(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の骨関節の滑膜組織に投与することにより該患者の慢性関節リウマチを治療するための医薬組成物であって、該滑膜組織におけるVEGF発現をダウンレギュレートしかつ該滑膜組織における新血管形成を抑制するのに十分なレベルでpRb2/p130遺伝子を発現する組換えベクターを含んでなり、その際、該ベクターがアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、上記医薬組成物。
【請求項２】
患者の網膜に投与することにより該患者の糖尿病性網膜症を治療するための医薬組成物であって、該網膜におけるVEGF発現をダウンレギュレートしかつ該網膜における新血管形成を抑制するのに十分なレベルでpRb2/p130遺伝子を発現する組換えベクターを含んでなり、その際、該ベクターがアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、上記医薬組成物。
【請求項３】
患者の脈絡膜組織に投与することにより該患者における脈絡膜血管新生を治療するための医薬組成物であって、該組織におけるVEGF発現をダウンレギュレートしかつ該脈絡膜組織における新血管形成を抑制するのに十分なレベルでpRb2/p130遺伝子を発現する組換えベクターを含んでなり、その際、該ベクターがアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、上記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、pRb2/p130のウイルス介在送達および発現により、患者の標的領域における新血管形成を抑制する方法に関する。特に、本発明は、標的組織における新血管形成を抑制するために、pRb2/p130の送達およびその発現の誘導により標的組織における血管新生因子の発現をダウンレギュレーションすることに係わる。
【背景技術】
【０００２】
新血管形成（angiogenesis）とは、既存の血管から新しい血管が形成されることである。新血管形成は組織（例えば、腫瘍組織）の形成および発達の過程で不可欠な段階である。なぜなら、一定の線を越えた組織の成長はこの血管ネットワークからの酸素と栄養分の供給に依存しているからである。例えば、腫瘍組織に関して、拡散によって全ての十分な栄養を受け取ることができるのは直径1〜2 mmの腫瘍だけである。それゆえ、さらなる増殖は新血管形成を介した十分な血液供給の発達に依っている (Folkman, J. Nat'1 Cancer Inst. 82: 4-6, 1990)。
【０００３】
新血管形成は毛細血管の成長速度に影響を及ぼす様々な正および負のエフェクター分子間のバランスによって駆動される。これまでに種々の血管新生因子および抗血管新生因子がクローニングされていて、公知である (Leungら, Science. 246: 1306-9, 1989; Uenoら, Biochem Biophys Acta. 1382: 17-22, 1998; Miyazonoら, Prog Growth Factor Res. 3: 207-17, 1991)。最も詳しく研究されているものは血管内皮増殖因子 (VEGF) とトロンボスポンジン-1 (TSP-1) の２つである。VEGF は、抗血管新生分子として機能するTSP-1と対照的な血管新生因子である(Tuszynskiら, Bioessays. 18: 71-6, 1996; Dameronら, Science. 265: 1582-4, 1994)。正常な血管の成長はこれらの相反する因子の調和のとれた発現によりもたらされる。正常な血管成長から制御不能な血管成長への切り替えは、血管新生促進因子のアップレギュレーションまたは血管新生抑制因子のダウンレギュレーションによって起こることがある。このことは、血管新生過程がこうした相反する因子間の変動により強固に調節されていることを示唆する (Bouckら, Adv Cancer Res. 69: 135-74, 1996)。例えば、腫瘍組織では、血管新生表現型への切り替えが新生物表現型へと進行する前の明確に区別されるステップとして起こり、発生的または遺伝的変化と結びついている (Hanahanら, Cell. 86: 353-64,1996)。この理論を支持するものとして、VEGFのmRNA発現は活性化されたras癌遺伝子を発現する攻撃的な腫瘍細胞系においてアップレギュレーションされる (Rakら, Neoplasia. 1: 23-30, 1999)。反対に、突然変異ras対立遺伝子を破壊した後の同じ腫瘍細胞系ではVEGFの転写がダウンレギュレーションされ、こうしてVEGF発現が除かれて、細胞がin vivoで腫瘍を形成できなくなる (Stieglerら, J Cell Physiol. 179: 233-6,1999)。また、血管新生表現型への切り替えは腫瘍抑制遺伝子p53の不活性化とも関連している (Holmgrenら, Oncogene. 17: 819-24, 1998)。逆に、p16が欠失されている細胞系は、野生型サイクリン依存性キナーゼ (cdk) 阻害剤p16の修復後には抗血管新生表現型に復帰する (Haradaら, Cancer Research. 59: 3783-3789, 1999)。
【０００４】
VEGFは、腫瘍のほかにも、病的な血管新生を引き起こすことが報告されており、これは糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、脈絡膜血管新生、化膿性肉芽腫、子宮内膜症、肺水腫、肺結核などの症状の一因となる。
【０００５】
網膜芽細胞腫 (RB) 遺伝子ファミリーには３つのメンバーが含まれる。すなわち、Rb腫瘍サプレッサー RB/p105、p107、およびRB2/pl30である。これらのタンパク質は「ポケット」領域において高い相同性を有し、このポケット領域は、これらのタンパク質間で高度に保存されているスペーサー領域により分離されたサブドメインAおよびBを含んでなる (Leeら, Science 235: 1394-9, 1987; Ewenら, Cell 66: 1155-64, 1991; Mayolら, Oncogene. 8: 2561-6,1993; Liら, Genes Dev. 7: 2366-77, 1993; Hannonら, Genes Dev. 7: 2378-91, 1993)。この機能性ドメインはウイルスの癌タンパク質の標的となり、多くの機能相互作用に関与している (Stieglerら, J Cell Biochem Suppl. 31: 30-6, 1998)。機能的には、Rbファミリーの全てのメンバーは、各メンバーでユニークな細胞型特異的増殖抑制作用を示す。それらは、それぞれ異なったやり方で、E2F転写因子ファミリーの特定のメンバーと結合してその活性を一時的にモジュレートし、かつ細胞周期依存的にリン酸化により調節されている (Paggiら, J Cell Biochem. 62: 418-30, 1996)。これらのタンパク質の構造上のアイデンティティーが、類似しているにもかかわらず明確に区別される機能特性の根底にある。実際、３種全てのファミリーメンバーは細胞周期のG1期における細胞周期の進行を抑制する (Zhuら, Genes Dev. 7: 1111-25, 1993; Claudioら, Cancer Res. 56: 2003-8, 1996; Huangら, Science. 242: 1563-6,1988)。興味深いことに、網膜芽細胞腫ファミリーのタンパク質はユニークな増殖抑制作用を示す。それらは相互に補い合うことができるが、それらの機能が完全に重複しているわけではない (Claudioら, Cancer Res. 54: 5556-60, 1994)。
【０００６】
