(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号:41に定められる配列を持つポリペプチド；
（b）配列番号:40に定められる配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされ、且つ3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド；
（c）配列番号:41に定められる配列と少なくとも90％の配列の同一性を持つアミノ酸配列を持ち、且つ3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド；および
（d）少なくとも1つの保存的置換を含む配列番号:41に定められるアミノ酸配列を持ち、且つ3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチド。
【請求項２】
請求項1記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項３】
核酸配列が、配列番号:40または42に定められる核酸配列である、請求項2記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項1記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む外因性核酸分子を少なくとも1つ含む形質転換細胞。
【請求項５】
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を生産する請求項4記載の細胞。
【請求項６】
外因性核酸分子がさらに、ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE1ポリペプチド、ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2αポリペプチド、ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2βポリペプチド、またはCoA転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする、請求項4または5記載の細胞。
【請求項７】
ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE1ポリペプチドが
（a）配列番号:10に定められる配列を持つポリペプチド；
（b）配列番号:9に定められる配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされ、且つラクチルCoA脱水酵素のE1ポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド；
（c）配列番号:10に定められる配列と少なくとも90％の配列の同一性を持つアミノ酸配列を持ち、且つラクチルCoA脱水酵素のE1ポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド；および
（d）少なくとも1つの保存的置換を含む配列番号:10に定められるアミノ酸配列を持ち、且つラクチルCoA脱水酵素のE1ポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド
からなる群より選択され、
ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2αポリペプチドが
（e）配列番号:18に定められる配列を持つポリペプチド；
（f）配列番号:17に定められる配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされ、且つラクチルCoA脱水酵素のE2αポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド；
（g）配列番号:18に定められる配列と少なくとも90％の配列の同一性を持つアミノ酸配列を持ち、且つラクチルCoA脱水酵素のE2αポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド；および
（h）少なくとも1つの保存的置換を含む配列番号:18に定められるアミノ酸配列を持ち、且つラクチルCoA脱水酵素のE2αポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド
からなる群より選択され、
ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2βポリペプチドが
（i）配列番号:26に定められる配列を持つポリペプチド；
（j）配列番号:25に定められる配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされ、且つラクチルCoA脱水酵素のE2βポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド；
（k）配列番号:26に定められる配列と少なくとも90％の配列の同一性を持つアミノ酸配列を持ち、且つラクチルCoA脱水酵素のE2βポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド；および
（l）少なくとも1つの保存的置換を含む配列番号:26に定められるアミノ酸配列を持ち、且つラクチルCoA脱水酵素のE2βポリペプチドとしての活性を持つポリペプチド
からなる群より選択され、並びに
CoA転移酵素活性を持つポリペプチドが
（m）配列番号:2に定められる配列を持つポリペプチド；
（n）配列番号:1に定められる配列と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされ、且つCoA転移酵素活性を持つポリペプチド；
（o）配列番号:2に定められる配列と少なくとも90％の配列の同一性を持つアミノ酸配列を持ち、且つCoA転移酵素活性を持つポリペプチド；および
（p）少なくとも1つの保存的置換を含む配列番号:2に定められるアミノ酸配列を持ち、且つCoA転移酵素活性を持つポリペプチド
からなる群より選択される、請求項6記載の細胞。
【請求項８】
外因性核酸分子がさらに、配列番号:1、9、17及び25に定められる核酸配列を含む単離された核酸分子を含む、請求項4または5記載の細胞。
【請求項９】
原核細胞である請求項4から8いずれか一項記載の細胞。
【請求項１０】
原核細胞が大腸菌細胞である、請求項9記載の細胞。
【請求項１１】
請求項1記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
細胞がポリペプチドを生産できる条件下で請求項4から10いずれか一項記載の細胞を培養し、ポリペプチドが生産される段階を含む、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドを生産する方法。
【請求項１３】
アクリリルCoAに請求項1記載のポリペプチドを接触させる段階を含む、3-ヒドロキシプロピオニルCoAを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は有機酸および関連産物を生産するための酵素および方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照として本明細書に組み入れられる以下の米国特許仮出願に基づく優先権を主張するものである：2000年11月20日出願米国特許仮出願第60/252,123号；2001年4月20日出願米国特許仮出願第60/285,478号；2001年7月20日出願米国特許仮出願第60/306,727号；2001年9月7日出願米国特許仮出願第60/317,847号。
【０００３】
背景
有機酸、エステル、およびポリオールのような有機化合物は、プラスチック材料および他の製品の合成に使用できる。有機化合物の需要の増加に応えるために、炭化水素ではなく炭水化物に基づく原料を使用した、より効率の良い費用効果の高い生産方法が開発されている。例えば、特定の細菌は、ポリ乳酸の生産に使用する乳酸の大量生産に使用されてきた。
【０００４】
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)は、有機酸である。3-HPの生産には、いくつかの化学合成経路が記述されているが、生体触媒経路は現在までに1つ開示されているのみである（国際公開公報第01/16346号、Suthersら）。3-HPは特殊品の合成に使用でき、化学産業で周知の市販の重要な中間体、例えば、脱水によりアクリル酸に、酸化によりマロン酸に、アルコールとのエステル化反応によりエステルに、および還元により1,3プロパンジオールに転換できる。
【０００５】
概要
本発明は3-ヒドロキシプロピオン酸および他の有機化合物（例えば、1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合3-HP、3-HPのエステル、およびマロン酸およびそのエステル）の生産に関する方法および材料に関する。具体的には、本発明は、3-HPおよび1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合3-HP、3-HPのエステル、およびマロン酸およびそのエステルのような他の有機化合物を生産するために使用できる、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞、および方法を提供する。3-HPは生物学的および商業的に重要である可能性がある。例えば、栄養産業は3-HPを食品、飼料添加物、または保存剤として使用でき、また3-HPから上述の誘導体も生産できる。本明細書に記述される核酸分子は、3-HPならびに1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合3-HP、および3-HPのエステルのような他の有機化合物を生産する能力を持つ宿主細胞の組換えに使用できる。本明細書に記述されるポリペプチドは、無細胞系に使用して、3-HPならびに1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合3-HP、および3-HPのエステルのような他の有機化合物を生産できる。本明細書に記述される宿主細胞は、培養系に使用して、3-HPならびに1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合3-HP、3-HPのエステルのような他の有機化合物を大量に生産することができる。
【０００６】
本発明の1つの局面では、ラクチルCoA脱水酵素活性および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ細胞、およびラクチルCoA脱水酵素活性および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ少なくとも1つの細胞を培養することによって、本明細書に記述されるような産物を生産する方法が提供される。いくつかの態様では、細胞は以下のポリペプチドを1つまたは複数コードする外因性核酸分子も含む場合がある：E1活性化因子活性を持つポリペプチド；ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるE2αポリペプチド；ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるE2βポリペプチド；および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド。また、細胞はCoA転移酵素活性、CoA合成酵素活性、ポリヒドロキシ酸合成酵素活性、3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性、3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性、および/または脂肪分解酵素活性を持つ場合がある。さらに細胞は、CoA転移酵素活性、3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性、3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性、CoA合成酵素活性、ポリヒドロキシ酸合成酵素活性、および/または脂肪分解酵素活性を持つ1つまたは複数のポリペプチドを発現する少なくとも1つの外因性核酸分子を含む場合がある。
【０００７】
本発明の別の態様では、ラクチルCoA脱水酵素活性および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ細胞は、例えば、3-HP、重合3-HP，および/またはメチルヒドロキシプロピオネート、エチルヒドロキシプロピオネート、プロピルヒドロキシプロピオネート、および/またはブチルヒドロキシプロピオネートのような3-HPのエステルのような産物を生産する。したがって、本発明はこれらの産物を1つまたは複数生産する方法も提供する。これらの方法には、ラクチルCoA脱水酵素活性および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ細胞を、産物が生産されるような条件下で培養する段階が含まれる。これらの細胞は、CoA合成酵素活性および/またはポリヒドロキシ酸合成酵素活性も持ち得る。
【０００８】
本発明の別の局面では、CoA合成酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性、およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ細胞が提供される。いくつかの態様では、これらの細胞は、以下のポリペプチドを1つまたは複数コードする外因性核酸分子も含むことができる：E1活性化因子活性を持つポリペプチド；ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるE2αポリペプチド；ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるE2βポリペプチド；CoA合成酵素活性を持つポリペプチド；およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチド。
【０００９】
本発明の別の態様では、CoA合成酵素活性、ラクチルCoAで脱水酵素活性、およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ細胞は、例えば、重合アクリレートのような産物を生産することができる。
【００１０】
本発明の別の局面は、CoA転移酵素活性、ラクチルCoAで加水酵素活性、および脂肪分解酵素活性を含む細胞を提供する。いくつかの態様では、細胞は以下のポリペプチドを1つまたは複数コードする外因性核酸分子も含むことができる：CoA転移酵素活性を持つポリペプチド；E1活性化因子活性を持つポリペプチド；ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるE2αポリペプチド；ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるE2βポリペプチド；および脂肪分解酵素活性を持つポリペプチド。この細胞は、特に、アクリル酸のエステル（例えば、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、およびブチルアクリレート）のような産物の生産に使用できる。
【００１１】
いくつかの態様では、3-HP-CoAまたは3-HPから、酵素活性を持つポリペプチドを用いることによって、1,3プロパンジオールが作製できる。これらのポリペプチドは、インビトロまたはインビボのいずれでも使用できる。3-HP-CoAを1,3プロパンジオールに変換する場合には、オキシド還元酵素活性または還元酵素活性を持つポリペプチド（例えば、1.1.1-クラスの酵素）が使用できる。または、3-HPから1,3プロパンジオールを作製する場合には、(1) アルデヒド脱水素酵素活性を持つポリペプチド（例えば、1.1.1.34クラスの酵素）および (2) アルコール脱水素酵素活性を持つポリペプチド（例えば、1.1.1.32クラスの酵素）の組み合せが使用できる。
【００１２】
本発明のいくつかの態様では、産物はインビトロ（細胞外）で生産される。本発明の別の態様では、産物はインビトロおよびインビボ（細胞内）の方法の組み合せを用いて生産される。本発明のまた別の態様では、産物はインビボで生産される。インビボ段階を含む方法では、細胞は、単離された培養細胞、またはトランスジェニック植物、非ヒト哺乳類、もしくは酵母および細菌（例えば、乳酸桿菌（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、バチルス（Bacillus）、および大腸菌（Escherichia coli)）のような単細胞生物のような生物全体でよい。以下では、そのような細胞は生産細胞と呼ばれる。これらの生産細胞によって生産された産物は、3-HPのような有機産物、および/または本発明に記述される核酸分子およびポリペプチドであり得る。
【００１３】
本発明の別の局面では、(1) 配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列、(2) 配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列の少なくとも10の連続するアミノ酸残基を持つアミノ酸配列、(3) 配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列の少なくとも10の連続するアミノ酸残基と少なくとも65％の配列の同一性を持つアミノ酸配列、(4) 保存的なアミノ酸置換を持つ配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列を持つアミノ酸配列、または(5) 配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列と少なくとも65％の配列の同一性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドが提供される。したがって、本発明は本明細書に記述される任意のポリペプチドをコードする核酸配列、および本明細書に記述される任意のポリペプチドに結合する特異的な結合剤も提供する。同様に、本発明は本明細書に記述される任意のポリペプチドをコードする任意の核酸配列を含む形質転換細胞も提供する。これらの細胞を用いて、核酸分子、ポリペプチド、および有機化合物が生産できる。ポリペプチドは有機化合物の形成の触媒、または特異的な結合剤を生産するための抗原として使用できる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は以下の核酸配列を少なくとも1つ含む単離された核酸分子を提供する：(1) 配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列；(2)配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列の少なくとも10の連続するヌクレオチドを持つ核酸配列；(3)配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列にハイブリダイゼーション条件下（例えば、中程度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズする核酸配列；(4)配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列の少なくとも10の連続するヌクレオチドと65％の配列の同一性を持つ核酸配列；および(5)配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列と少なくとも65％配列の同一性を持つ核酸配列。したがって、本発明は上記の任意の核酸配列を持つ、少なくとも1つの外因性核酸を含む生産細胞も提供する。生産細胞は、CoA転移酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性、CoA合成酵素活性、脱水酵素活性、脱水素酵素活性、マロニルCoA還元酵素活性、βアラニンアンモニアリアーゼ活性、および/または3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性のような酵素活性を持つポリペプチドを発現するために使用できる。したがって、本発明は上述の核酸配列によってコードされるポリペプチドの生産方法も提供する。
【００１５】
本発明は、ラクテート、ホスホエノールピルビン酸(PEP)、またはピルベートから3-HPを作製する方法のような、いくつかの方法も提供する。いくつかの態様では、ラクテート、PEP、またはピルベートから3-HPを作製する方法は、細胞が3-HPを生産できる条件下で、少なくとも1つの外因性核酸を含む細胞を培養する段階を含む。これらの方法は、本明細書に記述される種々の生産細胞を用いて実施できる。いくつかの態様では、生産細胞は、以下の活性を1つまたは複数持つことができる：CoA転移酵素活性、3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性、3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性、脱水酵素活性、および/またはマロニルCoA還元酵素活性。
【００１６】
別の態様では、本方法はCoA転移酵素活性またはCoA合成酵素活性を持つ第1のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルCoAを形成し、ラクチルCoAにラクチルCoA脱水酵素活性を持つ第2のポリペプチドを接触させてアクリリルCoAを形成させ、その後、アクリリルCoAに3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ第3のポリペプチドを接触させて3-ヒドロキシプロピオン酸CoAを形成させ、その後、3-ヒドロキシプロピオン酸CoAに第1のポリペプチドを接触させて3-HPを形成するか、または3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性もしくは3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性を持つ第4のポリペプチドを接触させて3-HPを形成する、3-HPの作製方法に関する。
【００１７】
本発明の別の局面では、重合3-HPの作製方法が提供される。これらの方法は、3-ヒドロキシプロピオン酸CoAを上述のようにして作製し、3-ヒドロキシプロピオン酸CoAにポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドを接触させて重合3-HPを形成させることに関する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、3-HPのエステルの作製方法が提供される。これらの方法では、上述のようにして3-HPを作製し、さらに3-HPに脂肪分解酵素活性を持つ第5のポリペプチドを接触させてエステルを形成する。
【００１９】
本発明は重合アクリレートの作製方法も提供する。これらの方法では、CoA合成酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性、およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ細胞を培養し、重合アクリレートが作製される段階を含む。したがって、本発明は、CoA合成酵素活性を持つ第1のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルCoAを形成させ、ラクチルCoAにラクチルCoA脱水酵素活性を持つ第2のポリペプチドを接触させてアクリリルCoAを形成させ、その後、アクリリルCoAにポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ第3のポリペプチドを接触させて重合アクリレートを形成する、重合アクリレートの作製方法も提供する。
【００２０】
本発明はアクリル酸のエステルの作製方法も提供する。これらの方法では、細胞がエステルの生産を行なえるような条件下で、CoA転移酵素活性、脂肪分解酵素活性、およびラクチルCoA脱水酵素活性を持つ細胞を培養する段階を含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、アクリリルCoAを上述のようにして形成し、その後、アクリリルCoAにCoA転移酵素活性を持つポリペプチドを接触させてアクリレートを形成し、アクリレートに脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドを接触させてエステルを形成する、アクリル酸のエステルの作製方法を提供する。
【００２２】
本発明は、3-HPを作製する方法も提供する。これらの方法では、少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む細胞を培養して、アセチルCoAまたはマロニルCoAから3-HPを生産する段階を含む。
【００２３】
別の態様では、アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を持つ第1のポリペプチドをアセチルCoAに接触させてマロニルCoAを形成し、マロニルCoAにマロニルCoA還元酵素活性を持つ第2のポリペプチドを接触させて3-HPを形成させる、3-HPの作製方法が提供される。
【００２４】
別の態様では、マロニルCoAにマロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドを接触させて3-HPを作製できる。
【００２５】
別の態様では、本発明はβアラニン中間体を用いた3-HPの作製方法を提供する。この方法では、βアラニンCoAにβアラニルCoAアンモニアリアーゼ活性（配列番号：160または161に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチドなど）を持つ第1のポリペプチドを接触させてアクリリルCoAを形成させ、アクリリルCoAに3-HP-CoA脱水酵素活性を持つ第2のポリペプチドを接触させて3-HP-CoAを形成させ、3-HP-CoAにグルタミン酸脱水素酵素活性を持つ第3のポリペプチドを接触させて3-HPを作製することによって、実施できる。
【００２６】
特に記載のないかぎり、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が共通して理解するのと同じ意味を持つ。本明細書に記述されたものと同様または同等な方法および材料が、本発明の実施または検証に使用できるが、適当な方法および材料は以下に説明される。本明細書に引用される全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先される。また、材料、方法、および実施例は説明のみのためであり、限定する意図はない。
【００２７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかであると思われる。
【００２８】
詳細な説明
I. 用語
核酸：
本明細書で使用される「核酸」という用語は、RNA、ならびにcDNA、ゲノムDNA、および合成（例えば、化学合成）DNAを含むがこれらに限定されないDNAの両方を含む。核酸は二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖の場合は、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。また、核酸は環状または線状であり得る。
【００２９】
単離された：
核酸に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、直接隣接している配列の両方（5’末端1つと3’末端1つ）と直接隣接していない、天然に存在する核酸を指す。例えば、単離された核酸は、天然に存在するゲノムでその組換えDNA分子に通常見出される直接隣接している核酸配列の1つが除去されたまたは存在しない場合、任意の長さの組換えDNA分子であり得るが、これに限定されない。したがって、単離された核酸は、他の配列とは独立して別の分子として存在する組換えDNA（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理で作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片）、ならびにベクター、自律複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス）、または原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAを含むが、これらに限定されない。また、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である組換えDNA分子も含み得る。
【００３０】
非天然核酸は、天然に存在せず、天然に存在するゲノムで直接隣接する配列を持たないため、核酸に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、任意の非天然核酸も含む。例えば、組換え核酸のような非天然核酸は、単離された核酸と考えられる。組換え核酸は、通常の分子クローニングまたは核酸の化学合成によって作製される。単離された非天然核酸は、他の配列とは独立しているか、またはベクター、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれている可能性がある。また、非天然核酸にはハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である核酸分子も含まれ得る。
【００３１】
例えばcDNAもしくはゲノムライブラリーの中で数百から数百万の他の核酸分子中に存在する核酸、またはゲノムDNAの制限消化物を含むゲルスライスは単離された核酸と考えられないことは、当業者には明らかであると思われる。
【００３２】
外因性の：
核酸および特定の細胞に関して本明細書で使用される「外因性の」という用語は、天然に存在するその特定の細胞からは生じない任意の核酸を指す。したがって、非天然核酸は、細胞中に導入されるとその細胞にとって外因性であると考えられる。天然に存在する核酸も、特定の細胞にとって外因性であり得る。例えば、ヒトXの細胞から単離された染色体全体は、その染色体がヒトYの細胞に導入されると、Yの細胞にとっては外因性の核酸である。
【００３３】
ハイブリダイゼーション：
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、2つの核酸分子のヌクレオチド配列中の相補性を検定する方法であり、相補的な一本鎖DNAおよび/またはRNAが二本鎖分子を形成する能力に基づく。核酸ハイブリダイゼーション技術は、本発明の範囲内の単離された核酸を得るために使用できる。簡単に述べると、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列にある程度の相同性を持つ任意の核酸をプローブとして使用して、中等度から高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって類似した核酸を同定することができる。同定されると、核酸を精製、配列決定、および分析して、それが本明細書に記述される発明の範囲内かどうかを決定できる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、プローブにハイブリダイズするそれぞれDNAまたはRNA配列を同定するサザンまたはノーザン分析によって行なえる。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、酵素、または32Pのような放射性同位元素で標識できる。分析するDNAまたはRNAは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロース、ナイロン、または他の適当な膜に転写し、サムブルック（Sambrook）ら、(1989) 「分子クローニング（Molecular Cloning）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Plainview、NYのセクション7.39-7.52に説明されるような、当技術分野で周知の標準的な手法を用いてプローブとハイブリダイズさせることができる。通常は、プローブは少なくとも約20ヌクレオチドの長さである。例えば、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、または142に定められる20ヌクレオチドの配列に対応するプローブを用いて、同一または類似した核酸を同定できる。また、20ヌクレオチドよりも長いまたは短いプローブも使用できる。
【００３５】
本発明は、長さが少なくとも約12塩基（例えば、少なくとも13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基）で、ハイブリダイゼーション条件下で配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列を持つ核酸のセンスまたはアンチセンス鎖にハイブリダイズする、単離された核酸配列も提供する。ハイブリダイゼーション条件は、中等度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり得る。
【００３６】
本発明の目的のためには、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約42℃で、25 mM KPO4 (pH 7.4)、5X SSC、5X デンハルト溶液、50μg/mL超音波処理した変性サケ精子DNA、50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、および1-15 ng/mLプローブ（約5 x 107 cpm/μg）を含むハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイゼーションが行われ、2X SSCおよび0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液を用いて約50℃で洗浄することを意味する。
【００３７】
かなりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約42℃で、25 mM KPO4 (pH 7.4)、5X SSC、5X デンハルト溶液、50μg/mL超音波処理した変性サケ精子DNA、50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、および1-15 ng/mLプローブ（約5 x 107 cpm/μg）を含むハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイゼーションが行われ、0.2X SSCおよび0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液を用いて約65℃で洗浄することを意味する。
【００３８】
精製した：
本明細書で使用される「精製した」という用語は、絶対的な純度を必要とせず、相対的な用語と意図される。したがって、例えば、精製したポリペプチドまたは核酸調製物は、それぞれ対象のポリペプチドまたは核酸が、生物の中の天然の環境におけるポリペプチドまたは核酸よりも、高い濃度であるもので良い。例えば、ポリペプチド調製物は、そのポリペプチド含量が、調製物の総タンパク質含量の少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、または99%であれば、精製されていると考えられる。
【００３９】
形質転換された：
「形質転換された」細胞は、例えば、分子生物学の手法によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用される「形質転換」という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入するための全ての手法を含み、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、接合、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、およびパーティクルガン法による裸のDNAの導入を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
組換え:
「組換え」核酸は、(1) それが発現される生物中に天然には存在しない配列、または(2) 2つの別々の、より短い配列の人工的な組み合せによって作製される配列を持つものである。この人工的な組み合せは、しばしば化学合成、またはより一般的には核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子組換え手法によって、実行される。「組換え」は、人工的に操作されたが、核酸が単離された生物に見られるものと同じ調節配列およびコード領域を含む核酸分子の記述にも使用される。
【００４１】
特異的結合剤:
「特異的結合剤」は、本明細書に記述される任意のポリペプチドに特異的に結合する能力がある物質で、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒト化モノクローナル抗体を含む）、およびFab、F(ab’)2、およびFv断片のようなモノクローナル抗体の断片、ならびにそのようなポリペプチドのエピトープに特異的に結合できる任意の他の物質を含み得る。
【００４２】
本明細書に提供されるポリペプチドに対する抗体（またはその断片）は、そのようなポリペプチドの精製または同定に使用できる。本明細書に提供されるアミノ酸および核酸配列を用いて、本明細書に記述されるポリペプチドを認識する、特異的な抗体に基づく結合剤を生産できる。
【００４３】
ポリペプチド、ポリペプチドの一部、またはその変異型に対してモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が作製できる。選択的に、ポリペプチド抗原上の１つまたは複数のエピトープに対して作製された抗体は、そのポリペプチドを特異的に検出する。すなわち、1つの特定のポリペプチドに対して作製された抗体は、その特定のポリペプチドを認識し、結合するが、他のポリペプチドを実質的に認識または結合しない。抗体が特定のポリペプチドに特異的に結合するという決定は、例えば、ウェスタンブロッティング（Sambrookら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第2版、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989参照）のような、いくつかの標準的な免疫アッセイ法の任意のものを用いてできる。
【００４４】
所定の抗体調製物（配列番号：2に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチドに対してマウスで作製された調製物）が適当なポリペプチド（例えば、配列番号：2に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチド）を特異的に検出することをウェスタンブロッティングによって決定するために、細胞の全タンパク質を細胞から抽出し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。分離した細胞の全タンパク質を膜（例えば、ニトロセルロース）に転写し、膜と抗体調製物をインキュベーションすることができる。膜を洗って非特異的に結合した抗体を除去した後、特異的に結合した抗体の存在を、アルカリホスファターゼのような抗体に結合した適当な2次抗体（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出できる。5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウムを適用すると免疫局在したアルカリホスファターゼによって濃青色の化合物が生産されるためである。
【００４５】
免疫原として使用するのに適した実質的に純粋なポリペプチドを、トランスフェクトされた細胞、形質転換細胞、または野生型細胞から得ることができる。最終調整物中のポリペプチド濃度は、例えば、アミコンフィルター装置で濃縮することにより、1ミリリットル当たり数マイクログラムのレベルに調整できる。また、全長のポリペプチドからわずか9アミノ酸残基のポリペプチドまでの範囲のサイズのポリペプチドが免疫原として使用できる。そのようなポリペプチドは、細胞培養での生産、標準的な方法を用いた化学合成、または大きなポリペプチドを精製可能なより小さなポリペプチドに切断することによって得られる。長さわずか9アミノ酸残基のポリペプチドは、MHCクラスIまたはMHCクラスII分子のような主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子と共に提示されると、免疫原性を持つ。したがって、少なくとも9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、またはそれ以上の、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列の連続するアミノ酸残基を持つポリペプチドは、抗体を生産するための免疫原として使用できる。
【００４６】
本明細書に開示される任意のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、ケーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein） (Nature 256:495 (1975))の古典的方法またはそれから派生する方法にしたがって、マウスハイブリドーマから調製できる。
【００４７】
本明細書に開示される任意のポリペプチドの異質性エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、免疫原性を増強するために改変したまたは改変していない、ポリペプチド（またはその断片）によって適当な動物を免疫することによって調製できる。ウサギの効果的な免疫プロトコールは、バイタカイティス（Vaitukaitis）ら（J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971)）に記述されている。
【００４８】
抗体全体の代わりに抗体断片も使用でき、これは原核宿主細胞中で容易に発現できる。「抗体断片」とも呼ばれる、モノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分の作製および使用方法は、当技術分野で周知であり、ベター（Better）およびホロウィッツ（Horowitz） (methods Enzymol. 178:476-496 (1989))、グロッックシュバー（Glockshuber）ら（Biochemistry 29:1362-1367 (1990)、米国特許第5,648,237号（「機能的抗体断片の発現(Expression of Functional Antibody Fragments)」）、米国特許第4,946,778号（「一本鎖ポリペプチド結合分子(Single Polypeptide Chain Binding Molecules)」）、米国特許第5,455,030号（「一本鎖ポリペプチド結合分子を用いた免疫療法(Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules)」）、および本明細書に引用された参照文献を含む。
【００４９】
機能的に結合：
