(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉ
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２    （Ｉ）
［式中、Ｒ１及びＲ２は相互に無関係に、同じ又は異なり、次のものを表す
１．  水素原子、
２．  −（Ｃ１〜Ｃ２０）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖である、
３．  −（Ｃ２〜Ｃ２０）−アルケニル、この場合にアルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の二重結合を含有する、
４．  −（Ｃ２〜Ｃ２０）−アルキニル、この場合にアルキニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の三重結合を含有する、
５．  −（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール、
６．  −（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール、又は
７．  Ｒ１及びＲ２は−Ｃ（Ｏ）−基と一緒になって−（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール又は−（Ｃ５〜Ｃ１４）−ヘテロ環を形成し、
その際、上記の１〜７に挙げられた基は非置換であるか、又は相互に無関係に次の基により１〜３箇所置換されている、
ａ）  −ＯＨ、
ｂ）  ハロゲン、
ｃ）  −ＮＯ２、
ｄ）  −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ２０）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖であり、非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されている、又は
ｅ）  −（Ｃ５〜Ｃ１４）−ヘテロ環、このヘテロ環は非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されている］のケト化合物をエナンチオ選択的に還元する方法において、
ａ）  反応バッチの全体積に対して２％〜３０％の割合の式Ｉの化合物、アルコールデヒドロゲナーゼ、水、補因子のＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ及びｌｏｇＰ  ０．５〜４．０の水と混合できない有機溶剤［ｌｏｇＰは、オクタノール／水の二相系（５０／５０）中での前記有機溶剤の分配係数のロガリズムであり、Ｐは、
Ｐ  ＝  オクタノール相中での前記有機溶剤の濃度／水相中での前記有機溶剤の濃度、
である］を、
ｂ）  水及び水と混合できない有機溶剤からなる二相系の形でインキュベートし、
ｃ）  アルコールデヒドロゲナーゼにより生成された酸化された補因子を連続的に再生し、かつ
ｄ）  キラルのヒドロキシ化合物を単離すること、
を特徴とし、前記アルコールデヒドロゲナーゼがラクトバチルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）もしくはラクトバチルス・ミノア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ）からのアルコールデヒドロゲナーゼであるか又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼであり、そして、式Ｉのケト化合物が４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル、ピルビン酸エチルまたはアセト酢酸メチルエステルである、ケト化合物のエナンチオ選択的還元方法。
【請求項２】
ｌｏｇＰ  ０．６〜３．０の有機溶剤（ｌｏｇＰは請求項１で定義されるとおりである）を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｌｏｇＰ  ０．６３〜１．７５の有機溶剤（ｌｏｇＰは請求項１で定義されるとおりである）を使用することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
有機溶剤としてジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル又は酢酸エチルエステルを使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ｐＨ値５〜１０の緩衝液を添加することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
緩衝液にマグネシウムイオンを０．２ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で添加することを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
補因子としてＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを、水相に対して０．０５ｍＭ〜０．２５ｍＭ添加することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
アルコール−デヒドロゲナーゼ用の安定剤としてグリセリン、ソルビトール又はジメチルスルホキシドを添加することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
イソプロパノールを添加することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
式Ｉの化合物を、全体積に対して１０％〜２５％使用することを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
反応を１０℃〜７０℃の温度で実施することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
有機溶剤を、反応バッチの全体積に対して１％〜９０％の量で使用することを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
有機溶剤対水の割合が９：１〜１：９であることを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
安定剤を、反応バッチの全体積に対して５％〜３０％の量で使用することを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
イソプロパノールを、反応バッチの全体積に対して５％〜３０％の量で使用することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
アルコール−デヒドロゲナーゼを反応させるべき式Ｉの化合物１ｋｇあたり２００００Ｕ〜２０００００Ｕの量で使用することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
次の式ＩＩ
Ｒ１−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ２    （ＩＩ）
［式中、Ｒ１及びＲ２は相互に無関係に、同じ又は異なり、次のものを表す
１．  水素原子、
２．  −（Ｃ１〜Ｃ２０）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖である、
３．  −（Ｃ２〜Ｃ２０）−アルケニル、この場合にアルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の二重結合を含有する、
４．  −（Ｃ２〜Ｃ２０）−アルキニル、この場合にアルキニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の三重結合を含有する、
５．  −（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール、
６．  −（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール、又は
７．  Ｒ１及びＲ２は−Ｃ（Ｏ）−基と一緒になって−（Ｃ６〜Ｃ１４）−アリール又は−（Ｃ６〜Ｃ１４）−ヘテロ環を形成し、
その際、上記の１〜７に挙げられた基は非置換であるか、又は相互に無関係に次の基により１〜３箇所置換されている、
ａ）  −ＯＨ、
ｂ）  ハロゲン、
ｃ）  −ＮＯ２、
