(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イコサペント酸、およびその製薬学上許容し得る塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する注射用組成物で、カルシウム濃度非依存性の血管平滑筋収縮に起因する脳血管攣縮、冠血管攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮あるいは手指血管攣縮に対して、該攣縮している血管に直接作用して攣縮を抑制する、血管攣縮治療用の注射用組成物。
【請求項２】
イコサペント酸、およびその製薬学上許容し得る塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する注射用組成物で、カルシウム拮抗剤抵抗性の血管平滑筋収縮に起因する脳血管攣縮、冠血管攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮あるいは手指血管攣縮に対して、該攣縮している血管に直接作用して攣縮を抑制する、血管攣縮治療用の注射用組成物。
【請求項３】
前記血管平滑筋収縮が、スフィンゴシルフォスフォリルコリン誘発血管平滑筋収縮である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記有効成分が脂肪酸混合物中に含有され、イコサペント酸、その塩およびエステルの全脂肪酸中の含量比が８０質量%以上である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記注射用組成物がさらに脂肪輸液を含有する請求項１〜４のいずれかに記載の注射用組成物。
【請求項６】
前記有効成分が、イコサペント酸および／またはイコサペント酸ナトリウム塩である請求項１〜５のいずれかに記載の注射用組成物。
【請求項７】
イコサペント酸、およびその製薬学上許容し得る塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを含有し、in vitroで用いられる試薬である、スフィンゴシルフォスフォリルコリン刺激によるＲｈｏキナーゼを介するシグナル伝達の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な平滑筋異常収縮の抑制剤、詳細には、イコサペント酸（以下ＥＰＡと略称する）、その塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする平滑筋異常収縮の抑制剤に関する。
また、本発明はＥＰＡ、その製薬学上許容し得る塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物に関する。特に該循環器系疾患が、脳血管攣縮または冠血管攣縮である注射用組成物に関する。
また、本発明は、ＥＰＡ、その塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを含有するＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤に関する。
本発明におけるＥＰＡは、全−シス−５，８，１１，１４，１７−イコサペント酸（ａｌｌ−ｃｉｓ−５，８，１１，１４，１７−ｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃａｃｉｄ）である。
【０００２】
【従来の技術】
平滑筋収縮には、骨格筋や心筋などの横紋筋と異なり、膜電位変化を伴う収縮以外に、アンギオテンシンIIやエピネフリン等の血管収縮物質による膜電位変化を伴わない収縮機構が存在する。これらの血管収縮物質は細胞質カルシウムイオン（以下Ｃａ2+と略称する）濃度を上昇させ、そのＣａ2+はカルモジュリンと結合し、Ｃａ2+−カルモジュリンによって活性化されたミオシン軽鎖キナーゼによるミオシン軽鎖のリン酸化が収縮を惹起させると考えられている。
この様な平滑筋収縮は、細胞質Ｃａ2+濃度の上昇の程度に依存した強度で収縮が起きる。すなわち、Ｃａ2+依存性の平滑筋収縮で、正常な収縮と考えられている。
【０００３】
これに対し、一部の血管収縮物質による収縮は細胞膜の低分子量ＧＴＰ結合性蛋白質（以下Ｇ蛋白質と略称する）を介してＣａ2+感受性が増強され、細胞質Ｃａ2+濃度の上昇以上の収縮あるいはＣａ2+濃度に依存しない収縮を引き起こすことが知られている。すなわち、Ｃａ2+非依存性の平滑筋収縮であり、異常な病的な収縮と考えられている。例えば、スフィンゴシルフォスフォリルコリン（以下ＳＰＣと略称する）はウサギ直腸平滑筋をイノシトール３リン酸−Ｃａ2+−カルモジュリンを介する経路とは独立した経路（少なくともＭｉｔｏｇｅｎ活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を含む）を介して収縮させることが知られている（アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、３２巻、Ｇ３７０−３７７頁、１９９５年）。
