(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、破骨細胞形成を抑制する活性を有する物質のスクリーニング方法、
１）下記A又はBに記載の蛋白質及び破骨細胞形成促進因子（OBM）の内、一方を固相化する工程、
A.下記のいずれかに記載の蛋白質、
ａ）配列表配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
ｂ）配列表配列番号１１に記載のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質、
ｃ）次のDNAにコードされる蛋白質、
c-ａ）配列表配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるDNA、
c-ｂ）c-ａ）に記載のDNAの相補的な塩基配列と高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質をコードするDNA。
B.下記のいずれかに記載の蛋白質、
ａ）配列表配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
ｂ）配列表配列番号７に記載のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質、
ｃ）次のDNAにコードされる蛋白質、
c-ａ）配列表配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなるDNA、
c-ｂ）c-ａ）に記載のDNAの相補的な塩基配列と高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質をコードするDNA、
２）被験物質を、１）において固相化しなかった蛋白質と共に、１）において固相化した蛋白質と接触させる工程、
３）一定時間経過後洗浄し、固相化しなかった蛋白質の固相化蛋白質との結合量を測定し、該結合量が少ない被験物質を選別する工程。
【請求項２】
下記A又はBに記載の蛋白質からなる、破骨細胞形成を抑制する活性を有する物質のスクリーニング用ツール、
A.下記のいずれかに記載の蛋白質、
ａ）配列表配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
ｂ）配列表配列番号１１に記載のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質、
ｃ）次のDNAにコードされる蛋白質、
c-ａ）配列表配列番号１０に記載のヌクレオチド配列からなるDNA、
c-ｂ）c-ａ）に記載のDNAの相補的な塩基配列と高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質をコードするDNA。
B.下記のいずれかに記載の蛋白質、
ａ）配列表配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
ｂ）配列表配列番号７に記載のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質、
ｃ）次のDNAにコードされる蛋白質、
c-ａ）配列表配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなるDNA、
c-ｂ）c-ａ）に記載のDNAの相補的な塩基配列と高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし、且つ、破骨細胞形成促進因子（OBM）に特異的に結合する蛋白質をコードするDNA。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、破骨細胞形成促進因子(OBM) に特異的に結合する蛋白質、その蛋白質をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含有するベクター及びこのベクターを組み込んだ宿主に関する。
さらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、破骨細胞形成促進因子と本発明蛋白質又はOBM 結合蛋白質(OBM-BP)との結合を特異的に阻害する物質を選択する方法、及び該蛋白質又は前記の選択する方法により得られた物質を有効成分とする医薬に関する。
本発明蛋白質は、生化学試薬、あるいは骨粗鬆症等の骨代謝疾患の予防及び／又は治療薬として有用である。又、本発明の破骨細胞形成促進因子(OBM) と該蛋白質又はOBM 結合蛋白質(OBM-BP)との結合を特異的に阻害する物質を選択する方法は、破骨細胞の形成を阻害する物質を探索する方法として、又、得られた物質は、生化学試薬、あるいは骨粗鬆症などの骨代謝疾患の予防及び／又は治療薬として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
骨代謝は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の、総合された活性に依存している。骨代謝異常は、骨形成と骨吸収の均衡が崩れることにより発生すると考えられている。骨代謝の異常を伴う疾患として、骨粗鬆症、高カルシウム血症、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リューマチあるいは変形性関節炎等が知られている。これらの骨代謝異常疾患の代表として、骨粗鬆症が挙げられる。この疾患は、破骨細胞による骨吸収が骨芽細胞による骨形成を上回ることにより発生する疾患であり、骨の石灰質と骨基質とが等しく減少することを特徴とする。この疾患の発生メカニズムについては未だ完全には解明されていないが、骨の疼痛が発生し、骨の脆弱化による骨折が起こる。高齢者人口の増加に伴い、骨折による寝たきり老人の原因にもなるこの疾患は社会問題にもなっており、その治療薬の開発が急務となっている。このような骨代謝異常による骨量減少症は骨吸収の抑制、骨形成の促進、或いはこれらのバランスの改善により治療することができると期待される。即ち、骨形成は、骨形成を担当する骨芽細胞の増殖、分化、機能を促進すること、或いは破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟を抑制すること、あるいは破骨細胞の骨吸収活性等の機能を抑制することにより促進されると期待される。このような活性を有するホルモン、低分子物質あるいは生理活性蛋白質について、現在精力的な探索及び開発研究が進められている。
【０００３】
既に、骨に関わる疾患の治療及び治療期間の短縮を図る医薬品として、カルシトニン製剤、活性型ビタミンＤ3 製剤、エストラジオールを含有するホルモン製剤、イプリフラボン、ビタミンＫ2 、ビスフォスフォネート系化合物等があり、さらにより副作用が少なく、有効性に優れた治療薬の開発を目指して活性型ビタミンＤ3 誘導体、エストラジオール誘導体、第２世代又は第３世代のビスフォスフォネート系化合物等の臨床試験が実施されている。
しかし、これらの薬剤を用いた治療法は、その効果並びに治療結果において必ずしも満足出来るものではなく、より安全かつ有効性の高い新しい治療薬の開発が期待されている。又、骨代謝疾患の治療に使用されている薬剤の中には、その副作用により治療可能な疾患が限定されているものもある。このような観点から、従来の医薬品とは異なった作用メカニズムを持ち、しかもより有効性が高くかつ副作用の少ない医薬品の開発が期待されている。
【０００４】
前述したように、骨代謝を担当する細胞は骨芽細胞と破骨細胞である。破骨様細胞をin vitroで形成させるためには骨芽細胞様細胞と破骨細胞前駆細胞を共存させることが必須であるという観察結果より、骨芽細胞は破骨細胞形成に重要な役割を担っていると考えられている(Takahashi et al., Endocrinology, 123, 2600-2602,1988)。この共存培養系においては、骨芽細胞様細胞が未熟な破骨細胞前駆細胞と接触することが破骨細胞様細胞の形成に必須であるとされている。この細胞間接着による破骨細胞形成に関与する因子として、骨芽細胞様ストローマ細胞の膜上に発現される破骨細胞分化誘導因子（osteoclast differentiation factor, ODF)(Suda T. et al.: Endocrine Rev. 13, 66-80, 1992; Suda et al.,: Bone 17, 87S-91S, 1995) という分子が仮想されている。Suda T. らの仮説によれば、破骨細胞の前駆細胞に ODFのレセプターが存在しており、 ODFが ODFレセプターに結合することにより破骨細胞が分化成熟すると考えられている。これらの分子の同定、メカニズムの解明は基礎医学領域の進歩に多大な貢献をするだけでなく、新しい作用メカニズムに基づく新規な骨代謝異常症治療薬の開発にも貢献することが期待される。今般、本発明者らはこのような現状に鑑み鋭意探索を進めた結果、ヒト胎児肺線維芽細胞IMR-90 (ATCC CCL186)の培養液中に共存培養系での破骨細胞形成を抑制する因子(osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF を見出した（WO96/26217号）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、破骨細胞の分化に関与する因子はOCIFと相互作用するとの仮定のもと、OCIFに結合する蛋白質のcDNAの単離を鋭意推進した結果、骨芽細胞様ストローマ細胞由来のcDNA発現ライブラリーから、OCIF結合蛋白質OBM のcDNAを単離することに成功した。このcDNAを用いてOBM を発現させ生物活性を調べた結果、OBM は細胞質膜上に発現する破骨細胞分化誘導因子であることを見出した。さらに本発明者らは、遺伝子組換え型OBM を用いてOBM に結合する蛋白質(OBM-BP)の探索を行った。その結果、マクロファージ系の細胞株、C7細胞のcDNAライブラリー中からOBM-BPをコードするcDNAを分離同定し、さらに、OBM が破骨細胞前駆細胞上のOBM-BPに結合することにより、破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へと分化成熟させることを見出すに至った。
