(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシニンに下記（１）〜（８）の理化学的性質を有するキモトリプシン様プロテアーゼを作用させることを特徴とする抗酸化性ペプチドの製造法。
（１）作用・基質特異性：キモトリプシン様のプロテアーゼ活性を有する。
アミノ酸配列がＡｓｎ―Ａｒｇ−Ｖａｌ―Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―Ｈｉｓ−Ｌｅｕであるヒト［Ａｓｎ1，Ｖａｌ5］−アンギオテンシンＩに作用してチロシンとフェニルアラニンのＣ末端側を加水分解し、合成基質Ｓｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡに作用するが、Ｎ―ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ―Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ及びＮ−ｔ−Ｂｏｃ―Ｏ―Ｂｚ―Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ―ｐＮＡには作用しない。
（Ｓｕｃ−：スクシニル（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ）−、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−：Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｎ−ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−、−ｐＮＡ：−ｐ−ニトロアニリド（ｐ−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ））
（２）至適ｐＨ：ｐＨ８である。
（３）至適温度：４０℃である。
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜１１．５の範囲で安定である。
（５）温度安定性：４０℃まで安定である。
（６）阻害剤：セリンプロテアーゼ阻害剤のＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）及びキモトリプシン阻害剤でもあるキモスタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）で阻害される。
（７）分子量：３１，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（８）等電点：８．５である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なキモトリプシン様プロテア−ゼ及びその製造法並びに新規なキモトリプシン様プロテアーゼを作用させるタンパク質分解物含有物の製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
キモトリプシンは脊椎動物に由来するセリンプロテアーゼであり、エンドペプチダーゼ活性を有するため、食品工業分野においてはこのキモトリプシンの性質を利用した食品の改質等が行われておりキモトリプシンの需要は今後益々増大することが予想される。
【０００３】
しかし、キモトリプシンの供給源となる動物臓器の供給量には制限があり、また狂牛病等のプリオン病への懸念もあるため、キモトリプシンの需要の増大に十分対応できない虞があり、キモトリプシンと同等の基質特異性を有する量産性のある酵素の出現が強く望まれていた。
【０００４】
一方、キモトリプシンと同様に食品の改質等に利用できる微生物由来の量産性のあるプロテアーゼが提供されている。例えば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）が工業的に広く利用されているが、ズブチリシンは基質特異性が低く特定のペプチド結合部位を特異的に切断できないため、食品を所望の特性に改質し難いという問題点があった。また、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属の微生物由来で塩基性アミノ酸のＣ末端を特異的に加水分解するトリプシン様のプロテアーゼが本出願人により報告されている（特開２０００−１１６３７７号参照）が、トリプシンの基質特異性はキモトリプシンのそれとは全く異なり、改質される食品の特性も異なるため、トリプシン様プロテアーゼをキモトリプシンの代替物として利用することができなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来の問題点を解決するためになされたものであり、量産性のある新規なキモトリプシン様プロテアーゼ及びその製造法を提供すること並びに新規なキモトリプシン様プロテアーゼを作用させるタンパク質分解物含有物の製造法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属由来の菌株がキモトリプシン様プロテアーゼをも生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、グリシニンに下記（１）〜（８）の理化学的性質を有するキモトリプシン様プロテアーゼを作用させることを特徴とする抗酸化性ペプチドの製造法を提供するものである。
（１）作用・基質特異性：キモトリプシン様のプロテアーゼ活性を有する。