第1の核酸配列が、第2の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に、第1の核酸は第2の核酸配列と「機能的に結合」しているという。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を与える場合、そのコード配列に機能的に連結している。一般に、機能的に連結したDNA配列は連続しており、2つのポリペプチドコード領域を結合させる必要がある場合には、同じリーディングフレームにある。
【００５０】
プローブおよびプライマー：核酸プローブおよびプライマーは、本明細書に提供されるアミノ酸配列および核酸配列に基づいて、容易に調製できる。「プローブ」には、検出可能な標識またはレポーター分子を含む単離された核酸が含まれる。代表的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、および酵素が含まれる。標識の方法、および種々の目的に適した標識の選択のガイドは、例えば、サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第2版、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989、およびアウスベル（Ausubel）ら編、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New York（定期的に改定）、1987に記述されている。
【００５１】
「プライマー」は、通常は10またはそれ以上のヌクレオチドの核酸分子である（例えば、約10ヌクレオチドと約100ヌクレオチドの間の核酸分子）。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的核酸鎖とアニーリングさせ、プライマーと標的核酸鎖の間のハイブリッドを形成させ、その後、例えばDNAポリメラーゼ酵素によって標的核酸鎖に沿って延長できる。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または当技術分野で周知の他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅に使用できる。
【００５２】
プローブおよびプライマーの調製および使用法は、例えば、サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第2版、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989；アウスベルら編、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New York（定期的に改定）、1987；イニス（Innis）ら編、「PCRプロトコール、方法と適用のガイド (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications)」Academic Press、San Diego、1990のような参照文献に記述されている。PCRプライマー対は、例えば、プライマー（Primer）バージョン0.5、.COPYRGT. 1991、Whitehead Institute for Biomedical Research、Cambridge、Mass.）のような、その目的のためのコンピュータプログラムを用いて、既知の配列から導き得る。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性は、長さとともに上昇するが、プローブまたはプライマーの長さは全長の配列からわずか5つの連続するヌクレオチドの範囲であり得ることを理解できると思われる。したがって、例えば、20の連続するヌクレオチドのプライマーは、15ヌクレオチドのみの対応するプライマーよりも、高い特異性で標的にアニーリングし得る。したがって、特異性を高くするためには、例えば、10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーが選択できる。
【００５３】
配列同一性のパーセント：
特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列同定番号で参照される配列との「配列同一性のパーセント」は、以下のように決定される。まず、BLASTNバージョン2.0.14およびBLASTPバージョン2.0.14を含むBLASTZの独立型のBLAST 2シーケンシーズ（BLAST 2 Sequences) (Bl2seq)プログラムを用いて、核酸またはアミノ酸配列を、特定の配列同定番号で定められる配列と比較する。この独立型BLASTZは、フィッシュ（Fish）およびリチャードソン（Richardson）のウェブサイト（www.fr.com）または米国政府の国立バイオテクノロジー情報（National Center for Biotechnology Information）ウェブサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）から入手できる。Bl2seqプログラムの使用方法は、BLASTZに同梱のリードミー（readme）ファイルに記載されている。Bl2seqはBLASTNまたはBLASTPアルゴリズムのいずれかを用いて2つの配列の比較を行なう。BLASTNは核酸配列の比較に使用され、BLASTPはアミノ酸配列の比較に使用される。2つの核酸配列を比較するには、以下のようにオプションを設定する。-iは比較する第1の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、 C:＼seq1.txt）；-jは比較する第2の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、C:＼seq2.txt）；-pはblastnに設定し；-oは任意の所望のファイル名に設定し（例えば、C:＼output.txt）；-qは-1に設定し；-rは2に設定し；他の全てのオプションは、初期設定のままにする。例えば、2つの配列の間の比較を含むアウトプットファイルを作製するためには、以下のようなコマンドが使用できる：C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt-j c:＼seq2.txt -p blastn -o c:＼output.txt -q -1-r 2。2つのアミノ酸配列を比較するためには、Bl2seqのオプションは、以下のように設定する。-iは比較する第1のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、 C:＼seq1.txt）；-jは比較する第2のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、C:＼seq2.txt）；-pはblastpに設定し；-oは任意の所望のファイル名に設定し（例えば、C:＼output.txt）；他の全てのオプションは、初期設定のままにする。例えば、2つのアミノ酸配列の間の比較を含むアウトプットファイルを作製するためには、以下のようなコマンドが使用できる：C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt。２つの比較された配列が相同性を持つならば、指定されたアウトプットファイルは、整列された配列として、相同な領域を示す。2つの比較された配列が、相同性を持たないならば、指定されたアウトプットファイルは、整列された配列を提示しない。
【００５４】
整列がされたら、両方の配列で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が示されている位置の数を数えることによって、一致した数が決定できる。配列同一性パーセントは、一致した数を同定された配列（例えば、配列番号：1）に定められる配列の長さ、または区切られた長さ（例えば、同定された配列中で定められる配列における100の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で割り、その値を100倍することで、得られる。例えば、配列番号：1に定められる配列と整列すると1166の一致を持つ核酸配列は、配列番号：1に定められる配列と75.0パーセント同一である（すなわち、1166÷1155‡100=75.0）。配列同一性パーセントは、0.1の位に四捨五入する。例えば、75.11、75.12、75.13および75.14は四捨五入で75.1になり、75.15、75.16、75.17、75.18および75.19は四捨五入で75.2になる。また、長さの値は必ず整数である。別の例では、以下のような同定された配列の20の連続するヌクレオチドと整列された20ヌクレオチドの領域を含む標的配列は、その同定された配列に対して75パーセントの配列同一性を持つ（すなわち、15÷20‡100=75）領域を含む。
0004490628.tif 000002
【００５５】
保存的置換：
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、表1に定められる任意のアミノ酸置換を指す。典型的には、保存的置換は、ポリペプチドの活性に影響をほとんどまたは全く持たない。例えば部位特異的突然変異導入法またはPCRのような標準的な手法を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、1つまたは複数の保存的置換を持つポリペプチドが生産できる。
【表１】
0004490628.tif 000003
【００５６】
II. 代謝経路
本発明は、3-HPおよび他の有機化合物（例えば、1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸エステル、重合3-HP，および3-HPのエステル）の生産に関する方法および材料を提供する。特に、本発明は3-HPの生産のための単離された核酸、ポリペプチド、宿主細胞、および方法および材料、ならびに1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸エステル、重合3-HP，および3-HPのエステルのような他の有機化合物を提供する。
【００５７】
したがって、本発明はPEPから有機化合物を生産するために使用できるいくつかの代謝経路を提供する（図1-5、43-44、54，および55）。図1に示されるように、乳酸はCoA転移酵素活性（EC 2.8.3.1）を持つポリペプチドによってラクチルCoAに変換される。得られたラクチルCoAはラクチルCoA脱水酵素活性（EC 4.2.1.54）を持つポリペプチド（または活性化E2αおよびE2β複合体のような複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルCoAに変換される。得られたアクリリルCoAは3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性（EC 4.2.1.-）を持つポリペプチドによって、3-ヒドロキシプロピオニルCoA（3-HP-CoA）に変換される、得られた3HP-CoAはCoA転移酵素活性を持つポリペプチド、3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性（EC 3.1.2.-）を持つポリペプチド、または3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性（EC 3.1.2.4）を持つポリペプチドによって3-HPに変換され得る。
【００５８】
CoA転移酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、メガスフェラ・エルスデニ(Magasphaera elsdenii)、クロストリジウム・プロピオニクム(Clostridium propionicum)、クロストリジウム・クルイベリ(Clostridium kluyveri)、および大腸菌を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、実施例1のようにしてメガスフェラ・エルスデニから得られ、配列番号：1に定められるような配列を持ち得る。また、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：1の変形は、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドをコードするために使用できる。
【００５９】
ラクチルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（または活性化E2αおよびE2β複合体のような複数のポリペプチドの複合体のポリペプチド）、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、メガスフェラ・エルスデニおよびクロストリジウム・プロピオニクムを含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ複数のポリペプチドの複合体を形成し得るE1活性化因子、E2αサブユニット、およびE2βサブユニットをコードする核酸は、実施例2に記述されるようにしてメガスフェラ・エルスデニから得られる。E1活性化因子をコードする核酸は、配列番号：9に定められる配列を含み得る。E2αサブユニットをコードする核酸は、配列番号：17に定められる配列を含み得る。およびE2βサブユニットをコードする核酸は、配列番号：25に定められる配列を含み得る。また、ラクチルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体のポリペプチド）、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：9、17、および25の変形は、CoA転移酵素活性を持つ複数のポリペプチドの複合体のポリペプチドをコードするために使用できる。
【００６０】
3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、クロロフレクサス・オーランチアクス（Chloroflexus aurantiacus）、カンジダ・ルゴーサ（Candida rugosa）、ロードスピリリウム・ラブラム（Rhodosprillium rubrum）、およびロドバクター・カプスレーテス（Rhodobacter capsulates）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドは、実施例3のようにしてクロロフレクサス・オーランチアクスから得られ、配列番号：40に定められるような配列を持ち得る。また3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：40の変形は、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードするために使用できる。
【００６１】
3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、カンジダ・ルゴーサを含むがこれに限定されない様々な種から得られる。3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)、クマネズミ（rattus）、およびヒト（homo sapiens）を含む様々な種から得られる。例えば、3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、ヒトから得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号U66669に定められる配列を持ち得る。
【００６２】
本明細書で使用する「酵素活性を持つポリペプチド」という用語は、反応の完了時にそれ自身が破壊または変化することなく、他の基質の化学反応を触媒する任意のポリペプチドを指す。典型的には、酵素活性を持つポリペプチドは、1つまたは複数の基質からの1つまたは複数の産物の形成を触媒する。そのようなポリペプチドは、脱水酵素/加水酵素、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素/加水酵素、CoA転移酵素、ラクチルCoA脱水酵素、3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素、3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素、ポリヒドロキシ酸合成酵素、CoA合成酵素、マロニルCoA還元酵素、βアラニンアンモニアリアーゼ、および脂肪分解酵素のような酵素に伴う酵素活性を含むがこれらに規定されない任意の種類の酵素活性を持ち得る。
【００６３】
図2に示すように、ラクテートはCoA合成酵素活性（EC 6.2.1.-）を持つポリペプチドによってラクチルCoAに変換される。得られたラクチルCoAはラクチルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルCoAに変換される。得られたアクリリルCoAは3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドによって、3-HP-CoAに変換され、得られた3-HP-CoAはポリヒドロキシ酸合成酵素活性（EC 2.3.1.-）を持つポリペプチドによって重合3-HPに変換される。CoA合成酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌、ロドバクター・スファロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、および腸炎菌（Salmonella enterica）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、CoA合成酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌から得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号U00006に定められる配列を持ち得る。ラクチルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に提供されるようにして得られる。3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸はまた、本明細書に提供されるようにして得られる。ポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、ロドバクター・スファロイデス、コマモナス・アシドロランス（Comamonas acidororans）、ラストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、およびシュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、ポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸はロドバクター・スファロイデスから得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号X97200に定められる配列を持ち得る。
【００６４】
図3に示すように、ラクテートはCoA転移酵素活性を持つポリペプチドによってラクチルCoAに変換される。得られたラクチルCoAはラクチルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルCoAに変換される。得られたアクリリルCoAは3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドによって、3-HP-CoAに変換される。得られた3-HP-CoAはCoA転移酵素活性を持つポリペプチド、3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性を持つポリペプチド、または3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性を持つポリペプチドによって3-HPに変換され、得られた3-HPは脂肪分解酵素活性（EC 3.1.1.-）を持つポリペプチドによって、3-HPのエステルに変換される。脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、カンジダ・ルゴーサ、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、カンジダ・ルゴーサから得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号A81171に定められる配列を持ち得る。
【００６５】
図4に示すように、ラクテートはCoA合成酵素活性（EC 6.2.1.-）を持つポリペプチドによってラクチルCoAに変換される。得られたラクチルCoAはラクチルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルCoAに変換される。得られたアクリリルCoAはポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドによって重合アクリレートに変換されることができる。
【００６６】
図5に示すように、ラクテートはCoA転移酵素活性を持つポリペプチドによってラクチルCoAに変換される。得られたラクチルCoAはラクチルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルCoAに変換される。得られたアクリリルCoAはCoA転移酵素活性を持つポリペプチドによってアクリレートに変換される。得られたアクリレートは脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドによってアクリル酸のエステルに変換され得る。
【００６７】
図44に示すように、アセチルCoAはアセチルCoAカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによってマロニルCoAに変換され、得られたマロニルCoAはマロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドによって3-HPに変換される。アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌およびクロロフレクサス・オーランチアクスを含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌から得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号M96394またはU18997に定められる配列を持ち得る。マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、クロロフレクサス・オーランチアクス、スルフォロブス・メタシラス（Sulfolobus metacillus）、およびアシディアナス・ブリアレイ（Acidianus brierleyi）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られ、配列番号：140に定められる配列と類似した配列を持ち得る。また、マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：140の変形は、マロニルCoA還元酵素を持つポリペプチドをコードするために使用できる。
【００６８】
マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドは、NADPHを補因子として使用する場合がある。例えば、配列番号：141に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチドは、マロニルCoAを3-HPに変換する際に、NADPHを補因子として使用する、マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドである。同様に、マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドは、NADHを補因子として使用する場合がある。そのようなポリペプチドは、マロニルCoA還元酵素活性を持ちNADPHを補因子として使用するポリペプチドを、マロニルCoA還元酵素活性を持ち、NADHを補因子として使用するポリペプチドに変換することによって得られ得る。NADPHを補因子として使用するポリペプチドを、NADHを補因子として使用するポリペプチドに変換するためには、他の研究者によって記述されたような（Eppinkら、J. Mol. Biol.、292(1):87-96 (1999)、HallおよびTomsett、Microbiology、146(Pt 6):1399-406 (2000)、およびDohrら、Proc. Natl. Acad. Sci.、98(1):81-86 (2001)）、任意の方法が使用できる。例えば、配列番号：140に定められる核酸配列によってコードされるポリペプチドを、マロニルCoAを3-HPに変換する際にNADPHの代わりにNADHを補因子として使用するポリペプチドに変換するために、変異誘発が使用できる。
【００６９】
図43に示すように、プロピオネートは、配列番号：39に定められる配列を持つポリペプチドのような、CoA合成酵素活性を持つポリペプチドによって、プロピオニルCoAに変換される。得られたプロピオニルCoAは、配列番号：39に定められるような配列を持つポリペプチドのような、脱水素酵素活性を持つポリペプチドによって、アクリリルCoAに変換される。得られたアクリリルCoAは、(1) CoA転移酵素活性またはCoA加水分解酵素活性を持つポリペプチドによってアクリレートに、(2) 配列番号：39に定められるような配列を持つポリペプチドのような、3-HP脱水酵素（アクリリルCoA加水酵素または単に加水酵素とも呼ばれる）活性を持つポリペプチドによって3-HP-CoAに、または (3) ポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドによって重合アクリレートに、変換され得る。得られたアクリレートは、脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドによって、アクリル酸のエステルに変換される。得られた3-HP-CoAは、(1) CoA転移酵素活性を持つポリペプチド、3-ヒドロキシプロピオニルCoA加水分解酵素活性（EC 3.1.2.-）を持つポリペプチド、もしくは3-ヒドロキシイソブトリルCoA加水分解酵素活性（EC 3.1.2.4）によって3-HPに、またはポリヒドロキシ酸合成酵素活性（EC 2.3.1.-）を持つポリペプチドによって重合3-HPに変換され得る。
【００７０】
図54に示すように、PEPはβアラニンに変換できる。βアラニンは、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドを使用してβアラニルCoAに変換できる。次に、βアラニルCoAは、βアラニルCoAアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドを使用して、アクリリルCoAに変換できる。その後、アクリリルCoAは、3-HP-CoA脱水酵素活性を持つポリペプチドを使用して、3-HP-CoAに変換でき、グルタミン酸脱水素酵素活性を持つポリペプチドを使用して、3-HP-CoAを3-HPに変換できる。
【００７１】
図55に示すように、3-HPはβアラニンから生産することができ、まずβアラニンに4,4-アミノブチレートアミノ転移酵素活性を持つポリペプチドを接触させて、マロン酸セミアルデヒドを生成する。マロン酸セミアルデヒドは、3-HP脱水素酵素活性を持つポリペプチド、または3-ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素活性を持つポリペプチドを用いて、3-HPに変換できる。
【００７２】
III. 核酸分子およびポリペプチド
本発明は、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列全体を含む単離された核酸を提供する。また、本発明は配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列の一部を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる任意の15ヌクレオチドの配列と同一の15ヌクレオチドの配列を含む単離された核酸を提供し、これにはヌクレオチド番号1から始まりヌクレオチド番号15で終わる配列、ヌクレオチド番号2から始まりヌクレオチド番号16で終わる配列、ヌクレオチド番号3から始まりヌクレオチド番号17で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。本発明が、15ヌクレオチドより長く（例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のヌクレオチド）、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列の任意の部分と同一のヌクレオチド配列を含む単離された核酸も提供することは理解されると思われる。例えば、本発明は配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる任意の25ヌクレオチドの配列と同一の25ヌクレオチドの配列を含む単離された核酸を提供し、これにはヌクレオチド番号1から始まりヌクレオチド番号25で終わる配列、ヌクレオチド番号2から始まりヌクレオチド番号26で終わる配列、ヌクレオチド番号3から始まりヌクレオチド番号27で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。別の例には、長さが50またはそれ以上のヌクレオチド（例えば、100、150、200、250、300、またはそれ以上のヌクレオチド）で、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列の任意の部分と同一のヌクレオチド配列を含む単離された核酸が含まれるが、これらに限定されない。そのような単離された核酸には、図6、10、14、18、22、23、25、27、29、31、39、49、または51に示される一行の配列の核酸配列を含む単離された核酸が含まれ、これは、これらの図に示される一行の配列は、最後の行を可能な例外として、少なくとも50塩基を含むヌクレオチド配列を提供するためであるが、これらに限定されない。
【００７３】
また、本発明は配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列の変異型を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、またはその任意の組み合せ（例えば、単一の欠失と複数の挿入）を含む、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列を含む単離された核酸を提供する。そのような単離された核酸分子は、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列と、少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、または99パーセントの配列同一性を持つことができる。
【００７４】
本発明は、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる核酸配列の変異型を含む単離された核酸の複数の例を提供する。例えば、図8は配列番号：1に定められる配列と他の3つの核酸配列を整列させたものである。配列番号：1に定められる配列の変異型の例には、図8に提供される配列番号：1に定められる配列の任意の変異型が含まれるが、これらに限定されない。配列番号：1に定められる配列の特定の位置におけるヌクレオチド（またはその欠如）と、図8に示される他の3つのヌクレオチド配列（配列番号：3、4、および5）の任意のものの整列した同じ位置におけるヌクレオチド（またはその欠如）を比較すると、配列番号：1に定められる配列の特異的な変化のリストが提供されるので、そのような変異型は、図8に提供されていることになる。例えば、配列番号：1の49番目の位置の「a」は、図8に示されるように「c」で置換できる。また図8に示されるように、配列番号：1の590番目の位置の「a」は、「atgg」と置換でき、配列番号：1の393番目の位置の「g」の」前に「aaac」が挿入でき；または配列番号：1の736番目の位置の「gaa」は削除できる。配列番号：1に定められる配列は、任意の数の変異および変異のタイプの任意の組み合せを含み得る。例えば、配列番号：1に定められる配列は、図8に提供される1つの変異または図8に提供される複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、またはそれ以上）の変異を含み得る。図8に提供される核酸配列は、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドをコードし得る。本発明は、図8に示され、本明細書に記述されるように、配列番号：1に定められる配列の一部の変異型を含む単離された核酸も提供する。
【００７５】
同様に、図12は配列番号：9の変異型およびその一部を提供する。図16は配列番号：17の変異型およびその一部を提供する。図20は配列番号：25の変異型およびその一部を提供する。図32は配列番号：40の変異型およびその一部を提供する。および図53は配列番号：140の変異型を提供する。
【００７６】
本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列全体をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。また、本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる任意の15アミノ酸の配列と同一の15アミノ酸をコードするの核酸配列を含む単離された核酸を提供し、このアミノ酸配列にはアミノ酸残基番号1から始まりアミノ酸残基番号15で終わる配列、アミノ酸残基番号2から始まりアミノ酸残基番号16で終わる配列、アミノ酸残基番号3から始まりアミノ酸残基番号17で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。本発明が、15アミノ酸残基より長く（例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 またはそれ以上のアミノ酸残基）、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸も提供することは理解されると思われる。例えば、本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる任意の25アミノ酸の配列と同一の25アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供し、このアミノ酸配列にはアミノ酸残基番号1から始まりアミノ酸残基番号25で終わる配列、アミノ酸残基番号2から始まりアミノ酸残基番号26で終わる配列、アミノ酸残基番号3から始まりアミノ酸残基番号27で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。別の例には、長さが50またはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、100、150、200、250、300、またはそれ以上のアミノ酸残基）で、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸が含まれるが、これらに限定されない。そのような単離された核酸には、図7、11、15、19、24、26、28、30、または50に示される一行の配列のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸が含まれ、これは、これらの図に示される一行の配列は、最後の行を可能な例外として、少なくとも50残基を含むアミノ酸配列を提供するためであるが、これらに限定されない。
【００７７】
また、本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、またはその任意の組み合せ（例えば、単一の欠失と複数の挿入）を含む、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。そのような単離された核酸分子は、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列と、少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、または99パーセントの配列同一性を持つアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。
【００７８】
本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸の例を複数提供する。例えば、図9は配列番号：2に定められるアミノ酸配列を、他の3つのアミノ酸配列と整列させたものである。配列番号：2に定められる配列の変異型の例には、図9に提供される配列番号：2に定められる配列の任意の変異型が含まれるが、これらに限定されない。配列番号：2に定められる配列の特定の位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）と、図9に示される他の3つのアミノ酸配列（配列番号：6、7、および8）の任意のものの整列した同じ位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）を比較すると、配列番号：2に定められる配列の特異的な変化のリストが提供されるので、そのような変異型は、図9に提供されていることになる。例えば、図9に示されるように、配列番号：2の17の位置の「k」は、「p」または「h」で置換できる。また図9に示されるように、配列番号：2の125の位置の「v」は、「i」または「f」で置換できる。配列番号：2に定められる配列は、任意の数の変異および変異のタイプの任意の組み合せを含み得ることは理解されると思われる。例えば、配列番号：2に定められる配列は、図9に提供される1つの変異または図9に提供される複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、またはそれ以上）の変異を含み得る。図9に提供されるアミノ酸配列は、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドであり得ることに留意すること。
【００７９】
本発明は、図9に示され、本明細書に記述されるように、配列番号：2に定められる配列の一部の変異型を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸も提供する。
【００８０】
同様に、図13は配列番号：10の変異型およびその一部を提供する。図17は配列番号：18の変異型およびその一部を提供する。図21は配列番号：26の変異型およびその一部を提供する。図33は配列番号：41の変異型およびその一部を提供する。図40、41、および42は配列番号：39の変異型を提供する。および図52は配列番号：141の変異型およびその一部を提供する。
【００８１】
特定の種のコドンの優先順位およびコドンの使用頻度の表を用いて、その特定の種のコドンの使用頻度を使用して、単離された核酸分子を遺伝子操作することができる。例えば、本明細書に提供される単離された核酸は、関心のある特定の生物によって優先的に使用されるコドンを持つように設計できる。
【００８２】
長さが少なくとも約12塩基（例えば、少なくとも13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基）で、ハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：1、9、17、25、33、34、36、38、40、42、129、140、142、162、または163に定められる配列を持つ核酸のセンスまたはアンチセンス鎖にハイブリダイズする、単離された核酸配列も、本発明は提供する。ハイブリダイゼーション条件は、中等度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり得る。
【００８３】
本発明は、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを提供する。また、本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドを提供する。例えば、本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる任意の15アミノ酸の配列と同一の15アミノ酸の配列を含むポリペプチドを提供し、これにはアミノ酸残基番号1から始まりアミノ酸残基番号15で終わる配列、アミノ酸残基番号2から始まりアミノ酸残基番号16で終わる配列、アミノ酸残基番号3から始まりアミノ酸残基番号17で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。本発明が、15アミノ酸残基より長く（例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上のアミノ酸残基）、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供することは理解されると思われる。例えば、本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる任意の25アミノ酸の配列と同一の25アミノ酸の配列を含むポリペプチドを提供し、これにはアミノ酸残基番号1から始まりアミノ酸残基番号25で終わる配列、アミノ酸残基番号2から始まりアミノ酸残基番号26で終わる配列、アミノ酸残基番号3から始まりアミノ酸残基番号27で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。別の例には、長さが50またはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、100、150、200、250、300、またはそれ以上のアミノ酸残基）で、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。そのようなポリペプチドには、図7、11、15、19、24、26、28、30、または50に示される一行の配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、これは、これらの図に示される一行の配列は、最後の行を例外として、少なくとも50残基を含むアミノ酸配列を提供するためであるが、これらに限定されない。
【００８４】
また、本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、またはその任意の組み合せ（例えば、単一の欠失と複数の挿入）を含む、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドは、配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められる配列と、少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、または99パーセントの配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。
【００８５】
