(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞又は植物組織を熱処理及び遠心処理することを伴う、アグロバクテリウム属細菌を介して行われる植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法。
【請求項２】
植物細胞又は植物組織を熱処理及び遠心処理した後、遺伝子導入処理を行う請求項１記載の方法。
【請求項３】
熱処理が３３℃〜６０℃の温度範囲で行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
熱処理が３５℃〜５５℃の温度範囲で行われる請求項３記載の方法。
【請求項５】
熱処理が３７℃〜５２℃の温度範囲で行われる請求項４記載の方法。
【請求項６】
熱処理が５秒間〜２４時間の範囲で行われる請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
３７℃〜５２℃の温度下で１分間〜２４時間熱処理を行う請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
遠心処理が１００Ｇ〜２５万Ｇの遠心加速度の範囲で行われる請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
遠心処理が５００Ｇ〜２０万Ｇの遠心加速度の範囲で行われる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
遠心処理が１０００Ｇ〜１５万Ｇの遠心加速度範囲で行われる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
遠心処理が１秒間〜４時間の範囲で行われる請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
用いる植物細胞又は植物組織が被子植物由来である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
用いる植物細胞又は植物組織が単子葉植物由来である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
用いる植物細胞又は植物組織がイネ科植物由来である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
用いる植物細胞又は植物組織がイネ、トウモロコシ又はシバである請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アグロバクテリウムによる形質転換法は、一般的に、効率が高い、導入される遺伝子のコピー数が少ない、T-DNAという特定の領域を断片化させることなく導入できる、短期間の培養により形質転換体を得ることができるため培養変異が少ないなど、多くの優れた特徴を持っている。このため、さまざまな植物種で最も有用な形質転換の手段として広く用いられている。
【０００３】
このように、アグロバクテリウム法は非常に優れた植物の形質転換方法であるが、形質転換の成否ならびに効率は、植物種、遺伝子型ならびに用いる植物組織に依存して大きく異なるのが実状である（Potrykus et al. 1998(参考文献(36))）。すなわち、形質転換に成功していない植物種があるほか、ごく一部の品種のみ形質転換が可能な植物種も多い。また、利用可能な組織が限定されており大量の材料を取り扱うことができない植物種もある。遺伝子組換えにより実用的な品種を作出するには、多数の形質転換植物を作出した上で、目的とする形質を持った系統を選抜する必要がある。しかしながら、この目的に即し多数の形質転換体を容易に得ることができる作物の種類は、現状では一部に限定されている。したがって、このような問題点を解決することができる改良手法の開発が強く望まれている。
【０００４】
アグロバクテリウムを介する形質転換方法自体は、植物種により供試材料や培養に用いる培地の組成などを異にするものの、材料となる組織にアグロバクテリウムの懸濁液を接触させ、共存培養の後に形質転換細胞の選抜を行い、形質転換植物を作出するという操作ではほぼ共通している。材料となる植物組織には対しては、通常、必要に応じ滅菌処理を行うがそれ以外に特別な処理を施すことなくアグロバクテリウムの感染が行われる（Rogers et al. 1988(参考文献(37)), Visser 1991(参考文献(41)), McCormick 1991(参考文献(31)), Lindsey et al. 1991(参考文献(30))）。従って、形質転換系の改良は、アグロバクテリウムの菌系、ベクター構成、培地組成、選抜マーカー遺伝子やプロモーターの種類、供試組織の種類などを中心に研究が行われてきた。
【０００５】
これに対し、アグロバクテリウムを接種する前の植物組織を、遺伝子導入が生じやすい生理的状態に変換するという考え方に基づく研究は、ほとんど行われていない。何らかの簡便な処理により、そのような生理的状態に変換することができればたいへん利用価値が高く、遺伝子導入効率の向上に加え、従来困難であった植物種や遺伝子型の形質転換を可能にする顕著な効果も期待される。これまでの植物組織への前処理に関する研究例としては、パーティクルガン(Bidney et al., 1992(参考文献(6)))および超音波(Trick H.N. et al., 1997(参考文献(40)))処理が上げられる。どちらも物理的に組織を付傷することでバクテリアの植物組織内への侵入を促し、感染対象となる植物細胞を増加させることを目的としている。しかしながら、これは従来より広く行われているリーフディスク法(Horsch et al., 1985(参考文献(19)))を発展させたものに過ぎず、新規な考え方に基づく処理法ではない。