【０００４】
Ｇ蛋白質の一つであるＲｈｏＡにより活性が亢進されるＲｈｏキナーゼは、蛋白質リン酸化酵素の一種である。Ｒｈｏキナーゼは、ミオシン軽鎖を直接リン酸化してＣａ2+感受性を亢進あるいはＣａ2+非依存的に平滑筋を収縮させ、さらに一方、ミオシンフォスファターゼをリン酸化することによりその活性を阻害してミオシン軽鎖の脱リン酸化を抑制していると考えられている。このＣａ2+非依存性のＲｈｏキナーゼ情報伝達系は、いわゆる病的な異常収縮であり、高血圧症などの血管平滑筋の緊張異常という病態においても重要な役割を果たしているものと考えられる（麻酔、４７巻、５号、５３０−５４０頁、１９９８年）。
【０００５】
Ｃａ2+チャンネルを抑制するカルシウム拮抗剤に代表される上市されている降圧剤は、前述したＣａ2+依存性の正常な平滑筋収縮を抑制するため、高血圧症の治療時に例えば正常な反射性収縮まで阻害され起立性低血圧の副作用が発現している。また、カルシウム拮抗剤が無効な高血圧症が知られている。従って、生理的かつ正常な平滑筋収縮には影響せずにＣａ2+非依存性の異常な平滑筋収縮のみを抑制する物質が望まれている。しかしながら、平滑筋異常収縮を選択的に抑制する抑制剤として満足できるものはないのが現状である。
【０００６】
また、病的な血管平滑筋収縮に起因する循環器系疾患のうち、特に速やかに治療が求められる疾患、例えば脳血管攣縮または冠血管攣縮等に対しても、カルシウム拮抗剤をはじめ種々のトライアルがなされているが十分な治療効果が得られていない。正常部位での生理的かつ正常な平滑筋収縮には影響しない、攣縮を起こした病体部位での異常な平滑筋収縮のみを抑制する治療剤が望まれているが、全く満足できないのが現状である。
【０００７】
さらに、視野の狭窄および暗黒視症は種々の原因で発生する眼血管の異常収縮による眼組織への血流不全により引き起こされる症状と考えられている。現在、治療剤としては一部カルシウム拮抗剤やニトログリセリンが使用されているが、これも治療効果は十分ではなく、全身血圧の低下等の副作用も懸念されている。
【０００８】
治療成績面では上記のような状況であるが、基礎に注目してこれらの異常収縮を抑制する化合物についてみると、ＲｈｏＡ、あるいはＲｈｏキナーゼを特異的に阻害する物質は殆ど知られておらず、わずかにファスジル酸（以下ＨＡ−１０７７と略称する）あるいはＹ−２７６３２およびその誘導体がＲｈｏキナーゼの阻害剤として報告されているのみである（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３８９巻、１０月３０日号、９９０−９９４頁、１９９７年）。
【０００９】
一方、ＥＰＡは血清脂質低下作用、血小板凝集抑制作用等を有することが知られており、日本において閉塞性動脈硬化症および高脂血症治療剤として市販されている。しかしながら、ＥＰＡの平滑筋異常収縮の抑制作用、血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患への有効性、あるいはＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害作用に関する知見は現在まで全くない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
既存のカルシウム拮抗剤等の平滑筋収縮の抑制剤は、Ｃａ2+依存性の生理的かつ正常な平滑筋収縮をインビトロでは用量依存的に完全に抑制するが、平滑筋異常収縮の抑制作用は必ずしも十分でなく、攣縮、高血圧症等の病態では無効例が多く問題になっている。本発明は、例えばＳＰＣにより惹起されるＣａ2+非依存性の平滑筋異常収縮を特異的に抑制し、例えば脱分極によるＣａ2+依存的な生理的な正常収縮には影響を及ぼさない選択性の高い抑制剤を提供することにある。
【００１１】
また、本発明は、血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患、特に速やかに治療が求められる疾患、例えば脳血管攣縮または冠血管攣縮、肺血管攣縮、腸管膜動脈攣縮あるいは手指血管攣縮等の治療用の注射用組成物を提供することにある。特に、正常部位での生理的かつ正常な平滑筋収縮には影響せずに、病態部位でのＣａ2+非依存性の平滑筋異常収縮のみを抑制することにより、速効性が高くかつ副作用の少ない治療用の注射用組成物を提供することにある。
