(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌自己誘発因子不活化タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、
ａ）配列番号１のコード部分の配列を有する核酸、および
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸、
よりなる群から選ばれる核酸分子。
【請求項２】
シグナルペプチド・コード領域をもさらに含む、請求項１の分子。
【請求項３】
真核細胞または原核細胞中で増殖する、請求項１の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項３の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた真核または原核の細胞。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、細菌自己誘発因子不活化活性を有する単離されたタンパク質。
【請求項６】
植物または非ヒト動物の疾病耐性を増加するための組成物であって、請求項３の発現ベクターを含む組成物。
【請求項７】
発現ベクターがシグナルペプチド・コード領域をもさらに含む、請求項６の組成物。
【請求項８】
発現ベクターが膜結合ドメイン−コード領域をさらに含む、請求項６の組成物。
【請求項９】
植物が細菌性軟腐病に感受性である、請求項６の組成物。
【請求項１０】
植物がジャガイモ、ナスビ、ハクサイ、ニンジン、セロリよりなる群から選ばれる、請求項９の組成物。
【請求項１１】
植物が細菌性疾病に感受性であり、この毒性遺伝子の発現がＮ−アシルホモセリンラクトン自己誘発因子により調節される、請求項６の組成物。
【請求項１２】
植物または非ヒト動物の細菌性障害を防止または減少するための組成物であって、下記：
ａ）有効量の請求項１の核酸分子によりコードされる細菌自己誘発因子不活化タンパク質、
ｂ）適当な担体、
を含む組成物。
【請求項１３】
タンパク質が配列番号２の配列を含む、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
請求項１の核酸分子を含有する細菌単離体を選別するための方法であって、下記：
ａ）土壌または植物サンプルから単一のコロニー細菌性培養物を単離すること、
ｂ）自己誘発因子不活化活性について培養物をスクリーニングすること、
ｃ）培養物から粗製のタンパク抽出物を作成すること、
ｄ）粗製のタンパク抽出物による自己誘発因子活性の酵素的不活化を確認すること、および
ｅ）培養物が請求項１の核酸分子を含有するか否かを決定すること
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１の核酸分子を単離する方法であって、下記の工程：
ａ）適当な宿主生物中に請求項１の核酸分子を含有するドナー生物から遺伝子バンクを作成すること、
ｂ）遺伝子バンクのクローンをスクリーニングすること、
ｃ）請求項１の核酸分子を含有するクローンを単離すること、
を含む方法。
【請求項１６】
大腸菌（E. coli) を宿主生物として使用する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
遺伝子バンクを作成し、クローンを選別し、クローンを単離する工程が、自己誘発因子を不活化しない大腸菌株中で行われる、請求項１６の方法。
【請求項１８】
下記：
ａ）請求項３の発現ベクターを細菌細胞中に導入すること、
ｂ）工程ａ）から得た細菌細胞を、変化した生物機能についてスクリーニングすること、
を含む方法。
【請求項１９】
変化した生物機能が、工程ａ）の結果として消失された機能である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
変化した生物機能が、工程ａ）の結果として抑制された機能である、請求項１８の方法。
【請求項２１】
変化した生物機能が、工程ａ）の結果として高められた機能である、請求項１８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願との相互参照は適用なし。
連邦政府によって後援された研究または開発に関する事項は適用なし。
。
【０００２】
（発明の背景）
１.発明の分野
本発明は、細菌病原性遺伝子の包括的な調節因子および疾病耐性を付与するためのその使用に関する。
２.関連技術の説明
引用文献は、本発明の詳細な説明の最後に随伴する。列挙した参考文献は、出典明示により本発明の一部とする。
小さいシグナル分子を介する細胞間伝達は、多細胞生物、例えば動物および植物にとって命にかかる重要なものだけでなく、また、細菌のような単細胞生物群の中でも共配列において、重要な役割を果たす。ここ数年間の急速な進歩により、自己誘発因子(ＡＩ)として知られているＮ-アシル-ホモセリンラクトンが、グラム陰性細菌において、広範囲に保存されているシグナル分子であると明らかになった。ＡＩは、海洋性細菌 Vibrio種で生物発光の調節について、初めて発見されたものである (Eberhard, et al., 1981; Cao and Meighen, 1989)。近年、ＡＩは広範なグラム陰性細菌で同定された。