ｄ）  −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ２０）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖であり、非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されている、又は
ｅ）  −（Ｃ６〜Ｃ１４）−ヘテロ環、このヘテロ環は非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されている］
のエナンチオ選択的（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を収得する方法において
ａ）  式ＩＩの化合物を含有するラセミ混合物、アルコールデヒドロゲナーゼ、水、補因子のＮＡＤＰ又はＮＡＤ、及び一連のジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル又は酢酸エチルエステルから選択されるｌｏｇ−Ｐ値０．６〜１．９の有機溶剤を、
ｂ）  水及び水と混合できない有機溶剤からなる二相系の形でインキュベートし、及び
ｃ）  エナンチオマー純粋の（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離すること、
を特徴とし、前記アルコールデヒドロゲナーゼがラクトバチルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）もしくはラクトバチルス・ミノア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ）からのアルコールデヒドロゲナーゼであるか又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列を有するアルコールデヒドロゲナーゼである、（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を収得する方法。
【請求項１８】
アセトンを添加することを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機ケト化合物を酵素を用いてエナンチオ選択的に還元して相応するキラルのヒドロキシ化合物にする方法、ラクトバチルス・ミノア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ）からのアルコール−デヒドロゲナーゼ、及び酵素を用いてラセミ体から（Ｓ）−ヒドロキシ化合物をエナンチオ選択的に得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性ヒドロキシ化合物は、多数の薬理学的に重要な化合物を製造するための有用な合成原料である。この化合物は古典的な化学的方法によって製造が困難であることが多く、薬理学的用途に必要なエナンチオマー純度が達成できるのはまれである。従って、キラル化合物の製造のために、一般にバイオテクノロジーによる方法が用いられ、この場合に立体選択的反応は完全な微生物か又は単離された酵素を用いて実施される。
【０００３】
この場合に、単離された酵素を使用することが有利であることが多い、それというのもこの酵素を用いると一般的に比較的高い収率ならびに比較的高いエナンチオマー純度が達成できるためである。
【０００４】
デヒドロゲナーゼ及び特にアルコール−デヒドロゲナーゼは、有機ケト化合物を相応するキラルのアルコールにする立体化選択的還元により、キラルの生成物を得るために有用な触媒である。主に酵母、ウマの肝臓又はサーモアネロビウム・ブロッキ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）からの相応する酵素が公知である。これらの酵素は補酵素としてＮＡＤＨ（ニコチンアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（ニコチンアデニンジヌクレオチドホスフェート）が必要である。他の公知のアルコール−デヒドロゲナーゼは、たとえばロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）からの（Ｓ）−特異的アルコール−デヒドロゲナーゼ又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｉｕｓ）属からの（Ｒ）−特異的アルコール−デヒドロゲナーゼである。２つの酵素タイプは、ケト化合物に関して広い基質スペクトルを有し、かつ高いエナンチオ選択性を示す。ラクトバチルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）（ドイツ連邦共和国特許第４０１４５７３号明細書）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（ドイツ連邦共和国特許第１９６１０９８４号明細書）からのアルコール−デヒドロゲナーゼは、特にキラルの（Ｒ）−アルコールを得るために適している。
【０００５】
アルコール−デヒドロゲナーゼを使用する欠点は、もちろん有機溶剤中でこのアルコール−デヒドロゲナーゼの酵素安定性及び酵素活性がわずかであることであり、かつ還元すべきケト化合物の水溶性がわずかなことが多いことである。さらに、有機溶剤中でアルコール−デヒドロゲナーゼを使用することに対して他の制限的要因は補因子需要としてのＮＡＤＰ又はＮＡＤの使用が必要であることである、それというのもこの補因子（ＮＡＤＰ又はＮＡＤ）は水溶性であり、かつ経済的方法で再生されるためである。
【０００６】
本発明は、プロセス条件を変更することにより前記の欠点を改善することを目的とする。この課題は、本発明の場合に、有機溶剤、アルコール−デヒドロゲナーゼ、水、補因子及びケト化合物を含有する二相系を使用することにより解決される。
【０００７】
本発明によるこの方法は、溶剤の酵素安定化作用による高い耐用時間、製造されたキラルのヒドロキシ化合物の９９．９％を越えるエナンチオマー純度及び使用したケト化合物の量に対する高い収率を示す。
【０００８】
従って、本発明による方法は、次の式Ｉ
Ｒ1−Ｃ（Ｏ）−Ｒ2    （Ｉ）
［式中、Ｒ1及びＲ2は相互に無関係に、同じ又は異なり、次のものを表す
１．  水素原子、
２．  −（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖である、
３．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルケニル、この場合にアルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の二重結合を含有する、
４．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルキニル、この場合にアルキニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の三重結合を含有する、
５．  −（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
６．  −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、又は
７．  Ｒ1及びＲ2は−Ｃ（Ｏ）−基と一緒になって−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール又は−（Ｃ5〜Ｃ14）−ヘテロ環を形成し、
その際、上記の１〜７に挙げられた基は非置換であるか、又は相互に無関係に次の基により１〜３箇所置換されてる、
ａ）  −ＯＨ、
ｂ）  ハロゲン、たとえばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素、
ｃ）  −ＮＯ2、
ｄ）  −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖であり、非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されているか、又は
ｅ）  −（Ｃ5〜Ｃ14）−ヘテロ環、このヘテロ環は非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されている］
のケト化合物をエナンチオ選択的に還元する方法に関において、
ａ）  式Ｉの化合物、アルコール−デヒドロゲナーゼ、水、補因子及びｌｏｇＰ  ０．５〜４．０の有機溶剤を、
ｂ）  二相系の形でインキュベートし、かつ
ｃ）  生成したキラルのヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする、ケト化合物をエナンチオ選択的に還元する方法に関する。
【０００９】
