(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略記する）もしくはその誘導体とエリスロポエチン（以下、ＥＰＯと略記する）もしくはその誘導体であるポリペプチドのコンジュゲートであって、
（ａ）ポリペプチドのＮ末端のα炭素原子とＰＥＧもしくはその誘導体の片末端がヒドラゾン結合もしくは還元ヒドラゾン結合を介して相互に結合されており、
（ｂ）ＰＥＧもしくはその誘導体は５，０００ダルトンの分子量を有し、
（ｃ）ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されておらず、そして
（ｄ）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基はセリンもしくはトレオニンでなく、かつ、
（ｅ）ＰＥＧもしくはその誘導体が、ポリペプチドのＮ末端のα炭素原子と結合する他の片末端においてアルキル基で置換されていないかまたは置換されたポリエチレングリコールであり、そして
（ｆ）ＥＰＯの誘導体が、Ｌ５Ｓ、Ｌ５Ｓ／Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｒ１０Ａ、Ｅ１３Ａ、Ｒ１４Ｌ、Ｒ１４Ａ、Ｌ１７Ａ、Ｅ１８Ａ、Ｋ２０Ａ、Ｅ２１Ａ、Ｎ２４Ｑ、Ｎ２４Ｑ／Ｎ８３Ｑ、Ｎ２４Ｑ／Ｎ３８Ｑ／Ｎ８３Ｑ、Ｃ２９Ｙ／Ｃ３３Ｙ、Ａ３０Ｓ／Ｌ３５Ｓ、Ａ３０Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｃ３３Ｐ／Ｒ１３９Ｃ、Ｌ３５Ｓ／Ａ１１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｎ３８Ｑ、Ｎ３８Ｑ／Ｎ８３Ｑ、Ｖ４１Ｓ、Ｋ４５Ａ、Ｆ４８Ｓ、Ｙ４９Ｓ、Ａ５０Ｓ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ１４４Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｖ１４４Ｎ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ／Ｌ１３０Ａ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ／Ｌ１３０Ａ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ／Ｌ１３０Ａ、Ｋ５２Ｓ、Ｍ５４Ｌ、Ｍ５４Ｓ／Ｖ５６Ｓ、Ｗ５７Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｅ６２Ａ、Ｗ６４Ａ、Ｑ６５Ａ、Ｇ６６Ａ、Ｌ６９Ａ、Ｌ６９Ｎ、Ｓ７１Ａ、Ａ７３Ｇ、Ｒ７６Ａ、Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｖ１４４Ｎ、Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｎ８３Ｑ、Ｑ９２Ａ、Ｌ９３Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｇ１０１Ａ、Ｌ１０２Ａ、Ｒ１０３Ａ、Ｓ１０４Ａ、Ｓ１０４Ｎ、Ｌ１０５Ａ、Ｌ１０５Ｆ、Ｔ１０６Ａ、Ｔ１０７Ａ、Ｌ１０８Ａ、Ｌ１０９Ａ、Ｌ１１２Ａ、Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ｓ／Ｌ１３０Ａ／Ｉ１３３Ａ、Ｐ１２２Ｑ、Ａ１２４Ｐ／Ａ１２５Ｔ、Ａ１２５Ｔ、Ａ１２５Ｎ／Ａ１２７Ｓ、Ｌ１３０Ａ、Ｄ１３６Ａ、Ｒ１３９Ａ、Ｋ１４０Ａ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１４６Ａ、Ｎ１４７Ａ、Ｒ１５０Ａ、Ｋ１５２Ａ、Ｌ１５３Ａ、Ｋ１５４Ａ、Ｌ１５５Ａ、Ｙ１５６Ａ、Ｔ１５７Ａ、Ｇ１５８Ａ、Ｅ１５９Ａ、Ｒ１６２Ｋ／Ｔ１６３Ｄ／Ｇ１６４Ｅ／Ｄ１６５Ｌ、Ｒ１６２Ｈ／Ｔ１６３Ｈ／Ｇ１６４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ／Ｒ１６６Ｈ／（１６７）Ｈ、２−５欠失、１３−１７欠失、３２−３６欠失、４３−４７欠失、５３−５７欠失、７８−８２欠失、１１１−１１９欠失、１１５−１２１欠失、１２０−１２２欠失、１２３−１２５欠失、１２６−１２９欠失、１６３−１６６欠失およびＫ１１６（ＬＩＳＥＥＤＬ挿入）からなる群より選ばれるＥＰＯの突然変異体である、
ことを特徴とする上記コンジュゲート。
【請求項２】
ヒドラゾン結合がＰＥＧの片末端のヒドラジンカルボキシレート、ヒドラジドもしくはセミカルバジドとポリペプチドのＮ末端のα炭素原子が形成するカルボニルとの反応により形成される、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
ヒドラゾン結合がＰＥＧの片末端のヒドラジンカルボキシレートとポリペプチドのＮ末端のα炭素原子が形成するカルボニルとの反応により形成される、請求項２記載のコンジュゲート。
【請求項４】
ポリペプチドがＥＰＯであり、そしてＰＥＧもしくはその誘導体がｍＰＥＧである、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略記する）もしくはその誘導体をエリスロポエチン（以下、ＥＰＯと略記する）もしくはその誘導体であるポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合せしめる方法であって、
（ａ）ポリペプチドを、Ｎ末端のα−カルボニル基を有するアミノ基転移ポリペプチドを形成するように、
（ｉ）０．１Ｍから２．０Ｍまでの濃度のグリオキシレートイオンもしくはその誘導体、
（ii）１０μＭから１Ｍまでの濃度の遷移金属イオン、および
（iii）１０ｍＭから１０Ｍまでの濃度のルイス塩基と、
５．０から７．０までのｐＨおよび０℃から１００℃までの温度で接触させる工程；および
（ｂ）アミノ基転移ポリペプチドを、３．０から５．０までのｐＨで、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してヒドラゾン結合を形成するように共有結合する部分を有するＰＥＧと接触させ、それによりＰＥＧをポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合させる工程を含んでなり、ただし、ＰＥＧもしくはその誘導体は５，０００ダルトンの分子量を有し、また、ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されず、かつ、