アミノ酸配列がＡｓｎ―Ａｒｇ−Ｖａｌ―Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―Ｈｉｓ−Ｌｅｕであるヒト［Ａｓｎ1，Ｖａｌ5］−アンギオテンシンＩに作用してチロシンとフェニルアラニンのＣ末端側を加水分解し、合成基質Ｓｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡに作用するが、Ｎ―ｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ―Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ及びＮ−ｔ−Ｂｏｃ―Ｏ―Ｂｚ―Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ―ｐＮＡには作用しない。
（Ｓｕｃ−：スクシニル（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ）−、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−：Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｎ−ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−、−ｐＮＡ：−ｐ−ニトロアニリド（ｐ−Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ））
（２）至適ｐＨ：ｐＨ８である。
（３）至適温度：４０℃である。
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜１１．５の範囲で安定である。
（５）温度安定性：４０℃まで安定である。
（６）阻害剤：セリンプロテアーゼ阻害剤のＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）及びキモトリプシン阻害剤でもあるキモスタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）で阻害される。
（７）分子量：３１，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（８）等電点：８．５である。
【０００９】
さらに本発明は、タンパク質又はタンパク質含有物に、上記の理化学的性質を有するキモトリプシン様プロテアーゼを作用させ当該タンパク質を分解させることを特徴とするタンパク質分解物含有物の製造法を提供するものである。ここで、タンパク質分解物含有物とは、動物由来、植物由来を問わずタンパク質又はタンパク質を含む素材に本発明のキモトリプシン様プロテアーゼを作用させてタンパク質の一部又は全部を酵素分解させて得られる物をいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のキモトリプシン様プロテアーゼはトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属に属する菌株から得ることができる。トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属に属する菌株としては、キモトリプシン様プロテアーゼ生産能を有するものであればいかなる菌株でも使用することができ、これらの菌株の変異株でも使用することができる。トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属に属するキモトリプシン様プロテアーゼ生産能を有する菌株の具体例としては、例えば、トリコデルマ・エスピーＮｏ．９０６４(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．Ｎｏ．９０６４)菌株が挙げられる．本菌株の菌学的性質は次の通りである。
【００１１】
１．形態
菌糸        ：無色。隔壁を有す。直径１．０〜６．０μｍ。
分生子柄    ：不規則に分岐し、各分岐にフィアライドを形成する。直径４．５〜５．５μｍ。
フィアライド：びん形。８〜１２×３．５〜４．５μｍ。無色。
分生子      ：フィアロ型分生子。楕円形あるいは卵形。３．５〜５．０×２．０〜３．０μｍ。濃緑色。フィアライドの頂端で塊状になる。
厚膜胞子    ：亜球形〜洋梨形。１０〜１２×６〜９μｍ。
【００１２】
２．生育状態
麦芽・イーストエキス寒天培地
形成は全面に起こる場合と不規則に点状もしくは斑状になる場合がある；裏面は白色で水溶性の黄色色素を生成する。
ポテトデキストロース寒天培地
生育は麦芽・イーストエキス寒天培地に比べやや悪いが、培養性状は殆ど同様である。
【００１３】
本菌株は有性胞子を欠き、栄養体が隔壁を有する菌糸体であるから不完全菌であること、菌糸はよく発達し、出芽細胞を欠き、裸出した分生子を形成するので不完全糸状菌類である。生育は速やかで、分生子の形成により濃緑色になり、分生子柄は分岐し、びん形のフィアライドを形成し、分生子はフィアロ型、フィアライドの頂端で塊状になることから、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属に分類される。
【００１４】
以上の性質から、この菌株をトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属に属する菌株と同定し、トリコデルマ・エスピーＮｏ．９０６４(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．Ｎｏ．９０６４)と命名した。
本菌株に最も類似した性質を示すものとしてトリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられる。本菌株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年９月２４日付でＦＥＲＭ  Ｐ−１７００３として寄託されている。
