(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、生存し得る大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））と、前記大腸菌株の生存性を維持するための配合物とを含むプロバイオティック組成物であって、前記配合物は、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含み、前記揮発性画分は、大気圧より低い圧力の下および３８℃を越えない浴温度で前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって得られ、前記植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つは１０７細胞／ｍｌの前記大腸菌株の生存性を、室温において、少なくとも２ヶ月にわたって持続させるように選択される、プロバイオティック組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの矯味矯臭剤をさらに含む請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項３】
前記植物抽出物は、葉、茎、根および実からなる群から選択される植物器官から得られる請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項４】
前記植物抽出物は、野菜および香草からなる群から選択される植物から得られる請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項５】
前記野菜は、ダイズ、アルファルファ、ニンニク、ビートおよびキャベツからなる群から選択される請求項４のプロバイオティック組成物。
【請求項６】
前記香草は、パセリ、ミントおよびディルからなる群から選択される請求項４のプロバイオティック組成物。
【請求項７】
ミツバチ巣生成物をさらに含む請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項８】
前記ミツバチ巣生成物はプロポリスである請求項７のプロバイオティック組成物。
【請求項９】
前記組成物は胃腸感染症または胃腸異常を防止または治療する請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１０】
前記組成物は正常な胃腸微生物叢を維持または回復させる請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１１】
前記組成物は下痢を防止または治療する請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１２】
前記組成物は腸病原体によって引き起こされる胃腸の感染を防止または治療する請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１３】
前記病原体は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌である請求項１２のプロバイオティック組成物。
【請求項１４】
蒸留水と、ビート、ディルおよびパセリの揮発性画分を含む請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１５】
蒸留水と、ビート、ディルおよびグレープフルーツの揮発性画分を含む請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１６】
前記組成物は胃腸サルモネラ感染症を防止または治療する請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１７】
前記組成物は感染性下痢、慢性的な下痢、または抗生物質療法もしくは放射線療法もしくは化学療法から生じる下痢を防止または治療する請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１８】
前記組成物は感染症下痢を治療し、前記組成物は蒸留水と、ビート、ディルおよびパセリの揮発性画分を含む請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項１９】
前記感染症下痢は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、サルモネラ属細菌、特に、Ｓ．シゲラ属細菌、カンピロバクター属細菌、大腸菌、プロテウス属細菌、シュードモナス属細菌、もしくはクロストリジウム属細菌によって引き起こされる請求項１８のプロバイオティック組成物。
【請求項２０】
胃腸管の生理学的活性を正常化する請求項１のプロバイオティック組成物。
【請求項２１】
大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））を増殖させる方法であって、大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））のスターター培養物を増殖培地に接種して、６５０ｎｍにおける光学密度が１５〜３０になるまで前記大腸菌株を増殖させる工程を含む方法。
【請求項２２】
プロバイオティック組成物を製造する方法であって、生存し得る大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））を、１０７細胞／ｍｌの前記大腸菌株の生存性を、室温において、少なくとも２ヶ月にわたって維持するための配合物に懸濁する工程を含み、前記配合物は、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含み、前記植物抽出物は水抽出によって得られ、前記揮発性画分は、大気圧より低い圧力の下および３８℃を越えない浴温度で前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される方法。
【請求項２３】
前記植物抽出物は、葉、茎、根および実からなる群から選択される植物器官から得られる請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記植物抽出物は、野菜および香草からなる群から選択される植物から得られる請求項２２の方法。
【請求項２５】
前記野菜または香草は、ダイズ、パセリ、ミント、ディル、アルファルファ、ニンニク、ビートおよびキャベツからなる群から選択される請求項２４の方法。
【請求項２６】
ミツバチ巣生成物の添加をさらに含む請求項２２の方法。
【請求項２７】
前記ミツバチ巣生成物はプロポリスである請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記揮発性画分の少なくとも１つは、アルファルファ、ダイズ、ビート、ディルおよびミントから調製される請求項２２の方法。
【請求項２９】
生物のバイオ制御方法であって、大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））を風土病地域において散布する工程を含み、前記大腸菌株は、１０７細胞／ｍｌの前記大腸菌株の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在し、前記植物抽出物は水抽出によって得られ、前記揮発性画分は、大気圧より低い圧力の下および３８℃を越えない浴温度で前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される、方法。
【請求項３０】
油汚染を除去する方法であって、大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））を汚染地域において散布する工程を含み、前記大腸菌株は、１０７細胞／ｍｌの前記大腸菌株の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させる、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在し、前記植物抽出物は水抽出によって得られ、前記揮発性画分は、大気圧より低い圧力の下および３８℃を越えない浴温度で前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される、方法。
【請求項３１】
バイオフィルターにおける有機物ガス分解微生物集団を復活させる方法であって、大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））をフィルターに施す工程を含み、前記大腸菌株は、１０７細胞／ｍｌの前記大腸菌株の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させる、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在し、前記植物抽出物は水抽出によって得られ、前記揮発性画分は、大気圧より低い圧力の下および３８℃を越えない浴温度で前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される、方法。
