(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FIVによる感染に対する治療又は予防のための医薬組成物を調製するためのペプチドの使用であって、該ペプチドは、次の配列番号１：Lys- Lys-Gly-Leu-Gln-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile-Gly- Asn(配列番号１)で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、使用。
【請求項２】
FIVによる感染に対する治療又は予防のための医薬組成物であって、本質的に配列番号１で示されるペプチドからなり、必要に応じて、少なくとも１種の薬学的に許容されるビヒクルと組合せて含むことを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、FIV(ネコ免疫不全ウイルス)のenv遺伝子に由来するペプチド、並びにそれらの免疫防御的使用(ネコ免疫不全の予防および治療)に関する。
【０００２】
ネコ免疫不全は、レンチウイルスであるネコ免疫不全ウイルス(FIV)によるもので、該ウイルスは、霊長類のレンチウイルス(HIVおよびSIV)のものに類似する遺伝子構造を有する。
【０００３】
本出願人の名称での1991年11月20日のヨーロッパ特許出願第0564477号、1993年6月16日のヨーロッパ特許出願第0577458号および1994年6月9日のフランス特許出願第94/07062号に記載されるように、一定の数のフラグメントが選択され、血清陽性の動物を検出するための鋭敏で特異的なテストを開発可能とし、854アミノ酸を含むFIVのEnvタンパク質に殆ど由来し、その配列はヨーロッパ特許出願第0577458号に記載されている。
【０００４】
Envタンパク質は、開裂後に、SU(表面糖タンパク質)およびTM(貫膜糖タンパク質)と称される２つの糖タンパク質フラグメントを生じ、そこでは、FIVsのエンベロープ糖タンパク質の連続的Bエピトープを含み、自然感染の間に認識される９個のドメイン(Pancino G.ら、J. Virol, 1993, 67, 664-672)が確認されている。
【０００５】
これら９個のドメイン中、そのうちの５個(SU1-SU5)は、表面糖タンパク質上に位置し、そのうちの４個(TM1-TM4)は、貫膜糖タンパク質上に位置する。
【０００６】
より詳細には、TMタンパク質中のドメインTM1-TM4の位置は、次の通りである：
−TM1ドメイン(51アミノ酸)は、FIVのEnvタンパク質の595-647位に対応する、
−TM2ドメイン(31アミノ酸)は、FIBVのEnvタンパク質の681-711位に対応する；このドメインは、配列：Cys697-Asn-Gln-Asn-Gln-Phe-Phe-Cys-Lys705(P237と称するペプチド)を含むエピトープを含む、
−TM3ドメイン(45アミノ酸)は、FIVのEnvタンパク質の744-788位に対応する、および
−TM４ドメイン(29アミノ酸)は、FIVのEnvタンパク質の826-854位に対応する。
【０００７】
検出領域では、１セットの試薬が免疫防御分野でFIVを検出するのに現在利用可能であるが、状況はより複雑である。
【０００８】
例えば、TM2ペプチドは、促進化抗体の形成を誘発し得、該抗体は、望まれるものと反対の効果、即ち、防御効果を有する代わりにウイルス感染を増幅する効果を有する。
【０００９】
特に、FIVエンベロープの調製物によるワクチン接種は、ウイルス感染の臨床的な悪化または促進を包含する。
【００１０】
抗体の機能は、培養中の細胞のウイルス感染性の中和化テストにより慣用的に評価されることが通常認識されているけれども、観察される結果は、殆どの中和抗体がエンベロープ糖タンパク質に対するものであるが、レンチウイルス・エンベロープによるワクチン接種が中和抗体の誘発にもかかわらず、実験的感染では好適な防御を得るのを可能としないことを示した(Johnson R.P., Curr. Opinion in Immunol., 1996, 8, 554-560)。
【００１１】
特に、FIVエンベロープ糖タンパク質による免疫化および病原性テストの後で、ウイルス負荷の減少(Hosie M.J.ら, Vaccine, 1996, 14, 405-411)または一次感染の悪化(Siebelink K.H.ら, J. Virol., 1995, 69, 3, 3704-3711)のいずれかがネコで観察された。後者の研究(Siebelink K.H.ら, 1995, 上記)では、FIVによる感染の悪化は、免疫されたネコからの血漿を受動的に転移された動物でも観察される；そのような結果は、それがインビボで観察される感染の増加を誘発している抗体である可能性を示唆する。
【００１２】
FIVエンベロープに対する免疫応答が宿主に有害であるという可能性は、env遺伝子によるワクチン接種実験において、それが感染の促進をもたらすことが本発明者によって確認された。
【００１３】
しかしながら、感染の悪化と抗体の存在との間の因果的関連の存在、および得られた防御の程度と抗体の存在との間の関連の存在の両方とも確立するのは困難であり、レンチウイルス、より詳細にはFIVに関して有効に防御的である組成物を開発するのに遭遇する複雑性を示す。この理由は、HIV-1に感染した患者の血清中の促進化抗体の存在が、特定の研究において、該疾患の進行と相関したことである(Fust G.ら、AIDS, 1994, 8, 603-609,; Hornsy J.ら、, J. Virol., 1990, 64, 1437-1440)。
【００１４】