【００１５】
次に、本発明のキモトリプシン様プロテアーゼの製造法について説明する。本製造法には、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属に属するいずれの菌株も使用することができるが、例えば、トリコデルマ・エスピー(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．)ＦＥＲＭ  Ｐ−１７００３が挙げられる。
【００１６】
トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属に属する菌株を用いて本製造法のキモトリプシン様プロテアーゼを生産蓄積させる培養方法としては、液体培養法、固体培養法の何れでもよい。固体培養法の培地としては、小麦ふすま単独あるいは小麦ふすまに種々の添加物、例えばきな粉、大豆粉、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物などの有機および無機の窒素化合物などを添加して用いることができ、また、適当な無機塩類を加えることもできる。
【００１７】
また、液体培養法の培地としては、当該菌株が良好に生育し、当該酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩類、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地があげられる。例えば、炭素源としては、澱粉またはその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα―澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげられる。
【００１８】
窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆または大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
【００１９】
そして、無機塩類としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
【００２０】
固体培養の場合には、静置培養で行い、培地のｐＨを３〜７に調整したものに本菌株を摂取し、１０〜４０℃で１〜１０日間培養を行う。培養後その培養抽出物からキモトリプシン様プロテアーゼをエタノール沈降などの手段により粗酵素沈殿物として得ることができる。
【００２１】
そして、液体培養の場合には、培養は、振盪培養もしくは、通気攪拌培養等の好気的条件下において行い、培地をｐＨ４〜１０の範囲，好ましくはｐＨ５〜８の範囲に調製し、温度１０〜４０℃の範囲、好ましくは２５〜３７℃で、２４〜９６時間培養する。培養後菌体を除去し、粗酵素液を得る。
【００２２】
次に、これらの粗酵素液に公知の硫安塩析、ゲルろ過、遠心分離、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの処理を適宜組み合わせることにより、精製された高純度のキモトリプシン様プロテアーゼが得られる。
【００２３】
次に、上記性質を有するキモトリプシン様プロテアーゼをタンパク質又はタンパク質含有物に作用させることにより、当該タンパク質を分解させてタンパク質分解物含有物を製造する方法について説明する。
【００２４】
タンパク質とは、例えば牛、豚、馬、めん羊、山羊、家兎、家禽等の動物由来又は米、麦、トウモロコシ、大豆等の植物由来のポリペプチドをいう。タンパク質含有物とは、動物由来、植物由来の別を問わず、少なくともタンパク質を含有している物であって、タンパク質の含有量の多少に拘らず本発明のキモトリプシン様プロテアーゼを作用させることができる物をいう。従って、この条件を満たすものは全て本発明におけるタンパク質含有物に含まれるが、例えば、穀類、乳、食肉、貝類、骨ガラ等又はこれらの処理物が挙げられる。穀類には、米、麦、トウモロコシ、大豆等が含まれるが、米、大豆が好適である。乳には、牛、めん羊、山羊等の乳が含まれるが、牛乳が好適である。食肉には、牛肉、豚肉、馬肉、めん羊肉、山羊肉、家兎肉、家禽肉等が含まれるが、牛肉が好適である。貝類には、アサリ、ハマグリ、カキ、アワビ、ホタテ貝等が含まれるが、ホタテ貝が好適である。骨ガラには、牛、豚、馬、めん羊、山羊、鶏等の骨ガラが挙げられるが、鶏の骨ガラが好ましい。上記の処理物としては、ホタテ貝について言えば、その中腸腺が好ましく、牛乳について言えば、そのホエーが好ましい。これらのタンパク質含有物として好適なものは、食品素材として広範な用途を有する点で利用価値が高い。タンパク質含有物の形態は特に限定される必要はなく、固形状、半固形状、流動状、液状のいずれの形態をとるものでもよい。
【００２５】
これらのタンパク質又はタンパク質含有物に本発明のキモトリプシン様プロテアーゼを作用させる際は、当該プロテアーゼの作用形態は特に制限されないが、粉末等の固形状の他、懸濁状、溶液状等の形態を、タンパク含有物の性質・形態等を考慮し、使用することができる。
【００２６】
ｐＨは、少なくとも５〜１１の範囲が好ましいが、更に効率的にタンパク質の加水分解を目的とする場合はｐＨ７〜９の範囲がより好ましい。作用温度は、タンパク質を含有する物質の性質等を考慮して適宜定めることができるが、効率的なタンパク質の加水分解が可能な点で約４０℃が好ましい。
【００２７】
