(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸の１文字表記によりＳＬＩＧＲＬ、又は２−furoyl−ＬＩＧＫＶ−ＯＨ（ＡＳＫＨ９５）で表されるペプチドの１種以上の有効成分、及び薬学的に許容される担体からなる糸球体に障害を起こしている糸球体症による腎疾患の予防及び治療用医薬組成物。
【請求項２】
腎疾患が腎炎である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
腎炎が、急速進行性糸球体腎炎症候群または半月体（管外性）形成性糸球体腎炎である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
被検物質のＰＡＲ−２活性化作用をスクリーニングすることからなる、糸球体に障害を起こしている糸球体症による腎疾患の予防及び治療用の有効成分をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＲ−２を活性化することができるＰＡＲ−２活性化剤の１種又は２種以上の有効成分、及び薬学的に許容される担体からなる腎疾患の予防及び治療用医薬組成物に関する。本発明は、さらにＰＡＲ−２活性化剤を有効成分として含有してなる腎疾患の予防及び治療用医薬組成物を腎疾患の患者に投与してなる腎疾患の予防及び治療方法に関する。さらに本発明は、被検物質のＰＡＲ−２活性化作用をスクリーニングすることからなる、腎疾患の予防及び治療用の有効成分をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓（腎）は脊椎動物の泌尿器系器官で、体腔背側に左右対をなしている。腎門と呼ばれる中央内側の凹部より腎動脈が入り腎静脈と尿管が出ている。腎実質内部は皮質と髄質で構成されている。髄質は十数個の錐体よりなり、その先端は乳頭を形成する。皮質には、糸球体が存在する。糸球体は直径約２００μｍの球状の毛細血管塊で血液のろ過を行う。腎の機能単位はネフロンと呼ばれ、１個の腎に約１００万個存在する。ネフロンは、糸球体とこれを覆うボーマン嚢と、これに連続する近位尿細管、ヘンレ係蹄、遠位尿細管よりなる。ネフロンは集合管に合流し、集合管はベルリーニ管を経て乳頭部管において腎盂に開口する。糸球体で濾過された尿は、尿細管を通過する際に再吸収と分泌を受けて、最終尿が形成される。腎はこの尿の生成を通して、１）水分の排泄、２）新陳代謝終末産物、特に含窒素成分の排泄、３）電解質の排泄、４）体異種物質の排泄、５）血液浸透圧・体液量および酸・塩基平衡の調節など、生体の内部環境の恒常性を維持している。腎はさらに、レニンやプロスタグランジンの産生と分泌を介して血圧の調節に、また、エリスロポエチンの産生を介して骨髄における赤血球の産生に関与する器官である。
【０００３】
一般に、腎疾患は糸球体に障害を起こしている糸球体症と、尿細管に障害を起こしている尿細管症の二つに大きく分けられる。現在、腎疾患治療には有効な薬剤はないものの、ステロイド製剤、免疫抑制剤、抗血小板・抗凝固剤、プロスタグランジン製剤、降圧・利尿製剤等が臨床的に用いられている。それらのうち、特にステロイド製剤が汎用されているが、一方でステロイド使用による白内障や骨粗鬆症などの重篤な副作用が知られている。薬剤適用外の腎炎では、食事制限（低蛋白食）等により、慢性腎不全への移行の遅延を目的とした治療が施されている。いずれにしても、腎炎が慢性化し、進行性になると、治療は困難となり、最終的には腎不全に至り、血液透析を余儀なくさせられる。血液透析は、患者に多大な経済的かつ肉体的な負担となり、更に透析期間が長くなるにつれ、他疾患（脳、心疾患等）の合併症の発現等の問題もでてくる。また社会的にも、莫大な透析医療費がかかるため、透析移行を阻止または遅延させる、有用な新規薬剤の開発が切望されている。
【０００４】
ＰＡＲ(Protease-activated receptor)−２は、７回膜貫通型のＧ蛋白共役型受容体ファミリーの１種であるプロテアーゼ受容体である。
【０００５】
