(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジエノゲストまたはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、老人性骨粗鬆症または続発性骨粗鬆症の予防および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ジエノゲストを有効成分として含有するインターロイキン１（以下、ＩＬ−１と示す。）、インターロイキン６（以下、ＩＬ−６と示す。）、腫瘍壊死因子α（以下、ＴＮＦ−αと示す。）の産生および／または分泌抑制剤に関する。
背景技術
ジエノゲストは、下記式（Ｉ）で示される構造（１７α−ｃｙａｎｏｍｅｔｈｙｌ−１７  β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｅｓｔｒａ−４，９（１０）−ｄｉｅｎ−３−ｏｎｅ）を有する既知化合物の国際一般名（ＩＮＮ）である。
0004418106.tif 000002
本化合物の性質および合成方法については、シュバート（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）等、エルゼビアサイエンスパブリッシャーズ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）編、ナチュラル・プロダクツ・ケミストリー１９８４（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８４）、１９８５年、１４３〜１５８頁に概要が述べられている。
ジエノゲストは、黄体ホルモン活性を有することが知られており、ドイツに於いてエチニルエストラジオールとの合剤が製造され、経口避妊薬として発売されている。ジエノゲストはまた、子宮内膜症の治療剤としても臨床開発が進められており（ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、アーカイブズ・オブ・ギネコロジー・アンド・オブステットリクス（Ａｒｃｈ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．）、第２５４巻、５９４〜５９５頁、１９９３年）、また、子宮体癌および乳癌に対する有効性が実験的に報告されている（甲木ら、特開平７−１８８０２６号；甲木ら、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、第７９巻、１６９〜１７６頁、１９９７年）。また、ジエノゲストはラットにおいて卵巣摘出による骨減少に対して保護的に作用することや（アイガー（Ｅｌｇｅｒ）ら、（Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．）、第１０１巻（ｓｕｐｐｌ．）、１号、７１頁、１９９３年）、子宮内膜症治療において、ＧｎＲＨアゴニストであるブセレリンとジエノゲストを併用すると、ジエノゲストはブセレリンにより起こる骨密度減少を通常のレベルにもどすことが報告されている（笹川ら、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、第６７巻（ｓｕｐｐｌ．）、１６２ｐ、１９９５年）。しかしながら、これまでのところ、これらの作用機序は解明されておらず、ジエノゲストがサイトカイン産生や分泌の抑制に影響を及ぼすとする報告はない。
サイトカインとは細胞、主として白血球の産生する抗体以外の蛋白性活性物質であり、その作用は多彩である。主なものをあげてみると、免疫系の調節制御や伝達に関係する働き、造血幹細胞の分化誘導から増殖に関する作用、炎症反応における働きがある。サイトカインの共通した特徴として、微量で特異的な作用を示し、産生する細胞自身への作用を含めて多種の細胞の機能を活性化し、生体防御−免疫機能に重要な働きを示す。
ＴＮＦ−αは、エンドトキシンを投与したマウスの血清中から見出され、ある種の腫瘍の出血性壊死を引き起こすことから腫瘍壊死因子と名づけられた。主な作用としては、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８をはじめサイトカインの誘導、ホスホリパーゼの活性化、アラキドン酸代謝物や血小板活性化因子の産生、造血幹細胞の分化誘導、ホルモン分泌の亢進、発熱などが知られている。
また近年、ＴＮＦ−αが筋肉等の末梢のインスリン抵抗性に関与していることが、注目されている。
ＩＬ−１は、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの２種があり、マクロファージの産生するリンパ球活性化因子として見出された。ｉｎ  ｖｉｖｏに投与すると、血圧下降、発熱、睡眠、好中球増加、ホルモン分泌促進、急性相蛋白質産生誘導などが見られる。
ＩＬ−６は、抗原刺激を受けたＢリンパ球が増殖、分化するために必要なマクロファージやＴリンパ球の出す体液性因子（Ｂ−ｃｅｌｌ活性化因子）として発見された。ＩＬ−６もまた、多彩な生理活性機能を有する。抗体産生の誘導、Ｔリンパ球の活性化、急性期反応の誘導、巨核球成熟の誘導、さらには破骨細胞の活性化等を引き起こす。これらの事から、ＩＬ−６産生の亢進は、慢性関節リウマチ（以下、ＲＡと示す。）、心房性粘液腫、キャッスルマン氏病、ＡＩＤＳなどでの高γグロブリン血病やＡＩＤＳのカポジ肉腫、メサギウム増殖性腎炎、乾癬、敗血症さらには骨粗鬆症と密接に関係していると言われている。
