(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号3の配列を含むSnaBI制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたDNA。
【請求項２】
請求項１に記載のDNAを含む組換えDNAベクター。
【請求項３】
ATCCに寄託番号ATCC第202166号として寄託されている大腸菌（E.coli）から入手可能な、SnaBI制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたDNA。
【請求項４】
請求項３に記載の単離されたDNAを含んでなる組換えDNAベクター。
【請求項５】
請求項２または４に記載の組換えDNAベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
SnaBI制限エンドヌクレアーゼの製造法であって、BsaAIメチラーゼで予め修飾され、請求項２または４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を、前記エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で培養することを含んでなる製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、SnaBI制限エンドヌクレアーゼおよびSnaBIメチラーゼをコードする組換えDNA、ならびに該組換えDNAからのSnaBI制限エンドヌクレアーゼの製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
II型制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に存在する酵素のクラスである。それらが他の細菌タンパク質から精製されている場合には、分子クローニングおよび遺伝子の特徴づけのための小さな断片にDNA分子を切断するために、これらの制限エンドヌクレアーゼを実験室内で使用することができる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子に沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）を認識しそれに結合することにより作用する。それらは、一旦結合すると、該認識配列の内部、片側または両側で該分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を有する。現在までに調べられている数千の細菌種において、特有の特異性を有する200個を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている（RobertsおよびMacelis, Nucl. Acids Res. 24:223-235 (1996)）。
【０００４】
制限エンドヌクレアーゼは、典型的には、それが由来する細菌に基づき命名される。したがって、例えば、デイノコッカス・ラジオフィルス（Deinococcus radiophilus）により合成される3つの異なる制限エンドヌクレアーゼは、Dral、DraIIおよびDraIIIと命名されている。これらの酵素は、それぞれ配列5’TTTAAA3’、5’PuGGNCCPy3’および5’CACNNNGTG3’を認識し切断する。同様に、大腸菌（Escherichia coli）RY13により合成される唯一の制限エンドヌクレアーゼは、EcoRIと命名されている。それは、配列5’GAATTC3’を認識する。
【０００５】
制限エンドヌクレアーゼは、一般には、もう1つの酵素である修飾メチラーゼと共に存在する。それらの2つの酵素は一緒になって、細菌の制限−修飾（R-M）系を形成する。メチラーゼは、制限エンドヌクレアーゼを補完するものであり、細菌がそれ自身のDNAを自己消化から保護するための手段を提供する。修飾メチラーゼは、それに伴う制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識しそれに結合するが、該DNAを切断する代わりに、メチル基の付加により該配列内のヌクレオチドの1つを化学修飾して、5-メチルシトシン、N４-メチルシトシンまたはN６-メチルアデニンを形成する。このメチル化後には、該認識配列はもはや、同族制限エンドヌクレアーゼによっては切断されない。細菌細胞のDNAは、その修飾メチラーゼの活性により常に完全に修飾され、したがって、それは、内在性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に不感受性となる。制限エンドヌクレアーゼの認識および切断に対して感受性なのは、未修飾DNA（すなわち、外来DNA）だけである。
【０００６】
組換えDNA技術の出現に伴い、遺伝子をクローニングしたり、それがコードする酵素を大量に過剰産生させることが可能となっている。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵となるのは、複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショットガン」法により誘導されるクローンの集団）内の該クローンを、それが10−３〜10−４の頻度でしか存在しない場合に同定するための簡便かつ信頼しうる方法を開発することである。好ましくは、望ましくない大部分のクローンが破壊され、望ましい希少クローンが生存するように、そのような方法は選択的であるべきである。
【０００７】
制限−修飾系は、頻度の増加を伴いながらクローニングされている。クローニングされた最初の系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択するための手段としてバクテリオファージの感染が用いられた（EcoRII: Kosykhら, Mol. Gen. Genet. 178:717-719 (1980); HhaII: Mannら, Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walderら, Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)）。細菌内の制限−修飾系の存在により該細菌はバクテリオファージによる感染に抵抗することができるため、クローン化制限−修飾遺伝子を保持する細胞は、原則として、ファージにさらされたライブラリーから生存体として選択的に単離することができる。しかしながら、この方法は、限られた価値しか有していないことが判明している。特に、クローン化制限−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに十分なファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判明している。