なお、効果の程度や汎用性は明らかでなく、一般的な手法として用いられていないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、従来のアグロバクテリウム法による遺伝子導入方法よりも高い効率で組織を付傷することなく簡便に遺伝子導入を行うことができる、植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入方法において、遺伝子導入に供する植物細胞又は植物組織を熱処理及び遠心処理することにより、遺伝子導入効率を有意に向上させることができることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、植物細胞又は植物組織を熱処理及び遠心処理することを伴う、アグロバクテリウム属細菌を介して行われる植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法では、アグロバクテリウム属細菌を介した遺伝子導入方法において、遺伝子を導入する植物細胞又は植物組織を熱処理及び遠心処理することを伴う。植物細胞又は植物組織は、熱処理及び遠心処理した後、常温及び通常の重力下でアグロバクテリウム属細菌と接触させてもよいし、熱処理及び／又は遠心処理しながらアグロバクテリウム属細菌と接触させてもよい。また、アグロバクテリウム属細菌と接触させる前に熱処理及び遠心処理を行う場合、これらの処理は同時に行ってもよいし、いずれかの処理を先に行った後にもう一方の処理を行ってもよい。
【００１０】
熱処理条件は、用いる植物の種類や熱処理する細胞又は組織の量等に応じて適宜選択されるが、通常、３０℃〜６０℃、好ましくは３３℃〜５５℃、さらに好ましくは３７℃〜５２℃程度の温度範囲で行われる。また、熱処理の時間は、熱処理温度、用いる植物の種類及び熱処理する細胞又は組織の種類等に応じて適宜選択されるが、通常５秒間〜２４時間程度である。なお、熱処理時間は、熱処理温度が高い場合には短くても遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。例えば、熱処理温度が６０℃の場合には５秒間程度の熱処理時間でも遺伝子導入効率を有意に向上させることができる場合がある。一方、熱処理温度が３４℃程度の低温の場合には、数十時間の熱処理により遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。特に好ましい熱処理条件は、３７℃〜５２℃で１分間〜２４時間程度の場合が多いが、その植物細胞又は植物組織にとっての適切な熱処理条件は、ルーチンな実験により容易に設定することができる。なお、植物細胞又は植物組織を５５℃以上の温度で長時間にわたって熱処理すると、植物細胞がダメージを受け、形質転換効率が低下する場合があるので、熱処理温度が５５℃以上の場合には、熱処理時間を短くし、例えば３分間以下、好ましくは１分間以下程度に設定して植物細胞がダメージを受けないようにすることが好ましい。
【００１１】
遠心処理条件は、用いる植物の種類等に応じて適宜選択されるが、通常、１００Ｇ〜２５万Ｇ、好ましくは５００Ｇ〜２０万Ｇ、さらに好ましくは１０００Ｇ〜１５万Ｇ程度の遠心加速度範囲で行われる。また、遠心処理の時間は、遠心加速度及び用いる植物の種類等に応じて適宜選択されるが、通常１秒間以上行うことが好ましい。なお、遠心時間の上限は特にないが、通常、１０分間程度で目的を達成することができる。なお、遠心処理時間は、遠心加速度が大きい場合には極めて短い時間、例えば１秒以下でも遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。一方、遠心加速度が小さい場合には、遠心処理を長く行うことにより遺伝子導入効率を有意に向上させることができる。特に好ましい遠心処理条件は、５００Ｇ〜２０万Ｇ、特には１０００Ｇ〜１５００００Ｇで１秒間〜２時間程度の場合が多いが、その植物細胞又は植物組織にとっての適切な遠心処理条件は、ルーチンな実験により容易に設定することができる。
【００１２】
本発明の方法は、アグロバクテリウム属細菌と接触させる植物細胞又は植物組織として熱処理及び遠心処理したものを用いる、又は熱処理、遠心処理を行いながらアグロバクテリウム属細菌と接触させることを特徴とするものであり、アグロバクテリウム属細菌を用いた遺伝子導入あるいは形質転換方法自体としては、周知の方法をそのまま適用することができる。
【００１３】
アグロバクテリウム属細菌を用いた植物への遺伝子導入あるいは形質転換方法自体は、この分野において周知であり、広く用いられている。
【００１４】
土壌細菌アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（crown gall disease）を引き起こすことは古くから知られており、1970年代には、Tiプラスミドが病原性に関与すること、さらにTiプラスミドの一部であるT-DNAが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後このT-DNAには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。T-DNAの切り出しと植物への伝達にはTiプラスミド上のヴィルレンス領域（vir領域）に存在する遺伝子群が必要であり、またT-DNAが切り出されるためにはT-DNAの両端に存在するボーダー配列が必要である。他のアグロバクテリウム属細菌であるAgrobacterium rhizogenesもRiプラスミドによる同様なシステムを有している（図３及び図４）。
【００１５】
