(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ホスファターゼを阻害するホスファターゼ標的毒素を測定するためのアッセイ方法であって、
（Ａ）表面に固定化された第一のリガンドを有する固体支持体を、
（ｉ）毒素で汚染させていると推測されるサンプルおよび
（ｉｉ）固体支持体に固定化されていない第二のリガンドと接触させること、
ここで、
（ａ）前記第一のリガンドがタンパク質ホスファターゼ酵素であり、前記ホスファターゼ標的毒素および前記第二のリガンドと競合的に結合することができるか、
（ｂ）前記第二のリガンドがタンパク質ホスファターゼ酵素であり、前記ホスファターゼ標的毒素および前記第一のリガンドと競合的に結合することができるか
（ｃ）前記第一のリガンドおよび前記第二のリガンドの少なくとも一方がタンパク質ホスファターゼ酵素を含有し、前記第一のリガンドおよび前記第二のリガンドが同時に前記ホスファターゼ標的毒素に結合することができるか、
（ｄ）前記第一のリガンドおよび前記第二のリガンドの少なくとも一方がタンパク質ホスファターゼ酵素を含有し、前記第一のリガンドがホスファターゼ標的毒素に結合することができ、前記第二のリガンドが前記ホスファターゼ標的毒素と前記第一のリガンドとの複合体に結合することができるか、
（ｅ）前記第一のリガンドおよび前記第二のリガンドの少なくとも一方がタンパク質ホスファターゼ酵素を含有し、前記第二のリガンドがホスファターゼ標的毒素に結合することができ、前記第一のリガンドが前記ホスファターゼ標的毒素と前記第二のリガンドとの複合体に結合することができ、
これにより前記毒素に結合された前記第一のリガンド、前記第二のリガンド、または前記毒素と前記第二のリガンドとの複合体の量比が前記サンプルの毒素含量に依存し、
（ｆ）前記第一のリガンドが、複合体を形成していないとき、前記毒素と複合体を形成しているとき、前記毒素と前記第二のリガンドとの複合体と複合体を形成しているとき、または前記第二のリガンドと複合体を形成しているときに、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することができるか、
（ｇ）前記第二のリガンドが、複合体を形成していないとき、または複合体を形成しているときに、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することができることを特徴としている、
（Ｂ）非結合フラクションから結合フラクションを分離すること、および
（Ｃ）第一のリガンドに結合した第二のリガンド（結合フラクション）または水溶液中で非複合化した第二のリガンド（非結合フラクション）を直接的または間接的に測定することからなり、
（ｉ）および（ｉｉ）の前記固体支持体への適用が、別個に、連続に、または同時に行ってもよく、別個にまたは連続に行う場合にはいかなる順序で行ってもよいことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ホスファターゼ標的毒素が、藻類により、またはシアノバクテリアにより産生されることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ方法。
【請求項３】
前記ホスファターゼ標的毒素が、肝細胞毒素またはオカダ酸であることを特徴とする請求項１または２に記載のアッセイ方法。
【請求項４】
前記（ａ）または（ｂ）から選択される場合において、前記サンプル中に存在する毒素分子が、前記第二のリガンドと、前記第一のリガンドの限られた数の結合部位を巡って競合し、かつ、前記サンプル中に存在する毒素のいずれもが、前記第二のリガンドが前記第一のリガンドの結合部位に結合するかまたは結合しないその程度に比例して測定されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項５】
ホスファターゼ標的毒素の存在または不在が測定されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項６】
前記サンプルが、貝類の表面または遊離の水分、またはこのような貝類が生息する生息地から取り出された水、または家庭用給水源から取り出された水であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項７】
前記第一のリガンドがタンパク質ホスファターゼであるときに前記第二のリガンドが抗体または抗体断片であるか、または前記第二のリガンドがタンパク質ホスファターゼであるときに前記第一のリガンドが抗体または抗体断片であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項８】
前記タンパク質ホスファターゼが、タンパク質ホスファターゼ２Ａであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項９】
前記第一または第二のリガンドのいずれかが、リポーター部分を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
前記第二のリガンドが、リポーター部分を有することを特徴とする請求項９に記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
前記第一のリガンドがタンパク質ホスファターゼ酵素であるときに、前記第二のリガンドが標識されたペプチド肝細胞毒素または標識されたオカダ酸であることを特徴とする請求項１０に記載のアッセイ方法。
【請求項１２】
前記肝細胞毒素が、nodularin、microcystin LRまたはmicrocystin YRから選択されることを特徴とする請求項１１に記載のアッセイ方法。
【請求項１３】
前記固体支持体が、ディップスティックまたは固体マトリックスであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項１４】
前記固体支持体が、ポリマーまたは磁性ビーズであることを特徴とする請求項１３に記載のアッセイ方法。
【請求項１５】
タンパク質ホスファターゼを阻害するホスファターゼ標的毒素を検出するためのキットであって、該キットは、