現在までに明かにされてきたことによると、ＡＩは、Agrobacterium tumefaciensにおけるＴiプラスミドの接合転写を含む生物学的機能の範囲に関する調節 (Zhang, et al., 1993)、Erwnia catorovora, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia stewartii, Xenorhabdus nematophilus, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacerumおよびXanthomonas campestrisにおける毒性遺伝子の誘導 (Jones, et al., 1993; Passador, et al., 1993; Pirhonen, et al., 1993; Pearson, et al.; 1994; Beck von Bodman and Farrand, 1995; Barber, et al.; 1997; Clough, et al., 1997; Costa and Loper, 1991; Dunphy, et al., 1997; Nasser, et al., 1998)、Pseudomonas aureofaciensおよびErwinia carotovoraにおける抗菌性物質産生の調節(Pierson, et al., 1994; Costa and Loper, 1997)、Serratia liquifaciensにおける遊走運動性の調節 (Eberl, et a1., 1996)、そしてPseudomonas fluorescensおよびP. aeruginosaにおけるバイオフィルムの形成(Allison, et al., 1998; Davies, et al., 1998)に関与する。 非常に多くの細菌種がＡＩを産生することは知られているが、関連する生物学的機能はまだ確立されていない (Bassler, et al., 1997; Dumenyo, et al., 1998; Cha, et al., 1998)。
【０００３】
異なる細菌の種類は異なるＡＩを産生する。全てのＡＩ誘導体は、同一のホモセリンラクトンの成分（構造体）を共有するが、そのアシル基の長さおよび構造において異なる。ＡＩ介在遺伝子調節系における鍵となる成分は、ＬuxＩおよびＬuxＲ型のタンパク質である。現在までに、ＬuxＩ型タンパク質が基質としてアシル-ＡＣＰおよびＡdoＭet(Ｓ-アデノシルメチオニン)を利用する自己誘発因子シンターゼとして働くことが確立された(More, et a1., 1996; Schaefer, et al., 1996)。ＬuxＲ型タンパク質は、ＡＩおよびｌuxプロモータのすぐ上流のＤＮＡに結合するＡＩ依存性転写調節因子についての両方の受容体であると考えられている (Meighen, 1994; Sitnikov, et a1., 1995)。２０個のヌクレオチドの逆転した繰返しが同定され、これは発光オペロンの転写開始部位の４４個のヌクレオチド上流に中心的位置を占めていた。ｌux ボックスと呼ばれるこの配列は、ＬuxＲによる転写活性化に必要であり、おそらくＬｕｘの結合部位である(Fuqua, et al., 1994)。類似の１８個の塩基の tra ボックスが、少なくとも３つのＴraＲ調節プロモーターの上流で見出されており、これらの配列の崩壊はＴraＲによる転写活性化を失わせる(Fuqua and Winans, 1996a)。
【０００４】
ＬuxＲ型タンパク質は、２つのモジュールからなると考えられる(Choi and Greenberg, 1991; Hanzelka and Greenberg, 1995)。 それらのカルボキシル（Ｃ）末端領域は、保存性の短い配列である１９個のアミノ酸、即ち推定プローブ型のヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを含有し、標的プロモーターへの結合に関与すると予想されている。 活性化の一般的機構は、ＬuxＲ型タンパク質のＮ末端ドメインが、そのＣ末端ドメインと標的ＤＮＡ結合部位との間の相互作用を防ぐように作用すると提唱されている。この阻害は、自己誘発因子リガンドの作用によって緩和され得る。一つの強い証拠は、ＬuxＲのＮ末端ドメイン部分での欠失がｌux Ｒの構造的活性アレイを生じ、一方で予想したＤＮＡ結合ドメイン部分を削除する大きな欠失により、転写活性化が失なわれることである(Choi and Greenberg, 1991)。しかし、別の群は、異なる機構を使用する可能性がある。最近の遺伝子研究によると、ＥsaＲおよびＥxpＲが、活性化因子としてよりもむしろそれらの標的遺伝子の抑制因子らしい。saＲおよびＥxpＲにより抑制される遺伝子発現が、自己誘発因子によって増加する(Beckvon Bodman and Farrand 1995; Throup, et al. 1995)。これらタンパク質がプロモーター領域の標的部位に結合することにより抑制を起し、それによって自己誘発因子リガンドが作用し、結合親和性を低下させるらしい。
【０００５】
