(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡ分子を構成する２本の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の特定部位のオリゴヌクレオチド配列を、少なくとも１個は標識されたヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列で置換することにより標識された二本鎖ＤＮＡ分子を調製する方法であって、
（Ａ）前記特定部位の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド配列と実質的に相同の配列を有する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと前記二本鎖ＤＮＡ分子とを、該オリゴヌクレオチドと二本鎖ＤＮＡ分子とが部分的に三本鎖ＤＮＡを形成しうる条件下でインキュベートする工程であって、かつ、該三本鎖ＤＮＡを形成しうる条件が、ＡＴＰ、ＡＴＰ−γＳ、ｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびＧＴＰからなる群より選ばれる１種以上のヌクレオチド三リン酸と、ｒｅｃＡタンパク質とを含有する水性溶液中でのインキュベーションにより、該タンパク質と前記二本鎖ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドとの複合体を形成しうる条件である、工程、ならびに
（Ｂ）工程（Ａ）で形成された三本鎖ＤＮＡ部分を有する二本鎖ＤＮＡと前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１種との複合体を、少なくとも１個は標識されているｄＮＴＰを含む４種のｄＮＴＰの存在下で、該複合体中の二本鎖ＤＮＡ分子を構成する２本の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の特定部位のオリゴヌクレオチド配列が少なくとも１個は標識されたヌクレオチド配列で置換しうる条件下でインキュベートする工程であって、該標識されたヌクレオチド配列で置換しうる条件が、ＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼIクレノウフラグメント（クレノウ酵素）、ＤＮＡポリメラーゼIフラグメント（エキソヌクレアーゼマイナス）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにこれらの遺伝子改変型ポリメラーゼおよび各種耐熱性ポリメラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素の存在する条件である、工程、を含んでなる上記の方法。
【請求項２】
特定部位のオリゴヌクレオチド配列が二本鎖ＤＮＡの３’末端側に存在し、かつ、そのオリゴヌクレオチド配列に相同の配列を有する１種のオリゴヌクレオチドが使用される請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
特定部位のオリゴヌクレオチド配列が二本鎖ＤＮＡの非末端領域に存在し、かつ、そのオリゴヌクレオチド配列に相同の配列を有する１種のオリゴヌクレオチドが使用される請求項１記載の調製方法。
【請求項４】
相同組換えタンパク質と二本鎖ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドとの複合体から該タンパク質を除去しうる条件をさらに含んでなる請求項１〜３のいずれかに記載の調製方法。
【請求項５】
タンパク質を除去しうる条件が、プロティナーゼＫが存在する条件である請求項４記載の調製方法。
【請求項６】
工程（Ｂ）における条件が、クレノウ酵素が存在する条件である請求項１記載の調製方法。
【請求項７】
工程（Ａ）で使用するオリゴヌクレオチドが少なくとも１５ｍｅｒからなる請求項１〜６のいずれかに記載の調製方法。
【請求項８】
標識されているｄＮＴＰが放射性同位体および低分子有機化合物からなる群より選ばれる標識によって標識されている請求項１〜７のいずれかに記載の調製方法。
【請求項９】
標識が ３２Ｐ、３５Ｓ、３３Ｐ、３Ｈ、ビオチン、フルオレッセイン、ジゴキシゲニン、テトラメチルローダミンおよびアルカリフォスファターゼからなる群より選ばれる請求項８記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識されたＤＮＡ分子の調製方法に関し、より具体的には特定の二本鎖ＤＮＡ分子を構成する２本の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の特定部位のオリゴヌクレオチド配列を、少なくとも１個は標識されたヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列で置換することによる標識されたＤＮＡ分子の新規な調製方法に関する。さらに、本発明はかような調製方法により得られる標識されたＤＮＡ分子のプローブ、遺伝子の直接クローニングおよびＤＮＡ断片の直接検出法への使用等にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
標識されたＤＮＡ分子は、例えば、特定のＤＮＡおよびその中の特定部位のヌクレオチド配列等を特異的に検出する手段、すなわちプローブとして生化学、医学、医療、等の技術分野で汎用されている。かようなプローブの調製方法の代表的なものとしては、（ａ）ニックトランスレーション法、（ｂ）ランダムプライマーＤＮＡラベリング法、（ｃ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いるＤＮＡ末端標識法および（ｄ）ＰＣＲを用いるＰＣＲ産物への標識ヌクレオチドの取込み法が挙げられる。しかし、これらの方法のうち、（ｃ）は目的とする高分子量ＤＮＡ中に標識されたヌクレオチドの１個をＤＮＡ分子の末端に取込むことができるが、その取込み効率は低い。そのためプローブとしての感度（比活性）が高められない点に短所を有する。また、（ｂ）はランダムプライマーを使用する特質上、標識できるＤＮＡ断片の長さは最低５００ｂｐ（ｍｅｒ）必要であり、それより短いＤＮＡを用いると生成する断片は短いものが多くなる傾向がある。（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ.，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８６、１５８（２）：３０７−３１５。）一方、（ｂ）および（ｄ）は、それぞれ、標識されたヌクレオチドを高効率で目的となるＤＮＡ中に取込むことができ、高比活性を達成できるが、所定の鎖長のプローブを取得し難い方法である（例えば（ｂ）については、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  ＡＰ，  ｅｔ  ａｌ.，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３、１３２（１）；６−１３参照）。また、（ａ）は、略述すれば、二本鎖ＤＮＡ分子を適当なエンドヌクレアーゼで切断してニックを入れ、ニックの入ったＤＮＡ鎖を５′→３′エキソヌクレアーゼで消化し、それをポリメラーゼ活性で新しいＤＮＡ鎖と置換する作用をもつ方法であって、比活性を高めることができるが、一般的に長時間の反応により標識されたヌクレオチドの取込み率が低下する上に、所定の鎖長のプローブを取得し難い。
【０００３】
加えて、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各方法では、原則としてＤＮＡ含有試料中に含まれる各種ＤＮＡ分子のすべてが標識される対象ＤＮＡとなるので、試料中に複数種のＤＮＡ分子が存在する場合、目的とするＤＮＡ分子を予め単一のものにしておくことが必要不可欠である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
以上の従来技術によれば、単にＤＮＡ検出用プローブを提供することのみを前提にする場合でさえ、得られる標識されたＤＮＡ分子の長さが一定でないことに起因して、それらをプローブに用いる場合標的とするＤＮＡの検出精度が低下する可能性のあるものが得られるにすぎない。
【０００５】
したがって、いかなる鎖長のＤＮＡ分子でも選択的に標識でき、しかも該分子中の特定のヌクレオチド配列のみを高比活性で特異的に標識されたヌクレオチド配列で置換しうる方法の提供が持たれるであろう。本発明の目的は、いかなる鎖長のＤＮＡ分子であっても、その特定部分のヌクレオチド配列を少なくとも１個の標識されたヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列により置換して、標識されたＤＮＡ分子を効率よく得ることのできる方法を提供するにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成すべく研究を重ねてきた。より具体的には、各種生物体において一本鎖ＤＮＡの相同な二本鎖ＤＮＡへの挿入を介して進行するとされる相同的組換え（または「普遍的組換え」ともいう）に類する多種多様な反応を生体外でＤＮＡ断片に対して試みてきた。その結果、標的とする二本鎖ＤＮＡ断片（分子）と、その特定部分のヌクレオチド配列に相同の一本鎖ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）とが三本鎖ＤＮＡを形成し、次いで、少なくとも１個の標識されたｄＮＴＰを含む４種のｄＮＴＰの存在下で、３′→５′のエキソヌクレアーゼ反応を行うと同時にか、あるいは続けて５′→３′のポリメラーゼを作用させると、オリゴヌクレオチドに対応する、二本鎖ＤＮＡ分子を構成する２本の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の特定部分が標識されたヌクレオチドを含むヌクレオチド配列で置換できることを見い出した。
【０００７】
したがって、上記目的は、本発明に従う、特定の二本鎖ＤＮＡ分子を構成する２本の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の特定部位のオリゴヌクレオチド配列を、少なくとも１個は標識されたヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列で置換することにより標識された二本鎖ＤＮＡ分子を調製する方法によって達成される。かような調製方法は、下記：
（Ａ）前記特定部位の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド配列と実質的に相同の配列を有する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと前記二本鎖ＤＮＡ分子とを、該オリゴヌクレオチドと二本鎖ＤＮＡ分子とが部分的に三本鎖ＤＮＡを形成しうる条件下でインキュベートする工程、ならびに
（Ｂ）工程（Ａ）で形成された二本鎖ＤＮＡと前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１種との複合体を、少なくとも１個は標識されているｄＮＴＰを含む４種のｄＮＴＰの存在下で、複合体中の二本鎖ＤＮＡ分子を構成する２本の一本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の特定部位のオリゴヌクレオチド配列が少なくとも１個は標識されたヌクレオチド配列で置換しうる条件下でインキュベートする工程、を含んでなる。
【０００８】
前記特定部位のオリゴヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡの３′末端側に位置するか、あるいは非末端領域に位置してもよい。本発明にいう「非末端領域」とは、本発明の目的に沿うかぎり、二本鎖ＤＮＡの両末端のヌクレオチドを包含しない領域であって、環状の二本鎖ＤＮＡであれば、そのどの領域であってもよく、また、直鎖状の二本鎖ＤＮＡであれば、その中間領域、その他の両末端ヌクレオチドを包含しない適当な領域を意味する。
【０００９】
上記調製方法は、特定の二本鎖ＤＮＡ分子が他の二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子と共存する条件下においても、選択的に特定の二本鎖ＤＮＡ分子を標的としてヌクレオチド配列の置換を行うことができる。さらに、上記調製方法によれば、二本鎖ＤＮＡ分子中で置換されるヌクレオチド配列は、複合体である三本鎖ＤＮＡの形成に使用したオリゴヌクレオチド（一本鎖ＤＮＡ）に対応する部分に実質的に限定される。さらに、上記調製方法によれば、特定の（または標的）二本鎖ＤＮＡ分子は、三本鎖ＤＮＡの形成に使用するオリゴヌクレオチドの長さを超える長さのものであれば、原理的には、いかなる長さのものであっても上記ヌクレオチド配列の置換を行うことができる。さらにまた、上記調製方法によれば、工程（Ｂ）で使用する標識されているｄＮＴＰの種類または量を選ぶことにより、所望の標識を所望の含有率で有する標識された二本鎖ＤＮＡを得ることができる。