いくつかの腫瘍細胞系において、pRb2/pl30はG0/Gl期の細胞周期の停止を仲介するが、かかる細胞系には、pRb/p105とpl07の両方の抑制作用に抵抗するヒトT98G神経膠芽細胞腫細胞系が含まれる (Zhuら, Genes Dev. 7: 1111-25, 1993; Claudioら, Cancer Res. 56: 2003-8, 1996; Claudioら, Cancer Res. 54: 5556-60, 1994)。本発明においては、RB2/pl30の発現によって、微調整された新血管形成のバランスを組織で破壊することができることを見出した。より詳しくは、血管内皮増殖因子 (VEGF) タンパク質 (血管新生因子) のin vitroおよびin vivo発現は、RB2/pl30の発現によりダウンレギュレーションさせることが可能である。また、本発明では、血管新生因子の血管内皮増殖因子 (VEGF) タンパク質のダウンレギュレーションが、組織の新血管形成をin vivoで抑制するのに十分であることを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、VEGFが関与する疾病状態、例えば、ある種の腫瘍や癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、脈絡膜血管新生、化膿性肉芽腫、女性の生殖周期障害などを治療するための遺伝子治療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明においては、RB2/pl30がげっ歯類およびヒト組織でVEGFのRNAおよびタンパク質発現を顕著に低下させて、病的な新血管形成を抑制するのに十分であることを見出した。さらに、RB2/pl30遺伝子発現を高めると、テトラサイクリン調節pRb2/pl30系においてVEGFプロモーターの活性がダウンレギュレーションされた。
【０００９】
本発明の一般的な形態では、新血管形成の防止を必要とする患者の標的組織領域における新血管形成を防止する方法が提供される。標的組織領域は、腫瘍形成のような、ある種の望ましくない疾病または状態を引き起こすのに新血管形成の進行が不可欠である組織でありうる。この方法は、患者の標的領域に、pRb2/p130を発現するベクターを含む組成物を、標的領域における新血管形成を抑制するのに十分なレベルで投与することを含んでなり、その場合に該ベクターはアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。本発明の方法は、タンパク質（その発現が患者における新血管形成と関連している）をコードする目的の遺伝子の発現を特異的にモジュレートする。この方法の１ステップは、該遺伝子を発現する１個以上の細胞に、Rb2/pl30またはその断片を発現するウイルスベクターを、該遺伝子の発現を特異的にモジュレートすることによって該遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルに影響を与えるのに十分なレベルで接触させることである。
【００１０】
目的の遺伝子はVEGFまたは新血管形成に関与する同じ遺伝子ファミリー内のその相同体である。Rb2/pl30またはその断片は、VEGFのプロモーター調節を妨げるか、またはVEGFのmRNA発現を妨げるか、あるいはまた、VEGFのタンパク質発現を妨げることも可能である。断片Rb2/pl30は新血管形成を抑制するのに十分なVEGFのダウンレギュレーションを引き起こすに足るものであるべきである。
【００１１】
接触させる細胞は、例えば、ヒト腫瘍の細胞、ヒト癌の細胞、網膜組織の細胞、網膜色素上皮の細胞、滑膜組織の細胞であってよい。VEGF発現に特異的に影響を与えて、患者組織における新血管形成に抑制効果を発揮することができるVEGF阻害性ペプチドも提供される。本発明方法で治療することができる癌として、ヒト神経膠芽細胞腫、メラノーマ、乳癌、前立腺癌、大腸癌、血液の癌、骨肉腫、肺癌、子宮内膜癌、および胃癌が挙げられる。
【００１２】
用いるベクターはウイルスベクターかプラスミドベクターのいずれかである。ウイルスベクターの中でも、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用して標的組織にpRb2/pl30を送達し、それを発現させると、結果的に標的領域におけるVEGFのダウンレギュレーションが生じる。
【００１３】
本発明のさらに別の形態では、癌を治療するために患者の癌組織における新血管形成を防止する方法が提供される。この方法は、患者の癌組織に、pRb2/p130を発現する組換えベクターを含む組成物を、該癌組織における新血管形成を抑制するのに十分なレベルで投与するステップを含んでなる。用いる組換えベクターはアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターまたは他の適当なベクターでありうる。
【００１４】
本発明のさらなる形態では、患者の肺癌組織における新血管形成を抑制する方法が提供される。この方法は、患者の該組織に、pRb2/p130を発現する組換えベクターを含む組成物を、該組織における新血管形成を抑制するためにVEGF発現をダウンレギュレートするのに十分なレベルで投与することを含んでなり、その場合該ベクターはアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
【００１５】
本発明のさらに別の形態では、患者の慢性関節リウマチを治療する方法が提供される。この方法は、患者の骨関節の滑膜組織に、pRb2/p130を発現する組換えベクターを含む組成物を、該滑膜組織におけるVEGF発現をダウンレギュレートしかつ該滑膜組織における新血管形成を抑制するのに十分なレベルで投与することを含んでなる。
【００１６】
本発明のさらに別の形態では、患者の糖尿病性網膜症を治療する方法が提供される。この方法は、該患者の網膜に、pRb2/p130を発現する組換えベクターを含む組成物を、該網膜におけるVEGF発現をダウンレギュレートしかつ該網膜における新血管形成を抑制するのに十分なレベルで投与することを含んでなる。
【００１７】
本発明のさらに別の形態では、患者における脈絡膜の新血管形成を治療する方法が提供される。この方法は、該患者の網膜下腔または網膜色素上皮に、pRb2/p130を発現する組換えベクターを含む組成物を、該組織におけるVEGF発現をダウンレギュレートしかつ脈絡膜組織における新血管形成を抑制するのに十分なレベルで送達することを含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、新血管形成を抑制する方法に関する。本発明においては、RB2/p130が血管新生因子 (VEGF) の発現をモジュレートし、かつ新血管形成をin vivoで抑制することを示す。本発明を説明するための例としては、腫瘍細胞におけるVEGF (血管新生因子) 発現のダウンレギュレーション、および腫瘍組織における新血管形成の抑制を使用する。VEGF発現のin vitroおよびin vivoでのダウンレギュレーションと、それに続くRB2/pl30発現の増加を本発明において示す。
【００１９】
腫瘍は血管透過因子／血管内皮増殖因子（VPF/VEGF）のような血管新生因子を分泌し、かかる因子は血管内皮細胞の表面にある特定の受容体と相互作用して新血管形成を促進する。
【００２０】
腫瘍発生は、制御不能な細胞増殖とアポトーシスの阻止をもたらすいくつかの遺伝的変化を伴う多段階プロセスである (Vogelsteinら, Trends Genet. 9: 138-41, 1993)。腫瘍成長および細胞増殖は、宿主から異質の腫瘍移植片までの適切な血管新生を促す腫瘍の能力と関連している。近年、宿主による血管新生が行われないと、腫瘍は2,3ミリメートルより大きくは成長しないことが証明された (J. Mendelson, P. M. Howley, M. A. IsraleおよびL. A. Liotta (編), pp. 206232. Philadelphia: W. B. Saunders, 1995に掲載のFolkman, J. The molecular basis of cancer)。組織の進行（例えば、腫瘍の進行）および成長には、腫瘍細胞の増殖速度にみあった血管形成の適切な速度が必要である。もしそうでなければ、腫瘍壊死と、その結果としての石灰化が起こるだろう。
【００２１】
pRB2/pl30は130kDaのタンパク質をコードしており、このタンパク質は増殖細胞周期ではない細胞における遺伝子発現を制御するようにその機能がより制限されているようである (Nevins, 1998)。細胞が細胞周期停止中の細胞周期および細胞分化から退くやいなや、このタンパク質は安定化されて活性化される。pRB2/pl30は、異所的に発現されると、モデル細胞培養物を停止させる効果がある (Claudioら, 1996; Claudioら, 1994 Cancer Res, 54, 5556-60)。たとえ３種全てのメンバー(pRB/plO5、pRB2/pl30およびpRBLl/pl07)が高い相同性およびオーバーラップする特徴と活性をもっていても、各タンパク質は独特の機能を有し、重複しない特異な役割を担っている (Claudioら, 1994; MulliganおよびJacks, 1998; Mulliganら, 1998)。
