(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体であって、該変異体が、野生型プロテオロドプシン変種の保存ヒスチジン残基に変異を含み、野生型プロテオロドプシン変種に比して、より低い pKrhを有する、プロテオロドプシン変異体。
【請求項２】
該野生型プロテオロドプシン変種が、配列番号: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, または 161 の自然界に存在するプロテオロドプシン変種、あるいはそれらと少なくとも 90% のアミノ酸同一性を共有する他のプロテオロドプシン変種である、請求項１のプロテオロドプシン変異体。
【請求項３】
該保存ヒスチジン残基が、配列番号：1 のアミノ酸部位 77 または配列番号: 3 のアミノ酸部位 75 にある、請求項１のプロテオロドプシン変異体。
【請求項４】
該保存ヒスチジン残基が、水素結合を形成し得るアミノ酸に変異されている、請求項１のプロテオロドプシン変異体。
【請求項５】
水素結合を形成し得る該アミノ酸が、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項４のプロテオロドプシン変異体。
【請求項６】
水素結合を形成し得る該アミノ酸が、アスパラギン、グルタミン、リシン、トリプトファン、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項５のプロテオロドプシン変異体。
【請求項７】
請求項１のプロテオロドプシン変異体をコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号: 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, および177よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項１のプロテオロドプシン変異体。
【請求項９】
配列番号: 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, および178よりなる群から選ばれる、請求項７の単離された核酸分子。
【請求項１０】
改善された光学特性を有する請求項１のプロテオロドプシン変異体を調製する方法であって、下記の工程：
(a) 野生型プロテオロドプシン変種の保存ヒスチジンアミノ酸残基を同定すること、
(b) 保存ヒスチジンアミノ酸残基を変異生成し、プロテオロドプシン変異体を得ること、
(c) プロテオロドプシン変異体の光学特性を決定すること、および
(d) 改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体を選択すること、
を含む方法。
【請求項１１】
該保存アミノ酸残基が、部位特異的変異誘発法により変異誘発されている、請求項１０の方法。
【請求項１２】
光学的データを保存および検索する方法であって、下記の工程：
(a) 請求項１のプロテオロドプシン変異体を固定しているマトリックスを含むフィルムを準備すること、
(b) そのフィルムを、予め定めたパターンにおける静止状態でプロテオロドプシン変異体により吸収される波長の光に暴露すること、
(c) フィルムの選択的部分を励起状態に変換し、その中に光学的データを保存すること、
(d) 工程 (c) のフィルムを、静止状態または励起状態でプロテオロドプシン変異体に吸収される波長の光に暴露すること、および
(e) 光学的記録機器により保存の光学データを検出すること、
を含む方法。
【請求項１３】
光駆動エネルギー発生器であって、下記 (a) 請求項１のプロテオロドプシン変異体、(b) 細胞膜、(c) オール-trans-レチナールの源、および (d) 光源を含み、ここで、プロテオロドプシン変異体が細胞膜に入り込み、組み込まれたプロテオロドプシン変異体をつくり、この組み込まれたプロテオロドプシン変異体がオール-trans-レチナールに共有結合し、光吸収色素をつくる、発生器。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体の組成物および使用に関する。特に、このプロテオロドプシン変異体は、自然界に存在するプロテオロドプシン変種またはその高度の同一性をもつ均等物の保存アミノ酸残基に変異を有する。
【０００２】
発明の背景
プロテオロドプシンは、必要不可欠の膜タンパク質である。このものは、非培養の海洋真正細菌から単離され、光駆動プロトンポンプとして機能する。オール-trans-レチナール補因子による光の吸収に際して、プロテオロドプシンは光サイクルを、いくつかの中間体をもって通過する。光刺激によるプロテオロドプシン分子の励起に際し、プロテオロドプシン／レチナール複合体が不安定な中間エネルギー状態に励起されると思われる。プロテオロドプシンは、横ばいまたは中間的エネルギーの観点から変化し得る一連のエネルギー状態、例えば、"M-様状態" もしくは "M-状態"、"K-様状態" もしくは "K-状態"、"N-様状態" もしくは "N-状態" または "O-様状態" もしくは "O-状態" へと進行する。ついで、この複合体は、プロトンの輸送を伴って、さらに安定な基本的状態へと移行する。
【０００３】
プロテオロドプシンは、Halobacterium salinarium に由来するバクテリオロドプシンに幾分関連する (22-24% の配列類似性)。Hampp (Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:633-9, 2000a) がバクテリオロドプシンの構造および機能ならびにその技術的適用について総説している。Hampp (Chem. Rev. 100:1755-76, 2000b) がバクテリオロドプシンの技術的適用について総説している。
【０００４】
プロテオロドプシンとバクテリオロドプシンは、いくつかの共通の特性を有するが、明らかに異なる性質も有する。プロテオロドプシンは、いくつかの技術的適用においてバクテリオロドプシンより利点を持つ。プロテオロドプシンの発現および産生が容易であるからである。しかし、プロテオロドプシンを種々の適用に使用し得る条件は、野生型プロテオロドプシンが細胞外 pH に依存する２種の異なるスペクトル形で存在するので、限定される。塩基性形は、高 pH でのスペクトル形であり、光刺激に対する暴露において励起の M-状態を達成して、プロトンを輸送する。酸性形は、低 pH でのスペクトル形であり、光刺激に対する暴露において励起の M-状態を提示できず、プロトンを輸送しない。
【０００５】
Bac31A8 プロテオロドプシンの２つの明らかな pH-依存性スペクトル形の性質は、ある程度特徴解明されている (Dioumaev, et al., Biochem. 41:5348-58, 2002; Krebs, et al., BMC Physiol. 2:1-8, 2002; Fredrich, et al., J. Mol. Biol. 321, 821-838, 2002)。Bac31A8 プロテオロドプシンの D97 残基は、スペクトルおよび光化学的性質に pH 依存性変化を含む滴定可能基の部分であるとして、かって同定された (Dioumaev, et al., 2002)。しかし Bac31A8 D97N 変異体タンパク質は、単一のスペクトル形、酸性形としてのみ存在するようである。異なる pH 値での Bac31A8 プロテオロドプシンの光サイクル中間体についての分析によると、高 pH ("塩基性") 形のみが、膜を通してプロトンが送られる光サイクルを提示する。従って、この Bac31A8 D97N 変異体は、タンパク質がプロトンをポンプせず、M-状態を形成できないので、大部分の適用において有用でない。
【０００６】
Beja, et al. (Science 289:1902-6, 2000) は、海洋γ−プロテオバクテリアの非培養メンバー (すなわち、"SAR86" グループ) に由来のプロテオロドプシン遺伝子のクローニングを開示している。このプロテオロドプシンは、E.coli で発現され、オール-trans-レチナールに結合して、活性の光駆動プロトンポンプを形成した。
【０００７】
Beja, et al. (Nature 411:786-9, 2001) が、種々の源からの２０以上の変種プロテオロドプシン遺伝子を開示している。このプロテオロドプシン変種は、異なる波長で光を最大限に吸収する、広く分布するプロテオロドプシン変種の広大なファミリーに属しているようである。
【０００８】
WO 01/83701 が、自然界に存在する細胞から回収される具体的なプロテオロドプシン遺伝子およびタンパク質を開示し、また光駆動エネルギー生成系におけるこれらのプロテオロドプシン変種の使用も開示している。
【０００９】
Dioumaev, et al. (Biochem. 41:5348-58)、Krebs, et al. (BMC Physiol. 2:1-8, 2002) および Friedrich, et al (J. Mol. Biol. 321, 821-38, 2002) が、Bac31A8 プロテオロドプシンの２つの明白な pH-依存性スペクトル形についての性質を開示する。Dioumaev, et al. はまた、N 残基が非プロトン性であるので、基本的に酸性形のみが Bac31A8 D97N 変異体に存在することを開示する。さらに、Dioumaev, et al. は、D97E 変異体が酸性形および塩基性形の最大吸収に小さい変化をもたらすことを開示する。E108Q 変異体 は、１００倍遅い M-様状態中間体の崩壊を起こす。D97E と E108Q 変異体の両者は野生型タンパク質に類似の pH 滴定を有する。
【００１０】
Varo, et al. (Bioophysical J., 84:1202-1207 (2003)) が、野生型 Bac31A8 プロテオロドプシンの光サイクルの分析結果を記載し、光サイクルにおける異なる中間体のスペクトル性質および寿命を解明している。
【００１１】
WO 02/10207 が Halobacterium salinarim バクテリオロドプシンなどのプロトン転座のレチナールタンパク質を開示している。ここでは、アミノ酸残基のグループ、D38、R82、D85、D96、D102、D104、E194 および E204 から、プロトン転座に関与するアミノ酸の１以上の位置が改変されている。かかるプロトン転座のレチナールタンパク質は、野生型タンパク質に比して遅い光サイクルを有する。
【００１２】
発明の要約
本発明は、改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体に関する。この変異体は、プロテオロドプシン変種のヒスチジン残基および／またはアルギニン残基などの保存残基中に変異を含む。変異体のひとつの改善された光学特性は、プロテオロドプシン分子の酸性および塩基性のスペクトル形が等しい濃度で存在する、より低い pH (pKrh) を有することである。変異体の別の改善された光学特性は、より小さい塩基性形と酸性形との最大吸収波長の相違を有することである。本発明はまた、具体的なアミノ酸配列を含むプロテオロドプシン変異体を提供する。
【００１３】
保存ヒスチジン残基は、例えば、Bac31A8 のアミノ酸部位 75、Hot75m1 の部位 77 またはプロテオロドプシン変種のその均等部位にある。保存アルギニン残基は、例えば、Bac31A8 のアミノ酸部位 94、Hot75m1 の部位 96 またはプロテオロドプシン変種のその均等部位にある。好ましい変異は、ヒスチジンをアスパラギン、グルタミン、リシン、トリプトファン、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換することであり、アルギニンをアラニン、グルタミン酸またはグルタミンに置換することである。
【００１４】
本発明はまた、プロテオロドプシン変異体をコードする単離された核酸配列を提供する。本発明はさらに、改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体を調製する方法を提供する。
【００１５】
図面の説明
図 1-1 は Hot75m1 (配列番号 1 および 2) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-2 は Bac31A8 (配列番号 3 および 4) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-3 は Bac40E8 (配列番号 5 および 6) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-4 は Bac64A5 (配列番号 7 および 8) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-5 は Hot0m1 (配列番号 9 および 10) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００１６】
図 1-6 は Hot75m3 (配列番号 11 および 12) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-7 は Hot75m4 (配列番号 13 および 14) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-8 は Hot75m8 (配列番号 15 および 16) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-9 は MB0m1 (配列番号 17 および 18) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-10 は MB0m2 (配列番号 19 および 20) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
図 1-11 は MB20m2 (配列番号 21 および 22) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-12 は MB20m5 (配列番号 23 および 24) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-13 は MB20m12 (配列番号 25 および 26) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-14 は MB40m1 (配列番号 27 および 28) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-15 は MB40m5 (配列番号 29 および 30) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００１８】
図 1-16 は MB40m12 (配列番号 31 および 32) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-17 は MB100m5 (配列番号 33 および 34) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-18 は MB100m7 (配列番号 35 および 36) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-19 は MB100m9 (配列番号 37 および 38) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-20 は MB100m10 (配列番号 39 および 40) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
