(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元で反復している反復単位を有する規則的な構造を有するタンパク質格子を有するタンパク質プロトマーアセンブリであって、
前記反復単位が、それぞれ少なくとも２つの融合している自己集合可能なモノマーを含む複数のタンパク質プロトマーを含み、前記モノマーがそれぞれ、前記プロトマーが集合して格子となるためにモノマーが集合してなるそれぞれのオリゴマーアセンブリのモノマーであり、
前記反復単位が、３次元で対称的な第１のオリゴマーアセンブリのモノマーである少なくとも一つの第１のモノマーと、さらなるオリゴマーアセンブリのモノマーであり、それぞれ前記第１のモノマーと融合しているさらなるモノマーとを含むプロトマーを含み、
前記第１のモノマーが３次元中に延びる１組の回転対称軸を有し、前記さらなるモノマーが、前記第１のオリゴマーアセンブリの前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸と同じ位数の１つの回転対称軸を有し、
それによって前記反復単位が、プロトマーの前記第１のモノマーが集合して前記第１のオリゴマーアセンブリとなり、かつ、前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸に関して、それぞれの第１のモノマーと融合しているプロトマーのさらなるモノマーが集合して、前記それぞれのさらなるオリゴマーアセンブリの前記回転対称軸が前記第１のオリゴマーアセンブリのそれぞれの回転対称軸に沿って、それぞれのさらなるオリゴマーアセンブリとなる、プロトマーを含む、タンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項２】
前記１組の回転対称軸の回転対称軸の位数がそれぞれ２、３、４または６である、請求項１に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項３】
前記それぞれのオリゴマーアセンブリの前記各モノマーが、天然に存在するタンパク質であるか、または、前記それぞれのオリゴマーアセンブリのモノマーの集合に実質的な影響を与えずに、天然に存在するタンパク質にペプチド要素が欠如、置換若しくは付加された天然に存在するタンパク質に基づく、請求項１または２に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項４】
前記プロトマー中、前記モノマーが結合基によって融合される、請求項３に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項５】
前記結合基が、集合した格子において、（ａ）前記第１のオリゴマーアセンブリ中に、その自然形態で、前記第１のオリゴマーアセンブリの前記１組の回転対称軸の前記それぞれの軸の周りで対称的に配置されるときの前記第１のモノマーの末端、（ｂ）前記さらなるオリゴマーアセンブリ中に、その自然形態で、前記それぞれのさらなるオリゴマーアセンブリの前記回転対称軸の周りで対称的に配置されるときの前記さらなるモノマーの末端、またはその両方の位置若しくは方向における任意の相違を減少するために、プロトマーにおける集合前の自然形態の第１のおよびさらなるモノマーに対して配向している、請求項４に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項６】
前記プロトマーがモノマーに関してホモである、請求項２〜５のいずれか１項に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項７】
前記第１のオリゴマーアセンブリが４面体点群または８面体点群に属する、請求項６に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項８】
前記さらなるオリゴマーアセンブリが、前記第１のオリゴマーアセンブリの前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸と同じ位数の２面体点群に属する、請求項７に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項９】
前記さらなるオリゴマーアセンブリが、４面体点群または８面体点群に属する、請求項７に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１０】
前記第１のオリゴマーアセンブリが、位数３、４または６の２面体点群に属し、かつ前記プロトマーが、それぞれのさらなるモノマーが前記第１のオリゴマーアセンブリの前記第１のモノマーの各末端と融合する少なくとも２つのさらなるモノマーを含む、請求項６に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１１】
前記さらなるモノマーの１つが、前記第１のオリゴマーアセンブリが属する２面体点群と同じ位数の２面体点群に属するオリゴマーアセンブリのモノマーである、請求項１０に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１２】
他の前記さらなるモノマーが、位数２の２面体点群に属するオリゴマーアセンブリのモノマーである、請求項１１に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１３】
前記プロトマーがモノマーに関してヘテロである、請求項２〜５のいずれか１項に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１４】
前記単位格子が２つのタイプのタンパク質プロトマーを含み、前記２つのタイプのプロトマーが同一のヘテロオリゴマーアセンブリの異なるモノマーを含む、請求項１３に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１５】
少なくとも第１のタイプのプロトマーが、集合して前記第１のオリゴマーアセンブリとなる前記プロトマーのモノマーによって前記プロトマーを構成し、それぞれの第１のモノマーと融合する前記プロトマーの前記さらなるモノマーが同一のヘテロオリゴマーアセンブリの前記異なるモノマーの１つであり、前記ヘテロオリゴマーアセンブリが円状点群に属する、請求項１４に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１６】
第１のタイプのプロトマーの前記第１のオリゴマーアセンブリが、４面体点群または８面体点群に属する、請求項１５に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１７】
第２のタイプのプロトマーが、前記ヘテロオリゴマーアセンブリと同じ位数の２面体点群に属するオリゴマーアセンブリのモノマーであるモノマーを含む、請求項１６に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１８】
第２のタイプのプロトマーが、４面体点群または８面体点群に属するオリゴマーアセンブリのモノマーであるモノマーを含む、請求項１５に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項１９】
高分子存在物が付着するアレイを有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項２０】
前記プロトマーが、前記プロトマー内の所定の位置に、高分子存在物に付着する親和性タグを有する、請求項１９に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項２１】
前記高分子存在物が、タンパク質格子内の前記プロトマーの１つと付着するペプチド親和性タグを有する、請求項１９または２０に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ。
【請求項２２】
高分子存在物のＸ線結晶構造解析における高分子存在物アレイの支持体としての請求項１から２１のいずれか１項に記載のタンパク質プロトマーアセンブリの使用。
【請求項２３】
請求項１から２４のいずれか１項に記載のタンパク質プロトマーアセンブリ上において高分子存在物アレイを支持するステップと、高分子存在物がその上に支持されている前記格子に対してＸ線結晶構造解析を行うステップとを含む、Ｘ線結晶構造解析を行う方法。
【請求項２４】
互いに融合している少なくとも２つのモノマーを含むプロトマーであって、前記モノマーがそれぞれ、３次元で反復している規則的な構造を有するタンパク質格子を有するタンパク質プロトマーアセンブリの反復単位の少なくとも一部を形成するための、自己集合可能なモノマーが集合してなるそれぞれのオリゴマーアセンブリのモノマーであり、前記プロトマー中、少なくとも第１のモノマーが３次元で対称的な第１のオリゴマーアセンブリのモノマーである、タンパク質プロトマー。
【請求項２５】
