(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
Met-Pro-Tyr-Leu-Leu-Pro-Gly-Phe-Phe-Cys-Asp-Arg-Val-Ile-Arg-Glu-Arg-Asp-Arg-Arg-Asn-Gly-Glu-Gly-Thr-Val-Ser-Gln-Pro-Leu-Lys-Phe-Glu-Gly-Gln-Asp-Phe-Val-Val-Leu-Lys-Gln-Arg-Cys-Leu-Ala-Gln-Lys-Cys-Leu-Phe-Glu-Asp-Arg-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Thr-Gln-Ala-Leu-Gly-Ser-His-Glu-Leu-Ser-Gln-Lys-Ala-Lys-Met-Lys-Ala-Ile-Thr-Trp-Lys-Arg-Pro-Lys-Glu-Ile-Cys-Glu-Asn-Pro-Arg-Phe-Ile-Ile-Gly-Gly-Ala-Asn-Arg-Thr-Asp-Ile-Cys-Gln-Gly-Asp-Leu-Gly-Asp-Cys-Trp-Phe-Leu-Ala-Ala-Ile-Ala-Cys-Leu-Thr-Leu-Asn-Glu-Arg-Leu-Leu-Phe-Arg-Val-Ile-Pro-His-Asp-Gln-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Ala-Gly-Ile-Phe-His-Phe-Gln-Phe-Trp-Arg-Tyr-Gly-Asp-Trp-Val-Asp-Val-Val-Ile-Asp-Asp-Cys-Leu-Pro-Thr-Tyr-Asn-Asn-Gln-Leu-Val-Phe-Thr-Lys-Ser-Asn-His-Arg-Asn-Glu-Phe-Trp-Ser-Ala-Leu-Leu-Glu-Lys-Ala-Tyr-Ala-Lys-Leu-His-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ala-Leu-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Ala-Met-Glu-Asp-Phe-Thr-Gly-Gly-Val-Thr-Glu-Phe-Phe-Glu-Ile-Lys-Asp-Ala-Pro-Ser-Asp-Met-Tyr-Lys-Ile-Met-Arg-Lys-Ala-Ile-Glu-Arg-Gly-Ser-Leu-Met-Gly-Cys-Ser-Ile-Asp-Asp-Gly-Thr-Asn-Met-Thr-Tyr-Gly-Thr-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Asn-Met-Gly-Glu-Leu-Ile-Ala-Arg-Met-Val-Arg-Asn-Met-Asp-Asn-Ser-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-Asp-Leu-Asp-Pro-Arg-Ala-Ser-Asp-Asp-Arg-Pro-Ser-Arg-Thr-Ile-Val-Pro-Val-Gln-Tyr-Glu-Thr-Arg-Met-Ala-Cys-Gly-Leu-Val-Lys-Gly-His-Ala-Tyr-Ser-Val-Thr-Gly-Leu-Glu-Glu-Ala-Leu-Phe-Lys-Gly-Glu-Lys-Val-Lys-Leu-Val-Arg-Leu-Arg-Asn-Pro-Trp-Gly-Gln-Val-Glu-Trp-Asn-Gly-Ser-Trp-Ser-Asp-Gly-Trp-Lys-Asp-Trp-Ser-Phe-Val-Asp-Lys-Asp-Glu-Lys-Ala-Arg-Leu-Gln-His-Gln-Val-Thr-Glu-Asp-Gly-Glu-Phe-Trp-Met-Ser-Tyr-Asp-Asp-Phe-Val-Tyr-His-Phe-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Cys-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp-Ala-Leu-Glu-Ser-Asp-Lys-Leu-Gln-Thr-Trp-Thr-Val-Ser-Val-Asn-Glu-Gly-Arg-Trp-Val-Arg-Gly-Cys-Ser-Ala-Gly-Gly-Cys-Arg-Asn-Phe-Pro-Asp-Thr-Phe-Trp-Thr-Asn-Pro-Gln-Tyr-Arg-Leu-Lys-Leu-Leu-Glu-Glu-Asp-Asp-Asp-Pro-Asp-Asp-Ser-Glu-Val-Ile-Cys-Ser-Phe-Leu-Val-Ala-Leu-Met-Gln-Lys-Asn-Arg-Arg-Lys-Asp-Arg-Lys-Leu-Gly-Ala-Asn-Leu-Phe-Thr-Ile-Gly-Phe-Ala-Ile-Tyr-Glu-Val-Pro-Lys-Glu-Met-His-Gly-Asn-Lys-Gln-His-Leu-Gln-Lys-Asp-Phe-Phe-Leu-Tyr-Asn-Ala-Ser-Lys-Ala-Arg-Ser-Lys-Thr-Tyr-Ile-Asn-Met-Arg-Glu-Val-Ser-Gln-Arg-Phe-Arg-Leu-Pro-Pro-Ser-Glu-Tyr-Val-Ile-Val-Pro-Ser-Thr-Tyr-Glu-Pro-His-Gln-Glu-Gly-Glu-Phe-Ile-Leu-Arg-Val-Phe-Ser-Glu-Lys-Arg-Asn-Leu-Ser-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Thr-Ile-Ser-Val-Asp-Arg-Pro-Val-Pro-Arg-Pro-Gly-His-Thr-Asp-Gln-Glu-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Gln-Phe-Arg-Asn-Ile-Phe-Arg-Gln-Ile-Ala-Gly-Asp-Asp-Met-Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Glu-Leu-Lys-Asn-Val-Leu-Asn-Thr-Val-Val-Asn-Lys-His-Lys-Asp-Leu-Lys-Thr-Gln-Gly-Phe-Thr-Leu-Glu-Ser-Cys-Arg-Ser-Met-Ile-Ala-Leu-Met-Asp-Thr-Asp-GLy-Ser-Gly-Arg-Leu-Asn-Leu-Gln-Glu-Phe-His-His-Leu-Trp-Lys-Lys-Ile-Lys-Ala-Trp-Gln-Lys-Ile-Phe-Lys-His-Tyr-Asp-Thr-Asp-His-Ser-Gly-Thr-Ile-Asn-Ser-Tyr-Glu-Met-Arg-Asn-Ala-Val-Asn-Asp-Ala-Gly-Phe-His-Leu-Asn-Ser-Gln-Leu-Tyr-Asp-Ile-Ile-Thr-Met-Arg-Tyr-Ala-Asp-Lys-His-Met-Asn-Ile-Asp-Phe-Asp-Ser-Phe-Ile-Cys-Cys-Phe-Val-Arg-Leu-Glu-Gly-Met-Phe-Arg-Ala-Phe-His-Ala-Phe-Asp-Lys-Asp-Gly-Asp-Gly-Ile-Ile-Lys-Leu-Asn-Val-Leu-Glu-Trp-Leu-Gln-Leu-Thr-Met-Tyr-Ala
を含有してなるタンパク質。
【請求項２】
カルパインである請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
網膜由来である請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号：２で表されるＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３７である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２２である請求項６記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項６記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１記載のタンパク質を生成蓄積せしめることを特徴とする当該タンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、眼組織中の網膜から由来する新たに同定されたカルパインである、Ｒｔ８８タンパク質およびそれをコードするＤＮＡに関する。
背景技術
カルパインは、特に、動物細胞の細胞質内に存在し、カルシウムで活性化されるシステインプロテアーゼであり、いくつかの分子種が存在していることが知られている。構造解析のために、それらのｃＤＮＡがクローニングされ、現在、普遍的にいろいろな組織において発現するμ−およびｍ−カルパインと、組織特異的なカルパイン、例えば、骨格筋に特異的に発現するｐ９４などの存在が明らかにされている（生化学  第６５巻  第７号  ５３７−５５２頁（１９９３）；実験医学  Ｖｏｌ．１３  Ｎｏ．９  ３５−４２（１９９５））。
カルパインの生理機能は、詳細には判明していないが、細胞内のカルシウム受容体としての機能を有し、例えば、シグナル伝達や転写の制御、細胞の増殖、分化などに関与するものと考えられている。
最近、骨格筋に特異的に発現するカルパインｐ９４の変異遺伝子が、炎症や外傷といった先行する疾患なしに分化した細胞が自然退化もしくは萎縮に陥る疾患として知られるジストロフィーの一種である、筋ジストロフィーの原因遺伝子の１つであることが報告されている（Ｉｓａｂｅｌｌｅ  Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８１，２７−４０）。また、筋ジストロフィーにおいてｐ９４蛋白が減少していることが明らかにされている（Ｍｅｌｉｓｓａ  Ｊ．Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４６，１７３−１７８）。