ＲＡの治療は、これまで抗炎症剤、修飾性抗リウマチ薬、免疫抑制薬、免疫調整剤等が使われているが、これらの治療はいずれも十分なものではなく、今なお原因が不明なため、決め手になる治療法は見つかっていない。ただ、これまでの研究からサイトカインの一つであるＩＬ−６がＲＡとかなり密接な関係があると推測されている。ＲＡ患者の滑膜液（関節液）には、実際ＩＬ−６が検出される。ＩＬ−６は、抗体産生を刺激し、リウマチ因子の出現、増加、高γグロブリン血症をはじめ、関節病変部のＴリンパ球の活性化、増加に関与し、さらに、骨破壊にも関与していると言われる。また、同様に、ＲＡ患者の滑膜液からはＴＮＦ−α、ＩＬ−１も検出され、病態の進展に関わっている。
ＲＡの初期は、滑膜の炎症のみであり、症状としては朝の手足関節のこわばり、全身倦怠感、易疲労性、体重減少、リンパ節腫大、皮下結節などがあるが、進行するに従って軟骨、骨の破壊が起こり、関節は変形、脱白し、拘縮、強直などの後遺症を呈して、日常生活動作が著しく障害されるに至る。
近年、骨の生理的リモデリングあるいは、その破綻による病態の発生に多数のサイトカインが関与していることが判明してきた。骨代謝に関わるサイトカインとして、骨吸収促進作用を有するものはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ、マクロファージ刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＩＬ−１１など、骨吸収抑制作用を有するものはＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、骨形成促進作用を有するものは骨形成因子（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βなどがある。前述のＩＬ−１、ＩＬ−６は、破骨細胞形成促進因子として、またＴＮＦ−αは、破骨細胞の調節因子として知られており、これらの骨吸収促進因子は、破骨細胞の分化誘導、成熟破骨細胞の活性化、骨芽細胞を介する破骨細胞活性化により骨吸収を促進する。また、ＩＬ−１などの刺激により骨芽細胞は、破骨細胞分化因子やＰＧを産生し破骨細胞の分化・活性化を誘導する。さらに、エストロゲンがＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αといった骨吸収サイトカインのレベルを抑制していることから、これらの骨吸収促進因子の産生および／または分泌抑制剤は過度の骨吸収促進により起こる閉経後骨粗鬆症の予防または治療剤として期待されている。
骨粗鬆症は、閉経後骨粗鬆症と老人性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症に分類される。閉経後骨粗鬆症の原因は、閉経後のエストロゲン喪失が骨吸収を過度に促進することにあるから、治療剤としては、カルシトニンやエストロゲンなどの骨吸収抑制剤が使用されている。しかし、カルシトニンは筋肉注射による投与に限られることや耐性化しやすいという問題があり、エストロゲンは乳癌、子宮内膜癌の発生率が増加するという問題がある。一方、老人性骨粗鬆症の原因としては、加齢による骨形成の低下が重要視されているため、治療剤としては、低下した骨芽細胞機能（骨形成）を賦活化する作用を有するもの、いわゆる骨形成促進剤が骨量改善に有効であると考えられる。具体的には、ビタミンＤの他には、フッ化ナトリウム、ビタミンＫ、ヒトＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）製剤などがある。
骨芽細胞機能を賦活化することが知られているＰＴＨにおいて、サイクリックＡＭＰ（以下、ｃＡＭＰと示す。）量の増加とプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示す。）活性亢進が関与し、骨芽細胞の増殖を刺激し、分化を促進することか報告されている（ヤング（Ｙａｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２７１巻、２９８３９〜８４６頁、１９９６年；アルストロム（Ａｈｌｓｔｒｏｍ）ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ、第１２巻、１７２〜１７８頁、１９９７年）。すなわち、ｃＡＭＰ量の増加、ＰＫＡの活性化は、骨芽細胞機能を賦活化し、骨形成促進に働くと考えられている。骨粗鬆症患者の骨量増加という点で十分有効な治療薬がない現在、骨形成促進剤は老人性骨粗鬆症の治療剤として期待されている。
続発性骨粗鬆症は、年齢・性別に関わらず内分泌疾患や炎症性疾患など特定の疾患に続発して生じ、その原因を除いた時に軽快するものをいう。続発性骨粗鬆症の原因として具体的には、副甲状腺機能亢進症や糖尿病などの内分泌・代謝疾患、ＲＡなどの炎症性疾患、多発性骨髄腫などの血液疾患、肝硬変などの消化器疾患、骨形成不全症などの先天性疾患等がある。病態は原疾患により若干異なるが、全体的にいえることは、骨形成が正常でも骨吸収が亢進している場合と骨吸収が正常でも骨形成が低下している場合とその両者が混在している場合とが考えられる。そのため、骨吸収抑制作用だけでは、予防および治療剤として十分とは言えない。
変形性関節症は、関節軟骨の変性破壊とその周囲における骨軟骨の増殖機転が同時に進行する病態とされ、二次性滑膜炎を合併し、膝痛、運動制限、関節水症、変形などが主症状である。特に変形性膝関節症が治療上重要な疾患となっている。治療としては、軽−中等症の患者には保存的治療が第一選択され、中−重症例に対しては、手術的治療が行われる。