第１のオリゴマーアセンブリが３次元中に延びる１組の回転対称軸を有し、前記プロトマー中、前記第１のモノマーと融合しているさらなるモノマーが、前記第１のオリゴマーアセンブリの前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸と同じ位数の回転対称軸を有するそれぞれのさらなるオリゴマーアセンブリのモノマーであり、
それによって前記反復単位が、プロトマーの第１のモノマーが集合して前記第１のオリゴマーアセンブリとなり、かつ前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸に関して、それぞれの第１のモノマーと融合しているさらなるモノマーが集合して、前記それぞれのさらなるオリゴマーアセンブリの前記回転対称軸が前記第１のオリゴマーアセンブリのそれぞれの回転対称軸に沿って、それぞれのさらなるオリゴマーアセンブリとなるプロトマーを含む、請求項２４に記載のタンパク質プロトマー。
【請求項２６】
複数の異なるプロトマーのモノマーが互いに自己集合してタンパク質格子全体を形成することができる、複数の異なる請求項２４または２５に記載のタンパク質プロトマー。
【請求項２７】
請求項２４若しくは２５に記載のタンパク質プロトマー、または請求項２６に記載の複数の異なるタンパク質プロトマーのそれぞれのタンパク質プロトマーをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２４若しくは２５に記載のプロトマー、または請求項２６に記載の複数の異なるタンパク質プロトマーのそれぞれのタンパク質プロトマーを発現することができるベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
宿主細胞内でプロトマーをコードするポリヌクレオチドを発現させるステップを含む、請求項２４若しくは２５に記載のタンパク質プロトマー、または請求項２６に記載の複数の異なるタンパク質プロトマーのそれぞれのタンパク質プロトマーを作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３次元で反復している規則的な構造を有するタンパク質格子に関する。このタンパク質格子は、オリゴマーアセンブリのモノマーから自己集合可能な対称的なオリゴマーアセンブリに基づいている。このようなタンパク質格子は、ナノメートルから数百ナノメートル程度の大きさの孔（ｐｏｒｅ）を有することがある。したがって、タンパク質格子は、例えば、Ｘ線結晶構造解析においてマトリックスとして高分子存在物（ｅｎｔｉｔｙ）を支持するなど多くの潜在的な用途を有するナノ構造である。
【０００２】
ＷＯ−００／６８２４８は、自己集合することができる対称的なオリゴマーアセンブリに基づく規則的なタンパク質構造を開示している。特に、ＷＯ−００／６８２４８は、それぞれの対称的なオリゴマーアセンブリの各モノマーである少なくとも２つのモノマー（ＷＯ−００／６８２４８では「ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ」と称する）を含むタンパク質プロトマー（ＷＯ−００／６８２４８では「ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ」と称する）から形成される構造を開示している。オリゴマーアセンブリを形成するためのモノマーの自己集合が、規則的な構造自体の形成を引き起こす。離散構造、ならびに１、２および３次元中に広がる構造を含む、いくつかの異なるタイプの構造が開示されている。
【０００３】
ＷＯ−００／６８２４８では、プロトマー内でのモノマーの相対配向は、自己集合による所望の規則的構造をもたらすように選択される。モノマーは、プロトマー内でモノマーの必要な相対配向をもたらすように慎重に選択されたリジッドな結合基を介して互いに融合する。例えば、ＷＯ−００／６８２４８中で報告された実験的生成物では、プロトマーの選択は、連続的な、介在αへリックスセグメントの形の結合基によって結合したモノマーを徐々に長さを増加させることによってモデル化するコンピュータプログラムを用いることによって行われた。したがって、ＷＯ−００／６８２４８で示唆された、３次元で反復している規則的な構造を有する格子は、単一の回転軸について対称的であるそれぞれの二量体または三量体オリゴマーアセンブリの２つのモノマーを含むプロトマーから形成される。２つのモノマーの相対配向は、２つのオリゴマーアセンブリの回転対称軸間で特定の交差角をもたらすように選択される。したがって、２つのオリゴマーアセンブリの間で単一の融合が存在し、また、オリゴマーアセンブリの相対配向は、融合をもたらす結合基を慎重に選択することによって制御される。
【０００４】
ＷＯ−００／６８２４８は、離散的なケージおよび１次元で延びるフィラメントからなるタンパク構造の実験的生成物を報告しているだけである。ＷＯ−００／６８２４８の教示を３次元で反復するタンパク質格子に適用しようとすると、以下の難点にぶつかると予想される。第１に、格子の構築に適したプロトマー内でのモノマーの相対配向を選択する必要から生じる設計上の難点が存在すると予想される。これによって、タンパク質格子の形成に利用可能なオリゴマーアセンブリの種類がおそらく減少し、したがって適切なタンパク質を同定するのが困難となる。第２に、集合させる間に実際的な難点にぶつかると予想される。ＷＯ−００／６８２４８中で開示された構造は、オリゴマーアセンブリ間の単一の融合を形成するプロトマーにおけるモノマー間の融合の剛直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）に依存している。ＷＯ−００／６８２４８は、プロトマー内のモノマーの相対配向が、得られた構造内のオリゴマーアセンブリの相対配向を制御することを教示し、そのため、所望の相対配向から離れた融合の変動が自己集合の信頼性を低下すると予想される。このような問題は、反復単位のサイズが増大するにつれてより重大となり、したがって、孔のサイズが比較的大きな格子の確実な生成が実際上制限されると予想される。
【０００５】
したがって、この予想される問題を軽減することができる、異なるタイプの構造を有するタンパク質格子を提供することが望ましいと考えられる。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、３次元で反復している反復単位を含む規則的な構造を有するタンパク質格子が提供され、当該反復単位が、それぞれ少なくとも２つの融合しているモノマーを含む複数のタンパク質プロトマーを含み、当該モノマーがそれぞれ、当該プロトマーが集合して格子となるためにモノマーが集合してなるそれぞれのオリゴマーアセンブリのモノマーであり、当該反復単位が、３次元で対称的な第１のオリゴマーアセンブリのモノマーである少なくとも一つの第１のモノマーを含むプロトマーを含む。
【０００７】
３次元で対称的な、少なくとも１つの第１のオリゴマーアセンブリを使用した結果、反復単位の、さらにタンパク質格子の構造が、オリゴマーアセンブリの対称性から得られる。特に、これは、プロトマー内でのモノマーの相対配向に依存しない。したがって、少なくとも第１のオリゴマーアセンブリが３次元で反復する格子を構築するのに適した３次元対称性を有するオリゴマーアセンブリを選択することによって、本発明に係るタンパク質格子を設計することができる。それで、プロトマーは選択したオリゴマーアセンブリのモノマーが互いに融合する複数のモノマーを含むように形成される。続いて、プロトマーを適切な条件下で自己集合させる。後でより詳細に説明するように、選択されたオリゴマーアセンブリの対称性によって、プロトマーが自己集合してタンパク質格子が生じる。
【０００８】
理解を助けるために、後でより詳細に説明するような本発明の具体例であるタンパク質格子１を示す図１を参照されたい。特に、タンパク質格子１は、この例の中では８面体対称性を有するヒト重鎖フェリチンである、３次元で対称的な第１のオリゴマーアセンブリ３を含む反復単位を含む規則的な構造を有する。第１オリゴマーアセンブリ３の各モノマー５は、この例中では２面体上の点Ｄ４の群４に属する対称性を有するＥ．Ｃｏｌｉ  ＰｕｒＥである、さらなるオリゴマーアセンブリ４のさらなるモノマー６と融合する。さらなるモノマー６は、集合してさらなるオリゴマーアセンブリ４となり、そのアセンブリは、その４回回転対称軸が第１のオリゴマーアセンブリ３の４回回転対称軸に沿って並ぶように配置される。したがって、反復単位の、さらにタンパク質格子１の対称性は、後でより詳細に説明するように、１組の４回回転対称軸の対称性と同じである。
【０００９】
したがって、本発明は、ＷＯ−００／６８２４８中で使用されたものと異なるクラスのオリゴマーアセンブリを使用するものであり、プロトマー内でのモノマーの相対配向の選択によって制限されないという利点をもたらす。したがって、プロトマー内でのモノマーの相対配向がそれほど重要な制約にならないという点でタンパク質格子の設計の助けとなると予想される。それと同様に、以下で詳細に説明するように、タンパク質格子のより確実な集合が可能となると予想される。
【００１０】
本発明の他の態様によれば、このようなタンパク質格子を形成する自己集合が可能な単独なプロトマーまたは複数のプロトマー、このようなプロトマーをコードするポリヌクレオチド、このようなプロモーターを発現させることができるベクターおよび宿主細胞、ならびにこのプロトマーを作成する方法が提供される。
