(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウィルスパッケージングシグナルにおける欠失及びプロテアーゼコード配列を含むレンチウィルスｐｏｌ遺伝子の一部を含むレンチウィルスパッケージング構築物であって、該プロテアーゼコード配列がコードされるレンチウィルスプロテアーゼにおけるＴ２６Ｓ置換から成る変異を含むものである、前記レンチウィルスパッケージング構築物。
【請求項２】
更にレンチウィルスｇａｇ遺伝子の一部を含む、請求項１記載のパッケージング構築物。
【請求項３】
ＨＩＶゲノム由来である、請求項１記載のパッケージング構築物。
【請求項４】
プロテアーゼがＨＩＶプロテアーゼである、請求項１記載のパッケージング構築物。
【請求項５】
更に、ＨＩＶｖｉｆ又はｖｐｒ遺伝子における変異を有する、請求項３記載のパッケージング構築物。
【請求項６】
ＢＩＶゲノム由来である、請求項１記載のパッケージング構築物。
【請求項７】
プロテアーゼがＢＩＶプロテアーゼである、請求項１記載のパッケージング構築物。
【請求項８】
更に、ＢＩＶｖｉｆ、Ｗ，Ｙ又はＴａｔ遺伝子における変異を有する、請求項６記載のパッケージング構築物。
【請求項９】
更にＳＡＲ要素を有する請求項１記載のパッケージング構築物。
【請求項１０】
ＳＡＲ要素がＩＦＮ−ＳＡＲ要素である、請求項９記載のパッケージング構築物。
【請求項１１】
ＩＦＮ−ＳＡＲ要素がβ−ＩＦＮ−ＳＡＲ要素である、請求項１０記載のパッケージング構築物。
【請求項１２】
ｖｉｆ及びｖｐｒである二つのアクセサリタンパク質が欠失している、請求項４記載のパッケージング構築物。
【請求項１３】
ｖｉｆ及びｖｐｒである二つのアクセサリタンパク質が欠失している、請求項９記載のパッケージング構築物。
【請求項１４】
請求項１記載のパッケージング構築物を含有するプレパッケージングセルライン。
【請求項１５】
更に、少なくとも５ｎｇ／ｍｌのＨＩＶｐ２４又はＢＩＶＲＴタンパク質を発現する能力があることを特徴とする、請求項１４記載のプレパッケージングセルライン。
【請求項１６】
レンチウィルスｐｏｌタンパク質の発現が構成的である、請求項１４記載のプレパッケージングセルライン。
【請求項１７】
請求項１記載のパッケージング構築物及び更にｅｎｖ遺伝子を含む構築物を含有するパッケージングセルライン。
【請求項１８】
ｅｎｖ遺伝子がＶＳＶ−Ｇｅｎｖ遺伝子である、請求項１７記載のパッケージングセルライン。
【請求項１９】
ｅｎｖ遺伝子が変異ＬＣＭＶｅｎｖ遺伝子である、請求項１７記載のパッケージングセルライン。
【請求項２０】
請求項１記載のパッケージング構築物、ｅｎｖ遺伝子、及び更にレンチウィルスベクターを含有する、プロデューサーセルライン。
【請求項２１】
更に、少なくとも１０Ｅ５ｃｆｕ／ｍｌのレンチウィルス力価を産生する能力があることを特徴とする、請求項２０記載のプロデューサーセルライン。
【請求項２２】
請求項２０記載のプロデューサーセルラインから得られた、複製欠如のレンチウィルスベクター粒子。
【請求項２３】
請求項１７記載の安定的なパッケージングセルラインをレンチウィルスベクターでトランスフェクトし、適当な培地中で得られたセルラインを増殖させ、該培地からレンチウィルスベクター粒子調製物を取得することから成る、レンチウィルスベクター粒子調製物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／２７５，２７５号；２００１年３月１３日出願（レンチウィルスパッケージング構築物）の３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づく利益を請求する。この仮出願の開示全体が本明細書に参照され援用される
【０００２】
本発明は、新規なレンチウィルスパッケージング構築物、安定的なパッケージングセルライン、安定的なプロデューサーセルライン、及びそれらの哺乳動物における組み換えレンチウィルスベクターの生産への使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
レンチウィルスは複雑なレトロウィルスであり、レトロウィルスに共通なｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子に加えて、調節又は構造的機能を有する他の遺伝子を有する。より複雑なおかげでレンチウィルスは潜伏感染（不顕性感染）の過程における生活サイクルを調整することが出来る。性質が調べられている典型的なレンチウィルスはヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）であるが、幾つかの動物レンチウィルスも同様に良く研究されている。
【０００４】
レンチウィルス由来のウィルスベクターは遺伝子運搬用の便利な道具である。広範囲なげっ歯類、霊長類、及びヒト体細胞へ遺伝子を運搬することの出来るレンチウィルスベクターの能力によって、該ベクターは遺伝子治療の目的で遺伝子を細胞に移入 (transfer) することに非常に適している。レンチウィルス神経及びマクロファージのような殆ど分裂しない最終的に分化した細胞に感染することが出来るので、それは非分裂細胞への形質導入を必要とする或る遺伝子治療には特に有効である。
【０００５】
組換えレンチウィルスベクターを産生するために、感染性ビリオンの産生に必要なタンパク質をイントランスで供給するパッケージングセルラインが使用される。レトロウィルスパッケージングセルラインを構築する際に考慮すべき重要なことは、組換え複製可能なレトロウィルス（recombinant replication competent retrovirus :ＲＣＲ）を含まない、高力価のベクター上清を製造することである。パッケージングセルにおいてＲＣＲが生じる可能性を最小にするためにアプローチの一つは、パッケージング機能を少なくとも二つの構築物、例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子産物を発現する構築物と、ｅｎｖ遺伝子産物を発現するもう一つの構築物とに分離することである。この手段は二つのゲノムのコパッケージング及びそれに続く移入の可能性を最小限にし、同様にパッケージングセルにおけるウィルスゲノム間の組換えによりＲＣＲが生産される頻度を減少させる。組換えが起こる場合には、望まない遺伝子産物内で変異又は欠失が構成され、可能性のある如何なる組換えも非機能的にしてしまう。更に、パッケージング構築物における３‘ＬＴＲの欠失によって更に機能的組換え体の形成能が減少する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当業界において、レンチウィルスに基づく（ベースの）安定的なパッケージングセルラインを産生する際に遭遇する主な障害の一つは、Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質の高レベルでの発現を維持する能力がないことである。これは、レンチウィルスタンパク質の幾つかの内在的な毒性、又は、プロモーターサイレンシング（promoter silencing）からのタンパク質発現の縮小によるものである。従って、当業界において現在知られているパッケージング系は、一過性パッケージング系又は毒性問題を最小にするための誘導性プロモーターを採用することである（Naldini
et al., Science 272:263-267, 1996; Kafri et al., Journal of Virology
73:576-584, 1999）。しかしながら、このようなアプローチはレンチウィルスベクター生産のためにかなりの時間と労力を必要とするので不利である。更に、このような系から得られたベクターバッチは安定的なパッケージングセルラインから得られるベクターバッチに比べて変動がより大きい。更に、一過性システムからのレンチウィルスベクター生産の規模を大きくすることは困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、安定的なパッケージングセルライン及びプロデューサーセルラインの確立に有用な、新規なレンチウィルスパッケージング構築物を提供する。特に、本発明は、例えば、ＨＩＶベースのパッケージングセルラインの場合にはＨＩＶｐ２４ｇａｇタンパク質、又は、ＢＩＶベースのパッケージングセルラインの場合にはＢＩＶＲＴタンパク質の生産のようなレンチウィルスタンパク質を高レベルで構成的に発現することの可能な、新規なパッケージングセルラインを提供する。
【０００８】
本発明の第一の態様において、レンチウィルスパッケージングシグナルにおける欠失及びプロテアーゼコード配列を含むレンチウィルスｐｏｌ遺伝子の一部を含むレンチウィルスパッケージング構築物であって、該プロテアーゼコード配列がコードされるレンチウィルスプロテアーゼにおけるＴ２６Ｓ置換に対応する変異を含むものである、前記レンチウィルスパッケージング構築物、を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明のパッケージング構築物を含有する安定的なプレパッケージングセルラインが提供される。
【００１０】
更に別の態様において、本発明のパッケージング構築物、及び更にｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドを含有する安定的なパッケージングセルライン、並びに、更にレンチウィルスプラスミドベクターを含有する、プロデューサーセルラインが提供される。
【００１１】
更に別の態様において、本発明の安定的なプロデューサーセルラインから得られたレンチウィルスベクター粒子が提供される。
【００１２】
更に、本発明の安定的なパッケージングセルラインをレンチウィルスベクターでトランスフェクトし、適当な培地中で得られたセルラインを増殖させ、該培地からレンチウィルスベクター粒子調製物を取得することから成る、レンチウィルスベクター粒子調製物の産生方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
特に断りのない限り、本発明を実施する際には、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、及び、ウィルス学等の当業者における従来技術を採用する。これらの技術は、現在ある文献に十分に開示されており、及び、具体的には、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);
Celis J.E. “Cell Biology, A Laboratory Handbook” Academic Press, Inc. (1994) and Bahnson et al., J. of Virol.
