(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる非メバロン酸経路上の反応を触媒する酵素をコードするＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換えベクターを原核生物由来の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にイソプレノイド化合物を生成蓄積させ、該培養物からイソプレノイド化合物を採取することを特徴とする、イソプレノイド化合物の製造方法。
（ａ）配列番号２６若しくは２８に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２７若しくは２９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２７若しくは２９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号５若しくは３０に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１０若しくは３１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号１０若しくは３１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
前記ベクターは以下の（ｅ）〜（ｊ）から選ばれる１つ以上のＤＮＡをさらに含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシルピロリン酸合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつファルネシルピロリン酸合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｈ）配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｊ）配列番号６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
イソプレノイド化合物が、ユビキノン、ビタミンＫ2およびカロテノイドから選ばれるイソプレノイド化合物である、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
形質転換体が、Escherichia属に属する微生物、Rhodobacter属に属する微生物またはErwinia属に属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原核生物由来の形質転換体を用いたイソプレノイド化合物の製造方法、ならびに非メバロン酸経路に係わる抗菌または除草活性物質の探索方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イソプレノイドとは、炭素数５のイソプレン単位を基本骨格に持つ化合物の総称で、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の重合によって生合成される。
自然界には多種多様なイソプレノイド化合物が存在しており、人類にとって有用なものも多い。
例えば、ユビキノンは電子伝達系の必須成分として、生体内で重要な機能を果たしており、心疾患に効果のある医薬品として使用されているほか、欧米では健康食品としての需要が増大している。
【０００３】
ビタミンKは血液凝固系に関与する重要なビタミンであり、止血剤として利用されているほか、最近骨代謝への関与が示唆され、骨粗鬆症治療への応用が期待されており、フィロキノンとメナキノンは医薬品として許可されている。
また、ユビキノンやビタミンＫ類には貝類の付着阻害作用があり、貝類付着防止塗料への応用が期待される。
【０００４】
さらに、カロテノイドと呼ばれる炭素数４０のイソプレン骨格を基本とする化合物は抗酸化作用があり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチンなど、がん予防や免疫賦活活性を有するものとして期待されているものもある。
このように、イソプレノイド化合物には多くの有用物質が含まれており、これらの安価な製造方法が確立されれば、社会的にも医学的にも多大な恩恵があると思われる。
【０００５】
発酵法によるイソプレノイド化合物の生産は以前から検討されており、培養条件の検討や変異処理による菌株育種、さらに遺伝子工学的手法による生産量の向上への試みもなされている。しかし、その効果は個々の化合物種に限定されており、イソプレノイド化合物全般に効果のある方法は知られていない。
イソプレノイド化合物の基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）は、動物や酵母などの真核生物ではアセチルCoAからメバロン酸を経由して生合成される（メバロン酸経路）ことが証明されている。
【０００６】
メバロン酸経路では３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（HMG-CoA）リダクターゼが律速と考えられており〔Mol．Biol．Cell，5，655(1994)〕、酵母において、HMG-CoAリダクターゼを高発現化させカロテノイドの生産性を上げる試みがなされている〔三沢ら  カロテノイド研究談話会講演要旨集(1997)〕。
【０００７】
原核生物ではメバロン酸経路の存在を証明した知見はなく、別の経路、即ち、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸が縮合して生じる１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を経由してＩＰＰが生合成されるという非メバロン酸経路が多くの原核生物において発見されており〔Biochem. J.,295,517 (1993)〕、13Ｃラベル化基質を使った実験から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸は２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を経由してＩＰＰへと転換されることが示唆されている[Tetrahedron Lett.38, 4769(1997)]。
【０００８】
大腸菌において、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸を縮合させ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生合成させる酵素１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸合成酵素（ＤＸＳ）をコードする遺伝子が同定されている〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,94, 12857 (1997)〕。該遺伝子は、ファルネシルピロリン酸合成酵素をコードするispＡを含む４つのORFからなるオペロンに含まれている。
【０００９】
更に、大腸菌においては、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸に変換する活性が存在することが知られている[Tetrahedron Lett.39, 4509(1998)]。
該オペロンに含まれるこれら遺伝子を操作して、イソプレノイド化合物の生産性を向上させることに関する記載も示唆も現時点ではない。
原核生物における非メバロン酸経路に関する知見は徐々に蓄積されつつあるが、関与する酵素やそれをコードする遺伝子の多くは未だ不明である。
【００１０】
光合成細菌において、コリスメートを４−ヒドロキシベンゾエートへ転換する酵素ｕｂｉＣの遺伝子（ｕｂｉＣ遺伝子）およびｐ−ヒドロキシベンゾエートトランスフェラーゼの遺伝子（ｕｂｉＡ）を導入することにより、ユビキノン−１０を効率的に生産する方法が知られている（特開平８−１０７７８９）が、非メバロン酸経路の酵素遺伝子を操作することによってイソプレノイド化合物の生産性を向上させた例は皆無である。
更に、非メバロン酸経路上の反応を、変異または薬剤処理等により阻害することにより、原核生物がいかなる影響を受けるかに関する知見はない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、心疾患、骨粗鬆症、止血、がん予防、免疫賦活等を目的とした医薬品、健康食品および貝類付着防止塗料等に有用なイソプレノイド化合物の生合成に関与するＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを原核生物由来の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にイソプレノイド化合物を生成蓄積させ、該培養物からイソプレノイド化合物を採取することを特徴とする、イソプレノイド化合物の製造方法、イソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の製造方法、該蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを提供することにある。さらに、本発明の課題は、非メバロン酸経路上の酵素反応を阻害する物質を探索することを特徴とする、抗菌および除草活性物質の探索方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、原核生物によるイソプレノイド生産性を向上させることのできるＤＮＡを検索し、得られたＤＮＡを原核生物に導入することにより、イソプレノイド生産性を向上させることのできることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本願の第１の発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）から選ばれるＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを原核生物由来の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にイソプレノイド化合物を生成蓄積させ、該培養物からイソプレノイド化合物を採取することを特徴とする、イソプレノイド化合物の製造方法である。
【００１４】
（ａ）はピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）はファルネシルピロリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ、
（ｃ）は配列番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｄ）は配列番号４記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｅ）は１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸から2-C-メチル-D-エリスリトール4-リン酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｆ）は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）から選ばれるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ選ばれたＤＮＡにコードされた蛋白質が有する活性と実質的に同一の活性を有している蛋白質をコードするＤＮＡである。
【００１５】
本明細書中の、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数、例えば１〜５個のアミノ酸を意味する。
【００１６】
かかる１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質は、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第二版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch)、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年刊（以下、モレキュラー・クローニング第二版と略す）〕、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の方法に準じて調製することができる。
【００１７】
上記において、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する蛋白質をコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号１、２６または２８に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、あるいはこれら蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等をあげることができる。
【００１８】
具体的な例として、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号２７または２９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
ファルネシルピロリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつファルネシルピロリン酸合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。具体的な例として、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
【００１９】
配列番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの具体的な例として、配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号４記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの具体的な例として、配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