一方、網膜の変性疾患は、ジストロフィーとそれ以外の変性に大別されることが多く、ジストロフィーは、遺伝性で、多くの場合、視力予後が不良で、臨床的にも重要である（堀田喜裕、「網膜変性の原因」：あたらしい眼科  １３（７）：９９３−１００１，１９９６）。とりわけ、網膜色素変性症は、現在、厚生省特定疾患治療研究事業の対象疾患に指定されている。
しかしながら、網膜変性疾患におけるジストロフィーと、カルパインとの関係についての研究は、これまで見当たらない。
発明の目的
本発明の主な目的は、眼組織中の網膜に組織特異的に発現しているカルパインを探求し、その遺伝子を単離し、タンパク質の構造を決定し、眼科領域における疾患の研究や、予防、治療、特に、網膜の変性疾患等の治療等に役立たせることである。
本発明のこの目的ならびに他の目的および効果を、添付の図面を参照して以下に明らかにする。
発明の概要
本発明者らは、カルパインが、筋ジストロフィーと関係していることに鑑み、眼組織に組織特異的に発現するカルパインを見出せば、網膜変性疾患におけるジストロフィーについての新しい研究に途をひらくことができ、また、このカルパインの、例えば、網膜症における、発現量や遺伝子の変異を検討することにより網膜症の原因解明を行うことができ、さらにそれを改善することにより治療法を確立することができると考え、鋭意研究を重ねた。
すなわち、本発明者らは、新規なカルパインを見出す目的で、骨格筋特異的カルパインｐ９４のＤＮＡからプライマーを設計し、ラット網膜組織の全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法と５’ＲＡＣＥを用いて新規カルパインをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を取得することに成功し、このｃＤＮＡの配列に基づいて該カルパインのアミノ酸配列を推定した。
当該ｃＤＮＡを宿主により発現させ、当該カルパインたるタンパク質を生産することが期待される。また、当該カルパインは動物細胞の分化、成長、増殖、生存維持および情報伝達などに関連する研究のための試薬として用いることが期待され、また疾病の解明ならびにそれを治療する医薬としても期待される。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであって、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、特に、網膜由来のカルパインたるタンパク質を提供するものである。
また、本発明は、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体も提供する。該ＤＮＡには、配列表の配列番号２で表される塩基配列およびそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有するものが包含される。
さらに、本発明は、本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を生成蓄積せしめることを特徴とする当該タンパク質の製造法も提供する。
さらにまた、本発明は、本発明のタンパク質に対する阻害剤、該タンパク質を翻訳するｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡもしくはセンスＤＮＡまたは該タンパク質を翻訳するｍＲＮＡを発現するゲノムＤＮＡに対するトリプレットＤＮＡを含有してなる網膜障害の予防・治療剤および該タンパク質を翻訳するｍＲＮＡを発現するゲノムＤＮＡを含む網膜診断剤も提供する。
発明の詳細な説明
本発明のタンパク質には、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する分子量約８８ｋＤａのタンパク質および当該タンパク質を分子内に含有するタンパク質、とりわけ、カルパインのプロテアーゼ活性を有するタンパク質が包含される。カルパインには、多くのアイソザイムが存在するが、いずれも基本骨格は同様で、４つの機能ドメインに分割でき（添付の図１１および図１２参照）、カルパインのプロテアーゼ活性は、システインプロテアーゼに相同性を有するプロテアーゼ領域であるドメインＩＩに由来する。
カルパインのプロテアーゼ活性は、基質タンパク質の分解能で示すことができる。基質としては、例えば、細胞骨格タンパク質（例、スペクトリン、ＭＡＰ−２、タウ因子、ニューロフィラメントＨ、ＭおよびＬ、α−アクチニン）、膜結合受容体タンパク質（例、ＥＧＦ受容体、ＡＭＰＡ受容体、カルシウムポンプ、アニオンチャネル、カルシウム放出チャネル、Ｌ−タイプ・カルシウムチャネル、Ｇ−タンパク質）、カルモジュリン結合タンパク質（カルシウムポンプ、カルシニューリン、ＣａＭ−依存性プロテインキナーゼＩＩ、ミオシン軽鎖キナーゼ、ニューロモジュリン、コネキシン、ＩＰ３キナーゼ）、酵素（例、プロテインキナーゼＣ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ｃＡＭＰ−依存性キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ）、筋原線維タンパク質（トロポニンＩ、トロポニンＴ、トロポミオシン、ミオシン）、転写因子（例、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−１、ＣＰ１ａおよびｂ、ｃ−Ｍｙｃ）などが挙げられる（Ｋｅｖｉｎ  Ｋ．ＷａｎｇおよびＰｏ−Ｗａｉ  Ｙｕｅｎ（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７，１１７−１５２）。基質タンパク質の分解能は、公知の方法で測定でき、例えば、基質としてＦＩＴＣカゼインを用い、それから分解される酸可溶性画分のＦＩＴＣカゼインのフラグメントの蛍光強度を測定することができる（Ｄａｖｉｄ，Ｌ．Ｌ．ａｎｄ  Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｔ．Ｒ．（１９８６）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．４２，２２７−２３８）。本明細書においては、カルパイン１単位を、１分間あたり１μｇのＦＩＴＣカゼインのフラグメントを放出させる酵素量と規定する。
本発明のカルパインは、そのｍＲＮＡの、各組織での発現状態から、網膜にのみ特異的に発現しているカルパインのファミリーの１つであると考えられる。
本発明のＤＮＡは、まず、例えば、ラットの組識から、全ＲＮＡ抽出用の市販のキットを使用し、キットのプロトコールに従って全ＲＮＡを抽出することにより得られる。
ついで、得られた全ＲＮＡについて、公知の骨格筋特異的カルパインｐ９４のｃＤＮＡの配列を基に設計した遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ）を用い、ＲＴ−ＰＣＲにより、３’端のクローニングを行なう。例えば、全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写反応を行い、各々、配列番号３〜６で表される配列のセンスおよびアンチセンスＧＳＰで、ｃＤＮＡを増幅する。このＰＣＲ産物を、例えば、市販のクローニングキットを使用してサブクローニングすることにより、３’端のクローニングを行ない、３’端の塩基配列を決定する。
一方、網膜からのものの５’端は、ＰＣＲで増幅されないので、５’ＲＡＣＥにより塩基配列を決定する。例えば、上記で抽出された全ＲＮＡについて、市販の５’ＲＡＣＥシステムを使用し、３’端の配列決定におけると同様な逆転写反応を行なって第一の鎖のｃＤＮＡを作製する。ただし、アンチセンスプライマーとしては、配列番号６で表される配列を有するＧＳＰを使用する。作製したｃＤＮＡを精製した後、ＴｄＴを付加し、このｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させる。センスプライマーはＰＣＲキットのプロトコールのものを、アンチセンスプライマーは配列番号７で表される配列を有するＧＳＰを用いる。このＰＣＲ産物を上記と同様にサブクローニングし、５’端の塩基配列を決定する。
なお、網膜からのものの５’端が骨格筋特異的カルパインｐ９４のｃＤＮＡ配列に基づくプライマーで増幅されないことは、５’側の配列がｐ９４のものと相違することを示している。
決定された３’端および５’端のそれぞれの塩基配列より、全塩基配列を決定する。配列番号２で表される塩基配列は、このようにして決定されたものである。配列番号２で表される配列は、骨格筋特翼的カルパインｐ９４と、エクソン１ならびにエクソン１５および１６において相違が認められる。
また、決定したｃＤＮＡの塩基配列のオープンリーディングフレームから推定される新規アミノ酸配列が、配列番号１で表されるものである。配列番号２で表される配列の第６７番目から第２３３７番目の塩基配列が、配列番号１のタンパク質をコードする。
本発明のＤＮＡには、上記した配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明のタンパク質をコードするＤＮＡも包含される。ここにストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーションが、配列間に、少なくとも９５％の同一性がある場合にのみ起こる条件を意味し、例えば、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、４２℃で一夜インキュベーションし、ついで約６５℃の０．１×ＳＳＣで洗浄する条件である。
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡの５’−Ｐ末端と、３’−ＯＨ末端をつなぎ合わせる酵素Ｔ４ＤＮＡライゲースを用い、挿入するＤＮＡとベクターとを結合させるライゲーション反応のような常法に従い、ベクターに組み込むことができる。タンパク発現ベクターとしては、例えば、ｐＱＥ（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＥＴ（ＮＯＶＡＧＥＮ）、ｐＴｒｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いることができる。
