(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の配列番号１で表されるＢＭＰ‐７ポリペプチドを含む瘢痕形成抑制剤。
【請求項２】
上記有効量は５０ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌまたは０.１ｎｇ〜１μｇ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項１に記載の瘢痕形成抑制剤。
【請求項３】
上記瘢痕は角膜瘢痕であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の瘢痕形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）‐７ポリペプチドを含む瘢痕形成抑制剤に関する発明であって、さらに詳しくはＢＭＰ‐７ポリペプチドを含む筋繊維母細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）形成抑制剤に関する発明である。
【０００２】
〔背景技術〕
Ｔｓｅｎｇらは瘢痕を除去する過程において羊膜が効果的であると報告した（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ；１７９（３）：３２５〜３５，ＩＯＶＳ１９９８；３９：Ｓ４２８）。また瘢痕除去に羊膜の成分が瘢痕発生を抑制し傷を治療するという報告がある（Ｂｕｌｌ  Ｈｏｓｐ  Ｊｔ  Ｄｉｓ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｉｎｓｔ  １９９０  Ｓｐｒｉｎｇ；５０（１）：２７〜３４）。
【０００３】
胎盤の最も内層において胎児を包んでいる羊膜は絨毛膜から容易に分離される約７０μｍ厚さの薄い半透明膜であって、血管がなく免疫学的に不活性組織であるので移植をしても拒否反応のない組織である。組織学的に羊膜の構造は単純立方細胞で配列された単層の羊膜細胞、厚い基底膜と無血管性の細胞外基質とからなっており、基底膜にはタイプＩＶコラーゲン、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）α５とβ１の成分などを含む。羊膜は炎症細胞を吸着し炎症細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発させて炎症細胞が創傷組織に浸透できないようにする抗炎症作用と基底膜として作用することによって創傷治癒の際上皮再生を促進する。また羊膜はＥＧＦ（ｅｐｏｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及び炎症サイトカインであるインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）とプロスタグラジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の分泌を調節して抗炎症作用を奏し、その外にもＴＧＦ‐β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ‐β）伝達体系の下向調節によって繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の増殖及び筋繊維母細胞への分化を抑制させるため抗癒着作用とともに抗瘢痕作用を奏すると知られており、１９４０年Ｄａｖｉｓによって臨床的に皮膚移植に初めて用いられた。
【０００４】
Ｇｏｏｄｒｉｃｈの２０００年の報告によると、切れた皮膚に羊膜を貼り付けて傷を治癒すれば羊膜を貼り付けなかった傷より１.５倍回復速度が増加し、Ｇｒｉｓの報告では皮膚癌の切除手術部位及び傷によって損傷された皮膚組織の破壊部位に羊膜を用いて治癒する場合全く瘢痕なく正常的に回復することを確認した報告がある（Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ． ２０００  Ｍａｒ；６１（３）：３２６〜９）。
【０００５】
現在、眼科治療に用いられている羊膜の機能はほとんど明らかになっていないが、手術後生じる角膜混濁などを治すのに用いられている。
【０００６】
角膜は外からの刺激に対応する障壁として重要な役割を果す透明な眼球の前方（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｏｃｕｌａｒ）組織である。角膜の傷治癒（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）は角膜の細部構造（ｃｏｒｎｅａｌ  ｓｕｂ‐ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分化と組織化の結果として現れる非常に複雑な過程である。人体のほかの部分とは異なり、角膜の傷治癒は多くの要素によって調節されるいろんな事件の連続的な過程であり、人体のいろんな所においての傷治癒は瘢痕形成と血管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）であるのに対し、角膜の傷治癒過程の最も重要な点は、最終結果である瘢痕形成をいろんな要素による連続的な過程によって除去すべきであるということである。
【０００７】