【００２０】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号５または３０に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等をあげることができる。
【００２１】
該ＤＮＡの具体的な例として、配列番号１０または３１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、上記のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第二版等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、具体的には配列番号１、２、３、４および５から選ばれる塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００２３】
イソプレノイド化合物として、例えば、ユビキノン、ビタミンＫ2、カロテノイド等をあげることができる。
本願の第２の発明は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質である。
【００２４】
（ａ）は配列番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）は配列番号４記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）は配列番号５記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質である。
【００２５】
本願の第３の発明は、上記の第２の発明に記載の蛋白質をコードするＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、イソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質の製造方法である。
上記において、形質転換体として、Escherichia属に属する微生物、Rhodobacter属に属する微生物またはErwinia属に属する微生物をあげることができる。
【００２６】
本願の第４の発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）から選ばれるイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。
（ａ）は配列番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）は配列番号４記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）は配列番号５記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）は配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｅ）は配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｆ）は配列番号１０記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｇ）は（ａ）〜（ｆ）いずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。
【００２７】
本願の第５の発明は、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸より１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生合成した後、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸の生合成を経由しイソペンテニルピロリン酸を生合成するための非メバロン酸経路上に存在する酵素から選ばれる酵素の有する活性を有している蛋白質の反応を阻害する物質を探索することを特徴とする抗菌活性を有する物質の探索方法である。
【００２８】
本願の第６の発明は、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸より１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生合成した後、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸の生合成を経由しイソペンテニルピロリン酸を生合成するための非メバロン酸経路上に存在する酵素から選ばれる酵素の有する活性を有している蛋白質の反応を阻害する物質を探索することを特徴とする除草活性を有する物質の探索方法である。
【００２９】
上記発明５および６において、蛋白質として、以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をあげることができる。
（ａ）はピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質、
（ｂ）は１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質である。
【００３０】
上記において、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する蛋白質として、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をあげることができる。
【００３１】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる反応を触媒する活性を有する蛋白質として、例えば、配列番号５記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をあげることができる。
本発明の第７の発明は、上記第５の発明の探索方法により取得される抗菌活性を有する物質である。ただし、該探索方法により取得される公知の物質は本発明に入らない。
【００３２】
本発明者らは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ反応の産物である２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸やこの酵素反応で想定される反応中間体とフォスミドマイシン〔3-(N-formyl-N-hydroxyamino)propylphosphonic acid〕との構造的類似性に着目し、フォスミドマイシンが１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ阻害活性を有し、かつ抗菌活性をも有するとの推測の基に、後述の実施例１０に示した上記第５の発明の探索方法の実験を行い、フォスミドマイシンが、該阻害活性を有し、かつ抗菌活性を有する物質であることを見いだすと共に、上記第５の発明の探索方法の妥当性を証明したが、公知であるフォスミドマイシンは本発明から除かれる。
【００３３】
本発明の第８の発明は、上記第６の発明の探索方法により取得される除草活性を有する物質である。上記同様、該探索方法により取得される公知の物質は本発明に入らない。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
【発明の実施の形態】
Ｉ．  イソプレノイド化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
（１）  ＤＸＳをコードするＤＮＡ（ＤＸＳ遺伝子）の塩基配列を利用した、イソプレノイド化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
既に決定されている、大腸菌の染色体およびＤＸＳ遺伝子の塩基配列情報〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,94, 12857 (1997)〕を利用し、大腸菌よりＤＸＳ遺伝子を含む、あるいはＤＸＳ遺伝子近隣の遺伝子のＤＮＡ領域をＰＣＲ法〔Science，230，1350(1985)〕によりクローニングし、取得することができる。
【００３５】
ＤＸＳ遺伝子を含む塩基配列情報として、例えば、配列番号１１に記載の塩基配列をあげることができる。
ＤＸＳ遺伝子を含むＤＮＡ領域の取得法としては、具体的には以下の方法をあげることができる。
【００３６】
大腸菌、例えばE. coli XL1-Blue株（東洋紡より購入可能）を大腸菌に適した培地、例えばＬＢ液体培地〔バクトトリプトン(ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、ＮａＣｌ５ｇを水１リットルに含みｐＨ７．２に調整した培地〕を用い常法に従って培養する。
培養後、培養物より遠心分離により菌体を取得する。
【００３７】
取得した菌体より公知の方法（例えば、モレキュラー・クローニング第二版）に従い染色体ＤＮＡを単離する。
配列番号１１に記載された塩基配列情報を利用し、ＤＸＳ遺伝子を含む、あるいはＤＸＳ遺伝子近隣の遺伝子のＤＮＡ領域に対応する塩基配列を含有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成する。
【００３８】
ＰＣＲ法により増幅後、該増幅ＤＮＡ断片をプラスミドに導入可能なようにセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５'末端には適切制限酵素サイト、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ等の制限酵素サイトを付加させることが好ましい。
【００３９】
該センスプライマー、アンチセンスプライマーの組合せとしては、例えば、配列番号１２および１３、配列番号１４および１５、配列番号１２および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および１３、配列番号２２および２３の組合せの塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
【００４０】
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマー、TaKaRa LA-PCRTM Kit Ver.2(宝酒造社製)またはExpandTM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハイム社製)等を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキンエルマージャパン社製)でＰＣＲを行う。
【００４１】
ＰＣＲの条件として、上記プライマーが２ｋｂ以下のＤＮＡ断片の場合には９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、２ｋｂを超えるＤＮＡ断片の場合にはは９８℃で２０秒間、６８℃で３分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件をあげることができる。
【００４２】
該増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌で増幅可能な適切なベクターを上記プライマーで付与した制限酵素サイトと同じサイトで切断後、アガロース電気泳動、シュークロース密度勾配超遠心分離等の手法によりＤＮＡ断片を分画・回収する。
【００４３】
該回収ＤＮＡ断片を、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法に従ってクローニングベクターに連結し、大腸菌、例えばE. coli DH5α株（東洋紡より購入可能）を形質転換する。
【００４４】
該大腸菌を形質転換するためのクローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research,17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（ストラタジーン社製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical Approach,1, 49 (1985)〕、λTriplEx（クローンテック社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファルマシア社製）、pcD2〔H.Okayama and P.Berg；Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)〕、pMW218（和光純薬社製）、pUC118（宝酒造社製）、pEG400〔J. Bac.,172, 2392 (1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等をあげることができる。
【００４５】
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを常法、例えば、モレキュラー・クローニング第二版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法により取得することができる。
【００４６】
該方法により、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、ファルネシルピロリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ、配列番号３記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号４記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等を有するプラスミドおよびこれらＤＮＡを１つ以上含むプラスミドを取得することができる。
【００４７】
該プラスミドとして、例えば、上記ＤＮＡを全て含むプラスミドｐＡＤＯ−１、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドpＤＸＳ-1あるいはｐＱＥＤＸＳ−１、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＩＳＰ−１、配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＸＳＥ−１、配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＴＦＥ−１等をあげることができる。
