(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（４−アミノブチロイルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジンである、バルジ塩基がグアニンであるバルジ塩基と特異的に水素結合を形成することができ、かつバルジ塩基の近隣に存在する塩基対によりスタックされ二本鎖内に安定に取り込まれ得るバルジ塩基認識分子。
【請求項２】
標識化されている請求項１に記載のバルジ塩基認識分子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のバルジ塩基認識分子を含有してなるバルジ塩基認識用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のバルジ塩基認識分子を用いて、ＤＮＡ中のバルジ塩基を測定する（ただし人間の体内への適用を除く）方法。
【請求項５】
２−（４−アミノブチロイルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジンであるバルジ塩基認識分子が、バルジ塩基がグアニンであるバルジ塩基と水素結合を形成し、当該バルジ塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされることによりバルジ塩基が安定化されたＤＮＡ。
【請求項６】
バルジ塩基の近隣に存在する塩基対が、バルジ塩基に隣接する塩基対である請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
水素結合が、ワトソン−クリック（Watson-Click）型の塩基対を形成し得る水素結合である請求項５又は６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
バルジ塩基認識分子が標識化されている請求項５〜７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ中のバルジ塩基を特異的に認識することができるバルジ塩基認識分子、バルジ塩基認識用組成物、及びそれを用いたバルジ塩基を測定する方法に関する。また、本発明は、バルジ塩基認識分子がバルジ塩基と水素結合を形成し、かつ近傍の塩基対によりスタックされることによりバルジ塩基が安定化されたＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ及びＲＮＡ中に存在するバルジ構造は、蛋白質による核酸の認識に重要な役割を果たしている。これらの構造に特異的に結合する分子は、バルジ構造を認識する蛋白質の阻害剤としての可能性を有しているため、医薬開発の見地からも注目されている。
バルジＤＮＡ認識分子は、二本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子である。この認識分子が標的とするバルジＤＮＡは、ＤＮＡの複製エラーや、ＤＮＡ損傷の結果として生じる。また、遺伝子の異常であるバルジ塩基の有無は、遺伝病などの診断に利用されている。従って、このバルジＤＮＡ認識分子は、１）遺伝子欠損の有無を調べる診断薬、２）ＤＮＡ損傷の検出薬、３）遺伝子損傷の安定化剤、４）ＤＮＡ修復酵素の阻害剤などへの利用が期待されているのみならず、遺伝子の損傷や遺伝子の複製ミスなどの研究開発において重要な物質である。
【０００３】
図１にバルジ塩基の例を示す。この例では、グアニン（Ｇ）がバルジ塩基として塩基対を形成することができない状態になっている。図１のバルジ塩基となっているグアニン（Ｇ）は、いずれの塩基とも水素結合をしておらず、図１に示されるように、バルジ塩基のグアニン（Ｇ）が塩基対の内側に入ることもできるし、また、図２に示すように塩基対の外側にくることもできる。いずれの場合においても、塩基対の中にバルジ塩基の存在による空間が生じることになる。図１及び図２には、このような空間部分を斜線を入れた四角形で示している。
【０００４】
このようなバルジ塩基を有するＤＮＡを検出する方法として、平面構造を持ちかつＤＮＡをアルキル化出来るＤＮＡインターカレーターがバルジに優先的に結合することを利用する方法が知られているが、この方法は図１又は図２に示されるバルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションするものである。
しかしながら、このような方法では、空間が生じた場合にインターカーレーションするものであり、バルジ塩基の種類にかかわらずインターカーレーションが起こり、バルジ塩基の種類に特異的なものではなかった。
