(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生体試料、
ｂ）コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＨ酵素類という）および
ｃ）少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレン誘導体と、一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬の存在下、コレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＬＤＬコレステロール濃度を定量することを特徴とする、生体試料中のＬＤＬコレステロールの定量方法。
【請求項２】
ａ）生体試料、
ｂ）ＣＨ酵素類および
ｃ）ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはこれらの混合物、および２価の金属塩からなる群より選ばれる高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬという）以外のリポ蛋白を凝集させる試薬の存在下、第１のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＨＤＬコレステロール濃度を定量し、次いで、
ｄ）少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレン誘導体と、一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬を添加して、第２のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＬＤＬコレステロール濃度を定量することを特徴とする、生体試料中のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの分別定量方法。
【請求項３】
ａ）生体試料、
ｂ）ＣＨ酵素類および
ｃ）ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはこれらの混合物、および２価の金属塩からなる群より選ばれるＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬の存在下、第１のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＨＤＬコレステロール濃度を定量し、次いで、
ｄ）ＣＨ酵素類および
ｅ）少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレン誘導体と、一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬を添加して、第２のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＬＤＬコレステロール濃度を定量することを特徴とする、生体試料中のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの分別定量方法。
【請求項４】
第１のコレステロールの反応に使用するＣＨ酵素類が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、構造に糖類を含む基、スルホプロピル基、および、ポリウレタン基からなる群より選ばれる基で化学修飾された酵素であり、第２のコレステロールの反応に使用するＣＨ酵素類が化学修飾されていない酵素である請求項３記載の定量方法。
【請求項５】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬がさらに凝集したリポ蛋白を溶解しない非イオン性界面活性剤を含有する請求項２〜４のいずれかに記載の定量方法。
【請求項６】
ＣＨ酵素類、および、
少なくともポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレン誘導体と、一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬からなるＬＤＬコレステロール定量用試薬。
【請求項７】
第１試薬にヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはこれらの混合物、および２価の金属塩からなる群より選ばれるＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬およびＣＨ酵素類を含有する試薬、および、第２試薬にポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレン誘導体と、一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬を含有する試薬からなる、ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールとを分別定量するための試薬キット。
【請求項８】
第１試薬にヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはこれらの混合物、および２価の金属塩からなる群より選ばれるＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬およびＣＨ酵素類を含有する試薬、および、第２試薬にポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれるポリオキシエチレン誘導体と、一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬およびＣＨ酵素を含有する試薬からなる、ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールとを分別定量するための試薬キット。
【請求項９】
第１試薬中のＣＨ酵素類が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、構造に糖類を含む基、スルホプロピル基、および、ポリウレタン基からなる群より選ばれる基で化学修飾された酵素であり、第２試薬中のＣＨ酵素類が化学修飾されていない酵素である請求項８記載の試薬キット。
【請求項１０】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬が、さらに凝集したリポ蛋白を溶解しない非イオン性界面活性剤を含有する請求項７〜９のいずれかに記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、臨床診断の分野において重要な低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）中のコレステロール（以下、ＬＤＬコレステロールという）の定量方法およびそれに用いる定量試薬に関する。また本発明は、臨床診断の分野において重要な、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬという）中のコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールという）およびＬＤＬコレステロールの連続分別定量方法およびそれに用いる試薬キットに関する。また、本発明は、臨床診断の分野において重要な、ＨＤＬコレステロールおよび総コレステロール［ＨＤＬ、ＬＤＬ、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬという）およびカイロミクロン（以下、ＣＭという）中の全コレステロールをいう］の連続分別定量方法およびそれに用いる定量試薬キットに関する。
【０００２】
【背景技術】
ＨＤＬは動脈壁のコレステロールを除去し肝臓へ運ぶ働きがあるため、通称善玉と呼ばれており、またＬＤＬは動脈壁などの末梢組織にコレステロールを運搬する働きがあるため通称悪玉と呼ばれている。臨床検査分野においてＨＤＬコレステロール濃度、ＬＤＬコレステロール濃度および総コレステロール濃度は、動脈硬化症等の脂質に関する疾病の総合判断の指標として利用されている。これらコレステロール濃度は、それぞれのコレステロールに特異性がある専用の試薬で個別に定量されており、自動分析機も別々に定量するように設定されているが、それぞれのコレステロールに対する特異性のさらなる向上が望まれている。また、同一検出系においてＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、総コレステロール等を連続して分別定量する簡便で自動分析可能な方法は知られていない。
【０００３】
【発明の開示】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はＬＤＬコレステロールの定量方法およびそれに用いる定量試薬を提供することにある。
また本発明の目的は、同一検体のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの連続分別定量方法およびそれに用いる定量試薬キットを提供することである。また、本発明の目的は、同一検体のＨＤＬコレステロールおよび総コレステロールの連続分別定量方法およびそれに用いる定量試薬キットを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）から（２７）に関する。
