(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列、即ち
Xaa1 Xaa2 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys   配列番号：3
（上の配列中、Ｘａａ１はＮ−末端のピログルタミン酸塩（ｐＧｌｕ）又はＤ−ピログルタミン酸塩（ＤｐＧｌｕ）の残基であり、そしてＸａａ２は、Ａｓｎ又は欠失である）又は次の（ｉ）〜（iii）のうちの少なくとも一つの置換がなされた該配列：（ｉ）一つ以上のＣｙｓがその対応するＤ−アミノ酸で置換された、（ii）Ｔｙｒが４−メトキシチロシンで置換された、（iii）Ｐｒｏが４−ヒドロキシプロリンで置換された、を含む単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチド、又はそれらの塩、エステル、アミド又はプロドラッグ。
【請求項２】
下記のアミノ酸配列、即ち
Xaa1 Xaa2 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys   配列番号：3
（上の配列中、Ｘａａ１はＮ−末端のｐＧｌｕ又はＤｐＧｌｕの残基であり、そしてＸａａ２はＡｓｎ又は欠失である）又は次の（ｉ）〜（iii）のうちの少なくとも一つの置換がなされた該配列：（ｉ）一つ以上のＣｙｓがその対応するＤ−アミノ酸で置換された、（ii）Ｔｙｒが４−メトキシチロシンで置換された、（iii）Ｐｒｏが４−ヒドロキシプロリンで置換された、からなる単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチド、又はそれらの塩、エステル、アミド又はプロドラッグ。
【請求項３】
χ−コノトキシン・ペプチドが下記のアミノ酸配列、即ち
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys       配列番号：4
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Xaa5      配列番号：5
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Xaa4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys      配列番号：6
Xaa1 Asn Gly Val Cys Cys Gly Xaa4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys  配列番号：7
Xaa1 Asn Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys   配列番号：8
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys-OH    配列番号：9
（上の配列中、Ｘａａ１はピログルタミン酸を指し、Ｘａａ３は４−ヒドロキシプロリンを指し、Ｘａａ４は４−メトキシチロシンを指し、Ｘａａ５はＤ−システインを指し、そして−ＯＨは遊離酸のＣ末端を示す。）
のいずれかを有する、請求項１に記載の単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチド、又はそれらの塩、エステル、アミド又はプロドラッグ。
【請求項４】
χ−コノトキシン・ペプチドが下記のアミノ酸配列、即ち
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys-OH    配列番号：10
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys       配列番号：11
（上の配列中、Ｘａａ１はＤ−ピログルタミン酸を指し、Ｘａａ３は４−ヒドロキシプロリンを指し、そして−ＯＨは遊離酸のＣ末端を示す。）
のいずれかを有する、請求項１に記載の単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチド、又はそれらの塩、エステル、アミド又はプロドラッグ。
【請求項５】
薬学的に許容しうる担体又は希釈剤とともに請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチドを含む組成物。
【請求項６】
一つ以上の他の活性物質を更に含む請求項５記載の組成物。
【請求項７】
医薬組成物の剤形である、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
ニューロンノルアドレナリン輸送体の阻害が効果的な治療に結びつく疾患若しくは状態の治療用若しくは予防用の医薬の製造における、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチドの使用。
【請求項９】
前記医薬が、泌尿器系若しくは心臓血管系の疾患若しくは状態、又は気分障害の治療用若しくは予防用、又は急性、慢性及び／若しくは神経障害性の疼痛、偏頭痛又は炎症の治療用若しくは制御用である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬が、手術（術後疼痛）、腸、癌、糖尿病、幻肢、神経損傷、炎症性疼痛及び末梢神経が関連する疼痛に関連する神経障害性疼痛の治療用である、請求項９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノルアドレナリン、セロトニン、ドーパミン、グルタミン酸及びグリシンなどの神経伝達物質の神経アミン輸送体の阻害剤として有用な新規なχ−コノトキシン・ペプチドに関する。本発明は、これらのペプチドを含む医薬組成物、並びに疼痛、炎症、失禁、心臓血管の状態及び気分障害などの状態、これらに限定されないが、の予防又は治療におけるこれらのペプチドの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
イモガイ属 (genus Conus)（円錐カタツムリ）の海カタツムリは獲物を捕獲するために巧妙な生化学的戦略を用いる。魚、虫又は他の軟体動物のいずれかの捕食動物として、円錐カタツムリは小さな生物活性ペプチドの混合物を含む毒液を獲物に注入する。コノトキシンと呼ばれるこれらの毒素分子は種々の受容体及びイオン・チャンネルを標的にすることにより神経伝達を妨げる。いずれか一つのイモガイ種から得た毒液は１００を上回る異なるペプチドを含みうる。コノトキシンはそれらの生理的標的に基づいて数種類に分類される。ペプチドのω−コノトキシン類は電位感受性Ｃａ2+−チャンネルを標的にし遮断して、神経伝達物質の放出を阻害する。α−コノトキシン及びψ−コノトキシンはニコチン性ＡＣｈ受容体を標的にし遮断して、神経節及び神経筋の遮断を引き起こす。μ−コノトキシン類のペプチドは電位感受性Ｎａ+−チャンネルを遮断するように作用して筋及び神経の活動電位を阻害する。δ−コノトキシンは電位感受性Ｎａ+−チャンネルの不活性化を標的にし遅延させ、ニューロンの興奮性を増強する。ペプチドのκ−コノトキシン類は電位感受性Ｋ+ −チャンネルを標的にし遮断し、これらもニューロンの興奮性を増強する。コノプレッシンはバソプレッシン受容体アンタゴニストであり、コナントキンはＮＭＤＡ受容体アンタゴニストである。γ−コノトキシン類は電位感受性非特異的陽イオンチャンネルを標的にする。σ−コノトキシン類は５ＨＴ3受容体と拮抗し、そしてχ−コノトキシン類は神経アミン輸送体を阻害する。
【０００３】
ペプチドのχ−コノトキシン類は最初に特許文献１に記載されたが、該類の二つの構成員はその後特許文献２で言及された。特許文献１で同定された具体的なχ−コノトキシン・ペプチドは、軟体動物を狩猟するＣ．マルモレウスから得たＭｒＩＡ及びＭｒＩＢであって、下記の配列を有する。
χ−ＭｒＩＡ Asn Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys 配列番号：１
χ−ＭｒＩＢ Val Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys 配列番号：２
【０００４】
これらの配列及び下記の配列において、Ｘａａ３は４−ヒドロキシ・プロリン（Ｈｙｐ）を指す。天然では、このアミノ酸残基はコードされたペプチドの翻訳後修飾から生じ、ヌクレオチド配列に直接コードされていない。
【０００５】
神経伝達物質の再摂取を阻害する化合物は、急性、慢性及び／又は神経障害性の疼痛、片頭痛又は炎症の治療に有用であることが見出された。このような化合物は、疼痛／炎症の緩和を改善するために及び／又は嘔気及び胃の不調などの望ましくない副作用の重症度を軽減するために、これらの治療に有用な他の薬剤とともに投与することもできる。これらは、尿失禁、排尿筋不安定及び間質性膀胱炎などの下部尿路障害の治療に有用であることも見出された。このような化合物の一つは「イミプラミン」であり、ノルアドレナリンの再摂取を阻害することに加えて、カルシウム・チャンネル遮断に悪影響を及ぼし抗コリン作用性の局部麻酔活性及び幾つかの他の効果を示すことが明らかにされた。ノルアドレナリンの再摂取を阻害できる他の化合物は特許文献３に記載されている。これらの化合物はイミプラミンと比べて抗コリン作用が低いといわれている。
【特許文献１】ＷＯ00/20444（ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド）
【特許文献２】ＷＯ00/44769（ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション）
【特許文献３】米国特許第5,441,985号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明のペプチドの場合、この神経伝達物質の再摂取の阻害は、シナプスから放出されたノルアドレナリンをニューロンに戻して速やかに一掃するよう機能するノルアドレナリン輸送体などのニューロンの神経伝達物質輸送体を選択的に阻害することにより達成される。
【０００７】