作用時間は通常１〜４８時間であるが、所望する分解の程度を考慮し適宜定めることができる。本発明のキモトリプシン様プロテアーゼの使用量は、通常、タンパク質含有物１ｇ当たり１０〜２０，０００単位であるが、タンパク質含有物中に含まれるタンパク質の量・性質等を考慮して適宜定めることができる。さらに、食品素材の改質に多様性を求める場合には、本発明のキモトリプシン様プロテアーゼに加えて、他のプロテアーゼを作用させることもできる。他のプロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられるが、酵母起源のカルボキシペプチダーゼや糸状菌起源のアミノペプチダーゼが好ましく、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム株式会社製）等は市販品を容易に入手できる。アミノペプチダーゼの添加量は食品素材の材質、所望する改質等を考慮し適宜定めることができるが、通常、タンパク質含有物１ｇ当たり４０〜１００，０００単位である。本発明のキモトリプシン様プロテアーゼ及び／又は他のプロテアーゼの作用を終了させるためには、必要に応じ当該プロテアーゼを加熱等により失活させることができる。
【００２８】
本発明のキモトリプシン様プロテアーゼを作用させて得られるタンパク質分解物含有物は、実施例に示すように、抗酸化性、呈味性の向上、低抗原性、低切断応力等の多様な特性を有し、食品素材として広範な用途が期待できるが、該タンパク質分解物含有物のこれらの特性は公知の測定手段、例えば、抗酸化性については、Ａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ法（油脂化学便覧：日本油化学協会編、５１５頁  ）等、呈味性については、パネリストによる官能試験、フォルモール滴定法によるアミノ酸定量、ケルダール法による総タンパク量の定量等、抗原性については、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｅｌｉｓａ法（日本小児アレルギー学会誌、１，３６，１９８７）等、切断応力については、ミートシェアー（ワーナーブラッツラー社製）を用いる方法等により確認できる。
【００２９】
以上のように、本発明により得られるキモトリプシン様プロテアーゼは、蛋白質も含めて、ポリペプチドの鎖中の芳香族アミノ酸残基のカルボキシル側を切断する性質を有し、該キモトリプシン様プロテアーゼにより改質された食品素材には、自動酸化に対する抗酸化性、呈味性の向上、抗原性の低減、切断応力の低減等の効果が認められるため、各種の蛋白質を含有する食品の製造に利用することができ、例えばヨーグルト、チーズ、発酵ハム等の品質の安定化、風味の向上が図れ、また低アレルゲン食品等の製造が可能となり、食品分野においてタンパク質の性質の改変に広範に資することができる。以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
実施例１（キモトリプシン様プロテアーゼの培養）
ポテトデキストロース寒天培地（極東製薬製）に３０℃、５日間培養したトリコデルマ・エスピーＮｏ．９０６４(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．Ｎｏ．９０６４)（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７００３）を、滅菌した８（ｗ／ｖ）％の小麦ふすま懸濁液２５０ｍＬを入れた培養フラスコに接種し、３０℃、４０時間、１４０ｒｐｍの条件下振盪培養し、種培養とした。
【００３１】
これを小麦ふすま８５０ｇと黄な粉１５０ｇに５６０ｍＬの水を散水し滅菌した固体培地に全量接種し、３０℃に６８時間、静置培養してプロテアーゼを産生させた。培養後、小麦ふすまに水４２００ｍＬを加え、産生した酵素を抽出し、粗酵素液３０００ｍＬを得た。分画分子量６０００の限外ろ過膜で６００ｍＬまで濃縮し、デキストリン４０ｇを溶解させた後、冷エタノール２０００ｍＬを添加し粗酵素沈殿物を得た。粗酵素沈殿物を濾別後、減圧下（６６５Ｐａ）、４０℃で２２時間乾燥し、６０ｇの粗酵素粉末を得た。
【００３２】
実施例２（キモトリプシン様プロテアーゼの精製）
実施例１で得られた粗酵素粉末１ｇを緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）１００ｍＬに溶解後、遠心分離（７，０００×ｇ、５分間）を行いその上清をＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラムに添加した。吸着したタンパク質を６０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）のリニアグラジエントで溶出した。溶出した酵素活性画分を回収し、３０％飽和となるように硫酸アンモニウム粉末を加え、３０％飽和硫酸アンモニウムを含む６０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したフェニルセファロースファーストフロー（ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、ファルマシア製）カラムに添加した。吸着したタンパク質を３０％飽和硫酸アンモニウムを含む６０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）から６０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）のリニアグラジエントで溶出した。溶出した酵素活性画分を精製酵素標品（以下、「本酵素液」という。）とした。本酵素液は、図１に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示した。
【００３３】
酵素活性測定法（カゼイン基質）