ＥＰＯの誘導体がＬ５Ｓ、Ｌ５Ｓ／Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｒ１０Ａ、Ｅ１３Ａ、Ｒ１４Ｌ、Ｒ１４Ａ、Ｌ１７Ａ、Ｅ１８Ａ、Ｋ２０Ａ、Ｅ２１Ａ、Ｎ２４Ｑ、Ｎ２４Ｑ／Ｎ８３Ｑ、Ｎ２４Ｑ／Ｎ３８Ｑ／Ｎ８３Ｑ、Ｃ２９Ｙ／Ｃ３３Ｙ、Ａ３０Ｓ／Ｌ３５Ｓ、Ａ３０Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｃ３３Ｐ／Ｒ１３９Ｃ、Ｌ３５Ｓ／Ａ１１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｎ３８Ｑ、Ｎ３８Ｑ／Ｎ８３Ｑ、Ｖ４１Ｓ、Ｋ４５Ａ、Ｆ４８Ｓ、Ｙ４９Ｓ、Ａ５０Ｓ、Ｗ５１Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ１４４Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｖ１４４Ｎ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ／Ｌ１３０Ａ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｗ５１Ｓ／Ｍ５４Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ／Ｌ１３０Ａ、Ｗ５１Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ／Ｌ１３０Ａ、Ｋ５２Ｓ、Ｍ５４Ｌ、Ｍ５４Ｓ／Ｖ５６Ｓ、Ｗ５７Ｓ／Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ａ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｅ６２Ａ、Ｗ６４Ａ、Ｑ６５Ａ、Ｇ６６Ａ、Ｌ６９Ａ、Ｌ６９Ｎ、Ｓ７１Ａ、Ａ７３Ｇ、Ｒ７６Ａ、Ｖ８２Ｓ、Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ｖ１４４Ｎ、Ｖ８２Ｓ／Ｗ８８Ｓ／Ａ１２４Ｓ／Ａ１２５Ｓ、Ｎ８３Ｑ、Ｑ９２Ａ、Ｌ９３Ａ、Ｋ９７Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｇ１０１Ａ、Ｌ１０２Ａ、Ｒ１０３Ａ、Ｓ１０４Ａ、Ｓ１０４Ｎ、Ｌ１０５Ａ、Ｌ１０５Ｆ、Ｔ１０６Ａ、Ｔ１０７Ａ、Ｌ１０８Ａ、Ｌ１０９Ａ、Ｌ１１２Ａ、Ｌ１１２Ａ／Ｉ１１９Ｓ／Ｌ１３０Ａ／Ｉ１３３Ａ、Ｐ１２２Ｑ、Ａ１２４Ｐ／Ａ１２５Ｔ、Ａ１２５Ｔ、Ａ１２５Ｎ／Ａ１２７Ｓ、Ｌ１３０Ａ、Ｄ１３６Ａ、Ｒ１３９Ａ、Ｋ１４０Ａ、Ｒ１４３Ａ、Ｓ１４６Ａ、Ｎ１４７Ａ、Ｒ１５０Ａ、Ｋ１５２Ａ、Ｌ１５３Ａ、Ｋ１５４Ａ、Ｌ１５５Ａ、Ｙ１５６Ａ、Ｔ１５７Ａ、Ｇ１５８Ａ、Ｅ１５９Ａ、Ｒ１６２Ｋ／Ｔ１６３Ｄ／Ｇ１６４Ｅ／Ｄ１６５Ｌ、Ｒ１６２Ｈ／Ｔ１６３Ｈ／Ｇ１６４Ｈ／Ｄ１６５Ｈ／Ｒ１６６Ｈ／（１６７）Ｈ、２−５欠失、１３−１７欠失、３２−３６欠失、４３−４７欠失、５３−５７欠失、７８−８２欠失、１１１−１１９欠失、１１５−１２１欠失、１２０−１２２欠失、１２３−１２５欠失、１２６−１２９欠失、１６３−１６６欠失およびＫ１１６（ＬＩＳＥＥＤＬ挿入）からなる群より選ばれるＥＰＯの突然変異体であり、かつ、
ＰＥＧもしくはその誘導体が、ポリペプチドのＮ末端のα炭素原子と結合する他の片末端においてアルキル基で置換されていないかまたは置換されたポリエチレングリコールである、
ことを特徴とする上記方法。
【請求項６】
ＰＥＧに共有結合される部分がヒドラジンカルボキシレートである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＰＥＧの誘導体がｍＰＥＧである、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
還元ヒドラゾン結合を形成するように、段階（ｂ）で形成されたヒドラゾン結合を還元する段階をさらに含んで成る、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のコンジュゲートを有効成分として含んで成る貧血の治療用製剤。
【請求項１０】
請求項１記載のコンジュゲートの製造での使用のためのキットであって、
（ａ）グリオキシレートイオンもしくはその誘導体；
（ｂ）遷移金属イオン；
（ｃ）ルイス塩基；および
（ｄ）５，０００ダルトンの分子量を有し、かつ、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してヒドラゾン結合を形成し、それによりＰＥＧをポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合する部分を有するＰＥＧ、
を含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はそれらのＮ末端に単一の水溶性ポリマーが結合されているポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、それらを薬剤および診断薬としての使用に有利にする特性を有する。本発明はこれらのポリペプチドの作成方法、ならびに関連する製薬学的組成物およびキットにも関する。
発明の背景
本出願を通じ多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、これにより、本発明が関する当該技術の状態をより完全に記述するため、本出願に引用により組み込まれる。
近年、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）のような非抗原性水溶性ポリマーが、治療的および診断的に重要なポリペプチドの共有結合性修飾に使用されている。例えば、インターロイキン（クナウフ（Knauf, M.J.）ら、J. Biol. Chem. 1988、263、15,064；ツツミ（Tsutsumi, Y.）ら、J. Controlled Release 1995、33、447）、インターフェロン（キタ（Kita, Y.）ら、Drug Des. Delivery 1990、6、157）、カタラーゼ（アブチョウスキ（Abuchowski, A.）ら、J. Biol. Chem. 1997、252、3,582）、スーパーオキシドジスムターゼ（ビュシャン（Beauchamp, C.O.）ら、Anal. Biochem. 1983、131、25）およびアデノシンデアミナーゼ（チェン（Chen, R.）ら、Biochim. Biophy. Acta 1981、660、293）のような治療的ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合的結合物が、それらのインビボでの半減期を延長すること、ならびに／もしくはそれらの免疫原性および抗原性を低下させることが報告されている。
しかしながら、こうした方法は重大な欠点を有する。とりわけ、大部分の例において、ＰＥＧ分子は多様な反応性部分を有するメトキシル化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）を使用してポリペプチドのアミノ基により結合される。こうしたポリマーは、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート、ｍＰＥＧ−イミデートおよびｍＰＥＧ−シアヌル酸塩化物を包含する。これらのポリマーを使用する結合は、通常、非特異的であり、すなわち無作為の様式でポリペプチドの多様なアミノ基で起こり、かつ、特定のアミノ基で独占的に起こらなかった。こうした非特異的結合は、ポリペプチドの生物学的活性を排除するような様式で活性部位のアミノ酸残基を修飾しうる。また、結果として生じる複合体（conjugate）は修飾されたポリペプチドの不均一な混合物を含有する可能性があり、これは製薬学的使用に望ましくない。
これらの問題を克服するため、ポリマーをポリペプチドに部位特異的に結合させることが望ましかった。ポリペプチドに関しては、そうすることは、生物学的活性を保存し、血液循環時間を延長し、免疫原性を低下させ、水溶性を増大させ、そしてプロテアーゼ消化に対する抵抗性を高めるとみられる。成長ホルモン放出因子の強力な類似物のＮ末端、側鎖およびＣ末端での部位特異的ペギル化（pegylation）が固相合成により実施されている（フェリックス（Felix, A.M.）ら、Int. J. Peptide Protein Res. 1995、46、253）。特異的ペギル化は樹脂上でのペプチドの集成の間に成し遂げられたため、当該方法は現存するペプチドに適用され得ない。