ＰＡＲは、現在までＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４の４種がクローニングされており、トロンビン、トリプシンなどのセリンプロテアーゼの各種細胞に対する作用を媒介する、受容体ファミリーである。ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３、及びＰＡＲ−４は、いずれもトロンビンによる血小板凝集に関連する受容体として、その機能が明らかにされているが、ＰＡＲ−２は、構造的あるいは活性メカニズム的には他のＰＡＲと多くの共通点があるものの、トロンビンでは活性化されず、トリプシンやトリプターゼで活性化されることなど、機能的には他のＰＡＲと異なる。
【０００６】
これらのＰＡＲは、ＰＡＲ分子のＮ末端側のアミノ酸配列の特定部位が、トロンビンやプロテアーゼの作用により切断され、新たに露出された切断末端が受容体自体の結合部位に結合して受容体の活性化が起こる。切断部位の受容体を活性化させるアミノ酸配列の概要を、アミノ酸の１文字表記で示す。
【０００７】
ＰＡＲ−１  ＳＦＬＬＲＮ−ＮＨ２  （ヒト）
ＰＡＲ−２  ＳＬＩＧＫＶ−ＮＨ２  （ヒト）
ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２  （マウス）
ＰＡＲ−３  なし
ＰＡＲ−４  ＧＹＰＧＱＶ        （ヒト）
ＧＹＰＧＫＦ        （マウス）
【０００８】
ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、及びＰＡＲ−４は、切断部位のアミノ酸配列を有する外来性のペプチドによっても非酵素的に活性化することができるが、ＰＡＲ−３はこのような外来性のペプチドでは活性化することができない。最近の研究では、マウスＰＡＲ−３はそれ自体では活性化されず、ＰＡＲ−４との共存下においてのみ機能することができる、ＰＡＲ−４のコファクターであることが証明された（Nature, 404, 609-613, 2000）。
【０００９】
ＰＡＲ−２は、ニステッド(Nystedt)らにより１９９４年にクローニングされ(Proc Natl Acad Sci USA, 91, 9208-9212, 1994)、ＰＡＲ−２を活性化する物質として、上記ＰＡＲ−２リガンドと同様の配列を持つ合成ペプチド、その誘導体のtrans-cinnamoyl-LIGRLO-NH2 (Br. J. Pharmacol., 123, 1434-1440, 1998)、トリプシン、トリプターゼ、ティッシュファクター／ＶＩＩａ因子、Ｘａ因子、精子プロテアーゼの一種アクロシン、ラットの脳より同定されたトリプシン様セリンプロテアーゼにより活性化されることが知られている(Pharmacological Rev., 53, 245-282, 2001)。
【００１０】
ＰＡＲ−２活性化の生理的意義や病態への関与は、各種細胞、組織、動物モデルで検討されており、そこでは、白血球のローリングと接着、好中球の浸潤、そして炎症性サイトカインの分泌や血漿蛋白の漏出を引き起こすことや、動脈硬化、皮膚炎、急性炎症の発症・増悪作用がin vitroおよびin vivoの実験系で報告されている（Circulation  99., 2590-2597, 1999;  Thromb Haemost., 81, 808-814 , 1999;  J. Neurochem., 69, 1890-1896, 1997;  Br. J. Pharmacol., 125, 419-422, 1998;  Br. J. Pharmacol., 127, 1083-1090, 1999;  Eur. J. Pharmacol., 328, 89-97, 1997;  Nat. Med. 6, 151-158, 2000;  J. Immunol., 163, 5064-5069, 1999;  J. Immunol., 159, 6216-6225, 1997;  J. Immunol., 161, 1939-1946, 1998;  Immunology 94, 356-362, 1998;  J. Biol. Chem., 276, 31657-31666, 2001,  J. Immunol., 165, 6504-6510, 2000;  Jpn. J. Pharmacol., 88,77-84, 2002）。