(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に連続的な不溶性グリコサミノグリカンおよびコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスによって包囲された、軟骨細胞成熟の別個のゾーンに分離しているのではなくランダムに組織化された複数層の細胞を有する、ビグリカンを実質的に含まない生体外軟骨の有効量を含んでなる、損傷軟骨または欠損軟骨を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
メッド酸を富化した膜リン脂質を含む軟骨の有効量を含んでなる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
膜リン脂質のメッド酸含量が、該膜リン脂質の総脂肪酸含量の少なくとも約０．４％である請求項２記載の組成物。
【請求項４】
リノール酸が欠乏した膜リン脂質を含む軟骨の有効量を含んでなる請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
膜リン脂質のリノール酸含量が、該膜リン脂質の総脂肪酸含量の約０．５％未満である請求項４記載の組成物。
【請求項６】
膜リン脂質のリノール酸含量が、該膜リン脂質の総脂肪酸含量の約０．２％未満である請求項４記載の組成物。
【請求項７】
アラキドン酸が欠乏した膜リン脂質を含む軟骨の有効量を含んでなる請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
膜リン脂質のアラキドン酸含量が、該膜リン脂質の総脂肪酸含量の約０．５％未満である請求項７記載の組成物。
【請求項９】
膜リン脂質のアラキドン酸含量が、該膜リン脂質の総脂肪酸含量の約０．２％未満である請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
軟骨が、内皮、骨および滑液細胞を実質的に含まない請求項２記載の組成物。
【請求項１１】
軟骨が、ＯＨ-プロリン１ｍｇ当たり少なくとも約４００ｍｇのＳ-ＧＡＧ含量を有する請求項２記載の組成物。
【請求項１２】
軟骨が、ＯＨ-プロリン１ｍｇ当たり約８００〜約２５００ｍｇのＳ-ＧＡＧ含量を有する請求項２記載の組成物。
【請求項１３】
軟骨が、Ｉ、IIIおよびＸ型コラーゲンを実質的に含まない請求項２記載の組成物。
【請求項１４】
ビグリカンを実質的に含まないマトリックスを含む軟骨の有効量を含んでなる請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
高分子量アグリカンが富化した軟骨を含んでなる請求項２記載の組成物。
【請求項１６】
高分子量アグリカンが、軟骨の総プロテオグリカン含量の少なくとも約８０％を構成する請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
高分子量アグリカンが、軟骨の総プロテオグリカン含量の約９０％を構成する請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
軟骨の有効量を含んでなる請求項１記載の医薬組成物であって、
（ａ）メッド酸を富化し、かつリノール酸およびアラキドン酸を欠乏させた膜リン脂質を含むこと、
（ｂ）高分子量アグリカンを富化したこと、
（ｃ）内皮、骨および滑液細胞を実質的に含まないこと、
（ｄ）ビグリカンを実質的に含まないこと、
を特徴とする組成物。
【請求項１９】
軟骨が、連続的な不溶性グリコサミノグリカンおよびビグリカンを含まないコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスによって包囲されている複数層の細胞を有することをさらに特徴とする請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
軟骨が、実質的に連続的な不溶性グリコサミノグリカンおよびリノール酸とアラキドン酸の両方が欠乏したコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスによって包囲されている複数層の細胞を有することをさらに特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
軟骨が、Ｉ、IIIおよびＸ型コラーゲンを実質的に含まない請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
軟骨が、リノール酸が欠乏した膜リン脂質を含むことをさらに特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
軟骨が、アラキドン酸が欠乏した膜リン脂質を含むことをさらに特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
軟骨が、内皮、骨および滑液細胞を実質的に含まない請求項１記載の組成物。
【請求項２５】
軟骨が、高分子量アグリカンを富化したものである請求項１記載の組成物。
【請求項２６】
軟骨が、Ｘ型コラーゲンを実質的に含まない請求項１記載の組成物。
【請求項２７】
膜リン脂質を含み、軟骨細胞成熟の別個のゾーンに分離しているのではなくランダムに組織化された複数層の細胞を有する生体外軟骨の有効量を含んでなる、損傷軟骨または欠損軟骨を処置するための医薬組成物であって、
（ａ）該膜リン脂質が、メッド酸を富化し、かつリノール酸およびアラキドン酸を欠乏させたものであること、
（ｂ）該軟骨が、高分子量アグリカンを富化したものであること、
（ｃ）該軟骨が、内皮、骨および滑液細胞を実質的に含まないものであること、
（ｄ）該軟骨が、ビグリカンを実質的に含まないものであること、
を特徴とする組成物。
【請求項２８】
軟骨が、IIIおよびＸ型コラーゲンを実質的に含まない請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
細胞が、実質的に連続的な不溶性グリコサミノグリカンおよびコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスによって包囲されていることをさらに特徴とする請求項２７記載の組成物。
【請求項３０】
軟骨が、Ｉ、IIIおよびＸ型コラーゲンを実質的に含まない請求項２７記載の組成物。
【請求項３１】
メッド酸を富化し、内皮、骨および滑液細胞を実質的に含まない軟骨の有効量を含んでなる請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３２】
メッド酸を富化し、リノール酸およびアラキドン酸を欠乏させた軟骨の有効量を含んでなる請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３３】
メッド酸および高分子量アグリカンを富化した軟骨の有効量を含んでなる請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３４】
内皮、骨および滑液細胞ならびにＩ、IIIおよびＸ型コラーゲンを実質的に含まない軟骨の有効量を含んでなる請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３５】
高分子量アグリカンを富化し、内皮、骨および滑液細胞を実質的に含まない軟骨の有効量を含んでなる請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３６】
高分子量アグリカンが、軟骨の総プロテオグリカン含量の少なくとも約８０％を構成する請求項２７記載の組成物。
【請求項３７】
高分子量アグリカンが、軟骨の総プロテオグリカン含量の約９０％を構成する請求項２７記載の組成物。
【請求項３８】
軟骨が、ＯＨ-プロリン１ｍｇ当たり少なくとも約８００ｍｇのＳ-ＧＡＧ含量を有する請求項２７記載の組成物。
【請求項３９】
軟骨が、ＯＨ-プロリン１ｍｇ当たり約８００〜約２５００ｍｇのＳ-ＧＡＧ含量を有する請求項２７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、一般に新規な新軟骨（neocartilage）組成物に関し、この新軟骨組成物は、インプラント（移植組織）や、損傷軟骨または欠損軟骨用の代替え組織として有用であり、また、関節軟骨疾患の研究用モデル系や、天然化合物および合成化合物に対する関節軟骨応答の研究用のモデル系として有用であり、さらに、バイオテクノロジー産業において有用な軟骨由来物質の単離用として有用である。
更に詳しくは、本発明は、実質的に連続的な不溶性グリコサミノグリカンおよびコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスによって包囲された複数層の細胞（多層細胞）を有する新軟骨、特にヒト新軟骨に関し、この新軟骨の膜リン脂質は、抗炎症性n-9脂肪酸、特に20：3 n-9エイコサトリエン酸またはメッド酸（Mead acid）が富化されている。また、本発明は、軟骨細胞を実質的に血清を含まない増殖培地で増殖することによってインビトロで新軟骨を形成する方法に関する。さらに本発明は、新軟骨形成の向上に有効な化合物を含んでなるならし増殖培地を製造する方法および軟骨由来物質を単離する方法を提供する。
成人の関節軟骨は、大半の他の組織と異なって、自己修復性を有しない。正常な関節軟骨は、軟骨に特異的なコラーゲン（II、VI、IXおよびXI型コラーゲン）と、圧縮力に耐えうる特異的な能力を軟骨に付与する凝集性プロテオグリカン（アグリカン）との特有な組み合わせを含んでなるヒアリン軟骨である。
軟骨細胞は、インビボで正常な関節軟骨組織を増殖する軟骨特異的細胞である。しかしながら、成人の軟骨細胞は、一般に、再生により新しい軟骨をインビボで形成する能力を失っているが、組織恒常性の維持には関与している。
