(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が気管支過敏症を特徴とする疾病に罹患しているかどうか、または発症する危険があるかどうかを調べる方法であって、当該被験者由来の細胞サンプルについて、
気管支過敏症と関連している配列番号１−６のいずれかのヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズする配列を含んでなるポリヌクレオチド（Ａ）において、配列番号１の６３７７位に対応する位置にＴおよび／または配列番号１の７３９０位に対応する位置にＣを有するものの存在を調べること
を特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に定義のポリヌクレオチド（Ａ）における、配列番号１の６３７７位に対応する位置または７３９０位に対応する位置における多型を検出することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、または対立遺伝子特異的プライマーであって、当該対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは１５−５０ヌクレオチドを有し、かつ配列番号１の６３７７位に対応する位置または７３９０位に対応する位置が重複しており、当該対立遺伝子特異的プライマーは１５−５０ヌクレオチドを有し、かつそのヌクレオチド配列が検出されるべき対立遺伝子に対応するもの。
【請求項３】
配列番号１の６３７７位に対応する位置にＴおよび／または７３９０位に対応する位置にＣを有する、請求項１に定義のポリヌクレオチド（Ａ）である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
気管支過敏症を特徴とする疾病の診断用薬剤の製造のための、請求項１に定義のポリヌクレオチド（Ａ）、または配列番号１のヌクレオチド６３７７および／またはヌクレオチド７３９０に対応する位置を含み、かつその位置と少なくとも２０の隣接塩基を有するポリヌクレオチドの使用。
【請求項５】
疾病が喘息である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
疾病が喘息である、請求項４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は患者集団の診断および予後スクリーニングにおけるAAGAと示される喘息関連遺伝子、AAGAによってコードされるタンパク質分子および関連分子の使用およびAAGAの多型、およびAAGAによってコードされるタンパク質またはその変異体の治療標的としての使用に関する。
【０００２】
喘息とは以下の特徴を有する極めて一般的な肺疾病である：
気道閉塞−通常これは可逆的であるが、進行性であることも多い
慢性気管支炎症−炎症細胞浸潤および活性化、生化学的媒介物質の放出および構造変化（気道リモデリング）を特徴とする症状
気管支過敏症（BHR）−種々の免疫性、生化学的および物理的刺激に対する過度の気管支収縮性応答。
【０００３】
喘息は臨床的には喘鳴音、咳嗽および息切れを伴う慢性の、断続的な気道閉塞を特徴とする。喘息は典型的には可逆性である閉塞障害を伴うが、この所見も何らかのその他の単一の試験または測定も喘息を診断するのに十分ではない［Guideline for diagnosis and development of asthma，1997，NIH Publication 97号−4051］。多くの疾病がこのパターンの異常と関連している。喘息という診断を確立するには、患者の症状パターン（患者の病歴からのその他の情報に加えて）およびその他の可能性ある診断の除外も必要とされる。喘息について評価を行うには臨床上の判断が必要である。喘息の患者は不均一であり患者ごとに、ならびに一人の患者についても時が経つにつれて極めて広範な兆候および症状を示す。
【０００４】
気道平滑筋、炎症の役割、気道の神経支配および媒介物質が関係する機構に関する問題をはじめ、喘息の病態生理を説明するために多くの仮説が掲げられてきた。これらの因子のすべてが重要であり得るが、どれが一次的な（すなわち、原因である）欠陥であり、どれが二次的な欠陥であるのかは明らかではない。しかしながら、環境および遺伝的性質の双方が重要であるということは一般に認められている。喘息の多因子性を考えると、基礎的な機構を同定するための1つのアプローチは、個体に喘息を発症させる素因となる喘息罹患性遺伝子を発見することである。
【０００５】
喘息罹患性遺伝子を同定するために使用できる1つの方法としてはポジショナルクローニングがある。この方法では、DNAマーカーを用いて家系を通して遺伝子の遺伝をたどることによって罹患性遺伝子をヒト染色体の特定の領域に局在化する。DNAマーカーは染色体上で所定の物理的位置を占め、その遺伝をモニターできるDNAの断片である。DNAマーカーが罹患性遺伝子に近いほど、マーカーおよび罹患性遺伝子が親から子へともに渡される可能性が大きい。この現象は遺伝子連鎖と呼ばれている。ひと度、特定の染色体領域の連鎖が得られれば、領域が配列決定するのに十分なほど小さくなり、罹患性遺伝子を同定できるまで、物理的および遺伝子マッピングの組み合わせを用いてその領域の大きさを狭める。罹患性遺伝子を同定した後、この遺伝子のあらゆる多型を調べることができ、これらの変異が非喘息患者と比べ喘息患者により大きな優勢を生じるかどうかを確認する解析を実施することができる。ポジショナルクローニングの主要な利点は疾病を引き起こす根底にある因子が未知であっても新規遺伝子を同定でき、かつ、同定された遺伝子は、それらが保因者を直接発症しやすくするので直接的に病理学的関連がある（すなわち、一次的な原因となる欠陥）ということである。
【０００６】
近年、いくつかの学術研究グループがヒト5番染色体上の喘息およびアレルギー性応答の調節に重要な遺伝子の存在についての証拠を明らかにした。特に、92のオランダの喘息家系の遺伝子連鎖解析からサブ領域5q31−5q33における5番染色体上のBHRおよび血清IgEレベルの上昇に関する罹患性遺伝子の存在についての証拠が得られた［Meyersら，Genomics 23：p.464−470；Postmaら，New England Journal Medicine 333：p.894−900およびBleeckerら，Clinical and Experimental Allergy 25：p.84−88］。マーカーD5S436、全血清IgEレベル［Meyersら，Genomics 23：p.464−470；Postmaら，New England Journal Medicine 333：p.894−900およびBleeckerら，Clinical and Experimental Allergy 25：p.84−88］およびBHR［Postmaら，New England Journal Medicine 333：p.894−900およびBleeckerら，Clinical and Experimental Allergy 25：p.84−88］間の遺伝子連鎖に関する強力な証拠がオランダの家系において認められた。
【０００７】
喘息罹患性遺伝子はまだ同定されていないので、当技術分野ではこのような遺伝子の同定が必要とされている。喘息罹患性遺伝子の同定により疾病プロセスの基礎的な理解が提供され、そこから多数の臨床上重要な応用が生じるであろう。同定された罹患性遺伝子は遺伝子または遺伝子のタンパク質産物を直接標的とする治療薬（小分子薬、アンチセンス分子、抗体分子）の開発をもたらし得るか、あるいはこのような薬剤の開発が遺伝子またはそのタンパク質産物を直接標的とするよりもより容易である場合には、タンパク質産物が上流または下流位置の一部である生化学的経路を標的としてもよい。
【０００８】
遺伝子を含んでなるポリヌクレオチド配列、その配列変異体およびそれらのタンパク質産物を喘息のおよび喘息発症のハイリスク個体の同定のための臨床診断試験を開発するために用いてもよい。このような試験の結果はまた予後的価値を有する場合もあり、また薬剤治療に応答する患者および応答しないものを予測するために用いてもよい。最後に、喘息罹患性遺伝子のDNA配列およびこれらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列についての情報によって組換え技術によるタンパク質の大規模生産およびタンパク質を天然に産生する組織／細胞の同定が容易となる。また、このような配列情報により抗体物質または罹患性遺伝子によってコードされるタンパク質と特異的に反応し、タンパク質が関与し得る天然リガンド／抗リガンド結合反応の調節におよび診断目的のために使用できるその他の新規の結合分子の調製も可能となる。
【０００９】
本明細書において用いた用語は以下の意味を有する：
「単離された」とはその本来の環境から取り出された物質を指す。
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とはポリヌクレオチド鎖が塩基対形成を介して相補的な鎖と結合するあらゆるプロセスを指す。
「ストリンジェントな条件」とは20％までの塩基対ミスマッチを許容する実験条件、典型的には65℃での0.1×SSC（15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0）での2回の15分の洗浄を指す。
「相同性」または「相同な」とはヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の類似度を指し、これは部分的なものである場合もあるし、配列が同一である場合には完全であり得る。
「発現ベクター」とは、その転写を提供するさらなるセグメントと機能しうる形で連結された注目するポリペプチドをコードするセグメントを含んでなる直線状または環状DNA分子を指す。
「アンチセンス」とは、オリゴまたはポリヌクレオチドの、標的タンパク質のメッセンジャーRNA（mRNA）中のその相補的な配列とのハイブリダイゼーションによるタンパク質合成の選択的阻害を指す。アンチセンス概念はZamecnikおよびStephensonによって（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 75：p.280−284；Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 75：p.285−288）最初に提唱され、その後実験ツールとしておよび推定上の治療分子を作製する手段の双方としての広範な適用が認められるようになった（Alama，A.，Pharmacological Research 36：p.171−178；Dean，N.M.、Biochemical Society Transactions 24：p.623−629；Bennet，C.F.，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 280：p.988−1000；Crooke，S.T.，Antisense Research and Applications，Springer）。
【００１０】
今回、AAGA、すなわち配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなり、そのヌクレオチド配列がmRNA配列およびプロトカドヘリン−42遺伝子に相当するESTと100％の相同性を有する5番染色体上の遺伝子が気管支過敏症と関連しているということが遺伝子連鎖解析およびバイオインフォマティクス解析により見いだされた。プロトカドヘリン−42はカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのタンパク質は、in vivoでの広範な事象において重要な役割を果たし、かつ組織完全性の維持に重要である細胞−細胞（細胞間）接着に関与している。M. Takeichi，Annual Revies Biochemistry（1990），58，p.237−52参照。AAGAはヒト気管支上皮細胞において高レベルで発現されると認められている。また、AAGAの多型は非喘息患者において生じるよりも喘息患者でより優勢であることが分かっている。
