(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-ＰＡ）を生産する方法において、３０℃から３５℃の間の温度の生産期において、無血清培地で前記ｔ−ＰＡをコードする核酸を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養することを含む方法であって、ＩＩ型ｔ−ＰＡ分子に対するＩ型ｔ−ＰＡ分子の割合を、３７℃で実行する同一の方法と比較して増加させる方法。
【請求項２】
生産期の培地が２ｍＭまでのブチラート塩を含み、ＩＩ型ｔ−ＰＡ分子に対するＩ型ｔ−ＰＡ分子の割合を、ブチラートの非存在下で実行する同一の方法と比較して増加させる方法。
【請求項３】
ブチラート塩が０．３５から２ｍＭの濃度で存在する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-ＰＡ）を生産する方法において、３７−４０℃の温度で生育期において無血清培地中で上記ｔ-ＰＡをコードする核酸を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養し、ここで上記培地は八面体配位構造を取り得て好む１０ｎＭから１００μＭの二価金属カチオンを含み；３７−４０℃の温度で過渡期において上記細胞を培養し；生産期に入って４８時間後に温度が３０℃と３５℃の間に下げられ、０．７５から１．５ｍＭのブチラート塩が培地に添加される生産期において上記細胞を培養することを含む方法であって、ＩＩ型ｔ−ＰＡ分子に対するＩ型ｔ−ＰＡ分子の割合を、３７℃でブチラート又は該カチオンの非存在下で実行する同一の方法と比較して増加させる方法。
【請求項５】
血漿成分又はＧ０／Ｇ１期において細胞を阻害する細胞周期阻害剤が生育期の前又は間に培地に添加される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サイロキシン、トリ-ヨードチロニン又はキニジンが培地に添加される請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、哺乳類細胞培養における糖タンパク質の生産方法に関する。さらに具体的には、本発明は、一部の糖タンパク質においてのみ占有されているＮ結合グリコシル化部位の占有率を高めることとなる哺乳類細胞における糖タンパク質の生産方法を提供する。特に、哺乳類細胞培養におけるＩ型組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-ＰＡ）画分を増加させるための方法が開示される。
【０００２】
(関連する開示と技術の記述)
糖タンパク質
糖タンパク質は、その多くが組換ＤＮＡ技術の手法により生産されているが、診断及び治療薬剤として極めて重要なものである。真核細胞環境においては、翻訳中及び翻訳後の修飾により分泌又は膜貫通型タンパク質にグリコシル化が伴う。細胞表面に向かう予定になっているタンパク質は、まず最初に、新生鎖のアミノ末端に又はその近傍に存在するシグナル配列に媒介されて、小胞体（ＥＲ）のルーメンへと翻訳共役的に移行される。通常、小胞体内部において、シグナル配列が取り除かれ、Ａｓｎ-Ｘ-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（ここでＸはおそらくプロリンを除く任意のアミノ酸である）の一部として存在するアスパラギン（Ｎ）残基（一又は複数）に高マンノースコアオリゴサッカライド単位が結合される。
この翻訳共役的グリコシル化過程の効率は、小胞体に移行する時のペプチド鎖の適切なコンフォメーションの提示に依存している（Imperiali 及びO'Connor, Pure & Applied Chem., 70:33-40 (1998)）。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位へはタンパク質が折り畳まれた後では、もはや接近できなくなる可能性がある(Kornfeld及びKornfeld, Ann Rev. Biochem. 54:631-664(1985))。次にタンパク質は小胞体から、硫酸化及び高マンノースオリゴサッカライド鎖から複合型オリゴサッカライドへのプロセッシングのような更なる修飾が行われるゴルジ装置へと移動し、タンパク質はそれらの適切な目的地へと向かうことになる。
Ｎ結合型オリゴサッカライドは糖タンパク質による治療の製薬上の性質（例えば、インヴィボにおける半減期及び生物学的活性）に対して多大な影響を与え得る。幾つかの生物過程の変数（例えば、バイオリアクター型、ｐＨ、培地組成、及びアンモニア）は、タンパク質のグリコシル化に有意な影響を与えることが示されている。末端グリコシル化（シアリル化及びガラクトシル化）及びＮ-グリカン分岐における変化が、最も高頻度に観察される変化である。
【０００３】
組織プラスミノーゲン活性化因子の糖質構造
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-ＰＡ）は、糖タンパク質であり、その生理学的役割がプラスミノーゲンからプラスミンへと変換することで、線維素溶解の過程を開始し又は促進するものである複数ドメイン構造のセリンプロテアーゼである。ｔ-ＰＡに対する初期の医学的な興味は、フィブリンの非存在下に比べて存在下の方が相対的に活性が高いことによって生じた。野生型ｔ-ＰＡはフィブリンの非存在下では低い活性を示す酵素であるが、フィブリンの存在により、プラスミノーゲンを活性化する能力が著しく促進される。組換体ヒトｔ-ＰＡは、双方とも通常は線維素含有血栓による血管閉塞から生じる急性心筋梗塞及び肺の塞栓症の治療における線維素溶解剤として治療上用いられる。
その著しいフィブリン特異性に加えて、ｔ-ＰＡは幾つかの更なる識別性のある性質を示す：
（ａ）T-PAは、分子の一本鎖型がかなりの酵素活性を持つ点で殆どのセリンプロテアーゼと異なる。幾つかの小分子基質に対して、またフィブリンの非存在下においてプラスミノーゲンに対して、二本鎖ｔ-ＰＡは一本鎖ｔ-ＰＡに比べてより高い活性を有している。しかし、フィブリンの存在下では、ｔ-ＰＡの二形態は同等に活性である（Rijken等, J. Biol. Chem., 257:2920-2925 (1982): Lijnen等, Thromb. Haemost., 64:61-68 (1990): Bennett等, J. Biol. Chem., 266:5191-5201 (1991)）。殆どの他のセリンプロテアーゼは酵素前駆体として存在しており、最大酵素活性を発揮するために二本鎖型へのタンパク質分解性切断が必要である。
（ｂ）インヴィボ及びインヴィトロにおけるｔ-ＰＡの作用は、セルピン、PAI-I により阻害できる(Vaughan等, J. Clin. Invest., 84:586-591 (1989): Wiman等, J. Biol. Chem., 259:3644-3647 (1984))。
（ｃ）T-PAはインヴィトロにおいて、フィブリンとμＭレンジのＫｄで結合する。
（ｄ）T-PAはインヴィボにおいて、肝臓における一又は複数のレセプターにより媒介される速いクリアランスを有する（Nilsson等, Thromb. Res., 39:511-521 (1985): Bugelski等, Throm. Res., 53:287-303 (1989): Morton等, J. Biol. Chem., 264:7228-7235 (1989)）。
【０００４】
ｔ-ＰＡの実質的に純粋な形態は、１９８８年６月２１日発行のCollen等の米国特許第4,752,603号により天然原料から最初に生産され、インヴィボにおいて活性が試験された（Rijken等, J. Biol. Chem., 256:7035 (1981)もまた参照のこと）。Pennica等(Nature. 301:214 (1983)はｔ-ＰＡのＤＮＡ配列を決定し、このＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推定した（１９８８年８月２３日発行の米国特許第4,766,075号）。
ヒト野生型ｔ-ＰＡは、アミノ酸位置１１７、１８４、２１８、及び４４８に潜在的なＮ結合グリコシル化部位を有する。ＣＨＯ細胞での発現により生産された組換体ヒトｔ-ＰＡ（ACTIVASE（登録商標）ｔ-ＰＡ）は、アミノ酸１１７に位置する高マンノースオリゴサッカライド及び１８４番のアスパラギン及び４４８番のアスパラギンに位置する複合オリゴサッカライドからなるおよそ７％の糖質を含むと報告されている（Vehar等, "Characterization Studies of Human Tissue Plasminogen Activator produced by Recombinant DNA Technology." Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, LI:551-562 (1986)）。
【０００５】
アミノ酸位置２１８番は天然のｔ-ＰＡ又は野生型組換体ｔ-ＰＡにおいてはグリコシル化されていることは見いだされなかった。位置１１７番と４４８番は、常にグリコシル化されているようであるが、一方、位置１８４番は一部の分子においてのみグリコシル化されていると考えられる。位置１８４番でグリコシル化されているｔ-ＰＡ分子は、Ｉ型ｔ-ＰＡと呼ばれ、位置１８４番がグリコシル化されていない分子はＩＩ型ｔ-ＰＡと呼ばれている。メラノーマに由来するｔ-ＰＡでは、ＩＩ型ｔ-ＰＡに対するＩ型ｔ-ＰＡの割合は約１：１である。ＣＨＯ細胞由来のヒトｔ-ＰＡにおける糖質構造の最も包括的な分析が、Spellman等, J. Biol. Chem., 264:14100-14111 (1989)によって行われ、少なくとも１７の異なるアスパラギン結合型糖質構造が該タンパク質上に検出されることを示した。これらの構造は、位置１１７における高マンノース構造から、位置１８４及び４４８番のジ-、トリ-、及びテトラ-触角状Ｎ-アセチルラクトサミン型構造にわたる。Ｉ型及びＩＩ型ｔ-ＰＡにおいて、同じ細胞系列から単離された場合１１７番のアスパラギンと４４８番のアスパラギンの位置で同様にＮ-グリコシル化されていることが報告されている。さらに詳細には、Parekh等, Biochemistry. 28:7644-7662 (1989)を参照のこと。ＩＩ型ｔ-ＰＡの特異的な線維素溶解性活性はＩ型ｔ-ＰＡの活性よりも約５０％高いことが示されている（Einarsson等, Biochim. Biophys. Acta. 830:1-10 (1985)）。さらに、Ｉ型の増加は半減期の延長と関連していた（Cole等, Fibrinolysis. 7:15-22 (1993)）。しかしながら、脱シアル化されたｔ-ＰＡと同様にＩ型ｔ-ＰＡに結合する一部の糖質が欠けたＩＩ型ｔ-ＰＡは標準のｔ-ＰＡよりも長いＴ1/2ベータを示した（Beebe及びAronson. Thromb. Res., 51:11-22 (1988)）。
【０００６】
ｔ-ＰＡの配列解析により５つのドメインを持つものとして分子が同定された。各々のドメインは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミノーゲン、 プロトロンビン、フィブロネクチン、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）のような他のタンパク質の相同な構造又は機能領域に関連して同定されている。これらのドメインは、ｔ-ＰＡのアミノ酸配列のＮ末端を起点にして、アミノ酸１からアミノ酸約４４に存在するフィンガー（Ｆ）ドメイン、アミノ酸約４５からアミノ酸約９１に存在する成長因子（Ｇ）ドメイン（ＥＧＦに対する相同性に基づく）、アミノ酸約９２からアミノ酸約１７３に存在するクリングル-１（Ｋ１）ドメイン、アミノ酸約１８０からアミノ酸約２６１に存在するクリングル-２（Ｋ２）ドメイン、及びアミノ酸約２６４からカルボキシル末端であるアミノ酸５２７に存在するセリンプロテアーゼ（Ｐ）ドメインとして示される。これらのドメインは本質的に互いに隣接しており、短い「リンカー」領域により連結される。これらのリンカー領域により、成熟ポリペプチドの全アミノ酸数が５２７になるようにされるが、３つの付加的な残基（Gly-Ala-Arg）がしばしばアミノ末端に見いだされる。この付加的なトリペプチドは一般に不完全な前駆体プロセッシングの結果であると考えられており、機能性を与えることは知られていない。天然ｔ-ＰＡは、二本鎖型分子を生じさせるために（セリンプロテアーゼドメインに位置する）アミノ酸位置２７５とアミノ酸位置２７６の間で切断され得る。
【０００７】
