(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲオトリクム・カンジダム（Geotrichum candidum）Dec 1 (ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３３)に由来し、下記の性質を有するパーオキシダーゼ酵素。
ａ）アゾ系染料及びアントラキノン系染料を分解・脱色する性質を有する
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる分子量評価で分子量６０ｋＤａを示す
ｃ）ゲルろ過法を用いる分子量評価で分子量５５ｋＤａを示す
ｄ）等電点電気泳動法による評価でｐＩ（等電点）３．８を示す
ｅ）至適温度は、３０℃付近である
ｆ）活性を示す温度範囲は、１５〜３５℃である
ｇ）染料分解活性が、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｆｅ＋＋で阻害される
【請求項２】
配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列を有するパーオキシダーゼ酵素。
【請求項３】
配列表の配列番号８記載のＤＮＡ配列を有し、配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列を有するパーオキシダーゼ酵素をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載のコード遺伝子を含む発現プラスミドベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現プラスミドベクターにより形質転換された微生物（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３２)。
【請求項６】
アゾ系染料又はアントラキノン系染料を分解・脱色するにあたり、請求項１記載の酵素又は請求項５記載の微生物を用いることを特徴とするアゾ系染料又はアントラキノン系染料の分解・脱色方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、染料に対して高い分解活性を有する新規なパーオキシダーゼ酵素、その遺伝的情報及びこれを用いた染料の分解・脱色方法を提供するものである。
背景技術
繊維製品の染色や染料製造の工程から排出される各種の合成染料は、自然界での分解が難しい難分解性物質が多い。これらの有色廃液は、自然界にとって有害であることから、その廃水に対する規制が強化されている。
従来、染色工業、染料製造工業の分野における染料廃液の処理は、主に吸着、濃縮、化学的変換、焼却などの物理的もしくは化学的な方法により行っている。しかしながら、これらの処理方法は効率的である反面、有害な副産物の生成による二次汚染や、高度のエネルギー消費による温室ガスの排出を伴うなどの問題点があった。
近年、上記の処理方法に代わるものとして、微生物や酵素などバイオテクノロジーを活用した処理方法が注目を集めており、既に染料や有色物質を分解できるいくつかの菌株も報告されている。例えば、リグニン分解菌として知られる白色腐朽菌の一種ファネロカエテ・クリソスポリウムを挙げることができる。
しかしながら、これまでに知られる染料分解菌は、いずれも一種類もしくは数種類の染料の分解活性しか持ち合わせておらず、その染料分解処理能力には自ずと限界があった。それ故、染料廃液の効率的な処理方法の開発が望まれている。
既に本発明者の一部は、アゾ系及びアントラキノン系に属する染料を分解できる微生物、ゲオトリクム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｎｄｉｄｕｍ）Ｄｅｃ  １（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託されており（平成１２年２月１７日に原寄託（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３４８）より移管）、その寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３３である。）を天然界より単離し、微生物処理によるより広範な染料分解・脱色方法を開発した（特開平９−１７３０５１号公報）。
このゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １株の優れた染料分解能は、該菌株の有するパーオキシダーゼ酵素活性に基づくものとの推定はされていたが、そのような酵素を具体的に単離・同定した例はなく、その遺伝的情報については全く解明されていなかった。
本発明は、上記した産業上の要請に鑑みなされたものであり、より効率的な染料廃液の処理を行うために利用できる酵素及び該酵素を用いた染料の分解・脱色方法を提供することを課題としている。
先述のゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １株は、広汎な染料分解活性を示すと共に、顕著な酵素安定性を有していることから、本菌株をそのまま、もしくは適当な担体に担持して染料の分解に利用することが可能である。
しかしながら、産業上の利用性をより高めるためには、染料廃液の処理、特に染料の分解を効率よく経済的に達成することが必要である。
このためには、微生物をそのまま利用するよりも、該微生物の有する染料分解酵素を単離・精製して使用すること、さらにその遺伝的構造を解明し、該酵素の大量生産を実現すること並びにこれらを組み合わせて用いることが有用である。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、前記の新規糸状菌であるゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １株が種々の染料に対し広汎な脱色スペクトラムを示すことから、本菌の生産する染料分解酵素に着目し、研究を重ね該酵素の一つを単離・同定し、さらに本酵素をコードする遺伝子の解明と大量発現系の開発に成功した。
発明の開示