【００１０】
したがって、別の態様の本発明として、上記調製方法により得られる標識された二本鎖ＤＮＡ分子または該二本鎖ＤＮＡ分子より得られる標識された一本鎖ＤＮＡ分子からなるＤＮＡのプローブ用組成物；また、該標識された二本鎖ＤＮＡ分子からなる遺伝子の直接クローニング用組成物およびＤＮＡ断片の検出法も提供される。
【００１１】
さらなる別の態様の本発明として、上記調製方法を、多種多様のＤＮＡ断片を含有する水溶液中で実施することを特徴とする該調製方法において使用するオリゴヌクレオチドと相同の特定部位のオリゴヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片の検出方法も提供される。
【００１２】
【発明の具体的な態様】
本発明および本明細書で、「オリゴヌクレオチド」と称する場合の「オリゴ」の語は、主として標識すべき二本鎖ＤＮＡの長さを三本鎖ＤＮＡの形成に用いられる一本鎖ＤＮＡの長さと区別する意図で使用しているものであり、当該技術分野で普通に認識されている「オリゴ」の概念に限定されることなく、一般的には「ポリ」の概念をも包含するものとして使用している。また、本発明にいう「ＤＮＡ分子」の語は、ＤＮＡ断片をも包含する概念であり、生体内のＤＮＡを排除する。さらに、本発明にいう「特定部位」のうちの「３′末端部位」とは、二本鎖ＤＮＡを図１に示されるように略図的に表した場合の、プラス鎖またはマイナス鎖の３′末端部位の一方または両方を意味する。一方、「非末端領域」（または部位）は、前述のように、本発明の目的に沿うかぎり、二本鎖ＤＮＡの両末端の少なくとも１個のヌクレオチドを包含しない領域である。したがって、末端をもたない環状の二本鎖ＤＮＡ分子であれば、そのいかなる領域であってもよく、また、直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子であれば、その中間領域を初めとする両末端の少なくとも１個のヌクレオチドを包含しないいかなる領域であってもよい。しかし、安定な三本鎖ＤＮＡ部分を形成するとの観点に立てば、二本鎖ＤＮＡがストレスを受けている、例えば、超（高次）らせん構造とっている部分、ＤＮＡトポイソメラーゼ活性によって生じた構造のねじれた部分を、非末端領域の具体的なものとして挙げることができる。以下、説明を簡単にする目的で主として、プラス鎖の３′末端部位の置換を例に説明するが、これらに本発明を限定するものでない。
【００１３】
本発明にいう、二本鎖ＤＮＡ分子は、上記調製方法によって標識されたオリゴヌクレオチドで置換しうるものである限り、起源、長さを問うことなくいかなるＤＮＡの断片であってもよい。例えば、人工的な合成ＤＮＡ、ならびに原核生物および真核生物のあらゆる生物種に由来するＤＮＡ断片であっても、標識することに技術的意義（例えば、プローブとして）を有するものであれば、いずれも本発明にいう二本鎖ＤＮＡに包含される。二本鎖ＤＮＡについて、ヒト、サル、マウスまたはラット由来のＤＮＡについて、さらに説明を加えれば、例えば、いずれかの疾患に関連付けられる遺伝子を全部または一部有する二本鎖ＤＮＡ断片を挙げることができ、また、人工的な合成ＤＮＡ、例えば、当該技術分野で常用されているＤＮＡ自動合成機等を使用して合成された二本鎖ＤＮＡも挙げることができる。かようなＤＮＡを対象とする場合、本発明の調製方法は、医療の分野、または生化学的な研究分野で有用である。なお、かような二本鎖ＤＮＡ分子は、例えば分子中にニックが存在する場合等には、配列非特異的な新たなヌクレオチド配列が形成されることがあるので、標的二本鎖ＤＮＡ分子はニックの存在を避けることが好ましい。
【００１４】
上記調製方法では、上記二本鎖ＤＮＡ分子におけるプラス鎖の３′末端部位または非末端領域のヌクレオチド配列と実質的に相同の配列を有するオリゴヌクレオチドが使用される。また、二本鎖ＤＮＡ分子におけるマイナス鎖の３′末端部位または非末端部位のヌクレオチド配列と実質的に相同の配列を有するオリゴヌクレオチドを、独立してもしくは一緒に使用することもできる。実質的に相同とは、該オリゴヌクレオチドと二本鎖ＤＮＡ分子とが、二本鎖ＤＮＡの３′末端部位または非末端領域で三本鎖ＤＮＡを形成でき、かつ上記ヌクレオチド配列が、本発明の方法に従い、新たなヌクレオチド配列で置換されうる程度に、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数個が異なっていてもよいことを意味する。かような程度としては、オリゴヌクレオチドの長さ、また位置によって変動するので限定できないが、通常、オリゴヌクレオチドの５′および３′末端付近では数個（２ないし４個）、その中心部では１個のヌクレオチドが対応する二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列と異なっている場合を挙げることができる。しかし、ヌクレオチド配列の正確な置換を行うとの観点からは、標的とする二本鎖ＤＮＡ分子の対応するヌクレオチド配列と完全に相同のオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。
【００１５】
かようなオリゴヌクレオチドの長さは、上記のように三本鎖ＤＮＡを形成しうるものであれば、特に限定されない。しかし、本発明の好ましい態様である、相同的組換えタンパク質を含有する水性溶液中で三本鎖ＤＮＡを形成する場合には、相同的組換えタンパク質の種類に応じて、オリゴヌクレオチドは少なくとも１５ｍｅｒの長さを有することが好ましい。この長さは、より好ましくは、３０ｍｅｒ以上である。
【００１６】
上記の好ましい態様で使用できる相同的組換えタンパク質は、その存在下で標的二本鎖ＤＮＡ分子と上記オリゴヌクレオチドが、該タンパク質を介して安定な複合体を形成しうるものであれば、起源を問うことなく、いかなるタンパク質であってもよい。しかし、かようなタンパク質の具体的なものとしては、大腸菌（Escherichia coli）に由来するｒｅｃＡタンパク質、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）、他の腸内細菌において、ｒｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能性タンパク質、また、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス  メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ  メイディス（Ustilago maydis）等に由来する、それ自体既知のｒｅｃＡ類似タンパク質が挙げられる。その他、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトに由来するｒｅｃＡ類似タンパク質も、上記相同的組換えタンパク質に包含される。これらのうち、入手容易性、安定性の観点から、大腸菌に由来するｒｅｃＡタンパク質またはそれに類似する機能を有するタンパク質（例えば、該タンパク質に由来する改変型タンパク質もしくはその断片）を使用することが好ましい。改変タンパク質としては、ｒｅｃＡ遺伝子の部位特異的変異誘発等により作出されたｒｅｃＡ遺伝子産物であって、ｒｅｃＡタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつｒｅｃＡタンパク質と同様に上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる機能を有するものを挙げることができる。数個のアミノ酸が欠失したものには、ｒｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドが包含される。このようなペプチドの例としては、Voloshin et al., Science, Vol. ２７２，１９９６：８６８−８７２に記載されているものを挙げることができる。なお、以上により理解できるように、本発明にいうタンパク質の語は、ペプチドをも包含する概念で使用している。
【００１７】
相同組換えタンパク質を使用する標的二本鎖ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドとの３成分の複合体の形成に際して、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）またはその類縁体、例えばアデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）、あるいはｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰまたはＧＴＰなどを必要とする。これらのヌクレオチド三リン酸またはその類似体は、少なくとも１種以上を用い、場合によりヌクレオチド二リン酸を含めてもよい。本発明に従う、標識された二本鎖ＤＮＡ分子の調製方法における後述する（Ｂ）工程でＡＴＰが生物学的な分解を伴なう場合には、後者のＡＴＰ−γＳを上記３成分複合体の形成に際して使用するのが好ましい。なお、上記ヌクレオチドに関する略号は、当該技術分野で慣用されているものに基づいている。
【００１８】
かような３成分複合体の形性反応条件は、当業者であれば、後述する実施例に従って、簡単な実験を行うことによって、使用するｒｅｃＡタンパク質またはｒｅｃＡ類似タンパク質に応じて、最適の反応条件を容易に選定しうるであろう。
【００１９】
上記のように、ｒｅｃＡタンパク質を用いて、３成分複合体を形成した場合には、場合により該複合体からｒｅｃＡタンパク質を除去した後、次の反応に供してもよい。かような除去反応は、本発明に従う調製方法に悪影響を及ぼさない限り、いかなる非特異的プロテアーゼを使用して実施することができる。しかし、入手容易性、安定性等を考慮すると、トリチラキウム  アルブム（Tritrachiumalbum）由来のプロティナーゼＫを都合よく使用できる。プロティナーゼＫを使用するタンパク質の分解反応条件は、当該技術分野で常用されている条件をそのまま、または改変して行うことができる。例えば、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、０．５％ＳＤＳからなる緩衝液中に、プロティナーゼＫを５０μｇ／ｍｌの濃度で加えて、３７℃、１０分間インキュベートするような条件下で上記反応を行う。
【００２０】
こうして、上記３成分複合体からタンパク質を除去して得られる三本鎖ＤＮＡであっても、上記酵素反応液中で安定であり、そのまま、あるいは必要により分離した後、本発明に従う、工程（Ｂ）のオリゴヌクレオチド配列の置換反応に供することができる。この置換反応は、理論により拘束されるものでないが、三本鎖ＤＮＡにおける標的二本鎖ＤＮＡのプラス鎖を３′末端から３′→５′のエキソヌクレアーゼで消化されると同時にか、またはそれに続いて、消化されたヌクレオチド配列に対応する新たなヌクレオチド配列の形成を、５′→３′のポリメラーゼにより行うことにより達成できる。上記２種の酵素は、目的の作用を奏するものであれば、いかなる起源の酵素も使用でき、またそれらの酵素の共存下で行うこともできる。これらの酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼIクレノウフラグメント（クレノウ酵素）、ＤＮＡポリメラーゼIクレノウフラグメント（エキソマイナス）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにこれらの遺伝子改変型ポリメラーゼおよび各種耐熱性ポリメラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素を挙げることができる。特に、ＤＮＡポリメラーゼIクレノウフラグメント（以下、クレノウ酵素ともいう）を都合よく使用できる。クレノウ酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＣ末端側にある５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性を欠失させたものであって、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で５′→３′のポリメラーゼ活性と３′→５′のエキソヌクレアーゼ活性を有する。クレノウ酵素は市販されているものを、そのまま使用することができる。
【００２１】
通常、上記ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの４種を使用して行うが、これらの少なくとも１個、すなわち、ｄＡＴＰの一部または全部を標識されたｄＡＴＰや他の標識されたｄＮＴＰに代えて、上記置換反応を行えば、新たに形成されるヌクレオチド配列には、その中に標識されたヌクレオチドを１個以上含めることができる。クレノウ酵素を使用する反応条件それ自体は当該技術分野で周知であり、また、後述する実施例に習って、最適条件を決定することは当業者にとって容易である。かような条件の具体例としては、例えば、０.０１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０.００５Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．００７５Ｍ  ジチオスレイトールからなる緩衝液中にクレノウ酵素を２００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で加えて、３７℃、１５分間インキュベートするような条件を挙げることができる。
