(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）ゲノムの１個以上または全ての染色体の一部、数箇所または全長にわたって実質的に均等に分布した複数の１個以上の修飾を有する菌株であって、該修飾が、各々、非修飾ゲノムに対して固有の複数の異なるマーカー配列を生じさせる第１の菌株に、前記第１の菌株とは異なる目的の表現型を有する第２の菌株を交配するステップと；
（ｂ）目的の前記表現型を有する（ａ）の交配の分離体を選択するステップと；
（ｃ）（ｂ）の分離体からＤＮＡを単離するステップと；
（ｄ）単離したＤＮＡを任意によりプールするステップと；
（ｅ）前記ＤＮＡ中に存在する少なくとも１個のマーカー配列の存在を検出するステップと；
（ｆ）前記少なくとも１個のマーカー配列の欠損に基づき目的の前記表現型に応答可能な１以上の遺伝子をマッピングするステップと
を含む、遺伝子マッピングのための方法。
【請求項２】
マーカー配列の検出がハイブリダイゼーションにより行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マーカー配列の検出がポリメーラーゼ連鎖反応により行なわれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法を用いて遺伝子をマッピングするための菌株の使用であって、前記菌株が、生存性があり有性生殖可能であり、ゲノムの１個以上または全ての染色体の一部、数箇所または全長にわたって実質的に均等に分布した複数の１種以上の部位指向的修飾を有する菌株であって、該修飾が、各々、少なくとも１修飾／１００遺伝子の割合で、非修飾ゲノムに対して固有の複数の異なるマーカー配列を生じさせるものである、使用。
【請求項５】
修飾が遺伝子のいずれかのコード領域の外部、および遺伝子のいずれかの調節部分の外部にある、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
未修飾菌との比較において、修飾が表現型に影響しない、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の株の使用であって、修飾が、以下の１つ以上より選択される欠失または挿入または置換である、使用。
・そのままの欠失または挿入または置換；
・１箇所以上の制限部位によりフランキングされている欠失または挿入または置換；
・１個以上のヌクレオチドタグによる欠失または挿入または置換；
・インバーテッドリピートによりフランキングされている欠失または挿入または置換；
・トランスポゾンのインバーテッドリピートによりフランキングされている欠失または挿入または置換；
・欠失または挿入または置換に隣接するリコンビナーゼに対する認識部位によりフランキングされている配列；
・ゲノム配列により一端または両端がフランキングされた前記欠失または挿入または置換であって、前記ゲノム配列が１つ以上の欠失または挿入または置換を含む；
・天然の移動性遺伝子エレメント、または移動性遺伝子エレメントの切除後のフットプリントである。
【請求項８】
修飾が、相同組み換え、転位、または、無作為組込みとその後の選択により導入される、請求項４〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記菌が相同組み換えを起こしやすい、請求項４〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記菌がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項４〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
以下のステップ：
（ａ）ゲノムが修飾されて、該ゲノムの１個以上または全ての染色体の一部、数箇所または全長にわたって実質的に均等に分布した複数の１個以上の修飾を有する菌であって、該修飾が、各々、非修飾ゲノムに対して固有の複数の異なるマーカー配列を生じさせる菌の株である、第１の菌中に、目的の表現型が得られるまで突然変異を生じさせるステップと；
（ｂ）目的の表現型を有する（ａ）の菌に第２の野生型の株を交配するステップと；
（ｃ）目的の表現型について野生型である、（ｂ）において交配する分離体を選択するステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）の選択された分離体からＤＮＡを単離し、ＤＮＡをプールするステップと；
（ｅ）ステップ（ｄ）のプールされたＤＮＡに存在するマーカー配列の存在を検出するステップと；
（ｆ）前記マーカーが前記突然変異に近接して位置するように、マーカーの非存在により、目的の表現型を引き起こす突然変異の位置をマッピングするステップと
を含む、遺伝子マッピングのための方法。
【請求項１２】
前記株において、生成した突然変異と、この株における前記菌中の非必須遺伝子数との間の割合が少なくとも０．５％である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
菌がサッカロマイセス・セレビシエである請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の菌が、生存性があり有性生殖可能であり、ゲノムの１個以上または全ての染色体の一部、数箇所または全長にわたって実質的に均等に分布した複数の１種以上の部位指向的修飾を有する菌株であって、該修飾が、各々、少なくとも１修飾／１００遺伝子の割合で、非修飾ゲノムに対して固有の複数の異なるマーカー配列を生じさせるものである株における遺伝子の突然変異、不活性化または欠失により得られる、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
マッピングされた遺伝子を単離し、精製するステップをさらに含む、請求項１〜３、１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有性生殖可能な真核生物の遺伝子のマッピングのための新規方法を記載する。本発明はゲノムのサイレントな領域における均一に分布した固有のマーカー配列のセットを含む修飾された株に目的の表現型を有する株を交配させることを利用することにより、他のマッピング方法とは異なる。本発明はまた、これらの操作された株の発生、遺伝子マッピングにおけるこれらの株の使用、および、固有のマーカー配列を検出するための方法および材料を記載する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子マッピングは表現型の特徴に関与する遺伝子を同定するための手段として有性生殖を行う真核生物において一般的に用いられている（Ｄｅａｒ  Ｐ．Ｈ．Ｅｄ．，１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ  ｍａｐｐｉｎｇ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。多数の遺伝子マッピング技術が存在する。本質的に全ての技術が、位置の解かっているマーカーを用いた連結の分析に基づくゲノム内のいずれかの場所における特異的な表現型特性に関与する遺伝子決定因子の位置を調べることを目標としている。厳密な位置が不明であるが表現型特性そのものよりも遥かに容易に追跡できるマーカーを用いた連結が、育種実験においてしばしば用いられている。遺伝子マッピングはヒトの疾患に関与する遺伝子を同定するために医療生物学において広範に使用されている（Ｏｔｔ  Ｊ．，１９９１，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ，Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）。農学的研究においては、これは生産性または性能にとって直接または間接的に重要である種々の特性に関与する、家畜化された動物および作物植物における遺伝子を同定するために使用されている（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ａ．Ｈ．，Ｅｄ．，１９９８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）。これはコウボであるサッカロマイセス・セレビシエのような真核生物の微生物においても同様の目的で使用されている（Ｓｐｅｎｃｅｒ等，１９８３，Ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ａｓｐｅｃｔｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。遺伝子マッピングは生物学的研究、特にサッカロマイセス・セレビシエ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｊ．Ｒ．，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ）、スキゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｃｏｘ  Ｂ．Ｓ．１９９５，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、アラビドプシス・サリアナ（ｔｈａｌｅ  ｃｒｅｓｓ）（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｚ．Ａ，２０００，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  Ｒ．Ｊ．，１９９７，Ｆｌｙ  ｐｕｓｈｉｎｇ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、線虫であるカエノルハブジフィス・エレガンス（Ｒｉｄｄｌｅ  Ｄ．Ｌ．等，Ｅｄｓ．，１９９７，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＩＩ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ミノカサゴ（ブラキダニオ・レリオ）（Ｄｅｔｒｉｃｈ  Ｈ．Ｗ．ＩＩＩ，Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｚｏｎ  Ｌ．Ｉ．，Ｅｄｓ，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）およびマウス（ムス・ムスクルス）（Ｌｙｏｎ  Ｍ．Ｆ．等，Ｅｄｓ．１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｏｕｓｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）のようなモデル生物において、表現型に関与する遺伝子のゲノム中の位置に表現型を相関づけるために、頻繁に使用されている。モデル生物は大部分が遺伝子実験、例えば遺伝子マッピングが容易に行なえることに基づいて選択されている。
【０００３】
遺伝子マッピングにおいては、種々の遺伝子マーカーが使用される。遺伝子マーカーの重要な特徴はそれを評価することが容易な点である。より少ない実験でより多くのマーカーを評価できるほど良い。全ての既存の遺伝子マッピング技術は特異的表現型特性をもたらす突然変異、または、天然のＤＮＡ配列の変異を利用している。容易に評価できる突然変異、例えば栄養素要求性または耐性の突然変異は、それらがその検出のために最も少ない実験的努力しか必要としないことから、非常に好まれている（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  Ｒ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｄ  Ｄ．１９８１，Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．，Ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ
ａｎｄ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｓｔｒａｔｈｅｍ  Ｊ．Ｎ．，Ｊｏｎｅｓ  Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｂｒｏａｃｈ  Ｊ．Ｒ．，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１１−２６）。栄養要求性、耐性、および特異的な表現型を生じる他の突然変異の重要な難点は、マーカー突然変異により生じた突然変異表現型が目的の表現型を妨害する点である。例えば、コウボにおける栄養要求性の突然変異は、栄養要求性である菌株のために栄養を培地に補給した場合においてもなお、生育速度を妨害する。多くのマーカー突然変異が遺伝子マッピングに必要とされているため、単一の株における表現型に影響する複数の突然変異の蓄積は容易に、その株の他の特性の多く、とりわけ、生育や収穫量のような商業的重要性に対する意図しない副作用を発生させる。従って、このような理由のため、表現型に影響するマーカー突然変異の使用は遺伝子マッピングにおいて望ましくない。天然のＤＮＡ配列の変異を用いる方法には、制限フラグメント長の多型（ＲＦＬＰ）の検出、多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）、増幅フラグメント長の多型（ＡＦＬＰ）、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライトリピート配列、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による染色体へのクローンのマッピングが包含される（Ｂｕｒｏｗ  Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂｌａｋｅ  Ｔ．Ｋ．，１９９８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ａ．Ｈ．Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．１３−２９；Ｍｏｎｔａｇｕｔｅｌｌｉ  Ｘ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｏｇｇｅｓｓ  Ｄ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．１５−３３；Ｋａｒｐ  Ａ．ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｋ．Ｊ．，Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ  Ｇ．，Ｇｒｅｓｓｈｏｆｆ  Ｐ．Ｍ．Ｅｄｓ．，１９９７，ＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｖｉｅｗｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１３）。現在まで、人工的ＤＮＡ配列、人工的ＤＮＡ配列と隣接ＤＮＡ配列の一部の組み合わせ、または、人工的に導入された天然の配列と隣接ＤＮＡ配列の組み合わせが遺伝子マーカーとして使用されている。全ての遺伝子マッピングは生物の天然の単離株または培養された菌株中に存在するＤＮＡ配列の変異を利用している。大部分において、導入された突然変異を利用しており、その理由はそれらが特異的で通常は容易に追跡できる表現型を与えるためである。
【０００４】
遺伝子マッピングの大部分の開発は遺伝子マーカーの原料としての生物の間にあるＤＮＡ配列の天然の分子の変異の利用である（Ｂｉｒｒｅｎ等，１９９９，Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｖｏｌ．４，Ｍａｐｐｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）。ＤＮＡ多型はそれらが表現型特性よりも遥かに容易に評価できるという利点を有する。これは多遺伝子性の特徴をマッピ