レンチウイルス感染性を増加させる抗体が、エンベロープ蛋白質のサブユニットでワクチン接種した後に、自然感染の間に得られる防御免疫の程度も減少させ得ることが、特に強力に可能である。
【００１５】
インビトロでウイルス感染を中和する抗体の誘発は、防御免疫を誘発し得る配列を選択する優れた指標としてこれまで考えられてきたけれども、上記の結果は、実際には、中和活性／防御の相関はないことを示す(Matteuci D.ら、J. Virol., 1996, 70, 617-622)。
【００１６】
さらに、活性の測定条件およびテストが為されるウイルスの選択は、結果の解釈に介在する。
【００１７】
特に、言及され得る影響の大きいパラメーターは：残留感染性およびウイルスの継代を測定するのに使用される細胞基質、実験室で適合されたウイルスに関連した一次分離株の使用である。
【００１８】
強い中和力を有し、構造的エピトープに対するモノクローナル抗体の選択は、非連続的エピトープが防御に重要であることを示唆した。しかしながら、ワクチン使用のためのミモトープ(mimotope)の同定および合成は、達成するのが特に困難である。
【００１９】
連続的エピトープを表わすペプチドは、ワクチン目的に全面的に好適である試薬である。最も広く研究されてきたHIV-1の連続的な中和化エピトープは、表面糖タンパク質の主要な中和化ドメイン、V3ドメインである(Goudsmit J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,  85, 4478-4482; Palker T.J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,  85, 1932-1936;  Rusche J.R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 3198-3202)。しかしながら、この領域は高変異性であり、中和は、本質的に同種ウイルスに限定される。
【００２０】
FIVのV3領域に由来するペプチドは、中和抗体を誘発し、免疫されたネコにおいて抗ウイルス防御を誘発しなかった(Lombardi、J. Virol, 1994, 68, 8374-8379)。これは、明らかに、インビトロでの中和が、防御能力を直接的に意味しないことを示す。
【００２１】
レンチウイルス蛋白質に関する免疫系の応答の複雑性および、全ての中和抗体が系統的に防御活性を有するのではないという事実を前提にして、本発明者は、ヨーロッパ特許出願第0577458号に記載されるもののような合成ペプチドを用いてFIVによる感染に対する一定の程度の防御を提供し得る医薬製品を調製すること、およびFIVの一次株を用いた病原性テストに対する一定の程度の防御を誘発し得る新規な合成ペプチドを選択することを自らの目的として設定した；そのような防御は、急性感染の際にウイルス負荷の減少または抑制によって観察される。
【００２２】
本発明の主題は、FIVによる感染に対して一定の程度の防御を誘発し得る医薬製品を調製するための、下記：
−12〜19アミノ酸を含み、その配列は次の配列番号１：Lys-Lys-Gly-Leu-Gln-Gln-Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp-Trp-Val-Gly-Trp-Ile-Gly-Asn(配列番号１)に含まれるペプチド、および
−配列番号１の該配列を含む50以下のアミノ酸を含むペプチド、
からなる群から選択されるペプチドの使用である。
【００２３】
本発明の主題はまた、FIVによる感染に対して一定の程度の防御(予防的または治療的)を誘発し得、それは12〜19アミノ酸を含むペプチドからなる群から選択され、その配列は配列番号１の配列に含まれることを特徴とするペプチドである。
【００２４】
本発明は、特定のアミノ酸が置換、欠失または付加された該ペプチドのアナローグを含み、得られるペプチドは、FIVによる感染に関して、上記のペプチドで得られるものと同じ程度の防御を誘発する。
【００２５】
驚くべきことに、ウイルス負荷の減少または排除は、配列番号１のペプチド、少なくとも12アミノ酸を含むそのフラグメントまたは配列番号１の該配列を含むペプチドによる免疫化の後でのみ、急性感染の間に観察される。
【００２６】
配列番号１の19アミノ酸ペプチドは、TM3-19とも称され、TM3ドメインに対応するペプチドのフラグメントである。
【００２７】
様々な上記のドメイン(SU1-SU5およびTM1-TM4)に対する抗体の機能的活性の系統的な分析は、第３可変領域に位置する単一ドメイン、SU2のみが、培養中の細胞のウイルス感染性を中和する抗体を誘発し得るものであるとの同定を可能にした(de Ronde A.ら、Virology, 1994, 198, 257-264；Lombardi S.ら、J. Virol., 1993, 67, 4742-4749；Richardson J.ら、J. Gen. Virol., 1996, 77, 759-771)。
【００２８】
感染ネコの大部分で認められる３個のドメイン(SU2、SU5およびTM3-19)は、本発明者により免疫原の"候補"として選択された。しかしながら、SU2ドメインは、中和抗体の産生を誘発するけれども、配列番号１の配列を含むフラグメントのみが、該感染に関して有効に防御的である。
【００２９】
驚くべきことに、配列TM3-19またはそれを含む50未満のアミノ酸の配列は、中和抗体の産生を誘発しないけれども、防御活性(予防的および治療的の両方)を有する。
【００３０】