羊膜は、１９４０年Ｄｅ  Ｒｏｔｔｈが眼科領域において結膜の瞼球癒着と欠損に羊膜を適用して以来癒着を抑制して傷部位を保護し、上皮のアポトーシスを抑制することによって上皮化を促進させるのみならず、正常上皮形質を保存し、炎症と新生血管生成を減少させて瘢痕生成を減らす効果があると報告された（Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  ｒｅｓｒｃｈ，１９９９  １８（３），３１１〜３５６）。現在、ＫｉｍとＴｓｅｎｇとが羊膜の様々な機能を用いていろんな眼疾患に適用させる研究をして、最近眼科の外眼部分野において羊膜を再発性翼状片及び難治性角膜炎、角膜潰瘍、角膜化学火傷、角膜穿孔及びＳｔｅｖｅｎｓ‐Ｊｏｈｎｓｏn症候群などの様々な難治性眼球表面疾患の治療に用いている。
【０００８】
しかし、羊膜によるいろんな効果や機能に対した完全な理解などはまだほとんど明らかになっていない。従って、羊膜を羊膜提供者から提供されて用いている実情であり、羊膜提供者は合併症がなく、血清検査を通じて感染症（Ｂ型、Ｃ型肝炎、梅毒、ヒト免疫不全ウイルス）が陰性である妊婦のみを適用者にして帝王切開した羊膜のみを用い、用いる器具は全て無菌処理したもののみを用いている。しかし、処理過程において細菌感染の危険性が存在する問題点があり、現在羊膜提供者の羊膜を冷凍保存して用いた目を対象にして羊膜を細菌学的に検討した結果、その１０％から細菌が検出されている実情である。従って、このような結果は羊膜を用いるに当たってさらに多くの不作用を誘発し得る深刻な問題であり、羊膜から瘢痕を抑制する物質のみを抽出して用いる際にはこのような感染の発生を予防することができるので、羊膜からこのような物質を抽出して適用する必要がある。
【０００９】
ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）‐７は、骨形成に関与する物質として知られており、発生の際歯牙と眼球の形成に重要な役割を果すと知られており、成人の場合には作られないと報告されている（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ． １９９９  Ｍａｒ１；２０７（１）：１７６〜８８，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｊａｎ  １０；２３０（１）：２８〜３７）。
【００１０】
〔発明の概要〕
本発明は上記の問題点を解決し、上記の必要から案出されたものであって、本発明の目的は羊膜から抽出した瘢痕形成抑制物質蛋白質を提供することである。
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は生理的に有効量のＢＭＰ‐７ポリペプチドを含む瘢痕形成抑制剤を提供する。
【００１２】
本発明のＢＭＰ−７ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドが望ましい。
【００１３】
本発明においてＢＭＰ‐７は、水溶液状で５０ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであることが望ましい。
【００１４】
用量としては、１回投与の際０.１ｎｇ〜１μｇ／ｋｇ体重が望ましく、１ｎｇ〜５０ｎｇ／ｋｇ体重がさらに望ましい。本発明はこの範囲においては用量（ｄｏｓｅ）依存的な効能の増加を見せ、毒性がなく、この範囲以下においては効果が低下し、この範囲を超えると、目に違和感及び痛みを誘発させるので上記の範囲が望ましい。
【００１５】
また本発明の組成物は、網膜、肝、腎臓など様々な臓器の繊維化抑制剤として用いることができて、このような作用は主にＴＧＦ‐ｂなどによるｓｍａｄ  ２信号の抑制を通じて現れるものである。
【００１６】
以下、本発明を簡単に説明する。
【００１７】
本発明の発明者らは、ヒトの羊膜から蛋白質を抽出し、膜を用いてこれを大きさ別に分類した。各画分のＴＧＦ‐ｂ抑制能を確認して効果のある画分を２‐Ｄゲル電気泳動して得られたポイントをＭＡＬＤＩ  ＴＯＦを用いて分析した。
【００１８】
最も量が多い蛋白質を分析した結果、これがＢＭＰ‐７であることが分かり、これをＢＭＰ‐７及びこれに対する抗体を購入して確認した。
【００１９】
これに商品化されているＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ３５４‐ＢＰ）を用いてヒトの皮膚由来細胞であるＨａＣａｔ細胞及び動物の角膜に対して実験し瘢痕形成抑制剤としての使用可能性を確認した。
【００２０】
〔発明の実施のための最良の形態〕
図１は、ＴＧＦ‐β１による筋繊維母細胞形成がＢＭＰ７（２００ｎｇ／ｍｌ）処理により抑制されることをウェスタンブロットを通じて確認した写真である。レーン１はＴＧＦ‐ｂ１とＢＭＰ処理しなかったもの、レーン２はＴＧＦ‐ｂ１のみ処理したもの、レーン３はＢＭＰ７のみ処理したもの、レーン４はＴＧＦ‐ｂ１とＢＭＰとを両方とも処理したものである。図２は、分子量１０万以上（レーン１）、１万〜１０万（レーン２）、１万以下（レーン３）の３種のサンプルをＳＤＳ‐ＰＡＧＥした結果の写真である。図３ａは、羊膜抽出物の２‐Ｄゲル電気泳動写真であり、図３ｂは染色した２‐ＤスポットのＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ結果図である。図４は、抽出液の蛋白質がＢＭＰ‐７であることをウェスタン免疫ブロッティングで確認した結果の写真である。レーン１は組換えＢＭＰ‐７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、レーン２は羊膜抽出液（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）、レーン３は組換えＢＭＰ‐７ウェスタンブロット、レーン４は羊膜抽出液ウェスタンブロットである。