵素中には存在せず、α1アイソフォームに対する関係はまだ知られていない。
一回通過によってペプチドアフィニティカラムに結合したＳＡＭＳペプチドホスホトランスフェラーゼの比率は変化した（ｎ＝７ラット肝臓調製物、９０〜９２％、ｎ＝６ラット肝臓調製物、７４〜８６％の範囲）。再循環によって、活性の約９４％がカラムに結合した。残留活性はα2特異的抗体による免疫沈降に基づいてα2アイソフォーム活性に帰することができた。しかし、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色法に基づくタンパク質の免疫沈降量は、総ＳＡＭＳペプチド活性の僅か６％から予想されたよりも実質的に多くのα2タンパク質が存在することを示した。基質としてのＳＡＭＳペプチド又はアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのいずれかによる単離ラット肝臓ＡＭＰＫα2アイソフォームの見かけの比活性は、ＡＭＰＫ  α1アイソフォームの２０分の１より小さかった。この推定はα2富化フラクション（α1除去）を用いた測定と、細菌発現α2に比べた免疫ブロッティングによる定量とに基づくものである。
精製α2アイソフォームの比活性は、結合抗体の不存在下ではまだ知られていない。α2 ｃＤＮＡ配列に基づいて、Ｃａｒｌｉｎｇ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１１４４２〜１１４４８は、ペプチド特異的抗体は肝臓からの部分精製ＡＭＰＫ活性の実質的に全てを免疫沈降したと報告している。これらの実験に用いたペプチド、ＰＧＬＫＰＨＰＥＲＭＰＰＬＩ（配列番号：４８）はα1とα2との間で同じである８／１５残基（下線付き）を含有するので、これらのポリクローナル抗血清は両方のアイソフォームを認識しうることが妥当に思われる。
これらの実験は、ＡＭＰＫ  α触媒サブユニットのアイソエンザイムファミリーが存在し、それによって活性分析の複雑さが高まることを明らかにしている。このことは、α2アイソフォームがどのような機能を有するのか、またα2がβサブユニット及びγサブユニットの特異的サブセットと会合するのかどうかという問題をも提起する。α2アイソフォームｍＲＮＡの有意な部分（significant fraction）は、その触媒ドメイン内に切頭非機能的タンパク質をコードするはずの、１４２ｂｐのアウト−オブ−フレーム（out-of-frame）欠失を有する［Ｇａｏ等（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２００，７３〜８２；Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ等（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８，２３６〜２４３］。ブタ、ラット及びヒトからのα1アイソフォーム間の密接な配列関係は、種全体にわたる強い保存が存在することを意味する。今までに、ヒト肝臓がＡＭＰＫ  ｍＲＮＡを含有しないことが報告されている［Ａｇｕａｎ等（１９９４）Ｇｅｎｅ，１４９，３４５〜３５０］。しかし、α2ｍＲＮＡが検査されていたが、主要なα1アイソフォームｍＲＮＡが検査されていなかったことは現在明らかである。それ故、染色体１に報告された、ヒト肝臓ＡＭＰＫ触媒サブユニットをコードする遺伝子はα2アイソフォームの遺伝子であり、α1アイソフォームの遺伝子は染色体５上に存在する。ＡＭＰＫサブユニット遺伝子は現在、主として次の染色体位置にマッピングされている：α1、５ｐ１２；β、５ｑ２４．１；及びγ、１２ｑ１３．１。
最近のゲノム配列決定はＡＭＰＫの非触媒γ及びβサブユニットの複数のアイソフォームを明らかにしている。脳にはγサブユニットの少なくとも３種類のアイソフォームが存在し、ラット肝臓γ1アイソフォームとは異なる、γ2とγ3が存在するように思われる。ヒトの脳は、ラット肝臓β1アイソフォームとは異なる、複数のβサブユニットアイソフォームをも含有する。推定のＡＭＰＫ  β及びγサブユニットアイソフォームの受託番号は、γ2、Ｍ７８９３９；γ3、Ｒ５２３０８；β2、Ｒ２０４９４；及びβ3、Ｒ１４７４６である。したがって、３種類のＡＭＰＫサブユニットの全ての種々な組合せに基づく、ヘテロトリマーＡＭＰＫの大きいサブファミリーが存在可能と考えられる。
ＡＭＰＫとＳＮＦ１キナーゼとの間の構造上の関係ならびに複数のアイソフォームの存在は、プロテインキナーゼのこの新規なサブファミリーの多様な生理的役割に関する問題の予想を明らかにする。ＡＭＰＫは代謝ストレスの条件下での肝細胞中の脂質代謝を調節するが、心臓及び腎臓を含めた他の組織におけるその役割は知られていない。最近の研究は、ＡＭＰＫが心臓虚血中に活性化され、この活性が再灌流中に持続し、恐らく代謝と心臓の機械的機能との虚血由来デカップリング（ischaemia-driven decoupling）の一因となると考えられることを示している［Ｋｕｄｏ等（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１７５１３〜１７５２０］。
ＡＭＰＫによる心臓アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの調節は、酸化燃料としてのグルコース使用と脂肪酸使用との間での心臓代謝の切り換えに重要な役割を果たす。ＡＭＰＫサブユニットが膵島細胞中に高度に発現される膵臓のβ細胞においては、グルコース利用可能性（availability）が、ＡＭＰＫによる（AMPK-directed）リン酸化における変化を介してアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを迅速に調節し、このことはインシュリン放出に関する刺激−分泌カップリングにおけるＡＭＰＫの役割を強く示唆する。これらの代謝役割の他に、ＳＮＦ１プロテインキナーゼサブファミリーのメンバーは、胚発生に重要な役割を果たす、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐａｒ−１遺伝子と共に発達に重要な役割を果たすように思われる。
選択されたＡＭＰＫ  βペプチド配列に対応する縮重（degenerate）オリゴヌクレオチドによるブタ及びラットの肝臓ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は２種類の主要なＰＣＲ生成物を生じた［Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２９３４３〜２９３４６］。一方の生成物、ラット３０９ｂｐ部分長さｃＤＮＡを用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、１１０７ｂｐクローンを得た［配列番号：６１］。スクリーニング用ＰＣＲプローブはこの配列のｎｔ残基２７９〜５８８に対応した。このクローンは２７０アミノ酸ペプチド（配列番号：６２）をコードするオープンリーディングフレームを含有し、これは精製タンパク質の広範囲な配列分析から得られた１５種類の独立した（一部重複した）ペプチド配列の全てを含有する。翻訳開始メチオニンコドンを、開始コドンのために存在する典型的なＫｏｚａｋ配列と、イン−フレームの上流に他のメチオニンコドンが存在しないことから推定する。この５’−上流配列にイン−フレーム停止コドンは存在しないが、データベース中のヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ，受託番号Ｔ７８０３３）はこのような停止コドンを同じ推定メチオニン開始点に先立って含有する。しかし、このリーディングフレームは、ＳＤＳゲル電気泳動で明らかな４０ｋＤａの推定分子量よりもかなり低い、３０，４６４ダルトンのタンパク質を予測する。