自己誘発因子結合部位がＬuxＲタンパク質のアミノ酸末端ドメインにあるという証拠が提示された(Hanzelka and Greenberg, 1995)。アミノ酸末端領域を変異させたＬuxＲアレイは、野生型でおこるこのシグナルのより高いレベルを必要とし、これにより領域がリガンド相互作用に必要であることを示している(Slock, et a1., 1990; Shadei, et al., 1990)。この領域(aa 79-127)およびＤＮＡ結合ドメイン内の領域(aa 180-230)は、これらポリペプチドの別の部分よりもＬuxＲおよびそのホモログの中で保存性が高い(約５０％同一性)ことを示している。しかし、ＬuｘＲと自己誘発因子とのタンパク質−リガンド相互作用はいまだ証明されていない。野生型および変異体ＬuxＲアレイを含む部分二倍体 E. coli株の分析からの示唆によると、ＬuxＲはホモマルチマーとして機能すること、そしてそのマルチメライゼーションに必要とされる領域はアミノ酸残基１１６および１６１残基内にある(Choi and Greenberg, 1992)。
【０００６】
ひとつの態様において、本発明は、細菌自己誘発因子不活化タンパク質をコードする単離核酸分子に関する。
【０００７】
他の態様において、本発明は、細菌自己誘発因子不活化タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。発現ベクターは原核細胞または真核細胞中で増殖する。
【０００８】
また他の態様において、本発明は、本発明の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた原核細胞または真核細胞に関する。
【０００９】
また他の態様において、本発明は、細菌自己誘発因子不活化活性を有する単離されたタンパク質に関する。このタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
また他の態様において、本発明は、植物または動物での疾病耐性を増加せしめる方法に関する。この方法は、細菌自己誘発因子不活化タンパク質をコードする核酸分子を該植物または動物の細胞に導入し、該細胞が該核酸配列を発現するようにすることを含む。
【００１１】
また他の態様において、本発明は、植物または動物に対する細菌性傷害を防止または減少する方法に関する。この方法は、該防止または減少を必要とする植物または動物に、有効量の細菌自己誘発因子不活化タンパク質を投与することを含む。
【００１２】
また他の態様において、本発明は、植物または動物に対する細菌性傷害を減少せしめる組成物に関する。この組成物は下記を含む。
ａ）有効量の細菌自己誘発因子不活化タンパク質、および
ｂ）適当な担体。
【００１３】
（図面の説明）
図１は、Bacillus sp. 株２４０ＢＩからの細胞抽出物によるＡＩ不活性化の時間経過を示す。１００μｇの全タンパク質を含有する細胞抽出物の０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）を、ＯＨＨＬを含有する同じ緩衝液に、最終濃度２０μＭとして加えた。１.５ｍｌエッペンドルフ遠心管中で最終容量２００μｌで反応せしめ、２８℃でインキュベートした。同じ濃度のＯＨＨＬリン酸緩衝液を対照として用いた。サンプルを１０分間隔で６０分間採取し、３分間煮沸して反応を停止した。サンプルの遠心を５分間ベンチトップ遠心器で最高速度で行い、（Zhang, 1993)に記載のようにＡＩ活性について調べた。青いコロニーが lacZ レポーター遺伝子を活性化するＡＩの存在を表し、白いコロニーがＡＩの不存在を表す。列中、左から右に、１がタンパク質抽出物のないＯＨＨＬ対照、２−７が１０、２０、３０、４０、５０、６０分の酵素反応後のサンプルである。
【００１４】
図２は、ＡＩ不活性化酵素の分子質量についての評価を示す。６００μｌアリコットの細胞抽出物を Centricon 30 (Amicon) に入れ、速度５０００ｘｇで３０分間４℃で遠心分離した。通過フラクション（５５０μｌ）および非通過フラクション（５０μｌ）に別個に、最終容量６００μｌまで０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）を加えた。バイオ検定のために、異なる量のタンパク質サンプルをＯＨＨＬ含有の管に最終濃度２０ｕＭで加えた。列中、１−６は、加えたタンパク質サンプルが２、４、６、８、１０および０μｌであって、最終反応量が各反応につき２０μｌである。プレートＡは通過フラクション、プレートＢは非通過フラクションである。
【００１５】
図３は、Bacillus sp.株２４０Ｂ１ ＡＩ不活性化領域についてのクローニングおよび欠失の分析を示す。欠失分析のために、同じ断片をクローニングベクター pGEM‐7Zf(+) にクローンＥ７−７の生成のためにクローニングした。欠失サブクローンの産生を制限酵素消化およびクローンＥ７−７からの Dnase I 処置により行った。コスミド中の Ptac プロモーターの位置および方向を矢印で表示する。クローンのＡＩ不活化活性を第２列に示す。すなわち、＋：ＡＩ不活化活性あり、−：ＡＩ不活化活性なし。制限酵素：E, EcoRI; H, HindIII; Ev, EcoRV; St, StyI。ａｉｉＡ ＯＲＦ の転写の位置および方向を白い矢印で表示する。
【００１６】
図４Ａは、ａｉｉＡ 遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号１)。潜在性リボソーム結合配列および−１０プロモーターエレメントにそれぞれ下線およびニ重下線を引いてある。推測の因子独立性終了部位を太い下線で示した。図４Ｂは、ａｉｉＡ 遺伝子産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号２)。アスパルチルプロテアーゼ活性部位共通モチーフに類似の短いペプチド配列に下線を引いてある。
