(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の成熟型ヒトMP52におけるアミノ酸配列中のメチオニン残基の少なくとも１個の残基を化学修飾により親水性アミノ酸残基に変換して得られる、骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を有する成熟型タンパク質であって、前記メチオニン残基の化学修飾がS-カルボキシメチル化反応であり、少なくとも１個のメチオニン残基がS-カルボキシメチル化されており、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する前記成熟型タンパク質。
【請求項２】
配列番号１の成熟型ヒトMP52におけるアミノ酸配列中のトリプトファン残基の少なくとも１個の残基を化学修飾により親水性アミノ酸残基に変換して得られる、骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を有する成熟型タンパク質であって、前記トリプトファン残基の化学修飾がアリルスルフェニル化反応である前記成熟型タンパク質。
【請求項３】
２個のトリプトファン残基がアリルスルフェニル化されており、配列番号７に示すアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の成熟型タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、疎水性アミノ酸の一部残基を、親水性または極性アミノ酸に、化学修飾または遺伝子工学的手法により置き換えた成熟型骨形成タンパク質に関する。本発明の成熟型タンパク質は、骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を示し、異所性骨形成（ectopic osteogenesis）および異所性石灰沈着（ectopic calcification）又は石灰沈着を伴う骨代謝性疾患（metabolic bone disease with calcification）、例えば、神経性骨化症（neurotic osteosis）、手術侵襲による異所性骨化（ectopic ossification caused by stress of operation）、外傷性骨化性筋炎（traumatic myositis ossificans）、酸素供給不足による骨化（ossification by defect of oxygen supply）、骨原性腫瘤（osteogenic tumor）、後縦靭帯骨化症（ossification of the posterior longitudinal ligament）、動脈硬化（arterial sclerosis）の症状を抑える医薬品として利用することができる。
【０００２】
〔従来の技術〕
骨形成タンパク質 (Bone morphogenetic protein：以降BMPと呼ぶ) は、脱灰骨組織に含有される骨形成活性を有するタンパク質である。1970年代から精力的にBMPの精製が試みられてきたが、単一のタンパク質としての分離はきわめて困難であった。1989年にウォズニー（Wozney）らは骨形成活性のある画分を酵素処理して未知のペプチドを分離してそのアミノ酸配列を手がかりに分子生物学的手法により、BMPと考えられる遺伝子のクローニングに成功した。この遺伝子は直ちに動物培養細胞に導入され、発現したタンパク質の活性がインビボ（in vivo）において測定され、このタンパク質にBMP活性が確かにあることが証明された（Wang, E.A. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p.2220-2224）。引き続きホモロジーを利用した骨形成活性を有するタンパク質のクローニングが行われ、現在まで骨形成活性を有する構造の似た複数のタンパク質が発見されている。これらはいずれもTGF（トランスフォーミング成長因子）-βスーパーファミリーに属し、基本的にin vivoにおいて異所性骨形成を引き起こす活性を有することが確認されている。BMPによる骨形成は内軟骨性といわれており、胎生期の長骨の形成を再現するものと考えられている。したがって、BMPそのものが骨欠損部を補う形での治療薬として利用し得るものである。
【０００３】
一方、BMP遺伝子が明らかにされ、その特異的抗体が作製されるようになってから、今まで治療法がなかった異所性石灰化部位にもBMPが発現しており、これらの発症にBMPが関与する可能性が示されるようになってきた。例えば、神経性骨化症、手術侵襲よる異所性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足による骨化、骨原性腫瘤、特定疾患（難病）に指定されている後縦靭帯骨化症 (ossification of the posterior longitudinal ligament：以降 OPLLと呼ぶ) (Spine, 17-3S, S33, 1992) や、動脈硬化石灰化部位 (J Clin Invest, vol.91, p.1800, 1993) に、BMPが発現したり含有されたりしていることが近年明らかにされている。また、偽悪性転位骨化症（pseudomalignant heterotopic ossification：以降 PHOと呼ぶ）、偽悪性骨性腫瘍（pseudomalignant osseous tumor）および限局性骨化性筋炎（myosistis ossificans circumscripta）は痛みをともなう筋肉内の硬組織の塊の出現が主な症状である。原因は不明であるが、BMPが患者の筋肉内の硬組織の出現に関与するものと考えられている。これらは、本来は発現しないはずの組織でBMPが発現し、オートクライン（autocrine）に作用して骨様硬組織(bone like hard tissue)が形成されていることを示している。OPLLについては現在のところ有効な治療法もなく、圧迫性の神経症状が重度であれば外科的に切除を試みるが、予後は必ずしも良いものではない。また、動脈の石灰化にしても治療法はない。
【０００４】
BMPの発現を抑制することが、これらの病変の治療の主要な手段の一つと推察されるが、それ以外に、例えば、BMPアンタゴニストの投与も有効と考えられる。BMPアンタゴニスト様活性をもつものとしてはBMP受容体やBMPに対する中和抗体、BMPの結合部位に対応するペプチド、BMPの特定のアミノ酸残基に化学修飾等をほどこしたものなどが考えられる。
【０００５】
いままで、BMPの構造活性相関について種々の検討がなされ、成熟型BMPの受容体との結合に関与する部位が推測され、それを基にした合成ペプチドはBMPのアンタゴニストとしてはたらく事が知られている（特願平７−２００１７５）。
【０００６】
〔発明が解決しようとする課題〕
合成ペプチドの他にも過形成症(hyperplasia)等の骨・軟骨の病気のための多種類の方法があると望ましい。本発明の目的は上記の骨関連疾患に有効な治療剤として、新規な、化学修飾したまたは遺伝子工学的手法により特定のアミノ酸を置換したBMPアンタゴニストタンパク質を提供することである。
【０００７】
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明は、配列番号１の成熟型ヒトMP52のアミノ酸配列中のメチオニン残基若しくはトリプトファン残基のうち少なくとも1個の残基を、化学修飾により親水性アミノ酸残基に変換するか、又は、遺伝子工学的手法により親水性アミノ酸残基若しくは極性アミノ酸残基に置換して得られる、骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を有する成熟型タンパク質に関する。
【０００８】
少なくとも１個のメチオニン残基を変換する場合、メチオニン残基の化学修飾は酸化反応またはアルキル化反応である。
【０００９】