第１の本発明は、ゲオトリクム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）Ｄｅｃ  １（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３３）に由来し、下記の性質を有するパーオキシダーゼ酵素（以下、ＤｙＰと略すことがある。）である。
ａ）染料を分解・脱色する性質を有する
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる分子量評価で分子量６０ｋＤａを示す
ｃ）ゲルろ過法を用いる分子量評価で分子量５５ｋＤａを示す
ｄ）等電点電気泳動法による評価でｐＩ（等電点）３．８を示す
第２の本発明は、配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項記載の酵素である。
第３の本発明は、配列表の配列番号８記載のＤＮＡ配列を有し、請求の範囲第１項記載の酵素をコードする遺伝子である。
第４の本発明は、請求の範囲第３項記載のコード遺伝子を含む発現プラスミドベクターである。
第５の本発明は、請求の範囲第４項記載の発現プラスミドベクターにより形質転換された微生物である。
第６の本発明は、染料を分解・脱色するにあたり、請求の範囲第１項記載の酵素又は請求の範囲第５項記載の微生物を用いることを特徴とする染料の分解・脱色方法である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明について詳述する。
本発明のパーオキシダーゼは、ゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １株に由来するものである。本発明者らは、以下のようにして本酵素の単離・精製を行った。
［培養液の調製］
常法に従いゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３３）株を液体培地にて培養した。液体培地は、ゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １株が増殖できる液体培地であれば、どのような組成のものでも用いることができる。好適な一例として、Ｄｉｆｃｏ社製Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地（以下、ＰＤと略すことがある。）を挙げることができる。また、目的とする酵素の誘導を促進するために、培地に染料を添加することもできる。
本菌株の培養条件は、用いる培地の種類等を考慮して決めればよいが、例えばＰＤ培地を採用する場合、１５〜３７℃、好ましくは３０℃で３〜８日間培養する。
こうして得られた培養液を、染料分解酵素精製原料として、以下の工程に供する。
［染料分解酵素の精製］
染料分解酵素の精製を行う。精製の条件は特に限定されないが、培養液の取扱いは、酵素活性の失活を防ぐ目的から低温下とすることが好ましく、特に冷蔵室中で行うことが好ましい。
具体的には、まず、培養液より菌体を分離し上清を得る。この際、ろ過、遠心分離、膜ろ過などの分離方法を用いることができるが、好ましくは遠心分離を行って菌体を除去したのち、さらにガラスフィルターろ過を行う。これらの組み合わせにより、夾雑する多糖類を除き純度の高い粗酵素液を得ることができる。
得られる粗酵素液については、続けて後述の染料分解活性を指標とした単離を行ってもよいが、その前に該分離を容易にするための濃縮・脱塩を行い、濃縮粗酵素液とすることも可能である。
濃縮は、通常用いられる方法、例えば限外ろ過濃縮、塩析、エバポレーション等によることができるが、好ましくは限外ろ過濃縮により行うことができる。また、脱塩は透析、限外ろ過、電気透析法などによることが可能である。
次に、得られた濃縮粗酵素液から、目的とする染料分解酵素を染料分解活性を指標とし単離することができる。
方法としては、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルフィルトレーションカラムクロマトグラフィーなどを用いることができる。
これらのカラムクロマトグラフィーの１種類、もしくはいくつかを組合せて使用し、活性画分を集めて染料分解酵素を単離・精製することができる。
以上の操作より、本発明者らは目的とする精製酵素を得た。この精製酵素（２０５倍活性品）は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと称することがある。）で単一のバンドを示す。この酵素が、請求の範囲第１項記載の本発明の染料分解酵素、パーオキシダーゼである。本発明者らは、この酵素をＤｙＰと命名した。
［精製染料分解酵素ＤｙＰの性質］
上記の操作により精製された本発明の酵素であるＤｙＰの性質を下記要領で測定した。
まず、分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定においては、分子量標品として市販の電気泳動用分子量標準キットを使用できる。
その一例として、ベーリンガー・マンハイム・山之内社製Ｃｏｍｂｉｔｈｅｋが挙げられる。本キットは、α−２−マクログロプリン（分子量１７０ｋＤａ）、ホスホリラーゼＢ（分子量９７．４ｋＤａ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（分子量５５．４ｋＤａ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（分子量３６．５ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（分子量２０．１ｋＤａ）よりなる。
測定の結果、第１図に示すように、本発明の酵素ＤｙＰの分子量は、６０ｋＤａであることが示された。
また、ゲルろ過クロマトグラフィーによる本酵素の分子量評価にあたり、本発明者らはＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラム、標準分子量蛋白（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用して行った。
この結果、本発明の酵素ＤｙＰの分子量は、５５ｋＤａと評価された。