図 1-21 は PalB1 (配列番号 41 および 42) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-22 は PalB2 (配列番号 43 および 44) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-23 は PalB5 (配列番号 45 および 46) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-24 は PalB7 (配列番号 47 および 48) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-25 は PalB6 (配列番号 49 および 50) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２０】
図 1-26 は PalB8 (配列番号 51 および 52) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-27 は PalE1 (配列番号 53 および 54) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-28 は PalE6 (配列番号 55 および 56) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-29 は PalE7 (配列番号 57 および 58) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-30 は MED26 (配列番号 59 および 60) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２１】
図 1-31 は MED27 (配列番号 61 および 62) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-32 は MED36 (配列番号 63 および 64) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-33 は MED101 (配列番号 65 および 66) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-34 は MED102 (配列番号 67 および 68) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-35 は MED106 (配列番号 69 および 70) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２２】
図 1-36 は MED25 (配列番号 71 および 72) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-37 は MED202 (配列番号 73 および 74) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-38 は MED204 (配列番号 75 および 76) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-39 は MED208 (配列番号 77 および 78) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-40 は REDA9 (配列番号 79 および 80) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２３】
図 1-41 は REDB9 (配列番号 81 および 82) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-42 は REDF9 (配列番号 83 および 84) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-43 は RED19 (配列番号 85 および 86) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-44 は RED2 (配列番号 87 および 88) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-45 は RED23 (配列番号 89 および 90) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２４】
図 1-46 は RED27 (配列番号 91 および 92) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-47 は RED30 (配列番号 93 および 94) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-48 は RED4 (配列番号 95 および 96) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-49 は RED5 (配列番号 97 および 98) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-50 は REDr6a5a14 (配列番号 99 および 100) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２５】
図 1-51 は REDr6a5a6 (配列番号 101 および 102) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-52 は REDr7_1_4 (配列番号 103 および 104) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-53 は REDs3_7 (配列番号 105 および 106) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-54 は REDr7_1_15 (配列番号 107 および 108) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-55 は REDs3_15 (配列番号 109 および 110) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２６】
図 1-56 は medA15r8ex6 (配列番号 111 および 112) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-57 は REDr7_1_16 (配列番号 113 および 114) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-58 は medA15r11b9 (配列番号 115 および 116) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-59 は medA15r9b5 (配列番号 117 および 118) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-60 は medA15r8b3 (配列番号 119 および 120) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２７】
図 1-61 は medA15r11b3 (配列番号 121 および 122) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-62 は medA15_r8_1 (配列番号 123 および 124) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-63 は medA17R9_1 (配列番: 125 および 126) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-64 は medA15r8b9 (配列番号 127 および 128) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-65 は medA19_R8_16 (配列番号 129 および 130) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２８】
図 1-66 は medA19_R8_19 (配列番号 131 および 132) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-67 は medA17_R8_6 (配列番号 133 および 134) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-68 は medA15r9b7 (配列番号 135 および 136) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-69 は medA15_R8_3 (配列番号 137 および 138) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-70 は medA15r10b5 (配列番号:139 および 140) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００２９】
図 1-71 は medA19_r9_9 (配列番号 141 および 142) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-72 は medA15_r8ex7 (配列番号 143 および 144) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-73 は medA19_R8_20 (配列番号 145 および 146) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-74 は medA15_R8ex9 (配列番号 147 および 148) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-75 は medA15_r9_3 (配列番号 149 および 150) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００３０】
図 1-76 は medA17_r8_15 (配列番号 151 および 152) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-77 は medA17_r8_11 (配列番号 153 および 154) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-78 は medA15r8b8 (配列番号:155 および 156) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-79 は medA15r8ex4 (配列番号 157 および 158) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-80 は ANT32C12 PR (配列番号 159 および 160) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
図 1-81 は HOT2C01 PR (配列番号 161 および 162) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００３１】
図 2-1 〜 2-11 は、プロテオロドプシン変異体 Bac31A8 H75K (配列番号 163 および 164)、Bac31A8 H75N (配列番号 165 および 166)、Bac31A8 H75Q (配列番号 167 および 168)、Hot75ml H77K (配列番号 169 および170)、Hot75ml H77N (配列番号 171 および 172)、Hot75ml H77Q (配列番号 173 および 174)、Hot75ml H77E (配列番号 175 および 176)、Hot75ml H77W (配列番号 177 および 178)、Hot75ml R96A (配列番号 179 および 180)、Hot75ml R96E (配列番号 181 および 182)、Hot75ml R96Q (配列番号 183 および 184) のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
図 3-1 〜 3-8 は、81 天然型プロテオロドプシン変種のアミノ酸配列の平行整列を示す。太字 "H" は Bac31A8 のH75 に対応する保存ヒスチジンの部位を表す。太字 "R" は Bac31A8 のR94 に対応する保存アルギニンの部位を表す。
【００３３】
図 4 は、プラスミド pTrcHis2-Hot75m1 のマップを示す。
図 5 は、pH 4.9、6.0、6.9、8.1 および 9.1 における変異体 Hot75m1 H77Q および野生型 (WT) Hot75m1 の吸収スペクトルの滴定曲線を示す。
図 6 は、種々の pH における Hot75ml および Hot75ml H77Q の酸性形のフラクションを示す。
【００３４】
図 7-1 は、照射の有無で Bac31A8 野生型を発現する細胞での細胞外 pH 変化を示す。
図 7-2 は、照射の有無で LacZ コントロールタンパク質を発現する細胞での細胞外 pH 変化を示す。
図 7-3 は、Bac31A8 野生型 および H75N 変異体についてのプロトンポンピング速度に対する細胞外 pH の作用を示す。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
定義
明細書および請求項での使用において、単数は、文意から明らかに反していない限り複数をも含み得る。例えば、単数のポリペプチドは複数のポリペプチドをも含み得る。
【００３６】
用語 "誘導される" は情報のみによる誘導を包含する。例えば、あるアミノ酸配列は野生型タンパク質から、野生型タンパク質の既知のアミノ酸配列から化学的にアミノ酸配列を合成することについての情報を用いて、誘導され得る。
【００３７】
用語 "プロテオロドプシン変種" は、既知であろうが未知であろうが、種々の自然界に存在するプロテオロドプシンおよびその同族体を包含する。これらは、"M-状態" または "M-様状態" を含有する光サイクルを受け得る。図 1-1 〜 1-81 は 81 プロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。これらのプロテオロドプシン変種は互いに 53 〜 99.6% のアミノ酸配列の同一性を示す。用語 "プロテオロドプシン変種" は、図 1-1 〜 1-81 に記載のいずれかのプロテオロドプシン変種とアミノ酸配列が少なくとも 53%、好ましくは 90%、さらに好ましくは 95%、最も好ましくは 97 または 98% 同一であるタンパク質を含む。用語 "プロテオロドプシン変種" はまた、２以上の天然に存在するプロテオロドプシンからのアミノ酸配列の融合により構築された融合プロテオロドプシンであって、各アミノ酸配列が得られたプロテオロドプシンの均等部位を占めるものを包含する (たとえ、これらの融合プロテオロドプシンが自然界に存在しなくても)。
【００３８】
本願の目的のために用語 "プロテオロドプシン変異体" は、１以上のアミノ酸残基および／またはヌクレオチドを、異なるアミノ酸および／またはヌクレオチド配列で置換される１以上の変異を含むプロテオロドプシン変種を意味する。
【００３９】