各々のドメインはｔ-ＰＡ分子の生物学上重要な性質の全体に様々な方法で貢献する。ドメイン欠損研究により、フィンガー、成長因子、もしくはクリングル-２ドメインが欠失する結果、フィブリンに対して低親和性結合変異体が生じる（van Zonneveld等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:4670-4677 (1986): Verheijen等, EMBO J., 5:3525-3530 (1986)）：しかし、より最近得られた置換変異体の結果は、クリングル-２ドメインが初期に予想されていた程フィブリン結合に関与していないことが示されている（Bennett等、上掲）。ドメイン欠損研究により、フィンガー及び成長因子ドメインが肝臓によるクリアランスに関係づけられた（Collen等, Blood, 71:216-219 (1988): Kalyan等, J. Biol. Chem., 263:3971-3978 (1988): Fu等, Thromb. Res., 50:33-41 (1988): Refino等, Fibrinolysis, 2:30 (1988): Larsen等, Blood, 73:1842-1850 (1989): Browne等, J. Biol. Chem., 263:1599-1602 (1988)）。クリングル-２ドメインはリジンとの結合の原因となっている。セリンプロテアーゼドメインはｔ-ＰＡの酵素活性の原因であり、変異がフィブリンとの結合及びフィブリン特異性（おそらく、フィブリンとの直接的相互作用）に影響を与えることが示されている特異的領域、及びフィブリン特異性のみが変更される（おそらくフィブリンとの間接的相互作用）領域を含んでいる（Bennett等、上掲）。部位特異的変更による変異体に関する研究により、ｔ-ＰＡのグリコシル化のクリアランスへの関与が示される（Lau等, Bio Technology. 5:953-958 (1987): Lau等, Bio Technology. 6:734 (1988)）。
【０００８】
クリングル-２及びプロテアーゼドメインによって構成されるｔ-ＰＡの非グリコシル化変異体は、野生型ｔ-ＰＡよりもより遅延した血漿中でのクリアランスを有することが記載されている（Martin等, Fibrinolysis. 4: (Suppl. 3):9 (Abstract 26) (1990)）。また、ｔ-ＰＡの位置１８４及び４４８におけるオリゴサッカライド構造を変更する影響が、Howard等, Glycobiology, 1:411-418 (1991)により調べられた。Hotchkiss等（Thromb. Haemost., 60:255-261 (1988)）はｔ-ＰＡ分子からオリゴサッカライド残基を選択的に取り除き、これらの残基の除去がｔ-ＰＡのクリアランス率を減少させることを証明した。また、これら研究者及びLau等（(1987).上掲、(1988).上掲）が、位置１１７におけるグリコシル化を阻害するｔ-ＰＡ変異体Ｎ１１７Ｑ（野生型ヒトｔ-ＰＡの位置１１７におけるアスパラギンがグルタミンに置換されている）を作成した。この変異体は、この位置の高マンノースオリゴサッカライドの酵素的な除去により得られたものと同様に、野生型ヒトｔ-ＰＡに比べて約２倍遅いクリアランス速度を示した。１９８７年９月２３日公開の欧州特許出願公開第238,304号及び１９８７年７月１日公開の欧州特許出願公開第227,462号も参照のこと。
【０００９】
幾つかの報告により、ｔ-ＰＡの糖質部分は当該酵素のインヴィトロにおける活性に影響を与えることが示唆された（Einarsson等. 上掲: Opdenakker等, Proc. Sci. Exp. Biol. Med., 182:248-257 (1986)）。ｔ-ＰＡは、肝臓内皮細胞のマンノースレセプター及び実質細胞のガラクトースレセプターによりエンドサイトーシスされる。実際、哺乳類細胞培養において生産された組換体ヒトｔ-ＰＡのインヴィボにおけるクリアランスは糖質構造、特に高マンノースオリゴサッカライドにより影響を受けた（Hotchikiss等, 上掲）。アミノ酸位置１０３にグリコシル化部位を付加し、アミノ酸位置１１７の天然に存するグリコシル化部位を除去し、天然ヒトｔ-ＰＡのアミノ酸位置２９６から２９９の配列をＡＡＡＡによって置き換えたｔ-ＰＡ変異体（TNKｔ-ＰＡと称する）は、増加した循環性の半減期を持ち、野生型ヒトｔ-ＰＡよりも著しく優れたフィブリン特異性を有することが示された（Keyt等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:3670-3674 (1994)）。
【００１０】
天然ｔ-ＰＡ以外の一以上の糖結合形態を持つ糖タンパク質
ｔ-ＰＡのクリングル-２及びセリンプロテアーゼドメインにより構成される分子であるｔＰＡ-６を発現する細胞において、ｔ-ＰＡ-６は二つの糖結合形態、すなわち４４８番のアスパラギンが占有されているモノグリコシル化体及び４４８番のアスパラギン及び１８４のアスパラギンが占有されているジグリコシル化体に処理される（Berg等, Blood. 81:1312-1322 (1993)）。
プラスミノーゲンは二つの糖結合形態で存在する。通常、「プラスミノーゲン-１」、「プラスミノーゲン１」又は「１型プラスミノーゲン」と呼ばれるよりグリコシル化された形態は、天然のヒトプラスミノーゲン分子のアミノ酸位置３４５（Thr345）に接着されたガラクトサミンをベースにしたオリゴサッカライド及びアミノ酸位置２８８（Asn288）に接着された複合グリコサミンをベースにしたオリゴサッカライドを有する。通常、「プラスミノーゲン-２」、「プラスミノーゲンＩＩ」又は「２型プラスミノーゲン」と呼ばれるグリコシル化が少ない形態は、アミノ酸位置３４５（Thr345）に一つのオリゴサッカライド鎖を有する（Hayes及びCastellino, J. Biol. Chem., 254(18):8772-8776. 8777-8780(1979); Lijnen等, Eur. J. Biochem., 120:149-154 (1981): Takeda等, Thrombosis Ressearch, 39:289-296 (1985)）。
【００１１】
不定の位置が占有されている（Ｎ-及びＯ-グリコシル化部位が占有されている異形）他の糖タンパク質には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Okamoto等, Archives of Biochemistry and Biophysics, 286: 562-568 (1991)）、インターフェロンγ（Curling等, Biochem. J., 272:333-337 (1990)）、プロテインＣ（Miletich及びBroze. J. Biol. Chem., 265:11397-11404 (1990)）、及びインターロイキン-２が含まれる。γ-インターフェロンのグリコシル化は、おそらくはグリコシル化効率に劇的な変動をもたらすグルコース飢餓状態に曝すフェッド-バッチ培養を使用した至適化された培養計画ストラテジーの全行程中安定であった（Xie等, Biotechnol. Bioeng., 56:577-582 (1997)）。
ドリコールリン酸及びヌクレオチド糖の有用性（Nyberg等, Biotechnol. Bioeng., 62:336-347 (1998)）、グリコシルトランスフェラーゼ活性（Hendrickson及びImperiali, Biochemistry, 34:9444-9450 (1995): Kaufman等, Biochemistry, 33:9813-9819 (1994)）、及びタンパク質の折り畳みとの競合に原因する可変グリコシル化部位への接近しやすさ（Holst等, The EMBO J., 15:3538-3546 (1996): Imperiali, Acc. Chem. Res., 30:452-459 (1997): Shelikoff等, Biotechnol. Bioeng., 50:73-90 (1996)）を含めて、種々の要因が不定的な部位占有の潜在的な原因であると議論されてきた。これらの要因のいずれかが細胞培養条件により影響を受けうる。通常、ｔ-ＰＡの部位占有はむしろ狭い範囲内（±５％）で変化する。
【００１２】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼの研究：グリコシル化における金属カチオン
アスパラギン結合性グリコシル化は、新生ポリペプチドのアスパラギン側鎖におけるトリ-アンテナリーテトラデカ-サッカライド部分での酵素-触媒的修飾に関与する。Ｎ-結合性糖タンパク質の生合成において最初に関連してくる過程は、真核細胞の小胞体のルーメンにおいて見いだされるオリゴサッカライドトランスフェラーゼ、異種性の膜結合性酵素複合体によって触媒される。Imperiali, 上掲: Allen等, J. Biol. Chem., 270:4797-4804 (1995): Sharma等, Eur. J. Biochem., 116:101-108 (1981): Silberstein及びGilmore. The FASEB Journal. 10:849-858 (1996): Kumar等, Biochem. Mol. Biol. Intl., 36: 817-826 (1995):Bause等, Biochem. J., 312: 979-985 81995); Xu及びCoward, Biochemistry, 36:14683-14689 (1997): Kumar等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 247:524-529 (1998): Watt等, Curr. Op. Struct. Biol., 7:652-660 (1997)）。
至適な活性のためには、オリゴサッカリルトランスフェラーゼは少量のマンガン２価イオンを要求するが、他の八面体配位幾何構造を持つ２価金属カチオンは、低い転移率ではあるが、転移を補助する（Hendrickson及びImperiali. 上掲: Kaufman等, 上掲, Biochem. & Mol. Biol. International. 36:817-826 (1995)）。
【００１３】
哺乳類細胞培養における温度の役割
正常な生体の環境をシミュレートするために、哺乳類細胞を培養する発酵槽の温度は、殆ど専ら３７℃に制御される。これまで、このドグマは非常に広く受け入れられており、細胞培養過程における温度を変動させることには殆ど注意が払われてこなかった。希に文献的なデータが発酵槽の温度を下げた結果、細胞の生存率及び剪断力に対する耐性を改善し、バッチ培養においてより高い細胞密度及び力価を示し、グルコース／乳酸生合成が減少することを示している（Chuppa等, Biotechnol. Bioeng., 55:328-338 (1997)）。
特に、Reuveny等, J. Immunol. Methods, 86:53-59 (1986)は、バッチのハイブリドーマ細胞培養において２８℃から３７℃の範囲で温度の影響を調べた。彼らは、より低い温度において細胞の生存率が改善するが、これはグルコースの取込みの減少及び特異的な抗体産生の減少を伴うことを見いだした。従って、この特別な場合では、より低い温度によって細胞培養過程の全体の実行を促進するわけではなかった。
【００１４】
Sureshkuman及びMutharasan. Biotechnol. Bioeng. 37:292-295 (1991)は、細胞培養過程に対する２９℃から４２℃の温度範囲の影響を調べ、最大細胞密度が３３℃で達成されることを見いだした。逆に、グルコースの取込み及び特異的な乳酸の産生率は、３９℃よりも３３℃において劇的に減少した。これらの結果は、成長及び生産性に対する至適温度がかなり異なりうることを示している。３７℃以下の温度における生存率の増加は一般的な現象であるようにみえる一方、特異的な生産性に対する温度の影響は細胞系に依存していることが示された（Chuppa等, 上掲）。
Weidemann等, Cytotechnology, 15:111-116 (1994) は、接着性組換体乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を３０℃から３７℃の間で培養した。低温における２リットルのバイオリアクター中でのバッチ及び繰り返しバッチモード培養において、より低い成長率及びより低いグルコース消費率（即ち、より少ない乳酸産生）が示された。他方、最大の細胞密度及び生産性は温度の減少によっては影響を受けなかった。
Kretzmer等は、"Cultivation Temperature - Effect on Cell Culture Processes and Their Optimization"（American Chemical Socity Meeting, San Francisco, CA）, abstract 138,１９９７年４月１６日発表において、細胞培養方法における培養温度の効果と至適化が開示されたが、明らかに明確なグリコシル化解析はしていなかった。