また、本発明は、本発明のＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体も提供する。形質転換は、塩化カルシウム法によるコンピテントセルを用いる方法またはエレクトロポレーション法などのような常法に従って行なうことができる。例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）や培養細胞などで、外来ＤＮＡ取り込み能力を持ったコンピテントセルなどが使用できる。また、宿主細胞として、真核生物および原核生物のいずれも用いることができる。例えば、動物細胞（ＣＯＳ細胞、線維芽細胞または上皮細胞、リンパ球、造血細胞、ＥＳ細胞など）、バキュロウイルス、酵母、イー・コリ、アフリカツメガエル卵母細胞、小麦胚、網状赤血球などを用いることができる。
かくして得られた形質転換体を、常法に従って培養することにより、本発明のタンパク質が得られる。本発明のタンパク質は、細胞質内で産生される。
本発明のタンパク質を分離精製するには、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液中で超音波などによって、菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離等により粗抽出液として得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤やトリトンなどの界面活性剤が含まれてもよい。培養液中にタンパク質等が分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞を分離し、上清を集める。このようにして得られた本発明のタンパク質を精製するには、例えば、塩析、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適切に組合わせて行うことができる。タンパク質が遊離体で得られた場合は、自体公知の方法に準じて適宜の塩（例、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属塩、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸付加塩、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸付加塩）に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、自体公知の方法に準じて遊離体に変換することができる。
本発明のタンパク質は、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここで、エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどの低級アルキル基、フェニル、ナフチルなどのアリール基、ベンジル、フェネチルなどのアラルキル基やピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。また、本発明のタンパク質には、Ｃ末端以外のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート基（−ＣＯＯ−）が上記のようにアミド化またはエステル化されているものも含まれる。さらに、本発明のタンパク質には、分子内アミノ酸の側鎖上の置換基、例えば、水酸基、チオール基、アミノ基、グアニジノ基などが適当な保護基、例えば、ホルミル基、アシル基などで保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した糖タンパク質なども包含される。
得られた本発明のタンパク質またはその塩の存在または活性は、特異抗体を用いたイムノブロット法、上記カルパインのプロテアーゼ活性等によって確認できる。
本発明のタンパク質またはそれらの塩に対する抗体は、本発明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れでもよい。本発明のタンパク質に対する抗体は自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。例えば、本発明のタンパク質あるいは配列番号１１のペプチド等の免疫抗原自体あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質等に対する抗体含有物を採取し、抗体を分離精製することにより製造できる。哺乳動物としては、ウサギ、モルモット、マウス、ラットなどが用いられる。抗原投与に際して、抗体産生能を高めるために、完全アジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常、２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。抗体は免疫された哺乳動物の血液から採取することができる。抗体価はドットブロット法、ＥＬＩＳＡ法等により測定できる。抗体の分離精製は免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
得られたタンパク質は、網膜特異的カルパインであり、カルパインの変異遺伝子が網膜症の原因である可能性が考えられることや、物理的障害により、この網膜特異的カルパインの遺伝子およびそのタンパク質が過剰発現したり、発現しなかった際に各種疾患が発症することも考えられることから、各種網膜症に関与している可能性が考えられる。
したがって、本発明のタンパク質は、各種網膜症の診断や、予防、治療に有用な薬剤として、また、そのような薬剤のスクリーニング等に使用できる。さらに、これらの疾患の研究等にも使用できる。
例えば、虚血および網膜血管新生などにより、本発明のタンパク質が異常亢進し、網膜疾患が発症することが考えられ、ＦＩＴＣカゼインを基質として用いるプロテアーゼ活性を測定することにより選択できる当該タンパク質の阻害剤は、これらの疾患の治療・予防剤として有用である。
また、虚血および網膜血管新生などにより、本発明のタンパク質を翻訳するｍＲＮＡの発現亢進が網膜疾患を発症することも考えられる。そこで、アンチセンスＤＮＡ、トリプレットＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを組み込んだレトロウイルス、カチオン性リポソームなどを硝子体や網膜下腔に注入することなどにより、これらの疾患を治療することができる。さらに、遺伝子導入した細胞を移植することによっても治療可能である。ここで、アンチセンスＤＮＡは、本発明のタンパク質のｍＲＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして、トリプレットＤＮＡは、当該タンパク質のｍＲＮＡを発現するゲノムＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして得られる。アンチセンスＲＮＡは、本発明のタンパク質のｍＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡとして得られる。
さらに、ロドプシン遺伝子の点突然変異による遺伝型網膜色素変性症が報告されており（梶原一人、あたらしい眼科  １２（２）：２３９−２５０，１９９５）、網膜由来のカルパインの変異遺伝子も、網膜変性症の原因と考えられる。このような疾患は、ベクターに組み込んだ本発明タンパク質を翻訳するｍＲＮＡに対するセンスＤＮＡを網膜下腔に注入または遺伝子導入した細胞を移植し、当該タンパク質を発現させることにより治療可能である。
さらにまた、患者の網膜または血液試料からゲノムＤＮＡを採取し、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＤＧＧＥ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、デファレンシャルディスプレイなどによって変異遺伝子を確認することにより、網膜疾患を診断することも可能である。
つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
実施例１
（１）各組織からの全ＲＮＡの抽出
１４日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラットの各組織（水晶体、網膜、脳、筋肉）を摘出し、全ＲＮＡ抽出キットＴＲＩｚｏｌＴＭ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のプロトコールに従い、全ＲＮＡを抽出した。
まず、組織１００ｍｇ当たり１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬を加えてホモジナイズした。ホモジナイズした後、室温で５分間インキュベートし、ＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍｌ当たりクロロホルム０．２ｍｌを加え、１５秒間軽く振盪した。振盪後、室温で５分間インキュベートし、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。遠心後、上清を新しいチューブに移し、そこにインプロパノールを０．５ｍｌ加え、軽く振盪した。さらに、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、ペレットが確認できたら７５％エタノールで１ないし２回洗浄し、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリーの水でペレットを溶解し、吸光度Ａ２６０／２８０にて濃度を測定した。
（２）３’端のクローニング
ラットの骨格筋特異的カルパインｐ９４のｃＤＮＡ配列（３１３８塩基）を基にＰＣＲ用のＧＳＰを設計し、その組み合わせを変えて４種類のＰＣＲ産物を得た。配列表の配列番号３、４、５および６に、用いたセンスおよびアンチセンス配列を示す。
上記（１）で抽出した網膜の全ＲＮＡについて、オリゴｄＴプライマーを用いて４２℃で、５０分、７０℃で、１５分、逆転写反応を行った。ついで、配列表の配列番号３および４のＧＳＰの組み合わせで、９４℃にて１分、５３℃にて１分および７２℃にて３分のサイクルを３０回、配列表の配列番号５および６のＧＳＰの組み合わせで、９４℃にて４５秒、５３℃にて４５秒および７２℃にて１分のサイクルを３５回、配列表の配列番号３および６のＧＳＰの組み合わせで、９４℃にて１分、５３℃にて１分および７２℃にて２分のサイクルを３０回、配列表の配列番号４および５のＧＳＰの組み合わせで、９４℃にて１分、５３℃にて１分および７２℃にて２分のサイクルを３０回繰り返し、ｃＤＮＡを増幅し、各々、２４９７塩基、５３８塩基、１２５７塩基および１７７８塩基のＰＣＲ産物を得た（図１、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４）。