さらに、この方法による従来のものは、図３に示されるようにＤＮＡ対の外側においてインターカーレーションを起こすものが多く、バルジ内に存在する塩基を区別することはできなかった。
【０００５】
また、バルジ塩基を有するＤＮＡを検出する方法として、ＭｕｔＳ等のＤＮＡ修復蛋白が遺伝子損傷箇所に選択的に結合することを利用する方法も知られているが、この方法もバルジ塩基の種類に特異的なものではなかった。
このように、バルジ塩基を有するＤＮＡを検出する方法は数多く開発されているが、バルジ塩基に対する選択性は全くなく、バルジ塩基を選択的に認識、検出することはできなかった。さらに、バルジ内に安定にかつ確実にスタッキングされるものでもなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、二本鎖ＤＮＡ鎖中に存在するバルジ塩基を選択的にかつ高感度で認識、検出することができるバルジ塩基認識分子を提供する。
より詳細には、本発明は、バルジ構造に結合するのみでなく、水素結合を介し、バルジ内に存在する塩基を認識する機能を持ち、さらにバルジ塩基の前後の塩基対によりスタックされ二本鎖内に安定に取り込まれる新規なバルジ塩基認識分子を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、バルジ塩基と水素結合するインターカレーターを用いて、バルジ塩基とインターカレーターの水素結合複合体が、二本鎖ＤＮＡにスタックして安定な複合体を形成することを見出した。これにより、バルジ塩基を選択的に認識し、検出することができた。
即ち、本発明は、バルジ塩基と特異的に水素結合を形成することができ、かつバルジ塩基の近隣に存在する塩基対によりスタックされ二本鎖内に安定に取り込まれ得るバルジ塩基認識分子、バルジ塩基認識剤、及びそれを用いたバルジ塩基を認識する方法に関する。
また、本発明は、バルジ塩基認識分子が、特定のバルジ塩基と水素結合を形成し、当該バルジ塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされることによりバルジ塩基が安定化されたＤＮＡに関する。
【０００８】
本発明者らは、バルジ構造にインタカレートし、相補鎖側の塩基をワトソン−クリック（Watson-Click）型の塩基対形成により認識させることを考え、芳香環と水素結合部位を合わせ持つ次式（Ｉ）で示される水溶性の１，８−ナフチリジン誘導体を合成した。
【０００９】
【化１】
0004413325.tif 000002
このナフチリジン誘導体（Ｉ）は図４に示されるように、グアニン（Ｇ）とワトソン−クリック（Watson-Click）型の塩基対を形成する。そして、このナフチリジン誘導体（Ｉ）は、図５に示されるようにＤＮＡの塩基対の内部にインターカーレートし、隣接する塩基によりスタックされることがわかった。
【００１０】
本発明者らは、５’−３２Ｐでラベルした５２塩基からなる次の塩基配列
GTC GTA GAA TCA GGC AGA ACT AAT AGG CTT AAC ATT CAG GCT TAC CAG TGT C
を有するＤＮＡと、その相補的な配列を有する５’−３２Ｐでラベルした５４塩基からなる次の塩基配列、
GAC ACT GGT AAG CCT GAA TGT TAA GCA＊ CTA TTA GTT CTG CG＊C TGA TTC TAC   GAC
を有するＤＮＡを用いて、DNase１フットプリンティング滴定により調べた。
この５４塩基からなるＤＮＡは、前記した５２塩基からなるＤＮＡと相補的な配列を有しているが、２７番目のアデニン（Ａ）と４１番目のグアニン（Ｇ）と（前記した配列において、塩基の右肩に＊印が付されている。）がバルジ塩基となっている。
【００１１】
このグアニンおよびアデニンバルジを持つ二本鎖ＤＮＡにナフチリジン誘導体（Ｉ）を種々の濃度で加え、DNase１（ＤＮＡ加水分解酵素）による切断の阻害場所を調べた。結果を図６の図面に代わる写真で示す。
DNase１による切断が阻害されたところが、白く見える。ナフチリジン誘導体（Ｉ）の濃度を変化させたときに、グアニン（Ｇ）バルジサイトで選択的に切断が阻害されていることが判る。そして、アデニンバルジサイトにおいては切断されていないことも判る。
切断バンドの強度と加えたナフチリジンの濃度の比から、グアニンバルジサイトへの結合常数が３．４×１０４Ｍ−１と求められた。
【００１２】
また、各バルジ構造を含むＤＮＡを設計し、ナフチリジン誘導体（Ｉ）の存在下における各バルジＤＮＡの熱力学的安定性を融解温度より測定した。その結果、ナフチリジン誘導体（Ｉ）の存在下ではグアニンバルジＤＮＡの融解温度が上昇することが確認され、ナフチリジン誘導体（Ｉ）がグアニンバルジＤＮＡ選択的に結合する分子であることが明らかとなった。
【００１３】