本発明の主題はまた、FIVによる感染に対する免疫防御的および／またはワクチン用組成物であり、それは本質的に、上述のような12〜19アミノ酸を含む少なくとも１種のペプチドからなり、必要に応じて、抗FIV抗体に関して免疫応答性を示し(他のウイルス・サブユニットおよび／または完全なエンベロープ糖タンパク質)、FIV感染に対する一定の程度の防御を誘発し得る他のペプチド、および少なくとも１種の薬学的に許容されるビヒクルと組合せられる、ことを特徴とする。
【００３１】
本発明の主題はまた、FIVによる感染の予防(ワクチン)または治療に使用されるための、上述のような免疫防御的組成物である。
【００３２】
FIVのウイルス負荷の評価および／またはワクチン接種もしくは生物学的サンプル中での治療の有効性のモニタリングは、下記：
(a)分析すべき生物学的サンプルからのウイルスRNAの抽出；
(b)ある範囲のサンプルの調製、それぞれは少なくとも１種の修飾が導入されたgag遺伝子の保存領域から得られる異なる数の競合RNAを含む；
(c)(a)で得られたRNA抽出物を、(b)で得られた範囲の各サンプルと別々に混合すること；
(d)(c)で得られた様々な混合物中に存在するRNAsを逆転写して、対応するcDNAを得ること；
(e)配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号10の配列からなる群から選択されるプライマーを用いる、(d)で得られたcDNAの増幅；
(f)増幅産物の分離、および
(g)比較デンシトメトリーおよび、競合RNAからの産物の密度／初期サンプルに存在する野生型RNAからの産物の密度の比の確立のような、好適な定量分析による初期ウイルスRNAのコピー数を、それぞれの混合物に加えられた競合RNAのコピー数の関数として検出すること、を含む方法によって行なわれ得る。
【００３３】
工程(b)による競合RNAは、前記の修飾が欠失であるときに、
(i)配列番号４および配列番号５の配列のプライマーを用いる、前記保存領域の増幅、
(ii)配列番号６および配列番号５の配列のプライマーを用いる、(i)で得られた産物の3'部分のPCRを介した突然変異誘発による欠失の実施、
(iii)(i)で得られた産物の3'末端部分の、(ii)で得られた欠失を有するフラグメントによる置換、および
(iv)(iii)で得られた最終産物をマトリックスとして用いる、該競合RNAの産生、によって得られる。
【００３４】
前記のアレンジメントに加えて、本発明は、他のアレンジメントも含み、それは下記の説明から明らかになり、本発明の主題であるプロセスを補足する実施例ならびに添付の図面を参照する。
【００３５】
しかしながら、これらの実施例は、純粋に本発明の主題を例示する目的でのみ与えられ、いかなる意味でも本発明の限定を構成するものではないことが、明らかに理解されるべきである。
実施例１：本発明によるペプチドの防御活性を例示するのに使用される材料および方法。
【００３６】
１．組織培養
Crandell'sネコ腎臓線維芽細胞(Crandell's feline kidney cellsまたはCrFK)のクローンID 10(Osborne R., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3641-3645)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FSC)、100IU/mlのペニシリンおよび100μg/ml のストレプトマイシンを補足したDMEM培地(ダルベッコ変法イーグル培地)で培養する。ネコTリンパ細胞系FL-4(Yamamoto J.ら、Intervirology, 1991, 32, 361-375)は、FIVのPetaluma株(Pedersen N.C.ら、Science, 1987, 235, 790-793)により慢性感染されており、FSCおよび上記の抗生物質を補足したRPMI-1640培地(完全RPMI培地)で培養される。
【００３７】
ネコ末梢血単核細胞(またはPBM細胞)を、密度勾配遠心分離によって非感染ネコの血液から単離し、5μg/lのコンカナバリンA、50μMの2-メルカプトエタノール(2-ME)および10mMのHEPESを含む完全RPMI培地中で３日間、活性化する。
【００３８】
２．ウイルス
FIVのPetalumaおよびWo分離株(Pedersen N.C.ら、Science, 1987, 235, 790-793)(Moraillon A.ら、Vet. Microbiol., 1992, 31, 41-54)を、FL-4細胞系の上清から及び感染したネコPBM細胞から、それぞれ得る。Wo分離株を、単核細胞(PBMC)上でのみ、限定された回数の継代に供した。
【００３９】
３．ペプチド
ペプチドは、連続的Bエピトープを含むものとして既に明確にされていた(Pancino G.ら、J. Virol., 1993, 67, 664-672)エンベロープ糖タンパク質ドメイン中に含まれる。
【００４０】
それらは、下記の表に従う配列表に示される配列を有する：
SU2                    配列番号２
SU5                    配列番号３
TM3-19(759-777)        配列番号１
env配列中のこれらのペプチドの位置は、図１に示される。番号付けは、Wo配列(Pancinoら、Virology, 1993, 192, 659-662)中のものに対応する。
【００４１】
４．免疫化および病原性テスト
４ヶ月半齢の４匹のネコの群を、フロイント完全アジュバント中に乳化された120μgのFIVペプチド(KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に結合された約250μgのペプチド)を用いて、皮下に免疫する。
【００４２】
４回繰返す免疫処置は、フロイント不完全アジュバント中で、一般に２−３週の間隔をおいて皮下投与するが、最後の２回の注射の間の間隔は７週間であった。