また、本発明は、平滑筋異常収縮の原因と考えられているＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の特異性の高い阻害剤を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、平滑筋異常収縮について鋭意研究を行ったところ、ＥＰＡがＳＰＣ−Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害作用を有すること、および平滑筋異常収縮の抑制作用を有し、かつ平滑筋正常収縮に全く影響を及ぼさないという、今までまったく知られていなかった事実を見出し、本発明を完成した。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明の第一の態様は、ＥＰＡ、その塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする平滑筋異常収縮の抑制剤である。平滑筋であれば臓器あるいは部位等に係わらずすべて含まれるが、特に血管平滑筋、消化器平滑筋あるいは呼吸器平滑筋が例示される。抑制効果が得られれば全脂肪酸中のＥＰＡ含量比および態様は特に問わないが、全脂肪酸中のＥＰＡ含量比は少なくとも８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上のものが使用でき、９７質量％以上のものがさらに好ましい。ＥＰＡの態様は、ＥＰＡ、ＥＰＡエチルエステル（以下ＥＰＡ−Ｅと略称する）、ＥＰＡナトリウム塩（以下ＥＰＡ−Ｎａと略称する）、ＥＰＡグリセリド（以下ＥＰＡ−Ｇと略称する）が好ましく、ＥＰＡ−Ｎａがさらに好ましい。
【００１４】
本発明の第二の態様は、イコサペント酸、その製薬学上許容し得る塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物である。該循環器系疾患としては、特に速効性が望まれる疾患であり、例えば脳血管攣縮または冠血管攣縮、肺血管攣縮、腸管膜動脈攣縮あるいは手指血管攣縮等が例示される。治療効果が得られれば全脂肪酸中のＥＰＡ含量比および態様は特に問わないが、全脂肪酸中のＥＰＡ含量比は少なくとも８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上のものが使用でき、９７質量％以上のものがさらに好ましい。ＥＰＡの態様は、ＥＰＡ−Ｅ、ＥＰＡ−ＮａあるいはＥＰＡ−Ｇが好ましく、ＥＰＡ−Ｎａがさらに好ましい。投与方法としては、静脈内あるいは動脈内に１回ないし数回に分けて急速投与することが好ましいが、点滴あるいはインフュージョンポンプ等を用いて数時間から数日にかけて持続的に投与することもできる。
【００１５】
本発明の第三の態様は、ＥＰＡ、その塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを含有するＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤である。好ましくは、平滑筋収縮におけるＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤であり、また、ＳＰＣ−Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤である。また、見かけ上のＲｈｏキナーゼ阻害剤である。阻害効果が得られれば全脂肪酸中のＥＰＡ含量比および態様は問わないが、ＥＰＡ、ＥＰＡ−Ｎａが好ましく、ＥＰＡ−Ｎａがさらに好ましい。
【００１６】
本発明の第四の態様は、イコサペント酸、その製薬学上許容し得る塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする暗黒視症および視野狭窄の予防および／または治療剤である。治療効果が得られれば全脂肪酸中のＥＰＡ含量比および態様は特に問わないが、全脂肪酸中のＥＰＡ含量比は少なくとも８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上のものが使用でき、９７質量％以上のものがさらに好ましい。ＥＰＡの態様は、ＥＰＡ−Ｅ、ＥＰＡ−ＮａおよびＥＰＡ−Ｇが好ましく、治療効果が得られれば投与経路は特に問わないが、経口投与、静脈内投与あるいは点眼が好ましい。さらに、ＥＰＡ−Ｅを有効成分として含有する経口投与用組成物あるいはＥＰＡ−Ｎａを有効成分として含有する注射用組成物が好ましい。
【００１７】