図１中、ＮＳは、新規配列、ＩＳ１および２は、挿入塩基配列１および２を意味する。
図１、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４で示したプライマーの組み合わせでｃＤＮＡを増幅した後、Ｎｏ．１は１．０％、Ｎｏ．２は１．５％、Ｎｏ．３およびＮｏ．４は１．２％のアガロースゲルをそれぞれ用いて、ＴＡＥバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、７５ボルトで、約１時間泳動して得られた電気泳動図を図２および図３に示す。図２のＡは、Ｎｏ．１のＰＣＲ産物の電気泳動図であり、レーン１および６は、１ｋｂｐＤＮＡラダー、レーン２は、水晶体組織からのもの、レーン３は網膜組織からのもの、レーン４は、脳組織からのもの、レーン５は、筋肉からのものである。図２のＢは、Ｎｏ．２のＰＣＲ産物の電気泳動図であり、レーン１および６は、１００ｂＤＮＡラダー、レーン２は、水晶体組織からのもの、レーン３は網膜組織からのもの、レーン４は、脳組織からのもの、レーン５は、筋肉からのものである。図３のＡは、Ｎｏ．３のＰＣＲ産物の電気泳動図であり、レーン１は、水晶体組織からのもの、レーン２は、網膜組織からのもの、レーン３は、脳組織からのもの、レーン４は、筋肉からのもの、レーン５は、１ｋｂｐＤＮＡラダーのものである。図３のＢはＮｏ．４のＰＣＲ産物の電気泳動図であり、各レーンは、図３のＡと同じである。
これらの図から明らかなごとく、網膜では３’側は増幅されるが、５’側は増幅されなかった。したがって、５’側の配列がｐ９４とは異なっていることがわかった。
また、図４は、図１のＮｏ．４のプライマーの組み合わせで増幅したｃＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ（図４、Ａ）およびＥｃｏＲＩ（図４、Ｂ）で消化したときの、同様な電気泳動図であり、これらが切る部位は図１の上部に示してある。図４のＡにおいて、レーン１および８は、１ｋｂｐＤＮＡラダー、レーン２および３は、水晶体およびＫｐｎＩ消化水晶体、レーン４および５は、網膜およびＫｐｎＩ消化網膜、レーン６および７は、筋肉およびＫｐｎＩ消化筋肉を示す。図４のＢにおいて、レーン１および５は、１００ｂｐＤＮＡラダー、レーン２は、ＥｃｏＲＩ消化水晶体、レーン３は、ＥｃｏＲＩ消化網膜、レーン４は、ＥｃｏＲＩ消化筋肉を示す。この図からもわかるように、水晶体、網膜および筋組織からのＰＣＲ産物はそれぞれサイズが異なる。
図１のＮｏ．４のＧＳＰの組み合わせで増幅したｃＤＮＡをＴＡ  ＣｌｏｎｉｎｇＴＭＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の方法に従ってサブクローニングを行った。
すなわち、ＰＣＲ産物１μｌをＴ４ライゲースとともに１４℃で一晩ライゲーション反応を行い、コンピテントセルを用いて形質転換した。形質転換したイー・コリをアンピシリン入りのＬＢプレートにまき、一晩３７℃で培養した。ＬＢプレートにできたコロニーをＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（１リットル当り、セレクトペプトン  １４０  １１．８ｇ、酵母エキス２３．６ｇ、リン酸水素二カリウム９．４ｇ、リン酸二水素カリウム２．２ｇを含有、グリセロール４ｍｌ添加；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で一晩３７℃にて培養した。
一晩培養したイー・コリから、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。すなわち、イー・コリを含む培地を１２，０００×ｇで遠心分離し、イー・コリを回収し、これに２５０μｌの緩衝液Ｐ１および緩衝液Ｐ２を加えて軽く振盪した。５分間静置した後、３５０μｌの緩衝液Ｎ３を加えて１２，０００×ｇで１５分間遠心した。遠心後、上清をカラムに移し、１２，０００×ｇで３０秒間遠心した。さらに、ＰＢを０．５ｍｌ加えて洗い、０．７５ｍｌの緩衝液ＰＥを加え、１２，０００×ｇで３０秒間遠心した。カラムに付着したプラスミドＤＮＡをＤＮａｓｅフリーの水４５μｌに溶かし、回収した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化し、ポジティブクローンを選択し、塩基配列を決定した。
（３）５’端のクローニング
５’ＲＡＣＥにより５’端の配列を決定した。上記（１）で抽出した網膜の全ＲＮＡ４μｇを用いて５’ＲＡＣＥシステム・バージョン２．０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のプロトコールに従って行った。まず、上記（１）で抽出した網膜の全ＲＮＡ４μｇについて４２℃で５０分、７０℃で１５分の逆転写反応を行い、第１の鎖のｃＤＮＡを作製した。ただし、この時のアンチセンスプライマーは配列番号６で表される配列を有するＧＳＰを用いた。作製した第１鎖のｃＤＮＡを、ＧＬＡＳＳ  ＭＡＸで精製した後、ＴｄＴを付加し、このｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させた。この時、センスプライマーはキットのプロトコールのものを、アンチセンスプライマーは配列表の配列番号７で表される配列を有するＧＳＰを用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクルを３５回繰り返した。
このＰＣＲ産物を、上記（２）と同様に、サブクローニングした。
上記で得られた３’端および５’端のそれぞれの塩基配列より、全塩基配列を決定した。配列表の配列番号２に決定したｃＤＮＡの全塩基配列を示す。また、図５〜図１０に、該ｃＤＮＡ配列（Ｒｔ８８）と、ラット骨格筋特異的カルパインｐ９４のｃＤＮＡ配列（ｐ９４）との対比を示す。
本発明のＤＮＡ配列は、ラット骨格筋特異的カルパインｐ９４と比較すると、新規カルパインとは、エクソン１ならびにエクソン１５および１６において相違が認められた。すなわち、ｐ９４のＮＳ領域およびＩＳ２領域の一部において相違が認められた。また、ラットの各眼組織、脳および筋組織において、この配列に対応するｍＲＮＡの発現をみたところ、網膜にのみ特異的に発現していた。これらのことから、本発明により得られたｃＤＮＡが網膜にのみ特異的に発現しているカルパインのファミリーの一つであると考えられる。
また、決定したｃＤＮＡの塩基配列から予想されるアミノ酸配列を決定し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を得た。また、図１１および図１２に、１文字表記による該アミノ酸配列（Ｒｔ８８）と、ｐ９４のアミノ酸配列との対比を示す。
実施例２
トランスファーベクターの構築
実施例１の（２）および（３）により得られた新規カルパインのｃＤＮＡ配列を基に、開始コドンおよび終止コドンをそれぞれ含むＰＣＲ用ＧＳＰを設計した。（１）で抽出した網膜の全ＲＮＡをオリゴｄＴプライマーを用いて４２℃で５０分、７０℃で１５分の条件下で逆転写反応を行った。つぎに、配列表の配列番号８および４で表されるＧＳＰを、各々、センスおよびアンチセンスプライマーとして使用して、９４℃で１分、５３℃で１分、７２℃で３分のサイクルを３５回繰り返し、ｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲ産物をＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の方法に従ってサブクローニングした。
すなわち、ＰＣＲ産物１μｌをＴ４ライゲースと共に１４℃で一晩ライゲーション反応を行うことによりＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１に挿入し、イー・コリＫ１２の形質転換を行い、形質転換体を得た。この形質転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２／Ｒｔ８８と命名し、１９９８年１月２６日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ  Ｈ）に、ブダペスト条約に従って、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３７の下に寄託してある。
実施例３
ノーザンブロット法
試験方法
ノーザンブロット解析は（１）組織からの全ＲＮＡの抽出、（２）全ＲＮＡの電気泳動とメンブレンへの転写、（３）プローブの作製、（４）プローブと転写されたＲＮＡのハイブリダイゼーションおよび（５）ハイブリダイズしたＲＮＡの検出からなる。
（１）組織からの全ＲＮＡの抽出
６週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラットの各組織から実施例１（１）に従い、全ＲＮＡを抽出した。具体的には、まず各組織の全ＲＮＡを採取し、ＴＲＩｚｏｌ試薬中でホモジナイズした。その後、ＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍｌに対して、０．２ｍｌのクロロホルムを加えよく懸濁し、室温で５分間放置した。放置後、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心して、全ＲＮＡ層とタンパク質層とＤＮＡ層とに分離した。ついで、全ＲＮＡを含む上層を回収し、ＴＲＩｚｏｌ試薬１ｍｌに対して０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを加え、懸濁した。室温で１０分間放置後、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心することにより全ＲＮＡを沈殿させた。沈殿させた全ＲＮＡを７５％エタノールで洗浄した後、エタノールを除去するため１０分間風乾し、最後にＲＮａｓｅを含まない水に溶解し、吸光度Ａ２６０／２８０にて濃度を測定した。
（２）全ＲＮＡの電気泳動とメンブレンへの転写