第一のリガンドを固定化させる固相と、
第二のリガンドとを含み、
前記第一のリガンドおよび/または前記第二のリガンドが、タンパク質ホスファターゼ酵素であり、
前記第一のリガンドおよび第二のリガンドのいずれかが、直接的または間接的に検出可能な部分、または前記第一のリガンドおよび第二のリガンドの一方と結合し、かつ検出可能なシグナルを発生させることができるレポーター部分を含むことを特徴とするキット。
【請求項１６】
前記第二のリガンドが水溶液中にあるか第一のリガンドに複合化されたものであることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記検出可能な部分またはシグナルが実験装置なしで直接読み出し可能であることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記ホスファターゼ標的毒素が、藻類により、またはシアノバクテリアにより産生されることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
毒素結合リガンドとしてのタンパク質ホスファターゼ酵素を固定化させた固相と、ホスファターゼ標的毒素による前記毒素結合リガンドへの結合を競合的に阻害して、実験装置なしに読み出し可能なシグナルを発生させることができるリポーター分子とを含むことを特徴とする、タンパク質ホスファターゼを阻害するホスファターゼ標的毒素を検出するためのキット。
【請求項２０】
表面に固定化させたタンパク質ホスファターゼを有する磁気的に移動可能なポリマー微小球体と、前記タンパク質ホスファターゼへのシアノバクテリア毒素の結合を競合的に阻害可能な金ゾル標識したペプチド肝細胞毒素分子を含むことを特徴とする請求項１５〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
表面に固定化させたタンパク質ホスファターゼを有する磁気的に移動可能なポリマー微小球体と、前記タンパク質ホスファターゼへの藻類毒素の結合を競合的に阻害可能な金ゾル標識したオカダ酸分子を含むことを特徴とする請求項１５〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
ホスファターゼ標的毒素の測定のための請求項１５〜２１のいずれかに記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ホスファターゼを標的とする毒素に関するアッセイ
本発明は、たとえば、シアノバクテリアおよび渦鞭藻類（dinoflagellate）のような微小藻類によって典型的に産生されるホスファターゼを標的とする毒素（ホスファターゼ標的毒素）の検出のためのアッセイ方法に関するものである。
【０００２】
渦鞭藻類は、典型的には、単細胞の光合成双鞭毛藻類である。海洋渦鞭藻類（例  Prorocentrum sp. およびDinophysis sp. ）には、ヒトに摂取されると胃腸の問題を引き起こす、オカダ酸（okadaic acid）およびdinophysis毒といった、ホスファターゼ標的毒素を産生するものがある。したがって、もしこのような藻類が消費用の貝の生息地を汚染すれば、このような藻類が問題となる可能性がある。
【０００３】
藍藻植物（blue-green algae）としてしばしば呼称されるシアノバクテリアもまた光合成微生物であり、これらは、主に水生であり、沿岸の水域、外海および外洋、河川、湖沼ならびに地下水に生息しているが、陸生生物でもあり、落ち葉層および土壌中にも見られる。
シアノバクテリアの多くの種および株、特にMicrocystis sp.、Aphanizomenon sp.、Anabena sp.、Nodularia sp.およびOscillatoria sp.は、毒素を産生し、もし、ヒトまたは他の動物、鳥および魚にでさえ摂取されれば、病気を起こし得る。このような毒素の摂取は、２つの主要なルート、すなわち、汚染された水を飲むかあるいは汚染された海産物を食べることのいずれかによって起こる。
【０００４】
２つの特定型の毒素が、シアノバクテリアおよび渦鞭藻類によって産生される。たとえば、アナトキシン（anatoxins）およびサキシトキシン（saxitoxins）といった神経毒は、罹病者に麻痺を引き起こし、このため、この状態をしばしば麻痺性貝中毒などのように呼んでいる。このような神経毒による中毒は珍しいが、致命的であることが判明しているといってよい。
【０００５】
別な型の毒素は、身体の細胞中のタンパク質ホスファターゼ酵素を、当該酵素に結合し、タンパク質基質を脱リン酸化する能力に影響を及ぼすことによって不活性化する。これらの毒素は、比較的共通しており、あるもの（たとえば、渦鞭藻類の毒素である、オカダ酸およびdinophysis毒といったもの）は、吐き気、嘔吐および下痢を引き起こしうるので、この状態を、しばしば下痢性貝中毒などのように呼んでいる。タンパク質ホスファターゼ標的毒素の中には、腫瘍プロモーターがあり、これらの毒素にさらされると癌になる可能性がある。他のもの、シアノバクテリア毒素であるミクロシスチン（microcysitin）およびノジュラリン（nodularin）は肝細胞毒性で、肝臓障害を引き起こす。最も大勢を占めるホスファターゼ標的毒素は、ミクロシスチン、ノジュラリンおよびオカダ酸である。
【０００６】
渦鞭藻類の毒素中毒の最もありふれた出所は、貝および魚の肝臓であり、また、シアノバクテリアの毒素中毒の最もありふれた原因は、汚染された飲料水および／または浴用水である。しかしながら、シアノバクテリアおよび渦鞭藻類の毒素の両方とも、貝および水中に潜んでいる。藻類の毒素中毒に特に共通する出所は、斧足類（mussels）であり、なぜなら、それらは、毒素産生藻類を餌とすると同時に毒素を蓄積するからである。たとえば、カキ、クラムおよびイタヤガイ（scallops)といった他の貝もまた影響を及ぼされ得る。
【０００７】
さらに、家庭用給水源は、特にもし、それらが地下水を源としている場合には、シアノバクテリアで汚染される可能性があり、したがって、毒素摂取の直接のルートを提供する。
