(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドに対して防御性免疫応答を誘発し得る、ペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドの化合物であって、ここで該化合物はｓｃＦｖフラグメントを含み、該ｓｃＦｖフラグメントの構造がＢ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドの抗原決定基を模倣する、化合物。
【請求項２】
前記免疫応答が、前記化合物に結合する抗体の生成を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記免疫応答が、前記化合物に結合するＴ細胞の活性化を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４】
患者の血流への前記化合物の送達を促進するのに有効であるか、または該化合物に対する免疫応答を促進するキャリアタンパク質に連結された、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
薬学的に受容可能な賦形剤と合わせられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
前記賦形剤が、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、局所的投与または静脈内投与に適切である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項５または６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記アジュバントがミョウバンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記アジュバントが水中油型エマルジョンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる疾患の制御における防御的免疫原としての使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物または請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬品としての、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物または請求項５〜９のいずれかに１項に記載の組成物の、使用。
【請求項１２】
Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる疾患の予防または処置のための医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物または請求項５〜９のいずれかに１項に記載の組成物の、使用。
【請求項１３】
ワクチンまたはワクチン成分としての、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物または請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物の、使用。
【請求項１４】
ワクチンまたはワクチン成分としての使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物または請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物または請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物を含む、ワクチン。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を選択する方法であって、以下の工程：
ａ）Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドに対する抗体で非ヒト哺乳動物を免疫する工程；
ｂ）免疫した哺乳動物から脾臓細胞を取り出し、そして該抗体に結合する細胞を選択する工程；
ｃ）選択した脾臓細胞からｍＲＮＡ種を分離し、そして該ｍＲＮＡ種によってコードされるタンパク質を発現するファージラブラリーを作製する工程；および
ｄ）目的の化合物を発現する組換えファージを選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる疾患の予防または処置のための組成物であって、ここで、該組成物は、有効量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含むか、または請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物である、組成物。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物をコードする核酸分子。
【請求項１９】
ＤＮＡを含む、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
請求項１８または１９のいずれかに記載の核酸分子を含むクローニングベクターまたは発現ベクター。
【請求項２１】
ウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項１８もしくは１９のいずれかに記載の核酸または請求項２０もしくは２１のいずれかに記載のベクターで形質転換したか、あるいはトランスフェクトした、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１８または１９のいずれかに記載の核酸分子によって、あるいは請求項２０または２１のいずれかに記載のベクターによって形質転換された、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を調製する方法であって、宿主細胞中で請求項２０または２１の記載のベクターを発現させる工程および前記タンパク質が発現される条件下で該宿主細胞を培養する工程、ならびにこのように発現された該タンパク質を回収する工程、を包含する方法。
【請求項２５】
Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドに対して防御性免疫応答を誘発し得る、ｓｃＦｖフラグメントを選択する方法であって、以下の工程：
ａ）Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドに対する抗体で非ヒト哺乳動物を免疫する工程；
ｂ）免疫した哺乳動物から脾臓細胞を取り出し、そして該抗体に結合する細胞を選択する工程；
ｃ）選択した脾臓細胞からｍＲＮＡ種を分離し、そして該ｍＲＮＡ種によってコードされるタンパク質を発現するファージラブラリーを作製する工程；および
ｄ）該ｓｃＦｖフラグメントを発現する組換えファージを選択する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｂ群Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＢＳ）、特にＩＩＩ型ＧＢＳの莢膜ポリサッカライドに対する防御的免疫応答を誘起し得る化合物に関する。そのような化合物は、そのような化合物は、これら病原体によって生じる疾患に対して効果的なワクチンの開発において有用である。
【０００２】
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）は、新生児における敗血症および髄膜炎、ならびに糖尿病、肝硬変および固形腫瘍に罹患しているような感受性の成人患者における敗血症および髄膜炎の主要な原因であると認識されている。抗体の使用は、症例の致死率に劇的な影響を与えたが、感染の発病率は、ほとんど変化しなかった。実際、先進国においてでさえ、死亡の発生率および恒久的障害は、適切な治療の適用にもかかわらず、高いままである。
【０００３】
ＧＢＳは、生物によって保有される特定の型の莢膜ポリサッカライド（ＣＨＯ）に基づく血清型に分類される。莢膜ポリサッカライドは、抗食細胞特性を有し、ＧＢＳの主要なビルレンス因子であると考えられる（Ｂａｋｅｒら、１９９５；Ｒｕｂｅｎｓら、１９８７）。ＩＩＩ型莢膜ＧＢＳは、新生児感染の主要な原因であり、そして髄膜炎症例の約９０％の原因である（Ｂａｋｅｒら、１９９５）。
【０００４】
型抗原の組み合わせを用いての受胎した女性の免疫が、胎盤の障壁を通る特定の抗体が新生児感染を予防し得るという理論的根拠とともに、新生児疾患の予防のための戦略として提唱されている（Ｂａｋｅｒら、１９８１）。実際に、新生児のＧＢＳ感染と、型特異的ＣＨＯに対する低レベルの母性抗体との間の有意な相関が示されている（Ｂａｋｅｒら、１９８１；Ｂａｋｅｒら、１９７６）。
【０００５】
ＧＢＳによって生じる疾患の発症頻度を制御する意図において、ポリサッカライドワクチンが開発されている。莢膜ポリサッカライドワクチンにともなう主要な問題は、その劣っている免疫原性である。このことは、ポリサッカライド抗原に対する抗体によって使用される唯一の抗体応答である、Ｔ細胞非依存性（ＴＩ）型の免疫反応に由来すると考えられている。この型の応答は、Ｔ細胞に対する抗原提示のためのＭＨＣクラスＩＩ拘束分子に関与しない；結果として、Ｔ細胞の補助が妨げられる。
【０００６】
ポリサッカライド抗原の免疫原性を増強する広範に受け入れられている方法は、タンパク質とポリサッカライド抗原との結合による。かなりの程度、このアプローチは、ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染の予防において成功している（Ａｌａ’ＡｌｄｅｅｎおよびＨｏｒｍａｅｃｈｅ、１９９５）。破傷風トキソイド（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、１９９４；Ｋａｓｐｅｒら、１９９６；Ｂａｋｅｒら、１９９６）と結合した型ＣＨＯ、またはＧＢＳタンパク質（Ｍａｄｏｆｆら、１９９２；Ｌａｒｓｏｎら、１９９６）と結合した型ＣＨＯは、ＧＢＳ疾患を予防するための可能性のあるワクチンとして、現在評価されている。
【０００７】
糖鎖抗原に対する効果的かつ追加免疫可能な抗体応答を得るための代替的な戦略は、関連する糖エピトープのコンフォメーションを模倣するタンパク質分子の開発に関連する。このアプローチの利点は、その化学的性質によって、タンパク質が、抗原特異的方法においてＴ細胞補助を刺激する内在的能力を有するという点である。この戦略は、致死的なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対するＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫防御する代理ワクチンとして成功して使用された、キャリアタンパク質と結合したモノクローナル抗イデオタイプ抗体（ｍＡｂ）の開発を生じた（ＭｃＮａｍａｒａら、１９８４）。Ｋ１３  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｔｅｉｎら、１９８４）莢膜抗原、およびＣ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら、１９８８）莢膜抗原を模倣するモノクローナル抗体もまた記載されている。
【０００８】
しかし、これらの報告は、莢膜ポリサッカライドの抗原決定基をある程度模倣する化合物が生成され得るという概念を説明するが、現在まで開発された特定の化合物（マウスモノクローナル抗体）が、ヒトワクチンの候補であるようではなく、そしてしばしば長時間持続する防御免疫を付与することにおいて効果的ではないことが、当該分野において広く理解されている。さらに、ＧＢＳに対して効果的なそのような化合物は、今日まで生成されていない。
【０００９】
従って、ＧＢＳによって生じる疾患と戦うのに効果的な新規の改善されたワクチン戦略の開発について、および、特に、ワクチンとして使用した場合に、ＧＢＳに対する防御的免疫応答を誘起し得る化合物についての大きな必要性が残っている。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明に従って、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの莢膜ポリサッカライドに対する防御的免疫応答を誘発し得るペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド化合物が提供される。そのような化合物は、免疫原性化合物として有用であり、ＧＢＳによって生じる疾患に対して防御的なワクチンの成分としてもまた有用であり得る。
【００１１】
好ましくは、この化合物は、ＧＢＳの主要なビルレンス決定基であると広く認識されているＢ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドに対する防御的免疫応答を誘発し得る。新生児防御は、これらの化合物で母親を免疫することによって得られ得る。
【００１２】
用語「防御的免疫応答」によって、動物またはヒト患者において、本発明の化合物に対して指向される有益な体液性応答および／または細胞性応答の発生が意味される。体液性応答は、抗体媒介性であり、そして本発明の化合物に対する親和性を有する抗体の生成を包含する。このことは、本発明の化合物で免疫された個体へのＧＢＳ侵入に際して、個体の免疫系はこの化合物の免疫記憶を有し、従って、ＧＢＳ生物に対する即時の体液性攻撃を開始し得ることを、意味する。
【００１３】
細胞性応答は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子と会合した抗原性エピトープの提示によって誘発される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞を活性化する。
【００１４】
本発明の化合物が免疫応答の誘発において効果的であり得る種としては、全ての哺乳動物、特にヒトが挙げられる。ほとんどの場合、化合物がヒトにおける免疫応答の誘発において活性であることが好ましい。ＧＢＳによって生じる疾患からの防御が大きく必要とされるヒトの集団は、新生児である。しかし、成人集団の種々の部門（特に、糖尿病、肝硬変のような衰弱する慢性疾患に罹患しているる集団、または固形腫瘍を保有する集団）もまた、危険性を有する。
【００１５】
新生児を防御するために効果的な戦略は、母親において、胎盤の障壁を通過し得る抗体の誘発を包含する。そのような抗体は、ＩｇＧクラスに属し、そしてＢおよびＴリンパ球の両方を刺激し得る抗原（Ｔ依存性抗原）に対する応答においてのみ、産生される。本発明に従って提供される化合物は、特異的ＩｇＧの産生を刺激する能力を有する。さらに、これらの化合物を用いる母性免疫は、新生児をＧＢＳ疾患から防御するのに効果的である。
【００１６】
ペプチドとは、ともに共有結合した３と１０との間のアミノ酸の化合物を意味する。オリゴペプチドは、１０と３０との間の連結したアミノ酸を含み、一方、ポリペプチドは、３０より多いアミノ酸を含む。
【００１７】