従って本発明の課題は、破骨細胞形成促進因子(OBM) に特異的に結合する特定の新規なアミノ酸配列を有する蛋白質を提供することにある。
また、本発明の課題は、該蛋白質をコードするＤＮＡ、これを含有するベクター及び該ベクターを組み込んだ宿主を提供することにある。さらに、本発明の課題は、該蛋白質に対する抗体、破骨細胞形成促進因子(OBM) と本発明蛋白質又はOBM 結合蛋白質(OBM-BP)との結合を特異的に阻害する物質を選択する方法、及び該蛋白質又は前記の選択する方法により得られた物質を有効成分とする医薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列表配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質に関する。
また本発明は、該アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、破骨細胞形成促進因子(OBM) に特異的に結合する蛋白質に関する。
さらに本発明は、該蛋白質をコードするＤＮＡに関する。このＤＮＡは、配列表配列番号１０のヌクレオチド配列で例示される。
また本発明は、該ＤＮＡとハイブリダイズし、破骨細胞形成促進因子(OBM) に特異的に結合する蛋白質をコードするＤＮＡに関する。又、該ＤＮＡを発現することにより得られる蛋白質に関する。又、該ＤＮＡを含有するベクターに関する。又、該ベクターを組み込んだ宿主に関する。
また本発明は、該蛋白質に対する抗体に関する。
さらに本発明は、(1) OBM 又はOBM を分子内に含む蛋白質を固相化する工程、(2)(1)の工程で固相化された蛋白質に、被験物質の共存下で該蛋白質又はOBM-BPを結合させる工程、(3)(2)において結合させた該蛋白質又はOBM-BPを、該蛋白質もしくはOBM-BPに対する標識抗体により定量する工程からなる、破骨細胞形成促進因子(OBM) と該蛋白質又は配列表配列番号７に示されるOBM 結合蛋白質(OBM-BP)との結合を特異的に阻害する物質を選択する方法に関する。
また本発明は、このような選択方法により選択された物質に関する。
さらに本発明は、該蛋白質、該物質又はOBM 結合蛋白質(OBM-BP)を有効成分とする医薬に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、上記のように、配列表配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は、該アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、破骨細胞形成促進因子(OBM) に特異的に結合する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター及び該ベクターを組み込んだ宿主に関する。さらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、破骨細胞形成促進因子(OBM) と本発明蛋白質又は配列表配列番号７に示されるOBM 結合蛋白質(OBM-BP)との結合を特異的に阻害する物質を選択する方法、及び該蛋白質又は前記の選択する方法により得られた物質を有効成分とする医薬に関する。
本発明の OBM、OBM-BP、及びそれらのcDNAの取得法としては、以下の方法が用いられる。
【０００８】
目的の蛋白質をコードするcDNAを分離する (cDNAクローニング) 方法としては、発現ベクター中にcDNAライブラリーを構築し、それらを細胞中に導入し、目的の蛋白質の発現の有無をスクリーニングすることにより目的のcDNAを単離する方法（発現クローニング法）が知られている(D'Andrea et al.: Cell 57, 277-285, 1989; Fukunaga et al.:Cell 61, 341-350, 1990) 。発現クローニング法では、宿主細胞として細菌、酵母、動物細胞などが目的に応じて使い分けられている。本発明のように、動物細胞の膜表面に存在すると考えられる蛋白質をコードするcDNAをクローニングする際には、動物細胞を宿主とする場合が多い。又ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率の高い宿主が通常使用される。
【０００９】
そのような特徴を持つ細胞のひとつが、本発明で用いたサル腎臓細胞 COS-7細胞である。COS-7 細胞ではSV40 large T antigenが発現しているため、SV40の複製開始点を持つプラスミドは細胞中で多コピーのエピソームとして存在し、通常より高発現が期待できる。又、ＤＮＡを導入した時点から数日のうちに最高の発現レベルに到達するので迅速なスクリーニングが可能である。この宿主細胞に高発現可能なプラスミドを組み合わせることによって、極めて高レベルの遺伝子発現が可能となる。プラスミド上で最も遺伝子の発現量に影響を与える因子はプロモーターであり、高発現用のプロモーターとしてSRαプロモーターやサイトメガロウィルス由来プロモーター等がよく使用される。
【００１０】
発現クローニングにより膜蛋白質のcDNAをクローニングしようとする際のスクリーニング法として、バインディング法 (binding 法) 、パニング法 (panning 法) 、フィルムエマルジョン法などが考案されている。OBMcDNA は、マウスST2 細胞を10-8M 活性型ビタミンD3及び10-7M デキサメタゾンを含む培地で培養した細胞のcDNAライブラリーから、OCIFをプローブとして発現クローニング法により単離することができる。OCIFはWO96/26217号に従って、ヒト胎児性線維芽細胞株IMR-90の培養液から単離することができる。OBM-BPはマウスC7細胞のcDNAライブラリーから、OBM をプローブとして発現クローニング法により単離することができる。
【００１１】
又、このマウス由来OBM-BPcDNAをプローブとして、ヒトなど他の哺乳動物のOBM-BPを得ることもできる。OBM あるいはOBM-BPのcDNAを発現ベクターに挿入したプラスミドを作製し、これらを動物細胞や細菌などの細胞中に導入して発現させることにより、組換え型OBM あるいはOBM-BPを製造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主としては COS-7、CHO 、Namalwa などを、又細菌の宿主として大腸菌などを用いることができる。遺伝子組換え型OBM はOCIF固定化カラム、また遺伝子組換え型OBM-BPはOBM 固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィー、あるいはゲルろ過クロマトグラフィーなどを組み合わせることにより精製することができる。このようにして得られたOBM-BPは、以下の特性を有する。
(1) 分子量：20,000〜30,000
(2) 結合：破骨細胞形成促進因子(OBM) に特異的に結合する。
(3) 活性：破骨細胞形成を抑制する。
(4) アミノ酸配列：配列表配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１２】
さらに、遺伝子組み換え型OBM あるいはOBM-BPは、PCR Protocol記載の方法（Russell Higuchi, 177-183, Academic Press, New York (1990))等に従い、各々の変異体を得ることができる。即ち、目的とする変異を持つ合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし、各々の蛋白質をコードするＤＮＡを鋳型として PCR(Polymerase Chain Reaction) を行うことにより、cDNAに置換、欠失、あるいは付加などの変異を導入することができる。得られた変異体cDNAを発現ベクターに挿入し、細菌、昆虫、動物細胞などで発現させることにより、アミノ酸が置換、欠失、あるいは付加した該蛋白質の変異体を得ることができる。
【００１３】
このようにして精製したOBM 又はOBM-BPを、マイクロプレート等に添加し一定時間静置することにより、これらの蛋白質が固相化されたプレートを作製できる。固相化の方法としては、これら蛋白質を直接プレートに固相化するか、又は特異的抗体を介して結合させ固相化することができる。OBM 又はOBM-BPは、酵素や放射性同位元素等で標識することができる。標識するための酵素としては、通常用いられるものであれば特に限定されないが、好ましくはアルカリフォスファターゼや西洋ワサビパーオキシダーゼなどが用いられる。又、放射性同位元素としては、通常用いられるものであれば特に限定されないが、好ましくは 125Ｉなどが用いられる。OBM 又はOBM-BPのどちらか一方をプレート上に固定しておき、もう一方の蛋白質を標識し、被験物質とともに前記プレートに加えて一定時間反応させることによって、OBM とOBM-BPとの結合を特異的に阻害する物質、即ち骨代謝疾患予防及び／又は治療薬の候補物質を単離することができる。又、OBM とOBM-BPとの結合の検出には、非固相化蛋白質に対する抗体を用いて検出することも可能である。