（１）  ａ）生体試料、ｂ） コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＨ酵素類という）およびｃ） 低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬという）中のコレステロール（以下、ＬＤＬコレステロールという）のみにｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬の存在下、コレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＬＤＬコレステロール濃度を定量することを特徴とする、生体試料中のＬＤＬコレステロールの定量方法。
（２）  ＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬が、少なくともポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬である（１）記載の定量方法。
（３）  ポリオキシエチレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルである（２）記載の定量方法。
（４）  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体が一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表される界面活性剤である（２）または（３）記載の定量方法。
【０００６】
（５）  ａ）生体試料、
ｂ）ＣＨ酵素類および
ｃ）高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬという）中のコレステロール（以下ＨＤＬコレステロールという）にのみｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬の存在下、第１のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＨＤＬコレステロール濃度を定量し、次いで、
ｄ）ＬＤＬコレステロールのみにｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬を添加して、第２のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＬＤＬコレステロール濃度を定量することを特徴とする、生体試料中のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの分別定量方法。
（６）  ａ）生体試料、
ｂ）ＣＨ酵素類および
ｃ）ＨＤＬコレステロールのみにｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬の存在下、第１のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＨＤＬコレステロール濃度を定量し、次いで、
ｄ）ＣＨ酵素類および
ｅ）ＬＤＬコレステロールのみにｄ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬を添加して、第２のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＬＤＬコレステロール濃度を定量することを特徴とする、生体試料中のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールの分別定量方法。
【０００７】
（７）  ＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬が、少なくともポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬である（５）または（６）の定量方法。
（８）  ポリオキシエチレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルである（７）記載の定量方法。
（９）  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体が一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表される界面活性剤である（７）または（８）記載の定量方法。
【０００８】
（１０）  ａ）生体試料、
ｂ）ＣＨ酵素類および
ｃ）ＨＤＬコレステロールのみにｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬の存在下、第１のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＨＤＬコレステロール濃度を定量し、次いで、
ｄ）全てのリポ蛋白中のコレステロールにｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬を添加して、第２のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することにより総コレステロール（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、およびＣＭ中の全コレステロールをいう）を定量することを特徴とする、生体試料中のＨＤＬコレステロールおよび総コレステロールの分別定量方法。
（１１）  ａ）生体試料、
ｂ）ＣＨ酵素類および
ｃ）ＨＤＬコレステロールのみにｂ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬の存在下、第１のコレステロールの反応を行い、生成する過酸化水素または還元型補酵素を測定することによりＨＤＬコレステロール濃度を定量し、次いで、
ｄ）ＣＨ酵素類および
ｅ）全てのリポ蛋白中のコレステロールにｄ）記載のＣＨ酵素類を作用させる試薬を添加して、第２のコレステロールの反応を行い、発生する過酸化水素または還元型補酵素を測定することにより総コレステロールを定量することを特徴とする、生体試料中のＨＤＬコレステロールおよび総コレステロールの分別定量方法。
【０００９】
（１２）  ＨＤＬ中のコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬が、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬である（５）〜（１１）のいずれかに記載の定量方法。
（１３）  ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬がさらに凝集したリポ蛋白を溶解しない非イオン性界面活性剤を含有する（１２）記載の定量方法。
（１４）  ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬が、ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはこれらの混合物、および２価の金属塩からなる試薬である（１２）または（１３）記載の定量方法。
（１５）  第１のコレステロールの反応に使用するＣＨ酵素類が化学修飾された酵素であり、第２のコレステロールの反応に使用するＣＨ酵素類が化学修飾されていない酵素である（６）または（１１）記載の定量方法。
（１６）  全てのリポ蛋白中のコレステロールにＣＨ酵素類を作用させる試薬が、リポ蛋白を溶解する界面活性剤を含む試薬である（１０）〜（１５）のいずれかに記載の定量方法。
【００１０】
（１７）  ＣＨ酵素類およびＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬からなるＬＤＬコレステロール定量用試薬。
（１８）  ＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬が、少なくともポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬である（１７）記載のＬＤＬコレステロール定量用試薬。
（１９）  ポリオキシエチレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルである（１８）記載の定量試薬。
（２０）  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体が一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表される界面活性剤である（１８）または（１９）記載のＬＤＬコレステロール定量用試薬。
【００１１】
（２１）  第１試薬にＨＤＬリポ蛋白以外のリポ蛋白を凝集させる試薬およびＣＨ酵素類を含有する試薬および第２試薬にＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬を含有する試薬からなる、ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールとを分別定量するための試薬キット。
（２２）  ＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬が、ポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬である（２１）記載の試薬キット。
（２３）  ポリオキシエチレン誘導体が、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルである（２１）記載の試薬キット。
（２４）  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体が一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表される界面活性剤である（２１）または（２２）記載の試薬キット。
【００１２】
