(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する放線菌核酸標的領域に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし、検出可能なプローブ：標的二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成し、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の配列内に含まれる、少なくとも１７の隣接するヌクレオチオドを含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
前記プローブが、配列番号１０の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチドを含む、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
前記プローブが、配列番号１０の配列内に含まれる、少なくとも２９の隣接するヌクレオチドを含む、請求項２のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、０．４８  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、各１  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより提供される、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、６０  ｍＭ  コハク酸リチウム、並びに各１０  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより提供される、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡを含む、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが少なくとも１つのヌクレオチド類似体（ａｎａｌｏｇ）を含む、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
前記の少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、リボース部分の２’位に、メトキシ基を含む、請求項７のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１またはその相補体、配列番号２またはその相補体、および配列番号３またはその相補体からなる群より選択される配列を有する、請求項１のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
前記配列が、配列番号２または配列番号３より提供され、前記オリゴヌクレオチドがヘルパーオリゴヌクレオチドである、請求項９のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
さらに検出可能標識を含む、請求項９のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１２】
検出可能標識が、化学発光標識または放射標識である、請求項１１のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
前記配列が、配列番号１より提供される、請求項９のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
さらに検出可能標識を含む、請求項１３のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】
検出可能標識が、アクリジニウムエステルである、請求項１４のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１６】
放線菌細菌の核酸を検出するためのプローブ組成物であって：
大腸菌２３Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する放線菌核酸標的領域に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、検出可能な標的：プローブ二重鎖を形成する、オリゴヌクレオチドプローブ
ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブは、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも１７の隣接するヌクレオチオドを含み、そして
前記ハイブリダイゼーション条件下で、前記オリゴヌクレオチドプローブは、コリネバクテリウム・アクアティクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ジェイキエウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｉｅｕｍ）、コリネバクテリウム・キセロシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、マイコバクテリウム・ケロナイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・テライ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・シミアイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｍｉａｅ）、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・ゴルドナイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）、マイコバクテリウム・カンサイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・フォルツイツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・ガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｓｔｒｉ）、マイコバクテリウム・キセノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）およびチモテ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）に存在する核酸に特異的にハイブリダイズする
を含む、前記プローブ組成物。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチドを含む、請求項１のプローブ組成物。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドプローブがＤＮＡを含む、請求項１６のプローブ組成物。
【請求項１９】
前記高ストリンジェンシー条件が、０．４８  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、各１  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより提供される、請求項１６のプローブ組成物。
【請求項２０】
前記高ストリンジェンシー条件が、０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、６０  ｍＭ  コハク酸リチウム、並びに各１０  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより提供される、請求項１６のプローブ組成物。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１またはその相補体の配列を含む、請求項１６のプローブ組成物。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドプローブの長さが６０塩基までである、請求項１６のプローブ組成物。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１の長さおよび配列を有する、請求項１６のプローブ組成物。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、さらに検出可能標識を含む、請求項１６のプローブ組成物。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、さらに検出可能標識を含む、請求項２２のプローブ組成物。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、さらに検出可能標識を含む、請求項２３のプローブ組成物。
【請求項２７】
検出可能標識が、化学発光標識または放射標識である、請求項２４、２５または２６のいかなる１つでもよいプローブ組成物。
【請求項２８】
化学発光標識がアクリジニウムエステルである、請求項２７のプローブ組成物。
【請求項２９】
前記ハイブリダイゼーション条件下で、検出可能プローブ：標的二重鎖の形成を促進する、少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２７のプローブ組成物。
【請求項３０】
前記の少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、請求項２９のプローブ組成物。
【請求項３１】
前記の少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、２’位に配置されるメトキシ基を有するリボース部分を含む、請求項３０のプローブ組成物。
【請求項３２】
前記の少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドが、配列番号２および配列番号３からなる群より選択される配列を有する、請求項２９のプローブ組成物。
【請求項３３】
試験試料中の放線菌類の存在を検出するための方法であって：
（ａ）大腸菌２３Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する放線菌核酸標的領域に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、検出可能な標的：プローブ二重鎖を形成し、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチオドを含み、そして前記ハイブリダイゼーション条件下で、コリネバクテリウム・アクアティクム、コリネバクテリウム・ジェイキエウム、コリネバクテリウム・キセロシス、ミクロコッカス・ルテウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、マイコバクテリウム・ケロナイ、マイコバクテリウム・テライ、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・シミアイ、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・ゴルドナイ、マイコバクテリウム・カンサイ、スメグマ菌、マイコバクテリウム・フォルツイツム、マイコバクテリウム・ガストリ、マイコバクテリウム・キセノピ、マイコバクテリウム・マリヌムおよびチモテ菌に存在する核酸に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ組成物を、前記試験試料に提供し；
（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、試験試料中に存在する可能性がある、いかなる放線菌核酸も、前記プローブ組成物とハイブリダイズさせ、プローブ：標的二重鎖を形成し；そして
（ｃ）試験試料中の放線菌類の存在の指標として、前記プローブ：標的二重鎖を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項３４】
前記試験試料が細菌を含む可能性があり、そして工程（ａ）の前に、前記試験試料中に存在する可能性がある、いかなる細菌からも核酸を放出させる工程がある、請求項３３の方法。
【請求項３５】