本発明の第五の態様は、ＥＰＡ、その製薬学上許容し得る塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする薬物誘発起立性低血圧の副作用軽減剤であり、該薬物が高血圧症治療剤、特にカルシウム拮抗剤、アンギオテンシンII変換酵素阻害剤あるいはニトロ化合物である。治療効果が得られれば全脂肪酸中のＥＰＡ含量比および態様は特に問わないが、全脂肪酸中のＥＰＡ含量比は少なくとも８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上のものが使用でき、９７質量％以上のものがさらに好ましい。ＥＰＡの態様は、ＥＰＡ−Ｅ、ＥＰＡ−ＮａおよびＥＰＡ−Ｇが好ましく、軽減効果が得られれば投与経路は特に問わないが、経口投与あるいは静脈内投与が好ましく、経口投与がさらに好ましい。さらに、ＥＰＡ−Ｅを有効成分として含有する経口投与用組成物あるいはＥＰＡ−Ｎａを有効成分として含有する注射用組成物が好ましい。ＥＰＡを副作用を誘発する薬剤と同時に投与する態様と、別々に投与する態様が提供される。別々に投与する場合、ＥＰＡを副作用を誘発する薬剤より先に投与することも後に投与することもできる。
【００１８】
本明細書において、「平滑筋異常収縮」の語は、Ｃａ2+濃度非依存的に起る平滑筋収縮であり、ＳＰＣに代表される化学物質で惹起される平滑筋収縮である。作用機作としては、血管収縮物質によりＧ蛋白質を介して平滑筋のＣａ2+感受性が増強されて起るＣａ2+非依存的に起る平滑筋収縮である。詳細には、平滑筋細胞のＲｈｏＡ、Ｒｈｏキナーゼ情報伝達系を介するＣａ2+非依存的に起る平滑筋収縮である。平滑筋異常収縮は、例えば、摘出血管標本あるいはスキンド処理した血管標本においてＳＰＣにより引き起こされ、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７）によって抑制されるＣａ2+非依存的に起る収縮として確認することができ、また、この時にｆｕｒａ−２等の細胞内Ｃａ2+濃度指示薬を用いてＣａ2+濃度をモニターすると、収縮に相関したＣａ2+濃度の上昇が認められないことにより特徴づけられる収縮である。膜の脱分極による、細胞質Ｃａ2+濃度の上昇の程度に依存した強度で収縮が起きるＣａ2+依存性の生理的な平滑筋正常収縮は含まれない。
【００１９】
病態においては、高血圧症、脳血管攣縮あるいは冠血管攣縮等の血管平滑筋の緊張異常が関与すると考えられる疾患において平滑筋異常収縮が重要な役割を果たしていると思われる。すなわち、平滑筋異常収縮が血管平滑筋で起った場合は、冠動脈攣縮や脳動脈攣縮等の循環器系疾患の原因になり得る。眼血管において平滑筋異常収縮が起きた場合は、暗黒視症あるいは視野の狭窄の原因になり得る。
【００２０】
また、平滑筋異常収縮が消化器平滑筋で起った場合は、食道痙攣、胃痙攣、腸管運動亢進に基づく下痢または腹痛、痙攣性イレウスあるいは腹部アンギナ等の消化器系疾患の原因になり得る。また、平滑筋異常収縮が呼吸器平滑筋で起った場合は、呼吸困難あるいは気管支喘息等の呼吸器系疾患の原因になり得る。
【００２１】
さらに、本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤は、摘出血管標本あるいはスキンド処理した血管標本を用いた平滑筋異常収縮に関する実験における抑制剤として有用である。また、本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤は、平滑筋異常収縮に起因する疾患に関する治療・研究等への応用が可能である。
【００２２】
また、血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物は、ヒトおよび動物において平滑筋異常収縮の抑制が必要な前記諸症状の、速やかでかつ起立性低血圧等の副作用の少ない治療剤として有用である。
【００２３】
本明細書において、「Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤」の語は、平滑筋において、例えばＳＰＣ刺激によりＲｈｏＡにＧＴＰが結合して活性化ＲｈｏＡとなり、活性化ＲｈｏＡによりＲｈｏキナーゼが活性化され、Ｒｈｏキナーゼによる蛋白質リン酸化が亢進する一連の経路（生化学、６９巻、１号、１６−２９頁、１９９７年）の全部あるいは一部を阻害するものである。
【００２４】
本明細書において「Ｒｈｏキナーゼ」の語は、活性型ＲｈｏＡに結合し活性化される蛋白質リン酸化酵素の一種であり、詳細には、ミオシン軽鎖を直接リン酸化し、一方また、ミオシンフォスファターゼをリン酸化してその活性を抑制するものであり、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＫαあるいはＲＯＣＫIIとも呼ばれる）およびｐ１６０ＲＯＣＫ（Ｒｈｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌｋｉｎａｓｅ、ＲＯＣＫＩあるいはＲＯＫβとも呼ばれる）が例示される。Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤は見かけ上のＲｈｏキナーゼ阻害剤である。