この結果、ナフチリジン誘導体（Ｉ）は、バルジ塩基と特異的にワトソン−クリック（Watson-Click）型の塩基対を形成することができ、かつバルジ塩基に隣接する塩基対によりスタックされ二本鎖内に安定に取り込まれ得るという、全く新しいタイプのバルジ塩基認識分子であることが見出された。
したがって、本発明は、バルジ塩基と特異的にワトソン−クリック（Watson-Click）型の塩基対を形成することができ、かつバルジ塩基に隣接する塩基対によりスタックされ二本鎖内に安定に取り込まれ得るという、全く新しいタイプのバルジ塩基認識分子を提供することができるというコンセプトを確立したものである。
【００１４】
前記した例では、グアニンバルジを例に取り、グアニン塩基と安全な水素結合を形成するナフチリジンを用いたバルジＤＮＡの認識を示したが、バルジの認識はグアニンバルジに限られるものではない。本発明は、バルジ塩基を特異的に認識し得るバルジ塩基認識分子という概念を提供するものであり、バルジ塩基とワトソン−クリック（Watson-Click）型の塩基対を形成することができる分子種を選択することにより、例示したグアニンに限らず、各種の塩基と特異的に塩基対を形成し得る本発明のバルジ塩基認識分子を得ることが可能である。
例えば、バルジ塩基がシトシンの場合には、２−アミノナフチリジン−４−オン又はその誘導体などが、バルジ塩基がアデニンの場合には、２−キノロン誘導体、例えば３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又はその誘導体などが、また、バルジ塩基がチミンの場合には、２−アミノナフチリジン−７−オン又はその誘導体などが用いられる。
【００１５】
特定のバルジ塩基に特異的に認識される本発明のバルジ塩基認識分子は、水素結合を形成するための水素結合部位と、近傍の塩基対にスタッキングされるための平面構造を有しているが、さらに、塩基に対する選択性を増強するためにある程度の立体障害を有する置換基を有するものが好ましい。
また、本発明のバルジ塩基認識分子はこれを単独で使用することもできるが、分子中の適当な位置に放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入するなどして、標識化して使用することもできる。さらに、本発明のバルジ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はリンカーなどを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。
【００１６】
本発明のバルジ塩基認識分子は低分子有機化合物であり、通常の有機合成法により適宜製造することができる。例えば、前記したナフチリジン誘導体（Ｉ）は、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンをＮ−保護−４−アミノ−酪酸の反応性誘導体、例えば酸塩化物を反応させて、２位のアミノ基をアシル化した後、アミノ基を保護基を脱保護して製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。
【００１７】
本発明のバルジ塩基認識分子は、これをバルジ塩基認識剤として使用することができ、また、適当な担体と組み合わせることによりバルジ塩基認識用組成物とすることができる。
さらに、本発明のバルジ塩基認識分子又は標識化若しくは固定化されたバルジ塩基認識分子を使用してＤＮＡ中のバルジ塩基を検出、同定又は定量するための測定をすることができる。
【００１８】
本発明のバルジ塩基認識分子を用いることにより、１個又は２個以上のバルジ塩基を有するＤＮＡにおいて、特定のバルジ塩基、例えば、グアニン、アデニン、シトシン又はチミンの特定のバルジ塩基と水素結合を形成させてこれを安定化させ、バルジ塩基を含有するＤＮＡを安定化させることができる。特に本発明のバルジ塩基認識分子は、特定のバルジ塩基と水素結合を形成するのみならず、近傍、好ましくは隣接する塩基対にスタックされ（図５参照）、バルジ塩基が存在しているにもかかわらず比較的安定なＤＮＡを得ることができる。
したがって、本発明は、バルジ塩基認識分子が、特定のバルジ塩基と水素結合を形成し、当該バルジ塩基の近隣に存在する塩基対にスタックされることによりバルジ塩基が安定化されたバルジ塩基を含有するＤＮＡを提供するものである。
本発明のＤＮＡは、バルジ塩基が本発明のバルジ塩基認識分子と水素結合により塩基対と同様な「対」を形成し、かつバルジ塩基と「対」を形成している本発明のバルジ塩基認識分子が近傍、好ましくは隣接の塩基対を形成している塩基にサンドイッチ状に挟まれてスタックされていることを特徴とするものである。
【００１９】