また、子宮内膜症や子宮筋腫の治療において、エストロゲンを低下させるためにＧｎＲＨアゴニストを用いると、骨密度減少の副作用が生じる。そのため、副作用軽減の目的で、酢酸メドロプロゲステロン（以下、ＭＰＡと示す。）の併用が知られている。しかしながら、その効果は高用量用いても十分とはいえず、副作用として血栓症等が問題となっている。また、ＭＰＡとエストロゲンの併用投与は、骨密度減少を抑制するが、ＭＰＡ単独では脊椎の骨密度を減少させることが報告されている（ガラガー（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・メディスン（Ａｍ  Ｊ．Ｍｅｄ）、第９０巻、１７１〜１７８頁、１９９１年）。さらに、ＭＰＡの骨吸収サイトカインとの関わりについては、明らかではない。
さらに、現在子宮内膜症や子宮筋腫の治療に用いられているダナゾールや乳癌治療に用いられているタモキシフェンには、骨量減少という副作用の問題点がある。
また、先にのべたＴＮＦ−αと末梢のインスリン抵抗性との関与において、脂肪細胞で産生されたＴＮＦ−αが近傍の筋肉細胞にインスリン抵抗性を誘導したり、筋肉自身が産生するＴＮＦ−αもインスリン抵抗性に関与していることが知られている（佐藤、最新医学、５２巻、６号、１１３１〜１１３６頁、１９９７年）。このため、ＴＮＦ−α産生および／または分泌阻害剤を用いてインスリン抵抗性の改善を図ることにより、糖尿病の治療またインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の発症の阻止又は遅延のための耐糖能不全の治療に用いられつつある。現在代表的なものにチアゾリジン誘導体があるが、副作用等の観点からいまだ満足すべき状況にあるとは言えない。
発明の開示
かかる状況下において、骨吸収サイトカイン産生および／または分泌異常に起因する疾患、特にＲＡ、変形性関節症、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、骨粗鬆症或いは糖尿病などの治療剤として、副作用が少なく、長期連用が可能な、有効性の高い薬剤の開発が望まれる。
本発明は、上記の疾患の症状の少なくともひとつを解決する。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、意外にもジエノゲストが骨吸収サイトカイン産生・分泌抑制作用を有することを見出した。また、ジエノゲストが骨芽細胞においても骨形成促進作用を有することを見出して、本発明を完成した。
本発明の第一の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの少なくとも１つの産生および／または分泌抑制剤である。好ましくは、該特徴を有するＩＬ−６の産生および／または分泌抑制剤である。
本発明の第二の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする骨吸収サイトカイン産生および／または分泌抑制剤である。好ましくは、骨吸収サイトカインはＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの少なくとも１つであり、より好ましくはＩＬ−６である。
また、本発明の第三の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、骨芽細胞における骨吸収サイトカイン産生および／または分泌抑制剤である。好ましい骨芽細胞における骨吸収サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの少なくとも１つであり、より好ましくはＩＬ−６である。
本発明の第四の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの少なくとも１つの産生および／または分泌異常に起因する疾患の予防および／または治療剤である。具体的には、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの少なくとも１つの産生および／または分泌異常に起因する疾患が、ＲＡ、変形性関節症、変形性膝関節症、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、老人性骨粗鬆症、および続発性骨粗鬆症および糖尿病、とりわけ、ＮＩＤＤＭの少なくとも１つである疾患の予防および／または治療剤である。
本発明の第五の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、ＲＡ、変形性関節症、変形性膝関節症、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、老人性骨粗鬆症および続発性骨粗鬆症の少なくとも１つの予防および／または治療剤である。好ましくは、該特徴を有するＲＡの予防および／または治療剤であり、また老人性骨粗鬆症の予防および／または治療剤である。
本発明の第六の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、破骨細胞における骨吸収抑制剤であり、また、破骨細胞のアポトーシス誘発剤である。
本発明の第七の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、骨形成促進剤である。
本発明の第八の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、骨芽細胞におけるｃＡＭＰ量増加剤であり、また、ＰＫＡ活性亢進剤である。
本発明の第九の態様は、ダナゾールに併用する副作用軽減剤である。
本発明の第十の態様は、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分とすることを特徴とする、試薬として有用な骨吸収サイトカイン産生および／または分泌抑制剤である。
