(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム結合型発光蛋白質を含む発光測定装置の検定用発光量標準物質。
【請求項２】
カルシウム結合型発光蛋白質が、イクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群から選択される天然由来または組換え蛋白質である、請求項１に記載の発光量標準物質。
【請求項３】
請求項２に記載されたカルシウム結合型発光蛋白質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたカルシウム結合型発光蛋白質を含む発光測定装置の検定用発光量標準物質。
【請求項４】
カルシウム結合型発光蛋白質が、
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
を有するカルシウム結合型発光蛋白質である、請求項１に記載の発光量標準物質。
【請求項５】
前記カルシウム結合型発光蛋白質が、その１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残基の少なくとも１つがセリンに置換されていることを特徴とする、請求項４に記載の発光量標準物質。
【請求項６】
カルシウム結合型発光蛋白質を発光測定装置の検定用発光量標準物質として用いる、カルシウム結合型発光蛋白質の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発光蛋白質を用いることを特徴とする発光量標準物質に関する。詳細には、発光測定装置検定において発光量標準物質として発光蛋白質を用いることを特徴とする発光量標準物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に学術研究の分野では、発光測定装置の検定および測定値フォトンの絶対量の決定を行う場合、そのフォトン量の絶対標準物質として半減期が５７３０年の放射性同位元素14Ｃ溶液が使用されてきた。しかし、14Ｃは、使用場所が法令上放射線同位元素の使用が許可されている場所に限定されるばかりか、取扱者がその放射線に曝されるという問題があった。
【０００３】
一方、発光測定検査は特に医薬や食品の分野において分析や検査の目的で重要な役目を担うようになり、発光測定装置の設置および使用は放射線管理区域外で行われるようになっている。しかし、放射線管理区域外では発光量標準物質として14Ｃを使用することができず、測定に際しては相対値（relative light unit）を用いているため、測定バッチ間および／または他の測定装置との間でデータを統一的に評価、管理することができないという問題が指摘されていた。
【０００４】
このため、化学発光反応系あるいは生物発光由来の酵素反応系、例えばルシフェラーゼによって生成される発光を発光量標準に用いることが考案されてきたが、これらの反応系は反応条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素濃度等の影響を比較的受けやすく、発光標準物質としては不適切であるとして、汎用法としては普及していない。
【０００５】
そこで、放射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用いることができる発光量標準物質が求められている。そのような発光量標準物質を用いて発光測定装置の検定を行うことができれば、各分析・検査において絶対量を決定することができ、各バッチ間でのデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られるデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一的に評価管理することが可能になる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、放射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用いることができ、非放射性物質からなり、生体系に影響を与えず、安定供給でき且つ信頼性の高い発光量標準物質を提供することを目的とする。発光量標準物質としては、発光反応が反応条件による影響を受けにくく発光量が安定していること、さらに取扱いが容易であることが必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、14Ｃをフォトン量標準物質として使用する場合と同様に、その標準物質を測定装置にセットすることにより簡単に検定する方法を開発するべく検討を行った結果、カルシウムイオン結合によりフォトンを誘発するイクオリンを代表とする発光蛋白質が発光量標準物質として使用可能であることを明らかにした。即ち、発光測定装置検定において発光量標準物質として前記発光蛋白質を用いる。
【０００８】
従って、本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質を含む発光測定装置の検定用発光量標準物質に関する。
【０００９】
本発明はまた、発光蛋白質がカルシウム結合型発光蛋白質である発光量標準物質に関する。
【００１０】
本発明はまた、発光蛋白質が、イクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインからなる群から選択される天然由来または組換え蛋白質である、発光量標準物質に関する。本発明において、前記発光蛋白質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているものも包含される。
【００１１】
本発明はまた、発光蛋白質が、
（ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
を有する蛋白質である発光量標準物質に関する。前記発光蛋白質には、その１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残基の少なくとも１つがセリンに置換されている発光蛋白質も包含される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の発光量標準物質において、発光蛋白質として使用されるイクオリンは、シアトル近郊に生育する発光オワンクラゲ（Aequorea  aequorea）の発光器から単離される蛋白質であり、蛋白質部分であるアポイクオリン（アポタンパク）と発光基質に相当するセレンテラジン、分子状酸素が複合体を形成した状態で存在している。そして、イクオリン分子にカルシウムイオンが結合すると、青色（λmax＝４６５nm）の瞬間発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミド、二酸化炭素を生成する。イクオリンは、プレチャージ型蛋白質と称されるように、発光のエネルギーを分子内に蓄積しており、カルシウム溶液を添加することのみで、瞬間光（＝フォトン）が発生する。
【００１３】
イクオリンまたは、そのカルシウムイオンに対する感受性の高さから微量カルシウムイオンの検出、定量（検出限界１０nM）や細胞内カルシウムの動的変化のイメージプローブ（カルシウムセンサー）として用いられてきた。クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質も同様な目的で使用されてきた。