次に、本発明の酵素の等電点についても測定した。等電点の測定は等電点電気泳動法（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により行った。
その結果、本酵素ＤｙＰの等電点は、第２図に示す如く、ｐＩ＝３．８と評価された。
［染料分解酵素ＤｙＰの染料分解スペクトラム］
本発明の染料分解酵素ＤｙＰは、染料のうち、特にアゾ系及びアントラキノン系の染料に対し酵素活性を有し、これらの色素の分解及び脱色能を有する。
アントラキノン系染料としては、例えばＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ５，Ｒｅａｃｔｉｖｅｂｌｕｅ  １９，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  １１４（いずれも日本化薬（株）製）、１−ａｍｉｎｏ−４−（３−ａｍｉｎｏ−４−ｓｏｄｉｕｍ−ｓｕｌｆｏｎｏａｎｉｌｉｎｏ）−２−ｓｏｄｉｕｍ  ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（以下、ＡＱ−１と略すことがある。）及び１−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｓｏｄｉｕｍ−ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（以下、ＡＱ−２と略すことがある。）等を挙げることができる。
ここで、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ５は、以下の化学式で表される化合物である。
0004418595.tif 000002
ＡＱ−１は、以下の化学式で表される化合物である。
0004418595.tif 000003
ＡＱ−２は、以下の化学式で表される化合物である。
0004418595.tif 000004
また、アゾ系染料としては、例えばＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌａｃｋ  ５，Ｒｅａｃｔｉｖｅｒｅｄ  ３３，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ２，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  １８２（いずれも日本化薬（株）製）等を挙げることができる。
上記染料のほか、染料分解酵素ＤｙＰは、マンガンパーオキシダーゼ（以下、ＭｎＰと略すことがある。）の基質として知られている２，６−ＤｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌやＧｕｉａｃｏｌなどのフェノール性化合物に対する分解能をも有している。しかし、後記の実施例に示すように、反応液へのマンガン化合物の添加による酵素活性の促進効果は認められない。
一方、ＤｙＰはリグニンパーオキシダーゼ（以下、ＬｉＰと略すことがある。）の基質として知られているＶｅｒａｔｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌとの反応は認められない。
このようにＤｙＰは、驚くべきことに、従来より知られているＭｎＰ、ＬｉＰとは異なる基質特異性を示すことから、既知の酵素とは別種のパーオキシダーゼであると言うことができる。
［染料分解酵素ＤｙＰの反応至適温度］
本発明の染料分解酵素ＤｙＰの反応至適温度は、第３図に示したように、３０℃付近であり、１５℃〜３５℃の温度範囲で安定した染料分解活性を示す。しかし、３５℃以上の温度で酵素活性は急速に低下する。
［染料分解酵素ＤｙＰの温度安定性］
本発明の染料分解酵素ＤｙＰを所定温度で一定期間保存し、その後の活性残存率を評価した。具体的には、染料分解酵素ＤｙＰの２５ｍＭ  クエン酸緩衝液溶液を３０℃又は４０℃で１４日間保存した。
その結果、ＤｙＰの残存酵素活性は、３０℃で保存の場合６３％、４０℃で保存の場合４１％である。
温度安定性を他のパーオキシダーゼと比較するため、市販のホースラディッシュパーオキシダーゼ（和光純薬製、以下、ＨＲＰと略すことがある。）を対照とし、各酵素の２５ｍＭ  クエン酸緩衝溶液を６０℃で３時間保存後の残存酵素活性を比較した。
その結果、本発明の染料分解酵素ＤｙＰは６５％の活性が残るが、ＨＲＰは僅かに１０％の活性しか残らないことが分かった。
この結果は、染料分解酵素ＤｙＰが、これまでに知られているパーオキシダーゼに比べ、熱安定性に優れていることを示すものである。
以上に、本発明に係る新規染料分解酵素ＤｙＰの酵素的特徴を述べた。
本発明の染料分解酵素ＤｙＰは、従来報告されているいずれの染料分解酵素に比較して広汎な染料分解活性を示すと共に、顕著な酵素安定性を有していることが、上述の酵素特性から明白である。
したがって、請求の範囲第６項記載の本発明のように、染料分解酵素ＤｙＰを用いることによって、染料の分解・脱色を効率よく行うことが可能である。
染料分解酵素ＤｙＰの産業上の利用性を高めるためには、効率的な染料廃液や染料の分解を経済的に達成することが必要である。
その一例として、ＤｙＰを固定化して用いる方法がある。ＤｙＰを固定化用担体、例えばイオン交換樹脂、合成高分子ゲル、天然由来の活性炭、ゼオライトなどへ吸着、共有結合を介し固定化し、これをバイオリアクターとして用いる方法が考えられる。この方法によれば、微生物自体を固定化して用いるよりも、より高活性のバイオリアクターの創出に有用である。
さらに、酵素をより経済的に製造する手段として、目的酵素のコード遺伝子を単離し、該酵素を大量発現可能なホスト微生物に導入すれば、さらに効率よく、かつ純度の高いＤｙＰを大量に、しかも安定的に得ることが可能である。
これらを組合せることにより、微生物自体を使用する場合に比べて、格段にコストパフォーマンスに優れたバイオリアクターの調製が可能となる。
［染料分解酵素ＤｙＰコード遺伝子の単離の概略］
上記の観点から、本発明者らは、本発明のＤｙＰの遺伝的情報を得るべく、以下の操作を行った。
具体的な遺伝子単離に向けての方法の概略は、以下の通りである。
最初に、先述の方法により精製した本発明の染料分解酵素であるＤｙＰに、トリプシン（和光純薬（株）社製）を作用させ、部分加水分解を行った。