高タンパク質の健康食品および食養生の補助としての藻類およびシアノバクテリアの消費に関し、ある関心がもたれている。毒素産生株による汚染に対し回収された藻類またはシアノバクテリアを監視することに関する公式のガイドラインはなく、AnabenaおよびAphanizomenonのような属の市場への出荷は、多数の毒素産生株がそれらの中に発見され得るので、特に厄介である。
【０００８】
藻類の毒素にさらされることに起因する短期間の不快感、医療費、貝産業への商業的コスト、仕事時間の空費などに加え、上述したように、ホスファターゼ標的毒素であるミクロシスチンおよびノジュラリンは、腫瘍プロモーターであることがわかっており、このような毒素に臨床的または亜臨床的レベルで、特にアルコールまたは喫煙の高摂取と組み合わせて繰り返しさらされることにより、癌、特に肝臓癌になる可能性がある。
【０００９】
現在、藻類およびシアノバクテリア由来のホスファターゼ標的毒素の検出および定量に関する多くの異なる方法が存在する。一つの標準的な方法は、斧足類または他のホスファターゼ標的毒素の可能性のある供給源をつぶし、つぶした斧足類組織の抽出物をマウスに注射することを含む。さらに、ホスファターゼ標的毒素の汚染の存在およびそのレベルが、マウスの生存率に関して決定される（Stabell et al. (1992), Food. Chem. Toxicol. 30 (2) : 139-44）。これは、明らかに、多くの時間を要し、大雑把で高価な、食物の安全性および品質コントロールを評価する方法である。
【００１０】
別の方法は、外部から加えられたホスファターゼの酵素活性における減少を測定することで、貝中のホスファターゼ標的毒素の存在を検出することを含む。さらに、この方法は、斧足類または他の貝組織をつぶし、外から加えたホスファターゼを害する内因性のホスファターゼを放出することを含むが、試験の感度および正確さを妥協している（シアノバクテリアの毒素の検出方法（Detection Methods for Cyanobacterial Toxins）  Codd, Jeffries, Keevil および Potter編, 王立化学会（Royal Society of Chemistry）においてSim and Mudge (1994)）。
【００１１】
このため、ホスファターゼ標的毒素、特に水中、貝中、および／または、藻類またはシアノバクテリアの食用産物中の、藻類およびシアノバクテリアのホスファターゼ標的毒素の存在についての定性的および／または定量的な測定を可能とする、迅速で、感度が良く、かつ安価なアッセイまたは方法に対する多大なニーズが存在する。特に、比較的に未熟なまたは未熟な人員、具体的には、魚屋あるいは水関係の公衆衛生員によって、現場で行えるほど簡単で、かつ、その実施に関し、実験器具または特殊な設備を必要としないアッセイ方法に対するニーズがある。
【００１２】
したがって、最初の観点によれば、本発明は、タンパク質ホスファターゼを阻害するホスファターゼ標的毒素を測定するためのアッセイ方法を提供するものであり、下記の段階からなる：
表面に固定化されたリガンドを有する固体支持体を、
(i)  毒素で汚染されていると推測されるサンプル、および、
(ii)  非固定化リガンド
と接触させる段階、
ここで、前記固定化リガンドは、前記毒素のうちの少なくとも一つ、前記非固定化リガンド、または該毒素および該非固定化リガンドの複合体に結合することができ、また、該非固定化リガンドが、該固定化リガンドのうちの少なくとも一つ、該毒素、または該毒素および該固定化リガンドの複合体に結合することができ、それによって、該毒素と結合した該固定化リガンド、該非固定化リガンドまたは該毒素と該非固定化リガンドの複合体の割合は、前記サンプルの毒素の量に依存しており、
前記固定化リガンドは、複合体が形成されていないとき、前記毒素により複合体が形成されているとき、前記毒素と前記非固定化リガンドとの複合体によって複合体が形成されているとき、または前記非固定化リガンドによって複合体が形成されているときに、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することができ、あるいは、前記非固定化リガンドは、複合体が形成されていないときまたは複合体が形成されているときに、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することができる；
非結合フラクションと結合フラクションを分離する段階；および
直接的または間接的に、固定化リガンドに結合した非固定化リガンド（結合フラクション）、または水溶液中で非複合化した非固定化リガンド（非結合フラクション）を検出する段階
ここで、(i)および(ii)の固体支持体への適用は、別々に、連続的に、または同時に行ってもよく、もし、別々にまたは連続的に行う場合は、それらはどちらの順序で行うこともできる。
【００１３】
したがって、ある態様では、毒素の定量は、固定化リガンドに直接的または間接的に結合できなかった非固定化リガンドの定量を含んでもよい。非固定化リガンドが、毒素と、固定化リガンドへの結合を巡って競争する場合には、非結合リガンドが高レベルであることは、毒素濃度が高いことの指標となる。さらにまた、非固定化リガンドが固定化リガンドに結合した毒素と複合体を形成し得る場合には、非結合リガンドが高レベルであることは、毒素濃度が低レベルであることの指標となる。
【００１４】
別の態様においては、毒素の定量には、固定化リガンドに直接的または間接的に結合した非固定化リガンドの定量を含んでいる。さらに、毒素および非固定化リガンドが固定化リガンドへの結合を巡って競争する場合には、結合したリガンドが高レベルであることは、毒素濃度が低レベルであることの指標となる。そして、非固定化リガンドが、固定化リガンドに結合した毒素と複合体を形成することができる場合には、結合リガンドが高レベルであることは、毒素濃度が高レベルであることの指標となる。
【００１５】