【００１４】
イクオリンの発光量は蛋白質濃度に比例し、イクオリンの正確な濃度を決定することによって発光量を規定することができるため、イクオリンを発光量標準物質として使用することができる。即ち、本発明は、14Ｃに代わる発光量標準物質として使用という、イクオリンの全く新しい使用方法を開示する。
【００１５】
本発明者は、発光オワンクラゲからイクオリン遺伝子を単離し（特開昭６１−１３５５８６号公報）、その後イクオリン変異体を用いてその発光機構を明らかにした（特開昭６３−２９１５９３号公報、特開昭６３−２９１５８６号公報、特開昭６４−０４７３７９号公報）。さらに、大腸菌系を用いるイクオリンの製造法を確立し、高純度イクオリンを製造した（特開平１−１３２３９７号公報）。
【００１６】
本発明において、発光量標準物質として使用するイクオリンは、天然由来または組換え体の何れでもよいが、正確な濃度を決定するという観点から均一で高純度のものが好ましく、上述の高純度組換えイクオリンがさらに好ましい。
【００１７】
また、天然型イクオリンの発光は高濃度カルシウムイオン（最終濃度が０.１mM以上）添加により数秒間で完了する高速発光反応であり、測定装置において発光をより正確に検出するためには、カルシウムイオンが高濃度であってもゆっくり反応が起きる変異型イクオリンがより好ましい。そのような変異型イクオリンは、本出願人の特開昭６３−２９１５９３号公報に記載されており、天然型イクオリンのアミノ酸配列において、１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残基の少なくとも１つがセリンに置換されているイクオリン変異体が特に好ましい。
【００１８】
本発明において使用し得る変異型イクオリンは、特に限定しないが公知の遺伝子組換え技術、例えば特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の方法によって製造することができる。このようにして得られるイクオリンの組換え変異体は、天然型イクオリンと同様に発光量標準物質として使用することができる。
【００１９】
また、イクオリンは天然型または変異体ともに、発光反応後にＥＤＴＡ等のキレート剤で処理することによりアポイクオリンからカルシウムを除去し、還元剤、セレンテラジン、酸素とともに低温でインキュベーションすることによって再生させて再利用することが可能である。
【００２０】
本発明において、発光量標準物質としてイクオリンを使用するためには、その活性を長期間安定的に保持させることが重要である。従って、本発明はまた、イクオリンの安定保存法に関する。高純度イクオリンの活性を維持するためには、使用目的あるいは使用場所にあわせて以下のような保存方法を採用することが好ましい。
１．濃度０.１mMのＥＤＴＡを含む１.０Ｍ以上の濃度の硫酸アンモニウム水溶液中１０℃以下で保存する。この保存方法の場合、最低２ヶ月は活性の低下が認められない。
２．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム溶液を液体チッソ等で凍結させ保存する。この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。
３．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム水溶液が飽和硫酸アンモニウム水溶液になるように硫酸アンモニウムを添加することにより高純度イクオリンを塩析沈澱させ、液体チッソ等で凍結させ保存する。この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。
４．前述の高純度イクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム水溶液に硫酸アンモニウムを徐々に加え、母液が薄く濁りはじめたら１０℃以下に保持して結晶を析出させ、結晶化したイクオリンを含む高濃度硫酸アンモニウム水溶液を１０℃以下で保存する。この方法の場合、最低１ヵ年は活性の低下が認められない。
【００２１】
イクオリンについて得られた上述の知見から、イクオリンと同様に微量カルシウムイオンの検出等に使用されているクライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシン、ベルボイン等の発光蛋白質についても、発光量標準物質として使用することができる。
【００２２】
イクオリンを発光蛋白質の代表例とし、実施例にて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
実施例１
高純度イクオリンの製造
１）組換えアポイクオリンの大腸菌での発現
大腸菌においてアポイクオリンを発現させるために、イクオリン遺伝子を包含するｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報）から構築した、アポイクオリン遺伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９７号公報）を用いた。宿主として大腸菌ＷＡ８０２株を使用し、常法によりｐｉＰ−ＨＥで該菌株を形質転換した。得られた形質転換株を３０℃で一晩培養後、アンピシリン（５０μg／ml）を含有する５０mlのＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７.２）に植菌し、さらに３０℃で８時間培養した。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２Ｌに添加し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、菌体と培養液を低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離した。菌体および培養液はともに発現したアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料とした。
【００２４】
２）菌体からのイクオリンの精製
集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（和光純薬社製）２００mgを含む４００mlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液中に懸濁させ、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、上澄み液を集めた。得られた上澄み液に化学合成したセレンテラジンを産生アポイクオリンの１.２倍のモル濃度になるように少量のメタノールに溶かしこみ、４℃で５時間以上放置した。この上澄み液を直ちに、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６の緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２cm×１０cm）に添加してイクオリンを吸着させ、カラムから溶液の２８０nmでの吸光度が０.０５以下になるまで２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７.６でカラムを洗浄した。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオリン画分を０.１Ｍ−ＮａＣｌ〜０.４Ｍ−ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出させた。