【００１１】
次に、非限定的な実施例によって、添付図面を参照しながら、本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
本発明に係るタンパク質格子は、少なくとも第１のオリゴマーアセンブリが３次元で対称的であり、互いに融合して３次元で反復することができる反復単位を生成する、オリゴマーアセンブリを選択することによって設計することができる。反復単位の、したがって格子全体の対称性は、オリゴマーアセンブリの対称性に依存するので、この方法では、適当な対称性をもたらす４次構造を有するオリゴマーアセンブリを選択する。オリゴマーアセンブリの対称性は一般に、タンパク質に関する科学文献中で、例えば、Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｚ．Ｆｅｎｇ，Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｔ．Ｎ．Ｂｈａｔ，Ｈ．Ｗｅｉｓｓｉｇ，Ｉ．Ｎ．Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ  ＆  Ｐ．Ｅ．Ｂｏｕｒｎｅ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８  ｐｐ．２３５−２４２（２０００）の、生体高分子の構造データの唯一の世界的なアーカイブであり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇなどのウェブサイトを介して利用することもできるタンパク質データバンク（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）から入手可能であるので、これは簡単な作業である。
【００１３】
ある種の格子では、反復単位は、格子全体にわたって同じ方向で反復する。他の格子では、２つ以上の隣り合った反復単位が一緒になって、格子全体にわたって同じ方向で反復する単位格子を形成するが、単位格子内でその反復単位は異なる方向で配置される。
【００１４】
３次元で反復する反復単位を有する格子を生成するオリゴマーアセンブリの例を以下に示す。
【００１５】
有利には、第１のオリゴマーアセンブリは、３次元中に延びる１組の回転対称軸を含む４次構造を有する。その結果、前記反復単位は、プロトマーの第１のモノマーが集合して第１のオリゴマーアセンブリとなり、かつ前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸に関して、それぞれの第１のモノマーと融合しているプロトマーのさらなるモノマーが前記１組の回転対称軸の前記それぞれの軸の周りに対称的に配置されている、プロトマーを含む。
【００１６】
したがって、反復単位の、したがって格子全体の配置は、第１のオリゴマーアセンブリの対称性に依存する。特に、集合した第１のオリゴマーアセンブリ中には、必然的にかつ定義上、第１のオリゴマーアセンブリの１組の回転対称軸の各軸の周りに対称的に配置された第１のモノマー群が存在する。これは、対称性が、同一のモノマーが回転対称軸の周りにこのように配置されていることから生じるからである。
【００１７】
さらなるモノマーが第１のそれぞれのモノマーとそれぞれ融合するので、さらなるモノマー群も１組の回転対称軸の各軸の周りに対称的に配置されることになる。さらなるモノマーは、第１のオリゴマーアセンブリ中の第１のモノマーに付着することにより、この対称的な配置に保持される。第１のオリゴマーアセンブリと融合している、対称的に配置されたさらなるモノマーからなるこれらの群は、他のモノマー（これは他の反復単位の対応するさらなるモノマーでもよく、同じ単位格子の異なる部分中にあるモノマーでもよい）と自己集合して、さらなるオリゴマーアセンブリを形成し、このアセンブリも、第１のオリゴマーアセンブリの１組の回転対称軸の周りに対称的に配置される。
【００１８】
したがって、反復単位の、したがって格子全体の配置は、第１のオリゴマーアセンブリの対称性に依存し、個々のプロトマー内でのモノマーの相対配向に依存しない。言い換えると、本発明は、タンパク質格子の３次元構造が、単にオリゴマーアセンブリの対称性に基づくだけでよいという利点を提供する。これは、タンパク質格子の設計上の利点を提供する。すなわち、反復単位の、したがって格子全体の設計は、オリゴマーアセンブリの対称性に基づくものでよい。これにより、タンパク質格子に使用する適当なオリゴマーアセンブリを選択することが容易となる。
【００１９】
望ましくは、第１のオリゴマーアセンブリは、３次元中に延びる１組の回転対称軸を含む４次構造を有し、前記プロトマー中で、前記第１のモノマーと融合しているさらなるモノマーは、前記第１のオリゴマーアセンブリの前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸と同じ位数の回転対称軸を有するそれぞれのさらなるオリゴマーアセンブリのモノマーである。その結果、前記反復単位は、プロトマーの第１のモノマーが集合して前記第１のオリゴマーアセンブリとなり、かつ前記１組の回転対称軸のそれぞれの軸に関して、それぞれの第１のモノマーと融合しているプロトマーのさらなるモノマーが集合して、前記それぞれのさらなるオリゴマーアセンブリの前記回転対称軸が前記第１のオリゴマーアセンブリのそれぞれの回転対称軸と並んだそれぞれのさらなるオリゴマーアセンブリとなる、プロトマーを含む。
【００２０】
したがって、反復単位の、したがって格子全体の配置は、第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリの対称性に依存する。特に、上記に記載のように、第１のオリゴマーアセンブリ中には、１組の回転対称軸の各軸の周りに対称的に配置された第１のモノマー群が存在し、その結果、第１のオリゴマーアセンブリの１組の回転対称軸の各軸の周りに同様に対称的に配置された、第１のモノマーと融合しているさらなるモノマー群が生じる。第１のオリゴマーアセンブリと融合している、対称的に配置されたさらなるモノマーのこの群は、他のモノマーと自己集合して、さらなるオリゴマーアセンブリを形成する。このさらなるモノマーは、他の反復単位のさらなるモノマーでもよく、同じ反復単位の異なる部分中にあるモノマーでもよい。
【００２１】
第１のオリゴマーアセンブリと融合しているさらなるモノマーが第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸の周りに対称的に配置されていると、融合しているさらなるモノマー群が第１のオリゴマーアセンブリのその回転対称軸の周りでやはり対称的に保持されるとともに、さらなるオリゴマーアセンブリが保持されることになる。しかし、必然的にかつ定義上、さらなるモノマーも、さらなるオリゴマーアセンブリ内で、さらなるオリゴマーアセンブリの回転対称軸の周りの対称的な配置で集合する。したがって、第１のオリゴマーアセンブリの１組の回転対称軸と同じ位数の回転対称軸を有するさらなるオリゴマーアセンブリが生じる結果、第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリが、その対称軸が互いに並んだ状態で集合する。オリゴマーアセンブリが両方とも対称性があることから、これは、最も安定した配置であることになる。これにより、第１とさらなるオリゴマーアセンブリの間にＮ重の融合が生じる。ここでＮは、第１のオリゴマーアセンブリのそれぞれの回転対称軸およびさらなるオリゴマーアセンブリの回転対称軸の位数に等しい複数である。第１のおよびさらなる各オリゴマーアセンブリ内では、Ｎ個のモノマーが回転対称軸の周りに配置され、各モノマーがそれぞれのプロトマー内で他方のオリゴマーアセンブリのモノマーと融合する。
【００２２】
したがって、１組の回転対称軸は、第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸をすべて含むわけではない。そうではなくて、この１組の回転対称軸は、さらなるオリゴマーアセンブリの回転対称軸と同じ位数の第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸を含む。例えば、図１の例では、さらなるオリゴマーアセンブリ４が４回回転対称軸を有するため、第１のオリゴマーアセンブリ３の１組の回転対称軸は、３回回転対称軸または２回回転対称軸ではなく、４回回転対称軸である。さらなる例を以下に示す。
【００２３】