【００１４】
抗OBM-BP抗体は、分泌型OBM-BP（以下、sOBM-BP と称することもある）を免疫原として常法により作製される。この時用いる抗原としては、分泌型OBM-BP cDNA を用いて微生物や真核細胞を宿主として生産された遺伝子組換え型OBM-BP、あるいはOBM-BPのアミノ酸配列に基づいて設計した合成ペプチドや、OBM-BPの加水分解部分ペプチドなどを用いることができる。これらの抗原を用いて、また必要ならば免疫アジュバントを併用して、適当な哺乳動物を免疫し、その血清から常法により精製することにより、抗OBM -BP ポリクローナル抗体を得ることができる。得られた抗OBM -BP ポリクローナル抗体をアイソトープや酵素で標識することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA) やエンザイムイムノアッセイ(EIA) の測定系に使用することができる。この測定系を用いることにより、血液や腹水などの生体試料や細胞培養液などのOBM-BP濃度を容易に測定できる。又、本抗体の性質から、破骨細胞形成を促進あるいは抑制することにより効果が得られる、骨粗鬆症などの骨代謝疾患治療剤として用いることもできる。さらには、上記OBM とOBM-BPを用いた骨代謝疾患治療剤を選択する方法において、OBM とOBM-BPの結合の検出に用いることができる。
【００１５】
本発明の蛋白質である分泌型OBM-BPは、その活性から骨粗鬆症などの骨量減少症、リウマチ、変形性関節症、又は多発性骨髄腫などの骨代謝異常疾患、あるいはこれらの骨代謝異常疾患に伴う高カルシウム血症などの治療及び改善を目的とした医薬組成物、あるいはこのような疾患の免疫学的診断を確立するための抗原、さらには上述のスクリーニングなどに用いる生化学試薬として有用である。本発明蛋白質及び選択する方法により得られた物質は、製剤化して経口あるいは非経口的に、ヒトあるいは動物に対して安全な薬剤として投与することができる。非経口的投与には、例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与、経肺投与、経鼻投与、経腸投与、口腔内投与、経粘膜投与等が挙げられ、これらの製剤が投与される。例えば注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収テープなどが挙げられる。経口投与製剤として例えば錠剤（糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コーティングされたものも含む）、丸剤、トローチ剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放化製剤等が挙げられる。経口投与用液剤には懸濁剤、乳剤、シロップ剤（ドライシロップを含む）、エリキシル剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等と共に医薬組成物として投与される。
【００１６】
これらの製剤に用いる担体や賦形剤としては、例えば乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末など、結合剤としては例えばデンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど、崩壊剤としては例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴールなど、着色剤としては医薬品に添加することが許容されているものを、それぞれ用いることができる。錠剤、顆粒剤は必要に応じ白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体などで被膜しても良く、又これらの２種以上を用いた層で被膜しても良い。さらにエチルセルロースやゼラチンのような物質のカプセルでも良い。又、注射剤を調製する場合は、主薬に必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して、常法により各注射剤とする。
【００１７】
【実施例】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１８】
【実施例１】
OBM cDNAのクローニング
(1) マウスST2 細胞からのRNA の抽出
マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2 (RIKEN CELL BANK, RCB0224)は、10％牛胎児血清を含むα-MEM（ギブコ BRL社）を用いて培養した。一枚の付着細胞用225cm2T-フラスコでコンフルエントになるまで培養したST2 細胞を、トリプシン処理してT-フラスコから剥がし洗浄した後、5 枚の225cm2T-フラスコに分配し、10-8M 活性化ビタミンD3(Calcitriol 、和光純薬社) 、10-7M デキサメサゾン、及び10％牛胎児血清を添加したα-MEM60mlを各々のフラスコに加えてCO2 インキュベーター中で５日間培養した。培養したST2 細胞からISOGEN (和光純薬) を用いて総 RNAを抽出した。総 RNA約600 μg からOligo(dT)-cellulose カラム(5'-3'Prime 社) を用いてポリ A+ RNA(約８μg)を調製した。
【００１９】
(2) 発現ライブラリーの構築
実施例１−(1) で得られたポリ A+ RNA ２μg からGreat Length cDNA Synthesis kit (Clontech 社) を用い、その説明書に従い二本鎖cDNAを合成した。即ち、ポリA RNA 2 μg とOligo(dT)25(dN) プライマーを混合し蒸留水を加えて最終容量を6.25μl とし、70℃で3 分保温後、氷中で2 分冷却した。この溶液に蒸留水2.2 μl 、5X First-strand buffer 2.5μl 、100 mM DTT (ジチオスレイトール) 0.25μl 、PRIME RNase Inhibitor(1U/ml) (5'-3' Prime 社) 0.5 μl 、５倍希釈した [α-32P]dCTP(アマシャム社、3000Ci/mmol 、2 μCi/ μl) 0.5μl 、dNTP (各20mM) 0.65μl 、MMLV (RNaseH- ) 逆転写酵素 1.25 μl(250 ユニット）を加え、42℃で90分保温した。さらに、蒸留水を 62.25μl 、5X second-strand buffer 20μl 、dNTP (各20mM) 0.75μl 、Second-strand enzyme cocktail ５μl を添加し、16℃で２時間保温した。この反応液にT4 DNA polymerase 7.5 ユニットを加え、16℃でさらに30分保温後 0.2 M EDTA ５μl を添加して反応を停止し、フェノール・クロロフォルム処理後、エタノール沈殿を行った。この二本鎖ｃＤＮＡの末端にEcoRI-SalI-NotI リンカー(Clontech 社) を付加し、末端をリン酸化した。サイズフラクショネーション用カラムにより500bp 以上のｃＤＮＡを分離し、エタノール沈殿を行った。沈殿したＤＮＡを水に溶解し、あらかじめ制限酵素 EcoRI (宝酒造社) 切断及びCIAP (ウシ小腸アルカリフォスファターゼ、宝酒造社) 処理して調製したpcDL-SR α296 (Molecular and Cellular Biology, Vol. 8, pp466-472, 1988) に挿入した。
【００２０】
(3) OCIFとの結合を指標とした発現ライブラリーのスクリーニング
得られたＤＮＡを用い大腸菌、XL2 Blue MRF'(東洋紡社) を形質転換し、ウェルあたり約100 コロニーとなるように細胞培養用24ウェルプラスティックプレートに調製したL-カーベニシリン寒天培地（１％トリプトン、0.5 ％イーストエキス、１％NaCl、60μg/mlカーベニシリン、1.5 ％寒天) 上に増殖させた。各ウェル中の形質転換株を３mlのTerrific Brothアンピシリン培地（1.2 ％トリプトン、2.4 ％イーストエキス、0.4 ％グリセロール、0.017 M KH2PO4、0.072 M K2HPO4、100 μg/mlアンピシリン）に懸濁し、37℃で一晩振盪培養した。遠心により集菌しQIAwell kit(QIAGEN社) を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。260nm における吸光度によりＤＮＡ含量を測定し、エタノール沈殿により濃縮し、200ng/μl となるように蒸留水に溶解した。この様にしてそれぞれ約100 個のコロニーから由来するＤＮＡプールを500 プール調製し、COS-7 細胞(RIKEN CELL BANK, RCB0539)へのトランスフェクションに用いた。COS-7 細胞を24ウェルプレートに８×104 細胞／ウェルとなるように播種し、10％牛胎児血清を含むDMEMを用いて、CO2 インキュベーター中で37℃にて一晩培養した。翌日、培地を除いた後、無血清DMEMで細胞を洗浄した。トランスフェクション用試薬リポフェクタミン（ギブコ BRL社) 添付のプロトコールに従い、予めOPTI-MEM（ギブコ BRL社) を用いて希釈しておいた前記プラスミドＤＮＡとリポフェクタミン（ギブコ BRL社）を混合し、15分後この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用いたＤＮＡ及びリポフェクタミンの量はそれぞれ１μg 及び４μl とした。５時間後培地を除去し、１mlの10％牛胎児血清を含むDMEM（ギブコ BRL社) を添加し、CO2 インキュベーター中（５％CO2)、37℃で２〜３日培養した。
