(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＯＸＬの形成を促進して、
加齢又は太陽暴露の過程で観察される組織のたるみに抵抗するために、
皮膚の皺を減らすために、抗皺効果を発揮させるために、
瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観を改善するために、
栄養失調による瘢痕やケロイド傷の改善のために、又は、
伸展線に抵抗するために、
弾性繊維の形成を刺激する化粧活性成分のスクリーニング方法であって、
−潜在的化粧活性成分をＬＯＸＬを発現する皮膚細胞と接触させること、及び、
−ＬＯＸＬの発現を調べること、及び
−ＬＯＸＬの活性又は発現を刺激する化粧活性物質を選択すること
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
ＬＯＸＬの形成を促進して、
加齢又は太陽暴露の過程で観察される組織のたるみに抵抗するために、
皮膚の皺を減らすために、抗皺効果を発揮させるために、
瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観を改善するために、
栄養失調による瘢痕やケロイド傷の改善のために、又は、
伸展線に抵抗するために、
弾性繊維の形成を刺激する化粧活性成分のスクリーニング方法であって、
−潜在的化粧活性成分を、タンパク質リシルオキシダーゼのＬ型のアイソフォーム（ＬＯＸＬとも称される）を発現する人間の皮膚の生細胞のうち少なくとも１種と接触させること、及び、
−ＬＯＸＬの発現を調べること、および
−ＬＯＸＬの発現を刺激する化粧活性物質を選択すること
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３】
前記潜在的活性成分が、
−タンパク質ＬＯＸＬをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１種の発現、又は、
−タンパク質ＬＯＸＬのペプチド断片を本質上構成するペプチド配列の発現
を刺激するかどうかを調べる
ことを特徴とする請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＬＯＸＬの発現の調査は、ＬＯＸＬをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の発現の定性又は定量分析によって行う
ことを特徴とする請求項２又は３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列は、ＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡであり、このＬＯＸＬのｃＤＮＡは配列番号２に記載される
ことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＬＯＸＬの発現の調査において、ＬＯＸＬをコードする相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）の少なくとも一部とハイブリダイズするプライマーの使用を含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＬＯＸＬをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅する
ことを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
再生皮膚モデル又は生検に基づくモデルにおいて、
−ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションすることによって、又は、
−免疫検出によって
ＬＯＸＬの発現の位置を確認する段階も含む
ことを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ＬＯＸＬの発現を、前記潜在的活性物質を含んでいない対照におけるＬＯＸＬの発現と比較することを含む
ことを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
生細胞は、正常な人間の皮膚に由来する繊維芽細胞、包皮又は成人被験者の皮膚に由来する繊維芽細胞等を含む
ことを特徴とする請求項２〜８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記生細胞は、正常な人間の皮膚に由来する上皮細胞もしくは角質細胞、又は包皮又は成人被験者の皮膚に由来する上皮細胞もしくは角質細胞を含む
ことを特徴とする請求項２〜９のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記生細胞は、顔、腹部又は胸部に由来し、かつ、「老化」又は日光等に「暴露」されたとみなすことができる少なくとも１種の皮膚、又は、瘢痕若しくは伸展線のある部分由来の皮膚から採取する
ことを特徴とする請求項２〜１０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
再生皮膚モデル、又は、繊維芽細胞を含む真皮モデルの少なくとも１種、又は、生検に基づくモデルを使用する
ことを特徴とする請求項２〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
再生皮膚モデル、又は角質細胞を含む表皮モデルの少なくとも１種を使用する
ことを特徴とする請求項２〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
タンパク質エラスチンの配列、又は、タンパク質エラスチンをコードするヌクレオチド配列の発現を、前記活性成分が前記生細胞と接触しているとタンパク質エラスチンの発現が最終的に刺激されることを明らかにするために、調べる段階を含む
ことを特徴とする請求項２〜１３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リシルオキシダーゼのアイソフォームの、特にＬＯＸＬ（リシルオキシダーゼ類似）アイソフォームの活性の刺激に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚や粘膜の抵抗力や弾力性といった特性は、真皮の膠原繊維及びエラスチン繊維によって本質的に決まる。エラスチンは、フィブリリンやＭＡＧＰ（ミクロフィブリル結合糖タンパク質（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ））等の他の分子と結合することによって弾性繊維を構成するタンパク質である。
【０００３】
「弾性繊維」は、ミクロフィブリル上に沈着したエラスチンから構成される。エラスチンは、可溶性のトロポエラスチンとして合成され、トロポエラスチンは、リシルオキシダーゼによって分子内及び分子間で架橋してミクロフィブリル上に沈着すると、その物理化学特性（不溶性、弾力性）を呈する。弾性繊維は、これを含む器官（管、肺柔組織、弾性軟骨、皮膚等）に収縮性を与える。弾性繊維は、ミクロフィブリル上に沈着したエラスチンから主に構成される。「エラスチン」の名称は、弾性繊維の無定形の部分を構成し、弾性繊維に弾力性を与えるタンパク質について用いられる。最近、弾性繊維を構成するこの成分が表皮中に存在することが分かった。
【０００４】
「コラーゲン細繊維」は、コラーゲンの三本鎖から構成される。このコラーゲンの繊維もまたリシルオキシダーゼによって架橋している。
【０００５】
皮膚や粘膜の加齢は、上記小繊維の網状組織の変性、特に劣化して正確に再生しない弾性繊維の変性と関係がある。同様に、瘢痕の弾性繊維の網状組織も正確な形ではない。ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４の５種のアイソフォームがリシルオキシダーゼ（ＬＯ）ファミリーにおいて知られている（非特許文献１）。ＬＯＸは膠原繊維の架橋に関与していることが分かっている（非特許文献２）。
【０００６】
機能性弾性繊維（主に皮膚、管、網膜の黄斑及び椎間板に存在する）は、胎児成長期及び出生直後に形成される。上記弾性繊維は皮膚中で真皮の繊維芽細胞によって形成されるが、上記弾性繊維の形成に不可欠なある化合物が表皮細胞内にも発見されている。膠原繊維は一生を通して結合組織で合成される。
【０００７】
弾性繊維の交換速度は成人では非常に遅いが、皮膚中の全エラスチン量は増加することがある（非特許文献３）。ミクロフィブリルは新生児においてエラスチンで完全に覆われているわけではなく、思春期頃には完全に覆われるようになる。４０代で繊維において封入体が（特に女性で多く）形成され、その後、真皮と表皮の境界部（ＤＥＪ）において弾性繊維の断裂及び消失がみられる。このようなＤＥＪにおける断裂及び／又は消失は、皮膚の弾力性がなくなって皺ができることから分かる。非機能性弾性繊維は光老化の過程で合成されるが、この増加に伴ってＤＥＪにおける弾性繊維の消失が加速する（非特許文献４）。
【０００８】
また、弾性繊維は、成人の瘢痕では新たに合成されることはほとんどないが、逆に、生成する弾性繊維が著しく断裂しているような高齢者（７０歳以上）において新たに合成される場合がある。この場合、弾性繊維の最終的な組成における主要な構成成分（エラスチン、ミクロフィブリル）も存在しており、またリシルオキシダーゼの活性も全体的に維持されている（非特許文献５）。このことから、本発明者らは、機能性弾性繊維を形成できる１種以上の要素が成人では欠損しているが、胎児成長期から１歳の時点では存在していると考えた。
【０００９】
従来の技術では、皮膚・化粧品学上の活性成分が機能性弾性繊維の新たな形成に与える影響を評価できる基準を定められていない。この状況では、調査すべき上記活性成分の与える影響を評価できるような所望の基準を定めることもまた難しい。実際の活性成分のスクリーニング方法は、エラスチンやフィブリリン等の弾性繊維の形成に関与する遺伝子の発現の評価に影響を与える。
【００１０】
また、現在、動物実験は化粧品においてヨーロッパでは禁止されており、人体実験は倫理上異論が唱えられている。このため、本発明者らは、動物や人間を用いたスクリーニングを化粧品の用途に実施できない。
【００１１】
Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）（Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）等の三次元モデルにおいて、角質細胞はトロポエラスチンの合成及びトロポエラスチンのミクロフィブリル上への沈着を誘導する（非特許文献６）。Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）モデルにおいて、細胞外マトリックスは、放射状のコラーゲンとミクロフィブリル上に沈着したエラスチンからなる弾性繊維とを有し、皮膚の超微細構造に似た超微細構造を呈した。このモデルは、リシルオキシダーゼ阻害剤等の特定分子の有効性を試験するためにも使用されている。このモデルを用いることにより、リシルオキシダーゼを阻害すると膠原繊維及びエラスチン繊維の断裂が誘導されるが、最終分化の標識（フィラグリン等）の発現量も減少することから、角質細胞の分化プログラムからの逸脱もまた誘導されることが証明された（特許文献１）。この特許文献においては、異種のＬＯアイソフォーム間の識別はされていない。
【００１２】
しかしながら、上記の研究では、機能性弾性繊維の形成を刺激できる活性成分の同定方法を明らかにできなかった。
【００１３】
そのため、機能性弾性繊維の形成を刺激できる活性成分は今までのところ明らかにされていない。
【００１４】
また、これまでは、特に従来の方法は不明確であるため、リシルオキシダーゼアイソフォームＬＯＸＬの発現領域を精力的に追跡できなかった。
【特許文献１】Ｆａｒｊａｎｅｌら，フランス特許０１１０４４３，ＣＮＲＳ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （＜Ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｄ’ｉｎｈｉｂｉｔｅｕｒｓ  ｄｅｓ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｙｄａｓｅｓ  ｐｏｕｒ  ｌａ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ  ａｎｄ  ｌｅ  ｇｅｎｉｅ  ｔｉｓｓｕｌａｉｒｅ＞）
【非特許文献１】Ｃｓｉｓｚａｒ，Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅｓ：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，ｖｏｌ  ７０，ｐ２−２８
【非特許文献２】Ｓｅｖｅら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ（ＬＯＸ）  ｉｎ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，４３：６１３−６１９
【非特許文献３】Ａｓｈｃｒｏｆｔら，Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｌａｓｔｉｎ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄｓ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎｓ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９９７，１８３  ：８０−８９
【非特許文献４】Ｗａｔｓｏｎら，Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ−ｒｉｃｈ  ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｓ  ａｒｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｐｈｏｔｏ−ａｇｅｄ  ｓｋｉｎ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｄｅｒｍａｌ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９９，１１２：７８２−７８７
【非特許文献５】Ｐａｓｑｕａｌｉ−Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，Ｂａｃｃａｒａｎｉ−Ｃｏｎｔｒｉ，Ｅｌａｓｔｉｃ  ｆｉｂｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，１９９７，３８：４２８−４３５
【非特許文献６】Ｄｕｐｌａｎ−Ｐｅｒｒａｔら，Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌａｓｔｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ａ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４：３６５−７０，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、主として、上記の技術的な問題、特に機能性弾性繊維の形成を刺激する活性成分の同定方法を提供するための技術的な問題を解決することである。「機能性弾性繊維」という語は、上述した従来の技術においては通常の意味で用いるが、特に本発明においては、三次元構造に由来する収縮性を持つ弾性繊維を意味する。
【００１６】
本発明はまた、特に機能性弾性繊維の形成を刺激するための、リシルオキシダーゼのＬ型のアイソフォームの使用、又は、リシルオキシダーゼのＬ型のアイソフォーム（ＬＯＸＬ）の酵素活性若しくは発現を刺激する活性成分の使用にも関する。
【００１７】
本発明によれば、ＬＯＸＬの発現箇所を確認してこの発現を追跡する方法を提供することからなる技術的な問題を解決できる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本記載中、本発明者らは、「ＬＯＸＬ」又は「ｈＬＯＸＬ」の語が、ヒトリシルオキシダーゼタンパク質のＬ型のアイソフォームＬＯＸＬを意味するものとする。
【００１９】
本記載中、本発明者らは、「ＬＯＸ」又は「ｈＬＯＸ」の語が、ヒトリシルオキシダーゼタンパク質の第一のアイソフォーム（ｉｎｉｔｉａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ）ＬＯＸを意味するものとする。
【００２０】
本発明者らは、「リシルオキシダーゼアイソフォームＬＯＸＬの発現を刺激する」という語が、ＬＯＸＬをコードする遺伝子の発現又はそのプロモーターを刺激すること、特にＬＯＸＬをコードするメッセンジャーＲＮＡの合成を刺激すること、更には、このメッセンジャーＲＮＡ由来のＬＯＸＬの合成を刺激することを意味するものとする。
【００２１】