【請求項３２】
生存し得る大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））が補充された食物製品。
【請求項３３】
乳汁から得られた少なくとも１つの物質を含む請求項３２の食物製品。
【請求項３４】
チーズおよびヨーグルトからなる群から選択される請求項３３の食物製品。
【請求項３５】
発酵プロセス用のスターター物を調製する方法であって、発酵ブロセスを誘導するのに十分な量の大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））を増殖させ、そして前記大腸菌株を、前記大腸菌株の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させる、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に懸濁する工程を含み、前記植物抽出物は水抽出によって得られ、前記揮発性画分は、大気圧より低い圧力の下および３８℃を越えない浴温度で前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、（ｉ）非病原性のプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物およびそのプロバイオティック／治療的使用、（ｉｉ）少なくとも１つの植物由来物の抽出物から調製される揮発性画分（ＶＦ）の水溶液を含む配合物およびその治療的使用、（ｉｉｉ）植物由来物からそのような配合物を製造する方法、（ｉｖ）本発明の非病原性プロバイオティック微生物および／または他のプロバイオティック微生物および本発明の配合物を含むプロバイオティック組成物、ならびにそのプロバイオティック／治療的使用、（ｖ）本発明の配合物および産業的有用性を有する微生物を含む産業的に応用される組成物、そして（ｖｉ）後者の組成物が使用される産業プロセスおよび装置に関する。
【０００２】
正常な状態では、胃腸（ＧＩ）管の微生物叢は個体の健康状態および安寧に大きく寄与している。微生物叢は複雑で多様な微生物集団であり、個体に対して有益な作用および有害な作用の両方を有し得ることはよく知られている。正常な状態では、子宮内の胎児は無菌であるが、出産時に膣を通過するとき、胎児は、消化管微生物叢の形成をもたらす微生物を獲得する。消化管内において安定化する最終的な固有の消化管微生物叢は、４００の異なるタイプの細菌からなる１０００以上の微生物の非常に複雑な集団である［Ｆｕｌｌｅｒ  Ｒ．Ｊ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、６６：３６５〜３７８（１９８９）］。消化管微生物叢の組成は宿主および微生物の要因によって決定される。ＧＩ管内において生存し、かつ増殖できる細菌が多数存在するが、ＧＩ管内において生存および増殖できない細菌も多い。さらに、生存する生物は、正常な場合には細菌を食物とともに流し去る蠕動作用を回避しなければならない。これは、細菌が消化管壁への結合によって自身を固定化することにより、および/あるいは蠕動による移動速度よりも早い速度で増殖することにより達成され得る。
【０００３】
一般に消化管微生物叢の存在は共生的である。何故なら、消化管微生物叢は未消化の食物を分解することを補助するからである。また、消化管微生物叢は病原体により引き起こされる感染症から個体を保護する。この後者の現象は、「細菌拮抗作用」、「細菌干渉」、「バリア効果」、「定着抵抗性」、「競合的排除」などのような名称で記載されている。
【０００４】
この消化管保護的な微生物叢は非常に安定である。しかし、これは、若年者、老齢者および抵抗力の落ちた患者ではあまり効果的ではない。さらに、ある種の食事因子および環境因子によって影響を受けることがある。その３つの最も重要な因子は、過度な衛生、抗生物質治療およびストレスである。
【０００５】
消化管微生物叢のバランスが有害な影響を受ける状態では、プロバイオティックは、消化管微生物叢を回復して、個体宿主を正常に戻し得ることにおいて潜在的に重要である。
【０００６】
プロバイオティックは、動物宿主およびヒト宿主に有益な影響を及ぼす生きた微生物として定義される微生物のクラスである。有益な作用には、腸管微生物叢の微生物バランスの改善、または固有微生物叢の性質の改善が含まれる。プロバイオティックの有益な作用は、数の減少を生じさせる特定の生物群に対する直接的な拮抗的作用によって、またはそれらの代謝に対する作用によって、または免疫性を刺激することによって媒介され得る。プロバイオティックは、抗菌性化合物を産生することによって、栄養物または接着部位について競合することによって、望ましくない生物の生存数を抑制し得る。さらに、プロバイオティックは、酵素活性を増減させることによって微生物の代謝を変化させることがあり、あるいは抗体レベルを増大させることによって、またはマクロファージの活性を増大させることによって免疫系を刺激し得る。
【０００７】
国際特許公開ＷＯ  ９５／１６４６１には、飼いならされた動物のサルモネラ属細菌定着を抑制または阻害することにおいて効果的な嫌気性細菌のプロバイオティック組成物が記載されている。このプロバイオティック組成物は、２９の実質的に生物学的に純粋な細菌（特に、大腸菌）の集団または培養物を含む。しかし、このＰＣＴ公報に記載されたプロバイオティック組成物による病原体の抑制には、非常に多くの細菌株の複合作用が必要である。
【０００８】
国際特許公開ＷＯ  ９７／３５５９６には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓを含有する粉末を液体と混合することによって得られるその都度新しく調製されるプロバイオティック混合物を投与することが記載されている。この混合物は、感染性下痢またはヒトにおける抗生物質治療により引き起こされる下痢を防止することにおいて効果的であると記載されている。しかし、凍結乾燥された生細菌は仮死状態にある。その活力を元に戻すために微生物を投与前に湿潤化しなければならない。このことは、通常の場合、多くの細菌は再水和に耐えられないので好ましいことではない。その上、生き残った生物は、直ちに代謝的に活性にならず、胃の極端な酸性条件を生き延びることができない。さらに、下痢を発現している投与体に投与する場合、細菌の活力が元に戻る率よりも消化管からの除去率が高いので有益効果はかなり少ない、あるいはまったくないという結果になる。
【０００９】
プロバイオティック生物のその配合物による生存性の保存および活性の保護は多数の刊行物の課題である。国際特許公開ＷＯ  ９８／２６７８７には、動物のＧＩ管における乳酸産生微生物（好ましくは、乳酸菌）の常在集団が、プレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）微生物および／またはプロバイオティック微生物と必要に応じて組み合わされたβ−グルカンを乳酸産生微生物に与えることによって増強されることが記載されている。
【００１０】
国際特許公開ＷＯ  ９７／３４５９１にはまた、１つまたは２つ以上のプロバイオティック微生物に対するキャリアとして、そして微生物に対する増殖媒体または維持媒体として作用する選択された修飾デンプンまたは非修飾デンプンまたはその混合物を個体に与えることによって、微生物の常在集団が増強されること、または個体のＧＩ管の選択された部位で望ましくない常在集団が抑制されることが記載されている。プロバイオティックの構成要素は、大腸またはＧＩ管の他の領域にまで通過するときに微生物を保護するような様式でキャリアに結合する。
【００１１】
微生物が様々な産業プロセスにおいて使用されている。これらのプロセスは連続プロセスおよび回分プロセスに分けることができる。例えば、エタノールおよびメタノールをはじめとする様々な発酵産物を製造するために使用されている連続プロセス、例えば、好気的または嫌気的な連続発酵生産ラインでは、生産ライン内の微生物集団がプロセスの始めから終わりまで維持されるように制御された様式で、発酵可能な原料が連続的に生産ラインに供給され、そして発酵生成物が連続的に生産ラインから回収される。回分プロセス、例えば、限定されないが、回分式の好気的または嫌気的な発酵、そして例えば油漏れ事故における油の生物分解などでは、発酵が行われるように、発酵可能な原料が微生物（１つまたは複数）の集団と混合される。連続発酵プロセスおよび回分式発酵プロセスの両方では、場合により、関係する微生物（１つまたは２つ以上）の生存し得る大きい集団によるプロセスを開始または回復させることが望まれる。例えば、油を生物分解するときには、例えば、油を完全に生物分解するための時間が最小限になるように、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）またはアルカリゲネス属細菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ．）のできる限り大きい微生物集団によるプロセスを開始することが好都合である。有機物ガスまたは有機揮発物を生物分解するための微生物が濃縮されたフィルターを使用するとき、結果は、汚染化合物が無害な化合物に分解される連続プロセスである。しかし、フィルター内に存在する微生物は、その生存のためには、有機物ガスまたは有機揮発物の連続した供給に依存している。それにも関わらず、場合により、有機物ガスまたは有機揮発物の供給は中断され、その結果として、微生物が失われる。そのような状況のもとでは、機能的なフィルターを直ちに復活させることができるように、フィルター内の微生物の効果的な生存し得る量を回復させることが短時間で要求される。