【００４８】
これらプラスミドに挿入された大腸菌由来のＤＮＡ断片の塩基配列を利用し、他の原核生物、例えば、Rhodobacter属に属する微生物等より、該ＤＮＡのホモログを上記と同様の方法により取得することができる。
【００４９】
（２）  大腸菌のメチルエリスリトール要求性変異株を相補することのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（メチルエリスリトール要求性相補遺伝子）の取得
▲１▼  大腸菌メチルエリスリトール要求性変異株の取得
大腸菌、例えばE. coli W3110株（ATCC14948）を、常法に従って培養する。
【００５０】
培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得する。
該菌体を、適切な緩衝剤、例えば、０．０５Ｍトリスーマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等で洗浄後、菌体濃度が１０4〜１０10細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁する。
【００５１】
該懸濁液を用いて常法により変異処理を行う。常法として、例えば、該懸濁液にＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理する方法をあげることができる。
該変異処理懸濁液を最少寒天培地に０．０５〜０．５％メチルエリスリトールを添加した培地で培養する。
【００５２】
最少寒天培地として、例えば、Ｍ９培地（モレキュラー・クローニング第二版）に寒天を添加した培地等をあげることができる。
メチルエリスリトールは、Tetrahedron Letters,38, 35, 6184 (1997)に記載の方法に準じて化学合成したものを用いることができる。
【００５３】
培養後、生育し形成されたコロニーを、最少寒天培地とメチルエリスリトールを０．０５〜０．５％含む最少寒天培地にレプリカし、メチルエリスリトール要求性を示すもの、すなわち、メチルエリスリトールを含む最少寒天培地では生育できるが、最少寒天培地では生育できない株を目的の変異株として選択する。
該操作により取得されたメチルエリスリトール要求性変異株としてＭＥ７株をあげることができる。
【００５４】
▲２▼  メチルエリスリトール要求性相補遺伝子の取得
大腸菌、例えば、E. coli W3110株（ATCC14948）を培養培地、例えば、ＬＢ液体培地に植菌し、常法に従って対数増殖期まで培養する。
培養後、得られた培養液を遠心分離して菌体を回収する。
【００５５】
得られた菌体より、常法（例えば、モレキュラー・クローニング第二版に記載の方法）に従い染色体ＤＮＡを単離・精製する。上記（１）に記載の方法で取得される染色体ＤＮＡを単離・精製された染色体ＤＮＡとして用いることもできる。
該染色体ＤＮＡの適当量を適切な制限酵素、例えば、Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、得られた消化ＤＮＡ断片を、常法、例えば、シュークロース密度勾配超遠心分離（２６，０００ｒｐｍ、２０℃、２０ｈｒ）により、サイズ分画する。
【００５６】
該分画により取得される大きさが４〜６ｋｂのＤＮＡ断片を、適切な制限酵素で消化したベクター、例えば、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）にライゲーションすることにより染色体ゲノムライブラリーを作製する。
作製した染色体ライブラリーを用い、上記▲１▼で分離されたメチルエリスリトール要求性変異株、例えば、ＭＥ７株を常法（例えば、モレキュラー・クローニング第二版に記載の方法）に従い形質転換する。
【００５７】
該形質転換体を、ベクターの有する薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加した最少寒天培地、例えば、アンピシリン１００μｇ／ｌ入れたＭ９寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養する。
該方法により、メチルエリスリトール要求性の回復された形質転換体を選択することができる。
【００５８】
得られた該形質転換体より、常法によりプラスミドを抽出する。該メチルエリスリトール要求性を回復させることのできるプラスミドとして、例えばpMEW73、pQEDXRをあげることができる。
該プラスミド中に導入されたＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００５９】
該方法により決定された塩基配列として、配列番号１０に示されるyaeM遺伝子の塩基配列を含む配列等をあげることができる。得られた該yaeM遺伝子の塩基配列情報を利用して他の原核生物あるいは植物から該yaeM遺伝子のホモログを上記と同様の方法により取得することができる。
【００６０】
II．  イソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質の製造
上記のようにして得られたＤＮＡを宿主細胞中で発現させるためには、まず、目的とする該ＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分解酵素類で、該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００６１】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等をあげることができる。
【００６２】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等を宿主細胞として用いる場合は、上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００６３】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry,48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）、pTrS30(FERMBP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社製）、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18〔gene, 33, 103 (1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29（宝酒造社製）、pUC118（宝酒造社製）、pPA1（特開昭63-233798）、pEG400〔J. Bacteriol.,172, 2392(1990)〕、pQE-30（QIAGEN社製）等を例示することができる。
【００６４】
プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモーター、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００６５】
リボソーム結合配列としては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミッドを用いることが好ましい。
目的とするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
【００６６】
宿主細胞としては、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Microbacterium属、Serratia属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas属等に属する微生物をあげることができ、好ましくは、Escherichia属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Bacillus属、Pseudomonas属、Agrobacterium属、Alicyclobacillus属、Anabaena属、Anacystis属、Arthrobacter属、Azobacter属、Chromatium属、Erwinia属、Methylobacterium属、Phormidium属、Rhodobacter属、Rhodopseudomonas属、Rhodospirillum属、Scenedesmun属、Streptomyces属、Synnecoccus属、Zymomonas属に属する微生物等をあげることができる。
【００６７】
該微生物の具体例として、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichiacoli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14297、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Pseudomonas sp. D-0110、Agrobacterium radiobacter、Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium rubi、Anabaena cylindrica、Anabaena doliolum、Anabaena flos-aquae、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globformis、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter mysorens、Arthrobacter nicotianae、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter protophormiae、Arthrobacter roseoparaffinus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter ureafaciens、Chromatium buderi、Chromatium tepidum、Chromatium vinosum、Chromatium warmingii、Chromatium fluviatile、Erwinia uredovora、Erwinia carotovora、Erwinia ananas、Erwinia herbicola、Erwinia punctata、Erwinia terreus、Methylobacterium rhodesianum、Methylobacterium extorquens、Phormidium sp. ATCC29409、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodopseudomonas blastica、Rhodopseudomonas marina、Rhodopseudomonas palustris、Rhodospirillum rubrum、Rhodospirillum salexigens、Rhodospirillum salinarum、Streptomyces ambofaciens、Streptomyces aureofaciens、Streptomyces aureus、Streptomyces fungicidicus、Streptomyces griseochromogenes、Streptomyces griseus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivogriseus、Streptomyces rameus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces vinaceus、Zymomonas mobilis等をあげることができる。
【００６８】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００６９】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００７０】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporonpullulans）、シュワニオミセス・アルビウス
（Schwanniomycesalluvius）等をあげることができる。
【００７１】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. Enzymol.,194, 182 (1990〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriol.,153, 163(1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。
【００７２】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329, 840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３〔J. Biochem.,101, 1307 (1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
【００７３】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。
【００７４】
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology, 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84, 7413(1987)〕、virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００７５】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント1-３８(1987-1997)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