しかしながら、本発明の方法は、ホスファターゼ標的毒素、特に藻類およびシアノバクテリアの毒素の検出のための競合的結合アッセイを含むことが好ましく、当該方法は、サンプル中に存在する毒素分子が、非固定化リガンドと、固定化リガンドの限られた数の結合部位を巡って競争し、該サンプル中に存在する任意の毒素が、固定化リガンドの結合部位に結合した、あるいは結合していない非固定化リガンドの程度に対応して測定されることを特徴としている。
【００１６】
本明細書で使用されるように、「検出する」、「定量する」または「評価する」という用語は、サンプル中に存在するホスファターゼ標的毒素の量または濃度の絶対値を得るという意味において定量的であり、また半定量的でもあり、さらに定性的である評価または定量を含む。毒素の存在のレベルまたは量の指標、割合、パーセンテージまたはモル示度（molar indication）も測定されてもよく、あるいは代わりに、サンプル中のこのような毒素の存在または不存在の単純な表示が得られてもよい。本発明の好ましい観点においては、毒素の存在の単純な有無（存在または不存在）の、あるいは半定量的な測定が達成される。この点に関し、毒素の「不存在」とは、毒素濃度がアッセイの検出限界を下まわるか、あるいは安全または許容できると考えられるレベルより下であることを意味してもよい。
【００１７】
本発明のアッセイ方法に使用されるサンプルは、ホスファターゼ標的毒素にさらされると推測されるいずれのサンプルであってもよく、あるいはホスファターゼ標的毒素を産生する微生物にさらされることによるもの、たとえば、水であってもよく、この水は、海水、淡水、地下水の他に、湖沼、河川、井戸、小川、貯水池、家庭用給水源から得られる水であってもよく、また、たとえば簡単な水切りまたはピペットを用いた抽出により貝から採取される水分または貝を浸していた水であってもよく、あるいは、藻類またはシアノバクテリアによって作られる、または藻類またはシアノバクテリアから作られる食料品、食品添加物、栄養補給物、代替治療剤または類似の製品であってもよい。貝が遊離水を含む場合（例えば、カキの中のように）には、該アッセイは、吸収性の基質（固体支持体）をその水に浸すことを含んでもよい。また、代わりに、単に、たとえば殻を開くと同時に分離した後に、吸湿性の基質を、湿った貝の身に対して押しつけることを含んでもよい。
【００１８】
本発明の好ましい観点においては、調査を受けるサンプルは、貝から得られる表面のまたは遊離の水分である。
すべての種類の貝、具体的には、イタヤガイ、エビ（prawns）、斧足類およびカキが、本発明のアッセイ方法に対して感度がよいが、好ましい面においては、貝は斧足類である。別の好ましい面では、調査を受けるサンプルは、このような貝が生息している生息地から得られる水であるが、さらに好ましい面においては、サンプルは、家庭用給水源から得られた水である。
【００１９】
分析に用いられるサンプルは、本質的には、無処置の様式で使用してもよいが、必要に応じて任意の既知の方法によってろ過されてもよく、あるいは分析前に、水、バッファーまたは他の任意の水性媒体を加えることによって希釈してもよく、また、分析に先立ち、たとえば冷却するかまたは冷凍することによって貯蔵または保存してもよい。
【００２０】
毒素に結合するいかなるリガンドも、固定化または非固定化リガンドとして、具体的には、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい）としてまたは、たとえばF(ab)、F(ab')2、F(v)フラグメントのような抗体断片として、本発明の方法で使用してもよい。このような抗体または抗体断片は、一価または二価であってもよく、また、ハイブリドーマ技術によって製造されてもよく、あるいは、組換DNA技術または化学合成のいずれかによる産物といった、合成起源のものであってもよい。たとえば、一本鎖抗体あるいは他の抗体の誘導体または擬似体を使用することができるだろう。抗体または抗体断片は、ホスファターゼ標的毒素の任意のエピトープ、成分または構造に対して、おあつらえ向きとなるよう、導入されまたは向けられてもよい。代わりに、たとえば小さな有機分子あるいはペプチド（例  オリゴペプチドまたはポリペプチド）のような毒素に対し親和性を有する化合物で、毒素と特異的に結合し得るもの、たとえばコンビナトリアルケミストリー（conbinatorial chemistry)またはファージディスプレイライブラリーから選ばれる特異的なバインダー、あるいはDNAまたはRNAの特異的な結合配列を使用し得るだろう。
【００２１】
しかしながら、本発明の毒素に結合するリガンドは、タンパク質ホスファターゼ酵素であることが好ましく、また、本アッセイ方法では、結合リガンドタンパク質ホスファターゼ２A（pp2A）を使用することがさらに好ましい。
同様に、本発明の方法で使用される第二のリガンドは、第一のリガンドとともに、競合的にまたは非競合的に毒素に結合するリガンドのいずれであってもよい。あるいは、第二のリガンドは、第一のリガンドに結合することを巡って、毒素と競合するいずれのリガンドであってもよい。好ましくは第一のリガンドは毒素結合リガンドであり、タンパク質ホスファターゼ酵素であることがより望ましい。２つのリガンドのうちの一方は、固定化されてなければならず、他方は、非固定化されてなければならない。また、リガンドの一方は直接的または間接的に検出可能でなければならない。好ましい態様では、非固定化リガンドは、固定化リガンドに結合する毒素を競合的に阻害し、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生し得るといった機能的要請を満たすべきであり、具体的には、該リガンドは、直接的または間接的なシグナルを形成する既知の任意形式の一部を用いてラベル化し得る分子であってもよい。このようなリガンドは、同様に、抗体（ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい）、またはたとえばF(ab)、F(ab')2またはF(b)フラグメントのような抗体断片の形をとっていてもよい。このような抗体または抗体断片は、一価または二価であってもよく、また、ハイブリドーマ技術によって製造されてもよく、あるいは、組換DNA技術または化学合成のいずれかの合成起源のものであってもよい。