アグロバクテリウムの感染によってT-DNAが植物ゲノムに組み込まれるので、T-DNA上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれることが期待された。しかしながら、Tiプラスミドは190kb以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学手法ではプラスミド上のT-DNA上に遺伝子を挿入することは困難であった。そのため、T-DNA上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。
【００１６】
まず、腫瘍性のTiプラスミドのT-DNAからホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型の菌系（disarmed strains）であるLBA4404(Hoekema et al., 1983(参考文献(14)))、C58C1(pGV3850) (Zambryski et al., 1983(参考文献(44)))、GV3Ti11SE(Fraley et al., 1985(参考文献(10)))などが作製された（図３）。これらを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリウムのTiプラスミドのT-DNA中に、あるいは所望の遺伝子を有するT-DNAをアグロバクテリウムに導入する2種類の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディスアーム型TiプラスミドのT-DNA領域中に、三系交雑法（triparental mating）(Ditta et al., 1980(参考文献(9)))を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる(Fraley et al., 1985(参考文献(10)); Fraley et al., 1983(参考文献(11)); Zambryski et al., 1983(参考文献(44))、特開昭59-140885号（EP116718）)。もう一つは、バイナリーベクター（binary vector）法とよばれるもので（図３）、T-DNAの植物への組み込みにvir領域が必要であるが、機能するために同じプラスミド上に存在する必要はないという結果(Hoekema et al., 1983(参考文献(14)))に基づいている。このvir領域にはvirA、virB、virC、virD、virE及びvirGが存在し、（植物バイオテクノロジー事典（エンタプライズ株式会社発行（1989）））、vir領域とはこのvirA、virB、virC、virD、virE及びvirGの全てを含むものをいう。したがって、バイナリーベクターは、T-DNAをアグロバクテリウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをディスアーム型Tiプラスミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入には、エレクトロポレーション法や三系交雑法などの方法により行うことができる。バイナリーベクターには、pBIN19(Bevan, 1984(参考文献(5)))、pBI121(Jefferson, 1987(参考文献(21)))、pGA482(An et al., 1988(参考文献(2))、特開昭60-70080号（EP120516）)などがあり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーベクターが構築され、形質転換に用いられている。また、Ri プラスミドのシステムにおいても、同様なベクターが構築され形質転換に用いられている。
【００１７】
アグロバクテリウムA281(Watson et al., 1975(参考文献(42)))は、強病原性（super-virulent）の菌系であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他の菌系より高い(Hood et al.,1987(参考文献(15)); Komari, 1989(参考文献(23)))。この特性は、A281が有するTiプラスミドのpTiBo542によるものである(Hood et al., 1984(参考文献(18)); Jin et al., 1987(参考文献(22)); Komari et al., 1986(参考文献(26)))。
【００１８】
pTiBo542を用いて、これまでに2つの新しいシステムが開発されている。一つはpTiBo542のディスアーム型のTiプラスミドを有する菌系EHA101(Hood et al., 1986(参考文献(17)))およびEHA105(Hood et al., 1993(参考文献(16)))を用いたものであり、これらを上述のバイナリーベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の植物の形質転換に利用されている。もう一つは、スーパーバイナリーベクター（'super-binary' vector）(Hiei et al., 1994(参考文献(13)); Ishida et al., 1996(参考文献(20)); Komari et al., 1999(参考文献(28))、WO94/00977号、WO95/06722号)システムである（図４）。このシステムは、vir領域（virA、virB、virC、virD、virE及びvirG（以下、これらをぞれぞれ「vir断片領域」ということもある。））を持つディスアーム型のTiプラスミドおよびT-DNAを有するプラスミドからなることから、バイナリーベクターシステムの一種である。