(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ７プロモーター配列の下流にオペレーター配列を有し、かつＴ７プロモーター配列の上流に更なるオペレーター配列を有するＴ７由来のプロモーター駆動性タンパク質発現システムであって、前記更なるオペレーター配列が完全なパリンドロームオペレーター（ｐｐｏｐ）配列であるタンパク質発現システム。
【請求項２】
Ｔ７プロモーター配列の下流のオペレーター配列が本来のｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）配列である、請求項１記載のタンパク質発現システム。
【請求項３】
Ｔ７プロモーター配列の下流のオペレーター配列がｐｐｏｐ配列であり、二連のｐｐｏｐオペレーターを提供する、請求項１記載のタンパク質発現システム。
【請求項４】
Ｔ７プロモーターコントロール下のターゲット遺伝子を有し、Ｔ７プロモーター配列の下流にオペレーター配列を有し、かつＴ７プロモーター配列の上流に更なるオペレーター配列を有するプラスミドであって、前記更なるオペレーター配列が完全なパリンドロームオペレーター（ｐｐｏｐ）配列であるプラスミド。
【請求項５】
Ｔ７プロモーター配列の下流のオペレーター配列が本来のｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）配列である、請求項４記載のプラスミド。
【請求項６】
Ｔ７プロモーター配列の下流のオペレーター配列がｐｐｏｐ配列であり、二連のｐｐｏｐオペレーターを提供する、請求項４記載のプラスミド。
【請求項７】
ｐＺＴ７＃３．１およびｐＺＴ７＃３．３からなる群から選択されるプラスミド。
【請求項８】
プラスミドｐＺＴ７＃３．３。
【請求項９】
請求項４から８までのいずれか１項記載のプラスミドによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
プラスミドｐＺＴ７＃３．３によって形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９または１０記載の宿主細胞であって、前記細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからなる群から選択される原核の宿主細胞である宿主細胞。
【請求項１２】
請求項９または１０記載の宿主細胞であって、前記細胞が哺乳類、酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類および卵巣からなる群から選択される真核の宿主細胞である宿主細胞。
【請求項１３】
プラスミドｐＺＴ７＃３．３によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ。
【請求項１４】
請求項１から１３までのいずれか１項記載の発現システム、プラスミドまたは宿主細胞を組み換えタンパク質の製造において用いる使用。
【請求項１５】
組み換えタンパク質の製造方法において、
（ａ）請求項９から１３までのいずれか１項記載の宿主細胞を、前記細胞の増殖に適した条件下で培養すること、および
（ｂ）培養培地にインデューサーを添加して、前記細胞による組み換えタンパク質の発現を引き起こすこと
を含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はポリペプチドの組み換え合成のための発現システム、特にＴ７プロモーター駆動性タンパク質発現システム（T7 promoter-driven protein expression system）に関する。また本発明はかかるシステムでの使用のための発現ベクターに関する。
【０００２】
多くの哺乳類、酵母および細菌を宿主とする発現システムは公知である（Methods in Enzymology(1990), 185, Editor:D.V.Goeddel）。特に関心が持たれているものはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するものである。適当なプロモーターに結合する任意のＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７様ファージからの同等のＲＮＡポリメラーゼが選択的に転写する能力を、所望のＲＮＡのインビトロおよび細胞内の両者での非常に特異的かつ十分な生産のための基礎として使用することができる。
【０００３】
ＵＳ−Ａ−４９５２４９６号（Studier）はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させ、これを使用して特定のタンパク質を産生できる、全てを宿主であるＥ．ｃｏｌｉ細胞内で実施する方法を開示している。関心のある特定のタンパク質はワクチンのための抗体、ホルモン、酵素または医薬もしくは商業的価値のある他のタンパク質である。潜在的にはファージのＲＮＡポリメラーゼの選択性および効率はかかる産生を非常に効率よくすることができる。更にこれらのファージのＲＮＡポリメラーゼの唯一の特性は、該ポリメラーゼが他のＲＮＡポリメラーゼによって非効率的にのみ発現するかまたは全く発現しない遺伝子を効率的に発現させることを可能にすることができる。これらのファージのポリメラーゼは、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼを選択的に阻害できるという更なる利点を有しており、その結果、細胞中での全ての転写は前記のファージのＲＮＡポリメラーゼによるものになる。
【０００４】
前記のものに基づく発現システムは現在市販されている。これはＮｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．５９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ（マディソン、ＷＩ５３７１１）から入手できるｐＥＴシステムである。このシステムはＥ．ｃｏｌｉ中でのクローニングおよび組み換えタンパク質の発現のために適当である。Ｍｏｆｆａｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８６，１８９，１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，５６，１２５−１３５；およびＳｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０，１８５，６０−８９参照のこと。
【０００５】
しかしながら、ｐＥＴシステムの提供にかかわらず、更に改善されたＴ７プロモーター駆動性発現システムが必要である。
【０００６】
入手できるＴ７に基づく発現システムと比較した場合に発現の改善された制御およびタンパク質発現の改善されたレベルを提供するようなシステムを考案している。インデューサーの不在下の基礎的発現を現在入手できるＴ７に基づく発現システムによっては不可能であるクローニングおよび毒性遺伝子産物の発現を可能にするレベルに低下させ、誘導された生産性に影響を与えないＴ７プロモーター駆動性の発現システムを提供している。更に本願発明は広範な発現レベルにわたりインデューサー濃度に依存する方法で異種タンパク質の生産の制御を可能にし、結果として最適な発現レベルを特定することができる。異種タンパク質の発現および生産におよぶ制御のレベルは現在入手できるＴ７に基づく発現システムによっては不可能である。
【０００７】
従って第１の態様においては、Ｔ７プロモーター配列の下流に１個のオペレーター配列を有し、Ｔ７プロモーター配列の上流に他のオペレーター配列を有しているＴ７プロモーター駆動性タンパク質発現システムを提供することである。
【０００８】
有利には他のオペレーターが本来のｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）配列であることが見出されている。または完全なパリンドロームオペレーター（ｐｐｏｐ）配列であることが見出されている。より有利にはＴ７プロモーター配列の下流の本来の（ｌａｃ）オペレーター配列をｐｐｏｐ配列によって交換し、二連のｐｐｏｐオペレーターを提供する。
【０００９】