従って、本発明のＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の研究に有用である。
【００２５】
本発明に用いられるＥＰＡ、その塩およびエステルは市販品としてＥＰＡ純度９９質量％以上、ＥＰＡ−Ｎａ純度約９９質量％、ＥＰＡ−Ｅ純度９８質量％以上を入手することができる。また、魚油やＥＰＡ産生菌およびその培養液を公知の方法、例えば連続式蒸留法、尿素付加法、液体クロマトグラフィー法、超臨界流体クロマトグラフィー法等あるいはこれらの組み合わせで精製して得ることができ、必要によりエステル化処理してエチルエステル等のアルキルエステルやグリセリド等のエステルとすることができる。また、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩基またはベンジルアミン塩、ジエチルアミン塩等の有機塩基あるいはアルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸との塩とすることができる。本発明においてＥＰＡとは、特に断らない限りは、脂肪酸の遊離体のほか上記のような塩およびエステルも含むものとする。ヒトあるいは動物に投与する場合は、製薬学上許容しうるものが好ましい。
【００２６】
本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤、血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物およびＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤が必須成分以外の脂肪酸混合物を含む場合は、全脂肪酸中のＥＰＡ含量は多いことが望まれ、少なくとも８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上のものが使用でき、９７質量％以上のものがさらに好ましい。他の長鎖脂肪酸は少ないことが好ましく、特にアラキドン酸含量は少ないことが望まれ、３質量％未満が好ましく、１質量％未満がさらに好ましく、０．５質量％未満がさらに好ましい。魚油あるいは魚油の単純濃縮物はＥＰＡ以外の脂肪酸、例えばアラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸等が全脂肪酸中の５０質量％以上含まれるため好ましくない。
【００２７】
また、有効成分としてはＥＰＡ−Ｅ、ＥＰＡ−ＮａあるいはＥＰＡ−Ｇが好ましく、経口投与する場合はＥＰＡ−Ｅがさらに好ましく、注射剤とする場合は、ＥＰＡ−ＮａあるいはＥＰＡ−Ｇが好ましく、ＥＰＡ−Ｎａがさらに好ましい。ＥＰＡ−Ｇとしては、トリイコサペンタエノイルグリセリド（以下ＥＰＡ−ＴＧと略称する）、１，２−ジ（イコサペンタエノイル）グリセリド、１，３−ジ（イコサペンタエノイル）グリセリド、１−イコサペンタエノイルグリセリド、２−イコサペンタエノイルグリセリドあるいはＥＰＡ基以外の水酸基がＥＰＡ以外の中鎖脂肪酸基で置換された混合グリセリド、およびそれらの混合物が含まれる。これらのうち、ＥＰＡ−ＴＧ、ジイコサペンタエノイルグリセリドあるいはジイコサペンタエノイル混合グリセリドが好ましく、ＥＰＡ−ＴＧがさらに好ましい。グリセリドの長鎖脂肪酸残基全量に対するＥＰＡ基の割合は少なくとも８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上、さらに好ましくは９５質量％以上であり、９７質量％以上のものがさらに好ましい。
【００２８】
本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤および血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物は、有効成分を化合物（精製の際に不可避的に含まれる他の成分を含む場合もある）単独で投与するか、或いは一般的に用いられる適当な担体または媒体の類、例えば賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、香味剤、必要に応じて滅菌水や植物油、更には無害性有機溶媒あるいは無害性溶解補助剤（たとえばグリセリン、プロピレングリコール）、乳化剤、懸濁化剤（例えばツイーン８０、アラビアゴム溶液）、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、無痛化剤などと適宜選択組み合わせて適当な医薬用製剤に調製することができる。
【００２９】
ＥＰＡは高度に不飽和であるため、上記の製剤は、さらに、抗酸化剤たとえばブチレート化ヒドロキシトルエン、ブレチート化ヒドロキシアニソール、プロピルガレート、没食子酸、医薬として許容されうるキノンおよびα−トコフェロールを有効量含有させることが望ましい。
