(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において1 個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号：１に記載の塩基配列を有する核酸と、ストリンジエント条件下でハイブリダイズし、且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において1 個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項６】
配列番号：３に記載の塩基配列を有する核酸と、ストリンジエント条件下でハイブリダイズし、且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項７】
前記蛋白質が、不定芽誘導能を有する蛋白質である請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項８】
前記蛋白質が、分枝誘導能を有する蛋白質である請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターにより形質転換された宿主。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質。
【請求項１２】
請求項１０に記載の宿主を培養し、又は成育させ、そして該宿主から分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
前記蛋白質が、不定芽誘導能を有する蛋白質である請求項１２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
前記蛋白質が、分枝誘導能を有する蛋白質である請求項１２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された植物又は植物細胞。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞から分化を誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞から不定芽形成を誘導する方法。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を植物体に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物体の分枝を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子に関する。具体的には、本発明は不定芽・分枝誘導能を有し、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子ならびにその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物は一般に分化全能性を持ち、例えば体細胞に由来する未分化組織から不定芽、あるいは不定胚の再生を経て植物個体を再生することができる。この能力は苗条培養における苗の生産等に利用されている。また、植物の体細胞組織や培養細胞に遺伝子を導入した後、不定芽や不定胚の再生を経て形質転換植物を再生することは、近年、植物バイオテクノロジー分野においては不可欠の重要な技術である。一般に未分化細胞塊であるカルスや、葉・茎等の植物組織からの不定根や不定芽の再生は植物ホルモンであるオーキシンやサイトカイニンの相互作用によって制御されると言われている。
【０００３】
また、植物の形態形成については、植物ホルモン以外に、ホメオボックスを含む一連の遺伝子群が関わっていることが報告されている。ホメオボックスはショウジョウバエの発生を制御するいくつかの遺伝子に共通して存在する、よく保存された183 塩基対のDNA 配列として見出された。この領域から翻訳される61アミノ酸配列はホメオドメインと呼ばれ、3 つのαヘリックスからなるヘリックス−ターン−ヘリックス構造をとり、特異的な塩基配列を認識してDNA に結合する。
【０００４】
動物のホメオボックス遺伝子は発生過程を調節する転写因子であることが明らかにされてきたが、高等植物のホメオボックス遺伝子は1991年、トウモロコシのKNOTTED1（KN1 ）遺伝子として単離されたのが最初である（Vollbrecht et al. 、Nature 350：241 −243 、1991）。トウモロコシの葉の葉脈は平行脈であるがKnotted1変異株は葉脈が乱れ、葉脈に沿って結び目（knot）のような突起を作ることからKnotted という名前がつけられた。
一方、多くの動物で見つかっていたホメオボックス内の特に保存性の高いアミノ酸配列に対応する合成DNA を用いて、双子葉植物のシロイヌナズナのゲノムDNA が検索され、いくつかのホメオボックス遺伝子が報告された（Ruberti et al.、EMBO J. 10: 1787-1791 、1991）。
【０００５】
これまでに報告された高等植物のホメオボックス遺伝子は、ホメオドメインのアミノ酸組成の類似性やホメオボックス部分以外の構造から大きく5 つのタイプに分類されてきた（田坂，蛋白質核酸酵素 40 （8 ）:1033-1042、1995）。第１のタイプはトウモロコシのKN1 遺伝子に代表されるタイプ、第2 のタイプはホメオボックスが蛋白質のほぼ中央に位置し、そのC 末端側に隣接して蛋白質の2 量体形成に関与するロイシン残基の規則的な繰り返し構造（ロイシンジッパー）が存在するものである。第3 のタイプは蛋白質のC 末端付近にホメオドメインを有し、さらにN 末端側に金属結合型のフィンガー構造を有する。第4 のタイプは、第3 のタイプと共通の構造に加えて、いくつかのアミノ酸配列の繰り返し構造を含むものである。第5 のタイプはN 末端側にホメオボックスを有するが、それ以外によく知られた特徴的な構造は見出されていない。