【００４３】
同じプロトコールによるアジュバントのみの皮下注射に供された４匹のネコを、陰性コントロールとして使用する。
【００４４】
免疫応答の進展を、定期的にモニターする。
【００４５】
ネコを、最終免疫の１週間後に、FIV Wo分離株を10 CID50腹腔内接種することにより病原性テストに供し、1 CID50はネコの50%を感染させ得る用量に対応する。
【００４６】
下記のテストを、各週に採集された血液に対して行なう：CD4+  Tリンパ球のカウント、ウイルスの単離、血漿中のウイルスRNAの測定(競合RT-PCR)および血清学的分析。
【００４７】
ネコを、病原性テストの５週間後に殺す。RNA抽出のために、リンパ器官(脾臓、胸腺、腋窩リンパ節)を回収し、液体窒素中で凍結する。
【００４８】
５．血清学的分析
抗体の産生は、テスト前に、固定化ペプチド(SU2、SU5、TM2またはTM3-19)および免疫沈降を用いてELISAにより評価する。テスト後、血清変換を、固定化エンベロープ・ペプチドおよび組換えFIVカプシド蛋白質を用いて、ELISAによりモニターする。
【００４９】
６．ELISA
免疫原性ドメインSU2およびTM2に対応する固定化エンベロープ・ペプチドを用いた、および固定化された組換えp25蛋白質(FIVカプシド蛋白質)を用いたELISAを、Avrameas A.ら(Res. Virol., 1993, 144, 209-218)に記載されるように行なう。
【００５０】
マイクロプレート(Immunolon II, Dynatech)を、ペプチドに対しては0.5μg／ウェルで、およびp25タンパク質に対しては0.1μg／ウェルでコートする。
【００５１】
テストを２重に行ない、結果を平均値で表す。
【００５２】
テスト前の抗ペプチド力価を、血清の最終希釈の逆数の対数で表し、それは(405nmで)0.1を超える吸光度を示す。
【００５３】
テスト後、エンベロープ・ペプチドおよびp25タンパク質に対する血清変換を、1/25および1/100の血清希釈物でそれぞれ評価する。
【００５４】
(405nmでの)吸光度測定値を、固定化コントロール・ペプチドとの結合によって得られる吸光度測定値を差し引くことによって補正する。
【００５５】
テストを、FIVに感染したネコからの血清の混合物の、FIV貫膜糖タンパク質(TM2)の免疫支配ドメインを示すペプチドとの結合に関して正規化する。(Avrameas A.ら、Res. Virol. , 1993, 144, 209-218)。
【００５６】
７．免疫沈降
テスト日に採集された血清(1/40の希釈で)を、代謝的に標識されたFL-4細胞および、G. Pancinoら(Virology, 1995, 206, 796-806)に記載されるようにFIV Wo株で感染されたネコ単核細胞(PBM細胞)に由来するエンベロープ糖タンパク質を免疫沈降するのに使用する。
【００５７】
８．中和およびウイルス感染性の低下のテスト
CrFKsのFIV Petaluma株による感染を中和する抗体の検出は、既に記載されている(Richardson J.ら、J. Gen. Virol., 1996, 77, 759-771)ように行なう。
【００５８】
ウイルス感染性の低下をテストするために、Wo分離株のストック懸濁液の連続希釈物(1/50、1/100、1/200および1/400)および血清の単一希釈物(1/5)を、50μMの2-MEおよび10mMのHEPESを含む完全RPMI培地中で調製する。
【００５９】
ネコ血清を、等量のウイルス連続希釈物と混合し、100μlの最終体積中で１時間37℃でインキュベートする。
【００６０】
マイトジェンで活性化されたPBM細胞の濃度を、2-ME、HEPESおよび200U/mlの組換えヒトIL-2を含む完全RPMI培地中で４×106／mlに調節する。0.1mlの細胞懸濁液(４×105細胞)を、試験管に加える。
【００６１】
終夜インキュベーション後、0.5mlの完全RPMI培地で細胞を２回洗浄することにより、ウイルス接種物を回収する。
【００６２】
続いて、細胞を、2-ME、HEPESおよび100U/mlのIL-2を含む完全RPMI培地に希釈されたネコ血清0.2mlに再希釈し、次に、96ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに移す。
【００６３】
培地の半分を、感染の４日後に、交換する。
【００６４】
逆転写酵素活性を分析するために、感染の７日後に、10μlのアリコートを回収する。
【００６５】
９．リンパ球サブセットの分析
CD4+ Tリンパ球のカウントは、テスト前に一定間隔で、テスト日に及び、急性感染の間に一定間隔で、行なう。
【００６６】
CD4+ Tリンパ球は、モノクローナル抗体(Clinisciences)を用いて、フローサイトメトリーによりカウントする。
【００６７】
１０．ウイルスの単離
血漿ウイルス血症を、PBM細胞を培養することにより定量する(Ho D.D.ら、N. Engl. J. Med., 1989, 321, 1621-1625)。
【００６８】
感染を、異なる体積の血漿(0.2、2、10、40、200または1000μl)を接種した14日および21日後に得られた培養上清中で、ELISA(Petcheck、IDEXX)によりp25を測定することによって評価する。陽性培養物を与える最終血漿希釈を、限界点として判断する。
【００６９】
血漿ウイルス血症を、血漿のTCID50/ml(→組織培養物の50%を感染し得る用量)として表わす。
【００７０】
１１．RNAの調製
−血漿RNA