使用された付加的方法は、Ｎ末端のトレオニンの過ヨウ素酸ナトリウム酸化により発生されるＮ末端の反応性アルデヒド基により、部位特異的様式でリポソームの表面グラフト化ＰＥＧ鎖の末端にペプチドを結合することを伴う（ザリプスキ（Zalipsky, S.）ら、Bioconj. Chem. 1995、6、705）。しかしながら、この方法はＮ末端のセリンもしくはトレオニン残基をもつポリペプチドに制限される。
ポリペプチドのＣ末端に特異的に、活性化された基を導入するための酵素に補助された方法もまた記述されている（シュヴァルツ（Schwarz, A.）ら、Methods Enzymol. 1990、184、160；ローズ（Rose, K.）ら、Bioconjugate Chem. 1991、2、154；ゲルトナー（Gaertner, H.F.）ら、J. Biol. Chem. 1994、269、7224）。典型的には、これらの活性基は、ポリペプチドへの機能性プローブのその後の結合のためのヒドラジド、アルデヒドおよび芳香族アミノ基であり得る。しかしながら、当該方法はプロテアーゼの特異性を基礎とするため、それらは極度の注意を必要とし、そしてそれらの応用の範囲は制限される。
部位特異的突然変異誘発は、部位特異的ポリマー結合のためポリペプチドを製造するのに使用されているさらなるアプローチである。ＷＯ  ９０／１２８７４は、システイン残基の挿入もしくは他の残基のシステイン残基での置換により修飾されたタンパク質の部位特異的ペギル化を記述する。この公開は、システイン特異的ｍＰＥＧ誘導体を、ＥＰＯの組換え的に導入されたシステイン残基と反応させることによるｍＰＥＧ−エリスロポエチン（「ｍＰＥＧ−ＥＰＯ」）の製造もまた記述する。同様に、インターロイキン−２は、部位特異的突然変異誘発後にそのグリコシル化部位でペギル化された（グッドソン（Goodson, R.J.）ら、Bio/Technology 1990、8、343）。
糖タンパク質は修飾の付加的標的部位として炭水化物を提供する。酵素ペルオキシダーゼが、その炭水化物部分によりＰＥＧ−ジアミンで修飾されている（ウルティオゴイティ（Urrutiogoity, M.）ら、Biocatalysis 1989、2、145）。ＷＯ  ９４／２８０２４は過ヨウ素酸酸化された炭水化物によるｍＰＥＧ−ＥＰＯの製造方法を記述する。必要とされる化学は、ｍＰＥＧ−ヒドラジドをＥＰＯの炭水化物部分のアルデヒド基と反応させることによるヒドラゾン形成であった。この型の修飾は酸化段階により反応性のアルデヒド基を生じ、これは炭水化物部分の多様な型の糖残基およびメチオニンのようなポリペプチド中のいくつかのアミノ酸残基を潜在的に酸化し得る。本方法の別の利点はＥＰＯの炭水化物部分の不均一性に由来する。チャイニーズハムスター卵巣細胞から発現されたＥＰＯは４個の炭水化物鎖を有し、これらはアスパラギン２４、３８および８３の３個のＮに結合した鎖ならびにセリン１２６の１個のＯに結合した鎖を包含する。全体で52個の多様なＮに結合したおよび最低６個のＯに結合したオリゴ糖構造が同定されている（ラッシュ（Rush, R.S.）ら、Anal. Chem. 1995、67、1442；リンズレイ（Linsley, K.B.）ら、Anal. Biochem. 1994、219、207）。従って、その炭水化物鎖を介してＥＰＯもしくは他のタンパク質を修飾する場合、ポリマー分子の数もしくは結合部位を制御することが困難である。
要するに、水溶性ポリマーをポリペプチドに結合させるための当該技術分野における方法は重大な欠点を被る。これらの欠点は以下を包含する。すなわち（ａ）化学量論的におよび結合の位置に関しての双方の精度の欠如；（ｂ）部位特異的突然変異誘発のような困難かつ労働集約型の技術を実施する必要性；（ｃ）ポリマーを先在するポリペプチドに結合することの代わりに、ポリマー結合と同時に固相ペプチド合成を使用する必要性；ならびに（ｄ）Ｎ末端アミノ酸残基の正体（identity）がトレオニンもしくはセリンであることの厳格な要件。
相当長い間、水溶性ポリマーをポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基に部位特異的に結合させる一般的方法の必要性が存在している。この方法は上に同定された欠点を被らない。しかしながら、こうした方法は存在しない。
発明の要約
本発明は物質の２種の組成物を提供する。第一の物質の組成物は、本質的に、ポリペプチド、および、ヒドラゾン結合もしくは還元ヒドラゾン結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子でそれに共有結合された水溶性ポリマーから成るが、ただし、（ａ）ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、（ｂ）ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されず、そして（ｃ）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基はセリンもしくはトレオニンでない。
第二の物質の組成物は、本質的に、ポリペプチド、および、オキシム結合もしくは還元オキシム結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子でそれに共有結合された水溶性ポリマーから成るが、ただし、（ａ）ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、そして（ｂ）ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されない。
本発明は、水溶性ポリマーをポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合する４種の方法もまた提供する。ポリマーをヒドラゾン結合を介して炭素原子に結合する第一の方法は、
（ａ）ポリペプチドを、Ｎ末端のα−カルボニル基を有するアミノ基転移ポリペプチドを形成するように、（ｉ）約0.1Mから約2.0Mまでの濃度のグリオキシレートイオンもしくはその誘導体、（ii）約10μMから約１Mまでの濃度の遷移金属イオン、および（iii）約10mMから約10Mまでの濃度のルイス塩基と、約3.0から約8.0までのｐＨおよび約０℃から約100℃までの温度で接触させること；そして
（ｂ）アミノ基転移ポリペプチドを、約1.0から約7.5までのｐＨで、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してヒドラゾン結合を形成するそれに共有結合された部分を有する水溶性ポリマーと接触させ、それによりポリマーをヒドラゾン結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合させること、ただし、ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、そして、ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されないものである、
の段階を含んで成る。
ポリマーをオキシム結合を介して炭素原子に結合する第二の方法は、
