(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ３Ａ４生産又は発現の転写エンハンサーを形成するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、以下のＣＹＰ３Ａ４の５′フランキング領域からの核内受容体応答要素：配列番号：２、配列番号：３、配列番号４：及び配列番号：５の各々を含み、前記核酸分子が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有することを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項２】
核酸分子が配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性を有する請求項１の核酸分子。
【請求項３】
核酸分子が配列番号：１のヌクレオチド配列を含む請求項２の核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
【請求項５】
核酸分子がＣＹＰ３Ａ４遺伝子の以下のフラグメントから選択されるヌクレオチド配列を含む請求項４の遺伝子構築物：
（ｉ）  ヌクレオチド位置−１３０００〜＋５３からなるフラグメント；
（ｉｉ）  ヌクレオチド位置−１３０００〜−１２７００及びそれに隣接した−８０００〜＋５３からなるフラグメント；
（ｉｉｉ）  ヌクレオチド位置−１３０００〜−５１００及びそれに隣接した−１２００〜＋５３からなるフラグメント；
（ｉｖ）  ヌクレオチド位置−７８００〜−６０００及びそれに隣接した−３６２〜＋５３からなるフラグメント。
【請求項６】
遺伝子構築物がレポーター分子をコードする遺伝子を含む請求項４又は５の遺伝子構築物。
【請求項７】
レポーター分子が蛍のルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グリーン蛍光タンパク質又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである請求項６の遺伝子構築物。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項の遺伝子構築物を含む細胞。
【請求項９】
細胞中でのＣＹＰ３Ａ４発現を生体異物誘導させるための化合物を選抜する方法であって、前記方法が、請求項４〜７のいずれか一項の遺伝子構築物を化合物に曝すこと、及びレポーター分子をコードする核酸分子の発現の誘導又はレポーター分子をコードする核酸分子の発現についての潜在力を測定することを含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項の単離された核酸分子又は請求項４〜７のいずれか一項の遺伝子構築物を含む非ヒトトランスジェニック生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は遺伝子発現の調節又は影響付与、及び／又はヒト及び非ヒト動物のシトクロムＰ４５０  ＣＹＰ３Ａサブファミリー酵素の生成に関する。
【０００２】
背景技術
医学的及び獣医学的使用のための治療用医薬の開発はヒト及び動物における治療様式を改良し進展させるために重要である。不幸なことに、現在開発されて使用されている医薬の多くは受容者による迅速な代謝のため、in vivoでは限られた半減期しか有しないことがわかっている。患者における代謝活動に対する感受性について潜在的に新しい医薬を選抜するための系を有することは有利であるだろう。
【０００３】
ＣＹＰ３Ａ４と称されるシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）は肝臓において発現されるが他の組織においてはほとんど発現されない酵素をコードする重要なヒト遺伝子である。それはヒトの肝臓において量的に最も豊富なＰ４５０である。ＣＹＰ３Ａ４酵素は治療用医薬を含む多くの外因性化学物質（生体異物）、並びにステロイドホルモンの如き一連の内因性化合物の代謝において中心的役割を果たしている。ＣＹＰ３Ａ４の発現レベルの変化は治療用医薬の排出率に劇的に影響を与えることができ、かくしてそれらの有効性に影響を与える。いくつかの治療用医薬を含む一連の外因性化学物質（以後、「生体異物誘導物質（xenobiotic inducers）」と称する）はＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写率を増大させ、かくしてＣＹＰ３Ａ４酵素を生成させる。その結果、ＣＹＰ３Ａ４によって代謝された医薬の排出が大幅に増大され、それによってそれらの治療効果が減少する。
【０００４】
本発明の発明者はヒトＰ４５０  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写開始部位に対して約７．５キロベース５′側にあるＤＮＡ分子を得た。これは治療用医薬を含む生体異物誘導物質によるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写を誘導する役割を果たしており、並びにこの遺伝子の構成的発現にも関与している。この核酸分子は本発明の発明者によって「生体異物応答的エンハンサーモジュール（xenobiotic-responsive enhancer module）」（ＸＲＥＭ）と命名され、いくつもの有用な用途を有する。
【０００５】
発明の開示
第一の側面においては本発明はシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）ＣＹＰ３Ａ４生産又は発現の転写エンハンサーを形成するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子にある。
【０００６】
好ましくは単離された核酸分子は図１（配列番号：１）に示されているものと実質的に同一のヌクレオチド配列、又はＣＹＰ３Ａ４のエンハンサーをコードするその機能的に等価のヌクレオチド配列又はその一部分、又は図１（配列番号：１）のヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列、又は図１（配列番号：１）のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の相同性を示す配列を含む。より好ましくは核酸分子は図１（配列番号：１）のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の相同性を有し、最も好ましくは核酸分子は前記配列と少なくとも９０％の相同性を有する。
【０００７】
好ましい実施態様においては本発明はＣＹＰ３Ａ４の５′フランキング領域からの核内受容体応答要素を含む単離された核酸分子にある。好ましくは応答要素は以下のものから選択される。
XREM-DR3-1  GAA TGAACTTGC TGACCC TCT（配列番号：２）；
XREM-ER6    CCT TGAAAT CATGTC GGTTCA AGC（配列番号：３）；