本発明は配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドの例を複数提供する。例えば、図9は配列番号：2に定められるアミノ酸配列を、他の3つのアミノ酸配列と整列させたものである。配列番号：2に定められる配列の変異型の例には、図9に提供される配列番号：2に定められる配列の任意の変異型が含まれるが、これらに限定されない。配列番号：2に定められる配列の特定の位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）と、図9に示される他の3つのアミノ酸配列（配列番号：6、7、および8）の任意のものの同じ整列した位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）を比較すると、配列番号：2に定められる配列の特異的な変化のリストが提供されるので、そのような変異型は、図9に提供されていることになる。例えば図9に示されるように、配列番号：2の17の位置の「k」は、「p」または「h」で置換できる。また図9に示されるように、配列番号：2の125の位置の「v」は、「i」または「f」で置換できる。配列番号：2に定められる配列は、任意の数の変異および変異のタイプの任意の組み合せを含み得ることは理解されると思われる。例えば、配列番号：2に定められる配列は、図9に提供される1つの変異または図9に提供される複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、またはそれ以上）の変異を含み得る。図9に提供されるアミノ酸配列は、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドであり得ることに留意すること。
【００８６】
本発明は、図9に示され、本明細書に記述されるように、配列番号：2に定められる配列の一部の変異型を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。
【００８７】
同様に、図13は配列番号：10の変異型およびその一部を提供する。図17は配列番号：18の変異型およびその一部を提供する。図21は配列番号：26の変異型およびその一部を提供する。図33は配列番号：41の変異型およびその一部を提供する。図40、41、および42は配列番号：39の変異型を提供する。および図52は配列番号：141の変異型およびその一部を提供する。
【００８８】
変異型のアミノ酸配列を持つポリペプチドは、酵素活性を保持する可能性がある。そのようなポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発またはPCRのような標準的な手順を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、生産できる。改変の1つのタイプは、同様な生化学的特性を持つアミノ酸残基で、1つまたは複数のアミノ酸残基を置換することを含む。例えば、ポリペプチドは、1つまたは複数の保存的置換を持った配列番号：2、10、18、26、35、37、39、41、141、160、または161に定められるアミノ酸配列を持ち得る。
【００８９】
表1のものよりも保存的ではない置換、すなわち、(a) 置換する部分のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはらせんの立体構造；(b) 標的部位におけるポリペプチドの電荷または疎水性度；または (c) 側鎖の大きさの維持に対する効果がより大きく異なる残基を選択することによって、より実質的な変化を起こすことができる。一般的にポリペプチド機能に最大の変化を起こすと期待される置換は、(a) 例えばセリンもしくはスレオニンのような親水性残基が、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、もしくはアラニンのような疎水性残基を置換している（もしくは置換されている）；(b) システインもしくはプロリンが任意の他の残基を置換している（もしくは任意の他の残基によて置換されている）；(c) 例えばリジン、アルギニン、もしくはヒスチジンのような正の電荷を持つ側鎖が、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸のような負の電荷を持つ側鎖を置換している（もしくは負の電荷を持つ側鎖によって置換されている）；または (d) 例えばフェニルアラニンのような大きな側鎖を持つ残基が、例えばグリシンのような側鎖を持たない残基を置換している（もしくはこの残基によって置換されている）ものである。酵素活性を持つポリペプチドに関して、これらのアミノ酸置換（または他の欠失もしくは付加）の効果は、関連する天然のポリペプチドと同一の基質の、関連する天然のポリペプチドと同一の産物への変換を、そのポリペプチドが触媒する能力を分析することによって、評価できる。したがって、5、10、20、30、40、50、またはそれ以下の保存的置換を持つポリペプチドは、本発明によって提供される。
【００９０】
ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸は、たとえばM13プライマー変異誘発のような標準的なDNA変異誘発技術によって、生産される。これらの技術の詳細は、サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第2版、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989、Ch.15に提供されている。核酸分子は、その分子が導入される特定の生物のコドン使用頻度に合うように、コード領域に変化を含み得る。
【００９１】
または、遺伝コードの縮重を使用して、核酸配列は実質的に変化しているが、天然のアミノ酸配列と同一または実質的に類似したアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするように、コード配列を変化させることができる。例えば、配列番号：2に定められる配列の9番目のアミノ酸残基はアラニンであり、ヌクレオチドの3連コドンGCTによって、オープンリーディングフレーム中にコードされている。遺伝コードの縮重のために、3つの他の3連ヌクレオチドコドン、GCA、GCC、およびGCGもアラニンをコードする。したがって、オープンリーディングフレームの核酸配列は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドの特性に影響を与えることなく、この位置でこれらの3つのコドンの任意のものに、変化させることができる。遺伝コードの縮重に基づいて、本明細書に記述される標準的なDNA変異誘発技術を用いて、または核酸配列の合成によって、本明細書に開示される核酸配列から、核酸変異型を得ることができる。したがって、本発明は同一のポリペプチドをコードするが、遺伝コードの縮重のために核酸配列が異なる、核酸分子も含む。
【００９２】
IV. 3-HPおよび他の有機酸を作製する方法
図1-5、43-44、54、および55に示される経路の各段階は、細胞内（インビボ）または細胞外（インビトロ、例えば、容器またはカラム内）で実行できる。また、有機酸産物は、インビボ合成およびインビトロ合成の組み合せで生産できる。さらに、インビトロ合成の段階は、化学反応または酵素反応でよい。
【００９３】
例えば、図1に提供される段階を実行するために本明細書に提供される微生物を使用するか、示された酵素活性を持つポリペプチドを含む抽出物を用いて図1に提供される段階を実行できる。また、図1-5、43-44、54、および55に提供される変換を実行するために、化学処理も使用できる。例えば、アクリリルCoAは加水分解によってアクリレートに変換できる。他の化学処理には、アクリレートをアクリル酸エステルに変換するトランスエステル化が含まれるが、これに限定されない。
【００９４】
生物変換の開始点として適した炭素源には、炭水化物および合成中間体が含まれる。細胞がピルベートに代謝可能な炭水化物の例には、デキストロースのような糖、トリグリセリド、および脂肪酸が含まれる。
【００９５】
さらに、中間体化学物質も、開始点となり得る。例えば、酢酸および二酸化炭素は発酵培養液に導入できる。アセチルCoA、マロニルCoA，および3-HPはCoA合成酵素活性を持つポリペプチド、アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチド、およびマロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドを用いて、順次生産できる。他の有用な中間体出発物質には、プロピオン酸、アクリル酸、乳酸、ピルビン酸、およびβアラニンが含まれる。
【００９６】
A. ポリペプチドの発現
本明細書に記述されるポリペプチドは、宿主細胞中で個別に生産できるか、宿主細胞中で組み合せて生産できる。また、特定の酵素活性を持つポリペプチドは、天然に存在するか、天然に存在しないポリペプチドである。天然に存在するポリペプチドは、野生型および多型性ポリペプチドを含め、天然に見られるようなアミノ酸配列を持つ任意のポリペプチドである。そのような天然に存在するポリペプチドは、動物（例えば、哺乳類）、植物、真菌、および細菌種を含むがこれらに限定されない、任意の種から得られる。天然に存在しないポリペプチドは、天然に見られないアミノ酸配列を持つ任意のポリペプチドである。したがって、天然に存在しないポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの変異型、または組換えポリペプチドであり得る。例えば、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ天然に存在しないポリペプチドは、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ天然に存在するポリペプチドの、少なくともいくらかの3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を保持した変異型である可能性がある。ポリペプチドは、配列の付加、欠失、置換、またはその組み合せによって変異できる。
【００９７】
本発明は本明細書に記述される代謝経路の段階のうち、1つまたは複数の段階を行なうために使用できる遺伝子組換え細胞、またはインビトロでその後に使用するための開示されたポリペプチドを生産するために使用できる遺伝子組換え細胞を提供する。例えば、個々の微生物は、図1、2、3、4、5、43、44、54、または55に示される段階を実行するために必要な各ポリペプチドが発現されるように、外因性核酸を含む可能性がある。そのような細胞は、任意の数の外因性核酸分子を含み得ることは重要である。例えば、特定の細胞は、図1に示されるように乳酸を3-HPに変換するために必要な6つのポリペプチドの１つを各々コードするような6つの外因性核酸分子を含んでもよく、または特定の細胞が乳酸をアクリリルCoAに変換するために必要なポリペプチドを内因性で生産し、かつアクリリルCoAを3-HPに変換するために必要なポリペプチドをコードする外因性核酸を含んでもよい。
【００９８】
さらに、1つの外因性核酸分子は、1つまたは複数のポリペプチドをコードできる。例えば、1つの外因性核酸分子は、3つの異なるポリペプチドをコードする配列を含み得る。また、本明細書に記述される細胞は、特定の外因性核酸分子を1コピー、または複数コピー（例えば、約5、10、20、35、50、75、100、または150コピー）含み得る。例えば、特定の細胞は図34、35、36、37、38、または45に示される構築物を約50コピー含む可能性がある。また、本明細書に記述される細胞は、複数の外因性核酸分子を含む可能性がある。例えば、特定の細胞は、外因性核酸分子Xを約50コピー、および外因性核酸分子Yを約75コピー含む可能性がある。
【００９９】
別の態様では、本発明の範囲内の細胞は、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み得る。そのような細胞は、任意のレベルの3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持ち得る。例えば、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む細胞は、1時間に乾燥細胞重量1グラムあたり約1mgを超える3-HP-CoA（例えば、1時間に乾燥重量1グラムあたり約10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、またはそれ以上のmgの3-HP-CoA）の比活性を持つ3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持ち得る。または、細胞は、1 x 106細胞からの細胞抽出物が、細胞は10分間につき総タンパク質1 mgあたり約1μgを超える3-HP-CoAが形成される（10分間につき総タンパク質1 mgあたり約約10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、125μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、500μg、またはそれ以上の3-HP-CoAが形成される）比活性を持つような、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持ち得る。
【０１００】
酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子は、本明細書に記述されるような任意の方法を用いて、同定および入手できる。例えば、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子は、PCRを含め、通常の分子クローニングまたは化学的核酸合成手順および手法を用いて、同定および入手できる。また、標準的な核酸配列決定手法、および遺伝コードに基づいて核酸配列をアミノ酸配列に翻訳するソフトウェアプログラムを用いて、特定の核酸が既知の酵素ポリペプチドと配列の相同性を持つかどうかを決定できる。MEGALIGN（登録商標）（DNASTAR、Madison、WI、1997）のような配列整列ソフトウェアは、種々の配列の比較に使用できる。また、既知の酵素ポリペプチドをコードする核酸分子は、標準的な分子クローニング手法（例えば、部位特異的変異誘発）を用いて、変異できる。可能な変異には、欠失、挿入、および塩基置換、ならびに欠失、挿入、および塩基置換の組み合せが含まれるが、これらに限定されない。さらに、核酸およびアミノ酸データベース（例えば、ゲンバンク（登録商標））を用いて酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列を同定できる。簡単に述べると、酵素活性を持つポリペプチドといくらかの相同性を持つ任意のアミノ酸配列、または酵素活性を持つポリペプチドをコードする配列にいくらかの相同性を持つ任意の核酸配列を、ゲンバンク（登録商標）の検索のクエリーに使用できる。同定されたポリペプチドを分析して、これが酵素活性を示すかどうかを決定できる。
【０１０１】
また、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子を同定および入手できる。簡単に述べると、既知の酵素ポリペプチドをコードする任意の核酸分子、またはその断片をプローブとして用いて、中等度から高度にストリンジェントな条件のハイブリダイゼーションによって、類似した核酸分子を同定できる。そのような類似した核酸分子は、単離し、配列決定をし、分析して、コードされているポリペプチドが酵素活性を持つかどうかを決定できる。
【０１０２】
発現クローニング法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子の同定および入手ができる。例えば、特定の酵素ポリペプチドと相互作用することが既知の基質を用いて、酵素ポリペプチドを含むファージディスプレイライブラリーのスクリーニングができる。ファージディスプレイライブラリーは、他の文献（Burrittら、Anal. Biochem. 238:1-13 (1990)）に記述されるようにして作製するか、ノバジェン（Novagen） (ウィスコンシン州マディソン)のような市販の製造元から入手できる。
【０１０３】
さらに、ポリペプチド配列決定法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子を同定および入手できる。例えば、精製されたポリペプチドをゲル電気泳動で分離し、例えば、アミノ酸微量配列決定法によりそのアミノ酸配列を決定できる。決定すると、アミノ酸配列を用いて縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを設計できる。縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRによりポリペプチドをコードする核酸を得られる。得られたら、核酸の配列決定をして、適当な発現ベクターにクローニングし、微生物に導入できる。
【０１０４】
外因性核酸分子を細胞に導入するためには任意の方法が使用できる。実際、細菌および酵母のような微生物に核酸を導入する多くの方法が当技術分野で周知である。例えば、ヒートショック、リポフェクション、電気穿孔法、接合、プロトプラストの融合、遺伝子銃送達が、細菌および酵母細胞に核酸を導入するための一般的な方法である。イトー（Ito）ら、J. Bacterol. 153:163-168 (1983); ダレンス（Durrens）ら、Curr. Genet. 18:7-12 (1990); およびベッカー（Becker）およびガレンテ（Guarente）、「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」 194:182-187 (1991)参照。
【０１０５】
本発明の特定の細胞内に含まれる外因性核酸分子は、任意の形で細胞内で維持され得る。例えば、外因性核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれたり、またはエピソーム状態で維持され得る。すなわち、本発明の細胞は、安定または一過性の形質転換体である。また、本明細書に記載される微生物は、本明細に記載される特定の外因性核酸分子を単一のコピーまたは複数のコピー（例えば、約5コピー、10コピー、20コピー、35コピー、50コピー、75コピー、100コピー、または150コピー）含み得る。
【０１０６】
外因性核酸分子からアミノ酸配列を発現する方法は、当技術分野で周知である。そのような方法には、調節領域がポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進するような核酸を作製する段階が含まれるが、これに限定されない。通常は、調節領域は転写レベルで他のDNA配列の発現を調節するDNA配列である。したがって、調節領域には、プロモーター、およびエンハンサー等が含まれるが、これらに限定されない。外因性核酸分子からのアミノ酸配列の発現には、任意の種類のプロモーターが使用できる。プロモーターの例には、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および特定の刺激（例えば、光、酸素、およびｓ化学物質の濃度等）に応答するまたは応答しないプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。さらに、細菌細胞および酵母細胞のような細胞中での外因性核酸分子からのポリペプチドの発現方法は、当技術分野で周知である。例えば、大腸菌中で外因性ポリペプチドを発現する能力のある核酸構築物は、周知である。サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、USA、第2版、1989参照。
【０１０７】
B. 宿主細胞を介した有機酸および関連産物の生産
本明細書に提供される核酸およびアミノ酸配列を細胞とともに使用して、3-HPおよび/または1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸エステル、3-HPのエステル、および重合3-HPのような他の有機化合物を生産できる。そのような細胞は、米国政府の主催する国立衛生研究所の分類学ウェブページ(www.ncbi.nlm.nih.gov)に列挙されるものを含めた任意の種でよい。細胞は、真核細胞または原核細胞でよい。例えば、本発明の遺伝子組換え細胞は、哺乳類細胞（例えば、ヒト、マウス、およびウシの細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、およびダイズ細胞）、真菌細胞（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）およびクモノスカビ（Rhizopus）細胞）、酵母細胞、または細菌細胞（例えば、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、エッシェリキア（Escherichia）、およびクロストリジウム（Clostridium）細胞）でよい。本発明の細胞は、微生物でもよい。本明細書で使用される「微生物」という用語は、細菌、藻類、真菌、原虫類を含めこれらに限定されない任意の顕微鏡的生物を指す。したがって、大腸菌、出芽酵母、クルベロミセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、カンジダ・ブランキ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴーサ、およびピキア・ポストリス（Pichia postoris）は微生物と考えられ、本明細書に記述されるように使用できる。
【０１０８】
通常は、本発明の細胞は特定の有機化合物が生産されるように遺伝子組換えされる。1つの態様では、本発明はPEPから3-HPを生産する細胞を提供する。細胞が3-HPを生産するために使用できる生合成経路の例は、図1-5、43-44、54、および55に示されている。
【０１０９】
一般に、特定の有機化合物を生産するように遺伝子組換えされる細胞は、特定の酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を1つまたは複数含む。例えば、微生物は、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸を含み得る。この場合、アクリリルCoAは3-ヒドロキシプロピオン酸CoAに変換され、これが3-HPの生産に至る。細胞が、その細胞が通常生産しない化合物の生産を触媒する酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を持つことができることに留意のこと。または、細胞は、その細胞が通常生産する化合物の生産を触媒する酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を持つことができる。この場合、遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換えをしない同様の細胞よりも、その化合物を大量に、またはより効率良く生産できる。
【０１１０】
1つの態様では、本発明は3-HPの形成に至る酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む細胞を提供する。生産された3-HPが細胞から分泌され、その有機化合物を回収するために細胞膜を破壊する必要がない場合もあることに留意のこと。通常は、本発明の細胞は1リットル当たり少なくとも約100 mg（例えば、少なくとも約1 g/L、5 g/L、10 g/L、25 g/L、50 g/L、75 g/L、80 g/L、90 g/L、100 g/L、または120 g/L）の濃度で3-HPを生産する。特定の細胞について3-HPのような有機化合物の収率を決定する場合には、任意の方法が使用できる。応用環境微生物学（Applied Environmental Microbiology）59(12):4261-4265 (1993)参照。通常は、微生物のような本発明の範囲内の細胞は、グルコースのようなヘキソースの炭素源を触媒する。しかし、細胞はペントース（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、およびリキソース）、脂肪酸、アセテート、またはグリセロールのような種々の炭素源を触媒し得る。すなわち、本発明の範囲内の細胞は種々の炭素源を使用し得る。
【０１１１】
本明細書に記述されるように、本発明の範囲内の細胞は、3-HPまたは1,3-プロパンジオール、アクリル酸、ポリアクリレート、アクリル酸のエステル、3-HPのエステル、重合3-HPのような他の有機化合物の形成に至る酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み得る。外因性核酸を含む細胞の同定方法は、当技術分野で周知である。そのような方法には、PCRならびにノーザンおよびサザン分析のような核酸ハイブリダイゼーション法（本明細書に記載のハイブリダイゼーション参照）が含まれるがこれらに限定されない。場合によっては、免疫組織化学および生化学的手法を用いて特定の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を検出することによって、細胞が特定の核酸を含むかどうかが決定され得る。例えば、ポリペプチドに対する特異性を持つ抗体は、特定の細胞がそのポリペプチドをコードする核酸を含むかどうかの決定に使用できる。さらに、生化学的手法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドの発現の結果として生産される有機化合物を検出することによって、酵素活性を持つポリペプチドをコードする特定の核酸分子を細胞が含むかどうかを決定できる。例えば、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸を、通常はそのようなポリペプチドを発現しない細胞に導入した後で3-HPを検出すると、細胞が導入された核酸分子を含むのみならず、導入された外因性核酸分子からコードされているポリペプチドを発現することも示すことができる。特定の酵素活性または特定の有機化合物の存在の検出方法は、当技術分野で周知である。例えば、3-HPのような有機化合物の存在は、文献に記述されたようにして決定できる。サリバン（Sullivan）およびクラーケ（Clarke）、J. Assoc. Offic. Agr. Chemists、38:514-518（1955）参照。
【０１１２】
C. ポリペプチド活性の低下した細胞
本発明は低下したポリペプチド活性を持つ遺伝子組換え細胞も提供する。本明細書で細胞および特定のポリペプチド活性に関して使用される「低下した」という用語は、同一の種の同等の細胞で測定された活性よりも低いレベルを指す。例えば、酵素活性Ｘを持たない特定の微生物は、同等な微生物が少なくともいくらかの酵素活性Ｘを持っていれば、酵素活性Ｘが低下していると考えられる。細胞は、酵素、転写因子、トランスポーター、受容体、およびシグナル分子等を含むがこれらに限定されない、任意の種類のポリペプチドの活性が低下する可能性があることに留意のこと。例えば細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性またはアルコール脱水素酵素活性を持つポリペプチドの調節配列および/またはコード配列を破壊する外因性核酸分子を含む可能性がある。ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび/またはアルコール脱水素酵素発現を破壊すると、ラクテートおよび3-HP、1,3-プロパンジオール、アクリル酸、ポリアクリレート、アクリル酸のエステル、3-HPのエステル、重合3-HPのようなラクテートから生産される産物の蓄積が起こる。また、ポリペプチド活性の低下は、ポリペプチド濃度の低下、ポリペプチドの比活性の低下、またはその組み合せの結果であり得る。ポリペプチド活性の低下した細胞を作製するためには、多くの異なる方法が使用できる。例えば、通常の変異誘発またはノックアウト技術を用いて、細胞が破壊された調節配列またはポリペプチドコード配列を持つように操作できる。「酵母遺伝学の方法(Methods in Yeast Genetics)」 (1997版)、アダムス（Adams）、ゴッチャリング（Gottschling）、カイザー（Kaiser）、およびスターンズ（Sterns）、Cold Spring Harbor Press (1998)参照。または、アンチセンス技術を用いて特定のポリペプチドの活性を低下させることができる。例えば、細胞がポリペプチドの翻訳を阻害するようなアンチセンス分子をコードするcDNAを含むように、操作できる。本発明で使用される「アンチセンス分子」という用語は、内因性ポリペプチドのコード鎖に対応する配列を含む任意の核酸分子または核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸）を含む。アンチセンス分子は、隣接配列（例えば、調節配列）を持つ場合もある。したがって、アンチセンス分子はリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。リボザイムは、RNAを切断する場合には、ヘアピン、ハンマーヘッド、またはアックスヘッド構造を含むがこれらに限定されない任意の一般的な構造を持ち得る。遺伝子サイレンシングを用いて特定のポリペプチドの活性を低下させることができる。
【０１１３】
ポリペプチド活性の低下した細胞は、任意の方法を用いて同定できる。例えば、本明細書で記述されたような酵素活性アッセイ法を用いて、酵素活性の低下した細胞を同定できる。
【０１１４】
(1) 配列番号：39（OS17ポリペプチド）に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチド、または (2) 配列番号：39に定められるアミノ酸配列と少なくとも約60パーセントの配列の同一性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドは、3つの機能的ドメインを持つ可能性がある：CoA合成酵素活性を持つドメイン、3-HP-CoA脱水酵素活性を持つドメイン、およびCoA還元酵素活性を持つドメインである。そのようなポリペプチドは、1つまたは2つの酵素活性が低下するように、変異誘発および/またはドメインの削除を行なうことにより、選択的に改変できる。OS17ポリペプチドの脱水酵素活性を低下させると、プロピオニルCoAからアクリリルCoAが生産され得る。その次に、アクリリルCoAをCoA加水分解酵素活性を持つポリペプチドに接触させ、プロピオネートからアクリレートを生産できる（図43）。同様に、例えば還元酵素活性の低下したOS17ポリペプチドを用いて、3-HPからアクリリルCoAが生産できる。
【０１１５】
D. インビトロ法による有機酸および関連産物の生産
また、酵素活性を持つ精製ポリペプチドを単独または細胞と組み合せて使用して、3-HPまたは1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、3-HPのエステル、重合3-HPのような他の有機化合物を生産することができる。例えば、3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つ実質的に純粋なポリペプチドを含む調製物を用いて、3-HPの前駆体である3-HP-CoAの形成を触媒できる。さらに、酵素活性を持つポリペプチドを含む無細胞抽出物を単独または精製ポリペプチドおよび/または細胞と組み合せて用いて、3-HPを生産できる。例えば、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドを含む無細胞抽出物は、ラクチルCoAの生産に使用でき、ラクチルCoAから3-HPを形成するために必要な反応を触媒するために必要な酵素活性を持つポリペプチドを含む微生物は、3-HPの生産に使用できる。無細胞抽出物の生産には、任意の方法が使用できる。例えば、浸透圧ショック、超音波処理、および/または凍結融解の繰り返し後の濾過および/または遠心を用いて、無傷細胞から無細胞抽出物を作製できる。
【０１１６】
細胞、精製ポリペプチド、および/または無細胞抽出物は3-HPの生産に使用でき、3-HPを化学的に処理して、別の化合物を生産できることに留意のこと。例えば、微生物を用いて3-HPを生産し、化学的過程を用いて3-HPを修飾して重合3-HPまたは3-HPのエステルのような誘導体にする。同様に、本発明に記述される細胞、実質的に純粋なポリペプチド、および/または無細胞抽出物を用いて3-HPまたは他の有機化合物（例えば、1,3-プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、3-HPのエステル、重合3-HP）に変換できる特定の化合物を、化学的過程によって生産できる。たとえば、化学的過程を用いてアクリリルCoAを生産し、微生物を用いてアクリリルCoAを3-HPに変換できる。
【０１１７】
E. 有機酸を生産するための細菌の発酵
通常は、微生物のような生産細胞を提供し、3-HPが生産されるようにその微生物を培地とともに培養することにより、3-HPは生産される。一般に、培地および/または培養条件は、微生物が適当な濃度まで増殖し、効率良く3-HPを生産できるようなものであることができる。大量の生産過程では、文献に記述されるような任意の方法が使用できる（「産業微生物学およびバイオテクノロジーのマニュアル(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology)」、第2版、A. L. DemainおよびJ. E. Davies、ASM Press；および「発酵技術の原理(Principles of Fermentation Technology)」、P. F. StanburyおよびA. Whitaker、Pergamon参照）。簡単に述べると、例えば、炭素源のグルコースを含む適当な培地を入れた大型タンク（例えば、100ガロン、200ガロン、500ガロンまたはそれ以上のタンク）に、特定の微生物を接種する。接種後、微生物をインキュベーションして、バイオマスを生産する。所望のバイオマスに到達したら、微生物を含む培養液を第2のタンクに移す。この第2のタンクは任意のサイズでよい。例えば、第2のタンクは第1のタンクよりも大きくても、小さくても、同じでもよい。通常は、第1のタンクの培養液に培地を追加できるように、第2のタンクは第1のタンクよりも大きい。また、第2のタンク内の培地は、第1のタンクに使用したものと同じでも異なっていてもよい。例えば、第1のタンクはキシロースを含む培地を含み、第2のタンクはグルコース入りの培地を含んでもよい。
【０１１８】
移したら、微生物をインキュベーションして、3-HPを生産させる。生産したら、任意の方法を用いて3-HPを単離する。例えば、通常の分離法で培養液からバイオマスを取り除き、通常の分離手法（例えば、抽出、蒸留、およびイオン交換手法）を用いて微生物を含まない培養液から3-HPを得ることができる。また、3-HPは生産しながら単離しても、生産段階が終了してから培養液から単離してもよい。
【０１１９】
F. 開示された生合成経路で生産される産物
図1-5、43-44、54、および55に提供される任意の段階で生産される有機化合物は、他の有機化合物に化学的に変換できる。例えば、3-HPは水素化して貴重なポリエステルモノマーである1,3プロパンジオールを形成できる。3-HPのような有機酸の水素化は、琥珀酸および/または乳酸の水素化に使用される方法のような任意の方法を用いて行なえる。例えば、3-HPは金属触媒を用いて水素化できる。別の実施例では、3-HPを脱水してアクリル酸を形成できる。脱水反応には任意の方法が使用できる。例えば、3-HPは触媒（例えば、金属または鉱酸触媒）の存在下で加熱してアクリル酸を形成できる。プロパンジオールは、オキシド還元酵素活性を持つポリペプチド（例えば、1.1.1.クラスの酵素）を用いて、インビトロまたはインビボで生産できる。
【０１２０】
V. PEPから3-HPを生産する生合成経路を作製するために使用される方法の概要
本発明は生合成経路を用いることによりPEPから3-HPおよび関連産物を作製する方法を提供する。実例となる実施例には、乳酸中間体、マロニルCoA中間体、およびβアラニン中間体を介して3-HPを生産する方法が含まれる。
【０１２１】
A. 乳酸中間体を介して3-HPを生産する生合成経路
PEPから3-HPを生産できるような生合成経路が作製された（図1）。この経路は、本明細書に記述されるようにクローニングされ発現されたいくつかのポリペプチドを使用することを含む。ゲノムDNAの供給源にはメガスフェラ・エルスデニ細胞（ATCC 17753）が使用された。プライマーを使用して、CoA転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：1）が同定およびクローニングされた。ポリペプチドはその後酵素活性の検定を行ない、CoA転移酵素活性を持つことがわかった。
【０１２２】
同様に、PCRプライマーを用いて、メガスフェラ・エルスデニゲノムDNAからE1活性化因子、E2α、およびE2βポリペプチドをコードする核酸配列（それぞれ、配列番号：9、17、および25）が同定された。これらのポリペプチドはその後ラクチルCoA脱水酵素活性を持つことが示された。
【０１２３】
ゲノムDNAの供給源にはクロロフレクサス・オーランチアクス細胞（ATCC 29365）が使用された。最初のクローニングで核酸配列OS17（配列番号：129）およびOS19（配列番号：40）が同定された。その後の解析で、OS17がCoA合成酵素活性、脱水酵素活性、および脱水素酵素活性（プロピオニルCoA合成酵素）を持つポリペプチドをコードすることがわかった。その後の解析で、OS19が3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性（アクリリルCoA加水酵素活性とも呼ばれる）を持つポリペプチドコードすることがわかった。
【０１２４】
大腸菌で使用するために、いくつかのオペロンが作製された。これらのオペロンは、細菌細胞中で3-HPの生産を可能にする。別の実験で、これらのポリペプチドが酵母でも発現され、酵母は3-HPの生産に使用できる。
【０１２５】
B. マロニルCoA中間体を介して3-HPを生産する生合成経路
PEPから3-HPを生産するための別の経路が構築された。この経路は、大腸菌から単離されたアセチルCoAカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチド（実施例9）、およびクロロフレクサス・オーランタシアス（Chloroflexus aurantacius）から単離されたマロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチド（実施例10）を使用した。これらの2つのポリペプチドの組み合せで、アセチルCoAから3-HPの生産が可能になる（図44）。
【０１２６】
マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸（配列番号：140）がクローニング、配列決定、および発現された。マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドは、その後3-HPの生産に使用された。
【０１２７】
C. βアラニン中間体を介して3-HPを生産する生合成経路
一般に、原核生物および真核生物は、グルコースを、エムデン‐マイヤーホフ‐パルナス経路を介して、炭素代謝の中心代謝物であるPEPに代謝する。グルコースから生産されたPEPは、カルボキシル化されてオキサロアセテートになるか、ピルベートに変換される。PEPのオキサロアセテートへのカルボキシル化は、PEPカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチド、PEPカルボキシキナーゼ活性を持つポリペプチド、またはPEPトランスカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによって触媒され得る。ピルビン酸キナーゼ活性を持つポリペプチドによってPEPから生産されるピルベートも、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによってオキサロアセテートに変換され得る。
【０１２８】
PEPまたはピルベートから生成したオキサロアセテートは、アスパラギン酸の生産の前駆体となる。この変換は、アスパラギン酸アミノ転移酵素活性を持つポリペプチドによって行われ、グルタメートのアミノ基がオキサロアセテートに転移する。この反応で消費されるグルタメートはグルタミン酸脱水素酵素活性を持つポリペプチドの作用、または4,4-アミノブチレートアミノ転移酵素活性を持つポリペプチドの作用によって、再生され得る。アスパルテートのβアラニンへの脱カルボキシル化は、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによって触媒される。この生化学によって生産されるβアラニンは、2つの可能な経路で3-HPに変換され得る。これらの経路は図54および図55に提供される。
【０１２９】
βアラニンの生産に関与する段階は、いずれの経路も同じであり得る。これらの段階は、PEPをβアラニンに変換する宿主細胞中の内因性ポリペプチドで行われるか、PEP-カルボキシキナーゼ活性（4.1.1.32）、アスパラギン酸アミノ転移酵素活性（2.6.1.1）、およびアスパラギン酸αデカルボキシラーゼ活性（4.1.1.11）を持つポリペプチドのような、既知のポリペプチドを用いた組換えDNA技術によって実施できる。
【０１３０】
図54に示すように、CoA転移酵素活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：2に定められる配列を持つポリペプチド）を用いて、βアラニンをβアラニルCoAに変換できる。βアラニルCoAは、βアラニルCoAアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：160に定められる配列を持つポリペプチド）によってアクリリルCoAに変換できる。アクリリルCoAは、3-HP-CoA脱水酵素活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：40に定められる配列を持つポリペプチド）によって、3-HP-CoAに変換できる。3-HP-CoAはCoA転移酵素活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：2に定められる配列を持つポリペプチド）によって3-HPに変換できる。
【０１３１】
図55に示すように、4,4-アミノブチレートアミノ転移酵素活性（2.6.1.19）を持つポリペプチドを用いて、βアラニンをマロン酸セミアルデヒドに変換できる。マロン酸セミアルデヒドは、3-ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性（1.1.1.59）を持つポリペプチドまたは3-ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素活性を持つポリペプチドのいずれかを用いて、3-HPに変換できる。
【０１３２】
実施例
実施例１−CoA転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
ゲノムDNAを、回転管で1053強化クロストリジウム培地中、嫌気性条件下、37℃で12〜14時間増殖させたメガスフェラ・エルスデニ細胞（ATCC 17753）から単離した。増殖後、細胞をペレット化し、10mMトリス溶液5mLで洗浄し、再度ペレット化した。ペレットを、リゾチーム14.2mgおよび20mg/mLプロテイナーゼK溶液4μLを加えたジェントラ細胞懸濁液（Gentra Cell Suspension Solution）1mLに再懸濁した。細胞懸濁液を37℃で30分間インキュベートした。次いで、ゲノムDNAをジェントラゲノムDNA単離キット（Gentra Genomic DNA Isolation Kit）を用い、提供されたプロトコルに従って単離した。沈殿したゲノムDNAを巻き取り、10分間風乾した。ゲノムDNAを10mMトリス溶液500μLに懸濁し、4℃で保存した。
