(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆体としてシクロヘキサンを用いて誘導結合型化学気相蒸着法でプラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜（ＰＰＣＨｅｘ）をガラス基板上に蒸着する段階と、
プラズマ重合されたシクロヘキサン／スライドガラス（ＰＰＣＨｅｘ／ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅ）上にパターン化されたマスクを置いて、前躯体としてエチレンダイアミン（ＥＤＡ）を用いて誘導結合型化学気相蒸着法でプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜をパターン化する段階と
を含む、タンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項２】
前記プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜は、基板温度を２７℃に維持することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項３】
プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜を形成するための運搬ガスとしては、アルゴン（Ａｒ）、窒素（Ｎ２）、ヘリウム（Ｈｅ）または水素（Ｈ２）が用いられることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項４】
前記プラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜（ＰＰＣＨｅｘ）をガラス基板上に蒸着する段階では、前記運搬ガスの気体流れ比率が約２０ｓｃｃｍであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項５】
前記プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜をガラス基板上に蒸着する段階では、前記プラズマ反応チャンバー内部の圧力が約３００ｍｔｏｒｒに維持され、蒸着が３０秒間施行されることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項６】
前記プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜をガラス基板上に蒸着する段階では、前記プラズマ反応チャンバー内部の圧力が約３００ｍｔｏｒｒに維持され、蒸着が３０秒間施行されることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項７】
前記プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜をガラス基板上にパターン化する段階では、前記運搬ガスの気体流れ比率が約１５ｓｃｃｍであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項８】
前記プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜をガラス基板上にパターン化する段階では、前記プラズマ反応チャンバー内部の圧力が約３０ｍｔｏｒｒに維持され、蒸着が２分間施行されることを特徴とする請求項７に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項９】
前記プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜をガラス基板上にパターン化する段階では、前記プラズマ反応チャンバー内部の圧力が約３０ｍｔｏｒｒに維持され、蒸着が２分間施行されることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項１０】
前記プラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜（ＰＰＣＨｅｘ）をガラス基板上に蒸着する段階では、プラズマ反応チャンバーのＲ．Ｆ生成器の電力として外部電極に加えるＩＣＰ電力が約１５Ｗに維持され、内部電極である基板支持台に加えるＳＢ電力が約１０Ｗ〜７０Ｗに維持されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項１１】
前記プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜をガラス基板上にパターン化する段階では、プラズマ反応チャンバーのＲ．Ｆ生成器の電力として外部電極に加えるＩＣP電力が約４Ｗに維持され、内部電極である基板支持台に加えるＳＢ電力が約４Ｗに維持されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項１２】
タンパク質チップ基板の製造方法であって、
基板をトリクロロエチレン、アセトン及びメタノールの順に洗浄する段階と、
前記基板を反応チャンバーの基板支持台上に配置する段階と、
真空手段を通して、前記プラズマ反応チャンバー内部の圧力を調節する段階と、
泡立て器を通して、前駆体であるシクロヘキサンを、運送ガスと一緒に前記プラズマ反応チャンバー内に注入する段階と、
基板支持台の下部に配置されるヒーターを通して、前記プラズマ反応チャンバー内部の温度を調節する段階と、
ＲＦ生成器で外部電極及び支持台にＩＣＰパワーとＳＢパワーを印加し、プラズマを前記基板と前記プラズマ反応チャンバーとの間に形成する段階と、
前記プラズマによって前記前駆体であるシクロヘキサンが重合されながらプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜を、基板上に均一に蒸着する段階と、