【００２１】
上記の様にトランスフェクトし２〜３日培養した COS-7細胞を無血清DMEMで洗浄した後、125I標識したOCIF 20ng/mlを加えた結合試験用培地(0.2％牛血清アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.1mg/ml heparin及び0.02％ NaN3 を加えた無血清DMEM) 200 μl を各ウェルに加えた。CO2 インキュベーター中（５％CO2)で37℃１時間培養した後、0.1mg/ml heparinを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500 μl で２回洗浄した。洗浄後、0.1 N NaOH溶液 500μl を各ウェルに加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解させ、各ウェル中の放射活性をガンマーカウンター (パッカード社) で測定した。計500 プールをスクリーニングすることにより、OCIFと特異的に結合する蛋白質(OBM) をコードするcDNAを含むＤＮＡプール１つを分離した。さらにこのＤＮＡプールを細分化し、前記と同様のトランスフェクションとスクリーニング操作を繰り返すことにより、OCIFと結合する蛋白質、OBM をコードするcDNAを単離した。配列を配列表配列番号１に示す。このcDNAを含むプラスミドをpOBM291 と名付けた。このプラスミドを含む大腸菌は、pOBM291 として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP-5953 として平成９年５月23日に寄託されている。
【００２２】
OCIFの 125Ｉ標識法ならびにELISA による 125Ｉ標識OCIFの定量法を以下に示す。OCIFはヨードジェン(Iodogen) 法により 125Ｉ標識した。2.5 mg/ml Iodogen −クロロホルム溶液 20 μl を 1.5 ml エッペンドルフチューブに移し、40℃でクロロホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを 0.5 Mリン酸ナトリウム緩衝液 (Na-Pi, pH 7.0) 400μl で3 回洗浄した後、 0.5 M Na-Pi, pH 7.0, 5 μl を加えた。このチューブに Na-125I溶液(Amersham 社、NEZ-033H20) 1.3 μl(18.5 MBq) を加えた後、直ちに１mg/ml ｒOCIF溶液（モノマー型あるいはダイマー型） 10 μl を加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め 10mg/mlヨウ化カリウム0.5 M Na-Pi, pH 7.0 溶液80μl と５％牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水 (BSA-PBS) 5μl を添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液をBSA-PBS で平衡化しておいたスピンカラム（１ml, G-25 fine,  ファルマシア社) に負荷し、2,000 rpm で５分間遠心した。カラムから溶出された画分にBSA-PBS を400 μl 加え攪拌した後、２μl を取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。
【００２３】
又、 125Ｉ標識OCIF溶液のOCIF生物活性は、WO 96/26217 号記載の方法に従い測定した。又、 125Ｉ標識OCIF濃度は以下のように ELISAにより測定した。即ち、WO96/26217号の方法で得られた抗OCIFウサギポリクローナル抗体を 2μg/mlになるように溶解させた 50 mM NaHCO3, pH 9.6 を 100μl ずつ96ウェルイムノプレート (MaxisoapTM、Nunc社）の各ウェルに加えて４℃で一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエース（雪印乳業社）とリン酸塩緩衝生理食塩水の混合水溶液（混合比25:75)(B-PBS) を 200μl ずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、各ウェルを0.01％ Polysorbate 80 を含むリン酸塩緩衝生理食塩水(P-PBS) で3 回洗浄し、次いで 125Ｉ標識OCIFサンプルあるいはOCIF標準品を添加したB-PBS を 100μl ずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、P-PBS  200μl で各ウェルを６回洗浄した。パーオキシダーゼ標識した抗OCIFウサギポリクローナル抗体をB-PBS で希釈した溶液を100 μl ずつ各ウェルに加え、室温で２時間放置した。この液を吸い取った後、P-PBS 200 μl で各ウェルを６回洗浄した。TMB 溶液（TMB Soluble Reagent, High Sensitivity, Scytek 社) を100 μl ずつ各ウェルに加え、室温で２〜３分放置した後、停止液(Stopping Reagent, Scytek 社) を100 μl ずつ各ウェルに加えた。各ウェルの 450 nm における吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。OCIF標準品を用いて作製した検量線より 125Ｉ標識OCIFの濃度を求めた。
【００２４】
【実施例２】
チオレドキシン−OBM 融合蛋白質(Trx-OBM) 発現ベクターの構築
10μl の10X ExTaq バッファー（宝酒造社）、８μl の10mMdNTP（宝酒造社）、77.5μl の滅菌蒸留水、２μl のpOBM291 (10ng/μl)、１μl のプライマーOBM3（100pmol/μl) (配列表配列番号２）、1 μl のプライマーOBMSalR2（配列表配列番号３）、0.5 μl のExTaq (5u/μl)（宝酒造社）を混合しマイクロ遠心管中でPCR 反応を行った。95℃５分、50℃１秒、55℃１分、74℃１秒、72℃５分の反応後、96℃１分、50℃１秒、55℃１分、74℃１秒、72℃３分の反応を25サイクル行った。１％アガロースゲル電気泳動により、反応液全量から約750bp のＤＮＡ断片をQIAEX II gel extraction kit(QIAGEN社）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片（全量）を制限酵素SalI,EcoRI（宝酒造社）で切断した後、1.5 ％アガロースゲル電気泳動を行い約160bp のＤＮＡ断片（断片１）を精製し20μl の滅菌蒸留水に溶解した。同様に、４μg のpOBM291 を制限酵素BamHI とEcoRI(宝酒造社）で切断して得られる約580bp のＤＮＡ断片（断片２）、並びに２μg のpTrXFus(Invitrogen社）を制限酵素BamHI とSalI（宝酒造社）で切断することにより得られる約3.6kb のＤＮＡ断片（断片３）をそれぞれ精製し、20μl の滅菌蒸留水に溶解した。ＤＮＡ断片の精製にはQIAEX II gel extraction kit を用いた。断片１、断片２、及び断片３をＤＮＡligation kit ver.2（宝酒造社）を用い、16℃で２時間30分保温することにより結合させた。このライゲーション反応液を用い大腸菌GI724 株（Invitrogen社）をThioFusion Expression System（Invitrogen社）添付のInstruction Manualに記載の方法で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株から、制限酵素切断により得られるＤＮＡ断片地図の解析、ならびにＤＮＡ配列の決定により、OBM cDNA断片がチオレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合しているプラスミドを持つ菌株を選び出した。得られた菌株をGI724/pTrxOBM25 と名付けた。
【００２５】
【実施例３】
大腸菌での Trx−OBM の発現
