(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法において、撮像装置で得た画像の輝度データを２次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る段階と、得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する段階と、補正された各メモリの輝度データを設定した第１の閾値及び第１の閾値よりも大きい第２の閾値により２値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否を判定する段階と、所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、を有し、前記第１の閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する第１の所定範囲の画素に第１の閾値以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を１個の輝点として計数し、前記第２の閾値以上の輝度を持つ輝点の第２の所定範囲の画素に前記第１の閾値以上で前記第２の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には該輝点の集合を１個の輝点として計数することを特徴とする微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法。
【請求項２】
試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する装置において、撮像装置で得た画像の輝度データを２次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る手段と、得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する手段と、補正された各メモリの輝度データを設定した第１の閾値及び第１の閾値よりも大きい第２の閾値により２値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否を判定する手段と、所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する手段を有し、前記第１の閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する第１の所定範囲の画素に第１の閾値以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を１個の輝点として計数し、前記第２の閾値以上の輝度を持つ輝点の第２の所定範囲の画素に前記第１の閾値以上で前記第２の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には該輝点の集合を１個の輝点として計数するようにしたことを特徴とする微生物又はそのコロニーの存在数を計数する装置。
【請求項３】
試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法において、撮像装置で得た画像の輝度データを２次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る段階と、得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する段階と、補正された輝度データを第１の閾値で２値化する段階と、前記第１の閾値よりも大きい第２の閾値で２値化する段階と、前記第１閾値以上の輝度値を持つか否かを判定する段階と、前記第２の閾値以上の輝度値を持つか否かを判定する段階と、前記第１の閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、前記第２の閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、前記補正された輝度データ内に所定以上の面積を有し、前記第２の閾値を越える輝点の存在の有無を確認する段階を有し、前記所定以上の面積を有し前記第２の閾値を越える輝点を持つ輝点が存在した場合には少なくとも前記第２の閾値で画像データを２値化した後、前記第２の閾値以上の輝度値を持つ輝点を計数することを特徴とする微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ法を利用した微生物迅速検査法に係り、特に微生物の存在を現す発光現象の映像から電気的に正確に菌数又は菌のコロニーの数をカウントできるようにした微生物迅速検査法及びこれを達成するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の存在を確認する方法として、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ法がある。このＡＴＰ−ルシフェラーゼ法は、生きた細胞に特異的にまとまって存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用してルシフェリン−ルシフェラーゼ反応（Ｒ−Ｒ反応）を行わしめ、ＡＴＰ含量に比例して発生する微妙な発光を高感度検出器で検出することにより、微生物の存在を確認する方法であり、微生物の迅速検査法として注目されている。