（ａ）ポリペプチドを、Ｎ末端のα−カルボニル基を有するアミノ基転移ポリペプチドを形成するように、（ｉ）約0.1Mから約2.0Mまでの濃度のグリオキシレートイオンもしくはその誘導体、（ii）約10μMから約１Mまでの濃度の遷移金属イオン、および（iii）約10mMから約10Mまでの濃度のルイス塩基と、約3.0から約8.0までのｐＨおよび約０℃から約100℃までの温度で接触させること；そして
（ｂ）アミノ基転移ポリペプチドを、約1.0から約7.5までのｐＨで、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してオキシム結合を形成するそれに共有結合された部分を有する水溶性ポリマーと接触させる、それによりポリマーをオキシム結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合させること、ただし、ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、また、ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されないものである、
の段階を含んで成る。
第三の方法は、第一の方法の段階、ならびに、段階（ｂ）で形成されたヒドラゾン結合を還元するさらなる段階を含んで成る。第四の方法は、第二の方法の段階、ならびに、段階（ｂ）で形成されたオキシム結合を還元するさらなる段階を含んで成る。
本発明は、有効量の本第一もしくは第二組成物および製薬学的に許容できる担体を含む製薬学的組成物も提供する。
最後に、本発明は、本組成物の製造での使用のためのキットを提供する。第一の本組成物を製造するための第一のキットは以下を含んで成る。すなわち
（ａ）グリオキシレートイオンもしくはその誘導体；
（ｂ）遷移金属イオン；
（ｃ）ルイス塩基；および
（ｄ）約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、かつ、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してヒドラゾン結合を形成し、それによりポリマーをポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合させる、それに共有結合された部分を有する水溶性ポリマー。
第二の本組成物の製造での使用のための第二のキットは以下を含んで成る。すなわち
（ａ）グリオキシレートイオンもしくはその誘導体；
（ｂ）遷移金属イオン；
（ｃ）ルイス塩基；および
（ｄ）約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、かつ、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してオキシム結合を形成し、それによりポリマーをポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合させる、それに共有結合された部分を有する水溶性ポリマー。
図面の簡単な記述
図１はＮ末端が修飾されたＥＰＯを製造するためのスキームを示す。これは２段階反応、すなわちアミノ基転移反応およびペギル化である。ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）、ヒドラジド（ＨＺ）、セミカルバジド（ＳＣＺ）およびオキシルアミン官能基をもつ４種のｍＰＥＧ５０００（すなわち5000ダルトンの分子量を有するｍＰＥＧ）を使用した。
図２は、ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷXLカラム（7.5×30mm）での、ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）部分、天然のＥＰＯおよびｍＰＥＧ５０００ヒドラジンカルボキシレートを使用して形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯのゲル濾過クロマトグラムを示す。移動相は100mM塩化ナトリウムを含有する20mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ7.0）である。
図３は、ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）部分を使用して形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ５０００ヒドラジンカルボキシレート、天然のＥＰＯおよびｍＰＥＧ−ＥＰＯのマトリックス補助レーザーディソープション飛行時間質量スペクトル（matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectra）を示す。
図４は電気泳動法によるｍＰＥＧ−ＥＰＯの特徴づけを示す。すなわち（１）４〜15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシー染色；（２）ウェスタンブロット；（３）４〜15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ヨウ素染色；そして（４）等電点電気泳動（ＩＥＦ、ｐＨ３〜７）。レーン１、ＭＷもしくはｐＩマーカー；レーン２、天然のＥＰＯ；レーン３、アミノ基転移ＥＰＯ；そしてレーン４および５、それぞれヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）およびヒドラジド（ＨＺ）部分を使用して形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯ。
図５は、ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）およびヒドラジド（ＨＺ）部分を使用して形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯについてのＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフを示す。
図６は、天然のＥＰＯ、アミノ基転移ＥＰＯ、ならびにヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）およびヒドラジド（ＨＺ）部分を使用して形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯの細胞増殖アッセイの結果のグラフを示す。
図７は、ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）、ヒドラジド（ＨＺ）およびセミカルバジド（ＳＣＺ）部分を使用して形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯについての外低酸素症（exhypoxic）マウスバイオアッセイの結果のグラフを示す。
発明の詳細な記述
本発明は物質の２種の組成物を提供する。第一の物質の組成物は、本質的に、ポリペプチド、および、ヒドラゾン結合もしくは還元ヒドラゾン結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子でそれに共有結合された水溶性ポリマーから成るが、ただし、（ａ）ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、（ｂ）ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されず、そして（ｃ）ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基はセリンもしくはトレオニンでない。