−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール基の環中の炭素原子はたとえばフェニル、ナフチルである。アリールの概念とは、６〜１４個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基であると解釈され、例えば１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、例えば２−ビフェニリル、３−ビフェニリル及び４−ビフェニリル、アントリル又はフルオレニルである。ビフェニリル基、ナフチル基及び特にフェニル基が有利なアリール基である。「ハロゲン」の概念は、一連のフッ素、塩素、臭素又はヨウ素からの元素であると解釈される。「−（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル」の概念は、炭素鎖が直鎖又は分枝鎖であり、１〜２０個の炭素原子を有する炭化水素基であると解釈される。
【００１０】
「−（Ｃ5〜Ｃ14）−ヘテロ環」の概念は５員〜１４員の単環式又は二環式の複素環であり、この複素環は部分的に飽和されているか又は完全に飽和されていると解釈される。ヘテロ原子の例はＮ、Ｏ及びＳである。−（Ｃ5〜Ｃ14）−ヘテロ環の概念の例は、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、１，２，３，５−オキサチアジアゾル−２−オキシド、トリアゾロン、オキサジアゾロン、イソオキサゾロン、オキサジアゾリジンジオン、トリアゾール（これらはＦ、−ＣＮ、−ＣＦ3又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルにより置換されている）、３−ヒドロキシピロロ−２，４−ジオン、５−オキソ−１，２，４−チアジアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、インダゾール、フタラジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルボリン及びこれらのヘテロ環のベンゼン縮合した、シクロペンタ縮合した、シクロヘキサ縮合した又はシクロヘプタ縮合した誘導体から誘導される基である。特に有利なのは、２−又は３−ピロリル、フェニルピロリル、例えば４−又は５−フェニル−２−ピロリル、２−フリル、２−チエニル、４−イミダゾリル、メチルイミダゾリル、例えば１−メチル−２−、−４−又は−５−イミダゾリル、１，３−チアゾル−２−イル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−、３−又は４−ピリジル−Ｎ−オキシド、２−ピラジニル、２−、４−又は５−ピリミジニル、２−、３−又は５−インドリル、置換２−インドリル、例えば１−メチル−、５−メチル−、５−メトキシ−、５−ベンジルオキシ−、５−クロロ−又は４，５−ジメチル−２−インドリル、１−ベンジル−２−又は−３−インドリル、４，５，６，７−テトラヒドロ−２−インドリル、シクロヘプタ［ｂ］−５−ピロリル、２−、３−又は４−キノリル、１−、３−又は４−イソキノリル、１−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−イソキノリル、２−キノキサリニル、２−ベンゾフラニル、２−ベンゾ−チエニル、２−ベンゾオキサゾリル又はベンゾチアゾリル又はジヒドロピリジニル、ピロリジニル、例えば２−又は３−（Ｎ−メチルピロリジニル）、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロチエニル又はベンゾジオキソラニルの基である。
【００１１】
式Ｉに有利な化合物は、４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル、アセトフェノン、アセト酢酸メチルエステル、エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート、２，５−ヘキサンジオン、エチルピルベート又は２−オクタノンであり、有利なのは４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルである。式Ｉの化合物は、本発明による方法において、全体積に対して２％〜３０％、有利に１０％〜２５％、特に１５％〜２２％の量で使用される。
【００１２】
水には緩衝剤、例えばｐＨ値５〜１０、有利にｐＨ値６〜９のリン酸カリウム緩衝剤、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝剤又はトリエタノールアミン−緩衝剤を添加するのが有利である。この緩衝剤濃度は１０ｍＭ〜１５０ｍＭ、有利に９０ｍＭ〜１１０ｍＭ、特に１００ｍＭである。付加的にこの緩衝剤はマグネシウムイオン、例えばＭｇＣｌ2を０．２ｍＭ〜１０ｍＭ、有利に０．５〜２ｍＭ、特に１ｍＭの濃度で含有する。
【００１３】
この温度は、例えば約１０℃〜７０℃、有利に３０℃〜６０℃である。
【００１４】
本発明による使用可能な有機溶剤は、有利にｌｏｇＰ  ０．６〜２．０、特に０．６〜１．９、特に有利に０．６３〜１．７５を有する。有利な有機溶剤は、例えばジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル又は酢酸エチルエステル、特に酢酸エチルエステルである。酢酸エチルエステルは、例えば反応バッチの全体積に対して１％〜９０％、有利に１５％〜６０％、特に２０％〜５０％の量で使用することができる。
【００１５】
有機溶剤対水の割合は、９：１〜１：９、有利に１：１〜１：３である。
【００１６】
水は本発明による二層系において第１の液相を形成し、有機溶剤は第２の液相を形成する。場合により、例えば完全には溶解しないアルコール−デヒドロゲナーゼ又は式Ｉの化合物によって生じる固相又は他の液相がなお存在することもできる。しかしながら固相のない２つの液相が有利である。この２つの液相は、機械的に混合するのが有利であり、それにより２つの液相間に大きな境界面が生じる。
【００１７】
水相に対する補因子のＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの濃度は、０．０５ｍＭ〜０．２５ｍＭ、特に０．０６ｍＭ〜０．２ｍＭである。
【００１８】
本発明による方法の場合に、アルコール−デヒドロゲナーゼの他の安定剤を使用することも有利である。適当な安定剤は、例えばグリセリン、ソルビトール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００１９】
グリセリンの量は、全体のバッチの体積に対して５％〜３０％である。グリセリンの有利な量は１０％〜２０％、特に２０％である。
【００２０】
使用されたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの再生のために、本発明による方法の場合に付加的にイソプロパノールを添加することができる。例えば、イソプロパノール及びＮＡＤＰはアルコール−デヒドロゲナーゼによりＮＡＤＰＨ及びアセトンに変換される。使用したイソプロパノール量は、全体のバッチの体積に対して５％〜３０％である。イソプロパノールの有利な量は１０％〜２０％、特に１０％である。
【００２１】
適当なアルコール−デヒドロゲナーゼは、例えば酵母、ウマの肝臓又はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓから由来し、この場合にこれらの酵素は補酵素としてＮＡＤＨを必要とし、またＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓから由来する酵素はこの場合に補酵素としてＮＡＤＰＨを必要とする。
【００２２】
本発明による方法において、例えば酵母、ウマの肝臓、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ又はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓからのアルコール−デヒドロゲナーゼを使用する場合には、式Ｉの化合物から相応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物が得られる。本発明による方法において、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓからのアルコール−デヒドロゲナーゼを使用する場合には、式Ｉの化合物から相応する（Ｒ）−ヒドロキシ化合物が得られる。
【００２３】
このアルコール−デヒドロゲナーゼは本発明による方法の場合に完全に精製して又は部分的に精製して使用することができるか、又は細胞中に含まれた状態で使用することができる。この場合に使用された細胞はネーティブの、易透化した形又は溶解した形で存在することができる。
【００２４】
