(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス（Bacillus）由来の親α−アミラーゼの変異体であって、増加した安定性を有し、そして配列番号：４の番号付けを用いて、
K176R＋I201F＋H205N＋E376K＋A420R；
K176R＋I201F＋H205N＋S417T＋A420Q；
K176R＋I201F＋H205N＋S356A＋Y358F；
からなる群から選択される変異を含む変異体。
【請求項２】
前記親α−アミラーゼが、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、又はバチルス・スペーシス（Bacillus sp.） NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513もしくはDSM 9375 の菌株に由来する請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記親α−アミラーゼが、配列番号： 12 の核酸配列と、高いストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる請求項１又は２に記載の変異体。
【請求項４】
前記親α−アミラーゼが、バチルス（Bacillus）α−アミラーゼのハイブリッドであり、当該ハイブリッドのアミノ酸配列が、配列番号：５に示すバスルス・アミロリクエファシエンスα−アミラーゼのＮ−末端の33アミノ酸によりＮ−末端の35アミノ酸が置換されている点を除き配列番号：４のバシルス・リケニホルメスα−アミラーゼと同一であり、且つ配列番号：４の番号付けを用いてH156Y＋181T＋190F＋209V＋264Sの変異を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項５】
pH 5.0、５ ppmのカルシウム、95℃において増加した安定性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列を含むDNA構築物。
【請求項７】
請求項６に記載のDNA構築物を有する組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のDNA構築物又は請求項７に記載のベクターによって形質転換された細胞。
【請求項９】
微生物である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）, バチルス・ラウトス（Bacillus lautus）及びバチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）からなる群から選択されるグラム陽性細菌である請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体を含む洗剤添加物。
【請求項１２】
さらに、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他の澱粉分解酵素及びセルラーゼからなる群から選択される別の酵素を含む請求項11に記載の洗剤添加物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体を含む洗剤組成物。
【請求項１４】
さらに、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他の澱粉分解酵素及びセルラーゼからなる群から選択される別の酵素を含む請求項13に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体を含む手動又は自動食器洗浄洗剤組成物。
【請求項１６】
さらに、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別の澱粉分解酵素及びセルラーゼからなる群から選択される別の酵素を含む請求項15に記載の食器洗浄洗剤組成物。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体を含む手動又は自動洗濯洗浄組成物。
【請求項１８】
さらに、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別の澱粉分解酵素及びセルラーゼからなる群から選択される別の酵素を含む請求項17に記載の洗濯洗浄組成物。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体の、洗濯及び／又は食器洗浄のため、織物のサイズ剤除去のための使用。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ変異体の、澱粉液化のための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、親のα−アミラーゼと比べて変更された特性を有する親ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの新規な変異体に関する。上記特性には、例えば酸性pH、例えば低カルシウム濃度および／または高い温度での酸性pHにおける安定性の向上が含まれる。このような変異体は多くの用途、特に工業的なデンプン加工（例えばデンプンの液化または糖化）に適している。
【０００２】
（発明の背景）
α−アミラーゼ類（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ類、ＥＣ  ３．２．１．１）は、デンプンおよびその他の直鎖状および分枝状１，４−グルコシドのオリゴ糖類と多糖類の加水分解を触媒する一群の酵素を構成する。
この工業的にきわめて重要な種類の酵素に関しては、きわめて多数の特許および科学文献がある。ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの変異体など複数のα−アミラーゼが、国際公開第90/11352号、第95/10603号、第95/26397号、第96/23873号、および第96/23874号により知られている。
【０００３】
国際公開第96/23874号は、バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）のα−アミラーゼの300個のＮ末端アミノ酸残基、およびアミノ酸配列を備えるバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼのＣ末端のアミノ酸301〜483からなるターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼ（後者は商品名ターマミル（Termamyl)(商標）で市販されている）に関する三次元Ｘ線結晶構造データを提供し、したがってそれは工業的に重要なバチルス（Bacillus）のα−アミラーゼ（これはこの文脈中では用語「ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼ」の意味の中に含まれ、
【０００４】
それには特にバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）、およびバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のα−アミラーゼが含まれる）と密接に関係している。さらに国際公開第96/23874号には、親ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの構造分析に基づいて、親と比べて変った特性を示す親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの変異体を設計する方法が記載されている。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの新規なα−デンプン分解変異体（突然変異体）、特に米国特許第3,912,590号および欧州特許公開第252,730号と第63,909号に記載のように、例えばデンプンの工業的加工（デンプンの液化または糖化など）に関して有利な、高温時の酸性pHで向上した安定性を示す（親に比べて）変異体に関する。
【０００６】
デンプンの転換：
デンプンを糖または脂肪代替物などの低分子量の炭水化物成分に分解する「伝統的な」デンプン転換法には枝切りのステップが含まれる。
「デンプンの糖への」転換：
デンプンを糖へ転換する場合、デンプンは解重合される。このような解重合プロセスは、前処理段階と、２または３の連続したプロセス段階、すなわち液化プロセス、糖化プロセス、および所望の最終製品次第では任意選択で異性化プロセスとからなる。
【０００７】
天然のデンプンの前処理：
天然のデンプンは室温で水に不溶の微視的顆粒からなる。水性のデンプンのスラリーを加熱すると、顆粒は膨潤し、最終的には壊れ、デンプン分子が分散して溶液となる。この「のり化」プロセスの間で粘度の劇的な増加がある。一般に工業的なプロセスでは固形物のレベルは30〜40％であるので、デンプンは取扱いが可能なように薄めた、すなわち「液状」であらねばならない。この粘度の低下は現在ではたいてい酵素分解により得られる。
【０００８】
液化：
液化プロセスの間に長鎖のデンプンは、α−アミラーゼ（例えば本明細書のターマミル（Termamyl)(商標）、配列番号：４）により分枝状または直鎖状の短い単位（マルトデキストリン）に分解される。この液化プロセスは105℃〜110℃で５から10分間、続いて95℃で１〜２時間行なわれる。pHは5.5と6.2の間にある。これらの条件下で最適な酵素の安定性を保証するために、カルシウム１mM（遊離カルシウムイオン40ppm）が加えられる。この処理の後、液化したデンプンは「デキストロース当量」（DE）10〜15を有することになる。
【０００９】
糖化：
液化プロセスの後、マルトデキストリンはグルコアミラーゼ（例えばAMG（商標））と、イソアミラーゼ（米国特許第4,335,208号）またはプルラナーゼ（例えばPromozyme（商標）、米国特許第4,560,651号）などの枝切り酵素とを添加することによりデキストロースに転換される。このステップの前にpHを4.5未満の値まで下げ、枝切り酵素で適正に加水分解することができない「パノース前駆物質」と呼ばれる短いオリゴ糖の形成を低減させるために高温（95℃を超える）を維持して液状化するα−アミラーゼを不活性化させる。
【００１０】
温度を60℃まで下げ、グルコアミラーゼおよび枝切り酵素を加える。糖化プロセスは24〜72時間進行する。
通常、液化のステップの後にα−アミラーゼを変性する場合、糖化生成物の約0.2〜0.5％がプルラナーゼにより分解できない分枝した三糖の６2−α−グルコシルマルトース（パノース）である。もし液化のステップ由来の活性なアミラーゼが糖化の間ずっと存在する（すなわち変性しない）ならば、このレベルが１〜２％ほどに高くなる可能性があり、糖化の収率を著しく下げるのできわめて望ましくない。
【００１１】
異性化：
所望の最終の糖生成物が、例えば高フルクトース・シロップである場合には、デキストロース・シロップをフルクトースに転換することができる。糖化プロセスの後、pHを６〜８の範囲の値、好ましくはpH7.5まで上げ、カルシウムをイオン交換により除去する。次いでデキストロース・シロップを、例えば固定化グルコースイソメラーゼ（Sweetzyme（商標）など）を用いて高フルクトース・シロップに転換する。
本発明の文脈中における用語「酸性pH」とは、7.0未満のpH、特に工業的なデンプン液化プロセスが前述のように伝統に基づいて行なわれる場合のpH範囲未満を意味し、それはpH5.5と6.2の間にある。
【００１２】
本発明の文脈中における用語「低カルシウム濃度」とは、カルシウムが０ppmと40ppmの間、好ましくは15ppmと25ppmの間などの10ppmと30ppmの間にあるような伝統的な工業的なデンプン液化プロセスに用いられる通常レベル未満の濃度を意味する。通常の濃度はトウモロコシ中の遊離Ca2+の濃度次第で変わる。通常、１mM（40ppm）に相当する適量が加え、トウモロコシ中のレベルと共に40ppmと60ppmの間の遊離Ca2+を付与する。
【００１３】
本発明の文脈中における用語「高温」とは、95℃と160℃の間、特に工業的なデンプン液化プロセスが通常行なわれる95℃と105℃の温度範囲を意味する。