（２５）  第１試薬にＨＤＬリポ蛋白以外のリポ蛋白を凝集させる試薬およびＣＨ酵素類を含有する試薬および第２試薬に全リポ蛋白中のコレステロールにＣＨ酵素類を作用させる試薬を含有する試薬からなる、ＨＤＬコレステロールと総コレステロールとを分別定量するための試薬キット。
（２６）  全てのリポ蛋白中のコレステロールにＣＨ酵素類を作用させる試薬が、リポ蛋白を溶解する界面活性剤を含む試薬である（２５）記載の試薬キット。
（２７）  ＨＤＬリポ蛋白以外のリポ蛋白を凝集させる試薬が、ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはこれらの混合物、および２価の金属塩からなる試薬である（２１）〜（２６）のいずれかに記載の試薬キット。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】  図１は、本発明方法（図中、ＤＢ  ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度と対照方法（Ｌ  ＨＤＬ−Ｃ方法、図中、Ｓ  ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度の相関を示す。
【図２】  図２は、本発明方法（図中、ＤＢ  ＬＤＬ−Ｃと表示）で得られるＬＤＬコレステロール濃度と対照方法（Ｌ  ＬＤＬ−Ｃ方法、図中、Ｓ  ＬＤＬ−Ｃと表示）で得られるＬＤＬコレステロール濃度の相関を示す。
【図３】  図３は、本発明方法（図中、ＤＢ−ＴＣと表示）で得られる総コレステロール濃度と対照方法（デタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ方法、図中、Ｌ  ＴＣ  ＩＩと表示）で得られる総コレステロール濃度の相関を示す。
【図４】  図４は、本発明方法（図中、ＤＢ  ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度と対照方法（Ｌ  ＨＤＬ−Ｃ方法、図中、Ｓ  ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度の相関を示す。
【図５】  図５は、本発明方法（図中、本法と表示）で得られるＬＤＬコレステロール濃度と対照方法（図中、対照方法と表示）であるフリーデワルドの計算式より得られるＬＤＬコレステロール濃度の相関を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、上記のごとく各種リポ蛋白を含む生体試料にＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる特定の試薬（以下、試薬Ａという）を添加してＬＤＬコレステロールを定量する方法およびそれに用いる試薬に関する。
また本発明は、上記のごとく各種リポ蛋白を含む生体試料にＨＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる特定の試薬（以下、試薬Ｂという）を添加してＨＤＬコレステロールを定量し、次いで試薬Ａを添加してＬＤＬコレステロールを定量する分別定量方法およびそれに用いる試薬キットに関する。
また本発明は、上記のごとく各種リポ蛋白を含む生体試料に試薬Ｂを添加してＨＤＬコレステロールを定量し、次いで全てのリポ蛋白中のコレステロールにＣＨ酵素類を作用させる試薬（以下、試薬Ｃという）を添加して総コレステロールを定量する分別定量方法およびそれに用いる試薬キットに関する。
【００１５】
本発明を適用する生体試料は、特に限定されず、具体的には血液自体または血漿、血清等血液画分を該試料として使用することができる。
【００１６】
本発明のコレステロールを定量するための反応は水性媒体中、特に緩衝液中で行われる。
緩衝液に使用する緩衝剤としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤およびグッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣ(12) ＷＯ００／１７３８８ＥＳ）、Ｎ−（２−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（以下、ＭＥＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下、ＰＩＰＥＳという）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）等があげられる。
緩衝液のｐＨは５〜１０、好ましくは６〜９である。緩衝剤の使用濃度は、５〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜２００ｍＭである。
【００１７】
ＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬Ａは、ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ中のコレステロールにはそれらＣＨ酵素類を作用させない試薬である。試薬Ａは、後述のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬の存在下でもＬＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させることができる。
【００１８】
該試薬Ａとしては、例えば少なくともポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とを含有する試薬等があげられる。
ポリオキシエチレン誘導体としては、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルおよびポリオキシエチレンアルキルエーテル等があげられ、該アルキルとしては、炭素数８以上の、例えばオクチル、ノニル等があげられ、該アリールとしては、フェニル等があげられる。
【００１９】
具体的なポリオキシエチレン誘導体としては、例えばノニオンＨＳ−２１０、ノニオンＨＳ−２１５、ノニオンＮＳ−２０８．５、ノニオンＨＳ−２０８（以上、日本油脂社製）、エマルゲンＬ−４０、エマルゲン９１１、エマルゲン８１０（以上、花王社製）等の市販品があげられる。ポリオキシエチレン誘導体の親水性・親油性バランス（以下、ＨＬＢという）は、９〜２０が好ましい。  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体としては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのランダム共重合体でもブロック共重合体でもよく、例えば一般式（Ｉ）
ＨＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃ−Ｈ    （Ｉ）
［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２００の整数を表す。］で表される化合物があげられる。
【００２０】
一般式（Ｉ）で表される化合物としては、例えば、プロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２２、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＰ−１０３、プルロニックＦ−１０８等の市販品（いずれも旭電化社製）があげられる。また、一般式（Ｉ）で表される化合物中のポリプロピレングリコール基の分子量としては、２，０５０以上が好ましく、２，７５０以上がより好ましく、３，２５０以上が特に好ましい。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のＨＬＢは、１〜６が好ましい。
【００２１】
ポリオキシエチレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の使用濃度は特に限定されないが、それぞれ独立に０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜５％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好ましい。
【００２２】
ＨＤＬコレステロールのみにＣＨ酵素類を作用させる試薬Ｂとしては、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、およびＨＤＬ以外のリポ蛋白に対する抗体等があげられる。
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬は、該リポ蛋白の凝集剤および／または２価の金属塩を含むものが用いられる。凝集剤としては、ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはこれらの混合物などがあげられ、シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンなどがあげられ、オリゴ糖としては、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどがあげられ、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩などがあげられる。２価の金属塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩などがあげられる。
【００２３】