使用したアルコール−デヒドロゲナーゼの体積活性は、約２０ｍｇ／ｍｌ〜２２ｍｇ／ｍｌのタンパク質含有量の場合に、１００単位／ｍｌ（Ｕ／ｍｌ）〜２０００Ｕ／ｍｌ、有利に約８００Ｕ／ｍｌである。有利に使用したアルコール−デヒドロゲナーゼは、タンパク質１ｍｇあたり約３５〜４０Ｕの比活性を示す。式Ｉの反応すべき化合物１ｋｇに応じてアルコール−デヒドロゲナーゼ２００００〜２０００００Ｕ、有利に約１０００００Ｕが使用される。この場合に酵素単位１Ｕは、１分（ｍｉｎ）あたり１μｍｏｌ分の式Ｉの化合物を反応させる酵素量に相当する。
【００２５】
本発明による方法は、例えばガラス又は金属からなる閉鎖した反応容器中で実施される。このため、これらの成分は個々に反応容器内へ導入され、例えば窒素又は空気の雰囲気下で撹拌される。基質及び使用した式Ｉの化合物に応じて、反応時間は１日〜１４日、有利に４〜７日である。
【００２６】
引き続き、この反応混合物は後処理される。このために、水相を分離し、酢酸エチルエステル相を濾過する。この水相を場合によりもう１回抽出し、同様に酢酸エチルエステル相をさらに後処理する。その後で、この濾過した相を減圧下で蒸発させる。こうして、例えば生成物の４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸エチルエステルが９９．９％を上回るエナンチオマー純度で得られ、これは出発物質の４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルを実質的に有していない。このプロセスの全体の収率は生成物の蒸留後に、使用した出発物質量に対して８２〜８８％である。
【００２７】
意外にも、ｌｏｇ−Ｐ値０〜４の有機溶剤はアルコール−デヒドロゲナーゼに関して安定化作用を示し、一方では先行技術において有機溶剤を用いた二相系の使用は推奨していなかった（Ｍ．Ｒ．  Ｋｕｌａ，  Ｕ．  Ｋｒａｇｅｌ著；  第２８章，  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ；  Ｒ．  Ｎ．  Ｐａｔｅｌ著，  Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｅｓ，  ２０００；  Ｐｅｔｅｒｓ  Ｊ．  著９．  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ−Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｉｎ：  Ｎ．Ｊ．  Ｒｅｈｍ，  Ｇ．  Ｒｅｅｄ著Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ３，  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  １９９３；  Ｊ．  Ｌｙｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．  著，−Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  １９９１，  ７，  １１６−  １２４頁）。本発明の方法の場合に、有機相として酢酸エチルエステルが使用され、この場合に有機相は一方で式Ｉの化合物のリザーバーとして用いられるが、同時にキラルのヒドロキシ化合物を水相から抽出する反応生成物でもある。
【００２８】
先行技術の場合とは反対に、ｌｏｇ−Ｐ値０〜３の有機溶剤の使用により、付加的に時間の経過と共にアルコール−デヒドロゲナーゼの安定化が増進される。先行技術においては、特にｌｏｇ−Ｐ値（オクタノール／水−分配係数の対数）０〜２の有機溶剤は酵素に関して特に不安定化作用を示し、従って、二相系の形での有機相としてほとんど記載されていない（Ｋ．  Ｆａｂｅｒ著，  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９７，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  第３章〜３．１７章まで）。
【００２９】
本発明は、さらにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからの高い最適温度を示すアルコール−デヒドロゲナーゼに関する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからのこのアルコール−デヒドロゲナーゼは、添付した配列表に記載のSEQ ID NO:３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）によるＤＮＡ配列及びSEQ ID NO:４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）によるアミノ酸配列を示す。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからのこのアルコール−デヒドロゲナーゼはＲ特異的であり、この場合に、式Ｉの化合物から相応する（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を得ることができる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからのこのエナンチオ選択的アルコール−デヒドロゲナーゼは、意外にもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＢ  ７９１中で過剰発現できるが、他の種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属からのアルコール−デヒドロゲナーゼは著しくわずかにしか発現することができなかった。このことはよりいっそう意外である、それというのもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒの野生株自体中でアルコール−デヒドロゲナーゼは極めてわずかにしか発現されず、従って通常のスクリーニング法（完全細胞バイオトランスフォーメーション、活性テスト）を用いて検出できなかったためである。従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからＲ−エナンチオ選択的アルコール−デヒドロゲナーゼがクローニングされ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で異常に強く過剰発現可能（クローンの細胞タンパク質の５０％、２００００単位／湿潤重量ｇ）であったことは極めて意外であった。
【００３０】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒから精製されたこの酵素は、約５．５〜８．５のｐＨ領域で安定である。この酵素は約４０℃まで安定であり、酵素反応の最適ｐＨはｐＨ７〜ｐＨ７．５の範囲内にある。この酵素反応の最適温度は、約５５℃であり、この酵素は広い基質スペクトルを示す。
【００３１】
この酵素は疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて３５〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性まで精製される。
【００３２】
本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからアルコール−デヒドロゲナーゼを収得する方法にも関する。このためには、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを適当な原核生物又は真核生物中で発現させる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏからのこのアルコール−デヒドロゲナーゼをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＢ  ７９１中に形質転換し、発現させる。
【００３３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼは、例えば組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を培養し、アルコール−デヒドロゲナーゼの発現を誘導し、引き続き約１０〜１８時間（ｈ）後に細胞を超音波処理によるか又はフレンチ−プレス（Ｇａｕｌｌｉｎ，  Ｓｉｅｍｅｎｓ）により分解することにより得られる。得られた細胞抽出物を、直接使用するか又はさらに精製することができる。このために、細胞抽出物は例えば遠心分離し、得られた上澄液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。このクロマトグラフィーはマグネシウムイオンを含有する水性緩衝液中でｐＨ７．０で実施するのが有利である。