伝統的な細胞培養法を用いてヒト関節軟骨を増殖する試み、例えば、血清含有増殖培地を用いて組織培養プラスチック表面上に軟骨細胞を増殖する試みは、不成功に終わったことがわかっている。血清（遠心沈降し凝固した、血液の非赤血球部分）は、軟骨細胞の有効なマイトジェン（分裂誘発因子）であることが知られているが、血清含有増殖培地での培養は、軟骨細胞表現型の逆分化をもたらすことが報告されている。
この分野でよく知られているように、単層の軟骨細胞をプラスチック製培養容器上で長期間増殖させると、軟骨細胞の球面形態が損なわれ、細長い繊維芽細胞の形態が形成される〔Reginatoら，Arthritis & Rheumatism 37:1338-1359（1994）〕。この形態学的変化に伴う生化学的変化には、関節軟骨表現型の損失、例えば丸みを帯びた細胞形態の損失、軟骨特異的コラーゲンおよびプロテオグリカンの合成抑制、IおよびIII型コラーゲンの合成開始および小型の非凝集性プロテオグリカンの合成増加が包含される〔Reginatoら、前掲〕。
成人のヒト軟骨細胞は、血清含有増殖培地の組織培養プラスチック上で直接増殖しても、プラスチック基体に付着してしまうため、グリコサミノグリカンが富化した不溶性マトリックスの沈降がうまくいかない。グリコサミノグリカンは、関節軟骨の生理学的機能に必須であるプロテオグリカン成分であって、ヒアリン組織にとってその特性を示すものである。血清含有増殖培地を用いる方法によって形成した細胞外マトリックスは、当初、グリコサミノグリカンは豊富でなく、細胞培養のエージングにつれてマトリックス材料の吸収が起こる。
インビトロでの軟骨細胞の逆分化を解消する試みには、軟骨細胞を、高密度で培養し、懸濁培養液中または細胞の組織培養プラスチックへの拡散／付着が防止された基体上で、増殖することが包含される。Reginatoらは、血清補足DMEM増殖培地中、ポリHEMA被覆プラスチック製培養皿上で培養する、ヒト胎児軟骨細胞を増殖する方法を開示する〔Arthritis & Rheumatism 37:1338-1359（1994）〕。この方法は、軟骨特異的表現型を維持している点で成功を収めているが、単に、関節軟骨に似せた結節状物質を生成しているにすぎず、関節軟骨組織のような連続層は、形成できない。
Kuettner,米国特許番号4,356,262は、ウシ軟骨性組織を形成する方法を開示し、この組織から、抗侵入因子を回収することができる。この方法では、ローラーボトル中、血清含有増殖培地の懸濁液にて単層の軟骨細胞を高濃度で培養している。この方法は、細胞外マトリックスを有する組織の結節状物質が形成されるにすぎず、連続層の関節軟骨組織は形成されない。
軟骨細胞の組織培養プラスチックへの付着を防止する別の方法が開示されている（Kandel,米国特許番号5,326,357）。この特許は、ウシ軟骨組織を、多孔質組織培養インサート基体に播種して、軟骨組織をインビトロで再構築する方法を開示し、この多孔質組織培養インサート基体には、血清含有増殖培地における軟骨細胞の付着促進および増殖促進のため、この血清含有増殖培地に予めI型コラーゲンが被覆されている。組織培養インサートは、軟骨細胞を組織培養プラスチックから分離するために用いられる。この方法では、天然ウシ軟骨に似せた細長く球状の軟骨区域を有する連続軟骨性組織が生成される。
近年、容易に入手しうる代用組織を用いずに、人工的代用物（プロテーゼ）または生体軟骨細胞のいずれかを用いて軟骨の欠損を生物学的に再表面処理する関節軟骨修復法に対し、注目が集まっている。インビトロで関節軟骨を修復する方法には、軟骨細胞を注入可能な細胞として移植する方法や、軟骨細胞を三次元的足場（マトリックス）中に埋設した細胞組成物として移植する方法が包含される。これらの方法は、インビトロ新軟骨形成法と同様に、完全に満足のゆく方法とは言えない。このような修復法の１つとして、自己免役軟骨移植法がある（Vacantiら，WO90/12603）。この方法では、患者から採取した正常軟骨細胞を、外科的に取り出し、培養して、細胞数を増加させ、次いで欠損部位に注入し、骨膜フラップで所定の場所に固定する（Brittberg,M.ら，N.Eng.J.of Med.,331:889-895（1994））。この方法の遂行には、２つの別々の外科的過程が必要である。
同種移植片移植法は、単一の外科手術を必要とし、この方法で使用するインプラントは、天然または合成の三次元的足場上に播種して増殖させたドナー軟骨細胞から形成される（Vacantiら，米国特許番号5,041,138;Gendler,EP 0739631 A2）。このような方法によれば、天然または合成の三次元的足場は、軟骨組織をインビボで形成する間に、細胞培養構造を形成して天然の細胞外マトリックスを模すために、準備される。
しかしながら、近年、自己免役性移植法および同種免役性移植法は、いずれも、関節軟骨の調和のとれたインビボ増殖が得られず、むしろ、軟骨細胞の逆分化および繊維軟骨の形成をもたらすことが、判明した。繊維軟骨は、そのアグリカン含量の低下によって、関節軟骨と同じ生化学的ストレスに耐えることができない。繊維軟骨は、使用するにつれて退化し、関節修復後の繊維軟骨の形成は、関節の機能障害や永久的な不安定性を促進しうる。
容易に入手可能な代用組織の臨床的な要請に加え、関節軟骨疾患の研究用のモデル系として使用するためや、増殖因子、サイトカインおよび医薬組成物に対する軟骨細胞の応答を評価するために、健全な関節軟骨が必要である。
骨関節炎は、関節疾患のごく一般的な形態であって、米国単独でもほぼ1千6百万人の人々が骨関節炎に冒されている。骨関節炎は、その軟骨表面の現れる病変を特徴とする。加齢や疾患の進行につれて、この病変には、プロテオグリカン含量の著しい減少や、コラーゲン構造の著しい破壊や、組織の水和状態の著しい増加や、その後の関節機能障害を伴う。
骨関節炎は、荷重を担う関節、特にひざ、腰、腕および足関節の軟骨内に発症するようである。正常な生理学的状態下では、軟骨恒常性は、常在性軟骨細胞によって維持されている。この非常に特異的な細胞は、凝集性プロテオグリカンや、II型、VI型、IXおよびXI型コラーゲンを含め、軟骨細胞外マトリックスの全ての成分を合成し、組み立て、再生するように機能する。骨関節炎の生物学的基礎を確証するため、集中的な研究作業にも拘わらず、その発症および進行のメカニズムについての理解は、乏しいままである。
ヒト骨関節炎におけるコラーゲン分解活性の特徴を研究する近年の試みが示すように、疾患進行の生物学的早期事象を解明するためには、動物モデルに代わる信頼性あるモデルが必要なことが明らかである。大半の動物モデルは、ヒトの疾患に関与する複雑な酵素作用を表示しない。すなわち、動物モデルは、ヒトの骨関節炎に対する疾患治療剤の有効な作用を評価するのに不十分である。
関節軟骨疾患の研究をするためや、天然／合成化合物に対する関節軟骨の応答を研究するための正常関節軟骨には、欠点がある。なぜなら、現在入手しうる健全関節軟骨供給源は、退化性の変化を示しうる死亡した成人ドナーからのみからだからである。
発明の概要
したがって、本発明のいくつかの目的のうち、次のような目的がある。
新規な新軟骨組成物およびその用途を提供すること。
このような新軟骨組成物を製造する方法およびこの方法に使用されるならし増殖培地を製造する方法、および組織操作に有用な軟骨特異的成分を提供すること。
本発明の新軟骨は、例えば、損傷または欠損軟骨用の代用組織として有用であり、また関節軟骨疾患および天然／合成化合物に対する応答を研究するためのモデル系として有用である。例えば、新軟骨の外科用インプラント（移植組織）または同種移植片は、インビトロで形成され、動物モデルの天然軟骨に外科的に付設して、損傷した欠損を外科的に修復する。
したがって、要約すれば、本発明は、1またはそれ以上の属性を特徴とする新軟骨を提供する：メッド酸を富化した膜リン脂質を含むこと、リノール酸またはアラキドン酸を欠乏した膜リン脂質を含む軟骨を含むこと、内皮、骨および／または滑液細胞を実質的に含まないこと、OH-プロリン1mg当たり少なくとも約400mgのS-GAGを含むこと、I、IIIおよびX型コラーゲンを実質的に含まないこと、ビグリカンを実質的に含まないマトリックスを含むこと、高分子量アグリカンが富化したこと、無血清増殖培地を用いてインビトロで製造すること、非軟骨材料を本質的に含まないこと、実質的に連続的な不溶性グリコサミノグリカンおよびコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスによって包囲された多層細胞を有することを特徴とすること。
本発明は、さらに、実質的に血清を含まない増殖培地によって新軟骨を成長させる方法を提供する。まず、軟骨細胞を単離し、この軟骨細胞を、単層細胞培養株の生成に有効な手段を用いて表面に固着する。細胞培養株を、実質的に血清を含まない増殖培地によって増殖して本発明の新軟骨を形成する。このようにして新軟骨は形成されるのである。
本発明は、また本質的に純粋な軟骨特異的巨大分子を含んでなる生物学的材料を提供する。
また本発明は、ヘパリン結合性増殖因子を含んでなり、その少なくとも１つは、軟骨由来の形態形成性タンパクであることを特徴とする、軟骨細胞培養株の増殖への使用に適したならし増殖培地を提供する（Changら，J.Biol Chem 269:28227-28234）。
さらに本発明の別の要旨によれば、インプラント材料のセットを提供する。この材料には、修復量のメッド酸富化新軟骨または前記したように形成した新軟骨が包含される。また、新軟骨を標的組織部位に移植して固着させるための手段が、包含される。
さらに本発明の他の要旨によれば、新軟骨の形成に有効な化合物を含んでなる調整増殖を製造する方法およびそのような調整増殖を提供し、また、無血清増殖培地を用いて軟骨由来化合物を製造する方法、およびそのような軟骨由来化合物を提供する。
さらに本発明の付加的な要旨によれば、関節疾患を環境適応化（変調）する能力を有する医薬をスクリーニングする方法を提供する。この方法によれば、本明細書に記載の新軟骨を医薬と共に、関節疾患の変調を示す特性が新軟骨において観察されるか否かを決定するのに有効な量および条件下に、共培養する。
他の目的および特徴は、その一部を、以下に記載し、明らかにする。