【０００６】
それぞれのタイプ間の全体を通したアミノ酸配列の相同性はホメオドメイン内で32〜58％であるが、動物のホメオドメインを含む蛋白質がDNA に結合する際に、ホメオドメイン中の3 番目のヘリックスがターゲットとなるDNA の2 重らせんの主溝に入り込み転写を調節するという報告からも推測できるように、植物のホメオボックス遺伝子産物でも、タイプを超えて、この3 番目のヘリックスが最も高い相同性を示す。この領域は、ホメオドメイン蛋白質が転写因子としてDNA に結合するために必須といわれている。なお、最近、これら５つのグループに属さないホメオボックス遺伝子WUSCHEL が報告された（Cell, vol.95, p805-815, 1998）。WUSCHEL 遺伝子の機能欠損突然変異体では茎頂分裂組織の正常な発達ができないが、WUSCHEL 遺伝子を過剰発現させた実験報告はなく、WUSCHEL 遺伝子の発現を人為的に上昇させた場合、どのような変化が起こるのかは不明である。
【０００７】
植物のホメオボックス遺伝子については、器官形成や発生過程の調節、また感染防御や植物体内での物質輸送の制御に関与する可能性が示唆されているが、その詳細は明らかになっていない。また、一般にホメオボックスを持つ蛋白質は転写因子として機能すると考えられるが、それぞれのホメオボックス蛋白質が転写調節を行うターゲット遺伝子も未だ明らかになっていない。さらに、ホメオボックス遺伝子のうち、KN1 タイプのものを過剰発現させると植物体に激しい形態異状が引き起こされるが、カルス上で不定芽を形成するかどうかは不明である。
また、農業への利用という観点から考えれば、組織培養系で、例えばカルス等の培養組織の上に不定芽や分枝を誘導する能力の高い遺伝子が有用であると考えられるが、そのようなものはない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質、具体的には不定芽・分枝誘導能を有する蛋白質をコードする遺伝子及びそれによりコードされる蛋白質並びにこれらの用途を提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いてアクティベーションタギング（activation tagging) を行い、不定芽・分枝誘導能を有する蛋白質をコードする遺伝子を得た。アクティベーションタギングとは、植物ゲノムにランダムにエンハンサー配列を挿入することにより、挿入エンハンサー近くの遺伝子の転写が活性化された突然変異体を分離する方法である。
従って、本発明は、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。詳しくは、不定芽・分枝誘導能を有し、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
【００１０】
より具体的には、本発明は配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号：２のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸の付加・欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸を有し且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号：１に記載する核酸、特にDNA 、又はその部分とハイブリダイズし、且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号：４のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸の付加・欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸を有し且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号：３に記載する核酸、特にDNA 、又はその部分とハイブリダイズし、且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
【００１２】
なお、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質とは、細胞が形態的・機能的に違いを持った細胞、例えば不定芽、枝、葉、花などに分化する過程に関わり、DNA 結合ドメインとして機能するホメオドメインに類似の配列を持つ蛋白質であり、具体的には、不定芽の形成を誘導する蛋白質、分枝を誘導する蛋白質等を示す。
本発明はまた、上記遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された宿主を提供する。この宿主は植物細胞であっても、植物体であってもよい。
【００１３】
本発明はまた、上記宿主を培養、栽培することによる、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記遺伝子を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞の分化を誘導する方法を提供する。
本発明はまた、上記遺伝子を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞の不定芽形成を誘導する方法を提供する。