特許文献１（ＷＯ00/20444）に記載されたように、χ−ＭｒＩＡペプチドは、尾部、残基１〜３、二つのループ、残基の６〜９（ループ１）及び残基１１〜１２（ループ２）からそれぞれ構成され、システイン残基の４及び１３並びに５及び１０の間にそれぞれ二つのジスルフィド結合を有する。ＭｒＩＡはシステイン残基の数に関してα−コノトキシン・ペプチドに似ているが、ジスルフィドの結合は異なる。この点で、α−コノトキシン・ペプチドはＭｒＩＡのＡ−Ｄ／Ｂ−Ｃ結合ではなく、Ａ−Ｃ／Ｂ−Ｄ結合により特徴付けられる。上文中、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはジスルフィド結合の形成に関与する第一、第二、第三及び第四のシステイン残基をそれぞれ表す。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、ピログルタミン酸残基によるＭｒＩＡのＮ−末端アスパラギン残基の置換又はＭｒＩＡのＮ−末端へのピログルタミン酸塩残基の付加は、インビボ有効性、効果持続期間、安定性及び調製方法の点でＭｒＩＡを上回る特段の利点を付与することがここに見出された。
【０００９】
従って、本発明の第一側面において、下記のアミノ酸配列、即ち
Xaa1 Xaa2 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys   配列番号：３
（上の配列中、Ｘａａ１はＮ−末端ピログルタミン酸塩（ｐＧｌｕ）若しくはＤ−ピログルタミン酸塩（ＤｐＧｌｕ）の残基であり、そしてＸａａ２はＡｓｎ若しくは欠失である）
又は一つ以上のＣｙｓがその対応するＤ−アミノ酸で置換された該配列及び／又はＣｙｓ以外の一つ以上のアミノ酸残基が側鎖の修飾を受けた該配列のアミノ酸
を含む単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチド、又はそれらの塩、エステル、アミド若しくはプロドラッグが提供される。
【００１０】
第二の側面において、本発明は、下記のアミノ酸配列、即ち
Xaa1 Xaa2 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys   配列番号：３
（上の配列中、Ｘａａ１はＮ−末端ｐＧｌｕ若しくはＤｐＧｌｕの残基であり、そしてＸａａ２はＡｓｎ若しくは欠失である）
又は一つ以上のＣｙｓがその対応するＤ−アミノ酸で置換された該配列及び／又はＣｙｓ以外の一つ以上のアミノ酸残基が側鎖の修飾を受けた該配列のアミノ酸
から成る単離された、合成された又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチド、又はそれらの塩、エステル、アミド若しくはプロドラッグを提供する。
【００１１】
上記配列において、ｐＧｌｕはピログルタミン酸塩を表し、ＤｐＧｌｕはＤ−ピログルタミン酸塩を表す。
【００１２】
本発明のペプチドはＭｒＩＡを上回る幾つかの驚くべき予想外の利点を有する。該ペプチドは４から７のｐＨ範囲及び３７ＥＣでの保存にとりわけ安定であることも見出され、室温から３７ＥＣに維持された例えば輸液ポンプの装置で長期送達できる。合成の望ましくない副産物からの該ペプチドの生産及び分離に関しても利点があり、純度が通常＜９３％である同様な手法を用いるＭｒＩＡに比べて、＞９９％の均質性に容易に精製できる。ラットの異痛の神経障害性モデルで鞘内(i.t.)送達された場合、本発明のペプチドは、動物モデルに副作用を及ぼすことなく又は治療適量を減らすことなく、ＭｒＩＡと比べてより高い最大効力を有することが見出された。該ペプチドの効果持続期間は、鞘内に30 nmolをボーラス投与した後、４８時間を超えて延長することが見出された。本発明のペプチドは、適切な緩衝液で鞘内又は硬膜外に送達される場合、神経障害性疼痛及びその徴候の治療にとりわけ有用である。このような神経障害性疼痛状態は、手術（術後疼痛）、腸、癌、糖尿病、幻肢、神経損傷、炎症性疼痛及び末梢神経が関連する疼痛を含む。
【００１３】
χ−コノトキシン・ペプチドにより阻害される神経アミン輸送体はニューロンノルアドレナリン輸送体であることが好ましい。
【００１４】
χ−コノトキシン・ペプチドは円錐カタツムリから単離された天然に存在するペプチド又はその誘導体若しくは合成体であって良い。
【００１５】
χ−コノトキシン・ペプチドはニューロンノルアドレナリン輸送体の選択的阻害剤であることが好ましい。本明細書で用いられるとき「選択的」及び「選択性」という用語は、ニューロンノルアドレナリン輸送体の阻害剤としての該ペプチドの活性がα1−アドレナリン受容体のいかなる活性よりかなり高いことを意味する。該ペプチドの阻害剤は、ニューロンノルアドレナリン輸送体に対して１０倍選択的であることが好ましく、１００倍選択的であることがより好ましく、１０００倍以上選択的であることが最も好ましい。該ペプチドはまたα2−アドレナリン受容体及び／又はセロトニン再摂取輸送体（ＳＥＲＴ）よりも選択的であることが好ましい。ニューロンノルアドレナリン輸送体の阻害剤の選択性は、当分野で既知の技法を用いて、例えば適切な標識リガンド置換検定法を用いて測定できる。
【００１６】
米国特許第5,441,985号は、抗コリン作用を殆ど持たないノルアドレナリン再摂取阻害剤が下部尿路疾患の治療にとりわけ有用であることを示している。本発明のペプチドも抗コリン作用を検出できないか又は実質的に検出できないことが見出されている。
【００１７】
従って、本発明の好ましい実施態様では、χ−コノトキシン・ペプチドは、ニューロンノルアドレナリン輸送体を選択的に阻害する能力を有し、抗コリン作用を殆ど又は実質的に全く有さない。
【００１８】
本発明のペプチドはナトリウム・チャンネル遮断薬として又はドーパミン輸送体の阻害剤として活性を有さないことが好ましい。他のノルアドレナリン輸送体の阻害剤に共通して存在するこれらの付加的な薬理活性が本発明のペプチド及び特に本発明の好ましいペプチドに欠如していることにより、これらのペプチドは有用な薬理学的手段になる。
【００１９】
本発明のペプチドはＭｒＩＡの特定の誘導体である。
【００２０】
χ−ＭｒＩＡなどの天然に存在するχ−コノトキシン・ペプチドに関連して本明細書で用いられる「誘導体」という用語は、一つ以上のアミノ酸の欠失、付加、置換、又は側鎖の修飾だけ天然に存在するペプチドと異なるペプチドを指す。本発明のあらゆるこのような誘導体はニューロンノルアドレナリン輸送体を阻害する能力を有する。
【００２１】
置換は、アミノ酸が天然に存在する別のアミノ酸残基又は従来型でないアミノ酸残基で置換されているアミノ酸の変化を包含する。このような置換は「同類」として分類されうる。その場合、ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基は、極性、側鎖の官能性又は大きさのいずれかに関して類似する特徴を持つ別の天然に存在するアミノ酸で置換され、例えばＳｅｒ⇔Ｔｈｒ⇔Ｐｒｏ⇔Ｈｙｐ⇔Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ｈｉｓ⇔Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ⇔Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ又はＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒである。従来型でない幾つかのアミノ酸も天然に存在するアミノ酸の適切な置換になりうると理解されるべきである。例えば、Ｌｙｓ残基は、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Ｌｙｓ、Ｎ−メチル−Ｌｙｓ、Ｎ,Ｎ−ジメチル−Ｌｙｓ及びＮ,Ｎ,Ｎ−トリメチル−Ｌｙｓにより置換されうる。Ｌｙｓ残基はまたＮ−１−（２−ピラゾリニル）−Ａｒｇ、２−（４−ピペリニル）−Ｇｌｙ、２−（４−ピペリニル）−Ａｌａ、２−[３−（２Ｓ）ピロリニニル]−Ｇｌｙ及び２−[３−（２Ｓ）ピロリニニル]−Ａｌａを含むがこれらに限定されない合成の塩基性アミノ酸で置換できる。Ｔｙｒ残基は４−メトキシ・チロシン（ＭｅＹ）、メタ−Ｔｙｒ、オルト−Ｔｙｒ、ノル−Ｔｙｒ、 125Ｉ−Ｔｙｒ、モノ−ハロ−Ｔｙｒ、ジ−ハロ−Ｔｙｒ、Ｏ−スルホ−Ｔｙｒ、Ｏ−ホスホ−Ｔｙｒ、及びニトロ−Ｔｙｒで置換されうる。Ｔｙｒ残基はまた３−ヒドロキシル又は２−ヒドロキシル異性体（それぞれメタ−Ｔｙｒ又はオルト−Ｔｙｒ）及び対応するＯ−スルホ及びＯ−ホスホ誘導体で置換されうる。Ｔｙｒ残基はまた４−ヒドロキシメチル−Ｐｈｅ、４−ヒドロキシフェニル−Ｇｌｙ、２,６−ジメチル−Ｔｙｒ及び５−アミノ−Ｔｙｒを含むがこれらに限定されない合成ヒドロキシル含有アミノ酸で置換できる。脂肪族アミノ酸は非天然脂肪族の分岐状又は直鎖状の側鎖ＣnＨ2n+2（ｎ＝８以下）を生じる合成誘導体により置換されうる。従来型でないアミノ酸による適切な同類置換の例はＷＯ02/064740で挙げられ、その全内容は参照により本明細書にインコーポレートされる。本発明に従って、置換は同類置換に限定される。
【００２２】
アミノ酸の置換は通常一つの残基であるが、複数の残基であってもよく、群がっていても分散していても良い。
【００２３】
付加は一つ以上の天然に存在する又は従来型でないアミノ酸残基の付加を包含する。Ｘａａ２がＡｓｎである本発明のペプチドは、Ｘａａ１残基を付加されたＭｒＩＡの誘導体とみなしてもよい。他の付加はＣ−末端に限定される。欠失は一つ以上のアミノ酸残基の欠失を包含する。
【００２４】
上記のように、本発明はＣｙｓ以外の一つ以上のアミノ酸が側鎖の修飾を受けたペプチドを含む。本発明により意図される側鎖の修飾の例は、アルデヒドとの反応による還元性アルキル化の後ＮａＢＨ4による還元、メチルアセチミデートによるアミジン化、無水酢酸を用いたアシル化、シアネートによるアミノ基のカルバモイル化、2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化、及びピリドキサール-５-リン酸によるリシンのピリドキシル化の後ＮａＢＨ4による還元、及びＮ−アセチル化などのアミノ基の修飾を含む。
【００２５】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3−ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬による複素環縮合産物の形成により修飾されうる。