XREM-DR6    AGG TGAATC ACAAGC TGAACT TCT（配列番号：４）；
XREM-DR3-2  ATA TATTGT TAT TGAACT ATC（配列番号：５）；及び
Prox-ER6    ATA TGAACT CAAAGG AGGTCA GTG（配列番号：６）
【０００８】
本発明の発明者によっていくつもの特異的な応答要素がＣＹＰ３Ａ４のエンハンサー中に同定されているので、配列番号：１が他の応答要素を同定するために用いることができるということは理解されるであろう。エンハンサーの全配列が続く使用のために必要であるわけではないので、本発明は他の源からの中間又は連結配列を有するエンハンサーからの応答要素の使用をもその範囲内に含む。
【０００９】
好ましくは、単離された核酸分子は図１（配列番号：１）に示されているものと実質的に同一のヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
好ましい形態においてはＣＹＰ３Ａ４はヒトのＣＹＰ３Ａ４である。しかし、本発明は他のヒトＣＹＰ３Ａサブファミリー酵素及び非ヒト哺乳動物からのＣＹＰ３Ａサブファミリー酵素をも含むことは理解されるであろう。
【００１１】
ＣＹＰ３Ａ４の誘導は一以上の生体異物誘導物質によって行われることが好ましい。
【００１２】
本発明は図１（配列番号：１）に示される配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドをも含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは高ストリンジェンシー下で図１（配列番号：１）に規定される配列とハイブリダイズする。ここにおいて用いる通り、ストリンジェントな条件とは、（ａ）洗浄に低イオン強度及び高温を用いること（例えば０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍくえん酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４、５０℃）；（ｂ）ホルムアミドの如き変性剤をハイブリダイゼーション中用いること（例えば０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％  Ficoll、０．１％ポリビニルピロリドンを含む５０％（体積／体積）ホルムアミド、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭくえん酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、４２℃）；又は（ｃ）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍくえん酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘDenhardt溶液、音波処理された鮭精液ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％硫酸デキストラン、４２℃を０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で用いることを意味する。
【００１３】
本発明の第一の側面の更なる好ましい実施態様においては、図１（配列番号：１）のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは５０００ヌクレオチド未満である。しかし、それは１０００ヌクレオチド長未満、又は５００ヌクレオチド長未満ですらあることができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドは好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長である。
【００１４】
第二の側面においては、本発明はレポーター分子の誘導を測定するために用いるのに好適な遺伝子構築物であって、レポーター分子をコードする核酸分子に操作可能に連結された本発明の第一の側面の核酸分子を含む遺伝子構築物にある。
【００１５】
好ましくはレポーター分子をコードする核酸分子は酵素をコードする。レポーターをコードする核酸分子は酵素ＣＹＰ３Ａ４をコードしていてもよいし、又はその機能的に等価な酵素をコードしていてもよい。好適なレポーター分子の例は蛍のルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ及びグリーン蛍光タンパク質を含む。代わりに核酸はノーザンブロッティング又はリボヌクレアーゼ保護アッセイの如き標準的方法によって検出することができるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードすることができる。
【００１６】
しかし、レポーター分子をコードする核酸分子は発現された時に検出可能な活性を有するならばいかなる核酸分子又は遺伝子でもあることができることは理解されるであろう。用いられる転写誘導物質（ＸＲＥＭ）はシトクロムＰ４５０系に由来するものの、レポーター分子をコードする核酸分子は、シトクロムＰ４５０系と関連している必要は必ずしもない。また、レポーター遺伝子をコードする核酸分子は一以上のレポーター分子を含むことができることも理解されるであろう。
【００１７】
第三の側面においては、本発明は本発明の第二の側面の構築物を含むアッセイ系にある。このアッセイ系は系が生体異物誘導物質に曝されるとレポーター分子をコードする核酸分子の発現が増大される。
【００１８】
アッセイ系は構築物（ＸＲＥＭ）を含む細胞及び構築物（ＸＲＥＭ）の機能を支持することができる細胞非含有系をその範囲内に含む。かかる細胞非含有系は核抽出物の如き細胞抽出物を通常含むが、常にそうであるわけでもない。アッセイ系は構築物（ＸＲＥＭ）への化合物の結合を測定する実験系をも含む。これらはＤＮａｓｅ  Ｉフットプリンティング及びゲル遅延アッセイを含む。これらのアッセイ系は構築物（ＸＲＥＭ）の活性化を検出するために用いることができるが、化合物の大規模選抜のためにはレポーター遺伝子構築物ほどは便利ではない。増大された発現はレポーター遺伝子生成物の活性を増大させることが好ましい。
【００１９】
細胞は細菌細胞、植物細胞又は動物細胞を含むいかなる好適な細胞であることができる。構築物は細胞中に別個の遺伝的存在として留まっていることもできるし、又は細胞のゲノム中に組み込まれることもできる。更に、細胞はトランスジェニック動物の一部からのものであることができる。
【００２０】
第四の側面においては、本発明は細胞中でのＣＹＰ３Ａ４発現の生体異物誘導のための化合物を選択する方法であって、本発明の第三の側面のアッセイ系を化合物に曝すこと、及びレポーター分子をコードする核酸分子の発現の誘導又は発現の潜在力を測定することを含む方法にある。
【００２１】