【００１２】
従って、プロバイオティック微生物および様々な産業的用途において有用な微生物を含む様々な微生物が、生存し得る状態および代謝的に活性な形態で長期間にわたって維持され得る配合物が必要であることが広く認識されており、そしてそのような配合物を有することは非常に好都合である。
【００１３】
本発明を実施に移しているとき、予想外にも、大腸菌に由来する単一種の非病原性プロバイオティック微生物により、ヒトならびに様々な哺乳動物および鳥類の正常なＧＩフローラが単独で回復され得ることが見出された。驚くべきことに、この微生物は、他の微生物と同様に、様々な植物抽出物の揮発性画分（１つまたは２つ以上）の水溶液を含む配合物において、生存し得る代謝的に活性な形態で長期間にわたって保存され得ることもまた見出された。そのような配合物に懸濁されたプロバイオティック生物を含むプロバイオティック組成物が、様々な胃腸異常の治療および防止において効果的であることが見出された。さらに、そのような配合物はそれ自体が、哺乳動物および鳥類において、体重増加増強剤として、そして免疫刺激剤として効果的であることが予想外にも見出された。
【００１４】
発明の開示
本発明の１つの局面により、大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））が提供される。
【００１５】
本発明の別の局面により、生存し得る大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））と、この大腸菌株の生存性を維持するための配合物とを含むプロバイオティック組成物が提供される。本発明のプロバイオティック組成物は、好ましくは、少なくとも１つの矯味矯臭剤をさらに含む。好ましくは、配合物は、減圧下および好ましくは３８℃を越えない浴温度で植物（例えば、ビート、ディル、パセリまたはグレープフルーツ）抽出物を水蒸気蒸留することによって調製された、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含む。
【００１６】
本発明のプロバイオティック組成物は、胃腸感染症または胃腸異常を防止または治療するために、および／あるいは正常な胃腸微生物叢を維持または回復させるために、および／あるいは下痢を防止または治療するために、および／あるいはグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌などの腸病原体によって引き起こされる胃腸の感染を防止または治療するために、および／あるいは胃腸のサルモネラ感染を防止または治療するために、および／あるいは、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、サルモネラ属細菌、特に、Ｓ．シゲラ属細菌、カンピロバクター属細菌、大腸菌、プロテウス属細菌、シュードモナス属細菌もしくはクロストリジウム属細菌によって引き起こされる感染性下痢、または慢性的な下痢、または抗生物質療法もしくは放射線療法もしくは化学療法から生じる下痢を防止または治療するために、および／あるいは胃腸管の生理学的活性を正常化するために同定され得る。
【００１７】
本発明のさらに別の局面により、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含む配合物が提供される。この場合、揮発性画分は、減圧下および好ましくは３８℃を越えない浴温度で植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される。植物抽出物は、好ましくは、葉、茎、根および実からなる群から選択される植物器官から得ることができる。植物には、ダイズ、アルファルファ、ニンニク、ビートおよびキャベツなどの野菜、またはパセリ、ミントおよびディルなどの香草を挙げることができる。本発明の配合物は、プロポリス（これに限定されない）などのミツバチ巣生成物をさらに含むことができる。本発明の配合物は、投与体における動物体重増加を強化するための動物飼料添加物または食物添加物として使用することができる。本発明の配合物はまた、本明細書中にさらに記載されるように、生存し得る細菌を保存するために役立ち得る。
【００１８】
従って、本発明のさらなる局面により、植物の揮発性画分を調製する方法が提供される。この方法は、（ａ）植物バイオマスを得るために植物由来物を粉砕する工程、（ｂ）植物バイオマスを水と混合して、周囲温度で撹拌する工程、（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合物を、減圧下および３８℃を越えない浴温度で水蒸気蒸留する工程、および（ｄ）水蒸気蒸留から得られる揮発性画分を集める工程を含む。好ましくは、減圧は５ｍｂａｒ〜１０ｍｂａｒである。この配合物は、食物添加物、飼料添加物として使用することができ、そして好都合な細菌保存特性だけでなく、予想外の治療的用途を有する。植物の揮発性画分を含有する治療用配合物もまた開示されるが、これは、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを、生理学的または獣医学的に受容可能な添加物またはキャリアまたは希釈剤と混合することによって調製することができる。好ましくは、揮発性画分は、減圧下および３８℃を越えない浴温度で植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される。
【００１９】
従って、本発明のなおさらに別の局面により、（ａ）胃腸管において有益な生物学的活性または治療活性を有する少なくとも１つの生存し得るプロバイオティック微生物の効果的な量と、（ｂ）本明細書中に記載されるように好ましくは調製された、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つとを含むプロバイオティック組成物が提供される。プロバイオティック微生物は大腸菌であり、好ましくはＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号）であり得る。これは、上記の様々な異常／病理／疾患／症候群のいずれかを治療または防止するために同定することができ、そしてさらに、または代替として、消化不良症状を治療または防止するために、例えば免疫応答抑制療法から生じる免疫異常に罹っている患者における免疫応答を増強するために同定することができる。
【００２０】
本発明のなおさらに別の局面により、（ａ）大腸菌属細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、アルカリゲネス属細菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ．）、アルスロバクター属細菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ビフィドバクテリウム属細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス属細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ラクトコッカス属細菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ニトロソモナス属細菌（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）およびシュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）などの少なくとも１つの微生物と、（ｂ）前記の少なくとも１つの微生物の生存性を、室温において、少なくとも２ヶ月間、好ましくは少なくとも３ヶ月間〜６ヶ月間、より好ましくは６ヶ月間〜１２ヶ月間またはそれ以上にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つとを含む組成物が提供される。
【００２１】
本発明の別の局面により、大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））を増殖させる方法が提供される。この方法は、大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））のスターター培養物を増殖培地に接種して、６５０ｎｍにおける光学密度が１５〜３０になるまでこの大腸菌株を増殖させる工程を含む。