第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリの対称性を特定のものに選択した結果、プロトマーが集合して格子となったとき、並んだこの回転対称軸を用いてオリゴマーアセンブリが構築される。このことは、反復単位の、したがって格子全体の配置が、個々のプロトマー内でのモノマーの相対配向ではなく、第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリの対称性によって制御されることを意味する。言い換えると、本発明は、タンパク質格子の３次元構造が、単にオリゴマーアセンブリの対称性に基づくものでもよいという利点を提供する。これは、タンパク質格子の設計において有利である。反復単位の、したがって格子全体の３次元構造をオリゴマーアセンブリの対称性に基づくものとすることにより、格子を形成するのに適したオリゴマーアセンブリを選択することが容易となる。設計中、集合しない形での個々のプロトマー内でのモノマーの相対配向は、例えばＷＯ−００／６８２４８の場合より制約がはるかに小さくなる。
【００２４】
格子の自己集合中に利益が得られることも予想される。特に、２つの所与のオリゴマーアセンブリ間でＮ重の融合が形成されると、その２つのオリゴマーアセンブリ間の結合は相対的に堅くなる。このことから、集合プロセス中、オリゴマーアセンブリの相対運動が小さくなると予想される。このことは、オリゴマーアセンブリが正しい相対位置にある格子を確実に形成する際の助けとなると予想される。
【００２５】
第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸と同じ位数の回転対称軸を有するさらなるオリゴマーアセンブリを使用する際に特定の利点は存在するが、これは必須ではない。あるいは、第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸の周りに対称的に配置されたさらなるモノマーが、別個のオリゴマーアセンブリの、例えばダイマーのオリゴマーアセンブリ（ヘテロまたはホモ）のモノマーであることも可能であるはずである。この場合、さらなるオリゴマーアセンブリは、第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸と位数が同じである別個のダイマーのオリゴマーアセンブリ群で有効に置き換えられ、別個のダイマーのオリゴマーアセンブリは、第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸のＮ回対称性を有してもよく有さなくてもよい配置で、第１のオリゴマーアセンブリの回転対称軸の周りに保持されることになる。
【００２６】
プロトマーの形態および生成を次に説明する。本発明が、ＷＯ−００／６８２４８と異なるモノマーの選択物が互いに融合しているプロトマーを使用する以外、プロトマー自体の形態および生成、ならびにプロトマーをコードするポリヌクレオチドは、ＷＯ−００／６８２４８中で開示されているものと同じでもよく、したがってこれを参照により本明細書に組み込む。
【００２７】
モノマー自体の性質を次に説明する。
【００２８】
このモノマーは、適当な条件下で自己集合してタンパク質格子を生成することができる、オリゴマーアセンブリのモノマーである。モノマーが集合して必要な対称性を有する４次構造となる場合、その２次および３次構造はそれ自体重要でない。しかし、異種発現系（例えばＥ．Ｃｏｌｉ中でプラスミド発現ベクターを用いる系）中で、このタンパク質が容易に発現され折り畳まれるなら有利である。
【００２９】
モノマーは、天然に存在するタンパク質でもよく、各モノマーが集合してそれぞれのオリゴマーアセンブリとなるのにほとんど影響を与えないという条件で、天然に存在するタンパク質からペプチド成分を欠如させる、そのタンパク質中でペプチド成分を置き換える、またはそのタンパク質にペプチド成分を加えることによって修飾されていてもよい。本発明のモノマーに適用することができる、異なるいくつかの目的によるそのような修飾は、それ自体周知である。言い換えると、このモノマーは、天然に存在するタンパク質の相同体および／または断片および／または融合タンパク質である。
【００３０】
このモノマーは、化学修飾されているもの、例えば翻訳後に修飾されているものでもよい。例えば、これは糖鎖付加されていてもよく、修飾されたアミノ酸残基を含むものでもよい。
【００３１】
原理上、化学的融合など他の融合も可能であるが、このモノマーは、遺伝子上で融合しているものが好ましい。
【００３２】
このモノマーは互いに直接融合することができるが、好ましくは、このモノマーは、ペプチドまたは非ペプチド成分からなる結合基によって融合する。一般に、結合基によって２つのタンパク質を結合させるステップは、他の目的によるものについて周知であり、このような結合基は、本発明に適用することができる。
【００３３】
適当なオリゴマーアセンブリを選択する際の他のファクターは、（ａ）その自然形態で（すなわちさらなるオリゴマーアセンブリと融合せずに）第１のオリゴマーアセンブリ中に配置されるときの第１のモノマーの末端、および（ｂ）その自然形態で（すなわち第１のオリゴマーアセンブリと融合せずに）さらなるオリゴマーアセンブリ中に配置されるときのさらなるモノマーの末端の位置および方向である。一般に、その自然形態におけるオリゴマーアセンブリ中での末端の配置に関するこのような情報は、例えば上記に示したタンパク質データバンクにあるオリゴマーアセンブリでは入手可能である。集合したタンパク質格子内でこれらの末端が互いに融合して、回転対称軸の周りに対称的に配置されたＮ重の融合を構成することになるので、理想的には、これらの末端は、同じ分離間隔および向きを有するべきである。そうではあるが、Ｎ重の融合の近くにあるモノマーを変形させ、かつ／または結合基を使用することによってどんな違いも調節することができるので、同様に区切られ同方向に向いていることは不可欠ではない。したがって、一般に、Ｎ重の融合において互いに融合することになる両方のオリゴマーアセンブリの末端が、オリゴマーアセンブリの、したがってタンパク質格子の集合を妨げずに融合することが可能なオリゴマーアセンブリを選択すべきである。
【００３４】
上記で述べたＮ重の融合の近くでモノマーが変形することを考慮すると、集合プロセスの信頼性を低下させる傾向があるそのような変形を最小限にすることが望ましい。しかし、モノマー間に結合基が融合している場合、少なくとも部分的に、結合基自体がこのような変形を行うことができる。そのためモノマーの変形が少なくなり、それによって自己集合の信頼性が増大する。結合基が、天然に存在するタンパク質の一部でないことから、集合プロセスに関与しないからである。結合基を使用すると、特定の利点が得られる。
【００３５】
さらに、結合基は、第１およびさらなるモノマーの末端の位置および／または方向のそのような違いを小さくするために、集合させる前に、その自然形態でのプロトマー内における第１のおよびさらなるモノマーに対して配向するように、特に設計することができる。上記で論じたように、オリゴマーアセンブリについて一般に利用可能である、その自然形態での第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリ内における第１のおよびさらなるモノマーの末端の位置および方向を使用すると、従来のモデル化技術を用いて適当な結合基を設計することが可能である。
【００３６】
通常、モノマーはその末端で融合する。あるいは、モノマーは、天然に存在するオリゴマーアセンブリの天然の折り畳みおよび対称性が依然として同じである限り、ポリペプチド鎖中の代替位置で融合することもできる。例えば、モノマーの一方を、他方のモノマーの構造的に寛容な部分、例えばオリゴマーアセンブリから延びているループの中に挿入することができる。また、モノマーの切断も実現可能であり、構造の検討によってそれを推定することができる。
【００３７】
タンパク質格子を生成するオリゴマーアセンブリの対称性のいくつかの例を挙げると、以下の通りである。
【００３８】
この例では、３次元で対称的な第１のオリゴマーアセンブリは、４面体点群、８面体点群、または２面体点群に属する。
【００３９】
タンパク質格子のクラスによっては、プロトマーは、モノマーに関して相同であり、すなわちタンパク質格子内に単一のタイプのプロトマーしか存在しない。例えば、表１に、タンパク質格子を形成することができるいくつかの単一のホモプロトマーを表す。
【００４０】
【表１】
0004488895.tif 000002
【００４１】
表１では、各プロトマーを、そのプロトマーのそれぞれのモノマーを表す文字で示す。具体的には、この文字は、そのモノマーのオリゴマーアセンブリが属する点群を示す。各文字について、下付きの数字は、その点群の位数を表す。文字ｐは、プラトン立体上の点群を表し、したがってｐ３は４面体点群を表し、ｐ４は８面体点群を表す。文字ｄは２面体点群を表す。
【００４２】
表の最後の２列中に、第１のオリゴマーアセンブリ内の第１のモノマーの数Ｍ、および第１のオリゴマーアセンブリの１組の回転対称軸の位数Ｎを示す。Ｎは、第１のオリゴマーアセンブリのそれぞれの回転対称軸と並んださらなるオリゴマーアセンブリの回転対称軸の位数でもあり、その軸の周りで第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリ間のＮ重の融合が形成される。
【００４３】
プロトマーは、参照の便宜上、タンパク質のモノマーの性質に従って名付けられたクラスに分けられる。
【００４４】
プラトン立体クラスおよび混合クラスでは、第１のオリゴマーアセンブリはどちらも、４面体点群または８面体点群である、プラトン立体上の点群に属する。