【００２２】
上記ｄＮＴＰを標識するのに使用できる標識および標識化方法も、当該技術分野で周知であり、一部は市販されているものをそのまま使用でき、また目的に応じて新たな標識されたｄＮＴＰを作成してもよい。かような標識としては、限定されるものでないが放射性同位体および低分子有機化合物が挙げられる。低分子有機化合物としては、上記置換反応に悪影響を及ぼさないで、それらを有するヌクレオチドが新たに形成されるヌクレオチド配列に組込むことのできるものであれば、所謂、標識としてではなく、何等かの薬効を有する薬物であってもよい。かような標識の代表的なものとしては、32Ｐ、35Ｓ、33Ｐ、3Ｈ、ビオチン、フルオレッセイン、ジゴキシゲニン、テトラメチルローダミンおよびアルカリフォスファターゼ等を挙げることができる。また、これらの標識で標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の例としては、［α−32ｐ］ｄＡＴＰ、［α−32ｐ］ｄＣＴＰ、［α−32ｐ］ｄＧＴＰ、［α−32ｐ］ｄＴＴＰ、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ビオチン−１１−ｄＣＴＰ、フルオレッセイン−２−ｄＣＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレッセイン−１２−ｄＵＴＰ、６−アミノヘキシルｄＡＴＰおよびテトラメチルローダミン−５−ｄＵＴＰ等を挙げることができる。
【００２３】
以上により、得られる標識された二本鎖ＤＮＡ分子は、通常のＤＮＡ変性条件下で変性した後、標識された一本鎖ＤＮＡ分子と未標識一本鎖ＤＮＡ分子を分離し、それらの混合物のまま、あるいは必要により標識された一本鎖ＤＮＡ分子を単離して、例えばサザンハイブリダイゼーション法のプローブとして使用することができる。
【００２４】
また、標識された二本鎖ＤＮＡ分子は、遺伝子の直接クローニングに使用することができる。
【００２５】
さらには、本発明に従う、標識された二本鎖ＤＮＡ分子の調製方法は、上述したように、多種多様のＤＮＡ断片の混合物から、特に二本鎖ＤＮＡ分子であって、そのプラス鎖の３′末端部分または非末端領域のヌクレオチド配列が、三本鎖ＤＮＡの形成に使用するために加えられたオリゴヌクレオチドと相同であるＤＮＡ分子を選択的に該ヌクレオチド配列を標識されたヌクレオチドを含む新たなヌクレオチド配列で置換しうるので、該標識を指標に、直接特定のＤＮＡの存否を検出できる。
【００２６】
加えて本発明に従えば、任意の長さのＤＮＡに標識を入れることができ、かつ、その標識は、ＤＮＡの片側鎖の末端付近または特定の非末端領域に限定して入れることができる。例えば、その標識物質がビオチンであるならば、ビオチン−ストレプトアビジンを介して、バイオチップ等のバイオセンサー表面へのＤＮＡプローブの固定に用いることができる。また、ＤＮＡにアミノ化ヌクレオチドを取り込ませることにより、末端がアミノ化されたＤＮＡを得ることができる。このアミノ化ＤＮＡは、カルボキシル基またはアミノ基を結合した固相担体上に、共有結合させることが可能である。これを用いて、バイオチップなどのバイオセンサー表面に、ＤＮＡプローブを簡単に結合させることが可能である。
【００２７】
以上のとおり、本発明に従えば、応用分野の広い、極めて特異性の高い二本鎖ＤＮＡ分子の標識方法が提供される。
【００２８】
【実施例】
本発明を以下の実施例により、さらに具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の理解を容易にするためのものであって、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。
【００２９】
実施例１
（Ａ）二本鎖ＤＮＡ分子の末端でのオリゴヌクレオチドを使用する三本鎖の形成標的とする二本鎖ＤＮＡ分子として、その３′末端のヌクレオチド配列が既知のｐＢＲ３２２［塩基配列については、例えば、Sutcliffe, J. G., Complete nucleotide sequence, of the Escherichia coli plasmid pBR322 JOURNAL, Cold Spring Harb. Symp. Duant. Biol. 43Pt1,77-90:(1979)参照］のＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたもの（断片）を用意した。一方、ｐＢＲ３２２のＳｃａ Ｉ断片の３′末端に相同の配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴという場合あり）：
オリゴ１  5′-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt
tctgtgactg gtgagt-3′
（配列番号：１）
と逆相補鎖である
オリゴ２  5′-actcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag
agaattatgc agtg-3′
（配列番号：２）
を合成し、これらのオリゴヌクレオチドを、市販されているＤＮＡ  ５′末端標識試薬（ＤＮＡ  ５′末端標識キットＭＥＧＡＬＡＢＥＬTM、宝酒造株式会社）を用いて、［γ−32ｐ］ＡＴＰで標識した。
【００３０】
三本鎖形成反応は、２つの反応液Ａ（２０μｌ）とＢ（２０μｌ）を準備し、反応液Ａには、５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド、３．０μｇのｒｅｃＡタンパク、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウムを含め、一方反応液Ｂには、１００ｎｇの標的ＤＮＡ、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．１５ｍＭ酢酸マグネシウムを含めた。反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間から１８時間インキュベートした。次に、除タンパクを行うために、三本鎖反応液全量に、０．５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え３７℃で１０分間インキュベートした。その１０μｌについて０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後に、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を取りＤＮＡを観察した。
【００３１】
結果は図２（図面に代わる写真）に示されるとおりである。図２のレーン１〜３は、それぞれ次の意味または結果を示す。
レーン１：ＤＮＡサイズマーカー
レーン２：オリゴ２を用いて反応を行ったもの。塩基配列特異性を調べるために、制限酵素ＢｓｔＰ Ｉで消化したλＤＮＡ断片も同時に反応を行ってある。オリゴ２の配列では、三本鎖は形成されない。
レーン３：オリゴ１を用いて反応を行ったもの。塩基配列特異性を調べるために、制限酵素ＢｓｔＰ Ｉで消化したλＤＮＡ断片も同時に反応を行ってある。オリゴ１の配列では三本鎖は形成される。
【００３２】
なお、レーン１のＤＮＡサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、［γ−32ｐ］ＡＴＰで標識したものである。
【００３３】
本実施例の一連の反応において、２つの６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて、三本鎖ＤＮＡ形成をさせたもののうち、１つは、二本鎖ＤＮＡ分子におけるプラス鎖の３′末端部位の配列をもつものである（レーン３に結果を示す。）。もう１つは、二本鎖ＤＮＡ分子におけるマイナス鎖の５′末端部分の配列をもつものである（レーン２に結果を示す。）。この結果から、すくなくとも６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて三本鎖形成を行うときには、プラス鎖の３′末端部位の配列をもつものでないと除タンパク後に安定な三本鎖は形成されないことがわかる。
（Ｂ−１）二本鎖ＤＮＡにおけるプラス鎖の３′末端部分のヌクレオチド配列の置換
上記プロティナーゼＫ処理液（４０μｌ）に、６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノールを加え、冷却・遠心を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０．５μｌの蒸留水に溶かした後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭジチオスレイトール、４ｕｎｉｔのクレノ酵素、０．０２ｍＭ［α−32ｐ］ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰ中で、３７℃で１５分間保温した。ＴＥ緩衝液を１０μｌ加え、Ｇ２５スピンカラムで過剰な［α−32ｐ］ｄＡＴＰを除去した。その１０μｌについて０．８％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後に、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。
【００３４】
結果は図３（図面に代わる写真）に示されるとおりである。写真に示されるレーン１〜３は、それぞれ次の意味または結果を示す。
レーン１：ＤＮＡサイズマーカー
レーン２：６０ｂオリゴヌクレオチドを用いないで反応を行い、［α−32ｐ］ｄＡＴＰの取込標識反応を行った結果を示す。塩基配列特異性を調べるために、制限酵素ＢｓｔＰ Ｉで消化したλＤＮＡ断片も同時に反応を行ってある。
レーン３：標的二本鎖ＤＮＡ分子におけるプラス鎖の３′末端部位の配列をもつ６０ｂオリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、［α−32ｐ］ｄＡＴＰの取込標識反応を行った結果を示す。塩基配列特異性を調べるために、制限酵素ＢｓｔＰＩで消化したλＤＮＡ断片も同時に反応を行ってある。
【００３５】
なお、レーン１のＤＮＡサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、［γ−32ｐ］ＡＴＰで標識したものである。
【００３６】
本実施例の一連の反応において、標的二本鎖ＤＮＡ分子へのクレノウ酵素による32Ｐの取込反応を行う前の、三本鎖形成を行うときに、プラス鎖の配列をもつオリゴヌクレオチドを用いて反応を行ったもの（レーン３に結果を示す）と、オリゴヌクレオチドを加えないで反応を行ったもの（レーン２に結果を示す）の結果である、この結果から、標的二本鎖ＤＮＡ分子は標識には、三本鎖形成が必要であることがわかる。また、同時に反応を行ったλＤＮＡ断片は標識されていないことから、標識の様式はＤＮＡの塩基配列特異的であることがわかる。
レーン３：標的二本鎖ＤＮＡ分子におけるプラス鎖の３′末端部位の配列をもつ６０ｂオリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、［α−32ｐ］ｄＡＴＰの取込標識反応を行った結果を示す。塩基配列特異性を調べるために、制限酵素ＢｓｔＰＩで消化したλＤＮＡ断片も同時に反応を行ってある。
（Ｂ−２）  二本鎖ＤＮＡの標識物質が取り込まれたＤＮＡ鎖の長さの同定
（Ｂ−１）の反応産物を、制限酵素Ｐｓｔ Ｉで消化し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、生成した一本鎖ＤＮＡの状態で解析した。結果は図４（図面に代わる写真）に示されるとおりである。写真に示されるレーン１〜３は、それぞれ次の意味または結果を示す。
レーン１：一本鎖ＤＮＡサイズマーカー
レーン２：標的二本鎖ＤＮＡ分子におけるプラス鎖の３′末端部位の配列をもつ６０ｂオリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、［α−32ｐ］ｄＡＴＰの取込標識反応を行った結果を示す。塩基配列特異性を調べるために、制限酵素ＢｓｔＰＩで消化したλＤＮＡ断片も同時に反応を行ってある。
レーン３：６０ｂオリゴヌクレオチドを用いないで反応を行い、
の取込標識反応を行った結果を示す。塩基配列特異性を調べるために、制限酵素ＢｓｔＰ Ｉで消化したλＤＮＡ断片も同時に反応を行ってある。
【００３７】
なお、レーン１は一本鎖ＤＮＡ分子のサイズマーカーである。
【００３８】