【０１３３】
二つの変性順方向（CoAF1およびCoAF2）および三つの変性逆方向（CoAR1、CoAR2、およびCoAR3）PCRプライマーを、アセトアセチルCoA転移酵素およびプロピオン酸CoA転移酵素の保存配列に基づいて設計した
0004490628.tif 000004
。
これらのプライマーを、Taqポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）および反応混合物1μLあたり1ngのゲノムDNAを用いたPCRにおいて、すべての論理的組み合わせで用いた。PCRを、アニーリング温度59℃で4サイクル、57℃で4サイクル、55℃で4サイクル、および52℃で18サイクルのタッチダウンPCRプログラムを用いて実施した。各サイクルは最初に94℃で30秒間の変性段階および72℃で3分間の伸長を用いた。プログラムには94℃で2分間の最初の変性段階および72℃で4分間の最終伸長段階が含まれていた。アニーリングのための時間は45秒であった。反応に用いたPCRプライマーの量は、プライマーの3'末端の縮重の量に応じて、典型的なPCRの量よりも2〜8倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のPCR反応を行って、単一の変性プライマーから生じるPCR産物を同定した。各PCR産物（25μL）を、1％TAE（トリス−酢酸−EDTA）アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。
【０１３４】
CoAFl-CoAR2、CoAFl-CoAR3、CoAF2-CoAR2、およびCoAF2-CoAR3の組み合わせにより、それぞれ423bp、474bp、177bp、および228bpのバンドが認められた。これらのバンドは他のCoA転移酵素配列に基づくサイズに一致していた。個々のプライマー対照反応からは、バンドはまったく見られなかった。CoAFl-CoAR3断片（474bp）をキアゲンゲル抽出キット（Qiagen Gel Extraction Kit）（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離および精製した。精製したバンド4μLをpCRIIベクターにライゲーションし、TOPOクローニング法（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いた熱ショックにより、TOP10大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体を100μg/mLのアンピシリン（Amp）および50μg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-B-D-ガラクトピラノシド（X-gal）を含むLB培地にプレーティングした。白色単コロニーを新鮮培地にプレーティングし、CoAF1およびCoAR3プライマーを用いたPCR反応でスクリーニングして挿入断片の存在を確認した。
【０１３５】
キアプレップスピンミニプレップキット（QiaPrep Spin Miniprep Kit）（Qiagen, Inc）を用いて得たプラスミドDNAを定量し、M13RおよびM13Fプライマーを用いてのDNA配列決定に用いた。配列解析により、CoAF1−CoAR3断片はアセトアセチルCoA転移酵素配列と配列類似性を有することが判明した。
【０１３６】
完全なコード配列を得るために、ゲノムウォーキングを実施した。上流および下流両方向のゲノムウォーキングのために、変性プライマー内部の474bpのCoAFl-CoAR3断片配列の一部を用いて、下記のプライマーを設計した
0004490628.tif 000005
。
COAGSP1FおよびCOAGSP2Fプライマーは下流向きで、COAGSP1RおよびCOAGSP2Rプライマーは上流向きであった。加えて、COAGSP2FおよびCOAGSP2RプライマーはCOAGSP1FおよびCOAGSP1Rプライマーの内側における入れ子状態である。ゲノムウォーキングは、追加のライブラリを酵素Nru I、Sca IおよびHinc IIで作製した他は、ユニバーサルゲノムウォーキングキット（Universal Genome Walking kit）（ClonTech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。第一ラウンドPCRは、パーキンエルマー2400サーモサイクラー（Perkin Elmer 2400 Thermocycler）で、94℃で2秒間および72℃で3分間を7サイクル、94℃で2秒間および65℃で3分間を36サイクルと、65℃で4分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドPCRは、94℃で2秒間および72℃で3分間を5サイクル、94℃で2秒間および65℃で3分間を20サイクルと、65℃で4分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンドの産物（20μL）を1％TAEアガロースゲル電気泳動で分離した。Stu Iライブラリから逆方向で増幅産物が得られた。このライブラリからの1.5Kbの第二ラウンド産物を、ゲル精製し、クローニングし、配列決定した。配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はCoAF1-CoAR3断片と重なっており、アセトアセチルCoA転移酵素配列などの他の配列と配列類似性を有することが判明した（図8〜9）。
【０１３７】
メガスフェラ・エルスデニ由来のCoA転移酵素（プロピオニルCoA転移酵素すなわちpct）をコードする核酸を、下記のPCRプログラムを用いて染色体DNAからPCR増幅した：変性のために95℃で30秒間、アニーリングのために50℃で30秒間、および伸長のために72℃で3分間を25サイクル（プラス各サイクル毎に2秒間）。用いたプライマーはPCT-1.114
0004490628.tif 000006
およびPCT-2.2045
0004490628.tif 000007
と命名した。得られたPCR産物（アガロースゲル電気泳動から判断して約2kb）をキアゲンPCR精製キット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をパーフェクトリーブラント（Perfectly Blunt）クローニングキット（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）を用いてpETBlue-1にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（NovaBlue chemically competent cell）（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、これを50μg/mLのカルベニシリン、40μg/mLのIPTG、および40μg/mLのX-Galを補足したLB寒天プレート上に拡げた。白色コロニーを単離し、制限酵素マッピングにより、挿入断片の存在についてスクリーニングした。正しい制限酵素切断パターンを有する単離物を、pETBlueUPおよびpETBlueDOWNプライマー（Novagen）を用いて各末端から配列決定し、ライゲーション点の配列を確認した。
【０１３８】
プラスミドをチューナー（Tuner）(DE3)pLacI化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、構築物からの発現を試験した。要するに、培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、適当な抗生物質を含む新鮮LB培地で1：20に希釈した。培養物を通気しながら37℃でOD600が約0.6になるまで増殖させた。培養物を最終濃度100μMのIPTGで誘導した。培養物を通気しながら37℃でさらに2時間インキュベートした。誘導前および誘導後2時間の時点でSDS-PAGE分析のために一定量を採取した。IPTG処理後に、予想される分子量（配列から予測して55,653ダルトン）のバンドが観察された。このバンドは、転移酵素をコードする核酸が欠損しているプラスミドを含む細胞では観察されなかった。
【０１３９】
酵素活性を評価するために無細胞抽出物を調製した。要するに、細胞を遠心沈降により回収し、超音波処理により破砕した。超音波処理した細胞懸濁液を遠心沈降して細胞片を除去し、上清をアッセイで用いた。
【０１４０】
転移酵素活性を下記のアッセイ法で測定した。用いたアッセイ混合物は100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、200mM酢酸ナトリウム、1mMジチオビスニトロ安息香酸（DTNB）、500μMオキサロ酢酸、25μM CoAエステル基質、および3μg/mLクエン酸合成酵素を含んでいた。存在する場合には、CoA転移酵素はCoAエステルからCoAをアセテートに転移させてアセチルCoAを生成する。添加したクエン酸合成酵素はオキサロアセテートとアセチルCoAを縮合してシトレートおよび遊離のCoASHを生成する。遊離CoASHはDTNBと複合体を形成し、この複合体形成を412nmの光学密度の変化によって測定することができる。CoA転移酵素の活性を、下記の基質を用いて測定した：ラクチルCoA、プロピオニルCoA、アクリリルCoA、および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA。タンパク質の単位/mgを下記の式を用いて計算した：
（ΔE/分 ‡ Vf ‡ 希釈率）/（Vs ‡ 14.2）＝単位/mL
式中、ΔE/分は412nmの吸光度の1分あたりの変化であり、Vfは反応物の最終体積であり、Vsは加えた試料の体積である。無細胞抽出物の全タンパク質濃度は約1mg/mLであったため、単位/mLは単位/mgに等しい。
【０１４１】
CoA転移酵素をコードする核酸を含む細胞からの無細胞抽出物はCoA転移酵素活性を示した（表2）。観察されたCoA転移酵素活性はラクチルCoA、プロピオニルCoA、アクリリルCoA、および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA基質で検出された（表2）。最も高いCoA転移酵素活性はラクチルCoAおよびプロピオニルCoAで検出された。
【０１４２】
【表２】
0004490628.tif 000008
【０１４３】
下記のアッセイ法を実施して、CoA転移酵素活性がCoA基質の受容体と同じ供与体を用いることができるかどうかを調べた。具体的には、CoA転移酵素活性をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）ボイジャー（Voyager） RPワークステーション（PerSeptive Biosystems）を用いて評価した。下記の五つの反応を解析した：
1)  アセテート＋ラクチルCoA→ラクテート＋アセチルCoA
2)  アセテート＋プロピオニルCoA→プロピオネート＋アセチルCoA
3)  ラクテート＋アセチルCoA→アセテート＋ラクチルCoA
4)  ラクテート＋アクリリルCoA→アクリレート＋ラクチルCoA
5)  3-ヒドロキシプロピオネート＋ラクチルCoA→ラクテート＋3-ヒドロキシプロピオニルCoA
【０１４４】
MALDI-TOF MSを用いて、生成物CoAエステルの出現と、供与体CoAエステルの消失を同時に測定した。アッセイ緩衝液は50mMリン酸カリウム（pH7.0）、1mM CoAエステル、および100mMのそれぞれの酸の塩を含んでいた。前述のとおりに調製した無細胞抽出物からのタンパク質を、最終濃度0.005mg/mLまで加えた。対照反応を、CoA転移酵素をコードする核酸を含む構築物を欠損している細胞から調製した無細胞抽出物から調製した。各反応に対し、無細胞抽出物を最後に加えて、反応を開始した。反応を室温で進行させ、1倍量の10％トリフルオロ酢酸（TFA）を加えることによって停止した。反応混合物をMALDI-TOF MS分析前に、セプパックバック（Sep Pak Vac）C18 50mgのカラム（Waters, Inc.）を用いて精製した。カラムをメタノール1mLでコンディショニングし、0.1％TFA 1mLで二回洗浄して平衡化した。各試料をカラムに添加し、素通り画分は廃棄した。カラムを0.1％TFA 1mLで二回洗浄した。試料は40％アセトニトリル、0.1％TFA 200μL中に溶出した。アセトニトリルを減圧遠心分離により除去した。試料を110mMシナピン酸/0.1％TFA、67％アセトニトリルと1：1で混合し、MALDI-TOF MS分析のために調製した。試料を風乾した。
【０１４５】
反応#1において、対照試料はラクチルCoA（MW841）に対応する分子量に主ピークを示した。アセチルCoA（MW811）に対応する分子量に小さいピークが見られた。この小ピークはラクチルCoAの合成から残留したアセチルCoAであると判定された。反応#1のCoA転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルCoAのアセチルCoAへの完全な変換を示した。ラクチルCoAのピークはまったく見られなかった。この結果は、CoA転移酵素活性はCoAをラクチルCoAからアセテートに転移させてアセチルCoAを生成しうることを示している。
【０１４６】
反応#2において、対照試料はプロピオニルCoA（MW825）に対応する分子量に主ピークを示した。反応#2のCoA転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、アセチルCoA（MW811）に対応する分子量に主ピークを示した。プロピオニルCoAのピークはまったく見られなかった。この結果は、CoA転移酵素活性はCoAをプロピオニルCoAからアセテートに転移させてアセチルCoAを生成しうることを示している。
【０１４７】
反応#3において、対照試料はアセチルCoA（MW811）に対応する分子量に主ピークを示した。反応#3のCoA転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルCoA（MW841）に対応するピークを示した。アセチルCoAに対応するピークは消失しなかった。事実、二つのピークのサイズ比は約1：1であった。ラクチルCoAに対応するピークの出現が観察されたことは、CoA転移酵素活性が反応#3を触媒することを示している。
【０１４８】
反応#4において、対照試料はアクリリルCoA（MW823）に対応する分子量に主ピークを示した。反応#4のCoA転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルCoA（MW841）に対応する主ピークを示した。この結果は、CoA転移酵素活性が反応#4を触媒することを示している。
【０１４９】
反応#5において、乳酸および3-HPはそれぞれのCoAエステルと同様に同じ分子量を有するため、CoAのラクテートから3-ヒドロキシプロピオネートへの転移を検出するために重水素化ラクチルCoAを用いた。重水素化ラクチルCoAを用いることで、MALDI-TOF MSを用いてのラクチルCoAと3-ヒドロキシプロピオネートとの間の区別が可能となった。対照試料は、重水素原子で置換された水素原子の量にばらつきがあったため、MW841からMW845の範囲の分子量に広範なピーク群を示した。加えて、アセチルCoA（MW811）に対応する分子量に顕著なピークが認められた。このピークはラクチルCoAの合成から残留したアセチルCoAであると判定された。反応#5のCoA転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、MW841からMW845の範囲のピーク群とは対照的に、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA（MW841）に対応する分子量に主ピークを示した。この結果は、CoA転移酵素活性が反応#5を触媒することを示している。
【０１５０】
実施例２−ラクチルCoA脱水酵素活性を有する複数のポリペプチド複合体をコードする核酸分子のクローニング
E1活性化因子ポリペプチドをクローニングするために下記の方法を用いた。要するに、四つの変性順方向および五つの変性逆方向PCRプライマーを、E1活性化因子タンパク質相同体の保存配列に基づいて設計した
0004490628.tif 000009
。
【０１５１】
これらのプライマーを、Taqポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）および反応混合物1μLあたり1ngのゲノムDNAを用いたPCRにおいて、すべての論理的組み合わせで用いた。PCRを、アニーリング温度60℃で4サイクル、58℃で4サイクル、56℃で4サイクル、および54℃で18サイクルのタッチダウンPCRプログラムを用いて実施した。各サイクルは最初に94℃で30秒間の変性段階および72℃で3分間の伸長段階を用いた。プログラムには94℃で2分間の最初の変性段階および72℃で4分間の最終伸長段階が含まれていた。アニーリングのための時間は45秒であった。反応に用いたPCRプライマーの量は、プライマーの3'末端の縮重の量に応じて、典型的なPCRの量よりも2〜10倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のPCR反応を行って、単一の変性プライマーから生じるPCR産物を同定した。各PCR産物（25μL）を、1％TAE（トリス−酢酸−EDTA）アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。
【０１５２】
E1F2-ElR4、E1F2-E1R5、E1F3-ElR4、E1F3-E1R5、およびElF4-E1R4R2の組み合わせにより、それぞれ195bp、207bp、144bp、156bp、および144bpのバンドが認められた。これらのバンドは他の種由来のE1活性化因子配列に基づいて予想されたサイズに一致していた。個々のプライマー対照反応では、バンドはまったく見られなかった。E1F2-E1R5断片（207bp）をキアゲンゲル抽出法（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離および精製した。精製したバンド（4μL）をpCRIIベクターにライゲーションし、これを次いでTOPOクローニング法（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いた熱ショックにより、TOP10大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体を100μg/mLのアンピシリン（Amp）および50μg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-B-D-ガラクトピラノシド（X-gal）を含むLB培地にプレーティングした。白色単コロニーを新鮮培地にプレーティングし、E1F2およびE1R5プライマーを用いたPCR反応でスクリーニングして挿入断片の存在を確認した。プラスミドDNAをキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen, Inc）を用いて複数のコロニーから得た。プラスミドDNAを得た後、これを定量し、M13RおよびM13FプライマーによるDNA配列決定に用いた。配列解析により、ポリペプチドをコードする核酸配列が明らかとなり、E1F2-E1R5断片はE1活性化因子配列と配列類似性を有することが判明した（図12〜13）。
【０１５３】
E2αおよびβサブユニットの完全なコード配列を得るために、ゲノムウォーキングを実施した。要するに、上流および下流両方向のゲノムウォーキングを実施するために、E1F2およびE1R5変性プライマー内部の207bpのE1F2-E1R5断片配列の一部を用いて、四つのプライマーを設計した
0004490628.tif 000010
。
E1GSP1FおよびE1GSP2Fプライマーは下流向きで、E1GSP1RおよびE12GSP2Rプライマーは上流向きであった。加えて、E1GSP2FおよびE1GSP2RプライマーはE1GSP1FおよびE1GSP1Rプライマーの内側に入れ子状態である。
【０１５４】
ゲノムウォーキングは、追加のライブラリを酵素Nru I、Sca IおよびHinc IIで作製した他は、ユニバーサルゲノムウォーキングキット（ClonTech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。第一ラウンドPCRは、パーキンエルマー2400サーモサイクラーで、94℃で2秒間および72℃で3分間を7サイクル、94℃で2秒間および65℃で3分間を36サイクルと、65℃で4分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドPCRは、94℃で2秒間および72℃で3分間を5サイクル、94℃で2秒間および65℃で3分間を20サイクルと、65℃で4分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド産物（20μL）を1％TAEアガロースゲルを用いての電気泳動で分離した。Stu Iライブラリから順方向および逆方向の両方で増幅産物が得られた。Stu Iライブラリからの、順方向は約1.5kb、逆方向は3kbの第二ラウンド産物を、ゲル精製し、クローニングし、配列決定した。配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はE1F2-E1R5断片と重なっていることが判明した。
【０１５５】
さらなる配列を得るために、第二のゲノムウォーキングを、第一ラウンドのプライマー
0004490628.tif 000011
および第二ラウンドのプライマー
0004490628.tif 000012
を用いて実施した。ゲノムウォーキングをNruI、ScaI、およびHincIIライブラリを用いて行った。加えて、クロンテック（ClonTech）のアドバンテージゲノミックポリメラーゼ（Advantage-Genomic Polymerase）をPCRに用いた。第一ラウンドPCRは、パーキンエルマー2400サーモサイクラーで、94℃で2分間の最初の変性段階、94℃で2秒間および72℃で3分間を7サイクル、94℃で2秒間および65℃で3分間を36サイクルと、65℃で4分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドPCRは、94℃で2秒間および72℃で3分間を5サイクル、94℃で2秒間および65℃で3分間を20サイクルと、65℃で4分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド産物（20μL）を1％アガロースゲル上での電気泳動で分離した。HincIIライブラリの第二ラウンドPCRからは約1.5kbの増幅産物が得られた。このバンドをゲル精製し、クローニングし、配列決定した。配列解析により、これは前に得られたゲノムウォーキング断片と重なっていることが判明した。加えて、配列解析により、他の配列と配列類似性を有する、E2αサブユニットをコードする核酸配列が明らかとなった（図16〜17）。さらに、配列解析により、他の配列と配列類似性を有する、E2βサブユニットをコードする核酸配列も明らかとなった（図20〜21）。
【０１５６】
さらなるPCRおよび配列解析により、ラクチルCoA脱水酵素をコードする配列を含む領域内の、ポリペプチドをコードする配列の順序が明らかとなった。具体的には、E1GSP1FおよびCOAGSP1Rプライマー対およびCOAGSP1FおよびE1GSP1Rプライマー対を用いて、CoA転移酵素およびE1活性化因子ポリペプチドの両方をコードする断片を増幅した。要するに、M.エルスデニゲノムDNA（1ng）を鋳型として用いた。PCRはパーキンエルマー2400サーモサイクラーで、ロングテンプレートポリメラーゼ（Long Template Polymerase)（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）を用いて行った。用いたPCRプログラムは下記のとおりであった：94℃で2分間；94℃で30秒間、61℃で45秒間、および72℃で6分間を29サイクル；ならびに72℃で10分間の最終伸長。両方のPCR産物（20μL）を1％アガロースゲル上で分離した。増幅産物（約1.5kb）が、COAGSP1FおよびE1GSP1Rプライマー対を用いて得られた。この産物を、ゲル精製し、クローニングし、配列決定した（図22）。
【０１５７】
ラクチルCoA脱水酵素をコードする配列を含むM.エルスデニオペロンの編成は、下記のポリペプチドをコードする配列を下記の順に含むと判定された：CoA転移酵素（図6）、ORFX（図23）、ラクチルCoA脱水酵素のE1活性化因子タンパク質（図10）、ラクチルCoA脱水酵素のE2αサブユニット（図14）、ラクチルCoA脱水酵素のE2βサブユニット（図18）、および切断型CoA脱水素酵素（図25）。
【０１５８】
M.エルスデニ由来ラクチルCoA脱水酵素（lactyl-CoA dehydrataseの頭文字でlcd）を、下記のプログラムを用いて染色体DNAからPCR増幅した：94℃で2分間；94℃で30秒間、47℃で45秒間、および72℃で3分間を7サイクル；94℃で30秒間、54℃で45秒間、および72℃で3分間を25サイクル；ならびに72℃で7分間。一つのプライマー対を用いた
0004490628.tif 000013
。
増幅産物（約3.2kb）を1％アガロースゲル上で分離し、ゲルから切り出し、キアゲンゲル抽出キット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をNde IおよびBamHI制限酵素で消化し、同じ酵素で消化したpET11aベクター（Novagen）にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen）に形質転換し、これを次いで50μg/mLのカルベニシリンを補足したLB寒天プレート上に拡げた。単離した個々のコロニーを、制限酵素マッピングにより、挿入断片の存在についてスクリーニングした。正しい制限酵素切断パターンを有する単離物を、ノバジェンプライマー（T7プロモータープライマー#69348-3およびT7ターミネータープライマー#69337-3）を用いて各末端から配列決定し、ライゲーション点の配列を確認した。
【０１５９】
正しい挿入断片を有するプラスミドを、チューナー(DE3)pLacI化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。この構築物からの発現を下記のとおりに試験した。培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、適当な抗生物質を含む新鮮LB培地で1：20に希釈した。培養物を通気しながら37℃でOD600が約0.6になるまで増殖させた。培養物を最終濃度100μMのIPTGで誘導した。培養物を通気しながら37℃でさらに2時間インキュベートした。誘導前および誘導後2時間の時点でSDS-PAGE分析のために一定量を採取した。予想される分子量（E1サブユニットについては27,024ダルトン、E2αサブユニットについては48,088ダルトン、およびE2βサブユニットについては42,517ダルトン−すべて配列から予測）のバンドが観察された。これらのバンドは、ラクチルCoA脱水酵素の三つの成分をコードする核酸が欠損しているプラスミドを含む細胞では観察されなかった。
【０１６０】
細胞を密封血清容器内、37℃で終夜培養することにより、無細胞抽出物を調製した。終夜培養後、培養物を1mM IPTG（嫌気性手法を用いて添加）で誘導し、37℃でさらに2時間インキュベートした。細胞をストリンジェントな嫌気性条件下で遠心沈降により回収し、超音波処理により破砕した。超音波処理した細胞懸濁液を遠心沈降して細胞片を除去し、上清をアッセイ法で用いた。細胞の再懸濁/超音波処理に用いた緩衝液は、50mMトリス-HCl（pH7.5）、200μM ATP、7mM Mg(SO4)、4mM DTT、1mM 亜ジチオン酸、および100μM NADHであった。
【０１６１】
脱水酵素活性をMALDI-TOF MSで検出した。アッセイ法は前述のものと同じ緩衝液中に1mMラクチルCoAまたは1mMアクリリルCoAを加え、約5mg/mL無細胞抽出物で行った。MALDI-TOF MS分析の前に、試料を実施例１に記載のとおりにセプパックバック C18カラム（Waters, Inc.）を用いて精製した。下記の二つの反応を解析した：
1)  アクリリルCoA→ラクチルCoA
2)  ラクチルCoA→アクリリルCoA
【０１６２】
反応#1において、対照試料はアクリリルCoA（MW823）に対応する分子量にピークを示した。反応#1の脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルCoA（MW841）に対応する分子量に主ピークを示した。この結果は、脱水酵素活性はアクリリルCoAをラクチルCoAに変換しうることを示している。
【０１６３】
ラクチルCoAに対する脱水酵素活性を検出するために、反応#2を80％D2O中で実施した。対照試料はラクチルCoA（MW841）に対応する分子量にピークを示した。反応#2の脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、重水素置換型にシフトしたラクチルCoAのピークを示した。この結果は、脱水酵素はラクチルCoAに対して活性であることを示している。加えて、両方の反応の結果は、脱水酵素がラクチルCoA←→アクリリルCoA反応を両方向に触媒することを示している。
【０１６４】
実施例３−3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
ゲノムDNAをクロロフレクサス・オーランチアクス細胞（ATCC29365）から単離した。要するに、920 クロロフレクサス培地中のC.オーランチアクス細胞を、イノーバ4230インキュベーター振盪機（Innova 4230 Incubator, Shaker）（New Brunswick Scientific；ニュージャージー州エジソン）を用い、50℃、内部照明下、50mL培養物（Falcon 2070ポリプロピレンチューブ）中で増殖させた。培養後、細胞をペレット化し、10mMトリス溶液5mLで洗浄し、再度ペレット化した。ゲノムDNAをペレット化した細胞からジェントラゲノム「ピュアジーン」DNA単離キット（Gentra Genomic "Puregene" DNA isolation kit（Gentra Systems；ミネソタ州ミネアポリス）を用いて単離した。要するに、ペレット化した細胞をジェントラ細胞懸濁液 1mLに再懸濁し、これにリゾチーム14.2mgおよび20mg/mLプロテイナーゼK溶液4μLを加えた。細胞懸濁液を37℃で30分間インキュベートした。沈殿したゲノムDNAを3500×g、25分間の遠心沈降で回収し、10分間風乾した。ゲノムDNAを10mMトリス溶液300μLに懸濁し、4℃で保存した。
【０１６５】
ゲノムDNAを、クロトナーゼ相同体の保存ドメインおよびクロロフレクサス・オーランチアクスコドン使用頻度表に基づいて設計したプライマーによるPCR増幅反応における鋳型として用いた。要するに、二つの変性順方向（CRF1およびCRF2）および三つの変性逆方向（CRR1、CRR2、およびCRR3）PCRプライマーを設計した
0004490628.tif 000014
。
【０１６６】
これらのプライマーを、Taqポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）および反応混合物1μLあたり1ngのゲノムDNAを用いたPCRにおいて、すべての論理的組み合わせで用いた。PCRを、アニーリング温度61℃で4サイクル、59℃で4サイクル、57℃で4サイクル、55℃で4サイクル、および52℃で16サイクルのタッチダウンPCRプログラムを用いて実施した。各サイクルは最初に94℃で30秒間の変性段階および72℃で3分間の伸長段階を用いた。プログラムには94℃で2分間の最初の変性段階および72℃で4分間の最終伸長段階も含まれていた。アニーリングのための時間は45秒であった。反応に用いたPCRプライマーの量は、プライマーの3'末端の縮重の量に応じて、典型的なPCRの量よりも4〜12倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のPCR反応を行って、単一の変性プライマーから生じる増幅産物を同定した。各PCR産物（25μL）を、1％TAE（トリス−酢酸−EDTA）アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。
【０１６７】
CRFl-CRRlおよびCRF2-CRR2の組み合わせにより、それぞれ約120bpおよび約150bpの特有のバンドが認められた。これらのバンドは他の種由来のクロトナーゼ遺伝子に基づいて予想されたサイズに一致していた。個々のプライマー対照反応では、120bpまたは150bpのバンドは見られなかった。両断片（すなわち、120bpおよび150bpのバンド）をキアゲンゲル抽出キット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離および精製した。各精製断片（4μL）をpCRIIベクターにライゲーションし、これを次いでTOPOクローニング法（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いた熱ショック法により、TOP10大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体を100μg/mLのアンピシリン（Amp）および50μg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-B-D-ガラクトピラノシド（X-gal）を含むLB培地にプレーティングした。白色単コロニーを新鮮培地にプレーティングし、CRF1およびCRR1プライマーならびにCRF2およびCRR2プライマーを用いたPCR反応でスクリーニングして、所望の挿入断片の存在を確認した。プラスミドDNAをキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen, Inc）を用いて所望の挿入断片を含む複数のコロニーから得た。プラスミドDNAを得た後、これを定量し、M13RおよびM13Fプライマーを用いてのDNA配列決定に用いた。配列解析により、約150bpのPCR産物から二つの異なるクローンの存在が明らかとなった。それぞれはクロトナーゼおよび水添加酵素配列と配列類似性を有していた。二つのクローンをOS17（157bpのPCR産物）およびOS19（151bpのPCR産物）と命名した。
【０１６８】
OS17の完全なコード配列を得るために、ゲノムウォーキングを実施した。要するに、CRF2およびCRR2変性プライマー内部の157bpのCRF2-CRR2断片配列の一部を用いて、上流および下流両方向のゲノムウォーキングを実施するためのプライマーを設計した
0004490628.tif 000015
。
OS17F1、OS17F3、およびOS17F2プライマーは下流向きで、OS17R2、OS17R3、およびOS17R1プライマーは上流向きであった。
【０１６９】
ゲノムウォーキングは、追加のライブラリを酵素Nru I、Fsp IおよびHinc IIで作製した他は、ユニバーサルゲノムウォーキングキット（ClonTech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。第一ラウンドPCRは、パーキンエルマー2400サーモサイクラーで、94℃で2秒間および72℃で3分間を7サイクル、94℃で2秒間および66℃で3分間を36サイクルと、66℃で4分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドPCRは、94℃で2秒間および72℃で3分間を5サイクル、94℃で2秒間および66℃で3分間を20サイクルと、66℃で4分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド増幅産物（5μL）を1％TAEアガロースゲル上での電気泳動で分離した。第二ラウンドPCRの後、Fsp Iライブラリで、OS17R1プライマーを逆方向で用いた場合には約0.4kbの増幅産物が得られ、Hinc IIライブラリで、OS17F2プライマーを順方向で用いた場合には約0.6kbの増幅産物が得られた。これらのPCR産物をクローニングして配列決定した。
【０１７０】
配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はCRF2-CRR2断片と重なっており、クロトナーゼおよび水添加酵素配列と配列類似性を有することが判明した。
【０１７１】
さらなる配列を得るために、第二のゲノムウォーキングを実施した。この第二のゲノムウォーキングのために、六つのプライマーを設計した
0004490628.tif 000016
。
OS17F4、OS17F5、およびOS17F6プライマーは下流向きで、OS17R4、OS17R5、およびOS17R6プライマーは上流向きであった。
【０１７２】
第二のゲノムウォーキングは、第一のゲノムウォーキングについて記載したのと同じ方法を用いて実施した。第二ラウンドのゲノムウォーキング後、Hinc IIライブラリで、OS17R5プライマーを逆方向で用いた場合には約2.3kbの増幅産物が得られ、Pvu IIライブラリで、OS17F5プライマーを順方向で用いた場合には約0.6kbの増幅産物が得られた。これらのPCR産物をクローニングして配列決定した。配列解析により、第二のゲノムウォーキングから導出された配列は第一のゲノムウォーキング中に得られた配列と重なっていることが判明した。加えて、配列解析により、3572bpの配列が明らかとなった。
【０１７３】
BLAST検索により、この配列によってコードされるポリペプチドは、三つの異なる活性を持つポリペプチドと配列類似性を有することが判明した。具体的には、OS17がコードするポリペプチドの始端部分はCoA合成酵素と配列類似性を有し、OS17がコードするポリペプチドの中央領域はエノイル-CoA水添加酵素と配列類似性を有し、OS17がコードするポリペプチドの終端領域はCoA還元酵素と配列類似性を有する。
【０１７４】
第三のゲノムウォーキングを四つのプライマーを用いて実施した
0004490628.tif 000017
。
OS17UP-6およびOS17UP-7プライマーは上流向きで、OS17DN-1およびOS17DN-2プライマーは下流向きであった。第三のゲノムウォーキングにより、Nru Iライブラリで、OS17UP-7プライマーを逆方向で用いた場合には約1.2kbの増幅産物が得られた。加えて、Hinc IIおよびFsp Iライブラリで、OS17DN-2プライマーを順方向で用いた場合には、それぞれ約4kbおよび約1.1kbの増幅産物が得られた。配列解析により、ポリペプチドをコードする核酸配列が明らかとなった（図27〜28）。完全なOS17遺伝子は5466ヌクレオチドを有し、1822アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。配列から計算したOS17ポリペプチドの分子量は201,346（pI＝5.71）であった。
【０１７５】
BLAST検索の解析により、OS17核酸の産物は、(1)OS17配列始端部のCoA合成酵素、(2)OS17配列中央部の3-HP脱水酵素、および(3)OS17配列終端部のCoA還元酵素に対する配列類似性に基づき、三つの異なる活性を有することが判明した。したがって、OS17クローンは、3-ヒドロキシプロピオネートのプロピオニルCoAへの直接変換につながる三つの異なる反応：3-HP→3-HP-CoA→アクリリルCoA→プロピオニルCoAを触媒することができる一つの酵素をコードすると考えられた。
【０１７６】
C.オーランチアクス由来のOS17遺伝子を、染色体DNAから下記の条件を用いてPCR増幅した：94℃で3分間；変性のために94℃で30秒間、アニーリングのために54℃で30秒間、および伸長のために68℃で6分間を25サイクル；続いて最終伸長のために68℃で10分間。二つのプライマーを用いた
0004490628.tif 000018
。
得られたPCR産物（約5.6kb）をキアゲン PCR精製キット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をNdeIおよびBamHI制限酵素で消化し、80℃で20分間加熱して酵素を不活化し、キアゲンPCR精製キットを用いて精製し、NdeIおよびBamHI酵素であらかじめ消化したpET11aベクター（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、これを50μg/mLのカルベニシリンを補足したLB寒天プレート上に拡げた。コロニー細胞から直接、個々の形質転換体を、OS17FおよびOS17Rプライマー、および前述の条件を用いたOS17 DNAのPCR増幅によりスクリーニングした。5.6kbの産物を生じるクローンを用いて、キアゲンキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen QiaPrep Spin Miniprep Kit）（Qiagen, Inc）によるプラスミド精製を行った。得られたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)細胞に形質転換し、OS17ポリペプチドの発現を誘導した。SDSゲル電気泳動によるOS17ポリペプチドの見かけの分子量は約190,000Daであった。
【０１７７】
OS17ポリペプチドの機能を解析するために、BL21-DE3/pETlla-OS17細胞の100mL培養を、終夜増殖させた培養物1mLを接種物として用いて開始した。培養物をOD 0.5〜0.6になるまで増殖させ、100μM IPTGで誘導した。2.5時間誘導した後、細胞を床置き型遠心分離器で8000rpmで遠心分離することにより回収した。細胞を10mMトリス-HCl（pH7.8）で洗浄し、フレンチプレス（French Press）をゲージ圧1000psiで二回通過させた。細胞片を15,000rpmの遠心分離により除去した。OS17ポリペプチドの活性を分光光度的に測定し、この酵素形質転換中に生じた産物をLC/MSで検出した。アッセイ混合物は下記のとおりであった（J. Bacteriol.、181：1088〜1098（1999））：
0004490628.tif 000019
【０１７８】
初期反応速度を、340nmでNAD(P)Hの消失をモニターすることにより測定した。OS17ポリペプチドの活性を3-HPを基質に用いて測定した。合計タンパク質の単位/mLを、実施例１に示した式を用いて計算した。発現されたOS17ポリペプチドの活性は、合計タンパク質1mLあたり0.061単位と計算された。反応生成物をセプパックバックカラム（Waters）を用いて精製した。カラムをメタノール1mLでコンディショニングし、0.1％TFA 0.5mLで二回洗浄した。次いで、試料をカラムに添加し、カラムを0.1％TFA 0.5mLでさらに二回洗浄した。試料を40％アセトニトリル、0.1％TFA 200μLで溶出した。試料からアセトニトリルを減圧遠心分離により除去した。反応生成物をLC/MSで分析した。
【０１７９】