【００１１】
従って、1つの態様では、本発明は被験者が気管支過敏症を特徴とする疾病に罹患しているか、または発症する危険があるかどうか調べる方法を提供し、これは被験者由来の細胞サンプルにおいて、（i）配列番号1もしくは配列番号2もしくは配列番号3もしくは配列番号4もしくは配列番号5もしくは配列番号6のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズする配列を含んでなるポリヌクレオチド（A）の発現レベル（以下、ポリヌクレオチド（A）は代わりにAAGA遺伝子と呼ぶ）、またはアミノ酸配列配列番号7もしくは配列番号8もしくはその機能的に同等な変異体を含んでなるポリペプチド（B）の発現レベル、または上記ポリペプチド（B）の生理活性レベルを調べ、（A）もしくは（B）の発現レベルまたは（B）の生理活性レベルを健常な被験者における（A）もしくは（B）それぞれの発現レベルまたは生理活性と比較するか、あるいは  （ii）気管支過敏症と関連している上記ポリヌクレオチド（A）もしくは上記ポリペプチド（B）の変異体の存在を調べることを含んでなる。
【００１２】
本明細書において「変異体」とは、アミノ酸配列に関して、1個以上のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を意味する。その変化はアミノ酸置換、欠失または挿入を含んでいてもよい。ヌクレオチド配列に関しては、本明細書において「変異体」とは、1個以上のヌクレオチドが変更されているヌクレオチド配列を意味し、その変化はヌクレオチド置換、欠失または挿入を含んでいてもよい。アミノ酸配列配列番号7または配列番号8の好ましい機能的に同等な変異体には配列番号7または配列番号8と少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、特に95％よりも高いアミノ酸配列同一性を有するものがある。このような好ましい機能的に同等な変異体では、通常、細胞外ドメインに相当する配列番号7または配列番号8の領域は実質的に保存されている。
【００１３】
配列番号7または配列番号8などの参照配列とx％の同一性を有するアミノ酸配列とは、参照配列のアミノ酸各100個の当たり100−x個までのアミノ酸変更を含み得るということを除いては参照配列と同一である配列を意味する。例えば、参照配列と少なくとも80％の同一性を有する被験アミノ酸配列では、参照配列中の20％までのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換、欠失または挿入されていてもよい。アミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、便宜には、既知のコンピュータープログラム、例えば、Brutlagら，（Computer Applications in the Biosciences（1990）6：p.237−245）のアルゴリズムを基にしたFASTDBプログラムを用いて求めることができる。
【００１４】
上記で定義されたポリヌクレオチド（A）または上記で定義されたポリペプチド（B）の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）、in situハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学によって求めることができる。被験者由来の細胞において上記の技術のうちの1種によって測定した（A）、例えば、mRNAとしてのまたはポリペプチド（B）のレベルを健常な被験者の（A）または（B）それぞれのレベルと比較すればよい。ポリヌクレオチド（A）またはポリペプチド（B）の異常なレベルは気管支過敏症と関連している異常なAAGA活性を示唆するものである可能性がある。
【００１５】
ポリペプチド（B）の生理活性レベルは、例えば、Sanoら，EMBO Journal 12：p.2249−2256によって記載されたように、例えば、L細胞においてホモタイプCa2＋依存性凝集および接着を促進することによって、例えば、カルシウム依存性細胞-細胞接着を測定することによって測定すればよい。被験者由来の細胞において測定された活性を健常な被験者由来の細胞において測定された活性と比較することで被験者が気管支過敏症と関連している異常なAAGA活性を有しているかどうかが示される。
【００１６】
気管支過敏症と関連しているポリヌクレオチド（A）の変異体はコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更するか、またはコードされるポリペプチドの発現レベル、転写物の安定性、もしくは転写物がプロセシングされる方法を変更する変更を含む変異体であり得る。このような変更は以下のうちの少なくとも1つを含む場合がある：（i）ポリヌクレオチド（A）からの1個以上のヌクレオチドの欠失、（ii）ポリヌクレオチド（A）への1個以上のヌクレオチドの付加、（iii）ポリヌクレオチド（A）の1個以上のヌクレオチドの置換、（iv）ポリヌクレオチド（A）の全染色体再構築、（v）ポリヌクレオチド（A）のメッセンジャーRNA転写物レベルの全変更、（vi）ゲノムDNAのメチル化パターンなどの、ポリヌクレオチド（A）の異常な修飾、（vii）ポリヌクレオチド（A）のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（viii）ポリペプチド（B）の非野生型レベル、（ix）ポリヌクレオチド（A）の対立遺伝子欠失および／または（x）ポリペプチド（B）の不適切な翻訳後修飾。AAGA遺伝子（ポリヌクレオチド（A））の変更を検出するためには種々のアッセイ技術を用いてもよい。これらの方法としては、限定されるものではないが、配列解析、サザンブロットハイブリダイゼーション、コンホメーション感受性ゲル電気泳動（CSGE）、制限酵素部位マッピングに関する方法、および分析される核酸とプローブ間でヌクレオチド対を形成しないことの検出に関する方法が挙げられる。
【００１７】
従って、1つの実施形態では、被験者における気管支過敏症と関連しているポリヌクレオチド（A）の変異体、すなわち、遺伝子の異常を被験者由来のDNAサンプルをプローブが相補的なポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする条件下で上記で定義されたポリヌクレオチド（A）の少なくとも5個、例えば、少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドプローブとともにインキュベートして第1の反応産物を得、第1の反応産物を、プローブと健常な被験者由来のDNAから得た対照反応産物と比較することによって検出する。第1の反応産物と対照反応産物の間に、例えば喘息における気管支過敏症と相関のある相違があれば、その相違は気管支過敏症を特徴とする疾病の発症に対する素因を示す。一般に、プローブは15〜50個のヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチドであり、検出可能なシグナルを提供するよう、例えば、フルオロフォアまたは放射性ヌクレオチドで標識してもよい。
【００１８】
特に、喘息またはBHRを特徴とするその他の炎症性もしくは閉塞性気道疾病の発症を引き起こすかまたは寄与する可能性があるAAGA変異にはAAGAの正常な（野生型の）機能、特に、ホモタイプ会合、ひいては細胞-細胞接着に関与する細胞外ドメインおよび構造タンパク質またはシグナル伝達分子と相互作用する細胞内ドメインに負の影響を及ぼす変異がある。このような変異の例としては、i）産生される転写物レベルに影響を及ぼす変異；ii）細胞内、膜貫通または細胞外ドメイン内に生じるミスセンス変異；および転写物がプロセシングされる方法に影響を及ぼす変異が挙げられる。
【００１９】
特定の疾病または疾患、例えば、遺伝的疾患または失病は特定の遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体と関連があるが、これは必ずしも変異タンパク質をコードしているわけではない。従って、被験者における単一ヌクレオチド多型（「SNP」）などの遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体の存在が被験者に特定の疾病または疾患を発症する感受性を付与し得る。遺伝子、例えば、AAGA遺伝子の多型領域は個体集団の遺伝子のヌクレオチド配列を調べることによって同定すればよい。多型領域、例えば、SNPまたはハプロタイプ、すなわち、SNPの組み合わせを同定すれば、特定の個体、例えば喘息などの特定の疾病を発生した個体の集団を研究することによって特定の疾病との関連を調べることができる。多型領域は遺伝子のいずれの領域にも、例えば、エキソン（エキソンのコードまたは非コード領域）、イントロンおよびプロモーター領域に位置し得る。
【００２０】
AAGA遺伝子はその特定の対立遺伝子が特に喘息患者における気管支過敏症と関連している多型領域を含んでなるということが分かっている。従って、上記で定義されたポリヌクレオチド（A）の変異体の存在を調べることは被験者においてポリヌクレオチド（A）の多型の対立遺伝子または対立遺伝子変異体の同一性を調べ、それによって被験者が気管支過敏症と関連している多型の特定の対立遺伝子変異体を有しているかどうかを調べることを含んでなる。
【００２１】
喘息患者由来のDNAサンプルにおいて同定された配列番号1中の多数のSNPを実施例3に示す。これらのうち、配列番号1の6377位（CからTへの変化）および7390位（GからTへの変化）での多型が気管支過敏症と関連していると示されている。従って、好ましい実施形態では、上記に定義のポリヌクレオチド（A）の変異体の存在を調べることは被験者由来の細胞サンプルにおいて、配列番号1の6377および7390位に相当する位置の一方または双方で塩基の同一性を調べることを含んでなる。上記6377位に相当する位置でのTおよび／または上記7390位に相当する位置でのCの存在が気管支過敏症と関連しているポリヌクレオチド（A）の変異体を示す。ハプロタイプ、すなわち、SNP  の組み合わせの存在を調べることが望まれる場合には、6377および7390位双方に相当する位置で塩基の同一性を調べてもよいし、またはこれらの位置の一方または双方での塩基の同一性および配列番号1の589、1001、1060、2033、2193、2561、5667、5804および7531位、ならびに配列番号2の1212、1216、1964および2330位に相当する位置の1箇所以上での塩基の同一性を調べてもよい。特に好ましい実施形態では、配列番号1を含んでなる核酸、またはヌクレオチド6377および／またはヌクレオチド7390を含んでなるその一部を細胞サンプルから単離して配列決定する。
【００２２】
例示的な実施形態では、被験者由来のサンプル細胞のDNAをハイブリダイゼーションに利用できるようにしてAAGA遺伝子（ポリヌクレオチド（A））またはその天然変異体、例えば、配列番号1の6377位および／または7390位を含む領域などの遺伝子の多型領域、またはAAGA遺伝子と天然に関連している5’もしくは3’フランキング配列またはその天然変異体のセンスまたはアンチセンス配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の領域を含む核酸プローブと接触させてプローブのサンプルDNAとのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術は欠失、置換などをはじめとする、ゲノムまたはmRNAレベルのいずれかでの変更または対立遺伝子変異体を検出するために、ならびにmRNA転写物レベルを調べるために用いてもよい。
【００２３】