これらの数多くの報告は全て、ＰＡＲ−２の活性化が炎症を惹起し、悪化させることを示している。このように、ＰＡＲ−２の活性化がある種の炎症を抑制する方向に働くことは全く予想されていなかった。また、ＰＡＲ−２の活性化が、腎疾患の予防及び治療に有効であることも全く知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、マウスの実験腎炎に及ぼすＰＡＲ−２遺伝子欠損の効果を検討してきたところ、野生型マウスに比べて、ＰＡＲ−２遺伝子欠損（ＰＡＲ−２−／−）マウスで腎炎の進展が顕著に憎悪されることを見出した。さらに野生型マウスを用いての同モデルでは、臨床で腎炎治療に汎用されているステロイド剤よりも、ＰＡＲ−２活性化剤にて腎炎が強力に抑制されることを見出した。これらの結果から、従来、起炎作用が知られているＰＡＲ−２活性化が、腎臓に原発性の障害が発生する一次性腎炎（メサンギウム増殖性腎炎等）のほか、他疾患がもとで腎臓に障害が発生する二次性腎炎（糖尿病性腎症等）の予防及び治療に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。また、腎機能の維持や回復にＰＡＲ−２の活性化が有効であることから、腎不全からの透析移行遅延効果も期待できることが見出された。
【００１２】
従って、本発明は、ＰＡＲ−２の活性化による腎疾患の予防及び治療用医薬組成物、それを用いた腎疾患の予防及び治療方法を提供するものである。さらに、本発明はＰＡＲ−２の活性化を指標とした腎疾患の予防及び治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１３】
すなわち、本発明は、ＰＡＲ−２を活性化することができるＰＡＲ−２活性化剤の１種又は２種以上の有効成分、及び薬学的に許容される担体からなる腎疾患の予防及び治療用医薬組成物を提供する。また、本発明は、ＰＡＲ−２を活性化することができるＰＡＲ−２活性化剤を有効成分として含有してなる腎疾患予防及び治療用医薬組成物を腎疾患の患者に投与することからなる腎疾患の予防及び治療方法を提供するものである。また、本発明は、腎疾患の予防及び治療用医薬組成物の製造のためのＰＡＲ−２を活性化することができるＰＡＲ−２活性化剤の使用を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、被検物質のＰＡＲ−２の活性化作用をスクリーニングすることからなる、腎疾患の予防及び治療用の有効成分をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、ＰＡＲ−２を活性化することができるＰＡＲ−２活性化剤の１種又は２種以上の有効成分からなる腎疾患の予防及び治療薬を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、自家繁殖した１３週齢のＣ５７ＢＬ／６と１２９／Ｏｌａの交雑系雄性ＰＡＲ−２遺伝子欠損マウス（ホモ欠損マウス：ＰＡＲ−２−／−マウス)を用いて、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ（GBM：Glomerular Basement Membrane））抗体により誘発される腎炎とＰＡＲ−２との関係を検討してきた。
【００１７】
腎炎の指標である尿中アルブミン量の経日変化を図１に示す。図１の縦軸は尿中アルブミン量（μｇ／１８時間／１００ｇ体重）を示し、横軸は約１６倍の抗体価を有するマウス糸球体基底膜（ＧＢＭ）に対するウサギ抗血清（抗ＧＢＭ抗血清、マウス1匹あたりに０．４ｍｌ）を、尾静脈内に単回投与してからの期間（週）を示す。図１中の白抜きは野生型マウスの場合を示し、黒抜きはＰＡＲ−２−／−マウスの場合を示す。図１中の各値は平均値±標準誤差を示し、＊は野生型マウスとの比較においてｐ＜０．０５の統計学的有意差があることを示し、＊＊は野生型マウスとの比較においてｐ＜０．０１の統計学的有意差があることを示す。
【００１８】
