(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然生成グリコリポペプチドの、少なくとも一のアミノ酸がグリコシル化アミノ酸でかつ少なくとも一のアミノ酸がリピド化アミノ酸であり、ここで少なくとも一のリピド化アミノ酸は内部アミノ酸であり、前記グリコリポペプチドはアミノ酸配列Ｐ（Ｄ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ）ＲＰを含む少なくとも二のＭＵＣ１エピトープからなり、
ｉ）アミノ酸配列Ｐ（Ｄ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ）ＲＰを含む少なくとも一のＭＵＣ１エピトープは少なくとも一のグリコシル化アミノ酸からなり、そして
ｉｉ）アミノ酸配列Ｐ（Ｄ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ）ＲＰを含む少なくとも一のＭＵＣ１エピトープは少なくとも一のグリコシル化していないアミノ酸からなり、そして
前記ｉ）およびｉｉ）のＭＵＣ１エピトープのアミノ酸配列は同じかまたは異なる、非天然生成グリコリポペプチド。
【請求項２】
少なくとも一のエピトープがガン関連エピトープである、請求項１記載のグリコリポペプチド。
【請求項３】
少なくとも一のエピトープがＭＵＣ１エピトープである、請求項２記載のグリコリポペプチド。
【請求項４】
非天然生成グリコリポペプチドは、少なくとも五つのアミノ酸からなり、少なくとも一のアミノ酸がグリコシル化アミノ酸でかつ少なくとも一のアミノ酸がリピド化アミノ酸であり、前記グリコリポペプチドはアミノ酸配列Ｐ（Ｄ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ）ＲＰを含む少なくとも二のＭＵＣ１エピトープからなり、
ｉ）アミノ酸配列Ｐ（Ｄ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ）ＲＰを含む少なくとも一のＭＵＣ１エピトープは少なくとも一のグリコシル化アミノ酸からなり、そして
ｉｉ）アミノ酸配列Ｐ（Ｄ／Ｅ）（Ｔ／Ｓ）ＲＰを含む少なくとも一のＭＵＣ１エピトープは少なくとも一のグリコシル化していないアミノ酸からなり、そして前記ｉ）およびｉｉ）のＭＵＣ１エピトープのアミノ酸配列は同じかまたは異なる、非天然生成グリコリポペプチド。
【請求項５】
グリコリポペプチドが少なくとも一のＭＵＣ１のＢ細胞ペプチドエピトープおよび少なくとも一のＭＵＣ１のＴ細胞エピトープからなる、請求項１ないし４のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項６】
グリコリポペプチドがアミノ酸配列ＰＤＴＲＰ（配列番号１０のアミノ酸６−１０）を含む請求項１ないし５のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項７】
グリコリポペプチドがアミノ酸配列ＳＡＰＤＴＲＰ（配列番号１０のアミノ酸４−１０）を含む請求項６記載のグリコリポペプチド。
【請求項８】
グリコリポペプチドが（ａ）ＭＵＣ１コンセンサス直列反復ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨ（配列番号１０）、（ｂ）その環状順列（周期的配列）、もしくは（ｃ）一またはそれ以上の保守的置換（同類置換）および／または単一の非保守的置換（非同類置換）によって（ａ）または（ｂ）と異なる配列、の少なくとも一からなる請求項１ないし４のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項９】
グリコリポペプチドが（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の少なくとも２つのコピーからなる請求項８記載のグリコリポペプチド。
【請求項１０】
少なくとも一のグリコシル化アミノ酸がＯ−グリコシル化である請求項１ないし９のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項１１】
グリコリポペプチドが腫瘍関連炭水化物エピトープからなる、請求項１ないし１０のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項１２】
前記炭水化物エピトープがＧａｌＮＡｃ（Ｔｎ）である、請求項１１記載のグリコリポペプチド。
【請求項１３】
前記炭水化物エピトープがシアリルＴｎである、請求項１１記載のグリコリポペプチド。
【請求項１４】
前記炭水化物エピトープがＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ（ＴＦ）である、請求項１１記載のグリコリポペプチド。
【請求項１５】
少なくとも二つのアミノ酸がグリコシル化されている、請求項１ないし１４のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項１６】
少なくとも一の内部アミノ酸がリピド化されている、請求項４記載のグリコリポペプチド。
【請求項１７】
少なくとも二つのアミノ酸がリピド化されている、請求項１ないし１６のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項１８】
少なくとも二つの内部アミノ酸がリピド化されている、請求項１ないし１６のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項１９】
すべてのリピド化アミノ酸が内部アミノ酸である、請求項１ないし１８のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項２０】
各セリンがリピド化されている、カルボキシ末端配列ＳＳＬによって特徴付けられる、請求項１ないし１９のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項２１】
少なくとも一のリピド化アミノ酸が、少なくとも６個の炭素原子を有する強親油性基からなる、請求項１ないし２０のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項２２】
少なくとも一のリピド化アミノ酸の少なくとも一の強親油性基が少なくとも１０個の炭素原子を有する、請求項２１記載のグリコリポペプチド。
【請求項２３】
少なくとも一のリピド化アミノ酸が、リピド化ＳｅｒまたはＴｈｒである、請求項１ないし２２のいずれか一記載のグリコリポペプチド。
【請求項２４】
少なくとも一のリピド化アミノ酸の強親油性基が下記の構造からなり、式中ｍおよびｎは６ないし２６の範囲から選択される独立した整数である、請求項１、２または６記載のグリコリポペプチド。
【化３】
0004527407.tif 000018
【請求項２５】
下記の構造をもち、式中ＴｎはＮ−アセチルガラクトサミンであり、「Lipids」は二またはそれ以上の連続したリピド化アミノ酸を表す、請求項１記載のグリコリポペプチド。
【化４】
0004527407.tif 000019
【請求項２６】
下記の構造をもち、式中ＴｎはａＮ−アセチルガラクトサミンであり、かつＳＴｎは（２−６）シアリル、ａＮ−アセチルガラクトサミン、かつ「Lipids」は二またはそれ以上の連続したリピド化アミノ酸を表す、請求項１記載のグリコリポペプチド。
【化５】
0004527407.tif 000020
【請求項２７】
リピド化アミノ酸が下記の構造をもち、式中ＺはＨまたはアミノ保護基であり、ＲはＨまたはＣＨ３であり、かつｎは６ないし２６の範囲の値をもつ整数である、請求項１記載のグリコリポペプチド。
【化６】
0004527407.tif 000021
【請求項２８】
リピド化アミノ酸が下記の構造をもち、式中Ｘは−Ｏ−または−Ｓ−であり、ＺはＨまたはアミノ保護基であり、ＲはＨまたはＣＨ３であり、ｋは０ないし６の範囲の値をもつ整数であり、ｍおよびｎは６ないし２６の範囲の値を独立にもつ整数である、請求項１記載のグリコリポペプチド。
【化７】
0004527407.tif 000022
【請求項２９】
請求項２７または２８記載のリピド化アミノ酸のＺがＢｏｃまたはＦｍｏｃである請求項２７または２８記載のグリコリポペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、コギャンティーらの、出願番号60/372,105、出願日2002年４月15日、代理人整理番号KOGANTY4−USA、および出願番号60/377,595、出願日2002年5月6日（KOGANTY4.1−USA）の、非仮出願であり、これらは本明細書に参照として完全に組み込まれる。
関連出願の相互参照表
以下の出願は本明細書に参照として完全に組み込まれる。
Jiangら、08/US00/31281、2000年11月15日出願（整理番号JIANG3A-PCT）。
Longeneckerら、08/229,606、1994年4月12日出願（整理番号LONGENECKER5-USA）、およびPCT/US95/04540、1995年4月12日出願（整理番号LONGENECKER5-PCT）。
Wong、USP、6,013,779。
Budzynskiら、60/278,698、2001年3月27日出願、「Ｔ１およびＴ２免疫反応間の調節のためのワクチン」。
【背景技術】
【０００２】
本発明は免疫療法および診断に関する。特に、ガンおよび交差反応性のエピトープを提示している病原体に対するワクチンとしての新規の合成グリコリポペプチドの使用に関する。このグリコリポペプチドは、標識化あるいは固定化した形で、診断上の試薬として使用することもできる。
【０００３】
免疫系
感染性の微生物、毒素、ウイルス、または他の外来性の巨大分子に対して自分自身を守る脊椎動物の能力は、免疫と呼ばれる。従来技術は、天然、および獲得もしくは特異免疫について識別する（Abbasらの非特許文献１、Hoodらの非特許文献２）。
自然免疫は、微生物または外来性の巨大分子に曝露される前から活性であり、このような曝露によっては強められず、身体に対して外来性の多くの物質を識別しない、防御機構からなる。自然免疫の作動体は、肌もしくは粘膜といった物理的なバリヤー、マクロファージもしくは好中球といった食細胞、ナチュラルキラー細胞と名付けられるリンパ球の類、および補体系である。補体は血清蛋白複合体で、特定のバクテリアおよび特定の補体結合の抗体に感作した他の細胞に対して破壊性である。すなわち、その活性は、少なくとも二つのうちの一またはそれ以外の経路に従うことのできるタンパク分解性の切断をもたらす一連の反応によって実施される（非特許文献３）。
獲得免疫または特異的免疫は、外来性物質への曝露によって誘導または刺激される防御機構からなる。
脊椎動物においては、自然免疫および特異免疫の機構は、宿主の防御系、すなわち免疫系で協調し、外来性侵入者を排除する。微生物、癌細胞、寄生虫およびウイルス感染細胞に加えて、免疫系は、同一種の遺伝的に異なる個体から（同種移植）もしくは異なる種から（異種移植）対象に移植された細胞もしくは組織をも認識および排除する。
侵入してきた微生物や癌細胞等に対する防御において特異免疫の機構が関与をはじめる現象を免疫反応という。脊椎動物は、二つの基本的な免疫反応をもつ。すなわち体液性免疫および細胞性免疫である。体液性免疫は、Ｂリンパ球によって供され、これは増殖および分化後に、血液およびリンパ液中を循環する抗体を産生する。細胞性免疫は、リンパ系のＴ細胞によって供される。細胞性免疫反応は、特に菌類、寄生虫、細胞間ウイルス性感染、癌細胞および外来性物質に対して効果的で、他方、体液性免疫は、バクテリアおよびウイルス性感染の細胞外相に対して最初に防御する。
「抗原」は、免疫反応を誘導することができるかどうかに関わらず、抗体またはＴ細胞受容体によって認識される（特異的に結合される）ものである。特異免疫を誘導する外来性物質は、「免疫抗原」または「免疫原」と呼ばれる。「ハプテン」は、それ自体、免疫反応を誘発することのできない抗原である（しかし、ハプテンのいくつかの分子の結合、または巨大分子キャリアーとハプテンの結合は、誘発することができる）。本出願は免疫反応の誘発に関するものなので、用語「抗原」は、他に記述のない限りは誘発する抗原として言及される。
免疫反応の時間経過は、特異的な白血球が外来性の抗原を認識する認知相、特異的な白血球が外来性の抗原に反応する活性相、そしてそこでは抗原−活性化白血球が抗原を排除するために必要な過程を媒介しているエフェクター相に細分される。
白血球は、特異的な免疫反応を媒介および指示することに特殊化している免疫細胞である（Abbasら、上記引用文中；Hoodら、上記引用文中）。
免疫系は、宿主の通常の成分でない巨大分子の表面の特徴を認識できるように進化してきた。免疫系によって認識された外来性の分子（たとえば抗体によって結合された）は、それ自体で免疫反応を誘発することができるか否かにかかわらず、「抗原」と呼ばれ、そして抗体が結合する抗原の部位は「抗原決定基」または「エピトープ」と呼ばれる。抗原がポリペプチドの場合、エピトープを直線状（すなわち、ポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の連続的な配列から構成されている）または非直線状（すなわち、ポリペプチド鎖の折りたたみの結果としての近接したアミノ酸から構成されている）に分類することが慣例である。（非直線状エピトープは、ポリペプチドの折りたたみによって特別なコンホメーションを生じるので「コンホメーション」的とも呼ばれる。）
遭遇するエピトープの莫大な多様性を処理するために、哺乳動物の各個体の免疫系は非常に多くの白血球のレパートリーを含んでいる。レパートリーの各リンパ球クローンは、一のエピトープに対して特異的な表面受容体を含む。哺乳動物の免疫系は少なくとも10８の抗原決定基を識別することができる（Abbasら、上記引用文中、8頁）。
外来性の抗原に対する初期または一次免疫反応は、その抗原に対して免疫系が再び反応する（二次免疫反応における）能力を増強する。特異的な免疫のこの特徴は免疫記憶と呼ばれる。二次免疫反応は、多くの場合一次反応よりも効果的である。
個体中の白血球は外来性の抗原に対して特異的に反応するが、その個体に生得である潜在性の抗原性物質に対しては通常反応しない。免疫的な不反応性は寛容と呼ばれる。潜在的な自己認識リンパ球が自己−抗原と接触して、自己抗原と陽性に反応することが可能となる段階に発達することを防ぐこととなる、初期の発達的な段階において自己免疫は獲得される（Abbasら、上記引用文中）。
リンパ球は、免疫反応において抗原性に特異的である媒介物である。リンパ球は二つに分類することができる。一の分類は、「Ｂリンパ球」または「Ｂ細胞」で、抗体の産生において中心的な役割を果たす。抗体（イムノグロブリン、Ｉｇ’ｓ）は、抗原に結合することができるタンパク質で、外来性の抗原の排除に関与するエフェクター機能を発揮することができる。他の分類は、Ｔリンパ球またはＴ細胞からなり、Ｂ細胞の補助、遅発性過敏反応の産生、およびウイルス感染細胞の特異的な死滅を含む種々の役割をはたす（Bjorkamanら、Annu.  Rev.  Biochem.、59、253、1990）。
通常、免疫反応は、ＢおよびＴリンパ球の両方の特性を持つエフェクター機構にむかって進行する。しかしながら、多くの免疫反応の過程においては、ＢまたはＴリンパ球のいずれかが支配的な役割で、他の白血球タイプの実質的な参加は少ないと考えられる。エフェクター機構がＢ細胞および抗体によって圧倒的に媒介される免疫反応は、体液性免疫反応と呼ばれる。Ｔ細胞がより重要なエフェクター機能を媒介する免疫反応は、細胞媒介性免疫反応または細胞免疫反応と呼ばれる。
Ｂ細胞は、体液性免疫反応において中心的なリンパ球集団を構成する。Ｂ−リンパ球の各クローンは膜イムノグロブリン（膜Ig's、表面結合抗体分子）を発現し、これはＢ−リンパ球クローンについて特異的な一つの特有のエピトープをもつ抗原受容体としてはたらく。これらの膜Ｉｇ分子（抗原受容体）はＢ細胞特異性の全原因である（Bjorkmanら、前記引用中）。膜Ｉｇに相補的なエピトープを含む抗原は、抗原受容体に結合する。このような抗原は、抗体の同族抗原とも呼ばれる。タンパク抗原上、抗体は、一次決定子（共有的な配列における近接したアミノ酸残基によって形成されたエピトープ）、または、ポリペプチドの折りたたみによって特に並列している一次ポリペプチドの分離部位からのアミノ酸によって形成されているコンホメーションの決定子に、結合することができる（Abbasら、上記引用中）。抗原受容体（膜Ｉｇ）への結合は、Ｂリンパ球の分化およびクローン増殖に結びつく。その子孫の一部は成熟プラズマ細胞に分化して、これはエピトープにおける膜Ｉｇに対応する抗体の合成に特化していて、これによってＢリンパ球ははじめに抗体に結合する。
体液性免疫反応の典型的なエフェクター機構によって、抗体はたとえばバクテリアといった侵入してきた標的細胞の表面上にある同族エピトープに結合する。抗体結合に続いて、補体系の構成成分が、標的細胞−抗体複合体に続いて付着して、最終的に標的細胞膜の破裂を引き起こして標的細胞を殺す。他の抗体介在エフェクター機構によって、抗体が標的抗原に結合して架橋（オプソニン化）し、そして顆粒球またはマクロファージといった細網内皮性起源の食細胞の摂取および引き続く破壊に備えられる。
抗体そのものはオリゴマーの分子で、その構造上、クラス（たとえばＩｇＧ）およびサブクラス（たとえばＩｇＧ１）に分類される。ＩｇＧ分子は体液性免疫反応のもっとも重要な構成成分で、二つの重鎖（長鎖）および二つの軽鎖（短鎖）からなり、ジスルフィド結合によって「Ｙ」の立体配置になっている。この分子は可変部（「Ｙ」の腕部）および不変部（「Ｙ」のヒンジおよび基部）の両方をもつ。異なる抗原に反応する特定の個体が産生する、特定のサブクラスの抗体が、可変部では異なるが不変部では異ならないので、これら部位はこのように命名されている。可変部そのものは、比較的不変のフレームワークと、高頻度可変性のループの両方から構成されていて、特定のエピトープにおける特異性を抗体上に与える。抗体は、分子相補性の結果として抗原のエピトープに結合する。相互作用に直接関与する抗体の部分は、「抗原結合部位」または「パラトープ」と呼ばれる。特定の抗体によって結合される抗原は、その抗体の「同族の抗原」と呼ばれる。
一の動物の抗体は、他の動物の免疫系によって外来性の抗原としてみなされ、こために免疫反応を誘発する。生成する抗体のいくつかは、免疫を与える抗体の可変部に特有のエピトープ（イディオトープ）に特異的となるので、このため抗イディオタイプ抗体とよばれる。これらは、免疫を与える抗体と同族の抗原に類似の免疫的特徴をもつ。非アイソトピック抗体は、逆に、免疫を与える抗原の不変部中のエピトープに結合する。
細胞媒介性もしくは細胞性免疫反応の典型的なエフェクター相には、細胞毒性もしくは細胞どおしの接触を通じての細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）による、標的細胞の溶解もしくは死滅が含まれる。細胞表面糖タンパク質の二つの異なる系統群からの分子、すなわちＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）および主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タイプＩ糖タンパク質は、外来性抗原に対するＣＴＬ反応の鍵となる要素である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）は、8から24のアミノ酸の短く直鎖状のペプチド決定因子を認識する。この決定因子の産生には、抗原タンパク質のアンフォールディングおよびタンパク質分解性断片化（プロセシング）を通常要する（Allen、Immunology  Today、8、270、1987；Unanueら、Science、236、551、1987；Bjorkmanら、上記引用文中；Bracialeら、Immunol.Rev.、98、95、1987；Unanue、Annu.Rev.Immunol.2、395、1984；Zieglerら、J.Immunol.、127、1869、1981；Shimonkevitzら、J.Exp.Med、158、303、1983；Zweerinkら、Eur.J.Immunol.、7、630、1977）。これらはオリゴ糖決定因子も認識することができる（Henningssonら、Cancer  Immunol.  Immunother.、25、231、1989；Fungら、Cancer  Res.、50、4308、1990）。抗体とは異なり、Ｔ細胞受容体は適合エピトープを認識することはできない。
抗体およびＴ細胞受容体による抗原認識における第二の相違は、Ｔ細胞受容体への抗原提示の役割を担う第三の分子の関与である。Ｂ細胞についてはこのような分子は必要ではなく、というのも膜Ｉｇ（抗体）が抗原タンパク質とともに安定な二分子複合体を形成するからである。Ｔ細胞については、抗原タンパク質はＭＨＣ糖タンパク質と結合しなければならず、そしてＴ細胞受容体によって認識される構造を形成するのは、このＭＨＣ分子およびペプチドの複合体である。ＭＨＣ糖タンパク質はこのため、ペプチドと結合するタンパク質で、これは抗原提示分子としてはたらく（Bjorkmanら、上記引用文中）
細胞毒性Ｔリンパ球は、細胞媒介性免疫反応の主要なエフェクター細胞として、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合したペプチドを認識し、ウイルス感染細胞およびガン細胞を殺すことが可能である（Zinkernagelら、Nature、248、701、1974；Rouseら、Rev.  Infect.  Dis.、10、16、1988；Lukacherら、J.  Exp.  Med.、160、814、1984；McMichaelら、N.  Engl.  J.  Med.、309、13、1983；Wraithら、J.  Gen.  Virol.、68、433、1987；Cerundoloら、Eur.  J.  Immunol.、17.  173、1987；Kastら、Cell、59、603、1989）。ＣＴＬｓは通常ＣＤ８という細胞表面マーカーを提示する（Abbasら、上記引用中、310頁）。ＣＤ命名は細胞表面マーカーの命名法体系に適用し、これにより、明確になった構造をもちモノクローナル抗体の群（「クラスター」）によって認識される細胞系列もしくは分化段階によって特徴付けられる細胞表面マーカーは、分化のクラスターのメンバーと呼ばれる（ＣＤ；Abbasら、上記引用中、pp.19；398−401）。
Ｔリンパ球の他の重要なセットは通常ＣＤ８陰性でＣＤ４マーカーを提示する。これらのＴ細胞は、認識ならびに、体液性および細胞媒介性免疫反応の両方の活性化相に関与し、Ｔヘルパー細胞と呼ばれる。Ｔヘルパー細胞は、そのＴ細胞受容体を通じて、単核食細胞（マクロファージ）、脾臓およびリンパ節の濾胞樹状細胞、表皮のランゲルハンス細胞、もしくは細静脈内皮細胞といった補助細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する外来性抗原を認識する（Abbasら、上記引用中122−3頁）。
ＴH１およびＴH２と名付けられたＴヘルパーリンパ球の二つの異なるサブセットは、主に細胞媒介性反応または主に体液性免疫化のいずれかそれぞれに免疫系を方向付ける（Mosmannら、Adv.  Immunol.、46、111、1989）。ＴH１およびＴH２細胞は、その異なる役割によっておよびその産生する免疫学的媒介物（サイトカイン）の型によって分類される。通常、ＴＨ１細胞はインターフェロン&shy;−ガンマおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を分泌し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）およびマクロファージ活性化に寄与する。ＴＨ２細胞は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、およびインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を産生して、Ｂ細胞の抗体反応産生を助ける（Mosmannら、J.  Immunol.、136、2348、1986；Cherwinskiら、J.  Exp.  Med.、166、1229、1987；Fiorentinoら、J.  Exp.  Med.  170、2081、1989）。
細胞媒介性免疫反応または体液性免疫反応のいずれが優性となるかの傾向は、交差調節の結果と考えられている（Parish、Transplant.  Rev.、13、35、1972；Mosmann、Ann.  New  York  Acad.  Sci.、628：337、1991）。このため、ＴH１細胞は、たとえばインターフェロン−ガンマの分泌によってＴH２反応の誘発を妨害する。逆に、ＴH２細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０といったサイトカインを産生することによってＴH１反応の産生を妨害する（Salkら、Science、260、1270、1993）。
【０００４】
従来および非従来型の抗原
従来の抗原は通常天然では巨大分子で、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩとして知られているタンパク質の主要組織適合複合体のコンテキストにおいてプロセシングおよび提示をするマクロファージといった抗原提示細胞によってとりこまれる。しかしながら、このような巨大分子抗原は、免疫系が認識して免疫反応を増すことのできる大量のエピトープを含んでいるタンパク質のサイズに従って非特異的免疫反応のいくつかのタイプを産生する。反応のこのような広範さは、常に有益であるということはできず、特に自己抗原の場合にはそうで、これはガンおよび自己免疫疾患における主要な標的である。ガン抗原は、通常の抗原と多くの共通な特徴を共有していて、このため、ガン抗原に対する免疫反応は正常な抗原までも認識する可能性がある。
従来の抗原に関する他の問題はその産生方法である。天然抗原を均一にする精製は困難かつ費用がかかる。もしタンパク質免疫原のアミノ酸配列が既知ならば、組換えＤＮＡ技術によってこれを産生することができる。しかしながら、天然免疫原におけるのと同一のグリコシル化を達成することは困難で、組換えＤＮＡ発現は、それ自身によっては、生物学的な混入物を排除することはできない。たとえば、細菌細胞において組換え的に産生したタンパク質は、細菌タンパク質から分離されなければならない。従って可能ならば、ペプチドは全てのタンパク質を素材とする生成物の置換体としてのぞましい。
これらの理由により、従来の免疫原の断片をワクチンとして使用することに興味が持たれてきた。このような断片は、より少なめのエピトープを提示するので、より特異的な免疫反応を誘発しやすく、そしてこのペプチドは非生物学的合成法によって産生されることができる。
残念ながら、通常小さなペプチド配列は大きな免疫反応を誘発しない。一つの解決は、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）のような免疫原性キャリヤタンパクに小さなペプチドハプテンを化学的に結合することである。他の解決はいくつかのハプテンを枝分れしているリシンコアに結合させて、ＭＡＰ−４と呼ばれているような、大きめの免疫原性分子を形成することである（Tam、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.（USA）、85：5409-13（1988））。第三の解決は、単純に、末端と末端で、スペーサーの存在下または非存在下、関心のあるエピトープの十分な数のコピーを結合させて、免疫原としてはたらくに十分なような大きさの人工的な抗原を産生することである。