前記試験試料が溶解物である、請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、０．４８  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、各１  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより提供される、請求項３３の方法。
【請求項３７】
前記高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、６０  ｍＭ  コハク酸リチウム、並びに各１０  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより提供される、請求項３３の方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１の長さおよび配列を有する、請求項３３の方法。
【請求項３９】
オリゴヌクレオチドプローブが検出可能標識を含む、請求項３８の方法。
【請求項４０】
検出可能標識がアクリジニウムエステルであり、そして検出工程が、発光測定を行い、いかなる前記プローブ：標的二重鎖も検出することを含む、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記プローブ組成物が、プローブ：標的二重鎖の形成を促進する、少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項３９の方法。
【請求項４２】
前記の少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドが、配列番号２および配列番号３からなる群より選択される、請求項４１の方法。
【請求項４３】
試験試料中の放線菌核酸の存在を検出するためのキットであって：
大腸菌２３Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する放線菌核酸標的領域に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、検出可能な標的：プローブ二重鎖を形成し、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチオドを含み、そして前記ハイブリダイゼーション条件下で、コリネバクテリウム・アクアティクム、コリネバクテリウム・ジェイキエウム、コリネバクテリウム・キセロシス、ミクロコッカス・ルテウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、マイコバクテリウム・ケロナイ、マイコバクテリウム・テライ、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・シミアイ、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・ゴルドナイ、マイコバクテリウム・カンサイ、スメグマ菌、マイコバクテリウム・フォルツイツム、マイコバクテリウム・ガストリ、マイコバクテリウム・キセノピ、マイコバクテリウム・マリヌムおよびチモテ菌に存在する核酸に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ組成物
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、１９９９年５月３日に提出された、米国仮特許出願第６０／１３２，４１２号の恩典を請求する。本関連出願の開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、核酸検出系に関する。より具体的には、本発明は、「放線菌類」として知られるグラム陽性細菌のサブセットのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに対し結合特異性を有するポリヌクレオチドプローブに関する。
【０００３】
発明の背景
放線菌、またはグラム陽性（グラム(+)）細菌の「高（Ｇ＋Ｃ）」サブセットは、真正細菌内の別個の進化系統である。放線菌類は、特徴的に高い突然変異率の反映として、非常に独特の表現型的特徴を示す。細菌のこの群の多くのメンバーは、抗生物質を産生し、そしてよく土中に見られる。放線菌は、結核、らい、ジフテリアおよび歯周病を含む、多様な重大な動物疾患に責任がある。特に、免疫不全の個体は、すべて放線菌の個々の種である、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、およびマイコバクテリウム・スクロフラセウムによる感染に特に感受性である。さらに、放線菌は、経済的に重要な多様な植物疾患に責任がある。
【０００４】
デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）またはリボ核酸（「ＲＮＡ」）の２つの一本鎖は、互いに結合しまたは「ハイブリダイズ」し、相補的塩基対間の水素結合により、共に保持される２つの鎖を有する二本鎖構造を形成することが可能であることが、よく確立されている。核酸の個々の鎖は、塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）およびイノシン（Ｉ）を含むヌクレオチドから形成される。核酸の二重らせん構造において、塩基アデニンは、塩基チミンまたはウラシルと水素結合し、塩基グアニンは、塩基シトシンと水素結合し、そして塩基イノシンは、アデニン、シトシンまたはウラシルと水素結合する。したがって、鎖沿いのいかなる点でも、古典的な「ワトソン−クリック」塩基対、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ、Ｔ：ＡまたはＵ：Ａ、およびＧ：ＣまたはＣ：Ｇが見出される可能性がある。しかし、伝統的な（「規範的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）」）塩基対に加え、Ａ：Ｇ、Ｇ：Ｕおよび他の「ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）」またはミスマッチ塩基対もまた、見出される可能性がある。
【０００５】
第一の一本鎖ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション促進条件下で、第一のポリヌクレオチドの配列に相補的な、十分な数の隣接する塩基を有する、第二の一本鎖ポリヌクレオチドと接触すると、二本鎖核酸ハイブリッドが生じるであろう。適切な条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成される可能性がある。
【０００６】
一般的に、プローブは、検出しようとする核酸配列（「標的配列」）とある程度の相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドである。プローブは、一般的に、放射性同位体、抗原または化学発光部分などの検出可能部分で標識される。
【０００７】
特定の核酸配列を検出する方法としての核酸ハイブリダイゼーションの説明は、Ｋｏｈｎｅらにより米国特許第４，８５１，３３０号に、そしてＨｏｇａｎらにより米国特許第５，５４１，３０８号および５，６８１，６９８号に提供される。これらの参考文献はまた、ＲＮＡ含有生物を含む可能性がある試料中の、こうした生物の存在を決定するための方法も記載する。これらの方法は、１つまたはそれ以上の非ウイルス生物または一群の非ウイルス生物のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に十分に相補的なプローブを必要とする。該方法にしたがい、試験しようとする試料由来の核酸および適切なプローブをまず混合し、そしてその後、明記されるハイブリダイゼーション条件下でインキュベーションする。必ずというわけではないが、慣用的に、プローブは、検出可能標識で標識されるであろう。生じたハイブリダイゼーション反応をその後、アッセイし、試験試料中に含まれるｒＲＮＡの存在を検出するため、二重鎖構造を形成した標識プローブの量を検出し、そして定量する。
【０００８】
ウイルスを例外とし、すべての原核生物は、原核５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ分子の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）をコードするｒＲＮＡ遺伝子を含む。真核生物では、これらのｒＲＮＡ分子は、原核分子に実質的に類似の５Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡである。試料中の特定の生物または一群の生物における、特異的に標的化されたｒＲＮＡ下位配列を検出するためのプローブは、先に記載されてきている。これらの非常に特異的なプローブ配列は、好都合に、適切なストリンジェンシー条件下で、いかなる他の細菌種または感染性病原体由来の核酸とも交差反応しない。
【０００９】
本発明は、非常に特異的な方式で、放線菌類を検出するのに用いることが可能なポリヌクレオチドプローブを提供する。
発明の概要
本発明の１つの側面は、放線菌細菌に特徴的な核酸標的領域に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし、検出可能プローブ：標的二重鎖を形成する、オリゴヌクレオチドプローブに関する。本標的領域は、大腸菌ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも１７の隣接するヌクレオチドを含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１０の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチドを含み、そして少なくとも２９の隣接するヌクレオチドを含んでもよい。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、０．４８  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、各１  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより、または０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、６０  ｍＭ  コハク酸リチウム、並びに各１０  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより、提供されてもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡで作成されてもよいが、また、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含んでもよい。例えば、プローブは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有する、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含んでもよい。１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１またはその相補体、配列番号２またはその相補体、あるいは配列番号３またはその相補体のいかなる１つである配列を有する。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２または配列番号３に提供され、そしてオリゴヌクレオチドはヘルパーオリゴヌクレオチドである。開示されるオリゴヌクレオチドのいずれも、検出可能標識を含んでもよい。検出可能標識の特定の例には、化学発光標識および放射標識が含まれる。別の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１に提供される配列を有する。本オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして特に有用であり、そして検出可能標識を含んでもよい。ハイブリダイゼーションプローブのための非常に好ましい検出可能標識は、アクリジニウムエステルである。
【００１０】