【００２２】
本発明者らは、RB2/p130を送達するレトロウイルスで処置した腫瘍の一部が中心部の壊死とそれに続く石灰化を受けることを見出した。
【００２３】
腫瘍−ヒト肺腺癌および神経膠芽細胞腫
RB2/p130の発現が腫瘍細胞においてVEGFをin vitroでダウンレギュレートすることを示すために、H23細胞を用いた。この細胞にRB2/p130を担う組換えウイルスまたは対照の組換えウイルスを感染させ、48時間後に回収した。VEGFに対するプローブを用いたノーザンブロット分析により示されるように（図１参照）、RB2/p130を過剰発現させると、血管内皮増殖因子の2倍のダウンレギュレーションが達成された。RB2/p130の発現はTSP-1のような抗血管新生タンパク質のいかなる改変も生じさせない。このことは、同一の実験条件下でTSP-1に対するプローブを用いて行ったノーザンブロット分析により示された（図１参照）。
【００２４】
遺伝子の低い発現量は、mRNAの分解を高めるか、またはプロモーターを調節するか、のいずれかにより得ることができる。本明細書にはVEGFプロモーターに対する強制的RB2/p130遺伝子発現の効果も示される。VEGFプロモーターでトランスフェクトして、抗生物質テトラサイクリンの非存在下で培養した（RB2/p130を誘導した）HJC #12細胞は、非誘導HJC #12 (+ Tet) 細胞および誘導状態(- Tet)または非誘導状態(+ Tet)のいずれかの対照ベクターでトランスフェクトした細胞に対して2〜3倍のダウンレギュレーションを示した（図２参照）。pRb2/pl30転写抑制活性のための陽性対照として、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結させたE2F共通結合部位を含むプロモーターを使用した。
【００２５】
また、RB2/p130発現を高めた後のin vitroおよびin vivoでのVEGFタンパク質の存在量も測定する。
【００２６】
RB2/pl30がVEGFタンパク質発現をin vitroでモジュレートすることを示すために、RB2/p130を担うアデノウイルスまたは対照のCMVアデノウイルスのいずれかで一過性に形質導入したH23細胞 (Kondoら, Biochim Biophys. Acta. 1221: 211-4, 1994) の馴らし培地を用いて、ELISAにより分析した。さらに、RB2/p130発現がテトラサイクリン誘導性プロモーターにより調節されているHJC #12細胞の馴らし培地を試験した (Howardら, J Natl Cancer Inst. 90: 1451-60, 1998)。両方の系において、RB2/p130の過剰発現は対照に対して3倍のVEGFタンパク質量のダウンレギュレーションをもたらした（図３参照）。細胞内コンパートメントに存在するVEGFの量も調べた。RB2/p130を担うアデノウイルスまたは対照のCMVアデノウイルスのいずれかでH23細胞を一過性に形質導入した。RB2/p130発現がテトラサイクリン誘導性プロモーターにより調節されているHJC #12細胞からのタンパク質抽出物も試験した。VEGFに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により、RB2/p130発現を高めた後では、細胞内のタンパク質発現量が1/2〜1/3に減少することがわかった（図４参照）。
【００２７】
RB2/p130がVEGF発現をダウンレギュレートするだけでなく、in vivoで新血管形成を抑制することを示すために、標的組織領域としてヌードマウスに形成させた腫瘍を用いた。ヌードマウスにおける腫瘍の形成は、すでに報告されている手順に従って行った (Claudioら, Cancer Res. 60: 372-82, 2000; Howardら, J Natl Cancer Inst. 90: 1451-60, 1998)。これらの腫瘍の一部にRB2/p130を発現するウイルスベクターを送達させた。ヌードマウスで成長させてRB2/p130で処理した、または処理しなかった腫瘍の連続切片を、VEGFおよびCD31について免疫染色した。CD31は内皮細胞に特異的なマーカーである (Horakら, Lancet. 340: 1120-4, 1992)。VEGF染色は、Takahashiとその共同研究者らによる以前の研究に若干の変更を加えて、0〜3のスケールで等級を付けた (Takahashiら, Cancer Res. 55: 3964-8, 1995)。次のような等級づけを採用した。すなわち、スコア0は検出不能な染色に等しく、1はわずかな染色に等しく、2は中程度の広がった染色に等しく、3は大量の広がった染色に等しい。RB2/p130の過剰発現は、試験した2つの腫瘍移植片グループにおいてVEGF免疫染色を、対照サンプルに特徴的な大量の拡散染色（スコア＝3）（図５のパネルA、B、Cおよび図６のパネルA、B、C、Dを参照）からわずかな染色（スコア＝0）（図５のパネルDおよび図６のパネルE、Fを参照）へと減少させた。
【００２８】
腫瘍内微小血管密度の評価は、RB2/p130を過剰発現したすべての腫瘍移植片（H23およびHJC）において、CD31免疫染色後に微小血管カウント数の少なくとも81％［CI＝1.95〜10.5］の減少を示した。図５および６を参照すると、図５のパネルF、GおよびHは、それぞれHJC Δ5(+Tet)、HJC Δ5(-Tet)およびHJC #12(+Tet)対照腫瘍移植片における微小血管密度の代表的な例を示す。これとは別に、図６のパネルGおよびHは、それぞれPacまたはβ-Galを担う対照レトロウイルスで処理したH23腫瘍移植片のサンプルを示す。しかし、図５のパネルIは、HJC #12(-Tet)腫瘍移植片でRB2/p130発現を誘導すると、CD31免疫染色により調べたとき、非常に低い微小血管密度を示す。低倍率（100X）での図６パネルIは、RB2/p130を担うレトロウイルスで処理したH23腫瘍移植片において低い微小血管密度を示す。さらに、図６のパネルIは、その上側に、CD31抗体により染色された正常な神経血管形成を実証する正常なヌードマウス組織の一部を含み、このことは、CD31染色の欠如が確かに腫瘍組織での増大したpRb2/pl30発現によるものであることを立証する。図６のパネルJはパネルIのより高い倍率の視野（400X）であり、この特定のスライド上に存在する唯一の血管形成を示している。最後に、図５のパネルJおよび図６のパネルKは、使用した条件での正常胎生期マウスの肺内皮における神経血管束に対するCD31染色の特異性を示す。VEGF染色強度および腫瘍内微小血管密度に対する影響はpRb2/pl30発現に特異的なものであった。なぜなら、HJCΔ5腫瘍からテトラサイクリンを取り除くと、VEGF強度が変わらず、実際には腫瘍内微小血管密度が増加したからである。
【００２９】
VEGF染色および腫瘍内微小血管密度（IMD）に関する結果の解析から（以下の表１参照）、腫瘍組織でRB2/pl30の発現を誘導したり増大させると、わずかなVEGF染色しか生じないことが明らかになった。これはそれぞれのサンプルにおける非常に低い微小血管密度と関係していた。
【表１】
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【００３０】
腫瘍−神経膠芽細胞腫
悪性の神経膠腫は、外科手術、放射線療法、化学療法といった現在利用可能な治療法を用いても予後が極めて悪い疾患である。Rb2/p130の過剰発現に基づいた遺伝子治療法を用いることにより、VEGFを阻害して腫瘍の新血管形成を阻止し、かつ腫瘍の成長を抑制することが可能である。
【００３１】
Rb2/p130を送達するための組換えベクターは、前記の腫瘍組織サンプルに用いられるようなアデノウイルスまたはレトロウイルスベクターであってよい。組換えレトロウイルスベクターを使用することができ、遺伝子治療にレトロウイルスベクターを使用することは当技術分野で公知である。例えば、Rb2/pl30は以下の実施例で詳述されるレトロウイルスベクターにサブクローニングすることができる。神経膠芽細胞腫についての以下の説明は、Rb2/pl30送達の一例としてこの組換えベクターを用いて説明することにする。
【００３２】