用語 "基本的状態" または "B-状態 または B-様状態" は、光励起なしでプロテオロドプシンの光サイクルの基本的状態を意味する。プロテオロドプシン変種の基本的吸収最大は一般的に 480 nm と 530 nm との間、しばしば 488 と 526 nm の間にある。
【００４０】
用語 "M-状態" または "M-様状態" は基本的状態に比して光サイクルの励起スペクトル状態を意味する。プロテオロドプシン変種の M-状態の吸収最大は一般的に 350 nm と 450 nm との間、しばしば約 410 nm である。M-状態 は他の同定されたスペクトル状態、K-、N- および O-様状態と識別される。他のすべては基本的状態に比して赤側にシフトされた吸収スペクトル (例えば、>530 nm) を持つ。
【００４１】
本願の目的のために用語 "pKrh" は、等しい濃度でプロテオロドプシン分子の酸性および塩基性スペクトル形が存在する pH を意味する。出願人は、この用語を、等しい濃度で分子の酸性形および塩基形が存在する pH を同定する用語である pKa から得た。あるプロテオロドプシンの pKrh が具体的な値であると決定されると、その特定値は塩基性形と酸性形が等しい濃度で存在する pH である。pKrh に関する環境の pH を動かすと、存在する塩基性形または酸性形の濃度が、動かされた方向 (より酸性またはより塩基性) および pH 単位に従って移動する。
【００４２】
本願の目的のために用語 "最大波長" は、具体的な pH でのプロテオロドプシンについての最大吸収の波長である。
【００４３】
略号
IPTG、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド、
MES、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、
MOPS、(3-N-モルホリノ)プロパンスルホン酸、
TAPS、N-([トリ(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ) プロパンスルホン酸、
CHES、2-(N-シクロヘキシルアミノ) エタンスルホン酸、
EDTA、エチレンジアミンテトラアセテート。
【００４４】
寄託
Bac31A8 クローンを含有する E. coli (ATCC No. PTA-3083)、Bac40E8 クローンを含有する E. coli (ATCC No. PTA-3082)、Bac41B4 クローンを含有する E. coli (ATCC No. PTA-3080) および Bac64A5 クローンを含有する E. coli (ATCC No. PTA-3081) は、ATCC 特許寄託機関 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, U.S.A.) に２００１年３月２１日に寄託された。
【００４５】
プラスミド PalE6 を含有する E. coli (ATCC No. PTA-3250)、プラスミド Hot0m1 を含有する E. coli (ATCC No. PTA-3251) およびプラスミド Hot75m4 を含有する E. coli (ATCC No. PTA-3252) は、ATCC 特許寄託機関 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, U.S.A.) に２００１年３月３０日に寄託された。
【００４６】
本発明は、改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体に関する。この変異体は、プロテオロドプシン変種の保存アミノ酸残基中に変異を含み、これがスペクトル移動を起こす。改善された光学特性は、変異体が誘導された元のプロテオロドプシン変種に比して、より低い pKrh または、より小さい塩基性形と酸性形との最大吸収波長の差異をもつことを含む。
【００４７】
プロテオロドプシンおよびその光化学的性質
プロテオロドプシンは、一般的にシリンダー型チャネルを形成する７つのリピド膜に及ぶα-ヘリックスの構造を有する膜貫通タンパク質である。正しくたたまれ、オール-trans-レチナールが供給されると、プロテオロドプシンの７つのα-ヘリックスはオール-trans-レチナールを囲む枠として整列される。適切に折りたたまれたプロテオロドプシンは、オール-trans-レチナールを結合し、プロトンが輸送される光サイクルを受け得る性質を有する。オール-trans-レチナールの源には、発光団レチナールおよびオール-trans-レチナールの化学的誘導体がある。レチナールの化学的誘導体は、限定でないが、3-メチル-5-(1-ピリル)-2E,4E-ペンタジエナル、3,7-ジメチル-9-(1-ピリル)-2E,4E,6E,8E-ノナテトラエナル、オール-trans-9-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロフェニル)-3,7-ジメチル-2,4,6,8-ノナテトラエナル、2,3-デヒドロ-4-オキソレチナールおよび類似化合物を含む。プロテオロドプシンは光-活性化プロトンポンプである。プロテオロドプシンはオール-trans-レチナールを結合し、光の可視波長範囲で吸収する色素を形成する。
【００４８】
シッフ塩基結合により保存リシン (Bac31A8 中 K231、Hot75M1 中 K234) に共有結合されたオール-trans-レチナールはプロテオロドプシンの可視光発光団に寄与する。この発光団による光エネルギーの吸光度は光サイクルを通して、細胞宿主の内部から外部へオール-trans-レチナール結合ポケットを介してプロトンをポンプする機械エネルギーに変える。ついで、プロトン不均衡が化学エネルギーとして細胞に使用される。
【００４９】
プロテオロドプシンは２つの明白な pH-依存性スペクトル形：塩基性形と酸性形を有する。塩基性形は、励起 M-状態 (または M 中間体) を含む光サイクルに入り、細胞の内側から外側にプロテオロドプシン含有膜にそってプロトン、H+ をポンプし得る。塩基性形は迅速光サイクルを有し、細胞または細胞ビヒクルからプロトンを輸送し得る。プロテオロドプシンは、塩基性形に存在し、光で刺激されると、最初に励起エネルギー状態、例えば M-状態に進み、ついでプロトンを輸送する基本的エネルギーまたは静止状態に戻る。それにより電荷すなわちプロトンが輸送され、この過程においてプロトンが膜を介しておよび細胞から送られる (参照、Dioumaev, et al. および Krebs, et al.)。
【００５０】
酸性形のプロテオロドプシンは、M-状態を含む光サイクルに入ることができず、プロトンをポンプし得ない。種々の pH の緩衝液における吸光度に対する波長をプロットした分光滴定曲線は、いくつかの野生型プロテオロドプシンの酸性形と塩基性形の濃度が pH 範囲約 7-8 (すなわち、pKrh が約 7 - 8) でほぼ等しいことを示す。例えば、無傷の細胞中の Hot75m1 は pKrh 値約 8.2 を有する。Hot75m1 は、pH が 4.9 から 9.1 に変化するときに、最大吸収約 45 nm での動きを提示する。ひとつの形、塩基性形のみが生産的な光サイクルをもたらすので、種々のスペクトル形の形成は、プロテオロドプシンを特定の適用に用いうる条件を制限する。
【００５１】
種々の自然界に存在するプロテオロドプシン変種は異なる吸収最大波長を有する。プロテオロドプシンが酸性形にあるときの最大吸収波長は、約 534 〜約 570 nm である。プロテオロドプシンが塩基性形にあるときの最大吸収波長は ２グループになる：約 488 〜 494 nm の範囲にあるものと約 516 〜約 528 nm の範囲にあるものとである。種々の自然界に存在するプロテオロドプシン変種はまた、異なる pKrh 値を有し、その範囲は約 7.1 〜約 8.6 である。
【００５２】
理論に縛られる意図でないが、プロテオロドプシンの光化学的性質は、pH、両親媒性分子の存在 (界面活性洗剤など)、環境の温度、環境における化学物質の存在 (アジドまたはグリセロールなど) およびプロテオロドプシンを含有する媒体の水含量のいずれかひとつまたはこれらの組合せにより変わり得ると思われる。
【００５３】
改善された光学特性
上記のように、プロテオロドプシンの有用な生産的な形態は塩基性形である。pKrh 8.0のプロテオロドプシン集団の塩基性スペクトル形を非常に多く得るために、pH 10.0 以上に２以上のpH 単位を動かすと、酸性形に対する塩基性形の相対量が増加すると思われる。しかし、かかる塩基性環境はプロテオロドプシンについて最良の pH ではない。なぜなら、タンパク質は一般的にこのような高い pH で変性するからである。従って、低い pKrh 値をもつプロテオロドプシン変異体が望ましい。
【００５４】
本発明のプロテオロドプシン変異体は、自然界に存在するプロテオロドプシンよりも低い（より酸性)、変えられた pKrh 値を好ましくは有する。ひとつの実施態様において、プロテオロドプシン変異体は中性 pH よりも低い pKrh 値を有する。これは、ほぼ中性の pH でポリペプチドがより安定であり、長い保存性をもつことによる。ほぼ中性の pH でプロトンが輸送される光サイクルをプロテオロドプシンが受け得るために、プロテオロドプシン変異体の pKrh 値は、塩基性形がほぼ中性の pH 範囲、例えば、約 5.5-9.0、約 6.0-9.0 または約 7.1 - 8.6 で多数となり得るように、できるだけ下げねばならない。
【００５５】
プロテオロドプシン変異体の pKrh 値は、変異体が誘導されてきた元のプロテオロドプシン変種の値に比して下げる。pKrh 値を少なくとも 1.0、好ましくは 2.0、より好ましくは 3.0 pH 単位下げる。
一般的に、プロテオロドプシン変異体の pKrh 値は、7.0 に、好ましくは 6.0、より好ましくは 5.0、さらに好ましくは 4.0、いっそう好ましくは 3.0 以下に下げる。
【００５６】
プロテオロドプシン変異体は、一般的に、塩基性形が支配的である pH について広い範囲を有する。プロテオロドプシンの塩基性形が支配的である pH の範囲は、 変異体が誘導されてきた元のプロテオロドプシン変種に比して、1.0、好ましくは 2.0、さらに好ましくは 3.0 増加される。好ましくは、プロテオロドプシン変異体の pKrh 値 は、基本的に塩基性形のみが有用な pH 範囲で存在するのに十分低い。
【００５７】
プロテオロドプシン変異体において、塩基性形が支配的である pH の範囲の低い限界は、少なくとも pH 7.0、好ましくは 6.0、より好ましくは 5.0、さらにより好ましくは 4.0 または 3.0 まで拡張される。あるいは、プロテオロドプシン変異体は、すべての pH 条件の塩基性形で支配的である。
【００５８】
本発明の他の実施態様において、プロテオロドプシン変異体は、変異体が誘導されてきた元のプロテオロドプシン変種に比して、より小さい相違を塩基性形と酸性形とに最大吸収波長に有する。最大吸収が塩基性形と酸性形とで接近しているような変異体は、環境 pH が pKrh 値に近い適用において有用である。かかる適用において、両スペクトル形が存在する。塩基性形と酸性形との間に最大吸収の大きい相違は、広い混成の吸収スペクトル (より広いスペクトル幅) となる。塩基性形と酸性形の吸収スペクトルが付け加わるからである。変異体プロテオロドプシンが塩基性形と酸性形とに最大吸収の小さい相違をもつときは、混成の吸収スペクトルは狭くなる(より小さいピーク幅)。
【００５９】
プロテオロドプシン変異体は、塩基性形と酸性形との最大吸収波長の相違が 25 nm 以下、好ましくは 20 nm 以下、より好ましくは 15 nm 以下、最も好ましくは 10 nm 以下である。
【００６０】
プロテオロドプシン変種
変異体が誘導される元のプロテオロドプシン変種は、自然界に存在するいずれのプロテオロドプシンでもあり得る。プロテオロドプシン変種およびそれをコードするヌクレオチドは、細菌分野の自然界に存在するメンバーから得られる。かかるメンバーには、SAR86 グループなどの海洋細菌がある。本発明で有用なプロテオロドプシン変種は、海洋細菌から誘導されるものおよび非海洋細菌から誘導または取得されるものを含む。プロテオロドプシンには多くの変種があり、そのすべてを本発明で使用し得る。 
【００６１】
種々の源からの 29 プロテオロドプシン変種のアミノ酸配列を図 1-1 〜 1-29 に示す(Baja, et al., Nature 411:786-9 (2001))。これらには、Hot75m1 (配列番号: 1)、Bac31A8 (配列番号: 3)、Bac40E8 (配列番号: 5)、Bac41B4 (配列番号: 7)、Bac64A5 (配列番号: 9)、Hot0m1 (配列番号: 11)、Hot75m3 (配列番号: 13)、Hot75m4 (配列番号: 15)、Hot75m8 (配列番号: 17)、MB0m1 (配列番号: 19)、MB0m2 (配列番号: 21)、MB20m2 (配列番号: 23)、MB20m5 (配列番号: 25)、MB20m12 (配列番号: 27)、MB40m1 (配列番号: 29)、MB40m5 (配列番号: 31)、MB100m5 (配列番号: 33)、MB100m7 (配列番号: 35)、MB100m9 (配列番号: 37)、MB100m10 (配列番号: 39)、PalB1 (配列番号: 41)、PalB2 (配列番号: 43)、PalB5 (配列番号: 45)、PalB7 (配列番号: 47)、PalB6 (配列番号: 49)、PalB8 (配列番号: 51)、PalE1 (配列番号: 53)、PalE6 (配列番号: 55)および PalE7 (配列番号: 57)がある。
【００６２】
地中海および紅海からの 22 プロテオロドプシン変種のアミノ酸配列を図 1-30 〜 1-51 に示す(参照、Man, et al., EMBO J., 22:1725-1731 (2003))。これらには、MED 26 (配列番号: 59)、MED 27 (配列番号: 61)、MED36 (配列番号: 63)、MED101 (配列番号: 65)、MED102 (配列番号:  67)、MED106 (配列番号: 69)、MED25 (配列番号: 71)、MED202 (配列番号: 73)、MED204 (配列番号: 75)、MED208 (配列番号: 77)、REDA9 (配列番号: 79)、REDB9 (配列番号: 81)、REDF9 (配列番号:  83)、RED19 (配列番号: 85)、RED2 (配列番号: 87)、RED23 (配列番号: 89)、RED27 (配列番号: 91)、RED30 (配列番号: 93)、RED4 (配列番号: 95)、RED5 (配列番号: 97)、REDr6a5a14 (配列番号: 99) および REDr6a5a6 (配列番号: 101)がある。
【００６３】
地中海および紅海からの他の 28 プロテオロドプシン変種のアミノ酸配列を図 1-52 〜 1-79 に示す(参照、Sabehi, et al., Environ. Microbiol., 5: 842-9 (2003))。これらには、REDr7_1_4 (配列番号: 103)、REDs3_7 (配列番号: 105)、REDr7_1_15 (配列番号: 107)、REDs3_15 (配列番号: 109)、medA15r8ex6 (配列番号: 111)、REDr7_11_6 (配列番号: 113)、medA15r11b9 (配列番号: 115)、medA15r9b5 (配列番号: 117)、medA15r8b3 (配列番号: 119)、medA15r11b3 (配列番号: 121)、medA15_r8_1 (配列番号: 123)、medA17R9_1 (配列番号: 125)、medA15r8b9 (配列番号: 127)、medA19_R8_16 (配列番号: 129)、medA19_R8_19 (配列番号: 131)、medA17_R8_6 (配列番号: 133)、medA15r9b7 (配列番号: 135)、medA15_R8_3 (配列番号: 137)、medA15r10b5 (配列番号: 139)、medA19_r9_9 (配列番号: 141)、medA15_r8ex7 (配列番号: 143)、medA19_R8_20 (配列番号: 145)、medA15_R8ex9 (配列番号: 147)、medA15_r9_3 (配列番号: 149)、medA17_r8_15 (配列番号: 151)、medA17_r8_11 (配列番号: 153)、medA15r8b8 (配列番号: 155) および medA15r8ex4 (配列番号: 157) がある。
