(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNAを導入した植物であって、該DNAを上流非翻訳領域（CMV 35S-up）を繋いだカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター（CMV 35S-P）の制御下で発現し、ラッカーゼを根から分泌することができる前記植物。
(a)配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラッカーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
植物が種子植物であることを特徴とする、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の植物を水耕栽培溶液にて培養し、該栽培溶液からラッカーゼを採取することを特徴とする、ラッカーゼの生産方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の植物を有害化学物質により汚染された環境で栽培することを特徴とする、有害化学物質の分解除去方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェノールオキシダーゼ遺伝子を導入した植物、該植物によるフェノールオキシダーゼの生産方法、及び、該植物を用いた利用した有害化学物質の分解除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フェノールオキシダーゼは、フェノール類を酸化してo-キノンあるいはp-キノンに変換する酵素であり、代表的な酵素としてラッカーゼがある。ラッカーゼは動植物、菌類に広く存在し、近年、ラッカーゼ生産能を有する菌体の菌体外酵素として得られている。菌体外酵素のラッカーゼは、該酵素産生菌の培養濾液から精製するか、アスペルギルス（Aspergillus）属のカビ等を宿主にラッカーゼ遺伝子の組換えを行い、該形質転換体を液体培養し、培養液からラッカーゼを採取することにより生産・精製している（YAVER, D.S. et al (1996) Appl Environ Microbiol 62: 834-841, Berka, R. M. et al (1997) Appl Environ Microbiol 63: 3151-3157）。しかし、ラッカーゼ産生菌、特に前記組換え体を用いてラッカーゼを生産する場合、生産効率は高まるが、一方で培養・精製等においてコストがかかるという問題が生じる。そのため、排水処理（例えばパルプ漂白排水中の有機塩素化合物の凝集沈殿処理）や有害化学物質の分解（例えば塩素化フェノール類の分解）（Roy-Arcand, L and Archibald, F. S. (1991) Enzyme Microbial Technol 13: 194-203, Ricotta, A. et al (1996) Bull Environ Contam Toxicol 57: 560-567, Johannes, C. et al (1996) Appl Microbiol Biotechnol 46: 313-317, Hoff, T. H. O. M. et al (1985) Appl Environ Microbiol 49: 1040-1045, Chivukula, M. U. R. A. and Renganathhan, V. (1995) Appl Environ Microbiol 61: 4374-4377, Bollag J. -M. et al (1988) Appl Environ Microbiol 54: 3086-3091, Amitai, G. et al (1998) FEBS Lett 438: 195-200）、人工漆塗料の製造、飲料の混濁防止、臨床分析等において、ラッカーゼの有用性が多数報告されているが、実際には実用化には至っておらず、付加価値が高いと考えられるデニム生地の洗いと脱色用にラッカーゼが製品化されているにとどまっている。
【０００３】
従って、生産効率が高く、かつコスト的にも望ましいフェノールオキシダーゼ、特に、ラッカーゼの簡便な生産方法が多分野において望まれている。しかしながら、ラッカーゼ等のフェノールオキシダーゼの生産方法について多くの特許出願や文献が確認されるが（特開平9-56378、特表平9-503126、特表平9-505481、YAVER, D.S. et al (1996) Appl Environ Microbiol 62: 834-841, Berka, R. M. et al (1997) Appl Environ Microbiol 63: 3151-3157等）、実用化の面から満足のいくものは得られていなかった。
【０００４】