本発明に従うペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド化合物の構造は、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの莢膜ポリサッカライドの免疫学的決定基を模倣する、エピトープを、その折り畳まれた３次元構造中に含有するようなものである。好ましくは、このエピトープは、Ｂ群ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドの免疫学的決定基を模倣する。
【００１８】
ペプチドおよびオリゴペプチドは、その小さなサイズに起因して、免疫原性化合物としての使用のための理想的な候補である；これらの分子は、抗原エピトープを模倣するのに十分大きく（代表的に５と１２との間のアミノ酸によって決定される）、なお、免疫グロブリンのようなより大きな分子を超える有利な薬物動態的特性を有するのに十分小さい。その化学的性質によって、これらの分子は、抗原特異的様式においてＴ細胞補助を刺激する内在的能力（例えば、ポリサッカライドによっては保有されない特性）を有する。このことは、ポリサッカライドワクチンの使用が、莢膜病原体によって生じる疾患の処置において固有の欠点を有する１つの理由である。
【００１９】
本発明に従うポリペプチド化合物もまた、これらの化合物を特定の適用に適合させる有利な性質を有し得る。これら分子の特性は、所望されるように正確に適合され得る（例えば、免疫系の種々のエフェクターを補充させるために、Ｆｃドメインを分子上に移植することにより）。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様に従って、ＧＢＳの莢膜ポリサッカライドに対する所望の免疫応答を誘起することにおいて効果的なポリペプチド化合物は、ｓｃＦｖフラグメントを含有し得る。これらの分子は、小さく、従って、有利な薬物動態学的特性を有する。これらの小さなサイズはまた、抗ｓｃＦｖ抗体の産生が最小化されることを意味する。抗ｓｃＦｖ応答の生成はまた、免疫される被験体動物と同一種由来の分子からｓｃＦｖを構築することにより、最小化され得る。最も好ましくは、本発明の化合物は、ｓｃＦｖ  Ｃ１０（抗ＩＩＩ型ＣＨＯ  Ｐ９Ｄ８  ｍＡｂを使用するｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーの選択によって生成された）を含有する（Ｔｅｔｉら、１９９２）。
【００２１】
本発明のペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド化合物は、キャリアタンパク質と融合され得る。キャリアタンパク質は、キャリア−抗原結合体が導入される生物の免疫系により、それに結合される抗原に対して指向する抗体の形成を誘導する抗原性ポリペプチド実体である。キャリアタンパク質の使用の必要性は、多くの短いエピトープは防御性であるが、これらはしばしば免疫原性に乏しいという事実に由来する。このことは、新規の効果的なワクチンの生成におけるこれらエピトープの有用性を消し去る。免疫原性キャリアタンパク質と非免疫原性分子との結合によって、キャリアタンパク質の高度の免疫原性を、結合分子に付与することが可能である。そのような結合分子は、結合分子の非免疫原性部分に対する免疫応答の生成を刺激し、従って、そうしなければ防御的免疫が生成され得なかった病原体に対して防御するワクチンにおいて効果的に使用される。
【００２２】
適切なキャリアタンパク質は、高度に免疫原性な破傷風トキソイドタンパク質、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｉｔｅ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コアタンパク質、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅマトリックスタンパク質、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ赤血球凝集素、ジフテリアトキソイド、非毒性ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７、Ｂ群Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、肺炎球菌毒素ニューモライシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ由来の熱ショックタンパク質のような従来使用されたキャリアを包含する。他の適切なキャリアタンパク質は、当業者に公知である。ＣＤ４＋  Ｔh細胞エピトープを含有するが、Ｔ細胞サプレッサー機能を含まない改善されたキャリアタンパク質が、近年開発された；これらのキャリアもまた、本発明の化合物との結合体における使用のために適切である。
【００２３】
キャリアタンパク質に加え、本発明の化合物は、他のペプチド、またはタンパク質フラグメント（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような免疫調節性サイトカイン由来のエピトープ）を含み得る。無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ペプチド（Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、１９８９）、いわゆる「ユニバーサル」ペプチド（Ｋｕｍａｒら、１９９２）、クラスターペプチド（Ａｈｌｅｒｓら、１９９３）、またはＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方を含有するペプチド（Ｌｅｔｔら、１９９４）もまた、必要とされる場合、免疫系の種々のエフェクター系を動員するために使用され得る。
【００２４】
本発明のペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド化合物が、当業者に明らかなように、任意の適切な手段によって生成され得る。ペプチドの場合、コンビナトリアルペプチドライブラリーが、最も適切である；所望の結合特性を提示するペプチド分子が、ＧＢＳ莢膜ポリサッカライド、好ましくはＩＩＩ型莢膜ポリサッカライドに特異的な抗体に結合する分子（例えば、抗ＩＩＩ型  ＣＨＯ  ｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８）について選択する選択レジメを介して単離され得る。
【００２５】
ペプチドライブラリーの生成の１つの方法は、縮重オリゴヌクレオチドライブラリーを使用する。この方法は、コードする核酸の引き続いての分析を可能にし、従って、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）についての直接の配列情報を与える（例えば、Ｃｕｌｌら、１９９２；Ｍａｔｔｅａｋｉｓら、１９９４を参照のこと）。
【００２６】
ファージディスプレー技術もまた、提示されたペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドの選択を可能にするビヒクルを提供し、表現型と遺伝子型との間の関連を同時に提供し、その結果コードする核酸が同定および分析され得る（総説について、ＣｌａｃｋｓｏｎおよびＷｅｌｌｓ（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １２：１７３〜１８４を参照のこと）。繊維状ファージ粒子は、その外側にタンパク質を、およびその内部にそのタンパク質をコードする核酸を有する遺伝子ディスプレーパッケージとして作用する。この技術によって可能となるライブラリーのサイズの実際の制限は、１０7〜１０11改変体のオーダーであり、その結果、大多数の異なる化合物の生成を可能にする。この技術はまた、選択の複数回の実行を可能にし、その結果、単離された分子の親和性を向上させる。
【００２７】
本発明に従うペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド化合物の好ましい生成方法は、ファージディスプレーライブラリーにおける候補化合物の選択を介する。
【００２８】
ファージディスプレーライブラリーからの核酸または遺伝子の選択は、ほとんどの場合において、大多数の改変体核酸または遺伝子のスクリーニングを必要とする。ファージディスプレー技術とともに使用するための核酸または遺伝子のライブラリーは、多数の方法によって生成され得る。例えば、天然に生じる遺伝子のプールが、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡよりクローン化され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。免疫ドナーまたは非免疫ドナーからの抗体遺伝子のＰＣＲ増幅レパートリーより作製されるファージ抗体ライブラリーは、機能的抗体フラグメントの非常に効果的な供給源であることが証明されている（Ｗｉｎｔｅｒら、（１９９４）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２、４３３〜５５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５、６２〜７０）。
【００２９】
好ましくは、本発明の化合物は、抗ＧＢＳ抗体で免疫された動物の脾臓リンパ球のｍＲＮＡに由来する核酸プールを含有するファージディスプレーライブラリー中に生成される。好ましくは、動物の免疫に使用する抗体は、ＧＢＳのＩＩＩ型ＣＨＯに対して指向する。最も好ましくは、使用される抗体は、Ｐ９Ｄ８抗体である。
【００３０】
遺伝子のライブラリーもまた、遺伝子の全部もしくは一部、または遺伝子のプールをコードすることによってか、あるいはランダム化合成オリゴヌクレオチドまたは予想された合成オリゴヌクレオチドを使用することによって、作製され得る。ライブラリーはまた、インビボにおいて種々の技術によって（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＤ５のような細菌の、いわゆる「ミューテーター株」の使用を含む）、遺伝子中または遺伝子のプール中にランダムに変異を導入することにより、作製され得る（Ｌｉａｏら、１９８６）。Ｂリンパ球の抗体過剰変異系もまた、使用され得る（Ｙｅｌａｍｏｓら、１９９５）。
【００３１】
ランダムな変異もまた、インビボおよびインビトロの両方において、化学的変異誘発因子および電離線またはＵＶ照射（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇら、１９９５を参照のこと）によってか、または変異原性塩基アナログの取り込みによって（Ｚａｃｃｏｌｏら、１９９６）導入され得る。変異はまた、インビトロでの重合化の間に（例えば、エラーを生じやすいポリメラーゼの使用により（Ｌｅｕｎｇら、１９８９））、遺伝子中に導入され得る。さらに、インビボ（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉら、１９９４を参照のこと）またはインビトロ（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４）のいずれかでの相同組換えの使用により、多様性が導入され得る。
【００３２】
一旦、本発明のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド化合物が単離されると、この化合物は、当業者に明らかなように、任意の適切な手段によって、大量に産生され得る。構築の２つの好ましい方法は、直接合成、および組換えタンパク質による産生である。配列が既知の短いペプチドの場合、好ましい産生方法は、直接合成であり得る。しかし、ほとんどの場合、好ましい方法は、組換え手段によって（コードする核酸分子からの発現による）である。組換え発現は、化合物の産生が高価でなく、安全であり、容易であり、そしてその後の除去を必要とし得る毒性化合物の使用を含まないという利点を有する。
【００３３】
組換え形態で発現される場合、本発明の化合物は、宿主細胞中のコード核酸からの発現によって生成される。種々の異なる発現系（例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母を用いて使用される発現系）が使用され得る。好ましくは、細菌宿主は、細菌を操作および増殖させ得る容易さのために、組換えタンパク質の産生に使用される。選り抜きの細菌宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００３４】
哺乳動物発現系は、当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し得かつ下流（３’）のコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの翻訳を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域を有し、この領域は、通常、コード配列の５’末端に近接して配置され、そしてＴＡＴＡボックスは、通常、転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に位置される。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを指向して正しい部位でのＲＮＡ合成を開始すると考えられる。哺乳動物プロモーターはまた、通常、ＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００ｂｐ内に位置する、上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写を開始する速度を決定し、そしていずれかの配向で作用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｕｎａｌ、第２版）。
【００３５】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば、高度に発現され、そして広範な宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、非ウイルス遺伝子由来の配列（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）はまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成的か、またはホルモン応答性細胞において、グルココルチコイドで誘導され得るプロモーターに依存して調節される（誘導性）かのいずれかであり得る。
【００３６】