血漿を濾過し(0.45μm)、細胞と関連しないRNAを、ウイルスRNAキット(Qiagene)を用いて濾過された血漿から直接抽出し、製造業者の指示に従い、50μlの水に溶出し、続いて、RNAをアリコートに分け、-80℃で貯蔵する。
【００７１】
−組織RNA
凍結された脾臓および胸腺組織を、粉末に粉砕し、組織ホモジナイザー(Ultra-Turrax)を用いて、RNA抽出キット(RNeasy、Qiagene)を加えた溶解用緩衝液中に直ちに分散する。凍結した腋窩リンパ節を、溶解用緩衝液中に直接的に分散し；続いて、RNAを、製造業者の指示に従いRNeasyキットを用いて抽出する。
【００７２】
混入DNAを、DNase１による加水分解によって除去する(RQ1.RNaseを含まないDNase、Promega)。
【００７３】
１２．競合RT-PCR
FIV gag遺伝子の保存領域を、競合RNAの逆転写およびオーバーラッピングPCR増幅のための標的配列として選択する。
【００７４】
天然の標的配列の増幅は、312塩基対の初期産物および165塩基対のオーバーラッピング産物を生じ、FIV 34TF10クローン(Talbott R.L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5743-5747)のヌクレオチド1059-1370およびヌクレオチド1157-1321に対応する。
【００７５】
−分子的構築物
312塩基対の標的配列を、FIV Wo株のgag遺伝子の全てを含むプラスミド(pKSgag)(Pancino G.ら、Virology, 1993, 67, 664-672)を用い、5'プライマーとして標的マトリックスの5'配列およびKpnI部位を含む配列番号４の配列(SKWoG107)、および3'プライマーとして標的マトリックスの3'配列およびXbaI部位を含む配列番号５の配列(RXWoG139)を用いて、下記に概説されるのと同じ条件下で増幅し、欠失によって修飾された配列を得る。
【００７６】
増幅産物を、pBluescript KS+プラスミドの対応する部位にサブクローン化し、このようにしてプラスミドpBSQCgagを生じる。
【００７７】
競合RNAの合成のためのマトリックスを調製するために、PCRにより、31ヌクレオチドはgag配列中で欠失される。
【００７８】
天然配列の3'部分を、天然HindIII部位(ヌクレオチド1241-1246)に相補性であり31ヌクレオチドの不連続を含む5'プライマーSHΔWoG128(配列番号６)、および標的マトリックスの3'配列およびXbaI部位を含む3'プライマーRXWoG139(配列番号５)を用いて、下記の条件下で増幅する：天然配列(10ngのpBSQCgag)を、2.5mMのMgCl2、200μMのdNTP、1×市販緩衝液および2.5UのTaqポリメラーゼ(GibcoBRL)および各プライマー0.2μMを含む最終体積100μl中で増幅する。DNAを、94℃で3分間変性し、30サイクルの増幅(94℃で30秒間／55℃で30秒間／72℃で30秒間)に供し、そして配列番号６および配列番号５の配列に関するプライマーの存在下に72℃で7分間、伸張させる。
【００７９】
増幅産物を、精製し、HindIIIおよびXbaI酵素で消化し、pBSQCgagの対応するフラグメントで置換し、プラスミドpBSQCΔgagを生じる。
【００８０】
−競合RNAの合成
競合RNAを、T3 RNAポリメラーゼ(Promega Geminiキット)を用いて、XbaIにより直線化されたプラスミドpBSQCΔgagの転写産物から合成する。
【００８１】
DNAマトリックスを、RQ1 RNaseを含まないDNase(Promega)を用いて加水分解する。競合RNAを、シリカ(Rneasy、Quagene)上での吸収により精製し、260nmでの吸光度を測定することによって定量する。RNAを、アリコートに分け、-80℃で貯蔵する。
【００８２】
−競合RT-PCR
cDNAを合成するために、2.5μlのウイルスRNAを、競合RNAの異なるコピー数を含む2.5μlと混合する；代表的には、競合RNAの様々なサンプルを、生物学的サンプル中で推定されるコピー数にまたがる、５つの半対数希釈物を用いて調製する。
【００８３】
RNAを、65℃で5分間変性し、直ちに氷上に置く。逆転写のための試薬(15μl)を加える。
【００８４】
最終反応混合物は、0.3U/mlのランダムな６ヌクレオチド(理論的に任意のRNAフラグメントを増幅可能とする６個のランダムに整列したヌクレオチドの配列)(Pharmacia)、0.5mMのdNTP、10mMのDTT、1×市販緩衝液(Gibco BRL)、および100UのSuperscript II(Gibco BRL)を、体積20μl中に含む。
【００８５】
反応は、プライマーのハイブリダイゼーションを促進するために、先ず25℃で10分間、続いて、42℃で50分間行なう。逆転写酵素を、95℃で５分間インキュベーションして不活性化する。
【００８６】
コントロールとして、全てのRNAサンプルも、PCRにより直接的に増幅して、生物学的サンプル中に存在し得る任意のDNAの完全な除去をチェックする。
【００８７】
高度に保存された配列を、プライマーとして選択する。相補性DNAを、下記：
・外部プライマーとして；
SWoG107 5'-CAATATGTAGCACTTGACCCAAAAAT-3' (1059-1084；配列番号７)およびRWoG139 5'-TCTTGCTTCTGCTTGTTGTTCTTGAG-3' (1370-1345；配列番号８)、並びに
内部プライマーとして；
SWoG116 5'-CTCTGCAAATTTAACACCTACTGACA-3' (1157-1182；配列番号９)およびRWoG133 5'-GCTGCAGTAAAATAGGGTAATGGTCT-3' (1321-1296；配列番号１０)