このｃＤＮＡから合成されうるタンパク質生成物のサイズを解明するために、ＡＭＰＫ  βクローンを細菌中と哺乳動物細胞中の両方で発現させた。両方の発現系において、このタンパク質生成物は予測された分子量よりも大きい分子量に移動する。Ｅ．ｃｏｌｉからのＨｉｓ6−タグ付き融合タンパク質として精製したときに、単離タンパク質はＳＤＳゲル上を約４３，０００Ｄａ（オボアルブミン基準品と同じ）の見かけの分子量で移動する。これは４０ｋＤａのＡＭＰＫ  βポリペプチド生成物に相当し、付加的な３ｋＤａダルトンの融合タグ配列はｐＥＴベクターに由来する。ＨＡ−タグ付き発現ベクターから哺乳動物細胞中で発現させたときに、２種類のポリペプチドが認められ、主要な生成物は４０ｋＤａ種に相当する（ＨＡエピトープタグのサイズに関する修正後）。４２〜４３ｋＤａの第２生成物もこの発現系を用いて認められる。これらのデータを一緒に考慮すると、このＡＭＰＫ  βのタンパク質生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を異常な高分子量的に移動するのであろう。
ラット肝臓ＡＭＰＫ  β配列をデータベースに比較すると、これが３種類の酵母タンパク質（Ｓｉｐ１ｐ、Ｓｉｐ２ｐ及びＧａｌ８３ｐ）と、２種類の最近クローン化されたヒトＥＳＴ−ｃＤＮＡ配列とに対して高度に相同であることが明らかである。この配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅタンパク質の配列、Ｓｉｐ１ｐに従ってギャッピングされると［Ｙａｎｇ等（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，６８０〜６８２］、ＡＭＰＫ  βとこれらの酵母タンパク質とのＣ−末端において最も顕著である。
ＡＭＰＫ  βサブユニットは、Ｓｉｐ１ｐ／Ｓｉｐ２ｐ／Ｇａｌ８３ｐによって表される、酵母中のタンパク質のクラスの哺乳動物相同体である。ＧＡＬ８３遺伝子生成物はＧＡＬ遺伝子のグルコース抑制に影響を及ぼすことが知られている。これらのタンパク質の全ては２−ハイブリッド系において又は免疫沈降によってＳｎｆ１ｐプロテインキナーゼと相互作用することが判明している。これらのタンパク質を、特定ターゲットに対するＳｎｆ１ｐの活性を促進するアダプターとして用いることが提案されている。酵母突然変異体の分析に基づくと、これらのタンパク質がＳｎｆ１ｐと特有ターゲット及び種々なターゲットとの相互作用を促進することができることが示唆されている。ＡＳＣドメインと呼ばれる、Ｓｉｐ１ｐ／Ｓｉｐ２ｐ／Ｇａｌ８３ｐのＣ−末端における約８０アミノ酸の高度に保存されたドメインが表示されることは重要である（Ｓｎｆ１ｐ複合体と会合）［Ｙａｎｇ等（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３，５８７８〜５８８６］。２−ハイブリッド系で試験すると、Ｓｉｐ１ｐとＳｉｐ２ｐの両方のＡＳＣドメインはＳｎｆ１ｐと強度に相互作用する。しかし、Ｓｉｐ２ｐとＳｎｆ１ｐとの相互作用がこのドメインの欠失時に完全には失われず、このことはＡＳＣドメインのみがこのタンパク質−タンパク質相互作用の原因ではないことを示唆する。推定のＡＳＣドメインもラット肝臓ＡＭＰＫ  βのＣ−末端において高度に保存される［残基２０３〜２７０として］、このことは、この領域が部分的に、ＡＭＰＫ  αサブユニットとの結合の要因であることを示唆する。
ＡＭＰＫ  βは、Ｓｉｐ２ｐ及びＧａｌ８３ｐと同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、触媒サブユニット（それぞれ、ＡＭＰＫ  α又はＳｎｆ１ｐ）と会合したときに、リン酸化される。Ｇａｌ８３ｐの突然変異は、抗−Ｓｎｆ１ｐ抗体によって沈降した免疫複合体中に検出可能なＳｎｆ１ｐキナーゼ活性の大部分を破壊することができる。Ｓｉｐ２ｐ／Ｅｇａｌ８３／Ｅ突然変異体は、突然変異体菌株（strain）中のＳｉｐ２ｐ又はＧａｌ８３ｐ  ＬｅｘＡ−融合タンパク質の発現後に修復される、低下したＳｎｆ１プロテインキナーゼ活性を示す［Ｙａｎｇ等（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３，５８７８〜５８８６］。一緒に考慮すると、これらのデータは、このＡＭＰＫ  βもＡＭＰＫ  α触媒単位のためのアダプター分子として役立ち、ＡＭＰＫ活性を有利に調節するであろうという可能性を示唆する。ＡＭＰＫ  βはＳＤＳゲル上で異常に移動するように思われ、このポリペプチドはｃＤＮＡから予想されるサイズよりも約１０ｋＤａ大きいＭrで移動する。この緩慢な移動は、細菌発現Ｈｉｓ6−融合タンパク質と、ＣＯＳ７細胞において発現されたタンパク質との両方に関して認められる。これらの観察は、より高い次数の分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での異常な移動を説明することを示唆する。ＡＭＰＫβサブユニットはｉｎ  ｖｉｔｒｏで自動リン酸化される；このことは、ＡＭＰＫβｃＤＮＡによる哺乳動物細胞のトランスフェクション時に発現される２つのＡＭＰＫ  βバンドが同じ翻訳後修飾に由来するものであり、より小さい移動度シフト（mobility shift）を生じることを示唆する。興味深いことには、ＡＭＰＫ  βのこの異常な移動挙動はそれの酵母相同体、Ｇａｌ８３ｐの移動挙動に類似する。酵母に発現される、Ｇａｌ８３のＬｅｘＡ−融合タンパク質（単数又は複数）も予想よりも大きい分子量で移動し、ＳＤＳゲル上で１つより多いバンドを示し、これはＳｎｆ１ｐによるＧａｌ８３ｐの公知リン酸化に一致する。βサブユニットの質量分光法分析は、アミノ末端グリシンがミリスチル化され、サブユニットが一リン酸化形及び二リン酸化形で単離されることを示す。
ＭＯＰＡＣ方法及び他のＰＣＲ増幅プロトコールを用いて、ラット肝臓ＡＭＰＫ  γ配列に対応する１９２ｂｐ  ｃＤＮＡを得て、ライブラリースクリーニングに用いて、約１．３ｋｂの部分長さのラット肝臓ｃＤＮＡを得た。この配列は開始メチオニンコドンも精製タンパク質から得られた全てのペプチド配列も含有しなかった。この配列をプライマー伸長ライブラリーと５’−ＲＡＣＥとを用いて５’−末端まで伸長する試みは、開始コドンを同定せずに、この配列に約２００ｎｔを加えることに成功したに過ぎなかった。次に、部分的長さのラットｃＤＮＡを用いて、ヒト胎児肝臓ライブラリーをスクリーニングして、配列番号：６３に示した全長クローンを得た。このクローンは、精製されたラット及びブタの肝臓ＡＭＰＫ  γから得られた２２個の独立した（一部重複した）ペプチド配列の全てに相当する演繹されたアミノ酸配列（配列番号：６４）を含有して、クローンアイデンティティを立証した。
典型的なＫｏｚａｋ翻訳開始配列が指定メチオニン開始コドンを囲み；この開始点も５’−上流停止コドンと共にイン−フレームである。指定開始メチオニンの次に、オープンリーディングフレームが続き、３３１アミノ酸から成り、ラット及びブタの肝臓から精製されたタンパク質のＳＤＳゲル電気泳動時に観察された分子量に一致する３７，５４６Ｄａを有するタンパク質が予想される。ＣＯＳ７細胞における、切頭ラットＡＭＰＫ  γ  ｃＤＮＡ（ａａ残基３３〜３３１）と全長ヒトＡＭＰＫ  γ（３３１ａａ）との発現は、各ｃＤＮＡに関して予測される分子量（それぞれ、３４，０８１と３７，５７７ダルトン）と一致する生成物を生じる。細菌中に発現されたラット肝臓ＡＭＰＫ  γ生成物も、ｃＤＮＡによって予測された分子量を示した。したがって、ＡＭＰＫ  βとは異なって、ＡＭＰＫ  γ  ｃＤＮＡのタンパク質生成物の異常な移動は生じない。