本発明はさらに、本発明の変異体をコードするDNA構築物、本発明の変異体の調製方法、およびさまざまな工業的プロセス、特にデンプンの液化において単独または他のα−デンプン分解酵素と組み合わせた本発明の変異体の使用方法に関する。
【００１４】
命名法：
本明細書および特許請求の範囲においては、アミノ酸残基に対して従来の１字および３字のコードを用いる。参照しやすいように本発明のα−アミラーゼの変異体は下記の命名法を用いて記述する。
元のアミノ酸：位置：置換したアミノ酸
この命名法によれば、例えばアラニンを30位でアスパラギンと置換することは、
Ala30Asn、またはA30N
として示され、同じ位置におけるアラニンの欠失は、
Ala30*、またはA30*
として示され、リジンなどの付加アミノ酸残基の挿入は、
Ala30AlaLys、またはA30AK
として示される。
【００１５】
アミノ酸残基30〜33などのアミノ酸残基の連続的範囲の欠失は（30〜33）＊またはΔ（A30〜N33）として表示される。
特定のα−アミラーゼが他のα−アミラーゼと比較して「欠失」を含み、そのような位置に挿入がなされるとき、36位にアスパラギン酸を挿入する場合、それは
*36Asp、または*36D
として表示される。
【００１６】
多重突然変異はプラス記号により区別される。すなわち
Ala30Asp+Glu34Ser、またはA39N+E34S
は30位および34位においてアラニンおよびグルタミン酸をそれぞれアスパラギンおよびセリンと置換する突然変異を表す。多重突然変異はまた下記のように区別することができる。すなわち
Ala30Asp/Glu34Ser、またはA30N/E34S
はプラス記号と同じことを意味する。
【００１７】
１または複数の別のアミノ酸残基を所与の位置に挿入することができる場合、それは
A30N，Ｅ、または
A30NまたはA30E
として表示される。
【００１８】
さらに修飾に適した位置が、具体的な修飾が提案されることなくその中で同定された場合、任意のアミノ酸残基をその位置に存在するアミノ酸残基と置換することができることは言うまでもない。したがって、例えば30位のアラニンの修飾について言及されるが細かく指定されない場合、そのアラニンは欠失または任意の他のアミノ酸、すなわちＲ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか一つと置換することができることは言うまでもない。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼ：
バチルス・スペーシス（Bacillus spp.）により産生される複数のα−アミラーゼはアミノ酸レベルに関して高い相同性をもつことはよく知られている。例えば配列番号：４で示されるアミノ酸配列を備えるバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼ（ターマミル（Termamyl)(商標）として市販されている）は、配列番号：５で示されるアミノ酸配列を備えるバチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）のα−アミラーゼと約89％相同であり、また配列番号：３で示されるアミノ酸配列を備えるバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のα−アミラーゼと約79％相同であることが分かっている。
【００２０】
さらに、相同のα−アミラーゼには、バチルス・スペーシス（Bacillus sp.）の株NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513、またはDSM9375から誘導されるα−アミラーゼがあり、これらは全て国際公開第95/26397号に詳細に記載されており、またα−アミラーゼについてはTsukamoto等の論文、Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp.25〜31に記載されている。
【００２１】
さらに、相同のα−アミラーゼには欧州特許公開第0252666号に記載のバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）株（ATCC27811）により産生されたα−アミラーゼ、および国際公開第91/00353号と国際公開第94/18314号において同定されているα−アミラーゼがある。その他市販のターマミル（Termamyl）様のバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼは、Optitherm（商標）およびTakatherm（商標）（Solvay社から入手できる）、Maxamyl（商標）（Gist-brocades/Genencor社から入手できる）、Spezym AA（商標）およびSpezyme Delta AA（商標）（Genencor社から入手できる）、ならびにKeistase（商標）（Daiwa社から入手できる）である。
【００２２】
これらのα−アミラーゼの間に見出される実質的な相同性の故に、これらは同じ綱のα−アミラーゼ、すなわち「ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼ」の綱に属すると考えられる。
したがって、本明細書の文脈における用語「ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼ」は、アミノ酸レベルでターマミル（Termamyl）（商標）、すなわち本明細書において配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有するバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼと実質的な相同性を示すα−アミラーゼを指すことを意図している。換言すればターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼは、本明細書で配列番号：１、２、３、４、５、６、７、または８で示されるアミノ酸配列、および
【００２３】
国際公開第95/26397号の配列番号：１（本明細書において配列番号：７として示されるアミノ酸配列と同じもの）で示される；または国際公開第95/26397号の配列番号：２（本明細書において配列番号：８として示されるアミノ酸配列と同じもの）で示される；またはTsukamoto等の1988年の論文（そのアミノ酸配列は本明細書においては配列番号：６で示される）で示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼ、あるいは
【００２４】
ｉ）配列番号：１、２、３、４、５、６、７、または８で示された前述のアミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも60％の相同性（アイデンティティー）を示す、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも97％、特に好ましくは少なくとも99％の相同性を示す、
および／またはii）前述の１または複数のα−アミラーゼに対して高められた抗体と免疫的交差反応性を示す、
【００２５】
および／またはiii）低い緊縮条件下からきわめて高い緊縮条件下（これら条件については下記に述べる）で、本願のそれぞれ配列番号：９、10、11、12、および25（本明細書ではこれはそれぞれ配列番号：１、２、３、４、および５で示されるアミノ酸配列をコードする）から；また国際公開第95/26397号の配列番号：４（そのDNA配列は終止コドンTAAと共に本明細書の配列番号：13に示され、本明細書の配列番号：８に示されたアミノ酸配列をコードする）から；また国際公開第95/26397号の配列番号：５（本明細書の配列番号：14に示される）から；それぞれ明らかな上記で指定されたα−アミラーゼをコードするDNA配列へ雑種形成するDNA配列によりコードされる、
アミノ酸配列を有するα−アミラーゼである。
【００２６】
特性ｉ）と関連して「相同性」（アイデンティティー）は、任意の従来のアルゴリズムを使用することにより、好ましくはギャップ・ペナルティに対するデフォルト値、すなわちギャップ生成ペナルティー3.0とギャップ拡張ペナルティー0.1を用いるGCGパッケージのバージョン８（1994年８月）のギャップ・プログラム（Genetic Computer Group (1991）のGCGパッケージ、バージョン８、575用のプログラムマニュアル；Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）を使用することにより判定することができる。
【００２７】
一実施例において、親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの骨格は、上記のように判定される配列番号：４に対するアイデンティティーの程度が少なくとも65％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、さらに好ましくは少なくとも約90％、さらに好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも99％のアイデンティティーをもつアミノ酸配列を有する。
【００２８】
ターマミル（Termamyl）（商標）（配列番号：４）とターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの間の構造的位置関係を、別のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの同等／対応位置を同定するために用いることができる。前述の構造的配列を得るための一つの方法は、ギャップ・ペナルティのデフォルト値、すなわちギャップ生成ペナルティー3.0とギャップ拡張ペナルティー0.1を用いるGCGパッケージのパイルアップ・プログラムを使用することである。
【００２９】
別の構造配列法には、疎水性クラスター分析（Gaboriaud等の論文（1987）、FEBS LRTTERS 224, pp.149〜155）および逆曳糸法（reverse threading）（Huber，ＴおよびTorda，AEの論文、PROTEIN SCIENCE Vol.7, No.1, pp.142〜149, 1998) がある。
例えば、すでに述べた複数のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼのアミノ酸配列においてバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼのＣドメイン中に見出される標的の残基の対応位置は下記の通りである。
【００３０】
【表１】
0004550285.tif 000002
さらに下記に記載のように、これらの保存されたアミノ酸残基の突然変異は、高温時の酸性pHおよび／または低カルシウム濃度における安定性を増すことと関連してきわめて重要である。
【００３１】
α−アミラーゼの特性ii）（上記参照）、すなわち免疫交差反応性は、関連するターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの少なくとも１つのエピトープに対して高められた抗体、またはそれと反応する抗体を用いて検定することができる。この抗体は単クローン性または多クローン性のいずれであってもよく、当業界で周知の方法、例えばHudson等の著書、Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publicationsに記述されているような方法により産生することができる。
【００３２】
免疫交差反応性は、当業界で周知の検定法を用いて判定することができ、その例には例えばHudson等（1989）により記述されたようなウェスタンブロットまたは放射免疫拡散検定がある。この点では、それぞれアミノ酸配列配列番号：１、２、３、４、５、６、７、または８を有するα−アミラーゼの間の免疫交差反応性が見出された。
【００３３】
