(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
縫合手術の間の外科手術部位を囲って止血効果を発揮する生体適合性材料であって、
ヒアルロン酸エステル、ヒアルロン酸とのコハク酸のヘミエステルおよびヒアルロン酸のアミド誘導体からなる群から選択される少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体を含み、
適宜、天然の、半合成の、または合成のポリマーと共に、および／または物理的な止血特性を有する医薬的に活性な物質を伴う生体適合性材料。
【請求項２】
ヒアルロン酸誘導体が、カルボキシル官能基の一部またはすべてが脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環式シリーズのアルコールでエステル化されたヒアルロン酸エステルである請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項３】
ヒアルロン酸誘導体が、カルボキシル基の一部またはすべてが同じ多糖鎖または他の鎖のアルコール性官能基でエステル化されているヒアルロン酸の自己架橋エステルである請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項４】
ヒアルロン酸誘導体が、カルボキシル基の一部またはすべてが脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環式シリーズのポリアルコールでエステル化され、スペーサー鎖により架橋を生ずる、ヒアルロン酸の架橋した化合物である請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項５】
ヒアルロン酸誘導体が、カルボキシ基の一部分がアリール脂肪族アルコールでエステル化され、カルボキシ基の第２の部分が１０−２２の炭素原子の直鎖脂肪族アルコールで誘導体化されているヒアルロン酸の化合物である請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項６】
ヒアルロン酸誘導体が、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の部分または全エステルとのコハク酸のヘミエステルまたはコハク酸のヘミエステルの重金属塩である請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項７】
天然のポリマーが、コラーゲン、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンの共沈殿物、セルロース、キチン、キトサン、ペクチン若しくはペクチン酸、寒天、アガロース、キサンタン、ゲランガム、アルギン酸若しくはアルギン酸塩、ポリマンナン若しくはポリグリカン、デンプン、天然ガムよりなる群から選択される請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項８】
半合成ポリマーが、アルデヒド若しくはアルデヒドの前駆体、ジカルボン酸またはそのハロゲン化物、ジアミンのような試薬と架橋したコラーゲン、セルロースの誘導体、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、ゲランガム、キサンタン、ペクチン若しくはペクチン酸、ポリグリカン、ポリマンナン、寒天、アガロース、天然ガム、グリコサミノグリカンよりなる群から選択される請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項９】
合成ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸若しくはその共重合体若しくはその誘導体、ポリジオキサン、ポリホスファゼン、ポリスルフォン樹脂、ポリウレタン樹脂、ＰＴＦＥよりなる群から選択される請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項１０】
ヒアルロン酸のエステル誘導体が６０−１００％の範囲内でエステル化されている請求項２に記載の生体適合性材料。
【請求項１１】
ヒアルロン酸の自己架橋誘導体が０．５−２０％の範囲以内で自己架橋している請求項３に記載の生体適合性材料。
【請求項１２】
フィルム、ゲル、スポンジ、ガーゼ、不織布、膜、微粒子、マイクロカプセル、糸、ガイドチャンネルおよびそれらの付随物の形の請求項１−１１に記載の生体適合性材料。
【請求項１３】
物理的な止血特性を有する医薬的に活性な物質が抗炎症剤または止血剤、抗生物質、抗血栓剤、プラスミノーゲンを活性化できる因子、および増殖因子よりなる群から選択される請求項１に記載の生体適合性材料。
【請求項１４】
物理的な止血特性を有する医薬的に活性な物質がフィブリノーゲンおよびトロンビンである請求項１−１３に記載の生体適合性材料。
【請求項１５】
心血管および腹膜手術における請求項１−１４に記載の生体適合性材料。
【請求項１６】
ヒアルロン酸の自己架橋誘導体が３％−１０％の範囲以内で自己架橋している請求項１１に記載の生体適合性材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の目的
本発明では、吻合手術で用いるための、ならびに外科手術後の、周囲組織の瘢痕形成を伴う管の癒着形成を予防するための、体液に対する吸収性および物理的な止血活性を有する、生体適合性かつ生物分解性の生体適合材料を製造するためのポリサッカライド誘導体の使用を記載する。
【０００２】
背景技術
吻合とは、一般に、管または器官の間に形成された開裂部位の外科的接合を意味する。これには、血管の静脈および動脈吻合（静脈および動脈の両者）、腸吻合（結腸の一部または全部を切除した後の腸管断片の接合を含む）、外科的なカテーテルの移植および内視鏡的手術手順に伴うものが含まれる。
管吻合とは、血栓症または動脈硬化症のため、ある長さの血管を除去した後の、切断された血管の２つの端を縫合することによる外科的な接合、または血行再開を目的とする、２つの別々の血管の接合（バイパスおよび遊離皮弁）を意味する。
【０００３】
縫合後、再び血管を通して血液を流れさせる場合、生じ得る問題の１つは、特に抗血栓剤を用いていた場合に、血液が縫い目の間から漏れることである。
血液の喪失が続くと、吻合周り、あるいは血管壁に血腫が形成され、それが血液凝固現象を引き起こす外圧を長期にわたって持続的に与え、次いで血栓形成性物質の放出によって血管内血栓症を引き起こし得る。さらに、血腫は感染を助長する。
【０００４】
血管吻合のための顕微手術では、以下の目的を持って「血管カフ技術（Vascular Cuff Technique)」を用いる：
血管吻合を強化し、ならびに血管のねじれまたはよじれまたは圧搾を防止するため（T. H. Robbins, "Microvascular anastomosis: vascular cuff technique", Plastic and Reconstructive Surgery, 87, 567-568);
止血作用を達成するため（N. B. Hart, British Journal of Plastic Surgery, 1987, 40, 300-304);
必要な縫合の縫い目の数を減少させるため（L. K. Hung et al., "Comparative study of artery cuff and fat warp in microvascular anastomosis in the rat", British Journal of Plastic Surgery, 41, 278-283); および
吻合周りの適当な環境を創出し、周りの組織との癒着を防ぐため（T. H. Robbins, "Microvascular anastomosis: vascular cuff technique", Plastic and Reconstructive Surgery, 87, 567-568)。
【０００５】
外科手術は現在まで、止血剤を含有する生体適合材料を用いて出血の問題を解決しようとしてきた（N. B. Hart, British Journal of Plastic Surgery, 1987, 40, 300-304)。しかし、これらは実際に出血時間を減少させるが、以下の２つの望ましくない副作用をも有する：
吻合の開存性に乏しく；
血管周りの繊維形成および癒着の発生率を増大させる。
【０００６】
さらに、静脈は動脈より開存性が低いので、静脈レベルで強い止血剤を用いるのは、血管内血栓症の危険性のため、非常に危険である。
生体適合材料が吻合に関与する組織の天然治癒を妨げることを理由に、それらの使用に反対している記載が数多くある。その代わりに、血管断片からなる自己由来の組織を使用して吻合周りを覆うのが好ましい（Plastic and Reconstructive Surgery, Vol. 87, No. 3, March 1991, pages 567-568)。
【０００７】
エステル誘導体（ＥＰ０２１６４５３）および自己架橋されたヒアルロン酸誘導体（ＥＰ０３４１７４５）によって構成される生体適合材料の使用は、外科手術後の癒着の予防において既知である（ＷＯ９７／０７８３３）が、それらが血管内血栓症を引き起こし得る凝固因子に対して生化学的活性を有する止血剤使用の必要性にとって代わる物理的な止血活性を有することを観察した者はこれまでいない。
これらの生体適合材料の、もう１つの利点は、これらが、このタイプの外科手術に用いられる他のタイプの生体適合材料と異なり、血管が周りの組織に癒着するのを予防し、かつ驚くべきことに、正しい組織再生に有利な、適当な環境を創出することができることである。
【０００８】
本発明は、予想外の物理的な止血性質のため、吻合、好ましくは血管の吻合において、ならびに外科手術後、周りの組織に対する血管の癒着を予防するのに有益に用いられる、ヒアルロン酸、ゲランおよびアルギン酸の誘導体、好ましくはヒアルロン酸誘導体に基づく生体適合性かつ生物分解性の生体適合材料の使用を記載する。以下のポリサッカライドヒアルロン酸誘導体が好ましい：
カルボキシ官能基の一部またはすべてが、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環式族のアルコールでエステル化されているヒアルロン酸エステル（ＥＰ０２１６４５３）；
カルボキシ官能基の一部がアリール化脂肪族（aralaphatic）のアルコールでエステル化されており、カルボキシ基の他の部分が長鎖脂肪族の基で誘導体化されているヒアルロン酸エステル（ＷＯ９８／０８８７６）；
カルボキシ基の一部またはすべてが同ポリサッカライド鎖または他の鎖のアルコール官能基でエステル化されている自己架橋されたヒアルロン酸エステル（ＥＰ０３４１７４５）；
カルボキシ基の一部またはすべてが、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環式族のポリアルコールでエステル化され、スペーサー鎖によって架橋が生成されている、架橋されているヒアルロン酸化合物（ＥＰ０２６５１１６Ｂ１）；
ヒアルロン酸またはヒアルロンの部分エステルまたはトータルエステルの、コハク酸ヘミエステルまたはコハク酸ヘミエステルの重金属塩（ＷＯ９６／３５７２０）；
