(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６レセプターのＮ末端１１２番目から３３３番目までのＣ末端側に、ＩＬ―６のＮ末端３８番目から２１２番目までを直接ペプチド結合させた造血幹細胞の増幅剤を使用することを特徴とする、造血幹細胞の生体外培養における増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術の分野】
本発明は、ＩＬ−６レセプター（以下ＩＬ−６Ｒと略記する）とＩＬ−６との融合蛋白質（以下ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質）からなる造血細胞の増幅剤に関するものであり、更には前記増幅剤を使用することを特徴とする造血細胞の生体外培養（ｅｘ  ｖｉｖｏ）における増幅方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
造血幹細胞や前駆細胞（巨核球前駆細胞、白血球前駆細胞、赤血球系前駆細胞）（本明細書ではこれら細胞を集合的に造血細胞と略記する）の移植に際して、臍帯血がそのソースとして使用される頻度が増加してきている。しかし、一人の提供者から得られる臍帯血は少量であり、造血細胞の移植に必要な大量の臍帯血を恒常的に確保するのは極めて困難である。この課題を解決するため、造血細胞の増殖及び分化（以下単に増幅と略記する）を促進し得る種々の生理活性物質（ファクター）を用いて患者から得た骨髄、抹消血或いは臍帯血画分中の造血細胞を増幅し、再び患者に戻すための、造血細胞の生体外培養（ｅｘ  ｖｉｖｏ）が提案され、臨床的な応用が試みられている（Ｂｒｕｇｇｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３，２８３頁，１９９５年、Ｈｏｌｙｏａｋｅら，ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９，１０５９頁，１９９７年、ＭｃＮｉｅｃｅら，Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒ．，４１，８２頁，１９９９年）。
【０００３】
現在のところ造血細胞を生体外で培養して増幅するには複数の生理活性物質を組み合わせて使用することが必須であり、従来の研究もいかなる生理活性物質の組み合わせが前記増幅に効果的であるかを解明しようとするものである。例えば、インターロイキン−３（以下ＩＬ−３と略記する）、ＩＬ−６及びヒト幹細胞因子（以下ＳＣＦと略記する）の組み合わせや、この組み合わせよりも造血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養時の増幅効果の高い、ＩＬ−６Ｒの細胞外領域部分のみからなる可溶性ＩＬ−６Ｒ（以下ｓＩＬ−６Ｒと略記する）、ＩＬ−６及びＳＣＦの組み合わせ等が報告されている（Ｓｕｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２，２５８９頁，１９９５年）。またｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及びＦｌｔ３リガンド（以下ＦＬと略記する）の組み合わせ（Ｅｂｉｈａｒａら，Ｂｌｏｏｄ，９０，４３６３頁，１９９７年）も報告されている。これらの報告においてｓＩＬ−６Ｒが必要とされたのは、多様なコロニーを形成し得る造血細胞はｇｐ１３０蛋白質及びＩＬ−６Ｒを発現している細胞ではなく、ｇｐ１３０蛋白質は発現しているもののＩＬ−６Ｒは発現していない細胞であるという知見（Ｔａｊｉｍａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４，１３５７頁，１９９６年）により説明された。近年になり、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＦＬ、トロンボポエチン（以下ＴＰＯと略記する）、顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−ＣＳＦと略記する）、エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略記する）といった生理活性物質の３種以上を組み合わせることでも造血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養が可能であることが報告され（Ｍｏｂｅｓｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６０，３４１頁，１９９８年、Ｋｏｂａｒｉら，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２１，７５９頁，１９９８年）、その際の増幅効果はｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及びＳＣＦの組み合わせと同等と考えられている。
【０００４】
ところで、ヒトの造血細胞の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での増幅を評価する方法はこれまで存在せず、ＣＤ３４陽性細胞の浮遊培養や半固定培養等の生体外評価が行われてきた。これは、骨髄画分に含まれる造血細胞がＣＤ３４蛋白質を細胞表面に発現しているという知見に基づくものである。この評価によればＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及びＥＰＯのうちの５種類以上の組み合わせは、造血細胞を多様なコロニーに分化させ、その数を増やすことが可能であるが、造血幹細胞の増殖に関しては効果的でないことが示されている。
【０００５】
上記評価方法に加え、ヒト造血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養した場合の増幅結果を、マウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで評価する方法が提案された。この方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養したヒト細胞を放射線照射した免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植し、それらの再定着能を観察することからなる（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２，１３２９頁，１９９６年）。そしてこの評価方法を用い、ＦＬ、ＴＰＯ、ＳＣＦ及びＩＬ−６の組み合わせ（Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏら，Ｂｌｏｏｄ，９３，３７３６頁，１９９９頁）やＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質、ＳＣＦ及びＦＬの組み合わせ（Ｋｏｌｌｅｔら，Ｂｌｏｏｄ，９４，９２３頁、１９９９年）により造血細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ培養すると、上記免疫不全マウスに再定着する細胞（以下該細胞をＳＲＣと略記する）を増加させることができると報告された。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
