(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チューブリンの重合阻害物質を有効成分とする細胞外物質を哺乳動物卵内へ導入するための哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤。
【請求項２】
チューブリンの重合阻害物質が、ビンブラスチンであることを特徴とする請求項１記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤。
【請求項３】
細胞外物質の哺乳動物卵内への導入が、精子の哺乳動物卵内への導入であることを特徴とする請求項１又は２記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤。
【請求項４】
精子の哺乳動物卵内への導入が、哺乳動物卵の受精能の向上によって促進されることを特徴とする請求項３記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤。
【請求項５】
哺乳動物卵が、マウス未受精卵であることを特徴とする請求項４記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤。
【請求項６】
細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入に際して、非ヒト哺乳動物卵をチューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤で処理することを特徴とする細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法。
【請求項７】
細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入に際して、非ヒト哺乳動物卵をビンブラスチンで処理することを特徴とする請求項６記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法。
【請求項８】
細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入が、非ヒト哺乳動物未受精卵内への精子の導入であることを特徴とする請求項６又は７記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法。
【請求項９】
細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入が、非ヒト哺乳動物の体外での卵子と精子の融合によって行なわれることを特徴とする請求項８記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法。
【請求項１０】
精子の非ヒト哺乳動物卵内への導入が、非ヒト哺乳動物未受精卵の受精能の向上によって促進されることを特徴とする請求項８又は９記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法。
【請求項１１】
非ヒト哺乳動物未受精卵の受精能の向上が、精子の卵細胞膜への融合の促進であることを特徴とする請求項１０記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤及び該導入促進剤を用いた哺乳動物卵内への細胞外物質の導入方法、より詳細には、チューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤を用いて、精子、細胞核、核酸、蛋白質のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入する方法、及び、そのための哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤に関する。本発明の一つの特徴は、チューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤の処理によって、哺乳動物卵の受精能の向上を図ることにより、精子の哺乳動物卵内への導入を促進して、哺乳動物の卵子の受精を促進する方法を提供することにある。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療、生殖医療、或いは発生工学を用いる哺乳動物の改変の分野においては、生殖細胞の改変の為に、精子、細胞核、核酸のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入することが行なわれる。従来、哺乳動物卵のような細胞に、遺伝子（核酸）物質を導入するには、レトロウイルスのようなベクターを用いて導入する方法が知られているが（ＷＯ９７／１８３１８）、精子や細胞核のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入するには、一般的には、ガラスキャピラリーで卵の細胞膜に穴をあけて注入する方法（intracytoplasmic sperm injection ：ＩＣＳＩ）が用いられており、ヒトを含めた哺乳動物卵への精子導入法においても、このＩＣＳＩ法が主流で（特開平５−３８３４５号公報）、ヒトの不妊治療にも広く用いられている。【０００３】