硫酸化誘導体（ＷＯ９５／２５７５１）またはＮ−硫酸化誘導体（１９９８年４月３日提出のＰＣＴ／ＥＰ９８／０１９７３）；
ヒアルロン酸のアミド誘導体；
ゲランの部分エステルおよび自己架橋されたエステル誘導体（ＥＰ０５１８７１０、ＥＰ０６５４０４６）；および
アルギナートのエステル誘導体（ＥＰ２５１９０５）。
【０００９】
本発明において有用な、ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステル、またはヒアルロン酸トータルエステルまたは部分エステルのコハク酸ヘミエステルは、以下の繰り返し単位（Ｉ）を有することによって特徴付けられる：
【化１】
0004417547.tif 000002
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに同じか、あるいは異なって、ＨまたはＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯＹ（式中、Ｙは負の電荷あるいはＨである）であり、ＲはＯＨ、Ｏ-またはアルコール基である］。
【００１０】
特に、ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルの重金属塩またはヒアルロン酸トータルエステルまたは部分エステルのコハク酸ヘミエステルの重金属塩は、以下の繰り返し単位（ＩＩ）を有することによって特徴付けられる：
【化２】
0004417547.tif 000003
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は互いに同じか、あるいは異なって、ＨまたはＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯ-であり、ＲはＯ-またはアルコール基であり、（Ｘz+）は重金属のカチオンであり、ここにｚは１から６の数であり、ｐは０．１から５までの整数または小数であり、ただしｐ（Ｘz+）は、該繰り返し単位に存在する陰イオン基ＣＯＯ-の数と等しいことを条件とする］。
【００１１】
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の部分エステルまたはトータルエステルの、コハク酸ヘミエステルまたはコハク酸ヘミエステルの重金属塩は、以下の工程にしたがって製造することができる：
ａ）ヒアルロン酸ナトリウム塩を、水および非プロトン溶媒の存在下で、ピリジニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラアリールアンモニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、テトラアリールホスホニウム塩からなる群から選択される塩に変換し、
ｂ）触媒としての有機塩基の存在下、工程（ａ）から得られた溶液を無水コハク酸で処理し、ピリジニウム、テトラアルキルアンモニウム、テトラアリールアンモニウム、テトラアルキルホスホニウムまたはテトラアリールホスホニウムカチオンを透析によって除去し、これにより繰り返し単位（Ｉ）を有するコハク酸ヘミエステル(ただし該繰り返し単位（Ｉ）の少なくとも１つがＲ＝ＯＨまたはＯ-であることを条件とする）を得、場合により得られた生成物を凍結乾燥によって回収し、
ｃ）先の工程から得られた溶液をそのまま、または先の工程から回収された固形生成物の水溶液を、重金属の無機塩の水溶液で処理し、生成物をろ過および減圧乾燥によって回収する。
【００１２】
ヒアルロン酸トータルエステルのコハク酸ヘミエステルの重金属塩を製造する場合、以下の方法を用いることができる：
ｂ’）水と非プロトン溶媒の混液中に溶解あるいは懸濁させたヒアルロン酸エステルを、触媒としての有機塩基の存在下に、無水コハク酸で処理し、これにより、Ｒがアルコール基である繰り返し単位（Ｉ）を有するコハク酸ヘミエステルを得、場合により、得られた生成物を凍結乾燥によって回収し、
ｃ’）先の工程から得られた溶液をそのまま、または先の工程から回収された固形生成物の水溶液を、重金属の無機塩の水溶液で処理し、ろ過および減圧乾燥によって生成物を回収する。
【００１３】
用語「重金属」とは、周期表の第４、第５または第６周期の、医薬的に活性な任意の金属を包含する。
本発明の好ましい重金属塩は、そのカチオンが、ヒアルロン酸のコハク酸誘導体の亜鉛塩、銀塩、銅塩、金塩、セシウム塩およびタングステン塩であるものである。
【００１４】
任意の分子量のヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルを、そのコハク酸誘導体の製造に用いることができる。以下の例では、３０，０００から７６０，０００ダルトンの範囲の分子量のヒアルロン酸サンプルを用いたが、この範囲は重要ではない。
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルの好ましいコハク酸ヘミエステルは、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈの繰り返し単位（Ｉ）を有するもの、および繰り返し単位（ＩＩ）の式中、Ｘが銀、金、銅および亜鉛からなる群から選択され、ｚが１から３の間であり、ｐが０．３から２の間である対応する重金属塩である。
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのもう１つのクラスの好ましいコハク酸ヘミエステルは、少なくとも１つの、Ｒ1＝Ｒ3＝Ｈであり、Ｒ2＝ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯＹである繰り返し単位（Ｉ）および少なくとも１つの、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈであり、Ｒ1＝ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯＹである繰り返し単位（Ｉ）（上記意義を有する）を有するもの、ならびに少なくとも１つの、Ｒ1＝Ｒ3＝Ｈであり、Ｒ2＝ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯ-である繰り返し単位（ＩＩ）および少なくとも１つの、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈであり、Ｒ1＝ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯＯ-である繰り返し単位（ＩＩ）（ここに、Ｘは銀、金、銅および亜鉛からなる群から選択され、ｚは１から３の間であり、ｐは０．６から３の間である）を有する対応する重金属塩である。
【００１５】
上記工程（ａ）では、ヒアルロン酸を対応するピリジニウム塩に変換するのが好ましい。特にこの変換には、ヒアルロン酸ナトリウム塩を水およびジメチルホルムアミドの混液中に前もって溶解させ、カチオン交換樹脂で処理して、対応する遊離のヒアルロン酸を得ることが含まれる。樹脂を除去した後、この溶液をピリジンで中和し、これによりピリジニウム塩を得る。
【００１６】
両方法の工程（ｂ）または（ｂ’）では、ヒアルロン酸と比べて大過剰の無水コハク酸を加えるのが好ましいが、この無水コハク酸の量は重要ではない。実際、無水コハク酸／出発ヒアルロン酸またはヒアルロン酸部分エステルの繰り返し単位（ＩＩＩ）：
【化３】
0004417547.tif 000004
［式中、Ｒは上記意義を有する］
に存在する遊離のＯＨ基のモル比が１５から９０の範囲のときに最良の結果が得られる。温度は重要ではないが、両方法の工程（ｂ）または（ｂ’）を７０℃で行った場合に最良の結果が得られる。両方法の工程（ｂ）または（ｂ’）で触媒として用いる好ましい有機塩基は、４−ジメチルアミノピリジン、ピリジンまたはそれらの混合物からなる群から選択される。大量の４−ジメチルアミノピリジンを用いることによって、高度にスクシニル化されたヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルが得られる。ピリジンを単独で、あるいは少量の４−ジメチルアミノピリジンとの混合物中で用いることによって、低度にスクシニル化されたヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルが得られる。温度、反応時間などの反応条件を強くすればするほど、より高度にエステル化された誘導体が形成される。
【００１７】
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルのＡｇ塩を製造するため、工程（ｃ）または（ｃ’）では、ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルまたはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルを、硝酸銀水溶液で処理して、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルの銀塩を形成させるのが好ましい。このＡｇ塩は溶液から沈殿し、ろ過または遠心によって回収される。次いでこの沈殿をエタノールで洗浄し、４０℃で減圧乾燥する。このコハク酸誘導体の銀化合物は完全暗所で製造する。硝酸銀溶液を製造し、スクシニル銀ヒアルロナートを製造するすべての操作は暗所で行い、得られた生成物は光源のないところに保存した。
【００１８】
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルのＣｕ塩を製造するため、両方法の工程（ｃ）または（ｃ’）では、ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルまたはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルをＣｕＣｌ2の水溶液で処理し、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルのＣｕ塩を形成させるのが好ましい。
【００１９】
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルのＺｎ塩を製造するため、両方法の工程（ｃ）または（ｃ’）では、ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルまたはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルをＺｎＣｌ2の水溶液で処理し、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルのＺｎ塩を形成させるのが好ましい。
【００２０】
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルのＡｕ塩を製造するため、両方法の工程（ｃ）または（ｃ’）では、ヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルまたはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルをＨＡｕＣｌ4の水溶液で処理し、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸エステルのコハク酸ヘミエステルのＡｕ塩を形成させるのが好ましい。