ングするために特に重要であるが、その理由は関与する作業がより大きく、表現型の決定への寄与が種々の遺伝子に渡って分岐しており、各遺伝子は表現型に対して僅かな作用しかもたらさず、これは表現型マーカー突然変異によりおこる表現型副作用によってさらに容易に影響を受け、伏在化してしまう。分子マーカーに関しては、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）がその広範な存在のため重要な例となっている。実際、無関連の２つの株を交配すると、ＳＮＰは数千もの遺伝子マーカーをもたらす。最近、無関連の起源の２つの株の間のアレル変異をコウボにおいて使用し、表現型特性をマッピングするためのゲノムワイドの遺伝子マーカーが得られている。この場合、ＳＮＰは３７１４個の有用な遺伝子マーカーを与えている（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  Ｅ．Ａ．等，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，１１９４−１１９７）。この高い密度にも関らず、２つのマーカーの間の最大ギャップはなお５９Ｋｂであった。明らかに、より緊密に関連する株においては、ギャップはより大きくなると考えられる。このアレル変異結合マッピング法は完全なコウボのゲノム配列、および、本来は遺伝子発現目的のために構築された全コウボ遺伝子の短い部分に相補的なオリゴヌクレオチドを用いたマイクロアレイが入手できたために可能となったたものである。マッピング目的のために数千の天然のＳＮＰを使用することは、遺伝子研究分野における高い関心と研究意欲を「ＳＮＰマッピング」に向けさせた。さらにまた、特にゲノムにおける厳密に指定された位置に人工ＤＮＡ配列を導入することは大部分の真核生物において困難である。コウボにおいてのみこれは比較的容易である。しかしながら、完全にゲノムをカバーするために必要なマーカーの数が多いため、単一の株に全てのマーカーを導入することはなお膨大な作業となる。たとえマーカーをパラレルな操作法で種々の株に同時に導入するとしても、株同士が相互に交配して全てのマーカーを単一の株に蓄積しなければならない。マーカーは常時、親株の間での交配において分離しているため、これもまた極めて労働集約的な作業である。さらにまた、好都合な有性生殖周期および短い発生時間を有する生物を必要とする。これらが恐らくはこれまで誰も遺伝子マッピング目的のために人工マーカーの使用を考えたことがない理由であり、そして特に、多数の遺伝子マーカーでゲノムを完全にカバーしようと誰も考えなかった理由である。現在まで、全ての遺伝子マッピングは天然の配列の変異を用いるか、特異的な表現型を与える突然変異を用いて行なわれている。後者の場合は、容易にスクリーニングできる表現型、例えば栄養要求性、抗生物質耐性または温度感受性の突然変異が使用されている。ある程度までゲノムをカバーするこのような突然変異の多くを有する株の収集が行なわれており、低分離のマッピングのために用いられている。例えば、コウボであるサッカロマイセス・セレビシエにおいては、ゲノム全体に渡り約５０ｃＭの間隔をおいた合計６６個のマーカーを有する９種類の株の収集物が使用できる（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  Ｒ．Ｋ．，Ｓｃｈｉｌｄ  Ｄ．，１９８１，Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏ���ｙｃｅｓ．，Ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  Ｊ．Ｎ．，Ｊｏｎｅｓ  Ｅ．Ｗ．，Ｂｒｏａｃｈ  Ｊ．Ｒ．，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１１−２６）。このような株をマッピングのために使用することは、９種の株で交配が起こるはずであり、そしてそれらが起こす特異的表現型を用いて全ての突然変異を評価しなければならないため、極めて労働集約的なものである。株はまた同系ではない。
【０００５】
遺伝子マップの構築にはＤＮＡ配列の相違が必要であるため、天然の遺伝子変異に基づく全てのマッピングの主要な難点は、それらが無関連または非同系の株の使用を必要とする点である。その結果、全てのこのような方法において、遺伝子マップは生物の表現型から独立したものではない。この問題点は、ハワイ島の特殊な単離株が均一に高い密度でＤＮＡ多型を示していたため、これをマッピングに用いたＣ・エレガンスを例として説明することができる（Ｗｉｃｋｓ  Ｓ．Ｒ．等，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
２８，１６０−１６４）。約６２００のＤＮＡ多型が同定され、うち４６７０は１塩基対置換であり、１５５２は小さい欠失と挿入であった。しかしながら、４００を超える挿
入と２塩基対以上の欠失もあった。このような大量のＤＮＡ配列変異が多くの表現型に影響することは自明である。この報告ではまた、ハワイ株の遺伝子的バックグラウンドの作用が幾つかの重要な表現型に関して既に観察されている。この問題を解決するために、標的突然変異の領域内にハワイ株からＤＮＡの大型連続導管を用いて近交系の雑種株の収集物を開発することが示唆されている。これは突然変異のマッピングのための大規模な追加の作業を含み、そして、目的の表現型に対するバックグラウンドの影響を完全に排除できる保証はないことは明らかである。この問題は、種々の突然変異が表現型の確立に寄与し、ＳＮＰおよびより大きいＤＮＡ多型から生じるバックグラウンドの影響が適切な遺伝子分析を容易に不可能としてしまう複遺伝子性の表現型の遺伝子分析には特に重要である。バックグラウンドにおける数千のＳＮＰの存在はまた表現型に関与する突然変異の同定を複雑化する。強調すべき点は、遺伝子マッピングは科学的研究においてはもはや最終目標ではなく、それは目的の表現型に関与する遺伝子の同定のための中間段階に過ぎないことである。株のバックグラウンドが表現型の決定とは無関係の数千の突然変異を含む場合、これは関連の突然変異の最終同定を複雑化する。これが複遺伝子性の特性にとって、そしてとりわけ表現型を起こす突然変異が相互に依存している場合の複遺伝子性の特性にとっては最も問題となる。複遺伝子性特性の遺伝子分析は全ての既存の遺伝子マッピング法を用いても極めて面倒である。
【０００６】
生物の種々の天然の単離株、特に普通でない生育環境からのものは、しばしば、特殊な表現型特性を示す。これらの特性に関与する突然変異または新遺伝子がマッピングされ、同定される場合、その株を、十分な数の分子マーカーが異なる無関連の株と交配しなければならない。これらのマーカーは遺伝子マップの構築のために使用される。単離された各々の新規株に対し、分子マーカーは、それらが新規株およびマッピングする株において異なっているかどうかを決定するために再度確認することが必要になる。その結果、調べるべき各々の新規株につき遺伝子マップを再度確立しなければならない。
【０００７】
人工ＤＮＡ配列はマッピング技術においては遺伝子マーカーとしてこれまで使用されていない。しかしながら、それらは他の用途においてタグとして使用されている。多くの例が挙げられる。良く知られている用途はタグ付き突然変異誘発であり、これについては広範な種類の転位可能なエレメント、例えば特別に操作されたトランスポゾンが使用される（Ｇａｒｎｆｉｎｋｅｌ  Ｄ．Ｊ．等，１９９８．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２６，Ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｒｏｗｎ  Ａ．Ｊ．Ｐ．，Ｔｕｉｔｅ  Ｍ．Ｆ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ．１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３，４９−８２）。この場合、オープンリーディングフレーム内に、または、少なくともオープンリーディングフレームの発現に影響するＤＮＡ配列（プロモーター、ターミネーター）の部分内に優先的に導入することを目的として転位可能なエレメントを用いて株を形質転換する。トランスポゾンはトランスポゾンに隣接するＤＮＡの配列の分析によりゲノム内の突然変異の位置を同定するためのタグとして機能する。或いは、Ｔ−ＤＮＡタグは細菌であるアグロバクテリウムを利用して幾つかの遺伝子形質転換方法の１つによりゲノム内に導入して良い。第２の例は独特で短いオリゴヌクレオチド、「シグネチャー」と称されるものの使用に関するものであり、これは株にランダムに挿入される。得られる「シグネチャータグつき突然変異体」を選択操作に付し、その後、シグネチャータグを用いて隣接ＤＮＡの配列分析によりゲノム内のタグの挿入位置を迅速に同定できる（Ｈｅｎｓｅｌ  Ｍ．，１９９８，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９，６０８−６１２）。第３の例は各株において異なるオープンリーディングフレームが完全に欠失しているコウボであるサッカロマイセス・セレビシエの欠失突然変異株の包括的収集を用いる。各株は特異的なタグを欠失遺伝子に隣接して含む。特定の表現型において影響を受けている突然変異体を増加させるために欠失突然変異体の全収集物を選択条件下に生育させる実験において、配列分析により選択された株で欠失して
いる遺伝子を同定するためにタグを後に用いる（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ＤＤ，Ｌａｓｈｋａｒｉ  ＤＡ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｄ，Ｍｉｔｔｍａｎｎ  Ｍ，Ｄａｖｉｓ  ＲＷ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４，４５０−４５６）。
【０００８】
特定の表現型に関連した分子マーカーの同定を容易にするために、種々の表現型または同じ表現型の両極端（定量的特徴の遺伝子座の場合）を呈する分離体のＤＮＡプール物が使用されている。この方法は「バルク分離体分析」（ＢＳＡ）と称されている。これは多数の分子マーカーの決定に関る作業を大きく低減する。現在まで、この方法は主に目的となる特定の表現型、遺伝子または遺伝子領域に関連した分子マーカーの同定のために用いられている（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ  Ｊ．Ｊ．等，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．１９，６５５３−６５５８；Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ  Ｒ．Ｗ．等，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，９８２８−９８３２）。これはまた分子マーカーの検出を複数回行なってゲノムの特定の領域における突然変異をマッピングするために使用されている（Ｋｏｒｓｗａｇｅｎ  Ｈ．Ｃ．等，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１４６８０−１４６８５；Ｗｉｃｋｓ  Ｓ．Ｒ．等，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２８，１６０−１６４）。バルク分離体分析は人工マーカーを用いては実施されておらず、また高い分離度で全ゲノムをカバーする全てのマーカーの同時検出を可能にする方法を用いては実施されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
微生物、例えばコウボにおける突然変異遺伝子を同定するためには、ゲノムライブラリとの相補性を用いる場合が多い（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｊ．Ｒ．１９８８，Ｙｅａｓｔ，Ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｉ，Ｄｕｆｆｕｓ  Ｊ．Ｈ．Ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０７−１２３）。この目的のために、生物のゲノムＤＮＡをまず制限酵素でフラグメント化する。その後、フラグメントをベクター（通常は特定のサイズ範囲で選択した後）に挿入し、得られたプラスミドを、レシピエント生物、通常は各細胞が１種のみプラスミドを含む大腸菌に形質転換する。ライブラリをレシピエント細胞、例えば大腸菌形質転換体の混合物として増殖させる。この操作法は幾つかの難点を有する。第１に、ライブラリを構築する際にその完全性が保証されていない。可能な限り完全な遺伝子ライブラリを作成するためには、ゲノムをカバーするために必要な理論的な量よりも多くの形質転換体をライブラリ調整の間に得なければならない。第２に、ライブラリの増殖により、プラスミドが無作為に消失するため、ライブラリの劣化が避けられない。第３に、ライブラリを用いる場合、形質転換体中のゲノムを統計学的に完全にカバーするためには多数の形質転換体を発生させなければならない。第４に、多数の形質転換体を得たとしても、ゲノムが完全にカバーされているかどうかは明確でなく、確認することもできない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は生物の表現型とは完全に独立したマーカーを使用する遺伝子マッピング方法を提供する。これは突然変異の単離とその後のマッピングのために同系の株を使用可能とする。マーカーはゲノム全体に渡り均一間隔で存在しなければならず、そして、その数は如何なる遺伝子の連結も検出するのに十分であり、不必要な情報の収集を回避するために必要な量を超えてはならない。マーカーは簡素な実験と同時に検出されなければならない。本発明の１つの局面において、マーカーとしての人為的に作成された、または人工のオリゴヌクレオチドが、１回の交配で高分解能の遺伝子マッピングを可能とし、そして全ゲノムをカバーするマーカーの急速な評価を可能とする。
【００１１】
人工マーカーは、好ましくは生物の新規天然の単離株中には存在しない。本発明はまた
、人工マーカーの１つ以上が偶然により新規株内のＤＮＡ配列同一である場合もその範囲に含める。このことは新規株のＤＮＡを用いて確認することができ、人工マーカーの密度が高い場合は、マーカーの１つまたは数個の損失であっても高分解能のマッピングを妨げない。
【００１２】
本発明は修飾された非ヒト真核生物に関する。該生物は人為的な介入により操作され、これにより生物のＤＮＡ配列は修飾の１種以上が複数起こることにより変化する。これらの修飾は、好ましくはゲノムの染色体の１個以上または全体の一部分、数箇所または全長に渡り実質的に等しく分布している。
【００１３】
本発明は修飾が好ましくは例えば遺伝子のコード領域および調節部分の外部のゲノムのサイレントな領域内に導入される修飾された生物に関する。より好ましくは、修飾はコーディングおよび／または調節領域の８０％より外部で起こる。さらに好ましくは、修飾はコーディングおよび／または調節領域の９０％より外部で起こる。より好ましくは、修飾はコーディングおよび／または調節領域の９５％より外部で起こる。最も好ましくは、修飾はコーディングおよび／または調節領域の９９％より外部で起こる。
【００１４】
人工的に導入されたマーカーにおいてのみ相違する同系の株の使用は、本発明の１つの局面において記載したとおり、上記した異種の株の使用の問題点を完全に克服する。これは突然変異がマッピングされた領域の簡素な配列分析により表現型にかかわる突然変異を同定可能とする。同系の株の使用は、それが目的の表現型に対するバックグラウンド突然変異（ＳＮＰ等）の作用を回避することからも遺伝子マッピングにおいて特に好ましい。特に多遺伝子性の特徴の場合、遺伝子バックグラウンド作用が遺伝子分析を極めて困難なものとする場合があり、しばしば実行不可能となる。同系の株（完全に同型接合または純系統とも称する）は全ゲノムにおいて同じＤＮＡ配列を原則として有している株である。従って、同型の株におけるマーカーの存在は実際は矛盾している。マーカーは常時ＤＮＡ配列の変異に基づいている。本発明において説明すれば、同系の株を用いた遺伝子マッピングの理想的な状況に最も近い可能性は、表現型に影響しないようにゲノム内の中立な位置に挿入された人工ＤＮＡ配列の使用である。本発明によれば「同系」とはより広義に用いており、即ち、サイレント領域は異なるが同じ活性遺伝子配列を有するゲノム配列を含む。
【００１５】
本発明は少なくとも１修飾／１００遺伝子の割合で修飾が起こり得る修飾された生物に関する。
【００１６】
このためには、本発明は、なお生存性があり有性生殖が可能である生物を修飾がもたらすことが好ましい。
【００１７】
本発明は修飾が好ましくはゲノムに渡って実質的に等しく分布し、好ましくは未修飾の生物と比較して表現型を修飾しない、修飾された生物に関する。
【００１８】
本発明は修飾が好ましくは部位特異的位置において起こるか、または、修飾が部位指向的に起こる生物に関する。
【００１９】
マーカーの通常の間隔の局所的偏位の限定的な数量は認容され、そして、遺伝子内で起こるか、またはマッピングされる表現型とは無関係の表現型において僅かな変化を起こす修飾の限定的な数量は許容できるものとする。さらにまた、修飾が例えば染色体の限定的な数量をカバーするのみであるか、または、分布した修飾が染色体の個別の領域に起こるような生物も本発明の範囲に包含されるものとする。
【００２０】
本発明はまた修飾が、挿入、欠失または置換であり、そしてこのような修飾が１種以上の別の修飾、例えば制限酵素認識部位、ヌクレオチドタグ、インバーテッドリピートでフランキングされた配列、例えばトランスポゾン、レトロウィルスの長末端リピートでフランキングされた配列と組み合わせられて生じる事もできるような、操作された生物に関する。修飾はまた、移動性の遺伝子エレメント、例えばトランスポゾン、または、移動性の遺伝子エレメントの切除後に残存するフットプリントであることもできる。
【００２１】
本発明の操作された生物は、相同組み換え、ウィルス感染、無作為組込み、または、アグロバクテリウム媒介形質転換に関る方法により得ることができる。
【００２２】
本発明の操作された生物は移動性が増大または低減した株を用いて移動性の遺伝子エレメントの移動過程を妨害するか、または、天然の条件下ではかけあわせることのできない種の株を交配することにより得ることもできる。
【００２３】
本発明の操作された生物は繊維状のカビを含むカビ、非維管束および維管束植物、無脊椎動物、節足動物、線虫、脊椎動物、哺乳類の分類学的群から選択されるメンバーであることができ、好ましくは、それはこれらの群の研究に用いられているモデル生物の１つ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、スキゾサッカロマイセス・ポンベ、アスペルギルス・ニズランス、ニューロスポラ・エスピー、カエノルハブジフィス・エレガンス、フィスコミトレラ・エスピー、アラビドプシス・サリアナ、オリザ・サティバ、ドロソフィラ・メラノガスター、ブラキダニオ・レリオ、ムス・ムスクルスである。