小ペプチドは細胞性免疫反応を誘発することが可能であるが、この反応は、抗原提示細胞ともしくはリポソームとペプチドを最初に結合させることで増強することができる。
【０００５】
グリコリポペプチド
Boonおよびその共同研究者は、Ｂ−エピトープとして作用するであろうＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース糖を含む化合物、ペプチド配列ＹＡＦＫＹＡＲＨＡＮＶＧＲＮＡＦＥＬＦＬ（配列番号１）で、ヒトＴ細胞についてＭＨＣクラスＩＩ制限認識部位に分類されていて、髄膜炎菌の外膜タンパク質から誘導されているもの、およびリポペプチドS-2-3[ジパルミトイルオキシ]−（Ｒ／Ｓ）−プロピル−Ｎ−パルミトイル−Ｒ−システイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）について記述している。この糖は、上述の配列の末端Ｌｅｕにスペーサー（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＣＯ−Ｇｌｙ−）を通じて結合している。このリポペプチドは、末端Ｔｙｒに結合している。このリポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓは非常に強力なＢ細胞かつマクロファージ活性化因子で、大腸菌の主要なリポタンパクの免疫的に活性なＮ末端配列から誘導したもので、合成ペプチドからなるワクチンおよびガンワクチン開発において使用されてきた。128.192.9.100／boonsgroup／target.htm参照。Reichel、F.ら、「合成炭水化物を素材とするワクチン：Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース抗原−Ｔエピトープ−リポペプチド接合体」、Chem.  Commun.、2087−8（1997）。
Toyokuniら（J.  Am.  Chem.  Soc.、116：395-96（1994））は、二量体のＴｎ抗原リポペプチド接合体について、特に、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリン（Ｐ３ＣＳ）に結合したジＴｎについて記述している。
Kudryashovら（Proc.  Nat.  Acad.  Sci.（ＵＳＡ）、98：3264-9（2001））は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ成分を末端にもつヘプタペプチドのセリン残基に結合した1または3のルイスＹペンタサッカライドをもったグリコリポペプチドを記述している。
【０００６】
リポペプチドワクチン
Hopp米国特許5,019,383および欧州特許出願93,851は、親油基をペプチドのアミノ末端に結合することを教示している。この結合は、Ｘを通してであり、すなわち3から5の官能基をもつ多機能の基（カルボニル基およびアミド基が好ましい）、これらのうち少なくとも一はペプチドのアミノ末端に結合していて、そしてこれらのうち少なくとも一は少なくとも一のＣ１２−Ｃ３６アルキル基もしくはアルケニル基に結合していて、これは直鎖または分枝鎖であることができ、置換もしくは非置換であることができる。
Heber-Katz、米国特許5,837,249（1998）および欧州特許出願203,676（1986）は、ペプチド−脂肪酸接合体であるワクチンについて記述している。このペプチドはウイルスのエピトープを構成する。一の実施例において、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーがウイルスのエピトープのアミノ末端に結合して、脂肪酸（パルミトイル）基が遊離アミノ末端および末端Ｌｙｓのイプシロンアミノ基の両方に結合する。Heber-Katzはさらにリポソームの一部としてこれらのリポペプチドを与えることを企図した。
リポペプチドについてBoutillon、米国特許6,015,564、米国特許5,993,823、米国特許5,871,746、欧州特許出願1,065,212、欧州特許出願945,461、欧州特許出願491,628もまた記述している。親油基は、ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に結合している。Martinonら、J.  Immunol.  149：3416-22（1992）；Sauzetら、Vaccine、13：1339-45（1995）；Vitielloら、J.  Clin.  Invest.、95：341-9（1995）；Mortaraら、J.  Virol.、72：1403-10（1998）も参照。
合成リポペプチド抗原（ＢＬＰ２５）、Ｈ２Ｎ−ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（Ｐａｌ）Ｇ−ＯＨ（Jiangら、PCT/US00/31281の図３４）（配列番号１１）、腫瘍結合ＭＵＣ１ムチン由来の修飾25アミノ酸配列が、ＭＵＣ１に対してＴｈ１反応を誘発することが示されている。
【非特許文献１】Abbasら、Cellular  and  Molecular  Immunology、W.B.Saunders  Company、1991。
【非特許文献２】Hoodら、Immunology、第二版、The  Benjamin/Cummings  Publishing  Company  Inc.、1984。
【非特許文献３】Illustrated  Stedman's  Medical  Dictionary、第２４版、Williams  and  Wilkins、Baltimore／London、1982。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ペプチド、グリコペプチドおよびポリペプチドの合成
オリゴマーおよびポリマー合成について二つの基本的な戦略、すなわち逐次合成およびブロック合成である。逐次合成においては一度に一のモノマーが、伸長するオリゴマーもしくはポリマーに加わる。固相合成においては、後の方の末端が固相担体に結合している。溶液合成においては、伸長するオリゴマーもしくはポリマーは溶液中で遊離していているが、保護基がモノマーの付着できる場所を制限する。
大きなペプチドおよびグリコペプチドの固相逐次合成は、最終生成物の純度および収率の両方の立場の不一致になやむ。逐次的に結合すべきアミノ酸の数が増えるにつれて、不純物としての欠落したペプチドの数が指数関数的に増加する。「非結合」の結果として形成される不純物は、固相へのその結合性のために次の段階に持ち越される。結合ごとに、９８％の結合効率にも関わらず、欠落の数（非結合または誤った結合のペプチド）は２ｎで増加する。ここで、ｎは結合したアミノ酸の数である。このため、２０個のアミノ酸配列の合成は、１個の正しい生成物に加えて、２２０すなわち、10,000個以上の欠落したペプチドを不純物としてもたらす。これらの欠落した生成物の多くは検知できないきわめて微量に生成するが、これらはかなりの量に累積してその除去には困難が伴う。不純物の同定および明確化は、不純物が所望の生成物にかなり類似したものなので不可能な課題である。臨床レベルの製品検出においては、かなりの量の不純物を同定および定量化することはおそらくもっとも重要な調節的な問題であり、これはかなりのコストおよび時間を要する。
ブロック合成においては、2もしくはそれ以上のオリゴマーブロックがともに縮合して最終的なオリゴマーもしくはポリマーを形成する。ブロックそのものは、天然から直接単離することができ、天然生成分子の断片化によって誘導することができ、または合成することができる。合成した場合、ブロック合成または逐次合成によってブロックそのものを調製することができる。
固相逐次合成の出現する以前から、ブロック合成は散発的に実施されていた。固相逐次合成は、ブロック結合法がほぼ姿を消す一方で、それ以来ずっとより大きな注目を受けてきた。ブロック結合のもっとも知られている例の一つは、ヒトホルミルメチオニル副腎皮質刺激ホルモン（Ｆｏｒ−Ｍｅｔ−ｈＡＣＴＨ）の合成である。この40個のアミノ酸配列は、Yajimaおよびその共同研究者が純粋な形で合成に成功して（Chem.  Pharm.  Bull.、30、866（1982）；Chem.  Pharm.  Bull.、34、4362、1986）、Chillemiらが液相合成によって8から15個のアミノ酸の幅の大きさである6個のペプチドを合成した（Int.  J.  Peptide  Protein  Res.、35、271、1990）。さらに最近では、G-J.Boonsが、大腸菌由来のアジュバントトリパルミトイルシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）および髄膜炎菌からのＴ細胞エピトープおよびシアル酸の化学的に結合した接合体を合成していて、この構造はグリコ−リポ−ペプチドに分類することができる。従来、ブロック合成を通じてはいかなる種類のペプチドにも関連したＭＵＣ１の報告はされていない。ブロック合成は、複合体ペプチドおよびグリコペプチドの必要性に直面する。この合成の開始は緩慢ではあるが、合成のスケールの大きさ、ペプチドの純度および各段階の品質コントロールという固相合成に欠けている利点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は複数エピトープのグリコ−リポ−ペプチドの設計および合成、ならびに免疫療法としてのその利用に処するものである。これらの分子は、ムチンといった従来の免疫原に比して大きさが小さいが、構造的にはよく限定されている。これらの構造は、ヒトもしくは病原性の起源のグリコ−タンパク質由来の炭水化物およびペプチドエピトープ、ならびに大きな粒子に自ら集合することを可能にするリピド鎖といったものの特徴を組み込むように設計されている。
あるいは、これらの構造はリポソーム膜中に組み込まれて、リポソーム膜の構造中に関与する不可欠な構成成分となることもできる。そのように組み込まれると、これらは巨大分子の免疫原のようにはたらく。これらは比較的小さいが、よく限定された構造は、これら小分子に組み込まれている複数エピトープを保存しながら、自己集合してより大きな粒子になる能力によって特徴付けられる。免疫原として、治療的な免疫反応を誘発するについて高い特異性をもちながら、この小分子は親の巨大分子グリコ−プロテインを模倣する。
好ましくは、本発明のこのグリコリポペプチドは、体液性免疫反応および細胞性免疫反応をともに誘発することが可能で、体液性反応は少なくとも一の成分Ｂエピトープに対してであり、細胞性免疫反応は少なくとも一の成分Ｔエピトープに対してである（ＢエピトープおよびＴエピトープは同一または異なることができる）。好ましくは、グリコリポペプチドに対する体液性免疫反応および／または細胞性免疫反応は少なくとも一の疾病に対して保護性である。
本発明は、高純度形成での市販用の大規模生産同様に、グリコリポペプチドの合成のための新規の液相法をも扱う。進行性のブロックを通じての段階的な液相集合は、最初から最後までよく管理された方法で、かなり複雑かつ大きなグリコ−リポ−ペプチドを合成することを可能とする。このような段階的な過程の管理は、ペプチドに基づく製薬において広く実施されている固相法では不可能である。
本発明の原理の証明として、二つのグリコ−リポ−ペプチド（図１および２）の設計、合成および免疫反応をここに記述する。これらの構造は、ヒトガン結合ＭＵＣ１ムチン（表２の略語一覧を参照）に基づいていて、ガンに結合していると広く考えられている２つの炭水化物エピトープ（図３）を組み込んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
グリコリポペプチド
本発明のグリコリポペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも一カ所でのグリコシル化、および少なくとも一カ所でのリピド化を構成する。
好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸がリピド化されている。好ましくは、少なくとも一のリピド化アミノ酸は内部のアミノ酸、すなわちペプチド成分の第一もしくは最後のアミノ酸ではない。さらに好ましくは、少なくとも２個のリピド化アミノ酸が内部のアミノ酸である。もっとも好ましくは、リピド化されたアミノ酸すべてが内部のアミノ酸である。
好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸がグリコシル化されいる。さらに好ましくは、少なくとも２個のグリコシル化アミノ酸および少なくとも２個のリピド化アミノ酸が存在する。
好ましくは、グリコリポペプチドは少なくとも一のＭＵＣ１ペプチドエピトープを包含し、さらに好ましくは、ＰＤＴＲＰ（配列番号１０のAAs  6-10）を包含する。その場合、リピド化アミノ酸は末端アミノ酸または内部アミノ酸であることができる。２個のリピド化アミノ酸が存在する場合、これらはともに末端アミノ酸であるか、ともに内部アミノ酸であるか、またはそれぞれであることができる。
好ましくは、少なくとも一のグリコシル化アミノ酸が、少なくとも一の炭水化物エピトープを供する。さらに好ましくは、少なくとも一の炭水化物エピトープがＴｎまたはシアリルＴｎである。なおさらに好ましくは、非シアリル化ＴｎおよびシアリルＴｎの両方が供される（異なるアミノ酸に結合する）。
好ましくは、200個を越えないアミノ酸で、さらに好ましくは150個を越えないアミノ酸で、なおさらに好ましくは100個を越えないアミノ酸で、なおいっそう好ましくは75個を越えないアミノ酸で、もっとも好ましくは50個を越えないアミノ酸である。分子量の観点においては、好ましくは20,000ダルトンを越えず、さらに好ましくは15,000ダルトンを越えず、さらに好ましくは10,000ダルトンを越えず、なおいっそう好ましくは7,500ダルトンを越えず、もっとも好ましくは5.000ダルトンを越えない。
このグリコリポペプチドはさらに少なくとも一の疾病関連エピトープを包含し、これはＢ細胞エピトープ（抗体認識している）またはＴ細胞エピトープであることができる。好ましくは、このエピトープは疾病関連であり、さらに好ましくは疾病特異的である。腫瘍関連エピトープ、特に腫瘍特異的エピトープは、特に興味深いものである。
好ましくは、このグリコリポペプチドは少なくとも一のＢ細胞エピトープおよび少なくとも一のＴ細胞エピトープを包含する。好ましくは、少なくとも一のグリコシル化アミノ酸を、前記エピトープの少なくとも一は含む。
【００１０】
リピド化アミノ酸
グリコリポペプチドは、定義によると、一またはそれ以上のリピド化アミノ酸を包含する。リピド化アミノ酸は、グリコシル化アミノ酸以外では、以下に定義するように強い親油性基を包含するアミノ酸である。このため、グリコリポペプチドは、グリコモノリポペプチド（一のリピド化アミノ酸）、グリコジリポペプチド（２個のリピド化アミノ酸）、グリコトリリポペプチド（３個のリピド化アミノ酸）、等である。好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸がリピド化アミノ酸である。さらにいっそう好ましくは、正確に２個のアミノ酸がリピド化アミノ酸である。
内部リピド化アルファアミノ酸の場合、側鎖は強い親油基からなる。末端リピド化アルファアミノ酸の場合、側鎖もしくは末端成分のいずれかが、またはその両方が、強い親油基からなる。
アミノ酸がアルファアミノ酸でない場合、一より多い側鎖を包含することができ、このような場合、同一アミノ酸の一より多い側鎖が強い親油基を包含することが可能となる。
側鎖が強い親油基を包含する場合、好適な具体例においては、側鎖そのものが強い親油基として認められる。
リピド化アミノ酸は、通常遺伝的にコード化している２０のアミノ酸のうちの一のアミノ酸の誘導体であることができ、前記誘導体はリピド化側鎖によって特徴付けられていて、特に以下の通りである。
【００１１】
リピド化ＡＡ                   リピド化側鎖
Ｓｅｒ                         −ＣＨ２ＯＺ
Ｔｈｒ                         −ＣＨ（ＣＨ３）ＯＺ
Ａｓｐ                         −ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＯＺ
Ｇｌｕ                         −（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）ＯＺ
Ｃｙｓ                         −ＣＨ２ＳＺ
Ｔｙｒ                         −ＣＨ２−Phenyl−ＯＺ
Ｌｙｓ                         −（ＣＨ２）４ＮＨＺ
Ａｒｇ                         −（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨＺ
Ａｓｎ                         −ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＺ
Ｇｌｎ                         −（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＺ
式中、Ｚは強親油基である（結果物であるリピド化アミノ酸そのものは、もちろん、遺伝的にコード化されていないアミノ酸である）。
リピド化アミノ酸は代わりに、遺伝的にコード化されていないアミノ酸の側鎖の誘導体であるリピド化側鎖によって、特徴付けられることができる。後者は、遺伝的にコード化されたアミノ酸の相同体または類似物であることができる。このため、側鎖は、たとえば、
−（ＣＨ２）ｍＯＲ、ｍ＞１（Ｓｅｒ、Ｔｈｒに関連）
−（ＣＨ２）ｍＳＲ、ｍ＞１（Ｃｙｓに関連）
−（ＣＨ２）ｍＮＨＲ、ｍ≠４（Ｌｙｓに関連）
−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、ｍ＞２（Ａｓｎ、Ｇｌｎに関連）
−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、ｍ＞２（Ａｓｐ、Ｇｌｕに関連）
末端アミノ酸は、末端アミノ酸残基（Ｒ−ＮＨ−ＡＡ）である場合は代替的もしくは付加的にリピド化アミノ酸末端によって特徴付けられ、またはカルボキシ末端残基（ＡＡ−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ）である場合はリピド化カルボキシ末端によって特徴付けられる。
この遺伝的にコード化したアミノ酸の側鎖は、親油性（疎水性）、疎油性（親水性）、または中性である。これら側鎖の親油性は、遺伝的にコード化されていないアミノ酸の側鎖と同様に、ＳＴＰにおいて、非極性溶媒（たとえば、エタノール、ジオキサン、アセトン、ベンゼン、ｎ−オクタノール）および水の間の分子ＨＺ（式中Ｚは問題となる側鎖である）の分配係数を測定することによって決定することができる。親油性はこの分配係数の対数として定義することができ、そして無極性溶媒を好む分子については正となる。このため、親油基はｌｏｇＰがゼロよりも大きいものである。
【００１２】
分配係数（Ｐ）は、ほとんど混合することのできない二つ溶媒からなる二相系中に溶解している物質の平衡濃度の比として定義される。このような系の一つはｎ−オクタノール：水であり、オクタノール相は約２０％の水を含み、水相は約0.008％のオクタノールを含む。このため、関連分配係数（Ｐｏｗ）は、水飽和オクタノール中の溶質モル濃度対オクタノール飽和水中の溶質モル濃度である。Ｎ―&shy;オクタノールは、他の多くの膜成分と同様、両親媒性であるので生体膜の有用な代用物である（以下、ｌｏｇＰの言及は他に記述がなければ、ｌｏｇＰｏｗを意味する）。
本明細書の目的において、強親油基は、水素の他に少なくとも５つの原子からなる基で、これについては親油性は、（Ａ）−（Ｃ）として以下に掲げる三つの既知の技術の方法のうちの任意の一つによって、ｎ−オクタノール：水分配係数の対数として計算され、これは遺伝的にコード化されたアミノ酸側鎖（以下、基準側鎖）のいずれについて計算されるものよりも大きい。親油性側鎖をもつ遺伝的にコード化したアミノ酸は、脂肪族アミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニン、ならびに芳香族アミノ酸であるトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンである。
「強親油性」の定義から、本発明のグリコリポペプチドは少なくとも一の遺伝的にコード化されていないアミノ酸、たとえばリピド化セリンまたはスレオニン、を包含していなければならない。
一の実施例では、問題となる基は、それ自体の親油性、および基準側鎖の親油性が、下記の方法（Ａ）に従って決定される場合、いかなる基準側鎖よりも親油性でなければならない。
第二の実施例では、問題となる基は、それ自体の親油性、および基準側鎖の親油性が、下記の方法（Ｂ）に従って決定される場合、いかなる基準側鎖よりも親油性でなければならない。
第三の実施例では、問題となる基は、それ自体の親油性、および基準側鎖の親油性が、下記の方法（Ｃ）に従って決定される場合、いかなる基準側鎖よりも親油性でなければならない。
【００１３】
方法（Ａ）−（Ｃ）は下記の通りである。
（Ａ）は0から4の予測log  Pow値について、EPA  Product  Properties  Test  Guidelines  OPPTS  830.7550  EPA  712-c-96-038（1996年8月）に記載の振盪フラスコ法（負のlog  Pow値は化合物が全く親油性でないことを示すことに留意）。
（Ｂ）は4から6の予測log  Pow値について、EPA  Product  Properties  Test  Guidelines  OPP13  830.7570  EPA  712-C-96-040（1996年8月）に記載の液体クロマトグラフィー測定法（この方法は、0から6のPow値について評価に使われる）。
（Ｃ）は6より大きい予測log  Pow値について、Meylanら、「Atom/fragment  contribution  method  for  estimating  octanol-water
partition coefficients」、J.  Pharm.  Sci.、84：83-92（1995）に記載された予測法（予測log  Pow値が6より大きい場合、実験的な判定が必要であることに注意）。
【００１４】
Meylanの方法では、予測log  Powは各フラグメントの加重係数（未処理の係数にそのフラグメント数を乗ずる）に定数0.2290を加えることで得られる。考慮しているフラグメントは、−ＣＨ３（0.5473）、−ＣＨ２（0.4911）、−ＣＨ（0.3614）、−ＯＨ（1.4086）、−ＮＨ２（1.4148）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（0.5236）、−ＳＨ（0.0001）、−ＮＨ−（-1.4962）、−Ｎ＝Ｃ（0.0010）、−Ｏ−（-1.2566）、アルデヒド−ＣＨＯ（-0.9422）、３＋Ｃが付加した−三級Ｃ（0.2676）、Ｈがなく三級でないＣ（0.9723）、芳香Ｃ（0.2940）、芳香Ｎ（五員環）（-0.5262）、および芳香族に付加した−ＯＨ（-0.4802）であり、すべてについて他に記述のないかぎり、脂肪族または脂肪族に付加しているものである。
第四の実施例では、問題となる基は、その親油性および基準側鎖の親油性が分配係数の好ましい決定法に従って決定される場合に、基準側鎖のいかなるものよりも親油性である。ここで、この決定法は予測log  Pow値に基づいて選択される（この予測値そのものは、方法（Ｃ）によって決定される。すなわち、
（１）0から4の予測log  Pow値について、方法（Ａ）、
（２）4から6の予測log  Pow値について、方法（Ｂ）、そして
（３）6より大きい予測log  Pow値について、方法（Ｃ））。
Pow値の決定についてのさらなる情報については、Sangster、J.、「Octanol-Water  Partition  Coefficients：Fundamentals  andPhysical  Chemistry（April  1997）（ISBN  0-471-9739）を参照。
【００１５】
オクタノール−水の分配係数の作表においては、EPA「Chemicals  in  the  Environement：OPPT  Chemicals  Fact  Sheets」、USDA農薬特性データベース、Sangster、J.、「Octanol-Water  Partition  Coefficients  of  Simple  Organic  Compounds」、J.  Phys.  Chem.  Ref.  Data、18：1111-1230（1989）；Verbruggen、E.M.J.ら、「Physiochemical  Properties  of  Higher  Nonaromatic  Hydrocarbons：Literature  Study」、J.  Phys.  Chem.  Ref.  Data、29：1435-46（2000）を参照。さらなるソースとして、Penn  State  University  Libraries、Physical  Sciences  Library、octanol-water  Partition  Coefficients（最新更新日2001年8月21日）、ＵＲＬはlibraries.psu.edu/crsweb/physic/coefficients.htm。異なる化合物について編集されたPow値は、異なる方法によって決定されていることを留意しなければならない。
Meylanアルゴリズムは、プログラムLogPow（KowWin）で実行される。このプログラムのオンラインバージョンは、esc.syrres.com/interkow/kowdemo.htmで利用でき、CAS登録番号またはSMILES構造記号のいずれも認識できる。このプログラムは、そのプログラムにある場合は、実験的に決定した値も報告している。
【００１６】
基のlogPが、Meylanアルゴリズムによって予測したところ、ゼロよりも大きい場合、その基は親油性であると予想される。好ましくは、Meylanアルゴリズムによって予測されるlogPが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10、さらに高いことがより好ましい。
少なくとも一の親油基が好ましくは「強親油性（Meylan）基」である。本願発明の目的のために、「強親油性（Meylan）基」は、Meylanアルゴリズムによって計算した親油性が、少なくとも2.7であるものとして定義できる。遺伝的にコード化したアミノ酸の側鎖についてMeylanアルゴリズムによって予測されたもっとも高いlogPは2.60(Trp)であり、同一の側鎖について実験的に決定したもっとも高いlogPは2.89（ＩＬｅ）である。もっとも「強い親油基」はまた「高親油（Meylan）基」であり、逆も真である。