【図面の簡単な説明】
図1は、２つの部分を含み、図1Aおよび図1Bは、インビトロで形成したヒト新軟骨の肉眼形態である。胎児軟骨細胞を無血清条件下に120日間増殖させて、概略1.5〜2mmの厚みのヒアリン組織を生成した。12ウェルの培養皿で増殖した材料から、湿潤重量300〜400mgの物質を得た。図1Aおよび図1Bは、各々、90日培養のヒト新軟骨の側面図および鳥瞰図である。このヒアリン軟骨の構造的特性は、天然関節軟骨の構造的特性を模したものである。
図2は、血清の存在下（実線）および不存在下（破線）に、増殖した胎児軟骨細胞の増殖曲線を示すグラフである。ＤＮＡ含量を、60日の期間にわたり、Hoechst 33528蛍光染料を用い、パパイン消化に従い、測定した。ヘーリング精子ＤＮＡを標準として用いた。特殊な無血清条件下に増殖する軟骨細胞は、血清の存在下に増殖した細胞と同じ数の倍加数によって行った。
図3は、２つの部分を含み、図3Aおよび図3Bは、血清の不存在による、インビトロでの新軟骨の形成促進を示すグラフである（胎児ヒト軟骨細胞によるグリコサミノグリカンおよびコラーゲンの沈殿）。軟骨細胞は、連続酵素消化によって、ヒト胎児（妊娠18〜21週間）のひざにおける基部脛骨および末梢大腿骨の上部域から単離した。次いで、細胞懸濁液をろ過し、計数し、10％計数し含有培地に高密度で播種して（24ウェルクラスター）、固着した。交会に達したのち（7日）、クラスターを、２つの群に分割し、これにより、培養皿の半分に無血清培地（破線）を残す一方、他の部分の培養皿に血清含有培地（実線）を保持した。増殖培地に50μg／mlアスコルベートを、培地を交換するごと（通常は72時間ごと）に補足した。硫酸化グリコサミノグリカン（S-GAG）（図3A）およびヒドロキシプロリン（OH-プロリン）（図3B）について、新たに合成した不溶性ヒアリンマトリックスを次のように測定した。無血清条件下での軟骨細胞の増殖は、10％FBS中に保持した対応するクラスターに比し、少なくとも10倍多量のプロテオグリカン（硫酸化グリコサミノグリカン）を生成し、かつ２倍多量のコラーゲン（ヒドロキシプロリン）を生成した。
図4は、２つの部分を含み、図4Aおよび図4Bは、血清添加法に従い（10％FBS）、ヒト新軟骨の形態学的外観を示す（56日）。28日から56日の終了時まで、新軟骨を10％FBSで処理し（図4B）、終了時点で、新軟骨を固定し、サフラニン（safranin）-Oで染色して、アグリカンを視覚化した。図4Aは、56日の対照新軟骨（無血清）である。注目すべきは、10％FBSの添加に対する応答において、異染性染色が著しく減少した（図4B）。また、注目すべきは、新軟骨表面に存在する軟骨細胞は、平板化した細長い表現型である。これらの変化の示唆するとことによれば、物理的刺激の不存在下では、血清は、ヒアリン軟骨マトリックスの自己分解性吸収（resorption）を促進し、そのメカニズムのさらなる研究が必要である。
図5は、６つの部分を含み、図5A〜図5Fは、ホルマリン固定およびパラフィン埋め込みに従う、天然および新軟骨マトリックスの形態学的外観を示す。組織セクションは、切断し、サフラニン-O（図5A、図5Cおよび図5E）またはペンタクロム（図5B、図5Dおよび図5F）のいずれかで染色して特異的細胞外マトリックス成分を視覚化した。
サフラニン-Oは、赤色に染色し、S-GAGを同定する一方、ペンタクロムは、コラーゲンについては黄色に染色し、プロテオグリカンについては緑色に染色し、エラスチンについては黒色に染色した。組織は、コラーゲンおよびプロテオグリカンが富化されているため、ペンタクロムの染色によってアクアブルーに染色された。
図5Aおよび図5Bは、図5C〜図5Fの新軟骨移植片の形成に用いた胎児基部脛骨の長手断面を示す。
図5Cおよび図5Dは、無血清条件下に新軟骨を増殖し、90日で収穫したものを示す。
図5Eおよび図5Fは、新軟骨形成に対する血清の抑制作用を示す（0日〜30日）。（10％FBS）。
血清補足によって、細胞層は、破壊され、組織培養株表面から30日後に分離した。注目すべきは、図5Cおよび図5Dに示すように、完全厚みの90日新軟骨は小さいフラクションのみである。軟骨細胞は、各小かに局在して、ヒアリン組織を形成することが示され、このヒアリン組織は、視覚的に、天然出発物質とは外観が区別できなく、15〜20細胞層の深さに拡大している。倍率は、図5A、図5B、図5Eおよび図5Fについては200倍で、図5Cおよび図5Dについては400倍である。
図6は、6つの部分を含み、図6A〜図6Fは、透過型電子顕微鏡（TEM）による新軟骨マトリックスの超微細構造特性を示す。図5の代表的培養株は、グルタルアルデヒドで固定し、オスミウム-四酸化物で後固定し、タンニン酸およびウラニルアセテートで全体を染色した。超薄膜セクションを、常法によってウラニルアセテートおよびクエン酸鉛で逆染色した。高倍率61,900倍ECM（B、D、F）：天然（図6Aおよび図6B）および新軟骨組織；10％FBSの存在下増殖（図6Eおよび図6F）または不存在増殖（図6Cおよび図6D）。
注目すべきは、図6Eは、培養物質の全厚みを示し、これら軟骨細胞は、細胞間の接触を示す。II型コラーゲン（直径20nmの原繊維）は、これら組織の各々において主構造タンパクを構成し、処理した組織が天然のヒアリンであることが確認された。低倍率：3,365倍（A、C、E）。マトリックスプロテオグリカンの欠如は、恐らく、図6Fに見られるような、コラーゲン原繊維の堆積に貢献する。
図7は、制限ペプシン処理および中性塩沈殿によって得られたマトリックス関連コラーゲンのSDS-PAGEおよびウエスタン分析を示す。
S1およびS2は、新軟骨組織の二重試料（90日）である一方、FCおよびSkは、各々、天然胎児の軟骨および皮膚である。
II型、IX型およびI型コラーゲンに対する抗体は、Oncogene Sciencesから得た。
分析は、II型コラーゲンの存在およびI型コラーゲンの不存在を示す。陽性対照（胎児皮膚）のみが、I型コラーゲンに対して向けられたモノクローナル抗体を認識した。
図8は、２つの部分を含み、図8Aおよび図8Bは、胎児関節軟骨のサイトカイン誘発性吸収を示す。処理および未処理の新軟骨培養株の相対的な外観からわかるように、サイトカインに暴露された新軟骨は、その寸法が著しく減少し、プラスチック表面から取り除かれたことを示す。
組織は、前記したように増殖し（28日）、さらに、36日間、示したサイトカインまたは増殖因子の濃度を増加させながら、刺激した（図8B）。
サイトカインは、新鮮なアスコルベート含有培地に、48時間ごとに添加した。
消耗した培地は、S-GAG、ヒドロキシプロリン含量の分析、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）合成のため、各供給ごとに、集め、凍結した。
同様に、残りの新軟骨を、ECM成分の化学分析のために、凍結した。
注目すべきは、各場合において、IL-1およびTNF処理サンプルは、プラスチック表面からの離脱によって著しく損なわれ（図8A）、これは、MMPの増加した合成および活性化は、組織の構造的一体性を減少させたこと意味する。
図9は、４つの部分を含み、図9A〜図9Dは、対照（図9Aおよび図9B）および活性化（図9Cおよび図9D）新軟骨（インターロイキン-1で刺激）の細胞外マトリックスの比較を示す。継続的IL-1刺激は、プロテオグリカンおよびコラーゲンについての軟骨染色を変化させることがわかる。
60日の新軟骨は、1ng/ml rhIL-1βで30日間処理した。新鮮な培地およびサイトカインを48時間ごとに添加した。
新軟骨は、90日で収穫し、サフラニン-Oおよびペンタクロムで前記したように染色した。染色の強さは、未処理対照（図9A,B）に比し、刺激によって（図9C,D）著しく減少した。
IL-1による軟骨細胞の活性化は、合成したマトリックス厚みの著しい減少を引き起こした。IL-1刺激後のペンタクロム染色の変化は、コラーゲンのMMP介在分裂が、コラーゲンに対するペンタクロム染料の結合特性に直接影響を与えることを示唆する。倍率100倍。
図10は、２つの部分を含み、図10Aおよび10Bは、胎児関節軟骨細胞（新軟骨椎間板）におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）のサイトカイン介在生成のSDS-基質ゲル（チモグラム）分析を示す。陰性の染色は、活性プロテアーゼの分子量（MW,kDa）を示す。
消耗した培地は、前記サイトカイン（5ng／ml）による刺激後、72時間で集め、透析／凍結乾燥によって16倍に濃縮した。
未処理試料は、ゼラチン（図10A）またはカゼイン（図10B）（0.1％）のいずれかを含む10％SDS基質ゲルで分離した。
MMPは、SDS除去後に、強力な洗浄（2.5％トリトン-X-100）によって再生し、溶解性バンドは、カルシウムおよび亜鉛含有緩衝液中、37℃×4時間インキュベートした後、Coomassie Blueによる陰性染色によって、視覚化した。
潜在性酵素活性は、レーン1〜4で示す一方、対応する活性酵素は、1mM 酢酸4-アミノフェニル第二水銀で予備インキュベートして生成した（APMAレーン5〜8）。
図11は、２つの部分を含み、図11Aおよび図11Bは、培養培地において、コラーゲナーゼ-1（図11A）およびコラーゲナーゼ-3（図11B）のサイトカイン誘発生成を示すイムノブロティングである。
細胞層は、5ng／ml rhIL-βで継続的に刺激し、消耗した培地を72時間ごとに集めた。
20μlのフラクションを、還元し、コラーゲナーゼ-1（図11A）およびコラーゲナーゼ-3（図11B）に対し単一特異性ポリクローナル抗血清でイムノブロティングした。
各ブロットについての陽性対照（精製した組替え体タンパク）は、レーン1に示し、その寸法は、50〜54kdである。
培地対照（レーン2）；未刺激対照（レーン3〜4）；3日刺激（レーン5）；6日刺激（レーン6）。