【００７６】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００７７】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（W. H. Freeman and Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、Trichoplusianiの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００７８】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第二版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
【００７９】
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養し、培養物中にイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、イソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質を製造することができる。
【００８０】
本発明のイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質製造用の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８１】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
【００８２】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。
【００８３】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００８４】
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００８５】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Medical Association,199, 519 (1967)〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Science,122, 501 (1952)〕、ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73, 1(1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
【００８６】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８７】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔Pharmingen社製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ExCell400、ExCell405〔いずれもJRH Biosciences社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
【００８８】
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の形質転換体の培養物から、本発明のイソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
【００８９】
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００９０】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００９１】
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
【００９２】
また、上記方法により発現させた蛋白質を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易(米国Advanced chemTech社製)、パーキンエルマージャバン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイオテク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
【００９３】
III．イソプレノイド化合物の製造
上記II．で取得された形質転換体を、上記II．の方法に準じて培養し、培養物中にイソプレノイド化合物を生成蓄積させ、該培養物からイソプレノイド化合物を採取することによりイソプレノイド化合物を製造することができる。
【００９４】
該培養により、ユビキノン、ビタミンＫ2、カロテノイド等のイソプレノイド化合物を製造することができる。具体的な例として、例えば、Escherichia属に属する微生物を形質転換体としたユビキノンー８やメナキノンー８の製造、Rhodobacter属に属する微生物を形質転換体としたユビキノンー１０の製造、Arthrobacter属に属する微生物を形質転換体としたビタミンＫ2の製造、Agrobacterium属に属する微生物を形質転換体としたアスタキサンチンの製造、Erwinia属に属する微生物を形質転換体としたリコペン、β-カロテン、ゼアキサンチンの製造等をあげることができる。
【００９５】
培養終了後、培養液に適当な溶媒を加えてイソプレノイド化合物を抽出し、遠心分離などで沈殿物を除去した後、各種クロマトグラフィーを行うことによりイソプレノイド化合物を単離・精製することができる。
【００９６】
ＩＶ．非メバロン酸経路上の酵素活性を阻害する物質の探索
（１）  非メバロン酸経路上の酵素活性の測定
非メバロン酸経路上の酵素活性の測定は、通常の酵素の活性測定法に準じて行うことができる。
即ち、活性測定の反応液に用いる緩衝液のＰＨは、目的とする酵素の活性を阻害しないＰＨ範囲であればよく、最適ＰＨを含む範囲のＰＨが好ましい。
【００９７】
例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼにおいては、ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜９である。
緩衝液としては、酵素活性を阻害せず、上記ｐＨを達成できるものであればいずれの緩衝液も用いることができる。該緩衝液として、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液、硼酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、炭酸水素緩衝液などを用いることができる。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼにおいては、例えば、トリス塩酸緩衝液が好適に用いられる。
【００９８】
緩衝液の濃度は酵素活性に阻害を及ぼさない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には１ｍＭから１Ｍである。
目的とする酵素に補酵素が必要な場合には、反応液に補酵素を添加する。例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼにおいては、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨあるいはその他の電子供与体を用いることができ、好ましくはＮＡＤＰＨをあげることができる。
【００９９】
添加する補酵素の濃度は、反応を阻害しない限りいずれの濃度でも用いることができるが、好適には０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度である。
反応液には必要に応じて金属イオンを添加してもよい。金属イオンは、反応を阻害しない限りどのようなものでも添加することができるが、好適にはＣｏ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+などがあげられる。
【０１００】
金属塩として金属イオンを添加することができ、例えば、塩化物や硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩などとして添加することができる。
添加する金属イオンの濃度は、反応を阻害しない限りどのような濃度でも添加できるが、好適には０ｍＭから１００ｍＭ、より好適には０．１ｍＭから１０ｍＭである。
【０１０１】
反応液には、目的とする酵素の基質を添加する。例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼにおいては、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を添加する。
基質の濃度は反応に支障のない限りどのような濃度でも用いることができるが、好適には反応液中の濃度は０．０１ｍＭ〜０．２Ｍである。
【０１０２】
反応に用いる酵素濃度に特に制限はないが、通常０．０１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で反応を行う。
用いる酵素は必ずしも単一にまで精製されている必要はなく、反応を妨害しない限り、他の侠雑蛋白質が混入した標品であってもよい。また、下記（２）の探索においては、該酵素活性を含む細胞抽出液あるいは該酵素活性を有する細胞も用いることができる。
【０１０３】
反応温度は、目的とする酵素の活性を阻害しない温度範囲であればよく、最適温度を含む範囲の温度が好ましい。即ち、反応温度は、１０℃から６０℃、より好ましくは３０℃から４０℃である。
活性の検出は、反応に伴う基質の減少、あるいは反応生成物の増加を、基質あるいは反応生成物を測定できる方法を用いて行うことができる。
【０１０４】
該方法として、例えば、必要に応じて高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等により目的物質を分離定量する方法をあげることができる。また反応の進行に伴ってＮＡＤＨやＮＡＤＰＨが増減する場合には、反応液の３４０ｎｍの吸光度を測定することで活性を直接測定することができる。例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼにおいては、３４０ｎｍの吸光の減少を分光光度計で測定することにより反応の進行に伴い減少するＮＡＤＰＨを定量し、活性を検出することができる。
【０１０５】
（２）非メバロン酸経路上の酵素活性を阻害する物質の探索
非メバロン酸経路上の酵素活性を阻害する物質の探索は、上記（１）の酵素活性測定系に被探索物質を加えて同様に反応させ、無添加時より基質の減少量を抑えるような物質あるいは反応産物の生成量を抑えるような物質を探索することで行うことができる。
【０１０６】
探索の方法としては、基質の減少量あるいは反応生産物の増加量等を経時的に追跡する方法、一定時間反応させた後の基質の減少量あるいは反応生産物の増加量等を測定する方法等をあげることができる。
基質の減少量あるいは反応生産物の増加量等を経時的に追跡する方法においては、反応中１５秒〜２０分程度の間隔で基質の減少量あるいは反応生産物の増加量を測定することが好ましく、１〜３分間隔で測定することがより好ましい。
【０１０７】
一定時間反応させた後の基質の減少量あるいは反応生産物の増加量等を測定する方法においては、反応時間は、１０分〜１日が好ましく、より好ましくは３０分〜２時間である。
非メバロン酸経路上の酵素活性を阻害する物質は、該非メバロン酸経路を有する微生物および植物の生育を阻害する。該物質が該微生物および植物の生育を阻害することは、本発明者らが始めて見出した。
【０１０８】
非メバロン酸経路は微生物や植物に存在し、動物や人には存在しないことより、上記探索方法により、人や動物に影響を及ぼさない、非メバロン酸経路上の酵素活性を阻害する物質を取得することができる。
該物質は、有効な抗菌剤あるいは除草剤となり得る。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例で示した遺伝子組換え実験は、特に言及しない限りモレキュラー・クローニング第二版に記載の方法（以下、常法と呼ぶ）を用いて行った。
【０１０９】
【実施例】
実施例１  イソプレノイド化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
（１）  大腸菌ＤＸＳ遺伝子の塩基配列を利用した、イソプレノイド化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
E. coli XL1-Blue株（東洋紡より購入）を1白金耳、１０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。
【０１１０】
培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得した。
該菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。
配列番号１２および１３、配列番号１４および１５、配列番号１２および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および１３の塩基配列の組合せを有する５'末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位をそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、配列番号２２および２３の塩基配列の組合せを有する５'末端にＢａｍＨＩ制限酵素切断部位をそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【０１１１】
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーと、TaKaRa LA-PCRTM Kit Ver.2(宝酒造社製)、ExpandTM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハイム社製)またはTaq DNA polymerase（Boelinnger社製）を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキンエルマージャパン社製)でＰＣＲを行った。
【０１１２】
ＰＣＲは、２ｋｂ以下のＤＮＡ断片は９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、２ｋｂを超えるＤＮＡ断片は９８℃で２０秒間、６８℃で３分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件で行った。