一本鎖抗体あるいは他の抗体誘導体または擬似体およびコンビナトリアルまたはファージディスプレイライブラリーから選ばれる小さな有機分子、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドを、たとえば使用することが可能であろう。抗体または抗体断片は、ホスファターゼ標的分子に結合するホスファターゼ標的毒素分子またはリガンドの任意のエピトープ、成分または構造に対して、おあつらえ向きとなるように、導入されまたは向けられてもよい。代わりに、たとえば小さな有機分子またはペプチド、毒素または毒素に結合するリガンドと特異的に結合し得るオリゴペプチドまたはポリペプチドといった、毒素に対しまたは毒素に結合するリガンドに対し親和性を有する化合物、具体的にはコンビナトリアルケミストリーまたはファージディスプレイライブラリーから選ばれる特異的なバインダー、あるいはDNAまたはRNAの特異的に結合する配列を使用し得るだろう。
【００２２】
一般にリガンドのうちの一方が保有するであろうレポーター部分が、直接的に検出可能な部分、たとえば金属ゾル（例  金ゾル）、発色団または蛍光物質（例  シアニン、フタロシアニン、メロシアニン（merocyanint）、トリフェニルメチル、equinanceなど。（Topics in Applied Chemistry, Infrared Absorbing Chromophores, M. Matsuoka編, Plenum Press, New York, NY, 1990, Topics in Applied Chemistry, The Chemistry and Application of Dyes, Waring 等, Plenum Press, New York, NY, 1990およびHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Molecular Probes Inc. 1996参照）、放射性ラベル、酵素、磁性粒子、混濁誘発剤（turbidity inducing agent）などのための結合部位であってもよく、あるいは、このような直接的に検出可能な部分をすでに保有していてもよい。レポーター部分が固定化リガンドに保有されている場合、一般に、レポーター部分が直接的に検出可能な部分のための結合部位となり、リガンドが複合体を形成しているときには、該結合部位が活性化またはより一般的には不活性化される。
【００２３】
レポーター部分は、非固定化リガンドに保有されることが好ましい。
本発明の好ましい態様では、非固定化リガンドは、ラベル化された、たとえば酵素、あるいは発色団または蛍光物質でラベル化されたペプチド肝細胞毒素、具体的には、ノジュラリン、ミクロシスチンLRまたはミクロシスチンYR、あるいは代わりにオカダ酸から選ばれる肝細胞毒素である。
【００２４】
放射性標識を用いるラベルが可能ではあるのだが、このアッセイは素人の使用者による現場での使用を主に意図しているため、視覚可能なシグナル、例えば発色団、蛍光発色団、リン光部分、混濁誘発剤、ガス発生誘発剤などを与えるレポーター部分を使用することが好ましい。
このシグナル形成部分が、リガンドの一つにある結合部位に結合する物質である場合、その形成部分は結合および未結合フラクションの分離後に、結合のまたは未結合フラクションとおあつらえ向きに接触させることが都合良いだろう。
【００２５】
一般的に、上記シグナルが結合フラクションに由来するものであるとき、リガンドを検出するかまたは生成して検出する前に基質を、例えば水で洗い落として、未結合のフラクションを流し去ることが好ましい。
ホスファターゼ標的毒素を生成する藻類またはシアノバクテリアのいかなる種または株も、本発明に供することができるが、それは特に毒素を生成するシアノバクテリアの株、例えばMicrocystis aeroginosa、Anabena種、Nodularia spuragenaおよびAnabena flus-aquaeまたは藻類に適用される。これにより、例えば毒素microcystin-LRおよびmicrocystin-YRはMicrocystis sp.により生成され、毒素nodularinはNodularia sp.により生成され、および毒素オカダ酸はProrocentrum sp.により生成される。
【００２６】
本方法による測定に供される毒素は、同様に、藻類またはシアノバクテリアにより産生されるホスファターゼ標的毒素であってもよいが、好ましい観点においては、ペプチド毒素は（その中でmicrocystinおよびnodularinが最も効果的である）肝細胞毒素またはオカダ酸である。
これにより、その最も一般的な意味において、本発明の方法は、ホスファターゼ標的毒素で汚染されたと推測されるサンプルを、毒素結合リガンド、およびレポーター分子と単純に接触させること、および固相に結合するかまたは溶液中で遊離のリポーター分子を測定することを包含する。このレポーター分子は、同時と、連続に、または別個の何れかで任意の順に、前記毒素と当該リガンドの結合部位を巡って競合することができ、必要に応じて調査するサンプルにさらす前に前記結合リガンドに結合させてもよい。
【００２７】
結合フラクションは、リポーターの評価の前に、好適な手段、例えば沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー手段、毛細管作用により、または単に液を排出することにより、未結合フラクションから分離することができる。この固相は、例えばディップスティック（dipstick）の形態、または公知の形態、例えばポリマー形態または磁性ビーズ形態、例えばDynabeadsTM（Dynal ASから入手可能）における固体マトリックスであってもよい。本発明の好ましい態様において、前記毒素結合リガンドが固定化された固相はDynabeadsTMの形態にある。
【００２８】
リポーター分子は、本発明の具体的態様によって、結合または未結合フラクションのいずれにおいて評価してもよいが、結合フラクションにおいて評価することが好ましい。