本酵素液１ｍＬと同量の１（ｗ／ｖ）％カゼイン溶液（６７ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を混合し、３７℃において２０分間反応する。反応後、５（ｗ／ｖ）％トリクロロ酢酸溶液３ｍＬを加え、反応を停止し、３０分放置後、東洋濾紙Ｎｏ．１３１で濾過し、得られた濾液の２８０ｎｍの吸光度を測定した。上記反応条件下、１分間あたり２８０ｎｍの吸光度を０．００１上昇させる酵素量を１単位とした。
【００３４】
実施例３（キモトリプシン様プロテアーゼの理化学的性質）
（１）作用・基質特異性：キモトリプシン様のプロテアーゼ活性を有する。
【００３５】
ヒトアンギオテンシンＩに対する基質特異性
ヒトアンギオテンシンＩに対する基質特異性を以下のように検討した。
本酵素液２５μＬにヒトアンギオテンシンＩ２５μＬを加え、ｐＨ７．０、３０℃、２４時間インキュベートさせた。生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣによって分取し、それをＰＩＣＯ−ＴＡＧ法によるアミノ酸組成分析を行うことにより、切断部位の推定を行った結果、ヒトアンギオテンシンＩのＮ末端から４番目のチロシンと８番目のフェニルアラニンのＣ末端側を加水分解していることが分かった。この結果より、本酵素はキモトリプシン様プロテアーゼであることが推定された。
【００３６】
合成基質に対する基質特異性
合成基質として、Ｓｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｖａｌ―Ａｌａ―ｐＮＡ、Ｇｌｔ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｌｅｕ―ｐＮＡ、ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ−Ａｌａ―ｐＮＡ、Ｐｙｒ−Ｐｈｅ―Ｌｅｕ―ｐＮＡ、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ―Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ―ｐＮＡ、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ―Ｏ―Ｂｚ―Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ―ｐＮＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ａｓｐ―ｐＮＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ―Ｐｒｏ−Ａｌａ―ｐＮＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ−Ａｌａ―ｐＮＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ―ｐＮＡ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ―Ｌｅｕ―ｐＮＡを用い、実施例２で得られたキモトリプシン様プロテアーゼの基質特異性を以下のように測定した。即ち、１０ｍｍｏｌ／Ｌの上記各ペプチジルパラニトロアニリド（ｐｅｐｔｉｄｙｌ―ｐＮＡ）のジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」という。）溶液１０μＬと、６７ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液７００μＬを混ぜ、これに本酵素液１００μＬを加えた。２５℃で１０分間反応後、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸２００μＬを加え反応停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。遊離するパラニトロアニリンの吸光係数を９９２０／（（ｍｏｌ／Ｌ）・ｃｍ）（２５℃）として基質分解速度を算出した。本酵素液の代わりに、６７ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液１００μＬで同様の操作を行ったものをコントロールとして、酵素サンプルとの差をとり活性を測定した。Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡに対する活性を１００％として、相対値で表した。その結果、表１に示すように、実施例２で得られた本酵素液はＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡのパラニトロアニリドに隣接するフェニルアラニンのＣ末端側を良く加水分解し、特異的なキモトリプシン様のプロテアーゼ活性を示した。一方、本酵素液はパラニトロアニリドに隣接するアミノ酸残基がアルギニン残基であるＮ−ｔ−Ｂｏｃ―Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ―ｐＮＡ及びＮ−ｔ−Ｂｏｃ―Ｏ―Ｂｚ―Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ―ｐＮＡを加水分解せず、トリプシン様プロテアーゼ活性は示さなかった。パラニトロアニリドに隣接するアミノ酸残基がアスパラギン酸残基であるＳｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ａｓｐ―ｐＮＡでは加水分解は認められなかった。パラニトロアニリドに隣接するアミノ酸残基がアラニン残基及びロイシン残基については、本酵素液による加水分解率が０〜２５％であり低い活性を示すに留まった。上記結果から、本発明のプロテアーゼはキモトリプシン様プロテアーゼであって、トリプシン様活性を有するプロテアーゼと異なることが推定される。