凝集剤としては、０．０２〜１０ｍＭの分子量５，０００〜２０，０００のヘパリンまたはその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量４，０００〜８，０００のリンタングステン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子量１０，０００〜５００，０００のデキストラン硫酸またはその塩、０．１〜２０ｍＭの分子量１，０００〜１０，０００のデキストラン硫酸またはその塩、０．３〜１００ｍＭの分子量４，０００〜２５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、０．１〜５０ｍＭの分子量１，０００〜３，０００の硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、０．１〜５０ｍＭの分子量４００〜３，０００の硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはそれらの混合物などが用いられる。好ましくは、０．０３〜１ｍＭの分子量１４，０００〜１６，０００のヘパリンまたはその塩、０．１〜３ｍＭの分子量５，０００〜７，０００のリンタングステン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子量１５０，０００〜２５０，０００のデキストラン硫酸またはその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量１，０００〜５，０００のデキストラン硫酸またはその塩、１．０〜５０ｍＭの分子量５，０００〜２２，０００のＰＥＧ、０．１〜１０ｍＭの分子量１，０００〜２，０００の硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量４００〜２，０００の硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはそれらの混合物などが用いられる。
【００２４】
２価の金属塩としては、０．１〜５０ｍＭのマグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、コバルト塩などがあげられ、好ましくは、０．１〜５０ｍＭのマグネシウム塩が用いられる。
【００２５】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬には凝集したリポ蛋白を溶解しない非イオン性界面活性剤を含有させるのが好ましい。
凝集したリポ蛋白を溶解しない非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩等があげられる。これらのうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、ポリオキシエチレンエーテル［エマルゲン２２０（花王社製）等］が、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテルとしては、市販品としてエマルゲンＢ６６等が、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物としては、市販品としてプルロニックＦ８８（旭電化社製）等が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム［市販品としては、エマール２０Ｃ（花王社製）等］が、アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが好ましい。
【００２６】
凝集したリポ蛋白を溶解しない非イオン性界面活性剤は、ＬＤＬコレステロールにＣＨ酵素類を作用させない限り組合わせて使用することができるが、単独で使用するのが好ましい。使用濃度は特に限定されないが、０．０１〜１０％が好ましく、０．１〜５％が特に好ましい。
【００２７】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白に対する抗体としては、抗アポリポ蛋白Ｂ抗体、抗アポリポ蛋白Ｃ抗体、抗アポリポ蛋白Ｅ抗体、抗βリポ蛋白抗体等があげられ、単独もしくは組み合わせて用いられる。抗体としては、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。またこれらの抗体は、酵素的または化学的に分解、修飾されたものでもよい。
【００２８】
全てのリポ蛋白中のコレステロールにＣＨ酵素類を作用させる試薬Ｃとしては、例えば全てのリポ蛋白を溶解する界面活性剤があげられる。
該界面活性剤としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭのリポ蛋白を溶解する非イオン性界面活性剤等が用いられる。具体的には、市販品としてトリトンＸ−１００などのノニオン界面活性剤、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン７０９等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類等があげられる。これらの界面活性剤は単独または組み合わせて使用することができる。使用濃度は特に限定されないが、０．０１〜１０％が好ましく、０．１〜５％が特に好ましい。
【００２９】
本発明に用いるコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を有する酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する微生物または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼなどがあげられる。
【００３０】
これらの酵素は、基質に対する特異性に合わせて用いうる。例えばＨＤＬコレステロールの定量のときには該コレステロールに特異的な酵素を用い、ＬＤＬコレステロールの定量のときには該コレステロールに特異的な酵素を用いることが好ましい。これら酵素の特異性、安定性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで該酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられる。
【００３１】
酵素を修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、ポリエチレングリコールにアミノ基と結合可能な基を結合させた化合物、例えばポリエチレングリコールにＮ−ヒドロキシサクシンイミド基等のアミノ基と結合可能な基を結合させたサンブライト ＶＦＭ４１０１［日本油脂（株）製］等、ポリアルキレングリコール構造および酸無水物構造を有するサンブライトＡＫＭシリーズ、同ＡＤＭシリーズ、同ＡＣＭシリーズ［いずれも日本油脂（株）製：化学工学論文集、第２０巻、第３号、４５９頁、１９９４年］、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体にアミノ基と結合可能な基を結合させた化合物、ポリエチレングリコールモノメタクリルモノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体等があげられる。また、ポリウレタンの化学修飾剤である活性化ポリウレタンＰ４０００（ベーリンガーマンハイム社製Ｅｎｚｙｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｔ能書）、デキストランの化学修飾剤であるデキストランＴ４０，活性化ＴＣＴ（同）、１，３−プロパンサルトン等も使用できる。これら化学修飾剤により、酵素を、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、構造に糖類を含む基、スルホプロピル基、ポリウレタン基等で修飾することができる。
【００３２】
酵素に上記化学修飾剤を反応させる方法は、蛋白質のハイブリット、稲田祐二著、共立出版（１９８７年）等に記載の方法が用いられる。例えばサンブライトを用いる場合は、酵素をｐＨ８以上のヘペス緩衝液等の緩衝液中に溶解し、０〜５０℃で例えば０．０１〜５００倍モル量のサンブライトを添加し、５〜６０分間撹拌する。この反応液をそのままあるいは必要に応じて限外濾過膜により低分子物を除去して用いる。
【００３３】
本発明におけるコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００３４】
本発明では、ＨＤＬコレステロールの定量に使用するＣＨ酵素類をＬＤＬコレステロールまたはＨＤＬ以外のコレステロールもしくは総コレステロールの定量にそのまま使用することもできるし、ＬＤＬコレステロールまたはＨＤＬ以外のコレステロールもしくは総コレステロールの定量に際し新たに同一または基質特異性の異なるＣＨ酵素類を添加することもできる。
【００３５】
ＨＤＬコレステロールの定量に使用するＣＨ酵素類は、化学修飾したものを用い、ＬＤＬまたはＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールもしくは総コレステロールの定量には化学修飾していないＣＨ酵素類を用いることが好ましい。
【００３６】
本発明のコレステロールの反応では、反応の特異性に影響を及ぼさない範囲でＣＨ酵素類を活性化するためによく使用される界面活性剤あるいはコール酸類も使用可能であり、また、グロブリンなどを可溶化するための種々の塩類を使用することもできる。
【００３７】
ＣＨ酵素類を活性化するための界面活性剤としては、例えばアニオン界面活性剤が０〜１％の範囲で使用される。コール酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸などが０〜５％の範囲で使用される。アニオン界面活性剤としては１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン酸塩などのアルキルスルホン酸塩があげられ０〜５％の範囲で使用される。
【００３８】
塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１００ｍＭの範囲で使用される。