【００１５】
発酵槽の温度を減少させることは産物の質及び完全性に関連するその他の利点を有しているかもしれないことが示唆されるが、産物の質、特にタンパク質のグリコシル化における低温の影響については殆ど研究されていなかった。Chuppa等, 上掲は、発酵槽の温度が糖タンパク質のシアル酸含有量に有意な影響を与えないことを報告している。総糖量はいくぶん３４℃又は３５．５℃に比べると３７℃において減少していたが、著者等はこの差違を「重要でない」と考えた。
しかし、米国特許第5,705,364号は哺乳類細胞培養による糖タンパク質の調製について開示しており、そこでは生産された糖タンパク質のシアル酸含有量は、温度を含んだ細胞培養環境を操作することにより広範囲の値にわたって制御されていた。宿主細胞は、アルカン酸又はその塩をある濃度範囲で培養物に加え、培養物を約２５０から約６００mOsmの浸透圧に維持し、培養物の温度を約３０から３５℃の間に維持することにより、培養物の生産期において培養された。
博士号の要件を部分的に満たして１９９５年５月にスタンフォード大学化学工学科及び大学院研究委員会に対し提出された学位論文である、Bahr-Davidsonの"Factors Affecting Glycosylation Site Occupancy of ASN-184 of Tissue-Typ Plasminogen Activator Produced in Chinese Hamster Ovary Cells"は、グリコシル化部位の占有に対する温度の影響について研究し、部位の占有は細胞を２６℃（50から51頁を参照のこと）に保温することにより増加した。
【００１６】
グリコシル化に対して影響を与えるホルモン的及びその他の処理
タンパク質の生産性及びグリコシル化に対する培養液への血漿成分のような様々な添加物の影響は、文献、例えば、ラット腎臓刷子縁膜における膜のグリコシル化に対するホルモン的な処理の影響（Mittal等, Indian J. Exper. Biol., 34:782-785 (1996)）において研究されている。Muc-1ムチンの発現に関する研究は、mRNAの発現に対するホルモン的な基礎を確立した（Parry等, J. Cell. Sci., 101:191-199 (1992)）。差動的なグリコシル化に関するα-ラクトアルブミンの甲状腺ホルモンによる制御が報告されている（Ziska等, Endocrinology, 123:2242-2248 (1988)）。タンパク質のＮグリコシル化に対する細胞の応答は、チロキシン、インシュリン、及びトロンビンの存在下で増加し、その影響は、用量依存的である（Oliverian及びBanerjee, J. Cell. Physiol., 144:467-472 (1990)）。チロキシンはラットα-フェトプロテインのグリコシル化のパターンにおける変化を誘導することが見いだされた（Naval等, Int. J. Biochem., 18:115-122 (1986)）。
【００１７】
ホルモン的な処理に加えて、グルタチオン及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼの欠損はタンパク質のグリコシル化を増加させた（Jain, Free Radical Biology & Medicine, 24:197-201 (1998)）。チロトロピンは、甲状腺細胞においてオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性を制御することが見いだされた（Desruisseau等, Mol. Cell. Endocrinol., 122:223-228 (1996)）。グルコース及びトリ-ヨードチロニン（Ｔ３）をプロ-ウロキナーゼの誘導体を生産する培地に添加すると、生産性が向上した（Hosoi等, Cytotechnology. 19:1-10 (1996)）。また、ラットの小腸におけるフコシルトランスフェラーゼ活性は、哺乳期の間ヒドロコルチゾンに対して応答性があった（Biol等, Biochim. Biophys. Acta. 1133:206-212 (1992)）。また、ヒドロコルチゾン処理は、マウス乳腺ガンウィスル前駆体のグリコシル化における定量的な変化を誘導した（Maldarelli及びYagi. JNCI. 77:1109-1115 (1986)）。癌腫細胞系における細胞性複合糖質のグリコシル化はレチノイン酸により促進された（Sacks等, Glycoconjugate J. 13:791-796 (1996)）。さらに、レチノイン酸は、ＨＬ-６０白血病細胞の分化の間におけるグリコサミノグリカン生合成に対し、可逆的な影響を与えた（Reiss等, Can. Res., 45:2092-2097 (1985)）。また、レチノイン酸はヒドロコルチゾンと同様にヒト悪性ケラチノサイトのグリコサミノグリカン生合成を調節することが見いだされた（Reiss等, J. Invest. Dermatol., 86:683-688 (1986)）。
【００１８】
小胞体における折り畳みとグリコシル化との競合については述べられており（Holst等、上掲）、迅速なグリコシル化現象を誘導する急性の熱ショックを伴う（Jethmalani等, J. Biol. Chem., 269:23603-23609 (1994)）。
一定の製品品質の糖タンパク質治療薬を生産するためには、複数のグリコシル化形態を有する糖タンパク質において、グリコシル化部位の占有率の増加を促進する必要がある。例えば、ｔ-ＰＡの生産方法においてＩ型ｔ-ＰＡの画分を増加させる必要がある。このように部位-占有率を増加させると、ヒトｔ-ＰＡの国際的基準により密接に類似し、よってヒトｔ-ＰＡにより密接に類似する活性を持つｔ-ＰＡが産生する。また、Ｉ型ｔ-ＰＡはＩＩ型よりもより可溶性であり、これは処理の過程においてある程度価値を持ちうる。さらに、増産されたｔ-ＰＡは、上に述べたように循環性の半減期を延ばすことと関連している。
【００１９】
(発明の概要)
哺乳類細胞、即ちチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞における野生型糖タンパク質、つまりｔ-ＰＡの生産過程において、ある種の二価カチオン、ホルモン、又はグリコシル化を制御し、又はグリコシル化に影響を与えるように細胞周期の分布を操作する因子を使用することで、糖タンパク質のグリコシル化部位の部位占有率を有意に増加させることが見いだされた。例えば、生産期において、培養温度を３７℃から約３０−３５℃に下げることにより、アミノ酸位置１８４のグリコシル化部位の占有率が有意に促進され、それにより、ＩＩ型ｔ-ＰＡに対するＩ型ｔ-ＰＡの割合が増加させられる。特に、温度を３７℃から３３又は３１℃に下げると、ｔ-ＰＡの部位-占有率が６％まで促進された。同様に、３７℃以下の温度は、他の糖タンパク質における容易に接近可能でないＮ結合性グリコシル化部位の占有率を促進させることが期待される。従って、温度は、タンパク質の一部においてのみ占有される一又は複数のＮ結合性グリコシル化部位を持つ糖タンパク質の、様々なグリコシル化形態の割合を微調整するための敏感なツールとして使用することが可能である。
【００２０】
さらに、ブチレートのような培養物の生育状態、及びそれに対応する細胞周期の分布を操作する因子、又はキニジンのようなＧ0／Ｇ1期の細胞の割合を増加させる細胞周期阻害剤、甲状腺ホルモンのような血漿成分、及び／又はある種の二価金属カチオンを含む他の環境因子は、コントロール条件に比較してＩ型ｔ-ＰＡ量（約１から２．５％）を顕著に上昇させたが、他の糖タンパク質に対しても同様に作用することが期待される。これに対し、関連するヌクレオシド前駆体分子（例えば、ウリジン、グアノシン、マンノース）の添加は、部位-占有率を向上させるに至らなかった。
一側面では、本発明は、（a）細胞培養における生育状態を変更する因子、（b）八面体配位構造を取り得、選びうる二価金属カチオン、（c）血漿成分の存在下において、糖タンパク質を産生する哺乳類宿主細胞（すなわち、糖タンパク質をコードする核酸を発現している細胞）を培養することを含んでなり、それにより糖タンパク質の一部にのみ占有されているＮ結合性グリコシル化部位の占有率が産生される糖タンパク質において促進され、生産されるようになる糖タンパク質を生産する方法に関する。好ましくは、その因子は、Ｇ0／Ｇ1期に細胞を阻害する細胞周期阻害剤である酪酸塩、及び／又は約３０から３５℃の間の培養温度であり、二価カチオンとはマンガン又は鉄であり、血漿成分とはホルモンである。好ましくは、細胞培養過程には、増殖期、その後の過渡期、生産期が含まれる。好適な実施態様では、増殖期では哺乳類宿主細胞を約３７℃で培養し、過渡期の間、すぐに温度を約３０℃及び３５℃の間まで下げる。宿主細胞は好適にはＣＨＯ細胞であり、糖タンパク質は好適にはｔ-ＰＡである。
【００２１】
他の側面では、本発明は、約３０℃と３５℃の間の温度下、０から２mMの酪酸塩の存在下で生産期に無血清培地における前記ｔ-ＰＡをコードする核酸を発現するＣＨＯ細胞を培養することを含んでなり、それによりｔ-ＰＡの一部においてのみ占有されているＮ結合性グリコシル化部位が生産されるｔ-ＰＡにおいて促進されるヒトｔ-ＰＡの生産方法を提供する。
さらなる側面では、本発明は、温度が約３７−４０℃で、増殖期に、その培地が八面体配位構造を取り得、それを好む二価金属カチオンを約１０nMから１００μＭ含む無血清培地中で、前記ｔ-ＰＡをコードする核酸を発現するＣＨＯ細胞を培養し：過渡期においては約３７−４０℃の温度下で前記細胞を培養し：及び、生産期に入ってから約４８時間後、温度を約３０℃から３５℃の間まで下げ、酪酸塩を約０．７５から１．５mM培地に添加する生産期において前記細胞を培養することを含んでなり、それによりｔ-ＰＡの一部においてのみ占有されていたＮグリコシル化部位の占有率が生産されるｔ-ＰＡにおいて促進するヒトｔ-ＰＡの生産方法を提供する。この方法では、甲状腺ホルモン、例えば、チロキシン又はトリ-ヨードチロニンのような血漿成分、又はキニジンのようなＧ０／Ｇ１期において細胞増殖を阻害する細胞周期阻害剤は、場合によっては、増殖期の前又は増殖期の最中に培地へ添加される。
従って、ここに開示された方法は、哺乳類細胞培養におけるＩ型ｔ-ＰＡのような糖タンパク質の好適な糖結合形態の産生を促進し、また、哺乳類細胞培養におけるＩＩ型ｔ-ＰＡに対するＩ型ｔ-ＰＡの割合のような好ましくない糖タンパク質に対する好ましい糖タンパク質の比率を増加させる。
【００２２】
発明の詳細な記述
Ｉ．定義
ここで使用されるように、糖タンパク質の一部のみ占有されているＮ結合性グリコシル化の占有率に関連するものとして、「促進された」という用語は、本発明において使用していない変数により得られたコントロール値に対する当該発明を実施することにより得られる相対値を意味する。この値は、ここで権利化を求めている因子、カチオン、又は血漿成分を用いることなく決定された基準値に対する、対象糖タンパク質の特定位置において占有されているグリコシル化部位のパーセンテージに基づいて計算される。例えば、ｔ-ＰＡは２つの主な糖結合形態、Ｉ型（３つ全てのＮグリコシル化部位が占有されている）及びＩＩ型（Ａｓｎ-184は占有されていない）の混合物として分泌され、促進された占有レベルは、混合物中でＩＩ型ｔ-ＰＡに比較してＩ型ｔ-ＰＡの量がコントロールに対し増加するような増加してた部位占有率を意味する。この占有レベルは、例えば、逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を用いることにより異なる型の糖タンパク質断片（異なるグリコシル化部位の占有レベルを持つ形態）を溶出し、相対量を決定するために各形態のピーク面積を積分することにより測定するいことができる。これらの含量を表すのに最も典型的な方法は、糖タンパク質の全形態に対するより高い占有性の糖タンパク質形態のパーセンテージによる。Ｉ型/ＩＩ型ｔ-ＰＡの促進性を測定するために用いられるアッセイの特定の実施例は、以下の実施例1において述べる。
【００２３】
ここで使用されるように、「糖タンパク質」は、通常約１０アミノ酸以上を有し、糖タンパク質産物、例えば、それらは可変性の部位占有率又はＮ-及びＯ-結合性部位占有率における多様性を示すような一部のみ占有されていて、少なくとも一のグリコシル化部位を持つペプチド又はタンパク質のことを称する。糖タンパク質は、宿主細胞のものと相同性があってもよく、又、好適にはそれらはＣＨＯ細胞で産生されるヒトのタンパク質のように、利用される宿主細胞のものとは異種性である、即ち、外来性であってもよい。好ましくは、哺乳類の糖タンパク質（元来哺乳類組織に由来する糖タンパク質）が用いられ、さらに好ましくは直接培地に分泌されるものであり、最も好ましくは、Ｎ結合性部位占有率に関わるようなものである。