第二の物質の組成物は、本質的に、ポリペプチド、および、オキシム結合もしくは還元オキシム結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子でそれに共有結合された水溶性ポリマーから成るが、ただし、（ａ）ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、そして（ｂ）ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されない。
本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」はペプチドおよびタンパク質の双方を包含する。「ペプチド」は長さが10アミノ酸残基より少ないポリペプチドを意味し、また、「タンパク質」は長さが10もしくはそれ以上のアミノ酸残基のポリペプチドを意味する。本発明において、ポリペプチドは、天然に存在するかもしくは組換え（すなわち組換えＤＮＡ技術を介して産生される）であってよく、また、突然変異（例えば、点、挿入および欠失突然変異）ならびに他の共有結合性修飾（例えば、グリコシル化および標識［ビオチン、ストレプトアビジン、フルオラシン、およびＩ131のような放射性同位体を介する］）を含有してよい。さらに、それぞれの本組成物は単一以上のポリペプチドを含有してよい。すなわちそれぞれは単量体（ポリマーに結合された１個のポリペプチド）または多量体（ポリマーもしくは相互に結合された２個もしくはそれ以上のポリペプチド）であってよい。
ポリペプチドは、例として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン、リンホカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＰＤＧＦおよびＥＧＦのような成長因子、ｈＧＨ、ＥＰＯのようなペプチドホルモンおよびそれらの誘導体、第VIII因子のような血液凝固因子、免疫原、酵素、酵素阻害剤、ならびに他のリガンドを包含する。本組成物の好ましい態様において、ポリペプチドはＥＰＯもしくはその誘導体である。ＥＰＯは天然に存在するかもしくは組換えであってよい。ＥＰＯの誘導体は、ポリペプチド
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ならびに下の表１に列挙される突然変異体、
を包含するがしかしこれらに制限されない。
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本明細書で使用されるところのポリペプチドの「本来の機能」は、そのＮ末端のα−アミノ基の共有結合性修飾に先立つその機能を意味する。本来の機能は、例えば、酵素活性、レセプター結合（例えば抗体）、リガンド結合および免疫原性を包含する。
下に、より完全に記述される本方法は、共有結合的に修飾されているポリペプチドのＮ末端のα−アミノ基の喪失を引き起こす。従って、ポリペプチドは、その本来の機能が共有結合性修飾の後に保存されかつ消去され得ないような一次構造を有しなければならない。ポリペプチドの本来の機能は、そのＮ末端のα−アミノ基の除去がその本来の機能を遂行するポリペプチドの能力を99％以上低下させる場合に、こうした除去により「消去」される。一態様において、この除去はその本来の機能を遂行するポリペプチドの能力を90％以上低下させない。好ましい態様において、この除去は、その本来の機能を遂行するポリペプチドの能力を50％以上低下させない。
本明細書で使用されるところの「ヒドラゾン結合」は共有結合構造ＮＨ−Ｎ＝Ｃを含む結合であり、「オキシム結合」は共有結合構造Ｏ−Ｎ＝Ｃを含む結合であり、「還元ヒドラゾン結合」は共有結合構造ＮＨ−ＮＨ−Ｃを含む結合であり、そして「還元オキシム結合」は共有結合構造Ｏ−ＮＨ−Ｃを含む結合である。還元ヒドラゾンおよびオキシム結合を含有する化合物が本明細書で提供される。なぜなら、これらの結合はより大きな化学的安定性を保有するからである。
上に論考されたように、Ｎ末端アミノ酸残基がセリンもしくはトレオニンである限りは、ヒドラゾン結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に水溶性ポリマーを結合する方法が当該技術分野で既知である。これらの既知の方法はいずれかの他のＮ末端残基を有するポリペプチドで作用することができない。これらの既知の方法は本方法と基礎的に異なるとは言え、それらはヒドラゾン結合を介してＮ末端のα−炭素原子に結合されたポリマーを有するＮ末端がセリンおよびトレオニンのポリペプチドをもたらす。この理由から、本第一組成物は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基がセリンもしくはトレオニンである、ヒドラゾン結合を介してポリマーに結合されるポリペプチドを包含しない。
本発明で使用される水溶性ポリマーは、（ａ）デキストランならびにデキストラン硫酸、架橋デキストリンおよびカルボキシメチルデキストリンを包含するデキストラン誘導体；（ｂ）セルロースならびにメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを包含するセルロース誘導体；（ｃ）デンプンおよびデキストリン、ならびにそれらの誘導体；（ｄ）ＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールのプロピレングリコールとのコポリマーを包含するポリアルキレングリコールおよびその誘導体であって、前記ホモポリマーおよびコポリマーは一端でアルキル基で置換されないもしくは置換され；（ｅ）ヘパリンおよびヘパリンの断片；（ｆ）ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル；（ｇ）ポリビニルピロリドン；（ｈ）ａ，ｂ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（aspartamide）；ならびに（ｉ）ポリオキシエチル化多価アルコールを包含するがしかしこれらに制限されない。これらのポリマーは広範な分子量をもつ直鎖状、分枝状もしくは星形であり得る。好ましい態様において、ポリマーはｍＰＥＧである。
本組成物が薬剤として使用されるべきである場合、ポリマーは非毒性である。さらに、ポリマーが所定の分子量を有すると言われる場合、その分子量はただ近似にすぎないことができ、各分子中に存在するサブユニットの数に関して相互に関して異なるポリマー分子の集団の平均分子量を反映する。
一態様において、ＰＥＧもしくはその誘導体は約700から約20,000ダルトンまでの分子量を有する。好ましい態様において、ＰＥＧもしくはその誘導体は約5,000ダルトンの分子量を有する。また、本組成物の好ましい態様において、ポリペプチドはＥＰＯであり、また、ポリマーは約5,000ダルトンの分子量を有するｍＰＥＧである。
本発明はまた、ポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に水溶性ポリマーを共有結合する４種の方法も提供する。ポリマーをヒドラゾン結合を介して炭素原子に結合する第一の方法は、
（ａ）ポリペプチドを、Ｎ末端のα−カルボニル基を有するアミノ基転移ポリペプチドを形成するように、（ｉ）約0.1Mから約2.0Mまでの濃度のグリオキシレートイオンもしくはその誘導体、（ii）約10μMから約１Mまでの濃度の遷移金属イオン、および（iii）約10mMから約10Mまでの濃度のルイス塩基と、約3.0から約8.0までのｐＨおよび約０℃から約100℃までの温度で接触させること；そして