腫瘍をラットのような適当なモデル動物に樹立することが可能である。例えば、GS9L（ラット神経膠芽細胞腫）細胞を用いてラットに腫瘍を樹立させることができる。Macheinら, Human Gene Therapy 10: 1117-1128に記載されるようにGS9L細胞を脳内に移植して脳内腫瘍モデルを樹立し、また、皮下に移植して皮下腫瘍モデルを樹立する。
【００３３】
組換えウイルスベクターは当技術分野で公知の様々なやり方で腫瘍細胞に送達することが可能である。例えば、樹立した腫瘍にウイルス産生細胞（ウイルスパッケージング系）を埋め込むか、またはウイルス粒子を含む産生細胞上清を投与することによって、ウイルスを送達することができる。
【００３４】
ウイルス産生細胞系の力価は1×1010〜1×1012 CFU/mlの範囲にすることが好適である。ウイルス含有上清を用いる場合は、レトロウイルスベクターの好適なウイルス力価を1×106〜1×107 Pfu/mlウイルスベクターとするか、または成長しつつある腫瘍の内皮細胞の大部分を形質導入するのに十分なものとする。Rb2/pl30ウイルスベクターは、腫瘍成長の初期段階の間に、好ましくは腫瘍細胞の接種後その腫瘍が25 mm3になった時点で、上清の形でまたはウイルス産生細胞の形で腫瘍に投与する。Rb2/pl30を送達するのにウイルス産生細胞を用いる場合は、腫瘍の細胞数に対して8倍から10倍過剰の該産生細胞を投与することが好ましい。腫瘍あたりのおよその細胞数は、腫瘍の大きさを測定して、それを予め確立された腫瘍の大きさと細胞数との相関チャートに照らし合わせることにより、決定することができる。
【００３５】
Rb2/pl30処理の前後に腫瘍の成長および腫瘍の進行に伴う症状について毎日動物を観察する。動物の腫瘍におけるRb2/pl30の発現および／またはVEGFのダウンレギュレーションをサザンブロット分析、ノーザンブロット分析、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学的手法などの公知の手法により測定する。
【００３６】
糖尿病性網膜症
本発明の別の形態では、網膜組織でのVEGF発現をダウンレギュレートするためにpRb2/pl30を網膜組織において発現させる。VEGFは糖尿病性網膜症を患うヒトを含めた動物において網膜の血管新生を引き起こすことが知られている。糖尿病性網膜症は１型糖尿病の患者に共通する微小血管合併症である。バックグラウンド網膜症から増殖性網膜症への進行は、出血による視覚障害または線維組織を伴うことによる網膜剥離へと至らせる。
【００３７】
眼の血管新生を誘発させたモデル動物での実験から、VEGFは新血管の形成に先立って数倍アップレギュレートされること、また、その作用の阻止は網膜の血管新生を抑制することが知られている。血管の透過性の増加は糖尿病性網膜症の初期段階（バックグラウンド網膜症）に特徴的な徴候であり、この段階の間にVEGFがアップレギュレートされる。糖尿病の動物およびヒトに由来する網膜消化物の標本は、血管透過性の増加を促進させる散乱した毛細管閉塞を示す。VEGFは血管透過因子である。
【００３８】
pRb2/pl30の送達および該遺伝子の網膜組織における過剰発現のために、実験的網膜症の糖尿病モデルラットを使用する。そのような網膜症の糖尿病モデルラットは当業者に公知である。例えば、4〜6週齢のWistarラットに60〜65 mg/kg（体重）のストレプトゾトシンを静脈内注射することにより慢性的な高血糖症を誘発させることができる。体重と血糖値を考慮に入れて、糖尿病を連続的にモニタリングする。
【００３９】
これらのラットが例えば体重約330 g、血糖値25 nmol/lに達したら、pRb2/pl30を1〜2週間おきに網膜組織に投与する。各ラットにつき、pRb2/pl30を発現する組換えアデノウイルスベクターを合計で1×108〜1×1010 pfu/ul、またはレトロウイルスベクターを合計で1×106〜1×107 pfu/ml、網膜腔に注入する。対照として同じ週齢の非糖尿病ラットも使用する。糖尿病ラットと対照ラットの網膜組織において、VEGFレベルを、VEGFのためのin situハイブリダイゼーション、免疫反応性、免疫組織化学的手法、ウェスタンブロット分析などの適切な手法を用いて7〜14日の一定間隔でモニタリングする。例えば、網膜組織におけるVEGFタンパク質レベルの相対的低下を確認するために、網膜タンパク質抽出物を使用することができる。網膜抽出物中のVEGFレベルが非糖尿病ラットのそれに近似するまで処置を続ける。細胞性毛細血管の定量化を糖尿病ラットで行って、それを対照と比較することもできる。こうして、pRb2/p130遺伝子治療は糖尿病性網膜症に有効な抗VEGFストラテジーを提供する。
【００４０】
脈絡膜の血管新生
別の形態では、本発明の方法を用いて脈絡膜の血管新生（CNV）を抑制することができる。CNVは加齢に伴う黄斑変性の重篤な合併症であり、脈絡膜からブルーフ膜を経て網膜下腔への新血管の成長を特徴とする。これは最終的に脈絡膜の新血管膜の形成をもたらし、かかる膜から血液と血清が漏出して視覚喪失を引き起こすことがある。目下のところ、加齢性の黄斑変性は臨床的に治療が困難である。
【００４１】
VEGFは、加齢性の黄斑変性をはじめとする様々な眼の血管形成疾患の原因物質であることが知られている。例えば、網膜色素上皮細胞でのVEGFの過剰発現はCNVを誘発させるのに十分である (Spilsburyら, Am J Pathol 1257: 135-144, 2000)。
【００４２】
網膜下腔における脈絡膜血管新生のモデル動物は当技術分野で公知である (Tobeら, J. Jpn Ophthalmol Soc 98: 837-845, 1994; Shenら, Br J Ophthamomol 82: 1062-1071, 1998)。例えば、CNVをもつラットにpRb2/pl30を発現するベクターを投与することができる。例えば、ラット網膜の色素上皮（RPE）を特異的にターゲッティングするために組換えアデノウイルスベクターを使用する。そのようなRPEを特異的にターゲッティングするベクターは公知である (Liら, PNAS, 1995, 92: 7700-7704; Rakoczyら, Aust NX J Ophthalmol, 1998, 26: S56-S58)。Rb2/pl30を含むそのような組換えアデノウイルスベクターを用いて、RPE細胞でのRb2/pl30のin vivo過剰発現がVEGF発現をダウンレギュレートして、ラットにおけるCNVを抑制するのに十分であるかを調べることができる。
【００４３】
簡単に述べると、Ad-CMV-Rb2/pl30ベクターの網膜下注入のためにCNVラットを使用する。例えば、ケタミンとキシラジンの混合物を筋内投与して、動物を麻酔する。さらに、眼を局所アメトカイン液滴で処理し、1％トロピカミドと2.5％塩酸フェニレフリン液滴を用いて瞳孔を広げる。結膜を縁の近辺で切断して強膜を露出させる。次に、この穴から、手術用顕微鏡のもとで32ゲージ針を接線方向に送入させる。2μlのAd-CMV-Rb2/pl30を、例えば4×105、4×107、または4×109 pfu/眼の用量で、網膜下腔に送達させる。網膜下注入の直後に、通常は手術用顕微鏡のもとで輪状のブレブ（液胞）が観察される。網膜下注入が成功したかは、間接眼底検査で見られるような部分的網膜剥離を観察することによっても確認することができる。針を網膜下腔に1分間保持し、穏やかに引き抜き、そして損傷部位に抗生物質軟膏を適用する。
【００４４】
VEGFレベルは、RPE細胞におけるVEGF mRNA発現により、また、これらの動物の眼に注入したAd-CMV-Rb2/pl30の組織学的分析により測定することができる。さらに、RPEにおけるRb2/pl30の過剰発現がVEGFをダウンレギュレートしたか（さもなくば、VEGF発現は血管に対して透過作用を及ぼすだろう）を調べるために、蛍光眼底血管造影を用いて血管漏出を検出することも可能である。CNVの状況下での蛍光眼底血管造影法は当技術分野でよく知られている。
【００４５】
例えば、組換えアデノウイルスを網膜下注入した5〜10日後に蛍光眼底血管造影を行って、血管漏出の領域を調べることができる。
【００４６】
こうして、このRb2/pl30は眼の標的抗血管新生遺伝子治療に理想的な系を提供する。
【００４７】
慢性関節リウマチ