本発明の別の側面は、放線菌細菌の核酸を検出するためのプローブ組成物に関する。本組成物には、高ストリンジェンシー条件下で、大腸菌２３Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する放線菌核酸領域にハイブリダイズし、検出可能標的：プローブ二重鎖を形成する、オリゴヌクレオチドプローブが含まれる。本オリゴヌクレオチドプローブは、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも１７の隣接するヌクレオチドを含む。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドプローブは、コリネバクテリウム・アクアティクム、コリネバクテリウム・ジェイキエウム、コリネバクテリウム・キセロシス、ミクロコッカス・ルテウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、マイコバクテリウム・ケロナイ、マイコバクテリウム・テライ、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・シミアイ、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・ゴルドナイ、マイコバクテリウム・カンサイ、スメグマ菌、マイコバクテリウム・フォルツイツム、マイコバクテリウム・ガストリ、マイコバクテリウム・キセノピ、マイコバクテリウム・マリヌムおよびチモテ菌に存在する核酸に特異的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブが、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチドを含むことが好ましい。特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡで作成される。有用な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、二者択一的に、０．４８  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各１  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより、または０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、６０  ｍＭ  コハク酸リチウム、並びに各１０  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより、提供される。非常に好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１またはその相補体の配列を有する。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブの長さは、６０塩基までであってもよい。非常に好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１の長さおよび配列を有する。本発明のプローブ組成物の特定の態様は、該オリゴヌクレオチドプローブ上に検出可能標識を含む。例えば、オリゴヌクレオチドプローブが、６０ヌクレオチドまでの長さを有する場合、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能標識を含んでもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１の配列を有する場合、検出可能標識が含まれてもよい。プローブ組成物が、長さ１７−１００ヌクレオチド、または長さ１７−６０ヌクレオチドの、あるいは配列番号１の配列を有する、標識オリゴヌクレオチドプローブを含むかどうかに関わりなく、検出可能標識は、化学発光標識（例えばアクリジニウムエステル）または放射標識いずれであってもよい。これらの標識オリゴヌクレオチドプローブが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、検出可能プローブ：標的二重鎖の形��を促進する、少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いられることが好ましい。少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含んでもよい。非常に好ましいヌクレオチド類似体の例は、リボース部分が、２’位に配置されるメトキシ基を有するものであろう。本発明の非常に好ましい態様において、標識オリゴヌクレオチドプローブは、長さに関わらず、配列番号２または配列番号３の配列を有する、少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる。
【００１１】
本発明のさらに別の側面は、試験試料中の放線菌細菌の存在を検出するための方法に関する。本方法は、大腸菌２３Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する放線菌核酸標的領域に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、検出可能な標的：プローブ二重鎖を形成し、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチオドを含み、そして前記ハイブリダイゼーション条件下で、コリネバクテリウム・アクアティクム、コリネバクテリウム・ジェイキエウム、コリネバクテリウム・キセロシス、ミクロコッカス・ルテウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、マイコバクテリウム・ケロナイ、マイコバクテリウム・テライ、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・シミアイ、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・ゴルドナイ、マイコバクテリウム・カンサイ、スメグマ菌、マイコバクテリウム・フォルツイツム、マイコバクテリウム・ガストリ、マイコバクテリウム・キセノピ、マイコバクテリウム・マリヌムおよびチモテ菌に存在する核酸に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ組成物を、前記試験試料に提供する工程を含む。その後、試験試料中に存在する可能性がある、いかなる放線菌類核酸も、プローブ組成物と組み合わされ、プローブ：標的二重鎖を形成するよう、生じた混合物を、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせる。最後に、該方法は、試験試料中の放線菌類の存在の指標として、該プローブ：標的二重鎖を検出することを伴う。本発明の方法の１つの態様において、試験試料は細菌を含み、そして前記試験試料中に存在する可能性がある、いかなる細菌からも核酸を放出させる予備工程が行われる。本方法の異なる態様において、試験試料は溶解物である。一般的に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は：（ａ）０．４８  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各１  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ、または（ｂ）０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、６０  ｍＭ  コハク酸リチウム、並びに各１０  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより提供してもよい。しかし、他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、よい結果を提供する可能性があることを理解すべきである。好ましい態様において、本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１の長さおよび配列を有する。この場合、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能標識を含んでもよい。非常に好ましい態様において、標識オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１の配列を有し、プローブ上の標識は、アクリジニウムエステルであり、そして本発明の方法の検出工程は、発光測定を行い、プローブ：標的二重鎖を検出することを伴う。標識オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１の配列を有する場合、プローブ組成物は、プローブ：標的二重鎖の形成を促進する、少なくとも１つのヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。典型的なヘルパーオリゴヌクレオチドは、配列番号２および配列番��３の配列を有する。
【００１２】
本発明のさらに別の側面は、試験試料中の放線菌核酸の存在を検出するために用いることが可能なキットに関する。該キットは、大腸菌２３Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド位１９８６−２０６４に対応する放線菌核酸標的領域に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、検出可能なプローブ：標的二重鎖を形成する、オリゴヌクレオチドプローブを含む、プローブ組成物を含む。該オリゴヌクレオチドプローブは、１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして配列番号１０またはその相補体の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチオドを含む。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、該オリゴヌクレオチドプローブは、コリネバクテリウム・アクアティクム、コリネバクテリウム・ジェイキエウム、コリネバクテリウム・キセロシス、ミクロコッカス・ルテウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、マイコバクテリウム・ケロナイ、マイコバクテリウム・テライ、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、マイコバクテリウム・シミアイ、鳥型結核菌、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・ゴルドナイ、マイコバクテリウム・カンサイ、スメグマ菌、マイコバクテリウム・フォルツイツム、マイコバクテリウム・ガストリ、マイコバクテリウム・キセノピ、マイコバクテリウム・マリヌムおよびチモテ菌に存在する核酸に特異的にハイブリダイズする。さらに、本発明のキットは、実行のため、オリゴヌクレオチドプローブおよび放線菌核酸標的の間の複合体を検出することにより、放線菌核酸を検出するためにしたがう工程を明記した、印刷した指示を含む。プローブ組成物および印刷した指示は、互いに組み合わせてパッケージングされている。
【００１３】
定義
本明細書において、以下の用語は、反対に言及されない限り、既定の意味を有する。
【００１４】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭糖および窒素性塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭糖は、２’−デオキシリボースである。５’−ヌクレオチドの糖は、５’−炭素−５位にヒドロキシル基（−ＯＨ）を含む。該用語はまた、天然発生ヌクレオチドの類似体も含み、そして特に、リボースの２’位にメトキシ基（ＯＭｅ）を有する類似体を含む。本明細書において、「Ｔ」残基を含むメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基を有し、そしてヌクレオチドの塩基位にウラシルを有する。
【００１５】