図12は、4つの部分を含み、図12A、図12B、図12Cおよび図12Dは、関節修復用外科モデルを示す。関節切開は、中央膝蓋切開および側部膝蓋転位によって行った。全厚関節欠損（基部から抹消部へ3mm、中央大腿骨骨頭の中央縁部から横断方向へ5mm）は、１５番小刀で形成した。欠損は、（冒涜することなく）キュレットで軟骨下骨口蓋に向かって、下方に掘った。新軟骨移植片の中央側部は、中央大腿骨の骨膜に縫合する一方、移植片の側面は、被移植体関節に、7-0 Proline縫合材を用いて欠損の側面縁部で縫合した。移植片の存在下、組織トランスグルタミナーゼ（Sigma Chemical Co.）をシリンジによって適用した後（Jurgensenら，J Bone Joint Surg,79-A:185-193,1997）、移植片と欠損との境界面を指圧によって5分間安定化させた。膝蓋を、次いで整復し、関節切開部分を不連続5-0 Ethibond縫合材で層状に閉じた。皮膚の切開部分を不連続表皮下5-0 Proline縫合材で閉じた。手術した膝の中央面および前面は、図12A,図12Cおよび図12B,図12Dの各々に示す。
図13は、２つの部分を含み、図13Aおよび図13Bは、ウサギ新軟骨の外科移植後、収穫時のウサギ膝の肉眼による外観を示す。3×5mmの実験的欠損を、白兎（30週、ニュージーランド）の中央大腿骨骨頭に形成した。術後6週の肉眼検査によれば、新軟骨同種移植片は、所定の場所に存在し（図13B）、その外観は、天然関節周囲に見られる。反対側面の膝の非装填欠損部分は、空のままである（図13A）。
図14は、２つの部分を含み、図14Aおよび図14Bは、リンパ球増殖によって同種移植活性を測定するのに用いた２つの別々のワンウェイ混合白血球分析についての結果を示す。図14Bの実験は、コラーゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの酵素的解離に従い、新軟骨の同種移植活性を調べるために設定したものである。記号の説明：A＝40日新軟骨から単離した軟骨細胞（胎児ドナー）；B＝30日培養株から単離した軟骨細胞（20才男性ドナー）；C＝30日培養株から単離した軟骨細胞（27才男性）；D＝30日培養株から単離した軟骨細胞（36才女性）
図14Aによれば、無関係な２人のドナーからの1×105照射済末梢血液白血球（PBL,American Red Cross,St.Louis,Missouri）は、第１ドナー（自己）または第２ドナー（同種）のいずれかからの非照射PBLと混合した。三重水素化チミジンを6日に添加した。培養株を収穫し、そのラジオラベル量を、新たに合成し計数したDNAに組み込んだ。
図14Bによれば、20〜36才の４人の異なるドナーからの1×105照射済軟骨細胞は、1×105非照射PBLと共にインキュベートし、その増殖を7日に測定した。軟骨細胞は、ドナー2から得た同種免役性PBLの増殖を模すのに失敗した。陽性（同種）および陰性（自己）対照は、比較のため、同じプレートで実験し、インキュベートした。記号の説明：PBL1＝無関係ドナー1からの末梢血液白血球、PBL2＝ドナー2からの末梢血液白血球
図１５は、ヒト新軟骨軟骨細胞の共刺激機能を示す。アフィニティカラム（R&D System）を用いてドナー2（図14A）からの半精製、1×105T-細胞を、図14に関して用いた照射済軟骨細胞と共にインキュベートした。インキュベートは、37℃×３日で行った。再度、軟骨細胞は、バックグラウンドを越える増殖応答を刺激するのに失敗した。
図１６は、軟骨細胞の二次通過によって新軟骨を付加分することは、同種移植片の厚みおよび剛性を増加させることを示す棒グラフである。10日ヒト新軟骨（12ウェル培養皿）に、二次通過によって得られた5×105軟骨細胞を付加分した。このような培養株を28日に収穫し、1×106細胞／ウェルで最初に播種した対照培養株と比較した。
図１７は、２つの部分を含み、図１７Aおよび図１７Bは、1.2％アガロースゲル上での新軟骨プロテオグリカンの特性を示す。ヒト新軟骨（35日）は、担体非含有硫酸ナトリウムで72時間ラベルした（10μCi／ml）。マトリックスプロテオグリカンは、グアニジン抽出し、エタノール析出し、激しく透析し、1.2％アガロースゲルで分別した。図１７Aは、トルイジンブルーで染色したプロテオグリカンで、図１７Bは、新軟骨の６つの複製物における組み込んだラベルの局在化を示すオートラジオグラフである。痕跡量のデコリンを、新軟骨の６つの複製物において同定する一方、12および43才の患者に存在するビグリカンは、合成されなかった。記号の説明：1（コンドロイチン-4-スルフェート、標準）；2（１２才女性）；3（４３才男性）；4〜9（ヒト新軟骨の複製物）。注目すべきは、天然デコリンは、代謝ラベル化後の新軟骨においてしか観察できない。
図１８は、２つの部分を含み、図１８Aおよび図１８Bは、新軟骨形成に対するヘパリンの作用を示す。10日新軟骨を、ヘパリンで、用量を増加させながら18日間処理した。新鮮な培地（ヘパリンおよびアスコルベートを含む）を72〜96時間ごとに添加した。培地を集めて凍結し、その後の分析に用いた。培養株28日に収穫し、S-GAG含量（図１８A）およびOH-プロリン含量（図１８B）について得られた新軟骨を次のように分析した。
図１９は、ヒト新軟骨マトリックスの軟骨由来形態形成性タンパク（CDMP）を示す。種々の年齢のドナーからの軟骨細胞の90日培養株によって形成した新軟骨を、1.2Mグアニジン-塩酸緩衝液で抽出し、ヘパリンアフィニティカラムに通した。タンパクを1M塩化ナトリウムで溶出し、Centriconフィルターを用い、10kカットオフで濃縮した。タンパクを還元条件下に12％SDSで電気泳動にかけ、Immobilon（Millipore）膜に通した。イムノブロッティングを、抗-CDMP抗体（N442,NIHから入手）でプローブした。二次抗体は、化学蛍光法を用いて検出した。記号の説明：1（胎児）；2（1日新生児）；3（８月幼児）；4（１２才青年）；5（４８才成人）。免疫反応性は、56Kdプレホーム、34Kd二量体および14〜17Kd成熟タンパクで検出した。
図２０は、６つの部分を含み、図２０A〜図２０Fは、ヒト新軟骨リン脂質-時間の関係を示すグラフである。軟骨細胞は、前記したような10％血清の存在（白丸）または不存在（黒丸）のいずれかによって増殖し、ケイ酸によって単離した膜リン脂質の脂肪酸組成は、キャピラリーガスクロマトグラフィーによって測定した。上部パネル（図２０A、図２０Bおよび図２０C）は、エイコサノイド合成のn-6ポリ不飽和脂肪酸前駆体に対応する一方、下部パネル（図２０D、図２０Eおよび図２０F）は、急速に増殖するヒアリン軟骨が豊富なn-9脂肪酸を意味する。注目すべきは、メッド酸（20：3 n-9エイコサトリエン酸）は、無血清条件下に、時間0で天然組織において同定されるよりも２倍もの多量のレベルに堆積する。加えて、血清補足は、３倍ものアラキドネート（20：4 n-６）の堆積を引き起こす。血清のメッド酸／アラキドネートの比率-無血清培養株の関係は、成人および胎児組織において、各々、反映され、同定された（Adkissonら，1991,前掲）。試料は、２回実験した。
図２１は、培養28日における、新軟骨リン脂質中に同定された豊富なポリ不飽和脂肪酸（即ち、20：3 n-9エイコサトリエン酸）を示すマスクロマトグラムである。分裂パターンは、真正な20：3 n-9エイコサトリエン酸またはメッド酸と一致した。
図２２は、２つの部分を含み、図２２Aおよび図２２Bは、ペンタクロム染色による新軟骨／脱塩骨（Lambone）組成物の形態学的外観を示す。倍率：22A、100倍；22B、200倍。
発明の詳細な説明
本発明によれば、健全な天然関節軟骨から実質的に区別できない形態学的外観を有する新軟骨組織が生成される。生成した軟骨は、強靭であるが、展性をも示す。本発明の軟骨は、培養容器から容易に取り出すことができ、また三次元的足場を用いるかまたは用いることなく増殖することができる。さらに、本発明の新規軟骨は、移植拒絶反応および炎症反応に対する抵抗性に寄与しうる、膜リン脂質脂肪酸成分を有する。この新規に開発した生物学的材料は、また、軟骨特異的巨大分子、例えば高分量アグリカンおよび、II型、VI型、IXおよびXI型コラーゲンを含め、遺伝子工学の用途に重要な精製組成物を得るのに容易な供給源として有用である。
本発明によって生成される生物学的材料は、実質的に連続的な不溶性グリコサミノグリカンおよびコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスによって包囲された多層細胞を有する新軟骨を含んでなる。さらに、新軟骨の細胞膜リン脂質は、驚くべきことにおよび有利にも、20：3 n-9エイコサトリエン脂肪酸（メッド酸）が富化され、リノール酸およびアラキドン酸が欠乏している。メッド酸含量は、好適には、総脂肪酸含量の少なくとも約2％、最も好適には約2.5〜10％である。リノール酸およびアラキドン酸含量は、好適には膜リン脂質の総脂肪酸含量の約0.5％未満、最も好適には約0.2％未満である。この新軟骨は、さらに、高含量のS-GAGおよびヒドロキシプロリン、豊富な高分量アグリカンおよび内皮、骨および／または滑液細胞を実質的に含まないこと、並びにビグリカンを実質的に含まないことを特徴とする。好適には、新軟骨は、OH-プロリン1mg当たり少なくとも約400mgのS-GAGを含み、より好適にはOH-プロリン1mg当たり少なくとも約500〜約2500mgのS-GAGを含む。好適には、高分量アグリカンは、軟骨の総プロテオグリカン含量の少なくとも約80％、最も好適には約90％を含む。本発明の新軟骨の軟骨細胞は、組成物全体に、実質的に球形で存在し、関節軟骨表現型を維持する。本発明の新軟骨組成物は、少なくとも２つの細胞層厚みの実質的に連続な層である。増殖14日後、新軟骨は、10〜15の細胞層の厚みに増殖する。新軟骨は、少なくとも120日間増殖することができ、3.8cm2の培養皿を用いた場合少なくとも2mmの厚みおよび300〜400mgの重量になる（15〜20細胞層厚み）。