【００３０】
製剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液体製剤、坐剤、シロップ剤、吸入剤、点眼剤、軟膏、注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性）、あるいは用時乳濁または懸濁して用いる固形注射剤の形で、経口および静脈内あるいは動脈内、吸入、点眼、直腸内、膣内あるいは外用を問わず患者に投与されるが、とりわけカプセルたとえば、軟質カプセルやマイクロカプセルに封入しての経口投与が好ましい。また、注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性）、あるいは用時乳濁または懸濁して用いる固形注射剤での静脈内あるいは動脈内投与が好ましい。平滑筋異常収縮の抑制が必要な諸症状のうち、予防的な効果が望まれる場合は経口投与が好ましく、比較的速効性が望まれる場合は静脈内あるいは動脈内投与が好ましい。また、気管支喘息等、呼吸器平滑筋異常収縮の抑制が必要な場合は、吸入剤として公知のネブライザー等を用いて投与することもできる。
【００３１】
なお、高純度ＥＰＡ−Ｅ軟質カプセル剤およびマイクロカプセル剤であるエパデールおよびエパデールＳ（いずれも持田製薬社製）は副作用の発現が少ない安全な閉塞性動脈硬化症および高脂血症治療薬として既に日本で市販されている。
【００３２】
本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤および血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物の投与量は対象となる作用を現すのに十分な量とされるが、その剤形、投与方法、１日当たりの投与回数、症状の程度、体重、年齢等によって適宜増減することができる。速効性が望まれる静脈内あるいは動脈内投与の場合は、ＥＰＡとして１〜２００ｍｇ、好ましくは５〜１００ｍｇ、さらに好ましくは１０〜５０ｍｇを１回あるいは数回に分けて投与するが、必要に応じて点滴あるいはインフュージョンポンプ等を用いて数時間から数日にかけて持続的に投与することもできる。また、経口投与する場合はＥＰＡとして０．１〜９ｇ／日、好ましくは０．５〜６ｇ／日、さらに好ましくは１〜３ｇ／日を３回に分けて投与するが、必要に応じて全量を１回あるいは数回に分けて投与してもよい。
【００３３】
（実験例）
以下に、本発明を詳細に説明するために実験例により効果を具体的に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
【００３４】
(実験例１：ウシ脳動脈およびブタ冠動脈のＳＰＣ収縮に及ぼすＥＰＡの影響）
ウシ脳動脈血管あるいはブタ冠動脈血管を分離し、周辺組織および内皮を除去して血管標本（ウシ脳動脈血管：幅５ｍｍ、長さ１５ｍｍ、ブタ冠動脈血管：幅３ｍｍ、長さ１０ｍｍ）とした。血管標本を、９５体積％Ｏ2 −５体積％ＣＯ2 混合ガスの通気下に、３７℃のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎａ+ １３７．４ｍＭ、Ｋ+ ５．９ｍＭ、Ｃａ2+１．２ｍＭ、Ｍｇ2+１．２ｍＭ、Ｃｌ- １４８．１ｍＭ、グルコース１１．５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１１．６ｍＭ（ｐＨ７．３））を満たしたマグヌス管に懸垂し、張力トランスジューサーにて等尺性張力を測定した。約３ｇの張力負荷にて定常状態となった後、以下の実験を行った。
【００３５】
Ｋ+ １１８ｍＭによって脱分極させてＣａ2+依存性の収縮時の張力を測定し、これを正常収縮とした。Ｋ+ を洗浄後、Ｃａ2+非依存性の異常な血管収縮惹起剤であるＳＰＣを４０μＭ添加して異常収縮時の張力を測定した。異常収縮時の張力が一定になった時点で、被験物質６０μＭを添加して張力変化を測定した。張力が一定になった時点で、更にＫ+ １１８ｍＭとして張力変化を測定した。ウシ脳動脈血管標本を用い、被験物質をＥＰＡ−Ｎａとして測定した張力変化を図１に示す。
【００３６】
Ｋ+ １１８ｍＭによって正常収縮が起きており、ＳＰＣによって正常収縮と同程度の異常収縮が観察された。この異常収縮は、ＥＰＡ−Ｎａによりほぼ完全に抑制されたが、再度Ｋ+ １１８ｍＭとすると正常収縮と同程度の収縮が観察された。すなわち、ＥＰＡ−Ｎａは、ＳＰＣによる異常収縮を抑制するが、Ｋ+ １１８ｍＭによる正常収縮には影響を及ぼさないことがわかる。
【００３７】
被験物質をＥＰＡ−Ｅ、ＥＰＡ−ＴＧ、ドコサヘキサエン酸ナトリウム塩、ドコサペンタエン酸ナトリウム塩あるいはアラキドン酸ナトリウム塩とし、同様の実験を行ったところ、ＳＰＣによる異常収縮およびＫ+ １１８ｍＭによる正常収縮のいずれにも影響を及ぼさなかった。