【００６４】
別の新たに単離された2プロテオロドプシン変種のアミノ酸配列を図 1-80 〜 1-81 に示す(参照、De La Torre, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 12830-5 (2003))。これは、ANT32C12 PR (配列番号: 159) および HOT2C01 PR (配列番号: 161) である。
【００６５】
変異体が誘導される元のプロテオロドプシン変種は、配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 のものを含み、限定でないが、自然界に存在するプロテオロドプシン変種またはこれらの列挙した配列とアミノ酸同一性が少なくとも 70% もしくは 80% もしくは 90% もしくは 95% であるプロテオロドプシン 変種であり得る。
【００６６】
81 プロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-1 〜 1-81) は、本発明において変異体を調製するのに使用できる。さらに、81 プロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は、本発明の変異体を調製するのに適当な機能的に均等の分子を調製するために、置換、付加または欠失により変えることができる。例えば、ヌクレオチドのコード配列の縮重により、図 1-1 〜 1-81 示されるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードする別の DNA 配列を本発明の実施で使用し得る。この DNA 配列は、サイレント変化をつくっている配列内で同じまたは実質的に均等のアミノ酸をコードする種々のコドンの置換により変えることができる。例えば、配列内のアミノ酸残基は、類似の極性または類似のクラスの別のアミノ酸で置換し得る。非極性 (疎水性) アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシンおよびメチオニンがある。極性の中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがある。陽電荷 (塩基性) アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンがある。負電荷 (酸性) アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。
【００６７】
本発明のひとつの実施態様において、プロテオロドプシン変異体は、アミノ酸配列 Bac31A8 H75K (配列番号: 163)、Bac31A8 H75N (配列番号: 165)、Bac31A8 H75Q (配列番号: 167)、Hot75ml H77K (配列番号: 169)、Hot75ml H77N (配列番号: 171)、Hot75ml H77Q (配列番号: 173)、Hot 75ml H77E (配列番号: 175)、Hot75ml H77W (配列番号: 177)、Hot75ml R96A (配列番号: 179)、Hot75ml R96E (配列番号: 181) および Hot75ml R96Q (配列番号: 183) を含む。
【００６８】
プロテオロドプシン変異部位
自然界に存在するプロテオロドプシン変種は約 234 〜 249 アミノ酸を有する。異なる形のプロテオロドプシンのアミノ酸配列の比較は、その物理的または化学的性質を識別して、有用な変異体タンパク質をつくり、慎重に改変された機能を持つ新しい変異体の創造に向けるであろう具体的な標的領域を明らかにできる。
【００６９】
本発明に従って、プロテオロドプシン Bac31A8 および／または Hot75m1 について決定された配列を、所望の変異についての部位を推論するために、既知のプロテオロドプシン配列 (参照、図 1-1 〜 1-81) または新たに発見されたプロテオロドプシン配列と比較する。これをなすために、まず、比較すべきプロテオロドプシン間の関係の緊密性を調べる。
【００７０】
関係の緊密性は、アミノ酸配列の比較により決定できる、タンパク質配列を平行整列するのに多くの方法がある。関係を定義できる方法は、Atlas of Protein Sequence and Structure, Margaret O. Dayhoff editor, vol. 5, supplement 2, 1976, National Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, Washington, D.C., p. 3 ff., entitled SEARCH and ALIGN に記載されている。当技術分野で知られているように、関係するタンパク質は、アミノ酸の数および鎖上の各アミノ酸の同一性が異なる。すなわち、２構造を最大の同一性について平行整列したとき、欠失または挿入があり得る。例えば、プロテオロドプシン Bac31A8 が 249 アミノ酸のみを有するのに対し、プロテオロドプシン Hot75m1 は 252 アミノ酸を有する。この２配列を平行整列すると、Bac31A8 はHot75M1 の 214 に対応する残基を有さない。このように、Bac31A8 のアミノ酸配列は、Bac31A8 の部位 211 と 212 との間でギャップを記録しないと、Hot75m1 と非常に異なるようにみえる (参照、平行整列について 図 2)。Bac31A8 と Hot75m1 の本来のアミノ酸配列の平行整列に基づいて、高程度の信頼性をもって、プロテオロドプシン Bac31A8 の部位75 での H を Q、N または K で置き換えると、プロテオロドプシン Hot75M1 の部位77 での H を Q、N または K で置き換えたのと、同じく変化された光化学的および立体測光的性質が生じることを推測できる。
【００７１】
Bac31A8 プロテオロドプシン中の保存アミノ酸 D97 (Asp97) は、光サイクルにおけるレチナール・シッフ塩基にプロトンを付与するアミノ酸残基である。Bac31A8 D97N プロテオロドプシン変異体は酸性形に閉じこめられており、プロトンをポンプしたり、完全な光サイクルを受けたりすることができない (Dioumaev, et al.)。Bac31A8 D97E プロテオロドプシン変異体は、保存アミノ酸の置換を有し、酸性および塩基性の pH で 野生型 Bac31A8 プロテオロドプシンに比して異なる波長スペクトルをもつ。しかし、Bac31A8 D97E 変異体は、野生型 Bac31A8 プロテオロドプシンに比して類似の pH 依存性スペクトル変化および類似の pKrh 値を有する (Dioumaev, et al.)。このように、Asp97 部位での保存的置換は、スペクトル変化を起こすが、pKrh 値の変化を起こさない。プロトン付与基の本質および部位がプロテオロドプシンの光サイクルの適切な機能化に重要であるので、Bac31A8 プロテオロドプシンの D97 の変化が、プロトンまたは光サイクルのポンピングを崩壊することなしに pKrh 値の変化を可能にするようではない。
【００７２】
オール-trans-レチナール結合部位を介してプロトンの交替に含まれるが、オール-trans-レチナール補因子に直接接触していない保存アミノ酸は、プロテオロドプシンの pH 依存性スペクトル移動および pKrh 値に影響を与え、プロトンそして生産的光サイクルの継続的なポンピングを可能にするようである。出願人は、プロテオロドプシンにおけるかかる保存アミノ酸残基を同定した。
【００７３】
本発明は、変異体プロテオロドプシンが１以上の変異を保存アミノ酸残基中に有し、該１以上の変異が該プロテオロドプシンに光化学性に変化をもたらし、該変異体プロテオロドプシンが光学的に刺激されたときに、プロトンを輸送する光サイクルを受けるようなプロテオロドプシン変異体を提供する。本発明のプロテオロドプシン変異体は、プロテオロドプシン変種に比して、改善された光学特性をもつ。改善された光学特性は、より低い pKrh 値または、より小さい塩基性形と酸性形との最大吸収スペクトルの相違である。本発明は、光サイクルにおいて輸送されるプロトンと相互作用し得る多数の保存アミノ酸残基を同定した。それらは、プロテオロドプシンの塩基性形が現れる pH を変え、および／または野生型に比してプロテオロドプシンのスペクトル測光性を変える。
【００７４】
プロテオロドプシンの保存アミノ酸残基は、図 3 に示される 81 プロテオロドプシンの均等部位にあるアミノ酸である。保存アミノ酸残基は、異なるアミノ酸で置換されたときに、プロテオロドプシンの光化学性を変え、本発明では重要である。図 3 は 81 天然型プロテオロドプシン変種のアミノ酸配列についての平行整列を示す。保存アミノ酸残基の例 (BAC31A8 の H75、R94、D227) を図 3 に示す。かかる保存アミノ酸残基は、プロテオロドプシンタンパク質に関するタンパク質の配座およびオール-trans-レチナール分子の部位化に影響を与え得る。
【００７５】
本発明は、プロテオロドプシン変種の保存ヒスチジンおよびアルギニン残基が光サイクルにおけるプロトン輸送に重要であることを明らかにする。保存ヒスチジン残基 (例えば、Bac31A8 中の H75 および Hot75m1 中の H77) および 保存アルギニン残基 (例えば、Bac31A8 中の R94 および Hot75m1 中の R96) が D97 残基およびオール-trans-レチナール分子の両方の近くに目的的に位置する。プロテオロドプシンにおけるこれらの残基は、D97 または他のアミノ酸または D97 と相互作用する水分子と相互作用するが、オール-trans-レチナールとは直接的に相互作用しない。保存ヒスチジンおよび保存アルギニンは、種々の pH 値でスペクトル変化の因である水素結合基の部分のようである。
【００７６】
水素結合を形成し得るアミノ酸で置換された保存ヒスチジンをもつプロテオロドプシン変異体は、pKrh を野生型プロテオロドプシンよりも低い pH (より酸性) 値に移動する光学化学性の変化を有する。例えば、Bac31A8 プロテオロドプシンの H75 および Hot75m1 プロテオロドプシンの H77 での変異は、プロテオロドプシン pKrh 値を下げ、塩基性形の pH 域を拡大する。いくつかの H75 または H77 プロテオロドプシン変異体において、塩基性形のみが試験した pH 域 (pH 4.9 〜 9.1 など)で存在する。これは移動する pKrh 値で起き、低いので実験に使用した pH 値の外側にある。酸性形が低い pH で現れることもある。塩基性形におけるかかる変異は、プロトン輸送をもたらし、光刺激で M-状態となる光サイクルを受け得る。
【００７７】
本発明において水素結合を形成でき、ヒスチジンを置換するのに適したアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸 (酸性 pH でそのプロトン化状態)、グルタミン酸 (酸性 pH でそのプロトン化状態)、トリプトファン、および水素結合を形成するのに水素に寄与し得る官能基を有するいかなる合成アミノ酸がある。好ましいプロテオロドプシン変異体は、グルタミン (Q)、アスパラギン (N)、グルタミン酸 (E)、リシン (K)、アスパラギン酸 (D) および トリプトファン (W) で置換された保存ヒスチジン残基を有する。
【００７８】
異なるアミノ酸で置換された保存アルギニンを有するプロテオロドプシン変異体は、塩基性形と酸性形との最大吸収波長の相違が野生型プロテオロドプシンよりも小さくなる改変された光化学性を有する。好ましいプロテオロドプシン変異体は、アラニン、グルタミン酸またはグルタミンに変えられた保存アルギニン残基を有する。
【００７９】
プロテオロドプシン変異体について変更された光化学性は、無傷または全細胞におけるプロテオロドプシンのスペクトル移動を測定することにより同定できる。その細胞では、プロテオロドプシンが、細胞質膜中に、または両親媒性分子により安定化された溶性ポリペプチド形中に、または純粋なポリペプチド形中に存在するものである。さらに、変更された光化学性は、膜調製におけるプロテオロドプシンのスペクトル移動を測定することにより同定できる。この膜は、限定でないが、粗製のまたは部分的に精製された膜を含む。膜調製はリピドおよびプロテオロドプシン以外の可能な膜タンパク質を含有する。
【００８０】
本発明は、改善された光学特性をもつプロテオロドプシン変異体を調製する方法を提供する。この方法は下記の工程を含む：(a) 野生型プロテオロドプシン変種の保存アミノ酸残基を同定すること、(b) 保存アミノ酸残基を変異誘発して、プロテオロドプシン変異体を得ること、(c) プロテオロドプシン変異体の光学特性を決定すること、(d) 改善された光学特性を有するプロテオロドプシン変異体を選択すること。保存アミノ酸残基は、例えばヒスチジンまたはアルギニン残基である。野生型プロテオロドプシン変種は当業者に知られている方法で変異誘発できる。その方は、限定でないが、部位特異的変異誘発法を含む。
【００８１】
プロテオロドプシン変種のヌクレオチド／アミノ酸配列
種々のプロテオロドプシンのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-1 〜 1-29) がジーンバンクに寄託番号 AF349976-AF350003 および AF279106 (これは Bac31A8 プロテオロドプシンをコードする遺伝子を含む 105 kilobase ゲノム領域のヌクレオチド配列を含有する) で寄託されている。新たに単離されたプロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-30 〜 1-51) がジーンバンクに寄託番号 AY210898-AY210919 で寄託されている。新たに単離されたプロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-52 〜 1-79) がジーンバンクに寄託番号 AY250714-AY250741 で寄託されている。新たに単離されたプロテオロドプシン変種のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列 (図 1-80 〜 1-81) がジーンバンクに寄託番号 AY372453 および AY372455 で寄託されている。これらの全配列は、本出願で引用により具体的に組み込む。
【００８２】
これらの天然型プロテオロドプシンのアミノ酸配列のいずれかを用いて、プロテオロドプシン変異体をつくることができる。例えば、天然型プロテオロドプシン変種には、Hot75m1、Bac31A8、Bac40E8、Bac41B4、Bac64A5、Hot0m1、Hot75m3、Hot75m4、Hot75m8、MB0m1、MB0m2、MB20m2、MB20m5、MB20m12、MB40m1、MB40m5、MB100m5、MB100m7、MB100m9、MB100m10、PalB1、PalB2、PalB5、PalB7、PalB6、PalB8、PalE1、PalE6、PalE7、MED 26、MED27、MED36、MED101、MED102、MED106、MED25、MED202、MED204、MED208、REDA9、REDB9、REDF9、RED19、RED2、RED23、RED27、RED30、RED4、RED5、REDr6a5a14、REDr6a5a6、REDr7_1_4、REDs3_7、REDr7_1_15、REDs3_15、medA15r8ex6、REDr7_1_16、medA15r11b9、medA15r9b5、medA15r8b3、medA15r11b3、medA15_r8_1、medA17R9_1、medA15r8b9、medA19_R8_16、medA19_R8_19、medA17_R8_6、medA15r9b7、medA15_R8_3、medA15r10b5、medA19_r9_9、medA15_r8ex7、medA19_R8_20、medA15_R8ex9、medA15_r9_3、medA17_r8_15、medA17_r8_11、medA15r8b8、medA15r8ex4、ANT32C12 PR および HOT2C01 PR がある。好ましい天然型プロテオロドプシン変種は Hot75m1 および Bac31A8 プロテオロドプシンである。