本発明のバルジＤＮＡ認識分子を用いることにより、従来の技術では達成できないバルジＤＮＡ認識分子を高感度で検出することが出来、バルジ塩基に特異的でかつ安定なバルジＤＮＡを形成することから、ＤＮＡ損傷に伴う各種疾患の治療、予防又は診断に有用である。
また、本発明のＤＮＡはバルジ塩基を有した状態で比較的安定に存在することができることから、バルジ塩基を含有するＤＮＡの安定化や、バルジ塩基の発生原因やバルジ塩基の修復機構の解明などの研究材料として重要である。
【００２０】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１（２−（４−アミノブチロイルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジンの製造）
（１）  ２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジン２６０ｍｇ（１．６３ｍモル）のクロロホルム溶液中に、室温でＮ−Ｂｏｃ−４−アミノ−酪酸スクシンイミジルエステル７３６ｍｇ（２．４５ｍモル）を加えた。室温で１２時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、目的の２−（Ｎ−Ｂｏｃ−４−アミノブチロイルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジン２９９ｍｇ（収率５３％）を白色個体として得た。
【００２２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ：
8.58 (s,1H) , 8.43 (d,1H,J=8.8Hz) , 8.12 (d,1H,J=8.8Hz) ,
7.99 (d,1H,J=8.4Hz) , 7.26 (d,1H,J=8.4Hz) , 4.72 (s,1H) ,
3.23 (m,2H) , 2.74 (s,3H) , 2.51 (t,2H,J=7.6Hz) , 1.93 (m,2H) ,
1.42 (s,9H) .
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ） δ：
172.2 , 163.4 , 156.1 , 154.1 , 153.4 , 139.2 , 136.5 , 121.7 ,
118.5 , 114.3 , 79.3 , 39.8 , 34.9 , 28.4 , 25.6 , 25.5
ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ），ｍ／ｅ（％）：
３４５［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００），２６１（４０）
0004413325.tif 000003
【００２３】
（２）  ２−（Ｎ−Ｂｏｃ−アミノブチロイルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジン１００ｍｇ（０．２９ｍモル）のクロロホルム溶液に、室温で４Ｍ塩酸酢酸エチル溶液１．５ｍＬを加えた。室温で３時間撹拌した後、溶媒を留去し、目的の２−（４−アミノブチロイルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジン塩酸塩８１ｍｇ（収率１００％）を白色個体として得た。
【００２４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ：
8.92 (d,1H,J=8.4Hz) , 8.70 (d,1H,J=8.8Hz) , 8.63 (d,1H,J=8.8Hz),
7.83 (d,1H,J=8.4Hz) , 3.06 (t,2H,J=8.0Hz) , 2.97 (s,3H) ,
2.78 (t,2H,J=6.8Hz) , 2.06 (m,2H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ） δ：
174.2 , 161.2 , 158.6 , 148.7 , 147.4 , 141.4 , 123.5 , 121.4 ,
118.8 , 40.2 , 34.6 , 23.5 , 20.7
ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ），ｍ／ｅ（％）：
２４５［（Ｍ＋Ｈ）＋］（１００）
0004413325.tif 000004
【００２５】
実施例２（DNase１  フットプリンティング滴定）
５’端を３２Ｐでラベルした次の塩基配列を有する５２−ｍｅｒのＤＮＡと、
GTC GTA GAA TCA GGC AGA ACT AAT AGG CTT AAC ATT CAG GCT TAC CAG TGT C５’端を３２Ｐでラベルした次の塩基配列を有する５４−ｍｅｒのＤＮＡ
