(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳由来神経栄養因子を有効成分とする歯周病の治療剤であって、歯周組織を再生させること、及び歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することを特徴とする、前記治療剤。
【請求項２】
セメント質を再生させることを特徴とする、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
歯周靭帯を再生させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
歯槽骨を再生させることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、歯周病や歯髄疾患の治療剤と治療方法、歯周組織再生用移植材、歯周組織の再生方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  歯肉、歯槽骨、歯周靱帯（歯根膜）、セメント質、歯髄等で構成される歯周組織は、歯牙を植立させ、咀嚼や咬合等の機能を維持させるための重要な組織であり、その損傷や破壊は歯の喪失につながる。例えば、日本国内に約３０００万人の患者が存在するといわれる歯周病においては、病気の進行と共に歯周組織の損傷や破壊が進み、歯を喪失する大きな原因となっている。損傷あるいは破壊された歯髄を含む歯周組織の治療には、医薬品投与や外科手術等、様々な方法が試みられているが、いずれの薬剤や治療方法も、損傷あるいは破壊された歯髄を含む歯周組織を再生させる効果は十分とはいえない。【０００３】  神経栄養因子には脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ３、ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン４／５（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ４／５、ＮＴ−４／５）があり、神経細胞の分化促進や生存維持、再生促進、機能維持に関与する。ＢＤＮＦとＮＴ−４／５はＴｒｋＢ（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）、ＮＧＦはＴｒｋＡ、ＮＴ−３はＴｒｋＣという高親和性レセプターに特異的に結合する。【０００４】  ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３は、主として脳内に存在する神経栄養因子であり、ＢＤＮＦとＮＧＦは運動神経障害モデル、パーキンソン病モデル、アルツハイマー病モデルなど、各種の疾患モデル動物を用いた実験で、有効性が証明されている。中でも、ＢＤＮＦは、運動・末梢神経疾患として筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病や化学療法剤による末梢神経障害など、また中枢神経系疾患としてアルツハイマー病、パーキンソン病、網膜関連疾患などの治療薬としての開発が期待されている。【０００５】  これらの神経栄養因子は、中枢神経系のみならず末梢神経系においても重要な役割を果たしていると言われている。マウス肋骨の骨折治癒過程においてＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＴｒｋＣ、ＴｒｋＡの発現が増加した（Ｋ．Ａｓａｕｍｉら、Ｂｏｎｅ  Ｖｏｌ  ２６，Ｎｏ．６，６２５−６３３，２０００）、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３がマウス歯周靱帯細胞の増殖を促進した（Ｙ．Ｔｓｕｂｏｉら、Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ８０，（３），８８１−８８６，２００１）等の報告もある。しかし、歯周組織や歯髄組織におけるこれらの神経栄養因子の働きについての詳しい報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の目的は、歯周病や歯髄疾患の治療剤と治療方法、歯周組織再生用移植材、歯周組織の再生方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、神経栄養因子が、ヒト歯周靱帯由来線維芽細胞の増殖を促進し、骨関連タンパク質のｍＲＮＡ発現を促進すること、イヌの根分岐部病変モデルにおいて歯周組織の再生を促進することを知得し、本発明を完成するに至った。【０００８】  すなわち、本発明によれば、神経栄養因子を有効成分とする、歯周病の治療剤が提供される。【０００９】  本発明の治療剤が、歯周組織を再生させることが好ましい。【００１０】  本発明の治療剤が、セメント質、歯周靭帯、歯槽骨または歯髄を再生させることが好ましい。【００１１】  本発明の治療剤が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。【００１２】  本発明の治療剤が、歯髄腔における修復象牙質の産生を促進することが好ましい。また、歯髄腔内壁への修復象牙質の添加を促進することが好ましい。【００１３】  本発明の治療剤において、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。【００１４】  本発明の別の側面によれば、神経栄養因子を含有する歯周組織再生用移植材が提供される。【００１５】  本発明の移植材が、歯周組織を再生させることが好ましい。【００１６】  本発明の移植材が、セメント質、歯周靭帯、歯槽骨または歯髄を再生させることが好ましい。【００１７】  本発明の移植材が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。【００１８】  本発明の移植材が、歯髄腔における修復象牙質の産生を促進することが好ましい。また、歯髄腔内壁への修復象牙質の添加を促進することが好ましい。【００１９】  本発明の移植材において、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。【００２０】  本発明のさらに別の側面によれば、神経栄養因子を使用する歯周組織の再生方法が提供される。【００２１】  本発明の再生方法が、歯周組織を再生させることが好ましい。【００２２】  本発明の再生方法が、セメント質、歯周靭帯、歯槽骨または歯髄を再生させることが好ましい。【００２３】  本発明の再生方法が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。【００２４】  本発明の再生方法において、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。【００２５】  本発明の別の側面によれば、歯周病の治療方法であって、そうした状態に罹患しているまたは罹患しやすい対象に治療有効量の神経栄養因子を投与することを含む、歯周病の治療法が提供される。【００２６】  本発明の治療法が、歯周組織を再生させることが好ましい。【００２７】  本発明の治療法が、セメント質、歯周靭帯、歯槽骨または歯髄を再生させることが好ましい。【００２８】  本発明の治療法が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。【００２９】  本発明の治療法が、歯髄腔における修復象牙質の産生を促進することが好ましい。また、歯髄腔内壁への修復象牙質の添加を促進することが好ましい。【００３０】  本発明の治療法において、神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。【００３１】  本発明のさらに別の側面によれば、歯周病の治療に使用する薬剤を製造するための神経栄養因子の使用が提供される。【００３２】  この薬剤が、歯周組織を再生させることが好ましく、セメント質、歯周靭帯、歯槽骨または歯髄を再生させることが好ましい。この薬剤が、歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止することが好ましい。この薬剤が、歯髄腔における修復象牙質の産生を促進することが好ましい。また、歯髄腔内壁への修復象牙質の添加を促進することが好ましい。神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。【００３３】  本発明のさらに別の側面によれば、神経栄養因子を有効成分とする、修復象牙質の形成促進剤が提供される。神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。修復象牙質が歯髄腔の内壁に添加されることが好ましい。【００３４】  本発明の別の側面によれば、歯髄疾患の治療方法であって、そうした疾患に罹患しているまたは罹患しやすい対象に、修復象牙質の形成を促進するために治療有効量の神経栄養因子を投与することを含む、歯髄疾患の治療法が提供される。神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。修復象牙質が歯髄腔の内壁へ添加されることが好ましい。【００３５】  本発明のさらに別の側面によれば、修復象牙質の形成を促進するために使用する薬剤を製造するための神経栄養因子の使用が提供される。神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン３、またはニューロトロフィン４／５であることが好ましい。修復象牙質が歯髄腔の内壁へ添加されることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＨＰＬ細胞およびヒト歯周靭帯における、ＢＤＮＦとＴｒｋＢとのｍＲＮＡ発現を示す電気泳動図である。各電気泳動図の、左端のレーンはマーカーである。（Ａ）は、ヒト歯周靭帯およびＨＰＬ細胞におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ（６１３ｂｐ）の発現を示す。（Ｂ）は、ヒト歯周靭帯におけるＢＤＮＦのｍＲＮＡ（４３８ｂｐ）とＴｒｋＢのｍＲＮＡ（４３４ｂｐ）の発現を示す。（Ｃ）は、ＨＰＬ細胞におけるＢＤＮＦとＴｒｋＢとのｍＲＮＡ発現を示す。
【図２Ａ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡ（３８１ｂｐ）の発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＨＰＬ細胞は、すべて最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図２Ｂ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＯＰＮのｍＲＮＡ（５３２ｂｐ）の発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＨＰＬ細胞は、すべて最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図２Ｃ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間と、ＢＭＰ−２のｍＲＮＡ（４４０ｂｐ）の発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＨＰＬ細胞は、すべて最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図２Ｄ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図である。ＨＰＬ細胞は、すべて最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。