「非ヌクレオチド単位」は、ポリマーのハイブリダイゼーションに重要には参加しない単位である。こうした単位は、例えば、ヌクレオチドとのいかなる重要な水素結合にも参加してはならず、そして構成要素として、５つのヌクレオチド塩基またはその類似体の１つを有する単位を排除するであろう。
【００１６】
「オリゴヌクレオチド」は、共に共有結合する、２つまたはそれ以上のヌクレオチドサブユニットを有するヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、一般的に、長さ約１０ないし約１００ヌクレオチドである。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース、またはその修飾された誘導体、例えばＯＭｅであってもよい。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾結合などの結合により、または、相補的標的ヌクレオチド配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない、非ヌクレオチド部分により、連結されてもよい。修飾結合は、標準的ホスホジエステル結合が、異なる結合、例えばホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、または中性ペプチド結合などで置き換えられたものを含む。窒素性塩基類似体もまた、本発明にしたがったオリゴヌクレオチドの構成要素であってもよい。
【００１７】
「標的核酸」は、標的核酸配列を含む核酸である。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることが可能な特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列である。
【００１８】
「オリゴヌクレオチドプローブ」は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、検出可能ハイブリッドプローブ：標的二重鎖を形成することが可能な、標的核酸配列に十分に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブは、単離化学種であり、そして高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを妨げない限り、標的領域の外側に、さらなるヌクレオチドを含んでもよい。非相補的配列、例えばプロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または触媒活性部位などの望ましい二次または三次構造を与える配列を用い、本発明のプローブを用いた検出を促進してもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、所望により、標的配列へのプローブハイブリダイゼーションを検出するまたは確認するのに用いることが可能な検出可能部分、例えば放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、酵素またはリガンドで標識してもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、長さ１０ないし１００ヌクレオチドの範囲の大きさであることが好ましい。
【００１９】
「検出可能部分」は、核酸プローブに結合した、または核酸プローブの一部として合成された分子である。本分子は、特有に検出可能でなければならず、そして、その結果、プローブが検出されるのを可能にするであろう。これらの検出可能部分は、しばしば、放射性同位体、化学発光分子、酵素、ハプテン、または特有なオリゴヌクレオチド配列でさえある。
【００２０】
「ハイブリッド」または「二重鎖」は、２つの一本鎖核酸配列の間に、相補的塩基間のワトソン−クリック塩基対形成または非規範的塩基対形成により、形成される複合体である。
【００２１】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸の２つの相補鎖が組み合わされ、二本鎖構造（「ハイブリッド」または「二重鎖」）を形成する過程である。
「相補性」は、各鎖上のワトソン−クリック塩基対の間の水素結合を通じ、ハイブリッドまたは二本鎖ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡを形成することが可能な、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖の塩基配列により与えられる特性である。アデニン（Ａ）は通常、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）を相補し、一方グアニン（Ｇ）は通常、シトシン（Ｃ）を相補する。
【００２２】
「ミスマッチ」は、ハイブリッドにおいて、規範的なワトソン−クリック水素結合を形成しない２つのヌクレオチドのいかなる対形成も指す。さらに、以下の議論の目的には、ミスマッチは、単数または複数の非対形成ヌクレオチドを生じる、ハイブリッドの１つの鎖における挿入または欠失も含む可能性がある。
【００２３】
「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび続くプロセシング工程中に存在する温度および溶媒組成を記載するのに用いられる。高ストリンジェンシー条件下では、非常に相補的な核酸ハイブリッドのみが形成されるであろうし；十分な度合いの相補性を持たないハイブリッドは形成されないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖の間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシー条件は、標的および非標的核酸で形成されるハイブリッドの間の安定性の相違を最大にするよう選択する。典型的な高ストリンジェンシー条件は、実用的な実施例に提供される。
【００２４】
「プローブ特異性」という用語は、プローブの特性を指し、標的および非標的配列の間を区別する能力を記載する。
「可変領域」という用語は、試料中に含まれる標的生物および非標的生物の間で、少なくとも１つの塩基が異なる、ヌクレオチドポリマーを指す。
【００２５】
「保存領域」は、少なくとも２つの異なるポリヌクレオチドの間で可変でない核酸下位配列である。
「細菌」は、３つの主な界の１つとみなされる、系統発生群、真正細菌のメンバーである。
【００２６】
「配列分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）」という用語は、ヌクレオチドポリマーが、進化中、より似なくなる過程を指す。
「配列収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）」という用語は、ヌクレオチドポリマーが、進化中、より似てくる過程を指す。
【００２７】
「Ｔｍ」は、プローブの５０％が、ハイブリダイズ型から非ハイブリダイズ型に変換される温度を指す。
「ヘルパーオリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドプローブが結合する領域以外の標的核酸領域に結合するオリゴヌクレオチドである。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸の標的領域上に新たに二次および三次構造を課し、オリゴヌクレオチドプローブの結合速度が加速されるようにする。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標識オリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いられる場合、検出可能標識で標識されないが、標識プローブの結合を促進し、そしてしたがって、間接的にハイブリダイゼーションシグナルを亢進する。
【００２８】
「本質的になる」、または「本質的になっている」という句は、オリゴヌクレオチドが、明記されるヌクレオチド配列に実質的に類似のヌクレオチド配列を有することを意味する。請求される特性を有すること、例えば高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸より標的核酸に優先的にハイブリダイズすることが可能であることを妨げない、いかなる付加または欠失も、明記される核酸配列の重要でない変動である。
【００２９】
当業者は、本発明の実質的に対応するプローブは、言及される配列と異なり、そしてなお同一の標的核酸配列にハイブリダイズする可能性があることを理解するであろう。核酸からのこの変動は、配列内の同一塩基の割合、またはプローブおよびその標的配列の間の完全に相補的な塩基の割合に関し、言及されてもよい。本発明のプローブは、これらの割合が、１００％から８０％、または１０ヌクレオチド標的配列における０塩基ミスマッチから１０ヌクレオチド標的配列における２塩基ミスマッチである場合、核酸配列に実質的に対応する。好ましい態様において、該割合は、１００％から８５％である。より好ましい態様において、この割合は、９０％から１００％であり；他の好ましい態様において、この割合は、９５％から１００％である。
【００３０】
「十分に相補的」または「実質的に相補的」により、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、検出のため安定であるハイブリッドを形成する、十分な量の隣接する相補的ヌクレオチドを有する核酸を意味する。
【００３１】
「核酸ハイブリッド」または「プローブ：標的二重鎖」により、二本鎖、水素結合構造で、好ましくは長さ１０ないし１００ヌクレオチド、より好ましくは長さ１４ないし５０ヌクレオチドである構造を意味する。構造は、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィー、電気化学的解析またはゲル電気泳動などの手段により検出するのに十分に安定である。こうしたハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含む。
【００３２】
「負のセンス」により、参照（すなわち、センス）核酸分子に完全に相補的な核酸分子を意味する。
「ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、同じ相補塩基対ハイブリダイゼーション特性を有する、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子を指す。ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物は、異なる糖基（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、そしてＲＮＡにはウラシル、そしてＤＮＡにはチミンが存在する点が異なる可能性がある。ＲＮＡおよびＤＮＡ均等物の間の相違は、均等物が、特定の配列に対し、同じ度合いの相補性を有するため、実質的に対応する核酸配列における相違に貢献しない。
【００３３】
「優先的にハイブリダイズする」により、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドプローブが、その標的核酸にハイブリダイズし、（他の生物由来の非標的核酸の存在を示すであろう）安定なプローブ：非標的ハイブリッドを形成することなく、（それにより標的核酸の存在を示す）安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成することが可能であることを意味する。したがって、プローブは、非標的核酸に対するより、標的核酸に対し、十分により高い度合いでハイブリダイズし、当業者が、放線菌細菌の存在を正確に検出し、そして他の生物の存在とそれらの存在を区別することを可能にする。優先的ハイブリダイゼーションは、当該技術分野において知られ、そして本明細書に記載される技術を用い、測定することが可能である。例えば、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ）核酸に対するハイブリダイゼーションと比較した際、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、約１００−２，０００倍、放線菌核酸に優先的にハイブリダイズする。
【００３４】