Methods, 54:131-143 (1995) を参照されたい。
【００１４】
本明細書に言及された全ての特許出願及び刊行物は本発明が関連する技術分野における当業者の水準を示し、その全体が参考として本明細書に取り込まれる。
【００１５】
本発明は、安定的なパッケージングセルライン及びプロデューサーセルラインの確立に有用な、新規なレンチウィルスをベースとしたパッケージング構築物に関する。驚くべきことに、夫々のレンチウィルスプロテアーゼ遺伝子の活性部位における変異によって、レンチウィルスベクター産生用の安定的なパッケージングセルラインの確立に有用なレンチイウィルスパッケージングベクターをすることが出来る。
【００１６】
ＨＩＶプロテアーゼの触媒中心には三つのアミノ酸モチーフ、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙが含まれている（Konvalinka, J.et al.,. J. Virol. 69:7180-7186, 1995）。これらの三つのアミノ酸は、これまでに文献に記されたＨＩＶ及びＳＩＶ単離物において保存されている（Korber
B, J. Theiler J, Wolinsky S Science 1998 Jun 19 280:5371 1868-71）。Konvalinka,
J.et al.,はＴｈｒ残基（ＨＩＶ単離物ＨＸＢ２におけるプロテアーゼの開始から２６番目のアミノ酸に対応する）をＳｅｒに変異させた。彼らは変異したＨＩＶプロテアーゼのプロテアーゼ活性は保存されている一方でその毒性が顕著に低下していることを見出した。
【００１７】
驚くべきことに、この情報により高レベルのレンチウィルスＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質を発現する安定的なセルラインを作成することが可能であることが判明した。これらのタンパク質の発現は、レンチウィルスベクター用、特に、ＨＩＶ又はＢＩＶベースのレンチウィルスベクター用の安定的なパッケージングセルラインの確立に必要欠くべからざるものである。
【００１８】
更に驚くべきことに、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＧｌｙモチーフがＢＩＶプロテアーゼにおいて同じ位置に存在することが本発明において発見された。ＨＩＶ及びＢＩＶプロテアーゼにおける最初の２９個のアミノ酸を比較すると、上記のＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙモチーフを含む、２５から２９番目のアミノ酸がＨＩＶ及びＢＩＶプロテアーゼ間で同一であることが判明した。
【００１９】
【化１】
0004413495.tif 000002
【００２０】
従って、本発明の一具体例において、ＢＩＶ１２７単離物プロテアーゼにおけるプロテアーゼ開始から２６番目ＴｈｒからＳｅｒへの変異（配列番号４）により、野生型ＢＩＶプロテアーゼと比較してより毒性の低いＢＩＶプロテアーゼが提供される。ついで、このプロテアーゼコード領域における点変異を有するＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質を発現する、ＢＩＶベースのレンチウィルスベクター産生のためのＢＩＶベースの安定的なパッケージングセルラインが作成される。このような安定的なパッケージングセルラインによってＢＩＶレンチウィルスベクターを産生するセルラインの開発が可能となる。
【００２１】
更に別の本発明の具体例において、活性部位に変異を有するプロテアーゼ遺伝子とＳＡＲ要素を組み合わせてレンチウィルスパッケージング構築物に取り込ませることによって特に有利な結果が得られる。このようなパッケージングセルラインは、ＨＩＶｐ２４Ｇａｇタンパク質のようなレンチウィルスタンパク質を高レベルで構成的に発現することが可能である。高レベル（＞５ｎｇ／ｍｌ  ｐ２４）のＧａｇは安定的なパッケージングセルラインが効率的な力価を生じるのに要求される。安定的なパッケージングセルラインでは、好ましくは＞１００ｎｇ／ｍｌ  ｐ２４、より好ましくは＞１μｇ／ｍｌ  ｐ２４である。
【００２２】
本発明の具体例において、一連のＨＩＶベースのパッケージング構築物が提供される。これらのパッケージング構築物は適当なセルラインにトランスフェクト（図１Ａ）。元の構築物であるｐＨＩＶΔΨは、ベクター上清の一過性生産用に広範囲に使用されているものであり、非常に効率的に様々な標的細胞及び組織に形質導入することが出来る。安定的なベクター生産により適したパッケージング構築物を作成するために導入された最初の変更（修飾）は、ｖｉｆ及びｖｐｒとい二つのアクセサリタンパク質を欠失させたｐΔＶΔＲを作成することである。これらのタンパク質のいずれもベクターの生産には必須ではなく（Zufferey et al., Nature Biotechnology, 15:871-875, 1997）、ｖｐｒは細胞増殖抑制性であるので、安定的なプロデューサーセルラインの生産を阻害する可能性がある（Rogel,
M.E. e al., J. Virol. 69:882-888, 1995）。この構築物の潜在的な毒性を更に減少させるために、点変異をプロテアーゼの活性部位に導入してｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊を作成した。この変異はプロテアーゼに起因する胞毒性を低下させるが、正常なウィルスプロセッシング機能を維持することが報告されている（Konvalinka, J. et al., J. Virol. 69:7180-7186, 1995）。
【００２３】
本発明の特定の具体例において、ＨＩＶＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質の安定的な発現を改良するための更なる修飾は、インターフェロンβＳＡＲ要素（Klehr, D et al., Biochemistry, 30:1264-1270, 1991）の導入である。例えば、このような変更によって二つのベクター、ｐΔＶΔＲ−ＳＡＲ及びｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊ＳＡＲが生じる。
【００２４】
パッケージング構築物について、以下の実施例に記載されるように、一過性アッセイにおいてＥＧＦＰ発現ベクターをパッケージングして２９３Ｔ細胞に形質導入する能力について試験した。
【００２５】
これらの構築物を使用して生成したベクター上清の全てが、ＥＧＦＰ発現に関するＦＡＣＳ分析で測定した結果９０％より大きい形質導入効率を示し、上記の修飾が正常なパッケージング機能を損なわれないことが示された。従って、パッケージング構築物が、毒性を阻害するようなプロテアーゼにおける活性部位変異、及びＳＡＲ要素を有していれば、安定的なパッケージングセルラインが得られることが判明した。本発明の原理的な説明に関する如何なる理論的な推測にも拘束されるものではないが、ＳＡＲ要素はプロモーターサイレンシングを低下すべく機能している可能性がある。
【００２６】
従って、本発明の一態様において、レンチウィルスパッケージングシグナルにおける欠失及びプロテアーゼコード配列を含むレンチウィルスｐｏｌ遺伝子の一部を含むレンチウィルスパッケージング構築物であって、該プロテアーゼコード配列がコードされるレンチウィルスプロテアーゼにおけるＴ２６Ｓ置換に対応する変異を含むものである、前記レンチウィルスパッケージング構築物が提供される。レンチウィルス「パッケージング構築物」は時には、ヘルパー構築物とも呼ばれ、レンチウィルスベクター粒子を得るのに必要なタンパク質をイントランス（in trans）で供給する一つ又はそれ以上のレンチウィルスヌクレオチド配列の発現を指令する能力を有するアセンブリ（集合体）を意味する。本発明の一具体例では、ヌクレオチド配列は、少なくともレンチウィルスのｇａｇ及び／又はｐｏｌ遺伝子、夫々のヌクレオチド配列と機能的に連結されたプロモーター、及び一般にｇａｇ及び／又はｐｏｌ遺伝子をコードする各ヌクレオチド配列の下流に位置するポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化配列は、例えば、サルウィルス４０（ＳＶ４０）に由来するものである。
【００２７】
コードされたレンチウィルスプロテアーゼにおけるＴ２６Ｓ置換に「対応する」変異とは、本発明における好適置換であるＴ２６Ｓ置換自体、又は、等価な生物学的効果を有する置換でありえる。「等価な生物学的効果」とは、Ｔ２６Ｓ置換自体に類似するプロテアーゼ細胞毒性の喪失を引き起こし、一方で、Ｔ２６Ｓ置換自体に類似するウィルスプロテアーゼ活性レベルを保持する置換を意味する。細胞毒性はKonvalinka, J. et al., J. Virol. 69:7180-7186, 1995に記載のように測定することが出来る。特にビメチン切断は細胞毒性のマーカーとして使用することができる。「ウィルスプロテアーゼ活性」は、Konvalinka,
J. et al., J. Virol. 69:7180-7186, 1995に記載のように測定することが出来る。評価される変異を有するウィルスにおける粒子関連ポリタンパク質の切断はウィルスプロテアーゼ活性の適当な測定手段である。実質的に同じ条件下でＴ２６Ｓに関して測定された活性及び細胞毒性に対する差が２倍未満、好ましくは１．５倍未満、更には１．２倍未満であるようなときに、本発明においては、活性及び細胞毒性は「類似する」ものである。
