(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
【化１】
0004413428.tif 000103
を含む、ＰＤＧＦに特異的に結合する核酸リガンド。
【請求項２】
以下の配列：
【化２】
0004413428.tif 000104
を含む、ＰＤＧＦに特異的に結合する核酸リガンド。
【請求項３】
３方向ヘリックスが以下の構造：
【化３】
0004413428.tif 000105
（ここでＰＥＧはポリエチレングリコールである）
をもつ請求項２の核酸リガンド。
【請求項４】
ＰＥＧがヘキサエチレングリコールである請求項３の核酸リガンド。
【請求項５】
３’逆方向Ｔをさらに含む請求項４の核酸リガンド。
【請求項６】
請求項１−５のいずれかに記載のＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体。
【請求項７】
さらに、前記リガンドおよび前記非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の間にリンカーを含む、請求項６の複合体。
【請求項８】
前記リガンドがリンカーを含む、請求項６の複合体。
【請求項９】
前記非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項６の複合体。
【請求項１０】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項９の複合体。
【請求項１１】
前記ポリエチレングリコールが１０−８０Ｋの間の分子量を有する、請求項１０の複合体。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコールが２０−４５Ｋの間の分子量を有する、請求項１１の複合体。
【請求項１３】
請求項１−５のいずれかに記載のＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合させる、ことを含む請求項６の複合体の調整方法。
【請求項１４】
前記複合体が、さらに脂質構築物に結合している、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記脂質構築物がリポソームである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記複合体がＰＤＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物を含み、そして前記複合体が：
ａ）リポソームを形成し；そして
ｂ）核酸リガンドおよび親油性化合物を含む前記複合体を、段階ａ）のリポソームと混合する、これにより前記複合体の核酸リガンド構成要素がリポソームの二重層と結合し、そして脂質二重層の外側から突出する
段階を含む方法により、前記リポソームの二重層と受動的に結合している、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記複合体が、さらに前記リガンドおよび前記親油性化合物の間にリンカーを含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記リガンドがさらにリンカーを含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
哺乳動物およびヒトにおけるＰＤＧＦ仲介疾患または医学症状の治療用医薬組成物の製造のための、請求項６−１２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２０】
哺乳動物およびヒトにおける前記リガンドの薬物動態学的特性を改良するための医薬組成物の製造のための、請求項６−１２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２１】
哺乳動物およびヒトにおける特定のあらかじめ決定された生物学的標的に、療法用または診断用剤を標的化するための医薬組成物の製造のための、療法用または診断用剤をさらに含む請求項６−１２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２２】
哺乳動物およびヒトにおけるＰＤＧＦ仲介血管形成を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項６−１２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２３】
哺乳動物およびヒトにおける腫瘍増殖を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項６−１２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２４】
前記腫瘍あるいは前記腫瘍の周囲の細胞または組織がＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ受容体を発現している、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
哺乳動物およびヒトにおける線維症を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項６−１２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２６】
前記線維症が腎臓線維症、肺線維症、骨髄線維症および放射線治療関連線維症からなる群から選択される、請求項２５の使用。
【請求項２７】
哺乳動物およびヒトにおける再狭窄を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項６−１２のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項２８】
前記再狭窄がイン・ステント（ｉｎ−ｓｔｅｎｔ）再狭窄、冠動脈再狭窄および非冠動脈再狭窄からなる群から選択される、請求項２７の使用。
【請求項２９】
薬学的有効量の請求項６−１２のいずれかに記載の複合体を活性成分として含む、ＰＤＧＦ仲介疾患または医学症状の治療用医薬組成物。
【請求項３０】
ＰＤＧＦ仲介疾患または医学症状が腫瘍、線維症、再狭窄およびＰＤＧＦ仲介血管形成からなる群から選択される、請求項２９の医薬組成物。
【請求項３１】
療法用または診断用剤をさらに含む請求項２９の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本明細書に記載されるのは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に対する、高親和性ｓｓＤＮＡおよびＲＮＡリガンドである。こうした核酸リガンドを同定するために本発明で利用される方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これはＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（指数的濃縮による体系的リガンド展開）の頭字語である。本発明にさらに含まれるのは、ＳＥＬＥＸ方法論によりＰＤＧＦ核酸リガンドを同定し、そして該ＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることにより、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む療法用または診断用複合体を調製するための方法である。本発明はさらに、１つまたはそれ以上のＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体を含む。本発明はさらに、ＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させ複合体を形成することにより、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬剤動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、ＰＤＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築物（Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）、またはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築物を使用することにより、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬剤動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、療法用または診断用剤を、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることにより、ＰＤＧＦを発現している生物学的標的に療法用または診断用剤に標的化するための方法であって、該複合体がさらに脂質構築物と結合し、そしてＰＤＧＦ核酸リガンドがさらに該脂質構築物の外側と結合している方法に関する。
発明の背景
Ａ．ＳＥＬＥＸ法
核酸は主に情報の役割をもつというのが長年の定説であった。ＳＥＬＥＸと呼ばれる、指数的濃縮による体系的リガンド展開として知られる方法によって、核酸はタンパク質と異なる三次元構造多様性を有することが明らかになってきている。ＳＥＬＥＸは高い特異性で標的分子に結合する核酸分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ展開する方法であり、そして１９９０年６月１１日に出願され、現在は放棄されている、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９１年６月１０日に出願された、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／７１４，１３１号、現在は米国特許第５，４７５，０９６号、１９９２年８月１７日に出願された、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／９３１，４７３号、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照されたい）に記載されており、これらはそれぞれ特に本明細書に援用される。これらの各特許出願を、本明細書においてはまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。該ＳＥＬＥＸ特許出願には、いかなる望ましい標的分子に対する核酸リガンドも調製するための、基本的には新規な方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、核酸リガンドと呼ばれる一群の産物を提供する。これらのリガンドはそれぞれ特有な配列を有し、そして望ましい標的化合物または分子に特異的に結合する特性を有する。ＳＥＬＥＸにより同定された核酸リガンドはそれぞれ、既定の標的化合物または分子に特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸が、モノマーであってもポリマーであっても、実質的にいかなる化学物質にもリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）のに十分な多様な二次元および三次元構造の形成能、ならびにそれに十分な化学的多能性をそれらのモノマー内に有するという、特有な洞察に基づく。いかなるサイズまたは組成の分子も、標的とすることが可能である。
【０００２】
ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的にいかなる望ましい基準の結合親和性および選択性も達成するものである。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム配列の部分を含む核酸混合物から出発し、結合に好ましい条件下で該混合物を標的と接触させ、標的分子に特異的に結合している核酸から未結合核酸を分配し、該核酸−標的複合体を解離させ、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅し、核酸のリガンド濃縮混合物を得て、次いで結合、分配、解離および増幅の各段階を望ましいサイクル数で再反復して、標的分子に対し特異性の高い高親和性核酸リガンドを得る段階を含む。
【０００３】
ＳＥＬＥＸ法は、核酸が化学物質として広範な形状、サイズおよび立体配置のアレイを形成することが可能であり、そして生物学的系において核酸が示すよりはるかに広いレパートリーの結合その他の機能を示しうることを証明することを、本発明者は認識してきた。
【０００４】
本発明者らは、いかなる既定の標的に対しても核酸リガンドを同定しうるものと類似の様式で、ＳＥＬＥＸまたはＳＥＬＥＸ様方法を利用していかなる選択された反応も促進しうる核酸を同定することが可能であることを認識してきた。理論的には、核酸約１０13ないし１０18の候補混合物内に、多様な物理的および化学的相互作用のそれぞれを促進するのに適した形状をもつ核酸が少なくとも１つ存在すると本発明者らは仮定する。
【０００５】
多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。例えば１９９２年１０月１４日に出願された、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”と題される米国特許出願第０７／９６０，０９３号は、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、例えば折れ曲がりＤＮＡを選択することを記載する。１９９３年９月１７日に出願された、“Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／１２３，９３５号は、ＳＥＬＥＸに基づく方法であって、標的分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいはそれらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するための方法を記載する。１９９３年１０月７日に出願された、“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｆｆｅｉｎｅ”と題される米国特許出願第０８／１３４，０２８号は、現在は米国特許第５，５８０，７３７号である米国特許出願第０８／４４３，９５７号に有利になるよう放棄されたが、非ペプチド性であってもよい非常に近縁な分子間を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法を記載する。１９９３年１０月２５日に出願された、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／１４３，５６４号は、現在は米国特許第５，５６７，５８８号である米国特許出願第０８／４６１，０６９号に有利になるよう放棄されたが、標的分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法を記載する。
【０００６】
ＳＥＬＥＸ法は、例えば改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性または改良された搬送特性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含む、高親和性核酸リガンドの同定を含む。こうした修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含む核酸リガンドは、１９９３年９月８日に出願された、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題される米国特許出願第０８／１１７，９９１号であるが、現在は米国特許第５，６６０，９８５号である米国特許出願第０８／４３０，７０９号に有利になるよう放棄された出願に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第０８／１３４，０２８号は、２′−アミノ（２′−ＮＨ2）、２′−フルオロ（２′−Ｆ）、および／または２′−Ｏ−メチル（２′−ＯＭｅ）で修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、高特異性核酸リガンドが記載されている。１９９４年６月２２日に出願された、“Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  ２’−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０８／２６４，０２９号は、種々の２′−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。
【０００７】
ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを、他の選択したオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを含む。これらはそれぞれ１９９４年８月２日に出願された、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２８４，０６３号、現在は米国特許第５，６３７，４５９号、および１９９４年４月２８日に出願された、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２３４，９９７号、現在は米国特許第５，６８３，８６７号に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状およびその他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。
【０００８】
ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包含する。これは１９９５年５月４日に出願された、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題される米国特許出願第０８／４３４，４６５号に記載されている。診断用または療法用複合体において、親油性化合物、例えばジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールと結合しているＶＥＧＦ核酸リガンドは、１９９６年１０月２５日に出願された、“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題される米国特許出願第０８／７３９，１０９号に記載されている。グリセロール脂質などの親油性化合物、またはポリエチレングリコールなどの非免疫原性高分子量化合物と結合しているＶＥＧＦ核酸リガンドは、１９９７年７月２１日に出願された、“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題される米国特許出願第０８／８９７，３５１号にさらに記載されている。非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合しているＶＥＧＦ核酸リガンドはまた、１９９７年１０月１７日に出願された、“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題されるＰＣＴ／ＵＳ９７／１８９４４にもさらに記載される。基本的ＳＥＬＥＸ法の修飾につき記載した上記特許出願それぞれは、全体として特に本明細書に援用される。
Ｂ．脂質構築物
脂質二重層小胞は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分を有する個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水性部分はホスファト、グリセリルホスファト、カルボキシ、スルファト、アミノ、ヒドロキシ、コリンまたはその他の極性基を含みうる。親油性基の例は、飽和または不飽和炭化水素、例えばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステロール類（例えばコレステロール）および他の薬学的に許容しうる佐剤（ａｊｕｖａｎｔ）（アルファ−トコフェロールのような酸化防止剤を含む）もまた、含有されてもよい。
【０００９】
リポソームはこれらの二重層小胞の集合体であり、主に、脂肪酸鎖からなる２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子を含む。これらの分子は水に曝露されると自発的に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で結合し、対向する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、球状二重膜を形成する。したがって膜のそれぞれの側は親水性表面となり、一方、膜の内部は親油性媒質を含む。これらの膜を、内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で薄い水の層で分離された一連の同心球状膜として配置させることが可能である。これらの多重膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を適用して、小さな小胞、または単膜小胞（ＵＶ）に変換することが可能である。
【００１０】
療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では通常は有毒である薬剤の搬送が含まれる。リポソームの形で有毒薬剤を密閉し、そして該薬剤に対し感受性である組織から逸らし、そして選択した領域に標的化することが可能である。リポソームはまた、長期間にわたって薬剤を放出させる療法に使用することも可能であり、これにより投与回数を減らすことが可能である。さらにリポソームは、通常は静脈内搬送に適さない疎水性または両親媒性薬剤の水性分散液の調製方法を提供することが可能である。
【００１１】
多くの薬剤および造影剤は、療法能または診断能を持つためには体内の適正な位置へ搬送されることが必要であり、そしてしたがって、リポソームを容易に注入し、そして特定の細胞種または身体部分へ持続放出および薬剤搬送するための基礎を形成することが可能である。被包（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）薬剤を、感受性組織から逸らし、選択した宿主の組織に標的化するためにリポソームを使用するには、幾つかの技術を採用してもよい。これらの技術には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれらの投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であるという理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取り込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアランス速度、および広い生体内分布を示すことが認められてきている。
【００１２】
リポソームの受動搬送には、種々の投与経路、例えば静脈内、皮下、筋内および局所の使用を伴う。各投与経路により、リポソーム局在性の違いが生じる。選択した標的領域へリポソームを能動的に向けるために用いる２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付着させることを伴う。抗体はそれらの対応する抗原に対し高い特異性をもつことが知られており、そしてリポソームの表面に付着されたが、多くの場合、結果は成功とはいえなかった。しかし抗体を用いずに腫瘍にリポソームを標的化する幾つかの試みが成功した。例えば米国特許第５，０１９，３６９号、米国特許第５，４４１，７４５号、または米国特許第５，４３５，９８９号を参照されたい。
【００１３】
研究者らが積極的に追求している開発分野は、特定の細胞種のみでなく、細胞の細胞質中へ、そしてさらには核中へ薬剤を搬送することである。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイムおよびタンパク質など、生物学的剤の搬送に特に重要である。この分野の有望な療法の試みは、アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドを疾患の治療に用いるものである。しかしアンチセンス技術の有効適用に際し生じる重大な問題のひとつは、ホスホジエステル型のオリゴヌクレオチドが標的細胞に達する前に、体液中で、そして細胞内および細胞外酵素、例えばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにより、速やかに分解されることである。静脈内投与によっても腎臓により血流から速やかにクリアランスされ、そして有効な細胞内薬剤濃度を生じるのには取り込みが不十分である。リポソーム被包は分解酵素からオリゴヌクレオチドを保護し、循環半減期を延長し、そしてリポソームの食作用の結果、取り込み効率を高める。このように、オリゴヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏでそれらの望ましい標的に到達させ、そして細胞に搬送することが可能である。
【００１４】
研究者らがアンチセンスオリゴヌクレオチドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に付着させた数例が報告されている。しかしアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内剤として有効であるにすぎない。上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体を標的とするアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドは、ポリエチレングリコールスペーサーを介し葉酸に結合させたリポソーム（葉酸−ＰＥＧ−リポソーム）に被包され、そして葉酸受容体仲介エンドサイトーシスにより培養ＫＢ細胞中へ搬送されている（Ｗａｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９５）９２：３３１８−３３２２）。さらに、アルキレンジオールがオリゴヌクレオチドに結合されている（Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，２４５，０２２号）。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させた親油性化合物が文献に示されている（ＥＰ  ４６２  １４５  Ｂ１）。
【００１５】
リポソームへの生物学的剤の装填は、脂質処方への含有またはあらかじめ形成したリポソームへの装填により達成してもよい。オリゴペプチドおよびオリゴ糖リガンドをリポソームの外面に受動的にアンカリング（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）させることが記載されている（Ｚａｌｉｐｓｋｙら（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：１１１：１１８）。
Ｃ．ＰＤＧＦ