【００４５】
混合クラスでは、さらなるモノマーは、２面体点群に属するオリゴマーアセンブリのモノマーである。各場合において、２面体点群の位数Ｎは、２面体点群の主要な回転対称軸の位数であり、第１のオリゴマーアセンブリの１つの回転対称軸の位数に等しい。これは、第１のオリゴマーアセンブリの主要な回転対称軸でもよく、第１のオリゴマーアセンブリの位数の低い回転対称軸の１つでもよい。したがって、第１オリゴマーアセンブリのＮ回回転対称軸が、第１オリゴマーアセンブリの１組の回転対称軸を構成する。第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリの対称性によって、２面体点群に属するさらなる各オリゴマーアセンブリの主要な回転対称軸が、プラトン立体上の点群の１組のＮ回回転対称軸の１つと並び、上記に記載のようにその間にＮ重の融合が生じる単位格子が形成される。
【００４６】
混合クラスのタンパク質格子は、視覚化するのが最も容易である。特に、プラトン立体のある点群に属する第１のオリゴマーアセンブリは、１組のＮ回回転対称軸がそこから外側へ延びている節として視覚化することができる。２面体点群は、２面体点群の主要な回転対称軸が第１のオリゴマーアセンブリの１組のＮ回回転対称軸の１つと並んだ直線の結合部として視覚化することができる。このように、オリゴマーアセンブリ間のそれぞれの空間に孔を有する格子の形成を視覚化することは容易である。
【００４７】
図１に、混合クラスに属し、特にｐ４ｄ４で表されるプロトマー２を有するタンパク質格子１の具体例を示す。第１のオリゴマーアセンブリ３は、ヒトフェリチン重鎖（ＨＦＨ）であり、８面体点群に属する。さらなるオリゴマーアセンブリは、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＰｕｒＥであり、位数４の２面体上の点Ｄ４の群に属する。このプロトマーは、互いに融合している、第１のオリゴマーアセンブリ３の第１のモノマー５、およびさらなるオリゴマーアセンブリ４のさらなるモノマー６を含む。集合後、プロトマー２は、例えば、第１のオリゴマーアセンブリ３の１つ、ならびに第１のオリゴマーアセンブリ１の第１のモノマー５と融合しているさらなるモノマー６によって形成される、格子１を形成する。この格子中の隣り合った第２のオリゴマーアセンブリ４の各半分を（単位格子でもある）反復単位とみなすことができる。第１のオリゴマーアセンブリ３およびさらなるオリゴマーアセンブリ４の対称性に基づくタンパク質格子１の対称性は、図１から明らかに認められる。特に、さらなるオリゴマーアセンブリ４の４回回転対称軸が第１のオリゴマーアセンブリ３の１組の４回回転対称軸と並んでいるので、格子の対称性は、この１組の回転対称軸の対称性と同じとなる。
【００４８】
プラトン立体クラスでは、さらなるオリゴマーアセンブリは、第１のオリゴマーアセンブリと同様にプラトン立体上の点群に属する。
【００４９】
プロトマーが同じ位数のプラトン立体上の点群に属する第１の２つのタンパク質格子中では、第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリは同一でもよく、この場合第１のおよびさらなるモノマーも同一であり、あるいは、同一の点群に属する異なるオリゴマーアセンブリでもよい。Ｎ重の融合がその周りに形成されている１組のＮ回回転対称軸が、２つのオリゴマーアセンブリの主要な回転対称軸である。
【００５０】
第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリがそれぞれ４面体および８面体点群に属する（またはその逆である）プラトン立体クラスの第３のタンパク質格子では、Ｎ重の融合がその周りで行われるＮ回回転対称軸は、２つのオリゴマーアセンブリの３回回転対称軸である。この場合、これらのオリゴマーアセンブリのどちらかを、第１のオリゴマーアセンブリとみなすことができる。４面体点群に属するオリゴマーアセンブリを第１のオリゴマーアセンブリとみなす場合、１組の回転対称軸は主要な回転対称軸である。８面体点群に属するオリゴマーアセンブリを第１のオリゴマーアセンブリとみなす場合、１組の回転対称軸は１組の３回回転対称軸である。それが４面体点群に属するさらなるオリゴマーアセンブリの回転対称軸の位数だからである。
【００５１】
各オリゴマーアセンブリを、１組のＮ回回転対称軸がそこから外側へ延び、他方のタイプのオリゴマーアセンブリの回転対称軸と結合する節とみなすことによって、プラトン立体クラスを視覚化することができる。
【００５２】
最後に、２面体クラスでは、プロトマーは、２面体点群に属する３つのモノマーすべてを含む。位数３、４または６の２面体点群に属する第１のオリゴマーアセンブリの第１のモノマーを中心的なモノマーとみなすことができる。第１のオリゴマーアセンブリの各末端と融合しているモノマーを、それぞれさらなるモノマーとみなすことができる。さらなるモノマーの１つは、第１のオリゴマーアセンブリの２面体点群と同じ位数の２面体点群に属するさらなるオリゴマーアセンブリのモノマーである。したがって、第１のオリゴマーアセンブリおよびさらなるオリゴマーアセンブリが対称性を有する結果、両方のオリゴマーアセンブリの主要な回転対称軸（すなわち、２面体点群と同じ位数の回転対称軸）が並んでいる反復単位が形成される。したがって、タンパク質格子中で、これらのオリゴマーアセンブリは、第１のおよびさらなるオリゴマーアセンブリがそれに沿って交互に配置される列として配置される。
【００５３】
その他のさらなるモノマーは、位数２の２面体点群に属するオリゴマーアセンブリのモノマーであり、そのため、第１のオリゴマーアセンブリの２回回転対称軸に等しい２回回転対称軸を有する。第１のオリゴマーアセンブリのこのような回転対称軸は、第１のオリゴマーアセンブリが属する２面体点群と位数が等しく、２面体点群の主要な回転対称軸に対して垂直に延び、その主要な回転対称軸の周りに対称的に配置される。したがって、位数２の２面体点群に属するさらなるオリゴマーアセンブリは、その主要な回転対称軸が第１のオリゴマーアセンブリの今説明した２回回転対称軸と並んで、集合したタンパク質格子中に配置される。後者の回転対称軸は第１のオリゴマーアセンブリの主要な回転対称軸に対して垂直に延びているので、位数２の２面体点群に属するさらなるオリゴマーアセンブリは、上記に記載のオリゴマーアセンブリの列の間の結合部とみなすことができる。
【００５４】
言い換えると、第１のオリゴマーアセンブリのこの１組の回転対称軸は、位数３、４または６の主要な回転対称軸、ならびにこの主要な回転対称軸に対して垂直な２回回転対称軸を含む。
【００５５】
タンパク質格子の他のクラスでは、そのプロトマーはそのモノマーに関してヘテロであり、すなわち、そのタンパク質格子内に２つ以上のタイプのプロトマーが存在する。２つのタイプのプロトマーがどんなものでもそれを集合させるために、２つのタイプのプロトマーは、同じヘテロオリゴマーアセンブリの異なるモノマーを含む。したがって、異なるタイプのプロトマーを集合させるとき、ヘテロオリゴマーアセンブリが集合し、それによって２つのタイプのプロトマーが結合する。しかし、ホモプロトマーと異なり、単一タイプのプロトマーがそれ自体で集合して、タンパク質格子全体となることができない。ヘテロオリゴマーアセンブリの個々のモノマーは、ヘテロオリゴマーアセンブリの他の異なるモノマーが存在しない場合、自己集合してこのヘテロアセンブリ全体となることができない。このことは、タンパク質格子を製造する際に利点を提供する。普通ならプロトマーの生成に支障をきたす恐れのあるタンパク質格子全体の集合を行わずに、各タイプのプロトマーを別々に生成することができるからである。このことにより、２段階のプロセスでの生成が可能となるが、このことを後でより詳細に説明する。
【００５６】
好ましくは、ヘテロオリゴマーアセンブリは、環状点群に属する。この場合、ヘテロオリゴマーアセンブリは、集合した格子内でＮ重の融合により第１のオリゴマーアセンブリと融合するさらなるオリゴマーアセンブリを構成することができる。
【００５７】
最も単純なタイプのタンパク質格子では、ヘテロプロトマーは、それぞれさらに、ホモオリゴマーアセンブリのモノマーを含み、このアセンブリは第１のオリゴマーアセンブリでよい。個々のタイプのプロトマーは、ホモオリゴマーアセンブリのモノマーが自己集合した結果、集合して単位格子のそれぞれ別々の成分となることができる。この成分が一緒にされるまで格子の集合が回避できるので、これはヘテロプロトマーの利点である。そうでなければ、格子の集合により、プロトマー自体の生成が妨害される恐れがある。
【００５８】
例えば、表２は、タンパク質格子を形成することができるいくつかの単純なヘテロプロトマーを表す。
【００５９】
【表２】
0004488895.tif 000003
【００６０】
表２では、タンパク質格子が第１列に示した２つのタイプのプロトマーから形成されるように、環状点群に属する単一のヘテロオリゴマーアセンブリのモノマーを使用する。各プロトマーは、ヘテロオリゴマーアセンブリのモノマーの１つを含む。
【００６１】