固定化リガンドは、公知の手段により、例えばリガンドを公知の固体支持体、または現在において分離または固定化に広く用いられまたは提案される材料のいずれかに結合またはカップリングさせることにより固定化してもよい。例えば、固相は、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、繊維または毛細管、または微量滴定ストリップ（microtitre strips）、井戸状の管または板などの形態をとってもよく、ガラス、シリカ、ラテックス、ポリマー材料または磁性ビーズから作られることが都合よい。リガンドを固体支持体に結合させるための技術は公知であり、文献に広く記載されている。本発明の好ましい態様では、ホスファターゼ標的毒素結合リガンドを固定化した固相は、DynabeadsTMの形態である。
【００２９】
本発明のアッセイ方法は、複雑な実験装置の必要性なしで行うことができることにおいて利点があり、比較的未熟な、または未熟な者によって行うことができる。したがって、このアッセイ方法は、家庭、店または現場での使用に好適であり、集約的な労力または危険な化学薬品の必要性なしで迅速にかつ容易に行うことができる。
【００３０】
本発明のアッセイにおける特別の利点は、例えば飲料水中の試験において毒素が非常に低レベルで存在するサンプルを分析する際、またはホスファターゼ標的毒素による汚染可能性を評価する際に、決定的に重要となる非常に高い程度の感度である。典型的には、このアッセイは、ピコモル濃度、例えば１０ｐＭ程度における毒素の検出が可能である。このアッセイは、１５〜５６０ｐＭの範囲における毒素を検出するのに用いることができることが都合良い。
【００３１】
存在する技術と比較した、本発明のアッセイのさらなる利点は、本発明のアッセイが、特に例えば、サンプルが貝類から採取される場合に、分析中のサンプルに存在するかもしれない内因的なホスファターゼの存在によっては影響を受けないことである。
本発明の一つの態様において、タンパク質ホスファターゼを固体支持体上に固定化させ、固定化されたホスファターゼを調査するサンプルと接触させ、サンプル中に存在するホスファターゼ標的毒素はすべて固定化ホスファターゼに結合する。毒素とホスファターゼ結合部位を巡って競合するリポーター分子源を添加する。このリポーター分子は、該結合部位から、毒素分子およびリポーター分子の相対濃度に依存した程度において毒素分子を排除する。リポーター分子の結合の程度は、調査するサンプルに存在する毒素の測定を容易にする。好ましいリポーター／標識（ラベル）としては、放射性標識、発色団（蛍光発色団を含む）および色素原または蛍光原となる生成物を生じさせる酵素が挙げられる。シンチレーション近接標識および光散乱において測定可能な変化を生じさせる標識をも考慮に入れるべきである。
【００３２】
別の態様において、固定支持体に固定化されリポーターブロックされたホスファターゼ分子を調査するサンプルと接触させて、該サンプル中に存在するホスファターゼ標的毒素を、いずれもホスファターゼ結合リポーター分子と競合させて、該サンプルに存在する毒素の量に比例した程度において、それらを固相から水相に移し変える。固相に結合したまま残っているリポーター分子の量を評価して、調査するサンプルに存在する毒素の測定を容易にする。
【００３３】
さらなる観点から、本発明は、本発明に係るシアノバクテリアまたは藻類のホスファターゼ標的毒素を検出するためのキットを提供し、該キットは、リガンドを固定化させた固相と、非固定化リガンド、好ましくは水溶液中にあるか固定化リガンドに複合化されたものを含む。ここで、前記固定化リガンドおよび非固定化リガンドのいずれかは、直接的または間接的に検出可能な部分、または前記固定化リガンドおよび非固定化リガンドの一方と結合し、かつ検出可能なシグナルを発生させることができるリポーター部分を含む。好ましくは、前記検出可能な部分またはシグナルは実験装置なしで直接読み出し可能である。
【００３４】
一つの好ましい態様において、本発明のキットは、
ホスファターゼ標的毒素結合リガンドを固定化させた固相と、
ホスファターゼ標的毒素による前記毒素結合リガンドへの結合を競合的に阻害して、実験装置なしに読み出し可能なシグナルを発生させることができるリポーター分子とを含む。
【００３５】
本発明のキットの特に好ましい態様は、表面に固定化させたタンパク質ホスファターゼを有する磁気的に移動可能なポリマー微小球体と、
前記タンパク質ホスファターゼへのシアノバクテリア毒素の結合を競合的に阻害可能な、金ゾル標識したペプチド肝細胞毒分子を含む。
さらに、本発明のキットの特に好ましい態様は、固定化したタンパク質ホスファターゼを表面に有し、磁気作用によって動かすことができるポリマー微小球；
金ゾルで標識され藻類の毒素が前記タンパク質ホスファターゼに結合するのを競合的に阻害できるオカダ酸分子含む。
【００３６】
他の好ましい側面において、前記キットの使用は、毒素が結合しているリガンドをその上に固定化し、発色団（または蛍光物質など）で標識した、競合的に結合するリガンドをしみこませた多孔性セルロースの基質をサンプルの水または貝の流動体に浸漬すること、飽和した基質を所定の期間（サンプルから除去するか、プリセット量のサンプルに移すかのどちらか）インキュベートすること、たとえば基質を毒素フリーの水で流すか、基質を毒素フリーの水の所定量に所定の期間浸して取り去ることにより、結合していない標識リガンドを除去すること、および基質の色または浸漬水の色を検査することを含んでいる。
【００３７】
望ましくは、前記基質を支持体上に乗せ、好ましくは該支持体は標定の色で印をつけ、基質の色または浸漬水の色との比較を容易にして、毒素濃度を決定するか、毒素濃度が１つまたはそれ以上の閾値より上かまたは下であるかどうかを示す。
ここで本発明を以下の限定的でない実施例に基づき説明する。
【００３８】
【実施例】
材料
ミクロシスチンYR、ミクロシスチン-LR、オカダ酸、ノジュラリン、カリキュリンA、タウトマイシンはCalbiochem（San Diego, CA）から購入できる。無担体Na125Iおよび［Y-32P］ATPはAmersham（Little Chalfont, UK）から得られる。
【００３９】