この結果、抗ＧＢＭ抗血清を投与していない無処置の野生型マウス、及びＰＡＲ−２−／−マウスの尿中アルブミン量には、統計学的な有意差はなかったが、抗ＧＢＭ抗血清を投与したＰＡＲ−２−／−マウスにおける尿中アルブミン量は、野生型マウスのそれに比べて、抗ＧＢＭ抗血清投与後１週から有意に増加し、２および３週後、そして5週後でも有意に増加していたことがわかった。即ち、ＰＡＲ−２遺伝子の欠損によるＰＡＲ−２の機能の欠損により、腎臓を機能的に著しく悪化させ、かつ腎炎の程度を経時的に進展させることが判明した。
【００１９】
さらに、実験終了後のマウスから摘出した腎臓の病理組織を検討した。病変部をＰＡＳ（periodic acid  Schiff）で染色した病理組織像を図２に写真により示す。図２の（ａ）は野生型マウスについての写真であり、図２の（ｂ）はＰＡＲ−２−／−マウスについての写真である。野生型マウスと比較してＰＡＲ−２−／−マウスでは、ＰＡＳ陽性物質の重度の沈着、及びボーマン嚢の重度の破綻が観察された。なお、ＰＡＳ陽性物質の沈着、及びボーマン嚢の破綻は、腎炎の病理学的指標として位置付けられている。
【００２０】
ＰＡＳ陽性物質の沈着の程度を数値化した結果を図３（ａ）に示す。図３（ａ）の縦軸はスコアを示し、横軸の白抜きは野生型マウスの場合を示し、黒抜きはＰＡＲ−２−／−マウスの場合を示す。図３（ａ）中の各値はスコアの平均値±標準誤差を示し、＊＊は野生型マウスとの比較においてｐ＜０．０１の統計学的有意差があることを示す。この結果、ＰＡＲ−２−／−マウスで、より重度なＰＡＳ陽性物質の沈着が認められた。また、ボーマン嚢の破綻の程度を数値化した結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）の縦軸はスコアを示し、横軸の白抜きは野生型マウスの場合を示し、黒抜きはＰＡＲ−２−／−マウスの場合を示す。図３（ｂ）中の各値はスコアの平均値±標準誤差を示し、＊＊は野生型マウスとの比較においてｐ＜０．０１の統計学的有意差があることを示す。この結果、ＰＡＲ−２−／−マウスで、より重度なボーマン嚢の破綻が認められた。
【００２１】
これらの結果から、ＰＡＲ−２遺伝子の欠損は腎炎を機能的にも、病理学的にも悪化させる、即ち、ＰＡＲ−２の活性化は腎炎の予防及び治療に有効である可能性が示唆された。
【００２２】
本発明者らは、これらの結果に基づいて、ＰＡＲ−２の活性化による腎炎の治療効果についてさらに検討した。
【００２３】
野生型マウスに抗ＧＢＭ抗血清を投与して腎炎を誘発させ、これらのマウスを３群に分け、第１群にはＰＡＲ−２の選択的刺激剤であるＳＬＩＧＲＬのアミノ酸配列を有するペプチドを投与し、第２群には腎炎の治療剤として使用されているプレドニゾロンを、それぞれ１日１回、７日間連続的に投与した。第３群は薬液未処置群（コントロ−ル群）とした。なお、比較のために抗ＧＢＭ抗血清の投与をしない無処置群を第４群として用意した（各群ともｎ＝６）。
【００２４】
薬液の最終投与直後から、１８時間の採尿を行い、尿中アルブミン量を測定した。結果を図４に示す。図４の縦軸は尿中アルブミン量（μｇ／１８時間／１００ｇ体重）を示し、横軸は左側から無処置群（第４群）、コントロール群（第３群）、プレドニゾロン投与群（第２群）、ＳＬＩＧＲＬ投与群（第１群）を示す。図４中の各値は平均値±標準誤差を示し、＊＊はコントロール群との比較においてｐ＜０．０１の統計学的有意差があることを示し、＋はプレドニゾロン群（第２群）との比較においてｐ＜０．０５の統計学的有意差があることを示し、＋＋はプレドニゾロン群（第２群）との比較においてｐ＜０．０１の統計学的有意差があることを示す。
【００２５】
この結果、抗ＧＢＭ抗血清を投与していない無処置群（第４群）の尿中アルブミン量に比べて、コントロール群（第３群）のそれは有意に高値を示した。ＰＡＲ−２選択的刺激剤であるＳＬＩＧＲＬ投与により、尿中アルブミン量は有意かつ劇的に（９７．０％）減少した。また、尿中アルブミン量の増加に対して抑制効果が認められているプレドニゾロンの３ｍｇ／ｋｇ投与は、尿中アルブミン量をコントロール群の５２．７％まで減少したが、有意な抑制ではなかった。
【００２６】