別の形態においては、本発明の方法を用いて、滑液（SF）のVEGFレベルをダウンレギュレートし、慢性関節リウマチ（RA）患者における病的な新血管形成を防止する。リウマチ様SF好中球は、RAで炎症を起こした関節において主要なVEGF供給源であることが示されている (Kasamaら, Clin Exp Immunol. 2000, 121: 533-538参照)。RA疾患では、滑膜細胞が炎症性刺激に応答して増殖し、これが非常に攻撃的かつ侵襲的な組織であるリウマチ様パンヌスを形成させる。
【００４８】
滑膜炎の初期段階では、滑膜に新しい血管が発生し、これが増殖しつつあるパンヌスに栄養分、酸素、細胞を運ぶ。関節炎のモデルマウスでは、不足量のVEGFタンパク質の生産が関節炎の臨床症状の開始と結びついている。同様に、ヒトRA疾患では、VEGF発現が、慢性RA患者における疾患の重症度、それゆえに、パンヌス誘発骨侵食および関節機能低下の防止、と関係することが知られている (Paleologら, 1978)。VEGFにより促進される血管新生の滑膜における抑制は、RA治療に有望なアプローチを提供することができる。
【００４９】
RAのモデル動物は当技術分野で公知である。そのようなモデル動物のひとつがモデルKRN/NODマウスである (Kouskoffら, Cell, 1996, 87: 811-822)。トランスジェニックKRN/NODマウスは関節炎を発症する。これらの動物では、この疾患が生後25〜29日目に現れ、急性期は関節滲出液および病勢盛んな滑膜炎を特徴とし、これが27〜36日目までに全ての関節に広がる。非トランスジェニックKRN/NODマウスは良好な状態のままで、この期間内に関節炎の徴候は見られない。
【００５０】
VEGF活性のin vivoダウンレギュレーションはRb2/pl30の投与により達成される。Rb2/pl30を発現するベクターを、白血球などの滑膜細胞を形質導入するために滑膜連結部に送達する。滑膜細胞でRb2/pl30を過剰発現させると、VEGF産生がダウンレギュレートされる。ベクターは例えば滑膜への直接注入により送達される。例えば、ウイルスベクターを関節炎の発症日に1×108〜1×1010 pfu/mlの用量で投与し、その後１日おきに14日間、同量を投与する。対照動物には、Rb2/pl30を含まないベクターを同じ投与計画で投与する。疾患の持続期間中、関節炎の臨床症状について動物を評価する。対照動物では、関節炎の発生に変更が見られない。評価の一部として、動物の各足の厚みを、例えばノギスを使って測定して、関節炎を定量化する。その後、各動物について足の測定値の合計として関節炎指数を算出する。
【００５１】
治療のためにベクターを送達して、治療後に分析されうる幾つかの関節は、手根関節、足関節、肩関節、肘関節、中手指節関節、中足指節関節、および股関節である。Rb2/pl30投与後の関節炎の組織学的特徴の改善を分析する。腱の断裂、炎症性物質が入り込んだ滑膜、炎症性物質で満たされた関節腔、足根間および手根間関節の重度の破壊的損傷、パンヌスの増殖および侵入、骨または軟骨の破壊といった激烈な骨損傷、線維症および融合が関節炎の特徴の一部であり、これらは対照RA動物では見られるが、Rb2/p130で治療した動物では見られないか、見られるにしても重症度が低下している。言い換えると、Rb2/p130の投与は滑膜炎および関節破壊の程度のみならず臨床スコアを低下させ、これはパンヌス形成の抑制を示す。パンヌスに栄養分を与えて維持するには血管が必要となるので、新血管形成および滑膜量を抑制することは、ほぼ確実に血管の総数を減らすことにつながる。
【００５２】
C反応性タンパク質（CRP）によって測定される急性期応答は、RA疾患が活発に活動していることのマーカーとなり、RAの疾患活発度をモニタリングするために臨床現場で普通に用いられている。一般に、CRPレベルの上昇は疾患の進行ならびに治療による改善の欠如を示している。血清CRPレベルは滑液中の細胞結合型VEGFと遊離VEGFの両方と有意に相関することが知られており、そのためRAの疾患活発度をモニタリングするための有効な方法を提供する。さらに、血清VEGF濃度は血清CRPレベルと相関することが報告されており、また、RAの活発度はCRPの血清濃度と相関している (Haradaら, Scand J Rheumatol, 1998 27: 377-380)。それゆえ、血清VEGFレベルはRAの疾患活発度を表している。
【００５３】
したがって、本発明は、Rb2/pl30遺伝子を発現するベクターを送達することにより、血管新生因子をダウンレギュレートしてin vivoで血管新生を抑制するための方法を提供する。ベクターはウイルスベクターでも非ウイルスベクター（例えば、裸のプラスミド）でもよい。好ましい実施形態においては、全長Rb2/pl30遺伝子をウイルスベクターにサブクローニングする。組換えベクターを作製するための公知のベクター構築法に従うことにより、適切なベクターは移入された細胞での該遺伝子の十分な発現に基づいて選択することができる。ウイルスベクターの中でも、アデノウイルスおよびレトロウイルスベクターが好ましいものである。また、当業者であれば、血管新生因子のダウンレギュレーションを行って血管新生を抑制するのに十分な量のRb2/pl30を所望の組織で発現させるために、真核細胞発現プラスミドのような非ウイルスベクターを如何に使用すべきか、熟知しているだろう。
【００５４】
その後、選択された組換えベクターは、当業者に公知の方法を使って、標的組織領域にトランスフェクトされるか、または送達される。トランスフェクションおよび／または送達の仕方は、病的な新血管形成の抑制が必要な標的組織領域に応じて変化しうる。好ましい実施形態では、送達方法として、組換えベクターの標的領域への直接注入を利用する。例えば、腫瘍の場合には、患者の腫瘍組織にベクターを直接注入することができる。様々な形のリポソームへの封入、組織特異的送達、パーティクルボンバードメントなど、その他の方法も哺乳動物（例えば、ヒト）体内の標的組織領域の位置に応じて使用することができる。
【００５５】
Rb2/pl30の組織特異的送達はいくつかの方法で行うことができる。一つのアプローチは、トランスジーンの発現を制御する組織特異的プロモーターを使用することである。もう一つのアプローチは、ベクターが特定の細胞型のみを選択的にターゲッティングして形質導入を行うように、ベクター粒子それ自体を操作することである。さらに他のアプローチは、特定の組織へのミクロバブル指令遺伝子送達を使用することである。
【００５６】
当技術分野ではいくつかの組織特異的プロモーターが知られている。骨への腫瘍転移を治療するための骨組織特異的プロモーター (Steinら, Cancer, 2000, 88: 2899-2902)；前立腺癌の遺伝子治療のための前立腺特異的抗原（PSA）プロモーター (Leeら, Anticancer Research, 2000, 20: 417-422)；増殖している細胞においてのみ活動するプロモーター (Nettelbeckら, 1999, Gene Therapy 6: 1276-1281)；肝細胞癌特異的α-フェトプロテイン（AFP）プロモーター (Satoら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1998, 244: 455-462)などである。
【００５７】
超音波媒介ミクロバブル破壊はRb2/pl30の組織特異的送達のための有効な方法でありうる。この方法は当業者に公知である。例えば、先行技術として、ガス充填ミクロバブルの超音波媒介破壊を用いてトランスジーン発現を特定の組織に向けることができるという成功例が存在している (Shohetら, Circulation, 2000, 101 (22): 2554-2556参照)。
【００５８】
本発明で用いるベクターは製薬上許容される担体と共に投与することが好適である。したがって、本発明の別の形態は上記ベクターと適当な担体を含有する医薬組成物である。投与に適する担体としては、（薬理学的または生理学的に許容される）水性または非水性の無菌注射液があり、これは緩衝剤、抗生物質、および該担体を患者の体液と等張にする溶質を含んでいてもよい。担体の処方、ベクターの用量、および治療の持続期間は、新血管形成を抑制する必要性に応じて個別に決定される。当業者であれば、そのような決定を行うことができる。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例で本発明をさらに詳しく説明するが、これらはいかなる場合も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。以下の実施例は、詳細に説明する場合を除いて、当業者にはよく知られたルーチンの標準方法を用いて実施される。実施例はあくまでも例示であって、本発明を限定するものではない。ここに記載する全ての動物の治療または予防方法は好ましくは哺乳動物に適用され、最も好ましくはヒトに適用される。