【００２４】
本発明は最初の例としてコウボであるサッカロマイセス・セレビシエに関するものであるが、方法は有性生殖可能な別の生存性のある真核生物にも適用できる。
【００２５】
本発明の操作された生物は、好ましくは完全に配列決定された、またはそのかなりの部分が配列決定された、または、近い将来に配列決定されることが予測されるゲノムを有する。
【００２６】
本発明の生物のゲノムにおける操作された修飾はゲノム内の人工的なマーカー配列の存在をもたらす。これらのマーカー配列は配列そのものの挿入により、または、導入された配列および隣接ゲノムＤＮＡの近くに位置する配列の架橋によってのみ生成する。
【００２７】
本発明は本発明の修飾された生物に目的の表現型を有する生物を交配し、目的の表現型を有する子孫の分離体を選択することにより遺伝子をマッピングする方法に関する。ＤＮＡは選択された分離体から単離され、単離されたＤＮＡの任意のプールステップの後に、表現型を決定する遺伝子に近い選択された分離体のＤＮＡ中のマーカー１個以上の存在を検出する。有性生殖の間の染色体間の組み換えの概念から理解されるとおり、目的の表現型をもたらす遺伝子の近接部にある所定のマーカー配列が、組み換えにより目的の表現型を有する分離体生物にマーカー株から移行する機会は、マーカー配列と目的の遺伝子の間の距離が近いほど減少する。従って、人工的に導入されたマーカー配列を用いた新規マッピング方法はＡＭＴＥＭ（登録商標）（人工マーカー追跡痕除外マッピング）と称する。
【００２８】
本発明はまたゲノムの一部のみを個別にカバーするが、同時に種の全ゲノムをカバーする人工マーカーを担持した操作された株の収集物に関する。本発明はマイクロアレイの場合のようにマトリックスに結合したオリゴヌクレオチドに目的の表現型を有する分離体のＤＮＡをハイブリダイズすることによりマーカーが検出される方法に関する。
【００２９】
上記したオリゴヌクレオチドは最終的には修飾で用いられるオリゴヌクレオチドよりも長いものであることができるが、より短くても良い。この長さの相違は例えば旨適ハイブ
リダイゼーションのために重要である場合がある。
【００３０】
或いは、マーカーの検出は、いわゆるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を含むポリメラーゼ連鎖反応において、そして好ましくは幾つかのマーカーに対するプライマー対を同時に含む重複反応において用いられるプライマーセットを用いて行なうことができる。
【００３１】
修飾された生物は１回の交配で遺伝子のマッピングを行うことができる。単一の遺伝子内の突然変異により、または、表現型を観察するために同時に必要となる幾つかの遺伝子内の突然変異により起こる表現型をマッピングできる。さらにまた、修飾された生物はゲノムの領域の欠失により生じる表現型をマッピングするために使用できる。さらにまた、各々の突然変異が修飾された生物は表現型を個別に与えることができる多くの突然変異により起こる表現型をマッピングするために使用することができる。
【００３２】
コウボに適用する本発明は、ビール醸造、ベーカリー、ワイン醸造のような産業において、そして、他のアルコール飲料の製造において、そして、アルコールの製造において、またさらに異種蛋白の発現のため、小型分子の製造または修飾のための道具としてコウボを用いる産業において、そして、薬剤のスクリーニングおよび他の医薬品用途のためにコウボを用いる産業において、適用される。
【００３３】
本発明はまた、株を最大限に突然変異性とするマーカー配列を有する株に関する。これにより多くの異なる表現型が発生できる。本発明のマッピング技術は目的の特定の表現型の発生に関る全ての突然変異した遺伝子のゲノム位置の同定を可能にする。
【００３４】
本発明はまた、修飾された生物に由来するＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントの使用に関する。本発明の特定の局面は修飾が希少な制限部位によりフランキングされている修飾された生物に関する。これにより、ゲノムライブラリの構築が可能となり、そのライブラリの各クローンは導入されたマーカーの１つおよび隣接する２マーカー間にゲノムＤＮＡを有する。
【００３５】
本発明はさらに、本発明の方法を用いて同定される遺伝子を単離して精製するため、該単離精製された遺伝子を有するベクターを発生させるため、該ベクターが導入された宿主細胞を発生させるため、製造のための本発明のマッピング方法の使用に関する。
【００３６】
本発明はさらに、マッピングされた遺伝子が導入されている真核生物を発生させるためのマッピング方法の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の説明
本発明は特定の実施形態および図面を参照しながら説明されるが、本発明はこれらに限定されず、請求項によってのみ特定される。特に、いわゆる人工配列の導入に関して述べるが、本発明はこれに限定されない。例えば、欠失のような修飾の如何なる適当な形態も包含され、天然の株の既存の修飾であってもこれを単一の株に交雑させることにより意図的に使用することも包含する。
【００３８】
本発明の１つの局面は人工マーカー付与株を作成するために生物のゲノム内に導入された人工ＤＮＡ配列を使用する遺伝子マッピング技術に関する。さらにまた、多数のこのような人工配列は、好ましくは、１株のゲノム内に導入され、これにより全ゲノムが原則として人工遺伝子マーカーに完全にカバーされる。完全にとは、この人工マーカー付与株のゲノム内にランダムな位置で突然変異が導入されるとすると、原則としてそれは、ゲノム内の位置に関らず、少なくとも１つのマーカーに遺伝子的に強固に連結することを意味す
る。従って、人工マーカー付与株の全ゲノムは「人工マーカーの追跡痕」でカバーされている。好ましくは、ゲノム内には、修飾される染色体またはその部分、平均して、好ましくは約１００遺伝子ごとに１修飾、より好ましくは約１０遺伝子ごとに１修飾、さらに好ましくは１０未満の遺伝子につき１修飾が存在する。その後、人工マーカー付与株を目的の特異的表現型特徴において異なっている株と交配する。交配の分離体を単離し、目的の表現型に関して評価し、目的の特性を呈する全分離体のＤＮＡをプールする。プールされたＤＮＡはその後、使用可能な幾つかの方法のいずれかの１つを用いてマーカーの検出のために使用される。目的の表現型特徴に関与する遺伝子は未マークの株から誘導されるのみであるはずであるから、これらの遺伝子に最も近傍のマーカーは存在しない。従って、ゲノムをカバーする人工マーカーの軌跡（追跡痕）には目的の各遺伝子に最も近傍のマーカーが排除されるギャップが存在する事になる。即ち、我々はこの新規技術を人工マーカー追跡痕除外マッピング即ちＡＭＴＥＭ（登録商標）と称している。ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の原理は図１〜図４中の例を用いて説明する。
【００３９】
図１は人工マーカー追跡痕除外マッピング（ＡＭＴＥＭ（登録商標））技術の概略図である。ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術を適用するためには、ゲノム内に導入された人工ＤＮＡ配列（マーカー）を用いて特殊マークされた株を構築する（Ａ）。例えば、コウボでは約１０遺伝子を含む間隔に相当する相互に約２０ｋｂの間隔で特異的な２０量体のオリゴヌクレオチドが導入されるコウボ株を構築する。特異的なマーカーは全てのコウボの染色体（Ｉ〜ＸＶＩ）中に導入され、このことは、ゲノムは約１２Ｍｂの長さを有し、約６０００遺伝子を含んでいるため、約６００マーカーが導入されなければならないことを意味する（Ｂ；各水平線はマーカーを示し、各染色体のマーカー総数を数値で示す）。マーカーの存在は幾つかの技術により検出できるが、そのうち、マーカーの相補物を含みゲノムＤＮＡがハイブリダイズしたマイクロアレイが最も好都合である（Ｃ）。アレイ上の黒色部分各々がゲノムＤＮＡ内の相当するマーカーの存在をシグナルする。
【００４０】
図２は本発明の実施形態によるＡＭＴＥＭ（登録商標）技術を用いた突然変異のマッピングを示す。人工マーカー付与株を、ゲノムにおける突然変異１つ以上（「＋」で示す）により目的の特定の性質において異なる別の株と交配する（Ａ）。数値は１突然変異の例を示す。他の株は人工マーカーを保有していない。交配の分離体は全て、約５０％のマーカーを有している。分離体の表現型を分析することによりそのうちのどれが目的の特性を有するかどうかを判断する。目的の性質は突然変異によるものであるため、そして、突然変異がマーカーを有さない株に由来するものであるため、突然変異体の表現型を有する全ての分離体は突然変異の位置に最も近く位置するマーカーを欠いている。マーカーは原則として全てのマーカーの相補物を含むマイクロアレイを用いて各々の個別の突然変異体の分離体を調べることにより同定できる（Ｂ）。しかしながら、突然変異体の表現型を有する分離体のＤＮＡをプールし、プールされたＤＮＡを用いてマイクロアレイにより全マーカーの存在を分析することがより好都合である（Ｃ）。従って、突然変異の位置はマーカーの強度のシャープで一過性の低下により示される。より多くの突然変異体の分離体を使用するほうが、シグナル強度の低下が突然変異の位置により近く濃縮されるため、方法の分解能はより高くなる。
【００４１】
図３は本発明の実施形態による例を示すが、ここでは目的の特性を生じさせるためには２突然変異（「＋」で示す）が同時に必要になる（「合成表現型」）。このような株は目的の特定の表現型が得られるまで突然変異誘発を反復した後に得られる。突然変異体の株とマーカー株を交配した後（Ａ）、分離体に突然変異体の表現型が存在するかどうか調べる（Ｂ）。２突然変異が存在する分離体のみ、突然変異体の表現型を示すことになる。目的の特性を呈する全ての分離体のＤＮＡをプールし、全マーカーの存在をマイクロアレイで分析する（Ｃ）。両方の突然変異の位置は２突然変異に最も近く位置するマーカーのシグナル強度の低下により同時に示される。特定の表現型のためにより多くの突然変異が同
時に必要となる場合にも同様の原理が当てはまる。各突然変異の位置は最も近傍のマーカーのシグナル強度の低下により示される。従って、単回の実験において、目的の表現型に必要な全突然変異の地図上の位置を測定できる。
【００４２】
図４は本発明の実施形態による特定の表現型をもたらす突然変異をマッピングするための多重突然変異した株の使用を示す。この図および次の図はＡＭＴＥＭ（登録商標）技術により可能になった重要な新規進歩を説明するものである。伝統的な突然変異体単離操作法においては、極めて多数の突然変異体を比較的簡素な突然変異誘発操作法で単離していた。その目的は特定の容易にスクリーニングされる表現型をもたらす１突然変異のみを有する株を得ることであった。この操作法の難点は、表現型に関して分析しなければならない突然変異体が多数であるため、容易にスクリーニングできる表現型のみしか検討できない点である。ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術が利用可能となったことで、目的の表現型が得られるまで単一の株内部に突然変異を繰り返し蓄積する新規方法が可能になった。目的の表現型は突然変異誘導を複数回の実施した後のみに確認されるため、測定することが困難である表現型も検討できる。目的の表現型が得られたら、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術を用いてこの表現型発現について全ての突然変異の位置をマッピングすることができる。この新規方法における唯一の条件は多重突然変異株の交配能力が人工マーカー付与株と交配するのに十分温存されていること、および、２倍体の株が必要数の分離体を得るのに十分な胞子形成能力を有していることである（Ａ）。目的の表現型を有する分離体のＤＮＡをプールし、マーカーの存在をマイクロアレイを用いて測定する（Ｂ）。マーカーの非存在により相当する突然変異の位置が明らかになる（丸印）。全ての無関連の突然変異はランダムに分離し、従って、関連の突然変異の位置に隣接するマーカーの同定には影響しない。
【００４３】
完全に人工的なマーカーが本発明において好ましい実施形態であると考えられる。このような場合、マーカーを新しく作成する。このことはマーカーの配列が他の生物、ウィルス、トランスポゾン、プラスミド等に存在する可能性があることを排除しない。唯一の要件は人工的にマークされる生物の天然のゲノムにその配列が存在しないことである。本発明の他の実施形態において、マーカーはゲノムに意図的に導入された、または、一部の単離体に天然に存在する人工配列の一部、および、ゲノム内に既に存在する隣接する配列の一部からなる。この場合、人工マーカーは特異的であるか、または、全てが同一であることができ、後者の場合、特異性はゲノム内の隣接する配列により与えられる。２つの部分が一緒になって特異的なマーカーを構成する限り、即ち、マークされた株の天然のゲノム内のどこにも存在しない配列を用いることにより、２つの部分をともに１つの単一のマーカーとして使用することができ、特異的な人工マーカーを構成することができるのである。本発明の他の実施形態においては、人工マーカーは可能な限り遺伝子的にそれをカバーするようにゲノムに反復して意図的に導入されたトランスポゾン、ウィルス、プラスミド等のような天然の配列の一部、および、ゲノム内に既に存在する隣接配列の一部からなる。トランスポゾンの転位の後（Ｐｌａｓｔｅｒｋ  Ｒ．Ｈ．Ａ，ｖａｎ  Ｌｕｅｎｅｎ  Ｈ．Ｇ．Ａ．Ｍ，１９９７，Ｒｉｄｄｌｅ  Ｄ．Ｌ．等，Ｅｄｓ，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＩＩ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ｐ．９７−１１６）、または、Ｃｒｅリコンビナーゼにより組替えられるｌｏｘＰ配列のような反復配列の組み換え後（Ｓａｕｅｒ  Ｂ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎ．１９９０，Ｎｅｗ．Ｂｉｏｌ．２，４４１−４４９）に残存する「瘢痕」（短ＤＮＡ配列、フットプリントとも称される）をゲノム内で隣接する特異的配列と組み合わせて人工マーカーとして使用することができる。２つの部分が一緒になって特異的マーカーを構成する限り、即ち天然のゲノム内の何処にも存在しない配列番号を用いることにより、２つの部分は一緒になって１つの単一の人工マーカーとみなすことができる。好ましくは、この様にして意図的に導入された天然の配列はゲノム内の中立的な位置に挿入しなければならない。このことは、挿入が遺伝子間の領域に優先的に起こる
場合に直接行なうことができる。或いは、天然の配列をランダムに挿入した後、天然の位置に挿入されたものをフランキングＤＮＡ領域の配列決定することにより同定し、その後、反復交雑により単一の株内に選択的に蓄積する。本発明のさらに他の実施形態においては、マーカーの人工的部分は１つの単一のヌクレオチドまたは１つ以上のヌクレオチドの置換に限定され、他の部分はゲノム内に既に存在する隣接する配列により形成される。結果として、遺伝子マッピングのための特異的マーカーのセットを作成するためにゲノムＤＮＡ配列の人工的に導入された修飾を用い、その目的がこのようなマーカーの多くを用いて少なくとも一部、好ましくは可能な限り多くのゲノムをカバーすることであるいかなる技術も、本発明の範囲内に包含される。
【００４４】
人工マーカーは種々の方法で生物のゲノム内に導入することができる、好ましくは、人工マーカーは厳密には予め決定された位置に相同組み換えを用いて導入される。これは実施例１に記載する。しかしながらこのことは本発明において、そして使用できる他の方法において必須ではない。マーカーは多くの形質転換方法のいずれか１つによりゲノム内にランダムに挿入することができる。挿入点におけるＤＮＡ配列はその後決定され、中立の位置に挿入されたマーカーのみが保持される。他のものはクロスアウトされる。人工マーカーに隣接するＤＮＡ領域の配列分析は以下に記載する方法で行なうことができる。ゲノムＤＮＡを制限酵素でフラグメント化し、制限フラグメントの一端にアダプターをライゲーションする。その後、一方が人工マーカーであり、他方がアダプターである２個のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う。或いは、ゲノムＤＮＡを１つの制限酵素で切断し、両側にアダプターを付加し、ベクトレットＰＣＲを用いてマーカーと下流のアダプターとの間のフラグメントを増幅する。同じ人工マーカーを１個より多く導入する場合は、異なる長さのＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントが得られる。フラグメントの数はゲノム内に導入された同一の人工マーカーの数と等しくなる。ＰＣＲフラグメントの配列分析により、ゲノム内の人工マーカーの挿入位置の配列がわかる。完全なゲノム配列がわかっている場合は、これによりゲノム内の厳密な挿入点が明らかになる。完全なゲノム配列の知見は真に必須な物ではないが、一方で、所定の生物のＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の開発を大きく促進する。現在、完全な真核生物ゲノムの配列決定は急速に行なわれている。その例としては、コウボであるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｍｅｗｅｓ  Ｈ．Ｗ．等，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７  Ｓｕｐｐｌ．７−６５）、線虫であるカエノルハブジフィス・エレガンス（Ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ
１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０１２−２０１８）、ミバエであるドロソフィラ・メラノガスター（Ａｄａｍｓ  Ｍ．Ｄ．等，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，２１８５−２１９５）、植物であるアラビドプシス・サリアナ（Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７９６−８１５）がある。
【００４５】
完全なゲノムＤＮＡ配列の知見はまたＰＣＲ増幅を用いたマーカーの検出のためのプライマーの設計を促進する（後記参照）。マーカーはまた天然のトランスポゾン、その変異体またはゲノムのランダムな位置に挿入する他のＤＮＡベヒクルを用いて反復して導入することができる。可能な限り遺伝子的にカバーできるようにゲノム内に何回も意図的に導入され、あるいは、特定の天然の単離株内にそのまま既に存在しているこのような天然のＤＮＡ分子の配列または配列の一部、および、隣接するＤＮＡの一部の組み合わせは、それが以前はゲノム内、少なくとも大部分の天然の単離株内には存在していなかったこと、そして、遺伝子マーカーとしてそれを使用する目的で導入され、または同定されたことからすると、「人工配列」にも成り得ると考えらえる。従って、このような遺伝子マーカーを使用する如何なる技術も、本発明のＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の範囲内に包含される。さらにまた、トランスポゾンの転位の後（Ｐｌａｓｔｅｒｋ  Ｒ．Ｈ．Ａ，  ｖａｎ  Ｌｕｅｎｅｎ  Ｈ．Ｇ．Ａ．Ｍ，１９９７，Ｒｉｄｄｌｅ  Ｄ．Ｌ．等，Ｅｄｓ，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＩＩ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ｐ．９７−１１６）、または、Ｃｒｅリコンビナーゼにより組替えられるｌｏｘＰ配列のような反復配列の組み換え後（Ｓａｕｅｒ  Ｂ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎ．１９９０，Ｎｅｗ．Ｂｉｏｌ．２，４４１−４４９）に残存する「瘢痕」（短ＤＮＡ配列、フットプリントとも称される）をゲノム内で隣接する特異的配列と組み合わせて人工マーカーとして使用することができる。それらは以前に導入されたリピート配列の複数の転位事象または複数の組み換え事象を介して導入され得る。原則として、ヌクレオチドの挿入、置換または欠失を起こす反復突然変異誘発、その後の中立位置のこれら突然変異を有する株の選択および突然変異と隣接する配列の組み合わせもまた特異的な人工マーカーを作成するために使用してよく、したがって本発明の範囲内に包含される。結論として、遺伝子マッピングのための特異的マーカーを作成する目的でゲノム内に意図的にそして反復して導入されたＤＮＡ配列を使用する如何なる技術も、本発明のＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の範囲内に包含される。
【００４６】
分離体のＤＮＡをプールすることは新規技術の適用にとって必須ではない。現在最も使用されている遺伝子マッピング技術として、遺伝子マーカーは、個々に交配の分離体において評価することができる。しかしながら、マーカーの人工的な性質のため、その組成はゲノム内の全ての他のＤＮＡと比較して極めて高い特異性を有するように選択することができる。その結果、全ての関連する分離体のＤＮＡをプールすることは、遺伝子マップの確立を妨害せず、そして、特に多遺伝子性の特性に関るマップ上の位置の決定を極めて容易にする。プールされたＤＮＡを用いて遺伝子マップを確立するために必要な分離体の数について論じる。１個の分離体は統計学的には約５０％の人工マーカーを含んでおり、２個の分離体のＤＮＡをプールすることで、約７５％のマーカーが得られ、３個では約８７．５％、４個では約９３．７５％、５個では約９６．８８％、６個では約９８．４４％そして７個では約９９．２２％が得られる。これは、僅か７個の分離体でプール中に存在する全てのマーカーを保有する機会が既に極めて高いことを示している。
【００４７】
人工マーカー付与株を交配させる相手となる株は、１つまたは多くの特性が異なるものである。技術に関連する唯一の事項は、目的の特性を呈する分離体のみがプールされ、そのＤＮＡを用いて人工マーカーの検出を行なう点である。
【００４８】
人工マーカー付与株を交配させる相手となる株は、好ましくは同系であり［目的の特定の表現型および人工マーカー（またはその部分）をもたらす突然変異を除く］、好適度は低いが異種であり、さらに好適度は低いが完全に異なる遺伝子組成物であってよい。この株およびマークされた株との交配で得られる分離体は特定の特徴に基づいて選択されるため、この特徴の確立のために重要な突然変異のみが優先的に選択され、従って、これらの突然変異の位置に隣接するマーカーのみが不在となる。他の全ての、即ち非関連の突然変異は分離体内にランダムに分布し、従って、これらの突然変異に隣接するマーカーもまたランダムに分布し、従って、すべての未連結のマーカーと同様のシグナル強度を示す。その結果、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術により可能となる興味深い新たな進歩は、今回、限定された数の突然変異株内に突然変異を蓄積できるようになった点であり、これは伝統的な突然変異株のスクリーニングの場合のように可能な限り多い株に渡って分散するのとは異なる（図４および図５参照）。後者の場合、株は比較的経度の突然変異誘発処置を行なうことにより好ましくは１つのみ突然変異を有する多くの突然変異株を得ている。この操作法の主な難点は容易にスクリーニングできる表現型のみしか研究できない点である。今回ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術により、目的の表現型が得られるまで単一または限定された数量の株内に突然変異を多数蓄積できるようになった。この表現型は、それが限定された数の株内で検討しなければならない点で測定が困難である場合がある。目的の表現型を有する株が発見されたら、それを人工マーカー付与株と交配し、目的の表現型を呈する分離体のＤＮＡをプールし、マーカーの存在を調べる。目的の表現型に関連する全ての突然変異の位置は、最も近傍のマーカーのシグナル強度の低下により示され、全ての無関連の
突然変異は、それが分離体内にランダムに分布しているため、マーカーの存在に影響しない（図４）。本発明のさらに他の実施形態においては、突然変異が蓄積される株は遺伝子の多重欠失が蓄積される株であることができる。例えば、遺伝子の欠失は、相同組み換えによりコウボにおいて高い精度で起こすことができる。１つの遺伝子に欠失を有する株の収集物が構築されている（必須遺伝子の場合は単一の欠失を２倍体に形成し、異種の株とする）（Ｏｌｉｖｅｒ  Ｓ．Ｇ．等，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，３７３−３７８；Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  Ｅ．Ａ．１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，９０１−９０６）。現時点では推定６２００のコウボの遺伝子の約５８００個に対する単一欠失株が入手可能である。これらの単一遺伝子欠失は、小数の株の多重交配により蓄積することができ、これにより遺伝子の全てまたは大部分をカバーする多重欠失株の収集物が得られる。次いでこの収集物を目的の特定の表現型が得られるようにスクリーニングすることができる。目的の表現型を株の１つに発見できれば、表現型に関与する欠失をＡＭＴＥＭ（登録商標）技術により迅速に同定することができる。実施例６（図１３）はゲノム内に１２欠失を有するコウボ株の構築を説明するものである。同じ方法を用いて、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の適用のために必要とされる生存性および交配能力を損なうことなく、可能な限り多くの遺伝子欠失を単一の株内で蓄積させることができる。
【００４９】
本発明のさらに他の実施形態、即ちリバースＡＭＴＥＭ（登録商標）においては、人工マーカー付与株そのものを目的の表現型が得られるまで突然変異誘発させる。これは多くの方法、例えば伝統的な方法またはトランスボゾン突然変異誘発により行なうことができる。コウボのような一部の生物においては、相同組み換えにより厳密な遺伝子欠失を起こすことが可能である。このような欠失は目的の表現型が得られるまで人工マーカー付与株中に繰り返し導入することができる。さらにまた、このような多重突然変異株の収集物は、株の生育および交配能力を低減することなく可能な限り多くの突然変異を蓄積できるように作成することができる。これらの突然変異体は目的の表現型の変化を含む多くの表現型の変化を示す。このような突然変異体は目的の野生型の表現型の発現のために必要な全ての遺伝子の地図上の位置を決定するために今回用いることができる。この目的のためには、株を、目的の表現型を単独または連係して起こすものを含む全ての突然変異体遺伝子の野生型の等価物を含む目的の野生型株と交配する。分離体のうち目的の表現型のものをスクリーニングし、目的の野生型表現型を回復している全ての分離体のＤＮＡをプールする。人工マーカーが存在することが決定され、目的の表現型の変化を単独または連係して起こすことのできる個々の突然変異の部分に最も近くに位置するものを除き、全てのマーカーが存在するようになる。従って、特定の野生型の表現型を発現するために必要な全ての遺伝子の地図上の位置が１回の交配で決定できる。リバースＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の原理は、実施例５において説明する。本明細書に記載するものは、目的の表現型が得られるまで、或いは、生育および交配能力を低減することなく可能な限り多くの遺伝子が突然変異性となるように、または、生育および交配能力を低減することなく相同組み換えにより可能な限り多くの遺伝子が欠失するように、それが飽和突然変異性となるまで、複数回の突然変異誘発を行なってそれ自身を突然変異性とした人工マーカー付与株である。幾つかの独立した多重突然変異のマーカー株が開発できる。多重突然変異株は多くの表現型の変化を示し、それには目的の表現型の変化も含まれる。後者は例えば株内に存在する５つの突然変異のうちのいずれか１つ（丸を付した「＋」）により起こる。従って、何れの突然変異も単独でそれ自体の表現型変化を起こすことができる（「独立表現型」）。多重突然変異した人工マーカー付与株を野生型株と交配させる（Ａ）。それは全ての突然変異下遺伝子の野生型等価物、例えば目的の表現型の変化を起こすことのできるものを含んでいる（丸で囲んだ数値）。分離体が目的の表現型を有するかどうかスクリーニングする。全ての５つの野生型遺伝子（１〜５）を回復していた分離体のみ、目的の表現型を再度失っており、野生型の表現型を示す。これらの野生型の分離体のプールされたＤＮＡを用いて得られたマーカーのマイクロアレイ検出によれば、個々に突然変異された場合の目的の表現型を与える全ての５つの遺伝子の位置が判明する（Ｂ）。従って、特定の野生型の
表現型を発現するために必要な、多くの、または、全ての遺伝子の地図上の位置も単回の交配の後に決定される。
【００５０】
ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術により良好に遺伝子マッピングをするための唯一の条件は、目的の表現型を呈する生存性があり交配能力のある分離体の発生である。その結果、人工マーカー付与株とは異なる種に由来する株であっても、それがマークされた株と良好に交配され生存性のある第１世代の子孫を発生させることができれば、使用可能である。
【００５１】
定量的な特性に関与する遺伝子もまたＡＭＴＥＭ（登録商標）技術によりマッピングできる。ある株が人工マーカー付与株とは定量的特徴において異なっている場合、人工マーカー付与株を用いて最も大きい相違を示す交配で得られた分離体のＤＮＡをプールし、マーカーの存在を調べる。試験対象の株と人工マーカー付与株との間の定量的特徴の相違の原因となる突然変異を優先的に選択すると、その結果、突然変異の位置に隣接するマーカーが不在となる。
【００５２】
マーカーの検出のためには幾つかの既存の方法を用いることができる。どのような方法を用いる場合でも、マーカーの人工的な特質は、天然の遺伝子の偏位を使用した全ての遺伝子マッピング技術と比較しても、独特の利点を示すことは明白である。マーカーは人工的であるため、その組成物は最も迅速で最も高感度の検出を可能とするように選択できる。特に、人工マーカーの融点を極めて同様とすることにより単一の実験における全てのマーカーの同時検出が極めて容易となる。マーカーの一部のみが人工であり、残りのマーカーがマーカーに隣接して位置するゲノム配列である場合も、このゲノム配列の長さを全マーカーの融点がほぼ同じとなるように選択することができ、これにより、全マーカーの同時検出が極めて容易となる。全マーカーの同時ハイブリダイゼーション温度を得るためにマーカーに隣接するフランキング配列の可変ストレッチを利用しているこのような検出方法は、これまで使用されておらず、本発明の一部である。
【００５３】
本発明者等はマーカーの検出のための多くの可能な方法を説明するが、これらは単なる例示であり、網羅されているわけではない。
【００５４】
検出方法は例えばＰＣＲ法を含むことができる。この目的のためには２個のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、そのうちの１つはマーカーと同一であり、他方はゲノム内の下流の好都合な距離に位置するＤＮＡ配列を有する。興味深い事に、この距離が異なるマーカーにおいて幾分異なるように取られた場合、多くのマーカーを、単一の多重ＰＣＲ反応とその後のゲル電気泳動において同時に検出できる（図１０Ｂおよび図１２参照）。反応産物は種々のＤＮＡ染色方法のいずれか、例えばＳｙｂｒＧｒｅｅｎまたは臭化エチジウムを用いるか、または、放射能または蛍光または化学ルミネセンスを用いて可視化して良い。或いは、リアルタイム多重ＰＣＲを用いてよく、この場合は増幅産物をＰＣＲ作業中連続的に検出し、これによりその後の電気泳動ステップを省略できる。
【００５５】
他の検出方法はマーカーの検出のために「２重」ＰＣＲ法を含む。これは図１１のゲノムに挿入された人工マーカーの検出において説明する。マーカーの検出を促進するために、マーカー配列を例えば蛍光または放射性のヌクレオチドで標識する（Ａ）。１つの方法においては、マーカーを含むゲノムフラグメントを先ずＰＣＲで増幅し（１）、そして次に標識されたｄｄＮＴＰ存在下の１塩基伸長反応（２）により標識されたマーカー配列を生成する。数個のマーカーを多重ＰＣＲ反応において組み合わせ、これにより数個のマーカー配列の増幅（およびその後の標識）を１回で行なえるようになる。Ｂにおいて、ＳＴＷＷ１１０株に存在する１７個の異なるマーカーフラグメントを、３回の多重ＰＣＲにおいて増幅し、その際それぞれ２、５および１０プライマー対を使用した。種々の大きさの増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離する。レーン１、マーカー１６３（３７３
塩基対）および５（５１１塩基対）；レーン２、マーカー１６５（３４５ｂｐ）、１６４（３６５ｂｐ）、２７８（３８４ｂｐ）、２８１（５００ｂｐ）および３（５２９ｂｐ）；レーン３、マーカー１６２（２９３ｂｐ）、２７９（３１４ｂｐ）、６（３３６ｂｐ）、１６６（３５４ｂｐ）、１１（３８４ｂｐ）、４（４２１ｂｐ）、２８２（４８１ｂｐ）、２（４９９ｂｐ）、２８０（５２５ｂｐ）および１６１（６４８ｂｐ）；Ｍ，標準ＤＮＡサイズマーカー（数値は塩基対を示す）。
【００５６】
多重ＰＣＲ反応の後、多重１塩基伸長（ＳＢＥ）または多塩基伸長（ＭＢＥ）反応を、鋳型として多重ＰＣＲ産物およびプライマーとして検出すべきマーカーと同一のオリゴヌクレオチドを用いて行う（図１１Ａ参照）。ＳＢＥ反応においては、放射標識または蛍光標識されたｄｄＮＴＰのみを用いる。ＭＢＥ反応の場合は、４種のｄＮＴＰのうち１つを放射性または蛍光化合物で標識する。精製を行なうか行なうことなく、その後、ＳＢＥまたはＭＢＥ反応の産物を、ナイロンメンブレン上にスポットされた、または、スライドガラス上の高密度マイクロアレイフォーマット内のマーカーの逆相補物（ＳＢＥ反応の場合）またはマーカーの逆相補物を含むより長いオリゴヌクレオチド（ＭＢＥ反応の場合）とハイブリダイズする（図１２参照）。これにより単一の試験において数百〜数千のマーカーの同時検出のためのハイスループットフォーマットが得られる。
【００５７】
検出はまたＰＣＲ法を行なうことなく実施することもできる。その場合、フラグメント化されたゲノムＤＮＡをアレイに直接ハイブリダイズし、ＳＢＥまたはＭＢＥ反応をアレイ上で行うか、または、ＳＢＥ／ＭＢＥ反応を先ずフラグメント化されたＤＮＡを鋳型として行い、その後反応混合物を精製するか精製することなくアレイにハイブリダイズする。
【００５８】
記載した全ての場合において、マーカーの最終検出はこのマーカーに特異的に会合している放射性シグナルまたは蛍光シグナルの存在に基づく。放射能は燐光測定法を用いて検出でき、蛍光は蛍光スキャナまたはＣＣＤカメラを用いて検出できる。