本発明はまた、上記遺伝子を植物に導入し、該遺伝子を発現せしめることにより植物の分枝形成を誘導する方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
発明者は、アクティベーションタギングによって過剰発現した時に、カルスの上に不定芽形成を誘導するような分化に関わる遺伝子を同定できるのではないかと考えた。そこで、アクティベーションタギング用ベクターpPCVICEn4HPTをアグロバクテリウムを介して導入したシロイヌナズナ形質転換体カルスをサイトカイニンを含まない培地上でスクリーニングし、通常は、サイトカイニン非存在下では不定芽が形成されないが、サイトカイニン非存在下でも不定芽を形成した突然変異体を分離した。このうち、many shoot（msh ）と名付けた変異体は、サイトカイニン非存在下において不定芽を形成した。
【００１５】
msh 変異体の表現型の原因となっているMSH 遺伝子とそれに対応するMSH cDNAを単離し解析した結果、MSH 遺伝子にコードされる蛋白質はホメオドメインと有意な相同性を示すアミノ酸配列を有し、中でも、一連のホメオドメイン蛋白質で保存されているホメオドメインの第3 番目のαヘリックス部分の相同性が高かった。また、MSH cDNAのコード領域をシロイヌナズナカルスに導入し過剰発現させたところ、msh 変異体の表現型からも推測されるように、形質転換されたカルスは培地中のサイトカイニンの有無に関わらず不定芽を形成した。さらに、MSH cDNAを過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換体では、野性型シロイヌナズナと比べて分枝が多くなる場合が多く、葉の上に不定芽が形成されることもあった。
【００１６】
以上のことから、MSH 遺伝子は分化に関わり、ホメオボックス様配列を持つ蛋白質をコードすることが明らかになり、これを過剰発現させることによって不定芽・分枝形成能が向上することが期待できる。
本発明の遺伝子としては、例えば配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質ももとの蛋白質と同様の作用を維持することが知られている。従って本発明は、配列番号：２又は４に記載のアミノ酸配列に対して1 個または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子も本発明に属する。
【００１７】
ここで、この修飾の程度は、本件出願の前に周知技術となっている手段、例えば部位特定変異誘発、PCR 法等により可能な程度である。不定芽・分枝誘導活性を維持しながら修飾の対象となるアミノ酸の数は、例えば50個以下、好ましくは25個以下、例えば10個以下である。
本発明はまた、配列番号：１又は３に記載の塩基配列を有する核酸、例えばDNA 、又はその部分と、ストリンジエント条件下でハイブリダイズすることができ、且つ分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。ここでストリンジエント条件とは、例えば５xSSC、50℃の条件下でハイブリダイズする条件をいう。なお適切なハイブリダイゼーションの温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なるため、適宜選択して行うことができる。
【００１８】
また、上記の核酸の部分とは、少なくとも数個の連続するアミノ酸配列をコードする部分であり、好ましくはホメオドメイン内の連続する数個のアミノ酸配列をコードする部分である。より好ましくは、配列番号：１又は３に記載の配列のうち、ホメオドメインの配列の一部又は全部を含み、かつ配列番号：１又は３に記載の全コード配列に対して、25％以上、例えば50％以上、さらに好ましくは75％以上の長さを有する部分又は断片を意味する。
上記ハイブリダイゼーションの対象としての遺伝子源としては、植物、微生物などから調製されるcDNAライブラリー、ゲノムDNA ライブラリー等を使用することができ、植物として例えばシロイヌナズナ、ペチュニア、キンギョソウ、イネ、トウモロコシ、タバコ、ポプラ等が挙げられる。
【００１９】
このようにして得られる、分化に関わり、ホメオドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号：１又は３に示す塩基配列に対して、50％以上、60％以上、好ましくは70％以上又は80％以上、例えば90％以上の相同性を有する。
配列番号：２又は４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする本発明の遺伝子は、cDNAまたはゲノムDNA として、シロイヌナズナから得ることができる。
【００２０】
生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、例えばcDNAライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNA は生来の塩基配列を有するDNA を基礎として、常用の部位特定変異誘発やPCR 法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したいDNA 断片を生来のcDNAまたはゲノムDNA の制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはPCR 法を実施し、所望の修飾を導入したDNA 断片を得る。その後、この変異を導入したDNA 断片を目的とする蛋白質の他の部分をコードするDNA 断片と連結すればよい。