Ｔ７プロモーター駆動性発現システムは適当には以下のように構築される：関連のターゲット遺伝子はバクテリオファージ転写および翻訳シグナルのコントロール下でプラスミド中にクローニングされる。最初にターゲット遺伝子を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有さない宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α、ＨＢ１０１を使用してクローニングする。得られたらプラスミドをＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有する発現宿主中に、例えばｌａｃＵＶ５のコントロール下に移行する。他の適当なプロモーターはｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃおよびバクテリオファージλプロモーター、例えばｐＬおよびｐＲである。次いで発現をインデューサー、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）、ラクトースもしくはメリビオースの添加によって誘導する。他のインデューサーを使用してもよく、これらは他の文献により詳細に記載されている。Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｅｄｓ ＭｉｌｌｅｒおよびＲｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９７８）を参照のこと。インデューサーは個々にまたは組み合わせて使用してもよい。
【００１０】
有利にはプラスミドは以下の１種以上を含む：選択可能な抗生物質耐性配列、ｃｅｒ安定エレメント（cer stability element）、およびマルチクローニングサイト。適当なプラスミドの構築は当業者に公知である。１つ以上の前記の特徴を有している有利なプラスミドの例は添付図中のプラスミドのｐＺＴ７＃３系列によって図解されている。欧州特許出願第０５０２６３７号（ＩＣＩ）中に開示された（ｐＩＣＩ００４２として）ｐＺＥＮ００４２ベクターから出発して構築された。本願発明の３シリーズのプラスミドはｐＺＴ７＃３．０、ｐＺＴ７＃３．１、ｐＺＴ７＃３．２およびｐＺＴ７＃３．３である。本願発明の特に有利なプラスミドはｐＺＴ７＃３．３プラスミドである。
【００１１】
例えばｌａｃＵＶのコントロール下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有利には宿主細胞にλバクテリオファージ構築物、Ｎｏｖａｇｅｎから入手できるλＤＥ３によって導入する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現カセットを、該遺伝子（CE6, US-A-4952496参照）を有する特定化されたバクテリオファージλ形質導入ファージでの感染によって細胞に移行した。
【００１２】
和合性のプラスミド（compatible plasmid）、例えばｐＬｙｓＳおよびｐＬｙｓＥ（Ｎｏｖａｇｅｎから入手できる）を発現宿主中に導入してもよい。これらのプラスミドは天然かつ選択的なＴ７ＲＮＡポリメラーゼのインヒビターであるＴ７リゾチームをコードし、従って未誘導細胞中でターゲット遺伝子を転写する能力を減少させる。ｐＬｙｓＳ宿主は少量のＴ７リゾチームを産生するが、一方ｐＬｙｓＥ宿主はより多くの酵素を産生し、従ってよりストリンジェントなコントロールを提供する。
【００１３】
任意の適当な適合した原核または真核の宿主細胞を使用してよい。最も通常に使用される原核宿主はＥ．ｃｏｌｉの株であるが、他の原核宿主、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｓｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを使用してもよい。哺乳類（例えばチャイニーズハムスターの卵巣細胞）または他の真核の宿主細胞、例えば酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombeまたはKluyveromyces lactis）、糸状菌、植物、昆虫、両生類もしくは卵巣の種類の宿主細胞を使用してもよい。特定の宿主生物は細菌、有利にはＥ．ｃｏｌｉ（例えばＫ１２またはＢ株）である。
【００１４】
使用される宿主生物によって任意の適当な増殖培地を使用してもよい。Ｅ．ｃｏｌｉのためには、本発明の実施であるが、天然増殖培地（complex growth media）、例えばＬブロスまたは最少増殖培地、例えばＭ９（以下に記載する）に制限されない。
【００１５】
本発明を以下の実施例、表および図により詳細に説明するが、実施例は本発明を制限するものではない：
表１は実施例で使用されるｈ−ＴＮＦαを発現するプラスミドの詳細である。
【００１６】
表２〜４は実施例および関連の実施で使用されるベクターの詳細である。
【００１７】
表５はＭ９最少増殖培地の組成の詳細である。
【００１８】
表６は種々の増殖培地でのｈ−ＴＮＦα発現の詳細である。
【００１９】
表７は実施例で使用されるベクターに関する宿主／形質転換効率の詳細である。
【００２０】
表８はｐＺＴ７＃３．３：ＤＮａｓｅＩベクターに関連するＤＮａｓｅＩ生産性の詳細である。
【００２１】
表９〜１１は実施例で使用されるＬＡＲｄ１（ａａ１２７５−１６２３）、ＺＡＰ７０（４−２６０）６ＨＩＳおよびＭＣＰ−１｛９−７６｝に関する蓄積レベル（accumulation level）の詳細である。
【００２２】
表１２はｐＺＴ７＃３．３および中間ベクター（intermediate vector）の構築で使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００２３】
表１３はｈＴＮＦαの核酸配列を示す。
【００２４】
表１４はＺＡＰ７０（４−２６０）６ＨＩＳの核酸配列を示す。
【００２５】
表１５はＬＡＲｄ１（ａａ１２７５−１６２３）の核酸配列を示す。
【００２６】
表１６はウシ膵臓のＤＮａｓｅＩの核酸配列を示す。
【００２７】
表１７はヒトのカルボキシペプチダーゼＢ（ミュータントＤ２５３＞Ｋ）６Ｈｉｓ ｃｍｙｃの配列を示す。
【００２８】
表１８は種々のＥ．ｃｏｌｉの発現株を示す。
【００２９】
表１９はヒトの単球走化性タンパク質ＭＣＰ−｛９−７６｝の配列を示す。
【００３０】
表２０はＡ５Ｂ７Ｆ（ａｂ′）2の核酸配列を示す。
【００３１】
図１はｐＺＥＮ００４２プラスミドを示す。
【００３２】
図２はｐＺＥＮ００４２からのｐＺＥＮ００４２＃ａの構築を示す。
【００３３】
図３はｐＺＥＮ００４２＃ｂプラスミドを示す。
【００３４】
図４はｐＺＥＮ００４２＃ｃプラスミドを示す。
【００３５】
図５はｐＺＥＮ００４２＃ｄプラスミドを示す。
【００３６】
図６はｐＺＥＮ００４２＃ｅプラスミドを示す。
【００３７】
図７はｐＺＴ７＃２．０プラスミドを示す。
【００３８】
図８はｐＺＴ７＃２．１プラスミドを示す。
【００３９】
図９は本発明のｐＺＴ７＃３．０プラスミドを示す。
【００４０】
図１０は本発明のｐＺＴ７＃３．２プラスミドを示す。
【００４１】
図１１は本発明のｐＺＴ７＃３．１プラスミドを示す。
【００４２】
図１２は本発明のｐＺＴ７＃３．３プラスミドを示す。
【００４３】
図１３は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される最大の比生産性（peak specific productivity）を示す。
【００４４】
図１４は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される最大のｈＴＮＦαの蓄積レベルを示す。
【００４５】
図１５は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される生物学的に活性のＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃ（活性の物質（μｇ）／培地（Ｌ）として）の蓄積を示す。
【００４６】
図１６は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される生物学的に活性なＡ５Ｂ７（Ｆａｂ′）2／Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′）（活性物質（ｍｇ）／培地（Ｌ）として）のＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム中での蓄積を示す。
【００４７】
特定の記載：
１．ｐＺＴ７系列のベクターの作成
ｐＺＴ７＃３．３の作成のための出発ベクターはｐＺＥＮ００４２であり、これは自社の欧州特許出願の公開第０５０２６３７号に記載されている。簡単には、該ベクターはｐＡＴ５３由来のバックグラウンドにおいてプラスミドＲＰ４からのｔｅｔＡ／ｔｅｔＲ誘導性テトラサイクリン耐性配列およびプラスミドｐＫＳ４９２からのｃｅｒ安定配列（stability sequence）を有している（図１）。