しかしながら、T-DNAを有する側のプラスミド、即ちバイナリーベクターにvir断片領域のうち、少なくとも一つのvir断片領域を実質的に取除いたvir領域の断片（このうち好ましくは少なくともvirB又はvirGを含む断片、さらに好ましくはvirB及びvirGを含む断片）を組み込んだ(Komari, 1990a(参考文献(24)))スーパーバイナリーベクターを用いる点で異なる。なお、スーパーバイナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の遺伝子を組み込んだT-DNA領域を導入するには、三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる(Komari et al., 1996(参考文献(27)))。このスーパーバイナリーベクターシステムは、上述の種々のベクターシステムと比べて、多くの植物種で非常に高い形質転換効率をもたらすことが明らかとなっている(Hiei et al., 1994(参考文献(13)); Ishida et al., 1996(参考文献(20)); Komari, 1990b(参考文献(25)); Li et al., 1996(参考文献(29)); Saito et al., 1992(参考文献(38)))。
【００１９】
本発明の方法においては、宿主となるアグロバクテリウム属細菌としては、特に限定されないが、Agrobacterium tumefaciens （例えば上述のAgrobacterium tumefaciens LBA4404(Hoekema et al., 1983(参考文献(14)))およびEHA101(Hood et al., 1986(参考文献(17))）を好ましく用いることができる。
【００２０】
本発明の方法によれば、アグロバクテリウム属細菌における病原性（vir）領域の遺伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく有意な効果を得ることができる。したがって、上述の中間ベクター、バイナリーベクター、強病原性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなどいずれのベクターシステムに対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができる。これらのベクター類を改変した異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、アグロバクテリウム属細菌のvir領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド中に組み込む、vir領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてアグロバクテリウムに導入するなど）。また、当然ではあるが本発明の方法によれば、野生型のアグロバクテリウム属細菌においても、植物へ野生型のT-DNA領域の導入効率を高め、事実上感染効率を向上することができる。
【００２１】
植物に導入しようとする所望の遺伝子は、上記プラスミドのT-DNA領域中の制限酵素部位に常法により組み込むことができ、当該プラスミドに同時に若しくは別途組込んだカナマイシン、パロモマイシン等の薬剤に対する耐性を有する遺伝子等の適当な選択マーカーに基づいて選択することができる。大型で多数の制限部位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では所望のDNAをT-DNA領域内に導入することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には、三系交雑法により、アグロバクテリウム属細菌の細胞内での相同組換えを利用することで目的のDNAを導入することができる。
【００２２】
また、プラスミドをAgrobacterium tumefaciens等のアグロバクテリウム属細菌に導入する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法やエレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法などが含まれる。
【００２３】
植物に導入しようとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的にはT-DNAの左右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界配列の数は１つでもよく、複数の遺伝子を異なる部位に配置しようとする場合には、境界配列が3個以上あってもよい。また、アグロバクテリウム属細菌中で、TiまたはRiプラスミド上に配置されてもよく、または他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
【００２４】
アグロバクテリウム属細菌を介して遺伝子導入を行う方法は、植物細胞又は植物組織をアグロバクテリウム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、１０6 〜１０11細胞／ｍｌ程度の細胞濃度のアグロバクテリウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に植物細胞又は植物組織を３〜１０分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。
【００２５】