表２では、各プロトマーのモノマーを表１の場合と同様に小文字で示す。小文字ｐおよびｄは表１の場合と同じ意味である。さらに、小文字ｃは、環状点群に属するヘテロオリゴマーアセンブリのモノマーを表す。下付きの数字はやはり、点群の位数を表す。下付きの大文字ＡおよびＡ＊を使用して、同じヘテロアセンブリの２つの異なるモノマーを示す。
【００６２】
表２では、第２列に、各タイプのプロトマーの集合から得られる成分が属する点群を示す。大文字を使用して成分の点群を指していることを示す点以外は、同様の表記をプロトマーのモノマーに関しても使用する。したがって、大文字Ｐは、その成分がプラトン立体上の点群に属することを示し、したがってＰ３は４面体点群を表し、Ｐ４は８面体点群を表す。大文字Ｄは、その成分が２面体点群に属することを示す。表１と同様に、該当する場合、各プロトマーに関して、第１のオリゴマーアセンブリ内のモノマーの数Ｍ、およびさらなるオリゴマーアセンブリの回転対称軸と並んでいる、第１のオリゴマーアセンブリの１組の回転対称軸の位数Ｎを最後の列に示す。
【００６３】
参照の便宜上、ホモプロトマーから形成されるタンパク質格子の分類と同様に、タンパク質格子をその成分の対称性に基づくクラスに分類する。各場合において、ヘテロプロトマーは、表１における対応するホモプロトマークラスに属するプロトマーに由来するものでよい。
【００６４】
混合クラスおよびプラトン立体クラスでは、２つのタイプのプロトマーはどちらも、
（ａ）対応するホモプロトマーのモノマーのそれぞれと同じ点群に属するホモオリゴマーアセンブリのモノマーと、
（ｂ）環状点群に属するヘテロオリゴマーアセンブリのそれぞれの２つの異なるモノマーであるモノマーとを含む。
【００６５】
ヘテロオリゴマーアセンブリが属する、環状点群の位数は、対応するホモプロトマーから形成されるタンパク質格子のオリゴマーアセンブリ間にあるＮ重の融合の次数Ｎと同じであり、これは、第１のオリゴマーアセンブリのそれぞれの回転対称軸の位数である。
【００６６】
したがって、以下の場合以外、集合したタンパク質格子内で、反復単位は、基本的にその対応するホモプロトマーの反復単位と同じ配置となる。ホモプロトマーの２つのホモオリゴマーアセンブリ間にあるＮ重の融合の代わりに、ホモオリゴマーアセンブリ間の結合部が、ヘテロオリゴマーアセンブリの挿入によって延びている。したがって、ヘテロオリゴマーアセンブリの反復単位が、第１のオリゴマーアセンブリ間の反復単位の結合部の長さ分有効に延びていることが認められることになり、このことは、このタンパク質格子の留意点とみなすことができる。したがって、このタンパク質格子内での孔のサイズも、対応するホモプロトマーを使用するのと比べて増大する。このように孔のサイズが増大することは、ヘテロプロトマーを使用するとかなりの利点が得られることを表している。
【００６７】
図２に、混合クラスに属し、特にそれぞれｐ３ｃ３Ａおよびｄ３ｃ３Ａ＊で表されるそれぞれのプロトマー８および９を有するタンパク質格子７の具体例を示す。第１プロトマー８は、第１のホモオリゴマーアセンブリ１１の第１のモノマー１０を含み、このモノマーはすなわちＥ．  Ｃｏｌｉ  ｄｐｓであり、４面体点群に属する。さらなるヘテロオリゴマーアセンブリ１３のさらなるモノマー１２は、第１プロトマー８内にある第１のモノマー１０と融合し、このモノマーはすなわちバクテリオファージＴ４  ｇｐ５およびｇｐ２７であり、位数３の環状点群に属する。集合後、第１プロトマー８は、第１のモノマー１０が互いに集合することによって、第１成分１４を形成する。第１成分１４は、第１プロトマー８の第１のオリゴマーアセンブリ１１と同じ対称性を有する。
【００６８】
第２のプロトマー９は、モノマー１５を含み、このモノマーは、第１プロトマー８のさらなるモノマー１２と異なる種類の、第１プロトマー８のさらなるオリゴマー１３の他方のモノマーである。第２プロトマー９はまた、ホモオリゴマーアセンブリ１７のモノマーであるモノマー１６を含み、このモノマーはすなわちヒトＰＴＰＳであり、位数３の２面体上の点Ｄ３の群に属する。集合後、第２プロトマー９は、ホモモノマー１６が互いに集合することによって、第２成分１８を形成する。
【００６９】
第１および第２成分１４および１８を一緒にしたとき、ヘテロオリゴマーアセンブリ１３が集合することにより、これらは集合してタンパク質格子７を形成する。タンパク質格子７の対称性が、ホモオリゴマーアセンブリ１１および１７のホモにどのように基づいているかが、図２から明らかに認められる。特に、第２プロトマー９のヘテロオリゴマーアセンブリ１３とホモオリゴマーアセンブリ１７の３回回転対称軸はどちらも、第１プロトマー８の第１のオリゴマーアセンブリ１１の１組の３回回転対称軸と並んでいる。ヘテロオリゴマーアセンブリ１３のせいでどのように第１のオリゴマーアセンブリ１１間の結合部の長さが実際に延びているかは、図２からさらに明らかである。格子７中で、例えば、第１成分１４の１つ、および隣接する各第２成分１８の半分を反復単位とみなすことができる。この場合、単位格子は、多数のこのような反復単位が互いに結合することによって形成される。
【００７０】
２面体クラスのヘテロプロトマーは、２面体クラスの対応するホモプロトマーに由来するものでよい３つのモノマーを含んでいるプロトマーを含む。特に、２つのタイプのプロトマーは、対応するホモプロトマーのさらなるモノマーのどちらかが（またはどちらも）、置き換えられるモノマーのオリゴマーアセンブリが属する２面体点群と同じ位数の環状点群に属するヘテロオリゴマーアセンブリのそれぞれのモノマーで置き換えられた、対応するホモプロトマーを含む。
【００７１】
タンパク質格子の上記の例は、タンパク質格子を形成することができる最も単純な形のプロトマーを表すと思われ、その理由で好ましい。しかし、適当な対称性を有するオリゴマーアセンブリのモノマーから形成された他のプロトマーもタンパク質格子を形成することができることが理解されるであろう。例えば、表１に列挙したより多数のモノマーを有する他のホモプロトマーも、タンパク質格子を形成することができる。それと同様に、他のヘテロプロトマーも、タンパク質格子を形成することができる。これは、表２の例より多数のモノマーを有する２つのタイプのプロトマーを含んでもよく、２つより多いタイプのプロトマーを含んでもよい。
【００７２】
各モノマーについて、必要な対称性を有するオリゴマーアセンブリの広い選択肢が存在する。原理上、必要な対称性を示す４次構造を有するどんなオリゴマーアセンブリも使用することができるので、本発明は、特定のオリゴマーアセンブリに限られるものではない。しかし、例として、表１および２の点群に関するオリゴマーアセンブリのいくつかの可能な選択肢を表３に列挙する。
【００７３】
【表３】
0004488895.tif 000004
【００７４】
したがって、本発明は、集合してタンパク質格子となることができる１つまたは複数のタンパク質プロトマーを提供する。プロトマーのモノマーは、どんな長さでもよいが、通常、長さ５〜１０００アミノ酸であり、好ましくは、少なくとも２０アミノ酸および／または多くとも５００アミノ酸である。
【００７５】
本発明はまた、本発明のタンパク質プロトマーをコードするポリヌクレオチドをも提供する。ポリヌクレオチドは通常、コード配列の５および／または３末端より先の追加の配列を含む。ポリヌクレオチドの長さは通常、コードされるプロトマーの長さの少なくとも３倍である。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡでもよく、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含めたＤＮＡでもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、メチルスルホン酸およびホスホロチオエートの骨格、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリシン鎖の付加など、合成または修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００７７】
このようなポリヌクレオチドは、標準的な技術を用いて、生成し使用することができる。例えば、ＷＯ−００／６８２４８中で核酸およびその使用についてなされた解説が、本発明のポリヌクレオチドにも同様に適用される。
【００７８】
モノマーは通常、遺伝子レベルでそれぞれの遺伝子を融合させることにより（例えば、５’側の遺伝子の終止コドンを除去し、３’側の遺伝子へとフレームを合わせて読み取らせることにより）結合されてプロトマーとなる。この場合、組換え遺伝子を単一ポリペプチドとして発現させる。あるいは、これらの遺伝子は、オリゴマーアセンブリが有する４次構造がほとんど影響を受けないままである限り、その末端以外の位置で融合させてもよい。具体的には、１つの遺伝子を第２の遺伝子の構造的に寛容な領域内に挿入して、フレームが合った融合を生じさせる。
【００７９】
遺伝子レベルでの融合の代替方法としてポリペプチド鎖の化学的融合を使用することもできる。この場合、共有結合によって、ただし特にインテイン化学融合の利用によってポリペプチドを翻訳後に融合させる。