多型領域の対立遺伝子または対立遺伝子変異体を同定する別の方法は、変異または多型部位に重なり、かつ、約5〜30、例えば、5、10、20、25または30個のヌクレオチドを含むプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。好ましい実施形態では、単一ヌクレオチド多型などの対立遺伝子変異体と特異的にハイブリダイズし得るいくつかのプローブを固相支持体、例えば、「チップ」に付着させる。リソグラフィーをはじめとする種々のプロセスによってオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させてもよい。例えば、チップは約250，000個までのオリゴヌクレオチドを保持し得る。「DNA  プローブアレイ」とも呼ばれるオリゴヌクレオチドを含んでなるこれらのチップを用いる変異検出分析は、例えば、Croninら（1996）Human Mutation 7：p.244に記載されている。1つの実施形態では、チップはある遺伝子の少なくとも1つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含んでなる。次いで、固相支持体を試験核酸と接触させて特異的プローブとのハイブリダイゼーションを検出する。従って、患者由来のDNAサンプル中の1以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同一性を単純なハイブリダイゼーション実験で同定することができる。
【００２４】
従って、別の態様では、本発明は配列番号1の6377および7390位のうちの1箇所以上での上記に記載のポリヌクレオチド（A）の多型を検出することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを提供する。一般に、対立遺伝子特異的プローブは約15〜50個のヌクレオチド、より通常は約15〜30個のヌクレオチドを含み、上記6377または7390位に重なる。便宜には、プローブの中心位置が上記6377または7390位とアラインしている。このようなプローブのヌクレオチド配列は一般にポリヌクレオチド（A）の多型領域中の相当する配列に対して100％相補的である。プローブは、例えば、便宜には、検出可能なシグナルを提供するために、例えば、フルオロフォアまたは放射性標識で標識することもできる。
【００２５】
特定の実施形態では、変更の検出はアンカーPCRまたはRACE  PCRなどのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において（例えば、米国特許第4，683，195号および同4，683，202号参照）、あるいは、リガーゼ連鎖反応（LCR）において（例えば、Landegranら（1988）Science 241：p.1077−1080およびNakazawaら（1994）PNAS  91：p.360−364参照）プローブ／プライマーを利用することを含んでなり、この後者はAAGA遺伝子の点変異を検出するのに特に有用であり得る（Abravayaら（1995）Nucleic Acidis Research 23：p.675−682参照）。単に例示的な実施形態では、この方法は（i）患者から細胞のサンプルを採取し、（ii）サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノムの、mRNAのまたはその双方）を単離し、（iii）核酸サンプルを、AAGA遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が（存在すれば）生じるような条件下でAAGA遺伝子と特異的にハイブリダイズする1種以上のプライマーと接触させ、そして（iv）増幅産物の有無を検出するか、または増幅産物の大きさを検出して対照サンプルの長さと比較するというステップを含む。PCR、LCRまたはいずれかのその他の増幅手順（例えば、自己持続性配列複製（Guatelli，J.C.ら，1990，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87：p.1874−1878））、転写増幅系（Kwoh，D.Y.ら，1989，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86：p.1173−1177）またはQ−βレプリカーゼ（Lizardi，P.M.ら，1988，Bio／Technology 6：p.1197）を予備ステップとして用いてサンプル量を増加させてもよく、それで本明細書に記載された変異を検出する技術のいずれかを実施してもよいということは予測される。
【００２６】
上記で定義されたポリヌクレオチド（A）の、単一ヌクレオチド多型を含んでなる変異体の存在を調べる好ましい方法は被験者由来のDNAサンプルを配列決定することによって対立遺伝子変異体を調べることを含んでなる。多型の対立遺伝子変異体を同定する別の方法では、細胞サンプル由来のDNA  断片を、特に配列番号1の6377および7390位のうちの1箇所以上でポリヌクレオチド（A）の多型を検出することができる対立遺伝子特異的プライマーの存在下でPCRで増幅する。喘息患者由来のDNAサンプルで同定された多数のSNPを実施例2に示す。これらのうち、配列番号1の6377および7390位の多型は特定の集団において気管支過敏症と関連していると示されている。
【００２７】
本発明はまた、例えば、配列番号1の6377および7390位のうちの1箇所以上での上記で定義されたポリヌクレオチド（A）の多型を検出することができる、増幅ステップを含む多型検出手順に用いられる対立遺伝子特異的プライマーを提供する。一般に、このプライマーは約15〜50個のヌクレオチド、より通常は約15〜30個のヌクレオチドを含む。プライマーのヌクレオチド配列は検出される対立遺伝子のものと対応するが、検出される対立遺伝子のものと対応するプライマーの3’末端の約5〜10のヌクレオチドを含む部分的に対応する配列を用いてもよい。
【００２８】
プライマーはその検出を補助するよう、例えば、フルオロフォアまたは放射性標識で標識してもよい。
【００２９】
本発明は上記の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブまたは上記の対立遺伝子特異的プライマーを、所望により標識試薬（検出可能な標識をハイブリダイズされた産物に組み込むための）、バッファーおよびTaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼなどのその他の試薬とともに含んでなる診断用または予後用キットをさらに提供する。
【００３０】
従って、別の態様では、本発明は配列番号1の6377および／または7390位での単一ヌクレオチド多型、特に、上記6377位でのTおよび／または上記7390位でのCなどの、気管支過敏症と関連している上記で定義されたポリヌクレオチド（A）の変異体、特に、気管支過敏症と関連している単一ヌクレオチド多型の特定の対立遺伝子変異体を含むポリヌクレオチド（A）の変異体である単離されたポリヌクレオチドを提供する。相応して、さらなる態様では、本発明は上記の気管支過敏症と関連しているポリヌクレオチド（A）のポリヌクレオチド変異体によってコードされている、気管支過敏症と関連している単離された変異ポリペプチド、または気管支過敏症と関連している上記のポリペプチド（B）の変異体である単離されたポリペプチドを提供する。
【００３１】
本明細書に記載の診断アッセイを用いて得られた情報は（単独で、または同一の疾病に寄与する別の遺伝子欠損に関する情報と併せて）症候性被験者が特定の疾病または疾患を引き起こすかまたは寄与する遺伝子欠損（例えば、AAGA遺伝子における、またはAAGA遺伝子の発現を調節する遺伝子における）を有することを予知、診断または確認するのに有用である。あるいは、この情報は（単独で、または同一の疾病に寄与する別の遺伝子欠損に関する情報と併せて）非症候性被験者が被験者における異常なAAGA活性またはタンパク質レベルによって引き起こされるかまたは寄与される疾病または症状を発症する可能性があるかどうかを予測するために予後的に用いてもよい。特に、アッセイによりAAGAの、またはそれと関連している、単一ヌクレオチド多型（SNP）などの多型である変異と関連している気管支過敏症を発症する個体の傾向を確認することが可能となる。予後情報を基に、医師は療法、例えば、個体において喘息の発症を防ぐか、または遅延させるのに有用な治療プロトコールを推奨することができる。
【００３２】
個体におけるて欠陥のある、または欠損したAAGA遺伝子またはタンパク質をもたらす特定の単一または複数の変更（AAGAプロフィール）についての知識は単独で、または同一の疾病に寄与する他の遺伝子欠損に関する情報（特定の疾病の遺伝子プロフィール）と併せて、個体の遺伝子プロフィール、「薬理ゲノミクス」の目標に向けた特定の疾病の治療のカスタマイズを可能にする。例えば、AAGA遺伝子の特定の対立遺伝子を有する被験者は特定の疾病の症状を示す場合もあるしそうでない場合もあり、または特定の疾病の症状を発症しやすい場合もあるしそうでない場合もある。さらに、それらの被験者が症候性である場合には、特定の薬剤、例えば、特定のAAGA治療薬に応答する場合もあり、応答しない場合もあるが、別のものに応答する場合もある。従って、欠陥および／または欠損AAGA遺伝子および／またはタンパク質によって引き起こされるかまたは寄与される疾病または症状について症候性である被験者集団からのAAGA遺伝子プロフィールの作製（例えば、喘息の発症と関連しているAAGA遺伝子の変更の分類）（AAGA遺伝子集団プロフィール）および個体のAAGAプロフィールの集団プロフィールとの比較により、特定の患者または患者集団（すなわち、同一の遺伝子変更を有する患者群）にとって安全であり、かつ、有効であると予想される薬剤の選択または設計が可能となる。
【００３３】
従って、別の態様では、本発明は喘息を罹患している個体に施す治療を薬理ゲノミクスにより選択する方法を提供し、これは個体のAAGA遺伝子プロフィールを調べて個体のAAGA遺伝子プロフィールをAAGA遺伝子集団プロフィールと比較し、それによって個体に施す治療を選択することを含んでなる。
【００３４】
例えば、AAGA集団プロフィールは欠陥または欠損AAGA遺伝子によって引き起こされるかまたは寄与される疾病を罹患している患者集団においてAAGAプロフィール、例えば、AAGA遺伝子の同一性を調べることによって実施することができる。所望により、AAGA集団プロフィールには1）AAGA関連疾病と関連している症状の重篤度、2）AAGA遺伝子発現レベル、3）AAGAmRNA  レベルおよび／または4）AAGAタンパク質レベルをモニターすること、ならびに（iii）そのAAGA遺伝子またはAAGA経路遺伝子に存在する特定の遺伝子の単一または複数の変更を基にして集団を分割するまたは分類することをはじめとする種々の方法のいずれかを用いてAAGA治療薬に対する集団の応答に関する情報をさらに含めてもよい。AAGA遺伝子集団プロフィールはまた、場合によっては特定の治療薬に対して患者が応答性か非応答性のいずれかである特定の変更を示し得る。従って、この情報または集団プロフィールはその個体のAAGAプロフィールに基づいて特定の薬剤に対してその個体が応答するはずであるかを予測するのに有用である。
【００３５】
好ましい実施形態では、AAGAプロフィールは転写または発現レベルプロフィールであり、ステップ（i）はAAGAタンパク質の発現レベルを、単独で、または同一の疾病に寄与すると知られている他の遺伝子の発現レベルと併せて調べることを含んでなる。AAGAプロフィールは疾病の種々の段階の多数の患者で調べてもよい。
【００３６】
薬理ゲノミクス研究はまたトランスジェニック動物を用いて実施してもよい。例えば、AAGA遺伝子の特定の対立遺伝子変異体を含むトランスジェニックマウスを、例えばヒトAAGA遺伝子の対立遺伝子を用いてその野生型AAGA遺伝子を複製することによって作製してもよい。次いで、特定のAAGA治療薬に対するこれらのマウスの応答を調べればよい。
【００３７】