同様に、野生型マウスに抗ＧＢＭ抗血清を投与して腎炎を誘発させ、これらのマウスを３群に分け、第１群にはＰＡＲ−２の選択的刺激剤であるＡＳＫＨ９５を投与し、第２群には腎炎の治療剤として使用されているプレドニゾロンを、それぞれ１日１回、７日間連続的に投与した。第３群は薬液未処置群（コントロ−ル群）（各群ともｎ＝６）とした。
【００２７】
薬液の最終投与直後から、１８時間の採尿を行い、尿中アルブミン量を測定した。結果を図５に示す。図５の縦軸は尿中アルブミン量（μｇ／１８時間／１００ｇ体重）を示し、横軸は左側からコントロール群（第３群）、プレドニゾロン投与群（第２群）、ＡＳＫＨ９５投与群（第１群）を示す。図５中の各値は平均値±標準誤差を示し、＊はコントロール群との比較においてｐ＜０．０５の統計学的有意差があることを示す。
【００２８】
この結果、コントロール群（第３群）の尿中アルブミン量と比べて、ＰＡＲ−２選択的刺激剤であるＡＳＫＨ９５投与により、尿中アルブミン量は著しく減少した。一方、プレドニゾロンの３ｍｇ／ｋｇ投与は、コントロール群に比べて、尿中アルブミン量にほとんど効果がみられなかった。
【００２９】
従って、ＰＡＲ−２活性化剤の１種であるＰＡＲ−２刺激剤であるペプチドのＳＬＩＧＲＬ及びＡＳＫＨ９５は、腎炎などの腎疾患の予防及び治療に極めて有効であることが実験により確認され、ＰＡＲ−２の活性化により腎炎などの腎疾患の予防及び治療が極めて有効に行えることが判明した。そして、その作用効果は現在臨床で腎炎治療に汎用されている、ステロイド剤のプレドニゾロンよりも強力であることが判明した。
【００３０】
本発明のＰＡＲ−２活性化剤としては、ＰＡＲ−２の機能を活性化できるものであればよく、ＰＡＲ−２を刺激してその機能を活性化することができるＰＡＲ−２刺激剤、ＰＡＲ−２遺伝子の発現を増強させることによりＰＡＲ−２の機能を活性化することができるＰＡＲ−２遺伝子発現増強剤等を本発明のＰＡＲ−２活性化剤として使用することができる。本発明のＰＡＲ−２活性化剤の具体例としては、例えば、ＰＡＲ−２リガンド、ＰＡＲ−２リガンド誘導体（例えば、ＡＳＫＨ９５等）、トリプシン、トリプターゼ、ティッシュファクター／ＶＩＩａ因子、Ｘａ因子、アクロシン、トリプシン様セリンプロテアーゼ等が挙げられる。より詳細には、ＰＡＲ−２の切断部位の受容体を活性化させるアミノ酸配列を有するペプチド又はその誘導体の例として、少なくともＬＩＧ（アミノ酸の１文字表記による ）のアミノ酸配列を有するペプチド、好ましくはＬＩＧ（アミノ酸の１文字表記による ）のアミノ酸配列を有する３〜８のアミノ酸からなるペプチド、より好ましくはＳＬＩＧＫＶ（アミノ酸の１文字表記による ）やＳＬＩＧＲＬ（アミノ酸の１文字表記による ）などのアミノ酸配列を有するペプチド又はＡＳＫＨ９５等が挙げられる。なお、ＡＳＫＨ９５は、文献（J. Clin. Invest. 111, 35-41, 2003）に記載されているＰＡＲ−２リガンド誘導体であり、その化合物は2-furoyl-LIGKV-OH として表されている。
【００３１】
本発明のＰＡＲ−２活性化剤は、前記してきたようにマウス腎炎モデルにおいて、優れた腎炎抑制作用を示し、これらのＰＡＲ−２活性化剤は、腎疾患の予防薬及び治療薬として有用である。
【００３２】
本発明の腎疾患の予防薬及び治療用の医薬組成物は、前記ＰＡＲ−２活性化剤を有効成分とするものであり、経口剤又は非経口剤、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤などとして、投与形態に適した医薬組成物として、薬学的に許容される担体を配合し、当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【００３３】
経口用固形製剤を調製する場合は、例えば、前記ＰＡＲ−２活性化剤に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００３４】
経口用液体製剤を調製する場合は、例えば、前記ＰＡＲ−２活性化剤に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３５】