本実施例の一連の反応において、標的二本鎖ＤＮＡ分子へのクレノウ酵素による［α−32ｐ］ｄＡＴＰの取込反応を行う前の、三本鎖形成を行うときに、プラス鎖の配列をもつオリゴヌクレオチドを用いて反応を行ったもの（レーン２に結果を示す）と、オリゴヌクレオチドを加えないで反応を行ったもの（レーン３に結果を示す）の結果である、変性ポリアクリルアミドゲルによる解析では、二本鎖ＤＮＡは一本鎖に変性して泳動される。泳動直前の標的ＤＮＡの状態は、直鎖状標的ＤＮＡをさらに制限酵素Ｐｓｔ Ｉで消化してあることから、そのプラス鎖は２３７ｂの長さであり、マイナス鎖の長さは２４１ｂをもつ。レーン２のシグナルは、レーン１のサイズマーカーの情報から、２３７ｂの長さをもつ。この結果から、標識されたＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子におけるプラス鎖であることがわかる。
【００３９】
実施例２
標識反応における、各反応成分の依存性
標的ＤＮＡとしてファージベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡ（宝酒造より入手）を制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、その標的ＤＮＡの末端部位の配列を持つ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド３を用意した。標的ＤＮＡとオリゴヌクレオチド３との間の三本鎖形成反応を行うために、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド１、６．０μｇのｒｅｃＡタンパク、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、２００ｎｇのターゲットＤＮＡ、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。
【００４０】
反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。三本鎖形成反応を終えた反応液４０μｌに、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除ｒｅｃＡ処理を行った。その後、６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとして、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０．５μｌの蒸留水に溶かした後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭジチオスレイトール、４ｕｎｉｔクレノウ・フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、０．０２ｍＭ  ［α−32ｐ］  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰ中で、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、標識反応を行った。
【００４１】
ＴＥ緩衝液を１０μｌ加え、Ｇ２５スピンカラムで過剰な［α−32ｐ］  ｄＣＴＰを除去した後、その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を、残りの半分量については０．７％アルカリ変性ゲル電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動については、泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。その結果を図５（Ｂ）のレーン１に示す。その後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。アガロースゲル電気泳動の結果を図５（Ａ）のレーン１に、アルカリ変性ゲル電気泳動の結果を図５（Ｃ）のレーン１に示す。
【００４２】
比較実験として、次のことを行った。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、［γ−32ｐ］ＡＴＰで５′末端標識したものである。レーン２は、ｒｅｃＡを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン４は、逆相補配列をもつオリゴヌクレオチド４を用いて反応を行った以外はレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン５は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡ配列をもつオリゴヌクレオチド１を用いて反応を行った以外はレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。
オリゴ３の配列： 5′-agaggctttg  aggactaaag  actttttcat  gaggaagttt
ccattaaacg  ggtaaaatac-3′（配列番号：３）
オリゴ４の配列： 5′-gtattttacc  cgtttaatgg  aaacttcctc  atgaaaaagt
ctttagtcct  caaagcctct-3′ （配列番号：４）
オリゴ１の配列： 5′-cact  gcataattct  cttactgtca  tgccatccgt
aagatgcttt  tctgtgactg  gtgagt-3′ （配列番号：１）
図５（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）によれば、図５（Ａ）のレーン１に示すように、標的ＤＮＡの標識反応には、レーン１の結果をもたらす各種処理条件が必要であることがわかる。また、図５（Ｃ）のレーン１に示すように、標識が入るのは標的ＤＮＡであり、標識の入った標的ＤＮＡは標識を入れる前の標的ＤＮＡの長さと同じであることがわかる。
【００４３】
実施例３
標識された標的ＤＮＡ鎖長
図６（Ａ）のレーン１は、標的ＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡの制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断したものを用いたことと、その末端部位の配列をもつオリゴヌクレオチド５を用いたこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。比較実験として、レーン２は、オリゴヌクレオチドを加えないで、レーン１と同じ反応を行った結果に由来する。図６（Ｂ）はゲルの染色写真である。図６（Ｃ）のレーン１は、（Ａ）のレーン１で得られたサンプルを、制限酵素ＢｓａＨＩで切断して、４．５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動したものである。レーン２は、（Ａ）のレーン２で得られたサンプルを制限酵素ＢｓａＨＩで切断してレーン１と同様に電気泳動したものである。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーを示し、その１つのサイズを（Ｃ）の左端に示す。
オリゴ５の配列： 5′-ggaaacagct  atgaccatga  ttacgaattc  gagctcggta
cccggggatc  ctctagagtc-3′ （配列番号：５）
図６（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）によれば、（Ｃ）のレーン１に示すように、標識されたＤＮＡは２本鎖の標的ＤＮＡの片側の一本鎖であり、その完全長である２６３ｂｐの長さであることがわかる。
【００４４】
実施例４
標識反応における、塩基配列特異性
図７（Ａ）のレーン１は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン２は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡ（宝酒造より入手）の配列を持つ上記オリゴヌクレオチド１を用いたこと以外はレーン１と同じ反応を行った結果に由来する。レーン３は、標的ＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断したものを用いたことと、その末端部位の配列をもつオリゴヌクレオチド１を用いたこと以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン４は、標的ＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断したものを用いたことと、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡの配列を持つオリゴヌクレオチド３を用いたこと以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来する。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。
【００４５】
図７（Ａ）および（Ｂ）によれば、標識反応は、三本鎖形成の反応液中に、標的ＤＮＡの末端部位のオリゴヌクレオチド配列と標識反応に用いるオリゴヌクレオチドの配列とが実質的に同一であることが必要であることを示す。
【００４６】
実施例５
標識反応における、標的ＤＮＡの標識部位
図８（Ａ）のレーン１は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン２は、ファージベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦのＳｎａＢＩ断片のもう一つの片末端側のヌクレオチド配列に対応するレーン１と同一のサンプルを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して電気泳動したものである。レーン３は、オリゴヌクレオチド６を用いたこと以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン４は、レーン３と同じサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して電気泳動したものである。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。
オリゴ６の配列： 5′-tgttttagtg  tattctttcg  cctctttcgt  tttaggttgg
tgccttcgta  gtggcattac-3′（配列番号：６）
図８（Ａ）および（Ｂ）によれば、レーン２とレーン４に示すように、それぞれ標的ＤＮＡの片側末端部位の配列をもつ２種のオリゴヌクレオチド３と６を用いて一連の反応を行った場合、標的ＤＮＡ上で、それぞれそれらのオリゴヌクレオチドが三本鎖形成する末端部位が標識されていることがわかる。
【００４７】
実施例６
標識反応における、標的ＤＮＡの標識部位
図９（Ａ）のレーン１は、標的ＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断したものを用いたことと、その末端部位の配列をもつオリゴヌクレオチド７を用いたこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン２は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＸｂａＩで切断したサンプルの電気泳動の結果である。レーン３は、レーン１と同一のサンプルを、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したサンプルに由来するものである。レーン４は、レーン１と同一のサンプルを、制限酵素ＳｍａＩで切断したサンプルに由来するものである。レーン５は、レーン１と同一のサンプルを、制限酵素ＫｐｎＩで切断したサンプルに由来するものである。レーン６は、レーン１と同一のサンプルを、制限酵素ＳａｃＩで切断したサンプルに由来するものである。レーン７は、レーン１と同一のサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したサンプルに由来するものである。レーン８は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＢｓａＨＩで切断したサンプルに由来するものである。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。
オリゴ７の配列： 5′-ttacgaattc  gagctcggta  cccggggatc  ctctagagtc-3′
（配列番号：７）
図９（Ａ）および（Ｂ）によれば、レーン１からレーン２に示すように、標的ＤＮＡの標識が入っている部位を端から制限酵素を用いて順に切断していくと、標識シグナルがそれに応じて減少していくことから、標的ＤＮＡの標識される部位は、ＤＮＡの末端領域であることがわかる。さらに、標識される部位は、オリゴヌクレオチドの長さの範囲内で、かつ、均一に標識されていることがわかる。