上記のプロモーターエレメントと組み合せた、エンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常、発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターと連結された場合、通常のＲＮＡ開始部位で開始する合成を伴う、転写を１０００倍まで刺激し得る調節性ＤＮＡ配列である。エンハンサーはまた、正常の配向または反転した配向（ｆｌｉｐｐｅｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）のいずれかにおいて、転写開始部位から上流または下流に、または、プロモーターから１０００を超えるヌクレオチドの距離で、配置された場合、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、特に有用であり得る。なぜなら、このエンハンサーエレメントは、通常、より広範な宿主範囲を有するからである。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｉｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）ならびにラウス肉腫ウイルス（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）の長末端反復（ＬＴＲ）およびヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）に由来するエンハンサー／プロモーターが挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは、調節可能であり、そしてインデューサー（例えば、ホルモンまたは金属イオン）の存在下でのみ活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７）。
【００３７】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において、細胞内に発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接的に連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端の初めのアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、このＮ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００３８】
あるいは、外来タンパク質はまた、哺乳動物細胞において、外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地中へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダー配列と外来遺伝子との間にコードされるプロセス部位が存在する。このリーダー配列フラグメントは、通常、細胞からタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。アデノウイルスの三つのリーダーは、哺乳動物において、外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。通常、哺乳動物細胞により認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３’ｅｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写のターミネーター／ポリアデニル化のシグナルの例としては、ＳＶ４０由来の転写のターミネーター／ポリアデニル化のシグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００３９】
いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配列としても呼ばれる）が存在する場合に、より効率的に発現され得る。しかし、幾つかのｃＤＮＡは、スプライシングシグナル（スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位とも呼ばれる）を欠くベクターから効率的に発現されている（例えば、ＧｏｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：６２０を参照のこと）。イントロンは、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含むコード配列内に介在する非コード配列である。イントロンは、一次転写物のポリアデニル化に続く、「スプライシング」と呼ばれるプロセスにより除去される（Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐａｄｇｅｔｔら（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９；ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８８）「ＲＮＡスプライシング」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編））。
【００４０】
通常、上記の成分（プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む）は、発現構築物へと組み立てられる。エンハンサー、機能的なスプライスのドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列はまた、所望される場合、発現構築物に含まれ得る。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば、哺乳動物細胞または細菌）中で安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中で維持される。哺乳動物複製系としては、複製するためにトランス作用性因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、パポバウイルスの複製系（例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５））またはポリオーマウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数を複製する。哺乳動物のレプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、２つの複製系を有し得、それによって例えば、哺乳動物細胞中においては発現のために、および原核生物宿主においてはクローニングおよび増幅のためにレプリコンが維持されることを可能にする。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００４１】
使用される形質転換の手順は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入するための方法は、当該分野で公知であり、そしてデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中でのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そしてそれらには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔（ｂａｂｙ）ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、および多数の他の細胞株を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。
【００４２】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクター中に挿入され得、そしてそのベクター内のコントロールエレメントに作動可能に連結される。ベクター構築は、当該分野で公知の技術を用いる。一般に、発現系の構成としては、バキュロウイルスゲノムのフラグメントと、異種遺伝子または発現されるべき遺伝子の挿入のための都合のよい制限部位との両方を含む、移入ベクター（通常は、細菌プラスミド）；移入ベクター中のバキュロウイルス特異的フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、異種遺伝子のバキュロウイルスゲノム中への相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地が挙げられる。
【００４３】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を移入ベクター中に挿入した後に、このベクターおよび野生型ウイルスゲノムは、昆虫宿主細胞中にトランスフェクトされ、ここで、このベクターおよびウイルスゲノムは、組換えられる。このパッケージングされた組換えウイルスは、発現され、そして組換え体のプラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）からキット形態で市販されている。これらの技術は、一般に、当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ第１５５５号（１９８７）（本明細書中以降、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ）に十分に記載されている。
【００４４】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノム中に挿入する前に、プロモーター、リーダー（所望される場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の成分は、通常、中間体のトランス配置性（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）構築物（移入ベクター）へと構築される。この構築物は、単一の遺伝子、ならびに作動可能に連結された調節エレメント；複数の遺伝子（それぞれ、調節エレメントに作動可能に連結されたセットを所有する）；または同じセットの調節エレメントによって調節される複数の遺伝子を含み得る。中間体のトランス配置性構築物は、しばしば、宿主（例えば、細菌）中で安定な維持を可能にする染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン中で維持される。このレプリコンは、複製系を有し、それによってレプリコンが適切な宿主中で、クローニングおよび増幅のために維持されることを可能にする。
【００４５】
現在、ＡｃＮＰＶ中に外来遺伝子を導入するために最も一般的に使用される移入ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当該分野で公知の多数の他のベクターもまた、設計されている。これらとしては、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴへと変更しており、かつそのＡＴＴから３２塩基対の下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入している；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８８）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。
【００４６】
プラスミドはまた、通常、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７）ならびにＥ．ｃｏｌｉ中での選択および増殖のための原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点を含む。
【００４７】
バキュロウイルス移入ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合し得、そしてｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（５’から３’）の転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス移入ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第２のドメイン（これは、存在する場合、通常構造遺伝子から離れている）を有し得る。発現は、調節されるかまたは構成的のいずれかであり得る。
【００４８】
ウイルス感染周期の後期で豊富に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；欧州特許公開番号１２７  ８３９および１５５  ４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
【００４９】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌された昆虫タンパク質またはバキュロウイルスタンパク質に対する遺伝子由来であり得る（例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ、７３：４０９））。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）についてのシグナルは、昆虫細胞により認識されるようであり、そして分泌および核の蓄積に必要とされるシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているようなので、ヒトγ−インターフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子に由来するリーダーのような、非昆虫細胞起源のリーダーはまた、昆虫における分泌を提供するために使用され得る。
【００５０】
組換えポリペプチドまたは組換えポリタンパク質は、細胞内で発現され得、または適当な調節配列と共に発現される場合、これらは、分泌され得る。非融合外来タンパク質の良好な細胞内発現は、通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子を必要とする。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションにより成熟タンパク質から切断され得る。
【００５１】
あるいは、天然で分泌されない組換えポリタンパク質または組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、昆虫細胞から分泌され得る。このリーダー配列フラグメントは、通常、小胞体中へのタンパク質のトランスロケーションを指向する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【００５２】
ＤＮＡ配列および／またはタンパク質の発現産物の前駆体をコードする遺伝子の挿入の後に、昆虫細胞宿主は、移入ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡで同時形質転換される（通常は、同時トランスフェクションによる）。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常、バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂ部分を含む。バキュロウイルス中の所望部位に異種ＤＮＡを導入するための方法は、当該分野において公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ前出；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同二重交差組換えによって、遺伝子（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中であり得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子中に操作された制限酵素部位中であり得る。Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ４：９１．ＤＮＡ配列は、発現ベクターにおいてポリヘドリン遺伝子の代わりにクローニングされた場合、ポリヘドリン特異的配列の５’および３’の両方に隣接され、そしてポリヘドリンプロモーターの下流に位置される。