【００４８】
１（ｉ）ｌａｃＩのクローニング
ｌａｃリプレッサーをコードする配列およびｌａｃＩプロモーターを有するｌａｃＩの配列をＥ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ１０１（Ｗ３１１０）から調製したゲノムＤＮＡを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって作成した。ＮｓｉＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を配列の両末端にＰＣＲプライマー＃１および＃２（表１２）中に組み込むことによって作成した。得られたＰＣＲ産物をＮｓｉＩで消化し、ＰｓｔＩ部位でｐＺＥＮ００４２中にクローニングした（ＰｓｔＩおよびＮｓｉＩは両部位の破壊を惹起する適合性の粘着末端（compatible cohesive end）を有している）。両方向のｌａｃＩが得られた。反時計回り方向で正しい配列ｌａｃＩを有するクローンが同定された（＝ｐＺＥＮ００４２＃ａ）（図２）。
【００４９】
１（ｉｉ）ポリリンカーのクローニング
新規のマルチクローニングサイトをｐＺＥＮ００４２＃ａ中に作成し、引き続きのＴ７発現カセットのクローニングを可能にした。これはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでのｐＺＥＮ００４２＃ａの消化ならびにアニーリングした合成オリゴマー＃３および＃４（表１２）によるライゲーションによって達成された。
【００５０】
得られたベクターｐＺＥＮ００４２＃ｂのポリリンカーは以下の制限部位を有していた：ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ−Ｋｐｎ−ＳｃａＩ−ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ。
【００５１】
ｐＺＥＮ００４２＃ｂは図３に示されている。
【００５２】
２．Ｔ７発現エレメントのクローニング
２（ｉ）Ｔ７ターミネーター
Ｔ７ｇｅｎｅ１０からのＴ７ターミネーター配列をアニーリングした合成オリゴマー＃５および＃６（表１２）としてｐＺＥＮ００４２＃ｂのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ部位の間にクローニングしてｐＺＥＮ００４２＃ｃ（図４）を作成した。
【００５３】
２（ｉｉ）ｔＲＮＡarg5
ｔＲＮＡarg5転写リポーター配列（Lopez, et al, (1994), NAR 22, 1186-1193, and NAR 22, 2434）をアニーリングした合成オリゴマー＃７および＃８（表１２）としてｐＺＥＮ００４２＃ｃ中のＸｈｏＩおよびＰｓｔＩ部位の間にクローニングしてｐＺＥＮ００４２＃ｄ（図５）を作成した。
【００５４】
２（ｉｉｉ）上流のターミネーター
ｔｅｔＡ配列は認識可能なターミネーターを有さないので、Ｔ４ターミネーター配列をＥｃｏＲＩ部位の上流で（ＥｃｏＲＩ部位の下流にクローニングされるべき）Ｔ７発現カセット中にクローニングしてｔｅｔＡ（または任意の他の同定されていないプロモーター配列）からの潜在的な転写における読み通しを減少させた。Ｔ４ターミネーター配列および付加的なＮｃｏＩ部位を有するアニーリングした合成オリゴマー＃９および＃１０（表１２）をｐＺＥＮ００４２＃ｄ中のＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングし、ｐＺＥＮ００４２＃ｅ（図６）を作成した。。
【００５５】
２（ｖｉ）Ｔ７ｌａｃプロモーター
Ｔ７プロモーターおよびｌａｃオペレーター配列をアニーリングした合成オリゴヌクレオチド＃１１および＃１２（表１２）としてｐＺＥＮ００４２＃ｅのＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩ部位の間にクローニングしてｐＺＴ７＃２．０（図７）を作成した。Ｔ７プロモーターおよびｌａｃオペレーターの配置はｐＥＴ１１ａと同じである。
【００５６】
２（ｖ）完全なパリンドロームオペレーターを有するＴ７プロモーター
完全なパリンドロームｌａｃオペレーター配列を導入しているＴ７ｇｅｎｅ１０プロモーター（Simons et al(1984), PNAS 81, 1624-1628）をアニーリングした合成オリゴマー＃１３および＃１４（表１２）としてｐＺＥＮ００４２＃ｅのＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩ部位の間にクローニングしてｐＺＴ７＃２．１（図８）を作成した。
【００５７】
２（ｖｉ）上流のｌａｃオペレーター
第２の本来のｌａｃオペレーター配列をｐＴ７＃２．０中のｌａｃオペレーター配列の９４塩基対上流でアニーリングした合成オリゴマー＃１５および＃１６（表１２）としてｐＺＴ７＃２．０のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングしてｐＺＴ７＃３．０（図９）を作成した。
【００５８】
同じｌａｃオペレーター配列を類似にｐＺＴ７＃２．１中にクローニングしてｐＺＴ７＃３．２（図１０）を作成した。
【００５９】
２（ｖｉｉ）上流の完全なパリンドロームｌａｃオペレーター
完全なパリンドロームオペレーター配列を、アニーリングした合成オリゴマー＃１７および＃１８（表１２）をｐＺＴ７＃２．０のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間でクローニングすることによってｐＺＴ７＃２．０のｌａｃオペレーター配列の９４塩基対上流に配置してｐＺＴ７＃３．１（図１１）を作成した。
【００６０】
同一の完全なパリンドロームオペレーター配列を類似にｐＺＴ７＃２．１中にクローニングしてｐＺＴ７＃３．３（図１２）を作成した。
【００６１】
３．試験構築物の作成
ｐＥＴ１１ａ
Ｔ７発現ベクターｐＥＴ１１ａをＮｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃから入手し、ｐＺＴ７ベクターの試験のための対照群として使用した。
【００６２】
３（ｉ）ｈＴＮＦα
ヒトＴＮＦαのコーディング配列を有するＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩのＤＮＡ配列をベクターｐＺＴ７＃２．０、ｐＺＴ７＃２．１、ｐＺＴ７＃３．０、ｐＺＴ７＃３．１、ｐＺＴ７＃３．２、ｐＺＴ７＃３．３およびｐＥＴ１１ａ中のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位の間にクローニングした。クローニングした配列は表１３に示している。
【００６３】
３（ｉｉ）ＺＡＰ７０（４−２６０）６ＨＩＳ
Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグ配列を有するヒトタンパク質のチロシンキナーゼＺＡＰ７０のアミノ酸４〜２６０をコードしているＤＮＡ断片をＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてｐＥＴ１１ａおよびｐＺＴ７＃３．３のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩクローニングサイトの間にサブクローニングした。クローニングした配列は表１４中に示した。
【００６４】
３（ｉｉｉ）ＬＡＲｄ１（ａａ１２７５−１６２３）
白血球抗原関連タンパク質のチロシンホスファターゼドメイン１（ａａ１２７５−１６１３）をＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてｐＥＴ１１ａおよびｐＺＴ７＃３．３（ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ）中にサブクローニングした。クローニングした配列は表１５に示している。
【００６５】
３（ｉｖ）ヒトカルボキシペプチダーゼＢ（ミュータントＤ２５３＞Ｋ）６Ｈｉｓ ｃｍｙｃ
Ｃ末端のヘキサヒスチジンｃｍｙｃタグ配列を有するミュータントのヒトカルボキシペプチダーゼ（Ｄ２５３＞Ｋ）のコーディング配列をエルウィニア カロトボーラ ｐｅｌ Ｂ分泌のリーダー配列の下流に配置し、ｐＺＴ７＃３．３およびｐＥＴ１１ａ中にクローニングした。クローニングした配列は表１７に示している。
【００６６】
３（ｖ）ウシ膵臓ＤＮａｓｅＩ
ウシ膵臓ＤＮａｓｅＩののコーディング配列をＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの間でｐＺＴ７＃３．３中にクローニングした。クローニングした配列は表１６に示している。
