(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源核酸集団から同一長のシグネチャー配列のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ポリヌクレオチドの集団の各々の末端に、第１の制限エンドヌクレアーゼ（ｒ１）の認識部位を含む第１のアダプタを付着する工程であって、その結果、該エンドヌクレアーゼの切断部位が該ポリヌクレオチド内にあり、
ここで、該第１の制限エンドヌクレアーゼは、その認識部位から少なくとも１６ヌクレオチドにおいて切断部位を有するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼであり、
該アダプタが付着する末端は、該集団の各ポリヌクレオチドについて同一であり、そして、（ｉ）全長ｃＤＮＡ転写物の５’末端、（ｉｉ）ポリＡ／ポリＴ領域が除去されたｃＤＮＡ転写物の３’末端、（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたｃＤＮＡフラグメントの５’末端、および（ｉｖ）ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたｃＤＮＡフラグメントの３’末端、から選択される、工程；
（ｂ）該ポリヌクレオチドを該第１の制限エンドヌクレアーゼで切断して、アダプタ−シグネチャー結合体の集団を産生する工程であって、ここで該アダプタ−シグネチャー結合体の各々は、少なくとも６塩基対長であり、新規の切断末端を有する、供給源核酸の同一長のシグネチャー配列を含む、工程；ならびに
（ｃ）前記アダプタ−シグネチャー結合体中のシグネチャーの新規の切断末端を、第２の制限エンドヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第２のアダプタと連結して、アダプタ−シグネチャー−アダプタ構築物のライブラリーを産生する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに、（ｄ）前記構築物を前記第２の制限エンドヌクレアーゼと前記第１のアダプタを切断するのに有効な制限エンドヌクレアーゼとを用いて消化して、クローニング部位に隣接する同一長のシグネチャーフラグメントのライブラリーを産生する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、付着工程（ａ）が、液相中で行われる、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第１のアダプタが付着する末端が：（ｉ）全長ｃＤＮＡの５’末端、および（ｉｉ）ポリＡ領域が除去された全長ｃＤＮＡの３’末端から選択される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第１のアダプタが付着する末端が、（ｉｉｉ）制限エンドヌクレアーゼを用いたｃＤＮＡの切断によって産生されたｃＤＮＡフラグメントの５’末端、および（ｉｖ）制限エンドヌクレアーゼを用いたｃＤＮＡの切断によって産生されたｃＤＮＡフラグメントの３’末端から選択される、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記（ｉｉｉ）のｃＤＮＡフラグメントの部分が、前記供給源核酸集団の３’領域由来であり、そして、前記（ｉｖ）のｃＤＮＡフラグメントの部分が、前記供給源核酸集団の５’領域由来である、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記供給源核酸集団の３’領域または５’領域を表すフラグメントが、前記付着の後に他のｃＤＮＡフラグメントから単離される、方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのアダプタが、プライマーの結合部位またはポリメラーゼの結合部位を含み、そしてさらに、工程（ｃ）の後であって、工程（ｄ）の前に：
各アダプタ−シグネチャー構築物の底部鎖を除去する工程；および
該底部鎖を、逆転写、プライマー伸長、またはＰＣＲ増幅によって再生する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、ｒ１は、ＢｐｍＩ、ＭｍｅＩ、ＧｓｕＩ、およびそれらのイソシゾマーから選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記シグネチャーは、少なくとも１０塩基対長である、方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法であって、さらに、以下：
オリゴヌクレオチドタグを、各シグネチャーフラグメントに付着する工程であって、その結果、実質的に全ての異なるシグネチャーフラグメントは、付着した異なるオリゴヌクレオチドタグを有し、タグ−シグネチャー結合体を形成する、工程；
該タグ−シグネチャー結合体を、タグ相補物のライブラリーと接触させ、ここで、該タグ相補物の各々は別個の固相支持体上にあり、そして該タグをその対応する相補物とハイブリダイズし、シグネチャー配列の固相支持されたクローン性の部分集団を形成する工程、ならびに
複数の該固相支持されたシグネチャー配列を配列決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記タグの付着工程が：
前記シグネチャーフラグメントをオリゴヌクレオチドタグ−ベクターのライブラリーに連結することであって、ここで、各タグ−ベクターは：左側制限切断部位、オリゴヌクレオチドタグ、該シグネチャーフラグメントの挿入のためのクローニング部位、および右側制限切断部位を含み、タグ−シグネチャー結合体のベクターライブラリーを形成する、工程；ならびに
該ベクターライブラリーを宿主生物中で複製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記タグ−ベクターライブラリー中の異なるオリゴヌクレオチドタグの数は、異なるフラグメントの数よりも少なくとも１００倍多く、該方法は、さらに、該ベクターライブラリーからサンプルを取り、その結果、該サンプル内の実質的に全ての異なるポリヌクレオチドフラグメントが、付着した異なるタグを有する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、さらに、以下：
前記タグ−シグネチャー結合体を前記ベクターライブラリーから切断する工程；
タグ−シグネチャー結合体のタグ成分の底部鎖を除去する工程；
該タグ−シグネチャー結合体を、タグ相補物のライブラリーと接触させる工程であって、ここで、該タグ相補物の各々は別個の固相支持体上にあり、それによって、前記一本鎖タグをその対応する相補物にハイブリダイズさせる、工程；ならびに
該シグネチャーフラグメントの底部鎖を、該タグ相補物に連結する工程、を包含し、
それによって、前記供給源ポリヌクレオチド集団からの各シグネチャー配列の、固相支持されたクローン性の部分集団を含むライブラリーを形成する、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第２のアダプタはプライマー結合部位を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ポリヌクレオチドを分類し、そして配列決定する方法に関し、より具体的には、多くのポリヌクレオチドを同時に配列決定する方法（例えば、供給源ＤＮＡ集団の比較のため）に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ポリヌクレオチドの大きな集団の並行配列決定は、ゲノムマッピング、遺伝子同定、医療診断などの分野において有用である。そのような配列決定は、ポリヌクレオチドフラグメントの固相支持されたライブラリーの提供によって促進される。そのライブラリーにおいては、各フラグメントは、クローン性の部分集団中の別個の微粒子に付着される（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，６０４，０９７号、Ｂｒｅｎｎｅｒら、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４１０１１、およびＡｌｂｒｅｃｈｔら、米国特許第６，２６５，１６３号に開示される）。複数の細胞または組織における遺伝子発現の分析における使用のための、そのようなライブラリーは、目的の細胞または組織から生成されたｃＤＮＡライブラリーから構築することができる。個体または個体の集団のゲノムＤＮＡサンプル間の遺伝的多様性の分析のために、ライブラリーを各々の個体から抽出したゲノムＤＮＡから得る。
【０００３】
以下に、より十分に説明されるように、そのようなライブラリーを作製する配列のクローン性部分集団は、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７号および同第５，７６３，１７５号、ならびにＢｒｅｎｎｅｒら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４１０１１号に詳細に開示される「固相クローニング」手順、によって形成することができる。手短には、ポリヌクレオチドフラグメントをタグベクター（オリゴヌクレオチドタグのレパートリーを保有する）のライブラリー中に挿入して、タグ−シグネチャー配列結合体のベクターライブラリーを形成する。タグ−シグネチャー結合体を含むベクターを、増幅する。次に、タグ−ＤＮＡ結合体のタグを、一本鎖にして、そしてタグ−シグネチャー結合体を、微粒子に付着したタグ相補物にハイブリダイズし、そして連結する。
【０００４】
次に、ロードした配列を同定し得る。この同定は、支持体に結合した配列の長さに沿って、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの短い配列を連続的に同定する段階的な方法によることが好ましい。同定のために、ＤＮＡの部分のみが、配列決定される必要がある。多くの場合、その部分は、９ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチドの程度の小ささであり得る（例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８６（１９９５）を参照のこと）。そのような配列決定法としては、例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６０４，０９７号、第５，９６２，２２８号、および第５，５９９，６７５号に記載される方法が挙げられる。１つの実施形態において、以下およびＢｒｅｎｎｅｒ、米国特許第６，０１３，４４５号、およびＡｌｂｒｅｃｈｔら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／４６７０４号に記載されるように、ＭＰＳＳ（大量並行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））によって、配列を並行して同時に同定する。
【０００５】
上記の方法は、例えば、米国特許第６，０１３，４４５号に記載されるように、核酸集団のシグネチャー配列決定のために使用されている。固相で分類された配列のライブラリーを並行で配列決定して、ライブラリーが由来する核酸集団のシグネチャーまたは「フットプリント」を提供し得る。米国特許第６，２６５，１６３号に記載されるように、ライブラリーを、競合的ハイブリダイゼーションによる複数のライブラリーの差示的分析のための参照ライブラリーとしてもまた使用し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以前に報告された、固相にてクローニングされたライブラリーの調製方法において、上記のように、最初に、供給源ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼを用いて切断してフラグメントを生成し、次に、これをタグ−ベクターライブラリー中にクローニングする。これらのフラグメントは、長さにおいてかなり多様であり得、処理における（特にＰＣＲ増幅工程において、そして、ある程度は、タグ−ＤＮＡ結合体の相補物含有微粒子へのロードおよび連結において）バイアスをもたらす可能性がある。特に、代表的な制限消化からの核酸フラグメントのＰＣＲ増幅は、より長い種に対するバイアスを導入することが予測される。なぜなら、短いＤＮＡ分子は、ＰＣＲにおいて優先的に増幅されることが公知だからである。
【０００７】
