(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシディチオバチルス・スピーシーズ（Acidithiobacillus sp.）TTH-19A株（NITE BP-164)。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物を含有する硫酸溶液を硫化銅鉱に5〜30g/Lの塩化物イオン濃度下で作用させ、該溶液中に硫化銅鉱から銅を浸出させることを特徴とする、銅の浸出方法。
【請求項３】
請求項１に記載の微生物と硫黄源とをアルカリ土壌に施用することを特徴とする、アルカリ土壌の改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能が失活することなく、硫黄分を硫酸に酸化することによりエネルギーを獲得し増殖する微生物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
硫黄酸化細菌は、グラム陰性の独立栄養細菌で、硫黄分を硫酸に酸化してエネルギーを獲得して増殖する。硫黄酸化細菌の産業分野への用途としては、この特性を生かして、硫化銅鉱から銅を溶出させて回収するバクテリアリーチング（非特許文献１）、アルカリ土壌の改質（特許文献１）が代表的である。しかしながら、硫黄酸化細菌の硫黄酸化能力は、高塩化物イオン濃度下においては、浸透圧の影響や塩化物イオンの毒性により著しく阻害されるという問題がある。
【０００３】
【非特許文献１】千田佶編著（１９９６）：微生物資源工学、コロナ社（東京）、pp. 74−83
【特許文献１】特開平１１−３１９７９５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、高塩化物イオン濃度下においても優れた硫黄酸化能を有する微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、アシディチオバチルス（Acidithiobacillus）属に属する微生物の中に、高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能を有する微生物を見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)  高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能を有するアシディチオバチルス（Acidithiobacillus）属に属する微生物。
(2)  アシディチオバチルス（Acidithiobacillus）属に属する微生物が、アシディチオバチルス・スピーシーズ（Acidithiobacillus sp.）TTH-19A株（NITE BP-164)である、(1)に記載の微生物。
(3)  (1)又は(2)に記載の微生物を含有する硫酸溶液を硫化銅鉱に高塩化物イオン濃度下で作用させ、該溶液中に硫化銅鉱から銅を浸出させることを特徴とする、銅の浸出方法。
(4)  (1)又は(2)に記載の微生物と硫黄源とをアルカリ土壌に施用することを特徴とする、アルカリ土壌の改良方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能を有する微生物が提供される。従って、本微生物は、例えば、高塩化物イオン濃度の浸出液を用いる硫化銅鉱のバクテリアリーチングを効率よく行うことできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．塩化物イオン耐性をもつ硫黄酸化細菌
本発明によれば、高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能を有する微生物が提供される。
【０００９】
本明細書において、「高塩化物イオン濃度」とは、塩化ナトリウム濃度に換算して5〜30g/L、好ましくは5〜20g/Lをいう。
【００１０】
このような微生物の例としては、本発明者らが、北海道札幌市豊羽鉱山で採取した土壌サンプルから分離したTTH-19A株を挙げることができる。
【００１１】
TTH-19A株の菌学的性質は以下のとおりである。
【００１２】
（ａ）形態的性質
形および大きさ：桿菌、2.0×0.4μｍ
多形性の有無：無し
運動性の有無：有り
鞭毛の着生状態：不明
胞子の有無：無し
【００１３】
（ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培養：生育しない
肉汁液体培養：生育しない
肉汁ゼラチン穿刺培養：生育しない
その他糖類を含む培地：生育しない
元素硫黄含有除鉄９Ｋ培地：良好に生育
テトラチオン酸含有除鉄９Ｋ培地：良好に生育
硫酸第一鉄９K培地：生育しない
【００１４】
（ｃ）生理学的性質
グラム染色：陰性
生育の範囲（温度）：20-35℃、最適温度30℃
生育の範囲（ｐＨ）：1.0-4.0
酸素に対する態度：好気性
【００１５】
（ｄ）その他の性質
耐塩化物イオン性：有り（生育NaCl濃度範囲0-30g/L、ただし要求性ではない）
【００１６】