本発明者らは、「エラスチンの発現を刺激する」という語が、エラスチンタンパク質をコードする遺伝子の発現又はそのプロモーターを刺激すること、特にエラスチンタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの合成を刺激すること、更には、エラスチンタンパク質又はその前駆体トロポエラスチンタンパク質の上記メッセンジャーＲＮＡ由来の合成を刺激することを意味するものとする。
【００２２】
このように、本発明において本発明者らは、上記のＬＯＸＬの発現又はＬＯＸＬの酵素活性のどちらかを主として刺激することを目的とする。
【００２３】
この刺激は、機能性弾性繊維の形成を刺激できる程十分な効果がなくてはならない。
【００２４】
ＬＯＸＬの発現及び／又は活性を示す少なくとも１種の細胞を有するモデルにおけるＬＯＸＬの発現及び／又は活性を、活性成分と接触させた状態で、対照とするモデル（活性成分を接触させない）におけるＬＯＸＬの発現量及び／又は活性に対して約１．５倍活性化又は増加させることができる場合に、その活性成分は有効であると考える。
【００２５】
本発明は、本発明の第一の態様から、配列番号１に記載のリシルオキシダーゼ類似アイソフォーム（ＬＯＸＬとも称される）、又は、その相同体若しくは本質的な相同体、又は、ＬＯＸＬの活性及び／又は発現を促進する成分の、弾性繊維の形成を刺激する組成物を製造するための使用に関する。
【００２６】
「その相同体若しくは本質的な相同体」という語は、本明細書に記載のＬＯＸＬと同じ又は類似の活性を有する、リシルオキシダーゼアイソフォームＬＯＸＬの相同体を意味する。
【００２７】
有利には、ＬＯＸＬの発現は、ＬＯＸＬをコードするヌクレオチド配列の発現か、又は、タンパク質ＬＯＸＬの一部を構成するペプチド配列の発現のどちらかである。このペプチド配列は、配列番号１から選択されることが好ましい。
【００２８】
有利には、上記組成物は、化粧組成物、栄養補助組成物、医療組成物又は医薬組成物である。
【００２９】
有利には、上記組成物は、タンパク質エラスチンの発現を刺激する第二の物質を、特に弾性繊維の形成を刺激するために更に含む。上記第二の物質は、ＬＯＸＬの活性及び／又は発現を促進する物質であることが好ましい。
【００３０】
有利には、上記の活性成分は、ヒトＬＯＸＬ遺伝子のプロモーター（Ｐｒ）のヌクレオチド配列（配列番号３）又はその相同体若しくは本質的な相同体のプロモーターのヌクレオチド配列の少なくとも一部に結合する領域、又は、ヒトＬＯＸＬ遺伝子のプロモーター（Ｐｒ）のヌクレオチド配列（配列番号３）又はその相同体若しくは本質的な相同体のプロモーターのヌクレオチド配列の少なくとも一部に結合するタンパク質の発現を変化させる領域を含む。この配列はＡＴＧコドンの前のヌクレオチド−２６３０に由来するものであり、−２１７２から−１のヌクレオチドについては詳細に研究した。
【００３１】
有利には、上記活性成分は、イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ（ｂｏｘ  ｈｏｌｌｙ）、桂皮、乳酸菌発酵物、エンバク、ジャガイモ、生糸、アサフェティーダガム（Ａｓａ  ｆｏｅｔｉｄａ  ｇｕｍ）、ヘキセン酸エチル及びその誘導体、酪酸メチル及びその誘導体、並びに、デカジエン酸エチル及びその誘導体からなる群より選択される。
【００３２】
有利には、上記使用は、組織における弾性繊維の新たな形成を誘導するために、特にその結果として得られた組織の弾力性を刺激するために、かつ、皮膚の皺を減らすために行う。
【００３３】
有利には、上記使用は、特に組織のたるみが加齢又は太陽暴露の過程で観察される場合、組織のたるみに抵抗するために、又は、細胞外マトリックスの密度を高めるために、又は、皮下組織を引き締めるために、又は、皮膚の皺を減らすために、又は、抗皺効果を発揮させるために、又は、特に栄養失調による瘢痕やケロイド傷の、瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観を改善するために、又は、伸展線に抵抗するために行う。
【００３４】
第二の態様によると、本発明は、上記活性成分を、必要に応じて化粧品に許容される賦形剤との混合物として含む化粧組成物に関する。
【００３５】
第三の態様によると、本発明は、上記活性成分を、必要に応じて食品に許容される賦形剤との混合物として含む栄養補助組成物に関する。
【００３６】
第四の態様によると、本発明は、上記活性成分を、必要に応じて薬学的に許容される賦形剤との混合物として含む医薬組成物に関する。
【００３７】
上記化粧組成物又は医薬組成物について、賦形剤は、例えば、防腐剤、皮膚軟化剤、乳化剤、界面活性剤、保湿剤、濃化剤、調整剤、つや消し剤、安定剤、抗酸化剤、質感調整剤、増白剤、フィルム化剤（ｆｉｌｍｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、可溶化剤、顔料、色素、香料及びソーラーフィルターからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。上記賦形剤は、好ましくは、アミノ酸及びその誘導体、ポリグリセリン、セルロースのエステル、ポリマー及び誘導体、ラノリン誘導体、リン脂質、ラクトフェリン、乳過酸化酵素、スクロース型安定剤、ビタミンＥ及びその誘導体、天然及び合成ワックス、植物油、トリグリセリド、不鹸化物、植物ステロール、植物エステル、シリコーン及びその誘導体、タンパク質加水分解物、ホホバ油及びその誘導体、脂溶性／水溶性エステル、ベタイン、アミン酸化物、植物抽出物、スクロースエステル、二酸化チタン、グリシン、並びに、パラベンからなる群より選択される。より好ましくは、ブチレングリコール、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５ステアリルエーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセリン、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピルヒドロキシセチルエーテル、ステアリン酸グリコール、トリイソノナオイン（ｔｒｉｉｓｏｎｏｎａｏｉｎｅ）、ヤシ油脂肪酸オクチル、 ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、 プロピレングリコール、グリセリン、ビサボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸塩、トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリル、オクタン酸セテアリル、アジピン酸ジブチル、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックス及び鉱物油、イソステアリン酸イソステアリル、プロピレングリコールジペラルゴン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｐｅｌａｒｇｏｎａｔｅ）、イソステアリン酸プロピレングリコール、ＰＥＧ−８ミツロウ、水添パーム核脂肪酸グリセリド、水添パーム油脂肪酸グリセリド、ラノリン油、 ゴマ油、乳酸セチル、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、ラクトース、スクロース、低密度ポリエチレン及び等張食塩水からなる群より選択される。
【００３８】
有利には、上記組成物は、特にビン又はチューブに入れた形での、水性若しくは油性の溶液、水性クリーム、水性ゲル又は油性ゲル、特にボディソープ、シャンプー；乳液；エマルション、マイクロエマルション又はナノエマルション、特に水中油又は油中水又は多相又はシリコーン含有マイクロエマルション又はナノエマルション；ローション、特にガラスビン、プラスチックビン若しくは計量ビンに入れた形の、又は、エアゾール状のローション；アンプル；液体セッケン；皮膚科学的な棒（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｒ）；軟膏；フォーム；無水製品、好ましくは液体、糊状又は固体の無水製品、例えばスティック状、特に口紅；からなる群より選択される形態で処方される。
【００３９】
有利には、上記組成物は十分に液状であれば、特に皮下、目、肺、口又は鼻から投与できる。
【００４０】
有利には、上記糊状又は固体の組成物（ペースト、粉末、タブレット、カプセル、顆粒、坐薬等）は、特に口、舌、鼻又は直腸から体内に導入できる。
【００４１】
有利には、上記組成物の処方において可能であれば、上記組成物は皮膚又は粘膜を通して、特に皮膚又は粘膜に塗布することによって投与する。
【００４２】
有利には、当業者は様々な処方及び投与経路の中から所望の効果に適したものを選択できる。
【００４３】
第五の態様によると、本発明は、上記組成物の使用を含むことを特徴とする美容処置の方法に関する。
【００４４】
有利には、上記美容処置は、特に組織のたるみが加齢又は太陽暴露の過程で観察される場合、組織のたるみへの抵抗、及び、細胞外マトリックスの高密度化、及び、皮下組織の引き締め、及び、皮膚の皺の低減、及び、抗皺効果、及び、特に栄養失調による瘢痕やケロイド傷の、瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観の改善、及び、伸展線への抵抗からなる群より選択される。
【００４５】
第六の態様によると、本発明は、ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を促進して弾性繊維の形成を刺激する成分のスクリーニング方法であって、
−潜在的活性成分を、アイソフォームＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体を発現できる細胞のうち少なくとも１種と接触させること、
−（ａ）特に上記潜在的活性成分がＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を刺激するかどうかを明らかにする目的で、ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の活性を調べること、又は
−（ｂ）特に上記潜在的活性成分がＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現を刺激するかどうかを明らかにする目的で、ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現を調べること
を含むことを特徴とするスクリーニング方法に関する。
【００４６】
ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の発現の調査について、
有利には、上記潜在的活性成分が、
−タンパク質ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１種の発現、及び／又は、
−タンパク質ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体のペプチド断片を本質上構成するペプチド配列の発現
を刺激するかどうかを調べる。
【００４７】
有利には、ＬＯＸＬの発現の調査は、ＬＯＸＬをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の発現の定性及び／又は定量分析によって行う。
【００４８】
有利には、上記ヌクレオチド配列は、ＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡであり、このＬＯＸＬのｃＤＮＡは配列番号２に記載される。
【００４９】
有利には、ＬＯＸＬの発現の調査において、ＬＯＸＬをコードする相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）の少なくとも一部とハイブリダイズするプライマーの使用を含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＬＯＸＬをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅する。
【００５０】
有利には、上記方法はまた、再生皮膚モデル又は生検に基づくモデルにおいて、
−特にＬＯＸＬをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を、例えばＬＯＸＬをコードする相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）の少なくとも一部とハイブリダイズするＤＮＡプローブを少なくとも１種用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションすることによって、又は、
−特にＬＯＸＬの特異的抗体を少なくとも１種用いた免疫検出によって
ＬＯＸＬの発現の位置を確認する段階も含む。
【００５１】
上記特異的抗体は実施例１に詳細に示す。
【００５２】
有利には、上記スクリーニング方法は、ＬＯＸＬの発現を、上記潜在的活性物質を含んでいない対照におけるＬＯＸＬの発現と比較することを含む。
【００５３】
有利には、生細胞は、繊維芽細胞、特に正常な人間の皮膚に由来する繊維芽細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する繊維芽細胞等を含む。
【００５４】
有利には、上記生細胞は、例えば角質細胞のような、上皮細胞、特に正常な人間の皮膚に由来する上皮細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する上皮細胞等を含む。
【００５５】
有利には、上記生細胞は、顔、腹部又は胸部等の特定の部位に由来し、かつ、「老化」又は日光等に「暴露」されたとみなすことができる少なくとも１種の皮膚、又は、瘢痕若しくは伸展線のある部分由来の皮膚から採取する。
【００５６】
有利には、上記スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは繊維芽細胞を含む真皮モデルの少なくとも１種、又は、生検に基づくモデルを使用する。
【００５７】
有利には、上記スクリーニング方法は、再生皮膚モデル又は生検に基づくモデルを使用する。使用する再生皮膚モデルは、有利にはＭｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）再生皮膚モデルであるが、結合性マトリックス、表皮、上皮、再生皮膚又は再生粘膜のモデルであってもよい。
【００５８】
（１）＜三次元結合性マトリックス（真皮又は絨毛膜）培養モデル＞
は、再生真皮又は再生絨毛膜を形成するために、間質細胞を播種した担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンＴＭ膜若しくはテフロンＴＭスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、ＡｎｏｐｏｒｅＴＭ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭＴＭ半透膜、ポリエステル半透膜又はポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体（上記群において、例えば、真皮モデルであるＳｋｉｎ２ＴＭｍｏｄｅｌ  ＺＫ１１００、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（Ｒ）及びＴｒａｎｓｃｙｔｅ（Ｒ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が挙げられる）
−細胞培養処理した樹脂（葉状真皮（ａ  ｄｅｒｍａｌ  ｌｅａｆ）の構造：Ｍｉｃｈｅｌ  Ｍ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ（１９９９）３５：３１８−３２６）
−ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｏｇｒａｆｔ（Ｒ）  ３Ｄ−Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ社）及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素を基盤とするゲル又は膜（上記群において、例えば、真皮モデルであるＶｉｔｒｉｘ（Ｒ）（オルガノジェネシス社）が挙げられる）
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は最終的にはキトサン（ＣＮＲＳのＥＰ０２９６０７８  Ａ１、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社のＷＯ０１／９１１８２１及びＷＯ０１／９２３２２）を含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス
から選択される。
【００５９】
（２）＜三次元表皮又は上皮培養モデル＞