【００５３】
続いて、新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターが、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージングされる。相同組換えは、低頻度（約１％〜約５％の間）で生じ；従って、同時トランスフェクションの後に産生されたウイルスの大部分は、なお野生型である。従って、組換えウイルスを同定するための方法が必要とされる。この発現系の利点は、組換えウイルスが区別されることを可能にする視覚的なスクリーニングである。ネイティブなウイルスにより産生されるポリヘドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期に、感染した細胞の核において非常に高レベルで産生される。蓄積したポリヘドリンタンパク質は、埋包された粒子をも含む封入体を形成する。これらの封入体（大きさが１５  ｍまで）は、非常に屈折性であり、光学顕微鏡下で容易に観察される明るく輝く外観を与える。組換えウイルスで感染された細胞は、封入体を欠く。組換えウイルスを野生型ウイルスから区別するために、トランスフェクションの上清は、当業者に公知の技術によって、単層の昆虫細胞上へとプラーク形成（ｐｌａｑｕｅｄ）される。すなわち、このプラークは、封入体の存在（野生型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）について、光学顕微鏡下でスクリーニングされる。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら、編）１６．８（補遺１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００５４】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、幾つかの昆虫細胞中への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、とりわけ；Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉについて開発されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および一般には、Ｆｒａｓｅｒら（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｏｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこと）。
【００５５】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系において、異種ポリペプチドの直接発現および融合発現について両方で市販されている；細胞培養技術は、一般に、当業者に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ前出を参照のこと。
【００５６】
次いで、改変された昆虫細胞を、改変された昆虫宿主において存在するプラスミドの安定な保持を可能にする適切な栄養培地中で増殖させ得る。発現産物遺伝子が誘導性の制御下にある場合、この宿主を高密度に増殖させ得、そして発現を誘導し得る。あるいは、発現が構成的である場合、この産物は、この培地中に連続的に発現され、そしてこの栄養培地は、目的の産物を取り出し、そして枯渇した栄養素を増強しながら、連続的に循環されなければならない。この産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような技術によって精製され得る。適切な場合、この産物は、この培地中に分泌されるかまたは昆虫細胞の溶解から生じる、実質的に全ての昆虫タンパク質を除去して、宿主破片（例えば、タンパク質、脂質、および多糖）を少なくとも実質的に含まない産物を提供するように、必要に応じてさらに精製され得る。
【００５７】
タンパク質発現を得るために、形質転換体由来の組換え宿主細胞を、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートする。これらの条件は、選択される宿主細胞に依存して変化する。しかし、この条件は、当該分野で公知であることに基づいて、当業者によって容易に確認可能である。
【００５８】
細菌発現技術は、当該分野で公知である。細菌性プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、かつｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流の（３’）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常はコード配列の５’末端に近位に配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、ＲＮＡ合成が開始される、隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と一部重複し得る、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを有し得る。オペレーターは、ネガティブに調節される（誘導性の）転写を可能にする。なぜなら、遺伝子リプレッサータンパク質が、このオペレーターに結合し得、それによって特定の遺伝子の転写を阻害し得るからである。構成的発現は、ネガティブ調節エレメント（例えば、オペレーター）の非存在下で生じ得る。さらに、ポジティブ調節が、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列（これは、存在する場合は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近位（５’側）に存在する）によって達成され得る。遺伝子アクチベータータンパク質の一例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｌａｃオペロンの転写を開始するのを補助するカタボライトアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）である［Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。それゆえ、調節される発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれかであり得、それにより、転写の増強または低減のいずれかを行い得る。
【００５９】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、解糖酵素（例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６］、およびマルトース）由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、生合成酵素（例えば、トリプトファン（ｔｒｐ））由来のプロモーター配列［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開第０３６  ７７６号および同第１２１  ７７５号］が挙げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージλＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。
【００６０】
さらに、天然では生じない合成プロモーターはまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージのプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌またはバクテリオファージのプロモーターのオペロン配列に連結されて、合成ハイブリッドプロモーター［米国特許第４，５５１，４３３号］を作製し得る。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッサーによって調節される、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃオペロン配列の両方を含むハイブリッドのｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼ結合能および転写開始能を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物において、適合性ＲＮＡポリメラーゼと結合されていくつかの遺伝子の高レベルの発現を生じ得る。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合されたプロモーター系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ公開第２６７  ８５１号）。
【００６１】
機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉでは、このリボソーム結合部位は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチドの配列を含む［Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４］。このＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端（ａｎｄ）との間の塩基対合によって、リボソームに対するｍＲＮＡの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。弱いリボソーム結合結合部位を用いて真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現する［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ］。
【００６２】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、このＤＮＡ分子に直接連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、このメチオニンは、ＡＴＧ開始コドンによってコードされる。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによって、または細菌性メチオニンＮ末端ペプチダーゼ（ＥＰＯ公開第２１９  ２３７号）とのインビボもしくはインビトロのいずれかでのインキュベーションによってタンパク質から切断され得る。
【００６３】
融合タンパク質は、発現を指向するための代替法を提供する。通常、内因性細菌タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現によって、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端で連結され得、そして細菌において発現され得る。得られる融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するためにプロセシング酵素（第Ｘａ因子）についての部位を保持する［Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：８１０］。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ遺伝子［Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６０：１９７］、ｔｒｐＥ遺伝子［Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１］、およびＣｈｅｙ遺伝子［ＥＰＯ公開第３２４  ６４７号］由来の配列から作製され得る。２つのアミノ酸配列の連結部でのＤＮＡ配列は、切断可能な部位をコードしてもよいし、コードしなくともよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、ユビキチンを外来タンパク質から切断するために、プロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を保持するユビキチン領域を用いて作製される。この方法によって、ネイティブな外来タンパク質を単離し得る［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８］。
【００６４】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって細胞から分泌され得る［米国特許第４，３３６，３３６号］。シグナル配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地中に分泌される（グラム陽性細菌）か、または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔中に分泌される（グラム陰性細菌）かのいずれかである。好ましくは、シグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間でコードされる、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、プロセシング部位が存在する。
【００６５】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌された細菌タンパク質についての遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子）（ｏｍｐＡ）［Ｍａｓｕｉら（１９８３）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２４３７］およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）［Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２］に由来し得る。さらなる例としては、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列を用いて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから異種タンパク質を分泌し得る［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰＯ公開第２４４  ０４２］。
【００６６】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置し、従って、コード配列に隣接するプロモーターと一緒に位置する調節領域である。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は頻繁に、転写を終結させるのを助けるステムループ構造を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｔｒｐ遺伝子、ならびに他の生合成遺伝子）に由来する転写終結配列が挙げられる。