本発明の第四、五、九の態様には、ジエノゲストもしくはその溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物を用いて各々の疾患の予防および／または治療をする方法、或いは当該副作用を軽減する方法が含まれる。また同様に、各々の疾患の予防および／または治療剤或いは当該副作用の軽減剤を製造するための、ジエノゲストもしくはその溶媒和物の使用も含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、発明を詳細に説明する。
本発明の骨吸収サイトカイン産生および分泌抑制剤の有効成分となるジエノゲストは、すでに示した如く、式（Ｉ）の構造を有する化合物であり、水、エタノール、グリセロール、酢酸等の薬剤学上許容される種々の溶媒と溶媒和物を形成し得る。
0004418106.tif 000003
ジエノゲストは、骨吸収サイトカイン産生および分泌抑制作用と骨形成促進作用を有する。従って本発明の剤は、ＲＡ、リウマチ様多発性関節炎、敗血症、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、ベーチェット病、結節性動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、変形性関節症、変形性膝関節症、痛風、アテローム硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎、原発性副甲状腺機能亢進症に伴う高カルシウム血症、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、骨粗鬆症及び糖尿病の予防または治療剤である。或いはＮＩＤＤＭの発症の阻止又は遅延のための耐糖能不全の治療剤である。好ましくは、ＲＡ、変形性関節症、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、老人性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症の予防または治療剤である。
好ましい例について、さらに詳細を示す。ＲＡは、発病原因は不明であるが、多因子性の遺伝的素因、とくにＨＬＡ−Ｄ４との関連、およびウイルス感染が注目されている。初期には滑膜の炎症のみであるが、進行すると軟骨、骨の破壊が起こり、関節は変形、脱白し、また骨性強直により可動性を失う。全身症状として貧血、微熱、朝のこわばり、全身倦怠感、昜疲労性、体重減少、リンパ節腫大、皮下結節など多彩な症状を呈する。病態生理としては、滑膜への血管新生がみとめられる。本発明の剤は、これらの各種症状を予防または治療、すなわち改善し、あるいは悪化を防止するのに有効である。
変形性関節症の発症は、通常潜行性であり、時には変性半月の断裂を生じて、一見急性の発症形式をとる変形性膝関節症の例もあるが、明らかな誘発原因は認めないことが多い。発症年齢は部位によって多少異なるが、一般に５０歳以後に発症する。主な症状は、関節痛（とくに運動時痛）、関節可動域の制限、関節周囲筋の萎縮、関節の変形、局所の腫脹・熱感などの関節炎症状である。臨床上もっとも頻度の高いのは、女性を中心とする変形性膝関節症であり、次いで問題となる変形性股関節症は、日本では８０〜９０％が脱臼性股関節症であり、残りが他の疾患、外傷による二次性のものと一次性の股関節症である。本発明の剤は、当該疾患の各種症状を予防または治療、すなわち改善し、あるいは悪化を防止するのに有効である。
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症は、原発性副甲状腺機能亢進症とともに代表的な高カルシウム血症であり、血中ＰＴＨ値の低値としばしば血中ＰＴＨ関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）の高値がみられる。治療としては、できれば抗腫瘍治療を行うが、対症的とならざるをえないことが多い。当該疾患の患者は脱水をきたしやすく、また脱水が高カルシウム血症を悪化させる。本発明の剤は、これらの各種症状を予防または治療、すなわち改善し、あるいは悪化を防止するのに有効である。
骨粗鬆症は、骨の絶対量の減少を生じているが骨の質的な変化を伴わない状態をいい、閉経後骨粗鬆症と老人性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症に分類される。閉経後骨粗鬆症は、女性の閉経後のエストロゲン分泌低下による骨量減少が原因で、老人性骨粗鬆症は、加齢による骨量減少が原因である。続発性骨粗鬆症は、年齢・性別に関わらず内分泌疾患や炎症性疾患など特定の疾患に続発して生じ、その原因を除いた時に軽快するものをいう。骨粗鬆症の診断の目安としては、腰椎Ｘ線像で著明な骨萎縮により縦の骨梁が粗となった状態（骨萎縮度２度）、または二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）装置により腰椎の骨塩量が若年成人平均値の−２．５標準偏差以下になった状態を確実な骨粗鬆症と診断する。本発明の剤は、これらの各種症状を予防または治療、すなわち改善し、あるいは悪化を防止するのに有効である。
なお、好ましくは、既にジエノゲストの有効性が公知となっている適応症は除かれる。本発明は、好ましくは、それらを対象とするものではなく、骨吸収サイトカイン産生および／または分泌抑制が有効と考えられる、これまでにジエノゲストが対象とは考えられていなかった新しい疾患の治療剤である。