放線菌「標的核酸配列領域」は、他の種の核酸に存在しない、放線菌細菌の核酸に存在する核酸配列またはそれに相補的な配列を指す。標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸は、標的増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または転写仲介増幅（例えば、ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  米国特許第５，８２４，５１８号）により生成してもよい。
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書中に、我々は、放線菌細菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出しそして同定するのに用いることが可能な、オリゴヌクレオチドプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドのための、好ましい標的ヌクレオチド配列を開示する。放線菌を特異的に検出するのに有用な、非常に好ましいポリヌクレオチドプローブおよび付属のヘルパーオリゴヌクレオチドが特に開示される。２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定のｒＲＮＡ配列に相補的なプローブは、好都合に、既知の系統発生的に最近である近縁体（ｎｅｉｇｈｂｏｒ）から放線菌を区別することが可能である。
【００３６】
放線菌細菌のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）またはＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列に対するハイブリダイゼーションを可能にする核酸配列を有するのに加え、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１１に同定される、記載される標的配列領域の少なくとも一部に、少なくとも９０％相補的であり、好ましくは完全に相補的である。該部分は、好ましくは、少なくとも長さ１７ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも長さ２５ヌクレオチドであり、そしてさらにより好ましくは、少なくとも長さ２９ヌクレオチドである。
【００３７】
上述のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、放線菌細菌の核酸配列を標的とする。これらのオリゴヌクレオチドは、放線菌核酸標的領域に優先的にハイブリダイズし、放線菌細菌の存在を示す、検出可能二重鎖を形成するプローブとして用いることが可能である。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、放線菌核酸標的領域にハイブリダイズし、そして標識オリゴヌクレオチドプローブおよびその相補的標的核酸の間の二重鎖の形成を亢進することが可能である、ヘルパーオリゴヌクレオチドとして用いてもよい。
【００３８】
好ましい態様において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプローブは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、他の生物由来のものより、放線菌細菌由来の核酸に、選択的にハイブリダイズする。本発明のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能部分、例えばアクリジニウムエステルまたは放射性同位体を含む。
【００３９】
放線菌細菌の存在を検出するのに好ましい方法は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、他の生物の核酸配列より、放線菌標的核酸に優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブと、試験試料を接触させる工程を含む。好ましくは、標的核酸配列は、配列番号１１に提供される配列内に含まれる、少なくとも１７の隣接するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２５の隣接するヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも２９の隣接するヌクレオチドの配列に完全に相補的である。したがって、本発明と関連して有用なオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さ１００ヌクレオチドまでであり、そして、ＧＧＴＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＴＡＡＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＴＣＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＧ（配列番号１０）に提供される配列またはその相補体に含まれる、少なくとも１７の隣接するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２５の隣接するヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも２９の隣接するヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡ均等物であってもよく、そしてヌクレオチド類似体を含んでもよい。
【００４０】
序論および背景
本発明の開発において、関連および非関連生物のコレクション由来のｒＲＮＡ配列を並列させ、放線菌生物を、他の細菌と共に真核生物から区別するのに用いることが可能な、２３Ｓ  ｒＲＮＡに存在する候補保存配列を同定した。放線菌および遠い系統発生上の近縁体のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ配列を並列させ、最大相同性の領域を明らかにした。放線菌類の中で保存され、そして他の近いまたは遠い関連属とミスマッチを示すｒＲＮＡ配列を同定するため、配列変動に関し、相同領域を調べた。以下に記載される方法にしたがい、候補プローブと推定される配列を、最後に、一団のｒＲＮＡ標準および細菌溶解物に対し試験し、実験室条件下でのプローブとしての有用性を確認した。
【００４１】
ｒＲＮＡのポリヌクレオチド配列は、ジデオキシヌクレオチド配列決定法を用いて、最も好都合に決定する。本方法において、長さ約１０−１００塩基で、そして５Ｓ、１６Ｓまたは２３Ｓリボソームサブユニットいずれでもよいもの由来のｒＲＮＡの保存領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、逆転写酵素により、伸長してもよい。生じたＤＮＡ伸長産物をその後、化学分解またはジデオキシヌクレオチド配列決定いずれかにより、配列決定してもよい（Ｌａｎｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：６９５５（１９８５））。別の好ましい方法にしたがい、ｒＲＮＡをコードするゲノム配列もまた、決定してもよい。
【００４２】
ｒＲＮＡ分子の二次構造および機能の強い相互依存が公知である。実際、ｒＲＮＡの一次配列における進化上の変化は、分子の二次構造が維持されるであろうように、有効に制限されている。例えば、ｒＲＮＡらせんの一方の側で塩基が変化すると、相補性を保存するため、らせんの逆側で、相殺する変化が行われるであろう（これは共変異（ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ）と呼ばれる）。この関係により、２つの非常に異なるｒＲＮＡ配列を、保存された一次配列および二次構造の保存要素に基づき、「並列させる」ことが可能になる。配列が並列にされたら、ｒＲＮＡ配列の保存および可変領域を同定することが可能になる。
【００４３】
ｒＲＮＡの可変領域は、公表されたｒＲＮＡ配列および本発明の開発中に決定された配列を用いた比較解析により、同定した。商業的に入手可能なソフトウェアを用いても、または本明細書に開示される目的に適応させたものを用いてもよい。ｒＲＮＡの可変領域（例えば、最低１０ヌクレオチドに広がる）の各々での配列進化は、大部分、分岐的であり、そして収束的でないため、標的生物およびその系統発生的に最近である類縁体（ｒｅｌａｔｉｖｅ）の間で異なるいくつかのｒＲＮＡ配列に基づき、自信を持ってプローブを設計することが可能である。実際、我々は、単一の試料中で、多くの標的生物およびその最近系統発生的類縁体のｒＲＮＡ配列間の十分な変動を検出し、以下に記載される方法にしたがって用いることが可能なプローブの設計を可能にしてきている。
【００４４】
プローブ選択指針
本発明にしたがった、望ましい特性を有するプローブを設計するのに、以下の一般的な指針を用いてもよい。ハイブリダイゼーション反応の度合いおよび特異性に影響を与える多くの要因の１つまたはそれ以上を操作すると、特定のプローブの感受性および特異性を決定することが可能である。これは、プローブが、その標的ポリヌクレオチド配列の全長に渡り、完全に相補的であってもなくても、あてはまる。本発明と関連し有用なプローブを調製する指針を以下に記載する。
【００４５】
まず、アッセイ条件に適合するよう、プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性を選択しなければならない。これは、長いＡおよびＴリッチ配列を避け、ハイブリッドをＧ：Ｃ塩基対で終結させ、そしてＴｍが、アッセイに使用しようとする標準的条件に適切であろうように、プローブを設計することにより、達成することが可能である。プローブのヌクレオチド配列は、長さ並びに％Ｇおよび％Ｃが、最終アッセイが行われるであろう温度より、約２−１０℃高いＴｍを有するプローブを生じるように、選択しなければならない。Ｇ：Ｃ塩基対は、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ塩基対と比較した際、より高い熱安定性を示すため、プローブの塩基組成は重要である。したがって、高Ｇ：Ｃ含量を有する相補的核酸を伴うハイブリッドは、より低いＧ：Ｃ含量を有するハイブリッドと比較した際、より高い温度で安定であろう。
【００４６】
ヌクレオチド間のホスホジエステル結合により提供されるであろうような、陰性荷電骨格を有するプローブを設計する際、ハイブリダイゼーション反応が行われるであろう、イオン強度および温度条件もまた、考慮しなければならない。ハイブリダイゼーション速度は、反応混合物のイオン強度が増加するにつれ、増加することが、一般的に知られる。同様に、ハイブリッドの熱安定性は、イオン強度の増加と共に増加する。逆に、水素結合破壊試薬、例えばホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコールは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させる。この種の試薬による水素結合の不安定化は、Ｔｍを非常に減少させることが可能である。一般的に、長さ約１０−５０塩基の合成オリゴヌクレオチドプローブの最適ハイブリダイゼーションは、既定の二重鎖の融解温度のおよそ５℃下で起こる。最適温度以下で行われるハイブリダイゼーション反応は、ミスマッチ塩基配列がハイブリダイズすることを可能にする可能性があり、そしてプローブ特異性の減少を生じる可能性がある。
【００４７】
第二に、プローブがその標的ポリヌクレオチドに結合する位は、プローブ：非標的ポリヌクレオチドの間に形成されるハイブリッドの安定性を最小にするよう選択しなければならない。これは、非標的生物のポリヌクレオチドとの完全な相補性の長さを最小限にし、非標的配列との相同性のＧ：Ｃリッチ領域を回避し、そして可能な限り多くの不安定化ミスマッチに渡るよう、プローブを配置することにより、達成することが可能である。プローブ配列が、特定の種類の生物のみを検出するのに有用であるかどうかは、主に、プローブ：標的ハイブリッドおよびプローブ：非標的ハイブリッドの間の熱安定性相違に依存する。非常に特異的なプローブを産生するため、Ｔｍの相違は、可能な限り大きくなければならない。
【００４８】
標的核酸配列の長さおよび対応するプローブ配列の長さもまた、放線菌類を特異的に検出するのに有用なプローブを設計する際、考慮すべき重要な要因である。完全に相補的でないポリヌクレオチドが、互いにハイブリダイズすることは可能であるが、完全に相同な塩基配列の最長の範囲が、通常、ハイブリッド安定性の主な決定要因であろう。