前述の反応からのチオエステル、すなわちプロピオニルCoA、アクリリルCoA、および3HP CoAの分析を、ウォーターズ2690液体クロマトグラフ（Waters 2690 liquid chromatograph）と、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ996フォトダイオードアレイ（Waters 996 Photo-Diode Array）（PDA）を有するウォーターズ/マイクロマス（Waters/Micromass）ZQ LC/MS装置を用いて実施した。LC分離は、4.6×150mmのYMC ods-AQ（粒径3μm、孔径120Å）逆相クロマトグラフィカラムを用いて室温で行った。CoAエステルは緩衝液A（25mM酢酸アンモニウム、0.5％酢酸）および緩衝液B（アセトニトリル、0.5％酢酸）の直線勾配中に溶出された。流速0.25mL/分を用い、フォトダイオードアレイUV吸光度を200nmから400nmでモニターした。エレクトロスプレーMSシステムのすべてのパラメーターを、対象分析物のプロトン化分子イオン（[M+H]+）の生成および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化し、選択した。CoAおよび有機酸CoAチオエステルの陽イオンモードでのESI-MS検出のために、下記の装置パラメーターを用いた；抽出器：1V；RFレンズ：0V；ソース温度：100℃；脱溶媒温度；300℃；脱溶媒ガス：500L/時間；コーンガス：40L/時間；低質量分解能：13.0；高質量分解能：14.5；イオンエネルギー：0.5；増倍管：650。質量/電荷比（m/z）および分子質量の不確定性は±0.01％である。
【０１８０】
OS17ポリペプチドを発現している株からの酵素アッセイ混合物は、プロピオニルCoA、アクリリルCoA、および3-HP CoAのピークを示し、プロピオニルCoAのピークが主ピークであった。これらのピークは、挿入断片を含まないベクターpET11aを有する対照株から得た酵素アッセイ混合物中では消失している。これらの結果は、OS17ポリペプチドがCoA合成酵素活性、CoA水添加酵素活性、および脱水素酵素活性を有することを示している。
【０１８１】
OS19の完全なコード配列を得るためのゲノムウォーキングも実施した。要するに、CRF2およびCRR2変性プライマー内部の151bpのCRF2-CRR2断片配列の一部を用いて、上流および下流両方向のゲノムウォーキングを実施するためのプライマーを設計した
0004490628.tif 000020
。
OS19F1、OS19F2、およびOS19F3プライマーは下流向きで、OS19R1、OS19R2、およびOS19R3プライマーは上流向きであった。
【０１８２】
Fsp Iライブラリで、OS19R1プライマーを用いた場合には約0.25kbの増幅産物が得られ、Pvu IIライブラリで、OS19R1プライマーを用いた場合には約0.65kbの増幅産物が得られた。加えて、Pvu IIライブラリで、OS19F3プライマーを用いた場合には約0.4kbの増幅産物が得られた。これらのPCR産物をクローニングして配列決定した。配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はCRF2-CRR2断片と重なっており、クロトナーゼおよび水添加酵素配列と配列類似性を有することが判明した。得られた配列は開始コドンコード配列のほとんどに相当していた。
【０１８３】
さらなる配列を得るために、二つのプライマーを用いて第二のゲノムウォーキングを実施した
0004490628.tif 000021
。
OS19F7およびOS19F8プライマーは下流向きであった。
【０１８４】
Pvu IIライブラリから得た増幅産物（約0.7kb）をクローニングして配列決定した。配列解析により、第二のゲノムウォーキングから導出された配列は第一のゲノムウォーキングから得られた配列と重なっており、停止コドンを含むことが判明した。完全長のOS19クローンは、クロトナーゼおよびエノイルCoA水添加酵素配列などの他の配列と配列類似性を有することが判明した（図32〜33）。
【０１８５】
OS19クローンは、アクリリルCoA水添加酵素活性とも呼ばれる3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性を有するポリペプチドをコードすることが明らかとなった。C.オーランチアクス由来のOS19脱水酵素をコードする核酸を、染色体DNAから下記の条件を用いてPCR増幅した：94℃で3分間；変性のために94℃で30秒間、アニーリングのために56℃で30秒間、および伸長のために68℃で1分間を25サイクル；ならびに最終伸長のために68℃で5分間。二つのプライマーを用いた
0004490628.tif 000022
。
【０１８６】
得られたPCR産物（約1.2kb）をアガロースゲル電気泳動で分離し、キアゲン PCR精製キット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をパーフェクトリーブラントクローニングキット（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）を用いてpETBlue-1にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、これを50μg/mLのカルベニシリン、40μg/mL IPTG、および40μg/mL X-Galを補足したLB寒天プレート上に拡げた。白色コロニーを単離し、制限酵素マッピングにより、挿入断片の存在についてスクリーニングした。正しい制限酵素切断パターンを有する単離物を、pETBlueUPおよびpETBlueDOWNプライマー（Novagen）を用いて各末端から配列決定し、ライゲーション点の配列を確認した。
【０１８７】
OS19脱水酵素をコードする配列を含むプラスミドを、チューナー(DE3)pLacI化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、この構築物からの発現を試験した。要するに、培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、適当な抗生物質を含む新鮮LB培地で1：20に希釈した。培養物を37℃、250rpmでOD600が約0.6になるまで増殖させた。この時点で、培養物を最終濃度1mMのIPTGで誘導した。培養物を37℃、250rpmでさらに2時間インキュベートした。誘導前および誘導後2時間の時点でSDS-PAGE分析のために一定量を採取した。予想される分子量（配列から予測して27,336ダルトン）のバンドが観察された。このバンドは、水添加酵素をコードする核酸が欠損しているプラスミドを含む細胞では観察されなかった。
【０１８８】
細胞を前述のとおりに培養して、無細胞抽出物を調製した。細胞を遠心沈降により回収し、超音波処理により破砕した。超音波処理した細胞懸濁液を遠心分離して細胞片を除去し、上清をアッセイ法で用いた。3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素の下記の三つの反応を行う能力を、MALDI-TOF MSを用いて測定した：
1)  アクリリルCoA→3-ヒドロキシプロピオニル-CoA
3)  3-ヒドロキシプロピオニル-CoA→アクリリルCoA
2)  クロトニルCoA→3-ヒドロキシブチリル-CoA
【０１８９】
アッセイ混合物は50mMトリス-HCl（pH7.5）、1mM CoAエステル、および約1μgの無細胞抽出物を含んでいた。反応を室温で進行させ、1倍量の10％トリフルオロ酢酸（TFA）を加えることによって停止した。反応混合物をMALDI-TOF MS分析前に、セプパックバック C18 50mgのカラム（Waters, Inc.）を用いて精製した。カラムをメタノール1mLでコンディショニングし、0.1％TFA 1mLで二回洗浄して平衡化した。試料をカラムに添加し、素通り画分は廃棄した。カラムを0.1％TFA 1mLで二回洗浄した。試料は40％アセトニトリル、0.1％TFA 200μL中に溶出した。アセトニトリルを減圧遠心分離により除去した。試料を110mMシナピン酸/0.1％TFA、67％アセトニトリルと1：1で混合し、MALDI-TOF MS分析のために調製した。試料を風乾した。
【０１９０】
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素によって触媒されるアクリリルCoAの3-ヒドロキシプロピオニル-CoAへの変換を、MALDI-TOF MS法を用いて検出した。反応#1において、対照試料はアクリリルCoA（MW823）に対応する分子量に主ピークを示した。反応#1の3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA（MW841）に対応する主ピークを示した。この結果は、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性が反応#1を触媒することを示している。
【０１９１】
3-ヒドロキシプロピオニル-CoAのアクリリルCoAへの変換を検出するために、反応#2を80％D2O中で実施した。反応#2の3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料から、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA分子に重水素が取り込まれていることが判明した。この結果は、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素が反応#2を触媒することを示している。加えて、#1および#2両方の反応の結果は、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素が3-ヒドロキシプロピオニル-CoA←→アクリリルCoAの両方向の反応を触媒しうることも示している。#1および#2両方の反応で、MW811にピークが観察され、これは3-ヒドロキシプロピオネートおよびアセチルCoAから3-ヒドロキシプロピオニル-CoAの合成からのアセチルCoAの残留によるものであることに留意のこと。
【０１９２】
クロトニルCoAの3-ヒドロキシブチリル-CoAへの変換を評価するアッセイ法も80％D2O中で実施した。反応#3において、対照試料はクロトニルCoA（MW837）に対応する分子量に主ピークを示した。この結果は、クロトニルCoAが他の生成物に変換されないことを示していた。反応#3の3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、重水素化3-ヒドロキシブチリル-CoA（MW855からMW857）に対応する広範なピーク群を示した。この結果は、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性が反応#3を触媒することを示している。
【０１９３】
一連の対照反応を、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素の特異性を確認するために実施した。ラクチルCoA（1mM）を、100mMトリス（pH7.0）を含む反応混合物に、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素存在下および非存在下の両方で加えた。いずれの場合にも、観察された主ピークはラクチルCoA（MW841）に対応する分子量を有していた。この結果は、ラクチルCoAが、D2O存在下でも、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素の存在によって影響を受けないことを示しており、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素がα炭素の位置にヒドロキシル基を結合しないことを意味している。80％D2O反応混合物中に3-ヒドロキシプロピオニル-CoAが存在することで、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性の添加によりピークのシフトが起こった。3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性非存在下では、MW811のピークに加えて3-ヒドロキシプロピオニル-CoAに対応するピークが観察された。MW811のピークは3-ヒドロキシプロピオニル-CoAの合成からの残留アセチルCoAによるものであった。3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性存在下では、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAのアクリリルCoAへの変換およびその逆の間のヒドロキシル基の交換により、重水素化3-ヒドロキシプロピオニル-CoAに対応するピークが観察された（MW842）。これらの対照反応は、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素が3-ヒドロキシプロピオニル-CoAに対して活性であり、ラクチルCoAに対しては活性がないことを示している。加えて、これらの結果は、アクリリルCoA反応の生成物はラクチルCoAではなく3-ヒドロキシプロピオニル-CoAであることを示している。
【０１９４】
実施例４−オペロン#1の構築
下記のオペロンを構築し、大腸菌において3-HPを産生するために用いることができた（図34）。要するに、オペロンをT7プロモーター（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）の制御下でpET-11発現ベクターにクローニングした。pET-11発現ベクターは、挿入された下流配列のための開始コドンとしてNdeI制限酵素切断部位のATG配列を用いる5677bpのプラスミドである。
【０１９５】
CoA転移酵素およびラクチルCoA脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムDNAからPCRによって増幅した。二つのプライマーを用いてCoA転移酵素をコードする配列を増幅し
0004490628.tif 000023
、
二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列を増幅した
0004490628.tif 000024
。
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムDNAから、二つのプライマーを用いるPCRによって増幅した
0004490628.tif 000025
。
【０１９６】
PCRはパーキンエルマー2400サーモサイクラーで、ゲノムDNA 100ngおよびrTthポリメラーゼ（Applied Biosystems；カリフォルニア州フォスターシティ）およびPfuターボポリメラーゼ（Stratagene；カリフォルニア州ラホイヤ）の8：1比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はPCR反応のより高い忠実度を確実にした。次のPCR条件を用いた：94℃で2分間の最初の変性段階；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で2分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。得られたPCR産物を、キアゲンゲル抽出キット（Qiagen, Inc.；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０１９７】
CoA転移酵素、ラクチルCoA脱水酵素（E1、E2αサブユニット、およびE2βサブユニット）、および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素PCR産物を、PCRを用いてアセンブルした。OSCTE-1およびOSCTE-2プライマーならびにOSEBH-1およびOSEBH-2プライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的DNA末端はPCR反応中に互いにアニーリングして、DNAを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（OSNBpctFおよびOSHBR）を、各PCR産物（すなわち、CoA転移酵素、ラクチルCoA脱水酵素、および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素反応からのPCR産物）100ngならびに前述のrTthポリメラーゼ/Pfuターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルPCR混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のPCR条件を用いた：94℃で1分間；94℃で30秒間、55℃で30秒間、および68℃で6分間を25サイクル；ならびに68℃で7分間の最終伸長。アセンブルしたPCR産物をゲル精製し、制限酵素（NdeIおよびBamHI）で消化した。これらの制限酵素部位を、OSNBpctF（NdeI）およびOSHBR（BamHI）プライマーを用いてアセンブルしたPCR産物に導入した。消化したPCR産物を80℃で30分間加熱して制限酵素を不活化し、pET-11aベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０１９８】
pET-11aベクターをNdeIおよびBamHI制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたPCR産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、NdeIおよびBamHI制限酵素を用いた消化によって解析した。
【０１９９】
実施例５−オペロン#2の構築
下記のオペロンを構築し、大腸菌において3-HPを産生するために用いることができた（図35AおよびB）。CoA転移酵素およびラクチルCoA脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムDNAからPCRによって増幅した。二つのプライマーを用いてCoA転移酵素をコードする配列を増幅し（OSNBpctFおよびOSCTE-2）、二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列を増幅した
0004490628.tif 000026
。
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムDNAから、二つのプライマーを用いるPCRによって増幅した
0004490628.tif 000027
。
【０２００】
PCRはパーキンエルマー2400サーモサイクラーで、ゲノムDNA 100ngおよびrTthポリメラーゼ（Applied Biosystems；カリフォルニア州フォスターシティ）およびPfuターボポリメラーゼ（Stratagene；カリフォルニア州ラホイヤ）の8：1比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はPCR反応のより高い忠実度を確実にした。次のPCR条件を用いた：94℃で2分間の最初の変性段階；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で2分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。得られたPCR産物を、キアゲンゲル抽出キット（Qiagen, Inc.；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２０１】
CoA転移酵素およびラクチルCoA脱水酵素（E1、E2αサブユニット、およびE2βサブユニット）PCR産物を、PCRを用いてアセンブルした。OSCTE-1およびOSCTE-2プライマーは互いに相補的であった。したがって、CoA転移酵素配列末端の22ヌクレオチドとラクチルCoA脱水酵素の始端部の22ヌクレオチドとはPCR反応中に互いにアニーリングして、DNAを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（OSNBpctFおよびOSNBeIR）を、CoA転移酵素PCR産物100ng、ラクチルCoA脱水酵素PCR産物100ng、および前述のrTthポリメラーゼ/Pfuターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルPCR混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のPCR条件を用いた：94℃で1分間；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で5分間を20サイクル；ならびに68℃で6分間の最終伸長。
【０２０２】
アセンブルしたPCR産物をゲル精製し、制限酵素（NdeIおよびBamHI）で消化した。これらの制限酵素部位を、OSNBpctF（NdeI）およびOSNBeIR（BamHI）プライマーを用いてアセンブルしたPCR産物に導入した。消化したPCR産物を80℃で30分間加熱して制限酵素を不活化し、pET-11aベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２０３】
pET-11aベクターをNdeIおよびBamHI制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたPCR産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、NdeIおよびBamHI制限酵素を用いた消化によって解析した。消化により、CoA転移酵素をコードする配列およびラクチルCoA脱水酵素をコードする配列を含むDNA断片がpET-11aベクターにクローニングされたことが判明した。
【０２０４】
CoA転移酵素をコードする配列およびラクチルCoA脱水酵素をコードする配列を有するプラスミド（pTD）をXbaIおよびNdeI制限酵素で消化し、ゲル精製し、CoA転移酵素をコードする配列の上流の3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする産物のクローニングに用いた。このXbaIおよびNdeI消化によってpET-11aベクターからリボソーム結合部位（RBS）が除去されたため、新しい相同性RBSを3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする産物と共にプラスミドにクローニングした。要するに、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードするPCR産物をXbaIおよびNdeI制限酵素で消化し、65℃で30分間加熱して制限酵素を不活化し、pTDにライゲーションした。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Novagen）に形質転換し、これを次いで50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。
【０２０５】
個々のコロニーを選択し、プラスミドDNAをキアゲンスピンミニプレップキットを用いて得た。得られたプラスミドをXbaIおよびNdeI制限酵素で消化し、ゲル電気泳動により解析した。挿入された3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードするPCR産物を含むpTDプラスミドをpHTDと命名した。pHTDからのラクチルCoA脱水酵素、CoA転移酵素、および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素配列の発現は、単一のT7プロモーターによって支配されていたが、各コード配列はそれらの開始コドン上流の個々のRBSを有していた。
【０２０６】
ラクチルCoA脱水酵素、CoA転移酵素、および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素配列の一つのオペロンへの正しいアセンブルおよびクローニングを確実にするために、オペロンの両端およびコード配列の間のすべての連結部を配列決定した。このDNA解析により、オペロンが正しくアセンブルされたことが判明した。
【０２０７】
pHTDプラスミドをBL21(DE3)細胞に形質転換して、コードされた配列の発現を試験した。
【０２０８】
実施例６−オペロン#3および#4の構築
オペロン#3（図36AおよびB）およびオペロン#4（図37AおよびB）はそれぞれE1活性化因子をオペロンの末端に配置している。オペロン#3は3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする配列とE1活性化因子をコードする配列との間にRBSを含む。しかし、オペロン#4においては、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする配列の停止コドンはE1活性化因子をコードする配列の開始コドンと次のとおりに融合している：TAGTG。オペロン#4にはRBSがないため、E1活性化因子の発現レベルが低下しうる。
【０２０９】
オペロン#3を構築するために、CoA転移酵素およびラクチルCoA脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムDNAからPCRによって増幅した。二つのプライマーを用いてCoA転移酵素をコードする配列を増幅し
0004490628.tif 000028
、
二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列のE2αおよびβサブユニットを増幅し
0004490628.tif 000029
、
二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列のE1活性化因子を増幅した
0004490628.tif 000030
。
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムDNAから、二つのプライマーを用いるPCRによって増幅した
0004490628.tif 000031
。
【０２１０】
PCRはパーキンエルマー2400サーモサイクラーで、ゲノムDNA 100ngおよびrTthポリメラーゼ（Applied Biosystems；カリフォルニア州フォスターシティ）およびPfuターボポリメラーゼ（Stratagene；カリフォルニア州ラホイヤ）の8：1比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はPCR反応のより高い忠実度を確実にした。次のPCR条件を用いた：94℃で2分間の最初の変性段階；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で2分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。得られたPCR産物を、キアゲンゲル抽出キット（Qiagen, Inc.；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２１１】
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素およびE1活性化因子PCR産物を、PCRを用いてアセンブルした。OSHrE1FおよびOSEIrHRプライマーは互いに相補的であった。したがって、プライマーはPCR反応中に互いにアニーリングして、DNAを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（OSTHFおよびOSE1BR）を、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素PCR産物100ng、E1活性化因子PCR産物100ng、および前述のrTthポリメラーゼ/Pfuターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルPCR混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のPCR条件を用いた：94℃で1分間；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で1.5分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。
【０２１２】
アセンブルしたPCR産物をゲル精製し、ゲル精製したCoA転移酵素PCR産物との第二のアセンブルPCRに用いた。OSTHFおよびOSHTRプライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的なDNA末端はPCR反応中に互いにアニーリングして、DNAを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（OSNBpctFおよびOSE1BR）を、精製した3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素/EI PCRアセンブル体100ng、精製したCoA転移酵素PCR産物100ng、および前述のポリメラーゼ混合物を含む、第二のアセンブルPCR混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のPCR条件を用いた：94℃で1分間；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で3分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。
【０２１３】
アセンブルしたPCR産物をゲル精製し、NdeIおよびBamHI制限酵素で消化した。これらの制限酵素部位を、OSNBpctF（NdeI）およびOSEIBR（BamHI）プライマーを用いてアセンブルしたPCR産物に導入した。消化したPCR産物を80℃で30分間加熱して制限酵素を不活化し、pET11aベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２１４】
pET-11aベクターをNdeIおよびBamHI制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたPCR産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。得られた、CoA転移酵素、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素、およびEI活性化因子配列を有するプラスミド（pTHrEI）をXbaIおよびNdeIで消化し、ゲル電気泳動およびキアゲンゲル抽出キットを用いて精製し、E2αサブユニット/E2βサブユニットPCR産物のクローニングのためのベクターとして用いた。
【０２１５】
E2αサブユニット/E2βサブユニットPCR産物を同じ酵素で消化し、pTHrEIベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Novagen）に形質転換し、これを次いで50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにXbaIおよびNdeI制限酵素で消化した。得られた、構築されたオペロン#3を有するプラスミド（pEIITHrEI）をBL21(DE3)細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。エレクトロスプレー質量分析により、これらの細胞からの抽出物はCoA転移酵素活性および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性を有することが確認された。同様の解析を用いて、これらの細胞からの抽出物がラクチルCoA脱水酵素活性も有することを確認する。
【０２１６】
オペロン#4を構築するために、CoA転移酵素およびラクチルCoA脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムDNAからPCRによって増幅した。二つのプライマーを用いてCoA転移酵素をコードする配列を増幅し（OSNBpctFおよびOSHTR）、二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列のE2αおよびβサブユニットを増幅し（OSEIIXNFおよびOSEIIXNR）、二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列のE1活性化因子を増幅した
0004490628.tif 000032
。
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムDNAから、二つのプライマーを用いるPCRによって増幅した
0004490628.tif 000033
。
【０２１７】
PCRはパーキンエルマー2400サーモサイクラーで、ゲノムDNA 100ngおよびrTthポリメラーゼ（Applied Biosystems；カリフォルニア州フォスターシティ）およびPfuターボポリメラーゼ（Stratagene；カリフォルニア州ラホイヤ）の8：1比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はPCR反応のより高い忠実度を確実にした。次のPCR条件を用いた：94℃で2分間の最初の変性段階；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で2分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。得られたPCR産物を、キアゲンゲル抽出キット（Qiagen, Inc.；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２１８】
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素およびE1活性化因子PCR産物を、PCRを用いてアセンブルした。OSHEIFおよびOSEIHRプライマーは互いに相補的であった。したがって、プライマーはPCR反応中に互いにアニーリングして、DNAを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（OSTHFおよびOSE1BR）を、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素PCR産物100ng、E1活性化因子PCR産物100ng、および前述のrTthポリメラーゼ/Pfuターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルPCR混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のPCR条件を用いた：94℃で1分間；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で1.5分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。
【０２１９】
アセンブルしたPCR産物をゲル精製し、ゲル精製したCoA転移酵素PCR産物との第二のアセンブルPCRに用いた。OSTHFおよびOSHTRプライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的なDNA末端はPCR反応中に互いにアニーリングして、DNAを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（OSNBpctFおよびOSE1BR）を、精製した3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素/EI PCRアセンブル体100ng、精製したCoA転移酵素PCR産物100ng、および前述のポリメラーゼ混合物を含む、第二のアセンブルPCR混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のPCR条件を用いた：94℃で1分間；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で3分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。
【０２２０】
アセンブルしたPCR産物をゲル精製し、NdeIおよびBamHI制限酵素で消化した。これらの制限酵素部位を、OSNBpctF（NdeI）およびOSEIBR（BamHI）プライマーを用いてアセンブルしたPCR産物に導入した。消化したPCR産物を80℃で30分間加熱して制限酵素を不活化し、pET11aベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２２１】
pET-11aベクターをNdeIおよびBamHI制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたPCR産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。得られた、CoA転移酵素、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素、およびEI活性化因子配列を有するプラスミド（pTHE1）をXbaIおよびNdeIで消化し、ゲル電気泳動およびキアゲンゲル抽出キットを用いて精製し、E2αサブユニット/E2βサブユニットPCR産物のクローニングのためのベクターとして用いた。
【０２２２】
E2αサブユニット/E2βサブユニットPCR産物を同じ酵素で消化し、pTHE1ベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Novagen）に形質転換し、これを次いで50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにXbaIおよびNdeI制限酵素で消化した。得られた、構築されたオペロン#4を有するプラスミド（pEIITHEI）をBL21(DE3)細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。エレクトロスプレー質量分析により、これらの細胞からの抽出物はCoA転移酵素活性および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素活性を有することが確認された。同様の解析を用いて、これらの細胞からの抽出物がラクチルCoA脱水酵素活性も有することを確認する。
【０２２３】
合成3-HPオペロンを有する大腸菌プラスミドpEIITHrEIを、NruI、XbaIおよびBamHI制限酵素で消化し、XbaI-BamHI DNA断片をキアゲンゲル抽出キット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製し、バチル（Bacillu）ベクターpWH1520（MoBiTec BmBH、ドイツ、ゴッティンゲン）にさらにクローニングするために用いた。ベクターpWH1520をSpeIおよびBamHI制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製した。3-HPオペロンを有するXbaI-BamHI断片をWH1520ベクターにT4リガーゼを用いて16℃で終夜ライゲーションした。ライゲーション混合物を化学的コンピテントTOP10細胞に形質転換し、50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。B.メガテリウム（pBPO26）なる名称の一つのクローンをCoA形質転換酵素およびCoA水添加酵素活性のアッセイ法に用いた。アッセイ法は大腸菌について前述したとおりに行った。酵素活性はそれぞれ5U/mgおよび13U/mgであった。
【０２２４】
実施例７−二つのプラスミド系の構築
下記の構築物を構築し、大腸菌において3-HPを産生するために用いることができた（図38AおよびB）。CoA転移酵素およびラクチルCoA脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムDNAからPCRによって増幅した。二つのプライマーを用いてCoA転移酵素をコードする配列を増幅し（OSNBpctFおよびOSHTR）、二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列のE2αおよびβサブユニットを増幅し（OSEIIXNFおよびOSEIIXNR）、二つのプライマーを用いてラクチルCoA脱水酵素をコードする配列のE1活性化因子を増幅した
0004490628.tif 000034
。
3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムDNAから、二つのプライマーを用いるPCRによって増幅した
0004490628.tif 000035
。
【０２２５】
PCRはパーキンエルマー2400サーモサイクラーで、ゲノムDNA 100ngおよびrTthポリメラーゼ（Applied Biosystems；カリフォルニア州フォスターシティ）およびPfuターボポリメラーゼ（Stratagene；カリフォルニア州ラホイヤ）の8：1比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はPCR反応のより高い忠実度を確実にした。次のPCR条件を用いた：94℃で2分間の最初の変性段階；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で2分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。得られたPCR産物を、キアゲンゲル抽出キット（Qiagen, Inc.；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２２６】
CoA転移酵素PCR産物および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素PCR産物を、PCRを用いてアセンブルした。OSTHFおよびOSHTRプライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的DNAの末端はPCR反応中に互いにアニーリングして、DNAを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（OSNBpctFおよびOSHBR）を、CoA転移酵素PCR産物100ng、精製した3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素PCR産物100ng、および前述のポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルPCR混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のPCR条件を用いた：94℃で1分間；94℃で30秒間、54℃で30秒間、および68℃で2.5分間を20サイクル；ならびに68℃で5分間の最終伸長。
【０２２７】
アセンブルしたPCR産物をゲル精製し、NdeIおよびBamHI制限酵素で消化した。これらの制限酵素部位を、OSNBpctF（NdeI）およびOSHBR（BamHI）プライマーを用いてアセンブルしたPCR産物に導入した。消化したPCR産物を80℃で30分間加熱して制限酵素を不活化し、pET11aベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２２８】
pET-11aベクターをNdeIおよびBamHI制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたPCR産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにNdeIおよびBamHI制限酵素を用いて消化した。得られた、CoA転移酵素および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素を有するプラスミド（pTH）をXbaIおよびNdeIで消化し、ゲル電気泳動およびキアゲンゲル抽出キットを用いて精製し、E2αサブユニット/E2βサブユニットPCR産物のクローニングのためのベクターとして用いた。