AAGA治療薬での個体の治療はAAGAタンパク質レベルまたは活性、AAGA  mRNAレベル、および／またはAAGA転写レベルなどのAAGA特性を調べることによってモニターすればよい。これらの測定値は治療が有効であるかどうか、または調整、または最適化するべきかどうかを示す。従って、AAGAを臨床試験の際の薬剤の有効性のマーカーとして用いてもよい。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明は被験者由来の投与前DNAサンプルにおいて、および被験者由来の投与後DNAサンプルにおいてポリヌクレオチド（A）（例えば、mRNAまたはゲノムDNA）もしくはポリペプチド（B）の発現レベルまたは上記ポリヌクレオチド（A）もしくはポリヌクレオチド（B）の活性レベルを調べて、投与前サンプルおよび投与後サンプルにおけるそれぞれの発現または活性レベルを比較して、所望によりそれに応じて被験者への医薬の投与を変更するというステップを含んでなる、被験者の医薬（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または上記のスクリーニングアッセイによって同定されたその他の薬剤候補）での治療の有効性をモニターする方法を提供する。例えば、AAGAの発現または活性を検出されたものよりもより高レベルに高めるために、すなわち、薬剤の有効性を高めるために薬剤の投与の増加が望ましい場合もある。あるいは、AAGAの発現または活性を検出されたものよりもより低レベルに低下させるために、すなわち、薬剤の有効性を低下させるために薬剤の投与の減少が望ましい場合もある。
【００３９】
また、被験者の細胞をAAGA治療薬の投与前後に採取してAAGA以外の遺伝子の発現レベルを検出してAAGA治療薬がこのような遺伝子の発現の有害な増加または減少を引き起こしていないことを確認してもよい。これは例えば、転写プロファイリング法を用いることによって実施すればよい。従って、in vivoでAAGA治療薬に曝された細胞由来のmRNAとAAGA治療薬に曝されなかった同種の細胞由来のmRNAを逆転写させて多数の遺伝子由来のDNAを含有するチップとハイブリダイズさせ、それによってAAGA治療薬で処理されたおよび処理されていない細胞における遺伝子の発現を比較すればよい。例えば、AAGA治療薬が個体においてプロトオンコジーンの発現をオンにする場合には、この特定のAAGA治療薬の使用は望ましくない。
【００４０】
個体のAAGA遺伝子プロフィールまたは喘息の遺伝子プロフィールは、1）喘息の分子的機序に対応する薬剤のより有効な処方；および2）特定の薬剤の適切な投与量のよりよい決定を可能にし得る。AAGAまたは喘息遺伝子プロフィールに基づいて、最も高い臨床上の利点を示すと予想される集団を標的にする能力により、1）期待はずれの市場結果の市販薬の再配置；2）患者部分群に特異的である安全性または有効性の限界の結果として臨床上の開発が中断されている薬剤候補の救済；ならびに、3）薬剤候補およびより最適な薬剤標識の急速、かつ、費用のかからない開発（例えば、AAGAのマーカーとしての使用が有効用量を最適化するのに有用であるため）が可能となり得る。
【００４１】
別の態様では、本発明はそれを必要とする被験者に有効量の上記のポリヌクレオチド（A）または上記のポリペプチド（B）または上記ポリペプチド（B）もしくは疾病と関連しているその変異体に対して免疫応答性である抗体（C）または上記ポリヌクレオチド（A）もしくは疾病と関連しているその変異体のものに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（D）を投与することを含んでなる気管支過敏症を特徴とする疾病を治療する方法を提供する。
【００４２】
ポリヌクレオチド（A）は配列番号4または配列番号5または配列番号6のヌクレオチド配列を含んでなるcDNA、配列番号1または配列番号2または配列番号3のヌクレオチド配列を含んでなるゲノムDNA、あるいはストリンジェントな条件下で配列番号1または配列番号2または配列番号3または配列番号4または配列番号5または配列番号6とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなるDNAであってもよい。
【００４３】
本発明の別の態様では、ポリヌクレオチド（A）は配列番号1または配列番号2または配列番号3または配列番号4または配列番号5または配列番号6由来の少なくとも20個の、例えば少なくとも50個の、例えば少なくとも100個の、例えば少なくとも200個の連続する塩基を含む一部を含んでなる。さらなる態様では、ポリヌクレオチド（A）は配列番号7または配列番号8由来の少なくとも10個の、例えば、少なくとも50個の、例えば少なくとも100個の、例えば少なくとも200個の連続するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００４４】
ポリヌクレオチド（A）はDNA配列のバイオインフォマティクス解析によって酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）および／またはP1人工染色体（PAC）の配列決定によって求められた5番染色体上のサブ領域5q31−5q33から、選択された遺伝子の予想されるエキソンと95％より高い同一性を有する配列を検索しその配列を用いて設計したプライマーを用いるPCRによってヒト肺cDNAライブラリーからcDNAを同定することで単離してサブ領域内の遺伝子を同定してもよい。
【００４５】
例えば、配列番号1または配列番号2または配列番号3または配列番号4または配列番号5または配列番号6の配列を含むポリヌクレオチド（A）は既知の手順および装置を用いる化学合成、例えば、自動固相合成によって、それを含むヌクレオチドから調製してもよい。
【００４６】
本発明の別の態様では、ポリペプチド（B）は配列番号7または配列番号8の少なくとも10個、例えば、少なくとも50個、例えば少なくとも100個、例えば少なくとも200個の連続するアミノ酸を含む一部を含んでなる。
【００４７】
上記のポリペプチド（B）または変異ポリペプチドは上記のポリヌクレオチド配列またはその変異体をプロモーターおよび転写のためのその他の適当な調節エレメントを含有する発現ベクターにクローニングし、細菌、植物、昆虫、酵母、動物またはヒト細胞などの原核生物のまたは真核生物の宿主細胞に導入し、組換え発現ベクターを含有する宿主細胞を好適な条件下で培養することによって生産してもよい。このようなポリペプチドの組換え発現のための技術は十分に公知であり、例えば、J.Sambrookら、Molecular Cloning 第2版、Cold Spring Harbor Press、1990に記載されている。
【００４８】
上記のポリペプチド（B）または変異ポリペプチドは、例えば、精製を容易にするために1種以上の異種ポリペプチドとの組換え融合タンパク質として発現させてもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列と異種ポリペプチド配列の間に位置する切断部位を含み、その結果、十分に公知の技術を用いて、配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたは気管支過敏症と関連しているその変異体が異種部分から切断されて精製され得る、ポリヒスチジンなどの異種ポリペプチドとの組換え融合タンパク質として発現させてもよい。
【００４９】
上記のポリペプチド（B）または変異ポリペプチドはまた、全体または一部を、十分に公知の化学法、例えば、自動固相技術を用いてそれを含むアミノ酸から合成してもよい。
【００５０】
上記のポリペプチド（B）または変異ポリペプチドは十分に公知の標準的な手順によって精製すればよい。
【００５１】
抗体（C）はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。このような抗体は従来の手順を用いて調製すればよい。精製された抗原に対するポリクローナル抗体の作製方法は十分に確立されている（Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley and Sons Inc、11章のCooperおよびPaterson参照）。典型的には、ウサギまたはマウスなどの宿主動物を抗原として精製された本発明のポリペプチドまたはその免疫原性部分で免疫化し、適当な時間間隔の後、宿主の血清を回収してポリペプチドに対して特異的な抗体について調べる。精製された抗原に対するモノクローナル抗体の作製方法は十分に確立されている（11章、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley and Sons Inc 参照）。ポリクローナル抗体の作製には血清を飽和硫酸アンモニウムまたはDEAEセファデックスで処理してもよい。モノクローナル抗体の作製には免疫化された動物の脾臓またはリンパ球を回収して公知の方法によって不死化するかまたはハイブリドーマを作製するのに用いる。不死化された細胞によって分泌された抗体を、例えば、ウェスタンブロット解析を用いてスクリーニングして所望の特異性の抗体を分泌するクローンを決定する。ヒト化抗体は従来手順によって調製することができる。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（D）はAAGAのmRNAのものに相補的なヌクレオチド配列、特に、配列番号1もしくは配列番号2もしくは配列番号3もしくは配列番号4もしくは配列番号5もしくは配列番号6に相補的な、または疾病、例えば、喘息と相関のある多型を有するポリペプチド（B）の変異体をコードするポリヌクレオチドのものに相補的なヌクレオチド配列、特に、配列番号1もしくは配列番号2もしくは配列番号3もしくは配列番号4もしくは配列番号5もしくは配列番号6のこのような多型変異体に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはDNA、DNAのホスホロチオエートまたはメチルホスホメート類似体などのDNAの類似体、RNA、RNAの類似体またはペプチド核酸（PNA）であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは従来法によって、例えば、自動固相技術を用いて合成してもよい。
【００５３】
喘息および気管支過敏症を特徴とするその他の閉塞性または炎症性気道疾病におけるポリペプチド（B）の役割は気管支過敏症の従来のアレルゲンによって誘発された動物モデル、例えば、以下に記載されるオボアルブミン誘導性BHRマウスモデル（Tsuyukiら，Journal of Clinical Investigation. 96：p.2924−2931）またはモルモットモデルを用いて調べることができる。
【００５４】
上記のあるいは以下まとめて本発明の薬剤と呼ばれる、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは炎症性または閉塞性気道疾病の治療（予防的または対症的）に用いてもよい。例えば、ポリペプチド（B）は、そのポリペプチドに欠陥のある、またはそれを必要とする哺乳類、特に、ヒトを治療するために用いてもよく；ポリヌクレオチド（A）はAAGA活性を高めることが望まれる場合に、例えば、被験者が変異したAAGA遺伝子を有するかAAGA遺伝子を失っている場合に遺伝子治療に用いてもよく；アンチセンスオリゴヌクレオチド（D）はAAGA活性または疾病、例えば、喘息と相関のある多型を有するAAGA遺伝子の変異体の活性を、これが望まれる場合に、阻害するために用いてもよく；抗体（C）はAAGAポリペプチドのリガンド／抗リガンド結合活性を阻害するために用いてもよい。
【００５５】
「遺伝子治療」とは遺伝物質を個体の体細胞に導入することに基づいた、ヒト疾病を治療するためのアプローチを指す。遺伝子導入は遺伝子を保持するウイルスまたは非ウイルスベクターを血液または組織へ投与することによってin vivoで直接的に、または実験室において操作した細胞へ遺伝物質を導入し、次いで、遺伝子を含有する細胞を個体に戻すことによってex vivoで間接的に達成してもよい。細胞内の遺伝物質を変更することによって、遺伝子治療は根底にある疾病病態生理を正し得る。動物において特定の組織および器官系へ遺伝子送達するのに好適なベクターおよび手順はDracopoli，N.C.ら，Current Protocols in Human Genetics. John Wiley and Sons Inc.，12章および13章にそれぞれ記載されている。上記のポリヌクレオチド（A）に関しては、遺伝子治療は好適な制御エレメント下にAAGA遺伝子の発現カセットを含有するウイルスまたは非ウイルス遺伝子治療ベクターを疾病個体（例えば、喘息患者の）の肺へ送達し、その結果根底にある疾病病態生理を正すかまたは寛解させることを含み得る。