ヒトとラットとの肝臓ＡＭＰＫ  γアミノ酸配列をデータベースに比較すると、このタンパク質とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳｎｆ４ｐとの顕著な配向が生ずる。更に、本発明のヒト全長ｃＤＮＡも、データベースに最近報告された、脳、胸部、胎盤、肝臓及び心臓からの幾つかの他のヒト部分長さＥＳＴ−ｃＤＮＡ配列に配向する。これらの配列を検査すると、ヒトＡＭＰＫ  γタンパク質に複数のアイソフォームが存在することが明らかになる。恐らく、ラット及びブタに発現された同様なＡＭＰＫ  γアイソフォームサブファミリーも存在するように思われる。この後者の予想は、32Ｐ−標識縮重オリゴヌクレオチド（degenerate oligonucleotide）によるＡＭＰＫ  γ  ＭＯＰＡＣ生成物のコロニーハイブリダイゼーションで同定された、他の１４ＭＯＰＡＣ誘導部分ＡＭＰＫ  γ  ｃＤＮＡ配列の配列分析に基づくものである。これらの生成物は非縮重コア内に少なくとも２種類の再現可能なパターンのヌクレオチド異種を示した。
ラット及びヒトの肝臓ＡＭＰＫ  γはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅ  Ｓｎｆ４ｐ（ＣＡＴ３）の哺乳動物相同体である［Ｃｅｌｅｎｚａ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，５０４５〜５０５４；Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，Ｈ．Ｊ．とＥｎｔｉａｎ，Ｋ．Ｄ．（１９８８）Ｇｅｎｅ，６７，２４７〜２５７；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．とＳｏｎｇ，Ｏ．Ｋ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４０，２４５〜２４６］。Ｓｎｆ４ｐは２−ハイブリッド系における最初に報告された使用ではＳｎｆ１ｐと相互作用し、それと同時−免疫沈降する（co-immunoprecipitate）ことも判明した［Ｈａｙｇｏｏｄ，Ｍ．Ｇ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５，１０８４〜１０８９］。実際に、酵母からのＳｎｆ１ｐキナーゼの単離時に、Ｓｎｆ４ｐは（他のＳｎｆ１ｐ相互作用タンパク質ではなく）、Ｓｎｆ１ｐポリペプチドと１：１化学量論で同時精製される（co-purify）。酵母中のＳＮＦ４突然変異体の分析は、Ｓｎｆ４ｐもそれの会合触媒サブユニット、Ｓｎｆ１ｐの活性を有利に調節することを示唆する。類推によって、ＡＭＰＫ  γもこのような有利な影響をＡＭＰＫ  αサブユニットに及ぼすことを我々は予測する。データベースの検査すると、Ｓｎｆ４ｐへのＡＭＰＫ  γの相同性の他に、我々のヒト及びラット肝臓ＡＭＰＫ  γ配列に対して高度に相同な又は同じである、２又は３種類の異なるヒトタンパク質が存在することが明らかになる。しかし、これらのデータベース配列の一部は、脳、心臓、胸部及び胎盤中のＥＳＴ−ｃＤＮＡから予測されるように、相互から及び我々のクローンから全く異なり；一部は、例えば、Ｃ−末端伸長部を有する。このことは、各々が恐らく異なる組織発現と調節との役割を有する、可能なＡＭＰＫ  γサブユニットの哺乳動物アイソフォームファミリーが存在することを示している。これらの異なるγアイソフォームは、それらの全長配列が描写されるときに、γ1、γ2、γ3・・・・・γnと呼ばれることが示唆される。本発明のラット肝臓／ヒト肝臓ＡＭＰＫ  γ配列を本明細書ではＡＭＰＫ  γ1と呼ぶ。
ＡＭＰＫ  α触媒ユニットは幾つかのラット組織において広範囲に発現される。ＡＭＰＫ  β配列とＡＭＰＫ  γ配列は同様に広く組織発現される。総ｍＲＮＡ調製物中では、２．７ｋｂと１．９ｋｂのＡＭＰＫ  γ  ｍＲＮＡの２種が認められる；ラット肝臓からのポリＡ＋−ＲＮＡ中には後者のみが存在し、このことは大きいｍＲＮＡが未加工先駆体（unprocessed precursor）であることを示唆する。１．９ｋｂのＡＭＰＫ  βの単一ｍＲＮＡ種のみが認められる。ＡＭＰＫ  γとＡＭＰＫ  βの両方のｍＲＮＡが腎臓、白色脂肪組織、肺及び脾臓中に高度に発現され、ＡＭＰＫ  γ  ｍＲＮＡは心臓と脳とにより高度に発現されるように思われる。骨格筋、乳を分泌する乳腺及び肝臓中では各サブユニットのｍＲＮＡレベルは、検出可能であるが、比較的低い。他の研究では、高濃度のｍＲＮＡラットが両方のサブユニットに関してＦａｏ肝細胞癌の細胞とゴールデンハムスターのインシュリン分泌ＨＩＴ細胞中で検出されており、これらの細胞系統は両方が実質的なレベルのＡＭＰＫ活性を発現する。
ＡＭＰＫは最初に、脂質代謝酵素（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ、及びホルモン感受性リパーゼ）に対して活性なプロテインキナーゼとして認識された。しかし、ＡＭＰＫ  αサブユニットに関して観察されたように、ＡＭＰＫ  βとＡＭＰＫ  γ1サブユニットは、脂質代謝の調節においてのみ活性なタンパク質に関して予想されるよりも広い組織分布を有する。各サブユニットのｍＲＮＡは例えば肝臓、白色脂肪組織及び乳を分泌する乳腺のような“典型的な”脂質生成組織中で検出可能であるが、例えば心臓、脳、脾臓及び肺のような非脂質生成組織中の高濃度のｍＲＮＡは、これらのタンパク質が、脂肪酸及びステロールの生合成と脂肪酸の酸化との調節を越えて広がる役割を有することを示唆する。
例えば、栄養素（グルコース）反応に関与する酵母タンパク質に対する３種類全てのサブユニットの顕著な相同性は、３種類の哺乳動物タンパク質が哺乳動物組織における遺伝子発現のグルコース（若しくは他の栄養素）調節、又は変化する栄養素環境に対する他の適合反応に関与する可能性があることを示唆する。更に、ＡＭＰＫは心臓における酸化燃料の選択と、恐らくインシュリン分泌に関して重要であると考えられる膵臓β細胞におけるグルコース感知（glucose sensing）とに関係した、重要な“代謝センサー”であると考えられる。
本発明を更に説明するために、下記非限定的実施例を提供する。
11実  施  例
実施例１：  ＡＭＰＫ触媒サブユニット（α１）の精製
酵素精製
ＡＭＰＫをブタ肝臓から精製した。肝臓（１ｋｇ）を４，０００ｍｌの緩衝液中でホモジナイズした。２．５〜７．０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ６０００フラクションを調製し、得られたフラクションを１，５００ｍｌのＤＥＡＥセルロース（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）上に回分処理して（batched）、０．２５Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液（２，０００ｍｌ）で溶出させた。溶出液を１５０ｍｌのＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）上でクロマトグラフィーして、ＡＭＰＫを１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で溶出させた。酵素フラクションを濃縮し、１０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ−６０００沈降によって脱塩してから、ペプチド基質アフィニティクロマトグラフィーによってクロマトグラフィーした。ペプチド基質アフィニティカラムを０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．５Ｍ  ＮａＣｌとを含有する同じ緩衝液によって洗浄して、ＡＭＰＫを２Ｍ  ＮａＣｌと３０％（Ｖ／Ｖ）エチレングリコールとを含有するこの緩衝液によって溶出させた。
プロテインキナーゼ分析