【００２１】
ヒアルロン酸およびヒアルロン酸エステルのヘミエステルコハク酸誘導体の具体例には、以下のものが含まれる：
ａ）繰り返し単位（Ｉ）を有するヒアルロン酸のコハク酸ヘミエステルの製造例
実施例１：
蒸留水（３５ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１００ｍＬ）中のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ-Ｎａ、１ｇ、ＭＷ １６０，０００）の溶液をイオン交換樹脂（３Ｇ．ＩＲ １２０ Ｈ＋）の存在下で１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（１００ｍＬ）でさらに希釈し、ろ過して樹脂を除去した。次いでこの溶液を過剰のピリジン（１０ｍＬ）で中和し、ヒアルロン酸のピリジン塩（ＨＡ−Ｐｙ）を得た。次いでこの粘性の溶液を減圧下で注意深く蒸発させ、溶液の総容量が約１００ｍＬ以下にならないように気をつけて、存在する水を除去した。この手法を毎回ＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えて、３回繰り返した。次いでこの溶液を室温で２４時間攪拌しながら、無水コハク酸（３ｇ）およびピリジン（１０ｍＬ）で処理した。次いでこの反応混合物を濃縮し、蒸留水（２０ｍＬ）と混合し、蒸留水（３回、７５０ｍＬ）に対して透析し、凍結乾燥して、ヒアルロン酸スクシニレート（コハク酸エステル）（９３０ｍｇ）を得た。
【００２２】
表１は、サンプル１の13Ｃ.ｎ.ｍ.ｒ.（５０．３ＭＨｚ）スペクトルの化学シフト値の割り当てを示す。
【表１】
表１
0004417547.tif 000005
Ｎ.Ｍ.Ｒ.分析は、Ｎ−アセチルグルコサミンの炭素６（Ｎ−６）のスクシニル化度、０．２（コハク酸（モル）／ポリマーの繰り返し単位（モル））を示している。
【００２３】
実施例２：
蒸留水（３５ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１００ｍＬ）中のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ−Ｎａ、１ｇ、３０，０００）の溶液を、イオン交換樹脂（３ｇ、ＩＲ １２０ Ｈ＋）の存在下で１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（１００ｍＬ）でさらに希釈し、ろ過して樹脂を除去した。次いでこの溶液を過剰のピリジン（１０ｍＬ）で中和し、ヒアルロン酸のピリジン塩（ＨＡ−Ｐｙ）を得た。次いでこの粘性の溶液を減圧下で注意深く蒸発させ、溶液の総容量が約１００ｍＬ以下にならないようにして、存在する水を除去した。この水を除去する手順を、毎回ＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えて、３回繰り返した。次いでこの溶液を７０℃で２４時間攪拌しながら、無水コハク酸（３ｇ）およびピリジン（１０ｍＬ）で処理した。次いでこの反応混合物を濃縮し、蒸留水（２０ｍＬ）と混合し、蒸留水（３回、７５０ｍＬ）に対して透析し、凍結乾燥して、ヒアルロン酸スクシニレート（９００ｍｇ）を得た。
【００２４】
表２は、サンプル２）の13Ｃ：ｎ.ｍ.ｒ.スペクトル（５０．３ＭＨｚ）の化学シフト値の割り当てを示す。
【表２】
表２
0004417547.tif 000006
Ｎ.Ｍ.Ｒ.分析は、Ｎ−アセチルグルコサミンの炭素６（Ｎ−６）のスクシニル化度、約０．４５（コハク酸（モル）／繰り返し単位（モル））を示す。
【００２５】
実施例３：
蒸留水（３５ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ １００ｍＬ）中のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ-Ｎａ、０．５ｇ、ＭＷ １６０，０００）の溶液を、イオン交換樹脂（３Ｇ、ＩＲ １２０ Ｈ＋）の存在下で１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（７５ｍＬ）でさらに希釈し、ろ過して樹脂を除去した。次いでこの溶液を過剰のピリジン（６ｍＬ）で中和し、ヒアルロン酸のピリジン塩（Ｈａ−Ｐｙ）を得、次いでこの粘性の溶液を減圧下で注意深く蒸発させ、溶液の総容量が約５０ｍＬ以下にならないようにして、存在する水を除去した。この水を除去する手順を、毎回ＤＭＦ（１０ｍＬ）を加えて、３回繰り返した。次いでこの溶液を７０℃で４８時間攪拌しながら、無水コハク酸（２ｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）、およびピリジン（１０ｍＬ）で処理した。さらなる量の無水コハク酸（１ｇ）およびピリジン（２．５ｍＬ）を加え、混合物をもう２４時間攪拌した。次いでこの反応混合物を濃縮し、蒸留水（２０ｍＬ）と混合し、３日間、蒸留水（３回、７５０ｍＬ）に対して透析し、凍結乾燥して、ヒアルロン酸スクシニレート（４５０ｍｇ）を得た。この生成物は水に溶解させると、高い粘性を特徴的に示した。このｎ.ｍ.ｒ.スペクトルは特に、サンプルの高い粘性のせいで、広いピークを特徴的に示した。修飾の度合を電位差アッセイによって評価し、１．８（コハク酸（モル）／繰り返し単位（モル））であることがわかった。
【００２６】
実施例４：
蒸留水（６０ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、６０ｍＬ）中のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ-Ｎａ、０．５Ｇ、ＭＷ ２４０，０００）の溶液を、イオン交換樹脂（１Ｇ、ＩＲ １２０ Ｈ＋）の存在下で１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（５０ｍＬ）でさらに希釈し、ろ過して樹脂を除去した。次いでこの溶液を過剰のピリジン（６Ｌ）で中和し、ヒアルロン酸のピリジン塩（ＨＡ−Ｐｙ）を得た。次いでこの粘性の溶液を減圧下で注意深く蒸発させ、溶液の総容量が約１００ｍＬ以下にならないようにして、存在する水を除去した。この水を除去する手順を、毎回ＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えながら、３回繰り返した。次いでこのゼラチン様の溶液を７０℃で１８時間攪拌しながら、無水コハク酸（２ｇ）およびピリジン（５ｍＬ）で処理した。さらなる量の無水コハク酸（２．５ｇ）および４−ジメチルアミノピリジン（２００ｍｇ）を加え、混合物をもう２４時間攪拌した。次いでこの反応混合物を濃縮し、蒸留水（２０ｍＬ）と混合し、凍結乾燥して、ヒアルロン酸スクシニレート（４５０ｍｇ）を得た。この生成物は水に溶解させると、高い粘性を特徴的に示した。このｎ.ｍ.ｒ.スペクトルは特に、サンプルの高い粘性のせいで、非常に広いピークを特徴的に示した。修飾の度合を電位差アッセイによって評価し、その結果は２．５（コハク酸（モル）／繰り返し単位（モル））であった。
【００２７】
実施例５：
蒸留水（６０ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、６０ｍＬ）中のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ-Ｎａ、１ｇ、ＭＷ ４０，０００）の溶液を、イオン交換樹脂（１ｇ、ＩＲ １２０ Ｈ＋）の存在下で１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（５０ｍＬ）でさらに希釈し、ろ過して樹脂を除去した。次いでこの溶液を過剰のピリジン（１０ｍＬ）で中和し、ヒアルロン酸のピリジン塩（ＨＡ−Ｐｙ）を得た。次いでこの粘性の溶液を減圧下で注意深く蒸発させ、溶液の総容量が約５０ｍＬ以下にならないようにして、存在する水を除去した。この水を除去する手順を、毎回ＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えながら、３回繰り返した。次いでこの溶液を７０℃で１８時間攪拌しながら、無水コハク酸（３ｇ）およびピリジン（１０ｍＬ）で処理した。さらなる量の無水コハク酸（２．５ｇ）および４−ジメチルアミノピリジン（２００ｍｇ）を加え、混合物をもう２４時間攪拌した。次いでこの茶色の反応混合物を濃縮し、蒸留水（２０ｍＬ）と混合し、蒸留水（３回、７５０ｍＬ）に対して透析し、凍結乾燥して、ヒアルロン酸スクシニレート（８５０ｍｇ）を得た。スクシニル化の度合を電位差アッセイによって評価したところ、３．５（コハク酸（モル）／繰り返し単位（モル））であった。
【００２８】
実施例６：
蒸留水（６０ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、６０ｍＬ）中のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ-Ｎａ、０．５ｇ、ＭＷ ７６０，０００）の溶液を、イオン交換樹脂（１ｇ、ＩＲ １２０ Ｈ＋）の存在下で１０分間攪拌した後、ＤＭＦ（５０ｍＬ）でさらに希釈し、ろ過して樹脂を除去した。次いでこの溶液を過剰のピリジン（６ｍＬ）で中和し、ヒアルロン酸のピリジン塩（ＨＡ−Ｐｙ）を得た。次いでこの粘性の溶液を注意深く蒸発させ、溶液の総容量が約５０ｍＬ以下にならないようにして、存在する水を除去した。この手順を、毎回ＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えながら、３回繰り返した。次いでこのゼラチン様の溶液を無水コハク酸（２ｇ）および４−ジメチルアミノピリジン（２００ｍｇ）で処理し、混合物をもう２４時間攪拌した。次いでこの反応混合物を濃縮し、蒸留水（２０ｍＬ）と混合し、蒸留水（３回、７５０ｍＬ）に透析し、凍結乾燥して、ヒアルロン酸スクシニレート（４３０ｍｇ）を得た。この生成物は、水に溶解させると、高い粘性を特徴的に示した。このｎ.ｍ.ｒ.スペクトルは特に、サンプルの高い粘性のせいで、非常に広いピークを特徴的に示した。修飾の度合を電位差アッセイによって評価したところ、２．５（コハク酸（モル）／繰り返し単位（モル））であった。
【００２９】
ｂ）Ｏ−スクシニルヒアルロナートの銀塩の製造例
実施例７：
実施例１に記載のように製造したＯ−スクシニルヒアルロナート１００ｍｇを蒸留水１０ｍＬに溶解させた。次いでこのポリマー溶液にＡｇＮＯ3の１Ｎ溶液１０ｍＬを加えた。このようにして形成された白色沈殿を２時間攪拌し続けて懸濁状態に維持した後、Buchner 漏斗を通すろ過によって集め、エタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。これらの操作はすべて暗所で行い、酸化銀の形成を回避した。原子吸収分析は、銀含量が２３．５重量％であり、理論的化学量論値の８７％と等しいことを示した。
【００３０】
実施例８：
実施例３に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート７０ｍｇを蒸留水１４ｍＬに溶解させた。この高い粘性のポリマー溶液にＡｇＮＯ3の１Ｎ溶液１４ｍＬを加えた。すぐに灰色沈殿が形成され、２時間攪拌を継続してこれを懸濁状態に維持した後、Buchner 漏斗を通すろ過によって集めた。これをエタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。これらの操作はすべて暗所で行い、酸化銀の形成を回避した。原子吸収分析は、銀含量が２７重量％であり、理論的化学量論値の７１％と等しいことを示した。