【００３７】
【表１】
0004401555.tif 000002
【００３８】
Ｓｕｃ：Ｓｕｃｃｉｎｙｌ
ｐＮＡ：ｐ―Ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ
Ｚ    ：Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ
Ｇｌｔ：Ｇｌｕｔａｒｙｌ
Ｂｚ  ：Ｂｅｎｚｏｙｌ
ｔ−Ｂｏｃ：ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ
Ｐｙｒ：Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌ
【００３９】
（２）至適ｐＨ：ｐＨ２〜８．４の６７ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液、ｐＨ８．４〜１２の６７ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用意し、各ｐＨの緩衝液７００μＬと１０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度に溶解したＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡのＤＭＳＯ溶液１０μＬに、本酵素液１００μＬを加え２５℃で１０分間インキュベートし、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸２００μＬを加え、反応停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。最も活性の高い所を基準（１００％）として、各ｐＨで相対活性を求め、至適ｐＨを求めた。図２に示すように、至適ｐＨは８を中心に存在した。
【００４０】
（３）至適温度：ｐＨ７．０、６７ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液７００μＬに１０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度に溶解したＳｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡのＤＭＳＯ溶液１０μＬを２０〜７０℃の各温度で２０分のプレインキュベーションを行った後、本酵素液１００μＬを加え各温度で１０分間反応させた。１ｍｏｌ／Ｌ酢酸２００μＬを加え、反応停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。図３に示すように至適温度は４０℃であった。
【００４１】
（４）ｐＨ安定性：６７ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ２〜８．４）及び６７ｍｍｏｌ／Ｌのグリシンー水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４〜１２．０）を用い、各ｐＨの緩衝液２００μＬと本酵素液１００μＬを混合し、４０℃に１時間放置後、ｐＨを７．０にした後、その１００μＬを６７ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７００μＬと１０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度に溶解したＳｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡのＤＭＳＯ溶液１０μＬに加え２５℃、１０分間反応させた。反応後１ｍｏｌ／Ｌ酢酸２００μＬを加え反応を停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図４に示すようにｐＨ５．０〜１１．５の範囲で元の活性の８割を維持していた。
【００４２】
（５）温度安定性：６７ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）７００μＬに本酵素液１００μＬを加え各温度で２０分プレインキュベートした後、２５℃まで冷却し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ濃度に溶解したＳｕｃ−Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ｐｈｅ―ｐＮＡのＤＭＳＯ溶液を加え２５℃、１０分間反応させた。反応後１ｍｏｌ／Ｌ酢酸２００μＬを加え反応を停止後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図５に示すように、４０℃まで安定性がみられたものの４０℃を過ぎると急激な低下が認められた。
【００４３】