は、再生上皮又は再生表皮を得るために、まず間質細胞、特に繊維芽細胞を、次に上皮細胞、特に角質細胞を播種した、又は、播種していない担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンＴＭ膜若しくはテフロンＴＭスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体（上記群において、再生表皮及び上皮のモデル（Ｓｋｉｎｅｔｈｉｃ（Ｒ））、並びに、ＥｐｉＤｅｒｍ（Ｒ）、ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（Ｒ）、ＥｐｉＯｃｃｕｌａｒ（Ｒ）（Ｍａｔｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）といったモデルが挙げられる）
−ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素を基盤とする薄膜又は膜（上記群において、特に、Ｅｐｉｓｋｉｎ（Ｒ）（ロレアル社）及びＬａｓｅｒｓｋｉｎ（Ｒ）（Ｆｉｄｉａ  ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ社）といったモデルが挙げられる）
から選択される。
【００６０】
（３）＜三次元再生皮膚又は粘膜培養モデル＞
は、再生粘膜を得るために上皮細胞を、又は、再生皮膚を得るために角質細胞を播種した（真皮の又は絨毛膜の）マトリックス担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロンＴＭ膜若しくはテフロンＴＭスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体（上記不活性な担体は間質細胞、特に繊維芽細胞を含む）
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素を基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は最終的にはキトサンを含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス（上記多孔性マトリックスは間質細胞、特に繊維芽細胞を統合したものである）
−人間又は動物の、上皮を剥がした真皮又は死んだ真皮
から選択される。
【００６１】
上記群において、Ａｐｌｉｇｒａｆ（Ｒ）（オルガノジェネシス社）、ＡＴＳ−２０００（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  Ｖｅｒｔｒｉｅｂ社）、特にはＳｋｉｎ２ＴＭ（ＺＫ１２００−１３００−２０００、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）といったモデルを挙げることができる。
【００６２】
また、組織治療に使用できて、本研究の対象ともなり得るモデルもある。上記モデルとしては、ＥｐｉｄｅｘＴＭ（Ｍｏｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅｓ社）、Ｅｐｉｂａｓｅ（Ｒ）（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｖｒｉｅｒ）、ＥｐｉｃｅｌｌＴＭ（ジェンザイム社）、ＡｕｔｏｄｅｒｍＴＭ及びＴｒａｎｓｄｅｒｍＴＭ（イノジェネティックス社）を挙げることができる。
【００６３】
有利には、上記スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは角質細胞を含む表皮モデルの少なくとも１種を使用する。
【００６４】
有利には、上記方法は、タンパク質エラスチン及び／若しくはトロポエラスチンのうち少なくとも１種の配列、又は、タンパク質エラスチンをコードするヌクレオチド配列の発現を、特に上記活性成分が上記生細胞と接触しているとタンパク質エラスチンの発現が最終的に刺激されることを明らかにするために、調べる段階を含む。
【００６５】
有利には、上記方法は、特に弾性繊維の新たな形成を追跡できるかどうかを調べる目的で、特に上皮組織及び／又は結合組織において、タンパク質ＬＯＸＬの発現を免疫検出する段階を含む。上記組織は、再生皮膚モデル又は生検に基づくモデルのうちの少なくとも１種に由来するものである。
【００６６】
有利には、上記活性成分は、イノンド、スグリ、カルダモン、クロハツカダイコン、ナギイカダ（ｂｏｘ  ｈｏｌｌｙ）、桂皮、乳酸菌発酵物、エンバク、ジャガイモ、生糸、アサフェティーダガム（Ａｓａ  ｆｏｅｔｉｄａ  ｇｕｍ）、ヘキセン酸エチル及びその誘導体、酪酸メチル及びその誘導体、並びに、デカジエン酸エチル及びその誘導体からなる群より選択される。
【００６７】
第七の態様によると、本発明は、弾性繊維の新たな形成を追跡できるかどうかを調べる目的で、ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体の組織における発現の位置を特に結合組織において確認する方法に関し、上記組織は再生皮膚モデルの少なくとも１種又は生検に由来し、上記方法は、タンパク質ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体を免疫検出する段階、又は、ＬＯＸＬ、又は、その相同体若しくは本質的な相同体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションする段階を含む。
【００６８】
本発明はまた、組織におけるＬＯＸＬの発現の位置を、弾性繊維の新たな形成を追跡できるかどうかを調べる目的で、特に上皮組織及び／又は結合組織において確認する方法にも関し、上記方法は、タンパク質ＬＯＸＬを免疫検出する段階又はＬＯＸＬをコードする遺伝子をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションする段階を含む。
【００６９】
本発明はまた、タンパク質ＬＯＸＬの酵素活性又は発現を変化させて弾性繊維の形成を刺激する活性成分の使用にも関する。
【００７０】
本発明はまた、タンパク質リシルオキシダーゼアイソフォームＬＯＸＬの酵素活性に関与する欠乏症の治療方法にも関し、上記方法は、患者に、タンパク質リシルオキシダーゼＬＯＸＬ、又は、「その相同体若しくは本質的な相同体」、又は、タンパク質リシルオキシダーゼＬＯＸＬの酵素活性若しくは発現を刺激する化合物を含む組成物を治療効果のある量投与することを含む。
【００７１】
有利には、上記治療方法によって、特に組織のたるみが加齢又は太陽暴露の過程で観察される場合、組織のたるみへの抵抗、及び、細胞外マトリックスの高密度化、及び、皮下組織の引き締め、及び、皮膚の皺の低減、及び、抗皺効果、及び、特に栄養失調による瘢痕やケロイド傷の、瘢痕の組織の質及び瘢痕の外観の改善、及び、伸展線への抵抗から選択される治療を行うことができる。
【００７２】
本発明者らは、ＬＯＸＬの活性が成人における弾性繊維の形成に主として欠けていたこと、そして、このリシルオキシダーゼアイソフォームの合成を再度活性化すると弾性繊維の形成に対する刺激効果が得られることを予想外にも明らかにした。
【００７３】
本発明者らは実際に、リシルオキシダーゼ（ＬＯ）ファミリーのこのアイソフォームが、弾性繊維を生成する再生皮膚モデルにおける弾性繊維の形成に関与していることを明らかにした。年齢の異なる被験者の皮膚中に、皮膚の変化の過程でこのアイソフォームが存在するかどうかを調べたところ、本発明者らは、このアイソフォームと弾性繊維形成とが同時に存在するかどうかということに着目した。そして、成人における弾性繊維の形成時にこのＬＯアイソフォームの活性が欠損しており、機能性弾性繊維の形成を調節するためにはこのＬＯアイソフォームの合成を変化させる必要があることが分かる。
【００７４】
このようにして本発明者らは、このＬＯアイソフォーム（ＬＯＸＬ）の発現における増加を視覚化する方法を見い出し、特に植物抽出物又は化学物質の中から、（特にＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡの発現を刺激する）活性成分を探した。そして活性成分を選択し、これを、特に化粧組成物、皮膚医薬組成物及び医薬組成物中に、加齢による組織のたるみに抵抗し、かつ、瘢痕の組織の質並びに瘢痕及び伸展線の外観を改善するために配合した。
【００７５】
本発明者らは、ＬＯＸＬの成熟形（実施例１及び２参照）に対する特異的抗体を作り、上記のようにして、このリシルオキシダーゼアイソフォームが存在しないことと機能性弾性繊維の合成における問題とが、特に皮膚組織の加齢の過程で、その加齢が自然なものであるか太陽暴露に誘導されるものであるかに関わらず、相互に関係していることを明らかにした。
【００７６】
アイソフォームＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４は、真皮において全く又はほとんど発現しておらず、弾性繊維の形成に関与していない（実施例４参照）。アイソフォームＬＯＸは真皮中に存在していてミクロフィブリルに結合でき、機能性膠原繊維の形成に関与しており、成人の皮膚中に存在する。これより、ＬＯＸが存在しないことと、加齢による弾性繊維の弾力性の消失との間に相互関係はない（実施例３参照）。
【００７７】
従って、弾性繊維の形成におけるＬＯＸＬの作用を明らかにすることは、本発明を完成するために重要であった（実施例５参照）。
【００７８】
ＬＯＸＬと弾性繊維又はミクロフィブリルとが結合していることを、電子顕微鏡検査によって本発明を完成する過程で明らかに示した。ミクロフィブリルに結合したＬＯＸＬは、エラスチンが沈着する足場を構成する。
【００７９】
ＬＯＸＬはエラスチンを架橋して成熟させる酵素であり、機能性弾性繊維を形成できる。
【００８０】
本発明において、本発明者らはＬＯＸＬの発現の位置を確認する方法を完成した。
【００８１】
上記位置確認方法は特にＬＯＸＬの免疫検出を含む。この方法を用いてタンパク質エラスチンの発現を明らかにすることもできる。本発明者らの研究から、ＬＯＸＬはミクロフィブリル上の高密度の沈着物には結合しているが、膠原繊維には結合していないことが分かった。エラスチンは、上記の高密度の沈着物及びミクロフィブリル中に認められた。この現象は、再生皮膚モデルにおいて、特に再生皮膚モデルにおいて角質細胞を添加して３０日後に認められた（実施例５参照）。
【００８２】
ＬＯＸＬとミクロフィブリル及び弾性繊維とが結合していることは、包皮の皮膚中でも、特に免疫検出に続いて透過型電子顕微鏡検査を行って確認した。
【００８３】
ＬＯＸＬは、まだ高いエラスチン合成力を持つ幼い患者（数か月児）から採取した包皮皮膚の真皮中に発現している。しかしながら、ＬＯＸＬは成人の首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中には発現していない。このような、首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中にＬＯＸＬが認められないという現象は、成人の場合には年齢を問わず確認された。人間の皮膚の表皮中にもＬＯＸＬが多く発現していることが（皮膚を約８０歳以上の患者から採取した場合にはその発現が徐々に消失するが）観察された（実施例６参照）。
【００８４】
瘢痕に関しては、ＬＯＸＬは３か月及び５年経過後の瘢痕においても真皮中で観察されなかった。
【００８５】
これに関して、瘢痕ができて３カ月経過後の瘢痕に存在していたエラスチンが、５年後にはこの瘢痕組織に存在していないことは留意すべきである。
【００８６】
このようにして、本発明者らは、弾性繊維の形成におけるＬＯＸＬの作用を、特に再生皮膚モデル又は幼い患者の包皮の真皮を用いて明らかにした。
【００８７】
本発明者らはまた、瘢痕の組織部分及び年齢の異なる人間の皮膚の真皮中に（すなわち加齢の過程において）ＬＯＸＬが発現していないことも明らかにした。
【００８８】
リシルオキシダーゼのアイソフォームのうち、ＬＯＸＬは、弾性繊維を架橋できるアイソフォームの１種である。しかしながら、このアイソフォームＬＯＸＬのみが欠損しているため、成人において、弾性繊維を架橋して機能性繊維を形成することができない。
【００８９】
本発明者らは、上記の予想外の発見により、機能性弾性繊維の形成を刺激する活性成分のスクリーニングを、化粧組成物又は医薬組成物をつくるために活性成分を特定する目的で行った。
【００９０】
本発明はまた、ＬＯＸＬをコードするヒト遺伝子のプロモーターの活性化にも関する（実施例７参照）。
【００９１】
上記プロモーターの様々な活性を明らかにした。このプロモーターの配列を本明細書に添付しており、ＰｒｈＬＯＸＬについての下記の記載に具体的に示す。
【００９２】
このプロモーターについて、ヌクレオチド−７１２／−３９１（ｈＬＯＸＬ遺伝子の翻訳を＋１から始めるとした場合の番号）の領域は、人間の包皮皮膚の繊維芽細胞において移行型トランスフェクションを行った後などに発現するレポーター遺伝子ルシフェラーゼに対しての上方制御活性を有する領域である。
【００９３】
本発明者らは、核因子の制御を受けると推定される部位を特定できた。この因子は、サイトカイン、又は、特定遺伝子の転写に作用することが知られている他の因子と相互に関係があった。
【００９４】
また、ＰｒｈＬＯＸＬの領域のいくつかが、活性化領域又は阻害領域であることが分かった。
【００９５】
特に、−２１７２／−２００２、−１４３８／−９６８及び−７１２／−３９１の領域が活性化領域で、−２００２／−１４３８及び−９６８／−７１２の領域が阻害領域であることが確認された。−８０／−１の領域は活性化領域ではなく、転写された領域の＋１より下流に位置している。この番号において、転写された領域の＋１は、翻訳開始位置から−３４２の位置に相当すると推定される。従って、上記領域のうちいくつかの部位は、ｈＬＯＸＬ遺伝子を制御している可能性があることが分かった。これらの部位とは特に、レチノイン酸応答部位と推定される部位２種、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）応答部位と推定される部位２種、ＥＧＦ（上皮増殖因子）応答部位と推定される部位１種、エストロゲン応答部位と推定される部位３種及びグルココルチコイド応答部位（ＧＲＥ）と推定される部位２種である。
【００９６】
このことは、ｈＬＯＸＬの新規合成及び／又は活性を刺激して弾性繊維の形成を刺激する活性成分が、上記部位に結合しているタンパク質の発現を変化させる際に、特に上記の領域において、直接又は間接的にｈＬＯＸＬ遺伝子のプロモーターに作用することを意味する。これより、ＰｒｈＬＯＸＬのヌクレオチド配列の少なくとも一部、特には上述の推定部位、に結合できる領域、又は、その部位に結合できるタンパク質の発現を変化させることができる領域を含む物質が活性を有すると考えることができるだろう。
【００９７】
本発明者らの研究全般によって、弾性繊維の形成を刺激する活性成分の同定方法を明らかにできた。
【００９８】
本発明において、本発明者らは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、特にＬＯＸＬをコードするメッセンジャーＲＮＡの発現の位置を確認して証明できた。このｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは特に、ジゴキシゲニン標識二本鎖ＤＮＡプローブを用いて、角質細胞を添加して３０日後の、パラフィンで包埋した再生皮膚モデルの断面において行う。同様のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、トロポエラスチン及びコラーゲンα１（Ｉ）のメッセンジャーＲＮＡの発現についても証明した（実施例８参照）。
【００９９】
ＬＯＸＬｍＲＮＡは、真皮深層及び表皮全体に発現している。トロポエラスチンｍＲＮＡは、真皮の繊維芽細胞の付近及び表皮中に発現している。コラーゲンＩα１のｍＲＮＡは、真皮中には発現しているが、表皮中には発現していない。このことから、本発明において、ＬＯＸＬｍＲＮＡの、特に再生皮膚モデルにおける、例えば機能性弾性繊維の形成を刺激する活性成分を塗布した後での発現位置が確認され、証明される。
【０１００】
本発明において、ｈＬＯＸＬ遺伝子は、再生皮膚モデルに、特に、再生皮膚モデルＭｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）（Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）に角質細胞を添加することによって活性化された。ＬＯＸＬｍＲＮＡの合成は、特にトロポエラスチンの合成に付随して、特に真皮と同等のものに角質細胞を添加して約６日後に誘導される。
【０１０１】
更に本発明によって、特にｈＬＯＸＬ遺伝子及びヒトエラスチン遺伝子の発現量の減少を、高齢者由来の繊維芽細胞において明らかにすることも可能になった。
【０１０２】
これに当たって、本発明者らは、包皮由来の繊維芽細胞（ＦＦ）（幼児由来）５株、及び、腹部の形成外科手術の際に採取した成人の繊維芽細胞（ＡＦ）６株（このうち３人の平均年齢は２０歳で、残りの３人の平均年齢は６０歳である）を用いた。また、タンパク質ＬＯＸをコードする遺伝子の発現についても調べた（実施例９参照）。
【０１０３】
目的の上記３種の遺伝子及びアクチンの発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって調べた。本発明はこの種の調査に限定されない。この方法によれば、一定とされるアクチンの発現と比較して遺伝子の発現を正確に定量できる。これによって、この遺伝子の発現量の制御を定量できる。