本発明は、ＤＮＡシグネチャー成分が全て同じ長さであるタグ−ＤＮＡ構築物またはライブラリーを生成する方法を提供し、そのようにして、配列の増幅に間における、上記のバイアスを除去する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、１つの局面において、供給源ポリヌクレオチド集団から同一長のシグネチャー配列のライブラリーを調製する方法を提供する。この方法は、以下の工程（以下の章において、より詳細に記載される）を包含する：
（ａ）ポリヌクレオチドの集団の各々の末端を、第１の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む第１のアダプタ（以下「Ｑアダプタ」という）に付着させる工程であって、その結果、そのエンドヌクレアーゼの切断部位は、ポリヌクレオチド内に存在し、
ここで、そのアダプタが付着する末端は、集団中の各ポリヌクレオチドについて同一であり、そして（ｉ）全長ｃＤＮＡ転写物の５’末端、（ｉｉ）ポリＡ／ポリＴ領域が除去されたｃＤＮＡ転写物の３’末端、（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたｃＤＮＡフラグメントの５’末端、および（ｉｖ）ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたｃＤＮＡフラグメントの３’末端、から選択される、工程；
（ｂ）ポリヌクレオチドを第１の制限エンドヌクレアーゼで切断して、アダプタ−シグネチャー結合体の集団を産生する工程であって、ここでアダプタ−シグネチャー結合体の各々は、少なくとも６塩基対長であり、新規の切断末端を有する、供給源核酸の同一長のシグネチャー配列を含む、工程；ならびに
（ｃ）シグネチャーの新規の切断末端を、第２の制限エンドヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含む第２のアダプタと連結して、アダプタ−シグネチャー−アダプタ構築物のライブラリーを産生する工程。
次に、構築物を、第２のエンドヌクレアーゼと、第１のアダプタを切断するのに有効な制限エンドヌクレアーゼとを用いて切断して、クローニング部位に隣接する同一長のシグネチャーフラグメントのライブラリーを産生し得る。
【０００９】
１つの実施形態において、第１の制限エンドヌクレアーゼは、以下にさらに考察するように、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼである。
【００１０】
選択された実施形態において、第１のアダプタが付着する末端は：（ｉ）全長ｃＤＮＡの５’末端、および（ｉｉ）ポリＡ領域が除去された全長ｃＤＮＡの３’末端から選択される。他の実施形態において、第１のアダプタが付着する末端は：（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたｃＤＮＡフラグメントの５’末端、および（ｉｖ）ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断することによって生成されたｃＤＮＡフラグメントの３’末端から選択される。後者の場合、（ｉｉｉ）のｃＤＮＡフラグメントの部分は、好ましくは、その供給源核酸集団の３’領域由来である。同様に、（ｉｖ）のｃＤＮＡフラグメントの部分は、好ましくは、その供給源核酸集団の５’領域由来である。それぞれ供給源核酸集団の３’領域または５’領域を表すこれらフラグメントは、好ましくは、第１のアダプタへの付着後に、他のｃＤＮＡフラグメントから単離される。
【００１１】
選択された実施形態において、Ｑアダプタは、上記工程（ａ）において液相中で付着され；他の実施形態において、反応の１つ以上の成分は、固相支持体に結合する。
【００１２】
好ましい実施形態において、少なくとも１つのアダプタ、そして好ましくは各アダプタは、プライマーの結合部位およびポリメラーゼの結合部位を含み、そして、この方法はさらに、工程（ｃ）の後であって、工程（ｄ）の前に、以下の工程を含む：各アダプタ−シグネチャー構築物の底部鎖を除去する工程、および、底部鎖を、逆転写、プライマー伸長、またはＰＣＲ増幅によって（好ましくは、ＰＣＲ増幅によって）再生する工程。
【００１３】
一般に、工程（ａ）での切断された末端は、一本鎖突出を有する。あるいは、突出は、第１のアダプタに連結するまえにフラグメントから除去され、この場合、第１のアダプタは、平滑末端を有する。
【００１４】
第２のアダプタは、代表的には、工程（ｂ）において生成された新規の切断末端の一本鎖突出とハイブリダイズするのに有効な、全ての可能な配列の一本鎖の突出を含むアダプタのセットを含む。
【００１５】
第１の制限エンドヌクレアーゼは、好ましくは、認識部位から少なくとも１０ヌクレオチドにおいて、より好ましくは認識部位から少なくとも１６ヌクレオチドにおいて、切断部位を有するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼである。例としては、ＢｐｍＩ、ＭｍｅＩ、ＧｓｕＩ、およびそのイソシゾマーが挙げられる。
【００１６】
第２の制限エンドヌクレアーゼは、好ましくは、切断の際に少なくとも２ヌクレオチドの突出を産生する４塩基認識部位を有するＩＩｓ型エンドヌクレアーゼである；より好ましくは、第２の制限エンドヌクレアーゼは、切断の際に少なくとも３ヌクレオチドの５’伸長を生じる。例としては、ＳｆａＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｂｖＩ、ＦｏｋＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｂｓＩ、およびそれらのイソシゾマーが挙げられる。
【００１７】
シグネチャー配列を、以下の工程を含むプロセスによって、並行に配列決定し得る：
オリゴヌクレオチドタグを、各シグネチャーフラグメントに付着する工程であって、その結果、実質的に全ての異なるシグネチャーフラグメントが、異なる付着されたオリゴヌクレオチドタグを有し、タグ−シグネチャー結合体を形成する、工程；
タグ−シグネチャー結合体を、タグ相補物のライブラリーと接触させ、ここで、タグ相補物の各々は別個の固相支持体上にあり、そして、タグをその対応する相補物とハイブリダイズさせて、固相に支持されたシグネチャー配列のクローン性の部分集団を形成する工程；ならびに、
複数の固相に支持されたシグネチャー配列を配列決定する工程。
好ましい実施形態において、シグネチャーを含む挿入物を、オリゴヌクレオチドタグ−ベクターのライブラリー中に連結し、ここで、各タグ−ベクターは、以下を含む：左側制限切断部位、オリゴヌクレオチドタグ、シグネチャーフラグメントの挿入のためのクローニング部位、および右側制限切断部位を含み；それによってタグ−シグネチャー結合体のベクターライブラリーを形成し、次に、そのベクターを宿主生物において複製する。
【００１８】
好ましくは、タグ−ベクターライブラリー中の異なるオリゴヌクレオチドタグの数は、異なるフラグメントの数よりも少なくとも１００倍多く、このプロセスは、さらに、ベクターライブラリーからサンプルを取り、その結果、サンプル内の実質的に全ての異なるポリヌクレオチドフラグメントが、付着した異なるタグを有する工程を包含する。
【００１９】
増幅したタグ−シグネチャー構築物のさらなる処理を、以下のように、構築物を固相支持体上にロードすることによって行い得る：好ましくは蛍光標識したプライマーおよびビオチン化したプライマーを使用して、構築物のサンプルをＰＣＲにより増幅し、そしてストレプトアビジン捕捉により増幅物を精製する；タグ−シグネチャー結合体をベクターから切断する；タグ−シグネチャー結合体のタグ成分の底部鎖を除去する；タグ−シグネチャー結合体とタグ相補物のライブラリーとを接触させ（ここで、タグ相補物の各々は別個の固相支持体上にある）、これによって、一本鎖タグをその対応する相補物にハイブリダイズする；および、シグネチャーフラグメントの底部鎖をタグ相補物に連結する；それによって、供給源ポリヌクレオチド集団からの各同一長シグネチャー配列の、固相に支持されたクローン性の部分集団を含むライブラリーを形成する。
【００２０】
蛍光標識（ＰＣＲの間に、取り込まれる、上記）を使用して、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）によって、固相支持体にロードしていないものからロードしたものを分類し得、次に配列決定の前に除去され得る。
【００２１】
代替的なロードプロセスにおいて、ＰＣＲ増幅工程は、省略され、タグ−シグネチャー構築物を、ベクター骨格から切断して単離し（例えば、電気泳動分離による）、そして蛍光アダプタを、タグ−シグネチャー結合体に連結し、その後、タグを「ストリッピング」し、上記のように固相支持体にハイブリダイゼーションして、連結する。
【００２２】
そのようなロードのなお別の方法は、以下：
ｉ）タグ−シグネチャー結合体を含むベクターを直鎖状にする工程；
ｉｉ）上部鎖を、インビトロ転写（第１のビオチン標識化プライマーを使用する、底部鎖の逆転写）によって複製し、そして、第２のビオチン標識化プライマーを用いて、上部鎖の第２鎖の合成を行う工程；
ｉｉｉ）左側制限切断部位において、ベクターを切断し、それによって、第１のビオチン標識を除去する工程；
ｉｖ）第２のビオチン標識を、ストレプトアビジン支持体に結合させ、そして上部鎖を支持体から除去する工程；
ｖ）プライマーをシグネチャーの３’側にある各上部鎖の領域にアニーリングさせる工程；
ｖｉ）タグ−シグネチャー構築物の上部鎖をタグ相補物のライブラリーと接触させる工程であって、ここでタグ相補物の各々は、別個の固相支持体上にあり、これによってタグをその対応する相補物にハイブリダイズさせる工程；
ｖｉｉ）上部鎖のシグネチャー部分を複製して、二本鎖シグネチャーを形成する工程；および
ｖｉｉｉ）シグネチャーを含む鎖をタグ相補物に連結する工程；
のように実施され得、それによって、供給源ポリヌクレオチド集団からの各同一長シグネチャー配列の、固相に支持されたクローン性部分集団を含むライブラリーを形成する。
【００２３】
後者の手順の１つの実施形態において、上記のシグネチャーの３’側の領域（工程ｖ）は、その５’末端に制限酵素切断部位を含み、そして、工程ｖｉｉｉの連結の後に、対応する制限酵素を使用して、シグネチャーからその領域を切断する。
【００２４】
オリゴヌクレオチドタグを参照して、各タグは、好ましくは、同一の最少に交差ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットから選択され；１つの実施形態において、各タグは、複数のサブユニットからなり、各サブユニットは、３〜９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドからなり、ここで、各サブユニットは、同一の最少に交差ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットから選択される。好ましくは、これらサブユニットの各々は、同一の最少に交差ハイブリダイズするセットの全ての他のサブユニットとは、少なくとも３ヌクレオチド異なる。
【００２５】
同一長シグネチャーを調製し、そしてそのようなシグネチャーの固相ライブラリーを調製する開示された方法を、各供給源ポリヌクレオチド集団について、そのような固相に支持された複数のシグネチャー配列を配列決定することによって、１つ以上の供給源ポリヌクレオチド集団の比較のために使用し得る。１つの実施形態において、配列決定は、以下にさらに記載されるように、大量並行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＭＰＳＳ）によって行われる。
【００２６】
そのような配列決定は、差示的に制御される遺伝子または差示的に発現する遺伝子の分析に向けられ得、ここで、供給源集団は、異なる細胞、組織または個体から選択された複数の供給源の各々の発現した遺伝子に由来するｃＤＮＡライブラリーである。これはまた、個体中または個体の集団中の遺伝的多様性の分析に向けられ得、ここで、供給源集団は、異なる個体または個体の集団に由来するゲノムＤＮＡライブラリーである。後者の場合、遺伝的多様性は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ中の既知または予測された、位置または領域において生じる。
【００２７】