一方、工業化学物質として生産されたPCB、BHC及びDDTや非意図的生成物であるダイオキシンなどの有害化学物質が高濃度でストックされていたり、環境中に蓄積している場合の処理技術として、物理化学的処理が開発されている。例えば、光化学分解、超臨界分解、溶媒抽出分解、触媒酸化、気相水素還元、溶融燃焼、還元雰囲気加熱処理及びガラス固化処理技術が実証試験されている。しかし、土壌や河川などの環境中に蓄積している低濃度の有害化学物質には、そうした物理化学的手法は対費用効果の観点から実用的とはいえず、また、現位置における処理法が必要とされる。こうした広範囲に拡散した有害化学物質は低濃度であっても、内分泌撹乱には十分な濃度レベルである。この問題を克服するための一つの手段として、有害化学物質を強力に分解する微生物を利用したバイオ・レメデイエーションが行われているが、こうした微生物浄化法にも問題点がある。それは、そうした微生物を長期にわたり優勢に維持するために、微生物の接種と栄養源の散布を行なわなければならないことであり、汚染範囲が広いほど難しくなる。
【０００５】
このような観点に立ち、近年、植物を利用した、ファイト・レメディエーション（植物による環境修復）による汚染浄化の試みがなされている。植物は、太陽、水、無機イオンで独立栄養的に成長でき、種子を管理することにより、広い範囲で栽培することができる。このため、持続的な環境浄化手法として注目されている。
【０００６】
これまでに検討されているファイト・レメディエーションには、植物が本来有する解毒機構や蒸散能力を活用したものがある。さらに、最近では、微生物由来の遺伝子を導入することで、植物の環境汚染除去機能を強化する試みがなされている。しかしながら、これまで検討されてきた形質転換植物による環境修復は、例えば、農薬や重金属等の場合、細胞画分への輸送蓄積によるものであり、植物が枯死すれば、蓄積された環境汚染物質が再度環境に放出され、根本的な浄化につながるものではなかった。さらに、有害化学物質がダイオキシンやPCBの場合には、易分解性のものは分解されるが、分解され難く、かつ毒性の高いものは濃縮蓄積されることが考えられるため、従来のファイト・レメディエーションは不十分なものであると考えざるをえない。
【０００７】
そうした経緯から、微生物由来の有害化学物質分解酵素遺伝子を導入した形質転換植物を用い、植物細胞内で直接有害化学物質を分解する試みが、2,4,6-トリクロロフェノール（日本農芸化学大会講演要旨集、p146, 1998）や、γ−ヘキサシクロヘキサン（日本農芸化学大会講演要旨集、p89, 1997）についてなされている。
【０００８】
ところで、ラッカーゼは、多岐にわたる難分解性化学物質を分解することが明らかにされている。例えば、クロロフェノール、農薬、多環芳香族炭化水素、アルキルフェノール、芳香族炭化水素、ニトロ化合物をはじめとする内分泌撹乱物質を酸化的に分解する。
【０００９】
従って、ラッカーゼ等のフェノールオキシダーゼ遺伝子を組み込み、その機能を発現できるような植物を作製できれば、高生産可能であり、かつコスト的にも望ましいフェノールオキシダーゼの生産方法が確立できるとともに、さらには、環境中の有害化学物質の分解除去に有用であるファイト・レメディエーションをも達成することができる。
【００１０】
しかしながら、植物に様々な外来遺伝子を導入して形質転換植物を得る方法についてはすでに報告があるが（特開平6-125782、特開平8-051986等）、活性のあるフェノールオキシダーゼを植物に導入して根から局所的に安定して該タンパク質を分泌生産することは困難であり、これまで、そのような形質転換植物の作製、該植物によるフェノールオキシダーゼの生産方法、及び、該植物を用いたファイト・レメディエーションは報告されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上のような技術的背景の下、ラッカーゼ等のフェノールオキシダーゼ（以下、本発明のタンパク質と称する）を根から分泌生産し得る植物を提供するとともに、該植物を用いた有害化学物質の分解除去方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ラッカーゼ等のフェノールオキシダーゼ遺伝子を導入した植物は該酵素を根から分泌生産することができるとともに、該植物により有害化学物質を分解除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１０）を提供する。
（１）フェノールオキシダーゼをコードするDNAが導入され、そのDNAが発現している植物。
（２）DNAが根において局所的に発現することを特徴とする、（１）に記載の植物。
（３）フェノールオキシダーゼをコードするDNAが、ラッカーゼをコードするDNAであることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の植物。
（４）ラッカーゼが分泌型ラッカーゼであることを特徴とする（３）に記載の植物。
（５）ラッカーゼが担子菌由来のラッカーゼであることを特徴とする、（３）に記載の植物。
（６）担子菌がカワラタケであることを特徴とする、（５）に記載の植物。
（７）以下の(a)又は(b)のタンパク質：
(a)配列番号１に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
(b)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列により表され、かつラッカーゼ活性を有するタンパク質、
をコードするDNAが導入され、そのDNAが発現している植物。