全ＲＮＡの電気泳動と転写はＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。具体的には、まず、９０ｍｌのＤＥＰＣ処理された水を沸騰させ、１ｇのアガロースを溶解した。５０〜６０℃に冷却した後、１０×ゲル変性用（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｅｌ）バッファーを１０ｍｌ加え攪拌後、泳動装置に流し込んだ。固化後、１×ＭＯＰＳゲルランニング用（ｇｅｌ  ｒｕｎｎｉｎｇ）バッファーにゲルを浸した。上記（１）の方法により抽出・精製した全ＲＮＡに対して、３倍量のホルムアルデヒド  ロード  ダイ（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｌｏａｄ  ｄｙｅ）を加え、さらに２００μｇ／ｍｌ濃度のエチジウムブロマイド溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１μｌを加えた。ついで、その溶液を６５℃で１５分間熱処理して、全ＲＮＡの二次構造を壊し、５０Ｖの定電圧で電気泳動を行った。泳動後、ＵＶトランスイルミネーターにより全ＲＮＡのバンドを確認し、ポラロイドカメラにより泳動写真を撮影した。ブロッティングはテフコ（ＴＥＦＣＯ）社のブロッティング装置を使用した。バッファーは０．５×ＴＢＥバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、２５Ｖの定電圧で２時間ブロッティングを行った。ブロッティング終了後、メンブレンを３０分間風乾し、その後、ＧＳ  ＧＥＮＥリンカーＵＶチャンバー（ＧＳ  ＧＥＮＥ  ｌｉｎｋｅｒ  ＵＶ  ＣＨＡＭＢＥＲ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により５０ｍｊのＵＶを照射し、メンブレンに全ＲＮＡを結合させた。
（３）プローブの作製
Ｒｔ８８ｍＲＮＡを検出するためのプローブを作製した。具体的な作製方法は、まず、最初にプローブ作製のためのＲｔ８８  ｃＤＮＡの部分配列をＰＣＲ法によって増幅させた。反応は１×ＰＣＲ用バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰの中に、鋳型のＤＮＡである全長Ｒｔ８８  ｃＤＮＡを１ｎｇ、０．２μＭのプライマー（センスプライマー：配列番号９およびアンチセンスプライマー：配列番号１０）および２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて行った。反応条件は９４℃にて４５秒、５８℃にて４５秒、７２℃にて１分のサイクルを３５回繰り返した。増幅した断片をＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従い、Ｔ７プロモーター配列を含むベクター（ｐＣＲ２．１）に組み込むライゲーション反応を行った。反応は１×ライゲーション用バッファー、５０ｎｇのｐＣＲ２．１、１０ｎｇ以上のＰＣＲ産物、４．０ワイス単位（Ｗｅｉｓｓ  ｕｎｉｔｓ）のＴ４  ＤＮＡライゲースで行い、１４℃で４時間以上行った。ついで、イー・コリへの形質転換を行った。具体的には、まず、５０μｌのワンショット  コンピテントセル（ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ）に２μｌの０．５Ｍ  β−メルカプトエタノールを加え、さらにライゲーション後の溶液１μｌを加え、氷中に３０分間放置した。その後、３０秒間４２℃で熱処理し、すぐに氷中に戻し、２分間放置した。ついで、２３０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間保温した。最後に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００μＭ  ＩＰＴＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだＬＢ寒天培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に保温した菌をまき、３７℃で１６時間保温してコロニーを形成させた。コロニーを採取して、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。培養後、イー・コリからのプラスミドの回収はＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で行った。まず、培養液３〜５ｍｌを遠心後、培養上清を捨て、残ったイー・コリのペレットを２５０μｌのバッファーＰ１で懸濁した。ついで、２５０μｌのバッファーＰ２を加えて混合し、さらに５分後バッファーＮ３を加え混合した。続いて、１０分間１３，０００×ｇで遠心し、上清をＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎにのせた。その後、カラムを１０，０００×ｇで３０秒間遠心し、カラムから溶液を取り除いた。ついで、５００μｌのバッファーＰＢをカラムに加え、遠心して溶液を取り除いた。さらに、７５０μｌのバッファーＰＥをカラムに加え、遠心して溶液を取り除いた。最後に、滅菌水を４５μｌ加え１分間放置し、その後、遠心して、溶出されたＤＮＡを回収した。また、組み込んだ配列の方向はＰＣＲ法により確認した。
大量に増やしたベクターは環状から線状にするために、プローブ配列下流で制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）により切断した。切断したＤＮＡはフェノール抽出によるタンパク質除去と、エタノール沈殿により精製した。
つぎに、Ｔ７プロモーターを用いて、プローブ配列の転写を行った。転写はＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行なった。具体的には、１μｇのプローブ配列を含むベクター、１×トランスクリプションバッファー、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０ＵのＴ７ポリメラーゼ、１０Ｕのリボヌクレアーゼインヒビター中で、３７℃、１時間反応させた。転写後、ＤＮＡを除去するために、２ＵのＤＮａｓｅＩを加え、３７℃で１５分間反応した。その後、転写物をエタノール沈殿し、反応物の濃縮と精製を行なった。
さらに、転写物にビオチンが結合したプソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）という標識物を結合させた。これはＢｒｉｇｈｔＳｔａｒＴＭＰｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行なった。プソラレンは核酸に対して親和性があり、３６０ｎｍの波長に照射されると、核酸に結合したまま安定状態を保つ物質である。そこで、転写したＲＮＡ５００ｎｇに対して、３６０ｎｍの波長を４５分間照射し結合させた。その後、蒸留水で飽和したｎ−ブタノールを加え、懸濁、遠心してｎ−ブタノールを除去することを２回繰り返すことにより余剰のプソラレンを取り除いた。
（４）プローブと転写されたＲＮＡのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションはＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。具体的には、あらかじめ６８℃で温めておいたプレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション溶液（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ／ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて、上記（２）で作製したメンブレンを３０分間以上プレハイブリダイズした。ついで、上記（３）で作製したプローブを０．１ｎＭになるように加え、６８℃で１６時間ハイブリダイズした。終了後、低ストリンジェンシー洗浄液（ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｗａｓｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）＃１を用いる１０分間の洗浄を２回行った。続いて、あらかじめ６８℃で温めておいた高ストリンジェンシー洗浄液（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｗａｓｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）＃２を用いる１５分間の洗浄を６８℃で２回行った。
（５）ハイブリダイズしたＲＮＡの検出
ハイブリダイズしたＲＮＡの検出はＢｒｉｇｈｔＳｔａｒＴＭＢｉｏＤｅｔｅｃｔＴＭＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いた。具体的には、まず、１×洗浄用バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いる５分の洗浄を２回行った。ついで、ブロッキング用バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で５分の洗浄を２回行い、さらに３０分間振とうした。その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含むブロッキング用バッファーで３０分間室温で振とうした。ＲＮＡプローブにはビオチン結合プソラレンが結合しているので、このビオチンとストレプトアビジンが吸着し、ＲＮＡプローブ特異的にストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートが結合する。続いて、ブロッキング用バッファーで１５分間、１×洗浄用バッファーで１５分間３回、１×分析用バッファー（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）で２分間２回の洗浄を行った。最後に、ＣＤＰ−Ｓｔａｒで５分間室温放置し、Ｂｉｏ  Ｍａｘカセット（Ｋｏｄａｋ）にＢｉｏ  Ｍａｘ  Ｌｉｇｈｔ  Ｆｉｌｍ（Ｋｏｄａｋ）と一緒に挟み、露光した。露光したフィルムは現像液に４分、蒸留水に１０秒、定着液に４分間浸し現像した。
各年齢のラット網膜を用いてＲｔ８８  ｍＲＮＡの発現を検討したところ、６週齢の網膜が最も発現量が多いと考えられたため、６週齢の各組織を用いてＲｔ８８  ｍＲＮＡの網膜特異的発現を、ノーザンブロット法により検討した。その結果、網膜および筋肉においてバンドが認められた（図１３）。筋肉にハイブリダイズしたバンドは、骨格筋特異的カルパインｐ９４であり、Ｒｔ８８でないことは別のプローブを用いて確認している。つまり、網膜においてこのプローブとハイブリダイスするバンドが検出されたことより、Ｒｔ８８は網膜特異的に発現していることが示された。