プラズマ重合されたシクロヘキサン／スライドガラス（ＰＰＣＨｅｘ／ｇｌａｓｓ  ｓｌｉｄｅ）上にパターン化されたマスクを置いて、前駆体としてエチレンダイアミン（ＥＤＡ）を用いて誘導結合型化学気相蒸着法でプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜をパターン化する段階と、を含むことを特徴とするタンパク質チップ基板の製造方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の製造方法で製造されるタンパク質チップ基板。
【請求項１４】
請求項１２に記載された製造方法で製造されるタンパク質チップ基板。
【請求項１５】
誘導結合型プラズマ化学気相蒸着法を用いて基板上に蒸着されたプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜と、前記プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜上にパターン化されるアミン機能性グループを有するプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜と、からなる、タンパク質チップ基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質チップ基板及びその製造方法に関するもので、詳しくは、アミン機能性グループを有するプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）と、非特異性吸着のないプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）を誘導結合型プラズマ化学気相法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；ＩＣＰ−ＣＶＤ）を用いて蒸着することで、スライド表面に発生する非特異性吸着を除去するタンパク質チップ基板の製造方法、及び誘導結合型プラズマ化学気相蒸着法（ＩＣＰ−ＣＶＤ）で蒸着されたタンパク質チップとして用いられる基板に製造されたタンパク質基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、人間遺伝体の構造がほぼ明らかになることで、人体を構成する機能研究に対する関心が急増しつつある。
【０００３】
上記のような遺伝子の機能を究明する総体的な研究分野は、機能ゲノミックス（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）という。
【０００４】
この機能ゲノミックスは、遺伝子を実験材料として用いて研究するゲノミックスと、細胞内の総体的なタンパク質群を対象にして研究し、遺伝子の機能を究明するプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）と、これら二つの分野を共通的に望むバイオインフォマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）と、に分けられる。
【０００５】
最近まで、遺伝子や細胞の機能研究に対する分子生物学的な接近は、ほとんど単一遺伝子やその遺伝子が発現するｍＲＮＡの発現調節を中心になされてきたが、この頃は、タンパク質体を中心になされている。
【０００６】
前記タンパク質体の研究に必需的な核心技術が、タンパク質チップである（Ｇａｖｉｎ  ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１７６０〜１７６３，２０００）。
【０００７】
タンパク質チップは、数十〜数千個のタンパク質を小さな基板上に固定化し、同時多発的にタンパク質の結合を分析する自動化機器システムである。
【０００８】
このタンパク質チップは、数十〜数千個の遺伝子を基板上に固定し、同時多発的に遺伝子の変化を各遺伝子間の相補的な結合を通して定量分析することで、遺伝子発現や突然変異を検索するマイクロアレイＤＮＡチップ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ＤＮＡ  ｃｈｉｐ）と類似している（Ｙａｓｕｄａ，Ｈ．，Ｌａｍａｇｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｊ．Ａ  ｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１７：２０１，１９７３；Ｍｕｇｕｒｕｍａ，Ｈ．，Ｋａｒｕｂｅ，I．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１８：６２，１９９９；Ｎａｌａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｍｕｇｕｒｕｍａ，Ｈ．，Ｋａｒｕｂｅ，I．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１６９５，１９９６；Ｍｉｙａｃｈｉ，Ｈ．，Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ａ．，Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ，Ｋ．，Ｙａｎｏ，Ｋ．，Ｍｕｇｕｒｕｍａ，Ｈ．，Ｋａｒｕｂｅ，I．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．６９：３２３，２０００）。
【０００９】
しかし、タンパク質チップによると、前記ＤＮＡチップでは得られない次のような分析が可能になる。
【００１０】
第一に、タンパク質-タンパク質間の相互作用に関する情報を得ることができる。細胞内の信号伝達や調節は、タンパク質-タンパク質間の相互作用の形態で表れるが、これをタンパク質チップを通して分析することができる。
【００１１】
第二に、人間を含む高等生物体から酵母に至るまで、タンパク質には、遺伝子とは関係なしに、翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が起きるが、リン酸化、酸化などの二次的な修飾に関する情報を得ることができる。