【００５６】
気道の過反応性を阻害するか、または回復させる本発明の薬剤の有効性はモルモット試験モデルで証明され得る。予め形成した免疫複合体の急性注入によりモルモットをヒスタミンに対して反応性亢進にする。免疫複合体の投与に先立つわずかな程度の気管支収縮のみを引き起こすヒスタミンの用量がその後にかなり強力な効果を引き起こす。モルモット（ダンキン−ハートレー、雄、400〜600g）をフェノバルビタール（100mg／kg、腹腔内）およびペントバルビタール（30mg／kg、腹腔内）で麻酔してガラミン（10mg／kg筋内）で麻痺させ、空気と酸素の混合物（45：55、v／v）を用いて人工呼吸した。動物は気管カニューレによって人工呼吸した（8ml／kg、1Hz）。人工呼吸はフロートランスデューサーによってモニターした。フローの測定を行う際には、胸郭における同時発生的圧力変化を胸腔内外套針によって直接モニターし、これによって気管に関連した圧力の差を示すことが可能となる。この情報から、各吸息での抵抗およびコンプライアンスを算出する。アレルギー反応は予め形成した免疫複合体（0.05mlのモルモット抗ウシγグロブリン抗血清に0.05mlの生理食塩水中の30μgのウシγグロブリンを添加することによって調製した）を10分間隔で3回静脈内注射することによって開始する。免疫複合体の最後の暴露の前後に、ヒスタミン（10分間隔での1.0〜3.2μg／kg）の静脈内注射を用いて気道の感受性を規定する。気道の過反応性は免疫複合体の反復注射の前後のヒスタミンに応答する肺抵抗の最大値の対差として現れる。本発明の薬剤はトラガカント中の溶液または懸濁液のいずれかとして気管内投与する。気道の反応性亢進の回復についてのED50値は用量応答曲線から図によって求め、気道の過反応性の50％減少をもたらす用量を表す。
【００５７】
本発明を適用できる、気管支過敏症を特徴とする疾病としては炎症性または閉塞性気道疾病、特に、内因性（非アレルギー性）喘息および外因性（アレルギー性）喘息、軽度の喘息、中程度の喘息、重症の喘息、気管支喘息、運動誘導性喘息、職業性喘息および細菌感染後に誘導された喘息をはじめとするいかなる種類または起源の喘息も挙げられる。喘息の治療はまた、例えば、喘鳴症状を示し、かつ、主要な医学的懸念についての確立された患者カテゴリーであり、今では初発性または初相喘息と同定されることが多い「喘鳴のある幼児」と診断されたかまたは診断可能である、4または5歳未満という年齢の被験者の治療を包含すると理解されるべきである。（便宜上、この特定の喘息症状は「喘鳴幼児症候群」と呼ばれる。）
【００５８】
喘息の治療の予防効率は、例えば、急性喘息の症候性の発作または気管支収縮発作の頻度または重篤度の軽減、肺機能の改善または気道の過反応性の軽減によって明らかとなる。その他の対症療法、すなわち症候性の発作をそれが生じる時に、例えば、抗炎症的に（例えば、副腎皮質ステロイド）または気管支拡張によって制限するか、中断する療法の必要性の減少によってさらに明らかとなり得る。喘息の予防利点は特に「モーニング・ディップ（morning dipping）」への被験者の傾向性において明らかとなり得る。「モーニング・ディップ（morning dipping）」は相当なパーセンテージの喘息患者に共通であり、かつ、例えば、約午前4時〜6時という時間の間、すなわち、通常それまでに施された喘息対症療法のいずれとも実質的に離れている時間の喘息発作を特徴とする、認識された喘息症状である。
【００５９】
本発明を適用できるその他の炎症性または閉塞性気道疾病および症状としては、成人急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、それに関連している慢性の気管支炎または呼吸困難を含む慢性閉塞性肺（pulmonary）、気道または肺（lung）疾患（COPD、COAD、COLD）、肺気腫、ならびに、その他の薬剤治療、特にその他の吸入薬治療の結果としての気道の過反応性の悪化が挙げられる。本発明はまた、例えば、急性、アラキディック（arachidic）、カタル性、クループ性、慢性または結核性（phthinoid）気管支炎をはじめとするいかなる種類または起源の気管支炎の治療にも適用できる。本発明を適用できるさらなる炎症性または閉塞性気道疾病としてはいかなる種類または起源の塵肺（粉塵の吸入の反復によって引き起こされる、慢性であるか急性であるかに関わらず気道閉塞を伴うことが多い、炎症性で、通常職業性の肺の疾病）も挙げられ、例えば、アルミニウム肺症、炭症、石綿沈着症、石肺症、プチローシス（ptilosis）、鉄沈着症、ケイ肺症、タバコシス（tabacosis）および綿肺症が挙げられる。
【００６０】
その抗炎症活性を考慮して、特に、好酸球活性化の阻害に関連して、本発明の薬剤はまた、それが気道および／または肺、ならびに、例えば、レフラー症候群、好酸球性肺炎、寄生虫（特に後生動物）感染（熱帯性好酸球増加症をはじめとする）、気管支肺アスペルギルス症、結節性多発性動脈炎（チャーグ・ストラウス症候群をはじめとする）、好酸球性肉芽腫の結果として起こるか、またはこれに付随する気道の好酸球関連疾患および薬剤応答によってもたらされた気道に影響を及ぼす好酸球関連疾患に作用するので、好酸球関連疾病、例えば、過好酸球増加症をはじめとする好酸球増加症、特に、気道の好酸球関連疾患（例えば、肺組織の病的な好酸球の浸潤をはじめとする）の治療にも有用である。
【００６１】
本発明の薬剤はいずれかの適当な経路、例えば、経口的に、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で；非経口的に、例えば、静脈内に；局所的に、例えば、軟膏またはクリームで；経皮的に、例えば、パッチで；吸入によって；または鼻腔内に投与すればよい。
【００６２】
本発明の薬剤を含有する医薬組成物は従来の希釈剤または腑形剤および生薬の技術分野で公知の技術を用いて製造すればよい。従って、経口投与形としては錠剤およびカプセル剤が挙げられ、吸入用組成物はエアロゾルまたはその他の微粒化可能な製剤または乾燥粉末製剤を含んでなっていてもよい。
【００６３】
本発明は（A）吸入可能な形態の、例えば、エアロゾルまたはその他の微粒化可能な組成物の、または吸入可能な微粒子、例えば、微粉化した形態の本発明の薬剤、（B）吸入可能な形態の本発明の薬剤を含んでなる吸入可能な医薬；（C）このような吸入可能な形態の本発明の薬剤を吸入装置と関連して含んでなる医薬製剤；および（D）吸入可能な形態の本発明の薬剤を含有する吸入装置を含む。
【００６４】
本発明を実施するのに用いる本発明の薬剤の用量はもちろん例えば、治療される特定の症状、望まれる作用および投与様式によって異なる。一般に、吸入による投与に好適な日用量は1μg〜10mg／kgのオーダーであり、他方、経口投与に好適な日用量は0.1mg〜1000mg／kgのオーダーである。
【００６５】
上記のポリペプチド（B）または気管支過敏症と関連している上記の変異ポリペプチド、例えば、配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの変異体によってコードされ、その変異体が配列多型を含むポリペプチドをその活性のエンハンサー（アゴニスト）またはインヒビター（アンタゴニスト）を同定するために、すなわち、炎症性または閉塞性気道疾病、特に喘息を治療するのに有用な化合物を同定するために用いてもよい。エンハンサーまたはインヒビターは例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、核酸または低分子量化合物であってもよい。従って、本発明はまた、ポリペプチド（B）または気管支過敏症、特に、喘息と関連しているその変異体の活性を調節する物質などの炎症性または閉塞性気道疾病の治療に有用な物質を同定する方法を提供し、これは候補物質を上記ポリペプチド（B）または上記のその変異体と混合して候補物質の上記活性に対する作用を測定することを含んでなる。ポリペプチド（B）または変異体の活性は、例えば、Sanoら，EMBO Journal 12：p.2249−2256によって記載されたように、例えば、L細胞におけるホモタイプなCa2＋依存性凝集および接着を促進することによって測定すればよい。本発明はまた上記のポリペプチド（B）またはその変異体と結合する物質、特に、喘息などの炎症性または閉塞性気道疾病の治療に有用な物質を同定する方法を含み、これは候補物質を上記ポリペプチド（B）または上記変異体と混合して結合が生じたかどうかを調べることを含んでなる。
【００６６】
別の態様では、本発明は上記のポリヌクレオチド（A）の変異体によってコードされる変異ポリペプチドと結合するか、その活性を調節する物質、特に、喘息などの炎症性または閉塞性気道疾病の治療に用いるのに好適な物質を同定する方法を提供し、これは候補物質を上記変異ポリペプチドと混合して（i）結合が生じたかどうかを調べ、かつ／または、候補物質の上記活性に対する作用を測定することを含んでなる。
【００６７】
本発明を以下の実施例によって例示する。実施例に用いた略語は以下の意味を有する：
AEBSF：  4−（2−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド
BAC：  細菌人工染色体
BAP：  1，4−ビス（アクリロイル）ピペラジン
BHR：  気管支過敏症
BLAST：  基礎的局所アラインメント検索ツール（basic local alignment search tool）
BSA：  ウシ血清アルブミン
CSGE：  コンホメーション感受性（conformation sensitive）ゲル電気泳動
dNTP：  デオキシヌクレオチド三リン酸
DTT：  ジチオスレイトール
EIA：  酵素免疫アッセイ
EST：  発現された配列タグ
FAM：  6−カルボキシ−フルオレセイン
FCS：  胎児ウシ血清
HBEC：  ヒト気管支上皮細胞
LBNL：  ローレンス・バークレー国立研究所
LOD：  オッズの対数
MTN：  マルチプル・ティシュー・ノーザン
ORF：  オープン・リーディング・フレーム
PAC：  P1人工染色体
PCR：  ポリメラーゼ連鎖反応
PBS：  リン酸緩衝生理食塩水
PEG：  ポリエチレングリコール
PMSF：  フェニルメチルスルホニルフルオリド
SDS−PAGE：  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
SNP：  単一ヌクレオチド多型
STS：  配列タグをつけた部位
TAMRA：  6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン
TDT：  伝達不均衡試験
TET：  テトラクロロ−6−カルボキシ−フルオレセイン
TTE：  44mMのTris、14.5mMのタウリン、0.1mMのEDTA、pH9.0
【実施例１】
【００６８】
喘息患者および非喘息患者の個体をオランダの喘息の遺伝学についての家系研究から選択する（［Panhuysenら，Clinical amd Experimental Allergy 25（付録2）：p.35−38］；フローニンゲン大学病院およびメリーランド大学の医薬品倫理委員会が本研究を承認しており、記入されたインフォームド・コンセントをすべての参加者から得る）。ビートリックソード、ハレン、オランダにおける、1962年と1975年の間の、喘息の患者を喘息の診断およびその治療の最適化について評価する。この第1の評価からこの研究に含めるには、患者は3つの基準を満たさなければならない：（1）喘息に一致する症状；（2）年齢≦45歳；（3）ヒスタミンに対する気管支過敏症（デ・フリースの30秒吸入法を用いてPC20≦32mg／ml；［de Vriesら，International Archives of Allergy 20：p.93−101］）。臨床評価は一般的な空気アレルゲンでの皮内皮膚試験の実施、ウォーターシール肺活量計（Lode Spirograph、グローニンゲン、オランダ）での肺機能試験、および30秒吸入プロトコールを用いるヒスタミンでの気管支過敏症についての試験［de Vriesら，Int. Arch. Allergy 20：p.93−101］を含む。DNA単離、総IgE、特異的IgEおよび好酸球測定のために血液サンプルを採取する。