【００３１】
実施例９：
実施例４に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水２０ｍＬに溶解させた。この高い粘性のポリマー溶液にＡｇＮＯ3の２Ｎ溶液２０ｍＬを加えた。すぐに白色沈殿が形成され、２時間攪拌を継続してこれを懸濁状態に維持した。次いでこれを Buchner 漏斗を通すろ過によって回収し、エタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。これらの操作はすべて暗所で行い、酸化銀の形成を回避した。原子吸収分析は、銀含量が２８．８重量％であり、理論的化学量論値の７０．５％と等しいことを示した。
【００３２】
実施例１０：
実施例５に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水１０ｍＬに溶解させた。この高い粘性のポリマー溶液にＡｇＮＯ3の１Ｎ溶液１０ｍＬを加えた。すぐに茶色がかった沈殿が形成され、２時間攪拌を継続してこれを懸濁状態に維持した後、Buchner 漏斗を通すろ過によって回収し、エタノールで数回洗浄し、減圧オーブン中、４０℃で乾燥した。これらの操作はすべて暗所で行い、酸化銀の形成を回避した。原子吸収分析は、銀含量が３１％であり、理論的化学量論値の７０．２％と等しいことを示した。
【００３３】
実施例１１：
実施例６に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水１０ｍＬに溶解させた。この高い粘性のポリマー溶液にＡｇＮＯ3の１Ｎ溶液１０ｍＬを加えた。すぐに茶色がかった沈殿が形成され、２時間攪拌を継続してこれを懸濁状態に維持した後、Buchner 漏斗を通すろ過によって回収し、エタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。これらの操作はすべて暗所で行い、酸化銀の形成を回避した。原子吸収分析は、銀含量が２７重量％であり、理論的化学量論値の７１％と等しいことを示した。
【００３４】
ｃ）ヒアルロン酸スクシニレートの亜鉛塩の製造例
実施例１２：
実施例１に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水１０ｍＬに溶解させた。次いでこのポリマー溶液に、ＺｎＣｌ2の０．２Ｎ溶液１０ｍＬを加えた。この溶液を２時間継続して攪拌した後、３容量のエタノールを加え、可溶性の亜鉛塩を沈殿させた。３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して、この沈殿を回収し、エタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。原子吸収分析は、亜鉛含量が１０％であり、理論的化学量論値の１０１％と等しいことを示した。
【００３５】
実施例１３：
実施例３に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水２０ｍＬに溶解させた。この高い粘性のポリマー溶液に、ＺｎＣｌ2の２Ｎ溶液２０ｍＬを加えた。亜鉛塩を加えた後、粉末状の沈殿が形成され、これを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して回収し、エタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。原子吸収分析は、サンプル中の亜鉛含量が１５．３％であり、理論的化学量論値の１０５％と等しいことを示した。
【００３６】
実施例１４：
実施例４に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水２０ｍＬに溶解させた。この高い粘性のポリマー溶液に、ＺｎＣｌ2の２Ｎ溶液２０ｍＬを加えた。亜鉛塩を加えた後、粉末状の沈殿が形成され、これを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して回収し、エタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。原子吸収分析は、サンプル中の亜鉛含量が１７．７重量％であり、理論的化学量論値の１０５％と等しいことを示した。
【００３７】
ｄ）ヒアルロン酸スクシニレートの銅塩の製造例
実施例１５：
実施例５に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水１０ｍＬに溶解させた。次いでこのポリマー溶液に、ＣｕＣｌ2の２Ｎ溶液１０ｍＬを加えた。銅塩を加えると、青色沈殿が形成され、これを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して回収し、エタノールで数回洗浄し、４０℃にセットした減圧オーブンで乾燥した。原子吸収分析は、サンプル中の銅含量が２１．４重量％であり、理論的化学量論値の１１０％と等しいことを示した。したがって、おそらく、誘導体の沈殿時に、少量の銅塩がポリマーに取り込まれている。
【００３８】
ｅ）ヒアルロン酸スクシニレートの金塩の製造例
実施例１６：
実施例３に記載のように製造したヒアルロン酸スクシニレート１００ｍｇを蒸留水２０ｍＬに溶解させた。次いでこの高い粘性のポリマー溶液にＨａｕＣｌ4の０．５Ｎ溶液２０ｍＬを加えた。金塩を添加した後、沈殿が形成され、これを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心して回収し、エタノールで数回洗浄し、減圧オーブン中、４０℃で乾燥した。サンプル中の金含量は１３重量％であり、理論的化学量論値の４４％と等しいことがわかった。
【００３９】
適当な硫酸化剤を用いて、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の半合成誘導体のポリマー鎖に存在するアルコール性のヒドロキシルを硫酸化することにより、ほとんどすべての生物学的特徴を除いて、出発物質のものとは異なる化学−物理的特徴を有する新規誘導体を形成させることができる。
特に重要なヒアルロン酸の半合成誘導体には、米国特許第４，８５１，５２１号、第４，９６５，３５３号および第５，２０２，４３１号およびＥＰ ０ ２１６ ４５３に記載の”ＨＹＡＦＦ”と示される脂肪族、アリール化脂肪族、ヘテロ環式族およびシクロ脂肪族のアルコールとのエステルであるものもある。この場合、硫酸化反応はもはや均一相では生じないが、不均一相の生体適合材料の表面では、反応溶媒に暴露されているヒドロキシ基を活性化し、反応が生じる。
【００４０】
直接、生体適合材料上で達成することができる硫酸化の程度は重要な特徴であり、注意深い動力学的制御が必要とされる。基質を構成するポリマーの親水性が増加することによって誘導される生体適合材料の可溶化を避けるため、二量体ユニット当たりの−ＳＯ3基の数はあるレベルを超えてはならず、出発生体適合材料の親水性の程度に応じて、一般には１．５−２以下である。例えば、すべてのカルボキシルがベンジル基とのエステル結合に関与しているＨＹＡＦＦ１１フィルムの場合、硫酸化の最大程度は１．５を超えるべきでない。
【００４１】
硫酸化に一般に用いられる試薬には、三酸化硫黄とピリジンの複合体（ＳＯ3−ピリジン）が含まれる。この反応は、非プロトン溶媒、例えばジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドおよびＮ−メチルピロリドン中、約０℃から約６０℃の温度範囲で、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩の溶液、または部分エステルの場合には、テトラブチルアンモニウム塩形態である残りのカルボキシ官能基を含むヒアルロン酸エステルの溶液に硫酸化試薬を加えることによって行う。
ジサッカライド（二糖類）単位当たりの硫酸基の数によって測定される種々の程度の硫酸化は、ＳＯ3−ピリジンの量を変化させることによって達成できる。水酸基のモルと硫酸化試薬のモルの比は１：１から１：１２までの間で変化させることができる。
【００４２】
本方法は、ポリマーの特徴、特にその分子量の喪失を引き起こすことなしに、ヒアルロン酸およびその半合成誘導体のポリサッカライド鎖を特異的かつ均質に硫酸化するのに用いることができる。
この方法によって、種々の硫酸化レベルであるが同じ分子量の新規ポリマーを得ることができる。カルボキシ基がテトラブチルアンモニウム塩で塩化されている生体ポリマーを出発物質として用いることによって、新規生物学的特徴を有するポリマーを得ることができる。このような生体ポリマーは溶血性ではない。
【００４３】
これらの硫酸化されたポリサッカライド（多糖類）の注目すべき特徴は、その血液凝固時間を増加させる能力である。例えば、２．５より大きな硫酸化の程度を有するヒアルロン酸誘導体は良好な抗凝固活性を示す。さらに出発ポリマーの分子量はまた、本発明の硫酸化されている新規生体ポリマーの性質に重大に影響し得る。
【００４４】
特に少なくとも４個の硫酸化されているヒアルロン酸誘導体が、その分子量および硫酸化の程度のため、注目に値する。これらは：
１．約１０，０００から約５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有し、硫酸化の程度２．５、３．０または３．５を有するヒアルロン酸；
２．約５０，０００から約２５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有し、硫酸化の程度２．５、３．０または３．５を有するヒアルロン酸；
３．約２５０，０００から約７５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有し、硫酸化の程度２．５、３．０または３．５を有するヒアルロン酸；および
４．約７５０，０００から約１，２５０，０００ダルトンの範囲の分子量を有し、硫酸化の程度２．５、３．０または３．５を有するヒアルロン酸である。
上記記載の分子量を有するヒアルロン酸画分は、当分野に既知の特定の分子量カットオフポイントを有する膜を使用することによって得ることができる。
【００４５】
ヒアルロン酸の半合成エステル誘導体の中でも、１．０および１．５の程度まで硫酸化されているＨＹＡＦＦ１１（ヒアルロン酸の１００％ベンジルエステル）、および０．５および１．０の程度まで硫酸化されているＨＹＡＦＦ１１ｐ７５（ヒアルロン酸の７５％ベンジルエステル）のポリマー化基質が特に特に興味深い。
【００４６】
具体的なヒアルロン酸の硫酸化誘導体は以下のように製造することができる。
ａ）ヒアルロン酸ナトリウムの硫酸化、硫酸化の程度３
ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素気流下、ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン１．３０５ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の間の温度で１時間振盪する。次いで、０℃にまで冷却した精製水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を０℃から４℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心してこの沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度は核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定する。