【００１２】
第三に、ｍＲＮＡ生成後に発生する問題点を検出することができる。多くの疾病は、転写後調節、タンパク質の生成及びタンパク質の位置などの問題点から引き起こされるが、ｍＲＮＡを検出するＤＮＡチップでは、このような情報を得ることが難しい。
【００１３】
第四に、ｍＲＮＡからタンパク質が発現するとき、両者の定量的な相関関係がそれほど高くないこともあるため、場合によって、タンパク質に関する正確な情報を提供することができない。しかし、このようなＤＮＡチップの限界は、タンパク質チップを通して克服することができる。
【００１４】
第五に、ＤＮＡチップで究明される遺伝子の塩基序列の差は、直接的な疾病または表現型の差を示さない。さらに、類似した特性を有するアミノ酸への突然変異は、タンパク質の固有特性をほとんど維持するため、疾病や表現型の差を誘発しない。
【００１５】
しかしながら、タンパク質チップを用いると、直接的な疾病及び表現型の差を示すタンパク質を究明することができる。
【００１６】
タンパク質チップを用いると、タンパク質-タンパク質間の相互関係に関するデータ生成が可能であり、新薬開発時における時間及び費用の節減効果をもたらす。例えば、現在の遺伝子を用いた治療薬開発にかかる時間より、遥かに時間を短縮させることができる。
【００１７】
また、タンパク質チップは、産業的需要のみならず、疾患診断、環境モニタリング、有害性検診などの潜在需要も非常に大きい。
【００１８】
上記のような長所のため、タンパク質チップがＤＮＡチップより大きい市場を形成すると予想され、タンパク質チップに対する開発が切実に要求されている。
【００１９】
タンパク質チップの構成を説明すると、タンパク質チップは、センサチップ及びタンパク質結合分析装置によって構成される。
【００２０】
これらのうち、センサチップは、タンパク質チップの核心部分として、タンパク質チップの発展速度を決定する主要な要因となる部分である。
【００２１】
前記センサチップは、数十〜数百個のタンパク質が小さい表面に一定の配列で結合されてなるが、そのほとんどがスライド大きさのガラスやプラスチックを用いる。
【００２２】
前記センサチップの核心技術は、タンパク質をチップの表面に結合するタンパク質固定化技術である。
【００２３】
タンパク質固定化技術は、その特性によって次のような３種類に分けられる。
【００２４】
第一の方法は、カルボキシメチル-デキストラン（ＣＭ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）-ｄｅｘｔｒａｎ）を用いて特定のタンパク質をセンサチップの表面に固定する方法で、最も広く用いられている方法である。
【００２５】
そのうち、アミン結合が最も普遍的に用いられるが、酸性を帯びるタンパク質やＤＮＡなどを結合するためのチオール結合またはアビジン-ビオチン結合が用いられることもある。
【００２６】
第二の方法は、多数の同一特性を帯びるタンパク質群を結合するようにセンサチップの表面を処理する方法である。
【００２７】
第三の方法は、不特定多数のタンパク質を結合する方法で、ポリリシンやカリックスクラウンが例として挙げられる。
【００２８】
上記のように、タンパク質固定化の調節及びバイオ分子のパターン化された整列の開発は、バイオチップ、バイオ電子工学及び細胞生物学の基礎的研究を含む多様でかつ幅広い分野で重要な含蓄性を有している。
【００２９】
一般的に、バイオ分子の固定化には、自己組み立て単分子層及びリソグラフィ方法などの多様な方法が用いられている。
【００３０】
最近は、プラズマ重合体薄膜を用いて固体スライド上にバイオ物質を固定化する研究が活発に行われている。
【００３１】
一方、プラズマとは、電気的に中性である気体分子が電気エネルギーまたは熱エネルギーを吸収し、イオンと電子とに分離された状態をいう。
【００３２】
現在、プラズマを用いる技術に対する研究が活発に行われている。
【００３３】
半導体工程では、プラズマエッチング及び化学気相蒸着（ｐｌａｓｍａ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：ＰＥＣＶＤ）、金属や高分子の表面処理、人造ダイアモンドなどの新物質の合成、プラズマディスプレイ（ｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐａｎｅｌ：ＰＤＰ）及び環境浄化技術などに、その応用分野が益々拡大されている。
【００３４】
上記のようなプラズマは、部分的に気体をイオン化させ、各分子を非常に効率的に活性化させる。
【００３５】
相対的に多くの非活性分子をプラズマに露出させることで、活性化が容易に行われる。
【００３６】
プラズマ重合膜をコーティングするためには、単量体である化学物質を蒸着チャンバーに移動させ、プラズマを用いて各反応種を活性化または分解させる。
【００３７】
その後、これら反応種がスライド表面に凝縮されることで、重合薄膜が形成される。
【００３８】
アミン及びアルデヒドなどの機能性グループを含む前駆体を用いる場合、プラズマ重合薄膜の表面には、上述した多量の機能性グループが含まれるので、これら固体スライドは、バイオ分子の固定化に用いられる。
【００３９】
上記のようなプラズマ重合薄膜は、一般的な化学的に合成された重合薄膜とは非常に大きな差を有する。
【００４０】
すなわち、上記のようなプラズマ重合膜は、気孔性がなく、機械的または化学的に非常に安定的であり、スライドとの強い接着性を有するが、その理由は、薄膜の非常に稠密な構造（ｃｒｏｓｓ-ｌｉｎｋｅｄ）の連結を有するためである。
【００４１】
さらに、プラズマ重合体は、一般的な化学的に合成された重合薄膜に比べて、厚さ調節及び膜の均一性に非常に優れており、相対的に短い時間に膜を蒸着できるという長所があり、タンパク質及びＤＮＡ整列においても大きな長所を有する。
【００４２】
高感度の診断タンパク質チップを実現するためには、窮極的に制限されたタンパク質チップ表面の領域に充分な量のタンパク質が固定化されるべきである。したがって、一層効率的なタンパク質固定化技術開発が要求される。