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、元来、血小板溶解物から単離され、そして血清に存在するが血漿には存在しない主要な増殖促進活性として同定された。２つの相同なＰＤＧＦアイソフォーム、ＰＤＧＦ  ＡおよびＢが同定されてきており、これらは別個の遺伝子（染色体７上および２２上）にコードされる。血小板由来の最も豊富な種は、ＡＢヘテロ二量体であるが、発生しうる３つの二量体（ＡＡ、ＡＢおよびＢＢ）はすべて、天然に発生する。翻訳に続き、ＰＤＧＦ二量体は〜３０  ｋＤａの分泌タンパク質にプロセシングされる。高い親和性でＰＤＧＦに結合する２つの細胞表面タンパク質、αおよびβが同定されてきている（Ｈｅｌｄｉｎら（１９８１）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７８：３６６４；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７９：５８６７）。両種とも、５つの免疫グロブリン様細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、およびキナーゼ挿入ドメインにより分離されている細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。機能する高親和性受容体は二量体であり、そして該受容体の細胞外ドメインをＰＤＧＦが占めると、いくつかのチロシン残基の交差リン酸化（１つの受容体チロシンキナーゼが二量体のもう一方をリン酸化する）が生じる。受容体リン酸化により、核への分裂促進性または走化性情報伝達を生じる事象のカスケードが導かれる。例えば、ＰＤＧＦ  β受容体の細胞内ドメインにおける９つのチロシン残基は、リン酸化された際、ホスホリパーゼＣ−ｇ、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質およびいくつかのアダプター分子、例えばＳｈｃ、Ｇｒｂ２およびＮｃｋを含む、異なるｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン含有タンパク質と相互作用すると同定されてきている（Ｈｅｌｄｉｎ（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８０：２１３）。ここ数年で、３つの受容体二量体（αα、αβ、およびββ）に対する３つのＰＤＧＦアイソフォームの特異性が解明されてきている。α受容体ホモ二量体は、高い親和性で３つのＰＤＧＦアイソフォームすべてと結合し、β受容体ホモ二量体は、ＰＤＧＦ  ＢＢにのみ高い親和性で結合し、そしてＰＤＧＦ−ＡＢにはおよそ１０倍低い親和性で結合し、そしてαβ受容体ヘテロ二量体は、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢと高い親和性で結合する（ＷｅｓｔｅｒｍａｒｋおよびＨｅｌｄｉｎ（１９９３）Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ  ３２：１０１）。この特異性パターンは、Ａ鎖がα受容体にのみ結合し、そしてＢ鎖が高い親和性でαおよびβ受容体サブユニット両方に結合できることから生じる。
【００１６】
増殖性疾患、例えば、癌、再狭窄、線維症、血管形成、および創傷治癒などにおけるＰＤＧＦの役割が確立されてきている。
【００１７】
癌におけるＰＤＧＦ
ＰＤＧＦ発現が悪性トランスフォーメーションに関連しているという最初の暗示は、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖のアミノ酸配列が、サル肉腫ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＳＶ）のトランスフォーミングタンパク質であるｐ２８sisのものと実質的に同一であるという発見に由来した（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：３５；Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：９２１）。ＰＤＧＦ−Ｂ鎖遺伝子のトランスフォーミング能および、それより低い度合いであるがＰＤＧＦ−Ａ遺伝子のトランスフォーミング能が、その後まもなく立証された（Ｃｌａｒｋｅら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：４６４；Ｇａｚｉｔら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３９：８９；Ｂｅｃｋｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１３４６；Ｂｙｗａｔｅｒら（１９９８）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８：２７５３）。それ以来、多くの腫瘍細胞株がＰＤＧＦを産生しそして分泌し、そのうちいくつかはまた、ＰＤＧＦ受容体も発現していることが示されてきている（Ｒａｉｎｅｓら（１９９０）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ中，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，第一部，ｐ１７３）。したがって、ＰＤＧＦによりパラクリン、そしていくつかの細胞株においてはオートクリン増殖刺激されている可能性がある。例えば、ヒト神経膠腫由来の生検の解析により、２つのオートクリンループの存在が明らかになってきている：腫瘍関連内皮細胞におけるＰＤＧＦ−Ｂ／β受容体ループおよび腫瘍細胞におけるＰＤＧＦ−Ａ／α受容体ループである（Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：７７４８；Ｈｅｒｍａｎｓｓｏｎら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２：３２１３）。高度の神経膠腫の進行には、腫瘍関連内皮細胞におけるＰＤＧＦ−Ｂおよびβ受容体、および神経膠腫細胞におけるＰＤＧＦ−Ａの発現増加が伴う。したがって、ＰＤＧＦ過剰発現は、腫瘍細胞を直接刺激することにより、または腫瘍関連ストローマ細胞（例えば内皮細胞）を刺激することにより、腫瘍増殖を促進する可能性がある。内皮細胞の増殖は、血管形成の特徴である。ＰＤＧＦおよび／またはＰＤＧＦ受容体の発現増加はまた、線維肉腫（Ｓｍｉｔｓら（１９９２）Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４０：６３９）および甲状腺癌（Ｈｅｌｄｉｎら（１９９１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：２１８７）を含む、他の悪性疾患でも観察されてきている。
【００１８】
心臓血管疾患におけるＰＤＧＦ
経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）は、１つまたは２つの冠動脈を含む閉塞性冠動脈疾患（ＣＡＤ）の最も一般的な治療となってきている。米国のみで、年間約５００，０００の処置がなされ、２０００年までに７００，０００を超える処置が計画され、そして世界的にはこれらの２倍の量がなされている。ＰＴＣＡは、冠動脈内部の操作を伴う一方、心臓の外科的介入とは見なされていない。最も一般的なＰＴＣＡ処置においては、バルーンカテーテルを大腿動脈を通して入れ、そして閉塞した冠動脈の斑（ｐｌａｑｕｅ）がある部分に配置し；配置したら直ちにバルーンを高圧で膨らませ、斑に圧を加え、そして血管腔を増加させる。不運なことに、３０−５０％のＰＴＣＡ処置で、罹患した血管壁での細胞事象のため、数週間または数か月の期間にわたり、再閉塞が次第に発展する。ひとたび、再閉塞が、元来の血管腔の５０％またはそれ以上の減少を達成したなら、血管において臨床的再狭窄が確立される。
【００１９】
冠動脈形成術がバイパス手術より侵襲性の低い代替法として人気が増加していることを考慮すると、再狭窄は、深刻な医学的問題である。平滑筋細胞（ＳＭＣ）は再狭窄損傷の主要な構成要素を代表する。未損傷動脈において、ＳＭＣは、主に中間の血管層（中膜）に位置する。内側の層（内膜）から内皮細胞を除く、バルーン損傷に際し、ＳＭＣが増殖しそして内膜に移動し、再狭窄損傷に特徴的な新規の内膜肥厚を形成する。血管形成術に続き、再狭窄が起こると、通常、ステント配置を伴うまたは伴わない血管形成術を繰り返すことにより、または血管移植手術（バイパス）により治療する。
【００２０】
ステントは、堅い筒状のメッシュであり、疾患血管部位にひとたび配置され、そして拡大すると、機械的に拡張血管壁を保持する。ステントは、カテーテルにより配置され、そして、望ましい部位に配置されると、高圧バルーンの膨張により、ｉｎ  ｓｉｔｕで拡大する。堅くそして非圧縮性であるため、拡張ステントは隣接する非疾患血管と匹敵する血管腔直径を達成し、そして維持する；上層の内膜／中膜に強く押し付けられることにより、血流に反応し血管内を移動することに抵抗する。ステント配置を伴うＰＴＣＡは、単独のＰＴＣＡと比較されてきており、そして再狭窄を約半数に減らし、そして他の臨床的結果、例えば心筋梗塞（ＭＩ）およびバイパス手術の必要性を、有意に改善することが示されてきている。
【００２１】
現在、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖が新規内膜損傷形成の主な貢献因子である、かなりの証拠がある。ラットの再狭窄モデルにおいて、新規内膜肥厚が抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体で阻害された（Ｆｅｒｎｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２９−１１３２；Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄら（１９９７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １３０：４５−５１）。逆に、ＰＤＧＦ−ＢＢの外因性投与は、ＳＭＣ移動を促進し、そして新規内膜肥厚増加を引き起こす（Ｊａｗｉｅｎら（１９９２）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８９：５０７−５１１）。ＳＭＣに対するＰＤＧＦ−Ｂの効果は、バルーン損傷後、これらの細胞で高レベルで発現されるＰＤＧＦ  β受容体を通じて仲介される（ＬｉｎｄｎｅｒおよびＲｅｉｄｙ（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．  ７６：９５１−９５７）。さらに、バルーン損傷後の新規内膜肥厚の度合いは、損傷部位のＰＤＧＦ  β受容体の発現レベルに逆に相関していることが見出された（Ｓｉｒｏｉｓら（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９５：６６９−６７６）。
【００２２】
米国特許第５，１７１，２１７号は、バルーンカテーテル処置、例えば血管形成術と組み合わせ、または該処置の後に、持続放出のため、罹患した壁内部位に薬剤を搬送するための方法および組成物を開示する。薬剤は、ＰＤＧＦに対する増殖因子受容体アンタゴニストを含む、平滑筋細胞増殖を阻害することが知られる多様な薬剤から選択してもよい。
【００２３】
米国特許第５，５９３，９７４号は、血管障害、例えば血管再狭窄を、アンチセンスオリゴヌクレオチドで治療するための方法を開示する。該方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでアンチセンスオリゴヌクレオチドを特定の部位に限局して適用することに基づく。該オリゴヌクレオチドは、移植物またはゲルとの混合物中で、標的組織に直接適用しても、あるいは直接注射または注入により適用してもよい。
【００２４】
米国特許第５，５６２，９２２号は、患者に、生物学的に活性がある化合物を限局化搬送するのに適した系を調製するための方法を開示する。該方法は、生物学的に活性がある化合物をポリウレタン被覆全体に浸透させることを可能にするであろう条件下で、ポリウレタン被覆支持体を、被覆増大溶液で処理することに関する。本発明に適した支持体には、とりわけ、金属性ステントが含まれる。本発明に使用するのに適した生物学的に活性がある化合物には、とりわけ、脂質修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２５】
Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄら（１９９７，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １３０：４５−５１）は、ラット頚動脈におけるバルーン損傷に対する新規内膜反応を、ＰＤＧＦ−ＢＢおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する抗体の組み合わせを用い、実質的に阻害することを報告する。
【００２６】
腎臓疾患におけるＰＤＧＦ
多様な進行性腎臓疾患は、線維症を導く、糸球体メサンギウム細胞増殖およびマトリックス集積により特徴付けられる（Ｓｌｏｍｏｗｉｔｚら（１９８８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１９：１５４７−１５４８）。１）メサンギウム細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦを産生し、そして多様な増殖因子がオートまたはパラクリンＰＤＧＦ−Ｂ鎖合成の誘導を介し、メサンギウム増殖を誘導し；２）ＰＤＧＦ  Ｂ鎖およびその受容体が多くの糸球体疾患で過剰発現され；３）ＰＤＧＦ−ＢＢの注入またはＰＤＧＦ−Ｂ鎖ｃＤＮＡでの糸球体トランスフェクションにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで選択的メサンギウム細胞増殖およびマトリックス集積を誘導することが可能であり；そして４）ＰＤＧＦ−Ｂ鎖またはβ受容体ノックアウトマウスはメサンギウムを発達させないことから、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖は、これらの過程の両方を操縦するのに中心的役割を有するようである（ＦｌｏｅｇｅおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９９５）Ｍｉｎｅｒ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ．  ２１：２７１−２８２）。腎臓線維症に貢献するのに加え、ＰＤＧＦはまた、肺および骨髄などの他の器官での線維症発展にも役割を果たすと考えられており、そして他の疾患と関連する可能性もある（Ｒａｉｎｅｓら（１９９０）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  ＳｐｏｒｎおよびＲｏｂｅｒｔｓ監修，中，ｐｐ．１７３−２６２，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。
【００２７】
１つの研究は、腎臓疾患におけるＰＤＧＦ−Ｂ鎖阻害の効果を調べている：Ｊｏｈｎｓｏｎらは、ＰＤＧＦに対する中和ポリクローナル抗体を用い、実験的膜性増殖性糸球体腎炎においてメサンギウム細胞増殖およびマトリックス集積を減少させることに成功した（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：１４１３−１４１６）。本モデルにおいて、抗メサンギウム細胞抗体（抗Ｔｈｙ１．１）をラットに注射することにより、メサンギウム細胞の補体依存溶解に続き、ヒト膜性増殖性腎炎に似た修復の行き過ぎ段階を生じた（Ｆｌｏｅｇｅら（１９９３）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  Ｓｕｐｐｌ．  ３９：Ｓ４７−５４）。Ｊｏｈｎｓｏｎら（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：１４１３−１４１６）の研究の限界には、多量の異種性ＩｇＧを投与する必要性、および異種性ＩｇＧが免疫反応を引き出す可能性がある懸念のため、研究期間が４日に限定されることが含まれた。
【００２８】
ＰＤＧＦの阻害
増殖因子、例えばＰＤＧＦの特異的阻害は、実験および臨床医学の主要な目的となってきている。しかし、本アプローチは、通常、特異的な薬理学的アンタゴニストの欠如により妨げられる。中和抗体はしばしば、ｉｎ  ｖｉｖｏで低い有効性を示し、そして通常免疫原性であるため、利用可能な代替アプローチもまた限定されており、そしてこれによりこれらの目的のためのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療は、まだ初期にある。現在、ＰＤＧＦに対する抗体（Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：１７２１−１７２５；Ｆｅｒｎｓら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２９−１１３２；Ｈｅｒｒｅｎら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１７３：２９４−３０２；Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄら（１９９７）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １３０：４５−５１）および可溶性ＰＤＧＦ受容体（Ｈｅｒｒｅｎら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１７３：２９４−３０２；Ｄｕａｎら（１９９１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：４１３−４１８；Ｔｉｅｓｍａｎら（１９９３）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：９６２１−９６２８）は、最も強力でそして特異的なＰＤＧＦのアンタゴニストである。ＰＤＧＦに対する中和抗体は、ＳＳＶトランスフォーム表現型を逆転させること（Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：１７２１−１７２５）、および動脈損傷後の新規内膜損傷の発展を阻害すること（Ｆｅｒｎｓら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２９−１１３２）が示されてきている。他のＰＤＧＦの阻害剤、例えばスラミン（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８４）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９：２８７−５２９４；Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３９：４４７−４５７）、ネオマイシン（Ｖａｓｓｂｏｔｎら（１９９２）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：１５６３５−１５６４１）およびＰＤＧＦアミノ酸配列由来のペプチド（Ｅｎｇｓｔｒｏｍら（１９９２）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：１６５８１−１６５８７）が報告されてきているが、これらは、優れた薬剤候補になるには、毒性が強すぎるかまたは十分な特異性または効能を欠いている。臨床利用の可能性がある他の種類のアンタゴニストは、ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼを選択的に阻害する分子である（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒら（１９９５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：２５５８−２５６２；Ｋｏｖａｌｅｎｋｏら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：６１０６−６１１４）。
発明の概要
本発明は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および相同タンパク質に対する核酸リガンドを同定しそして産生する方法、ならびにこうして同定されそして産生された核酸リガンドを含む。本適用の目的には、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、および−ＢＢアイソフォームならびに相同タンパク質を指す。特に該定義に含まれるのは、ヒトＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、および−ＢＢアイソフォームである。
【００２９】
本明細書に記載されるのは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に対する高親和性ｓｓＤＮＡおよびＲＮＡリガンドである。このような核酸リガンドを同定するために本発明で利用される方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これは指数的濃縮による体系的リガンド展開の頭字語である。本明細書に含まれるのは、表２−３、６−７、および９ならびに図１−２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、８Ａ、８Ｂおよび９Ａに示される展開されたリガンドである。本発明にさらに含まれるのは、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体を調製するための方法であって、（ａ）候補核酸混合物をＰＤＧＦと接触させ、（ｂ）前記候補混合物のメンバーをＰＤＧＦに対する親和性に基づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＰＤＧＦに対する結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列が濃縮されている核酸混合物を得る方法により、候補核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＰＤＧＦのリガンドである）を同定し、そして前記の同定したＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法による前記方法である。本発明はさらに、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体を含む。
【００３０】
本発明はさらに、ＰＤＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む脂質構築物を含む。本発明はさらに、複合体を含む脂質構築物を調製するための方法であって、該複合体がＰＤＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物を含む方法に関する。
【００３１】
別の態様において本発明は、ＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、そして該複合体を患者に投与するための方法を提供する。本発明はさらに、該複合体をさらに脂質構築物と結合させることにより、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良するための方法に関する。
【００３２】
本発明の目的は、１つまたはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合している１つまたはそれ以上のＰＤＧＦ核酸リガンドを含む複合体、および該複合体を産生するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、複合体を含む脂質構築物を提供することである。本発明のさらなる目的は、改良された薬物動態学的特性を備えた、１つまたはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合している１つまたはそれ以上のＰＤＧＦ核酸リガンドを提供することである。
【００３３】
ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物を含む複合体に向けられる本発明の態様において、非免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコールであることが好ましく、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。より好ましくは、ＰＥＧは約１０−８０Ｋの分子量を有する。最も好ましくは、ＰＥＧは約２０−４５Ｋの分子量を有する。ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物を含む複合体に向けられる本発明の態様において、親油性化合物はグリセロ脂質であることが好ましい。本発明の好ましい態様において、脂質構築物は、好ましくは脂質二重層小胞であり、そして最も好ましくはリポソームである。好ましい態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。
【００３４】
単数または複数のＰＤＧＦ核酸リガンドに共有結合している非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体に向けられる本発明の態様において、単数または複数のＰＤＧＦ核酸リガンドは標的化能に作用することが可能である。
【００３５】
さらにＰＤＧＦ核酸リガンドは、複合体の一部となることなく、脂質構築物と共有結合または非共有結合相互作用により結合していてもよい。
【００３６】
さらに、ＰＤＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築物または非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物／ＰＤＧＦ核酸リガンド複合体を含む脂質構築物に向けられる本発明の態様であって、該脂質構築物が内部コンパートメントを定める膜を有するタイプのもの、例えば脂質二重層小胞である場合、脂質構築物と結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドまたは複合体は脂質構築物の膜と結合するか、またはコンパートメント内に被包されていてもよい。ＰＤＧＦ核酸リガンドが膜と結合している態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドは膜の内側に面した部分または外側に面した部分と結合し、これによりＰＤＧＦ核酸リガンドが小胞の内側または外側へ突出していてもよい。特定の態様では、あらかじめ形成した脂質構築物の外側にＰＤＧＦ核酸リガンド複合体を受動的に装填することが可能である。核酸リガンドが脂質構築物から突出した態様の場合、ＰＤＧＦ核酸リガンドは標的化能に作用することが可能である。
【００３７】
脂質構築物のＰＤＧＦ核酸リガンドが標的化能に作用する態様において、脂質構築物はさらに療法用または診断用薬剤と結合していてもよい。１つの態様において、療法用または診断用剤は脂質構築物の外側に結合している。他の態様において、療法用または診断用剤は脂質構築物に被包されているか、または脂質構築物の内側に結合している。さらに他の態様において、療法用または診断用剤は複合体と結合している。１つの態様において、療法用剤は薬剤である。他の態様において、療法用または診断用剤は１つまたはそれ以上の他の核酸リガンドである。
【００３８】