【０１１３】
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片のうち、５'末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位をそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、５'末端にＢａｍＨＩ制限酵素切断部位をそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片は制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。
【０１１４】
消化後、これら制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片およびＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片を取得した。
ｌａｃプロモーターを有する広宿主域ベクターｐＥＧ４００〔J. Bac.,172, 2392 (1990)〕を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ｐＥＧ４００断片を取得した。
【０１１５】
ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｍＨＩ処理ｐＵＣ１１８断片を取得した。
上記で取得されたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片各々についてＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ処理ｐＥＧ４００断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを各々取得した。
【０１１６】
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli（東洋紡より購入）DH5α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたスペクチノマイシン耐性の形質転換体のコロニー数個について、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【０１１７】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
【０１１８】
配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＡＤＯ−１、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをpＤＸＳ-1、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＩＳＰ−１、配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＸＳＥ−１、配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドをｐＴＦＥ−１と命名した。
【０１１９】
また、上記で取得されたＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片およびＢａｍＨＩ処理ｐＵＣ１１８断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。以後上記と同様の方法で、大腸菌を形質転換し、該大腸菌よりプラスミドを単離した。
【０１２０】
上記同様、該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
該プラスミドをＢａｍＨＩ処理し、目的のＤＮＡ断片を上記と同様の方法で回収し、発現ベクターｐＱＥ３０(Qiagen社製)に常法によりサブクローニングした。
該サブクローニングにより得られた、配列番号６記載の塩基配列を有するプラスミドをｐＱＥＤＸＳ−１と命名した。
【０１２１】
（２）  メチルエリスリトール要求性相補遺伝子の取得
▲１▼  大腸菌メチルエリスリトール要求性変異株の取得
E. coli W3110株（ATCC14948）を、LB液体培地に植菌し、対数増殖期まで培養した。
培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得した。
該菌体を、０．０５Ｍトリスーマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が１０9細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。
【０１２２】
該懸濁液にＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理を行った。
得られた変異処理菌体をメチルエリスリトール０．１％を含むＭ９最少寒天培地〔モレキュラー・クローニング第二版〕プレートに塗布し、培養した。
メチルエリスリトールは、Tetrahedron Letters,38, 35, 6184 (1997)に記載の方法に準じて化学合成した。
【０１２３】
メチルエリスリトール０．１％を含むＭ９最少寒天培地上で生育してきたコロニーを、Ｍ９最少寒天培地とメチルエリスリトールを０．１％含むＭ９最少寒天培地にレプリカし、メチルエリスリトール要求性を示すもの、すなわち、メチルエリスリトールを０．１％含むＭ９最少寒天培地では生育できるが、Ｍ９最少寒天培地では生育できない株を目的の変異株として選択した。
該選択により得られたメチルエリスリトール要求性変異株ＭＥ７株を以下の実験に用いた。
【０１２４】
▲２▼  メチルエリスリトール要求性相補遺伝子の取得
E. coli W3110株（ATCC14948）をLB液体培地に植菌して対数増殖期まで培養した後、遠心分離して菌体を回収した。
得られた菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。
【０１２５】
該染色体DＮＡ２００μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、得られた消化ＤＮＡ断片を、シュークロース密度勾配超遠心分離（２６，０００ｒｐｍ、２０℃、２０ｈｒ）により、サイズ分画した。
該分画により取得された大きさが４〜６ｋｂのＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化したベクターｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）にライゲーションすることにより染色体ゲノムライブラリーを作製した。
【０１２６】
作製した染色体ライブラリーを用い、上記▲１▼で分離されたＭＥ７株を常法に従い形質転換した。
得られた形質転換体を、アンピシリン１００μｇ／ｌ入れたＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
該培養において生育してきた複数のコロニーからプラスミドを抽出して塩基配列を決定した。
【０１２７】
塩基配列を決定したクローンは配列番号１０に示される塩基配列を含む配列を有していた。これらのプラスミドをpMEW41およびpMEW73と名づけた。
該配列を有するクローンの１株より抽出したプラスミドをpMEW73と命名した。
pMEW73をＨｉｎｄIIIおよびＳａｃＩで二重消化し、得られた配列番号１０に示される塩基配列を有するＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ処理DNA断片を広宿主域ベクターpEG400〔J. Bac.,172, 2392 (1990)〕のマルチクローニングサイトに連結してpEGYM1を作製した。
【０１２８】
上記ＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ処理ＤＮＡ断片をベクターpUC19〔Gene, 33,103 (1985)〕のＨｉｎｄIII−ＳａｃＩ部位に連結してpUCYM-1を作製した。
Genbankのデータベースに基づく大腸菌の染色体塩基配列情報より、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片はｙａｅＭ遺伝子を含有することが分かった。
【０１２９】
ｙａｅＭ遺伝子を十分発現させるような組換え体ベクターをPCR法〔Science，230，1350 (1985)〕を用いて下記方法により構築した。
配列番号２０に示した配列を有するセンスプライマーおよび配列番号２１に示した配列を有するアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【０１３０】
該センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５'末端にはそれぞれＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付加させた。
染色体DNAを鋳型として、これらプライマーおよびTaq DNA polymerase（Boelinnger社製）を用い、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマージャパン社製）でＰＣＲを行うことによりyaeM遺伝子を増幅した。
【０１３１】
ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片およびpUC118（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、各々のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１３２】
これら精製された両断片を混合した後エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡがｙａｅＭ遺伝子であることをＤＮＡ配列を決定することによって確認した後、発現ベクターｐＱＥ３０(Qiagen社製)にサブクローニングした。
得られた組換え体ＤＮＡをｐＱＥＹＭ１と命名した。
【０１３３】
ｐＱＥＹＭ１を用いて、ＭＥ７株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
該形質転換株は、野生型株と同程度の生育速度でコロニーを形成することが確認されたことより、ｙａｅＭ遺伝子によりＭＥ７株の変異が相補されることが分かった。
【０１３４】
実施例２  組換え大腸菌によるユビキノン−８（ＣｏＱ８）の生産
（１）実施例１で取得したプラスミドｐＡＤＯ−１、pＤＸＳ−１、ｐＸＳＥ−１またはコントロールとしてｐＥＧ４００をE. coli DH5α株にそれぞれ導入し、１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノマイシンに抵抗性を示す形質転換体E. coli DH5α／pADO-1、E. coli DH5α／pDXS-1、E. coli DH5α／pXSE-1およびE. coli DH5α／pEG400を各々取得した。
【０１３５】
チアミン（thiamine）とビタミンB6をそれぞれ１００ｍｇ／ｌ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸５０ｍｇ／ｌ、スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌ添加したＬＢ培地を１０ｍｌ入れた試験管にこれら形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。
培養終了後、各々の培養液を１０倍濃縮した。
【０１３６】
各々の濃縮液３００μｌに２−ブタノール３００μｌおよびガラスビーズ３００μｌを加え、マルチビーズショッカーＭＢ−２００（安井器械社製）で５分間菌体破砕しつつ、イソプレノイド化合物の溶媒抽出を行った後、遠心分離により2−ブタノール層を採取した。
該ブタノール層中のＣｏＱ８を、高速液体クロマトグラフィー（LC-10A  島津製作所製）で定量分析することにより、形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定した。
【０１３７】
カラムはDevelosil ODS-HG-5（野村化学）を用い、メタノール：ｎ−ヘキサン＝８：２の溶液を移動相とし、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、測定波長２７５ｎｍの条件で分析した。
結果を第１表に示す。
【０１３８】
【表１】
0004401471.tif 000002
【０１３９】
ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株DH5α／pEG400と比較し、DH5α／pADO-1、DH5α／pDXS-1およびDH5α／pXSE-1では有意に高かった。特に、実施例１で取得したＤＮＡを全て導入したDH5α／pADO-1において最も高い生産性が得られた。
【０１４０】
（２）Ｍ９培地を１０ｍｌ入れた試験管に、上記（１）で取得したE. coli DH5α／pDXS-1またはE. coli DH5α／pEG400をそれぞれ植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。
培養終了後、上記（１）と同様の方法により形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定した。
結果を第２表に示す。
【０１４１】
【表２】
0004401471.tif 000003
【０１４２】
ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株DH5α／pEG400と比較し、DH5α／pDXS-1では有意に高かった。
（３）  組換え大腸菌によるＣｏＱ８の生産
実施例１で取得したプラスミドｐＥＧＹＭ１またはコントロールとしてｐＥＧ４００をE. coli DH5α株に導入し、１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノマイシンに抵抗性を示す形質転換体E. coli DH5α／pEGYM1およびE. coli DH5α／pEG400を各々取得した。
【０１４３】