【００２６】
カルボキシル基はＯ−アシルイソウレア形成を介したカルボジイミドの活性化後、続いて、例えば対応するアミドへの誘導体化により修飾されうる。
【００２７】
酸性アミノ酸は、ＷＯ02/600923に記載されたように、グリシン及びアラニンのテトラゾリル誘導体で置換されうる。
【００２８】
チロシン残基は例えば４−位のメトキシル化により改変されうる。チロシンはまたテトラニトロメタンを用いたニトロ化により改変され、３−ニトロチロシン誘導体を形成しうる。チロシン誘導体の例はＷＯ02/064740に記載されている。
【００２９】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化又はジエチルピロカーボネートを用いたＮ−カルベトキシル化により達成されうる。
【００３０】
プロリン残基は例えば４−位のヒドロキシル化により修飾されうる。
【００３１】
本発明により意図される他の誘導体は一連のグリコシル化変異体を含む。グリコシル化の改変された型は異なる宿主細胞での組み換え分子の発現から生じうる。Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＨｙｏの残基はＯ−グリカンを含むように修飾されうる一方、Ａｓｎ及びＧｌｎの残基はＮ−グリカンを形成するように修飾できる。本発明に従って、「グリカン」という用語は、当分野で知られる合成方法又は酵素的方法により修飾アミノ酸の天然の任意のヒドロキシ基、アミノ基又はチオール基に結合できるＮ−、Ｓ−又はＯ−結合の単糖類、二糖類、三糖類、多糖類又はオリゴ糖類を指す。グリカンを構成する単糖類はＤ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（GlcNAc）、Ｄ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（GalNac）、Ｄ−フコース又はＤ−アラビノースを含み得る。これらの糖類は一つ以上のＯ−硫酸塩、Ｏ−リン酸塩、Ｏ−アセチル又はシアル酸などの酸性基（これらの組み合わせを含む）で構造的に修飾されうる。グリカンはまたＤ−ペニシラミン２,５及びそのハロゲン化誘導体又はポリプロピレングリコール誘導体などの類似のポリヒドロキシル基をも含みうる。グリコシド結合はベータであり且つ１−４又は１−３であって、好ましくは１−３である。グリカンとアミノ酸との結合はアルファ又はベータであり、好ましくはアルファであり、そして１−である。
【００３２】
修飾した側鎖を有する一部のアミノ酸及び他の非天然アミノ酸の一覧を表１に示す。
【００３３】
【表１】
0004565087.tif 000002
【００３４】
【表１−１】
0004565087.tif 000003
【００３５】
【表１−２】
0004565087.tif 000004
【００３６】
特に好ましい側鎖の修飾には、ＭｅＹによるＴｙｒの置換及び／又はＨｙｐによるＰｒｏの置換が含まれる。
【００３７】
これらのタイプの修飾、及びより実質的な側鎖の修飾を含む他のタイプの修飾は、個体に投与される場合若しくは診断薬として使用される場合にペプチドを安定化させるために、又は溶解度若しくは生体利用率を向上させるために、又は他の薬理学を提供するために重要であることがある。例えば、これらの効果を達成するために、例えばニトロキシド供与基の導入により、側鎖の長さを伸長若しくは収縮する又は官能基を挿入若しくは除去することが可能である。
【００３８】
本発明のペプチドは、その塩、エステル、アミド又はプロドラッグの形態でありうる。本発明のχ−コノトキシンは通常Ｃ−末端でアミド化されるが、Ｃ−末端に遊離のカルボキシル末端又は他の修飾をもつ化合物は本発明の範囲内であると考えられる。これらのペプチドはＣ−末端でアミド化されるか又は遊離のカルボキシルを有することが好ましい。本発明のペプチドは塩又はプロドラッグの形態でありうる。
【００３９】
適切な塩の例には、塩化物、酢酸塩、乳酸塩及びグルタミン酸塩が含まれる。適切な塩の常套的調製手法は当分野で周知である。
【００４０】
本発明のペプチドはプロドラッグの形態であってもよい。プロドラッグは必要な活性ペプチドにインビボで容易に変換できる本発明のあらゆるペプチドの誘導体を含むと理解される。本発明の適切なプロドラッグの常套的調製手法は、「プロドラッグの設計」、エイチ．ブンドガード編集、エルセフィア、1985年などの教科書に記載されている。
【００４１】
本発明のペプチドはＣｙｓ残基及びχ−コノトキシン・ペプチドの特徴的なジスルフィド結合パターンを保持する。
【００４２】
該ペプチドは、同じ部位に作用する新たな分子を同定するための結合検定を確立するため、標識して用いることもできる。例えば、標識されたペプチド・リガンドはトリチウムを含有しうる又はＴｙｒ若しくは他の適切な残基を介して結合する放射性ヨウ素若しくは類似物質を有しうる。このような標識ペプチドの組織ホモジネート又は発現輸送体への結合を化合物又は混合物により阻害することにより、哺乳動物の血清及び神経及び筋組織（ヒトの組織を含む）に存在するペプチドを含む、この部位で活性な新たなペプチドを同定できるであろう。該検定は、χ−コノトキシン・ペプチドと同じ部位に作用もし且つこれらのペプチドの経口活性型としての有用性を有しうる非ペプチド分子の同定も可能である。標識ペプチドは更に種々の組織にわたってペプチド結合の位置を同定するオートラジオグラフィー研究を可能にする。
【００４３】
ＷＯ00/20444で提唱されたことに反して、χ−コノトキシン・ペプチドはノルアドレナリンに関して非競合的阻害剤であるが、マジンドール、コカイン及びデシプラミンなどの三環系抗鬱剤などのノルアドレナリン輸送体にも結合する小分子に関して競合的であることが見出された。
【００４４】
従って、本発明の標識ペプチド、好ましくは放射性同位元素で標識されたペプチドを用いた結合検定は、ノルアドレナリン輸送体を介してノルアドレナリン輸送の非競合的阻害剤として作用しうるであろう小分子を発見するために使用できる。この検定は、ノルアドレナリン、又はカイ−コノペプチドの結合部位と重複しないがノルアドレナリン輸送体の多数の小分子阻害剤（例えば三環系抗鬱剤）と重複する同類の小分子、の遮断濃度の存在下で行うことが好ましい。
【００４５】
本発明のχ−コノトキシンは標準的なペプチド合成方法それに続く酸化的ジスルフィド結合形成を用いて調製されうる。例えば、直鎖ペプチドは、シュノルツァーら（1992）により記載されたように、ＢＯＣ化学を用いた固相法により合成されうる。脱保護及び固体支持体からの切断の後、還元型ペプチドは分取クロマトグラフィーを用いて精製される。精製された還元型ペプチドは例えば実施例で記載するような緩衝系で酸化される。酸化型ペプチドは分取クロマトグラフィーを用いて精製できる。
【００４６】
コノトキシンの合成を記載する引用文献には、サトウら、ルーら及びＷＯ91/07980が含まれる。
【００４７】
χ−コノトキシンはまた組み換えＤＮＡ技術を用いて調製してもよい。所望のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を適切なベクター中に挿入し、タンパク質を適切な発現系で発現されれば良い。時には、発現したペプチドの更なる化学修飾、例えばＣ−末端のアミド化及びＮ−末端のグルタミン酸残基のピログルタミン酸残基への変換が適当であろう。ある状況下では、ペプチド発現後、化学工程として発現ペプチドの酸化的結合の形成を行うことが望ましいかもしれない。これに先立ち、折り畳まれていないペプチドを得るため還元的工程を先行させても良い。当業者は該ペプチドの還元及び酸化に適切な条件を容易に決定しうる。
【００４８】
当分野で知られた技法を用いて抗イディオタイプ抗体を調製することも可能である。これらの抗イディオタイプ抗体及び治療剤としてのそれらの使用は本発明の更なる側面を表す。
【００４９】
該核酸分子は、単離された形態であっても良く又はベクター分子及び特に発現ベクター分子などの他の遺伝分子に組み込まれ又は連結され又は他の方法で融合若しくは結合されていても良い。ベクター及び発現ベクターは一般的に原核細胞又は真核細胞のいずれか又は両方で複製でき、妥当な場合発現できる。原核細胞は大腸菌、バチルス種及びシュードモナス種を含むことが好ましい。好ましい真核細胞は酵母、真菌類、哺乳動物及び昆虫の細胞を含む。
【００５０】
遺伝構築物の遺伝子部分は、プロモーターが適切な細胞中で該遺伝子部分の発現を指令できるようにベクター上で、該プロモーターと操作可能なように連結されることが好ましい。
【００５１】
他分子中に該活性を遺伝子工学てきに組み込むため、時には付加的機能を持つ新しい分子を生産するため、他のコノトキシン又は更には他のペプチド若しくはタンパク質と本発明のχ−コノトキシンとのキメラを作製することができる。例えば、Ｎ−型カルシウム・チャンネルに結合するアミノ酸をＮＥＴを阻害するアミノ酸と結合させて、Ｎ−／Ｃ−閉環したＣＣＳＫＬＭＹＤＣＣＧＹＫＬＧにおけるような、ＮＥＴでの活性（χ−コノペプチドのループ１残基を用いて）及びＮ−型カルシウム・チャンネルでの活性（ＣＶＩＤのループ２を用いて）を持つペプチドを生産できる。同様に、ある環状ペプチドは、ｃＣＣＲＲＱＩＣＣＧＹＫＬＧにおけるように、ループ１カイ残基及びオピエート受容体で活性を有するアミノ酸のループと対比できる。これらのキメラ・ペプチドは、相加的な又は更に相乗的な薬理を有するため特に有用である場合がありそしてヒトに存在する広範囲の疼痛症候群の治療に有益であると期待される。
【００５２】
従って、コノトキシン・ペプチド又はコノトキシンという用語は、イモガイ属から得られる天然に存在する毒性ペプチドに限定されず、むしろ該ペプチドが由来した最初の起源を単に示すと理解されるべきである。コノトキシン・ペプチドは合成で創出される天然に存在しない非毒性ペプチド誘導体であっても良い。コノペプチドはコノトキシン・ペプチドと互換できる代替用語である。
【００５３】