ＰＤＧＦ仲介疾患を阻害するための方法を提供するのが、本発明のさらなる目的である。ＰＤＧＦ仲介疾患には、限定されるわけではないが、癌、血管形成、再狭窄、および線維症が含まれる。したがって、ＰＤＧＦ核酸リガンド、またはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築物を投与することにより、血管形成を阻害するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。本発明の他の目的は、ＰＤＧＦ核酸リガンド、またはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築物を投与することにより、腫瘍増殖を阻害するための方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、ＰＤＧＦ核酸リガンド、またはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築物を投与することにより、線維症を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、ＰＤＧＦ核酸リガンド、またはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築物を投与することにより、再狭窄を阻害する方法を提供することである。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、療法用または診断用剤を、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることにより、ＰＤＧＦを発現している生物学的標的に療法用または診断用剤を標的化する方法であって、該複合体がさらに脂質構築物と結合し、そしてＰＤＧＦ核酸リガンドがさらに該脂質構築物の外側と結合している方法を提供することである。
【００４０】
これらおよび他の本発明の目的、ならびに本発明の性質、範囲および有用性は、以下の記載および付随する請求項の記載から当業者に明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
定義：
“共有結合”は、電子の共有により形成される化学結合である。
【００４１】
“非共有結合相互作用”は、分子実体が共有結合以外の、イオン性相互作用および水素結合を含めた相互作用により互いに保持される手段である。
【００４２】
“親油性化合物”は、脂質および／または誘電率の低い他の物質もしくは相と結合するか、またはそれらに分配される傾向を有する化合物であり、実質的に親油性構成要素を含む構造体がこれに含まれる。親油性化合物には、脂質と共に、脂質（および／または誘電率の低い他の物質もしくは相）と結合する傾向を有する脂質非含有化合物が含まれる。コレステロール、リン脂質、ならびにグリセロ脂質、例えばジアルキルグリセロールおよびジアシルグリセロール、ならびにグリセロールアミド脂質は、親油性化合物のさらなる例である。
【００４３】
本明細書において“複合体”は、ＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有結合させることにより形成される分子実体を表す。本発明の特定の態様において、複合体はＡ−Ｂ−Ｙとして示され、ここでＡは本明細書に記載される親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物であり；Ｂは所望により、そして１つまたはそれ以上のリンカーＺを含んでもよいスペーサーを含み；そしてＹはＰＤＧＦ核酸リガンドである。
【００４４】
本発明の目的に関し“脂質構築物”は、脂質、リン脂質、またはそれらの誘導体を含む構造であり、多様な異なる構造様式を含み、これらの脂質は水性懸濁液中に受容されることが知られている。これらの構造には、限定されるわけではないが、脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルジョン、脂質リボンまたはシートが含まれ、そして薬学的に許容しうることが知られている種々の薬剤および構成要素と複合体を形成していてもよい。好ましい態様において、脂質構築物はリポソームである。好ましいリポソームは単層であり、そして２００ｎｍ未満の相対サイズを有する。脂質構築物の一般的な追加構成要素には、特にコレステロールおよびアルファ−トコフェロールが含まれる。脂質構築物は単独で、または特定の適用に望ましい特性を提供すると当業者が認めるであろういかなる組合わせで使用してもよい。さらに、脂質構築物およびリポソーム形成の技術的観点は当業者に周知であり、そして当技術分野で一般的に実施されるいかなる方法も本発明に用いてもよい。
【００４５】
本明細書において“核酸リガンド”は、標的に対し望ましい作用を有する、非天然発生核酸である。本発明の標的はＰＤＧＦであり、したがってこの用語はＰＤＧＦ核酸リガンドである。望ましい作用には、限定されるわけではないが、標的に結合すること、触媒作用により標的を変化させること、標的または標的の機能活性を修飾／変化させるように標的と反応すること、自殺阻害物質のように標的と共有結合すること、または標的および別の分子の間の反応を促進することが含まれる。好ましい態様において、該作用はＰＤＧＦに対する特異的結合親和性であり、その際、該核酸リガンドはＰＤＧＦが結合する、既知の生理学的機能を有する核酸ではない。
【００４６】
本発明の好ましい態様において、本発明の複合体および脂質構築物のＰＤＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ方法論により同定される。ＰＤＧＦ核酸リガンドは、候補核酸混合物（核酸がＰＤＧＦのリガンドである）から：ａ）該候補混合物をＰＤＧＦと接触させ、その際、ＰＤＧＦに対し該候補混合物と比較して増加した親和性をもつ核酸を、残りの候補混合物から分配することが可能である；ｂ）親和性が増加している核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｃ）親和性が増加している核酸を増幅して、リガンドが濃縮されている核酸混合物を得ることを含む方法により、同定される（本明細書に援用される、１９９５年６月７日に出願された、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／４７９，７２５号、現在は米国特許第５，６７４，６８５号；１９９５年６月７日に出願された、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／４７９，７８３号、現在は米国特許第５，６６８，２６４号、および１９９６年３月２０日に出願された、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／６１８，６９３号、現在は米国特許第５，７２３，５６４号を参照されたい）。
【００４７】
特定の態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドの部分（Ｙ）は、結合を維持するのに必ずしも必要ではなく、そして隣接しているＰＤＧＦ核酸リガンドの特定の部分をスペーサーまたはリンカーで置換してもよい。これらの態様において、例えばＹはＹ−Ｂ’−Ｙ’−Ｂ”−Ｙ”として表してもよく、ここで、Ｙ、Ｙ’およびＹ”は、単一のＰＤＧＦ核酸リガンドの一部または異なるＰＤＧＦ核酸リガンドの部分であり、そしてＢ’および／またはＢ”は、元来のＰＤＧＦ核酸リガンドの特定の核酸特徴を置換するスペーサーまたはリンカー分子である。Ｂ’およびＢ”が存在し、そしてＹ、Ｙ’およびＹ”が１つのＰＤＧＦ核酸リガンドの一部である場合、ＰＤＧＦに結合する三次構造が形成される。Ｂ’およびＢ”が存在しない場合、Ｙ、Ｙ’およびＹ”は、１つの連続するＰＤＧＦ核酸リガンドを表す。こうした様式で修飾されているＰＤＧＦ核酸リガンドが、本定義に含まれる。
【００４８】
“候補混合物”は、望ましいリガンドをそれから選択する、種々の配列の核酸の混合物である。候補混合物源は、天然発生核酸もしくはその断片、化学的に合成した核酸、酵素により合成した核酸、または以上の技術の組合わせにより作成した核酸由来であってもよい。好ましい態様において、増殖過程を促進するために、それぞれの核酸はランダム領域を囲む固定配列を有する。
【００４９】
“核酸”は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのいかなる化学修飾体をも意味する。修飾には、限定されるわけではないが、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込む他の化学基を提供するものが含まれる。このような修飾には、限定されるわけではないが、２′−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、例えばヌクレオシド間ホスホロチオエート結合、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、例えばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンおよびそれらに匹敵するものが含まれる。修飾にはまた、キャッピングのような３′および５′修飾も含んでもよい。
【００５０】
“非免疫原性高分子量化合物”は、典型的には免疫原応答を生じない、約１０００ないし１，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約１０００ないし５００，０００Ｄａ、および最も好ましくは約１０００ないし２００，０００Ｄａの間の化合物である。本発明の目的に関し、免疫原応答は、生物に抗体タンパク質を産生させるものである。非免疫原性高分子量化合物の例には、ポリアルキレングリコールおよびポリエチレングリコールが含まれる。本発明の１つの好ましい態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドに共有結合している非免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコールであり、そして構造Ｒ（Ｏ（ＣＨ2）x）nＯ−を有する、ここでＲは独立してＨおよびＣＨ3からなる群より選択され、ｘ＝２−５であり、ｎはほぼ、ポリアルキレングリコールの分子量／（１６＋１４ｘ）である。本発明の好ましい態様において、分子量は約１０−８０ｋＤａの間である。最も好ましい態様において、ポリアルキレングリコールの分子量は約２０−４５ｋＤａの間である。最も好ましい態様において、ｘ＝２およびｎ＝９×１０2である。１つまたはそれ以上のポリアルキレングリコールが同一のＰＤＧＦ核酸リガンドに結合して、分子量の和が好ましくは約１０−８０ｋＤａ、最も好ましくは約２０−４５ｋＤａの間であってもよい。
【００５１】
特定の態様においては、非免疫原性高分子量化合物もまた核酸リガンドであってもよい。
【００５２】
“脂質二重層小胞”は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分を有する個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水性部分はホスファト、グリセリルホスファト、カルボキシ、スルファト、アミノ、ヒドロキシ、コリンおよびその他の極性基を含んでもよい。非極性基の例は、飽和または不飽和炭化水素、例えばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステロール類（例えばコレステロール）および薬学的に許容しうる他の構成要素（アルファ−トコフェロールのような酸化防止剤を含む）を含んでもよい。
【００５３】
“リポソーム”は脂質二重層小胞の集合体であり、そして主に、長い脂肪酸鎖からなる２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子を含む。これらの分子は水に曝露されると自発的に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で結合し、対向する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、二重膜を形成する。したがって膜のそれぞれの側は親水性表面を提供し、一方、膜の内部は親油性媒質を含む。これらの膜は、形成されたとき一般に内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で層間水相により分離された、閉じた同心膜の系として配列する。これらの多重膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を適用して、単膜小胞（ＵＶ）に変換することが可能である。
【００５４】
“陽イオンリポソーム”は、生理学的ｐＨで全体として正の電荷をもつ脂質構成要素を含むリポソームである。
【００５５】
“ＳＥＬＥＸ”方法論は、標的と望ましい様式で相互作用する（例えばタンパク質への結合）核酸リガンドの選択と、選択したこれらの核酸の増幅との組合わせを伴うものである。選択／増幅の段階を反復循環することにより、きわめて多数の核酸を含むプールから、標的と最も強く相互作用する１つまたは少数の核酸を選択することが可能になる。選択した目標に達するまで、この選択／増幅過程循環を続ける。ＳＥＬＥＸ方法論はＳＥＬＥＸ特許出願に記載されている。
【００５６】
“標的”は、それに対するリガンドが望ましいという関心のあるいかなる化合物または分子も意味する。標的は、タンパク質（例えばＰＤＧＦ、トロンビンおよびセレクチン）、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養素、増殖因子などであってもよく、制限がない。本発明の主な標的はＰＤＧＦである。
【００５７】
“改良された薬物動態学的特性”とは、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に共有結合しているか、または脂質構築物と結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドが、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に結合していない、または脂質構築物と結合していない同一のＰＤＧＦ核酸リガンドと対比して、より長い循環半減期をｉｎ  ｖｉｖｏで示すことを意味する。
“リンカー”は、２つまたはそれ以上の分子実体を共有結合または非共有結合相互作用により連結し、そして１つまたはそれ以上の該分子実体の機能特性を保存する様式で分子実体を空間的に分離しうる分子である。リンカーはまたスペーサーとしても知られる。リンカーの例には、限定されるわけではないが、図９Ｃ−９Ｅに示される構造および図９Ａに示されるＰＥＧスペーサーが含まれる。
【００５８】
好ましい態様において、リンカーＢ’およびＢ”は、ペンタエチレングリコールである。
【００５９】
本明細書において“療法”には、治療および／または予防が含まれる。療法という場合、これはヒトおよび他の動物について述べたものである。
【００６０】
本発明は、ＰＤＧＦに対するｓｓＤＮＡおよびＲＮＡリガンドを含む。本発明はさらに、表２−３、６−７、および９、ならびに図１−２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ、８Ａおよび８Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４−３５、３９−８７、９７−１４４、１４８−１４９）に示されるＰＤＧＦに対する特異的なｓｓＤＮＡおよびＲＮＡリガンドを含む。より詳細には、本発明は、表２−３、６−７、および９、ならびに図１−２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ、８Ａおよび８Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４−３５、３９−８７、９７−１４４、１４８−１４９）に示される特異的核酸リガンドと実質的に相同な核酸配列、および実質的に同じＰＤＧＦ結合能を有する核酸配列を含む。実質的に相同とは、７０％以上、最も好ましくは８０％以上、そしてさらにより好ましくは９０％、９５％または９９％以上の一次配列相同性の程度を意味する。本明細書に記載する相同パーセンテージは、比較する配列中の同一のヌクレオチド残基で並列する２配列のうち小さい方にみられるヌクレオチドのパーセンテージとして計算される。その際、並列を補助するために１０ヌクレオチドの長さに１ギャップを導入してもよい。実質的に同じＰＤＧＦ結合能とは、該親和性が、本明細書に記載するリガンド親和性の１桁または２桁以内であることを意味する。本明細書に具体的に記載したものと実質的に相同である既定の配列が、同じＰＤＧＦ結合能をもつか否かの判定は、当業者が容易になしうる。
【００６１】
表２−３、６−７、および９、ならびに図１−２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ、８Ａおよび８Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４−３５、３９−８７、９７−１４４、１４８−１４９）に示される、ＰＤＧＦの核酸リガンドの配列相同性をみると、一次相同性をほとんど、または全くもたない配列が、実質的に同じＰＤＧＦ結合能を有する可能性があることが分かる。これらの理由から、本発明はまた、表２−３、６−７、および９、ならびに図１−２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ、８Ａおよび８Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４−３５、３９−８７、９７−１４４、１４８−１４９）に示される核酸リガンドと実質的に同じ推定構造または構造モチーフおよびＰＤＧＦ結合能をもつ核酸リガンドも含む。実質的に同じ構造または構造モチーフは、ツッカーフォールド（Ｚｕｃｋｅｒｆｏｌｄ）プログラム（Ｚｕｃｋｅｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２を参照されたい）を用いる配列並列により推定することが可能である。当業で知られているように、二次構造および構造モチーフを推定するために他のコンピュータープログラムを使用してもよい。溶液中または結合構造体としての核酸リガンドの実質的に同じ構造または構造モチーフはまた、ＮＭＲまたは当業に知られるであろう他の技術を用いて推定してもよい。
【００６２】
本発明はさらに、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体を調製するための方法であって、（ａ）候補核酸混合物をＰＤＧＦと接触させ、（ｂ）前記候補混合物のメンバーをＰＤＧＦに対する親和性に基づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＰＤＧＦに対する結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列が濃縮されている核酸混合物を得る方法により、候補核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＰＤＧＦのリガンドである）を同定し、そして同定した前記ＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法による前記方法を包含する。
【００６３】
本発明のさらなる目的は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有結合している１つまたはそれ以上のＰＤＧＦ核酸リガンドを含む複合体を提供することである。このような複合体は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合していないＰＤＧＦ核酸リガンドに優る下記の利点１つまたはそれ以上を有する：１）改良された薬物動態学的特性、および２）改良された細胞内搬送能、または３）改良された標的化能である。さらに脂質構築物と結合している複合体も同じ利点を有する。
【００６４】
複合体、またはＰＤＧＦ核酸リガンドもしくは複合体を含む脂質構築物は、これらの利点のうち１、２または３つを有するであろう。例えば、本発明の脂質構築物は、下記のものを含んでもよい：ａ）リポソーム、ｂ）リポソームの内部に被包された薬剤、およびｃ）ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物を含む複合体であって、該複合体のＰＤＧＦ核酸リガンド構成要素が脂質構築物の外側と結合し、そこから突出しているもの。そのような場合、複合体を含む脂質構築物は、１）改良された薬物動態学的特性を有し、２）被包された薬剤の細胞内搬送能が増大し、そして３）外側に結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドにより、ＰＤＧＦを発現しているあらかじめ選択された位置を、ｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に標的化する。
【００６５】
別の態様において本発明は、ＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、そして該複合体を患者に投与するための方法を提供する。本発明はさらに、該複合体を脂質構築物とさらに結合させることにより、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良するための方法に関する。
【００６６】
別の態様において本発明の複合体は、親油性化合物、例えばグリセロ脂質、または非免疫原性高分子量化合物、例えばポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合している、ＰＤＧＦ核酸リガンドを含む。これらの場合、複合体の薬物動態学的特性はＰＤＧＦ核酸リガンド単独と比較して向上するであろう。別の態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させ、そして該複合体を脂質構築物とさらに結合させるか、あるいはＰＤＧＦ核酸リガンドを脂質構築物に被包すると、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性がＰＤＧＦ核酸リガンド単独と比較して改良される。
【００６７】
多数のＰＤＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＰＤＧＦとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が多数のＰＤＧＦ核酸リガンドを含む態様では、１つのＰＤＧＦ核酸リガンドのみと比較して、複合体の薬物動態学的特性が改良されるであろう。脂質構築物が多数の核酸リガンドまたは複合体を含む態様では、１つの核酸リガンドまたは複合体のみがある脂質構築物と比較して、ＰＤＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性が改良されるであろう。
【００６８】
本発明の特定の態様において、本発明の複合体は他の核酸リガンド１つ（二量体）またはそれ以上（多量体）に結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドを含む。該核酸リガンドはＰＤＧＦに対するものであってもよく、または異なる標的に対するものであってもよい。多数のＰＤＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＰＤＧＦとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が１つまたはそれ以上の他のＰＤＧＦ核酸リガンドに結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドを含む本発明の態様では、１つのＰＤＧＦ核酸リガンドのみと比較して、該複合体の薬物動態学的特性が改良されるであろう。
【００６９】
非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物をＰＤＧＦ核酸リガンドの多様な位置に、例えば塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５−位、プリンヌクレオチドの８−位、リン酸のヒドロキシル基、またはＰＤＧＦ核酸リガンドの５′もしくは３′末端のヒドロキシル基もしくは他の基に、共有結合させてもよい。非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコール、またはポリエチレングリコールである態様では、好ましくは該化合物は、それらのリン酸基の５’または３’ヒドロキシルに結合する。最も好ましい態様において、非免疫原性高分子量化合物は核酸リガンドのリン酸基の５’ヒドロキシルに結合する。非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物のＰＤＧＦ核酸リガンドに対する結合は、直接またはリンカーもしくはスペーサーを利用し、行ってもよい。脂質構築物が複合体を含む態様またはＰＤＧＦ核酸リンカーがリポソームに被包されている態様では、ＰＤＧＦ核酸リガンドまたは複合体および脂質構築物間の非共有結合相互作用が好ましい。
【００７０】
核酸を療法に用いる際に生じる問題のひとつは、オリゴヌクレオチドがそれらのホスホジエステル型である場合、望ましい効果を表す前に、体液中で細胞内および細胞外酵素、例えばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって速やかに分解される可能性があることである。ＰＤＧＦ核酸リガンドのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を高めるために、またはＰＤＧＦ核酸リガンドの搬送を向上もしくは仲介するために、ＰＤＧＦ核酸リガンドの特定の化学修飾を行ってもよい。本発明において意図されるＰＤＧＦ核酸リガンド修飾には、限定されるわけではないが、ＰＤＧＦ核酸リガンド塩基またはＰＤＧＦ核酸リガンド全体に、付加的な電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用および流動性を取り込む他の化学基を提供するものが含まれる。このような修飾には、限定されるわけではないが、２′−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルリン酸修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、例えばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンおよびそれらに匹敵するものが含まれる。修飾にはまた、キャッピングのような３′および５′修飾も含んでもよい。
【００７１】
核酸リガンドがＳＥＬＥＸ法に由来する場合、修飾はＳＥＬＥＸ前または後、いずれの修飾であってもよい。ＳＥＬＥＸ前修飾によれば、ＰＤＧＦに対する特異性および改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の両方を備えたＰＤＧＦ核酸リガンドが得られる。２′−ＯＨ核酸リガンドにＳＥＬＥＸ後修飾を行うと、核酸リガンドの結合能に不都合な影響を与えずに、改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を得ることが可能である。本発明のＰＤＧＦ核酸リガンドの好ましい修飾は、５′および３′ホスホロチオエートキャッピング、ならびに３′末端の３′３′逆転ホスホジエステル結合である。最も好ましい態様では、好ましいＰＤＧＦ核酸リガンド修飾は３′末端の３′３′逆転ホスホジエステル結合である。さらに、一部または全部のヌクレオチドの２′−フルオロ（２′−Ｆ）、２′−アミノ（２′−ＮＨ2）、および２′−Ｏ−メチル（２′−ＯＭｅ）修飾が好ましい。最も好ましい態様において、好ましい修飾は、いくつかのヌクレオチドの２’−ＯＭｅおよび２’−Ｆ修飾である。さらに、ＰＤＧＦ核酸リガンドをＳＥＬＥＸ後修飾し、特定の部分を、ヘキサエチレングリコールスペーサーなどのリンカーまたはスペーサーで置換してもよい。