一方、TTH-19Aより抽出したDNAについて細菌16S rDNA増幅のためのプライマー：
514F：5' CGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT3’（配列番号２）
1540R：5' AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’（配列番号３）
を用いてPCRにて増幅し、16S rRNAをコードするDNA（以下、「16S rRNA遺伝子」という）の塩基配列を決定した（配列表の配列番号１）。このTTH-19A株16S rRNA遺伝子の部分塩基配列を用いて、GenBankデータベースによるホモロジー解析を行った結果、TTH-19A株はアシディチオバチルス（Acidithiobacillus）属の16S rRNA遺伝子に高い相同性を示した。
【００１７】
上記の菌学的性質を最新の当該菌分類に関する文献（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50, 511-516）に照らし合わせた結果、TTH-19A株は、塩化物イオン耐性以外の性質はアシディチオバチルス・チオオキシダンス（Acidithiobacillus thiooxidans）と一致するものの、塩化ナトリウム20g/L存在下でも生育を示す特徴を有し、かつ、16S rRNA遺伝子の部分塩基配列ではAcidithiobacillus thiooxidans のタイプカルチャーATCC19377株と95.5%の相同性しか示さなかった。以上の事項から、TTH-19A株は、アシディチオバチルス・スピーシーズTTH-19A株（Acidithiobacillus sp. TTH-19A株）と命名した。本菌株は、2006年1月13日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD)（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号NITE P-164として寄託され、2006年10月20日付でブタベスト条約の規定下で受託番号NITE BP-164として国際寄託に移管されている。
【００１８】
本発明の微生物には、上記のTTH-19A株のほか、この菌株と一定の類似性を有する微生物（類縁微生物）も含まれる。TTH-19A株の類縁微生物とは、例えば、微生物の分類に利用されている16S rRNA遺伝子が上記菌株と類似し、かつ、塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能を有する微生物をいう。具体的には、16S rRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１の塩基配列と95％以上、好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上相同である微生物であって、かつ、高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能を有する微生物をいう。
【００１９】
このようなTTH-19A株の類縁微生物は、例えば、硫酸酸性土壌などのサンプルから、上記の高塩化物イオン濃度下における硫黄酸化能と配列番号１に記載の塩基配列を指標として単離することができる。
【００２０】
２．本発明の微生物の用途
本発明の微生物は、高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能を有する。従って、本発明の微生物は、高濃度に塩化物イオンを含む水系（地下水、排水、海水、河川水、湖沼水等）や土壌において硫黄を酸化し、硫酸を産生させる反応工程に利用できる。微生物の使用形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物のいずれであってもよい。菌体処理物としては、例えば、菌体破砕物、培養物（培養菌体、培養上清）、該培養物から抽出した酵素などをいう。また、微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。また、微生物を凍結乾燥処理した乾燥粉末とし、乾燥粉末と増殖を補助する無機塩類を混合・造粒し、使用しやすい固形形態（粉末状、顆粒状、ペレット状など）に製剤化して用いてもよい。
【００２１】
本発明の微生物は、好適には、硫化銅鉱の硫酸溶液、好ましくは高塩化物イオン濃度の硫酸溶液を浸出液とする湿式製錬に利用できる。また、本発明の微生物は、硫酸溶液を浸出液とする銅の湿式製錬であれば、いずれの浸出形態にも用いることができ、例えば、回分攪拌浸出のみならず、鉱石を堆積させた上から硫酸を散布して、銅を硫酸中に浸出させるヒープリーチング、ダンプリーチング等の積層体リーチングのいずれであってもよい。また、硫酸溶液のｐＨは１．４〜１．８が好ましい。
【００２２】
硫化銅鉱の溶解、浸出は下記（式１）から（式３）に示す一連の反応によって進行する。
[化１]
Ｃｕ２＋＋Ｆｅ２＋  ⇔  Ｃｕ＋＋Ｆｅ３＋                           （式１）