【００１７】
図５は、ａｉｉＡ 遺伝子産物（ＡｉｉＡ) の共通アスパルチルプロテアーゼ活性部位モチーフ（Ａｓｐ）に対するアミノ酸配列の最良対合を示す。記号：ｘ、なんらかのアミノ酸。垂直線は完全な対合を示す。
【００１８】
図６は、Bacillus sp. 株２４０Ｂ１のＡＩ不活化活性、E.coli クローン、Erwinia carotovora 株におけるＡＩ産生活性を示す。列１、OHHL 対照; 列２、Bacillus sp.株240BI; 列３、E. coli DH5α; 列４、E. coli DH5α (pE7-R3); 列５、E. coli DH5α (pF41); 列６、Erw. carotovora SCGl(pE7R3); 列７、Erw. carotovora SCGl(pLAFR3); 列８、Erw. carotovora SCG1。バイオアッセイにおいて、OHHL を最終濃度２０μＭに列１−５のサンプルに加えた。非外因性ＡＩを列６−８のサンプル に加えた。
【００１９】
図７は、（Ａ）ジャガイモ、（Ｂ）ナスビ、（Ｃ）ハクサイ、（Ｄ）ニンジン、（Ｅ）セロリにおける病原に対する Erw. carotovora での ａｉｉＡ 遺伝子発現の作用を示す。上部：Erw. carotovora SCGlとともにインキュベートした植物組織。下部：Erw. carotovora SCGl (pE7-R3) とともにインキュベートした植物組織。活性的に成長する細菌を１分間３０００ｘｇで遠心し、ＹＥＢ液体培地でＯＤ６００＝１.３（２ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌ）に再懸濁し、１００接種物とした。１００接種物を５倍および１０倍に稀釈し、それぞれ１０−１／２および１０−１稀釈物を作った。植物組織の接種を、４μｌの細菌接種物を新たに切断の表面およびピペットチップで孔を開けた損傷部位に加えて行った。接種物の濃度はプレートの左から右へ：１００、１０−１／２、１０−１である。接種した植物組織をプラスチックのプレートに入れ、２８℃でインキュベートした。接種４８時間後に撮影した。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、配列番号２のタンパク質が細菌自己誘発因子（ＡＩ）の活性を減少または消失せしめる作用を有するとの発見に基づいている。すなわち、このタンパク質およびそれをコードするいかなる核酸も、該細菌の作用を減少または消失せしめたい種々の状態において使用できる。
【００２１】
ひとつの好ましい態様において、本発明は、下記よりなる群から選ばれる核酸分子を提供する。
ａ）配列番号１を有する核酸、
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸、
ｃ）上記ａ）またはｂ）にハイブリドする核酸。陽性のハイブリド形成シグナルを、５５℃で１時間１ｘＳＳＤおよび０.１％ＳＤＳで洗浄後に認める。核酸は選択的に、いかなる配列についてのシグナルペプチドコード領域も含む。
【００２２】
核酸配列を用いて、植物または動物中の細菌耐性を付与できる。細菌自己誘発因子不活化タンパク質をコードする核酸を、植物または動物が不活化タンパク質を発現するように、細胞中に導入できる。
【００２３】
核酸配列を用いて、自己誘発因子により病原性遺伝子の発現が調節される疾病に対する耐性を付与できる。例えば、疾病は次のものにより生じる。Pseudomonas aeruginosa、Erwinia stewartii、Xenorhabdus nematophilus、Erwinia chrysanthemi、Pseudomonas solanacerum、Xanthomonas campestris (Passador, et al., 1993; Pirhonen, et al., 1993; Pearson, et al., 1994; Beck von Bodman and Farrand, 1995; Barber, et al., 1997; Clough, et al., 1997; Costa and Loper, 1997; Dunphy, et al., 1997; Nasser, et al., 1998)。好ましくは、農作環境において、配列を用いて、ジャカイモ、ナスビ、ハクサイ、ニンジン、セロリなどの感受性ある植物における軟腐病に対する耐性を付与できる。
【００２４】
配列の植物または動物細胞への導入は、既知方法で行い得る。外因性核酸配列による真核細胞の形質転換またはトランスフェクションの方法には、Agrobacterium tumefaciens によるトランスフェクション法、投射衝撃法、エレクトロポレーション法、感染法がある。これらの方法は、分子生物学およびバイオテクノロジーの分野での専門家によく知られており、ここで詳細に説明する必要はないであろう。病原性細菌細胞は植物組織の細胞間に閉じ込められており、ＡｉｉＡタンパク質を細胞間への標的にするのが望ましい。このことは、分泌シグナルペプチドをＡｉｉＡタンパク質に融合せしめることで行い得る(Sato, et al., 1995; Firek, et al., 1993; Conrad and Fiedler, 1998; Borisjuk, et al., 1999)。あるいは、植物膜結合モチーフをＡｉｉＡのペプチド配列中に組込んで、ＡｉｉＡ酵素を植物細胞膜の外表面に固定せしめ得る。