【００６７】
通常、プロモーター、シグナル配列（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成成分は、発現構築物中に一緒に入れられる。発現構築物は、しばしば、レプリコン（例えば、宿主（例えば、細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド））中で保持される。このレプリコンは、複製系を有し、従って、それが発現、またはクローニングおよび増幅のいずれかのために真核生物宿主中で保持されるのを可能にする。さらに、レプリコンは、多コピー数性かまたは低コピー数性のいずれかのプラスミドであり得る。多コピー数性のプラスミドは一般に、約５〜約２００の、そして通常、約１０〜約１５０の範囲にわたるコピー数を有する。多コピー数性のプラスミドを含む宿主は好ましくは、少なくとも約１０、そしてより好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含む。多コピー数性または低コピー数性のいずれかのベクターが、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択され得る。
【００６８】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて細菌ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは通常、ベクターが組み込まれるのを可能にする細菌染色体に相同な、少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同なＤＮＡと、細菌染色体との間の組換えによって得られるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡを用いて構築された組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体中に組み込まれる（ＥＰＯ公開第１２７  ３２８号）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾンの配列を含み得る。
【００６９】
通常、染色体外構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択を可能にするための選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、そして細菌を薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）に対して耐性にする遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９］。選択マーカーはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路における生合成遺伝子）を含み得る。
【００７０】
あるいは、上記の構成成分のうちのいくつかは、形質転換ベクター中に一緒に入れられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコン中に保持されるかまたは組み込みベクター中に開発されるかのいずれかである選択マーカーを含む。
【００７１】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれもが、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されている：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰＯ公開第０３６  ２５９号および同第０６３  ９５３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８４／０４５４１号］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰＯ公開第０３６  ７７６号、同第１３６  ８２９号、および同第１３６  ９０７号］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第４，７４５，０５６号］。
【００７２】
外因性ＤＮＡを細菌宿主中に導入する方法は、当該分野で周知であり、そして通常、ＣａＣｌ2または他の薬剤（例えば、二価のカチオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理した細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって細菌細胞に導入され得る。形質転換手順は通常、形質転換されるべき細菌種によって変化する。例えば、［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰＯ公開第０３６  ２５９号および同第０６３  ９５３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８４／０４５４１号、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９，Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］；［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］；［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．第４回  Ｅｖｒ．  Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］を参照のこと。
【００７３】
酵母発現系はまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）のｍＲＮＡへの転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常このコード配列の５’末端に近位に配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、存在する場合、通常、構造遺伝子に遠位である、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得る。ＵＡＳは、調節された（誘導性）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、ポジティブまたはネガティブのいずれかであり得、それにより、転写を増強または低減し得る。
【００７４】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、それゆえ、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰＯ公開第２８４  ０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ公開第３２９  ２０３号）が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、有用なプロモーター配列を提供する［Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１］。
【００７５】
さらに、天然では生じない合成プロモーターはまた、酵母プロモーターとして機能し得る。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化調節に連結されて、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、解糖酵素の遺伝子（例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫ）の転写活性化領域と組み合わされたＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５のいずれかの遺伝子の調節配列からなるプロモーターが挙げられる（ＥＰＯ公開第１６４  ５５６号）。さらに、酵母プロモーターとしては、酵母ＲＮＡポリメラーゼ結合能および転写開始能を有する、非酵母起源の、天然に存在するプロモーターが挙げられ得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、［Ｃｏｈｅｎら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」：Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ，  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ  １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｅ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；］が挙げられる。
【００７６】
ＤＮＡ分子は、酵母で細胞内発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接結合され得る。この場合、組換えタンパク質のＮ末端での最初のアミノ酸は、常にメチオニン（ＡＴＧ開始コドンによりコードされる）である。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００７７】
融合タンパク質は、酵母発現系、ならびに哺乳動物発現系、バキュロウイルス発現系および細菌発現系のための代替を提供する。通常、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種性コード配列の５’末端に融合される。発現の際、この構築物は２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外因性遺伝子の５’末端に結合され得、そして酵母で発現され得る。２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、しなくてもよい。例えば、ＥＰＯ  公開番号１９６  ０５６を参照のこと。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質由来のユビキチンを切断するために、プロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ましくは保持するユビキチン領域をともなって作製される。従って、この方法を通じて天然の外来タンパク質が単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【００７８】
あるいは、外来タンパク質はまた、外来タンパク質の酵母への分泌をもたらすリーダー配列フラグメントからなる融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から増殖培地に分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位（インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る）が存在する。このリーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を方向付ける疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。
【００７９】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ  公開番号０１２  ８７３；ＪＰＯ  公開番号６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）のような分泌型酵母タンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、また酵母での分泌をもたらすインターフェロンリーダーのような非酵母起源のリーダーが存在する（ＥＰＯ  公開番号０６０  ０５７）。
【００８０】
分泌リーダーの好ましいクラスは、酵母α因子遺伝子のフラグメント（「プレ」シグナル配列および「プロ」領域の両方を含む）を使用するクラスである。使用され得るα因子フラグメントの型は、完全長プレ−プロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常、約２５〜約５０アミノ酸残基）（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰＯ公開番号３２４  ２７４）を含む。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを用いるさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列で作製されるハイブリッドα因子リーダーを含むが、第２の酵母α因子由来のプロ領域は含まない（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【００８１】
通常、酵母により認識される転写終止配列は、翻訳停止コドンに対して３’に位置される調節領域であり、このためプロモーターとともにコード配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終止配列および他の酵母認識終止配列（例えば、糖分解酵素をコードする配列）の例。
【００８２】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望される場合）、目的のコード配列、および転写終止配列を含む）は、発現構築物に一緒に配置される。発現構築物は、酵母または細菌のような宿主に安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコンにしばしば維持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従ってそれが、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としてはＹＥｐ２４［Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７〜２４］、ｐＣｌ／１［Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：４６４２〜４６４６］、およびＹＲｐ１７［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７］が挙げられる。さらに、レプリコンは高コピー数のプラスミドまたは低コピー数のプラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約２００の範囲、通常は約１０〜約１５０のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０、より好ましくは少なくとも約２０を有する。宿主へのベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数または低コピー数ベクターを挿入することが選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら（前出）を参照のこと。