【００６７】
この配列はｐＥＴ１１ａ中に突然変異なしにクローニングできない。
【００６８】
しかしながらウシ膵臓ＤＮａｓｅＩ配列は以前にｐＥＴ１１（ｐＥＴ１１ａではない）中にクローニングされている（Doherty et al (1993) Gene, 136, pp337-340）。この構築物において、リボソーム結合部位を有する５′の非翻訳領域は、ｐＴ７＃３．３中にあるようなＴ７ｇｅｎｅ１０からよりもむしろ本来のウシ膵臓ＤＮａｓｅＩ配列から得られる。この構築物ｐＡＤ１０はｐＴ７＃３．３のためのコントロールとして使用した。
【００６９】
３（ｖｉ）ヒト単球走化性タンパク質ＭＣＰ−１｛ａａ９−７６｝
ヒト単球走化性タンパク質（ａａ９−７６）のコーディング配列をｐＥＴ１１ａのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位の間でクローニングした。クローニングした配列は表１９に示している。
【００７０】
３（ｖｉｉ）Ａ５Ｂ７ Ｆ（ａｂ′）2
Ａ５Ｂ７ Ｆ（ａｂ′）2のコーディング配列をエルウィニア カロトボーラのｐｅｌＢ分泌リーダー配列の下流に配置し、ｐＺＴ７＃３．３およびｐＥＴ１１ａのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位の間にクローニングした。
【００７１】
４．Ｔ７発現のための宿主株の作成
λＤＥ３溶原化キット（λDE3 lysogenisation kit）をＮｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃから入手し、説明書に従って使用して表１８に列記したＥ．ｃｏｌｉ株からＴ７発現宿主を作成した。プラスミドｐＬｙｓＳおよびｐＬｙｓＥならびにＥ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬ２１およびＢＬ２１（ＤＥ３）はＮｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃから入手した。
【００７２】
例１
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを、ヒトＴＮＦαを発現するプラスミド（以下に記載、表１）で別々に形質転換した。得られた組み換え株を精製し、グリセロール保存液中で−８０℃で保持した。宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥはこの分野で広範に使用されており、一般の機関、例えばＮｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ（マディソン、ＵＳＡ）で容易に入手できる。ＢＬ２１（ＤＥ３）の遺伝子型はＦ-、ｏｍｐＴ、ｈｓｄＳB（ｒB- ｍB-）、ｇａｌ、ｄｃｍ、（ＤＥ３）である。
【００７３】
【表１】
0004394826.tif 000002
【００７４】
【表２】
0004394826.tif 000003
【００７５】
各組み換え株のアリコートを保存液から取り出し、Ｌアガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）および／またはクロラムフェニコール（１μｇ／ｍｌ）を場合により供給して選択可能にする）上にストリークし、３７℃で１６時間インキュベートした。次いで各培養のアリコートを滅菌ＰＢＳ（ホスフェートで緩衝させた生理食塩水溶液；８ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２ｇ／Ｌのオルトリン酸二水素カリウム、１．１５ｇ／Ｌの塩化マグネシウム）１０ｍｌ中に再懸濁し、これを使用して、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）および／またはクロラムフェニコール（１μｇ／ｍｌ）を場合により供給したＬ−ブロス（１０ｇ／Ｌのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム；ｐＨ７．２）７５ｍｌを含有する２個の２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコそれぞれにＯＤ550＝０．１で播種した。次いでフラスコを往復運動型振盪機（reciprocating shaker）上で３７℃でインキュベートした。増殖をＯＤ550＝０．４〜０．５まで観察した。この時点で培養を、インデューサーのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭで各組み換え株に関して各（２個の）セットからの１個のフラスコに添加することによって誘導した。第２のフラスコは誘導しなかった。各組み換え株のための両者のフラスコを前記の条件で更に２４時間インキュベートした。誘導された培養中でのｈＴＮＦαの蓄積レベルを、試料の細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にクーマシーブルー染色したゲルのレーザーデンシトメトリースキャニング（laser densitometory scanning）によって測定した。誘導していない培養中のｈＴＮＦαの基礎的蓄積レベルは試料の細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後のウエスタンブロット分析（抗ｈＴＮＦα抗原を使用する）によって測定した。次いで細胞あたりのｈＴＮＦα分子における蓄積レベルを、この分野においてよく確立されているようにブロット（“未知のもの”と一緒に公知のスタンダードを使用して準備した）のレーザーデンシトメトリースキャニングによって測定した。結果を以下にまとめる（表２）。
【００７６】
【表３】
0004394826.tif 000004
【００７７】
（１）：本文中でより完全に記載した
（２）：ＴＭＰ＝全微生物タンパク質
（３）：モル／細胞＝細胞あたりのｈＴＮＦα分子；検出限界：２５０分子／細胞
（４）：ｎｄ＝検出されず（ウエスタンブロット）
前に明確に示したデータは、異種タンパク質の基礎的発現レベルは最近に確立された技術（単一の本来のｌａｃプロモーター：ベクターｐＥＴ１１ａ／ｐＺＴ７＃２．０）を使用すると依然として高いということを示している。基礎的発現はｐＥＴ１１ａ／ｐＺＴ７＃２．０発現システムで、Ｔ７リゾチームを発現するプラスミド（ｐＬｙｓＳ／ｐＬｙｓＥ）で同時形質転換した宿主株の使用によって低下させることができる。しかしながら誘導される生産性は激しく損なわれる。
【００７８】
意想外にも、２個の本来のｌａｃオペレーター配列は、基礎的発現レベルを大きく低下させるＴ７プロモーター駆動性システムと一緒にはたらくが、誘導された生産性に影響を及ぼさない。
【００７９】
より意想外にも、２個の完全なパリンドロームオペレーターは、誘導された生産性を損なうことなく基礎的発現レベルを低下させる際に最も良好に機能する。Ｔ７プロモーター駆動性システムを有する単一の完全なパリンドロームオペレーターの使用が基礎的発現の低下に重大な改善をもたらすことは予想され得なかった。本来のｐｐｏｐのｌａｃオペレーターの他の組合せ、例えばｐＺＴ７＃３．２およびｐＺＴ７＃３．１を使用してもよい。
【００８０】
例２
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ６２３（ＤＥ３）、ＭＳＤ６２４（ＤＥ３）、ＭＳＤ６８（ＤＥ３）、ＭＳＤ１０１（ＤＥ３）およびＭＳＤ５２２（ＤＥ３）−表１８参照−を、ヒトＴＮＦαを発現するｐＥＴ１１ａ：ＴＮＦ、ｐＺＴ７＃２．０：ＴＮＦ、ｐＺＴ７＃２．１：ＴＮＦ、ｐＺＴ７＃３．０：ＴＮＦ、ｐＺＴ７＃３．１：ＴＮＦ、ｐＺＴ７＃３．２：ＴＮＦおよびｐＺＴ７＃３．３：ＴＮＦ（既に記載した（表１））によって別々に形質転換した。得られた組み換え株を精製し、グリセロール保存液中に−８０℃で保持した。ｈＴＮＦαの基礎的発現／蓄積および誘導した発現／蓄積を例１に記載のように厳密に測定した。ｈＴＮＦαの発現／蓄積の基礎的（誘導していない）レベルおよびＩＰＴＧで誘導したレベルを以下に表３および表４にそれぞれまとめる。例１に記載した宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して得られたデータは参考のために含んでいる。
【００８１】
【表４】
0004394826.tif 000005
【００８２】
【表５】
0004394826.tif 000006
【００８３】
*検出限界：２５０分子／細胞
【００８４】