グルコース１％、ビタミンＢ1 １００ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ6 １００ｍｇ／ｌ、ｐ−ハイドロキシ安息香酸５０ｍｇ／ｌ添加したＬＢ培地を１０ｍｌ入れた試験管にこれら形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。
培養終了後、上記（１）と同様の方法により形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定した。
結果を第３表に示す。
【０１４４】
【表３】
0004401471.tif 000004
【０１４５】
ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株DH5a／pEG400と比較し、DH5a／pEGYM1では有意に高かった。
【０１４６】
実施例３  組換え大腸菌によるメナキノンー８(ＭＫ−８)の生産
（１）スペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ添加したＴＢ培地〔バクトトリプトン(ディフコ社製）１２ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ、グリセロール５ｇを水９００ｍｌに溶解し、ＫＨ2ＰＯ4を０．１７Ｍ、Ｋ2ＨＰＯ4を０．７２Ｍ含有する水溶液を１００ｍｌ加えて調製した培地〕を１０ｍｌ入れた試験管に、実施例２（１）で取得した、E. coli DH5α／pADO-1またはE. coli DH5α／pEG400をそれぞれ植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。
【０１４７】
培養終了後、実施例２（１）のＣｏＱ８の定量法と同様の方法によりＭＫ−８を定量し、形質転換体によるＭＫ−８の生産量を算定した。
結果を第４表に示す。
【０１４８】
【表４】
0004401471.tif 000005
【０１４９】
ＭＫ−８の生産量は、コントロール株DH5α／pEG400と比較して、DH5α／pADO-1では有意に高かった。
（２）実施例２（１）で取得したE. coli DH5α／pDXS-1またはE. coli DH5α／pEG400を、上記（１）と同様の方法で培養し、形質転換体によるＭＫ−８の生産量を算定した。
結果を第５表に示す。
【０１５０】
【表５】
0004401471.tif 000006
【０１５１】
ＭＫ−８の生産量は、コントロール株DH5α／pEG400と比較して、DH5α／pDXS-1では有意に高かった。
【０１５２】
実施例4 Erwinia carotovoraによるＣｏＱ８の生産
実施例１で取得したプラスミドｐＤＸＳ−１またはコントロールとしてｐＥＧ４００をErwinia carotovora IFO-3380株に導入し、１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノマイシンに抵抗性を示す形質転換体IFO-3380／pDXS-1およびIFO-3380／pEG400を取得した。
【０１５３】
スペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ添加したＬＢ培地を１０ｍｌ入れた試験管にこれら形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。
培養終了後、実施例２（１）と同様の方法により形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定した。
結果を第６表に示す。
【０１５４】
【表６】
0004401471.tif 000007
【０１５５】
ＣｏＱ８の生成量は、コントロール株IFO-3380／pEG400と比較し、IFO-3380／pDXS-1では有意に高かった。
【０１５６】
実施例５：Erwinia uredovoraによるユビキノンおよびカロテノイドの生産
実施例１で取得したプラスミドpUCYM-1、pQEDXS-1、pQEYM-1またはコントロールとしてpUC19およびpQE30をエレクトロポレーション法によりErwinia uredovora DSM-30080株に導入し、１００μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンに抵抗性を示す形質転換体E. uredovora DSM-30080／pUCYM-1、E. uredovora DSM-30080／pQEDXS-1、E. uredovora DSM-30080／pQEYM-1、E. uredovora DSM-30080／pUC19およびE. uredovora DSM-30080／pQE30を取得した。
【０１５７】
アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、グルコース１％、ビタミンＢ1 １００ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ6 １００ｍｇ／ｌ、ｐ−ハイドロキシ安息香酸５０ｍｇ／ｌ添加したＬＢ培地を１０ｍｌ入れた試験管にこれら形質転換体を植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。
【０１５８】
培養終了後、実施例２（１）と同様の方法により形質転換体によるＣｏＱ８の生産量を算定した。
カロテノイド色素の生産量は、実施例２（１）と同様の方法により得られた２−ブタノール層を分光光度計を用い、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。
結果を第７表に示す。
【０１５９】
【表７】
0004401471.tif 000008
【０１６０】
ＣｏＱ８の生産量およびカロテノイド色素の生産量ともに、コントロール株DSM-30080/pUC19と比較し、DSM-30080/pUCYM-1では有意に高かった。
同様に、ＣｏＱ８の生産量およびカロテノイド色素の生産量ともに、コントロール株DSM-30080/pQE30と比較し、DSM-30080/pQEYM-1およびDSM-30080/pQEDXS-1では有意に高かった。
【０１６１】
実施例６  光合成細菌Rhodobacter sphaeroidesからのイソプレノイド化合物の生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
（１）R．sphaeroidesからのＤＸＳ遺伝子の取得
大腸菌で見出されたDXS遺伝子配列を用いて、他生物種で保存されているDXSホモログをgenbankより検索した。その結果、Haemophilus influenzae(P45205)、Rhodobacter capsulatus(P26242)、Bacillussubtilis(P54523)、Synechocystis sp. PCC6803(P73067)およびMycobacteriun tuberculosis(O07184)等でホモログが見出された。これら配列を比較して、高度に保存されているアミノ酸配列を選択した。保存アミノ酸配列に対応する塩基配列をR. sphaeroidesのコドン使用頻度を考慮にいれて設計し、センスプライマーとして配列番号３２および配列番号３３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、アンチセンスプライマーとして配列番号３４を有するＤＮＡ断片をＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【０１６２】
R．sphaeroides KY4113株（FERM-P4675）の染色体ＤＮＡを鋳型として、上記プライマーと、ExpandTM High-Fidelity PCR System(ベーリンガー・マンハイム社製)を用い、ＤＮＡThermal Cycler(パーキンエルマージャパン社製)でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件で行い、目的とするＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片をDIG DNA Labeling Kit（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてＤＩＧ標識した。
【０１６３】
R. sphaeroidesのＤＸＳ遺伝子全長を取得するため、ＫＹ４１１３株のゲノムライブラリーを作成した。ＫＹ４１１３株をＬＢ培地で一晩培養し、染色体ＤＮＡを抽出した。制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化してショ糖密度勾配超遠心法により４〜６ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩ消化したベクターｐＵＣ１９をLigation Pack(ニッポンジーン社製)を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに塗布し、約１００００個のコロニーを得た。
【０１６４】
上記方法で取得したＤＩＧ標識ＤＮＡ断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法によるスクリーニングをしたところ、２種類のＤＮＡ断片が検出された。各々をシークエンスしたところ、それぞれのＤＮＡ断片から他生物種の既知ＤＸＳ遺伝子と相同性の高いＯＲＦが見出された。配列番号２６に示すアミノ酸配列をＤＸＳ１、配列番号２８に示すアミノ酸配列をＤＸＳ２と命名した。
【０１６５】
（２）大腸菌ＤＸＳ遺伝子欠損株を用いた相補性確認
▲１▼  大腸菌ＤＸＳ遺伝子欠損株の取得
E. coli W3110株（ATCC14948）を、ＬＢ液体培地に植菌し、対数増殖期まで培養した。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得した。
該菌体を、０．０５Ｍトリスーマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が１０9細胞／ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。
【０１６６】
該懸濁液にＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理を行った。
得られた変異処理菌体を１−デオキシキシルロース０．１％を含むＭ９最少寒天培地〔モレキュラー・クローニング第二版〕プレートに塗布して培養した。１−デオキシキシルロースは、J. C. S. Perkin Trans I, 2131-2137 (1982)に記載の方法に準じて化学合成した。
【０１６７】
１−デオキシキシルロース０．１％を含むＭ９最少寒天培地上で生育してきたコロニーを、Ｍ９最少寒天培地と１−デオキシキシルロースを０．１％含むＭ９最少寒天培地にレプリカし、１−デオキシキシルロースを０．１％含むＭ９最少寒天培地では生育できるが、Ｍ９最少寒天培地では生育できない、１−デオキシキシルロース要求性を示す株を目的の変異株として選択した。
【０１６８】
該方法で選択され、取得された変異株をＭＥ１株と命名した。
該ＭＥ１株にｐＤＸＳ−１を導入したところ、１−デオキシキシルロース要求性を相補したことから、ＭＥ１株はＤＸＳ遺伝子が欠損した株であると判断した。
【０１６９】
（３）ＤＸＳ１およびＤＸＳ２の相補性試験
ＫＹ４１１３株由来の、配列番号２７からなるＤＸＳ１をコードするＤＮＡ断片、および配列番号２９からなるＤＸＳ２をコードするＤＮＡ断片を各々ベクターｐＵＣ１９のｌａｃプロモーター下流に連結したプラスミドを構築した。
【０１７０】
これら構築したプラスミドをそれぞれＭＥ１株に導入したところ、ＤＸＳ１およびＤＸＳ２いずれもＭＥ１株の１−デオキシキシルロース要求性を相補した。
以上のことから、R. sphaeroidesはピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸から１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸を生成する反応を触媒する活性を有するＤＸＳ１およびＤＸＳ２のＤＸＳ遺伝子を2つ持つことが判明した。
【０１７１】
（４）R.sphaeroides由来メチルエリスリトール要求性相補遺伝子の取得実施例１（２）▲１▼で得られた大腸菌メチルエリスリトール要求性変異株ＭＥ７株を、メチルエリスリトール０．１％含むＬＢ液体培地に植菌して対数増殖期まで培養した後、遠心分離して菌体を回収した。
【０１７２】
該菌体を１０％グリセロールを含む１ｍＭＨＥＰＥＳ水溶液で２回洗浄して培地成分を可能な限り除去した。
該洗浄菌体に、実施例６（１）で作成したR.sphaeroides KY4113株のゲノムライブラリーから抽出したプラスミドを、常法に従い、エレクトロポレーションにより導入した。
【０１７３】
導入後、アンピシリン１００μｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたコロニーを釣菌し、ＬＢ液体培地に植菌して培養し、該培養菌体よりプラスミドを抽出した。
【０１７４】
抽出したプラスミドをＭＥ７株に再導入したところ、メチルエリスリトールを含まない培地でも生育したことから、抽出したプラスミドにR.sphaeroides由来のメチルエリスリトール要求性を相補するＤＮＡ断片が含まれていることを確認した。
本ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した結果、配列番号３１からなる、大腸菌yaeMと相同性の高いアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が見出された。
【０１７５】
実施例７  組換え光合成細菌によるユビキノンー１０（ＣｏＱ１０）の生産
実施例６で取得した配列番号２７からなるＤＮＡ断片ＤＸＳ１および配列番号２９からなるＤＮＡ断片ＤＸＳ２の上流に、KY4113株由来のglnBプロモーターを連結し、広宿主域ベクターpEG400に挿入して作成したプラスミドをpRSDX-1およびpRSDX-2と命名した。また、yaeMとＤＸＳ１をタンデムに連結し、glnBプロモーター下流に連結したプラスミドを構築し、pRSYMDX1と命名した。これらプラスミドを、エレクトロポレーション（Bio-Rad社製）によりR．sphaeroides KY4113株に導入した。
【０１７６】
導入後、１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。