しかしながら、細胞外物質を哺乳動物卵へ導入する方法として、ＩＣＳＩ法はいくつかの問題を有している。すなわち、ＩＣＳＩ法の問題点は、（１）ＩＣＳＩ法により細胞外物質を哺乳動物卵へ確実に導入するには、技術的に修練を要する、（２）ＩＣＳＩ法により細胞外物質を哺乳動物卵へ導入する方法は、成功率が低い、（３）ＩＣＳＩ法は、卵細胞膜にガラスキャピラーにより穴をあけることによって行われるため、穴をあけることによる、胚発生への悪影響などが考えられる。しかし、現在、ＩＣＳＩ法に代わる方法がないため、問題点が指摘されているものの、ＩＣＳＩ法が用いられているのが現状である。【０００４】
一方で、哺乳動物卵内への精子の導入は、受精によって行われるが、哺乳動物卵内への精子の導入を促進する方法もいくつか提案されている。例えば、特表平８−５０３７０５号公報には、サイモシンα１のような受精促進サイモシン・ポリペプチドを投与して受精を促進し、哺乳動物雄の不妊症の治療を行う方法について、特開平９−２８７２１号公報には、ウシの精子をウシ卵管上皮細胞と共培養した後、ウシ卵子と培養し体外受精させ、ウシ精子の体外受精能を向上させる方法について、開示されている。【０００５】
また、特表２００１−５０６２２５号公報には、哺乳動物の卵子受精を促進するために、アンギオテンシンIIを使用する方法について、特開平６−１８９６５０号公報には、精子や卵子に磁力を作用させることにより、活性を向上させ、受胎率の向上を図る方法について、及び、特表２００１−５００１０２号公報には、１０〜１２％のグリセロールの存在下で、凍結及び解凍した精液懸濁液の遠心によって精製されたポリペプチドであり、プロサボシン（ＳＧＰ−１）及びサボシンを含む一群の蛋白質の一員であるポリペプチドを用いて精子−卵子の結合の改善及び受精能力の増進を図ることについて開示されている。これらは、いずれも、哺乳動物の卵子の受精に際して、卵子や精子を活性化させ、その受精を促進する効果を狙った方法である。【０００６】
他方で、動物・植物・真菌等の真核生物の細胞においては、該細胞に広く存在する直径２５ｎｍ前後の管状蛋白質繊維で、微小管と呼ばれる小器官があることが知られている。その機能としては、有糸分裂装置の形成、細胞形態の形成と維持、鞭毛・繊毛運動、細胞内オルガネラの配置、物質輸送、ホルモン分泌、細胞膜の流動性など極めて多岐にわたっている。特に神経細胞においては軸索や樹状突起の主構成分子として存在し、モーター蛋白質のレールとして物質の輸送に寄与している。通常、微小管は、α−、β−チューブリン各１分子からなるヘテロ２量体が規則正しく重合して形成されており、細胞周期の進行に伴い重合／脱重合による消長を繰り返している。また、これら微小管は微小管結合蛋白質（ＭＡＰｓ、τ蛋白質）によってもその重合／脱重合が制御されており、その制御機構には主にこれら微小管結合蛋白質を基質とする蛋白質リン酸化酵素（キナーゼ）及び蛋白質脱リン酸化酵素（フォスファターゼ）が関与している。これらのことから、この微小管系に作用する化合物は、細胞分裂阻害など様々な生物活性を示すことが知られている。【０００７】
上記のように、微小管は、有糸分裂時に赤道板に配列された染色体を両極に導く分裂方錘糸の主要な成分であり、分裂間期に細胞の形状、運動性及び付着の維持、並びに細胞内輸送を含む多くの細胞作用において必要不可欠な役割を演じている(Shiff，P．B．and Horwitz，S．B.，1981，「抗癌化学療法剤における分子作用及び標的」の項の「チューブリン：化学療法剤の標的」，pp483-507，Academic Press，NY，USA;Glotz，J．S．et al.，1992，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89:7026-7030;Rowinsky，E．K．et al.,1990，Nature，82:1247-1259)。それらは、また成長因子と細胞表面上の受容体の相互作用及びこれらの相互作用により誘導される膜通過性の増殖信号を調節することにおいても重要である。受精と細胞骨格との関連についても、報告されている（Molecular Reproduction and Development,56:89-98,2000）。【０００８】
チューブリンは、微小管の主要構成蛋白質であって、細胞の分裂・増殖に必要不可欠な蛋白質であり、いわゆる細胞骨格要素である。したがって、チューブリンの重合阻害或いは脱重合は、細胞の分裂・増殖に重要な係わり合いをもつ。このようなチューブリンの機能から、チューブリンは、抗癌剤（抗がん剤）、抗真菌剤、除草剤の標的としても公知であり、生命科学の基礎と応用の両面に深くかかわってきた。【０００９】
チューブリンの重合阻害物質としては、今までに多くのものが知られている。現在、よく知られた、癌（がん）の処置のためのチューブリンの重合阻害物質として、ビンカアルカロイドがある（特開平５−１９２１７４号公報）。ビンカアルカロイドは、抗癌剤（抗がん剤）の一種の総称で、その成分は植物から抽出されたもので、チューブリンという細胞の運動や形の保持に関わる蛋白質に結合し、微小管を阻害することにより、細胞分裂を阻害する。【００１０】