関連する実施形態において、本発明は、サンプル核酸集団からのシグネチャー配列の並行配列決定における使用のためのキットを提供する。キットの成分は、以下：（ｉ）オリゴヌクレオチドタグベクターライブラリーであって、ライブラリー中の各タグベクターは、以下：左側プライマー結合部位、左側制限切断部位、最少に交差ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットより選択されたオリゴヌクレオチドタグ、シグネチャー配列の挿入のためのクローニング部位、右側制限切断部位、および右側プライマー結合部位を含む、ライブラリー；（ｉｉ）対応するオリゴヌクレオチドタグ相補物のセットであって、各々は、空間的に別個の固相支持体に結合する、セット；ならびに、（ｉｉｉ）クローニング部位に隣接するシグネチャー挿入物の集団であって、シグネチャー挿入物の各々は、サンプル核酸集団からの同一長のシグネチャー配列を含む、フラグメント、を含む。
【００２８】
そのようなキットは、さらに、アダプタ結合部位に結合するのに有効な、右側ＰＣＲプライマーおよび左側ＰＣＲプライマーを含む。タグベクターはまた、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での複製のためのプラスミドＤＮＡを含む。
【００２９】
サンプル核酸集団からの、同一長シグネチャー配列の調製における使用のためのキットの成分は、開示された方法に従って、以下を含み得る：その認識部位から少なくとも１０ヌクレオチドにおいて切断部位を有するＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼである第１の制限エンドヌクレアーゼ；第２の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む第１の二重鎖アダプタ；その第２の制限エンドヌクレアーゼによる、二本鎖ｃＤＮＡまたは二本鎖ｃＤＮＡフラグメントの切断によって産生された突出とハイブリダイズするのに有効な一本鎖突出を有する第２のアダプタであって、第２の制限エンドヌクレアーゼの認識部位および切断部位を含むアダプタ；ならびに第２の制限エンドヌクレアーゼ。
【００３０】
第２のアダプタは、好ましくは、全ての可能なヌクレオチド配列の、一本鎖の２〜４ヌクレオチド突出、より好ましくは、２ヌクレオチド突出を含むアダプタのセットを含む。代表的には、各アダプタは、プライマー結合部位を含み、そして、キットはさらに、これら結合部位に結合するのに有効なＰＣＲプライマーを含む。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の目的、ならびに特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面とともに読む場合に、より十分に明らかとなる。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
以下の用語は、他のように示されない限り、以下の意味を有する。用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、モノマー−モノマー相互作用の規則的なパターン（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形成、塩基スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成）によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然または改変型のモノマーまたは連結物（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのαアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）の直鎖オリゴマーを含む。モノマーは、一般には、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結されて、少数のモノマーユニット（例えば、３〜４個）から数十個のモノマーユニット（例えば、４０〜６０個）の範囲にわたる大きさのオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが一連の文字（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）により示される場合は、他のように記載されない限り、そのヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順であること、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。通常、オリゴヌクレオチドは、４種の天然のヌクレオチドを包含する；しかし、それらは、非天然ヌクレオチドアナログもまた包含し得る。天然のヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが用いられ得る場合（例えば、酵素により処理される必要がある場合）、通常は、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要であることは、当業者には明らかである。
【００３３】
「相補物」または「タグ相補物」とは、オリゴヌクレオチドタグに関して本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドタグが、完全にマッチした二重鎖または完全にマッチした三重鎖を形成するように特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。特異的ハイブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施形態において、このオリゴヌクレオチドタグは、二本鎖または一本鎖のいずれかであるように選択され得る。従って、三重鎖が形成される場合、用語「相補物」は、一本鎖オリゴヌクレオチドタグの二本鎖相補物、または二本鎖オリゴヌクレオチドタグ一本鎖相補物のいずれかを包含することになっている。
【００３４】
二重鎖に関して「完全にマッチした」とは、二重鎖を作るポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖中の全てのヌクレオチドがもう一方の鎖中のヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成するように、互いに二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対形成を包含する。三重鎖に関して、この用語は、その三重鎖が、完全にマッチした二重鎖と第３鎖とからなり、その三重鎖において、全てのヌクレオチドが、その完全にマッチした二重鎖の塩基対とＨｏｏｇｓｔｅｅｎ会合または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ会合することを意味する。逆に、二重鎖におけるタグとオリゴヌクレオチドとの間の「ミスマッチ」は、その二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチドの対またはトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）が、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合および／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合および／または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合をし損なうことを意味する。
【００３５】
本明細書中に用いられる場合、「ヌクレオシド」は、２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシル型（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ）Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されるような）を含む、天然ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関して「アナログ」とは、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）などに記載された）を、それらが特異的ハイブリダイゼーションをし得るという条件付きで含む。このようなアナログは、結合特性を増強し、複雑度を低減し、特異性を増すなどのために設計された合成ヌクレオシドを包含する。
【００３６】
ポリヌクレオチドの末端への「アダプタの付着」とは、（好ましくは溶液相における）そのアダプタの連結を指し得るか、またはこれは、そのポリヌクレオチドの合成中に使用されるプライマー中にそのアダプタを使用し、それによりそのポリヌクレオチドの末端にそのアダプタを組み込むことを包含し得る。
【００３７】
「供給源核酸集団の５’領域由来」のフラグメントとは、好ましくは、その核酸集団の（一般的には、制限エンドヌクレアーゼによる）切断によって調製されるフラグメント集団の最も５’側のフラグメントにあるＤＮＡを含むか、またはそのＤＮＡからなる。「供給源核酸集団の３’領域由来」のフラグメントとは、同様に規定され得るが但し、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの場合、３’ポリＡ／ポリＴ領域（ｔｒａｃｔ）は除外される。
【００３８】
（ＩＩ．オリゴヌクレオチドタグ）
オリゴヌクレオチド「タグ」が、本発明の方法における使用のために、固相支持体（好ましくは、微粒子）に付着したＤＮＡ集団を構築するために使用され得る。そのようなタグ、ならびにその調製方法および使用方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１００１およびＷＯ９６／１２０１４ならびに共有に係る米国特許第５，６０４，０９７号に詳細に記載される。上記に引用される公開物に記載されるように、そのタグは、オリゴヌクレオチドの最少交差ハイブリダイズするセットから選択される。そのようなセットのうちのいずれか２つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、常に、少なくとも２ヌクレオチド、好ましくは３ヌクレオチド、異なる。そのようなセットのメンバーは、２つ（または３つ）未満のミスマッチしたヌクレオチドを含む、同じセットの別のメンバーの相補物とは、二重鎖も三重鎖も形成し得ない。好ましくは、最少交差ハイブリダイズするセットは、二重鎖の安定性に対して、そのセット中の他のどのサブユニットともほぼ等しい寄与をなすサブユニットを含む。このように、あらゆるサブユニットとその相補物との間の完全にマッチした二重鎖の安定性は、ほぼ等しい。
【００３９】
最少交差ハイブリダイズするセットの好ましい実施形態は、４種の天然ヌクレオチドのうちの３種からサブユニットが作製されるセットである。以下に考察するように、オリゴヌクレオチドタグ中に１つの型のヌクレオチドが存在しないことは、標的ポリヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の使用によって固相支持体上にロードされることを可能にする。
【００４０】
以下は、Ａ、Ｇ、およびＴからなる群より選択される４つのヌクレオチドを各々が含むサブユニット（「ワード」）の例示的な最少交差ハイブリダイズするセットである：
【００４１】
【化１】
0004446746.tif 000002
このセットにおいて、各メンバーは、他のどのメンバーの相補物とも、３つのミスマッチした塩基を有する二重鎖を形成する。
【００４２】
分類および固相クローニングのためのオリゴヌクレオチドタグは、長さが１２ヌクレオチド〜６０ヌクレオチドもしくは１２塩基対〜６０塩基対、好ましくは１８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドもしくは１８塩基対〜４０塩基対、より好ましくは２５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドもしくは２５塩基対〜４０塩基対の範囲であり得る。分類および固相クローニングのための一本鎖オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、好ましくは、少なくとも１００個のメンバー、より好ましくは少なくとも１０００個のメンバー、そして最も好ましくは少なくとも１０，０００個のメンバーを含む。オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物に関して本明細書中で使用される場合、用語「レパートリー」とは、固相クローニング（分配）または同定のために使用される、異なるオリゴヌクレオチドタグまたはタグ相補物の総数を意味する。オリゴヌクレオチドタグが分類のために使用される場合、それらのオリゴヌクレオチドタグは、（好ましくは固相支持体に結合している）タグ相補物にハイブリダイズされる。そのようなタグ相補物は、固相支持体（例えば、微視的なビーズ）の表面上でかまたは単一支持体上の合成位置アレイの特定の位置上で、合成され得、その結果、同一配列の集団または実質的に同一の配列の集団が、特定の領域中で生成される。