【０００３】
この微生物の検査法を行う方法及び装置として、例えば、特開平６−２３７７９３号に示されているものがある。ここでは、先ず、検体液を濾過して生菌をフィルター上に補足し、このフィルターを微生物発光画像解析システムを用いて検出する。この微生物発光画像解析システムは、生菌を捕捉したフィルターを抽出試薬及び発光試薬で処理した後、標本ホルダーにセットし、光学系及び撮像手段（ＣＣＤ等）で構成されたテレビカメラを上記フィルターにできるだけ近接させてセッティングし、フィルターの発光状態を撮影し、画像処理装置、データ解析装置を介して画像データをディスプレイで表示、観察したり、解析結果をプリントアウトする。
【０００４】
図１は、そのシステムの概要を示し、１はテーパーファイバー、光増幅部及び撮像管からなる高感度テレビカメラ、カメラコントローラ２、イメージプロセッサ３、データ解析装置４、テレビモニター５から構成されている。測定は、発光処理した生菌を保持したフィルター６を高感度テレビカメラ１に接近させておき、カメラコントローラ２及びイメージプロセッサ３を用いて２次元的の光子を所定時間、例えば、３０〜１８０秒間蓄積し、菌体からの発光を撮像し、データ解析装置４により発光ノイズを消去して生菌による強い発光のみを残してテレビモニター５に表示する。この処理によって菌体由来以外の発光がノイズとして消去され、測定された輝点数は生菌の数又はコロニーの数となる。その発光状態を現す映像であり、培地上でＲ−Ｒ反応をおこさせ、微生物の存在する位置が周囲に対して明るく発光しており、これらの輝点の数が微生物の数に相当する。
【０００５】
このように、微生物の存在と数を画像解析を用いて自動的に検出する装置は既に存在している。しかしながら、これまでの検出装置においても不具合は存在していた。図２はフィルターのＡＴＰの発光状態を撮影した映像を示す。検出装置が強い光を認識した場合は、高いピークとなって現れ、モニター上ではピークの高さ応じた疑似カラーの点として表示される。
【０００６】
輝点は、図２の上部のウインドウ（白い四角）内の輝点のように白い輝点となって表示される。また、図２の下方は輝点を３次元的に現したものである。３次元の画像において、界面のように波打っている部分が画像データのバックグラウンド（ＢＫＧ）となる青い点の集合を示し、広い輝点は中央の高いピークの束となって表示される。これらのピークは全て数値化されており、必要な座標のピーク強度がデータとして記憶される。画像データの低いレベルで揺らいでいるピーク強度を平均化し、この値を基準にしてある値（閾値）以上の高さと面積を持つピークを認識した場合に輝点１つとしてカウントする。
【０００７】
画像に表示された点がＡＴＰによる輝点かＢＫＧかを区別するために、輝点とＢＫＧを区別するための閾値は、検出する菌の種類やＢＫＧの高さにより設定される。
【０００８】
上述のように、閾値を設定してカウントする従来の検出装置は、輝点を弁別するという点では有効であったが、目視で数えた輝点数と差がでてくる場合があった。これは、従来のカウントの方法が、ピークの高さと面積だけを基準としてなされており、これだけでは、種々の形状や大きさを有する輝点を正確にカウントすることはできなかった。その原因の一つとして以下の２つのことが考えられる。（１）一つの輝点の中のピークに山と谷が存在する場合があり、これが実際の数と異なるカウントをする原因となることがある。
【０００９】
一つの輝点は、必ずしも一本のピークからなるものではない。ＡＴＰの抽出具合や、微生物単独あるいはコロニーへの発光試薬のかかり方により、いびつな形で光る場合があり、３次元解析をするとピークに肩があったり、幾つかのピークが重なり合っている場合がある。この場合、実質的には輝点であっても、ピークに山と谷がある場合は山の数をそれぞれ輝点の数として認識してしまい、目視で数える輝点数との間にずれが生じる。図３はモニターテレビ上に映し出されたオリジナル画像（Ａ）と改良前のカウウント法によるカウント結果（Ｂ）を示す。オリジナル画像の最上部にある輝点は目視では１つとカウントされるが、改良前の検出装置においては、この輝点を４つの輝点と判定している。さらに上部より２番目の輝点についても、従来のカウント法によれば２つに判定し、全体として１０の輝点をカウントしている。これは、最上部の輝点が図３（Ｂ）の部分拡大図に模式的に示すような形状をしており、これを電気的にカウントするとき、各４つの突出部ａ，ｂ，ｃ，ｄを夫々１の輝点として数えてしまった結果によるものである。（２）輝度の強い輝点が発生した場合は、拡散した光が輝点の周囲にバックグラウンドのピークを大きく揺らがせるため、微生物由来のＡＴＰが存在しない部分に輝点と認識させるピークが発生する場合がある。
【００１０】