【００８３】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて酵母ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターを組み込むことを可能にする、酵母染色体に対する少なくとも１つの配列相同体を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同ＤＮＡと酵母染色体との間の組換えから生じるようである［Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５］。組み込みベクターは、ベクターへの封入に適切な相同配列を選択することにより酵母における特定の遺伝子座に対して指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（前出）を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込み得、潜在的に産生される組換えタンパク質のレベルに影響する［Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７５０］。
【００８４】
ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター全体の組み込みを生じる、ベクター中の単一セグメントとしてか、または、発現構築物のみの安定な組み込みを生じ得る、染色体中の隣接セグメントに対して相同であり、かつベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメントとしてのいずれかで見出され得る。
【００８５】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子、例えばＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子（これらは、それぞれツニカマイシンおよびＧ４１８に対して酵母細胞に耐性を付与する）を含み得る。さらに、適切な選択マーカーはまた、毒性化合物（例えば、金属）の存在下で増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、銅イオンの存在下で酵母の増殖を可能にする［Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１］。
【００８６】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターに一緒に配置され得る。形質転換ベクターは、通常、上記のようにレプリコンで維持されるかまたは組み込みベクター中に発現されるかのいずれかである選択マーカーから構成される。
【００８７】
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか）が、多くの酵母への形質転換のために開発された。例えば、発現ベクターは、特に、以下の酵母のために開発された：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ［Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２］、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ［Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１］、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ［Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２］、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ［Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５］、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ［Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５］、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ［Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１］、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号］、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｈｉｎｎｅｎら、（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３］、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ［Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６］、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ［Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９］。
【００８８】
酵母宿主に外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、そして、通常、アルカリ陽イオンで処理したスフェロプラストの形質転換またはインタクトな酵母細胞の形質転換のいずれかを含む。形質転換手順は、通常、形質転換されるべき酵母種と共に変化する。例えば、以下を参照のこと：［Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ］；［Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ］；［Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ］；［Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ］；［Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５；１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ］；［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ］；［Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ］。
【００８９】
本発明のさらなる局面に従って、本発明の第１の局面による化合物の産生方法が提供される。この方法は以下の工程を包含する：
ａ）哺乳動物を、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの莢膜ポリサッカライドに対する抗体で免疫化する工程；
ｂ）免疫化された哺乳動物から脾臓細胞を取り出す工程および抗体に結合する細胞について選択する工程；
ｃ）選択された脾臓細胞からｍＲＮＡ種を分離する工程、およびこのｍＲＮＡ種でコードされるタンパク質を発現するファージライブラリーを産生する工程；
ｄ）目的の化合物を発現する組換えファージを選択する工程。
【００９０】
哺乳動物を免疫化するため、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（好ましくはＩＩＩ型ＣＨＯ）の莢膜ポリサッカライドに対する抗体が、好ましくは非経口的に、免疫応答を惹起するのに十分な量で導入される。免疫化のための哺乳動物の選択は、防御的化合物が意図される哺乳動物に主に依存する。ほとんどの場合、これはヒトである。免疫化は、最も好ましくは抗体Ｐ９Ｄ８を利用する（Ｔｅｔｉら、１９９２）。次いで、脾臓性のリンパ球が免疫化された患者から取り出され、そして、細胞はコーティング抗原として最初の免疫化に使用された抗体を用いる抗原パニングにより選択される。次いで、選択されたリンパ球由来のｍＲＮＡは、逆転写のための鋳型として使用され、次いで得られたｃＤＮＡはｇＩＩＩｐとの融合タンパク質として、組換えペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドを発現する組換えファージライブラリーを構築するために用いられ得る。表面上で適切な候補化合物を発現するファージは、コーティング抗原として免疫化に最初に用いられた抗体を用いるアフィニティー精製により、再度選択され得る。次いで、これらのファージは、当業者に容易に明らかである方法を用いて分析され得る。
【００９１】
本発明のさらなる局面に従って、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、好ましくはＧＢＳのＩＩＩ型ＣＨＯの莢膜ポリサッカライドに対して、防御免疫応答を誘発し得る、ペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド化合物を含む組成物（薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせた）が提供される。このような組成物は、病原性ＧＢＳ細菌によって生じる疾患に対する防御を提供するために用いられ得、従ってワクチンとして用いられ得る。本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐこと）または治療的（すなわち、感染後の疾患を処置すること）のいずれかであり得る。
【００９２】
薬学的に受容可能な賦形剤とは、それ自体が、組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生を誘導しない任意の化合物を意味する。この賦形剤は、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与または静脈内投与に適するべきである。適切な化合物は、代表的には大きく、緩徐に代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子）である。このような化合物は、当業者には周知である。さらに、これらの化合物は、免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原は、細菌のトキソイドに結合体化され得る。
【００９３】
組成物の有効性を増強する好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油型乳濁処方物（ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激因子と共にまたは伴わずに）、これには、例えば以下のようなものがある：（ａ）マイクロ流動化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いてミクロン以下の粒子に処方された、５％スクアレン、０．５％ＴｗｅｅｎTM８０および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有する（必須ではないが、必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）ＭＦ５９TM（ＷＯ９０／１４８３７）、（ｂ）ミクロン以下の乳濁にマイクロ流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）されるか、またはボルテックスされより大きい粒子サイズの乳濁液を生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロック化ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有する、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノリン酸脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロース  ジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM））を含む、ＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM、またはそれから生成される粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ）（免疫刺激複合体）が用いられ得る）；（４）フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバント（ＣＦＡおよびＩＦＡ）；（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮγ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン；ならびに（６）組成物の有効性を増強する免疫刺激因子として作用する他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９TMが好ましい。
【００９４】
上述のように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバント）は、代表的に希釈液（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）が、このようなビヒクルに存在し得る。
【００９６】
代表的に、免疫原性組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかで、注射剤として調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適切な固体形態がまた調製され得る。調製物はまた、上記の様に、アジュバント性効果を増強するため、乳化されるかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【００９７】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原性ポリペプチド、および必要な場合、任意の他の上述の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体へのその量（単回用量または一連の投与の部分のいずれか）の投与が処置または防御に有効である投与量を意味する。この量は、処置される個体の健康状態および生理学的状態、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類、など）、個体の免疫系の抗体合成能力、所望の防御程度、ワクチンの処方、医学的状態の主治医の評価、および他の関連因子に依存して変化する。この量は、慣用的なトライアルを通じて決定され得る比較的広範な範囲におさまることが予期される。
【００９８】