【００４３】
好ましくは、タグ相補物は、微粒子上で組み合わせ的に合成され、その結果、各微粒子は、同じタグ相補物の多くのコピーを結合している。広範な種類の微粒子支持体が、本発明とともに使用され得、そのような支持体としては、当該分野で公知であるような、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）製の微粒子、高度架橋ポリスチレン製の微粒子、アクリルコポリマー製の微粒子、セルロース製微粒子、ナイロン製微粒子、デキストラン製微粒子、ラテックス製微粒子、ポリアクロレイン製微粒子などが挙げられる。
【００４４】
好ましくは、混合物中のタグ相補物は、組み合わせ的に合成されようと、または個別に合成されようと、互いに類似する二重鎖安定性または三重鎖安定性を有するように選択され、その結果、完全にマッチしたハイブリッドが、類似する融解温度または実質的に同一の融解温度を有する。この特徴によって、ミスマッチしたタグ相補物を、ハイブリダイゼーション工程において（例えば、ストリンジェントな条件下での洗浄工程によって）完全にマッチしたタグ相補物からより容易に区別することが可能になる。
【００４５】
分類における使用のための例示的タグライブラリーが、以下に示される（配列番号１）。
【００４６】
【化２】
0004446746.tif 000003
上記タグレパートリーは、[４（Ａ，Ｇ，Ｔ）８]により示され、これは、上記に記載されるような、８つの連結された４ヌクレオチドの「ワード」を示し、この「ワード」は、上記にように、示される３種のヌクレオチドを含み、そして最少交差ハイブリダイズするセットから選択される。このオリゴヌクレオチドタグの隣接領域は、クローニングベクター中への簡便な挿入およびクローニングベクターからの簡便な切り出しのために、上記に例証されるように、制限部位を含むように操作され得る。必要に応じて、左のプライマーまたは右のプライマー（配列番号３および配列番号２）は、（従来の試薬（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）を使用して）ビオチンを付着させて合成され得、増幅および／または切断後の精製が容易になり得る。好ましくは、タグ−フラグメント結合体を作製するために、上記ライブラリーが、従来のクローニングベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）中に挿入される。必要に応じて、そのタグライブラリーを含むベクターは、「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」領域「ＸＸＸ．．．ＸＸＸ」を含み得、これは、例えば、ＢａｍＨＩおよびＢｂｓＩで完全消化されたフラグメントの単離を容易にする。シグネチャーの固相クローニングのための例示的なタグベクターが、以下の実施例１に示される（配列番号１６）。
【００４７】
ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）中のＤＮＡ配列集団を、分類し、そして微粒子または固相支持体の別個の領域へ付着させることは、各微粒子または領域が、実質的に１種類だけの付着した配列を有するように、すなわち、それらのＤＮＡ配列が、クローン性の部分集団中に存在するように、実行される。
【００４８】
好ましくは、それらのＤＮＡ配列のうちの少なくとも９５％が、付着した独特の（ｕｎｉｑｕｅ）タグを有する。この状態は、以下にさらに記載されるように、ポリヌクレオチド集団より実質的に大きいタグレパートリーを使用すること、そしてタグ化ポリヌクレオチドの全集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）からタグ化ポリヌクレオチドの十分に小さいサンプルを得ることによって、達成される。（同一のＤＮＡ配列が異なるタグを有することが許容される。なぜなら、これは、ただ単に二回操作または分析される同じＤＮＡ配列を生じるのみだからである）。そのようなサンプリングは、例えば、タグをＤＮＡ配列に結合した後に、小容量をより大きな混合物から得ることによって、明白に実行され得るか、このようなサンプリングは、ＤＮＡ配列およびタグを処理するために使用される技術の二次的効果として固有に実行され得るか、またはサンプリングは、明白にかつ処理工程の固有部分として実行され得る。
【００４９】
好ましくは、ＤＮＡ配列は、その配列を、上記のような、タグライブラリーを保有する従来のクローニングベクター中に挿入することによって、オリゴヌクレオチドタグに結合される。サンプルが、増幅および分類のためにこのライブラリーから得られる。サンプリングは、そのライブラリーの連続希釈によってか、またはプラスミド含有細菌宿主をコロニーから単に釣菌することによって、達成され得る。増幅後、そのタグ−ＤＮＡ結合体は、そのプラスミドから切り出され得る。
【００５０】
そのＤＮＡ−タグ結合体は、タグとその相補物との間での完全にマッチする二重鎖の形成を支持する条件下で、そのタグ相補物を含む微粒子と（例えば、図５Ａに示され、以下に考察されるように）混合される。これらの条件を生成するための広範な指針が、文献中に存在する。例えば、Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｌｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７〜２５９（１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｇ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）を参照のこと。好ましくは、そのハイブリダイゼーション条件は、完全にマッチする配列だけが安定な二重鎖を形成するために十分にストリンジェントである。そのような条件下で、そのタグ全体にわたり特異的にハイブリダイズしたポリヌクレオチドは、微粒子に付着している相補的配列に連結され得る。最後に、その微粒子は、未連結タグおよび／またはミスマッチタグを有するポリヌクレオチドを除去するために洗浄される。
【００５１】
（ＩＩＩ．固相クローン化ライブラリーの調製）
（Ａ．シグネチャ−配列挿入物の調製）
本明細書中に記載されるシグネチャーは、一般的に、ｃＤＮＡに由来する。従来の方法に従うｃＤＮＡライブラリーの調製のために、ｍＲＮＡが、従来技術を使用して、目的とする各細胞供給源または組織供給源から抽出され、そしてｃＤＮＡへと変換される。このような従来技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７〜４７０（１９９５）；ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：６８０〜６８６（１９９７）に開示される。好ましくは、ｃＤＮＡの第１鎖は、５’ビオチンと、ｍＲＮＡ鎖へのアニリーングのためのポリ（ｄＴ）領域とを有するプライマーを使用して、４種のｄＮＴＰの存在下で、逆転写酵素を用いて合成される。望ましい場合、そのｃＤＮＡは、ｄＣＴＰの代わりにメチル−ｄＣＴＰを使用することによってメチル化され得、後の工程において、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼによる望ましくない切断が防止され得る。特定の他の改変が、下記のシグネチャー配列を調製するための別のプロトコルに従って使用され得る。
【００５２】
本発明の方法は、付着したｃＤＮＡ中に切断部位がある制限酵素認識部位を有する、第１アダプターを使用する。そのような酵素の最も一般的で広範に利用されているのは、ＩＩｓ型制限酵素である。この定義中に入る他の種類の酵素としては、ＩＩｂ型制限酵素が挙げられ、この酵素は、二分され中断されている認識部位を有し、そしてその認識部位の両方の側の両方のＤＮＡ鎖を切断し、それにより、その認識部位は、そのＤＮＡから切り出される。これらの酵素のうち、以下の第Ｆ節においてさらに考察されるＢｃｇＩが、市販されている。ＩＩＩ型制限酵素は、非パリンドローム認識部位を有し、その認識部位から約２５塩基にて切断が生じる。ＩＩｅ制限酵素としては、ＩＩｓ型として分類されるが遅い切断部位または抵抗性の切断部位を示す酵素が、挙げられる。これらの部位での効率的な切断は、その酵素の遠位の非触媒部位に、別の（アフェクター）認識配列が結合することによって、達成され得る。
【００５３】
（Ａ１．ｃＤＮＡの３’末端を示すフラグメント由来のシグネチャー）
上記の方法の一実施形態において、シグネチャー配列が、全長ｃＤＮＡの３’末端を示すｃＤＮＡ制限フラグメントから調製される。例示的方法が、図１に示される。この実施形態はまた、図６に示されるフローチャートに示され、実施例１において詳細に記載される。
【００５４】
第２鎖合成の後、ｃＤＮＡが、２塩基認識部位〜４塩基認識部位（好ましくは、４塩基認識部位）を有する制限エンドヌクレアーゼを用いて消化される（１０）。適切なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＮｌａＩＩＩ、ＤｐｎＩＩ、ＣｈａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、およびそれらのイソシゾマーが挙げられる。本明細書中に記載されるプロセスにおけるこの工程および他の工程のために適切な他の酵素は、当業者によって決定され得る。この工程は、図１に示されるような、（好ましくは３’突出を有する）切断末端を有する二本鎖フラグメント集団を生成するために、有効である。
【００５５】
望ましい場合、この段階において、その３’突出は、例えば、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して除去され得て、平滑切断末端が生成され得る。下記の工程から明らかであるように、この工程は、より長い独特のシグネチャー配列を生じる。しかし、処理を簡単にするために、この３’突出は、一般に保持される。
【００５６】
第１アダプタ（Ｑアダプタと呼ばれる）が、その後、上記切断末端と連結される（１２）。（図１におけるアダプタ中の領域およびｃＤＮＡ中の領域は、一般に比例（ｓｃｌａｅ）するように示されていないことに留意されたい）。このアダプタは、上記突出が除去されていない限り、上記切断末端における突出と相補的な突出を含み、上記突出が除去されている場合、平滑末端アダプタが使用される。このＱアダプタはまた、そのＤＮＡ中の切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼの認識部位（一般には、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの認識部位）を含み、このＱアダプタは、その認識部位から少なくとも１０ヌクレオチドに、好ましくはその認識部位から少なくとも１６ヌクレオチドに、切断部位を有する。適切なＩＩｓ型酵素としては、例えば、ＢｍｐＩ、ＭｍｅＩ、ＧｓｕＩおよびそれらのイソシゾマーが挙げられる。
【００５７】
例えば、図１のアダプタは、ＭｍｅＩの認識部位を含み、３’方向に２０ヌクレオチドの位置に切断部位を有し、この場合、この切断部位は、制限フラグメント中に１６ヌクレオチドである。ＭｍｅＩ部位を有する例示的アダプタの上部鎖および底部鎖が、対応するＰＣＲプライマーとともに、以下に示される（配列番号４〜６）。
【００５８】
（ＱＭ２アダプタおよびプライマー（ＭｍｅＩ用））
【００５９】
【化３】
0004446746.tif 000004
部分的（下記を参照のこと）ＭｍｅＩ部位を有する第２の例示的Ｑアダプタが、対応するＰＣＲプライマーとともに以下に示される（配列番号７〜８）：
【００６０】
【化４】
0004446746.tif 000005