【００４８】
実施例７
異なるＤＮＡポリメラーゼを用いる標識反応
図１０（Ａ）のレーン１は、標識反応で大腸菌（E．coli）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いたこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン２は、標識反応で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いたことと、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン３は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ・フラグメント（Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）で標識反応を行ったこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン４は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＬａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔで標識反応を行ったことと、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン５は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン６は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来する。
【００４９】
図１０（Ａ）および（Ｂ）によれば、どんな種類のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素でも、標識反応に用いることができることがわかる。また、レーン６に示すように、バックグラウンドシグナルを低くするためには、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＬａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（３′−５′ｅｘｏマイナス）で標識反応を行うことが望ましいこともわかる。
【００５０】
実施例８
異なる種類のＤＮＡポリメラーゼを用いる標識反応
図１１（Ａ）のレーン１は、図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン７は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、図５（Ａ）のレーン１と同じ反応を行った結果に由来する。レーン２は、標的ＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、オリゴヌクレオチド１との間で三本鎖形成を行った結果に由来する。その反応は、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド１、６．０μｇのｒｅｃＡタンパク、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、２００ｎｇの標的ＤＮＡ、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。
【００５１】
反応液ＡとＢを、それぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での、組み換え反応後の反応液量は４０μｌであった。その１０μｌに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭジチオスレイトール、４ｕｎｉｔ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、０．０２ｍＭ  α−３２Ｐ  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰを含んだ反応液２０μｌ中で、３７℃で６０分間インキュベートした。全量に０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え３７℃で１０分間インキュベートした後、ＴＥ緩衝液を３０μｌ加え、Ｇ２５スピンカラムで過剰なα−３２Ｐ  ｄＣＴＰを除去した。その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後に、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を取りＤＮＡを観察した。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。
【００５２】
レーン８は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、レーン２と同様の反応を行った結果に由来するものである、レーン３は、標識反応を４５℃で行ったこと以外は、レーン２と同様の反応を行った結果に由来する。レーン９は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、レーン３と同じ反応を行った結果に由来する。レーン４は、標識反応を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｕｎｉｔｓ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、０．０２ｍＭ  α−３２Ｐ  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰを含んだ反応液２０μｌ中で、６５℃で６０分間インキュベートしたこと以外は、レーン２と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン１０は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、レーン４と同様の反応を行った結果に由来する。レーン５は、標識反応を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、５ｕｎｉｔｓ  ＰｙｒｏＢｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、０．０２ｍＭ  ［α−32ｐ］  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰを含んだ反応液２０μｌ中で、６５℃で６０分間インキュベートしたこと以外は、レーン２と同様の反応を行った結果に由来する。レーン１１は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、レーン５と同様の反応を行った結果に由来する。レーン６は、標識反応を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｕｎｉｔｓ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、０．０２ｍＭ  ［α−32ｐ］  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰを含んだ反応液２０μｌ中で、６５℃で６０分間インキュベートしたこと以外は、レーン２と同様の反応を行った結果に由来する。レーン１２は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、レーン６と同様の反応を行った結果に由来する。（Ｂ）は（Ａ）と同様のアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。
【００５３】
図１１（Ａ）および（Ｂ）によれば、レーン４に示すように、耐熱性のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いて標識反応を行うことにより、除ｒｅｃＡ処理を行わないで標識反応を行うことができる。また、レーン１とレーン４を比較すると、その標識効率は、除ｒｅｃＡを行って標識反応を行う場合と、ほぼ同じであることがわかる。
【００５４】
実施例９
閉環状の標的ＤＮＡを用いた標識反応
標的ＤＮＡとして閉環状のＤＮＡ（ｐＢＲ３２２  ＤＮＡ）と、その１部位の配列を持つ１２０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド８を用意した。標的ＤＮＡとオリゴヌクレオチド８との間の三本鎖形成反応を行うために、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド８、６．０μｇのｒｅｃＡタンパク、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれている。反応液Ｂには、２００ｎｇの標的ＤＮＡ、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。
【００５５】
反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での三本鎖形成反応を終えた反応液４０μｌに、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除ｒｅｃＡ処理を行った。その後、６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとして、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０．５μｌの蒸留水に溶かした後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭジチオスレイトール、４ｕｎｉｔ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、０．０２ｍＭ  ［α−32ｐ］  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰ中で、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、標識反応を行った。ＴＥ緩衝液を１０μｌ加え、Ｇ２５スピンカラムで過剰なα−３２Ｐ  ｄＣＴＰを除去した後。その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を行った泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。結果を図１２（Ｂ）のレーン１に示す。その後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。アガロースゲル電気泳動の結果を図１２（Ａ）のレーン１に示す。
【００５６】
比較実験として、次のことを行った。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、［γ−32ｐ］ＡＴＰで５′末端標識したものである。レーン４は、用いた標的ＤＮＡをそのまま電気泳動したものである。レーン２は、逆相補オリゴヌクレオチド９を用いたこと以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン３は、オリゴヌクレオチド加えないで反応を行ったこと以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来する。
オリゴ８の配列： 5′-gtcctccgat  cgttgtcaga  agtaagttgg  ccgcagtgtt
atcactcatg  gttatggcag  cactgcataa  ttctcttact  gtcatgccat  ccgtaagatg
cttttctgtg  actggtgagt-3′（配列番号：８）
オリゴ９の配列： 5′-actcaccagt  cacagaaaag  catcttacgg  atggcatgac
agtaagagaa  ttatgcagtg  ctgccataac  catgagtgat  aacactgcgg  ccaacttact
tctgacaacg  atcggaggac-3′（配列番号：９）
図１２（Ａ）および（Ｂ）によれば、レーン１と２に示すように、三本鎖形成体が安定に保持されており、閉環状ＤＮＡを標的ＤＮＡとして用いることで、ＤＮＡのどこの部位でも標識をいれることができることがわかる。
【００５７】
実施例１０
標識反応後のオリゴヌクレオチドの状態