[化２]
ＣｕＦｅＳ２＋Ｃｕ＋＋Ｆｅ３＋→Ｃｕ２Ｓ＋ ２Ｆｅ２＋＋Ｓ        （式２）
[化３]
Ｃｕ２Ｓ＋４Ｆｅ３＋→２Ｃｕ２＋＋ ４Ｆｅ２＋＋Ｓ                  （式３）
【００２３】
さらに、上記（式２）、（式３）の反応で生成した元素硫黄は、浸出液中の硫黄酸化菌の作用により下記（式４）の反応により酸化されて硫酸となる。
[化４]
Ｓ＋１．５Ｏ２ ＋Ｈ２Ｏ→ Ｈ２ＳＯ４                          （式４）
【００２４】
上記（式１）の平衡状態は、浸出液の塩化物イオン濃度を増加させることによって右側に傾くため、結果として、（式２）、続いて（式３）の反応を加速させることができるので銅の浸出速度促進に有利である。本発明の微生物（硫黄酸化菌）は、高塩化物イオン濃度下においても硫黄酸化能が低下しないので、高塩化物イオン濃度の浸出液を用いても、（式４）の反応が円滑に行われる。その結果、浸出反応で生成した元素硫黄の鉱物表面への付着が発生することなく、銅の効率良い浸出が可能となる。
【００２５】
本発明の微生物の浸出液への添加量は、特に限定されないが、一般的には、菌濃度が１×10６〜１×10７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように添加する。時間の経過とともに変動する菌の濃度は特に調整する必要はない。
【００２６】
本発明の微生物はまた、海岸に近い地帯、多量の塩分を含む生活排水や工業用排水で汚染された地帯など、高塩化物イオン濃度下にある地帯においてアルカリ土壌の改質を可能とする。
【００２７】
本発明の微生物をアルカリ土壌の改質に利用する場合は、本発明の微生物（菌体、菌体処理物)を、硫黄源（硫黄、硫黄化合物）とともにアルカリ土壌に施用することによって、該微生物の硫黄酸化によって生じた硫酸によってアルカリ土壌のｐＨを下げることができる。上記の硫黄としては硫黄末の溶液（鉄鋼スラグ溶出水など）、硫黄化合物としてはパイライト、チオ硫酸ナトリウム等が用いられる。施用は当分野で通常に行われている方法で行えばよく、例えば、上記微生物と硫黄源を土壌に直接散布し混合する方法、上記微生物の培養液と硫黄源を含む液状組成物を地下に掘削挿入した井戸またはパイプから注入・圧入する方法などが挙げられる。また、施用の際には、適宜水と空気（酸素）の供給を行う。
【００２８】
また、本発明の微生物のアルカリ土壌への使用量は、その施用形態等に応じ、任意に定めることができるが、通常、土壌１ｍ２に培養液であれば１Ｌ、乾燥菌体であれば５ｇ程度が例示できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
対象とする硫黄分として、黄銅鉱を主成分とするチリ産の精鉱を用いた。この品位は、Ｃｕ：２８ｍａｓｓ％、Ｆｅ：２８ｍａｓｓ％、Ｓ：３２ｍａｓｓ％であった。
【００３１】
上記の精鉱３gを、硫酸にてｐＨ１．５〜１．８に調整した培養液（硫酸アンモニウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．１ｇ／Ｌを含む）３００ｍＬに混合し、５００ｍＬ容量の坂口フラスコに注いだ。上記のフラスコ内の培養液に、塩化物ナトリウム濃度が１０ｇ／Ｌになるように添加し、さらに硫黄酸化細菌Acidithiobacillus sp. TTH-19Aを１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で添加してスポンジ栓を施して常温で振とうした。培養液の硫酸イオン濃度をＩＣＰ発光分光装置にて経時的に測定した。また、培養液の菌濃度を位相差光学顕微鏡によりトーマ血球係数盤により経時的に測定した。
【００３２】
（比較例１，２）
実施例１で調製した培養液に塩化物イオン耐性のないAcidithiobacillus thiooxidans（菌株１）を１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で添加する（比較例１）、または硫黄酸化細菌を添加しない（比較例２)以外は、実施例１と同様にして常温で振とうし、培養液の硫酸イオン濃度及び菌濃度を経時的に測定した。
【００３３】
実施例１及び比較例１〜２の試験結果を図１（硫酸イオン濃度増加分の変化）、図２（菌濃度増加分の変化）に示す。
【００３４】
この結果、塩化ナトリウム濃度１０ｇ/Ｌ条件下で黄銅鉱を主成分とする銅精鉱を硫黄源として培養した場合、Acidithiobacillus sp. TTH-19A株は硫黄分を酸化して盛んに増殖したのに対し、比較例１の菌株１では比較例２の菌無添加の場合と同じく易溶硫酸塩の溶解によると見られる硫酸イオンの増加が初期に確認されたものの、硫黄分のバクテリア酸化の効果による硫酸イオンの増加はほとんど見られず菌も増殖しなかった。
【００３５】
（実施例２，３）
対象とする硫黄分として元素硫黄粉末（和光純薬工業社製、特級）を用いた。
【００３６】