アルファアミノ酸は一の側鎖をもち、任意の（グリシンは側鎖をもたない）、そしてそのためリピド化内部アルファアミノ酸は一の強親油基を包含する必要がある。非アルファアミノ酸は一より多くの可能性のある側鎖付加部位をもつ。リピド化内部非アルファアミノ酸の場合、もしアミノ酸が一より多い側鎖をもつならば、少なくともその側鎖の一つは強親油基からなる。
好ましくは、強親油基は水素以外の100を越えない原子、より好ましくは80を越えない同様の原子、さらに好ましくは60を越えない同様の原子、いっそう好ましくは40を越えない同様の原子から構成される。
前記の通り、強親油基は少なくとも水素以外の少なくとも5原子（ロイシンおよびイソロイシンの側鎖はこのような原子を4つもつ）からならなければならない。好ましくは、少なくとも６（Ｌｙｓの側鎖は５）、より好ましくは少なくとも８（ＡｒｇおよびＰｈｅの側鎖は７）で、さらにより好ましくは少なくとも９（Ｔｙｒは８）で、いっそうより好ましくは、少なくとも11の同様の原子（トリプトファンは10もつ）からなり、さらに好ましくは少なくとも13の同様の原子、いっそう好ましくは少なくとも21の同様の原子から構成される。
好ましくは、強親油基は、成分炭素、ケイ素、水素、酸素、窒素、硫黄、およびリンに制限された基本構成成分をもつ。好ましくは、水素に関与しない側鎖中の結合の大部分は、炭素−炭素結合である。
酸素、窒素、硫黄およびリンの存在は親油性を減じるので、強親油基中では、好ましくは非水素原子の５０％を越える、より好ましくは７５％を越える原子は炭素原子である。
同じ理由で、強親油基は好ましくは少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の炭素原子を包含する。
好ましくは、側鎖は一般式−Ａ−Ｙ−Ｚであり、式中−Ａ−は選択的であるが、もし存在する場合は、水素以外の原子は１２を越えない有機の基であり、Ｙは水素以外の原子は１２を越えないスペーサーで、窒素、酸素、硫黄またはリンを包含し、そしてＺは強親油基である。
Ａは、存在する場合、好ましくは脂肪族である。さらに好ましくは、アルキルである。好ましくは、水素以外の原子は１０を越えず、より好ましくは、８を越えない。もっとも好ましくは、存在する場合には１−８炭素原子のアルキルである。
スペーサーＹは好ましくは少なくとも、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−（式中Ｒは１−４のアルキル）、−ＲＯ４−、Ｃ（＝Ｏ）、−Ｃ（＝Ｓ）、−Ｃ（＝ＮＨ）−、および−Ｃ（＝ＮＲ）−からなる群から選択される。より好ましくは、スペーサーは一または二のこのような成分を構成する。もっとも好ましいスペーサーは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−および−Ｃ（＝Ｓ）である。
好ましくは、ラジカル−Ｙ−Ｚおよび／または−Ａ−Ｙ−Ｚそのものの性質上強親油基として認められる。
強親油性側鎖は、すべて一または複数の脂肪性成分、すべて一または複数の芳香性成分、または少なくとも一の脂肪生成分および少なくとも一の芳香性成分の組み合わせであることができる。脂肪性成分が好ましい。
各脂肪性成分は、個々に、直鎖状、環式、直鎖および環式の組み合わせ、分枝であるが非環式、または分枝であるが一もしくはそれ以上の枝が環式成分から構成されることができる。また、飽和または不飽和であることもできる。飽和している場合、一またはそれ以上の二重結合および／または一またはそれ以上の三重結合があることができる。脂肪性成分、たとえば−Ｚのといったものは、独立に、一またはそれ以上のスペーサーを包含し、これは好ましくは先に定義したグループから選択される。
強親油基Ｚそのものは、一またはそれ以上の式−Ａ’−Ｙ’−Ｚ’の成分を包含することができ、式中Ａ’、Ｙ’およびＺ’は、Ａ、ＹおよびＺの類似物として定義される。
これは直鎖形−Ａ’（−Ｙ’−Ｚ’−）ｎであることができ、式中ｎ＞１で、たとえば、−Ａ’−Ｙ’−Ｚ’−Ｙ’−Ｚ’−であり、式中Ｙ’および各Ｚ’は独立して選択される。
一の好ましい実施例では、強親油基Ｚは−Ａ−Ｏ−Ｑの形の脂肪族成分からなり、式中Ａは選択的なものでかつアルキル基で、そしてＱはアルキル基である。より好ましくは、Ａは−（ＣＨ２）ｉ−で、式中「ｉ」は０または１で、Ｑは−（ＣＨ２）−ＣＨ３で、式中ｊは６から26である。
【００１７】
他の好ましい実施例では、強親油基は一またはそれ以上の脂肪酸成分からなる。このため、少なくとも一のＺ（またはＺ’）は式−Ｏ−ＣＯ−Ｑの形の脂肪酸基からなり、式中Ｑは主にアルキルであるがアルケニル、アルキニルまたはエーテル結合を含むことができる。この脂肪酸はカルボン酸で、しばしば動物もしくは植物の脂肪または油から抽出もしくは含有しているものである。すべての脂肪酸は、4から22の炭素原子を含む炭化水素基の鎖から構成されて、そして末端カルボキシラジカルによって特徴付けられる。「炭素数：二重結合数」、および選択的にシス／トランス異性体の位置によって命名することができる。このため、適切な脂肪酸は、4：0、6：0、8：0、10：0、12：0、14：0、16：0、16：1(9c)、18：0、18：1(9c)、18：2(9c、12c)、18：3(9c、12c、15c)、18：4(6c、9c、12c、15c)、18：3(9c、11t、13t)、18：1(9c)、12−ＯＨ、20：1（9c）、20：1（11c）、20：4(8c、11c、14c、17c)、20：5(5c、8c、11c、14c、17c)、22：0、22：1（11c）、22：1（13c）、22：5(7c、10c、13c、16c、19c)および22：6(4c、7c、10c、13c、16c、19c)と命名されたものを含み、このすべては天然産グリコシドに見出される。
強親油基が複数の環状成分から構成される場合、これらは融合されている（ポリ環状成分を構成する）かあるいは融合されていないことができ、同一または異なる数の側鎖を持つことができる。典型的には、このそれぞれが3から6の側鎖をもつ。一またはそれ以上の側鎖は、二重または三重結合を持つことができる。環式成分は、特徴としてヘテロ環であることができる。一の好ましい実施例では、側鎖はステロイド成分から構成される。これは四つの融合環をもつ多環成分で、一つは５側であり三つは６側である。
脂肪性成分は、一またはそれ以上のホスホリル基から構成されることができ、そして、この場合、側鎖中のこのような基の数は、好ましくは２を越えないものである。ホスホリル基は、たとえばリピドモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）といったバクテリア膜のリピド中に見出される。
芳香性成分は、一またはそれ以上の環を構成することができる。一以上の環が存在する場合、この環は融合または非融合することができる。
強親油基は分枝構造を構成することができ、好ましくは−Ｂ（−Ｙ’−Ｚ’）ｎといった自然界の脂肪族で、式中Ｂは、少なくとも２の原子価をもつ分枝の有機的な基で、その他の点ではＡおよびＡ’と同様に定義され、ｎは少なくとも２で、そしてＹ’およびＺ’は以前に定義されているが、各Ｙ’および各Ｚ’はＢに付加する各−Ｙ’−Ｚ’において独立して選択されることができる。
好ましくは、各分枝−Ｙ’−Ｚ’そのものは強親油基の性質をもつ。
特に好ましい実施例では、各Ｙ’は−Ｏ−で各Ｚ’は（ＣＨ２）ｊＣＨ３で、式中ｊは６から２６（各分枝について独立して選択される）。ｎが２である場合、もっとも好ましいＢは−ＣＨ（ＣＨ２−）２−である。ｎが３である場合、より好ましい−Ｃ（ＣＨ２−）３である。
プログラムLogKowを使用することで、いくつかの遺伝的にコード化されたアミノ酸の側鎖のlog  Pow値を、いくつかの好ましい側鎖についてと同様計算した（下記参照）。LogKowが供する実験的なデータベース値も、以下に与える。
【００１８】
【表１】
0004527407.tif 000002
【００１９】
【表２】
0004527407.tif 000003
【００２０】
【表３】
0004527407.tif 000004
【００２１】
リポソーム製剤に対するリピド化アミノ酸の関係
リピド化は通常リポソーム中への免疫原の組込みを促進し、これは次々に免疫原の免疫発現を改善する。もっとも効率的な組込みのために、リピド化アミノ酸の強親油性側鎖は、好ましくはリポソームのリピド化合物の少なくとも一つにサイズが類似していなければならない。たとえば、リポソームの基準リピド化合物のサイズの５０％−２００％の幅のサイズでなければならない。サイズは、それぞれの非水素原子の数を数えるか、それぞれの分子量を算出するか、もしくはそれぞれの分子体積または一番長いディメンションを算出する（３Ｄ分子モデルの助けをえる）かによって測定することができる。
好ましくは、リピド化アミノ酸の少なくとも一つは、グリコリポペプチドに対する体液性免疫反応または細胞性免疫反応の免疫賦活剤となる親油性成分を構成する。
グリコシル化アミノ酸
グリコリポペプチドは、定義により、一またはそれ以上のグリコシル化アミノ酸を包含する。好ましくは、グリコシル化アミノ酸の少なくとも一つは疾病−関連炭水化物エピトープを構成し、たとえば腫瘍−関連炭水化物エピトープといったものである。
タンパク質の通常のＣＯ−または翻訳後の修飾は、特定のアミノ酸のグリコシル化である。グリコシル化は一またはそれ以上の炭水化物ユニットの、アミノ酸への共有結合的な付加である。
本願請求の目的のために、グリコシル化アミノ酸は、その側鎖が少なくとも一の炭水化物単量体ユニットを構成する。これは他の脂肪族および／または芳香族成分を構成することもできる。単にグリコシル化したアミノ酸は、−Ｏ−、−Ｓ−および−ＮＨ−からなる群、および一またはそれ以上の炭水化物ユニットから選択されるリンカーからなる側鎖をもつものである。
天然のタンパク質にもっとも通常に付着しているモノマーユニットは、ガラクトース、マンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、フコース、およびキシロースである。糖単位の数は変化し、典型的には１から２０のいずれかであり、好ましくは、１から２０である。オリゴサッカライド鎖（すなわち、２またはそれ以上の糖単位）が付加する場合、この鎖は直鎖または分枝状である。分枝鎖の場合、一番長い直鎖の長さは通常１から１０の糖単位であり、より好ましくは１から５である。
もっとも通常の付着物は、−Ｏ−および−Ｎ−結合である。Ｏ−グリコシル化は、天然においては、セリンまたはスレオニンといったヒドロキシ含有アミノ酸のものである。チロシンもＯ−グリコシル化されることができる。コラーゲンにおいては、異常なアミノ酸すなわちヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）をもち、これは配列−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｈｙｌ−Ｘａａ−Ａｒｇ−において生じるＯ−グリコシル化で、式中Ｘａａは任意のアミノ酸である。ヒドロキシプロリンもＯ−グリコシル化されることができる。
Ｎ−グリコシル化は、天然では、アミド含有アミノ酸側鎖のもので、たとえばＡｓｎで、またはタンパク質のアミノ末端のものである。これは通常、配列−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−または−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−のＡｓｎで生じる。Ｎ−結合において、窒素は置換していない（−ＮＨ−）かまたは置換している（−ＮＺ−）。
Ｓ−グリコシル化も可能で、たとえばシステインのチオールについてである。この結果−Ｓ−結合が生じる。
本発明の分子は生合成である必要はないので、遺伝的にコード化されたアミノ酸のグリコシル化に限定されない。
本発明のＯ−グリコシル化アミノ酸は、−Ｃ−Ｏ−糖構造を構成する側鎖をもった任意のアミノ酸であることができ、式中「糖」は一またはそれ以上のサッカライドユニットである。この−Ｃ−は−ＣＨ２−、またはさらに置換されることができる。これはアミノ酸のアルファ炭素であることができるが、必要とするものではない。
任意のヒドロキシ含有アミノ酸はＯ−グリコシル化されることができ、セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、およびヒドロキシリシンを含むことができるが、限定されるものではない。
同様に、本発明のＮ−グリコシル化アミノ酸は、−Ｎ−糖構造を構成する側鎖を持った任意のアミノ酸であることができ、式中「糖」は一またはそれ以上のサッカライドユニットである。この−Ｎ−は−ＮＨ−であることができ、またはさらに置換されたものであることができる。これは、アミノ酸のアルファ炭素に付加することができるが、必要とするものではない。
任意のアミン含有アミノ酸はＮ−グリコシル化されることができ、これはアスパラギンを含むが制限されるものではない。任意のチオール含有アミノ酸は、Ｓ−グリコシル化されることができ、これはシステインを含むが制限されるものではない。
ペプチド配列の合成の前、最中、または後にグリコシル化を実施することができる。好ましくは、グリコシル化アミノ酸のすべては、最初に調製され、次にペプチド（またはそのブロック）に組み込まれる。
グリコシル化アミノ酸は、一またはそれ以上の強親油基を含有することができるが、制限されるものではない。
【００２２】
アミノ酸およびペプチド
ペプチドは、ペプチジル（−ＮＨＣＯ−）結合によって互いに結合したアミノ酸残基の複数から構成される。生合成ペプチドは、残基がすべて遺伝的にコード化されたアミノ酸残基
であるペプチドであるが、生合成ペプチドが実際に遺伝子発現によって生成される必要はない。
アミノ酸は基礎的な組立ブロックの基本であり、これによってペプチドおよびタンパク質が構成される。アミノ酸はアミノ基（−ＮＨ２）およびカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）の両方を含有する。多くの、しかしすべてではないアミノ酸は、アルファアミノ酸構造ＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯＯＨをもち、式中Ｒは水素、もしくは種々の官能基の任意である。
２０のアミノ酸が遺伝的にコード化されている。すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。これらのうち、グリシンを除くすべては、光学異性体であるが、しかし、Ｌ型のみがヒトに見出される。しかしながら、これらアミノ酸のＤ型が生物学的に重要である。たとえばＤ−Ｐｈｅは既知の鎮痛薬である。
技術的に言えば、プロリンはアミノ酸ではないが、しかし、環式イミノ酸であり、式中、アルファ炭素にのみならずペプチド結合のアミド窒素にも側鎖−（ＣＨ２）３−が結合していて、五員環のピロリジンを形成する。アミド水素はプロリン残基には存在しない。以下において、「アミノ酸」に言及する場合、特に除外していない限りはプロリン（および３−ヒドロキシプロリンといった置換体）を含んで考えなければならない。
他の多くのアミノ酸も知られていて、以下を含む。すなわち、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アミノプロピオン酸、２−アミノブチル酸、４−アミノブチル酸（ピペリジン酸）、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタノン酸、２−アミノイソブチル酸、３−アミノイソブチル酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノブチル酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンである。
ペプチドは、アミノ酸および／または小さめのペプチドの縮合によって構成される。一のアミノ酸（またはペプチド）のアミノ基は第二のアミノ酸（またはペプチド）のカルボン酸基と反応して、ペプチド結合（−ＮＨＣＯ−）を構成し、一の水分子を放出する。このため、アミノ酸がペプチドに組み込まれる場合、技術的に言えば、アミノ酸残基として呼ばれる。この残基の核は、他の残基に結合する−ＮＨおよび−ＣＯ結合機能性を除く成分である。この成分は、一またはそれ以上の主鎖原子（下記参照）で、側鎖に結合する。
各ＡＡの主鎖成分は、−ＮＨおよび−ＣＯ結合機能性ならびに主鎖の核成分から構成される。通常後者は単一の炭素原子である。しかしながら、主鎖の核成分は付加的な炭素原子を含むことができ、そして窒素、酸素または硫黄原子をも含むことができ、これらとともに単一の鎖を形成する。好適な具体例では、主鎖の核原子は炭素原子からのみ構成される。
側鎖は、主鎖の核原子に付加する。アルファアミノ酸、ここでは側鎖がアルファ炭素に結合している、については、核残基のＣ−１、Ｃ−２およびＮ−２が主鎖の反復ユニットを形成していて、用語「側鎖」はＣ−３およびそれ以上の番号の炭素原子およびその置換体を指している。これは主鎖の原子に付着しているＨ原子をも含む。
アミノ酸は炭素原子の数に従って分類することができ、この炭素は、主鎖のペプチド結合に関与しているカルボニル炭素原子およびアミノ窒素原子の中間的に存在しているものである。天然に存在する１５０前後のアミノ酸のうち、アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタアミノ酸が知られている。これらは、１から４の中間的な炭素をもつ。アルファアミノ酸のみが、タンパク質に生じる。プロリンはアルファアミノ酸の特別な場合であり、すなわちその側鎖はペプチド結合窒素にも結合している。
ベータおよびより大きなオーダーのアミノ酸については、Ｈでない側鎖がどの主鎖の核炭素原子に付加するかという選択が存在する。好ましい付着部位は、Ｃ−２（アルファ炭素）で、すなわち−ＣＯ結合機能性のカルボキシル炭素に隣接する炭素である。Ｈでない側鎖を所持する原子が一よりも多くなることも可能である。しかしながら、好適な具体例では、主鎖の核原子の一つのみが、Ｈでない側鎖を所持する。
主鎖炭素原子は、一または二の側鎖を所持することができるが、一がより一般的である。側鎖は、単結合または二重結合によって主鎖炭素原子に付着していて、単結合がより一般的である。
【００２３】
免疫原
本発明の免疫原は、上記のように定義されたグリコリポペプチドで、下記のように定義された少なくとも一の疾病関連のＢ細胞またはＴ細胞エピトープからなり、そして、対象（これは、ある場合には、リポソームとまたは抗原提示細胞と会合する）に対して適切に投与した場合、病気に対して保護性である体液性および／または細胞性免疫反応を誘発する。
エピトープ
本発明のエピトープは、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープであることができ、制限なく、ペプチド、炭水化物、リピド、グリコペプチドおよびグリコリピドを含む任意の化学的性質であることができる。このエピトープは、少なくとも実質的に天然エピトープと同様である。天然エピトープと同一、または天然エピトープの修飾した形であることができる。
「ＭＵＣ１エピトープ」といった用語は、他の条件がない場合、ＭＵＣ１の天然エピトープのみならず、実質的に天然エピトープと同一である変異体エピトープを包含することを意図している。このような変異体エピトープは、天然ＭＵＣ１エピトープと交差反応するはずである。同様に、「腫瘍関連エピトープ」のような用語は、天然および変異体エピトープの両方を含むが、変異体エピトープは天然腫瘍関連エピトープと交差反応するものである。
Ｂ細胞エピトープ
Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞によっておよび抗体によって認識されるエピトープである。
Ｂ細胞ペプチドエピトープは、典型的には長さが少なくとも５つのアミノ酸で、さらにしばしば少なくとも６のアミノ酸であり、なおしばしば少なくとも７または８のアミノ酸であり、そして連続的（「直鎖」）または非連続的（「立体配置的」）（後者は、一次アミノ酸配列の物理的に近接していない部分の配列を、近接するところへ持ってくる、タンパク質の折りたたみによって形成される）であることができる。
Ｂ細胞エピトープもまた、炭水化物エピトープであることができる。
Ｔ細胞エピトープ
Ｔ細胞エピトープは、もしあるとして、エピトープに対し細胞免疫反応を刺激もしくは強めるのに、予防上もしくは治療上有用であることができる程度に病害もしくは有害な状態と関連のある、ハプテンを含む抗原のＴ細胞エピトープと少なくとも実質的に同一である任意のＴ細胞エピトープであることができる。このような疾病および状態は、住血吸虫症およびレーシュマニアといった寄生的疾患、カンジダ症といった真菌性疾患、ハンセン病といったバクテリア性疾患、ＨＩＶ感染症といったウイルス感染、、ならびに腫瘍、特に固形腫瘍を含むが、これに制限されるものではない。勿論、関連する疾患または有害な状態に対するエピトープの特異性の程度が上がるほど、そのエピトープの免疫反応の刺激は副作用が少なくなる。
このエピトープは、もちろん、Ｔ細胞受容体によって認識されて、細胞性免疫反応を生ずることができる。ペプチドについて、Ｔ細胞エピトープはクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子と反応する。クラスＩエピトープは、通常８から１５、さらに頻繁には９から１１のアミノ酸の長さである。クラスＩＩエピトープは、通常５から２４（２４マーは、クラスＩＩの溝に適合することができる最長のペプチドである）で、さらに頻繁には８から２４のアミノ酸である。免疫原がこれらのサイズよりも大きい場合、免疫系によって加工されて、ＭＨＣクラスＩＩまたはＩＩ分子と反応するのにより適する大きさの断片になる。
炭水化物Ｔ細胞エピトープは、単糖ユニット（たとえば、Ｔｎ）と同じくらいの小ささであることができる。
多くのＴ細胞エピトープが知られている。付加的なＴ細胞エピトープを同定するいくつかの技術が既知である。一般的に、これらは、潜在的にＴ細胞エピトープを供することのできる分子を調整し、その分子に対する免疫反応を特徴付けることを含む。免疫反応を特徴付ける方法については、後のセクションで議論する。
ＨＬＡ−Ａ１といった、ＭＨＣクラスＩ分子の特定の対立遺伝子によって「制限」されるようなＣＴＬエピトープへの言及は、このようなエピトープが、問題となっている対立遺伝子形によって結合されて提示されることを示している。これは、前記エピトープが、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、またはＨＬＡ−Ｂ４４といった、ＭＨＣの異なる対立遺伝子形によって結合されて提示されることができないということを意図するものではない。
【００２４】
疾病関連および疾病特異的エピトープ
疾病は、ウイルス、単細胞生物もしくは多細胞生物に、よる感染もしくは寄生状態、またはガン（腫瘍）細胞の発生もしくは増殖によってもたらされる有害な臨床的な状態である。
単細胞生物は任意の単細胞病原体もしくは寄生虫であることができ、バクテリア、菌もしくは原虫を含む。多細胞生物は、任意の病原体または寄生虫であることができ、原虫、虫、もしくは節足動物を含む。多細胞生物は内部寄生者および外部寄生者をともに含む。内部寄生者は、免疫反応を誘発しやすいが、しかし、保護性の免疫反応を誘発する程度であり、外寄生生物およびその抗原は、本発明の範囲内にある。
エピトープは、ウイルス小片によって提示したか、またはウイルス性ゲノムによってエンコードされて感染細胞に発現された場合に、ウイルス性疾患に直接関連しているということができる。
エピトープは、原因生物の細胞内、表面、もしくは分泌抗原によって提示された場合に、単細胞もしくは多細胞生物による疾患に直接関連しているということができる。
エピトープは、特定の腫瘍の細胞内、表面、もしくは分泌抗原によって提示された場合に、その特定の腫瘍に直接関連しているということができる。問題となる腫瘍タイプのすべての株細胞によって、または特定の腫瘍の全細胞によって、または腫瘍の全生存期間を通じて提示される必要はない。問題となる腫瘍に特異的である必要はない。エピトープは、なんらかの腫瘍（ガン、新生物）と関連している場合は、一般的に「腫瘍に関連した」ということができる。
腫瘍は、間葉または上皮起源である。ガンは、大腸癌、直腸癌、頸癌、乳癌、肺癌、胃癌、子宮癌、皮膚癌、口癌、舌癌、口唇癌、喉頭癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、脳腫瘍、および白血病を含む。
エピトープは、対象の感染細胞によって特異的に産生もしくは過剰産生される場合、または、たとえば腫瘍により分泌される調節物質の結果として近接の細胞から過剰産生される血管形成ファクターといった、疾病に対して特異的ではあるが、非免疫的に対象の他の細胞によって特異的に産生もしくは過剰産生される抗原の場合に、疾病に間接的に関連しているといえる。
用語「疾病に関連したエピトープ」は、天然の疾病エピトープを認識する抗体またはＴ細胞が類似の非天然エピトープをも認識するくらい、問題となる疾病に天然に関連したエピトープと十分に類似している任意の非天然産生エピトープをも包含する。特定の疾病または疾病のクラスに関連したエピトープについても同様のコメントを適用することができる。
エピトープが検出可能かつ臨床的に有用な程度に、他の原因よりもより頻繁に特定の原因に関連する場合、そのエピトープはその原因（疾病原因生物、または、より特定には、腫瘍といったもの）に特異的であるということができる。予防上、治療上または診断上の有用な効果が得られるならば、完全な特異性は必要ない。
「特異的腫瘍−特異的」エピトープの場合、他の腫瘍または正常細胞とよりも、その腫瘍とさらに頻繁に関連する。好ましくは、問題となる腫瘍と関連して発生する頻度ならびに、（ａ）腫瘍が除去されたタイプの正常細胞、および（ｂ）他の腫瘍の少なくとも一種に関連した発生頻度との間で、統計学的に有意な（ｐ＝0.05）違いが存在すべきである。エピトープは、正常細胞とともにある場合に比して、（どれかまたは全部の種類の）腫瘍とともにある場合により頻繁に関連する場合に、一般的に「腫瘍特異的」ということができる。すべての腫瘍と関連している必要はない。
用語「腫瘍特異的エピトープ」は、問題となる腫瘍に特異的な（適切なら、腫瘍一般に特異的な）天然産生エピトープに十分類似している、任意の非天然産生エピトープをも包含していて、このため、類似のエピトープによって刺激された抗体またはＴ細胞がは、天然エピトープによって刺激されたＣＴＬｓと本質的に同様の特異性である。
一般的により高い特異性はより少ない反対の効果を導くので、一般的に、（投薬の経路および影響を受けた正常組織に依存して）腫瘍対正常特異性は、腫瘍対腫瘍特異性よりも重要である。腫瘍対腫瘍特異性は、治療的使用とは逆に診断的使用に重要である。
用語「特異的」は、完全な特異性を意味するよう意図しているのではなく、単に、対応する正常な対象に比べて病原体または腫瘍に関連する発生の確率が、臨床的に有用な違いであることを意味するように意図している。
寄生虫関連エピトープ
一の実施例では、エピトープは寄生虫関連エピトープで、たとえばレーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ症、バベシア症、または住血吸虫症に関連したエピトープといったものである。好適な寄生虫関連エピトープは、以下を含むが、これに制限されるものではない。