注射剤を調製する場合は、例えば、前記ＰＡＲ−２活性化剤にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉及び静脈内注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調製剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００３６】
他の剤型においても公知の方法に準じて同様に製剤化することができる。
【００３７】
かくして得られる本発明の腎疾患の予防薬及び治療薬は、腎臓での病変が認められるあらゆる腎疾患の予防及び治療に有効である。特に臨床的に分類される急性腎炎症候群、急速進行性糸球体腎炎症候群、再発性・持続性血尿、慢性腎炎症候群等の一次性（原発性）腎炎及び、ネフロ−ゼ症候群等の二次性腎炎や、病理組識学的に分類される原発性糸球体疾患（軽度糸球体病変群、巣状／局所性病変群及び、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎(IgA腎症等)、管内増殖性糸球体腎炎、メサンギウム性毛細血管性糸球体腎炎、高密度沈着物性糸球体腎炎、半月体（管外性）糸球体腎炎、硬化性糸球体腎炎等のびまん性糸球体腎炎群等）等の一次性（原発性）腎炎及び、系統的疾患に基づく糸球体疾患（ル−プス腎炎、Goodpasture症候群等）、血管性疾患に基づく糸球体疾患（糸球体血栓症等）、代謝性疾患に基づく糸球体疾患 （糖尿病性腎症、アミロイド−シス等）、遺伝性腎病変（アルポ−ト症候群等） 、移植腎糸球体病変等の二次性腎炎等の予防及び治療に有効である。
【００３８】
本発明の腎疾患の予防薬及び治療薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与形態及び投与回数等によって異なるが、通常は成人に対して前記ＰＡＲ−２活性化剤として一日０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇを１回または数回に分けて経口投与又は非経口投与するのが好ましい。
【００３９】
また、本発明は、被検物質のＰＡＲ−２活性化作用をスクリーニングすることからなる、腎疾患の予防及び治療用の有効成分をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法は、特に限定されないが、様々な文献に記載の方法、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞又はＰＡＲ−２遺伝子を導入したＣＯＳ−１細胞等のＰＡＲ−２を発現している培養細胞等を用いた細胞内Ｃａ２＋濃度変動（J. Biol. Chem., 272, 11133-11141, 1997）あるいはリン酸化イノシトールの産生（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8884-8889, 1997）等を指標にした細胞アッセイによるものや、ラット大動脈における内皮依存性の血管弛緩反応の検出（Can. J. Physiol. Pharmacol., 73, 1203-7, 1995）あるいはラット唾液腺からのムチン分泌の検出（Biochemical and Biophysical Research Communications, 270, 298-302, 2000）等の機能解析等が挙げられる。
【００４１】
実施例
以下、実施例を挙げてこの発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
ＰＡＲ−２遺伝子欠損の抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）抗体誘発腎炎に及ぼす効果を検討した。実験には、自家繁殖した１３週齢のＣ５７ＢＬ／６と１２９／Ｏｌａの交雑系雄性ＰＡＲ−２遺伝子欠損(ＰＡＲ−２−／−)マウス、及びその野生型マウスを使用した。
【００４３】