【００２１】
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA を得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするDNA を所望の制限酵素により切断し、その結果得られたDNA 断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるDNA 断片を合成し、連結すればよい。
【００２２】
得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺伝子発現系を用いて発現させることにより、遺伝子産物であるMSH 蛋白質を得ることができる。あるいはまた、配列番号：２又は４のいずれかに記載のアミノ酸配列がコードする蛋白質に対する抗体を用いても、MSH の蛋白質を得ることができ、抗体を用いて他の生物からMSH と同様の機能を有する蛋白質の遺伝子をクローン化することもできる。
【００２３】
従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Escherichia)属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）、バシルス（Bacillus）属微生物、例えばバシルス．スブシルス（Bacillus subtilis)など常用の宿主を用いることができる。
【００２４】
真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス（Saccharomyces)属微生物、例えばサッカロミセス．セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Aspergillus)属微生物、例えばアスペルギルス．オリゼ（Aspergillus oryzae) 、アスペルギルス．ニガー（Aspergillus niger)、ペニシリウム（Penicillium)属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用され、具体的にはCOS 細胞、Vero細胞、CHO 細胞、Ｌ細胞、C127細胞、BALB／c3T3細胞、Sp−2/O 細胞等を用いることもできる。植物細胞としては、タバコの培養細胞、ポプルス属、ユーカリ属、アカシア属の培養細胞等が使用される。
【００２５】
さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。具体的には、昆虫細胞、例えばヨガ細胞（Spodoptera frugiperda)、カイコ細胞（Bombyx mori)等を用いることができる。
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス（バキュロウイルス（昆虫細胞発現系）、ワクシニアウイルス（動物細胞発現系））等が使用できる。
【００２６】
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えばtrc プロモーター、tac プロモーター、lac プロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター、adhIプロモーター、pqk プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、trpC等が使用される。
また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動物細胞としてはSimian Virus 40 のearly およびlateプロモーター、CMV プロモーター、HSV-TKプロモーターまたはSRαプロモーター等が挙げられる。
【００２７】
また、植物用プロモーターとしては、例えばCaMV35S プロモーター、ノバリン合成酵素のプロモーター、誘導型プロモーターとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼII系遺伝子のプロモーター、hsp80 プロモーター、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター等が挙げられる。また、発現ベクターには、以上の他にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メトトレキセート耐性）、neo 遺伝子（Ｇ418 耐性）等）等を含有しているのを用いるのも好ましい一態様である。なお、エンハンサーを使用する場合、例えばSV40のエンハンサー等を遺伝子の上流または下流に挿入する。
【００２８】
発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業者においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons 社、1995年、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。培養物からの精製は、蛋白質を単離・精製するための常法に従って、例えば、限外ろ過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセファロースを用いるクロマトグラフィー等により行うことができる。また、GST やポリヒスチジンとの融合タンパク質として宿主中で発現させた場合、適切なアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できる。