【００２８】
一般的に本発明においては、レンチウィルスは外因性、非発癌性のレトロウイルスであり、限定されるものではないが、ウマ感染性貧血ウィルス（EIAV: 米国特許第6,277,633号）、サル免疫不全症ウィルス（ＳＩＶｓ）、ヒツジのビスナ及び進行性肺炎ウィルス、ネコ免疫不全症ウィルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全症ウィルス（ＢＩＶｓ）及びヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２）を含むものである。
【００２９】
レンチウィルスゲノムはレトロウィルスで見出された三つの遺伝子：ｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖを含み、それらは二つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列の間にはさまれている。ｇａｇ遺伝子は、マトリックス、キャプシド及びヌクレオキャプシドタンパク質のような内部構造タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素（ＲＴ））、プロテアーゼ及びインテグラーゼをコードし、そして、ｅｎｖ遺伝子はウィルスエンベロープ糖タンパク質をコードしている。５’ 及び３’ ＬＴＲはウィルスＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進するために働く。ＬＴＲにはウィルス複製に必要な他の全てのシス活性（cis-acting）配列が含まれている。レンチウィルスには、ｖｉｆ，ｖｐｒ，ｔａｔ，ｒｅｖ，ｖｐｕ，ｎｅｆ及びｖｐｘのような配列が更に含まれていることがある（ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２及び／又はＳＩＶ）。５’ＬＴＲの隣には、ｔＲＮＡプライマー結合部位のようなゲノムの逆転写、及び、Ｐｓｉ部位のような粒子内へのウィルスＲＮＡの効率的なキャプシド化に必要な配列がある。ウィルスゲノムからキャプシド化に必要な配列が失われた場合には、このようなシス欠陥はゲノムＲＮＡのキャプシド化を阻害することであろう。しかしながら、得られた変異体はすべてのウィルスタンパク質の合成を指示する能力を保持している。
【００３０】
本発明の一具体例において、パッケージング構築物は更にレンチウィルスｇａｇ遺伝子を含む。ｇａｇ遺伝子はレトロウィルスゲノムにおいて５’ の大部分の遺伝子（5’-most gene） であり、上記により詳細に記載したように、ウィルス粒子を形成する際に必要な構造タンパク質をコードする。ｇａｇ遺伝子は翻訳されて前駆体であるポリタンパク質を生じ、それが次に切断されて、３〜５個の構造タンパク質を生じる。好適具体例においては、ｇａｇ遺伝子は再コード（re-coded）されたものである。
【００３１】
「再コード」された遺伝子とは、核酸にコードされたポリペプチドは変更前のものと同じであるが、該ポリペプチドをコードする核酸配列は変化するというような方式で変更された遺伝子（群）を意味する。遺伝子コードの縮重によって、同じアミノ酸翻訳産物をコードする複数のＤＮＡ及びＲＮＡが存在することは当業者には周知である。例えば、一具体例として、ＢＩＶのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、該ヌクレオチド配列は変更されるがＧＡＧ及びＰＯＬに対するそのアミノ酸翻訳配列は野生型アミノ酸配列と同一であるように再コードされる。更に、異なる生物はアミノ酸を合成するために、異なる特定のコドンの利用を好むことも当業者には周知である。
【００３２】
本発明の好適具体例においては、本発明のパッケージング構築物はＨＩＶゲノム由来である。特に好適な具体例では、本発明のパッケージング構築物は更に、ＨＩＶｖｉｆ又はｖｐｒ遺伝子における変異を有する。更に好適な具体例では、本発明のパッケージング構築物は、以下の実施例に記載されるように、ｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊構築物、及びｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊ＳＡＲ構築物である。
【００３３】
好適一具体例において、パッケージング構築物はＢＩＶゲノム由来である。ＢＩＶの基本的なゲノム組織はGarey et al., Virology,
175:391-409, 1990 及び米国特許第5,380,830 号明細書に開示されている。更に、ＢＩＶ感染細胞からＢＩＶゲノムＤＮＡを取得する方法も開示されている。ＢＩＶをコードする配列及びベクター構築物を調製するに適当なレトロウィルスゲノムを含むプラスミドは本明細書の開示、又は例えば、ATCC Accession No.68092 及び ATCC Accession No.68093のようなアメリカン・タイプ・ティッシュ・カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）及び
GENBANK のような寄託機関及びデータベースから容易に入手することが出来る。ＢＩＶベースのベクターはＰＣＴ公開WO 01/44458 に記載されている。
【００３４】
ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は異なる枠（フレーム）にあり、重複している。ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子は同じ読み取り枠にあり、「中央領域」によって分離されている。この中央領域には五つの読み取り枠（ORFs:open reading frames）がある。これらのうちの三つは、ＨＩＶ及びその他のレンチウィルスの vif, tat及び
rev に対するエキソン構造に類似している。その他の二つのORFsは、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩＶ−２のvpr, vpx 及び vpu をコードするORFsと類似した中央領域内に位置する。他のレンチウィルスのゲノムにおいてenv
の後に位置するnef ORF はＢＩＶでは欠けているようである。
【００３５】
ＢＩＶゲノムのヌクレオチド配列について、自然の変異が各々のＢＩＶウィルスに存在することを理解されたい。主張するゲノムの機能が失われない限り、これらの変異によって、一つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、逆位（転換）、又は付加が引き起こされても良い。このような変異をコードするＤＮＡ配列は標準的なクローニング方法又はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって生じることがある（米国特許第4,683,195 号及び米国特許第4,683,202 号参照）。本発明は、ＢＩＶの任意の株又はクローンから得られるＢＶゲノムに由来する核酸セグメントに関する。本発明の一具体例において、ＢＩＶベクター構築物は一つ又はそれ以上の機能的なＢＩＶ遺伝子を発現するＢＩＶゲノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオチドを含有する。
【００３６】
好適な具体例において、本発明のＢＩＶ由来のパッケージング構築物は、ＢＩＶ ｖｉｆ、Ｗ，Ｙ又はｔａｔ遺伝子の一部又は全ての欠失を含む、それらにおける変異を有する。
【００３７】
本発明のＢＩＶベクターにおいて構成的輸送要素（CTE: Constitutive Transpot Element）が使用されるときは、ＢＩＶ  Ｒｅｖ遺伝子及びＲｅｖ応答要素（ＰＲＥ）もまた変異しているか、又は欠失していても良い。
【００３８】
本発明の別の具体例では、本発明のレンチウイルスベクターは、広い意味において定義すれば、核スカフォールド又はマトリックスに対する親和性又は内在性結合能力を有するＤＮＡ配列である、スカフォールド付着領域（ＳＡＲ）要素を含む。特に、ＩＦＮ−ＳＡＲ要素が好ましく、β―ＩＦＮ−ＳＡＲ要素が最も好ましい。ＳＡＲ要素は通常、１００−３００又はそれ以上の長さの塩基対であり、配列情報の冗長性を必要としてタンパク質―ＤＮＡ相互作用の多部位を含有することもある。ＳＡＲ要素は、単離された核スカフォールド又はマトリックスに高親和性で結合するＤＮＡ要素である（Cockerill, P.N. and Garrad, W.T. (1986). Cell 44:273-282, Gasser,
S.M. and Laemmli, U.K. (1986). Cell 46:521-530）。幾つかのＳＡＲ配列はエンハンサー活性を有していることが示されており（Phivan,
L., et al (1990). Mol. Cell Biol. 10:2302-2307, McKnight, R.A., et al (1992).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6943-6947）、幾つかのＳＡＲ配列はシス活性要素であり、イムノグロブリンｋ座位におけるＢ細胞特異的デメチレーションを引き起こすことが知られている（Lichtenstein,