【０２２９】
同じ酵素で消化したE2αサブユニット/E2βサブユニットPCR産物を、pTHベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Novagen）に形質転換し、これを次いで50μg/mLのカルベニシリンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにXbaIおよびNdeI制限酵素で消化した。得られた、ラクチルCoA脱水酵素のE2αおよびβサブユニット、CoA転移酵素、および3-ヒドロキシプロピオニル-CoA脱水酵素を有するプラスミド（pEIITH）をBL21(DE3)細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。
【０２３０】
ゲル精製したE1活性化因子PCR産物をEcoRIおよびKpnI制限酵素で消化し、65℃で30分間加熱して、これをEcoRIおよびKpnI制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）で処理したベクター（pPROLar.A）にライゲーションした。ライゲーションはT4リガーゼ（Roche Molecular Biochemicals；インディアナ州インディアナポリス）を用いて16℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をDH10B電気的コンピテント細胞（Gibco Life Technologies；メリーランド州ゲイザースバーグ）に電気穿孔法を用いて形質転換した。電気穿孔した後、細胞を25μg/mLのカナマイシンを補足したLBプレート上にプレーティングした。プラスミドDNAを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにEcoRIおよびKpnI制限酵素を用いて消化した。得られた、E1活性化因子を有するプラスミド（pPROEI）をBL21(DE3)細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。
【０２３１】
pPROEIおよびpEIITHプラスミドは同じ細菌宿主細胞で用いることができる互換性プラスミドである。加えて、pPROEIおよびpEIITHプラスミドからの発現は、IPTGおよびアラビノースを用いて異なるレベルで誘導することができ、クローニングした配列の発現の微調整を可能にする。
【０２３２】
実施例８−3-HPの産生
組換え大腸菌を用いて小規模バッチ発酵反応で3-HPを産生した。誘導型T7 RNAポリメラーゼを有するALS848株（TA3476とも命名されている（J. Bacteriol.、143：1081〜1085（1980）））の構築を、λDE3溶原化キット（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、製造者の指示に従って実施した。構築した株をALS484(DE3)と命名した。ALS484(DE3)株をpEIITHrEIプラスミドで標準の電気穿孔法を用いて形質転換した。形質転換体をLB/カルベニシリン（50μg/mL）プレート上で選択した。単コロニーを用いて15mL培養管中の4mL培養物に接種した。ベクターpET11aを有するALS484(DE3)株を対照として用いた。細胞をイノーバ4230インキュベーター振盪機（New Brunswick Scientific、ニュージャージー州エジソン）中、37℃、250rpmで8〜9時間培養した。この培養物（3mL）を用いて嫌気性発酵を開始した。ALS(DE3)/pET11aおよびALS(DE3)pEIITHrEIの二つの100mL嫌気性培養物を、0.4％グルコース、50μg/mLカルベニシリン、および100mM MOPSを補足したLB培地を用いて血清瓶中で培養した。培養物を振盪せずに37℃で終夜増殖させた。終夜増殖培養物を、0.4％グルコース、50μg/mLカルベニシリン、および100mM MOPSを補足した新鮮LB培地を用いて血清瓶中で継代培養した。これらの培養物の開始時OD(600)を0.3に調節した。これらの血清瓶を振盪せずに37℃でインキュベートした。1時間のインキュベーション後、培養物を100μM IPTGで誘導した。30分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、および24時間の時点で試料3mLを各血清瓶から採取した。試料を二つの適当に標識した2mL微量遠沈管に移し、それぞれ1.5mLの試料を含んでいた。試料を微量遠沈管内、14000gで3分間遠心沈降した。上清を0.45μシリンジフィルターを通過させ、得られたろ液をさらに分析するまで-20℃で保存した。発酵産物、主にラクテートおよび3-ヒドロキシプロピオネートの生成を、LC/MSを用いて乳酸および3-HPの誘導体化CoAエステルを検出することにより測定した。
【０２３３】
乳酸および3-HPをそれぞれのCoAエステルに変換するために、下記の方法を実施した。要するに、ろ液をCoA反応緩衝液（200mMリン酸カリウム緩衝液、2mMアセチルCoA、および0.1mg/mL精製転移酵素）と1：1比で混合した。反応を室温で20分間進行させた。1倍量の10％TFAを加えることによって反応を停止した。試料をセプパックバックカラム（Waters）を用いて精製した。カラムをメタノールでコンディショニングし、0.1％TFAで二回洗浄した。次いで、試料をカラムに添加し、カラムを0.1％TFAでさらに二回洗浄した。試料を40％アセトニトリル、0.1％TFAで溶出した。アセトニトリルを試料から減圧遠心分離により除去した。試料をLC/MSで分析した。
【０２３４】
標準CoA/CoAチオエステル混合物および発酵ブロスからのCoAチオエステル混合物の分析を、ウォーターズ2690液体クロマトグラフと、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ996フォトダイオードアレイ（PDA）吸光度モニターを有するウォーターズ/マイクロマス ZQ LC/MS装置を用いて実施した。LC分離は、4.6×150mmのYMC ODS-AQ（粒径3μm、孔径120Å）逆相クロマトグラフィカラムを用いて室温で行った。CoAエステルの分離のために、異なる移動相を用いて二つの勾配溶出系を開発した。これら二つの系を表3にまとめている。溶出系１はCoA/CoAチオエステル混合物の5成分（CoA、アセチルCoA、ラクチルCoA、アクリリルCoA、およびプロピオニルCoA）の最も迅速で効率的な分離を提供するために開発し、一方、溶出系2は構造異性エステルのラクチルCoAおよび3HP-CoAの基線分離ならびに前述の残りのエステルの分離を提供するために開発した。すべての場合に、流速は0.250mL/分で、フォトダイオードアレイUV吸光度は200nmから400nmでモニターした。エレクトロスプレーMSシステムのすべてのパラメーターを、対象分析物のプロトン化分子イオン（[M+H]+）の生成および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化し、選択した。CoAおよび有機酸CoAチオエステルの陽イオンモードでのESI-MS検出のために、下記の装置パラメーターを用いた：キャピラリー：4.0V；コーン：56V；抽出器：1V；RFレンズ：0V；ソース温度：100℃；脱溶媒温度；300℃；脱溶媒ガス：500L/時間；コーンガス：40L/時間；低質量分解能：13.0；高質量分解能：14.5；イオンエネルギー：0.5；増倍管：650。報告された質量/電荷比（m/z）および分子質量の不確定性は±0.01％である。表3は有機酸−補酵素Aチオエステル分離のための勾配溶出系の概要を示している。
【０２３５】
【表３】
0004490628.tif 000036
【０２３６】
下記の方法を用いて、3-HPから生成した誘導体化3-ヒドロキシプロピオニル-CoAを、ラクテートから生成した2-ヒドロキシプロピオニル-CoA（すなわち、ラクチルCoA）から分離した。これらの構造異性体は同じ質量および質量分析でのフラグメント化挙動を有するため、混合物中のこれらの分析物の分離および同定は、それらのクロマトグラフィによる分離に依存する。溶出系1は試験したCoAチオエステルのすぐれた分離を提供した（図46）が、3-HP-CoAとラクチルCoAとを分離することはできなかった。別のLC溶出系を酢酸アンモニウムおよびトリエチルアミンを用いて開発した（系2；表3）。
【０２３７】
系2の3-HP-CoAとラクチルCoAとを分離する能力を、これら二つの化合物の混合物で試験した。3-HP-CoAおよびラクチルCoAの混合物からの結果（図47、パネルA）とラクチルCoAのみからの結果（図47、パネルB）との比較により、系2は3-HP-CoAおよびラクチルCoAを分離しうることが判明した。図46、パネルCと比較した場合に、ピーク1の下で記録された質量スペクトル（図47、パネルAの挿入図）を用いて、ピーク1をヒドロキシプロピオニルCoAチオエステルであると同定した。加えて、図47のパネルAおよびBならびに各ピークに対応する質量スペクトルの結果の比較により、ピーク1は3-HP-CoAに対応し、ピーク2はラクチルCoAに対応することが明らかとなった。
【０２３８】
系2を用いて、3-HP-CoAが検出されたため、pEIITHrEIでトランスフェクトされた大腸菌が3-HPを産生することが確認された。具体的には、pEIITHrEIを含む大腸菌の培養物からCoA転移酵素処理した発酵ブロスの一定量を採取し、その分析におけるm/z＝840のイオンクロマトグラムから、3-HP-CoAの存在が明らかとなった（図48、パネルA）。pEIITHrEIを含まない大腸菌の培養物から採取した、CoA転移酵素処理した発酵ブロスの一定量は、3-HP-CoAに対応するピークを示さなかった（図48、パネルB）。したがって、これらの結果は、pEIITHrEIプラスミドがプロピオニルCoA転移酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性、およびアクリリルCoA水添加酵素活性を有するポリペプチドの発現を支配していることを示している。これらの結果は、これらのポリペプチドの発現が3-HPの生成につながることも示している。
【０２３９】
実施例９−アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、アセチルCoAをマロニルCoAにカルボキシル化することにより、脂肪酸合成に関連する第一の段階を触媒する。アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、適当な細胞機能に要求される超長鎖脂肪酸生合成のためのマロニルCoAの提供も担っている。アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、補因子であるビオチンが翻訳後に特定のリシン残基に結合される、ビオチン依存酵素でありうる。そのようなポリペプチドによって触媒される反応は、二つの異なる半反応からなる。第一の半反応において、ATP依存反応でビオチンは重炭酸塩によってカルボキシル化されてカルボキシビオチンを生じる。第二の半反応において、カルボキシル基はアセチルCoAに転移してマロニルCoAを生じる。
【０２４０】
アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を有する原核細胞および真核細胞のポリペプチドが存在する。原核細胞ポリペプチドは多サブユニット酵素（四つのサブユニット）で、各サブユニットは異なる核酸配列によってコードされる。例えば、大腸菌において、下記の遺伝子がアセチルCoAカルボキシラーゼの四つのサブユニットをコードする：
accA：アセチル-補酵素aカルボキシラーゼカルボキシル転移酵素サブユニットα（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号M96394）
accB：ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号U18997）
accC：ビオチンカルボキシラーゼ（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号U18997）
accD：アセチル-補酵素aカルボキシラーゼカルボキシル転移酵素サブユニットベータ（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号M68934）
【０２４１】
真核細胞ポリペプチドは単一の遺伝子によってコードされる高分子量多機能酵素である。例えば、出芽酵母において、アセチルCoAカルボキシラーゼはゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号M92156に示した配列を有しうる。
【０２４２】
大腸菌由来の原核細胞型アセチルCoAカルボキシラーゼを、別に記載のT7プロモーターベクターpFN476（デービス（Davis）ら、J. Biol. Chem.、275：28593〜28598（2000））を用いて過剰発現させた。真核細胞型アセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子を、出芽酵母ゲノムDNAから増幅した。出芽酵母からacc1遺伝子を増幅するために、二つのプライマーを設計した
0004490628.tif 000037
ただし、太字は相同配列であり、イタリックはNot I部位であり、下線はRBSであり、小文字は余分である。および
0004490628.tif 000038
ただし、太字は相同配列であり、イタリックはXho I部位であり、下線はRBSであり、小文字は余分である）。下記のPCR混合物を用いてacc1遺伝子を増幅した：10×pfu緩衝液（10μL）、dNTP（10mM；2μL）、cDNA（2μL）、acc1F（100μM；1μL）、acc1R（100μM；1μL）、pfu酵素（2.5単位；2μL）、および脱イオン水（82μL）。下記のプロトコルを用いてacc1遺伝子を増幅した。PCR実施後、PCR産物をゲル上で分離し、acc1核酸（約6.7kb）に対応するバンドをキアゲンゲル単離キットを用いてゲル単離した。PCR断片をNot IおよびXho I（New England BioLab）制限酵素で消化した。消化したPCR断片を次いで、Not IおよびXho Iで切断し、SAP酵素で脱リン酸化したpET30aにライゲーションした。大腸菌DH10B株をライゲーション混合物1μＬで形質転換し、細胞をSOC培地1mL中で回復させた。形質転換細胞をLB/カナマイシン（50μg/μL）プレート上で選択した。八つの単コロニーを選択し、PCRを用いて正しい挿入断片についてスクリーニングした。正しい挿入断片を有するプラスミドを、キアゲンスピンミニプレップキットを用いて単離した。
【０２４３】
アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを得るために、大腸菌または出芽酵母アセチルCoAカルボキシラーゼを過剰発現しているプラスミドpMSD8またはpET30a/acc1をチューナー pLacI化学的コンピテント細胞（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。形質転換細胞をLB/クロラムフェニコール（25μg/mL）＋カルベニシリン（50μg/mL）またはカナマイシン（50μg/mL）上で選択した。
【０２４４】
この株の粗抽出物を下記の様式で調製することができる。チューナー pLacIのpMSD8との終夜培養物を、0.4％グルコース、1μg/mLチアミン、0.1％カザミノ酸、ならびに50μg/mLカルベニシリンまたは50μg/mLカナマイシンおよび25μg/mLクロラムフェニコールを補足した新鮮M9培地200mL（1リットルのバッフル培養フラスコ内）に継代培養する。培養物を振盪機内、250rpmで撹拌しながら37℃で600nmの光学密度約0.6に達するまで増殖させる。次いで、IPTGを最終濃度100μMまで加える。次いで、培養物を振盪速度250rpm、37℃でさらに3時間インキュベートする。細胞を8000×gでの遠心分離によって回収し、0.85％NaClで一回洗浄する。細胞ペレットを最少量の50mMトリス-HCl（pH8.0）、5mM MgCl2、100mM KCI、2mM DTT、および5％グリセロールに再懸濁した。細胞をフレンチプレッシャー細胞（French Pressure cell）を1000psigの圧で二回通過させることにより溶解する。細胞片を30,000×gで20分間遠心分離して除去した。
【０２４５】
酵素をデービスら（J. Biol. Chem.、275：28593〜28598（2000））からの方法を用いてアッセイすることができる。
【０２４６】
実施例１０−クロロフレクサス・オーランチアクス由来マロニルCoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
マロニルCoA還元酵素活性を有するポリペプチドを、クロロフレクサス・オーランチアクスから部分精製し、アミノ酸微量配列決定の結果を得るために用いた。アミノ酸配列決定の結果を用いて、マロニルCoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定およびクローニングした。
【０２４７】
タンパク質精製に必要なバイオマスを、ビーブラウンバイオスタット発酵槽（B. Braun BIOSTAT B fermenters）（B. Braun Biotech International GmbH、ドイツ、メルスンゲン）内で培養した。加熱用の水ジャケットを備えたガラス容器を用いて、必要とされるバイオマスを増殖させた。ガラス容器をそれ自体の制御装置に連結した。液体の可使容積は4Lで、発酵槽は55℃、75rpmの撹拌で操作した。二酸化炭素を発酵槽の上部空間を通して随時通気し、嫌気性条件を維持した。培養物のpHを標準のpHプローブを用いてモニターし、8.0から8.3の間に維持した。発酵槽用の接種材料を、イノーバ4230インキュベーター振盪機（New Brunswick Scientific、ニュージャージー州エジソン）内、55℃、内部照明下、二つの250mLボトルで培養した。発酵槽を三つの65Wプラント用光反射ランプ（plant light reflector lamp）（General Electric、オハイオ州クリーブランド）で照明した。各ランプをガラス容器から約50cm離して設置した。接種材料および発酵槽培養物用に用いた培地は1リットルあたり次のとおりであった：0.07g EDTA、1mL 微量栄養素溶液、1mL FeCl3溶液、0.06g CaS04・2H20、0.1g MgSO4・7H20、0.008g NaCl、0.075g KC1、0.103g KNO3、0.68g NaN03、0.111g Na2HP04、0.2g NH4Cl、1g酵母抽出物、2.5gカザミノ酸、0.5g グリシル−グリシン、および900mL脱イオン水。微量栄養素溶液は1リットルあたり下記を含んでいた：0.5mL 濃H2S04、2.28g MnS04・7H2O、0.5g ZnS04・7H2O、0.5g H3BO3、0.025g CuSO4・2H2O、0.025g Na2MoO4・2H2O、および0.045g CoC12・6H20。FeCl3溶液は1リットルあたり0.2905g FeCl3を含んでいた。培地のpHを8.2から8.4に調節した後、0.75g/LのNa2S・9H2Oを加え、pHを8.2から8.4に再度調節し、培地を0.22μフィルターを通してフィルター滅菌した。
【０２４８】
発酵槽に増殖培養物500mLを接種した。細胞密度が600nmで約0.5から0.6になった後、発酵を停止し、バイオマスを回収した。
【０２４９】
細胞を4℃、5000×gの遠心分離（Beckman JLA 8.1000ローター）によって回収し、1倍量の氷冷0.85％NaClで洗浄し、再度遠心分離した。細胞ペレットを氷冷した2mM DTT、5mM MgCl2、0.4mM PEFABLOC（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）、1％硫酸ストレプトマイシン、およびコンプリートEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete EDTA-free protese inhibitor cocktail）2錠（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）を補足した100mMトリス-HCl（pH7.8）緩衝液30mLに再懸濁した。細胞懸濁液を1600psi（ゲージ読みとリ値）で操作した50mLのフレンチプレッシャー細胞を三回通過させて溶解した。細胞片を30,000×gの遠心分離（Beckman JA 25.50ローター）で除去した。粗抽出物をクロマトグラフィ前に0.2μm HT Tuffryn膜シリンジフィルター（Pall Corp.、ミシガン州アンアーバー）を用いてろ過した。粗抽出物のタンパク質濃度は29mg/mLで、これはバイオラッド蛋白質あアッセイ（BioRad Protein Assay）を製造者のマイクロアッセイプロトコルに従って用いて定量した。標準曲線の定量にはウシγグロブリンを用いた。このアッセイ法はブラッドフォードの色素結合法（Bradford dye-binding procedure）（ブラッドフォード、Anal. Biochem.、72：248（1976））に基づいていた。
【０２５０】
タンパク質精製を始める前に、下記のアッセイ法を用いて粗抽出物中のマロニルCoA還元酵素の活性を定量した。細胞抽出物（29mg/mL）の一部50μLを、96穴UV透過プレート（Corning、ニューヨーク）中、1Mトリス-HCl 10μL（アッセイ中の最終濃度100mM）、10mMマロニルCoA 10μL（アッセイ中の最終濃度1mM）、5.5mM NADPH 5.5μL（アッセイ中の最終濃度0.3mM）、および脱イオン水24.5μLに加えた。酵素活性を、スペクトラマックスプラス96穴プレートリーダー（SpectraMAX Plus 96 well plate reader）（Molecular devices、カリフォルニア州サニーベール）を用いて45℃で測定した。マロニルCoA還元酵素の活性を、340nmの波長でNADPHの消失を測定することによってモニターした。粗抽出物はマロニルCoA還元酵素活性を示した。
【０２５１】
タンパク質細胞抽出物5mL（全145mg）を緩衝液A（20mMエタノールアミン（pH9.0）、5mM MgCl2、2mM DTT）20mLで希釈した。クロマトグラフィによるタンパク質精製を、バイオロジックタンパク質精製システム（BioLogic protein purification system）（BioRad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて行った。細胞懸濁液25mLを、緩衝液A（1mL/分）で平衡化しておいたUNO Q-6イオン交換カラムに添加した。試料添加後、カラムをカラム容積の2.5倍の緩衝液A（2mL/分）で洗浄した。タンパク質を、カラム容積の25倍の緩衝液A中NaCl 0〜0.33Mの直線勾配で溶出した。全クロマトグラフィ分離中、3mL画分を分取した。溶出された試料のpHが約pH7に低下するように、分取チューブにはトリス-HCl（pH6.5）50μLが含まれていた。主なクロマトグラフィピークは、画分18から21および画分23から30に対応する領域で検出された。これらの画分から200μLの試料を取り、マイクロコン（Microcon）YM-10カラム（Millipore Corp.、マサチューセッツ州ベッドフォード）を製造者の指示どおりに用いて、微量遠心分離機中、4℃で濃縮した。濃縮した各画分に、緩衝液A−トリス（100mMトリス-HCl（pH7.8）、5mM MgCl2、2mM DTT）を加えて、全量100μLとした。これらの各画分を、前述の分光光度アッセイ法を用いてマロニルCoA還元酵素活性について試験した。マロニルCoAの比活性の大部分は画分18から21に認められた。これらの画分を集め、集めた試料をPD-10カラム（Amersham Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を製造者の指示どおりに用いて脱塩した。
【０２５２】
脱塩したタンパク質抽出物10.5mLを緩衝液A−トリスで体積25mLまで希釈した。この脱塩希釈試料を、緩衝液A−トリスで平衡化したHiTrap Blueカラム（Amersham Pharmaciaニュージャージー州ピスカタウェイ）に添加した。試料は0.1mL/分の速度で添加した。未結合のタンパク質をカラム容積の2.5倍の緩衝液A−トリスで洗浄した。タンパク質を100Mmトリス（pH7.8）、5mM MgCl2、2mM DTT、2mM NADPH、および1M NaClで溶出した。この分離工程中、1mLの画分を分取した。試料200μLを画分49から54から取り、濃縮した。緩衝液A−トリスを濃縮した各画分に加えて、全量100μLとした。画分を、前述のとおりに酵素活性について解析した。最も高い比活性は画分51で認められた。画分51をすべて前述のとおりに濃縮し、濃縮した試料をSDS-PAGEゲル上で分離した。
【０２５３】
バイオラッドプロテアンII（Bio-Rad Protean II）ミニゲルシステムおよび成型済みSDS-PAGEゲル（4〜15％）、またはプロテアンII XIシステムおよび16cm×20cm×lmmのSDS-PAGEゲル（10％）型を製造者の指示どおりに用いて、電気泳動を行った。ゲルを製造者に指示に従い、25mMトリス-HCl（pH8.3）、192mMグリシン、および0.1％SDSの泳動緩衝液で泳動した。
【０２５４】
1mmのゲル厚を用いて画分51からの試料を泳動した。画分51からのタンパク質を10％SDS-PAGEに添加した（3レーン、それぞれ全75μgのタンパク質を含む）。ゲルをクーマシーブルー（BioRad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で短時間染色し、次いで10％酢酸および20％メタノール溶液でバックグラウンドが澄明になるように脱染した。染色により、約130〜140KDaのバンドが明らかとなった。
【０２５５】
約130〜140KDaのタンパク質バンドを、過剰の未染色ゲルがないように切り出した。タンパク質を含まない等面積のゲルを陰性対照として切り出した。ゲル切片を、HPLC等級の水中50％アセトニトリルで予備洗浄した無色の微量遠沈管に入れ、50％アセトニトリルで二回洗浄し、ドライアイス上でハーバードマイクロケミストリーシーケンシングファクトリー（Harvard Microchemistry Sequencing Facility）、マサチューセッツ州ケンブリッジに送った。
【０２５６】
ポリペプチド試料のトリプシンによるインサイチュー酵素消化後、得られたポリペプチドをマイクロキャピラリー逆相HPLCで分離した。HPLCをファニガン（Finnigan）LCQ四重極イオントラップ質量分析計のナノ−エレクトロスプレーイオン化源に直接連結した（μLC/MS/MS）。個々の配列スペクトル（MS/MS）を、クロマトグラフィ実施中に分離された複数のポリペプチドについて、オンラインで高感度で得た。ポリペプチドのMS/MSスペクトルを、ワシントン大学で開発されたアルゴリズムシークエスト（Sequest）（エング（Eng）ら、J. Am. Soc. Mass Spectrom.、5：976（1994））およびハーバードで開発されたプログラム（チタム（Chittum）ら、Biochemistry、37：10866（1998））を用いて、既知の配列で補正した。結果を既知のタンパク質との一致について、および忠実度の手動確認について見直した。
【０２５７】
同様の精製法を用いてもう一つの試料（タンパク質1の試料）を得、これを画分51の試料を評価するために用いたものと同じ分析にかけた。
【０２５８】
ポリペプチド配列の結果は、画分51の試料およびタンパク質1の試料の両方から得たポリペプチドは、C.オーランチアクスゲノムから配列決定され、ジョイントゲノムインスチュテート（Joint Genome Institute）のウェブサイト（http ://www.jgi.doe.gov/）に載せられている六つのコンティグ（764、799、859、923、1090、1024）と類似性を有することを示していた。764コンティグは約40のペプチド配列が類似性を示し、六つの中で最も顕著であった。ゲンバンクのウェブサイト上でのこれらの各コンティグのBLASTX解析（http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）は、764コンティグ（4201塩基）のDNA配列が脱水素酵素/還元酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすることを示していた。しかし、764コンティグを厳密に調べると、このコンティグは130〜140KDaのポリペプチドをコードする適当なORFを持っていないことが明らかとなった。
【０２５９】
BLASTX解析を、他の五つのコンティグを用いても実施した。この解析の結果は下記のとおりであった。799コンティグ（3173塩基）は、リン酸および脱水素酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。859コンティグ（5865塩基）は合成酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。923コンティグ（5660塩基）は延長因子および合成酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。1090コンティグ（15201塩基）は脱水素酵素/還元酵素ならびにチトクロームおよびσ因子活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。1024コンティグ（12276塩基）は脱水素酵素および脱カルボキシル酵素および合成酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。したがって、859および923コンティグはこれ以上のいかなる解析からも除外した。
【０２６０】
BLASTX解析の結果より、1024コンティグで見いだされた脱水素酵素は、イノシトール一リン酸脱水素酵素である可能性が高いことも判明した。したがって、1024コンティグは、マロニルCoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする可能性のある候補として除外した。799コンティグは前述のOS17ポリペプチドの一部であるため、このコンティグも除外した。
【０２６１】
これにより、検索は764コンティグおよび1090コンティグの2つのコンティグに限定された。コンティグは同じタンパク質試料を用いて同定され、これらのコンティグで認められた脱水素酵素活性からは非常に類似したBLASTX結果が得られたため、これらは同じポリペプチドの一部であるとの仮説が立てられた。この仮説を裏付けるさらなる証拠が、ジョイントゲノムインスチュテートによって提供された骨格データの解析によって明らかになった、C.オーランチアクスゲノムにおいて764コンティグおよび1090コンティグが互いに隣接しているという発見から得られた。しかし、配列類似性およびアセンブル解析からは、これら二つのコンティグの間には重なりがないことが判明し、これはゲノム配列決定にギャップがあったことによると考えられる。
【０２６２】
764コンティグおよび1090コンティグに属するポリペプチド配列をマッピングした。この解析に基づき、適当なコード枠および可能性のある開始および停止コドンを同定した。マロニルCoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしていた断片をPCR増幅するために、下記のPCRプライマーを設計した：
0004490628.tif 000039
PRO140Fプライマーは1090コンティグの配列に基づいて設計し、可能性のある開始コドンの開始部に対応している。プライマー−ダイマー形成を避けるために、12番目の塩基をGからCに変更した。この変更は、コドンによってコードされるアミノ酸を変更しない。PRO140Rプライマーは764コンティグの配列に基づいて設計し、可能性のある停止コドンから約1kB下流に位置する領域に対応している。PRO140UPFプライマーは1090コンティグの配列に基づいて設計し、可能性のある開始コドンの約300塩基上流に位置する領域に対応している。
【０２６３】
ゲノムC.オーランチアクス DNAを得た。要するに、C.オーランチアクスを50mL培養液中で3〜4日間培養した。細胞をペレット化し、10mMトリス溶液5mLで洗浄した。次いで、ゲノムDNAをジェントラゲノム「ピュアジーン」DNA単離キット（Gentra Systems、ミネソタ州ミネアポリス）と共に提供されているグラム陽性菌プロトコルを用いて単離した。細胞ペレットをジェントラ細胞懸濁液 1mLに再懸濁し、これにリゾチーム14.2mgおよび20mg/mLプロテイナーゼK溶液4μLを加えた。細胞懸濁液を37℃で30分間インキュベートした。沈殿したゲノムDNAを3500g、25分間の遠心分離によって回収し、10分間風乾した。ゲノムDNAを10mMトリス溶液適量に懸濁し、4℃で保存した。
【０２６４】
二つのPCR反応を、C.オーランチアクスゲノムDNAを鋳型として用い、下記のとおりに計画した：
0004490628.tif 000040
【０２６５】
両PCR反応からの産物を0.8％TAEゲル上で分離した。両PCR反応はサイズ4.7〜5Kbの産物を生成した。これはマロニルCoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしうる核酸分子の予測サイズにほぼ一致していた。
【０２６６】
両PCR反応を配列決定プライマーを用いて配列決定した
0004490628.tif 000041
。
配列解析により、764コンティグおよび1090コンティグの間のギャップが明らかとなった。764コンティグおよび1090コンティグからの配列の間の核酸配列は、長さが300塩基対よりも大きかった（図51）。加えて、配列解析により、脱水素酵素/還元酵素型の酵素に類似性を示す3678塩基のORFが明らかとなった（図52）。このORFによってコードされるアミノ酸配列は長さ1225アミノ酸である（図50）。また、このORFによってコードされるアミノ酸配列のBLASTP解析により、二つの短鎖脱水素酵素ドメイン(adh型）も明らかとなった。そのような酵素はマロニルCoAの3-HPへの変換のために二つの還元段階を含むため、これらの結果はマロニルCoA還元酵素活性を有するポリペプチドと一致している。さらに、ポリペプチドのコンピューターによって計算したMWは約134KDaと決定された。
【０２６７】
PCRをPR0140F/PR0140Rプライマー対、C.オーランチアクスゲノムDNA、およびPCR反応#1として前述のプロトコルを用いて行った。PCR完了後、Taqポリメラーゼ0.25U（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）をPCR混合物に加え、次いでこれを72℃で10分間インキュベートした。PCR産物をキアゲンPCR精製キット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いてカラム精製した。次いで、精製PCR産物を発現ベクターpCRT7/CTに、製造者の指示どおりに（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）TOPOクローニングした。TOP10F'化学的コンピテント細胞をTOPOライゲーションミックスで、製造者の指示どおりに（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）形質転換した。細胞を半時間回復させ、形質転換体をLB/アンピシリン（100μg/mL）プレート上で選択した。20の単コロニーを選択し、プラスミドDNAをキアゲンスピンミニプレップキット（Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離した。
【０２６８】
これら20のクローンそれぞれを、PCRにより正しい配向および正しい挿入断片サイズについて試験した。要するに、PCR増幅においてプラスミドDNAを鋳型として用い、下記の二つのプライマーを用いた：
0004490628.tif 000042
。
下記のPCR反応混合物およびプログラムを用いた：
0004490628.tif 000043
【０２６９】
試験した20のクローンのうち、一つのクローンのみが正しい挿入断片を示した（クローン#P-10）。BL21(DE3)pLysSの化学的コンピテント細胞（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）をP-10プラスミドDNA 2μLで、製造者の指示どおりに形質転換した。細胞を37℃で30分間回復させ、LB/アンピシリン（100μg/mL）およびクロラムフェニコール（25μg/mL）上にプレーティングした。
【０２７０】
BL21(DE3)pLysS/P-10の20mL培養物およびBL21(DE3)pLysSの20mL対照培養物を終夜インキュベートした。終夜培養物を接種材料として用い、二つの100mL BL21(DE3)pLysS/P-10クローン培養および二つの対照株培養（BL21(DE3)pLysS）を開始した。すべての培養物のODが600nmで約0.5に達した時、これらをIPTGで誘導した。対照株培養物は10μM IPTGまたは100μM IPTGで誘導した一方で、BL21(DE3)pLysS/P-10クローン培養物の一つは10μM IPTGで誘導し、他の一つは100μM IPTGで誘導した。培養物を誘導後2.5時間増殖させた。誘導前とその2.5時間後に、各培養フラスコから一定量を取り、ポリペプチド発現を試験するために4〜15％SDS-PAGEを用いて分離した。誘導したBL21(DE3)pLysS/P-10試料において、約135KDaの分子量を有するポリペプチドに対応するバンドが観察された。このバンドは対照株試料およびIPTG誘導前に採取した試料には認められなかった。
【０２７１】
マロニルCoA還元酵素活性を評価するために、BL21(DE3)pLysS/P-10およびBL21(DE3)pLysS細胞を培養し、次いで8,000×gの遠心分離（Rotor JA 16.250、Beckman Coulter、カリフォルニア州フラートン）によって回収した。 回収後、細胞を等量の0.85％NaCl溶液で一回洗浄した。細胞ペレットを、5mM MgCl2および2mM DTTを補足した100mMトリス-HCl緩衝液に再懸濁した。細胞を1,000psi圧（ゲージ値）でフレンチプレス細胞を二回通過させることにより破砕した。細胞片を30,000×gの遠心分離（Rotor JA 25.50、Beckman Coulter、カリフォルニア州フラートン）によって除去した。細胞抽出物を次に使用するまで4℃または氷上で維持した。
【０２７２】
対照細胞およびIPTG誘導細胞の両方でマロニルCoA還元酵素の活性を37℃で測定した。マロニルCoA還元酵素の活性は、前述のとおり添加したNADPHの消失を観察することによってモニターした。対照株の細胞抽出物では活性は認められなかったが、IPTG誘導したBL21(DE3)pLysS/P-10細胞からの細胞抽出物はマロニルCoA還元酵素活性を示し、比活性計算値は全タンパク質1mgあたり約0.0942μmole/分であった。
【０２７３】
マロニルCoA還元酵素活性を、下記の反応を37℃で実施して、マロニルCoAからの3-HP生成を分析することによっても測定した：
0004490628.tif 000044
【０２７４】
反応を37℃で30分間実施した。対照反応において、BL21(DE3)pLysSからの細胞抽出物を全タンパク質322mgの最終濃度まで加えた。実験反応混合物において、BL21(DE3)pLysS/P-10からの細胞抽出物を全タンパク質226mgの最終濃度まで加えた。反応混合物を次に分析するまで-20℃で凍結した。
【０２７５】
反応混合物中の成分のクロマトグラフィによる分離を、HPX-87H（7.8×300mm）有機酸HPLCカラム（BioRad Laboratories、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて実施した。カラムは60℃に維持した。移動相の組成はHPLC等級の水をトリフルオロ酢酸（TFA）でpH2.5とし、流速0.6mL/分で供給した。
【０２７６】
反応試料中の3-HPの検出は、ウォーターズ2690液体クロマトグラフ（Waters Corp.、マサチューセッツ州ミルフォード）と、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ996フォトダイオードアレイ（PDA）吸光度モニターからなるウォーターズ/マイクロマス ZQ LC/MS装置を用いて実施した。イオン化源は大気圧化学的イオン化法（Atmospheric Pressure Chemical Ionization）(APCI)イオン化源であった。APCI-MSシステムのすべてのパラメーターを、3-HPのプロトン化分子イオン（[M+H]+）の生成に基づいて最適化した。3-HPを陽イオンモードで検出するために、下記のパラメーターを用いた：コロナ：10μA；コーン：20V；抽出器：2V；RFレンズ：0.2V；ソース温度：100℃；APCIプローブ温度：300℃；脱溶媒ガス：500L/時間；コーンガス：50L/時間；低質量分解能：15；高質量分解能：15；イオンエネルギー：1.0；増倍管：650。データはm/z＝90.9に設定した選択的イオン検出（Selected Ion Reporting）（SIR）モードで補正した。
【０２７７】
対照反応試料および実験反応試料の両方を、HPLC質量分析法を用いて3-HPの存在について調べた。対照試料では、3-HPのピークは観察されなかったが、実験試料は3-HPの保持時間および質量に一致するピークを示した。
【０２７８】
実施例１１−3-HPを産生する組換え細胞の構築
グルコースからアセチルCoAを介して3-ヒドロキシプロピオネートを直接生成する経路を図44に示している。大腸菌、バチルス、および酵母などのほとんどの微生物は、グルコースから解糖およびピルビン酸脱水素酵素の作用を介してアセチルCoAを産生する。グルコースから生じたアセチルCoAを転用するために、二つの遺伝子、すなわち一つはアセチルCoAカルボキシラーゼをコードするもの、および他の一つはマロニルCoA還元酵素をコードするものを過剰発現することが望ましい。一例として、これらの遺伝子はベクターpET30aおよびpFN476を用い、T7プロモーターを通じて大腸菌で発現される。ベクターpET30aはpBR oriおよびカナマイシン耐性を有する一方、pFN476はpSC101 oriを有し、カルベニシリン耐性を選択に用いる。これら二つのベクターは互換性のoriおよび異なるマーカーを有するため、これらは大腸菌で同時に維持することができる。したがって、グルコースから3-ヒドロキシプロピオネートを直接産生するための大腸菌操作に用いられる構築物はpMSD8（pFN476/accABCD）（デービスら、J Biol. Chem.、275：28593〜28598、2000）およびpET30a/マロニルCoA還元酵素またはpET30a/acc1およびpFN476/マロニルCoA還元酵素である。構築物を図45に示している。
【０２７９】