実施例４
ペプチドの合成
配列番号１１のペプチドにシステイン（Ｃｙｓ）を結合したペプチドを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いた固相法で合成し、白色粉末として得た。合成したペプチドの確認は、ＨＰＬＣ法、マススペクトル法（Ｋｏｍｐａｃｔ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩ；Ｋｒａｔｏｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）およびアミノ酸分析法（Ｓｙｓｔｅｍ６３００；Ｂｅｃｈｍａｎ）で行った。ＨＰＬＣ（カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８５μ（内径：４．８ｍｍ、長さ：２５ｃｍ；Ｖｙｄａｃ）、溶出条件：溶出液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）と溶出液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル）を用い、２０分間で溶出液Ｂ量が１０％から４０％となるように変化させるリニアグラジエント法、流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１５ｎｍ）：保持時間約１１分。
マススペクトル（Ｍ＋）：実測値２７４７．０、理論値２７４６．１。
アミノ酸分析実測値：Ａｒｇ，４．７７（５）；Ａｓｘ，１．９５（２）；Ｃｙｓ，０．３４（１）；Ｇｌｘ，３．９７（４）；Ｇｌｙ，２．００（２）；Ｉｌｅ，０．６０（１）；Ｌｅｕ，０．９５（１）；Ｌｙｓ，０．９９（１）；Ｐｈｅ，１．０１（１）；Ｐｒｏ，１．００（１）；Ｓｅｒ，０．８６（１）；Ｔｈｒ，０．８８（１）；Ｖａｌ，１．５７（１）。ここで、括弧内の値は理論値を示す。また、Ｃｙｓ、ＩｌｅおよびＶａｌの実測値は加水分解されたために、低い値となったと考えられる。
実施例５  ポリクローナル抗体の作製
実施例４で合成したペプチドをｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）でキャリアタンパク質であるヘモシアニン（ＫＬＨ）と共有結合させた。これを抗原とし、その０．５０ｍｇとフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）の混液を１０週齢の雄性ウサギ（ＫＢＬ：ＪＷ、体重２．１８ｋｇ）の背部皮下に投与した。初回感作１４日後、２８日後および４２日後にさらに感作した。初回感作２４日後および３８日後に採血した。上記抗原を１０μｇ／ｍｌの濃度でプレートに同相化し、ブロッキング後、感作ウサギの部分血を１０１〜１０８まで希釈して抗原と反応させた。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＰＯＤ標識二次抗体を反応させ、洗浄後、基質液ＡＢＴＳの発色でもって力価を測定した。ポリクローナル抗体の精製は、免疫されたウサギ血清から抗体精製用担体ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＩｇＧ画分を精製し、さらにペプチドカラムを用いて精製した。
実施例６
Ｒｔ８８組換えタンパク質の製造
コンピテントセルの作製
２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２ｍｌにイー・コリＭ１５（ＱＩＡＧＥＮ）を１０μｌ加え、３７℃で一晩振とう培養した。この一晩培養したイー・コリＭ１５溶液１２０μｌを２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地１２０ｍｌに加え、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００が０．４になるまで培養し、０．４を超えた時点でこのＭ１５を含む培養液を、凍結しておいたチューブに移し、氷中で１０分間静置した。その後４，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを回収した。このペレットを冷えた１５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２）に再懸濁させ、２時間以上氷中で静置した。さらに４，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離することによりＴｒｉｓ緩衝液を除去し、グリセロールを含むＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０％グリセロール）１ｍｌに懸濁し、これをチューブに５０μｌずつ分注して、使用するまで−８０℃で保存した。
形質転換体の作製（発現用ベクターの構築）
形質転換体の作製はＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｙｐｅ  ＡＴＧ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるｐＱＥ−７０ベクターおよびイー・コリＫ１２株をベースとしたＭ１５を用いて行った。Ｒｔ８８  ｃＤＮＡの５’末端にＳｐｈＩ、３’末端にＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付け、さらにＲｔ８８本来の終止コドンを削除するため、配列番号１２および１３に記載されたプライマーを作製した。ｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に構築されたＲｔ８８  ｃＤＮＡをテンプレートとし、配列番号１２および１３に記載されたプライマーを用いてＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃にて４５秒、６０℃にて４５秒、７２℃にて３分のサイクルを３５回繰り返した。このＰＣＲ産物を一旦ｐＣＲ２．１ベクターに構築し、形質転換させ、充分量のプラスミドを回収した。このイー・コリから抽出されたプラスミドをＳｐｈＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＢａｍＨＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で切断し、これを１％アガロースゲルで電気泳動することにより、切断されたＲｔ８８  ｃＤＮＡを分離し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１）によりＲｔ８８  ｃＤＮＡをゲルから抽出した。また、発現用ベクターであるｐＱＥ−７０（ＱＩＡＧＥＮ）ベクターも同様にＳｐｈＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＢａｍＨＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で切断した。
ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを持ったＲｔ８８  ｃＤＮＡの１５０ｎｇとＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＱＥ−７０の５０ｎｇをＴ４ライゲース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により１４℃で一晩ライゲーション反応させ、コンピテントセルＭ１５に形質転換した。この形質転換体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２／Ｍ１５／Ｒｔ８８と命名し、１９９９年１月１９日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に、ブダペスト条約に従って、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２２の下に寄託してある。
組換えタンパク質の発現誘導およびタンパク精製
２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地８ｍｌに、Ｒｔ８８  ｃＤＮＡを含むｐＱＥ−７０ベクターの形質転換体を接種し、３７℃で一晩培養した。２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地２００ｍｌに、一晩培養したイー・コリ７ｍｌを加え、ＯＤ６００が０．５から０．７になるまで培養し、ＯＤ６００が０．５から０．７になった時点で１ｍＭ濃度になるようにＩＰＴＧを加え、タンパク発現誘導を開始した。誘導開始後４時間で培養をストップし、遠心チューブに移した後、４，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を捨てペレットを回収した。このペレットをＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオエリトリトール）２ｍｌ中で超音波破砕した後、１０，０００×ｇ、１５分間、４℃で遠心分離することにより可溶性および不溶性タンパク質に分離した。Ｒｔ８８タンパク質は不溶性タンパク質中に存在していたため、この不溶性タンパク質を６Ｍの塩酸グアニジン溶液により一部可溶化し、透析用遠心チューブ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ；ミリポア）によりＨＣｌグアニジンを除去しながら、徐々に上記Ｔｒｉｓ緩衝液に置換した。発現タンパク質はＣ末端にヒスチジンタグを持っているため、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｙｐｅ  ＡＴＧ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。溶媒置換した溶液４ｍｌと５０％ＮｉＮＴＡ１ｍｌを４℃で６０分間振とう混和し、これをカラム（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｙｐｅ  ＡＴＧ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）上部から挿入した後下部のキャップをはずし、溶液を流出させた。