図４に示した画像データは大きな輝点の画像データであり、輝度が強いため輝点を中心にした光が拡散しているように表示される。そして、この拡散光が強い部分が生じ（輝点の左下の十字状の輝点）、この部分を輝点として認識されている。その他、強い拡散光の存在のため、図４の例では、本来１個と計数されるべきものが、３個と計数されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、映像信号をもとに電気的に輝点の数をカウントするにあたり、ＡＴＰの輝点の形状に基づく上記カウント誤差と、大きい輝度に基づくカウント誤差をなくすことのできる菌数の計数方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明の一つの態様は、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する方法において、撮像装置で得た画像の輝度データを２次元のマトリックス状画素に対応させたメモリに読み取る段階と、得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する段階と、補正された各メモリの輝度データを設定した閾値により２値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否かを判定する段階と、前記閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、前記閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する所定範囲に所定以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を１個の輝点として計数する段階とからなる。
【００１３】
また、本願発明の他の態様は、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する装置において、撮像装置で得た画像の輝度データを２次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る手段と、得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する手段と、補正された各メモリの輝度データを設定した閾値により２値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否かを判定する手段と、所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する手段と、前記所定以上の輝度を持つ輝点の隣接する所定範囲に所定以上の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を１個の輝点として計数する手段とを有する。
【００１４】
上記発明の態様によれば、微生物から発生する蛍光の輝点を画像解析により電気的に計数するに際し、本来、１個の微生物から発生している輝点をその不規則な形状によって２あるいはそれ以上の微生物に由来する蛍光と誤って判断して輝点の計数することを避けることができ、正確な計数を行うことができる。
【００１５】
また、本願発明の他の態様においては、一つの輝点中の中にピークの山と谷が複数存在する場合、複数のピークを複数の輝点として計数することを避けるため、一つの輝点の隣接する周囲の所定範囲内に存在する輝点は、それぞれを独立した輝点として計数することはせず、それらの集合を一つとして計数処理を行うようにしている。
【００１６】
また、輝度の大きい輝点が存在する場合に、その光が周りに拡散して輝点として認識されることを避けるため、輝度の大きい輝点の周りの所定範囲に現れる輝点は、輝度の大きい輝点とともにその集合を一つと計数するように処理する。
【００１７】
本願発明のさらに他の態様においては、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する方法において、撮像装置で得た画像の輝度データを２次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る段階と、得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する段階と、補正された各メモリの輝度データを設定した第１の閾値及び第１の閾値よりも大きい第２の閾値により２値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否かを判定する段階と、所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、を有し、前記第１の閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する第１の所定範囲の画素に第１の閾値以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を１個の輝点として計数し、前記第２の閾値以上の輝度を持つ輝点の第２の所定範囲の画素に前記第１の閾値以上で前記第２の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には該輝点の集合を１個の輝点として計数することを特徴とする。
【００１８】