図５は、ＴＧＦ‐β１による筋繊維母細胞形成がＢＭＰ７（２００ｎｇ／ｍｌ）処理により抑制されることをＰＣＲを通じて確認した写真である。レーン１はＴＧＦ‐β１、レーン２はＴＧＦ‐β１＋ＢＭＰ７処理したものである。図６は、ラット（ｒａｔ）の目にアルカリ火傷を負わせＢＭＰ‐７を処理して瘢痕形成が抑制されたことを示す写真である。ａはアルカリ＋ＢＭＰ‐７、ｂはアルカリ処理、ｃは正常の写真を示す。図７は、ＢＭＰ‐７が炎症を抑制することをＴＮＦ‐ａ分泌にて確認した図である。図８は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）免疫染色を進めた写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはフィブロネクチンが発現されていないことを確認した。図９は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためα‐ＳＭＡ免疫染色を行った写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはα‐ＳＭＡが発現されていないことを確認した。図１０は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためコラーゲンＩＶ免疫染色を行った写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはコラーゲンＩＶが発現されていないことを確認した。図１１は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためＰＣＮＡ免疫染色を行った写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはＰＣＮＡが発現されていないことを確認した。図１２は、ウサギ角膜細胞での筋繊維母細胞の分化抑制を示す図であり、一次細胞でＴＧＦ‐１を処理してフィブロネクチン（Ａのレーン２）及びα‐ＳＭＡ（Ａのレーン２）の発現を確認し、ＢＭＰ７がこのような発現を抑制すること（Ａのレーン４とＢの４番）をウェスタンブロット（Ａ）とＥＬＩＳＡ（Ｂ）とを通じて確認した。図１３は、ヒト皮膚角質細胞での筋繊維母細胞分化抑制を示す図であり、細胞レベルにおいてＴＧＦ‐１を処理してフィブロネクチン（Ａのレーン２）及びα‐ＳＭＡ（Ａのレーン２）の発現を確認し、ＢＭＰ７がこのような発現を抑制すること（Ａのレーン４とＢの４番）をウェスタンブロット（Ａ）とＥＬＩＳＡ（Ｂ）とを通じて確認した。
【００２１】
以下、非限定的な実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。
【００２２】
本発明で用いられた実験動物としてはＳＤラット（ｍａｌｅ、１８０〜２００ｇ、韓国）と重さが２.５ｋｇであるニュージーランドホワイトラビットとを用いた。細胞培養に用いられる試薬は高品質の試薬を用い、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＭＥＭとはＧｉｂｃｏ‐ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）社、ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）社の製品を、プラスチック製品はＦａｌｃｏｎ（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）社の製品を用いた。ＴＧＦ‐β１（二つの１１２個アミノ酸を含むポリペプチドからなっており、約２５ｋＤａであり、中国ハムスタの卵巣細胞株から発現させた蛋白質である）とＢＭＰ７（ソースはヒトＢＭＰ‐２（Ｍｅｔ  １〜Ａｒｇ  ２８２）ヒトＢＭＰ‐７（Ｓｅｒ  ２９３〜Ｈｉｓ  ４３１）であって、−２０℃で保管し、中国ハムスタの卵巣細胞株から発現させた蛋白質である）とは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）社、抗‐ＰＣＮＡ抗体（ラット  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎであって、３６ｋＤａであり、マウスＩｇＧ２ａである）はＳｉｇｍａ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）社、 抗‐フィブロネクチン抗体はＢｉｏＨｉｔ社、そしてコラーゲンＩＶとα‐ＳＭＡ抗体（Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌを認識して、ヒト、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ）、カエル（ｆｒｏｇ）、ヤギ（ｇｏａｔ）、テンジクネズミ（ｇｕｉｎｅａｐｉｇ）、マウス、ウサギ、ラット、イヌ、ヒツジ、とヘビ種に反応性を持っている）はＳｉｇｍａ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）社製品を用いた。