さらに、発症後の治療剤として用いる他、それぞれの疾患のリスクファクターが亢進している者に対して、発症前に予防的に投与し得る。慢性関節リウマチの場合には、朝のこわばり、手指関節のはれ、対称性関節のはれ、皮下結節などの症状がみられはじめた患者に対して、予防的に投与し得る。変形性関節症の場合には、関節痛（とくに運動時痛）、関節可動域の制限、関節周囲筋の萎縮、関節の変形、局所の腫脹・熱感などの関節炎症状がみられはじめた患者に対して、予防的に投与し得る。悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の場合には、悪性腫瘍患者のうち、血中ＰＴＨ値の低値としばしば血中ＰＴＨ関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）の高値がみられる者に対して、予防的に投与し得る。骨粗鬆症の場合には、運動不足、カルシウム摂取不足、生理不順、低体重、喫煙、遺伝性などの低骨量危険因子をもつ者に、また老人においては骨密度がある一定量より低下した者に対して、予防的に投与し得る。
本発明の剤は、試薬として試験や検査に用いることができる。具体的には、対象となる系中での本試薬のサイトカイン産生抑制を検出することにより特定の疾病の有無や、体液、組織あるいは排泄物中に、ある物質があるかないかを決定する方法として、本発明の剤は有用である。
次に、本発明の剤の効果を下記の実験例によって具体的に示す。
実験例１：マウスの骨芽細胞に対する作用
（１）骨芽細胞の採取および培養
ヨハンセン（Ｊｏｈａｎｓｅｎ）らの方法（ジャーナル・ボーン・エンド・ミネラル・リサーチ（Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ）、第７巻、５０１〜５０９頁、１９９２年）に準じて、１５週齢のＳＬＣ：ＩＣＲ雌マウスの大腿骨より骨芽細胞を採取した。動物をペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）麻酔下、下大動脈を切断して放血致死後、両側大腿骨を摘出した。これを骨ハサミで切断し、骨髄をミクロスパーテルで除き、骨内面を鋭利な刃で擦り落とした。これを１％コラゲナーゼ液（ニッタゼラチン）内で３７℃下で２０分間振盪し、培養液（１０％活性炭処理ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地（日水製薬））を添加して遠心分離（３００×ｇ、５分間、２０℃）を行った。得られた細胞を新鮮な培養液に分散してプラスチック製培養シャーレ（３５ｍｍ径、Ｐｒｉｍａｒｉａ（Ｆａｌｃｏｎ））に播種した。３７℃および５％ＣＯ２／９５％空気下で２４時間培養後、付着細胞を０．２５％トリプシン液で回収し、１×１０４個／ｍｌの細胞懸濁液とした。骨芽細胞同定には、骨芽細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ染色を用いた。なお、卵巣摘出動物から骨芽細胞を得る場合、１１週齢時に卵巣摘出を行い、４週飼育した後、上記と同じ処理を行った。
（２）薬物処理
被験物質として、ジエノゲストをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬）に溶解および希釈して用いた。また、対照物質としてＭＰＡ、ダナゾールをＤＭＳＯに溶解および希釈して使用した。溶媒対照にはＤＭＳＯを用いた。
プラスチック製２４ウエル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウエルに１×１０４個／ｍｌの骨芽細胞懸濁液１００μｌ、培養液８９０μｌならびに薬物溶液１０μｌを添加後、３７℃および５％ＣＯ２／９５％空気下で２４時間培養後、遠心分離（３００×ｇ、５分間、２０℃）して上清を得、サイトカイン測定用とした。薬物の最終濃度は、１０−１１、１０−１０および１０−９Ｍとした。なお、実験には、各群３枚のシャーレを用いた。
（３）培養上清中サイトカイン量の測定
培養終了後の上清をＳＭＲＡＲＴＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて約１０倍に濃縮した。この検体中のサイトカイン量をマウスＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦα測定キット（ＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎＴＭ，ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆ．ＣＡ，ＵＳＡ）およびユーロピウム標識ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。その結果を表１〜表３に示す。
0004418106.tif 000004
データは、ダネットの検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって解析した。
コントロールからの有意差：＊Ｐ＜０．０５    ＊＊Ｐ＜０．０１
0004418106.tif 000005
データは、ダネットの検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって解析した。
コントロールからの有意差：＊＊Ｐ＜０．０１
0004418106.tif 000006
データは、ダネットの検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって解析した。
コントロールからの有意差：＊Ｐ＜０．０５    ＊＊Ｐ＜０．０１
表１〜表３に示す結果より、卵巣摘出マウスの骨芽細胞から放出されるサイトカインにおいて、ジエノゲストは１０−１０Ｍ以上の濃度でＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの上清中サイトカイン量を有意に減少させた。また、無処理マウスの骨芽細胞から放出されるサイトカインにおいても、ジエノゲストはサイトカイン量を減少させた。一方、子宮内膜症治療剤であるＭＰＡやダナゾールは１０−９Ｍですべてのサイトカイン量を有意に増加させた。