【００２５】
【表４】
0004527407.tif 000005
ウイルス関連エピトープ
他の実施例中、エピトープはウイルス性エピトープであり、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、または肝炎に関連したエピトープである。好適なウイルス性エピトープは、以下を含むが、これに制限されるものではない。
【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
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【００２８】
ガン関連エピトープ
他の実施例において、エピトープはガン（腫瘍）に関連していて、呼吸器系（肺、気管、喉頭）、消化器系（口、食道、胃、腸）、排泄系（腎臓、膀胱、大腸、直腸）、神経系（脳）、生殖系（卵巣、子宮、子宮頸部）、分泌系（乳房、肝臓、膵臓、前立腺）、皮膚等のガンを含むが、これに限定するものではない。ガンの二つの主要な群は、間葉由来かつ骨および筋肉に影響する肉腫、ならびに上皮由来かつ乳腺、胃、子宮、皮膚および舌の腺ガンの大部分を作る癌腫である。肉腫は、線維肉腫、リンパ肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫および脂肪肉腫を含む。癌腫は、腺がん、基底細胞癌腫、および扁平上皮がんを含む。
ガン関連エピトープは、変異体p53、部位変異Rasオンコジーン生成物、her2/neu、c/erb2、およびMUC1コアタンパクといったペプチドエピトープ、ならびにシアリルTn（STn）、ＴＦ、Ｔｎ、ＣＡ125、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅａおよびＰ９７といった炭水化物エピトープを含むが、これに限定するものではない。
【００２９】
炭水化物エピトープ
炭水化物エピトープも興味深い。たとば、通常のヒトガンに大いに発現する腫瘍関連炭水化物エピトープの３種のいずれをも示すことができる。これらは特に、ラクトシリーズタイプ１およびタイプ２鎖、ガン関連ガングリオ鎖、および中性スフィンゴ糖脂質を含む。ラクトシリーズタイプ１鎖およびタイプ２鎖の例は、以下の通りである。すなわち、ルイスa、二量体ルイスa、ルイスb、ルイスb/ ルイスa、ルイスx、ルイスy、ルイスa/ ルイスx、二量体ルイスx、ルイスy/ ルイスx、トリフコシルルイスy、トリフコシルルイスb、シアロシルルイスx、シアロシルルイスy、シアロシル二量体ルイスx、Tn、シアロシルTn、シアロシルTF、TFである。ガン関連ガングリオ鎖の例は、以下の通りである。すなわち、ＧＭ３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ４、ＧＤ２、ＧＭ１、ＧＤ−１ａ、ＧＤ−１ｂである。中性スフィンゴ糖脂質は、グロボトリオース、グロボテトラオース、グロボペンタオース、イソグロボトリオース、イソグロボテトラオース、ムコトリオース、ムコテトラオース、ラクトトリオース、ラクトテトラオース、ネオラクトテトラオース、ガングリオトリオース、ガングリオテトラオース、ガラビオース、および９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３を含む。
多数の臨床的に重要な抗原は炭水化物決定基をもつ。このような抗原の一つの群は、腫瘍関連ムチンから構成される（Rousseら、Biochimie70、1471、1988）。
一般的に、ムチンは唾液、胃液、等の中に見出される糖タンパク質で、粘性の溶液で、体の外部表面および内部表面上の潤滑剤または保護剤としてはたらく。ムチンは、典型的には高分子量（しばしば1,000,000ダルトンをこえる）で、大規模にグリコシル化されている。ムチンのグリカン鎖はＯ−結合（セリンまたはトレオニン残基に対して）で、糖タンパクの分子量の80％以上に達することができる。ムチンは管状上皮細胞および同一由来の腫瘍によって産生され、そして分泌され、または不可欠な膜タンパクとして細胞に結合する（Burchellら、Cancer  Res.、47、5476、1987；Jeromeら、Cancer  Res.、51、2908、1991）。
癌性の組織は、正常な対応物に比べて比較的グリコシル化されていないことが知られている異常なムチンを産生する（Hullら、Cancer  Commun.、1、261、1989）。ガン細胞中のタンパク質グリコシル化機構の機能変化のために、腫瘍関連ムチンは典型的には短く、不完全なグリカンを含む。このため、ヒト乳脂肪小球に関連した正常なムチンが基本的に四糖グリカン、gal  β1-4  glcNAcpl1-6（gal  β1-3）gal  NAcαおよびそのシアル酸付加類似物（Hullら）からなる一方で、腫瘍関連Tnハプテンは、単糖残基、α−２−アセトアミド−３−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノシル、および二糖類β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−３）α−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノシルのＴ−ハプテンからのみなる。腫瘍関連ムチンの他のハプテンは、たとえばシアリル−Ｔｎおよびシアリル−（２−６）Ｔハプテンで、末端シアリル残基の短いＴｎおおびＴグリカンへの付加によって生じる（Hanischら、Biol.  Chem.  Hoppe-Seyler、370、21、1989；Hakormori、Adv.  Cancer  Res.、52：257、1989；Torbenら、Int.  J.Cancer、45、666、1980；Samuelら、Cancer  Res.、50、4801、1990）。
ＴおよびＴｎ抗原（Springer、Science、224、1198、1984）は、多くの初期癌腫細胞およびその転位（全ヒト癌腫の90％以上）の外表面膜上に免疫反応形で見出される。腫瘍マーカーとして、ＴおよびＴｎは、いくつかの癌腫の早期免疫組織化学的検出および予後判定を可能とする（Springer）。最近では、腫瘍組織上のシアリル−Ｔｎハプテンの存在が、好ましくない予後のパラメータとして同定されている（Itzkowitzら、Cacer、66、1960、1990;  Yonezawaら、Am.  J.  Clin.  Pathol.、98  167、1992）。異なる３種の腫瘍関連炭水化物抗原が、通常のヒト癌において高度に発現する。ＴおよびＴｎハプテンは、ラクト系列タイプ１鎖、およびタイプ２鎖中に含まれる。加えて、ガン関連ガングリオ鎖およびスフィンゴ糖脂質は、様々なヒトガン上に発現する。
ガン関連ムチンによって提示される変化したグリカン決定基は、患者の免疫系によって非自己または外部者として認識される（Springer）。特に、多くの患者において、Ｔハプテンに対する強力な自己免疫反応が観察される。これらの反応は、容易に測定することができ、従前可能だったよりも早期に、高い感応性および特異性で癌腫の検出が可能となる。最後に、ＴおよびＴｎの発現の程度は、癌腫の分化の程度としばしば関連する（Springer）。
炭水化物ハプテンの広範な議論が、Wong、USP  6,013,779において示されている。種々の炭水化物は、本発明に従っては、特に腫瘍の検出および治療における使用のために、合成糖リポタンパク免疫原中に組み込まれることができる。Ｔｎ、Ｔ、シアリルＴｎおよびシアリル（２→６）Ｔハプテンが特に好ましい。
特に、腫瘍を検出および治療するために、通常のヒト癌に高度に発現する３種類の腫瘍関連炭水化物エピトープがアミノ化化合物と接合する。これらは、特にラクト系列タイプ１鎖およびタイプ２鎖、および中性スフィンゴ糖脂質を含む。
ラクト系列タイプ１鎖およびタイプ２鎖の例は以下の通りである。
【００３０】
【化１１】
0004527407.tif 000008
【００３１】
【化１２】
0004527407.tif 000009
【００３２】
【化１３】
0004527407.tif 000010
【００３３】
【化１４】
0004527407.tif 000011
【００３４】
【化１５】
0004527407.tif 000012
【００３５】
上記に加え て、本発明に従ってアミノ化した化合物に中性スフィンゴ糖脂質も接合できる。
選択した中性スフィンゴ糖脂質
球形トリオース：         Galα→4Galβ1→4Glcβ1→
球形テトラオース：       GalNAcβ1→3Galα→4Galβ1→4Glcβ1→
球形ペンタオース：       GalNAcα1→3GalNAcβ1→3Galα→4Galβ1→4Glcβ1→
イソ球形トリオース：     Galα→4Galβ1→4Glcβ1→
イソ球形テトラオース：   GalNAcβ1→3Galα1→3Galβ1→4Glcβ1→         
ムコトリオース：         Galβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ムコテトラオース：       Galβ1→3Galβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ラクトトリオース：       GalNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→
ラクトテトラオース：     GalNAcβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→
ネオラクトテトラオース： Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→
ガングリオトリオース：   GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ガングリオテトラオース： Galβ1→GlcNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ガラビオース：           Galα→4Galβ1
9-O-アセチル-GD3：       9-O-Ac-NeuAcα2→8NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→
【００３６】
ムチンエピトープ  
実施例中、エピトープは癌関連ムチンのエピトープである。ムチンは、高分子量（＞1,000,000ダルトン）および大規模なグリコシル化（80％以上）によって特徴付けられる糖タンパク質である。ムチンは、細胞外で発現することができ、または明瞭な外部の領域、膜貫通の領域、および細胞質領域にあるときの不可欠な細胞膜糖タンパクとして発現することができる。細胞膜ムチンは、柔軟な桿体として存在して、細胞表面から比較的大きな距離で突出して、糖衣の重要な構成要素を形成し（Jentoff、1990）、その炭水化物末端部位はおそらく抗体および免疫系の細胞と接触する最初の部位である。
異常なまたは癌関連ムチンは、比較的少ししかグリコシル化されていないことが知られていて（Hullら、1989）、そのため正常に陰性の炭水化物−エピトープ（Hashishら、1989；Torbenら、1990；Samuelら、1990）、ペプチド−エピトープ（Burchellら、1987）およびおそくらく糖タンパク−エピトープを発現する、対応するその正常細胞ムチンとは抗原的に異なっている。このため、細胞表面ムチンが突出するので、これらそのものが免疫攻撃の標的としてはたらくことができる（Henningsonら、1987；Fungら、1990；Singhalら、1991；Jeromeら、1991；Oncogen，EP268,279；Biomembrane  Institute、WO89/08711；Longenecker、USP  4,971,795）。幾つかの環境下では、癌関連細胞膜ムチンが、他の細胞表面抗原を「マスク」して癌細胞を免疫攻撃から防御することができる（Codingtonら、1983；Friberg、1972；Millerら、1977）。
このムチンエピトープは、コアペプチド、炭水化物、または糖ペプチドであることができる。エピトープを運搬することができるムチンの制限するものでない例は、ヒト腫瘍関連Thomsen-Friedenrieich抗原（Maclean、1992）、エピグリカニン関連糖タンパク（Codington、1984）ヒツジ下顎ムチン、ウシ下顎ムチン、乳癌ムチン（たとえば、乳癌ムチンを含む、ヒト多型上皮ムチン、Gendler、1988、1990；乳癌上皮腫瘍抗原、Hareuveni、1990、乳癌、Hull、1989）、哺乳動物腫瘍ムチン（たとえば、マウス乳腺癌、Fung、1990）、腎臓（例えば、腎細胞癌）、卵巣（たとえば卵巣癌関連皮脂線性腺抗原、Layton、1990）、膀胱、大腸（たとえば、結腸直腸癌中のシアロシル−Ｔｎ、Itzkowitz、1990）、膵臓腫瘍ムチン（Lan、1990）、胆嚢、膀胱、大腸（たとえば、悪性大腸粘膜ムチン、Torbin、1980）および幾つかの肺細胞組織から発生するムチンのような癌ムチン、メラノーマムチン（たとえば、メラノーマ関連抗原、Kahn、1991）、上皮腫瘍細胞ムチン、白血病関連ムチン、癌胎児性の抗原、もしくは、癌関連ムチンまたは異常なグリコシル化（Hakomori、1989、およびSinghal、1990）といった異常なムチンの既知の特徴に従う異常な細胞に関連する任意の他のムチンである。
【００３７】
ＭＵＣ１エピトープ
ヒトＭＵＣ１遺伝子生成物は、種々の名称で言及されていて、ＭＡＭ６、乳ムチン；ヒト乳脂肪球形抗原（ＨＭＦＧ）；ヒト乳腺上皮抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７．２９；エピシアリン；および多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）（Taylor-Papadimitriouら、1988に概説）（このセクションで不完全に引用された参照のための完全な参照は、Longeneckerら、08/229,606を参照）を含む。このムチンはヒト乳房（Gendlerら、1988）、膵臓（Lanら、1990）および特定の卵巣癌細胞（Laytonら、1990）に強力に発現する。種々の癌に発現するＭＵＣ１エンコードムチンは同一のタンデム反復コアペプチド配列を含んでいるが、グリコシル化の相違が存在する（Gendlerら、1988；Lanら、1990）。ガン細胞中のグリコシル化条件下、ガン細胞上のＭＵＣ-1分子は、正常上皮細胞上には発現しない（すなわち陰性である）陰性のエピトープを発現する。
ＭＵＣ１は、クローン化およびマップ化された最初の癌関連ムチンで（Gendlerら、1990）、最近ではマウスの乳腺株細胞、410.4中に形質移入されている（Lalaniら、1991）。ＭＵＣ１形質移入410.4細胞は、細胞表面上にＭＵＣ１遺伝子産生物を発現する。
グリコシル化のパターンは、ヒト癌関連ＭＵＣ１によって発現する陰性のペプチドエピトープと同一のものを発現するムチンから誘導される悪性の細胞と類似であるが、異なっている（Taylor-Papadimitriouら、1988）。Lalaniおよび共同研究者（1991）は、マウスの410.4形質移入体の免疫原性について調べている。これらの研究者は、細胞腫瘍発生形質移入体410.4細胞の低投与量を拒否したマウスが、形質移入していない野生型410.4では効果がみられない一方で、形質移入体410.4細胞の高投与量を連続的に移植した後に腫瘍を発生しなかったことを示した（Taylor-Papadimitirouら、1988）。（完全な参照のために、Longenecker5-USA、およびその参照4-11を参照）。
癌細胞上の陰性のＭＵＣ−１ペプチド配列を擬態する合成ペプチド抗原から構成される癌ワクチンが、マウスモデル中の腫瘍細胞を発現しているＭＵＣ−１に対する効果的な抗がん免疫療法を誘導する。Finnおよび共同研究者は、癌患者が、癌細胞上のＭＵＣ−１分子上に発現したペプチドエピトープを認識する特異的な非ＭＨＣ制限細胞障害性T-リンパ球（ＣＴＬ）を産生することができることを示した（参照１２およびLongenecker5-USAの53-55を参照）。特にＭＵＣ１配列ＳＡＰＤＴＲＰ（配列番号１０のAAs4-10）が、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方であることが示されている。チンパンジーの合成ＭＵＣ−１抗原を用いた免疫化が、ＭＵＣ−１に対する特異的抗体およびＣＭＩの発生を誘導することが示されている。
ヒト上皮ムチンＭＵＣ１が、乳腺、卵巣および膵臓の癌の90％以上において過剰発現して、そしてこれらの腫瘍中で異常にグリコシル化されている。ＳＭ３抗体はＭＵＣ１のコアタンパクに結合し、腫瘍糖タンパクにも結合する。おそらくＳＭ３エピトープが上述の異常なグリコシル化の結果として曝露されるからである。
ヒトＭＵＣ１のアミノ酸配列は、SWISS−PROTデータベース中にP15941として利用可能である。反復回数は、高度に多型性である。北欧人においては21から125に変化する。もっとも頻繁な対立遺伝子は、41および85繰り返す。タンデムに繰り返すイコサペプチドは、次のかっこで示されたように、三カ所で多型性の基底をなす。PAPGSTAP[P/A/Q/T]AHGVTSAP[D/E][T/S]R（配列番号5）。一般的な多型性は、二重の突然変異ＤＴ→ＥＳおよび単一置換Ｐ→Ａ、Ｐ→ＱおよびＰ→Ｔに同等である。もっとも頻度の高い置換ＤＴ＞ＥＳは反復の５０％以下おこる。マウスＭＵＣ１については、SWISS−PROT  Q02496参照。
Mollerら、Eur.  J.  Biochem.269：1444-55（Mar.  2002）は、ＮＭＲ分光を使ってＳＭ３抗体のペンタペプチドＭＵＣ１エピトープＰＤＴＲＰへの結合および、スレオニンがアルファ−ｄ−GalNAcへO-系列である関連糖ペンタペプチドへの結合を調査している。Mollerは、ＰＤＴがＳＭ３抗体と、ＲＰよりもより強く相互作用することを見出し、このＲＰが変異に対して耐性のあること示唆している。対照的に、グリコペプチドは、もっとも強い効果はProlとの場合ではあるが、そのすべてのアミノ酸を使用してＳＭ３と相互作用する。ドッキング研究がなされていて、３Ｄ構造が推論可能または決定できる変異ペプチドとのものについてなされている。
Hiltboldら、Cancer  Res.、58:5066-70（1998）は、100アミノ酸の合成ＭＵＣ１ペプチドとインビトロで初回刺激を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞が、５回の非グリコシル化タンデム反復を示して、樹状突起細胞によって提示され、ＩＦＮ−ガンマおよび中程度の細胞学的活性を産生する。コアペプチド配列も同定していて、PGSTAPPAHGVT（配列番号６）で、ＨＬＡ−ＤＲ３によって提示される場合この反応を誘発する。
Heukampら、Int.  J.  Cancer、91：385-92（2001）は、不定数の直列反復部位の外側に位置する３つのＭＵＣ１由来ペプチドをもつA2/K(b)遺伝子組換えマウス中でペプチド特異的ＣＴＬ免疫を示した。これらのペプチドは、ＭＵＣ（79-87）（TLAPATEPA）（配列番号７）、ＭＵＣ（167-175）（ALGSTAPPV）（配列番号８）およびＭＵＣ（264-72）（FLSFHISNL）（配列番号９）。すべてＨＬＡ−Ａ＊0201のペプチド結合モチーフに従う。
Engelmannら、J.  Biol.  Chem.  276：27764-9（Jul.  2001）は、ＭＵＣ１の直列反復部位の三つの配列変異形を報告している。変異形１はＤＴをＥＳに置換した。
Soaresら、J.  Immunol.  166：6555-63（Jun.  2001）は、七つの直列反復ＭＵＣ１ペプチドを使用して免疫反応を誘発した。樹状突起細胞上にペプチドが届くと、Ｔ細胞免疫のみが誘発された。可溶性ペプチドとともに注入した場合、Ａｂ産生も引き起こった。
Von  Mensdorff-Pouillyら、J.  Clin.  Oncol.  18：574-83（Feb.2000）は、乳癌患者に、抗ＭＵＣ１抗体レベルの免疫測定において、ＢＳＡに結合するＭＵＣ１トリプル直列反復ペプチドを用いた。
Dentonら、Pept.  Res.  7：258-64（Sept.／Oct.  1994）、Ｔ−ＢおよびＢ−Ｔ両方の配向性において、既知のマウスＴ細胞エピトープにＭＵＣ１ムチンＢ細胞ペプチドエピトープがコリニアーに類似する。Brossartら、Blood、93：4309-17（June、1999）は、ＭＵＣ１アミノ酸配列を分析してＨＬＡ−Ａ２分子への高い結合可能性をもつ二つの新規のペプチドを同定した。一つは、不定直列反復部位からで、もう一つはそれ以外の部位からであった。
Carmonら、Int.  J.  Cancer、85：391-7（Feb.  2000）は、分子の非直列反復部位からのＨＬＡ−Ａ2.1選択モチーフペプチドの抗腫瘍能を評価している。Pieterszら、Vaccine、18：2059-71も参照（Apr.2000）。
Keilら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.  40：366-9（Jan.2001）は、ＭＵＣ１エピトープを破傷風毒素エピトープに結合した。
Von  Mensdorff-Pouillyら、Int.  J.  Cancer、86：702-12（Jun.2000）は、天然ＭＵＣ１  ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のもっとも頻度の高い最小エピトープ配列がＲＰＡＰＧＳ（配列番号10のAAs  9-14）、ＰＰＡＨＧＶＴ（配列番号11；これは配列番号10のAAs1-3につながるAAs17-20に同等）であると報告。ＭＵＣ１ペプチドワクチン接種は、主に、直列反復のＰＤＴＲＰＡＰ（配列番号10のAAs6-12）およびＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（配列番号２のAAs1-9）配列に対して、それぞれ、ＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体の高タイターを誘起した。乳癌患者からの天然ＭＵＣ  Ａｂｓは、非グリコシル化ペプチドとよりも、GalNac-グリコシル化ペプチドとより強く反応した。
欧州特許出願1,182,210；Sandrin、米国特許6,344,203；Finn、米国特許5,744,144も参照。
Petrakouら、「Epitope  Mapping  of  Anti-MUC1  Mucin  protein  Core  Monoclonal  Antibodies」（21-29）；Imaiら、「Epitope  Characterization  of  MUC1  Antibodies」（30-34）、Scholら、「Epitope  Fingerprinting  Using  Overlapping  20-mer  peptides  of  the  MUC1  Tandem  repeat  sequence」(35-45)、およびBlockzjil、「Epitope  characterization  of  MUC1  Antibdies」（46-56）、すべてＭＵＣ１に対するモノクローナル抗体についてのＩＳＯＢＭ  ＴＤ−４国際ワークショップ（Nov.  1996）中、Tumor  Biology、19  Suppl.  1：1-152（1998）に別刷、も参照。
Von  Mensdorff-Pouillyら、「Human  MUC1  mucin：a  multifacted  glycopotein」、Int.  J.  Biol.  Markers、15：343-56（2000）も参照。
このため本発明は、ＭＵＣ１の少なくとも一の天然Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞エピトープ、またはそのような天然エピトープと実質的に同一の少なくとも一の変異エピトープからなるグリコリポペプチドを企図している。本発明は、さらに、エピトープの一部ではない付加的なＭＵＣ１配列を包含することができる。
好ましくは、前記グリコリポペプチドは、ＭＵＣ１のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ（それぞれの場合について、天然エピトープまたはその許容変異であることができる）の両方を包含し、そしてこれらエピトープは同一、重複、または異なっていることができる。
抗原のＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは重複することができる。たとえば、ＭＵＣ−１の場合、ＳＡＰＤＴＲＰ（配列番号10のAAs 4-10）はＴ細胞エピトープで、一方ＰＤＴＲＰ（配列番号10のAAs6-10）は単にＢ細胞エピトープである。
さらに、付加的なＢ細胞エピトープ、および／または付加的なＴ細胞エピトープを包含することができる。Ｂ細胞エピトープは、同一または異なることができ、そして同様にＴ細胞エピトープも同一または異なることができる。
本発明の抗原が、少なくとも5個のアミノ酸のＭＵＣ１配列と少なくとも実質的に同一のＭＵＣ１関連配列を包含する場合、前記ＭＵＣ１関連配列は、対応するＭＵＣ１配列中に見られた一またはそれ以上のグリコシル化部位を含むことができる。変異の結果として、可能なグリコシル化部位の数について対応するＭＵＣ１配列と異なることができ、または可能なグリコシル化部位の数について同一であることができる。
グリコシル化可能な部位は、（１）ＭＵＣ１誘導腫瘍糖タンパク中の実際にグリコシル化している部位、（２）前記腫瘍糖タンパク中の実際にはグリコシル化されていないがグリコシル化される可能性のある部位、および／または（３）前記糖タンパクの隣接部位であることができる。同様に、実際のグリコシル化部位は、（１）ＭＵＣ１誘導腫瘍糖タンパク中の実際にグリコシル化されている部位、（２）前記腫瘍糖タンパク中の実際にはグリコシル化されていないがグリコシル化される可能性のある部位、および／または（３）前記糖タンパクの隣接部位であることができる。ＭＵＣ１誘導腫瘍糖タンパク中で正常にグリコシル化される全グリコシル化部位のうちの全くないか、一か、幾つかまたは全部は、本発明の抗原においてグリコシル化されることができる。
ＭＵＣ１は多型性の抗原で、以下の配列の完全および不完全な反復の、変数（典型的には21-125、特に41または85）で特徴付けられる。
ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨ（配列番号10）
この配列の複数の反復があるために、示される出発部位は任意で、そしてエピトープは二つの反復をつなぐことができる。
従って、本発明の免疫原は、前述の完全な反復配列またはその環状順列であることができる。さらに、前記反復またはその環状順列の二またはそれ以上のコピーを包含することもできる。このため、化合物１ａおよび１ｂにおいて、上記反復の環状順列（ＴＳＡ．．．で出発して、ＨＧＶで終了）の二つのコピーがあって、無関係のＳＳＬ配列が続く。