【００７２】
本発明の別の側面では、ＰＤＧＦ核酸リガンドと非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の共有結合により、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合していないＰＤＧＦ核酸リガンドと比較して改良された薬物動態学的特性（すなわち、より遅いクリアランス速度）が得られる。
【００７３】
本発明の別の側面では、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体をさらに脂質構築物と結合させてもよい。この結合により、脂質構築物と結合していないＰＤＧＦ核酸リガンドと比較して改良された薬物動態学的特性が生じる可能性がある。ＰＤＧＦ核酸リガンドまたは複合体を共有結合または非共有結合相互作用により脂質構築物と結合させてもよい。別の側面では、ＰＤＧＦ核酸リガンドを共有結合または非共有結合相互作用により脂質構築物と結合させてもよい。好ましい態様において、結合は非共有結合相互作用による。好ましい態様において、脂質構築物は脂質二重層小胞である。最も好ましい態様において、脂質構築物はリポソームである。
【００７４】
本発明に用いるリポソームは当業で現在知られている種々の技術または今後開発される技術のいずれによって調製してもよい。典型的には、それらはリン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、そして他の材料、例えば中性脂質、例えばコレステロール、および表面修飾剤、例えば正に荷電した化合物（例えばコレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノースまたはアミノマンニトール誘導体）または負に荷電した化合物（例えばジアセチルリン酸、ホスファチジルグリセロール）を含んでもよい。多重膜リポソームは慣用技術により、すなわち脂質を適切な溶剤に溶解し、そしてその後、溶剤を蒸発させて容器の内側に薄膜を残留させて、適切な容器または器の内壁に選択した脂質を沈着させるか、または噴霧乾燥することにより形成することが可能である。その後、容器に水相を添加し、回転運動または渦撹拌運動を与えると、ＭＬＶが生成する。その後、ＭＬＶのホモジナイゼーション、超音波処理または押出し（フィルターを通して）により、ＵＶを形成することが可能である。さらに、界面活性剤除去技術によりＵＶを形成することが可能である。
【００７５】
本発明の特定の態様において脂質構築物は、脂質構築物の表面と結合している単数または複数の標的化用ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび被包された療法剤または診断剤を含む。好ましくは、脂質構築物はリポソームである。あらかじめ形成したリポソームをＰＤＧＦ核酸リガンドと結合するように修飾してもよい。例えば陽イオン性リポソームは静電相互作用によりＰＤＧＦ核酸リガンドと結合する。グリセロ脂質などの親油性化合物に共有結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドを、あらかじめ形成したリポソームに添加してもよく、これによりグリセロ脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質がリポソーム膜と結合する。あるいはリポソーム形成中にＰＤＧＦ核酸リガンドをリポソームと結合させてもよい。
【００７６】
リポソームが広範な療法剤および診断剤の被包または取り込みに有利であることは当業に周知である。多様ないかなる化合物もリポソーム内部の水性コンパートメントに収容することが可能である。療法剤の例には、抗生物質、抗ウイルス性ヌクレオシド、抗真菌性ヌクレオシド、代謝制御剤、免疫調節剤、化学療法薬剤、毒素解毒薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれる。同様に、脂質二重層小胞に診断用放射性核種（例えばインジウム１１１、ヨウ素１３１、イットリウム９０、リン３２またはガドリニウム）、ならびに蛍光物質、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ適用において検出可能な他の物質を装填してもよい。療法剤または診断剤を、リポソーム壁により水性内部に被包してもよいことを理解すべきである。あるいは保持される剤が小胞壁形成材料の一部であってもよく、すなわち該材料に分散または溶解していてもよい。
【００７７】
リポソーム形成中に、水溶性キャリヤー剤を水和溶液に含有させることにより水性内部に被包し、そして親油性分子を脂質処方に含有させることにより脂質二重層に取り込ませてもよい。特定の分子（例えば陽イオン性または陰イオン性の親油性薬剤）の場合、あらかじめ形成したリポソーム中への薬剤の装填は、例えば、その開示が本明細書に援用される米国特許第４，９４６，６８３号に記載される方法で達成してもよい。薬剤被包後、リポソームをゲルクロマトグラフィーまたは限外ろ過などの方法で処理して、被包されていない薬剤を除去してもよい。その後、典型的には、リポソームを無菌的にろ過し、懸濁液中に存在する可能性があるいかなる微生物も除去する。微生物はまた、無菌処理によって除去してもよい。
【００７８】
大型の親水性分子をリポソームで被包したい場合、逆相蒸発法（ＲＥＶ）または溶剤注入法などの方法で、比較的大きな単層小胞を形成することが可能である。リポソーム形成のための他の標準法は当業に知られ、例えば商業的なリポソーム製造方法には、米国特許第４，７５３，７８８号に記載されるホモジナイゼーション法、および米国特許第４，９３５，１７１号に記載される薄膜蒸発法が含まれる。これらは本明細書に援用される。
【００７９】
療法剤または診断剤はまた、脂質二重層小胞の表面と結合していてもよいことを理解すべきである。例えば、薬剤をリン脂質またはグリセリドに結合させてもよい（プロドラッグ）。このプロドラッグのリン脂質またはグリセリド部分を脂質処方に含有させることによりリポソームの脂質二重層に取り込ませてもよく、またはあらかじめ形成したリポソーム中へ装填してもよい（本明細書に援用される、米国特許第５，１９４，６５４号および第５，２２３，２６３号を参照されたい）。
【００８０】
特定のリポソーム調製法が、意図する用途、および二重膜形成に用いる脂質の種類に依存するであろうことは当業者に自明である。
【００８１】
ＬｅｅおよびＬｏｗ（１９９４，ＪＢＣ，２６９：３１９８−３２０４）、ならびにＤｅＦｒｅｅｓら（１９９６，Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１８：６１０１−６１０４）は、リガンド−ＰＥＧ−脂質と脂質構成要素の同時処方によりＰＥＧ−リガンドが内側と外側の両方に面したリポソームが得られることを最初に示した。受動アンカリングはＺａｌｉｐｓｋｙら（１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８：１１１−１１８）が、オリゴペプチドおよびオリゴ糖リガンドをもっぱらリポソーム外面にアンカリングする方法として概説した。彼らの研究に提示された中心的概念は、オリゴ−ＰＥＧ−脂質結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を調製し、そしてその後、既存の脂質二重層中への脂質テイルの自発的取り込み（“アンカリング”）により、あらかじめ形成したリポソーム中へ処方しうるというものである。脂質基は、その疎水性脂質アンカーを水溶液から除去し、そして続いて疎水性脂質二重層中に配置することによって、より低い自由エネルギー状態に達するために、この挿入を経る。このような系の重要な利点は、オリゴ脂質がもっぱら脂質二重層の外側にアンカリングすることである。したがって、オリゴ脂質が内側に面した配向であることによりそれらの生物学的標的との相互作用に利用されず浪費されるということはない。
【００８２】
細胞へのＰＤＧＦ核酸リガンド搬送効率は、リポソームと細胞膜の融合を促進することが知られている脂質処方および条件を用いることにより、最適化することが可能である。例えば、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンなど負に荷電した特定の脂質は、特に他の融合誘導物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）（例えばＣａ2+など多価陽イオン、遊離脂肪酸、ウイルス性融合タンパク質、短鎖ＰＥＧ、リゾレシチン、洗浄剤および界面活性剤）の存在下で融合を促進する。ホスファチジルエタノールアミンもまた、膜融合を高め、そして同時に細胞搬送を促進するために、リポソーム処方に含有させてもよい。さらに、例えばカルボキシラート部分を含む遊離脂肪酸およびその誘導体を用いて、高いｐＨでは負に荷電し、そして低いｐＨでは中性であるまたはプロトン付加されるｐＨ感受性リポソームを調製することが可能である。そのようなｐＨ感受性リポソームは、より高い融合傾向をもつことが知られている。
【００８３】
好ましい態様において、本発明のＰＤＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法由来である。ＳＥＬＥＸは、現在は放棄されている、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９１年６月１０日に出願された、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／７１４，１３１号、現在は米国特許第５，４７５，０９６号、１９９２年８月１７日に出願された、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／９３１，４７３号、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照されたい）に記載されている。これらの各特許出願は本明細書に特に援用され、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。
【００８４】
ＳＥＬＥＸ法によれば、それぞれ特有な配列を有し、そしてそれぞれ望ましい標的化合物または分子に特異的に結合する特性を有する核酸分子である一群の生成物が得られる。標的分子は、好ましくはタンパク質であるが、特に炭水化物、ペプチドグリカンおよび多様な小分子もまた、含んでもよい。ＳＥＬＥＸ方法論は、生物学的構造体、例えば細胞表面またはウイルスに、その生物学的構造体に不可欠な部分である分子との特異的相互作用により標的化するのにも使用してもよい。
【００８５】
ＳＥＬＥＸ法は、その最も基本的な形態では下記の一連の段階により定義される：
１）候補となる、異なる配列の核酸の混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列の領域（すなわち候補混合物の各メンバーが同じ位置に同じ配列を含む）およびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は：（ａ）後記の増幅段階を補助する、（ｂ）標的に結合することが知られる配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物中の既定の構造配置の核酸の濃度を高めるよう、選択する。ランダム配列は完全にランダムであってもよく（すなわちある塩基をいずれかの位置に見出す確率は１／４である）、または部分的にランダムであってもよい（例えばある塩基をいずれかの位置に見出す確率は、０および１００％の間のいずれの水準でも選択することが可能である）。
【００８６】
２）標的および候補混合物のメンバーの結合に好ましい条件下で、候補混合物を選択された標的と接触させる。これらの状況下では、標的および候補核酸混合物間の相互作用により、標的および該標的に対し最も強い親和性を有する核酸の間に核酸−標的対が形成されるものと考えることが可能である。
【００８７】
３）標的に対し最も高い親和性を持つ核酸を、標的に対しより低い親和性を持つ核酸から分配する。候補混合物中には最高親和性の核酸に相当する配列はきわめて少数存在するにすぎない（そしてわずか１分子の核酸である可能性がある）ため、一般に分配に際し、候補混合物中にかなりの量の核酸（約５−５０％）が保持されるように分配基準を設定することが望ましい。
【００８８】
４）分配に際し、標的に対し比較的高い親和性を有するとして選択された核酸を、その後増幅し、標的に対し比較的高い親和性を有する核酸が濃縮されている新たな候補混合物を生成する。
【００８９】
５）上記の分配段階および増幅段階を反復することにより、新たに形成された候補混合物が含有する特有な配列はいっそう少なくなり、そして標的に対する核酸の平均親和度は一般に高まるであろう。極端にはＳＥＬＥＸ法は、最初の候補混合物から標的分子に対し最も高い親和性を有する核酸に相当する１つまたは少数の核酸を含有する候補混合物を生じるであろう。
【００９０】
多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。例えば１９９２年１０月１４日に出願された、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”と題される米国特許出願第０７／９６０，０９３号は、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、例えば折れ曲がりＤＮＡを選択することを記載する。１９９３年９月１７日に出願された、“Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／１２３，９３５号は、ＳＥＬＥＸに基づく方法であって、標的分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいはそれらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するための方法を記載する。１９９３年１０月７日に出願された、“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｆｆｅｉｎｅ”と題される米国特許出願第０８／１３４，０２８号は、現在は米国特許第５，５８０，７３７号である米国特許出願第０８／４４３，９５７号に有利になるよう放棄されたが、非常に近縁な分子間を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸと呼ばれる方法を記載する。１９９３年１０月２５日に出願された、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／１４３，５６４号は、現在は米国特許第５，５６７，５８８号である米国特許出願第０８／４６１，０６９号に有利になるよう放棄されたが、標的分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法を記載する。１９９２年１０月２１日に出願された、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ＨＩＶ−ＲＴ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ”と題される米国特許出願第０７／９６４，６２４号は、現在は米国特許第５，４９６，９３８号である米国特許第０８／４６２，２６０号に有利になるよう放棄されたが、ＳＥＬＥＸが行われた後、改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する。１９９５年３月８日に出願された、“Ｓｙｓｔｅｍｅｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／４００，４４０号、現在は米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドをその標的に共有結合させるための方法を記載する。
【００９１】
ＳＥＬＥＸ法は、例えば改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性または改良された搬送特性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含む、高親和性核酸リガンドの同定を含む。このような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含む核酸リガンドは、１９９３年９月８日に出願された、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題される米国特許出願第０８／１１７，９９１号であるが、現在は米国特許第５，６６０，９８５号である米国特許出願第０８／４３０，７０９号に有利になるよう放棄された出願に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含む、オリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第０８／１３４，０２８号には、２′−アミノ（２′−ＮＨ2）、２′−フルオロ（２′−Ｆ）、および／または２′−Ｏ−メチル（２′−ＯＭｅ）で修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、高特異性核酸リガンドが記載されている。１９９４年６月２２日に出願された、“Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  ２’−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０８／２６４，０２９号は、種々の２′−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。
【００９２】
ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを、他の選択したオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを含む。これらはそれぞれ１９９４年８月２日に出願された、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２８４，０６３号、現在は米国特許第５，６３７，４５９号、および１９９４年４月２８日に出願された、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２３４，９９７号、現在は米国特許第５，６８３，８６７号に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状およびその他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。
【００９３】
ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包含する。これは１９９５年５月４日に出願された、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題される米国特許出願第０８／４３４，４６５号に記載されている。ＳＥＬＥＸ法はさらに、親油性化合物、例えばジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールと、選択したＶＥＧＦ核酸リガンドを組み合わせることを含む。これは１９９６年１０月２５日に出願された、“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題される米国特許出願第０８／７３９，１０９号に記載されている。診断用または療法用複合体において、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原性化合物、またはグリセロ脂質、リン脂質、またはグリセロールアミド脂質などの親油性化合物と結合しているＶＥＧＦ核酸リガンドは、１９９７年７月２１日に出願された、“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”と題される米国特許出願第０８／８９７，３５１号に記載されている。基本的ＳＥＬＥＸ法の修飾につき記載した上記特許出願それぞれは、全体として本明細書に特に援用される。
【００９４】
ＳＥＬＥＸにより、高い親和性および卓越した特異性で標的と結合しうる核酸リガンドが同定される。これは核酸研究の分野で前例のない見事な成果である。これらの特性はもちろん当業者が療法用または診断用リガンドにおいて追求するであろう望ましい特性である。
【００９５】
薬剤として使用するのに望ましい核酸リガンドを得るために、核酸リガンドは、好ましくは（１）標的に対し望ましい効果を達成する様式で標的に結合し；（２）望ましい効果を得るのに可能な限り小さく；（３）可能な限り安定であり；そして（４）選択した標的に対する特異的リガンドである。大部分の場合、核酸リガンドは標的に対し可能な限り最高の親和性を有することが好ましい。さらに、核酸リガンドは促進性を有してもよい。
【００９６】
同一出願人による、１９９２年１０月２１日に出願された米国特許出願第０７／９６４，６２４号、現在は米国特許第５，４９６，９３８号（’９３８）には、ＳＥＬＥＸが行われた後、改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ＨＩＶ−ＲＴ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ”と題されるこの’９３４特許は、特に本明細書に援用される。
【００９７】
ＳＥＬＥＸ法は、ランダムｓｓＤＮＡライブラリーからＰＤＧＦに対する一群の高親和性ＲＮＡリガンドを同定し、そしてランダムｓｓＤＮＡライブラリーから２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡリガンドを同定するために用いられてきている（それぞれ本明細書に援用される、１９９５年６月７日に出願された、“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／４７９，７８３号および１９９５年６月７日に出願された、“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／４７９，７２５号の一部係属出願である、１９９６年３月２０日に出願された、“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／６１８，６９３号を参照されたい；Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：６８３−６９５も参照されたい）。
【００９８】
単数または複数のＰＤＧＦ核酸リガンドが標的化能に作用することが可能な態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドは、ＰＤＧＦ核酸リガンドがその標的に結合しうるために保持しなければならない三次元構造を採用する。脂質構築物が複合体を含み、そして該複合体のＰＤＧＦ核酸リガンドが脂質構築物の表面から突出している態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドは、その標的結合能が損なわれないように脂質構築物の表面に対し適正に配向しなければならない。これは、ＰＤＧＦ核酸リガンドをＰＤＧＦ核酸リガンドの結合部分から離れた位置で付着させることにより達成することが可能である。該三次元構造および適正な配向はまた、前掲のリンカーまたはスペーサーを用いることによって保持することも可能である。
【００９９】
複合体による標的化搬送のために、多様な療法剤または診断剤のいずれを複合体に結合させてもよい。さらに、脂質構築物による標的化搬送のために、多様な療法剤または診断剤のいずれを前記の脂質構築物に結合させ、被包し、または取り込ませてもよい。
【０１００】
複合体が例えばリポソームに結合している親油性化合物およびＰＤＧＦ核酸リガンドを含む態様において、ＰＤＧＦ核酸リガンドは、抗腫瘍薬剤（例えばダウノルビシン）または造影剤（例えば放射性標識）の搬送のために、ＰＤＧＦを発現している腫瘍細胞（例えばカポジ肉腫）に標的化してもよい。腫瘍の周囲の細胞および組織もまたＰＤＧＦを発現する可能性があり、そしてこれらの細胞に標的化した抗腫瘍薬剤搬送も有効であることを留意すべきである。
【０１０１】
別態様において、標的細胞へ搬送すべき療法剤または診断剤は別の核酸リガンドであってもよい。
【０１０２】
本発明によればさらに、搬送すべき剤（例えばプロドラッグ、受容体アンタゴニスト、または治療もしくは造影のための放射性物質）をリポソームの外面と結合するように複合体に取り込ませてもよい。ＰＤＧＦ核酸リガンドと同様に、該剤を共有結合または非共有結合相互作用により結合させてもよい。リポソームによりこれらの剤を細胞外から標的化搬送し、その際リポソームはリンカーとして作用するであろう。
【０１０３】
別の態様では、非免疫原性高分子量化合物（例えばＰＥＧ）をリポソームに結合させて、複合体の薬物動態学的特性を改良してもよい。ＰＤＧＦ核酸リガンドをリポソーム膜に結合させるか、または非免疫原性高分子量化合物に結合させ、これを膜に結合させてもよい。この方法で複合体を血液タンパク質から遮蔽し、そしてこうしてＰＤＧＦ核酸リガンドがなおその標的と接触して結合するのに十分な程度に露出した状態で、長期間循環させることが可能である。
【０１０４】
本発明の別の態様では、１つより多いＰＤＧＦ核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これにより同じＰＤＧＦ分子を互いに接近させることが可能となり、そしてこれを利用してＰＤＧＦ分子間に特異的相互作用を生じさせることが可能である。
【０１０５】
本発明の別態様では、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび異なる標的に対する核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これによりＰＤＧＦを異なる標的に接近させることが可能となり、そしてこれを利用してＰＤＧＦと他の標的間に特異的相互作用を生じさせることが可能である。標的を接近させる方法としてリポソームを用いるほか、相互作用の強度を高めるためにリポソームに剤を被包してもよい。
【０１０６】
複合体を含む脂質構築物は、ＰＤＧＦに多くの結合相互作用をもたらすことが可能である。これはもちろん複合体当たりのＰＤＧＦ核酸リガンド数、および脂質構築物当たりの複合体数、ならびにそれぞれの膜中でのＰＤＧＦ核酸リガンドおよび受容体の運動性に依存する。有効結合定数は各部位についての結合定数の積と共に増大することが可能であるので、多数の結合相互作用があることは実質的に有利である。すなわち、多数のＰＤＧＦ核酸リガンドを脂質構築物に結合、そしてしたがって多価を形成することにより、標的に対する多重複合体の有効親和性（すなわちアビディティー）は、各部位についての結合定数の積と同様に良好になるであろう。
【０１０７】