遺伝子導入に供される細胞又は組織は、何ら限定されるものではなく、葉、根、茎、実、その他いずれの部位であってもよいし、カルスのような脱分化したものでも脱分化していない胚等であってもよい。また、植物の種類も何ら限定されないが、被子植物が好ましく、被子植物ならば双子葉植物でも単子葉植物でもよい。
【００２６】
下記実施例において具体的に示されるように、本発明の方法によれば、従来のアグロバクテリウム法に比較して、遺伝子導入の効率が有意に向上する。また、従来からアグロバクテリウム法により遺伝子導入が可能であった植物の遺伝子導入効率が向上するだけではなく、従来のアグロバクテリウム法によっては遺伝子導入することができなかった植物に対しても本発明の方法により遺伝子導入が初めて可能になった。従って、本発明における「遺伝子導入の効率の向上」には、従来の方法では遺伝子導入が不可能であったものを可能にすることも包含される（すなわち、従来０％であった遺伝子導入効率を向上させたと考える）。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
(1)  供試組織および供試菌系
ジャポニカイネの朝の光を供試品種とし、未熟胚を材料として用いた。供試未熟胚は、開花後1〜2週間の未熟種子から採取し、Hiei, Y., et al. (参考文献(13))の方法により調製した。すなわち、開花後、７〜１２日目の未熟種子を頴を除去した後、70% エタノールに３０秒、1%次亜塩素酸ナトリウムに１０分間浸漬することにより消毒した後、未熟胚を取り出し供試材料とした。また、未熟胚由来カルスは、未熟胚を4g/l Gelriteを含む2N6培地（Hiei et al. 1994(参考文献(13))、（Ｎ6 の無機塩およびビタミン類（Chu C. C. 1978(参考文献(8))、1 g/l カザミノ酸、2 mg/l  ２，４−Ｄ））上で2週間培養することにより得た。
【００２９】
アグロバクテリウムの菌系及びプラスミドベクターとして、LBA4404(pIG121Hm)(Hiei et al., 1994(参考文献(13)))、LBA4404(pNB131)（図２参照）、LBA4404(pTOK233) (Hiei et al., 1994(参考文献(13)))を用いた。
【００３０】
pNB131の構築は、以下のように行った。pSB31(Ishida Y, 1996(参考文献(20))を大腸菌LE392株に導入した後、Triparental mating法(Ditta G, 1980(参考文献(9))により、pNB1(Komari T et al., 1996(参考文献(27))を有するアグロバクテリウムLBA4404株に導入した。アグロバクテリウム内でpNB1とpSB31の間の相同組換えによりpNB131を得た。
【００３１】
pIG121HmのT-DNA領域には、ノパリン合成酵素(nos)遺伝子のプロモーターにより制御されるカナマイシン耐性(nptII)遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の３５Ｓプロモーターにより制御されるハイグロマイシン耐性(hpt)遺伝子、３５Ｓプロモーターにより制御されヒマのカタラーゼ遺伝子のイントロンが介在するGUS遺伝子(Ohta, S. et al., 1990(参考文献(33))を有する。
【００３２】
pNB131のT-DNA領域には、３５Ｓプロモーターにより制御されるbar遺伝子、３５Ｓプロモーターにより制御されイントロンが介在するGUS遺伝子（上述）を有する。
【００３３】
pTOK233のT-DNA領域には、nosプロモーターにより制御されるnptII遺伝子、３５Ｓプロモーターにより制御されるhpt遺伝子、３５Ｓプロモーターにより制御されイントロンが介在するGUS遺伝子（上述）を有する。pTOK233は形質転換能力が高いスーパーバイナリーベクター(Komari, T. et al., 1999(参考文献(28)))である。
【００３４】
(2)  熱処理
供試組織５〜２００ｍｇを2 mlの滅菌水の入ったチューブに浸漬した。チューブを各処理温度に設定したウォーターバスに数秒〜数十時間浸漬することにより熱処理を行った。熱処理終了後、チューブは流水で冷却した。
【００３５】
(3)  遠心処理
供試組織を滅菌水の入った遠心用チューブに浸漬し、25℃、20,000Gで1分ないし60分の遠心処理を行った。
【００３６】
(4)  接種および共存培養
熱もしくは遠心処理、あるいは組合せて処理した後、チューブ内部の滅菌水を除き、アグロバクテリウムの懸濁液を加え、5〜30秒間ボルテックスミキサーにより攪拌した。バクテリア懸濁液の調製はHiei, Y. et al.,(参考文献(13))によった。すなわち、ＡＢ培地（Chilton, M-D., et al., 1974(参考文献(7))）上で３〜１０日間培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかきとり、修正ＡＡ培地（ＡＡ主要無機塩類、ＡＡアミノ酸及びＡＡビタミン類（Toriyama K. et al., 1985(参考文献(39))）、ＭＳ微量塩類（Murashige, T. et al., 1962(参考文献(32))）、1.0 g/l カザミノ酸、100 μＭアセトシリンゴン、0.2 M ショ糖、0.2 M グルコース）に懸濁した。また、懸濁液の菌密度は、約0.3〜1 x 109 cfu/mlに調整した。約5分間室温で静置した後、共存培養用の培地に置床した。共存培養の培地には、8g/l アガロースを培地固化剤とした2N6-AS（Hiei et al. 1994(参考文献(13))）を用いた。25℃、暗黒下で3〜7日間共存培養した後、未熟胚の一部を、 Hieiら（1994）(参考文献(13))の方法によりX-Gluc処理によるGUS遺伝子の発現調査に供した。すなわち、共存培養処理直後、組織を0.1% Triton X-100 を含む0.1 M リン酸緩衝液(pH6.8)に浸漬し、３７℃で１時間静置した。リン酸緩衝液でアグロバクテリウムを除去した後、1.0 mM  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸(X-gluc)および20% メタノールを含むリン酸緩衝液を添加した。３７℃で２４時間処理した後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察した。