【表６】
0004394826.tif 000007
【００８５】
（*）：ＴＭＰ＝全微生物タンパク質
前記のデータは、ｐＺＴ７＃３．０、ｐＺＴ７＃３．１、ｐＺＴ７＃３．２およびｐＺＴ７＃３．３が誘導した生産性に悪影響を与えずに全ての試験した宿主株の使用で基礎的発現レベルを（ｐＥＴ１１ａ／ｐＺＴ７＃２．０に比して）低下させることを示している。ｐＺＴ７＃３．３は全ての試験した宿主株より一貫して優れている。
【００８６】
例３
−８０℃のグリセロール保存液からのＥ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ１０１（ＤＥ３）ｐＺｅｎ１７９８（ｐＥＴ１１ａ：ＴＮＦ）およびＭＳＤ１０１（ＤＥ３）ｐＺｅｎ１８２７（ｐＺＴ７＃３．３：ＴＮＦ）のアリコートをＬ−アガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により供給して選択可能にする）上にストリークし、３７℃で１６時間インキュベートした。次いで各培養のアリコートを滅菌ＰＢＳ１０ｍｌ中に再懸濁し、これを使用して、７５ｍｌの：
１．Ｌ−ブロス（グルコース不含）
２．Ｌ−ブロス＋１ｇ／Ｌのグルコース
３．２ｇ／Ｌグルコースを含有するＭ９最少培地
４．４ｇ／Ｌのグリセロールを含有するＭ９最少培地
を含有する２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコにＯＤ550＝０．１で播種した。
【００８７】
前記で使用した全ての増殖培地に場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を供給した。Ｍ９最少培地の組成は以下の表５に挙げている。Ｌ−ブロス培地の組成は以前に記載した。
【００８８】
【表７】
0004394826.tif 000008
【００８９】
（*最終ｐＨをｐＨ７に調整した）
次いでフラスコを往復運動型振盪機上で３７℃で２４時間インキュベートした。誘導していない培養中でのｈＴＮＦαの基礎的蓄積レベル（以下の表６でまとめた）を前記のように厳密に測定した。
【００９０】
【表８】
0004394826.tif 000009
【００９１】
*検出限界：２５０分子／細胞
この例はベクターｐＺＴ７＃３．３の広範な有用性を証明するものである。ｐＥＴ１１ａは増殖培地に依存した発現の抑制を示すが、ベクターｐＺＴ７＃３．３はそれに著しく反してＬ−ブロスおよびＭ９最少増殖培地の両者において厳しい抑制を示す。このことは意想外であり、完全に予想外であった。Ｌ−ブロスおよびＭ９最少増殖培地は微生物の増殖培地の２種の基本的な形態である：天然（Ｌ−ブロス）および最少塩（Ｍ９）。
【００９２】
例４
クローニングおよび毒性タンパク質の大量生産のためのベクターｐＺＴ７＃３．３の有用性はこの例において組み換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅＩ）を使用して例示している。宿主株ＢＬ２１（発現しない宿主のバックグラウンド）およびＢＬ２１（ＤＥ３）（発現するバックグラウンド）を以下のように形質転換した。ＣａＣｌ2法（Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989, “Molecular Cloning”, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Press, New York）を使用して調製したコンピテント細胞を、“ヒートショック”法（Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989, “Molecular Cloning”, 2nd Edition, Cold Spring Harbour Press, New York）を使用して、ｐＺｅｎ２００６（ｐＡＤ１０、前記のＤＮａｓｅＩを発現するｐＥＴ１１誘導体）、ｐＺｅｎ１９８０（ｐＺＴ７＃３．３：ＤＮａｓｅＩ）およびｈＴＮＦα（コントロールとして使用した：比較的毒性のない遺伝子産物）を発現するｐＺｅｎ１８２７（ｐＺＴ７＃３．３：ＴＮＦ）によってプラスミドＤＮＡ濃度の範囲で形質転換した。各宿主−プラスミドの組合せの形質転換効率をこの分野でよく記載されるように測定した。結果は以下に表７でまとめた。
【００９３】
【表９】
0004394826.tif 000010
【００９４】
【表１０】
0004394826.tif 000011
【００９５】
*３種の別々の試験からのデータ（ｎ＝３）
前記のデータはｐＺＴ７＃３．３を使用して達成された基礎的発現の厳密な制御を例示している。この結果は、ｐＺＴ７＃３．３：ＤＮａｓｅＩが抑制され、細胞の生存度に悪影響を及ぼさずにＴ７のＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３））への移行をサポートすることを示している。達成された形質転換効率はＢＬ２１（Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを有さない）中への形質転換によって得られるものか、または比較的毒性のない遺伝子産物ｐＺＴ７＃３．３：ｈＴＮＦαを有するものに相当する。ＤＮａｓｅＩの発現が漏出性であったならば細胞は生存していない。このことはｐＥＴ１１ａおよびｐＡＤ１０によって得られた結果と対照的である。組み換え細胞の増殖時に異種タンパク質が有することがある有害な作用および生産性の問題を回避するためにどのようにｐＺＴ７＃３．３を使用できるかは当業者には公知である。
【００９６】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＺｅｎ１９８０（ｐＺＴ７＃３．３：ＤＮａｓｅＩ）を使用するＤＮａｓｅＩの発現／蓄積を前記の試験からＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＺｅｎ１９８０形質転換体の単コロニーを採り、これを使用してＬ−ブロス（１ｇ／Ｌのグルコース、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）７５ｍｌを含有する単一のエルレンマイヤーフラスコに播種することによって測定した。このフラスコを往復運動型振盪機上で３７℃で１６時間インキュベートした。次いでこの培養を使用し、新しいＬ−ブロス（１ｇ／Ｌのグルコース、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）にＯＤ550＝０．１で播種した。次いでフラスコを増殖がＯＤ550＝０．５になるまで往復運動型振盪機上で３７℃でインキュベートした。次いで培養をＩＰＴＧ（０．５ｍＭ最終）の添加によって誘導し、前記の条件下で更に４時間インキュベートし続けた。細胞を回収し、細胞のペレットを−２０℃で保管した。細胞のペレットを解凍し、リシス緩衝液（１０ｍＭトリス；ｐＨ７．６、２ｍＭの塩化カルシウム、１００μＭのベンズアミジンおよび１００μＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））中に再懸濁（１０％ｗ／ｖ（湿重量））した。次いで細胞の懸濁液を、光学検鏡法による懸濁液の検定による細胞の破壊が＞９５％を示すまで音波処理（氷上で２０〜３０秒のバースト）した。細胞の破片を遠心分離（４℃、２５０００×ｇ、２０分）によって除去し、上清でのＤＮａｓｅＩ活性を澄明な上清１００μｌのクニッツ（Kunitz）アッセイ緩衝液（１０ｍＭトリス；ｐＨ８．０、０．１ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび５０μｇの子ウシ胸腺ＤＮＡ）１ｍｌへの添加によって測定した。１“クニッツ単位”はＡ260nm０．００１／分の増加をもたらすＤＮａｓｅＩの量である。結果は以下に表８でまとめた。
【００９７】
【表１１】
0004394826.tif 000012
【００９８】
Ｄｏｈｅｒｔｙ他（Gene, 1993, 136, pp337-340）は、ｐＡＤ１０によるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換によって生存可能な細菌コロニーが得られないことを見出した。このことは実質的に本願の観察（表７に前記）と（データにおける標準偏差を想定すれば）類似している。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳによっても、Ｄｏｈｅｒｔｙ他は、形質転換体は液体培地への移動による生存度が乏しいことを見出した。これと著しく異なって、ｐＺｅｎ１９８０（ｐＺＴ７＃３．３：ＤＮａｓｅＩ）で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）は発現しない宿主バックグラウンドを使用して達成されたものに相当する高い形質転換効率を達成し、更にＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＺｅｎ１９８０形質転換体は液体培養において生存度が高く、継代培養後でさえも生物学的に活性のＤＮａｓｅＩを発現する能力を保持する。