これらのＭｒＩＡ類似体の部分集合はＮＥＴに加えて受容体に作用して相乗的又は相加的な効果を可能にしうる。これらの付加的な相互作用は相乗作用して鎮痛効果を増強することが好ましい。これらの付加的な相互作用は、オピオイド受容体、オピオイド受容体様受容体、ＭＲＧファミリーのＧＰＣＲ、ＮＭＤＡ受容体、グルタミン酸塩受容体、ニューロキニン、シクロオキシゲナーゼ受容体、セロテルゲン(serotergenic)受容体、アドレナリン受容体、バニロイド受容体、ベンゾジアゼピン受容体、Ｎ−型カルシウム・チャンネル・アンタゴニスト、ニューロンのニコチン性受容体、ムスカリン性アセチルコリン・カプサイシン受容体、ＴＮＦ−α、テトロドトキシン耐性及びテトロドトキシン感受性のＮａチャンネル、電位感受性カルシウム・チャンネル並びにエンドセリン受容体（endothelian receptor) で起きることがより好ましい。
【００５４】
本発明のχ−コノトキシン・ペプチドは１０から３０のアミノ酸を有することが好ましく、より好ましくは１１から２０である。
【００５５】
そのＣ−末端は「尾部」ペプチドの付加により伸長しうる。時には、ペプチドの活性はこのような修飾により向上し得る。
【００５６】
本発明のχ−コノトキシン・ペプチドの例としては下記のものが挙げられる。
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys         配列番号：４
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Xaa5        配列番号：５
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Xaa4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys        配列番号：６
Xaa1 Asn Gly Val Cys Cys Gly Xaa4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys    配列番号：７
Xaa1 Asn Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys     配列番号：８
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys-OH      配列番号：９
【００５７】
上記の配列において、Ｘａａ１はピログルタミン酸を指し、Ｘａａ３は４−ヒドロキシプロリンを指し、Ｘａａ４は４−メトキシチロシンを指し、Ｘａａ５（Ｃｙｓ）はＤ−システインを指し、そして−ＯＨは遊離酸のＣ末端を示す。
【００５８】
他に断らない限り、該ペプチドのＣ末端はアミド化されていることが好ましい。
【００５９】
本発明のχ−コノトキシン・ペプチドの更なる例には下記のものが含まれる。
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys-OH      配列番号：１０
Xaa1 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys         配列番号：１１
【００６０】
上記の配列において、Ｘａａ１はＤ−ピログルタミン酸を指し、Ｘａａ３は４−ヒドロキシプロリンを指し、そして−ＯＨは遊離酸のＣ末端を示す。
【００６１】
本発明のχ−コノトキシン・ペプチドはニューロンノルアドレナリン輸送体を阻害する活性がある。従って、本発明はニューロンノルアドレナリン輸送体の阻害剤としてのχ−コノトキシン・ペプチドの使用、及びニューロンノルアドレナリン輸送体の阻害が有効治療に結びつく疾患又は状態の治療又は予防における該ペプチドの使用を提供する。薬理学的物質におけるこのような活性は、泌尿器系若しくは心臓血管系、若しくは気分障害の疾患若しくは状態の予防若しくは治療、又は急性、慢性及び／若しくは神経障害性の疼痛、片頭痛若しくは炎症の治療若しくは制御における活性と関連する。
【００６２】
製剤の例及び治療におけるノルアドレナリン再摂取阻害剤の使用は、アルディッド，ディら，（1992）Fund. Clinical Pharmacology 6(2): 75-8、ヤクシュ，ティ．エル．，(1985) Pharmacology Biochemistry and Behaviour 22: 845-858 、ヤクシュ，ティ．エル．及びタカノ，ワイ．，(1992) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 261(2): 764-772 、ヤクシュ，ティ．エル．及びホウ，ジェイ．アール．, (1982) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 220(2): 311-321 、ホウ，ジェイ．アール．ら, (1983) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 224(3): 552-558 、ソロモンら, (1989) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 251(1): 28-38 、フリートウッド−ウォーカー，エス．エム．ら, (1985) Brain Research 334: 243-254 、タカギ，エイチ＆ハリマ，エイ．, (1996) European Neuropsychopharmacology 6, 43-47 、アイゼナッハ，ジェイ．シイ．ら, (1998) Anesth Analg 87, 591-6 、デュブナー，アール．及びハルグレブス，ケイエム, (1989) Clin J Pain, 5 pS1-6 、マックス，エムビイ, (1992) N Engl J Med 326, p1287-8 、アトキンソン，ジェイエイチら, (1998) Pain 76, p287-96 、ミコ，ジェイ．エイ．ら, (1997) European Neuropsychopharmacology 7, S162 に見出せる。
【００６３】
従って、本発明は、泌尿器系若しくは心臓血管系の状態若しくは疾患又は気分障害の治療若しくは予防の方法又は急性、慢性及び／若しくは神経障害性の疼痛、片頭痛若しくは炎症の治療若しくは制御の方法を提供する。この方法はニューロンノルアドレナリン輸送体を阻害する能力を有する単離され、合成され又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチドの有効量を哺乳動物に投与する工程を含む。ここで該χ−コノトキシン・ペプチドは下記のアミノ酸配列
Xaa1 Xaa2 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys       配列番号：３
（上配列中、Ｘａａ１はＮ−末端のｐＧｌｕ又はＤｐＧｌｕ残基であり、そしてＸａａ２はＡｓｎ又は欠失である）
又は一つ以上のＣｙｓがその対応するＤ−アミノ酸と置換する配列及び／又はＣｙｓ以外の一つ以上のアミノ酸残基が側鎖の修飾を受けた配列又はそれらの塩若しくはプロドラッグを含む。
【００６４】
本発明の方法を実施する際に、χ−ペプチドの投与は該状態、疾患又は障害の治療に有用な他の治療と併せて行われうる。従って、該ペプチドは該状態、疾患又は障害の治療に有用な他の薬剤と実質的に同時に又は逐次的に投与されうる。併用投与が同時である場合、該ペプチドは一つ以上の他の薬剤と共に組成物に製剤されうる。他の薬剤の併用投与はχ−ペプチドの投与経路と同じ経路又は異なる経路を経て実施され得る。本方法が急性、慢性及び／又は神経障害性の疼痛又は片頭痛の治療用又は制御用である場合、該ペプチドは、オピオイド鎮痛薬、オピオイド受容体様アンタゴニスト、ＭＲＧファミリーのＧＰＣＲアンタゴニスト、ＮＭＤＡアンタゴニスト、物質Ｐアンタゴニスト、ＣＯＸ１及びＣＯＸ２の阻害剤、三環系抗鬱剤（ＴＡＣ）、選択的セロトニン再摂取阻害剤（ＳＳＲＩ）、カプサイシン受容体アンタゴニスト、麻酔薬、ベンゾジアゼピン、骨格筋弛緩薬、片頭痛治療薬、抗痙攣薬、降圧剤、抗不整脈剤、抗ヒスタミン剤、ステロイド、カフェイン、Ｎ−型カルシウム・チャンネル・アンタゴニスト、ニコチン性受容体の半アゴニスト及びアンタゴニスト、バニロイド受容体のアンタゴニスト及びアゴニスト、ＴＮＦ−αのアンタゴニスト及び抗体、テトロドトキシン感受性Ｎａチャンネルの阻害剤、Ｐ−型チャンネル阻害剤、エンドセリン（endothelian)アンタゴニスト及びボツリヌス毒素より成る群から選択される鎮痛薬と実質的に同時に又は連続的に投与されうる。該ペプチドはまた、二つ以上の他の薬剤、例えばＳＳＲＩ及びノルアドレナリン再摂取阻害剤の混合物と同時に投与されうる。
【００６５】
該鎮痛薬がオピオイド受容体様鎮痛剤である場合、ナルトレキソン及びナルメフェン、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００６６】
該鎮痛薬がオピオイド鎮痛薬である場合、プロポキシフェン、メペリジン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、モルヒネ、コデイン及びトラモドル、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００６７】
該鎮痛薬がＮＭＤＡアンタゴニスト鎮痛薬である場合、２−ピペリジノ−１アルカノール誘導体、デキストロメトルファン、エリプロジル、及びイフェンプロジル、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００６８】
該鎮痛薬がＰアンタゴニスト鎮痛薬である場合、２−フェニル−ピペリジン−３−イル又は米国特許出願第2001/00336943 A1号（コーら）に記載の２−ジフェニルメチル−１−アザビシクロ[２.２.２]−オクタン−３−アミン誘導体、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００６９】
該鎮痛薬がＣＯＸ２阻害鎮痛薬である場合、ロフェコキシブ及びセレコキシブ、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７０】
該鎮痛薬が麻酔鎮痛薬である場合、亜酸化窒素、ハロタン、リドカイン、エチドカイン、ロピバカイン、クロロプロカイン、サラピン及びブピバカイン、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７１】