ウェスタンＥＣＬキット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｆ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｕｍｉｎｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔで２次抗体に結合されている西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）を用いて反応を誘導する）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）社、イミュソーステイン（ｉｍｍｕｎ−ｓｔａｉｎ）キット（マウス、ラット、テンジクネズミ種に反応性がある１次抗体を含み、褐色に染色される特徴がある）とＥＬＩＳＡキットはＺｙｍｅｄ  ＬＡＢｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）社製品を用い、顕微鏡とデジタルカメラはＮｉｋｏｎ（Ｊａｐａｎ）社製品を用いた。
【００２３】
〔実施例１：羊膜からの蛋白質の抽出〕
帝王切開した健康な産婦から羊膜を得た。
【００２４】
羊膜１０ｇを生理食塩水にて３回洗浄後１０ｍｌ  ＰＢＳとともに乳鉢内で磨りつぶした。
【００２５】
得られた液を遠心分離して沈澱物を除去した。ここで得られた抽出液を分子量１０万の膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）を通過させた。通過されずに回収された液はＰＢＳともう一度混ぜて膜を通過させる方法で抽出液を１０万以上と以下に分けた。ここで得られた分子量１０万以下の抽出液を分子量１万の膜を用いてまた１万以下と１万以上に分けた（図２）。
【００２６】
〔実施例２：羊膜抽出液のＨａＣａｔ細胞トランスフォーメーション抑制能測定〕
（ＨａＣａｔ細胞培養）
ＨａＣａｔ細胞（Ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を１０％  ＦＢＳが含まれたＭＥＭで５％ＣＯ２、３７℃培養器で培養した。このときディッシュに９０％以上細胞が成長すると１０％  ＦＢＳが含まれていないＭＥＭ培地で２４時間セラム欠乏させた。
【００２７】
（トランスフォーメーション及び抑制能測定）
６ウェルプレートに細胞が２ｘ１０５になるように培養されたＨａＣａｔ細胞にＴＧＦ‐β１（５ｎｇ／ｍｌ）と分子量別羊膜抽出液を処理した（対照群にはＴＧＦ‐β１無し）。処理後２４時間筋繊維母細胞の生成を誘導した。このとき生成されたフィブロネクチンの量をＥＬＩＳＡ法にて測定した（表１）。
【００２８】
このとき、抗‐フィブロネクチンＡｂ（Ａｃｃｕｒａｔｅ、ＩＭＳ０２‐０６０‐０２）をコーティングバッファ（０.１Ｍ  カルボネートバッファ、ｐＨ９.６）に１０μｌ／ｍｌ濃度で９６‐ウェルフラットボトムプレートに付着させ、１％  ＢＳＡ  ブロッキングした後フィブロネクチンスタンダードと培養液を処理し、抗‐フィブロネクチンＡｂ、ＨＲＰ（Ａｃｃｕｒａｔｅ、ＩＭＳ０４‐０６０‐０２）を用いて発色させてその量を測定した。
【００２９】
【表１】
0004488902.tif 000002
【００３０】
〔実施例３：羊膜抽出物の２‐Ｄゲル電気泳動及びＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析〕
（抽出液の蛋白質分析）
分子量１万〜１０万の羊膜抽出物を蛋白質１ｍｇ／ｍｌになるようにして０.５ｍｌを取った後、ＴＣＡ／アセトンを１.５ｍｌ加えた。その後遠心分離して得られた沈澱物をアセトンにて洗浄後、１０％  ＳＤＳと２.５％  ＤＴＥ水溶液１０μｌに溶かした後５分間煮た。ここに、ｐＨ３‐１０  ＩＰＧ    ゲルストリップ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａａｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＩＥＦ（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓ）後、８‐１０％  アクリルアミドゲルにて電気泳動後、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）  Ｇ２５０を用いて染色した（図３）。
【００３１】
染色したゲルの主要スポットを切り出してＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ及びＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳを用いたＥＳＩ‐ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳへ蛋白質配列一部を分析依頼した。（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）その結果、スポットがＢＭＰ‐７であることが明らかになった。
【００３２】
【表２】
0004488902.tif 000003
【００３３】
〔実施例４：ウェスタン免疫ブロッティングを用いたＢＭＰ‐７の確認〕
分子量１万〜１０万の羊膜抽出物を蛋白質１ｍｇ／ｍｌになるようにして０.５ｍｌを取った後、ＴＣＡ／アセトンを１.５ｍｌ加えた。その後遠心分離して得られた沈澱物をアセトンにて洗浄後、１０％  アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥをした後、ニトロセルロース膜にトランスファーした後ＢＭＰ‐７単一クローン抗体を用いてウェスタンブロットした結果（図１）、羊膜抽出物にＢＭＰ‐７があることを確認した。
