(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−Ｏ−β−Ｄ−フラクトピラノシル−Ｄ−フラクトース（以下、特許請求の範囲の記載においてＦｐＦという）。
【請求項２】
ＦｐＦを有効成分として含有する甘味剤。
【請求項３】
ジヘテロレブロサンＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）に以下の酵素学的性質を有するジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素を作用させることを特徴とするＦｐＦの製造方法：
基質特異性
ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解することに加え、ＤＦＡＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）のα−フラクトフラノシド結合を分解し、イヌロビオースを生成する。また、ＦｐＦを分子内縮合させてジヘテロレブロサンＩＩを生成し、イヌロビオースを分子内縮合させてＤＦＡＩを生成する。ＤＦＡＩＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒドリド）には作用しない。
至適ｐＨ        ７．５
安定ｐＨ範囲    ５０℃、１時間の処理で６．０〜８．０である。
至適温度        ５０℃
温度安定性
ｐＨ７．５、１時間の処理で１００％の活性を保持する温度は５０℃までである。
分子量
Ｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した値は約２００，０００であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した値は約５０，０００である。          
等電点          約５．０
【請求項４】
以下の酵素学的性質を有するジヘテロレブロンサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素：
基質特異性
ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解することに加え、ＤＦＡＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）のα−フラクトフラノシド結合を分解し、イヌロビオースを生成する。また、ＦｐＦを分子内縮合させてジヘテロレブロサンＩＩを生成し、イヌロビオースを分子内縮合させてＤＦＡＩを生成する。ＤＦＡＩＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒドリド）には作用しない。
至適ｐＨ        ７．５
安定ｐＨ範囲    ５０℃、１時間の処理で６．０〜８．０である。
至適温度        ５０℃
温度安定性
ｐＨ７．５、１時間の処理で１００％の活性を保持する温度は５０℃までである。
分子量
Ｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した値は約２００，０００であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した値は約５０，０００である。          
等電点          約５．０
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に食品分野において利用することができ、医薬分野への利用も考えられる、β−フラクトピラノシド結合を有する新しいタイプの果糖の二量体（二糖）、それを含有する甘味剤、該二糖の製法、およびその製造に使用する酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】
果糖を構成単位として含有するヘテロビオースとしては非還元性のショ糖（１−α−Ｄ−グルコピラノシル−２−β−Ｄ−フラクトフラノシド）等、還元性のマルツロース（４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フラクトース）、ラクツロース（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−フラクトース）等が知られている。果糖を構成単位として含有するホモビオースとしては還元性のイヌロビオース（１−Ｏ−β−Ｄ−フラクトフラノシル−Ｄ−フラクトース）等が知られている。果糖を構成単位として含有する二糖の味質については、ショ糖、イヌロビオースが甘味を有することが知られている。
また、果糖を構成単位として含有するホモビオースが新たな環を形成するように脱水縮合した形態のジフラクトースジアンヒドリド（以下、ＤＦＡという）類が知られている（科学と工業、７０（８），３２０〜３３１（１９９６）。ＤＦＡ類の味質については、イヌリンから酵素的に生成させることができるＤＦＡＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）およびＤＦＡＩＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒドリド）が甘味を有することが知られている（特開昭６３−２６９９６２）。
【０００３】