M. et al., (1994). Cell 76:913-923, Kirillov, A. et al., (1996). Nat. Genet.
13:435-441）。ｈＩＦＮ−β  ＳＡＲ要素は、５’ＬＴＲの新生（デノーボ）メチレーションを阻害し、レトロウィルスの組み込み（インテグレーション）部位において隣接する宿主クロマチンの影響から導入遺伝子を隔離する働きを有しているようである。こうして位置効果（Position effects）が減少される。ＳＡＲ要素は、例えば、哺乳動物、植物、昆虫、及び酵母のような真核細胞、好ましくは哺乳動物から得ることが出来る。本発明で使用するＳＡＲ要素を同定するための適当なプロトコールはWO96/19573 に記載されている。
【００３９】
好ましくは、ＳＡＲ要素は導入遺伝子及びレンチウィルスｅｎｖ配列の下流に位置させるべきである。一具体例において、一つ以上のＳＡＲ要素が本発明のパッケージングベクター内に挿入される。本出願人は如何なる原理的推測に拘束されることを欲しないが、核酸分子における隣接するＳＡＲ要素の使用により、ＳＡＲ要素が独立したループ又はクロマチンドメインを形成し、それが隣のクロマチンの影響から隔離することになるものと考えられる。
【００４０】
ＳＡＲ要素の使用に加えて、又はそれに代えて、他の方法を使用することが出来る。これらの方法には、ｇａｇ／ｐｏｌ発現構築物を染色体の高発現領域又は高発現遺伝子に組み込むことが挙げられる。このような高発現領域の非限定的な例として、ＳＡＲ、座調節領域（ＬＣＲｓ）及び隔離領域（Emery, et al., PNAS, 97(16):9150-9155 (2000)）を挙げることが出来る。当業者には明らかであるが、ｇａｇ／ｐｏｌ発現構築物を高発現領域又は高発現遺伝子内に組み込むために使用できる幾つかの方法がある（例えば、相同組換え）。
【００４１】
本発明の更なる態様では、本発明のパッケージング構築物を含有する安定的なプレパッケージングセルラインが提供される。特に好適なプレパッケージングセルラインは、安定的に少なくとも５ｎｇ／ｍｌのＨＩＶｐ２４タンパク質、又は少なくとも５ｎｇ／ｍｌのＢＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）タンパク質を発現し、このようなタンパク質が構成的であるようなセルラインである。好適には、５０ｎｇ／ｍｌのＢＩＶＲＴが産生される。より好適には５００ｎｇ／ｍｌのＢＩＶＲＴが産生される。
【００４２】
本発明の更なる態様では、本発明のパッケージング構築物及び更にｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドを含有する安定的なパッケージングセルラインが提供される。従って、「本発明における「パッケージングセルライン」とは、レトロウィルスＧａｇ,Ｐｏｌ及びＥｎｖ構造タンパク質を発現する核酸配列を含む組換えセルラインである。パッケージングセルラインはパッケージングシグナル及びその他のシス活性要素を欠いているために、感染性ビリオン粒子は産生されない。
【００４３】
ｅｎｖ遺伝子はエンベロープタンパク質をコードする。本明細書において、ｅｎｖ遺伝子は天然のｅｎｖ遺伝子配列のみならず、レトロウィルス及びレンチウィルスの標的特異性を変更させる修飾を有するｅｎｖ遺伝子、又は偽レトロウィルス／レンチウィルスを生じるようなｅｎｖ遺伝子も含むものである。ＰＣＴ公開WO92/14829, WO94/11524 及び米国特許第6,004,798 を参照されたし。ｅｎｖ遺伝子はレトロウィルスを含む任意のウィルスに由来するものである。好ましくはｅｎｖは、ヒト及び他の種の細胞の形質導入を可能にするような両指向性（amphotropic）エンベロープタンパク質である。エンベロープタンパク質に特定の細胞型の受容体を標的とするための特定のリガンド又は抗体を結合されることによって、組換えウィルスを標的化することが好ましい。目的とする調節領域を含む配列を、特異的な標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする遺伝子と共に、ウィルスベクター内に挿入することによって、ベクターが標的特異的となる。例えば、グリコリピド又はタンパク質を挿入することによってベクターを標的特異的とすることが出来る。更に、抗体の抗原結合タンパク質、又は一本鎖抗体のような組換え抗体型分子を用いて標的化を完成しレトロウィルスベクターを標的化することが出来る。当業者であれば、過度の実験なしで、特定の標的へのレトロウィルスベクターの運搬を達成する具体的な方法を知ることが出来る。
【００４４】
一般的に、本発明のセルラインは、上記のようにｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，ｔａｔ及びｒｅｖのような組換えビリオンのパッケージング機能を提供する別個のベクターを含むものであっても良い。ベクターが形質転換及びパッケージングセルラインの産生に使用され組換えレンチウィルスを生じるものである限り、用いるベクターの数に制限はない。ベクターはトランスフェクション又は感染によってパッケージングセルラインに導入される。パッケージングセルラインは、ベクターゲノムを含むウィルス粒子を産生する。トランスフェクション又は感染の方法は当業者には公知である。パッケージングベクター及び移入ベクター（transer vector）をパッケージングセルラインにコトランスフェクションさせた後に、組換えウィルスを培養培地から回収し、当業者に使用されている標準的な方法で力価を測定する。即ち、パッケージング構築物は、通常ｎｅｏ,ＤＨＦＲ，Ｇｌｎ合成酵素又はＡＤＡのようなドミナント選択マーカーと共に、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションによってヒトセルライン内に導入することが出来、その後、適当な薬剤の存在下で選択され、クローンが単離される。
【００４５】
好適具体例では、本発明のパッケージングセルラインはＶＳＶ−Ｇｅｎｖ遺伝子を含む。ＶＳＶ−Ｇは組換えウィルスに広範な宿主範囲を付与するので、ＶＳＶ−Ｇｅｎｖタンパク質は望ましいｅｎｖ遺伝子である一方で、ＶＳＶ−Ｇは宿主細胞に有害であることがある。即ち、ＶＳＶ−Ｇのような遺伝子が使用された場合には、誘導性プロモーター系を使用することによって、ＶＳＶ−Ｇ発現が必要でないときにＶＳＶ−Ｇ発現を調節し、宿主毒性を最小限にすることができる。例えば、テトラサイクリン調節遺伝子発現系（Gossen & Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci.(1992)89:5547-5551）を採用することによってＶＳＶ−Ｇの誘導発現が得られる。ｔｅｔ／ＶＰ１６トランスアクチベーターを第一ベクターに存在させて、もう一つのベクターにあるｔｅｔオペレーター配列によって調節されるプロモーターの下流にＶＳＶ−Ｇコード配列をクローニングすることができる。調節可能な他の非限定的例はＰＣＴ公開WO01/30843及び WO02/06463 に記載されている。
【００４６】
別の好適具体例では、本発明のパッケージングセルラインはＬＣＭＶ変異ｅｎｖ遺伝子を含む（Beyer, et al., J. Virol., 76:1488-1495）。一具体例では、ＬＣＭＶ変異ｅｎｖ遺伝子は構成的に発現される。別の具体例では、ＬＣＭＶ変異ｅｎｖ遺伝子は誘導性プロモーターから発現される。誘導性プロモーター系は本明細書に記載されている。
【００４７】