【００４３】
共有結合の固定化方法は、ガラス表面上における化学的または物理的形成による親核または親電磁気的な性質に依存する。
【００４４】
タンパク質チップにおいて、チップに基づく実験と関連してよく知られた問題点は、スライド表面に発生する非特異性吸着であるが、このような非特異性吸着は、診断検査において明らかに偽った応答として誤認される。
【００４５】
しかしながら、従来のタンパク質チップは、アミンのない部分にも非特異性吸着が発生するという問題点を有する。
【００４６】
そのため、チップに基づく診断法において、非特異性吸着を減少させる技術が一層良好に開発されるべきである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４７】
本発明の目的は、タンパク質固定化において、スライド表面で発生する非特異性吸着を防止することにある。
【課題を解決するための手段】
【００４８】
上記のような目的を達成するために、本発明では、プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）と、非特異性吸着のないプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）を誘導結合型プラズマ化学気相法を用いて蒸着した。
【００４９】
それぞれの前駆体としては、エチレンダイアミン（ＥＤＡ）及びシクロヘキサン（ＣＨｅｘ）を用いた。
【００５０】
タンパク質固定化においては、スライドガラス表面の化学的特性を細密に改質することが重要である。
【００５１】
タンパク質を固定させるために、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜をスライドガラス上に蒸着した。このとき、スライドガラスの表面は、疎水性に変換される。
【００５２】
その後、シクロヘキサンが蒸着されたスライドガラス（ＰＰＣＨｅｘ／ｇｌａｓｓ  ｓｉｌｄｅ）上にパターン化されたマスクを載置し、プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）をパターン化した。
【００５３】
全ての薄膜表面の疎水性／親水性は、水の接触角を測定することで検査した。
【００５４】
プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜の表面に対する水の接触角が略４５゜を示す場合、プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜の表面が親水性であることを示す。
【００５５】
一方、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜の表面に対する水の接触角が略９０゜以上を示す場合、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜の表面が疎水性であることを示す。
【００５６】
適切な条件で蒸着されたプラズマ重合されたシクロヘキサン（ｐｌａｓｍａ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ；ＰＰＣＨｅｘ）には、非特異性結合がほとんどなかった。
【００５７】
非特異性吸着のない、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）の表面粗度及び化学的構造は、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＡＦＭ）及びフーリエ赤外線分光法（ＦＴＩＲ）によって調査した。
【００５８】
固定されたタンパク質及び非特異性吸着程度は、励起波長４９０nm及び放出波長５２０nmの蛍光検査で測定した。
【００５９】
本発明で固定化されたタンパク質は、非特異性吸着のない、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）上にパターン化されたプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）区域のみで観察された。
【００６０】
本発明者たちは、ほとんどのタンパク質が、親水性でありながらタンパク質と結合するアミン作用基を有するプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）のみで固定化されることを発見した。
【００６１】
上記のような本発明は、タンパク質を制限された領域に固定化し、選択された領域のみに配置するため、非常に有用である。
【００６２】
その結果、非特異性吸着のないプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）上に、アミン機能性グループを有するプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）をパターニングする技術は、バイオチップ分析において非常に優れた技術方向を提示する。
【発明の効果】
【００６３】
本発明に係るタンパク質チップ製造方法においては、スライド表面に発生する非特異性吸着を防止することで、遺伝子と関連した診断検査などの信頼性を高められるという効果がある。
【００６４】
また、本発明に係るタンパク質チップ製造技術においては、プラズマを用いて大面積基板に短い時間の間均一に蒸着することができ、大量生産の利点があって商業化が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
以下、本発明に係るタンパク質チップ基板の製造方法に対し、添付の図面に基づいて詳細に説明する。
【００６６】
本発明に係るタンパク質チップ基板の製造方法において、基板上の前駆体付着には、誘導結合型プラズマ化学気相法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；ＩＣＰ−ＣＶＤ）を用いることが一層好ましい。
【００６７】
図１は、本発明に係るタンパク質チップ基板を製造するための誘導結合型プラズマ化学気相蒸着装置を概略的に示した模式図である。