【０１０４】
図１２に示す結果はまず、ＬＯＸＬｍＲＮＡの合成は、成人の繊維芽細胞において著しくかつ統計上有意に、包皮の繊維芽細胞と比較して７０％近く減少しているが、エラスチンｍＲＮＡの合成は年齢によって有意な差がないことを示す。弾性組織が劣化して交換されないのであれば、この結果がエラスチン遺伝子の活性の阻害によるものとは思われないので、このデータはエラスチンに関する従来の報告と一致する。
【０１０５】
ＡＦにおけるＬＯＸｍＲＮＡの合成はＦＦに対して平均４０％減少するが、この酵素は正常な人間の皮膚中に常に発現しているわけではないため、この変化がｉｎ  ｖｉｖｏにおける現象を非常によく示しているとはいえない。
【０１０６】
弾性繊維の形成を更に刺激するために、エラスチンの発現を刺激することもまた有利である。
【０１０７】
本発明は、ＬＯＸＬの発現を、特に繊維芽細胞において明らかにできる方法を提供する。
【０１０８】
本発明は、弾性繊維の形成を刺激する活性成分を同定するようなやり方で上記様々な方法を実施することを目的とする。
【０１０９】
通常、本発明の方法は、タンパク質ＬＯＸＬの発現を探す方法であり、特にはＬＯＸＬをコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を探す方法である（実施例１０参照）。
【０１１０】
本発明はまた、弾性繊維の形成を刺激する活性成分にも関する（実施例１１及び１２参照）。
【０１１１】
本発明はまた、酵素ＬＯＸＬ若しくはその誘導体又は上記活性成分の、化粧組成物又は医薬組成物を製造するための使用にも関する（実施例１３〜１８参照）。ＬＯＸＬの刺激は、メッセンジャーＲＮＡの、又は、タンパク質そのものの遺伝子レベルで行うことができる。こうして活性化することによって、特に酵素ＬＯＸＬによるエラスチンの架橋によって、弾性繊維を形成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１２】
当業者には、本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の実施例を参照した説明から明らかであろう。
【０１１３】
実施例は本発明に不可欠であり、また、実施例を含む本明細書全体の中に記載される従来技術に照らして新規の特徴は全て、その機能、概略共に本発明に不可欠である。
【０１１４】
上記より、実施例は全て、一般的な範囲を示す。
【０１１５】
また、実施例において、特に指示のない限り、百分率は重量％で、温度は摂氏で、圧力は大気圧で表す。
【実施例１】
【０１１６】
本発明はまずＬＯＸ及びＬＯＸＬの特異的抗体を新規に作ったが、この抗体を用いることによってこれらの成熟形を検出できる。この抗体は、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟領域に対して作った。抗原領域は、他のリシルオキシダーゼ（ＬＯ）アイソフォーム上の対応する領域との類似性が最低限になるように選択した。ペプチドＬＯＸＶ２２８−Ｓ２８０の領域に対して得られた抗体を抗ＬＯＸｍａｔ抗体、同様にペプチドＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８の領域に対して得られた抗体を抗ＬＯＸＬｐｒｏ抗体と称した。
【０１１７】
図１：特異的抗体を作るために決定したＬＯの配列の解説：この図は、抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を作るために抗原領域を選択する段階を表わす。
図１（Ａ）：ｈＬＯＸ（ヒトＬＯＸタンパク質）及びｈＬＯＸＬ（ヒトＬＯＸＬタンパク質）の概略図。
【０１１８】
ｈＬＯＸ及びｈＬＯＸＬの配列を中抜きの長方形で示し、Ｃ末端領域は点を付して類似性の高い領域を強調している。前領域の切断部位、及び、プロコラーゲンＣプロテイナーゼ（ＰＣＰ）による切断部位の位置を、ｈＬＯＸのＡ２２及びＤ１６９残基上にそれぞれ示す。ＬＯＸＬについては、５６ｋＤａの前駆体のＮ末端成熟部位における前領域の切断部位（Ｑ２６残基の前）、及び、５６ｋＤａのＬＯＸＬ前駆体のＰＣＰによる切断部位の位置を、Ｑ１３５残基の前及びＤ３３８残基の前にそれぞれ示す。対応するＬＯＸＬタンパク質Ｑ２６−Ｓ５７４、Ｄ１３５−Ｓ５７４及びＤ３３８−Ｓ５７４の分子量はそれぞれ約６３ｋＤａ、５４．６ｋＤａ及び２６．７ｋＤａと推定される。抗ＬＯＸ抗体を作るために用いた組み換えペプチドの位置を、抗ＬＯＸｐｒｏ抗体についてはペプチドＧ１２８−Ｌ２１２、抗ＬＯＸｍａｔ抗体についてはペプチドＶ２２８−Ｓ２８０、抗ＬＯＸｃａｔ抗体についてはペプチドＤ３０５−Ｎ３７３のように示す。抗ＬＯＸＬ抗体を作るために用いた組み換えペプチドの位置を、抗ＬＯＸＬｐｒｏ抗体についてはペプチドＲ２３１−Ｇ３６８、抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体についてはペプチドＳ３５５−Ｄ４１５のように示す。
【０１１９】
図１（Ｂ）：この表は、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの抗原領域と、ＬＯアイソフォーム上の相当する領域との類似率を示す。
図１（Ｂ）の表中で、ｈＬＯＸＬはヒトＬＯＸＬタンパク質、ｂＬＯＸＬはウシＬＯＸＬタンパク質、ｍＬＯＸＬはマウスＬＯＸＬタンパク質、ｈＬＯＸＬはヒトＬＯＸタンパク質、ｂＬＯＸはウシＬＯＸタンパク質、ｈＬＯＸＬ２はヒトＬＯＸＬ２タンパク質、ｈＬＯＸＬ３はヒトＬＯＸＬ３タンパク質、ｈＬＯＸＬ４はヒトＬＯＸＬ４タンパク質を表わす。
長さ（ａａ）の欄には、対応する領域に含まれるアミノ酸の数を記載する。
【０１２０】
抗体を作るため、決定されているｈＬＯＸＬ又はｈＬＯＸの配列をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の遺伝子と共に発現プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャムバイオサイエンス社）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入して、キメラ遺伝子を構築した。
【０１２１】
センスプライマー５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣ−３’（配列番号１６）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１７）を用いたＰＣＲによって作成したＨＬＯＸＬ（ｃＤＮＡ  ｈＬＯＸＬ）のｃＤＮＡ配列を導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬＳ３５５−Ｄ４１５を構築した。
【０１２２】
センスプライマー５’−ＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号１８）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＧＴＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣ−３’（配列番号１９）をそれぞれ用いて増幅したｈＬＯＸｃＤＮＡを導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＧ１２８−Ｌ２１２を構築した。
【０１２３】
センスプライマー５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号２０）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧ−３’（配列番号２１）をそれぞれ用いて増幅したｈＬＯＸ配列を導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９を構築した。
【０１２４】
センスプライマー５’−ＣＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣ−３’（配列番号２２）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＡＴＡＴＣＧＴＴＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２３）をそれぞれ用いて増幅したｈＬＯＸｃＤＮＡを導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＤ３０６−Ｎ３７３を構築した。
【０１２５】
これらのＰＣＲによる増幅にはすべて、ＴａｑポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイマン（Ｍｅｙｍａｎ）、フランス）を使用した。
【０１２６】
融合タンパク質ＧＳＴ−ＬＯＸ及びＧＳＴ−ＬＯＸＬ、並びに、ウサギポリクローナル抗体を得て、上述の方法で融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬＳ３５５−Ｄ４１５及びＧＳＴ−ＬＯＸＧ１２８−Ｌ２１２の発現に由来する融合タンパク質を精製した（Ｄｅｃｉｔｒｅら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、７８：１４３−１５１、１９９８年；Ｂｏｒｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６：４８９４４−４９、２００１年）。
【０１２７】
吸着実験を、免疫検出に先立ってＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロース膜（アマシャムバイオサイエンス社）上に吸着させておいた融合タンパク質と共に、抗体を２０℃で３時間インキュベートして行った。
【０１２８】
上記の実験を行って、まず最初に、成熟タンパク質の免疫化学上及び生化学上の特性に基づいて、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟形を明らかにすることができた（実施例２（図２）参照）。得られた抗体は、従来ＬＯＸＬに対して用いられていた、ＬＯＸＬの成熟形を認識できない抗体とは区別される（Ｄｅｃｉｔｒｅら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、７８：１４３−１５１、１９９８年；Ｂｏｒｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７６：４８９４４−４９、２００１年）。本発明では抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体及び抗ＬＯＸｍａｔ抗体を用いたが、これらにより、抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体には認識されるが、抗ＬＯＸｍａｔ抗体には認識されない、ＬＯＸＬの成熟形に相当する３１ｋＤａのタンパク質を明らかにすることができた。これより、先行技術、特に、ＬＯファミリーの遺伝子に由来する全てのタンパク質を記載しながらそれらの特徴については定義していないＣｓｉｓｚａｒらの特許に対して、本発明が事実上進展していることが分かる（ＷＯ０１／８３７０２Ａ２：アミンオキシダーゼファミリーのうちリシルオキシダーゼファミリーに属する新規酵素に関連する出願）。
【実施例２】
【０１２９】
「新規抗体、抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体による、筋細胞のＬＯＸ及びＬＯＸＬの免疫検出」
図２：図２は、下記に示す方法で行った電気泳動の写真である。この電気泳動は、実施例１で明らかにした抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を用いることによって、平滑筋細胞（ＳＭＣ）のＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟タンパク質の特性を明らかにしている。
【０１３０】
ラット平滑筋細胞系（Ｊｅａｎ−Ｍａｒｉｅ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｌａｍａｚｉｅｒｅ（ボルドー）により開発）の細胞株（Ｌ）及び細胞培地（Ｍ）からタンパク質を抽出し、抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体、抗ＬＯＸｍａｔ抗体、抗ＬＯＸＬｐｒｏ抗体及び抗ＬＯＸｐｒｏ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。細胞は、３７℃において５％ＣＯ２雰囲気下、１０％ウシ胎児血清、グルタミン２ｍＭ及びゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ）中で培養した。
【０１３１】
細胞株タンパク質を、ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、２時間かけて４℃においてゆっくりと撹拌しながら、溶解バッファー（１６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）、０．５％ＮＰ４０、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートミニ、ロシュ・ダイアグノスティックス社）、及び、尿素６Ｍ）中で抽出した。溶解物を、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートミニ、ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイラン（Ｍｅｙｌａｎ）、フランス）を含む１６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）の２倍量で希釈し、１５０００ｇで５分間遠心分離した。可溶性タンパク質を１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて沈殿させ、電気泳動を行った。
【０１３２】
血清を添加せずに４８時間培養した細胞の培地中のタンパク質を、１０％ＴＣＡ又は５０％飽和硫酸アンモニウムを加えて回収し、沈殿させた。
【０１３３】
免疫検出を行うために、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離した。このタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（イモビロンＰＳＱ、ミリポア社）上に転写し、上述のように免疫検出した（Ｂｏｒｅｌら、２００１年）。
【０１３４】
このように、上記で作った抗体を用いることによって、生体組織中におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟形及び未成熟形を特徴付けてその位置を確認することができる。
【実施例３】
【０１３５】
「弾性繊維の形成におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの作用の実証」
本発明者らは、ＬＯＸ及びＬＯＸＬタンパク質が再生皮膚モデルにおける真皮中の結合組織の形成に関与している可能性があることを、免疫組織化学的手法によって明らかにした（図３）。このことは、２種の酵素（ＬＯＸ及びＬＯＸＬ）の酵素前駆体領域及び成熟領域に対する抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を用いることによって明瞭となった。
【０１３６】
図３：再生皮膚（ＲＳ）及び正常な人間の皮膚中におけるＬＯＸＬ及びＬＯＸの免疫組織学的検出の結果を示すものである。１６日後（Ａ）、３５日後（Ｃ）及び４５日後（Ｅ）の再生皮膚のＬＯＸＬ（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）の免疫検出を、抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体（Ａ、Ｃ、Ｅ）、又は、免疫検出する前に対応するペプチドＧＳＴ−ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８と吸着させた抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体（Ｇ）を用いて行ったものを示す。１６日後（Ｂ）、３５日後（Ｄ）及び４５日後（Ｆ）におけるＬＯＸ（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）の免疫検出を、抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体（Ｂ、Ｄ、Ｆ）、又は、免疫検出する前に対応するペプチドＧＳＴ−ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９と吸着させた抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体（Ｈ）を用いて行ったものを示す。人間の包皮皮膚中のＬＯＸＬ（Ｉ）及びＬＯＸ（Ｊ）の免疫検出を、抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体（Ｉ）及び抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体（Ｊ）を用いて行った。真皮と表皮の境界部を白抜きの矢印で、真皮の基質を矢印で、１６日後の角質細胞の位置を矢印の先端で示す。