上記の特性iii）に応じてターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの特性評価に用いるオリゴヌクレオチドのプローブは、問題になっているα−アミラーゼの完全もしくは部分ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列に基づいて適切に調製することができる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、５×SSC中に予備浸漬し、20％ホルムアミド、５×Denhardt溶液、50mMリン酸ナトリウム（pH6.8）、および変性し、音波処理した子ウシ胸腺のDNA50mgからなる溶液中において〜40℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行ない、続いて100mMのATPを追加した同一溶液中で〜40℃で18時間ハイブリダイゼーションを行ない、続いて２×SSC、0.2％SDS中において40℃（低緊縮性）、好ましくは50℃（中緊縮性）、より好ましくは65℃（高緊縮性）、さらに好ましくは〜75℃（超高緊縮性）で30分間、フィルターを３回洗浄することを含む。
【００３５】
ハイブリダイゼーションのより詳細については、Sambrook等の著書、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989に見出すことができる。
【００３６】
本明細書の文脈において「から誘導される」は、問題になっている生物体の株により産生されたまたは産生することができるα−アミラーゼを指すだけでなく、そのような株から単離されたDNA配列によりコードされた、またそのDNA配列により形質転換された宿主生物中で産生されたα−アミラーゼを指すことを意図している。結局この用語は、合成および／またはｃDNA起源のDNA配列によりコードされるα−アミラーゼ、また問題になっているα−アミラーゼの識別特性を有するα−アミラーゼを指すことを意図している。この用語はまた、親のα−アミラーゼが天然に産出するα−アミラーゼの変異体、すなわち天然に産出するα−アミラーゼの１または複数のアミノ酸残基を修飾（挿入、置換、欠失）した結果の変異体であってもよいことを指すことを意図している。
【００３７】
親のハイブリドα−アミラーゼ：
親のα−アミラーゼ（骨格）は、ハイブリドα−アミラーゼ、すなわち少なくとも２種類のα−アミラーゼから誘導された部分的なアミノ酸配列の組み合わせを含むα−アミラーゼであってもよい。
親のハイブリドα−アミラーゼは、アミノ酸相同性および／または免疫交差反応性および／またはDNAハイブリダイゼーション（上記の定義による）に基づいてターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの系統群に属すると判定することができるものであるであればよい。
【００３８】
この場合、一般にハイブリドα−アミラーゼはターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの少なくとも一部分と、微生物（細菌または真菌）および／または哺乳類起源のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼあるいは非ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼから選択された１または複数の別のα−アミラーゼの部分とからなる。
【００３９】
したがって親のハイブリドα−アミラーゼは、少なくとも２種類のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼから誘導される；または少なくとも１種類のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼと少なくとも１種類の非ターマミル（Termamyl）様の細菌のα−アミラーゼとから誘導される；または少なくとも１種類のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼと少なくとも１種類の真菌のα−アミラーゼとから誘導される部分的アミノ酸配列の組み合わせを含むことができる。部分的アミノ酸配列が誘導されるターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼは、例えば本明細書で参照した特定のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼのいずれであってもよい。
【００４０】
例えば、親のα−アミラーゼは、バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）の株から誘導されたα−アミラーゼのＣ末端部分と、バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）の株またはバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）の株から誘導されたα−アミラーゼのＮ末端部分とを含んでもよい。例えば、親のα−アミラーゼは、バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼのＣ末端部分のアミノ酸残基を少なくとも430個含むことができる。
【００４１】
このような雑種のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼは、Ｎ末端の３５個のアミノ酸残基（成熟タンパク質の）を、配列番号：５に示されたバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ（BAN）の成熟タンパク質のＮ末端の33個のアミノ酸残基で置き換えることを除けば、配列番号：４に示されたバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼと同一であってもよい。
【００４２】
このような雑種はまた、配列番号：３に示されたアミノ酸配列を有するバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のα−アミラーゼの68個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントと、配列番号：４に示されたアミノ酸配列を有するバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼの415個のＣ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントとからなっていてもよい。
【００４３】
非ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼは、例えば真菌のα−アミラーゼ、哺乳類もしくは植物のα−アミラーゼ、または細菌のα−アミラーゼ（ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼとは異なる）であってもよい。このようなα−アミラーゼの具体的な例には、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAのα−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（A. niger）酸のα−アミラーゼ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のα−アミラーゼ、ブタの膵臓のα−アミラーゼ、およびオオムギのα−アミラーゼがある。これらのα−アミラーゼは全て解明された構造を有し、それらは本明細書で参照した典型的なターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの構造とは著しく異なる。
【００４４】
上記、すなわちアスペルギルス・ニガー（A. niger）およびアスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）から誘導された真菌のα−アミラーゼは、アミノ酸レベルに関して相同性がきわめて高く、一般に同一系統群のα−アミラーゼに属する考えられる。アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）から誘導される真菌のα−アミラーゼは商品名Fungamyl（商標）で市販されている。
【００４５】
さらに、ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの特殊な変異体（本発明の変異体）が、特定のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の修飾（例えば欠失または置換）に関して通常のやり方で参照される場合、同等の位置（それぞれのアミノ酸配列の間で最善の可能性のあるアミノ酸配列の位置関係から決まる）で修飾された別のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの変異体がそれに包含されることは言うまでもない。
【００４６】
本発明の変異体の好ましい実施形態は、バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼ（親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼとして）から誘導されるもの、例えば配列番号：４に示されたアミノ酸配列を有するバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼなど上記で参照されたものの１つである。
【００４７】
本発明の変異体の変更された特性：
下記において、本発明の変異体中に存在する可能性のある変質／突然変異の間の関係、およびそれから結果として得られる特性の望ましい変更（親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの特性と比べて）について論ずる。
高温時の酸性pHおよび／または低カルシウム濃度における安定性の向上：
本発明は、親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの変異体に関するものであり、その変異体α−アミラーゼはα−アミラーゼの全体的な疎水性を向上させるために、および／または表面を溶剤に曝してアミノ酸残基の側鎖中のメチル基の全体数を増加させるために、親のα−アミラーゼと比べてα−アミラーゼの表面を１または複数種の溶剤に曝したアミノ酸残基に変えられた。
【００４８】
好ましい実施形態において、内側でねじれを有する凹んだ表面を１または複数種の溶剤に曝したアミノ酸残基は、より疎水性のアミノ酸残基に変わる。
別の好ましい実施形態において、凸状の表面を１または複数種の溶剤に曝したアミノ酸残基は、側鎖中のメチル基の数を増すように変わる。
本発明は、E376、S417、A420、S356、Y358の群から選択される１または複数の位置における変更を含む、親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼのα−アミラーゼの変異体に関する。
【００４９】
ただし、（ａ）その変更は独立に、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流にアミノ酸を挿入すること、
（ii）その位置を占めるアミノ酸を欠失させること、または
（iii）その位置を占めるアミノ酸を別のアミノ酸で置換すること
であり、（ｂ）その変異体はα−アミラーゼ活性を有し、（ｃ）各位置は配列番号：４のアミノ酸配列を有する親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００５０】
ある実施形態において変更は下記の置換のうちの一つである。
E376A、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
好ましい実施形態において置換はE376Kである。
好ましい実施形態において変更は下記の置換の一つである。
S417A、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
好ましい実施形態において置換はS417Tである。
好ましい実施形態において変更は下記の置換の一つである。
A420R、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
好ましい実施形態において置換はA420Q、Ｒである。
【００５１】
好ましい実施形態において変更は下記の置換の一つである。
S356A、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