【００２５】
本発明は、疾病に対する耐性をつくるための戦略を提供する。この戦略は、多くの細菌性病原体の病原性遺伝子の発現を閾値濃度で誘発するＮ-アシルホモセリンラクトン自己誘発因子を標的とする。この戦略が適用可能なのは、細菌性病原体の病原性遺伝子の発現がＮ-アシルホモセリンラクトン自己誘発因子により誘発され得るようなすべての植物、動物、哺乳動物の疾病についてである。
【００２６】
本発明はまた、細菌自己誘発因子不活化タンパク質を細菌性傷害の治療または予防に直接使用することを含む。例えば、このタンパク質は、該治療や予防を必要とする植物に直接的に適用できる。好ましい実施態様において、タンパク質は、有効量のタンパク質および適当な担体を含む組成物の形態で適用する。組成物は多種の形態を有する。例えば、溶液、粉末、エマルション、分散剤、パスタ、エアゾルなどである。
【００２７】
細菌自己誘発因子不活化タンパク質は、ヒトを含む動物における細菌感染の処置のために使用できる。この適用にあっては、有効量の活性成分を該処置を必要とする動物に投与する。
【００２８】
医療的処置のために、活性成分を医薬組成物に製剤できる。この組成物は、有効量の活性成分以外に、薬学的に許容される担体、稀釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性剤などを含む。組成物は、必要または所望により、１以上の他の活性成分を含有し得る。
【００２９】
本発明の医薬組成物は当業者に明らかな多くの方法により投与できる。例えば、局所的、経口的、吸入的、非経口的に投与できる。
【００３０】
局所製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、粉末などがある。経口製剤には、粉末、顆粒、水または非水媒体の懸濁液や溶液、カプセル、錠剤などがある。賦形剤、香料、稀釈剤、乳化剤、分散補助剤、結合剤などを必要に応じて使用し得る。
【００３１】
非経口製剤には、緩衝剤、稀釈剤、他の適当な助剤も含有することのある無菌水溶液などがある。
【００３２】
用量は、容易に決定できる多くの因子によって異なり得る。例えば、処置しようとする重篤度および応答性などによる。
【００３３】
本発明の態様を、下記の非限定的実施例を参照して明らかにする。
【００３４】
実施例１
細菌単離体２４０Ｂ１を、Ｎ−β−オキソ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリン ラクトン(ＯＨＨＬ)およびＮ−β−オキソオクタノイル−Ｌ−ホモセリン ラクトン(ＯＯＨＬ)およびＮ−β−オキソデカノイル−Ｌ−ホモセリン ラクトン(ＯＤＨＬ)を不活性化する機能に基づいて、土壌懸濁液から単離した(Zhang, et al., 1993)。特記しない限り、ＯＨＨＬを慣用のバイオアッセイで使用した。Erwinia carotovora SCG1株を、軟腐病の徴候を示す白菜の葉から単離した。SCG1株はＡＩを産生し、ジャガイモおよび白菜における軟腐病を顕在化させることが確認されている。Escherichia coil DH5α株をＤＮＡクローニングおよびサブクローニングの宿主として使用した。Agrobacterium tumefaciens NT1株(traR; tra::lacZ749)を、ＡＩ活性のバイオアッセイにおける指標として使用した(Piper, et al., 1993)。E. coli株をLuria-Bertani(LB)培地中で３７℃で培養し、他の株は、ＬＢ培地(Miller, 1972)またはＹＥＢ培地(１Ｌあたり:カゼイン水解物 10 g、酵母抽出物 5 g、NaCl 10 g、スクロース 5 g、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ 0.5 g、寒天 15 g含有、pH 7.2)中、２８℃で培養した。炭素および窒素源としてマンニトールおよび(ＮＨ４)２ＳＯ４の入った最小培地を、ＯＨＨＬのバイオアッセイに使用した(Petit and Tempe, 1978)。適当な抗体を以下の濃度になるように添加した：アンピシリン １００μg/ml; テトラサイクリン ２０μg/mlおよびカナマイシン ５０μg/ml。
【００３５】
ＡＩ活性のバイオアッセイ
ＡＩ活性の検定のための定性および定量バイオアッセイが、以前より記載されている(Zhang、1993)。野生型および遺伝的に修飾されたErwinia株のＡＩ産生能力を検定するため、ＯＨＨＬを細菌培養物に添加しないことを除いて、同一のバイオアッセイの手順を使用した。
【００３６】
ＡｉｉＡ遺伝子のクローニングおよび配列決定
２４０Ｂ１由来のゲノムＤＮＡをEcoRIで部分的に消化した。ＤＮＡフラグメントをコスミドベクターpLAFR3の脱リン酸化EcoRIとライゲーションさせた(Staskawicz, et al., 1987)。ライゲーションしたＤＮＡをGigapack III XL Packaging Extract(Stratagene)に入れ、E. coil DH5αにトランスフェクションさせた。ＯＨＨＬ不活性化能を有するコスミドクローンを、上記のバイオアッセイ法を用いることにより同定した。シーケンスベクターpGEM-7Zf(+)とのサブクローニングを慣用技術(Sambrook, et al., 1989)により実施した。欠失解析を、Linら(1985)により記載されたDnaseI法を用いることにより実施した。配列決定を、ABI PRISM(商標) dRhodamineターミネーター・サイクルシーケンス法・簡易キット(Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(PE Applied Biosystems)を用いて、両方の鎖に対して行った。核酸配列のデータおよび推定アミノ酸配列を、DNASTAR(商標)シーケンス・アナリシス・ソフトウエア・パッケージ(sequence analysis software package)(DNASTAR Inc.)で解析し、データベース検索を、BLASTA search algorithm(Altschul, et al., 1990)を用いて行った。