【００６９】
1990年以降、これらの発端者をその配偶者、最小2人の子供、可能なら孫とともに再研究する。全体で、200の2および3世代の家族を研究する。この第2の評価（1990〜1998）では、発端者では第1の評価（1962〜1975）で行われた測定を反復し、また家族でも実施する。800μgのサルブタノール（アルブテロール）の投与の20分後に肺活量計を反復することによって可逆性を調べる。すべての参加者に可能であれば臨床試験の前に肺の薬物治療を停止するよう求める：吸入副腎皮質ステロイドは14日間、吸入長時間作用性βミメティックスおよび経口抗ヒスタミンは48時間、吸入短時間作用性βミメティックスおよび抗コリン薬は8時間停止する。喘息患者は研究の前に喘息悪化しなかったか、または6週間の経口プレドニゾンの過程を必要としなかった。
【００７０】
この評価は喘息およびアレルギーの症状および治療についてのさらなる質問を含む英国医療審議会（British Bedical Counscil）アンケートの改変型をさらに含む［Panhuysenら，Clinical and Experimental Allergy 25（付録2）：p.35−38］。定義により、発端者には医師の喘息の診断が存在する。配偶者においては、被験者が（1）現在喘息の定期的な治療を受けている、（2）これまでに開業医または喘息の専門医を訪れたか、あるいは（3）これまでに喘息の医薬を用いたと報告する場合には、喘息の所見があるとする。アレルギー性鼻炎は以下の質問のうちの1つに対する肯定的回答と定義しうる：（1）動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、羽（例えば、枕の中の）の周辺にいるとき、または家のほこりっぽい場所；または（2）木、草、および花の周辺にいるときに鼻水や鼻詰まりがあるか？。花粉症は質問：これまでに花粉症だったことはあるか？に対する肯定的な回答と定義する。
【００７１】
第1の92家族では血清総IgEは固相免疫アッセイによって測定されている［Panhuysenら，Clinical and Experimental Allergy 25（付録2）：p.35−38］。108家族の第2のセットでは、血清IgEレベルは酵素結合蛍光アッセイによって測定する（Mini Vidas、Biomerieux Vitek Inc.、マーシー、フランス）。皮膚試験は16種の一般的な空気アレルゲン、陽性および陰性対照を用いる皮下皮膚試験によって実施されている。以下のアレルゲンを試験する：混合した花粉、2種の混合した木の花粉、混合した草、イエダニ、貯蔵庫ダニ、ネコ、イヌ、ウマ、ウサギ／モルモットの鱗屑、羽混合物および5種の糸状菌類（Aspergillus fumigatus、Alternaria alternata、Cladosporium herbarum、Penisillium notatum、Botrytis Cineria）。（ALK−Abello、ニューゲイン、オランダ）。陽性皮膚試験は最大膨疹径が≧5mmである場合に存在すると考えられている。
【００７２】
オランダの家族において、候補遺伝子アプローチを用いて、総血清IgEレベル［Meyersら，Genomics 23：p.464−470］、気管支過敏症［Postmaら，New England Journal Medicine 333：p.894−900］および喘息［Panhuysenら，Journal of Investigative Medicine 43：281A；Bleeckerら，American Journal of Human Genetics 59：A213］のヒト染色体5qとの連鎖についての証拠がこれまでに認められている。しかしながら、その他の複雑な疾病で認められたように、連鎖領域は広い（＞40cMにまたがるサイトカインクラスターからβ2アドレノセプター領域）。連鎖領域を絞り込むために、標準的なプロトコール（ピュアジーン（Puregene）キット、Gentra Systems Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて血液DNAサンプルからDNAを抽出する。染色体5q31〜q33領域にまたがるトリおよびテトラヌクレオチドリピートからなる37種のマーカーの収集物を用いてDNAサンプルの遺伝子型を同定する。蛍光標識したプライマーを用いるマルチプレックスPCRを実施し、得られる増幅された断片を変性ポリアクリルアミドゲルで分離する。標識した断片をABI377配列決定機を用いて検出し、従来技術を用いてGENOTYPERソフトウェア［Applied Biosystems、USA］を用いて遺伝子型をスコアづけする。プログラムリンケージ・デザイナー［Van Campら，Trends Genetics 13：82］の改変版を用いて対立遺伝子をビンとして遺伝を調べる。次いで、疾病情報を用いずに、Linkage DesignerのアウトプットをLINKAGEバージョン5.1ソフトウェア［Handbook of Statistics，Vol.8、RaoおよびChakraborty（編）p.81−123のLathropおよびLalouel、Elsevier Science Publishers BV、アムステルダム］を用いていずれかの不一致について解析する。データの最終チェックとして、CRIMAP［LanderおよびGreen、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84：p.2363−2367］を用いて染色体マップの順序および長さを調べ、二重組換えを検出する。連鎖している家族では、この解析により7.0を超えるLODスコアを有するBHRの連鎖領域が同定される。ピークLODスコアはマイクロサテライトマーカーD5S2011およびD5S2017によって規定される。
【実施例２】
【００７３】
ローレンス・バークレー国立研究所ゲノムセンターウェブサイト（LBNL;www-hgc.lbl.gov/biology/bacmap/2.gif）で入手可能なヒト染色体5q31〜q33についての物理的マップ情報を用いて同定され、Research Genetics（ハンツビル、アラバマ、USA）からBACクローン番号h164（22f14）、c5（50g20）、h187（35k5）、h167（8e5）およびh177（32d16）として得られるマーカーD5S2011とD5S2017の間の染色体領域にまたがる細菌人工染色体（BAC）クローンおよびGenome Systems Inc.（セントルイス、ミズーリ、USA）によるLBNLウェブサイト（www_hgc.lbl.gov/sts.html）で入手可能なSTSマーカーbac51107T（BAC50g20の5’末端）およびbac51330T（BAC22f14の3’末端）に関して、配列番号9〜12を含むプライマーを用いるPCRによって単離されたP1人工染色体（PAC）（BACおよびPACはともにヒト染色体領域5q31〜5q33のサブ領域をカバーしている）をABI377配列に関する従来技術（http://www.pebio.com/ab/about/dna/377/）を用いて配列決定する。得られるゲノムDNA配列をGENSCAN（BurgeおよびKarlin，Journal of Molecular Biology 268：p.78−94）およびGENEMARKバージョン2.4（BorodovskyおよびMcIninch，Computers and Chemistry 17：p.123−133）遺伝子検出プログラムおよびBLAST（Altschulら，Journal of Molecular Biology 215：p.403−410）相同性検索を用いて公開タンパク質、ESTおよびDNAデータベース（SWISSPROT、SWISSPROTPLUS、GenBank、Genbankアップデート、EMBL、GENEMBLPLUS、GenBank EST、EMBL EST、GenBank STS、EMBL STS）に対して解析し、その結果をグラフィック・ディスプレーのためにACeDb（A C. elegans Database；http://www.sanger.ac.uk/Software/Acedb/）のヒト5番染色体特異的バージョンに解析する。このグラフィック・ディスプレーから重要な領域（すなわち、遺伝子）を予想されるエキソンおよびアラインされたEST／タンパク質ヒットによって同定する。遺伝子AAGAは、まず、グラフィック・ディスプレーでゲノムDNAの少なくとも22.5kbをカバーし、かつ、配列決定されていないDNAのストレッチによって分離されたDNA配列の2つの島に広がる153〜2196bpの大きさにわたる5個のエキソンを含んでなるGENSCANで予測された遺伝子として同定される。
【表１】
0004428478.tif 000002
【００７４】
GENSCANで予測されたエキソン中のDNA配列はヒトをはじめとする各種生物におけるカドヘリン型分子と相同性を有するタンパク質をコードし、このことはそれがカドヘリンタンパク質ファミリーのメンバーであるということを示唆する。100％の相同性はプロトカドヘリン42遺伝子（GENEBANK受託番号L11370、L11369およびAA481656）に相当するmRNA配列およびESTで検出される。mRNAおよびEST配列のアラインメントにより3種のスプライシング変異体が確認されており（配列番号4、5および6）、そのうちの2種がこれまでに同定されている（Sanoら，EMBO Journal 12：p.2249−2256）、1種（配列番号6）は新規のものである。LasergeneソフトウェアのEditSeqモジュール（DNASTAR社、マディソン、ウィスコンシン、USA）を用いる最長オープン・リーディング・フレーム（ORF）についての配列番号4、5および6の解析により3198個のヌクレオチド（配列番号4、377〜3574位）および3729個のヌクレオチド（配列番号5および6、377〜4105位）のORFが示されている。配列番号4のORFはこれまでに報告されたものよりも118ヌクレオチド長く（494−3574位；Sanoら，EMBO Journal 12：p.2249−2256およびGenBank受託番号L11370）、翻訳によりGenBank受託番号L11370について予測されるものよりも39アミノ酸長いタンパク質（配列番号7）を生じる（1065個のアミノ酸対1026個のアミノ酸）ということを注記する。配列番号5および6のORFは1242個のアミノ酸のタンパク質（配列番号8）に翻訳される。
【００７５】
エキソン2に相当し、かつ、配列番号13および14を含むプライマーを用いてヒトゲノムDNAから作製した441bpのPCR断片を用い、多数のヒト組織由来のmRNAのノーザンブロット（ヒト12レーン  MTNブロット；Clontech Laboratories UK Ltdベージングストーク、ハンプシャー州、UK）をプローブしてAAGAの発現パターンを調べる。スプライシング変異体に相当するバンドが脳、心臓、骨格筋、大腸、腎臓、肝臓、小腸、膵臓および肺で検出されている。胸腺、脾臓および末梢血リンパ球についてはハイブリダイゼーションは検出されていない。配列番号13および14を含むプライマーを用いる種々の細胞系由来の第1鎖cDNAのPCR解析によりAAGAは活性化されたおよび活性化されていないヒト気管支上皮細胞（HBEC）で高レベルで、線維芽細胞で中程度のレベルで、そして好中球およびマクロファージで低レベルで発現されるということが示されている。
【実施例３】
【００７６】