【００５９】
本発明者等は、ゲノム内の人口マーカーの導入により思いもよらなかった完全に新規な機会を創生することを説明する。本発明の他の実施形態においては、希少切断酵素の制限部位をマーカーに隣接して付加することができる（図６）。好ましくは、制限酵素はゲノム内の如何なる場所も切断してはならない。このことは生物の完全なゲノム配列を用いて測定するか、または実験的に試験することができる。制限酵素がゲノム内の数カ所を切断する場合は、標準的な部位指向性の突然変異誘発法により制限部位を排除することができる。人工マーカー内の制限部位の存在により、それぞれが特異的マーカーを含むフラグメントの限定数において制限酵素でゲノムＤＮＡを切断できるようになる。次にフラグメントをベクターにクローニングし、得られたコンストラクトを宿主、例えば大腸菌またはバクテリオファージラムダ（λ）に形質転換することにより、インサートをマーカーに基づいて同定できる。次に形質転換体を例えばマイクロプレートのウェル内において適切な順序（第１の染色体の第１のフラグメントから最終染色体の最終フラグメントまで）でソーティングする。また、全てのコンストラクトを混合して完全なゲノムライブラリを作成する。ライブラリの品質（全ゲノムフラグメントの存在）は常時、例えば人工マーカーに対するマイクロアレイ検出法を用いて容易に評価することができる。ゲノムライブラリをレシピエント株に形質転換し、形質転換体をプレーティングした後、形質転換体を２連でプールし、形質転換体内の全ゲノムが完全にカバーされていることを特異的人工マーカーの存在に基づいて確認することができる。形質転換体内のゲノムのこのような完全なカバー状態の確認はゲノムライブラリを用いてはこれまで不可能であった。形質転換体のプールにおいて欠けているゲノムフラグメントは何れも、マイクロプレート内のソーティングされたライブラリから得ることができ、レシピエント株に個々に形質転換できる。この新規操作法は形質転換体の限定数におけるゲノムの完全なカバー状態を保証するものである。
またさらに、欠けている如何なるクローンもその後個々に導入できるため、完全なカバー状態のために必要な形質転換体の数を低減できる。ゲノムライブラリを用いた既存の全ての形質転換操作法において、全ゲノムがカバーされていることが確実であったものは無く、全ゲノムをカバーする可能性を最大限とするためには、必要な形質転換体の数がライブラリ内のゲノムインサートの推定数の何倍にもなっていた。
【００６０】
前述したとおり、理想的な遺伝子マッピング技術は生物の表現型とはまったく独立したマーカーを有さなければならない。これは、マーカーがゲノム内の中立的位置に意図的に挿入された人工オリゴヌクレオチドであるＡＭＴＥＭ（登録商標）技術を用いる場合に相当する。使用する生物に応じて、人工マーカーはゲノム内にランダムに挿入する事もでき、その後、適切なマーカーを挿入位置の配列分析により同定し、単一の生物内に交配することにより蓄積することができる。人工マーカーを用いることにより、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術は本来同系の株も突然変異の単離とその後のマッピングのために使用できるようにする。ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術においては、マーカーは全ゲノムにわたって均一な間隔となるように特異的な位置に挿入されるか、または全ゲノムをカバーするように選択される。マーカーの適切な数量は生物の組み換え頻度に基づいて決定する。それは如何なる遺伝子との連結も検出できる程度に多く、不必要な情報の収集を回避できる程度に多すぎない。人工ＡＭＴＥＭ（登録商標）マーカーは例えば高密度マイクロアレイまたは多重ＰＣＲを用いて同時に検出できる。目的の突然変異のマッピングを容易にするために、特異的表現型特徴を呈する全分離体のＤＮＡをプールし、マーカーの存在を全分離体について一括して１回の実験で測定する。その結果、特定の特徴のために必要な全突然変異の遺伝子マップ上の位置がたった１回の遺伝交配により決定できる。これはマッピング操作、特に多遺伝子性の特性に関わる操作を大きく簡素化するものである。従って、ゲノムを遺伝子的に完全にカバーしている多数の人工マーカーの使用により、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術は理想的な遺伝子マッピング法に近づいた最初のマッピング技術である。
[実施例]
ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術は有性生殖可能な如何なる真核生物を用いて実施することもできる。原則として、人工マーカー付与株をこのような生物のいずれかに対して構築することができる。唯一の相違点は構築に必要な作業と時間である。一部の生物においては、マーカーオリゴヌクレオチドをゲノムの所定の位置に厳密に挿入する。この方法では、表現型に影響する位置にマーカーを挿入することは予め可能な限り回避することができ、これにより株の構築のための時間を節約できる。これが最良であり、従って、好ましい方法である。しかしながら、最も困難な方法でもある。本発明の実施形態として、本発明者等はコウボであるサッカロマイセス・セレビシエの人工マーカー付与株の構築を説明する。他の生物に関しては、マーカーオリゴヌクレオチドを短に使用可能な数種類の方法のいずれかを用いてゲノム内にランダムに挿入する。その後、その位置をゲノム内の隣接領域の配列により決定し、中立の位置に挿入され、そのため表現型に影響しないと考えられるマーカーのみを温存する。目的の全マーカーを交配により単一の株に蓄積させる。望ましくない位置に挿入されたマーカーはクロスアウトされる。
【実施例１】
【００６１】
実施例１：コウボサッカロマイセス・セレビシエの人工マーカー付与株の構築
コウボサッカロマイセス・セレビシエの人工マーカー付与株をどのようにして構築するかを説明する。第１に全ゲノムに渡り遺伝子的にカバーするために必要なマーカーの概数を文献から既知組み換え率に基づいて計算した。
【００６２】
配列決定プログラムから得たコウボＯＲＦの分布に関するデータと組み合わせた文献記載の伝統的なマッピングデータを用いて、未連結のマーカー由来のシグナルと比較した場合の特異的突然変異による特定の距離に位置する人工マーカー由来のシグナルの強度の低下を予測した。以下の実施例においては、比較のために、突然変異の１つが目的の突然変
異であり、他方が最も近傍の人工マーカーであることを毎回推定できる。連結がない場合は、子孫の５０％がマーカーを有する。従って、子孫の総数の５０％で得られる２重突然変異体の数を比較しなければならない。このような遺伝子の交配の例の数を以下に示す。（ＰＤ＝「親ジタイプ」；ＮＰＤ＝「非親ジタイプ」；Ｔ＝「テトラタイプ」）
１．ＳＳＮ２−ＳＮＦ１
距離：１４．４ｃＭ
間にある遺伝子数：４１遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：１５  ＮＰＤ：０  Ｔ：６
分離体の総数：８４；５０％＝４２
ｓｓｎ２ｓｎｆ１分離体：６
マーカー強度：未連結マーカー強度の６／４２即ち１／７
２．ＣＹＲ１−ＩＬＶ３
距離：１０ｃＭ
間にある遺伝子数：２２遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：１６  ＮＰＤ：０  Ｔ：４
分離体の総数：８０；５０％＝４０
ｃｙｒ１ｉｌｖ３分離体：４
マーカー強度：未連結マーカー強度の４／４０即ち１／１０
３．ＨＩＳ３−ＳＴＥ１３
距離：２９．９ｃＭ
間にある遺伝子数：１６遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：１１  ＮＰＤ：０  Ｔ：１５
分離体の総数：１０４；５０％＝５２
ｈｉｓ３ｓｔｅ１３分離体：１５
マーカー強度：未連結マーカー強度の１５／５２即ち±１／３．５
４．ＡＤＥ２−ＳＵＦ５
距離：９．９ｃＭ
間にある遺伝子数：１４遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：１４５  ＮＰＤ：１  Ｔ：２９
分離体の総数：７００；５０％＝３５０
ａｄｅ２ＳＵＦ５分離体：２９
マーカー強度：未連結マーカー強度の２９／３５０即ち±１／１２
５．ＵＲＡ３−ＧＣＮ４
距離：７．５ｃＭ／９．６ｃＭ／８．４ｃＭ
間にある遺伝子数：１２遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：５２／１３９／４５  ＮＰＤ：０／０／０  Ｔ：０／３２／９
分離体の総数：１１４４；５０％＝５７２
ｕｒａ３ｃｇｎ４分離体：５０
マーカー強度：未連結マーカー強度の５０／５７２即ち±１／１１
６．ＵＲＡ３−ＭＣＭ３
距離：８．３ｃＭ
間にある遺伝子数：１０遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：５  ＮＰＤ：０  Ｔ：１
分離体の総数：２４；５０％＝１２
ｕｒａ３ｍｃｍ３分離体：１
マーカー強度：未連結マーカー強度の１／１２
７．ＨＩＳ３−ＳＴＥ４
距離：１１．８ｃＭ
間にある遺伝子数：９遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：１０  ＮＰＤ：０  Ｔ：３
分離体の総数：５２；５０％＝２６
ｈｉｓ３ｓｔｅ４分離体：３
マーカー強度：未連結マーカー強度の３／２６即ち±１／９
８．ＳＮＦ１−ＲＮＡ３（ＰＲＰ３）
距離：５．６ｃＭ
間にある遺伝子数：３遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：８７  ＮＰＤ：０  Ｔ：１１
分離体の総数：３９２；５０％＝１９６
ｓｎｆ１ｒｎａ３分離体：１１
マーカー強度：未連結マーカー強度の１１／１９６即ち±１／１８
９．ＡＤＥ２−ＰＦＹ１
距離：測定不能の短い長さ
間にある遺伝子数：５遺伝子
マッピングデータ：ＰＤ：３８／７  ＮＰＤ：０／０  Ｔ：０／０
分離体の総数：１８０；５０％＝９０
ａｄｅ２ｐｆｙ１分離体：０
マーカー強度：０、マーカー完全消失
マッピングされた距離（ｃＭ）と物理的距離（ｋｂ、間にある遺伝子の数を反映、平均でコウボゲノム内の２０ｋｂ当たり約１０遺伝子が存在）との間の関係は、染色体の長さに渡る組み換え頻度の相違により、常時同じではない。これが上記実施例において遺伝子距離が異なる数の遺伝子をカバーする理由である。しかしながら一般的には、この関係は極めて一定である。マップ距離と物理的距離との間の関係がどのように厳密であっても、試験における人工マーカーと突然変異との間の距離が１０遺伝子である場合にマーカーのシグナル強度は他の（未連結の）バンドの約１０％まで低下することは、上記実施例が明確に示している。これは明白であるはずである。５遺伝子の距離の場合は、マーカーのシグナル強度は一般的にはゼロ値である。このことは、１０遺伝子おきにマーカーを挿入し、突然変異を２マーカー間の中央に位置させる場合、両方のマーカーがマーカーの追跡痕から完全に消失する可能性が最も高いことを意味している。当然ながら、突然変異が中央に位置しない場合は、最も近傍のマーカーは確実に完全に消失する。これらの結果は２マーカー間の約１０遺伝子（または約２０ｋｂ）の間隔が本発明の目的のためには適切であることを示している。
【００６３】
従って、マーカーの総数は、目的の表現型を有する分離体の選択およびそのＤＮＡのプールの後、ゲノム内の関与する突然変異の位置に関らず、少なくとも１つのマーカーが完全に消失するように選択している。ゲノムに渡り組み換え頻度の変動があり、突然変異に隣接（各側に１つ）して消失する少なくとも２個のマーカーの信頼性が高い場合には、好ましいマーカーの必要数は約６００であることが解かっている。
【００６４】
その後、マーカーをＳ２８８Ｃ株のゲノム内の種々の染色体に渡り２０ｋｂの間隔で分布させた。第１のマーカーは染色体Ｉ上の第１の遺伝子の上流に位置させ、最後のマーカーは染色体ＸＶＩ上の最後の遺伝子の下流に位置させた。この分布ではマーカーの総数は６１１となる。このマーカーの分布を図１Ｂに示す。この数は単なる例示であり、遺伝子的にゲノムの一部をカバーし、好ましくは完全にカバーする如何なる他の数も適切である。
【００６５】
使用する株はコウボであるサッカロマイセス・セレビシエの如何なる菌株でも良いが、好ましくは全てのゲノムＤＮＡ配列が決定されているＳ２８８Ｃ株が好ましい。これにより、遺伝子の位置が厳密にわかっており、また挿入点のＤＮＡ配列が厳密に解かっていることから、マーカーの厳密な挿入点の決定が容易になる。高度に特異的なマーカー、即ち
、配列が全ゲノムＤＮＡ配列に全く存在しないマーカーの選択が可能になる。マーカーの配列は他の生物の好適ＤＮＡ配列データベースおよび配列のマニュアルによる修飾を用いて決定している。全てのマーカーは全コウボゲノム配列中の如何なる配列とも配列の相同性が無いことを確認している。
【００６６】
各マーカーの挿入のためには、６個の特異的なプライマーを用い、４個のユニバーサルプライマーを用いてＫ．ｌａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子の増幅を行なう。コウボ菌株に挿入した人工マーカー配列の５つの例を以下に示す。
【００６７】
【化１】
0004490685.tif 000002
【００６８】
以下のＰＣＲプライマーを用いて上記マーカーの導入を行なった。プライマー１および２はＰＣＲ  Ｉ，Ａのために使用し；プライマー３および４はＰＣＲ  Ｉ，Ｂのために使用し；プライマー１および４はＰＣＲ  ＩＩのために使用し；チェッキングプライマー（ＣＨＥ）とマーカープライマーを組み合わせてゲノム内のマーカーの適切な導入を確認する。
【００６９】
プライマー１および４に結合させた２種のアダプター配列はそれぞれ以下のとおりである。
【００７０】
【化２】
0004490685.tif 000003
【００７１】
これらのアダプター配列はそれぞれ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子の３’および５’末端の増幅にそれぞれ用いられるプライマー８および５に結合したアダプタ−配列に相補的である（図７参照）。プライマー２および３に結合したアダプター配列は相互に相補的であり、それぞれ逆（アンチセンス）および順（センス）の方向のマーカー配列に相当する。全てのアダプター配列を以下に斜体文字で示す。Ｆｓｅｌ制限部位をプライマー２および３のアダプター配列に付加し（以下において下線）、これにより挿入されたマーカーの５’末端においてＦｓｅｌ部位が付加される（実施例２参照）。
【００７２】
図７はコウボゲノムにおける人工マーカーの挿入のための方法を概説したものである。所望のマーカー挿入部位をフランキングするゲノム配列の５’および３’末端（それぞれＩ，ＡおよびＩ，Ｂ）を種々のアダプター配列を含むプライマー（１〜４）を用いてＰＣＲ増幅する。プライマー１および８、プライマー４および５、およびプライマー２および３上のアダプター配列は、各対が相互に相補的であることに留意されたい。両方のＰＣＲフラグメントを再度次のＰＣＲステップ（ＩＩ）において連結することにより、マーカー
配列を挿入し、これがプライマー２および３のアダプター配列に相当する。得られた増幅産物は、ＰＣＲステップＩＶ，ＡおよびＩＶ，Ｂにおいてそれぞれ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子の５’部位または３’部位に同様に連結される。部分オーバーラップＫ．ｌａｃｔｉｓ５’および３’部分はそれぞれＰＣＲステップＩＩＩ，ＡおよびＩＩＩ，Ｂで得られる。得られたＫ．ｌａｃｔｉｓ遺伝子のいずれかの部分および人工マーカーの配列にフランキングする同一のゲノム配列を含むキメラＰＣＲ産物を合わせ（Ｖ），ｕｒａ３株に形質転換し、形質転換体をウラシル欠乏ＵＲＡ培地で生育させる（ＶＩ）。正しい方向にＫ．ｌａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子フラグメントを組み込まれており、活性ＵＲＡ３遺伝子を形成する形質転換体のみがＵＲＡ培地上で生育できる。相同組み換えが起こる結果、形質転換体の大部分がこの時点でマーカー配列の２コピーを有するようになる。その後これらの形質転換体をＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞にとっては毒性であるＦＯＡ選択培地上で生育させると、相同組み換えを介したＵＲＡ３遺伝子のポップアウトによりゲノムからＵＲＡ３遺伝子が排除され、所望のゲノム位置に単一のマーカー配列が挿入された株が得られる。正しいゲノム位置にマーカーが存在することはマーカー配列に相補的なプライマーおよびマーカー含有ＰＣＲフラグメントの相同組み換えに用いたフランキング配列の下流のゲノム配列に相補的な「チェッキングプライマー」を用いたＰＣＲ増幅により確認される（矢印）。全てのゲノムが人工マーカーによりカバーされるまで、コウボゲノム内に挿入される各マーカーに対して同じ方法を反復する。
【００７３】
【表１】
0004490685.tif 000004
【００７４】
【表２】
0004490685.tif 000005
【００７５】
Ｋ．ｌａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子の増幅に用いた４個のユニバーサルプライマーの配列を以下に示す（アダプター配列は斜体）。
【００７６】
【化３】
0004490685.tif 000006
【００７７】