新軟骨は、加圧室におけるような、インビボで関節軟骨が自然の状態で付される生化学的力を模すような条件下に増殖させた場合、実質的により大きい厚みに増殖することができる。前記したように、30日間増殖した後、新軟骨のグリコサミノグリカン含量は、OH-プロリン1mg当たり約600〜1,500mgのS-GAGである。これは、10％血清の存在下での軟骨細胞増殖の約10倍である。
新軟骨は、鳥類または哺乳類の軟骨細胞、好適にはヒト軟骨細胞を含むことができる。加えて、哺乳類軟骨細胞は、免疫介在異種移植片移植拒絶反応を防止するために遺伝子操作されたトランスジェニック動物から得ることができる（Sandrin,MSら，Nature Med 1:1261-1267,1995;Sandrin,MSら，Xenotransplantation 3:134-140,1996;およびOsman,Nら，Proc Nat Acad Sci 94:14677-14682,1997）。すなわち、新軟骨は、ヒトおよびブタまたは鳥類新軟骨を含む、哺乳類新軟骨であってよい。
動物ドナーからの器官／組織の使用（異種移植片移植）は、同種移植片器官の慢性的な不足に対する有効な解決法である。ブタ組織は、ヒトとブタの間では寸法上、組織上および生理学上、類似性を有するため、ヒトの使用に最も適しているようである。血管拒絶反応、内皮細胞活性化および異種移植片組織に対する細胞応答に関与するメカニズムに関し、近年の見解は、免疫介在異種移植片拒絶反応を抑制するように設計された新規な方策の開発につながる（Dorling,A.,Expert Opinion on Therapeutic Patents,7:1307-1319,1997）。
本発明の新軟骨は、組成物中に、生合成ポリマー構造を含めることが不要である。しかしながら、このような構造は、所望により使用することができる。別の一具体例によれば、新軟骨は、脱塩化骨同種移植片を形成する複合材料、特に外科移植に適した複合材料によって増殖することができる。
本発明の新軟骨は、非軟骨物質を含まずに形成できるため、移植組織または代用組織として用いることによって、向上した生体適合性が得られる。例えば、足場が少ない新軟骨は、容易に周囲組織に組み込むことができる一方、人工ポリマー足場を含む軟骨構造体は、もはや組み込むことができない。なぜなら、細胞が人工的な足場によってまず破壊される必要があるからである。
本発明の別の態様によれば、新軟骨は、損傷または欠損関節軟骨の修復用代用組織として使用することができる。
代用組織は、哺乳類または鳥類代用組織、最も好適にはヒト代用組織である。さらに、哺乳類代用組織は、免疫介在異種移植片移植拒絶反応を防止するために遺伝子操作されたトランスジェニック動物からの軟骨細胞を用いて生成することができる。
代用組織は、常法、例えば伝統的な外科手段または正像検査法による移植によって移植することができる。
新軟骨を含んでなる外科インプラントは、外科手術によって移植することができ、縫合または縫合と生体適合性生物学的接着剤（例えば組織用トランス-グルタミナーゼ、Jurgensenら，J.Bone J.Surg.79A:185-193）の組み合わせによってインビボで天然軟骨に付着することができる。
新軟骨代用組織は、また、化学的組織溶接のような非縫合材料取付具によってインビボで天然軟骨に付着することができる。
新軟骨は、種々の寸法の仕様に増殖して移植を容易にすることができる。
本発明の別の具体例によれば、新軟骨についての、関節軟骨疾患の研究用モデルおよび天然化合物および合成化合物に対するインビトロでの関節軟骨応答の研究用モデル系としての使用が提供される。この分野では、対象となる天然および合成化合物として、例えば、酵素、サイトカイン、成長因子、抗侵入因子、分化因子および薬剤が一般に知られている。
特に、新軟骨は、骨関節炎および関節炎症のような関節疾患の処置に有用な薬剤の試験に使用することができる。関節炎は、種々の関節由来のメタロプロテイナーゼおよび炎症メデイエイタの合成および放出の増加を特徴とする。これら酵素は、関節炎における組織破壊の直接的な原因であるため、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）は、新規な疾患変調薬の開発にとって、好適な薬剤標的である。この態様において、薬剤は、関節疾患を変調（環境適応化）する能力についてスクリーニングされる。新軟骨は、対象となる医薬と共に共培養され、関節疾患の変調を示す特性が観察されるか否かを決定するために、観察される。用量および使用条件は、特定の被験医薬に大きく依存し、常法が採用される。
本発明の別の具体例によれば、軟骨細胞からインビトロで新軟骨組成物を製造する新規方法が提供される。この具体例の方法は、次の工程を含んでなる。
軟骨細胞を単離し、
この軟骨細胞を、細胞培養株の生成に有効な手段を用いて表面に固着し（これは、軟骨細胞を、この軟骨細胞の適切な培養容器への固着に有効な量の血清を含む増殖培地によって増殖させることによって達成することができる。）、
所定量の血清を含む増殖培地を、実質的に血清を含まない増殖培地によって置換して、実質的に血清を含まない細胞培養株を生成し、ついで
実質的に血清を含まない細胞培養株を増殖して、新軟骨および新軟骨由来因子を生成する。
好適な方法によれば、胎児、幼児またはプレ青年層の軟骨細胞のような未熟ドナーから単離した軟骨細胞を、単離し、実質的に血清を含まない増殖培地で増殖して、新軟骨を生成する。
この方法に使用する軟骨細胞は、鳥類または哺乳類、好適にはヒト軟骨細胞である。さらに、この分野で既知の新軟骨を製造する他の方法、例えば、三次元構造物質または細胞拡散防止用の物質による細胞播種方法とは対照的に、付加的な異種移植片材料は、三次元新軟骨を形成する必要がない。この分野の既知方法とは異なって、本発明の方法によれば、播種のため、適切な組織培養容器、最も好適には未被覆組織培養プラスチックに、軟骨細胞を直接接触させる。足場材料は、不要ではあるが、使用することもできる。
本発明の好適な具体例によれば、細胞培養株は、ドナー関節軟骨からの未熟軟骨細胞、例えば胎児、新生児およびプレ青年層（pre-adolescent）の軟骨細胞の単離によって生成する。
軟骨細胞は、連続酵素消化技術によるような常法で単離することができる。
単離した軟骨細胞は、ついで、有効量の血清を含む基礎培地、例えばダルベッコー変性イーグル培地（DMEM）中、組織培養容器に直接播種することができ、これにより軟骨細胞を培地容器に直接固着して、分裂を促進することができる。
添加される有効量の血清は、2〜15％のウシ胎仔血清、好適には10％である。
培養株は、また、アスコルベート、異種移植片オートクリン（自己分泌性）増殖因子またはならし増殖培地を含んでなることができる。
細胞培養株は、この分野で既知の適切な培養条件下に増殖することができ、例えば細胞培養株を37℃で、加湿雰囲気下に、2〜10％、好適には5％の二酸化炭素を添加しながら、増殖することができる。
血清含有増殖培地を、半分の血清、好適には増殖培地全量の5％の血清を含む増殖培地によって、1〜10日の間、好適には7日に置換する。
5〜14日、好適には10日に、血清含有増殖培地を、実質的に血清を含まない増殖培地によって置換して、実質的に血清を含まない細胞培養株を生成する。
実質的に血清を含まない好適な増殖培地は、HL-1、そのタンパク源としてのみインシュリン-トランスフェリン-セレン複合体を含む無血清培地である。HL-1は、登録商標（Hycor Biomedical,Inc.）であり、またBioWhittaker,Walkersville,Marylandから入手することができる。他の好適な無血清増殖培地は、当業者には明白である。
実質的に無血清増殖培地は、好適には増殖期間全体を通して、定期的にその一部を変えることができる。10日を越えた後、実質的に血清を含まない培地において、本発明の新軟骨は、10〜15日の細胞層厚みになり、細胞培養株から、鉗子によって新軟骨の硬質椎間板として取り出すことができる。
実質的に無血清細胞培養株によって形成された新軟骨は、少なくとも300日間増殖することができる。120日の培養後でも、新軟骨の軟骨細胞は、逆分化せず、またI、IIIおよびX型コラーゲンを合成することがない。本発明の方法は、種々の寸法の培養容器を用いて種々の寸法の新軟骨を形成することができる。
さらに、本発明の別の態様によれば、増殖培地の製造法が提供される。この方法は、次の工程を含んでなる。
軟骨細胞を単離し、
軟骨細胞を、この軟骨細胞の適切な容器への固着に有効な量の血清を含む増殖培地によって増殖して、細胞培養株を生成し、
所定量の血清を含む増殖培地を、初めの期間経過後に実質的に血清を含まない増殖培地によって置換して、実質的に血清を含まない細胞培養株を生成し、
実質的に血清を含まない細胞培養株を増殖して、ならし増殖培地を製造し、
次いでならし増殖培地を実質的に血清を含まない細胞培養株から取り出すか、または濃縮する。
本発明の方法によって生成したならし増殖培地は、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーのような手段によって抽出することができる。またならし増殖培地は、透析および凍結乾燥によって濃縮することができる。このようにして生成したならし増殖培地は、さらなる使用のために保存される。この方法で得られたならし増殖培地は、新軟骨形成の促進に有効な化合物、例えばオートクリン因子、逆分化因子および抗インバシオン因子を含んでなる。このようなオートクリン因子うち、少なくとも2つは、本発明者によって、軟骨由来形態形成性プロテイン-1および-2とし同定されている。
ならし増殖培地を実質的に血清を含まない培地に、培地全量の約5〜30％、好適には少なくとも約30％で添加すると、これにより、新生児および幼児軟骨細胞の増殖が増加し、その後、実質的に連続な不溶性グリコサミノグリカンおよびコラーゲン富化ヒアリン細胞外マトリックスの沈殿が増加する。
本発明をさらに詳細に説明するため、次のような特定な実験例を行った。特定な実験例を本明細書に記載したが、本発明は、これらの特定な実験例またはその詳細に制限されるものではない。
特定の実験例に用いた種々の材料の供給源は、次のとおりである。