【００３４】
本発明は、さらにエナンチオ選択的に式ＩＩ
Ｒ1−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ2    （ＩＩ）
［式中、Ｒ1及びＲ2は相互に無関係に、同じ又は異なり、次のものを表す
１．  水素原子、
２．  −（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖である、
３．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルケニル、この場合にアルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の二重結合を含有する、
４．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルキニル、この場合にアルキニルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ場合により１、２、３又は４個の三重結合を含有する、
５．  −（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
６．  −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、又は
７．  Ｒ1及びＲ2は−Ｃ（Ｏ）−基と一緒になって−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール又は−（Ｃ6〜Ｃ14）−ヘテロ環を形成し、
その際、上記の１〜７に挙げられた基は非置換であるか、又は相互に無関係に次の基により１〜３箇所置換されてる、
ａ）  −ＯＨ、
ｂ）  ハロゲン、たとえばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素、
ｃ）  −ＮＯ2、
ｄ）  −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、この場合にアルキルは直鎖又は分枝鎖であり、非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されている、又は
ｅ）  −（Ｃ6〜Ｃ14）−ヘテロ環、このヘテロ環は非置換であるか又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより１〜３箇所置換されている］の（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を得る方法において、
ａ）  式ＩＩの化合物を含有するラセミ混合物、本発明によるアルコール−デヒドロゲナーゼ、水、補因子及びｌｏｇ−Ｐ値０．５〜４．０の有機溶剤、例えば一連のジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル又は酢酸エチルエステルからの有機溶剤を、
ｂ）  二相系の形のインキュベートし、かつ
ｃ）  生成したエナンチオマー純粋の（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離する
ことを特徴とする、（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を得る方法に関する。
【００３５】
この反応条件は、式Ｉのケト化合物をエナンチオ選択的に還元する前記方法とほぼ同じである。しかしながら、この方法の場合には式Ｉのケト化合物のエナンチオ選択的還元を行う代わりに、式ＩＩの相応する（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を相応するケト化合物に酸化する。さらに、この方法の場合には、ＮＡＤＰの再生のためにイソプロパノールの代わりにアセトンを使用する。例えば、アセトン及びＮＡＤＰＨはアルコール−デヒドロゲナーゼによりＮＡＤＰ及びイソプロパノールに変換される。使用したアセトン量は、全体のバッチの体積に対して５％〜３０％である。アセトンの有利な量は１０％〜２０％、特に１０％である。
【００３６】
本発明によるアルコール−デヒドロゲナーゼは、式ＩＩの化合物の製造のために、完全に又は部分的に精製して存在することができるか、又は細胞中に含まれた状態で方法に使用することもできる。この細胞はネーティブの、易透化した形又は溶解した形で存在することができる。
【００３７】
本発明の対象は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼを発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＢ  ７９１の組み換えクローンでもあり、これは２００１年３月２６日にブタペスト条約の条件下でＤｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕeｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に番号ＤＳＭ１４１９６で寄託されている。
【００３８】
本発明を次の実施例により詳説する：
【実施例１】
【００３９】
完全細胞バイオトランスフォーメーションを用いたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の株中でのＲ−アルコール−デヒドロゲナーゼのスクリーニング
スクリーニングするために、次の媒体中で多様なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｅｎ株を培養した（数値はそれぞれｇ／ｌ）：グルコース（２０）、酵母抽出物（５）、肉抽出物（１０）、クエン酸水素二アンモニウム（２）、酢酸ナトリウム（５）、硫酸マグネシウム（０．２）、硫酸マンガン（０．０５）、リン酸水素二カリウム（２）。
【００４０】
この媒体を１２１℃で滅菌し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の株（以後、短縮してＬ．と表記する）をさらにｐＨ調節又は酸素供給せずに培養した引き続き、この細胞を遠心分離により除去し、完全細胞バイオトランスフォーメーションのために細胞４ｇをリン酸カリウム緩衝液（ＫＰｉ−緩衝液）（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）１０ｍｌの最終体積に再懸濁させた。グルコースをそれぞれ０．１ｇ添加した後に、細胞を１５分間３０℃で振盪させた。細胞懸濁液に４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル４を４０ｍＭの最終濃度で添加し、それぞれ１０分後及び１２０分後に媒体のガスクロマトグラフィー分析を行った。このために細胞を遠心分離により除去し、上澄液を濾過し、クロロホルム中で４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルが最終濃度１０〜１５μｇ／ｍｌになるまで希釈した。
【００４１】
基質として使用した４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルを、多様なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｅｎ株で反応させて次のエナンチオマー純度でエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートにした。
【００４２】
このエナンチオマー過剰量は次のように計算した：ｅｅ（％）＝（（Ｒ−アルコール−Ｓ−アルコール）／（Ｒ−アルコール＋Ｓ−アルコール））×１００。
第１表
【００４３】
【表１】
0004417628.tif 000002
【実施例２】
【００４４】
組み換えたＲ−特異的アルコール−デヒドロゲナーゼの収得
Ａ．）  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の株からのゲノムＤＮＡの調製
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の培養液約２ｍｌからの細胞ペレットを、ＴＥ−緩衝液３００μｌ（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ＝８、ＥＤＴＡ  １ｍＭを含有）中に再懸濁させ、リゾチーム２０ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。引き続き、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）１００μｌ、過塩素酸Ｎａ（５Ｍ）１００μｌ及びクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）５００μｌを添加した。強力に振盪した後、タンパク質を遠心分離により除去し、水相を新たなエッペンドルフ型容器に移した。その後、エタノール（ＥｔＯＨ）（９６％）８００μｌを添加した。このエッペンドルフ型容器を数回インキュベートし、引き続き沈殿した染色体ＤＮＡを新たなエッペンドルフ型容器に移し、ＥｔＯＨ２００μｌで洗浄した。このＤＮＡをまた新たなエッペンドルフ型容器に移し、減圧下で乾燥し、ＴＥ−緩衝液１００μｌ中に溶かした。