ＡＭＰＫをＤａｖｉｅｓ等（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，１２３〜１２８に述べられている方法に従ってＳＡＭＳペプチド基質、ＨＭＲＳＡＭＳＧＬＨＬＶＫＲＲ−アミド（配列番号：４９）を用いて分析した。この酵素を、分析に先立って希釈用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０，０．１％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で希釈し、ペプチド基質を含有する反応混合物に１０ｍｌの希釈された酵素を加えることによって反応を開始させた。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｒ．Ｂ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ，Ｋ．Ｉ．及びＫｅｍｐ，Ｂ．Ｅ．（１９９３）が「タンパク質リン酸化：実用的アプローチ」，Ｈａｒｄｉｅ，Ｇ．Ｄ．（編集）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２６５〜２９１頁に述べている方法に従って、３０ｍｌアリコートを取り出し、Ｐ８１濾紙に供給することによって、反応を停止させた。
ペプチド合成
Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｒ．Ｂ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ，Ｋ．Ｉ．及びＫｅｍｐ，Ｂ．Ｅ．（１９９３）が「タンパク質リン酸化：実用的アプローチ」，Ｈａｒｄｉｅ，Ｇ．Ｄ．（編集）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２６５〜２９１頁に述べている方法に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０合成機を用いて、ペプチドを合成した。全てのペプチドをカチオン交換クロマトグラフィーとその後の逆相クロマトグラフィーとによって、精製した。Ｂｅｃｋｍａｎ６３００アミノ酸アナライザーを用いる定量アミノ酸分析によってペプチドを分析した。ＡＤＲ１（２２２〜２３４）P229ペプチドをＰｈａｒｍａｃｉａ  ＨｉＴｒａｐ  Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエステル活性化スーパーロース（superose）カラムにカップリングさせることによって、ペプチド基質アフィニティカラムを用意した。この樹脂は６−アミノヘキサン酸スペーサーアームを含有する。カップリング条件は製造者の指示に従って１０ｍｇペプチド／５ｍｌカラムによって実行し、ペプチドカップリングを逆相ＨＰＬＣによってモニターした。
実施例２：  ＡＭＰＫ触媒サブユニット（α１）をコードするｃＤＮＡの単離
ペプチド配列決定
ラット及びブタのＡＭＰＫα１サブユニットから、Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２３６１〜２３６４に述べられている方法による現場タンパク分解によってペプチドを得て、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７１Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ又はＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇ１０００Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒのいずれかで配列決定した。
組織分布活性試験
ＡＭＰＫホモジナイゼーション緩衝液（ＨＢ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、２５０ｍＭスクロース、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭベンズアミジン、１μｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤及び０．２ｍＭフェニルメチル−スルホニルフルオリド）中でのホモジナイゼーション後に、各組織に関して３５％飽和硫酸アンモニウムフラクションを調製した。得られたペレットを５ｍｌのＨＢ中に再懸濁させ、タンパク質濃度に関して分析した。Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２３６１〜２３６４に述べられている方法に従って、これに下記改良を加えて、ＡＭＰＫを分析した：１２０μｌの最終反応量を用いた、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中で予備希釈した（pre-diluted）１μｇタンパク質と０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを含有する酵素アリコート（３０μｌ）を用いて、反応を開始させた。２分間、４分間及び６分間後に、３アリコート（３０μｌ）を取り出した。反応は二連で±５’−ＡＭＰ（２００μＭ）とペプチド基質を含まない対照でおこなった。酵素の比活性を、特異的合成ペプチド基質ＳＡＭＳによりリン酸化の線速度を用いて測定した。ＡＭＰＫはラット又はブタ肝臓から実施例１に述べたように基質アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。
ＡＭＰＫｃＤＮＡの単離
ブタＡＭＰＫ  α1をコードする放射性標識ｃＤＮＡ（７７４ｂｐ）を用いて、製造者の指示に従って、ラット視床下部ＺａｐＩＩ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をスクリーニングした。ポジティブなものを次のラウンドのスクリーニングでプラーク精製し（plaque-purified）、ポジティブクローンからのファージミド（phagemid）をヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって取り出した。７ｘ１０6プラークのスクリーニングは３種類の特有クローンを生じ、最大のものはＡＭＰＫ  α1（２〜５４９）に相当するオープンリーディングフレームから構成された。
残基４１〜４８に対するα1特異的プライマーと、ラット肝臓ｃＤＮＡと共にＧｉｂｃｏ５’−ＲＡＣＥキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＵＳＡ）を用いて、ＡＭＰＫ  α2５’−末端を単離した。ヒトＡＭＰＫ  α1（１４〜２７０）は、α1ペプチド配列に対するセンス及びアンチセンス部分縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離された。ヒトＡＭＰＫ  α1、残基２９１〜４４８はＬａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られた部分長さヒト肝臓ｃＤＮＡクローンである（クローン７８２９７、受託番号Ｔ５０７９９）。
ノーザンブロット法
個々の組織のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ  ２ｍｇを含有するラット多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を，32Ｐ標識ラットＡＭＰＫ  α1とα2のｃＤＮＡを用いて、与えられた指示に従って検査した。
抗ＡＭＰＫ抗体の調製