メチオニン残基の化学修飾が酸化反応の場合、本発明の好ましい成熟型タンパク質は4個のメチオニン残基が酸化され、配列表配列番号５のアミノ酸配列を有するものである。
【００１０】
メチオニン残基の化学修飾がアルキル化反応の場合、本発明の好ましい成熟型タンパク質は少なくとも1個のメチオニン残基がＳ−カルボキシメチル化され、配列番号６のアミノ酸配列を有するものである。
【００１１】
少なくとも１個のトリプトファン残基を変換する場合、トリプトファン残基の化学修飾はアリルスルフェニル化反応(allylsulphenylation)である。
【００１２】
本発明の好ましい成熟型タンパク質は、２個のトリプトファン残基がアリルスルフェニル化され、配列番号７のアミノ酸配列を有するものである。
【００１３】
本発明は、成熟型ヒトMP52がダイマータンパク質である骨誘導因子に対するアンタゴニスト様活性を示す上に定義された発明の成熟型タンパク質に関連する。
【００１４】
本発明は、さらに、配列番号２の成熟型ヒトBMP-2、配列番号３の  成熟型ヒトBMP-4、または、配列番号４の成熟型ヒトBMP-7のアミノ酸配列のうち少なくとも1個のトリプトファン残基を化学修飾により親水性アミノ酸残基に変換するか、あるいは遺伝子工学的手法により親水性アミノ酸又は極性アミノ酸に置換して得られる、骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を示す成熟型タンパク質に関する。
【００１５】
本発明は、さらに、配列番号２の成熟型ヒトBMP-2、配列番号３の成熟型ヒトBMP-4、または、配列番号４の成熟型ヒトBMP-7のアミノ酸配列の、配列番号１の成熟型ヒトMP52のアミノ酸配列の30位、71位および74位のメチオニン残基の位置に対応する位置にある受容体との結合部位に関連する疎水性アミノ酸残基のうちの３個の疎水性アミノ酸残基の少なくとも1個を、遺伝子工学的手法により親水性アミノ酸残基又は極性アミノ酸残基に置換して得られる、骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を示す成熟型タンパク質に関する。
【００１６】
本発明は、成熟型ヒトBMP-2、成熟型ヒトBMP-4または成熟型ヒトBMP-7がダイマータンパク質である骨誘導因子に対するアンタゴニスト活性を示す上に定義された発明の成熟型タンパク質に関連する。
【００１７】
さらに、本発明は、上に定義された骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を示す成熟型タンパク質を有効成分として含む異所性骨化の治療及び/又は予防剤に関する。
【００１８】
さらに、本発明は上に定義された骨形成タンパク質に対するアンタゴニスト活性を示す成熟型タンパク質を有効成分として含む石灰沈着を伴う代謝性疾患の治療及び/又は予防剤に関する。
【００１９】
TGF-βスーパーファミリーに属するタンパク質は、その遺伝子構造から細胞内では、いずれも前駆体として合成された後、種々のプロセッシングを受け、成熟型（活性型）のペプチドホモ二量体を形成すると推測されている。成熟型ヒトTGF-β1の活性型はＣ末端側112残基のペプチドの二量体であることが知られている（Nature 316, 701-705, 1985）。本発明において「成熟型BMP」とは、この活性型ヒトTGF-β1のC末端側112残基と相同性のあるアミノ酸配列より実質的に成るBMPを意味する。本発明におけるTGF-βスーパーファミリーに属するタンパク質としてはBMP-2、BMP-4、BMP-7、ヒトMP52等が例示される。
【００２０】
本発明者らは、受容体のBMP結合部位に結合してBMPアンタゴニストとして強く働く化学修飾タンパク質を作る目的でTGF-βスーパーファミリーに属し、その中でもBMPファミリーの一員であるヒトMP52に化学修飾およびアミノ酸の置換を試みた。
【００２１】
ヒトMP52の活性型はダイマーであること、及び、成熟型MP52の受容体結合部位はタンパク質分子の外側に露出した部分であると考えられることから、ヒトMP52がダイマーを形成したときに隣接する２つのペプチド領域 (配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列において２０番目のArgから３８番目のAla及び６０番目のGluから７７番目のGluまで)が受容体結合部位を形成していると推定される。
【００２２】
タンパク質のアミノ酸組成において一般的にトリプトファンとメチオニンは含有率が最も低く選択的な化学修飾に適していること、および、推定されたヒトMP52の立体構造モデルから、MP５２単量体に存在する４つのメチオニン残基のうち３つ（30番目、71番目、74番目）が推定された受容体結合部位に存在することおよび成熟型ヒトMP52単量体に2つ存在するトリプトファン残基の両方（32番目、35番目）が推定された受容体結合部位に存在することから、これら２つのアミノ酸残基に化学修飾を施したタンパク質を作製した。
【００２３】
本発明における化学修飾とは、受容体への結合能力を保ちつつタンパク質の活性を無効にするに充分な程度にメチオニンまたはトリプトファンの側鎖を修飾することを意味する。この化学修飾にはタンパク質化学の研究のために一般的に行われるものが適用される。この方法は、「タンパク質の化学IV」p.6-118, 1977（社）日本生化学会等に記載されている。メチオニンは疎水性アミノ酸であるが化学修飾によって親水性に変化させ得る。親水性を高めるために行った化学修飾は、酸化剤を用いたメチオニンのメチオニンスルホキシドあるいはメチオニンスルホンへの変換と、アルファ−ハロゲノ酢酸を用いたＳ−カルボキシメチルメチオニン等の変換がある。メチオニンの酸化剤としては過酸化水素、過ギ酸、過ヨウ素酸、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド等が挙げられる。またアルファ−ハロゲン酢酸としては、モノヨード酢酸及びモノヨード酢酸アミドを用いることができる。
【００２４】
トリプトファンのインドール環への化学修飾は、近傍の環境や構造に微妙な変化を与える。好適な例としてはP−あるいはＯ−ニトロフェニルスルフェニルクロライド、２−ニトロ−４−カルボキシフェニルスルフェニルクロライド、２，４−ジニトロフェニルスルフェニルクロライド等によるインドール核2の位のアリルスルフェニル化、あるいは、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド、ジメチル（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル）スルホニルブロミドによるインドール核の3位への２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル化が挙げられる。
【００２５】
本発明は、特に、配列表配列番号１に示す成熟型ヒトMP52のうち１ないし4個のメチオニン残基あるいは１ないし2個のトリプトファン残基に化学修飾を施した成熟型タンパク質に関する。
【００２６】
配列表配列番号１に示すタンパク質は国際特許出願WO96/33215に記載の方法で製造することが出来る。この方法によって製造された成熟型ヒトMP52の受容体結合部位において構成アミノ酸のメチオニン残基の４個のうち3個が存在していること、および構成アミノ酸のトリプトファン残基のうち２個ともが存在し、かつこれらアミノ酸が疎水性であることから、これらの疎水性アミノ酸が骨形成活性に重要な役割していることが考えられる。
本発明の成熟型ヒトMP52には、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する成熟型タンパク質だけでなく、国際特許出願WO95/04819およびWO97/06254にそれぞれ開示された本成熟型タンパク質のアミノ酸配列のN末端にAlaまたはArg-Alaを有するものも含まれている。
【００２７】