【００３４】
〔実験例：ＢＭＰ‐７の効能試験〕
（ＨａＣａｔ細胞トランスフォーメーション抑制）
ＣＨＯ細胞から発現させた組換えＢＭＰ‐７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を購入して、実施例２と同じ方法でＨａＣａｔ細胞トランスファ抑制能を確認した。このとき効能の確認はフィブロネクチンの抗体を用いたウェスタンブロットティングと（図４）フィブロネクチン遺伝子プライマーを用いたＰＣＲ（図５）との二種類の方法で確認した。
【００３５】
（アルカリ火傷を負わせたラット角膜の回復の際の瘢痕形成抑制試験）
ＳＤラット（ｍａｌｅ、１８０〜２００ｇ、韓国）に両眼の角膜中央に１.０  Ｎ  ＮａＯＨに浸したディスクを６０秒間処理後、左側目‐培地、右側目‐ＢＭＰ７（３２０ｎｇ／ｍｌ）を５０μｌずつ眼球に点滴し、対照群にはＮａＯＨ処理なしに培地及びＢＭＰ‐７を処理した。このとき培地及びＢＭＰ‐７は７日間昼間の時間（午前１０：００〜午後７：００）に３時間間隔、４回注入した。この後２週後に写真撮影した（図６）。
【００３６】
（ヒトの血液を用いたＴＮＦ‐ａ分泌抑制効果）
２０Ｕ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎ処理された注射器を用いて採血したヒト血液に同量の３％  デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）を入れた後、室温で約２０分間放置後上層液を分離した。遠心分離して得られた沈澱物をアイス冷却された０.２％  ＮａＣｌ  ２０ｍｌで浮遊し、またアイス冷却された１.６％  ＮａＣｌ  ２０ｍｌを添加して得られたＰＭＮを１０％  ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０に１Ｘ１０６細胞／ｍｌで再浮遊して２４ウェルプレートにウェル当たり１ｍｌずつ分注し、またウェル当たりＥ．ｃｏｌｉ  ０１２７：Ｂ８  ＬＰＳ  １００ｎｇ／ｍｌになるように添加した後、食塩水及びＢＭＰ７を濃度別に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した後、ウェル別に上等液を収集してＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ‐ａ  ｑｕａｔｉｋｉｎｅ  ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて分泌されたサイトカインを定量した（図７）。
【００３７】
（α‐ＳＭＡ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチンとＰＣＮＡの免疫組織化学染色の実験）
ラットの両眼の角膜中央に１.０Ｎ  ＮａＯＨに浸した直径３５ｍｍ  ディスクを６０秒間処理後、食塩水３ｍｌにて洗浄する。７日間一日４回（午前１０：００〜午後７：００に３時間間隔）、左眼は対照群として生理的食塩水を、右眼はＢＭＰ７（３２０ｎｇ／ｍｌ）を５０μｌずつ眼球に点滴した。眼球摘出日程（毎０、２４、７２時間、１週、２週、３週）によってラットをエーテルを用いて麻酔させた後、眼球を摘出した。摘出された眼球をパラフォルムアルデヒドに浸して４℃で２４時間固定した後、ビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）を用いて４〜５μｍ厚さで連続切片を制作して免疫組織化学染色を施した。
【００３８】
薄切した組織はキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）、１００％  ＥｔＯＨ、９０％  ＥｔＯＨ、８０％  ＥｔＯＨ、７０％  ＥｔＯＨ順で３〜５分間処理後燐酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）にて数回洗浄し、１％  ソジウムボロハイドライド（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）にて１時間処理して残っている固定液成分を除去した。免疫組織化学染色のための前処理過程として３％の過酸化水素溶液に１０分間処理し、またＰＢＳにて数回洗浄後一次Ａｂ（α‐ＳＭＡ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ＰＣＮＡ）の各々を室温で６０分間組織が乾かないように落とし続けて反応させた。ＰＢＳにて洗浄後二次Ａｂを室温で２０分間反応させた。またＰＢＳにて洗浄後、アビジン‐ビオチンされた西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ａｖｉｄｉｎ‐ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）で室温で１時間反応させ、０.０５％  ジアミノベンジジン‐テトラヒドロ‐クロライド（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ‐ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ‐ｃｈｌｏｒｉｄｅ）に０.０１％  過酸化水素を添加した溶液で発色させて蒸留水で洗った後、通常の方法で脱水、透明過程を経て蓋ガラスを被せて観察できる組織標本を制作した。
【００３９】