上記アダプタおよび制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼの認識部位が、上記ｃＤＮＡの初期消化に使用される酵素の認識および切断部位と重複するように、選択され得る。例えば、上記配列番号８を有するアダプタが、最初の塩基Ｃを有する認識部位を有するエンドヌクレアーゼ（例えば、認識部位ＣＡＴＧを有するＮｌａＩＩＩ）とともに使用される場合、ＭｍｅＩの認識部位（ＴＣＣＲＡＣ）は、この認識部位と１ヌクレオチド重複する。結果として、以下にさらに記載されるように、切断の際に生成されるシグネチャー配列（以下に太字で示される）は、（図１に示される実施形態におけるように）１６ヌクレオチドではなく、１７ヌクレオチド、フラグメント中に延びる。
【００６１】
【化５】
0004446746.tif 000006
ＢｐｍＩを有するさらなる例示的Ｑアダプタが、対応するＰＣＲプライマーとともに、以下に示される（配列番号１１〜１２）：
（Ｑアダプタおよびプライマー（ＢｐｍＩ用））
【００６２】
【化６】
0004446746.tif 000007
上記Ｑアダプタの上部鎖は、例えば、チオヌクレオチドの使用によってか、または（上記ＱＭ２ｔｏｐについて示されるように）小さい５’突出によって、その５’末端にて保護される。このことは、後の工程におけるエクソヌクレアーゼによる鎖の切断を防ぐ。
【００６３】
図１を継続して参照すると、その後、ｃＤＮＡの３’末端を示すフラグメント−アダプタ構築物が、ビオチン標識を介して、ストレプトアビジン支持体（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））に結合される（１４）。この操作は、ｃＤＮＡの３’末端を示すフラグメントを、ビオチン標識を含まない他のフラグメントから単離するために役立つ。
【００６４】
ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼを用いる切断（１６）は、各々が均一な長さすなわちシグネチャー配列を含む、供給源ｃＤＮＡの切断フラグメントを生じる。ＭｍｅＩ切断を使用する図１の実施形態において、新しく切断された末端は、２塩基の３’突出を有する。その後、このアダプタ−シグネチャーフラグメントは、ストレプトアビジン支持体から溶出することによって単離され得る。
【００６５】
（Ａ２．ｃＤＮＡの３’末端由来のシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ））
別の実施形態において、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化領域が取り除かれ、上述のＱアダプターが、対応するｃＤＮＡの残りの３’末端にライゲーションされる。
【００６６】
図２Ａに示されるように、ポリＡ領域の除去の１つの方法において、第１鎖のｃＤＮＡ合成が、ビオチン−アダプター−オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して行われる（３０）。上述のように、Ｑアダプターは、代表的には、ＩＩ型の認識部位を含み、そのために、Ｑアダプター−ｃＤＮＡ結合体がそれぞれのＩＩ型酵素で切断される場合に、ｃＤＮＡ内、好ましくはｃＤＮＡの少なくとも６塩基対の内側で、切断が起きる。下でさらに考察するように、第２の認識部位がまた、後の構築物からのＱアダプターの切断のために含まれ得る。
【００６７】
第２鎖の合成は、上述の５−メチルシトシンを使用して行われる（３２）。この二本鎖ｃＤＮＡのＩＩ型酵素による切断（３４）は、図２Ａに示すように、ポリＡ領域を除去するために有効である。次いで、切断されたポリＡを含むフラグメントは、ビオチン標識を介して除去され得る（３４）。
【００６８】
次いで、ＩＩ型認識部位を含む第２のアダプターが、ｃＤＮＡの切断された３’末端にライゲーションされる（３６）。上述のように、認識部位を認識する酵素は、好ましくは、その認識部位から少なくとも１０ヌクレオチド、および好ましくはその認識部位から少なくとも１６ヌクレオチドに切断部位を有する。適切な酵素としては、例えば、ＢｍｐＩ、ＭｍｅＩ、ＧｓｕＩ、およびそれらのイソシゾマーが挙げられる。また、アダプターは、好ましくは、増幅のためのＰＣＲプライマー部位および／または精製のためのビオチンを含む。ＩＩ型酵素による切断（３８）は、３’シグネチャーに連結されたＱアダプターを与える。
【００６９】
この方法において、２つのアダプターでの認識部位の配置は、所望の部位での切断を起こし、シグネチャーがｃＤＮＡの３’末端付近の異なる領域で捕捉されることを可能にするために、変更され得る。
【００７０】
図２Ｂに示されるように、ｍＲＮＡからポリＡテイルを切断するための代替的な手順において、第１鎖ｃＤＮＡ合成（４０）が、ビオチン−オリゴ（ｄＴ）−（ｒＴ）ハイブリッドプライマーによってプライミング（ｐｒｉｍｅ）される。このハイブリッドプライマーは、プライマーの３’末端に、またはその付近に、リボヌクレオチド（ｒＴ）ｎの短い配列（約２４個までのｒＴが使用され得るが、好ましくは１〜３個のｒＴ、より好ましくは１つのｒＴ）を有する。第２鎖の合成（４２）は、上述のように、５−メチルシトシンを使用して行われる。次いで、アダプターのリボヌクレオチド部位が、ＲＮａｓｅＨによってニックが入れられ、ポリＡ領域が、Ｓ１ヌクレアーゼによって消化され、平滑末端が精製される（４４）。平滑末端Ｑアダプターは、ＩＩ型認識部位を含み、平滑な３’末端にライゲーションされる（４６）。それぞれのＩＩ型酵素による切断（４８）によって、アダプターに連結された３’シグネチャーが提供され、これは、アダプター中に取り込まれたビオチンを介して精製され得る。
【００７１】
（Ａ３．ｃＤＮＡの５’末端由来のシグネチャー）
別の実施形態において、シグネチャーは、ｃＤＮＡ、好ましくは全長ｃＤＡＮの５’末端から調製される。これらの５’シグネチャーは、プロモーター、エンハンサー、および転写開始部位に関する配列情報を提供し得る。３’シグネチャーから得られた情報と組合わせた場合、５’配列情報はまた、完全な転写物を延びるＰＣＲプライマーの設計を可能にすることで、全長ｃＤＮＡの配列決定を容易にし得る。定量的な転写物レベルが、より詳細に決定され得る。
【００７２】
さらに、制限酵素によるフラグメントよりも全長ｃＤＮＡの末端（３’または５’のいずれか）由来のシグネチャーの誘導によって所定の制限酵素部位を含まないｃＤＮＡへのアクセスが可能になる。
【００７３】
５’シグネチャーは、ＱアダプターをｃＤＮＡ、代表的には全長ｃＤＮＡの５’末端へ結合することによって調製され得る。上述のように、Ｑアダプターは、好ましくは、ｃＤＮＡ内に対応する切断部位を有するＩＩ型制限酵素部位を有し、また、下でさらに考察するように、後の構築物からのＱアダプターの切断のための第２の認識部位も含み得る。種々の方法が、ｍＲＮＡの５’末端にアダプターを結合するために使用され得る。
【００７４】
図３Ａに示されるように、１つの方法に従って、ビオチンは、ｍＲＮＡの３’末端および５’末端に存在するジオール構造を利用することによって、ｍＲＮＡの５’末端に結合され、必要に応じて３’末端にも同様に結合される（例えば、Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉら，米国特許第６，１７４，６６９号を参照のこと）。第１鎖ｃＤＮＡの合成は、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して行われ（５０）、上述のように、後の工程で使用される制限酵素によるｃＤＮＡの切断を防止するために、メチル−ｄＣＴＰがｄＣＴＰの代替として使用され得る。
【００７５】
次いで、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの集団が、一本鎖ＲＮＡを切断するＲＮＡｓｅＩで処理される（５２）。従って、図に示されるように、５’ビオチンは全長ｍＲＮＡを含む二重鎖に対してのみ保持される。これらの二重鎖は、ストレプトアビジンビーズと接触させることで単離され得る（５４）。
【００７６】
次いで、ＲＮＡ鎖が、ＲＮＡｓｅＨで消化され（５６）、第２鎖ｃＤＮＡの合成が行われる。これは種々の方法で行われ得る；例えば、１つの方法において、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡ（この時点では、ビーズから解放されている）が、５’末端において、オリゴ（ｄＧ）（または、（ｄＣ））でホモテイル（ｈｏｍｏｔａｉｌ）される（５６）。次いで、オリゴ（ｄＧ）（または、それぞれ（ｄＣ））突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有し、好ましくは後の精製、プライミング、および最終的な除去のための要素を含む二本鎖のＱアダプターが、５’末端へアニーリングされる（５８）。第２鎖ｃＤＮＡの合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩを使用して行われる（６０）。
【００７７】
あるいは、別の方法において、ニック翻訳による第２鎖の合成のために、ハイブリッド中のＲＮＡ鎖にニックを入れるために、ＲＮＡｓｅＨが使用される。次いで、Ｑアダプター−オリゴ（ｄＣ）およびニックの入ったＲＮＡによってプライミングされたフラグメントをシールするために、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが使用される。
【００７８】
ＩＩ型酵素による切断（６２）により、ｃＤＮＡ内で切断され、示されるように、５’シグネチャーに連結したアダプターが得られる。好ましくは、Ｑアダプターは、結合部分（例えば、精製のためのビオチンおよび／または増幅のためのプライマー結合部位）を含む。
【００７９】
好ましくは全長ｃＤＮＡに由来する５’シグネチャーを作製するための第２の方法（図３Ｂ）は、例えば、Ａ．Ｃｈｅｎｃｈｉｋら，米国特許第５，９６２，２７２号に記載されるように、「テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド」を利用する。テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、短いｄＧ配列（添加された短いｄＣ配列を、逆転写酵素によって第１鎖ｃＤＮＡの３’末端へ結合させるため）、および選択した配列（例えば、ＩＩ型認識部位およびプライマー部位が挙げられる）を有するアダプターを含む。オリゴヌクレオチド（例えば、図３Ｂの「Ｑアダプター−ＧＧＧ」）は、第１鎖の合成（７０）の間に、逆転写酵素のための伸長した鋳型を作成し、第１鎖ｃＤＮＡの３’末端にアダプター配列を取り込ませる。
【００８０】
アダプター中のプライマー配列に相補的なプライマーが、第２鎖の合成（７２）のために使用され、それによって、第２鎖ｃＤＮＡの５’末端にＱアダプターが取り込まれる。好ましくは、Ｑアダプターは、結合部分（例えば、精製のためのビオチン）を含む。（あるいは、ビオチンは、第１鎖の合成の間にオリゴｄＴプライマーを介して取り込まれ得る。３’末端または５’末端のいずれかでのビオチンの使用は、所望の精製スキームによって決定される。）上述のように、ＩＩ型酵素による切断（７４）は、ｃＤＮＡ内を切断し、示されるように、５’シグネチャーに連結されたアダプターを与える。
【００８１】
第３の方法は、不完全なｃＤＮＡ転写物も含む調製物から全長ｃＤＮＡを単離について、Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａら（Ｇｅｎｅ  １３８：１７１−１７４，１９９４）およびＳ．Ｋａｔｏら（Ｇｅｎｅ  １５０：２４３−５０，１９９４）によって記載された戦略の変法を利用する。この方法（図３Ｃ）に従って、ｍＲＮＡサンプル中の任意のキャップされていない（全長ではない）ｍＲＮＡ種が、仔ウシ小腸のホスファターゼを使用して脱リン酸化される（８０）。次いで、全長ｍＲＮＡの５’キャップ構造が、タバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）によって除去されて、５’リン酸基が残る（８２）。ＩＩ型認識部位、および好ましくは精製のためのビオチンを含むアダプターが、これらの５’リン酸化末端にライゲーションされる（８４）。この時点で、ビオチンが、これらの配列をキャップされていないｍＲＮＡから単離するために使用され得る。
【００８２】
次いで、従来の手順に従って、ビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマーおよび５−メチルシトシンを用いて第１鎖ｃＤＮＡの合成が行われる（８６）。ｍＲＮＡをＲＮＡｓｅで除去し、次に５−メチルシトシンを用いて第２鎖ｃＤＮＡの合成を行う（８８）。次いで、二本鎖ｃＤＮＡをＩＩ型エンドヌクレアーゼで切断して（９０）、５’シグネチャーに連結したＱアダプターを得る。
【００８３】