本発明の特定の態様において、本発明の複合体は親油性化合物に結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドを含む。この場合、複合体の薬物動態学的特性は、ＰＤＧＦ核酸リガンド単独と比較して改良されるであろう。上に論じたように、親油性化合物を、ＰＤＧＦ核酸リガンド上の多数の位置でＰＤＧＦ核酸リガンドに共有結合させてもよい。
【０１０８】
本発明の別の態様では、脂質構築物がＰＤＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む。この態様において、グリセロ脂質は他の親油性化合物と結合する傾向があるため、グリセロ脂質がリポソームへのＰＤＧＦ核酸リガンドの取り込みを補助することが可能である。ＰＤＧＦ核酸リガンドと結合しているグリセロ脂質を、処方に含有させることにより、またはあらかじめ形成したリポソームに装填することにより、リポソームの脂質二重層に取り込ませることが可能である。グリセロ脂質は、ＰＤＧＦ核酸リガンドがリポソームの内または外へ突出する様式で、リポソームの膜と結合させることが可能である。ＰＤＧＦ核酸リガンドが複合体の外へ突出する態様では、ＰＤＧＦ核酸リガンドは標的化能に作用することが可能である。脂質構築物の薬物動態学的特性をさらに改良するために、さらなる化合物を脂質構築物と結合させてもよいことを理解すべきである。例えばＰＥＧを脂質構築物の膜の外側に面した部分に結合させてもよい。
【０１０９】
他の態様において、本発明の複合体は非免疫原性高分子量化合物、例えばポリアルキレングリコールまたはＰＥＧに共有結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドを含む。この態様では、ＰＤＧＦ核酸リガンド単独と比較して複合体の薬物動態学的特性が改良される。ポリアルキレングリコールまたはＰＥＧをＰＤＧＦ核酸リガンド上の種々の位置に共有結合させてもよい。ポリアルキレングリコールまたはＰＥＧを用いる態様では、ＰＤＧＦ核酸リガンドを５′ヒドロキシル基によりホスホジエステル結合を介して結合させることが好ましい。
【０１１０】
特定の態様では、多数の核酸リガンドを単一の非免疫原性高分子量化合物、例えばポリアルキレングリコールもしくはＰＥＧ、または親油性化合物、例えばグリセロ脂質に結合させてもよい。核酸リガンドはすべてがＰＤＧＦに対するものであってもよく、ＰＤＧＦおよび異なる標的に対するものであってもよい。多数のＰＤＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＰＤＧＦとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに他の態様では、多数のポリアルキレングリコール、ＰＥＧ、グリセロール脂質分子を互いに結合させることが可能である。これらの態様では、１つまたはそれ以上のＰＤＧＦ核酸リガンドまたはＰＤＧＦおよび他の標的に対する核酸リガンドを、ポリアルキレングリコール、ＰＥＧ、またはグリセロール脂質それぞれに結合させることが可能である。これもまた、標的に対するそれぞれの核酸リガンドのアビディティーの増大を生じる。多数のＰＤＧＦ核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセロール脂質に結合している態様では、ＰＤＧＦ間に特異的相互作用を生じさせるために、ＰＤＧＦ分子を互いに接近させる可能性がある。ＰＤＧＦおよび異なる標的に特異的な多数の核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセロール脂質に結合している態様では、ＰＤＧＦおよび他の標的間に特異的相互作用を生じさせるために、ＰＤＧＦおよび別の標的を互いに接近させる可能性がある。さらに、ＰＤＧＦに対する核酸リガンドまたはＰＤＧＦおよび異なる標的に対する核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧ、またはグリセロール脂質に結合している態様では、薬剤をポリアルキレングリコール、ＰＥＧ、またはグリセロール脂質と結合させることも可能である。したがって複合体は該薬剤を標的化搬送し、その際ポリアルキレングリコール、ＰＥＧ、またはグリセロール脂質はリンカーとして作用するであろう。
【０１１１】
ＰＤＧＦ核酸リガンドはＰＤＧＦに選択的に結合する。したがってＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、またはＰＤＧＦ核酸リガンドもしくはその複合体を含む脂質構築物は、医薬または診断剤として有用である。ＰＤＧＦ核酸リガンド含有複合体および脂質構築物を用い、不適切なＰＤＧＦ産生を含むいかなる疾患状態、例えば癌、血管形成、再狭窄および線維症を、治療し、阻害し、予防しまたは診断してもよい。ＰＤＧＦは多くの腫瘍細胞により、異なる量で産生され、そして分泌される。したがって本発明は、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、複合体を含む脂質構築物、あるいは複合体の一部となることなく脂質構築物と結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドを投与することにより、癌を治療し、阻害し、予防し、または診断する方法を含む。
【０１１２】
血管形成は月経周期および創傷治癒以外には、健康な成人で起きるのは稀である。しかし、限定されるわけではないが、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチを含む種々の疾患状態では、血管形成は主な特徴である。したがって本発明は、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＰＤＧＦ核酸リガンドまたはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築物を投与することにより、血管形成を治療し、阻害し、予防しまたは診断する方法を含む。
【０１１３】
ＰＤＧＦはまた、肺、骨髄および腎臓などの器官の線維症において産生される。線維症はまた、放射線治療と関連する可能性もある。したがって本発明は、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＰＤＧＦ核酸リガンドまたはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築物を投与することにより、肺、骨髄、腎臓および放射線治療関連線維症を治療し、阻害し、予防しまたは診断する方法を含む。
【０１１４】
ＰＤＧＦは再狭窄に関与する重要な増殖因子である。再狭窄は、狭窄を除去する治療後の疾患血管の再閉塞であり、冠動脈介入に続いてよく発生し、そして末梢血管介入でもときに発生する。さらに、冠動脈および非冠動脈の治療にまたは治療と組み合わせ、ステントが使用されてきている；が、再狭窄はステントの使用にも関連付けられている（イン・ステント再狭窄と呼ばれる）。イン・ステント再狭窄は冠動脈介入の約１５−３０％で発生し、そしていくつかの末梢血管介入でもしばしば発生する。例えば、イン・ステント再狭窄は、小血管における重大な問題であり、ステント配置された大腿または膝窩動脈での頻度は１５％ないし４０％の範囲である。中程度の大きさの血管、例えば腎動脈のイン・ステント再狭窄率は１０−２０％である。
【０１１５】
本発明は、したがって、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＰＤＧＦ核酸リガンドまたはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築物を投与することにより、再狭窄を治療し、阻害し、予防しまたは診断する方法を含む。本発明はまた、冠動脈および非冠動脈における再狭窄を治療し、阻害し、予防しまたは診断する方法も含む。本発明はまた、イン・ステント再狭窄を治療し、阻害し、予防しまたは診断する方法も含む。
【０１１６】
さらに、癌、血管形成、再狭窄および線維症は、ＰＤＧＦ以外の増殖因子の産生を伴う。したがって、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＰＤＧＦ核酸リガンドまたはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築物を、他の増殖因子（例えばｂＦＧＦ、ＴＧＦβ、ｈＫＧＦなど）に対する核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＰＤＧＦ核酸リガンドまたはＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築物と組み合わせて用いてもよいことが、本発明により意図される。
【０１１７】
本発明の１つの態様において、脂質構築物はＰＤＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物を含む複合体を含み、さらに脂質構築物に被包された、または脂質構築物の内側と結合した診断剤もしくは療法剤を含む。好ましい態様において、脂質構築物は脂質二重層小胞であり、そしてより好ましくはリポソームである。療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では通常は有毒である薬剤の搬送が含まれる。リポソームの形で有毒薬剤を密閉し、そして該薬剤に対し感受性である組織から逸らし、そして選択した領域に標的化することが可能である。リポソームはまた、長期間にわたって薬剤を放出させる療法に使用することも可能であり、これにより投与回数を減らすことが可能である。さらにリポソームは、通常は静脈内搬送に適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供することが可能である。
【０１１８】
多くの薬剤および造影剤は、療法能または診断能を有するためには体内の適正な位置へ搬送されることが必要であり、そしてしたがって、リポソームを容易に注入し、そして特定の細胞種または身体部分へ持続放出および薬剤搬送するための基礎を形成することが可能である。被包薬剤を、感受性組織から逸らし、選択した宿主の組織に標的化するためにリポソームを使用するには、幾つかの技術を採用してもよい。これらの技術には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれらの投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であるという理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取り込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアランス速度、および広い生体内分布を示すことが認められてきている。
【０１１９】
リポソームの受動搬送には、種々の投与経路、例えば静脈内、皮下、筋内および局所の使用を伴う。各投与経路により、リポソーム局在性の違いが生じる。選択した標的領域へリポソームを能動的に向けるために用いる２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付着させることを伴う。本発明の１つの態様では、ＰＤＧＦ核酸リガンドがリポソームの外面に結合し、そして標的化能に作用する。当業者に知られるように、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドなど、さらなる標的化構成要素を含有させてもよい。さらに、抗体を用いずに腫瘍にリポソームを標的化させる幾つかの試みが成功してきている。例えば米国特許第５，０１９，３６９号、米国特許第５，４３５，９８９号、および米国特許第４，４４１，７７５号を参照されたい。これらの代替標的化法を採用するのは当業者に自明であろう。
【０１２０】
ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、ＰＤＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築物、ならびに複合体の一部となることなく脂質構築物と結合しているＰＤＧＦ核酸リガンドの、療法用または診断用組成物を、注射により非経口的に投与してもよいが、他の効果的な投与形態、例えば関節内注射、吸入ミスト、経口用活性処方、経皮イオン導入（ｉｏｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）または坐剤もまた想定される。これらはまた、直接注射により局所的に適用してもよく、移植ステントまたはカテーテルなどの装置から放出してもよく、あるいは注入ポンプにより該部位に直接搬送してもよい。好ましいキャリヤーのひとつは、生理的食塩水であるが、薬学的に許容しうる他のキャリヤーの使用も考慮される。１つの態様では、キャリヤーおよびＰＤＧＦ核酸リガンド複合体が生理学的に適合する徐放性処方を構成することが想定される。このようなキャリヤー中の主な溶剤は、水性でも非水性でもよい。さらにキャリヤーは、処方のｐＨ、浸透圧モル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、または臭気を変更または維持するための、薬理学的に許容しうる他の賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含有してもよい。同様に、キャリヤーは、ＰＤＧＦ核酸リガンドの安定性、溶解、放出または吸収の速度を変更または維持するために、さらに他の薬理学的に許容しうる賦形剤を含有してもよい。このような賦形剤は、１回量形または多数回量形の非経口投与用剤形を製造するのに普通に慣用されている物質である。
【０１２１】
療法用および診断用組成物を処方した後、それを無菌バイアルに液剤、懸濁液剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、または脱水もしくは凍結乾燥した散剤として保存してもよい。このような処方は、そのまま使用する形または投与直前に再構成する必要のある形で保存してもよい。ＰＤＧＦ核酸リガンドを含有する処方を全身搬送のために投与する方法は、皮下、筋内、静脈内、鼻腔内、または膣もしくは直腸坐剤を介してもよい。
【０１２２】
本発明の複合体および脂質構築物の利点には：ｉ）血漿中での核酸リガンドの薬物動態を改良し；ｉｉ）核酸リガンドを、それらの標的との相互作用のアビディティーを高めるために多価アレイで提示し；ｉｉｉ）異なる特異性をもつ提示核酸リガンド２つまたはそれ以上を、同一リポソーム粒子に組み合わせ；ｉｖ）リポソーム固有の腫瘍標的化特性を利用して、腫瘍への提示核酸リガンドの搬送を高め；そしてｖ）リポソーム内容物を特定の標的へ導くために、抗体のものに匹敵する提示核酸リガンドの高い親和性および特異性を用いることが含まれる。大部分のタンパク質と異なり、熱、種々の分子変性剤および有機溶剤による提示核酸リガンドの変性は易可逆性であるので、提示核酸リガンドは本明細書に記載する種類の製剤に好適である。
【０１２３】
以下の実施例は本発明を説明及び例示するために提供されるのであって、本発明を限定すると受け取られてはならない。実施例１は、ＰＤＧＦに対するｓｓＤＮＡリガンドを産生するために実施例２〜４において使用される様々な材料及び実験方法、及びそれに関連した試験を記載する。実施例２は、ＰＤＧＦに対するｓｓＤＮＡリガンド、及び選択される核酸リガンド及び共通の二次構造モチーフの予測される二次構造を記載する。実施例３は、高アフィニティー結合に必要な最小配列、核酸とＰＤＧＦが接触する部位、ＰＤＧＦイソ型のＤＮＡリガンドによる培養細胞に対する阻害、及び細胞内ＰＤＧＦのマイトジェニック効果のＤＮＡリガンドによる阻害を記載する。実施例４は、ＳＥＬＥＸ−派生リガンドの修飾ヌクレオチドを用いた置換を記載する。実施例５は、ＰＥＧ修飾ＰＤＧＦ核酸リガンドの合成を記載する。実施例６は、修飾されたリガンドの血清における安定性を記載する。実施例７は、修飾されたリガンド（ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ）の再狭窄における効果を記載する。実施例８は、糸球体腎炎におけるＰＤＧＦの阻害を試験することについて実施例９で使用される様々な材料及び方法を記載する。実施例９は、糸球対腎炎におけるＰＤＧＦの阻害を記載する。実施例１０は、ＰＤＧＦに対する２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡリガンドを伸展させる実験方法及び得られたＲＮＡ配列を記載する。
実施例１．実験方法
この実施例は、以下の実施例２〜４に組み込まれている一般法を提供する。
材料
組換えヒトＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｍｒ＝２９，０００）、ＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｍｒ＝２７，０００）及びＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｍｒ＝２５，０００）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ＭＮ）より、担体タンパク質を含まない、凍結乾燥品として購入した。これら３種のイソ型は、成熟ヒトＰＤＧＦ−Ａ鎖（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：６９５−６９９）の長形及び天然に存在するヒトＰＤＧＦ−Ｂ鎖（Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：９２１−９２８）の成熟形についての配列に基づいた合成遺伝子から大腸菌において産生された。無作為化されたＤＮＡライブラリー、ＰＣＲプライマー及びＤＮＡリガンド及び５’−ヨード−２’−デオキシウリジン置換ＤＮＡリガンドは、標準的な固相ホスホロアミダイト法（Ｓｉｎｈａら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４５３９−４５５７）を使用して、ＮｅＸｓｔａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（ボウルダー、ＣＯ）又はＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アラメダ、ＣＡ）によって合成された。
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ＳＥＬＥＸ
ＳＥＬＥＸ法の本質的な特徴は、参照により本明細書に組込まれている、ＳＥＬＥＸ特許出願に詳しく記載されている（ＴｕｅｒｋとＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１０４５０；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１２２７も参照のこと）。定まった配列のプライマーアニーリング領域（表１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−３）が隣接した４０ヌクレオチドの連続ランダム領域を含有する最初のｓｓＤＮＡライブラリーを、４つのホスホロアミダイトの等モル混合物を使用する固相ホスホロアミダイト法によって合成し、無作為化された位置を産生した。このｓｓＤＮＡライブラリーを８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で電気泳動して精製した。完全長のＤＮＡに相当するバンドをＵＶ光で視覚化し、ゲルから切出し、破砕浸漬法によって溶出させ、エタノール沈殿して遠心分離によってペレット状にした。このペレットを真空乾燥し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を補充したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＭ＝１０．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４）で再懸濁した。タンパク質とインキュベーションする前に、ｓｓＤＮＡをＰＢＳＭにおいて２分間９０℃で加熱し、氷冷した。約５００ｐｍｏｌ（３ｘ１０14分子）の５’32Ｐ末端標識化ランダムｓｓＤＮＡを結合緩衝液（０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳＭ）においてＰＤＧＦ−ＡＢとインキュベートすることによって最初の選択を開始した。この混合物を一晩４℃でインキュベートし、次いで３７℃で短い間（１５分）インキュベートした。４℃、８％ポリアクリルアミドゲル（ビス−アクリルアミド：アクリルアミド＝１：３０）、泳動緩衝液：２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有８９ｍＭトリスホウ酸塩（ｐＨ８．３）、５Ｖ／ｃｍの条件で電気泳動することにより、ＰＤＧＦ−ＡＢに結合したＤＮＡを非結合ＤＮＡから分離した。フリーｓｓＤＮＡの約半分の電気泳動移動度で泳動するＰＤＧＦ−ｓｓＤＮＡ複合体に相当するバンドを、オートラジオグラフィーによって視覚化し、ゲルから切出し、破砕浸漬法により溶出させた。次のアフィニティー選択では、ｓｓＤＮＡを結合緩衝液において３７℃で１５分間ＰＤＧＦ−ＡＢとともにインキュベートし、既報のように（Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：６８３−６９５）、ニトロセルロース濾過によって、非結合ＤＮＡからＰＤＧＦ結合ｓｓＤＮＡを分離した。アフィニティー選択されたｓｓＤＮＡのプールをＰＣＲによって増幅したが、ここでは、５０ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ウシ血清アルブミン０．０５ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ  デオキシヌクレオシド三リン酸、５μＭ  プライマー（表１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３）及びＴａｑポリメラーゼ０．１ユニット／μｌを含有する１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．４）において、１２〜２０ラウンドの熱サイクル（９３℃で３０秒、５２℃で１０秒、７２℃で６０秒）にＤＮＡをかけた。５’ＰＣＲプライマーは、ポリヌクレオチドキナーゼ及び［α���32Ｐ］ＡＴＰで５’末端を標識化し、３’ＰＣＲプライマーは、ビオチンホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、スターリング、ＶＡ）を用いて５’末端をビオチニル化した。ＰＣＲ増幅に続き、ストレプタビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、ＩＬ）を、ビオチニル化プライマーの１０倍過剰モル量で非精製ＰＣＲ反応混合物へ加え、室温で１５分間インキュベートした。等量の停止液（９０％ホルムアミド、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０２５％ブロモフェノールブルー及びキシレンシアノール）を加え、室温で２０分間インキュベートしてｄｓＤＮＡを変性させた。１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動によって、放射標識された鎖をストレプタビジン結合ビオチニル化鎖から分離した。より速く泳動する放射標識化（非ビオチニル化）ｓｓＤＮＡ鎖をゲルから切出し、上記のように回収した。ｓｓＤＮＡの量は、２６０ｎｍでの吸光度から、３３μｇ／ｍｌ／吸光度ユニットの吸光計数を用いて算定した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．３  ｖｏｌｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。
クローニング及び配列決定：ＳＥＬＥＸ１２ラウンド由来の増幅されたアフィニティー濃縮プールを１２％ポリアクリルアミドゲルで精製し、大腸菌ＪＭ１０９株のＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ部位の間でクローン化した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．３  ｖｏｌｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー）。各クローンを使用してアルカリ溶解によってプラスミドを製造した。製造業者のプロトコールにより、前進配列決定プライマ−及びＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ２．０（アマーシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）を使用してプラスミドの挿入領域配列を決定した。
見かけの平衡解離定数及び解離速度定数の決定：様々な濃度のＰＤＧＦに対する低濃度のｓｓＤＮＡリガンドの結合性を、既報のように（Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：６８３−６９５）、ニトロセルロースフィルター結合法によって決定した。ＰＤＧＦのストック（ＰＢＳ）溶液濃度は、アミノ酸配列から算出される以下のｅ２８０値を使用して、２８０ｎｍでの吸光度読み取り値から決定した（Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：３１９−３２６）：ＰＤＧＦ−ＡＡに対しては１９，５００M-1ｃｍ-1、ＰＤＧＦ−ＡＢに対しては１５，７００M-1ｃｍ-1、ＰＤＧＦ−ＢＢに対しては１１，８００M-1ｃｍ-1。結合実験用のｓｓＤＮＡは、８％（＞８０ヌクレオチド）又は１２％（＜４０ヌクレオチド）ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動して精製した。すべてのｓｓＤＮＡリガンドを高希釈（約１ｎM）の結合緩衝液において９０℃で２分間加熱し、氷上で冷却後、タンパク質溶液へさらに希釈した。典型的には、この結合混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、ニトロセルロースフィルター上に分配した：
ＤＮＡリガンド（Ｌ）のＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐ）に対する結合性は、平衡時の結合ＤＮＡ分画（ｑ）が以下の式１で与えられる２分子結合モデルで十分示される：
【０１２４】
【式１】
0004413428.tif 000002
【０１２５】
ここで、［Ｐ］t及び［Ｒ］tは、全タンパク質濃度及び全ＤＮＡ濃度であり、Ｋdは平衡解離定数、及びｆは、タンパク質−ＤＮＡ複合体がニトロセルロースフィルター上に保持される効率性である（Ｉｒｖｉｎｅら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：７３９−７６１；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１２２７−１１２３１）。
【０１２６】
ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢに対するＤＮＡリガンドの結合は二相性であり、異なるアフィニティー（対応する解離定数、Ｋd1及びＫd2によって示される）でタンパク質に結合する２種の非相互変換成分（Ｌ1及びＬ2）からＤＮＡリガンドが構成されるモデルによって記述され得る（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１２２７−１１２３１）。この場合、結合ＤＮＡ分画（ｑ）に対する明確な解は以下の式２によって与えられる。