【００８３】
上記プロテオロドプシン遺伝子のいずれのヌクレオチド配列も Beja, et al. (2000) または WO 01/83701 の方法を用いて、取得または誘導できる。プロテオロドプシン変種をコードする遺伝子の例は、バクテリオプランクトン Bacterial Artificial Chromosome (BAC) クローン Bac31A8 (EBAC31A08 としても知られる)である (参照、WO 01/83701)。当業者は、異なるプロテオロドプシン変種をコードする他の遺伝子を、上記と同様の方法を用いて得ることができる。当業者はまた、プロテオロドプシン遺伝子を、天然型生育物から得られる生物体から、プライマーを設計し、DNA の縮重 PCR、異型ハイブリダイゼーションまたはランダム配列決定を用いることにより、取得またはクローン化し得る。
【００８４】
適切な宿主
プロテオロドプシンは、適切な宿主において発現または合成されたときに、膜中に適当に折りたたまれ、組み込まれ得る。適切な宿主は SAR 86 株などのプロテオロドプシンを天然で発現する細胞である。適切な宿主はまた、プロテオロドプシンを天然で発現しない細胞である。適切な宿主には、海洋系または非海洋系の細胞がある。好ましくは、適切な宿主は、膜外プロテアーゼを欠いており、かかるプロテアーゼを天然的に発現しないか、そのように構築されている。適切な宿主の例は、ユーバクテリア細胞、好ましくはグラム陽性菌、例えば、ガンマプロテオバクテリアなどのプロテオバクテリアである。ガンマプロテオバクテリアは、Escherichia、Edwardsiella、Citrobactor、Salmonella、Shigella、Klebsiella、Enterobacter、Serratia、Proteus および Yersinia などの腸内菌科に属する。実施態様において、Salmonella 属に属するガンマプロテオバクテリアは Salmonella typhimurium である。別の実施態様において、Escherichia 属に属するガンマプロテオバクテリアは Escherichia coli である。
【００８５】
任意に、ポリペプチドは、膜外プロテアーゼ欠損株で発現または合成される。かかる適切な株には、E. coli 株: UT5600 (Beja, et al. (2000), およびDioumaev, et al. で開示) および BL21-Codonplus-RIL がある。あるいは、ガンマプロテオバクテリア は SAR86 株である。
【００８６】
本発明はまた、プロテオロドプシン変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞は、ポリヌクレオチドから機能的プロテオロドプシンを発現または合成し得る。機能的プロテオロドプシンは適切な環境において光サイクルを受け得るポリペプチドである。
【００８７】
１以上の変異は、クローン化プロテオロドプシン遺伝子の部位特異的変異誘発法により構築できる。様々な変異体をつくるために、特殊な設計の変異を構築でき、あるいは変化性を導入できる。かかる変異誘発法ならびに核酸およびタンパク質の操作についての方法は、当業者に周知であり、Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. 3d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY).により記載されている。
【００８８】
適切なベクター
本発明は、プロテオロドプシン変異体をコードするポリペプチドを提供する。当業者は、普遍的な遺伝子コードに基づき、ポリペプチドのアミノ酸についての情報を用いて、ヌクレオチドを構築できる。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをコードするオープン・リーディング・フレイムに作動し得るように 5' 連結されたプロモーターを含む。ポリヌクレオチドはさらに、適当な宿主においてポリペプチドが発現されるために、適当なプロモーター・コントロール、翻訳コントロールおよび停止などの必要な配列を含む。
【００８９】
ポリヌクレオチドは、染色体、エピソーム、プラスミドまたは適当な発現ベクターであり得る。ポリヌクレオチドは宿主細胞で増幅可能である。ユーバクテリア宿主細胞について、非常に様々な発現ベクターを、ポリヌクレオチドのユーバクテリア宿主細胞への形質転換、複合、形質導入またはトランスフェクトによる導入のために使用できる。ベクターには、プラスミド、例えば pBR322、pMB9、pBAD-TOPO (登録商標）(pBAD TOPO TA Expression Kit, Invitrogen, La Jolla, CA)、pTrcHis2-TOPO (登録商標）( pTrcHis2-TOPO TA Expression Kit, Invitrogen, La Jolla, CA) など、コスミド、例えば pVK100 など、およびウイルス、例えば as P22 などがある。
【００９０】
宿主からのプロテオロドプシンの単離
プロテオロドプシン・ポリペプチドは宿主細胞から、種々の方法を用いて精製できる。その方法は下記の一般的順序に従う。
1. ポリペプチドを含有する宿主細胞を融解する。
2. 膜を洗剤で溶解する。
3. 不純の樹脂を Hag-tag アフィニティー樹脂に入れる。
4. 樹脂を洗い、不純物を除去する。
5. カラムからタンパク質を取り出す。
6. 緩衝液を交換し、タンパク質を濃縮する。
各適用において収量および純度の必要性が異なるので、タンパク質の各意図する用途により精製法は異なる。
【００９１】
融解は、音波破壊、浸透圧ショック、冷凍解凍、フレンチプレスまたはこれらの組合せにより実施できる。融解の好ましい方法は冷凍解凍ついでフレンチプレスである。不溶物を遠心分離 (例えば、1500 xg、30 分間) で除去し、上澄み液を集める。上澄み液をさらに遠心分離し (例えば、150,000 xg、1 時間)、一義的に膜物質を含有するペレットを集める。
【００９２】
膜物質は洗剤で溶解できる。有用な洗剤には、限定でないが、ドデシル-β-マルトシド、オクチル-β-グルコシドまたは Triton X-100（登録商標）がある。ドデシル-β-マルトシド (2%) が好ましい洗剤である。
【００９３】
溶解された膜物質を His-tag アフィニティー樹脂とインキュベートする。例えば、溶解された膜物質を Talon（商標）樹脂 (Clontech, Palo Alto, CA) と一夜 4 ℃で緩やかに動かしながらインキュベートする。
【００９４】
溶解された膜物質を汚染タンパク質から、例えば、0.1% ドデシル-β-マルトシドを含有する緩衝液の３カラム量で３回樹脂を洗うことで精製する。
【００９５】
精製されたポリペプチドを His-tag 精製樹脂から種々の方法で取り出す。その方法には、限定でないが、EDTA とのインキュベーション、酸性 pH でのインキュベーションまたは高温度でのインキュベーションがある。好ましい方法は、樹脂を0.5 M EDTA 含有の緩衝液とインキュベートすることである。
【００９６】
緩衝液を種々の方法で交換できる。その方法には、限定でないが、膜を基にする濃縮器を用いる濃縮および希釈、透析または脱塩カラムがある。好ましい方法において、タンパク質を、膜を基にする遠心分離濃縮器で濃縮し、ついで所望の緩衝液に希釈する。この方法を繰り返して、緩衝液を完全に交換する。ついで、タンパク質を同じ濃縮器でさらに濃縮する。
【００９７】
粗製または部分的に純粋の形態にあるポリペプチドの単離のためのさらなる方法は、Dioumaev, et al および Krebs, et al.（両者を出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。
【００９８】
本発明の具体的な実施態様
本発明のひとつの実施態様において、プロテオロドプシン変異体を、グルタミン残基で置換された保存ヒスチジンを有する Hot75m1 プロテオロドプシン変種から誘導する。ポリペプチドが E. coli 宿主細胞から発現される。その吸光度の挙動を無傷細胞の膜で分析するとき、変異体ポリペプチドは約 5.8 以下の pKrh 値 (野生型プロテオロドプシンは 7.2) をもってスペクトル移動を提示する。pKrh の移動は約 1.4 単位である。
【００９９】
本発明の別の実施態様において、プロテオロドプシン変異体を、アスパラギン残基で置換された保存ヒスチジンを有する Hot75m1 プロテオロドプシン変種から誘導する。ポリペプチドが E. coli 宿主細胞から発現される。その吸光度の挙動を無傷細胞膜で分析するとき、変異体ポリペプチドは約 5.1 以下の pKrh 値 (野生型プロテオロドプシンは 7.2) をもってスペクトル移動を提示する。pKrh の移動は約 2.1 単位である。
【０１００】
本発明の別の実施態様において、プロテオロドプシン変異体を、リシン残基で置換された保存ヒスチジンを有する Hot75m1 プロテオロドプシン変種から誘導する。ポリペプチドが E. coli 宿主細胞から発現される。その吸光度の挙動を無傷細胞膜で分析するとき、ポリペプチドは、pH 域 4.9 〜 9.1で分析すると、スペクトル移動を提示しない（または滴定しない)。この変異体プロテオロドプシンについて得られた曲線の形は、ポリペプチドの吸光度を光源の波長に対してプロットするとき、野生型 Hot75m1 プロテオロドプシンの塩基性形について得られた曲線の形に類似する。また、この変異体プロテオロドプシンの最大吸収度の波長 (約 495 nm) は、Hot75m1 の酸性形 (約 540 nm) よりも Hot75m1 の塩基性形 (約 490 nm) についての最大吸収度の波長に非常に近い。このことから理論つけると、この変異体プロテオロドプシンは、その環境 pH が 4.9 〜 9.1 であるとき、塩基性形であるようである。この変異体の pKrh は pH 4.9 よりもさらに低い pH に移動するようである。
【０１０１】
対象ポリペプチドの技術的適用
本明細書で教示されるプロテオロドプシン変異体は多くの技術的適用をもつ。例えば、プロテオホドプシン変異体を、着色光線適用、光電気適用および／または光輸送適用をもつ装置または器具中に組み込み得る。
【０１０２】
着色光線適用において、ポリペプチドは、光学的データ保存、干渉分光法および／またはホトニックス（photonics）のためその光吸収性について使用できる。着色光線適用には、限定でないが、ホログラフフィルムがある。プロテオロドプシン変異体は、着色光線性 オール-trans-レチナールタンパク質として光学的データ保存機器に使用できる。プロテオロドプシン変異体は、2-D 保存、3-D 保存、ホログラフ保存、連合的保存などの情報保存のための機器に使用できる。プロテオロドプシン変異体は、光学的二重安定／光、スウィチング、光学的フィルター、シグナル条件神経ネットワーク、空間光モジュレーター、相結合、パターン認識、干渉分光法などの情報処理のための機器に使用できる。
【０１０３】
本発明はまた、本発明のプロテオロドプシン変異体を用いて、光学的データを保存および検索する方法を提供する。光学的データを保存および検索する方法は、例えば、次の工程を含む：(a) マトリックスに固定されたプロテオロドプシン変異体を含むフィルムを用意する、(b)予め決定したパターンでプロテオロドプシン変異体により吸収される波長の光にフィルムを暴露して光学的データを記録し、そしてフィルムの部分を励起状態に選択的に転換する、(c) 基本的状態または励起状態のプロテオロドプシン変異体により吸収される波長の光に、工程 (b) のフィルムを暴露する、(d) 光学的記録機器により光学的データを検出する。工程 (d) の検出は、光学的記録機器により実施できる。光学的記録機器は、電荷結合デバイス (CCD) であり得るビデオカメラであり得る。この方法は、バクテリオロドプシンおよびその変異体に適用され、当技術分野で既知であり (参照、表１の特許)、バクテリオロドプシンを本発明のプロテオロドプシン変異体に置き換えることで、容易に改変できる。
【０１０４】
光電気適用において、プロテオロドプシン変異体を、プロトン輸送により起きる電気場での光誘導変化のための機器に使用できる。例えば、ウルトラファスト光検出、人工網膜および／または光／運動検出器などである。
【０１０５】
光輸送適用において、プロテオロドプシン変異体は、光量機器などの膜を介する光誘導のプロトン輸送に使用し得る。ひとつのかかる光量機器は光駆動エネルギー発生器であり、そこでは光エネルギーが化学エネルギーに転換され得る。かかる光駆動エネルギー発生器の製造者および使用は WO 01/83701 に開示されている。プロテオロドプシン変異体はまた、反応器における ATP 生成、海水の脱塩および／または大陽光の電気への転換のための機器に使用できる。
【０１０６】
本発明は、プロテオロドプシン変異体の使用を含む光駆動エネルギー発生器を提供する。光駆動エネルギー発生器は下記を含む： (a) 本発明のプロテオロドプシン変異体、(b) 細胞膜、(c) オール-trans-レチナールの源、および (d) 光源、ここでは、プロテオロドプシン変異体が細胞膜中に組み込まれ、組み込まれたプロテオロドプシン変異体をつくり、この組み込まれたプロテオロドプシン変異体がオール-trans-レチナールに共有結合し、光吸収色素をつくる。天然型プロテオロドプシン変種に適用される光駆動のエネルギー発生器は、WO 01/83701 に開示されており、プロテオロドプシンをプロテオロドプシン変異体で置き換えることにより改変できる。光駆動エネルギー発生器は、プロテオロドプシン変異体を用いて、光エネルギーを生化学的エネルギーに変換する。光駆動エネルギー発生器は、適当な宿主細胞において発現され、正しく折りたたまれるプロテオロドプシン変異体の機能性について利点を有する。
【０１０７】
プロテオロドプシン変異体はまた、2D 調和産生、放射検出、バイオセンサー適用などについての機器において使用できる。
【０１０８】
Hampp (Chem. Rev.,100:  1755-76 (2000)) は、バクテリオロドプシンの光化学的性質を利用する種々の使用および装置や機器を開示する。本発明のプロテオロドプシン変異体は、Hampp（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているのと類似の方法で使用できる。
【０１０９】
さらに、プロテオロドプシン変異体は、例えば、下記の特許（出典明示により本明細書の一部とする）についての表１においてバクテリオロドプシン (BR) を利用する種々の機器／方法について、バクテリオロドプシンに代わって使用できる。
【０１１０】
表１
【表１】
0004448776.tif 000002
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１１１】
下記の実施例はさらに本発明を説明する。これらの実施例は、本発明を単に説明するためのものであって、限定を構成しない。
【０１１２】
実施例１
プロテオロドプシンの発現ベクターへのクローニング.