実験例２：マウスの破骨細胞に対するピット形成への影響
（１）破骨細胞の採取および培養
破骨細胞は、タカダ（Ｔａｋａｄａ）らの方法（ボーン・ミネラル（Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ）、第１７巻、３４７〜３５９頁、１９９２年）に準じてマウスより得た。すなわち、１３日齢ＩＣＲマウスを麻酔（ペントバルビタールナトリウム）下で放血致死させた後、両側大腿骨を摘出した。α−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で大腿骨を骨ハサミで５分間細切し、さらに、ボルテックスミキサーを用いて３０秒間攪拌した。細胞懸濁液を遠心分離（１０００ｇ、２分間、１５℃）して上清を除去後、沈殿をα−ＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を１×１０７個／ｍｌに調整した。
（２）薬物添加
購入した象牙片を精密低速切断機（ＢＵＥＨＬＥＲ社製）およびせん刀を用いて直径５．５ｍｍ、２００μｍ厚の円形に加工した。これを蒸留水中で超音波処理し、活性炭処理したウシ胎児血清（大日本製薬）１０％を含むα−ＭＥＭ培地（培養液）に浸した。これを９６ウエル培養プレート（ファルコン）の各ウエルに１枚ずつ添加して薬物溶液１００μｌを添加した。この上に、破骨細胞懸濁液１×１０６個（１００μｌ）を播種後、５％ＣＯ２／９５％空気下、３７℃で３日間培養した。いずれの薬物についても最終濃度を１０−１１、１０−１０および１０−９Ｍとした。なお、各濃度あたり５検体ずつ実験した。
（３）吸収能の測定
吸収能は、骨上の貧食面積を顕微鏡下で計測することにより求めた。すなわち、薬物処理後の象牙片をガーゼで拭い取り、３０分間超音波洗浄機により洗浄後、酸ヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で５分間染色した。これを蒸留水で洗浄後、１００倍の倍率下で貧食された吸収部分の面積を画像解析装置（ルーゼックス、ニレコ）にて計測した。１象牙片あたり９つの異なる部分を計測してその平均値を求めた。その結果を表４に示す。
0004418106.tif 000007
データは、ダネットの検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって解析した。
コントロールからの有意差：＊＊Ｐ＜０．０１
表４に示す結果より、ジエノゲストはマウスの破骨細胞によるピット形成を有意に減少し顕著な骨吸収抑制作用が認められた。一方、ＭＰＡとダナゾールは、ピット形成に影響を与えなかった。
実験例３：マウスの破骨細胞に対するアポトーシス発生率への影響
（１）破骨細胞の調製
高橋らの報告（エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、第１２２巻、１３７３〜１３８２頁、１９８８年）に準じた方法により、破骨細胞を調製した。すなわち、７週齢のＳＬＣ：ＩＣＲ雌性マウス（ＳＰＦ）を、ペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）麻酔下、放血致死させた後、大腿骨を摘出した。この両端を切断し、１ｍｌのα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で骨髄を洗い出した。これをα−ＭＥＭで２回洗浄し、１０％活性炭処理ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ（培養液）に懸濁して１．５×１０６個／ｍｌの細胞懸濁液を得た。
（２）薬物処理
２４穴マイクロプレートに細胞懸濁液０．５ｍｌを播種した。これに１００ｎｇ／ｍｌの副甲状腺ホルモン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を添加し、５％ＣＯ２／９５％空気下、３７℃で２日間培養した。非付着性細胞を除去後、各薬物溶液（最終濃度：１０−１１，１０−１０および１０−９Ｍ）を培養液に添加して、さらに７日間培養した。なお、各薬物の各濃度ごと３枚のプレートを用いて実験した。
（３）アポトーシスの検出
細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）で洗浄後、０．２５％トリプシン溶液で剥離し、サイトスピンにて塗抹標本を作製後、メチルアルコールで−２０℃で７分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、アポトーシス細胞は、ＡｐｏｐＴａｇＰｌｕｓ  ＩｎＳｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔペルオキシダーゼ（Ｏｎｃｏｒ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）およびＴＳＡ−ｄｉｒｅｃｔ  ｋｉｔ（Ｇｒｅｅｎ  ＦＩＳＨ、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて検出した。同時に、５０Ｕ／ｍｌＲＮａｓｅ含有２０μｇ／ｍｌよう化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）溶液で室温、１５分間染色して核を染めた。共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡（ＭＲＣ−１０００、ＢｉｏＲａｄ）により、２個以上の核を有する細胞１００個を観察し、アポトーシス陽性細胞数の出現数を求めた。その結果を表５に示す。