【００６０】
実施例１：  RB2/pl30および対照ベクターの構築
RB2/pl30を発現するレトロウイルスおよびアデノウイルスベクター、または細菌のβ-ガラクトシダーゼ（Lac-Z）もしくはピューロマイシン耐性（Pac）遺伝子のみを発現する対照ベクターは、当技術分野ですでに記載されている (Claudioら, Cancer Res. 60: 372-82, 2000; Claudioら, Circ Res. 85: 1032-9, 1999)。レトロウイルス介在遺伝子導入研究はマウス白血病ウイルス（MLV）に基づく系を用いて実施された (Claudioら, Cancer Res. 60: 372-82, 2000)。高力価のレトロウイルスベクターを産生させるために一過性の3プラスミド発現系を使用した。この系は、MLV系のレトロウイルスベクターと、強力なCMVプロモーターから発現されかつSV40複製起点を含むプラスミドに担持されたそれらのパッケージング成分とから成っていた。これはSV40ラージT抗原を担う細胞系でのレトロウイルス遺伝子発現を増強する。ヘルパーウイルス形成の危険性を少なくするために、2つのパッケージング成分、gag-polおよびenv、を別個のプラスミドにクローニングした。env発現プラスミドは、組換え現象を介したヘルパーウイルス形成を防止するために、gag-pol発現プラスミドの領域に相同な3’ LTR配列を欠失させてある。このenvおよびgag-polプラスミドはRNA転写物をコードしており、この転写物は293T細胞（この細胞は高度にトランスフェクト可能で、ラージT抗原を含む）内での翻訳にのみ利用される基質であった。第3のプラスミドはキメラな「プロウイルス」RNAゲノムを産生した。このゲノムはビリオンへのパッケージング、逆転写、および宿主ゲノムへの組込みのための基質であった。このプラスミドは、5'MLV-LTRを駆動するCMVプロモーター、カセット（任意のもの）、SV40プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、および3'MLV-LTRを含んでおり、また、このプラスミドのバックボーンはSV40 oriをもっていた。リン酸カルシウム-DNA共沈物の除去後、培地に酪酸ナトリウム（NaB）を10 mMの最終濃度で12〜14時間添加して、ウイルス力価をほぼ10倍に増加させた。次いで新鮮な培地を加え、12時間後に上清を回収した
。NaBは外因性DNAを発現する細胞の比率を高め、かつNaBはCMVプロモーターを含めて数種の真核生物プロモーターを活性化した。
【００６１】
以下のプラスミドを作製した。すなわち、pHIT456--CMV-MLV両栄養性env-SV40ori ; pHIT123--CMV-MLVエコトロピックenv-SV40ori ; pHIT60--CMV-MLV gag-pol-SV40ori ; pHITl11--CMV-LacZ-SV40プロモーター-NEO-SV40ori ; MCSV-Pac ; MCSV-neoである。
【００６２】
MSCVプラスミドを入手し、RB2/pl30遺伝子の全長cDNAを挿入してMSCV-pRb2/pl30構築物を作製した。neoまたはPac遺伝子は、培地へのG418またはピューロマイシンの添加により、形質導入がうまくいった細胞の選択を可能にした。細菌のβ-ガラクトシダーゼ（LacZ）遺伝子を含むpHITl11プラスミド（Retro-p-gal）は、ウイルスベクターのみ（RB2/pl30とは無関係）が腫瘍抑制に及ぼす影響を調べるための対照として使用した。エコトロピック（環境栄養性）エンベロープ、プラスミドpHIT123は、安全性の問題のため、げっ歯動物腫瘍およびげっ歯動物細胞系で研究するためのウイルスを産生するために使用した。両栄養性エンベロープ、プラスミドpHIT456は、ヒト腫瘍細胞系で研究するためのウイルスを産生するために使用した。一過性の3プラスミド発現系は、高力価レトロウイルスベクターの生産のために使用し、また、培養下の腫瘍細胞系およびin vivo腫瘍の形質導入において使用した。マウス幹細胞ウイルス（MSCV）系のトランスファーベクターMSCV-Pac、MSCV-Pac-LacZ、MSCV-Pac-RB2/pl30と共にPHIT60 (CMV-MLV-gag-pol-SV40ori)およびPHIT456 (CMV-MLV-両栄養性env-SV40ori)ベクターを用いる293T/17細胞の一過性のDNA同時トランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈により行った (Claudioら, Cancer Res. 60: 372-82, 2000)。
【００６３】
トランスフェクションの48時間後にレトロウイルス上清を回収し、0.45μmフィルターを通して濾過し、以前に記載されたようにして(Claudioら, Cancer Res. 60: 372-82, 2000)タイトレーションを行い、それぞれピューロマイシン耐性遺伝子のみを含むか、または、LacZ遺伝子もしくはRB2/p130オープンリーディングフレーム（ORF）との組合せで含むレトロウイルスを得た。1 x 107感染単位/mLのウイルス力価が得られた (Claudioら, Cancer Res. 60: 372-82, 2000)。
【００６４】
アデノウイルスは、以前に記載されたようにして(Claudioら, Circ Res. 85: 1032-9, 1999)、RB2/p130遺伝子の全長ORFをpAd.CMV-Link1ベクターにサブクローニングしてAd.CMV-RB2/pl30ウイルスを形成させることにより作製した。トランスジーンを送達しないウイルス感染のみの影響を調べるための陰性対照として、pAd.CMV-Link1ベクター（Ad-CMVウイルスの生産のため）を使用した。上記ウイルスは、アデノウイルスバックボーンを有する以前に記載された構築物を、剪断アデノウイルスタイプ5で形質転換されたパッケージング細胞系293一次胚性ヒト腎細胞に同時トランスフェクションすることにより作製した。以前に記載されたようにして(Claudioら, Circ Res. 85: 1032-9, 1999)、アデノウイルスを回収し、スクリーニングして、増やした。CsClを用いる連続的平衡密度勾配により精製した後、ウイルスストックを5 x 10l2粒子/mLとなし、10％グリセロールを含む溶液中に-80℃で保存した。Ad-CMVおよびAd-CMV-RB2/pl30ウイルスについてのプラークアッセイにより、ウイルス力価は22 x 109 pfu/mLであると決定された。非許容性細胞への感染により、これらのウイルスは複製欠損であることが確認された。
【００６５】
実施例２：  in vitroでのVEGF発現に及ぼすRB2/pl30の効果
H23細胞（ヒト肺腺癌）は以前に記載されている(28)。HJCΔ5細胞、およびpRb2/pl30を誘導性テトラサイクリンプロモーターのもとで発現するそのクローンHJC#12（JC-T抗原で形質転換されたハムスター神経膠芽細胞腫）は以前に記載されている (Howardら, J Natl Cancer Inst. 90: 1451-60, 1998)。簡単に述べると、本発明者らは、改変したテトラサイクリン調節法を利用して、ヒトポリオーマウイルス誘発（JCウイルス）ハムスター脳腫瘍に由来するHJC-15c細胞系中に作製された自己調節性誘導性RB2/p130遺伝子発現系を作り出した (Howardら, J Natl Cancer Inst. 90: 1451-60, 1998)。親細胞系HJC-15cを用いて、Tetpプロモーターの制御下にテトラサイクリントランスアクチベーター（tTA）を含む対照細胞系HJCΔ5を作製した。HJCΔ5細胞を用いてHJC#12細胞系を形成させたが、これはtTAに加えてtetpプロモーターの下流にヒトRB2/pl30遺伝子の全長cDNAを含んでいる。この系では、Rb2/pl30発現が抗生物質テトラサイクリンの存在下(+)で抑制され、その不在下(-)ではタンパク質レベルで100倍へと誘導される(29)。293T/17細胞系（ヒト腎癌）(Stieglerら, J Cell Biochem Suppl. 31: 30-6, 1998)は、ロックフェラー大学の認可のもとでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から購入した。H23細胞は10％ウシ胎児血清(FBS)、2 mM 1-グルタミンを補充したダルベッコの改変イーグル培地(D-MEM)中に維持した。293T/17細胞系は10％熱不活性化FBSおよび2 mM 1-グルタミンを補充したDMEM中に維持した。HJCΔ5およびHJC#12細胞は、5％ウシ胎児血清(Sigma St. Louis, MO)および抗生物質ストレプトマイシン(lOmg/mL)とペニシリン(100単位/mL)を補充したダルベッコの改変イーグル培地(D-MEM)中で2μg/mLのテトラサイクリン(Sigma St. Louis, MO)の存在下または不在下に増殖させた。