81 既知天然型プロテオロドプシン遺伝子のうち計 21 を pTrcHis2 発現ベクター中にクローン化した。異なる天然型プロテオロドプシン遺伝子を Taq DNA ポリメラーゼ (Roche Applied Science) で、製造業者の説明に従い PCR 増幅した。全プロテオロドプシン変種を増幅するのに使用されるプライマーは PR-u4 および PR-d2 であり(参照、表 2)、テンプレートは関連プロテオロドプシンを含有する pCR2.1 (Beja, et al., 2000; Beja, et al., 2001) である。PCR 産物を pTrcHis2 ベクター中に、pTrcHis2 TOPO TA 発現キット (Invitrogen, Carlsbad, CA) を製造業者の説明に従い、クローン化した。プラスミドの制限酵素消化を用い、正しい方向で挿入物を含有するクローンを同定した。プラスミドを、プライマー pTrcHis Forward および pTrcHis Reverse を用いて配列し、PCR およびクローニング過程で配列変種が導入されなかったことを確認した。プラスミドは、myc エピトープおよび６ヒスチジン残基を含有するC-末端伸張をもつプロテオロドプシン遺伝子を転写する pTrc プロモーターを含有する。発現プラスミドのひとつのマップを図 4 に示す。
【０１１３】
表２：使用されたオリゴヌクレオチド・プライマーの配列
【表５】
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【表６】
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【０１１４】
pTrcHis Forward および pTrcHis Reverse オリゴヌクレオチドを Invitrogen から得た。残りのオリゴヌクレオチドを Operon から購入した。部位特異的変異誘発に用いられるプライマーを PAGE 精製した。太字は、変異されたヒスチジンまたはアルギニンのコドンを表し、小文字は、野生型配列に比して変えられたヌクレオチドを表す。
【０１１５】
無傷細胞におけるプロテオロドプシンスペクトルの測定
プロテオロドプシン発現プラスミドおよびコントロール・プラスミド pTrcHis2-LacZ (Invitrogen) を株 BL21-Codonplus-RIL (Stratagene) のコンピテント細胞中に、製造業者の説明に従い、形質転換した。形質転換された細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコールのプレートに置き、一夜 37 ℃でインキュベートした。これらのプレートからの細胞を 6 ml LB + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコール + 10 μM オール-trans-レチナール媒体のガラス管中で 37 ℃、6 時間生育した。細胞は早期に定常期に達する。細胞はプロテオロドプシンを非誘発 pTrc プロモーターから構成的に発現する。細胞を遠心分離、4,500xg 6 分間で集め、培地を除き、細胞を 5 ml 無菌水中に再懸濁した。900 μl サンプルの細胞を 100 μl アリコートの濃縮緩衝液 (1.0 M アセテート (pH 4.9)、1.0 M MES (pH 5.8)、1.0 M MOPS (pH 6.7)、1.0 M TAPS (pH 8.1) または 1.0 M CHES (pH 9.1)) に加えた。21 天然型プロテオロドプシンのスペクトルを無傷の細胞中で、５の異なる細胞外 pH 値で、スペクトル光メーター (On-Line Instrument Systems, Inc.) により測定した。これは、サンプルクベットに隣接の光増幅検出器を置くことにより混濁状サンプルでの使用に適合する。コントロール・プラスミド (pTrcHis2-LacZ) を含有する株からの吸収をプロテオロドプシン含有のサンプルから控除した。サンプルと対照との間の細胞密度により起きる背景光拡散の相違を補正するために、各スペクトルにおける最初の１０および最後の１０の波長および吸光度値についての最少平方フィッティングにより決定された直線的ベースラインを、各スペクトルから控除した。ついでスペクトルを同じ最小値に、最小値における相違を控除することにより調整した。
【０１１６】
異なる pH 値での無傷細胞内 Bac31A8 および Hot75m1 などの典型的プロテオロドプシンスペクトルを、吸光度に対する波長をプロットすることで構築できる。プロテオロドプシン変種 (Bac31A8 および Hot75m1) の２つの異なるスペクトル形を酸性条件 (pH 4.9) および塩基性条件 (pH 9.1) で観察する。中間 pH 値で、酸性形および塩基性形の混合物を表すスペクトルを観察する。
【０１１７】
pKrh 値を決定するために、各波長および pH での異なる調整の吸収強度を方程式 1 に、マイクロソフト・エクセルのソルバー機能を用いて最小平方回帰分析により、当てはめた。
【数１】
0004448776.tif 000008
【０１１８】
Abs酸性 および Abs塩基性-酸性の異なる値を各波長に当てはめ、pKrh の同じ値をデータについてすべての波長に当てはめた。値 Abs酸性および Abs塩基性-酸性を用いて、プロテオロドプシンの酸性形および塩基性形についての波長スペクトルを再構築し、このデータから酸性および塩基性 pH における波長を決定した (表 3)。無傷細胞における野生型 Bac31A8 プロテオロドプシンは、吸光度最大を酸性条件で 538 nm に、塩基性条件で 519 nm に有した。スペクトル移動の因をなす滴定可能基の pKrh 値を 7.6 と決定した。野生型 Hot75m1 プロテオロドプシンは、吸光度最大を酸性条件で 546 nm に、塩基性条件で 493 nm に有した。スペクトル移動の因をなす滴定可能基の pKrh 値を 8.2 と決定した。
【０１１９】
表 3 は、発現され特徴解明された 21 の異なるプロテオロドプシン遺伝子についての結果を示す。
【０１２０】
表３：プロテオロドプシン変種のスペクトル特性
【表７】
0004448776.tif 000009
【０１２１】
81 の既知プロテオロドプシンのうち 21 について異なる pH 値でのスペクトル特性を測定した。これらのすべてが異なる吸収スペクトルを酸性および塩基性条件で有し、pKrh 値は試験したすべての天然型プロテオロドプシンについて pH 7-8.5 の範囲である。このように、スペクトル特性における pH 依存性移動は、全プロテオロドプシン・ファミリーの特質である。
【０１２２】
実施例２：プロテオロドプシンの変異誘発
保存ヒスチジン残基 (Bac31A8 中の H75 および Hot75m1中の H77) および保存アルギニン残基 (Hot75m1中の R96) がプロテオロドプシン変種のスペクトル特性における pH 依存性変化の因をなすプロトン化基を形成するのに関与するかを調べるために、Bac31A8 および Hot75m1 中のこれらのアミノ酸残基を、QuickChange 部位特異的変異誘発キット (Stratagene) を製造業者の説明に従い用いて、変異誘発した。
【０１２３】
表 4 は、異なる変異体を構築するために用いたテンプレートおよびプライマーを要約する。
【０１２４】
表４：変異体を構築するために用いたテンプレートおよびプライマー
【表８】
0004448776.tif 000010
【０１２５】
pTrcHis Forward プライマー (Invitrogen) を用いてプラスミドの配列決定を行い、所望の変異がプラスミド中に導入されていることを確認した。
これらのプロテオロドプシン変異体を発現させた。異なるpH 値での無傷細胞中のこれらのスペクトルを測定し、pKrh 値を上記のように計算した。
【０１２６】
(a) ヒスチジン残基
表 5 は、Bac31A8.の野生型および変異体の pKrh 値および酸性および塩基性スペクトルの吸収最大を要約する。
【０１２７】
表５：変異体の pKrh 値および吸収最大
【表９】
0004448776.tif 000011
【０１２８】
注："NA" は、pH 滴定 が有意でないことを意味し、従って pKrh 値 を決定できない。"−" は、試験した pH 域における滴定の欠如により、単一の吸収最大のみが報告され得ることを意味する。
【０１２９】
これらの結果は、Bac31A8 の保存ヒスチジンにおけるアスパラギンまたはグルタミン変異が、酸性 pH 側に移動された pKrh をもたらしたことを示す。Bac31A8 H75Q 変異体は pKrh 値 6.0 を有し、一方、野生型タンパク質は 7.6 であった。Bac31A8 H75N および Bac31A8 H75K の両変異体は、スペクトル特性における pH 依存性変化がないか、または非常に小さく、変異体タンパク質は試験した pH 域で塩基性形でのみのようである。これは、pH 域 4.9-9.1 の外側にあって非常に移動される pKrh 値 によって起きるようである。Bac31A8 H75N 変異体の pKrh 値はこれらのデータから正確には決定できなかったが、5.8 以下であると思われる。
【０１３０】
異なる pH 値での Hot75m1 H77Q、Hot75m1 H77N、Hot75m1 H77K、Hot75m1 H77D、Hot75m1 H77E および Hot75m1 H77W のスペクトルを測定した。図 5 は、野生型 Hot75m1 および 変異体 Hot75m1 H77Q の酸性形および塩基性形の吸収スペクトルの pH-依存性変化を示す。野生型の pKrh は 8.2 であり、変異体の 5.8 より低い。図 6 は、異なる pH 値での Hot75m1 および Hot75m1 H77Q の酸性形のフラクションを示す。塩基性形が pH 9 以上で 野生型 Hot75ml タンパク質について、および pH 7 以上で Hot75ml H77Q タンパク質について支配的である。
【０１３１】
表 6 は、野生型および６変異体の pKrh 値ならびに酸性および塩基性吸収スペクトルの最大を要約する。
【０１３２】
表６：Hot75M1 変異体の pKrh 値および吸収最大
【表１０】
0004448776.tif 000012
【０１３３】
注："NA" は、pH 滴定 が有意でないことを意味し、従って pKrh 値 を決定できない。"−" は、試験した pH 域における滴定の欠如により、単一の吸収最大のみが報告され得ることを意味する。
【０１３４】
これらの結果は、ヒスチジンをアスパラギン、グルタミン、グルタミン酸またはトリプトファンに変える Hot75m1 の保存 H77 ヒスチジン残基における変異が、酸性 pH に 野生型 Hot75m1 タンパク質に比して有意に移動される pKrh 値をもたらす。Hot75m1 H77Q および Hot75m1 H77W 変異体は pKrh 値が 5.8 であり、一方、野生型タンパク質は 8.2 である。Hot75m1 H77N および Hot75m1 H77E 変異体は pKrh 値がさらに低く、それぞれ 5.5 および 5.3 である。Hot75m1 H77K および Hot75m1 H77D 変異体は、ヒスチジンがそれぞれリシンまたはアスパラギン酸に変えられ、スペクトル特性の pH 依存性変化がないか、非常に小さく、試験した pH 域のみのようである。これは、pH 域 4.9-9.1 の外側にあって非常に移動される pKrh 値 によって起きるようである。
【０１３５】
２の異なるプロテオロドプシン変種における保存ヒスチジン残基の変化 (Bac31A8 中の H75 および Hot75m1中の H77) の結果は同じであることを明らかにする。ヒスチジンがアスパラギン、グルタミン、グルタミン酸またはトリプトファンに変えられると、スペクトル移動の pKrh 値は有意に下がる。ヒスチジンがリシンまたはアスパラギン酸に変わったプロテオロドプシンは、試験した pH 域で滴定が有意でなく、pH 域 4.9-9.1 の塩基性形であるようである。
【０１３６】
(b) アルギニン残基
保存アルギニン残基 (Bac31A8 中の R94 および Hot75m1中の R96) は、プロテオロドプシンのスペクトル特性における pH 依存性変化の因であるプロトン化基に影響を与え得る。従って、Hot75m1 中の R96 アミノ酸残基がアラニン、グルタミン酸またはグルタミンに変異誘発され、プロテオロドプシン変種が発現され、異なる pH 値での無傷細胞におけるスペクトルを測定し、スペクトル移動の pKrh’値を上記のように計算した。
【０１３７】
異なる pH 値での Hot75m1 R96A、Hot75m1 R96E および Hot75m1 R96Q のスペクトルを決定した。
表 7 は、Hot75m1 の異なる変種の pKrh 値s および 酸性および塩基性スペクトルの吸収最大を要約する。
【０１３８】
表７：Hot75m1 変異体の pKrh 値および吸収最大
【表１１】
0004448776.tif 000013
【０１３９】
全３の R96 変異体が、酸性形の波長最大で有意の変化を示し、吸収最大値は 507-512 nm の範囲にあり、一方、野生型 Hot75m1 タンパク質での酸性形波長最大は 546 nm であった。すなわち、Hot75m1 R96 変異体は、酸性形と塩基性形との吸収最大の差異が野生型 Hot75m1 プロテオロドプシンよりも小さい。このような変異体は、いくつかの技術適用において有用であり、機器において pKrh に近接の pH で吸光度ピークの狭いバンド幅を提供する。
【０１４０】