【０００８】
もう1つのクローニングアプローチは、プラスミドを保持することが初めに確認された系を大腸菌（E. coli）クローニングプラスミド中に導入することを含むものである（EcoRV: Bougueleretら, Nucl. Acids. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7: GingerasおよびBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983); TheriaultおよびRoy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthalら, J. Bacteriol. 164:501-509 (1985)）。
【０００９】
R-M系をクローニングするためのもう1つのアプローチは、活性メチラーゼ遺伝子に関する選択によるものである（米国特許第5,200,333号およびBsuRI: Kissら, Nucl. Acids. Res. 13:6403-6421 (1985)）。RおよびM遺伝子は、通常、密接に連鎖しているため、両遺伝子は同時にクローニングできることが多い。しかしながら、この選択は、完全な制限系を常に与えるわけではなく、むしろメチラーゼ遺伝子しか与えないことがある（BspRI: Szomolanyiら, Gene 10:219-225 (1980); BcnI: Janulaitisら, Gene 20:197-204 (1982); BsuRI: KissおよびBaldauf, Gene 21:111-119 (1983);およびMspI: Walderら, J. Biol. Chem. 258:1235-1241 (1983)）。
【００１０】
大腸菌（E. coli）においてR-M系をクローニングするためのもう1つのアプローチは、ある修飾遺伝子が新規宿主中にクローニングされ適切に発現された場合に、該修飾遺伝子が、異なる制限遺伝子の存在を該宿主が許容するのを可能にするという事実を利用するものである（Wilsonら, 米国特許第5,246,845号 (1993)）。
【００１１】
より最近の方法（「エンドブルー（endoblue）」法）が、dinD::lacZ融合体を含有する大腸菌（E. coli）の指示株に基づく大腸菌（E. coli）における制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の直接クローニングに関して記載されている（Fomenkovら, 米国特許第5,498,535号 (1996); Fomenkovら, Nucl. Acids Res. 22:2399-2403 (1994)）。この方法は、制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアーゼが引き起こすDNA損傷の後の大腸菌（E. coli）のSOS応答を利用するものである。多数の耐熱性ヌクレアーゼ遺伝子（Tth111I、BsoBI、Tfヌクレアーゼ）が、この方法によりクローニングされている（米国特許第5,498,535号）。
【００１２】
精製された制限エンドヌクレアーゼ、およびそれより低度ではあるが修飾メチラーゼは、実験室内でDNA分子を分析し再構成させるための有用な手段であるため、これらの酵素を大量に産生する細菌株を作製することが商業的に強く要請されている。また、そのような過剰発現株は、該酵素収率を増加させ、酵素精製の労力を軽減するであろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）（ATCC15291）からSnaBIメチラーゼ遺伝子（snaBIM）をクローニングするために、メチラーゼ選択方法を用いた。ApoIでの部分消化により、プラスミドベクターpSnaBI-2（2つのSnaBI部位を含有するpUC19誘導体；該部位の1つはSspI部位に、もう1つは、pUC19のAmp遺伝子とoriとの間に位置するDraI部位に存在する）を使用して活性なSnaBIメチラーゼを大腸菌（E. coli）においてクローニングした。DNA配列決定により、挿入されたsnaBIM遺伝子の位置を確認し、不完全な収束（converging）オープンリーディングフレーム（ORF1）を同定した。
【００１４】
メチラーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子は、通常、制限−修飾系内に互いに並んで存在するため、snaBIM遺伝子に隣接するDNAをクローニングするように努めた。新規（de novo）クローニングのために隣接DNA断片を同定するために、サザンブロットを用い、フランキングDNAを単離するために逆PCRを用いた。ブロッティングは、AatII-、BamHI-、PstI-、SalI-およびSphI-断片が、snaBIMだけでなく、SnaBI制限遺伝子（snaBIR）を含むのに十分な隣接DNAをも含有しているはずであることを示した。ブロットはまた、後で逆PCRに使用するHincII断片を同定した。AatII、BamHI、PstI、SalIおよびSphIで調製されたde novoライブラリー上でのメチラーゼの選択は、SnaBIメチラーゼクローンを与えなかった。SnaBIメチラーゼ遺伝子（snaBIM）を含有するプラスミドにより予め修飾された大腸菌（E. coli）中への形質転換選択によりクローンを得る試みも、失敗した。1ラウンドの逆PCRおよびそれに続くディレクティド（directed）PCRの後、隣接染色体DNAをpUC19中にクローニングした。2つのオープンリーディングフレーム（ORF）が、SnaBIメチラーゼ遺伝子の下流に見出された。第1のORF（ORF1）は、Genbankデータベース中の公知タンパク質にマッチしなかった。このことは、それが潜在的な制限エンドヌクレアーゼであることを示している。第2の収束（converging）ORF（ORF2）は、既に記載されている調節（またはC）タンパク質（Brooksら, NAR 19:841-850 (1991), Taoら, J. Bacteriol. 173:1367-1375 (1991)）と相同であった。
【００１５】
SnaBIメチラーゼ遺伝子を含有する予め修飾された大腸菌（E. coli）宿主中への形質転換により活性なSnaBI制限遺伝子（ORF1）をpRRS（Skoglundら, Gene, 88:1-5 (1990)）中にクローニングする試みは、失敗した。減少したSnaBIエンドヌクレアーゼ活性を有するpRRS snaBIRクローンだけが唯一、SnaBIメチラーゼで予め修飾された大腸菌（E. coli）宿主から常に単離された。