（８）植物が種子植物であることを特徴とする、（１）〜（６）のいずれかに記載の植物。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の植物を水耕栽培溶液にて培養し、該栽培溶液からフェノールオキシダーゼを採取することを特徴とする、フェノールオキシダーゼの生産方法。
（１０）（１）〜（８）のいずれかに記載の植物を有害化学物質により汚染された環境で栽培することを特徴とする、有害化学物質の分解除去方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の植物は、フェノールオキシダーゼをコードするDNAが導入され、そのDNAが発現している植物である。フェノールオキシダーゼは、酸素の存在下にフェノール類を酸化してo-キノンあるいはp-キノンに変換する酵素であり、チロシナーゼなどのポリフェノールだけでなくモノフェノールにも作用するモノフェノール酸化酵素と、ラッカーゼなどのｐ−ジフェノールのみに作用するジフェノール酸化酵素が含まれる。
このうち、酵素の用途の多様性、酵素活性、有害化学物質の分解除去能力等からラッカーゼが特に好ましい。
【００１５】
ラッカーゼは天然に広く動植物、菌類において存在し、いずれの起源からのラッカーゼも本発明に利用することができるが、特に、酵素生産上の操作容易性、（酵素の安定性、有害化学物質の毒性低減能力）等の観点から種々の菌類、例えば、担子菌類、子嚢菌類、不完全糸状菌類に由来するラッカーゼが好ましい。そのうち、特に担子菌から得られるラッカーゼが好適である。担子菌としては、例えば、カワラタケ（Coriolus versicolor）、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）等がある。
また、本発明の植物に導入し得るラッカーゼは分泌型ラッカーゼであってよい。ここで、分泌型ラッカーゼとは、植物体外へタンパク質を分泌するために必要なシグナル配列によって植物体外へ分泌されるラッカーゼのことを意味する。
【００１６】
植物に導入し得る本発明のタンパク質は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するものが挙げられ、担子菌から得られるラッカーゼ活性を有する天然のタンパク質だけでなく、その天然のタンパク質に、活性を失わせない範囲内で、１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、付加して得られるタンパク質をも含む。この配列のうち、アミノ酸位置１〜２１のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む領域はシグナル配列として機能し、このシグナル配列によって本発明のタンパク質が安定的に確実に植物体外に分泌され得る。シグナル配列はタンパク質を分泌するための遺伝子であり、シグナル配列はラッカーゼ遺伝子のＮ末端に機能的に結合している。このため、形質転換植物から分泌型のタンパク質、例えば、分泌型ラッカーゼを得ることを所望する場合、配列番号１に示される、配列部分のアミノ酸位置１〜２１のアミノ酸配列部分については、置換、欠失、付加は避けるのが好ましい。
【００１７】
上記のアミノ酸位置１〜２１のアミノ酸配列で示される、ラッカーゼ遺伝子に天然に存在するシグナル配列以外にも、公知のシグナル配列をフェノールオキシダーゼに連結することによって分泌生産することも可能である。しかしながら、安定的に確実にラッカーゼを植物体外に分泌させることができるという点から、配列番号１に示されるシグナル配列を含むアミノ酸配列を有する分泌型ラッカーゼを用いるのが特に好ましい。
【００１８】
植物に導入し得る本発明のタンパク質をコードするDNAを単離するには、幾つかの遺伝子クローニング方法を使用することができる。例えば、酵素を精製し、そのアミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成ヌクレオチドを作製し、ハイブリダイゼーション法により遺伝子ライブラリーから選択できる。また、酵素の精製を経ず、既知の遺伝子塩基配列情報を基にポリメラーゼチェインリアクション（PCR）に用いるプライマーを作製し、PCRを行うことにより遺伝子の特定の領域、或いは全領域を増幅し、単離する方法もある。
【００１９】
植物に導入し得る本発明のタンパク質をコードするDNAは、適当なプロモーター等と共に植物に導入することにより、発現させることができる。プロモーターとしては、局所的な発現を可能にし得るプロモーターが含まれ、例えば、根において強力な発現を可能にし得るカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター(CMV 35S-P)等を挙げることができる。また、この他、葉や茎における局所的発現を促す公知のプロモーターを利用できるが、産生されたタンパク質を分離・精製するための操作が煩雑になるため、根における強力な発現を可能にし得るプロモーターの利用が特に好ましい。なお、ここで、局所的な発現とは、植物の局所においてのみ生じる発現だけではなく、他の部分と比較して、局所の発現が一段と強力に生じ得るものも含まれることを意味する。その一段と強力に生じる程度とは、局所の発現が他の部分の発現よりも約１／３〜１／２以上である場合をいう。具体的には、根において局所的に発現し得るとは、葉や茎においても発現を認めるが、根における発現がそれらの部分の発現よりも著しく顕著であることを意味する。