（ｂ）アミノ基転移ポリペプチドを、約1.0から約7.5までのｐＨで、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してヒドラゾン結合を形成するそれに共有結合された部分を有する水溶性ポリマーと接触させ、それによりポリマーをヒドラゾン結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合させること、ただし、ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、また、ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されないものである、
の段階を含んで成る。
ポリマーをオキシム結合を介して炭素原子に結合する第二の方法は、
（ａ）ポリペプチドを、Ｎ末端のα−カルボニル基を有するアミノ基転移ポリペプチドを形成するように、（ｉ）約0.1Mから約2.0Mまでの濃度のグリオキシレートイオンもしくはその誘導体、（ii）約10μMから約１Mまでの濃度の遷移金属イオン、および（iii）約10mMから約10Mまでの濃度のルイス塩基と、約3.0から約8.0までのｐＨおよび約０℃から約100℃までの温度で接触させること；そして
（ｂ）アミノ基転移ポリペプチドを、約1.0から約7.5までのｐＨで、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してオキシム結合を形成するそれに共有結合された部分を有する水溶性ポリマーと接触させ、それによりポリマーをオキシム結合を介してポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合させること、ただし、ポリマーは約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、また、ポリペプチドの本来の機能はそのＮ末端のα−アミノ基の除去により消去されないものである、
の段階を含んで成る。
第三の方法は、第一の方法の段階、ならびに、段階（ｂ）で形成されたヒドラゾン結合を還元するさらなる段階を含んで成る。第四の付加的な方法は、第二の方法の段階、ならびに、段階（ｂ）で形成されたオキシム結合を還元するさらなる段階を含んで成る。還元段階は、例えば、既知の方法に従って、ホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ4）およびシアノホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）を使用することにより実施され得る。
グリオキシレートイオン誘導体はグリオキシルアミドおよびフェニルグリオキシルイオンを包含するがしかしこれらに制限されない。遷移金属イオンは、銅、ニッケル、コバルトもしくは亜鉛イオンを包含するがしかしこれらに制限されない。ルイス塩基はアセテートおよびピリジンを包含するがしかしこれらに制限されない。
アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してヒドラゾン結合を形成する部分は、ヒドラジンカルボキシレート、ヒドラジン、セミカルバジド、ヒドラジド、チオセミカルバジド、炭酸ジヒドラジド、カルバジド、チオカルバジドおよびアリールヒドラジドを包含するがしかしこれらに制限されない。それに共有結合されたこれらの部分をもつ水溶性ポリマーは商業的に入手可能である。加えて、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してオキシム結合を形成する部分は、オキシルアミンを包含するがしかしこれに制限されない。それに共有結合されたオキシルアミン（ならびに他のオキシム形成性部分）をもつ水溶性ポリマーは商業的に入手可能である。
本方法の好ましい態様では、段階（ａ）のｐＨは約5.0から約7.0までであり、段階（ｂ）のｐＨは約3.0から約5.0であり、そしてタンパク質はＥＰＯもしくはその誘導体である。
本方法の一態様では、ポリマーはＰＥＧもしくはその誘導体である。さらなる一態様では、ＰＥＧもしくはその誘導体は約700から約20,000ダルトンまでの分子量を有する。好ましい態様では、ＰＥＧもしくは組成物の誘導体は約5,000ダルトンの分子量を有する。
第一の方法の一態様において、アミノ基転移ポリペプチドと反応されるポリマーに結合された部分はヒドラジンカルボキシレートである。好ましい態様において、ポリペプチドはＥＰＯであり、ポリマーは約5,000ダルトンの分子量を有するｍＰＥＧであり、そしてポリマーに共有結合された部分はヒドラジンカルボキシレートである。
第二の方法の一態様において、アミノ基転移ポリペプチドと反応されるポリマーに結合される部分はオキシルアミンである。
本方法のそれぞれにおいて、段階（ａ）の好ましい接触時間は20分から２時間までであり、そして段階（ｂ）については、好ましい接触時間および温度はそれぞれ10から50時間までおよび４℃から室温までである。
あるポリペプチドでは、ポリペプチドがその本来のコンホメーションにある場合に、ポリペプチドのＮ末端が「埋められる」、すなわちその中の溶媒もしくは試薬に露出されない。テトラメチル尿素もしくは尿素のような試薬が、そのＮ末端残基が本方法の必要とされる反応を受けることを可能にするために、こうしたポリペプチドを変性させる（unfold）のに使用されてよい。
本発明は、有効量の本第一もしくは第二組成物および製薬学的に許容できる担体を含む製薬学的組成物もまた提供する。例として、本製薬学的組成物は、貧血症に罹っている対象を治療するのに有効な量の本ｍＰＥＧ−ＥＰＯを含んでよい。
製薬学的に許容できる担体は当業者に公知であり、かつ、0.01〜0.1Mおよび好ましくは0.05Mリン酸緩衝液もしくは0.8％生理的食塩水を包含するがしかしこれらに制限されない。加えて、こうした製薬学的に許容できる担体は、水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液であってよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびエチルオレエートのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、生理的食塩水および緩衝媒体を包含する、水、アルコール／水溶液、乳濁液もしくは懸濁液を包含する。非経口ベヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖（ringer’s dextrose）、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルもしくは固定油を包含する。静脈内ベヒクルは、液体および栄養素補充液（replenishers）、リンゲルブドウ糖を基礎とするもののような電解質補充液などを包含する。保存剤、および例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどのような他の添加物もまた存在してよい。
最後に、本発明は、本組成物の製造での使用のためのキットを提供する。第一の本組成物を製造するための第一のキットは以下を含んで成る。すなわち
（ａ）グリオキシレートイオンもしくはその誘導体；
（ｂ）遷移金属イオン；
（ｃ）ルイス塩基；および
（ｄ）約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、かつ、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してヒドラゾン結合を形成し、それによりポリマーをポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合する、それに共有結合された部分を有する水溶性ポリマー。
第二の本組成物の製造での使用のための第二のキットは以下を含んで成る。すなわち
（ａ）グリオキシレートイオンもしくはその誘導体；
（ｂ）遷移金属イオン；
（ｃ）ルイス塩基；および
（ｄ）約200から約200,000ダルトンまでの分子量を有し、かつ、アミノ基転移ポリペプチドのＮ末端のα−カルボニル基と反応してオキシム結合を形成し、それによりポリマーをポリペプチドのＮ末端のα−炭素原子に共有結合する、それに共有結合された部分を有する水溶性ポリマー。
これらのキット中の試薬は予め決められた量で包装されてよく、また、別個の区画に含有されてよい。あるいは、ある試薬は、本方法の束縛が許す際に同一の区画に含有されてよい。最後に、当該キットは、本方法に従って還元ヒドラゾンおよびオキシム結合を生じさせるための還元試薬、ならびに適する緩衝液および反応容器をさらに含んでよい。
本発明は、後に続く実験実施例の参照により、より良好に理解されることができるが、しかし、当業者は、詳述される特定の実験はその後に続く請求の範囲でより完全に記述されるように本発明を単に具体的に説明するにすぎないことを容易に認識することができる。
実験実施例
１．アミノ基転移ＥＰＯの製造
20mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ6.9）および100mM塩化ナトリウム中の５mgのＥＰＯを、セントリコン（Centricon）−１０（アミコン（Amicon）、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して100mM酢酸ナトリウム（ｐＨ7.0）緩衝液に交換した。最終濃度を、１mg/mlＥＰＯ、２M酢酸ナトリウム、0.4M酢酸、0.1Mグリオキシル酸、および10mM硫酸銅（ｐＨ5.5）に調節した（図１）。反応を室温で２時間許し、そして100mlの0.5MＥＤＴＡを添加することにより停止した。アミノ基転移ＥＰＯを、100mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.5）緩衝液を使用するセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を介して精製した。
アミノ基転移の程度を、文献（フィールズ（Fields, R.）ら、Biochem. J.、1971、121、587）に記述されたように２，４−ジニトロフェニルヒドラジンにより推定した。370nmでの消光を、最初の数分後および１時間後に測定した。吸光度の差異はＥＰＯ分子に存在するカルボニル基の量に比例する。アミノ基転移ＥＰＯもまた、プレカラムＰＩＴＣの化学を使用して、ＡＢＩ  ４２０Ｈシステム（アプライド  バイオシステムズ（Applied Biosystems）、カリフォルニア州フォスターシティ）でのアミノ酸分析にかけた。結果は、リシン残基すなわち非Ｎ末端残基がアミノ基転移されなかったことを示す。
２．ｍＰＥＧ−ヒドラジンカルボキシレートを用いるｍＰＥＧ−ＥＰＯの製造
100mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.5）中のアミノ基転移ＥＰＯ（１mm）を、0.5M塩化ナトリウムに１mlの最終体積に調節し、これに10mgのｍＰＥＧ５０００ヒドラジンカルボキシレート（シアウォーター  ポリマーズ（Shearwater Polymers）、アラバマ州ハンツビル）を添加した。反応混合物を室温で40時間攪拌し、そして100mM塩化ナトリウムを含有する20mMクエン酸ナトリウム（7.0）緩衝液を使用するセファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００カラム（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を介して精製した。加えて、0.1％ＳＤＳを反応混合物に添加して複合の収量（conjugation yield）を増加させてよい。
ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて、ｍＰＥＧ−ＥＰＯ複合体は、ＥＰＯおよびｍＰＥＧ５０００ヒドラジンカルボキシレートのものに比較して本質的に増大した分子量を示した（図２）。
マトリックス補助レーザーディソープション質量分析法（フィニガン（Finnigan）−ＭＡＴ  レーザーマット（LaserMAT）２０００、直線飛行時間）を使用して、分子量測定によりｍＰＥＧ−ＥＰＯを特徴づけした（図３）。ｍＰＥＧ５０００ヒドラジンカルボキシレートはｍ／ｚ  5157.4にイオンを示す。ＥＰＯは、２電荷（two-charge）単量体（ｍ／ｚ  14604）、１電荷単量体（ｍ／ｚ  28569）、二量体（m／ｚ  57208）および三量体（ｍ／ｚ  85284）を示す。同様に、ｍＰＥＧ−ＥＰＯは、２電荷単量体（ｍ／ｚ  17092）、１電荷単量体（ｍ／ｚ  34279）、二量体（ｍ／ｚ  69071）および三量体（ｍ／ｚ  102955）を示す。
ｍＰＥＧ−ＥＰＯの円二色性（ＣＤ）スペクトル（ジョバン・イヴォン（Jobin-YVON）ＣＤ６、ダイクログラフ  スペクトロメーター  インストゥルメンツ（Dichrograph Spectrometer Instruments）、ＳＡ、ニュージャージー州エディソン）は、当該タンパク質が天然のＥＰＯに存在するα−ヘリックス束構造を保持したことを示した（データは示されない）。この結果は、ＥＰＯのＮ末端のＰＥＧ分子がその二次構造を崩壊しないことを意味する。
３．ｍＰＥＧ−ヒドラジド、ｍＰＥＧ−セミカルバジドおよびオキシルアミンを用いるｍＰＥＧ−ＥＰＯの製造
100mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.5）中のアミノ基転移ＥＰＯ（１mg）を、0.5M塩化ナトリウム、0.1％ＳＤＳに１mlの最終体積に調節し、そして、10〜20mgのｍＰＥＧ５０００ヒドラジド、セミカルバジドもしくはオキシルアミンを添加した。反応混合物を室温で40時間攪拌し、そして、100mM塩化ナトリウムを含有する20mMクエン酸ナトリウム（7.0）緩衝液を使用するセファクリル（Sephacryl）Ｓ−２００カラム（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を介して精製した。
ｍＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を、多様な方法すなわちクマシー染色（タンパク質に特異的）、ウェスタンブロット（ＥＰＯに特異的）およびヨウ素染色（ＰＥＧに特異的）を用いて、４〜15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（バイオラッド（Bio-Rad）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）により分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のより高分子量のｍＰＥＧ−ＥＰＯ複合体の移動距離は天然のＥＰＯのものより小さい。等電点電気泳動のパターンは、ＥＰＯの等電点（ｐＩ）が修飾に際して有意に変えられないことを示す。しかしながら、アミノ基転移ＥＰＯは天然のＥＰＯおよびｍＰＥＧ−ＥＰＯよりわずかにより酸性である。