他のBMP例えばBMP-2（配列番号２）、BMP-4（配列番号３）、BMP-7（配列番号４）等の成熟型タンパク質とヒトＭＰ５２成熟型タンパク質のアミノ酸配列を比較するとこれらの骨形成タンパク質では成熟型ヒトMP52のメチオニン残基に位置するアミノ酸はすべてメチオニン残基か疎水性アミノ酸である。
【００２８】
具体的には成熟型ヒトBMP-2の受容体結合部位は配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列（Science 242（4885）、1528−1534、1988）において16番目のArgから34番目のAla及び56番目のAsnから73番目のLysまでのペプチドと予測され、ヒトMP52のメチオニン（30番目、71番目、74番目）に相当する成熟型ヒトBMP-2のアミノ酸は26番目のバリン、67番目のバリン、70番目のバリンに置換されている。
【００２９】
成熟型ヒトBMP-4の受容体結合部位は配列表配列番号３に記載のアミノ酸配列（DNA Seq. 5 （5）、272−275、1995）に示されるように18番目のArgから36番目のAla及び58番目のAsnから75番目のSerまでのペプチドと予測され、成熟型ヒトMP52のメチオニンの位置（30番目、71番目、74番目）に相当する成熟型BMP-4のアミノ酸は28番目のバリン、69番目のバリン、72番目のバリンに置換されている。
【００３０】
BMP-7の受容体結合部位は配列表配列番号4に記載のアミノ酸配列（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93（2）、878−883、1996）で40番目のLysから58番目のAla及び80番目のAsnから97番目のGluまでのペプチドと予測され、成熟型ヒトMP52のメチオニンの位置（30番目、71番目、74番目）に相当するアミノ酸は50番目のロイシン、91番目のバリン、94番目のイソロイシンに置換されている。
【００３１】
これらの成熟型ヒトMP52のメチオニンの位置に対応する位置の疎水性アミノ酸の選択的な化学修飾は困難である。しかし、遺伝子工学的手法を用い疎水性から親水性又は極性アミノ酸に変換することは可能である。
【００３２】
またトリプトファン残基は上述のBMPすべてで保存されていることから、化学修飾法でも遺伝子工学的手法においても疎水性から親水性又は極性アミノ酸に置換することが可能である。トリプトファン残基は化学修飾および遺伝子工学においてその立体構造に変化を起こさせる点でも重要な役割をもつ。
【００３３】
従って、本発明は、特に、配列表配列番号１に示すメチオニン残基のうち１ないし4個のメチオニン残基あるいはトリプトファン残基の１ないし2個を遺伝子工学的手法を用いることにより疎水性から親水性アミノ酸又は極性アミノ酸に変換した成熟型ヒトMP52に関する。本発明において、親水性のアミノ酸や極性アミノ酸とはアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン残基等をいう。本発明においてメチオニン残基あるいはトリプトファン残基を他の親水性又は極性アミノ酸に変換する場合、配列番号１に記載する30番目、71番目、74番目および111番目のメチオニンに相当するコドンを、又は32番目、35番目のトリプトファンに相当するコドンを、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニンなどのコドンで置換した組み換えDNAを大腸菌に導入し発現させ本発明のタンパク質を得ることができる。
【００３４】
さらに、本発明は、１又は２個のトリプトファン残基を化学修飾した配列番号２から４に示されるアミノ酸配列を有する成熟型タンパク質に関連する。
【００３５】
さらに、本発明は配列番号２から４に示される受容体結合部位を構成する疎水性アミノ酸のうち、30番目、71番目および74番目に位置するメチオニン残基に相当する位置の疎水性アミノ酸のうち１ないし3個のアミノ酸残基あるいはトリプトファン残基の１又は2個を親水性アミノ酸又は極性アミノ酸に置換した成熟型タンパク質に関する。本発明における疎水性アミノ酸とはメチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシンあるいはトリプトファンをいう。
【００３６】
本発明は4個のメチオニン残基を酸化した配列表配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する成熟型タンパク質に関する。詳細にはメチオニン残基を酸化する場合、２mg/mlの濃度の成熟型タンパク質に、終濃度が0.014％となるように過酸化水素を添加し、室温にて15時間以上反応させると、メチオニン残基がメチオニンスルホキシド化された成熟型タンパク質を得ることができる。
【００３７】
本発明はメチオニン残基の１ないし4個のメチオニン残基をアルキル化した配列表配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する成熟型タンパク質に関する。詳細には、２mg/mlの濃度のタンパク質に、メチオニン残基の50‐100倍のモル比のモノヨード酢酸を添加し、室温にて15時間以上反応させると、メチオニン残基がＳ-カルボキシメチル化された成熟型タンパク質を得ることができる。
【００３８】
本発明はトリプトファン残基のうち2個のトリプトファン残基がアリルスルフェニル化した配列表配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する成熟型タンパク質に関する。詳細には、２mg/mlの濃度のタンパク質に、100％酢酸に溶解したP‐ニトロフェニルスルフェニルクロライドを20当量添加し、室温にて1時間反応させると、トリプトファン残基がアリルスルフェニル化された成熟型タンパク質を得ることができる。
【００３９】
本発明は配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列の28番目、31番目のトリプトファン残基の１個又は2個をアリルスルフェニル化した成熟型タンパク質に関する。
【００４０】
本発明は配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列の26番目、67番目、70番目のバリンの１つ若しくは全部又は28番目、31番目のトリプトファン残基の１個若しくは2個をアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等に置換した成熟型タンパク質に関する。
【００４１】
本発明は配列表配列番号３に記載のアミノ酸配列の30番目、33番目のトリプトファン残基の１個又は2個をアリルスルフェニル化した成熟型タンパク質に関する。
【００４２】
本発明は配列表配列番号３に記載のアミノ酸配列の28番目、69番目、72番目のバリンのいずれか１つ若しくは全部又は30番目、33番目のトリプトファン残基の１個若しくは2個をアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等に置換した成熟型タンパク質に関する。
【００４３】
本発明は配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列の５２番目、５５番目のトリプトファン残基の１個又は2個をアリルスルフェニル化した成熟型タンパク質に関する。
【００４４】
本発明は配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列の５０番目のロイシン、９１番目のバリン、９４番目のイソロイシン、１３１番目のメチオニンの１つ若しくは全部又は５２番目、５５番目のトリプトファン残基の１個若しくは2個をアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン等に置換した成熟型タンパク質に関する。
【００４５】