腎炎は、約１６倍の抗体価を有するマウスＧＢＭに対するウサギ抗血清（抗ＧＢＭ抗血清）を、マウス１匹あたりに０．４ｍｌ尾静脈内に単回投与することで惹起した（Jpn. J.  Pharmacol., 33, 1145-1154, 1983）。腎炎の指標とした尿中アルブミン量は、メタボリックケ−ジ（杉山元社製）を用いて１８時間採取した尿中のアルブミン量を、Exocel社製のＥＬＩＳＡキットを用いて定量し、μｇ／１８ 時間／１００ｇ 体重で表示した。得られたデータは、Student t-testにて解析し、評価した。
【００４４】
野生型およびＰＡＲ−２−／−マウスにおける、抗ＧＢＭ抗血清投与１、２、３及び５週後の尿中アルブミン量の測定結果を図１に示す（各群８匹づつ使用）。なお、抗ＧＢＭ抗血清を投与していない無処置の野生型マウス、及びＰＡＲ−２−／−マウスの尿中アルブミン量はそれぞれ、９９．２±２７．９（ｎ＝６）及び２２２．９±６３．９（ｎ＝６）であり、統計学的な有意差はなかった。
【００４５】
抗ＧＢＭ抗血清を投与したＰＡＲ−２−／−マウスにおける尿中アルブミン量は、野生型マウスのそれに比べて抗ＧＢＭ抗血清投与１週後から有意に増加し（野生型マウス：１４４１．２±８４０．４、ＰＡＲ−２−／−マウス：４６８９．２±７８７．１）、２および３週後、そして５週後（野生型マウス：３０９４．９±１８３４．７、ＰＡＲ−２−／−マウス：４６４６２．２±７２５５．５）でも有意に増加していた。
【００４６】
この結果より、ＰＡＲ−２遺伝子欠損は腎炎を機能的に著しく悪化させ、かつ腎炎の程度を経時的に進展させることが判明した。
【実施例２】
【００４７】
実施例１の実験終了後のマウスから摘出した、腎臓の病理組織像と、腎炎の病理学的指標となるＰＡＳ（periodic acid Schiff）陽性物質の沈着、及びボーマン嚢の破綻をスコアー化した数値を、図２（ａ，ｂ）および図３（ａ，ｂ）にそれぞれ示した。なおＰＡＳを用いた染色によって、ＧＢＭ、メサンギウム基質、ボーマン嚢や尿細管の基底膜、近位尿細管上皮刷子縁などが良く識別され、免疫複合体を含む糖蛋白の沈着も観察可能となる。方法は、次のように行った。既報(Kidney Blood Press Res 24, 27-32, 2001)に従い、摘出した腎臓を中性緩衝ホルマリン溶液で固定した後にパラフインに包埋し、作製した厚さ２ｍｍの切片をＰＡＳで染色し、病理学的障害を光学顕微鏡下で評価してスコアー化した。抗ＧＢＭ抗血清投与５週後の、野生型マウスの腎臓ではＰＡＳ陽性物質の沈着やボーマン嚢の破綻といった病理学的障害が生じているが（図２（ａ）、矢印）、ＰＡＲ−２−／−マウスではそれらの病理学的障害がより顕著であった（図２（ｂ）、矢印）。さらに、それら病理所見をスコアー化した値の比較でも、PAS陽性物質の沈着（図３（ａ）、野生型マウス：０．１３±０．０６、ＰＡＲ−２−／−マウス：０．９２±０．３０）およびボーマン嚢の破綻（図３（ｂ）、野生型マウス：０．０５±０．０２、ＰＡＲ−２−／−マウス：０．８±０．１５）に関して、ＰＡＲ−２−／−マウスは野生型マウスより有意に高値を示した。
【００４８】
実施例１並びに実施例２の結果より、ＰＡＲ−２遺伝子欠損は腎炎を機能的にも（実施例１）、病理学的にも（実施例２）悪化させることが判明した。
【００４９】
実施例１および実施例２の結果から、ＰＡＲ−２活性化剤が腎炎に有効である可能性が示唆されたので、次にＰＡＲ−２刺激剤の腎炎の治療効果について検討した。
【実施例３】
【００５０】
野生型マウスに抗ＧＢＭ抗血清を投与し、その直後から、リン酸緩衝液に溶解した０．３μｍｏｌ／ｋｇのＰＡＲ−２選択的刺激剤であるＳＬＩＧＲＬ、あるいは０．５％メチルセルロース溶液に懸濁した３ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンを、それぞれ１日１回、７日間連続的に投与した（各群ともｎ＝６）。ＳＬＩＧＲＬは尾静脈内に、０．１ｍｌ／秒の速度で、１ｍｌ／１００ｇ 体重で投与した。プレドニゾロンは、１ｍｌ／１００ｇ体重で強制経口投与した。なお対象として、薬液未処置群（コントロ−ル群）を設定した。薬液の最終投与直後から、メタボリックケ−ジを用いて１８時間の採尿を行い、尿中アルブミン量を測定した。結果を図４に示す。
【００５１】
