(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて該被検出物質を免疫学的に測定する方法において、上記多孔性分離マトリックスに界面活性剤を予め浸潤せしめそして該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を、マンニトールを含有する展開溶媒で展開せしめることを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項２】
被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて該被検出物質を免疫学的に測定する方法において、上記多孔性分離マトリックスに界面活性剤を予め浸潤せしめそして該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を、マンニトールと界面活性剤との両方を含有する展開溶媒で展開せしめることを特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項３】
上記界面活性剤のＨＬＢが８〜２０の範囲にある請求項１または２に記載の免疫学的測定方法。
【請求項４】
上記展開溶媒が１〜１５重量％の濃度でマンニトールを含有する請求項１または２に記載の免疫学的測定方法。
【請求項５】
被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および界面活性剤で浸潤された、細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片ならびに該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を展開するための、マンニトールを含有する展開溶媒の組み合わせからなることを特徴とする免疫学的測定用キット。
【請求項６】
被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および界面活性剤で浸潤された、細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片ならびに該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を展開するための、マンニトールと界面活性剤との両方を含有する展開溶媒の組合せからなることを特徴とする免疫学的測定用キット。
【請求項７】
上記界面活性剤のＨＬＢが８〜２０の範囲にある請求項５または６に記載の免疫学的測定用キット。
【請求項８】
上記展開溶媒が１〜１５重量％の濃度でマンニトールを含有する請求項５または６に記載の免疫学的測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学的測定法および免疫学的測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的測定法により被検出物質を測定例えば血液中の被検出物質を測定する場合には、血液中の赤血球等が細胞分離マトリックスの細孔を詰まらせて抗体等が担持されたラテックス粒子や金コロイド粒子等の不溶性担体を流れにくくしたり、あるいは赤血球が溶血して色素判定を妨害したり、ヘモグロビンが非特異的反応を起きやすくするといった問題がある。
この問題を解決するために、特許文献１には、免疫クロマトグラフィー用試験片の多孔性分離マトリックスの細胞分離構造に特徴を持たせたり、あるいは該多孔性分離マトリックスにマンニトールを含浸させることが開示されている。しかしながら、かかる提案では免疫クロマトグラフィー用試験片の構造を煩雑とすることは避けられずまた溶血の問題を完全に解決し得たとは云い難い。多孔性分離マトリックスに含浸されるマンニトールは例えばＭＡＰ液の成分として用いられているように、赤血球の溶血防止作用を有することが知られているが、免疫学的測定法において溶血を防止するに十分な濃度で用いると、被検出物質の検出時間が長くなりまた非特異的反応が起り易くなるといった新たな問題が発生することがあった。
【特許文献１】特開２００６−１７７９７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、それ故、短い検出時間でしかも非特異的反応を抑制しうる免疫学的測定法を提供することにある。
【０００４】
本発明の他の目的は、血液中の被検出物質を、測定系内においてマンニトールと界面活性剤とを共存させることで、溶血反応を防止しつつ短い検出時間で、非特異的反応を抑制して検出し得る免疫学的測定法を提供することにある。
【０００５】
本発明のさらに他の目的は、上記測定法のためのキットを提供することにある。
【０００６】
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて該被検出物質を免疫学的に測定する方法において、上記多孔性分離マトリックスに界面活性剤を予め浸潤せしめそして該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を、マンニトールを含有する展開溶媒で展開せしめることを特徴とする免疫学的測定方法により達成される。
【０００９】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて該被検出物質を免疫学的に測定する方法において、上記多孔性分離マトリックスに界面活性剤を予め浸潤せしめそして該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を、マンニトールと界面活性剤との両方を含有する展開溶媒で展開せしめることを特徴とする免疫学的測定方法により達成される。
【００１０】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および界面活性剤で浸潤された、細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片ならびに該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を展開するための、マンニトールを含有する展開溶媒の組み合わせからなることを特徴とする免疫学的測定用キットにより達成される。
【００１２】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第４に、被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および界面活性剤で浸潤された、細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片ならびに該被検出物質と該第２抗体または第２抗原を介して特異的に結合した該不溶性担体を展開するための、マンニトールと界面活性剤との両方を含有する展開溶媒の組合せからなることを特徴とする免疫学的測定用キットにより達成される。
本発明の技術的特徴は測定系内にマンニトールと界面活性剤の共存によってもたらされるものと考える。
【００１４】