【００８０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のタンパク質プロトマーを発現させることができる発現ベクターをも提供する。このようなベクターは、例えば、タンパク質を発現させるために正しい向きに置かれた、適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、および必要となる可能性があるポリアデニル化シグナルなど他の成分も含むことができる。
【００８１】
したがって、ベクター内のコード配列は、（通常、細胞内で）コード配列の発現をもたらすように、そのような成分と作動的に連結している。「作動的に連結」という用語は、記載の成分がそれぞれ、その意図されたように機能することができる位置関係にあるような並び方を指す。
【００８２】
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターでもよい。通常、ベクターは複製起点を有する。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子、酵母（ｆｕｎｇａｌ）ベクターの場合の耐性遺伝子を含むことができる。
【００８３】
プロモーターおよび他の発現制御シグナルは、発現が設計される宿主細胞に適合するものを選択することができる。例えば、酵母プロモーターには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターがある。哺乳動物プロモーターには、カドミウムなどの重金属に反応して誘発することができるメタロチオネインプロモーターがある。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、アデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターも使用することができる。
【００８４】
β−アクチンプロモーターなどの哺乳動物プロモーターも使用することができる。組織特異的プロモーターが特に好ましい。ウイルスプロモーター、例えば、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルス末端長反復配列（ＭＭＴＶ  ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、（ＨＳＶ  ＩＥプロモーターなどの）ＨＳＶプロモーター、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流制御領域（ＵＲＲ）も使用することができる。
【００８５】
タンパク質プロトマーの発現に使用することができる他の方法は、例えば、細菌、酵母または哺乳動物の無細胞発現である。
【００８６】
本発明はまた、本発明のプロトマーを発現するように改変された細胞をも含む。このような細胞には、哺乳動物細胞、または例えばバキュロウイルス発現システムを用いる昆虫細胞などの一時的なもしくは好ましくは安定な高等真核細胞系統、酵母などの下等真核細胞、あるいは細菌細胞などの原核細胞が含まれる。本発明に係るポリペプチドをコードするベクターの挿入によって改変することができる細胞の具体例には、哺乳動物のＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＣＯＳ細胞がある。好ましくは、選択された細胞系統は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟した糖鎖付加も可能なものである。形質転換卵母細胞中で発現を行うことができる。
【００８７】
本発明のタンパク質プロトマー、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は、実質的に分離した形で存在してもよい。これはまた、実質的に精製された形であってもよく、この場合、これは一般に、タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞または乾燥調製物を少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％または９９％含む。
【００８８】
プロトマーは、ベクターおよび宿主細胞を使用し、標準的な技術を使用して調製することができる。例えば、プロトマーを調製する方法に関してＷＯ−００／６８２４８中でなされた解説（ＷＯ−００／６８２４８中で「融合タンパク質」として示されている）が、本発明に係るプロトマーの調製にも同様に適用される。
【００８９】
プロトマーからタンパク質格子への集合は、オリゴマーアセンブリのモノマーの自己集合に適した条件下にプロトマーを単に置くだけで行うことができる。通常は、溶液中、好ましくは水溶液中にプロトマーを入れることによってこれを行う。通常、適当な条件は、天然に存在するタンパク質が自然に自己集合する条件に相当する。適当な条件は、ＷＯ−００／６８２４８中に具体的に開示されているものでよい。
【００９０】
ホモプロトマーの場合、その結果、タンパク質格子が直接集合する。
【００９１】
ヘテロプロトマーの場合、好ましくは、集合を複数の段階で行う。第１段階で、各タイプのプロトマーを別々に集合させてそれぞれ別々の成分を生成する。第２段階で、別々の成分を一緒にし、集合させてタンパク質格子を生成する。複数のヘテロプロトマーを使用する場合、それぞれ別々の成分を一緒にし、集合させて、より大きな中間成分を生成する、さらなる段階が第１段階と第２段階の中間に存在してもよい。
【００９２】
図１で示した特定のタイプのタンパク質格子は、以下の方法を用いて調製された。
【００９３】
ヒトフェリチン重鎖（ＨＦＨ）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＰｕｒＥ遺伝子を、それぞれヒトｃＤＮＡおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｇＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。フェリチン遺伝子の増幅用プライマーは、５’−ＣＣＴＴＡＧＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣ−３’、および５’−ＧＧＧＡＡＡＴＴＡＧＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣ−３’であった。ＰｕｒＥ遺伝子の増幅用プライマーは、５’−ＧＴＴＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＧＣＡＡＴＡＡＴＣＣＧ−３’、および５’−ＣＧＣＡＡＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＣＣＴＣＧＣＧＧ−３’であった。ＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間で、ｐＥＴ−２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にＰｕｒＥ遺伝子をクローン化した。ＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位の間で、得られたベクター中にＨＦＨ遺伝子をクローン化して、Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下にある、フレームを合わせた２つの遺伝子の融合体を作成した。
【００９４】
発現用Ｅ．  ｃｏｌｉ株Ｂ８３４（ｐＬｙｓＳ）をこのベクターで形質転換した。以下の通りに発現を誘導した。（３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中の）発現株の一晩培養物１０ｍｌを、３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む新鮮ＬＢ培地で１：１００で希釈した。ＯＤ６０００．６に相当する密度まで３７℃で振盪して細胞を増殖させ、次いで、終濃度１ｍＭになるまでＩＰＴＧを加えることにより、標的タンパク質の発現を誘導した。３７℃で振盪しながら培養をさらに３時間維持した後、遠心分離（５０００ｇ、１０分、４℃）によって細胞を回収した。細胞ペレットをバッファーＡ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）２０ｍｌ中に再懸濁させた。超音波処理によって細胞を溶解させ、遠心分離（２５，０００ｇ、３０分、４℃）によって不溶性分画を回収した。この分画を８Ｍの尿素中に溶解させ、遠心分離（２５，０００ｇ、３０分、４℃）して、不溶性の粒子を除去した。尿素に可溶性の物質を、１６ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２２μｍのフィルターを通過させた。次いで、この物質の液滴（１μｌ）をバッファーＡのより大きな液滴（５μｌ）中に直接注入した。タンパク質格子粒子が１時間以内に観察された。図３は、直径約０．６ｍｍである１つのタンパク質格子粒子の写真である。μＰＩＸＥ技術を用いて、タンパク質格子の元素組成を限定した。