アルカリを処理したラットの角膜から傷治癒（ｗｏｕｎｇ  ｈｅａｌｉｎｇ）初期にフィブロネクチンの発現程度を免疫染色を通じて確認した結果、２時間後にＢＭＰ‐７を処理していない方で広範囲な発現が観察された（図８）。
【００４０】
α‐ＳＭＡの免疫染色の結果、対照群はＢＭＰ‐７処理群と異なり基底膜部位の細胞のサイトゾル（ｃｙｔｏｓｏｌ）に集中的に染色されることを見ることができる。また１４日経過後対照群の場合基底膜部位近くの細胞の壊死と組織変成が起きた（図９）。
【００４１】
また瘢痕を形成する主要蛋白質であるコラーゲンＩＶ免疫染色結果、１４日が経てＢＭＰ‐７を処理していない対照群の方に多量染色されることを見ることができ（図１０）、アルカリ処理したラットの角膜のＰＣＮＡ発現程度を免疫染色を通じて確認した結果、ＢＭＰ‐７処理群で良好な発色が起きることを確認することができた（図１１）。
【００４２】
（ＴＧＦ‐βによる筋繊維母細胞の分化抑制試験）
＜Ａ．ラビット角膜細胞の一次培養＞
重さが２.５ｋｇであるニュージーランドホワイトラビット（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ）の眼球を摘出した後、網膜、脈絡膜、水晶体を除去し角膜（ｃｏｒｎｅａ）層部位のみを解剖してＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ  ｂｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に入れた後、コラーゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で１２時間処理して単一細胞に分離させる。分離された細胞はポリ‐Ｄ‐リシン（ｐｏｌｙ‐Ｄ‐ｌｙｓｉｎｅ）にてコーティングされた２４ウェルプレートにプレーティングする。用いられた培地は１０％  熱‐不活性のウシ胎児血清（ｈｅａｔ‐ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）とＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を用いる。培養条件は３７℃で５％  ＣＯ２濃度にする。培養後１０〜１１日に実験に用いる。
【００４３】
＜Ｂ．ＨａＣａｔ細胞培養＞
ＨａＣａｔ細胞は組織培養フラスコの中で３７℃、５％  ＣＯ２条件を維持しながら培養し、培地としては１０％  ＦＢＳが含まれたＭＥＭを用い、３日に一回ずつ培地を入れ替えた。細胞を倒立顕微鏡で見たとき、互いにくっついて単一層を形成する直前の状態（ｓｕｂｍｏｎｏｌａｙｅｒ）になると、以下のような方法でトランスファーした。組織培養フラスコの中の培地をピペットで全部取り出した後、細胞をＰＢＳにて洗浄し０.５％  トリプシンを処理して細胞を取り除いた。１，０００ｘｇで３分間遠心分離して集めた細胞をまた成長培地に希釈した後、ｍｌ当り１x１０５細胞になるようにして新しい組織培養フラスコに入れた。このとき、細胞の数は血球算定器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。
【００４４】
＜Ｃ．分化及び分化抑制能の測定＞
６ウェルプレートに細胞数が１x１０５に培養されたウサギの角膜細胞またはＨａＣａｔ細胞を血清を含まないＭＥＭ培地にて６時間培養した後、ＴＧＦ‐β１（５ｎｇ／ｍｌ：１ｎｇ／μｌストック１０μｌ添加）を処理し、対照群及びＢＭＰ７（２００ｎｇ／ｍｌ：１０ｎｇ／μｌストック４０μｌ添加）を処理した。処理後２４時間筋繊維母細胞誘導した。このとき生成されたフィブロネクチン及びα‐ＳＭＡの量をウェスタン免疫ブロッティング及びＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００４５】
＜Ｄ．ＥＬＩＳＡ＞
免疫プレートをニワトリ抗‐ヒトフィブロネクチン（ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｎｔｉ‐ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）ＩｇＧでコーティングした。この過程はＩｇＧを３５ｍＭ重炭酸（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝溶液に１μg／ｍｌになるようにしてウェル当り１００μｌずつ入れて４℃で一晩処理したものである。コーティング後プレートはＰＢＳにて３回洗浄し１％  ＢＳＡ‐ＰＢＳをウェル当り３００μｌずつ入れて常温で１時間処理後、またプレートをＰＢＳにて洗浄した。このように用意されたウェルに試料及び標準溶液（ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、そしてサンプルを各々２０μｌずつ添加した。このプレートを４℃で一晩反応させた後ＰＢＳＴ（０.１％  Ｔｗｅｅｎ‐２０  ｉｎ  ＰＢＳ）にて３回洗浄した。そしてディテクションＡｂ（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ｃｈｉｃｋｅｎ  ａｎｔｉ‐ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＲＰ）１％  ＰＢＳ溶液を各々に添加して常温で２時間さらに反応させた。反応後ＰＢＳＴにて３回洗浄後ペルオキシダーゼの気質であるＡＢＴＳ溶液（４‐ｃｈｏｌｒｌ‐１‐ｎａｐｈｔｏｌとＨ２Ｏ２混合物）を入れて溶液の色が変わるのを観察した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ／ウェルに入れて発色反応を停止させた後、吸光の変化は４０５ｎｍ  フィルタを用いたＥＬＩＳＡ  リーダ（ｒｅａｄｅｒ）、にて測定した。