【００６６】
実施例３：  VEGF発現および新血管形成に及ぼすRB2/p130の効果
以前に記載されたようにして(Claudioら, Cancer Research: 60-372-382, 2000, Howardら, J. Nat'1 Cancer Inst., 90: 1451-60,1998)、ヌードマウス（アイソレーターに維持した異系交配の雌NU/NU-nuBRマウス、4〜5週齢、Charles Rivers Wilmington, MAより購入）に2.5×106個のH23細胞または5×106個のHJCΔ5もしくはHJC#12細胞を皮下注入することにより腫瘍を形成させた。
【００６７】
H23注入マウスの場合は、腫瘍が15日後に20 mm3ほどの体積になった時点で、各腫瘍を、Pac遺伝子のみ、またはPac遺伝子と大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子（対照として）、またはPac遺伝子とRB2/p130オープンリーディングフレーム（ORF）を担う5×106個のレトロウイルスにより形質導入した。その際、１群３匹の動物を用いて、各腫瘍に20μLのレトロウイルス上清を直接注入した。
【００６８】
HJCヌードマウス群の場合は、注入に先立って4日間マウスをテトラサイクリンで処理した。マウスの左右の横腹（マウスにつき2個所）に沿って5×106個ずつの細胞を、イソプロパンガスで麻酔しながら、皮下注入した。１群３匹で４群の動物を使用した。２群にHJC12細胞を注入し、一方の群(12+)では注入後にテトラサイクリン処理を続けたが、他方の群(12-)は細胞の注入後にテトラサイクリンの投与を中止した。2つの対照群にはHJCΔ5細胞を注入し、一方(Δ5+)にはテトラサイクリンを投与しつづけたが、他方の対照群(Δ5-)には投与しなかった。
【００６９】
PacおよびLacZレトロウイルスにより形質導入された腫瘍、HJCΔ5（±テトラサイクリン）およびHJC#12腫瘍（＋テトラサイクリン）が300〜350 mm3の大きさになった時点で、動物をCO2で窒息死させた。切片にすべき組織をOTC (Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA)に入れ、液体窒素で凍結させ、-80℃で貯蔵するか、またはパラフィン包埋の前に4℃で中性緩衝化ホルマリン中に保存した。
【００７０】
実施例４：  RB2/p130がVEGF発現および新血管形成に及ぼす効果の分析
a)  ノーザンブロット分析
Ad-CMVまたはAd-RB2/pl30のいずれかで形質導入されたH23細胞のノーザンブロット分析を図１に示す。用いたプローブは左側に示してある。下のパネルは同様のゲルローディングのエチジウムブロミド染色を示す。RB2/pl30発現を増加させると、VEGF量が半分に減少することが認められた。H23細胞を70％の集密度にまで増殖させた後、RB2/p130 ORFを担う50 MOIのアデノウイルスまたは対照のadeno-CMVを感染させた。14時間後、培地を変えて、感染後合計48時間経過した時点で細胞を収穫した。
【００７１】
VEGFノーザンブロット分析は本質的に以前に記載されたとおりに行った(Rakら, Cancer Res. 55: 4575-80,1995)。簡単に述べると、RNAzolキット(TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX)を使って製造業者の説明書に従いRNAを抽出した。6.6Mホルムアルデヒドを含む1％アガロースゲル上でRNAを分離し、Zeta Probe (Bio-Rad, Hercules, CA)膜に移行させ、そして、VPF/VEGFタンパク質の4種すべてのアイソフォームに共通するヒトVEGF配列の200bp断片またはTSP-1のいずれかを含む32P標識cDNAプローブと65℃でハイブリダイズさせた(Rakら, Cancer Res. 55: 4575-80, 1995; Berseら, Mol. Biol. Cell. 3: 211-220, 1992)。各レーンにロードされたRNAの量は、移行前のゲルのエチジウムブロミド染色により評価した。TSP-1プローブはATCCから購入した。
【００７２】
b)  ルシフェラーゼアッセイ
HJC#12細胞におけるVEGFルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを図２に示す。VEGFおよびE2Fプロモータールシフェラーゼ構築物をHJC#12細胞に一過性にトランスフェクトし、続いてpRb2/pl30発現を誘導した(-Tet)。用いたプロモーターは上に示してある。RB2/pl30発現を増加させると、VEGFプロモーター活性が1/2〜1/3に低下することが認められた。
【００７３】
ルシフェラーゼアッセイは、HJC#12細胞に、合計3μgの、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結されたマウスVEGFプロモーター(Suら, Proc. Natl. Acad. Science USA. 96: 15115-20, 1999)または3つの連続したE2Fコンセンサス結合部位を含む人工E2Fプロモーター(Magnaghi-Jaulinら, Nature 391: 601-4, 1998)のいずれかをトランスフェクトすることにより、抗生物質テトラサイクリンの存在下(+)（非誘導状態）およびその不在下(-)（pRb2/p130タンパク質誘導状態）で行った。実験の前日にHJC#12細胞を6ウェルディッシュに60％の集密度でプレートし、以前に記載されたような標準リン酸カルシウム法によりトランスフェクションを行った(Howardら, J Natl Cancer Inst. 90: 1451-60, 1998)。それぞれの実験につき、合計1μgのCMV Lac-Z (Promega, CA)を同時トランスフェクトして正規化を行った。実験は3通り行い、2回繰り返した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼキットアッセイを用いて製造業者の説明書(Promega, Madison, WI)に従いアッセイし、ルミノメーター(Corning Costar Corp., Cambridge, MA)により測定した。
【００７４】
c)  固相酵素免疫検定法(ELISA)
VEGF ELISAは、以前に記載されたとおりに、Genentech社(San Francisco, CA)から入手した抗VEGF（希釈率1:2000）および二次抗体としての抗ウサギHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート抗体(Hamersham, Arlington Heights, IL)（希釈率1:5000）および3,3’,5’,5-テトラメチルベンジジン(TMB)液体基質系を用いて、製造業者(Sigma, Saint Louis, MO)が推奨するとおりに実施した(Dirixら, Br J Cancer. 76: 238-43, 1997)。RB2/p130を過剰発現させた後のH23およびHJC#12細胞の馴らし培地におけるVEGF固相酵素免疫検定法(ELISA)の単一の実験結果を図３に示す。レーン1〜4は対照培地；レーン5〜9は馴らし培地。レーン1〜3は陰性対照。レーン4はバックグラウンドを表す。バーは右側に表記してある。このグラフは、3回繰り返した（結果は同じ）単一の実験を表したものである。
【００７５】
d)  ウェスタンブロット