Ｂ．）  ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための５′−及び３′−プライマーとしてのオリゴヌクレオチド
ＰＣＲのために使用したプライマーは、Ｌ．ｋｅｆｉｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼの公知のＮ−末端及びＣ−末端配列から誘導した。この場合に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｅｎ中の所定のコドンについての公知の優先性を考慮した。各５′−プライマーの前にコドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）を開始コドンとして配置し、さらに発現ベクター内での後のクローニングを可能にするために、５′−プライマーの先頭の開始コドンに続いて制限酵素Ｂａｍ  ＨＩ用の切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）を配置した。３′−プラマーの背後に停止コドン（ＴＡＧ）及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ用の切断部位（ＡＡＧＣＴＴ）を配置した。このプライマー構築物を次に記載する。
【００４５】
Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ；  Ｙ＝Ｔ又はＣ；  Ｒ＝Ａ又はＧ
５′プライマー
５′ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＮＧＡＹＣＧＮＴＴＲＡＡＲＧＧＮＡＡＲＧＴＮＧＣ３′
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
３′プライマー
５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＹＴＧＮＧＣＮＧＴＲＴＡＮＣＣＮＣＣＲＴＣＮＡＣ３′  
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
これらのプライマーは公知の方法により製造した。
Ｃ．）  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の株からのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
ＰＣＲ−バッチ（１００μｌ）
【００４６】
【表２】
0004417628.tif 000003
【００４７】
ｄＮＴＰ'ｓはデオキシヌクレオチドトリホスフェート、たとえばｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰである。
【００４８】
サイクル：
９５℃で２分、その後
８０℃を維持
ホットスタート、その後
９５℃で３０秒間、その後
４０℃で１分間    ３０×
その後、それぞれ３０回９５℃で３０秒、４０℃で１分、引き続き
７２℃で２．５分、
その後
７２℃で２．５分、
その後
１０℃を維持
分析のためにこのバッチ１０μｌを１％のアガロースゲル上に設置し、一定の１００Ｖで電気泳動により分離した。このＰＣＲは約７５０ｂｐのＤＮＡフラグメントの明らかな増幅を示した。
Ｄ．）  ゲルからのＰＣＲ−フラグメントの単離
ＰＣＲ−フラグメントを得るために、全ＰＣＲ−バッチを１％のアガロースゲル上に設置し、一定の１００Ｖで電気泳動により分離した。このために、ゲルは２つのトレースに分かれ、そのトレースの一方は完全なＰＣＲ−バッチを有し、他方は５μｌの試料を有するため、ゲルからＰＣＲ−フラグメントを切り出すために、試料を有するトレースをエチジウムブロミドで染色し、エチジウムブロミドによる及びＵＶ光による単離すべきＰＣＲ−フラグメントの損傷を排除した。
【００４９】
ゲルからの単離はＱｉａｇｅｎ社  （Ｈｉｌｄｅｎ在）のＱｌＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。
【００５０】
濃度測定により全体濃度は２０ｎｇ／μｌ  ＤＮＡであった。
Ｅ．）  リゲーション
リゲーションを準備するために、精製されたＰＣＲ−フラグメント及び使用したクローニングベクターｐＱＥ３０又はｐＱＥ７０（両方ともＱｕｉａｇｅｎ社）をＢａｒｎ  Ｈｌ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断した（４μｌ  ＤＮＡ＝２００ｎｇ  ＤＮＡ、１μｌ  １０×緩衝液、１μｌ  酵素、ＢＳＡ及びＨ2Ｏ（Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ））。
【００５１】
切断されたこのプラスミドを新たにＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、水中に入れ、アルカリ性ホスファターゼにより脱リンした（ＵＳＢ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。
【００５２】
精製のために相応する反応バッチを新たに１％のアガロースゲル上に設置し、消化させた増幅物並びにプラスミドをＤ．）に記載したのと同様にゲルから単離した。プラスミド及び増幅物の濃度は精製後に約２０ｎｇ／μｌであった。
【００５３】
リゲーションのためにｐＱＥ３０又はｐＱＥ７０（６０ｎｇ）３μｌ、増幅物（５０ｎｇ）２．５μｌ、リガーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２μｌ、Ｈ2Ｏ  １．５μｌ及びＴ４−リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ；  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１μｌを使用した。このバッチを一晩中１６℃でインキュベーションした。
【００５４】
引き続き、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＢ７９１のエレクトロコンピテント細胞４０μｌをリゲーションバッチ１．５μｌでエレクトロポレーションにより形質転換した。この細胞をＳＯＣ−媒体５００μｌに入れ、３７℃で４５分間インキュベーションし、引き続きＬＢamp−寒天プレート上でそれぞれ２５０μｌを平板培養した。このＳＯＣ−媒体は水１リットルあたり、トリプトン２０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ、１Ｍ  ＭｇＳＯ4  １０ｍｌ及び１Ｍ  ＭｇＣｌ2  １０ｍｌを含有する。ＬＢamp−寒天プレートは水１リットルあたり、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、寒天２０ｇ、ｐＨ７．０及びアンピシリン５０ｍｇを含有する。
【００５５】
成長したクローンを継代培養し、４ｍｌ液体培地（ＬＢamp媒体）中で一晩中３７℃で培養した。この細胞懸濁液からそれぞれ２ｍｌをプラスミド調製物（Ｑｕｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコル（Ｑｕｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ）に従って）のために使用した。
【００５６】
プラスミド調製物からＢａｍ  ＨＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いる制限消化を行った。完全な消化物を１％のアガロースゲル上に設置し、１００Ｖで電気泳動により分離（７５０ｋｐのインサートの検出）し、このためにプラスミドを場合により配列決定のために使用した。７５０ｋｐのインサートを有するクローンを次いでＬＢamp−寒天プレート上で平板培養した。
Ｆ．）  プラスミドの配列決定