好ましい実施形態において変更は下記の置換の一つである。
Y358A、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｖ。
好ましい実施形態において置換はY358Fである。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において変異体は下記の１または複数の置換を含む。
E376K、S417T、A420Q、Ｒ、S356A、Y358F。
高温時の酸性pHおよび／または低カルシウム濃度における安定性の向上は、本発明を例示する下記の実施例２に記載の方法を用いて判定することができる。
本発明の変異体を調製するために骨格として使用される親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼは、上記で規定した任意のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼであることができる。
【００５３】
バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）株ATCC27811などのバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）；バチルス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）；バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）；バチルス・スペーシス（Bacillus sp.）NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513、もしくはDSM9375；ならびに配列番号：１、２、３、４、５、６、７、および８で表される親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼ；から誘導される群から選択された親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼが特に考慮される。
【００５４】
本発明の一実施形態において親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼは、Ｎ末端の35個のアミノ酸残基（成熟タンパク質の）が配列番号：５に示されたバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ（BAN）の成熟タンパク質のＮ末端の33個のアミノ酸残基で置き換えられることを除けば、配列番号：４（ターマミル（Termamyl））に示されたバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼと同一の雑種α−アミラーゼである。親のターマミル（Termamyl）様の雑種α−アミラーゼは、さらに突然変異、H156Y+181T+190F+209V+264S（配列番号：４のナンバリングを用いて）を有する前述の雑種のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼであってもよい。上記骨格を、以下「LE174」と呼ぶ。
【００５５】
親のα−アミラーゼは、有利にはさらにK176、I201、およびH205（配列番号：４のナンバリングを用いて）の１または複数の位置に突然変異があってもよく、特にK176R、I201F、およびH205N（配列番号：４のナンバリングを用いて）の１または複数の置換、特にK176R+I201F+H205N（配列番号：４のナンバリングを用いて）などの置換があってもよい。
【００５６】
本発明者等は前述の変異体が、温度95から160℃の範囲（すなわち高温）で、pH7.0未満（すなわち酸性pH）および／またはカルシウム濃度１mM（40ppm）未満（すなわち低カルシウム濃度）において親のターマミル（Termamyl）様のハイブリドα−アミラーゼと比べて安定性を向上させることを見出した。
１または複数種の溶剤に曝したアミノ酸残基の変質（例えば置換による）は、１）酵素の全体的な疎水性を向上させ、または２）溶剤に曝したアミノ酸残基の側鎖中のメチル基の数を増加させて温度安定性を改良する。内側でねじれを有する凹んだ表面は、より疎水性の残基に変える（例えば置換により）ことが好ましい。凸状表面については側鎖中のメチル基の数を増加させたアミノ酸残基に変えることが好ましい。
【００５７】
http://sunrise.cbs.umn.edu/cast/version 1.0 (1998年２月公開）のインターネット上で見付けたプログラムCASTを用いて表面に接続するくぼみの面積を割り出すことができる（参考文献：Jie Liang、Herbert Edelsbrunner、およびClare Woodwardの論文（1998年）、Anatomy of protein Pockets and Cavities:Measurements of binding site geometry and implications for ligand design, Protein Science, 7, pp.1884〜1897）。表面との接続については、直径1.4Åのプローブが出入りすることができるようにプログラム中で定義する。CASTプログラム中のデフォルトパラメータを用いた場合、凹みの空隙はBrookhavenのデータベース（１BPL）で検索されたバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）からカルシウムを枯渇させたα−アミラーゼの構造を用いて求めることができる。
【００５８】
合理的に３つの型の相互作用が考えられる。すなわち
Ａ、残基の側鎖とタンパク質との間の相互作用、
Ｂ、残基の側鎖と周囲の水との間の相互作用、
Ｃ、水とタンパク質との間の相互作用。
骨格として配列番号：４に示した親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼを用いた場合、下記の位置が溶剤に曝されると考えられ、適宜変えることができる。
【００５９】
E376、S417、A420、S356、Y358。
他のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼの表面の対応および溶剤に曝される他の位置は、W. KabschおよびC. Sanderの論文、Biopolymers 22 (1983) pp.2577〜2637によるdsspプログラムを用いて確認することができる。凸状表面は、WHATIFパッケージ（G. Vriendの論文、Whatif and drug design program, J. Mol. Graph. 8, pp. 52〜56 (1990) version 19980317）のAACAVIプログラム部分を用いて確認することができる。
【００６０】
本発明の実施形態において変異体は下記の１または複数の置換を含む。
E376K、S417T、A420Q、Ｒ、S356A、Y358F。
本発明者等は、高温時の酸性pHおよび／または低カルシウム濃度における安定性は、前述の位置、すなわちE376、S417、A420、S356、Y358（配列番号：４のナンバリングを用いて）の突然変異を、位置K176、I201、およびH205の１または複数の突然変異と組み合わせることにより一層向上させることができることを見出した。
【００６１】
下記の置換を付加することが好ましい。
K176A、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
I201A、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
H205A、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｉ，Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
【００６２】
また本発明を例示する実施例２に示すように、下記の突然変異を組み合わせると安定性が向上する。すなわち親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼとしてLE174と呼ばれるハイブリドα−アミラーゼを用いる場合、K176+I201F+H205N+E376K+A420R、またはK176+I201F+H205N+S417T+A420Q、またはK176+I201F+H205N+S356A+Y358Fである。
【００６３】
本発明の変異体における一般的突然変異：
本発明の変異体は、上記で略述したものに加えて１または複数の修飾を含むことが好ましい。したがって修飾されるα−アミラーゼの変異体の部分中に存在する１または複数のプロリン残基を非プロリン残基で置き換えることが有利であり、それは可能性のある天然に産出する非プロリン残基のいずれであってもよく、好ましくはアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、またはロイシンである。
【００６４】
同様に、親のα−アミラーゼを修飾するアミノ酸残基の間に存在する１または複数のシステイン残基を、セリン、アラニン、スレオニン、グリシン、バリン、またはロイシンなどの非システイン残基で置き換えることが好ましいかも知れない。
さらに本発明の変異体を、配列番号：４のアミノ酸断片185〜209に対応するアミノ酸断片中に存在する１または複数のAspおよび／またはGluをそれぞれAsnおよび／またはGlnで置き換えるように、単一の修飾としてまたは上記で略述した修飾のいずれかと組み合わせて修飾してもよい。また、ターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼにおいて、配列番号：４のアミノ酸断片185〜209に対応するアミノ酸断片中に存在する１または複数のLys残基をArgで置き換えることも興味がある。
【００６５】
本発明には２つ以上の上記で略述した修飾を組み込む変異体が含まれることは言うまでもない。
さらに、本明細書に記載の変異体のいずれかに点変異を導入することが有利であるかも知れない。
【００６６】
本発明のα−アミラーゼをコードするDNA配列のクローニング：
親のα−アミラーゼをコードするDNA配列は、問題になっているα−アミラーゼを産生する任意の細胞または微生物から当業界で周知のさまざまな方法を用いて単離することができる。まず、ゲノムDNAおよび／またはｃDNAライブラリーが、調査すべきα−アミラーゼを産生する生物体から染色体DNAまたはメッセンジャーRNAを用いて構築されるはずである。
【００６７】
次いで、α−アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合には、相同の標識されたオリゴヌクレオチドのプローブを合成し、使用して問題になっている生物体から調製されたゲノムライブラリーからα−アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。別法では、低緊縮性のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用する場合、周知のα−アミラーゼ遺伝子と相同の配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドのプローブをプローブとして用いてα−アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。
【００６８】
α−アミラーゼをコードするクローンを同定するためのさらに別の方法は、プラスミドなどの発現ベクター中にゲノムDNAの断片を挿入し、得られるゲノムDNAのライブラリーでα−アミラーゼに対するネガティブ細菌を形質転換し、次いで形質転換した細菌をα−アミラーゼ用の基質を含有する寒天上に塗布し、それによりクローンが同定すべきα−アミラーゼを発現することを可能にする。
【００６９】
別法では酵素をコードするDNA配列を、確立されている標準的な方法、例えばS.L.BeaucageおよびM.H.Caruthers（1981）により記述されたリンアミダイト（phosphoroamidite）法またはMattes等（1984）により記述された方法によって合成的に調製してもよい。リンアミダイト法ではオリゴヌクレオチドを、例えば自動DNA合成装置で合成し、精製し、アニールし、結合させ、適切なベクター中でクローン化する。