（Ａ４．ｃＤＮＡの５’末端を表すフラグメント由来のシグネチャー）
全長ｃＤＮＡの５’捕捉を用いる上述の方法はまた、ｃＤＮＡの３’末端を表すフラグメントからシグネチャーを調製するために図１に示された工程と類似の工程を用いることで、ｃＤＮＡの５’末端を表すフラグメントからシグネチャーを提供するように改変され得る。図３Ａに示されるプロセスに基づくプロセスの例が、図４に示される。
【００８４】
図３Ａのプロセスは、第１鎖ｃＤＮＡの５’−オリゴ（ｄＧ）テイルの作製を介して、行われる（５６／１０６）。この時点で、第２鎖の合成が、ビオチン−オリゴ（ｄＣ）プライマーを用いて行われ（１０８）、二本鎖ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ、好ましくは４−切断エンドヌクレアーゼ、および好ましくは粘着末端（例えば、２塩基突出部または４塩基突出部）を生成するエンドヌクレアーゼで消化する（１１０）。例としては、セクション１Ａで考察した制限酵素（例えば、ＮｌａＩＩＩ、ＤｐｎＩＩ、ＣｈａＩおよびＣｓｐ６Ｉ）が挙げられる。
【００８５】
次いで、ＩＩ型エンドヌクレアーゼのための認識部位を含み、フラグメントの切断した３’末端にアニーリングするように設計されたＱアダプターが、フラグメントにライゲーションされる（１１２）。次いで、示されるように、ｃＤＮＡの５’末端を表すフラグメントを、例えばストレプトアビジンビーズ上で、ビオチン化プライマーを介して単離し得る（１１２）。ＩＩ型エンドヌクレアーゼでの切断（１１４）によって、アダプターに連結したｃＤＮＡの５’末端を表すシグネチャーが作製される。
【００８６】
（Ｂ．クローニング部位の調製）
微粒子に取り付けられたシグネチャー配列のクローンの部分集団は、例えば、同有に係る米国特許第６，２６５，１６３号に記載されるプロセスから適合された図５Ａ〜Ｂに示したプロセスを使用して調製され得る。上述のように、本発明の方法は、各クローンの部分集合における同じ長さのシグネチャー配列（例えば、図５Ａの１４０で示される）という利点を提供する。シグネチャー配列は、好ましくは、少なくとも６、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド（または塩基対）の長さである。
【００８７】
図１を続いて参照して、シグネチャー−Ｑアダプター結合体の精製の後で、Ｒアダプターと名付けた第２のアダプターが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼによって切断された切断末端にライゲーションされる（１８）。このセクションおよび以下のセクションに記載される操作は、図２〜４に示されるように、本発明の他の実施形態に従って調製された同じ長さのシグネチャーにも適用され得ることに注意のこと。例えば、切断末端は３’末端よりも５’末端である場合に、いくつかの改変が必要であり得、これは当業者にとって明らかである。
【００８８】
Ｒアダプターは、ＩＩ型酵素による切断によって生成された突出部とハイブリダイズするために有効である一本鎖の突出を有する。従って、Ｒアダプターは、好ましくは、切断末端の突出部（図１でＮＮとして太字で示される）とハイブリダイズするために有効である全ての可能性のある配列の一本鎖突出部を含む、複数のアダプターである。
【００８９】
Ｒアダプターはまた、さらなる制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含み、この制限エンドヌクレアーゼは、好ましくはまたＩＩ型酵素であり、切断の際に、好ましくは少なくとも２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３ヌクレオチドの５’伸長部を作製する。この制限エンドヌクレアーゼはまた、メチル感受性エンドヌクレアーゼであり得る。適切な例としては、ＳｆａＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｂｖＩ、ＦｏｋＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｂｓＩ、およびそれらのイソシゾマーが挙げられる。
【００９０】
ＳｆａＮＩ認識部位を有する例示的なＲプライマーが、以下（それぞれ、配列番号１３、１４および９）に示され、ここで、ＮＮは全ての可能性のある２ヌクレオチド配列を表す。
【００９１】
（Ｒ４アダプターおよびプライマー）
【００９２】
【化７】
0004446746.tif 000008
アダプターはまた、アダプターのダイマーが、アダプターのサインに対するライゲーションの間に副生成物として形成され、適切な制限エンドヌクレアーゼでの処置によりすぐに切断され得るように設計され得る。例えば、上記のアダプターのダイマーは、以下の式を有し：
【００９３】
【化８】
0004446746.tif 000009
酵素ＢｓａＪＩにより切断され得、これは認識部位および切断部位ＧＧＮ＾ＮＣＣを有する。
【００９４】
好ましい実施形態において、ＮＮ部位でのトップ鎖とボトム鎖との間の相補性の正確さを確実にするために、アダプター−サイン−アダプター構築物のボトム鎖（これは、この部位でのミスマッチを含み得る）を除去する（例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼにより）（２０）。（これは、上のセクションＡ１で記載される実施形態についての図１において示され、そして本明細書中で記載される任意の他の方法により調製されるサインに適用され得る。）次いで、トップ鎖が、好ましくはＰＣＲ増幅（２２）により、複製される。従って、ＱおよびＲアダプターは、好ましい実施形態において、上の例示的なアダプターのように、ＰＣＲのためのプライマー結合部位を含む。あるいは、鎖が、直線状プライマー伸長により、またはＴ７ポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼにより、複製され得、この場合、アダプターの１つは、ポリメラーゼ結合部位を含む。
【００９５】
次いで、構築物は、第３の制限エンドヌクレアーゼで切断され（２４）、Ｒアダプターを切断し、そしてＱアダプターを切断することによりサインの構築物５’を切断するのに有効なエンドヌクレアーゼにより切断される。（図１に示される実施形態について、これは下で考察されるようにｃＤＮＡ制限フラグメントを生成するために初めに使用される酵素であり得る。他の実施形態において、Ｑアダプターは、サインからの切断のための別個の制限部位を含むように設計され得る。）この工程は、クローニング部位により隣接される同じ長さのサイン配列（図１においてＮＮＮＮ．．．により表される）を生じる。
【００９６】
Ｑアダプターは、第３の制限エンドヌクレアーゼでの切断が、配列番号８（Ｑアダプター）について示されるように、両方のアダプターを切断し、下のＱアダプター−サイン−Ｒアダプター構築物（配列番号１０）に組み込まれるように設計され得る。例示的なＱアダプターは、酵素が両方のアダプターを切断するように配置される第３の制限エンドヌクレアーゼ、ＳｆａＮＩについての認識部位を含む。
【００９７】
【化９】
0004446746.tif 000010
供給源ポリヌクレオチドから得られる同じ長さのサイン配列が、第１のアダプターおよび／または第２のアダプターのいくつかの残っているフラグメントにより隣接され得ることに注意のこと；しかし、このようなアダプターフラグメントを含めて、全体の構築物が、同様の均一な長さである。一般に、本明細書中で使用されるような、「サイン」は、供給源ポリヌクレオチドから得られる配列のみをいい、「サインフラグメント」は、アダプターから得られる１つまたは２つの短い隣接配列を含み得る。
【００９８】
削除されたサイン含有フラグメントは、標準的な技術（例えば、エタノール沈殿および／または電気泳動）を使用して精製される。１つの実施形態において、アダプター−サイン−アダプター構築物のＰＣＲ増幅（図１における最後から２番目の工程）は、ビオチン化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）プライマーを使用して行われる。アダプターの切断に続いて、サインフラグメントは、ストレプトアビジン支持体からの溶出により精製される。
【００９９】
（Ｃ．タグ−サインライブラリのクローニング）
適切な緩衝液中に再懸濁した後、サインフラグメントは、指向的にタグベクターのライブラリに連結され（図５Ａ）、タグサイン結合体のベクターライブラリを形成する（１４２）。各々のタグベクターは、左側制限切断部位（１４４）、オリゴヌクレオチドタグ（１４６；上のセクションＩを参照のこと）、サインフラグメントの挿入のためのクローニング部位、および右側制限切断部位（１４８）を含む。好ましくは、ベクターは、その後のＰＣＲ増幅のためのＥ．ｃｏｌｉおよびプライマー結合部位（１５２、１５４）中にクローニングするためのプラスミドＤＮＡ（１５０）さらに含む。（本明細書中で使用されるような「タグ−サイン結合体」がまた、上の「サインフラグメント」について示されるような、いくらかの残りのアダプターＤＮＡを含み得る。）
好ましくは、タグ−サイン結合体のライブラリのＥ．ｃｏｌｉ複製後に、宿主細胞のサンプルが、培養培地のユニット体積当たりの組換え体の数を決定するためにプレートされる。サンプルが、さらなる処理のために採取され、サンプルのサイズは、タグベクターライブラリで使用されるタグレパートリーのサイズ（セクションＩを参照のこと）に依存する。「二重体（ｄｏｕｂｌｅ）」（すなわち、同じタグを有するが、異なるｃＤＮＡフラグメントを有する２つ以上の結合体）の発生を最小化するために、サンプルは、好ましくは、タグレパートリーと約１％のサイズと等しい多くの結合体を含む。（Ｂｒｅｎｎｅｒら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１０１１および米国特許第５，６０４，０９７号を参照のこと。）従って、８つの４−ヌクレオチド「単語」の最小の交差ハイブリダイゼーションセットから選択される８つ単語の連結からなるタグレパートリー（下のセクションＩＩＩを参照のこと）について、レパートリーのサイズは、８８すなわち約１．７×１０７タグである。従って、このようなタグレパートリーを用いて、約１．７×１０５種類の結合体含有ベクターのサンプルが、好ましくはさらなる処理のために選択される。このようなサンプリングのための実際的な方法が、上、および例えば、米国特許第６，２６５，１６３号に記載される。
【０１００】
サンプリングの後、タグ−サイン結合体は、好ましくは５−メチルｄＣＴＰの存在下で、ビオチン化プライマー（１５６）および標識化プライマー（１５８）を使用して、ＰＣＲにより増幅され、その後、結果として生じるアンプリコンが、ストレプトアビジン捕捉により単離される。ベクターにおける制限部位（１４４）が、好ましくは希切断（ｒａｒｅｃｕｔｔｉｎｇ）制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、ＰｍｅＩ、またはＳｗａＩ）に対応し、このエンドヌクレアーゼは、捕捉されたアンプリコンがサインフラグメントに対して内部の部位にて生じる切断の最小の確率で支持体から放出されることを可能にする。
【０１０１】
タグサイン結合体が、ＰＣＲ増幅なしに複製されたベクターから負荷される場合、結合体は、ベクターから放出され、例えば、電気泳動による精製により、単離される。好ましくは、蛍光標識を有するアダプターは、下に記載されるようなＦＡＣＳ分類においての使用のために、構築物に連結される。
【０１０２】
（Ｄ．固体相支持体上への負荷）
「ストリッピング（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）」反応が、タグ−サイン結合体のタグを一本鎖にするために実行される（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，６０４，０９７号を参照のこと）。これは、単一のｄＮＴＰの存在下で、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、達成され得る。図５Ａに示される、連結（１６０）は、配列５’ＧＧＧＣＣＣ−３’（トップ鎖）を有し、エキソヌクレアーゼ反応がｄＧＴＰの存在下で実施される場合、ストリッピング反応をＧトリプレットにて休止させる。さらに、タグが、Ａ、ＣおよびＴの場合においてセクションＩで考察されるように、４つの天然のヌクレオチドから３つだけを含むように設計される。従って、放出されたタグ−サイン結合体が、ｄＧＴＰの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理される場合、タグの相補的鎖が、図５Ａに示されるように、最初のＧまでストリッピングされる。