洗浄用バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）４ｍｌで２回洗浄し、溶出用バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）０．５ｍｌで８回溶出した。この溶出したフラクションを実施例４で作製したＲｔ８８抗体（ポリクローナル抗体）およびＰｅｎｔａＨｉｓ抗体（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてイムノブロット法により目的タンパク質が精製できたかどうか確認した。その方法は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動には１０％ポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ）を用い、泳動用緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）中で１５０Ｖ定電圧、９０分の泳動を行った。泳動後、ゲル中に分離されたタンパク質をＴｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４，１９７９）の方法に従い、バッファータンク型転写装置を用いて氷冷した転写用緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）中、１００Ｖ定電圧にて７０分間イモビロン−Ｐメンブレン（ＰＶＤＦ；ミリポア）上に転写した。転写をおこなったメンブレンは２％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ塩化ナトリウム）中で３０分間ブロッキングをおこない、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で５分間、２回洗浄した後、実施例４で作製したＲｔ８８抗体中で一晩インキュベートすることにより、メンブレン上のタンパク質と反応させた。また、発現タンパク質はＣ末端にヒスチジンタグを持っていることを利用し、５×Ｈｉｓに反応するモノクローナル抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体；ＱＩＡＧＥＮ）も用いた。反応を終えたメンブレンをＴＴＢＳで５分間、２回洗浄した後、２次抗体として、Ｒｔ８８抗体に対してはアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、また、ＰｅｎｔａＨｉｓ抗体に対してはアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳに３，０００倍希釈した溶液中で１時間インキュベートした。反応終了後、ＴＴＢＳで５分間、２回洗浄し、ついで、ＴＢＳで５分間、２回メンブレンを洗浄した後、ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてメンブレン上に分離されたタンパク質中のＲｔ８８抗体と反応するタンパク質を検出した。さらに、挿入遺伝子を含まない、つまりＲｔ８８遺伝子を含まないベクターの形質転換体から、上記方法と同様に試験した。その結果、精製する前のタンパク質では、Ｒｔ８８遺伝子を含まないベクターの形質転換体からはＲｔ８８抗体によりバンドが検出されなかったが、Ｒｔ８８遺伝子を含むベクターの形質転換体からは、Ｒｔ８８抗体によって不溶性タンパク質中の約８８ｋＤａ付近にバンドが確認された（図１４）。このことから、Ｒｔ８８抗体で反応するタンパク質は、Ｒｔ８８由来のものであることが確認された。さらに、このＲｔ８８を含むタンパク質を金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製後、上記方法と同様にＲｔ８８タンパク質を抗体で検出したところ、Ｒｔ８８抗体によってシングルバンドが約８８ｋＤａ付近に確認された。その同じサイズのところにＰｅｎｔａＨｉｓ抗体によってもバンドが検出された（図１５）。したがって、Ｒｔ８８組換えタンパク質が発現精製できたことが確認された。
実施例７  ラット網膜からのＲｔ８８の分離精製
６週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットを屠殺したのち眼球を摘出し、氷冷した緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオエリトリトール、０．１ｍＭロイペプチン）中で網膜組織を採取した。氷中、網膜組織を上記緩衝液中で超音波破砕することによりホモジナイズし、遠心分離法（１３，０００×ｇ、１５分、４℃）により可溶性タンパク質を調製した。得られた溶液に含まれる可溶性タンパク質の濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて定量した。標準溶液として既知濃度の牛血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）溶液を用いた。定量した網膜可溶性タンパク質溶液を減圧乾燥した後、サンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８％グリセロール、１．６％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４％  ２−メルカプトエタノール、０．００２％ブロモフェノールブルー）に溶解し、１００℃で５分間熱処理した後、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０−６８５，１９７０）に従い、網膜可溶性タンパク質４０μｇに対し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。泳動には８％アクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ）を用い、泳動用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）中で１５０Ｖ定電圧、９０分の泳動を行った。泳動後、ゲル中に分離されたタンパク質を上記Ｔｏｗｂｉｎらの方法に従い、バッファータンク型転写装置を用いて氷冷した転写用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）中、１００Ｖ定電圧にて７０分間イモビロン−Ｐメンブレン（ＰＶＤＦ；ミリポア）上に転写した。転写をおこなったメンブレンは２％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ塩化ナトリウム）中で３０分間ブロッキングをおこない、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で５分間、２回洗浄した後、実施例４で作製したＲｔ８８に対する抗体中で一晩インキュベートすることによりメンブレン上のタンパク質と反応させた。反応を終えたメンブレンをＴＴＢＳで５分間、２回洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳに３，０００倍希釈した溶液中で１時間インキュベートした。反応終了後、ＴＴＢＳで５分間、２回洗浄し、ついでＴＢＳで５分間、２回メンブレンを洗浄した後、ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてメンブレン上に分離された網膜可溶性タンパク質中のＲｔ８８抗体と反応するタンパク質を検出した。その結果、分子量約９０ｋＤａのＲｔ８８と考えられるタンパク質が検出された。
得られた網膜可溶性タンパク質溶液をＨＰＬＣを用いた陰イオン交換樹脂ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー）により分画化した。分画化には２０ｍｇのタンパク質溶液を用い、上記緩衝液にて流速１ｍｌ／分で樹脂に吸着させた後、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を０ｍＭから５００ｍＭまで直線的に上昇させることで吸着したタンパク質を溶出、分離した。分離した全画分を用いてカルシウムによる活性化後のカゼイン分解活性をザイモグラフィー法を用いて検出した。各画分は１，０００μｌを１００μｌに濃縮し、その２０μｌをタンパク質溶液として非変性還元条件のサンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８％グリセロール、４％  ２−メルカプトエタノール、０．００２％ブロモフェノールブルー）に溶解して、０．１％カゼインを含む７％アクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ）を用いて氷中、１２５Ｖ定電圧、１５０分の電気泳動により分離した。泳動用緩衝液には、２５ｍＭＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン（ｐＨ８．３）を用いた。分離後のゲルをカルシウムを含む緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭジチオスレイトール）中で２０時間インキュベートすることにより、ゲル中のカルシウム依存性プロテアーゼを活性化させた。プロテアーゼ活性はインキュベートしたゲルを０．０５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（１０％酢酸、４０％メタノール）により染色し、カゼインを分解する活性として検出した。その結果、いくつかの画分においてカゼイン分解活性が検出された。さらに、カゼイン分解活性の得られたこれらの画分を上記方法にしたがってＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、メンブレンへの転写をおこない、実施例４で作製したＲｔ８８抗体との反応性を調べたところ、分子量約９０ｋＤａ付近でこの抗体と反応する画分が得られた。
実施例８  Ｒｔ８８遺伝子の導入
Ｒｔ８８遺伝子導入のためのベクター構築
ベクター構築は大きく分けて、（１）全ＲＮＡ抽出およびＤＮａｓｅ  Ｉ処理、（２）Ｒｔ８８  ｃＤＮＡを増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ、（３）プラスミドへの組み込みおよびイー・コリへの形質転換、（４）プラスミドの精製、（５）プラスミドからＲｔ８８の配列の切断とゲルからの切り出し、（６）ヒト２９３細胞で発現させるためのベクターｐＲｃ／ＣＭＶの切断と脱リン酸処理、（７）上記（５）で切り出した配列の上記（６）の脱リン酸化されたベクターへの組み込み、および（８）プラスミド精製および方向確認の８つの手順からなる。詳しい方法は以下の通りである。