【０１３７】
再生皮膚（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）を、ブアン固定液（ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、エラスチン）、又は、１０％ホルマリン溶液（エラスチン用）中で調製し、その後パラフィンで包埋した。厚さ６μｍの断面からパラフィンを除去し、グリシンの塩酸溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）中で漂白した。抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体は上記のものである。
【０１３８】
抗体は次のように希釈して使用した：５００倍（抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体）、１００倍（抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体、抗ＬＯＸＬＳ３５５−Ｄ４１６抗体）。免疫複合体を、ペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧウサギ（ヤギ）抗体（ダコ社、トラップ、フランス）により、基質としてジアミノベンジジン（ダコ社）を用いて検出した。
【０１３９】
上記より、ＬＯＸＬは、再生皮膚モデル（特にＭｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）等）における弾性繊維の形成に関与している可能性が高い。
【実施例４】
【０１４０】
「弾性繊維の形成におけるＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４の作用の実証」
本発明はまた、新規の抗ＬＯＸＬ２抗体２種も作ったが、これらのうち１種は、理論上はＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４も認識する。これを用いることによって、これらの酵素が、再生皮膚モデルにおける真皮中でエラスチンと共に発現するかどうかを明らかにすることができた。上記２種の抗ＬＯＸＬ２抗体を用いて免疫組織化学的に調べたところ、これらの抗原、並びに、抗原性の関連する２種のタンパク質ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４が真皮中に全くあるいはほとんど発現せず、従って弾性繊維の形成に関与していないことが実際に分かった。
【０１４１】
図４：再生皮膚（１６、３５及び４５日後）及び人間の包皮皮膚の断面における、抗ＬＯＸＬ２５１７−５８１抗体（左欄）、及び、理論的にＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を認識する抗ＬＯＸＬ２６６４−７２０抗体（右欄）を用いて行った免疫検出の結果を示す。
【０１４２】
抗ＬＯＸＬ２抗体を、融合ペプチドＧＳＴ−ＬＯＸＬ２に対して上述のようにして得た（Ｄｅｃｉｔｒｅら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７８、１４３−１５１、１９９８年）。融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬ２５１７−５８１を、ヒトＬＯＸＬ２遺伝子（ｈＬＯＸＬ２）配列の１５４３〜１７４７をプラスミドに導入して、上述のように構築した。
【０１４３】
この断片は、ＰＣＲにより、センスプライマー５−ＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＡＣＴＧＣＣ−３’（配列番号３２）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＧＧＣＴＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号３３）を用いて作成した。
【０１４４】
センスプライマー５’−ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号３４）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＴＴＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号３５）を用いて、対応するｈＬＯＸＬ２配列を導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬ２６６４−７２０を構築した。
【０１４５】
上記タンパク質に対して作成した融合タンパク質及び抗ウサギ抗体を、上述のようにして作った。５１７−５８０ペプチドに対する抗体を、この領域がＬＯＸＬ２に特有の領域であることから抗ＬＯＸＬ２抗体と称した。
【０１４６】
６６４−７３４ペプチドに対する抗体を、ＬＯＸＬ２のこの領域がＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４と高い類似性を持つことから（それぞれ、約７４．６％及び６０．５％）、抗ＬＯＸＬ−Ｒ（「関連する」の意）抗体と称した。
【０１４７】
１６日後（ＲＳ−Ｄ１６）、３５日後（ＲＳ−Ｄ３５）及び４５日後（ＲＳ−Ｄ４５）の再生皮膚（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）、及び、人間の包皮皮膚について、上述のように免疫組織化学的手法により、抗ＬＯＸＬ２−Ｒ抗体及び抗ＬＯＸＬ２抗体を用いて調べた。抗ＬＯＸＬ２抗体により、ＬＯＸＬ２が表皮中に発現していて真皮中には発現していないことが分かった。一方、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４に共通するＣ末端領域に対する抗体により、これらの酵素が表皮中に発現していることが確認でき、またこれらの酵素が、真皮中に少し発現しているが、弾性繊維を形成する部位に相当する部分には発現していないことが分かった。
【０１４８】
従って、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４は、弾性繊維の形成には関与していない。
【実施例５】
【０１４９】
「弾性繊維の形成におけるＬＯＸＬの作用の実証」
ＬＯＸＬ及びＬＯＸと、弾性繊維又はミクロフィブリルとの結合が、透過型電子顕微鏡を用いて本発明により明らかに示された。
【０１５０】
ミクロフィブリルに結合したＬＯＸＬ及びＬＯＸは、エラスチンが沈着する足場を構成するが、ＬＯＸのみが膠原繊維の形成と関連している（図５参照）。
【０１５１】
図５：角質細胞を添加して３０日後の再生皮膚、及び、正常な人間の皮膚の真皮部分において透過型電子顕微鏡検査を用いて行ったＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンの免疫検出の結果を示す。
【０１５２】
組織を４℃において３時間、ＰＢＳバッファー（０．１％グルタルアルデヒド含有）に溶解した４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、リン酸バッファー（０．４Ｍスクロース−カコジル酸、及び、０．２Ｍリシン含有）中で洗浄した後、エタノール溶液中で脱水し、ＬＲホワイト（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ社、フランス）で包埋した。検出は、トリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．２）で５０倍に希釈した一次抗体に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたものを用いて行った。４０倍に希釈した金コロイド粒子（１０〜２０ｎｍ）標識抗ＩｇＧウサギ抗体（Ｂｉｏｃｅｌｌ社、トゥブュ（Ｔｅｂｕ）、フランス）を用いて、免疫複合体を検出した。試料を酢酸ウラニルとクエン酸鉛の３％水溶液で染色して、日本電子製１２００ＥＸ透過型電子顕微鏡で調べた。この免疫検出は再生皮膚（Ａ〜Ｄ）及び人間の包皮皮膚（Ｆ〜Ｉ）について行った。
【０１５３】
再生皮膚においては以下の抗体を用いて行った：抗ＬＯＸＬ抗体（Ａ、Ｂ）、抗ＬＯＸ抗体（Ｃ）、抗エラスチン抗体（Ｅｌｍ）（Ｄ）、市販の抗エラスチンヒト抗体（シグマ社、アメリカ）を５０倍に希釈したもの、及び、ネガティブコントロールとして、真皮中の一次抗体を含まないもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｅ）。人間の包皮皮膚においては二重標識を行った（Ｆ〜Ｉ）。
【０１５４】
「Ａ〜Ｄ」：ＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンの、４５日後の再生皮膚の真皮部分における電子顕微鏡を用いた免疫検出。
「Ｅ」：４５日後、すなわち角質細胞を添加して３０日後の再生皮膚の真皮中における、抗エラスチン抗体及び抗コラーゲンＩ抗体を用いたポジティブコントロール。
「Ｆ及びＩ」：ＬＯＸＬ、ＬＯＸ、エラスチン及びコラーゲンの、人間の包皮の真皮部分における電子顕微鏡を用いた二重免疫検出。
「Ｇ及びＨ」：抗ＬＯＸＬウサギ抗体（抗ＩｇＧウサギ抗体は１０ｎｍの金粒子で標識）、及び、抗エラスチンマウス抗体（抗ＩｇＧマウス抗体は２０ｎｍの金粒子で標識）を用いた、人間の包皮の真皮部分における二重標識。
図中の記号：ｍ；ミクロフィブリル、ｃ；膠原繊維、ｅ；無定形のエラスチン。
縮尺の棒：５００ｎｍ。
【０１５５】
ＬＯＸＬ（Ａ、Ｂ）は、高密度の沈着物と結合して、又は、ミクロフィブリル上に検出されたが、上記断面上に白色で現れている膠原繊維と結合しては検出されなかった。ＬＯＸ（Ｃ）の標識については、金粒子が高密度の沈着物、ミクロフィブリル及びコラーゲンと結合してわずかに観察されたが、標識は薄かった。抗エラスチン抗体によって同様に、高密度の沈着物及びミクロフィブリルが検出された（Ｄ）。ＬＯＸＬ及びＬＯＸと、ミクロフィブリル及び弾性繊維との結合を、人間の包皮皮膚中において、免疫検出した後で電子顕微鏡を用いて確認した（Ｇ、Ｈ）。再生皮膚モデルにおける観察と同様に、ＬＯＸＬは膠原繊維とは結合しておらず、ＬＯＸ（膠原繊維と共に多く存在し、ミクロフィブリル上にはほとんど存在しない）とは正反対である。抗原ＬＯＸＬは、ミクロフィブリルと結合していて、人間の包皮皮膚の弾性繊維周辺で検出された。ＬＯＸＬは、ミクロフィブリルの周りに広がる無定形のエラスチンとは結合していないが、ミクロフィブリルの周囲で主に観察され、膠原繊維とも結合していない。
【０１５６】
ＬＯＸＬは、再生皮膚モデル及び人間の包皮皮膚中において弾性繊維と結合している。
【実施例６】
【０１５７】
「ＬＯＸＬの発現と弾性繊維形成との関係の実証」
ＬＯＸＬ及びＬＯＸは、まだ高いエラスチン合成力を持つ幼い患者（数か月児）から採取した包皮皮膚の真皮中に発現している。ＬＯＸＬは成人の首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中には発現していないのに対して、ＬＯＸはいずれの年齢においても真皮中に発現している（図６）。
【０１５８】
図６：ＬＯＸ及びＬＯＸＬの人間の皮膚中における免疫検出の結果を示す。
抗ＬＯＸ抗体（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）及び抗ＬＯＸＬ抗体（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）を用いて、エドアール・エリオ病院（リヨン、フランス）の組織バンク提供の包皮（Ａ、Ｂ）、首（Ｃ、Ｄ）、胸（Ｅ、Ｆ）及び腹（Ｇ、Ｈ）の皮膚の試料中におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。
【０１５９】
首、胸、腹及び顔の皮膚真皮中にＬＯＸＬが検出されないことを、幼児及び成人において確認した（図７：腹）。
【０１６０】
図７：年齢の異なる人間から採取した腹の皮膚におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの免疫検出の結果を示す。
抗ＬＯＸ抗体（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）及び抗ＬＯＸＬ抗体（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）を用いて、エドアール・エリオ病院の組織バンク提供の１．５歳（Ａ、Ｂ）、３５歳（Ｃ、Ｄ）、６０歳（Ｅ、Ｆ）及び９１歳（Ｇ、Ｈ）の人から採取した腹の皮膚の試料中におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。
【０１６１】
この実験において、人間の皮膚表皮中にＬＯＸ及びＬＯＸＬが多く発現していること、これら２種の酵素の発現は非常に長く続くことが観察された（９１歳）（図７）。
【０１６２】
瘢痕については、３か月経過後にも５年経過後にも、瘢痕組織においてＬＯＸＬ及びＬＯＸは観察されなかった。３か月経過後の瘢痕ではエラスチンが免疫検出され、５年経過後の瘢痕では検出されなかったことは留意すべきである（図８）。
【０１６３】
図８：ＬＯＸ及びＬＯＸＬの、治療後の経過期間の異なる瘢痕組織の皮膚中における免疫検出の結果を示す。
抗ＬＯＸ抗体（Ａ、Ｄ、Ｇ）、抗エラスチン抗体（Ｂ、Ｅ、Ｈ）及び抗ＬＯＸＬ抗体（Ｃ、Ｆ、Ｉ）を用いて、１７歳患者の首皮膚の瘢痕周辺（「正常な」部分、Ａ〜Ｃ）、治療から３か月経過後（Ｄ〜Ｆ）及び５年経過後（Ｇ、Ｈ）の試料におけるＬＯＸ、エラスチン及びＬＯＸＬの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。エラスチンの標識には、０．２％ヒアルロニダーゼ（シグマ社）を用いて遮蔽除去（ｄｅｍａｓｋｉｎｇ）することが必要である。
【０１６４】
上記実施例によって、本発明は以下のことを明らかにした：（ｉ）再生皮膚モデル、及び、幼い患者の包皮真皮中において、ＬＯＸＬが弾性繊維の形成に間違いなく関与していること、及び、（ｉｉ）年齢の異なる人間の皮膚真皮、及び、瘢痕において、ＬＯＸＬが本当に発現していないこと。従って、ＬＯＸＬは実際、機能性弾性繊維を架橋することができ、また、機能性繊維を形成するために弾性繊維の架橋が必要な場合において欠損している唯一のリシルオキシダーゼアイソフォームである。また、弾性繊維の形成に関与している可能性のあるＬＯＸについては、成人の皮膚に欠損していない。
【実施例７】
【０１６５】
「ＬＯＸＬ遺伝子の転写前制御に関する研究」
さらに本発明は、ヒトＬＯＸＬ遺伝子（ｈＬＯＸＬ）がプロモーターレベルで活性化される可能性があることを明らかにした（図９）。配列番号３は、このプロモーターの配列の−２７３０から−１のヌクレオチドを記載している。ｈＬＯＸＬプロモーターの活性化領域がいくつか明らかになった。特に、ヌクレオチド−７１２／−３９１（ＬＯＸＬ遺伝子の翻訳を＋１から始めるとした場合の番号）の領域は、人間の包皮皮膚の繊維芽細胞において移行型トランスフェクションを行った後に発現するレポーター遺伝子ルシフェラーゼに対しての上方制御活性を有する領域である。
【０１６６】
ｈＬＯＸＬの発現の変化を遺伝子レベル及び／又はタンパク質レベルで同時に追跡できることを本発明者らが以前明らかにしたので、ＬＯＸＬ遺伝子の転写前上方制御によって、この遺伝子の合成を活性化でき、従ってこの遺伝子に相当するｈＬＯＸＬタンパク質の合成を活性化できることが示される。このことはまた、ＬＯＸについても明らかにされた（Ｄｅｃｉｔｒｅら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７８、１４３−１５１、１９９８年）。
【０１６７】
インターネット上のソフトウェアＴｒａｎｓｆａｃ（Ｒ）を用いて核配列ＰｒＬＯＸＬについて研究した結果、本発明者らは、核因子の制御を受けると推定される部位を特定できた。これらの因子は、サイトカイン、又は、これらの転写因子を経由して特定遺伝子の転写に作用することが知られている他のエフェクターと相互に関係があった。最も興味深い部位を図１０中に示す。このスキームはこの研究をまとめたもので、レチノイン酸応答部位と推定される部位２種、ＴＧＦ−β応答部位と推定される部位２種、ＥＧＦ応答部位と推定される部位１種、エストロゲン応答部位と推定される部位３種及びグルココルチコイド応答部位と推定される部位２種を示す。制御領域については研究されていたため、本発明者らはＬＯＸＬ遺伝子の転写を制御できる可能性のある部位をいくつか特定できた。これらは、レチノイン酸、ＴＧＦ―β、ＥＧＦ及びグルココルチコイドに応答する要素であると推定される。これらの要素がない場合にはプロモーターの活性がそれぞれ約５０％及び６０％減少することから、レチノイン酸及びエストロゲンの制御を受けると推定される部位に対応する領域は、転写を実際に活性化する効果があると思われる。ＴＧＦ−βによる制御部位は、プロモーター活性を低下させると思われる。