GAC ACT GGT AAG CCT GAA TGT TAA GCA＊ CTA TTA GTT CTG CG＊C TGA TTC TAC   GAC
からなるＤＮＡ対（４ｎＭ、１０×１０３ｃｐｍ）を、種々の濃度のナフチリジン誘導体（Ｉ）（０−５００μＭ）の存在下に、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（５ｍＭ）を含有するトリス−ＨＣｌバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で、４℃で１２時間インキュベートした。
この混合物中にDNase１（０．２ユニット）を加え、さらに２５℃で８分インキュベートした。エタノールでＤＮＡを沈殿させて、ＤＮＡを回収し、１２％ポリアクリルアミド及び７Ｍの尿素を含有する変性ゲルによる電気泳動で分析した。
結果を図６に示す。レーン１はマキサム−ギルバードのＡ＋Ｇ切断反応（Sequencing reaction ）を、レーン２−１２は各々、０．０、１．０、２．０、３．９、７．８、１６、３１、６３、１２５、２５０、５００μＭのナフチリジン誘導体（Ｉ）を加えた場合ものを示す。バルジサイトが図６の左側に示されている。
【００２６】
切断バンドの強度と加えたナフチリジンの濃度の比から、グアニンバルジサイトへの結合常数が３．４×１０４Ｍ−１と求められた。
【００２７】
実施例３（バルジＤＮＡの融解温度の測定）
次の表１に示されるＤＮＡを用いて、トータル塩基濃度１００μＭのＤＮＡ（２本鎖）を、ナフチリジン誘導体の存在下及び非存在下に、ＮａＣｌ（１００μＭ）を含有するカコジル酸バッファー中で、９０℃で５分間インキュベートし、１時間かけて室温まで冷却した。
この混合物の融解温度を２６０ｎｍの吸収の変化としてＵＶスペクトルを用いて測定した。結果を次の表１に示す。
【００２８】
【表１】
0004413325.tif 000005
表１中のドラッグ１は本発明のナフチリジン誘導体（Ｉ）を示し、Ｔｍ（−）はドラッグを加えない場合の融解温度を示し、Ｔｍ（＋）はドラッグを加えた場合の融解温度を示す。ドラッグの濃度は１００μＭである。（  ）で示した融解温度はドラッグが３００μＭの場合を示す。
この結果、融解温度はナフチリジン誘導体を加えることにより、グアニンバルジで５．０度上昇した。なお、グアニン以外の塩基がバルジ塩基となっている場合及び正常なＤＮＡでは、ナフチリジン誘導体（Ｉ）を加えても融解温度に変化はみられなかった（表１参照）。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のバルジ塩基認識分子を用いることにより、従来の技術では達成できないバルジ塩基認識分子を高感度で検出することが出来る。
本発明のバルジ塩基認識分子は、塩基に特異的で且つ安定性にすぐれており、ＤＮＡ損傷などに起因する各種疾患の治療、予防又は診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、塩基対の内側に向いているバルジ塩基（図ではグアニン）を模式的に示したものである。
【図２】図２は、塩基対の外側に向いているバルジ塩基（図ではグアニン）を模式的に示したものである。
【図３】図３は、塩基対の外側に向いているバルジ塩基（図ではグアニン）に、塩基対の外側からインターカーレーションする様子を模式的に示したものである。
【図４】図４は、本発明のナフチリジン誘導体（Ｉ）とグアニンとの水素結合の様子を示したものである。
【図５】図５は、本発明のナフチリジン誘導体（Ｉ）とグアニンとが水素結合し、塩基対の内部において隣接する塩基にスタッキングされている様子を模式的に示したものである。
【図６】図６は、DNase１フットプリンティング滴定の結果を示す図面に代わる写真である。レーン１はマキサム−ギルバードのＡ＋Ｇ切断反応（Sequencing reaction ）を、レーン２−１２は各々、０．０、１．０、２．０、３．９、７．８、１６、３１、６３、１２５、２５０、５００μＭのナフチリジン誘導体（Ｉ）を加えた場合ものを示す。左側はバルジサイトを示す。
【図１】
0004413325.tif 000006
【図２】
0004413325.tif 000007
【図３】
0004413325.tif 000008
【図４】
0004413325.tif 000009
【図５】
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【図６】
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