【００１６】
ついで、Vent&reg;DNAポリメラーゼを用いて、snaBIR PCR断片をクローニングし、配列決定した［これは、BsaAI部位（Bill JackおよびLucia Greenough, New England Biolabsにより提供された）にてpCAB16中に連結した後に行なった］。pCAB16は、pUC18のポリリンカー中にクローニングされた活性なmspIR遺伝子を含有するpUC18誘導体である（この場合、mspIRは、Placプロモーターから転写される）。pCAB16をBsaAI部位で遮断すると、そのようにしない場合には致死的となるmspIR発現が遮断される。これにより、BsaAI部位のインサートに関して選択される（図6）。該snaBIR PCR断片をpCAB16中に連結し、SnaBIで予め修飾された大腸菌（E. coli）宿主中に形質転換した。プラスミドDNAを15個の単離体（分離菌）から精製し、PstIおよびBamHIで消化した。6個の単離体が該PCR snaBIR断片を含有していた。これらのうちの4個（#1、#2、#4および#9）を配列決定した。配列決定は、クローン#2および#4が突然変異を含有すること、およびクローン#1および#9だけが、snaBIRの正しいDNA配列を有することを示した。4個のクローンはすべて、PlacおよびmspIRに対して逆配向であり、アッセイを行なったところ、それらはいずれも、検出可能なSnaBI制限エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。
【００１７】
#1および#9からのSnaBIエンドヌクレアーゼ遺伝子（snaBIR）断片を、PstIおよびBamHIで消化した後にゲル精製し、別々にpRRS中に連結した。ついで、R.SnaBIの過剰発現を確立するためには、SnaBI消化に対して予め修飾された大腸菌（E. coli）宿主を使用する必要があった。しかしながら、SnaBIメチラーゼで予め修飾された宿主中にこれらの連結体を形質転換しても、SnaBIエンドヌクレアーゼに関して減少した活性を有する1つのpRRSクローンを除き、活性なSnaBI制限クローンを確立することができなかった。単離した16個のクローンのうち1個（#12）だけが、正しい断片を有しているらしかったが、アッセイを行なったところ、それは、減少したSnaBIエンドヌクレアーゼ活性を示した。
【００１８】
SnaBIエンドヌクレアーゼは、DNA配列5’ TAC/GTA 3’を認識し、3番目の塩基と4番目の塩基との間で切断して、平滑末端を与える。DNA配列5’ PyAC/GTPu 3’を認識する異種特異的メチラーゼであるBsaAIメチラーゼを使用して、高度に発現するSnaBIエンドヌクレアーゼクローンを大腸菌（E. coli）において確立した。まず、BsaAIメチラーゼ遺伝子（Huimin Kong, New England Biolabsにより提供された）を、Placプロモーターおよびポリリンカー（pUC18由来）を含有するpACYC184の誘導体であるpIH919中にクローニングし、ついで大腸菌（E. coli）中に形質転換した。このM.BsaIで予め修飾された大腸菌（E. coli）株は、SnaBI消化に対して、そしておそらく、認められるSnaBIエンドヌクレアーゼスター活性に対して保護されていた（未公開の結果、Paul Walsh, New England Biolabs）。#1および#9のゲル精製断片のpRRS連結体を、M. BsaAIで予め修飾された大腸菌（E. coli）宿主中に形質転換し、各形質転換からの12個のコロニーを単離した。24個すべてのコロニーが、正しいインサートを含有しているらしかった。各プレートからの6個のコロニーを配列決定し、SnaBIエンドヌクレアーゼに関してアッセイした。アッセイしたすべてのクローンは、含水大腸菌（E. coli）細胞1グラム当たりに産生されるSnaBIエンドヌクレアーゼの8×106以上の単位で、R.SnaBIを発現した。すべてのクローンが、正しいsnaBIR DNA配列を含有していた。該SnaBIエンドヌクレアーゼを、これらのクローンからクロマトグラフィーによりほぼ均一になるまで精製する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
SnaBIエンドヌクレアーゼをクローンから過剰産生させるためには、大腸菌（E. coli）DNAをSnaBI消化から保護するための異種特異的メチラーゼM.BsaAIの使用を含む、通常のメチラーゼ選択方法にはない追加的な工程が必要である。まず、bsaAIMを含有するプラスミドを使用して、大腸菌（E. coli）宿主を修飾する。ついでこの宿主を、snaBIR遺伝子を含有する和合性プラスミドpRRS+snaBIRで形質転換し、ついで両プラスミドを含有するコロニーに関して抗生物質プレート上で選択する。M.BsaAIをコードする遺伝子は、既に記載されている。
【００２０】
SnaBIメチラーゼ遺伝子およびSnaBI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、好ましくは、大腸菌（E. coli）においてクローニングし発現させる本明細書に記載の方法では、以下の工程を行なう。
【００２１】
1．ApoI部分ゲノムDNAライブラリーの構築
スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）ゲノムDNAをApoIと共にインキュベートして、部分消化を行なった。0.5〜20kbの該ApoI部分消化ゲノムDNAを、EcoRIで切断されCIPで処理されたベクターpSnaBI-2中に17℃で一晩連結した。該連結DNAを大腸菌（E. coli）RR１コンピテント細胞中に形質転換した。該形質転換体をプレーティングし、プールし、増幅した。該プールの一晩細胞培養物から、プラスミドDNAを調製した。
【００２２】
2．SnaBI消化による該ApoI部分ライブラリーDNAの攻撃およびSnaBIメチラーゼ遺伝子の単離
該ApoI部分ライブラリーDNAを、SnaBIで37℃で一晩消化した。該消化DNAを沈殿させ、CIPでの処理により脱リン酸化し、ついでRR1コンピテント細胞中に形質転換した。28個の形質転換体からプラスミドDNAを単離した。個々のプラスミドDNAをSnaBIで消化して、消化に対する抵抗性を検出した。単離した1個のプラスミド（#18）は、SnaBI消化に対する抵抗性を示した。SnaBI消化に対する抵抗性の程度は完全なものであった。