【００３７】
(5)  形質転換細胞の選抜（ジャポニカイネ）
共存培養後、肥大生長した未熟胚の胚盤部位をメスにより4〜7分割した後、選抜薬剤を含まない2N6培地（上述）で数日間30℃明条件下で培養した。次に、50〜100 mg/lハイグロマイシン含む2N6培地上に移植し、30℃明条件下で約2〜3週間培養した。なお、10mg/lフォスフィノスリシン(PPT)を選抜薬剤に含む培地には、 2 mg/lの2.4-Ｄを含みココナッツ水を除いたCC培地（Potrykus et al. 1979(参考文献(34))）を用いた。培地上に形成された薬剤耐性カルスを、それぞれ同濃度の選抜薬剤を含むN6-7培地（Hiei et al. 1994(参考文献(13))）に移植し、7日間30℃明条件下で2次選抜を行った。各培地には250 mg/lセフォタキシムと250 mg/l カルベニシリン二ナトリウムを組み合わせ、もしくは250 mg/lセフォタキシムを単独で添加した。また培地固化剤には、4g/l Gelriteを用いた。培地上で増殖した薬剤耐性カルスに X-Gluc処理を行い、上記の方法によりGUS遺伝子の発現を調査した。
【００３８】
(6)  結果
熱および遠心を組合せおよび単独で未熟胚に処理し、LBA4404(pIG121Hm)およびLBA4404(pNB131)との共存培養した後のGUS遺伝子の一過性発現の結果を表1および表2に示した。無処理区に比べ、熱処理もしくは遠心処理を行った場合に、胚盤におけるGUS発現領域は明らかに広く、より高頻度で遺伝子導入が生じていた。さらに、熱と遠心処理を組み合わせることにより、その頻度がさらに高くなった。
【００３９】
イネ未熟胚とアグロバクテリウムを共存培養した後、選抜薬剤を含む培地上で培養して得られた形質転換カルスの選抜結果を表-3、表-4および表-5に示した。薬剤耐性かつ一様なGUS遺伝子の発現を示す形質転換カルスが得られる効率は、いずれの試験においても、熱または遠心処理を行うことにより、顕著に向上した。また、熱および遠心処理を組み合わせることで、それぞれの単独処理よりもさらに形質転換効率が向上した（表3、表4、表5）。以上のように、イネ未熟胚へ熱および遠心処理を組合せて行うことにより、それぞれ単独の処理よりもさらに高い頻度で形質転換できることが明らかとなった。
【００４０】
また、品種の違いなどによって遠心処理単独で遺伝子導入の効果が低い場合には、熱処理を併用することによって遺伝子導入効率が顕著に向上し、その効果は熱処理単独区より高頻度となることも確認した。さらに、遠心処理時に遠心機の温度設定を40℃前後とすることで、遠心と熱の同時処理が可能であり、上記の組み合わせ処理と同様な効果があることを確認している。
【００４１】
Hiei et al. (1994)（参考文献(13)））は、イネのカルスを材料として比較的高い効率で形質転換が行うことができることを報告している。また、Aldemita RR et al.,(参考文献(1))は、イネの未熟胚を用いた形質転換例を報告している。これらの形質転換手法をより効率よく安定して実施するために、上述した組み合わせ処理法は非常に有効である。特に、未熟胚は栽培環境に左右されやすく形質転換に好適な未熟胚材料を常時得ることは容易ではないが、組み合わせ処理を施すことにより安定した高い形質転換効率を維持することが可能である。Hiei et al. (1994(参考文献(13))は、形質転換能力の高いベクターであるスーパーバイナリーベクターがイネの形質転換効率を向上させることを示した。また、Aldemita RR. et al., 1996(参考文献(1))によれば、スーパーバイナリーベクターのLBA4404(pTOK233)を用いた試験においてのみ、形質転換体を得ている。本研究における組み合わせ処理法は、通常のバイナリーベクターを用いた場合においても、スーパーバイナリーベクターに匹敵するか、それ以上の遺伝子導入効率を得ることができる。また、スーパーバイナリーベクターと組み合わせ処理法を併用することにより、より一層効率を向上させることが可能である。さらに、組み合わせ処理法を用いることにより、これまで全く形質転換体を得ることができなかった品種においても形質転換体を得ることができるものと推察される。
【００４２】
【表１】
表1  熱・遠心処理と未熟胚胚盤におけるGUS遺伝子の一過性発現（品種：朝の光）
0004428757.tif 000002
供試菌系：LBA4404(pIG121Hm), 共存培養期間：5日
【００４３】
【表２】
表2  熱・遠心処理と未熟胚胚盤におけるGUS遺伝子の一過性発現（品種：朝の光）
0004428757.tif 000003
供試菌系：LBA4404(pNB131), 共存培養期間：6日
【００４４】
【表３】
表3  未熟胚への熱・遠心処理と形質転換カルスの選抜効率（品種：朝の光）
0004428757.tif 000004
供試菌系：LBA4404(pIG121Hm), 共存培養期間：5日, Hm：100mg/lハイグロマイシン
【００４５】
【表４】
表4  未熟胚への熱・遠心処理と形質転換カルスの選抜効率（品種：朝の光）
0004428757.tif 000005