標的ＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、その標的ＤＮＡの末端部位の配列を持つ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド３を用意した。オリゴヌクレオチドは、［γ−32ｐ］ＡＴＰで５′末端を事前に標識しておいた。標的ＤＮＡとオリゴヌクレオチド３との間の三本鎖形成反応は、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、１ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド１、６．０μｇのｒｅｃＡタンパク、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、２００ｎｇの標的ＤＮＡ、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。
【００５８】
反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での三本鎖形成反応を終えた反応液４０μｌに、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除ｒｅｃＡ処理を行った。その後、６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとして、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０．５μｌの蒸留水に溶かした後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭジチオスレイトール、４ｕｎｉｔ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、０．０２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰ中で、３７℃で３０分間インキュベートすることにより取り込み反応を行った。反応終了液に、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除タンパク処理を行った。その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。結果を図１３（Ｂ）に示す。その後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。その結果を図１３（Ａ）のレーン２で示す。
【００５９】
比較実験として、次のことを行った。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、［γ−32ｐ］ＡＴＰで５′末端標識したものである。レーン１は、レーン２と同様に三本鎖形成を行い、取り込み反応を行わないで電気泳動したもの。レーン３は、レーン２と同様に三本鎖形成を行い、取り込み反応で４種のｄＮＴＰｓを加えないで反応を行った結果に由来する。レーン４は、レーン２と同様に三本鎖形成を行い、取り込み反応でｄＡＴＰを加えないで反応を行った結果に由来する。レーン５は、レーン２と同様に三本鎖形成を行い、取り込み反応でｄＣＴＰを加えないで反応を行った結果に由来する。
【００６０】
図１３（Ａ）および（Ｂ）によれば、レーン２に示すように、ＤＮＡポリメラーゼによる４種類のｄＮＴＰｓの取り込み反応を行った後には、三本鎖形成に用いたオリゴヌクレオチドがターゲットＤＮＡから解離していることがわかる。
【００６１】
実施例１１
標識反応の再現性
図５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行ったサンプルで電気泳動する前のものを、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。こうして得られるＤＮＡを標的ＤＮＡとして用いてオリゴヌクレオチド３との間で三本鎖形成を行った。反応は、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、１ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド３、６．０μｇのｒｅｃＡタンパク、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、２００ｎｇのターゲットＤＮＡ、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。
【００６２】
反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での三本鎖形成反応を終えた反応液４０μｌに、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除ｒｅｃＡ処理を行った。その後、６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとして、フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０．５μｌの蒸留水に溶かした後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭジチオスレイトール、４ｕｎｉｔ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、０．０２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．０２ｍＭ  ｄＴＴＰ中で、３７℃で３０分間インキュベートすることにより取り込み反応を行った。反応終了液に、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除タンパク処理を行った。その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。結果を図１４（Ｂ）に示す。その後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。その結果を図１４（Ａ）のレーン１に示す。レーン２は、取り込み反応でＤＮＡポリメラーゼを加えないでレーン１と同様の反応を行った結果に由来する。レーン３は、取り込み反応で４種類のｄＮＴＰｓを加えないでレーン１と同じ反応を行った結果に由来する。レーン４は、取り込み反応でｄＣＴＰのみを加えてレーン１と同じ行った結果に由来する。
【００６３】
図１４（Ａ）および（Ｂ）によれば、標識反応により標的ＤＮＡに取り込まれた標識は、くり返して行う一連の本発明に従う反応により、ｄＮＴＰｓでの取り込み反応を行うことで、その標識がはじき出されることから、反応に再現性もしくは一定の生化学的反応の特徴があることが確認される。
【００６４】
実施例１２
三本鎖形成反応における、各反応成分の依存性
標的ＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、その標的ＤＮＡの末端部位の配列を持つ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド３を用意した。オリゴヌクレオチドは、［γ−32ｐ］ＡＴＰで５′末端を標識した。標的ＤＮＡとオリゴヌクレオチド３との間の三本鎖形成反応は、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、１ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド３、６．０μｇのｒｅｃＡタンパク、０．４８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、２００ｎｇの標的ＤＮＡ、０．４８ｍＭＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）、２．１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。
【００６５】
反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での三本鎖形成反応を終えた反応液４０μｌに、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除ｒｅｃＡ処理を行った。その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。結果を図１５（Ｂ）に示す、その後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。その結果を図１５（Ａ）のレーン１に示す。
【００６６】
比較実験として、次のことを行った。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、［γ−32ｐ］ＡＴＰで５′末端標識したものである。レーン２は、ｒｅｃＡを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン４は、逆相補オリゴヌクレオチド４を用いて反応を行った以外はレーン１１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン５は、逆相同な配列を持つオリゴヌクレオチド１０を用いて反応を行った以外はレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン６は、オリゴヌクレオチド１を用いて反応を行った以外はレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン７は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断したターゲットＤＮＡに対するオリゴヌクレオチド１を用いて、反応を行った結果に由来するサンプルの電気泳動である。レーン７は、ターゲットＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断したものを用いたことと、その末端部位の配列をもつ標識オリゴヌクレオチド６を用いたこと以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。
オリゴ１０の配列： 5′-tctccgaaac  tcctgatttc  tgaaaaagta  ctccttcaaa
ggtaatttgc  ccattttatg-3′（配列番号：１０）
図１５（Ａ）のレーン１に示すように、三本鎖形成には、レーン１の基となる全ての反応成分を反応に加える必要がある。また、逆相補オリゴヌクレオチドと逆相同オリゴヌクレオチドでは、三本鎖形成体は得られないことから、オリゴヌクレオチドの方向性は一方のみであることがわかる。
【００６７】
実施例１３
三本鎖形成反応における、用いるオリゴヌクレオチドの配列方向性
図１６（Ａ）のレーン１は、図１５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン２は、逆相補な配列をもつ標識オリゴヌクレオチド４を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン３は、標識オリゴヌクレオチド７を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン４は標識オリゴヌクレオチド３２を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。（Ｂ）は（Ａ）と同様のアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。
オリゴ１１の配列： 5′-gtaatgccac  tacgaaggca  ccaacctaaa  acgaaagagg
cgaaagaata  cactaaaaca-3′（配列番号：１１）
図１６（Ａ）および（Ｂ）によれば、直鎖状標的二本鎖ＤＮＡの両末端部位で三本鎖形成が可能であり、そのとき用いるオリゴヌクレオチドは、標的二本鎖ＤＮＡの両末端配列の一方の方向を持った相同配列でなければならないことがわかる。
【００６８】
実施例１４
オリゴヌクレオチド鎖長による変化
図１７（Ａ）のレーン１は、図１５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン２は、レーン１で用いたオリゴヌクレオチドの５′末端部位を１０−ｍｅｒ削った標識オリゴヌクレオチド１１を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン３は、レーン１で用いたオリゴヌクレオチドの５′末端部位を２０−ｍｅｒ削った標識オリゴヌクレオチド１３を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン４は、レーン１で用いたオリゴヌクレオチドの５′末端部位を３０−ｍｅｒ削った標識オリゴヌクレオチド１４を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン５は、レーン１で用いたオリゴヌクレオチドの５′末端部位を４０−ｍｅｒ削った標識オリゴヌクレオチド１５を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。
オリゴ１２の配列： 5′-aggactaaag  actttttcat  gaggaagttt  ccattaaacg
ggtaaaatac-3′（配列番号：１２）