ＥＰＯおよびｍＰＥＧ−ＥＰＯのバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して十分に分離されるため、この技術は複合反応の効率を監視するのに使用され得る。複合反応は、ｍＰＥＧ５０００−ヒドラジンカルボキシレートを使用する場合に95％以上完了された一方、当該反応は、ｍＰＥＧ５０００−ヒドラジド、ｍＰＥＧ５０００−セミカルバジドもしくはｍＰＥＧ５０００−オキシルアミンを使用する場合に約20％のみ完了されたことが観察された。かように、ヒドラジンカルボキシレート部分は、ヒドラジド、セミカルバジドもしくはオキシルアミン部分でそうであるよりカルボニル基に対しより反応性であるようである。
４．抗ＥＰＯ抗体とのｍＰＥＧ−ＥＰＯの反応性
ｍＰＥＧ−ＥＰＯの抗原性を、クアンティカイン［Quantikine］（商標）ＩＶＤ（商標）ＥＰＯ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  システムズ（R&D Systems）、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して研究した。このアッセイは、ＥＰＯに対するモノクローナル抗体で被覆されたマイクロタイタープレートから成る。ＥＰＯもしくはｍＰＥＧ−ＥＰＯは、被覆されたプレートと相互作用することを可能にされる。プレートを洗浄した後、抗ＥＰＯポリクローナル抗体およびワサビペルオキシダーゼの複合体を添加する。過剰の複合体を除去した後、色原体をウェルに添加し、そして酵素反応により酸化して青色の複合体を形成させる。この複合体の吸光度を450nmで測定する。
ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）およびヒドラジド（ＨＺ）から形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯについてのＥＬＩＳＡアッセイの結果が図５に提示される。このデータは、ＥＰＯのＮ末端に結合された１個のＰＥＧ分子でさえ、おそらく立体障害により、ＥＰＯへのモノクローナル抗体の結合の親和性を有意に低下させることを示す。
５．ｍＰＥＧ−ＥＰＯのインビトロ活性
ｍＰＥＧ−ＥＰＯのインビトロの生物学的活性を、マウス造血細胞系ＦＤＣ−Ｐ１／ＨＥＲ細胞を使用する細胞増殖アッセイにより評価した。当該細胞系はＥＰＯレセプターを発現し、また、成長に関してＥＰＯ依存性である。細胞をＥＰＯの非存在下に24時間成長させた後、ＥＰＯもしくはｍＰＥＧ−ＥＰＯを細胞に添加した。細胞を42時間インキュベーションし、そしてその後トリチウム化チミジンを細胞に添加した。６時間後、細胞の成長をチミジンの取込みにより測定した。
ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）およびヒドラジド（ＨＺ）から形成されたヒドラゾン結合をもつアミノ基転移ＥＰＯならびにｍＰＥＧ−ＥＰＯについての細胞増殖アッセイの結果が図６に提示される。アミノ基転移ＥＰＯは、そのＥＤ50により測定されるように、天然のＥＰＯに匹敵する完全な生物学的活性を示す。ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）およびヒドラジド（ＨＺ）から形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯサンプルは、それらのＥＤ50により測定されるように、それぞれ38.5％および25％の活性のみを保持する。このデータは、ＥＰＯのＮ末端に結合された１個のＰＥＧ分子が、おそらく立体障害によりそのレセプターに対するＥＰＯの親和性を有意に低下させることを示す。
６．ｍＰＥＧ−ＥＰＯのインビボ活性
ｍＰＥＧ−ＥＰＯのインビボ活性を、外低酸素症マウスバイオアッセイ（コアテス（Coates, P.M.）ら、Nature、1961、191、1065）により評価した。マウスの内因性赤血球形成は、減圧への曝露により生じられる赤血球増加症により抑制される。ＥＰＯもしくはｍＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を１単位／マウスのレベルで注入する。鉄−59を、ＥＰＯもしくはｍＰＥＧ−ＥＰＯ注入後48時間に投与した。新たな赤血球形成を示す鉄−59の取り込みを、ＥＰＯもしくはｍＰＥＧ−ＥＰＯの投与後48、72および96時間に測定した。
ヒドラジンカルボキシレート（ＨＺＣ）、ヒドラジド（ＨＺ）およびセミカルバジド（ＳＣＺ）を用いて形成されたヒドラゾン結合をもつｍＰＥＧ−ＥＰＯについての外低酸素症マウスのバイオアッセイの結果が図７に提示される。ｍＰＥＧ−ＥＰＯサンプルは、天然のＥＰＯに比較して、高インビボ活性ならびにより長い活性持続時間を示す。インビボの結果は、ｍＰＥＧ−ＥＰＯサンプルがインビボでのより長い循環時間および循環の間のＥＰＯの持続性の放出を有することを示す。
７．ｍＰＥＧ−フィブリン17−29二量体の製造
フィブリン17−29二量体は以下の構造を有する。
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２mgのフィブリン17−29二量体を、0.5mlの２M酢酸ナトリウム、0.4M酢酸、0.1Ｍグリオキシル酸および10mM硫酸銅（ｐＨ5.5）に溶解した。反応を室温で２時間進行させ、そして20mlの0.5MＥＤＴＡを添加することにより停止した。アミノ基転移フィブリン二量体を、100mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.5）緩衝液を使用するセファデックス（Sephadex）Ｇ−１０カラム（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を介して精製した。アミノ基転移フィブリン二量体は、アミノ酸分析において有意に減少されたＧｌｙを示し、Ｎ末端のＧｌｙのアミノ基転移を示した。
0.5mlの100mM酢酸ナトリウム（ｐＨ4.5）中の１mgのアミノ基転移フィブリン二量体を、10mgのｍＰＥＧ５０００ヒドラジンカルボキシレートに添加した。反応混合物を室温で24時間攪拌した。ｍＰＥＧ−フィブリン二量体を、ＨＥＭＡ  ＩＥＣ  ＢＩＯ  ＣＭカラム（オールテック（Alltech））を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。移動相Ａは20mM酢酸ナトリウム（ｐＨ5.5）であった。移動相Ｂは0.2MＭＯＰＳ、0.05Mリン酸二カリウムおよび0.25Mリン酸一カリウム（ｐＨ7.5）であった。濃度勾配はＡ100％５分間、その後25分でＢ０ないし100％であった。未修飾フィブリン二量体（18分）の前に出現する14.5分の新たなピークをさらなる分析のため収集した。レーザーディソープション質量スペクトルはｍ／ｚ  8070.9にイオンを示し、これは１個のＰＥＧ分子がフィブリン二量体（ｍ／ｚ  2986.8）に結合されたことを証明した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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