【００４６】
＜Ｅ．ウェスタンブロット＞
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法を修正して用いた。サンプルを０.０５Ｍ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ６.８）、２％  ＳＤＳ、５％  β‐メルカプトエタノール、１０％  グリセロール、０.００１％  ブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を混合したサンプルバッファと混合させた後、１００℃の水で湯煎して１０分間加熱して蛋白質を完全に変成させた。このサンプルと蛋白質標準マーカとを５％  アクリルアミドからなったスタッキングゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）と６％  アクリルアミドからなったランニングゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌ）から分離した。このとき用いたランニングバッファとスタッキングゲル及びランニングゲルは０.１％  ＳＤＳを含んだものであって、スタッキングの際には８０Ｖに維持させ、ランニングの際には１３０Ｖに維持させた。このとき用いた蛋白質標準マーカはｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品であって、ミオシン（ｍｙｏｓｉｎ）（２５０ｋＤａ）、ホスホリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）  Ｂ（１４８ｋＤａ）、ＢＳＡ（９８ｋＤａ）、グルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（５０ｋＤａ）、アルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（３６ｋＤａ）、ミオグロビンレッド（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ  ｒｅｄ）（２２ｋＤａ）、リゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）（１６ｋＤａ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（６ｋＤａ）、インシュリン  Ｂ  チェーン（ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｂ  ｃｈａｉｎ）（４ｋＤａ）の混合物を用いた。
【００４７】
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（６％）を行った後ゲルをトランスファーバッファ（１９２ｍＭ  グリシン、２５ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）、２０％  メタノール）に１５分くらい振って平衡になるようにした。ブロティングキットにトランスファーバッファを満たしカセット、スポンジ、ワットマン  ３ＭＭ  ペーパ  ２枚、ニトロセルロース膜、ゲル、ワットマン  ３ＭＭ  ペーパ２枚、スポンジ、カセットの手順で組み立てた後、ゲルを陰極に、ニトロセルロース膜を陽極に位置するようにした後、２時間３００ｍＡの電流で展開させた。ニトロセルロース膜を取り除いて５％  脱脂牛乳溶液に入れて常温で３０分間徐々に振った後ＰＢＳＴにて洗浄しＰＢＳＴに１：５００に希釈された抗‐フィブロネクチンＡｂで４℃で一晩反応させた。反応終了後、ニトロセルロース膜をＰＢＳＴにて１０分の間隔をおいて３回洗浄後、５％  脱脂牛乳ブロッキング溶液に１：５０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ付抗‐マウス（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ‐ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧと４０分間徐々に振りながら反応させた。またＰＢＳＴにて１０分の間隔をおいて３回洗浄後膜をＥＣＬ溶液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において反応させた後、Ｘ‐ｒａｙ  フィルムに露出させて信号を検出する。
【００４８】
ラビット角膜細胞の一次培養細胞にＴＧＦ‐βを処理してフィブロネクチン及びα‐ＳＭＡの発現を確認し、ＢＭＰ‐７がこのような発現を抑制できることをウェスタン免疫ブロッティングを用いて確認した（図１２）。
【００４９】
ヒトＨａＣａｔ細胞にＴＧＦ‐βを処理してフィブロネクチン及びα‐ＳＭＡの発現を確認し、ＢＭＰ‐７がこのような発現を抑制できることをウェスタン免疫ブロッティングを用いて確認した（図１３）。
【００５０】
〔産業上の利用可能性〕