また、β−フラクトピラノシド結合はＤＦＡ中の、ジヘテロレブロサンＩ（α−Ｄ−フラクトピラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）、ジヘテロレブロサンＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）、ジヘテロレブロサンＩＩＩ（β−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）、ジヘテロレブロサンＩＶ（β−Ｄ−フラクトピラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ  Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１３６〜１１４０，１９８９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３６（１９８５），５３〜６５）等に認められるが、単量体と単量体とが１カ所でβ−フラクトピラノシド結合で結合した重合体は二量体についてもそれ以上の重合体についても報告されていない。
β−フラクトピラノシド結合結合を有する物質の性質についてはｎ−ペンチル−β−Ｄ−フラクトピラノシド（化学合成）のＩｇＥ抗体生成抑制能が報告されている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２５，ｐ１４９５〜１４９９（１９８２））。
【０００４】
また、現在知られているノンカロリーの糖質としては糖アルコールの一種であるエリスリトールだけである。この糖質はそのほとんどすべてが体内に吸収された後、代謝されずにそのまま尿中に排泄されるため、ノンカロリーとされている。しかし、エリスリトールは溶解するとき高い吸熱作用を示すので、食した際に口の中で冷涼感を感じる。このため、冷涼感が好ましくない製品には使用し難い場合があった。また、エリスリトールは四炭糖の単糖であるため、氷菓に使用する際、氷点降下が大きすぎる問題もあった。マルチトールなどの二糖類の糖アルコールは消化酵素で分解されないが、腸内細菌により有機酸に変換され、体内に吸収されるとして、２ｋｃａｌ／ｇ扱いとなっており、二糖類以上のノンカロリー糖質は現在知られていない。
【０００５】
また、α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド（ＤＦＡＩ）およびα−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒドリド（ＤＦＡＩＩＩ）については、そのα−フラクトフラノシド結合を加水分解してイヌロビオースを生成する酵素が知られている（澱粉科学  第３５巻  第２号  ｐ１１３〜ｐ１２０（１９８８）。しかしながら、ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は口腔細菌による酸の産生がなく、胃で加水分解されず、ノンカロリーであるかカロリーがゼロに近く、ショ糖に近い味質を示す新規二糖およびそれを含有する甘味剤、該二糖の製法、およびその製造に使用する酵素を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の化学式で表される１−Ｏ−β−Ｄ−フラクトピラノシル−Ｄ−フラクトース（以下、ＦｐＦという）に関する。
【０００８】
【化１】
0004417465.tif 000002
【０００９】
本発明はまた、ＦｐＦを有効成分として含有する甘味剤に関する。
本発明はさらに、ジヘテロレブロサンＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリド）にジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素を作用させることを特徴とするＦｐＦの製造方法、およびジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のＦｐＦの製造方法については後述する。
ＦｐＦの比旋光度は［α］20D（ｃ＝９．７）：−１３１である。
ＦｐＦの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。
ＦｐＦの甘味度を他の二糖類と比較して表１に示す。甘味度は５ｗ／ｖ％または１０ｗ／ｖ％のショ糖溶液を標準として、２０℃で１０人のパネラーで判定した。判定方法は澱粉糖技術研究会報、第１４号、ｐ４４（１９５６）に準じた。
【００１１】
【表１】
0004417465.tif 000003
【００１２】
また、ＦｐＦの味質は次のようにして評価した。すなわち、５ｗ／ｖ％ショ糖、１２．５ｗ／ｖ％ＦｐＦおよび１２．５ｗ／ｖ％マルトースをそれぞれ調製し、これらの２０℃における甘味度が一致していることを確認した上で、１０人のパネラーにより表２に示した項目についてショ糖と同程度であれば０、やや強ければ＋１、強ければ＋２、やや弱ければ−１、弱ければ−２で評価し、平均点を算出した。その結果、表２に示したようにショ糖に近い味質を示すことが判明した。
【００１３】
【表２】
0004417465.tif 000004
【００１４】
また、ＦｐＦの酸安定性は、ｐＨ２．０、１．５または１．０に設定した１００ｍＭＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液で１ｗ／ｖ％溶液を調製し、これを３７℃で１時間保持し、残存した各二糖類の残存率を測定することで評価した。対照としてイヌロビオース、ショ糖、マルトースについても同様に調べた。結果を図２に示す。図２から明らかなごとく、ＦｐＦの酸安定性はイヌロビオースより高く、ショ糖と同等で、マルトースより低かった。
【００１５】
ＦｐＦは口腔細菌により利用されなかった（実施例３）。