（６）阻害剤：シグマアルドリッチジャパン株式会社製のセリンプロテアーゼ阻害剤であるＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライド）及びＳＴＩ（大豆由来トリプシンインヒビター）、システインプロテアーゼ阻害剤であるＰＣＭＰＳ（パラクロロマーキュリフェニルスルホン酸）及びＭＩＡ（モノヨード酢酸）、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼの阻害剤であるロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、アンチパイン（Ａｎｔｉｐａｉｎ）及びキモトリプシン阻害剤でもあるキモスタチン（ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤であるペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）及び含金属プロテアーゼ阻害剤であるＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いて実施例２で得られた本酵素液に対する阻害効果を次のように測定した。即ち、本酵素液１００μＬに阻害剤溶液（６７ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）１００μＬを加え３０℃にて１時間プレインキュベートした後、更にＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡのＤＭＳＯ溶液１０μＬと６７ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６００μＬを加えて２５℃にて１０分インキュベートし、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸２００μＬを加え反応を停止した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。基質の自己分解をコントロールとしてサンプルとの差をとり活性を定量した。阻害剤を含まない時の活性を１００％として表２に示した。その結果、キモトリプシン様プロテアーゼはＤＦＰ、ＰＭＳＦ、キモスタチンで完全に阻害され、ＳＴＩ、ＰＣＭＰＳ、ＭＩＡおよびＰｅｐｓｔａｔｉｎでは阻害されなかった。またＡｎｔｉｐａｉｎは強度の阻害、ＥＤＴＡは中等度の阻害、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎは弱い阻害をそれぞれ示した。基質特異性及び各阻害剤の阻害効果から判断して、本発明のプロテアーゼはキモトリプシン様プロテアーゼであると共にセリンプロテアーゼに属すると推定され、本出願人が既に報告（特開２０００−１１６３７７号参照）したトリプシン様プロテアーゼとは異なる性質を示すことが分かった。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
（７）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（１５％ゲル）はＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行った。標準タンパク質としては、ファルマシア製のフォスフォリラーゼｂ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｂ（９４，０００）））、牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（６７，０００））、オボアルブミン（ｏｖａｌａｌｂｕｍｉｎ（４３，０００））、カルボニックアンハイドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（３０，０００））、大豆トリプシンインヒビター（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０，１００））、α―ラクトアルブミン（α―ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（１４，４００））を使用し、ゲル染色はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０（ファルマシア製）を用いたＣＢＢ染色を用いた。その結果、本発明のキモトリプシン様プロテアーゼの分子量は３１，０００と推定された。
【００４６】
（８）等電点：等電点電気泳動（１５％ゲル）は、スラブゲルを用いた。ｐＨ勾配の作成にはアンフォライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ、ファルマシア製、ｐＨ３〜１０）を用い、泳動は３５Ｖ、６ｍＡで行った。その結果、本発明のキモトリプシン様プロテアーゼの等電点は８．５と推定された。
【００４７】
実施例４  抗酸化性ペプチドの製造法
市販大豆から単離したグリシニン３ｇに、水１００ｍＬを加えｐＨ７．０に調製後、本発明の酵素をミルクカゼイン活性で５００単位加え、４０℃に１時間反応させた後、８５℃で１０分間保ち酵素を失活させた。本グリシニン分解物と、未分解グリシニンとをリノール酸の自動酸化に対する抗酸化性をＡｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ法で測定（油脂化学便覧：日本油化学協会編、５１５頁）したところ、未分解グリシニンに比し８倍の抗酸化能が上昇した。本グルシニン分解物は食品の酸化防止又は酸化遅延作用を有する食品素材として利用することができる。
【００４８】
実施例５  調味液の製造
５％市販脱脂大豆懸濁液１Ｌを、ｐＨ７．０に調整後、本発明の酵素をタンパク質１ｇ当たり１００単位と、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム株式会社製）１ｇ（４２０単位）を添加し、４０℃に２０時間攪拌しつつ反応させた。反応後、８０℃に１５分保ち、酵素を失活させ、遠心分離により清澄なタンパク分解液を得た。この分解液をカフェイン溶液を指標に呈味性試験をしたところ、苦みは無く、旨みが感じられた。分解液の分析値は、総窒素２．５ｍｇ／ ｍＬ、タンパク質１．５％、遊離アミノ酸０．６２％、フォルモール態窒素 ／総窒素 ×１００は４３．５％であった。本タンパク分解液は肉エキス配合調味液やスープのベースとして利用することができる。