ここにおいて特別に好ましい糖タンパク質は、ｔ-ＰＡ、プラスミノーゲン、インターフェロン-γ、プロテインＣ、ＩＬ-２、及びＣＳＦ例えばＧＭ-ＣＳＦである。より好ましい糖タンパク質は、ｔ-ＰＡ又はプラスミノーゲンであり、最も好ましくはｔ-ＰＡであり、とりわけヒトｔ-ＰＡである。
【００２４】
「組織プラスミノーゲン活性化因子」及び「ｔ-ＰＡ」という用語は、ヒト外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子で線維素溶解性活性を持ち、典型的には５つのドメイン（フィンガー、成長因子、クリングル-1、クリングル-2、及びプロテアーゼドメイン）を持つ構造を有するものを称するが、それにかかわらず、より少ないドメインを持つ可能性もあり、さらに血栓溶解剤として機能し、位置117、184、448のＮ結合性グリコシル化部位を保持していれば幾つかの繰り返されたドメインを有してもよい。最小限、ｔ-ＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し得るプロテアーゼドメインと、フィブリンとの結合に対して少なくとも部分的に寄与すると考えられいるＮ末端領域から構成されており、野生型ヒトｔ-ＰＡの117、184、448のアミノ酸位置に相当する位置においてＮ結合性部位を保持している。これらのグリコシル化部位が保持されているということは、組換体の可変部位の占有性及びメラノーマに由来する野生型ｔ-ＰＡは、それぞれ「Ｉ型ｔ-ＰＡ」及び「ＩＩ型ｔ-ＰＡ」と称される２種の変異体を産するに至るという事実に基づく。Ｉ型ｔ-ＰＡは位置117、184、448にＮ結合性オリゴサッカライドを含む。ＩＩ型ｔ-ＰＡは位置117、448にＮ結合性オリゴサッカライドを含む。Ｆｉｇ１を参照のこと。個々におけるｔ-ＰＡのアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸相違により示されるように、個体間において天然対立遺伝子変異が存在し、生じ得る。
【００２５】
「野生型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子」、「野生型ヒトｔ-ＰＡ」、「天然ヒトプラスミノーゲン活性化因子」及び「天然ヒトｔ-ＰＡ」という用語において、「ヒトｔ-ＰＡ」は「hｔ-ＰＡ」と略称され、天然配列ヒトｔ-ＰＡ、即ち、米国特許第4,766,075、1988年8月23日発行において報告されているcDNA配列によりコードされるものを意味する。ｔ-ＰＡのアミノ酸部位番号又は位置は、米国特許第4,766,075に従って番号付けされる。ｔ-ＰＡは、いずれかの天然原料に由来してもよい。さらに、ｔ-ＰＡは、例えば、ＣＨＯ細胞又はヒト胎児性腎臓293細胞を含むいずれかの組換体発現系から得てもよい。
ここで使用されるように、様々なｔ-ＰＡのドメインに対する対照は、上記に定義したように野生型ヒトｔ-ＰＡのドメインを意味し、天然ヒトｔ-ＰＡ配列に比較して変更されたアミノ酸を持つヒトｔ-ＰＡ、又はコウモリの組織プラスミノーゲン活性化因子（baｔ-ＰＡ）のような他の種由来の（天然又は変異体）ｔ-ＰＡと機能的に等価な部分を意味する。従って、ここで用いられるように、「プロテアーゼドメイン」は、野生型ｔ-ＰＡの成熟形態アミノ酸位置264からアミノ酸位置527に至る領域を意味し、またコウモリの組織プラスミノーゲン活性化因子（baｔ-ＰＡ）のような他の種由来の（天然又は変異体）ｔ-ＰＡと機能的に等価な部分を意味する。
ここで用いられる「細胞培養において、成長状態を修正する因子」とは、Ｇ０／Ｇ１期に細胞が蓄積されるか細胞を阻止することを引き起こす細胞周期阻害剤のような、Ｇ０／Ｇ１期において細胞の割合を増やす因子に相当する。このような因子は、細胞周期分布を操作し、グリコシル化を制御又は影響を与える。このような因子は、成長状態を越えた機構におけるグリコシル化へ作用しうるが、ここでは、少なくとも成長状態へ作用すると定義されている。
【００２６】
ここで用いられる、「増殖においてＧ０/Ｇ1期で細胞を阻害する細胞周期阻害因子」は、増殖期のＧ０/Ｇ1期に細胞を蓄積させる分子である。これは、細胞周期分析、即ち、核の均一な懸濁液をフローサイトメトリー解析によって相対的な細胞内ＤＮＡ含量を決定するために、Vindelov等, Cytometry. 3:323-327 (1983)の界面活性剤-トリプシン法を用いてプロピジウムアイオダイド（PI）で染色することにより決定される。解析においては、二重項を除くために二重項識別を用いゲート化し、データはModFit LT Cell Cycle Analysis(商品名）ソフトウェアー（Verity Software House）を用いてモデル化した。ここでの好適な阻害剤はキニジンである。
ブチルラート又は酪酸塩とは、酪酸ナトリウム又は酪酸カリウムのような酪酸の塩のいずれかに相当するものを意味する。
【００２７】
「期」とは、実施者により熟知されているような細胞のある培養時期を意味する。例えば、培養細胞の「増殖期」は、細胞が通常迅速に分裂する指数的細胞増殖（対数増殖期）の時期を意味する。この時期、細胞は通常1から4日の一時期、細胞増殖が最大になるような条件下で培養される。宿主細胞の増殖周期は、過度の実験を行うことなく、想定される特定の宿主細胞に対して決定され得る。増殖期において、細胞は必要な添加物を含む栄養性倍位置中、通常は約30から40℃、好ましくは約37℃にて加湿され制御された空気環境中、特定の細胞系において至適増殖が達成されるように培養される。細胞は、およそ1から4日、通常はおよそ2から3日の一時期間増殖期に維持される。
【００２８】
細胞培養の「過渡期」とは、生産期の培養条件が充実する一時期を意味する。過渡期において温度のような環境因子増殖条件から生産条件へと移行される。
【００２９】
細胞培養の「生産期」とは、細胞増殖が平衡に達する一時期を意味する。増殖期において、対数増殖は終了し、糖タンパク質の生産が主となる。この時期において、糖タンパク質の生産を維持を補助し、所望の糖タンパク質産物を達成するために培地が補充される。
【００３０】
「八面体配位構造に適し、選択し得る二価金属カチオン」とは、二の原子価をもち八面体配位構造に適応することができ、実際に選択性を示すような金属を意味する。また、そのようなカチオンはオリゴサッカリルトランスフェラーゼがそれらの存在下で機能し得る（即ち活性化される）ようなものとして特徴づけられる。そのような金属イオンの例としては、マンガン（Mn2+）、鉄（Fe2+）、カルシウム（Ca2+）、及びマグネシウム（Mg2+）がある。他の配位構成に選択性を示す、ニッケル（Ni2+）、銅（Cu2+）、カドミウム（Cd2+）、及び亜鉛（Zn2+）を含む二価カチオンは、酵素を活性化し得ず、高濃度においてマンガン存在下の活性を競合的に阻害する。従って、これら後者のカチオンは、定義から除外される。
【００３１】
「血漿成分」とは、正常血漿の成分を意味する。これには、増殖プロモーター及び内皮細胞増殖に対する発ガン促進剤、上皮組織の分化制御因子である、グルカゴン、ヘパリン、ホルボルミリステートアセテート、ＰＲＬ、チログロブリン、８Br-cAMP、トロンビン、ビタミンＡ、及びその誘導体（例えば、β-オール-トランスレチノイン酸に代表されるレチノン酸のようなレチノイド）、グルタチオン、コルチコステロン、コルチソル及びコルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾンのようなグルココルチコイド）のようなステロイド、及び好ましくはエストロジェン、インシュリンのような生合成バイタルホルモン及びチロキシン及びトリ-ヨードチロニン（Ｔ3）のような甲状腺ホルモン等のホルモンが含まれる。甲状腺ホルモンは好適であり、最も好ましくは、チロキシン及びトリ-ヨードチロニンである。牛胎児血清を含むある種の血清には、甲状腺ホルモン及び甲状腺ホルモン結合タンパク質をナノモーラーレベルで含有するため、特に甲状腺ホルモンが部位占有率を促進するために使用される場合、無血清培地を使用することが好ましい。
【００３２】
「細胞培養培地」、「培養液」及び「発酵培地」という用語は、哺乳類細胞を増殖させるのに用いられる栄養性溶液を意味し、典型的には少なくとも以下の範疇の一又は複数に由来する一成分を提供する：
１）エネルギー源、通常はグルコースのような炭水化物の形態：
２）全ての必須アミノ酸、通常は２０のアミノ酸にシステインを加えた基本的なセット：
３）ビタミン及び/又は低濃度で要求される他の有機化合物：
４）遊離脂肪酸：及び
５）トレース成分、トレース成分は無機化合物又は天然に生じる成分で典型的には非常に低濃度、通常はマイクロモーラーの範囲で要求さる
【００３３】
培地が、いかなる哺乳類由来の血清（例えば、胎児性牛血清（FBS））をも必須的に含まない細胞培養液は通常「無血清」である。「必須的に無」とは、細胞培養液が約0から5％の血清、好ましくは0から1％の血清及び最も好ましくは0から0.1％の血清を含むことを意味する。有利には、無血清と「確定」された培地を使用することができ、培養液中の各々の組成の同一性及び濃度は既知である（即ち、牛下垂体抽出（BPE）のような不確定な組成が培養液中に存在しないこと）。
【００３４】
本発明の内容において、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」という表現は相互に交換可能で、全てのそのような命名は子孫も含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換（宿主）細胞」には、初代適用細胞及び植え次ぎ回数を考慮せずに初代から派生した培養細胞が含まれる。また、全ての子孫は、故意または偶発的な変異に由来して、ＤＮＡ含量が正確に同一でなくてもよいと理解されている。当初形質転換された細胞でスクリーンされたのと同様な機能又は生物学的活性を持つ変異体の子孫も含まれる。明確な命名が意図される場合は、内容から明らかであろう。
【００３５】
「哺乳類宿主細胞」、「宿主細胞」、「哺乳類細胞」、「哺乳類組換体宿主細胞」等の用語は、適当な栄養素及び成長因子を含む単層培養又は懸濁培養の状態にする場合に増殖及び生存し得る哺乳類由来の株化細胞を意味する。特定の株化細胞に対して必要な成長因子は、例えば、Mammalian Cell Culture(Mather, J.P.編, Plenum Press, N.Y. [1984])、及びBarnes及びSato,Cell, 22:649(1980)に記載されているように、過度の実験をすることなく、経験的に直ぐに決定することができる。典型的には、細胞は、関心のある特定の糖タンパク質を多量に発現し培地に分泌することができる。本発明の適切な哺乳類宿主細胞の例には、ＣＨＯ細胞(1989年8月29日に発行の欧州特許第117,159号：米国特許第4,766,075: 4,853,330: 5,185,259：Lubiniecki等, in Adbances in Animal Cell Biology 及び Technology for Bioprocesses. Spier等編集、(1989)pp442-451)、例えば、ＣＨＯ/-ＤＨＦＲのようなＣＨＯ由来の細胞（Urlaub and Chasin. Proc .Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216 (1980)）、ＣＨＯ-Ｋ１ＤＵＸＢ１１（Simonsen and levinson. Proc .Natl. Acad. Sci. USA. 80:2495-2499 (1983):Urlaub and Chasin、上掲）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（1989年3月15日発行、欧州特許第307,247）、：ラットミエローマＹＢ２/３．ｏＡｇ20（国際公開第８６/００１２７、1985年4月1日発行）：マウスＣ１２７線維芽細胞（Reddy 等, DNA. 6:461-472 (1987)）：マウスセルトリ細胞（TM4. Mather. Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）：ヒト頸部癌腫細胞（HEAL. ATCC CCL2）：ヒト肺細胞（W138. ATCC CCL75）：ヒト肝臓細胞（Hep G2. HB 8065）：マウス乳児性ガン（MMT 060562. ATCC CCL51）：ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）：ＭＲＣ５細胞：ＦＳ４細胞：及びヒトミエローマ細胞（Browne等, Thromb. Haemost., 54:422-424 (1985)）。好まし宿主細胞には、ＣＨＯ-Ｋ１ＤＵＸＢ１１及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞が含まれる。