問題となっている各ＭＵＣ１エピトープは、不定の直列反復部位のエピトープか、または前記部位の外部にあるエピトープであることができる。前者はＲＰＡＰＧＳ（配列番号10のAAs  9-14）、ＰＰＡＨＧＶＴ（配列番号11のAAs  4-10）およびＰＤＴＲＰ（配列番号10のAAs  6-10）を含む。配列ＰＤＴＲＰＡＰＧＳ（配列番号10のAAs  6-14）は、特に興味深く、なぜなら二つの重複エピトープを含んでいるからである。ＰＤＴＲＰ配列は、溶媒にさらされる突起した小頭部の先端部を形成して、安定タイプIIベータターンを形成する。
非ＶＮＴＲ部位エピトープは、ＭＵＣ（79-87）（ＴＬＡＰＡＴＥＰＡ）（配列番号7）、ＭＵＣ（167-175）（ＡＬＧＳＴＡＰＰＶ）（配列番号8）およびＭＵＣ（264-72）（ＦＬＳＦＨＩＳＮＬ）（配列番号9）を含む。
好ましくは、グリコリポペプチドは多型性エピトープＰ［Ｄ／Ｅ］［Ｔ／Ｓ］ＲＰまたはその実質的に同一な変異体である。より好ましくは、ＰＤＴＲＰまたはその実質的に同一な変異体を包含する。
幾つかの実施例において、グリコリポペプチドは少なくとも一の20アミノ酸配列（効果的な直列反復）で、単にＭＵＣ１直列反復から一もしくはそれ以上の保存的な置換、および／または単一の非保存的な置換によって異なり、そしてＭＵＣ１の不定直列反復部位のエピトープを包含する（ともに同一であるか、または変異形を許容する）。好ましくは、あったとしても、保存的な置換によってのみ異なり、さらに好ましくは、単一の保存的な置換によって以上は異ならず、もっとも好ましくは、このような直列反復において同一である。ＭＵＣ１の直列反復は不完全で、このため配列は一の反復については同一であるが他については同一でないこともできるということに注意しなければならない。また、これらの反復中、対立遺伝子の配列が存在し、この配列は、対立遺伝子について同一であるが他については同一でないことができる。
これらの実施例のサブセットにおいて、グリコリポペプチドは、2（全部で40のアミノ酸）、3（全部で60のアミノ酸）、4、5、6、7または8といった、複数の非重複有効性直列反復を包含する。これらの有効性直列反復は、それぞれ同一であることができるが、そうである必要はない（対照的に、天然ヒトＭＵＣ１ムチンにおいては、反復数は典型的には21-125であることに注意）。
一またはそれ以上の有効性直列反復に加えて、グリコリポペプチドのペプチド部分は付加的なアミノ酸部分列を包含することができる。この場合、これらの部分列は付加的なエピトープを包含することができ、これはＭＵＣ１不定直列反復部位エピトープ（有効性直列反復がだめになっている）、その部位の外側からのＭＵＣ１エピトープ、または他の癌抗原のエピトープであることができる。免疫調節性要素をも含むこともできる。Longeneckerら、08/229,606を参照。
好ましくは、ＭＵＣ１直列反復の一またはそれ以上のセリンおよび／またはスレオニンがグリコシル化されて、好ましくはＴｎまたはシアリルＴｎによってグリコシル化される。天然ヒトＭＵＣ１ムチン中、五つの正常なグリコシル化部位が反復ごとにある。正常ＭＵＣ１中、これら五つの部位のうち平均2.6が事実上占有されている。グリコシル化アミノ酸の反復ごとの平均数は、「天然値」と比して、それ以下、同じ、またはそれ以上であることができる。
好ましくは、グリコリポペプチドは、そのＣ末端部位に、配列ＳＳＬを包含し、その両方のセリンは脂質化されている。
【００３８】
天然生成エピトープの同定
天然生成エピトープは、分割と検査プロセスによって同定できる。抗原性または免疫原性として既知のタンパク質からはじめる。免疫学的活性についてタンパク質の断片を次に検査する。これらのフラグメントは、タンパク質をタンパク分解性作用薬で処理することによってかた、または、ペプチド配列が既知の場合は、タンパク質の部分列に対応する小さめのペプチドを合成して調製することができる。検査した断片は、全タンパク質配列にわたることができ、またはその一部のみであることもでき、そして隣接することもでき、重複することもでき、または分離することもできる。
たとえば、５アミノ酸の連続的な重複をもつ２０マーペプチドの一連を、たとえば、もとのポリペプチドの、残基１−２０、１６−３５、３１−５０等を、調製することができる。ペプチドの長さ、および重複の程度は、実行者次第である。この重複は、少なくとも５アミノ酸であることが好ましく、またはもっと一般的には、興味のあるもっとも小さなエピトープの長さである。
ペプチドのアミノ酸配列が既知の場合、断片は容易に調製することができて、コード化している配列は任意の所望の断片について作成することができ、そしてフラグメントは組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。フラグメントが小さい場合、液相または固相ペプチド合成によって調製することもできる。
配列情報が利用できない場合、ポリペプチド抗原は、臭化シアン、ヨードソ安息香酸、およびトリプシンとといった、部位特異的開裂剤によって断片化することができる。大きめの断片は、少ない基質をもつ薬剤を用いるか、もしくは低濃度の薬剤を用いるか、低温または短い反応時間で、得ることができる。小さめの断片は、複数の薬剤を同時に組み合わせて使用するか、または高濃度、高温、もしくは長めの反応時間で、そして選択的にカオトロピックな薬剤を用いてペプチドを保持しないように補助することで得ることができる。断片は、大きいにせよ小さいにせよ、スクリーニングされる。正のフラグメントは、断片化してエピトープをさらに局在化することができる。
フラグメントのいずれかが免疫学的に活性の場合、活性化フラグメントそのものが分割と検査分析を受けることができ、そしてプロセスは、最小の長さの免疫学的に活性な配列が同定されるまでプロセスを続けることができる。このアプローチは、検査法は異なることのはもちろんだが、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープのいずれを同定するのにも使用することができる。Geysenは、直鎖エピトープを同定するために、免疫学的な活性について特定のタンパク質の断片に隣接または重複するすべての可能なオリゴペプチド（参照、6-10  a.a.）を系統的にスクリーニングすることを教示している。参照ＷＯ84/03564。
スクリーニングされる断片の数は、アミノ酸配列が既知の場合、アミノ酸配列を使用してどの断片が体液性エピトープまたはＴ細胞エピトープとしてはたらきやすいかを予想することで、減ずることができる。一般的に、既知の体液性またはＴ細胞抗原部位のデータベース（そしておそらく、体液性またはＴ細胞エピトープではないものとして既知の配列の、第二のデータベース）を構築し、これらの部位を（ａ）問題となるタンパク質の既知の三次元構造、および／または（ｂ）特にその部位に近傍の、既知のアミノ酸配列と比較することで、これらの予想法はなされる。
体液性またはＴ細胞エピトープ活性について多くの断片を試験するとき、分断攻略戦略を用いて、必要となる試験動物または培地の数を最小化することができる。断片は二またはそれ以上の既知のグループに分けることができ、そのグループのすべての断片は単一動物または培地に投与される。免疫反応が観察されない場合で全フラグメント混合物が陽性ならば、小さめのサブグループに分割して、そのプロセスを反復する。
単一ハプロタイプのＴ細胞に対して、またはいくつかの異なるハプロタイプのＴ細胞に対して断片を試験することができる。
天然生成Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩエピトープ分子との複合体から分離することで回収することができ、そしてたとえば質量分析技術によって、配列決定することができる。
エピトープを一度同定すれば、エピトープのアミノ酸の類似性および配列の系統的な可変性の知識の組み合わせにより、機能的に同等なエピトープを同定することができる。
【００３９】
Ｂ細胞（体液性）およびＴ細胞エピトープの予測
アミノ酸配列が利用可能ならば、Ｂ細胞またはＴ細胞ペプチドエピトープの部位を予測することが可能である。Ｂ細胞エピトープは、局所的に高い親水性の平均値の部位にある傾向にある。HoppおよびWood、Proc.  Nat.  Acd.  Sci.  （ＵＳＡ）78：3824（1981）；JamesonおよびWolf、CABIOS、4：181(1988)。
Ｔ細胞エピトープは、特定のハプロタイプの細胞のＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドについての、既知のコンセンサス配列に基づいて予測することができる。たとえば、Slingluff、WO98/33810、特に15-16頁；Parkerら、「Scheme  for  ranking  potential  HLA-A2  binding  peptides  based  on  independent  binding  of  individual  peptide  side  chains」、J.  Immunol.  152：163（1994）参照。
Margalitら、「Prediction  of  Immunodominant  Helper  T  Cell  Antigenic  Sites  from  the  Primary  Sequence」、J.  Immunol.、138=2213-29（1987）は、両親媒性構造の存在によって特徴付けられるＴ細胞エピトープのサブセットを（ＡＭＰＨＩプログラムを用いて）同定した。Margalitのアルゴリズムにおいて、アミノ酸配列は、疎水性値（好ましいスケールはFauchere-Pliskaのスケール）の配列に変換されて、この配列は重複するブロックに分割される（好ましくは、１１の長さ）。このブロックは、規則的な両親媒性のらせん構造と一致する疎水性の周期現象について調べられる。すなわち、好ましいパワースペクトル進行はシヌソイドに一致する最小自乗である。Margalitは、４以上の両親媒性スコア（ブロックの両親媒性指数の合計）をもついくつかの保存的なブロックのセグメントを探すことを好んだ。
Ｔ細胞エピトープデータベースを研究することによって他のアルゴリズムを開発することができる。
【００４０】
エピトープ変異体
一般的に、天然に発生する疾病または腫瘍特異的エピトープと同一のエピトープに加えて、本発明は、そのようなエピトープと異なってはいるが実質的に同一のエピトープを包含し、そしてこのため、当然に疾病または腫瘍特異的である。天然発生エピトープと実質的に同一ではないが、それでもなお三次元立体配座の類似性の結果として、天然発生と交差反応性である。
ペプチド成分のアミノ酸配列の許容できる修飾の一つの種類は、アミノ酸置換である。保存的な置換は、アミノ酸を他の同様の大きさ、電荷および極性のアミノ酸で置換する。すなわち、これらはペプチドの立体配座を実質的に変更しやすくはない。本発明のタンパク質またはペプチド分子中で作ることのできる置換の種類は、異なる種の相同的なタンパク質間のアミノ酸変化の頻度を分析することに基づいていて、これはたとえばSchulzら、上記の表1-2、およびCreighton、上記の図3-9に示されたものである。このような分析に基づき、保存的置換は、以下５つのグループの一の変化としてここに定義される。
表Ｖ
１．小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr（Pro、Gly）
２．極性、負荷電残基およびそのアミド：Asp、Asn、Glu、Gln
３．極性、正荷電残基：His、Arg、Lys
４．大きい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Met、Leu、Ile、Val（Cys）、および
５．大きい芳香族残基：Phe、Tyr、Trp
グループ1から3は、半保存的と考えることができるセットの範囲内にあるなんらかの関連および変位体である。同様に、グループ4および5の範囲内の変異体は半保存的と考えることができる。
残基Pro、GlyおよびCysは、タンパク質構築におけるその特別な役割のために括弧でくくられる。Proはペプチド鎖を強固にし、そしてアルファらせん構造と干渉する傾向にある。Glyはペプチド鎖を柔軟にし、そしてアルファらせんの間またはベータ鎖の間の「ループ」中よく見られる。システイン残基のチオールグループは、酸化されて隣接しないシステイン残基間のジスルフィド結合を形成する。
前記グループ中、以下の置換は「高度に保存的」であると考えられる。
Asp/Glu、His/Arg/Lys、Phe/Tyr/Trp、Met/Leu/Ile/Val
半保存的置換は、上記グループ（Ｉ）から（Ｖ）のうち二つの間の交換として定義され、上記（Ｉ）、（II）および（III）から構成される高次グループ（Ａ）に制限されるか、上記（IV）および（Ｖ）からなる高次グループ（Ｂ）に制限される。また、Alaは、グループＩでないすべてのアミノ酸について半保存的置換であると考えられる。
基準エピトープの免疫学的な活性の少なくとも10％をもち、かつ非保存的置換を一を越えないで基準エピトープと異なる場合（下記を除く）に、基準エピトープ（たとえば天然発生エピトープ）と実質的に同一であると考えられる。好ましくは、任意の非保存的置換は、半保存的置換である。好ましくは、非保存的置換がない。
保存的置換が任意の数あることができる。好ましくは、そのような置換が3を越えず、さらに好ましくは、2を越えず、そしてより好ましくは、1を越えない。
ＣＴＬエピトープの場合、非保存的置換をさらに組み込むことができ、これは適切なＭＨＣ分子の既知の結合モチーフによって示唆される。Kastら、J.  Immunol.、152：3904-12（1994）は、ＨＬＡ分子Ａ１、Ａ２．１、Ａ３、Ａ１１およびＡ２４についてのＨＬＡ−Ａ特異的ペプチド結合モチーフを陳述している。Engelhardら、Sette、ed.、Naturally  Processed  Peptides、57：39-62（1993）は、ＨＬＡ−Ａ２．１およびＨＬＡ−Ｂ７への結合を決定する特徴を探究している。Hobohimら；Eur.  J.  Immunol.、23：1271-6（1993）；Kawakamiら、J.  Immunol.、154：3961-8（1995）も参照。これらおよび他のソースに基づいて、種々のＨＬＡ分子についての好ましくかつ許容的なＡＡｓは以下を包含する（しかし、これに制限はされない）。
【００４１】
【表７】
0004527407.tif 000013
位置が収載されていない場合、収載された位置に比してＡＡＳのより大きな可変性を研究は示した。収載された位置について、特に、「好ましい」または「許容できる」ＡＡｓについて保存的または半保存的置換の場合、収載されていないＡＡｓが許容できる。
高度に保存的な置換は、他の保存的な置換に比して活性に影響をおよぼしにくく、保存的置換は単なる半保存的置換に比して活性に影響をおよぼしにくく、そして半保存的置換は他の非保存的置換に比して活性に影響をおよぼしにくいことが認められよう。加えて、単一の置換は複数の変異体に比して活性に影響をおよぼしにくい。
興味のあるペプチドの置換変異体は、単一または複数のいずれについても、もとのペプチドの効力を完全には持つことはできないかもしれないが、このような変異体は有用であることができる。
置換は、遺伝的にコード化されたアミノ酸、または天然生成アミノ酸にも制限されない。ペプチド合成によってエピトープが調製されるとき、所望のアミノ酸を直接使用することができる。代替的に、遺伝的にコード化されたアミノ酸は、これを選択した側鎖または末端残基と反応する能力のある有機誘導剤によって、修飾されることができる。
他の交換グループに属する遺伝学的にコード化されたアミノ酸よりも、もとのアミノ酸、および同一交換グループ中の他のアミノ酸に大きさ（体積）および疎水性（親油性）において類似している場合、遺伝学的にコード化されていないアミノ酸は、遺伝学的にコード化されたアミノ酸の保存的置換と考えることができる。
実質的に同一のペプチドエピトープは、種々の技術によって同定することができ、そのいくつかは、結合モチーフの既知の知識に基づかない。このため、既知のペプチドエピトープのすべての可能な単一置換変異体を合成することができるということは、従来技術において既知である。非ペプチドについて、このような変異体は（20×9−1＝179）存在する。Geysenら、Proc  Nat.  Acad.  Sci.（USA）、81：3998−4002（1984）。異なる置換の効果は常に相加的ではない一方で、エピトープ中の異なる残基位置での二つの有利なまたは中性の単一置換がもっとも多くの場合に安全に併用することができるということを期待するのは、合理的である。
ペプチドの一またはそれ以上の残基をランダムに変異させて、２０の可能なアミノ酸、または選択したセット（たとえばすべての保存的置換）の任意のものをその残基位置に生成させることができ、そして所望の免疫的活性をもつ変異体をスクリーニングすることができるということも既知である。ParmleyおよびSmity、Gene、73：305-18（1988）；Devlinら、Science、25：49：404-6（1990）；Scott  and  Smith，Science，249:386-90(1990)；Greenwoodら、J．Mol．Biol．220：821-7（1991）；Cwirlaら、Proc．Nat．Acad．Sci．（USA）、87：6378-82（1990）；StephanおよびLane、J.  Mol.  Biol．225：577-83（1992）；Barrettら、Anal．Biochem．204：357-64（1992）；Ladner、米国特許5,223,409。
たとえば、ノナペプチドのすべての可能な保存的置換体を調査できるかもしれない。各位置につき３から５の可能性がある。すなわち、平均４を仮定すれば、配列スペースは４９、すなわち約250,000となる。組み合わせたライブラリは、１０８またはそれ以上の配列スペースを容易に探索することができる。
適切な抗体または他の受容体が利用可能な場合、標的が結合したペプチドについての組み合わせのペプチドライブラリをスクリーニングすることによって、天然生成および非天然生成ペプチドエピトープの両方を同定することができる。
体液性ペプチドエピトープは、興味のある抗原を認識することが既知の標的モノクローナル抗体に特異的に結合する、組み合わせたペプチドファージライブラリをスクリーニングすることで同定することができる。好ましくは、抗体のエピトープ結合部位ではない場所で抗体に結合するペプチドを除外するために、このライブラリをプレスクリーニングする。すなわち、同じイソタイプの２番目の対照抗体に結合するファージを除外することによって、なすことができる。
同様に、ＣＴＬペプチドエピトープを同定するために、関連する単一または複数の置換変異体の系統を合成することができ、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性リンパ芽球腫細胞株Ｔ２（または特異的ＣＴＬエピトープを提示することができる他の細胞株）へこの混合物を提示することができ、そしてＴ２細胞を所望の特異性のＣＴＬｓに曝露することができる。Ｔ２細胞が溶解している場合、Ｔ２細胞からの直接回収によってまたは効果的なペプチド混合物のサブセットを試験する進行過程によってのいずれかで、効果的なエピトープを同定することができる。変性ペプチドの調製のための方法は、Rutter、米国特許5,010,175、Haughtenら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.（USA）、82：5131-35（1985）、Geysenら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.（USA）、81：3998-4002（1984）；WO86/06487；WO086/00991に記述されている。
多発性突然変異誘発戦略は、Ｈ−Ｙエピトープを擬態するペプチドについての探索において、Gavinら、Eur.  J.  Immunol．24：2124-33（1994）によって適用されている。
多発性突然変異誘発は、少数の残基位置を強くスクリーニングするのに、または多数の位置をより拡散的にスクリーニングすることに使用することができる。一つのアプローチは、たとえば下記に定義する交換グループＩからＶのそれぞれの一代表といった、各位置における各ａ．ａ．タイプの代表的メンバーを少なくとも探索することである。好ましくは、GlyおよびProが、グループＩ残基に加えてスクリーニングされる。好ましくは、少なくとも一のスクリーニングされた残基は、Ｈ−結合残基である。陽性の変異体が特に代表的であることを特徴とする場合、アミノ酸のように引き続くライブラリ中に探索できる。たとえば、Phe置換が結合を向上させる場合、TyrおよびTrpを次のラウンドで調べることができる。
通常の当業者が、どの残基を改変するか決定するとき、ＭＨＣまたはＴＣＲ結合中に関与する残基を同定するために、天然加工ＭＨＣ関連ペプチドの配列を比較することができ、そしてＭＨＣ：ペプチド：ＴＣＲ複合体の三次元構造を得ることができる。このような残基は、そのまま放置することもできるし、ＭＨＣまたはＴＣＲ結合を増強しやすくなるよう賢明に変異することもできる。
ペプチド成分はコンセンサスペプチドであることができ、たとえば、既知のガン関連ムチンコアペプチド配列とは異なるが、既知のガン関連ムチンコアペプチド配列の組み合わせから誘導したものである。非制限的な実施例として、このようなコンセンサスペプチドは、分子モデリングによって誘導することができ、選択的に疎水性分析および／またはモデルらせんへのフィッティングを組み合わせることができる。このようなモデリングは、たとえば、制限するものではないが、ＥＣＥＰＰ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＤＩＳＣＯＶＥＲ、ＣＨＥＭ−ＤＲＡＷ、ＡＭＢＥＲ、ＦＲＯＤＯおよびＣＨＥＭ−Ｘといった既知のモデリングアルゴリズムを使用する既知の方法過程に従って、達成することができる。このようなアルゴリズムはペプチドを比較してありうる適切な代替コンセンサスポリペプチド断片を決定する。
【００４２】
リポソーム製剤
リポソームは、水性区画の周りを囲む一またはそれ以上の脂質二重膜からなる顕微鏡的な小胞である。たとえば、Bakker-Woudenbergら、Eur.  J.  Clin.  Microbiol.  Infect.  Dis.  12（補遺1）：S61（1993）およびKim、Drugs、46：618（1993）を参照。リポソームは天然の細胞膜にも見出される大量の脂質分子から調剤することができるので、リポソームは通常安全に与薬することができ、かつ生分解性である。
リポソームは、極性脂質の物理的な自己組織化による球形の粒子で、これはリポソーム中の膜組織化を決定する。リポソームは、一層または多層の種々の大きさをもつ小胞として形成することができる。このようなリポソームは、それ自体免疫原性の性質を持たない小さな分子から構成されるが、巨大分子の粒子のごとく振る舞い、かつ強力な免疫原性の特徴を示す。
調製の方法に依存して、リポソームは一層または多層であることができ、そして約0.02マイクロメーターから約10マイクロメーターを越える範囲の直径をもつサイズで変化する。種々の薬剤を、リポソーム中に封入することができる。疎水性の薬剤は二重膜により仕切られ、親水性の薬剤は内部水溶性スペース内に仕切られる。たとえば、Machyら、「Lipsomes  in  Cell  Biology  and  Pharmacology（John  Libbey、1987）、およびOstroら、「American  J.  Hosp.  Pharm.」46：1576（1989）を参照。
リポソームは実質的に任意のタイプの細胞に吸収され、そして組み込まれた薬剤を放出する。代替的に、前記リポソームは標的細胞と融合して、それによってリポソームの内容物が標的細胞に移される。代替的に、リポソームは食細胞によりエンドサイトーシスによって取り込まれることができる。エンドサイトーシスに引き続き、リソソームによるリポソーム脂質の分解、そして封入薬剤の放出がある。Scherphofら、Ann.  N.  Y.  Acad.  Sci.、446：368（1985）。
本発明に使用される他の適切なリポソームは、多重層膜小胞（ＭＬＶ）、少層膜小胞（ＯＬＶ）、単層膜小胞（ＵＶ）、小単層膜小胞（ＳＵＶ）、中型単層膜小胞（ＭＵＶ）、大型単層膜小胞（ＬＵＶ）、巨大単層膜小胞（ＧＵＶ）、多小胞小胞体（ＭＶＶ）、逆相蒸発法（ＲＥＶ）によって作られた単一層もしくは少層小胞体、逆相蒸発法によって作られた多重膜小胞体（ＭＬＶ−ＲＥＶ）、安定多数膜小胞体（ＳＰＬＶ）、凍結および解凍ＭＬＶ（ＦＡＴＭＬＶ）、押し出し法によって調製した小胞体（ＶＥＴ）、フレンチプレスによって調製された小胞体（ＦＰＶ）、融合により調製された小胞体（ＦＵＶ）、脱水−再水和小胞体（ＤＲＶ）、および気泡体（ＢＳＶ）を含む。当業者は、これらのリポソームの調製のための技術が従来技術に知られていることを認識する。「Colloidal  Drug  Delivery  Systems」、66巻（J.  Kreuter編、Marcel  Dekker、Inc.、1994）。
「リポソーム製剤」は、インビトロで生成した脂質小胞体で、この中に本発明の抗原を組み込むことができる。このため、「リポソームに結合した」は、抗原がリポソームに一部組み込まれまたは付着していることをしめす。本発明の免疫原は、リポソームに結合した抗原であるが、前記リポソームについては、免疫原ではなく、またはリポソームなしの状態でも免疫原となることができる。
幾つかの異なるグリコリポペプチドが、同一のリポソームに、またはそれぞれが異なるリポソームに組み込まれことができ、そしてリポソームは対象に対して、一緒に投与されるかまたは個別に投与される。
分子の脂質部位は自然に脂質二重膜中に組み込まれるので、グリコリポペプチドはリポソームに組み込まれることができる。このため、グリコリポペプチドは、リポソームの「表面」上に提示されることができる。代替的に、ペプチドはリポソーム内に封入されることもできる。リポソームの調製技術およびペプチドといった分子を用いた調剤技術は、当業者によく知られているものである。
リポソームの形成には、一またはそれ以上の脂質を要する。単独または組み合わせで、リポソーム二重膜構造を形成することが可能な任意の脂質を使用することができる。一般的には、これらのリピドは少なくとも一のリン脂質を含む。前記リン脂質は、天然材料からのリン脂質、修飾された天然リン脂質、半合成リン脂質、完全合成リン脂質、または非天然頭部基をもったリン脂質（必然的に合成）であることができる。もっとも関心のあるリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチド酸、およびホスファチジルイノシトールである。
前記リポソームは中性、正荷電、および／または負荷電脂質を含むことができる。ホスファチジルコリンは、中性リン脂質である。ホスファチジルグリセロールは負荷電糖脂質である。Ｎ−[１−(２，３−ジオレイロクス)プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドは正荷電合成脂質である。他は、３ベータ−[Ｎ−(Ｎ’,Ｎ”−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]−コレステロールである。