（１）実施例１（１）の方法に従い、６週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラットを用いて全ＲＮＡ抽出およびＤＮａｓｅ  Ｉ処理を行った。
（２）ＤＮａｓｅ  Ｉ処理された全ＲＮＡをオリゴｄＴプライマーを用いて、４２℃で５０分、７０℃で１５分の条件下で逆転写反応を行った。ついで、配列番号８および４で表されるＧＳＰをそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用して、９４℃で１分、５３℃で１分、７２℃で３分のサイクルを３５回繰り返し、ｃＤＮＡを増幅した。
（３）実施例１（２）に従い、プラスミドへの組み込み及びイー・コリへの形質転換を行った。
（４）実施例１（２）に従い、プラスミドの精製を行った。
（５）Ｒｔ８８  ｃＤＮＡを含むｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）からＲｔ８８のｃＤＮＡのみを抽出するため、制限酵素ＢｓｔＸ  Ｉ（宝酒造）により切断した。１％アガロースゲルで電気泳動を行い、Ｒｔ８８ｃＤＮＡのバンドをゲルから切り出した。その後、ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭＶｅｒ．２（宝酒造）を用いて、ゲルからＲｔ８８ｃＤＮＡを回収した。さらに、エタノール沈殿を行い濃縮を行った。
（６）ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞で発現させるためのベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も制限酵素ＢｓｔＸ  Ｉ（宝酒造）により切断した。上記（５）同様、ゲルからベクターを回収した。ベクターはさらに脱リン酸処理を行った。具体的には、１×バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、ベクター２μｇと１２０Ｕのウシ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎ）由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を、３７℃で１５分、５０℃で１５分反応させた。反応終了後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い精製及び濃縮を行った。
（７）上記（６）で得られたベクターへのＲｔ８８の組み込みおよび形質転換は実施例１（２）に従った。
（８）得られた形質転換体からのプラスミドの精製は実施例１（２）に従った。プラスミドに組み込まれたＲｔ８８の向きの確認は制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ（宝酒造）により切断し、泳動することにより確かめた。
遺伝子導入
ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞を細胞培養用６ｃｍディシュに５０％となるように遺伝子導入２４時間前に継代した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２００μｌに溶解し、室温で４５分間静置し、これを溶液Ａとした。また、発現用ベクターＤＮＡ２μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  ２００μｌに溶解し、これを溶液Ｂとした。溶液Ａと溶液Ｂを混合し、室温で１５分間静置した。６ｃｍディシュの細胞を、血清を含まないダルベッコ改変ＭＥＭ培地で洗浄し、これに溶液Ａと溶液Ｂの混合液および１．６ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間培養した。培地を除き、４ｍｌの１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地を加えて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。１０ｃｍディシュに細胞を１：５となるように希釈後継代し、遺伝子導入された細胞のみが生存できるように、４００μｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地で培養した。形質転換細胞のみになるまで細胞の選択を続けた。その後、細胞培養用６ｃｍディシュに継代し、２００μｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８を含む１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地で培養した。細胞がコンフルエントになったところで、培地を除き、細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１ｍｌを加えて、室温で１０分間静置した。ホモジナイザーに移し、細胞をホモジナイズした。その後、１．５ｍｌチューブに移し、０．２ｍｌのクロロホルムを加えて混合し、室温で３分間静置した。４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心を行い水層を回収した。この水層に２−イソプロパノールを０．５ｍｌを加えて混合し、室温で１０分間静置し、４℃、１２，０００×ｇで１０分間遠心を行い沈殿を回収した。７５％エタノール１ｍｌを加えて沈殿を懸濁し、４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心を行い、沈殿を回収後、適量の水を加えて溶解した。この後、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）処理を行い、全ＲＮＡとした。この全ＲＮＡをオリゴｄＴプライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて４２℃で５０分、７０℃で１５分、逆転写反応を行った。ついで、配列番号４および８のＧＳＰを用いて、９４℃にて１分、５８℃にて１分、７２℃にて３分のサイクルを３５回繰り返し、ｃＤＮＡを増幅した。また、反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび０．２μＭのプライマーを含む５０μｌの反応液中で行った。ＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲルを用いてＴＡＥバッファー中（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、７５Ｖで約１時間泳動した。その結果、予想サイズのところに増幅されたｃＤＮＡバンドが確認された（図１６）。また、Ｒｔ８８遺伝子を含まない、つまり、ベクターのみを導入した２９３細胞では何も増幅されなかった。従って、Ｒｔ８８遺伝子を導入した２９３細胞中でＲｔ８８  ｍＲＮＡが発現されており、導入された細胞中で正常に転写されていることが証明された。
配列表フリーテキスト
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  ｉｓ  ｃＤＮＡ（６１−１２４０）／ｍＲＮＡ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  ｔｏ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０  ａｎｄ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  ｔｏ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２  ａｒｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ．
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、以下の実施例１のＲＴ−ＰＣＲにおける４種類のプライマーの組み合わせと増幅後のサイズを示した図である。
図２ＡおよびＢは、各々、図１、Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＰＣＲ産物の電気泳動図を示す図面代用写真である。
図３ＡおよびＢは、各々、図１、Ｎｏ．３およびＮｏ．４のＰＣＲ産物の電気泳動図を示す図面代用写真である。
図４ＡおよびＢは、図１、Ｎｏ．４のＰＣＲ産物の、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩでの消化後の電気泳動図を示す図面代用写真である。
図５は、実施例１で得られたｃＤＮＡ配列と、ｐ９４のｃＤＮＡ配列を比較する図面である。
図６は、実施例１で得られたｃＤＮＡ配列と、ｐ９４のｃＤＮＡ配列を比較する図面である（図５のつづき）。
図７は、実施例１で得られたｃＤＮＡ配列と、ｐ９４のｃＤＮＡ配列を比較する図面である（図６のつづき）。
図８は、実施例１で得られたｃＤＮＡ配列と、ｐ９４のｃＤＮＡ配列を比較する図面である（図７のつづき）。
図９は、実施例１で得られたｃＤＮＡ配列と、ｐ９４のｃＤＮＡ配列を比較する図面である（図８のつづき）。
図１０は、実施例１で得られたｃＤＮＡ配列と、ｐ９４のｃＤＮＡ配列を比較する図面である（図９のつづき）。
図１１は、配列番号２で表されるｃＤＮＡから推定したアミノ酸配列と、ｐ９４のアミノ酸配列を比較する図面である。
図１２は、配列番号２で表されるｃＤＮＡから推定したアミノ酸配列と、ｐ９４のアミノ酸配列を比較する図面である（図１１のつづき）。
図１３は、実施例３で得られたＲｔ８８  ｍＲＮＡのノーザンブロットを示す図面代用写真である。
図１４は、実施例５で得られたＲｔ８８抗体と反応したタンパク質の電気泳動図ある。
図１５は、実施例５で得られたＲｔ８８抗体およびＰｅｎｔａＨｉｓ抗体と反応したＲｔ８８の電気泳動図である。
図１６は、実施例７で得られたＰＣＲ産物の電気泳動図を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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