また、各種消化酵素によるＦｐＦの消化性について調べたところ、まったく分解されなかった（実施例４）。
さらに、ＦｐＦは大腸における腸内細菌にもほとんと資化されない。通常、難消化性糖質であるマルチトールなどは腸内細菌で発酵を受け有機酸を生じ、これが体内に吸収されてカロリーになる。しかし、ＦｐＦは消化酵素でも分解されず、腸内細菌にもほとんど資化されないので、通常の難消化性糖質とは異なり、ノンカロリーであるかカロリーがほとんどゼロに近い糖質であると理解される。
上記の資化性や消化性はβ−フラクトピラノシド結合のみで結合した、ＦｐＦ以外の果糖の重合体（すなわちオリゴ糖および多糖）も共通して有する性質であると考えられる。したがって、例えばＦｐＦ以外のβ−フラクトピラノシル−Ｄ−フラクトースもノンカロリー性糖質であると考えられる。
【００１６】
上述したＦｐＦの性質を利用して、本発明はまた、ＦｐＦを有効成分として含有する甘味剤に関する。
この甘味剤はＦｐＦのみからなっていても良く、補助成分または他の活性成分、例えば他の甘味成分と混合された形態にあっても良い。
【００１７】
補助成分としては、水、常用される賦形剤・結合剤等を用いることができる。賦形剤としては甘味成分としても用いられるショ糖、乳糖、果糖、ソルビトール、マルチトール等の他、可溶性デンプン、デキストリン、ガム質マンナン、ペクチン、アルギン酸等の多糖類、ゼラチン、低分子量ポリペプチド等のタンパク質、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等の塩、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸等の酸等から適宜選択して用いることができる。結合剤としてはグアーガム、アラビアガム、デキストリン等を必要に応じ適宜選択して用いることができる。その他、フレーバー、エッセンス、ビタミン、調味料等を必要に応じ適宜選択して用いることができる。
他の甘味成分としてはショ糖、ブドウ糖、果糖、ソルビトール、マルチトール、アスパルテーム、ステビオサイド、サッカリン等を用いることができる。また、他の呈味成分として酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などを与える成分が挙げられる。
【００１８】
本発明の甘味剤は、種々の形状で、例えば粉末、顆粒、シロップ等として用いることができる。
【００１９】
本甘味剤は、人および他の動物によって摂取あるいは投与される飲食品または薬品の甘味付与および／または糖含量上昇のために広く使用することができる。該飲食品類の例としては、各種調味料（例えば、醤油、味噌、マヨネーズ、ドレッシング、天つゆ、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの素、スープの素、ダシの素等）、各種和菓子（例えば、煎餅、あられ、餅類、饅頭、ういろう、羊羮、ゼリー、カステラ、飴玉等）、各種洋菓子（例えば、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、シュークリーム、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム等）、パン類、氷菓子（例えば、アイスクリーム、シャーベット等）、シロップ類（例えば、果実のシロップ漬等）、ペースト類（例えば、フルーツペースト、ピーナツペースト等）、ジャム、マーマレード、漬物類（例えば、福神漬、千枚漬、らっきょう漬等）、畜肉練り製品（例えば、ハム、ソーセージ等）、魚肉練り製品（例えば、かまぼこ、竹輪等）、各種珍味類、佃煮類、アルコール飲料、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、スタミナドリンク、乳酸飲料、乳酸菌飲料、インスタント飲食品（例えば、インスタントジュース、インスタントコーヒー等）等が挙げられる。また、該薬品の例としては、散剤、錠剤、水剤、シロップ剤などのほか、歯みがき、含嗽剤等が挙げられる。
【００２０】
本甘味剤の使用量については、対象の飲食品類または薬品類にとって甘味付与のための必要な程度まで任意に使用することができる。具体的な使用量は飲食品類または薬品類によって異なるが、通常、本甘味剤が対象品中においてＦｐＦとして約０．５〜７０ｗ／ｗ％、さらには約５〜３０ｗ／ｗ％となるような範囲から選択するのが好ましい。
【００２１】
甘味付与および／または糖含量上昇のための対象品への本甘味剤の使用方法は通常の甘味剤と同様に行えば良い。例えば、飲食品類または薬品類の製造時においてあるいはこれらの摂取時において、混和、混捏、溶解、浸漬、浸透、散布、噴霧、注入などの適宜の方法を採用して対象品類に含有せしめることができる。
【００２２】
次にＦｐＦの製法について説明する。
ＦｐＦはジヘテロレブロサンＩＩにジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素（以下、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素という）を作用させることにより製造することができる。この酵素は、まず
（１）作用として、ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する作用を有する。
【００２３】
上記酵素は詳しくはさらに以下の酵素学的性質を有する。
（２）基質特異性
ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解することに加え、ＤＦＡＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリドのα−フラクトフラノシド結合を加水分解し、イヌロビオースを生成する。また、ＦｐＦを分子内縮合させてジヘテロレブロサンＩＩを生成し、イヌロビオースを分子内縮合させてＤＦＡＩを生成する。ＤＦＡＩＩＩ（α−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトフラノース１，２´：２，３´ジアンヒドリドには作用しない。
（３）至適ｐＨ
ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．５）を用いて反応を行い、相対活性を調べたところ、至適ｐＨは７．５であった（図３）。
（４）安定ｐＨ範囲
ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ４．５〜８．５）を用いて５０℃で１時間インキュベートし、残存活性を測定したところ、本酵素はｐＨ６．０〜８．０で安定であった（図３）。
【００２４】
（５）至適温度
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で種々の温度（３０〜６５℃）で反応を行い、相対活性を調べたところ、至適温度は５０℃であった（図４）。
（６）温度安定性
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で種々の温度（３０〜６５℃）で１時間インキュベートし、残存活性を測定したところ、１００％の活性を保持する温度は５０℃までであった（図４）。
【００２５】
（７）分子量
Ｎａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動により各種標準タンパク質との相対移動度から求めた分子量は約２００，０００であり、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により各種標準タンパク質との相対移動度から求めた分子量は約５０，０００であった。
上記電気泳動の結果から、本酵素は４量体を形成しているものと考えられる。
（８）等電点
本酵素をＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ電気泳動システム（ファルマシア  バイオテク（株））で、等電点測定用のゲルとしてＡｍｐｈｏｌｉｎｅ  ＰＡＧｐｌａｔｅ（ファルマシア  バイオテク（株））を用いて等電点電気泳動を行い、染色すると共に、ゲルを５ｍｍ間隔で切り出し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で抽出し、活性を測定した。活性が検出された位置と染色された染色バンドの位置は一致し、等電点は約５．０と測定された。
【００２６】
なお、上記酵素学的性質の決定に当り、本発明のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の活性は以下のようにして測定した。
本酵素はジヘテロレブロサンＩＩ分解活性を有するが、酵素反応の平衡がジヘテロレブロサンＩＩに大きく傾いているため、感度の良い測定法としてＤＦＡＩを基質に以下のように活性測定を行った。
１ｗ／ｖ％ＤＦＡＩ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中）０．５ｍｌと酵素液０．５ｍｌとを混合し、４０℃で３０分反応させた後、沸騰水浴中で３分間処理して反応を停止した。この溶液をＨＰＬＣで分析して、ＤＦＡＩの分解量を測定した。酵素１単位は１分間に１μｍｏｌのＤＦＡＩを加水分解する酵素量とした。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＱ（４．６×２５０ｍｍ）（（株）ワイエムシイ製）
移動相：蒸留水
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００２７】
本発明のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素は、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能を有するバチルス属細菌を栄養培地に培養し、培養物から生成したジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素を採取することにより製造することができる。
【００２８】
製造に使用される微生物としてはバチルス属に属し、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能を有する微生物であればいずれの微生物でもよい。具体的には本発明者らが土壌より分離した５６−７株が挙げられる。この菌株の菌学的性質は表３に示す通りである。一方、菌体の脂肪酸組成を調べたところＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓに最も近いが、一致とは言えなかった。また１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列を調べたところＢａｃｉｌｌｕｓ ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｍｐｌｅｘと９１．４％の相同性を示したが、種の同定では９７％以上で一致と言えるので、これも相同性が低い。したがって、５６−７株はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（バチルス・エスピー）５６−７と命名した。５６−７株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０９０として寄託されている。