【００２９】
現在の技術水準をもってすれば、さらに、このcDNAあるいはゲノムクローンを構成的なあるいは誘導型のプロモーターの制御下に連結し、アグロバクテリウムを用いるシステムあるいはパーティクルガン、エレクトロポーレーションを用いるシステムで、この遺伝子を植物に導入し発現させることで、植物ホルモンによる人為調節によっても個体再生が困難な植物、例えばバラなどにおいて、不定芽の形成や分枝形成等の分化を促進することが可能である。
さらに、本発明の遺伝子の発現を制御することで、園芸植物の形態を変化させること、例えばスタンダードタイプの植物をスプレータイプに変化させ、その結果として花数や葉数の増加させることができると考えられる。
【００３０】
【実施例】
以下実施例に従って発明の詳細を述べる。分子生物学的手法は特に断らない限り、Molecular Cloning (Sambrook et al.、1989) に従った。
実施例１．サイトカイニン応答突然変異体のスクリーニング
分化、例えば不定芽・分枝の形成に関与する遺伝子の転写量を増大させ、サイトカイニン非存在下でもサイトカイニン応答を示す突然変異体を得るため、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いてアクテイベーションタギングを行った。
【００３１】
約50,000個のシロイヌナズナのカルスを赤間らの方法（Akama et al., Plant Cell Rep., 12, 7, 1992）に従い、アクテイベーションタギング用ベクターpPCVICEn4HPT（Hayashi et al.、Science, 258, p1350-1353, 1992）を用いて形質転換を行った。なお、pPCVICEn4HPTにはカリフラワーモザイクウイルス35SRNA遺伝子プロモーターに由来する強力なエンハンサー配列が存在するので、植物のゲノムに挿入された後に、このエンハンサー配列に隣接する遺伝子の転写が活性化される。形質転換後、形質転換されたカルスをサイトカイニンを含まない培地上で培養した。
【００３２】
野生型（非形質転換）シロイヌナズナカルスはサイトカイニンを含まない培地上では細胞増殖が抑えられ、不定芽形成を行うことができないが、形質転換カルスの中には、サイトカイニンが存在しないにも関わらず、不定芽を形成するカルスが存在した。その中でも、不定芽形成能が高く多くの不定芽を形成する突然変異体をmsh （many shoot）突然変異体と名付けた。msh 変異体から得られた種子を通常シロイヌナズナ培養用寒天培地に播種したところ、子葉の上にも多くの不定芽が観察された。
【００３３】
実施例２．msh 突然変異体の原因遺伝子MSH の単離
実施例１で得られたmsh 突然変異体からゲノムDNA を抽出した。このゲノムDNA を制限酵素SacIで処理した後、DNA を精製し、T4リガーゼによりDNA 断片の環状化をおこなった。これを大腸菌に導入し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりプラスミドを回収した。このようにして回収されたプラスミドはT-DNA のほとんどの領域とmsh 突然変異体のゲノム内でT-DNA のRight border（RB）に隣接しているゲノム配列を含んでいる。
このRBに隣接するゲノムDNA 5610bpの塩基配列を決定し、得られた塩基配列についてGENSCAN アルゴリズム(http://CCR-081.mit.edu/GENSCAN.html) で遺伝子の存在を予測したところ、RBに最も近い遺伝子はRBから882 番目の塩基から転写が始まることが明らかとなり、本遺伝子をMSH と名付けた。
【００３４】
実施例３． MSH cDNA の単離
msh 突然変異体ならびに野生型シロイヌナズナの植物体全体からRNA を抽出し、oligotex dT30 （日本ロッシュ社）を用いてmRNAを精製した。これを鋳型とし、ラムダZAPII cDNAライブラリー合成キット(Stratagene 社) を用いて、Stratagene社の推奨する方法によりcDNAライブラリーを作製した。これらmsh 突然変異体並びに野生型シロイヌナズナのcDNAライブラリーを実施例２で得られたMSH 遺伝子をプローブとしてスクリーニングした。野性株由来のcDNAライブラリーは、約300,000 クローンをスクリーニングしてもMSH 遺伝子に対応するcDNAは得られず、このことから、野生型シロイヌナズナにおいてMSH 遺伝子の発現は非常に弱い、あるいは特定の細胞でのみ発現していると考えられる。
【００３５】
一方、msh 突然変異体由来のcDNAライブラリー約20,000クローンをスクリーニングしたところ、31個の陽性クローンが得られ、このうち、M6と名付けたクローンをその後の解析に用いた。M6クローンの塩基配列を決定し、その配列を配列表の配列番号：１に示す。また、その塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００３６】
このコード領域全長の配列はMSH 遺伝子に含まれており、M6はMSH 遺伝子に対応するcDNAであることが判明した。cDNAの塩基配列を解析した結果、MSH 遺伝子にコードされる蛋白質はホメオドメイン蛋白質と有意な相同性を示し、中でもホメオドメイン蛋白質間で保存されているホメオドメインの第3 番目のαヘリックスに相当する配列が、MSH 遺伝子にコードされる蛋白質においてもよく保存されていることがわかった。また、MSH 遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ホメオドメイン蛋白質の中でもWUSCHEL の配列と最も高い相同性を示した。