オリゴ１３の配列： 5′-actttttcat  gaggaagttt  ccattaaacg
ggtaaaatac-3′（配列番号：１３）
オリゴ１４の配列： 5′-gaggaagttt  ccattaaacg  ggtaaaatac-3′
（配列番号：１４）
オリゴ１５の配列： 5′-ccattaaacg  ggtaaaatac-3′（配列番号：１５）
図１７（Ａ）および（Ｂ）によれば、確実な三本形成に必要なオリゴヌクレオチドの長さは、３０−ｍｅｒ以上が必要であることがわかる。また、三本鎖形成効率は、オリゴヌクレオチドの長さが長い方が高いことがわかる。
【００６９】
実施例１５
三本鎖形成反応に必要とされる、オリゴヌクレオチド配列位置関係
図１８（Ａ）のレーン１は、図１５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン２は、ターゲットＤＮＡの末端１０−ｍｅｒを残した末端部位の配列をもつオリゴヌクレオチド１６を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン３は、ターゲットＤＮＡの末端２０−ｍｅｒを残した末端部位の配列をもつオリゴヌクレオチド１７を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。レーン４は、ターゲットＤＮＡの末端３０−ｍｅｒを残した末端部位の配列をもつオリゴヌクレオチド１８を用いた以外は、レーン１と同様の反応を行った結果に由来するものである。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。
オリゴ１６の配列： 5′-caacggctac  agaggctttg  aggactaaag  actttttcat
gaggaagttt  ccattaaacg-3′（配列番号：１６）
オリゴ１７の配列： 5′-acgagggtag  caacggctac  agaggctttg  aggactaaag
actttttcat  gaggaagttt-3′（配列番号：１７）
オリゴ１８の配列： 5′-cagcatcgga  acgagggtag  caacggctac  agaggctttg
aggactaaag  actttttcat-3′（配列番号：１８）
図１８（Ａ）および（Ｂ）によれば、三本形成に必要なオリゴヌクレオチド配列の位置は、ターゲットＤＮＡの末端から２０−ｍｅｒ以内の領域の配列を持つものから、直鎖状ターゲットＤＮＡの末端をおおう配列を持つものまでが必要である。また、直鎖状ターゲットＤＮＡの末端まで、または、末端をおおう配列を持つオリゴヌクレオチドを用いた方が、より三本鎖形成効率は高いことがわかる。
【００７０】
実施例１６
三本鎖形成反応における、オリゴヌクレオチド配列の熱安定性
図１５（Ａ）のレーン１と同様の反応を行ったサンプル１０μｌに２０ｍＭ  ＮａＣｌを加えて、熱処理（３７℃、１０分）を行ったサンプルに由来する電気泳動の結果である。レーン２は、熱処理（４５℃、１０分）のサンプルに由来するものである。レーン３は、熱処理（５５℃、１０分）のサンプルに由来するものである。レーン４は、熱処理（６５℃、１０分）のサンプルに由来するものである。レーン５は、熱処理（７５℃、１０分）のサンプルに由来するものである。レーン６は、熱処理（８５℃、１０分）のサンプルに由来するものである。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。（Ｃ）は。、（Ａ）と同様の実験を、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つ、４０−ｍｅｒの長さのオリゴヌクレオチド２０を用いて行った結果に由来するものである。（Ｄ）は（Ｃ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真である。これらをまとめて、図１９に示す。オリゴ１９の配列： 5′-actttttcat  gaggaagttt  ccattaaacg
ggtaaaatac-3′（配列番号：１９）
図１９によれば、６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いた三本鎖の熱安定性は、８５℃付近が限界で、４０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いた場合には、７５℃付近が限界であることがわかる。用いるオリゴヌクレオチドの長さが６０−ｍｅｒ以上であると、三本鎖の熱安定性は、高いこともわかる。
【００７１】
【配列表】
0004453115.tif 000002
0004453115.tif 000003
0004453115.tif 000004
0004453115.tif 000005
0004453115.tif 000006
0004453115.tif 000007
0004453115.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において標的にされる二本鎖ＤＮＡ分子の模式図である。三本鎖を形成させるためのオリゴヌクレオチド分子と該二本鎖ＤＮＡ分子との関係を配列方向および配列部位と共に示す図である。
【図２】実施例（Ａ）のアガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロミド染色を行ったゲルにおける泳動挙動を示す図に代わる写真である。
【図３】実施例（Ｂ−１）のアガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロミド染色を行ったゲルにおける泳動挙動を示す図に代わる写真である。
【図４】実施例（Ｂ−２）の変性ポリアクリルアミドゲル（通称シーケンシング用ゲル）電気泳動後にオートラジオグラフィーを行ったゲルにおける泳動挙動を示す図に代わる写真である。
【図５】実施例２の標識反応における、各反応成分の依存性を調べた実験データー。それぞれ、下記のサンプルのアガロース電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、ファージベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、全反応成分を加えて反応を行ったサンプル。レーン２は、ｒｅｃＡタンパクを除いてレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを除いてレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン４は、逆相補オリゴヌクレオチドを用いて反応を行ったサンプル。レーン５は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断した標的ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドを用いて、反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲル電気泳動の、ＤＮＡ全染色写真。
（Ｃ）は（Ａ）と同じサンプルを、０．７％アルカリ変性アガロースゲルで電気泳動した結果。
【図６】実施例３の標識された標的ＤＮＡの長さを調べた実験データ。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、反応を行ったサンプル。レーン２は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン１と同じ反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
（Ｃ）は（Ａ）と同じサンプルを、制限酵素ＢｓａＨＩで切断した後に、４５％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。
【図７】実施例４の標識反応における、塩基配列特異性を調べた実験データー。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、反応を行ったサンプル。レーン２は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、制限酵素ＳｃａＩで切断したｐＢＲ３２２  ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて反応を行ったサンプル。レーン３は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて反応を行ったサンプル。レーン４は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断した標的ＤＮＡと、制限酵素ＳｎａＢＩで切断したＭ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、全反応成分を加えて反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図８】実施例５の標識反応における、標的ＤＮＡの標識部位を調べた実験データ。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断したダーゲットＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、反応を行ったサンプル。レーン２は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したサンプル。レーン３は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、制限酵素ＳｎａＢＩで切断Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡのもう１つの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチド（オリゴ６）を用いて、反応を行ったサンプル。レーン４は、レーン３と同じサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図９】実施例６の標識反応における、標的ＤＮＡの標識部位を調べた実験データ。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、反応を行ったサンプル。レーン２は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＸｂａＩで切断したサンプル。レーン３は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したサンプル。レーン４は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＳｍａＩで切断したサンプル。レーン５は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＫｐｎＩで切断したサンプル。レーン６は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＳａｃＩで切断したサンプル。レーン７は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したサンプル。レーン８は、レーン１と同じサンプルを、制限酵素ＢｓａＨＩで切断したサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１０】実施例７の異なるＤＮＡポリメラーゼを用いて標識反応を行った実験データ。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドで三本鎖形成を行い、除ｒｅｃＡ後に、大腸菌ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩで標識反応を行った。レーン２は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン３は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドで三本鎖形成を行い、除ｒｅｃＡ後に、大腸菌ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔで標識反応を行った。レーン４は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン３と同じ反応を行ったサンプル。レーン５は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの配列を持つオリゴヌクレオチドで三本鎖形成を行い、除ｒｅｃＡ後に、大腸菌ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（３′−５′ｅｘｏマイナス）で標識反応を行った。レーン６は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン５と同じ反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１１】実施例８の異なるＤＮＡポリメラーゼを用いて標識反応を行った実験データ。