本発明の更なる態様では、本発明のパッケージング構築物、ｅｎｖ遺伝子、及び更にレンチウィルスベクター、即ち、レンチウィルス５’ＬＴＲ、レンチウィルス３’ＬＴＲ及び適当なパーッケージングシグナルを含むベクターを含有する、プロデューサーセルラインが提供される。従って、「プロデューサーセルライン」とは、上記で定義したパッケージングセルラインで、更にベクター粒子内にパッケージされた複製欠如のレンチウィルスベクターを含むものである。プロデューサーセルラインは、治療または選択遺伝子のような異種性（即ち、非レンチウィルス）遺伝子を含むことができる、レンチウィルスベースの粒子を産生する。
【００４８】
好適な具体例では、プロデューサーセルラインは、少なくとも１０Ｅ５ｃｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０Ｅ６ｃｆｕ／ｍｌ以上のレンチウィルス力価を産生する能力があることを特徴とする。
【００４９】
更に本発明の態様において、本発明の安定的なプロデューサーセルラインから得られたレンチウィルスベクター粒子が提供される。更に、本発明の安定的なパッケージングセルラインをレンチウィルスベクターでトランスフェクトし、適当な培地中でセルラインを増殖及び単離し、該培地からレンチウィルスベクター粒子調製物を取得することから成る、レンチウィルスベクター粒子調製物の生産方法を提供する。
【００５０】
一般的に、ウィルスは、適当な時間経過時、例えば、トランスフェクション後４８時間に、上清のろ過のような標準的技術で採集される。ウィルス力価は適当な細胞を適当量のウィルス上清で感染させて測定する。例えば、４８時間後に、形質導入効率がアッセイされる。即ち、本発明は、高力価の組換えレンチウィルスベクター粒子を生産する方法及び手段を提供する。このような粒子調製物は次いで当業界で公知の技術によって標的細胞に感染させることが出来る。
【００５１】
以下の実施例は本発明を更に説明する目的で提供されるが、如何なる意味でも、限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００５２】
実施例１：ＨＩＶベースのパッケージングベクター構築物
本研究で使用したパッケージングプラスミドは図１Ａに描かれている。ｐＨＩＶΔΨは、１）両ＴＬＲ、２）ｇａｇ遺伝子の５’ にあるパッケージングシグナル（Ψ）の３３ｂｐ、３）ｅｎｖ遺伝子の１５８７ｂｐ、４）ｖｐｕ遺伝子、及び５）ｎｅｆ遺伝子を欠失したＨＩＶ−１  ＮＬ４−３単離物である。他の全ての遺伝子に影響はない。ＨＩＶ遺伝子の転写は、ｐＣＩベクター由来のサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター（promega WI）の調節下にある。ｐＨＩＶΔΨはｐＨＩＶ−ＰＶ（Sutton, R.E., H.T.M. Wu, R. Rigg, E.
Bohnlein, and P.O. Brown, 1998. 72:5781-5788）を修飾したものである。６６０ｂｐのＮｄｅＩ／ＳａｌＩ断片をｐＨＩＶΔΨから欠失させて、ｖｉｆ及びｖｐｒを除去し、ｐΔＶΔＲを得た。ＰＣＲ突然変異生成を用いて、点変異（ｎｔ２３２８，ＡからＴ）をｐΔＶΔＲのプロテアーゼ遺伝子に導入し、ｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊を作成した。これは、Ｔｈｒ２６からＳｅｒ２６へのアミノ酸置換に対応する。ＰＣＲ突然変異生成用のプライマーは以下のとおりである。
【００５３】
【化２】
0004413495.tif 000003
【００５４】
プライマーＢ及びプライマーＣは相補的であり、ＴｈｒからＳｅｒへのアミノ酸置換を与えるＡからＴへの変異（nt2328）、及び、ただ一つのEco471II 制限酵素部位を導入するがアミノ酸配列に変化は与えないＴからＧへの変異（nt2318）を含む。プライマーＡ＆Ｂから増幅されたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＣ＆Ｄから増幅された精製ＰＣＲ産物と結合させた。この混合物をプライマーＡ＆Ｄを用いて増幅させ、ApaI
及びAgeI（プライマー中に元来存在する制限部位）で切断し、ｐΔＶΔＲにクローニングして戻した。変異の存在は、Eco471II 消化及び配列決定により確認した。インターフェロンβスカフォールド付着領域（ＳＡＲ）（８００ｂｐ断片）（Agarwal,
M., T.W. Austin, F. Morel, J. Chen, E. Bohnlein, and I. Plavec, 1998. 72:3720-3728）をｐΔＶΔＲ及びｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊のNotI制限部位（nt8800）に導入し、夫々、ｐΔＶΔＲ−ＳＡＲ及びｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊ＳＡＲを作成した。
【００５５】
本研究で使用した移入ベクターであるｐＨＬＥＩＰを図１Ｂに示した。ｐＨＬＥＩＰは１）両ＴＬＲ、２）ｇａｇ遺伝子の５’ 末端の１２５ｂｐ、３）中央ポリプリントラクト（ｐｐｔ）及び転写エンハンザー配列を含む、ｐｏｌ遺伝子の３’
末端の７１５ｂｐ、４）ｔａｔ及びｒｅｖの第１エクソンをコードする３１１ｂｐ、及び５）ＲＥＶ応答要素（ＲＲＥ）及びｔａｔの第２エクソンをコードする９７７ｂｐ含む、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３単離物である。ｎｅｆ及びｒｅｖをコードする配列はｅｇｆｐマーカー遺伝子（Clontech, CA）、並びに、それに続くピコルノウィルス内部リボソームエントリー部位（Jang, S. K., V.
Davies, R.J. Kaufman, and E. Wimmer. 1989, J. Virol. 63:1651-1660）及びピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Vara,
J.A., A. Portela, J. Ortin, and A. Jimenez. 1986. Nuc. Acids Res. 14:4617-4624）の挿入により分裂されている。ｅｇｆｐの発現はｔａｔ依存様式でＨＩＶ  ＬＴＲにより調節されている。このベクターはｐＨＩＶ−ＡＰＧ−Ｐ−Ｅ−Ｆ−Ｖ（Sutton,
R.E., H.T. M. Wu, R. Rigg, E. Bohnlein, and P. O. Brown. 1988.Journal of
Virology. 72:5781-5788）を修飾したものである。偽型に用いたエンベロープ構築物は、ｐＣｌ由来のＣＭＶプロモーターの調節下にあるＶＳＶ−Ｇ遺伝子（Burns,
J.C., T. Friedmann, W. Driever, M. Burrascano, and J.K. Yee. 1993. Proceedings
of the National Academy of Science, USA. 90:8033-8037; Yee, J. K., A.
Miyanohara, P. LaPorte, K. Bouic, J. C. Burns, and T. Friedmann. 1994.
Proceedings of the National Academy of Science USA. 91:9564-9568）を含むｐＣＩＧＬ、及び、ｐＣｌにクローニングされた両指向性マウス白血球ウィルス（Ａ−ＭＬＶ）エンベロープ遺伝子（Rigg,
R.J., J. Chen, J.S. Dando, S.P. Forestell, I. Plavec, and Bohnlein. 1996. Virology.