本発明で使用する微生物は野生株に限らず、野生株例えば上記野生株を紫外線、エックス線、放射線、薬品［ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチル  メタンスルホネート）等］等を用いる既知の人工的変異手段で変異した変異株も、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素遺伝子を導入した微生物も、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能を有する限り使用できる。
【００２９】
【表３】
0004417465.tif 000005
【００３０】
ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素産生能を有する微生物を培養するための栄養培地としては、炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源としてはマルトース、グルコース、フラクトース、乳糖、デンプン、デキストリン、グリセリン等の炭水化物等が用いられる。
なお、本酵素は誘導酵素であるため、炭素源の一部として培地に０．０１〜１ｗ／ｖ％となるようにジヘテロレブロサンＩＩまたはＤＦＡＩを加えることが好ましい。
窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機窒素化合物が用いられる。窒素源としてはペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン等の窒素含有天然物も使用できる。
無機物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等が用いられる。その他にビオチン、チアミン等の微量栄養素を必要に応じ使用する。
【００３１】
培養法としては液体培養法（振盪培養法もしくは通気攪拌培養法）が良く、工業的には通気攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は２０〜４０℃の範囲で行うことができる。ｐＨは６．５〜７．５が好適である。培養時間は培養条件によって変ってくるが、通常１５〜４８時間程度であり、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の生成が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培養を停止する。
【００３２】
このようにして得られた培養物から本発明のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素を採取するには、まず遠心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と菌体画分に分ける。ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素は前述の両画分に検出されるが、主に菌体画分から得られるので、菌体を超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレスなどの物理的処理やリゾチームなどの酵素処理により破壊し、菌体抽出液を得て、これをさらに限外ろ過、塩析、透析、溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等の周知の単離・精製方法の単独或いは組合せに付すことにより、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の濃縮或いは精製標品を得ることができる。本発明のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の単離・精製の具体例を実施例１に示す。
【００３３】
ジヘテロレブロサンＩＩに、上記ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素を作用させることによりＦｐＦを製造することができる。さらに詳しくは、ジヘテロレブロサンＩＩに、上記ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素を、水性媒体中で、３０〜５５℃、ｐＨ６．０〜８．５で作用させることによりＦｐＦを製造することができる。
【００３４】
このＦｐＦの製造に利用する該ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素としては、精製酵素であっても、ＦｐＦの製造に悪影響を及ぼさない他の酵素を含有していても良い粗酵素であっても良い。粗酵素としては上記培養液画分等のジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素含有画分から塩析または溶媒沈殿により沈殿させた粗酵素、またはこれをさらに前記のような精製手段で精製した精製途中段階の粗酵素が挙げられる。さらにこれらの酵素を常法により担体に固定化した固定化酵素を用いることも可能である。
【００３５】
出発原料として用いるジヘテロレブロサンＩＩは化学名はα−Ｄ−フラクトフラノースβ−Ｄ−フラクトピラノース１，２´：２，１´ジアンヒドリドであり、下記の式で示される。
【００３６】
【化２】
0004417465.tif 000006
【００３７】