ＡＭＰＫ  α1とα2とに対するポリクローナル抗体を次のように調製した。残基３３９〜３５８（ＤＦＹＬＡＴＳＰＰＤＳＦＬＤＤＨＨＬＴＲ（配列番号：５０））に対するＡＭＰＫ  α1と、残基３５２〜３６６（ＭＤＤＳＡＭＨＩＰＰＧＬＫＰＨ（配列番号：５１））に対するＡＭＰＫα2との予測アミノ酸配列に基づいたペプチドを合成して、キーホールリンペット（keyhole limpet）ヘモシアニン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｈ−２１３３）に、ペプチドのＮ−末端に加えたシステイン残基を介して、ヘテロ二官能性試薬、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）を用いてカップリングさせた。ニュージーランド白ウサギを最初に５０％（Ｖ／Ｖ）Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント中で、その後の免疫感作のためには５０％（Ｖ／Ｖ）Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント中で、２ｍｇのペプチドコンジュゲートによって免疫感作させた。ウサギに２週間毎に２ｍｇのペプチドコンジュゲートによって追加免疫し、追加免疫注射後７日目に採血した。抗ＡＭＰＫα1及びα2ペプチド抗体をペプチドアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
ウェスタンブロット法
多ラット組織ウェスタンブロットを次のように用意した。ラット組織をＡＭＰＫ  ＨＢ中でホモジナイズして、２．５〜７％ポリエチレングリコール６０００フラクションを調製した。得られたペレットを５ｍｌのＨＢ中に再懸濁させ、タンパク質濃度に関して分析した。１００μｇの各組織フラクションをＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１３％アクリルアミドゲル）によって分析し；ニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓａｌ，ドイツ）に移し；３μｇ／ｍｌと６μｇ／ｍｌのアフィニティ精製したＡＭＰＫ  α1とα2抗体によってそれぞれ検査した。一次抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）にコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ抗体と、０．０３２％の３，３’−ジアミノ−ベンジジン（Ｄ−５６３７，Ｓｉｇｍａ）とを０．０６４％Ｈ2Ｏ2と共に用いて検出した。
ＡＭＰＫ  α2の精製
アフィニティ精製したＡＭＰＫα2抗体（２ｍｇ）をＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）に製造者の指示に従ってカップリングさせた。基質アフィニティカラムからの非結合フラクションをＡＭＰＫ  α2抗体カラムに直接供給して、５倍量のＰＢＳによって洗浄し、２００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．５によって溶出させ、直接中和した。
実施例３：  ＡＭＰＫ非触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡの単離
ＡＭＰＫ単離とペプチド配列決定
ブタ及びラットの肝臓ＡＭＰＫを単離した。ラット肝臓β（４０ｋＤａ）とγ（３８ｋＤａ）サブユニットに由来したペプチド配列が、ＳＤＳゲル電気泳動、バンド溶出及び、Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２３６１〜２３６４とＳｔａｐｌｅｔｏｎ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２９３４３〜２９３４６とによって述べられている方法に従ったｉｎ  ｓｉｔｕプロテアーゼ消化によるサブユニット分離後に得られた。
ＡＭＰＫ  βサブユニットｃＤＮＡの単離
ＡＭＰＫ  βサブユニットから得られたペプチド配列を用いて、Ｇａｏ等（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２００，７３〜８２によって述べられている方法に従ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって部分長さＡＭＰＫ  βサブユニットｃＤＮＡを生成した。一つの生成物、３０９ｂｐ  ｃＤＮＡを用いて、ラット肝臓λＺＡＰＩＩ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。フィルターをα−32Ｐ−ＣＴＰ（３０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）によって標識した32Ｐ−ｃＤＮＡと、５０％ホルムアミド、１０％デンハルト（Denhardt’s）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、及び１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中での４２℃における１８時間のランダムプライミング（random priming）（Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）によってハイブリダイズした。次に、これらを室温において３ｘ１０分間洗浄し、次に５５℃において１５分間洗浄した。オートラジオグラフィーを−８０℃において一晩おこなった。全てのプレートを二連で写し取り（lifted）、ポジティブプラークをさらに３回のプレーティングと再スクリーニングとによって精製した。
ＡＭＰＫ  γサブユニットｃＤＮＡの単離
ペプチド配列を本明細書に記載する場合に、文字Ｙ、Ｈ、Ｎ及びＲは縮重の領域を意味する。ＡＭＰＫ  γサブユニットに関しては、Ｌｅｅ，Ｃ．Ｃ．とＣａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．（１９９０）によって、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．、Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．、Ｓｒｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．及びＷｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．編集者）４６〜５３頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，ロンドンに述べられているＭＯＰＡＣ方法によって、６７ｂｐ  ｃＤＮＡを作製した。１７−アミノ酸ラット肝臓ＡＭＰＫ  γペプチドのＮ−及びＣ−末端配列（ＶＶＤＩＹＳＫＦＤＶＩＮＬＡＡＥＫ（配列番号：５２））に相当する縮重ＰＣＲプライマーを合成した。センスプライマーの配列はＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＮＧＡＹＡＴＨＴＡ（配列番号：５３）であり、アンチセンスプライマーの配列はＣＧＧＡＡＴＴＣＹＴＴＹＴＣＮＧＣＮＧＣＮＡ（配列番号：５４）であった。ＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位とをこれらのプライマーの５’−末端に加えた。この方策（strategy）は、ライブラリースクリーニングに用いられると考えられるペプチド配列の中央部分に相当する非縮重ヌクレオチド配列を形成することであった。オリゴ−ｄＴ及びランダムヘキサマー（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ予備増幅キット）によって調製された総ラット肝臓ｃＤＮＡをＰＣＲに用いて、ＡＭＰＫγｃＤＮＡの一部に相当する６７マー（プライマーを包含）オリゴヌクレオチドを増幅した。精製されたＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとによって消化し、ＤＨ５α細菌の形質転換のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにライゲートした。コロニーハイブリダイゼーションを用いて、目的のクローンを同定した；コロニーをレプリカプレートからニトロセルロースフィルター上にリフトした。細菌溶解とＤＮＡ変性後に、フィルターを２種類のＰＣＲプライマーの配列の内側のアミノ酸配列（ＫＦＤＶＩＮＬＡ（配列番号：５５））に相当する２種類の32Ｐ−末端−標識縮重オリゴヌクレオチドプローブの混合物によって検査した。これらのオリゴヌクレオチド（＃１：ＡＡＲＴＴＹＧＡＹＧＴＮＡＴＨＡＡＹＣＴＮＧＣ（配列番号：５６）；＃２：ＡＡＲＴＴＹＧＡＹＧＴＮＡＴＨＡＡＹＴＴＲＧＣ（配列番号：５７））を、Ｌｅｕコドンの縮重を考慮して、２部のオリゴ＃１  対  １部のオリゴ＃２の比率で加えた。ポジティブコロニーを同定して、各々からプラスミドＤＮＡを配列分析のために単離した。このようなｃＤＮＡの１つを選択し、次に、非縮重“コア”２３マーオリゴヌクレオチド配列をライブラリースクリーニングに用いるために合成した（ＣＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＣＡＡＣＣ（配列番号：５８））。しかし、このプローブによる約１０6プラークのスクリーニングはポジティブクローンを生成しなかった。
次に、非縮重２３マーｃＤＮＡを他の２ペプチド配列から構成された縮重プライマーと共に用いて、ＰＣＲによってさらに大きいＡＭＰＫ  γ  ｃＤＮＡを作製した。ペプチド配列、ＥＥＬＱＩＧ（配列番号：５９）とＦＰＫＰＥＦＭ（配列番号：６０）に相当するセンスとアンチセンスの両方の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、センスＭＯＰＡＣ誘導非縮重配列と共に用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡを鋳型として用いて、あらゆる可能なＰＣＲ生成物を作製した。得られた最大の生成物（１９２ｂｐ）ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でサブクローニングして、配列決定した。ＰＣＲ方策に用いられた３種類全てのＡＭＰＫ  γペプチドに相当する予測アミノ酸配列を実際に有するこの配列を、次に、上述のように、ライブラリースクリーニングに用いた。この大きいＰＣＲ生成物による２ｘ１０6プラークのスクリーニングは幾つかのポジティブクローンを生じた；しかし、単離されたラットｃＤＮＡ（１〜１．３ｋｂ）のいずれも全長オープンリーディングフレームに相当しなかった。配列をＯＲＦの５’−末端側へ伸長させようと試みて、ＡＭＰＫ  γ特異的アンチセンスプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；λＺＡＰＩＩ）を用いて、プライマー伸長用ライブラリーを構成した。このライブラリーの追加のスクリーニングは、若干の５’−伸長配列を生じたが、開始Ｍｅｔコドンを生じなかった。ラット肝臓ｃＤＮＡによる５’−ＲＡＣＥ方策の適用も配列伸長の試みにおいて不成功であったが、ブタ肝臓からの５’−ＲＡＣＥ生成物は得られた。次に、最大の５’ラットｃＤＮＡ配列（５２０ｂｐ）を用いて、ヒト胎児肝臓ライブラリーをスクリーニングして、全長ＡＭＰＫ  γ  ｃＤＮＡを得た。
プラスミド調製とＤＮＡ配列決定
Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ−又はＭｉｄｉ−カラム（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて、製造者の指示に従って、プラスミドＤＮＡを調製した。ＤＮＡをベクター又は遺伝子特異的プライマーによって、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ（ｔｍ）（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）即反応性（ready reaction）Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて配列決定して、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおいて、製造者の指示に従って、循環させた。得られた配列反応物（sequence reactions）からＣｅｎｔｒｉ−Ｓｔｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社）を用いて、染料ターミネーターを取り出した。精製された配列決定反応物（sequencing reactions）を次にＳｐｅｅｄ−Ｖａｃにおいて乾燥させ、自動化ＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３）で分析した。
ｃＤＮＡの細菌発現
全長ラットＡＭＰＫβサブユニットｃＤＮＡと部分長さラットＡＭＰＫγ（ａａ３３〜３３１）サブユニットｃＤＮＡとを、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）とＴ７融合エピトープタグ配列とを導入するｐＥＴベクター系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現させた。１．０ｍＭ  ＩＰＴＧによって３７℃において２時間、細菌発現を誘導した。発現されたタンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色と、抗−Ｔ７モノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）によるイムノブロッティングとの両方によって検出した。融合タンパク質を細菌の封入体からニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって変性条件下で精製した。Ｈｉｓ６−ＡＭＰＫ  β又はＨｉｓ６−ＡＭＰＫ  γを、製造者の指示に従って、６Ｍ尿素中で封入体から可溶化した。サンプル供給後に、カラムをＴｒｉｓ−Ｃｌ（２０ｍＭ；ｐＨ７．９）、０．５Ｍ  Ｎａｃｌ（０．５Ｍ）、イミダゾール（２０ｍＭ）及び尿素（６Ｍ）によって大規模に洗浄した。Ｈｉｓ６−タンパク質を３００ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液によって溶出させた。
ｃＤＮＡの細胞発現
全長ラットＡＭＰＫ  β  ｃＤＮＡ、部分長さラットＡＭＰＫ  γ（ａａ３３〜３３１）及び全長ヒトＡＭＰＫ  γサブユニットｃＤＮＡをもＣＯＳ７細胞中で発現させた。ｃＤＮＡを、ｐＭＴ２ベクター中に、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグ（ｐＭＴ２−ＨＡ）と共にイン−フレームにクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、製造者の指示に従って、トランスフェクションをおこなった。細胞を６孔プレートにおいて１０％ウシ胎児血清とペニシリン／ストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ中に３ｘ１０6／孔でプレーティングした。翌日、細胞を無血清無抗生物質ＤＭＥＭに切り換え、同じ媒質中で希釈したリポフェクタミン−ＤＮＡコンジュゲート（孔当たり、２μｇのＤＮＡ；１０μｌのリポフェクタミン）を加えた。３７℃において５時間インキュベートした後に、２０％ウシ胎児血清を含有する等量の培地を各孔に加えた。翌朝、培地を最初の細胞培地に切り換えた。トランスフェクション後４８時間目に細胞を回収した。ＰＢＳで洗浄した後に、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（５０ｍＭ；ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、ＮａＦ（５０ｍＭ）、ＮｉａＰＰ1（５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＤＴＴ（２ｍＭ）及びＮＰ−４０（０．５％）を数種類のプロテアーゼ阻害剤と共に含有する緩衝液中で、細胞を溶解させた。