得られた５種類の部分加水分解フラグメントを精製し、各フラグメントのアミノ酸配列を決定した後、各アミノ酸配列に対応するコード遺伝子を合成した。
この後、得られたコード遺伝子をプライマーとし、ゲオトリクム・カンジダム由来のｃＤＮＡをテンプレート遺伝子として用いてＰＣＲ法を行い、ＰＣＲ増幅遺伝子を得た。
得られた増幅遺伝子を、ＤＩＧラベリング検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてラベル化した。
このラベルした増幅遺伝子をプローブとして用い、常法により、ラムダファージλｇｔ１０を用いて作成されたゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １由来ｃＤＮＡライブラリーとのプラークハイブリダイゼーションを行った。
このようにして得られたいくつかのハイブリダイズしたコロニーより、目的遺伝子を切り出し、ｐＵＣ１８プラスミドに組み込み、こののちシークエンシングを行った。これを、以下のＰＣＲにおけるテンプレートとして用いた。
［染料分解酵素ＤｙＰの部分アミノ酸配列の決定］
ＤｙＰコード遺伝子プライマーの作成を行うため、ＤｙＰの精製を行った。
ＤｙＰの精製は、通常用いられる方法により行うことができ、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルよりエレクトロブロッティング法を用いて精製する方法や、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により精製する方法等を挙げることができる。
精製されたＤｙＰは、通常の方法により変性させた後、トリプシンを用い部分加水分解を行ったのち、部分消化ペプチドをＨＰＬＣ法を用いて分画した。この結果、５つのフラグメントを得ることができた。各々のフラグメントは、エドマン法によるプロテインシークエンサーによりアミノ酸配列を決定した。得られた５つのフラグメントのアミノ酸配列のうち１番目の配列はＴｒｐ  Ｌｙｓであり、２番目以降のアミノ酸配列は配列表に示した通りであり、２番目は配列番号１に、３番目は配列番号２に、４番目は配列番号３に、５番目は配列番号４にそれぞれ示してある。
これらのアミノ酸配列のうち、配列番号３の一部の配列（配列番号５）及び配列番号４の一部の配列（配列番号６）をＰＣＲプライマーとして選択した。
［プローブの調製］
以下の方法により、上記２種類のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し調製した。
得られたプライマー遺伝子を用い、ゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １のｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いて、ＰＣＲ法により第一段階の遺伝子増幅を実施した。その結果、２つのプライマーに対応する２００ｂｐの新たなプライマーが得られた。
プライマーの両末端に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行い、プラスミド連結部位を合成した。次に、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）発現ベクターであるｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションを行い、リコンビナントプラスミドを得た。
本組み換えプラスミドを、大腸菌ＪＭ  １０９株を用いて増幅し、得られたプラスミドよりコード遺伝子を切り出した後、第２回目のＰＣＲにより得られたＤＮＡシークエンスを決定した（後記の配列表の配列番号８の１０１２〜１１８１番目参照）。
［染料分解酵素ＤｙＰコード遺伝子ＤｙＰのクローニング］
別途培養されたゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １株より、通常の方法に従いＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡよりポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。この後、得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用い、ｃＤＮＡキット（タカラ（株）社製）によりｃＤＮＡを得た。
得られたｃＤＮＡについて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼキットを用いライゲーションを行った後、１２００〜２０００ｂｐのＤＮＡを電気泳動により分画した。
さらに、ラムダファージλｇｔ１０のＥｃｏＲＩサイトに導入し、ラムダファージにパッキングした。得られたファージを大腸菌に感染させた。
先に調製したラベル化プローブとハイブリダイズするコロニーをスクリーニングした。この結果、１１の候補株を得た。
先の測定結果より、本発明のＤｙＰの分子量は６０ｋＤａ、糖鎖を１７％含有することから、アミノ酸一次配列は４９．８ｋＤａと見積もられる。また、ＤｙＰコード遺伝子のオープンリーディングフレームは４６０アミノ酸、即ち１３８０ｂｐと見積もられる。
得られた１１の候補株のコード遺伝子を用いてそれぞれ再度ＰＣＲを行い、導入ｃＤＮＡのフラグメントサイズを評価、すなわち１３８０ｂｐ近傍の遺伝子の検索を行った。
この結果、１６００ｂｐのサイズのｃＤＮＡを有するクローン９２を得た。本ｃＤＮＡを、組み換えプラスミドよりＢａｍＨＩを用いて切り出し、ｐＵＣ１８に組み込み、得られたプラスミドをｐＢ９２とした。本クローン９２は染料分解酵素ＤｙＰに基づく染料分解活性が確認された。
［ｐＢ９２遺伝子のＤＮＡ配列］
ｐＢ９２のシークエンジングはＤＮＡシークエンサーを用い行った。この結果、ｐＢ９２のオープンリーディングフレームは１４９４ｂｐ、４９８アミノ酸よりなること、さらに、その分子量は５３３０６であることが判明した。