【図３Ａ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＢＭＰ−４のｍＲＮＡ（３３９ｂｐ）の発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＨＰＬ細胞は、すべて最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。
【図３Ｂ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＯＰＧのｍＲＮＡ（７３６ｂｐ）の発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＨＰＬ細胞は、すべて最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。
【図４Ａ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの投与量とＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。各濃度のＢＤＮＦを、ＨＰＬ細胞に２４時間作用させた。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ投与量０のときのｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、各投与量におけるｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＢＤＮＦの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図４Ｂ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの投与量とＯＰＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。各濃度のＢＤＮＦを、ＨＰＬ細胞に１２時間作用させた。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ投与量０のときのｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、各投与量におけるｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＢＤＮＦの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図４Ｃ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの投与量とＢＭＰ−２のｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。各濃度のＢＤＮＦを、ＨＰＬ細胞に２４時間作用させた。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ投与量０のときのｍＲＮＡ発現量を１とした場合の、各投与量におけるｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＢＤＮＦの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図４Ｄ】ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの投与量とＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ（６１３ｂｐ）発現量との関係を示す電気泳動図である。
【図５】（Ａ）は、ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの投与量とＯＰＮの分泌量の関係を示すグラフである。各濃度のＢＤＮＦを、ＨＰＬ細胞に１２時間作用させた。縦軸にＯＰＮの分泌量（ｎｇ／ｍｌ）、横軸にＢＤＮＦの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。（Ｂ）は、ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの投与量とＢＭＰ−２の分泌量の関係を示すグラフである。各濃度のＢＤＮＦを、ＨＰＬ細胞に、２４時間作用させた。縦軸にＢＭＰ−２の分泌量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸にＢＤＮＦの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。（Ｃ）は、ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＢＭＰ−２の分泌量の関係を示すグラフである。細胞は最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。縦軸にＢＭＰ−２の分泌量（ｐｇ／ｍｌ）、横軸にＢＤＮＦの作用時間を示す。（Ａ）〜（Ｃ）の各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図６】ＢＤＮＦの投与量とＨＰＬ細胞およびＨＧＫのＤＮＡ合成能との関係を示すグラフである。各濃度のＢＤＮＦを、ＨＰＬ細胞およびＨＧＫに２４時間作用させた。各グラフの縦軸は、ＢＤＮＦあるいはｂＦＧＦ非投与（つまりＢＤＮＦ濃度０あるいはｂＦＧＦ濃度０）のときのＤＮＡ合成能を１００としたときの、各投与量におけるＤＮＡ合成能の割合を示している。横軸はＢＤＮＦまたはｂＦＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。（Ａ）はＨＰＬ細胞におけるＤＮＡ合成能を示し、（Ｂ）はＨＧＫにおけるＤＮＡ合成能を示す。
【図７】（Ａ）は、ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの投与量とＩ型コラーゲンの合成量との関係を示すグラフである。各濃度のＢＤＮＦを、ＨＰＬ細胞に２４時間作用させた。縦軸にＩ型コラーゲンの合成量（μｇ／ｍｌ）、横軸にＢＤＮＦの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。（Ｂ）は、ＨＰＬ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＩ型コラーゲン合成量の関係を示すグラフである。細胞は最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。縦軸にＩ型コラーゲン合成量（μｇ／ｍｌ）、横軸にＢＤＮＦの作用時間を示す。（Ａ）、（Ｂ）の各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図８】イヌの３級根分岐部病変モデルにおける、ＢＤＮＦの投与量とセメント質および歯槽骨の再生との関係を示すグラフである。縦軸にセメント質再生率（％）または骨再生率（％）を示し、横軸にＢＤＮＦの濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１の統計学的有意差を示す（ｔ−ｔｅｓｔ）。（Ａ）はセメント質再生率との関係を示し、（Ｂ）は骨再生率との関係を示す。
【図９Ａ】実施例２で作成された、ＢＤＮＦを含まないテルプラグを填塞した根分岐部骨欠損部位（対照群）のヘマトキシリン・エオジン染色標本の光学顕微鏡像（倍率２０倍）である。
【図９Ｂ】実施例２で作成された、ＢＤＮＦ（５μｇ／ｍｌ）を含む移植材を填塞した分岐部骨欠損部位の顕微鏡像（倍率２０倍）である。
【図１０】図９Ｂの根分岐部直下の部分拡大像である（倍率２００倍）。根分岐部直下において、裸出させた歯根面のほとんどの部分でコラーゲン線維を埋入したセメント質が再生しており、上皮の進入も見られなかった。
【図１１Ａ】ＨＰＬ細胞における、ＮＧＦのｍＲＮＡ発現量を示す放射活性のバンドとグラフである。グラフ縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するＮＧＦのｍＲＮＡ発現量の割合を示す。グラフ中、ＨＧＦは歯肉線維芽細胞、ＨＰＣは歯髄細胞、ＨＳＦは包皮由来線維芽細胞、ＨＮＢはヒト神経芽細胞腫細胞を示す。
【図１１Ｂ】ＨＰＬ細胞における、ＴｒｋＡのｍＲＮＡ発現量を示す放射活性のバンドとグラフである。グラフ縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対するＴｒｋＡのｍＲＮＡ発現量の割合を示す。グラフ中、ＨＧＦは歯肉線維芽細胞、ＨＰＣは歯髄細胞、ＨＳＦは包皮由来線維芽細胞、ＨＮＢはヒト神経芽細胞腫細胞を示す。
【図１２】ＨＰＬ細胞におけるＯＰＮのｍＲＮＡ発現量に及ぼす、ＮＧＦの影響を示すグラフである。（Ａ）はＮＧＦの経時効果の測定結果を示すグラフであり、グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各作用時間におけるＯＰＮのｍＲＮＡ発現量の割合を示す。グラフ横軸はＮＧＦの作用時間を示す。すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。（Ｂ）は濃度効果の測定結果を示すグラフである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ濃度０におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各濃度におけるＯＰＮのｍＲＮＡ発現量の割合を示す。横軸はＮＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。ＮＧＦはすべて２４時間作用させた。