本実施例では、喘息患者から単離された血液DNAからPCR増幅したDNA断片において可能性ある配列変化を検出するためにコンホメーション感受性ゲル電気泳動（CSGE：Ganguly et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90：p.10325−10329；GangulyおよびWilliams，Hum. Mut. 9：p.339−343）を用いる。DNAヘテロ二本鎖中の単一塩基のミスマッチを、コンホメーション変化を生じさせ、かつ、ホモ二本鎖とヘテロ二本鎖の移動の相違をもたらしてミスマッチの傾向を増幅する軽い変性溶媒の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出する。ヘテロ二本鎖を作製するために、増幅したPCR産物を熱変性させ、アニーリングさせ、次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析する。DNA断片は臭化エチジウムによって可視化する。次いで、差のある電気泳動移動パターンを示すDNA断片を配列決定してポリヌクレオチド配列の変化の存在およびこの変化の正確な性質を確認する。
【００７７】
LasergeneソフトウェアのEditSeqモジュール（DNASTAR，Inc.，マディソン、ウィスコンシン州、USA）を用いて配列番号4、5および6を手作業で配列番号1および2とアラインする。この解析は配列番号4、5および6の5’末端でDNA配列の470bpのセグメントは配列番号1または2とアラインしないということを示す。失われているゲノム配列を同定するためにGENBANKデータベースのBLAST検索をこの470bpのmRNA配列を用いて行う。これによりGENBANK受託番号ACO13643（ヒトクローンRP11−16P20由来の13個の順序づけられていない部分の154594bpのワーキングドラフト配列）において2717bpのゲノムDNA配列（配列番号3）が同定されている。アラインメント解析は3つの選択的転写物はゲノムDNAの少なくとも21kbにまたがる7つのエキソンに由来するということを示す。
【表２】
0004428478.tif 000003
【表３】
0004428478.tif 000004
【表４】
0004428478.tif 000005
【００７８】
AAGA遺伝子配列に対応するPCRプライマーセットを配列番号1および2およびPrimer Express（登録商標）（バージョン1.0；Perkin Elmer、P／N604313）を用いて設計する。これらのプライマーセット（配列番号15〜94）は以下のとおりである。
【表５】
0004428478.tif 000006
【００７９】
上記のプライマーセットを用いて、16人の喘息患者由来の血液DNAサンプルから40種のポリヌクレオチドを増幅する。PCR反応を1×GeneAmp（登録商法）10×PCRバッファー（Perkin Elmer P／N N808−0240）、13ngの鋳型DNA、400μMの各dNTP（Amersham Life Science Nucleix Plus（登録商標）25mM dNTPミックス；製造番号US77119）、30ngの各プライマー、2mMのMgCl2および0.5uのAmpliTaq Gold（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin−Elmer P／N N808−0242）を含有する10μlの反応容積で実施する。
【００８０】
Biometra  UNO  IIサイクラー（パート番号050−603；アナケム社、ルートン、UK）を用いる典型的な熱サイクリング条件は以下のとおりであり、配列ステップ2−ステップ3−ステップ4を36回反復する：
ステップ1      95℃  10分
ステップ2      92℃  1分
ステップ3      60℃  1分
ステップ4      72℃  2分
ステップ5      72℃  10分
【００８１】
ヘテロ二本鎖を作製するために、熱サイクラー（例えば、Biometra UNOII）を用いて2μlのPCR産物を95℃で10分間変性させて68℃にて30分間アニーリングさせる。ゲル解析の前に各サンプルに2μlの2×ローディングバッファー（20％のエチレングリコール、30％のホルムアミド、0.025％のキシレンシアノール、0.025％のブロムフェノールブルー）を加える。
【００８２】
標準的なDNA配列決定装置（Owl Scientific S3S；Autogen Bioclear UK Ltd.）を60のサンプルコーム（Owl Scientific S2S−60A；Autogen Bioclear UK Ltd.）および温度プローブ（Biorad、カタログ番号165−5058）を備えた標準的な電源装置（Biorad、カタログ番号165−5057）とともに用いる。0.4mmの厚さの15％ポリアクリルアミドゲルを99：1の割合のアクリルアミド対BAP架橋剤、0.5×TTE中の10％エチレングリコールおよび15％のホルムアミドを用いて調製する。ゲルは温度を最高25℃に制限しながら（必要に応じて扇風機、例えば、Jencons、カタログ番号292−004を用いて温度を低く維持しながら）30ワットにて1時間プレ・ランする。プレ・ラン後、ウェルをピペットを用いて洗い流してサンプルをウェルにのせる。次いで、ゲルを25℃にて12ワットで一晩（15時間）電気泳動する。350bpよりも大きい断片はゲルに残す。
【００８３】
電気泳動後、ゲルプレートを分離する。ゲルを1μg／mlの臭化エチジウム（バイオラッド、カタログ番号161−0433）を含有する0.5×TTEに10分間入れることでゲルを染色し、次いで、0.5×TTE中で10分間脱染する。次いで、UVトランスイルミネーター（例えば、UVP GDS 7500）上でゲルの写真をとる。
【００８４】
40種のPCR断片のうちの15種について16人の患者のうちの1人以上において可能性あるポリヌクレオチド変化がCSGEによって検出されている。これらの可能性ある変化の各々について、16人の患者すべて由来のPCR断片を標準的な方法を用いるABI377自動シークエンサーでの二本鎖DNA配列決定に付し（http://www.pebio.com/ab/about/dna/377/）、得られるDNA配列をCONSEDソフトウェアを用いて解析し（Gordonら，Genome Research 8：p.195−202）、配列変化の存在を確認し、正確な塩基変化を同定する。CSGEによって検出された15種の可能性ある変化のすべてが確認されている。多型変化を示す患者の番号を以下の表に示す：
【表６】
0004428478.tif 000007
【００８５】
検出されたポリヌクレオチド変化のうちの2つはAAGAによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更し（非症候性変化）、2つは症候性であり（遺伝コードの縮重による残基変化はない）、11は遺伝子の非コード領域に生じている。
【００８６】
オランダの家族から200組の3人組（両親と罹患した子供）をABI PRISM（登録商標）7700配列検出機（PE−Applied Biosystems、ウォリントン、UK）でTagMan（登録商標）技術を用いる対立遺伝子識別アッセイによって配列番号1の1060、2561、6377、7390位および配列番号2の2330位でのSNPについて遺伝子型を同定する。2つのTaqMan（登録商標）蛍光発生プローブ（一方は非SNP対立遺伝子に特異的であり、他方はSNP対立遺伝子に特異的である）を設計してPCR増幅した標的配列のSNP部位とハイブリダイズさせる。
【表７】
0004428478.tif 000008
【００８７】
TaqMan（登録商標）プローブは蛍光レポーター色素（FAMまたはTET）およびクエンチャー色素（TAMRA）がそれぞれ5’および3’末端に共有結合されたオリゴヌクレオチドからなる。無処理のプローブではレポーター色素のクエンチャー色素への近接はレポーター蛍光の抑制もたらす。標的配列の増幅の際には、プローブはPCRの伸長ステップの間に切断される。これによりクエンチャー色素の影響がなくなりレポーター色素が蛍光を発することが可能となる。SNPおよび非SNPプローブは異なるレポーター色素を保持するので、各色素の蛍光レベルはサンプル中のSNPまたは非SNP標的配列の量に比例する。
【００８８】
伝達不均衡試験［Spielmanら，American Journal of Human Genetics 52：p.506−516］を用いて5つの遺伝子型のSNPと喘息／喘息の亜型の間の遺伝的関連について調べる。この試験では、親から罹患した子供に伝達された対立遺伝子を同じ親から伝達されていないその他の対立遺伝子に対してマッチさせる。次いで、得られた対に不一致についてのMcNemarのカイ2乗検定を適用する［TerwilligerおよびOtt，Human Heredity 42，p.337−346］。200組のオランダの喘息家族から得られた遺伝子型データのTDT解析により配列番号1の6377位（p＝0.00017）および7390位（p＝0.00049）のSNPと気管支過敏症の間の強い遺伝的関連が示され、AAGAは喘息の罹患性遺伝子であり、また2つのSNPを保持する個体は気管支過敏症を発症する危険が高いということを示している。さらに、家族ベースの関連試験［FBAT；Horvath，XuおよびLaird, European Journal of Human Genetics 9，301−306］を用いて、6377および7390位のSNPそれぞれについてp＝0.01およびp＝0.001が得られている。
【実施例４】
【００８９】
本実施例はT. ni Hi5細胞におけるバキュロウイルス系を用いるC末端に6個のヒスチジンタグをつけた全長AAGAの発現および得られたポリペプチドの精製に関する。
【００９０】
1．組換えAAGAバキュロウイルスの構築
以下のプライマー：
5ST
5’−GAAGATCTTCGGAATTCCATCATGGTGATGGGGAGCCCTTTGGAG−3’
を用いるPCR増幅によってユニークなEcoRI部位をAAGA開始コドンの5’（配列番号4、5および6の377位）に組み込む。
別のプライマーを用いて6個のヒスチジン残基をAAGA停止コドンの直前に（3ST1については配列番号4の3574位ならびに3ST2については配列番号5および6の4105位）導入する。このプライマーはまたユニークなKpnI部位もAAGA停止コドンの3’に組み込む。
3ST1（スプライシング変異体1）
5’−
AAGATCTTCGGTACCTCAATGGTGATGGTGATGGTGCTCCCACACCTCGGTCCAG
−3’
3ST2（スプライシング変異体2および3）
5’−
AAGATCTTCGGTACCTCAATGGTGATGGTGATGGTGCAGGTAGATCTCGCGCTTG
−3’
AAGAスプライシング変異体1の組換え「Hisタグをつけた」バージョンを3208bpのEcoRI／KpnI断片としてEcoRI／KpnI消化したpFastbac1バキュロウイルストランスファーベクター（Life Sciences）に連結する。AAGAスプライシング変異体2および3の組換え「Hisタグをつけた」バージョンは3739bpのEcoRI／KpnI断片としてEcoRI／KpnI消化したpFastbac1に連結する。組換えAAGA配列はDH10Bac細胞に保持されるBacmid DNAにトランスポーズする（Life Sciences；Bac to Bacバキュロウイルス発現システム）。開示されたプロトコール（Bac to Bacバキュロウイルス発現システムマニュアル；Life Sciences）を用いてAAGA組換えBacmidをDH10Bac細胞から単離してSf9細胞にトランスフェクトする。
【００９１】
2．組換えバキュロウイルスストックの増幅
組換えバキュロウイルスを0.5×106細胞／mlの細胞密度および0.01の感染効率（moi）で96時間Sf9細胞（SF900  SFMII培地；Life Sciences）で維持された）に感染させることで増幅する。次いで、Sf9細胞を1000×gで5分間遠心分離する。高力価ウイルスを含有する上清を4℃にて保存する。
【００９２】
3．Hi5細胞における組換えAAGAの発現