また、本願発明の他の態様においては、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する装置において、撮像装置で得た画像の輝度データを２次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る手段と、得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する手段と、補正された各メモリの輝度データを設定した第１の閾値及び第１の閾値よりも大きい第２の閾値により２値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否かを判定する手段と、所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する手段を有し、前記第１の閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する第１の所定範囲の画素に第１の閾値以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を１個の輝点として計数し、前記第２の閾値以上の輝度を持つ輝点の第２の所定範囲の画素に前記第１の閾値以上で前記第２の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には該輝点の集合を１個の輝点として計数するようにしたことを特徴とする。
【００１９】
上記本願は発明の態様によれば、微生物から発生する蛍光の輝点を画像解析により電気的に計数するに際し、本来、１個の微生物から発生している輝点をその不規則な形状によって２あるいはそれ以上の微生物に由来する蛍光と誤って判断して輝点の計数することを避けることができ、また、輝度の大きい輝点が発生した場合、それによる拡散光を独立した輝点と計数することを避けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】微生物計数装置のシステムの概要を示す図である。
【図２】撮像装置で得られる輝点および輝点の３次元画像を示す図である。
【図３】モニターテレビ画面上の輝点の画像を示す図である。（Ａ）はオリジナル画像を、（Ｂ）は電気的に計数処理した結果を示す画像である。
【図４】輝度の大きい輝点とその周囲に発生した拡散光を示すモニターテレビ画面を示す図である。
【図５】本発明の第１の実施例による画像解析装置が行う計数の処理のフローチャートである。
【図６】各画素に対応するメモリのデータを示す図である。
【図７】本発明の第１の実施例の計数法により計数した結果をテレビモニター上に映した状態を示す図である。
【図８】本発明の第２の実施例による画像解析装置が行う計数の処理のフローチャートである。
【図９】各画素に対応するメモリのデータを示す図である。（Ａ）は、映像の画素に対応したメモリの輝度値データを示す。（Ｂ）は、２つの閾値で２値かして得たデータをまとめたものである。（Ｃ）は、輝点を計数した結果を示す。
【図１０】本発明の第２の実施例の計数法により計数した結果をテレビモニター上に映した状態を示す図である。
【図１１】本発明の第３の実施例の処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
次に、本発明の実施の形態について図面と共に説明する。
【００２２】
先ず、図５〜図７により本発明の第１の実施例について説明する。
【００２３】
本実施例においては図１に示した生菌測定装置を使用して生菌又はそのコロニーの数を計数するが、画像取得後の輝点の計数方法に改良を加えたものであり、以下、図５〜図７に基づいて説明する。
【００２４】
図５は、本実施例における画像読み取り後のデータ解析装置４が行う輝点の計数処理のための処理フローを示す。先ず、発光処理された生菌を高感度テレビカメラで画像として読み取る（ステップＳ１０）。読み取られた画像は光の強度分布を表す輝度値の画像データとして画像メモリに元画素データとして書き込まれる（Ｓ１２）。この画像メモリは、マトリックス状のアドレスを有するメモリを有し、座標位置と試料のフィルター面の位置とが対応するようにしてある。
【００２５】
次に、測定された元画素データをもとに、バックグラウンドによる輝度値の補正を行う（Ｓ１４）。この輝度値の補正は、各アドレスの輝度値に対し、フィルタリングマトリックスの範囲（例えば、特定アドレスを中心とする３×３のマトリックス）で切り出し、切り出した範囲の輝度値に対して加算平均を計算し、各アドレスに対応するバックグランド画像値として各アドレスに書き込む。これにより各アドレス毎に対応するバックグラウンド値が書き込まれる。次いで、各アドレスに読み込まれた元画像データから各アドレスに対応するバックグランド値を減算する。これによって、各アドレスの輝度補正されたデータが書き込まれる。
【００２６】
図６（Ａ）は、各メモリに書き込まれた補正後の輝度値の例を示している。次に補正された輝度値のデータを所定の閾値により２値化していく（Ｓ１６）。図６の例では、閾値を５とし、輝度値が５以上のものを１とし、５未満のものを０として２値化した例である。図６（Ｂ）は（Ａ）のデータを２値化して結果を示している。２値化した結果、１であるものは、所定レベル以上の輝度を有するものであり、生菌由来の発光に基づくものである。
【００２７】
本実施例においては、２値化された結果の１のものを全て生菌又はそのコロニー（以下、総称して「生菌」という）１個に対応させて計数することはせず、さらに、発光形態を調査して生菌の数の計数を行う。
【００２８】