グルコースからの3-ヒドロキシプロピオネートの産生を試験するために、プラスミドpMSD8（pFN476/accABCD）およびpET30a/マロニルCoA還元酵素またはpET30a/acc1およびpFN476/マロニルCoA還元酵素を有する大腸菌株チューナー pLacIをビーブラウンバイオスタット発酵槽にて培養する。加熱のための水ジャケットを備えたガラス容器を用いてこの実験を行う。発酵槽の可使容積は1.5Lで、37℃で操作する。発酵槽に1vvmの速度で滅菌空気をバブリングすることにより、酸素を継続的に供給する。撹拌は溶解酸素濃度に合わせて段階的に行い、40％DOに維持する。液体培地のpHは2N NaOHを用いて7に維持する。大腸菌株を1％グルコース、1μg/mLチアミン、0.1％カザミノ酸、10μg/mLビオチン、50μg/mLカルベニシリン、50μg/mLカナマイシン、および25μg/mLクロラムフェニコールを補足したM9培地中で培養する。細胞密度が0.5OD（600nm）に達すれば、100μM IPTGを加えることによって遺伝子の発現を誘導する。誘導後、1時間、2時間、3時間、4時間、および8時間の時点で2mL量の試料を採取する。加えて、誘導後3時間の時点で、細胞抽出物を作成するために200mLの試料を採取する。2mL試料を遠心分離にかけ、上清を用いてLC/MS法により生成物を分析する。上清を次の分析まで-20℃で保存する。
【０２８０】
細胞懸濁液200mLを8000gで遠心分離し、細胞ペレットを50mMトリス-HCl（pH8.0）、5mM MgCl2、100mM KCl、2mM DTT、および5％グリセロール50mLで洗浄して、抽出物を調製する。細胞懸濁液を8000gで再度遠心分離し、ペレットを50mMトリス-HCl（pH8.0）、5mM MgCl2、100mM KCl、2mM DTT、および5％グリセロール5mLに再懸濁する。細胞を100psigでフレンチプレスを二回通過させることにより破砕した。細胞片を30,000gで20分間の遠心分離によって除去する。操作はすべて4℃で行う。この組換え細胞抽出物を用いての3-ヒドロキシプロピオネートのインビトロ生成を示すために、下記の200μLの反応を37℃で行う。反応混合物は以下のとおりである：トリスHCl（pH8.0；100mM）、ATP（1mM）、MgCl2（5mM）、KCl（100mM）、DTT（5mM）、NaHCO3（40mM）、NADPH（0.5mM）、アセチルCoA（0.5mM）、および細胞抽出物（0.2mg）。15分後に1倍量の10％トリフルオロ酢酸（TFA）を加えることにより、反応を停止する。この反応の生成物をLC/MS法を用いて検出する。
【０２８１】
上清およびインビトロ反応混合物中の3-ヒドロキシプロピオネートの存在についての検出および分析は、ウォーターズ/マイクロマス ZQ LC/MS装置を用いて実施する。 この装置は、ウォーターズ2690液体クロマトグラフと、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ 2410屈折率検出器からなっている。LC分離は、バイオラッドアミネックス87-Hイオン交換カラム（Bio-Rad Aminex 87-H ion-exchange column）を45℃で用いて行う。糖、アルコール、および有機酸生成物は0.015％TFA緩衝液で溶出する。溶出のために、緩衝液を流速0.6mL/分で通過させる。3-ヒドロキシプロピオネートの検出および定量のために、米国TCI（オレゴン州ポートランド）から得た試料を標準として用いる。
【０２８２】
実施例１２  出芽酵母における発現のためのプロピオニルCoA転移酵素、ラクチルCoA脱水酵素（LDH）、および水添加酵素（OS19）のクローニング
乳酸を介しての3-ヒドロキシプロピオン酸の産生に関与する遺伝子のクローニングにおいて、pESC酵母エピトープタギングベクターシステム（pESC Yeast Epitope Tagging Vector System）（Stratagene、カリフォルニア州ラホイヤ）を用いた。pESCベクターはそれぞれGAL1およびGAL10プロモーターを反対方向に含み、各ベクターから二つの遺伝子の発現を可能にしている。GAL1およびGAL10プロモーターはグルコースによって抑制され、ガラクトースによって誘導される。四つの利用可能なpESCベクターはそれぞれ異なる酵母選択可能マーカー（HIS3、TRP1、LEU2、URA3）を有しているため、複数のプラスミドを単一の菌株中で維持することができる。各クローニング領域は、発現されたタンパク質のC-末端またはN-末端エピトープタギングのための遺伝子挿入、転写終結信号、およびエピトープコード配列用のポリリンカー部位を有している。pESCベクターは大腸菌における複製および選択を可能にする、ColE1複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子も有している。下記のベクター/プロモーター/核酸の組み合わせを構築した：
0004490628.tif 000045
用いたプロモーターは下記のとおりであった：
0004490628.tif 000046
【０２８３】
制限酵素はすべてニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、マサチューセッツ州ベバリーから入手した。プラスミドDNAの調製はすべて、キアプレップスピンミニプレップキットを用いて行い、ゲル精製はすべてキアクイックゲル抽出キット（QIAquick Gel Extraction Kits）（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて行った。
【０２８４】
A. pESC-Trp/OS19水添加酵素ベクターの構築
pESC-Trpにおける二つの構築物を、C.オーランチアクス由来OS19核酸のために作製した。これらの構築物の一つはGAL1マルチクローニング部位のApa IおよびSal I制限酵素部位を用い、c-mycエピトープを含むように設計された。第二の構築物は、Apa IおよびKpn I部位を用い、したがってc-mycエピトープ配列を含んでいなかった。
【０２８５】
pESC-TrpベクターDNA 6μgを制限酵素Apa Iで消化し、消化物をキアクイックPCR精製カラム（QIAquick PCR Purification Column）を用いて精製した。次いで、Apa Iで消化したベクターDNA 3μgを制限酵素Kpn Iで消化し、3μgをSal Iで消化した。二重消化したベクターDNAを1％TAE-アガロースゲル上で分離し、精製し、エビアルカリホスファターゼ（Roche Biochemical Products、インディアナ州インディアナポリス）で脱リン酸化し、キアクイックPCR精製カラムで精製した。
【０２８６】
水添加酵素活性を有するクロロフレクサス・オーランチアクスポリペプチドをコードする核酸（OS19）を、ゲノムDNAから、PCRプライマー対OS19APAFおよびOS19SALRならびにプライマー対OS19APAFおよびOS19KPNRを用いて増幅した。OS19APAFは増幅断片の始端部にApa I制限酵素部位および翻訳開始部位（ACCATGG）を導入するように設計した。OS19KPNRプライマーは増幅断片の終端部にKpn I制限酵素部位を導入し、水添加酵素遺伝子の翻訳停止コドンを含むように設計した。OS19SALRは増幅断片の終端部にSal I部位を導入し、変更された停止コドンを有するため、翻訳がベクターc-mycエピトープを通じてインフレームで続く。PCR混合物は以下を含んでいた：最終量100μL中に、1×エキスパンドPCR緩衝液（Expand PCR buffer）、C.オーランチアクスゲノムDNA 100ng、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびエキスパンドDNAポリメラーゼ（Expand DNA Polymerase）（Roche）5.25単位。PCR反応をMJリサーチPTC100（MJ Research PTC100）で、以下の条件下で行った：94℃で1分間の最初の変性；94℃で30秒間、57℃で1分間、および72℃で2.25分間を8サイクル；94℃で30秒間、62℃で1分間、および72℃で2.25分間を24サイクル；ならびに72℃で7分間の最終伸長。次いで、増幅産物を1％TAE-アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離した。ゲルから0.8Kbの断片を切り出し、各プライマー対について精製した。精製した断片をKpn IまたはSal I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで精製し、Apa I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２８７】
水添加酵素活性を有するC.オーランチアクスポリペプチドをコードする核酸（OS19）を含む、消化したPCR産物50〜60ng、および調製したpESC-Trpベクター50ngをT4 DNAリガーゼを用いて16℃で16時間ライゲーションした。ライゲーション反応物1μLを用いて、大腸菌エレクトロマックス（Electromax）(商標）DH10B(商標）細胞40μLを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、100μg/mLのカルベニシリンを含むLBプレート（LBC）にプレーティングした。個々のコロニーを適当なPCRプライマーによるコロニーPCRを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを10mMトリス約25μLに懸濁し、懸濁液2μLをLBC培地にプレーティングした。残りの懸濁液を95℃で10分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞2μLを25μL PCR反応に用いた。PCR混合物は以下を含んでいた：反応毎に、1×Taq緩衝液、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびTaq DNAポリメラーゼ1単位。用いたPCRプログラムは、ゲノムDNAからの核酸の増幅について前述したものと同じであった。
【０２８８】
プラスミドDNAを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してPCRからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。配列を確認した構築物を、フローズンEZ酵母形質転換IIキット（Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit)（商標）（Zymo Research、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母YPH500株に形質転換した。形質転換反応物をSC-Trp培地にプレーティングした（培地調製法についてはストラタジーンpESCベクター取扱説明書マニュアル（Stratagene pESC Vector Instruction Manual）を参照されたい）。個々の酵母コロニーをコロニーPCRでOS19核酸の存在についてスクリーニングした。コロニーを、ザイモリエース(zymolase) 5単位を含むY溶解緩衝液（Y-Lysis Buffer）（Zymo Research）20μLに懸濁し、37℃で10分間加温した。この懸濁液3μLを、大腸菌形質転換体のコロニースクリーニングについて記載したPCR反応混合物およびプログラムを用いての25μL PCR反応に用いた。水添加酵素アッセイ法の対照として用いるために、pESC-TrpベクターもYPH500に形質転換し、形質転換体をGAL1およびGAL10プライマーを用いてのPCRによってスクリーニングした。
【０２８９】
B. pESC-Trp/OS19/EI水添加酵素ベクターの構築
GAL10プロモーターの下流のM.エルスデニ E1活性化因子ポリペプチドに対する核酸挿入のために、配列を確認し、アッセイ結果が陽性であったpESC-Trp/OS19構築物のプラスミドDNA（Apa I-Sal I制限酵素部位）を用いた。プラスミドDNA 3μgを制限酵素Cla Iで消化し、消化物をキアクイックPCR精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターDNAを制限酵素Not Iで消化し、消化物を65℃で20分間加熱することにより不活化した。二重消化したベクターDNAをエビアルカリホスファターゼ（Roche）で脱リン酸化し、1％TAE-アガロースゲル上で分離し、ゲル精製した。
【０２９０】
M.エルスデニE1活性化因子ポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムDNAから、PCRプライマー対EINOTFおよびEICLARを用いて増幅した。EINOTFは増幅断片の始端部にNot I制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。EICLARプライマーは増幅断片の終端部にCla I制限酵素部位を導入し、FLAGエピトープのインフレーム翻訳を可能にするための変更された翻訳停止コドンを含むように設計した。PCR混合物は以下を含んでいた：最終量100μL中に、1×エキスパンド PCR緩衝液、M.エルスデニゲノムDNA 100ng、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびエキスパンドDNAポリメラーゼ 5.25単位。PCR反応をMJリサーチPTC100で、以下の条件下で行った：94℃で1分間の最初の変性；94℃で30秒間、55℃で45秒間、および72℃で3分間を8サイクル；94℃で30秒間、62℃で45秒間、および72℃で3分間を24サイクル；ならびに72℃で7分間の最終伸長。次いで、増幅産物を1％TAE-アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、0.8Kbの断片を切り出して精製した。精製した断片をCla I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで精製し、Not I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２９１】
M.エルスデニE1活性化因子ポリペプチドに対する核酸を含む、消化したPCR産物60ng、および調製したpESC-Trp/OS19水添加酵素ベクター70ngをT4 DNAリガーゼを用いて16℃で16時間ライゲーションした。ライゲーション反応物1μLを用いて、大腸菌エレクトロマックス(商標）DH10B(商標）細胞40μLを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、LBC培地にプレーティングした。個々のコロニーをEINOTFおよびEICLARプライマーによるコロニーPCRを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを10mMトリス約25μLに懸濁し、懸濁液2μLをLBC培地にプレーティングした。残りの懸濁液を95℃で10分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞2μLを25μL PCR反応に用いた。PCR混合物は以下を含んでいた：反応毎に、1×Taq緩衝液、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびTaq DNAポリメラーゼ1単位。用いたPCRプログラムは、ゲノムDNAからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。プラスミドDNAを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してPCRからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。
【０２９２】
C. pESC-Leu/EIIα/EIIβ水添加酵素ベクターの構築
ベクターpESC-LeuのDNA 3μgを制限酵素Apa Iで消化し、消化物をキアクイックPCR精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターDNAを制限酵素Sal Iで消化し、消化物を65℃で20分間加熱することにより不活化した。二重消化したベクターDNAをエビアルカリホスファターゼ（Roche）で脱リン酸化し、1％TAE-アガロースゲル上で分離し、ゲル精製した。
【０２９３】
M.エルスデニE2αポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムDNAから、PCRプライマー対EIIαAPAFおよびEIIaαSALRを用いて増幅した。EIIαAPAFは増幅断片の始端部にApa I制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。EIIαSALRプライマーは増幅断片の終端部にSal I制限酵素部位を導入し、c-mycエピトープのインフレーム翻訳を可能にするための変更された翻訳停止コドンを含むように設計した。PCR混合物は以下を含んでいた：最終量100μL中に、1×エキスパンド PCR緩衝液、M.エルスデニゲノムDNA 100ng、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびエキスパンドDNAポリメラーゼ 5.25単位。PCR反応をMJリサーチPTC100で、以下の条件下で行った：94℃で1分間の最初の変性；94℃で30秒間、55℃で1分間、および72℃で3分間を8サイクル；94℃で30秒間、62℃で1分間、および72℃で3分間を24サイクル；ならびに72℃で7分間の最終伸長。次いで、増幅産物を1％TAE-アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、1.3Kbの断片を切り出して精製した。精製した断片をApa I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで精製し、Sal I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２９４】
M.エルスデニE2αポリペプチドをコードする核酸を含む、消化したPCR産物80ng、および調製したpESC-Leuベクター80ngをT4 DNAリガーゼを用いて16℃で16時間ライゲーションした。ライゲーション反応物1μLを用いて、大腸菌エレクトロマックス(商標）DH10B(商標）細胞40μLを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、LBC培地にプレーティングした。個々のコロニーをEIIαAPAFおよびEIIαSALRプライマーによるコロニーPCRを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを10mMトリス約25μLに懸濁し、懸濁液2μLをLBC培地にプレーティングした。残りの懸濁液を95℃で10分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞2μLを25μL PCR反応に用いた。PCR混合物は以下を含んでいた：反応毎に、1×Taq緩衝液、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびTaq DNAポリメラーゼ1単位。用いたPCRプログラムは、ゲノムDNAからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。プラスミドDNAを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してPCRからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。
【０２９５】
M.エルスデニE2βポリペプチドをコードする核酸挿入のために、配列を確認したpESC-Leu/EIIαベクターのプラスミドDNAを用いた。プラスミドDNA 3μgを制限酵素Spe Iで消化し、消化物をキアクイックPCR精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターDNAを制限酵素Not Iで消化し、1％TAE-アガロースゲルからゲル精製した。二重消化したベクターDNAをエビアルカリホスファターゼ（Roche）で脱リン酸化し、キアクイックPCR精製カラムで精製した。
【０２９６】
M.エルスデニE2βポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムDNAから、PCRプライマー対EIIβNOTFおよびEIIβSPERを用いて増幅した。EIIβNOTFプライマーは増幅断片の始端部にNot I制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。EIIβSPERプライマーは増幅断片の終端部にSpe I制限酵素部位を導入し、FLAGエピトープのインフレーム翻訳を可能にするための変更された翻訳停止コドンを含むように設計した。PCR混合物は以下を含んでいた：最終量100μL中に、1×エキスパンド PCR緩衝液、M.エルスデニゲノムDNA 100ng、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびエキスパンドDNAポリメラーゼ 5.25単位。PCR反応をMJリサーチPTC100で、以下の条件下で行った：94℃で1分間の最初の変性；94℃で30秒間、55℃で45秒間、および72℃で3分間を8サイクル；94℃で30秒間、62℃で45秒間、および72℃で3分間を24サイクル；ならびに72℃で7分間の最終伸長。増幅産物を1％TAE-アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、1.1Kbの断片を切り出して精製した。精製した断片をSpe I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで精製し、Not I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２９７】
M.エルスデニE2βポリペプチドをコードする核酸を含む、消化したPCR産物38ng、および調製したpESC-Leu/EIIαベクター50ngをT4 DNAリガーゼを用いて16℃で16時間ライゲーションした。ライゲーション反応物1μLを用いて、大腸菌エレクトロマックス(商標）DH10B(商標）細胞40μLを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、LBCプレート上にプレーティングした。個々のコロニーをEIIβNOTFおよびEIIβSPERプライマーによるコロニーPCRを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを10mMトリス約25μLに懸濁し、懸濁液2μLをLBC培地にプレーティングした。残りの懸濁液を95℃で10分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞2μLを25μL PCR反応に用いた。PCR混合物は以下を含んでいた：反応毎に、1×Taq緩衝液、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびTaq DNAポリメラーゼ1単位。用いたPCRプログラムは、ゲノムDNAからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。
【０２９８】
プラスミドDNAを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してPCRからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。配列を確認したpESC-Leu/EIIα/EIIβ構築物を、pESC-Trp/OS19/EIベクターと共に、フローズンEZ酵母形質転換IIキット（商標）（Zymo Research、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母YPH500株に同時形質転換した。形質転換反応物をSC-Trp-Leu培地にプレーティングした。個々の酵母コロニーをコロニーPCRによりOS19、E1、E2α、およびE2β核酸の有無についてスクリーニングした。コロニーを、ザイモリエース 5単位を含むY溶解緩衝液（Zymo Research）20μLに懸濁し、37℃で10分間加温した。この懸濁液3μLを、大腸菌形質転換体のコロニースクリーニングについて記載したPCR反応混合物およびプログラムを用いての25μL PCR反応に用いた。ラクチルCoA脱水酵素アッセイ法の対照として用いるために、pESC-Trp/OS19およびpESC-LeuベクターもYPH500に同時形質転換した。これらの形質転換体をGAL1およびGAL10プライマーを用いてコロニースクリーニングした（Instruction manual、pESC Yeast Epitope Tagging Vectors、Stratagene）。
【０２９９】
D. pESC-His/D-LDH/PCTベクターの構築
ベクターpESC-HisのDNA 3μgを制限酵素Xho Iで消化し、消化物をキアクイックPCR精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターDNAを制限酵素Apa Iで消化し、1％TAE-アガロースゲルからゲル精製した。二重消化したベクターDNAをエビアルカリホスファターゼ（Roche）で脱リン酸化し、キアクイックPCR精製カラムを用いて精製した。
【０３００】
大腸菌D-LDH遺伝子を、DH10B株のゲノムDNAから、PCRプライマー対LDHAPAFおよびLDHXHORを用いて増幅した。LDHAPAFは増幅断片の始端部にApa I制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。LDHXHORプライマーは増幅断片の終端部にXho I制限酵素部位を導入し、D-LDH遺伝子のための翻訳停止コドンを含むように設計した。PCR混合物は以下を含んでいた：最終量100μL中に、1×エキスパンド PCR緩衝液、大腸菌ゲノムDNA 100ng、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびエキスパンドDNAポリメラーゼ 5.25単位。PCR反応をMJリサーチ PTC100で、以下の条件下で行った：94℃で1分間の最初の変性；94℃で30秒間、59℃で45秒間、および72℃で2分間を8サイクル；94℃で30秒間、64℃で45秒間、および72℃で2分間を24サイクル；ならびに72℃で7分間の最終伸長。増幅産物を1％TAE-アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、1.0Kbの断片を切り出して精製した。精製した断片をApa I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで精製し、Xho I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０３０１】
大腸菌D-LDH遺伝子を含む、消化したPCR産物80ng、および調製したpESC-Hisベクター80ngをT4 DNAリガーゼを用いて16℃で16時間ライゲーションした。ライゲーション反応物1μLを用いて、大腸菌エレクトロマックス(商標）DH10B(商標）細胞40μLを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、LBC培地にプレーティングした。個々のコロニーをLDHAPAFおよびLDHXHORプライマーによるコロニーPCRを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを10mMトリス約25μLに懸濁し、懸濁液2μLをLBC培地にプレーティングした。残りの懸濁液を95℃で10分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞2μLを25μL PCR反応に用いた。PCR混合物は以下を含んでいた：反応毎に、1×Taq緩衝液、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびTaq DNAポリメラーゼ1単位。用いたPCRプログラムは、ゲノムDNAからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。プラスミドDNAを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してPCRからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。
【０３０２】
M.エルスデニPCTポリペプチドをコードする核酸挿入のために、配列を確認したpESC-His/D-LDH構築物のプラスミドDNAを用いた。プラスミドDNA 3μgを制限酵素Pac Iで消化し、消化物をキアクイックPCR精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターDNAを制限酵素Spe Iで消化し、1％TAE-アガロースゲルからゲル精製した。二重消化したベクターDNAをエビアルカリホスファターゼ（Roche）で脱リン酸化し、キアクイックPCR精製カラムで精製した。
【０３０３】
M.エルスデニPCTポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムDNAから、PCRプライマー対PCTSPEFおよびPCTPACRを用いて増幅した。PCTSPEFは増幅断片の始端部にSpe I制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。PCTPACRプライマーは増幅断片の終端部にPac I制限酵素部位を導入し、PCT遺伝子のための翻訳停止コドンを含むように設計した。PCR混合物は以下を含んでいた：最終量100μL中に、1×エキスパンド PCR緩衝液、M.エルスデニゲノムDNA 100ng、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびエキスパンドDNAポリメラーゼ 5.25単位。PCR反応をMJリサーチ PTC100で、以下の条件下で行った：94℃で1分間の最初の変性；94℃で30秒間、56℃で45秒間、および72℃で2.5分間を8サイクル；94℃で30秒間、64℃で45秒間、および72℃で2.5分間を24サイクル；ならびに72℃で7分間の最終伸長。増幅産物を1％TAE-アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、1.55Kbの断片を切り出して精製した。精製した断片をPac I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで精製し、Spe I制限酵素で消化し、キアクイックPCR精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０３０４】
M.エルスデニPCTポリペプチドをコードする核酸を含む、消化したPCR産物95ng、および調製したpESC-His/D-LDHベクター75ngをT4 DNAリガーゼを用いて16℃で16時間ライゲーションした。ライゲーション反応物1μLを用いて、大腸菌エレクトロマックス(商標）DH10B(商標）細胞40μLを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、LBCプレート上にプレーティングした。個々のコロニーをPCTSPEFおよびPCTPACRプライマーによるコロニーPCRを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを10mMトリス約25μLに懸濁し、懸濁液2μLをLBC培地にプレーティングした。残りの懸濁液を95℃で10分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞2μLを25μL PCR反応に用いた。PCR混合物は以下を含んでいた：反応毎に、1×Taq緩衝液、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびTaq DNAポリメラーゼ1単位。用いたPCRプログラムは、ゲノムDNAからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。
【０３０５】
プラスミドDNAを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してPCRからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。配列を確認した構築物を、フローズンEZ酵母形質転換IIキット（商標）（Zymo Research、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母YPH500株に形質転換した。形質転換反応物をSC-His培地にプレーティングした。個々の酵母コロニーをコロニーPCRによりD-LDHおよびPCT遺伝子の有無についてスクリーニングした。コロニーを、ザイモリエース 5単位を含むY溶解緩衝液（Zymo Research）20μLに懸濁し、37℃で10分間加温した。次いで、この懸濁液3μLを、大腸菌形質転換体のコロニースクリーニングについて記載したPCR反応混合物およびプログラムを用いての25μL PCR反応に用いた。アッセイ対照として用いるために、pESC-HisベクターもYPH500に形質転換し、形質転換体をGAL1およびGAL10プライマーを用いてのPCRによりスクリーニングした。
【０３０６】
実施例１３−出芽酵母における酵素の発現
A.  形質転換酵母における水添加酵素活性
pESC-Trp/OS19構築物またはpESC-Trpベクター（陰性対照）を有する個々のコロニーを用いて、2％グルコースを含むSC-Trp培地の5mL培養物に接種した。これらの培養物を30℃で16時間増殖させ、同じ培地35mLに接種するために用いた。継代培養物を30℃で7時間増殖させ、OD600を求めた。OD×体積が40となる量の細胞をペレット化し、炭素源を含まないSC-Trp培地で洗浄し、再度ペレット化した。細胞を2％ガラクトースを含むSC-Trp培地5mLに懸濁し、全量100mLのこの培地に接種するために用いた。培養物を30℃、250rpmで17.5時間増殖させた。次いで、細胞をペレット化し、0.85％NaCl中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞ペレット（70mg）を50mMトリス-HCl、pH7.5 140μLに懸濁し、等量（ペレットプラス緩衝液）のあらかじめ洗浄したガラスビーズ（Sigma、150〜212μm）を加えた。この混合物を30秒間ボルテックスにかけ、氷上に1分間置き、ボルテックス/冷却サイクルをさらに8回繰り返した。次いで、細胞を5,000gで6分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ビーズ/ペレットを緩衝液250μLで二回洗浄し、遠心分離し、上清を最初の上清と合わせた。
【０３０７】
前述のpETBlue-1/OS19構築物を有する大腸菌株を、水添加酵素アッセイ法の陽性対照として用いた。この菌株の培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、新鮮LBC培地で1：20に希釈した。培養物を37℃、250rpmでOD600が0.6になるまで増殖させ、この時点で、培養物を最終濃度1mMのIPTGで誘導した。培養物を37℃、250rpmでさらに2時間インキュベートした。細胞をペレット化し、0.85％NaCl中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞をバクバスタータンパク質抽出試薬（BugBuster Protein Extraction Reagent）(商標）およびベンゾナーゼ（Benzonase)（登録商標)（Novagen）を製造者の指示どおりに用い、室温で20分間インキュベートして破砕した。16,000g、4℃で遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、活性アッセイ法に用いた。
【０３０８】
前述の出芽酵母から得た細胞抽出物の全タンパク質含量を、マイクロプレートバイオラッドタンパク質アッセイ（Bio-Rad Protein Assay）（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。YPH500中のOS19構築物（Apa I-Sal IおよびApa I-Kpn I部位両方）、YPH500中のpESC-Trp陰性対照、および大腸菌中のpETBlue-1/OS19構築物を、それらがアクリリルCoAを3-ヒドロキシプロピオニル-CoAに変換する能力について試験した。アッセイ法は、大腸菌チューナー株中のpETBlue-1/OS19構築物について前述したとおりに実施した。陰性対照株の細胞抽出物を、アクリリルCoAを含む反応混合物に加えた場合、一つのMW823の主ピークが認められた。このピークはアクリリルCoAに対応し、アクリリルCoAがいかなる他の生成物にも変換されなかったことを示している。pESC-Trp/OS19構築物（Apa I-Sal IまたはApa I-Kpn I部位いずれか）を有する菌株の細胞抽出物を反応混合物に加えた場合、主ピークはMW841にシフトし、これは3-ヒドロキシプロピオニル-CoAに対応している。大腸菌対照からの反応混合物も、MW841のピークを示した。経時試験をpESC-Trp/OS19（Apa I-Sal I）構築物について実施し、反応時間0分、1分、3分、7分、15分、30分、および60分後のMW841およびMW823のピークの出現を測定した。この構築物および大腸菌対照両方からの細胞抽出物で、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAピークの増加が経時的に認められたが、ベクターだけのYPH500株からの細胞抽出物は、アクリリルCoAの主ピークのみを示した。
【０３０９】
B.  形質転換酵母におけるプロピオニルCoA転移酵素活性
pESC-His/D-LDHもしくはpESC-His/D-LDH/PCT構築物または挿入断片を含まないpESC-Hisベクター（陰性対照）を有する出芽酵母YPH500株の個々のコロニーを用いて、2％グルコースを含むSC-His培地の5mL培養物に接種した。これらの培養物を30℃、250rpmで16時間増殖させ、次いで同じ培地35mLに接種するために用いた。継代培養物を30℃で7時間増殖させ、OD600を求めた。各株について、OD×体積が40となる量の細胞をペレット化し、炭素源を含まないSC-His培地で洗浄し、再度ペレット化した。細胞を2％ガラクトースを含むSC-His培地5mLに懸濁し、全量100mLのこの培地に接種するために用いた。培養物を30℃、250rpmで16.75時間増殖させた。次いで、細胞をペレット化し、0.85％NaCl中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞ペレット（70mg）を100mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.5 140μLに懸濁し、等量（ペレットプラス緩衝液）のあらかじめ洗浄したガラスビーズ（Sigma、150〜212μm）を加えた。この混合物を30秒間ボルテックスにかけ、氷上に1分間置き、ボルテックス/冷却サイクルをさらに8回繰り返した。次いで、細胞を5,000gで6分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ビーズ/ペレットを緩衝液250μLで二回洗浄して遠心分離し、上清を最初の上清と合わせた。
【０３１０】
前述のpETBlue-1/PCT構築物を有する大腸菌株を、プロピオニルCoA転移酵素アッセイ法の陽性対照として用いた。この菌株の培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、100μg/mLのカルベニシリンを含む新鮮LB培地で1：20に希釈した。培養物を37℃、250rpmでOD600が0.6になるまで増殖させ、この時点で、培養物を最終濃度1mMのIPTGで誘導した。培養物を37℃、250rpmでさらに2時間インキュベートした。細胞をペレット化し、0.85％NaCl中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞をバクバスタータンパク質抽出試薬(商標）およびベンゾナーゼ（登録商標)（Novagen）を製造者の指示どおりに用い、室温で20分間インキュベートして破砕した。16,000g、4℃で遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、活性アッセイ法に用いた。
【０３１１】
細胞抽出物の全タンパク質含量を、マイクロプレートバイオラッドタンパク質アッセイ（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。出芽酵母YPH500株中のD-LDHおよびD-LDH/PCT構築物、YPH500中のpESC-His陰性対照、および大腸菌中のpETBlue-1/PCT構築物を、それらがプロピオニルCoAおよびアセテートのアセチルCoAおよびプロピオネートへの変換を触媒する能力について試験した。用いたアッセイ混合物は、大腸菌チューナー株中のpETBlue-1/PCT構築物について前述したものであった。
【０３１２】
陰性対照株またはYPH500/pESC-His/D-LDH株の全細胞抽出タンパク質1μgを反応混合物に加えた場合、11分間で吸光度の上昇は見られなかった（0.00から0.00）。YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT株および大腸菌/PCT株からの細胞抽出タンパク質1μgでは、それぞれ0.00から0.04および0.00から0.06への吸光度の上昇が見られた。全細胞抽出タンパク質2mgでは、陰性対照株およびYPH500/pESC-His/D-LDH株は11分間で0.00から0.01への吸光度の上昇を示したが、YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT株および大腸菌/PCT株ではそれぞれ0.00から0.10および0.00から0.08への上昇が認められた。
【０３１３】
C.  形質転換酵母におけるラクチルCoA脱水酵素活性
pESC-His/D-LDHもしくはpESC-His/D-LDH/PCT構築物または挿入断片を含まないpESC-Hisベクター（陰性対照）を有する出芽酵母YPH500株の個々のコロニーを用いて、4％グルコースを含むSC-His培地の5mL培養物に接種した。これらの培養物を30℃で23時間増殖させ、2％ラフィノースを含むSC-His培地35mLに接種するために用いた。継代培養物を30℃で8時間増殖させ、OD600を求めた。各株について、OD×体積が40となる量の細胞をペレット化し、2％ガラクトースを含むSC-His培地10mLに再懸濁し、全量100mLのこの培地に接種するために用いた。培養物を30℃、250rpmで17時間増殖させた。次いで、細胞をペレット化し、0.85％NaCl中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞ペレット（190mg）を100mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.5 380μLに懸濁し、等量（ペレットプラス緩衝液）のあらかじめ洗浄したガラスビーズ（Sigma、150〜212μm）を加えた。この混合物を30秒間ボルテックスにかけ、氷上に1分間置き、ボルテックス/冷却サイクルをさらに7回繰り返した。次いで、細胞を5,000gで6分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ビーズ/ペレットを緩衝液300μLで二回洗浄して遠心分離し、上清を最初の上清と合わせた。