【図１３】ＨＰＬ細胞におけるＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量に及ぼす、ＮＧＦの影響を示すグラフである。（Ａ）はＮＧＦの経時効果の測定結果を示すグラフであり、グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０におけるＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各作用時間におけるＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量の割合を示す。グラフ横軸はＮＧＦの作用時間を示す。（Ｂ）は濃度効果の測定結果を示すグラフである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ濃度０におけるＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各濃度におけるＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡ発現量の割合を示す。横軸はＮＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図１４】ＨＰＬ細胞におけるＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量に及ぼす、ＮＧＦの影響を示すグラフである。（Ａ）はＮＧＦの経時効果の測定結果を示すグラフであり、グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０におけるＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各作用時間におけるＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量の割合を示す。グラフ横軸はＮＧＦの作用時間を示す。（Ｂ）は濃度効果の測定結果を示すグラフである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ濃度０におけるＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各濃度におけるＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量の割合を示す。横軸はＮＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図１５】ＮＧＦの投与量とＨＰＬ細胞およびＨＧＫのＤＮＡ合成能との関係を示すグラフである。各濃度のＮＧＦを、ＨＰＬ細胞およびＨＧＫに２４時間作用させた。各グラフの縦軸は、ＮＧＦ濃度０におけるＤＮＡ合成能を１００としたときの、ＮＧＦ各投与量におけるＤＮＡ合成能の割合を示している。横軸はＮＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。（Ａ）はＨＰＬ細胞におけるＤＮＡ合成能を示し、（Ｂ）はＨＧＫにおけるＤＮＡ合成能を示す。
【図１６Ａ】ＨＰＬ細胞における、ＮＴ−３のｍＲＮＡ発現量を示す放射活性のバンドとグラフである。グラフ縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を１としたときのＮＴ−３のｍＲＮＡ発現量の割合を示す。グラフ中、ＨＧＦは歯肉線維芽細胞、ＨＰＣは歯髄細胞、ＨＳＦは包皮由来線維芽細胞、ＨＮＢはヒト神経芽細胞腫細胞を示す。
【図１６Ｂ】ＨＰＬ細胞における、ＴｒｋＣのｍＲＮＡ発現量を示す放射活性のバンドとグラフである。グラフ縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を１としたときのＴｒｋＣのｍＲＮＡ発現量の割合を示す。グラフ中、ＨＧＦは歯肉線維芽細胞、ＨＰＣは歯髄細胞、ＨＳＦは包皮由来線維芽細胞、ＨＮＢはヒト神経芽細胞腫細胞を示す。
【図１７】ＨＰＬ細胞における、ＮＴ−３の投与量とＡＬＰａｓｅ活性との関係を示すグラフである。グラフ縦軸はＡＬＰａｓｅ活性（ｎｍｏｌ／ウェル）を示し、横軸はＮＴ−３濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図１８】ＨＰＬ細胞における、ＮＴ−３の投与量とＨＰＬ細胞のＤＮＡ合成能との関係を示すグラフである。グラフの縦軸は、ＮＴ−３各濃度におけるＨＰＬ細胞のＤＮＡ合成能を吸光度で比較したものである。横軸はＮＴ−３濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図１９Ａ】ＨＰＬ細胞における、ＮＴ−４／５の作用時間とＯＰＮ、ＯＣＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＮＴ−４／５の最終濃度は５０ｎｇ／ｍｌとした。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。各グラフ縦軸は、ＮＴ−４／５の作用時間０のときの各ｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、各作用時間における各ｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＮＴ−４／５の作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。
【図１９Ｂ】ＨＰＬ細胞における、ＮＴ−４／５の作用時間とＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７のｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＮＴ−４／５の最終濃度は５０ｎｇ／ｍｌとした。電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。各グラフ縦軸は、ＮＴ−４／５の作用時間０のときの各ｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、各作用時間における各ｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＮＴ−４／５の作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。
【図１９Ｃ】ＨＰＬ細胞におけるＮＴ−４／５の作用時間とＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフ、およびＮＴ−４／５の作用時間とＧＡＰＤＨの発現量との関係を示す電気泳動図である。ＮＴ−４／５の最終濃度は５０ｎｇ／ｍｌとした。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＴ−４／５の作用時間０のときのｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の割合を示す。横軸は、ＮＴ−４／５の作用時間を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊はｐ＜０．０５を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。
【図２０】ＨＰ細胞の各骨関連タンパク質（ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＤＳＰＰ、ＯＰＮ、ＯＣＮ）のｍＲＮＡ発現に対する、ＮＧＦの濃度効果の測定結果を示すグラフである。ＮＧＦの作用時間は２４時間である。各グラフ縦軸は、ＮＧＦ濃度０におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各濃度における各ｍＲＮＡ発現量の割合を示す。横軸はＮＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。
【図２１】ＨＰ細胞の各骨関連タンパク質（ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＤＳＰＰ、Ｉ型コラーゲン、ＯＰＮ、ＯＣＮ）のｍＲＮＡ発現に対する、ＢＤＮＦの濃度効果の測定結果を示すグラフである。各グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ濃度０における各ｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各濃度におけるｍＲＮＡ発現量の割合を示す。横軸はＢＤＮＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。
【図２２】ＨＰ細胞の各骨関連タンパク質（ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＤＳＰＰ、ＯＰＮ、ＯＣＮ）のｍＲＮＡ発現に対する、ＮＴ−３の濃度効果の測定結果を示すグラフである。各グラフ縦軸は、ＮＴ−３濃度０におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各濃度における各ｍＲＮＡ発現量の割合を示す。横軸はＮＴ−３濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。
【図２３】ＨＰ細胞の各骨関連タンパク質（ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＤＳＰＰ、Ｉ型コラーゲン、ＯＰＮ、ＯＣＮ）のｍＲＮＡ発現に対する、ＮＴ−４／５の濃度効果の測定結果を示すグラフである。各グラフ縦軸は、ＮＴ−４／５濃度０におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、各濃度における各ｍＲＮＡ発現量の割合を示す。横軸はＮＴ−４／５濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。
【図２４】各神経栄養因子（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５）の投与量とＨＰ細胞のＤＮＡ合成能との関係を示すグラフである。各濃度の神経栄養因子を、ＨＰ細胞に２４時間作用させた。各グラフの縦軸は、神経栄養因子非投与（つまり神経栄養因子の濃度０）のときの吸光度を１００としたときの、各投与量における吸光度の割合を示している。横軸は各神経栄養因子の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。
【図２５Ａ】ＨＭＳ細胞における、ＮＧＦの作用時間とＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。コントロールであるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＧＦの作用時間を示す。
【図２５Ｂ】ＨＭＳ細胞における、ＮＧＦの作用時間とＯＣＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＧＦの作用時間を示す。
【図２５Ｃ】ＨＭＳ細胞における、ＮＧＦの作用時間とＯＰＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＧＦの作用時間を示す。
【図２５Ｄ】ＨＭＳ細胞における、ＮＧＦの作用時間とＢＳＰのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＧＦの作用時間を示す。
【図２５Ｅ】ＨＭＳ細胞における、ＮＧＦの作用時間とＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＧＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＧＦの作用時間を示す。
【図２６Ａ】ＨＭＳ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。
【図２６Ｂ】ＨＭＳ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＯＣＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。
