(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定相として、高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とする高速液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２】
上流側の高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムの上流側に、更に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる請求項１記載のシステム。
【請求項３】
多孔質グラファイトを充填したカラムが、使用前に酸化処理又は還元処理されていることを特徴とする請求項１又は２記載のシステム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のシステムを用いることを特徴とする酸化還元性物質の分離定量法。
【請求項５】
高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とする高速液体クロマトグラフィー用固定相。
【請求項６】
上流側の高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムの上流側に、更に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる請求項５記載の固定相。
【請求項７】
多孔質グラファイトを充填したカラムが、使用前に酸化処理又は還元処理されていることを特徴とする請求項１又は２記載の固定相。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は固定相中に酸化還元反応場を設けた高速液体クロマトグラフィーシステム及びこれを用いた酸化還元性物質の分離定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は優れた分離分析法であり、無機化合物及び有機化合物を問わず広く利用されている。しかし、多成分混合物中の微量成分の分離及び定量に関しては必らずしも容易でない場合があり、新しい分離選択性を有するシステムの構築が求められている。目的の化合物に対する特異的な化学反応を利用することは、高い選択性を得るのに有効な方法の一つであり、これまであらかじめ誘導体化を行う方法、固定相あるいは移動相に反応試薬を導入して保持を特異的に高める方法、反応の平衡を試薬濃度によって制御して高度な分離を目指す、いわゆる「二次的化学平衡（Secondary chemical equilibra:SCE）の導入」による方法が用いられてきている。このうちＳＣＥとして化学反応を利用する方法は、一つの反応で対象となる化合物の範囲が広いことから利用価値が高い。しかし、原理的に酸塩基反応のような反応速度の大きな反応以外は利用できないという欠点があり、酸化還元反応のような反応速度の小さい反応には応用できなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、反応速度の小さい酸化還元反応を利用した高速誘導体化ＨＰＬＣシステムを構築し、ＳＣＥと同等の分離選択性を実現することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は多孔質グラファイトの酸化還元触媒機能に着目して種々検討してきたところ、通常のＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの中間に多孔質グラファイトを充填したカラムを配設すれば、通常のＨＰＬＣ用充填剤による分離機能と、多孔質グラファイトの酸化還元触媒機能とが効率良く機能し、従来分離が困難であった酸化還元性物質が良好に分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、固定相として、ＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とするＨＰＬＣシステムを提供するものである。
また本発明は、当該ＨＰＬＣシステムを用いることを特徴とする酸化還元性物質の分離定量法を提供するものである。
更に本発明は、ＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とするＨＰＬＣ用固定相を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のＨＰＬＣシステムに用いる固定相は、通常のＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる。ここで、多孔質グラファイトとしては、大きな表面積と高い耐圧性を有するものが好ましく、表面積３０〜１００cm2／ｇ、細孔直径２０〜５００Åのものがより好ましい。当該多孔質グラファイトとしては、石油ピッチ、合成高分子などを高温で焼成して得られたものがいずれも使用できる。また、多孔質グラファイトの形状は、粒状、繊維状、ディスク状等のいずれでもよい。
【０００７】
また、当該多孔質グラファイト充填カラムの両側に設けられるカラムに充填されるＨＰＬＣ用充填剤は、被検対象により選択され、ゲル濾過用充填剤、疎水クロマトグラフィー用充填剤、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤、分配クロマトグラフィー用充填剤等を用いることができる。具体的には、シリカ系充填剤、アルミナ系充填剤、ポリマー系充填剤等を用いることができる。シリカ系充填剤としては、多孔性シリカゲル、アルキル基を結合したシリカゲル（オクチルシリル化シリカゲル、オクタデシルシリル化シリカゲル等）のほかフェニル基やアミノ基を結合したシリカゲル等が挙げられる。ポリマー系充填剤としては、ポリスチレンゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリヒドロキシメタアクリレートゲルやそれらにイオン交換基を修飾したイオン交換樹脂等が挙げられる。このほか、ヒドロキシアパタイトやチタニア、ジルコニアなどの無機系充填剤も用いることができる。