ペプチダーゼ活性測定法
５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液にロイシルグリシルグリシン（Ｌｅｕｃｙｌ−Ｇｌｙｃｙｌ−Ｇｌｙｃｉｎｅ）を０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度に溶解した基質液１ｍＬに、酵素液０．１ｍＬを加え３７℃で６０分間反応した。反応後、沸騰水中に５分間保ち、冷却した後、２ｍＬのニンヒドリン溶液と０．１ｍＬの塩化第一スズ溶液を加える。沸騰水中に２０分間保った後、冷却、１０ｍＬの５０（ｗ／ｖ）％のｎ−プロパノールを加え、５７０ｎｍで吸光度を測定する。上記条件下、１分間当たり１マイクロモルのアミノ酸を遊離する酵素量を１単位とした。
【００４９】
実施例６  低アレルゲン化ホエー蛋白分解物の製造
ホエー蛋白の水溶液２Ｌに、本発明の酵素を蛋白質１ｇ当たり４００単位加え、ｐＨを７．０に調整後、４０℃に１０時間反応した。反応後、８５℃に１０分間保ち酵素を失活させ遠心分離により、不溶物を除去後、上清を常法により濃縮後、乾燥し１１５ｇの粉末を得た。得られたホエー分解物の抗原性を、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｅｌｉｓａ法（日本小児アレルギー学会誌、１，３６，１９８７）に従い、β―ラクトアルブミンを対照として測定したところ、ホエー分解物の抗原性 はβ―ラクトアルブミンの抗原性の１／ １０，０００未満であった。本ホエー分解物は、各種の食物アレルギー、アトピー性皮膚炎その他のアレルギー体質の消費者を対象とする食品素材として、広範に使用され得るものである。
【００５０】
実施例７  低蛋白米の製造法
精白度９０％の精白米３ｋｇを、常法により洗米後、０．０５％の本発明の酵素液に浸漬した。
ｐＨを７．０に調整し、４０℃に１０時間処理した後、白米を分離し水洗により酵素を除去した。本発明の酵素で処理することにより、原料精白米のタンパク質を５４％除去した低タンパク米を製造した。低アレルゲン化したこの低タンパク米は、各種の食物アレルギー、アトピー性皮膚炎その他のアレルギー体質の消費者を対象とする食品素材として、広範に使用され得るものである。
【００５１】
実施例８  食肉の軟化
市販輸入牛のもも肉を１０ｍｍ厚にスライスした。その肉質の均一な部分を２０ｇ程に成形後、本発明の酵素を振り掛け、ラップで覆った後、５℃の冷蔵庫に５時間放置した。酵素添加量は、肉１ｇ当たり３０単位である。その後、２００℃のホットプレートで片面１分づつ焼成し、２ｃｍ幅の帯状にカットした後、ミートシェアー（ワーナーブラッツラー３０００型、ワーナーブラッツラー社製）で切断応力を測定した。その結果、酵素無処理に比べ、酵素処理した肉の切断応力は５５％低下しており、本発明の酵素が食肉の軟化に有用であることが明らかとなった。軟化した食肉は、食肉の食感に変化を与えると共に咀嚼能力の低下した高齢者に適するため、高齢化社会の進展につれて今後ますます需要の増大が期待される。
【００５２】
実施例９ 貝類エキスの製造
帆立貝中腸腺１００ｇを３００ｍＬの水にケンダク後、ホモジナイザーで均質化した後、１０分間９５℃に保った。４０℃に冷却後本発明の酵素を基質１ｇ当たり２０００単位加え、同温度に３時間分解した。反応後、８５℃で１５分間加熱し、酵素を失活させ、遠心分離後、限外ろ過膜（分画分子量１０，０００）でろ過、蛋白濃度 １．３０（ｗ／ｖ）％、遊離アミノ酸０．７１（ｗ／ｖ）％のエキス２３０ｍＬを得た。当該エキスは、各種のスープのベース、調味液のベースとして広範に利用され得るものである。
【００５３】
実施例１０ チキンエキスの製造
ブロイラー首部骨ガラ１００ｇをミンチ後、水２００ｍＬを添加し、９５℃で１時間エキス抽出した。６０メッシュの篩(飯田製作所製)でろ過後、残査に２００ｍＬの水と本発明の酵素５００単位を加え、４０℃で４時間反応後、１５分間煮沸、遠心分離し、上澄をエキスとして得た。更にエバポレーター濃縮し、水分５０（ｗ／ｖ）％、蛋白質３８（ｗ／ｖ）％を含む呈味性に優れた、チキンエキスを得た。当該エキスは、上記貝殻エキスと同様、各種のスープのベース、調味液のベースとして広範に利用され得る。
【００５４】
【発明の効果】
本発明の微生物由来のキモトリプシン様活性を有するプロテアーゼは新規であり、かつ動物由来のキモトリプシンと同様の高い基質特異性を有しており、キモトリプシンの代替プロテアーゼとなることができ有用である。
【００５５】
本発明のタンパク質分解物含有物の製造法は、キモトリプシン様プロテアーゼの高い基質特異性により各種タンパク質又はタンパク質含有物の分解に使用することが可能であり、広く食品分野に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のキモトリプシン様プロテアーゼの分子量を測定したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】  本発明のキモトリプシン様プロテアーゼのｐＨ特性を示す図である。
【図３】  本発明のキモトリプシン様プロテアーゼの温度特性を示す図である。
【図４】  本発明のキモトリプシン様プロテアーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図５】  本発明のキモトリプシン様プロテアーゼの温度安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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