【００９９】
例５
−８０℃でのグリセロール保存液からのＥ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ１０１（ＤＥ３）ｐＺｅｎ１７９８（ｐＥＴ１１ａ：ＴＮＦ）およびＭＳＤ１０１（ＤＥ３）ｐＺｅｎ１８２７（ｐＺＴ７＃３．３：ＴＮＦ）をＬ−アガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により選択のために供給した）上にストリークし、３７℃で１６時間インキュベートした。各培養のアリコートを使用して、これをＭ９最少培地（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により供給した２ｇ／Ｌのグルコース）７５ｍｌを含有する２つの２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコそれぞれに播種した。培養を往復運動型振盪機上で３７℃で１６時間インキュベートし、これを使用してＭ９最少培地（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により供給した２ｇ／Ｌのグルコース）６００ｍｌを含有する各５つの２Ｌのエルレンマイヤーフラスコに別々にＯＤ550＝０．１で播種した。Ｍ９最少培地の組成は表５に挙げられている。前記フラスコを往復運動型振盪機上で３７℃でインキュベートし、増殖を培養のＯＤ550の測定により経時的に観察した。増殖がＯＤ550＝０．５に達した際に、培養を、インデューサーＩＰＴＧを各フラスコ（０．２５ｍＭ、０．０７５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０２５ｍＭおよび０．０１ｍＭ（最終））に添加することによって誘導した。これを前記の条件下で更に１０時間インキュベートし続け、その間に試料を採取し、細菌細胞中の増殖、ｈＴＮＦαの蓄積および全微生物タンパク質を測定した。ｈＴＮＦαの蓄積レベルを、この分野でよく知られているように試料の細菌の全体の細胞溶解産物のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャニングによって測定した。全微生物タンパク質のレベルを、製造者の解説書に従って使用されるＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（BCA Protein Assay Reagent）を使用して測定した。バイオマスの蓄積レベルを、この分野で容易に達成されるようにＯＤ550測定からのバイオマスの乾燥重量を計算することによって測定した。ｈＴＮＦαの比生産性（Ｑp）（生産されたｈＴＮＦα（ｇ）／細胞の乾燥重量（ｇ）／時間）を、この分野でよく達成されているプロトコールを使用して誘導期間の間に各標本点に関して計算した。誘導のために使用される各ＩＰＴＧ濃度で達成されるＱp(max)（ピークの比生産性）および最大のｈＴＮＦα蓄積レベル（全微生物タンパク質％）を図１３および図１４にそれぞれまとめた（*ＴＭＰ＝全微生物タンパク質）。
【０１００】
これらの結果は、濃度を増加させてＩＰＴＧを培地に添加することでｐＺＴ７＃３．３により用量に依存して発現が誘導されることを示している。しかしながら、ｐＥＴ１１ａによって発現は非常に低い濃度のインデューサーでさえも殆ど最大のレベルに誘導される。ｐＺＴ７＃３．３の意想外かつ予想できない特性によって当業者が広範な発現レベルにわたり異種タンパク質の生産を制御でき、その結果として最適な発現レベルを特定できることは明らかである。これは例９および例１０に例示した。
【０１０１】
例６
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、ＬＡＲｄ１（１２７５−１６１３）を発現するプラスミドｐＺｅｎ１９１１（ｐＥＴ１１ａ：ＬＡＲｄ１（１２７５−１６１３））で別々に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ４６０（ＤＥ３）およびＭＳＤ４６０（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、ＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓを発現するプラスミドｐＺｅｎ１９１４（ｐＥＴ１１ａ：ＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓ）で別々に形質転換した。得られた組み換え株を精製し、−８０℃でグリセロール保存液中に保持した。各培養のアリコートを保存液から採り、Ｌ−アガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１μｇ／ｍｌ）を場合により供給して選択可能にした）上にストリークし、３７℃で１６時間の増殖後に単コロニーを分離した。次いで各培養の単コロニーを、Ｌ−ブロス（＋１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１μｇ／ｍｌ））７５ｍｌを含有する２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に別々に播種した。フラスコを往復運動型振盪機上で３７℃で１６時間インキュベートした。次いでこれらの各播種した培養（seeder culture）を使用して、これをＬ−ブロス（１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１μｇ／ｍｌ））７５ｍｌ含有の２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにＯＤ550＝０．１で別々に播種した。次いでフラスコを、ＯＤ550＝０．５に達するまで往復型振盪機上で２０℃でインキュベートした。次いで培養をＩＰＴＧ（ＬＡＲｄ１（１２７５−１６１３）のためには０．５ｍＭおよびＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓのためには２ｍＭ）の添加によって誘導し、前記の条件下で更に２４時間インキュベートし続けた。ＬＡＲｄ１（１２７５−１６１３）およびＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓの蓄積を、前記の播種した培養およびＩＰＴＧで誘導した培養においてこの分野でよく知られているように試料の細菌の全体の細胞分解産物のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをスキャニングすることによって測定した。結果を以下に表９でまとめた。
【０１０２】
【表１２】
0004394826.tif 000013
【０１０３】
*ＴＭＰ：全微生物タンパク質
1. クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では検出されなかった
この例は高い基礎的発現に関するｐＥＴ１１ａの乏しい能力を例示している。インデューサーの不在下でのｐＬｙｓＳを使用する基礎的発現の低下は基礎的発現レベルを低下させるが、誘導された生産性に悪影響を及ぼさない。
【０１０４】
例７