【００７０】
結局DNA配列は、合成、ゲノム、またはcDNA起源の断片（適宜にDNA配列全体のさまざまな部分に対応する断片）を標準的な技術に従って結合させることにより調製されるゲノム起源と合成起源を混合したもの、合成起源とｃDNA起源を混合したもの、またはゲノム起源とｃDNA起源を混合したものであってもよい。DNA配列はまた、例えば米国特許第4,683,202号またはR.K.Saiki等の論文（1988）に記載のように特定のプライマーを用いて重合酵素の連鎖反応（PCR）により調製することもできる。
【００７１】
部位特異的突然変異誘発：
もしα−アミラーゼをコードするDNA配列が単離され、突然変異にとって望ましい部位が同定されたならば、合成オリゴヌクレオチドを用いて突然変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有し、突然変異体のヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成の間に挿入される。具体的な方法においては、α−アミラーゼをコードする配列を橋渡しするDNAの一本鎖の間隙が、α−アミラーゼ遺伝子を運ぶベクター中に創られる。
【００７２】
次いで所望の突然変異を担う合成ヌクレオチドを、一本鎖DNAの相同部分に対してアニールする。次いで残存する間隙をDNA重合酵素Ｉ（クレノウ断片）でふさぎ、T4合成酵素を用いて構築物を結合する。この方法の具体的な例がMorinaga等の論文（1984）に記載されている。米国特許第4,760,025号には、カセットのより小さい変更を行うことによる多重変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入について開示されている。しかしながらMorinagaの方法によりさらに多数の突然変異を一度に導入することができる。何故ならばさまざまな長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるためである。
【００７３】
α−アミラーゼをコードするDNA配列中に突然変異を導入するための別の方法がNelsonおよびLongの論文（1989）に記載されている。それはPCR反応におけるプライマーの一つとして化学的に合成したDNA鎖を用いることにより導入される所望の突然変異を含有するPCR断片の３段階の世代を含む。PCRで生成した断片から、突然変異を運ぶDNA断片が制限エンドヌクレアーゼで開裂することにより単離され、発現プラスミド中に再挿入される。
【００７４】
ランダム変異誘発：
ランダム変異誘発は、問題になっているアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも３つの部分で、またはその遺伝子全体の中で、局部的もしくは区域特異的のいずれかのランダム変異誘発として適宜行なわれる。
親のα−アミラーゼをコードするDNA配列のランダム変異誘発は、当業界で周知の任意の方法を使用することにより都合よく行なうことができる。
【００７５】
上記に関して本発明の更なる態様は、例えば親と比べて変更または向上した熱安定性を示す、親のα−アミラーゼの変異体を生成させるための方法に関するものであって、その方法は
（ａ）親のα−アミラーゼをコードするDNA配列にランダム変異誘発を受けさせること、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた変異したDNA配列を宿主細胞中において発現させること、および
（ｃ）親のα−アミラーゼと比べて変更された特性（すなわち熱安定性）を有するα−アミラーゼの変異体を発現させる宿主細胞をスクリーニングすることを含む。
【００７６】
本発明の上記方法のステップ（ａ）は、好ましくはドープされたプライマーを用いて行なわれる。
例えば、ランダム変異誘発は、適切な物理的または化学的な突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、またはDNA配列をPCRが起こす変異誘発にさらすことにより行なうことができる。さらにランダム変異誘発は、これら突然変異誘発剤の任意の組み合わせを使用することにより行なうことができる。突然変異誘発剤は、例えばトランジション、トランスバージョン、逆位、スクランブリング、欠失、および／または挿入を誘導するものであることができる。
【００７７】
本発明の目的に適した物理的又は化学的な突然変異誘発因子としては、紫外線（UV）、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG）、０−メチル  ヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチル  メタン  スルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体、などがある。これらの作用因子を用いる場合、突然変異誘発は、突然変異を誘発しようとする親酵素をコードするDNA配列を突然変異が起こるのに適当な条件の下で、選んだ突然変異誘発因子の存在下でインキュベーションし、望ましい性質を有する突然変異したDNAを選び出すというやり方で行われる。
【００７８】
突然変異誘発をオリゴヌクレオチドを用いて行う場合、オリゴヌクレオチドの合成のさい、オリゴヌクレオチドを、変更しようとする位置で３つの非親ヌクレオチドでドープ又はスパイクすることができる。このドーピング又はスパイキングは、望まないアミノ酸のコドンを回避するように行うことができる。ドープ又はスパイクされたオリゴヌクレオチドは、公表されている方法によって、例えばPCR、LCR、又は適当と思われるDNAポリメラーゼ及びリガーゼ、を用いて、アルファ−アミラーゼ酵素をコードするDNA配列に組み込むことができる。
【００７９】
ドーピングは、各位置の野生タイプ及び突然変異のパーセンテージが予め決まっている“一定ランダム・ドーピング”によって行われることが好ましい。さらに、ドーピングは、いくつかのヌクレオチドの導入が優先される方向に、したがって１又は複数の特定アミノ酸残基の導入が優先される方向に向けることができる。例えば、ドーピングは、各位置で90%の野生タイプと10%の突然変異が導入されるように行うことができる。ドーピング・スキームの選択における別の考慮は、遺伝子ならびにタンパク質の構造的な制約に基づいている。ドーピング・スキームはDOPEプログラムを用いて作成できるが、これは、特に、停止コドンの導入を回避するようにしている。
【００８０】
PCRで発生する突然変異誘発を用いる場合、親のα−アミラーゼをコード化している化学的に処理された又は処理されない遺伝子が、ヌクレオチドの組み込みミスを増加させるような条件の下でPCRによって増幅される（Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15）。
【００８１】
エッシェリシア・コリ（E. coli）の突然変異誘発株（Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191）、サッカロミセス・セレビシアエ（S. cereviseae）又はその他の微生物を、α−アミラーゼをコード化しているDNAのランダム突然変異誘発に用いることもできる。例えば親グリコシラーゼを含むプラスミドを突然変異誘発株に移入し、その突然変異誘発株をプラスミドと一緒に増殖させ、突然変異誘発株から突然変異したプラスミドを単離するというやり方で用いることができる。突然変異したプラスミドを、その後発現生物に移入することができる。
【００８２】
突然変異させようとするDNA配列は、親のα−アミラーゼを発現している生物から調製されるゲノム又はｃDNAライブラリーの中に好適に存在することがある。あるいはまた、DNA配列はプラスミドやバクテリオファージなどの適当なベクターに存在し、それを突然変異誘発因子と共に培養したり、その他の仕方でそれに曝露することができる。突然変異させようとするDNA配列は、また、宿主細胞に、その細胞のゲノムに組み込まれた形で、又はその細胞に入り込んだベクター上に存在するという形で、存在することもある。最後に、突然変異させようとするDNA配列は単離された形で存在することもある。ランダム突然変異誘発を行おうとするDNA配列はｃDNA又はゲノムだ配列であることが好ましいことは言うまでもない。
【００８３】
場合によっては、発現ステップｂ）又はスクリーニング・ステップｃ）を実行する前に突然変異したDNA配列を増幅すると好都合である。この増幅は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。現在好まれている方法は、親酵素のDNA又はアミノ酸配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチド・プライマーを用いるPCRで生成される増幅である。
【００８４】
突然変異誘発因子とと共に培養した後、又はそれに曝露した後、突然変異したDNAは、発現が起こることを可能にする条件の下でそのDNA配列を含む適当な宿主細胞を培養することによって発現される。この目的に用いられる宿主細胞は突然変異したDNA配列（オプションとしては、あるベクター上に存在する）で形質転換したものであっても、突然変異誘発処理のさい親酵素をコードするDNA配列を持っていたものでも良い。
【００８５】
適当な宿主細胞の例としては次のものがある：グラム陽性バクテリア、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）, バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）, バチルス・レンタス（Bacillus lentus）, バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）, バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）, バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）, バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）,
【００８６】
バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）, バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）, バチルス・ラウトス（Bacillus lautus）, バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）, バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）, 又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトマイセス・ムリナス（Streptomyces murinus）, 及びグラム陰性バクテリア、例えばエッシェリシア・コア（E. coli）、などである。突然変異したDNA配列は、さらに、突然変異したDNA配列の発現を可能にする機能をコード化したDNA配列を含むことがある。
【００８７】
局在化されたランダム突然変異誘発
ランダム突然変異誘発は問題のおやα−アミラーゼの一部分に有利に局在化することができる。これは、例えば、その酵素のいくつかの領域が酵素のある性質に関連して特に重要であると同定され、そしてそれが修飾されると改良された性質を有する変異体が得られると予期される場合に有利になる。普通、親酵素の三次構造が明らかにされ、酵素の機能と関連づけられたときにそのような領域が同定される。
【００８８】
限局化された、又は領域特異的なランダム突然変異誘発は、上述のようなPCRで発生される突然変異誘発方法、又は当業者に公知の他の適当な方法、を用いると好適に実行される。あるいはまた、修飾しようとするDNA配列の部分をコード化しているDNA配列を、例えば適当なベクターに挿入して、単離し、その部分に上で述べた突然変異誘発方法のどれかを用いて突然変異を誘発させることもできる。
【００８９】
α−アミラーゼの変異体を提供する別の方法
本発明の変異体を提供する別の方法としては、例えば、WO 95/22625 （Affymax Technologies N. V.）及びWO 96/00343 （Novo Nordisk A/S）に記述されている方法も含め、当業者には公知の遺伝子シャッフリング法がある。