これまでの知見では、３種類以上の生理活性物質を用いることが造血細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ培養により増幅させるための増幅剤として必須であり、事実、いずれの報告においてもいかなる生理活性物質を組み合わせて増幅効果を高めるかという点に注力している。
【０００７】
しかし、３種類以上の生理活性物質を用いることになれば、生理活性物質間の比率によっても造血細胞の増幅効果が変化する可能性を否定できない。また生理活性物質は高価であり、３種類もの生理活性物質を必須成分として使用するのではコスト的な負担が大きい。更に各生理活性物質それぞれに純度や活性の均一化が要求されるため、各生理活性物質の製造及び精製に多大な労力を必要とするという課題がある。しかも、各生理活性物質を製造する際には、それぞれの物質についてロット間格差を生じさせないような厳密さも求められる。
【０００８】
そこで本願発明の目的は、造血細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ培養する際に、単一成分で造血細胞を効果的に増幅し得る増幅剤を提供することにある。また本願発明の他の目的は、単一成分の増幅剤を用いる造血細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで培養して増幅する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質からなる造血細胞の生体外培養における増幅剤である。本願請求項２の発明は、請求項１の発明に係り、前記融合蛋白質がＮ末端側からＩＬ−６Ｒ部分、ＩＬ−６部分の順で融合されたものであることを特徴とする。本願請求項３の発明は、本願請求項１の発明に係り、前記融合蛋白質が天然のＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基のＣ末端側に天然のＩＬ−６を構成するアミノ酸残基のＮ末端がペプチド結合されたものであることを特徴とする。
【００１０】
そして本願請求項４の発明は、造血細胞の生体外培養における増幅方法に関し、前記本願請求項１乃至３の増幅剤を使用することを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質は、そのＮ末端側にＩＬ−６Ｒが位置し、そのＣ末端側にＩＬ−６が位置したものと、その逆にＮ末端側にＩＬ−６が位置し、Ｃ末端側にＩＬ−６Ｒが位置したもののいずれでも良い。ＩＬ−６ＲとＩＬ−６とは、適当な長さのペプチドリンカーを介して融合されていても良いし、かかるペプチドリンカーを介することなく直接に融合されていても良い。前者の例としては文献に記載された蛋白質（Ｆｉｓｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５，１４２頁，１９９７年、Ｃｈｅｂａｔｈら，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，８，３５９頁，１９９７年；特開平１１−１９６８９７号）が例示でき、後者の例としては特願平１１−２１７８８号に記載されたものが例示できる。
【００１２】
ＩＬ−６Ｒは、天然には４６８アミノ酸残基で構成された膜蛋白質で、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域からなる（Ｙａｍａｓａｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，８２５頁，１９８８年）。ヒトＩＬ−６Ｒでは、前記シグナル領域はＮ末端１番目のメチオニン残基付近から１９番目のアラニン残基付近まで、前記細胞外領域は２０番目のロイシン残基付近から３５８番目のアスパラギン酸残基付近まで、前記膜貫通領域は３５９番目のセリン残基付近から３８６番目のロイシン残基付近まで、そして前記細胞内領域は３８７番目のアルギニン残基付近から４６８番目のアルギニン残基付近までと考えられている。前記細胞外領域はイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域に分けられ、イムノグロブリン様領域は２０番目のロイシン残基付近から１１１番目のアスパラギン酸残基付近まで、サイトカインレセプター領域は１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までと考えられている。ＩＬ−６Ｒにおいて、ＩＬ−６との結合、即ちＩＬ−６が有する生理活性を細胞に伝達するために必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イムノグロブリン様領域は不要であることが知られている。従ってＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を構成するＩＬ−６Ｒとしては、全長のＩＬ−６Ｒはもちろんのこと、その細胞外領域の全部又は細胞外領域のサイトカインレセプター領域のいずれかのみからなる、部分的ＩＬ−６Ｒを用いることもできる。
【００１３】
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質中のＩＬ−６は、４つのαヘリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基の分泌型蛋白質である（Ｈｉｒａｎｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１巻、１９８６年）。ＩＬ−６が活性を示すためには、これら４つのαヘリックス全てが必要であることが知られている。従って、本発明で使用するＩＬ−６としては、４つのαヘリックスすべてを有するものであれば良い。
【００１４】
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、これをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え操作を行うで容易に作製することができる。ＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６をコードする遺伝子は既に単離されており、その塩基配列も既に知られている。ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を遺伝子組換えで作製する場合に使用する宿主には特に制限がなく、大腸菌や、ＣＨＯ細胞等に代表される動物細胞等の通常の遺伝子組換えで使用されているものを使用することが可能である。中でも特に、ピキア・パストリス種の酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母であることや、ＣＨＯ細胞等のような動物細胞と比較して安価に培養できることから、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を製造するにあたり、特に好ましい宿主として例示できる。
【００１５】