Excell 401培地（JRH Biosciences；振盪フラスコ（90RPMで回転させた）またはスピナーフラスコ（75PRMで回転させた）のいずれかでAMS Biotechnology ）によって分配された）で3×105から3×106個の間の細胞／mlの密度で維持されたHi5細胞（Invitrogen）を増幅させた組換えバキュロウイルスを用いて2.0のmoiにて2.0×106の細胞密度で60時間感染させる。感染後、Hi5細胞を1000×gで5分間遠心分離し、上清を捨てて細胞ペレットを−80℃にて凍結する。
【００９３】
4．粗溶菌液調製
細胞（1×109個）を100mlの溶解バッファー（20mMのHepes pH7.5、100mMのNaCl、5％のグリセロール、2mMのβ−メルカプトエタノール、0.5mMのイミダゾール、0.1％のノニデットP−40、40μg／mlのAEBSF、0.5μg／mlのロイペプチン、1μg／mlのアプロチニンおよび0.7μg／mlのペプスタチンA）に再懸濁する。細胞を氷上で15分間インキュベートし、次いで、4℃にて39，000×gで30分間遠心分離する。このサンプルを使用直前に0.22μmのフィルターを通して濾過する。
【００９４】
5．金属キレートアフィニティークロマトグラフィー
金属キレートアフィニティークロマトグラフィーを室温にてBioCADクロマトグラフィーワークステーションに取り付けたカラムを用いて実施する。20mlのポロスMC／M（16mmD×100mmL）カラムに使用前および各精製後にNi2＋を充填する。Ni2＋を充填するために、カラムを10カラム容積（CV）の50mMのEDTA pH8、1MのNaCl次いで10CVの水で洗浄する。カラムに500mlの0.1MのNiSO4 pH4.5〜5を充填し、10CVの水で洗浄し、次いで、5CVの0.3MのNaClで洗浄することで結合していないNi2＋を全て除去する。すべてのステップは20ml／分の流速で実施する。充填したMC／Mカラムを5CVのバッファーB（20mMのHepes pH7.5、500mMのNaCl、5％のグリセロール、2mMのβ−メルカプトエタノール、1mMのPMSF、250mMのイミダゾール）で満たし、次いで、10CVのバッファーA（0.5mMのイミダゾールを除いてバッファーBと同一）で平衡化する。20ml／分の流速での実施当たり90〜95mlの粗溶菌液をカラムに入れる。次のステップは30ml／分の流速で実施する。12CVのバッファーAで洗浄することで結合していない物質はいずれも除去し、10CVにわたって0〜100％のバッファーB勾配を適用することによってAAGAを溶出する。勾配にわたって画分（8ml）を回収する。AAGA含有画分を合してプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーについて前に記載された最終濃度まで加える。DTTも1mMの最終濃度まで加える。合した画分を4℃にて4リットルの20mMのTris−HCl pH7.5、1mMのDTT、0.2mMのPMSFに対して一晩透析する。
【００９５】
6．イオン交換（陰イオン交換）クロマトグラフィー
4℃にてFPLCワークステーション（Amersham Pharmacia Biotech）に取り付けたカラムでResource（登録商標）Qクロマトグラフィーを実施する。6mlのResource（登録商標）Qカラム（16mmD×30mmL）を2ml／分の流速にて10CVのバッファーC（20mMのTris−HCl pH7.5、1mMのDTT）で平衡化する。透析した金属キレート溶出液をカラムに入れて、10CVのバッファーCで洗浄する。10CVにわたる0〜100％のバッファーD勾配（20mMのTris−HCl pH7.5、1mMのDTT、1MのNaCl）を入れることでタンパク質を溶出する。カラムを溶出する際に画分（3ml）を回収する。
【００９６】
7．ゲル濾過
4℃にてBioCAD SPRINTクロマトグラフィーワークステーション（PE Biosystems）に取り付けたカラムでゲル濾過クロマトグラフィーを実施する。24ml（10mmD×300mmL）のSuperdex 200HR（Amersham Pharmacia Biotech）カラムを0.5ml／分の流速にて10CVのバッファーE（20mMのTris−HCl pH7.5、1mMのDTT、150mMのNaCl）で平衡化する。イオン交換溶出液をカラムに入れバッファーEで溶出する。精製の実施による画分（1ml）を回収して分析する。
【００９７】
8．サンプル濃縮
4℃にてMillipore Ultrafree−15遠心分離装置（分子量カットオフ50kDa）を用いてサンプルを約10倍濃縮する。この装置は使用前に水で予めすすぐ。−80℃での長期保存に用いる最終保存バッファーは20mMのHepes pH7.5、1mM DTT、100mMのNaCl、5％のグリセロールとする。4℃での保存にはサンプルからグリセロールを省略してもよい。
【実施例５】
【００９８】
本実施例は実施例4に記載されたように精製したAAGAタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製に関する。
【００９９】
ウサギの免疫化：
オランダウサギ（Harlen−Olac）を以下のスケジュールに従って4箇所の皮下部位でPBS中の500μgの精製したAAGAタンパク質で免疫化する。
【表８】
0004428478.tif 000009
【０１００】
試験出血（500μl）を採取して血清を抗体力価について評価する。最大力価に到達した時点で血清を回収する。これは血液（10ml）を採取によって行い、それを4℃にて2時間凝結させることで可能となる。血液を1000×gで5分間遠心分離して血清を分離する。血清を回収してアッセイするまで−20℃にて保存する。
【０１０１】
ELISAスクリーニング：
Nunc−Immuno Plate・Maxisorp 96ウェルプレート（Nunc，Fisher Scientific UK、ラフバラ、UK）を個体支持体として用い、4℃にて精製したAAGAタンパク質（100ng／ウェル）で一晩コーティングする。このプレートを37℃にて2％BSA（Sigma）および0.02％のNaN3（Sigma）を含有するPBSで3時間ブロッキングする。ブロッキングした後、プレートをPBSの種々の希釈液中の血清とともに室温にて一晩インキュベートする。ポリクローナル抗体の存在を双方ともビオチン標識したウサギのIgG抗体（ヤギ抗ウサギIgG抗血清、1：25000希釈）を用いて40分のインキュベーション時間で調べる。次いで、アルカリホスファターゼを結合させたストレプトアビジン（Immununo research、Dianova、CH）を1：10000希釈液で加える。ジエタノールアミンに溶解したアルカリホスファターゼ基質（Sigma、f.c. 1mg／ml）を加えることで反応の進行を実施する。45分後、ELISAプレートリーダー（Bio−rad laboratories Ltd.、ヘメルヘムステッド、UK）を用いて490nmを参照して405nmの吸光度を読む。
【０１０２】
精製：
5mlのプロテインA−アガロースをクロマトグラフィーカラムに流し入れて6カラム容積の0.1Mのtris（ヒドロキシメチル）メチルアミン（Tris）バッファーpH7.5で洗浄する。抗AAGA抗体を含有するウサギ血清をTrisバッファーで希釈し（1／2）てプロテインA−アガロースに加える。カラムを6容積のTrisバッファーで洗浄することで結合していないタンパク質を除去する。3カラム容積の0.1MのグリシンバッファーpH3.0を用いてカラムからIgGを溶出して1mlの画分として28μlの1MのTrisを含有するチューブに回収する。還元条件下でSDS−PAGEによってタンパク質含量について陽性である画分を純度について調べる。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖に相当する50および25Kdの2つのバンドを可視化する。免疫グロブリンのみを含有する画分をプールし、タンパク質濃度について再び調べて−20℃にて保存する。
【実施例６】
【０１０３】
本実施例は実施例4に記載されたように精製したAAGAタンパク質に対するモノクローナル抗体の調製を記載する。
【０１０４】
マウスの免疫化
以下に示されるスケジュールに従って、雌のBalb／cマウスをPBS中の100μgのAAGAタンパク質を用いて腹腔内で免疫化する。
【表９】
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【０１０５】
融合用脾臓細胞を調製するために動物を屠殺した後ELISA（実施例5）によって血清を抗体力価について評価する。抗体力価が十分であれば（1／1000〜1／100，000）、ハイブリドーマをスクリーニングし、そうでなければ廃棄する。
【０１０６】
骨髄腫細胞の調製
融合前にSp2／0ネズミ骨髄腫細胞（ATCC＃CRL1581；20μg／mlの8−アザグアニンを含有する培養培地で維持された）をRPMI1680（8−アザグアニンは含まれていない）、10％（v／v）FCSおよび1％ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ50IU／mlおよび50μg／ml）で1週間培養する。細胞を遠心分離（200×g5分間）によって回収して冷RPMI1640で3回洗浄する。96ウェルマイクロタイタープレート当たり約2.5×106個の細胞を用いる。
【０１０７】
脾臓細胞懸濁液の調製
マウスを過量の麻酔薬（フォーレン）で屠殺し、脾臓を摘出してセルストレーナー（70μmメッシュセルストレーナー；ベクトン＆ディキンソン、オックスフォード、UK、カタログ番号2350）に押し付けて通す。細胞懸濁液をRPMI1640（上記と同じ）で3回洗浄してカウントする：5.106細胞／96ウェルプレートが必要である。
【０１０８】
骨髄腫細胞と脾臓細胞の融合
脾臓および骨髄腫細胞を混合し（2：1）、遠心分離して（200×g、5分間）ペレットを37℃水浴で加温する。予め加温しておいたポリエチレングリコール4000（108個の細胞当たり1ml）を1分にわたって、次いで、20mlの予め加温しておいた洗浄培地を2分にわたってゆっくりと加える。遠心分離した後、ペレットを選抜培地（RPMI1640、10％のFCS、1％のペニシリン−ストレプトマイシン、10％のBMコンディムドH1（Boehringer Mannheim、ルイス、UK製支持細胞置換；カタログ番号1088947））、10％のHAT培地サプリメント（融合されていない骨髄腫細胞を選択するためのヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン；Boehringer Mannheim、ルイス、UK；カタログ番号644579）に注意深く再懸濁して、200μl／96ウェルマイクロタイタープレートのウェルでプレーティングする。5日後、倒立顕微鏡でマイクロタイターウェルの底を調べることによってハイブリッド細胞のクラスターを同定すればよい。10〜14日後、ELISA（実施例4）によって培養上清を抗体の存在について調べる。陽性クローンを24ウェルアッセイプレートに拡大して再試験する。
【０１０９】
陽性ハイブリドーマのクローニング
依然として陽性である拡大したクローンを限界希釈によってクローニングする。細胞を96ウェルマイクロタイタープレートにおける4つの希釈ステップで連続希釈する；5、2、1および0.5細胞／ウェル。HAT培地上清をHT培地サプリメント（Boehringer Mannheim、ルイス、UK；カタログ番号623091）で置換する。約1週間後、細胞をELISA（実施例4）によってスクリーニングする。単一の陽性クローンを含むウェルの細胞を拡大する。
【０１１０】
モノクローナル抗体上清の作製
細胞をハイブリドーマが異常増殖して壊死するまで培養フラスコ中で標準的な培地（RPMI1640、10％（v／v）FCSおよび1％ペニシリン−ストレプトマイシン）で増殖させる。遠心分離によって細片を除去し、ELISA（実施例4）を用いて抗体を含有する上清の力価を求め、次いで4℃、−20℃または−70℃にて滅菌条件下で保存する。
【配列表】
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