Hot75m1 の保存 R96 残基の変異は、野生型 Hot75m1 タンパク質で観測される値と僅かに異なる pKrh 値をもたらす。Hot75m1 R96A および Hot75m1 R96E 変異体は、それぞれ pKrh 値 8.0 および 7.0 を有し、野生型 Hot75m1 タンパク質の値よりも僅かに小さい。アルギニンがグルタミンに変わった Hot75m1 R96Q タンパク質は、pKrh 8.7 の値を有し、野生型 Hot75m1 タンパク質の値よりも少し高い。このように、Hot75m1 の保存 R96 残基の変異は、スペクトル移動の pKrh 値になんらかの影響を与える。
【０１４１】
実施例３：プロテオロドプシンの精製
上記の結果は、タンパク質が細胞質膜に存在する無傷の細胞におけるプロテオロドプシンについて得られた。他の細胞構成成分の不存在でのプロテオロドプシン変種のスペクトル特性を特徴解明するために、野生型および異なる変異体 Bac31A8 および Hot75m1 プロテオロドプシンを下記のように精製した。
【０１４２】
プロテオロドプシン (野生型または変異体) 発現プラスミドを株 BL21-Codonplus-RIL (Stratagene) 中のコンピテント細胞に製造業者の説明に従い形質転換した。形質転換された細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコールのプレートに置き、一夜 37 ℃でインキュベートした。これらのプレートからの細胞を 200 ml LB + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 10 μM オール-trans-レチナール 媒体中で 37 ℃で 500 ml バッフル付振盪フラスコにおいて生育した。培養物を新鮮な形質転換プレートから直接接種した。異なる培養物中のプロテオロドプシン発現が、培養物の OD600 が約 0.8 (4 時間生育後) のとき、0.5 mM IPTG + 10 μM オール-trans-レチナールを加えることにより誘導し、培養物をさらに 4 時間 37 ℃で培養した。細胞を遠心分離 3,500xg 10 分間で集菌し、-80 ℃で保存した。細胞を、40 mM MOPS pH 7.0、20 mM MgCl2、0.2 mg/ml リゾチーム、0.2 mg/ml DnaseI、2% ドデシル-β-D-マルトシドおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液 (完全、EDTA-なしのプロテアーゼ阻害剤カクテル錠、Roche Applied Science）中に再懸濁し、超音波により 0 ℃で分解した。
【０１４３】
分解物を、40 mM MOPS pH 7.0 および 0.5% ドデシル-β-D-マルトシドを含有する 1 ml 洗緩衝液で平衡にしておいた Talon スピンカラム (Clontech) 樹脂と 16 時間インキュベートした。樹脂を３回 40 mM MOPS pH 7.0 および 0.5% ドデシル-β-D-マルトシドを含有する 1 ml 洗緩衝液で洗った。プロテオロドプシンを樹脂から２回 40 mM MOPS pH 7.0、0.5% ドデシル-β-D-マルトシドおよび 250 mM EDTA を含有する 0.5 ml 溶出緩衝液で溶出した。２溶出液を合わせ、EDTA を３連続の１０倍濃縮により、Microcon YM-10 遠心分離フィルター (Millipore) および 40 mM MOPS pH 7.0 を含有する緩衝液での希釈を製造業者の説明に従い用いて、除去した。ついで、プロテオロドプシンサンプルを１０倍濃縮し、4 ℃で保存した。
【０１４４】
実施例４：精製されたプロテオロドプシンのスペクトルの測定
5 μl 精製プロテオロドプシンを、100 mM のシトレート (pH 3.54、3.97、4.50 または 5.03)、アセテート (pH 4.88)、MES (pH 5.34、5.80 または 6.35)、MOPS (pH 6.75 または 7.32)、TAPS (pH 7.91 または 8.43)、CHES (pH 9.00 または 9.50) または CAPS (10.12 または 10.64) のいずれかを含有する 500 μl の緩衝液に溶解した。250 nm 〜 650 nm の波長を Cary3 スペクトル光計 (Varian) で得た。スペクトル移動の値 pKrh を上記の方程式 1 で計算した。
【０１４５】
洗剤溶解および精製の野生型 Bac31A8、Bac31A8 H75Q、Bac31A8 H75N および Bac31A8 H75K のスペクトルを異なる pH 値で測定した。表 8 は、野生型および異なる変異体の pKrh 値 および酸性および塩基性吸収スペクトルの最大を示す。
【０１４６】
表８：Bac31A8 変異体の pKrh 値 および吸収最大
【表１２】
0004448776.tif 000014
【０１４７】
注："NA" は、pH 滴定 が有意でないことを意味し、従って pKrh 値 を決定できない。"−" は、試験した pH 域における滴定の欠如により、単一の吸収最大のみが報告され得ることを意味する。
【０１４８】
洗剤溶解および精製の Bac31A8 について得られたこれらの結果は、無傷の細胞におけるプロテオロドプシンについて得られた結果に類似する。Bac31A8 の保存 H75 ヒスチジン残基をアスパラギンまたはグルタミンに変えると、スペクトル移動の値 pKrh が有意に低下した。精製 Bac31A8 H75Q 変異体 は pKrh 値 5.5 を有し、精製 Bac31A8 H75N 変異体 は pKrh 値 5.2 を有す。これに対し、精製野生型 Bac31A8 タンパク質は pKrh 値 7.1 を有す。ヒスチジンがリシンに変えられた Bac31A8 H75K 変異体はスペクトル特性の pH 依存性変化がないか、ほとんどなく、タンパク質が試験した pH (pH 4.9-9.1) 域の塩基性形に閉じこめられているようである。
【０１４９】
精製された野生型 Hot75m1、Hot75m1 H77Q、Hot75m1 H77N および Hot75m1 H77K のスペクトルを異なる pH 値で測定した。
表 9 は、種々の変種の pKrh 値および酸性および塩基性吸収スペクトル最大を要約する。
【０１５０】
表９：Hot75M1 変異体の pKrh 値 および吸収最大
【表１３】
0004448776.tif 000015
【０１５１】
注："NA" は、pH 滴定 が有意でないことを意味し、従って pKrh 値 を決定できない。"−" は、試験した pH 域における滴定の欠如により、単一の吸収最大のみが報告され得ることを意味する。
【０１５２】
精製された野生型および変異体 Hot75m1 プロテオロドプシンについてのこれらの結果によると、Hot75m1 の保存 H77 ヒスチジンがアスパラギンまたはグルタミンに変えられたとき、pKrh 値が 酸性 pH 側に有意に移動した。精製 Hot75m1 H77Q は値 pKrh 6.3 を有し、精製 Hot75m1 H77N は pKrh 値 6.5 を有し、一方、野生型タンパク質は 8.4 であった。ヒスチジンをリシンに変えた精製 Hot75m1 H77K 変異体は、試験した pH 域 (pH 4.9-9.1) でスペクトル特性において pH 依存性変化がないか、ほとんどなく、１塩基性形のみを有しているようである。
【０１５３】
結論として、２つの異なるプロテオロドプシン変種における保存ヒスチジン残基の変異 (Bac31A8 中の H75 および Hot75m1中の H77) は類似の結果をもたらす。このことは、タンパク質が無傷細胞の細胞質膜に存在するとき、および洗剤安定化・精製タンパク質の両方で認められた。ヒスチジンをアスパラギンまたはグルタミンに変えると、pKrh 値が有意に低下する。ヒスチジンをリシンに変えると、pH 4.9-9.1 での塩基性形をもたらし、非常に低い pKrh 値を有するようである。
【０１５４】
実施例５：プロトン・ポンピングの測定
プロテオロドプシンの塩基性形は、励起 M-状態 (または M-様状態)の形成および細胞の内側から外側にプロテオロドプシン含有膜を通過するプロトンのポンピングを含む光サイクルを受ける。プロテオロドプシン変種が生産的光サイクルを受けるかどうかを調べるために、これらの変種のポンプ・プロトンに対する能力を決定した。プロトン・ポンピングを、細胞の内側から細胞外媒体へのプロトンのポンピングに起こされる、プロテオロドプシンを発現する細胞の照射での細胞外 pH の変化として測定した。Bac31A8 野生型および H75N 変異体のプロトン・ポンピングの pH 依存性も決定した。
【０１５５】
細胞の産生および調製
プロテオロドプシン (野生型または変異体) 発現プラスミドを、株 BL21-Codonplus-RIL (Stratagene) のコンピテント細胞中に、製造業者の説明に従い形質転換した。形質転換された細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコール・プレートに置き、一夜 37 ℃でインキュベートした。これらのプレートからの細胞を LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 10 μM オール-trans-レチナール媒体中で 37 ℃で 250 ml バッフル付振盪フラスコにおいて生育した。培養物を新鮮な形質転換プレートから直接インキュベートした。異なる培養物におけるプロテオロドプシンが、培養物の OD600 が約 0.8 (4 時間生育後)のとき 0.1 mM IPTG + 10 μM オール-trans-レチナールを加えることで誘導され、培養物をさらに 4 時間 37 ℃でインキュベートした。細胞を遠心分離 3,500xg 10 分間で採取し、-80 ℃で保存した。
【０１５６】
細胞を解凍し、150 mM NaCl 中に緩衝液なしで (ヘリウムを入れ、二酸化炭素を除去) 懸濁した。細胞をさらに３回 150 mM NaCl で緩衝液なしで洗った。細胞を OD600 2.0 まで 150 mM NaCl 中で懸濁した。細胞サンプルを pH 7.5 〜 8.5 に 0.5 M HCl または 0.5% NaOH で調整した。
【０１５７】
装置および方法
10 ml ホウケイ酸ガラス管中の 2.0 ml 細胞サンプルについての pH 値を、電圧出口を National Instruments (Austin, TX) データ取得ボードに接続された Beckman (Fullerton, CA) Phi40 pH を用いて測定し、これを１秒間隔でシグナルを平均化し Pentium に基づくパーソナルコンピューターでデータを保存した。細胞サンプルを磁気攪拌し、ふたつの側から Melles Griot (Irvine, CA) の赤外フィルター (03FC569) および Oriel Instruments (Stratford, CT) の 450 nm カットオン色ガラスフィルター (51284) を備えた Dolan-Jenner Industries (Lawrence, MA) の 150-watt 照射器 (Fiber-Lite A3200) に連結されたスピリットファイバー光ケーブルにより照射した。シャッターの手動開閉により光を調節した。光の入射角度を注文作成の細胞ホルダーの使用で一定とした。照射前 3 分間の pH の測定後、細胞サンプルの pH を一定照射の 3 分間測定した。ついで、照射中止後 3 分間 pH 測定した。この工程を各細胞サンプルにつき２回以上繰り返し、各細胞サンプルにつき３回の反復測定値を得た。
【０１５８】
図 7-1 は、活性プロトン・ポンプである Bac31A8 野生型を発現する細胞の pH が照射なしの期間、緩やかに動揺することを示す。しかし、照射後に、pH の急激な変化（数秒以内）が起きた。照射終了後、細胞サンプルの pH 値 は照射前の値に戻る。この pH 変化は、膜ポテンシャルを調節する細胞メカニズムの結果である。
【０１５９】
図 7-2 は、LacZ コントロールタンパク質を発現する細胞の pH も照射なしの期間中、緩やかに動揺することを示す。照射により、pH が緩やかに (全 3 分間) かつ僅かに (最大で 0.05 pH 単位) 移動する。おそらく、pH プローブでの温度変化によるのであろう。この温度効果は、赤外フィルターにより劇的に低下するが、完全には消失し得ない。 
【０１６０】
データ分析
時間との細胞外 pH 値の動揺を数学的に除去するために、照射により影響されないデータをモデル非依存性多項近似の方程式 2 に当てはめた。
【数２】
0004448776.tif 000016
式中、 pH は照射がもはや pH に影響を与えなくなったとき（すなわち照射なしで収集されたデータの最後の１０秒）測定された pH 値であり、A、B、C、D および E は経験的な適合パラメーターであり、t は pH が測定されたときの時間である。上記方程式の結果を全データセットから控除すると、pH の照射依存性変化を得る。照射依存性変化を方程式 3 に当てはめた。この式は、細胞がプロトン流を動的に調整し、膜 pH 示差を維持することを推定できる指数減衰モデルである。
【数３】
0004448776.tif 000017
式中、ΔpH は照射による pH の変化であり、ΔpHmax は pH の最大変化を表す適合パラメーターであり、k は最大に達する速度を表す適合パラメーターであり、t は照射開始後の時間である。ふたつの産物値はパラメーターに適合し、ΔpHmax × k は t = 0 でのタンジェント線の傾斜である。この値は、プロトンポンピングに対する細胞応答前の単位 ΔpH / 分でのプロトンポンピングを表す。
【０１６１】
プロトンをポンプする能力