マーカーは図７に示す方法を用いて挿入している。ゲノム挿入点を決定した後、ＰＣＲプライマー２対を設計した。各ＰＣＲプライマーは２部分からなるものであった。第１のプライマー（プライマー１、順方向）は第１部分としてアダプターＡおよび第２部分として挿入点の上流約２００〜３００ｂｐのゲノム配列からなるものであった。その相手であるプライマー（プライマー２、逆方向）は第１部分としてマーカー、および、第２部分として他の鎖上の下流の挿入点をフランキングするゲノム配列からなるものであった。これらの２つのプライマーを用い、鋳型としてＳ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応Ｉ，Ａを行った。プライマー３（順）は第１部分としてマーカー、および、第２部分として下流の挿入点をフランキングするゲノム配列からなるものであった。その相手のプライマー（プライマー４、逆）は第１部分としてアダプターＢおよび第２部分としてもう一方のＤＮＡ鎖上の挿入点の上流約２００〜３００ｂｐのゲノム配列からなるものであった
。これらの２つのプライマーを用い、鋳型としてＳ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応Ｉ，Ｂを行う。その後、プライマー１および４を用い、混合鋳型としてＰＣＲ反応Ｉ，ＡおよびＩ，Ｂの産物を用いてＰＣＲ反応ＩＩを行う。これにより正しい位置に挿入されたマーカーおよびフランキング配列としてアダプターＡおよびアダプターＢを有するゲノムＤＮＡ配列の一部を含むＤＮＡフラグメントが生成する。その後、クルイベロマイセス：ラクティスＵＲＡ３遺伝子の２つのオーバーラップ部分をＰＣＲ（ＰＣＲＩＩＩ，ＡおよびＩＩＩ，Ｂ）で増幅した。ＰＣＲＩＩＩ，Ａには以下のプライマーを使用した。第１のプライマー（プライマー５、順）はアダプターＢに相補的なアダプターｂおよびＵＲＡ３遺伝子の最も上流のフラグメントからなるものであった。第２のプライマー（プライマー６、逆）はＵＲＡ３遺伝子の下流の中央直後の配列からなるものであった。ＰＣＲＩＩ，Ｂでは以下のプライマーを用いた。第１のプライマー（プライマー７、順）はＵＲＡ３遺伝子の上流の中央直後の配列からなるものであった。第２のプライマー（プライマー８、逆）はアダプターＡに相補的なアダプターａおよびＵＲＡ３遺伝子の最も下流の配列からなるものであった。その後、ＯＣＲ反応ＩＩおよびＩＩＩ，Ａの産物を鋳型として用い、プライマー１および６を用いてＰＣＲ反応ＩＶ，Ａを行なった。ＰＣＲ反応ＩＩおよびＩＩＩ，Ｂの産物を鋳型として用い、プライマー７および４を用いてＰＣＲ反応ＩＶ．Ｂを行なった。次にＰＣＲ反応ＩＶ，ＡおよびＩＶ，Ｂの産物をそのまま、ｕｒａ３突然変異を有し、このためウラシルに対して栄養要求性であるＳ２８８Ｃ株に同時形質転換した（Ｖ）。次にウラシル原栄養性の形質転換体をウラシル欠乏培地上で選択した。ウラシルに対する原栄養性を獲得させるために、細胞は、機能性ＵＲＡ３遺伝子が回復するようにゲノム内に２つのコンストラクトを組み込まなければならない。また結果として、このＵＲＡ３遺伝子は挿入したマーカーを有するゲノムＤＮＡ配列のコピーにより両側をフランキングされている（ＩＶ）。その後株を５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）を含有する培地に移す。このような培地上では、ＵＲＡ３原栄養性の株は生育できず、ゲノムＤＮＡの２つのリピート配列とマーカーとの間の組み換えによりＵＲＡ３遺伝子が排除されている株のみが生育可能である（ＶＩＩ）。このような菌株はゲノム内の正しい位置に挿入されたマーカーを有する。この操作法をここで、第２のマーカー、第３のマーカー等に対しても、ゲノムの正しい位置に全てのマーカーが挿入されるまで、反復する。
【００７８】
この方法で開発され記載した５個の人工マーカーを（図９，Ａにおいて菌株７αの１２５番〜１２９番）担持した菌株（ＳＴＷＷ１２５−１２９）は、受託番号ＩＨＥＭ１８７２８の下、２００１年６月２１日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｌｏｕｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  ＩＨＥＭ（Ｊ．Ｗｙｔｓｍａｎｓｔｒａａｔ  １４，Ｂ１０５０
Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に対しＤｒ．Ｊｏｈａｎ  Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ，Ｄｒ．Ｐ．ＭａおよびＤｒ．Ｐａｔｒｉｃｋ  ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋ、により（全てＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋａｓｔｅｅｌｐａｒｋ  Ａｒｅｎｂｅｒｇ  ３１，Ｂ−３００１  Ｈｅｖｅｒｌｅｅ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）により寄託されている。
【００７９】
１７個の人工マーカーを含む菌株もまた寄託されており（株名ＳＴＷＷ１１０）、これは記載したマーカー挿入方法を用いて開発された３種の株を含む２回のその後の交配の結果得られるものである（後述参照）。
【００８０】
図８において、マーカー挿入ストラテジーの各ステップにおけるＰＣＲ分析の結果をコウボゲノム内に導入されたマーカーの１つに関して示す（マーカー番号１６８、菌株ＳＴＷＷ１１０に導入（後述参照）、この段階で１８マーカー含有）。
【００８１】
図８にマーカー１６８の挿入の間の各段階で得られた増幅産物を示す。レーン１、ＰＣＲ反応Ｉ，Ａ；レーン２、反応Ｉ，Ｂ；レーン３、反応ＩＩ；レーン４、反応ＩＩＩ，Ａ；レーン５、反応ＩＩＩ，Ｂ；レーン６、反応ＩＶ，Ａ；レーン７、反応ＩＶ，Ｂ；レーン８、マーカーおよびチェッキングプライマーおよびＫ．ｌａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子に対するプライマー６および反応ＩＶ，ＡおよびＩＶ，ＢのＰＣＲ産物によるコウボの形質転換後に得られたＵＲＡ「ｍｉｎ」（ＵＲＡ−）コロニーを鋳型として使用したＰＣＲ；大型のＤＮＡバンド（約１．２ｋｂ）が左側のマーカーコピーから組み換えＵＲＡ３遺伝子に向けて伸長し、小型のＤＮＡバンド（４７４ｂｐ）が右側のマーカーコピーからゲノムのチェッキング配列に向けて伸長する；挿入が図７に示す組み換えスキームに従って起こったことの両方バンドの存在による実証；レーン９、マーカーおよびチェッキングプライマーおよび鋳型としてＦＯＡ選択プレート上で得られたコロニー由来のＤＮＡを用いたマーカー挿入の最終実証；４７４ｂｐのフラグメントの存在は、人工マーカーがコウボゲノム中の正しい位置に挿入されたことを示す。
【００８２】
マーカー１６８の挿入のために以下のプライマーを用いた。
【００８３】
【化４】
0004490685.tif 000007
【００８４】
アダプター配列を含むプライマーを用いることにより、得られる増幅産物は次のＰＣＲ反応でプライマーとして機能する人工配列のタグを有している。ＰＣＲステップＩＩにおいては、これにより人工マーカー配列の挿入が起こり、ＰＣＲステップＩＶにおいては、これによりマーカーおよびＫ．ｌａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子のいずれかの部分を含むゲノムフラグメントからなるキメラ配列が生成する。コウボゲノムへのキメラＵＲＡ３配列の組み込みは３プライマー（マーカーおよびチェッキングプライマーおよびユニバーサルプライマー６）を用いたＰＣＲにより調べられ、これにより組み換えＵＲＡ３遺伝子により分離されたマーカー含有ゲノムフラグメントの２個のコピーの存在が確認される（図７参照）。形質転換に用いるフラグメントの外部の配列に結合するチェッキングプライマーを用いることにより、フラグメントが正しいゲノム部位に挿入されたことをさらに確認できる。ＵＲＡコロニーをＦＯＡ培地に移すと、相同組み換えによりＵＲＡ３遺伝子の除去された細胞のみが生育可能であり；ＵＲＡ３遺伝子のポップアウトによりゲノムにマーカーの単一のコピーを獲得している菌株が得られる。
【００８５】
ｈｉｓ３遺伝子座から２０ｋｂの間隔で導入された６個の連続マーカーおよびｕｒａ３遺伝子座から２０ｋｂの間隔で導入された４個の連続マーカーを有する被験菌株もこの方法により構築し、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の原理の証明を行なった（実施例４および５参照）。
【００８６】
マーカーの挿入は簡素な反復過程であり、原則として全てのマーカーを同じ株に１個づつ挿入することにより６１１マーカーを有する株を発生させることができると考えられる。しかしながら、本発明の好ましい実施形態においては、他の方法を用いてマーカーの導入を迅速化することができる。この方法ではマーカーは単一の株に１個づつ導入するのではなく、それらを異なる株に同時に導入し、その後、株同士を交配し、同じ株内に全てのマーカーを蓄積させるのである。
【００８７】
このような方法の一例を図９に示す。マーカーは４０株に導入する。染色体Ｉの１３マーカーを、マーカーＮｏ．１から始めて単一の株、Ｎｏ．１に導入する。染色体ＩＩの５４マーカーは２個の株、Ｎｏ．２およびＮｏ．３に導入する。他の染色体のマーカーも同様の方法で残りの３７株に導入する。各株内のマーカーの位置および数は図９，Ａに示す。この図において、良好に導入できたマーカーを太字で示す。単一の株へのその後の染色体ＩＩの全マーカーの蓄積を促進するために、例えば５マーカーのオーバーラップを用いることができる。従って、株Ｎｏ．２はマーカー１４〜３６を、株ＮＯ．３はマーカー３２〜５４を含む。これらの２つの株は個別に構築することができる。しかしながら、株の構築の迅速化のためには、本発明の好ましい実施形態は、最初にオーバーラップの５マーカーを１つの株に導入し、次に、この株を、逆方向にマーカーが挿入された２個の株に複製する。この方法は例えば５マーカーオーバーラップ領域を有する株２０αおよび２１αの生成に用いられている。或いは、元の５マーカー株を用いて、幾つかの可能な操作法のいずれかにより、逆の交配型の同じ株を生成させて良い。これは株を野生型株と交配するか、頻繁な交配型交代をもたらすＨＯ遺伝子を含むプラスミドで形質転換することにより行なうことができる。本発明のより好ましい実施形態においては、５マーカーを有する株を他の染色体（または染色体中１個より多いオーバーラップ領域がある場合は同じ染色体）の５マーカーオーバーラップ領域を含む別の株と交配させる。この交配から、５マーカーのオーバーラップ領域を両方とも含む２交配型の分離体を取り出す。この操作法は、単一の株内への全てのマーカーのこの蓄積を促進する。
【００８８】
４０株にマーカーを導入した後、株を相互に交配して１つの単一の株内にマーカーを蓄積させる。この目的のためには異なる方法を用いることができる。例えば、株Ｎｏ．１を株２〜４０と交配することにより、別の染色体（１＋２、１＋３等）の特異的マーカーに加えて染色体Ｎｏ．１のマーカーを全てが有している３９株を得ることができる。その後、株Ｎｏ．（１＋２）を株（１＋３）〜（１＋４０）に交配し、株２のマーカーを全ての他の株に蓄積させる。ここで新規株は株１、株２のマーカーおよびその本来のマーカーを有するようになる。この操作法を図９，Ｃに示す。図９，Ｂに示す別の方法は、株１を株２と、株３を株４と等々、交配することにより、５０％株数を低減し、各株内のマーカー数を倍加する。その後、株を再度２個づつ交配し、株数を半減させ、株当たりのマーカー数を倍加する。これらの２通りの方法の複合型も使用できる。この交配方法を促進する別の操作法の１つは同じ染色体をマークする２つの部分的にオーバーラップする株が得られるように部分的にオーバーラップしたゲノム領域にマーカーを挿入することである。このオーバーラップ領域は、例えば、前に説明したとおり５個の隣接するマーカーに相当するものであって良い。
【００８９】
マーカーを単一の株に蓄積させる厳密な方法は本発明では重要ではない。これは多くの方法で行なうことができる。マーカーの導入時においても、株を既に相互に交配し、これにより株数を減らし、株当たりマーカー数を増大できる。構造のマーカーについて、交配による全マーカーの蓄積が困難であることがわかった場合も、欠けているマーカーを図７に示す方法で直接導入できる。
【００９０】
ゲノム内に１７個の人工マーカーを含むコウボ菌株（名称ＳＴＷＷ１１０）は受託番号ＩＨＥＭ１９４１３の下、２００２年６月１４日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔ
ｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｌｏｕｉｓ
Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  ＩＨＥＭ（Ｊ．Ｗｙｔｓｍａｎｓｔｒａａｔ  １４，Ｂ１０５０  Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に対し、Ｋ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｇｒｏｏｔ  Ｂｅｇｉｊｎｈｏｆ  ５９，Ｂ−３０００  Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｎ）の法人代表であるＰｒｏｆ．Ｋｏｅｎｒａａｄ  Ｄｅｂａｃｋｅｒｅ，Ｄｒ．Ｐａｕｌ  Ｖａｎ  Ｄｕｎの代理として、Ｄｒ．Ｊｏｈａｎ  Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ，  Ｄｒ．Ｗｉｍ  Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ，Ｄｒ．Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ  ＤｕｍｏｒｔｉｅｒおよびＤｒ．Ｐａｔｒｉｃｋ  ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋ、により（全てＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋａｓｔｅｅｌｐａｒｋ  Ａｒｅｎｂｅｒｇ  ３１，Ｂ−３００１  Ｈｅｖｅｒｌｅｅ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）により寄託されている。この株は図１０Ａに示した交配方法により得られた。染色体１に６マーカーを含む株１ａを染色体ＩＸ上に５マーカー含む株１７αと交配させた。その親から由来する全マーカーを獲得した分離体の１つ（１１７α）を再度、染色体Ｖ上にさらに６マーカーを含む株１０αと交配させた。この後者の交配の分離体に親マーカーがあるかどうかＰＣＲで分析した。
【００９１】
分析結果を図１０，Ｂに示す。２０個の分離体をマーカーの有無について分析した。これは２段階の方法で行い、全株を先ず４マーカーの存在について分析し、そしてこれらのマーカー全てを含んでいたものだけを残りのマーカーの存在について再度調べた（注記：これら４マーカーのうち３種のみを含んでいた表中の株４Ａは最終分析から除外した）。菌株ＳＴＷＷ１１０（表中の６Ａに相当）はその親由来の全１７マーカーを形質移入していることがわかった。結果はまた、クロスオーバー交配は隣接するマーカー同士で頻繁に起こり、これにより染色体上の隣接領域のマーカーのクロスイン交配が促進され、後のマッピング技術の分解能を向上させることを示している。
【００９２】
人工マーカーは好ましくはゲノムのサイレントな領域、即ち好ましくは２つの隣接する遺伝子の間の非転写領域内に導入される。この方法により、得られたマーカー菌株の表現型は人工ＤＮＡ配列の存在により影響されない。このことは、１７種類のマーカー配列が異なる染色体上の属間領域に挿入されている菌株ＳＴＷＷ１１０について示される。図１０，ＣはＢｉｏｓｃｒｅｅｎ装置（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた本菌株と野生型株の感受性生育速度分析の結果を示すものである。この方法は３０℃でインキュベートした場合の定常期の培養物の濁度増大を測定するものである。元培養物をＹＰＤでＯＤ600０．０５まで希釈した。独立した２種類の培養物を同時に２連で測定した。結果によれば、野生型株と１７マーカー株との間には生育速度に差はない。
【実施例２】
【００９３】
実施例２：マーカーに隣接する希少切断制限部位を有するマーカーを用いたコウボサッカロマイセス・セレビシエの人工マーカー付与株の構築および特定のマーカー含有フラグメントを用いた全コウボゲノムをカバーするゲノムライブラリの構築
このような株の構築は、マーカーとして使用したオリゴヌクレオチドが、特異的オリゴヌクレオチド配列の５’側上流にＦｓｅｌ制限部位を特定するさらに８個のヌクレオチドを含んでいる以外は実施例１に記載した方法と同様にして行なった。これを図６に示す。
【００９４】
Ｆｓｅｌ制限部位を有する連続した人工マーカー（Ｎｏ．１２５〜１２９）を有するＳ２２８Ｃ背景中のＳＴＷＷ１２５〜１２９と命名された菌株は上記した受託番号ＩＨＥＭ１８７２８の下、２００１年６月２１日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託されている。
【００９５】
ＳＴＷＷＷ１１０と命名されＦｓｅｌ認識部位を有する１７マーカーを含む別の菌株は、上記したとおり受託番号ＩＨＥＭ１９４１３の下、２００２年６月１６日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に対しＫ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔにより寄託されている。