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、短い時間で被検出物質の検出を可能とし且つ非特異的反応を抑制して正確な検出を可能とする免疫学的測定法およびそのためのキットが提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の免疫学的測定法で用いられる、界面活性剤としては、生化学用として使用される界面活性剤であればいかなるものでもよい。好ましくはＨＬＢが８〜２０の界面活性剤であり、より好ましくはＨＬＢが８〜２０の非イオン性界面活性剤が挙げられる。具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）：ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０：ノニデット  Ｐ−４０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ  ３−１４：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ−ト、ＣＨＡＰＳ：３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等を挙げることができる。これらの界面活性剤は、単独であるいは２種類以上混合して用いることができる。
免疫クロマトグラフィーの手法は公知であるが、その原理を模式的に図１に示す。
【００１７】
図１の資料添加部位（１）に、検査対象となる被検出物質についての検体の試料が滴下される。
試料添加部位（１）は細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片からなる。多孔性分離マトリックスは、試料が滴下される前に予め界面活性剤で浸潤されている。多孔性分離マトリックスを界面活性剤で浸潤する方法は特に限定されず、例えば界面活性剤溶液に該マトリックスを浸漬した後、熱乾燥する方法等が挙げられる。
【００１８】
本発明で対象とする検体としては、細胞や血球を含むものであれば良く、例えば血液、尿、髄液が挙げられる。
また、検体から検出する被検出物質としては、例えばＨＢｓ抗原等のウイルス表面抗原、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ等の腫瘍マーカー、抗ＨＩＶ抗体、抗ＨＢＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ダニアレルゲン抗体、抗スギ花粉アレルゲン抗体等の免疫グロブリン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの検体は、細胞や血球を破壊しない方法で採取されることが好ましい。
試料添加部位（１）に滴下された試料は、被検出物質と特異的に結合する抗体または抗原（それぞれ第２抗体、第２抗原という）が固定された不溶性担体が保持された標識物質保持部位（２）を経てクロマトグラフィー媒体（３）を介して吸収部位（５）の方向に試料が展開される。検出部位（４）には被検出物質と特異的に結合する抗体または抗原（それぞれ、第１抗体、第１抗原という）が固定されている。被検出物質をクロマトグラフィー媒体（３）で展開するための、そして検出部位（４）を有する担体は膜担体からなる。
【００１９】
本発明では、上記クロマトグラフィー媒体として、マンニトールを含有する展開溶媒が用いられる。マンニトールは好ましくは展開溶媒中に１〜１５重量％の割合で含有される。かかるマンニトール濃度の展開溶媒を用いることにより、溶血防止をしつつ非特異的反応を抑制して短時間で被検出物質を検出することができる。かかるマンニトール濃度の溶媒は、免疫クロマトグラフィー用展開溶媒としては知られていない。
検体中に対象とする被検出物質が混入している場合には、被検出物質と第２抗体あるいは第２抗原が反応し、これらの複合体が検出部位（４）に第１抗原または第１抗体によって補足され、着色のバンドが現れる。（４）に現れたバンドの色調等により、検体中に含まれる被検出物質の量を概略的に把握することができる。
標識物質保持部位（２）に使用する第２抗原または第２抗体、及び検出部位（４）に使用する第１抗原または第１抗体は、被検出物質の異なる部位を結合するものであれば良い。
【００２０】
抗体としては、被検出物質と特異的に結合する抗体が用いられる。抗体は、その産生動物種としてヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等があり、それぞれに所定範囲の免疫グロブリンがある。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでも良く、また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びこれらの断片（抗原と結合能を有するもの；例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等のいずれでも良い。）が挙げられる。
具体的には、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等、及びこれらの断片（抗原と結合能を有するもの；例えばＦ（ａｂ）’２又はＦａｂ’等のいずれでも良い。）が挙げられる。
また、抗原としても、被検出物質と特異的に結合する抗原が用いられる。例えば、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ダニアレルゲン、スギ花粉アレルゲン等が挙げられる。
【００２１】
さらに、抗原や抗体を標識する不溶性担体としては、例えば金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子等の非金属コロイド粒子、ラテッックス粒子等の着色樹脂粒子、染料コロイド粒子及び着色リポソーム等の不溶性粒状物質等が挙げられる。抗原や抗体を標識する酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。
また、クロマトグラフィー媒体のための膜担体としては、毛細管現象により試料検体を吸収し流動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマーからなる群から選択される。
【００２２】
上記の如く、本発明方法で用いられる免疫クロマトグラフィー用試験片は、多孔性分離マトリックスが予め界面活性剤、より好ましくはＨＬＢが８〜２０の界面活性剤により浸潤されている特徴を有する。かかる特徴に基づき、本発明によれば、被検出物質と特異的に結合する第１抗体または第１抗原が固定された膜担体、被検出物質と特異的に結合する第２抗体または第２抗原が固定された不溶性担体および界面活性剤で浸潤された、細胞分離が可能な多孔性分離マトリックスからなる免疫クロマトグラフィー用試験片が提供される。
また、本発明によれば、上記本発明方法を実施するためのキットとして、本発明の上記免疫クロマトグラフィー用試験片と、マンニトールを、好ましくは１〜１５重量％の濃度で含有する展開溶媒の組合せからなる免疫学的測定キットが同様に提供される。また、上記発明方法を実施するためのキットには、上記免疫学的測定法で用いられる界面活性剤およびマンニトールを含有する展開溶媒の好ましい範囲が同様に提供される。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳述する。本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
（１）クロマトグラフィー媒体上への判定部の作製