【図２６Ｃ】ＨＭＳ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＯＰＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。
【図２６Ｄ】ＨＭＳ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＢＳＰのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。
【図２６Ｅ】ＨＭＳ細胞における、ＢＤＮＦの作用時間とＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＢＤＮＦ作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＢＤＮＦの作用時間を示す。
【図２７Ａ】ＨＭＳ細胞における、ＮＴ−３の作用時間とＡＬＰａｓｅのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３で処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＴ−３作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＴ−３の作用時間を示す。
【図２７Ｂ】ＨＭＳ細胞における、ＮＴ−３の作用時間とＯＣＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３で処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＴ−３作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＴ−３の作用時間を示す。
【図２７Ｃ】ＨＭＳ細胞における、ＮＴ−３の作用時間とＯＰＮのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３で処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＴ−３作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＴ−３の作用時間を示す。
【図２７Ｄ】ＨＭＳ細胞における、ＮＴ−３の作用時間とＢＳＰのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３で処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＴ−３作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＴ−３の作用時間を示す。
【図２７Ｅ】ＨＭＳ細胞における、ＮＴ−３の作用時間とＩ型コラーゲンのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図とグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量との関係を示す電気泳動図も示す。ＨＭＳ細胞は、すべて最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３で処理した。各電気泳動図の左端のレーンはマーカーである。グラフ縦軸は、ＮＴ−３作用時間０のｍＲＮＡ発現量を１００％としたときの、各作用時間におけるｍＲＮＡの発現量の百分率を示す。横軸は、ＮＴ−３の作用時間を示す。
【図２８】ＨＭＳ細胞の増殖に及ぼすアスコルビン酸（Ａａ）、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３の効果を示すグラフである。グラフの縦軸は、対照群に対する試験群の吸光度の百分率を示す。各棒グラフのバーは、平均値±標準偏差の範囲を表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。
【図２９Ａ】実施例８で作成された、ＮＧＦ（１００μｇ／ｍｌ）を含む移植材を填塞した根分岐部骨欠損部の光学顕微鏡像（倍率２０倍）である。
【図２９Ｂ】実施例８で作成された、ＮＴ−３（１００μｇ／ｍｌ）を含む移植材を填塞した根分岐部骨欠損部の光学顕微鏡像（倍率２０倍）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】  以下、本発明のより具体的な態様、並びに本発明を実施するための方法につき説明する。【００３８】  本明細書において「歯周組織」とは、歯肉、歯槽骨、歯周靱帯（歯根膜）、セメント質で構成される組織を意味する。【００３９】  「歯肉」とは、歯頚部と歯槽骨の一部を被覆している軟組織で、歯肉上皮と歯肉固有層とからなる。【００４０】  「歯周靭帯」とは、歯槽骨とセメント質の間に介在している結合組織のことであり、歯根膜とも呼ばれる。【００４１】  「歯槽骨」は、歯根を取り巻いている歯槽壁の緻密質の部分に相当する固有歯槽骨と、さらにその外側に位置する海綿質と緻密質の部分からなる支持歯槽骨とに区分される。【００４２】  「セメント質」は、歯根の最表層の硬組織であり、セメント細胞を有する有細胞性セメント質とセメント細胞を有さない無細胞性セメント質とに区分される。【００４３】  「歯髄」は、歯の生活反応を司る組織で、生理的、病的刺激に反応して、象牙質を形成する。歯髄細胞、神経線維、細胞外基質、血管などから構成される。【００４４】  「再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」とは、喪失組織、破壊された組織や損傷組織の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）および再構築（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のことであり、「歯周組織の再生」とは、歯周組織を元の状態に回復させ機能させることである。【００４５】  「修復（ｒｅｐａｉｒ）」とは、創傷部の構造と機能がいまだ完全な状態では回復していない組織の治癒のことであり、「歯周組織の修復」には、歯根表面への上皮性付着などが含まれる。【００４６】  「歯肉上皮の歯根面根尖方向への進入を防止する」とは、歯肉上皮細胞が歯根面に沿って根尖側に向かって増殖していくことを防ぐことを意味する。【００４７】  「歯周組織再生用移植材」とは、歯周組織の再生を促す材料のことである。ＢＤＮＦ等の神経栄養因子を所定の生体部位（歯槽骨の欠損部位など）に一定の濃度で作用させるためには、何らかの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）が必要である。こうした足場となる材料とＢＤＮＦ等の神経栄養因子を組合わせたものが本願の移植材である。【００４８】  「歯周病」とは、局所の細菌等を原因として起こる歯周組織の炎症性疾患を意味する。【００４９】  「修復象牙質」とは、外来刺激を受けた結果形成された象牙質を意味する。【００５０】  「歯髄疾患」とは、歯髄の炎症性疾患、退行変性などを意味する。【００５１】  本発明は、ヒトなどの温血動物において、特に好ましくはヒトに適用される。【００５２】  本発明に使用する神経栄養因子、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５等は、遺伝子組換えや化学合成などで人工的に製造したものでも天然型（ｎａｔｉｖｅ）でもよい。【００５３】  本発明の歯周病治療剤は、外用剤などによる局所投与が好ましい。シリンジ等に充填し、歯周ポケット内に注入してもよい。また、歯周外科治療の際に、歯周組織の欠損部に投与することも可能である。その場合には、長時間一定の濃度で作用させるために、本発明の治療剤をシートやスポンジなどに吸収させて使用することも好ましい。感染した歯周組織を除去してから投与することが好ましい。本発明の治療剤は注射により局所投与することも可能であ��。例えば、歯周ポケット部の歯肉に注射してもよいし、歯槽骨頂付近の歯根膜腔に注射してもよい。根尖部付近に注射してもよい。【００５４】  本発明の修復象牙質形成促進剤は、外用剤などによる局所投与が好ましい。例えば、露髄部に、液状、クリーム状、ペースト状などの修復象牙質形成促進剤を適用しても良いし、断髄や抜髄に適用しても良い。活性成分を吸収させたシートやスポンジを適用し、一定期間仮封しても良い。あるいは外傷等で脱落した歯牙を再植する際に根尖部等に適用しても良い。【００５５】  本発明の歯周病治療剤と修復象牙質形成促進剤の剤型としては、通常の製剤方法により、製剤的に許容しうる担体または希釈剤などを使用して製造されるクリーム剤、軟膏剤、ローション剤等の外用剤の他、例えば水系の溶剤を主成分とした注射剤などが挙げられる。粉末状の剤型として、使用直前に精製水などの溶解液に溶解して使用することも可能である。【００５６】  本発明の歯周病治療剤と修復象牙質形成促進剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、症状等により異なるが、局所投与においては、通常１歯あたり、神経栄養因子として１×１０−１２ｇ〜１×１０−３ｇ、特に１×１０−１１ｇ〜１×１０−７ｇ、さらに特に１×１０−１０ｇ〜１×１０−８ｇであることが好ましい。一般に、注射で局所投与する場合は外用薬よりも少ない投与量でよい。【００５７】  本発明の移植材は、１つの根分岐部欠損に使用する量あたり、１×１０−１２ｇ〜１×１０−３ｇ、特に１×１０−１１ｇ〜１×１０−８ｇ、さらに特に１×１０−１０ｇ〜１×１０−９ｇの神経栄養因子を含むことが好ましい。【００５８】  本発明の歯周病治療剤、修復象牙質形成促進剤や移植材は、その有効性を妨げない限り、他の薬剤と組合わせて使用してもよい。ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５を互いに組合わせて使用してもよい。骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、歯周靱帯由来線維芽細胞、歯肉線維芽細胞、血管内皮細胞等と組み合わせて使用してもよい。水酸化カルシウム製剤、抗菌剤などと併用してもよい。【００５９】  本発明の移植材において神経栄養因子と組合わせる材料としては、神経栄養因子を投与局所に維持できる生体為害性のない材料であればよいが、例えば、多孔性のシートやスポンジなどが好ましい。生体分解性タンパク材料（コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、プレートレット・リッチ・プラズマ（ＰＲＰ））や組織吸収性材料（ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、三リン酸カルシウム（ＴＰＣ））であれば、後に摘出する必要がないためさらに好ましい。例えば、テルプラグ（商品名）（テルモ株式会社）、ジーシーメンブレン（商品名）（株式会社ジーシー）、オスフェリオン（商品名）（オリンパス株式会社）等がある。
【実施例】
【００６０】  以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。【００６１】  （実施例１）