【００３８】
以上の結果は、ウシ脳動脈血管でもブタ冠動脈血管でも同様に得られた。
上記結果より、ＥＰＡ−Ｎａは特異的に、Ｋ+ １１８ｍＭによる正常収縮には影響を及ぼさずにＳＰＣによるＣａ2+非依存性の異常な血管収縮を抑制することがわかった。
【００３９】
（実験例２：スキンドファイバーＳＰＣ収縮に対するＥＰＡ−Ｎａの抑制作用）
ブタ冠動脈血管標本の小片（幅０．１ｍｍ、長さ１．５ｍｍ）を切り出し、Ｋｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むバブル・プレート上のウェル中で張力トランスジューサーにて等尺性張力を測定した。Ｋ+ １１８ｍＭによって生じた収縮を測定し、これを正常収縮とした。その後、弛緩溶液（Ｍｇ−ＡＴＰ４．５ｍＭ、ＥＧＴＡ２ｍＭ、カルモジュリン２．７μＭ、カルボニルシアニドｐトリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン１μＭ、ロイペプチン１μＭ）中で２０μＭのβ−エスシンで２０分間、２５℃でスキンド処理した。
【００４０】
Ｃａ2+濃度を一定（ｐＣａ６．３）とした状態で、ＥＰＡ−Ｎａ６０μＭの存在下あるいは非存在下に、ＳＰＣ４０μＭを添加して張力変化を測定した。
その結果、ＥＰＡ−Ｎａ非存在下ではＳＰＣにより正常収縮よりさらに強い異常収縮が観察されたが、ＥＰＡ−Ｎａ存在下ではＳＰＣによる異常収縮はほぼ完全に抑制された。また、ＥＰＡ−ＮａのかわりにＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＨＡ−１０７７３０μＭ存在下で同様の実験を行ったところ、ＳＰＣによる収縮はほぼ完全に抑制された。
【００４１】
上記結果より、ＳＰＣはＲｈｏキナーゼを介する経路でＣａ2+非依存性の平滑筋異常収縮を引き起こし、ＥＰＡ−ＮａはこのＳＰＣ−Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系による異常収縮を完全に抑制することがわかった。
【００４２】
（実験例３：ヒト腸管膜動脈のＳＰＣ収縮に対するＥＰＡ−Ｎａの抑制作用）
消化器癌手術の際、患者から摘出した胃腸や周囲組織より腸間膜動脈を分離した。分離した動脈血管の周辺組織および内皮を除去して血管標本（幅１ｍｍ、長さ５ｍｍ）とした。血管標本を、９５体積％Ｏ2 −５体積％ＣＯ2 混合ガスの通気下に、３７℃のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液を満たしたマグヌス管に懸垂し、張力トランスジューサーにて等尺性張力を測定した。約０．５ｇの張力負荷にて定常状態となった後、以下の実験を行った。
【００４３】
Ｋ+ １１８ｍＭによって脱分極させてＣａ2+依存性の収縮時の張力を測定し、これを正常収縮とした。Ｋ+ を洗浄後、ＳＰＣを４０μＭ添加して異常収縮時の張力を測定した。
その結果、いずれの患者の血管標本でもＫ+ １１８ｍＭによって同程度の正常収縮が観察された。血清総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄｌ以上の患者の血管標本ではＳＰＣにより正常収縮とほぼ同程度の異常収縮が観察されたが、血清総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄｌ未満の患者の血管標本ではＳＰＣによる収縮は殆ど観察されなかった。この異常収縮はＥＰＡ−Ｎａ６０μＭの添加でほぼ完全に抑制された。
上記結果より、血清総コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄｌ以上の患者の血管標本においてＣａ2+非依存性の異常な血管収縮が起き、それがＥＰＡ−Ｎａにより抑制されていることがわかった。
【００４４】
以上の結果より、ＥＰＡはＣａ2+非依存性の平滑筋異常収縮を選択的に抑制し、脱分極によるＣａ2+依存性の生理的な平滑筋正常収縮に影響を及ぼさないことから、特異性の高い平滑筋異常収縮の抑制剤となること、速効性が高くかつ副作用の少ない血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物、暗黒視症および視野狭窄の予防および／または治療剤あるいは薬物誘発起立性低血圧の副作用軽減剤となること、また、平滑筋異常収縮の原因と考えられているＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の特異性の高い阻害剤となることが判明した。
【００４５】
【実施例】
以下に、本発明の抑制剤の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）  注射剤
ＥＰＡ−Ｎａ            １ｇ