材料
ダルベッコー変性イーグル培地（DMEM）：L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびグルコース（4.5g／l）、添加、ウシ胎仔血清（FBS）および抗生物質（100x）（ペニシリンG、ナトリウム（10,000単位）およびストレプトマイシンスルフェート（25mg／標準生理的食塩水1ml）、を添加。この培地は、Life Technologies,Inc.（Grand Island,NY）から入手した。
プロナーゼ-E（タイプXIV、ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）から得た）、ヒアルロニダーゼ（タイプIII）、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-2-アミノエタンスルホン酸（TES）、およびMILLEX-GSシリンジ滅菌フィルターは、Sigma Chemical Company（St.Louis,MO）から入手した。
コラーゲナーゼ（CLS II）は、Worthington Biochemicals（Freehold,NJ）から入手した。組織培養皿（12ウェルおよび24ウェルクラスター）、ボトル頂部滅菌フィルター装置（タイプCA）は、Costar Corporation（Cambridge,MA）から入手した。
ウシ血清アルブミン（フラクションV、脂肪酸含まず）は、Calbiochem（San Diego,CA）から入手した。HL-1増殖培地は、Hycor Biomedical（現在BioWhittakerによって販売）から入手した。
実施例1
ヒト未熟および成人軟骨細胞の調製および培養
軟骨細胞は、死後8〜24時間以内に、脛骨プラトーの上部域および無傷胎児骨（18〜21週の妊娠期間、Advanced Bioscience Resources,Inc.,Alameda,CA）の大腿骨骨頭から単離した。新生児膝（8ヵ月以内）のヒアリン軟骨は、基部脛骨および末梢大腿骨の両方の骨幹端骨幹端からリブ小刀で取り出し、滅菌無血清ダルベッコー変性イーグル培地（抗生物質（2×）および1％ウシ血清アルブミン含有）に、次のような軟骨細胞の単離のために移した。より成熟した軟骨（12〜58才）の付加的な試料を同様に処理した。全ての軟骨組織は、Mid-America Transplant Association（St.Louis,MO）から入手した。また全ての組織は、使用前に、湿潤氷冷で輸送した。
胎児脚部の皮膚を取り出し、−20℃で保存して、限られたペプシン処理によって標準コラーゲン（即ち、IおよびIII型コラーゲン）を製造した。構造筋肉および他の接続組織を、無菌条件下に切断して、脛骨および大腿骨骨頭の関節表面を暴露した。十字型靭帯、半月板および滑液嚢を除去した。
関節軟骨を、その下部の松果体（即ち、より血管が分布した領域）から分離し、冷却合成軟骨リンパ（MajeskaおよびWuthier,Biochim Biophys Acta,391:51-60（1975））に移し、4回激しく洗浄して、滑液流体を除去した。残りの接続組織を軟骨から、1×トリプシン-EDTA（Sigma Chemical Co.）でのインキュベート（37℃×30分間）で除去した。酵素溶液に、新鮮な無血清ダルベッコー変性イーグル培地を補給し、渦型ミキサーで付加的に洗浄して残ったトリプシンを除去した。
この調製段階において、軟骨は、輝く白色であって、繊維組織による汚染の形跡は、全く示さなかった。軟骨は、ついで1mmのさいの目に切断し、洗浄し、50ml容の滅菌円錐管（約2g組織／管）に移した。この管は、7mlのプロナーゼ-E溶液（2mg／ml Sigma Type XIV、S.griseus）を含む（HL-1中、37℃×30分間の消化、インバイロンメンタルインキュベーションシェイカー（200r.p.m.、New Brunswick Scientific）使用）。酵素溶液を除去し、4mlのHL-1（1mg/ml BSA、抗体およびアスコルベート（50μg／ml）を含有）を添加した。この溶液に、ストックコラーゲナーゼ（HL-1中、1,000単位／ml、Worthington CLS-II）および1mlのヒアルロニダーゼ（HL-1中、5mg／ml、Sigma Type III）を、添加して、一夜、37℃で機械的に撹拌しながら消化した。翌朝、軟骨残物を、10mlの新鮮な培地で希釈し、穏やかに撹拌して（3×1分間）、残りの細胞外マトリックスから軟骨細胞を放出した。
軟骨細胞を、次いで組織残骸から、滅菌ファルコン細胞ストレイナーユニットによる重力ろ過によって、分離し、600g×10分間、臨床用遠心分離によって沈殿させた。細胞生存能力は、95％を越えた。次に、軟骨細胞をダルベッコー変性イーグル培地＋10％FBSで希釈して、12または24ウェルプラスチック培養皿のいずれかに、密度1〜2×105細胞／cm2および1mlの増殖培地中にてプレーティングし、37℃で95％空気＋二酸化炭素雰囲気下に増殖した。
軟骨細胞を、まずウシ胎仔血清に播種して、固着を促進し、細胞分裂を刺激した。アスコルベート（50μg／ml、Sigma Chemical,St.Louis,MO）を、プレーティングおよび各供給において、ほぼ72〜96時間ごとに新たに添加した。
7日において、新軟骨培養株から、血清を取り去り、10日以後は、残った100％無血清培養株（即ちHL-1中）培養株である。HL-1は、インシュリン-トランスフェリン-セレン複合体をその唯一のタンパク源として含む、既知組成無血清培地である。しかしながら、アルギニン高含量でインシュリン-トランスフェリン-セレンを補足した、他の無血清培地も、HL-1に代えて、使用することができる。胎児培養株からのならし培地を、総培地変化で20％に添加して、幼児からの新軟骨形成を向上させた。
前記した無血清条件下に、未熟軟骨細胞は、著しい増殖能力並びに不溶性ヒアリン軟骨マトリックスの合成および沈殿能力を示した。90日新軟骨組織の全体像は、図1に示す。新軟骨は、硬質であるが、展性を示し、20日後に、鉗子によって培養容器から容易に取り出すことができる。この材料は、培養30日後に縫合材料を保持するのに十分な強度であって、40日で外科移植に使用することができる。
新軟骨培養株は、前記条件に維持し、収穫して、1〜60日および90日および120日に、生化学および組織学的分析を行うことができる。比較のため、対応する培養株を、ダルベッコー変性イーグル培地＋10％ウシ胎仔血清で維持した。
実施例2
新軟骨形成の生化学的評価
新軟骨形成は、硫酸化グリコサミノグリカン（S-GAG）およびヒドロキシプロリン（OH-プロリン）の熱量分析、プロテオグリカンおよびコラーゲン合成の全般的測定の各々で評価した。新軟骨椎間板を凍結乾燥し、18時間、56℃で、500μlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.6）（5mM Na4EDTA、5mM L-システインおよび125μg／mlパパインを含有）中にて、消化した。この消化物を室温に冷却して、硫酸化グリコサミノグリカン、ヒドロキシプロリンおよびＤＮＡ含量を測定した。
パパイン消化材料の硫酸化グリコサミノグリカンおよびヒドロキシプロリン含量は、前記時間、マイクロプレート熱量分析法によって測定した（各々、Farndaleら，Biochim Biophys Acta 883:173-177（1986）およびStegemannおよびStalder,Clin Chim Acta 18:267-273（1967）参照）。コンドロイチン-6-スルフェート（Calbiochem）およびシス-4-ヒドロキシ-L-プロリン（シグマ）を標準として用いた。
ＤＮＡ含量は、Cyto Fluorマイクロプレートリーダーを用い、蛍光定量分析によって評価した。ビスベンズアミド（Hoechst 33258,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）を、1mg／mlで、水中に溶解し、使用ストックをさらに、0.1μg／mlに、10mMトリス-塩酸（ｐＨ7.4、0.1M塩化ナトリウムおよび10mM EDTAを含有）で希釈した。
各試料の10倍、20倍および50倍希釈液を製造し、10μlのアリコートを、100μlの染料溶液と混合して、分析した。蛍光を読み取り（励起波長＝355nm、発光波長＝460nm）、ＤＮＡ含量を、ヘリング精子ＤＮＡ（Gibco BRL）を用いて作製した標準曲線から決定した。
胎児軟骨細胞は、細胞成長の急速増殖段階（図2）およびマトリックス沈殿（無血清条件下の増殖時）を示し、1.5〜2.0mmの厚みおよび重量300〜400mg（3.8cm2培養皿、120日）の組織を生成した。これとは対照的に、10％血清を補足すると、硫化グリコサミノグリカンおよびヒドロキシプロリン総含量が80〜90％減少した（30日、図3）。さらに、これら試料（＋10％血清）の構造的一体性は、非常に乏しい。これら試料では、30日経過時に、培養株は、振とうおよびボーリングすることなく、採取することができなかった。付加的な28日期間の28日新軟骨（10％血清）は、＞90％のマトリックスアグリカン損失を引き起こした（図4）。この作用は、滴定可能であり、これにより、血清のいずれかの特定成分が軟骨マトリックスを直接崩壊するか、これとは別の態様として、血清が軟骨細胞由来のマトリックスメタロプロテイナーゼの合成および／または活性化を誘発することが、示唆される。
プレ青年および成人（成体）の関節軟骨からの新軟骨形成の有効性は、表1に示したが、これは、構造の発育と相関関係があるようである。新軟骨形成は、ポスト青年（post adolescent）患者から得た関節軟骨を用いたこれらの実験では、再現できなかた。
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高密度培養は、前記したように、12ウェルクラスターで行い、新軟骨形成は、収穫時まで進行させた。S-GAG総含量については、ジメチルメチレンブルーを用い、3回の試料を分析した。