【００４９】
第三に、プローブのハイブリダイゼーションに阻害性である強い内部構造を形成することが知られるｒＲＮＡの領域は、標的としてより好ましくない。広範囲の自己相補性を有するプローブもまた、避けなければならない。上述のように、ハイブリダイゼーションは、水素結合二本鎖構造を形成する、相補的核酸の２つの一本鎖の結合である。２つの鎖の１つが、完全にまたは部分的に二本鎖を形成している場合、これは、新たなハイブリッドの形成により参加しにくいであろう。重要なことに、すべてのｒＲＮＡ分子は、非常に安定な分子内ハイブリッドを形成する。
【００５０】
プローブおよびその標的の間のハイブリダイゼーションの速度および度合いは、目的の配列のかなりの部分が一本鎖であるように、プローブを設計することにより、実質的に増加させることが可能である。検出しようとする標的核酸が、ｒＲＮＡをコードするゲノム配列である場合、標的は、当然、二本鎖型で発生するであろう。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物にもあてはまる。これらの二本鎖標的は、当然、プローブとのハイブリダイゼーションに阻害性である。最後に、十分な自己相補性があれば、単一のプローブ分子内でまたは異なるプローブ分子間で、望ましくない分子間および分子内ハイブリッドが形成される可能性がある。したがって、プローブ配列内の広範囲の自己相補性は、避けなければならない。
【００５１】
好ましくは、以下に記載される方法を行うのに有用なプローブは、高ストリンジェンシーの条件下でのみ、ハイブリダイズするであろう。これらの条件下では、非常に相補的な核酸ハイブリッド（すなわち、一連の隣接する塩基の、１７のうち少なくとも１４が相補的であるもの）のみが、形成されるであろう。十分な度合いの相補性が存在しなければ、ハイブリッドは形成されないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する2つの核酸鎖の間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、標的および非標的核酸で形成されるハイブリッド間の安定性の相違を最大にするよう選択される。典型的な高ストリンジェンシー条件が、以下に示される実施例に使用される。
【００５２】
異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを、放線菌検出に用いることが可能であるが、本発明の好ましいプローブは、１００ヌクレオチド、そしてより好ましくは、６０ヌクレオチドまでの長さを有する。本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい長さの範囲は、長さ１０ないし１００塩基、またはより好ましくは、長さ１５および５０塩基の間であり、そして標的核酸に対し、以下に記載される実施例に使用されるような、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相同である。しかし、以下に記載される特定のプローブ配列はまた、核酸クローニングベクターまたは転写物あるいはより長い核酸中に提供される可能性があり、そしてなお放線菌類のメンバーを検出するのに使用することが可能である。
【００５３】
オリゴヌクレオチドの化学構造
本発明のすべてのオリゴヌクレオチドは、その成果を亢進するため、化学基で修飾してもよい。したがって、「オリゴヌクレオチドプローブ」または「ヘルパーオリゴヌクレオチド」または単に「オリゴヌクレオチド」は、天然ヌクレオチドのポリマーと共に、少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含むポリマーも含むと理解すべきである。
【００５４】
骨格修飾オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートまたはメチルホスホネート基を有するものが、本発明のオリゴヌクレオチドと関連して用いてもよい類似体の例である。これらの修飾は、オリゴヌクレオチドに、特定のポリメラーゼまたはヌクレアーゼ酵素の核酸溶解活性に対する耐性を与える。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの構造に取り込んでもよい他の類似体には、ペプチド核酸、または「ＰＮＡ」が含まれる。ＰＮＡは、ホスホジエステル骨格でなくペプチド骨格に結合したリガンドを含む化合物である。代表的なリガンドには、適切なリンカーを通じ、ペプチド骨格に結合した、４つの主な天然発生ＤＮＡ塩基（すなわち、チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン）または他の天然発生核酸塩基（例えば、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシンまたはチオウラシル）または人工的塩基（例えば、ブロモチミン、アザアデニン類またはアザグアニン類など）のいずれかが含まれる。ＰＮＡは、相補的ｓｓＤＮＡおよびＲＮＡ鎖に結合することが可能である。ＰＮＡを作成しそして用いるための方法は、米国特許第５，５３９，０８２号に開示される。本明細書に記載される配列を有するオリゴヌクレオチドを作成するのに用いてもよい修飾の別の種類は、プライマーのハイブリダイゼーションまたは伸長に緩衝しない、核酸鎖中のヌクレオチド間に取り込まれた、非ヌクレオチドリンカーの使用を伴う（例えば、本明細書に援用される、Ａｒｎｏｌｄら，  “Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ”，  米国特許第６，０３１，０９１号）。
【００５５】
ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出する、核酸に基づく方法
オリゴヌクレオチドプローブを含む組成物は、単独で、あるいは１つまたはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせ、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、放線菌細菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出するのに用いてもよい。本発明を実施するのに用いることが可能な明示されたオリゴヌクレオチドは、シアノエチルホスホロアミダイト前駆体を用いた自動化固相化学合成（Ｂａｒｏｎｅら，  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：４０５１（１９８４））を含む、いくつかの公知の方法のいずれにより、産生してもよい。合成オリゴヌクレオチドを調製するための他の公知の方法もまた、使用してもよい。
【００５６】
標識プローブが望ましい場合、本質的に、特異的な核酸ハイブリダイゼーションをモニターするのに用いることが可能な、いかなる標識および検出系を、本明細書に開示されるプローブに関し用いてもよい。有用な標識のコレクションに含まれるのは：同位体標識、酵素、ハプテン、結合オリゴヌクレオチド、化学発光分子および電気化学的検出法を行いやすい酸化還元活性部分である。標識オリゴヌクレオチドを産生するのに用いてもよい標準的同位体標識には、3Ｈ、35Ｓ、32Ｐ、125Ｉ、57Ｃｏおよび14Ｃが含まれる。放射標識プローブを用いる場合、ハイブリッドは、オートラジオグラフィー、シンチレーション計測またはガンマ計測により、検出することが可能である。
【００５７】
非同位体成分もまた、オリゴヌクレオチドプローブを標識するのに用いてもよい。これらの非同位体標識は、オリゴヌクレオチドプローブの内部に、または末端に配置してもよい。修飾ヌクレオチドは、プローブ合成中または合成後に行われる、プローブの修飾により、例えば非ヌクレオチドリンカー基の使用により、酵素的または化学的に取り込んでもよい。非同位体標識には、蛍光分子、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたは他のリガンドが含まれる。アクリジニウムエステルは、プローブハイブリッドを検出するのに、特に好ましい非同位体標識である。
【００５８】
実際、本発明にしたがい、標識オリゴヌクレオチドを調製するのに、いかなる数の異なる非同位体標識を用いてもよい。好ましい化学発光分子には、Ａｒｎｏｌｄらにより、米国特許第５，２８３，１７４号に開示される、均質保護アッセイと関連して使用するための種類の、そしてＷｏｏｄｈｅａｄらにより、米国特許第５，６５６，２０７号に開示される、単一反応中で、多数の標的を定量化するアッセイと関連して使用するための種類の、アクリジニウムエステルが含まれる。これらの特許文書に含まれる開示は、本明細書に援用される。米国特許第５，９９８，１３５号は、蛍光測定を用い、プローブ上に配置されたランタニド金属標識からの蛍光発光を検出する、本発明のプローブを標識しそして検出するのに用いてもよいさらに別の方法を開示し、ここで、これらの標識からの発光は、エネルギー移動パートナーにごく近接した際、亢進される。好ましい電気化学的標識および検出アプローチは、米国特許第５，５９１，５７８号および第５，７７０，３６９号、並びに公表国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０８２号に開示され、これらの開示は、本明細書に援用される。本発明において、電気化学標識として有用な酸化還元活性分子は、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、ＦｅおよびＲｕなどの遷移金属を含む。
【００５９】
一般のレベルの当業者は、本発明のプローブを用い、標識プローブまたは非標識プローブを用いる、放線菌細菌の核酸を検出する代替法を行ってもよいことを認識するであろう。例えば、標識プローブの使用に頼らないハイブリダイゼーションアッセイ法が米国特許第５，９４５，２８６号に開示され、該特許は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で作成された非標識プローブの固定、および二本鎖ＰＮＡプローブ／標的核酸二重鎖に結合することが可能な検出可能に標識された挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）分子を記載する。これらの方法と共に、公表国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０８２号、表題“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ”、公表国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２４３０号、表題“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ”、および公表国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２００１４号、表題“Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｖｉａ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｔｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”に開示されるものなどの特定の電気化学的検出法において、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能標識を宿する必要がない。
【００６０】
オリゴヌクレオチドの合成および精製後の最終産物の許容性は、いくつかの方法のいずれにより、確認してもよい。第一に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、標準的実験室法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｕｂｌ．，  １１．５１（１９８９）を参照されたい）にしたがい、オリゴヌクレオチドの大きさおよび純度を決定してもよい。あるいは、この同じ目的に、高圧液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）法を用いてもよい。