218:290-295）を含むｐＣＭＶ＊Ｅａである（図１Ｃ）。
【００５６】
実施例２：パッケージング構築物の機能分析
パッケージング構築物が全ての必要な機能を保持しているかを確認するために、一過性アッセイを実施した。最初のウィルス上清は２９３Ｔ細胞（５ｘ１０６）に３つの構築物（１０μｇパッケージング構築物、５μｇエンベロープ構築物、及び２０μｇ移入ベクター）をＣａ２ＰＯ４沈殿（Clontech, CA）によりトランスフェクトすることによって作成した。トランスフェクション上清を２４，４８及び７２時間後に回収して集め、０．４５μｍフィルターでろ過した。形質導入効率を測定するために、集めたベクター上清を培養培地（DMEM
plus 10%FBS）で１：１に希釈し、６穴ディッシュ上の２９３Ｔ細胞（２ｘ１０５）に加え、８μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Sigma,
MO）存在下で２５００ｘｇで遠心した。「スピノキュレーション（spinoculation）」（Bahnson, A.B., J.T. Dunigen,
B.E. Baysal, T. Mohney, R.W. Atchison, M.T Nimgaonkar, E.D. Ball, and J.A.
Barranger. 1995, J. Virol Meth. 54:131-143）として知られているこの形質導入プロトコールは３７℃で３〜４時間行った。スピノキュレーション後に、培地を交換し、細胞を３７℃で４８−７２時間培養した。インキュベーション後に、細胞を１−２％ホルムアルデヒドで固定し、ＥＧＦＰ発現をFACScan（Becton
Dickinson,MD）におけるフローサイトメトリーで測定した。
【００５７】
実施例３：プロデューサーセルラインの産生
Ｇａｇ／Ｐｏｌプロデューサーセルラインを作成する為に、２９３Ｅａ６細胞（５ｘ１０６）を１０ｃｍディッシュ上にまき、２つの構築物（１０μｇパッケージング構築物、１μｇ  ｐＣＤＮＡｐｕｒｏ）をＣａ２ＰＯ４沈殿（Clontech, CA）によりトランスフェクトした。ｐＣＤＮＡｐｕｒｏは、ｐＣＤＮＡ１．１／Ａｍｐ（Invitrogen, CA）由来のＣＭＶプロモーターにより機能するピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドである。２９３Ｅａ６細胞はＡ−ＭＬＶエンベロープ（Rigg, R.J., J. Chen, J.S. Dando, S.P.Forestell, I. Plavec, and E. Bohnlein.
1996. Virology. 218:290-295）を構成的に発現する。トランスフェクション後に、細胞を４８時間培養し、５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Sigma,
MO）含有培地に移した。この細胞をピューロマイシン選択下に維持し、ｐ２４ＥＬＩＳＡ（Beckma/Coulter, CA）によってＧａｇ産生を定期的に追跡した。セルラインのｐ２４産生を測定するために、１ｘ１０６個の細胞を６穴ディッシュのウェルにまき、上清をその２４時間後に回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、ｐ２４ＥＬＩＳＡでアッセイした。FACStar（Becton
Dickinson, MD）によるソーティングで、最高レベルのｐ２４を発現するセルラインから単一の細胞クローンを得た。移入ベクターであるpHLEIPは安定的に最高レベルのｐ２４を産生するクローンに導入された。前セクションに記載したように、この導入は該クローンを一過性VSV-G偽型pHLEIPベクター上清で形質導入することにより実施した。形質導入後の様々な時間経過後に、得られたパッケージングラインからの上清を回収し、２９３T細胞で力価を測定した。この力価の測定に、２ｘ１０５個の２９３T細胞を６穴ディッシュのウェルにまき、既に記載したように、１０倍連続希釈されたウィルス上清で形質導入した。４８時間の培養後に、５μｇ／ｍｌピューロマイシンを培地に添加し選択した。細胞を選択培地中で２週間維持した。生存したコロニーを固定し、クマシーブルー溶液（50% メタノール、0.05％クマシーブリリアントブルー R-250、10％酢酸）で染色し、力価を測定するために計数した。
【００５８】
実施例４：安定的なｐ２４産生に関するパッケージング構築物の評価
修飾したどのパッケージング構築物が長期に亘り高レベルのＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質発現を可能にするか否かを測定するために、安定的な２９３Ｅａ６−ベースのセルラインを作成し、Material and Methdsに記載のようにウィルス粒子産生を追跡した。図２はｐ２４レベルで測定したウィルス産生に関して、異なるパッケージングセルラインを一定期間（約１２週間）について比較したグラフである。予想されたように、ｖｐｒを有する構築物であるｐＨＩＶΔΨのｐ２４発現レベルは選択の直後に低く、２回目の継代によってｐ２４発現は検出限界以下になった。ｖｐｒを欠いた構築物で作成したセルラインであるｐΔＶΔＲ、及びプロテアーゼ変異（ｐΔＶΔＲ―ＰＲ＊）又はＳＡＲ挿入（ｐΔＶΔＲ―ＳＡＲ）のいずれかを有する２つのセルラインは初期は高いｐ２４レベルであったが（３−１２ｎｇ／ｍｌ）、１ｎｇ／ｍｌ未満のレベルまで低下してしまった。興味深いことには、プロテアーゼ変異及びＳＡＲ挿入の両方を有する構築物（ｐΔＶΔＲ―ＰＲ＊ＳＡＲ）を有するセルラインは単一の修飾構築物を有するセルラインに比べて約４倍のｐ２４産生を維持した。これらの結果から、プロテアーゼ毒性及びプロモーターサイレンシングの双方ともセルラインにおけるｐ２４産生のレベル及び安定性を増加させることが出来るが、これらのいずれの修飾も単独では顕著な改良を提供することができないことを示唆している。
【００５９】
実施例５：修飾パッケージング構築物のクローン分析
二重の修飾構築物であるｐΔＶΔＲ―ＰＲ＊ＳＡＲを有するセルラインは他の構築物と比較して最も高いｐ２４レベルを示したが、このレベルも効率的なパッケージングセルラインを作成するには充分ではない。高ｐ２４産生クロ−ンを見つけるために、このセルラインから単一細胞クローンを単離した。表１に示されるように、多数のクローンは無視できるレベルのｐ２４しか発現しなかったが、分析した４０クローンのうちの２つは親セルラインに比べて極めて高いレベル（１０−１００ｎｇ／ｍｌ）のｐ２４を産生した。このうちの一つのクローン（ＰＲ＊ＳＡＲクローン）は少なくとも１２週間に亘って１００ｎｇ／ｍｌのｐ２４を発現した。このような高レベルのｐ２４産生を可能にするためのプロテアーゼ変異の重要性を実証するために、ｐΔＶΔＲ―ＳＡＲを有するセルラインから単一クローンを得て、ｐ２４産生を分析した。表１では、＋／−プロテアーゼ変異を有するパッケージング構築物を有するクローンの比較が示されている。ｐΔＶΔＲ―ＰＲ＊ＳＡＲを有する構築物と比較してほぼ２倍の数のクローンを評価したにも拘わらず、いずれのｐΔＶΔＲ―ＳＡＲクローンも１０ｎｇ／ｍｌより高いレベルのｐ２４を発現しなかった。これらの結果から、高レベルのＧａｇ／Ｐｏｌプロデューサーセルラインを産生するに際して、プロテアーゼ変異の重要性が確認された。
【００６０】
【表１】
0004413495.tif 000004
【００６１】
実施例６：最高レベルのＧａｇ／Ｐｏｌ産生パッケージングセルクローンの力価
ＰＲ＊ＳＡＲクローンがベクターを効率的にパッケージし移入することが出来る否かを測定するために、力価分析を実施した。一過的に産生された、ＥＧＦＰ及びピューロマイシン抵抗性遺伝子を有するＶＳＶ−Ｇ偽ベクターであるｐＨＬＥＩＰを、Material and Methdsに記載のように形質導入によってパッケージングセルクローンに導入した。上清を形質導入後の様々な時間経過時点で回収し、ｐ２４産生に関して分析し、ＥＧＦＰ  ＦＡＣＳ及びピューロマイシン選択によって２９３Ｔ細胞で力価を測定した。表２の実験１で示されているように、２４時間時点におけるｐ２４産生は９１ｎｇ／ｍｌであり、２４時間及び４８時間時点で回収した上清の力価はピューロマイシン選択で測定したところ５ｘ１０４ＩＵ／ｍｌであった。表２の実験２は、分析の前に夫々示した時間だけウィルスを蓄積（accumulation）したこと以外は実験１と同様であった。これらの条件下で、ｐ２４産生は４８時間で９５４ｎｇ／ｍｌから９６時間で２３００ｎｇ／ｍｌまでいった。これらのレベルはもはや一過性系で産生される範囲（１−１０μｇ／ｍｌ）（データ示さず）である。興味深いことに、ｐ２４レベルは蓄積によって増加したが、これら３点からの上清は２９３Ｔ細胞で同様の力価（６ｘ１０４ＩＵ／ｍｌ）であった。これは、４８時間及び７２時間蓄積された上清で形質導入された２９３Ｔ細胞でのＥＧＦＰ発現の１％未満に対応する。更に、一過性系から生成されるウィルス上清は蓄積後のＰＲ＊ＳＡＲクローンに匹敵するｐ２４レベルを有している一方で、それらは常に５−１０ｘ１０６ＩＵ／ｍｌの力価を有していた（表３）。これらデータからは、ｐ２４産生はおそらくパッケージングセルクローンからの高力価を達成するための限定因子ではないことが示唆される。