ジヘテロレブロサンＩＩは公知物質で、種々の、果糖やイヌリンの酸処理物から単離されている（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３６（１９８５），５３−６５）。通常、７０〜９０重量％の高濃度果糖水溶液をｐＨ２．５〜３．５、温度１１０〜１５０℃、好ましくは１３０〜１４０℃、大気圧下で１〜１８０分、好ましくは２０〜６０分保持して反応させると、５０％以上の生成率でジフラクトースジアンヒドリド（ＤＦＡ）類が得られ、そのうち約２０重量％がジヘテロレブロサンＩＩである。
反応混合物をｐＨ２に調整し、沸騰水浴中で３０〜６０分保持してＤＦＡ以外の縮合物を果糖に分解し、ついでＮａ型陽イオン交換樹脂カラムでＤＦＡ類と果糖に分離し、さらに逆相クロマトグラフィー用カラムでジヘテロレブロサンＩＩを単離する。
ジヘテロレブロサンＩＩの具体的製造例を参考例１に示す。
【００３８】
ＦｐＦ製造における水性媒体としては水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸カリウム・クエン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液当を用いることができる。
酵素の使用量については、特に制限ないが、ジヘテロレブロサンＩＩ１ｇに対し、０．３〜３０単位、好ましくは０．５〜１０単位使用するのが適当である。
上記条件下で十分なＦｐＦの生成が見られた時点で反応を終了するが、反応は通常１０〜３０時間で終了する。
【００３９】
反応終了後、反応液の加熱による酵素の失活、ｐＨの低下（塩酸等の酸の添加）による酵素の失活等の適当な手段で反応を停止させ、活性炭処理、イオン交換樹脂処理等の単離・精製手段を適宜組み合わせて、ＦｐＦを得ることができる。
ジヘテロレブロサンＩＩの加水分解によるＦｐＦの製造の具体例を実施例２に示す。
【００４０】
【実施例】
次に実施例および参考例により本発明を具体的に説明する。
実施例１  ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の製造
０．３ｗ／ｖ％ＤＦＡＩ、０．１ｗ／ｖ％ポリペプトン、０．２ｗ／ｖ％酵母エキス、０．２ｗ／ｖ％硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、０．０５ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、０．０５ｗ／ｖ％リン酸１カリウム、０．０２ｗ／ｖ％硫酸マグネシウム、ｐＨ７．０の培地を１２１℃、２０分オートクレーブ処理後、バチルス・スピーシーズ５６−７（ＦＥＲＭ−Ｐ１７０９０）を植菌し、３０℃、２０時間振盪培養した。
培養後、超音波処理で菌体を破砕し、菌体抽出液を得た。これを硫安分画５０〜７０ｗ／ｖ％飽和、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）による陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ファルマシア・バイオテク（株））によるゲル濾過、ｍｏｎｏＱ５／５（ファルマシア・バイオテク（株））による陰イオン交換クロマトグラフィーに付して、電気泳動的に単一に精製した。
得られた精製ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の酵素学的性質は既述の通りである。
【００４１】
実施例２  ジヘテロレブロサンＩＩの加水分解によるＦｐＦの製造
参考例１のようにして調製したジヘテロレブロサンＩＩ７０ｇを５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４００ｍｌに溶解し、ジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素２８単位を添加し、４５℃で３０時間反応させた。反応液をイオン精製し、逆相クロマトグラフィー用カラム（（株）ワイエムシイ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ、１０×１００ｃｍ×２本）により分画分取し、ＦｐＦ画分を減圧濃縮したところ純度９７ｗ／ｗ％のＦｐＦ７５ｗ／ｗ％溶液１．９ｇが得られた。これをさらに８０ｗ／ｗ％まで濃縮し、室温で静置することで結晶化させ、９９ｗ／ｗ％以上の結晶ＦｐＦ０．７ｇを得た。
【００４２】
実施例３  口腔細菌による酸産生性試験法
水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した１０ｗ／ｖ％ＦｐＦ溶液０．３ｍｌにｐＨ７．０に調整した培地２．７ｍｌを加えて調製した試験液に、１×１０個／ｍｌの菌体懸濁液０．１ｍｌを加え、３７℃で７２時間静置培養し、ｐＨを測定した。対照としてショ糖とマルチトールを用いた。う蝕菌は代表としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓＭＴ８１４８およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ６７１５を用いた。その結果、どちらの菌株においてもショ糖はｐＨ４．２に低下したが、ＦｐＦおよびマルチトールはｐＨ７．５であり、ＦｐＦの口腔細菌による利用は認められなかった。
【００４３】
実施例４  ＦｐＦの各種消化酵素による分解性
１．α−アミラーゼ