【００２０】
さらに、発現を上昇させるプロモーターをも導入可能である。そのようなプロモーターとしては、例えば、CMV 35S-Pの上流の非翻訳領域（CMV 35S-up）等を利用することができる。
ターミネーターとしては、植物細胞で機能するものであればよく、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。
DNAの植物への導入は、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いる方法、及びアグロバクテリウムを用いる方法等、化学的、物理的、生物的方法を用いて植物のゲノムに導入することが可能である。DNAの導入された植物細胞は、抗生物質等の薬剤耐性等のマーカーを利用することにより選抜され、再分化させることができる。
【００２１】
本発明で使用できる植物は、細胞、組織、器官からの再分化法が確立され、かつ遺伝子導入系が構築されているものであればいずれの植物種にも適用できる。好ましい植物種としては、種子植物を例示することができる。種子植物は、草本植物や木本植物のいずれでもよいが、栽培上の容易性から草本植物が好ましく、例えば、タバコ、イネ、芝草等が挙げられる。
【００２２】
以上のようにして作製される形質転換植物の根から本発明のタンパク質が分泌されるので、この植物を水耕栽培溶液にて培養し、該栽培溶液から採取することにより、不純物の少ない本発明のタンパク質を得ることが可能となる。水耕栽培溶液は、該形質転換植物が生育し、かつ、本発明のタンパク質を分泌し得る溶液であれば特に制限されないが、例えば、Murashige & Skoog培地を利用することができる。水耕栽培溶液に本発明の形質転換植物を植え、該植物の成長に適した温度下において培養する。形質転換植物からフェノールオキシダーゼが十分に分泌されるまでの期間は、利用する植物の種類によって異なり、該酵素の分泌状態を確認しながら培養期間を適宜設定できるが、通常、１週間程度である。水耕栽培溶液中に分泌された本発明のタンパク質は、通常の酵素分離・精製法によって採取することができる。例えば、フェノールオキシダーゼを含む栽培溶液を遠心分離にかけ、さらに限外濾過膜を用いて濃縮することができる。さらに、フェノールオキシダーゼのN末端もしくはC末端に６残基のヒスチジンを連結する構築物を作成し、それを発現させることにより、例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー精製レジンで、簡便に該酵素を精製することができる。このようにして得られた酵素は、排水処理、人工漆塗料の製造、飲料の混濁防止、臨床分析等の分野において利用することができる。
【００２３】
また、上述のように、本発明のタンパク質には有害化学物質の分解除去作用があるので、本発明の形質転換植物を有害化学物質により汚染された環境で栽培することにより、持続的かつ自立的に、根圏における有害物質を分解除去することも可能である。さらに、本発明の形質転換植物から採取されたタンパク質を有害化学物質により汚染された環境に散布することによっても有害物質を分解除去することができる。ここで、有害化学物質とは、人体に毒性又は内分泌撹乱性を示す物質であって、フェノールオキシダーゼ、特にラッカーゼにより分解もしくは毒性の低減が可能な物質をいう。具体的には、クロロフェノール、農薬、多環芳香族炭化水素、アルキルフェノール、芳香族炭化水素、ニトロ化合物を例示できる。また、環境とは、例えば、土壌、湖沼、河川などをいう。
【００２４】
【実施例】
〔実施例１〕カワラタケのラッカーゼcDNAのクローニング
ラッカーゼをコードするcDNAを単離するために、DDBJ accession No. D13372に登録されているカワラタケ（Coriolus versicolor IFO30340）のラッカーゼ・ゲノムの塩基配列のなかからラッカーゼをコードする領域の上流と下流領域、即ち、開始コドンより２０塩基また終始コドンより２２塩基の塩基配列を選択し、オリゴヌクレオチドを化学合成した。
【００２５】
上記のように作製したオリゴヌクレオチドをプライマーに、カワラタケのcDNAを鋳型としてPCRを行った。反応は、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で90秒を25サイクル行った。反応には、Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造）を用いた。反応液の一部を1.5％アガロースゲルの電気泳動で分離したところ、予想したサイズにDNAの増幅物が認められた。増幅断片をアガロースより切り出し、抽出した後、シークエンスに供した。これにより、配列番号１に示す完全長のcDNAを得た。また、対応するアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００２６】