２値化されたデータマトリックスに基づき、次に、各アドレスについて順次、１か０かの判定を行う（Ｓ１７）。そして、該当アドレスの値が１のものであれば、次に、その該当アドレスの隣接する周囲に１の値を持つアドレスが存在するかどうかを判断する（Ｓ１８）。なお、ここで、１でなければ、即ち、０であれば、輝点でないと判断する（Ｓ１９）。ステップ１８において、隣接する周囲に１が存在している場合には、その画素の集合を１個と判断し、それらの集合に計数番号を順次付していく。図６（Ｂ）の２値化データを例にとれば、アドレス（２，Ｂ），（２，Ｃ）及び（３，Ｂ）は互いに隣接している輝点である。したがって、ステップ２０において、アドレス（Ｂ，２）の輝点を判断した時点で、アドレス（Ｂ，２），（Ｃ，２）及び（Ｂ，２）のアドレスに計数番号１を付与する。次に、（２，Ｅ）のアドレスにおいては、輝点を示す２値化データが存在し、周囲に１を持つアドレスは存在しないから、この場合は、１個の輝点と判断し（Ｓ２２）計数番号２を付与する。このようにして、以下、計数番号が付与されていないアドレスを順次判定し、すべてのアドレスのついて判定を行い、最終的に、計数番号の最大の値が、生菌による輝点の数となる（Ｓ２２）。全てのアドレスの判定が終了したことを確認し（Ｓ２６）、計数処理を終了する。
【００２９】
以上のように、マトリックス状のメモリに得られた２値化データのうち、輝点を表すデータが隣接するものは、それらの集合を１つの輝点として計数することにより、実際の生菌の数と合致する計数を行うことができる。すなわち、生菌１個に由来する輝点であるにもかかわらず、前述の図３に示した例のように、４個と計数するようなことを回避することができる。
【００３０】
図７は、本発明による計数の処理方法により画像解析装置が行った計数結果を示し、図３（Ａ）のオリジナル画像が示すとおり６個の生菌の数と一致する、計数値を表示しており、画像解析に基づく電気的な自動計数によっても正確な計数が可能となることを示している。
【００３１】
次に、本発明の第２の実施例について、図８〜図１０に基づいて説明する。
【００３２】
本実施例においては図１に示した生菌測定装置を使用して生菌の数を計数するが、画像取得後の輝点の計数方法に改良を加えたものである。
【００３３】
図８は、本実施例における画像読み取り後のデータ解析装置４が行う輝点の計数処理のための処理フローを示す。先ず、発光処理された生菌を高感度テレビカメラで画像として読み取る（ステップＳ１００）。読み取られた画像は光の強度分布を表す輝度値の画像データとして画像メモリに元画素データとして書き込まれる（Ｓ１０２）。この画像メモリは、マトリックス状のアドレスを有するメモリを有し、座標位置と試料のフィルター面の位置とが対応するようにしてある。次に、測定された元画素データをもとに、バックグラウンドによる輝度値の補正を行う（Ｓ１０４）。この輝度値の補正は、各アドレスの輝度値に対し、フィルタリングマトリックスの範囲（例えば、特定アドレスを中心とする３×３のマトリックス）で切り出し、切り出した範囲の輝度値に対して加算平均を計算し、各アドレスに対応するバックグランド画像値として各アドレスに書き込む。これにより各アドレス毎に対応するバックグラウンド値が書き込まれる。次いで、各アドレスに読み込まれた元画像データから各アドレスに対応するバックグランド値を減算する。これによって、各アドレスの輝度補正されたデータが書き込まれる。
【００３４】
図９（Ａ）は、各メモリに書き込まれた補正後の輝度値の例を示している。
【００３５】
次に補正された輝度値のデータを所定の閾値により２値化していく（Ｓ１０６）。本実施例では、輝度値（Ｌ）を２値化を２つの閾値Ｌ１，Ｌ２（Ｌ２＞Ｌ１）を設定し、Ｌ≧Ｌ２にあるもの（Ａ）とＬ２＞Ｌ≧Ｌ１のもの（Ｂ）を夫々判別して画像に対応させてマトリックス状のメモリに書き込むようにしている。
【００３６】
図９（Ｂ）は、２段階で２値化した結果をまとめて書き込んだものである。この例ではＬ２＝８、Ｌ１＝５と設定している。Ｌ１＝５は、輝度値が５以上のものを生菌よりの発光と識別するものであり、Ｌ２＝８は、そのうちでも特に輝度の大きい輝点を識別するための閾値である。
【００３７】
本実施例においては、２値化して得た所定レベルの輝度値のものを全て生菌１個に対応させて計数することはせず、さらに、発光形態と、発光の強さを識別してこれを考慮して生菌の数の計数を行う。
【００３８】
先ず、作成されたデータマトリックスにもとづき、輝点と判定されたものうち、輝度がレベルＬ２より大であるかを判断する（Ｓ１０８）。そして、Ａと判定されたものについては、さらに、その周囲に輝度Ｂ以上のものがあるかどうかを判断する（Ｓ１１０）。輝度Ｂ以上のの輝点が存在すれば、それは、もとの輝点と同じ生菌由来の蛍光であると判断し１つ集合として１と計数する（Ｓ１１２）。
【００３９】
図９（Ｂ）に示した例では、座標（Ｅ，６）と（Ｅ，７）に対応する輝点は、１つの集合のものとして計数される。ステップ１１０において、周囲に輝度Ａが存在しない場合は１個をカウントする（Ｓ１１４）。
【００４０】
ステップ１０８において、輝度Ａではない場合は、輝度Ｂの輝点かどうかが判断される（Ｓ１１６）。輝度Ｂであると判断されると、次にその画素を中心として、周囲に輝度Ｂの輝点が存在しているかどうかが判断される（Ｓ１１８）。そして、輝点Ｂが隣接して存在していれば、その輝点は、中心の輝点と同じ生菌由来の蛍光と判断し、それらの集合を１と計数する（Ｓ１２２）。
【００４１】
ステップ１１８において、周囲の範囲内にない場合は、さらに、その画素を中心に周囲に輝度Ａの輝点が存在しているかどうかが確認される（Ｓ１２０）。そして、存在していれば、その輝点は輝度Ａの輝点の拡散光により発生したものであると判断し、カウントしない（Ｓ１２４）。なおステップ３０において、輝点Ｂが存在し、その周囲５画素の範囲に輝度Ａが存在しなければ、１をカウントする（Ｓ１２６）。なお、ステップ１１８において周囲３画素内に輝度Ｂがあれば、輝度Ｂの輝点の集合として１個と判断する。