0004418106.tif 000008
データは、ダネットの検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）により解析にした。
コントロールからの有意差：＊＊Ｐ＜０．０１
表５に示す結果より、ジエノゲストは破骨細胞において、１０−９Ｍで有意にアポトーシス発生率を増加させた。一方、ＭＰＡとダナゾールは、アポトーシス発生率に影響を与えなかった。
実験例４：マウスの骨芽細胞のｃＡＭＰ量への影響
実験例１の方法で得られた骨芽細胞を用いた。薬物処理条件も実験例１の記載に従って行った。培養した細胞のホモジネート（１０４個／ｍｌ）の上清を検体として用い、時間分解蛍光測定法により定量した。すなわち、９６穴マイクロプレートの各穴にヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体溶液１００μｌを添加し、２０℃で１時間反応した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有Ｔｒｉｓ緩衝液生理食塩液（洗浄液）で洗浄後、抗ｃＡＭＰ抗体溶液１００μｌを添加し、２０℃で１時間反応させ、洗浄した。ブロックエース溶液でブロッキング後、洗浄し、検体溶液およびユーロピウム標識ｃＡＭＰ標識タンパク質溶液１００μｌを添加した。ＤＥＬＦＩＡ洗浄液で洗浄後、増強試薬１００μｌを添加し、室温で５分間振とう後、時間分解蛍光測定装置で蛍光強度を測定した。予め作成した標準曲線より、ｃＡＭＰ量を算出した。その結果は図１に示す。図１のカラムは、左より、１０−１１、１０−１０、１０−９Ｍの投与量をそれぞれ示す。
図１に示す結果より、マウス骨芽細胞内のｃＡＭＰ量において、ジエノゲストは１０−９Ｍ以上の濃度で有意に増加した。一方、ＭＰＡやダナゾールは、ｃＡＭＰ量に影響を与えなかった。
実験例５：マウスの骨芽細胞のＰＫＡ活性への影響
実験例１の方法により得られた骨芽細胞を用いた。薬物処理条件も実験例１の記載に従って行った。培養した細胞のホモジネート（１０４個／ｍｌ）の上清を検体として用い、時間分解蛍光測定法により定量した。すなわち、９６穴マイクロプレートの各穴にＰＫＡ反応溶液（ＭＢＬキット）１０８μｌを添加し、さらに検体溶液１２μｌを添加して、２５℃で５分間反応した。反応停止液１００μｌを添加し、洗浄液で５回洗浄した。これにマウス由来抗ＹＣ抗体溶液１００μｌを添加し、２５℃で３０分間反応後、洗浄した。これにユーロピウム標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液１００μｌを添加し、２５℃で３０分間反応後、ＤＥＬＦＩＡ洗浄液で洗浄した。増強試薬１００μｌを添加し、室温で５分間振とう後、時間分解蛍光測定装置で蛍光強度を測定した。予め作成した標準曲線より、ＰＫＡ活性値を算出した。その結果を図２に示す。図２のカラムは、左より、１０−１１、１０−１０、１０−９Ｍの投与量をそれぞれ示す。
図２に示す結果より、ジエノゲストは１０−９Ｍ以上の濃度でマウス骨芽細胞のＰＫＡ活性を有意に亢進したが、ＭＰＡとダナゾールは変化しなかった。
また、本発明骨吸収サイトカイン産生および分泌抑制剤の、毒性（安全性）については、今回のｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効性を示した用量から推定される臨床用量が、ドイツにおいて経口避妊薬としてすでに使用されている本薬物の臨床用量（１日投与量２ｍｇ）にほぼ匹敵する用量であり、且つ、単剤の子宮内膜症治療薬としての臨床治験（１日投与量１〜４ｍｇ）においても安全性が確認されていることから、何ら問題ないと考えられる。
以上の実験結果により、ジエノゲストが１０−１０Ｍ以上の濃度で卵巣摘出マウス由来の骨芽細胞からのＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの放出を抑制することが確認された。マウスの破骨細胞によるピット形成において、ジエノゲストは１０−９Ｍで抑制効果を示したが、ＭＰＡやダナゾールは抑制効果を示さなかった。
また、破骨細胞におけるアポトーシス発生率で、ジエノゲストは１０−９Ｍで増加を示すのに対し、ＭＰＡやダナゾールは変化しなかった。このことより、ジエノゲストは骨吸収サイトカイン産生抑制作用を示すことがわかった。さらに、ジエノゲストは１０−９Ｍで、骨芽細胞のｃＡＭＰ量を増加し、ＰＫＡ活性を亢進したのに対して、ＭＰＡやダナゾールは変化しなかったことから、ジエノゲストは骨形成促進作用を有することがわかった。
次に本発明の剤の投与形態について述べる。本発明の骨吸収サイトカイン産生および／または分泌抑制剤は、有効成分として少なくともジエノゲストを有効量含有していればよく、通常製薬上許される担体とともに製造される。すなわち、本発明の剤は、医薬、獣医学上の組成物であり、少なくともジエノゲストと製薬上許容される担体とを含有している。適当な添加剤（製剤原料）、例えば乳糖やりん酸水素カルシウムなどの賦形剤、粉末セルロースやデキストリンやポリビニルアルコールなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースやカルボキシメチルスターチなどの崩壊剤、ショ糖脂肪酸エステルやステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、顔料などの着色剤、植物性香料などの矯味剤、安定化剤などが含まれていても良い。投与の形態としての具体例は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液体状の溶液または懸濁剤、乳濁剤、脂肪乳剤、軟膏剤、坐剤、さらにパッチ剤、テープ剤、皮肉埋め込み型等の徐放性製剤等の形態である。投与方法としては、経口的あるいは直腸内投与、膣内投与、経皮吸収、経粘膜吸収、静脈内投与、関節腔内、筋肉内投与または皮下投与等の非経口投与が挙げられる。また、注射剤、点眼剤による投与も考えられる。