【００２２】
本発明のさらに別の局面により、プロバイオティック組成物を製造する方法が提供される。この方法は、生存し得る大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））を、この大腸菌株の生存性を維持するための配合物に懸濁する工程を含む。好ましくは、配合物は、例えば、ダイズ、パセリ、ミント、ディル、アルファルファ、ニンニク、ビートまたはキャベツなどの野菜および香草のいずれでも、葉、茎、根および実からなる群から選択される植物器官から得られる植物抽出物を減圧下および３８℃を越えない浴温度で水蒸気蒸留することによって好ましくは調製される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含む。
【００２３】
本発明のなおさらに別の局面により、プロバイオティック組成物を調製する方法が提供される。この方法は、胃腸管において有益な生物学的活性または治療活性を有する少なくとも１つの生存し得るプロバイオティック微生物の効果的な量を、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に懸濁する工程を含む。
【００２４】
本発明のさらなる別の局面により、生存し得る微生物を含む組成物を調製する方法が提供される。この方法は、少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含む配合物に少なくとも１つの微生物を懸濁する工程を含む。微生物は、例えば、大腸菌属細菌、アルカリゲネス属細菌、アルスロバクター属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、ラクトコッカス属細菌、ニトロソモナス属細菌またはシュードモナス属細菌であり得る。
【００２５】
さらに、本発明のさらなる局面により、リザーバーと、リザーバーに接続されている分配機構とを含む微生物のディスペンサーが提供される。この場合、リザーバーは、少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物において少なくとも１つの微生物を収容する。
【００２６】
さらに、本発明のさらなる局面により、生物のバイオ制御方法が提供される。この方法は、生物をバイオ制御することができる少なくとも１つの生存し得る微生物を風土病地域において散布する工程を含むが、この場合、少なくとも１つの生存し得る微生物は、少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在する。
【００２７】
本発明のさらなる局面により、油汚染を除去する方法が提供される。この方法は、油を分解することができる少なくとも１つの生存し得る微生物を汚染地域において散布する工程を含むが、この場合、少なくとも１つの生存し得る微生物は、少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在する。
【００２８】
さらに、本発明のさらなる局面により、バイオフィルターにおける有機物ガス分解微生物集団を復活させる方法が提供される、この方法は、有機物ガスを分解することができる少なくとも１つの生存し得る微生物をフィルターに施すことを含むが、この場合、少なくとも１つの生存し得る微生物は、少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在する。
【００２９】
さらに、本発明のさらなる局面により、発酵プロセス用のスターター物を調製する方法が提供される。この方法は、十分な量のスターター微生物を増殖させ、そしてスターター微生物を、スターター微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に懸濁する工程を含む。
【００３０】
図面の簡単な説明
本発明は、添付された図面を参照して、単に例として本明細書中に記載されるだけである。次に図面を詳細に特に参照することにより、示される特定の事項は例としてであり、また本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけであること、そして本発明の原理および概念的な面の最も有用かつ容易に理解される記載であると考えられる事項を提供するために示されることに重点が置かれている。これに関連して、本発明の基本的な理解のために必要とされるよりも詳しく本発明の構造的詳細を示すことはなされていない。しかし、図面とともに理解される説明により、本発明のいくつかの形態がいかにして実際に具体化され得るかが当業者には明らかになる。
図１は、本発明によるディスペンサーの概略図である。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、（ｉ）非病原性のプロバイオティック微生物およびそのプロバイオティック／治療的使用、（ｉｉ）少なくとも１つの植物由来物の抽出物から調製される揮発性画分（ＶＦ）の水溶液を含む配合物およびその治療的使用、（ｉｉｉ）植物由来物からそのような配合物を製造する方法、（ｉｖ）本発明の非病原性プロバイオティック微生物および／または他のプロバイオティック微生物および本発明の配合物を含むプロバイオティック組成物、ならびにそのプロバイオティック／治療的使用、（ｖ）本発明の配合物および産業的有用性を有する微生物を含む産業的に応用される組成物、そして（ｖｉ）後者の組成物が使用される産業プロセスおよび装置に関する。
【００３２】
本発明の原理および操作は、図面および添付された説明を参照してより良く理解することができる。
【００３３】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００３４】
一つの局面において、本発明は、ＧＩ管において有益な生理学的活性および／または治療活性を有し、かつＡＴＣＣに寄託番号第２０２２２６号で寄託され、そしてＤＳＭＺに寄託番号第１２７９９号で寄託されている、大腸菌に由来する非病原性細菌であるプロバイオティック微生物に関する。
【００３５】
「プロバイオティック」は、本明細書中では、少なくとも１つの病原体の増殖を阻害する性質を有する単離された細菌を記載するために使用される。本明細書中で使用される阻害試験は、単離された候補細菌の培養上清が、固体培地の表面に添加されたときに病原体の増殖を阻害するその性質について観測される固体培地でのインビトロ試験であった。典型的には、候補プロバイオティック菌株の培養上清を含浸させたペーパーディスクが、病原体が播種された寒天平板の表面に置かれた。プロバイオティック細菌の上清は、ディスクの近傍における病原体の阻害を示す透明な寒天の環または低下した増殖密度の環を生じさせた。阻害に関する様々な他の試験を利用または考案することができ、これには、本明細書中に記載されるプロバイオティック細菌集団と類似するプロバイオティック細菌集団をもたらし得るインビトロまたはインビボでの直接的な増殖競合試験が含まれる。任意のそのような試験によって同定された細菌株は、その用語が本明細書中で使用されるように、プロバイオティック細菌の範疇に含まれる。
【００３６】
本発明のプロバイオティック細菌は食物添加物または飼料添加物として使用することができ、その結果、生存し得る大腸菌ＢＵ−２３０−９８株（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ１２７９９））が補充された食物製品または飼料製品が得られるようになる。本発明の食物製品は、少なくとも１つの乳汁由来物質をさらに含むことができ、そしてチーズおよびヨーグルトからなる群から選択することができる。
【００３７】
本発明はさらに、植物抽出物の少なくとも１つの揮発性画分（ＶＦ）を含む配合物に関する。この揮発性画分は、減圧下および３８℃を越えない浴温度のもとで前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって調製される。
【００３８】
揮発性画分を得ることができる植物体は、実、葉または根などの任意の好適な植物部分であり得る。多くの植物が、そのような揮発性画分の供給源として好適であり、例えば、リンゴ、柑橘類、ダイズ、ビート、キャベツ、ニンニクおよびアルファルファ、ならびにパセリ、ミントおよびディルなどの香草である。本発明の配合物は、蜂蜜、プロポリスまたは他のミツバチ巣生成物などの養蜂産物の揮発性画分の適量を必要に応じてさらに含むことができる。この揮発性画分も、植物抽出物から揮発性画分を得るために本明細書中に記載されているのと同じ様式で調製することができる。
【００３９】