【０１６８】
上記に記載したツールは、ｈＬＯＸＬのプロモーターに対して、特に認識部位と推定される部位に対してアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用を有する活性成分のスクリーニングに用いることができる。
【０１６９】
それゆえ、ｈＬＯＸＬのプロモーターのヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズする領域か、又は、この特性を有するエフェクタータンパク質を誘導する領域を有する活性成分を探すのが有利である。
【０１７０】
「ｈＬＯＸＬ遺伝子のプロモーターの機能分析」
ヒトＬＯＸＬ遺伝子のプロモーター（ＰｒｈＬＯＸＬ）を、データベースの配列により特定した。転写開始位置は知られていなかったので、本発明者らは翻訳される＋１からその番号をつけた。しかしながら、この領域に相当するＥＳＴ（発現配列タグ）ｃＤＮＡを検索したが−３４２から上流の配列が得られなかったことから、ｈＬＯＸＬ遺伝子の転写がこの領域（ＴＡＴＡボックスを含まない）から開始されると仮定できる。特異的プライマーは、この配列上の−２１７２〜＋１８９の位置に示されている（エクソン１）。このプライマーを用いることにより、皮膚繊維芽細胞由来のヒトゲノムＤＮＡからＰｒｈＬＯＸＬを増幅及び単離できた。これをクローニングして配列を決定したところ、その配列が予想したものと一致することが分かった。その後、−２１７２〜−１に位置する（完全長であることが分かっている）プロモーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社、シャルボニエール、フランス）にサブクローニングし、真核細胞における研究に用いることができた。このプロモーターはレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだ。これにより、トランスフェクションさせた細胞によるルシフェラーゼの生産はＰｒｈＬＯＸＬに制御され、その活性に比例する。細胞には、結果の標準とするために、強度に再現性よくβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）を発現するプロモーターを同時にトランスフェクションした。同様の条件でルシフェラーゼ及びβ―Ｇａｌ酵素活性を測定した。
【０１７１】
ＰｒｈＬＯＸＬを徐々に短くしていき（５’欠失）、取り出した領域の作用を調べた。人間の皮膚の繊維芽細胞におけるＰｒｈＬＯＸＬの制御を調べるため、この細胞のトランスフェクションを行った。細胞系のトランスフェクションは容易だが、正常な繊維芽細胞のトランスフェクションは非常に難しい。そのため、約４０％の培養繊維芽細胞をトランスフェクションできるＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｒ）（キアゲン社、クルタブーフ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ）、フランス）を用いた。
【０１７２】
その構築物及び包皮繊維芽細胞における活性を図９に示す。本発明者らは、大きな転写活性化領域３つと阻害領域２つの位置を特定した。例えば、−７１２→−３９１領域は、これを取り除くとプロモーターの活性が顕著に減少するので、活性化効果が非常に高い（−３９１→−１の構築物）。この研究により、ＰｒｈＬＯＸＬの転写を刺激するために調べる領域を特定できた。
【０１７３】
特に図９は、プロモーターＰｒｈＬＯＸＬの配列とルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼ活性との相関を示す。この図から、人間の包皮皮膚の繊維芽細胞におけるプロモーターの活性化領域及び阻害領域の定義を容易に理解できる。
【０１７４】
ＰｒｈＬＯＸＬの５’末端を次々に短くしていくことにより、レポーター遺伝子ルシフェラーゼの上流に位置するプロモーターの配列が短くなっていく構築物が７種得られた：ｐＬＬ−２１７２、ｐＬＬ−２００２、ｐＬＬ−１４３８、ｐＬＬ−７１２、ｐＬＬ−３９１、ｐＬＬ−８１。これらの構築物を人間の包皮皮膚の繊維芽細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した。並行して、β―ガラクトシダーゼ遺伝子（プロモーターＳＶ４０の制御を受ける）を有するプラスミドを細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション効果のコントロールとした。β―ガラクトシダーゼ活性（トランスフェクション効果を示す）に対するルシフェラーゼ活性（ｈＬＯＸＬプロモーターの配列の活性を示す）を最終的な値として示す。こうした活性の評価により、＋（−２１７２→−２００２；−１４３８→−９６８；−７１２→−３９１）で表わされる活性化領域３つ、及び、−（−２００２→−１４３８；−９６８→−７１２）で表わされる阻害領域２つを含むプロモーターの制御領域をいくつか特定できた。−８０→−１のプロモーターには活性がなく、転写された領域の＋１より下流に位置している。転写された領域の＋１は、翻訳開始位置から−３４２の位置に相当すると推定される。
【０１７５】
図１０は、ｈＬＯＸＬ遺伝子のプロモーターの概略図であり、特にｈＬＯＸＬ遺伝子の転写制御位置と推定される位置を示す。「＋」で示す領域は、遺伝子の発現を活性化する領域に相当し、「−」で示す領域はこの発現を阻害する領域に相当する。
【実施例８】
【０１７６】
「再生皮膚モデルにおける角質細胞の導入によるＬＯＸＬの活性化の実証」
ＬＯＸＬをコードする遺伝子の発現を、ＬＯＸＬをコードするメッセンジャーＲＮＡとジゴキシゲニン標識二本鎖ＤＮＡプローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをパラフィンで包埋した断面において行うことによって検出した。
３５日後の皮膚モデル断面（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ））を示す図１１において、
（Ａ）ＬＯＸＬの発現は、真皮深層及び表皮全体に渉って陽性である。
（Ｂ）ＬＯＸの発現は、真皮全体及び表皮基底層上部において陽性である。
（Ｃ）トロポエラスチン（ＴＥ）の発現は、真皮の繊維芽細胞及び表皮において見られる。
（Ｄ）遺伝子ＣＯＬ１Ａ１（コラーゲンα１（Ｉ））の発現は、真皮で検出され、表皮では検出されていない。
（Ｅ）プローブのないコントロール。
ＤＥＪを白抜きの矢印で、多孔性の真皮基質を矢印で、陽性細胞を矢印の先端で示す。
【０１７７】
二本鎖ＤＮＡプローブはＰＣＲによって作成した。以下のプライマーをそれぞれ使用した。
Ｉα１コラーゲンの遺伝子にはセンス５’−ＧＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＴＴＧ−３’（配列番号１４）及びアンチセンス５’−ＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧ−３’（配列番号１５）を、トロポエラスチンにはセンス５’−ＧＴＡＴＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１０）及びアンチセンス５’−ＣＧＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧ−３’（配列番号１１）を、ｈＬＯＸにはセンス５’−ＧＧＴＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１２）及びアンチセンス５’−ＧＣＡＡＡＴＣＧＣＣＴＣＴＧＧＴＡＧＣＣＡＴＡＧＴＣ−３’（配列番号１３）を、ｈＬＯＸＬにはセンス５’−ＧＡＣＡＴＡＡＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号８）及びアンチセンス５’−ＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号９）を用いた。
【０１７８】
Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ社、シャルボニエール、フランス）、及び、標識ヌクレオチドとしてＤｉｇ−１１−ｄＵＴＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイラン（Ｍｅｙｌａｎ）、フランス）を用いてＤＮＡを増幅した。次にアガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ抽出キット（キアゲン社、クルタブーフ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ）、フランス）を用いてＤＮＡを精製した。その後、パラフィンで包埋した断面においてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。試料からパラフィンを除去し、２μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ロシュ社）で１５分間２０℃において処理した。内因性のペルオキシダーゼを、ＴＳＡ＋増幅キット（ＮＥＮ社、ボストン、アメリカ）の指示通りに阻害した。プレハイブリダイゼーションを、３７℃において２時間、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）（５０％脱イオン化ホルムアミド、２×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、２．５×デンハート溶液、２００μｇ／ｍｌ変性ニシンＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌサケ精液ＤＮＡ、及び、ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む）中で行った。ハイブリダイゼーションを、３７℃において１６時間、２０ｍＭリン酸バッファー（５０％脱イオン化ホルムアミド、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、２．５×デンハート溶液、２００μｇ／ｍｌ変性ニシン精液ＤＮＡ、及び、１０％硫酸デキストランを含む）中で行った。上記変性プローブは、沸騰湯浴中で５分間処理したものと処理しないものを用いた。ハイブリダイゼーション後、２０℃（コラーゲンについては３７℃）において、２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ、及び、０．５×ＳＳＣ中で断面を洗浄した。乾燥させた後、ジゴキシゲニン標識ハイブリッドを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ロシュ社）を用いて検出した。そしてこの複合体をＴＳＡ＋増幅キット（ＮＥＮ社）を用いて最終的に検出した。陽性シグナルは、アルカリホスファターゼの活性に相当する。この活性は、ＴＳＡキットの増幅手順に基づいて室温において２時間経過後の活性とし、テトラゾリウム塩（ニトロブルーテトラゾリウム／ブロモクロロインドリルリン酸（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を基質として使用）の沈殿によって分かる。
【０１７９】
本発明において、ｍＲＮＡの発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって追跡した結果、ＬＯＸＬ遺伝子とＬＯＸ遺伝子が、再生皮膚モデル（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）中に角質細胞を添加することによって活性化される可能性があることが分かる。（図１１）。
【０１８０】
ＬＯＸＬの合成は、トロポエラスチンの合成に付随して（真皮と同等のものに角質細胞を添加して６日後）誘導されている。
【０１８１】
またＬＯＸ遺伝子も、角質細胞を添加した後、コラーゲンＩα１遺伝子（Ｃｏｌ１Ａ１）と同時に活性化されている。
【実施例９】
【０１８２】
「成人の繊維芽細胞中におけるＬＯＸ遺伝子の発現量低下の実証」
本発明者らは、包皮由来の繊維芽細胞（ＦＦ）（幼児由来）５株、及び、腹部の形成外科手術の際に採取した成人の繊維芽細胞（ＡＦ）６株（このうち３人の平均年齢は２０歳で、残りの３人の平均年齢は６０歳である）を用いた。目的の上記３種の遺伝子及びアクチンの発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、図１２）によって調べた。この方法によれば、（一定とされる）アクチンの発現と比較して遺伝子の発現を正確に定量できる。従って、この遺伝子の発現量の制御を定量できる。
【０１８３】
図１２に示す結果はまず、ＬＯＸＬｍＲＮＡの合成は、成人の繊維芽細胞、特に２０歳代の成人の繊維芽細胞において著しくかつ統計上有意に、包皮の繊維芽細胞と比較して７０％近く減少しているが、エラスチンｍＲＮＡの合成は年齢によって有意な差がないことを示す。弾性組織が劣化して交換されないのであれば、この結果がエラスチン遺伝子の活性の阻害によるものとは思われないので、このデータはエラスチンに関する従来の報告と一致する。
【０１８４】
ＡＦにおけるＬＯＸｍＲＮＡの合成はＦＦに対して平均４０％減少するが、個体差があるため、この変化はあまり重要ではない。
【０１８５】
全ＲＮＡを「ＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」キット（プロメガ社、シャルボニエール、フランス）を用いて精製した。精製したＲＮＡをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（プロメガ社、シャルボニエール、フランス）１００μｌ中に溶解して測定後、プレートに分注した（９６ウェル、各１０μｌ（ＰＣＲによる全ＲＮＡ：５ｎｇ／μｌ））。この実験に用いたプライマーは下記表Ｉの通りである。
【０１８６】
【表１】
0004527451.tif 000002
【０１８７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ｍＲＮＡを含むウェルに対し「Ｑｕａｎｔｉ  Ｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ」キット（キアゲン社、フランス）を用いて、増幅サイクルを行うＯＰＴＩＣＯＮ社製サーマルサイクラー内で行った。５０℃において３０分間逆転写（ＲＴ）反応を行った後、９５℃において１５分間保つことによって、逆転写酵素を阻害し、ポリメラーゼを活性化して、得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を変性させた。その後、連鎖重合（ＰＣＲ）を５０サイクル行った（９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）。１サイクル終了毎に、増幅断片数に比例する蛍光量を読み取った。発現量は、アクチンに対する各遺伝子の発現量の比率で示した。
【０１８８】
前述の研究は弾性繊維の形成におけるＬＯＸＬの関与、及び、成人の皮膚におけるその消滅を明らかにするものであるが、本発明の以下の点は、年齢の異なる繊維芽細胞におけるＬＯＸＬ遺伝子、ＬＯＸ遺伝子及びエラスチン遺伝子の発現量に関連するものである。
【０１８９】
上記実施例は、ＬＯＸＬ遺伝子及びＬＯＸ遺伝子による生成物の合成が、遺伝子レベルで活性化される可能性があることを示すものである。ＬＯＸＬ及びトロポエラスチンのｍＲＮＡの合成は、再生皮膚においても同時に活性化されている。ＬＯＸＬ遺伝子及びトロポエラスチン遺伝子を活性化すると、弾性繊維を形成できる。活性成分をスクリーニングすることによって、エラスチン遺伝子及びＬＯＸＬ遺伝子の発現を同時に再度誘導できる分子を同定し、弾性繊維の形成を刺激できる。
【０１９０】
結論として、本発明により、ＬＯＸＬと弾性繊維とが直接関係していること、再生皮膚における弾性繊維の形成にＬＯＸＬが重要であること、及び、機能性弾性繊維が合成されない組織（成人組織、瘢痕）にＬＯＸＬが存在しないことが分かる。本発明は特に、再生皮膚、皮膚生検及び人間の皮膚中における機能性弾性繊維の発現を再度誘導することを目的とした、ＬＯＸＬとエラスチンの合成を同時に誘導できる新規分子を検出するためのスクリーニング方法に関する。
【実施例１０】
【０１９１】
「ＬＯＸＬ及び／又はエラスチンのメッセンジャーＲＮＡの発現の（例えば、活性を試験する活性成分と接触させて、又は、接触させずに行う定性ＲＴ−ＰＣＲによる）分析」
活性成分を、１％（ｖ／ｖ）の濃度で、正常な人間の皮膚（幼児の包皮又は成人由来）の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、２４ウェル培養プレート中に単層で、既知組成無血清培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で行った。細胞を、例えば１ｃｍ２当たり４０，０００個播種した。コンフルエントになった時点で、細胞を活性成分と有利には２４時間接触させた。有利には、並行して、無処理コントロール１種（培地のみ）及びポジティブコントロール３種（１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１α、及び、２％（ｖ／ｖ）のＰｈｙｔｏｋｉｎｅ（Ｒ）（Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス））についても、例えば同一の培養プレート中で試験した。