一般的に、脂質は、一またはそれ以上の脂肪酸群からなる。これらは飽和または不飽和であることができ、炭素数が変わることができ、一般的には12−24の炭素であることができる。特に関心のあるリン脂質は、下記脂肪酸をもつものである。C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3（アルファおよびガンマ）、C20:0、C20:1、C20:3、C20:4、C20:5、C22:0、C22:5、C22:6、およびC24:0であり、ここで第一の数字は脂肪酸鎖中の総炭素数で、第二の数字は二重結合の数を表す。哺乳動物または植物材料由来の脂肪酸は、すべて偶数の炭素数をもち、その不飽和は３つの炭素間隔で離れていて、それぞれ介在性のメチレン基をもつ。
コレステロールは「液体−結晶状態」二重膜の浸透性を減じる。
リポソームは、特定の標的細胞に対して特別な親和性を含むことができる。たとえば、ラクトースセラミドは、肝細胞について（およびおそらく肝ガン細胞についても）特別の親和性を持つ。
好ましいリポソーム形成においては、成分脂質はホスファチジルコリンを含む。より好ましくは、コレステロールも含み、さらにより好ましくは、ホスファチジルグリセロールも含む。
脂質の自己組織化性質の利用で、極性脂質に一またはそれ以上の免疫原を付加することができ、次々にリポソーム粒子の一部となる。各免疫原は一またはそれ以上の抗原決定基（エピトープ）を含む。これらのエピトープは、Ｂ細胞エピトープ（抗体によって認識される）またはＴ細胞エピトープ（Ｔ細胞によって認識される）であることができる。リポソームは関連する免疫原によって誘発された免疫反応を免疫賦活するようはたらくことができる。免疫賦活剤を単に免疫原と混合するよりも、局所的に高い効果的な濃度をもつことで、より効果的になりやすくなる。
さらに、上述の免疫原の代わりに、ハプテンを付加することができる。免疫原のように、ハプテンは抗原決定基からなるが、しかしそれのみでは免疫反応を誘発するのには小さすぎる定義である（通常、ハプテンは5,000ダルトンよりも小さい）。この場合、脂質成分は免疫賦活剤としてのみならず、免疫原キャリアとしてはたらくことができ、ハプテンおよび脂質接合体は合成免疫原として振る舞う（すなわち、この物質に対して、体液性免疫反応および／または細胞免疫反応を誘発することができる）。
脂質が免疫原キャリアとしてはたらかない場合でも、ハプテンにになわれたリポソームはまだ合成抗原として振る舞うことができる（すなわち、たとえば抗体またはＴ細胞といった、体液性または細胞性免疫系の成分によって認識される物質である）。用語「抗原」はハプテンおよび免疫原の両方を含む。
【００４３】
免疫賦活剤
低分子量の合成抗原は、弱い免疫原であることができ、これは完全な合成ワクチンの成功に対する最大の障害であると一般的に理解される。このような合成抗原の免疫原としての性質を改善する一つの方法は、免疫賦活剤の環境中に送達することである。従来技術に通常知られているように、免疫賦活剤は、特異的な抗原刺激と組み合わせてはたらいて、抗原に対する特異的な反応を強める物質である。理想的な免疫賦活剤は、非特異的に宿主の免疫系を刺激するものと考えられていて、これは、任意の異質な抗原と連続して遭遇すると、その異質な抗原に対して強力かつ特異的な免疫反応を生じさせる。このような強力かつ特異的な免疫反応は、その記憶によっても特徴付けられるので、宿主免疫系のＴリンパ球（Ｔ細胞）が活性化したときのみ生じる。
Ｔ細胞ブラストジェネシスおよびＩＦＮ−ｇ生成は、免疫反応を測定する二つの重要なパラメーターである。実験的に、Ｔ細胞ブラストジェネシスは、Ｔ細胞増殖と直接関連するＤＮＡ合成を測定し、これは次には、Ｔ細胞活性の直接の結果となる。一方、ＩＦＮ−ｇは、活性化されたＴ細胞によって分泌される主要なサイトカインである。このため、Ｔ細胞ブラストジェネシスおよびＩＦＮ−ｇ生成はＴ細胞活性化を誘導し、これは、宿主免疫系を助けて任意のタンパク質をもととする抗原に対する強力かつ特異的な免疫反応を誘導する免疫賦活剤としての能力を示唆する。
免疫原単独によって誘発される水準に比して、少なくとも一のリポソーム／免疫原コンビネーションに対する反応において、Ｔ細胞ブラストジェネシスの生成水準またはインターフェロンガンマの生成水準のいずれかを有意に（ｐ＝0.05）上昇させる場合、この化合物は免疫賦活剤と考えられる。好ましくは、ともに上昇させる。好ましくは、上昇は、少なくとも10％であり、より好ましくは少なくとも50％であり、さらにより好ましくは少なくとも100％である。
多くの免疫賦活剤が当業者に知られており、これはフロイントの完全免疫賦活剤、サポニン、DETOX（Ribi  Immunochemicals）、Montanide  ISA-51、-50および-70、ＱＳ−２１、モノホスホリル脂質Ａ、およびそれらの類似体を含む。脂質免疫賦活剤は、リポソームの状況で示されることができる。
このリポソームワクチンは、免疫賦活剤とともに有利に製剤することができる。たとえば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）は、Ｔリンパ球に特異的なリポソームの抗原の増加した提示を引き起こす効果的な免疫賦活剤である。Alving、C.  R.、Immunobiol.、187：430-446（1993）。当業者は、たとえばリピドＡおよびその誘導体といった、脂質に基づく免疫賦活剤も適当であることを認識するであろう。ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）も、リポソームに組み込まれると、免疫賦活性の上昇を示した（Gupta  RKら、「Adjuvants-A  balance  between  toxicity  and  adjuvancity」、Vaccine、11、293-306（1993））。
免疫賦活剤の使用は必須のもではない。
【００４４】
合成戦略
製薬グレードのペプチドおよびグリコペプチドの複合体は、最初から最後まで品質管理および工程管理ともに保障される革新的なプロセスを適応しなければならない。同一の親和性で、すべてのアミノ酸が他と結合するものではない。いくつかのアミノ酸の間の結合部位は、他と比べて立体的に邪魔されやすい。グリコペプチド合成のための保護されたグリコシル化アミノ酸（図４）は、保護基をもった通常のアミノ酸と比べてよりかさ高い。現在の戦略は、合成するペプチドを調べて、ペプチドの結合する二つのブロックを連結することとなるときに比較的高めの効率をもつように形成されることができる結合を同定する。このような連結は、ブロック結合の効率を高めるアッセンブリーの遅い段階まで保たれる。
【００４５】
利点
長くかつ複雑なペプチドもしくはグリコペプチドの合成は、従来の固相法を通じてではとても実行できるものではなかった。すべての段階において、液相中での適切に保護された小さなブロックの合成および精製は、実行しやすいものである。このアプローチを通じることは、開始時に労働集約的かつ時間を消費するが、このような戦略を通じることで、おそらく製剤グレードペプチドの大規模製造をもっともよく扱える。製造規模においては、高価な樹脂が免除されるので対費用効果が高く、一方、調節性のコンプライアンスを簡便にして、品質およびプロセスコントロールが必要な際にいつでも取り込むことができる。このようなコントロールは固相法においてはほとんど不可能であった。
【００４６】
レトロ合成分析：
最終生成物の配列および構造は既知なので、理論的に生成物を分割して、最終生成物に合成および組立てできるような小さめのペプチドの簡便なブロック最小数にすることは、簡便かつ効率的である（図５）。以下の基準は、結合効率性および費用効果の両方を達成するために、小さめのブロックに生成物を分割する際に考慮される。
配列中において比較的容易に形成されるペプチド結合は、小さめのブロックがブロック結合反応における高効率の結合に利用できるように同定される。
配列中の二またはそれ以上の部位において反復する通常のブロックは、合成の負担を減じる。
高価なグリコシル化アミノ酸の結合は、可能な限り留保されて、複数の結合段階での損失を最小限にするために遅めの合成段階となる。Ｎ末端保護基およびＣ末端保護基は、任意のその独立した選択的除去のために注意深く選択される。このブロックはその完全性のために、精製され、、質量スペクトルおよび核磁気共鳴分析を用いて調べられる。酸性溶媒中での最終生成物の分解は可能な限り維持され、特に炭水化物の場合にはそうである。分解物質の最終精製は、逆相カラムクロマトグラフィーによって実施される。
【００４７】
免疫応答の特徴付け
細胞媒介性免疫反応は、インビトロまたはインビボでアッセイすることができる。通常のインビトロアッセイはＴ細胞増殖アッセイである。血液試料を関心のある疾病に罹患した患者からとり、その疾病に関連した、またはワクチン接種した個人からとる。この個人のＴ細胞はこのため、増殖によりその抗原に新しくさらされることに反応するよう初回刺激を受ける。増殖は、ＤＮＡ複製におけるその役割のためにチミジンを要する。
一般的に、Ｔ細胞増殖はＢ細胞増殖に比して大規模であり、分離されていない細胞群においてさえも強いＴ細胞反応を検知することができる。しかしながら、Ｔ細胞の精製は、Ｔ細胞反応の検知を容易にするのに望ましい。その抗原特異的増殖に実質的に反対に影響しなければ、Ｔ細胞精製の任意の方法をとることができる。ここでの好ましい手順は、10.7の特別な密度の等密度の勾配で、すなわちFicoll-HypagueまたはPercoll勾配分離で、まず全リンパ球個体群を捕集により得る（血液、脾臓、リンパ節から）。この細胞の混合個体群を、次に数通りの方法を経てＴ細胞個体群にさらに精製する。もっとも簡便な分離は、Ｂ細胞および単球／マクロファージ個体群のナイロンウールカラムへの結合に基づくものである。Ｔ細胞個体群は、ナイロンウールを通過し、90％以上の精製Ｔ個体群を単一の経過により得ることができる。他の方法には、補体タンパク質の存在下、非Ｔ細胞個体群（ネガティブ選択）を溶解するために、Ｂ細胞に対する特異的抗原および／または単球抗原を使用することを含む。さらに他の方法は、抗Ｔ細胞抗体（ＣＤ３）が固相マトリックス（磁性ビーズといったもの）に結合して、このためＴ細胞が付着してこれを非Ｔ細胞個体群から分離する（すなわち、磁性的に）ことを可能にする、ポジティブ選択技術である。これらは、機械的または化学的分裂によってマトリックスから回収することができる。
精製Ｔ細胞個体群を得れば、照射を受けた抗原提示細胞（脾臓マクロファージ、Ｂ細胞、樹状突起細胞はすべて存在）の存在下、培養される（これらの細胞は、トリチウム化チミジンに反応および組み込まれることを防止するために照射を受ける）。生存可能なＴ細胞（20ユニットでIL2で補充される100μl培地中のウェルあたり100,000-400,000）は、次に試験ペプチドまたは他の抗原とともに、3ないし7日間、試験抗原とともに1ないし100μg/mlの濃度で培養される。
抗原刺激期間の終わりに、幾つかの方法で反応を測定することができる。まず、細胞のない上清を採取して、特異的サイトカインの存在を試験する。αインターフェロン、IL2またはIL12の存在は、Ｔｈヘルパータイプ１個体群反応を示す。IL4、IL6およびIL10の存在はともに、Ｔヘルパータイプ２免疫反応を示す。このため、この方法は、ヘルパーＴ細胞サブセットの同定を可能にする。
ブラストジェネシスと名付けられた第２の方法は、抗原刺激期間の終わりに、トリチル化チミジンを培養に加え（たとえば、ウェルごとに1μキュリー）、4ないし16時間かけて放射性標識をつけた代謝生成物を細胞に組み込み、続いてシンチレーションカウントのためにフィルター上で採取する。組み込まれた放射性チミジンの水準は、Ｔ細胞複製活性度の測定となる。ネガティブ抗原または抗原非存在対照ウェルが、刺激指標の面からブラストジェニック反応を算出するために使用される。これはＣＰＭテスト／ＣＰＭ対照である。好ましくは、達成する刺激指標は少なくとも2で、より好ましくは少なくとも3で、さらに好ましくは5で、もっとも好ましくは少なくとも10である。ＣＭＩは、標準的な実験動物、たとえばマウスの、インビボで測定することもできる。マウスは初回刺激抗原で免疫化される。Ｔ細胞の反応をまったあと、このマウスをテスト抗原のフットパッド注入によって攻撃する。ＤＴＨ反応（テストマウスの腫脹）は、たとえば、サリン溶液を注射した対照マウスと比較される。
好ましくは、反応は、少なくとも0.10mm、より好ましくは少なくとも0.15mm、さらにより好ましくは0.20mm、もっとも好ましくは少なくとも0.30mmである。
インビボで、体液性免疫反応は、免疫化したマウスからの血液をとり、関心のある抗原に結合する抗体の存在下、その血液をアッセイすることによって測定する。たとえば、テスト抗原は固定され試料とともに培養されて、それよって同族の抗体を捕獲し、そして捕獲抗体を次に、標識化した抗アイソタイプの抗体とともに固相で培養することによって測定する。
好ましくは、体液性免疫反応は、望まれる場合、少なくとも1/100の抗体タイターによって示されるのと少なくとも同じ強さで、より好ましくは少なくとも1/1000であり、さらにより好ましくは少なくとも1/10,000である。
【００４８】
対象
本発明のワクチンのレシピエントは、体液性免疫反応または細胞免疫反応を経て特異的免疫を取得することできる任意の脊椎動物であることができる。
哺乳動物においては、霊長目（ヒト、類人猿およびサルを含む）、偶蹄類（馬、ヤギ、ウシ、ヒツジ、豚を含む）、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む）、および食肉目（猫、および犬を含む）の哺乳動物が好ましいレシピエントである。鳥においては、七面鳥、ニワトリおよび同目の他のメンバーが好ましいレシピエントである。もっとも好ましいレシピエントはヒトである。  
本発明の好ましい対象動物は霊長類の哺乳類である。用語「哺乳類」によっては、哺乳綱に属するそれぞれの個体を意味し、これは、もちろん、ヒトを含む。本発明は、獣医学への使用も同様に意図しているが、特に、ヒト被検者の治療に対して有用である。用語「非ヒト霊長類」は、ヒト科をのぞく類人猿亜目の任意のメンバーを意図している。このような非ヒト霊長類は、新世界サル上科、オマキザル科（オマキザル、ホエザル、クモザルおよびリスザルを含むアメリカ大陸のサル）；およびマーモセット科（マーモセットを含む）、オナガザル上科（マカク、マンドリル、ヒヒ、テングザル、モナザル、およびインドの聖ヒトザルを含む）；およびヒト上科、ショウジョウ科（テナガザル、オランウータン、ゴリラ、およびチンパンジーを含む）を含む。アカゲザルはマカクの一メンバーである。
【００４９】
製薬的組成
本発明の製薬的な製剤は、少なくとも一の免疫原を、保護性の免疫反応を誘発するのに十分な量含んでいる。この反応は、体液性、細胞性、またはその組み合わせである。この組成は複数の免疫原からなることができる。
少なくとも１の免疫源は本質的に免疫源であるグリコリポペプチド、またはリポソームへの混和の結果として免疫源であるグリコリポペプチドのいずれかである。
製薬的な組成は好ましくはさらにリポソームを含む。好ましいリポソームは、Jiangら、PCT/US00/31281、2000年11月15日出願（我々の整理番号JIANG3A-PCT）、およびLogeneckerら、08/229,606、1994年4月12日出願（我々の整理番号LONGENECKER5-USA、およびPCT/US95/04540、出願1995年4月12日（我々の整理番号LONGEGECKER5-PCT）。
組成は、抗原提示細胞を含むことができ、この場合免疫原は、投与前に先立ち、より効果的な提示のために、細胞上にパルスで送ることができる。
組成は、従来技術に既知の補助的な薬剤または賦形剤を含むことができる。たとえば、Berkowら編、「The  Merck  Manual、第15版」、Merck  and  Co.、Rahway、N.  J.、1987；Goodmanら編、「Goodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第8版、Pergamon  Press、Inc.、Elmsford、N.  Y.、（1990）；Avery's  Drug  Treatment：Principles  and  Practice  of  Clinical  Pharmacology  and  Therapeutics、第3版、ADIS  Press、LTD.、Williams  and  Wilkins、Baltimore、MD.（1987）、Katzung編、Basic  and  Clinical  Pharmacology、第5版、Appleton  and  Lange、Norwalk、Conn.（1992）、これら参考文献およびその中での引用は、ここに参照として完全に組み込まれる。
組成は、さらに免疫賦活剤を含んで、非特異的に免疫反応を強めることができる。幾つかの免疫賦活剤は、体液性免疫反応および細胞性免疫反応の両方を増強することができ、そして他のｓは一または他に特異的である。幾つかは一を増強し、他を阻害する。免疫賦活剤の選択は、このため、所望の免疫反応に基づく。
組成は、細胞性もしくは体液性免疫反応のいずれかを支持または阻害するサイトカイン、またはこのようなサイトカインに対する阻害性抗体といった、他の免疫調節物質を含むことができる。
本発明に従う製薬的な組成は、少なくとも一のガン化学療法物質を含むことができ、たとえば抗代謝生成物、ブレオマイシンペプチド抗生物質、ポドフィリンアルカロイド、ビンカアルカロイド、アルキル化作用薬、抗生物質、シスプラチン、またはニトロソ尿素からなるグループから選択される。
本発明に従う製薬的な組成は、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、チオセミカルバゾン、メチサゾン、リファンピン、リブビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、フォスカーネット、ホスホ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、またはガンシクロビルから選択される、少なくとも一のウイルス性化学的療法化合物をさらにまたは付加的に含むことができる。たとえば、Katzung、上記、およびそこで引用している参照、798ないし800頁および680ないし681頁を参照。それぞれ、参照はここに完全に参照として組み込まれる。
抗寄生虫薬は、節足動物、蠕虫（線虫、蟯虫、線虫、鈎虫、条虫、鞭虫、および住血吸虫を含む）、および原虫（アメーバ、およびマラリア、トキソプラズマ、およびトリコモナス生物体）に対して使われるのに適した薬剤を含む。実施例は、チアベナゾール、種々のピレトリン、プラジカンテル、ニクロスアミド、メベンダゾール、クロロキンＨＣｌ、メトロニダゾール、ヨードキノール、ピリメタミン、メフロキンＨＣｌ、およびヒドロキシクロロキンＨＣｌを含む。
【００５０】
製薬的な目的
本発明の目的は、疾病から対象を保護することである。「感染または疾病からの保護」にあるような、用語「保護」は、ここでは、「予防」、「抑制」または「治療」を包含して使用される。「予防」は、疾病の誘発に先立つ製薬的な組成の投与を含む。「抑制」は、疾病の臨床的な発現に先立つ製薬的な組成の投与を含む。「治療」は、疾病の出現後の保護的な組成物の投与を含む。治療は改善性または治癒であることができる。
ヒトおよび獣医学的な医薬において、「予防」および「抑制」の間を区別することは常には可能でないということを理解しなければならない。なぜなら、究極的な誘導的な現象は知られていない、潜在的、または現象の出現後にしか患者をよく確かめられないからである。このため、用語「防御」を使用して、「治療」とは異なるが、ここに定義した「予防」および「抑制」の両方を包含するようにするのが通常である。ここで使用する用語「保護」は、「防御」を包含するよう意図している。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記およびKatzung、上記、を参照。これらおよびこれらで引用されている参照はここに完全に参照として組み込まれる。
与えられる「保護」は、完全である必要はなく、すなわち、疾病が完全に予防または根絶される必要はなく、対照個体群に比較して統計的に有意な改善（p＝0.05）が存在すればよい。保護は、疾病症状の発症の重症度または急性度を軽減することに限定することができる。競合的な薬剤に比して比較的小さい程度の保護しか供さない薬剤も、特定の個人について他の薬剤が効果的でない場合、他の薬剤と組み合わせて保護の程度を増大できる場合、または競合的な薬剤に比して安全な場合は価値がある。
好ましくは疾病ステージの時期を一致させて、非治療対照群と治療完了群の疾病の持続時間、重症度、等を比較することで、治療の効果を判定することができる。
防御の効果は、通常、処置群の疾病の発生率および対照群の発生率を比較することで確認することができ、ここで処置群および対照群は等しいリスクであると考えられて、またはリスクの予想される違いについて補正をかける。
一般的に、防御は、家族歴、個人の既往歴、または原因薬物への曝露の増大を鑑みて、疾病について高いリスクであると考えられた場合に与えられる。
【００５１】
製薬的な投与
本発明の少なくとも一の保護的薬剤を、前記の製薬的な組成を使用して、意図した目的を達成する任意の方法により、投与することができる。
投与は経口または非経口的であることができ、そして、非経口的な場合、局所的または組織的のいずれでもよい。たとえば、このような組成の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、または頬側経路といった種々の非経口的な経路によることができる。非経口的投与は、ボーラス注入によってまたは時間をかけての漸進的な灌流によることができる。本発明の製薬的組成を用いた好ましい方法は、皮下、筋肉内または静脈内による適用である。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記およびKatzung、上記を参照。これらは、その中に引用された参照も全て含んで、完全にここに参照として組み込まれる。
活性特異的免疫療法による免疫反応によって軽減することのできる疾病または状態を、予防、抑制、または治療するための典型的な療法は、上記の製薬的な組成の有効量投与することを含み、これは単一の治療として投与されるか、または増強またはブースター投与量として、一週間から約24ヶ月の間の期間内繰り返される。
効果的な投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康、および体重、同時期に行う治療の性質、複数ならば治療の頻度、そして所望の効果の性質に依存すると理解される。以下に用意した効果的な投与量の範囲は、本発明を制限することを意図せず、好ましい投与量の範囲を説明するためのものである。しかしがら、もっとも好ましい投与量は、個々の対象にあわせられていて、これは当業者にとって、過度の実験をせずに、理解および決定できるものである。これは、典型的には、標準の投与量の調製を含み、たとえば、患者が低体重の場合は投与量を減少する。たとえば、Berkowら編、「The  Merck  Manual、第15版」Merck  and  Co.、Rahway、N.  J.、1987；Goodmanら編、「Goodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第8版」Pergamon  Press、Inc.、Elmsford、N.Y.、(1990)；「Avery's  Drug  Treatment：Principles  and  Practice  of  Clinical  Pharmacology  and  Therapeutics、第3版」AIDS  Press、LTD.、Williams  and  Wilkins、Baltimore、MD.（1987）、Ebadi、「Pharmacology」、Little、Brown  and  Co.、Boston、(1985)；Chabnerら、上記；De  Vitaら、上記；Salmon、上記；Schroederら、上記；Sartorelliら、上記；およびKatsung、上記を参照。これら参照およびその中で引用された参照は、ここに完全に参照として組み込まれる。
ヒトに用いる前に、まず、安全性および効力について実験動物で評価する。ヒト臨床実験では、問題となる薬についての臨床前のデータに基づき、そして類似薬（あれば）についての通例の投与量に基づいて、ヒトで安全と考えられる投与量からはじめる。この投与量が効果的である場合、もし望まれるならば、投与量は減らされて、最小有効投与量を決定する。この投与量が有効でない場合、患者の副作用の徴候を観察しながら、慎重に増やされる。たとえば、Berkowら編、「The  Merck  Manual、第15版」、Merck  and  Co.、Rah  way、N.  J.、1987；Goodmanら編、「Goodman  and  Gilman's
The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第8版」Pergamon  Press、Inc.、Elmsford、N.Y.、(1990);「Avery's  Drug  Treatment：Principles  and  Practice  of  Clinical  Pharmacology  and  Therapeutics、第3版」AIDS  Press、LTD.、Williams  and  Wilkins、Baltimore、MD.（1987）、Ebadi、「Pharmacology」、Little、Brown  and  Co.、Boston、(1985)を参照。これらの参照およびその中で引用された参照は、ここに完全に参照として組み込まれる。
各治療に要する全投与量は、予め決定したかまたは臨時の免疫化の予定に従って、複数回の投与（同一または異なることができる）または単一の投与で与薬することができる。この予定は、免疫学的に効果的になるように、すなわち抗原に対する効果的な免疫反応を誘発し、そしてそれによって、可能ならば他の薬剤と組み合わせて、保護を供するように選択される。これを達成する投与量を、「治療上効果的な投与量」として定義する（各投与量が、それだけで与薬した場合、効果的でなくとも、予定は免疫学的に有効であり、そして「治療上効果的な投与量」は免疫化の予定の前後関係においてもっともよく解釈されることに注意）。この使用に効果的な量は、たとえば、ペプチド成分、投与方法、治療する疾病の段階および重症度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
典型的には、70kgの大人について、医薬品の活性成分の一日量は、10ナノグラムから10グラムの範囲である。免疫原について、このような患者に対するより典型的な一日量は、10ナノグラムから10ミリグラムであり、さらに適当には1マイクログラムから10ミリグラムである。しかしながら、本発明はこれらの投与量の範囲に制限されるものではない。
留意すべきことは、本発明の組成は重篤な疾病段階においても、すなわち、生命を危うくするかまたは生命を危うくする可能性のある状況においても、一般的に使用することができる。このような状況では、外来性物質の最小化およびペプチドの相対的な無毒性の観点から、治療医師にとって、これらのペプチド組成の実質的な超過投与が好ましく感じる可能性がある。
効果的である任意の間隔で投与されることができる。間隔が短すぎる場合、免疫麻痺または他の副作用が生じうる。間隔が長すぎる場合、免疫が苦しくなりうる。最適な間隔は、個々の投与量が大きい場合に長くすることができる。典型的な間隔は、1週間、2週間、4週間（または1ヶ月）、6週間、8週間、（または2ヶ月）および1年である。付加的な投与量の与薬の妥当性、および間隔の増加または減少の妥当性は、患者の免疫適格性（たとえば、関連する抗原に対する抗体の水準）の観点から、継続根拠を再評価することができる。