下記の実施例においてさらに詳しく記載されているように、配合物自体を食物／飼料添加物として使用することができる。この配合物は、体重増加増強活性を有していること、そして本発明の１つの局面を構成することが本発明者らによって見出された。本発明のこの局面の１つの特定の実施形態により、動物体重増加増強用配合物または飼料添加物は、蒸留水と、好ましくは揮発性画分の重量比が２：８：１：４であるアルファルファ、ダイズ、ビートおよびディルの各揮発性画分とを含む。あるいは、本発明の配合物または飼料添加物は、蒸留水と、１００部の水についてそれぞれ１部の、ニンジン、ビート、ディルおよびグレープフルーツの揮発性画分とを含む。さらにあるいは、本発明の配合物または食物添加物は、蒸留水と、１００部の水についてそれぞれ１部の、ビート、ディルおよびパセリの揮発性画分とを含む。
【００４０】
さらなる局面において、本発明は、本発明の上記配合物と、少なくとも１つの生存し得る微生物、すなわち、例えば、ヒトおよび／または動物のＧＩ管において治療的活性または有益な生物学的活性を有し、それにより、プロバイオティック組成物をもたらすプロバイオティック生物、または産業的用途を有し、それにより、産業的有用性を有する組成物をもたらす生物のいずれかを含む組成物に関する。
【００４１】
本発明のプロバイオティック組成物及び産業用組成物の個々の利点は、組成物が液状の調製物であるという事実に由来する。生物学的に活性な状態にあるので、本発明の配合物はまた、細菌が仮死状態にある凍結乾燥配合物とは対照的に、生細菌の支持媒体としても役に立つ。その結果、本発明のプロバイオティック組成物は、例えば、経口投与後、直ちに活性になる。これは、有害な胃腸症状を発症させる大部分の腸病原体の一次効果が生じるＧＩ管の上部部分で始まる。本発明のプロバイオティック組成物はまた、体重を増大させる調製物または食物／飼料添加物としても使用することができる。同様に、本発明の産業用組成物も産業的有用性における微生物の集団を効率的に元に戻すのに使用できる。
【００４２】
従って、プロバイオティックの適用について菌株ＢＵ−２３０−９８（ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号、これはまたＤＳＭに第１２７９９号で寄託されている）に属するそのような細菌菌株以外のプロバイオティック細菌も本発明の植物材料由来の配合物とともに使用され得ることに留意する。そのような細菌は、非常に広い作用スペクトルの拮抗活性を有している。そのような細菌は、大部分の腸病原体の同じ系統進化群に属し、同じ生存システムを共有している。従って、腸病原体の抑制および排除には、多くの異なる機構が含まれ得るが、例えば、拮抗性物質の分泌、栄養分の利用に対する競合、および接着受容体に対する競合が含まれる。従って、これらの基準を満たす非病原性細菌はどれも、本発明のプロバイオティック組成物において使用することができる。
【００４３】
本発明のさらなる局面により、本発明のプロバイオティック組成物は、胃腸感染症の防止または治療のために使用することができる。用語「胃腸感染症」は、なかでもグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌を含む腸病原体によって引き起こされる任意の感染症を意味すると解釈されるものとする。ＧＩ管の全体的なバランスおよび健康状態を改善することによって、本発明の配合物およびプロバイオティック組成物は、酵母、ウイルスおよび原生動物によって引き起こされるＧＩ感染症の予防にも役立ち得る。
【００４４】
「治療有効量」または「効果的な量」の用語は、本明細書中の目的に関して、この分野で知られているような検討によって決定されるそのような量である。この量は、ＧＩ微生物叢の効率的な回復を可能にし、従って、ＧＩ管の機能の正常化をもたらすために十分でなければならない。
【００４５】
特定の実施形態において、胃腸感染症の発症を防止するためのプロバイオティック組成物は、蒸留水と、容量比が例えば５：１：５：１５：１である、本明細書中に記載されているアルファルファ、ダイズ、ビート、ディルおよびミントの各揮発性画分とから作製された本発明の配合物、および大腸菌ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ  １２７９９と同一）などのプロバイオティック細菌またはいかなる他のプロバイオティック細菌の治療有効量を含む。
【００４６】
胃腸感染症に対する具体的な例は、サルモネラ属細菌により引き起こされる感染症であり、本発明は、それらにより引き起こされる胃腸感染症の防止または治療において特に好都合である。
【００４７】
さらに、本発明の食物添加物または配合物は、単独で、あるいは大腸菌菌株ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ  １２７９９と同一）などのプロバイオティック微生物の効果的な量との組み合わせで、感染性下痢、慢性下痢、または抗生物質治療もしくは化学療法によって引き起こされる下痢の治療または防止のために使用することができる。
【００４８】
本発明のさらなる具体的な実施形態により、感染性下痢を治療するためのそのようなプロバイオティック組成物は、蒸留水と、容量比が例えば５：１：５：１５：１であるアルファルファ、ダイズ、ビート、ディルおよびミントの各揮発性画分と、ＡＴＣＣ第２０２２２６号（ＤＳＭＺ  １２７９９）の治療有効量とを含むことができる。
【００４９】
感染性下痢は、多数の要因によって、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、サルモネラ属細菌、特にＳ．Ｓｈｉｇｅｌｌａ、カンピロバクター属細菌、大腸菌、プロテウス属細菌、シュードモナス属細菌、クロストリジウム属細菌、腸内ブドウ球菌から選択される微生物によって引き起こされ得る。これらは、多くの感染性因子の少数にすぎない。
【００５０】
なおさらに、本発明のプロバイオティック組成物は、ＧＩ管の機能を正常化させるそのような治療を必要とする被検体におけるＧＩ微生物叢を効果的に回復させるために使用することができる。そのような組成物は、例えば、蒸留水と、好ましくは揮発性画分の比が例えば１：５：５：２：２：１であるアルファルファ、ダイズ、ビート、ディル、ミント、パセリおよびキャベツの各揮発性画分と、プロバイオティック細菌ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号（ＤＳＭ  １２７９９）の治療有効量とを含むことができる。
【００５１】
例えば、ＧＩ管における治療作用を有する少なくとも１つのプロバイオティック細菌を含む本発明のプロバイオティック組成物に対する他の目的には、ラクトース不耐性に苦しんでいる被検体におけるラクトース不耐性の緩和、全腸炎の治療、便秘の治療、血中コレステロールレベルの低下、消化不良症状の治療、および／または免疫抑制治療によって引き起こされる免疫異常であり得る免疫系の異常に苦しんでいる被検体における免疫系の刺激が含まれる。
【００５２】
異なる局面において、本発明は、植物抽出物の揮発性画分を調製するための方法に関する。この方法は下記の工程を含む：（ａ）植物バイオマスを得るために植物由来物を粉砕する工程；（ｂ）工程（ａ）で得られた植物バイオマスを、重量比が１部の植物バイオマスに対して３部の水である水と混合して、混合物を周囲温度で少なくとも２時間にわたって攪拌する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合物を減圧下および３８℃を越えない浴温度で水蒸気蒸留する工程；および（ｄ）前記水蒸気蒸留から得られた揮発性画分であって、好適な緩衝液でさらに希釈され得る揮発性画分を集める工程。
【００５３】
本発明の揮発性画分は、本発明の食物／飼料添加物または配合物を得るために水と混合され得る。本発明の食物／飼料添加物または配合物はまた、本発明の方法で得られる２つ以上の植物揮発性画分を混合することによって調製され得る。この混合物はさらに、水と混合され得る。
【００５４】
揮発性画分は、植物の任意の好適な実、野菜、葉、茎または根から調製することができる。植物は、例えば、リンゴ、柑橘類の果実、ダイズ、ビート、ニンニク、キャベツまたはアルファルファ、あるいはパセリ、ミントまたはディルなどの香草であり得る。適する場合には、配合物は、蜂蜜またはプロポリスまたは他のミツバチ巣生成物などの養蜂産物に由来する揮発性画分をさらに含み得ることには留意しなければならない。これらの揮発性画分は、植物抽出物揮発性画分と同じ様式で調製することができる。
【００５５】
本発明の方法により、蒸留工程は、好ましくは、５ｍｂａｒ〜１０ｍｂａｒの減圧下で行われる。
【００５６】
本明細書中前記に示されているように、本発明の食物／飼料添加物または配合物は、本発明のプロバイオティックまたは産業用組成物を得るために、少なくとも１つのプロバイオティックまたは産業用因子とさらに組み合わせることができる。従って、本発明の調製方法はまた、少なくとも１つの生きたプロバイオティックまたは産業用微生物を、前記工程（ｄ）で得られる揮発性画分に、または上記に記載されているようにして得られるそのような揮発性画分の混合物に懸濁する工程をさらに含むことができる。
【００５７】
本発明の特定の方法により、懸濁されたプロバイオティック微生物は、大腸菌に由来し、ＡＴＣＣに寄託番号第２０２２２６号で（そしてＤＳＭに寄託番号第１２７９９号で）寄託されている本発明の新規な細菌であり得る。