ビンカアルカロイドの代表的なものには、ビンブラスチン及びビンクリスチンがある（J.Med.Chem. 34:1998,1991）。ビンブラスチンは、キョウチクトウ科ニチニチソウ(Catharanthus roseus)に含まれるアルカロイドのうち、抗腫瘍作用を有するインドールアルカロイドで、微小管又はその構成蛋白質のチューブリンに作用し、細胞の有糸分裂を中期で停止させ、細胞分裂を妨げる作用がある。現在、ビンクリスチンは白血病、悪性リンパ腫、小児腫瘍などに、ビンブラスチンは非小細胞癌に用いられている。ビンブラスチンは、近年、合成方法により製造されている（特開２００３−６４０８４号公報）。【００１１】
その他、チューブリンの重合阻害物質としては、リゾキシン（Tetrahedron Lett.,34:1035,1993）、コンブレタスチン（Biochemistry, 28:6984,1989；特開平６−２０７２６４号公報）、２−スチリルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（ＳＱＯ）（J. Med. Chem., 33:1721,1990）、ハリスタチン１、２（特開平６−２７９４５０号公報；特開平６−２７９４５１号公報）、及び、ピロネチン又はその類縁体（特開平１１−１４３４号公報）等、多くのものが知られており、抗腫瘍剤等への利用が図られている。【００１２】
【特許文献１】特開平５−３８３４５号公報。
【特許文献２】特開平５−１９２１７４号公報。
【特許文献３】特開平６−１８９６５０号公報。
【特許文献４】特開平６−２０７２６４号公報。
【特許文献５】特開平６−２７９４５０号公報。
【特許文献６】特開平６−２７９４５１号公報。
【特許文献７】特開平９−２８７２１号公報。
【特許文献８】特開平１１−１４３４号公報。
【特許文献９】特開２００３−６４０８４号公報。
【特許文献１０】特表平８−５０３７０５号公報。
【特許文献１１】特表２００１−５００１０２号公報。
【特許文献１２】特表２００１−５０６２２５号公報。
【特許文献１３】ＷＯ９７／１８３１８。
【非特許文献１】Shiff，P．B．and Horwitz，S．B.，1981，「抗癌化学療法剤における分子作用及び標的」の項の「チューブリン：化学療法剤の標的」，pp483-507，Academic Press，NY，USA。
【非特許文献２】Glotz，J．S．et al.，1992，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89:7026-7030。
【非特許文献３】Rowinsky，E．K．et al.,1990，Nature，82:1247-1259。
【非特許文献４】Molecular Reproduction and Development,56:89-98,2000。
【非特許文献５】J.Med.Chem. 34:1998,1991。
【非特許文献６】Tetrahedron Lett.,34:1035,1993。
【非特許文献７】Biochemistry, 28:6984,1989。
【非特許文献８】J. Med. Chem., 33:1721,1990。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、精子、細胞核、核酸、蛋白質のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入するに際して、哺乳動物卵に対して安全で、効率的な導入が可能であり、かつ、技術的にも容易な細胞外物質の哺乳動物卵内への導入方法を提供することにある。更に、本発明の課題は、精子の哺乳動物卵内への導入に際して、技術的に容易で、かつ、哺乳動物卵へのダメージが少ない精子の哺乳動物卵への導入方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、精子のような細胞外物質を、哺乳動物卵内へ導入する方法について、鋭意検討する中で、ビンブラスチンのようなチューブリンの重合阻害物質を用いて、哺乳動物卵を処理することにより、卵子と精子の膜融合が促進され、卵細胞膜に穴をあけることなく、精子と卵子を融合して、受精を行うことが可能であることを見い出して、本発明を完成するに至った。【００１５】
より詳細に説明すれば、哺乳動物卵内へ精子のような細胞外物質を導入する従来の方法は、ガラスキャピラリーで卵子の細胞膜に穴をあけるＩＣＳＩ法が用いられていたため、技術的に難しく、成功率も低く、なおかつ、卵細胞膜にガラスキャピラリーにより穴をあけることによる胚発生への悪影響があった。そこで、本発明者は、技術的に容易で、卵へのダメージが少ない精子導入法について鋭意検討する中で、精子と卵子の細胞膜間での融合を促進する、哺乳動物卵用の精子導入促進剤の開発に着目した。【００１６】