アルブミン（RIAグレード）、酢酸アンモニウム、クロラミンT、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジチオエリスリトール（DTE）、EDTA、EGTA、グリセロール、Hepes、ヒストンII-AS、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびトリプシン阻害剤（ダイズ）はSigma（Sｔ Louis, MO）から購入できる。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸（TFA）はRathburn（Walkerburn, Scotland）から購入できる。部分精製のタンパク質ホスファターゼ2AはUpstate Biotechnology（Lake Placid, NY）から購入するか、Resinkら（Eur. J. Biochem.133：455-461（1983））に従い精製する。
ミクロシスチン-YRのヨウ素化
ミクロシスチンYR（10μg）をCiechanoverら（PNAS 77:1365-1368(1980)）が記載したようにクロラミンTを用いて1mCi無担体Na125I（37MBq）でヨウ素化する。
【００４０】
ヨウ素化反応の次に、ヨウ化物をRunnegarら（Toxicon 24:506-509(1986)）の方法に従い、Sep-PakTMプラスカートリッジ（Waters, Milford,MA）を用いて［125I］ミクロシスチン-YRから分離する。［125I］ミクロシスチン-YRをChrompack（Raritan, NJ）の3×250mm Inertsil ODS-2 HPLCカラムに適用し、アセトニトリル勾配により溶離する。
競合的結合アッセイ
50mM Hepes（pH7.2）、1mM EDTA、0.3mM EGTA、1mM DTE、5mM MnCl2、0.5mg ml-1 BSAおよび0.2mg ml-1トリプシンインヒビターで緩衝化された0.5ml容量中で競合的結合アッセイを実施する。100% DMSO中で希釈した藻類の毒素を10% DMSOの最終濃度が0-100nMになるように添加してアッセイする。［125I］ミクロシスチン-YR（1Ci/13ng）を添加して35pMにする。タンパク質ホスファターゼ2A（30pM）を最後に添加し、反応混合物を氷上で一晩インキュベートする。タンパク質ホスファターゼ2Aと結合した［125I］ミクロシスチン-YRをBio-Rad（Hercules,CA）の0.7×15cmカラム中でPharmacia（Uppsala, Sweden）のSephadexTM G-50 fineを用いて、ゲル濾過によりフリーの［125I］ミクロシスチン-YRから分離する。1mM EDTA および0.3mM EGTAを有する50mM Hepes緩衝液（pH7.2）を分離に用いて4℃で行う。タンパク質ホスファターゼ2Aと結合する［125I］ミクロシスチン-YRを含む分画を集め、その放射能をシンチレーションカウンティングにより定量する。ミクロシスチン-LRを過剰に（1μM）添加したコントロール反応において［125I］ミクロシスチン-YRの非特異的な結合が検出される。
【００４１】
【実施例１】
タンパク質ホスファターゼ2Aを磁性ビーズに結合させる（直接的にビーズに結合させるか、ホスファターゼのビオチニル化経由で結合させる）。固定化したタンパク質ホスファターゼをその後、サンプルおよび放射能標識した毒素（たとえば［125I］ミクロシスチン-YR）と混合する。前記の固定化したタンパク質ホスファターゼを反応混合物から磁力により分離する。タンパク質ホスファターゼ（磁性ビーズ）に関係する放射能をシンチレーションカウンティングによって検出する。タンパク質ホスファターゼに関係する放射能標識の量は、サンプル中の毒素と結合しているホスファターゼの関数として減少する。
【００４２】
【実施例２】
タンパク質ホスファターゼ2Aを磁性ビーズに結合させる（直接的にビーズに結合させるか、ホスファターゼのビオチニル化経由で結合させる）。固定化したタンパク質ホスファターゼをその後、サンプルおよび着色ビーズと結合させた毒素と混合する。前記の固定化したタンパク質ホスファターゼを反応混合物から磁力により分離する。タンパク質ホスファターゼ（磁性ビーズ）に関係する着色ビーズを視覚または低倍率の顕微鏡（たとえばNikon TMS）により評価する。タンパク質ホスファターゼ（磁性ビーズ）に関係する着色ビーズの量は、サンプル中の毒素と結合しているホスファターゼの関数として減少する。
【００４３】
【実施例３】
タンパク質ホスファターゼ2Aを磁性ビーズに結合させる（直接的にビーズに結合させるか、ホスファターゼのビオチニル化経由で結合させる）。固定化したタンパク質ホスファターゼをその後、サンプルおよび固定化酵素を担持するビーズ上に固定化した毒素と混合する。前記酵素は、色素原のまたは蛍光原の基質との好適なインキュベートで検出可能な生成物（着色または蛍光）を生成できる。前記の固定化したタンパク質ホスファターゼを反応混合物から磁力により分離する。タンパク質ホスファターゼ（磁性ビーズ）に関係する着色または蛍光をそれぞれ分光法または蛍光定量法により測定する。磁性ビーズに関係する色/蛍光の量は、サンプル中の毒素と結合しているホスファターゼの関数として減少する。
【００４４】
【実施例４】
シンチレーション近接アッセイ：
タンパク質ホスファターゼをビオチニル化し、ストレプトアビジンと発光物質（scintillant）とでプレコートしたウェル（たとえばNEN により供給されるFlashPlate PLUSストレプトアビジン SMP103）に固定化する。サンプルおよび［125I］ミクロシスチン-YRをウェルに添加する。固定化したタンパク質ホスファターゼに結合した［125I］ミクロシスチン-YRの量をシンチレーションカウンティングにより検出する。
【００４５】
【実施例５】
さまざまな毒素の存在下におけるタンパク質ホスファターゼ2Aへの［125I］ミクロシスチン-YRの結合の阻害
【００４６】
【表１】
0004460779.tif 000002
【００４７】
1 試験した化合物を上述したように［125I］ミクロシスチン-YRおよびタンパク質ホスファターゼ2Aとインキュベートした。