【００４７】
ｂ）ヒアルロン酸ナトリウムの硫酸化、硫酸化の程度３．５
ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素流下、ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン２．０８８ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の範囲の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃にまで冷却した水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を４℃から０℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心してこの沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度は核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定する。
【００４８】
ｃ）ヒアルロン酸の部分エチルエステル（カルボキシ基の７５％がエチルエステル形態である）の硫酸化、硫酸化の程度３
ヒアルロン酸の７５％部分エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−７ｐ７５）のテトラブチルアンモニウム塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素流下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン１．３０５ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の範囲の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃にまで冷却した水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を４℃から０℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度はＮＭＲによって測定する。
【００４９】
ｄ）ヒアルロン酸の部分エチルエステル（カルボキシ基の５０％がエチルエステル形態である）の硫酸化、硫酸化の程度２．５
ヒアルロン酸の５０％部分エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−７ｐ５０、カルボキシ基の５０％がエタノールでエステル化されている）のテトラブチルアンモニウム塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素流下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン１．０４４ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の範囲の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃にまで冷却した水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を４℃から０℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度はＮＭＲによって測定する。
【００５０】
ｅ）ヒアルロン酸の部分エチルエステル（カルボキシ基の２５％がエチルエステル形態である）の硫酸化、硫酸化の程度２
ヒアルロン酸の部分エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−７ｐ２５、カルボキシ基の２５％がエタノールでエステル化されている）のＴＢＡ塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素流下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン０．７８３ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の範囲の温度で少なくとも１時間シェイクする。次いで、０℃にまで冷却した水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を４℃から０℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度はＮＭＲによって測定する。
【００５１】
ｆ）ヒアルロン酸の部分ベンジルエステル（カルボキシ基の７５％がベンジルエステル形態である）の硫酸化、硫酸化の程度３．５
ヒアルロン酸の部分エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−１１ｐ７５、カルボキシ基の７５％がベンジルアルコールでエステル化されている）のテトラブチルアンモニウム塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素流下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン２．０８８ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の範囲の温度で少なくとも１時間シェイクする。次いで、０℃にまで冷却した水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を４℃から０℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度はＮＭＲによって測定する。
【００５２】
ｇ）ヒアルロン酸の部分ベンジルエステル（カルボキシ基の５０％がベンジルエステル形態である）の硫酸化、硫酸化の程度３
ヒアルロン酸の部分エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−１１ｐ５０、カルボキシ基の５０％がベンジルアルコールでエステル化されている）のテトラブチルアンモニウム塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素流下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン１．３０５ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の範囲の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃にまで冷却した水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を４℃から０℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度はＮＭＲによって測定する。
【００５３】
ｈ）ヒアルロン酸の部分ベンジルエステル（カルボキシ基の２５％がベンジルエステル形態である）の硫酸化、硫酸化の程度２
ヒアルロン酸の部分エチルエステル（ＨＹＡＦＦ−１１ｐ２５、カルボキシ基の２５％がベンジルアルコールでエステル化されている）のテトラブチルアンモニウム塩０．２５０ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬ中に溶解させる。窒素流下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬ中に溶解させたＳＯ3−ピリジン０．５２２ｇをこの溶液に加える。この溶液を４℃から０℃の範囲の温度で少なくとも１時間振盪する。次いで、０℃にまで冷却した水約２００ｍＬを加える。１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、この混合物のｐＨを８．５から９．５の範囲の値にする。次いでこの誘導体をエチルアルコール１２０ｍＬで沈殿させる。無水酢酸ナトリウムを飽和するまで加え、沈殿を４℃から０℃の範囲の温度で１から２４時間沈積させておく。例えば１，５００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を分離し、精製水に溶解させた後、すべての残留試薬および反応生成物が完全に除去されるまで透析する。硫酸化の程度はＮＭＲによって測定する。
【００５４】
ｉ）ＨＹＡＦＦ１１のフィルムの製造、硫酸化の程度１．５
ＨＹＡＦＦ１１のフィルム０．２５０ｇを、クロロホルム：ジメチル−ホルムアミドの１：１混合物２５０ｍＬ浴に浸す。次いで、ピリジン−ＳＯ3の複合体３．４ｇをジメチルホルムアミドに溶解させて得られた溶液５０ｍＬを加える。
この反応を室温で２時間進行させた後、フィルムを取り出し、次いで蒸留水（１００ｍＬ）浴に浸し、最後に水：エタノールの５０：５０溶液に浸す。次いでこのフィルムを５５℃のオーブンで４８時間乾燥する。
【００５５】
ｊ）ＨＹＡＦＦ１１ｐ７５のフィルムの製造、硫酸化の程度１
ＨＹＡＦＦ１１ｐ７５のフィルム０．２５０ｇを、クロロホルム：ジメチルホルムアミドの１：１混合物２５０ｍＬ浴に浸す。次いで、ピリジン−ＳＯ3の複合体２．３ｇをジメチルホルムアミドに溶解させて得られた溶液５０ｍＬを加える。
この反応を室温で２時間進行させた後、フィルムを取り出し、次いで蒸留水（約１００ｍＬ）浴に浸し、最後に水：エタノールの５０：５０溶液に浸す。このフィルムを５５℃のオーブンで４８時間乾燥する。
場合により、抗凝固剤または抗血栓活性を有する化合物で塩化されている、ヒアルロン酸およびその誘導体のＮ−硫酸化誘導体（ここにグルコサミンは部分的にＮ−硫酸化されているか、あるいは部分的にＮ−硫酸化され、かつ第６位が部分的もしくはトータルにＯ−硫酸化されている）は以下のように製造することができる。
【００５６】
以下の化学的方法は、グルコサミンのアミノ基または第６位のヒドロキシ基を選択的に硫酸化し、変化しない範囲内の分子量を有するヒアルロン酸の新規硫酸化誘導体を得るために十分に特徴付けされている出発生成物、例えばヒアルロン酸を用いる方法を提供する。
【００５７】
用語、ヒアルロン酸の「部分的に２−Ｎ−硫酸化されている誘導体」とは、P. Shaklee (1984) Biochem. J. 217, 187-197 に記載されている手法にしたがい、前もってＮ−脱アセチル化されたヒアルロン酸のグルコサミンのアミノ基を、制御して硫酸化反応させることによって得られる生成物を意味する。この反応は以下に示すように進行する：
【化４】
0004417547.tif 000007
【００５８】
用語「部分的に２−Ｎ−硫酸化され、かつ６−Ｏ−硫酸化されている誘導体」とは、以下の図に示すように、グルコサミンのアミノ基に加えて、同基の第一級ヒドロキシ官能基もまた、トータルあるいは部分的に硫酸化反応に関与している図１に例示される化学反応の生成物を意味する。