【００５８】
最後に、本発明は、食物／飼料添加物の調製における植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の使用に関する。この場合、ＶＦは、３８℃を越えない浴温度で、前記植物抽出物を水蒸気蒸留することによって、あるいは蜂蜜またはプロポリスなどの養蜂産物抽出物から水蒸気蒸留することによって調製される。
【００５９】
本発明のさらなる局面には、生存し得る微生物を含む組成物を調製する方法が含まれる。この方法は、少なくとも１つの微生物を、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に懸濁することによって達成される。配合物は、微生物（１つまたは２つ以上）の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される。選ばれる微生物は、プロバイオティック性であり得るか、または産業的有用性を有し得る。本発明の配合物において維持され得る生物には、大腸菌属細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、アルカリゲネス属細菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ．）、アルスロバクター属細菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ビフィドバクテリウム属細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス属細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ラクトコッカス属細菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ニトロソモナス属細菌（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）およびシュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）が含まれる。
【００６０】
図１に示されるように、別の局面において、本発明は、微生物のディスペンサー１０を提供する。ディスペンサー１０は、リザーバー１２と、それに接続されている分配機構１４とを含む。リザーバー１２は、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物において少なくとも１つの微生物を収容する。配合物は、微生物（１つまたは２つ以上）の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される。リザーバー１２は、例えば、約２℃〜２０℃に、好ましくは約４℃に冷蔵することができる。ディスペンサー１０は、害虫駆除生物剤の分散を可能にするように、空気浮遊型ディスペンサーであり得る。ディスペンサーは手持ち型であり得る。いずれの場合でも、ディスペンサーは、例えば定期的に、所定の容量がディスペンサーから自動的に分配されるように設計することができる。この目的のために、ディスペンサー１０は、プログラム可能な制御機構１６または事前に設定された制御機構１６、弁１８などを含むことができる。
【００６１】
従って、別の局面により、本発明は、生物をバイオ制御することができる少なくとも１つの生存し得る微生物を風土病地域において散布することによって達成される、生物のバイオ制御方法を提供する。生存し得る微生物（１つまたは２つ以上）は、少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在する。
【００６２】
なおさらに、別の局面により、本発明は、油を分解することができる少なくとも１つの生存し得る微生物（シュードモナス属細菌など）を汚染地域において散布することによって達成される、油汚染を除去する方法を提供する。生存し得る微生物（１つまたは２つ以上）は、前記の少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在する。
【００６３】
さらに、別の局面により、本発明は、有機物ガスを分解することができる少なくとも１つの生存し得る微生物（シュードモナス属細菌、ニトロソモナス属細菌またはアルスロバクター属細菌など）をフィルターに施すことによって、バイオフィルターにおける有機物ガス分解微生物集団を復活させる方法を提供する。生存し得る微生物（１つまたは２つ以上）は、前記の少なくとも１つの微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に存在する。
【００６４】
なおさらに、本発明の別の局面により、十分な量のスターター微生物（ラクトコッカス属細菌、大腸菌属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、またはシュードモナス属細菌など）を増殖させ、そしてスターター微生物を、前記スターター微生物の生存性を室温において少なくとも２ヶ月間にわたって持続させるように選択される、植物抽出物の揮発性画分（ＶＦ）の少なくとも１つを含有する配合物に懸濁することによって発酵プロセス用のスターター物を調製する方法が提供される。
【００６５】
本発明のさらなる目的および利点および新規な特徴は、限定であることを意図しない下記の実施例を検討したとき、当業者に明らかになる。さらに、本明細書中上記に示され、そして下記の請求項の節に記載される本発明の様々な実施形態および局面のそれぞれは、実験的裏づけが下記の実施例に見出される。
【００６６】
実施例
次に、下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する。
【００６７】
実施例１
植物抽出物または養蜂産物由来の抽出物の「揮発性画分」の調製
市場から得られた新鮮な野菜を水道水で十分に洗浄して、切り刻み、そして工業用ブレンダーで細かく粉砕した。蒸留水を、この野菜バイオマスに、重量比で１部の野菜バイオマスに対して３部の水の割合で加え、周囲温度において少なくとも２時間の攪拌下においた。
【００６８】
その後、混合物をロータリーエバポレーターの蒸発フラスコに移し、減圧下（５〜１０ｍｂａｒ）、水浴の温度が３８℃を越えず、かつ冷却器入口の温度が２℃〜５℃であるような条件のもとでエバポレートした。２．５ｋｇの植物バイオマスあたり、約１ｌの凝縮物（揮発性画分）が回収された。この物質は、本発明でさらに詳述する通り、その性質を失うことなく、少なくとも１２ヶ月間にわたって冷蔵状態で保存することができる。
【００６９】
同じ手順を、植物材料を蜂蜜またはプロポリスなどの養蜂産物に換えて行うことができる。
【００７０】
通常、それぞれの「揮発性画分」が１種類の野菜から調製され、様々な目的のために種々の混合物を調製するために異なる希釈で使用された。
【００７１】
実施例２
プロバイオティック生物の大腸菌ＡＴＣＣ寄託番号第２０２２２６号の単離および増殖
実施例１で述べた植物由来材料の揮発性画分を含有する配合物において、３７℃以上で保存された長期（２ヶ月）生存菌から継代し、以下に詳述するように病原菌を競合する能力のある分離菌として選ばれた分離菌を順次移すことによりプロバイオティック生物の大腸菌（ＡＴＣＣに第２０２２２６号で１９９９年５月３日に、そしてＤＳＭに第１２７９９号で１９９９年５月４日に寄託）を大腸菌Ｍ−１７から単離した。プロバイオティック生物の大腸菌（ＡＴＣＣに第２０２２２６号で１９９９年５月３日に、そしてＤＳＭに第１２７９９号で１９９９年５月４日に寄託）を下記の培地（ｇ／ｌ）において増殖させた：（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ/ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １３ｇ/ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １３ｇ/ｌ、ＭｇＣｌ２  ３ｇ/ｌ、ＣａＣｌ２  ０．３ｇ/ｌ、酵母抽出物  １０ｇ/ｌ、ダイズペプトン  １０ｇ/ｌ、グルコース  ５ｇ/ｌ。さらなる養分（酵母抽出物  １ｇ/ｌ、ダイズペプトン  ２．５ｇ/ｌ、グルコース  ９０ｇ/ｌ）を、発酵液中のグルコース濃度が２ｇ／ｌのレベルで保たれるような方法で培養物の増殖に従って連続的に加えた。発酵液のｐＨを、４ＮのＮＨ４ＯＨを連続的に添加することによって中性で保った。培養を、標準的な発酵糟において０．５ｖｖｍの通気を行いながら３０℃で１６時間行った。１６時間後、増殖はコンフルエンスになった。この手順により、１０１０〜１０１１細胞／ｍｌが得られた。大腸菌細胞を遠心分離により集め、生理食塩水に再懸濁して、再度沈殿させた。この微生物バイオマスは、生存性を失うことなく冷蔵庫で生理食塩水中で４８時間保存することができる。
【００７２】
実施例３