生育してきたコロニーを１００μｇ／ｍｌ濃度のスペクチノマイシンを含むＬＢ培地に植菌して一晩培養後、培養菌体を遠心分離により回収した。
【０１７７】
得られた菌体よりプラスミド抽出（Qiagen社製）し、各々導入したプラスミドを保持していることを確認した。このようにして得られた形質転換体をKY4113/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2、KY4113/pRSYMDX1およびKY4113/pEG400と命名した。
種培地〔グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス１％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ７．２、ＮａＯＨで調整）〕を５ｍｌ入れた試験管に各形質転換体を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養した。
【０１７８】
得られた培養液０．５ｍｌを、ユビキノンー１０生産培地（廃糖蜜４％、グルコース２．７％、コーンスチープリカー４％、硫酸アンモニウム０．８％、リン酸１カリウム０．０５％、リン酸２カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０２５％、硫酸第一鉄・７水和物３ｍｇ／ｌ、チアミン８ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、トレースエレメント１ｍｌ／ｌを含む培地をｐＨ９に調整後、炭酸カルシウム１％を添加してオートクレーブ滅菌したもの）を５ｍｌ入れた試験管に添加し、３０℃で５日間振盪培養した。
培養終了後実施例２（１）のＣｏＱ８の定量法と同様の方法により、形質転換体によるＣｏＱ１０の生産量を算定した。結果を表８に示す。
【０１７９】
【表８】
0004401471.tif 000009
【０１８０】
ＣｏＱ１０生成量は、コントロール株KY4113/pEG400と比較しKY4113/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2およびKY4113/pRSYMDX1では有意に高かった。
【０１８１】
実施例８  yaeM遺伝子がコードする酵素の活性測定
（１）yaeM遺伝子の高発現化
ｙａｅＭ遺伝子を十分発現させるような組換え体プラスミドをＰＣＲ法〔Science，230，1350 (1985)〕を用いて下記方法により構築した。
配列番号２４に示した配列を有するセンスプライマーおよび配列番号２５に示した配列を有するアンチセンスプライマーをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【０１８２】
該センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの５'末端にはそれぞれＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付加させた。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーおよびTaq DNA polymerase（ベーリンガー社製）を用い、DNA Thermal Cycler（パーキンエルマージャパン社製）でＰＣＲを行うことによりｙａｅＭ遺伝子を増幅した。
【０１８３】
ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルと３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件で行った。
増幅されたＤＮＡ断片およびpUC118（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、各々のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。
【０１８４】
これら精製された両断片を混合した後エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡがｙａｅＭ遺伝子であることをＤＮＡ配列を決定することによって確認した。
【０１８５】
該組換え体からプラスミドを抽出し、制限酵素制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｍＨＩ処理ｙａｅＭ遺伝子含有ＤＮＡ断片を取得した。
ｐQE30（QIAGEN社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行いＢａｍＨＩ処理pQE30断片を取得した。
【０１８６】
上記で取得されたＢａｍＨＩ処理ｙａｅＭ遺伝子含有ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ消化pQE30断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、E. Coli JM109株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【０１８７】
上記と同様の方法で、該大腸菌よりプラスミドを単離した。
上記同様、該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpQEDXRと命名した。
【０１８８】
（２） ｙａｅＭ遺伝子産物の活性測定
(i)ｙａｅＭ遺伝子産物の精製
（１）で作成したpQEDXRを常法によりpREP4を有するE. coli M15株(QIAGEN社製)に導入し、アンピシリン200μg/ml、カナマイシン25μg/mlに耐性を示すM15/pREP4+pQEDXR株を得た。
【０１８９】
M15/pREP4+pQEDXR株をアンピシリン２００μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地１００ｍｌ中、３７℃で培養し、６６０ｎｍの濁度が０．８に達した時点でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．２ｍＭになるように添加した。さらに３７℃で５時間培養した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）によって培養上清を除いた。この菌体を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）６ｍｌに懸濁し、超音波破砕機(SONIFIER,BRANSON社製)を用いて氷冷しつつ破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）にかけ、上清を回収した。この細胞抽出液遠心上清をNi-NTAレジンカラム(QIAGEN社製)に通し、２０ｍｌの洗浄緩衝液〔１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭイミダゾール、０．５％ Tween２０〕で洗浄した。ついで溶出緩衝液〔１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、２００ｍＭイミダゾール〕１０ｍｌを通塔し、溶出液を１ｍｌづつ分画した。
各分画について蛋白量を測定（ＢｉｏＲａｄ社の蛋白量定量キット使用)し、蛋白質を含む画分を精製蛋白画分とした。
【０１９０】
(ii) 基質１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸の調製
反応基質である１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸は以下のようにして調製した。１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸の検出は、ＨＰＬＣ〔カラム：Senshu pak NH2-1251-N(4.6 x 250mm、Senshu社製)、移動層：１００ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ３．５）〕によって１９５ｎｍの吸光度を測定する方法で行った。
【０１９１】
大腸菌のｄｘｓ遺伝子を高発現するプラスミドpQDXS-1を上記と同様にE.coli M15/pREP4株に導入し、M15/pREP4+pQDXS-1株を得た。該株を実施例８（２）(i)と同様に培養し、Ni-NTAレジンカラムを用いてｄｘｓ酵素蛋白質を精製した。
【０１９２】
該精製ｄｘｓ蛋白質を２０ｍｌの反応液〔１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、３０ｍＭＤＬ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、１．５ｍＭチアミンピロリン酸、１０ｍＭＭｇＣｌ2、１ｍＭＤＬ−ジチオスレイトール〕に加え３７℃で保温した。
【０１９３】
１２時間反応した後、反応液を水で３００ｍｌに希釈し、活性炭カラム（２．２ｘ８ｃｍ）を通した後、Dowex 1-X8（Ｃｌ−型、３．５ｘ２５ｃｍ）に通塔し、１％食塩水で溶出した。溶出画分を濃縮後、Sephadex G-10（１．８ｘ１００ｃｍ）に通塔し、水で溶出した。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸含有画分を凍結乾燥し、約５０ｍｇの白色粉末を得た。
該粉末が１−デオキシ-D-キシルロース5-リン酸であることをＮＭＲ分析(A-500、日本電子社製)で確認した。
【０１９４】
(iii) yaeM遺伝子産物の酵素活性測定
１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨと実施例８（２）(i)で得たｙａｅＭ遺伝子産物を含む反応液１ｍｌに、上記のように合成した１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸０．３ｍＭ（終濃度）を加え、３７℃でインキュベートした。インキュベート中のＮＡＤＰＨの増減を３４０ｎｍの吸光を分光光度計(UV-160、島津社製)で測定する方法で追跡したところ、経時的にＮＡＤＰＨが減少することが分かった。
【０１９５】
上記反応産物の構造を確認するため、以下のようにスケールを大きくして反応を行い、産物を単離した。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の濃度を０．１５ｍＭとした以外は上記と同じ組成の反応液２００ｍｌを、同様に３７℃で３０分間インキュベートした後、その全量を活性炭カラムに通し、通過液を水で１Ｌに希釈した後、Dowex 1-X8（Cl-型、３．５ｘ２０ｃｍ）カラムに通塔した。
【０１９６】
１％食塩水４００ｍｌで溶出し、Sephadex G-10（１．８ｘ１００ｃｍ）に通塔し、水で溶出した。溶出画分を凍結乾燥することで、反応産物を単離した。
ＨＲ−ＦＡＢＭＳ解析から単離された反応産物の分子式はＣ5Ｈ12Ｏ7Ｐ［ｍ／ｚ２１５．０２７６（Ｍ−Ｈ）-、△−４．５ｍｍｕ］と推定された。1Ｈおよび13ＣＮＭＲ解析から、以下のケミカルシフトが得られた。
【０１９７】
1H NMR(D2O, 500 MHz):δ4.03(ddd, J=11.5, 6.5, 2.5 Hz, 1H), 3.84(ddd, J=11.5, 8.0, 6.5 Hz, 1H), 3.78(dd, J=80, 2.5 Hz, 1H), 3.60(d, J=12.0 Hz, 1H), 3.50(d, J=12.0 Hz, 1H), 1.15(s, 3H); 13C NMR(D2O, 125 MHz):δ75.1(C-2), 74.8(C-3), 67.4(C-1), 65.9(C-4), 19.4(2-Me)
この反応産物をアルカリ性ホスファターゼ(宝酒造社製)で処理して得られる化合物を1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲ解析して得られるケミカルシフトは、Tetrahedron Letter,38, 6184 (1997)に記載の方法で合成した２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールのＮＭＲ解析で得られるケミカルシフトと完全に一致した。
【０１９８】
さらに前者の旋光度は［α］D21=＋６．０（ｃ=０．０５０，Ｈ2Ｏ）で、報告されている〔Tetrahedron Letter, 38, 6184 (1997)〕２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの旋光度［α］D25=＋７．０（ｃ=０．１３，Ｈ2Ｏ）と一致した。
【０１９９】
これらの結果から、ｙａｅＭ遺伝子産物の反応産物は２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸であることが明らかになった。即ち、ｙａｅＭ遺伝子産物はＮＡＤＰＨの消費を伴いながら１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる活性を有することが判明した。この触媒活性に基づき、本酵素を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼと命名した。
【０２００】
(iv) １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼの性質
実施例８（２）(iii)に記した１ｍｌ反応系を用いて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼの酵素学的性質を調べた。なお１ｕとは１分間に１ｍｍｏｌのＮＡＤＰＨを酸化する活性と定義する。ＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに置換した場合、活性は１／１００以下に低下した。
【０２０１】
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の代りに１−デオキシ−Ｄ−キシルロースを用いると全く反応は起らなかった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析から、本酵素は４２ｋＤａポリペプチドから構成されていることが分かった。
反応系への金属添加効果を第9表に示した。
【０２０２】
【表９】
0004401471.tif 000010
【０２０３】
ＭｎＣｌ2存在下での１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸、ＮＡＤＰＨへのＫｍは、それぞれ２４９μＭ、７．４μＭだった。