該鎮痛薬がベンゾジアゼピン鎮痛薬である場合、ジアゼパム、クロルジアゼポキシド、アルプラゾラム、ロラゼパム、ミダゾラム、Ｌ−365260、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７２】
該鎮痛薬が骨格筋弛緩薬鎮痛薬である場合、フレケセリル(flexeril)、カリソプロドール、ロバキシサール(robaxisal)、ノルゲシック(norgesic)及びダントリウム(dantrium)、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７３】
該鎮痛薬が片頭痛の治療薬である場合、エリトリプタン(elitriptan)、スマトリプタン、リザトリプタン、ゾルミトリプタン、及びナラトリプタン、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７４】
該鎮痛薬が抗痙攣薬の鎮痛薬である場合、ガバペンチン、プレガバリン(pregabalin)、カルバマゼピン、及びトピラメート(topiramate)及びバルプロ酸、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７５】
該鎮痛薬がＣＯＸ１阻害剤の鎮痛薬である場合、サリシリック酸(salicylic acid)、アセトミノフェン、ジクロフェナク、ピロキシカン(piroxican)、インドメタシン、イブプロフェン、及びナプロキセン、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７６】
該鎮痛薬が三環系抗鬱薬の鎮痛薬である場合、アミトリプチリン、デシプラミン、ペルフェナジン、プロトリプチリン、及びトラニルシプロミン、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７７】
該鎮痛薬がＳＳＲＩ鎮痛剤である場合、トラマドール及びミルナシプラン(milnacipran)、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７８】
該鎮痛薬がＳＳＲＩとノルアドレナリン再摂取阻害薬の混合物である場合、後者はレボキセチン(reboxetine)及びアトモキセチン(atomoxetine)、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００７９】
該鎮痛薬はまたアデノシン、バクロフェン、クロニジン、メキシリテン(mexilitene)、ジフェニル−ヒドラミン、ヒドロキシシン(hydroxysine)、カフェイン、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、デカドロン(decadron)、パロキセチン、セルトラリン、フルオキセチン、ジコノチド(Ziconotide)（登録商標）、及びレボドパ、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択してもよい。
【００８０】
該鎮痛薬がＴＮＦ−αのアンタゴニスト又は抗体である場合、この薬物はエタネルセプト(etanercept)、インフリキシマブ及びサリドマイド、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００８１】
該鎮痛薬がエンドセリン（endothelian)アンタゴニストである場合、この薬物はボセンタン(bosentan)及びテソセンタン(tesosentan)、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００８２】
該鎮痛薬がバニロイド・アンタゴニストである場合、該鎮痛薬はアナナミド(ananamide)、カプサゼピン(capsazepine)、チオカルバミン酸誘導体（ＷＯ02/16317 A1に記載）及びチオ尿素誘導体（ＷＯ02/16318 A1に記載）、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。
【００８３】
該鎮痛薬がニコチン受容体部分アゴニストから選択される場合、１,２,３,４,５,６−ヘキサヒドロ−１,５−メタノ−ピリド[１,２−ａ][１,５]ジアゾシン−８−オン誘導体、ジアザテトラシクロ[９.３.１.０.sup.２,１０.０.sup.４,８]ペンタデカ−２（１０）,３,８−トリエン誘導体、１０−アザ−トリシクロ[６.３.１.０.sup.２,７]ドデカ−２−（７）,３,５−トリエン誘導体、トリアザテトラシクロ[９.３.１.０.sup.２,１０.０.sup.４,８]ペンタデカ−２（１０）,３,５,８−テトラエン誘導体、５,８,１４−トリアザテトラシクロ[１０.３.１.０.sup.２,１１.０.sup.４,９]ヘキサデカ−２（１１）,３,５,７,９−ペンタエン誘導体、ジアザテトラシクロ[９.３.１.０.sup.２,１０.０.sup.４,８]ペンタデカ−２（１０）,３,６,８−テトラエン誘導体、１０−アザトリシクロ[６.３.１.０.sup.２,７]ドデカ−２（７）,３,５−トリエン誘導体、５,７,１４−トリアザテトラシクロ[１０.３.１.０.sup.２,１０.０.sup.４,８]ヘキサデカ−２（１０）,３,５,８−テトラエン誘導体、５,８,１５−トリアザテトラシクロ[１１.３.１.０.sup.２,１１.０.sup.４,９]ヘプタデカ−２（１１）,３,５,７,９−ペンタエン誘導体、５,１４−ジアザテトラシクロ[１０.３.１.０.sup.２,１０.０.sup.４,８]ヘキサデカ−２（１０）,３,５,８−テトラエン誘導体、１１−アザトリシクロ[７.３.１.０.sup.２,７]トリデカ−２（７）,３,５−トリエン誘導体、それらの薬学的に活性な塩及びそれらの光学異性体から選択されることが好ましい。これらは全て、米国特許出願第2001/00336943 A1号に記載されている。
【００８４】
急性、慢性及び／又は神経障害性の疼痛及び炎症性疼痛に関連する状態の例としては、急性外傷、変形性関節症、関節リウマチ、筋骨格の疼痛、特に外傷後、脊椎の疼痛、歯痛、筋膜痛症候群、頭痛、会陰切開の疼痛、及び火傷などの軟組織及び末梢の損傷など、心臓痛、筋肉痛、眼痛、口腔顔面痛、例えば歯痛、腹痛、婦人科の疼痛、例えば月経困難症、及び陣痛などの深部痛及び内臓痛など、末梢神経障害に関連する疼痛、例えば神経絞扼及び上腕神経叢剥離、切断、末梢神経障害、神経痛、疼痛チック、非定型顔面痛、神経根の損傷、疼痛及び／又は慢性神経圧迫、及びくも膜炎などの神経及び神経根の損傷に関連する疼痛など、しばしば癌疼痛と呼ばれる癌腫に関連する疼痛など、ＡＩＤＳに関連する疼痛、脊髄又は脳幹の損傷による疼痛などの中枢神経系疼痛など、腰痛、坐骨神経痛、片頭痛、急性及び慢性の緊張性頭痛、群発頭痛を含む頭痛、側頭下顎骨の疼痛及び上顎洞の疼痛、強直性脊椎炎、痛風、術後疼痛、幻想痛、糖尿病性神経障害、帯状疱疹、並びに傷跡の疼痛が挙げられる。
【００８５】
疼痛治療におけるコノトキシン・ペプチドの製剤及び使用の例は、ＷＯ9107980、米国特許第5,587,454号及びＷＯ9701351に見出せる。これらの文書はオメガ・コノトキシンに関するものである。Ｎ−型電位感受性カルシウム・チャンネルの選択的遮断薬であるコノトキシン・ペプチド及びラットの急性、持続性及び神経障害性の疼痛治療におけるそれらの使用に関するボワーソックス・エスエス，ガドボイス・ティ、シング・ティ、ペツス・エム、ワング・ワイエックス及びルザー・アールアール，(1996) J Pharmacol Exp Ther 、279(3)、1243-9頁も参照せよ。
【００８６】
泌尿器系の疾患又は状態の例には尿失禁及び便失禁が含まれる。心臓血管の疾患又は状態の例には種々の器官の不整脈及び冠状動脈性心臓病が含まれる。気分障害の例には、鬱、不安、渇望、嗜癖障害及び禁断症候群、適応障害、加齢に伴う学習障害及び精神障害、拒食症、無関心、全身状態による注意力欠如障害、注意欠陥過活動性障害、双極性障害、多食症、慢性疲労症候群、慢性又は急性のストレス、行為障害、循環障害、鬱、気分変調性障害、線維筋痛及び他の身体表現性障害、全般性不安障害、失禁、吸入障害、中毒障害、マニア、肥満、強迫神経障害及び類似の自閉症スペクトル障害、反抗的行為障害、パニック障害、末梢神経障害、心的外傷後ストレス障害、月経前不快気分障害、精神異常、季節性情動障害、睡眠障害、対人恐怖、特殊発達障害、選択的セロトニン再摂取阻害（ＳＳＲＩ）「故障」症候群及びＴＩＣ障害が含まれる。
【００８７】
泌尿器系の疾患又は状態の治療におけるノルエプリネフリン(noreprinephrine)再摂取の選択的阻害剤の使用例には、スプリンゲル，ジェイピイ．、クロップ，ビイピイ＆ソル・ケイビイ，(1994) J Urol 152(2) 、p 515-9（下部尿路に関して）、ペンティラ，オー．ら，(1975) Ann Clin Res (7), 32-6 ( 潰瘍性大腸炎の治療に関して）及びディナン，ティジイら, (1990) J Psychosom Res 34, p575-80（過敏性腸症候群の治療に関して）が含まれる。
【００８８】
該ペプチドは予防的な意味で投与されうるが、哺乳動物はこのような治療の必要があることが好ましい。
【００８９】
本発明はまたニューロンノルアドレナリン輸送体を阻害する能力を有する単離され、合成され又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチド及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む組成物も提供する。ここで、該χ−コノトキシン・ペプチドは、下記のアミノ酸配列：
Xaa1 Xaa2 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys       配列番号：３
（上配列中、Ｘａａ１はＮ−末端ｐＧｌｕ若しくはＤｐＧｌｕの残基であり、そしてＸａａ２はＡｓｎ若しくは欠失である）
又は一つ以上のＣｙｓがその対応するＤ−アミノ酸と置換される該配列及び／又はＣｙｓ以外の一つ以上のアミノ酸残基が側鎖の修飾を受けた該配列、又はそれらの塩又はプロドラッグを含む。
【００９０】