本発明の化学修飾又は他のアミノ酸で置換されたタンパク質のBMPアンタゴニスト様作用は、児玉ら（Kodama, H. et al. (1981) Jpn. J. Oral Biol. vol.23, p.899） により確立された骨芽細胞様の性質を有するマウス頭蓋冠クローン化細胞株（MC3T3-E1細胞）の培地に添加し、細胞中のアルカリホスファターゼ（ALPase）活性を指標として生物活性を測定することにより証明され得る。ALPaseは骨芽細胞および軟骨細胞の分化・成熟の指標酵素としてしばしば用いられる (Pfeilschifter, J., et al., Endocrinology (1987), vol. 121, p 212-218; Rodan, G.A., et al., calcium regulating hormones and bone metabolism, Elsevier Science Publishers B.V., (1992), p 183-196)。
【００４６】
本発明の実施例1〜3により得られた成熟型タンパク質は骨芽細胞様の性質を有するMC3T3-E1細胞株やC3H10T1/2細胞株の組換え成熟型ヒトBMP-2（rh-BMP-2）や成熟型ヒトMP52により誘導されたALPase活性の上昇を用量依存的に抑制した。このことは、本発明タンパク質がヒトMP52の活性のみならず他のBMPの活性をも抑えることを示している。
【００４７】
本発明は上記で得られたいずれかのタンパク質を有効成分として含む異所性骨化の治療および予防剤に関する。
【００４８】
さらに本発明は上記で得られたいずれかのタンパク質を有効成分として含む石灰沈着を伴う代謝性疾患の治療および予防剤に関する。
【００４９】
本発明のタンパク質は、OPLL及び動脈硬化の症状の悪化を抑える薬剤及びBMPが発現している骨や軟骨の腫瘍の治療剤、及びその他骨代謝疾患の治療剤として治療に有用である。この物質は骨代謝サイクルに影響を及ぼし骨芽細胞機能を抑制することで、パジェット病(Paget’s disease)のような悪化しつつある状態を抑えることができる。また、この物質はBMPや受容体結合と競合する医薬品のスクリーニングや評価システムのための試薬としても有用である。
【００５０】
その投与方法としては静脈内及び筋肉内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の静脈内注射の他点滴静注が可能である。
【００５１】
注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の１種又は２種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアンプルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とすることができる。
【００５２】
臨床における成人１日当たりの投与量は、投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、通常は本タンパク質として0.01〜5 mgの範囲である。
【００５３】
以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００５４】
〔実施例〕
(実施例１)  メチオニン残基を酸化した成熟型ヒトMP52の作製
（１）過酸化水素による成熟型ヒトMP52のメチオニン残基の酸化（メチオニンスルホキシドへの変換）
2mM EDTA−10mM塩酸に溶解した２mg/mlの濃度の成熟型ヒトMP52に、終濃度が0.014％となるように過酸化水素を添加し、室温にて15時間以上反応させた。
【００５５】
（２）メチオニンが酸化された成熟型ヒトMP52の分離
配列番号１に記載の成熟型ヒトMP52（以下未修飾成熟型ヒトMP52と記す）、および、配列番号５に記載のメチオニン酸化成熟型ヒトMP52は、逆相HPLCを用いて両者の保持時間の違いにより分離した。酸化を受けることによってタンパク質の親水性が増し、逆相HPLCにおける保持時間は、メチオニン酸化成熟型ヒトMP52の方が未修飾成熟型ヒトMP52より早くなる。分離条件は、以下の通りである。カラムは、Nucleosil 5-C18-300カラム（4.6mm I.D.x150mm, GL Sciense社製）を用い、流速を1分間あたり1.3 mlに設定、カラム温度45℃、ピーク検出波長として214 nm及び280 nmを用いた。溶媒は、A液として0.05％TFAを含む水、B液として0.05％TFAを含むアセトニトリルを用いた。溶出は、HPLCポンプ、HP1050(HEWLETT PACKARD)を用いてB液25％から45％までの80分間の直線勾配で行った。
【００５６】
この条件で、未修飾成熟型ヒトMP52が51分付近で溶出するのに対し、メチオニン酸化成熟型ヒトMP52は、47分付近で溶出した。このように、両者は容易に分離できた。
【００５７】
（３）メチオニン残基の酸化の確認
未修飾成熟型ヒトMP52及びメチオニン酸化成熟型ヒトMP52のトリプシン消化フラグメントの逆相カラムクロマトグラフィにおける溶出パターンを比較することによって、メチオニン残基の酸化の検出を行なった。
【００５８】
未修飾成熟型ヒトMP52は配列番号１に示すごとく、システイン残基を7つ持つ。７つのうち６つが3組の分子のジスルフィド結合を形成し、残りの１つのシステインで二量体を形成している。完全な酵素的消化のためには、ジスルフィド結合を減じ、再結合を阻害するためのSHのブロックが必要となる。このため、トリプシン消化の前に、ジチオスレイトールを用いてジスルフィド結合を還元後、システイン残基をアルキル化(S-カルボキシルメチル化)する処理を行なった。
【００５９】
まず、凍結乾燥した未修飾成熟型ヒトMP52及びメチオニン酸化成熟型ヒトMP52をそれぞれ終濃度１mg/mlとなるように8M 尿素−0.2M重炭酸アンモニウム−2mM EDTA、pH8.5の溶液に溶かし、システイン残基の50倍量のジチオスレイトール(DTT)を加えて50℃で30分反応させた。この溶液に、システイン残基の250倍量のモノヨード酢酸アミドを加え、遮光して30分反応させることにより、S−カルボキシメチル化未修飾成熟型ヒトMP52及びS-カルボキシメチル化メチオニン酸化成熟型ヒトMP52を得た。これらのタンパク質の消化はトリプシンを添加することにより行った。この溶液を水で4倍に希釈し尿素の終濃度を２Mとした後、ヒトMP52の重量あたり1/50量のトリプシンを加え、37℃で18時間消化を行なった。このトリプシン消化物を逆相HPLCカラムにかけ、すべてのフラグメントを分離した。分離条件は、以下の通りである。カラムは、Nucleosil 5-C18-300カラム（4.6mm I.D.x150mm, GL Sciense社製）を用い、流速を1分間あたり1.3 mlに設定、カラム温度45℃、ピーク検出波長として214 nmを用いた。溶媒は、A液として0.05％TFAを含む水、B液として0.05％TFAを含むアセトニトリルを用いた。溶出は、HPLCポンプ、HP1050(HEWLETT PACKARD)を用いて5分間B液0％に維持した後、0％から45％までの90分間の直線勾配で行った。
【００６０】
次に、分離した未修飾成熟型ヒトMP52及び還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトMP52の消化フラグメントの１次構造上の位置を決定するためにアミノ酸組成分析を行なった。アミノ酸組成分析の操作は主として続生化学実験講座（東京化学同人）第２巻、タンパク質の化学（上）第４章記載の方法に従った。以下、簡単に操作を記す。加水分解は、0.1％フェノールを含む６N塩酸の蒸気下、Waters社のPICO.TAG.WORK STATIONを用いて、110℃、21時間行なった。その後、ピアス社のAmino acid standard Hを標準アミノ酸として用い、PTC法によるアミノ酸組成分析を行なった。PTC-アミノ酸の分離は、HPLCポンプ（Waters社の510HPLCポンプ）、和光純薬のWakopak WS-PTC(4.0 mm I.D.x 200 mm)、溶媒としてはPTCアミノ酸溶離液A及びPTCアミノ酸溶離液B（共に和光純薬）を用いて行った。