【００３９】
コレステロールの反応がコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼにより行われる場合は、過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬または高感度の色素源を用いて定量することができる。
【００４０】
フェノール類としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００４１】
トリンダー試薬（同仁化学研究所第１９版総合カタログ、１９９４年）としては、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニンジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン等のアニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等があげられる。
【００４２】
高感度の色素源としては、特公昭６０−３３４７９で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−２９６で示される化合物等があげられる。
これら色素源の濃度としては、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００４３】
コレステロールの反応が、基質として酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）存在下に、コレステロールエステラーゼとコレステロールデヒドロゲナーゼにより行われる場合は、還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の吸光度を測定することにより定量することができる。なお、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を添加してホルマザン色素の発色に導き、ホルマザン色素を比色して行うこともできる。
【００４４】
ＬＤＬコレステロール定量のための反応は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。
【００４５】
分別定量における、ＨＤＬコレステロール定量のための反応（以下、第１の反応という）は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行い、ＬＤＬコレステロールまたは総コレステロール定量のための反応（以下、第２の反応という）は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。第２の反応の開始は、第１の反応で反応が実質的に終了した後でも第１の反応が進行中でも、ＨＤＬの定量が完了すればいかなる時期でもよい。第２の反応は、ＬＤＬコレステロールにＣＨ酵素類を特異的に作用させる試薬Ａまたは全てのリポ蛋白中のコレステロールにＣＨ酵素類を作用させる試薬Ｃおよび必要に応じてＣＨ酵素類を添加して開始する。第２の反応により発生する過酸化水素または還元型補酵素［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］を定量する試薬は、第１の反応液に使用したものがそのまま使用できるが、必要により新たに添加してもよい。
【００４６】
本発明で、ＨＤＬコレステロールの反応後にＬＤＬコレステロールの反応を行い、ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールを分別定量する場合においては、前述の通りＬＤＬコレステロールの反応は、試薬Ａを添加して開始されるが、第１のＨＤＬコレステロールの反応が、前述のＨＤＬ以外の凝集したリポ蛋白を溶解しない非イオン性界面活性剤、すなわちポリオキシエチレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のいずれかを添加して行われているときは、該第２のＬＤＬコレステロールの反応は、ＨＤＬコレステロール反応に使用されている界面活性剤と合わせて試薬Ａを構成すような界面活性剤を添加することにより開始することもできる。
【００４７】
各リポ蛋白中のコレステロール濃度は、検体試料を用いた場合の各反応前後の吸光度の差（ΔＯＤ）および各種リポ蛋白中のコレステロール濃度既知の試料を用いた場合の吸光度の差（ΔＯＤｓｔｄ）から下記の計算により算出される。
ＬＤＬコレステロール濃度は、ΔＯＤ÷ΔＯＤｓｔｄ×（既知のＬＤＬコレステロール濃度）から求めることができる。ＨＤＬコレステロール濃度は、例えばΔＯＤ÷ΔＯＤｓｔｄ×（既知のＨＤＬコレステロール濃度）の計算により求めることができる。なお、分別定量において、第１の反応と第２の反応で生成する
化合物が同一であり検出方法が同一の場合は、総コレステロール濃度は、第１の反応前と第２の反応後の吸光度差を用いてΔＯＤ÷ΔＯＤｓｔｄ×（既知の総コレステロール濃度）の計算により求めることができる。
【００４８】
本発明のＬＤＬコレステロール定量試薬としては、ＣＨ酵素類およびポリオキシエチレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を含有する試薬を含有する試薬があげられる。該ＬＤＬ定量試薬には、必要に応じて前述の緩衝剤、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、コレステロール定量に用いられる界面活性剤、コール酸類、種々の塩類、パーオキシダーゼ等の酵素、４−アミノアンチピリンおよびトリンダー試薬等の色源体等、ＮＡＤ（Ｐ）等の酸化型補酵素を含有することができる。
【００４９】
本発明のＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールとを分別定量するための試薬キットは、第１試薬と第２試薬のキットからなり、例えば第１試薬はＨＤＬ以外のリポ蛋白の凝集剤およびＣＨ酵素類を含有する試薬からなり、第２試薬は、ポリオキシエチレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を含有する試薬を含有する試薬からなる。
【００５０】
また、本発明のＨＤＬコレステロールと総コレステロールとを分別定量するための試薬キットは、第１試薬と第２試薬のキットからなり、例えば第１試薬はＨＤＬ以外のリポ蛋白の凝集剤およびＣＨ酵素類を含有する試薬からなり、第２試薬はすべてのリポ蛋白（ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ）を溶解する非イオン性界面活性剤を含有する試薬からなる。
【００５１】
本発明の試薬キットの第１試薬または第２試薬には、必要に応じて前述の緩衝剤、コレステロール定量に用いられる界面活性剤、コール酸類、種々の塩類、パーオキシダーゼ等の酵素、４−アミノアンチピリンおよびトリンダー試薬等の色源体等、ＮＡＤ（Ｐ）等の酸化型補酵素を含有することができる。
【００５２】
第２試薬には、必要に応じて、第１試薬と同一または異なる起源のＣＨ酵素類としてもよい。第１試薬に使用するＣＨ酵素類は、前述の化学修飾された酵素とし、第２試薬に用いるＣＨ酵素類は、化学修飾されていない酵素を用いるのが好ましい。
【実施例】
【００５３】
実施例１  （ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールの定量）
試薬１（ｐＨ＝７）
ＭＥＳ（ナカライテスク社製）                            ２０ｍＭ
デキストラン硫酸（東京化成社製）                        ０．２３ｍｇ／ｍｌ
硫酸マグネシウム（関東化学社製）                        １．５ｍｇ／ｍｌ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                              ０．２３ｍｇ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                  ０．１３ｍｇ／ｍｌ
ポリエチレングリコール修飾コレステロールエステラーゼ（＊１）
０．２５Ｕ／ｍｌ
ポリエチレングリコール修飾コレステロールオキシダーゼ（＊２）
１．６５Ｕ／ｍｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製）                          １２．５Ｕ／ｍｌ
＊１：５０ｇのコレステロールエステラーゼ（天野製薬社製）を１Ｌの０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、２５℃にて、３３０ｇのサンブライトＶＦＭ４１０１を添加し２時間撹拌して調製した。
＊２：５０ｇのコレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）を１Ｌの０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１５℃にて１０ｇのサンブライトＶＦＭ４１０１を添加し２時間撹拌して調製した。
試薬２（ｐＨ＝７）
ＭＥＳ（ナカライテスク）                                ２０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡社製）
３Ｕ／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）          ２Ｕ／ｍｌ
プルロニックＬ−１２１（旭電化社製）                    ０．７％