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドで三本鎖形成を行い、除ｒｅｃＡ後に、大腸菌ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（３′−５′ｅｘｏマイナス）で標識反応を行った。レーン７は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン２は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドで三本鎖形成を行い、除ｒｅｃＡを行うことなしに、大腸菌ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（３′−５′ｅｘｏマイナス）で標識反応（反応温度３７℃）を行った。レーン８は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン２と同じ反応を行ったサンプル。レーン３は、除ｒｅｃＡを行うことなしに、大腸菌ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（３′−５′ｅｘｏマイナス）で標識反応（反応温度４７℃）を行った。レーン９は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン３と同じ反応を行ったサンプル。レーン４は、除ｒｅｃＡを行うことなしに、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔで標識反応（反応温度６５℃）を行った。レーン１０は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン４と同じ反応を行ったサンプル。レーン５は、除ｒｅｃＡを行うことなしに、ＰｙｒｏＢｅｓｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩで標識反応（反応温度６５℃）を行った。レーン１１は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン５と同じ反応を行ったサンプル。レーン６は、除ｒｅｃＡを行うことなしに、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩで標識反応（反応温度６５℃）を行った。レーン１２は、オリゴヌクレオチドを加えないでレーン６と同じ反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１２】実施例９の標的ＤＮＡとして、閉環状のＤＮＡに対して標識反応を行った実実験データ。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを標的ＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７を用いて標識反応を行ったサンプル。レーン２はオリゴヌクレオチド８の逆相補オリゴヌクレオチド９を用いて標識反応を行ったサンプル。レーン３はオリゴヌクレオチドを用いないで標識反応を行ったサンプル。レーン４は、用いた標的ＤＮＡを標識反応を行うことなく、そのままサンプルとしたものである。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルのＤＮＡ全染色写真。
【図１３】実施例１０の標識反応後のオリゴヌクレオチドの状態を検討した実験データー。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチド（５′末端標識）で三本鎖形成を行ったサンプル。レーン２は、レーン１と同じ三本鎖形成を行い、続いてｄＸＴＰｓを加えて取り込み反応を行ったサンプル。レーン３は、レーン１と同じ三本鎖形成を行い、続いてｄＸＴＰｓを加えないで取り込み反応を行ったサンプル。レーン４は、レーン１と同じ三本鎖形成を行い、続いてｄＸＴＰｓ（マイナスｄＡＴＰ）を加えて取り込み反応を行ったサンプル。レーン５は、レーン１と同じ三本鎖形成を行い、続いてｄＸＴＰｓ（マイナスｄＣＴＰ）を加えて取り込み反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１４】実施例１１の標識反応の再現性を検討した実験データー。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドで三本鎖形成と標識反応を行った。続いてその標識ターゲットＤＮＡを用いて再度、標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドで、三本鎖形成とｄＸＴＰｓを加えて取り込み反応を行ったサンプル。レーン２は、取り込み反応でＤＮＡポリメラーゼを加えないでレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン３は、取り込み反応でｄＸＴＰｓを加えないでレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン４は、取り込み反応でｄＸＴＰｓの代わりにｄＣＴＰを加えてレーン１と同じサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１５】実施例１２の三本鎖形成反応における、各反応成分の依存性を調べた実験データー。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、全反応成分を加えて三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン２は、ｒｅｃＡタンパクを除いてレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを除いてレーン１と同じ反応を行ったサンプル。レーン４は、逆相補オリゴヌクレオチド（オリゴ４）を用いて反応を行ったサンプル。レーン５は、逆相補オリゴヌクレオチド（オリゴ７）を用いて反応を行ったサンプル。レーン６は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断したターゲットＤＮＡに対するオリゴヌクレオチド（オリゴ１）を用いて、反応を行ったサンプル。レーン７は、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断したターゲットＤＮＡと、そのターゲットＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチド（オリゴ配列３）を用いて、全反応成分を加えて三本鎖形成反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１６】実施例１３の三本鎖形成反応における、用いるオリゴヌクレオチドの配列方向性を調べた実験データー。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチド（５′末端標識）を用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン２は、該オリゴヌクレオチド配列に対して、逆相補配列を持つオリゴヌクレオチド（５′末端標識）を用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン３は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡのもう１つの末端領域の配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン４は、オリゴ配列に対して、逆相補配列を持つオリゴヌクレオチド（５′末端標識）を用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１７】実施例１４の三本鎖形成反応に必要とされる、オリゴヌクレオチドの長さを調べた実験データー。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つ６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン２は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡ末端領域の配列を持つ５０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン３は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡ末端領域の配列を持つ４０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン４は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡ末端領域の配列を持つ３０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン５は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡ末端領域の配列を持つ２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて、三本鎖形成反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１８】実施例１５の三本鎖形成反応に必要とされる、オリゴヌクレオチド配列の位置を調べた実験データー。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つ６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン２は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡ末端から、１０−ｍｅｒ鎖内に入った領域の配列を持つ６０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン３は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡ末端から、２０−ｍｅｒ鎖内に入った領域の配列を持つ６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて三本鎖形成反応を行ったサンプル。レーン４は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡ末端から、３０−ｍｅｒ鎖内に入った領域の配列を持つ６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて三本鎖形成反応を行ったサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１９】実施例１６の三本鎖形成反応における、オリゴヌクレオチド配列の熱安定性を調べた実験データ。それぞれ、下記のサンプルの電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
（Ａ）レーンＭはＤＮＡサイズマーカーで、そのサイズをデータの左に示す。
レーン１は、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡと、その標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つ６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて三本鎖形成反応を行い、除ｒｅｃＡ後に、１×ＳＳＣ中で熱処理（３７℃、１０分）を行ったサンプル。レーン２は、熱処理（４５℃、１０分）のサンプル。レーン３は、熱処理（５５℃、１０分）のサンプル。レーン４は、熱処理（６５℃、１０分）のサンプル。レーン５、熱処理（７５℃、１０分）のサンプル。レーン６は、熱処理（８５℃、１０分）のサンプル。
（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
（Ｃ）は、（Ａ）と同じ実験を、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断した標的ＤＮＡの末端領域の配列を持つ、４０−ｍｅｒの長さのオリゴヌクレオチドを用いて、行った。
（Ｄ）は（Ｃ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0004453115.tif 000021
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0004453115.tif 000024
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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