本発明による方法は新規の治療用医薬の選抜のために特に好適である。開発段階では有効な潜在的医薬は多数あるが、もしある医薬がin vivoではＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導するならば、有効な治療用医薬としてのその好適さは減少してしまう。使用中、その医薬は患者の肝臓において誘導されたＣＹＰ３Ａ４酵素によって代謝されるため、その医薬の半減期は短くなるであろう。生じうるその他の問題はその医薬が患者に与えられた他の医薬の代謝又は排出をも増大させてしまうということである。医薬の「カクテル」又は医薬の組合せは多くの病気の治療においてしばしば必要とされる。もし投与された医薬のうちの一つが特定の病気の治療において用いられる一つ以上の他の医薬の排出を増大させる傾向を有するならば、これは極めて望ましくなく、治療の効力を減少させることになるであろう。
【００２２】
もしある化合物又は新規医薬が本発明による方法によって試験された場合にレポーター遺伝子の発現を誘導できないならば、このことはその化合物又は新規医薬が生体異物誘導物質ではないこと、それ故更なる開発のための好適な候補であることを意味するということは理解されるであろう。好適でない候補が開発の初期段階で切り捨てられるので、この選抜方法は治療用医薬の開発において有益であろう。更に代替又は関連化学化合物も選抜アッセイにおける化合物の陰性結果に基づいて開発することができる。
【００２３】
本発明による方法はトランスジェニック動物を化学物質又は医薬に曝した後でレポーター遺伝子の誘導について前記動物を測定することをも含む。
【００２４】
第五の側面においては、本発明は本発明の第一の側面によるＸＲＥＭの遺伝子分析ツールとしての使用にある。この場合、ヒトにおける対立遺伝子変異体に応答する突然変異が導入され、それらの機能的結果が観察される。又、ＸＲＥＭは転写制御の規定された機能を有するので、それは対立遺伝子変異の決定にも用いることができる。
【００２５】
更なる側面においては、用途はＸＲＥＭ内の対立遺伝子変異（構成的発現に関して）の決定及び対立遺伝子変異の影響を測定するためのＸＲＥＭの部位特異的突然変異の使用を含む。
【００２６】
この明細書全体を通して特に指定しない限り、用語「含む」は言及された要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数又はステップの包含を意味し、他のいかなる要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数又はステップを除外するものではないものとして理解されるべきである。
【００２７】
本発明をより明確に理解してもらうため、以下の実施例及び図面を参照して好ましい実施態様を説明する。
【００２８】
図面の簡単な説明
図１はＣＹＰ３Ａ４遺伝子のＸＲＥＭ領域の配列を示す。塩基の番号付けは相対的なものであり、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子構造内での位置を示すものではない。
【００２９】
図２は生体異物応答要素を限定するために用いられるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の５′フランキング領域の一連の欠失構築物の例を示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現倍率はビークル単独（０．１％ジメチルスルホキシド）と比較した強力なＣＹＰ３Ａ４誘導物質（５μＭリファンピシン）を用いた処理に関する。これは「空の（empty）」ｐＧＬ３−基本レポーターベクターの活性について標準化された。全ての構築物はＨｅｐＧ２細胞中へ一時的にトランスフェクトされた。
【００３０】
図３は強力なＣＹＰ３Ａ４誘導物質（５μＭリファンピシン）の存在下又は不在下での、ＣＹＰ３Ａ４  ＸＲＥＭレポーター構築物を含むＨｅｐＧ２細胞に対するｈＰＸＲ発現ベクター（ｐＳＧ−ｈＰｘＲ）のコトランスフェクションの影響を示す。挿入されているグラフはコントロール細胞に対する影響の拡大図を示す。
【００３１】
図４はビークル（ジメチルスルホキシド）０．１％単独と比較したｈＰＸＲ発現ベクター及びＣＹＰ３Ａ４  ＸＲＥＭレポーター構築物を含むＨｅｐＧ２細胞に対する様々な誘導的医薬の影響を示す。図中、１はＤＭＳＯであり；２はリファンピシンであり；３はＲＵ−４８６であり；４はクロトリマゾールであり；５はフェノバルビトンであり；６はメチラポンであり；７はプレグネナロン１６α−カルボニトリルである。
【００３２】
図５は５μＭリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ４の５′フランキング領域の転写誘導に対する推定的核内受容体応答要素の欠失又は部位特異的突然変異誘発の影響を示す。塗りつぶされたボックスは突然変異させられた要素に対応する。番号付けは転写開始部位に対して相対的である。
【００３３】
図６は生体異物がＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写活性化を誘導する能力を測定するための、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ）に結合されたＣＹＰ３Ａ４の最適化された５′フランキング領域構築物を示す。番号付けは転写開始部位に対して相対的である。
【００３４】
発明を実施するための様式
定義
一般的分子生物学
特に示さない限り、本発明において利用される組換えＤＮＡ技術は標準的手法であり、当業者には周知のものである。かかる技術は例えばJ.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley 及び Sons (1984),J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989),T.A.Brown (editor),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1 及び 2,IRL Press (1991),D.M.Glover 及び B.D.Hames (editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press (1995 及び 1996), 及び F.M.Ausubel et al. (Editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates 及び Wiley-Interscience（1988, 現在に至るまでのあらゆる先端を含む）のような文献に記載され説明されている。これらの文献は参考文献としてここに組入れる。
【００３５】
突然変異体、変異体及び相同性−核酸
突然変異体ポリヌクレオチドは一以上の突然変異を有し、それらはヌクレオチド残基の欠失、挿入、又は置換である。突然変異体は自然に生じた（つまり天然源から単離された）ものであることもできるし、又は合成のもの（例えばＤＮＡに部位特異的突然変異誘発を行わせることによる）であることもできる。従って本発明のポリヌクレオチドが自然に生じたものであってもよいし、組換え体（つまり、組換えＤＮＡ技術を用いて調製された）ものであってもよいことは明らかである。