ヒト歯周靱帯由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ、ＨＰＬ細胞）およびヒト歯肉上皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＧＫ）に及ぼすＢＤＮＦの影響を検討した。【００６２】  （１）使用細胞
（ｉ）ヒト歯周靱帯由来線維芽細胞（ＨＰＬ細胞）
矯正治療のために便宜的に抜歯された健全なヒト小臼歯の歯周靭帯から、ＨＰＬ細胞を分離した。歯周靭帯周囲の他の結合組織からの細胞の混入を防ぐため、抜去ヒト小臼歯の歯頚部、根尖部を除く歯根中央部の健康な歯周靭帯を、メスを用いて剥離し、細切した。細切した組織を、直径６０ｍｍの細胞培養用シャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ、ＮＹ）に貼り付け、３７℃、５％ＣＯ２気相条件で培養した。培地は、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）（明治製菓、東京）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（明治製菓）、およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍｌ）（ＧＩＢＣＯ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、日水製薬、東京）を使用した（ここで使用した培地を「培地Ａ」と記す）。４〜８代継代したＨＰＬ細胞を以下の実験に供した。【００６３】  （ｉｉ）ヒト歯肉上皮細胞（ＨＧＫ）
ヒト培養細胞を用いた実験の必要性および歯肉の使用目的などを患者に十分説明し、患者の同意を得た後に、歯肉の提供を受けた。智歯周囲炎の患者から、原因となった智歯を抜歯する際に、余剰の歯肉弁から歯肉片を獲得した。得られた歯肉片を、４℃で一昼夜、０．０１％エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）と０．０２５％トリプシンを含むダルベッコＰＢＳ（−）（ＰＢＳ（−），日水製薬）で処理して、ＨＧＫを分離した。ウシインシュリン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｒｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、２−メルカプトエタノール（１０μＭ）、２−アミノエタノール（１０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（１０μＭ）、牛下垂体抽出液（５０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびアンホテリシンＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ）で初代培養を行った（ここで使用した培地を「培地Ｃ」と記す）。培養は、ウシＩ型コラーゲンがコートされた直径６０ｍｍのシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１、住友ベークライト、東京）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２気相条件で行った。３〜４代継代したＨＧＫを以下の実験に供した。【００６４】  （２）ＨＰＬ細胞におけるＢＤＮＦとそのレセプターの発現
ＨＰＬ細胞およびヒト歯周靭帯におけるＢＤＮＦとＴｒｋＢのｍＲＮＡ発現を、１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を使用して、逆転写ＰＣＲ法で調べた。【００６５】  上記（１）（ｉ）で得られたＨＰＬ細胞がコンフルエントになった時点で細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン、東京）にて細胞を溶解させた後、クロロホルムを加えて遠心分離し、得られた水相にイソプロパノールを加えて総ＲＮＡを抽出した。【００６６】  上記（１）（ｉ）で得られたヒト歯周靭帯をＩＳＯＧＥＮ中でホモジナイズした後、クロロホルムを加えて遠心分離し、得られた水相にイソプロパノールを加えて総ＲＮＡを抽出した。【００６７】  精製した総ＲＮＡのうち１μｇの各ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマ−を用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ反応３０サイクルにて増幅させた後、１．５％アガロースゲルに泳動した。コントロールとしてはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を使用した。【００６８】  結果を図１に示す。コントロールとしてはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を使用した。図から明らかなように、ヒト歯周靭帯においてＢＤＮＦとＴｒｋＢのｍＲＮＡの発現がみられ、そのヒト歯周靱帯より分離、培養したＨＰＬ細胞においても、ＢＤＮＦとＴｒｋＢのｍＲＮＡが発現していることが確認された。【００６９】  （３）細胞のＢＤＮＦでの処理
（ｉ）ＨＰＬ細胞
上記（１）（ｉ）で得られたＨＰＬ細胞を、ウシＩ型コラーゲンがコートされた直径６０ｍｍのシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１）に、１シャーレあたり３．５×１０５個で、５０μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸を含む培地Ａを用いて、３７℃、５％ＣＯ２気相条件で１３日間培養した（ここで使用した培地を「培地Ｂ」と記す）。培地は２日に１回交換した。１４日目の培養終了前０、３、６、１２または２４時間において、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、最終濃度０、１、１０、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＢＤＮＦ、Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を含む無血清培地（ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（１μｇ／ｍｌ）（ＧＩＢＣＯ）、およびＬ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ）（ここで使用した培地を「培地Ｄ」と記す）に交換した。【００７０】  （ｉｉ）ＨＧＫ
上記（１）（ｉｉ）で得られたＨＧＫを、ウシＩ型コラーゲンがコートされた９６穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１プレート９６Ｆ、住友ベークライト）に、２×１０３個／ウェルで接種し、３７℃、５％ＣＯ２気相条件で、培地Ｃを用いて培養した。培地は２日に１回交換した。細胞増殖期にあたる培養４〜５日目に、プレートの細胞をＭＣＤＢ１５３培地で２回洗浄し、最終濃度０、１、１０、２５、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを含む培地（牛下垂体抽出液を含まないこと以外は培地Ｃと同一の組成の培地）に交換し、２４時間培養した。【００７１】  （４）ＨＰＬ細胞における骨関連タンパク質の発現
（ｉ）ｍＲＮＡの発現
上記（３）（ｉ）に記載の方法と同様にして、最終濃度０、１、１０、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦで処理したＨＰＬ細胞から、ＩＳＯＧＥＮを用いて総ＲＮＡを抽出し、精製した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）、骨形成タンパク−２（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２、ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク−４（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４、ＢＭＰ−４）、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＯＰＮ）、オステオプロテジェリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＯＰＧ）のｍＲＮＡ発現量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、東京）を用いて、ＰＣＲプロダクトの生成過程をリアルタイムでモニタリングし、定量的に解析した（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法）。コントロールとしてはＧＡＰＤＨを使用した。【００７２】  各骨関連タンパク質のｍＲＮＡ発現に対する、ＢＤＮＦの経時効果測定の結果を図２Ａ〜２Ｃ、３Ａ、３Ｂに、濃度効果測定の結果を図４Ａ〜４Ｃに示す。各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。【００７３】  これらの図から明らかなように、ＢＤＮＦはＯＰＧ、ＢＭＰ−４のｍＲＮＡ発現に影響を及ぼさなかったが、ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＯＰＮのｍＲＮＡ発現量を濃度および時間依存的に増加させた。【００７４】  （ｉｉ）タンパク質の発現
上記（１）（ｉ）で得られたＨＰＬ細胞を、ウシＩ型コラーゲンがコートされた４８穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１プレート  ４８Ｆ、住友ベークライト）に、１×１０４個／ウェルで播種し、培地Ｂを用いて１３日間培養した。培地は２日に１回交換した。１４日目の培養終了２４時間前に、プレートの細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、最終濃度０、１、１０、２５、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを含む無血清培地Ｄに交換した。培養終了後に、上清を回収し、上清中の分泌ＯＰＮ量、分泌ＢＭＰ−２量を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。分泌ＯＰＮ量の測定にはサンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ、群馬）を、分泌ＢＭＰ−２量の測定にはサンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。【００７５】  図５に、ＨＰＬ細胞の分泌ＯＰＮ量と分泌ＢＭＰ−２量に対する、ＢＤＮＦの経時効果測定および濃度効果測定の結果を示す。各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。図５から明らかなように、ＢＤＮＦは、ＨＰＬ細胞におけるＯＰＮとＢＭＰ−２の分泌を促進した。【００７６】  （５）ＨＰＬ細胞とＨＧＫの増殖