【００２３】
3．SnaBIメチラーゼ遺伝子を保持するインサートの配列決定
プラスミド#18中の全ApoI断片インサートを配列決定した。該インサートは、1264bp長であり、1つの完全なオープンリーディングフレーム（ORF）および1つの不完全な収束オープンリーディングフレーム（ORF1）をコードしていることが判明した。BLASTを用いて、該完全ORFをGenBank中の公知遺伝子産物と比較すると、それは、N６-メチルアデニンメチラーゼに対して著しい相同性を示した。したがって、該完全ORF（687bp）は、SnaBIメチラーゼ（228aa、分子量＝26.1kDa）をコードしている。
【００２４】
4．snaBIRの欠落部分をクローニングするための逆PCRおよびsnaBICの同定
スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）ゲノムDNAを逆PCRにより増幅した。該逆PCR産物を、HincIIで切断された自己連結DNAからゲル精製した。該逆PCR産物をApoIおよびXbaIで消化し、ApoIおよびXbaIで切断されたpUC19中にクローニングし、配列決定した。371bpの新規配列を得た。スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）DNAの染色体上の元のクローン化DNAの外側に、新規ApoI部位を見出した。該HincII逆PCR断片をこのApoI部位まで短縮し、それが、このApoI部位からHicII部位までのDNAを含有するようにした。該クローン化ApoI-XbaI断片は、ATG開始コドンと、元のクローン化ApoI断片に向かって収束する新規不完全ORF（ORF2）の54コドンとを含有していた。該HincII逆PCR断片からの新規DNAの残りの部分は、該隣接染色体DNA中のこの新たに見出されたApoI部位のために失われた。BLASTを用いて、ORF2をGenBank中の公知タンパク質と比較したところ、それは、既に記載されている調節（またはC）タンパク質（Brooksら, NAR 19:841-850, (1991), Taoら, J. Bacterial 173:1367-1375, (1991)）に対して密接な相同性を示した。
【００２５】
ORF2は、SnaBI R-M系の新規調節遺伝子（snaBIC）であると考えられた。C遺伝子は、通常、制限遺伝子に先行するため、本発明者らは、SnaBIエンドヌクレアーゼ遺伝子が、snaBIMを含有する元のApoI断片に向かって収束するsnaBICの下流に位置すると正確に推論した。ついで、この欠落配列を越えてsnaBIMおよび該不完全ORF1を含有する元のApoI断片へ戻るPCRを行なうためのPCRプライマーを設計した。該PCR産物をBamHIで消化し、SmaIおよびBamHIで切断されたpUC19中にクローニングし、ついで配列決定した。その新たに誘導された配列は、配列決定された全DNAを1805bpにまで拡張し、元のメチラーゼ単離体#18とHincII染色体断片の逆PCRとに由来する配列を含んでいた。6個のリーディングフレーム中のこのDNA配列の翻訳は、SnaBIメチラーゼ遺伝子に向かって収束する2個の完全なオープンリーディングフレームが下流に存在することを示した。それらの2つのORFは20塩基にわたり重複する（遺伝子体制に関しては図1を参照されたい）。該第1 ORF（ORF1）は、Genebankデータベース中の公知タンパク質にマッチしなかった。このことは、それが潜在的な制限エンドヌクレアーゼであることを示している。第2の収束ORF（ORF2）は、既に記載されている調節遺伝子またはCタンパク質と相同であった。
【００２６】
5．大腸菌（E. coli）におけるSnaBIメチラーゼ遺伝子の発現
Vent（Ｒ）ポリメラーゼとsnaBIMに対する2個のプライマーとを使用して、全SnaBIメチラーゼ遺伝子（687bp）をゲノムDNAからPCR増幅した。該PCR産物をPstIおよびXmaIで消化し、PstIおよびXmaIで消化されたpIH919中にクローニングし、ついで大腸菌（E. coli）株ER2267中に形質転換した。8個のコロニー上でコロニーPCRを行なった。2個の単離体（#3および#8）は、snaBIM PCR断片を含有し、両者はSnaBI消化に対して完全に修飾されていた。ついで#8を大腸菌（E. coli）株ER2683中に形質転換し、標準的なCaCl2法でコンピテントにした。
【００２７】
6．大腸菌（E. coli）におけるBsaAIメチラーゼ遺伝子の発現
bsaAIMメチラーゼ遺伝子を含有する1.4kbのSspI断片をゲル精製し、CIPで処理されたベクターpIH919のSmaI部位中に連結し、ついで大腸菌（E. coli）ER2502中に形質転換した。プラスミドDNAを16個のコロニーから精製した。1個のクローン#8が、1.4kbのSspI断片を含有していた。pSnaBI-2（2個のSnaBI部位を含有するpUC19誘導体）で同時形質転換することにより、pIH919-bsaAIM単離体#8はSnaBI消化からpSnaBI-2を完全に保護することが示された。ついでBsaAIメチラーゼクローン#8を大腸菌（E. coli）株ER2683中に形質転換し、標準的なCaCl２法でコンピテントにした。
【００２８】
7．完全なSnaBI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
snaBIR（ORF1）のPCR増幅用に、2個のプライマーを合成した。該PCR産物をPstIおよびBamHIで消化し、ついでPstIおよびBamHIで消化されたpRRS中に連結した。ついでER2683［pIH919-snaBIM］およびER2683［pIH919-bsaAIM］細胞を形質転換した。
【００２９】
両方の大腸菌（E. coli）株は、SnaBI消化に対して保護されていたが、ER2683［pIH919-bsaAIM］細胞だけは、直接スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）染色体PCRから、SnaBIエンドヌクレアーゼ活性を有するクローンを与えた。12個の単離体のうちの1個のクローン、すなわちER2683［pIH919-bsaAIM］細胞由来の#33が、減少したエンドヌクレアーゼ活性を示した。ER2683［pIH919-snaBIM］は、snaBIR遺伝子の直接SnaBI染色体PCRによってはSnaBIエンドヌクレアーゼクローンを与えなかった。
【００３０】