このことは、ｐＢ９２がＤｙＰ遺伝子を有することを示すものである。ｐＢ９２の有するＤｙＰのアミノ酸配列及びＤｙＰ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号７及び８に示す。すなわち、配列表の配列番号７記載のアミノ酸配列を有するＤｙＰが請求の範囲第２項記載の本発明の酵素であり、配列表の配列番号８記載の塩基配列を有する遺伝子が、請求の範囲第３項記載の本発明の遺伝子である。
なお、請求の範囲第３項記載の本発明の遺伝子（配列表の配列番号８参照）において、配列の一部に欠失、置換、付加等がなされたものであっても、本発明の遺伝子と同様の効果を有している限り、本発明の範囲内である。
また、これらの遺伝子を有するプラスミドベクターであるｐＢ９２が請求の範囲第４項記載の本発明である。
さらに、ｐＢ９２を大腸菌に形質転換して得られる形質転換体が請求の範囲第５項記載の本発明である。この形質転換体を用いれば、本発明の染料分解酵素ＤｙＰを効率よく生産することができる。
以下において、本発明を実施例により具体的に説明する。但し、本発明は実施例により限定されるものではない。
実施例１（染料分解酵素ＤｙＰの精製及び性質）
［染料分解酵素ＤｙＰの精製］
１５０ｍＬのＰＤ培地（ポテトデキストロース培地、Ｄｉｆｃｏ社製）を５００ｍＬ容のエルレンマイヤーフラスコに仕込み、ゲオトリクム・カンジダムＤｅｃ  １（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３３）株の胞子懸濁液５ｍＬを接種して培養を開始した。培養は３０℃、１２０ｒｐｍで６日間行った。
培養後、培養液を４℃に冷却した後、７２００×ｇ、２０分間の遠心分離を行った。得られた遠心上清のうち４３８０ｍＬを以下の操作に使用した。
遠心上清は、ガラスフィルター（ＧＣ５０、東洋ろ紙製）にてろ過を行い、含有されているポリサッカライドを除去した。
次いで、ろ過液はアミコン社製限外ろ過膜（ＹＭ１０）を用い限外ろ過し、６０ｍＬまで濃縮した。濃縮液を、さらに２５ｍＭピペラジン緩衝液（ｐＨ５．５）で透析後、アミコン社製Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０を用い、１７．２ｍＬにまで濃縮した。
濃縮液１７．２ｍＬを２５ｍＭ  ピペラジン緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化された２．８×６．０ｃｍのＳｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０Ｍカラム（トーソー社製）にチャージした。この後、２００ｍＬの同一緩衝液で洗浄後、０〜０．４Ｍのリニアーグラジエントにより溶出した。
色素分解活性を示すフラクションを集め、アミコン社製Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０を用い、２．８ｍＬまで濃縮した。濃縮液を１．６×６．５ｃｍの２５ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、０．８Ｍ  硫酸アンモニウムで平衡化されたブチルトヨパール（トーソー社製）にチャージした。次に、５０ｍＬの同一緩衝液で洗浄後、０．８Ｍから０Ｍの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより溶出された染料分解活性を示す画分を集め、これをＤｙＰとした。
ＤｙＰを２５ｍＭ  クエン酸緩衝液により透析し、１．５ｍｇの精製ＤｙＰを得た。精製ＤｙＰ溶液は４℃で保存した。
［染料分解酵素の性質］
上記操作で得られた染料分解酵素ＤｙＰの分子量及び等電点を測定した。
分子量については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法及びゲルろ過法により決定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動には、１０％のポリアクリルアミドゲルを用い、ＡＴＴＯ社製ＡＥ−６４４０電気泳動装置を使用した。また、分子量コントロールとして、ベーリンガー・マンハイム・山之内社製Ｃｏｍｂｉｔｈｅｋを用いた。
この結果、ＤｙＰの分子量は６０ｋＤａと評価された。
一方、ゲルろ過には、２５ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化された３．１×９５ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラムを用い、バイオラッド社製標準蛋白キットを使用した。
その結果、ＤｙＰの分子量は５５ｋＤａと評価された。
また、等電点電気泳動の測定には、ファルマシア社製Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  ２−Ｄの低ｐＩキャリブレーションキット（ｐＨ２．５−６．５）を用いた。その結果、ＤｙＰの等電点は３．８と評価された。
［染料分解活性の評価］
精製ＤｙＰの染料分解スペクトラムを、９つの染料と３つのモデル化合物につき調査した。精製ＤｙＰのこれらの染料又はモデル化合物の分解活性を、分解速度の測定により評価した。
染料としては、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ５，１９及び１１４；ＡＱ−１，ＡＱ−２；Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌａｃｋ  ５，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｄ  ３３，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ２，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  １８２を用いた。
また、モデル化合物としては、２，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ，Ｇｕａｉａｃｏｌ，Ｖｅｒａｔｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌを用いた。
染料分解活性の測定は、以下のようにして行った。