精子と卵が融合して受精卵を作るためには、細胞膜間での融合が必須である。受精の膜融合を制御する分子メカニズムの詳細は不明であるが、最近の発明者の研究から、チューブリンを構成単位とする微小管が重要な役割を果たしていることがわかってきた。そこで、チューブリン重合促進剤及び阻害剤の受精の膜融合における効果を検討したところ、チューブリンの重合阻害物質ビンブラスチンは、精子の卵細胞膜への融合を促進する作用があることを見出した。そして、この薬剤処理により、卵細胞膜に穴をあけることなく、精子を導入することが可能となることを見い出した。【００１７】
すなわち、ビンブラスチン処理により膜融合が促進されるメカニズムを調べるため、ビンブラスチン処理後、体外受精させたマウス卵での膜蛋白質の局在を調べた。その結果、膜融合を制御していると考えられている膜４回貫通型蛋白質ＣＤ９の局在が野生型とは異なっていた。今までの研究から、受精の膜融合が起こるためには、精子によって卵の細胞膜上にＣＤ９の存在しない領域が一過性に形成されることが必須であることがわかっている。ビンブラスチン処理により、精子が結合する前にＣＤ９の存在しない円形の領域が形成されることがわかった。しかも、精子が融合するのは、ＣＤ９の存在しない領域の中心に１個だけであった。【００１８】
本発明は、上記知見の上になされたものであり、本発明の方法は、哺乳動物卵内への精子の導入の場合のみでなく、その他、細胞核、核酸、蛋白質のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入する場合にも、適用できるものである。すなわち、本発明は、チューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤を用いて、精子、細胞核、核酸、蛋白質のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入する方法、及び、そのための哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤からなる。更に、本発明の態様の一つは、チューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤の処理によって、哺乳動物卵の受精能の向上を図ることにより、精子の哺乳動物卵内への導入を促進して、哺乳動物の卵子の受精を促進する方法からなる。【００１９】
すなわち具体的には本発明は、（１）チューブリンの重合阻害物質を有効成分とする細胞外物質を哺乳動物卵内へ導入するための哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤や、（２）チューブリンの重合阻害物質が、ビンブラスチンであることを特徴とする上記（１）記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤や、（３）細胞外物質の哺乳動物卵内への導入が、精子の哺乳動物卵内への導入であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤や、（４）精子の哺乳動物卵内への導入が、哺乳動物卵の受精能の向上によって促進されることを特徴とする上記（３）記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤や、（５）哺乳動物卵が、マウス未受精卵であることを特徴とする上記（４）記載の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤からなる。
【００２０】
また本発明は、（６）細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入に際して、非ヒト哺乳動物卵をチューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤で処理することを特徴とする細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法や、（７）細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入に際して、非ヒト哺乳動物卵をビンブラスチンで処理することを特徴とする上記（６）記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法や、（８）細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入が、非ヒト哺乳動物未受精卵内への精子の導入であることを特徴とする上記（６）又は（７）記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法や、（９）細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入が、非ヒト哺乳動物の体外での卵子と精子の融合によって行なわれることを特徴とする上記（８）記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法や、（１０）精子の非ヒト哺乳動物卵内への導入が、非ヒト哺乳動物未受精卵の受精能の向上によって促進されることを特徴とする上記（８）又は（９）記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法や、（１１）非ヒト哺乳動物未受精卵の受精能の向上が、精子の卵細胞膜への融合の促進であることを特徴とする上記（１０）記載の細胞外物質の非ヒト哺乳動物卵内への導入方法からなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施例において、透明帯を除去したマウス未受精卵を、チューブリンの重合阻害物質であるビンブラスチンで処理した後、マウス精子と体外受精を行った結果において、融合した精子数についての結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、透明帯非除去マウス未受精卵を、チューブリンの重合阻害物質であるビンブラスチンで処理した後、マウス精子と体外受精を行った結果において、受精した卵の割合についての結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、精子のような細胞外物質の哺乳動物卵内への導入に際して、哺乳動物卵をチューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤で処理し、細胞外物質を哺乳動物卵内へ導入することよりなる。本発明で、哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤の有効成分として使用されるチューブリンの重合阻害物質としては、チューブリンの重合阻害剤として公知の、チューブリンの重合阻害物質を用いることができる。チューブリンの重合阻害剤としては、ビンカアルカロイドを挙げることができ、該ビンカアルカロイドの代表的なものとしては、ビンブラスチン及びビンクリスチンを挙げることができる。本発明の哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤の有効成分として特に好ましいものとして、ビンブラスチンを挙げることができる。【００２３】
本発明で対象とする哺乳動物卵としては、特に、制限はないが、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、及びサル等の卵子を挙げることができる。本発明の細胞外物質の哺乳動物卵内への導入方法は、精子、細胞核、核酸、蛋白質のような細胞外物質に対して適用することができるが、本発明の細胞外物質の導入方法は、特に、精子の哺乳動物卵内への導入に適用して、有効な哺乳動物卵の受精の手段として、提供することができる。【００２４】
本発明において、哺乳動物卵をチューブリンの重合阻害物質を有効成分とする哺乳動物卵用細胞外物質導入促進剤で処理するには、卵子を採卵後、適当な培地（例えば、ＴＹＨ培地）で培養したのち、チューブリンの重合阻害物質を添加した培地で、数時間培養することにより、行うことができる。【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［ビンブラスチン処理による受精効率の増加］
マウス未受精卵の受精におけるチューブリンの重合阻害剤の影響を調べるために、チューブリンの重合阻害剤として、ビンブラスチンを用い、マウス未受精卵をビンブラスチンで処理して、その受精能を調査した。【００２７】
（材料及び実験条件）
0004448172.tif 000002
【００２８】
0004448172.tif 000003
【００２９】
３．培養温度：３７℃【００３０】
（実験操作）
１．採卵
（１）生後８週齢以上のマウスを購入し、使用前１週間飼育環境に順応させた。
午後８時に０．１ｍＬずつＰＭＳ（あすか製薬（株）動物専用セロトロピン）をマウス腹腔に注入した。
（２）４８時間後、０．１ｍＬずつＨＣＧ（あすか製薬（株）動物専用ゴナドトロピン）を腹腔に注入した。
（３）翌日（ＨＣＧ注入後、１４〜１６時間後）、マウスを安楽死させ、卵管膨大部を取り出し、卵丘細胞に囲まれた卵子を回収し、ドロップ（１００μＬ）内のＴＹＨ培地中で培養した。
（４）ヒアルロニダーゼ（３００μｇ／ｍＬ）処理によって卵丘細胞を除去した。その後、ＴＹＨ培地中で３時間培養した。透明帯除去を行なう場合には、酸性タイロード液処理により、卵子の透明帯を除去した後、ＴＹＨ培地中で３時間培養した。【００３１】
２．チューブリンの重合阻害物質による処理
採卵したマウス未受精卵を、チューブリンの重合阻害物質としてビンブラスチン（ＶＢ）を用いて処理した。対照として、チューブリンの重合促進物質パクリタクセル（paclitaxel（Ｐａｃ）；商品名：タキソール）及び未処理（コントロール）のものを用いた。ビンブラスチン（ＶＢ）の処理は、ビンブラスチン溶液（ＴＹＨ培地）２０μＭで、１時間培養して処理し、パクリタクセル（Ｐａｃ）の処理は、パクリタクセル（Ｐａｃ）溶液（ＴＹＨ培地）１０μＭで、同じく１時間培養して処理した。【００３２】
３．体外受精
マウス未受精卵を、チューブリンの重合阻害物質ビンブラスチン（ＶＢ）で処理した後、マウス精子と体外受精を行った。対照として、チューブリンの重合促進物質パクリタクセル（Ｐａｃ）及び未処理（コントロール）のものを用いた。【００３３】