GI724/pTrxOBM25 株及びpTrxFus を持つGI724 株（GI724/pTrxFus)それぞれを2ml のRMG-Amp 培地（0.6 ％Na2HPO4, 0.3％KH2PO4, 0.05％NaCl, 0.1 ％NH4Cl , ２％カザミノ酸（Difco 社) 、１％グリセロール、１mM MgCl2、100 μg/mlアンピシリン(Sigma社) 、pH7.4)で30℃で６時間振とう培養した。菌液0.5ml を50mlのInduction 培地(0.6％Na2HPO4 、0.3 ％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1 ％NH4Cl 、0.2 ％カザミノ酸、0.5 ％グルコース、１mM MgCl2、100 μg/ml  アンピシリン、pH 7.4）に添加し、30℃で振とう培養した。OD600nm での値が約0.5 になった時点で最終濃度が0.1mg/mlになるようにL-トリプトファンを添加し、さらに30℃での振とう培養を６時間継続した。菌液を3000×ｇで遠心し菌体を集め、12.5mlのPBS(10mMリン酸バッファー、0.15M NaCl,  pH7.4) に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（UltraSonic社）にかけ菌体を破砕し、7000×ｇで30分遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。この可溶性蛋白質画分液10μl ずつを還元条件下でのSDS ポリアクリルアミド（10％）電気泳動に供した。GI724/pTrxOBM25 の可溶性蛋白質画分液にはGI724/pTrxFus の可溶性蛋白質画分液には見られない約40kDa のバンドが検出された。よって、チオレドキシンとOBM の融合蛋白質(Trx-OBM) が大腸菌中で発現していることが確認された。
【００２６】
【実施例４】
Trx−OBM を生産する大腸菌の大量培養
GI724/pTrxOBM25 をRMG-Amp 寒天培地（0.6 ％Na2HPO4 、0.3 ％KH2PO4、0.05％NaCl、0.1 ％NH4Cl 、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１mM MgCl2、100 μg/mlアンピシリン、 1.5％寒天、 pH7.4) に白金耳で塗まつし30℃で一晩培養した。菌を10mlのInduction 培地に懸濁し、５mlずつを500ml のInduction 培地の入った２Ｌ用三角フラスコ計２本に添加し、30℃で振とう培養した。OD600nm での値が約0.5 になった時点で最終濃度が0.1mg/mlになるようにL-トリプトファンを添加し、さらに30℃で振とう培養を６時間継続した。菌液を3000×ｇで20分間遠心分離して菌体を集め、菌体を160ml のPBS に懸濁した。懸濁液を超音波発生装置（UltraSonic社）にかけ菌体を破砕し、7000×ｇで30分間遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。
【００２７】
【実施例５】
OCIF固定化アフィニティーカラムの調製
TSKgel AF-トレシルトヨパール650 （東ソー社) ２ｇに、WO96/26217号に記載の方法で調製した遺伝子組換え型OCIF 35.0 mgを含む 1.0 Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 40ml を加え、４℃で一晩ゆっくり振とうしてカップリング反応を行った。過剰な活性基を不活性化する為、遠心分離により上清を除去し、沈殿した担体に40mlの0.1 M トリス-HCL緩衝液(pH 7.5)を加え、室温で１時間穏やかに振とうした。担体を0.01％ Polysorbate 80 と0.2M NaCl を含む0.1 M グリシン−塩酸緩衝液(pH 3.3)及び0.01％ Polysorbate 80 と0.2M NaCl を含む0.1 M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 2.0)で順次洗浄した後、0.01％ Polysorbate 80 を含む10mM  リン酸緩衝液 (pH 7.4) で２度洗浄し、平衡化した。
【００２８】
【実施例６】
OCIF固定化アフィニティーカラムによる Trx−OBM の精製
Trx-OBMの精製は、特に断らない限り４℃で行った。上記のOCIF固定化アフィニティー担体(10ml)と、実施例４記載の可溶性蛋白質画分液(120ml) とを混合後、50ml遠心管（４本）中で、ローテーターを用いて４℃で一晩穏やかに振とうした。この混合液中の担体をエコノカラム（バイオラッド社、内径1.5cm 、長さ15cm) に充填した。0.01％ Tween 80 を含むPBS 300ml 、0.01％ Polysorbate 80 と 2M NaClを含む10mMリン酸バッファー (pH 7.0)100ml、及び0.01％ Polysorbate 80 と0.2M NaCl を含む0.1 M グリシン−塩酸緩衝液(pH 3.3) 100 ml を順次通液してカラムを洗浄した。次に、0.01％ Polysorbate 80 と0.2M NaCl を含む0.1 M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 2.0)を通液し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は５mlずつ分取した。分取した画分には、10％容量の２Ｍトリス溶液(pH 8.0)を加え、直ちに中和した。分取した画分中の Trx-OBMは、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色で検出した。 Trx-OBMを含む画分を集め、さらに精製した。
【００２９】
【実施例７】
ゲル濾過による Trx-OBMの精製
実施例６で得られた Trx−OBM フラクション約 25 mlを、Centriplus 10 及び Centricon 10(amicon社) を用いて、約 0.5mlに遠心濃縮した。このサンプルを、予め 0.01 ％  Polysorbate 80を含む PBSで平衡化した Superose 12 HR 10/30 カラム(1.0×30cm、ファルマシア社）にかけた。分離には、0.01％  Polysorbate 80を含む PBSを移動相として用い、流速 0.25 ml/minでカラムを展開した。カラムからの溶出液は 0.25 mlずつ分取した。分取した画分の Trx-OBMは、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動に負荷し、ゲル中の Trx-OBM蛋白質を銀染色により検出した。純化された Trx-OBMを含むフラクションを集め、 Trx-OBMの蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度の測定は、ウシ血清アルブミンを標準品とし、 DC-protein assay kit(バイオラッド社）を用いて行った。この結果、純度90％以上、濃度100 μg/mlの Trx-OBMが得られた。
【００３０】
【実施例８】
OBM-BP cDNA のクローニング
(1) 発現クローニング用ベクターpSR αEXの構築
pcDL-SRα296(Molecular and Cellular Biology, Vol.8, pp466-472, 1988) を制限酵素PstI（宝酒造社) 及びAsp718（ベーリンガーマンハイム社) で切断しアガロースゲル電気泳動で断片を精製した。合成したオリゴヌクレオチドSRαMCS1（配列表配列番号４）ならびにSRαMCS2（配列表配列番号５）をアニールした後、上記pcDL-SR α296 のPstIとAsp718によって得られたcDNA断片と混合し、ライゲーションキットver.2  (宝酒造社) を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌DH5 α（ギブコＢＲＬ社）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリSDS 法によりプラスミドを精製し、その制限酵素による切断並びにＤＮＡ塩基配列の決定により、pcDL-SR α296 由来3.4kb ＤＮＡ断片にオリゴヌクレオチドSRαMCS1とSRαMCS2が挿入されたプラスミドを選びだした。得られたプラスミドをpSR αEXと名付けた。
【００３１】
(2) マウスＣ７細胞からの RNAの抽出
マウスマクロファージ様細胞株Ｃ７（鳥取大学医学部、林教授より分与）は、10％牛胎児血清を含むα-MEM (ギブコ BRL社）を用いて培養した。付着細胞用225cm2T-フラスコでコンフルエントになるまで培養したＣ７細胞を、トリプシン処理してT-フラスコから剥がし洗浄した後、５枚の225cm2T-フラスコに分配し、10％牛胎児血清を添加したα-MEM60mlを各々のフラスコに加えてCO2 インキュベーター中で５日間培養した。培養したＣ７細胞からISOGEN (和光純薬) を用いて総 RNAを抽出した。総 RNA1095.6μg からOligo(dT)-cellulose カラム(5'-3'Prime 社) を用いることにより、約50.4μg のポリ A+ RNA を得た。
【００３２】
(3) 発現ライブラリーの構築