所定濃度（３０〜１２０ｐｐｍ）の各染料を含有する２５ｍＭ  クエン酸緩衝液（各染料分解至適ｐＨに調整）３ｍＬと、１．８６ｎＭ  ＤｙＰ溶液１ｍＬとの混合液に、０．２〜０．４ｍＭの過酸化水素水を添加することにより酵素反応を開始した。反応は３０℃で所定時間行い、反応速度を評価した。
染料分解活性１Ｕは、１μｍｏｌｅのＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ５またはＡＱ−２を１分間に脱色できる活性と定義した。結果を第１表に示す。
0004418595.tif 000005
一方、モデル化合物として用いた２，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌについては、酸化により生ずる４７０ｎｍの吸収を定色した。
すなわち、ＤｙＰ  ２．７９ｎＭ、０．２ｍＭの２，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌと０．２ｍＭの過酸化水素とを含有する２５ｍＭクエン酸（ｐＨ４．５）で反応を行った。
Ｇｕａｉａｃｏｌについては、上記反応系の０．２ｍＭ  ２，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌの代わりに１ｍＭのｇｕａｉａｃｏｌを使用し、４６５ｎｍの吸光度を測定した。
モデル化合物についての結果を第２表に示した。
0004418595.tif 000006
第１表の結果より、以下のことが分かる。
染料分解酵素ＤｙＰは、アントラキノン系色素に対して高い分解活性を示す。特に、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ５，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  １９，ＡＱ−２に対し、優れた分解活性を示し、これらの色素を効率よく分解できる。
また、アゾ系色素に対しても分解活性を示し、特にＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  １８２を効率よく分解した。その他のアゾ系色素Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌａｃｋ  ５，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｄ  ３３，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ２に対しても分解能を有している。
このことから、ＤｙＰはアントラキノン系色素及びアゾ系色素を分解する作用を有することが明らかとなった。
一方、ＤｙＰのモデル化合物に対する活性は、第２表の結果より、以下のようであった。
まず、フェノール性水酸基を有する２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ，ＧｕａｉａｃｏｌはＤｙＰにより効率よく分解できた。一方、リグニンパーオキシダーゼの基質として知られるＶｅｒａｔｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌは分解することができなかった。
このことから、ＤｙＰはフェノール性水酸基を有する化合物に対して特異的に高い酵素活性を有することが明らかとなった。
［染料分解酵素ＤｙＰの至適温度］
ＤｙＰの至適温度は、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ５の脱色（分解）活性を所定の温度で評価して求めた。この結果を第３図に示す。
第３図より、ＤｙＰは２０〜３５℃の範囲で高いパーオキシダーゼ活性を示し、至適温度は３０℃であることが明らかである。
実施例２［金属イオンの染料分解酵素ＤｙＰ活性への影響］
ＤｙＰ及び１００ｐｐｍのＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ５からなる反応液中に、カルシウム、亜鉛、銅（２価）、カリウム、銅（１価）、ナトリウムの各イオン５ｍＭを共存させ、これらの金属イオンがＤｙＰ酵素相対活性に与える影響を調べた。
この結果を第３表に示した。
0004418595.tif 000007
第３表より、上記のイオン添加時には、いずれも無添加時に比べ８０％程度の相対活性を示し、特に２価鉄イオンは、０．２ｍＭの共存で５０％活性が阻害された。
このことから、金属イオンの共存がＤｙＰの酵素活性に悪影響を与えることが示唆された。
実施例３（ＤｙＰをコードする遺伝子及びアミノ酸配列の決定）
［染料分解酵素ＤｙＰの部分アミノ酸配列の決定］
ゲオトリクム・カンジダム  Ｄｅｃ  １（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３３）株より、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２２７，６８０−６８５（１９７０））に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して精製ＤｙＰを分離した。
その後、Ｔｏｗｂｉｎの方法（Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．，Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４（１９７９）に従い、ポリビニルジフルオライド（以下、ＰＶＤＦと略すことがある。）膜にエレクトロブロッティングした。
ＰＶＤＦ膜をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ−２５０）処理し、次いでＤｙＰの染色バンド部分の膜のみを切り出し、１．５ｍＬ容の試験管に移した。これに５０μＬのメタノールを加え、さらに、２００μＬの還元緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、０．５Ｍ  トリス、０．３％のエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、５％のアセトニトリルを含むｐＨ８．５の緩衝液）を加え、ゆっくり振った後、還元緩衝液を除いた。