本発明の構成において説明したように、本発明はラット角膜にアルカリ損傷を負わせ角膜の創傷治癒過程を観察した結果、ＢＭＰ‐７を処理した角膜が対照群として食塩水を処理した群に比べて混濁なく良好な創傷治癒を見せ、角膜の創傷治癒過程の筋繊維母細胞の分化過程を観察するため筋繊維母細胞の分化過程に現れるフィブロネクチンと筋繊維母細胞の特徴的な蛋白質であるα‐平滑筋アクチン（α‐ＳＭＡ）とを染色して観察した結果、創傷治癒過程に広範囲に現れる二種類の蛋白質がＢＭＰ‐７の処理の際減ることを確認することができた。また瘢痕を構成する重要な蛋白質であるコラーゲンＩＶの染色結果、ＢＭＰ‐７の処理の際同じく減ることを確認し、瘢痕形成の抑制は正常的な創傷治癒の抑制を引き起こす場合があるが、ＢＭＰ‐７の創傷治癒速度に対する影響を観察するためＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａ  ａｎｔｉｇｅｎ）の染色を通じてこれを確認した結果、ＢＭＰ‐７の処理が創傷治癒を阻害しないということを確認した。
【００５１】
またウサギの角膜を分離して角膜細胞を培養した後、ＴＧＦ‐βを処理してフィブロネクチンとα‐ＳＭＡとの発現を誘導することができた。このとき、ＢＭＰ‐７の処理がＴＧＦ‐βの作用を抑制することを確認し、ヒト由来ＨａＣａｔ細胞でも同じ結果を確認することができた。
【００５２】
従って、ＢＭＰ‐７は、既存に知られている骨形成などの効能以外にも、筋繊維母細胞への形質転換を抑制することによって角膜及び皮膚において瘢痕が形成されることを抑制することができる。これを用いて成形手術や角膜のレーザー手術の際にでき得る瘢痕の抑制剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、ＴＧＦ‐β１による筋繊維母細胞形成がＢＭＰ７（２００ｎｇ／ｍｌ）処理により抑制されることをウェスタンブロットを通じて確認した写真である。レーン１はＴＧＦ‐ｂ１とＢＭＰ処理しなかったもの、レーン２はＴＧＦ‐ｂ１のみ処理したもの、レーン３はＢＭＰ７のみ処理したもの、レーン４はＴＧＦ‐ｂ１とＢＭＰとを両方とも処理したものである。
【図２】図２は、分子量１０万以上（レーン１）、１万〜１０万（レーン２）、１万以下（レーン３）の３種のサンプルをＳＤＳ‐ＰＡＧＥした結果の写真である。
【図３ａ】図３ａは、羊膜抽出物の２‐Ｄゲル電気泳動写真である。
【図３ｂ】図３ｂは染色した２‐ＤスポットのＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ結果図である。
【図４】図４は、抽出液の蛋白質がＢＭＰ‐７であることをウェスタン免疫ブロッティングで確認した結果の写真である。レーン１は組換えＢＭＰ‐７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、レーン２は羊膜抽出液（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）、レーン３は組換えＢＭＰ‐７ウェスタンブロット、レーン４は羊膜抽出液ウェスタンブロットである。
【図５】図５は、ＴＧＦ‐β１による筋繊維母細胞形成がＢＭＰ７（２００ｎｇ／ｍｌ）処理により抑制されることをＰＣＲを通じて確認した写真である。レーン１はＴＧＦ‐β１、レーン２はＴＧＦ‐β１＋ＢＭＰ７処理したものである。
【図６】図６は、ラット（ｒａｔ）の目にアルカリ火傷を負わせＢＭＰ‐７を処理して瘢痕形成が抑制されたことを示す写真である。図６ａはアルカリ＋ＢＭＰ‐７、図６ｂはアルカリ処理、図６ｃは正常の写真を示す。
【図７】図７は、ＢＭＰ‐７が炎症を抑制することをＴＮＦ‐ａ分泌にて確認した図である。
【図８】図８は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）免疫染色を進めた写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはフィブロネクチンが発現されていないことを確認した。
【図９】図９は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためα‐ＳＭＡ免疫染色を行った写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはα‐ＳＭＡが発現されていないことを確認した。
【図１０】図１０は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためコラーゲンＩＶ免疫染色を行った写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはコラーゲンＩＶが発現されていないことを確認した。
【図１１】図１１は、角膜混濁にＢＭＰ７が与える影響を観察するためＰＣＮＡ免疫染色を行った写真であり、ＢＭＰ７を処理した角膜においてはＰＣＮＡが発現されていないことを確認した。
【図１２】図１２は、ウサギ角膜細胞での筋繊維母細胞の分化抑制を示す図であり、一次細胞でＴＧＦ‐１を処理してフィブロネクチン（Ａのレーン２）及びα‐ＳＭＡ（Ａのレーン２）の発現を確認し、ＢＭＰ７がこのような発現を抑制すること（Ａのレーン４とＢの４番）をウェスタンブロット（Ａ）とＥＬＩＳＡ（Ｂ）とを通じて確認した。
【図１３】図１３は、ヒト皮膚角質細胞での筋繊維母細胞分化抑制を示す図であり、細胞レベルにおいてＴＧＦ‐１を処理してフィブロネクチン（Ａのレーン２）及びα‐ＳＭＡ（Ａのレーン２）の発現を確認し、ＢＭＰ７がこのような発現を抑制すること（Ａのレーン４とＢの４番）をウェスタンブロット（Ａ）とＥＬＩＳＡ（Ｂ）とを通じて確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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