【００３７】
Erwinia SCG1株の遺伝的修飾
コスミドベクターpLAFR3中のａｉｉＡ遺伝子を運ぶE7-R3プラスミドを、ヘルパーRK2013株と共に三つ親接合(triparental mating)法によりErwinia SCGl株に導入した(Ditta, et al., 1980)。得られた転換体を、テトラサイクリンを有する最小培地を含むプレート上で選別し、ＰＣＲ法により、ａｉｉＡ遺伝子に特異的なプライマーを用いて確認した。
【００３８】
毒性試験
野生型Erw. carolovora SCG1株およびａｉｉＡ遺伝子で形質転換したSCG1(E7-R3)の毒性を評価するために接種した。４μlの初期定常期の細菌懸濁液(１mLあたり2 x 109個までの細胞を含む)または希釈した細菌を植物組織の切断表面または損傷部位に添加した。感化した植物組織をペトリ皿で２８℃にて一夜インキュベートした。軟腐病の重症度をインキュベーション４８時間後に試験した。
【００３９】
結果
ＡＩを不活化する細菌のスクリーニング
植物および土壌サンプル由来の細菌単離株をＡＩの酵素的不活化についてスクリーニングした。細菌単離株２４０Ｂ１（ＡＩ活性を消失する強力な能力を示した）を、さらなる研究のために選抜した。単離株２４０Ｂ１由来の全タンパク質抽出物は、１時間のインキュベーション中にＡＩ活性を完全に無くし（図１）、タンパク質抽出物がＡＩを不活化する能力は、プロテイナーゼＫによる１時間の処理または５分間の煮沸によって除去された。これらの観察結果は、細菌単離株２４０Ｂ１によるＡＩの酵素的不活化を示している。この単離株は、次の特徴により分類学的にBacillus sp.に分類される。すなわち、グラム陽性、桿菌形態、カタラーゼ陽性、条件嫌気性および他のBacillus細菌との１６のｒＲＮＡ配列相同性である（データーは示さず）。
ＡＩの不活化のための酵素の分子量は、３０ｋＤａより大きいようである。その活性は、タンパク質抽出物のCentricon 30(Amicon)通過後に失われた。しかし、その活性はCentricon 30を通過しなかった再懸濁フラクションにおいて回復した（図２）。
【００４０】
ＡＩ不活化領域のクローニングおよび位置決定
ＡＩ不活化をコードしている遺伝子を同定するために、コスミドライブラリーをListera sp.  ２４０Ｂ１株のゲノムＤＮＡで構築した。１２００のクローンをＡＩ不活化活性についてスクリーニングした。ＡＩ不活化機能を示す３つのクローンを同定した。制限分析によれば、ＥｃｏＲＩ消化によって生成した４．３ｋｂの１つの共通のバンドがあった。この４．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むサブクローンＥ７−７によるバイオアッセイによって、断片がＡＩ不活化機能をコードしているのを確認した（図３）。ＡＩ不活化遺伝子（ａｉｉＡ）の最小サイズおよび位置を同定するために、一連の欠失クローンを、この４．３ｋｂ断片の両末端からの欠失によって、ＤＮａｓｅＩ法（Lin, et al., 1985）で生成した。結果によると、ａｉｉＡ遺伝子がクローンＦ４１において１．２ｋｂ断片を含む（図３）。
【００４１】
ＡｉｉＡ遺伝子は新規なタンパク質をコードしている
クローンＦ４１の１．２ｋｂのＤＮＡ挿入物を、両方の鎖から完全に配列決定した。ａｉｉＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図４に示す。該ＤＮＡ挿入物の完全な配列は、１２２２塩基対を含み、これらは４つの可能なインフレームなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、それぞれ１、４２、１５６および２２８位のヌクレオチド位置から開始するものを含む（図４）。欠失分析によると、最長のＯＲＦのみがＡＩ不活化機能をコードしている。なぜなら、クローンＲ３４（４８ｂｐのプロモーター領域および最長のＯＲＦにおけるヌクレオチド１ないし１３が欠失していた）は、残りのＤＮＡ挿入物が機能性Ｐｔａｃプロモーターの制御下にあったにもかかわらず、ＡＩ不活化機能を完全に喪失していたからである（図３）。このことは、最長のＯＲＦを同じＯＲＦのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子に融合し、精製された融合タンパク質のＡＩ不活化活性を試験することによって確認される（データーは示さず）。このＯＲＦは７５０ｂｐヌクレオチドを含み、２５０アミノ酸のタンパク質をコードし、このタンパク質は２８,０３６ダルトンの推定分子量および４．７の等電点を有する。なぜなら、１９の強い塩基性および３９の強い酸性のアミノ酸残基を有するからである。可能なリボゾーム結合配列（ＡＡＧＧＴＧＧ）（E. coli  １６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端と相補的である）は、７ｂｐの間隔で該推定開始コドンに先行する。共通−１０プロモーターエレメント（ＴＡＴＡＡＴ）に対する最良の配列対合部（ＴＡＴＴＧＴ）は、開始コドンの３５ｂｐ上流に存在する。可能な因子独立性終了部位に似るＴに富む領域に続くＴＣＴＴボックスは、終結コドンの下流に見出される(Brendel, 1986)。ａｉｉＡ遺伝子の全ＧＣ含量は３７％であり、該コドンの第３の位置のＧＣ含量は２７．２％である。