該組成物は医薬組成物の剤形であることが好ましい。該組成物は医薬組成物に存在し且つ該状態、疾患又は障害の治療に有用な他の活性物質であってもよい。
【００９１】
泌尿器系又は心臓血管系の状態若しくは疾患、又は気分障害の治療用又は予防用、又は急性、慢性及び／若しくは神経障害の疼痛、片頭痛又は炎症の治療用又は制御用の医薬の製造における、ニューロンノルアドレナリン輸送体を阻害する能力を有する単離され、合成され又は組換えのχ−コノトキシン・ペプチドの使用も提供される。ここで、該χ−コノトキシン・ペプチドは、下記のアミノ酸配列、
Xaa1 Xaa2 Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys       配列番号：３
（上配列中、Ｘａａ１はＮ−末端ｐＧｌｕ若しくはＤｐＧｌｕの残基であり、そしてＸａａ２はＡｓｎ若しくは欠失である）
又は一つ以上のＣｙｓがその対応するＤ−アミノ酸と置換される該配列、及び／又はＣｙｓ以外の一つ以上のアミノ酸残基が側鎖の修飾を受けた該配列、又はそれらの塩又はプロドラッグを含む。
【００９２】
ノルアドレナリン輸送体が神経細胞だけでなく胎盤、肺内皮細胞及び子宮を含む他の組織によっても発現されることにも留意される。本発明のペプチドはこれらのノルアドレナリン輸送体を阻害するのにも効果的でありうるそしてこれらの輸送体が関係する状態を治療するのにも有用でありうる。
【００９３】
当業者に容易に理解されるように、投与経路及び薬学的に許容しうる担体の性質は治療される状態及び哺乳動物の性質に依存する。具体的な担体及び輸送系の選択、並びに投与経路は当業者により容易に決定されうると考えられる。該ペプチド活性を含むいずれの製剤の調製においても、該ペプチドの活性が該工程で破壊されないこと及び該ペプチドが破壊されずにその作用部位に到達できることを確実にするよう注意が払われるべきである。ある状況下では、例えばマイクロカプセル化などの当分野で既知の手段により該ペプチドを保護することが必要な場合がある。同様に、選択される投与経路は該ペプチドがその作用部位に到達するようなものであるべきである。
【００９４】
例えば、泌尿器系疾患の治療に好ましい投与経路は、経口、局部、鼻腔内、直腸内、粘膜内及び静脈内である。上記の経路は、くも膜下投与に加えて疼痛及び気分障害の治療に用いられうる。くも膜下投与におけるコノトキシン・ペプチドの使用の方法及び製剤はＷＯ9701351に記載されており、その内容は相互参照によりインコーポレートされる。
【００９５】
注射用途に適した医薬剤形は滅菌注射溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液の即時調製用の滅菌粉末を含む。これらは、製造及び保存の状態下で安定であるべきであり、酸化及び細菌又は真菌などの微生物の汚染作用から保護される。
【００９６】
当業者は常套方法を用いて本発明のペプチド又は修飾ペプチドの適切な製剤を容易に決定しうる。例えば抗酸化剤のための、好ましいｐＨ範囲及び適切な賦形剤の同定は当分野では機械的作業である（例えばクレランドら、1993を参照）。緩衝系は日常的に用いられ所望の範囲のｐＨ値を提供し、カルボン酸緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩及びコハク酸塩を含む。ＢＨＴ又はビタミンＥなどのフェノール化合物、メチオニン又は亜硫酸塩などの還元剤、及びＥＤＴＡなどの金属キレート剤を含む種々の抗酸化剤が、このような製剤に利用可能である。
【００９７】
薬学的に活性なペプチドの製剤のための従来の手法は下記の文献、即ちリアン，ジェイら，(1986) Clin Pharmacol Ther(39), 40-2（ペプチド・ニファラチド(nifalatide)の経口投与を詳述する臨床試験）、クレームス・イー．エス．ら, (1986) Pain 24, 205-9 （ペプチドのくも膜下輸送を記載する）、ＷＯ9614079A1（ペプチド・サイクロスポリン製剤の経口投与及び直腸投与を記載する）、ＷＯ9640064A1（ペプチド安定性のための製剤を記載する）、ＷＯ9805309A1（ペプチド製剤−内服用のサイクロスポリンの医薬組成物を記載する）及びＷＯ9802148A2（徐放性の直腸及び経口のペプチド製剤を記載する）。これらの文献の方法は、は参照によりインコーポレートされる。
【００９８】
注射可能な溶液用又は分散用の溶媒又は分散媒は、ペプチド活性のためあらゆる従来からの溶媒又は担体系を含んでも良く、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含んでも良い。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆剤の使用により、分散の場合必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により保持できる。微生物の作用の防止は、必要な場合、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の含有により、実施できる。多くの場合、浸透圧を調整するための薬剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用の製剤は血液と等張であることが好ましい。注射組成物の持続的吸収は吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物の使用により行える。注射用途に適した医薬剤形は静脈内、筋内、大脳内、くも膜下、硬膜外の注射又は注入を含むいずれかの適切な経路により送達されうる。
【００９９】
滅菌注射溶液は、必要ならば上に列挙したような種々の他成分とともに、必要量の活性化合物を適切な溶媒に加えた後、濾過滅菌により調製される。一般的に、分散は、基本的な分散媒及び上記に列挙したものから必要な他成分を含む滅菌媒体に、種々の滅菌した活性成分を加えることにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は活性成分及び任意の付加的な所望成分の予め滅菌濾過された溶液の真空乾燥又は凍結乾燥である。
【０１００】
該活性成分が適切に保護される場合、それらは例えば不活性希釈剤とともに若しくは吸収可能な食用担体とともに経口投与されてもよく、又は硬殻若しくは軟殻のゼラチン・カプセルに封入されてもよく、又は錠剤に圧縮されてもよく、又は食事の食物とともに直接取り入れてもよい。経口治療投与のため、該活性化合物は賦形剤と組み合わされ摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の剤形で用いられうる。このような組成物及び調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含むことが好ましい。該組成物及び調製物の百分率は、無論、変更してもよく、便宜上、約５％から約８０％の単位重量でありうる。このような治療に有用な組成物における活性化合物の量は適切な用量が得られるものである。
【０１０１】
錠剤、トローチ、ピル、カプセル等は以下に列挙する成分をも含みうる。即ち、ガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、片栗粉、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及びショ糖、乳糖又はサッカリンなどの甘味剤又はペパーミント、冬緑油、又はサクランボの風味の香味剤が添加されてもよい。単位投与剤形がカプセルである場合、上の型の物質に加えて、液体の担体を含有してもよい。種々の他物質が被覆剤として又は他の方法で投与単位の物理的形態を改変するために存在しうる。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルはセラック、糖類又は両方で被覆されうる。シロップ又はエリキシルは該活性化合物、甘味剤としてのショ糖、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素並びにサクランボ又はオレンジの風味などの香料を含みうる。無論、任意の単位投与剤形を調製する際に使用されるいずれの物質も、薬学的に純粋であり使用量において実質的に無毒であるべきである。その上、該活性化合物（単数又は複数）は徐放性の調製物及び製剤に導入されてもよい。
【０１０２】
本発明は、投与、例えばクリーム、ローション、経皮貼布、スプレー及びジェル、又は吸入若しくは鼻内送達に適した組成物、例えば溶液若しくは乾燥粉末などの局部適用に適した任意の他の剤形にも及ぶ。
【０１０３】
静脈内、皮下、鞘内、大脳内又は硬膜外の送達に適したものを含む非経口投与剤形が好ましい。
【０１０４】
該組成物は、浸透ポンプなどの埋め込み可能ポンプを含む徐放性のインプラントを通した送達用に製剤されてもよい。
【０１０５】
薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤は任意の及びあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。薬学活性物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当分野で周知である。通常使用されるいずれの媒体又は薬物も該活性成分と配合禁忌でない限り、治療組成物におけるその使用が意図される。補足的な活性成分も該組成物に取り込むことができる。
【０１０６】
投与の簡便性及び用量の均一性のため単位投与剤形で非経口組成物を製剤することは特に有利である。本明細書で用いられる単位投与剤形とは、治療される哺乳動物被験体のための単一用量として適した物理的に不連続な単位を指す。各単位は必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された所定の量の活性物質を含む。本発明の新規な単位投与剤形の仕様書は、（ａ）活性物質の固有の特徴及び達成すべき特定の治療効果、及び（ｂ）本明細書に詳細に開示されるような身体の健康に障害がある疾患状態を有する生きている被験体の疾患を治療するため該活性物質を配合する技術に付いて回る制限により指示され直接依存する。
【０１０７】