反応温度の影響を図１に、反応ｐＨの影響を図２に示した。
【０２０４】
実施例９  ｙａｅＭ欠損変異株の作成と性質
（１）ｙａｅＭ欠損変異株の作成
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼが細胞の生育に必須か否かを調べるため、以下のようにしてその欠損変異株を作成した。
ｙａｅＭ遺伝子中に挿入するためのカナマイシン耐性遺伝子カセットを以下のようにして作成した。
【０２０５】
実施例１（２）▲２▼で得たプラスミドｐＭＥＷ４１を制限酵素ＢａｌＩで消化後アガロースゲル電気泳動し、ＢａｉＩＩ処理ＤＮＡ断片を取得した。
Ｔｎ５を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｍＩで消化した後、DNA blunting kit（宝酒造社製）を用いて断片の末端を平滑化した。
得られた平滑化ＤＮＡ断片を先に作成したＢａｉＩＩ処理ｐＭＥＷ４１ＤＮＡ断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【０２０６】
該組換え体ＤＮＡを用い、E. coli JM109株（宝酒造より購入）を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌとカナマイシン１５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン１００μｇ／ｍｌとカナマイシン１５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
【０２０７】
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpMEW41Kmと名づけた。
pMEW41Kmを用いて、相同組換えによる染色体上のyaeM遺伝子の破壊を行った。組換えの模式図を図３に示した。
【０２０８】
pMEW41Kmを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い直鎖状の断片を精製した。この断片を用いて常法に従って、大腸菌FS1576株を形質転換した。FS1576株は国立遺伝学研究所よりME9019株の名で入手可能である。該形質転換体をカナマイシン１５μｇ／ｍｌと２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール１ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【０２０９】
生育してきたカナマイシン耐性コロニー数個について、カナマイシン１５μｇ／ｍｌと２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール１ｇ／ｌを含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従って染色体ＤＮＡを単離した。
【０２１０】
染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩまたはＰｓｔＩで消化した。またFS1576株の染色体についても同様に処理した。常法に従って、これら制限酵素処理ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後、カナマイシン耐性遺伝子およびｙａｅＭ遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析に供した。その結果、カナマイシン耐性コロニーの染色体は図３に示した構造をとっており、目的どおりｙａｅＭ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子で分断破壊されていることが確かめられた。
【０２１１】
（２）  ｙａｅＭ欠損変異株の性質
上記の手順で作成されたｙａｅＭ欠損株およびその親株であるＦＳ１５７６株を、ＬＢ寒天培地および２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール１ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で培養した。２日後の生育度合いを第１０表に示した。
【０２１２】
【表１０】
0004401471.tif 000011
【０２１３】
ｙａｅＭ欠損変異株は２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールを添加しない培地では生育できないため、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール非存在下では本遺伝子が細胞の生育に必須であることが明白となった。
【０２１４】
実施例１０  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ阻害剤が菌の生育に及ぼす効果
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ反応の産物である２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸やこの酵素反応で想定される反応中間体とフォスミドマイシンは構造的に似ているため、フォスミドマイシンが該酵素を阻害する可能性があるとの推定の基に以下の実験をおこなった。
【０２１５】
実施例８に示した１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ活性測定系にフォスミドマイシンを添加し、酵素活性への影響を調べた。
フォスミドマイシンは〔Chem. Pharm. Bull., 30, 111-118 (1982)〕に記載の方法に従って合成した。
【０２１６】
実施例８（２）(iii)に示した反応系を０．２ｍｌにスケールダウンした系（各濃度は同じ）に各種濃度のフォスミドマイシンを添加し、３７℃でインキュベートし、ＮＡＤＰＨの増減をベンチマークマイクロプレートリーダー（バイオラド社製）を用いて測定した。
【０２１７】
図４に示したように、フォスミドマイシンは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼを阻害することが判った。
大腸菌W3110株をＬＢ寒天培地、フォスミドマイシンを３．１３ｍｇ／ｌ含むＬＢ寒天培地およびフォスミドマイシン３．１３ｍｇ／ｌと２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール０．２５ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地にそれぞれ塗布し、３７℃で培養した。
【０２１８】
培養２日後において、ＬＢ寒天培地、フォスミドマイシンおよび２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール０．２５ｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地上の２種類の培地では菌は生育することができたが、フォスミドマイシンだけを添加したＬＢ寒天培地では菌は生育することができなかった。
【０２１９】
これらの結果から、フォスミドマイシンが１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼを阻害することによって菌の生育を阻害することが明白となった。  以上のことから、ｙａｅＭ（１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ）の活性を阻害する物質は有効な抗菌剤あるいは除草剤となり得る。
【０２２０】
【発明の効果】
本発明によれば、心疾患、骨粗鬆症、止血、がん予防、免疫賦活等を目的とした医薬品、健康食品および貝類付着防止塗料等に有用なイソプレノイド化合物の生合成に関与するＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを原核生物由来の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中にイソプレノイド化合物を生成蓄積させ、該培養物からイソプレノイド化合物を採取することを特徴とする、イソプレノイド化合物の製造方法、イソプレノイド化合物の生合成効率を向上させることのできる活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを１つ以上含むＤＮＡをベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の製造方法、および該蛋白質、ならびに１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸を生じる反応を触媒する活性を有する新規な酵素蛋白質および該酵素を阻害する物質を探索することによる、抗菌およびまたは除草活性を有する化合物の探索方法を提供することができる。
【０２２１】
【配列表】
0004401471.tif 000012
0004401471.tif 000013
0004401471.tif 000014
0004401471.tif 000015
0004401471.tif 000016
0004401471.tif 000017
0004401471.tif 000018
0004401471.tif 000019
0004401471.tif 000020
0004401471.tif 000021
0004401471.tif 000022
0004401471.tif 000023
0004401471.tif 000024
0004401471.tif 000025
0004401471.tif 000026
0004401471.tif 000027
0004401471.tif 000028
0004401471.tif 000029
0004401471.tif 000030
0004401471.tif 000031
0004401471.tif 000032
0004401471.tif 000033
0004401471.tif 000034
0004401471.tif 000035
0004401471.tif 000036
【０２２２】
0004401471.tif 000037
0004401471.tif 000038
0004401471.tif 000039
0004401471.tif 000040
0004401471.tif 000041
0004401471.tif 000042
0004401471.tif 000043
0004401471.tif 000044
0004401471.tif 000045
0004401471.tif 000046
0004401471.tif 000047
0004401471.tif 000048
0004401471.tif 000049
0004401471.tif 000050
0004401471.tif 000051
0004401471.tif 000052
0004401471.tif 000053
0004401471.tif 000054
0004401471.tif 000055
0004401471.tif 000056
0004401471.tif 000057
0004401471.tif 000058
0004401471.tif 000059
0004401471.tif 000060
0004401471.tif 000061
0004401471.tif 000062
0004401471.tif 000063
0004401471.tif 000064
0004401471.tif 000065
0004401471.tif 000066
0004401471.tif 000067
0004401471.tif 000068
【０２２３】
0004401471.tif 000069
0004401471.tif 000070
0004401471.tif 000071
0004401471.tif 000072
0004401471.tif 000073
0004401471.tif 000074
0004401471.tif 000075
0004401471.tif 000076
0004401471.tif 000077
0004401471.tif 000078
0004401471.tif 000079
0004401471.tif 000080
0004401471.tif 000081
0004401471.tif 000082
0004401471.tif 000083
0004401471.tif 000084
【０２２４】
0004401471.tif 000085
0004401471.tif 000086
0004401471.tif 000087
0004401471.tif 000088
0004401471.tif 000089
0004401471.tif 000090
0004401471.tif 000091
0004401471.tif 000092
0004401471.tif 000093
0004401471.tif 000094
0004401471.tif 000095
0004401471.tif 000096
0004401471.tif 000097
0004401471.tif 000098
【０２２５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＤＮＡ
配列番号３４：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼの活性に対する反応温度の影響を示した図である。
【図２】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼの活性に対する反応液ｐＨの影響を示した図である。１００ｍＭトリス塩酸緩衝液中の各ｐＨにおける活性を示した。ｐＨ８．０での活性を１００％として、各ｐＨにおける活性を相対活性として示した。
【図３】相同組換えを利用した染色体上のｙａｅＭ遺伝子破壊方法を示した図である。
【図４】１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ活性に及ぼすフォスミドマイシンの影響を示した図である。
【図１】
0004401471.tif 000099
【図２】
0004401471.tif 000100
【図３】
0004401471.tif 000101
【図４】
0004401471.tif 000102