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）をＭＣＰ−１（９−７６）を発現するプラスミドｐＺｅｎ１９７７（ｐＥＴ１１ａ：ＭＣＰ−１（９−７６））およびｐＺｅｎ１８４８（ｐＺＴ７＃３．３：ＭＣＰ−１（９−７６））で別々に形質転換した。得られた組み換え株を精製し、−８０℃でグリセロール保存液中に保持した。各培養のアリコートを保存液から採り、Ｌ−アガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により供給して選択可能にした）上に別々にストリークし、３７℃で１６時間増殖した後に単コロニーを分離した。次いで各培養の単コロニーを、Ｌ−ブロス（＋１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））７５ｍｌを含有する２つのそれぞれの２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に播種した。フラスコを往復運動型振盪機上で３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、これらの培養のそれぞれを使用して、これらをＬ−ブロス（１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））７５ｍｌを含有する３つの２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにＯＤ550＝０．１で播種した。次いでフラスコを、増殖がＯＤ550＝０．５に達するまで往復運動型振盪機上で３７℃、３０℃および２０℃でインキュベートした。次いで培養をＩＰＴＧ（０．２５ｍＭ最終）の添加により誘導し、前記の条件下で更に５〜２４時間インキュベートし続けた。ＭＣＰ−１（９−７６）の蓄積を、この分野でよく知られているように試料の細菌の全体の細胞分解産物のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをスキャニングすることによって測定した。細胞の細胞質（可溶）およびペレット（不溶）のフラクションにおけるＭＣＰ−１（９−７６）の分割（partitioning）（可溶性）をこの分野でよく知られているように試料の細菌に音波処理によるリシスを実施することによって測定した。結果を以下に表１０でまとめた。
【０１０５】
【表１３】
0004394826.tif 000014
【０１０６】
*ＴＭＰ＝全微生物タンパク質
ＭＣＰ−１（９−７６）の高レベルの可溶性蓄積のためのベクターｐＺＴ７＃３．３の有用性は前記のデータから明らかである。
【０１０７】
例８
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ４６０（ＤＥ３）をＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓを発現するプラスミドｐＺｅｎ１９１４（ｐＥＴ１１ａ：ＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓ）およびｐＺｅｎ１９１３（ｐＺＴ７＃３．３：ＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓ）で別々に形質転換した。得られた組み換え株を精製し、−８０℃でグリセロール保存液に保持した。各培養のアリコートを保存液から採り、Ｌ−アガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により供給し選択可能にした）上にストリークし、３７℃で１６時間増殖させた後に単コロニーを分離した。次いで各培養の単コロニーを、Ｌ−ブロス（＋１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））７５ｍｌを含有する２つの２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコそれぞれに播種した。フラスコを往復運動型振盪機上で３０℃で１６時間インキュベートした。次いで、これらの培養のそれぞれを使用して、これをＬ−ブロス（１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））７５ｍｌを含有する２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにＯＤ550＝０．１で播種した。次いでフラスコを、増殖がＯＤ550＝０．５に達するまで往復運動型振盪機上で２０℃でインキュベートした。次いで培養をＩＰＴＧ（２ｍＭ（最終））の添加により誘導して、前記の条件下で更に２４時間インキュベートし続けた。
【０１０８】
誘導後のＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓの蓄積を、この分野でよく知られているように試料の細菌の全体の細胞の分解産物のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのスキャニングによって測定した。細胞の細胞質（可溶）およびペレット（不溶）のフラクションにおけるＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓの分割（可溶性）をこの分野で公知のように試料の細菌に音波処理によるリシスを実施することによって測定した。音波処理によるリシス緩衝液は、試料のプロセス中にＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓのタンパク質分解を低下させるためにプロテアーゼインヒビター（１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのベンズアミジンおよび１ｍＭのヨードアセトアミド）を含んでいた。結果を以下に表１１でまとめた。
【０１０９】
【表１４】
0004394826.tif 000015
【０１１０】
*ＴＭＰ＝全微生物タンパク質
ＺＡＰ７０（４−２６０）−６Ｈｉｓの可溶性蓄積のためのベクターｐＺＴ７＃３．３の有用性を以下の表のデータによって例示する。
【０１１１】
例９
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ６２４（ＤＥ３）をＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃを発現するプラスミドｐＺｅｎ１９５３（ｐＥＴ１１ａ：ＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃ）およびｐＺｅｎ１９５４（ｐＺＴ７＃３．３：ＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃ）で別々に形質転換した。得られた組み換え株を精製し、−８０℃でグリセロール保存液中に保持した。各培養のアリコートを保存液から採り、Ｌ−アガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により供給して選択可能にした）上に別々にストリークし、３７℃での１６時間の増殖後に単コロニーを分離した。次いで各培養の単コロニーを、Ｌ−ブロス（＋１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））７５ｍｌを含有する２つの２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコそれぞれに播種した。フラスコを往復運動型振盪機上で３７℃で１６時間インキュベートした。次いでこれらの培養それぞれを使用して、これを６００ｍｌのＬ−ブロス（１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））を含有する１０個の２ＬのエルレンマイヤーフラスコにＯＤ550＝０．１で播種した。次いでフラスコを、増殖がＯＤ550＝０．５に達するまで往復運動型振盪機上で２０℃でインキュベートした。次いで培養をＩＰＴＧ（ＩＰＴＧ０．００１、０．００２５、０．００５、０．００７５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１および０．２５ｍＭ（最終））の添加によって誘導し、以下の条件下で更に４８時間インキュベートし続けた。次いで細胞を回収し（４℃、２５０００×ｇ、２０分）、浸透圧ショック細胞分画（この分野でよく知られているように）を実施し、可溶性のＥ．ｃｏｌｉペリプラズムのフラクションに分割されるタンパク質を含有する細胞フラクションを単離した。可溶性のＥ．ｃｏｌｉペリプラズムの抽出物における生物学的に活性のＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃの蓄積を以下のように基質のヒプリル−Ｌ−グルタミンからの馬尿酸の放出の測定によって決定した。
【０１１２】
細胞不含のペリプラズムの抽出物（１２５μｌ）を、２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌ、１００ｍＭの塩化亜鉛および０．５ｍＭの基質（ヒプリル−Ｌ−グルタミン）２．５μｌを含有する試験管に添加した。これを３７℃で２４時間インキュベートした。反応を、“停止溶液”（４０％のメタノール（ＨＰＬＣ純度）、６０％の５０ｍＭリン酸緩衝液（シグマＰ８１６５）、０．２％ｗ／ｖのトリクロロ酢酸）２５０μｌの添加によって停止させた。混合後に、形成した任意の沈殿物を遠心分離（４℃、１６０００×ｇ、３分）によって分離した。次いで澄明な上清中の馬尿酸の量をこの分野でよく達成されているようにＨＰＬＣを使用して測定した。