完全な細胞溶解のために、細胞を氷上に１５分間置いてから、溶解物をかき取り、激しく撹流した（vortexing）（１５秒間）。短時間の遠心分離によって、細胞破片を除去した後に、この溶解物をＳＤＳゲル電気泳動とイムノブロッティングとに用いた。ブロットを抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５ハイブリドーマ系統に由来）によって検査した。抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ抗体による第２抗体処理後に、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってブロットを展開させた。
ノーザンブロット分析法
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重１５０〜２００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の組織から又は雌ラットの乳を分泌する乳腺から、イソチオシアン酸グアニジウム−塩化リチウム方法を用いて、全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分画し、ニトロセルロース（ＭＳＩ）に毛管転移させた。ｃＤＮＡプローブをランダムプライミングによって標識した。
ハイブリダイゼーションを５％デンハルト、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１Ｍ  ＮａＣｌ、及び０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で４２℃において２０時間おこなった。フィルターを２ＸＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ（室温；２ｘ１５分間）、０．２ＸＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ（室温；２ｘ１５分間）、及び０．２ＸＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ（５５℃；２ｘ１５分間）で連続的に洗浄した。Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲフィルム上でのオートラジオグラフィーは、強化スクリーンを用いて、−８０℃に置いて１８〜４８時間おこなった。
ＤＮＡ配列分析とＤＮＡ配列
ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ｒ）とＧＣＧソフトウェアパッケージとを用いて、ＤＮＡ配列を分析した。ＢＬＡＳＴとＧＣＧとを用いて、配列をデータベースと比較した；ＧＣＧのＰｉｌｅｕｐプログラムを用いて、アミノ酸アラインメント（alignment）をおこなった。Ｅｘｃｅｌ（ｒ）ｍａｃｒｏを用いて、配列をフォーマットした。本明細書に記載するＤＮＡ配列は次の受託番号でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている：ラット肝臓ＡＭＰＫ  β（Ｕ４２４１１）；ラット肝臓ＡＭＰＫ  γ（Ｕ４２４３３）及びヒト胎児肝臓ＡＭＰＫ  γ（Ｕ４２４１２）。
配列表
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0004448201.tif 000036
（2）配列情報SEQ ID NO:34:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  20
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:34:
0004448201.tif 000037
（2）配列情報SEQ ID NO:35:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  16
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:35:
0004448201.tif 000038
（2）配列情報SEQ ID NO:36:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  9
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:36:
0004448201.tif 000039
（2）配列情報SEQ ID NO:37:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  9
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:37:
0004448201.tif 000040
（2）配列情報SEQ ID NO:38:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  10
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:38:
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（2）配列情報SEQ ID NO:39:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  5
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:39:
0004448201.tif 000042
（2）配列情報SEQ ID NO:40:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  14
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:40:
0004448201.tif 000043
（2）配列情報SEQ ID NO:41:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  10
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:41:
0004448201.tif 000044
（2）配列情報SEQ ID NO:42:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  18
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:42:
0004448201.tif 000045
（2）配列情報SEQ ID NO:43:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  12
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:43:
0004448201.tif 000046
（2）配列情報SEQ ID NO:44:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  1647
（B）型:  核酸
（C）鎖の数:  一本鎖
（D）トポロジー:  直鎖状
（iv）アンチセンス:  No
（xi）配列:  SEQ ID NO:44:
0004448201.tif 000047