次に、ＰＶＤＦ膜上の蛋白質に、１ｍｇのジチオスレイトールを含む５０μＬの還元緩衝液を加え、２５℃で１時間置いた。ＰＶＤＦ膜を２００ｍＬのコニカルビーカーに移した後、１００ｍＬの水で５分、１００ｍＬの２％アセトニトリルで５分、１００ｍＬの０．１％ＳＤＳで５分各々洗浄した。
この後、ＰＶＤＦ膜を１．５ｍＬ容の新しい試験管に移し、岩松の方法（Ｉｗａｍａｔｓｕ，Ａ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３，１４２−１４７（１９９２））に従い、５００μＬの１ｍｇのメチオニンを含むポリビニルピロリドン  ＰＶＰ−４０（以下、ＰＶＰ−４０と略すことがある。）を加え、室温で３０分間静置した。
さらに、ＰＶＤＦ膜を１００ｍＬの１０％アセトニトリル溶液で洗浄後、５００μＬの分解緩衝液（１００ｍＭ  重炭酸アンモニウム、１０ｍＭ  塩化カルシウム、ｐＨ７．８）で３回洗浄し、洗液を棄てた。続いて、１ｐｍｏｌのトリプシンを含むほかは上記と同様の分解緩衝液５００μＬを添加し、２５℃で１２時間酵素反応を行った。
ＰＶＤＦ膜より反応液に溶出したオリゴペプチドを凍結乾燥後、１００μＬの分解緩衝液に溶解し、ＨＰＬＣ（カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ−Ｐａｋ  Ｃ−１８，４．６×１５０ｍｍ）で、０．０２％トリフルオロ酢酸含有イソプロピルアルコール−アセトニトリル（７：３ｖ／ｖ）の０〜５０％の直線勾配溶出（１００分、０．８ｍＬ／ｍｉｎ．）で溶出し、各々のフラクションを分画した。
分画精製された部分分解ペプチドを、蛋白シークエンスシステム（シマズ  ＰＰＳＱ−２１）により一次構造を決定した。
［ｃＤＮＡライブラリーの調製］
ＲＮＡの抽出を目的として、ゲオトリクム・カンジダム  Ｄｅｃ  １株の培養液を遠心分離して該菌株の菌糸２５ｍＬを分離した。これを遠心管に入れ、液体窒素を添加して該菌糸を凍結させた後、１２時間の凍結乾燥を行い粉末を得た。
得られた菌糸の粉末に、再び液体窒素を注ぎ菌糸を粉砕し、１０ｍＬのグアニジウム溶液（４Ｍ  グアニジウムイソチオシアナート、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅを含有する）を添加し、ホモゲナイズした。これを遠心分離（１５００×ｇ）して上清を得た。
得られたＲＮＡは、塩化セシウム超遠心法（Ｕｌｌｒｉｃｈ）により分離後、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて分画した。ｃＤＮＡの合成は、得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用い、ｃＤＮＡ合成キット（タカラ（株）、Ｇｕｌｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ）により行った。
得られたｃＤＮＡに、ＤＮＡライゲーションキットを用いてアダプター（ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ）を挿入した。ライゲーションした両末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、アガロース電気泳動によりｃＤＮＡを分離した。
さらに、ｃＤＮＡの中からＤｙＰの分子量に見合う１２００〜２０００ｂｐのｃＤＮＡを分離し、８μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ―２Ｎａ）を加えて溶出した。
得られたｃＤＮＡフラグメントを、ラムダファージのＥｃｏＲＩサイトにライゲーションした。これをＧｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）によりラムダファージへのパッケージングを行った。
ラムダファージλｇｔ１０は、大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ  ＮＭ５１４株に３７℃で１５分間感染させたのち、ＬＢ寒天（バクトトリプトン、０．５％バクト酵母エキス、１％食塩、１．５％寒天／１０００ｍＬ）に０．７％寒天を用いて重層した。プレートは３７℃で１２時間培養した。
［染料分解酵素ＤｙＰのコード遺伝子のシークエンシング］
先に調製したラベル化プローブとハイブリダイズするコロニーをスクリーニングした結果、プラーク・ハイブリダイゼーションによりポジティブなｃＤＮＡライブラリー及びＰＣＲにより得られたＤＮＡのうち、１１の候補株を得た。
これらを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりｐＵＣ１８プラスミドにライゲーションし、大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株で増幅した。
先述のＤｙＰの特性の測定結果より、ＤｙＰの分子量は６０ｋＤａであり、糖鎖を１７％含有することから、アミノ酸一次配列は４９．８ｋＤａと見積もられる。また、ＤｙＰコード遺伝子のオープンリーディングフレームは４６０アミノ酸、すなわち１３８０ｂｐと見積もられる。
そこで、得られた候補株１１のコード遺伝子を用いて再度ＰＣＲを行い、導入ｃＤＮＡのうち、１３８０ｂｐ近傍の遺伝子の検索を行った。
この結果、１６００ｂｐのサイズのｃＤＮＡを有するクローン９２を得た。
本ｃＤＮＡを組み換えプラスミドよりＢａｍＨＩを用いて切り出し、ｐＵＣ１８に組み込み、得られたプラスミドをｐＢ９２とした。
その後、プラスミドＤＮＡをアルカリ抽出法で調製した。得られた両ストランドをＤＮＡシークエンサー（モデル４０００Ｌ、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂ．，ＵＳＡ）で解析しシークエンスを行った。
［異種ホストでの発現］
その結果得られたｐＢ９２のオープンリーディングフレームは１４９４ｂｐ、４９８アミノ酸であり（配列表の配列番号７参照）、このアミノ酸数より推定される分子量は、５３３０６であることが判明した。このことから、上記ｐＢ９２はＤｙＰ遺伝子を有することが示された。