【００９６】
例えば、コウボＳ・セレビシエの場合は、Ｆｓｅｌ部位をマーカーに加える（図６Ａ参照）。この酵素はコウボゲノム配列中、僅か１０回切断するのみである。このような株のゲノムＤＮＡをＦｓｅｌを用いて設計する場合、Ｆｓｅｌ部位から隣接するＦｓｅｌ部位まで伸長するゲノムフラグメントが得られる（図６，Ｂ）。例えばマーカーを２０ｋｂの間隔で導入する場合、Ｆｓｅｌ消化フラグメントは約２０ｋｂの長さとなる。その後、消化産物をベクターにクローニングする（図６，Ｃ参照）。このベクターはプラスミドであってよいが、２０ｋｂフラグメントのクローニングのためには、外来性ＤＮＡのより大きいフラグメント（２５ｋｂまで）を収容できるバクテリオファージλを使用するのが好ましい。大腸菌を増殖させた後、得られた形質転換体をマーカーの存在に関してＰＣＲで分析する。次に形質転換体を、マーカー１から始まり最終挿入マーカーで終わるように、秩序のある方法で、例えばマイクロプレート中に保存する（図６．Ｄ）。この方法により、全ゲノムが形質転換体の収集物に現れ、各形質転換体は２０ｋｂフラグメントを含有する。各フラグメントが特異的な人工マーカーを含み、そしてこれらのマーカーの存在がＰＣＲで分析されるため、これは構築、増殖およびライブラリの使用の際にゲノムの各部分が現れることの明確な証明が与えられている最初のゲノムライブラリを構成する。この独特の特徴が本発明の別の重要な要素を構成する。ゲノムライブラリをコウボ菌株に形質転換した後、形質転換体のＤＮＡをプールし、マーカーの存在をマイクロアレイで調べ、全ゲノムが形質転換体の収集物中に存在するかどうか確認することができる。特定の表現型をゲノムの特定の領域における突然変異に逆追跡できれば、野生型遺伝子を含む相当する２０ｋｂフラグメントはソーティングされたゲノムライブラリから容易に取り出すことができ、突然変異株内に形質転換し、相補性に基づいてマッピングされたゲノム領域と同されることを確認できる。
【実施例３】
【００９７】
実施例３：人工マーカーのシリーズおよびシリーズの第１のマーカーに近接して位置する突然変異の間の連結の確認
ｈｉｓ３突然変異を有するＳ２８８Ｃバックグラウンド内の菌株を用い、実施例１において記載した操作法により６個の人工マーカーをｈｉｓ３遺伝子座に隣接して挿入した。第１のマーカーはｈｉｓ３遺伝子座から２０ｋｂの距離に挿入した。他のマーカーは前のマーカーから２０ｋｂの間隔で挿入した。
【００９８】
マーカーは以下の配列からなるものであった。
【００９９】
【化５】
0004490685.tif 000008
【０１００】
この人工的にマークしたｈｉｓ３菌株を野生型ＨＩＳ３遺伝子を有するＳ２８８Ｃ背景中の野生型菌株と交配した。２倍体の菌株を胞子形成培地上で胞子形成させ、標準的な操作法に従って、子嚢壁をチモラーゼ処理した後、数個の子嚢をマイクロマニピュレーターで切開した（Ｓｈｅｒｍａｎ等，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）。分離体をヒスチジン欠乏培地上でヒスチジン栄養要求性について調べた。次に２０個のヒスチジンマイナス（即ちｈｉｓ３）分離体をＰＣＲにより６個の人工マーカーの存在について分析した。２つのプライマーはマーカー（上述）およびゲノム内のマーカーの下流２００〜８００ｋｂのゲノム配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチド（チェッキングプライマー）であった。チェッキングプライマーの配列は以下の通りであった。
【０１０１】
【化６】
0004490685.tif 000009
【０１０２】
結果は以下のとおりである。
【０１０３】
株数
マーカー１：         ２０
マーカー２：         １７
マーカー３：         ７
マーカー４：         ３
マーカー５：         ７
マーカー６：         ４
これらの結果は最も近傍のマーカーであるＮｏ．１がｈｉｓ３突然変異に対する最も強力な連結を示し（突然変異を有していた２０分離体のすべてた最も近傍のマーカーを含んでいる）、また、マーカー２もｈｉｓ３突然変異に対する強力な連結を示している。その後、連結は消失する。ｈｉｓ３突然変異とマーカーとの間に連結がない場合は、統計学的に５０％のｈｉｓ３株がマーカーを有し、残りの５０％が欠いていなければならない。現
時点での結果における５０％からの逸脱は検討した分離体の数が少ないためである。
【０１０４】
第１のマーカーをｈｉｓ３突然変異から２０ｋｂの距離に導入したため、今回の結果は２０ｋｂの距離に渡り強力な連結が存在することが確認された。従って、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の適用において、２０ｋｂ離れた２個のマーカーの間の、マークされた株内の同じ位置に相当する位置において未マーク株内に位置する如何なる突然変異も、突然変異を有する分離体のプールされたＤＮＡ内では、そのマーカーを完全に、またはほぼ完全に消失させる。その結果、突然変異の位置は突然変異に隣接して位置する少なくとも２個のマーカーについて、シグナル強度が急激に低下することにより示される。
【０１０５】
他の実施形態においては、６個の人工マーカーおよび最後と最後から２番目のマーカーの間に位置するＵＲＡ３遺伝子（ｕｒａ３）内の突然変異を有する株を使用した。この株は図９，Ａにおける株９ａに相当し、以下の配列を有するマーカーを含んでいる。
【０１０６】
【化７】
0004490685.tif 000010
【０１０７】
ｕｒａ３突然変異はマーカー１５３と１５４の間、マーカー１５３から１３．７ｋｂの距離、および、マーカー１５４から５．５ｋｂの距離に位置していた。この株を野生型ＵＲＡ３遺伝子を含む野生型と交配し、分離体のウラシル欠乏培地上の生育を分析した。次に２０のウラシルマイナス（ｕｒａ３）分離体を、以下のチェッキングプライマーと組み合わせたマーカープライマーを用いながら、ＰＣＲにより６個のマーカーの存在について分析した。
【０１０８】
【化８】
0004490685.tif 000011
【０１０９】
結果は以下のとおりである。
【０１１０】
ｕｒａ３（−）株数
マーカー１４９：            １１
マーカー１５０：            １５
マーカー１５１：            １８
マーカー１５２：            １９
マーカー１５３：            １９
この結果もまた、突然変異に隣接するマーカー（マーカー１５３および１５４）が突然変異に強力に連結していることを示している。２番目に近いマーカー（１５２）もまたこの例における突然変異に強力に連結している。結果はまた突然変異と最も近傍のマーカーとの間の組み換えは可能であるが、低頻度でしか起こらないことを示している。この例においては、マーカー１５３とｕｒａ３の間に１つのクロスオーバー、そしてマーカー１５４とｕｒａ３との間にもう１つ観察された。組み換えを介して野生型ＵＲＡ３を獲得している全分離体のＤＮＡをプールした場合、最も近傍のマーカーの分析では僅かのみのシグナルが検出されるか、全く検出されなくなる。６マーカーに渡る領域内のクロスオーバーの総数は変動している。２０分離体のうち１０個は全て６マーカーを含んでおり、恐らくはこの領域ではクロスオーバーは起こっていないことが示された。８分離体ではクロスオーバーはマーカーの分布領域内部で１回起こっており、そして１分離体においては、この領域内で２回のクロスオーバーが起こっていた。突然変異と２０ｋｂ未満の距離に位置する隣接マーカーとの強力な連結に加え、結果は、染色体のより大きい領域（＞２０ｋｂ）内のクロスオーバーは十分な頻度で怒り、これにより目的の突然変異を短いゲノム配列にマッピングできるようになることを明らかにしている。後者の領域は一般的には２個の隣接マーカーの間にある配列に相当するが、それは本例よりも大きい領域を含むと考えられる。分離体のプールＤＮＡを用いたマーカー分析が２個の隣接マーカー間の突然変異の位置特定を可能としない場合は、分析により多くの分離体を含めなければならず、或いは突然変異の概ねの位置を突然変異の両側のマーカー強度の増大に基づいて推定することができる（突然変異は一般的にこの領域の中央に位置する）。或いは、分離体を個々に、大部分の場合において突然変異の厳密な位置を示すことになるマーカーの存在について、分析しなければならない。
【０１１１】
これらの結果は今回始めて、完全な人工マーカーを用いて連結分析を行うことができることを示しており、そして今回始めて、連結分析のための人工マーカーの追跡痕による菌株の有用性を示している。
【実施例４】
【０１１２】
実施例４：ｈｉｓ３突然変異に隣接して位置するマーカーの排除および人工マーカー付与株との交配後の未連結のｕｒａ３突然変異に隣接して位置するマーカーの非排除の証明
ｈｉｓ３突然変異およびｕｒａ３突然変異を有するＳ２８８Ｃバックグラウンドの菌株を用いた。ＨＩＳ３およびＵＲＡ３遺伝子は未連結であり、ＨＩＳ３は染色体ＸＶ上に位置し、ＵＲＡ３は染色体Ｖ上に位置する。実施例１に記載した操作法により、６人工マーカーをｈｉｓ３遺伝子座に隣接して挿入し、４人工マーカーをｕｒａ３遺伝子座に隣接して挿入した（図１２Ａ参照）。
【０１１３】
第１のマーカーはｈｉｓ３またはｕｒａ３遺伝子座より２０ｋｂの距離に挿入した。他のマーカーは前のマーカーから２０ｋｂ間隔で挿入した。この菌株はＳＴＷＷ１と命名され、受託番号ＩＨＥＭ１８７３０の下、２００１年６月２１日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｌｏｕｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  ＩＨＥＭ（Ｊ．Ｗｙｔｓｍａｎｓｔｒａａｔ  １４，Ｂ１０５０  Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に対しＤｒ．Ｊｏｈａｎ  Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ，Ｄｒ．Ｐ．ＭａおよびＤｒ．Ｐａｔｒｉｃｋ  ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋ、により（全てＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋａｓｔｅｅｌｐａｒｋ  Ａｒｅｎｂｅｒｇ  ３１，Ｂ
−３００１  Ｈｅｖｅｒｌｅｅ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）により寄託されている。
【０１１４】
ｈｉｓ３突然変異に隣接するマーカーおよび隣接するチェッキングプライマーは以下のとおりである。
【０１１５】
【化９】
0004490685.tif 000012
【０１１６】
この人工マーカー付与ｈｉｓ３ｕｒａ３株を野生型ＨＩＳ３およびＵＲＡ３遺伝子を有するＳ２８８Ｃバックグラウンドの野生型菌株と交配した。２倍体の菌株を胞子形成培地上で胞子形成させ、標準的な操作法に従って、子嚢壁をチモラーゼ処理した後、数個の子嚢をマイクロマニピュレーターで切開した（Ｓｈｅｒｍａｎ等，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）。分離体をヒスチジンまたはウラシル欠乏培地上でヒスチジンおよびウラシル栄養要求性について調べた。次に１０個のヒスチジンプラス（即ちＨＩＳ３）分離体をＨＩＳ３遺伝子座に隣接する６人工マーカーおよびＵＲＡ３遺伝子座に隣接する４人工マーカーの存在について分析した。分離体のＤＮＡを抽出し、プールした。マーカーの存在は、鋳型としてプールされたＤＮＡ１００ｎｇまたは１０ｎｇのいずれかを用いた多重ＰＣＲ、４放射性３３Ｐ−デオキシヌクレオチドを用いた１塩基伸長（図１１，Ａ参照）およびマーカーの総補体を含有するナイロンメンブレンへのハイブリダイゼーションを用いて検出した。結果は図１２，Ｂに示す。それらはｈｉｓ３突然変異に最も近傍のマーカーであるマーカーＮｏ．１が完全に排除され、次の５マーカー並びにｕｒａ３突然変異に隣接する４マーカーが明らかに検出できていることを示している。ゲノムＤＮＡ１０ｎｇを多重ＰＣＲ反応の鋳型として用いた場合（右パネル）、ＨＩＳ３遺伝子座から始まるシグナルの強度に勾配が観察できる。この勾配はマーカーとｈｉｓ３突然変異との間の連結の低下を反映している。
【０１１７】
本実験においては、マーカーをｈｉｓ３突然変異の隣に挿入し、この株を野生型株と交配させた。この技術は本明細書では「リバースＡＭＴＥＭ（登録商標）」と称する。ＨＩＳ３野生型遺伝子の隣へのマーカーの挿入、ｈｉｓ３突然変異体の交配およびｈｉｓ３突然変異体由来のＤＮＡのプールにより、ＤＮＡのプールから第１のマーカーが全く同じ方法で排除されていることは明らかである（これはベーシックＡＭＴＥＭ（登録商標）技術である）。従って本質的に同じ結果が得られ、即ち、第１のマーカーはＤＮＡがプールされる分離体の表現型に関与する遺伝子の位置を示す。
【０１１８】
次の実験においてはガラスマイクロアレイ上にスポットされたマーカーの相補物へのハイブリダイゼーションによりマーカーの検出を行なった。この場合は、ＨＩＳ３分離体由
来のＤＮＡおよびＵＲＡ３分離体由来のＤＮＡの双方をプールし、マーカーの存在を検出した。結果を図１２，Ｃに示す。これらによれば、この場合においてもやはり、ＨＩＳ３分離体のＤＮＡをプールするとＨＩＳ３遺伝子座に最も近傍のマーカーが排除され、ＵＲＡ３分離体のＤＮＡをプールするとＵＲＡ３遺伝子座に最も近傍のマーカーが排除される。
【０１１９】
これらの結果は今回始めて、突然変異体と人工マーカー付与株との間の交配により得られる突然変異体分離体のＤＮＡをプールした場合、突然変異（ゲノムのＤＮＡ配列のいずれかの変化として定義）の位置に近接して位置する人工マーカーが排除され、遠隔部または別の染色体上に位置する人工マーカーは排除されないことを明らかにした。これらは同系の株における遺伝子マッピングのための人工マーカーの有用性を示しており、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の原理を証明している。
【実施例５】
【０１２０】
実施例５：人工マーカー付与株との交配後のゲノム内の未連結位置の突然変異２箇所に近接して位置するマーカーの排除の証明
実施例４で記載したものと同様の株を用いた。人工マーカー付与ｈｉｓ３ｕｒａ３株を野生型ＨＩＳ３およびＵＲＡ３遺伝子を有するＳ２８８Ｃバックグラウンドの野生型菌株と交配した。２倍体の菌株を胞子形成培地上で胞子形成させ、標準的な操作法に従って、子嚢壁をチモラーゼ処理した後、数個の子嚢をマイクロマニピュレーターで切開した（Ｓｈｅｒｍａｎ等，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＵＳＡ）。分離体をヒスチジンまたはウラシル欠乏培地上でヒスチジンおよびウラシル栄養要求性について調べた。次に１６個のヒスチジンプラス（即ちＨＩＳ３）およびウラシルプラス（即ちＵＲＡ３）分離体をＨＩＳ３遺伝子座に隣接する６人工マーカーおよびＵＲＡ３遺伝子座に隣接する４人工マーカーの存在について分析した。１６分離体のＤＮＡを抽出し、プールした。マーカーの存在は、多重ＰＣＲ増幅、蛍光デオキシヌクレオチド（Ｃｙ５標識）を用いた１塩基伸長、スライドガラス上のマイクロアレイフォーマットとしてスポットされたマーカーの相補物とのハイブリダイゼーション、および、蛍光走査法による検出により検出した。結果を図１２，Ｄに示す。
【０１２１】
これらの結果によれば、今回始めて、完全人工マーカーを用いて同系菌株の単回交配により多遺伝子性の表現型に必要な多重突然変異の同時マッピングが行なえることが示され、そして今回始めて、同系菌株の単回交配により多遺伝子性の表現型に必要な多重突然変異の同時マッピングのための人工マーカーの追跡痕による菌株の有用性を示している。
【実施例６】
【０１２２】
実施例６：ゲノム内に多重遺伝子欠失を含む株の構築
公に入手可能な欠失株収集物の以下の１倍体菌株を使用した（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  Ｅ．Ａ．１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，９０１−９０６）（菌株は欠失しているオープンリーディングフレームに従って命名する）。
ＹＬＲ１０２Ｃ，ＹＬＬ０６０Ｃ，ＹＬＬ０１７Ｗ，ＹＬＲ０２３Ｃ，ＹＡＲ０４２Ｗ，ＹＣＬ０１６Ｃ，ＹＭＬ０５８Ｃ−Ａ，ＹＯＬ０４７Ｃ，ＹＬＲ２０５Ｃ，ＹＯＲ３８２Ｗ，ＹＬＲ２２４Ｗ，ＹＯＬ００８Ｗ
これらの株を２個づつ交配して２欠失を有する６系統、即ちＹＬＲ１０２ＣおよびＹＬＬ０６０Ｃに欠失を有するＣＡＴ１１１７株、ＹＬＬ０１７ＷおよびＹＬＲ０２３Ｃに欠失を有するＣＡＴ１１１８株、ＹＡＲ０４２ＷおよびＹＣＬ０１６Ｃに欠失を有するＣＡＴ１１１９株を作成した。
【０１２３】
２重欠失株を交配し、４欠失を有する系統を作成し、例えば、ＣＡＴ１１２０株はＹＬＲ１０２Ｃ、ＹＬＬ０６０Ｃ、ＹＬＬ０１７Ｗ、ＹＬＲ０２３Ｃにおいて欠失を含んでいる。
【０１２４】
次のステップでは、６重欠失株を構築し、例えば４重欠失株ＣＡＴ１１２０を２重欠失株ＣＡＴ１１１９と交配してその両親株中に存在する６欠失を含むＣＡＴ１１２１株を作成した。
【０１２５】
次のステップでは９重欠失株を構築し、例えば６重欠失株ＣＡ１１２１をＹＭＬ０５８Ｃ−Ａ、ＹＯＬ０４７Ｃ、ＹＬＲ２０５Ｃ、ＹＯＲ３８２Ｗ、ＹＬＲ２２４Ｗ、ＹＯＬ００８Ｗにおいて欠失を有する６重欠失株ＥＶＹ５１２３と交配し、ＹＬＲ１２０Ｃ、ＹＬＬ０６０Ｃ、ＹＬＬ０１７Ｗ、ＹＬＲ０２３Ｃ、ＹＡＲ０４２Ｗ、ＹＣＬ０１６Ｃ、ＹＬＲ２０５Ｃ、ＹＬＲ２２４Ｗ、ＹＯＬ００８Ｗに欠失を有する９重欠失株ＥＶＹＣＡＴ１１２１を得た。