供試菌系：LBA4404(pIG121Hm), 共存培養期間：6日, Hm：100mg/lハイグロマイシン
【００４６】
【表５】
表5  未熟胚への熱・遠心処理と形質転換カルスの選抜効率（品種：朝の光）
0004428757.tif 000006
供試菌系：LBA4404(pNB131), 共存培養期間：6日, PPT：10mg/lフォスフィノスライシン
【００４７】
実施例２
大きさ約1.2 mmのトウモロコシ未熟胚（品種A188、農林水産省生物資源研究所より入手）を無菌的に取り出し、LS-inf液体培地を含む2 mlのチューブに入れた。同液体培地で一回洗浄した後、新たに同液体培地2.0 mlを加えた。熱処理は46℃のウォーターバスにチューブを3分間浸漬することにより行った。遠心処置は冷却遠心分離機により20 KG、4℃で30分間遠心することにより行った。熱・遠心の組合せ処理は、上記熱処理後、上記遠心処理を行った。対照は、室温で同時間静置した。各処理をした後、培地を除き、100μＭのアセトシリンゴンを含むLS-inf液体培地に約1 x 109 cfu/mlの濃度で、Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131)（Ishida et al. 1996(参考文献(20))）を懸濁した液1.0 mlを加え、30秒間ボルテックスミキサーにより攪拌した。5分間室温で静置した後、胚軸面が培地に接するように10 μＭ  AgNO3を含むLS-AS培地に置床した。25℃、暗黒下で3日間培養した後、一部の未熟胚を採取し、X-glucによりGUS遺伝子のトランジェントな発現を調査した。なお、pSB131はスーパーバイナリーベクターである。
【００４８】
共存培養後の未熟胚をフォスフィノスリシン(PPT)及び10 μＭAgNO3を含む培地で培養し、形質転換細胞の選抜を行った。選抜培地上で増殖したカルスをPPTを含む再分化培地に置床し、形質転換植物の再分化を行った。再分化した植物の葉の一部を切り取り、実施例１と同様にX-glucによりGUS遺伝子の発現を調査した。なお、上記の培地および培養法は、Ishida, Y. et al., 1996(参考文献(20))に記載の方法に従った。
【００４９】
各処理を行った未熟胚にLBA4404(pSB131)を接種したときのGUS遺伝子のトランジェントな発現の結果を表６に示す。無処理の対照を含め試験に供した全ての未熟胚でGUS遺伝子の発現が認められた。しかし、その発現部位は対照に比べ熱処理及び熱・遠心の組合せ処理した場合に強く見られた。特に組合せ処理した場合には、未熟胚の胚盤表面の広い部位でGUS遺伝子の発現を示すものが最も多く見られた。
【００５０】
LBA4404(pSB131)を接種した未熟胚での形質転換結果を表７に示す。熱処理していない対照の未熟胚からは、10.7%の効率で形質転換植物が得られた。これに対し、20 KG、4℃、30分間の遠心処理を行った未熟胚では、形質転換効率は13.3%で、無処理に比べ、効率が向上した。熱処理を行った未熟胚での形質転換効率は20%で、無処理の約2倍に効率が向上した。さらに、熱・遠心の組合せ処理を行った場合、形質転換効率は無処理の約3倍の29.6%であった。
【００５１】
以上の結果から、材料の未熟胚を接種前に遠心処理あるいは熱処理することにより、従来法に比べ形質転換効率が向上するが、両処理を組み合わせることにより、さらに、高い効率で形質転換のなされることが明らかとなった。これらのことから、従来のアグロバクテリウム法では形質転換できなかったA188以外のトウモロコシ品種（Ishida et al. 1996(参考文献(20))）についても熱、遠心を組み合わせて処理することにより形質転換植物の得られる可能性が示唆された。
【００５２】
【表６】
表６  各処理の遺伝子導入効率に及ぼす影響（LBA4404(pSB131)を接種）
0004428757.tif 000007
共存培養後の未熟胚でのGUS遺伝子のトランジェントな発現の結果
【００５３】
【表７】
表７  各処理の形質転換効率に及ぼす影響（LBA4404(pSB131)を導入）
0004428757.tif 000008
カルス数、植物数はいずれもクローンを含まない。
【００５４】
実施例3
クリーピングベントグラス（Agrostis palustris cv. Pencross、雪印種苗（株））の完熟種子を滅菌後、MS無機塩、MSビタミン、4 mg/l dicamba、0.5 mg/l 6BA、0.7 g/lプロリン、 0.5 g/l MES、20 g/lショ糖、 3 g/l gelrite (pH 5.8)を含む培地（TG2培地）に置床し、25℃、暗黒下で培養した。誘導されたカルスを同組成の培地で継代培養し、エンブリオジェニックなカルスを増殖した。得られたエンブリオジェニックなカルスをTG2からgelriteを除いた組成の液体培地（TG2L）に移し、25℃、暗黒下で振盪培養することにより、懸濁培養細胞を得た。継代後3-4日目の懸濁培養細胞をTG2L培地を含む2 mlのチューブに入れた。同液体培地で一回洗浄した後、新たに液体培地2 mlを加えた。46℃のウォーターバスにチューブを5分間浸漬した。培地を除き、新たに同液体培地を加えた後、5,000 rpm、4℃、10分間遠心処理した。対照は、室温で同時間静置した。培地を除き、100 μＭのアセトシリンゴンを含むTG2-inf培地（TG2培地からプロリン、MES、gelriteを除き、48.46 g/lショ糖、36.04 g/lグルコースを添加(pH 5.2)）に約1 x 109 cfu/mlの濃度で、Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pTOK233)（上述）を懸濁した液1.0 mlを加え、30秒間ボルテックスミキサーにより攪拌した。5分間室温で静置した後、TG2L培地に10 g/lグルコース、100 μＭアセトシリンゴン、4 g/l タイプＩアガロース (pH5.8)を添加した培地（TG2-AS培地）に置床した。25℃、暗黒下で3日間培養した後、250 mg/lのセフォタキシム及びカルベニシリンを含むTG2L培地で細胞を3回洗浄した。同培地に懸濁し、25℃、暗黒下、70 rpmで回転振盪培養した。1週間後、同培地に50 mg/lのハイグロマイシンを含む培地で継代し、さらに1週間培養した後、一部の細胞を採取しX-glucによりGUS遺伝子の発現を調査した。