【００９５】
本発明に係るタンパク質格子は、多くの異なる使用法を有する。一般に、そのような使用は、格子内の規則的な反復構造および孔を利用するものである。本発明に係る格子は、数ナノメートルから数百ナノメートル程度と予想される大きさの孔を有するように設計することができる。所望の使用に適した孔のサイズで、格子を設計することができる。
【００９６】
タンパク質格子の、非常に明確で、異常な大きさで、精密に制御された孔のサイズ、ならびにその格子構造の安定性は、今述べた範囲の孔のサイズを有する微孔性物質を必要とする適用分野に理想的である。一例として、これらの格子は、濾過または分離プロセスに関するフィルター成分または分子篩として有用であると予想される。この使用の場合、孔のサイズが実現可能であり、孔のサイズを設計できるなら、特に有利であるはずである。
【００９７】
他のクラスの使用法では、高分子存在物をタンパク質格子に付着させる。従来技術を用いて、そのような付着を行うことができる。高分子存在物は、例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド、非生体性の物体など適当なサイズのどんな物体でもよい。そのようなものとして、タンパク質格子は、高分子存在物を運搬するための、例えば、薬物送達に使用するための、または高分子存在物を結晶化させるための生体マトリックスとして有用であると予想される。
【００９８】
タンパク質格子への高分子存在物の付着は、タンパク質プロトマーまたは対象の高分子存在物、あるいはその両方を「タグ付け」することによって行うことができる。ここにおいて、タグ付けとは、タンパク質プロトマーまたは標的の高分子存在物あるいはその両方に、標的構造と強い相互作用が生じる、タグとして知られる構造を共有結合で付加させることである。標的構造は、他のタンパク質プロトマーまたは標的高分子存在物に付着したさらなるタグでもよく、またタンパク質プロトマーまたは標的高分子存在物の一部でもよい。タンパク質プロトマー、またはタンパク質である高分子存在物の場合、これは、例えばその末端の一方に、またはループ領域中に、タグを構成するペプチド成分の追加配列を運搬するように遺伝子改変されたタンパク質を発現させることによって達成することができる。タグを付加する代替方法には、インテイン技術などの技術による、発現後のタンパク質の共有結合による修飾がある。
【００９９】
したがって、高分子存在物をタンパク質格子に付着させるために、タンパク質プロトマーは、プロトマーの所定の位置に、対象となる高分子存在物に付着する親和性タグを含んでもよい。
【０１００】
あるいは、対象の高分子存在物が、プロトマー内の所定の位置に、高分子存在物に付着する親和性タグを有していてもよい。
【０１０１】
タンパク質格子の成分が既知のペプチド配列と強く相互作用することが知られているとき、そのペプチド配列をタグとして使用して、標的高分子存在物に付加することができる。そのような堅い結合相手が知られていない場合は、スクリーニングによって、適当なタグを同定することができる。可能なスクリーニングのタイプは、ファージディスプレイ技術、または多数の異なる短い（例えば３〜５０アミノ酸）ペプチドを生成する重複化学物質ライブラリーによる手法である。標準的な技術、例えばファージディスプレイを行ったライブラリーの場合は増幅および配列決定を用いて、あるいは重複ライブラリーの場合はペプチドスクリーニングによって、最も堅い結合ペプチド成分を同定することができる。
【０１０２】
格子上、または高分子存在物上の親和性タグを用いて、高分子存在物をタンパク質格子に付着させるために、例えば、結合させる高分子存在物をアニーリングすることにより、予め形成させたタンパク質格子中に高分子存在物を拡散させ、それによって格子に付着させて、タンパク質格子内でエネルギーが最も低い構造にすることができる。これは、液体窒素の低温気流における調節された冷却を用いて行うことができる。あるいは、タンパク質格子形成の間に、高分子存在物をプロトマーと混合して、格子と集合させることができる。
【０１０３】
他のクラスの使用法では、有用な特性を有するタンパク質を、プロトマーの１つとして組み込むことができる。
【０１０４】
物体をタンパク質格子に付着させる使用目的は、高分子存在物のＸ線結晶構造解析を行うためである。この場合、タンパク質格子の規則的な構造によって、規則的な配列および規則的な向きで高分子存在物が保持されるように、反復単位と相対的な所定の位置で、配列中に高分子存在物を保持することができる。Ｘ線結晶構造解析は、生化学研究、および合理的な薬剤設計において重要である。
【０１０５】
標準的なＸ線結晶構造解析技術を用いて、高分子存在物の配列が支持されているタンパク質格子を研究することができる。Ｘ線結晶構造解析における支持体としてのタンパク質格子の使用は、以下の点を含めて、Ｘ線結晶構造解析の現在の技術およびプロトコルに勝る、多くの重要な利点を提供すると予想される。
（１）  （おそらくミリグラムではなくマイクログラム程度の）かなり少ない量の高分子しか必要としない。そのため、以前は扱い難かったいくつかの標的の決定が可能となる。
（２）  親和性タグの使用によって、通常は必要な多数の精製ステップを必要とせずに構造決定が可能となる。
（３）  高分子存在物を結晶化させる必要がなくなる。従来のＸ線による構造決定において、これは、困難であり、たまには克服できないこともあるステップである。
（４）  必要な位相の情報を得るために、新規の各結晶構造について結晶誘導体を得る必要がなくなる。散乱物質の大部分がそれぞれの場合に既知のタンパク質格子であるため、構造決定を自動化し、結晶構造分析の経験がほとんどまたは全くないコンピュータ使用者によって、迅速に達成することができる。
（５）  全く新しい結晶化条件を必要とせずに、化学物質（基質／薬剤）とのタンパク質複合体または他のタンパク質とのタンパク質複合体を調べることができる。
（６）  この方法は、極めて迅速であり、また普遍的に適用可能であると予想され、これによって、時間および費用が大きく節約される。
【０１０６】
生体内変換を触媒する際に使用する場合、酵素を、タンパク質格子に付着させることもでき、タンパク質格子内に組み込むこともできる。
【０１０７】
データ記憶の際に使用する場合、光学的にまたは電子的に活性なタンパク質を付着させることが可能であるかもしれない。一例はバクテリオロドプシンであるが、他の多くのタンパク質をそのようなタンパク質として使用することもできる。この場合、タンパク質格子は、付着したタンパク質を高度に整った配列の状態で保持し、それによって、その配列をアドレス指定することが可能となるはずである。タンパク質格子は、データ記憶の際に使用する場合、タンパク質を保持するための既存のマトリックスのサイズ上の制限を克服することができると予想される。
【０１０８】
表示の際に使用する場合、光活性または蛍光タンパク質を付着させることが可能であるかもしれない。この場合、タンパク質格子は、付着したタンパク質を高度に整った配列の状態で保持し、それによって、画像を表示するためにその配列をアドレス指定することが可能となるはずである。
【０１０９】
電荷分離の際に使用する場合、電荷分離プロセスを実施することができるタンパク質を、タンパク質格子に付着させることもでき、タンパク質格子内に組み込むこともできる。次いで、例えば、クロロフィルなどの光活性中心、またはロドプシンなどの光活性タンパク質の場合、ＡＴＰなどの「燃料」によって生化学的に、または光学的にそのタンパク質に分離を実施させることができる。様々な電荷分離プロセス、例えば、イオンポンピングまたは光起電力充電法の開発をこのようにして行うことができる。
【０１１０】
ナノワイヤとして使用する場合、電気伝導能を有するタンパク質を、タンパク質格子に付着させることもでき、タンパク質格子内に組み込むこともできる。異方性タンパク質格子を用いて、特定の方向に電流を運搬する能力をもたらすことができる。
【０１１１】
モーターとして使用する場合、誘導によって伸縮することができるタンパク質をタンパク質格子内に組み込むことができる。
【０１１２】
タンパク質格子を鋳型として使用することができる。例えば、ケイ素を拡散させ、またはその他の方法でタンパク質格子の孔に注入し、それによって部分的にまたは完全に格子の空間を満たすことができる。次いで、必要な場合、例えば加水分解溶液の使用により、元の格子を含むタンパク質物質を除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】第１のタンパク質格子について、２つのオリゴマーアセンブリに基づくホモプロトマーの設計、および格子自体の生成を概略的に示す図である。
【図２】第２のタンパク質格子について、３つのオリゴマーアセンブリに基づく２つのヘテロプロトマーの設計、および格子自体の生成を概略的に示す図である。
【図３】図１に示したタイプの実験的に生成されたタンパク質格子の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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