【０１９２】
あらかじめ１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、及び、５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１αについて試験し、エラスチンｍＲＮＡ合成の刺激がこの濃度の２種のサイトカインに誘導されることを、ｍＲＮＡ解析、例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＴＧＦ−βについて１０回、ＩＬ−１αについて６回）によって確認した。活性成分を細胞と接触させた後（例えばその２４時間後）に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で洗浄して−８０℃において凍結乾燥して保存した。全ＲＮＡを（例えばシリカカラムを有する９６ウェル抽出キットを用いて）抽出し、９６ウェル分光光度計で２６０ｎｍにおいて測定した（純度の指標：２８０ｎｍにおけるタンパク質の測定）。ＲＮＡを、例えば５ｎｇ／μｌに希釈する。ワンステップ定性ＲＴ−ＰＣＲを、アクチン遺伝子、エラスチン遺伝子、ＬＯＸ遺伝子及びＬＯＸＬ遺伝子について、例えば初期ＲＮＡ５０ｎｇを用いて９６ウェルプレート中で行った。各遺伝子の特異的プライマーは、例えば０．５μＭで用いた。
【０１９３】
−センスエラスチン遺伝子：１Ｅｌａ  ５’−ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＴＧ−３’（配列番号２４）；
−アンチセンスエラスチン遺伝子：２Ｅｌａ  ５’−ＣＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＡＧ−３’（配列番号２５）；
−センスＬＯＸＬ遺伝子：３０Ｌ１  ５’−ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  Ｃ−３’（配列番号２６）；
−アンチセンスＬＯＸＬ遺伝子：３１Ｌ１  ５’−ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＡＣ−３’（配列番号２７）；
−センスＬＯＸ遺伝子：Ｏｘ６４  ５’−ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＣ−３’（配列番号２８）；
−アンチセンスＬＯＸ遺伝子：Ｏｘ６５  ５’−ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号２９）；
−センスアクチン遺伝子：アクチン  Ｕ  ５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３（配列番号３０）；
−アンチセンスアクチン遺伝子：Ｄ  ５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号３１）
【０１９４】
有利には、増幅パラメーターは下記の通りであった。４８℃、３０分間：９４℃、２分間：（９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；６８℃、３０秒間）をアクチンについて２８サイクル、ＬＯＸＬについて３０サイクル、ＬＯＸについて３２サイクル、及び、エラスチンについて３４サイクル：６８℃、１０分間：１４℃、無限。増幅後、産物を、例えば（アクチン増幅産物３μｌ＋エラスチン遺伝子増幅産物５μｌ＋ＬＯＸ遺伝子増幅産物５μｌ＋ＬＯＸＬ遺伝子増幅産物５μｌ）の割合で混合した。ローディングバッファー（２μｌ）を加え、全量（２０μｌ）を、あらかじめ充填しておいたアガロースゲル（インビトロジェン社、フランス）（例えば２％）に載せた。本発明者らは、当業者に公知の方法で発現量を可視化した（例えば、泳動後の試料のバンドを暗室において紫外線下で視覚化し（１５分間）、デジタル撮影した）。ゲルの写真を画像解析し、バンドの濃さを定量した（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ１Ｄ、フランス）。エラスチン遺伝子、ＬＯＸ遺伝子及びＬＯＸＬ遺伝子の発現量を、ネガティブコントロール（無処理）における値に対する百分率で示した。
【０１９５】
＜結果の解釈＞
『「若い」細胞及び「成熟」細胞』
包皮の細胞は、エラスチンをコードするｍＲＮＡを成人における平均量と同じレベルの量発現しているが、ＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡ及びＬＯＸをコードするｍＲＮＡの発現量の場合には、包皮における発現量は非常に多いことが分かる。従って、老齢細胞におけるＬＯＸＬの発現の減少（その結果としてＬＯＸの発現の減少）を逆に上昇させることができるため、このような活性を有する成分をスクリーニングした。
【０１９６】
『活性成分のスクリーニング』
各試験におけるｃＤＮＡ量をアクチンのｃＤＮＡ量と比較し、続いてネガティブコントロール（活性成分を含まない）と比較した。予備実験から、エラスチン（Ｅｌｎ）ｍＲＮＡを約１．３倍増加させ、ＬＯＸＬのｍＲＮＡを約２倍増加させるものが重要であると考えられた。試験した９００種以上の分子又は活性抽出物のうち、１３種の活性成分が試験した濃度において、かつ、規定した条件下でこの基準を満たしていた。これらの活性成分は、下記表ＩＩの通りである。
【０１９７】
【表２】
0004527451.tif 000003
【０１９８】
植物を２〜５％（ｗ／ｗ）の割合で、濃度１００／０〜０／１００の水／（アルコール、グリコール又はポリオール）混合物（エタノール、グリセリン、ブチレングリコール等のグリコール類、キシリトール等）に浸漬して植物抽出物を得た。得られた抽出物をろ過又は蒸留して可溶性画分を回収し、さらに無菌状態でろ過した。化学物質はシグマ社（セントルイス、アメリカ）提供のもので、アルコール又はグリコールで濃度１％に希釈又は分散させて用いた。
【０１９９】
＜結論＞
活性成分バンクの活性成分９６０種のうち１３種が、試験条件下で、成熟年齢の成人（この場合のドナーは６３歳）の腹部の繊維芽細胞において、ＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成量を著しく活性化できた。
【実施例１１】
【０２００】
「化粧品用又は皮膚医薬用活性成分の有効性に関する（例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる）研究」
スクリーニングの第一段階で選択した活性成分を、０．１％〜５％（ｖ／ｖ）の範囲で濃度を変えて、正常な人間（成人）の皮膚の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、２４ウェルプレート中に単層で、既知組成無血清培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で行った。細胞を、例えば１ｃｍ２当たり４０，０００個播種した。活性成分を細胞と接触させた後（２４時間後）に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で洗浄して−８０℃において凍結乾燥して保存した。試験後、エラスチン、ＬＯＸＬ及びアクチンのｍＲＮＡ量をｍＲＮＡ解析、例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。この評価を行うために、これら遺伝子に特有の断片を増幅できるプライマー対として上記のものを用いた（実施例１０）。
【０２０１】
ＲＮＡは、（例えばシリカカラムを有する９６ウェル抽出キットを用いて）抽出して９６ウェル分光光度計で２６０ｎｍにおいて測定した後、希釈した（例えば５ｎｇ／μｌ）。ＲＴ−ＰＣＲ反応（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を、「Ｏｐｔｉｃｏｎ」システム（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いた定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって行った。有利には、ウェルに添加した反応混合液（５０μｌ）は、各試料について下記の通りであった：
−濃度５ｎｇ／μｌのＲＮＡ  １０μｌ、
−様々に標識した所望の特異的プライマー、
−反応混合液（キアゲン社、２×「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ」（ＭｇＣｌ２５ｍＭ含有）２５μｌ＋「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＲＴｍｉｘ」０．５μｌ）、標識ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを伸長過程においてＤＮＡ２本鎖に挿入した。
【０２０２】
「有利には、ＲＴ−ＰＣＲは下記の条件で行った」
逆転写：５０℃で３０分間、その後、９５℃で１５分間。
ＰＣＲ反応：（９４℃、１５秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、３０秒間）を５０サイクル。
コンタミネーションがないことの確認、及び、増幅産物の純度の確認は、例えば、増幅ＰＣＲ産物の融解曲線によって行った。ダブルピーク又は異常な融解温度を示す産物は除去した。
【０２０３】
「分析及び計算方法」
増幅されたＤＮＡの中に組み込まれた蛍光の量を、ＰＣＲサイクルを行う間連続的に測定した。これにより、ＰＣＲサイクル数に対する蛍光量の曲線が得られ、増幅されたＤＮＡの相対量を調べることができた。
【０２０４】
細胞数を考慮するために、上記の結果を全て、ハウスキーピング遺伝子として用いた≪アクチン≫シグナルと比較した。実験から、Ｃ（Ｔ）の測定閾値（＝サイクル閾値）はＴ＝０．０５〜０．０１の間に固定され、任意の測定単位は、各遺伝子について以下の式により計算した。
Ｓｇｅｎｅ≪ｘ≫＝１０７×（１／２）Ｃ（Ｔ）ｇｅｎｅ≪ｘ≫
Ｃ（Ｔ）ｇｅｎｅ≪ｘ≫は、ｇｅｎｅ≪ｘ≫のサイクル閾値が０．０１〜０．０５となるために必要なサイクル数を表わす。
調べたい遺伝子についてのこの値を、以下の比率により≪アクチン≫シグナルと比較した。
Ｒ＝Ｓｇｅｎｅ≪ｘ≫／Ｓアクチン
この比率を、処理した試料と未処理の試料とで比較した。≪ｘ≫はＬＯＸＬ遺伝子又はエラスチン遺伝子である。
【０２０５】
＜結果＞
選択した活性成分のうち２種についての結果を例として表ＩＩＩに示す。
【０２０６】
【表３】
0004527451.tif 000004
【０２０７】
＜結論＞
選択した活性成分は、成熟年齢の成人（この場合のドナーは６３歳）の腹部の繊維芽細胞において、ＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成量を活性化できた。この研究によって、選択した各活性成分の最適な使用濃度を決定することができた。
【０２０８】
実施例１〜１１について：当業者は、本明細書に記載した組成物（処方）を変化させた組成物を作る際に、これらの実施例を見れば適切な方法が分かるであろう。
【実施例１２】
【０２０９】
「水中油エマルション型の化粧品又は医薬品の処方における本発明の生成物の使用」
＜処方１２ａ＞
Ａ      水                                              ｑｓｐ１００
ブチレングリコール                              ２
グリセリン                                      ３
ジヒドロキシセチルリン酸ナトリウム、            ２
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル
Ｂ      ステアリン酸グリコールＳＥ                    １４
トリイソノナオイン                              ５
（ｔｒｉｉｓｏｎｏｎａｏｉｎｅ）
ヤシ油脂肪酸オクチル                            ６
Ｃ     ｐＨ５．５に調節した                            ２
ブチレングリコール、
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
Ｄ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【０２１０】
＜処方１２ｂ＞
Ａ      水                                              ｑｓｐ１００
ブチレングリコール                              ２
グリセリン                                      ３
ポリアクリルアミド、                            ２．８
イソパラフィン、ラウレス−７
Ｂ      ブチレングリコール、                            ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン；
２
フェノキシエタノール、
メチルパラベン、
プロピルパラベン、
ブチルパラベン、
エチルパラベン                                  ０．５
ブチレングリコール
Ｄ     本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【０２１１】
＜処方１２ｃ＞
Ａ      カルボマー                                      ０．５０
プロピレングリコール                            ３
グリセリン                                      ５
水                                              ｑｓｐ１００
Ｂ      ヤシ油脂肪酸オクチル                            ５
ビサボロール                                    ０．３０
ジメチコン                                      ０．３０
Ｃ      水酸化ナトリウム                                １．６０
Ｄ      フェノキシエタノール、                          ０．５０
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｅ      香料                                            ０．３０
Ｆ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１３】
【０２１２】
「油中水型の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸        ３
カプリン酸トリグリセリド                        ３
オクタン酸セテアリル                            ４
アジピン酸ジブチル                              ３
ブドウ種子油                                    １．５
ホホバ油                                        １．５
フェノキシエタノール、                          ０．５
メチルパラベン、プロピルパラベン、
ブチルパラベン、エチルパラベン
Ｂ      グリセリン                                      ３
ブチレングリコール                              ３
硫酸マグネシウム                                ０．５
ＥＤＴＡ                                        ０．０５
水                                              ｑｓｐ１００
Ｃ      シクロメチコン                                  １
ジメチコン                                      １
Ｄ      香料                                            ０．３
Ｅ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１４】
【０２１３】