膜担体（メンブレン）としてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０，３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。５重量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにマウス由来抗前立腺癌特異抗原（ＰＳＡ）モノクローナル抗体（第１抗体）を希釈した。この溶液１５０μＬをメンブレン上に１ｍｍの幅で塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。乾燥後、０．５重量％のカゼイン（和光純薬工業（株）製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１００ｍＬに室温で３０分間浸漬し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフィー媒体（第１抗原が固定された膜担体）を作製した。
【００２５】
（２）標識物質溶液の作製
金コロイド分散液（田中貴金属工業（株）製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈したマウス由来抗ＰＳＡモノクローナル抗体（第２抗体）を０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。次いで、１０重量％の牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８，０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１重量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
【００２６】
（３）免疫クロマトグラフィー用試験片の作製
上記作製した標識物質溶液３００μＬに３００μＬの１０重量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１５ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識保持部材（第２抗体が固定された不溶性担体）を作製した。
サンプルパッド（多孔性分離マトリックス）には血球分離膜（ポール社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。このサンプルパッドを０．１重量％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００（ＨＬＢ＝１３）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を均一に３ｍＬ吸収させた後、４０℃にて１時間、乾燥させた。
次に、バッキングシートから成る基材に、上記作製したクロマトグラフィー媒体、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いる上記サンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマトグラフィー用試験片とした。
【００２７】
（４）展開用溶媒の作製
１重量％のＢＳＡと１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬに１０重量％となるようにＤ−マンニトール（和光純薬工業（株）製）を加えたものを調製し、展開用溶媒とした。
【００２８】
（５）測定
上記作製した免疫クロマトグラフィー用試験片を用いて、以下の方法で血液中のＰＳＡの存在の有無を測定した。
即ち、血液中のＰＳＡ濃度が０．１ｎｇ／ｍＬ未満の陰性検体と、ＰＳＡ濃度が４ｎｇ／ｍＬである陽性検体を被検体とし、被検体２５μＬを免疫クロマトグラフィー用試験片のサンプルパッド上に載せて、次いで１００μＬの展開用溶媒をサンプルパッド上に載せて展開させ、１５分後に目視判定をした。テストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが、非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「−」、溶血により測定できないものを「判定不可」とした。その結果を表１に示す。また、溶血の有無を表２に示す。
【００２９】
実施例２
実施例１でサンプルパッドに吸収させる界面活性剤をＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００からＴｗｅｅｎ２０（ＨＬＢ＝１７）に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表１に示す。また、溶血の有無を表２に示す。
【００３０】
実施例３
実施例１でサンプルパッドに吸収させる界面活性剤をＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００からアデカノールＮＫ−４（ＨＬＢ＝９）に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表１に示す。また、溶血の有無を表２に示す。
【００３１】
実施例４
実施例１で展開用溶媒中のＤ−マンニトール濃度を３重量％に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表１に示す。また、溶血の有無を表２に示す。
【００３２】
実施例５
実施例１で展開用溶媒中のＤ−マンニトール濃度を１２重量％に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表１に示す。また、溶血の有無を表２に示す。
【００３３】
実施例６
実施例１で展開溶媒中にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．０５重量％となるように加えた以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表１に示す。また、溶血の有無を表２に示す。
【００３４】
比較例１
実施例１で展開用溶媒中のＤ−マンニトールをグリセロールに変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。結果を表１に示す。また、溶血の有無を表２に示す。
【００３５】
【表１】
0004428670.tif 000002
【００３６】
【表２】
0004428670.tif 000003
【００３７】
実施例７
実施例１でメンブレンに塗布する抗体をマウス由来抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）モノクローナル抗体（第１抗体）に変更し、金コロイドに固定する抗体をマウス由来抗ＣＥＡモノクローナル抗体（第２抗体）に変更したこと、測定に用いた被検体は、陰性検体がＣＥＡ濃度１ｎｇ／ｍＬ未満の血液、陽性検体がＣＥＡ濃度１０ｎｇ／ｍＬの血液としたこと以外は、実施例１と同様の方法で測定を行った。溶血の有無を含め結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
0004428670.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】免疫クロマトグラフィー用試験片の概略図。
【符号の説明】
【００４０】
１  試料添加部位
２  標識物質保持部位
３  クロマトグラフィー媒体
４  検出部位
５  吸収部位
【図１】
0004428670.tif 000005