本発明の造血細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増幅剤は、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質からなり、他の生理活性物質、例えばＳＣＦ、ＩＬ−３、ＦＬ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ等を必要としない増幅剤である。本願発明は、ＣＤ３４を発現しているか否かを指標として臍帯血、末梢血又は骨髄から選択した造血細胞を含む画分を、ｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外）にて前記増幅剤を含む培地中で培養して造血幹細胞を増殖し、造血前駆細胞を増殖、分化させることを含む。ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、培地成分とは別個の試薬として提供することもできるし、予め培地成分に添加した状態で提供することもできる。例えばα−ＭＥＭ培地に添加して使用するのであれば、２５０μｇ／ｍｌ程度使用すれば良い。
【００１６】
ｅｘ  ｖｉｖｏ増幅は、例えばプラスチックバッグのような容器の中で、例えばＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を添加した無血清培地中で前記造血細胞含有画分を３７℃、数日〜３週間培養することにより実施できる。なお本願発明により増幅された造血細胞を患者に戻す操作は、現行の末梢血幹細胞移植と同じ方法を採用すれば良い。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本願発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１  各種ファクターのＣＤ３４陽性細胞に対するコロニー形成誘導効果
ＣＤ３４陽性細胞（商品名；Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  Ｃｅｌｌｓ、宝酒造（株）製）２０００個を、４０％メチルセルロース（信越化学（株）製）、３０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）、１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社製）、０．０１mM２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、及び以下の１から４のいずれかを含むα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社製）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック培養皿（Ｎｕnｃ社製）に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で半固定培養した。
【００１９】
１；ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質（ＦＰ６；特願平１１−１２３４１１号に１１２ＶＡＤとして記載した、ＩＬ−６ＲのＮ末端１１２番目のバリン残基から３３３番目のアラニン残基のＣ末端側に、ＩＬ−６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸残基から２１２番目のメチオニン残基が直接ペプチド結合した融合蛋白質）（２５０ｎｇ／ｍｌ）
２；ＩＬ−６（Ｙａｓｕｋａｗａら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．，１２，４１９頁，１９９０年）（１００ｎｇ／ｍｌ）
３；ＩＬ−１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（１００ｎｇ／ｍｌ）
４；ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（１００ｎｇ／ｍｌ）
２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行い、顆粒球コロニー（Ｇ）、マクロファージコロニー（Ｍ）、顆粒球・マクロファージの混合コロニー（ＧＭ）、芽球コロニー（Ｂｌａｓｔ）、顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニー（Ｍｉｘ）、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球コロニー（Ｍｋ）の７種類に分類した。結果を図１に示す。
【００２０】
図１から明らかなように、１を加えた場合では、２、３又は４を加えた場合を大きく上回る数のコロニーが形成された。このことは、ＦＰ６はＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＴＰＯと比較して非常に造血細胞の増幅効果（コロニー形成効果）を有することを示す。
【００２１】
実施例２  各種ファクターのＣＤ３４陽性細胞に対するコロニー形成細胞増幅効果
ＣＤ３４陽性細胞６０００個を、３０％ウシ胎児血清アルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM  ２−メルカプトエタノール、以下の１から５のいずれかを含むα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社製）３ｍｌを分注した１２穴ウエル（Ｎｕnｃ社製）に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で浮遊培養した。
【００２２】
１；ＦＰ６（２５０ｎｇ／ｍｌ）
２；ＦＰ６（１００ｎｇ／ｍｌ）
３；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）
４；ＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ）
５；ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）
１週間後、細胞数を計測した。上記のようにして培養した細胞それぞれ１０００個及び浮遊培養に使用しなかった前記細胞２０００個を、４０％メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．製）、１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社製）、０．０１mM  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＴＰＯ（４ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）（２００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社製）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック培養皿に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で半固定培養した。結果を図２に示す。