【００６８】
図１に示すように、誘導結合型プラズマ化学気相蒸着装置は、プラズマ反応チャンバー１と、該プラズマ反応チャンバー１内部の圧力を調節するための真空手段７と、前駆体１１を気体状態で前記プラズマ反応チャンバー１内に注入するための泡立て器９と、該泡立て器９からの気化された前駆体を前記反応チャンバー１に噴射させるシャワーリング１０と、前記プラズマ反応チャンバー１の上部に配置された外部電極２と、前記プラズマ反応チャンバー１の内部に配置されて基板３を支持し、内部電極としての機能をする基板支持台４と、前記外部電極２にＩＣＰ（誘導結合型プラズマ）パワーを提供し、内部電極である前記基板支持台４にＳＢ（スライド電圧）パワーを提供するＲＦ生成器６と、から構成される。
【００６９】
上記のような構成の他に、Ｈｅ、Ａｒなどの運搬気体が含まれた気体貯蔵部（図示せず）と、通過する気体のモル数を調節する流量調節器（図示せず）と、プラズマ反応チャンバー内部の温度を調節する冷却装置（図示せず）と、チャンバー内部の対流を容易にするファン（図示せず）と、が設置される。
【００７０】
前記基板３を支持する基板支持台４は、その内部にヒーターが装着されている。
【００７１】
以下、本発明のタンパク質チップ基板を製造するために、プラズマ化学気相蒸着装置を用いて薄膜を蒸着する方法を説明する。
【００７２】
まず、前駆体としてシクロヘキサンを用いて、誘導結合型化学気相蒸着法でプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜を基板上に蒸着する。
【００７３】
次に、前駆体としてエチレンダイアミン（ＥＤＡ）を用いて、誘導結合型化学気相蒸着法でプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜を、スライドガラス上に形成されたプラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜上に蒸着する。
【００７４】
以下、重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜を基板上に蒸着する方法を説明する。
【００７５】
基板３は、蒸着チャンバーに入れる前に、トリクロロエチレン、アセトン及びメタノールで順次洗浄した後、反応チャンバー１の基板支持台４上に載置する。
【００７６】
その後、前記真空手段７を通して、前記プラズマ反応チャンバー１内部の圧力を調節する。また、前記泡立て器９を通して、前駆体であるシクロヘキサンを運送ガスと一緒に前記プラズマ反応チャンバー１内に注入する。また、前記基板支持台４の下部に配置されるヒーターを通して、前記プラズマ反応チャンバー内部の温度を上昇させる。
【００７７】
上記のような状態で、前記ＲＦ生成器（Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）６で前記外部電極２及び前記内部電極４に誘導結合型プラズマ（ＩＣＰ）パワー及びスライド電圧（ＳＢ）パワーを印加すると、前記外部電極２及び支持台４によって生成された各プラズマは、前記基板３と前記プラズマ反応チャンバー１との間に形成される。
【００７８】
このとき、生成された前記プラズマによって前記前駆体であるシクロヘキサンが重合されながら、プラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜（ＰＰＣＨｅｘ）が基板３上に均一に蒸着される。
【００７９】
本発明において、蒸着チャンバーは、円筒状のステンレス材質からなるチャンバーである。蒸着チャンバーの直径及び高さは、それぞれ３０cm及び２８cmである。
【００８０】
シクロヘキサン単量体は、５０℃で加熱された泡立て器に入れて用いた。
【００８１】
シクロヘキサン分子は、不活性アルゴン気体を運搬ガスとして用いて蒸気化させ、蒸着チャンバー内に流入させた。
【００８２】
誘導結合型プラズマ（ＩＣＰ）は、円状のコイルが結合された高周波数を有する発生器を通してシャワーリングの周囲に発生させた。
【００８３】
スライド電圧パワー（ＳＢ  ｐｏｗｅｒ）は、高周波数を有する発生器を基板支持台に付着し、スライドの周囲にもプラズマを生成させた。
【００８４】
蒸着チャンバーの壁面は、接地させた。
【００８５】
蒸着チャンバーの基本圧力は、真空手段７を用いて約１０-５ｔｏｒｒ程度に維持した。
【００８６】
プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜は、基板温度を２７℃に維持した。
【００８７】
前記前駆体は、運搬ガスを用いてプラズマ反応チャンバー内に注入することが好ましく、このとき、運搬ガスとしては、アルゴン（Ａｒ）、窒素（Ｎ２）、ヘリウム（Ｈｅ）及び水素（Ｈ２）などが用いられるが、これらのうち、アルゴン（Ａｒ）を用いることが一層好ましい。
【００８８】
アルゴン気体流れ比率を約２０ｓｃｃｍにし、基板３として用いられたスライドガラス上に蒸着した。
【００８９】
前記プラズマ反応チャンバー内部の圧力は、約３００ｍｔｏｒｒに維持し、蒸着は３０秒間施行することが好ましい。
【００９０】
プラズマ反応チャンバー１のＲＦ生成器６の電力として外部電極に加えるＩＣＰ電力は、約１５ワット（Ｗ）に維持することが好ましい。
【００９１】
内部電極である基板支持台４に加えるＳＢ電力は、約１０Ｗ〜７０Ｗに増加させた。
【００９２】
次に、前駆体としてエチレンダイアミン（ＥＤＡ）を用いて誘導結合型化学気相蒸着法でプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜を、スライドガラス上に形成されたプラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜上にパターン化されたマスクを通して蒸着し、プラズマ重合されたエチレンダイアミンをパターン化した。
【００９３】
このとき、蒸着温度は常温を維持し、アルゴン気体流れ比率は約１５ｓｃｃｍにして蒸着した。蒸着圧力は約３０ｍｔｏｒｒに維持し、蒸着は約２分間施行した。それぞれの蒸着パワーは、ＩＣＰパワーを約４Ｗに維持し、ＳＢパワーを約３Ｗに維持した。