ｔ-ＰＡの大容量生産のために改良されたＣＨＯ細胞は、Large Scale Mammalian Cell Culture Technoloby, Lubiniecki編集（Marcel Dekker:New York. 1990）.pp147-160においてWiebe等により記述されたMCB/working cell bank(WCB)システムにおいて低温貯蔵的に維持される。ヒトｔ-ＰＡをコードするＤＮＡで形質移入されたＤＨＦＲ+ＣＨＯ-Ｋ１細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションManassas. Virginia (ATCC)に寄託され、アクセッション番号ＣＣＬ６１により入手可能である。ｔ-ＰＡ産生ＣＨＯ細胞株の他の試料（ＣＨＯ細胞株1-1515）は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ９６０６により寄託された。後者の細胞株は５０ｐｇ/細胞/日に近いレベルのヒトｔ-ＰＡを産生すると報告された。
【００３６】
ＩＩ．  発明の実施の形態
発明の一般的及び特異的な特徴
細胞培養における増殖状態を変更する因子（酪酸塩のような細胞周期阻害剤、又は哺乳類細胞培養中37℃から約30から35℃へ温度を低下させるような）を利用し、又は八面体配位構造に適し、選択し得る二価金属カチオンを利用し、血漿成分を利用することで、野生型糖タンパク質の選択され所望のアミノ酸位置のグリコシル化部位の占有を促進することが見いだされた。
例えば、この温度低下は野生型ヒトｔ-ＰＡのアミノ酸位置184のグリコシル化部位の占有を促進し、従って、ＩＩ型ｔ-ＰＡに対するＩ型ｔ-ＰＡの割合を増加させる。ＩＩ型ｔ-ＰＡに対するＩ型ｔ-ＰＡの割合を調節し、増加させる能力は、製造者に天然のｔ-ＰＡ（約1：1）中の存在比に極めて近い割合であるような組換体タンパク質を生産ならしめるため、有効である。さらに、ＩＩ型ｔ-ＰＡに対するＩ型ｔ-ＰＡの割合はｔ-ＰＡの可溶性及びクリアランス速度に影響をおよぼし、Ｉ型ｔ-ＰＡ濃度の増加は、ｔ-ＰＡの循環性半減期をある程度遅延させるという証拠も存在する。アミノ酸位置117の高マンノースオリゴサッカライドは主として天然ヒトｔ-ＰＡの迅速なクリアランスの要因であることが知られている。このオリゴサッカライドが除去されると、Ｉ型ｔ-ＰＡはより長い半減期を持つようになることが観察されており、このことは、Ｉ型ｔ-ＰＡ上に存在する別のオリゴサッカライドが正の影響を有するような第二の機構が存在することを示す。ここにおいて、実験的に見いだされた事は、糖タンパク質産物の一部のみが占有されている少なくとも一のグリコシル化部位を持つ（ｔ-ＰＡのような）他の糖タンパク質にも広げて適用でき得る。
【００３７】
因子が酪酸塩である場合、通常、酪酸塩は約2mM、より好ましくは約0.35から2mM、さらにより好ましくは約0.75から1.5mMまでの濃度で存在する。この範囲内で選択されたその濃度は、主に培養される温度及び糖タンパク質に依存する。従って、ｔ-ＰＡに対して温度が約37℃又は約33から35℃まで低下させた場合、酪酸塩濃度は好ましくは約1.5mM、さらに好ましくは約0.3から1mMまで、最も好ましくは0.75mMまで低下させる。この例示は、これらの因子のうち一以上が細胞培養において作用され、存在してもよいことを示す。
好ましい場合には、温度の低下及び/又は酪酸塩の添加は、増殖周期の生産期において行われる。このような筋書きにおいて、温度は約30から35℃の間まで低下させ、さらに/又は酪酸塩は生産期に48時間添加される。生産期は、増殖周期の増殖期及び過渡期から適切に進行される。増殖期において、温度は好ましくは約37℃に維持され、及び/又は過渡期では、培養温度は好ましくは約30℃から35℃の間まで、さらに好ましくは約31から33℃、最も好ましくは約31℃まで添加される。
【００３８】
上記因子に対して場合によっては、又は付加的には、細胞は上記で定義したような二価カチオンの存在下で培養される。使用すべき二価カチオンの選択は、その特異的な濃度と同様に、特に生産される糖タンパク質、及び金属カチオン、及び既に培養液中に存在する他の成分、そしてそれらの濃度に依存する。例えば、糖タンパク質が幾らかのチオグループを持つ場合、チオ親和性のマンガンや鉄、鉄は最もチオ親和性である、そのような金属を使用することが好ましい。これに対して、糖タンパク質がより多くの酸素グループを含む場合、マグネシウムやカルシウムといった酸素親和性のカチオンが好ましい。カルシウムイオンが培養液中に既に十分量存在する場合、典型的にはここでの目的に対してはカルシウムイオンは使用せず、異なる金属カチオンが用いられる。さらに、金属カチオンのサイズが影響を及ぼすかもしれない。鉄及びマグネシウムはより小さく、カルシウム及びマンガンはより大きい。糖タンパク質に対する、硫黄グループの構造上の影響により、より小さなイオン半径カチオンが指示され得る。ここで、好ましい二価金属カチオンはマンガン、マグネシウム、又は鉄であり、より好ましくはマンガン又は鉄であり、最も好ましくはマンガンである。
【００３９】
二価金属カチオンは好適には、全培養時間中、培養液に存在し、少なくとも増殖期には補充添加される。その濃度は、通常、約10ｎＭ及び150μＭの範囲にあり、好ましくは約10ｍＭから100μＭのマグネシウム及び20μＭから100μＭの鉄である。
場合によっては、二価カチオンのみ又はと共に、及び/又は、血漿成分が培養中に存在する。典型的には、血漿成分は約1ｎＭから15-20μMの量で存在し、主として生産される糖タンパク質のタイプ、用いられる血漿構成成分のタイプ、及び発酵の規模に依存する。例えば、血漿構成成分が甲状腺ホルモンである場合、約1-150nM、好ましくは約10-100nM、の量で存在する。血漿構成成分がグルタチオンである場合、好ましくは約1-10μM、ヒドロコルチコイドの場合は、好ましくは約5-15nM、好ましくは10nMで存在する。好ましくは、血漿構成成分はホルモンであり、より好ましくは甲状腺ホルモンであり、最も好ましくはチロキシン又はトリ-ヨードチロキシンである
糖タンパク質に対して達せされる部位-占有の程度は、糖タンパク質の所望の分泌程度に均衡し、通常は、使用される因子及び他の成分の選択、及び如何なる濃度、温度であるかが考慮される。例えば、部位-占有は通常、ｔ-ＰＡの分泌に影響することなく選択幅約±5％で制御される。
【００４０】
細胞培養手順
本発明によると、哺乳類細胞は、所望の糖タンパク質産物を生産するために培養された。本発明の中で糖タンパク質の生産のための宿主細胞を選択においては、異なる細胞が、発現タンパク質の翻訳及び翻訳後プロセス及び修飾(例えばグリコシル化切断）に特徴的及び特異的なメカニズムを有することを認識することが重要である。適切な細胞株は、所望する翻訳後修飾が可能であることを確かめて選択されるべきである。あるいは、宿主細胞は、特異的翻訳後修飾に必要な所望する遺伝子産物が発現するように改変が可能である。
特に、所望する糖タンパク質を発現する哺乳類細胞は、適当な条件下でインビボの適当な翻訳後修飾が起こるように、特定の酵素を発現し又は発現するように操作されなければならない。これらの酵素は、Ｎ−結合オリゴ糖に関してHubbard及びIvan. Ann., Rev. Biochem. 50: 555-583(1981) に記載されているような、Ｎ-及びＯ-結合炭化水素の付加及び完成に必要な酵素を含む。酵素は、場合によってはオリゴ糖トランスフェラーゼ、アルファ−グルコシダーゼＩ、アルファ−グルコシダーゼＩＩ、ＥＲアルファ（１，２）マンノシダーゼ、ゴルジアルファ−マンノシダーゼＩ、Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、ゴルジアルファ−マンノシダーゼＩＩ、Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ、及びβ（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼを含む。
所望のタンパク質を発現し、所望の糖タンパク質を特定部位及び結合へ付加できる哺乳動物細胞の培養のために、培養される宿主細胞に特に注意しながら、多くの培養条件が用いられる。哺乳動物細胞のための適切な培養条件は、この分野で知られているか（J. Immunol. Methods (1983) 56: 221-234）、又は当業者によって容易に決定され（例えば、Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. 及び Hames, B.D. eds. Oxford University Press, New Tork (1992)）、選択する特定の宿主細胞により変化する。
【００４１】
本発明の哺乳類細胞培養は、特定の細胞に適切な培地で調製される。栄養液は、随意的に、次のカテゴリーの任意の１つ以上の成分で補っても良い：
１）上記に定義したような血漿成分、及び／又は例えばインシュリン，トランスフェリン、及びＥＧＦのような成長因子：
２）例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩、及びＨＥＰＥＳのような塩類と緩衝液：
３）例えば、アデノシン、チミジン、ヒポキサンチンのようなヌクレオチド及び塩類：
４）タンパク質及び組織の加水分解産物：
５）ゲンタマイシン（商品名）薬のような抗生物質：及び
６）リノール酸又は他の脂肪酸のような脂肪及びそれらに適した担体。
任意の他の必要な補充物質も又当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。
ＨａｍのＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ)(シグマ))、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)、及びダルベッコの改変イーグル培地((ＤＭＥＭ)、シグマ)等の商業的に入手し得る培地が、模範的な栄養液である。更に、HamおよびWallace，Methods in Enzymology，58：44(1979)；BarnesおよびSato,Anal.Biochem.，102：255(1980)；米国特許第４,７６７,７０４号、第４,６５７,８６６号、第４,９２７,７６２号、第５,１２２,４６９号、または４,５６０,６５５号；国際公開９０／０３４３０または同８７／００１９５号に記載されたいずれの培地も、培養培地として使用し得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、上記に記載の成分で補い得る。
【００４２】
動物血清(無血清培地）を欠く特別な培地の使用は、１つ以上の因子、2価の金属カチオン、血漿成分、又は本発明に基づいて用いられた他の成分を共なう血清成分による妨害又は逆作用を避けるために好まれる。更には、アミン基の濃度は、溶液中のｔ-ＰＡが保持されるように十分に高くなければならない。これは、他の任意のアミン又はアンモニウム源で可能であるが、おおよそ１ｍＭ リジン濃度より高い濃度を使用することによって、ＨＥＰＥＳの存在によって、又は十分に高い塩化アンモニウムの使用によって達成が可能である。
目標が、ｔ-ＰＡを実質的に単鎖型で生産することならば、培養培地(次の回収及び精製段階で使用される培地のような）は、アプロチニン、アルファ-１抗トリプシン、アルファ-２マクログロブリン、大豆トリプシンなどのプロテアーゼインヒビターを含む。好ましくは、アプロチニンは、ｔ-ＰＡ生産培地において、５から１００KIU/ml、さらに好ましくは約１０KIU/mlの濃度で用いられる。
【００４３】
特に好ましい実施態様では、哺乳類宿主細胞はＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸＢ１１である。それらの濃度を含む、特定の株化細胞に対して必要な栄養分及び成長因子は、例えば、Mammalian Cell Culture(Mather, J.P.編, Plenum Press, N.Y. [1984])、及びBarnes及びSato, (1980) Cell, 22:649に記載されているように、過度の実験をすることなく、経験的に直ぐに決定することができる。適切な培地は、微量元素；ゲンタマイシン(商品名）；プルロニック(PLURONIC)Ｆ６８(商品名）又はプルロニックポリオール等価物等の細胞保護剤；プリマトーン(PRIMATONE)ＨＳ(商品名）又はプリマトーンＲＬ(商品名）(Sheffield, England)等の加水分解されたペプトン、組換えヒトインシュリン；チミジン、ヒポキサンチン、グリシンを場合によっては含み、ビタミン、糖、塩、アミノ酸等のいくつかの成分を濃度を変更して含むＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ-１２ベースの処方(ＤＭＥＭ及びＨＡＭＦ１２培地の組成は、American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,第6版, 1988, 346-349頁の培地処方を参照されたい)のような基本培地成分を含む。以下に示すＰＳ−２０と同じような、高いレベルのあるアミノ酸の存在で特徴づけられる米国特許第５，１２２，４６９号に記載の培地の形態は、特に適切である。