主要な活性成分は薬学的に許容しうる適切な担体と共に有効な量で簡便且つ効果的な投与のため単位投与剤形中に混合される。単位投与剤形は例えば0.25μgから約2000 mgに及ぶ量の該主要活性化合物を含み得る。比率で表すと、該活性化合物は一般的に1 mlの担体当たり約0.25μgから約200 mg存在する。補足の活性成分を含む組成物の場合、該用量は常用量及び該成分の投与様式を参照して決定される。
【０１０８】
本発明はここに添付の図面及び実施例を参照して記載するが、下記の記載の特殊性は本発明のこれまでの記載の一般性に優先するものでないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【０１０９】
ＭｒＩＡ（配列番号：１）、配列番号：４及びＭｒＩＡ関連誘導体の合成及び精製
（ａ）合成
（i）配列番号：４のペプチドは、ポリマー・ラボラトリーズから入手したリンク・アミド樹脂にショルザーらの方法（ショルザーら，Int. J. Prot. Pept. Res., 40, 180, (1992)）に基づいたＦ−ｍｏｃ化学の方法を用いて組み立てられた。該鎖の組み立てを通して、従来のＴｒｔ／ｆ−Ｂｕ側鎖保護を使用した。カップリング効率はニンヒドリン試験（サリンら，Anal. Biochem. 117, 145-157(1981)）を用いて監視した。
（ii）他のペプチドは、Ｂｏｃ−化学及び従来の側鎖保護基を用い、（シュノルザーら、1992）を用いてＭＢＨＡ樹脂上で組み立てられた。この方法が使用される場合、切断は０℃から−10℃で１時間ＨＦ：スカベンジャー（9:1）を用いて行った。
【０１１０】
（ｂ）酸化及び精製
（i）(a)(i)に従って組み立てられた純粋な還元型ペプチドの酸化は最適化緩衝系（30重量％DMSO/0.1M NH4HCO3、pH6、12時間）を用いて実施し、ＭｒＩＡの構造にに対応するジスルフィド結合連結を有する所望の酸化型生成物をＲＰ−ＨＰＬＣ工程（４０分間にわたって10%Bから33%Bの勾配をもつＣ−８カラム）により精製し、99％を上回る純度のペプチドを得た。
(ii)精製は還元型ペプチド及び酸化型ペプチドの両段階でＲＰ−ＨＰＬＣの一工程を用いて達成した。これは、近接して溶出するＡｓｐ−分解不純物（Mw 1408.8、Asp、B-Asp）を除去するために最適化クロマトグラフィー計画を用いた更なる精製工程を必要とするＭｒＩＡと対照的である。
(iii)他のペプチドは上述したものと実質的に同じ手法に従って酸化及び精製した。一部の合成において、使用した緩衝系は30%イソプロパノール／0.1 M NH4HCO3、pH 8.0又はイソプロパノール／ＤＭＳＯ／0.1 M NH4HCO3、pH8.8の混合液であった。
【実施例２】
【０１１１】
ＭｒＩＡと比べたペプチドの安定性
方法
ペプチドは5 mM酢酸ナトリウム緩衝液／0.9%生理食塩水中に１mg/mLで溶解した。該試料は３７℃で保存し、試料は31日間にわたって時々採取した。比較研究のため、両ペプチドの新鮮な試料を評価直前に−２０℃で保存された凍結乾燥粉末から水で同濃度に作成した。試料は上記の最適化クロマトグラフィー計画を用い、300-1800 amuの質量範囲にわたってＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳにより評価した。
【０１１２】
結果
（ａ）異なる緩衝液を用いた場合の安定性
配列番号：４のペプチドの安定性は３７℃で一連の緩衝条件で測定した。表２に示す結果は、このペプチドが一連の条件の下で長期間安定であることを示している。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
グラフ１：種々の時間後及び種々の緩衝液においた後の３７ＥＣでの配列番号：４の安定          性
酢酸塩緩衝液＝5 mM Na酢酸塩／酢酸＋0.9％生理食塩水
乳酸塩緩衝液＝5 mM Na乳酸塩／乳酸＋0.9％生理食塩水
【０１１５】
（ｂ）ＭｒＩＡと配列番号：４の比較
配列番号：４のペプチドの安定性は、３７℃でＭｒＩＡの安定性とも直接比較した。表３に示す結果は非常に向上した配列番号：４のペプチドの安定性を浮き彫りにしている。３１日後、配列番号：４のペプチドについては、99％を上回る親産物が依然存在している。３７℃で同じ時間の後、ＭｒＩＡはその一貫安定性に関して明確により不安定である。その上、３１日後、ＭｒＩＡはほとんど完全に分解産物に変換される（ＡｓｎからＡｓｐ及びＢ−Ａｓｐ、JBC、286巻(33)、22549-22556、1991、タイラー−クロス，アール及びシュリッヒ，ブイ．）。
【０１１６】
【表３】
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【実施例３】
【０１１７】
本発明の幾つかのペプチドについて並びにＭｒＩＡ及び本発明でない他のペプチドについて、ヒト・ノルアドレナリン輸送体（ｈＮＥＴ）及びノルアドレナリン（ＮＡ）の摂取での結合活性が測定された。
【０１１８】
（i）ｈＮＥＴ放射性リガンドの結合検定
ヒトのノルアドレナリン輸送体（ｈＮＥＴ）の阻害剤として作用するχ−コノトキシンの能力は、ｈＮＥＴを発現するＣＯＳ−７哺乳動物細胞から調製した膜由来の 3Ｈ−ニソキセチン(nisoxetine)の競合的阻害により測定できる。マジンドールなどの他の３Ｈ小分子でも同様の結果が観察される。
【０１１９】
ＤＭＥＭ及び10％血清を含む150 mm皿で増殖したＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）を、メタフェクテン(metafectene)試薬（ビオンテックス社）を用いて、哺乳動物（ヒト）のＮＥＴ（パーシーら，1999、Br J Pharmacol 128: 774-780）をコードするプラスミドＤＮＡで一過性にトランスフェクションした。細胞はトランスフェクションの４８時間後に集菌し、細胞はＴＥＭ緩衝液を用いて擦り取り、洗浄し、ホモジナイズし、遠心分離した。個々の150 mm皿について、膜は500 μLのＴＥＭ及び10％グリセロールに再懸濁した。ＢＣＡタンパク質を見積もると約6 μg/μLであった。１μLの膜＋49μLの検定用緩衝液を検定では１ウェル毎に使用した（検定用緩衝液は20 mM トリスHCl pH 7.4、75 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、0.1% BSA）。全検定容量は150 μLであり、それぞれのデータポイントは三連で実施した。種々の濃度のペプチド（10-4 Mから10-11 M）又は対照リガンド（ニソキセチン(nisoxetine)）は検定プレートに添加した後、4.3 nM 3H−ニソキセチン（パーキン・エルマー社、カタログ番号#NET1084）を添加した。最後に、上記の膜を添加し、該検定は室温で１時間インキュベートした後、該反応液をトムテック細胞集菌器を用いて0.6%ＰＥＩで予め処理されたＧＦフィルターマットＢ（パーキン・エルマー社、カタログ番号: 1450-521 ）に濾過し、洗浄緩衝液（20 mM ヘペス pH 7.4 、125 mM NaCl、4℃）を用いて３回洗浄した。次いで、フィルターマットを乾燥し、フィルター・バッグに置き、9 mLのベータプレート・シンチラント（パーキン・エルマー社、カタログ番号 1205-440）を添加し、フィルターマットはヴァラック・マイクロベータ・インスツルメントで計数した。それぞれのデータポイントは三連で実施した。表４に要約した結果はn≧3の実験から得られる。
【０１２０】
（ii）ＮＡ摂取検定
ヒトのノルアドレナリン輸送体（ｈＮＥＴ）の阻害薬として作用するχ−コノトキシンの能力は、ｈＮＥＴを発現するＣＯＳ７哺乳動物細胞に3H−ノルアドレナリンを輸送するノルアドレナリン輸送体の機能の非競合的阻害により測定できる。
【０１２１】
ＤＭＥＭ及び10％血清を含む２４穴プレートで増殖したＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ）を、メタフェクテン試薬（ビオンテックス社）を用いて、哺乳動物（ヒト）のＮＥＴをコードするプラスミドＤＮＡで一過性にトランスフェクションした。摂取検定は125 mM NaCl、4.8 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、1.3 mM CaCl2、25 mM ヘペス pH 7.4 、5.55 mMグルコース、1.02 mMアスコルビン酸、10μM U-0521及び100 μMパーギリン(pargyline)を含む輸送緩衝液でトランスフェクションの４８時間後に室温で実施した。全検定容量は250 μLであった。細胞は温ＰＢＳで３回洗浄した後、検定緩衝液を添加した。これに対照又は種々の濃度の競合リガンド（10-4 Mから10-11 M）を添加した。該検定は20分間インキュベートした後、100 nMの3H−ノルアドレナリンを添加し10分間インキュベートした。検定は除去により終了し冷ＰＢＳで洗浄した。細胞は500 μL 0.1%SDS、0.1 N NaClで溶菌した。100 μLのアリコートを採取し、弾力性96穴プレートに添加し（計測用）、スーパーミックス・シンチラントを添加し（100 μL）、よく混合し、１穴につき３分間計測した。それぞれのデータポイントは三連で実施した。表４に要約した結果はn≧3の実験から得られる。
【０１２２】
結果は以下の表４に示す。表中の「ｈ」、「ｃ」及び「ｕ」はＤ−ヒスチジン、Ｄ−システイン及びＤ−ピログルタミン酸塩をそれぞれ指す。Ｏは４−ヒドロキシプロリンを指し、ＭｅＹは４−メトキシチロシンを指し、そしてＵはピログルタミン酸塩を指し、−ＯＨは遊離酸のＣ末端があることを示す。
【０１２３】
【表４】
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【実施例４】
【０１２４】
神経障害性疼痛のラット・モデルにおける配列番号：４、ＭｒＩＡ及びモルフィネの鎮痛効果の比較
方法
動物
雄成体のスプラギュ−ドーリー・ラットはオーストラリアのパースの動物資源センター（ＡＲＣ）及びクイーンズランド大学のハーストン医学研究センターから購入した。ラットは１２時間／１２時間の明／暗周期の温度制御された環境（２１±２℃）で飼育された。食物及び水は随時与えられた。本研究の倫理的承認はクイーンズランド大学の動物実験倫理委員会から得られた。