投与量は、成人一日当り、約０．５〜１０ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇで一日当り１〜５回に分けて投与されるが、患者の年齢、体重、健康状態および投与経路により、投与量、投与回数ともに調節できる。
また、本発明の剤は、有効成分としてジエノゲストの他に、他の有効成分を含有することが可能である。他の有効成分としては、好ましくは、骨粗鬆症治療剤、抗リウマチ薬、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療に用いる抗腫瘍剤などである。具体的には、骨粗鬆症治療剤として、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン、エストロゲン、カルシウム製剤、イプリフラボン、エストリオール、副甲状腺ホルモン製剤、ビタミンＫ、フッ化ナトリウム、ビスホスホネートなどがある。抗リウマチ薬としては、インドメタシン、ケトプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬、オーラノフィンなどの経口金製剤、ペニシラミンなどがある。抗腫瘍剤としては、シクロフォスファミドなどのアルカリ化薬、アメトプテリンなどの代謝拮抗薬、マイトマイシンなどの抗生物質、植物アルカロイドなどがある。
さらに、本発明の剤は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αのいずれかの産生および／または分泌を抑制する作用を有する薬物との併用も可能である。
投与形態としては、ジエノゲストと他の化合物とを含有する製剤でもよいし、それぞれを別に投与してもよい。また、患者に対して、ジエノゲストと当該化合物を同時に投与するほか、従来の治療剤の漸減、離脱や、従来の治療剤の休薬期間中の使用などが有り得る。
以下に、本発明の実施例を示す。なお、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
（実施例１）
ジエノゲスト                              ２．０ｇ
乳糖                                    ８７．０ｇ
コーンスターチ                            ６．０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                  ５．０ｇ
上記成分を混合し、１００ｍｇずつを日本薬局方３号カプセルに封入し、カプセル剤となす。
（実施例２）
ジエノゲスト                              ０．４ｇ
乳糖                                    ９１．６ｇ
コーンスターチ                          ５０．０ｇ
タルク                                    ３．０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                  ５．０ｇ
上記成分を適宜混合し、湿式顆粒圧縮法により１錠当りジエノゲスト０．４０ｍｇを含有する１５０ｍｇの錠剤となす。
（実施例３）
ジエノゲスト                              １．０ｇ
ポリソルベート８０                        １．０ｇ
ウィテップゾール（Ｓ−５５）            ９８．０ｇ
上記成分を加温下練合し、プラスチックパッケージに封入して、１個当り重量１．０ｇの坐剤となす。
産業上の利用可能性
本発明の骨吸収サイトカイン産生および／または分泌抑制剤は、強力な骨吸収サイトカイン産生および／または分泌抑制活性を有し、ＲＡ、変形性関節症、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、骨粗鬆症或いは糖尿病などのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αの産生および／または分泌異常に起因する疾患の予防または治療効果を発揮し得る。本発明の剤は、ＲＡ因子ＣＲＰの亢進、フィブリノーゲン、血小板数貧血アルブミン低下等の臨床検査値を改善するのみならず、疼痛、腫脹の自覚症状も改善する。さらには、破骨細胞の活性を抑制し、ＲＡの治療剤となりうる。また、本発明の剤は、骨吸収抑制作用を有するのみならず、骨形成促進作用を有することから、老人性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症の治療剤となり得る。さらに、本発明の剤は、ダナゾールの副作用である骨量減少を軽減し得る。本発明の薬剤は、単独で用いられる他に、従来の骨粗鬆症治療剤、抗リウマチ剤、高カルシウム血症治療剤と併用することが可能である。また、本発明の薬剤は、試薬としても有用である。さらに、本発明の薬剤は、副作用が少なく、長期間投与することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実験例４のｃＡＭＰ量を示すグラフである。
図２は、実験例５のＰＫＡ活性を示すグラフである。
【図１】
0004418106.tif 000009
【図２】
0004418106.tif 000010