【０１２６】
次のステップでは、ＥＶＹＣＡＴ１１２２株をＹＬＲ１０２Ｃ、ＹＬＬ０６０Ｃ、ＹＬＲ０２３Ｃ、ＹＭＬ０５８Ｃ−Ａ、ＹＯＬ０４７Ｃ、ＹＬＲ２０５Ｃ、ＹＯＲ３８２Ｗ、ＹＬＲ２２４Ｗ、ＹＯＬ００８Ｗおいて欠失を有するＥＶＹＣＡＴ１１２３株と交配し、１２個のオープンリーディングフレーム：ＹＬＲ１２０Ｃ、ＹＬＬ０６０Ｃ、ＹＬＬ０１７Ｗ、ＹＬＲ０２３Ｃ、ＹＡＲ０４２Ｗ、ＹＣＬ０１６Ｃ、ＹＭＬ０５８Ｃ−Ａ、ＹＯＬ０４７Ｃ、ＹＬＲ２０５Ｃ、ＹＯＲ３８２Ｗ、ＹＬＲ２２４Ｗ、ＹＯＬ００８Ｗにおいて欠失を有するＥＶＹＣＡＴ１１２４−ＭＡＴａ株を作成した。
【０１２７】
欠失の存在は欠失株収集物中において各欠失を挿入された特定のオリゴヌクレオチドタグ（「ダウンタグ」および「アップタグ」）をプライマーとして用いたＰＣＲにより確認した（Ｗｉｎｚｅｌｅｒ  Ｅ．Ａ．１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，９０１−９０６）。ＥＶＹＣＡＴ１１２４−ＭＡＴａ菌株における１２欠失のＰＣＲによる検出は図１３に示すとおりである。菌株ＥＶＹＣＡＴ１１２４−ＭＡＴａは受託番号ＩＨＥＭ１８７２９の下、２００１年６月２１日にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｌｏｕｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  ＩＨＥＭ（Ｊ．Ｗｙｔｓｍａｎｓｔｒａａｔ  １４，Ｂ１０５０  Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に対しＤｒ．Ｊｏｈａｎ  Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ，Ｄｒ．Ｐ．ＭａおよびＤｒ．Ｐａｔｒｉｃｋ  ｖａｎ  Ｄｉｊｃｋ、により（全てＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋａｓｔｅｅｌｐａｒｋ  Ａｒｅｎｂｅｒｇ  ３１，Ｂ−３００１  Ｈｅｖｅｒｌｅｅ
Ｂｅｌｇｉｕｍ）により寄託されている。
【０１２８】
図１３は株（ＥＶＹＣＡＴ１１２４−ＭＡＴａ）中の突然変異（欠失）の存在を各反応において６ＯＲＦ突然変異に対するプライマー対を用いた多重ＰＣＲにより分析した結果を示している。
【０１２９】
左のレーン：ＹＬＲ１２０Ｃ、ＹＬＬ０６０Ｃ、ＹＬＬ０１７Ｗ、ＹＬＲ０２３Ｃ、ＹＡＲ０４２Ｗ、ＹＣＬ０１６Ｃ
右のレーン：ＹＭＬ０５８Ｃ−Ａ、ＹＯＬ０４７Ｃ、ＹＬＲ２０５Ｃ、ＹＯＲ３８２Ｗ、ＹＬＲ２２４Ｗ、ＹＯＬ００８Ｗ
【実施例７】
【０１３０】
実施例７：ＡＭＴＥＭ（登録商標）遺伝子マッピング技術のためのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ菌
株の発生
ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術はコウボ以外の他の生物にも適用できる。配列決定されたゲノムが利用できることは、マーカーの導入の操作および評価を大きく簡素化する。増大し続けるゲノム配列プロジェクトにより、ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術のために使用できる生物の数も増大する。
【０１３１】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいては、個々の昆虫の卵母細胞を限定数〜コウボで使用される６００ヌクレオチドの全収集物までの範囲で、特定のオリゴヌクレオチドの混合物と共に注入する。コウボで用いたものと同じ方法により子孫のＤＮＡにオリゴヌクレオチドが存在するかどうか調べる。最も多数のマーカーを有する生物を選択する。生物のＤＮＡをフラグメント化し、ベクターに連結する。マーカーに隣接する配列をマーカー内のプライマーおよびベクター内のプライマーを用いて増幅し、その後、配列を決定する。遺伝子の中立の領域に存在するマーカーを異系交配する。その後の交配により、中立の領域に全マーカーを含む昆虫が得られる。この様にして限定数のマーカーを有する昆虫が得られる。形質転換および交配をさらに反復することにより全ゲノムをカバーし、ＡＭＴＥＭ（登録商標）およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓに関る他の手法を実施するために十分な量のマーカーを有する昆虫が得られる。
【０１３２】
別の方法においては、通常の実験用Ｎ２系統には存在しないＴＣ１トランスポゾン挿入を多数有する線虫系統（ＲＷ７０００）を用いる。これらのトランスポゾンは活性であるが、別の突然変異に交雑させると安定化する。トランスポゾンのフランキング配列およびその隣接ゲノム配列を特異的マーカーとして使用することができる。第１の試みにおいて、これらのマーカーの限定数の配列をマイクロアレイに適用する。ＲＷ７０００系統のゲノムＤＮＡおよびトランスポゾンを有さない対照系統のゲノムＤＮＡを用いてマイクロアレイをプローブすることによりマーカーの特異性が解かる。その後の段階において、より多くのトランスポゾン挿入を配列決定し、ＡＭＴＥＭ（登録商標）マッピング技術におけるマーカーとしての有用性を評価する。トランスポゾンの挿入はＲＮＡサイレント化において欠損している突然変異体において高頻度で起こることが解かっている（Ｋｅｔｔｉｎｇ  Ｒ．Ｆ．等，１９９９，ｍｕｔ−７  ｏｆ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，ｒｅｑｕｉｒｅｄ
ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ｉｓ  ａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｎｄ  ＲＮａｓｅ  Ｄ（トランスポゾンのサイレント化およびＲＮＡ干渉に必要なＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｍｕｔ−７はウエルナー症候群ヘリカーゼおよびＲＮａｓｅＤの相同体である），Ｃｅｌｌ  ９９，１３３−１４１）。これは全ゲノムをマーカーでカバーする系統を開発する可能な方法の１つであると考えられる。
【実施例８】
【０１３３】
実施例８：ＡＭＴＥＭ（登録商標）遺伝子マッピング技術のためのマウス系統の作成
マウスへのＡＭＴＥＭ（登録商標）技術の適用はマウスのゲノム配列が完了した時点で促進される。現実的な理由から、マウスの交配は制限されており、マーカーの導入は胚性幹（ＥＳ）細胞において優先的に行なわれる。
【０１３４】
先ずコウボで用いたものと同じセットのマーカーをｌｏｘＰ部位にフランキングされたネオマイシン耐性遺伝子を有するカセットの隣でベクター中にクローニングする。胚性幹細胞をこれらのコンストラクトの混合物で形質転換する。形質転換体をマーカーの導入に関してスクリーニングする。多数の形質転換体を与える細胞を選択し、その後、ネオマイシン耐性遺伝子をＣｒｅリコンビナーゼの導入により除去する。これにより特異的オリゴヌクレオチドマーカーに隣接する３４塩基対の瘢痕が得られる。フランキング配列はＣ．ｅｌｅｇａｎｓの場合と同様にして決定する。好ましくは、マーカーの最小数をコード配列内またはその近傍に導入するように細胞系統を選択する。
【０１３５】
選択された細胞系統を用いてマウスを作成する。これらのマウスの胚性幹細胞を再度用いてマーカーの導入を繰り返す。十分な数のマーカーを有するマウスを交配してより多数のマーカーを有する新世代を作成する。最終的に、全ゲノムをカバーし、ＡＭＴＥＭ（登録商標）および関連技術を実施するために十分な量のマーカーを有するマウスが得られる。
【０１３６】
マウスマーカー系統を作成するためのより好ましい方法は、雄性細胞系統由来のＥＳ細胞を形質転換し、Ｙ染色体損失を起こしている細胞から４倍体胚相補作用により雌性マウスを作成し（ＥＳ細部４倍体マウス）、これらを用いて同じ突然変異を有するＥＳ細胞４倍体雄性動物と交配することであり、これにより、単回の交配サイクル後に同種突然変異仔が得られる（Ｅｇｇａｎ等，２００２，Ｍａｌｅ  ａｎｄ  ｆｅｍａｌｅ  ｍｉｃｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ（４倍体胚相補作用による同胚細胞クローン由来雌雄マウス）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，４５５−４５９）。この方法により多数のマーカーを有する突然変異マウス系統を作成するために必要な時間と経費を実質的に低減できる。
【実施例９】
【０１３７】
実施例９：ＡＭＴＥＭ（登録商標）遺伝子マッピング技術のための植物のマーカー遺伝子型の作成
アラビドプシス・サリアナおよびコメのようなモデル植物種のゲノム配列が最近決定されており、他のゲノム配列も今後解明されるだろう。ＡＭＴＥＭ（登録商標）技術を用いて探索されるゲノムに添ってマーカーを有する植物を作成するために幾つかの方法を用いることができる。
【０１３８】
同じ植物種の幾つかの変異型（生態型）はかなりの量の変異をそのゲノムに有することが知られている。多くのこれらの変異は欠失および挿入である。既存の配列データベースを分析することにより、マーカーとして使用できるほど十分な欠失または挿入が起こったかどうか調べることができる。この場合、これらの欠失および挿入をカバーするオリゴヌクレオチドを有するマイクロアレイを作成する。このマイクロアレイの価値は、アレイの作成に用いた生態系のＤＮＡおよびその子孫のＤＮＡを用いて評価する。
【０１３９】
この変異が十分でない場合は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓまたはマウスを用いる場合と同様の操作法を用いる。アラビドプシス植物を適当な形質転換ベクター内に作成した多数のオリゴヌクレオチドの混合物で形質転換する。多数の組込みオリゴヌクレオチドを有する植物をマイクロアレイ技術により選択する。挿入されたオリゴヌクレオチドに隣接するＤＮＡ配列を両側とも決定する。ゲノムの中立的な領域に存在するマーカーを異系交配し、新たに交配して最大量のマーカーを中立的領域に含む植物を作成する。ここでもまたさらに形質転換および交配を行なうことにより所望の数および間隔のマーカーを有する植物を得ることができる。
【０１４０】
特にアラビドプシスにおいては、突然変異遺伝子型の大規模な収集物が突然変異誘発またはランダムＴ−ＤＮＡまたはトランスポゾンタグ付けにより得られている。大部分の場合において、これらの植物は遺伝子の発現を途絶させ、選択可能な表現型を得るために作成されている。しかしながら、これらの系統の多くはまた非コード領域への挿入を有しており、マッピングのためのマーカーとして使用される。従って、既存または作成されたこれらの突然変異の収集物は主に非コード領域の遺伝子修飾の存在についてスクリーニングされるか、または新規突然変異遺伝子型を形質転換および／または突然変異誘導により作成する。スクリーニングは発現された遺伝子（ｃＤＮＡ）および全ＤＮＡへの示差的マイ
クロアレイハイブリダイゼーション、および、後者のマイクロアレイにのみ、またはこれに優先的にハイブリダイズする遺伝子型の選択により行なわれる。或いは、種々の植物組織からｃＤＮＡを取り出すことにより非コードＤＮＡでランダムＤＮＡ配列を増大させることにより得られる非コードＤＮＡのみ、またはこれを優先に含むマイクロアレイを構築する。次にこのような非コードマイクロアレイを用いて外来性ＤＮＡ挿入を検出し、その後の配列分析によりゲノムに挿入されたＤＮＡの位置を明らかにする。さらに形質転換および交配を選択された植物について行なうことによりゲノム内に均一な間隔を置いて存在するマーカーを多数有する植物が得られる。
【０１４１】
或いは、相同組み換えを用いることによりゲノムの所望の位置にマーカー配列を挿入する。相同組み換えを介した遺伝子ターゲティングは可能であるが、現時点では大部分の植物種ではまだ極めて効率的とは言えない（Ｋｅｍｐｉｎ等，１９９７，Ｔａｒｇｅｔｅｄ
ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（アラビドプシスにおけるターゲティング分裂），Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，８０２−８３０）。かなりの研究が相同組み換え頻度の向上に向けられている（Ｈａｎｉｎ等，２００１，Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（アラビドプシスにおける遺伝子ターゲティング），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２８，６７１−６７７）。アラビドプシスにおける形質転換の高い効率とＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ検出に基づく効率的なスクリーニングシステムの組み合わせにおいて、相同組み換えを介してマーカー配列を多数保有する植物の作成が可能となる。
【０１４２】
コウボと同等の効率の相同組み換えはコケであるフィスコミトレラ・パテンスにおいて可能である（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ＤＧ，Ｚｒｙｄ  ＪＰ，１９９７，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｓｓ  Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（コケであるフィスコミトレラ・パテンスにおける効率的な遺伝子ターゲティング），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１，１１９５−１２０６）。この生物の全ゲノム配列が入手可能になれば、多数のマーカー配列を有するこの種の植物を作成することが可能になり、ゲノムマウスピース研究におけるマークされた遺伝子型のモデルとしてこれらの植物が使用できるようになる。ゲノムの大部分がコケおよびアラビドプシスまたはコメにおいて保存されており、既知のゲノム配列との相同性を介してコケのゲノムの特定の領域を選択して配列決定し、そしてこれらの選択された領域にマーカーを挿入することも可能である。この場合、全てのコケのゲノム配列を決定する必要はない。
【０１４３】
相同組み換えによる外来ＤＮＡの組込みはＤＮＡ２重鎖切断を修復するために細胞が用いるミスマッチ修復システムと関連していることがわかっている。この植物種で相同組み換えがこのように効率的である理由を、例えばミスマッチ修復システムの電子をターゲティングすることによって理解することは、他の植物の相同組み換えの制御を解明するのに有益である。植物内のマーカー遺伝子型の作成に用いられる方法は本発明において重要ではなく、そのために使用する技術の如何なる進歩も本発明の有効性には影響しない。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】人工マーカー追跡痕除外マッピング（ＡＭＴＥＭ（登録商標））技術の概略図であり、（Ａ）染色体内のマーカーの存在、（Ｂ）コウボゲノムに渡るマーカーの分布、および（Ｃ）本発明の実施形態のマーカーによるアレイの提示を示す。
【図２】本発明の実施形態の１突然変異のマッピングを示す。
【図３】本発明の実施形態の２突然変異のマッピングを示す。
【図４】本発明の実施形態の重複して突然変異した株に生じる表現型のマッピングを示す。
【図５】本発明の実施形態の１突然変異のマッピングを示し、ここでは、人工マーカー付与株を突然変異性とすることにより、その後マッピングされる表現型を得ている。
【図６】本発明の実施形態による人工マーカーへの希少な制限部位の導入およびその後のゲノムライブラリの発生を示す。
【図７】本発明の実施形態によるコウボゲノムへの人工マーカーの導入の操作法を示す。
【図８】本発明の実施形態の挿入マーカーの検出を示す。
【図９】（Ａ）マーカーのクラスターを含む種々の株の概略図（株は垂直の列に示す）、ＢおよびＣは本発明の実施形態に従ってマーカーを蓄積させる別法を示す。
【図１０】全ての親マーカーを含む単一の株への部分的にマークされた株のマーカーの形質移入のための交配方法（パネルＡ）の本発明の実施形態を示す。パネルＢは最終交配の種々の分離体のマーカーの存在を示す。パネルＣは野生型株と比較した場合のマークされた株の生育速度分析を示す。
【図１１】本発明の実施形態を示し、パネルＡは導入されたマーカーの検出のためのＰＣＲ増幅方法を示す。パネルＢは株ＳＴＷ１００上の多重ＰＣＲ反応によるマーカーの検出を示す。
【図１２】本発明の実施形態による、１突然変異（Ｂ、Ｃ）または２突然変異（Ｄ）に隣接して位置する人口マーカーの排除を示す。
【図１３】本発明の実施形態による１２遺伝子欠失を有する多重突然変異したコウボ株の例を示す。突然変異（欠失）の存在は多重ＰＣＲにより、各反応において６ＯＲＦ突然変異に対するプライマー対を用いながら分析する。
【図１】
0004490685.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004490685.tif 000017
【図６】
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【図７】
0004490685.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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