【００６２】
【表２】
0004413495.tif 000005
【００６３】
実施例７：パッケージングセルクローンへのエンベロープ発現の影響
エンベロープ発現の欠如がＰＲ＊ＳＡＲパッケージングクローンの低い力価に寄与しているか否かを決めるために、まずＦＡＣＳ分析を実施して、Ａ−ＭＬＶｅｎｖ発現を確認した。２９３Ｅａ６親細胞と比較して等価なレベルのエンベロープが検出可能であった。更にエンベロープが限定しているか否かを試験するために、エンベロープ発現構築物を、既にｐＨＬＥＩＰベクターで形質導入されているＰＲ＊ＳＡＲパッケージングクローン内にトランスフェクトした。ＶＳＶ−Ｇ及びＡ−ＭＬＶｅｎｖ発現構築物の双方を使用した。表３は、追加のエンベロープの有無において安定的パッケージングクローンからの上清の力価及び形質導入効率の比較を示す。ＶＳＶ−Ｇの追加によって力価値は５−８倍となり、検出可能な１４％の形質導入効率を可能とした。Ａ−ＭＬＶｅｎｖの追加によっても、力価が上昇したが２倍までであった。これらの結果から、ＰＲ＊ＳＡＲパッケージングクローンの力価はエンベロープタンパク質の発現により増加できることが示された。
【００６４】
ＰＲ＊ＳＡＲパッケージングクローンから産生されたＧａｇのレベルは一過性パッケージング系で得られるレベルに達した。しかしながら、力価は依然として一過性系のものよりも低い。我々はエンベロープは我々が単離したクローンにおいて限定因子であることを示したので、ｐ２４発現及びエンベロープ発現に基づくより多くのクローンをスクリーニングすることによって、より高い力価のクローンを得られる可能性が増大する。更に、移入ベクターは形質導入１ラウンドのみでパッケージングクローン内に導入されるので、ベクターコピー数が制限される。パッケージングセルライン内のベクターコピー数を増大させることによっても力価が改善される。
【００６５】
【表３】
0004413495.tif 000006
【００６６】
実施例８：ＢＩＶベースレンチウィルスベクター用のパッケージング構築物の構築
ＢＩＶベースのレンチウィルスパッケージング構築物を作成する為に、ＣＴＥは以下の２つのプライマー（ＣＴＥ１，ＣＴＥ２）で増幅したＰＣＲである。
【００６７】
【化３】
0004413495.tif 000007
【００６８】
増幅産物はＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化し、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化したｐＣＩプラスミドに結合し、ｐＣＩ．ＣＴＥを作成する。第二に、ＢＩＶｇａｇ及びｐｏｌをコードする配列を以下の２つのプライマーを用いて増幅する。
【００６９】
【化４】
0004413495.tif 000008
【００７０】
増幅産物をＸｈｏＩで消化し、ＸｈｏＩで消化したｐＣＩ．ＣＴＥと結合し、ＢＩＶベースのパッケージング構築物であるｐＣＩＢＩＶＧＰを作成する。別の方法として、ＣＴＥをＢＩＶＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）及びＲｅｖと置換することも出来る。ＢＩＶプロテアーゼにおいてスレオニンからセリンへ置換（プロテアーゼの開始から２６番目のアミノ酸）してより毒性の低い可能性のあるＢＩＶプロテアーゼを作成する為に、ｐＣＩＢＩＶＧＰを以下のプライマーでＰＣＲ増幅にかける。
【００７１】
【化５】
0004413495.tif 000009
【００７２】
プライマーＢにはＡからＴへの変異が含まれ、それによってＴｈｒからＳｅｒへのアミノ酸置換が生起する。プライマーＡ及びＢから増幅されたＰＣＲ産物はＡｃｃＩで消化し、既にＡｃｃＩで消化したｐＣＩＢＩＶＧＰに結合し、プロテアーゼに所望の変異を有するｐＣＩＢＩＶＧＰｍｕｔを得た。
【００７３】
実施例９：再コードされたｇａｇ／ｐｏｌ配列、又は、プロテアーゼに変異を含む再コードされたｇａｇ／ｐｏｌ配列を有するＢＩＶパッケージング構築物
理論的に拘束されるものではないが、ＨＩＶ，ＳＩＶ及びＢＩＶのようなレンチウィルスは、ＲＮＡの不安定化を引き起こし、それによってウィルスＲＮＡの効率的な輸送を阻害するような核酸配列をそれらのウィルスＲＮＡ中に有していることが考えられる。これは、レンチウィルスが稀なコドンを使用していること、及び／又はＲＮＡ配列によって決定されるＲＮＡ二次構造を採用しているという事実に拠るものである。これら稀なコドンを含むウィルスＲＮＡはＲｅｖ／ＲＲＥなしでは効率的に核外に輸送することが出来ない。我々は、好適なホモサピエンスのコドン（表４：配列番号１５）を用いてｇａｇ／ｐｏｌ配列を再コードし、ＲＲＥをパッケージング構築物から除外し、パッケージング及び移入ベクター間の重複を除去又は最小にし、そしてＢＩＶｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子発現レベルを増加させた。配列番号１５は再コードされたｇａｇ／ｐｏｌ構築物用に選ばれたものである。Aptagen 会社はこのＤＮＡ構築物をクローニングすることを契約した。再コードされたｇａｇ／ｐｏｌをコードする配列はｐＣＩ哺乳動物発現ベクター内にクローニングされ、ｐＣＩｉｇｐＳｙｎ（図３）が得られた。ｐＣＩｉｇｐＳｙｎが作成されたことによって、ｐＣＩｉｇｐＳｙｎ、ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ（配列番号１６：表７を含むＢＩＶＲｅｖ発現構築物）、ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃ（ＧＦＰをコードするＢＩＶベース移入ベクター構築物）、及びｐＣＭＶＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ発現ベクター）をコトランスフェクトすることによって４つのコンポーネントシステムからＢＩＶベクターを産生することが可能となった。このシステムから産生された、再コードされたｇａｇ／ｐｏｌを有するＢＩＶベクターは、細胞を効率的に形質導入する能力に示されるように完全に機能的なものであった。
【００７４】
【表４−１】
0004413495.tif 000010
【００７５】
【表４−２】
0004413495.tif 000011
【００７６】
【表４−３】
0004413495.tif 000012
【００７７】
【表４−４】
0004413495.tif 000013
【００７８】
【表５】
0004413495.tif 000014
【００７９】
Hela細胞におけるＢＩＶによるＧＦＰ発現の比較。ＧＦＰをコードするＢＩＶベクターはパッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＳｙｎ又はパッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒによって作成され、Hela細胞への形質導入効率及びＧＦＰ発現強度に関して比較された。形質導入効率は陽性Hela細胞のパーセンテージで測定した。平均ＧＦＰ強度は相対的蛍光強度で点数化した。形質導入効率及び平均ＧＦＰ強度のいずれもＦＡＣＳキャリバー（Becton
Dickinson Biosciences）によるフローサイトメトリー分析で分析した。
【００８０】
我々は本明細書において、ＢＩＶプロテアーゼコード領域における変異によって、ＢＩＶプロテアーゼの細胞に対する毒性が減少することを提案した。具体的には、パッケージング構築物ｐＣＩｒｉｇｐＳｙｎにおいてＡＣＴによりコードされるアミノ酸Ｔｈｒ（ＢＩＶウィルスゲノム単離物１２７におけるヌクレオチド１８０６から１８０８までに相当）で点突然変異を作成した。該構築物の他のコード領域には何等の変更もなく、当該Ｔｈｒは同じ位置でＳｅｒに置換された。このＴｈｒからＳｅｒへの変異を有するパッケージング構築物はｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒと命名された。ｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒとｐＣＩｒｉｇｐＳｙｎはＢＩＶベクター産生及び該ＢＩＶベクターによる達成される形質導入効率を助ける能力に関して比較された。具体的には、１０ｃｍディッシュ中の８ｘ１０６個の２９３Ｔ細胞にｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒ又はｐＣＩｉｇｐＳｙｎ（１μｇ）、ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ（１０μｇ）、ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃ（１５μｇ）、及びｐＣＭＶＶＳＶ−Ｇ（４．５μｇ）をトランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後にベクターをオランスフェクトされた細胞から取得した。Hela細胞を逆転写酵素（ＲＴ）活性により同数であるとされたベクター粒子により形質導入した。形質導入の４８時間後にフローサイトメトリー分析を行い陽性Hela細胞を計数した。表５に示されるように、ＴｈｒからＳｅｒへの変異を有するパッケージング構築物で作成したベクターであるｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒはパッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＳｙｎと同じ効率でHela細胞を形質導入した。この変異ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１７）を以下の表６に示す。又、Ｒｅｖ遺伝子の配列（配列番号１６）を表７に示す。