を用いて、オーバーラッピングPCRによって増幅する。
【００８８】
第１増幅のために、PCR試薬(80μl)を、20μlのcDNAとの混合物として加える。
【００８９】
より詳細には、反応混合物は：200μMのdNTP、1.5mMのMgCl2、0.1μMの各外部プライマー、0.8×市販緩衝液(Gibco BRL)、および0.25UのTaqポリメラーゼを含む。
【００９０】
DNAを、94℃で3分間変性し、28サイクルの増幅(94℃で30秒間／55℃で30秒間／72℃で30秒間)および72℃で7分間の伸張に供する。
【００９１】
オーバーラッピング増幅のために、第１増幅の産物2μlを、200μMのdNTP、1.5mMのMgCl2、0.5μMの各外部プライマー、１×市販緩衝液(Gibco BRL)、および0.25UのTaqポリメラーゼ(Gibco BRL)を含む98μlの反応混合物に移す。
【００９２】
DNAを、94℃で3分間変性し、28サイクルの増幅(94℃で30秒間／52℃で30秒間／72℃で30秒間)および72℃で7分間の伸張に供する。
【００９３】
−分析
増幅産物(10μl)を、2.75%アガロースゲル上での電気泳動に供する。
【００９４】
臭化エチジウムで染色したゲルのデジタル画像を、Appligene Imagerを用いて得、デンシトメトリー分析をImage NIHソフトウェアを用いて行なう。競合産物の密度を、天然配列の長さと競合配列の長さとの差の関数として調節する。
【００９５】
競合産物の密度／天然産物の密度の比の対数を、それぞれの反応に加えた競合RNAのコピー数の対数の関数としてプロットする。
【００９６】
最良の調節は、最小自乗法により決定し、天然RNAのコピー数は、Xs軸の交差に対応する(Piatak M. Jr.ら、Biotechniques, 1993, 14, 70-80)。
【００９７】
１３．統計学的分析
曲線の下の累積面積(Dawson J., Drug Information J., 1994, 28, 723-732)を、ウイルスRNAのコピー／血漿ml／時間の比を示すグラフから計算し、Mann-Whitney検定と比較する。
【００９８】
実施例２：TM3-19で得られる体液性応答およびその防御効果の評価
１．エンベロープ・ペプチドへの体液性応答の発生
FIVによる一次感染の間のエンベロープ糖タンパク質の特定のドメインに関する体液性免疫の効果を評価するために、ネコを、自然感染の間に認められる連続的Bエピトープを含むエンベロープ・ドメインに対応するペプチド(図１)で免疫する。
【００９９】
免疫されたネコの全ては、免疫原として使用されたエンベロープ・ペプチドを用いてELISAで測定されるように、強力な抗体反応を示す。
【０１００】
これらのELISAアッセイの結果は、下記の表Ｉに要約される。
【０１０１】
【表１】
0004477770.tif 000002
【０１０２】
ａ：405nmでの吸光度が0.1より大きい血清の最終希釈の逆数の対数として表される力価。
ｂ：代謝標識したFL-4細胞(SU2およびSU5群)または感染されたPBM細胞(TM3-19群)を用いた、エンベロープ糖タンパク質の免疫沈降。
【０１０３】
テスト日に、血清希釈の逆数の対数として表される力価は、4.40〜5.61である。
【０１０４】
エンベロープ糖タンパク質の認識は、表Ｉに要約されるように、テスト日に採集された血清を用いた、生合成的に標識されたエンベロープ糖タンパク質の免疫沈降によって評価される。
【０１０５】
SU5ペプチドで免疫された全てのネコおよびSU2ペプチドで免疫された４匹のネコのうち３匹(324、325および327)からの血清は、慢性感染されたFL-4細胞のライゼートから得られたPetaluma株のエンベロープ糖タンパク質を免疫沈降する。
【０１０６】
FIV Wo株のEnv配列から推測されるTM3-19ペプチドが、Petaluma配列と比較して、19のうち４個の異なる残基を含む場合、TM3-19ペプチドで免疫されたネコのテスト前の血清を免疫沈降する能力を、FIV Wo株で急性感染後のPBM細胞ライゼートから得たWo株のエンベロープ糖タンパク質に対してテストした。
【０１０７】
TM3-19ペプチドで免疫された２匹のネコ(346、347)の血清のみ、Wo株のエンベロープ蛋白質を沈降するが、ウイルス・エンベロープの免疫沈降は、慢性感染したリンパ芽球細胞系を用いるよりも、急性感染したPBM細胞を用いると、より有効性が低い。
【０１０８】
２．生物学的テストにおけるエンベロープ・ペプチドに対する抗体の活性
抗体の機能を評価するために、SU2ペプチドに対するネコ血清を、FIV Petaluma株によるCrFK細胞の感染に関して、それらの中和値をテストする。
【０１０９】
SU2ペプチドで免疫した１匹のネコ(327)のみ、中和抗体を発生する：感染を少なくとも50%減少させる最終希釈は、1/160である。
【０１１０】
SU5およびTM3-19ペプチドで免疫されたネコからの血清は、FIV Petaluma株を中和しない(CrFK細胞系における測定)。
【０１１１】
特にTM3ドメインにおける、PetalumaおよびWo株に関するエンベロープ糖タンパク質の配列の多様性のために、抗体の機能的活性も、同種テストで研究された。
【０１１２】
Wo株は、CrFK細胞上での継代によって適合されなかった場合、抗体の影響は、ネコPBMC細胞における感染について研究された。
【０１１３】
マイトジェンで活性化されたPBMC細胞を用いた感染性の低下のテストにおいて、SU2およびTM3-19ペプチドに対する血清は、SU2ペプチドに対する血清の１つに関して観察された中和活性にもかかわらず、CrFK細胞が細胞基質として使用されるとき、FIV Woによる感染を修飾しない。