【００６１】
アミノ酸組成分析により未修飾成熟型ヒトMP52及びメチオニン酸化成熟型ヒトMP52の１次構造上のトリプシンペプチドのHPLCにおける溶出時間を比較した。メチオニン残基を含む成熟型ヒトMP52のトリプシンフラグメントは、配列番号１に示す29番目から56番目に対応するもの(29-56、30番目のメチオニンを含む)、配列番号１に示す57番目から88番目に対応するもの(57-88、71及び74番目のメチオニンを含む)及び配列番号１に示す107番目から119番目に対応するもの(107-119、111番目のメチオニンを含む)の3種類であった。還元アルキル化未修飾成熟型ヒトMP52由来のそれぞれのフラグメントの溶出時間は、順に84分、62分、36分付近であるのに対し、還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトMP52（配列番号５）由来のフラグメントは、順に80分、48分、31分付近で、未修飾成熟型ヒトMP52由来のフラグメントより早く溶出した。
【００６２】
一方、これ以外のメチオニンを含まないフラグメントの溶出時間は両者で変化がなかった。以上により、メチオニン残基特異的に酸化反応がおきていることが確認できた。
【００６３】
(実施例２)  メチオニン残基をＳ-カルボキシメチル化した成熟型ヒトMP52の作成
（１）モノヨード酢酸による成熟型ヒトMP52のメチオニン残基のアルキル化
モノヨード酢酸を用いたアルキル化反応は、ジスルフィド結合をしていないシステイン残基のSHに最も反応性が高いが、前述したように、未修飾成熟型ヒトMP52のシステイン残基はすべてジスルフィド結合をしているため、酸性条件においては、アルキル化反応はほぼ選択的にメチオニン残基に起きる。よって、以下のように操作を行なった。10mM塩酸に溶解した２mg/mlの濃度の未修飾成熟型ヒトMP52に、メチオニン残基の50‐100倍のモル比のモノヨード酢酸を添加し、室温にて3-18時間反応させた。
【００６４】
（２）メチオニン残基をアルキル化した成熟型ヒトMP52の分離
配列番号６のアミノ酸配列を有する未修飾成熟型ヒトMP52とメチオニンアルキル化成熟型ヒトMP52は、逆相HPLCを用いて両者の保持時間の違いに基づいて分離した。分離条件（使用カラム、流速、温度、検出波長およびHPLCポンプ）は実施例1（２）と同様である。溶媒は、A液として0.05％TFAを含む水、B液として0.05％TFAを含むアセトニトリルを用いて、初期条件である5分経過後からの60分間でB液30％から45％まで直線勾配を行なった。
【００６５】
この条件で、未修飾成熟型ヒトMP52が38分付近で１つのピークとして溶出するのに対し、アルキル化成熟型ヒトMP52は、未処理成熟型ヒトMP52の溶出時間である38分付近のピークの他にピークが4本（溶出時間；36分、34分、32分、29分）確認できた。反応が進むほど、すなわちアルキル化されたメチオニンの数に応じて溶出時間が早くなる。これらピークを分取し、その確認のために実施例1（３）と同様にアミノ酸組成分析を行なった。アミノ酸組成分析において、アルキル化されたメチオニンは加水分解で壊れないため、反応していないメチオニンとは別のピークとして検出される。すなわち、反応の進行はメチオニンピークの減少によって確認できる。
【００６６】
この分離実験により、溶出時間29分の溶出ピークはメチオニン4つすべてがアルキル化したもの、溶出時間32分のピークはメチオニン3つがアルキル化したもの、溶出時間34分のピークはメチオニン2つがアルキル化したもの、溶出時間36分のピークはメチオニン1つがアルキル化したものであることがわかった。また、38分付近の溶出ピークは、アルキル化されていないもののピークであることがわかった。これらのピークについて、メチオニン以外のアミノ酸については、成熟型ヒトMP52のアミノ酸組成の理論値と一致した。以上により、メチオニン残基特異的にアルキル化反応が起きていること、分離したピークは、アルキル化反応の進行程度の違うものであることが確認できた。
【００６７】
（３）メチオニン残基のアルキル化の確認
未修飾成熟型ヒトMP52及びメチオニンアルキル化成熟型ヒトMP52のトリプシン消化フラグメントの逆相HPLCにおける溶出パターンを比較することによって、メチオニン残基のアルキル化の確認を行なった。
【００６８】
実施例１（３）と同様に、ジチオスレイトールを用いてジスルフィド結合を還元後、トリプシン消化の前に、システイン残基をアルキル化によりブロックした。ただし、メチオニンのアルキル化反応にモノヨード酢酸を用いたＳ-カルボキシメチル化を行なっているため、システインのアルキル化はモノヨード酢酸アミドを用いた実施例１と同様のＳ-カルボキシメチル化ではなく、モノヨード酢酸の替わりにアルキル化試薬として4‐ビニルピリジンを用いて行なった。アルキル化反応は、pH8.5においては還元したシステインにほぼ選択的でメチオニンには殆ど起きない。異なるアルキル化を行うのは副反応があった場合に区別し得るためである。
【００６９】
まず、凍結乾燥した未修飾MP52及びメチオニンアルキル化成熟型ヒトMP52を終濃度１mg/mlとなるように6M Guanidine‐HCl−0.4M トリス塩酸緩衝液、pH8.5の溶液に溶かし、システイン残基の50倍量のジチオスレイトール(DTT)を加えて50℃で30分反応させた。システイン残基の250倍量の4‐ビニルピリジンを加え、遮光して30分反応させS-ピリジル-エチル化を行った。この溶液を、6M Guanidine‐HCl−0.4M トリス塩酸緩衝液、pH8.5の溶液にて平衡化させてある脱塩用のゲルろ過カラム(PD-10、ファルマシア)にかけ過剰の試薬を除いた後、逆相カラム(Cosmasil 10C18-300、4.6mmI.D.x100mm、ナカライテスク)を用いた逆相HPLCにて分離した。分光光度計で、トリプトファンに由来する280nmにおける吸収とピリジンに由来する254nmにおける吸収を併せ持つ分画を確認した。
【００７０】
その後、実施例１（３）と同じ方法でトリプシン消化を行ない、消化フラグメントの分離を行なった。
【００７１】
次に、実施例１（３）と同様にして、アミノ酸組成分析により各フラグメントの１次構造上の位置を決定した。
【００７２】
アミノ酸組成分析により１次構造上の位置が決定された未修飾成熟型ヒトMP52及びメチオニンアルキル化成熟型ヒトMP52の各トリプシンフラグメントの溶出時間を逆相HPLCにより比較した。メチオニン残基を含む成熟型ヒトMP52のトリプシンフラグメントは、配列番号１に示す29番目から56番目に対応するもの(29-56、30番目のメチオニンを含む)、配列番号１に示す57番目から88番目に対応するもの(57-88、71及び74番目のメチオニンを含む)及び配列番号１に示す107番目から119番目に対応するもの(107-119、111番目のメチオニンを含む)の3種類で、未修飾成熟型ヒトMP52由来のそれぞれのフラグメントの溶出時間が、順に77分、58分、36分付近であった。それに対し、メチオニンアルキル化成熟型ヒトMP52（配列番号６）由来のフラグメントは、順に74分、42分、30分付近で、未修飾成熟型ヒトMP52由来のフラグメントより早く溶出した。一方、これ以外のメチオニンを含まないフラグメントの溶出時間は両者で変化がなかった。
【００７３】
また、アミノ酸組成分析において、メチオニンアルキル化成熟型ヒトMP52由来のメチオニン数は理論値と違っていた。さらに、Apllied Biosystem社のシークエンサー（Model476A)を用い、これらフラグメントのN末シークエンス分析も行ない、メチオニン残基特異的にアルキル化反応がおきていることが確認できた。
【００７４】