2 IC50値は、タンパク質ホスファターゼ2Aへの［125I］ミクロシスチン-YRの結合の50%阻害を得るのに必要な濃度を表す。これらの値をFig.3に記載したように測定した。前記データは少なくとも3つの別々の実験の平均値を表す。
【００４８】
【実施例６】
タンパク質ホスファターゼアッセイとの比較において競合的結合アッセイに対する外因性化合物の影響
【００４９】
【表２】
0004460779.tif 000003
【００５０】
1タンパク質ホスファターゼ2Aを、50mM Hepes（pH7.2）中に溶解した、前記の化合物と、または緩衝液単独で（コントロール）、氷上で30分間プレインキュベートした。
ホスファターゼ活性を上述したホスホヒストンの脱リン酸化により測定した。
%活性はコントロール反応と比較したものである。
2競合的結合アッセイにおける活性は、緩衝液に溶解した外因性化合物の存在下および緩衝液単独の場合とを比較したタンパク質ホスファターゼ2Aの［125I］ミクロシスチン-YRに対する結合能力を表す。前記データは少なくとも3つの別々の実験の平均値±標準誤差を表す。
【００５１】
【実施例７】
ノジュラリンおよびミクロシスチン−LRに関する結合アッセイの感度
【００５２】
【表３】
0004460779.tif 000004
【００５３】
1ノジュラリンおよびミクロシスチン-LRを表示した濃度で逆浸透水、飲料水、または海水に溶解した。上述したようにして、これらの溶液の300μl分量をタンパク質ホスファターゼ2Aの結合に関し［125I］ミクロシスチン-YRと競合する能力について試験した。
2逆浸透水で1/10に希釈した海水。
【００５４】
前記データは、平均値±標準誤差を示す。
【００５５】
【実施例８】
HPLC分析およびタンパク質ホスファターゼ結合アッセイにより測定された貝抽出物中のオカダ酸当量
【００５６】
【表４】
0004460779.tif 000005
【００５７】
1 ノルウェーの海岸沿いで採集したムラサキイガイの肝膵すいから抽出物をつくった。
2 HPLCにより抽出物をオカダ酸当量に関して分析した。
3抽出物を100%DMSO中で希釈し、上述した結合アッセイを用いて、タンパク質ホスファターゼ2Aへの結合を巡り［125I］ミクロシスチン-YR と競合するそれらの能力について試験した。オカダ酸当量の濃度は、100%DMSOに溶解したオカダ酸の標準曲線とデータを比較することによって決定した。
【００５８】
【実施例９】
添付図
添付図の図１は、タンパク質ホスファターゼ結合毒素の検出に関する競合的結合アッセイの概要図である。
タンパク質ホスファターゼ2Aを［125I］ミクロシスチン-YRとタンパク質ホスファターゼ2Aに指向する他の毒素とインキュベートする。該毒素は、ホスファターゼとの結合を巡って［125I］ミクロシスチン-YRと競合する。
【００５９】
大量の毒素の添加は、ホスファターゼに対する［125I］ミクロシスチン-YRの結合を減少させおよびその逆も同様である結果になる。結合平衡に達した後、タンパク質ホスファターゼ2Aに結合した［125I］ミクロシスチン-YRをフリーの［125I］ミクロシスチン-YRからゲル濾過クロマトグラフィーによって分離する。ホスファターゼと結合した［125I］ミクロシスチン-YRを含有する分画を集め、放射能の量をシンチレーションカウンティングにより測定する。
【００６０】
添付図の図２は、異なる藻類の毒素量の増加がタンパク質ホスファターゼ2Aへの［125I］ミクロシスチン-YRの結合に及ぼす効果を示す。
タンパク質ホスファターゼ2A（30pM）を35pM［125I］ミクロシスチン-YR（1Ci/13ng）および図に示した0-100nMの異なる藻類毒素の存在下でインキュベートした。
【００６１】
タンパク質ホスファターゼ2Aと結合した［125I］ミクロシスチン-YRをゲル濾過クロマトグラフィーにより単離し、その放射能をシンチレーションカウンティングにより測定した。各曲線は少なくとも3つの別々の実験の平均値を示す。
添付図の図３は、競合的結合アッセイにおけるミクロシスチン-LRの結合に関するIC50を示す。
【００６２】
タンパク質ホスファターゼ2Aへの［125I］ミクロシスチン-YRの結合を、非結合［125I］ミクロシスチン-YR（Co-Cx）と結合［125I］ミクロシスチン-YR（Cx）との比として、ミクロシスチン-LRの濃度に対してプロットした。Coは、ミクロシスチン-YRが存在しない場合の結合［125I］ミクロシスチン-YRの量を表し、Cxは、さまざまな濃度のミクロシスチン-LR存在下における結合［125I］ミクロシスチン-YRの量を示す。
【００６３】
添付図の図４は、過剰のミクロシスチン-LRが存在する場合のタンパク質ホスファターゼ2Aに結合した［125I］ミクロシスチン-YRの安定度を示す。
タンパク質ホスファターゼ2A（1nM）を［125I］ミクロシスチン-YR（100pM）の存在下で1時間インキュベートした。ミクロシスチン-LR（2μM）を反応混合物にゼロの時点で添加した。表示された時点におけるタンパク質ホスファターゼ2Aに結合した［125I］ミクロシスチン-YRの量を、上述のゲル濾過およびシンチレーションカウンティングにより測定した。曲線は４つの別々の実験の平均値を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、タンパク質ホスファターゼ結合毒素の検出に関する競合的結合アッセイの概要図である。
【図２】  図２は、異なる藻類の毒素量の増加がタンパク質ホスファターゼ2Aへの［125I］ミクロシスチン-YRの結合に及ぼす効果を示す。
【図３】  図３は、競合的結合アッセイにおけるミクロシスチン-LRの結合に関するIC50を示す。
【図４】  図４は、過剰のミクロシスチン-LRが存在する場合のタンパク質ホスファターゼ2Aに結合した［125I］ミクロシスチン-YRの安定度を示す。
【図１】
0004460779.tif 000006
【図２】
0004460779.tif 000007
【図３】
0004460779.tif 000008
【図４】
0004460779.tif 000009