【０１２７】
【式２】
0004413428.tif 000003
【０１２８】
ここで、χ1及びχ2（＝１−χ1）は、Ｌ1及びＬ2のモル分画である。ＤＮＡリガンドのＰＤＧＦへの結合に対するＫd値は、非線形最少２乗法を用いてデータ点を式１（ＰＤＧＦ−ＡＡ）又は式２（ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢ）へフィッティングして算出した。
【０１２９】
解離速度定数（ｋoff）は、分配法としてニトロセルロース結合を使用して、５００倍過剰量の非標識リガンド添加後の時間を関数とした、ＰＤＧＦ−ＡＢ（１ｎＭ）に結合した32Ｐ−５’末端標識化最小リガンドの量（０．１７ｎM）を測定して決定した。ｋoff値は、データ点を以下の１次速度式３へフィッティングして決定した：
【０１３０】
【式３】
0004413428.tif 000004
【０１３１】
ここで、ｑ、ｑ0及びｑ∞は、それぞれ任意時間（ｔ）、ｔ＝０及びｔ＝∞のときにＰＤＧＦ−ＡＢに結合しているＤＮＡの分画を表す。
最小リガンドの決定．３’末端から連続的に先端切れした５’末端標識ＤＮＡリガンドの集団を産生するために、ＤＮＡリガンド鋳型の３’不変配列に相補的なプライマー（先端切れプライマー、５Ｎ２、表１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の５’末端を［γ−32Ｐ］−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで放射標識し、鋳型へアニールして、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、アーリントンハイツ、ＩＬ）及び全４種のｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰを用いて伸張した。結合緩衝液において３７℃で１５分間インキュベーションした後、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する高アフィニティー結合を保持しているこの集団由来のフラグメントを、ニトロセルロースフィルター分配によって、より弱いアフィニティーを有しているものから分離した。アフィニティー選択の前後で、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルによりこのフラグメントを電気泳動的に分離すれば、３’境界部分の判定が可能になる。５’末端から連続的に先端切れした３’末端標識ＤＮＡリガンドの集団を産生するために、［α−32Ｐ］−コルジセピン−５’−三リン酸（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，ボストン、ＭＡ）及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，マジソン、ＷＩ）でＤＮＡリガンドの３’末端を放射標識し、５’末端をＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、λエクソヌクレアーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ゲイサースブルグ、ＭＤ）で部分的に消化した。３’−標識化リガンド１０ピコモルの部分消化は、７ｍＭ  グリシン−ＫＯＨ（ｐＨ９．４）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ＢＳＡ  １μｇ／ｍｌ、ｔＲＮＡ１５μｇ及びλエクソヌクレアーゼ  ４ユニットを含む１００μＬにおいて、３７℃、１５分間で実施した。５’境界部分は、３’境界部分について記載したものと同様の方法で決定した。
融解温度（Ｔm）の測定．最小ＤＮＡリガンドの融解プロフィールは、Ｃａｒｙ  Ｍｏｄｅｌ  １Ｅ分光光度計を用いて得た。オリゴヌクレオチド（３２０〜４００ｎＭ）を、ＰＢＳ、ＰＢＳＭ又は１ｍＭ  ＥＤＴＡを有するＰＢＳにおいて９５℃へ加熱し、室温へ冷却して融解プロフィールを決定した。１５〜９５℃まで１℃／分の割合でサンプルを加熱し、０．１℃ごとに吸光度を記録することによって融解プロフィールを作成した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈのプロットプログラム（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，リーディング、ＰＡ）を用いてデータ点の第一微分係数を算出した。この第一微分係数値は、各点を各サイドの２７データ点で平準化することによって、５５点の補整関数を使用して補整した。補整された第一微分曲線のピークを用いてＴmを評価した。
ＰＤＧＦ−ＡＢに対する５’−ヨード−２’−デオキシウリジン置換ＤＮＡリガンドの架橋結合．単数又は複数の置換がある５’−ヨード−２’−デオキシウリジンをチミジンの代わりに含有するＤＮＡリガンドを、固相ホスホロアミダイト法を用いて合成した。架橋結合する能力について試験するために、微量の５’−32Ｐ末端標識リガンドを、結合緩衝液において３７℃で１５分間ＰＤＧＦ−ＡＢとともにインキュベートしてから照射した。この架橋混合物を３７℃サーモスタット付き１ｃｍ長キュベットへ移し、ＸｅＣｌ充電したＬｕｍｏｎｉｃｓ  Ｍｏｄｅｌ  ＥＸ７４８エキシマレーザーを使用して、２０Ｈｚで２５〜４００秒３０８ｎｍで照射した。集束レンズの焦点から２４ｃｍ後方にキュベットを置き、焦点でのエネルギーは１７５ミリジュール／パルスと測定された。照射後、０．１％ＳＤＳを含有する等量のホルムアミドローディング緩衝液とアリコートを混合し、９５℃で５分間インキュベートしてから、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルでフリーリガンドからＰＤＧＦ／リガンドの架橋複合体を分離した。
【０１３２】
リガンド２０ｔ−Ｉ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）について架橋結合したタンパク質の部位を同定するために、より大きなスケールで結合及び照射を実施した。ＰＤＧＦ−ＡＢ及び５’−32Ｐ末端標識リガンド（それぞれ１μＭ／ＰＢＳＭ）を、２つの１ｍｌ反応槽において、上記のようにインキュベートして照射（３００秒）した。反応混合液を１つにし、エタノール沈殿して、トリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ８．５）０．３ｍｌにおいて再懸濁した。ＰＤＧＦ−ＡＢ／リガンドの架橋複合体を、改良トリプシン（ベーリンガーマンハイム）０．１７μｇ／μｌにより３７℃で２０時間消化した。消化混合物をフェノール／クロロホルム、クロロホルムで抽出し、次いでエタノール沈殿した。ペレットを水及び等量の５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール含有（ＳＤＳなし）ホルムアミドローディング緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間インキュベートし、４０ｃｍの８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで分離させた。フリーリガンドのバンドから約１．５ｃｍ上にある２つの近接したバンドとして泳動する架橋トリプシン分解ペプチド／リガンドをゲルから切出し、破砕浸漬法によって溶出させ、エタノール沈殿した。この架橋ペプチド（比活性に基づけば約１６０ピコモル）を乾燥し、エドマン分解（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社、セントルイス、ＭＯ）によって配列を決定した。
受容体結合アッセイ．記載のようにして（Ｈｅｌｄｉｎら、（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１３８７−１３９４）、ＰＤＧＦα−又はβ−受容体でトランスフェクトしたブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞へ125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡ及び125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢを結合させた。１ｍｌあたりウシ血清アルブミン１ｍｇを補充したリン酸緩衝化生理食塩水０．２ｍｌの細胞培養液（１．５ｃｍ2）へ様々な濃度のＤＮＡリガンドを、125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡ（２ｎｇ，１００，０００ｃｐｍ）又は125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（２ｎｇ，１００，０００ｃｐｍ）とともに加えた。４℃、９０分のインキュベーションの後、細胞培養液を洗浄し、細胞に結合した放射活性をｇ−カウンターで定量した（Ｈｅｌｄｉｎら、（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１３８７−１３９４）。
［3Ｈ］チミジン取込みアッセイ．ＰＤＧＦ−ＢＢ２０ｎｇ／ｍｌ又は１０％胎仔血清に反応して様々な濃度のＤＮＡリガンドの存在下でＰＤＧＦβ−受容体を発現するＰＡＥ細胞への［3Ｈ］チミジン取込みを、記載（Ｍｏｒｉら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１１５８−２１１６４）のようにして実施した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＤＮＡに取込まれた3Ｈ−放射活性を、β−カウンターを用いて定量した。
実施例２．ＰＤＧＦのｓｓＤＮＡリガンド
ＰＤＧＦ−ＡＢに対する高アフィニティーＤＮＡリガンドを、４０個の連続位置（表１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で無作為化した約３ｘ１０14個の分子（５００ピコモル）の１本鎖ＤＮＡライブラリーからＳＥＬＥＸ法によって同定した。ＰＤＧＦ結合ＤＮＡを、第一ラウンドはポリアクリルアミドゲル電気泳動で、次のラウンドはニトロセルロースフィルター結合によって非結合ＤＮＡから分離した。１２ラウンドのＳＥＬＥＸの後では、アフィニティー濃縮化プールは、約５０ｐＭの見かけ解離定数（Ｋd）で（データ示さず）、ＰＤＧＦ−ＡＢに結合した。これは当初の無作為化ＤＮＡライブラリーに比較してアフィニティーが約７００倍向上したことを示した。このアフィニティー濃縮化プールを用いてクローニングライブラリーを産生し、それから３９種を単離して配列決定した。これらリガンドの３２個にユニーク配列が見出された（表２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：４−３５）。最小配列の決定に用いたリガンドにはカラム番号の隣に星印（＊）が付いている。最小リガンドとして高アフィニティー結合性を保持していることが見出されたクローン番号をイタリック体で示す。表２に示した全リガンドを、ニトロセルロースフィルター結合法を使用して、ＰＤＧＦ−ＡＢに対するその結合能力でスクリーニングした。この群から最良のリガンドを同定するために、タンパク質の濃度範囲においてＰＤＧＦ−ＡＢに結合する５’32Ｐ末端標識リガンドの分画を測定することによって、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する相対アフィニティーを決定した。ＰＤＧＦ−ＡＢと高アフィニティーで結合したリガンドについては、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＡに対するアフィニティーも試験した。いずれの場合も、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢに対するリガンドのアフィニティーは同等であったが、ＰＤＧＦ−ＡＡに対するアフィニティーはかなり低かった（データ示さず）。
【０１３３】
３２種のユニークリガンドのうち２１種（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５、７〜９、１４〜２４、２６、３１、３２、３４及び３５）は、表３に示す配列ファミリーへ群分けし得る。最初の無作為化領域の配列（大文字）をコンセンサス３方向ヘリックス連結部モチーフによって並置する。配列の不変領域内のヌクレオチド（小文字）は、それらが予測される二次構造に参画する場合にのみ示す。いくつかのリガンドは、コンセンサスモチーフとの円順列を介した関連性を示すために「断続」（等号記号）された。塩基対合に参画すると予測されたヌクレオチドを下線の逆矢印で示し、矢印の先端はヘリックス連結部分のほうを指す。これらの配列は、ヘリックス連結部の（５’末端から）最初の１本鎖ヌクレオチドに基づいて（ヘリックスＩＩ及びＩＩＩの間のＡ又はＧ）、Ａ及びＢの２群へ分けられる。ヘリックス領域のミスマッチを、対応する文字の下にドットを付けて示す（Ｇ−Ｔ及びＴ−Ｇ塩基対は許容される）。単一のヌクレオチドバルジ（膨らみ）が起こるところでは、そのミスマッチヌクレオチドをその近隣配列内の残りの配列上に示す。
【０１３４】
上記の分類は、これらリガンド間の配列相同性に一部基づいているが、大部分は共有された二次構造モチーフ、即ち、分岐点に３ヌクレオチドループを有する３方向ヘリックス連結部（図１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）に基づいている。これらリガンドを２群へ細分した。Ａ群のリガンドでは分岐点のループはＡＧＣの不変配列を有し、Ｂ群ではその配列はＧ（Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ）である。提唱されるコンセンサス二次構造モチーフを裏付けるのはヘリックス内の非保存ヌクレオチドにおける塩基対合の共変異である（表４）。３方向連結部は連続したＤＮＡ鎖でコードされるので、ヘリックスの２つは連結部からの遠位端ループで終わる。これらのループは長さと配列のいずれも高度に可変性である。さらに、コンセンサスモチーフの円順列により、このループは３つのヘリックスすべてで発生するが、最も頻繁に起こるのはヘリックスＩＩ及びＩＩＩである。まとめると、上記の観察事実は、ヘリックス連結部から遠位の領域はＰＤＧＦ−ＡＢに対する高アフィニティー結合にとって重要ではないことを示唆する。実際、高度に保存された配列は、ヘリックス連結部の近くに見出される。
実施例３．最小リガンドの決定
高アフィニティー結合に必要な最小配列をＰＤＧＦ−ＡＢに対する６個の最良リガンドについて決定した。一般に、３’及び５’の最小配列境界に関する情報は、核酸リガンドを部分的に切断し、次いでターゲットに対する高いアフィニティーを保持するフラグメントを選択して得られる。ＲＮＡリガンドについては、好便にも温和なアルカリ分解によってフラグメントが得られる（Ｔｕｅｒｋら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３：７４９−７６１；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１０４５０−１０４５６；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２；Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：６０−６８）。ＤＮＡのほうが塩基に対してより抵抗するので、フラグメントを産生する別の方法がＤＮＡには必要とされる。３’境界を決定するために、ジデオキシ配列決定法を用いて、ＤＮＡリガンドの３’不変配列にアニールしたプライマーの５’末端を伸張することによって、３’末端から連続的に先端切れしたリガンドフラグメントの集団を産生した。この集団をニトロセルロース濾過によってアフィニティー選択し、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する高アフィニティー結合を保持している（３’末端から先端切れしている）最も短いフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。５’境界も同様の方法で決定したが、５’末端で連続的に先端切れした３’末端標識リガンドフラグメントの集団は、λエクソヌクレアーゼを用いた限定消化によって産生した。次いで、最小リガンドをこの２つの境界間の配列として定義する。上記実験から派生した情報は有用であるが、その境界がその時点で試験された１つの末端でしかない以上、示唆された境界は絶対ではないことを銘記すべきである。先端切れしていない（放射標識された）末端は、結合に対する効果を増強、減少するか又はそれに影響しない（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１０４５０−１０４５６）。
【０１３５】
実験的に境界を決定した６つの最小リガンドのうち、２つ（２０ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）（図２Ａ）及び４１ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）（図２Ｃ）；リガンド２０及び４１の先端切れバージョン）は、その完全長の類似体に匹敵するアフィニティー（１／２以内）で結合したが、４つはかなり低いアフィニティーを有した。ＰＤＧＦに対する高アフィニティー結合を保持していたこの２つの最小リガンド、２０ｔ及び４１ｔは、予測される３方向ヘリックス連結部の二次構造モチーフ（図２Ａ〜Ｃ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：８３−８５）を含有する。高アフィニティーでＰＤＧＦ−ＡＢに結合する第三の最小リガンドである３６ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）の配列はコンセンサスモチーフの知識から導いた（図２Ｂ）。後続の実験で、リガンド２０ｔの５’末端にある１本鎖領域は高アフィニティー結合には重要でないことが判明した。さらに、リガンド３６ｔにあるヘリックスＩＩ及びＩＩＩ上の３ヌクレオチドループ（ＧＣＡ及びＣＣＡ）は、ヘキサエチレングリコールのスペーサーで置換し得る（下記参照）。これらの実験は、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する高アフィニティー結合におけるヘリックス連結部領域の重要性のさらなる裏付けを提供する。
ＰＤＧＦに対する最小リガンドの結合．様々な濃度のＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢに対する最小リガンド２０ｔ、３６ｔ及び４１ｔの結合を図３Ａ〜３Ｃに示す。その完全長の類似体が有する結合特性に一致して、この最小リガンドは、ＰＤＧＦ−ＡＡに対するよりも実質的に高いアフィニティーでＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢに結合する（図３Ａ〜３Ｃ、表４）。事実、ＰＤＧＦ−ＡＡに対するそれらのアフィニティーは、ランダムＤＮＡのそれと同等である（データ示さず）。ＰＤＧＦ−ＡＡに対する結合が単相の結合式で十分記載されるのに対し、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢへの結合は明らかに二相性である。以前のＳＥＬＥＸ実験では、二相性の結合は、様々なアフィニティーでその標的タンパク質に結合する分離可能な核酸分子種が存在するためであることが判明している（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２、及び未発表結果）。この高アフィニティー分画と低アフィニティー分画との同一性は現時点では不明である。ここに記載されたこれらのＤＮＡリガンドは化学的に合成されたので、ＰＤＧＦ−ＡＢ及びＰＤＧＦ−ＢＢにより低いアフィニティーで結合する分画は化学的に不完全なＤＮＡを表すのかもしれない。また、高アフィニティーと低アフィニティーの分子種は、異なるアフィニティーでＰＤＧＦ−Ｂ鎖に結合する安定なコンホメーションの異性体であるのかもしれない。いずれにせよ、より高いアフィニティー結合の成分は、いずれの場合でも最も多く存在するリガンド種である（図３Ａ〜３Ｃ）。比較のために、０．５ｎＭのＫdでヒトのトロンビンに結合して予測されるステムループ構造を有する、３９マーＤＮＡリガンド（リガンドＴ３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）：５’−ＣＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴＴＣＧＴＧＧＡＡ［３’Ｔ］；ここで、［３’Ｔ］は、３’−エクソヌクレアーゼ分解を抑制するために追加した３’−３’結合性のチミジンヌクレオチドを表す）は、ＰＤＧＦ−ＡＢに０．２３μＭのＫdで結合する（データ示さず）。
最小リガンドの解離速度．ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＤＮＡ複合体の動態安定性を評価するために、最小リガンド２０ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）、３６ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）及び４１ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）とＰＤＧＦ−ＡＢとの複合体の３７℃における解離速度を、過剰量の非標識リガンド添加後の時間を関数としてＰＤＧＦ−ＡＢ（１ｎＭ）に結合した放射標識リガンドの量（０．１７ｎM）を測定して決定した（図４）。上記のタンパク質及びＤＮＡリガンド濃度では、ＤＮＡリガンドの高アフィニティー分画のみがＰＤＧＦ−ＡＢに結合する。解離速度定数についての以下の数値は、図４のデータ点を１次速度式へフィッティングして得た：リガンド２０ｔは４．５±０．２ｘ１０-3ｓ-1（ｔ1/2＝２．６分）、リガンド３６ｔは３．０±０．２ｘ１０-3ｓ-1（ｔ1/2＝３．８分）及びリガンド４１ｔは１．７±０．１ｘ１０-3ｓ-1（ｔ1/2＝６．７分）。解離定数と解離速度定数から算出した結合速度（ｋon＝ｋoff／Ｋd）は、２０ｔが３．１ｘ１０7Ｍ-1ｓ-1、３６ｔが３．１ｘ１０7Ｍ-1ｓ-1、４１ｔが１．２ｘ１０7Ｍ-1ｓ-1である。
最小リガンドの融解温度．最小リガンドである２０ｔ、３６ｔ及び４１ｔの温度に対するＵＶ吸収のプロフィール（図５）から、融解温度（Ｔm）を決定した。この実験で用いたオリゴヌクレオチド濃度（３２０〜４４０ｎＭ）では、非変性ポリアクリルアミドゲル上で単一バンドとして観察されたのはモノマー分子種だけである。Ｔm値は、融解プロフィールの第一微分係数の再プロットから得た。リガンド２０ｔ及び４１ｔは、４４℃及び４９℃のＴm値で単相の融解を示した。リガンド３６ｔの融解プロフィールは二相性で、Ｔm値は第一（主要）転移で４４℃、第二転移で約６３℃であった。
５’−ヨード−２’−デオキシウリジンで置換された最小ＤＮＡリガンドのＰＤＧＦ−ＡＢに対する光架橋形成．ごく近接しているＤＮＡリガンドとＰＤＧＦの部位を決定するために、５’−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＩｄＵ）で置換されたＤＮＡリガンド、２０ｔ、３６ｔ及び４１ｔを用いて、一連の光架橋形成実験を実施した。３０８ｎｍで単色性の励起をすると、最初のｎからπ*遷移へのシステム内交叉の後で、５−ヨード及び５−ブロモ置換されたピリミジンヌクレオチドが反応性の三重項状態を多く占めるようになる。次いで励起された三重項状態の分子種は、その近傍にある電子リッチなアミノ酸残基（例、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＨｉｓ）と反応して共有結合性の架橋を形成する。この方法が核酸−タンパク質相互作用の研究に広く使用されてきたのは、光損傷を最小化する３００ｎｍ以上の光による照射が可能だからである（Ｗｉｌｌｉｓら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４９４７−４９５２；ＳｔｕｍｐとＨａｌｌ（１９９５）ＲＮＡ  １：５５−６３；Ｗｉｌｌｉｓら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１２５５−１２５７；Ｊｅｎｓｅｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１２２２０−１２２２４）。すべてのチミジン残基をＩｄＵ残基で置換したリガンド２０ｔ、３６ｔ及び４１ｔの類似体を、固相ホスホロアミダイト法を用いて合成した。これらＩｄＵ置換リガンドのＰＤＧＦ−ＡＢに対するアフィニティーは、非置換リガンドに比較してやや増強され、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上でのより遅い電気泳動度を有するバンドの外観によれば、３種の５’末端標識ＩｄＵ置換リガンドはいずれも３０８ｎｍで励起されるとＰＤＧＦ−ＡＢと架橋結合した（データ示さず）。最高の架橋効率が観察されたのはＩｄＵ置換リガンド２０ｔである。観察される架橋の原因となる特定のＩｄＵ位置を同定するために、単一又は複数のＩｄＵで置換した７種の２０ｔ類似体（リガンド２０ｔ−Ｉ１〜２０ｔ−Ｉ７：５’−ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＴ1Ｔ1ＣＴ1Ｔ1ＣＧＴ2ＧＧＴ3Ｔ4ＡＣＴ5Ｔ6Ｔ6Ｔ6ＡＧＴ7ＣＣＣＧ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−９５、ここで数字は７種のリガンドに対して指定したチミジンヌクレオチドのＩｄＵ置換位置を示す）を、ＰＤＧＦ−ＡＢに対して光架橋する能力について試験した。上記７種のリガンドのなかで、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する効率的な架橋形成が観察されたのは、リガンド２０ｔ−Ｉ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）だけである。この光反応性のＩｄＵ位置は、ヘリックス連結部のループにある３’近傍チミジンに相当する（図２）。
【０１３６】
ＰＤＧＦ−ＡＢ上で架橋形成したアミノ酸残基を同定するために、５’末端標識した２０ｔ−Ｉ４とＰＤＧＦ−ＡＢの混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、次いで３０８ｎｍで照射した。次いでこの反応混合物を改良トリプシンで消化し、架橋形成フラグメントを８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにて分離した。フリーＤＮＡの最も近くに泳動したバンドから回収したペプチドフラグメントをエドマン分解したところ、アミノ酸配列、ＫＫＰＩＸＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６：ここでＸは２０種の誘導される標準アミノ酸では同定し得なかった被修飾アミノ酸を示す）が明らかになった。Ｘがフェニルアラニンであれば、このペプチド配列はＰＤＧＦ−Ｂ鎖のアミノ酸８０−８６に相当し（Ｊｏｈｎｓｓｏｎら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：９２１−９２８）、これはＰＤＧＦ−ＢＢの結晶構造において溶媒露出したループＩＩＩの一部を構成する（Ｏｅｆｎｅｒら（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：３９２１−３９２６）。ＰＤＧＦ−Ａ鎖では、このペプチド配列は出現しない（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：６９５−６９９）。以上から、上記データは、リガンド２０ｔの特定チミジン残基とＰＤＧＦ−Ｂ鎖のフェニルアラニン８４との点接触を立証する。