種々の方法がリポソームの調製について利用可能で、これはたとえば以下に記述されている。Szokaら、Ann.  Rev.  Biophys.  Bioeng.  9：467（1980）、米国特許4,235,871、4,501,728、4,837,028おｙび5,019,369。これはここに参照として組み込まれる。
好適な与薬形式は、疾病、免疫原、および投与方法に依存する。可能性として、錠剤、カプセル、トローチ剤、歯科ペースト剤、坐薬、吸入剤、溶剤、軟膏および非経口的デポを含む。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記、およびEbadi、上記。これらおよびその中で引用された参照は、ここに完全に参照として組み込まれる。
免疫原性を強める方法で免疫原を届けることができ、たとえば、抗原提示の「内在性経路」が生じるように、抗原性の物質を細胞内区画に届ける。たとえば、免疫原はリポソーム（これは細胞と融合する）によって閉じこめることができ、またはウイルス性ベクター（これは細胞に感染する）のコートタンパク質に組み込まれることができる。
他のアプローチは、免疫原がペプチドの場合に適応できるのだが、免疫原をエンコードしているむきだしのＤＮＡを、筋肉内注射で宿主に注入するものである。このＤＮＡは内部移行して発現する。
本発明の組成により、自己のＰＢＬｓを初回刺激することも可能である。ＰＢＬｓは顕著かつ所望の反応をもつことを確認し、そしてＰＢＬｓ、またはそのサブセットを対象に投与する。
【００５２】
実施例
二つのグリコリポペプチド１ａおよび１ｂを、液相中のブロック結合法によって合成した。化合物１ａ（図６）は二つのＴｎ−スレオニンおよび一のＴｎ−セリンを含み、同様に化合物１ｂ（図６）は二つのＴｎ−スレオニン、一のＴｎ−セリン、および一のＳＴｎ−セリン（Ｔｎ：ａＧａｌＮＡｃ−Ｏ−；ＳＴｎ：シアリルＴｎ、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−６）αＧａｌＮＡｃ−Ｏ−）を含む。１ａおよび１ｂの合成のための戦略は、レトロ合成プラン中に提示される（図５）。最終グリコペプチドは、対応する前駆体２ａおよび２ｂを分解することで得られ、これらは二つのブロックを結合することで得られる。すなわち、２０−マー３および２３−マー４ａまたは４ｂである。この２０−マーはさらに、１１−マー５および９−マー６に解体される。同様に、この２３−マー４ａおよび４ｂも、１１−マー７および１２−マー８になる。ブロック５および７はさらに基本的なブロック９、１０および９／１１、１２に分割される。このブロック８はさらに、ブロック１４およびブロック１３に分割され、これは６に類似している。このブロック１４はセリン−セリン−ロイシン（Ｓ＊Ｓ＊Ｌ）三連構造で、ここにおいてセリンはリピド鎖に付加していて、最終グリコリポペプチド中でリピドキャリアとしてはたらくように設計されている。基本ブロック５、６、９、１０、１１、１２、１３および１４（図７）は、各グリコシル化および非グリコシル化保護アミノ酸から合成される。
【００５３】
基本ブロックの合成
リポ−アミノ酸三連構造、１４（図８）は、Ｂｏｃ保護リポセリンから合成されて、これは、Ｂｏｃ保護セリンおよびブロモテトラデカンをＤＭＦ中のＮａＨで処理することによって、５５％の収率で順番に合成される。このリポ−セリンは、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によってロイシンメチルエステルに結合する。このＢｏｃ基は、生成Ｂｏｃ−リポ−セリン−ロイシンメチルエステルからＨＣｌによって脱保護して、そして他のＢｏｃリポ−セリンに結合して１４を収率８４％で与える。ブロック６および１３（図９）は、個々の保護アミノ酸から合成される通常のブロックＡＰＰＡＨＧＶから合成される。ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によってトリチル保護Ｆｍｏｃ−ヒスチジンがグリシンベンジルエステルに結合して８９％の収率で保護ＨＧブロックを与え、これから、６℃でＴＨＦ−メタノール混合物中においてパラジウム炭の存在下ギ酸アンモニウムで処理することによって、ベンジルエステルが開裂される。ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によって遊離酸がバリンベンジルエステルの遊離アミンと結合する。このＦｍｏｃ基は、室温においてモルフォリンで処理して脱ブロック化してから、Ｆｍｏｃ−ＰＡ−ＯＨおよび続いてＦｍｏｃ−ＡＰ−ＯＨと結合して、ＦｍｏｃＡＰＰＡＨ（Ｔｒｔ）ＧＶベンジルエステルを与える。このブロックをまずモルフォリンで処理してＦｍｏｃ保護を除去し、次にＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によってＦｍｏｃ保護Ｓ（ｔＢｕ）Ｔ（ｔＢｕ）−ＯＨをに結合して、ブロック１３を収率９１％で得る。ＡＰＰＡＨ（Ｔｒｔ）ＧＶベンジルエステルの遊離アミンをグリコシル化アミノ酸、Ｔｎ−スレオニンおよびＴｎ−セリンに同じ方法で連続して結合させて、全工程で６０％の収率でブロック６を得る。
ブロック９を、まずＤＣＣ／ＮＨＳ法によってｔＢｕ保護スレオニンおよびセリンの結合から始めてＴＳブロックを得た。これをモルホリン処理した。生成遊離アミンを同じ方法を用いてＦｍｏｃ保護ＡＰ−ＯＨで再び処理した。生成テトラペプチドをｔＢｕ保護アスパラギン酸と結合して、ブロック９を収率７５％で得た。グリコシル化アミノ酸、ＳＴｎ−セリンを含んでいる類似のブロック１１を、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によって連続的に、Ｆｍｏｃ保護ＡＰ−ＯＨをｔＢｕ保護アスパラギン酸ベンジルエステルに結合して、次にＳＴｎ−セリンおよびｔＢｕ&shy;−スレオニンに結合することによって合成した。モルフォリンによるＦｍｏｃ保護の最終的な脱保護により、全体で約８０％の収率により１１を得た。
ブロック１０および１２は、通常のブロックＦｍｏｃＲＰＡＰＧベンジルエステルから合成され（図１２）、これは順番に、Ｂｏｃ保護プロリンをグリシンベンジルエステルと結合することから始め、これをＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によってＢｏｃグループを脱ブロック化した後にＦｍｏｃＰＡ−ＯＨブロックと結合することによって合成した。得られたＰＡＰＧブロックはＰｍｃ保護アルギニンと結合してＦｍｏｃＲＰＡＰＧベンジルエステルを与えた。これにＦｍｏｃ保護後のｔＢｕ保護スレオニンに結合させブロック１０が得られた。一方、Ｔｎ−スレオニンに結合させブロック１２を得た。それぞれ収率は８２％および８３％であった。
【００５４】
ブロック結合によるグリコリポペプチド（１ａ／１ｂ）の合成
グリコペプチド１ａおよび１ｂの組立の最終ステップは、予定した戦略に従い各段階における適切なブロックを用いることで実施される（図１３）。それぞれ適切な保護アミノ酸から開始される七の基本ブロックの合成は上述したとおりである。これら基本ブロックのすべては適切に結合して、対応する中間体第二ブロックを得て、これは完全にブロック化した化合物２ａおよび２ｂに導かれ、これらはそれぞれ最終生成物１ａおよび１ｂの前駆体である。ブロック９をＤＣＣおよびＮＨＳで処理して対応するコハク酸イミドを作り、塩基の存在下ＤＭＦ中で１０の遊離アミンと結合して（モルフォリンで処理してＦｍｏｃグループを非ブロック化する）ブロック５を４５％の収率で得た。同様に、ブロック９を１２の遊離アミンと結合してブロック７ａを６７％の収率で得た。１１の遊離酸（６℃にて、ＴＨＦ−ＭｅＯＨ中、ギ酸アンモニウムおよびパラジウム炭で処理してベンジルエステルを非ブロック化する）を、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によって１２の遊離アミンと結合して、ブロック７ｂを９０％収率で得た。同様に、１３の遊離酸をＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によってＢｏｃ脱保護１４と結合してブロック８を９２％の収率で得た。その他のブロックのそれ以上の結合は、すべてＤＣＣ／ＨＯＢｔ法によって実施される。８の遊離アミンの７ａの遊離酸への結合は９０％の収率で４ａが得られ、一方７ｂの遊離酸への結合は６３％の収率で４ｂが得られた。６をモルフォリンで処理して遊離アミンを放出させて、次に５の遊離酸と結合させて９５％の収率で３を得た。３の遊離酸の４ａの遊離アミンへの結合により前駆体２ａを得る一方、４ｂの遊離アミンへの結合により他の前駆体２ｂを得た。すべての保護基の三段階の非ブロック化における２ａおよび２ｂはともに、平均６０％の収率でそれぞれ最終化合物１ａおよび１ｂを与えた。作業終了後、アセトニトリル−水系を用いたＣ４カラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣによって最終生成物を脱塩および精製した。
このように、ごく少数の基、アミン機能性についてのＦｍｏｃおよびＢｏｃならびに酸機能性についてのベンジルエステルおよびメチルエステルが、このペプチド合成において使用された。他のすべてのアミノ酸は、ｔＢｕ（スレオニン、セリンおよびアスパラギン酸について）またはＰｍｃ（アルギニンについて）またはＴｒｔ（ヒスチジンについて）グループのいずれかにより適切に保護された。適切な保護基をもったグリコシル化（ＴｎおよびＳＴｎ）セリンおよびスレオニンを合成し、ブロック中適切な場所で使用した。同様に、合成前リポ−セリンを適切なブロックの合成において使用した。このため、全合成は、最小の化学反応の多様性にて達成した。結合の二つの方法のみ、すなわち、ＦｍｏｃおよびＢｏｃについてのＤＣＣ／ＮＨＳ法およびＤＣＣ／ＨＯＢｔ法ならびに標準非ブロック化法が全合成に使用された。このため、結合および脱結合の一般的な方法についての簡単な記述を与える。
【００５５】
Ｉ．結合法
ペプチドブロックの合成またはブロック結合に使用される二つの製法、すなわち、ＤＣＣ／ＮＨＳ法およびＤＣＣ／ＨＯＢｔ法がある。二つの方法はともに収率が非常によい。
ＤＣＣ／ＮＨＳ法
窒素雰囲気下、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸またはペプチドブロックＡ（14.33mmol）、Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミド（17.13mmol）およびＤＣＣ（17.15mmol）を入れたフラスコに無水ＴＨＦを加え、一晩撹拌した。白色固体として生成した尿素を濾過してからＴＨＦで洗浄した。溶媒を収集した濾液から除去してから減圧下洗浄した。コハク酸イミドは、粗製、またはクロマトグラフィーもしくは結晶化による精製後のいずれかで使用した。コハク酸イミド誘導体を、次のアミノ酸に二つの方法で結合させた。
方法Ａ：
コハク酸イミド誘導体をＤＭＦ（120ml）に溶解し、遊離アミノ官能基およびカルボキシル官能基（14.29mmol）を持った適切な保護アミノ酸またはペプチドブロックＢおよびＤＩＥＡ（2.5ml）を加えた。この懸濁液を室温にて一晩撹拌すると、時間中に透明溶液になった。ＤＭＦを除去して残渣をＤＣＭ中に再度溶解し、水（75ml）および塩水（75ml）で洗浄してから無水硫酸ナトリウムで乾燥した。このＤＣＭ層を濃縮して粗製アミノ酸ブロックＡＢを得て、これを0.5％酢酸を含むＤＣＭ中の（3-5％）メタノールを使用してカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶液の除去後、75％の収率で純粋ブロックＡＢを白色固体として得た。
方法Ｂ：
アミノ酸Ｂ(5.42mmol)を水に溶解してから重炭酸ナトリウム（4.5mmol）を加えた。混合物を30分間撹拌してから、１，２−ジメトキシ−エタン（250ml）に溶解したブロックＡのコハク酸イミド誘導体（3.0mmol）を加えた。反応混合物を一晩室温にて撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーター上で除去して、白色スラリーを得、これを0℃に冷却してから10％ＨＣｌでｐＨ4-5まで酸性化した。ＤＣＭをこの混合物に加えてから数分間撹拌して、内容物を分液ロートに移した。このＤＣＭ層を分離して、水層をＤＣＭ（×2）で抽出した。収集した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して乾燥物に濃縮した。残渣を温かい酢酸エチルおよびヘキサンで再結晶して純粋ペプチドブロックＡＢを約80％の収率で得た。
ＤＣＣ／ＨＯＢｔ結合：
遊離カルボン酸基をもったアミノ酸またはブロックＡ（4.09mml）、ＨＯＢｔ（4.46mmol）ならびに遊離アミンをもったブロックＢ（3.72mmol）を約50ml乾燥ＤＣＭ中に溶解した。ＤＣＣ（7.44mmol）を10ml乾燥ＤＣＭ中に溶解してから上記混合物に室温にてゆっくり滴下して加えた。この反応混合物を室温にて一晩撹拌した。約0.4mlの水をこの反応混合物に加えてから30分間撹拌し、すべての未反応ＤＣＣを尿素に変換した。この形成した尿素を無水硫酸ナトリウムを通して濾過し除去し、DCMを完全に除去した。ＤＣＭ中4-5％メタノールを使用してシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製した。溶液を除去すると、このペプチドブロックＡＢの純粋な生成物を約85-97％の収率で得た。
【００５６】
ＩＩ．非ブロック化法
Ｆｍｏｃ非保護：
Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（1.0mml）をモルフォリン（10ml）とともに室温で30分間撹拌した。ＴＬＣが反応完了を示したとき、モルフォリンを減圧下除去し、トルエンで共蒸留した。残渣を強減圧下乾燥してから、粗製物として、またはＤＣＭ中5-10％メタノールを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したものとして、次のステップに使用した。得られた遊離アミンの収率は約92-95％であった。
Ｂｏｃ脱保護：
Ｂｏｃ保護化合物（19.0mmol）の酢酸エチル溶液に10ml濃ＨＣｌを加えてから、約30分間撹拌した。ＴＬＣが反応完了を示したとき、減圧下溶媒を除去した。残渣を200mlＤＣＭ中に溶解してから重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。水層をＤＣＭで数回抽出した。有機層を濃縮してから強減圧下乾燥した。粗製アミンを定量的な収率で得て、そのまま次のステップに使用できる。
ベンジルエステル脱保護：
ベンジルエステル（0.3mol）を10mlのＴＨＦ：ＭｅＯＨ（1：1）混合物に溶解してから、Ｐｄカーボン100mgを加えた。この混合物を６℃に冷却し、ギ酸アンモニウム（4.0mmol）を加えて、６℃にて40分間撹拌した。ＴＬＣが不完全な反応を示した場合には、さらにＰｄ／Ｃおよびギ酸アンモニウムを加えて、ＴＬＣが開始物質の不在を示すまで反応を続けることを要した。ＴＬＣが反応完了を示したとき、反応混合物を小さなセライト床上で濾過してＰｄ／Ｃを除去し、触媒をメタノールおよびＤＣＭで連続的に洗浄した。収集した濾液を濃縮して、残渣をＤＣＭの最小量に溶解した。白色固体を沈殿させて除去した。濾液を濃縮して粗製遊離酸を得て、１％酢酸を含むＤＣＭ中7-10％メタノールを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。純粋な化合物を白色固体として得、これをメタノール中に再度溶解してからトルエンとともに共蒸留して存在する酢酸の微量を除去した。それでも化合物中に酢酸の微量が存在する場合、過剰量のクロロフォルムに溶解してから少量の塩水（×４）で洗浄した。クロロフォルム層を乾燥および濃縮して遊離アミノ酸を約85-90％の収率で得た。
【００５７】
III．グリコリポペプチドの最終非ブロック化：
酸に鋭敏なグループの非ブロック化（試薬Ｂによる）：
完全にブロック化したグリコリポペプチド２ａまたは２ｂ（0.08mmol）をカクテル試薬Ｂ（ＴＦＡ：フェノール：トリイソプロピルシラン：水、8.8：0.5：0.2：0.5）の60mlとともに室温で2時間撹拌した。溶液を90％まで減圧下除去してから冷却したエーテル（200ml）を加えた。白色沈殿物が形成し、これを微細に焼結したロートを通じて濾過し、多量の冷却エーテルでフェノールを洗浄除去した。この化合物を最終的にメタノール中に溶解し、強真空下、濃縮および乾燥した。ＴＬＣは反応が完全であることを示し、収率は通常約95-98％であった。
塩基に鋭敏なグループの非ブロック化（ナトリウムメトキシドによる）：
上記ステップからの化合物（0.055mmol）を20ml乾燥メタノールに溶解してから、1.5mlのＮａＯＭｅ（0.3Ｍ）メタノール溶液を、反応混合物のｐＨをチェックしながらゆっくりと加えた。このｐＨは約9-10であり、塩基の全体的な濃度は約0.02Ｍである。混合物を室温にて３時間撹拌して、メタノール中５％酢酸で混合物のｐＨが約６に変化するまで酸性化した。溶媒を減圧下除去してから、残渣を水（20ml）に溶解し、エーテル（15ml×1）で抽出した。水層を分離してから凍結乾燥して、白色のふわふわした固体を生成物として得、これもまた少量の塩を含んでいる（酢酸ナトリウム）。
メチルエステルの脱ブロック化：
上記のステップからの化合物（0.06mmol）を20mlのＤＭＦ：水（７：１）混合物に溶解してから０℃に冷却した。ＮａＯＨの0.1Ｎ溶液5mlを反応混合物に滴下して、塩基の濃度が全体で0.02Ｍ溶液となるようにした。この反応混合物を０℃にて２時間撹拌してから、メタノール中5％酢酸でｐＨが約６になるまで酸性化した。この溶媒を減圧下除去してから、強真空下乾燥して粗製化合物１ａまたは１ｂを得た。
【００５８】
ＩＶ．脱塩手順  
この粗製化合物をＲＰ−ＨＰＬＣ精製に先立ち脱塩した。カラムを約100mlメタノール中のＣ４物質で充填してから、同一溶媒で一時間溶出した。徐々に、溶媒を100％メタノールから100％水に（溶媒の急激な変化による熱遊離を避けるために水の量を徐々に増やすことにより）変化させた。このカラムを水でもう一時間溶出した。生成物を水に溶解してから、最初に約500mlの水および次に60％のアセトニトリル水溶液に変えて溶出した。この塩は最初に水で溶出し、続いて60％アセトニトリル水溶液中で不純物が溶出した。次に溶媒を90％メタノール水溶液に変えた。生成物はそ極性不純物とともにゆっくり溶出してから、100％メタノールに溶媒を変えると完全に溶出する。生成物を含む分画をすべていっしょにプールしてから、減圧下溶媒を除去した。脱塩した粗製生成物を、さらにＣ４カラム上0.1％ＴＦＡを含む水およびアセトニトリルを用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ（図１４および１５）によって精製した。
【００５９】
Ｖ．選択ブロックの分光および分析データ：
ブロック６：
MS m/z（％）：2203.9［M+Na］＋（100），2181（35），113.6（10）．
1HNMR：300MHz（CDC13+CD30D）dO.82（d，J=5Hz，3H，CH3（Va1）），
0.85（d，J:5Hz，3H，CH3（Va1）），1.2-1.25（m，16H），1.3（d，J=
7Hz，3H，CH3（Thr）)，1.6-1.9（m，8H，CH2-CH2（Pro）），1.75（s，
3H，COCH3），1.85（s，3H，COCH3），22（m，2H），2.95（d，J=6Hz，
2H，CH2（His）），3.35-3.6（m，4H，N-CH2（Pro）），3.8（m，5H），3.9-
4.6（m，20H），4.73-4.85（m，2H），5.O（m，１H），5.05（dd，J=12，
10Hz，2H，CH2C6H5），5.2-5.3（m，3H），5.45（s，1H，CHC6H5），5.5
（s，1H，CHC6H5），6.7（s，1H，CH（His）），7.1（m，6H，
5ArH，CH（His）），7.2-7.8（m，43H，8ArH（Fmoc），35ArH），8.0（m，
4H，NH）．[α]D20：＋27.5  ｃO.1，CHC13）
ブロック９：
MS m/z（％）：902.5［M+Na］＋（100），880（10），846.4（25）.
1HNMR：500MHZ（CDC13+CD30D）d1.09（d，J=11.5Hz，3H，CH3
（Thr）），1.19（s，9H，C（CH3）3），1.32（s，9H，C（CH3）3），1.39（d，
J=12Hz，3H，CH3（Ala）），1.45（s,9H,C（CH3）3），1.9-2.1（m，
4H，CH2-CH2（Pro）），2.76（dd，J:17，5Hz，1H，CHH（Asp）），2.86
（dd，J＝17，5Hz，1H，CHH（Asp）），3.48（dd，J=9，5Hz，1H，
CHH（Ser）），3.64-3.74（m，2H，N-CH2（Pro）），3.85（dd，J=9，4
Hz，CHH（Ser）），4.12（m，lH，CH（Thr）），4.25（m，2H，2CH（Pro，
Ala）），4.40-4.50（m,4H，CH2（Fmoc），CH（Ser），CH（Thr）），4.7
（t.J=5Hz，1H，CH（Fmoc）），4.77（m，1H，CH（Asp）），7.1-7.8
（m，8H，ArH（Fmoc））.
[α] D20：−5.5 ｃ0.2，CHC13）
【００６０】
ブロック１０：
MS m/z（％）：1254.6［M+Na］＋（100）
1H  NMR：500MHZ（CDC13）d1.05（d,J=6Hz，3H，CH3（Thr）），1.25
（s，9H，C（CH3）3），1.29（d，J=3.5Hz，6H，C（CH3）2（Pmc）），1.35
（d，J≡7Hz，3H，CH3（A1a）），1.8（t，J=7Hz，2H，CH2（Pmc）），
1.90-2.0（m，10H），2.1（s，3H，CH3（Arg）），2.5（s，3H，Ar-CH3
（pmc）），2.6（s，3H，Ar-CH3（Pmc）），2.62（t，J=7Hz，2H，Ar-CH2
（Pmc）），3.05-3.30（2m，2H，CH2（Arg）），3.55-3.75（m，5H，N-CH2
（Pro）），3.95（m，2H），4.10-4.30（m,4H），4.40（m，2H，CH2
（Fmoc）），4.53（m，2H，CH2（Arg）），4.65（m，1H），4.75（m，1H），
5.14（d，J=1.5Hz，2H，CH2C6H5），5.87（d，J=6Hz，1H，NH），
6.17（bs，2H，NH2），6.4（bs，1H，NH），6.80（d，J=6Hz，1H，
NH），7.20-7.80（m，14H，ArH（Fmoc，C6H5），1NH），8.20（d，J=6
Hz，1H，NH）.
[α] D20＝−14.5 ｃ0.1，CHCl3）
ブロック１１：
MS  m/z（％）：1758.7［M+Na］＋（100），1736（7），1398.7（8），891.6（10）.
1HNMR：500MHZ（CDC13）d1.08（d，J=6Hz，3H，CH3（Thr）），
1.32（s，9H，C（CH3）3），1.34（s，9H，C（CH3）3），1.42（d，J=7Hz，
3H，CH3（Ala）），1.85-2.20（m，25H，CH2-CH2（4Pro），7COCH3
（STn）），2.52（dd，1H，J＝12.5，4.5Hz，1H，STn），2.57（dd，J
＝17.5Hz，1H，CHH（Asp）），2.70（dd，J=17.5Hz，1H，CHH
（Asp）），3.28（dd，J=9.5，6.5Hz，lH，STn），3.55（m，1H），
3.6-3.9（m，6H）。3.95-4.40（m，8H），4.55-4.65（m，3H），4.70−
4.85（m，3H），5.02（q，J=45，12Hz，2H），5.1（d，J=４Hz，
2H），5.15-540（m，2H），5.55（d，J=3Hz，1H，NH），6.OO（d，
J=5.5Hz，1H，NH），6.95（d，J=8Hz，1H，NH），7.12（dd，J
＝15.7Hz，1H，NH），7.25-8.00（m，19H，ArH（Fmoc，C6H5），NH）.
[α] D20＝＋4.0 ｃO.1，CHCl3
【００６１】
ブロック１２
MS  m/z（％）：1593.7［M+Na］＋（100），1571.7（80）.
1HNMR：300MHz（CDC13）d1.1-1.4（m，12H，CH3（Ala，Thr，Pmc）），
1.7-2.5（m，18H，CH2（Arg，Pro，Pmc），NHCOCH3，ArCH3），2.50-2.70
（m，8H，ArCH3（Pmc）），2.90-3.30（2m，2H，CH2（Arg）），3.50-3.70
（m，4H），3.70-3.90（m，3H），4.05-4.50（m，9H），4.50-5.10（m，
8H）、5.30（m，2H，CH2C6H5），5.50（s，lH，CHC6H5），5.80-6.00（bs,
2H，NH2），6.50（bs，1H，NH），7.10-7.60（m，19H，ArH（C6H5，
Fmoc）），7.7（m，2H，ArH（Fmoc）），8.10（m，3H，ArH_（Fmoc），1NH）.
[α] D20＝＋19.O ｃO.1，CHC13）
ブロック１３：
MS  m/z（％）：1524［M+Na］＋（70），1503.8（100）.
1HNMR：500MHZ（CD30D）dO.9（d，J=7Hz，6H，C（CH3）2（Va1）），
1.15（d，J=6Hz，3H，CH3（Thr）），1.20（s，9H，C（CH3）3），1.24
（s，9H，C（CH3）3），1.30（m，6H，CH3（2Ala），1.85-2.2（m，9H），
3.O（m，2H，CH2(His))，3.50-4.0（m，8H，CH2-CH2（Pro))，4.10-
4.80（m，13H)，5.10（m，2H，CH2C6H5)，6.8（s，1H，CH(His))，
7.0-8.O（m，29H，ArH（Fmoc，C6H5)，CH(His)).
[α] D20＝−19.75 ｃ  0.2，CHC13)
ブロック１４：
MS  m/z(％)：834［M+Na］＋(100)，778.6(7)，712.6(7)，539.5(5).
1HNMR：500MHZ（CDC3）d0.85（t，J＝6.5Hz，6H，CH3（21ip)，
0.90（2bs，6H，CH3（Leu），1.24（s，44H，CH2(1ip)），1.43（s，9H，
C(CH3)3)，1.50-1.55（m，4H，OCH2CH2−(1ip)，1.60-1.65（m，3H，CH2-
CH(CH3)2(Leu))，3.40-3.50（m，5H，O-CH2−(1ip)，CHH(Ser))，3.55
(m，lH，CHH（Ser)），3.66（s，3H，COOCH3)，3.750-3.78（m，1H，
CHH（Ser)，3.85-3.88（m，1H，CHH（Ser))，4.24(bs，1H，CH
(Leu))，4.45-4.48（m，1H，CH（Ser）），4.58-4.62（m，1H，CH
(Ser))，5.36（bs，1H，NH)，7.04（d，J＝8Hz，1H，NH)，7.15(d
=7.5Hz，1H，NH).