［結果］
（透明帯除去卵を用いた場合）：
精子の卵への融合効率を定量化するために、透明帯を除去したマウス未受精卵をチューブリンの重合阻害物質ビンブラスチン（ＶＢ）、チューブリンの重合促進物質パクリタクセル（Ｐａｃ）で処理した後、或いは未処理（コントロール）で、マウス精子と体外受精を行った結果を図１に示す。図には、体外受精（透明帯除去卵、媒精後１時間）の結果を示す。図中、白色バーは、融合した精子の数を示す。１時間後の融合した精子数は、ＶＢ（ビンブラスチン）処理卵が一番多く、パクリタクセル（Ｐａｃ）処理のものは、精子が融合しにくくなるため、多数の精子が卵表面に着くが融合はしなかった。【００３４】
（透明帯非除去卵を用いた場合）：
透明帯除去などの特殊な処理を行わない排卵直後のマウス未受精卵を、チューブリンの重合阻害剤であるビンブラスチンで処理した後、マウス精子と体外受精を行った。結果を、図２に示す。この実験においては、同時に、融合阻害効果のある抗マウスＣＤ９抗体を用いた実験を行なった。マウスの場合、２割程度の卵は未成熟及び過成熟が原因で受精できない。しかし、受精効率を２細胞期胚の数で調べたところ、未処理卵に比べてビンブラスチン処理卵では受精効率が２割上昇した。下記のように未成熟卵でも、ビンブラスチンで処理することにより、精子と融合することができたことから、ビンブラスチンで処理することにより、精子の卵への融合効率が上昇した結果と考えられる。この実験結果は、ビンブラスチン処理によって未成熟卵及び過成熟卵でも精子と融合可能となることを示している。更に、融合阻害効果のある抗マウスＣＤ９抗体で処理した卵でも、ビンブラスチン処理によって融合効率を上昇させることができた。【００３５】
（ビンブラスチン処理による受精効率の増加）
マウス未受精卵をチューブリンの重合阻害剤であるビンブラスチンで処理した後、マウス精子と体外受精を行った結果、未処理群に比べて、受精効率が２割増加した。マウスの場合、２割程度は卵が未成熟であるため精子と融合できない。しかし、未成熟卵でも、ビンブラスチンで処理することにより、精子と融合することができた。【００３６】
（パクリタクセルによる処理）
マウス未受精卵を、チューブリン重合促進剤であるパクリタクセル（Ｐａｃ）で処理すると、精子の卵膜への融合は阻害された。卵膜の形態を電子顕微鏡で調べると、変形した微絨毛が多数観察された。【００３７】
（ビンブラスチン処理による精子融合領域の形成）
ビンブラスチン処理により膜融合が促進されるメカニズムを調べた。ビンブラスチン処理後、体外受精させたマウス卵での膜蛋白質の局在を調べた。チューブリンの重合阻害剤であるビンブラスチンで処理すると、卵膜でのＣＤ９の局在が変化しない円形の領域が形成された。円形の領域の個数は、卵によって異なっており、１〜６個であった。しかも、その円形の領域の中心には、精子が一個づつ融合することが確認された。これは、精子が融合するためにはチューブリンの脱重合が必要なことを示している。【００３８】
すなわち、上記結果では、膜融合を制御していると考えられている膜４回貫通型タンパク質ＣＤ９の局在が野生型とは異なっていた。今までの研究から、受精の膜融合が起こるためには、精子によって卵の細胞膜上にＣＤ９が存在しない領域が一過性に形成されることが必須であることがわかっている。ビンブラスチン処理により、精子が結合する前にＣＤ９が存在しない円形の領域が形成されることがわかった。しかも、精子が融合するのは、ＣＤ９が存在しない領域の中心に１個だけであった。なお、半透膜が存在する卵の受精では、多精排除機構があるため、導入される精子は１個に限定されることを確認している。これらの結果から、卵膜の特定の領域をビンブラスチン処理することにより、ガラスキャピラリーを用いることなく、精子の卵内への導入が可能となることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の方法によれば、精子、細胞核、核酸、蛋白質のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入するに際して、哺乳動物卵に対して安全で、効率的な導入が可能であり、かつ、技術的にも容易な細胞外物質の哺乳動物卵内への導入方法を提供することができる。特に、本発明の方法は、精子の哺乳動物卵内への導入方法として適用して、従来法のＩＣＳＩ法のような特殊な装置を用いることなく、技術的にも容易で、かつ、ＩＣＳＩ法のようにガラスキャピラリーで卵子の細胞膜に穴をあけることがなく、哺乳動物卵へのダメージが少ない精子の哺乳動物卵への導入を可能とする。したがって、本発明は、遺伝子治療、生殖医療、或いは発生工学を用いる哺乳動物の改変の分野において、受精や生殖細胞の改変の為に、精子、細胞核、核酸、蛋白質のような細胞外物質を哺乳動物卵へ導入する有力な手段として、この分野の進展に大きな貢献が期待できるものである。
【図１】
0004448172.tif 000004
【図２】
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