【０１０３】
「ストリッピング」反応が、クエンチされる場合、結果物は、一本鎖タグ（１６４）を有する二重鎖（１６２）である。単離後、以下の工程が、実施される（米国特許第５，６０４，０９７を参照のこと）：タグ−サイン結合体が、微小粒子（１６８）に接着したタグ補体にハイブリダイズされる；充填反応が、タグ−サイン結合体の相補鎖と微小粒子に接着したタグ補体の５’末端との間の任意のギャップを満たすように実施され、そしてタグ−ｃＤＮＡ結合体の相補鎖が、タグ補体（１６６）の５’末端に結合され、この補体は、この目的のためにリン酸化される。
【０１０４】
タグ−サイン結合体のサンプリングされたセット（上に記載されるように）が、タグ補体の完全レパートリーにハイブリダイズされるために、結合体は、一般に微小粒子のわずか約１％にハイブリダイズされる。負荷された微小粒子は、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）の使用により負荷されていない微小粒子から分離され得、このソーターは、ＰＣＲプライマー（１５８）により接着された、増幅された結合体上の蛍光標識を検出する。
【０１０５】
配列決定の前に、蛍光標識は、ベクターの切断部位（１４８）を認識する制限エンドヌクレアーゼで処理することにより、好ましくは除去される（図５Ｂ）。この切断は、二重鎖タグ−サイン結合体（１７０）を有する微小粒子（１６８）を結果として生じる。
【０１０６】
（Ｅ．代替的負荷方法）
「チューバック（ｃｈｅｗｂａｃｋ）」反応を必要としない、ビーズ上に構築物を負荷する代替的な方法が、以下のように実施され得る（図７）。この実施形態において、上の第１のアダプターは、好ましくは、下に記載されるような、その後のプライマー除去のための、ＩＩ型制限部位の３’側の、さらなる制限部位（１７２）を含む。
【０１０７】
タグ−サイン結合体を含むベクターは、例えば、ＰａｃＩで切断することにより、直線状にされる。トップ鎖が、所望される場合、インビトロ転写により複製され、次いでボトム鎖が、第１のビオチン標識化されたプライマー（１７４）を使用して転写され、そしてトップ鎖の第２の鎖の合成が、第２のビオチン標識化プライマー（１７６）を使用して実施される。次いで、ベクターが、左側制限切断部位で切断され、これにより、第１のビオチン標識を除去し、そして生成物が、ストレプトアビジンビーズ（１７８）上に負荷され、従って第２のビオチン標識に結合する。トップ鎖（１８０）が、支持体から溶出される。（ボトム鎖の短い３’領域（１８２）がまた溶出され、しかしさらなる処理を妨げない。）
好ましくは負荷されたビーズのＦＡＣＳ分類のために蛍光的に標識された、プライマー（１８４）が、サインの３’側である各々のトップ鎖の領域（１８６）にアニーリングされる。次いで、一本鎖タグおよびサインを有する、トップ鎖は、タグ補体（１８８）のライブラリ（上のように、それぞれ別個の固体相支持体（１９０）上に存在する）と接触され、これによりタグをそれぞれの補体にハイブリダイズさせる。
【０１０８】
次いで、プライマーが伸長されてサインのボトム鎖を複製し、次いでこれが、固体支持体上のタグ補体と結合される。次いで、上で参照されるさらなる制限部位が、切断されてプライマー標識およびサインの３’側のＤＮＡの一部を除去し得る。
【０１０９】
（Ｆ．同じ長さのサインを調製するための代替的方法）
１つの方法において、ゲノムＤＮＡ中のメチル化シトシンに隣接するサインが、捕捉され得る。このようなサイン由来の配列データを使用して、ゲノムＤＮＡ中の、メチル化プロモーター領域のような、メチル化ＣｐＧをマッピングし得る。脊椎動物ＤＮＡにおける約６０〜９０％のＣｐＧ部位が、メチル化されると概算される（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：２０９−２１３，１９８６）。
【０１１０】
この方法に従って、ＤＮＡが、酵素ＭｃｒＢＣで切断され、この酵素は、配列５’．．．ＰｕｍＣ（Ｎ４０−３０００）ＰｕｍＣ．．．．３’を認識し、ここで必要に応じてＮ＝５５〜１０３塩基であり、そしてｍＣは、メチル化シトシンを表す。酵素は、１つの半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）または他の半部位と近接して、「半部位」の各々の対の間のＤＮＡを切断する。切断位置は、いくつかの塩基対（メチル化塩基からおよそ３０塩基対）にわたって分布される（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｆ．Ｊ．およびＲａｌｅｉｇｈ，Ｅ．Ａ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９，６１１−６１６，１９９８）。
【０１１１】
平滑断端フラグメントを作製すると考えられる切断の後に、上に記載されるようなＩＩ型認識部位を有する平滑断端アダプターの結合が続く。続く工程（ＩＩ型酵素での切断、「Ｒ」アダプターの結合、クローニングなど）が、上に記載される。
【０１１２】
別の方法において、同じ長さのサインが、配列５’．．．（Ｎ）１０ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ（Ｎ）１２．．．３’を認識するＩＩｂ型酵素ＢｃｇＩ、または配列５’．．．（Ｎ）１０ＡＣ（Ｎ）４ＧＴＡＹＣ（Ｎ）１２．．．３’を認識する酵素ＢａｅＩのような、「二重切断」酵素で切断し、５−ヌクレオチド突出部を作製することにより、１工程で作製される。従って、切断により、それぞれ３２塩基対または３３塩基対のサイン配列が生成され、この配列に対して、クローニングのために、アダプターが結合され得る。
【０１１３】
（ＩＶ．シグネチャーの配列決定）
本発明は、１つの実施形態において、発現された遺伝子の大量並行分析方法を提供し、モニターされる差示的に発現する遺伝子の事前の知識を必要とすることなく、差示的に発現された配列の検出および単離を可能とする。より一般的には、この方法は、任意の２つの核酸集団からの、差示的に表わされた核酸の検出（例えば、ゲノムＤＮＡの多様性）を可能にする。この方法を、複数の細胞および／または組織（例えば、疾患組織または疾患細胞型および健常組織または健常細胞型、あるいは刺激またはストレス（例えば、栄養、温度などの変化）に供された細胞または組織型、およびストレスを与えられていない状態または刺激を受けていない状態の対応する細胞または組織型）中の相対的な遺伝子発現の分析のために使用し得る。この方法はまた、個体中のゲノムＤＮＡ中の差示的に表わされる多様性を同定するために使用され得る（例えば、ＳＮＰ、欠失、挿入または重複）。
【０１１４】
この方法の利点は、多くの場合において、分析される核酸の同一性が、分析の前に知られている必要がないということである。しかし、いくつかの場合において、差示的に表される配列の予測される位置の事前の知識（例えば、ゲノムＤＮＡ中のＳＮＰ）は、有用である。
【０１１５】
固相支持体においてクローニングされたシグネチャーは、任意の多数の段階的な配列決定法（支持体に結合されたヌクレオチド配列の長さに沿って、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの短配列を連続的に同定する）によって配列決定され得る。そのような配列決定法としては、例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒの米国特許第５，６０４，０９７号、同５，９６２，２２８号、および同５，５９９，６７５号に記載される。従来の配列決定方法（シーケンス−バイ−ハイブリダイゼーション（ＳＢＨ）および合成による配列決定を包含する）もまた、使用し得る。
【０１１６】
１つの実施形態において、配列は、以下に記載され、そしてＢｒｅｎｎｅｒ、米国特許第６，０１３，４４５号、およびＡｌｂｒｅｃｈｔら、ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／４６７０４号に記載されるように、ＭＰＳＳ（大量並行シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって、同時並行して同定される。この手順は、好ましくは、以下の工程を用いて行われる：
（ａ）コードされたアダプタを、微粒子上のフラグメントの末端に連結する工程であって、ここで、コードされたアダプタは、その切断部位がその認識部位から離れているヌクレアーゼのヌクレアーゼ認識部位を有する、工程；
（ｂ）フラグメントに連結されたコードされたアダプタの同一性によって、フラグメントの末端における１つ以上のヌクレオチドを同定する工程；
（ｃ）コードされたアダプタのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼを用いて、フラグメントを切断し、その結果、フラグメントが１ヌクレオチド以上短くなる工程；および
（ｄ）所望の数のヌクレオチドが、フラグメントの末端において同定されるまで、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返す工程。
【０１１７】
第Ｉ章において考察され、そして、さらにＡｌｂｒｅｃｈｔら、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／４６７０４において考察されるように、工程（ａ）の各コードされたアダプタは、突出した鎖、および最小に交差ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットから選択されたオリゴヌクレオチドタグを有する。その突出鎖が、フラグメントの相補的な突出鎖とともに、完全にマッチした二重鎖を形成する場合、コードされたアダプタが連結される。連結後、突出鎖のヌクレオチドの同定および順序付けが、標識したタグ相補物または「デコーダー」を、連結したアダプタ上のその対応するタグに対して、特異的にハイブリダイズすることによって、決定されるか、または「デコード」される。好ましくは、標識を送達するための一本鎖タグ相補物の長さは、８〜２０の間であり、より好ましくは９〜１５の間である。
【０１１８】
同定工程において、タグ相補物の連続するセットまたはデコーダーは、連結したコードされたアダプタによって保有されるそれぞれのタグに特異的にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドの突出した鎖におけるヌクレオチドの型および配列は、特異的にハイブリダイズしたデコーダーによって保有される標識およびデコーダーが由来するセットによって同定される（米国特許第５，５９９，６７５号に記載される）。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例は、例示であって、いかなる方法によっても、本発明を限定することを意図しない。
【０１２０】
（材料）
オリゴヌクレオチドを、購入したか、または従来法によって合成した。ラピッドライゲーションバッファー１（Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １）、ラピッドライゲーションバッファー２（Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２）、およびラピッドライゲーションリガーゼ（Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｌｉｇａｓｅ）は、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｄａｔｉｏｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＃１６３５３７９）の成分である。ＮＥＢと示した試薬は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡによって供給される。
【０１２１】
（ｃＤＮＡからのクローニングされたシグネチャーライブラリーの調製）
（Ａ．第１の制限エンドヌクレアーゼでの消化）
従来のプロトコールを使用して、ｃＤＮＡを約１μｇのｍＲＮＡから調製し、ＥｔＯＨで沈殿し、そしてＤｐｎＩＩで以下のように開裂した。ペレットに対して、１０μｌの１０×ＤｐｎＩＩ緩衝液および１．５μｌのＤｐｎＩＩ（５０Ｕ／μｌ）を添加して、混合物を、３７℃で２時間インキュベートした。次に混合物を、水で希釈して、２００μｌの緩衝液で飽和したフェノール（２×）、および２００μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、次に、２０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび５００μｌの−２０℃のＥｔＯＨを添加して、−２０℃で一晩インキュベートした。ペレットを−２０℃の７０％エタノールで洗浄した。