この配列決定を、ＤＮＡ配列決定キット（ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍＥＸＣＥＬ  ＩＩ  Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｂｉｏｚｙｍ，  Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ））を用いて、Ｌｉ−Ｃｏｒ−シークエンサー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）で製造元の指示に従って実施した。プライマーとして、ｐＱＥ−ベクター用の標準の配列決定プライマーを利用した。
Ｇ．）  Ｒ−ＡＤＨの可溶性発現に関したクローンのスクリーニング
７５０ｋｐのインサートを有するクローンを、酵素活性及び立体選択性に関して調査した。このため、クローンをＬＢamp−寒天プレートから継代培養し、液体培養（ＬＢamp−媒体）２０ｍｌ中で２５分間培養した。次いで、０．５の細胞密度（ＯＤ500）で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１ｍＭを用いて誘導を行った。１８時間後に細胞を遠心分離により除去し、それぞれ細胞４０ｍｇをＫｐｉ−緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ）３５０μｌに収容した。細胞からの酵素の分離をガラスパール（０．５ｇ、０．３ｍｍ）を用いた湿式粉砕により行った。このために、４℃でラチェットミルを用いて２０分間分解を行った。
【００５７】
酵素試験物はトリエタノールアミン緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ）８７０μｌ、４−Ｃｌ−アセト酢酸エチルエステルの１００ｍｍｏｌ濃度の溶液１００μｌ、ＮＡＤＰＨ（最終濃度０．１９ｍＭ）１０μｌ及び酵素溶液２０μｌを有していた。
【００５８】
酵素単位の定義：  １Ｕは１分あたり基質１μｍｏｌ（４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル）を反応させるのに必要な酵素量に相当する。
【００５９】
立体選択性の検出のために、４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル１．０ｍＭ、ＮＡＤＰＨ（それぞれ最終濃度）１．９ｍＭ及び酵素溶液２０μｌを有するトリエタノールアミン緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ）４８０μｌを培養した。１５分間培養した後で、この反応バッチを濾過し、クロロホルム中で１：１０に希釈し、この試料をＧＣ−ＭＳで分析した。
【００６０】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）の条件：
キラルのカラム：Ｌｉｐｏｄｅｘ  Ｅ，  ＩＤ＝０，２５ｍｍ，  ｌ＝２５ｍ  （Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）
１．  ２分  ６０℃
２．  ２８分間で６０℃から１３０℃に、１分あたり２．５℃の速度で
３．  １５分  １３０℃
次のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｅｎ株から、（Ｒ）−特異的アルコール−デヒドロゲナーゼをクローニングし、活発な過剰発現を行うことができた。
【００６１】
【表３】
0004417628.tif 000004
【００６２】
＊  活性はＧ．）（湿式粉砕）から計算した；この活性は発酵及びフレンチプレスを用いた分解後に極めて高かった。
Ｈ．）  酵素の収得及び精製
最も高い酵素活性を示す株を酵素の収得のために発酵容器（フェドバッチ式、１０ｌ）中で培養した。この誘導をＯＤ500でＩＰＴＧ  １ｍＭを用いて行った。１８時間後に細胞を収穫し、その際、細胞３００ｇをＫｐｉ−緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ＝７、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ）３ｌ中に収容し、引き続き細胞分解をフレンチプレス（Ｇａｕｌｌｉｎ，  Ｓｉｅｍｅｎｓ）を用いて行った。遠心分離後に得られた上澄液を、以後粗製抽出液と呼び、これは約２０００Ｕ／ｍｌ（２００００Ｕ／ｇ湿潤質量）の体積活性を示した。
【００６３】
酵素特性決定のために、得られた酵素の一部をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆｆ  （ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製した。この使用したカラムはこのために５０ｍＭ  Ｋｐｉ−緩衝液（ｐＨ＝７．０）、ＭｇＣｌ2  １ｍＭで平衡化させたこの粗製抽出液をカラム上に置き、かつ平衡化緩衝液で短時間洗浄した後に、酵素を直線的に上昇する塩勾配（０〜１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍｌ／ｍｉｎ）でＮａＣｌ約０．３Ｍの塩濃度で溶出させた。酵素含有フラクションを集めた後に、約８００Ｕ／ｍｌの体積活性及び２０〜２２ｍｇ／ｍｌのタンパク質含有量を示す精製された酵素約２５ｍｌが得られた。こうして精製された酵素は、つまりタンパク質１ｍｇあたり約３５〜４０Ｕの比活性を示す。
【００６４】
全ての酵素活性は２５℃で測定した。この酵素活性は次のように計算した：
計算：  １単位＝１μｍｏｌ基質転化率／ｍｉｎ
ランベルト−ベールの法則
ＮＡＤＰＨの減少は３４０ｎｍで追跡した（酵素試験バッチ参照）＝ΔＥ／ｍｉｎ
Ｎ＝酵素の希釈ファクタ
Ｖ＝酵素の体積  ｍｌ  （０．０１）
Ｖキュヘ゛ット＝キュベット容量＝１ｍｌ
ｄ＝キュベットの層厚＝１ｃｍ
ｅNADPH＝ＮＡＤＰＨの吸光係数＝６．２２［ｍＭ-1*ｃｍ-1］
活性＝（ΔＥ／ｍｉｎ*Ｎ*Vキュヘ゛ット）／（ｅNADPH*Ｖ*ｄ）
タンパク質測定はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）により行った（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ，  タンパク質アッセイ）。
【実施例３】
【００６５】
エチル  （Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートの酵素触媒による製造
Ａ．）  ５リットル規模で
４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルからのエチル  （Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートの酵素触媒による合成のために、実施例２で得られた、アルコール−デヒドロゲナーゼの粗製抽出液と補酵素ＮＡＤＰとを使用した。酸化された補酵素を、イソプロパノールの同時存在により再生することで、この反応は触媒量の補酵素が必要なだけである。
【００６６】
このバッチは次のものを含有していた：
トリエタノールアミン緩衝液  ２ｌ  １００ｍＭ  ｐＨ＝７．０  ＭｇＣｌ2  １ｍＭ  １０％グリセリン、
ＮＡＤＰ  ４００ｍｇ
イソプロパノール  ６００ｍｌ
酢酸エチルエステル  ８００ｍｌ
４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル６００ｍｌ及び
アルコール−デヒドロゲナーゼ  約１０００００単位。
【００６７】
室温で３日間撹拌した後、ガスクロマトグラフィーにより４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルからエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートへの９９．９％のエナンチオマー純度での完全な変換が検出された。
【００６８】
水相を分離し、溶剤を蒸発させ、場合により蒸留した後に、純粋なエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートが９９．９％を上回るエナンチオマー純度で得られた。
Ｂ．）  ５０ｌ規模で
４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル１０ｌの変換のための反応バッチは次のような組成を有していた：
トリエタノールアミン緩衝液  １８ｌ  １００ｍＭ  ｐＨ＝７．０  ＭｇＣｌ2  １ｍＭ  １０％グリセリン、
ＮＡＤＰ  ４ｇ、
イソプロパノール１０ｌ、
酢酸エチルエステル１０ｌ、
４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル１０ｌ及び
アルコール−デヒドロゲナーゼ約２百万単位（粗製抽出液１．２５ｌ）。
【００６９】