さらに、常法によりｐＢ９２を大腸菌に形質転換した。この形質転換体は日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７０３２である。この形質転換体をＬ培地（酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、トリプトン１．０％）にて培養後、集菌・破砕することによりＤｙＰ活性を確認することができた。
［他のペルオキシダーゼ配列との比較］
ＤｙＰ遺伝子のホモロジーサーチを３種類のデーターベース（Ｇｅｎｅｂａｎｋ，ＥＭＢＬ，ＤＤＢＪ）を用い行った。この結果、ＤｙＰに相同な遺伝子としてＧｅｎｅｂａｎｋに登録されたＵ７７０７３（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ  ｓｐ．）の由来のペルオキシダーゼが検索された。そこで、両者の相同性を調べた。相同性の高い領域をみると、４０７番から４３８番目の領域が最も相同性が高く８８％、次いで６２番から８５番目の領域の相同性が８３％であったが、遺伝子の全配列においては５６％の相同性が認められたに過ぎなかった。また、上記のＰｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ  ｓｐ．由来のペルオキシダーゼ以外の他のペルオキシダーゼの中で高い相同性を示すものは見出されなかった。
［他のかび由来ペルオキシダーゼとの比較］
微生物のペルオキシダーゼは、植物型ペルオキシダーゼに分類されている。植物型ペルオキシダーゼの分類は、Ｗｅｌｉｎｄｅｒら（Ｗｅｌｉｎｄｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，３８８−３９３（１９９２））により体系付けられており、３つのクラスに分類されている。これによれば、クラスＩは、原核生物由来または真核生物のミトコンドリア由来のペルオキシダーゼ、クラスＩＩは、真菌由来のペルオキシダーゼ、クラスＩＩＩは高等植物由来のペルオキシダーゼが分類されている。
Ｗｅｌｉｎｄｅｒらの分類は、各ペルオキシダーゼの一次配列中共通性の高い配列を比較することにより行われる。詳しくは、活性中心に配位するヘム鉄近位（Ｐｒｏｘｉｍａｌ）のＨｉｓ残基及び遠位（Ｄｉｓｔａｌ）のＨｉｓ、Ａｒｇ残基近傍の一次配列を比較することにより行われる。Ｗｅｌｉｎｄｅｒらの作成した配列比較表を用いＤｙＰの配列を比較した（第４図）。なお、第４図では、クラスＩのペルオキシダーゼとしてＣＣＰ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のチトクロームＣ  パーオキシダーゼ）、ＥＣＰ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来のパーオキシダーゼ）を挙げた。クラスＩＩのペルオキシダーゼとしてＡＲＰ（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｏｓｕｓ由来のパーオキシダーゼ）、ＭｎＰ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属かび由来のマンガンパーオキシダーゼ）、ＬｉＰ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｔｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のリグニンパーオキシダーゼ）との比較を行った。また、クラスＩＩＩのペルオキシダーゼとしてＴＰ（Ｔｕｎｉｐのパーオキシダーゼ）、ＨＲＰ（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）を掲げた。
以上から、ＤｙＰはかび由来であるため、クラスＩＩに分類されるが、クラスＩＩで特徴的に見られる近位Ａｒｇ残基（図中：□の位置）が存在しないこと、遠位Ｈｉｓ残基（図中：●の位置）近傍の配列に相同性が見出されないことが分かった。これらのことから、ＤｙＰがかび由来ペルオキシダーゼとし特異的配列を有していることが判明した。
産業上の利用可能性
本発明により、広範な種類の染料に対して高い分解活性を有するパーオキシダーゼ及び該酵素を利用した染料の分解方法が提供される。しかも、本発明は本酵素の遺伝的情報を提供し、これに基づいて本酵素を大量に供給することが可能となり、染色工業等の分野における染料廃液の処理等に活用することができる。
従って、染料分解酵素である本酵素を固定化することにより、より高活性のバイオリアクターとして、産業上の利用性をより高めることが可能である。
【配列表】
0004418595.tif 000008
0004418595.tif 000009
0004418595.tif 000010
0004418595.tif 000011
0004418595.tif 000012
0004418595.tif 000013
0004418595.tif 000014
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の酵素ＤｙＰのＳＤＳ電気泳動の結果を示したものである。図中、左側の数字は分子量を示し、上側の数字は１〜５のそれぞれが分子量マーカー、粗酵素液、イオン交換クロマトグラフィー通過後の酵素液、疎水クロマトグラフィー通過後の酵素液及びイオン交換クロマトグラフィー通過後の酵素液を示す。
第２図は、本発明の酵素ＤｙＰの等電点電気泳動の結果を示したものである。図中、右側の数字は等電点（ｐＩ）を示し、上側の数字は、１〜３のそれぞれが粗酵素液、精製ＤｙＰ、等電点マーカーを示す。
第３図は、本発明の酵素ＤｙＰの酵素活性と温度との関係を示すグラフである。
第４図は、活性中心に位置するアルギニン（Ａｒｇ）残基、ヒスチジン（Ｈｉｓ）残基近傍の一次構造を比較したものである。図中、□は近位Ａｒｇ残基、○は近位Ｈｉｓ残基、●は遠位Ｈｉｓ残基の位置を示す。
【図１】
0004418595.tif 000015
【図２】
0004418595.tif 000016
【図３】
0004418595.tif 000017
【図４】
0004418595.tif 000018