【化５】
0004417547.tif 000008
【００５９】
図１および２にしたがって製造された誘導体は、欧州特許第０２１６４５３ Ｂ１号に記載の手法にしたがう化合物の製造の中間体反応物として用いることができ、ここでは部分的に２−Ｎ−硫酸化され、あるいは部分的に２−Ｎ−硫酸化され、かつ部分的またはトータルに６−Ｏ−硫酸化されているヒアルロン酸のグルクロン基のカルボキシ官能基が脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環式族のアルコールと部分的または完全に反応し、それぞれ部分的またはトータルエステルを生じる：
【化６】
0004417547.tif 000009
【００６０】
さらに、欧州特許第０３４１７４５ Ｂ１号および第２６５１１６ Ｂ１号にそれぞれ記載の手法にしたがう架橋された化合物の合成に、図１および図２に記載の合成誘導体を中間体として用い、ここではＤ−グルクロン基に属するカルボキシ基の一部または全部を、ｉ）同じサッカライド鎖または他の鎖のアルコール官能基と、縮合剤を用いて反応させ、内部（またはラクトン）エステルおよび分子間エステルを製造し；ｉｉ）脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、シクロ脂肪族、ヘテロ環式族のポリアルコールと反応させ、スペーサー鎖による架橋を生成させることができる。
【００６１】
上記の、本発明の方法にしたがって得られる硫酸化された化合物を、場合により、重金属で塩化することができる。この重金属は周期表の第４、第５および第６周期の金属元素、例えば銀、鉄、コバルト、銅、亜鉛、ヒ素、ストロンチウム、ジルコニウム、アンチモニウム、金、セシウム、タングステン、セレン、白金、ルテニウム、ビスマス、すず、チタンおよび水銀の群から選択される。
また、この硫酸化された誘導体を、場合により、薬理的に活性な物質、例えば抗生物質、抗感染剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、細胞成長抑止剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤および傷害治癒物質、麻酔剤、コリン作動性またはアドレナリン作動性アゴニストまたはアンタゴニスト、抗血栓剤、抗凝固剤、止血剤、繊維素溶解剤、および血栓溶解剤、タンパク質およびその断片、ペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて塩化することもできる。
【００６２】
本発明の化合物の製造方法は主に２つの工程から構成され、第一の工程には天然ポリサッカライドの制御されたＮ−脱アセチル化が含まれ、第二の工程にはグルコサミンの第一級ヒドロキシまたは遊離アミノ官能基の特異的硫酸化反応が含まれる。
【００６３】
生物学的ソースおよび発酵ソース由来の、分子量５，０００から５，０００，０００Ｄａの範囲、好ましくは５０，０００Ｄａから３００，０００Ｄａの範囲のヒアルロン酸のフラクションを、９８％以上の純度、１から５０ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは５から２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でヒドラジン水和物に溶解させる。次いでこの溶液に、０．１から３％の範囲、好ましくは１％の重量／容量濃度で硫酸ヒドラジンを加える。
この反応は４０から９０℃の範囲内の温度、好ましくは６０℃で、攪拌しながら、Ｎ−脱アセチル化が所望の程度に達するまで行う。
【００６４】
以下の表１は、反応時間に関し、遊離のアミノ基のパーセンテージで表した収率を示す：
【表３】
表１
0004417547.tif 000010
★  Ｎ−脱アセチル化のパーセンテージは、J. Riesenfeld (Analy. Bioch. 1990, vol. 188, pages 383-389) の方法にしたがって測定する
★★  ”ＤＡｃ”＝Ｎ−脱アセチル化
【００６５】
次いで極性溶媒、好ましくはエタノールで沈殿させることにより、この反応を停止させる。この沈殿を一部減圧乾燥し、０．１から１Ｍの範囲のモル濃度、好ましくは０．５Ｍのヨウ素酸溶液で処理し、最後に５７％（ｗ／ｖ）の濃度のヨウ化水素酸（iodohydric acid）で処理する。酢酸ナトリウム溶液（１０％ ｗ／ｖ）を加えてこの溶液のｐＨを５から７の範囲で維持する。
修飾されたポリサッカライドを含む水相をジエチルエーテルで繰り返し処理して抽出し、黄色が完全に消えたら、エタノールでこの溶液を再処理する。
さらに４０℃で乾燥した後に形成された沈殿を、１０ｎｇ／ｍＬから４０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、好ましくは２５ｎｇ／ｍＬの濃度で水に溶解させ、この溶液を、テトラアルキルアンモニウムヒドロキシドで活性化させたイオン交換樹脂を含むカラムに通してろ過する（ここに第４アンモニウムのアルキル基は１から４個の炭素原子を有する鎖によって構成されている）。テトラブチルアンモニウムヒドロキシドを用いるのが好ましい。
次いで、修飾されたポリサッカライドの第４アンモニウム塩によって代表される、ろ過された生成物を凍結乾燥する。
【００６６】
部分的２−Ｎ−硫酸化誘導体の製造：
方法Ａ
部分的にＮ−脱アセチル化されたポリサッカライドの第４アンモニウム塩、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を、非極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）中に、５から５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度（好ましくは２５ｍｇ／ｍＬ）で溶解させる。
この有機溶液に、ジメチルホルムアミドスルホトリオキシド（ＤＭＦＡ−ＳＯ3）からなる硫酸化複合体を、５０から２００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＦＡ中に溶解させることによって得られるもう１つの溶液を加える。驚くべきことに、ＳＯ3のモル数で表される、用いるべき複合体の量は、Ｎ−脱アセチル化反応によって放出されるアミノ基のモル数と等量であることがわかった。
【００６７】
硫酸化反応は０℃から２０℃の範囲の温度、好ましくは４℃で４時間以内の間進行させ、次いで冷蒸留水を加えて停止させる。
部分的に２−Ｎ−硫酸化されたヒアルロン酸をエタノールで沈殿させ、再溶解した生成物を蒸留水で透析することによって、この反応溶媒をまず精製する。
最後にこの溶液を凍結乾燥し、これにより得られた固形生成物を化学分析による特徴付けに付し、Ｎ−硫酸化の程度および平均分子量を測定する（表２）。
【表４】
表２
0004417547.tif 000011
ＨＡ＝ヒアルロン酸
ＨＡ−Ｎ−Ｓ＝Ｎ−硫酸化ヒアルロン酸
【００６８】
部分的に２−Ｎ−硫酸化され、６−Ｏ−硫酸化されている誘導体の製造
方法Ｂ
部分的にＮ−脱アセチル化されたポリサッカライドの第４アンモニウム塩、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩を、非極性溶媒、例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）中に、５から５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度、好ましくは３０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させる。
この有機溶液に、ジメチルホルムアミドスルホトリオキシド（ＤＭＦＡ−ＳＯ3）からなる硫酸化複合体を、５０から２００ｍｇ／ｍＬの範囲で変化する濃度、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＦＡ中に溶解させることによって得られるもう１つの溶液を加える。驚くべきことに、ＳＯ3のモル数で表される、用いるべき複合体の量は、Ｎ−脱アセチル化反応によって放出されるアミノ基のモル数と等量であることがわかった。
【００６９】
この硫酸化反応は、０℃から２０℃の範囲の温度、好ましくは４℃で４時間進行させる。硫酸化剤のＳＯ3のモル数と−ＣＨ2ＯＨのモル数の比が１．１から１．３の範囲になるような量のピリジン−スルホトリオキシド複合体をジメチルスルホキシド中に溶解させ、溶液を製造する。より大量の試薬を用いると、ポリサッカライド鎖の他のアルコール基（二次的）での任意の置換反応に有利になり得る。
次いでこの反応を少なくともさらに１６時間進行させた後、冷蒸留水を加えて停止させる。
修飾されたポリサッカライドの精製に関するそれ以後のすべての工程は「方法Ａ」に記載のものである。
得られた誘導体に対して行った分析による特徴付けにより、この硫酸化法は、驚くべきことに、部分的Ｎ−脱アセチル化によって得られたすべてのアミノ基を置換するだけでなく、結果的にヒアルロン酸のグルコサミン基の第一級アルコール基を完全に置換することがわかった(表３）。
【表５】
表３
0004417547.tif 000012
HA-N-O-S1＝Ｎ−硫酸化され、かつ第６位がトータルにＯ−硫酸化されているヒアルロン酸
【００７０】
さらに、第一級ヒドロキシル基に対してピリジン−ＳＯ3複合体のモル量を変える（０．１から１の範囲のモル比）ことによって、「方法Ｂ」は、部分的に２−Ｎ−硫酸化され、かつ部分的に６−Ｏ−硫酸化されている一連の誘導体を得ることを可能にする。
【００７１】
Ｎ−硫酸化されているヒアルロン酸誘導体の具体例は以下のように製造することができる。
ａ）部分的に２−Ｎ−硫酸化されているヒアルロン酸（Ｎ−アセチル基の約５％が硫酸化されている基によって置換されている）の製造
平均分子量１８１，０００Ｄａの、雄鶏のとさか由来のＨＡ１．００ｇを、硫酸ヒドラジン０．５ｇとともにヒドラジン一水和物５０ｍＬに溶解させる。
この溶液を攪拌しながら、反応を６０℃で８時間継続した後、エタノール１００ｍＬを加えて停止する。これによって形成されたゼラチン様の沈殿をエタノールで洗浄した後、減圧下、室温で乾燥する。
中間体生成物を水５０ｍＬおよび１０％酢酸ナトリウム溶液２０ｍＬからなる混液に溶解させ、最後に濃度０．５Ｍのヨウ素酸溶液２５ｍＬで処理する。攪拌しながら約３０分間反応させた後、過剰のヨウ素をヨウ化水素酸の５７％溶液５ｍＬで滴定する。この操作の間、反応容器を氷冷しておくのが好ましい。次いで濃い茶色の溶液をジエチルエーテル３０ｍＬで少なくとも５回処理し、修飾ポリマーを含む水溶液から反応残留物を抽出する。最後にこれを減圧下、４０℃で濃縮し、容量約４０ｍＬにした後、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドの４０％ｗ／ｖ溶液で活性化させたイオン交換スルホン酸樹脂２０ｍＬを充填したカラムに通してろ過する。
【００７２】
次いで、テトラブチルアンモニウム塩形態の修飾されたポリサッカライド（ＨＡＴＢＡ）を含む水溶液を収集し、１凍結乾燥サイクルに付する。
ＴＢＡの凍結乾燥ＨＡ塩１．３０ｇをジメチルホルムアミド４５ｍＬに溶解させ、このようにして得られた溶液に、濃度５０ｍｇ／ｍＬのＮ−Ｎジメチルホルムアミド スルホトリオキシド複合体の溶液０．６ｍＬを加える。この反応を４℃で５時間、穏やかに攪拌し続けながら継続させた後、冷蒸留水４５ｍＬを加えて停止させる。ＮａＯＨの２Ｍ溶液で中和し、ｐＨを７．５から８の範囲にし、次いで孔サイズＧ２の Gooch フィルターを通してろ過し、エタノール２５０ｍＬで処理する。