室温で７日間撹拌した後、ガスクロマトグラフィーにより４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルからエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートへの９９．９％のエナンチオマー純度での完全な変換が検出された。
【実施例４】
【００７０】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからクローニングされたアルコール−デヒドロゲナーゼの生化学的特性決定
Ａ．）  ｐＨ−安定性
多様なｐＨ値を示す緩衝液中で貯蔵した際の酵素の活性の依存性をｐＨ４〜１１の範囲内で試験した。このためにｐＨ４〜１１の範囲内の多様な緩衝液（５０ｍＭ）を調製し、実施例２中で精製された酵素をその中に１：１００で希釈し、３０分間インキュベートした。全ての緩衝液はＭｇＣｌ2  １ｍＭを含有していた。引き続き、この中の１０μｌを通常の酵素試験で使用した（トリエタノールアミン緩衝液  １００ｍＭ  ｐＨ＝７．０、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ、４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル１０ｍＭ及びＮＡＤＰＨ  ０．１９ｍＭ）。この反応を３０℃で１分間、３４０ｎｍで行った。
【００７１】
出発値はこの場合に、トリエタノールアミン緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ＝７．０）中で酵素を希釈直後に得られた測定値である。この値は所定の条件下で０．２０／ｍｉｎの吸光度変化に一致し、１００％値と仮定して、全ての次の測定値をこの値に対する割合とした。
【００７２】
第２表
【００７３】
【表４】
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【００７４】
第２表は酵素が、特に酸性領域で良好なｐＨ安定性を示し、この場合、酵素安定性はｐＨ値だけでなく、使用した緩衝液系に依存するようにに思われる。例えばＴＲＩＳ及びＭＥＳ−緩衝液の使用時に同じｐＨ値でＫｐｉ−緩衝液の場合よりも酵素の著しい失活が確認された。
【００７５】
Ｋｐｉ−緩衝液中では５．５〜８．５の範囲内では明らかな失活は示さなかった。
Ｂ．）  温度安定性
Ａ．）に記載したのと同様の方法で、２５℃〜５０℃の範囲の温度安定性を測定した。このためにそれぞれ精製した酵素の１：１００希釈液を３０分間それぞれの温度でインキュベートし、引き続き３０分間上記の試験物質を用いて測定した。この場合でも出発値として、トリエタノールアミン緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ＝７．０）中で酵素を希釈直後に得られた測定値を使用した。この値はこの場合でも１００％値として仮定した。Ｌ．ｍｉｎｏｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼは４０℃の温度まで安定である。その後でこの活性は急激に低下する。
第３表
【００７６】
【表５】
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【００７７】
Ｃ．）  ｐＨ−最適値
ｐＨ−最適値の測定のために、この酵素反応を第３表に記載した緩衝液中でそれぞれ測定した。４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルの濃度は標準試験の場合と同様に１０ｍＭ及びＮＡＤＰＨ  ０．１９ｍＭであった。この反応を３０℃で測定した。この場合に、本発明による酵素について７〜７．５のｐＨ−最適値を測定することができた。
【００７８】
第４表
【００７９】
【表６】
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【００８０】
Ｄ．）  温度最適値
最適温度の測定のために２５℃〜６０℃での酵素活性を測定した。この試験バッチは４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステル及びＮＡＤＰＨの標準濃度に一致する。第５表から明らかなように、この酵素は５５℃の最適温度値を示し、続いてこの活性は急激に低下する。
【００８１】
第５表
【００８２】
【表７】
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【００８３】
Ｅ．）  基質スペクトル
さらに、４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルの代わりになお他の基質を試験バッチ中で使用した。このために次の試験バッチを使用した：
トリエタノールアミン緩衝液９７０μｌ（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０  ＭｇＣｌ2  １ｍＭ、ケト化合物１０ｍＭを含有）
ＮＡＤＰＨ（試験バッチ中０．１９ｍＭ）２０μｌ
酵素１０μｌ（１：１００）
この場合に、４−クロロ−３−オキソ−酪酸エチルエステルで測定した活性を１００％と仮定し、他の基質の酵素活性をこの値に対して割合で表した。
【００８４】
第６表
【００８５】
【表８】
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【００８６】
Ｆ．）  有機溶剤中での酵素活性
有機溶剤との接触時の酵素活性の試験のために、Ｌ．  ｍｉｎｏｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼを所定の溶剤混合物で１：１００に希釈し、室温でインキュベートした（水と混合できない有機溶剤の場合には水相上での希釈に関する）。この場合、２つの相の持続的な混合を保証した（シェイカー、２００ｒｐｍ）。引き続きこの酵素溶液１０μｌを標準試験バッチ中に使用した。この場合でも、出発値は緩衝液（トリエタノールアミン緩衝液１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ）中の希釈後に１００％として設定し、全ての他の値はこの値に対する割合で表した。
【００８７】
第７表：
Ａ．）  水と混合可能な溶剤：
【００８８】
【表９】
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【００８９】
第７表Ａから明らかなように、グリセリン、ＤＭＳＯ及びソルビトールは使用したアルコールデヒドロゲナーゼに関して活性化もしくは安定化する作用を示す。プロセス中で使用するイソプロパノールはそれに対して不活性化する作用を示す。
【００９０】
Ｂ．）  水と混合不可能な溶剤
【００９１】
【表１０】
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【００９２】
第７表Ｂから明らかなように、調査したアルコールデヒドロゲナーゼは広範囲の数の溶剤中で著しい安定性を示した。この場合、ｌｏｇＰ−値０〜３の溶剤が調査したアルコールデヒドロゲナーゼをｌｏｇＰ−値３〜４．５の溶剤よりも著しく阻害せず、特に長時間インキュベーション（２４時間及び４８時間）に関してｌｏｇＰ−値０〜３の溶剤は緩衝液中での相応する値と比較して調査したＡＤＨの安定化作用を有することが顕著であった。試験した脂肪族溶剤のペンタン、ヘキサン、ヘプタン及びオクタンは長時間インキュベーション時にこの安定化作用を示さなかった。
【００９３】
成分ＸのｌｏｇＰ−値は、オクタノール／水の二相系（５０／５０）中でのＸの分配係数のロガリズムであり、Ｐはオクタノール相中でのＸの濃度／水相中でのＸの濃度である。
Ｇ．）  プロセス条件下での酵素安定性
プロセス条件下での酵素安定性の試験のために、  Ｌ．ｍｉｎｏｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼを二相系で使用した溶剤混合物を用いて１：１００に希釈し、室温でインキュベートした。引き続きこの酵素溶液１０μｌを標準試験バッチ中に使用した。
【００９４】
第８表中で酵素活性は出発値の％で示されている。
【００９５】
【表１１】
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【００９６】
混合物Ｂ：  緩衝液、グリセリン１０％、イソプロパノール１０％
混合物Ｃ：  緩衝液、グリセリン２０％、イソプロパノール１０％
混合物Ｄ：  緩衝液、グリセリン１０％、イソプロパノール１０％＋酢酸エチルエステル２０％
Ｌ．ｍｉｎｏｒからの組み替えられたアルコール−デヒドロゲナーゼは二相系の形で使用した、溶剤の組み合わせ中で数日間安定でかつ活性であったことが確認された。
【配列表】
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