プロテオロドプシン変種が、プロトンをポンピングし得るかどうかを調べるために、プロテオロドプシン変種を発現する細胞についての 値 ΔpHmax × k を student-t 検定を用いて、LacZ コントロールを発現する細胞について決定される値 ΔpHmax × k と比較した。自由度 n および student-t 検定の信頼度 60-99% の結果を表 10 に示す。この検定は、特定のプロテオロドプシン変異体が与えられた信頼度でプロトンポンプかどうかを示す。この検定の否定結果は、与えられたプロテオロドプシン変異体がプロトンポンプでないことを意味しない。ただ、その変異体によるポンピングを検出するのにアッセイが十分感受的でなかったことを示す。
【０１６２】
表１０：プロトン・ポンピング結果（与えられた信頼度での t-検定の結果）
【表１４】
0004448776.tif 000018
【０１６３】
このアッセイを用いて、Bac31A8 および Hot75m1 野生型プロテオロドプシンによるプロトンポンピングを予想のように観測した。検出可能なプロトンポンピングを、酸性形のみで存在すると見られる Bac31A8 D97N 変異体プロテオロドプシンでは認めなかった (Dioumaev, et al.)。酸性形でのプロテオロドプシンはプロトンをポンプできない(Dioumaev, et al.) ので、このことは、プロトンポンピングを含む光サイクルをプロテオロドプシン変異体が受け得るかどうかを決定するためにこのアッセイを利用する実行可能性を確認する。光サイクルが野生型タンパク質変異体より１００倍以上遅い Bac31A8 E108Q によるプロテオロドプシンは検出しない。Bac31A8 野生型、H75K、H75N および H75Q；および Hot75m1 野生型、R96A、H77K、H77N、H77Q、H77E、H77W、R96E および R96Q についてのプロトンポンピングを検出した。これは、これらのタンパク質が光に暴露されたときに、プロトンポンピングを含む生産的光サイクルを受けることを示す。
【０１６４】
プロトンポンピングに対する細胞外 pH の依存性
保存ヒスチジン残基中に変異をもつプロテオロドプシンは、低い pH で野生型プロテオロドプシンよりも優れたプロトンポンピングをもつと思われる。変異体のより低い pKrh 値が、低い pH で生産的な塩基性形におけるタンパク質のより大きいフラクションをもたらすからである。これを確認するために、Bac31A8 野生型 と H75N 変異体によるプロトンポンピングの速度を比較した。
【０１６５】
プロトンポンピング活性を検出するのに使用したのと類似の方法でつくられた細胞サンプルを、0.5 M HCl または 0.5% NaOH で種々の pH 値に調整し、ポンピングの速度を調べた。細胞外 pH 値を実験中の平均 pH 値 から決定した。図 7-3 は、Bac31A8 野生型 および H75N 変異体について、細胞外 pH に対するプロトンポンピングの依存性を表す。結果によると、Bac31A8 H75N 変異体は Bac31A8 野生型より、酸性 pH で優れたプロトンポンプである。この結果は、pKrh 値を低下する変異が、生産的光サイクルが存在する伸張の pH 域を持つプロテオロドプシンをもたらすことを確認する。
【０１６６】
本発明を現在好ましい実施態様に言及しながら説明したが、本発明の範囲から逸脱することなしに、種々の改変を行い得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図 1-1 は Hot75m1 、図 1-2 は Bac31A8、図 1-3 は Bac40E8、図 1-4 は Bac64A5、図 1-5 は Hot0m1、図 1-6 は Hot75m3、図 1-7 は Hot75m4 、図 1-8 は Hot75m8 、図 1-9 は MB0m1、図 1-10 は MB0m2 、図 1-11 は MB20m2、図 1-12 は MB20m5 、図 1-13 は MB20m12 、図 1-14 は MB40m1、図 1-15 は MB40m5 、図 1-16 は MB40m12 、図 1-17 は MB100m5 、図 1-18 は MB100m7、図 1-19 は MB100m9、図 1-20 は MB100m10、図 1-21 は PalB1、図 1-22 は PalB2、図 1-23 は PalB5、図 1-24 は PalB7、図 1-25 は PalB6 、図 1-26 は PalB8、図 1-27 は PalE1 、図 1-28 は PalE6 、図 1-29 は PalE7 、図 1-30 は MED26 、図 1-31 は MED27、図 1-32 は MED36 、図 1-33 は MED101、図 1-34 は MED102 、図 1-35 は MED106、図 1-36 は MED25 、図 1-37 は MED202 、図 1-38 は MED204 、図 1-39 は MED208、図 1-40 は REDA9 、図 1-41 は REDB9 、図 1-42 は REDF9 、図 1-43 は RED19 、図 1-44 は RED2 、図 1-45 は RED23 、図 1-46 は RED27 、図 1-47 は RED30 、図 1-48 は RED4 、図 1-49 は RED5 、図 1-50 は REDr6a5a14、図 1-51 は REDr6a5a6 、図 1-52 は REDr7_1_4、図 1-53 は REDs3_7、図 1-54 は REDr7_1_15 、図 1-55 は REDs3_15、図 1-56 は medA15r8ex6 、図 1-57 は REDr7_1_16 、図 1-58 は medA15r11b9 、図 1-59 は medA15r9b5、図 1-60 は medA15r8b3、図 1-61 は medA15r11b3 、図 1-62 は medA15_r8_1 、図 1-63 は medA17R9_1 、図 1-64 は medA15r8b9 、図 1-65 は medA19_R8_16、図 1-66 は medA19_R8_19 、図 1-67 は medA17_R8_6 、図 1-68 は medA15r9b7 、図 1-69 は medA15_R8_3 、図 1-70 は medA15r10b5 、図 1-71 は medA19_r9_9 、図 1-72 は medA15_r8ex7 、図 1-73 は medA19_R8_20 、図 1-74 は medA15_R8ex9 、図 1-75 は medA15_r9_3 、図 1-76 は medA17_r8_15 、図 1-77 は medA17_r8_11 、図 1-78 は medA15r8b8 、図 1-79 は medA15r8ex4 、図 1-80 は ANT32C12 PR、図 1-81 は HOT2C01 PR のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【図２】図 2-1 〜 2-11 は、プロテオロドプシン変異体のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。
【図３】図 3-1 〜 3-8 は、81 天然型プロテオロドプシン変種のアミノ酸配列の平行整列を示す。
【図４】図 4 は、プラスミド pTrcHis2-Hot75m1 のマップを示す。
【図５】図 5 は、pH 4.9、6.0、6.9、8.1 および 9.1 における変異体 Hot75m1 H77Q および野生型 (WT) Hot75m1 の吸収スペクトルの滴定曲線を示す。
【図６】図 6 は、種々の pH における Hot75ml および Hot75ml H77Q の酸性形のフラクションを示す。
【図７−１】図 7-1 は、照射の有無で Bac31A8 野生型を発現する細胞での細胞外 pH 変化を示す。
【図７−２】図 7-2 は、照射の有無で LacZ コントロールタンパク質を発現する細胞での細胞外 pH 変化を示す。
【図７−３】図 7-3 は、Bac31A8 野生型 および H75N 変異体についてのプロトンポンピング速度に対する細胞外 pH の作用を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図１−３５】
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【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図１−４０】
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【図１−４１】
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【図１−４２】
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【図１−４３】
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【図１−４４】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図１−４９】
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【図１−５０】
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【図１−５１】
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【図１−５２】
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【図１−５３】
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【図１−５４】
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【図１−５５】
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【図１−５６】
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【図１−５７】
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【図１−５８】
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【図１−５９】
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【図１−６０】
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【図１−６１】
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【図１−６２】
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【図１−６３】
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【図１−６４】
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【図１−６５】
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【図１−６６】
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【図１−６７】
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【図１−６８】
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【図１−６９】
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【図１−７０】
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【図１−７１】
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【図１−７２】
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【図１−７３】
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【図１−７４】
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【図１−７５】
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【図１−７６】
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【図１−７７】
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【図１−７８】
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【図１−７９】
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【図１−８０】
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【図１−８１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【配列表】
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