〔実施例２〕ベクターの構築と植物への導入
制限酵素部位を導入したラッカーゼcDNAを得るために、プライマーの合成を行った。各プライマーの塩基配列は、以下の通りである。
LfXb:5'-ttgtttctagatgtcgaggtttcactctct-3'
LBa:5'-aattggatccttactggtcgctcgggtcgagcg-3'
上記の合成DNAをプライマーに用い、配列番号１のラッカーゼcDNAをテンプレートとし、Pyrobest DNAポリメラーゼによりPCRを行った。反応は、98℃で10秒、60℃で30秒、72℃で80秒を30サイクル行った。LfXbとLBaのプライマーにより、完全長のラッカーゼcDNA（配列番号１）にXba I制限部位とBam HI制限部位を付加した断片を得て、これをpCR2.1に挿入した。塩基配列は、シークエンスを行い確認した。
【００２７】
上記で増幅したcDNA断片をpCR2.1から切りだし、特に植物の根における強力な発現を可能にし得るCMV 35S-Pを含むプラスミドpBI221のXba I、Bam HI部位に挿入した。そのプラスミドをpfLac/pBI221と命名した。
さらに、プラスミドpfLac/pBI221のCMV 35S-Pの上流にあるHind III、Pst I部位にCMV 35S-upを挿入することでラッカーゼ遺伝子の発現効率の向上を図った。得られたプラスミドをpW35SfLac/pBI221と命名した。
プラスミドpW35SfLac/pBI221をHind III、Bam HIで消化し、CMV 35S-up、CMV 35S-P及びラッカーゼ遺伝子を含む断片をpBI121のHind III、Bam HI部位に挿入した。そのプラスミドをpW35SfLac /pBI121（図１）と命名した。
【００２８】
pW35SfLac /pBI121を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株を用いて、タバコSR1 株に分泌型ラッカーゼ遺伝子を導入し、形質転換植物体を得た。また、pBI121を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株を用いてタバコSR1株の形質転換植物体を得、これを対照とした。これらの形質転換植物体にそれぞれの遺伝子が導入されていることは、各個体由来の全DNAを用いたサザン解析、PCR解析によって確かめた。
【００２９】
〔実施例３〕形質転換植物体の根から分泌されたラッカーゼ活性の検出
ショ糖含量を所定量の１／５にしたMurashige & Skoog 培地を水耕栽培溶液として調製した。体長20cm程度に生育させた、実施例２で作製の形質転換植物体タバコSR1 株を植え、２８℃で培養した。１週間培養後、培養液１０mlを取り、それを12,000xgで１５分間遠心し、分子量１０，０００以下を除外する限外濾過膜を用いて１／１，０００に濃縮した。このときの蛋白濃度は１０μg/１０μｌであった。この溶液を等電点電気泳動により展開し、４−クロロ−１−ナフトールにより活性染色した。その結果を図２に示す。図中、１はカワラタケの粗酵素液、２〜１２は形質転換植物体の培養液の濃縮物、C1及びC2は対照植物（pBI121のみを導入した植物）の培養液の濃縮物の結果である。図２から明らかなように、ラッカーゼ遺伝子を導入した形質転換植物の栽培溶液からだけ、該遺伝子がコードするラッカーゼの等電点であるpI３．５付近に明瞭なバンドが認められた（図２中の２から１１）。また、同条件で調製した、pBI121のみを導入した対照植物の培養液には全くバンドが認められなかった（図２中のＣ１とＣ２）。
【００３０】
以上の結果から、ラッカーゼ遺伝子を導入した形質転換植物は、その根から活性のあるラッカーゼを分泌していることが明らかとなった。従って、草本類や木本類にラッカーゼ遺伝子を導入し、それら遺伝子を形質転換植物体で発現させることによって、ラッカーゼを形質転換植物体の根から分泌させることが出来ることが確認された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によるフェノールオキシダーゼ遺伝子が導入された植物によって、効率よく、かつ低コストでフェノールオキシダーゼを生産することができる。また、この植物を有害化学物質により汚染された環境で栽培することにより、有害化学物質を分解除去することができる。
【００３２】
【配列表】
0004446085.tif 000002
0004446085.tif 000003
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【００３３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：プライマー LfXb
配列番号４：プライマー LBa
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpW35SfLac /pBI121の構造を示す図である。
【図２】栽培溶液中に分泌されたラッカーゼを等電点電気泳動し、活性染色した図である。
【図１】
0004446085.tif 000011
【図２】
0004446085.tif 000012