ついで前記の未消化のPCRのsnaBIR（ORF1）をpCAB16中にBsaAI部位において連結し、ついでER2502［pIH919-snaBIM］コンピテント大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換した。15個の単離体からのプラスミドDNAを精製し、PstIおよびBamHIで消化した。6個の単離体が、PCRで生成したsnaBIR断片を含有していた。4個の単離体（#1、#2、#4および#9）を配列決定した。配列決定は、クローン#2および#4が突然変異を含有すること、およびクローン#1および#9だけがsnaBIRの正しいDNA配列を有することを示した。単離したすべてのクローンは、PlacおよびmspIRに対して逆配向を有していた。そして、#1および#9を含むアッセイしたsnaBIRのクローンのすべてが、検出可能なSnaBI制限エンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。
【００３１】
8．大腸菌（E. coli）株ER2683［pIH919-snaBIM］におけるSnaBIエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現
#1および#9 pCAB16-snaBIRクローンは、PCRプライマー内に設計された隣接するPstIおよびBamHI部位を含有していたため、両方のプラスミドをPstIおよびBamHIで消化し、該snaBIRインサートをゲル精製し、PstIおよびBamHIで消化されたpRRS中にPlacプロモーターと直列に連結した。snaBIRの直接染色体PCRクローニングを試みるために、第7節に記載のとおりに、この連結反応物を再びER2683［pIH919-snaBIM］大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換した。
【００３２】
大腸菌（E. coli）ER2683［pIH919-snaBIM］中への形質転換後、プラスミドDNAを16個のコロニー（すなわち、前記連結体#1および#9のそれぞれから8個）から精製した。それと平行して、ER2683［pIH919-snaBIM］のsnaBIR+pRRS形質転換の直接染色体PCR由来の12個のコロニーからのプラスミドDNAも精製した。プラスミドDNAをPstIおよびBamHIで消化して、該snaBIRインサートを同定し、ついで各連結からの潜在的なクローンを、SnaBIエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。1個の単離体#12［#9-pCAB16由来の、ゲル精製されたPstI/BamHI snaBIR+pRRS連結体］だけが、1グラム当たり5×10５単位の減少した活性を示した。直接染色体snaBIR+pRRS ER2683［pIH919-snaBIM］形質転換に由来するSnaBIエンドヌクレアーゼ活性を有するクローンは存在しなかった。
【００３３】
9．大腸菌（E. coli）株ER2683［pIH919-bsaAIM］におけるSnaBIエンドヌクレアーゼ遺伝子の過剰発現
SnaBIエンドヌクレアーゼを過剰発現するクローンを単離することに本発明者らが失敗したのは、M.SnaBIメチラーゼによりもたらされた不適切な保護の結果であると判断した。その代わりにM.BsaAIメチラーゼを使用することにより、この問題を解決した。
【００３４】
本発明者らは、SnaBIエンドヌクレアーゼをクローンから成功裡に過剰産生させるためには、異種特異的M.BsaAIメチラーゼを含有する大腸菌（E. coli）株の使用が不可欠であることを見出した（図5）。第8節に記載のとおり、#1および#9 pCAB16 snaBIRクローンからのこの同じ連結体［snaBIR+pRRS］をコンピテント大腸菌（E. coli）株ER2683［pIH919-bsaAIM］中に形質転換した。各形質転換からの12個のコロニーを単離した。24個すべてのコロニーが、正しいサイズのインサートを含有していた。6個のクローン（#1、#2、#6、#13、#15、#18）が、一晩培養物から、SnaBIエンドヌクレアーゼに関する高い活性を示した。SnaBIエンドヌクレアーゼ活性に関して、T7 DNA上、37℃で15分間および1時間、細胞抽出物をアッセイした。該酵素活性収率は、含水大腸菌（E. coli）細胞1グラム当たり約8×10６単位である。
【００３５】
10．SnaBI制限エンドヌクレアーゼの精製
該組換えSnaBIエンドヌクレアーゼを、イオン交換クロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術により精製した。
【００３６】
【実施例】
つぎに実施例により本発明を更に詳しく説明する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
【００３７】
前記および後記で引用されている参照文献は、参照により本明細書に組入れるものとする。
【００３８】
実施例1
大腸菌（E. coli）におけるSnaBI制限−修飾系のクローニング
スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）（ATCC15291）のNEB Culture Collection #308（Borsettiら. New England Biolabs, 未公開の観察）からゲノムDNAを調製した。
【００３９】
1．ApoI部分ゲノムDNAライブラリーの構築
2.5μgのスフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）ゲノムDNAを、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125および0.05単位のApoIで50℃で60分間消化した。0.125および0.05単位の消化は、所望の程度の部分消化を引き起こした。0.5〜20kbのこのApoI部分消化ゲノムDNAを、80℃で20分間インキュベートした。該ゲノムDNAを、EcoRIで切断されCIPで処理されたベクターpSnaBI-2中に17℃で一晩連結した。pSnBI-2は、SnaBIリンカー（（5’ GTACGTAC）3’  8量体）を、pUC19（Yanisch-Perronら, Gene, 33:103-119 (1985)）中の2つの異なる部位（1つはSspI部位、もう1つはAmp遺伝子とoriとの間のDraI部位）に含有する。RR1（TonA−、DnaseI−）コンピテント細胞および該連結DNAを標準的な方法で混合することにより形質転換を行なった。形質転換体を、Amp（100μg/ml）を含有するLB寒天上にプレーティングした。この形質転換から、約5000個のコロニーを得た。コロニー数を増加させるために、RR1（TonA−、DnaseI−）細胞および連結DNAを使用して再び4×形質転換を行ない、約25,000個の形質転換体を得た。該形質転換体をプールし、Ampを含有する500mlのLBブロス中に接種し、37℃で一晩インキュベートした。この一晩培養物から、CsCl遠心分離法によりプラスミドDNAを調製した。