【０１１４】
３．病原性テスト後のFIVの分離
テスト後、テストから２および３週間後に採集される血漿を接種した後で、全てのネコを、PBM細胞中のFIVウイルスの分離により測定されるように感染させる。
【０１１５】
４．病原性テスト後の血清変換
FIV Wo株を用いたテスト後、殆どのネコは、外部および貫膜糖タンパク質に由来するSU2およびTM2ペプチドそれぞれ、ならびに組換えカプシド蛋白質を用いたELISAによって例示されるように、ウイルス成分に関する体液性応答を示す。
【０１１６】
結果を、下記の表IIに示す。
【０１１７】
【表２】
0004477770.tif 000003
【０１１８】
a SU2およびTM2エンベロープ・ペプチド、ならびにp25組換えFIVカプシド蛋白質を、1/25(ペプチド)および1/100(p25)の連続希釈物として用いて行なわれたELISAによって得られたデータ；これらのデータは、光学密度として表される(実施例１を参照)；
b データは、SU2でワクチン接種されたネコの群(病原性テスト前に血清陽性)に関しては示していない。
【０１１９】
抗ウイルス体液性応答の発生は、この群の最後のネコ(347)は強力で迅速な抗体反応を発生したが、コントロールのネコの応答と比較して、TM3-19ペプチドで免疫した３匹のネコ(346、348、349)において、より弱く遅延している。
【０１２０】
テストの５週間後、コントロールのネコは検出可能な応答を示すが、TM3-19ペプチドで免疫されたネコのいずれも、SU2ペプチドに関して検出可能な抗体応答を発生しなかった。
【０１２１】
４週間目に、SU2およびSU5ペプチドで免疫されたネコの殆ど(11/12)およびアジュバントのみを受けたネコが、TM2ペプチドに対する大きな応答を発生したが、TM3-19ペプチドで免疫したネコのうち１匹(347)を除く全てが、弱いか又は検出不可能な応答を示す。
【０１２２】
５週間後、全てのコントロールのネコがp25タンパク質に良く応答するが、TM3-19ペプチドで免疫された１匹のネコ(348)は応答せず、他の３匹のうちの２匹(346、349)は弱い応答のみを発生する。
【０１２３】
５．急性感染の間の血液学的修飾
一次感染に関連する病理に対する免疫化の効果を評価するために、循環CD4+リンパ球を、FIV Wo株によるテストの前後にカウントする。
【０１２４】
CD4+リンパ球の数を、図２に例示する。
【０１２５】
傾向は、個々の異質性によってマスクされるが、SU2およびSU5ペプチドで免疫されたネコの殆どおよびアジュバントのみを受けたネコは、感染後にCD4+リンパ球数に除々の減少を示す(図２)。
【０１２６】
一定の程度の変動にもかかわらず、CD4+リンパ球の数は、TM3-19群のネコにおける急性感染の間に、他の群で観察されるもののような大きな減少を示さない(図２)。
【０１２７】
６．RT-PCRにより測定される血漿ウイルス負荷
エンベロープ糖タンパク質の１ドメインのみでのワクチン接種により好適な免疫を得ることが期待され得なかった場合には、特に大きな重要性を有するのであるが、ウイルス伝播の適度の減少を検出可能とさせるウイルス負荷を評価する定量的方法を開発することが必要であった。
【０１２８】
従って、本発明者は、血漿および組織中のウイルスRNAの定量的測定を可能にする競合RT-PCRを開発した。
【０１２９】
このテストは、反応の間に、RNAの10コピーの検出を可能にし、それは、ウイルスRNAが140μlの血漿から抽出されるとき、1430コピーのRNA／血漿mlという検出のより低い限界を確立する。
【０１３０】
Wo分離株の10 CID50を用いたテスト後、ウイルスRNAは、感染の２週間後に、RT-PCRにより血漿中で検出し得る。
【０１３１】
アジュバントのみを受けたネコでは、ウイルスRNAのコピー数のピークは、３週間で観察され、それは、2.5×109コピー/血漿mlまで観察され得る(図３)。
【０１３２】
中和抗体を誘発することが公知であるドメインSU2に対する抗体のテスト前の存在は、一次感染の経過を修飾するようには見えない。
【０１３３】
SU5ペプチドで免疫したネコの間では、３匹のネコの急性感染は、コントロール・ネコのものと類似の動態をたどったが、ネコの中の１匹での感染は、遅延した様式であるように見える。
【０１３４】
TM3-19ペプチドで免疫したネコにおける感染の経過は、一般に、コントロール・ネコで観察されるものと異なる。
【０１３５】
ネコのうちの１匹(347)での感染は、迅速に見えるが、この群の他の３匹のネコでの感染は、遅延した様式であるように見える。
【０１３６】
さらに、測定期間中の、ネコの１匹(348)において、血漿ウイルス血症を検出するのは可能でなかった。
【０１３７】
TM3-19ペプチドで免疫したネコで観察されたウイルスRNAのコピー数は、3.1×106コピー/mlを決して超えず、それは、コントロール・ネコ群で観察されるウイルス血症に対して、有意な減少を示す。
【０１３８】
これらのデータを、テストの３および４週間後に、累積曲線(Dawson J.D.、Drug Information J., 1994, 28, 723-732)の下の面積を比較して、分析した。
【０１３９】
Mann-Whitney検定によると、TM3-19ペプチドで免疫したネコで観察されるウイルス負荷の、コントロール・ネコに比較した減少は、３および４週間目とも有意である(p=0.02)。
【０１４０】
７．血漿ウイルス血症
TM3-19ペプチドで免疫したネコおよびコントロール・ネコに関して、テストの３週間後にウイルスを分離することにより、血漿ウイルス負荷を評価する。
【０１４１】