【００３７】
ただし、報告されている中でMSH と最も相同性の高いWUSCHEL と比較した場合でも、ホメオドメイン内の同一アミノ酸の割合は42％、タンパク質全体では約20％であり、配列からはWUSCHEL と類似の機能を持つかどうかは判断できない。ホメオドメイン蛋白質の中で、WUSCHEL の次に相同性が高かったのはKN1 タイプの蛋白質であるが、これらをMSH とホメオドメイン内で比較した場合の相同性は、同一アミノ酸の割合が20％以下であった。また、クローニングの過程で、MSH cDNAとホメオドメイン内で86％、全領域で40％の同一性のある配列を有するcDNAクローンも単離され、M8と名付けた。その塩基配列を配列表の配列番号：３に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００３８】
実施例４．MSH cDNAの過剰発現による不定芽形成
実施例２で予測されたように、MSH 遺伝子の過剰発現が不定芽の形成を引き起こすのかどうかを解析した。バイナリーベクターpBE2113GUS（Plant Cell Physiology, 37, p49-59, 1996 、NIARより入手）から、制限酵素BamHI ／SacI  処理によってGUS 遺伝子を除き、替わりにMSH cDNAのコード領域をプライマー#170(5‘−GAAGATCTCATCATGTCCTCCTCAAAC-3') （配列番号：５）とプライマー#172（５’−CGGAGCTCTAAATAAGATAATAGATTGCGC-3' ）（配列番号：６）を用いたPCR で増幅し、その後制限酵素BglII/SacIで処理したDNA 断片を組み込んだ。この操作により、バイナリーベクターに挿入されたMSH cDNAはカリフラワーモザイクウイルス35SRNA遺伝子プロモーター由来の人工プロモーターの制御下に置かれている。このプラスミドをpBE2113MSHと名付けた。
【００３９】
pBE2113GUSとpBE2113MSHをアグロバクテリウムを介して野生型シロイヌナズナカルスに導入した。カナマイシン耐性を指標として形質転換細胞を選別した。pBE2113GUSを導入した形質転換体カルスは不定芽形成にサイトカイニンを要求したが、pBE2113MSHで形質転換されたカルスはサイトカイニンの有無に関わらず不定芽を再生することができた。サイトカイニン存在下では、どちらのプラスミドで形質転換したカルスも不定芽を再生したが、pBE2113MSHで形質転換されたカルスは、pBE2113GUSで形質転換されたカルスよりも速やかに不定芽を再生した。また、既に報告されている２成分制御系（two-component system）のセンサー・ヒスチジンキナーゼであるCKI1 cDNA を過剰発現するシロイヌナズナカルスもサイトカイニン非存在下で不定芽を形成できるが、形成される不定芽の数はMSH cDNAを過剰発現しているカルスのほうが多かった。
【００４０】
一方、pBE2113MSHをアグロバクテリウム減圧浸潤法を用いてシロイヌナズナの生殖細胞に導入し（Bechtold et al., C.R.Acad.Sci.Paris, Life Sciences, 316, p1194-1199, 1993 、荒木崇, 植物細胞工学シリーズ４, モデル植物の実験プロトコール, p109-113, 1996）、遺伝子が導入された芽生えをカナマイシン耐性を指標として選択した。このようにして得られた形質転換体シロイヌナズナでは、野性株と比べて分枝が多いことが観察された。
【００４１】
さらに、実施例3 で得られた、MSH cDNAと相同な蛋白質をコードするM8 cDNA にコードされる蛋白質の機能に関しても、M8ｃDNA にコードされる蛋白質とGUS の融合タンパク質をシロイヌナズナ植物体で過剰発現させることによって解析した。M8 cDNA のコード領域をプライマー#224（5 ‘−GCTCTAGAACAATGGCTTCTTCGAATAGACAC-3' ）（配列番号：７）とプライマー#225（５’−TCCCCCGGGCTGATCAGATAGTACGAGGCTCC-3' ）（配列番号：８）を用いてPCR によって増幅後、制限酵素XbaI/SmaI 処理によって得られる遺伝子断片を、ｐBE2113GUS のXbaI/SmaI 認識部位の間に挿入した。
【００４２】
得られたバイナリーベクターpBE2113M8GUSをアグロバクテリウム減圧浸潤法を用いてシロイヌナズナの生殖細胞に導入し、遺伝子が導入された芽生えをカナマイシン耐性を指標として選択した。このようにして得られた形質転換体シロイヌナズナでは、先のMSH cDNAを過剰発現したシロイヌナズナ変異株と同様、分枝が多くなった。
【００４３】
【発明の効果】
以上のように、アクテイベーションタギングによってシロイヌナズナから得られた遺伝子MSH は、不定芽形成に関与するホメオボックス遺伝子と考えられ、不定芽形成に関わる遺伝子の転写因子をコードすると推測される。MSH ｃDNA を35S プロモーターの制御下で過剰発現させた結果から、サイトカイニンの有無に関わらず、MSH が不定芽形成を促進すること、加えて、植物体の分枝にも関与することが示唆された。
このことから、MSH 遺伝子の発現を制御することによって、植物又は植物細胞からの不定芽・分枝形成を制御することが可能となった。
【００４４】
【配列表】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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