【０１２５】
試薬及び材料
イソフルラン（フォルサン（登録商標））はアボット・オーストラリア社（シドニー、オーストラリア）から得た。ベンジルペニシリン・ナトリウムのバイアル（600 mg）はＣＳＬ社（メルボルン、オーストラリア）から購入した。標準生理食塩水アンプルはデルタ・ウェスト社（パース、オーストラリア）から入手し、ヘパリン添加生理食塩水（50 IU/5 mL）はアストラ・ファーマシューティカルズ社（シドニー、オーストラリア）から購入した。単管ポリエチレン・チューブ（I.D. 0.2 mm、O.D. 0.6 mm）はオーバーン・プラスチックス・アンド・エンジニアリング社（シドニー、オーストラリア）から購入した。シリコン処理された滅菌絹縫合（ダイシルク（登録商標））はダイネック社（アデレード、南オーストラリア）から入手し、ミシェル・クリップはメディカル・アンド・サージカル・リクウィジット社（ブリズベン、オーストラリア）から購入した。
【０１２６】
坐骨神経の慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）
ラットを腹腔内注射により投与されたケタミン（80 mg/kg）及びキシラジン（8 mg/kg）で麻酔し、坐骨神経の慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）はベネットとシエの方法（1988）に従って形成した。簡潔に述べると、左総坐骨神経は大腿二頭筋を介した鈍的切開により中大腿のレベル（mid-thigh level）で露にした。三分枝の近位で、約10 mmの神経は付着組織がなく、四つの緩い結紮糸（3.0絹）は（約1 mm離れて）坐骨神経周辺で結んだ。切開は層状に閉じた。外科手術後、ラットは感染を防止するためにベンジルペニシリン（60 mg、皮下注射）を投与し外科的回復中温め続けた。ラットはオピオイド又は賦形剤の投与前に１４日間単独で飼育した。ラットは罹患した後ろ足、探索行動、体重及び水分摂取量、並びにあらゆる自切の兆候に関してＣＣＩ外科手術の時から毎日検査した。一匹のラットに初期の自切の兆候が見られ（爪先及び同側（ipsalteral）後足の幾つかの周辺組織をかじる）、この動物は直ちに安楽死させた。
【０１２７】
鞘内カテーテル挿入
ＣＣＩ手術の１０〜１１日後又は未処理の対照において、ラットは単回の腹腔内（i.p.）注射として投与されたケタミン（80 mg/kg-1）及びキシラジン（8 mg/kg）の混合物で強く麻酔をかけられた。外科手術前に、ラットの背中及び首の領域は毛を剃り、その皮膚をベータダイン（betadine）外科的スクラブで洗浄した。次いでラットを腹臥位に置き、Ｌ６腰椎をos回腸の管状仙骨の触診（ヘーベル＆ストロンバーグ、1976）により位置付けた。６ｃｍの切開は背中の中線でなされ、３ｃｍは尾側並びに３ｃｍはＬ６の頭側であった。皮下ポケット（鞘内カテーテル用）は切開の両側にはさみで鈍的切開により形成した。浅背筋を覆う筋膜はＬ５を包含する５ｍｍのＶ字型切開において切断された。更なる５ｍｍの尾側切開はＬ６に平行になされた。該筋膜は次に引っ込め、Ｌ５〜Ｌ６の棘突起間にある棘間筋のように、Ｌ５及びＬ６の基底を囲む腰筋を取り除いた。
【０１２８】
骨鉗子によるＬ６棘突起の除去後、Ｌ５腸骨弓の下方にある軟組織を取り除き、硬膜を曝した。硬膜に23Ｇ針で穴を開け、透明なＣＳＦを放出させた。予め生理食塩水を充填したポリエチレン・カテーテル（O.D. 0.6 mm、I.D. 0.2 mm；長さ20 cm）は鞘内空間へ１ｃｍの距離だけ慎重に前進させ、小容量の生理食塩水（20μL）はカテーテルを通して投与された。カテーテル周辺で生理食塩水の漏出が観察された場合、ラットは更なる実験から除外された。「漏出試験」が成功裏に終了した後、鞘内(i.t.)カテーテルをＬ５から約２ｃｍの周辺筋肉上に歯科用セメントで充填し、皮下(s.c.)トンネルを通して頸部の基底の小切開に露出させ、定位置に縫合した。腰筋及び皮膚の縫合後、ラットに感染を防止するためベンジルペニシリン（50000 IU、腹腔内）及びエンロフロキサシン(enrofloxacin)（5 mg/kg-1、皮下）を与え、麻酔からの回復中温め続けた。外科手術の終了後、ラットを鞘内薬物投与の３〜４日前の回復期間中単独で飼育した。外科手術の翌日、局部麻酔薬のリグノカイン（2%、20μL）を鞘内カテーテルを通して投与した。両後足の完全麻痺が観察されなかった場合、ラットは更なる実験から除外された。
【０１２９】
投与薬物
配列番号：４はpH 5.5の5 mM酢酸ナトリウム緩衝液で調製し、0.2〜30ナノモルのボーラス単回投与でラットに送達した。該ペプチドの保存溶液はゼノメ社でＵＶ検出と逆相ＨＰＬＣによりアミノ酸分析された保存溶液と比べて定量した。モルフィネＨＣｌ粉末はロイヤル・ブリスベン・ホスピタル・セントラル・ファーマシー社（ハーストン、クイーンズランド州）から購入し、標準生理食塩水に溶解し、10μg/10μL（モルフィネ基剤）の保存濃度を調製した。個々のラットは3.5〜50ナノモル（10〜15μL）のモルフィネを受容した。標準生理食塩水を用いて全希釈液を作製した。全ての鞘内注射後、生理食塩水（２０μｌ）を出水し、鞘内空間への完全なペプチドの送達を確かなものにした。
【０１３０】
保存溶液の保管
保存溶液のアリコート（10μL）は動物実験での使用前に−２０℃で保管した。実験直前に、当該化合物のアリコートを室温で解凍した後、滅菌生理食塩水で必要な濃度に希釈し、後の鞘内用に望ましい最終濃度を得た。未使用の部分は、化合物が一回の凍結−解凍周期しか経ないことを確実にするため、廃棄した。
【０１３１】
鞘内薬物投与
ＣＣＩ外科手術の１４日後、薬物未使用−ＣＣＩラットの各群は10〜15μLの容量で配列番号：４、モルフィネ又は生理食塩水の鞘内ボーラス注射を受けた。鎮痛効果は反応が基線に戻るまでフォン・フレイ・フィラメントを用いて評価した。
【０１３２】
鎮痛効果の評価：フォン・フレイ・フィラメントを用いたＣＣＩラット
神経障害性疼痛の際立った特徴である触覚性異痛は、後足に無害な機械刺激（軽い圧力）をかけるために使用するフォン・フレイ・フィラメントを用いて定量した。ラットを金網製試験ケージ（20 cm x 20 cm x 20 cm）に移し、１０分間順応させた。フォン・フレイ・フィラメントを用いて活発な四肢の引込め反射に必要な最低機械閾値を測定した。簡潔に述べると、最小の強度を生じるフォン・フレイ・フィラメントを用いて開始し、該フィラメントが僅かに曲がるまで、該フィラメントを後足の裏面に適用した。５秒後に反応がないと、次の増量フィラメントを使用した。使用フィラメントは、２g、４g、６g、８g、10 g、12 g、14 g、16 g、18 g及び20 gの座屈重量を生じ、これらは定期的に調整した。いずれのフォン・フレイ・フィラメントにも応答しなかった動物には、20 gの点数がつけられた。後足引込め閾値は曲線下面積（ＡＵＣｈ）に変換した。同側の最大応答は４５ＡＵＣｈであった。
【０１３３】
正しい鞘内カテーテル配置の確認
各実験の終了時に、マラカイト・グリーン色素（30μL）を鞘内カテーテルを通して注射し、一方ラットをＯ2：ＣＯ2（50%:50%）で軽く麻酔した。３０秒後、ラットを断頭し、脊柱を外科的に露出した。該カテーテルがＬ６上の背筋に入る部位に皮下の色素漏出の証拠があるラット又は脊髄に沿って少なくとも３〜４ｃｍに分布する色素に不具合があるラットから得られるデータは分析から除外した。
【０１３４】
データ分析
それぞれのペプチドについての痛覚抑制度対時間曲線下面積（ＡＵＣ値）は、時間０から３時間まで計算した。それぞれのペプチドについての用量−反応曲線はＡＵＣ値対鞘内ペプチド用量（１ラット当たりnmolで表す）をプロットすることにより作図した。
【０１３５】
結果
配列番号：４（図１Ａ、Ｃ）及びモルフィネ（図１Ｂ）の両方は、鞘内経路（i.t.）により単回ボーラス用量として注射された場合、神経障害性疼痛のラット・モデルにおいて鎮痛効果を生じた。これらの効果は用量依存性であった（図２）。両化合物は同様に軽度の副作用を生じたが、配列番号：４は低用量の化合物を用いて程度及び期間の両方でより高い鎮痛効果を生じた。驚くべきことに、最大有効用量に近い配列番号：４は２日間続く鎮痛効果を生じた。対照的に、最大有効鞘内用量のモルフィネは僅か３時間しか効果が続かなかった。配列番号：４が１ナノモルで中等度の鎮痛効果を生じ30 nmole（用量制限でない）で比較的軽い副作用を生じることを考えれば、配列番号：４は少なくとも３０倍の治療濃度域を有する。モルフィネ及び配列番号：４の両方の鎮痛効果は反対側の後足より同じ側の後足に対して選択的であった。
【０１３６】
本明細書及び続く請求の範囲を通して、文脈が他の意味を要しない限り、「含む(comprise)」という単語、並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変形は、明記した整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の排除を意味するものではないと理解されるであろう。
【０１３７】
当業者は、本明細書に記載された本発明が具体的に記載されたもの以外の変形及び修飾を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明は発明の精神及び範囲に収まるこのようなあらゆる変形及び修飾を包含することが理解されるべきである。本発明は、この明細書中で言及した又は示した工程、特徴、組成物及び化合物の全てを個別に又は集合的に包含し、並びに任意の二つ以上の該工程若しくは特徴の任意の組合わせ又はあらゆる組合わせも包含する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】（ａ）６時間にわたる配列番号：４（0.2-30 nM）、（ｂ）６時間にわたるモルフィネ（3.5-50 nM）、及び（ｃ）７２時間にわたる配列番号：４（1-30 nM）を用いたＣＣＩラットにおける同側足の触覚異痛の軽減。
【図２】ＣＣＩラットにおける同側足の触覚異痛を軽減するための鞘内モルフィネ対鞘内２１７４。
【図１】
0004565087.tif 000008
【図２】
0004565087.tif 000009
【配列表】
0004565087000001.app