組織の形態学的外観および生化学的組成の特性は、天然関節軟骨とはほぼ区別できないようなヒアリンまたは天然のヒアリンである、超構造的組織を示した。軟骨細胞は、各骨小窩内に閉じ込められ、集合プロテオグリカン（サフラニン-O）およびコラーゲン（ペンタクロム）のために異染的に染色した、多量の細胞外マトリックス内に収められた（図5）。さらに、ペンタクロム技術は、血清の存在下に維持したウシ関節軟骨細胞のクラスターの存在を予め示す弾性繊維を同定できなかった（Leeら，Dev.Biol.163:241-252（1994））。
繊維軟骨の汚染は、関節軟骨細胞を、伝統的な細胞培養法（即ち10％血清を含む培地による方法）を用いて培養する場合に遭遇する代表的な問題であるが、この問題は、新軟骨材料のペプシン処理抽出物において、Western分析（化学的蛍光検出法）または透過型電子顕微鏡（TEA）（組織固定後）によって、確認できなかった。豊富なコラーゲンは、透過型電子顕微鏡で、20nmの原繊維を含むことが同定された一方、VI型コラーゲンを示すビーズ化フィラメントは、骨小窩に局在する（図6）。I型コラーゲン繊維は、代表的には、原繊維直径100nmを示す。ウエスタン分析では、II型コラーゲンの存在が豊富な（90％）アイソタイプとして確認され、少量の軟骨特異的コラーゲン、例えばIXおよびXI型コラーゲンが同定された（図7）。
IIIおよびX型コラーゲンに対する抗体との交差反応性は、新軟骨において陰性であったが、成人関節軟骨から得たコラーゲン組成物において反応性を示した。すなわち、本発明の方法によって生成した新軟骨組織内に含まれたコラーゲンの組成は、細胞に起源を有する出発材料の外観とは区別がつけられない。しかしながら、上記コラーゲン組成は、成人および骨関節炎関節軟骨とは、I型、III型およびX型コラーゲンが検出されない点で、異なっている。
新軟骨マトリックスのコラーゲンは、ペプシン処理および中性塩沈殿によって単離することができ（Miller,EJおよびRhodes RK;1982,Methods of Enzymology 82:33-64）、軟骨バイオマトリックスの製造に使用される。本明細書に開示の培養条件は、II型、VI型、IX型およびXI型コラーゲン（これらに制限されない）を含む、正常な数量および比率の関節コラーゲンを製造するのに理想的である。
実施例3
関節軟骨疾患の研究および、天然および合成化合物に対する関節軟骨の応答の研究
新軟骨培養を、24または48ウェルプラスチック培養皿（Corning）で前記実施例1と同様に、行い、30日まで増殖した。ヒアリン軟骨マトリックスを次いで、種々のサイトカインおよび／または炎症剤（IL-1、IL-6、IL-17、TNF-αLPSおよびホルボールエステルを含む）の濃度増加による30日活性化にしたがい、刺激して自己溶菌崩壊を行った。培養培地は、48時間ごとに集め、新鮮な培地±炎症性刺激の添加によって、実質的に変えた。
培養を終了し、残った新軟骨マトリックスの生化学的組成を、前記したように分析した。対応する試料を、細胞外マトリックス成分の組織学的評価のため、光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡用に処理した。
ならし培地をもどし、軟骨細胞由来のメタロプロテイナーゼの同定は、チモーゲンゲル電気泳動並びにウエスタン分析（SDS-PAGE）によって評価した。さらなる研究として、ラジオラベル組み込みにって硫酸化グリコサミノグリカンおよびコラーゲンの合成に対する活性化剤の作用を調べた。
新軟骨材料の吸収は、20〜25日の刺激の間の肉眼検査によって、容易に明らかになった（図8）。吸収は、新軟骨直径の減少および新軟骨の培養容器からの離脱による退縮を特徴とし、組織の構造的一体性は、疑わしいことを示す。
処理および対照材料の組織学的評価（サフラニン-Oおよびペンタクロム染色）は、処理試料の硫酸化グリコサミノグリカンおよびコラーゲン含量の著しい減少を示す（図9）。透過型電子顕微鏡による研究として、多数の繊維芽細胞／マクロファージ系統に対する軟骨細胞の形態学的外観の実質的な変化を調べた（即ち、多数の微絨毛突起、平面的でスピンドル形態の細胞表面上で同定した）。他方、未処理対照の軟骨細胞は、丸みを帯びた表現型を維持した（図示せず）。
新軟骨椎間板のヒドロキシプロリンおよび硫酸化グリコサミノグリカン含量は、活性化剤の用量および種類に応じて20〜85％減少した（表２）。ザイモグラムおよびウエスタン分析の両方では、活性化剤の存在下に上向きに調節されたコラーゲン分解およびカゼインナーゼ活性が証明された。
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ホルボールエステルは、ゲラチナーゼBの合成を特異的に誘発する一方、サイトカイン処理は、基質ゲル上の多数のバンド（9〜11）の形成をもたらし、これらのうち、３つは、コラーゲナーゼ１、２および３として、ウエスタンイムノブロティングによって同定された（図11）。これら酵素の各々は、関節疾患に関与する。
この方法は、正常ヒト軟骨細胞代謝の同化および異化特性を制限（defined）無血清条件下に調べることができる点で、特異的である。新軟骨形成の前記モデルは、関節炎破壊から軟骨マトリックスを保護するための医薬の開発および評価を促進することが明白である。
実施例4
ウサギ新軟骨同種移植片の移植によるウサギ関節軟骨の外科的修復
新軟骨同種移植片を、実施例1と同様に10日の新生児から形成した。非常に注意を払って、組織調製の間に、血管付骨端軟骨の使用を排除した。
新軟骨インプラントを30日まで増殖し、固定し、染色し（組織学的評価のため）、さらに、取り出して、軟骨特異的巨大分子を分析した。この方法では、軟骨特異的コラーゲンおよびグリコサミノグリカンの両方が富化したヒアリン組織を得た（表３）。
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高密度培養は、前記したように12ウェルクラスターで行い、新軟骨形成は、40日に収穫するまで進行させた。硫酸化グリコサミノグリカンの総含量についてはジメチルメチレンブルーを用い、３回の試料で分析した。コラーゲンのアイソタイプ化は、電気泳動によって、6.5％SDS-ポリアクリルアミドゲルを用い、還元条件下に行った。
18匹の構造が成熟した（30週）雄性白兎（ニュージーランド）を、３つの群に分け、手術後１、３、６および１２週で、移植済新軟骨の治療効果を評価した。幅約3mmで、中央大腿骨骨頭の周囲5mmに広がった長方形欠損を、両方の膝に外科的に形成した（図12）。この方法の間、軟骨下の骨の冒涜は、避けた。
滅菌新軟骨インプラント（35〜45日、インビトロ）を、その後、所定の寸法に切断し、実験的欠損（右側）に、7-0 Vicryl縫合材を用いて縫合し、組織トランスグルタミナーゼを添加して（Jurgensenら，J.Bone Joint Surg.79-A,185-193（1997））、新軟骨を中央および側方周辺軟骨に固定した。未充填欠損（左側）を自然治癒に委ね、対側性模擬対照として用いた。関節切開部分は、4-0 Vicryl縫合材を用いて修復し、動物を、ケージ内で自由に活動させた。経口鎮痛剤を、痛みの必要に応じて術後、２４時間投与した。
動物は、手術に対し良好な耐性を示し、正常な行動および食欲の増加を術後24時間以内に示した。6週間で収穫した実験的欠損の肉眼検査によれば、良好な、移植片の周囲組織への固着を示す一方、未充填検査は、充填されないままであった（図13）。
実施例5
同種移植片拒絶反応の免疫学的評価
ワンウェイ（one-way）混合白血球反応（MLR）を設定し、この反応において、刺激物質集団として作用する軟骨細胞を、まずガンマ照射して、その増殖能力をブロックした。同種移植白血球（末梢血液または白血球軟層のいずれかから入手、American Red Cross）を、次いでフィコール密度勾配遠心分離にかけた。単核白血球の集団を計数し、その後、30〜45日新軟骨同種移植片から最初に単離した軟骨細胞と共に共培養した。成人細胞を、また、新軟骨と同じ条件下に増殖した30日培養株から単離した。
非照射白血球の増殖を、7日に、三重水素化チミジン（Amersham、1μCi／ml）による24時間パルスに従い、測定した（Abbas,AKら，1991,Cellular and Molecular Immunology,320-322頁）。培養プレートを凍結し、細胞を水に溶解し、核DNAを吸引し、ガラスフィルターマットに、細胞自動ハーベスターを用いて結合した。フィルターマットを、次いで乾燥し、Wallac MicroBetaシンチレーションカウンターで計数した。30〜45日新軟骨から単離した軟骨細胞では、交差マッチ（match）を示す混合白血球反応は、起こらなかった（図14B）。他方、陽性対照は、19倍の増殖増加を示した。
これらのデータは、軟骨細胞は、免疫学的に形成できるという概念を支持するものである。軟骨細胞は、その細胞表面上にMHCクラスII抗原を有すると、報告され（Elves,J.Bone Joint Surg.,56B:178-185（1974）;Jahnら，Arth Rheum 30:64-74（1987）;およびJobanputraら，Clin.Exp.Immunol.90:336-344（1992））、レスポンダー白血球集団の増殖は、少なくとも12個の異なる新軟骨試料を含む、３つの別々の分析において検出されなかった。免疫学的見解から、これらの実験は、本発明の軟骨修復法（例えば、同種移植片移植法）が実行可能でことを示す。
T-細胞系分析における軟骨細胞の共刺激機能を実験する、付加的な研究においても（Abbas,AKら，1991,Cellular and Molecular Immunology,320-322頁）、陰性を示し、共刺激分子、恐らくはB7.1（CD80）およびB7.2（CD86）は、軟骨細胞によって通常発現されない（図１５）。すなわち、本発明者によって、同種移植片受容体内に新軟骨を移植できるのに適切な培養条件が開示される。
実施例6