哺乳類及び鳥類における体重増加を促進させるための食物／飼料添加物の調製
混合物は下記の揮発性画分を含有した：実施例１に述べた通り調整した、アルファルファ  ５０ｍｌ/ｌ、ダイズ  ２００ｍｌ/ｌ、ビート  ２５ｍｌ/ｌ、およびディル  １００ｍｌ/ｌ。残量は蒸留水で構成された。
【００７３】
実施例４
ヒトＧＩ管の機能を正常化させるための食物補助物の調製
混合物は下記の揮発性画分を含有した：実施例１に述べた通り調整した、アルファルファ  ５０ｍｌ/ｌ、ダイズ  １０ｍｌ/ｌ、ビート  ５０ｍｌ/ｌ、ディル  ５０ｍｌ/ｌ、ミント  ２０ｍｌ/ｌ、パセリ  ２０ｍｌ/ｌ、およびキャベツ  １０ｍｌ/ｌ。残量は蒸留水で構成された。大腸菌（ＡＴＣＣ  ２０２２２６）細胞（実施例２）を１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で混合物に懸濁した。ＮａＣｌ（４〜１０ｇ／ｌ）を、味を改善するために必要に応じて加えてもよい。
【００７４】
実施例５
哺乳類および鳥類におけるＧＩ感染症を予防するための飼料添加物配合物の調製
混合物は下記の揮発性画分を含有した：実施例１に述べた通り調整した、アルファルファ  ５０ｍｌ/ｌ、ダイズ  １０ｍｌ/ｌ、ビート  ５０ｍｌ/ｌ、ディル  １５０ｍｌ/ｌ、およびミント  １０ｍｌ/ｌ。残量は蒸留水で構成された。大腸菌（ＡＴＣＣ  ２０２２２６）細胞（実施例２）を１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で混合物に懸濁した。ＮａＣｌ（４〜１０ｇ／ｌ）を、味を改善するために必要に応じて加えてもよい。
【００７５】
実施例６
ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ、ＡＴＣＣ  １４０２８）に対する大腸菌（ＡＴＣＣ  ２０２２２６）の拮抗活性
改変ブリリアントグリーン寒天（サルモネラ属細菌に対する選択的増殖培地）を含有するペトリ皿にＳ．ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍを接種した。直径が９ｍｍのウエルを寒天中に作製した。食物補助物（実施例４）の一定容量を各ウエル内に置き、プレートを３５℃で２４時間インキュベーションした。同じことを繰り返したが、食物補助物の代わりに、微生物学的フィルター膜（０．４５μｍの細孔サイズ）によるそのろ過で得られた液体をウエル内に置いた。
【００７６】
飼料添加物を含有する各ウエルの周りには、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍのコロニーが存在しない阻止域（１０〜１７ｍｍ）が認められた。プロバイオティック生物を含まないろ液を含有するウエルの周りには阻止域は認められなかった。
【００７７】
実施例７
Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｓ．に対する大腸菌ＡＴＣＣ  ２０２２２６ならびにその親株大腸菌Ｍ−１７の拮抗活性
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ、大腸菌（ＡＴＣＣ  ２０２２２６）およびＭ−１７の培養物を普通栄養寒天において別々に１８時間〜２０時間にわたって３７℃で増殖させた。すべての培養物を生理食塩水中に集め、１０Ｋｌｅｔｔ単位の光学密度に希釈した。Ｓｈｉｇｅｌｌａ種の希釈培養物の一部（１ｍｌ）を、単独で、または大腸菌（ＡＴＣＣ  ２０２２２６）の希釈培養物（１ｍｌ）との組み合わせで、普通栄養培養液（５ｍｌ）を含有する通気キャップ試験管に接種した。試験管を３７℃で２４時間インキュベーションした。病原体および大腸菌（ＡＴＣＣ  ２０２２２６）のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）数を、普通栄養寒天に培養物を播種することによって測定した。純粋培養物および２つのプロバイオティック大腸菌種との混合培養物における２つのＳｈｉｇｅｌｌａ種のＣＦＵ数を表１に示す。
【表１】
0004410992.tif 000002
【００７８】
実施例８
胃腸炎の入院患者における食物補助物（実施例４）およびコリバクテリン（大腸菌Ｍ−１７の乾燥配合物）の適用
入院を伴う胃腸炎を発症した６０名の患者群を、性別、年齢および胃腸炎症状の重篤度の類似する分布を有する３つの小グループに無作為に分けた。すべての患者には、再水和、ビタミンなどを含む正常な支持療法が施された。状態の重症度は、抗生物質による治療を必要としなかった。２０名の患者からなる第１グループには、１０ｍｌの食物補助物（実施例４）が、７日間にわたって１日に３回、食前３０分に与えられた。同じ数の第２グループには、コリバクテリン（Ｃｏｌｉｂａｃｔｅｒｉｎｕｍ  ｓｉｃｃｕｍ）が製造者が勧めるようにして与えられた（１用量を、食前３０分に、１日に２回）。第３グループには、補助物が全く与えられなかった。
すべてのグループにおける胃腸炎の症状の正常化開始（日数）を記録し、以下の表２に示す。
【表２】
0004410992.tif 000003
【００７９】
コリバクテリン（Ｃｏｌｉｂａｃｔｅｒｉｎｕｍ  ｓｉｃｃｕｍ）は、ＢＩＯＭＥＤ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）によって製造された生大腸菌Ｍ−１７の凍結乾燥調製物であり、下痢に対する使用が勧められている［Ｖｉｄａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｒｕｓｓｉａ（Ｎ．Ｂ．Ｎｉｋｏｌａｅｖａ、Ｂ．Ｐ．ＡｌｐｅｒｏｖｉｃｈおよびＶ．Ｎ．Ｓｏｖｉｎｏｖ編）、ＡｓｔｒａＰｈａｒｍＳｅｒｖｉｃｅ、１９９７年、Ｍｏｓｃｏｗ、２７５頁］。
【００８０】
実施例９
急性ＧＩ感染症患者における食物補助物（実施例４）の適用
様々な病因（サルモネラ症、大腸菌症、細菌性赤痢、ブドウ球菌感染症および病因不明の食中毒）の重症なＧＩ感染症を有する患者を本試験に組み入れた。すべての患者は、急性胃腸炎の疾患および様相の急性発症によって入院が指示された。総数が１８６名の患者は食物補助物で治療され、１０２名の類似する患者群には標準的な治療が施された。
すべてのグループにおける胃腸炎の症状の正常化開始を（日数で）記録し、以下の表３に示す。
【表３】
0004410992.tif 000004
【００８１】
別の研究において、腸チフスの３０名の患者群を食物補助物で治療した。患者の８０％において、疾患の症状が３日以内に消失した。３例のみにおいて、補助物の治療は、より重要な慢性大腸炎を発症したために中止された。
【００８２】
実施例１０
抗生物質により引き起こされたＧＩ異常を有する患者における食物補助物（実施例４）の適用
重症なＧＩ異常を有する患者を２つのグループに分けた。グループＩには、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する抗生物質治療後にＧＩ異常を発症した消化性潰瘍疾患を有する４８名の患者が含まれた。グループＩＩには、肺炎の抗生物質治療後にＧＩ異常を発症した２２名の患者が含まれた。
食物補助物（５ｍｌ）が、７日間にわたって１日に３回、食前に投与された。両グループにおいて、下痢症状は、すべての患者で２日〜３日で消失した。補助物の投与後、腸微生物叢の完全な正常化が８４．５％の患者で認められた。その正常化は、乳酸菌およびビフィドバクテリウム属細菌の劇的な増大、大腸菌の全体的な計数の減少、溶血性大腸菌および他の病原体（ブドウ球菌属細菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓおよびさらにはＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｓ．など）の完全な消失により明らかにされた。残る１５．５％の患者では、顕著な改善が認められた。
【００８３】
実施例１１
後期放射線全腸炎の患者における食物補助物（実施例４）の適用
食物補助物（１０ｍｌ、１４日間にわたって１日に３回、食前３０分）を、放射線療法または放射線と化学療法との組合せの後に全腸炎を発症した子宮ガン、結腸ガンおよび胃ガンの２４名の患者に与えた。
重量比が＞０．１であることを特徴とする像形成材料が提供される。
【００８４】
食物補助物を使用する前、すべての患者は、痛みを伴う頻繁な排便感、液状の便（１日に４回〜１２回）を訴えた。便には粘膜（９例）および血液（３例）が見られた。
【００８５】
補助物を摂取した２日後または３日後に、すべての患者は痛みの軽減および排便回数の減少を認めた；便は正常な外見を有した。４日後〜５日後、下痢症状は消失し、血液および粘膜は見られなくなった。血液分析は、血液指標の強い改善を示していた。
類似するサイズのコントロール群では、症状が持続していた。
【００８６】
実施例１２
ＡＩＤＳ患者における食物補助物（実施例４）の適用
ＡＩＤＳ罹患患者は慢性下痢を頻繁に発症する。そのような患者群に、１０ｍｌの食物補助物（実施例４）を、２０日間にわたって１日に３回、食前３０分に与えた。コントロール群には補助物を与えなかった。治療の結果を以下の表４に示す。