タンパク質濃度はブラッドフォード（Bradford）分析 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Melvile, New York)によりアッセイし、12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)で10μgのタンパク質を泳動し、クーマシーブルーで染色することにより確認した。ウェスタンブロッティングのために、各サンプルにつき等量の100μgのタンパク質抽出物を12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)で電気泳動にかけ、0.2μmニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell, Germany)に移した。等量のタンパク質のローディングおよび移行は、該膜をRed Ponceau (Sigma, St. Louis, MO)で染色することにより確認した。非特異的結合をブロックするために、膜をTBS-T (Tris緩衝生理食塩水＋0.5% Tween-20)および5% 粉ミルクの溶液中、4℃で一晩クエンチした。TBS-Tおよび3% 粉ミルクの溶液で1:200に希釈した一次ウサギポリクローナル抗VEGF (Genentech, San Francisco, CA)または抗VEGF (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)のいずれかを個別に使用してブロットをインキュベートした。TBS-Tの溶液で数回洗浄してから、ブロットを、1:20,000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(Amersham, Life Science)を含むTBS-Tの溶液と共に室温で１時間インキュベートした。その後、ブロットをTBS-Tで数回洗浄し、ECL (ケモルミネッセンスキット、NEN, Boston, MA)と反応させて、X線フィルムに露出させた。
【００７６】
H23およびHJC#12細胞においてpRb2/pl30を過剰発現させたときのVEGFタンパク質存在量のウェスタンブロット分析を図４に示す。細胞系を最上部に示してある。H23細胞はRB2/pl30を担うアデノウイルスベクター(pRb2)または空のアデノウイルスベクター(CMV)のいずれかで形質導入した。HJC#12細胞は誘導(-Tet)または非誘導(+Tet)条件下で増殖させた。RB2/pl30発現を増大させると、VEGFタンパク質の存在量が1/3に減少することが認められた。タンパク質濃度および等量のローディングを実証するために、全溶解物の10μgタンパク質のクーマシーブルー染色を示す。
【００７７】
e)  抗体、免疫組織化学的分析、および腫瘍内微小血管密度(IMD)の評価
ウサギポリクローナル抗VEGFはGenentech社(San Francisco, CA)から入手した。精製した抗マウスCD31 (PECAM-1)、クローンMEC 13.3はPharmingen(San Diego, CA)から購入した。免疫組織化学的分析のため、製造業者の説明書に従い抗VEGFは1:500の希釈率で、抗CD31は1:50の希釈率で使用した。
【００７８】
VEGF染色強度は0から3のスケールで等級づけした。0は検出不能な染色、1はわずかな染色、2は中程度の広がった染色、3は大量の広がった染色である。この等級づけスケールは従来技術で知られていた方法(Takahashiら, Cancer Res. 55: 3964-8, 1995)を改変したものである。
【００７９】
腫瘍内微小血管は、同じ腫瘍移植片の一連のホルマリン固定・パラフィン包埋切片を抗CD31で免疫染色することにより際立たせた。IMD（腫瘍内微小血管密度）は以前に記載されたように測定した(Vermeulenら, Eur J Cancer. 32A: 2474-84, 1996)。簡単に述べると、CD31染色切片の最も強い血管新生の領域（ホットスポット）において倍率400 Xで個々の微小血管をカウントした。IMDは微小血管/mm2として表した。
【００８０】
ヌードマウスで成長させたHJCΔ5およびHJC#12腫瘍移植片のVEGFとCD31の免疫組織化学的分析を図５に示す。A) HJCΔ5(+Tet)腫瘍［対照］における高いVEGF発現(100X) ; B) HJCΔ5(-Tet)腫瘍［対照］における高いVEGF発現(100X) ; C) HJC#12(+Tet, pRb2/pl30非誘導)腫瘍[対照]における高いVEGF発現(100X) ; D) HJC#12(-Tet, pRb2/pl30誘導)腫瘍における低いVEGF発現(1OOX) ; E) ヒト大腸癌におけるVEGF発現: 下左端はこの腫瘍における高いVEGF発現を示し、一方上右端は正常な大腸組織における低いVEGF発現を示す; F) HJCΔ5(+Tet)腫瘍［対照］のCD31免疫染色 ; G) HJCΔ5(-Tet)腫瘍［対照］のCD31免疫染色(400X) ; H) HJC#12(+Tet, pRb2/pl30非誘導)腫瘍[対照]のCD31免疫染色(400X) ; I) HJC#12(-Tet, pRb2/pl30誘導)腫瘍のCD31免疫染色(400X) ; J) 正常なマウス肺のCD31免疫染色(400X)。
【００８１】
ヌードマウスで成長させたH23腫瘍移植片のVEGFとCD31の免疫組織化学的分析を図６に示す。A) 対照レトロウイルス(Pac)により形質導入したH23腫瘍における高いVEGF発現(100X) ; B) パネルAの高倍率視野(400X) ; C) LacZを担うレトロウイルスにより形質導入したH23腫瘍における高いVEGF発現(100X) ; D) パネルBの高倍率視野(400X) ; E) RB2/pl30を担うレトロウイルスにより形質導入したH23腫瘍における低いVEGF発現。このパネルの上側は正常なマウス神経血管形成を示す(100X) ; F) VEGF免疫染色の欠如を示すパネルEの高倍率視野(400X); G) 対照レトロウイルス(Pac)により形質導入したH23腫瘍のCD31免疫染色(Pac)(400X) ; H) LacZを担うレトロウイルスにより形質導入したH23腫瘍のCD31免疫染色(400X) ; I) RB2/pl30を担うレトロウイルスにより形質導入したH23腫瘍のCD31免疫染色(100X)。このパネルの上側はCD31について染色された正常なマウス神経血管形成を示す ; J) スライドに見られる唯一の血管を示すパネルIの高倍率視野(400X) ; K) 正常なマウス肺のCD31免疫染色(400X)。
【００８２】
本明細書に引用した全ての刊行物および文献（特許出願を含むが、これに限らない）は、各刊行物または文献が明確かつ個別に本明細書中に示されているかのように、その全体を参考として本明細書に組み入れるものとする。本発明を特定の実施形態により説明してきたが、これらの方法および組成物を変更することができ、また、本発明をここに具体的に記載したものとは違ったやり方で実施できることが当業者には理解されよう。したがって、本発明は、特許請求の範囲により規定された本発明の精神および範囲に包含されるあらゆる修飾・変更を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、Ad-CMVまたはAd-RB2/pl30のいずれかで形質導入したH23細胞のノーザンブロット分析を示す。
【図２】図２は、HJC#12細胞におけるVEGFルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。VEGFおよびE2Fプロモータールシフェラーゼ構築物をHJC#12細胞に一過性にトランスフェクトし、続いてpRb2/pl30発現を誘導した(-Tet)。用いたプロモーターは最上部に示してある。
【図３】図３は、RB2/p130を過剰発現させた後のH23およびHJC#12細胞の馴らし培地におけるVEGF固相酵素免疫検定法(ELISA)の単一の実験を示すグラフである。
【図４】図４は、H23およびHJC#12細胞においてpRb2/pl30を過剰発現させたときのVEGFタンパク質存在量のウェスタンブロット分析を示す。細胞系を最上部に示してある。
【図５】図５は、ヌードマウスで成長させたHJCΔ5およびHJC#12腫瘍移植片のVEGFとCD31の免疫組織化学的分析を示す。
【図６】図６は、ヌードマウスで成長させたH23腫瘍移植片のVEGFとCD31の免疫組織化学的分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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