軟骨細胞の付加分による、新軟骨の厚みおよび構造的一体性の増加
ウサギおよびヒト軟骨細胞を単離し、12ウェル培養皿に播種し、前記したように10日まで増殖させた。この培養株の初期平面培養の間、1.4×107の細胞を、100mm培養皿の平面培養のために保存した。細胞を、その後、培養株表面から、10日に、コラーゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ法（実施例1参照）によって放出した。
軟骨細胞をろ過し、計数し、アスコルベート含有1:1混合物（ダルベッコー変性イーグル培地＋10％ウシ胎仔血清/HL-1）に、密度0.5×106／mlで再懸濁した。10日培養株（12ウェルプレート）に、1mlの細胞懸濁液を付加分して新軟骨移植片の厚みおよび構造的一体性を増加させた。培養株を、1：1混合物（ダルベッコー変性イーグル培地＋10％ウシ胎仔血清/HL-1）中に維持し、その後、HL-1培地で、40日の収穫まで増殖させた。新軟骨マトリックスの硫酸化グリコサミノグリカンの総量を前記したように定量化した。図１６は、付加分法は、硫酸化グリコサミノグリカンの総量を約50％増加させ、その結果、新軟骨マトリックスの剛性を増加させたことを示す。
実施例7
新軟骨プロテオグリカンの単離および特性
新軟骨の培養株を、実施例1記載のように形成し、35日まで増殖した。新たに合成したプロテオグリカンを、無担体[35S]-硫酸ナトリウム（55μCi／ml,Amersham前掲）を用いて代謝的にラベルした。リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄して、ユニコーポレイティッド（unicorporated）ラベルを除去した後、新軟骨マトリックスのプロテオグリカンを、4Mグアニジンで抽出し、エタノールで沈殿させた。非ラベル天然プロテオグリカンを、比較のため、１２才女性および４３才男性の関節軟骨から抽出した。20μgの硫酸化グリコサミノグリカンを、常法に従い、1.2％寒天ゲルで装填、分離した（Bjornsson,Anal.Biochem.,210:292-298（1993））（図１７）。
95％を越えるラベルした材料を、分子量で判断して、アグリカンとして同定した。しかしながら、この材料は、１０代の前半および成人に見られるアグリカンよりもより高い分子量であることに注意すべきであり、アグリカンモノマーは、より高いグリコシル化されていることを示す。天然デコリン同じ電気泳動移動度を有する少量のバンドが、新軟骨マトリックスにおいて観察された。天然関節軟骨の少量成分として存在するビグリカンは、６つの新軟骨レプリカのラジオラベル（放射能標識）組み込みによって同定されなかった。ラジオラベルした硫酸化グリコサミノグリカン全量の12〜15％のみ培養上澄み液で回収することができ、本明細書に記載のものと同じプロフィルを形成する。
すなわち、新軟骨プロテオグリカンの組成は、２つの異なった方法による成熟関節軟骨の組成とは、異なっている。まず、ビグリカンは、新軟骨の組成として同定されず、第２に、新軟骨プロテオグリカンの天然組成は、高度にグリコシル化され、高分子量のアグリカンである。このアグリカンは、組織の成長に役割を果たし、成人アグリカンよりもより大きいアビディティーを有する特異的成長因子の結合によって修復することができる。
外傷治療剤として試験するための、この材料の精製は、比較的容易で、コストが安い。1.2％寒天ゲルで同定された高分子量アグリカンバンドを取り出し、BioRadエレクトロエルーション装置を用いて溶出して精製した。予備的な研究によれば、200mgの新軟骨椎間板によって、3〜4mgの高分子量アグリカンが形成されることが証明された。
実施例8
新軟骨形成におけるヘパリン結合性タンパクの役割：TGF-β上科の２つの新規な体部の同定
胎児軟骨細胞を前記のように増殖し、10日で３つの群に分け、新軟骨形成に対するヘパリンの作用を調べた。低用量では、ヘパリンは、ある種の成長因子（例えば、関連タンパクの繊維芽細胞成長因子（FGF）系統群）の活性を、共因子として作用することによって増加させることが知られている。他方、より多量のヘパリンは、ある種の成長因子を、細胞外マトリックスから除去して、組織の修復を阻害する。
殺菌ヘパリンを培地に、最終濃度0.2、2.0および20μgで培養期間（10〜28日）の間に添加した。培地は、3〜4日ごとに交換し、回収して、分泌タンパクの電気泳動分析にかけた。細胞層を取り出し、硫酸化グリコサミノグリカン（図１８A）、ヒドロキシプロリン（図１８B）およびDNA含量を前記のように定量化した（図１８）。最高濃度のヘパリンは、マトリックス沈殿において著しい欠乏（硫酸化グリコサミノグリカンの60％抑制およびヒドロキシプロリンの33％抑制）をもたらした。この作用は、2μg／μl処理群でも明白であるが、欠乏の程度はやや劣る。
これらヘパリン結合性タンパクは、次いで新軟骨マトリックスから、Changらの方法を用いて抽出すると、分子量60kd未満の約10個のタンパクは、4〜20％傾斜法（トリス／トリシン ポリアクリルアミドゲルによって視覚化した（図１９）。ウエスタンブロット法（NIHから入手した抗体を使用）によれば、軟骨由来形態形成性プロテイン-1および-2（CDMP-1および-2）は、接続組織由来成長因子（CTGF）として存在することがわかった（図示せず）。
実施例9
無血清培地による、新軟骨のエイコサノイド合成用前駆体脂肪酸の欠乏
文献（Adkissonら、FASEB J 5:344-353（1991））は、数種の脊椎動物の正常で急速に成長する軟骨中の高濃度20：3 n-9エイコサトリエン酸および低濃度n-6ポリ不飽和脂肪酸（PUFA）（必須脂肪酸欠乏の生化学的特性）を記載する。n-6脂肪酸、特にアラキドン酸（20：4 n-6）は、炎症および移植拒絶反応の重要なメディエイタであって（Schreinerら，Science 240:1032-1033（1988））、インビトロでの28日の期間、新軟骨移植片の脂肪酸組成を特徴とする。
細胞脂質およびリン脂質フラクションの全てを常法で単離した（Adkissonら，前掲）。リン脂質フラクションから得た遊離脂肪酸のペンタフルオロベンジルエステル誘導体を調製して、SP-2380溶融シリカカラム（Supelco Inc.,Bellefonte,PA）を用いるキャピラリーガスクロマトグラフィーによる微量分析に用いた。ガスクロマトグラフィー（HPモデル5890）は、160℃で2分間保持し、10℃/minで200℃に加熱し、この温度でさらに10分間維持した。インジェクターおよび電気化学的ディテクターの両方の温度は、225℃に設定した。誘導体脂肪酸は、真性標準との共移動によって同定する一方、例外的な脂肪酸は、ピコリニルエステル誘導体のマススペクトル分析を用いる分裂パターンによって特徴づけた（Adkissonら，1991）。個々の脂肪酸の割合組成は、Hewlett Packard model 3393Aインテグレーターを用いる組込みによって測定した。
図２０は、必須脂肪酸である、培養培地（即ち、1〜10日の5〜10％ウシ胎仔血清）の成分は、単離した軟骨細胞のリン脂質貯蔵庫に組み込まれることを示す。さらに、培養培地を無血清HL-1培地に変更し、維持すると（閉鎖回路）、脂肪酸の天然補足物が保存され、これにより、低レベルのn-6ポリ不飽和脂肪酸が検出されることが明白である。新軟骨培養株を血清含有培地中に維持すると、n-6脂肪酸（上部３つのパネルに図示）は、継続して軟骨細胞リン脂質中に堆積する（開回路）。
図２１は、培養28日における、新軟骨リン脂質中に同定された豊富なポリ不飽和脂肪酸（20：3 n-9エイコサトリエン酸）のマスクロマトグラフィーである。分裂パターンは、真正な20：3 n-9エイコサトリエン酸のパターンに整合した。
n-9脂肪酸の富化によって、同種移植片拒絶反応の免疫原性を確立するのに必要なMHCクラスII分子またはB7共刺激分子の抗原発現が減少するか否かは、不明である。文献によれば、n-6ポリ不飽和脂肪酸（PUFA）の不足は、炎症細胞の侵入を、ロイコトリエン形成の抑制によって変調（modulate）する事実が支持されている（Clelandら，1984,Lipids 29:151-155,およびSchreinerら，1988,前掲）。これは、また、器官を、有り得る移植拒絶反応から保護する。
要約すると、新軟骨組織生成に使用される新規な無血清培地系は、新軟骨の同種移植片の移植を、軟骨細胞の免疫原性の調整並びに炎症性エイコサノイド／サイトカインの同化によって容易にすることができる。
実施例10
新軟骨／脱塩骨複合体の製造
60日新軟骨培養株を、実施例1記載のように、酵素によって分散し、100万の軟骨細胞を次いで脱塩同種移植片骨（Lambone（登録商標）、100〜300μmの厚み）の試料に播種した。なお、試料は、12ウェルクラスターでのインビトロ培養に適合するようにトリミングした。Lambone（登録商標）（Pacific Coast Tissue Bank,ロスアンジェルス、CA）を、培養培地で十分に洗浄して、組織処理の間に使用される残留酸化エチレンを除去した。
脱塩同種移植片骨上の新軟骨の形成は、前記したように、28日まで進行させた。新軟骨／Lambone複合体は、次いで洗浄し、一夜、10％中性緩衝ホルマリン中で、ペンタクロム染色による形態学的実験のために定着した。
図２２AおよびBは、ペンタクロム染色後の新軟骨／Lambone複合体の形態学的外観を示す。倍率：22A、100倍；22B、200倍。
以上、本発明のいくつかの目的を達成できることがわかる。
当業者ならば、本明細書の記載から、本明細書の精神および範囲を逸脱することなく、前記組成物および方法の変形例をなすことができる。このため、本明細書の記載に含まれる全ての事項は、本発明を説明するためのもので、請求の範囲に記載の本発明を制限する意図はない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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