【００３６】
対立遺伝子変異体は個々の生物内で自然に生じた変異体であるだろう。
【００３７】
複数のヌクレオチド配列はこれらが共通の祖先から分岐したことによって関連があるならば相同である。結果としてポリヌクレオチドの種相同物は他の種において自然に生じた等価のポリヌクレオチドであるであろう。いかなる一つの種内でも相同物が多数の対立遺伝子変異体として存在することができ、これらはポリヌクレオチドの相同物とみなされるであろう。対立遺伝子変異体及び種相同物は当業者に知られている標準的技術を用いることによって得ることができる。好ましい種相同物は同一の門、より好ましくは同一の綱、更に好ましくは同一の目の代表例からのものを含む。
【００３８】
当業者には周知の方法（例えばSmith, T.F. 及びWaterman, M.S. (1981) Ad. Appl. Math., 2:482-489 又は Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol., 48:443-453 に記載されている方法）によって測定される通り、本発明のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドは本発明に含まれる。同様に、本発明のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質も本発明に含まれる。これは少なくとも６０、好ましくは少なくとも９０の隣接するヌクレオチド残基の領域を一般的に含むであろう。
【００３９】
実質的に精製された
「実質的に精製された」という表現は脂質、核酸、他のポリペプチド又はポリヌクレオチド、及び他の汚染分子から分離されたポリヌクレオチドを意味する。
【００４０】
活性フラグメント
「活性フラグメント」という表現はＣＹＰ３Ａ４と称されるシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）の転写エンハンサーをコードする図１に示される配列のフラグメントを意味する。
【００４１】
背景
ヒトのシトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）
ＣＹＰ３Ａ４はヒトの臨床薬学における重要な遺伝子である。治療用医薬及び内因性ステロイドホルモンの代謝におけるその中心的役割に加えて、最近の研究はこの遺伝子の推定的制御領域における非コード多型を前立腺がん及びがんの化学的治療後の二次的白血病の進行の両方と関連付けてきている。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子制御の理解は治療用医薬の開発において重要である。加えて、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子は薬学的操作のための新規標的及び薬学遺伝学的分析及びたぶん病気の予測の両方のためのツールを表す。しかし、これらの目的を達成するためにはＣＹＰ３Ａ４の制御及び遺伝学の完全な理解が必要である。この本発明はその生体異物誘導及び構成的発現に責任のあるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の５′フランキング領域内の制御モジュールに指向されている。
【００４２】
ヒトの肝臓のシトクロムＰ４５０ｓ
ヒトの肝臓のＰ４５０ｓは広範囲の親油性基質の代謝において活性のある膜結合血液タンパク質である。Ｐ４５０タンパク質は医薬及び他の生体異物代謝におけるそれらの中心的役割のためのみならず、それらの数多くの「天然」又は「内因性」親油性基質のためにも医学にかなり関連がある。これらはステロイドホルモン、脂肪酸（特にロイコトリエン）、コレステロール及び胆汁酸塩を含む。Ｐ４５０系が進化したのはコレステロール及びステロイド代謝におけるその中心的な役割のためであろうと考えられている。ＣＹＰ３Ａ４を含む構成的に発現されるヒト肝臓Ｐ４５０ｓのいくつかは特に関心がある。というのはそれらは量的に最も重要な形態であり、一連の生物学的に重要な反応を触媒するからである。
【００４３】
ＣＹＰ３Ａ４の生理的役割及び変異性
ＣＹＰ３Ａ４はヒトの肝臓中に見出される主要なシトクロムＰ４５０であり、肝臓のシトクロムＰ４５０タンパク質の総量の最大６０％を占める。ＣＹＰ３Ａ４は広範囲の医薬及び内因性ステロイドの代謝に関与している。あらゆる治療用医薬の６０％以上がこの酵素によって完全に又は部分的に代謝されるであろうと推定されている。ＣＹＰ３Ａ４の発現レベルにおける変化は治療用医薬の代謝に劇的な影響を有することがあり得、かくして数多くの重要な医薬相互作用を生ずることができる。又、この酵素の構成的発現レベルの変異は酸化的医薬代謝の個体間変異に主に寄与している。加えて、ＣＹＰ３Ａ４はステロイドホルモンの酸化的代謝の主要な経路であり、コルチゾール、アンドロステンジオン及びテストステロンの如きいくつかの内因性ステロイドの６β−ヒドロキシル化を触媒し、並びにエストラジオールの２−及び４−ヒドロキシル化を触媒してカタコールエストロゲンを生成する。二つの他のＣＹＰ３ＡサブファミリーシトクロムＰ４５０がヒトにおいて見出されている。ＣＹＰ３Ａ７は胎児肝臓中に主に見出されるが、一方ＣＹＰ３Ａ５は成人の肝臓並びに肺及び腎臓中に主に見出される。
【００４４】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現の制御
ＣＹＰ３Ａ４は多数のレベルの転写制御を受ける。これらは生体異物誘導（例えばいくつかの治療用医薬による）、組織特異的制御及び構成的発現におけるかなりの変異（既知の誘導物質又は阻害剤に曝されていない個体間で最大１０倍）を含む。
【００４５】
ＣＹＰ３Ａ遺伝子の生体異物誘導
ヒトを含むいくつかの哺乳動物種においてはＣＹＰ３Ａ遺伝子はいくつもの構造的に非類似の治療用医薬によって転写的に誘導可能である。ＣＹＰ３Ａ４の生体異物誘導はこの遺伝子の５′フランキング領域中の応答要素によって仲介されるという推測に基づいて本発明の発明者は転写開始部位の５′側の２２キロベース（ｋｂ）のＣＹＰ３Ａ４遺伝子をクローニングした。これは転写活性分析用のルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結された１３ｋｂの５′フランキング領域をカバーする構築物の欠失シリーズを作製するために用いられた。これらの構築物はヒト肝芽腫細胞系（ＨｅｐＧ２）並びにラット及びウサギの肝細胞の一次培養物中に一時的にトランスフェクトされた。リファンピシンの如き誘導剤で処理されたトランスフェクト細胞を未処理のコントロールと比較することによって本発明の発明者は応答要素（以後、生体異物応答エンハンサーモジュール（xenobiotic-responsive enhancer module）（ＸＲＥＭ）と称する）は転写開始部位の５′側の−７．２ｋｂから−７．８ｋｂの間にほぼ位置していることを決定した（図２）。本研究によりＸＲＥＭが何百塩基対にも及ぶ複合体要素であることが示される（図１、配列番号：１）。ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリンティングはこの領域がＤＮＡ−タンパク質相互作用に富むということ、及びこの領域がいくつかの転写因子に結合することができるように見えるということを示す。これらの転写因子の内でも近年明らかにされたヒトプレグナン−Ｘ受容体（ｈＰＸＲ）（このプレグナン−Ｘ受容体はプレグナン−活性化受容体（ＰＡＲ）及びステロイド−Ｘ受容体（ＳＸＲ）と同一である）［１−３］がＣＹＰ３Ａ４の生体異物誘導制御にとって最も重要である。