競合RT-PCRにより測定されるウイルスRNAのコピー数を、PBM細胞を培養することにより測定される血漿ウイルス血症と比較する。
【０１４２】
結果を、下記の表IIIに示す。
【０１４３】
【表３】
0004477770.tif 000004
【０１４４】
α：血漿ウイルス血症を、競合RT-PCRにより測定し、ウイルスRNAのコピー数／血漿mlとして表す。
β：血漿ウイルス血症をPBM細胞を培養することにより測定し、TCID50／血漿mlとして表す。
【０１４５】
病原性テスト前のTM3-19ペプチドによる免疫化は、ネコの４分の３において、一次感染の経過の非常に初期に、血漿中の感染性ウイルスのレベルに大きな減少(約３ログ)をもたらす。
【０１４６】
これらのデータは、TM3-19ペプチドで免疫されたネコに関して観察されたウイルスRNAの減少したレベルが、コントロール・ネコで得られるものと比較して、感染性ウイルスの血漿力価の減少を明確に反映することを確認する。
【０１４７】
８．競合RT-PCRで測定される組織中のウイルス負荷
組織中のウイルス負荷を、テストの５週間後に、腋窩リンパ節におけるウイルスRNAのコピー数をカウントすることにより、及び胸腺における競合RT-PCRにより評価する。
【０１４８】
増幅されたフラグメント(アンプリコン)が、亜ゲノムウイルスRNAのイントロン中に位置する場合、組織中でカウントされたウイルスRNAのコピーは、完全な転写物を示し、それは、細胞内にあるか又は細胞外ウイルス粒子中でカプシドに包まれるかのいずれかである。
【０１４９】
ウイルスRNAは、検査された組織全て及び全てのネコで検出される(図４)。
【０１５０】
腋窩リンパ節中のウイルスRNAのレベルは、TM3-19ペプチドで免疫された３匹のネコ(346、348および349)において、SU2およびSU5ペプチドで免疫されたネコおよびコントロール・ネコよりも低い。
【０１５１】
脾臓では、ウイルスRNAのレベルは、TM3-19ペプチドで免疫された１匹のネコ(348)において、特に低い。
【０１５２】
しかしながら、胸腺では、ウイルス負荷は、４群のネコで同様であり、一般に、それは検査された他の組織においてより高い。
【０１５３】
感染の初期の段階での胸腺における高いウイルス負荷は、in situハイブリダイゼーション(Beebe A.M.ら、J. Virol., 1994, 68, 3080-3091)によっても観察された。
【０１５４】
胸腺の明らかな、より大きい感染が、(i)感染の開始時に優先的に感染された細胞におけるその豊富さ、(ii)ウイルス粒子をトラップする大きい能力、または(iii)コロニー形成の連続的性質(急性感染の消退前に検査された組織)を反映するかどうか、知ることは可能でない。
【０１５５】
これらの結果は、表面糖タンパク質(SU2およびSU5)に由来する２つのペプチドによる免疫化が感染の経過を修飾しないけれども、貫膜糖タンパク質の細胞外膜近位ドメインに由来するTM3-19ペプチドによる免疫化が、ウイルス播種を有意に遅延することを示す。
【０１５６】
これらの結果は、インビトロでウイルス感染を中和する抗体の誘発が、所望の免疫防御との優れた相関関係を必ずしも有しないことも示す。
【０１５７】
特に、中和活性／防御の相関関係は、測定された活性が、使用されたテストの条件、およびより詳細には残留感染性を測定するのに使用される細胞基質に依存する場合に特に問題となる。
【０１５８】
事実の点からすると、一次レンチウイルス分離株の中和は、細胞培養物中の増殖に適合したウイルスの中和と基本的に異なる。
【０１５９】
本発明によるペプチドで得られた結果は、それらが、感染を有意に遅延させることも示す。
【０１６０】
上述の開示から明らかであるように、本発明は、より詳細に記載された実施、調製または用途のその様式をいかなる意味でも限定せず、反対に、それは本発明の文脈または範囲から逸脱することなく、当業者に生じ得る任意の変異を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、FIVの表面(SU)および貫膜(TM)エンベロープ糖タンパク質の図式的表示である。ペプチドSU2、SU5およびTM3-19(黒四角)を、免疫原として使用する。シグナルペプチド(◆)を除去し、成熟エンベロープ糖タンパク質を生じるタンパク質分解性開裂部位(↓)が示されている。位置は、野生型株Woのエンベロープ糖タンパク質のものに対応する。ゾーン-□-は、膜間ドメインに対応する；ゾーン-□-は、シグナルペプチドに対応する。
【図２】  図２は、リンパ球サブセットの分析に対応する。循環CD4+リンパ球の数は、免疫化の際、および病原性テスト後、急性感染の際に、平均値の形態で表わされる。
【図３】  図３は、一次感染の際の血漿中のウイルス負荷を示す。RT-PCRによって測定されるウイルス負荷は、日数(x軸)の関数として、ウイルスRNAのコピー数／血漿ml(y軸)により表される。不連続ハイフンのラインは、ウイルスRNAが検出されるけれども、30未満のコピー／反応の値で存在する血漿に対応する（×8580コピー/血漿ml）；点線は、検出閾値に対応する(×2860コピー/血漿ml)。
【図４】  図４は、組織中のウイルス負荷を示す。それは、それぞれのネコについて、ウイルスRNAのコピー数／RNAのトータルμg(y軸)として表される。それは、RT-PCRで測定される。得られた結果を、腋窩節(黒四角)、脾臓(□)および胸腺(□)に関して示す。
【配列表】
0004477770.tif 000005
0004477770.tif 000006
【図１】
0004477770.tif 000007
【図２】
0004477770.tif 000008
【図３】
0004477770.tif 000009
【図４】
0004477770.tif 000010