【０００８】
２つのＨＰＬＣ用充填剤を充填したカラムには、同一の充填剤を用いてもよいし、相互に異なる充填剤を用いてもよい。
【０００９】
また、前記２つのＨＰＬＣ用充填剤を充填したカラムの上流側には、更に前記の多孔質グラファイト充填カラムを配置してもよい。かくすることにより、目的物質の化学種（酸化状態）をそろえることができる。
【００１０】
上記のようなシステムを用いることにより、通常のＨＰＬＣカラムによる分離が、酸化還元反応に基づく化学種変換機能により特異的な選択性を有するようになり、酸化還元物質の分離が可能になる。この機能について、遷移金属の分離を例にして説明する。すなわち、銅、鉄、コバルト、ニッケル、ビスマス等の遷移金属混合物にＥＤＴＡを反応させて錯体を生成させ、これを従来の逆相イオン対モードＨＰＬＣに付すと、コバルトの２価および３価イオンの錯体のピークはそれぞれＦｅ3+とＮｉ2+のピークと重なってしまい、良好な分離は不可能である（図３参照）。これに対し、コバルトをすべて２価イオンにした後にＥＤＴＡ錯体とした金属混合物を、２つのＨＰＬＣカラムの間に酸化剤（過酸化水素）で処理した多孔質グラファイトカラムを配置したＨＰＬＣシステムに付すと、前段の分離カラムを２価錯体として通過したコバルトがグラファイトカラムで酸化されて、後段の分離カラムでは３価錯体として溶出する。そのため、前段ではＦｅ3+と後段ではＮｉ2+と完全に分離される（図４参照）。これらの遷移金属の分離は通常のＨＰＬＣカラムのみでは不可能である。また、多孔質グラファイトカラムのみを用いた場合には、酸化還元機能と溶質保持機能の両方を多孔質グラファイトカラムに依存することになるが、両者は独立ではないため、分離の制御が極めて複雑になる。したがって、本発明のように分離場と酸化還元反応場を分離して組み合わせることにより、高度でかつ設計が容易な分離分析システムが可能になる。
【００１１】
ここで、多孔質グラファイト充填カラムをあらかじめ還元処理しておけば、このカラム内で還元反応を行なわせることができ、一方あらかじめ酸化処理しておけばこのカラム内で酸化反応を行なわせることができる。そして、この酸化処理及び還元処理の強さを制御することによって、このカラム内での酸化反応及び還元反応を制御することができる。また、用いる還元剤及び酸化剤の種類を変えることにより、反応の強さを制御することができる。還元剤の例としては亜硫酸ナトリウム、塩化ヒドロキシルアンモニウム、アスコルビン酸などが、酸化剤の例としては過酸化水素などが挙げられる。
【００１２】
酸化処理および還元処理は多孔質グラファイトカラムに電位を印加することによっても行うことができる。すなわち多孔質グラファイト充填剤をカラムに詰め、これを電極とするか、または多孔質グラファイトディスクを電極として電位を印加する。この電位をポテンショスタットを用いて調節することにより、酸化反応および還元反応の進行を制御することができる。
【００１３】
本発明のＨＰＬＣシステムは、前記の固定相を用いる以外は通常のＨＰＬＣと同様に適宜選択することができる。すなわち、本発明のシステムは、逆相ＨＰＬＣ、イオン対ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣなどいずれにも適用可能である。従って溶離液も、水、各種有機溶媒から適宜選択できる。更に検出手段に関しても、紫外吸光検出、屈折率検出、蛍光検出等が使用できる。
【００１４】
本発明のＨＰＬＣシステムは、酸化還元反応を利用するものであるため、酸化還元性物質の分離定量に好適である。当該酸化還元物質には、各種の金属（希土類金属を含む遷移金属）をはじめとする無機化合物や多くの有機化合物が含まれるので、対象試料としては金属材料、鉱石、無機成分含有試薬や酸化還元酵素、カテコールアミン等の生体関連物質等が挙げられる。
【００１５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
２つのオクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）充填カラムの間に多孔質グラファイト充填カラムを設けた。すなわち、ＯＤＳ（Capcell Pak C18 UG120,3μm）を充填したカラム（４．６×１００nm）を２本用意した。また、多孔質グラファイト（ＢＬ−０１，３．５μm）を充填したカラム（４．６×１０mm）を用意した。ＯＤＳ充填カラムのみを用いて図１に示すＨＰＬＣシステムを構築した。また、ＯＤＳ充填カラムの間に多孔質グラファイト充填カラムを設けカラムシステムを構築した。このカラムシステムを用いて、図２に示すＨＰＬＣシステムを構築した。試料として、コバルト（０．１mM）、ビスマス（０．１mM）、鉄（０．１mM）、ニッケル（０．１mM）及び銅（０．１mM）をＥＤＴＡでキレート化した水溶液を用いた。カラムをあらかじめ０．１mMセチルトリメチルアンモニウムブロミドで処理し、溶離液として０．１Ｍ酢酸バッファ（pH５）を用い、流速０．６mL／minの条件で分析した。その結果、ＯＤＳカラムのみを用いた場合には、図３に示すように、コバルトがＣｏ3+とＣｏ2+とに分離し、Ｃｏ3+がＦｅ3+のピークと重なり、一方Ｃｏ2+がＮｉ2+のピークと重なってしまい、コバルトは他の金属と分離できなかった。
一方、本発明の固定相を用いた場合には、図４に示すようにコバルトを、他の金属と完全に分離することができた。
【００１７】
【発明の効果】
本発明のＨＰＬＣシステムを用いれば従来分離が困難であった酸化還元性物質が良好かつ簡便に分離定量できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＯＤＳ充填カラムのみを用いたＨＰＬＣシステムを示す概略図である。
【図２】本発明の固定相を用いたＨＰＬＣシステムの一例を示す概略図である。
【図３】図１のＨＰＬＣシステムを用いた遷移金属の分離結果を示す図である。
【図４】図２のＨＰＬＣシステムを用いた遷移金属の分離結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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