【表４】
0004410992.tif 000005
【００８７】
食物補助物が投与された患者は、腸微生物叢の正常化：大腸菌群の全体的な数の低下、溶血性大腸菌の消失、乳酸桿菌属細菌およびビフィドバクテリウム属細菌の数の増大、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｓ．の減少を示した。
【００８８】
実施例１３
健康な子ブタにおける促進された体重増大に対する食物／飼料添加物（実施例３）の適用
健康な子ブタに、１日あたり１頭につき３ｍｌの食物／飼料添加物を乳離れするまで経口投与した。飼料添加物が投与されたグループは、コントロール群よりも平均して１頭あたり１．０ｋｇ多い体重を乳離れの時に獲得していた。
【００８９】
実施例１４
健康な子ブタにおける食物／飼料添加物（実施例５）の適用
数百頭の健康な子ブタに、配達後の１日目および３日目ならびに乳離れ時に１頭あたり３ｍｌの飼料添加物を経口投与した。死亡率は、抗生物質による標準的な予防治療を受けたコントロール群と比較して５０％低下した。飼料添加物投与群は、コントロール群よりも平均して１頭あたり０．３９ｋｇ多い体重を乳離れの時に獲得していた。飼料添加物治療および抗生物質治療を同じ同腹子で比較した場合、飼料添加物を含む子ブタにおける体重増加は、コントロールよりも２．４ｋｇ大きいことが見出された。
【００９０】
実施例１５
下痢を示す子ブタにおける飼料添加物（実施例５）の適用
下痢を示す数百頭の子ブタに、毎日、１頭あたり５ｍｌの飼料添加物を経口投与した。同じサイズのコントロール群は抗生物質（アドボシン、ゲンチアマイシン、アモキシリン）で治療された。飼料添加物投与群における下痢症状は１日〜２日で消失した。死亡は認められず、子ブタは正常に発育した。抗生物質は、大多数の子ブタで下痢を止めたが、子ブタは、その発達において発達が妨げられたままであった。
【００９１】
下痢に対する抗生物質治療を１週間にわたって受け、そして一般には損失と見なされる約７０頭の発育が遅れた子ブタに飼料添加物を３日間にわたって与えた。２頭を除くすべてが生存した。
【００９２】
実施例１６
健康な子ウシにおける飼料添加物（実施例５）の適用
日齢の健康な子ウシに、１日あたり５ｍｌの飼料添加物をミルクにおいて７日間投与した。９５％を越える子ウシは、ロタウイルスについて少数の陽性例が診断された１４日齢になるまで下痢を発症しなかった。このファームにおける下痢の発現率は通常２０％〜３０％である。
【００９３】
実施例１７
下痢を示す子ウシにおける飼料添加物（実施例５）の適用
下痢を発症する子ウシに、毎日、１頭あたり１０ｍｌの飼料添加物をミルクとともに３日間〜５日間投与した。下痢症状は、９０％〜９５％の子ウシにおいて１日〜２日で消失した。残る５％〜１０％では、下痢はウイルスにより生じていた。これらの子ウシは抗生物質で治療されたが、結果は不良であった。
【００９４】
実施例１８
健康な子ヒツジおよび子ヤギにおける飼料添加物（実施例５）の適用
１日齢の健康な子ヒツジおよび子ヤギに、１日あたり３ｍｌの飼料添加物をミルクにおいて７日間投与した。数例で、軽度〜普通の下痢徴候が認められた。これらの徴候は、通常は自然に消失し、または増量した飼料添加物（５ｍｌ）を用いて問題なく治療された。これらファームでの下痢の発現率は子ヒツジおよび子ヤギにおいて通常５０％である。
【００９５】
実施例１９
下痢を示す子ヒツジおよび子ヤギにおける飼料添加物（実施例５）の適用
飼料添加物を、病原性大腸菌感染症に罹っている家畜群において試験した。実験の前年には、約９０頭〜１２０頭の子ヒツジおよび子ヤギが下痢のために死亡した。抗生物質を用いた治療は、この疾患が突然発症し、早い死亡をもたらすので効果的ではなかった。下痢を発症する子ヒツジおよび子ヤギに、毎日、１頭あたり５ｍｌの飼料添加物をミルクとともに３日間〜５日間投与した。匹敵する動物群を、通常の場合には勧められるようにして抗生物質で治療した。下痢の症状は、飼料添加物が投与された子ヒツジおよび子ヤギの約９０％において１日〜２日で消失した。それらのさらなる発育は正常のようであった。抗生物質（ゲンタマイシン）が投与されたコントロール群は、はるかに悪い結果を示した。この群における下痢は持続し、抗生物質による反復的な治療が必要であった。コントロール群の発育はひどく遅れていた。
【００９６】
実施例２０
家禽における飼料添加物（実施例５）の適用
飼料添加物を、１羽のヒナあたり１日につき０．０１ｍｌの添加物の平均摂取量で飲料水に飼育期間中（４２日間〜４９日間）加えた。体重増加における３．２％の増大が、食物転換率における４％の改善を伴って、ブロイラーにおける管理された試験において認められた。
優れた結果が、１日齢〜６週齢の七面鳥の場合にも得られた。それぞれのトリには、１日あたり０．０１ｍｌの添加物が投与された。１０％を越える体重増加が、低下した死亡率とともに認められた。下痢を依然として示すトリを、抗生物質による治療を何ら行うことなく、１日あたり０．１ｍｌの食物添加物で治療した。抗生物質のみで治療されたコントロールのトリからのより良好な回復が示された。
【００９７】
実施例２１
イヌおよびネコにおける飼料添加物（実施例５）の適用
子イヌにおける飼料添加物を適用することにより、下痢症状は２４時間〜４８時間のうちに止まった。
【００９８】
実施例２２
マウスにおける飼料添加物（実施例５）の適用；免疫刺激に対する証拠
２週齢のＣ５７Ｂ１マウスを、それぞれが１０匹の動物からなる４つの群に分けた。マウスには、午後４：００時から午前８：００時まで水が与えられず、その後、１５ｍｌの水（群１＆群３）または飼料添加物（群２＆群４）のいずれかが与えられた。この処置を２週間にわたって繰り返した。この処置が終了したとき、群３および群４のマウスをエーテル麻酔下での開腹術に供した。１．５ｃｍの切開を腹壁において行った。腸の刺激を乾燥ガーゼによって行った。マウスはすべて、開腹術の２４時間後に屠殺され、脾臓が切除された。脾臓細胞を単離して、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の存在下においてＲＰＭＩ培地で４８時間〜７２時間培養した。飼料添加物で処置された群において、開腹術によって低下した脾臓細胞の増殖活性が回復した。
ＰＨＡにより誘導される脾臓細胞の増殖
１．コントロール群／水                ３０６０±２９０
２．コントロール群／水／開腹術        ２１２０±３００
３．試験群／バイオカクテル            ２７４０±３７０
４．試験群／バイオカクテル／開腹術    ３０４０±５２０
【００９９】
実施例２３
ヒトにおける食物添加物（実施例４）の適用；免疫刺激に対する証拠
多数の患者が、子宮、頸部、胃および腸の悪性腫瘍のために手術されていた。婦人科患者（２０名の患者）はその後の定期的な放射線療法を受け、腹部患者（３０名の患者）は化学療法を受けた。約半数の患者には、治療期間中、食物添加物が１日に２回与えられた。食物添加物が与えられたすべての患者において、下記に表されるように、著しい免疫刺激が認められた：
0004410992.tif 000006
【０１００】
実施例２４
配合物の細菌保存作用
大腸菌細胞を、上記の実施例１に記載されるように調製された配合物に分散させて、室温において６ヶ月間保った。６ヶ月の期間の開始時および終了時の両方で、分散物に由来するサンプルを適切な連続希釈で栄養ブロス寒天平板に播種した。コロニー形成ユニット数を両方のサンプルについて求めた。測定された濃度は両方の場合において１ｘ１０７であった。このことは、微生物を保存することにおける配合物の効果を示している。上記の実験はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）との比較で行われたが、同じ結果が得られた。
【０１０１】
本発明がその具体的な実施形態とともに記載されているが、多くの代替および改変および変化が当業者には明かであることはいうまでもないことである。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替および改変および変化を包含するものとする。本明細書中で言及されているすべての刊行物および特許および特許出願は、個々の刊行物または特許または特許出願のそれぞれが、参考として本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのようにそれと同じ程度に、参考として本明細書中にその全体が組み込まれる。さらに、本明細書中におけるいずれかの参照事項の引用または同一化は、そのような参照事項が本発明に対する先行技術として利用できるという許可として解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、本発明によるディスペンサーの概略図である。
【図１】
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