【００６１】
以下に記載される方法において、標識オリゴヌクレオチドプローブおよび標的核酸の間のハイブリダイゼーションは、Ｈｏｇａｎらにより、米国特許第５，０３０，５５７号、表題“Ｍｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”に開示される方法にしたがい、非標識「ヘルパーオリゴヌクレオチド」の使用を通じ、亢進してもよい。上述のように、ヘルパーオリゴヌクレオチドは、アッセイプローブが結合する領域以外の標的核酸領域に結合する。本結合は、一本鎖核酸の標的領域上に新たな二次および三次構造を課し、そしてプローブ結合速度を加速する。本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いてもよいヘルパーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ１７ないし１００ヌクレオチドであり、そして配列番号１０の配列内に含まれる、少なくとも１７の隣接するヌクレオチドを含む配列を有する。他の好ましいヘルパーオリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチドまでの長さを有し、そして配列番号１０の配列内に含まれる、少なくとも２５の隣接するヌクレオチドを含む。
【００６２】
一般の当業者は、プローブ：標的ハイブリッドの熱安定性に影響を与える要因はまた、プローブ特異性に影響を与える可能性もあることを認識するであろう。したがって、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を含む融解プロフィールは、各プローブ：標的の組み合わせに関し、実験的に決定しなければならない。この決定を行うのに好ましい方法は、Ａｒｎｏｌｄらにより、米国特許第５，２８３，１７４号、表題“Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ”に記載される。
【００６３】
プローブ：標的ハイブリッドのＴｍを測定するための１つのアプローチは、ハイブリダイゼーション保護アッセイを行うことを伴う。本アッセイの方法にしたがい、ラウリル硫酸リチウムを含むコハク酸リチウム緩衝溶液中で、標的過剰の条件下で、プローブ：標的ハイブリッドを形成させる。「あらかじめ形成された」ハイブリッドのアリコットを、ハイブリダイゼーション緩衝液中で希釈し、そして予期されるＴｍ（典型的には５５℃）以下で始まり、そして２−５℃増分で増加する、多様な温度で、５分間インキュベーションする。その後、本溶液を、穏やかなアルカリホウ酸緩衝液で希釈し、そしてより低い温度（例えば５０℃）で１０分間希釈する。一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステル（ＡＥ）は、これらの条件下で加水分解されるであろうが、ハイブリダイズプローブに結合したアクリジニウムエステルは、比較的「保護される」であろう。本方法は、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（「ＨＰＡ」）と称される。残存する化学発光の量は、ハイブリッドの量に比例し、そして過酸化水素に続き、アルカリの添加により、発光測定装置中で測定する。データは、温度に対する最大シグナル（通常、最低温度からのもの）のパーセントとしてプロットする。Ｔｍは、最大シグナルの５０％が残存する点と定義される。
【００６４】
別のアプローチにおいて、同位体標識したプローブを用い、プローブ：標的ハイブリッドのＴｍを決定してもよい。すべての場合で、既定のハイブリッドのＴｍは、ハイブリダイゼーション溶液に含まれる塩、界面活性剤および他の溶質の濃度に応じて異なるであろう。これらの要因はすべて、熱変性中の相対ハイブリッド安定性に影響を与える（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｕｂｌ．，９．５１（１９８９））。
【００６５】
プローブがその標的にハイブリダイズする速度は、プローブ領域における標的二次構造の熱安定性の測定値であり、そしてＣ0ｔ1/2測定値を用い、決定することが可能である。ハイブリダイゼーション速度のこれらの動力学的測定値は、（１リットルあたりのヌクレオチドのモル数）ｘ（秒）の単位を有する。より簡単に表現すると、Ｃ0ｔ1/2値は、プローブ濃度にその濃度でのハイブリダイゼーションの半減期を乗じたものである。この値は、多様な量のプローブを、一定の量の標的核酸に、固定した時間、ハイブリダイズさせることにより、決定することが可能である。例えば、０．０５  ｐｍｏｌの標的を、０．０１２、０．０２５、０．０５、０．１および０．２  ｐｍｏｌのプローブと３０分間インキュベーションする。Ｃ0ｔ1/2値はまた、標的過剰の条件下で、標的およびプローブをハイブリダイズさせ、そしてその後、時間に渡る二重鎖形成の増加を測定することにより、決定することも可能である。存在するハイブリッドの量は、上述のＨＰＡ法を用い、または方法に放射標識プローブを用いた場合、シンチレーション計測により、測定してもよい。その後、ＡＥ標識プローブを用いた場合、測定シグナルを、プローブ濃度（１リットルあたりのヌクレオチドのモル数）に対する、最高プローブ濃度からの最大相対光単位（「ＲＬＵ」）のパーセントの対数としてプロットする。Ｃ0ｔ1/2は、最大ハイブリダイゼーションの５０％に対応する濃度に秒のハイブリダイゼーション時間を乗じ、グラフ的に決定する。これらの値は、９  ｘ  １０-6ないし９  ｘ  １０-5の範囲であり、好ましい値は、３．５  ｘ  １０-5未満である。同様の値は、放射能を測定し、そして最大の度合いに対し、既定の時点での％ハイブリダイゼーションをプロットすることにより、得ることが可能である。
【００６６】
生物学的試料が、放線菌類のメンバーの存在を示すであろうｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを含むかどうか決定する好ましい方法において、超音波破壊により、例えばＭｕｒｐｈｙらにより米国特許第５，３７４，５２２号に開示される方法にしたがい、細菌細胞から核酸を放出させてもよい。細胞を破壊する他の既知の方法には、酵素、浸透圧ショック、化学薬品処理、およびガラスビーズでのボルテックスの使用が含まれる。本明細書に開示されるハイブリダイゼーション法に供することが可能な、核酸を微生物から遊離させるのに適した他の方法は、Ｃｌａｒｋらにより米国特許第５，８３７，４５２号に、そしてＫａｃｉａｎらにより米国特許第５，３６４，７６３号に開示されている。ｒＲＮＡの放出に続きまたはそれと同時に、促進剤の存在下で、標識プローブを添加し、そしてかなりのハイブリダイゼーション反応を達成するのに必要な期間、最適ハイブリダイゼーション温度でインキュベーションしてもよい。
【００６７】
以下のポリヌクレオチド配列、ＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＴＣＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＴＴＣＧ（配列番号１）は、長さ、Ｔｍおよびヌクレオチド配列の規準により、性質決定され、そして放線菌のｒＲＮＡに特異的であることが見出された。本明細書において、ＭｔｕＢ２０１１と称される本ポリヌクレオチドは、すべての放線菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡに見られる特有の部分に相補的である。放線菌細菌の代表的なリストは、表２に見出すことが可能である。該プローブは、長さ２９塩基であり、５’端から１１および１２ヌクレオチドの間にＲＸＬリンカーを有し、そして６５．５℃のＴｍを有し、そして大腸菌２３Ｓ  ｒＲＮＡの塩基２０１１−２０４０に対応する領域において、鳥型結核菌のｒＲＮＡにハイブリダイズする。
【００６８】
本プローブは：（１）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的核酸にハイブリダイズし、（２）１００ヌクレオチド塩基までの長さを有し、そして（３）配列番号１０により同定される１９８６−２０６４標的領域またはその相補体内に属する、少なくとも１７の隣接するヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの１つの例である。これらの特性を有する他のオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションアッセイ検出プローブとしての使用に意図され、そして本発明に含まれる。
【００６９】
同様に、配列番号２および３の配列を有するオリゴヌクレオチドが、有用なヘルパーオリゴヌクレオチドの例として、本明細書に開示される。本明細書中の実用的な実施例に使用されるヘルパーオリゴヌクレオチドと同様、本発明に含まれる他のヘルパーオリゴヌクレオチドもまた、長さ１００ヌクレオチドまでの配列を有し、そして、配列番号１０により同定される標的領域またはその相補体に含まれる、少なくとも１７の、またはより好ましくは少なくとも２５の隣接するヌクレオチドをさらに有する。
【００７０】
以下に示されるように、ＭｔｕＢ２０１１プローブは、ヘルパーオリゴヌクレオチドの使用により促進される方式で、放線菌ｒＲＮＡにハイブリダイズした。この決定を行うのに用いた方法にしたがい、５’端で放射標識された一本鎖プローブオリゴヌクレオチドを、ヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で、鳥型結核菌由来のｒＲＮＡと接触させた。ｒＲＮＡとハイブリダイズし、二本鎖ハイブリッドを形成するプローブ分子は、ヒドロキシアパタイト捕捉により、一本鎖プローブ分子から分離した。二本鎖ハイブリッドは、ヒドロキシアパタイトに結合させ、そしてシンチレーション計測により検出し、そして定量化した。その後、ハイブリダイゼーションの度合いを、割合として計算した。以下に示されるように、プローブ：標的ハイブリッドのＴｍは、１つまたはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下で、有意に増加した。
【００７１】
以下の実施例は、ＭｔｕＢ２０１１プローブが、鳥型結核菌由来のｒＲＮＡにハイブリダイズし、そしてこの相互作用が、ハイブリダイゼーション混合物中にヘルパーオリゴヌクレオチドを含むことにより、促進されたことを立証するのに用いた方法を記載する。
【００７２】
【実施例】
実施例１
プローブ：標的ハイブリッドのＴｍ決定
プローブ：標的およびヘルパー：標的ハイブリッドのＴｍ値は、ＭｔｕＢ２０１１の配列を有する末端標識プローブ、並びに群：（Ａ）ＯＭｅＦｒａＢ１９８６および（Ｂ）ＯＭｅＦｒａＢ２０４０より選択される末端標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用い、決定した。ＭｔｕＢ２０１１の配列は、ＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＴＣＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＴＴＣＧ（配列番号１）であり、ＯＭｅＦｒａＢ１９８６の配列は、ＣＣＧＡＧＵＣＵＧＵＧＧＵＵＧＡＧＡＣＡＧＵＧＧＧ（配列番号２）であり、そしてＯＭｅＦｒａＢ２０４０の配列は、ＧＧＵＣＵＵＵＣＣＧＵＣＣＵＧＣＣＧＣＧＣＧＵＡＡ（配列番号３）である。ヘルパーオリゴヌクレオチドＡおよびＢは、プローブにすぐ隣接した分子の領域において、放線菌ｒＲＮＡに結合するよう選択し、ヘルパーＡは２３Ｓ  ｒＲＮＡのほぼ１９８６−２０１０領域に結合し、そしてヘルパーＢは、２３Ｓ  ｒＲＮＡの２０４０−２０６４領域に結合する。プローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドは、本質的に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｕｂｌ．  １０．５９（１９８９））に記載されるように、リン酸ドナーとして［γ−32Ｐ］ＡＴＰを、そしてリン酸移動反応を触媒するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、５’端標識した。末端標識ヘルパーオリゴヌクレオチドは、別個に、マイコバクテリウム・ゴルドナイ由来の精製ｒＲＮＡと合わせ、そしてプローブオリゴヌクレオチドは、鳥型結核菌由来の精製ｒＲＮＡと合わせ、標的過剰の条件を提供した。プローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチド両方を含む試験では、プローブのみを末端標識し、そして各ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的として働く鳥型結核菌ｒＲＮＡより、少なくとも１０倍モル過剰で存在した。すべての混合物は、０．４８  Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム、１  ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１  ｍＭ  ＥＧＴＡを含む溶液中で、完全にハイブリダイズさせた。陰性コントロールとして、プローブおよび／またはヘルパーオリゴヌクレオチドを、核酸標的の非存在下で、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション法が終了した際、混合物を希釈し、そしてヒドロキシアパタイトカラムに通過させ、二本鎖ハイブリッドから一本鎖核酸を分離した。カラムフロースルー中の放射能の量は、一本鎖プローブに相当し、そしてシンチレーション計測により、測定した。ヒドロキシアパタイトに結合した放射能の量は、シンチレーション計測により、別個に測定した。割合として表す、ハイブリッド形成の度合いは、ヒドロキシアパタイトに結合したプローブの量（ｃｐｍで測定）を、カラムに適用したプローブ総量（ｃｐｍ）で割ることにより、計算した。これらの方法の結果を表１に提供する。