【００４０】
2．ApoI部分ライブラリーDNAのSnaBI消化およびSnaBIメチラーゼ遺伝子のクローニング
1μgの該ApoI部分ライブラリーDNAを、12単位のSnaBIで37℃で一晩消化した。該消化DNAを沈殿させ、仔ウシ腸ホスファターゼ（CIP）で脱リン酸化し、ついでRR1コンピテント細胞に形質転換した。120個の形質転換体を得た。プラスミドDNAを28個の形質転換体の細胞培養10mlから単離し、8単位のSnaBIで37℃で2時間消化して、消化に対する抵抗性をアッセイした。単離した1個のプラスミド単離体（#18）が、SnaBI消化に対する完全な抵抗性を示した。ApoIによる#18プラスミドDNAの制限消化は、それが約1.2kbのDNAのインサートを含有することを示した。
【００４１】
3．SnaBIメチラーゼ遺伝子を保持するインサートの配列決定
#18プラスミドDNAのインサートを、Ampli Taq DNAポリメラーゼ色素デオキシターミネーターシークエンシングキットとABI373A自動DNAシークエンサーとを使用するジデオキシターミネーション法を用いるプライマー歩行により配列決定した。1264bp長のその全インサートは、1つの完全なオープンリーディングフレーム（ORF）および1つの不完全な収束オープンリーディングフレーム（ORF1）をコードしている。ヌクレオチド配列の分析は、該完全ORFがSsnaBIM遺伝子であることを示した。それは、687bp長であり、26.1kDの推定分子量の228aaのタンパク質をコードしている。M.SnaBIメチラーゼのアミノ酸配列は、α型N６-メチルアデニンメチラーゼにおいて見出される保存モチーフを含有する（図2）。
【００４２】
4．snaBIRの欠落部分をクローニングするための逆PCRおよびsnaBICの同定
SnaBIエンドヌクレアーゼ（ORF1）の欠落部分をクローニングするために、スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）ゲノムDNAの適当な断片を逆PCRにより増幅した。スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）ゲノムDNAをHincIIで切断した。該切断DNAを低濃度（2μg/ml）で自己連結させ、その連結した混合物を、以下のプライマーのセットを用いる逆PCRにおける鋳型として使用した。
【００４３】
5’ TTCTCTAGAAGCTTGGGAGCGGGTCAAACCCGC 3’（SnaBI1）（配列番号7）
5’ TTCGGATCCCCGGGCTCTCGGAGCCAATCATTGCGC 3’（SnaBI2）（配列番号8）
Vent（Ｒ）（Exo-）ポリメラーゼおよび95℃ 1’、60℃ 1’、72℃ 3.5’、30サイクルのサイクリング条件を用いて、約600bpの逆PCR産物を得た。ついで1μgのこの600bpのPCR産物を第2ラウンドのPCR増幅（100μlの反応、95℃ 1’、55℃ 1’、72℃ 3.5’、30サイクル、Vent（Ｒ）(Exo+)ポリメラーゼ）におけるDNA鋳型として使用して、同じ600bpの更なるPCR断片を得た。ゲル精製した600bpのPCR断片をApoIおよびXbaIで消化し、ApoおよびXbaIで消化されたpUC19中に連結し、大腸菌（E. coli）ER2502中に形質転換し、Amp（100μg/ml）を含有するLB寒天上にプレーティングした。pUC19汎用プライマー#1233および#1224（New England Biolabs）を使用する12個のコロニーの直接PCRにより、以下のとおり、潜在的な逆PCRクローンを同定した。個々のクローンをLB寒天プレートから拾い、100μlのdH２O中に配置し、5分間煮沸し、ついでそれぞれを室温に冷却した。Vent（Ｒ）（Exo-）ポリメラーゼを含有する50μlの反応液中の2.5μlの煮沸DNAを使用して、95℃ 10秒、62℃ 1’、72℃ 1’、30サイクルのコロニーPCRの条件を用いた。インサートを有するコロニーをCsCl精製し、同じプライマーで配列決定した。
【００４４】
これらの逆PCRクローンから、371bpの新規配列を得た。その追加的な371bpは、ATG開始コドンおよびそれに続く、元のクローン化ApoI断片に向かって収束する新規不完全体（ORF2）の55コドンを含有していた。snaBIR遺伝子の開始点は存在しなかった。HincII逆PCR断片からの該新規DNAの残りの部分は、隣接染色体DNA中の新たに見出したApoI部位のため、失われた。ORF2の54コドンは、この新たに見出したApoI部位におけるトランケート化SnaBI調節遺伝子（snaBIC）であることが判明した。調節遺伝子は、通常、エンドヌクレアーゼ遺伝子に先行するため、本発明者らは、snaBIRが、SnaBIメチラーゼ遺伝子（snaBIM）を含有する元のApoI断片に向かって収束するsnaBICの下流に位置するはずだと推論した。ついで、この欠落ApoI断片を越えてsnaBIMおよび該部分SsnaBIR（ORF1）を含有する元のApoI断片へ戻るPCRを行なうためのPCRプライマー（SninvAP）を設計した。以下の新たに設計したプライマー（SninvAP）を（SnaBI2）プライマーと共に使用して、スフェロチルス・ナタンス（Sphaerotilus natans）ゲノムDNA上でPCRを行なった。
【００４５】
5’ GGCGCGGCATCAATGTTTGAATAC 3’（SninvAP）（配列番号9）
5’ TTCGGATCCCCGGGCTCTCGGAGCCAATCATTGCGC 3’（SnaBI2）（配列番号10）
Vent（Ｒ）（Exo-）ポリメラーゼを使用して、95℃ 1’、54℃ 1’、72℃ 1’、30サイクルのPCR条件を用いた。約430bpのPCR断片を得た。それをBamHIで消化し、SmaIおよびBamHIで消化されたpUC19中に連結し、ついで大腸菌（E. coli）株ER2502中に形質転換し、Amp（100μg/ml）を含有するLB寒天上で増殖させた。94℃ 10秒、62℃ 1’、72℃ 1’、30サイクルのPCR条件で汎用pUC19プライマー#1233および#1224（New England Biolabs）を使用する10個のコロニーのコロニーPCRを、Vent（Ｒ）（Exo-）ポリメラーゼを使用して行なった。#8からのプラスミドDNAは、クローン化PCR（430bp）断片を含有していた。それをCsCl精製し、汎用pUC19プライマーを使用して配列決定した。配列決定は、残りの24aaのsnaBICおよびATGコドンおよび40aaのsnaBIRを示した。完全なsnaBIR遺伝子（ORF1）は、672bp長であり、24.5kDの推定分子量の223aaのタンパク質をコードしていることが判明した（図3）。