エマルゲンＬ−４０（花王社製）                          ０．５％
塩化カルシウム（和光純薬社製）                          ０．１ｍｇ／ｍｌ
【００５４】
検体として、健常人の血清３０検体を用意し、下記の操作により検体中のＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールの定量を行った。試薬１、２．２５ｍｌに検体３０μｌを添加、攪拌し、直後５８５ｎｍの吸光度Ｅ１を測定した。続いて３７℃で５分間反応後同じ吸収波長の吸光度Ｅ２を測定した。これにさらに試薬２、０．７５ｍｌを添加、攪拌し、直後の５８５ｎｍの吸光度Ｅ３を測定した。続いて３７℃で５分間反応後同じ吸収波長の吸光度Ｅ４を測定した。一方、コレステロール既知濃度の血清を同様な操作をして、各吸光度Ｅ１ｓｔｄ、Ｅ２ｓｔｄ、Ｅ３ｓｔｄおよびＥ４ｓｔｄを求めた。
【００５５】
ＨＤＬコレステロール濃度は上記吸光度から、（Ｅ２−Ｅ１）÷（Ｅ２ｓｔｄ−Ｅ１ｓｔｄ）×（既知ＨＤＬコレステロール濃度）の式により求めた。同様にＬＤＬコレステロール濃度も上記吸光度から、（Ｅ４−Ｅ３）÷（Ｅ４ｓｔｄ−Ｅ３ｓｔｄ）×（既知ＬＤＬコレステロール濃度）の式により求めた。
【００５６】
また、別途各コレステロールの個別定量用市販キットであるデタミナーＬ  ＨＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）およびデタミナーＬ  ＬＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）を使用して各検体中のＨＤＬコレステロール濃度、ＬＤＬコレステロール濃度を定量した。該市販キットで得られた定量値と本発明方法で得られた定量値の相関係数を計算したところ、ＨＤＬコレステロールでは０．９９７、ＬＤＬコレステロールでは０．９８８であった。
【００５７】
図１は、本発明方法（図１中、ＤＢ  ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）と対照方法（Ｌ  ＨＤＬ−Ｃ方法、図１中、Ｓ  ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）の相関図を示す。また図２は、本発明方法（図２中、ＤＢ  ＬＤＬ−Ｃと表示）で得られるＬＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）と対照方法（Ｌ  ＬＤＬ−Ｃ方法、図２中、Ｓ  ＬＤＬ−Ｃと表示）で得られるＬＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）の相関図を示す。
【００５８】
実施例２  （ＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールの定量）
試薬１（ｐＨ＝７）
ＭＥＳ（ナカライテスク）                                    ２０ｍＭ
リンタングステン酸（和光純薬社製）                          ７．５ｍｇ／ｍｌ
硫酸マグネシウム（和光純薬社製）                            １．５ｍｇ／ｍｌ
ＴＯＯＳ（同仁化学社製）                                    ０．５ｍｇ／ｍｌ
エマルゲンＢ６６（花王社製）                                １０ｍｇ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５ｍｇ／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（ＬＰＢＰ、旭化成社製）          ４Ｕ／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（ｒＣＯ、オリエンタル酵母社製）  ２Ｕ／ｍｌ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製）                              １０Ｕ／ｍｌ
試薬２（ｐＨ＝７）
ＭＥＳ（ナカライテスク）                                    ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡社製）
３Ｕ／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              ２Ｕ／ｍｌ
プルロニックＬ−１２１（旭電化社製）                        ０．７％
エマルゲンＬ−４０（花王社製）                              ０．５％
塩化カルシウム（和光純薬社製）                              ０．１ｍｇ／ｍｌ
【００５９】
実施例１と同じ検体を用い、測定波長を５５５ｎｍにした他は実施例１と同様な操作を行ってＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールの定量を行った。市販キット（前述の、デタミナーＬ  ＨＤＬ−ＣおよびデタミナーＬ  ＬＤＬ−Ｃ）で得られた定量値と本発明方法で得られた定量値の相関係数を計算したところ、ＨＤＬコレステロールでは０．９２９、ＬＤＬコレステロールでは０．９１１であった。
【００６０】
実施例３  （ＨＤＬコレステロールと総コレステロールの定量）
試薬１（ｐＨ＝７）
ＭＥＳ（ナカライテスク）                                    ２０ｍＭ
デキストラン硫酸（東京化成社製）                            ０．２３ｍｇ／ｍｌ
硫酸マグネシウム（関東化学社製）                            １．５ｍｇ／ｍｌ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                                  ０．２３ｍｇ／ｍｌ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．１３ｍｇ／ｍｌ
ポリエチレングリコール修飾コレステロールエステラーゼ（＊１）０．２５Ｕ／ｍｌ
ポリエチレングリコール修飾コレステロールオキシダーゼ（＊１）１．６５Ｕ／ｍｌ
パーオキシダーゼ                                            １２．５Ｕ／ｍｌ
＊１：実施例１の＊１と同様に調製
＊２：実施例１の＊２と同様に調製
試薬２（ｐＨ＝６．７５）
ＭＥＳ（ナカライテスク）                                    ２０ｍＭ
トリトンＸ−１００（シグマ社製）                            １ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製）                    ２．４Ｕ／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（天野製薬社製）                  ６．２５Ｕ／ｍｌ
【００６１】
検体として、実施例１で用いた健常人血清３０検体を用意し、下記の操作により検体中のＨＤＬコレステロールと総コレステロールの定量を行った。
試薬１、２．２５ｍｌに検体３０μｌを添加、攪拌し、直後５８５ｎｍの吸光度Ｅ１を測定した。続いて３７℃で５分間反応後同じ吸収波長の吸光度Ｅ２を測定した。これにさらに試薬２、０．７５ｍｌを添加、攪拌し、直後の５８５ｎｍの吸光度Ｅ３を測定した。続いて３７℃で５分間反応後同じ吸収波長の吸光度Ｅ４を測定した。一方、コレステロール既知濃度の血清を同様な操作をして、各吸光度Ｅ１ｓｔｄ、Ｅ２ｓｔｄ、Ｅ３ｓｔｄおよびＥ４ｓｔｄを求めた。
ＨＤＬコレステロール濃度は上記吸光度から、（Ｅ２−Ｅ１）÷（Ｅ２ｓｔｄ−Ｅ１ｓｔｄ）×（既知ＨＤＬコレステロール濃度）の式により求めた。同様に総コレステロール濃度は上記吸光度から、（Ｅ４−Ｅ１）÷（Ｅ４ｓｔｄ−Ｅ１ｓｔｄ）×（既知総コレステロール濃度）の式により求めた。
【００６２】
また、別途各コレステロールの個別定量用市販キットであるデタミナーＬ  ＨＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）およびデタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ（協和メデックス社製）を使用して各検体中のＨＤＬコレステロール、総コレステロール濃度を定量した。該市販キットで得られた定量値と本発明方法で得られた定量値の相関係数を計算したところ、ＨＤＬコレステロールでは０．９９２、総コレステロールで０．９９９であった。
【００６３】
図３は、本法（図３中、ＤＢ−ＴＣと表示）で得られる総コレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）と対照方法（デタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ方法、図３中、Ｌ  ＴＣ  ＩＩと表示）で得られる総コレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）の相関図を示す。
【００６４】
図４は、本発明方法（図４中、ＤＢ ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）と対照方法（Ｌ ＨＤＬ−Ｃ方法、図４中、Ｓ  ＨＤＬ−Ｃと表示）で得られるＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）の相関図を示す。