これにより形成された沈殿を少なくとも１５０ｍＬのエタノールで洗浄し、少なくとも１６時間減圧乾燥した後、蒸留水５０ｍＬに再溶解させ、次いで水５０容量に透析する。
【００７３】
生成物を凍結乾燥し、次いで特徴付けして、Ｎ−置換アミノ基のパーセンテージおよびその平均分子量を決定する。
凍結乾燥生成物の重量：                                  ０．７２ｇ；
収率：                                                  ８５％
ＳＯ3−（モル）／ＨＡ（単量体ユニット、モル）           ０．０４５
遊離−ＮＨ2基（モル）／ＨＡ（モル）：                   ０．０５２
脱Ｎ−アセチル化（％）：                                ５．２％
再Ｎ−硫酸化（％）：                                    ４．５％
Ｎ−硫酸化反応の収率：                                  ８７％
平均分子量：                                            174,000 Ｄａ
【００７４】
ｂ）部分的に２−Ｎ−硫酸化されているヒアルロン酸（Ｎ−アセチル基の約２５％が硫酸化されている基で置換されている）の製造
平均分子量１８１，０００Ｄａの、雄鶏のとさか由来のＨＡ１．２ｇを、硫酸ヒドラジン０．６ｇとともにヒドラジン一水和物６０ｍＬに溶解させる。
この溶液を攪拌しながら、反応を６０℃で２４時間進行させた後、エタノール１２０ｍＬを加えて停止する。これによって形成されたゼラチン様の沈殿をエタノールで洗浄した後、減圧下、室温で乾燥する。
中間体生成物を水６０ｍＬおよび１０％酢酸ナトリウム溶液２５ｍＬからなる混液に溶解させ、最後に濃度０．５Ｍのヨウ素酸溶液３０ｍＬで処理する。攪拌しながら約３０分間反応させた後、過剰のヨウ素をヨウ化水素酸の５７％溶液６ｍＬで滴定する。この操作の間、反応容器を氷冷しておくのが好ましい。
次いで濃い茶色の溶液をジエチルエーテル４０ｍＬで少なくとも５回処理し、修飾ポリマーを含む水溶液から反応残留物を抽出する。最後にこれを減圧下、４０℃で濃縮し、容量約５０ｍＬにした後、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドの４０％ｗ／ｖ溶液で活性化させたスルホン酸樹脂２５ｍＬを充填したイオン交換カラムに通してろ過する。
【００７５】
次いで、テトラブチルアンモニウム塩形態の修飾されたポリサッカライド（ＨＡＴＢＡ）を含む水溶液を収集し、１凍結乾燥サイクルに付する。
ＴＢＡの凍結乾燥ＨＡ塩１．６５ｇをジメチルホルムアミド５５ｍＬに溶解させ、このようにして得られた溶液に、濃度５０ｍｇ／ｍＬのＮ−Ｎジメチルホルムアミド スルホトリオキシド複合体の溶液３．０ｍＬを加える。この反応を４℃で６時間、穏やかに攪拌し続けながら継続させた後、冷蒸留水５５ｍＬを加えて停止させる。ＮａＯＨの２Ｍ溶液で中和し、ｐＨを７．５から８の範囲にし、次いで孔サイズＧ２の Gooch フィルターを通してろ過し、エタノール３００ｍＬで処理する。
これにより形成された沈殿を少なくとも１５０ｍＬのエタノールで洗浄し、少なくとも１６時間減圧乾燥した後、蒸留水５０ｍＬに再溶解させ、次いで水５０容量に透析する。
【００７６】
生成物を凍結乾燥し、次いで特徴付けして、Ｎ−置換アミノ基のパーセンテージおよびその平均分子量を決定する。
凍結乾燥生成物の重量：                                  ０．９８ｇ；
収率：                                                  ８９％
ＳＯ3−（モル）／ＨＡ（単量体ユニット、モル）           ０．２３
遊離−ＮＨ2基（モル）／ＨＡ（モル）：                   ０．２４
脱Ｎ−アセチル化（％）：                                ２４％
再Ｎ−硫酸化（％）：                                    ２３％
Ｎ−硫酸化反応の収率：                                  ９６％
平均分子量：                                            161,000 Ｄａ
【００７７】
ｃ）部分的に２−Ｎ−硫酸化され（Ｎ−アセチル基の約２５％が硫酸化されている基によって置換されている）、かつ６−Ｏ−硫酸化されているヒアルロン酸の製造
発酵によって得られた平均分子量１９５，０００ＤａのＨＡ５．０ｇを、硫酸ヒドラジン２．５ｇとともにヒドラジン一水和物２５０ｍＬに溶解させる。
この反応を、攪拌しながら、６０℃で２４時間維持した後、エタノール５００ｍＬを加えて停止する。これによって形成されたゼラチン様の沈殿をエタノールで洗浄した後、減圧下、室温で乾燥する。
中間体生成物を水２５０ｍＬおよび１０％酢酸ナトリウム溶液１０５ｍＬからなる混液に溶解させ、最後に濃度０．５Ｍのヨウ素酸溶液１２５ｍＬで処理する。攪拌しながら約３０分間反応させた後、過剰のヨウ素をヨウ化水素酸の５７％溶液２５ｍＬで滴定する。この操作の間、反応容器を氷冷しておくのが好ましい。
【００７８】
次いで濃い茶色の溶液をジエチルエーテル１５０ｍＬで少なくとも５回処理し、修飾ポリマーを含む水溶液から反応残留物を抽出する。最後にこれを減圧下、４０℃で濃縮し、容量を約２００ｍＬにした後、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドの４０％ｗ／ｖ溶液で活性化させたイオン交換スルホン酸樹脂１００ｍＬを充填したカラムに通してろ過する。
次いで、テトラブチルアンモニウム塩形態の修飾されたポリサッカライド（ＨＡＴＢＡ）を含む水溶液を収集し、１凍結乾燥サイクルに付する。
ＴＢＡの凍結乾燥ＨＡ塩６．０ｇをジメチルホルムアミド３００ｍＬに溶解させ、このようにして得られた溶液に、濃度５０ｍｇ／ｍＬのＮ−Ｎジメチルホルムアミド スルホトリオキシド複合体の溶液１３ｍＬを加える。この反応を４℃で６時間、穏やかに攪拌し続けながら継続させる。
【００７９】
ジメチルスルホキシド中に濃度５０ｍｇ／ｍＬで溶解させたピリジン スルホトリオキシドの複合体４０ｍＬから構成される第二の溶液を反応混合物に加える。
約１６時間後、冷蒸留水２５０ｍＬを加え、２Ｍ ＮａＯＨで溶液を中和し、ｐＨ８までにし、次いで孔サイズＧ３の Gooch フィルターを通してろ過し、エタノール１，２５０ｍＬで処理する。
これにより形成された沈殿を少なくとも５００ｍＬのエタノールで洗浄し、少なくとも１６時間減圧乾燥した後、蒸留水２５０ｍＬに再溶解させ、次いで水５０容量に透析する。
【００８０】
生成物を凍結乾燥し、次いで特徴付けして、Ｎ−置換アミノ基のパーセンテージ、６−Ｏ−硫酸化の程度およびその平均分子量を決定する。
凍結乾燥生成物の重量：                                  ４．１２ｇ；
収率：                                                  ８２％
ＳＯ3−（モル）／ＨＡ（単量体ユニット、モル）           １．２４
遊離−ＮＨ2基（モル）／ＨＡ（モル）：                   ０．２６
脱Ｎ−アセチル化（％）：                                ２６％
再Ｎ−硫酸化（％）：                                    ２４％
Ｏ−硫酸化（％）：                                      １００％
平均分子量：                                            170,000 Ｄａ
【００８１】
ｄ）部分的にＮ−硫酸化され、かつＯ−硫酸化されているヒアルロン酸のベンジルエステルの製造
実施例３で得られた誘導体２．００ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、この溶液を、テトラブチルアンモニウム ヒドロキシドで活性化されたイオン交換樹脂（ＴＢＡ＋形態）４０ｍＬを前もって充填したガラスカラムを通してろ過する。溶出液を凍結乾燥し、生成物３．３ｇを得た。
この生成物を、Ｎ−メチルピロリドン１３０ｍＬおよび水１．３ｍＬから構成される混液に溶解させ、ベンジルブロミド０．２９ｍＬと４℃で反応させる。この溶液を光源のないところで攪拌しながら、反応を２８℃で４８時間進行させた後、酢酸エチル３００ｍＬを加える。
【００８２】
これにより形成された、主に修飾ポリサッカライドからなる沈殿をアセトン１００ｍＬで洗浄し、次いで室温で減圧乾燥した後、１０％ｗ／ｖの塩化ナトリウム溶液１００ｍＬで処理する。
食塩水での処理が終了した時点（約１時間で終了）で、生成物を、１５０ｍＬの水／アセトン２０：８０で洗浄し、最後にアセトン１００ｍＬで洗浄する。
３０℃で４８時間乾燥した後、０．９２ｇ（収率８０％）を得た。
特徴付け：
エステル化（％）                             ９６％
【００８３】
ｅ）部分的にＮ−硫酸化され、かつＯ−硫酸化されている１０％自己架橋ヒアルロン酸の製造
実施例３で得られた誘導体２．００ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させ、この溶液を、テトラブチルアンモニウム ヒドロキシドで活性化されたイオン交換樹脂（ＴＢＡ＋形態）４０ｍＬを充填したガラスカラムに通してろ過する。溶出液を凍結乾燥し、生成物３．３ｇを得た。
この生成物を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）１６５ｍＬおよび水０．８ｍＬで構成される混液に溶解させ、次いで、２−クロロ−１−メチルピリジンヨーダイド２０５ｍｇをＮＭＰ８．２ｍＬ中に溶解させることによって得られた溶液と反応させる。反応を−２０℃で１８時間進行させた後、３％酢酸アンモニウム水溶液１６５ｍＬを加える。
【００８４】
この混合物を約４時間継続して攪拌した後、エタノール６５０ｍＬで処理する。これにより形成された沈殿をろ過によって分離し、エタノールで洗浄し、次いで２４時間減圧乾燥する。
次いで生成物を、イオン交換に有利なように、３％塩化ナトリウム溶液６０ｍＬで処理し、最後にエタノール１８０ｍＬをこの溶液に加えて再び沈殿させる。上清を除去した後、この生成物を、エタノール５０ｍＬで少なくとも３回洗浄し、次いでアセトン１００ｍＬで処理した後、最後に３０℃で４８時間乾燥する。
これにより、硫酸化され、かつ部分的に自己架橋された誘導体０．９７ｇを得た。
【００８５】
ｆ）部分的にＮ−硫酸化され、かつＯ−硫酸化されているヒアルロン酸のベンジルエステルのフィルムの製造
濃度１８０ｍｇ／ｍＬの、部分的にＮ−硫酸化され、かつＯ−硫酸化されているヒアルロン酸のベンジルエステルのジメチルスルホキシド溶液を調製する。