【００９４】
本実施例で、１-エチル-３-［３-ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（１-Ｅｔｈｙｌ-３-［３-ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＥＤＣ）と、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＦＩＴＣ）とが結合されたヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ；ＩｇＧ）を使用し、各試薬は、リン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）に希薄させて使用した。
【００９５】
本実施例に用いられるプラズマ蒸着器において、前記外部電極及び前記基板支持台は、一般的なプラズマ化学気相装置で用いられる電極であれば、材質及び形態に特別な制限はない。
【００９６】
特に、外部電極の場合、その形態が平板円状コイル形態であることが好ましい。内部電極の場合、その材質は、化学的反応がなく、汚染の少ない材質を用いることが好ましく、ステンレス材質を用いることが一層好ましい。
【００９７】
前記基板としては、ガラス板、プラスチック、金属及びシリコンからなるグループから選択されるもの、特に、ガラス板を用いることが一層好ましい。
【００９８】
以下、接触角測定、蛍光測定、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）による表面粗度調査及びフーリエ赤外線分光法（ＦＴＩＲ）による化学的構造測定を通して、本発明によって製造された薄膜のタンパク質固定化能力を確認する。
【００９９】
〔接触角測定〕
本発明者たちは、２マイクロリットルの水と試料との間の静的な接触角測定を施行した。この測定は、サンプルと水平に上がったＣＣＤで記録したデジタルイメージを基本とした。
【０１００】
静的な接触角を測定することで、疎水性または親水性程度を把握することができる。
【０１０１】
上記の測定結果は、図２に示されている。
【０１０２】
図２に示すように、プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜表面の水の接触角が略４５゜を示す場合、プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）薄膜の表面が親水性であることを示す（図２Ｆ）。
【０１０３】
アミン作用基は、親水性であるとともに、タンパク質との結合力にも優れたものとして知られている。
【０１０４】
一方、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜の表面に対する水の接触角が９０゜以上を示す場合、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜の表面が疎水性であることを示す（図２Ａ〜図２Ｅ）。
【０１０５】
疎水性を有する表面は、水と薄膜との界面における弱い相互作用を意味し、このとき、薄膜は、ハイドロカーボン（−ＣＨｘ）グループのみで構成されている。
【０１０６】
その反面、親水性を有する表面は、水と薄膜との強い相互作用を意味し、これは、薄膜の表面に酸素グループが存在することを意味する。
【０１０７】
〔タンパク質固定化〕
常温で１０分間、パターン化されたスライドガラスをＥＤＣ溶液に培養した。次に、脱イオン化された水で、パターン化されたスライドガラスを洗浄した。
【０１０８】
４ｎｇ／μlのＦＩＴＣ結合されたＩｇＧ溶液を、パターン化された薄膜上に１時間の間培養させた。
【０１０９】
その次に、ＩｇＧ溶液を脱イオン化された水で洗浄した後、常温で乾燥させた。
【０１１０】
〔蛍光測定〕
ＦＩＴＣ結合されたＩｇＧが固定されたパターン化されたスライドガラスを、レーザー蛍光スキャナーで調査した。
【０１１１】
ＦＩＴＣ結合されたＩｇＧは、４９０nmの波長で励起され、５２０nmの波長で放出される。
【０１１２】
プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）スライド表面における非特異性タンパク質吸着は、蛍光測定を通して調査した。
【０１１３】
蒸着パワーによってプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）が蒸着されたスライドガラスを準備し、これらスライドがタンパク質チップに適しているかを調査した。
【０１１４】
図３Ａ〜図３Ｅは、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）上の非特異性タンパク質固定化を蛍光測定したイメージである。
【０１１５】
図３Ａ〜図３Ｅに示すように、ＳＢパワーが１０Ｗ〜７０Ｗまでに増加することで、非特異性タンパク質吸着が減少した。
【０１１６】
特に、プラズマＳＢパワーが７０Ｗであるときは、 非特異性タンパク質吸着が表れなかった。
【０１１７】
図４Ａ〜図４Ｃは、プラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜（ＰＰＥＤＡ／ＰＰＣＨｅｘ）上にプラズマ重合されたエチレンダイアミンがパターン化されたスライドガラスと、プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）が蒸着薄膜を有するスライドガラスの平均信号対雑音比率値及び蛍光強さを示すもので、図４Ａは、イメージ処理過程前の平均信号対雑音比率値及び蛍光強さを示し、図４Ｂは、イメージ処理過程後の平均信号対雑音比率値及び蛍光強さを示し、図４Ｃは、プラズマパワーの増加による平均信号対雑音比率値を比較して示したグラフである。
【０１１８】