実施例１と同様に、抗ＧＢＭ抗血清を投与していない無処置群の尿中アルブミン量（９９．２±２７．９）に比べて、コントロール群のそれは有意に高値（３５２８．５±１２３８．６）を示した。ＰＡＲ−２選択的刺激剤であるＳＬＩＧＲＬ投与により、尿中アルブミン量は有意かつ劇的に（９７．０％）減少した（１０４．２±５４．０）。尿中アルブミン量の増加に対して抑制効果が認められているプレドニゾロンの３ｍｇ／ｋｇ投与は、尿中アルブミン量をコントロール群の５２．７％まで減少したが（１６７０．６±５７９．４）、有意な抑制ではなかった。
【実施例４】
【００５２】
実施例３と同様の方法で、野生型マウスに抗ＧＢＭ抗血清を投与し、その直後から、リン酸緩衝液に溶解した１０ｍｇ／ｋｇのＰＡＲ−２選択的刺激剤であるＡＳＫＨ９５、あるいは０．５％メチルセルロース溶液に懸濁した３ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンを、それぞれ１日１回、７日間連続的に投与した（各群ともｎ＝６）。ＡＳＫＨ９５は尾静脈内に、０．１ｍｌ／秒の速度で、１ｍｌ／１００ｇ 体重で投与した。プレドニゾロンは、１ｍｌ／１００ｇ体重で強制経口投与した。なお対象として、薬液未処置群（コントロ−ル群）を設定した。薬液の最終投与直後から、メタボリックケ−ジを用いて１８時間の採尿を行い、尿中アルブミン量を測定した。結果を図５に示す。なお、ＡＳＫＨ９５は、文献（J. Clin. Invest. 111, 35-41, 2003）の記載に従って合成し、使用した。
【００５３】
実施例３と同様に、  コントロール群の尿中アルブミン量（８１３１９．０±８８８４．３）と比べて、ＰＡＲ−２選択的刺激剤であるＡＳＫＨ９５投与により、尿中アルブミン量（３４７０９．６±８７０３．３）は著しく減少した。一方、プレドニゾロンの３ｍｇ／ｋｇ投与は、コントロール群に比べて、尿中アルブミン量（７５６９２．１±１２８４６．９）にほとんど効果がみられなかった。
【００５４】
従って、ＰＡＲ−２刺激剤は腎炎の抑制に有効で、かつその効果は現在臨床で腎炎治療に汎用されている、ステロイド剤のプレドニゾロンよりも強力であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、ＰＡＲ−２を活性化することができるＰＡＲ−２活性化剤の１種又は２種以上の有効成分、及び薬学的に許容される担体からなる腎疾患の予防及び治療用医薬組成物を提供することができる。
本発明はさらに、ＰＡＲ−２刺激剤あるいはＰＡＲ−２遺伝子発現の増強剤等に代表される、ＰＡＲ−２活性化剤を有効成分とする腎疾患の予防及び治療方法を提供することができ、また、被検物質のＰＡＲ−２活性化作用をスクリーニングすることからなる、腎疾患の予防及び治療用の有効成分をスクリーニングする方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、腎炎を惹起した野生型マウス及びＰＡＲ−２−／−マウスにおける、尿中アルブミン量の経日変化を示す。
【図２（ａ）】図２（ａ）は、腎炎惹起５週後の野生型マウスにおける、腎臓（糸球体）の病理組織像である。
【図２（ｂ）】図２（ｂ）は、腎炎惹起５週後のＰＡＲ−２−／−マウスにおける、腎臓（糸球体）の病理組織像である。
【図３（ａ）】図３（ａ）は、腎炎惹起５週後の野生型マウス及びＰＡＲ−２−／−マウスにおける、腎のＰＡＳ陽性物質の沈着の程度をスコアー化した数値である。
【図３（ｂ）】図３（ｂ）は、腎炎惹起５週後の野生型マウス及びＰＡＲ−２−／−マウスにおける、ボーマン嚢の破綻の程度をスコアー化した数値である。
【図４】図４は、腎炎を惹起した野生型マウスにおける、ＰＡＲ−２活性化剤（選択的アゴニストであるＳＬＩＧＲＬ）、及びステロイド剤のプレドニゾロンの効果を示す。
【図５】図５は、腎炎を惹起した野生型マウスにおける、ＰＡＲ−２活性化剤（選択的アゴニストであるＡＳＫＨ９５）、及びステロイド剤のプレドニゾロンの効果を示す。
【図１】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４】
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【図５】
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