【００２３】
２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行い全コロニー数およびＭｉｘコロニー数の計測を行った。コロニー形成細胞の増加率は以下の式１により求めた。Ｍｉｘコロニー形成細胞の増加率を以下の式２により求めた。
【００２４】
式１；（Ａ×Ｂ）／Ｃ
ただし、Ａ＝一週間浮遊培養した後の全コロニー数
Ｂ＝一週間浮遊培養した後の全細胞数／（１０００×（６０００／２０００））。
【００２５】
Ｃ＝浮遊培養する前の全部コロニー数。
【００２６】
式２；（Ａ×Ｂ）／Ｃ
ただし、Ａ＝一週間浮遊培養した後のＭｉｘコロニー数
Ｂ＝一週間浮遊培養した後の全細胞数／（１０００×（６０００／２０００））。
【００２７】
Ｃ＝浮遊培養する前のＭｉｘコロニー数。
【００２８】
図２から明らかなように、１又は２を加えた場合は、３、４又は５を加えた場合を上回るコロニー形成細胞の増幅率とＭｉｘコロニー形成細胞の増幅率が認められた。このことは、ＦＰ６がＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＴＰＯと比較して非常に強いコロニー形成細胞増幅効果および未成熟な造血前駆細胞の増幅効果を有することを示す。
【００２９】
実施例３  ＦＰ６のＣＤ３４陽性細胞に対するＭｉｘコロニー形成細胞増幅効果
ＣＤ３４陽性細胞６０００個を、３０％ウシ胎児血清アルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM  ２−メルカプトエタノール、ＦＰ６（２５０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ１ｍｌを分注した２４穴ウエル（Ｎｕnｃ社製）に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で浮遊培養した。
【００３０】
培養開始後３、６、１０、１４日目に細胞数を計測した。各計測後に、培養した細胞のうちの５００個を、４０％メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清アルブミン、１％ＢＳＡ、０．０１mM  ２−メルカプトエタノール、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（４ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むα−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社）１ｍｌを分注した３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック培養皿に加え、３７℃、５％ＣＯ2、湿度１００％の条件で半固定培養した。
【００３１】
比較のために、浮遊培養する前のＣＤ３４陽性細胞２０００個についても、同様に半固定培養した。
【００３２】
それぞれ２週間後に、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行い、Ｍｉｘコロニー数の計測を行った。更に、ＣＤ３４陽性細胞２０００個を浮遊培養せずに、直ぐに半固定培養した場合（１）、及び、３日間培養した後に半固定培養した場合（２）、６日間培養した後に半固定培養した場合（３）、１０日間培養した後に半固定培養した場合（４）、１４日間培養した後に半固定培養した場合（５）のＭｉｘコロニー形成数を下記式３により算出した。結果を図３に示す。
【００３３】
式３；[浮遊培養した後のＭｉｘコロニー数×（浮遊培養した後の全細胞数／５００／（６０００／２０００））]
図３から明らかなように、２〜３では１と比較して、顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーの増加が認められた。このことは、ＦＰ６はより未分化な造血幹細胞の増幅を誘導し、ｅｘ  ｖｉｖｏ増幅に適していることを示す。
【００３４】
【発明の効果】
本願発明により提供されるＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質からなる増幅剤は、他の生理活性物質を併用する必要なしに、それ単独で造血幹細胞や造血前駆細胞を分化、増殖するための増幅剤としての効果を有する。この結果、従来の３種類以上の生理活性物質を用いる増幅剤と比較して、増幅効果に影響を与える生理活性物質間の比率を考える必要がないという効果がある。
【００３５】
また、高価な生理活性物質を複数種類使用する必要がないため、安価に増幅剤を提供し得るという効果もある。
【００３６】
そして更には、複数種類の生理活性物質を使用する場合、各生理活性物質それぞれに要求される純度や活性の均一化についても、本願発明ではＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質一種類しか使用しないため、その製造及び精製は比較的容易に行い得るという効果があり、しかも、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を製造する際には、比較的容易にロット間格差を生じさせないように管理することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１に示す方法で、１；ＦＰ６（２５０ｎｇ／ｍｌ）、２；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、３；ＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、４；ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下でＣＤ３４陽性細胞２０００個を培養し、各種コロニー数を計測した結果を示す図である。図中、Ｇは顆粒球コロニーを、Ｍはマクロファージコロニーを、ＧＭは顆粒球・マクロファージの混合コロニーを、Ｂｌａｓｔは芽球コロニーを、Ｍｉｘは顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーを、ＢＦＵ−Ｅは赤芽球コロニーを、Ｍｋは巨核球コロニーをそれぞれ示す。
【図２】図２は、実施例２に示す方法で、１；ＦＰ６（２５０ｎｇ／ｍｌ）、２；ＦＰ６（１００ｎｇ／ｍｌ）、３；ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、４；ＩＬ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、５；ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下でのＣＤ３４陽性細胞を１週間培養した後のコロニー形成細胞の増加率とＭｉｘコロニー形成細胞の増加率を求めた図である。
【図３】図３は、実施例３に示す方法で、ＣＤ３４陽性細胞を、１；０日間、２；３日間、３；６日間、４；１０日間、５；１４日間培養した後のＭｉｘコロニー形成数を求めた図である。
【図１】
0004453135.tif 000002
【図２】
0004453135.tif 000003
【図３】
0004453135.tif 000004