受容体結合アッセイ．培養細胞に対するＰＤＧＦイソ型の効果をＰＤＧＦに対するＤＮＡリガンドが阻害し得るかどうかを決定するために、トランスフェクションによりブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞において安定発現されているＰＤＧＦ−α−及びβ−受容体に対する125Ｉ−標識化ＰＤＧＦイソ型の結合に対する効果を先ず定量した。リガンド２０ｔ、３６ｔ及び４１ｔは、いずれもＰＤＧＦα−受容体（図６）又はＰＤＧＦβ−受容体（データ示さず）に対する125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合を効率的に阻害し、半最大効果のＤＮＡリガンド濃度は約１ｎＭであった。トロンビンに対して向けられ、対照として包含されるＤＮＡリガンドＴ３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）（上記参照）は効果を示さなかった。、125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡのＰＤＧＦα−受容体に対する結合を阻害し得たリガンドは１つもなく（データ示さず）、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢに対するリガンド２０ｔ、３６ｔ及び４１ｔの観察された特異性と矛盾しない。
最小リガンドによるマイトジェニック効果の阻害．ＰＤＧＦβ−受容体を発現するＰＡＥ細胞に対するＰＤＧＦ−ＢＢのマイトジェニック効果を阻害するＤＮＡリガンドの能力を検討した。図７に示すように、［3Ｈ］チミジン取込みに対するＰＤＧＦ−ＢＢの促進効果は、リガンド２０ｔ、３６ｔ及び４１ｔによって中和された。リガンド３６ｔの半最大阻害濃度は２．５ｎＭであり、リガンド４１ｔはそれよりやや効率的で、２０ｔはやや非効率であった。対照リガンドのＴ３９には効果がなかった。さらに、この細胞での［3Ｈ］チミジン取込みに対する胎仔血清の促進効果を阻害したリガンドは１つもなかった。このことは、阻害効果がＰＤＧＦ特異的であることを示している。
実施例４．ＳＥＬＥＸ後の修飾
ヌクレアーゼに対する核酸の安定性は、核酸をベースとする治療薬を開発する営為において重要な考察事項である。これまでの実験では、ＳＥＬＥＸ−派生リガンドにおけるヌクレオチドの多くが、場合によってはそのほとんどが、ヌクレアーゼ消化に抵抗する修飾されたヌクレオチドによって、高アフィニティー結合性を低下させずに置換され得ることが示された（Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：６８３−６９５；Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：６０−６８）。
【０１３７】
２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）又は２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換を許容するリガンド３６ｔ内のポジションを同定するために、一連の置換実験を実施した。表６と７、及び図８Ａと８Ｂは、試験した置換及び、ＰＤＧＦ−ＡＢ又はＰＤＧＦ−ＢＢへのアフィニティーに対する修飾リガンドの効果をまとめる。２−フルオロピリミジンヌクレオシドホスホロアミダイトはＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サンルイスオビスポ、ＣＡ）から入手した。２’−Ｏ−メチルプリンホスホロアミダイトは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ボストン、ＭＡ）から入手した。他のヌクレオシドホスホロアミダイトもすべてＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ボストン、ＭＡ）から入手した。必ずしもすべての置換の組み合わせを試験したわけではない。しかしながら、上記の実験は、ＰＤＧＦ−ＡＢ又はＰＤＧＦ−ＢＢに対する高アフィニティー結合に適合する２’−Ｏ−Ｍｅ及び２’−Ｆ置換のパターンを同定するために用いられてきた。リガンド３６ｔのヘリックスＩＩ及びＩＩＩ（図２Ｂ及び８Ｂ）上のトリヌクレオチドループがペンタエチレングリコール（１８原子）スペーサー（Ｓｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  １８、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，スターリング、ＶＡ）（ペンタエチレングリコール置換リガンドの合成に関する説明は実施例５を参照のこと）により、ＰＤＧＦ−ＡＢ又は−ＢＢに対する高アフィニティー結合性を低下することなく置換し得ることは注目に値する。このことは、リガンドのヘリックス連結部ドメインが高アフィニティー結合に必要とされる構造モチーフの核心を表すという考え方に一致している。実用的に述べると、６つのヌクレオチドを２つのペンタエチレングリコールスペーサーで置換することは、リガンド合成に必要なカップリングの工程数を４つ減少させるという点で有利である。この置換実験に加えて、ヘリックスＩの塩基から４つのヌクレオチドが結合活性を失うことなく除去し得ることが見出された（例えば、表６及び７で、リガンド３６ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）を３６ｔａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）と比較する、又はリガンド１２６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）を１２９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）と比較すること）。
実施例５．ＰＥＧ修飾ＰＤＧＦ核酸リガンドの合成
Ａ）固体支持体におけるＮＸ３１９７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）合成の一般法
デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト標準品、２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルグアノシン−ホスホロアミダイト、２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ６−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルアデノシン−ホスホロアミダイト、２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−ホスホロアミダイト、２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ４−アセチルシチジン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−（２−シアノエチル）−ホスホロアミダイト、１８−Ｏ−ＤＭＴ−ヘキサエチレングリコール−１−［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−（２−シアノエチル）−ホスホロアミダイト］（図９Ｃ）、及び５−トリフルオロアセトアミドペンタン−１−［Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−（２−シアノエチル）−ホスホロアミダイト］（図９Ｄ）を使用して、ミリポア８８００自動合成機において１ミリモルスケールで合成を実施した。５’−スクシニルチミジン６０〜７０μモル／ｇでロードした、孔サイズ６００Ａ、８０〜１２０メッシュの制御孔ガラス（ＣＰＧ）支持体上で、４，５−ジシアノイミダゾールを活性化剤として用いて、合成を実施した。合成の後で、５５℃で１６時間かけて、４０％ＮＨ4ＯＨによりオリゴを脱保護化した。支持体を濾過し、水及び１：１アセトニトリル／水で洗浄し、洗液を合わせて蒸発乾固した。骨格上のアンモニウムカウンターイオンを逆相塩交換によってトリエチルアンモニウムイオンに変換し、溶媒を蒸発させて粗オリゴをトリエチルアンモニウム塩として得た。
【０１３８】
ループ上のヘキサエチレングリコールスペーサーは、リン酸結合を介してヌクレオチドに付けられる。２つのループの構造を図９Ａ及び９Ｂに示す。示された５’リン酸基はヘキサエチレングリコールホスホロアミダイトに由来する。
Ｂ）ＰＤＧＦ核酸リガンド上のアミノリンカーに対する４０Ｋ  ＰＥＧ・ＮＨＳエステルの接合
５’−１級アミノ基を含有するＮＸ３１９７５の粗オリゴヌクレオチドを１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に溶かして６０ｍｇ／ｍｌの濃度にした。別の試験管に２当量のＰＥＧ・ＮＨＳエステル（図９Ｅ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社）を乾燥ＤＭＦ（ホウ酸：ＤＭＦ＝１：１）に溶かし、この混合物を温めてＰＥＧ・ＮＨＳエステルを溶かした。次いで、オリゴ溶液を速やかにＰＥＧ溶液へ加え、この混合物を室温で１０分間激しく撹拌する。約９５％のオリゴがＰＥＧ・ＮＨＳエステルに接合した。
実施例６．修飾されたリガンドの血清における安定性
ＤＮＡ（３６ｔａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）及び修飾されたＤＮＡ（ＮＸ２１５６８）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）リガンドのラット血清における安定性を３７℃で比較した。上記実験に用いた血清はスプレーグ−ドーリーラットから入手し、０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターで濾過し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で緩衝化した。この血清に被験リガンド（３６ｔａ又はＮＸ２１５６８）を加え、最終濃度を５００ｎＭとした。血清の最終濃度は、緩衝液とリガンドを加えたために８５％となった。元のインキュベーション混合液９００μｌから様々な時点で１００μｌのアリコートを分取し、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌを加え、振盪し、ドライアイスで凍結し、実験終了まで−２０℃に保存した。各時点で残存している完全長オリゴヌクレオチドリガンドの量をＨＰＬＣ分析によって定量した。ＨＰＬＣ注入サンプルを調製するには、ホルムアミド３０％及び１％アセトニトリル含有２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）７０％の混合液２００μｌを各点サンプルの融解液１００μｌへ加え、５秒間振盪し、エッペンドルフ微量遠心管において１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ＬｉＣｌ勾配を適用する陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＮｕｃｌｅｏＰａｃ，Ｄｉｏｎｅｘ，ＰＡ−１００，４ｘ５０ｍｍ）を用いて分析を実施した。各時点で残存している完全長オリゴヌクレオチドの量をピーク面積から決定した（図１０）。修飾されたリガンド（ＮＸ２１５６８）の半減期は約５００分であり、約３５分の半減期で分解するＤＮＡリガンド（３６ｔａ）に比較して、ラット血清において実質的に優る安定性を示した（図１０）。従って、血清における安定性の増加は２’−置換に由来するものである。
実施例７．ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）の再狭窄における効果
ラット再狭窄モデルと効果の結果．核酸リガンドの血漿滞留時間は、ポリエチレングリコールのような大きな不活性官能基を加えることにより劇的に向上される（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１８９４４を参照のこと）。ｉｎ  ｖｉｖｏの有効性実験のために、実施例５Ｂに記載のように（分子の説明については図９Ａを参照のこと）、４０Ｋ・ＰＥＧをＮＸ３１９７５へ接合してＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧを創出した。重要にも、結合実験に基づけば、リガンドの５’末端に４０ｋＤａのＰＥＧ基を加えても、ＰＤＧＦ−ＢＢに対するその結合アフィニティーには影響しない。
【０１３９】
ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧによるＰＤＧＦ−Ｂの選択阻害効果を３月齢の雄スプレーグ−ドーリーラット（３７０〜４５０ｇ）で試験した。ラットは１ケージあたり３匹収容し、標準実験食及び水を自由に摂取させた。人工照明を毎日１４時間当てた。この実験は、ウプサラ大学（スウェーデン）大学病院外科部門、動物部の体系的なガイドラインに準拠して実施した。
【０１４０】
全３０匹のラットを２処置群のいずれかへ無作為に割当てた：第１群のラット１５匹にはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かしたＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧを体重ｋｇあたり１０ｍｇ、１日２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して与え、第２群（対照群）のラット１５匹には等量（約１ｍｌ）のＰＢＳを与えた。処置期間は１４日であった。両群の初回注射は動脈損傷の１時間前になされた。
【０１４１】
動脈性の損傷を発生させるために、全動物にフェンタニール−フルアニゾン（Ｈｙｐｎｏｒｍ  ｖｅｔ，フルアニゾン１０ｍｇ／ｍｌ、フェンタニール０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，ビアス、ベルギー）、ミダゾラム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ，ミダゾラム５ｍｇ／ｍｌ、Ｆ．ホフマン−ラ・ロシュＡＧ、バーゼル、スイス）及び滅菌水の、１：１：２混合液をラット１００ｇにつき０．３３ｍｌ、ｉ．ｐ．注射して麻酔した。頚部正中切開により、遠位の左総頚動脈及び外頚動脈を露出させた。外頚動脈を介して導入した２Ｆ  Ｆｏｇａｒｔｙ塞栓摘出カテーテルの管腔内通過によって左総頚動脈を傷つけた。蒸留水０．０６ｍｌで十分膨らませたバルーンを用いてカテーテルを３回通過させ、頚動脈自体を膨張させた。カテーテル除去後に外頚動脈を結紮し、創傷部を閉じた。すべての外科処置は、どれが処置群かを知らされない外科医によって実施された。
【０１４２】
カテーテルによる損傷から１４日目に、動物を上記のように麻酔した。腹大動脈を露出する２０分前に、０．５％エバンスブルー染料（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ＭＯ）０．５ｍｌを動物に静脈内注射し、内皮化しないままになっている血管部分が同定できるようにした。溶出液が下大静脈の静脈孔を経て澄明になるまで、腹大動脈内に逆向きに置いた大カニューレを介し、１００ｍｍＨｇにおいて、氷冷ＰＢＳで頚動脈をｉｎ  ｓｉｔｕ灌流した。右及び左総頚動脈の分枝部までの遠位半分を切除し、液体窒素に凍らせた。すぐ後で残りの近位部分を、１００ｍｍＨｇ圧において、２．５％グルタルアルデヒド／リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて同じ大動脈カニューレを介して灌流固定した。ＰＢＳを用いた灌流を開始する前に、動物を過量のフェノバルビタールで屠殺した。灌流固定から約１５分後、残りの近位右及び左総頚動脈を、大動脈弓及び無名動脈も含めて、次の調製のために回収した。
【０１４３】
左総頚動脈のエバンスブルー染色部分の中央から約０．５μｍ離れた５断面、及び対側性の非損傷動脈の１断面を動物ごとにコンピュータ支援プラニメトリーで解析した。以下の領域を測定した：外弾性内腔（ＥＥＬ）に囲まれた領域、内弾性内腔（ＩＥＬ）及び内腔内細胞層。中膜及び内膜の面積を算出した。すべての測定はどれが処置群かを知らされない実験者によってなされた。
【０１４４】
対照群と核酸リガンド処置群についての内膜／中膜比の数値に基づけば、ＰＤＧＦ核酸リガンドは、内膜新形成の約５０％を有意に（ｐ＜０．０５）阻害した（図１１）。
実施例８．糸球体腎炎におけるＰＤＧＦのＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧによる拮抗作用
この実施例は以下に示す実施例９に組込まれる一般法を提供する。
材料と方法
すべての核酸リガンド及びその配列スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）対照物は、制御孔ガラス上の固相ホスホロアミダイト法により、８８００Ｍｉｌｌｉｇｅｎ・ＤＮＡ合成機を使用して合成し、水酸化アンモニウムを５５℃で１６時間用いて脱保護化した。この実施例及び実施例９で説明する実験に用いた核酸リガンドは、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）（図９Ａ）である。ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧは、ＮＸ３１９７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）（表７）を実施例５に記載のように４０Ｋ・ＰＥＧへ接合して創出した。配列スクランブル対照の核酸リガンドでは、ＮＸ３１９７５のヘリックス連結部領域にある８つのヌクレオチドを、コンセンサス二次構造を形式的には変化させることなく相互交換した（図８Ｃ参照）。配列スクランブル対照核酸リガンドのＰＤＧＦ−ＢＢに対する結合アフィニティーは約１μＭであり、これはＮＸ２１６１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）に比較して１０，０００倍低い。次いでこの配列スクランブル対照核酸リガンドをＰＥＧに接合し、ＮＸ３１９７６−４０Ｋ・ＰＥＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）（分子の説明については図９Ｂを参照のこと）と命名した。ＰＥＧの核酸リガンド（又は配列スクランブル対照）に対する共有カップリングは、実施例５に記載のようにして達成した。
【０１４５】
交叉反応結合実験に用いるラットのＰＤＧＦ−ＢＢは、ラットのＰＤＧＦ−ＢＢ配列を含有するｓＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ・Ａｍｐ・ＳＫ（＋）プラスミドでトランスフェクトした大腸菌由来のものである。ラットＰＤＧＦ−ＢＢの配列は、ラット肺由来ポリＡ＋ＲＮＡ（クローンテック、サンディエゴ、ＣＡ）から、ＰＤＧＦ−ＢＢの成熟型をコードする配列を増幅するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを介して導いた。ラットＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質の発現及び精製はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓで実施した。
糸球体間質細胞の培養実験
ヒト糸球体間質細胞を、既報のようにして（Ｒａｄｅｋｅら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１２８１−１２９２）培養で確立し、特徴づけて維持した。この培養された糸球体間質細胞に対するリガンドの抗増殖効果を試験するために、細胞を９６穴プレート（Ｎｕｎｃ，ウィスバーデン、ドイツ）にまき、半集密状態まで増殖させた。次いＭＣＤＢ３０２培地（シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ）で４８時間増殖を停止させた。４８時間後、５０又は１０μｇ／ｍｌの核酸リガンドＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧか、又は５０又は１０μｇ／ｍｌの配列スクランブル核酸リガンド（ＮＸ３１９７６−４０Ｋ・ＰＥＧ）のいずれかとともに以下の様々な刺激を加えた：培地のみ、ヒト組換えＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ又は−ＢＢ（ドイツ、ヴュルツブルグ大学のＪ．Ｈｏｐｐｅの厚意により提供された）１００ｎｇ／ｍｌ、ヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，バッドソーデン、ドイツ）１００ｎｇ／ｍｌ又は組換えヒト繊維芽細胞増殖因子−２（Ｓｙｎｅｒｇｅｎ，ボウルダー、コロラドの厚意により提供された）１００ｎｇ／ｍｌ。７２時間インキュベーションした後に、記載のように（Ｌｏｎｎｅｍａｎｎら（１９９５）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５１：８３７−８４４）、２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−カルボキシアニリド（ＸＴＴ；シグマ）を用いて、生細胞の数を定量した。
実験デザイン
体重１５０〜１６０ｇの雄ウィスターラット（チャールズリバー、ズルツフェルド、ドイツ）３３匹に、モノクローナル抗−Ｔｈｙ１．１抗体（クローンＯＸ−７；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ソールズベリー、イギリス）を１ｍｇ／ｋｇ注射することによって、抗−Ｔｈｙ１．１間質細胞増殖性糸球体腎炎を誘導した。疾患誘導後３〜８日の間、ラットを核酸リガンド又はＰＥＧで処置した（下記参照）。処置は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）４００μｌに溶かした試験物質を１日２回ｉ．ｖ．ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射することを含んだ。この処置期間を選択したのは、発症後第１日目から糸球体間質細胞増殖がピークに至るまでにラットを処置するためである（Ｆｌｏｅｇｅら（１９９３）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ．３９：Ｓ４７−５４）。試験したのは以下の４群である：１）ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）を受けたラット９匹（即ち、全体で４０Ｋ・ＰＥＧ１５．７ｍｇに接合したＰＤＧＦ−Ｂリガンド４ｍｇ）；２）同量のＰＤＧＦ接合スクランブル核酸リガンド（ＮＸ３１９７６−４０Ｋ・ＰＥＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）を受けたラット１０匹；３）同量（１５．７ｍｇ）の４０Ｋ・ＰＥＧだけを受けたラット８匹；４）ＰＢＳのみのボーラス注射４００μｌを受けたラット６匹。疾患誘導後６日目と９日目に、組織学的分析用の腎臓生検サンプルを得た。疾患誘導後５〜６日目と８〜９日目に、２４時間かけて尿を採取した。９日目に屠殺する４時間前に、チミジン類似体の５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ；シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ）を腹腔内注射した。
【０１４６】
同年齢である１０匹の未処置ウィスターラットでは、タンパク尿及び腎組織パラメーター（以下参照）が正常範囲にあることを確かめた。
腎臓の形態学
光学顕微鏡及び免疫ぺルオキシダーゼ染色用に組織をメチルカルノイ液に固定し（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：３６９−３７４）、パラフィンに埋め込んだ。４μｍの断面を過ヨード酸シッフ（ＰＡＳ）試薬で染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。ＰＡＳ染色切片において、１００個の腎糸球体における有糸分裂数を定量した。
免疫ぺルオキシダーゼ染色
メチルカルノイ液で固定した生検組織の４ｍｍ切片を、記載のような間接免疫ぺルオキシダーゼ技術によって処理した（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：３６９−３７４）。１次抗体は既報のものと同一であり（Ｂｕｒｇら（１９９７）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：５０５−５１６；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（１９９１）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４０：４７０−４７６）、α−平滑筋アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（クローン１Ａ４）；ＰＤＧＦ−Ｂ鎖に対するマウスモノクローナル抗体（クローンＰＧＦ−００７）；単球、マクロファージ及び樹状細胞に存在する細胞質抗原に対するマウスモノクローナルＩｇＧ抗体（クローンＥＤ１）；ラット赤血球で前吸着させたアフィニティー精製ポリクローナルヤギ抗ヒト／ウシＩＶ型コラーゲンＩｇＧ；ポリクローナルウサギ抗ラットフィブロネクチン抗体のアフィニティー精製ＩｇＧ分画；既報のような好適な陰性対照物（Ｂｕｒｇら（１９９７）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：５０５−５１６；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（１９９１）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４０：４７０−４７６）を包含した。全スライドに対する評価は、スライドの起源について知らない観察者によってなされた。
【０１４７】
糸球体に浸潤している白血球の平均数を得るために、２０以上の別々の毛細管断片を含有する糸球体の５０以上の連続した横断面を評価し、腎臓あたりの平均値を算出した。α−平滑筋アクチン、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖、ＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチンについて免疫ペルオキシダーゼ染色を評価するために、各糸球体領域を半定量的に等級づけし、生検ごとの平均スコアを算出した。各スコアは染色の強さというよりは程度の変化を主に反映し、焦点が強められたポジティブ染色を示す糸球体領域の比率に依存する：Ｉ＝０〜２５％、ＩＩ＝２５〜５０％、ＩＩＩ＝５０〜７５％、ＩＶ＝＞７５％。この半定量的な評点システムは種々の観察者の間で再現性があり、データはコンピュータ形態計測によって得られた結果と非常によく相関している（Ｋｌｉｅｍら（１９９６）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４９：６６６−６７８；Ｈｕｇｏら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２４９９−２５０８）。