【０３１４】
大腸菌DH10B株の嫌気的培養物を、D-LDHアッセイ法の陽性対照として用いた。この菌株の培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、新鮮LB培地で1：20に希釈した。培養物を37℃で7.5時間嫌気的に増殖させた。細胞をペレット化し、0.85％NaCl中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞をバクバスタータンパク質抽出試薬(商標）およびベンゾナーゼ（登録商標)（Novagen）を製造者の指示どおりに用い、室温で20分間インキュベートして破砕した。16,000g、4℃で遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、活性アッセイ法に用いた。
【０３１５】
細胞抽出物の全タンパク質含量を、マイクロプレートバイオラッドタンパク質アッセイ（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。YPH500中のD-LDHおよびD-LDH/PCT構築物、YPH500中のpESC-His陰性対照、および嫌気的に培養した大腸菌株を、それらがピルベートのラクテートへの変換を触媒する能力について、同時に起こるNADPHのNADへの変換をアッセイすることにより試験した。アッセイ混合物は、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.5、0.2mM NADH、および0.5〜1.0μgの細胞抽出物を含んでいた。反応を、ピルビン酸ナトリウムを最終濃度5mMまで加えることによって開始し、340nmの吸光度の低下を10分間測定した。陰性対照株の全細胞抽出タンパク質0.5μgを加えた場合、200秒間で-0.01から-0.02への吸光度の低下が見られた。YPH500/pESC-His/D-LDHまたはYPH500/pESC-His/D-LDH/PCT株からの細胞抽出物では、200秒間でそれぞれ-0.21から-0.47および-0.20から-0.47への吸光度の低下が見られた。嫌気的に培養した大腸菌株からの細胞抽出物0.5μL（7.85μg）は、YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT株の細胞抽出物1μgと非常に類似した吸光度の低下を示した。細胞抽出物4μgを用いた場合、YPH500/pESC-His/D-LDH/PCT株は10分間で-0.18から-0.60への吸光度の低下を示したが、陰性対照株は吸光度の低下を示さなかった（-0.08から-0.08）。
【０３１６】
D.  出芽酵母における3-HP産生の証明
pESC-Trp/OS19/EI、pESC-Leu/EIIa/EIIB、およびpESC-His/D-LDH/PCT構築物を、フローズンEZ酵母形質転換IIキット（商標）（Zymo Research、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母YPH500の単一株に同時形質転換した。陰性対照株も、pESC-Trp、pESC-Leu、およびpESC-HisベクターのYPH500株への形質転換によって発生させた。形質転換反応物をSC-Trp-Leu-His培地にプレーティングした。個々の酵母コロニーを、各構築物に対応する核酸の有無についてコロニーPCRによってスクリーニングした。
【０３１７】
六つの遺伝子すべてを有する株および陰性対照株を、2％グルコースを含むSC-Trp-Leu-His培地5mL中で培養した。これらの培養物を30℃で31時間増殖させ、2mLを用いて同じ培地50mLに接種した。継代培養物を30℃で19時間増殖させ、OD600を求めた。各株について、OD×体積が100となる量の細胞をペレット化し、炭素源を含まないSC-Trp-Leu-His培地で洗浄し、再度ペレット化した。細胞を2％ガラクトースおよび2％ラフィノースを含むSC-Trp-Leu-His培地10mLに懸濁し、全量250mLのこの培地に接種するために用いた。培養物を30℃のボトル中で振盪せずに増殖させ、試料を0時間、4.5時間、20時間、28.5時間、および70時間の時点で採取した。試料を遠心沈降にかけて細胞を除去し、上清を0.45μmのアクロディスクシリンジフィルター（Acrodisc Syrige Filters) （Pall Gelman Laboratory、ミシガン州アンアーバー）を用いてろ過した。
【０３１８】
ろ過したブロス100マイクロリットルを用いて、精製プロピオニルCoA転移酵素6マイクログラム、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、および1mMアセチルCoAによりブロス中のいかなる乳酸または3-HPのCoAエステルをも誘導した。反応を室温で15分間進行させ、1倍量の10％トリフルオロ酢酸を加えることによって停止した。反応混合物をセプパック C18カラムを前述のとおりに用いて精製し、LC/MSで分析した。
【０３１９】
実施例１４  β-アラニンから有機酸を産生する生合成経路の構築
β-アラニンから3-HPへの可能性のある一つの経路は、CoA転移酵素活性を有するポリペプチド（例えば、CoA基を一つの代謝物から他の代謝物に転移させる酵素類からの酵素）の使用を含む。図54に示すとおり、β-アラニンは、CoA転移酵素活性を有するポリペプチドおよびアセチルCoAまたはプロピオニルCoAなどのCoA供与体を用いてβ-アラニル-CoAに変換することができる。または、β-アラニル-CoAは、CoA合成酵素活性を有するポリペプチドの作用によって生成することもできる。β-アラニル-CoAは、β-アラニル-CoAアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドにより脱アミノ化してアクリリルCoAを生成することができる。3-HP-CoAを生成するためのアクリリルCoAのβ位での水添加は、3-HP-CoA脱水酵素活性を有するポリペプチドによって実施することができる。3-HP-CoAは、β-アラニンのCoA供与体としてはたらくことができ、CoA転移酵素活性を有するポリペプチドによって触媒されうる反応はしたがって、生成物として3-HPを生ずる。または、特定のCoA加水分解酵素活性を有するポリペプチドにより、3-HP-CoAを加水分解して3-HPを生成することもできる。
【０３２０】
CoA転移酵素活性を有するポリペプチドの単離、配列決定、発現、および活性試験法は本明細書に記載されている。
【０３２１】
A.  β-アラニル-CoAアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドの単離
β-アラニル-CoAアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドは、β-アラニル-CoAのアクリリルCoAへの変換を触媒することができる。そのようなポリペプチドの活性がクロストリジウム・プロピオニクムにおいてベイジロス（Vagelos）ら（J. Biol. Chem.、234：490〜497（1959））によって記載されている。このポリペプチドをプロピオン酸を産生するためにクロストリジウム・プロピオニクムにおけるアクリレート経路の一部として用いることができる。
【０３２２】
C.プロピオニクムを、0.2％酵母抽出物、0.2％トリプチケースペプトン、0.05％システイン、0.5％b-アラニン、0.4％VRB-塩、5mMリン酸カリウム、pH7.0を含む無酸素培地中37℃で培養した。12時間後に細胞を回収し、50mMリン酸カリウム（Kpi）、pH7.0で二回洗浄した。湿パック細胞約2gをKpi 40mL、pH7.0、1mM MgCl2、1mM EDTA、および1mM DTT（緩衝液A）40mLに再懸濁し、3mmチップ（Branson sonifier 250）を用いた約85〜100Wでの超音波処理によりホモジナイズした。細胞片を、セントリコンT-1080超遠心分離機（Centricon T-1080 Ultra centrifuge）で、100,000g、45分間の遠心分離によって除去し、無細胞抽出物（活性約110U/mg）をソース-15Q-マテリアル（Source-15Q-meterial）上のアニオン交換クロマトグラフィにかけた。ソース-15Qカラムに無細胞抽出物32mLを添加した。カラムをカラムの10倍量以内の0Mから0.5M NaClの直線勾配によって展開した。ポリペプチドは70〜110mM NaClの間で溶出した。
【０３２３】
溶液を1M (NH4)2SO4の最終濃度に調節し、緩衝液A中1M (NH4)2SO4で平衡化しリソース-Phe（Resource-Phe）カラムに添加した。ポリペプチドはこのカラムに結合しなかった。
【０３２４】
アミコン（Amicon）チャンバー（フィルターカットオフ30kDa）での濃縮後に最終調製物を得た。機能性ポリペプチドは、それぞれ16kDaの分子質量を有する四つのポリペプチドサブユニットからなっていた。ポリペプチドは標準アッセイ法（下記参照）で1033U/mgの最終比活性を有していた。
【０３２５】
すべての精製段階後のポリペプチド試料を、15％SDS-PAGEゲル上で分離した。ゲルを0.1％クーマシーR250で染色し、7.1％酢酸/5％エタノール溶液を用いて脱染色を行った。
【０３２６】
ポリペプチドをRP-HPLCで脱塩し、気相エドマン分解によるN-末端配列決定にかけた。この解析の結果から、35アミノ酸のポリペプチドN-末端配列が得られた。配列は下記のとおりであった：
0004490628.tif 000047
【０３２７】
B.  遺伝子断片の増幅
β-アラニル-CoAアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドの35アミノ酸配列を用いて、C.プロピオニクムのゲノム由来の対応するDNAを増幅するためのプライマーを設計した。C.プロピオニクム由来のゲノムDNAを、ジェントラゲノムDNA単離キット（Gentra Systems、ミネアポリス）をグラム陽性菌のためのゲノムDNAプロトコルどおりに用いて単離した。クロストリジウム・プロピオニクムのコドン使用頻度表を用いて、アミノ酸配列のいずれかの末端の7アミノ酸を逆翻訳し、20-ヌクレオチド変性プライマーを得た：
0004490628.tif 000048
【０３２８】
これらのプライマーを、1×Taq PCR緩衝液、0.6μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、Taq DNAポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals、インディアナ州インディアナポリス）2単位、2.5体積％DMSO、およびゲノムDNA 100ngを含む50μLのPCR反応に用いた。PCRは、アニーリング温度58℃で4サイクル、56℃で4サイクル、54℃で4サイクル、および52℃で24サイクルのタッチダウンPCRプログラムを用いて実施した。各サイクルは94℃で30秒の最初の変性段階、および72℃で1.25分の伸長を用い、プログラムには94℃で2分間の最初の変性段階および72℃で5分間の最終伸長が含まれていた。反応に用いたPCRプライマーの量は、プライマーの3'末端の縮重の量に応じて、典型的なPCRの量よりも3倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のPCR反応を行って、単一の変性プライマーから生じるPCR産物を同定した。各PCR産物20μLを、2.0％TAE（トリス−酢酸−EDTA）アガロースゲル上で分離した。
【０３２９】
順方向および逆方向両方のプライマーを含む反応によって、約100bpのバンドが生じたが、個々の順方向および逆方向プライマー対照反応では認められなかった。この断片を切り出し、キアクイックゲル抽出キット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製したバンド4マイクロリットルをpCRII-TOPOベクターにライゲーションし、TOPOクローニング法（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてTOP10大腸菌細胞に熱ショック法により形質転換した。形質転換体を50μg/mLのカナマイシンおよび50μg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-B-D-ガラクトピラノシド（X-gal）を含むLB培地上にプレーティングした。個々の白色コロニーを10mMトリス25μLに再懸濁し、95℃で10分間加熱して細菌細胞を破砕した。加熱細胞2μLを、pCRII-TOPOベクターに相同性のM13RおよびM13F汎用プライマーを用いての25μL PCR反応に用いた。PCR混合物は以下を含んでいた：反応毎に、1×Taq PCR緩衝液、0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、およびTaq DNAポリメラーゼ1単位。PCR反応をMJリサーチPTC100で、以下の条件下で行った：94℃で2分間の最初の変性；94℃で30秒間、52℃で1分間、および72℃で1.25分間を30サイクル；ならびに72℃で7分間の最終伸長。所望の挿入断片を示すコロニーの培養物からプラスミドDNAを得（QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen）、M13R汎用プライマーを用いたDNA配列決定に用いた。下記の核酸配列は変性プライマーの内部で、35アミノ酸残基配列の部分に対応している：
0004490628.tif 000049
【０３３０】
C.  完全なコード配列を得るためのゲノムウォーキング
上流および下流両方向のゲノムウォーキングを行うためのプライマーを、変性プライマー内部の核酸配列の一部を用いて設計した。プライマーの配列は下記のとおりであった：
0004490628.tif 000050
【０３３１】
GSP1FおよびGSP2Fは下流向きのプライマーで、GSP1RおよびGSP2Rは上流向きのプライマーであり、GSP2FおよびGSP2RはそれぞれGSP1FおよびGSP1Rの内側に入れ子状態である。ゲノムウォーキングライブラリを、制限酵素Dra I、EcoR V、およびPvu IIに加えてSsp IおよびHinc IIを用いた以外は、クロンテック（CLONTECH）のユニバーサルゲノムウォーキングキット（CLONTECH Laboratories、カリフォルニア州パロアルト）のマニュアルに従って構築した。PCRをパーキンエルマー9700サーモサイクラー（Perkin Elmer 9700 Thermocycler）で、下記の反応混合物を用いて行った：反応物50μL中に、1×XL緩衝液II、0.2mMの各dNTP、1.25mM Mg(OAc)2、0.2μMの各プライマー、rTth DNAポリメラーゼXL（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）2単位、およびライブラリ1μL。第一ラウンドPCRは、94℃で5秒間の最初の変性；94℃で2秒間および72℃で3分間からなる7サイクル；94℃で2秒間および64℃で3分間からなる32サイクル；ならびに64℃で4分間の最終伸長を用いた。第二ラウンドPCRは、94℃で15秒間の最初の変性；94℃で5秒間および70℃で3分間からなる5サイクル；94℃で5秒間および64℃で3分間からなる26サイクル；ならびに66℃で7分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド産物各20μLを1％TAEアガロースゲル上で泳動した。順方向反応の第二ラウンドPCRにおいて、Dra Iでは1.4Kbのバンドが得られ、Hinc IIでは1.5Kbのバンド、Pvu IIでは4.0Kbのバンド、ならびにSsp Iでは2.0および2.2Kbのバンドが得られた。逆方向反応の第二ラウンドPCRにおいて、Dra Iでは1.5Kbのバンドが得られ、EcoR Vでは0.8Kbのバンド、Hinc IIでは2.0Kbのバンド、Pvu IIでは2.9Kbのバンド、およびSsp Iでは1.5Kbのバンドが得られた。これらの断片のいくつかをゲル精製し、クローニングし、配列決定した。
【０３３２】
β-アラニル-CoAアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドのコード配列を配列番号：162に示す。このコード配列は配列番号：160に示すアミノ酸配列をコードする。コード配列をクローニングし、細菌細胞内で発現させた。予想されたサイズのポリペプチドを単離し、酵素活性を試験した。
【０３３３】
3-HP-CoA脱水酵素活性（例えば、図54の第七の酵素活性で、配列番号：41に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドによって達成することができる）を有するポリペプチドをコードする核酸分子の単離は、本明細書に記載されている。このポリペプチドをCoA転移酵素活性を有するポリペプチド（例えば、配列番号：2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）およびβ-アラニル-CoAアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチド（例えば、配列番号：160に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）と組み合わせることにより、β-アラニンから3-HPを製造する一方法が提供される。
【０３３４】
実施例１５  β-アラニンから有機酸を産生する生合成経路の構築
もう一つの経路において、アスパルテートから生じたβ-アラニンを、4,4-アミノ酪酸アミノ基転移酵素活性を有するポリペプチドによって脱アミノ化することができる（図55）。この反応はアスパルテートの生成中に消費されるグルタメートを再生成することもできる。β-アラニンの脱アミノ化はマロン酸セミアルデヒドを生成することができ、これは3-ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドまたは3-ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドによって3-HPへとさらに還元することができる。そのようなポリペプチドは下記のとおりに得ることができる。
【０３３５】
A. C.アセトブチシリクム由来のgabT（4-アミノ酪酸アミノ基転移酵素）のクローニング
下記のPCRプライマーを、クロストリジウム・アセトブチシリクム由来のgabT遺伝子（ゲンバンク#AE007654）について報告されている配列に基づき設計した：
0004490628.tif 000051
【０３３６】
このプライマーは5'末端にNco I部位および3'末端にBamH I部位を導入した。PCR反応を、C.アセトブチシリクム由来染色体DNAを鋳型として用いて計画した。
【０３３７】
0004490628.tif 000052
【０３３８】
アガロースゲル解析後、サイズ約1.3Kbの単一のバンドが観察された。この断片をキアクイックPCR精製キット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、TOPOゼロブラントPCRクローニングキット（TOPO Zero Blunt PCR cloning kit）（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてpCRII TOPOにクローニングした。pCRII TOPOライゲーション混合物1μLを用いて化学的コンピテントTOP10大腸菌細胞を形質転換した。細胞をSOC培地中に1時間置き、形質転換体をLB/カナマイシン（50μg/mL）プレート上で選択した。LB/カナマイシン培地中で終夜培養した形質転換体の単コロニー、およびプラスミドDNAをミニプレップキット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。スーパーコイルプラスミドDNAを1％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を配列決定して、配列およびその品質を確認した。
【０３３９】
正しい挿入断片を有するプラスミドを制限酵素Nco IおよびBamH Iで消化した。消化した挿入断片をゲル単離し、同じくNco IおよびBamH I酵素で消化したpET28b発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物1μLを用いて、化学的コンピテントTOP10大腸菌細胞を形質転換した。細胞をSOC培地中で1時間回復させ、形質転換体をLB/カナマイシン（50μg/mL）プレート上で選択した。スーパーコイルプラスミドDNAを1％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を含むプラスミドをミニプレップキット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離し、このプラスミドDNA 1μLを用いて、電気的コンピテントBL21(DE3)（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）を形質転換した。これらの細胞を用いて、4-アミノ酪酸アミノ基転移酵素活性を有するポリペプチドの発現をチェックした。
【０３４０】
B.  緑膿菌（P. aeruginosa）由来のmmsB（3-ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素）のクローニング
下記のPCRプライマーを、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来のmmsB遺伝子（ゲンバンク#M84911）について報告されている配列に基づき設計した：
0004490628.tif 000053
【０３４１】
このプライマーは5'末端にNde I部位および3'末端にBamH I部位を導入した。
0004490628.tif 000054
【０３４２】
PCR反応を、緑膿菌由来染色体DNAを鋳型として用いて計画した。染色体DNAはATCC（バージニア州マナッサス）緑膿菌17933Dから得た。
【０３４３】
アガロースゲル解析後、サイズ約1.6Kbの単一のバンドが観察された。この断片をキアクイックPCR精製キット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、TOPOゼロブラントPCRクローニングキット（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてpCRII TOPOにクローニングした。pCRII TOPOライゲーション混合物1μLを用いて化学的コンピテントTOP10大腸菌細胞を形質転換した。細胞をSOC培地中で1時間回復させ、形質転換体をLB/カナマイシン（50μg/mL）プレート上で選択した。LB/カナマイシン培地中で終夜培養した形質転換体の単コロニー、およびプラスミドDNAをミニプレップキット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。スーパーコイルプラスミドDNAを1％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を配列決定して、配列およびその品質を確認した。
【０３４４】
正しい挿入断片を有するプラスミドを制限酵素Nde IおよびBamH Iで消化した。消化した挿入断片をゲル単離し、同じくNde IおよびBamH I酵素で消化したpET30a発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物1μLを用いて、化学的コンピテントTOP10大腸菌細胞を形質転換した。細胞をSOC培地中で1時間回復させ、形質転換体をLB/カナマイシン（50μg/mL）プレート上で選択した。スーパーコイルプラスミドDNAを1％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を含むプラスミドをミニプレップキット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離し、このプラスミドDNA 1μLを用いて、電気的コンピテントBL21(DE3)（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）を形質転換した。これらの細胞を用いて、3-ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドの発現をチェックした。
【０３４５】
他の態様
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は例示を意図しており、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および変更は添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  3-HPを作製する経路の模式図である。
【図２】  重合3-HPを作製する経路の模式図である。
【図３】  3-HPのエステルを作製する経路の模式図である。
【図４】  重合アクリレートを作製する経路の模式図である。
【図５】  アクリル酸のエステルを作製する経路の模式図である。
【図６】  CoA転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：1）。
【図７】  CoA転移酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：2）。
【図８】  配列番号：1、3、4、および5に定められる核酸配列のアライメントである。
【図９】  配列番号：2、6、7、および８に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図１０】  E1活性化因子活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：9）。
【図１１】  E1活性化因子活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：10）。
【図１２】  配列番号：9、11、12、および13に定められる核酸配列のアライメントである。
【図１３】  配列番号：10、14、15、および16に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図１４】  ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2αサブユニットをコードする核酸配列のリストである（配列番号：17）。
【図１５】  ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2αサブユニットのアミノ酸配列のリストである（配列番号：18）。
【図１６】  配列番号：17、19、20、および21に定められる核酸配列のアライメントである。
【図１７】  配列番号：18、22、23、および24に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図１８】  ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2βサブユニットをコードする核酸配列のリストである（配列番号：25）。443の位置の「G」は「A」でもあり得、571の位置の「A」は「G」でもあり得る。
【図１９】  ラクチルCoA脱水酵素活性を持つ酵素のE2βサブユニットのアミノ酸配列のリストである（配列番号：26）。
【図２０】  配列番号：25、27、28、および29に定められる核酸配列のアライメントである。
【図２１】  配列番号：26、30、31、および32に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図２２】  メガスフェラ・エルスデニのゲノムDNAの核酸配列のリストである（配列番号：33）。
【図２３】  メガスフェラ・エルスデニ由来のポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：34）。
【図２４】  メガスフェラ・エルスデニ由来のポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：35）。
【図２５】  酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：36）。
【図２６】  酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：37）。
【図２７】  CoA合成酵素、脱水酵素、および脱水素酵素活性を持つポリペプチドのコード配列および非コード配列を含む核酸配列のリストである（配列番号：38）。コード配列の開始部位は、480の位置で、リボソーム結合部位は466-473の位置、停止コドンは5946の位置である。
【図２８】  CoA合成酵素、脱水酵素、および脱水素酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：39）。
【図２９】  3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：40）。
【図３０】  3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：41）。
【図３１】  3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性を持つポリペプチドのコード配列および非コード配列を含む核酸配列のリストである（配列番号：42）。
【図３２】  配列番号：40、43、44、および45に定められる核酸配列のアライメントである。
【図３３】  配列番号：41、46、47、および48に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図３４】  CoA転移酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性（E1、E2α、およびE2β）、および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性（3-HP-CoA脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（pTDH）の構築の模式図である。
【図３５】  CoA転移酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性（E1、E2α、およびE2β）、および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性（3-HP-CoA脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（pHTD）の構築の模式図である。
【図３６】  CoA転移酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性（E1、E2α、およびE2β）、および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性（3-HP-CoA脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（pEIITHrEI）の構築の模式図である。
【図３７】  CoA転移酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性（E1、E2α、およびE2β）、および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性（3-HP-CoA脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（pEIITHEI）の構築の模式図である。
【図３８】  2つのプラスミドpEIITHおよびpPROEIの構築の模式図である。pEIITHプラスミドは、CoA転移酵素活性、ラクチルCoA脱水酵素活性（E2αおよびE2β）、および3-ヒドロキシプロピオニルCoA脱水酵素活性（3-HP-CoA脱水酵素）を持つポリペプチドをコードし、pPROEIプラスミドはEI活性化因子活性を持つポリペプチドをコードする。
【図３９】  CoA合成酵素、脱水酵素、および脱水素酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：129）。
【図４０】  配列番号：39、130、および131に定められるアミノ酸配列のアライメントである。大文字のアミノ酸残基は、そのアミノ酸残基が2つまたはそれ以上の配列でその位置に存在することを示す。
【図４１】  配列番号：39、132、および133に定められるアミノ酸配列のアライメントである。大文字のアミノ酸残基は、そのアミノ酸残基が2つまたはそれ以上の配列でその位置に存在することを示す。
【図４２】  配列番号：39、134、および135に定められるアミノ酸配列のアライメントである。大文字のアミノ酸残基は、そのアミノ酸残基が2つまたはそれ以上の配列でその位置に存在することを示す。
【図４３】  多機能酵素OS17を用いて有機化合物を作製するいくつかの経路を示す模式図である。
【図４４】  アセチルCoAおよびマロニルCoAを介して3-HPを作製する経路の模式図である。
【図４５】  pMSD8、pET30a/acc1、pFN476、およびPET286構築物の模式図である。
【図４６】  補酵素Aチオエステルの全イオンクロマトグラムおよび5つの質量スペクトルを示す。パネルAは補酵素Aと4つのCoA有機チオエステルの分離を示す全イオンクロマトグラムである：1=補酵素A、2=ラクチルCoA、3=アセチルCoA、4=アクリリルCoA、5=プロピオニルCoA。パネルBは補酵素Aの質量スペクトルである。パネルCはラクチルCoAの質量スペクトルである。パネルDはアセチルCoAの質量スペクトルである。パネルEはアクリリルCoAの質量スペクトルである。パネルFはプロピオニルCoAの質量スペクトルである。
【図４７】  イオンクロマトグラムおよび質量スペクトルを示す。パネルAはラクチルCoAおよび3-HP-CoAの混合物の全イオンクロマトグラムである。パネルAの挿入図はピーク1で記録された質量スペクトルである。パネルBはラクチルCoAの全イオンクロマトグラムである。パネルBの挿入図はピーク2で記録された質量スペクトルである。各パネルでピーク1は3-HP-CoA、ピーク2はラクチルCoAである。アスタリスクのついたピークはCoAエステルではないことが確認された。
【図４８】  イオンクロマトグラムと質量スペクトルを示す。パネルAはpEIITHrEIでトランスフェクトされた大腸菌の培養液より得られたCoAエステルの全イオンクロマトグラムである。パネルAの挿入図は、ピーク1で記録された質量スペクトルである。パネルBはpEIITHrEIでトランスフェクトされなかった対照大腸菌の培養液より得られたCoAエステルの全イオンクロマトグラムである。パネルBの挿入図は、ピーク2で記録された質量スペクトルである。各パネルでピーク1は3-HP-CoA、ピーク2はラクチルCoAである。アスタリスクのついたピークはCoAエステルではないことが確認された。
【図４９】  マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：140）。
【図５０】  マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：141）。
【図５１】  マロニルCoA還元酵素活性を持つポリペプチドの一部をコードする核酸配列のリストである（配列番号：142）。
【図５２】  配列番号：141、143、144、145、146、および147に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図５３】  配列番号：140、148、149、150、151、および152に定められる核酸配列のアライメントである。
【図５４】  βアラニン中間体を介して3-HPを作製する経路の模式図である。
【図５５】  βアラニン中間体を介して3-HPを作製する経路の模式図である。
【図５６】  βアラニルCoAアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：160）。
【図５７】  βアラニルCoAアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：161）。
【図５８】  βアラニルCoAアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：162）。
【図５９】  βアラニルCoAアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドをコードできる核酸配列のリストである（配列番号：163）。
【図１】
0004490628.tif 000055
【図２】
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【図３】
0004490628.tif 000057
【図４】
0004490628.tif 000058
【図５】
0004490628.tif 000059
【図６】
0004490628.tif 000060
【図７】
0004490628.tif 000061
【図８（１−３）】
0004490628.tif 000062
【図８（２−３）】
0004490628.tif 000063
【図８（３−３）】
0004490628.tif 000064
【図９】
0004490628.tif 000065
【図１０】
0004490628.tif 000066
【図１１】
0004490628.tif 000067
【図１２（１−２）】
0004490628.tif 000068
【図１２（２−２）】
0004490628.tif 000069
【図１３】
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【図１４】
0004490628.tif 000071
【図１５】
0004490628.tif 000072
【図１６（１−３）】
0004490628.tif 000073
【図１６（２−３）】
0004490628.tif 000074
【図１６（３−３）】
0004490628.tif 000075
【図１７】
0004490628.tif 000076
【図１８】
0004490628.tif 000077
【図１９】
0004490628.tif 000078
【図２０（１−３）】
0004490628.tif 000079
【図２０（２−３）】
0004490628.tif 000080
【図２０（３−３）】
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【図２１】
0004490628.tif 000082
【図２２（１−２）】
0004490628.tif 000083
【図２２（２−２）】
0004490628.tif 000084
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0004490628.tif 000088
【図２７（１−２）】
0004490628.tif 000089
【図２７（２−２）】
0004490628.tif 000090
【図２８】
0004490628.tif 000091
【図２９】
0004490628.tif 000092
【図３０】
0004490628.tif 000093
【図３１】
0004490628.tif 000094
【図３２（１−２）】
0004490628.tif 000095
【図３２（２−２）】
0004490628.tif 000096
【図３３】
0004490628.tif 000097
【図３４】
0004490628.tif 000098
【図３５Ａ】
0004490628.tif 000099
【図３５Ｂ】
0004490628.tif 000100
【図３６Ａ】
0004490628.tif 000101
【図３６Ｂ】
0004490628.tif 000102
【図３７Ａ】
0004490628.tif 000103
【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
0004490628.tif 000105
【図３８Ｂ】
0004490628.tif 000106
【図３９（１−２）】
0004490628.tif 000107
【図３９（２−２）】
0004490628.tif 000108
【図４０（１−３）】
0004490628.tif 000109
【図４０（２−３）】
0004490628.tif 000110
【図４０（３−３）】
0004490628.tif 000111
【図４１（１−３）】
0004490628.tif 000112
【図４１（２−３）】
0004490628.tif 000113
【図４１（３−３）】
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【図４２（１−３）】
0004490628.tif 000115
【図４２（２−３）】
0004490628.tif 000116
【図４２（３−３）】
0004490628.tif 000117
【図４３】
0004490628.tif 000118
【図４４】
0004490628.tif 000119
【図４５】
0004490628.tif 000120
【図４６Ａ】
0004490628.tif 000121
【図４６Ｂ】
0004490628.tif 000122
【図４６Ｃ】
0004490628.tif 000123
【図４６Ｄ】
0004490628.tif 000124
【図４６Ｅ】
0004490628.tif 000125
【図４６Ｆ】
0004490628.tif 000126
【図４７Ａ】
0004490628.tif 000127
【図４７Ｂ】
0004490628.tif 000128
【図４８Ａ】
0004490628.tif 000129
【図４８Ｂ】
0004490628.tif 000130
【図４９】
0004490628.tif 000131
【図５０】
0004490628.tif 000132
【図５１】
0004490628.tif 000133
【図５２（１−３）】
0004490628.tif 000134
【図５２（２−３）】
0004490628.tif 000135
【図５２（３−３）】
0004490628.tif 000136
【図５３（１−９）】
0004490628.tif 000137
【図５３（２−９）】
0004490628.tif 000138
【図５３（３−９）】
0004490628.tif 000139
【図５３（４−９）】
0004490628.tif 000140
【図５３（５−９）】
0004490628.tif 000141
【図５３（６−９）】
0004490628.tif 000142
【図５３（７−９）】
0004490628.tif 000143
【図５３（８−９）】
0004490628.tif 000144
【図５３（９−９）】
0004490628.tif 000145
【図５４】
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【図５５】
0004490628.tif 000147
【図５６】
0004490628.tif 000148
【図５７】
0004490628.tif 000149
【図５８】
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【図５９】
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