【００４６】
5．SnaBIメチラーゼ遺伝子のサブクローニング
完全なSnaBIエンドヌクレアーゼ遺伝子（snaBIR）をクローニングするために、SnaBIエンドヌクレアーゼによる消化に対して修飾された大腸菌（E.coli）株を、snaBIMを和合性pACYC184誘導体（pIH919）中にクローニングすることにより作製した。95℃ 1’、54℃ 1’、72℃ 1’、30サイクルのPCR条件および以下の2つのプライマー（SnaBI 5M）および（SnaBI 3M）を用い、Vent（Ｒ）ポリメラーゼを使用して、ゲノムDNAから全メチラーゼ遺伝子（687bp）を増幅した。
【００４７】
5’ TGGCCCGGGAAGGAGGTTTAAAATATGTTTTACTACGGCAGAAAAAAAC AAATCGC 3’（SnaBI 5M）（配列番号11）
5’ TTGCTGCAGTCACTACGCGACTAGCCTGAGTTGCATGGGC 3’（SnaBI 3M）（配列番号12）
ついで該PCR断片をPstIおよびXmaIで37℃で2時間消化し、ついで、PstIおよびXmaIで消化されたpIH919中に17℃で2時間連結した。該連結体を大腸菌（E. coli）ER2267中に形質転換し、該形質転換細胞を、クロラムフェニコール（25μg/ml）を含有するLB寒天上にプレーティングした。汎用pUC19プライマー（#1233）およびプライマー（SnaBI 5M）を94℃ 10秒、62℃ 1’、72℃ 1’、30サイクルのPCR条件で使用する8個のコロニーのコロニーPCRを、Vent&reg;（Exo-）ポリメラーゼを使用して行なった。2個の単離体（#3および#8）が、snaBIM PCR断片を含有していた。#3または#8［snaBIM-pIH919］を含有する大腸菌（E. coli）ER2502を、CaCl２法によりコンピテントにし、pSnaBI-2（2個のSnaBI部位を含有するpUC19誘導体）で形質転換した。それぞれに関する4個のコロニーからのプラスミドDNAを精製し、SnaBIエンドヌクレアーゼと共にインキュベートした。すべての場合において、pSnaBI-2はSnaBIエンドヌクレアーゼ消化に対して完全に保護された。ついで#8を大腸菌（E. coli）株ER2683中に形質転換し、標準的なCaCl２法によりコンピテントにした。
【００４８】
6．BsaAIメチラーゼ遺伝子のサブクローニング
1.9kb EcoRI断片を含有する10μgのbsaAIM-pUC19プラスミドを、10単位のSspIで37℃で60分間消化し、ゲル精製した。該bsaAIM含有SspI断片を、CIPで処理されたベクターpIH919のSmaI部位中に連結し、ついで大腸菌（E. coli）ER2502中に形質転換し、クロラムフェニコール（25μg/ml）を含有するLB寒天上にプレーティングした。プラスミドDNAを16個のコロニーから精製した。1個のコロニー（#8）がSnaBIエンドヌクレアーゼ消化に対して完全に保護されていることが示され、これは、BsaAIメチラーゼ遺伝子の発現を介したインビボでのSnaBI部位の修飾を示すものである。ついで#8をER2683中に形質転換し、CaCl２法によりコンピテントにした。
【００４９】
7．完全なSnaBI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
完全なsnaBIR（ORF1）のPCR増幅のために、2個のプライマーを合成した。Vent（Ｒ）ポリメラーゼおよび95℃ 1’、54℃ 1’、72℃ 1’、30サイクルのPCR条件および以下の2個のプライマー（SnaBI 5R）および（SnaBI 3R）を用いて、該遺伝子をゲノムDNAから増幅した。
【００５０】
5’ TTGTTCTGCAGTAAGGAGGTTTAAAATATGCTGAATTACAAGATTAATCC AGGACTC 3’（SnaBI 5R）（配列番号13）
5’ TTGGGATCCTCATGGAAATCTAAACCTCAAGATTCTGGAGTACGC 3’（SnaBI 3R）（配列番号14）
該PCR産物をPstIおよびBamHIで消化し、ついでゲル精製し、ついで、PstIおよびBamHIで消化されたpRRS中に17℃で一晩連結した。該連結体をER2683［pIH919-snaBIM］およびER2683［pIH919-bsaAIM］中に形質転換し、Amp（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/ml）を含有するLB寒天プレート上にプレーティングした。各形質転換に関する12個のコロニーからの10mlの細胞培養から、プラスミドDNAをミニプレパレーション（mini-preparation）により精製した。両方の大腸菌（E. coli）株がSnaBI消化に対して保護されていたが、ER2683［pIH919-bsaAIM］細胞だけが、SnaBIエンドヌクレアーゼ活性を有するsnaBIR PCR断片を含有するクローンを与えた。12個の単離体のうちの1個のクローン、すなわちER2683［pIH919-bsaAIM］の形質転換に由来する#33が、減少したエンドヌクレアーゼ活性を示した。ER2683［pIH919-snaBIM］は、pRRS中へのsnaBIR遺伝子の直接SnaBI染色体PCRによっては、活性なSnaBIエンドヌクレアーゼクローンを与えなかった。
【００５１】
また、snaBIR（ORF1）のプライマー（SnaBI 5R）および（SnaBI 3R）を使用した場合の同じPCR断片を、BsaAIで消化されゲル精製されたpCAB16中に17℃で一晩連結し、ついでER2502［pIH919-snaBIM］コンピテント大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換し、Amp（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/ml）を含有するLB寒天プレート上にプレーティングした。プラスミドDNAをミニプレパレーションにより15個のコロニーから精製し、PstIおよびBamHIで消化した。6個の単離体が、そのPCRで生成したsnaBIR断片を含有していた。4個のクローン（#1、#2、#4および#9）を配列決定した。「概要」および「詳細な説明」において既に記載したとおり、#1および#9は、snaBIRの正しいDNA配列を含有していたが、検出可能なSnaBIエンドヌクレアーゼ活性を有していなかった。配列決定したクローンはすべて、PlacおよびmspIRに対して逆配向であり、このことが、SnaBIエンドヌクレアーゼ活性を欠く原因となっている可能性がある。