実施例８−(2) で得られたポリ A+ RNA ５μg からcDNA Synthesis kit (Stratagene社) を用い、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。10X first strand buffer ５μl, first-strand methyl nucleotide mixture ３μl, Not "T" directioinal primer (Invitrogen社、1 μg/ml) ２μl,  滅菌蒸留水 34.5 μl, RNase Block Ribonuclease Inhibitor (42 ユニット/ μl) 1μl を混合した。この溶液に前記ポリ A+ RNA ５μg(３μl)を添加しよく混合し、室温で10分放置する事によってprimerを RNAにアニーリングさせた。1.5 μl のMMLV逆転写酵素(50 ユニット/ μl)を反応液に添加し混合後37℃で１時間、42℃で30分で保温し、４℃で保冷した。さらに、反応液に10×second-strand buffer 20 μl 、second-strand dNTP mixture 6μl 、蒸留水 109μl 、５倍希釈した[ α-32P]dCTP(２μCi/ μl)２μl 、RNase H (1.5ユニット/ μl)２μl 、DNA polymerase I（９ユニット/ μl) 11 μl を添加混合し16℃で２時間30分保温し、その後４℃で保冷した。この反応液にblunting dNTP mix 23μl とcloned pfu DNA polymerase (2.5ユニット/ μl)２μl を添加混合後、72℃で30分保温した。フェノール・クロロフォルム処理後、エタノール沈殿を行った。この沈殿をキットに添付のEcoRI adaptor ７μl(0.4 μg/μl)に溶解し、さらに10×ligase buffer １μl, 10mM ATP １μl, T4 DNA ligase (４ユニット/ μl)１μl を添加し８℃で16時間保温した。70℃で30分保温しligaseを失活させた。この反応液に10×ligation buffer １μl, 10 mM ATP２μl,滅菌蒸留水６μl, T4 polynucleotide kinase (10 ユニット/ μl)１μl を添加し混合後、37℃30分で保温した。その後70℃にて30分間保温し、kinaseを失活させた。フェノール・クロロフォルム処理後、エタノール沈殿を行った。ＤＮＡを30μl の10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA  に溶解し制限酵素NotI( New England Biolabs 社) により切断した後、アガロースゲル電気泳動により1000bp以上のcDNAを分取し、エタノール沈殿を行った。さらに、混入しているアダプターをカラム(Greatlength cDNA Synthesis Kit,Clontech社) により除去した後、ＤＮＡを水に溶解し、あらかじめ制限酵素EcoRI 及びNotI（宝酒造社）で消化して調製したpcSRαEXに挿入した。この操作により1.05×106 のcomplexityを持つ発現ライブラリーを構築した。
【００３３】
(4) OBM との結合を指標とした発現ライブラリーのスクリーニング
実施例８−(3) 記載の発現ライブラリーＤＮＡを用い、大腸菌XL2 Blue MRF'(東洋紡社) を形質転換し、１ＬのTerrific Brothアンピシリン培地（1.2 ％トリプトン、2.4 ％イーストエキス、0.4 ％グリセロール、0.017 M KH2PO4、0.072 M K2HPO4、 100μg/mlアンピシリン）に懸濁し、37℃で一晩振盪培養した。遠心により集菌しEndo Free Plasmid Mega kit(QIAGEN 社) を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。260nm における吸光度によりＤＮＡ含量を測定した。得られたＤＮＡをCOS-7 細胞(RIKEN CELL BANK, RCB0539)に以下に記述した方法によりトランスフェクションした。COS-7 細胞を６ウェルプレートに３×105 細胞/ ウェルとなるように播種し、10％牛胎仔血清を含むDMEMを用いて、CO2 インキュベーター中で37℃にて一晩培養した。翌日、培地を除いた後、無血清IMDMで細胞を洗浄した。トランスフェクション用試薬リポフェクタミン（ギブコ BRL社）添付のプロトコールに従い、予めOPTI-MEM（ギブコ BRL社）を用いて希釈しておいた前記プラスミドＤＮＡとリポフェクタミン（ギブコ BRL社）を混合し、15分後この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用いたＤＮＡ及びリポフェクタミンの量はそれぞれ３μg 及び12μl とした。５時間後、培地を除去し、１mlの10％牛胎仔血清を含むDMEM（ギブコBRL 社) を添加し、CO2 インキュベーター中 (５％CO2)、37℃で２〜３日培養した。上記の様にトランスフェクトし２〜３日培養した COS-7細胞をウェルあたり３mlのPBS で洗浄後、10mM HEPES (pH7.3), 20mM EDTA, 100μg/mlコンドロイチン硫酸を含むIMDM１mlを添加し37℃で10分間静置した。ピペッティングし細胞をウェルから剥がした後 PBSで洗浄し、900rpmで５分間遠心して細胞を回収した後、２×106/3ml になるように５％牛胎仔血清及び0.02％アジ化ナトリウムを含むPBS に懸濁した。３mlの細胞懸濁液を Trx−OBM をコーティングしたディッシュに添加し室温で２時間静置した。 Trx-OBMをコーティングしたディッシュは、５μg/mlの Trx-OBMを含む0.1M NaHCO3 溶液３mlを６cm細胞培養用ペトリディッシュ(Falcon 社) に入れて室温で２時間静置した後、0.15M NaClで３回洗浄し、５％牛胎仔血清、1mM EDTA、及び0.02％アジ化ナトリウムを含むPBS ３mlを入れ４℃一晩静置することにより調製した。ディッシュから細胞懸濁液を除去した後、５％牛胎仔血清及び0.02％アジ化ナトリウムを含むPBS で３〜６回穏やかに洗浄し、ディッシュに付着していない細胞を除去した。ディッシュに0.4ml のHirt溶液(0.6％ラウリル硫酸ナトリウム、10 mM EDTA水溶液) を添加し数分静置し付着細胞を溶解させた。細胞溶解液を1.5ml 用微量遠心管に入れ0.1 mlの５Ｍ NaCl を添加し混合し、一晩氷冷した。遠心管を４℃、15000rpmで15分間遠心し上清を新しい微量遠心管に移し、フェノール・クロロホルムで除タンパクを行った。水相液にpellet paint (Novagen 社) 及び1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、さらに2.5 倍量のエタノールを添加し室温で２分静置した。遠心管を４℃、15000rpmで15分間遠心しＤＮＡを沈殿させた。沈殿を70％エタノールで２回、99％エタノールで１回洗浄した後乾燥させ、20μl の滅菌蒸留水に溶解した。このＤＮＡ溶液の一部を用い大腸菌XL2 Blue MRF' を形質転換した。以上の操作によりOBM に結合する分子（OBM-BP) の  cDNAを濃縮した。上記の操作をさらに３回繰り返した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌を形質転換し形質転換株中のプラスミドＤＮＡを解析した。10���ローンの内５クローンが同一の構造を有していた。そのひとつをpOBM-BP1と名付けた。pOBM-BP1中に挿入されたOBM-BP  cDNAの塩基配列を配列表配列番号６に、又該cDNAがコードするアミノ酸配列を配列表配列番号７にそれぞれ示す。尚、このようにして得られたOBM-BP (膜結合型）をコードするＤＮＡは、pmOBM-BPとして、平成10年３月12日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている(FERM P-16702)。
【００３４】
【実施例９】
OBM-BPの発現
24ウェルプレートの各ウェル中で COS-7細胞、及びpOBM-BP1をトランスフェクトした COS-7細胞を、それぞれ２〜３日間培養した。各ウェルの細胞を無血清DMEMで洗浄し、これにボルトンハンター法（Bolton A.E. and Hunter W.M., Biochem. J., Vol.133, pp529-539 (1973))にて 125Ｉ標識した Trx−OBM 20ng/ml を含む結合試験用培地 (0.2 ％牛血清アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.1mg/ml heparin、0.2 ％ NaN3 を加えた無血清DMEM) 200 μl を加えた。又、別のウェルには 125Ｉ標識した Trx-OBM 20ng/mlと非標識 Trx-OBM８μg/mlを含む結合試験用培地を200 μl 加えて実験を行った。CO2 インキュベーター中（５％ CO2) で37℃にて１時間培養した後、細胞を0.1mg/mlのheparin を含むPBS 500 μl で２回洗浄した。洗浄後、0.1 N NaOH溶液 500μl を各ウェルに加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解させ、細胞溶解液中の放射活性をガンマーカウンターで測定した。その結果、pOBM-BP1をトランスフェクトした細胞にのみ 125Ｉ標識した Trx-OBMが結合することが確認された。又、その結合は、400 倍濃度の非標識 Trx-OBMを添加することで著しく阻害されることが確認された。以上の結果から、pOBM-BP1上の  cDNAにコードされる蛋白質OBM-BPは、COS-7 細胞表面でOBM と特異的に結合することが明らかとなった。
【００３５】
【実施例１０】
分泌型 OBM-BP(sOBM-BP)発現ベクターの構築