【００２５】
再生イクオリンと未再生のアポイクオリンとの分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液を、硫酸アンモニウムの最終濃度が２Ｍになるように調整した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、その上澄み液を、２Ｍ−硫酸アンモニウムを含有する２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６で平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２cm×８cm）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イクオリン画分を収集した。
【００２６】
一方、未再生のアポイクオリンは、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ７.６でのみ溶出された。再生イクオリン画分について、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。その結果、精製画分について分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約８０％で、８０mgの高純度イクオリンを得た。
【００２７】
３）培養液からのイクオリンの精製
培養液からの高純度アポイクオリンの精製は、特開平１−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液に溶解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同様にＱ−セファロ−スカラムクロマト法、ブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、純度９８％以上のイクオリンを取得した。得られた精製イクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、分子量２５kDa蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。得られた高純度アポイクオリン５０mgから高純度イクオリン４５mgを得た。
【００２８】
実施例２
イクオリン変異体の製造
大腸菌においてイクオリン変異体を製造するために、特開昭６１−１３５５８６号公報に記載のｐＡＱ４４０の代わりに特開昭６３−２９１５８６号公報に記載の変異型イクオリン遺伝子を用いて発現ベクターを構築し、上述のｐｉＰ−ＨＥと同様に大腸菌においてイクオリン変異体（本実施例においては代表例として、１４５位、１５２位および１８０位のシステイン残基が全てセリンに置換された変異体）を発現させた。次いで、実施例１と同様に精製した。精製したイクオリン変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示し、その純度は９８％以上であった。
【００２９】
実施例３
イクオリンの純度検定およびイクオリンを用いた発光測定装置の評価
実施例１および２で取得した９８％以上の純度をもつ組換えイクオリン０.００１μgに高濃度のカルシウム溶液を添加し、その全発光量を14Ｃの標準溶液により補正された発光測定装置にて測定し、蛋白質１mgあたりの絶対発光量を算出した。その結果、得られた絶対発光量は、実施例１の天然型イクオリン、実施例２の変異体ともに蛋白質１mgあたり４.８×１０15フォトンであった。また、組換えイクオリン濃度を吸光度法にて測定した結果、吸収スペクトル２８０nmにおける０.０１％（ｗ／ｖ）イクオリンの吸光度は０.３０であった。
【００３０】
次いで、実施例１の組換えイクオリン（１２pg、６０pg、１２０pg、６００pgまたは１２００pg）に高濃度カルシウム溶液を添加し、上述の発光測定装置を用いて、その全発光量を実測値として相対発光量（rlu）を測定した。また、各々の量の組換えイクオリンについて、絶対発光量を蛋白質１mgあたりの絶対発光量４.８×１０15フォトンから求めた。そして、下記の式により、１相対発光量の絶対量を算出した。
１相対発光量の絶対量＝絶対発光量（フォトン）／相対発光量（rlu）
その結果を下記の表に示す。
【００３１】
【表１】
0004501211.tif 000002
【００３２】
表１の結果から、組換えイクオリンの濃度と発光量は直線性を示し、絶対発光量から算出した１相対発光量の絶対量もほぼ一定であった。このようにイクオリンを用いて相対発光量を絶対発光量に変換すれば、他のバッチおよび／または他の測定装置で得られた測定値（相対値）を絶対発光量として評価することができる。
【００３３】
実施例４
＜高純度イクオリンの保存試験＞
実施例１のブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法で得られた高純度イクオリン画分について保存試験を行った結果を下記に示す。
（１）ＥＤＴＡ０.１mMを含む濃度１.０Ｍ以上の硫酸アンモニウム水溶液である実施例１で得られた高純度イクオリン画分を４℃で保存したところ、２ヶ月を超えても活性の低下は認められなかった。
（２）前記の高濃度硫酸アンモニウム溶液を含む高純度イクオリン画分を液体チッソを用い−８０℃で凍結保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかった。
（３）前記の高純度イクオリン画分に対し硫酸アンモニウム濃度が飽和になるように硫酸アンモニウムを添加して高純度イクオリンを塩析沈殿させ、−８０℃で凍結させて保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかった。
（４）前記の高純度イクオリン画分を結晶化のための母液として、それに硫酸アンモニウムを徐々に加え母液が薄く濁りはじめたところで温度を下げ５℃に維持して結晶を析出させた。この結晶化したイクオリンを含む硫酸アンモニウム水溶液をそのまま５℃で保存したところ、保存期間１ヵ年を超えても活性の低下が認められなかった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、放射性同位元素14Ｃの代わりに発光測定装置の検定に用いることができる発光量標準物質が提供される。本発明の発光量標準物質を用いて発光測定装置の検定を実施すれば、各分析・検査において絶対発光量を決定することができ、各バッチ間でのデータおよび／または種々の発光測定装置にて得られるデータ、特に医薬食品関連の分析や検査データを統一的に評価管理することが可能である。
【００３５】
【配列表】
0004501211.tif 000003