【００９０】
本発明のα−アミラーゼ変異体の発現
本発明によると、上述の方法、又はそれに代わる当業者に知られている何らかの方法によって生成される変異体をコードするDNA配列は、発現ベクターを用いて酵素の形で発現させることができる。発現ベクターは、普通、プロモーター、オペレーター、リボソ−ム結合部位、翻訳開始信号、そしてオプションとして抑制遺伝子あるいはいろいろな活性化遺伝子、をコード化している制御配列を含む。
【００９１】
本発明のα−アミラーゼ変異体をコード化しているDNA配列を運ぶ組み換え体発現ベクターは、組み換えDNAの手順に従うどんなベクターであっても良く、ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存する。従って、ベクターは自律的に複製されるベクター、すなわち、染色体外部のある単位として存在し、その複製が染色体の複製とは無関係であるベクター、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体、であって良い。あるいはまた、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに統合されて、それが統合された染色体と一緒に複製されるものであっても良い。
【００９２】
ベクターの中で、そのDNA配列は適当なプロモーター配列と作用的に結合されていなければならない。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すどんなDNA配列であっても良く、宿主細胞と相同的又は非相同的なタンパク質をコードする遺伝子から得られる。本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列の転写を指示するのに適当なプロモーターの例は、特にバクテリア宿主におけるプロモーターの例としては、エッシェリシア・コリ（E. coli）のlac オペロンのプロモーター、
【００９３】
ストレプトマイセス・コエリコラ（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子dagA プロモーター、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）プロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）のマルトジェニック（maltogenic）・アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）xylA 及びxylB遺伝子のプロモーター、等がある。
【００９４】
菌類宿主における転写では、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）TAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテナーゼ、アスペルギルス・ニガー（A. niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（A. niger）酸性安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（A. niger）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）三炭糖リン酸イソメラーゼ、又はアスペルギルス・ニジュランス（A. nidulans）アセタミダーゼ、をコードする遺伝子から得られるものである。
【００９５】
本発明の発現ベクターは、また、適当な転写ターミネーター及び、真核生物では、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列と作用的に結合したポリアデニレーション・配列を含むことがある。ターミネーション及びポリアデニレーション・配列は、プロモーターと同じ源から適当に得ることができる。
ベクターは、さらに、そのベクターが問題の宿主細胞で複製されることを可能にするDNA配列を含むことがある。そのような配列の例は、例えば、プラスミドpUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, 及びpIJ702 の複製の起点である。
【００９６】
ベクターは、また、選択可能マーカーを含むことがある。例えば、その生成物が宿主細胞の欠陥を補う遺伝子、例えばバチルス・ズブチリス（B. subtilis）又はバチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）からのdal 遺伝子、あるいは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するもの、である。さらに、ベクターは、アスペルギルス（Aspergillus）選択マーカー、例えばamdS, argB, niaD 及びsCなど、ハイグロマイシン耐性を生ずるマーカー、を含むこともできる。あるいは、選択は、例えばWO 91/17243 で記述されているような、同時形質転換によって遂行されることもある。
【００９７】
いくつかの点で細胞内の発現が有利であるが、例えばある種のバクテリアを宿主細胞として用いる場合には、一般に発現が細胞外である方が好ましい。一般に、ここで述べたBacillus α−アミラーゼは、発現されたプロテアーゼを培地に分泌することを可能にする前領域を含んでいる。望ましい場合、この前領域は異なる前領域又はシグナル配列で置き換えても良く、これはそれぞれの前領域をコードするDNA配列の置換によって適当に遂行される。
【００９８】
α−アミラーゼ変異体をコードする本発明のDNA構築物、プロモーター、ターミネーター、及びその他の要素、をそれぞれ結紮し、それを複製のために必要な情報を含む適当なベクターに挿入するのに用いる手順は当業者には周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labortatory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989, を参照）。
【００９９】
本発明のDNA構築物又は上で定義したような発現ベクターを含む本発明の細胞は、本発明のα−アミラーゼ変異体を組み換え生産する宿主細胞として有利に使用される。細胞を、この変異体をコード化したDNA構築物によって、宿主染色体にこのDNA構築物を（１又は複数のコピーで）適当に統合することで形質転換することができる。この統合は、DNA配列が細胞内で安定して維持される可能性が大きくなるので、一般に利点であると考えられる。宿主染色体へのこのDNA構築物の統合は通常の方法によって、例えば同種又は異種の組み換えによって、行うことができる。あるいはまた、いろいろなタイプの宿主細胞に関して上で述べたような発現ベクターによって細胞を形質転換させることもできる。
【０１００】
本発明の細胞は、哺乳類や昆虫などの高等生物の細胞であっても良いが、好ましくは微生物細胞、例えばバクテリア又は菌類（酵母菌を含む）細胞である。
適当なバクテリアの例は、グラム陽性バクテリア、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）, バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）, バチルス・レンタス（Bacillus lentus）, バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）, バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）, バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）, バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）,
【０１０１】
バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）, バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）, バチルス・ラウトス（Bacillus lautus）, バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）, バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）, 又はステプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はステプトマイセス・ムリナス（Streptomyces murinus）, 又はグラム陰性バクテリア、例えばエッシェリシア・コリ（E. coli）、などである。バクテリアの形質転換は、例えば、原形質形質転換によって、又はそれ自体公知の仕方でその能力をもつ細胞を用いて行うことができる。
【０１０２】
酵母菌は、サッカロマイセス（Saccharomyces）又はスチゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）の種から、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、を有利に選ぶことができる。糸状菌は、アスペルギルス（Aspergillus）種に属するもの、例えばアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、が有利である。菌類細胞は、原形質形成を含むプロセス及び原形質の形質転換とそれに続くそれ自体公知の仕方による細胞壁の再生によって形質転換させることができる。アスペルギルス（Aspergillus）宿主細胞の形質転換に適当な手順は欧州特許第238 023号に記述されている。
さらに別の態様では、本発明は、本発明のα−アミラーゼ変異体を生産する方法に関する。この方法は、上述のような宿主細胞を変異体の産生に導く条件の下で培養するステップと、細胞及び／又は培地から変異体を回収するステップを含む。
【０１０３】
細胞を培養するために用いる培地は、問題の宿主細胞を増殖させ、本発明のα−アミラーゼ変異体を発現させるのに適当な通常のどんな培地でも良い。適当な培地は、商業的な供給業者から入手することもできるし、公開されているレシピ（例えば、American Type Culture Collection に記述されているようなもの）に従って調製することもできる。
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼは、公知の手順によって培地から適当に回収できる。例えば遠心分離及び濾過によって細胞を培地から分離し、培地のタンパク質様成分を硫酸アンモニウムなどの塩によって析出させ、その後イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、などのクロマトグラフィー手順を用いる、などである。
【０１０４】
工業的応用
本発明のα−アミラーゼ変異体はいろいろな工業的応用を可能にする貴重な性質をゆうする。本発明の酵素変異体は、洗濯、食器洗浄、及び硬い表面のクリーニング洗剤組成物の成分として応用することができる。多くの変異体は、澱粉からの甘味料及びエタノールの生産、及び／又は織物のサイズ剤除去に特に有用である。通常の澱粉変換プロセスのための条件、例えば澱粉の液化及び／又は糖化プロセスなど、は、例えば米国特許第3,912,590号及び欧州特許公開第252,730 号及び63,909 号に記述されている。
【０１０５】
澱粉からの甘味料の生産
澱粉から果糖シロップへの変換の“伝統的”プロセスは、普通、引き続く３つの酵素プロセス：すなわち、液化プロセスとそれに続く糖化プロセスと異性化プロセス、から成る。液化プロセスでは、澱粉は、5.5 から6.2 までの間のpH値で、95-160℃の温度で、約２時間、α−アミラーゼ（例えば、ターマミル（Termamyl）（商標））によってデキストリンに分解される。これらの条件で最適な酵素安定性を保証するために１mMのカルシウムが加えられる（40 ppm の自由カルシウム・イオン）。
【０１０６】