[α] D20＝＋8.75 ｃO.2，CHC13)
【００６２】
ブロック５：
MS  m/z(％)：1895［M+Na］＋(100)，1873（90)，931（20)．
1HNMR：600MHZ（CDC13)，d1.03（d，J=6.5Hz，3H，CH3(Thr))，
1.07（d，J=6.5，3H，CH3(Thr))，1.17（s，9H，C(CH3)3)，1.24
(s，9H，C(CH3)3)，1.26（m，3H，CH2(Pmc)），1.29（d，J=5Hz，
3H，CH3(Ala))，1.32(s，9H，C(CH3)3)，1.36(t，J＝6.5Hz，6.O
Hz，3H)，1.39（d，J=5Hz，3H，CH3（Ala），1.40（s，9H
(C(CH3)3)，1.55（bs，1H)，1.62（bs，lH)，1.7）（bs，1H)，1.8(t，
J＝6.5Hz，2H)，1.83-2.15(m，17H)，2.28(m，1H)，2.53-2.65
(m，9H)，2.83（dd，J＝11.5，5.0Hz，1H，CHH（Asp))，3.10-3.30
(m，2H，CH2(Arg))，3.42（m，1H)，3.50-3.70（m，6H，CH2-CH2
(Pro))，3.88-4.05（m，3H)，4.10-4.18（m，2H)，4.20-4.30（m，
3H)，4.35-4.42（d，J=7Hz，2H)，4.5（m，4H），14.60-4.65（p，
J=6.5Hz，1H)，4.7(m，2H)，4.78(p，J=7Hz，lH)，5.13(d，
J=2Hz，2H，CH2C6H5)，5.95（d，J=6.5Hz，1H，NH），6.３（bs，
2H，NH2），6.95（bs，1H，NH），7.2-7.8（m，18H，ArH(Fmoc)，NH)．
[α] D20＝＋0.5  ｃO.1，CHC13)
ブロック７a：
MS  m/z(％)：2233.5［M+Na］＋（100），2211.5（25），1128.3（35)，
1105.5（33）.
1HNMR：500MHZ（CDC13+CD30D)，d1.0-1.35（m，45H，CH3（Thr)，
C(CH3)3，CH3(Ala)，CH3(Pmc))，1.50-2.15(m，22H，CH2-CH2（Pro），
CH2，ArCH3（Pmc），CH2（Arg），NHCOCH3)，2.35-2.85（m，1OH)，3.1
(bs，2H)，3.30-3.70（m，7H)，3.76-4.10（m，10H)，4.15-4.80(m，
13H)，5.O-5.10（m，3H)，5.25（m，2H，(CH2C6H5))，5.45（s，1H，
CH(C6H5))，7.18-8.O（m，24H，ArH(Fmoc，C6H5)，NH）.
[α] D20＝−15.0  ｃ0.1，CHCl3)
ブロック７ｂ：
MS  m/z(％)：3001［M+Na］＋(25)，2979（100）．
1HNMR：500MHZ（CDC13)，d1.08（d，J=3Hz，3H，CH3（Thr)），
1.14（d，J＝3Hz，3H，CH3（Thr）），1.20-1.48（m，30H，CH3（Ala），
C(CH3)3，C(CH3)2(Pmc)），1.50-2.20（m，43H，CH2（Arg），ArCH3，
ArCH2（Pmc)，CH2-CH2（Pro)，COCH3)，2.40-2.80（m，11H)，3.10-
3.40（m，3H)，3.40-3.65（m，4H），3.65-3.80（m，5H)，3.80-4.18
(m，13H)，4.18-4.60（m，15H)，4.60-4.90（m，6H)，4.90-5.0（m，
2H），5.08-5.24（m，5H），5.24-5.42（m，3H)，5.45-5.6（m，2H)，
5.95（m，1H)，6.9（bs，3H)，7.25-8.05（m，33H)．
[α] D20＝＋4.5  ｃO.1，CHC13)
【００６３】
ブロック８：
MS  m/z(％)：2129［M+Na］＋（35），2107（100）．
1HNMR：500MHZ（CDC13+CD30D），d0.88（t，J=7Hz，6H，CH3(1ip)），
0.90-0.98（m，12H，CH(CH3)2（Va1)，CH（CH3)2（Leu）），1.10
（d，J=6.5Hz，3H，CH3（Thr）），1.20-1.40（m，68H，CH3（Ala)，
CH2（1ip），C(CH3)3），1.48-1.74（m，7H，OCH2CH2（1ip），CH-CH2
(Leu))，1.80-2.25（m，９H)，3.0（d，J=6Hz，2H，CH2（His），
3.40-3.85（m，19H），7.25-7.40（m，12H)，7.60-7.85（m，6H）．
[α] D20＝−16.0  ｃO.1，CHC13)
ブロック３：
MS  m/z(％)：3723.8［M+H］＋（55），3481.2（100）1862.1（75），
1762.7（25）．
1HNMR：500MHZ（CD30D)，dO.90（d，J=7Hz，6H，CH(CH3)2
(Va1)），1.05-1.45（m，63H，C(CH3)3，CH3（Thr)，CH3（Ala)，C(CH3)2
(Pmc)）．1.45-2.20（m，35H)，2.50-2.90（m，10H)，2.40-2.90（m，
10H），3.0-3.20（m，4H，CH2（Arg)，CH2（His）），3.50-4.25（m，
30H），4.3-4.95（m，24H），5.05-5.17（m，3H)，5.30-5.40（m，3H)，
5.55（s，1H，CHC6H5)，5.63（s，1H，CHC6H5)，6.80（s，1H，CH
(His)，7.13（m，6H，CH（His），ArH），7.25-7.48（m，32H），7.58-
8.20（m，11H).
[α] D20＝＋25.O  ｃO.1，CHC13)
ブロック４ａ：
MS m/z(％)：2018［M+2Na］＋2（25），2007（75），1995（100），1928
（25），1885（25）.
1HNMR：500MHZ（CD30D），d0.9（m，18H），1.05-1.30（m，107H)，
1.4（s，9H），1.50-1.70（m，10H），1.75-2.30（m，28H），2.50（d，
J=4.5Hz，6H），2.60-2.90（m，4H），3.O-3.40（m，4H)，3.40-4.O
（m，27H），4.O-4.80（m，36H），5.10（m，1H），5.35（dd，1H，J=
11，3Hz，1H)，5.55（s，1H，CHC6H5)，6.80（s，1H，CH（His）)，7.11
（m，6H），7.20-8.0（m，28H）．
[α] D20＝−6.5  ｃO.1，CHC13）
ブロック４ｂ：
MS  m/z（％）：2387.5［M+2Na］＋2（70)，2377.5（100）．
1HNMR：500MHZ（CD30D)，dO.8-0.9（m，18H)，1.10-1.15（m，9H,
CH3（Thr）），1.15-1.45（m，98H)，1.45-2.40（m，59H)，2.40-2.80
（m，11H），2.90-3.10（m，2H），3.10-3.25（m，3H)，3.35-4.0（m，
35H），4.O-4.20（m，15H），4.25-4.50（m，18H），4.60-4.90（m,
10H），5.0-5.15（m，3H），5.25-5.40（m，5H），5.55-5.62（m，3H），
6.80（s，1H，CH（His）），7.1-7.45（m，30H），7.50-8.15（m,12H）．
[α] D20＝＋4.0  ｃ0.1，CHC13）
【００６４】
ブロック２ａ：
MS  m/z（％）：MALDI，7403［M+Na］＋（95），7161.8（100）．
ES+，3713（30），3592.2（10），2483.1（100），1868.3（35）．
1HNMR：600MHZ（CD30D），d0.85-O.95（m，24H），1.05-1.34（m,
161H），1.40（s,9H），1.41（s,9H），1.48-1.70（m，12H），1.75-2.O
（m，49H），2.06（s，3H），2.08-2.20（m，10H），2.50-2.56（m，13H），
2.59-2.64（m，3H），2.66-2.75（m，2H），2.76-2.90（m，2H），2.94-
3.06（m，4H），3.08-3.25（m,4H），3.32-4.0（m,52H），4.O-4.2
（m，20H），4.24-4.90（m，42H），5.10（dd,J=19，5Hz，2H），
5.28-5.39（m，4H），5.53（s，1H，CHC6H5），5.57（s，1H，CHC6H5），
5.59（s，1H，CHC6H5），6.72（s，1H），6.75（s，1H），6.95-7.15（m，
13H），7.25-7.30（m，12H），7.33-7.45（m，10H），7.55-8.01（m，14H）．
[α] D20＝−0.5  ｃ0.1，CHC13）
ブロック２ｂ：
MS  m/z（％）：MALDI，8147.6［M］＋（100）．
ES+，4096（65），2738.7（100），2059.6（17）．
1HNMR：600MHZ（CD30D），d0.85-1.O（m，24H），1.05-1.45（m,
161H），1.45-2.40（m，94H），2.45-2.90（m，21H），2.90-3.30（m,
9H），3.40-4.30（m，80H），4.30-5.O（m，52H），5.02-5.15（m，4H），
5.25-5.40（m，8H），5.50-5.65（m，4H），6.75（s，2H），7.10-7.20
（m，13H），7.20-7.65（m，54H），7.70-8.10（m，8H）．
[α] D20＝O.0  ｃ0.1，CHC13）
【００６５】
化合物１ａ：
MS  m/z（％）：MALDI，5046.89［M+H］＋（100），4824.66（25）．
ES＋，2524.2［M＋2H］+2（30），1682.9（90），
1262.6（100）． 
［α］Ｄ20＝−100.0  ｃ0.1，H２O
化合物１ｂ：
MS  m/z（％）：MALDI，5541.34［M+H］＋（100），5249.5（50），5028.21（55）．
ES+，2771［M+2H］＋2，(25)，1848（55）．
（20），1386（100），1313（70），1263（85），1212（55）．
［α］D20＝−29.5.0  ｃ0.1，H2O．
【００６６】
免疫学的調査：
合成グリコリポペプチド（ＧＬＰ）１ａおよび１ｂの二つの実施例に対する免疫学的反応を完全に調査した。この結果は、これら分子に組み込まれた構造的な特徴が、体液性免疫反応および細胞性免疫反応両方の広範にわたって反映していることを示している。合成リピドＡが、リポソーム中ＧＬＰの両方の形成の免疫賦活剤として使用されてきた。
二つのグリコペプチド１ａおよび１ｂについてワクチン形成による免疫化をしたマウスからの免疫学的データは、１ａおよび１ｂそれぞれに示されていて、図１６に提示している。合成リピド−Ａでリポソーム中でのグリコリポペプチド形成のいずれか一により免疫化したＣ５７Ｂｌ／６マウスグループ（図１６）は、非常に強力かつＴ細胞特異的増殖性の反応ならびに高いＩＦＮ−ｇレベルを産生した（図１７および図１８）。二つの免疫化のあとの同じマウスから取りだした血清を、特異的ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体タイターについて種々の固相に対してスクリーニングした。１ａおよび１ｂグリコリポペプチドを合成固相の原料として使用し、ノイラミニダーゼ処理ヒツジ顎下ムチン（ＯＳＭ）、およびガン患者より得た腹水から精製したヒトＭＵＣ１ムチンを天然固相の原料として使用した。表３に示したように、１ａおよび１ｂともに強力なＩｇＧ抗体反応を合成固相に対して１／218,700のタイターで誘発した。Ｍｕｃ１ムチン固相に対してはタイターは１／300から１／900の範囲であった。
ＩｇＭ反応を表４に示す。両方のグリコ−リポ−ペプチドがＩｇＭタイターを合成固相に対して中央値１／2700のタイターで示した。類似のタイターが固相としてノイラミニダーゼ処理ＯＳＭで観察され、これはＴｎ炭水化物抗原に対する炭水化物特異的抗体を示唆する。いくつかのＩｇＭタイターがヒトＭＵＣ１ムチン固相に結合することが見出されている。これも、免疫血清抗体がヒトＭＵＣ１形質移入腫瘍細胞に結合することを証明する。
提示したデータは、合成グリコリポペプチドが、リポソーム送達システムに形成される場合、ＭＵＣ１抗原の合成および天然原料の両方に対して細胞免疫反応（Ｔ１）および体液性免疫反応（Ｔ２）の両方を非常に強力に誘発することを明らかに示した。これらの高い反応は、これらの合成グリコリポペプチドを認識する正常Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの結果であることができ、これは、外来性抗原としての、ヒトＭＵＣ１ムチンの擬態である。これらの抗原に対してヒトＭＵＣ１遺伝子で形質転換したマウス中で耐性を示すかどうかを調べるために、ＭＵＣ１ムチンを発現している遺伝子組換えマウスを免疫化した。図１８に示すように、ヒトＭＵＣ１遺伝子組換えマウスは、正常Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに観察される免疫反応に匹敵する、強力なＴ細胞特異的増殖性反応およびＩＦＮ−ｇ産生を維持している。ヒトＭＵＣ１で遺伝子組換えをしたマウスの免疫化は、正常Ｃ５７Ｂｌ／６に観察されるのと同じように高いタイターのＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を複製する（表５および６）。強力な免疫反応、Ｔ１およびＴ２種の両方は、隔週で１０回の免疫化を通じて維持された。これらの観察により、合成グリコペプチドリポソームワクチンが、マウスモデル中で自己−抗原に対する耐性を克服可能なことを示す。本研究は、合成自己抗原が、グリコリポペプチドの形で、ガンに対するワクチンとして利用可能なことを示す。
【００６７】
表の簡単な説明
注意：表１は削除
表２：試薬、保護基および中間体の略語のリスト。
表３：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける、２回の免疫化後のＩｇＧ抗体のタイター。
表４：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける、２回の免疫化後のＩｇＭ抗体のタイター。
表５：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける、１０回の免疫化後のＩｇＧ抗体のタイター。
表６：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける、１０回の免疫化後のＩｇＭ抗体のタイター。
【００６８】
表２
明細書に使用した試薬および用語の略語
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＣ：１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルフォルムアミド
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｇａｌ：ガラクトース
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
ＨＰＴＬＣ：高速薄層クロマトグラフィー
Ｌｉｐ：リピド鎖（−Ｃ１４Ｈ２９）          
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＵＣ１：ムチン１
ＮａＯＭｅ：ナトリウムメトキシド
Ｎｅｕ５Ａｃ：Ｎ−アセチルノイラミン酸
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
Ｐｄ／Ｃ：木炭上のパラジウム
Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
Ｒｆ：保持因子
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＴ：室温
ｔＢｕ：三級ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
Ｔｎ：αＮ−アセチルガラクトサミン
Ｔｒｔ：トリチル
【００６９】
【表８】
0004527407.tif 000014
【００７０】
【表９】
0004527407.tif 000015
＊：免疫化マウスからの血清を、合成および天然固相の両方を用いてＩｇＧおよびＩｇＭ抗体についてスクリーニングした。合成グリコぺプチド１ａおよび１ｂを合成固相として使用した。天然固相は、卵巣ガン患者の腹水から精製したヒトＭＵＣ１ムチン、およびＳＴｎ炭水化物抗原の天然材料であるＯＳＭ（ヒツジ顎下ムチン）である。ノイラミニダーゼによるＯＳＭの処理でＴｎ炭水化物抗原の曝露を導く。
【００７１】
【表１０】
0004527407.tif 000016
【００７２】
【表１１】
0004527407.tif 000017
＊：免疫化マウスからの血清を、合成および天然固相の両方を用いてＩｇＧおよびＩｇＭ抗体についてスクリーニングした。合成グリコリポぺプチド１ａおよび１ｂを合成固相として使用した。天然固相は、卵巣ガン患者の腹水から精製したヒトＭＵＣ１ムチン、およびＳＴｎ炭水化物抗原の天然材料であるＯＳＭ（ヒツジ顎下ムチン）である。ノイラミニダーゼによるＯＳＭの処理でＴｎ炭水化物抗原の曝露を導く。
【００７３】
この明細書で引用された文書は、この明細書で引用された文書が適切な従来技術であることを認め、またはこの明細書で引用された文書が本願請求項のいずれについての特許性についても考え抜かれた材料と認めることを意図するものではない。日付についての全記述またはこれら文書の内容についての表現は、出願人が利用できる情報に基づいており、日付またはこれら文書の内容の正確さについてのいかなる承認をも構成することはない。
添付した請求項は、好適な実施例の詳説を制限しないものとして扱われなければならない。
他で述べたものに加えて、本願の出願時にもっとも最新である版で、以下の参照がここに参照として組み込まる：Kay、Phage  Display  of  Peptides  and  Proteins：A  Laboratory  Manual；the  John  Wiley  and  Sons  Current  Protcols  series、including  Ausubel、Current  Protocols  in  Molecular  Biology；Coligan、Current  Protocols  in  Protein  Science；Coligan、Current  Protocols  in  Immunology；
Current  Protocols  in  Human  Genetics；Current  Protocols  in  Cytometry；Crrent  Protocols  in  Pharmacology；Curret  Protocols  in  Neuroscience；Current  Protocols  in  Cell  Biology；Current  Protocols  in  Toxicology；Current  Protocols  in  Field  Analytical  Chemistry；Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry、および、Current  Protocols  in  Human  Genetics；ならびに、以下のCold  Spring  Harbor  Laboratory  Publications；Sambrook、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual；Harlow、Antibodies；A  Laboratory  Manual；Manipulating  the  Mouse  Embryo：A  Laboratory  Manual;
Methods  in  Yeast  Genetics：A  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Course  Manual；Drosophila  Protocols；Imaging  Neurons：A  Laboratory  Manual；Early  Development  of  Xenopus  laevis：A  Laboratory  Manual；Using  Antibodies：A  Laboratory  Manual；At  the  Bench：A  laboratory  Navigator；Cells：A  Laboratory  Manual；Methods  in  Yeast  Genetics：A  Laboratory  course  Manual；Discovering  Neurons：The  Experimental  Basis  of  Neuroscience；Genome  Analysis：A  Laboratory  Manual  Series；Laboratory  DNA  Science；Strategies  for  Protein  Purification  and  Characterization：A  Laboratory  Course  Manual；Genetic  Analysis  of  Pathogenic  Bacteria：A  Laboratory  Manual；PCR  Primer：A  Laboratory  Manual；Methods  in  Plant  Molecular  Biology：A  Laboratory  Course  Manural;
Manipulating  the  Mouse  Embryo：A  Laboratory  Manual；Molecular  Probes  of  the  Nervous  System；Experiments  with  Fission  Yeast：A  Laboratory  Course  Manual；A  Short  Course  in  Bacterial  Gnenetics：A  Laboratory  Manual  and  Handbook  for  Escherichia  coli  and  Related  Bacteria；DNA  Science：A  First  Course  in  Recombinant  DNA  Technology；Methods  in  Yeast  Genetics：A  Laboratory  Course  Manual；Molecular  Biology  of  Plants：A  Laboratory  Course  Manual.
ここで参考文献として引用された参考文献はすべて、学術誌の記事もしくは要約、刊行物、通信、以前もしくは他の関係する米国もしくは外国特許出願、刊行された米国もしくは外国特許、または任意の他の参考文献も含めて、参考文献として個々に組み込まれ、これはこれら参考文献中のすべてのデータ、表、図面、および文章をも含む。加えて、ここで引用した参考文献中に引用された参考文献のすべての内容もまた、ここに完全に参考文献として組み込まれる。
既知の方法過程、通常の方法過程、既知の方法または通常の方法への言及は、いかなる面においても、いかなる意味でも、本発明がその関連する技術によって開示、教示または示唆されることを記述または包含することを許容するものではない。
前述の特定の実施例は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにして、他の者が、当業者の通常の知識（ここで引用した参考文献の内容を含む）を適用することにより、本発明の一般的な概念から離れることなく、過度の実験なく、特定の実施のための種々の応用に容易に修正および／または適応することができる。このため、こような適用および修正は、ここで示された教示およびガイダンスに基づき、開示した実施例の同等物の意味するところおよび範囲のなかにある。ここでの表現または用語は、記載の目的のためであって制限のためではないと理解すべきであり、したがって本明細書の用語および表現は、一般的な当業者の一の知識と組み合わせて、ここで示された教示およびガイダンスの知識の観点から当業者によって解釈されるべきである。
本発明の実施に有用または好ましいものとしての部門または範囲のいかなる記述も、前記部門または範囲の各個々のメンバーもしくは値のそれぞの記述と同様に、任意の下位分類（たとえば、一またはそれ以上のメンバーの開示を省略したもの）またはそれに含まれる下位領域ものとして考えられるべきである。
好適な実施例の各記述は、不可能な組み合わせ（たとえば、本発明の要素に相互に排他的）または本明細書の記載によって排しているものをのぞいては、このような好適な実施例の任意の可能な組み合わせを意味していると考えられるべきである。
本発明の実施例が先行技術によって開示されている場合、本発明の記述は、そのような実施例を除いてここに開示している発明を包含するものと考えられなければならない。
本発明は、出願人によって企図したように、添付の請求項に述べられたもの、そして現在請求していない組み合わせを含むがそれに限定するものではない。従来技術において開示された一またはそれ以上の欠点を克服する範囲において制限される範囲で、本発明はさらに対象を含むものである。従来技術によって開示または示唆された対象を請求項が侵食する範囲において、本願出願人は、その請求項から侵食する範囲を除いて対応する発明を企図するものである。
本明細書中の任意の場所で引用した特許、特許出願、文献、記事、およびオンライン情報を含む全ての参考文献は、ここに参考文献として組み込まれ、前記参考文献中に引用された参考文献も同様である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、グリコリポペプチド１ａの完全な配列および構造である。ペプチド配列は配列番号２である。
【図２】図２は、グリコリポペプチド１ｂの完全な構造および配列である。ペプチド配列は配列番号２である。
【図３】図３は、通常見出されるガン結合炭水化物エピトープの構造である。
【図４】図４は、グリコペプチド合成のためのＯ−グリコシル化セリンおよびスレオニンの完全な構造である。
【図５】図５は、グリコリポペプチド１ａおよび１ｂ、ペプチド配列の配列番号２のレトロ合成分析および分解である。
【図６】図６は、最終ペプチドブロック（配列番号２）および非ブロック化生成物である。
【図７】図７は、配列を結合するのに使う一次および中間のブロックである。図６および図７のすべてのブロックはペプチド配列で、配列番号２の部分配列であり、以下の通りである。３（AAs  1―20）、４（AAs  21―43）、５（AAs  1―11）、６（AAs  12―20）、７ａ、７ｂ（AAs  21―31）、８（AAs  32―43）、９（AAs  1―5）、１０（AAs  6―11）、１１（AAs  21―25）、１２（AAs  26―31）、１３（AAs  32―40）、および14（AAs  41―43）。
【図８】図８は、リピドブロック１４の合成のための図式である。
【図９】図９は、ペプチドブロック６および１３の合成のための図式である。APPAHGVは配列番号２のAAs  14-20である。PAHGVは配列番号２のAAs  16-20である。TAPPAHGVは配列番号２のAAs  13-20である。化合物６および１３はあらかじめ議論した。
【図１０】図１０は、ブロック９のための合成図式であり、配列番号２のAAs  1-5である。
【図１１】図１１は、ブロック１１のための合成図式であり、配列番号２のAAs  21-25である。
【図１２】図１２は、ブロック１０（AAs  6-11）および１２（配列番号２のAAs  26-31）のための合成図式である。
【図１３】図１３は、通常のブロック戦略を用いた、二つのグリコ−リポ−ペプチド１および２（配列番号２）の同時合成の図式を示している。
【図１４】図１４は、グリコリポペプチド１ａのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、グリコリポペプチド２ｂのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１６】図１６は、リポソーム製剤に使用される合成リピドＡの構造である。
【図１７】図１７は、グリコリポペプチド１および２のリポソーム製剤によって免疫化されたＣ５７Ｂ１／６マウスにおけるＴ細胞の増殖およびインターフェロン−ｇ（ＩＦＮ−ｇ）反応である。
【図１８】図１８は、グリコリポペプチド１および２のリポソーム製剤によって免疫化され、ヒトＭＵＣ１遺伝子を形質移入したマウスにおけるＴ細胞の増殖およびインターフェロン−ｇ（ＩＦＮ−ｇ）反応である。
【図１９】図１９は、リピド鎖が天然に存在するアミノ酸の側鎖に結合しているリピド化アミノ酸の例である。
【図２０】図２０は、リピド化アミノ酸のさらなる例である。構造ＩおよびＩＩは、リピドがカルボン酸すなわちＣ−末端で結合された例を示していて、一方ＩＩおよびＩＶはリピドがアミノすなわちＮ−末端で結合された例を示している。構造ＶおよびＶＩはリピド化非天然アミノ酸である。構造ＩおよびＩＩはＣ−末端のために設計されていて、構造ＩＩＩよびＩＶはＮ−末端のために設計されていて、そしてＶおよびＶＩはペプチド配列の任意の場所に位置することができる。
【図２１】図２１は、ガン関連炭水化物抗原の例である。これらの炭水化物構造またはその構造の一部は、ガンワクチンの開発のためのグリコリポペプチドとして調製される。
【図２２】図２２は、リポセリン合成の組み立てブロック（ＶＩＩ、ＩＸ）ならびに、ペプチド合成のための液相方法および固相方法の両方によるリピド化ペプチドおよびグリコペプチドの調製のためのその利用である。図および請求項中、「Ｒ」はアミノ酸残基アルギニンのための標準記号として、およびある残基に結合した側鎖を示す基としての両方に使用される。
【図１】
0004527407.tif 000023
【図２】
0004527407.tif 000024
【図３】
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【図４】
0004527407.tif 000026
【図５】
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【図６】
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【図７】
0004527407.tif 000029
【図８】
0004527407.tif 000030
【図９】
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【図１０】
0004527407.tif 000032
【図１１】
0004527407.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
0004527407.tif 000039
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
0004527407.tif 000043
【図２２】
0004527407.tif 000044
【配列表】
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