１ｗ／ｖ％ＦｐＦ（１ｍＭ  ＣａＣｌを含有する５０ｍＭマレイン酸緩衝液；唾液アミラーゼ試験ではｐＨ６．０、膵液アミラーゼ試験ではｐＨ６．９）ｍｌにヒト唾液アミラーゼ（シグマ社製）、ブタ膵液アミラーゼ（シグマ社製）をそれぞれ１単位*添加し、３７℃で２時間反応させた後、残存ＦｐＦをＨＰＬＣで分析した（ＨＰＬＣ条件はジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の活性の測定で既述したＨＰＬＣ条件と同じ）。どちらの酵素を使用した場合にもＦｐＦは１００％残存していた。
＊１単位は１ｗ／ｖ％可溶性デンプンを基質として３７℃で反応させたとき、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元力を生成する酵素量を意味する。
【００４４】
２．小腸粘膜局在酵素
ラット小腸アセトン粉末（シグマ社製）を生理食塩水に懸濁（１００ｍｇ／ｍｌ）し、ホモズナイズ後、遠心分離した上清を酵素液として使用した。１ｗ／ｖ％ＦｐＦ（２５ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に酵素液を１単位*添加し、３７℃で４時間反応させた。ＦｐＦは１００％残存していた。
＊１単位は１ｗ／ｖ％マルトースを基質として３７℃で反応させたとき、１分間に１μｍｏｌのマルトースを分解する酵素量を意味する。
【００４５】
実施例５  甘味剤製剤例１
実施例２の方法で調製したＦｐＦシロップ（水分２５ｗ／ｗ％）５０ｇとマルチトールシロップ（水分２５ｗ／ｗ％）５０ｇとを混合して液状甘味剤を調製する。本甘味剤は甘味度約６０で味質はショ糖に近いものである。
実施例６  甘味剤製剤例２
実施例２の方法で調製した結晶ＦｐＦ１０ｇとキシリトール１０ｇとを粉砕混合して粉末甘味剤を調製する。本甘味剤は甘味度約７５で味質はショ糖に近いものである。
【００４６】
実施例７  飲食品への添加例１
実施例５に示した甘味剤５０ｇ、α−グルコシルステビア甘味剤０．１ｇ、クエン酸０．１ｇ、リンゴ酸０．２５ｇ、フマル酸ナトリウム０．０５ｇおよびライムフレーバー０．５ｍｌを水５００ｍｌに添加し、ミキサーで十分攪拌した後、ミクロフィルターで濾過し、６５℃で３０分殺菌後、ガス充填、瓶詰めを行う。本品はショ糖を使用したと同様な味質のサイダーでありながら、カロリーが低く押さえられたものである。
実施例８  飲食品への添加例２
水２５２．１ｇ、リンゴ果汁１７５ｇ、実施例５に示した甘味剤７０ｇ、アスパルテーム０．２ｇ、アルギン酸ナトリウム１ｇ、カラギーナン０．５ｇ、ペクチン０．７ｇおよびゼラチン０．５ｇを混合し、６５℃で３０分殺菌後、冷却し、−２０℃でフリージングして製品とする。本品はショ糖を使用したと同様に風味が良いシャーベットでありながら、カロリーが低く押さえられたものである。
【００４７】
実施例９  薬品への添加例
リン酸カルシウム２水和物５０ｇ、グリセリン１３ｇ、実施例６で調製した甘味剤１０ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム２．５ｇ、スペアミントオイル１．５ｇ、トラガカントガム１．０ｇおよび水２２ｇを混合して製品とする。本品はミントフレーバーとやさしい甘味がマッチした歯磨き剤である。
【００４８】
参考例１  ジヘテロレブロサンＩＩの製造例
果糖１５０ｇを水に溶解し、１０ｗ／ｖ％クエン酸水溶液０．６ｍｌを添加した。これをミキサーで攪拌しながら、電熱器で加熱し、水分を蒸発させながら１３０℃〜１４０℃で２０分反応させた。反応物を糖濃度５０ｗ／ｗ％程度になるように水で希釈し、塩酸でｐＨ２に調整した後、沸騰水中で３０分処理してジフラクトースジアンヒドリド以外の縮合物を分解した。これをＮａ型強酸性陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製ＵＢＫ−５３０、樹脂量１１．８Ｌ）により分離し、ジヘテロレブロサンＩＩ高含有（４０ｗ／ｗ％）画分を固形分として３５ｇ得た。ついで、この溶液を５０ｗ／ｗ％濃度に濃縮し、５ｇずつ逆相クロマトグラフィー用カラム（（株）ワイエムシイ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ、１０×１００ｃｍ×２本）に負荷し、移動相としての脱塩水を２５０ｍｌ／分の流速で通液して分画分取を行い、得られた水溶液を減圧濃縮して９８％純度のジヘテロレブロサンＩＩの７５ｗ／ｗ％水溶液１３ｇを得た。さらに、この溶液を８０ｗ／ｗ％程度に濃縮後、４℃静置することで結晶化させ、９９％以上の純度のジヘテロレブロサンＩＩの結晶４ｇを得ることができた。
【００４９】
【発明の効果】
本発明のＦｐＦは、口腔細菌による酸の産生がなく、胃で加水分解されず、ノンカロリーであるかカロリーがゼロに近く、ショ糖に近い甘味を有する果糖のホモビオースであり、虫歯予防、カロリー制限等の見地から好都合である。また本発明によって、ジヘテロレブロサンＩＩのα−フラクトフラノシド結合を加水分解する酵素およびそれを用いるＦｐＦの工業的製法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦｐＦの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】ＦｐＦの酸安定性を、イヌロビオース、ショ糖およびマルトースと比較して示す。
【図３】本発明で得られたジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲を示す。
【図４】本発明で得られたジヘテロレブロサンＩＩ分解酵素の至適温度および温度安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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