液化プロセスの後、デキストリンは、グルコアミラーゼ（例えば、AMG（商標））、及び、イソアミラーゼ又はプルラナーゼなどの宿鎖酵素（例えば、Promozyme（商標））を加えることによってデキストロースに変換される。このステップの前に、pHを4.5よりも低い値に下げ、高い温度を維持し（95℃より高い）、液化するα−アミラーゼ活性を変性させる。温度を60℃に下げ、グルコアミラーゼと宿鎖酵素を加える。糖化プロセスは24-72 時間にわたって進行する。
糖化プロセスの後、pHを6-8 の範囲の値、好ましくはpH7.5,に高め、カルシウムをイオン交換によって除去する。次に、デキストロース・シロップを高果糖シロップに、例えば固定されたグルコースイソメラーゼ（Sweetzyme（商標）など）を用いて変換する。
【０１０７】
このプロセスでは、少なくとも１酵素の改善が考えられる。すなわち、液化するα−アミラーゼのカルシウム依存性の減少である。十分に高いα−アミラーゼの安定性を保証するためには自由カルシウムを加えることが必要であるが、自由カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻害するので、高価なユニット操作によって、自由カルシウムを3-5 ppm よりも低いレベルになるように除去する必要がある。もしもこの操作を省くことができ、自由カルシウム・イオンを加えずに液化プロセスを実行できるならばコスト節約が可能になるであろう。
【０１０８】
それを実現するためには、低濃度の自由カルシウム（＜40 ppm）でも安定であって高い活性を有する、カルシウムに対する依存性が小さいターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼが必要である。そのようなターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼは、4.5-6.5という範囲に、好ましくは4.5-5.5という範囲に、pH最適値を有するものでなければならない。
【０１０９】
洗剤組成物
上述のように、本発明の変異体は洗剤組成物に適当に取り入れることができる。洗剤組成物（例えば、洗濯用洗剤や食器用洗剤）の関連成分の詳細、それらの洗剤組成物に変異体を配合する適当な方法、及び関連したタイプの洗剤組成物の例については、WO 96/23874 及びWO 97/07202 が参照としてあげられる。
【０１１０】
本発明の変異体を含む洗剤組成物は、さらに１又は複数の他の酵素、例えばリパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペロキシダーゼ、又はラッカーゼ、及び／又は別のα−アミラーゼ、など、を含むことがある。
本発明のα−アミラーゼ変異体は従来用いられている濃度で洗剤に組み込むことができる。本発明の変異体は、従来の洗剤の用量レベルを用いて、洗濯／食器洗浄液体の１リットルあたりα−アミラーゼ0.00001-1 mg （純粋な、活性酵素タンパク質として計算して）に対応する量で組み込むことができる、と現在考えられている。
【０１１１】
材料及び方法
酵素：
LE174 ハイブリッド・アルファ−アミラーゼ変異体：LE174 は、ハイブリッド・ターマミル（Termamyl）様のアルファ−アミラーゼであり、ターマミル（Termamyl）配列、すなわち、配列番号： 4 で示されるバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼと同一であるが、ただし（成熟タンパク質の）N- 末端35アミノ酸残基が、BAN（成熟タンパク質）、すなわち、配列番号： 5で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens） アルファ−アミラーゼ、の N-末端33残基に置き換えられており、これはさらに次の変異を有する：H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S （配列番号： 4 の番号付けを用いて）。
【０１１２】
pSNK101の構築
この大腸菌（E. coli）／バチルス（Bacillus）シャトル・ベクターを用いて大腸菌（E. coli）でα−アミラーゼを発現させることなく突然変異を導入し、そのα−アミラーゼがバチルス（Bacillus）で活性になるように変性させることができる。このベクターは次のように構築された：pX ベクターにおけるα−アミラーゼ遺伝子（amyLの内部に次の変更が加えられたpDN1528：BAN(1-33), H156Y, A181T, N190F, A209V, Q264S, プラスミドpDN1528は実施例１で詳しく記述されている）が、アルファ−アミラーゼ遺伝子の５’コーディング領域においてE. coli起源の断片を含む1.2 kb の断片によるPstI 部位への割り込みによって不活性化された。
【０１１３】
この断片は、pUC19(GenBank accession #:X02514)から、フォワード・プライマー１：5'-gacctgcagtcaggcaacta-3'(配列番号：21)及びリバース・プライマー１：5'-tagagtcgacctgcaggcat-3'(配列番号：22)を用いて増幅された。PCR アンプリコン及びα−アミラーゼ遺伝子を含むpXプラスミドは、37℃で２時間、PstIによって消化された。pXベクター断片とE. coli 起源のアンプリコンは、１時間室温で結紮され、電気トランスフォーメーションによってE. coliで形質転換された。得られたベクターはpSnK101と呼ばれる。
【０１１４】
この大腸菌（E. coli）／バチルス（Bacillus）シャトル・ベクターを用いて大腸菌（E. coli）でα−アミラーゼを発現させることなく突然変異を導入し、そのα−アミラーゼがバチルス（Bacillus）で活性になるように変性させることができる。このベクターは次のように構築された：pX ベクターにおけるα−アミラーゼ遺伝子（amyLの内部に次の変更が加えられたpDN1528：BAN(1-33), H156Y+ A181T+ N190F+ A209V+ Q264S, プラスミドpDN1528は実施例１で詳しく記述されている）が、アルファ−アミラーゼ遺伝子の５’コーディング領域において大腸菌（E. coli）起源の断片を含む1.2 kb の断片によるPstI 部位への割り込みによって不活性化された。
【０１１５】
この断片は、pUC19(GenBank accession #:X02514)から、フォワード・プライマー2：5'-gacctgcagtcaggcaacta-3'(配列番号：23)及びリバース・プライマー2：5'-tagagtcgacctgcaggcat-3'(配列番号：24)を用いて増幅された。PCR アンプリコン及びα−アミラーゼ遺伝子を含むpXプラスミドは、37℃で２時間、PstIによって消化された。pXベクター断片とE. coli 起源のアンプリコンは、１時間室温で結紮され、電気トランスフォーメーションによってE. coliで形質転換された。得られたベクターはpSnK101と呼ばれる。
【０１１６】
低pHフィルタ分析
バチルス（Bacillus）ライブラリーが、酢酸セルロース（OE 67, Scleicher & Schuell, Dassel, Germany）- 及びニトロセルロース・フィルタ（Protran-Ba 85, Scleicher & Schuell, Dassel, Germany）のサンドイッチで、少なくとも21 時間、37 ℃で、10 μｇ/mlのクロラムフェニコールを含むTY寒天プレートに平板培養される。酢酸セルロース層はTY寒天プレート上に位置している。
【０１１７】
各サンドイッチ・フィルタは、プレーティング後、インキュベーションの前に針で細かくマークしてポジティブ変異体が限局化できるようにし、結合した変異体を含むニトロセルロース・フィルタは、クエン酸緩衝液、pH4.5、と共に容器に移され、90℃で15分間インキュベートされる。コロニーを含む酢酸セルロース・フィルタは、使用するときまで室温でTYプレート上に貯蔵される。インキュベーション後、残留活性がクエン酸緩衝液、pH6.0 、に1 %アガロース、0.2 %澱粉を含む分析プレートで検出される。
【０１１８】
ニトロセルロース・フィルタの分析プレートもフィルタ・サンドイッチと同じ仕方でマークされ、2時間50℃でインキュベートされる。フィルタを除去した後、分析プレートを10 %リュゴール液で染色する。澱粉を分解する変異体は、ダークブルーの背景の上の白いスポットとして検出され、貯蔵プレートで同定される。ポジティブ変異体は、第１回のスクリーニングと同じ条件で２回再スクリーニングされる。
【０１１９】
二次スクリーニング
再スクリーニングの後、ポジティブ形質転換株は貯蔵プレートからピックアップされて二次プレート分析でテストされる。ポジティブ形質転換株は、5 mlの LB + クロラムフェニコールの中で22 時間37 ℃で培養される。各ポジティブ形質転換株及び対照LE 174 変異体のバチルス（Bacillus）培養が、クエン酸緩衝液、pH4.5、90℃でインキュベートされ、サンプルが0, 10, 20, 30, 40, 60, 及び80 分に採取された。3 マイクロリットルのサンプルが分析プレートにスポットされた。分析プレートは10 %リュゴール液で染色された。改良された変異体は、バックボーンよりも高い残留活性が分析プレートにハローとして検出される変異体として認められた。改良された変異体はヌクレオチド・シーケンシンッグによって決定される。
【０１２０】
発酵及びα−アミラーゼ変異体の精製
関連する発現プラスミドを含むバチルス・ズブチリス（B. subtilis）株が、-80 ℃のストックから15 μｇ/ml のクロラムフェニコールを含むLB- 寒天プレートに線条接種され、37 ℃で一晩培養される。コロニーを、500 mlの振とうフラスコ内の15 μｇ/ml のクロラムフェニコールを補充された100 ml のBPX培地に移す。
【０１２１】
BPX培地の組成は次の通り：
ポテト・スターチ       100   g/l
オオムギ粉              50   g/l
BAN 5000 SKB             0.1 g/l
ナトリウム・カゼイネート10   g/l
ソイビーン・ミール      20   g/l
Na2HPO4 , 12H2O          9   g/l
Pluronic（商標）         0.1 g/l
培養は、37℃、270 rpm で5日間振とうされる。
【０１２２】
発酵ブロスから細胞及び細胞破片が4500 rpm で20-25 分の遠心分離によって除去される。その後、上澄みを濾過して完全に透明な溶液が得られる。濾液をUF-フィルタ（10000 カットオフ膜）で濃縮し洗浄し、緩衝液を20 mM 酢酸pH5.5に変える。UF-濾液をS-セファロースF.F. で用いて、同じ緩衝液で0.2 M NaCl によるステップ溶出で溶出を行う。溶出液を、10 mM Tris、pH9.0、に対して透析し、Q-セファロース F.F.で用いて0-0.3 M NaCl 直線勾配で6 カラム体積にわたって溶出させる。活性（Phadebas 分析で測定される）を含む分画はプールし、pH7.5 に調整し、残りの色は0.5% W/vol. 活性炭による処理で5 分で除去した。
【０１２３】
安定性の決定
全ての安定性試験は同じセットアップを用いて行われる。その方法は次の通りである：
酵素を関連する条件の下で（1-4）恒温槽でインキュベートする。サンプルは、0, 5, 10, 15, 及び30分で取り出し、分析緩衝液で25 倍に希釈し（取り出した全てのサンプルで同じ希釈度）、標準条件pH7.3 、37 ℃で、活性をPhadebas 分析（Pharmacia）を用いて測定する。
インキュベーションの前（0 分）に測定された活性が基準（100 %）として用いられる。パーセントの低下がインキュベーション時間の関数として計算される。表は、30 分のインキュベーションの後の残留活性を示す。
【０１２４】
活性決定−（KNU）
１キロ・アルファ−アミラーゼ単位（1 KNU）というのは、次の条件に基づいて、アルファ−アミラーゼの決定のためのNovo Nordisk の標準的な方法で毎時5.26 ｇの澱粉（Merck, Amylum Solubile, Erg. B6, Batch 9947275）を分解する酵素の量である：
基質                          可溶澱粉
溶媒中のカルシウム含有量      0.0043 M
反応時間                      7-20 分