本発明の糖タンパク質は、多様な細胞培養条件下で所望する糖タンパク質を発現する成長細胞によって生産され得る。例えば、大規模又は小規模なタンパク質の生産のための細胞培養手順が本発明において潜在的に有用である。これに限定するものではないが、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、又は攪拌タンクバイオリアクターシステムを含む手順が使用され、後者の２つのシステムではマイクロキャリアを伴うか伴わず、バッチ式、流加式、又は連続式で操作される。
【００４４】
好ましい実施態様では、本発明の細胞培養は、攪拌タンクバイオリアクターシステム及び流加式培養法によって行われる。好ましい流加式培養では、哺乳動物宿主細胞及び培養培地は培養容器へ最初に供給され、さらなる培養培養栄養分は、培養の停止前に周期細胞及び／又は生産物の収集を伴うか伴わず、連続的に又は不連続的な増量によって培養中の培養液へ供給される。流加式培養は、例えば、定期的に全培養液(細胞及び培地）を除き、そして新鮮な培地に置き換える、半連続式流加培養を含むことが可能である．流加式培養は、培養過程が開始される時点において細胞培養に対する全ての構成成分（細胞及び全ての培養栄養分を含む）が培養容器へ供給され、単純培養法とは異なる。さらに、流加式培養は、上清が培養過程中に培養容器から取り除かれない点においては、灌流培養法とは区別され得る（灌流培養において細胞は、例えば、濾過、封入、マイクロキャリアーへ固定する等により培養物中へ拘束され、培養液は連続的もしくは断続的に導入され、そして培養容器から取り除かれる）。
【００４５】
さらに、培養される細胞は、考え得る所定の宿主細胞及び所定の生産計画に適した計画もしくは定法のいずれかに従って繁殖され得る。従って、本発明では、単一段階又は複数の段階による培養方法を考慮する。単一段階培養において、宿主細胞は培養環境へ接種され、速やかな発明の処理過程が、細胞培養の単一段階培養期の間利用される。場合によっては、複数段階培養が想定される。複数段階培養において、細胞は幾つかの段階又は時期において培養されてもよい。例えば、細胞は、おそらく保存サンプルから取り出され増殖及び良好な生存性を促進するのに適した培地へ接種されるような最初の段階又は増殖期培養にて増殖され得る。細胞は、宿主細胞培養物に新しい培養液を添加することにより適当な一時期間、増殖期に維持されてもよい。
【００４６】
本発明の好ましい状態に従って、流加式又は連続的細胞培養条件は、細胞培養の増殖期において哺乳類細胞の成長を促進するために、工夫される。温度、pH、溶解酸素（DO2）及びこれに同種の培養条件は、所定の宿主の用いられるもので、当業者にとって明らかである。通常、pHは酸（例えば、CO2）又は塩基(例えば、Na2CO3又はNaOH)約6.5から7.5の間のレベルに設定される。ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞を培養するために適切は温度範囲は、30から40℃の間であって、好ましくは37℃であり、適切なDO2は大気飽和濃度が5から90％である。
【００４７】
所定の段階において、細胞は細胞培養の生産期又は生産段階のものを接種するために使用され得る。場合によっては、上述したように生産期又は生産段階は接種もしくは増殖期又は増殖段階と連続てきであってもよい。
細胞培養の生産期間中の細胞培養環境は、本発明に従って制御される。好ましい場合には、細胞培養過程の生産期は、細胞培養の生産期に対する変数が保証される細胞培養の過渡期によって先行される。
哺乳類、例えばＣＨＯ細胞におけるｔ-ＰＡの生産は典型的には、細胞が、様々な時間帯において「シードトレイン（seed-train）」中で培養され、大規模なｔ-ＰＡ生産の途中で細胞ー増幅過程を開始させるために接種用の発酵槽へ周期的に移される半連続的過程を使用する。従って、rｔ-ＰＡの生産に使用される細胞は、予め決められた細胞寿命の最大限まで様々な期間培養される。培養中の接種密度、pH、DO2及び温度、生産培養の持続時間、回収の作動条件の等の細胞培養方法における変数は、使用される所定の細胞株及び培養液における関数であり、過度の実験を行うことなく決定できる。
【００４８】
細胞培養物からの糖タンパク質の回収
ポリペプチドの生産期の後、所望の糖タンパク質は当該技術分野において十分に確立された技術を用いることで培養液から回収される。所望の糖タンパク質は宿主細胞の溶解物から回収してもよいが、好ましくは培養液から回収される。
最初の段階で、培養液又は溶解物は粒子状の細胞片を除くために遠心される。その後、糖タンパク質は適当な生成方法の例として以下に挙げる方法を用いて、夾雑物可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製される：イムノアフィニティー又はイオン交換カラムでの分画：エタノール沈殿：逆送ＨＰＬＣ：シリカ又はＤＥＡＥのようなカチオン交換坦体：クロマトフォーカッシング：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：硫安沈殿：例えば、SEPHADEX G-75（商品名）を用いたゲル濾過：及びＩｇＧのような夾雑物を除くためのプロテインSEPHAROSE（商品名）カラム。また、フェニルメチルサルフォニルフルオリド（PMSF）のようなプロテアーゼ阻害剤は精製過程におけるタンパク質分解を抑えるために有用である。所望の糖タンパク質に適した精製方法は、組換体細胞培養において発現される糖タンパク質の性質の違いに起因する修正を必要とする可能性があることを、当業者は理解するであろう。
【００４９】
また、本発明の糖質に対して選択された精製技術及び処理過程も本発明の内容の範囲内において有用である。選択されている糖質に依存して、そのような技術には、例えば、より酸性又は塩基性の画分が回収されるようなイオン交換ソフトゲルクロマトグラフィー又はカチオンーもしくはアニオンー交換樹脂を用いたＨＰＬＣが含まれる。
好ましい実施態様において、ｈｔ-ＰＡを生産できるＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ培養液、で予め決定された細胞密度まで増殖される。細胞懸濁液は、クロスーフローろ過により濃縮され得る。引き続き、活性のあるｔ-ＰＡは、無血清発現用培地に懸濁されＣＨＯ細胞により生産される。従って、生産されたhｔ-ＰＡは、ＣＨＯ細胞によって発現培養液中に分泌され、標準的な技術により培養液から分離される。
【００５０】
幾つかの技術がｔ-ＰＡの回収に対して使用され得る。例えば、培養の終了時点において、高圧接線方向流動ろ過（tangential flow filtration）を含む接線方向流動ろ過が、ｔ-ＰＡを含む培養液を細胞から除くために使用できる。
細胞培養上清は、濃縮され、透析ろ過され、典型的にはリジン親和性カラムのようなｔ-ＰＡに特異的に結合することができるアフィニティーカラムに添加される。用いられるクロマトグラフィー条件下で、ｔ-ＰＡが回収され、さらなる精製に供されるようなアフィニティーカラムへ選択的に結合する。
透析ろ過の段階において、透析膜上の細胞培養上清は、プロピレングリコールを含む透析緩衝液により透析ろ過され、透析ろ過により得られる溶液はｔ-ＰＡの選択的結合を可能ならしめるアフィニティーカラムに添加され得、ｔ-ＰＡはpH約5.0から約9.0の緩衝液によりアフィニティーカラムから溶出され得る。好ましくは、アフィニティーかラムは、pH約5.0から約8.5で好適に溶出され、さらに好適には約6.0から約8.5で溶出されるようなリジンアフィニティーカラムである。リジンアフィニティーカラムは、当該技術において周知であり、市販されている。適切なカラムには、LysineCPG（商品名）（バイオプロセッシング）、ECH LysineCL（商品名）（ファルマシア）、及びLysine Hyper D（商品名）（バイオセプラ）が含まれる。好ましくは、ゲルはｔ-ＰＡ溶液の添加に先立って、50 mM Na2HPO4又はK2HPO4溶液（pH7.5）で平衡化される。典型的には、溶出緩衝液は、200 mM アルギニン及び50 mM Na2HPO4又はK2HPO4溶液（pH7.5）を含む。好ましくは、溶出緩衝液は、さらに約2.5から20％の濃度でプロピレングリコールを含む。
【００５１】
先行した回収/初期精製段階の後、0.5から3.0 mg/mlのｔ-ＰＡを含む供給流動物には同時に、同じ細胞株に由来する32Ｐ標識ＤＮＡを用いたドットブロットＤＮＡアッセイにより決定されるように約0.05から5 ng/mlのＤＮＡが通常含まれ、計算上およそ2x104倍のクリアランスになる（リジン坦体の原料及び用いられた洗浄条件に依存する）。さらに、ＤＮＡのレベルをヒトへの投与量あたり1ピコグラム以下に減少させるためには、DE-52（商品名）カラム（ワットマン）、又はDEAE-SEPHAEROSE FAST FLOW（商品名）のようなイオン交換カラムを用いて、特別のイオン交換カラムが精製過程に導入されてもよい。
【００５２】
さらに、精製法には、連続的な哺乳類細胞株の細胞培養流液中に潜在的に存在し得るレトロウィルスを不活性化及び/又は除去する付加的な段階を含む。有意な数のウィルスクリアランスステップが有用であり、付加的な超遠心/透析ろ過段階、ウレア又はグアニジンのようなカオトロピックな試薬、極端なpH、界面活性剤、熱などによる処理、ホルムアルデヒド、プロテアーゼのような化学的誘導体化、イオン交換又はサイズ排除クロマトフラフィー、有機溶媒などによる、通常の分離を含む。ウィルス除去に対し特に選択されたステップは、本発明の重要な条件ではないが、以下に記述するｔ-ＰＡに対する基準を満たす必要がある：1.  標的ウィルスがその処理に対して感受性がある場合、ｔ-ＰＡはその処理下において安定でなければならない  2.  「クリアランスの枠（window of clearance）」は最大でなければならない。「クリアランスの枠（window of clearance）」とは、プロセス培養流動体中処理後のウィルス価に対する、処理前のプロセス培養流動体中の初期ウイルス価（spike）の割合として本目的のために定義される。
【００５３】
前述方法に続いて回収され精製された組換体ヒトｔ-ＰＡは、典型的には、少なくとも約97-99％の純度である（リジン坦体によるが）。必要ならば、さらなる精製が付加的なステップ、例えば、カチオン交換クロマトグラフィーにより達成され得る。従って、産物は治療上の処理にとって適したものとなる。天然ｔ-ＰＡの様々な変異体は、基本的に同様な方法により精製され、他の糖タンパク質は当該技術分野において周知の方法を用いることにより、それらの野生型対応物に対して用いられる方法により精製され得る。
本発明はさらに以下に示す、限定されない実施例により例示される。本発明の方法は、哺乳類細胞において一以上の糖結合形態を持つ他の糖タンパク質の生産に対して、基本的に適用可能であり、例示された方法を異なる糖タンパク質の生産に対して適用する際に必要と思われる修正は、通常の技術者の技術の範囲内でよい。
【００５４】
実施例1
rｔ-ＰＡの生産における温度変化
材料及び方法
ＣＨＯ細胞：哺乳類細胞株として使用されるＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ1（ATCC番号CCL61CHO-K1）からの誘導体であって、ＣＨＯ−Ｋ1ＤＵＸ−Ｂ11（DHFR-）（コロンビア大学L.Chasin博士より供与頂いた: Simonsen及びLevinson.上掲: Urlaub及びChasin. 上掲）と命名されたジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR-）欠損細胞株ＣＨＯ−Ｋ1変異体である。
PS-20基本培地：本培地の構成成分は、以下の表1に列挙する。
【００５５】
表1
構成成分                                                濃度（mg/ml）
塩化カルシウム無水和物                                  116.61
硫酸銅五水和物                                            0.0012
硝酸酸化鉄                                                  0.05
硫酸第一鉄七水和物                                          0.417