【００４６】
本発明の発明者はｈＰＸＲが生体異物誘導物質（例、リファンピシン）とＸＲＥＭ内の要素の間の重要なリンクを形成するということを示した。ヒトにおいてはリファンピシン処理はＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現を５０倍以上に通常誘導する。ＸＲＥＭ配列を含む好適なレポーター構築物がＨｅｐＧ２細胞中へトランスフェクトされる場合、リファンピシン処理はレポーター遺伝子の発現を３−５倍に誘導する。しかし、本発明の発明者はｈＰＸＲ発現ベクターでのＸＲＥＭ含有レポーター遺伝子構築物のコトランスフェクションは完全なリファンピシン誘導を回復するということを示した（図３）。本発明の発明者はフェノバルビトン及びクロトリマゾールの如き他の医薬もｈＰＸＲを介してＸＲＥＭに作用することを示し（図４）、これがＣＹＰ３Ａ４遺伝子の生体異物誘導の一般的メカニズムであることを証明した。
【００４７】
ｈＰＸＲは核内受容体遺伝子スーパーファミリーに属する孤立した核内受容体である［４］。他の研究室からの研究によればそれはレチノイド−Ｘ受容体（ＲＸＲ）と共にヘテロダイマーとしてＤＮＡに結合することが示唆されている［１−３］。本発明の発明者は３塩基スペーサーを持つ直接反復（ＤＲ３）、６塩基スペーサーを持つ直接反復（ＤＲ６）又は６塩基スペーサーを持つ外反反復（ＥＲ６）として配置されたＸＲＥＭ内のいくつかの推定的核内受容体応答要素を同定した（表１）。ｈＰＸＲ−ＲＸＲヘテロダイマーに対するこれらの推定的応答要素の親和性を評価するため、電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）がin-vitroで転写された／翻訳されたｈＰＸＲ及びＲＸＲを用いて行われた。これらはＸＲＥＭ−ＤＲ３−１及びＰｒｏｘ−ＥＲ６はｈＰＸＲ−ＲＸＲヘテロダイマーに有効に結合してゲルシフトを生ずるが、ＸＲＥＭ−ＤＲ６及びＸＲＥＭ−ＤＲ３−２を用いるとシフトは明らかに生じないということを示した。この結果にもかかわらず後者の二つの応答が機能的に重要であるということを本発明の発明者は部位特異的突然変異誘発によって示した（図５）。ＸＲＥＭ−ＥＲ６はｈＰＸＲ−ＲＸＲヘテロダイマーにたしかに結合したが、ＸＲＥＭ−ＤＲ３−１又はＰｒｏｘ−ＥＲ６よりは親和性が低かった。
【００４８】
表１。近接のＣＹＰ３Ａ４  ５′フランキング領域における推定的応答要素（Ｐｒｏｘ−ＥＲ６）と比較したＣＹＰ３Ａ４  ＸＲＥＭ内の推定的核内受容体応答要素の配列。プレグナン−Ｘ受容体と相互作用するラットのＣＹＰ３Ａ２３遺伝子の近接の５′フランキング領域からの要素（ＣＹＰ３Ａ２３  ＤＲ３）が比較の目的のため示されている。
【００４９】
【表１】
0004446603.tif 000002
【００５０】
ＸＲＥＭがＣＹＰ３Ａ４  ５′フランキング領域を含むレポーター遺伝子構築物から欠失させられると、生体異物誘導活性は見られない。このことはＸＲＥＭ領域が生体異物誘導の過程にとって必須であることを証明する。更にＸＲＥＭが最小ヘルペスシンプレックスウィルスチミジンキナーゼプロモーターの如き非相同遺伝子プロモーターに連結された場合でも、生体異物誘導は観察される。このことはＸＲＥＭがＣＹＰ３Ａ４遺伝子内の他の要素に絶対的に依存しているわけではないことを証明する。しかし、最大の生体異物応答性のためにはＣＹＰ３Ａ４遺伝子の近接プロモーター領域内のＥＲ６要素（Ｐｒｏｘ−ＥＲ６、表１）が必要であることを本発明の発明者は決定した。Ｐｒｏｘ−ＥＲ６要素はＸＲＥＭの不在下では生体異物誘導可能活性を全く持たないということを理解することは重要である。
【００５１】
上述の発見からＣＹＰ３Ａ４遺伝子の生体異物誘導分析のための最適化されたＤＮＡ配列が決定された。それはＸＲＥＭ領域並びに近接ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの塩基−３５６から＋５３を含み、構築物＃５と称される（図６）。通常このＤＮＡ配列はレポーター遺伝子に連結されており、好適な細胞又は細胞非含有系において研究される。本発明の発明者は１０％胎児ウシ血清を含むDulbeccoの改変されたEagleの培地（ＤＭＥＭ）中で培養され、商業的に入手可能な試薬（FuGene-6, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）を用いてトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞系がうまく働くことを決定した。
【００５２】
ＣＹＰ３Ａサブファミリー遺伝子の組織特異的かつ構成的発現
ＣＹＰ３Ａ４の組織限定的かつ構成的発現を決定するメカニズムは同一ではないとしてもたぶん類似しているであろう。遺伝子制御のこれらの側面を理解することはＣＹＰ３Ａ４によって仲介される医薬代謝においてヒトがこれほどまでに顕著な個体間変異を示す理由を決定的に説明するために必須である。
【００５３】
ヒトＣＹＰ３ＡサブファミリーＰ４５０は肝臓で主に発現される。しかし肝臓以外でも有意な組織限定的発現がある。ＣＹＰ３Ａ４は小腸、結腸及び膵臓並びに胸組織中で有意量発現される。肝臓における構成的発現の相対レベル及び腸における構成的発現の相対レベルはほとんど一致せず、このことは各組織で異なるメカニズムが作用していることを示唆する。ＣＹＰ３Ａ４はすべての成人ヒト肝臓において構成的に発現されるが、ＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡは肝臓サンプル間で１０倍もの変異がある。腸における発現の変異はさらに顕著であり、３０倍以上の変異が報告されている。
【００５４】