【００５２】
8．大腸菌（E. coli）株ER2683［pIH919-snaBIM］におけるSnaBIエンドヌクレアーゼの発現
#1および#9 pCAB16-snaBIRクローンは、snaBIR用のPCRプライマー内に設計されたPstIおよびBamI部位を含有していたため、両方のプラスミドをPstIおよびBamHIで消化した。該snaBIRインサートをゲル精製し、PstIおよびBamHIで消化されたpRRS中にPlacプロモーターと直列に連結した。この連結反応物を再びER2683［pIH919-snaBIM］大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換した。合計16個の単離体（すなわち、#1および#9の各連結からの8個の単離体）からのプラスミドDNAを、ミニプレパレーションにより精製した。プラスミドDNAをPstIおよびBamHIで消化して、該snaBIRインサートを同定した。ついで各連結からの潜在的なクローンを、SnaBIエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。1個の単離体#12［pCAB16由来の、ゲル精製されたPstI/BamHI snaBIR+pRRS連結体］だけが、1グラム当たり5×10５単位未満の減少した活性を示した。これは、大腸菌（E. coli）ER2683［pIH919-snaBIM］において確立されたSnaBIエンドヌクレアーゼ活性を有する唯一のクローンであった。
【００５３】
9．大腸菌（E. coli）株ER2683［pIH919-bsaAIM］におけるSnaBIエンドヌクレアーゼの発現
SnaBIエンドヌクレアーゼをクローンから過剰産生させるためには、異種特異的メチラーゼ（M.BsaAI）の使用が必要であった。第7節に記載のとおり、全SnaBI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子（672bp）をゲノムDNAから増幅し、BsaAIで線状化されゲル精製されたpCAB16中に17℃で一晩連結し、ER2502［pIH919-snaBIM］コンピテント大腸菌（E. coli）細胞中に形質転換し、Amp（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/ml）を含有するLB寒天プレート上にプレーティングした。ついで、snaBIRの正しいDNA配列を含有する単離されたpCAB16 snaBIRクローン#1および#9を、PstIおよびBamHIで消化し、ゲル精製し、PstIおよびBamHIで消化されたpRRS中に連結し、ついで、Amp（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/ml）を含有するLB寒天プレート上にプレーティングされたコンピテント大腸菌（E. coli）株ER2683［pIH919-bsaAIM］中に形質転換した。各形質転換からの12個のコロニーに由来するプラスミドDNAを、合計24個のコロニーに関してミニプレパレーションにより単離した。全24個のクローンが、正しいサイズのインサートを含有しているらしかった。各プレートからの6個のクローンをPstIおよびBamHIで消化したところ、正しいサイズのsnaBIR断片を含有していることが判明した。6個のクローン（#1、#2、#6、#13、#15、#18）が、以下のとおりに37℃で成長させた一晩培養物から、SnaBIエンドヌクレアーゼに関する高い活性を示した。Amp（100μg/ml）およびクロラムフェニコール（25μg/ml）ならびに50mlのルリアブロスを含有するER2683［pIH919-bsaAIM, pRRS-snaBIR］培養を、37℃で一晩増殖させた。細胞を収穫し、4mlの音波処理緩衝液（100mM KCl, 10mM Tris pH7.0, 0.1mM EDTA, 10mM β-メルカプトエタノール）中に再懸濁した。細胞を音波処理により溶解した。残渣（debris）を除去するために遠心分離を行なった後、該粗製細胞抽出物を、以下のとおり、SnaBIエンドヌクレアーゼ活性に関してT7 DNA上で37℃でアッセイした。1μlの粗製抽出物を、T7 DNAを含有する反応緩衝液中で100倍希釈し、混合した。1μlを50μlに移し混合し、25μlを一連の6個のチューブで移し、15分間および1時間インキュベートした。SnaBIエンドヌクレアーゼ活性収率は、含水大腸菌（E. coli）細胞1グラム当たり約8×10６単位である。
【００５４】
ER2683［pHI919-bsaAIM, pRRS-snaBIR］（NEB#1166）を含有する大腸菌（E. coli）のサンプルは、ブダペスト条約の条項および条件に基づき、American Type Culture Collectionに1998年8月26日に寄託されており、ATCC受託第202166号を付与されている。
【００５５】
10．SnaBI制限エンドヌクレアーゼの精製
該組換えSnaBIエンドヌクレアーゼを、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術により精製した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  SnaBI制限−修飾系の遺伝子体制を示す。
【図２】  SnaBIメチラーゼ遺伝子（配列番号1）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号2）である。
【図３】  SnaBIエンドヌクレアーゼ遺伝子（配列番号3）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号4）である。
【図４】  SnaBI調節遺伝子（配列番号5）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号6）である。
【図５】  pIH919-BsaAIメチラーゼクローンのプラスミド地図を例示する。
【図６】  pCAB16のプラスミド地図を例示する。
【図７】  pRRS-SnaBIRエンドヌクレアーゼクローンのプラスミド地図を例示する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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