塩化カリウム                                              759.0
硫酸マグネシウム無水和物                                   48.835
塩化マグネシウム無初和物                                  143.05
第一リン酸ナトリウム一水和物                               62.5
第二リン酸ナトリウム無水和物                               71.02
硫酸亜鉛七水和物                                            0.4315
リノール酸                                                  0.294
リポ酸（DLチオクト酸）                                     0.735
塩化二水素プトレシン                                        0.5635
ピルビン酸ナトリウム                                      385.0
アラニン                                                   31.15
塩化アルギニン                                            780.5
一水素アスパラギン                                         52.53
アスパラギン酸                                             46.55
システイン一塩酸塩一水和物                                122.92
システイン二塩酸塩                                         31.285
グルタミン酸                                               51.45
グルタミン                                               1606.0
ヒスチジン一塩酸塩一水和物                                 94.36
イソロイシン                                               66.29
ロイシン                                                   98.35
リジン一塩酸塩                                            200.75
メチオニン                                                 30.68
フェニルアラニン                                           50.36
プロリン                                                  120.75
セリン                                                     57.75
トレオニン                                                 89.15
トリプトファン                                             15.14
チロシン二ナトリウム塩二水和物                             79.125
バリン                                                     87.95
ビオチン                                                    0.0256
Ｄーパントテン酸カルシウム                                   3.68
塩化コリン                                                 50.86
シアノコバラミン（B12）                                     4.76
葉酸                                                        6.55
iーイノシトール                                             66.60
ニコチンアミド                                              2.1296
ピリドキサール一塩酸塩                                      2.000
ピリドキシン一塩酸塩                                        0.217
リボフラビン                                                0.3330
チアミン一塩酸塩                                            3.190
グルコース                                               4301.0
炭酸水素ナトリウム                                       2440.0
塩化ナトリウム                                           5900.0
プルロニックF-68  プリル                                 1000.0
HEPES                                                    2383.0
フェノールレッド                                            8.10
【００５６】
簡便には、培地の固体成分はアミノ酸と共に混合し、この混合物は一単位として貯蔵してもよい。
I型  II型ｔ-ＰＡアッセイ：
1.  細胞培養上清試料を解凍（培養液全体の場合、遠心により細胞を沈殿させる）
2.  解凍直後のプラスミノーゲン2μlを400μlの試料に添加
3.  37℃で60分間保温
4.  解凍直後の1 M DTTを20μl、及び400μlの8 M グアニジン塩酸/50 mM トリス3.2 mM EDTA溶液を添加
5.  37℃で15分間保温
6.  バイアルに移し、以下の条件により250μlを分析用にHP10902（商品名）HPLC      にかける：
40℃にて、ZORBAX（商品名）C8カラム：
蛍光（275nmの励起340nmで発光）により溶離液を検出し：
以下に示す70分間の方法にて各試料をカラムにかける、溶離液Aは0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液で、溶離液Bは0.1％TFAアセトニトリル溶液：
0から５分まで−75％A(及び25%B)
5から35分まで−75％Aから60％Aの直線的濃度勾配
35.1から45分まで−0％A
45分から70分まで−75％Aでカラムを再平衡化
I型/II型断片およそ25分後溶出され、相対量を決定するためにピーク面積を積算する
【００５７】
方法
ＣＨＯ細胞産生組換体hｔ-ＰＡは、選択培地（PS-20基本培地に500 mM メトトレキセート、10 mg/L 組換体ヒトインシュリン（rh-insulin）、0.1 ml/L トレース成分、及び0.05 ml/L エタノールを補充したもの）で３日又は４日毎に継代され（パックされた細胞容積（PCV）で0.1％の細胞密度で）、スピナーフラスコ中で保持された。十分量の培養物は、0.2％PCVにて15 mlの培養液に播種され、50 ml の滅菌されたファルコンチューブ中で静置された。培養物は700から1000rpmで10分間遠心され、上清は捨てた。15 mlの新しい選択培地を添加し、細胞を懸濁するために培養物を穏やかに撹拌した。5 mlの培養物は、３つのT-25フラスコ（25cm2 T-フラスコ）中に静置した。インキュベータの大気環境に平衡化するためにキャップは緩めた状態にし、フラスコは33℃又は31℃、5％の二酸化炭素のインキュベータ中に静置した。インキュベーション後５から８日で、細胞数は、血球計を用いて及び/又はパックされた細胞容積をチェックすることにより計測された。培養物は、フラスコから除かれ、2000から2200 rpmにて10分間遠心され、上清はrｔ-ＰＡグリコシル化の分析が行われた。Ｔ-２５フラスコに代わって、細胞は、三つ組１つで60-mm細胞培養プレートを使用して培養された。
【００５８】
上清は、I/II型ｔ-ＰＡ分析を行うまで、-20℃又は-70℃で冷凍された。
スピナー実験に対しては、細胞は、250-mlのスピナーフラスコ中の200 mlの新鮮培地（0.1％の初期PCV）にて継代されることを除いて、前述の方法が使用された。キャップはフラスコに対してきつく締め付け、その後、30℃又は31℃のインキュベーター内、60 rpmのマグネチックスターラープレート上に静置した。
小規模発酵槽実験は、5リットルの撹拌タンクバイオリアクター（Applikon. Foster City. CA）中、ここで前述したような流加式培養形式の標準的ｔ-ＰＡ生産条件下にて実施された。温度は生産期の２日目に33℃又は31℃へ変更した。
コントロール実験に対しては、37℃にてインキュベーションが行われた点以外は、前述のように実験が行われた。さらに、実験は、上述の如く12-K発酵槽中で200時間に渡り実施され、Ｉ型ｔ-ＰＡの割合が評価された。
この部分及び下記にて示される実験において、通常、培養条件は4日目（例えば、異なる培地構成成分の添加）及び2日目（例えば、温度シフト）に変更された。
【００５９】
結果
Asn-184の位置におけるｔ-ＰＡ部位占有が、種々の培養規模（T-フラスコ、スピナー、及び80-L、400-L、2000-L、12,000-Lの発酵槽）（Ｆｉｇ２）及びタンパク質生産の実験毎において相対的に一定であることが見いだされ。部位占有率に影響を与える因子には、オリゴサッカライドードリコール有用性（ドリコールリン酸、脂質、及びホルモン）に影響を与える因子、タンパク質の翻訳伸長速度に影響を与える因子（例えば、シクロヘキシミド）、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性又はタンパク質の折り畳み速度に影響を与える因子（例えば、ジチオスレイトール）、及び培養時間のようなメカニズムが未知である因子が含まれる。一番最後の現象を例示するが、Ｆｉｇ３は、12k-発酵槽による実行時間を関数として37℃にてＣＨＯ細胞の細胞培養におけるＩ型ヒトｔ-ＰＡの割合のグラフを示し、各グラフ線は異なる実行（実験）を表す。これらの結果は、部位占有率はバッチ培養の全行程に渡って増加する（培養の長さに渡って）ことを示す。
Ｆｉｇ４は、温度を下げることによりｔ-ＰＡの部位占有率が増加することを示す。特に、Ｆｉｇ４Ａは、5から7日間実施された研究室規模の実験（T-フラスコ及びスピナーフラスコ）の結果を示す。生産期に温度を37℃のまま維持したコントロール実験においては、生産物は約38％のＩ型ｔ-ＰＡを含んでいた。これに対し、生産期に温度を33℃まで低下させた実験においては、得られたｔ-ＰＡ産物は約43から46％のＩ型ｔ-ＰＡを含んでいた。Ｆｉｇ４Ｂは、バイオリアクターの実験結果を示しており、同じくより低い温度において高い割合のＩ型ｔ-ＰＡを産することが示されている。
【００６０】
実施例２
rｈｔ-ＰＡの生産に対する酪酸の添加
材料及び方法
パックされた細胞容積の0.2％の播種密度に必要は細胞量がおよそ700 x g、10分間遠心され、それぞれの試験においれ25 cm2T-フラスコ中、適当な新鮮な培地に再懸濁された。T-フラスコ中、5 mlで三組一つで配置され、37℃、95％空気/5％二酸化炭素の条件下にてインキュベートされた。酪酸ナトリウムは、25 cm2T-フラスコ中、0.375 mM、0.75 mM、1.5 mMの濃度になるように、播種時に添加された。また、細胞はT-フラスコの場合と同様の酪酸濃度にて、スピナーフラスコ中、100 ml容積で培養した。発酵槽による実験では、酪酸は実験２日目に添加された。また、T-フラスコ培養は酪酸を添加せずに33℃及び37℃にて実施された。33℃におけるT-フラスコ培養について示されるデータは、二組の実験を二度行った（n=6）結果からのものである。ｔ-ＰＡの部位占有率は実施例1の方法を用いて解析された。
【００６１】
結果
Ｆｉｇ５は、37℃のT-フラスコ培中では、酪酸ナトリウムが播種時に0.375から1.5 mＭの濃度で存在することにより、ｔ-ＰＡの部位占有率が増加することを示している。同様の増加効果がスピナーフラスコ及び発酵槽の実験においても観察された。