図４Ａ及び図４Ｃにおいて、（ａ）は、プラズマＳＢ蒸着パワー１０Ｗで蒸着したシクロヘキサン膜上にＰＰＥＤＡパターン化されたスライドガラスの平均信号対雑音比率値を示し、（ｂ）は、プラズマＳＢ蒸着パワー３０Ｗで蒸着したシクロヘキサン膜上にＰＰＥＤＡパターン化されたスライドガラスの平均信号対雑音比率値を示し、（ｃ）は、プラズマＳＢ蒸着パワー５０Ｗで蒸着したシクロヘキサン膜上にＰＰＥＤＡパターン化されたスライドガラスの平均信号対雑音比率値を示し、（ｄ）は、プラズマＳＢ蒸着パワー７０Ｗで蒸着したシクロヘキサン膜上にＰＰＥＤＡパターン化されたスライドガラスの平均信号対雑音比率値を示し、（ｅ）は、ガラス基板上にＰＰＥＤＡパターン化されたスライドガラスの平均信号対雑音比率値を示す。
【０１１９】
本発明者たちは、非特異性タンパク質吸着を減少させる重要な変数の一つがＳＢ蒸着パワーであることを発見した。
【０１２０】
図４Ａ〜図４Ｃに示すように、蒸着パワーによる各試料の平均信号対雑音比率値がそれぞれ３．３６、３．９６、４．２１及び４．９２であった。その反面、シクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）がなく、直ぐにガラス基板上にパターン化されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）スライドガラスは、平均信号対雑音比率値が２．８１であった。
【０１２１】
ＰＰＣＨｅｘなしに直ぐにガラス基板上にパターン化されたＰＰＥＤＡスライドガラスは、信号が大きくなるにつれて雑音も大きくなるが、プラズマＳＢパワーが７０Ｗでパターン化されたＰＰＥＤＡ／ＰＰＣＨｅｘ基板では、信号が小さくても雑音がほとんど発生しないことを発見した。
【０１２２】
〔ＦＴＩＲによる化学的構造及び組成分析〕
非特異性吸着の原因を知るために、ＦＴＩＲ測定を通して薄膜の化学的構造及び組成を調査した。
【０１２３】
ＦＴＩＲスペクトラムは、同一の厚さで補正した。
【０１２４】
図５Ａは、プラズマ重合されたシクロヘキサンのＦＴＩＲスペクトラムを示し、図５Ｂは、蒸着パワーに対するＯＨピークを示す。
【０１２５】
図５ＡのＦＴＩＲによると、ＳＢ信号が１０Ｗ及び３０Ｗで緩慢な信号が３４００cm−１及び１６５０cm-１に示されたが、これは、１０Ｗ及び３０Ｗで蒸着したプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜の表面に大気中の水分が吸着されたためである。
【０１２６】
この信号が３４００cm−１と１６５０cm−１で大きく示されたことは、表面にハイドロキシル基（−ＯＨ）があることを意味するが、これは、表面の酸化によって形成されたものである。
【０１２７】
プラズマＳＢパワーが１０Ｗ〜３０Ｗまでの低いパワーであるときは、シクロヘキサン前駆体が少なく分解されて単量体形態で蒸着された。
【０１２８】
また、このときの薄膜は稠密でなく、これは、薄膜を常温の大気中に露出させたとき、水分や水が薄膜の表面に吸着されることを示す。
【０１２９】
しかし、プラズマＳＢパワーが５０Ｗ〜７０Ｗにまで増加することで、シクロヘキサン前駆体が完全に分解され、ダイアモンド形態の炭素で蒸着される。
【０１３０】
ＦＴＩＲスペクトラムでは３４００cm−１と１６５０cm−１で信号が表れなく、ハイドロカーボン（−ＣＨｘ；ｘ＝２または３を意味する）信号のみが表れた。
【０１３１】
蒸着パワーによるプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜を比較することで、ＦＴＩＲと蛍光イメージを通して、薄膜の化学的構造が大きく変わったことが分かった。
【０１３２】
これによって、薄膜の化学的構造が蒸着パワーに影響を受けることが分かる。
【０１３３】
今までの報告によると、−ＯＨと−ＣＨＯなどの機能性グループがガラス表面に存在する場合、タンパク質の化学的吸着を誘導する。
【０１３４】
しかし、図５Ｂに示すように、−ＯＨグループや−ＣＨＯ機能性グループは、プラズマパワー７０Ｗで蒸着されたシクロヘキサン表面にほとんど表れなかった。
【０１３５】
相対的なハイドロキシル（−ＯＨ）グループピークの面積比も、プラズマパワーが増加するにつれて減少することを確認できる。
【０１３６】
上記のような表面の差は、疎水性の−ＣＨ３グループが親水性の−ＯＨグループに取り替えられる構成変化に大きく依存することが報告された。
【０１３７】
上記のような−ＯＨの存在は、薄膜の表面にアルデヒド、カルボニル、カルボキシル酸グループが形成されることを暗示し、薄膜の表面に非特異性吸着が発生することを意味する。
【０１３８】
プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜の表面は、非常に大きい疎水性を示し、プラズマパワー７０Ｗで蒸着されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜は、非常に稠密であるため、薄膜の表面に水分や酸素が吸着されなかった。
【０１３９】
〔原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で表面粗度を調査〕
本発明者たちは、スライドガラスの表面粗度を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で調査した。
【０１４０】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定は、接触形態で行い、検査領域の範囲を１マイクロメーターにして行った。
【０１４１】
図６は、プラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜の表面粗度を示した写真である。
【０１４２】
図６に示すように、蒸着パワーによる各試料の表面粗度に対する二乗平均平方根（ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ；ＲＭＳ）値は、それぞれ０．０８８５４nm、０．１４５７nm、０．２２８２nm、０．２６１１nmに示された。
【０１４３】