ＨＰＬ細胞とＨＧＫのＤＮＡ合成能に及ぼすＢＤＮＦの影響を、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ２（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、ＥＬＩＳＡ法で測定した。【００７７】  上記（１）（ｉ）で得られたＨＰＬ細胞を、ウシＩ型コラーゲンがコートされた９６穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１プレート９６Ｆ）に、５×１０３個／ウェルで播種し、培地Ｂを用いて１０日間培養した。細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、１０％ＦＢＳの代わりに０．３％ＦＢＳを添加した培地Ｂで２４時間培養した後、同じ培地にＢＤＮＦを最終濃度０、１、１０、２５、５０又は１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して調製した培地と交換し、さらに２４時間培養した。培養終了の２時間前（つまりにＢＤＮＦ添加の２２時間後）に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに添加して、細胞に取り込ませた。培養は３７℃、５％ＣＯ２気相条件下で行った。【００７８】  上記（１）（ｉｉ）で得られたＨＧＫを、上記（３）（ｉｉ）と同一の方法で培養し、ＢＤＮＦで処理した。培養終了の２時間前（つまりにＢＤＮＦ添加の２２時間後）に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに添加して、細胞に取り込ませた。【００７９】  培養終了後、ＨＰＬ細胞とＨＧＫを固定した後、ブロッキングを行い、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体を室温で２時間作用させ、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンシジン）基質を加え、波長４５０ｎｍにおける吸光度を吸光度計（ＭＩＣＲＯ  ＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ、ＴＯＳＯＨ）で測定した。コントロールとして、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を最終濃度０、０．３、１、３、５、１０ｎｇ／ｍｌで２４時間作用させた細胞を同様に処理して、ＤＮＡ合成能を測定した。【００８０】  結果を図６に示す。（Ａ）はＨＰＬ細胞に対する効果を示すグラフであり、（Ｂ）はＨＧＫに対する効果を示すグラフである。なお、各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。【００８１】  図６から明らかなように、ＢＤＮＦはＨＰＬ細胞のＤＮＡ合成能を促進させたのに対し、ＨＧＫのＤＮＡ合成能には影響を及ぼさなかった。【００８２】  （６）ＨＰＬ細胞のコラーゲン合成
上記（１）（ｉ）で得られたＨＰＬ細胞をウシＩ型コラーゲンをコートした４８穴プレートに播種し、培地Ｂを用いて１３日間培養した。培地は２日に１回交換した。１４日目の培養終了前０、３、６、１２または２４時間、プレートの細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、最終濃度０、１、１０、２５、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを含む無血清培地Ｄに交換した。【００８３】  Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＰ）ＥＩＡ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を使用して、ＥＬＩＳＡ法でＨＰＬ細胞のコラーゲン合成量を測定した。Ｉ型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（ＰＩＰ）に特異的なモノクローナル抗体（ペルオキシダーゼ標識）を用いて、ＨＰＬ細胞培養上清中のコラーゲン合成量を、波長４５０ｎｍにおける吸光度を吸光度計（ＭＩＣＲＯ  ＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ）で測定した。【００８４】  結果を図７に示す。（Ａ）はＢＤＮＦのＩ型コラーゲン合成への濃度効果測定の結果を示し、（Ｂ）は経時効果測定の結果を示す。図７から明らかなように、ＢＤＮＦはＨＰＬ細胞のＩ型コラーゲン合成量を増加させた。
（実施例２）
ビーグル犬の３級根分岐部病変モデルにおけるＢＤＮＦの効果を検討した。【００８５】  直径８ｍｍ×５ｍｍのテルプラグ（商品名）（テルモ）に、濃度５、２５、５０μｇ／ｍｌのＢＤＮＦ溶液（滅菌生理食塩液中）の２５μｌをしみこませ、移植材とした。【００８６】  ７頭の雌ビーグル犬（１２〜２０ヵ月齢、体重１０〜１４ｋｇ）を、ドミトール（明治製菓）筋注による鎮静下に、全顎的にハンドスケーラーでスケーリングを行った。以後２日に１回の割合でブラッシングとポビドンヨードを有効成分とする含嗽薬であるイソジン（商品名）（明治製菓）による口腔清掃とを１ヵ月行い、臨床的に健康な歯周組織の状態を確立した。【００８７】  これらのビーグル犬に、ペントバルビタール系麻酔剤の静脈内注射により、全身麻酔を施し、左右両側下顎頬側歯肉に浸潤麻酔を行い、第一小臼歯遠心から第一大臼歯近心にかけての歯肉溝切開を行い、歯肉を剥離し粘膜骨膜弁を形成した。次いで、左右両側第二、第三、第四小臼歯の根分岐部歯槽骨をラウンドバーと骨ノミで削除し、根分岐部３級（Ｌｉｎｄｈｅ  ＆  Ｎｙｍａｎの分類による）の骨欠損を作成した。骨欠損の大きさは、未処置の根分岐部直下から約４ｍｍ根尖側寄りまでとした。【００８８】  露出させた歯根面の残存セメント質をハンドスケーラーで除去した後、根分岐部骨欠損内を生理食塩液で十分洗浄して削片を洗い流し、１ヵ所あたり直径８ｍｍ×５ｍｍのテルプラグ移植材を填塞した。ＢＤＮＦを含まない、滅菌生理食塩液２５μｌのみをしみこませた直径８ｍｍ×５ｍｍのテルプラグ移植材を填塞して、コントロールとした。【００８９】  手術６週間後に、ペントバルビタール系麻酔剤の静脈内注射による全身麻酔下で、４％パラホルムアルデヒドで全身を灌流固定した。灌流固定後、下顎を切断し、処理した歯及び歯周組織を一塊として摘出した。得られた標本を、４％パラホルムアルデヒドで１日浸漬固定後、１０％ＥＤＴＡにて脱灰を行い、通法に従いアルコール脱水しパラフィンに包埋した。この標本から、近遠心方向に歯軸と平行な切片（厚さ約５μｍ）を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。【００９０】  作成した組織標本のなかで、近遠心方向歯軸に平行でしかも根中央付近で薄切された標本を選択し、光学顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００、ＮＩＫＯＮ）で組織観察と計測を行った。骨再生率は、裸出させた根分岐部欠損の面積に対する再生歯槽骨の面積の割合（百分率）として表した。セメント質再生率は、裸出させた歯根面の長さに対する、再生セメント質の長さの割合（百分率）として表した。【００９１】  結果を図８、９Ａ、９Ｂ、１０に示す。図８の（Ａ）はセメント質再生へのＢＤＮＦの効果の測定結果を示し、図８の（Ｂ）は歯槽骨再生へのＢＤＮＦの効果の測定結果を示す。図９ＡはＢＤＮＦ非投与（コントロール）の根分岐部骨欠損部のヘマトキシリン・エオジン染色標本であり、図９Ｂは、ＢＤＮＦを投与した（ＢＤＮＦ（５μｇ／ｍｌ）を含む移植材を填塞）根分岐部骨欠損部の光学顕微鏡像である（倍率２０倍）。図１０は図９Ｂの根分岐部直下の部分拡大像である（倍率２００倍）。【００９２】  図８から明らかなように、ＢＤＮＦの投与により、イヌの３級根分岐部病変モデルに���いて、セメント質の再生と歯槽骨の再生が認められた。【００９３】  図９Ａのコントロール標本においては、セメント質、歯槽骨、歯周靱帯の再生がいくらか観察されたものの、骨欠損底部から歯冠側方向のほぼ１／２に留まっていた。根分岐部直下の欠損部にはセメント質再生、歯槽骨再生は認められず、上皮の進入も認められ、線維芽細胞、コラーゲン線維、血管を主体とした結合組織で埋めつくされていた。【００９４】  図９Ｂおよび図１０のＢＤＮＦを投与した根分岐部骨欠損部の標本では、裸出させた歯根面のほとんどの部分でセメント質が再生しており、上皮の進入も見られなかった。また、再生セメント質と再生歯槽骨の間には一定の幅を維持した歯周靱帯も観察された。
（実施例３）
ＨＰＬ細胞およびＨＧＫに及ぼすＮＧＦの影響を検討した。【００９５】  （１）ＨＰＬ細胞におけるＮＧＦとそのレセプターの発現
上記実施例１（２）と同一の方法でＨＰＬ細胞から総ＲＮＡを回収し、精製した。得られた総ＲＮＡを試料として、ＮＧＦとＴｒｋＡとのｍＲＮＡ発現をノーザンブロット法で測定した。コントロールとしてはＧＡＰＤＨを使用した。【００９６】  結果を図１１Ａ、１１Ｂに示す。図１１ＡはＮＧＦのｍＲＮＡ発現を示し、図１１ＢはＴｒｋＡのｍＲＮＡ発現を示す。図から明らかなように、ＨＰＬ細胞においてＮＧＦのｍＲＮＡとＴｒｋＡのｍＲＮＡとが発現していることが確認された。【００９７】  （２）ＨＰＬ細胞における骨関連タンパク質の発現
ＨＰＬ細胞の骨関連タンパク質のｍＲＮＡ発現に及ぼすＮＧＦの影響を測定した。【００９８】  ＨＰＬ細胞を、最終濃度０、５、１０、２５、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＮＧＦ、Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）をＢＤＮＦの代わりに使用すること以外は、実施例１（４）（ｉ）と同一の方法で処理した。ＮＧＦ処理したＨＰＬ細胞のＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＯＰＮの各ｍＲＮＡ発現量を、実施例１（４）（ｉ）と同一の方法で測定した。【００９９】  図１２、１３、１４に、それぞれ、ＯＰＮ、ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現に対する、ＮＧＦの経時効果測定および濃度効果測定の結果を示す。各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す。検定はｔ−ｔｅｓｔによる。【０１００】  図１２、１３、１４から明らかなように、ＮＧＦは、ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＯＰＮのｍＲＮＡ発現量を濃度および時間依存的に増加させた。【０１０１】  （３）ＨＰＬ細胞とＨＧＫの増殖