【００４２】
データーベースを調査し、ヌクレオチドまたはペプチド配列レベルにおけるＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ分析によれば、ａｉｉＡ遺伝子は主要なデーターベース（Genbank、European Molecular Biology Laboratory、Protein Information Resource、およびSwiss-Prot）における既知の配列と有意な類似性がなかった。これはＡｉｉＡが新規タンパク質であることを示唆する。Gentics Computer Group（Madison, WI）MOTIFプログラムを使用する共通タンパク質モチーフサーチによると、短いペプチド配列、すなわちＡｉｉＡにおける４７ないし５８位の「ILVDTGMPESAV」は、アスパルチルプロテアーゼ活性部位典型パターン(Rawlings and Barrett, 1995)に類似するが同一ではない（図５）。
【００４３】
Erwinia carotovoraにおけるａｉｉＡ遺伝子の発現は、ＡＩ放出を減少させ、病原性を弱める
コスミドクローンＥ７−Ｒ３をErwinia carotovora  ＳＣＧ１株に三つ親接合法によって送達した。該ｐＬＡＦＲ３ベクターは選択圧なくErwinia carotovoraに安全に維持される。バイオアッセイによれば、Erwinia carotovora（Ｅ７−Ｒ３）によって放出されたＡＩは有意に減少し（図６、レーン６）、一方、Erwinia carotovoraにおけるコスミドベクターｐＬＡＦＲ３のみの存在によってはＡＩ生産に影響がなかった（図６、レーン７）。データーは、Erwinia carotovora  ＳＣＧ１株によって生産されたＡＩの殆どがａｉｉＡ遺伝子産物によって不活化されたことを示唆している。
【００４４】
ＡｉｉＡタンパク質を発現するErwinia carotovora  ＳＣＧ１（Ｅ７−Ｒ３）は、ジャガイモ、ナス、ハクサイ、ニンジンおよびセルリーの軟腐病を発生させないか、軽微な病徴のみであり、一方、その親株は重度な病徴を発生させた（図７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。遺伝的変異に起因する実験誤差を防止するため、Erwinia carotovora  ＳＣＧ１株およびそのａｉｉＡ遺伝子形質転換体に由来のそれぞれ４つのコロニーを、ＡＩ生産およびジャガイモへの病原性を試験するために無作為に選択した。両方の実験で同様の結果が得られた。コスミドベクターを有するErwinia carotobora  ＳＣＧＩ株（ｐＬＡＦＲ３）は、親株Erwinia carotovora  ＳＣＧＩ株と同じレベルの病害重度を発生させたのみであった（図７Ｆ）。
【００４５】
考察
Bacillus sp.として同定された細菌性単離体２４０Ｂ Ｉは、試験された３つのＡＩを有効に不活化し得る酵素を産生する。この３つのＡＩは、Ｎ−β−オキソ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−β−オキソ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンおよびＮ−β−オキソ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンＡＩである。不活化酵素をコードする遺伝子(ａｉｉＡ)をクローニングし、完全に塩基配列を決定した。形質転換E. coliおよび病原性細菌Erwinia carolovora内のａｉｉＡ遺伝子の発現は、ＡＩ不活化能を供与し、Erwinia carolovoraからのＡＩ放出を有意に減少する。我々の理解するところでは、このものは、Ｎ−アシル−ホモセリンラクトン、すなわち、種々の細菌種の総括的遺伝子調節についての自己誘発因子を酵素的に不活化し得る最初に同定されたタンパク質である。
【００４６】
ＡｉｉＡは新規タンパク質である。主要なデータベースでの既知タンパク質との有意な相同性はなかった。アスパルチルプロテアーゼ活性部位の共通パターンが類似する(Rawlings and Barret, 1995)。アスパルチルプロテアーゼはまた、酸プロテアーゼとしても知られ、脊椎動物、真菌類、植物、レトロウイルスおよび幾つかの植物ウイルスに広く分布している。殆どのレトロウイルスおよび幾つかの植物ウイルス由来のアスパルチルプロテアーゼは、ホモダマーである。ＡｉｉＡタンパク質の分子質量は、約２８ｋＤａであるが、３０ｋＤａの大きさを通さない分子篩を通過しない。これは、ＡｉｉＡタンパク質が天然条件下、ホモダイマーまたはホモマルチマーとして存在することを示す。しかし、また、ＡｉｉＡモノマーが、分子篩の通過を妨げる変則の３次元構造を有する可能性もある。アスパルチルプロテアーゼは、エンドペプチダーゼであり、タンパク質のアミド連結を加水分解する。結晶学的研究は、アスパルチルプロテアーゼファミリーの酵素が、ローブ(lobe)間に活性部位間隙が位置する分子を二裂することを示し、この場合、各ローブは、触媒活性に応答するアスパラギン酸残基対の１つを提供する(Sielecki et al., 1991)。