「シャンプー又はボディソープ状の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      キサンタンガム                                  ０．８
水                                              ｑｓｐ１００
Ｂ      ブチレングリコール、                            ０．５
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、                          ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｃ      クエン酸                                        ０．８
Ｄ      ラウレス硫酸ナトリウム                        ４０．０
Ｅ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１５】
【０２１４】
「口紅等の無水製品状の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      ミネラルワックス                              １７．０
イソステアリン酸イソステアリル                ３１．５
プロピレングリコールジペラルゴン                ２．６
（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｐｅｌａｒｇｏｎａｔｅ）
イソステアリン酸プロピレングリコール            １．７
ＰＥＧ−８ミツロウ                              ３．０
水添パーム核脂肪酸グリセリド、                  ３．４
水添パーム油脂肪酸グリセリド      
ラノリン油                                      ３．４
ゴマ油                                          １．７
乳酸セチル                                      １．７
鉱物油、ラノリンアルコール                      ３．０
Ｂ      ヒマシ油                                        ｑｓｐ１００
二酸化チタン                                    ３．９
ＣＩ  １５８５０：１                            ０．６１６
ＣＩ  ４５４１０：１                            ０．２５６
ＣＩ  １９１４０：１                            ０．０４８
ＣＩ  ７７４９１                                ２．０４８
本発明の生成物                                  ０．０１〜５％
【実施例１６】
【０２１５】
「水性ゲル（アイライナー、痩身剤等）の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      水                                              ｑｓｐ１００
カルボマー                                      ０．５
ブチレングリコール                            １５
フェノキシエタノール、                          ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１７】
【０２１６】
「ＬＯＸＬを含有する医薬品の処方の調製」
＜処方１７ａ＞錠剤の調製
Ａ      賦形剤                                          ｇ単位、１錠あたり
乳糖                                            ０．３５９
スクロース                                      ０．２４０
Ｂ      ＬＯＸＬ抽出物＊                                ０．００１〜０．１
（ＬＯＸＬ抽出物＊は、例えば実施例２に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。）
【０２１７】
＜処方１７ｂ＞軟膏の調製
Ａ      賦形剤
低密度ポリエチレン                              ５．５
流動パラフィン                                  ｑｓｐ１００
Ｂ      ＬＯＸＬ抽出物＊                                ０．００１〜０．１
（ＬＯＸＬ抽出物＊は、例えば実施例２に記載したように抽出し、その後必要に応じて乾燥させることによって得られる。）
【０２１８】
＜処方１７ｃ＞注射剤の処方の調製
Ａ      賦形剤
等張食塩水                                      ５ｍｌ
Ｂ     ＬＯＸＬ抽出物＊                                ０．００１〜０．１ｇ
（ＬＯＸＬ抽出物＊は、例えば実施例２に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。）
Ａ相とＢ相は別々にアンプルで包み、使用前に混合する。
【実施例１８】
【０２１９】
「本発明の生成物を含む製剤の化粧品としての許容性の評価」
実施例１０及び１１で得られた化合物を１０％の割合で０．５％キサンタンガムに混合したものの毒性を、ウサギにおける眼刺激試験、ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験、及び、モルモットにおける感作性試験によって調べた。
【０２２０】
『ウサギの皮膚における一次刺激の評価』
上記製剤を、ウサギ３匹の皮膚に、≪皮膚に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関するＯＥＣＤ推奨の方法に従って、希釈せずに０．５ｍｌずつ投与した。
【０２２１】
生成物を、１９８２年２月２１日のフランス共和国の公式機関紙（“ＪＯＲＦ”）で公表された、１９８２年２月１日の決議の中で定義された基準に従って分類した。
【０２２２】
上記試験結果から、実施例１１で得られた物質を含有する製剤は、皮膚に対して刺激がないものとして分類されることが分かる。
【０２２３】
「ウサギにおける眼刺激試験」
上記製剤を純粋な状態で、≪眼に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関して１９８７年２月２４日にＯＥＣＤ指令書４０５番によって公式に推奨されている方法に従い、０．１ｍｌを１回でウサギ３匹の眼中に滴下した。
この試験の結果から、これらの製剤は、純粋な状態で又は希釈せずに使用した場合、９１／３２６のＥＥＣの意味において、眼に対して刺激がないものとして考えられる。
【０２２４】
「ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験」
上記製剤を、１９８７年２月２４日のＯＥＣＤ指令書４０１番から着想して化粧品に適用したプロトコールに従って、雄ラット５匹及び雌ラット５匹に、５ｇ／体重１ｋｇの量を１回で経口投与した。
ＬＤ０及びＬＤ５０は、５０００ｍｇ／ｋｇ以上であることが分かっている。従って、試験した製剤は、経口摂取が危険な製剤には分類されない。
【０２２５】
『モルモットにおける潜在的皮膚感作性試験』
上記製剤に対して、ＯＥＣＤ４０６番の指令書に従ったプロトコールであるＭａｇｎｕｓｓｏｎ−Ｋｌｉｇｍａｎｎ極大試験を行った。
これらの製剤は、皮膚との接触において感作性がないものとして分類される。
【０２２６】
記載した配列の解説
配列番号１：ヒトタンパク質ＬＯＸＬのペプチド配列である。
配列番号２：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号３：配列番号１に記載したタンパク質ＬＯＸＬをコードするヒト遺伝子のプロモーターをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号４：ヒトタンパク質トロポエラスチンのペプチド配列である。
配列番号５：配列番号４に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号６：ヒトタンパク質ＬＯＸのペプチド配列である。
配列番号７：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【０２２７】
二本鎖ＤＮＡプローブに関しては
配列番号８：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号９：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１０：配列番号４に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１１：配列番号４に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１２：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１３：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１４：ヒトタンパク質コラーゲンＩα１ＬをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１５：ヒトタンパク質コラーゲンＩα１ＬをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
【０２２８】
融合遺伝子ＧＳＴに関しては
配列番号１６：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｓ３５５−Ｄ４１５のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１７：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｓ３５５−Ｄ４１５のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１８：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｇ１２８−Ｌ２１２のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１９：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｇ１２８−Ｌ２１２のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号２０：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｖ２２８−Ｓ２７９のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号２１：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｖ２２８−Ｓ２７９のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号２２：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｄ３０６−Ｎ３７３のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号２３：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｄ３０６−Ｎ３７３のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
【０２２９】
ＰＣＲプライマーに関しては
配列番号２４：配列番号４に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号２５：配列番号４に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアンチセンスプライマーである。
配列番号２６：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号２７：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡの配列のアンチセンスプライマーである。
配列番号２８：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号２９：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアンチセンスプライマーである。
配列番号３０：ヒトタンパク質アクチンをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号３１：ヒトタンパク質アクチンをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアンチセンスプライマーである。
【０２３０】
融合遺伝子ＧＳＴに関しては
配列番号３２：融合遺伝子ＧＳＴ  ５１７−５８１のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号３３：融合遺伝子ＧＳＴ  ５１７−５８１のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号３４：融合遺伝子ＧＳＴ  ６６４−７２０のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号３５：融合遺伝子ＧＳＴ  ６６４−７２０のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】特異的抗体を作るために決定したＬＯの配列の解説。図１（Ａ）：ｈＬＯＸ（ヒトＬＯＸタンパク質）及びｈＬＯＸＬ（ヒトＬＯＸＬタンパク質）の概略図。図１（Ｂ）：ＬＯＸ及びＬＯＸＬの抗原領域と、ＬＯアイソフォーム上の相当する領域との類似率を示す。
【図２】抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を用いて平滑筋細胞（ＳＭＣ）について行った電気泳動の写真。
【図３】再生皮膚（ＲＳ）及び正常な人間の皮膚中におけるＬＯＸＬ及びＬＯＸの免疫組織学的検出。
【図４】再生皮膚（１６、３５及び４５日後）及び人間の包皮皮膚の断面における、抗ＬＯＸＬ２５１７−５８１抗体（左欄）、及び、理論的にＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を認識する抗ＬＯＸＬ２６６４−７２０抗体（右欄）を用いて行った免疫検出。
【図５】角質細胞を添加して３０日後の再生皮膚、及び、正常な人間の皮膚の真皮部分において透過型電子顕微鏡検査を用いて行ったＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンの免疫検出。
【図６】ＬＯＸ及びＬＯＸＬの人間の皮膚中における免疫検出。
【図７】年齢の異なる人間から採取した腹の皮膚におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの免疫検出。
【図８】ＬＯＸ及びＬＯＸＬの、治療後の経過期間の異なる瘢痕組織の皮膚中における免疫検出。
【図９】プロモーターＰｒｈＬＯＸＬの配列とルシフェラーゼ／β−ガラクトシダーゼ活性との相関。
【図１０】核配列ＰｒＬＯＸＬにおける、核因子の制御を受けると推定される部位。
【図１１】３５日後の皮膚モデル断面において行ったｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる、ＬＯＸＬをコードする遺伝子の発現の検出。
【図１２】ＬＯＸ遺伝子、ＬＯＸＬ遺伝子、エラスチン遺伝子及びアクチン遺伝子の、幼児包皮及び成人皮膚における発現。
【図１】
0004527451.tif 000005
【図２】
0004527451.tif 000006
【図９】
0004527451.tif 000007
【図１０】
0004527451.tif 000008
【図１２】
0004527451.tif 000009
【図３】
0004527451.tif 000010
【図４】
0004527451.tif 000011
【図５】
0004527451.tif 000012
【図６】
0004527451.tif 000013
【図７】
0004527451.tif 000014
【図８】
0004527451.tif 000015
【図１１】
0004527451.tif 000016
【配列表】
0004527451000001.app