pOBM-BP1を鋳型とし、m NheF（配列表配列番号８）とm XhoR（配列表配列番号９）をプライマーとして、EX Taq（宝酒造社）を用いてPCR を行った。増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、制限酵素NheI及びXhoI（宝酒造社）で切断した。このＤＮＡ断片を予めNheI及びXhoIで切断しておいたpCEP4 （インビトローゲン社）にDNA Ligation Kit Ver.2を用いて挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌DH5 αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリSDS 法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することにより、目的の構造を持った分泌型OBM-BP (sOBM-BP)発現プラスミド（pCEP sOBM-BP）を持つ大腸菌株を選び出した。さらにこのプラスミドの塩基配列を、ダイターミネーターサイクルシークエンシングFSキット（パーキン−エルマー社）を用いて決定し、このプラスミドが sOBM-BPをコードする配列を持っていることを確認した（ＤＮＡ：配列表配列番号１０、アミノ酸：配列表配列番号１１）。pCEP sOBM-BPを持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキット（キアゲン社）を用いてpCEPsOBM-BP を精製した。尚、pCEPsOBM-B中のシグナル配列を含まない部分をコードするＤＮＡを持つプラスミドをpCEPsmOBM-BPと名付け、平成10年３月12日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した(FERM P-16703)。
【００３６】
【実施例１１】
分泌型OBM-BPの発現
293-EBNA細胞（インビトローゲン社）を10％FCS を含むIMDM培地(IMDM-10％FCS)に懸濁し、コラーゲンコートした24ウェルプレート（住友ベークライト社）に２×105 個／２ml／ウェルになるように播種し、一晩培養した。この細胞に実施例１０で得られたpCEPsOBM-BP １μg をリポフェクタミン（ギブコ社）４μl を用いて形質導入しｓOBM-BP発現細胞を得た。ｓOBM -BP 発現細胞を225cm2フラスコで培養し、コンフルエントになった時点で血清を含有しないIMDMに置換し、さらに培養を３日間行った。得られた培養液計10L を限外ろ過膜により処理し、濃縮液250 mlを得た。
【００３７】
【実施例１２】
OBM 固定化アフィニィティーカラムによる分泌型OBM-BPの精製
(1) OBM 固定化アフィニティーカラムの調製  
TSKgel AF-トレシルトヨパール650 （東ソー社) 2gを Trx-OBM 35.0 mgを含む 1.0 Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7.5)  40mlに混合し、４℃で一晩ゆっくり振とうしカップリング反応を行った。遠心分離により上清を除去した後、過剰な活性基を不活性化する為、沈殿した担体に40mlの0.1 M トリス-HCL緩衝液(pH 7.5)を加え、室温で１時間穏やかに振とうした。0.01％ Polysorbate 80 と0.2M NaCl を含む0.1 M グリシン−塩酸緩衝液(pH 3.3)及び0.01％ Polysorbate 80 と0.2M NaCl を含む 0.1Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 2.0)でそれぞれ担体を洗浄した後、0.01％ Polysorbate 80 を含む10mM  リン酸緩衝液 (pH 7.4) で２度洗浄し、平衡化した。
【００３８】
(2)  Trx-OBM固定化アフィニティーカラムによるｓOBM-BPの精製
ｓOBM-BPの精製は、特に断らない限り４℃で行った。上記のTrx-OBM 固定化アフィニティー担体(10ml)と上記実施例１１記載のｓOBM-BPを含む濃縮培養上清(120ml) とを混合後、50ml遠心管(4本) 中で、ローテーターを用いて4 ℃で一晩おだやかに振とうした。この混合液中の担体をエコノカラム( バイオラッド社、内径1.5cm 長さ15cm) に充填した。0.01％ Polysorbate 80 を含むPBS (pH7.4) 300ml 、0.01％ Polysorbate 80 と 2M NaClを含む10mMリン酸バッファー (pH 7.0)100mlを順次通液してカラムを洗浄した。次に、0.01％ Polysorbate 80 と0.2M NaCl を含む0.1 M クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 2.0)を通液し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は5 mlずつ分取した。分取した画分に10％容量の２Ｍトリス溶液(pH 8.0)を加え、直ちに中和した。溶出液各画分中のｓOBM -BP の有無をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べた。ｓOBM -BP を含む画分を集めさらに精製した。
【００３９】
(3) ゲル濾過によるｓOBM -BP の精製  
上記のｓOBM -BP を含むフラクション約 25 mlを、Centriplus 10 及び Centricon 10(Amicon, USA)を用いて、約 0.5 ml に遠心濃縮した。このサンプルを、予め 0.01 ％  Polysorbate 80を含む PBSで平衡化した Superose 12 HR 10/30 カラム (1.0 x 30 cm)にかけた。分離には、0.01％  Polysorbate 80を含む PBSを移動相として用い、流速 0.25 ml/minで展開した。分取した画分のｓOBM-BPは、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動に負荷し、ゲル中のｓOBM-BPを銀染色により検出した。純化されたｓOBM-BPを含むフラクションを集め、ｓOBM-BPの蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度の測定は、ウシ血清アルブミンを標準品として用い DC-protein assay kit （バイオラッド社 )で行った。
【００４０】
【実施例１４】
ウサギ抗ｓOBM -BP ポリクローナル抗体の作製
雄性日本白色ウサギ（体重 2.5-3.0kg、北山ラベス社より入手)3羽に、実施例１３記載の方法により得られた精製ｓOBM -BP 溶液(200μg/ml）と同容量のフロイント完全アジュバント(DIFCO社) とを混合してエマルジョンとしたものを、１回１mlずつ皮下注射した。免疫は１週間間隔で合計６回行い、最終免疫後10日目に全採血を行った。分離した血清から抗体を以下の様に精製した。ＰＢＳで２倍希釈した抗血清に最終濃度が40％(w/v％) となるように硫酸アンモニウムを添加して４℃で１時間放置後、8000×ｇで20分間遠心分離を行い沈殿を得た。沈殿を少量の PBSに融解し、 PBSに対して４℃で透析した後、protein G-Sepharose カラム (ファルマシア社) に負荷した。 PBSで洗浄後、0.1 M グリシン- 塩酸緩衝液(pH 3.0)で吸着した免疫グロブリンＧを溶出し、溶出液に直ちに1.5 M トリス- 塩酸緩衝液 (pH 8.7) を加えて中和した。溶出蛋白質画分をＰＢＳに対して透析後、280 nmにおける吸光度を測定し、その濃度を決定した（Ｅ1% 3.5) 。
【００４１】
さらに、得られた抗体をイムノピュアFab プレパレーションキット（ピアス社) を用いて、そのプロトコールに従ってFab フラグメントを作製した。西洋ワサビパーオキシダーゼ標識した抗OBM -BP 抗体は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキット（ピアス社) を用いて作製した。１mgの精製抗体に80μg のN-スクシンイミド-S- アセチルチオ酢酸を添加し、室温で30分間反応させた。これに５mgのヒドロキシルアミンを添加して脱アセチル化した後、修飾された抗体をポリアクリルアミド脱塩カラムにて分画した。蛋白質画分を１mgのマレイミド活性化パーオキシダーゼと混合し、室温で１時間反応させ酵素標識抗体を得た。
【００４２】
【実施例１５】
破骨細胞誘導メカニズムの解析