【００６５】
実施例４
第１試薬（ｐＨ  ７．２５）
ＰＩＰＥＳ（ナカライテスク社製）                            ５０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                                  ０．３ｍｇ／ｍＬ
第２試薬（ｐＨ  ７．２５）
ＰＩＰＥＳ（ナカライデスク社製）                            ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡社製）
５Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              １Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製）                              ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５１ｍｇ／ｍＬ
塩化カルシウム（和光純薬社製）                              ０．１ｍｇ／ｍＬ
界面活性剤（第１表に記載の種類と濃度）
【００６６】
検体として超遠心法によって人血清から分離されたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを使用した。なお、各リポ蛋白の画分は、福祉医療技術振興会より得た。該画分は、アドバンスド・リピド・リサーチ（Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．），６（１９６８）［Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｈａｔｃｈ Ｆ ＆ ＬｅｅｓＲ］に従って調製されたものである。なお、本実験に使用した各リポ蛋白中のコレステロール濃度をデタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ（協和メデックス社製）により定量した結果、ＨＤＬで７３ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬで２６４ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬで８４ｍｇ／ｄＬ、ＣＭで１７ｍｇ／ｄＬであった。
【００６７】
第１試薬３００μＬに各検体４μＬを混合し５分間、３７℃で保温した。このときの吸光度を測定し、次いで第２試薬１００μＬを添加し反応させ、５分後の吸光度を測定した。日立７０７０自動分析装置を用い、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍを用いた。
試料としてＬＤＬ画分を用いて得られた反応前後の吸光度差をＡＬＤＬ、ＨＤＬ画分を用いて得られた反応前後の吸光度差をＡＨＤＬ、ＶＬＤＬ画分を用いて得られた反応前後の吸光度差をＡＶＬＤＬおよびＣＭ画分を用いて得られた反応前後の吸光度差をＡＣＭとした。
【００６８】
結果を第１表に示す。結果は、ＡＨＤＬ／ＡＬＤＬ値、ＡＶＬＤＬ／ＡＬＤＬ値およびＡＣＭ／ＡＬＤＬ値を表した。これらの値が小さいほどＬＤＬに特異的な定量条件であることを示す。
【００６９】
【表１】
0004428863.tif 000002
【００７０】
第１表に示すように、界面活性剤を組合わせて使用することにより、界面活性剤を単独で使用する場合に比べて、コレステロールの反応がＬＤＬコレステロールに特異的となる。
【００７１】
実施例５
第１試薬（ｐＨ  ６．７５）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              ５０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                                  ０．３ｍｇ／ｍＬ
第２試薬（ｐＨ  ６．７５）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡績社製）
１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              ３Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製）                              ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５１ｍｇ／ｍＬ
塩化カルシウム（和光純薬工業社製）                          ０．１ｍｇ／ｍＬ
界面活性剤（第２表に記載の種類と濃度）
【００７２】
第２表の界面活性剤を用いる以外は、実施例４と同様に試験し、ＡＬＤＬ、ＡＨＤＬ、ＡＶＬＤＬおよびＡＣＭを求め、ＡＨＤＬ／ＡＬＤＬ値、ＡＶＬＤＬ／ＡＬＤＬおよびＡＣＭ／ＡＬＤＬを算出した。なお、本実験に使用した各リポ蛋白中のコレステロール濃度をデタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ（協和メデックス社製）により定量した結果は、ＨＤＬで８１ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬで２６３ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬで７２ｍｇ／ｄＬ、ＣＭで１４ｍｇ／ｄＬであった。
結果を第２表に示す。
【００７３】
【表２】
0004428863.tif 000003
【００７４】
第２表に示すように、界面活性剤を組合わせて使用することにより、界面活性剤を単独で使用する場合に比べて、コレステロールの反応がＬＤＬコレステロールに特異的となる。
【００７５】
実施例６
第１試薬（ｐＨ  ６．７５）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              ２０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                                  ０．３ｍｇ／ｍＬ
第２試薬（ｐＨ  ６．７５）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              ２０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡績社製）
２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              ３Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製）                              ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５１ｍｇ／ｍＬ
塩化カルシウム（和光純薬工業社製）                          ０．１ｍｇ／ｍＬ
界面活性剤（第３表に記載の種類と濃度）
【００７６】
第３表の界面活性剤を用いる以外は、実施例４と同様に試験し、ＡＬＤＬ、ＡＨＤＬ、ＡＶＬＤＬおよびＡＣＭを求め、ＡＨＤＬ／ＡＬＤＬ値、ＡＶＬＤＬ／ＡＬＤＬおよびＡＣＭ／ＡＬＤＬを算出した。なお、本実験に使用した各リポ蛋白中のコレステロール濃度をデタミナーＬ ＴＣ ＩＩ（協和メデックス社製）により定量した結果は、ＨＤＬで８５ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬで２５２ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬで７５ｍｇ／ｄＬ、ＣＭで１９ｍｇ／ｄＬであった。
結果を第３表に示す。
【００７７】
【表３】
0004428863.tif 000004
【００７８】
第３表に示すように、界面活性剤を組合わせて使用することで、ＬＤＬコレステロールを特異的に測定できる。
【００７９】
実施例７
第１試薬（ｐＨ  ７．０）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              １０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                                  ０．３ｍｇ／ｍＬ
第２試薬（ｐＨ  ７．０）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡績社製）
１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              ３Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ（東洋紡社製）                              ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５１ｍｇ／ｍＬ
塩化カルシウム（和光純薬工業社製）                          ０．１ｍｇ／ｍＬ
界面活性剤（第４表に記載の種類と濃度）
【００８０】