Ｆｉｇ６は、60-mm培養プレートの実験において、33℃及び31℃への温度シフトが最も大きな影響を与え、ｔ-ＰＡ部位占有率を徐々に6％まで増加させることを示している。0.75 mMの酪酸は、酪酸が存在しない場合と比較してＩ型の含量をわずかに（約1％）増加させた（Ｆｉｇ６）。これに対して、さらに酪酸の濃度を増加させると（1.5 mM）、37℃及び33℃においては部位占有率を低下させるが、31℃では増加させた（Ｆｉｇ６）。
Ｆｉｇ７は、5リットルのバイオリアクター中における、温度及び酪酸のｔ-ＰＡ部位占有率への影響を示す。Ｉ型の含量は5から7日目に分析した。37℃から33℃へ温度を低下させると、ｔ-ＰＡの部位占有率が増加した。しかし、酪酸の濃度を0.75から1.5 mMに増加させると、Ｉ型の含量は両温度において減少した。この事実は、60-mm培養プレートの実験において得られたデータを確認するものである（Ｆｉｇ６を参照のこと）
【００６２】
実施例３
ｒｈｔ-ＰＡの生産に対する細胞周期阻害剤の添加
序論
先の実施例１及び２で述べたように、温度の低下、培養の長さ、及び酪酸の添加は、Asn-184の位置におけるｔ-ＰＡのグリコシル化を増加させることが見いだされた。これらの因子の全ては、細胞増殖速度の低下に対応し、このことから、グリコシル化及び部位占有率は細胞周期依存的であるという仮説が導かれる。この仮説は、細胞周期阻害剤（キニジンおよびチミジン）を用いた本実施例において示される２つのさらなる実験を実施することにより調べられた。
材料及び方法
細胞は実施例２において記述された酪酸ナトリウムの実験のように培養された。チミジンは水に溶解され、33から36倍濃度のストック溶液として滅菌ろ過された。キニジンはジメチルスルホキシド（DMSO）中で調製され1000から1800倍濃度のストックを作成するように滅菌ろ過された。チミジン及びキニジンは、それぞれ最終濃度250μg/mL及び90μMになるように播種時に添加された。ｔ-ＰＡの部位占有率は実施例１の方法を用いて解析された。
【００６３】
結果
コントロール、キニジン、チミジンに対する細胞周期の解析は、モデルF_AN1_T3.MODにより定量され、表２に示してある。
【００６４】
0004543131.tif 000002
【００６５】
Ｆｉｇ８は、部位占有率と細胞周期上の位置が培養している時間に渡り同じようにバラついていることを示す。Ｆｉｇ９はキニジンが細胞をG0/G1期（67％がG0/G1期）に阻害し、細胞周期阻害剤無添加のコントロール（54％がG0/G1期）と比較して増加した部位占有率を示す結果となり、チミジンは細胞をS/G2期に蓄積させ（33％がG0/G1期）、コントロールと比較して減少した部位占有率を示す結果となることを示す。これらの結果は、G0/G1期における細胞の割合を増加させる因子が部位占有率を増加させることを確証した。
【００６６】
実施例４
rｔ-ＰＡの生産に対する二価金属カチオン、ヌクレオチド糖前駆体の添加
材料及び方法
全ての実験は、マンガン塩、鉄塩、ヌクレオチド糖前駆体又はホルモンが増殖期に増殖培地に添加され、マンガン又は鉄の塩又はヌクレオチド糖前駆体については1日目に添加されたということを除いて、実施例１に記載された方法を用いて60-mm培養皿中で行われた。全てのプレートは、播種密度0.1%PCV及び6から8 mlの作業体積で接種された。全ての実施において、三通り行われた。プレートは37℃のCO2インキュベーター中でインキュベートされた。
増殖期における増殖培養液中のMnCl2又はクエン酸酸化鉄の量が、増加された。MnCl2については、3 nMがコントロールで、10 nM、100 nM、1μM、10μM、及び100μMの濃度でMnCl2の量を増加させた。クエン酸酸化鉄については、塩を添加しないものをコントロールとし、10μM、50μM、及び100μMで量を増加させた。
ウリジン、アデノシン及びグアノシンの量はそれぞれ0.5 mM、マンノースの量は5g/l（グアノシンとマンノースは混合させた）、-GHTは選択培地からグリシン、ヒポキサンチン、及びチミジンを除いたものである。
培養液に用いられたトリーヨードチロニン及びチロキシンの量は、ホルモンを含まないコントロールに比較して、1 nM、10 nM、又は100 nMのトリーヨードチロニン量、又は1 nM、10 nM、100 nMのチロキシン量にて増加させた。
T-ＰＡの部位占有率は、4から６日目（マンガン、鉄、又はヌクレオチド糖前駆体の実験）又は7日目（ホルモンの実験）において実施例１で記載した方法を用いて解析された。
【００６７】
結果
ｔ-ＰＡの部位占有率に対するマンガン濃度増加の影響（３組の実行による）は、Ｆｉｇ１０Ａ及び１０Ｂに示されている。3nMのコントロール値以上に添加するマンガンを培地に加えると、顕著にｔ-ＰＡの含量（向上した部位占有率）を約2.5％増加させた。正の滴定効果は3 nMと100 nMの間で観察された。既に効果的な濃度である100μM以上に濃度を上昇させてもさらなる改善は生じなかった。
オリゴサッカリルトランスフェラーゼは最大の活性を示すにはMn2+イオンを必要とするが、Mg、Ca、Feを含む他の八面体配位構造をとる二価金属カチオンは、減少した割合ではあるが転移を補助する（Hendorickson and Imperiali, 上掲及びKaufman等、上掲）。そこで、ｔ-ＰＡの部位占有率に対するFe2-の影響が調べられた。Ｆｉｇ１１に示すように、10から100μMのFe2-の添加によりｔ-ＰＡの部位占有率を徐々に約4％まで増加させた。
ヌクレオチド糖前駆体（ヌクレオシド、マンノース、グリシン、チミジン又はヒポキサンチン）の利用を増加させても、部位占有率を向上させなかった。さらに、ウリジン及びグアノシンの添加により、約2％部位占有率が減少した。（Ｆｉｇ１２を参照のこと）。
甲状腺ホルモン（チロキシン及びトリーヨードチロニン）のｔ-ＰＡ部位占有率に対する効果はＦｉｇ１３Ａ及び１３Ｂに示されている。これらのホルモンは約2％部位占有率を増加させ、上記で定義した他の血漿構成成分が同様にそのような効果を持つことが予想される。
【００６８】
結論として、ｔ−ＰＡのＮグリコシル化部位占有率に影響を与える幾つかの培養条件が同定された。これらの因子は、潜在的にさらなる産物濃度の改善を行うのに有用である。Asn-184におけるt−ＰＡ部位占有率は、種々の培養規模（T-フラスコ、スピナー、80リットル、400リットル、2000リットル及び12000リットル）を含む様々な条件に渡り、また実施毎に相対的に一定している。温度、酪酸、及び細胞周期阻害剤のようなG0/G1期における細胞の比率を増加させる因子は、部位占有率を増加させ、同様に、全培養時間中において、ある種の増加した二価金属カチオン及び/又は血漿構成成分が好適に存在する場合にも生じる。
明細書を通して引用された全引用文献の全体の開示及びここに引用された文献は出典明示により明示的にここに取り込まれる。
前述の事項は、特定の好ましい実施態様に言及するが、本発明はそのように限定されるものでないと理解されるであろう。当該技術分野における当業者であれば、本発明の全概念から逸脱しないで、それらに様々な変更を加えることができるであろう。そのような全ての変更は本発明の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】  Ｉ型ｔ-ＰＡとＩＩ型ｔ-ＰＡとそのクロマトグラムを示す図である。
【Ｆｉｇ２】  ３７℃で様々な規模で培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示す。
【Ｆｉｇ３】  １２Ｋ-発酵実施時間の関数としての３７℃でのＣＨＯ細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示すグラフであり、それぞれのラインが異なった実施回を表している。
【Ｆｉｇ４Ａ−４Ｂ】  対照（３７℃に保持された細胞培養物）に対して３３℃で５−７日の間、実験室規模（２５ｃｍ２のＴフラスコと１００ｍｌのスピナーフラスコにおいて−Ｆｉｇ４Ａ）又は５リットルのバイオリアクターにおいて（Ｆｉｇ４Ｂ）培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示す。
【Ｆｉｇ５】  ３７℃で３−４日の間Ｔフラスコで培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、酪酸ナトリウムが播種時に示された量で添加される。値は３回の実験のものである。
【Ｆｉｇ６】  ３７℃で３−４日の間、Ｔフラスコで培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、ここで酪酸ナトリウムを伴うか伴わない状態での温度変化が比較される（ここで、３７℃１−はブチラートのない３７℃での対照を意味する；３７℃１１Ｘは０．７５ｍＭのブチラートでの３７℃のものである。３７℃１２Ｘは１．５ｍＭのブチラートでの３７℃のものである。３３℃１−はブチラートのない３３℃のものである。３３℃１１Ｘは０．７５ｍＭのブチラートでの３３℃のものである。３３℃１２Ｘは１．５ｍＭのブチラートでの３３℃のものである。３１℃１−はブチラートのない３１℃のものである。３１℃１１Ｘは０．７５ｍＭのブチラートでの３１℃のものである。３１℃１２Ｘは１．５ｍＭのブチラートでの３１℃のものである。
【Ｆｉｇ７】  ５−７日の後、５リットルのバイオリアクターで培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、ここで酪酸ナトリウムを伴うか伴わない状態での温度変化が比較される（ここで、対照はブチラートのない３７℃のものである。３３℃はブチラートなしの３３℃である。２Ｘブチラートは１．５ｍＭのブチラートでの３７℃のものであり、３３℃２Ｘは１．５ｍＭのブチラートでの３３℃のものである。
【Ｆｉｇ８】  ３７℃で長い時間発酵槽で培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントであって、酪酸ナトリウムがおよそ４８時間で０．７５ｍＭの濃度で添加されたものと、対応する時点でのＧ０／Ｇ１相の細胞のパーセントを示す。これらの結果は３の別個の培養の平均を反映している。
【Ｆｉｇ９】  ３７℃で３−４日の間Ｔフラスコで培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、ここで、播種時に、細胞周期阻害剤が添加されないか（対照）、チミジン（２５０μｇ／ｍＬ）が添加されるか、又はキニジン（９０μＭ）が添加される。値は３回の実験のものである。
【Ｆｉｇ１０Ａ−１０Ｂ】  ３７℃で４−６日の間６０ｍｍの培養皿で培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、ここで、播種時に、３ｎＭのＭｎＣｌ２が添加されるか（対照）、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、又は１００μＭのＭｎＣｌ２が添加される。値はＦｉｇ１０Ａでは３通りが表され、Ｆｉｇ１０Ｂでは３回の平均値が表される。
【Ｆｉｇ１１】  ３７℃で４−６日の間６０ｍｍの培養皿で培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、ここで、播種時に、クエン酸酸化鉄が添加されないか（対照）、１０μＭのクエン酸酸化鉄、５０μＭのクエン酸酸化鉄、又は１００μＭのクエン酸酸化鉄が添加される。
【Ｆｉｇ１２】  ３７℃で４−６日の間６０ｍｍの培養皿で培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、ここで、細胞は、特定のヌクレオチド糖前駆体分子の量を増加させた状態で培養される。
【Ｆｉｇ１３Ａ−１３Ｂ】  ３７℃で７日の間６０ｍｍの培養皿で培養されたＣＨＯ細胞の細胞培養物中のＩ型ヒトｔ-ＰＡのパーセントを示し、ここで、播種時に、ホルモンが添加されないか（対照）、１ｎＭ、１０ｎＭ、又は１００ｎＭのトリ-ヨードチロニン（Triiod.）又はサイロキシン（Thyrox.）が添加される。値はＦｉｇ１３Ａでは３通りが表され、Ｆｉｇ１３Ｂでは３回の平均値が表される。
【図１】
0004543131.tif 000003
【図２】
0004543131.tif 000004
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
0004543131.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
0004543131.tif 000015
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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