免疫原性の組成物は、従来、非経口的に、例えば、皮下か筋肉内のいずれかの注射により、投与される。それらはまた、粘膜表面（例えば、口内または鼻内）に、または肺の処方物、座剤、もしくは経皮適用の形態で投与され得る。投与処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。
【００９９】
本発明によるペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドの化合物はまた、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて用いられ得る（または逆に、本発明の化合物に対する抗体は、抗原レベルを検出するために用いられ得る）。十分規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、侵襲性の診断方法に置き換わるように開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液、または血清サンプルを含む）内の本発明の化合物に対する抗体は、検出され得る。イムノアッセイの設計は、多数の改変に供され、これらの改変は当該分野において公知である。イムノアッセイについてのプロトコールは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコールはまた、例えば、固体支持体を用い得るか、または免疫沈降により得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含む；この標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である；この例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識イムノアッセイおよび酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）である。
【０１００】
本発明はまた、免疫診断に適切なキットを提供する。これらは、適切な標識試薬を含み、そして適切な物質を包装することにより構築される。この物質には、アッセイを実施するために必要な、その他の試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）とともに適切な容器内にある、本発明の組成物、ならびにアッセイの指示の適切なセットが含まれる。
【０１０１】
タンパク質を基礎とするワクチンへの代わりとして、ＤＮＡワクチンが使用され得る［例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１〜２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７〜６４８］。従って、本発明のワクチンは、ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドの化合物を含むよりも、これらの化合物をコードする核酸を含み得る。
【０１０２】
本発明のなおさらなる局面に従って、ＧＢＳによって引き起こされる疾患の予防または処置方法が提供され、この方法は、哺乳動物（好ましくはヒト）に、ＧＢＳの莢膜ポリサッカライドに対する防御免疫応答を誘発し得る化合物または組成物の有効量を導入する工程を包含する。
【０１０３】
本発明のなおさらなる局面に従って、ＧＢＳによって引き起こされる疾患に対して、哺乳動物（好ましくはヒト）にワクチン投与する方法が提供され、この方法は、この哺乳動物に、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア（例えば、アジュバント）とともに、本発明の第１の局面に従うペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド化合物の組成物を投与する工程を包含する。
【０１０４】
本発明のさらなる実施態様に従って、本発明の第１の局面に従うペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドをコードする核酸分子がまた提供される。当業者に認識されるように、これらの核酸分子の配列は、遺伝コードの特異性を通して所望の活性を有するペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。
【０１０５】
さらに、コードされた化合物の正確な特性を正確に仕立てるために、当業者は、もともと単離されたペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド配列から、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換、欠失、または挿入によって、変化がヌクレオチドレベルで作製され得ることを認識する。部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）は、本発明に従う、変異され、改善された化合物を生成するために使用される好ましい方法である。当業者に現在公知の多くのＳＤＭの技術が存在する。これらには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記載されるような、ＰＣＲを使用するか、または市販のキットを使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発が含まれる。
【０１０６】
このような変異誘発の技術によって産生される大部分の化合物は、もともと選択された化合物よりも効果がない。しかし、少数の場合において、導入された変異は改善された機能（例えば、ＧＢＳのＩＩＩ型ＣＨＯエピトープに対するより密接な構造的類似性、または特定の生物におけるより強い免疫原性）を有する分子を産生する。
【０１０７】
本発明のこの局面に従う核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含み得、そしてコード配列中にヌクレオチドアナログをさらに含み得る。好ましくは、その核酸分子は、ＤＮＡを含む。
【０１０８】
本発明のさらなる局面は、本発明の第１の局面に従う化合物をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。なおさらなる局面は、宿主細胞または生物に、コード核酸を導入する工程を包含する方法を提供する。核酸の導入は、上記に議論したように、任意の利用可能な技術を使用し得る。
【０１０９】
１つの実施態様において、この核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組込みは、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって促進され得る。
【０１１０】
生殖系列中で、本発明の第１の局面に従う１つ以上のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド化合物を発現または過剰発現するために形質転換されたトランスジェニック動物は、それらの産生のための方法とともに本発明のなおさらなる局面を形成する。
【０１１１】
本発明の種々の局面および実施態様が、現在、ファージライブラリーから単離されたｓｃＦｖ化合物への特定の言及を伴う例示によってより詳細に記載される。詳細な改変が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが認識される。本明細書中で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が参考として援用される。
【０１１２】
（発明の詳細な説明）
（標準的な手順および技術の要約）
本発明の実施は、他に示されない限りは、当該技術の範囲にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来的な技術を利用する。このような技術は、文献（例えば、
【０１１３】
【数１】
0004446601.tif 000002
）に十分に記載されている。
【０１１４】
（実施例）
（統計学的分析）
マウス血清中の抗体濃度間の差異を、分散の一元分析（ｏｎｅｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）およびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｋｅｕｌｓ−Ｎｅｗｍａｎ検定を用いて、統計学的な有意さについて分析した。致死率の差異を、Ｆｉｓｈｅｒの完全検定を用いて分析した。
【０１１５】
（細菌株および試薬）
Ｈ７３８株（ＩＩＩ型）は、メリーランド州、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＢａｓｃｏｍ  Ａｎｔｈｏｎｙ博士により恵与された。ＣＯＨ１株（別名ＧＢＳＩＩＩ型）および非カプセル化同遺伝子型変異体ＣＯＨ１−１３（Ｒｕｂｅｎｓら、１９８７）は、Ｓｅａｔｌｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＣｒａｉｇ  Ｒｕｂｅｎｓ博士により恵与された。ＩＩＩ型ＣＨＯおよび群特異的ＣＨＯを、以前に記載された（Ｍａｎｃｕｓｏら、１９９４；ｖｏｎ  Ｈｕｎｏｌｓｔｅｉｎら、１９９７）ように、Ｈ７３８株の培養上清からイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過によって精製した。ＩＩＩ型ＣＨＯは、重量で２４％のシアル酸を含んだ（Ａｍｉｎｏｆｆ、１９６１）。この調製物は、十分な純度と見なされた。なぜなら、これは、重量基準で０．５％未満のタンパク質（ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）、核酸（２５０ｎｍにおける吸光度）、または群抗原の主要な構成成分であるラムノース（ＤｉｓｃｈｅおよびＳｈｅｔｔｌｅｓ、１９４８）を含んだからである。
【０１１６】
マウスｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８の特性および精製は、他で記載されている（Ｔｅｔｉら、１９９２）。このｍＡｂは、新生仔のラットまたはマウスに受動的に投与された場合に、ＩＩＩ型ＣＨＯのシアル酸依存性エピトープに結合し、オプソニン食作用性のＧＢＳの殺傷を促進し、そしてＧＢＳによって誘導される致死性に対する有意な防御活性を有する。
【０１１７】
ウサギ抗ＩＩＩ型ＧＢＳ血清（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、加熱殺傷した（８０℃、４５分間）カプセル化していないＧＢＳ（ＣＯＨ１−１３株）を用いて吸収させ、非型特異的な抗ＧＢＳ抗体を除去した。吸収後、この調製物はＩＩＩ型ＧＢＳと反応したが、非カプセル化株または他の血清型に属する株とは反応しなかった。
【０１１８】
（ファージライブラリーの産生）
ファージライブラリーを、以下のプロトコールを用いて産生した。雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）に、０日目および１５日目に、０．２ｍｌの完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒｓ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙより入手）中の５０μｇのｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８を皮下（ｓ．ｃ．）注射し、そして０．２ｍｌの不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）中の同用量の抗原を、２１日目および２８日目に注射した。最終の追加免疫注射（生理食塩水中の５０μｇの抗原）を、３５日目に腹腔内で与え、そして３日後、マウスを屠殺してそれらの脾臓を取り出した。
【０１１９】
脾臓細胞を、組織培養培地に再懸濁し、そして炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）中のｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８（２５μｇ／ｍｌ）であらかじめコートし、そして２％脱脂粉乳（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）でブロッキングした７５ｃｍ2組織培養フラスコに分注した。
【０１２０】
５％ＣＯ2中で３７℃にて一晩インキュベーションの後、非接着脾臓細胞を除去し、そしてグアニジウムイソチオシアネートを使用して、パニングフラスコ中でｍＲＮＡを接着細胞から直接的に抽出した。オリゴ（ｄＴ）−セルロース（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ精製キット、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）上でのアフィニティークロマトグラフィーによる精製の後、精製したｍＲＮＡの逆転写を、Ｍａｇｌｉａｎｉら、（１９９７）に記載されるように、ランダムなヘキサデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして使用して、マウス逆転写酵素を用いて行った。
【０１２１】
抗体フラグメントをクローニングおよび発現するために、市販のシステム（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。重鎖および軽鎖抗体遺伝子を、２セットの特異的プライマーを用いることによって、２つの別個のＰＣＲ反応において増幅し、３４０および３２５塩基対のフラグメントをそれぞれ生成した。重鎖および軽鎖ＤＮＡ産物を、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3リンカー（ＶH鎖のカルボキシ末端とＶL鎖のアミノ末端との間の橋として作用する）をコードするＤＮＡフラグメントを使用して、単一の遺伝子に組み立てた。次いで、この遺伝子は、再び増幅されて、特定のファージミドベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ）へのクローニングのために２つの制限酵素部位（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）を導入した。
【０１２２】
Ｃ末端１３アミノ酸ペプチドタグ（Ｅ−タグ）、続いてアンバー翻訳停止コドンをコードする配列に連結したｓｃＦｖ遺伝子を含む連結したベクターを、コンピテントｓｕｐＥ  Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＴＧ１）に導入した。次いで、この株に、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、それらの先端に組換えｓｃＦｖ抗体を提示する組換えファージを産生した。
【０１２３】
（ファージの選択）