ＨＰＬ細胞とＨＧＫのＤＮＡ合成能に及ぼすＮＧＦの影響を測定した。【０１０２】  ＨＰＬ細胞とＨＧＫを、最終濃度０、５、１０、２５、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦをＢＤＮＦの代わりに使用すること以外は、実施例１（５）と同一の方法で処理した。ＮＧＦ処理したＨＰＬ細胞とＨＧＫのＤＮＡ合成能を、実施例１（５）と同一の方法で測定した。【０１０３】  結果を図１５に示す。ＮＧＦ作用時間はすべて２４時間である。（Ａ）はＨＰＬ細胞に対する効果を示し、（Ｂ）はＨＧＫに対する効果を示す。各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す。検定はｔ−ｔｅｓｔによる。【０１０４】  図１５から明らかなように、ＮＧＦはＨＰＬ細胞のＤＮＡ合成能を促進させたのに対し、ＨＧＫのＤＮＡ合成能を低下させた。
（実施例４）
ＨＰＬ細胞およびＨＧＫに及ぼすＮＴ−３の影響を検討した。【０１０５】  （１）ＨＰＬ細胞におけるＮＴ−３とそのレセプターの発現
上記実施例１（２）と同一の方法でＨＰＬ細胞から総ＲＮＡを回収し、精製した。得られた総ＲＮＡを試料として、ＮＴ−３とＴｒｋＣのｍＲＮＡ発現を、ノーザンブロット法で測定した。コントロールとしてはＧＡＰＤＨを使用した。【０１０６】  結果を図１６Ａ、１６Ｂに示す。図１６ＡはＮＴ−３のｍＲＮＡ発現を示し、１６ＢはＴｒｋＣのｍＲＮＡ発現を示す。これらの図から明らかなように、ＨＰＬ細胞においてＮＴ−３のｍＲＮＡとＴｒｋＣのｍＲＮＡとが発現していることが確認された。【０１０７】  （２）ＨＰＬ細胞における骨関連タンパク質の発現
ＨＰＬ細胞のＡＬＰａｓｅ活性に及ぼすＮＴ−３の影響を測定した。【０１０８】  ＨＰＬ細胞を、最終濃度０、１、１０または５０ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＮＴ−３、Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）をＢＤＮＦの代わりに使用すること以外は実施例１（３）（ｉ）と同一の方法で処理し、そのＡＬＰａｓｅ活性をＢｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法に従って定量した。すなわち、ＮＴ−３処理したＨＰＬ細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液を加えた後、氷冷下で超音波処理を行い、試料を調製した。ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とするＡＬＰａｓｅ測定キット（和光純業）を使用して、試料中のＡＬＰａｓｅの活性を測定した。【０１０９】  図１７に、ＡＬＰａｓｅ活性に対するＮＴ−３の濃度効果測定の結果を示す。ＮＴ−３作用時間はすべて２４時間である。図から明らかなように、ＮＴ−３は、ＡＬＰａｓｅ活性に対してそれほど影響が見られなかった。【０１１０】  （３）ＨＰＬ細胞の増殖
実施例１（１）と同一の方法で分離したＨＰＬ細胞を、最終濃度０、１、５、１０、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３をＢＤＮＦの代わりに使用すること以外は、実施例１（５）と同一の方法で処理し、そのＤＮＡ合成能を、実施例１（５）と同一の方法で測定した。【０１１１】  結果を図１８に示す。ＮＴ−３作用時間はすべて２４時間である。本グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す。検定はｔ−ｔｅｓｔによる。図から明らかなように、ＮＴ−３はＨＰＬ細胞のＤＮＡ合成能を促進させた。
（実施例５）
ヒト歯周靱帯由来線維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ、ＨＰＬ細胞）におけるＮＴ−４／５による骨関連タンパク質のｍＲＮＡ発現を調べた。【０１１２】  （１）ＨＰＬ細胞のＮＴ−４／５での処理
上記実施例１（１）（ｉ）で得られたＨＰＬ細胞を、ウシＩ型コラーゲンがコートされた直径６０ｍｍのシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１）に、１シャーレあたり３．５×１０５個で、５０μｇ／ｍｌの培地Ｂを用いて、３７℃、５％ＣＯ２気相条件で１３日間培養した。培地は２日に１回交換した。１４日目の培養終了前０、３、６、１２または２４時間において、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＮＴ−４／５（Ｒ＆Ｄ）を含む培地Ｄに交換した。【０１１３】  （２）ＨＰＬ細胞におけるｍＲＮＡの発現
上記（３）（ｉ）に記載の方法と同様にして、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのＮＴ−４／５で処理したＨＰＬ細胞から、ＩＳＯＧＥＮを用いて総ＲＮＡを抽出し、精製した。ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＯＰＮ、オステオカルシン（ＯＣＮ）、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＯＰＧのｍＲＮＡ発現量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、東京）を用いて、ＰＣＲプロダクトの生成過程をリアルタイムでモニタリングし、定量的に解析した（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法）。コントロールとしてはＧＡＰＤＨを使用した。【０１１４】  各骨関連タンパク質のｍＲＮＡ発現に対する、ＮＴ−４／５の経時効果測定の結果を図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃに示す。各グラフにおいて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。図から明らかなように、ＨＰＬ細胞において、ＮＴ−４／５は、ＯＰＮ、ＢＭＰ−２、ＡＬＰａｓｅ、ＯＣＮ、ＢＭＰ−７のｍＲＮＡ発現を促進した。しかし、ＢＭＰ−４、ＯＰＧの発現には影響を与えなかった（データは示さず）。
（実施例６）
ヒト歯髄細胞（ｈｕｍａｎ  ｐｕｌｐ  ｃｅｌｌ、ＨＰ細胞）に及ぼすＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５の影響を検討した。【０１１５】  （１）使用細胞
便宜的歯髄除去時に得られた健全歯髄を細切した。細切した組織を、直径６０ｍｍの細胞培養用シャーレ（コーニング、ＮＹ）に貼り付け、３７℃、５％ＣＯ２気相条件で培地Ａにて培養した。４〜８代継代したＨＰ細胞を以下の実験に供した。【０１１６】  （２）細胞のＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５での処理
ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５を培地Ｄに最終濃度０、５、１０、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌで加えて、各種濃度の神経栄養因子含有培地を用意した。上記（２）で得られたＨＰ細胞を、ウシＩ型コラーゲンがコートされた直径６０ｍｍのシャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１）に、１シャーレあたり３．５×１０５個で、培地Ｂを用いて、３７℃、５％ＣＯ２気相条件で１３日間培養した。培地は２日に１回交換した。１４日目の培養終了前２４時間において、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、いずれかの神経栄養因子含有培地に交換した。【０１１７】  （３）ＨＰ細胞におけるｍＲＮＡの発現
上記（１）で、各濃度のＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、またはＮＴ−４／５で２４時間処理したＨＰ細胞から、ＩＳＯＧＥＮを用いて総ＲＮＡを抽出し、精製した。ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、象牙質シアロタンパク（ＤＳＰＰ）、Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ＯＰＮ、ＯＣＮのｍＲＮＡ発現量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、東京）を用いて、ＰＣＲプロダクトの生成過程をリアルタイムでモニタリングし、定量的に解析した（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法）。コントロールとしてはＧＡＰＤＨを使用した。【０１１８】  ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５の各骨関連タンパク質のｍＲＮＡ発現に対する濃度効果の測定結果を、それぞれ、図２０、２１、２２、２３に示す。図から明らかなように、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５は、ＨＰ細胞において、ＡＬＰａｓｅ、ＢＭＰ−２、ＤＳＰＰ、ＯＰＮ、ＯＣＮのｍＲＮＡ発現を促進した。ＢＤＮＦとＮＴ−４／５は、Ｉ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現も促進した。【０１１９】  （４）ＨＰ細胞の増殖
ＨＰ細胞のＤＮＡ合成能に及ぼすＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５の影響を、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、ＥＬＩＳＡ法で測定した。【０１２０】  ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５のそれぞれを、１０％ＦＢＳの代わりに０．３％ＦＢＳを添加した培地Ｂに、最終濃度０、５、１０、２５、５０又は１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、各種神経培養因子含有培地を調製した。【０１２１】  上記（１）で得られたＨＰ細胞を、ウシＩ型コラーゲンがコートされた９６穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ  セルタイトＣ−１プレート９６Ｆ）に、５×１０３個／ウェルで播種し、培地Ｂを用いて１０日間培養した。細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、１０％ＦＢＳの代わりに０．３％ＦＢＳを添加した培地Ｂで２４時間培養した後、上記の各種神経培養因子含有培地と交換し、さらに２４時間培養した。培養終了の２時間前（つまりに神経培養因子添加の２２時間後）に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに添加して、細胞に取り込ませた。培養は３７℃、５％ＣＯ２気相条件下で行った。【０１２２】  培養終了後、ＨＰ細胞を固定後、ブロッキングを行い、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体を室温で２時間作用させ、ＴＭＢ（３，３，５，５’−テトラメチルベンシジン）基質を加え、波長４５０ｎｍにおける吸光度を吸光度計（ＭＩＣＲＯ  ＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ、ＴＯＳＯＨ）で測定した。【０１２３】  結果を図２４に示す。図から明らかなように、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５はＨＰ細胞のＤＮＡ合成能を促進させた。