上記の硫黄粉末１gを、硫酸にてｐＨ１．８に調整した培養液（硫酸アンモニウム３ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．１ｇ／Ｌを含む）３００ｍＬに混合し、５００ｍＬ容量の坂口フラスコに注いだ。上記のフラスコ内の培養液に、塩化ナトリウム濃度が１０ｇ／Ｌ（実施例２）、または２０ｇ／Ｌ（実施例３）になるように添加した。さらに、同培養液に硫黄酸化細菌Acidithiobacillus sp. TTH-19Aを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で添加し、スポンジ栓を施して常温で振とうした。培養液の硫酸イオン濃度をＩＣＰ発光分光装置にて経時的に測定した。
【００３７】
（比較例３）  
実施例２と同様に調製した培養液に、塩化ナトリウムを添加せず、硫黄酸化細菌Acidithiobacillus sp. TTH-19Aを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で添加し、同様にして常温で振とうし、培養液の硫酸イオン濃度を経時的に測定した。
【００３８】
（比較例４〜６）
実施例２と同様に調製した培養液に、塩化ナトリウムを添加せず（比較例４）、または塩化ナトリウム濃度が１０ｇ／Ｌ（比較例５）、２０ｇ／Ｌ（比較例６）になるように塩化ナトリウムを添加し、さらに、塩化物イオン耐性のないAcidithiobacillus thiooxidans（菌株２）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で添加し、同様にして常温で振とうし、培養液の硫酸イオン濃度を経時的に測定した。
【００３９】
実施例２〜３及び比較例３〜６の試験結果を図３と図４に示す。
【００４０】
図３に示されるように、塩化ナトリウム濃度が１０ｇ/Ｌ条件下では、Acidithiobacillus sp. TTH-19Aは、塩化ナトリウム無添加の場合と同等の硫黄酸化能を示し、塩化物イオンによる硫黄酸化能の阻害は見られなかった（実施例２と比較例３の結果を比較)。一方、菌株２は塩化物イオンによる硫黄酸化能の阻害が現れた (比較例４と比較例５の結果を比較）。
【００４１】
また、図４に示すように、塩化ナトリウム濃度が２０ｇ/Ｌ条件下においては、Acidithiobacillus sp. TTH-19Aは阻害を受けるものの(実施例３と比較例３の試験結果を比較）、菌株２は、Acidithiobacillus sp. TTH-19Aよりも塩化物イオンによる硫黄酸化能の阻害の程度が大きく（比較例４と比較例６の結果を比較）、結果的に、Acidithiobacillus sp. TTH-19Aのほうが良好な硫黄酸化能力を示した。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例１、及び比較例１〜２の培養液（黄銅鉱を硫黄源）を用いて硫黄酸化細菌の培養を行った場合における培養液の硫酸イオン濃度増加分の経時変化を示す図である（実施例１：Acidithiobacillus sp. TTH-19A株、比較例１：Acidithiobacillus thiooxidans（菌株１）、比較例２：菌無添加、塩化ナトリウム濃度はいずれも10g/L）。
【図２】実施例１、及び比較例１の培養液（黄銅鉱を硫黄源）を用いて硫黄酸化細菌の培養を行った場合における培養液の菌濃度増加分の経時変化を示す図である（実施例１：Acidithiobacillus sp. TTH-19A株、比較例１：Acidithiobacillus thiooxidans（菌株１）、塩化ナトリウム濃度はいずれも10g/L）。
【図３】実施例２、及び比較例３〜５の培養液（元素硫黄粉末を硫黄源）を用いて硫黄酸化細菌の培養を行った場合における培養液の硫酸イオン濃度の経時変化を示す図である(実施例２： Acidithiobacillus sp. TTH-19A株;塩化ナトリウム濃度10g/L、比較例３：Acidithiobacillus sp. TTH-19A株、塩化ナトリウム濃度0g/L；比較例４:Acidithiobacillus thiooxidans（菌株２）；塩化ナトリウム濃度0g/L、比較例５:Acidithiobacillus thiooxidans（菌株２）；塩化ナトリウム濃度10g/L）。
【図４】実施例３、及び比較例３、４、６の培養液（元素硫黄粉末を硫黄源）を用いて硫黄酸化細菌の培養を行った場合における培養液の硫酸イオン濃度の経時変化を示す図である(実施例３： Acidithiobacillus sp. TTH-19A株；塩化ナトリウム濃度20g/L、比較例３：Acidithiobacillus sp. TTH-19A株、塩化ナトリウム濃度0g/L；比較例４:Acidithiobacillus thiooxidans（菌株２）、塩化ナトリウム濃度0g/L；比較例６:Acidithiobacillus thiooxidans（菌株２）、塩化ナトリウム濃度20g/L)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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