【００８１】
【表６−１】
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【００８２】
【表６−２】
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【００８３】
【表６−３】
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【００８４】
【表７】
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【００８５】
実施例１０：ＢＩＶベースレンチウィルスベクター用のプロデューサーセルラインの作成方法
ＢＩＶベースレンチウィルスパッケージング構築物ｐＣＩＢＩＶＧＰｍｕｔを、本発明のＨＩＶベースレンチウィルスパッケージング構築物において記載された選択性マーカーであるピューロマイシンをコードするベクターと共に、２９３Ｅａ６細胞（本発明の実施例３に記載されたＡ−ＭＬＶエンベロープ発現細胞）にトランスフェクトする。本発明の実施例３に記載されたように、トランスフェクトされた細胞をピューロマイシンを含有する培地で培養する。ピューロマイシン抵抗性単一クローンを、ＢＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）活性を特異的にアッセイすることによって培養培地中のＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ産生に関して追跡する。ＲＴアッセイはロッシュ（Roche）から購入したＲＴアッセイキット（Product :1828657）を用い、ＢＩＶＲＴがＨＩＶＲＴと交叉反応する事実を利用して実施する。最も高いレベルのＲＴを発現する単一細胞クローンをそのＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ産生における安定性に関して追跡する。別の方法として、２９３セルラインの代わりに他の哺乳動物セルラインを使用できる。更に別の方法として、Ａ−ＭＬＶエンベロープの代わりに他のウィルスエンベロープを構成的に発現する細胞を使用できる。ＢＩＶベースの移入ベクタープラスミドを用いるトランスフェクション又はＢＩＶベースのレンチウィルスベクター粒子を用いる感染によって、ＢＩＶベースの移入ベクターを最も高いレベルのＢＩＶＲＴを安定的に発現する細胞クローンに導入する。上清を様々な時間においてパッケージングセルラインから回収する。
【００８６】
実施例１１：ＢＩＶベースレンチウィルスベクター用のプロデューサーセルラインの別の作成方法
ＢＩＶベースレンチウィルスベクター産生用のプロデューサーセルラインを作成する為に、再コードされたＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌとプロテアーゼ変異をコードする構築物を選択マーカーであるハイグロマイシンをコードするプラスミドと共に２９３細胞にコトランスフェクトする。ハイグロマイシン抵抗性クローンを、逆転写酵素（ＲＴ）活性アッセイによるＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ発現によって選択してスクリーニングする。ＢＩＶＲｅｖ発現構築物（ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ）、ＶＳＶ−Ｇ発現構築物、及びＧＦＰをコードするＢＩＶ移入ベクター構築物とのコトランスフェクションによる機能分析の為に、ＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌを発現する陽性クローンを増殖させる。トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクトした細胞からの上清を回収し、野生型２９３細胞への形質導入に使用する。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージにより判断して最も多い量の機能的ＢＩＶベクターを産生スするクローンを後に使用する為に保存する。ＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌを発現すると同定された機能細胞クローンに対して、ＢＩＶＲｅｖ及び選択マーカーであるピューロマイシンをコードする第二構築物（ｐＥＦ１ａＲｅｖＩＲＥＳＰｕｒｏ）をトランスフェクションによって導入する。ピューロマイシン抵抗性クローンを選択する。次に、ＶＳＶ−Ｇ発現構築物及びＧＦＰをコードするＢＩＶ移入ベクター構築物とのコトランスフェクションによって、ＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ及びＲｅｖの機能的発現についてこのクローンをスクリーニングする。トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクトした細胞からの上清を回収し、野生型２９３細胞への形質導入に使用する。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージにより判断して最も多い量の機能的ＢＩＶベクターを産生スするクローンを後に使用する為に保存する。ＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ及びＲｅｖを発現すると同定された機能細胞クローンに対して、変異ＬＣＭＶグリコプロテイン（Beyer et al., J. Virol. 76:1488-1495）及び選択マーカーネオマイシンをコードする第三構築物（ｐＣＩＬＣＭＶｇｐｌＲＥＳＮｅｏ）をトランスフェクションによって導入する。ネオマイシン（Ｇ４１８）抵抗性クローンを選択する。次に、ＧＦＰをコードするＢＩＶ移入ベクター構築物のトランスフェクションによって、ＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ、Ｒｅｖ及び変異ＬＣＭＶグリコプロテインの機能的発現についてこのクローンをスクリーニングする。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージにより判断して最も多い量の機能的ＢＩＶベクターを産生スするクローンを後に使用する為に保存する。機能的ＢＩＶＧａｇ／Ｐｏｌ、Ｒｅｖ及び変異ＬＣＭＶグリコプロテイン同時に発現するものと同定されたクローンをパッケージングセルラインとして使用する。所定のＢＩＶベースベクター産生用のプロデューサーセルラインを作成する為に、所望の導入遺伝子（マーカー遺伝子又は治療用遺伝子）をコードするＢＩＶベースの移入ベクターを、ＢＩＶベースの移入ベクタープラスミドを用いるトランスフェクション又はＢＩＶベースのレンチウィルスベクター粒子を用いる感染によってパッケージングセルラインに導入する。パッケージングセルラインから回収される上清は所望のＢＩＶベースのレンチウィルスベクターが含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明のＨＩＶベースの模式図である。図１Ａは一連のパッケージング構築物：ｐＨＩＶΔΨ；更にｖｉｆ及びｖｐが欠失したｐΔＶΔＲ；更にプロテアーゼの活性部位に変異を有するｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊；更にインターフェロンβＳＡＲ要素を含むｐΔＶΔＲ−ＳＡＲ及びｐΔＶΔＲ−ＰＲ＊ＳＡＲ。図１Ｂは移入ベクターｐＨＬＥＩＰを示す。図１Ｃは偽型化（pseudotyping）に有用なエンベロープを示す。
【図２】ＨＩＶｐ２４レベルで測定した、異なるＨＩＶパッケージングセルラインからの長期に亘る（約１２週間）ウィルス産生を比較したグラフである。
【図３】ｐＣＩｉｇｐＳｙｎの模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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