肝臓でのＣＹＰ３Ａ４発現の場合、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の５′フランキング領域を含むレポーター構築物を用いて本発明の発明者は肝臓特異的因子はＣＹＰ３Ａ４転写を支持するのに好ましくは必要とされるということを証明した。肝臓由来の細胞系（ＨｅｐＧ２）を肝臓に由来しない細胞系（ＮＩＨ−３Ｔ３）とｈＰＸＲの存在下又は不在下で転写活性化を支持するそれらの能力について比較した場合、肝臓に由来しない細胞系は顕著に劣っていた。明らかにこのことは肝臓特異的転写因子の付加的な役割を示唆する。しかし本発明の発明者はＨｅｐＧ２細胞がヒトの肝臓由来の細胞系であるにもかかわらずＣＹＰ３Ａ４を有意な量で構成的に発現しないということを知っている。本発明の発明者はヒトの構成的アンドロスタン受容体−β（ｈＣＡＲ−β）と称される異常なヒトの孤立した核内受容体［５］がＣＹＰ３Ａ４  ５′フランキング領域受容体構築物と共にＨｅｐＧ２細胞中へコトランスフェクトされるとレポーター活性を６〜１０倍に増大させるということを見出した。ｈＣＡＲ−βはトランス活性化制御ＤＮＡ配列に対するリガンドを必要とせず、その発現は肝臓にほぼ完全に限定されている。欠失構築物を用いて行われた実験はｈＣＡＲ−β受容体に対するＣＹＰ３Ａ４遺伝子の応答はＸＲＥＭに依存するということを示す。また、ｈＰＸＲを用いた生体異物誘導について観察される通り、ＸＲＥＭが最小チミジンキナーゼプロモーターに連結された場合、元々のプロモーターを用いた場合に観察されるよりは低レベルではあるものの、ｈＣＡＲ−βによって仲介される構成的発現が観察された。予備実験からｈＣＡＲ−βによって仲介される構成的発現においてＸＲＥＭとＰｒｏｘ−ＥＲ６要素の間には協同作用があるということが示唆される。しかし元々のプロモーター単独ではｈＣＡＲ−βコトランスフェクションに対して何の応答も示さない。
【００５５】
結果
成人のヒトの肝臓において発現される主要なＰ４５０であるシトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）は、抗生物質であるリファンピシンを含む様々な構造的に非関連の生体異物化合物による転写誘導に供される。本発明の発明者はＣＹＰ３Ａ４プロモーターの一連の５′欠失を含む様々なＣＹＰ３Ａ４−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物でヒト肝臓由来の細胞系（ＨｅｐＧ２）をトランスフェクトした。レポーター遺伝子のリファンピシン誘導性転写は最長の構築物を用いた場合にのみ観察された。１３０００／＋５３−ルシフェラーゼ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞をリファンピシン処理するとレポーター遺伝子の活性は３−５倍に増大した。この構築物はリファンピシンによって用量依存的な様式で活性化され、５μＭで最大誘導が見られた。いくつかの欠失クローンが更に調製され、応答領域は−７８００から−７２００塩基の位置におよそ存在することが明らかになった。ポリメラーゼ連鎖反応によって生成された欠失突然変異体により、リファンピシン応答は短いシス作用要素に依存しているというよりもむしろ、数百塩基を含む大きな領域全体に依存しているということが示唆された。この領域は最小ＣＹＰ３Ａ４プロモーター（−３６２から＋５３）と関連してレポーター遺伝子へのリファンピシン応答性に関与することができた。誘導は−７８００／−７２００フラグメントの配向及びＣＹＰ３Ａ４の近接プロモーターに関するその位置とは無関係であった。ヘルペスシンプレックスウィルスチミジンキナーゼプロモーターに連結されたＣＹＰ３Ａ４の遠位のエンハンサー領域を含む非相同レポーター遺伝子構築物もまたリファンピシン処理によってルシフェラーゼ発現を誘導することができた。この領域のヌクレオチド配列分析により、多数の推定的転写因子結合部位が明らかにされた。まとめると、本発明の発明者はリファンピシンによる転写活性化を仲介することができるＣＹＰ３Ａ４遺伝子中のエンハンサー領域を同定した。
【００５６】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子５′フランキング領域の一連の欠失構築物を用いて本発明の発明者は治療用医薬を含む生体異物誘導物質によるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写誘導に責任のあるＤＮＡ配列を発見した。このＤＮＡ配列はヒトＰ４５０ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写開始部位に対して約７．５キロベース５′側にある。本発明の発明者はこの要素を「生体異物応答エンハンサーモジュール」（ＸＲＥＭ）と命名した。この仕事は初期には結核の治療のために一般的に用いられる抗生物質であるリファンピシンという強力なＣＹＰ３Ａ４誘導物質を用いて行われた。しかしながら他の医薬を用いた予備研究によればＸＲＥＭは広範囲の化学化合物に対して応答することができるであろうということが示唆された。本発明の発明者はＣＹＰ３Ａ４からのＸＲＥＭ含有ＤＮＡ配列を用いてヒトで生ずるのと同様の様式でＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写を増大させることによって生体異物誘導物質に対して応答する細胞培養モデルを構築した。
【００５７】
本発明の発明者はＸＲＥＭを含むＣＹＰ３Ａ４  ５′フランキング領域構築物であってルシフェラーゼレポーターに連結されている構築物をＨｅｐＧ２細胞中へｈＰＸＲ発現構築物と共に、又はｈＰＸＲ発現構築物なしでコトランスフェクトした（ｐＳＧ−ｈＰＸＲ）。ｈＰＸＲを添加するとレポーター構築物の転写率が構成的に（ビークル単独での処理）及び生体異物誘導物質（５μＭリファンピシン）の添加後かなり増大した。ｈＰＸＲの単独添加がＣＹＰ３Ａ４  ＸＲＥＭ含有レポーターの転写率を増大させるという観察はｈＰＸＲはリガンドの不在下でいくらかのトランス活性化を行うことができること、又はｈＰＸＲのための内因性リガンドがＨｅｐＧ２細胞内に存在することを示す。
【００５８】
ｈＰＸＲはレチノイド−Ｘ受容体（ＲＸＲ）と共にヘテロダイマーとしてシス作用するＤＮＡ応答要素（ＰＸＲＥ）に結合することが示されている。ＰＸＲＥは直接又は外反／逆方向反復として配列 TGAACT の反復から一般的になるように思われる。本発明の発明者は表１に示されるＸＲＥＭ内に多数の推定的な核内受容体応答要素（ＰＸＲＥｓ）を同定した。
【００５９】
本発明の発明者はｈＰＸＲ−ＲＸＲヘテロダイマーがＸＲＥＭ内の推定的ＰＸＲＥｓに結合することができるかどうか測定するため32Ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを用いたゲル移動度シフト実験を行った。
【００６０】
リファンピシンによるＣＹＰ３Ａ４の転写誘導に対するＸＲＥＭ領域内の推定的ＰＸＲＥｓの寄与を更に調べるため、ＰＸＲＥｓの欠失及び／又は部位特異的突然変異誘発を含む一連のルシフェラーゼレポーター構築物が作製された（図５）。ＰＸＲＥ  ＸＲＥＭ−ＤＲ３−１を含む領域（−７８３４から−７６１０ｂｐ）を欠失させると、転写活性はほぼ完全に停止した。これはＸＲＥＭ−ＤＲ３−１の機能の喪失のみによるものではない。何故ならこのＰＸＲＥの部位特異的突然変異誘発は４７％の活性の喪失しかもたらさないからである。ＸＲＥＭ−ＤＲ６の突然変異もまた、このモチーフはゲルシフト実験においてｈＰＸＲ−ＲＸＲヘテロダイマーに結合することが明らかにできないのにもかかわらず転写率を（野生型の５２％に）減少させた。この部位は他の転写因子と結合するか又はこの部位はｈＰＸＲ−ＲＸＲに対する低親和性部位であるということがあり得る。
【００６１】