温度                          37℃
pH                            5.6
Novo Nordisk の分析方法（AF 9）の詳しい記述はリクエストすれば入手できる。
【０１２５】
比活性の決定
α−アミラーゼ活性の分析
α−アミラーゼ活性は、Phadebas（商標）タブレットを基質として用いる方法によって決定される。Phadebas タブレット（Phadebas（商標）Amylase Test, Pharmacia Diagnostic が供給）は、架橋した不溶性の青色澱粉ポリマーを含み、それがウシ血清アルブミン及び緩衝物質と混合されて錠剤に成形されている。
【０１２６】
一回の測定毎に、一つの錠剤を5 ml 50 mM Britton-Robinson 緩衝液（50 mM の酢酸、50 mMのリン酸、50 mM のホウ酸、0.1 mM のCaCl2, pHをNaOH によって問題とする値に調整）を含む試験管に懸濁させる。テストは、水浴で、問題とする温度で行われる。テストされるα−アミラーゼは、ｘml の50 mM Britton-Robinson 緩衝液に希釈される。このα−アミラーゼ溶液１ml が、上の5 ml 50 mM Britton-Robinson 緩衝液に加えられる。澱粉はα−アミラーゼによって加水分解されて可溶な青い断片になる。得られた青い溶液の、620 nm で分光測光的に測定された吸収率はα−アミラーゼ活性の関数である。
【０１２７】
10 又は15 分のインキュベーション（試験時間）の後で620 nm で測定された吸収率は、620 nm で0.2 乃至2.0 吸収単位という範囲にあることが重要である。この吸収範囲では、活性と吸収率の間に直線関係がある（Lambert-Beer の法則）。したがって、酵素の希釈はこの規準に適合するように調整しなければならない。所定の条件の組（温度、pH、反応時間、緩衝液の条件）の下で、与えられた１mg のα−アミラーゼはある量の基質を加水分解し、青い色が生ずる。色の強度が620 nm で測定される。測定された吸収率は、与えられた条件の組における問題のα−アミラーゼの比活性（活性／mg の純粋なα−アミラーゼ・タンパク質）に正比例する。
【０１２８】
実施例
実施例１．
親酵素に比べて、低いpHでの安定性が改良され、安定性に関してカルシウム・イオンへ依存性が減少したターマミル（Termamyl）様のLE174 α−アミラーゼ変異体のランダム突然変異誘発による構築
【０１２９】
ランダム突然変異誘発
低いpH及び低いカルシウム濃度での親LE174 α−アミラーゼ変異体の安定性を改良するために、予め選択された領域におけるランダム突然変異誘発が行われた。
領域は次の通りであった：
領域：            残基：
SERＩ            A425-Y438
SERII            W411-L424
SERIII           G397-G410
SERＶ            T369-H382
SERVII           G310-F323
SERIX            L346-P359
【０１３０】
６つの領域の各々で、ランダムなオリゴヌクレオチドが、上記領域における各ヌクレオチド位置において同じ突然変異率を用いて（97%バックボーン、及び残り３つのヌクレオチドの各々が1%で突然変異率3%となる）合成される。例えば、A425のコンドンの1. 位置の場合：97%C, 1%A, 1%T, 1%G となる。６つのランダムなオリゴヌクレオチド及び、用いられる場合、相補的なSOE補助プライマーが表２〜表７に示されている：４つのヌクレオチドの分布が下に示されている。
【０１３１】
表２．
RSERＩ: 5'-GC GTT TTG CCG GCC GAC ATA 312 234 322 243 333 133 444 233 423 242 212 211 243 343 CAA ACC TGA ATT-3'
1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
表３．
RSERII: 5'-GC GTT TTG CCG GCC GAC ATA CAT TCG CTT TGC CCC ACC GGG TCC GTC TGT TAT TAA TGC CGC 311 133 241 122 243 113 341 432 423 433 223 332 242 331 GCC GAC AAT GTC ATG GTG-3'
1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
【０１３２】
表４．
RSERIII : 5'-GTC GCC TTC CCT TGT CCA 433 413 I12 423 124 424 423 411 121123 124 324 243 233 GTA CGC ATA CTG TTT TCT-3'
1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
補助プライマー FSERIII : 5'-TGG ACA AGG GAA GGC GAC AG-3'（配列番号：15）
表５．
RSERV: 5-TAA GAT CGG TTC AAT TTT 424 222 311 443 144 I12 223 434 324 441423 233 222 342 CCC GTA CAT ATC CCC GTA GAA-3
1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
補助プライマーFSERV: 5-AAA ATT GAA CCG ATC TTA-3（配列番号：16）
【０１３３】
表６．
FSERVII: 5'-TT CCA TGC TGC ATC GAC ACA GGG AGG CGG CTA TGA TAT GAG GAA ATT GCT GAA 344 213 442 342 223 311 431 233 422 411 123 442 213 122 TGT CGA TAA CCA-3'
1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
補助プライマーRSERVII: 5'-TGT CGA TGC AGC ATG GAA-3'（配列番号：17）
表７．
FSERIX: 5'-GT CCA AAC ATG GTT TAA GCC 432 243 221 343 222 212 232 313 I14 441 123 244 121 333 TCA GGT TTT CTA CGG GGA-3'
1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
補助プライマーRSERIX: 5'-GGC TTA AAC CAT GTT TGG AC-3'（配列番号：18）
【０１３４】
突然変異するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドの分布
l:97%A, 1%T, l%C, l%G
2:97%T, l%A, l%C, l%G
3:97%C, l%A, l%T, l%G
4:97%G, l%A, 1%T, 1%C
【０１３５】
プラスミド・ライブラリーの構築
ほぼ1.4 kb の二つのフラグメントが、プライマー1B: 5'-CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG-3' と、それぞれ、表1 から明らかなランダムなオリゴヌクレオチド、及び表2 から明らかなランダムなオリゴヌクレオチドを用いてPCR増幅された。ベクターpSnK101 及びPCRフラグメントはEcoRV 及びEagＩによって2 時間消化された。ほぼ3.6 kb のベクター・フラグメント及びほぼ1.3 kb のPCRフラグメントは精製され、ひと晩結紮され、大腸菌（E. coli）に移され、さらに、下で述べるようにバチルス（Bacillus）宿主細胞株の中に移された。
【０１３６】
各領域に関して表３−６から明らかなランダムなオリゴヌクレオチド（図２では共通の用語でaSER及びbSER と記されている）及びLE174 配列のEcoRV 及びEagＩ部位を含む特異バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis） プライマー1B（配列番号：19）及び＃63: 5'-CTA TCT TTG AAC ATA AAT TGA AAC C-3'（配列番号：20）を用いて、オーバーラップ延長法（Horton et al., Gene, 77 (1989), pp. 61-68）によってPCRライブラリー・フラグメントが生成される。
【０１３７】
図２はPCR戦略を示す。PCRはE. coli/Bacillus シャトル・ベクターpSNK101でクローニングされ（物質及び方法、を見よ）、エッシェリシア・コリ（E. coli）における突然変異誘発及びバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）における早急な発現が可能になり、アミラーゼが大腸菌（E. coli）に致死的に蓄積されることが防がれる。クローニングされたPCRフラグメントを大腸菌（E. coli）で確立した後、修飾されたpUC19フラグメントはプラスミドから消化され、プロモーターとターマミル（Termamyl）遺伝子は物理的に結合されて、バチルス（Bacillus）宿主での発現が可能になる。
【０１３８】
スクリーニング
６つのライブラリーが、上の“材料及び方法”の節で述べた低pHフィルタ分析でスクリーニングされた。
下の実施例２の表にリストされている全ての変異体は、実施例１で述べたように調製された。
【０１３９】
実施例２．
安定性の測定
通常、工業的な液化プロセスは、95℃-105℃での安定性を改良するために、約40 ppm の自由カルシウムを加えることによって、pH6.0-6.2で運転される。本発明の変異体は
１．pH6.2より低いpH、及び／又は
２．40 ppm の自由カルシウムより低い自由カルシウム・レベル
での安定性を改良するために作られたものである。
【０１４０】
5 ppm の自由カルシウムの存在下で、酸性のpH、pH5.0、での安定性を測定する分析を用いて、安定性の増加を測定した。
10 μｇの変異体が次の条件の下でインキュベートされた：5 ppm カルシウム及び5 % w/w 普通トウモロコシシ澱粉（カルシウムを含まない）を含む0.1 M 酢酸溶液、pHをpH5.0 に調整。インキュベーションは、95℃の水浴で30 分間行われた。
【０１４１】
結果：
【表２】
0004550285.tif 000003
【０１４２】
比活性の決定
比活性は、（上述の）Phadebas 分析（Pharmacia）を用いて、活性／酵素 mg として決定された。活性は、本明細書の物質及び方法の節で記述されたα−アミラーゼ分析を用いて決定された。
次の置換を有するLE174：
K176R+ I201F+ H205N
決定された比活性：  13400NU/mg
次の置換を有するLE174：
K176R+ I201F+ H205N+ E376K+ A420R:
決定された比活性：  14770NU/mg
次の置換を有するLE174：
K176R+ I201F+ H205N+ S417T+ A420Q:
決定された比活性：  16670NU/mg
次の置換を有するLE174：
K176R+ I201F+ H205N+ S356A+ Y358F:
決定された比活性：  15300NU/mg
【０１４３】
引用された参照文献
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0004550285.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の文脈中の６種類の親のターマミル（Termamyl）様のα−アミラーゼのアミノ酸配列の位置関係を示す図である。最左端の数字は下記のそれぞれのアミノ酸配列を指定する。
１：配列番号：２
２：アミラーゼ
３：配列番号：１
４：配列番号：５
５：配列番号：４
６：配列番号：３
【図２】実施例１で用いたPCRの方策を示す図である。
【図１】
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【図２】
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