第４表の界面活性剤を用いる以外は、実施例４と同様に試験し、ＡＬＤＬ、ＡＨＤＬ、ＡＶＬＤＬおよびＡＣＭを求め、ＡＨＤＬ／ＡＬＤＬ値、ＡＶＬＤＬ／ＡＬＤＬおよびＡＣＭ／ＡＬＤＬを算出した。なお、本実験に使用した各リポ蛋白中のコレステロール濃度をデタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ（協和メデックス社製）により定量した結果は、ＨＤＬで７９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬで２７３ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬで７６ｍｇ／ｄＬ、ＣＭで１６ｍｇ／ｄＬであった。
結果を第４表に示す。
【００８１】
【表４】
0004428863.tif 000005
【００８２】
第４表に示すように、界面活性剤を組合わせて使用することで、ＬＤＬコレステロールを特異的に測定できる。
【００８３】
実施例８
第１試薬（ｐＨ  ７．０）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              １０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                                  ０．３ｍｇ／ｍＬ
塩化マグネシウム６水塩（関東化学社製）                      ７ｍｇ／ｄＬ
デキストラン硫酸ナトリウム（東京化成社製）                  ０．７ｍｇ／ｄＬ
第２試薬（ｐＨ  ６．７５）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡績社製）
１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              ３Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ（東洋紡績社）                              ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５１ｍｇ／ｍＬ
塩化カルシウム（和光純薬工業社製）                          ０．１ｍｇ／ｍＬ
界面活性剤（第５表に記載の種類と濃度）
【００８４】
第４表の界面活性剤を用い、第２試薬添加直後の吸光度と第２試薬添加５分後の吸光度を測定し、この吸光度の差をＡＬＤＬ、ＡＨＤＬ、ＡＶＬＤＬおよびＡＣＭをとする以外は実施例４と同様に試験し、ＡＨＤＬ／ＡＬＤＬ値、ＡＶＬＤＬ／ＡＬＤＬおよびＡＣＭ／ＡＬＤＬを算出した。なお、本実験に使用した各リポ蛋白中のコレステロール濃度をデタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ（協和メデックス社製）により定量した結果は、ＨＤＬで７９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬで２７３ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬで７６ｍｇ／ｄＬ、ＣＭで１６ｍｇ／ｄＬであった。
結果を第５表に示す。
【００８５】
【表５】
0004428863.tif 000006
【００８６】
第５表に示すように、界面活性剤を組合わせて使用することで、ＬＤＬコレステロールを特異的に測定できる。
【００８７】
実施例９
第１試薬（ｐＨ  ７．０）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              １０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製                                    ０．３ｍｇ／ｍＬ
塩化マグネシウム６水塩（関東化学社製）                      ７ｍｇ／ｄＬ
デキストラン硫酸ナトリウム（東京化成社製）                  ０．７ｍｇ／ｄＬ
第１試薬（ｐＨ  ７．０）
ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製）                              ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡績社製）
１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              ０．６Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）                            ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５１ｍｇ／ｍＬ
塩化カルシウム（和光純薬工業社製）                          ０．１ｍｇ／ｍＬ
界面活性剤（第６表に記載の種類と濃度）
【００８８】
第６表の界面活性剤を用いる以外は、実施例８と同様に試験し、ＡＬＤＬ、ＡＨＤＬ、ＡＶＬＤＬおよびＡＣＭを求め、ＡＨＤＬ／ＡＬＤＬ値、ＡＶＬＤＬ／ＡＬＤＬおよびＡＣＭ／ＡＬＤＬを算出した。なお、本実験に使用した各リポ蛋白中のコレステロール濃度をデタミナーＬ  ＴＣ  ＩＩ（協和メデックス社製）により定量した結果は、ＨＤＬで８２ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬで２７０ｍｇ／ｄＬ、ＶＬＤＬで７３ｍｇ／ｄＬ、ＣＭで１４ｍｇ／ｄＬであった。
結果を第６表に示す。
【００８９】
【表６】
0004428863.tif 000007
【００９０】
第６表に示すように、界面活性剤を組合わせて使用することで、ＬＤＬコレステロールを特異的に測定できる。
【００９１】
実施例１０
第１試薬（ｐＨ  ７．２５）
ＰＩＰＥＳ（ナカライテスク社製）                            ５０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                                  ０．３ｍｇ／ｍＬ
第２試薬（ｐＨ  ７．２５）
ＰＩＰＥＳ（ナカライテスク社製）                            ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（リポプロテインリパーゼ、東洋紡績社製）
２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（協和醗酵工業社製）              ３Ｕ／ｍＬ
パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）                            ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）                      ０．５１ｍｇ／ｍＬ
塩化カルシウム（和光純薬工業社製）                          ０．１ｍｇ／ｍＬ
エマルゲン  Ｌ−４０（花王社製）                            ０．１６％
プルロニック  Ｌ−１２１（旭電化社製）                      ０．２％
【００９２】
検体として患者の血清８８検体を用意し、下記の操作により検体中のＬＤＬコレステロールの定量を行った。第１試薬３００μＬに各検体４μＬに混合し５分間、３７℃で保温した。このときの吸光度を測定し、次いで第２試薬１００μＬを添加し反応させ、５分後の吸光度を測定した。一方ＬＤＬコレステロール既知濃度の血清を同様な操作をして吸光度を測定することにより、検体中のコレステロールを定量した。測定には、日立７０７０自動分析装置を用い、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍとした。
【００９３】
一方、市販キットであるデタミナーＬ  ＴＣ（協和メデックス社製）で総コレステロールを、デタミナＬ ＨＤＬ−Ｃ（協和メデックス社製）でＨＤＬ−コレステロールを、デタミナーＬ ＴＧ（協和メデックス社製）で中性脂肪を測定し下記のフリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の計算式からＬＤＬコレステロール濃度を求めた。本発明方法で得られるＬＤＬコレステロール濃度とフリーデワルドの計算式から求めたＬＤＬコレステロール濃度の相関係数を計算したところ、０．９７６７となった。
フリーデワルドの計算式：
（ＬＤＬコレステロール濃度）＝（総コレステロール濃度）
−（ＨＤＬコレステロール濃度）−（中性脂肪濃度）／５
【００９４】
図５は、本発明方法（図５中、本法と表示）で得られるＬＤＬコレステロール濃度と対照方法（図５中、対照方法 と表示）で得られるＬＤＬコレステロール濃度の相関図を示す。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本願発明により、ＬＤＬコレステロールを定量する方法および該方法に用いる試薬キットが提供される。また本願発明により、同一試料中のＨＤＬコレステロールとＬＤＬコレステロールまたは総コレステロールを同一系内で連続的に分別定量する方法および該方法に用いる試薬キットが提供される。
【図１】
0004428863.tif 000008
【図２】
0004428863.tif 000009
【図３】
0004428863.tif 000010
【図４】
0004428863.tif 000011
【図５】
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