【００４２】
以上の処理でカウントされた輝点あるいはその集合は、最終的に合計される（Ｓ１２８）。図９（Ｃ）は周囲に所定レベル以上の画素が存在しているものについて、それらの輝点の集合を生菌１とカウントするために画素に対応したメモリにカウント番号を付した様子を示すものである。座標（Ｅ，１），（Ｅ，２），（Ｆ，２）の輝点は通常の輝度レベルＢの蛍光を発する生菌１をしめし、座標（Ｅ，６），（Ｅ，７），（Ｈ，６）は、輝度レベルＡを持つ輝点とその拡散光によるものと判断し、１つの集合として生菌の２番目のカウント番号を付した状態を示す。
【００４３】
全輝度マップのすべてのアドレスのメモリが判定されたことを確認して（Ｓ１３０）、この計数処理を終了する。
【００４４】
以上のように、本発明においては、マトリックス状のメモリに得られた２値化データのうち、輝点を表すデータが隣接するものは、それらの集合を１つの輝点として計数し、また所定レベル以上の大きい強い輝度を持つ輝点については、その周囲の５画素の範囲内に通常レベルの輝度を持つ輝点が存在していても、それらを１つの生菌に由来する蛍光と判断し、輝点の集合を１としてカウントするようにしたものである。これにより、実際の生菌の数と合致する計数を行うことができる。すなわち、生菌１個に由来する輝点であるにもかかわらず、前述の図３に示した例のように、４個と計数するようなことを回避することができ、また、図４に示したように、大きい輝度をもつ輝点の場合に発生する近傍の拡散光を別の生菌由来の蛍光による輝点としてカウントすることを避けることができる。
【００４５】
図１０は、本発明による計数の処理方法により画像解析装置が行った計数結果を示し、図４の画像が拡散による蛍光をカウントして３個と計数したものは、それらの集合を１と適切に計数している。
【００４６】
画像解析に基づく電気的な自動計数によっても正確な計数が可能となることを示している。
【００４７】
上述の第２の実施例は計数すべき微生物による輝点の拡散光という偽輝点を計数しないようにして精密な計数を可能にするものであるが、微生物の有無を確認するだけで簡易的な計測であれば、先の第１の実施例に示した方法で十分である。ただし、本発明者の研究によれば、拡散光による偽輝点は条件にもよるが大量に発生する場合があり、その場合、計数値が１０倍〜５０倍も多くなることがあり、少なくともこの拡散光の影響を除去したい場合には、第１の実施例の図５に示した処理フローにおいて、ステップ１４の画像データをチェックし、拡散光を発生するような輝度が高く、所定以上の大きさを持った輝点の有無を確認し、そのような輝点の確認したら、第２のしきい値Ｌ２で２値化する。得られた２値化マトリックスは拡散光の影響を除去したものが得られる。
【００４８】
次に図１１は、本発明の第３の実施例を示し、拡散光の影響がどの程度か大まかに把握した場合に実施する例を示す。なお、本実施例は、図５に示す処理を基本にしており、説明の便宜上、同一の処理には同一の符号を用いて説明している。
【００４９】
図１１に示すフローチャートに示すように、ステップ１４でで得た画像データはさらに、拡散光を発生するような輝点が存在するかどうかを、所定以上の輝度（例えば、輝度値１０）で画素面積３×３以上の輝点が存在するかどうかを確認し（Ｓ３００）、そのような輝点が存在しない場合（Ｍ１）、存在する場合（Ｍ２）それぞれメモリに記憶する。そして、第１の実施例のように、第１のしきい値Ｌ１で２値化し、輝点を計数してその数を確認しておく（Ｓ１０〜Ｓ２６）。なお、ここで、ステップ２０の後、更に、離れた画素であってもその距離が２画素以内のものは、同一輝点のものとしてカウントするための処理を加えている（Ｓ３０６〜Ｓ３１２）。第１のしきい値に基づく計数の終了後、ステップ３００においてか確認されたメモリＭ２に輝点が記憶されたか否かの判断が実行されたかどうかの判断を経て（Ｓ３１６）、始めての判断の結果、輝点の存在が在れば（Ｓ３１８），ステップ１４で得た画像データ（別途メモリにデータを保存しておくものとする。）を第２のしいき値Ｌ２により、２値化する（Ｓ３２０）そして、ステップ１７よりステップ２６の処理を同様に実行する。
【００５０】
第１のしきい値Ｌ１と第２のしきい値Ｌ２とにより得られた輝点の数はそれぞれ記録してし保持しておき、これらの輝点計数の差を知ることにより、大まかな拡散光の影響を数量的に把握することができる。
【００５１】
上述の如く本発明によれば、生菌より発生する蛍光の輝点を電気的に計数して生菌の個数を計数する方法において、輝点の形状により１個を複数個に計数することにより生ずる計数誤差を無くすことができ、正確な生菌の計数が可能となる。
【００５２】
また、生菌より発生する蛍光の輝点を電気的に計数して生菌の個数を計数する方法において、輝点の形状により１個を複数個に計数することにより生ずる計数誤差を無くすことができ、また、輝度の大きい輝点から発生する拡散光を独立して発生した輝点と判断して計数することを避けることができる。これにより、微生物を電気的の正確に計数することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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