ブドウ糖                ５ｇ
上記各成分を秤量し、注射用滅菌水を加えて全量を１００ｍｌとし、水酸化ナトリウムでｐＨを調製し、濾過滅菌後５ｍｌづつ無菌バイアルに分注した。
【００４６】
（実施例２）  注射剤
ＥＰＡ−Ｎａ            ２ｇ
塩化ナトリウム        ０．９ｇ
没食子酸              ０．２ｇ
上記各成分を秤量し、注射用滅菌水を加えて全量１００ｍｌとし、水酸化ナトリウムでｐＨを調製し、濾過滅菌後５ｍｌづつ無菌バイアルに分注した。
【００４７】
（実施例３）  乳剤
ＥＰＡ−ＴＧ            １００ｇ
濃グリセリン              ２５ｇ
卵黄リン脂質              １２ｇ
α−トコフェロール          ３ｇ
上記各成分を秤量し、注射用蒸留水を加えて１Ｌとし、ホモミキサーで分散させた。これを高圧噴射式乳化機にて乳化し、脂肪乳液を調製した。該脂肪乳液を１００ｍｌずつプラスチックボトルに分注した後、１２１℃、２０分間オートクレーブにて滅菌して脂肪輸液とした。滅菌後、ＯＶ−フィルム（ユニチカ社製）で真空包装した。
【００４８】
（実施例４）  脂肪輸液
ＥＰＡ−Ｅ                  ５０ｇ
精製大豆油                ９５０ｇ
精製卵黄レシチン          １２０ｇ
オレイン酸                    ５ｇ
濃グリセリン              ２５０ｇ
上記各成分を０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌに加えホモミキサーで分散させた後、注射用蒸留水を加えて全量を１０Ｌとした。これを高圧噴射式乳化機にて乳化し、脂肪乳液を調製した。該脂肪乳液を２００ｍｌずつプラスチックボトルに分注した後、１２１℃、２０分間オートクレーブにて滅菌して脂肪輸液とした。滅菌後、ＯＶ−フィルム（ユニチカ社製）で真空包装した。
【００４９】
（実施例５）  軟質カプセル剤
軟質ゼラチンカプセル（約０．５ｍｌ容）を滅菌し、エチル化および精製した魚油、すなわちＥＰＡ−Ｅ９０．６質量％、アラキドン酸エチル２．３質量％、オクタデカテトラエン酸エチル２．２質量％、ω−３イコサテトラエン酸エチル０．７質量％を含む組成物にα−トコフェロールを０．２質量％となるように加えて、ＥＰＡ−Ｅとして３００ｍｇとなるように満たし、次いで封じた。
【００５０】
【発明の効果】
ＥＰＡを有効成分として含有することを特徴とする本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤は、摘出血管標本あるいはスキンド処理した血管標本を用いた平滑筋異常収縮に関する実験における抑制剤として有用である。また、本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤は、平滑筋異常収縮に起因する疾患に関する治療・研究等への応用が可能である。
【００５１】
また、血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物は、ヒトおよび動物において平滑筋異常収縮の抑制が必要な疾患、例えば、脳動脈や冠動脈等の血管攣縮等の循環器系疾患、暗黒視症あるいは視野の狭窄、食道痙攣、胃痙攣、腸管運動亢進に基づく下痢または腹痛、痙攣性イレウスあるいは腹部アンギナ等の消化器系疾患、あるいは、呼吸困難あるいは気管支喘息等の呼吸器系疾患等に対して起立性低血圧等の副作用の少ない治療剤として有用である。特に、治療剤の速効性が望まれる疾患、例えば脳血管攣縮または冠血管攣縮に対して、正常部位での生理的かつ正常な平滑筋収縮には影響せずに、病態部位でのＣａ2+非依存性の平滑筋異常収縮のみを抑制することにより、速効性が高くかつ副作用の少ない治療用の注射用組成物となる。
【００５２】
本発明の平滑筋異常収縮の抑制剤および血管平滑筋異常収縮に起因する循環器系疾患治療用の注射用組成物の全脂肪酸中のＥＰＡ含量比は魚油およびその単純濃縮物に比べ高いため、抑制効果の特異性が高く、あるいは治療効果が高くかつ悪心等の副作用が少ない極めて優れた性質を有している。
また、本発明のＲｈｏキナーゼシグナル伝達系の阻害剤は、その阻害活性および特異性が高く、Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系の機能の研究あるいは平滑筋異常収縮が関与する疾患の治療剤開発の研究に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ウシ脳動脈血管標本のＳＰＣ収縮に及ぼすＥＰＡ−Ｎａの影響を観察した際の張力変化の記録である。
【図１】
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