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（2）配列情報SEQ ID NO:45:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  20
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:45:
0004448201.tif 000049
（2）配列情報SEQ ID NO:46:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  12
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:46:
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（2）配列情報SEQ ID NO:47:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  13
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:47:
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（2）配列情報SEQ ID NO:48:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  14
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:48:
0004448201.tif 000052
（2）配列情報SEQ ID NO:49:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  15
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:49:
0004448201.tif 000053
（2）配列情報SEQ ID NO:50:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  20
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:50:
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（2）配列情報SEQ ID NO:51:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  15
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:51:
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（2）配列情報SEQ ID NO:52:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  17
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:52:
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（2）配列情報SEQ ID NO:53:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  19
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:53:
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（2）配列情報SEQ ID NO:54:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  22
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
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（i）配列の特性:
（A）長さ:  8
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
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（2）配列情報SEQ ID NO:56:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  23
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
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（2）配列情報SEQ ID NO:57:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  23
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:57:
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（2）配列情報SEQ ID NO:58:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  23
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:58:
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（2）配列情報SEQ ID NO:59:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  6
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
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（2）配列情報SEQ ID NO:60:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  7
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:60:
0004448201.tif 000064
（2）配列情報SEQ ID NO:61:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  1978
（B）型:  核酸
（C）鎖の数:  一本鎖
（D）トポロジー:  直鎖状
（iv）アンチセンス:  No
（xi）配列:  SEQ ID NO:61:
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（2）配列情報SEQ ID NO:62:
（i）配列の特性:
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（2）配列情報SEQ ID NO:63:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  1576
（B）型:  核酸
（C）鎖の数:  一本鎖
（D）トポロジー:  直鎖状
（iv）アンチセンス:  No
（xi）配列:  SEQ ID NO:63:
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（2）配列情報SEQ ID NO:64:
（i）配列の特性:
（A）長さ:  331
（B）型:  アミノ酸
（D）トポロジー:  直鎖状
（xi）配列:  SEQ ID NO:64:
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0004448201.tif 000072