高いパワーで蒸着したプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜は、低いパワーで蒸着したシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜よりやや粗くなった。
【０１４４】
この理由は、プラズマ重合薄膜を蒸着する間、薄膜の表面がプラズマに露出されるためである。したがって、プラズマパワーが増加するにつれて、イオンと電荷を帯びた作用基と同一種類の種がプラズマによって生成され、これらによって薄膜表面が損傷されたはずである。
【０１４５】
上記のようなプラズマ誘導による損傷は、プラズマ露出パワーの増加（この場合は、蒸着パワー）によって大きくなるはずで、その結果、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）の表面が粗くなる。
【０１４６】
以前のいくつかの報告書では、一般的に、タンパク質は、より粗い表面で容易に吸着されると報告した。
【０１４７】
これは、滑らかな表面よりも粗い表面でタンパク質が容易に吸着されることを示す。二乗平均平方根の粗度はやや変化したが、本発明の結果を見ると、物理的なタンパク質吸着が生じないことが分かる。
【０１４８】
その理由は、物理的なタンパク質吸着がタンパク質吸着の主要原因であれば、表面粗度が最も大きい７０Ｗで蒸着されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜でタンパク質吸着が多く生じなければならないためである。
【０１４９】
結果的に、タンパク質吸着は、物理的吸着より化学的吸着によって引き起こされることが分かる。
【０１５０】
上記のように、本発明では、アミン機能性グループを有するプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）と、非特異性吸着のないプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）を誘導結合型プラズマ化学気相法を用いて蒸着した。
【０１５１】
各前駆体としては、エチレンダイアミンとシクロヘキサンを用いた。
【０１５２】
そして、非特異的吸着のないプラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）上にパターン化された、プラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）にタンパク質固定化を行った。
【０１５３】
この場合、ほとんどのタンパク質は、ＰＰＣＨｅｘ領域では非特異的に結合せず、親水性を有するプラズマ重合されたエチレンダイアミン（ＰＰＥＤＡ）領域のみに固定化されることを発見した。
【０１５４】
ＰＰＥＤＡ／ＰＰＣＨｅｘ薄膜とＰＰＣＨｅｘなしに単純にパターン化されたＰＰＥＤＡ薄膜を比較すると、信号対雑音比率値が改善された。
【０１５５】
プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜の化学的構造が変化し、電力が１０Ｗから７０Ｗに上昇するにつれて、表面粗度も０．０８８５４nmから０．２６１１nmにやや増加した。
【０１５６】
その結果、プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）薄膜におけるタンパク質吸着は、ほとんどが物理的吸着より化学的吸着によって引き起こされることが分かる。
【０１５７】
タンパク質チップにおいて、チップに基づく実験と関連してよく知られた問題点は、スライド表面に発生する非特異性吸着である。
【０１５８】
本発明者たちは、誘導結合型化学的気相蒸着法を用いて、上記のような問題点を解決することができた。
【０１５９】
今回の実験の結果は、誘導結合型化学気相蒸着法が、タンパク質チップにおいてマイクロ-整列として適用可能な実用的な優れた手段であることを示している。
【０１６０】
以上、本発明の一実施例を説明してきたが、本発明は、上記の実施例に限定されることなく、特許請求の範囲で請求するように、本発明の要旨から逸脱せず、発明の属する分野で通常の知識を有する者が変更実施可能な範囲が、本発明の範囲に属すると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】本発明によってタンパク質基板を製造するためのプラズマ化学気相蒸着装置を概略的に示した模式図である。
【図２】ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）カメラを用いて、プラズマ重合された薄膜の接触角を測定したイメージである。
【図３】プラズマ重合されたシクロヘキサン（ＰＰＣＨｅｘ）上の非特異性タンパク質固定化を蛍光測定したイメージである。
【図４Ａ】イメージ処理過程前の平均信号対雑音比率値及び蛍光強さを示した図である。
【図４Ｂ】イメージ処理過程後の平均信号対雑音比率値及び蛍光強さを示した図である。
【図４Ｃ】プラズマパワー増加による平均信号対雑音比率値を比較して示したグラフである。
【図５Ａ】プラズマ重合されたシクロヘキサンのフーリエ赤外線分光法（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＦＴＩＲ）スペクトラムに関するグラフである。
【図５Ｂ】蒸着パワーに対するハイドロキシル基（−ＯＨ）のピークに関するグラフである。
【図６】プラズマ重合されたシクロヘキサン薄膜の表面粗度に関する写真である。
【符号の説明】
【０１６２】
１    反応チャンバー
２    外部電極
３    基板
４    基板支持台
６    ＲＦ生成器
７    ターボ分子ポンプ
９    泡立て器
１０  シャワーリング
１１  前駆体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
0004527711.tif 000007
【図５Ａ】
0004527711.tif 000008
【図５Ｂ】
0004527711.tif 000009
【図６】
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