Ｐｒｏｘ−ＥＲ６モチーフからなる近接プロモーター領域内の推定的ＰＸＲＥはそれ自体では何の機能も有しないということは理解されるであろう。しかし、完全なＸＲＥＭを含む構築物中のＰｒｏｘ−ＥＲ６の部位特異的突然変異誘発は転写率を（野生型の４１％に）たしかに減少させる（図５）。このことはＸＲＥＭとＰｒｏｘ−ＥＲ６の間の協同作用を示唆する。
【００６２】
ＸＲＥＭはリファンピシンだけでなく多くの生体異物に対するＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写誘導を仲介する
多くの医薬はＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写を誘導する。リファンピシンの誘導特性は強力であるため、本発明の発明者はＸＲＥＭの同定及び特性決定にリファンピシンを用いた。ＸＲＥＭを含有するレポーター構築物が他の生体異物に対して応答することができるかどうかを測定するため、ＸＲＥＭでトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞は広範囲の医薬で処理された（図４）。ＲＵ−４８６（ミファプロストン）及びクロトリマゾールがin vivoで引き起こされるのと同様の様式でＸＲＥＭ構築物を誘導するということが見出された。本発明の発明者はin vivoでＣＹＰ３Ａ４を誘導するということが知られている広範囲の医薬をも調査し、そしてin vitroでのモデルがin vivoでの経験を密接に反映するということを見出した。
【００６３】
本発明の用途
本発明はいくつかの適用領域を有する。その中には治療用医薬の開発が含まれるがそれに限定されるわけではない。これらの適用領域のいくつかにおいてはＸＲＥＭを含むＤＮＡ構築物はＣＹＰ３Ａ遺伝子転写に対する化合物の影響を測定するために用いられる。これらの構築物は通常レポーター遺伝子を含み、これは遺伝子活性の簡便な測定を可能にする。かかるレポーター遺伝子はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ及びグリーン蛍光タンパク質を含む。しかしメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むいかなる検出可能な遺伝子生成物も使用することができる。かかる遺伝子構築物は一過的に又は永久的に好適な培養細胞中に導入されるか又はトランスジーンとしてトランスジェニック動物に導入される。付加的なＤＮＡ構築物をＸＲＥＭを含む構築物と共にコトランスフェクトすることができ、これによってＣＹＰ３Ａ遺伝子制御に関する特定の問題に答える好適な条件を提供することができる。かくコトランスフェクトされた構築物はｈＰＸＲ及びｈＣＡＲ−β（これはＸＲＥＭと相互作用することが本発明の発明者によって証明されている）のための発現プラスミドを含む。ＸＲＥＭ内には多くのタンパク質−ＤＮＡ相互作用があること、従って他のコトランスフェクト構築物も特定の状況のためには有用であろうということも本研究によって示されている。
【００６４】
他の適用領域は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現に関連する多型の存在についてヒトのゲノムＤＮＡを調査するためのＸＲＥＭ配列の使用である。かかる多型は医薬代謝能力の予測及び病気の関連を含むいくつかの使用領域に結び付いていることがあり得る。
【００６５】
ＣＹＰ３Ａ４酵素の生成を誘導する能力について化学物質を選抜するための細胞又はトランスジェニック動物モデルの使用
治療用医薬によるＣＹＰ３Ａサブファミリー酵素の誘導は望ましくない効果であると一般的にみなされている。かかる誘導はその医薬自体の又は一緒に投与された医薬の排出を増大させるかもしれない。これは一般的に医薬をより有効でないようにしてしまう。ＣＹＰ３Ａを誘導する潜在的な医薬を初期開発段階で選抜する能力は有用である。何故ならかかる医薬をこの作用を有するために切り捨てることができるからである。かかる医薬選抜から得られる情報は、ＣＹＰ３Ａ４を誘導する傾向を有する分子又は分子の一部分を示す構造−機能の関係の開発をも可能にする。かかる知識はより好ましい特性を有する新規化合物を合成するためのための合理的な医薬設計の使用を可能にする。この過程は表２に掲示されたもののようなＣＹＰ３Ａｓを誘導する（この性質は望ましいことではない）現存の医薬に適用することができる。
【００６６】
表２。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現を誘導することが知られている治療用医薬の非限定的なリスト。
【００６７】
【表２】
0004446603.tif 000003
【００６８】
上述のものに加えて主要作用としてＣＹＰ３Ａ酵素の生成を誘導するか又は阻害するように特別に設計された医薬についての潜在的治療用途がある。ＣＹＰ３Ａ４の誘導物質はＣＹＰ３Ａ４の基質である生体異物毒物又は生体内部で生成された物質の代謝を加速させるために用いることができる。ＣＹＰ３Ａ４の阻害剤は表２に掲示されているもののような治療用医薬によるＣＹＰ３Ａ４の望ましくない誘導を克服するために用いることができる。ＣＹＰ３Ａ酵素の生成を調節するように特別に設計された医薬にはここに掲げたもの以外にも多数の潜在的用途がある。ＸＲＥＭ配列はかかる医薬を同定するために有用である。
【００６９】
薬物遺伝学的分析／病気の感受性のためのツールとしてのＸＲＥＭ
ヒトが生体異物化合物（治療用医薬の如き）及び内因性化合物（生体内で分泌されるホルモンの如き）を代謝する能力には個体間で顕著な差異がある。これらの差異の少なくともいくつかは酵素又はこれらの生体異物化合物又は生体内で生成された化合物と相互作用する移送タンパク質をコードする遺伝子における多型に関係していることがあり得る。
【００７０】
シトクロムＰ４５０遺伝子スーパーファミリーは広範囲の親油性基質の代謝に関与している。ＣＹＰ３ＡサブファミリーＰ４５０ｓ（ＣＹＰ３Ａ４の如き）は治療用医薬及び生体内で生成されたステロイドホルモンの代謝に特に関与している。ＣＹＰ３Ａ基質の代謝には顕著な個体間差異（最大２０倍）が存在することはよく認識されている。しかしながら現在に至るまでＣＹＰ３Ａ４遺伝子のＣＹＰ３Ａ４タンパク質コード領域内にはこれらの差異を説明できるような多型は見出されていない。このことはこれらの個体間差異に寄与しているのはＣＹＰ３Ａ遺伝子発現の制御であるということを強く示唆する。
【００７１】
本発明の発明者はＣＹＰ３Ａ４のＸＲＥＭ領域がこの遺伝子の発現の転写制御にとって重要な制御要素であることを示した。従ってＸＲＥＭ内の多型は遺伝子の転写及びＣＹＰ３Ａ４タンパク質の発現に有意な影響を与え、かくしてＣＹＰ３Ａによって仲介される代謝における個体間差異の少なくとも一部分を説明することができる。
【００７２】
Rebbeck及びその同僚は前立腺がんの進行［６］及びがんの化学的治療後の二次的血病の発症率の減少［７］と相関があるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の近接５′フランキング領域における多型を最近記述している。まだ証明されていないが、これらの変化が生じたのはこの多型がＣＹＰ３Ａ４発現に影響を与えるからであると推察される。