薄層の溶液をガラスプレートに広げる：溶液層の厚さは最終フィルムより１０倍厚くなければならない。エステルを溶解させることなしに、このジメチルスルホキシドを吸収したガラスプレートをエタノールに浸し、これを固化する。このフィルムをガラスプレートから分離し、エタノール、水、次いで再びエタノールで繰り返し洗浄する。
得られたフィルムを３０℃で４８時間加圧下で乾燥する。
【００８６】
ｇ）部分的に２−Ｎ−硫酸化され（２５％）、かつ６−Ｏ−硫酸化されているヒアルロン酸誘導体の銀塩の製造
実施例２にしたがって得られた化合物０．５０ｇを蒸留水２５ｍＬに溶解させ、得られた溶液を、Ｈ+形態の強いイオン交換樹脂１６ｃｍ3を充填したカラムに通してろ過する。溶出液を回収し、凍結乾燥する。凍結乾燥によって得られた酸形態の中間体生成物を、光源のないところで攪拌しながら、ＡｇＮＯ3の０．５Ｍ溶液２０ｍＬで６０分間処理する。
液相をろ過によって除去し、生成物を蒸留水１５０ｍＬ、次いで無水エタノール５０ｍＬで十分に洗浄する。硫酸化されたヒアルロン酸誘導体、銀塩を４０℃で減圧乾燥した後、０．６４９ｇを得た（収率９５％）。
【００８７】
該ヒアルロン酸誘導体は、単独で、互いに組み合わせて、あるいは天然、半合成または合成ポリマーと組み合わせて用いることができる。用いることができる天然ポリマーには、例えばコラーゲン、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンの共沈殿、セルロース、およびキチン、キトサン、ペクチンまたはペクチン酸、寒天、アガロース、キサン、ゲランゴム、アルギン酸またはアルギナート、ポリマンナンまたはポリグリカン、デンプン、天然ゴムのようなゲル形態のポリサッカライドなどがある。半合成ポリマーは、例えばアルデヒドまたはその前駆体、ジカルボン酸またはそのハロゲン化物、ジアミンのような物質と架橋されたコラーゲン、セルロース、キチンまたはキトサン、ゲランゴム、キサン、ペクチンまたはペクチン酸、ポリグリカン、ポリマンナン、寒天、アガロース、天然ゴム、グリコサミノグリカンの誘導体からなる群から選択され得る。最後に、用いることができる合成ポリマーの例には以下のものがある：ポリ乳酸、ポリグリコール酸または同物質の共重合体またはそれらの誘導体、ポリジオキサン、ポリホスファゼン（polyphosphazene)、ポリスルホン樹脂、ポリウレタン樹脂、ＰＴＦＥ。
【００８８】
本特許出願において用いられるヒアルロン酸エステルのうち、カルボキシ基の５０−１００％、好ましくは６０−１００％；より好ましくは７５−１００％がエステル化されているベンジルエステル、エチルエステルまたはプロピルエステルを用いるのが好ましい。７５％から１００％の範囲のカルボキシ基がエステル化され、残りのパーセンテージがアルカリ金属およびアルカリ土類金属、好ましくはナトリウムによって塩化されているベンジルエステルが特に好ましい。また、カルボキシ基の一部がアリール化脂肪族のアルコールでエステル化されており、カルボキシ基の他の部分が１０から２２個の炭素原子の直鎖脂肪族アルコールで誘導体化されているヒアルロン酸のエステル誘導体も好ましい。このようなエステル誘導体のうち以下の化合物が特に好ましい：
ベンジルアルコール（７５％）およびドデシルアルコール（２５％）でエステル化されているヒアルロン酸
ベンジルアルコール（７５％）およびヘキサデシルアルコール（２５％）でエステル化されているヒアルロン酸
ベンジルアルコール（７５％）およびオクタデシルアルコール（２５％）でエステル化されているヒアルロン酸
ベンジルアルコール（７５％）、エイコサニルアルコール（eicosanyl alcohol)（２０％）でエステル化され、ナトリウム（５％）で塩化されているヒアルロン酸；および
ベンジルアルコール（７５％）、ドコサニルアルコール（docosanyl alcohol)（１５％）でエステル化され、ナトリウム（１０％）で塩化されているヒアルロン酸。
【００８９】
本発明の好ましい架橋誘導体は０．５％から５０％まで；好ましくは０．５％から２０％まで、さらに好ましくは３％から１０％まで架橋されているものである。
特許第ＥＰ ０２１６４５３号、第ＥＰ ０３４１７４５号、第ＵＳ ５，５２０，９１６号、第ＥＰ ０５１７５６５号、第ＥＰ ０５７１４１５号、第ＷＯ ９４／０３２１２号に報告されている手法にしたがい、この生体適合材料をフィルム、ゲル、スポンジ、ガーゼ、不織物、膜、ミクロスフェア、マイクロカプセル、およびガイドチャンネルの形態に調製することができる。
【００９０】
本発明の１つの好ましい態様では、ポリサッカライド誘導体を糸形態で製造する。特に興味深いものの中には、カルボキシ官能基の一部がアリール化脂肪族のアルコール、例えばベンジルアルコールでエステル化されており、カルボキシ官能基の別の部分が、例えば国際特許出願第ＷＯ ９８／０８８７６号に開示されているもののような、１０から２２個の範囲の炭素原子を有する、長鎖の直線状脂肪族アルコールで誘導体化されているヒアルロン酸のエステル誘導体から作られた糸がある。
また糸には、場合により、他の生体適合ポリマー、例えばポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ＰＴＦＥおよびポリヒドロキシ酪酸などを含ませることもできる。ヒアルロン酸誘導体からなる糸は、吻合、特に心臓血管分野における縫合糸として用いることができ、あるいは吻合される血管または他の器官の周りに用いられるべきメッシュ、編物、不織物、チューブまたは他の材料の製造に用いることができる。
【００９１】
さらにこれらの生体適合材料を、種々の他の形態のヒアルロン酸、ゲランまたはアルギナートの誘導体の組み合わせによって構成することができ、これらには薬理学的に活性な物質、例えば止血剤および抗炎症剤、抗生物質、抗血栓剤、プラスミノーゲンを活性化することができる因子および／または成長因子を含ませることができる。
特に興味深いのは、生体適合材料が止血剤を包含することである。包含させることができる止血剤の例には、アドレナロン、アドレノクロム、アミノクロム、バトロキソビン（batroxobin）、サリチル酸カルバゾクローム、硫酸ナトリウムカルバゾクローム（carbazochrome sodium sulfonate）、ケファリン、コタルニン、エタムシレート、因子ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、フィブリノーゲン、１，２−ナフトキノン、１−ナフチルアミン−４−スルホン酸、オキサマリン（oxamarin）、酸化セルロース止血コロジオン、サルマリン（sulmarin）、トロンビン、トロンボプラスチン、塩化トロニウム、トラネキサム酸、バソプレシンおよびビタミンＫ２、Ｋ５およびＫ−Ｓ（ＩＩ）がある。
【００９２】
本発明に記載の生体適合材料を、単独で、あるいは上記誘導体であってもよいもう１つの材料と組み合わせ、心臓血管および腹膜手術のような手術において用い、その体液吸収能を利用して、外科手術にかかわる部位におけるその蓄積を減少させるのは特に興味深い。
この体液を吸収する作用を用い、そのような蓄積が回避されるべき吻合手術において利益を得ることができる。
【００９３】
発明の例示的態様
試験例１
フィルム形態の８０％エステル化されているヒアルロン酸のベンジルエステルおよびゲル形態の５％自己架橋されているヒアルロン酸誘導体を含む生体適合材料に対する、ラットの血管および血管周囲組織の応答の評価
【００９４】
材料および方法
８匹のラットの予備分析により、静脈吻合後の処置用の、好ましい生体適合材料の形態はゲル形態であるが、動脈吻合後の処置の場合では、好ましい処置はフィルムであり、あるいは出血が穏やかな場合にはゲルであることが確認された。
フィルムを静脈に適用すると、過度の血管収縮を引き起こし得るため、静脈吻合後の処置ではゲルが好ましい。ゲルはこのような収縮を全く引き起こさず、ゲルの付着性は接合箇所に封をし、縫い目を通した出血を防止する。
動脈内の血圧は非常に高いので、フィルムを用いるのがより適当であり、あるいは穏やかな出血だけである場合には、ゲルが適当であり得る。
平均重量３７０ｇ（２９５ｇから４８０ｇの範囲）の、成体の雄性 Sprague Dawley ラット４８匹を用いた。
ラットをまずエーテルで麻酔し、次いで腹膜内経路で４０ｍｇ／ｋｇのペントサルを投与し、大腿血管を切開した。
血管の直径をグラフ用紙で測定した後、クランプで循環を遮断し、血管を切断した。
被検動物をラット２４匹を含む２つの群に細別した。
【００９５】
第一群−ラット２４匹
各ラットは両後肢の静脈吻合手術を受けた。
この群では、まず両後肢の静脈が８から１０針の範囲の縫い目の吻合手術を受け、次いでその一方は自己架橋された化合物のゲルを縫い線の周りに広げて処置された後、血流を回復させたが、反対の後肢の静脈は生体適合材料で処置せず、すなわち対照標準とした。
【００９６】
第二群−ラット２４匹
各ラットは、一方の後肢に静脈吻合を、他方の後肢に動脈吻合を受けた。
静脈を自己架橋された化合物のゲルで覆い、動脈をヒアルロン酸ベンジルエステルのフィルムで覆った。
各群を、それぞれラット６匹の４群に細別し、生体適合材料の適用後、その吻合をそれぞれ１０、１５、２５および４５日後に観察し、標本を組織学的に試験した。
血管の開存性の臨床評価を、O'Brien, B. McC. (1997,"Microvascular Reconstructive Surgery", Edinburgh: Churchill Livingstone）に記載の開存性試験によって行った。
血管周囲の組織のサンプルを観察し、繊維形成および癒着の発生を評価した。
【００９７】
結果：
この試験の結果を表１および２にまとめる。
１５の大腿静脈が閉塞され、５７開存性であることがわかった（開存率７９．１４％）。
【表６】
表１
0004417547.tif 000013
静脈＋ゲル              自己架橋ヒアルロン酸ゲルで処置された静脈
動脈＋フィルム          ヒアルロン酸ベンジルエステルのフィルムで処置された動脈
【００９８】
【表７】
表２
0004417547.tif 000014
【００９９】
この結果は、平均の出血時間の減少、特に自己架橋された化合物で構成されたゲルで処置された静脈の場合、繊維形成の減少および処置された血管周りの瘢痕組織形成の減少を示した。
種々の日数後の、第一および第二群から無作為に選択された約２０の血管に対して行われた標本の組織学的分析では、静脈および動脈は、血管内膜の穏やかな繊維質の肥厚化によってわずかに狭められていることもあるが、一般に開存性であることが示された。血管壁に付着した、目に見える小さい血栓がただ一例存在しただけであった。
【０１００】
内皮は肥厚しておらず、目に見える繊維形成または癒着は存在せず、見たところ良好かつ全く完全でさえあった。ヘマトキシリン−エオシン（Hematoxylin-eosin）染色によっては、外科手術の瘢痕作用に起因する、散在する繊維形成領域を除いて、血管壁に対する他の構造的変化は全く示されなかった。
顕微鏡下で外来の非晶性、複屈折性材料として見える、手術に用いられる外科手術材料は、リンパ球、血漿細胞および多核性組織細胞の存在によって特徴付けられる肉芽腫反応の断片によって取り巻かれていた。
顆粒性白血球型炎症の徴候は見られなかった。
【０１０１】
このように本発明を記載してきたが、これらの方法が種々に修飾可能であることが明らかである。このような修飾は、本発明の精神および目的から逸脱していると考えるべきではなく、当業者に明白であり得るいかなる修飾も上記請求の範囲の範囲内であるものとして考えるべきである。