【００４７】
Erwinia carotovoraは、ジャガイモ、キャベツ、トマト、シマトウガラシ、ニンジン、セロリ、タマネギおよびレタスを含む種々の植物の軟腐病の有毒性決定因子として作用する外酵素を産生し分泌する植物病原体である(Kotoujansky, 1987)。
【００４８】
Ｎ−３−(オキソヘキサノイル)−Ｌ−ホモセリンラクトンの産生欠損の変異体はまた、ペクチナーゼ、セルラーゼおよびプロテアーゼ外酵素の合成を欠損している。これら変異体は、ジャガイモの塊茎で軟腐病を誘発しない(Jones, et al., 1993)。Vibrio fischeriのｌｕｘＩ遺伝子に相同なｅｘｐＩ遺伝子がErwinia carotovora内での自己誘発因子の産生をコードすることが判明した。ｅｘｐＩ変異体はタバコの葉に接種されると無毒となるが、毒性は外部自己誘発因子の添加により保持された(Pirhonen, et al., 1993)。明らかに、自己誘発因子は、植物の軟腐病耐性の遺伝子工学において可能性ある標的である。予備的実験および概念証明手段として、ａｉｉＡ遺伝子を含むコスミドクローンを、Erwinia carotovora株ＳＣＧ１に導入した。Erwinia carotovora内のＡｉｉＡ酵素の発現は、自己誘発因子の放出を有意に減少させた。ＡｉｉＡを発現した遺伝学的修飾Erwinia carotovoraはジャガイモ、ナス、ハクサイ、ニンジンおよびセロリを含む試験したすべての植物において軽症の軟腐病徴候をのみを誘発するか全く誘発しなかった。我々の結果は、Erwinia carotovora内の毒性遺伝子の発現の調節において自己誘発因子が重要な役割をすること、および自己誘発因子が病原性遺伝子発現の調節に関与している軟腐病および他の疾病に対する耐性を、ａｉｉＡ遺伝子が供与する可能性があることを更に支持する。
【００４９】
本発明は、疾病に対する耐性を工作するための新規ストラテジーを提供する。好ましくは、このストラテジーは、閾値濃度で多くの細菌性病原体の病原性遺伝子の発現を誘導するＮ−アシル−ホモセリンラクトン自己誘発因子を標的とする。上記の概念証明手段を用いることにより、本発明は、自己誘発因子不活化酵素により病原性細菌から産生される自己誘発因子の減少または除去が、他の毒性細菌性病原体の病原性を有意に減弱することを示す。病原性細菌内の病原性遺伝子の発現が閾値濃度を必要とするため、細菌性病原体の病原性遺伝子の発現がＮ−アシルホモセリンラクトン自己誘発因子により誘導される場合、ＡＩ不活化ストラテジーは、すべての植物、動物または哺乳類疾患に適用可能である。
【００５０】
ａｉｉＡ遺伝子はまた、ＡＩにより調節される生物学的機能が確立していない場合、細菌のＡＩの役割の検査に有用な手段となり得る。近年、より多くの細菌種がＡＩを産生することが示されている(Bassler, et al., 1997; Dumenyo, et al., 1998; Cha, et al., 1998; Surette, et al., 1999)。これらの幾つかは、PsendomonasおよびXanthomonasのような重要な植物病原体である。塩基配列相同性に基づく遺伝子ノックアウトアプローチは難しいであろう。ＡＩシンターゼおよび異種種族からの関連調節タンパク質の配列類似性の全体レベルは、相当に低く、しばしば、ＬｕｘＩ型タンパク質の間では２８−３５％以下の同一性、ＬｕｘＲ型タンパク質の場合では１８−２５％の同一性である(Fuqua et al., 1996)。しかし、ａｉｉＡ遺伝子をこれらの細菌に導入し、ＡＩにより調節される生物学的機能を探索することは、可能かつ簡単である。
【００５１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Bacillus sp. 株２４０ＢＩからの細胞抽出物によるＡＩ不活性化の時間経過を示す。
【図２】  図２は、ＡＩ不活性化酵素の分子質量についての評価を示す。
【図３】  図３は、Bacillus sp.株２４０Ｂ１ ＡＩ不活性化領域についてのクローニングおよび欠失の分析を示す。
【図４Ａ】  図４Ａは、ａｉｉＡ 遺伝子のヌクレオチド配列を示す（配列番号１)。
【図４Ｂ】  図４Ｂは、ａｉｉＡ 遺伝子産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号２)。
【図５】  図５は、ａｉｉＡ 遺伝子産物（ＡｉｉＡ) の共通アスパルチルプロテアーゼ活性部位モチーフに対するアミノ酸配列の最良対合を示す。
【図６】  図６は、Bacillus sp. 株２４０Ｂ１のＡＩ不活化活性、E.coli クローン、Erwinia carotovora 株におけるＡＩ産生活性を示す。
【図７】  図７は、（Ａ）ジャガイモ、（Ｂ）ナスビ、（Ｃ）ハクサイ、（Ｄ）ニンジン、（Ｅ）セロリにおける病原に対する Erw. carotovora での ａｉｉＡ 遺伝子発現の作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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