ddY マウス(SLC社）より常法にて採取した脾臓細胞又はマウスC7細胞をそれぞれ 1.4×106 個/ml 、５×104 個/ml の細胞密度で10％牛胎仔血清と10ng/ml M-CSF を含むα-MEMに懸濁し、24ウェルプレートに１ウェルあたり 500μl 添加した。精製したTrx-OBM を上記培地にて希釈した溶液(40ng/ml) 又は上記培地を、ウェルあたり 250μl 加えた。次いで、精製したｓOBM-BPを上記培地にて希釈した溶液（400ng/ml）、精製した抗OBM-BP抗体(Fabフラグメント) を上記培地にて希釈した溶液(400ng/ml)又は上記培地を、ウェルあたり250 μl 追加した。６日間培養後、培養プレートをPBS で１回洗浄したのちアセトン−エタノール溶液(50:50) で１分間細胞を固定した。風乾後、LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASEキット（シグマ社) を用いて破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性(TRAP 活性) を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、脾臓細胞及びC7細胞に Trx-OBMのみを添加したウェル中にはそれぞれ480 ±46個、374 ±21個 (平均±標準偏差、n=3)のTRAP陽性細胞が観察された。これに対し、Trx-OBM を添加しなかったウェル、Trx-OBM とsOBM-BP を添加したウェル、及び Trx-OBMと抗OBM-BP抗体を添加したウェル中には、TRAP陽性細胞は全く検出されなかった。これとは別に、C7細胞を１×105 個/ml にて10％牛胎仔血清と１ng/ml M-CSF を含むα-MEMに懸濁し、24ウェルプレートに１ウェルあたり１ml添加した。一晩培養後α-MEMで１回洗浄し、これに 125Ｉ標識したTrx-OBM 20ng/ml を加えた結合試験用培地 (0.2 ％牛血清アルブミン、20mM Hepes緩衝液、0.1mg/ml heparin、0.2 ％ NaN3 を加えたα-MEM) 200 μl を加えた。又、別のウェルには、125 Ｉ標識したTrx-OBM 20ng/ml と非標識Trx-OBM ８μg/mlを含む添加した結合試験用培地を 200μl 加えて実験を行った。CO2 インキュベーター中（５％ CO2) で37℃にて１時間培養した後、細胞を0.1mg/mlのheparin を含むリン酸緩衝生理食塩水500 μl で２回洗浄した。洗浄後、0.1 N NaOH溶液 500μl を各ウェルに加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解させ、溶解液中の放射活性をガンマーカウンターで測定した。その結果、C7細胞に 125Ｉ標識したTrx-OBM が結合することが確認された（7663±125cpm、平均±標準偏差、ｎ＝３）。又、その結合は、400 倍濃度の非標識のTrx-OBM を添加することで著しく阻害されることが確認された（2735±158cpm、平均±標準偏差、ｎ＝３）。
これらの結果より、Trx-OBM は破骨前駆細胞上に発現しているOBM-BPに直接結合することにより破骨細胞を誘導するシグナルを伝達していることが明らかとなった。即ち、OBM とOBM-BPとの結合を阻害、修飾する物質が発見できれば、破骨細胞の分化誘導を調節することが可能となり、骨代謝異常症に対して極めて有望な治療薬になることが示された。
【００４３】
【実施例１６】
ウサギ抗sOBM-BP ポリクローナル抗体による破骨細胞の誘導
実施例14に示した方法でウサギ抗sOBM-BP ポリクローナル抗体を作製した。ddY マウス(SLC社) より定法にて脾臓細胞を採取した。0.7X106 個/ml の細胞密度の脾臓細胞を、10% 牛胎仔血清と20ng/mlM-CSFを含むα-MEM中で下記の各条件で培養した場合の破骨細胞形成を調べた。▲１▼抗sOBM-BP 抗体（100 μg/ml) を添加、▲２▼抗sOBM-BP 抗体（100 μg/ml) およびsOBM-BP (1μg/ml) を添加、▲３▼sOBM-BP (1μg/ml) を添加、▲４▼何も添加しない場合、の４条件で実験をおこなった。培養は24ウェルプレートに１ウェルあたり１mlの培地を添加しておこなった。６日間培養後、以下の方法にて酒石酸耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)活性を測定した。細胞をエタノール・アセトン(1:1) にて室温で１分間固定後風乾し、500 μl の1.5mg/ml p-nitrophenol phosphate,20mM 酒石酸ナトリウムを含む50mMクエン酸バッファー、pH4.5 溶液を加えて37℃10分反応させた。250 μl の1N NaOH を添加して酵素反応を停止させた後、OD405nm の吸光度を測定した。結果を表１に示す。この結果、破骨細胞がOBM-BPを介して誘導されることが明らかとなった。
【００４４】
【表１】
0004394188.tif 000002
【００４５】
【実施例１７】
OBM とOBM-BPとの結合を阻害・修飾する分子のスクリーニング系の構築
96ウェルイムノプレート(Nunc, MaxiSorp TM) の各ウェルに10mM炭酸水素ナトリウム水溶液で5000倍に希釈した抗チオレドキシン抗体（Invitrogen社）を 100μl ずつ添加し４℃で一晩放置した。各ウェル中の液を捨てた後、ブロックエース（雪印乳業社）をPBS で２倍希釈した溶液(BA-PBS)を各ウェルに 200μl ずつ添加し室温で1 時間放置した。液を捨てた後、各ウェルにTrx-OBM(100ng/ml)100μl ずつ添加し室温で２時間放置した。PBS-T(0.05％ Tween20を含むPBS)で各ウェルを３回洗浄した後、BA-PBSで希釈した sOBM-BP(0〜100ng/ml）を各ウェルに100 μl ずつ添加し２時間室温で放置した。PBS-T で各ウェルを３回洗浄した後、実施例１４で得られたパーオキシダーゼ標識ウサギ抗OBM-BP抗体をBA-PBSで2000倍希釈したものを、各ウェルに100 μl ずつ添加し２時間室温で放置した。PBS-T で各ウェルを６回洗浄した後、TMB 溶液（TMB Soluble Reagent, High Sensitivity, Scytek 社) を100 μl ずつ各ウェルに加え、室温で約10分放置した後、停止液(Stopping Reagent, Scytek 社) を100 μl ずつ各ウェルに加えた。各ウェルの 450 nm における吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。BA-PBSで段階希釈したOBM-BP(0-100ng/ml)を添加した場合の実験結果を図１に示す。OBM-BP濃度に依存して吸光度が上昇した。従って、この系を利用することによりOBM-BPとOBM の結合を定量化することができる。さらに、上記 OBM-BP(50ng/ml)添加時に、同時に一定量(0-200ng/ml)の破骨細胞形成を特異的に阻害する分子OCIFを添加した時の結果を図２に示す。OCIFの濃度に依存して吸光度が低下していることより、OCIFはOBM とOBM-BPの結合を阻害する因子であることがわかる。即ち、このような系を利用することにより、破骨細胞形成を特異的に阻害・修飾する分子を得ることができる。
【００４６】
【実施例１８】
本発明蛋白質を有効成分とする注射剤
0004394188.tif 000003
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に2 mlずつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００４７】
0004394188.tif 000004
上記組成をpH7.0 の0.01M PBS に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に2 mlずつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００４８】
【発明の効果】
本発明は、配列表配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は、該アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、破骨細胞形成促進因子（OBM)に特異的に結合する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質に対する抗体、破骨細胞形成促進因子（OBM)と本発明蛋白質又は配列表配列番号７に示されるOBM 結合蛋白質（OBM-BP）との結合を特異的に阻害する物質を選択する方法、及び該蛋白質又は前記の選択する方法により得られた物質を有効成分とする医薬に関する。本発明蛋白質は、生化学試薬、あるいは骨粗鬆症等の骨代謝疾患の予防及び／又は治療薬として、又、本発明の破骨細胞形成促進因子（OBM)と該蛋白質又はOBM 結合蛋白質（OBM-BP）との結合を特異的に阻害する物質を選択する方法は、破骨細胞の形成を阻害する物質を探索する方法として、又、得られた物質は生化学試薬、あるいは骨粗鬆症などの骨代謝疾患の予防及び／又は治療薬として有用である。
【配列表】
0004394188.tif 000005
0004394188.tif 000006
0004394188.tif 000007
0004394188.tif 000008
0004394188.tif 000009
0004394188.tif 000010
0004394188.tif 000011
0004394188.tif 000012
0004394188.tif 000013
0004394188.tif 000014
0004394188.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】プレートに抗チオレドキシン抗体を介して固定化したTrx-OBM と段階希釈したsOBM-BP との結合を、パーオキシダーゼ標識した抗sOBM-BP 抗体により検出した結果を示す。
【図２】破骨細胞形成抑制因子(OCIF)が Trx-OBMと sOBM-BPとの結合を阻害することを示す図。抗チオレドキシン抗体を介して Trx-OBMを固相化したプレートに 50ng/mlの sOBM-BPと段階希釈したOCIFを添加し、OCIFが Trx-OBMと sOBM-BPの結合を阻害するかどうかをパーオキシダーゼ標識した抗 sOBM-BP抗体により解析した。
【図１】
0004394188.tif 000016
【図２】
0004394188.tif 000017