ファージの選択を、以下のプロトコルを用いて行った。組換えファージを、炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）中の５ｍｌのｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８（１０μｇ／ｍｌ）であらかじめコートした２５ｃｍ2組織培養フラスコに分注した。３７℃、２時間のインキュベーションおよび徹底的な洗浄後、対数期のＴＧ１細胞をフラスコに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。この懸濁液を、滅菌した試験管に移し、そしてアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（２％）、およびＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージの添加後、３７℃で振盪しながらさらにインキュベートした。組換えファージ上清の生成後、第２回目のパニングを反復し、そして細胞をアンピシリンを含む寒天プレートにプレーティングした。単離したコロニーを、別個の９６ウェルマイクロタイタープレート（マスタープレート）に移し、次いでそれをＭ１３ＫＯ７を用いるライブラリーレスキューのために使用した。
【０１２４】
マスタープレートから得られた組換えファージ上清を、あらかじめｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８（１０μｇ／ｍｌ）でコートしたマイクロタイタープレートのウェル中でスクリーニングした。あらかじめ等容量のブロッキング緩衝液で希釈した２００μｌの各々の上清を、抗原でコートした各ウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いる５回の洗浄の後、結合したファージを、２００μｌのペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗Ｍ１３ファージ−Ｍ１３ファージ抗体（Ｍａｇｌｉａｎｉら、１９９７）を用いて検出した。
【０１２５】
ライブラリーの２回のパニングの後、ｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８を用いてコートしたウェルを再度用いるＥＬＩＳＡ試験において、６つの異なるファージクローンが強い反応を生じた。これらのクローンのうちの１つ（Ｃ１０と呼ばれる）を、さらなる特徴付けのために選択した。さらに、無関係なＨ６  ｓｃＦｖ（Ｍａｇｌｉａｎｉら、１９９７）（これは、ｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８に結合し得ない）を、本研究を通じて使用するためのコントロールとして選択した。
【０１２６】
（ｓｃＦｖ組換え抗体の産生）
陽性のＥＬＩＳＡシグナルを与える組換えファージを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ２１５１を感染させ、可溶性ｓｃＦｖ組換え抗体を産生した。
【０１２７】
抗原陽性組換えファージを使用して、ペリプラズム抽出物を得るために１ｍＭ  ＥＤＴＡに暴露した対数期のＨＢ２１５１細胞を感染させた。ｓｃＦｖ組換え分子をまた、ＨＢ２１５１培養物の濃縮した上清から得た。ペリプラズム抽出物または上清のいずれかからのｓｃＦｖの精製を、Ｍａｇｌｉａｎｉら（１９９７）によって記載されたように、抗−Ｅ−タグ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ａｎｔｉ−Ｅ−ｔａｇ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して行った。精製の間、ｓｃＦｖを、抗−Ｅ−タグ抗体を使用して、ドットブロットまたはウェスタンブロットによって検出した。
【０１２８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ２１１５細胞の感染後、Ｃ１０およびコントロールＨ６  ｓｃＦｖを、ペリプラズム抽出物または形質転換した株の濃縮した上清のいずれかから産生した。高度な量が上清から得られた（６ｍｇ／ｌ）ので、これらは、引き続く研究においてｓｃＦｖの好ましい供給源として使用された。アフィニティー精製されたＣ１０またはＨ６  ｓｃＦｖのウェスタンブロット分析は、両方が約２９ｋＤａの分子量を有する単一のモノマーからなることを示した（示さず）。
【０１２９】
（ＧＢＳ凝集阻害アッセイ）
予備的な研究において、可溶性のＣ１０およびＨ６  ｓｃＦｖを、抗ＩＩＩ型抗体によるＧＢＳ凝集を阻害するそれらの能力について試験した。
【０１３０】
細菌凝集アッセイを、マイクロタイタープレートのＵ字型のウェル中で、ＩＩＩ型特異的抗体を用いて、死菌ＧＢＳを混合することによって設定した。このアッセイにおいて、ＩＩＩ型ＧＢＳは（非カプセル化された変異体ではなく）、ｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８または吸収ウサギ血清のいずれかによって凝集された。凝集阻害アッセイのために、インヒビター（１％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳ中の５０μｌ）を、等容量の抗体含有溶液とともにマイクロタイタープレートのウェル中で混合した。抗体溶液を、インヒビターの非存在下で凝集を誘導するのに必要な最低濃度の２倍に相当する最終希釈を達成するために調整した。インヒビターを、型特異抗体または吸収ウサギ血清とともに３７℃で３０分間インキュベートした後に、５０μｌの死菌ＧＢＳ懸濁液を添加した。この懸濁液を、ＧＢＳ株Ｈ７３８（ＩＩＩ型）を、３％ホルマリン中で殺傷させた（４℃で３日間）後に得、洗浄したペレットをＰＢＳ−アルブミン中で再懸濁し、５×１０8細胞／ｍｌの濃度にした。このプレートを、３７℃で４時間インキュベートし、次いで室温で一晩インキュベートした。結果を目視的に評価した。
【０１３１】
ＩＩＩ型ＣＨＯについての試験の特異性を、精製した型の抗原であるが、群特異的抗原ではない抗原の、ｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８によるＩＩＩ型ＧＢＳの凝集を阻害する能力によって確認した（表１）。１５μｇ／ｍｌ以上の濃度のＣ１０  ｓｃＦｖは、ｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８によって誘導されるＧＢＳ細胞の凝集を阻害し得た。顕著には、２４０μｇ／ｍｌまでの関連性のないＨ６  ｓｃＦｖは、凝集に影響を与えなかった（表１）。Ｃ１０  ｓｃＦｖの阻害活性は、そのフラグメントが、パラトープ結合部位に類似しているか、または同一であるかのいずれかであるｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８のイディオタイプの決定基を認識することを示唆した。
【０１３２】
これらの２つの可能性の間を区別するために、凝集を誘導するｍＡｂ  Ｐ９Ｄ８の代わりにウサギ抗ＩＩＩ型抗体を使用して、凝集阻害実験を行った。これらの研究の背後の理論的根拠は、抗原結合に関連しないイディオタイプ抗体が、異なる種内で惹起された抗体中にほとんど存在しないということである（Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら、１９９０）。
【０１３３】
【表１】
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表１は、Ｃ１０  ｓｃＦｖがウサギ抗体によって誘導された凝集を阻害し得たことを示す。このことは、Ｃ１０  ｓｃＦｖが抗ＩＩＩ型ＣＨＯ抗体の抗原結合部位に対して特異的であり、従って通常のＩＩＩ型抗原のコンホメーションを模倣し得ることを強く示唆した。
【０１３４】
（ｓｃＦｖでの免疫）
さらなる実験において、マウスを可溶性Ｃ１０またはＨ６  ｓｃＦｖ分子に対して生成された免疫応答の性質を決定するために、５０μｇの可溶性Ｃ１０またはＨ６  ｓｃＦｖで免疫した。
【０１３５】
雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齡）を、精製したｓｃＦｖまたはポリエチレングリコール−ＮａＣｌ沈澱させたファージディスプレイ型ｓｃＦｖのいずれかで免疫した（Ｍａｇｌｉａｎｉら、１９９７）。０．２ｍｌの完全フロイントアジュバント中に５０μｇの抗原の最初の皮下注射の２週間後に、０．２ｍｌの不完全フロイントアジュバント中、同用量の第２の皮下投与を行った。０．２ｍｌの生理食塩水中に５０μｇの免疫原のさらなる注射を３回、最初の免疫の２１、２８、３５日後に腹腔内に行った。
【０１３６】
血清を、免疫後、示された時間で眼球後の叢から入手し、そして酵素結合免疫吸着アッセイ（ここでは、１μｇ／ウェルのチロシル化ＩＩＩ型ＣＨＯを用いてマイクロタイタープレートがコーティングされた）を使用してＩＩＩ型抗原に対する抗体について分析した（Ｔｅｔｉら、１９９２）。結合した抗体を、ビオチン化多価抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｂｔｅｋ  Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙから配給）またはμ鎖特異的またはγ鎖特異的アルカリホスファターゼ−ウマ抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を用いて、Ｔｅｔｉら（１９９２ａ）に記載のように、検出した。死菌ＩＩＩ型ＧＢＳで免疫したマウス由来のプール血清からなる陽性コントロールを各決定に含めた。結果を、試験血清の吸収度と陽性コントロール血清の吸収度との間の比に１，０００を乗じたのに等しい任意の単位で表した。
【０１３７】
図１は、コーティング抗原としてＩＩＩ型ＣＨＯを使用するＥＬＩＳＡによって、抗体レベルについて試験した血清サンプル（示された時間で採取した）のＥＬＩＳＡ結果を示す。Ｃ１０  ｓｃＦｖでワクチン接種したマウス由来の血清は、免疫前の値と比較して、抗ＩＩＩ型ＩｇＭおよびＩｇＧにおいて有意な上昇（Ｐ＜０．０５）を示した（図１）。対照的に、コントロールＨ６  ｓｃＦｖで免疫したマウス由来の血清は、有意な抗ＩＩＩ型ＣＨＯ応答を全く示さなかった（データ示さず）。Ｃ１０  ｓｃＦｖ誘導抗ＩＩＩ型ＣＨＯ抗体の上昇は、反復ワクチン接種によってブーストされ、そして３５日目のｓｃＦｖでの最後の免疫後に徐々に減少した（図１）。
【０１３８】
これらの免疫が正常抗原に対する応答についてマウスを感作したか否かを決定するために、Ｃ１０  ｓｃＦｖ免疫動物を、９７日目に死菌ＩＩＩ型ＧＢＳでブーストした。図１は、９７日目での値と比較して、１０４日目でのよりＩｇＭ、ＩｇＧおよび総抗体の高力価によって証明されるように、死菌細菌が、抗ＩＩＩ型ＣＨＯ抗体の急激な増加を引き起こしたことを示す。これらのデータは、Ｃ１０  ｓｃＦｖが病原体に曝露する際に増加した応答についてマウスを感作し得たことを示した。
【０１３９】
さらなる研究を、Ｃ１０  ｓｃＦｖを表面上で提示するファージが抗ＩＩＩ型ＣＨＯ応答をやはり誘導し得るか否かを決定するために行った。ファージディスプレイ型Ｃ１０フラグメントで免疫したマウスにおける抗ＩＩＩ型ＣＨＯ抗体応答（図２）は、同じ免疫スケジュールおよび用量（すなわち、１マウスあたり５０μｇのファージ）を使用して、精製したＣ１０  ｓｃＦｖを用いて観察された応答に酷似した。再び、コントロールのファージディスプレイ型Ｈ６フラグメントは、有効ではなかった（示さず）。これらのデータは、ファージ表面上での組換え抗イディオタイプフラグメントの提示が、抗体応答を誘導することにおいて、特に３〜５のＳｃＦｖ分子のみが、各ファージ表面上で発現されることを考慮に入れると、きわめて有効であり得ることを示唆する（Ｋｏｒｔｔら、１９９４）。
【０１４０】
（ＧＢＳ疾患の新生仔モデル）
受動的に投与された血清の防御効果を研究するために、ＧＢＳ感染の新生仔マウスモデルを使用した結果、Ｃ１０  ｓｃＦｖがきわめて有毒なＧＢＳでの致死的な感染に対して仔マウスを受動的に防御する能力を評価し得た（Ｍａｎｃｕｓｏら、１９９４；Ｃｕｓｕｍａｎｏら、１９９６；Ｍａｎｃｕｓｏら、１９９７）。また、同じモデルを使用して、感染から新生仔を防御することにおける、能動的な先天性免疫の有効性を評価した。
【０１４１】
血清の防御活性を評価するために、新生仔（２４時間齢）Ｂａｌｂ／ｃマウスをコントロール群または実験群に無作為に割り当て、母親とともに印づけし、そして飼育した。仔マウスを、２５μｌの正常または免疫血清の示された希釈物を皮下接種した。６時間後、動物を、ＣＯＨ１株（２５μｌ中１００ＣＦＵ（ＰＢＳ中）；ＧＢＳの９０％致死用量）で皮下チャレンジした。致死率を、１２時間毎に５日間評価した。この後にはほとんど死亡は認められなかった。
【０１４２】
表２は、可溶性Ｃ１０  ｓｃＦｖで免疫したマウスか、またはファージディスプレイ型Ｃ１０  ｓｃＦｖで免疫したマウスのいずれかに由来する血清が、免疫前血清と比較して、ＧＢＳチャレンジに対して有意な受動的免疫防御を付与し得ることを示す。Ｃ１０  ｓｃＦｖ免疫マウス由来血清の防御力価は、１：１０〜１：４０の範囲であった（表２）。対照的に、無関係なＨ６  ｓｃＦｖで免疫した動物由来の血清は、非防御性であった（表２）。
【０１４３】
抗イディオタイプフラグメントでの先天性免疫が感染に対して新生仔マウスを保護するに有用であるか否かを決定するために、４週齡の雌性マウスを、５０μｇの可溶性ｓｃＦｖまたはファージディスプレイ型ｓｃＦｖで３回免疫し、交尾させ、そして初回免疫の３５日後に再びブーストした。０．２ｍｌの完全フロイントアジュバント中、５０μｇの抗原の最初の皮下注射の２週間後に、０．２ｍｌの不完全フロイントアジュバント中、同用量の第２の皮下投与を行った。０．２ｍｌの生理食塩水中、５０μｇの免疫原の１回のさらなる注射を初回免疫後の２１日目に皮下に与えた。次いで、メスを３１日目に交尾させ、そして３５日目に生理食塩水中、５０μｇの抗原で皮下投与してブーストした。
【０１４４】
次いで、新生仔マウスを９０％致死用量のＧＢＳで感染させた。表３は、可溶性Ｃ１０  ｓｃＦｖまたはファージディスプレイ型Ｃ１０  ｓｃＦｖで免疫した母マウスから生まれた新生仔が、無関係のＨ６  ｓｃＦｖで免疫した母マウスから生まれた新生仔と比較して、ＧＢＳ誘導致死率に対して有意に防御されたことを示す。
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
【表３】
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（参考文献）
【０１４７】
【数２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｃ１０  ｓｃＦｖを用いるマウスの免疫後の種々の時点において収集した血清中の抗ＩＩＩ型抗体レベルを示す。マウスを、示した時間（矢印）で、精製したＣ１０  ｓｃＦｖまたは加熱死菌（ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ）ＧＢＳを用いて免疫した。点および棒は、各々異なる血清サンプルで行った５つの定量データの平均±標準偏差を表す。
【図２】  図２は、ファージ提示型Ｃ１０  ｓｃＦｖを用いるマウスの免疫後の種々の時点において収集した血清中の抗ＩＩＩ型抗体レベルを示す。マウスを、示した時間（矢印）で、Ｃ１０  ｓｃＦｖまたは加熱死菌ＧＢＳを発現するファージを用いて免疫した。点および棒は、各々異なる血清サンプルで行った５つの定量データの平均±標準偏差を表す。
【図１】
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【図２】
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