免疫組織化学的な二重染色
増殖細胞のタイプを同定するための二重免疫染色は、既報のように（Ｋｌｉｅｍら（１９９６）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４９：６６６−６７８；Ｈｕｇｏら（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２４９９−２５０８）、先ず間接免疫ペルオキシダーゼ法を使用して、トリス緩衝化生理食塩水（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ブラウンシュヴァイク、ドイツ）にヌクレアーゼを含有するブロモデオキシウリジンに対するマウスモノクローナル抗体（クローンＢＵ−１）で増殖細胞断面を染色することによって実施した。次いで、ＩｇＧ1モノクローナル抗体である、α−平滑筋アクチンに対する１Ａ４及び単球／マクロファージに対するＥＤ１とともに断面をインキュベートした。ＢｒｄＵに対して陽性の核染色を示し、その核がα−平滑筋アクチンに陽性な細胞質で完全に囲まれている細胞は、増殖している糸球体間質細胞か又は単球／マクロファージとして同定された。陰性対照にはいずれの１次抗体も含まれていないので、どの場合でも二重染色は認められなかった。
ＩＶ型コラーゲンｍＲＮＡに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
既報のようにして（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（１９９１）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４０：４７０−４７６）、緩衝化１０％ホルマリンに固定された生検組織の４ｍｍ断面に対し、ＩＶ型コラーゲンに対するジゴキシゲニン標識アンチセンスＲＮＡプローブを利用して（Ｅｉｔｎｅｒら（１９９７）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５１：６９−７８）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。アルカリホスファターゼに共役した抗ジゴキシゲニン抗体（Ｇｅｎｉｕｓ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ドイツ）を用いた連続発色によってＲＮＡプローブの検出を実施した。対照試験には、適合する連続断面に対するセンスプローブとのハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションの前にＲＮアーゼとインキュベートした組織断面に対するアンチセンスプローブとのハイブリダイゼーション、又は記載された（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（１９９１）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４０：４７０−４７６）プローブ、抗体又は発色液の省略が含まれた。糸球体ｍＲＮＡの発現は、上記の評点システムを用いて半定量的に評価した。
その他の測定
尿タンパク質は、ウシ血清アルブミン（シグマ）を標準品として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ミュンヘン、ドイツ）を用いて測定した。
統計解析
数値はすべて平均値±ＳＤとして表した。統計的有意差（ｐ＜０．０５として定義される）は、ＡＮＯＶＡ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉのｔ−検定を使用して評価した。
実施例９
ここで述べるすべての実験については、修飾したＤＮＡ核酸リガンドを、実施例５及び８、及び図９Ａ及び９Ｂに記載のように、４０Ｋ・ＰＥＧへ接合した。ほとんどの核酸リガンドは８〜１２ｋＤａに及ぶ分子量を有する（修飾されたＰＤＧＦ核酸リガンドは１０ｋＤａの分子量を有する）ので、ＰＥＧのような大きな不活性分子成分を付加すると、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸リガンドの滞留時間が向上する（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１８９４４を参照のこと）。重要にも、核酸リガンドの５’末端にＰＥＧ成分を加えても、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する核酸リガンドの結合アフィニティーには影響しない（Ｋd＝約１ｘ１０-10Ｍ）。
ラットＰＤＧＦ−ＢＢに対する核酸リガンドの交叉反応性
ＰＤＧＦの配列は生物種間で高度に保存されていて、ヒト及びラットのＰＤＧＦ−Ｂ鎖の配列は８９％同一である（Ｈｅｒｒｅｎら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１７３：２９４；Ｌｉｎｄｎｅｒら（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：９５１）。それでも、核酸リガンドの高い特異性に照らせば（Ｇｏｌｄら（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３−７９７）、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を正確に解釈するには、核酸リガンドのラットＰＤＧＦ−Ｂ鎖に対する結合特性を理解することが必要とされる。従って、ラットＰＤＧＦ−ＢＢの成熟型をクローン化して大腸菌で発現させた。このＰＤＧＦ核酸リガンドは、ラット及びヒトの組換えＰＤＧＦ−ＢＢに同一の高アフィニティーで（データ示さず）結合した。
ＰＤＧＦ−Ｂ鎖ＤＮＡリガンドは、糸球体間質細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を特異的に阻害する。
【０１４８】
増殖停止した糸球体間質細胞において、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）又はスクランブル核酸リガンド（ＮＸ３１９７６−４０Ｋ・ＰＥＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）の、増殖因子誘導性の増殖に対する効果を試験した。スクランブル核酸リガンドを加えても、促進された細胞の増殖速度は影響されなかった（図１２）。一方、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ５０μｇ／ｍｌで、ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性の糸球体間質細胞増殖は有意に抑制された（図１２）。ＰＤＧＦ−ＡＢ及び−ＡＡ誘導性の糸球体間質細胞増殖もＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧにより低下する傾向が認められたが、これらの違いは統計的に有意ではなかった（図１２）。対照的に、ＥＧＦ又はＦＧＦ−２誘導性の増殖に対するＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧの効果は認められなかった。核酸リガンドを１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた場合も同様の効果が認められた（データ示さず）。
抗−Ｔｈｙ１．１腎炎を有するラットにおけるＰＤＧＦ−Ｂ鎖ＤＮＡリガンドの効果
抗−Ｔｈｙ１．１抗体を注射した後でＰＢＳ処置された動物は、初期の糸球体間質炎及び６日目と９日目に続く糸球体間質細胞増殖及びマトリックス蓄積のフェーズにより特徴づけられる、腎炎の典型的な経過をたどった（Ｆｌｏｅｇｅら（１９９３）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ．３９：Ｓ４７−５４）。核酸リガンド又はＰＥＧを単独で何度も注射しても明らかに有害な効果は認められず、全ラットは試験終了まで生き続け、正常に見えた。
【０１４９】
ＰＡＳ染色した腎臓断面では、疾患誘導後６日目と９日目に糸球体間質の増殖性変化が激しく、ＰＢＳ、ＰＥＧ単独又はスクランブル核酸リガンドを受けたラットの間で区別がつかなかった（データ示さず）。この組織学的な変化は、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧリガンド処置群では顕著に抑制され、ほとんど正常化された。この糸球体間質の増殖性変化を（半）定量的に評価するために、様々なパラメーターを分析した：
ａ）糸球体間質細胞増殖の減少
糸球体の有糸分裂数を数えることによって評価される、糸球体細胞の増殖は、６日目も９日目も３つの対照群間に有意な違いがなかった（図１３Ａ）。スクランブル核酸リガンドを受けたラットに比較して、ＰＤＧＦ−Ｂリガンドでの処置により、糸球体の有糸分裂は６日目６４％、９日目７８％減少した（図１３Ａ）。糸球体間質細胞に対する処置の効果を評価するために、活性化された糸球体間質細胞だけで発現されるα−平滑筋アクチンについて腎臓断面を免疫染色した（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：８４７−８５８）。やはり、６日目も９日目も３つの対照群間に有意な違いがなかった。しかしながら、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ処置群では、６日目と９日目にα−平滑筋アクチンの免疫染色スコアが有意に減少した（図１３Ｄ）。糸球体間質細胞の増殖が特異的に減少したのかどうかを判定するために、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ処置ラットとスクランブル核酸リガンド処置ラットを、細胞増殖マーカー（ＢｒｄＵ）及びα−細胞平滑筋アクチンについて二重免疫染色した。データにより、疾患誘導後９日目に増殖性の糸球体間質細胞が顕著に減少していることが確かめられた：糸球体横断面でのＢｒｄＵ（＋）／α−平滑筋アクチン（＋）細胞が、スクランブル核酸リガンドを受けたラットで４３．３±１２．４であるのに対し、ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー処置ラットでは２．２±０．８であり、糸球体間質細胞の増殖が９５％減少したことになる。対照的に、増殖している単球／マクロファージに対するＰＤＧＦ−Ｂアプタマーの効果は、疾患誘導後９日目でも認められなかった（ＢｒｄＵ（＋）／ＥＤ−１（＋）細胞／１００糸球体横断面は、ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー処置ラット：２．８±１．１に対し、スクランブルアプタマー処置ラット：２．７±１．８であった）。
ｂ）内因性ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の発現減少
免疫組織化学的では、以前の観察と同じように（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（１９９１）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．４０：４７０−４７６）、３つの対照群すべてで糸球体ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の発現が顕著にアップレギュレートされていた（図１３Ｂ）。ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ処置群では、増殖性糸球体間質細胞の減少に併行して、糸球体のＰＤＧＦ−Ｂ鎖の過剰発現が有意に減少した（図１３Ｂ）。
ｃ）糸球体単球／マクロファージ流入の減少
糸球体単球／マクロファージ流入は、疾患誘導後６及び９日目で、スクランブル核酸リガンドを受けたラットに比較して、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ処置ラットにおいて有意に減少した（図１３Ｅ）。
ｄ）タンパク尿に対する効果
３つの対照群では、疾患誘導後６日目に１４７ｍｇ／２４時間までの中等度のタンパク尿が存在した（図１３Ｃ）。ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧで処置すると、６日目に平均タンパク尿が減少したが、統計的有意差はなかった（図１３Ｃ）。疾患誘導後９日目のタンパク尿は低く、全４群で同等であった（図１３Ｃ）。
ｅ）糸球体マトリックスの産生と蓄積の減少
組織免疫化学的では、３つの対照群すべてにおいて、ＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチンが糸球体に顕著に蓄積していた（図１４Ａ〜Ｃ）。ＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチンの糸球体での過剰発現は、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ処置ラットでは有意に減少した（図１４Ａ〜Ｃ）。後者では、糸球体染色スコアは正常ラットで観察されるものに近かった（図１４Ａ〜Ｃ）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ・ＰＥＧ処置ラットにおいてＩＶ型コラーゲンの糸球体発現が減少したのは、このコラーゲン型の糸球体での合成が減少したことに関連していることが示された（図１４Ａ〜Ｃ）。
実施例１０．２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡリガンドを伸展させてＰＤＧＦ及びＲＮＡ配列を得るための実験法
２’−フルオロ− ２’−デオキシピリミジンＲＮＡのＳＥＬＥＸ
ＰＤＧＦ−ＡＢをターゲットにする２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンＲＮＡを用いたＳＥＬＥＸを、表８に示したようなプライマー鋳型セット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６〜３９）を使用して、ほとんど既報のようにして実施した（上記参照、及びＪｅｌｌｉｎｅｋら、１９９３，１９９４：上記）。簡略に言うと、アフィニティー選択用の２’−フルオロ− ２’−デオキシピリミジンＲＮＡを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成ＤＮＡ鋳型からｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって製造した（Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８７８３）。既報（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９４）同上）により詳しく説明されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の条件を使用したが、ただしＡＴＰ及びＧＴＰ（１ｍＭ）に比較してより高濃度（３ｍＭ）の２’−フルオロ− ２’−デオキシピリミジンヌクレオシド三リン酸（２’−Ｆ−ＵＴＰ及び２’−Ｆ−ＣＴＰ）を使用した。アフィニティー選択は、ＰＤＧＦ−ＡＢを２’−フルオロ− ２’−デオキシピリミジンＲＮＡと、０．０１％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳにおいて３７℃で少なくとも１５分間インキュベートして実施した。タンパク質結合ＲＮＡからフリーＲＮＡを分離するには、記載（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、１９９３，１９９４：上記）のようにニトロセルロース濾過を使用した。アフィニティー選択されたＲＮＡの逆転写及びＰＣＲによる増幅は、既報のように実施した（Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９４）同上）。１９ラウンドのＳＥＬＥＸを実施し、典型的にはインプットＲＮＡの１〜１２％を選択した。最初８ラウンドの選択には、スラミン（３〜１５μＭ）を選択緩衝液に含ませ、選択圧力を高めた。アフィニティー濃縮されたプール（１９ラウンド）をクローン化し、記載のように配列決定した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９２）同上）。同定された４６種のユニーク配列を、表９に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９〜８１）。このユニーク配列リガンドをそのＰＤＧＦ−ＡＢとの高アフィニティー結合能力についてスクリーニングした。ランダム２’−フルオロピリミジンＲＮＡ（表８）が３５±７ｎＭの解離定数（Ｋd）でＰＤＧＦに結合したのに対し、アフィニティー選択されたリガンドの多くはそれより約１００倍高い親和性でＰＤＧＦ−ＡＢに結合した。このユニークリガンドのなかでＰＤＧＦ−ＡＢに対して最高のアフィニティーを示したのは、クローン９（Ｋd＝９１±１６ｐＭ）、１１（Ｋd＝１２０±２１ｐＭ）、１６（Ｋd＝１１６±３４ｐＭ）、２３（Ｋd＝１７３±３８ｐＭ）、２５（Ｋd＝８０±２２ｐＭ）、３７（Ｋd＝９７±２９ｐＭ）、（Ｋd＝７４±３９ｐＭ）及び４０（Ｋd＝９１±３２ｐＭ）である（これら全リガンドのＰＤＧＦ−ＡＢに対する結合は二相性であり、より高いアフィニティー結合成分のＫdを示す）。
【０１５０】
【表１】
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【０１５１】
【表２】
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【０１５２】
【表３】
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【０１５３】
【表４】
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【０１５４】
【表５】
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【０１５５】
【表６】
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【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
【表８】
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【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、表３に示される配列のコンセンサス二次構造を示す。ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＫはＧまたはＴ、ＮおよびＮ’はいかなる塩基対も示す。
【図２】  図２Ａ−２Ｃは、コンセンサス二次構造モチーフにしたがい、フォールディングされている最小リガンド２０ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８３）、３６ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８４）および４１ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８５）を示す。[３’Ｔ]は、３’−エキソキナーゼ分解を減少させるため添加された３’−３’連結チミジンヌクレオチドを表す。
【図３】  図３Ａ−３Ｃは、それぞれ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、およびＰＤＧＦ−ＢＢに対する高親和性最小リガンドの結合を示す。異なる濃度のＰＤＧＦに結合している32Ｐ  ５’端標識ＤＮＡリガンドの比を、ニトロセルロースフィルター結合法により測定した。試験した最小リガンドは、２０ｔ（白丸）、３６ｔ（白三角）、および４１ｔ（白四角）であった。これらの実験におけるオリゴヌクレオチド濃度は、〜１０  ｐＭ（ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢ）および〜５０  ｐＭ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）であった。データ点は、非直線最小二乗法を用い、等式１（ＰＤＧＦ−ＡＡに対するＤＮＡリガンドの結合）または等式２（ＰＤＧＦ−ＡＢおよび−ＢＢに対する結合）に当てはめた。結合反応は、３７℃で、結合緩衝液（０．０１％  ＨＳＡを含むＰＢＳＭ）中で行った。
【図４】  図４は、最小ＤＮＡリガンドおよびＰＤＧＦ−ＡＢの間の高親和性相互作用に関する解離速度測定を示す。ＰＤＧＦ−ＡＢ（１  ｎＭ）に結合している、すべて０．１７  ｎＭの、５’  32Ｐ末端標識ＤＮＡリガンド、２０ｔ（白丸）、３６ｔ（白三角）、および４１ｔ（白四角）の比を、５００倍過剰の未標識競合剤の添加後、示された時点でニトロセルロースフィルター結合により測定した。データ点を、実施例１の等式３に当てはめることにより、解離速度定数（Ｋoff）値を決定した。実験は、３７℃で、結合緩衝液中で行った。
【図５】  図５は、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する高親和性最小ＤＮＡの熱変性プロフィールを示す。リガンド、２０ｔ（白丸）、３６ｔ（白三角）、および４１ｔ（白四角）に対する温度作用として、２６０  ｎｍでの吸光度の変化を、１  ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含むＰＢＳ中で測定した。
【図６】  図６は、125Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの、ＰＡＥ細胞で発現されたＰＤＧＦα受容体への結合に対する、ＤＮＡリガンドの効果を示す。
【図７】  図７は、ＰＤＧＦβ受容体を発現しているＰＡＥ細胞に対する、ＰＤＧＦ−ＢＢの分裂促進性効果に対する、ＤＮＡリガンドの効果を示す。
【図８】  図８Ａ−８Ｂは、ＰＤＧＦ−ＡＢに対する高親和性結合に適合する置換パターンを示す。図８Ａ−８Ｃにおいて、下線記号は、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシヌクレオチドを示し；斜字記号は、２’−フルオロ−２’−デオキシヌクレオチドを示し；通常フォントは２’−デオキシリボヌクレオチドを示し；[３’Ｔ]は逆方向（３’３’）チミジンヌクレオチド（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、バージニア州スターリング）を示し；図８Ｂのらせん（ヘリックス）ＩＩおよびＩＩＩのループ内のＰＥＧはペンタエチレングリコールスペーサーホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、バージニア州スターリング）を示す（分子の描写には図９を参照されたい）。図８Ｃは、実施例８および９のコントロールとして用いたスクランブル核酸リガンド配列の予測される二次構造を示す。スクランブル領域は、図８Ｂに示される核酸リガンドに対するスクランブル核酸リガンドの全体的な類似性を強調するため、囲んでいる。
【図９】  図９Ａ−９Ｅは、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４６）（図９Ａ）、ＮＸ３１９７６−４０Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１４７）（図９Ｂ）、ヘキサエチレングリコールホスホロアミダイト（図９Ｃ）、ペンチルアミノリンカー（図９Ｄ）、および４０Ｋ  ＰＥＧ  ＮＨＳエステル（図９Ｅ）の分子の描写を示す。図９Ａおよび９ＢのＰＥＧスペーサーに示される５’リン酸基はヘキサエチレングリコールホスホロアミダイト由来である。
【図１０】  図１０は、３７℃での時間経過に渡る、ＤＮＡ（３６ｔａ）および修飾ＤＮＡ（ＮＸ２１５６８）核酸リガンドのラット血清中の安定性を示す。３６ｔａは、記号黒丸で示され；そしてＮＸ２１５６８は記号黒三角で示される。
【図１１】  図１１は、コントロール（ＰＢＳ）およびＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧ群に対する内膜／中膜比に基づき、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧが、ラットにおいて新規内膜形成の約５０％を有意に阻害した（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図１２】  図１２は、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧの、培養中のメサンギウム細胞の分裂促進剤刺激増殖に対する効果を示す（分裂促進剤はすべて、最終濃度１００  ｎｇ／ｍｌで添加された）。スクランブル核酸リガンドＮＸ３１９７６および４０Ｋ  ＰＥＧもまた、試験した。データはＸＴＴアッセイで測定した光学密度であり、そしてベースライン、すなわち２００μｇ／ｍｌの４０Ｋ  ＰＥＧ（すなわち、５０μｇ／ｍｌの核酸リガンドに付着しているＰＥＧと同等の量）を加えた培地で刺激した細胞のパーセンテージとして表す。結果は、５つの別個の実験（４０Ｋ  ＰＥＧを加えた培地の場合、ｎ＝３；したがって統計的評価は、ＮＸ３１９７５およびスクランブル核酸リガンド群に限られる）平均±ＳＤを意味する。
【図１３】  図１３Ａ−１３Ｅは、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧの、糸球体細胞増殖（図１３Ａ）、糸球体ＰＤＧＦ−Ｂ鎖発現（図１３Ｂ）、抗Ｔｈｙ１．１腎炎のラットにおける蛋白尿（図１３Ｃ）、メサンギウム細胞活性化（α平滑筋アクチンの糸球体ｄｅ  ｎｏｖｏ発現により評価されるものとして）（図１３Ｄ）、および単球／マクロファージ流入（図１３Ｅ）に対する効果を示す。ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧは黒で示され、そしてＮＸ３１９７６−４０Ｋ  ＰＥＧは交差斜線で示され、４０Ｋ  ＰＥＧは白で示され、ＰＢＳは斜線で示され、そして正常範囲は点描で示されている。
【図１４】  図１４Ａ−Ｃは、ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧの糸球体マトリックス集積に対する効果を示す。フィブロネクチンおよびＩＶ型コラーゲンに対する糸球体免疫染色スコアと共にＩＶ型コラーゲンｍＲＮＡ発現（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に関する糸球体スコアを示す。ＮＸ３１９７５−４０Ｋ  ＰＥＧは黒で示され、ＮＸ３１９７６−４０Ｋ  ＰＥＧは交差斜線で示され、４０Ｋ  ＰＥＧは白で示され、ＰＢＳは斜線で示され、そして正常範囲は点描で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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