【００７３】
表１
標的ｒＲＮＡとＭｔｕＢ２０１１プローブのハイブリダイゼーション
【００７４】
【表１】
0004488629.tif 000002
【００７５】
本方法の結果は、末端標識プローブが、鳥型結核菌および／またはマイコバクテリウム・ゴルドナイ由来のｒＲＮＡにハイブリダイズしたことを確認し、そしてこの相互作用が、ヘルパーオリゴヌクレオチドにより、好都合に促進されたことを示した。我々は、両ヘルパーオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション反応に含まれると、プローブ：標的複合体のＴｍを、６５．５から６９．５℃に増加させることが可能であることを、特に観察した。放線菌ｒＲＮＡとハイブリダイズさせるのに、プローブを、単独で、あるいは１つまたはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いてもよいが、プローブを性質決定する以下に記載される実験は、ＯＭｅＦｒａＢ１９８６およびＯＭｅＦｒａＢ２０４０の配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせたプローブを用い、行った。本明細書に記載される方法に有用なプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドの組み合わせは、好ましくは、上述の条件下で、約６５−７０℃の範囲のプローブ：標的Ｔｍ値を有する。
【００７６】
プローブ特異性は、特異性パネル由来のｒＲＮＡに対する陽性ハイブリダイゼーションを立証することにより、確認した。本方法の標的核酸の供給源として用いた生物のコレクションは、生物の広い分類の代表的な一面および最近近縁体群に相当した。以下の方法において、ＡＥ標識ハイブリダイゼーションプローブを用いた定量的結果を、陽性コントロールプローブを用い、各試料に存在する細菌ｒＲＮＡの量に比較した。細菌のすべての種由来のｒＲＮＡにハイブリダイズするこの陽性コントロールプローブは、ＭｔｕＢ２０１１プローブにハイブリダイズしない、試料中の細菌ｒＲＮＡの存在を確認するのに、特に有用であった。こうした場合、陽性コントロールプローブは、ハイブリダイズ可能ｒＲＮＡの存在の確認を提供し、そしてしたがって、陰性の結果を有効にした。真菌ｒＲＮＡ標的の場合、広く反応性である真菌ｒＲＮＡハイブリダイゼーションプローブが、陽性コントロールとして作用した。
【００７７】
以下の実施例は、ＭｔｕＢ２０１１プローブが、一団の放線菌生物由来のｒＲＮＡにハイブリダイズすることを立証するのに用いた方法を記載する。
実施例２
プローブ特異性の立証
細菌溶解物または精製ＲＮＡを、ＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＣＴＣＧＴＡＧＴＧＣＡＡＴＴＴＣＧ（ＭｔｕＢ２０１１）（配列番号１）の配列を有するプローブと共に、ＣＣＧＡＧＵＣＵＧＵＧＧＵＵＧＡＧＡＣＡＧＵＧＧＧ（ＯＭｅＦｒａＢ１９８６）（配列番号２）およびＧＧＵＣＵＵＵＣＣＧＵＣＣＵＧＣＣＧＣＧＣＧＵＡＡ（ＯＭｅＦｒａＢ２０４０）（配列番号３）の配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの核酸標的として用いた。本方法において、ｒＲＮＡの供給源として使用した生物は、型決定された臨床的単離体またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より得たものであった。すべての試料は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄのマスターログ番号により、表２に同定される。大部分の試料は、ＡＴＣＣより得た。各ｒＲＮＡの平行試料を、ＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＵＵＵＣＧＣ（ＯＭｅＥｃｏＢ１９３３）（配列番号４）の配列を有する標識陽性コントロールプローブ、並びに配列ＵＡＣＣＵＵＡＧＧＡＣＣＧＵＵＡＵ（ＯＭｅＥｃｏＢ１９１６）（配列番号５）およびＣＡＧＧＵＣＧＧＡＡＣＵＵＡＣＣ（ＯＭｅＥｃｏＢ１９４９ａ）（配列番号６）を有する非標識ヘルパーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は、０．６  Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、６０  ｍＭ  コハク酸リチウム、並びに各１０  ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ、ｐＨ  ５．５を含んだ。ＭｔｕＢ２０１１プローブおよび陽性コントロールプローブはどちらも、本質的に、米国特許第５，１８５，４３９号、表題“Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ”に開示される方法にしたがい、アクリジニウムエステルで標識した。ハイブリダイゼーション反応が終了した際、非ハイブリダイズプローブに結合したアクリジニウムエステルは、穏やかなアルカリ条件下で、非化学発光性となり、一方、ハイブリダイズプローブに結合したアクリジニウムエステルは、不活性化に耐性のままである。加水分解およびアクリジニウムエステルで標識されたハイブリダイズプローブの検出条件は、Ａｒｎｏｌｄらにより、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３５：１５８８（１９８９）に記載される。これらの方法におけるプローブハイブリダイゼーションの大きさは、一般の当業者によく知られる方法を用い、発光測定により、定量化した。放線菌プローブシグナルの大きさをその後、細菌陽性コントロールシグナルの大きさで割り、研究結果を定量的に規準化した。陽性コントロールシグナルの３０％より大きいＭｔｕＢ２０１１プローブシグナルを有する試料は、ヘルパーを伴うＭｔｕＢ２０１１プローブの特異的ハイブリダイゼーションを示し、一方、より低い値は、アッセイ形式に関し、陰性結果を示した。アッセイ結果を表２に示す。
【００７８】
表２
ＭｔｕＢ２０１１プローブおよび放線菌のコレクション由来のｒＲＮＡ含有溶解物のハイブリダイゼーション
【００７９】
【表２】
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【００８０】
*「ＧＰ＃」記入項は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄのマスターログ番号を示す。
表２に示される結果は、放線菌ｒＲＮＡに対して向けられるプローブが、多くの放線菌種由来のｒＲＮＡ試料に効率的にハイブリダイズしたことを立証した。
【００８１】
系統発生的に多様な生物の広い範囲に相当する種のコレクションと、標識プローブをハイブリダイズさせることにより、放線菌特異的プローブの特異性をさらに調べた。本方法では、ＡＥ標識プローブを、放線菌の遠い系統発生類縁体でしかない生物由来の個々のｒＲＮＡ含有溶解物と別個に混合した。以下の方法で、陽性コントロールプローブを用いて得た陽性ハイブリダイゼーション結果、およびＭｔｕＢ２０１１プローブを用いて得た陰性結果は、ＭｔｕＢ２０１１プローブが、好都合に、放線菌生物に非常に特異的であることを示した。
【００８２】
以下の実施例は、プローブの特異性を示すのに用いたさらなる方法を記載する。より詳細には、以下の方法は、ＭｔｕＢ２００１プローブが、非系統発生関連生物由来の溶解物と交差ハイブリダイズしないことを示した。
【００８３】
実施例３
系統発生的に関連しない生物との交差ハイブリダイゼーションの欠如
多くの多様な種から単離したｒＲＮＡを含む溶解物を標的核酸として利用したことを除き、先の実施例に記載される方法にしたがい、ＡＥ標識プローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを用い、ハイブリダイゼーションアッセイを行った。方法の結果を表３に示す。配列ＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣＣ（配列番号７）を有する全真菌プローブ、並びに配列ＣＧＵＧＵＵＧＡＧＵＣＡＡＡＵＵＡＡＧＣＣＧＣ（配列番号８）およびＧＣＵＣＵＣＡＡＵＣＵＧＵＣＡＡＵＣＣＵＵＡＵＵＧＵ（配列番号９）を有するメトキシヘルパーオリゴヌクレオチドを、真菌ｒＲＮＡを検出する陽性コントロールとして用いた。真菌生物由来のｒＲＮＡ標的を使用したハイブリダイゼーション法において得た結果を表４に示す。
【００８４】
表３
系統発生的に関連しない生物のコレクション由来のｒＲＮＡとＭｔｕＢ２０１１プローブのハイブリダイゼーション
【００８５】
【表３】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
*「ＧＰ＃」記入項は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄのマスターログ番号を示す。
表４
真菌生物のコレクション由来のｒＲＮＡとＭｔｕＢ２０１１プローブのハイブリダイゼーション
【００９０】
【表４】
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【００９１】
*「ＧＰ＃」は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄのマスターログ番号を示す。
表３および表４に示した結果は、ＭｔｕＢ２０１１プローブが、多くの非関連細菌および真菌種由来のｒＲＮＡと交差ハイブリダイズしないことを立証した。表２に示された陽性ハイブリダイゼーション結果と合わせると、プローブが、放線菌のｒＲＮＡに非常に特異的であることが明らかであった。
【００９２】
これらの結果は、本明細書に開示される新規プローブが、放線菌を検出することが可能であることを立証した。さらに、該プローブは、放線菌を、系統発生的に近い関連にある生物と区別することが可能であった。
【００９３】
本発明は、いくつかの特定の実施例およびその態様に関し、記載されてきている。もちろん、前述の詳細な説明を再吟味すると、一般の当業者には、本発明のいくつかの異なる態様が示唆されるであろう。したがって、本発明の真の範囲は、付随する請求項を参照し、決定されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、陽性反応性および非反応性標的配列のコレクションと、１つのオリゴヌクレオチドプローブおよび２つのヘルパーオリゴヌクレオチドの並列を示す。
【配列表】
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【図１】
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