(実施例３)  トリプトファン残基をアリルスルフェニル化した成熟型ヒトMP52の作製
（１）P‐ニトロフェニルスルフェニルクロライドによる成熟型ヒトMP52のトリプトファン残基のアリルスルフェニル化
50％酢酸に溶解した２mg/mlの未修飾成熟型ヒトMP52に、100％酢酸に溶解したP‐ニトロフェニルクロライドを20倍のモル比で添加し、室温にて1時間反応させた。
（２）アリルスルフェニル化ヒトMP52の分離
未修飾成熟型ヒトMP52及び配列番号７のアミノ酸配列を有するアリルスルフェニル化成熟ヒトMP52を、逆相HPLCにおけるカラムの保持時間の違いに基づいて分離した。アリルスルフェニル化によって疎水性が増すことから、アリ−ルスルフェニル化成熟型ヒトMP52の逆相HPLCにおける溶出時間は、未修飾成熟型ヒトMP52に比べて遅くなる。分離条件は、以下の通りである。使用カラム、流速、およびHPLCポンプは実施例１（２）と同様で、カラム温度40℃、ピーク検出波長としてそれぞれ214 nm及び365 nmを用いた。溶媒は、A液として0.05％TFAを含む水、B液として0.05％TFAを含むアセトニトリルを用いて、B液25％で５分間維持した後、その後の35分間でB液25％から60％までの直線勾配で溶出を行った。この条件で、未修飾成熟型ヒトMP52が22分付近で溶出するのに対し、トリプトファンをアリルスルフェニル化した成熟型ヒトMP52は、26分付近で溶出した。これらのタンパク質間の溶出時間の違いにより両者は容易に分離できた。
【００７５】
（３）トリプトファン残基のアリルスルフェニル化の確認
実施例１に記した方法と同様の方法で、ジスルフィド結合を還元後、システイン残基をアルキル化(S-カルボキシメチル化)した未修飾成熟型ヒトMP52及びトリプトファンをアリルスルフェニル化した成熟型ヒトMP52をトリプシン消化後C18逆相カラムで消化フラグメントを分離した。アミノ酸組成分析により各フラグメントのアミノ酸の位置を決定した。
【００７６】
トリプトファン残基を含む成熟型ヒトMP52のトリプシンフラグメントは、配列番号１に示す29番目から56番目に対応するもの(29-56、32番目及び35番目のトリプトファンを含む)のみである。トリプトファン残基を含むトリプトファン残基のアリルスルフェニル化成熟型ヒトMP52（配列番号７）由来のフラグメントの溶出時間（95分付近）のみが、未修飾成熟型ヒトMP52由来のフラグメントの溶出時間（84分付近）に比べて遅くなっていた。一方、これ以外のトリプトファンを含まないフラグメントの溶出時間は変化がなかった。また、Ｎ末シークエンス分析によってもトリプトファンのみが未修飾と修飾ヒトMP52で違うことが確認できた。
【００７７】
(実施例４)  骨形成活性抑制の検定
本発明の成熟型タンパク質のBMP-2アンタゴニスト作用は、児玉ら（前述）により確立された骨芽細胞様の性質を有するマウス頭蓋冠からクローン化されたMC3T3-E1細胞株、および未分化細胞であるが、培養条件により骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などに分化する多分化能を持つC3H10T1/2細胞の培地に添加することにより検定された。本細胞株の培養は、多久和ら（前述）による記載の方法に準じて行い、MC3T3-E1細胞の場合、10%牛胎児血清を含むα-MEM培地中で1 cm2当たり約5×10３細胞の密度でイノキュレートし、3日間培養した。α-MEM培地で細胞を洗浄した後に、培地を0.3％牛血清アルブミンを含むα-MEM培地に交換した。種々の濃度の本発明の成熟型タンパク質及び成熟型rh-BMP-2 （リコンビナントヒトＢＭＰ−２）を添加し培養した（ポスト培養）。細胞中のALPase活性をp-ニトロフェニルリン酸を基質として用いる比色法により定量した。
【００７８】
C3H10T1/2細胞株の場合は、プレ培養のために用いた培地だけが、10％の牛胎児血清を含むBME培地であり、ポスト培養で用いた培地が2%牛胎児血清を含むBME培地である他は、MC3T3-E1細胞株の条件と同様である。
【００７９】
図１は、メチオニンをアルキル化した成熟型ヒトMP52によるMC3T3-E1細胞におけるALPase活性の結果を、未修飾成熟型ヒトMP52との比較において表してある。両タンパク質は実施例２の逆相HPLCの保持時間の違いにより得られた。図中の黒丸実線は未修飾成熟型ヒトMP52を、黒四角実線は1個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52を、黒三角破線は２個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52を、白抜き丸実線は３個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52を、白抜き三角点線は４個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52をそれぞれ表わしている。Y軸上に示してある黒丸は、薬物を添加していない未処理の活性を示している。図1に示すごとく、メチオニンのアルキル化反応進行に連れ、MC3T3-E1細胞株中のALPase誘導活性が減少した。
【００８０】
図２は細胞株の違いによるメチオニンを酸化した成熟型ヒトMP52およびトリプトファン残基をアリルスルフェニル化した成熟型ヒトMP52のアンタゴニスト活性を示した図である。図2-Aは、C3H10T1/2細胞における成熟型rh-BMP-2に対するアンタゴニスト活性、図2-Bは、MC3T3-E1細胞における成熟型ヒトMP52に対するアンタゴニスト活性をそれぞれ表わしている。両図において黒丸実線はトリプトファン残基をアリルスルフェニル化した成熟型ヒトMP52を、白抜き丸点線はメチオニンを酸化した成熟型ヒトMP52を表している。図２−Ａでは黒四角は300 ng/mlの成熟型rh-BMP-2単独により誘導されたC3H10T1/2細胞中のALPase活性を表している。図２−Ｂでは黒四角は600 ng/mlの未修飾成熟型ヒトMP52単独で誘導されたMC3T3-E1細胞中のALPase活性を表している。また、白抜き四角は薬物未添加時の活性を示している。
【００８１】
図2-Aに示すごとく、300 ng/mlの成熟型rh-BMP-2はC3H10T1/2細胞中のALPase活性を対照群の約40倍に上昇させた。本発明の修飾成熟型ヒトMP52は１当量から20当量において用量依存的にそのALPase活性を抑制した。また、図2-Bに示すごとく、600 ng/mlの未修飾ヒト成熟型MP52はMC3T3-E1細胞株中のALPase活性を対照群の約3倍に上昇させた。本発明のアミノ酸修飾成熟型ヒトMP52は１当量から10当量において用量依存的にそのALPase活性を抑制した。
【００８２】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：119
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
起源：
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：ヒト胎児
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：成熟型MP52の配列
配列：
Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp
20                  25                  30
Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu
35                  40                  45
Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His