【０１１３】
生物学的に活性なＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃの蓄積を精製した活性な組み換えＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃおよび馬尿酸（シグマＨ６３７５）によって作成した検量線を参考に測定した。
【０１１４】
生物学的に活性なＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃのＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム中の蓄積（活性物質（μｇ）／培養（Ｌ））を図１５に表した。
【０１１５】
例１０
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＳＤ６２４（ＤＥ３）を、Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′）2を発現するプラスミドｐＺｅｎ１９９９（ｐＥＴ１１ａ：Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′）2）およびｐＺｅｎ１９９７（ｐＺＴ７＃３．３：Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′2））で別々に形質転換した。得られた組み換え株を精製し、−８０℃でグリセロール保存液中に保持した。各培養のアリコートを保存液から採り、Ｌ−アガープレート（アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を場合により供給して選択可能にした）上に別々にストリークし、３７℃での１６時間の増殖後に単コロニーを分離した。次いで各培養の単コロニーを、Ｌ−ブロス（＋１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））７５ｍｌを含有する２つの２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコそれぞれに播種した。フラスコを往復運動型振盪機上で３７℃で１６時間インキュベートした。次いでこれらの培養それぞれを使用して、Ｌ−ブロス（１ｇ／Ｌのグルコースならびに場合によりアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）またはテトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ））６００ｍｌを含有する１３個の２ＬのエルレンマイヤーフラスコにＯＤ550＝０．１で播種した。次いでフラスコをＩＰＴＧ（ＩＰＴＧ０．００５、０．０１、０．０２５、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２および０．２５ｍＭ（最終））の添加によって誘導し、前記の条件下で更に４８時間インキュベートし続けた。次いで細胞を回収（４℃、２５０００×ｇ、２０分）し、浸透圧ショック細胞分画（この分野でよく知られているように）を実施し、可溶性のＥ．ｃｏｌｉペリプラズムのフラクションに分割されるタンパク質を含有する細胞フラクションを単離した。可溶性のＥ．ｃｏｌｉペリプラズムの抽出物における生物学的に活性なＡ５Ｂ７（Ｆａｂ′）2／Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′）の蓄積をＡ５Ｂ７（Ｆａｂ′）2／Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′）とヒト腫瘍癌胎児性抗原（ＣＥＡ）とのＥＬＩＳＡアッセイでの結合の測定により評価した。生物学的に活性なＡ５Ｂ７（Ｆａｂ′）2／Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′）のＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおける蓄積（活性物質（ｍｇ）／培養（Ｌ））を図１６に表した。
【０１１６】
両者の（前記の例９および例１０に記載の）タンパク質によって、ｐＺＴ７＃３．３はｐＥＴ１１ａよりもＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム中に高レベルの活性産物を蓄積する。図１５〜１６に示されるデータは、ｐＺＴ７＃３．３の制御特性を組み換えタンパク質の収量を最適化するためにどのように活用できるかを示している。これらの例は分泌のためのｐＴＺ７＃３．３ベクターの使用を例示している。しかしながら、ｐＺＴ７＃３．３の発現特性の基礎的レベルの発現／調節が異種の膜タンパク質の発現および蓄積をどのように促進するかを当業者は容易に理解することができる。
【０１１７】
【表１５】
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【０１１８】
【表１６】
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【０１１９】
【表１７】
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【０１２０】
【表１８】
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【０１２１】
【表１９】
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【０１２２】
【表２０】
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【０１２３】
【表２１】
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【０１２４】
【表２２】
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【０１２５】
【表２３】
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【０１２６】
【表２４】
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【０１２７】
【表２５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はｐＺＥＮ００４２プラスミドを示す。
【図２】  図２はｐＺＥＮ００４２からのｐＺＥＮ００４２＃ａの構築を示す。
【図３】  図３はｐＺＥＮ００４２＃ｂプラスミドを示す。
【図４】  図４はｐＺＥＮ００４２＃ｃプラスミドを示す。
【図５】  図５はｐＺＥＮ００４２＃ｄプラスミドを示す。
【図６】  図６はｐＺＥＮ００４２＃ｅプラスミドを示す。
【図７】  図７はｐＺＴ７＃２．０プラスミドを示す。
【図８】  図８はｐＺＴ７＃２．１プラスミドを示す。
【図９】  図９は本発明のｐＺＴ７＃３．０プラスミドを示す。
【図１０】  図１０は本発明のｐＺＴ７＃３．２プラスミドを示す。
【図１１】  図１１は本発明のｐＺＴ７＃３．１プラスミドを示す。
【図１２】  図１２は本発明のｐＺＴ７＃３．３プラスミドを示す。
【図１３】  図１３は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される最大の比生産性を示す。
【図１４】  図１４は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される最大のｈＴＮＦαの蓄積レベルを示す。
【図１５】  図１５は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される生物学的に活性のＣＰＢ［Ｄ２５３Ｋ］−６Ｈｉｓ−ｃｍｙｃ（活性の物質（μｇ）／培地（Ｌ）として）の蓄積を示す。
【図１６】  図１６は種々のＩＰＴＧ濃度で達成される生物学的に活性なＡ５Ｂ７（Ｆａｂ′）2／Ａ５Ｂ７（Ｆａｂ′）（活性物質（ｍｇ）／培地（Ｌ）として）のＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム中での蓄積を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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