【０１２２】
（Ｂ．アダプタの生成）
Ｑ３ｔｏｐ．Ｓ、Ｑ３ｂｏｔ．Ｐ、ＱＭ２ｔｏｐ．Ｓ、ＱＭ２ｂｏｔ．Ｐ、Ｒ４ｔｏｐ．ＦＡＭおよびＲｂｏｔＡＡ  ．．．  ＴＴ（以下を参照のこと）と称するオリゴヌクレオチドを、各２００μＭで水の中に懸濁した。各アダプタについて、３０μｌの「上部」オリゴ、３０μｌの「底部」オリゴ、１０μｌの１０×ＮＥＢ２および３０μｌの水を０．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に混合して、９５℃で５分間加熱し、室温まで冷却し、手短に遠心し、そして−２０℃で保存した。
【０１２３】
（オリゴヌクレオチド）
【０１２４】
【化１０】
0004446746.tif 000011
ｓ＝ホスホロチオエート結合；ｐ＝５’−ホスフェート；ＦＡＭ＝６−フルオレセインアミダイト。
【０１２５】
（Ｃ．Ｑアダプタの連結およびＳＡビーズへの結合）
上記ＡからのＤｐｎＩＩ−フラグメント、および９．５μｌのＱアダプタ（Ｑ３またはＱＭ２）の混合液に対して、２．３μｌのラピッドライゲーションバッファー２を添加した。混合的を混合し、そして手短に遠心し、その後、１１．８μｌのラピッドライゲーションバッファー１を添加し、さらに混合し、１μｌのラピッドライゲーションリガーゼを添加し、さらに混合し、そして４時間室温にてインキュベートした。次に混合物を、８０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌおよび１９６μｌのＴＥ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で処理し、そして６５℃で１０分間加熱して、リガーゼを不活性化した。
【０１２６】
４μｌのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、混合物を、２×の５００μｌのＴＥ（上記）で洗浄し、１００μｌのＴＥ中に再懸濁した１５０μｌのストレプトアビジン−ダイナビーズＭ−２８０（Ｄｙｎａｌ  １１２．０５）に添加した。混合物を、１時間３０℃で持続する回転のもとで、インキュベートした。上清を捨て、５×の５００μｌのＴＥを用いて、ビーズを慎重に洗浄した。
【０１２７】
（Ｄ．ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼでの切断（ＳＡビーズからのシグネチャーの除去））
いずれのアダプタ（それぞれ、Ｑ３またはＱＭ２）が上記で使用されたかに依存して、第２の消化物を、ＢｐｍＩまたはＭｍｅＩのいずれかを用いて調製した。ＢｐｍＩ消化物は、４０μｌの１０×ＮＥＢ３バッファー、１０μｌのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、６μｌのＢｐｍＩ（２Ｕ／μｌ）、および４００μｌまでの水を含んだ。ＭｍｅＩ消化物は、
４０μｌの１０×ＭｍｅＩバッファー、４０μｌの１０×ＳＡＭ（４００μＭ）、１０μｌのＢＳＡ、８μｌのＭｍｅＩ（４Ｕ／μｌ）、および４００μｌまでの水を含んだ。
【０１２８】
消化物を、ＳＡビーズと混合し、そして３７℃で１．５時間の回転のもとでインキュベートし、次に、上清の除去のために、磁器粒子コンセントレーターに移した。混合物を、３μｌのエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ；１Ｕ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加によって脱リン酸化し、３７℃での１時間の後、７０℃で２０分間インキュベートすることにより不活性化した。混合物を冷却し、そしてバッファーで平衡化したフェノール（１００μｌ）およびＣＨＣｌ３：ＩＡＡ（２４：１）（１００μｌ）を用いて抽出した。０．１容量の３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）および１μｌのグリコーゲン（２０μｌ／μｌ）の添加後、混合物を２．５容量のエタノールを用いて沈殿させた。
【０１２９】
（Ｅ．第２の（Ｒ）アダプタの連結および底部鎖の除去）
ペレットをＲ４アダプタライゲーション混合液（１μｌのＲ４アダプタ（６０μＭ、上記を参照のこと）および３μｌのＨ２Ｏからなる）中で再懸濁した。以下のものを順次、各添加後に混合／遠心して、添加した：１μｌのラピッドライゲーションバッファー２（５×）、５μｌのラピッドライゲーションバッファー１（２×）；および１μｌのラピッドライゲーションリガーゼ。混合物を、４時間室温にてインキュベートし、その後、９μｌの１０×ＮＥＢ４および７９μｌのＨ２Ｏを添加し、その時点で、迅速に１０分間６５℃にまで加熱し、リガーゼを不活性化した。
【０１３０】
混合物を氷上でクエンチングした後、２μｌのＴ７エクソヌクレアーゼ（１０Ｕ／μｌ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃Ｍ０２６３Ｓ）を添加し、その後、１００μｌの総容量にまで、水を添加した。混合物を、３０分間３７℃でインキュベートし、次に、９５℃で５分間不活性化した。
【０１３１】
（Ｆ．挿入物の生成（ＰＣＲ増幅；アダプタの除去））
増幅混合物を、以下のように調製した：
１０μｌ  エクソヌクレアーゼ処理ＤＮＡ（上記）
１０μｌ  １０×クローン化Ｐｆｕバッファー
４μｌ  １０μＭのＱ３プライマー．ＦＡＭまたはＱＭ２プライマー．ＦＡＭ
４μｌ  １０μＭのＲプライマー．ＦＡＭ
２μｌ  ＳＣ  ｄＮＴＰミックス（１０ｍＭの各ｄＡＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ＋５−Ｍｅ−ｄＣＴＰ）（注意：５−Ｍｅ−ｄＣＴＰを、第１鎖および第２鎖の両方において使用する）
６８μｌ  Ｈ２Ｏ
２μｌ  Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）（ストラタジーン）
１００μｌまでの水。
【０１３２】
増幅を以下のサイクルを用いて行った。
【０１３３】
【化１１】
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反応混合物をフェノールおよびクロロホルムを用いて抽出し、その後、１μｌのグリコーゲン、５０μｌの７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、および４００μｌのエタノールを添加し、ＣＯ２（ｓ）上で３０分間または、−２０℃で一晩で沈殿させた。
【０１３４】
ペレットをエタノールで洗浄し、そして１２．５μｌの水および１．５μｌの１０×ＤｐｎＩＩ−バッファーに再懸濁し、その後、１μｌのＤｐｎＩＩ（ＮＥＢ、１０Ｕ／μｌ）を添加し、３７℃で１〜１．５時間インキュベートした。制限反応物に対して、１３．５μｌのＮＥＢ３および１２０．５μｌのＨ２Ｏを添加し、その後、６５℃で２０分間不活性化した。
【０１３５】
ＳｆａＮＩ（ＮＥＢ；１Ｕ／μｌ）を添加（６μｌ）し、その後、３７℃で１〜１．５時間インキュベートした。混合物を、一度、フェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（２５：２４：１）で抽出し、そして１６μｌの３ＭのＮａＯＡｃおよび４５０μｌのエタノール（−２０℃）を添加した。ペレットを洗浄し、次に、１２μｌのＴＥ（上記を参照のこと）中に再懸濁した。
【０１３６】
（Ｇ．電気泳動精製）
ローディングバッファー（５０％グリセロール＋ＢＰＢ；４μｌ）を、Ｆからの懸濁液に添加し、そして混合物を、２０％ＰＡＧＥ／１×ＴＢＥ  １０ウェルゲル（Ｎｏｖｅｘ）にロードし、そして４０分間２００Ｖで電気泳動した。関連するバンド（ＢｐｍＩについて２９ｂｐ、ＭｍｅＩについて３２ｂｐ）を同定し、そして従来法にて単離した。
【０１３７】
（Ｈ．ライブラリーのクローニング）
ライゲーション混合物を調製した（１μｌのベクター（ＭＢＳ１−８−ワードタグ／ＢａｍＨＩ／ＢｂｓＩ／ＥｃｏＲＶ／ＣＩＡＰ／ゲル精製した、〜２００ｎｇ／μｌ；配列番号１６、下記）、２μｌのラピッドライゲーションバッファー２（５×）、および６μｌの挿入物（上記）からなる）。（オリゴヌクレオチドタグを、ベクター中のＢｓｅＲＩ−Ｂｓｐ１２０Ｉ部位中にクローニングした）混合物を手短に遠心し、その後、１０μｌのラピッドライゲーションバッファー１（２×）を添加し、さらに混合／遠心をして、そして１μｌのラピッドライゲーションリガーゼを添加した。この混合物を室温で４時間インキュベートした。
【０１３８】
連結の後、１０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび７０μｌのＨ２Ｏを添加し、混合物を一度、フェノール：クロロホルム：ＩＡＡ（２５：２４：１）で抽出し、その後２μｌのＰｅｌｌｅｔ  Ｐａｉｎｔ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）および２７５μｌの−２０℃エタノール（１００％）を添加した。混合物をＣＯ２（ｓ）上で少なくとも３０分間インキュベートして、１０分間遠心した。上清を除去し、そしてペレットを−２０℃のエタノール（７０％）で洗浄した。さらに遠心して、上清を除去した後、ペレットを１０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁した。
【０１３９】
エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ株（ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｉｒｏｇｅｎ））を、０．５μｌのライゲーション産物および４０μｌの細胞を用い、標準的な手順に従った。
【０１４０】
【化１２】
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【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従う、ｍＲＮＡサンプル集団の３’領域を示す制限フラグメントから同一長のシグネチャ−配列のライブラリーを調製するための一手順を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のさらなる実施形態に従う、ｍＲＮＡの３’末端から同一長のシグネチャー配列を調製するための例示的手順を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のさらなる実施形態に従う、ｍＲＮＡの３’末端から同一長のシグネチャー配列を調製するための例示的手順を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のさらなる実施形態に従う、ｍＲＮＡの５’末端から同一長のシグネチャー配列を調製するための例示的手順を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のさらなる実施形態に従う、ｍＲＮＡの５’末端から同一長のシグネチャー配列を調製するための例示的手順を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明のさらなる実施形態に従う、ｍＲＮＡの５’末端から同一長のシグネチャー配列を調製するための例示的手順を示す。
【図４】図４は、本発明のさらなる実施形態に従う、ｍＲＮＡの５’領域を示すフラグメントから同一長のシグネチャー配列を調製するための例示的手順を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、シグネチャー配列の固相クローン化ライブラリーを調製するための手順を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、シグネチャー配列の固相クローン化ライブラリーを調製するための手順を示す。
【図６】図６は、図１の実施形態に従う、固相クローン化ライブラリーの調製における重要な工程を概説するフローチャートである。
【図７】図７は、固相支持体上にタグ−シグネチャー構築物をロードするための別の手順を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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