50                  55                  60
Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro
65                  70                  75                  80
Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe
85                  90                  95
Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val
100                 105                 110
Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
115
配列番号：2
配列の長さ：114
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
起源：
物名：ヒト（Homo sapiens）
織の種類：ヒト胎児
配列の特徴：
在位置：
の情報：成熟型BMP-2の配列
配列：
Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg
1               5                   10                  15
His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile
20                  25                  30
Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro
35                  40                  45
Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln
50                  55                  60
Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val
65                  70                  75                  80
Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu
85                  90                  95
Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly
100                 105                 110
Cys Arg
配列番号：3
配列の長さ：116
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
起源：
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：ヒト胎児
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：成熟型BMP-4の配列
配列：
Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys
1               5                   10                  15
Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp
20                  25                  30
Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp
35                  40                  45
Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile
50                  55                  60
Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys
65                  70                  75                  80
Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu
85                  90                  95
Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu Gly
100                 105                 110
Cys Gly Cys Arg
115
配列番号：4
配列の長さ：139
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
起源：
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：ヒト胎児
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：成熟型BMP-7
配列：
Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys
1               5                   10                  15
Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser
20                  25                  30
Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg
35                  40                  45
Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn
65                  70                  75                  80
Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro
85                  90                  95
Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile
100                 105                 110
Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr
115                 120                 125
Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His
130                 135
配列番号：5
配列の長さ：119
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
起源：
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：ヒト胎児
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：成熟型MP52の配列の30番目、71番目、74番目および111番目のメチオニンが修飾されてメチオニンスルフォキシドに変換している。
配列：
Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp
20                  25                  30
Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu
35                  40                  45
Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His
50                  55                  60
Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro
65                  70                  75                  80
Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe
85                  90                  95
Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val
100                 105                 110
Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
115
配列番号：6
配列の長さ：119
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
起源：
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：ヒト胎児
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：成熟型MP52の配列の30番目、および/または、71番目、および/または、74番目、および/または、111番目のメチオニンが修飾されてS-カルボキシメチルメチオニンに変換している。
配列：
Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp
20                  25                  30
Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu
35                  40                  45
Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His
50                  55                  60
Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro
65                  70                  75                  80
Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe
85                  90                  95
Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val
100                 105                 110
Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
115
配列番号：7
配列の長さ：119
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：N末端フラグメント
起源：
生物名：ヒト（Homo sapiens）
組織の種類：ヒト胎児
配列の特徴：
存在位置：
他の情報：成熟型MP52の配列の32番目および35番目のトリプトファンが修飾されてアリールスルフェニルトリプトファンに変換している。
配列：
Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala
1               5                   10                  15
Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp
20                  25                  30
Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu
35                  40                  45
Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His
50                  55                  60
Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro
65                  70                  75                  80
Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe
85                  90                  95
Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val
100                 105                 110
Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
115
【図面の簡単な説明】
【図１】  MC3T3-E1細胞における、メチオニン残基をアルキル化した成熟ヒトMP52sによるALPase誘導活性の未修飾成熟ヒトMP52によるものとの比較を示し、これらの成熟ヒトMP52は、逆相HPLCにおいて異なる保持時間で分離された。図中の黒丸実線は未修飾ヒトMP52の逆相分画を、黒四角実線は1個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52、黒三角破線は２個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52を、白抜き丸実線は３個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52を、白抜き三角点線は４個のメチオニン残基がアルキル化された成熟型ヒトMP52をそれぞれ表わしている。Ｙ軸上に示してある黒丸は、薬物処理されていない細胞におけるALPase活性を示している。
【図２】  細胞株の違いによるメチオニン残基を酸化したヒトMP52およびトリプトファン残基をアリールスルフェニル化したヒトMP52のアンタゴ二スト様活性を示した図である。図2-Aは、C3H10T1/2細胞における成熟型rh-BMP-2に対するアンタゴニスト活性、図2-Bは、MC3T3-E1細胞における成熟型ヒトMP52に対するアンタゴニスト様活性をそれぞれ表わしている。両図において黒丸実線はトリプトファン残基をアリールスルフェニル化した成熟型ヒトMP52を、白抜き丸点線はメチオニン残基を酸化した成熟型ヒトMP52を表している。図２−Ａでは、黒四角はC3H10T 1/2細胞において300ng/mlの成熟rh-BMP-2単独で誘導されたALPase活性を示す。図２−Ｂでは、黒四角はMCT3T3-E1細胞において未成熟ヒトMP52単独で誘導されたALPase活性を示す。白抜き四角は薬物未添加における活性を示している。
【図１】
0004410939.tif 000002
【図２】
0004410939.tif 000003