【００５５】
LBA4404(pTOK233)を接種したシバ懸濁培養細胞でのGUS遺伝子の発現を表８に示す。対照の細胞は、わずかに1細胞塊がGUSの発現を示したのみであった。これに対し、熱・遠心処理した場合、約3割の細胞塊がGUS遺伝子の発現を示した。また、GUS遺伝子の発現部位も対照の細胞塊に比べ、熱・遠心処理した細胞塊ではその部位は大きかった。
【００５６】
今までに報告されているシバの形質転換はパーティクルガン（Zhong et al. 1993(参考文献(45)), Hartman et al. 1994(参考文献(12)), Xiao,L. et al., 1997(参考文献(43))）やエレクトロポーレーション（Asano Y., 1994(参考文献(3))、Asano Y. et al. 1998(参考文献(4))）による直接導入法によるもので、アグロバクテリウムによる形質転換の成功例はみられない。本実施例でもみられたように、従来法による遺伝子導入の効率の低さが、アグロバクテリウム法によるシバの形質転換を困難にしている原因であれば、高頻度で遺伝子導入のなされる本願発明の熱、遠心の組合せ処理により、形質転換植物の得られる可能性が示された。
【００５７】
【表８】
表８  シバ懸濁培養細胞への遺伝子導入効率に及ぼす熱・遠心処理の効果
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共存培養後、2週間後にGUS遺伝子の発現を調査
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、従来のアグロバクテリウム法による遺伝子導入方法よりも高い効率で、組織を付傷することなく簡便に遺伝子導入を行うことができる、植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法が提供された。本発明の方法は、単子葉植物に対しても双子葉植物に対しても適用可能である。また、シバのように、従来のアグロバクテリウム法では形質転換することができなかった植物も、本発明の方法により形質転換が可能になった。
【００５９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に好ましく用いることができるスーパーバイナリーベクターの例であるpTOK233の構築方法を示す図である。
【図２】本発明の方法に好ましく用いることができるスーパーバイナリーベクターの例であるpNB131の遺伝子地図を示す図である。
【図３】アグロバクテリウム属細菌の主要な２種類のベクターシステムである中間ベクターシステムとバイナリーベクターシステムの構築過程を示す模式図である。
【図４】アグロバクテリウム  ツメファシエンスの強病原性菌株A281に由来する２種類のバイナリーベクターシステムを示す模式図である。
【符号の説明】
BL  アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダー配列
BR  アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列
TC  テトラサイクリン抵抗性遺伝子
SP  スペクチノマイシン抵抗性遺伝子
IG  イントロンＧＵＳ遺伝子
HPT  ハイグロマイシン抵抗性遺伝子
NPT  カナマイシン抵抗性遺伝子
K  制限酵素ＫｐｎＩ部位
H  制限酵素ＨｉｎｄIII 部位
Ampr  アンピシリン耐性遺伝子
BAR  bar遺伝子
COS, cos  ラムダファージのCOS部位
ORI, ori  ColE1の複製開始点
P35S  CaMV 35Sプロモーター
Tnos  ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター
virB  Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるTiプラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirB遺伝子
virC  Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるTiプラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirC遺伝子
virG  Agrobacterium tumefaciens A281に含まれるTiプラスミドpTiBo542のヴィルレンス領域中のvirG遺伝子
Vir  アグロバクテリウム属細菌のTiプラスミドの全vir領域
S Vir  強病原性アグロバクテリウム属細菌のTiプラスミドpTiBo542の全vir領域
s vir*  TiプラスミドpTiBo542のvir領域の一部を含む断片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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