【００７３】
かくしてＸＲＥＭ配列及び機能の使用はＣＹＰ３Ａ遺伝子多型を調査するための潜在的に強力なツールを提供する。かかる多型についての選抜はある個体が医薬を代謝する能力の測定（薬物遺伝学的分析）において又は病気の感受性（例、前立腺がん）の測定においてかなり有用であろう。かかる選抜を行う方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた関心のあるゲノムＤＮＡ領域（この場合はＸＲＥＭ）の増幅を通常含む。次にＰＣＲ生成物は制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＤＮＡの配列決定又はＤＮＡの一重鎖構造多型（ＳＳＣＰ）の如きいくつかの手法のうちの一つを用いて多型について調査することができる。
【００７４】
分子生物学、トランスジェニック及び指向遺伝子発現の広範囲における遺伝子発現についての誘導性エンハンサーとしてのＸＲＥＭの使用
シトクロムＰ４５０遺伝子の一部分を遺伝的スイッチとして使用するという考えはＣＹＰ１Ａ１遺伝子を用いて以前に示されている。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子のＸＲＥＭ領域は生体異物並びに特定のステロイドホルモンに対する応答において転写を制御することができるので、分子生物学及び指向遺伝子発現の広範囲における遺伝的スイッチとして潜在的に有用である。一例はＰＸＲ／ＸＲＥＭ依存性代謝を介した動物肝臓におけるトランス遺伝子の活性化である。
【００７５】
幅広く記述された本発明の精神又は範囲から逸脱することなく特異的な実施態様に示されるように多数の変形及び／又は改変を本発明に対して行うことができることは当業者には理解されるであろう。従って本発明の実施態様はあらゆる点で例示的であり、限定的とみなされるべきではない。
【参考文献】
0004446603.tif 000004
【配列表】
〔配    列    表〕
(1) 一般情報:
(i) 出願人:
(A) 名称: ユニヴァーシティ  オブ  シドニー
(B) 住所:
(C) 都市名: シドニー
(D) 州名: ニュー  サウス  ウェールズ
(E) 国名: オーストラリア
(F) 郵便番号 (ZIP): 2006
(ii) 発明の名称: 遺伝子発現の生体異物誘導
(iii) 配列の数: ７
(iv) コンピューターが読出し可能なフォーム:
(A) 媒体の種類: フロッピーディスク
(B) コンピューター: IBM PC コンパチブル
(C) オペレーティングシステム: PC-DOS/MS-DOS
(D) ソフトウェア: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(2) 配列番号: 1についての情報:
(i) 配列の特性:
(A) 配列の長さ: 632
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: DNA（ゲノミック）
(xi) 配列:配列番号: 1:
0004446603.tif 000005
(2) 配列番号: 2についての情報:
(i) 配列の特性:
(A) 配列の長さ: 21
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: DNA（ゲノミック）
(xi) 配列:配列番号: 2:
0004446603.tif 000006
(2) 配列番号: 3についての情報:
(i) 配列の特性:
(A) 配列の長さ: 24
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: DNA（ゲノミック）
(xi) 配列:配列番号: 3:
0004446603.tif 000007
(2) 配列番号: 4についての情報:
(i) 配列の特性:
(A) 配列の長さ: 24
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: DNA（ゲノミック）
(xi) 配列:配列番号: 4:
0004446603.tif 000008
(2) 配列番号: 5についての情報:
(i) 配列の特性:
(A) 配列の長さ: 21
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: DNA（ゲノミック）
(xi) 配列:配列番号: 5:
0004446603.tif 000009
(2) 配列番号: 6についての情報:
(i) 配列の特性:
(A) 配列の長さ: 24
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: DNA（ゲノミック）
(xi) 配列:配列番号: 6:
0004446603.tif 000010
(2) 配列番号: 7についての情報:
(i) 配列の特性:
(A) 配列の長さ: 21
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: DNA（ゲノミック）
(xi) 配列:配列番号: 7:
0004446603.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＣＹＰ３Ａ４遺伝子のＸＲＥＭ領域の配列を示す。
【図２】  生体異物応答要素を限定するために用いられるＣＹＰ３Ａ４遺伝子の５′フランキング領域の一連の欠失構築物の例を示す。
【図３】  強力なＣＹＰ３Ａ４誘導物質（５μＭリファンピシン）の存在下又は不在下での、ＣＹＰ３Ａ４  ＸＲＥＭレポーター構築物を含むＨｅｐＧ２細胞に対するｈＰＸＲ発現ベクター（ｐＳＧ−ｈＰｘＲ）のコトランスフェクションの影響を示す。
【図４】  ビークル（ジメチルスルホキシド）０．１％単独と比較したｈＰＸＲ発現ベクター及びＣＹＰ３Ａ４  ＸＲＥＭレポーター構築物を含むＨｅｐＧ２細胞に対する様々な誘導医薬の影響を示す。
【図５】  ５μＭリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ４の５′フランキング領域の転写誘導に対する推定的核内受容体応答要素の欠失又は部位特異的突然変異誘発の影響を示す。
【図６】  生体異物がＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写活性化を誘導する能力を測定するための、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｌｕｃ）に結合されたＣＹＰ３Ａ４の最適化された５′フランキング領域構築物を示す。
【図１】
0004446603.tif 000012
【図２】
0004446603.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
0004446603.tif 000016
【図６】
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