（実施例７）
ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＨＭＳ細胞）に及ぼすＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、アスコルビン酸の影響を検討した。【０１２４】  （１）使用細胞
ＨＭＳ細胞の分離は堤ら（Ｓ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ：ＢＢＲＣ，２６，２８８（２），２００１）の方法に準じて行った。すなわち、十分なインフォームドコンセントを得た患者の智歯抜去時に下顎骨骨髄腔へ穿刺し、骨髄液を得た。得られた骨髄液をヘパリンナトリウム（２００Ｕ／ｍｌ，シグマ、米国）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ、米国）と速やかに混合し，遠心分離（１５０ｇ，５ｍｉｎ）を行った。遠心分離後、上清を除去し、得られた細胞成分を１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，イスラエル）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン（明治製菓、東京）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（明治製菓，東京）、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（ギブコ、米国）を含むＤＭＥＭに懸濁し、骨髄液が２００〜５００μｌ／ｄｉｓｈ、培地が１０ｍｌ／ｄｉｓｈとなるように、直径１００ｍｍの細胞培養用シャーレ（コーニング、米国）に播種した。培養は３７℃，５％ＣＯ２気相条件で行った。以後４日毎に培地交換を行った。増殖した細胞がコンフルエントに達する直前に、０．０５％トリプシン（ディフコ、米国）、０．０２％ＥＤＴＡ（片山化学、大阪）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ，日水製薬，東京）を用いて細胞を分散させた。分散させた細胞は２０％ＦＣＳ、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，片山化学，大阪）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭに、細胞密度が１．０ｘ１０６細胞／ｍｌとなるよう懸濁し、セラムチューブ（住友ベークライト，東京）に１ｍｌずつ分注した後に−２０℃で２時間、−８０℃で通夜冷却した後に、液体窒素中に保存した。【０１２５】  （２）ＨＭＳ細胞における骨関連タンパク質のｍＲＮＡの発現
（ｉ）細胞のＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３での処理
上記（１）で得られたＨＭＳ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン（明治製菓、東京）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（明治製菓，東京）、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（ギブコ、米国）を含む）に懸濁し、１．０ｘ１０５細胞／ウエルの密度で６穴細胞培養プレートに播種した。細胞を１週間培養し、細胞がコンフルエントになる直前の時点で培地をＦＣＳを含まないＤＭＥＭ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン（明治製菓、東京）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（明治製菓，東京）、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（ギブコ、米国）を含む）に交換し、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３のいずれかをそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌの濃度で１２時間および２４時間作用させた。培養終了後，ＩＳＯＧＥＮ（商品名）を用いて総ＲＮＡの抽出を行った。【０１２６】  （ｉｉ）ｍＲＮＡの発現
ＡＬＰａｓｅ、ＯＣＮ、ＯＰＮ、骨シアロタンパク（ＢＳＰ）、Ｉ型コラーゲンに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃、１５秒間、アニーリング３０秒間、７２℃、５０秒間を３０サイクル（ＢＳＰのみ３５サイクル）繰り返し、その後７２℃、７分間の伸長によって行った。得られたＰＣＲ産物は０．００２％臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動後のバンドの濃さをＮＩＨ  ｉｍａｇｅを用いて測定した。【０１２７】  結果を図２５Ａ〜Ｅ、２６Ａ〜Ｅ２７および２７Ａ〜Ｅに示す。図から明らかなように、ＮＧＦについては、ＨＭＳ細胞のＡＬＰａｓｅ、ＯＣＮ、ＯＰＮ、ＢＳＰ、Ｉ型コラーゲンのいずれのｍＲＮＡ発現に対しても著明な作用は認められなかった。ＢＤＮＦは、ＡＬＰａｓｅ、ＯＰＮ、ＢＳＰ、ＢＭＰ−２のｍＲＮＡ発現を強く促進させ、ＯＣＮの遺伝子発現をいくらか促進させた。ＮＴ−３は、ＡＬＰａｓｅおよびＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現を促進させた。【０１２８】  （３）ＨＭＳ細胞の増殖に及ぼすアスコルビン酸、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３の影響
上記（１）で得られたＨＭＳ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（日水製薬製）（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン（明治製菓、東京）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（明治製菓，東京）、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（ギブコ、米国）を含む）に懸濁し、９６穴細胞培養プレート（コーニング、米国）上に５．０ｘ１０３細胞／ウエルの密度で播種した。試験群については、培養開始２４時間後から５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（シグマ、米国）、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（フナコシ，東京）、１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（フナコシ，東京）、あるいは１００ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３（フナコシ、東京）をそれぞれ単独で培地に添加し、さらに７日間培養した。培地交換は４日目に行った。対照群は１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（日水製薬製です）（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン（明治製菓、東京）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（明治製菓，東京）、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（ギブコ、米国）を含む）で培養したものとした。７日間培養後、培地を全て１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン（明治製菓、東京）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（明治製菓，東京）、１μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（ギブコ、米国）を含む）に交換し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（商品名）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、生細胞数を計測した。【０１２９】  結果を図２８に示す。グラフの縦軸は、対照群に対する試験群の吸光度の百分率を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を表す（統計学的検定はｔ−ｔｅｓｔによる）。図から明らかなように、アスコルビン酸、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３のいずれかを添加した培地で培養したＨＭＳ細胞は、コントロールと比べて有意に高い細胞増殖を示した。特に、アスコルビン酸、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３の増殖促進作用はＮＧＦに比べ強かった。
（実施例８）
ビーグル犬の３級根分岐部病変モデルにおけるＮＧＦとＮＴ−３の効果を検討した。【０１３０】  直径８ｍｍ×５ｍｍのテルプラグに、濃度５、２５、５０μｇ／ｍｌのＢＤＮＦ溶液（滅菌生理食塩液中）の２５μｌの代わりに濃度１００μｇ／ｍｌのＮＧＦ溶液（滅菌生理食塩液中）の２５μｌをしみこませたものと、濃度１００μｇ／ｍｌのＮＴ−３溶液（滅菌生理食塩液中）の２５μｌをしみこませたものを、移植材として用いたこと以外は、実施例２と同様に実験を行った。作成した組織標本（ヘマトキシリン・エオジン染色）から、近遠心方向歯軸に平行でしかも根中央付近で薄切された標本を選択し、光学顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００、ＮＩＫＯＮ）で観察した。【０１３１】  図２９ＡはＮＧＦを含む移植材を填塞した根分岐部骨欠損部の光学顕微鏡像であり、図２９Ｂは、ＮＴ−３を含む移植材を填塞した根分岐部骨欠損部の光学顕微鏡像である（倍率２０倍）。図から明らかなように、ＮＧＦあるいはＮＴ−３の投与により、イヌの３級根分岐部病変モデルにおいて再生骨が観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】  本発明の歯周病治療剤、修復象牙質形成促進剤、治療方法、歯周組織再生用移植材、歯周組織の再生方法は、歯周病治療や歯内療法において有効と成り得る可能性がある。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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