(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反復数が正常な場合よりも増大した反復配列に関する多型を分析する方法であって、
(1)分析すべき所定の反復配列を有する標的核酸を含有する液体試料を、前記所定の反復配列と相補的な配列を有し且つ反復数が正常な標的核酸よりも少ない核酸である固相化された核酸プローブとハイブリダイズ可能な条件下で混合することにより、ハイブリダイズさせることと、
(2)前記ハイブリダイズ後に、標識され、且つ反復数に応じて標的核酸に対して結合する標識核酸を加えることで前記核酸プローブとハイブリダイズしていない標的核酸の１本鎖部分に当該標識核酸をハイブリダイズさせた前記混合物について解離処理を施すことと、
(3)解離処理した混合物について、前記解離処理を異なる解離条件に変更して繰り返すことと、
(4)前記解離条件の差と前記標識核酸からの信号とに基づいて、前記反復配列の多型の有無および反復数を決定することを具備する方法。
【請求項２】
前記解離条件が解離温度であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記解離条件の変更が、解離条件の強度を高めることであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸中の反復配列の多型を分析するための装置及び方法に関する。本発明は、反復配列の多型の有無等を確認するために有用である。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学・遺伝学の進歩により、多数の遺伝性神経疾患の原因遺伝子が同定されてきた(1)（かっこ内の数字は、本発明の属する分野における現状をより的確に把握し得るように、本明細書に引用した参照文献の番号を示す。これらの参照文献のリストは、図面の簡単な説明の前に記載されている）。その中には、塩基の置換、欠失、挿入、重複等の遺伝子変異ではなく、トリプレットリピート（3塩基反復配列）の異常な伸長が原因で発症する疾患（トリプレットリピート病）(2,3)が新たに見出されている。これらの疾患では、同一家系内においても症状が異なる臨床的多様性、世代を経るごとに若年化する表現促進現象、疾患を伝えた親の性によって次世代の重症度が異なる等の現象が観察され、臨床遺伝学的な観点から興味が持たれている。
【０００３】
トリプレットリピートの存在する遺伝子上の領域に基づいて、今日までに見出されたトリプレットリピート病を整理すると、トリプレットリピートの伸長が、▲１▼5'末端の非翻訳領域に存在する脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、▲２▼翻訳領域に存在する球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症1型、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、マチャド・ジョセフ病、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型、▲３▼3'末端の非翻訳領域に存在する筋緊張性ジストロフィー、▲４▼イントロン内に存在するフリートライヒ失調症がある。
【０００４】
これらの疾患の原因遺伝子におけるリピート数は、健常者ではおよそ40リピート以下の一定の範囲に分布し、この範囲の中で著しい多型を示すことが多い。一方、患者におけるリピート数の増大の程度は、タンパク質の翻訳領域に存在するトリプレットリピートの場合は、約40〜100リピート程度であるのに対して、非翻訳部位やイントロンに存在するトリプレットリピートの場合は、約200〜1000リピート以上という著しい増大を示す。これら原因遺伝子の生理的機能については、球脊髄性筋萎縮症がアンドロゲン受容体を、脊髄小脳失調症６型が電位依存性Ca2+チャネルのα1Aサブユニットをコードしていることが分かっている以外は不明である。
【０００５】
これらの疾患の原因遺伝子の反復配列の反復回数を測定する方法には、以下のような方法がある。
【０００６】
まず、最も古典的な方法は、サザンブロットを利用する方法であり、概略は以下のとおりである。
【０００７】
(1) 既知の制限酵素でゲノムDNA切片を切断して、多くのDNA断片を作製する。
【０００８】
(2) 該DNA断片をゲル電気泳動にかけて分画した後、得られた電気泳動パターンをナイロン膜上にサザンブロットする(4)。
【０００９】
(3) 目的遺伝子と特異的にハイブリダイズできる標識DNAプローブと前記サザンブロットされたDNA断片とのハイブリダイゼーションを行う。
【００１０】
(4) 標識プローブが結合した電気泳動パターン上のバンドを検出することによ
って、上記の目的遺伝子の反復配列の反復回数を決定する(5)。
【００１１】
また、PCRによる多型分析の一態様として、反復配列の反復回数を決定する方法も盛んに行われている。該方法では、検出すべき反復配列を増幅し得るプライマーを用いて該配列を増幅した後、増幅産物を電気泳動し、染色又はオートラジオグラフィー等を用いて該産物を検出している(6)。
【００１２】
しかし、両分析方法は何れも、電気泳動法やブロッティング法のように、複雑な実験操作を必要とするので、多大な労力及び時間を要する。また、ブロッティング法、PCR法とも電気泳動を用いるため、多検体・多項目を処理するのが困難であるのみならず、反復回数を正確に測定するためには、1塩基の差異を検出し得る極めて精度の高い電気泳動を行わなければならない。さらに、目的の遺伝子を検出するための標識として、32P等の放射性アイソトープを用いる場合には、関係法令によって取扱者が限定されるという問題もある。
【００１３】
一方、これらの分析法とは全く異なる方法として、近年、ジーンチップ（マイクロアレイ）と呼ばれる基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法と(7)、スライドグラス等にPCR産物やプラスミドDNAをスポットする方法(8)が開発された。これらの方法では、約1万個のクローンがアレイ化され、遺伝子の塩基配列決定、単塩基多型、ジーンハンティング、遺伝子発現モニタリング等の遺伝子解析への適用が試みられている。これらの方法は、多種類のDNAプローブによって効率よく測定できるために、多数の検体を同時に検出することが可能であるという利点を有している。
【００１４】
しかしながら、塩基配列に大きな差違がある核酸群から特定の核酸を検出する場合とは異なり、各反復配列の多型は反復回数のみが異なるにすぎないので、各反復配列を識別するためには、各反復配列とプローブとの会合・解離状態を微妙に調整するための複雑な手段が必要であるが、上述の方法では、このような精密な制御は不可能である。また測定が、乾燥状態で行われるために、ハイブリダイゼーションの変化をリアルタイムで検出し得ないという欠点も有している。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、多数の反復配列の多型分析を簡易に行い得る装置及び方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明は、
反復配列の多型を分析するための装置であって、
所定の反復配列を有する標的核酸を含む液体試料と接触可能な反応部が設けられた基板と、
前記反応部の所定領域表面に固相化され、前記所定の反復配列と相補的な配列を有する核酸を含む核酸プローブと、
前記核酸プローブに前記標的核酸をハイブリダイズ可能な条件下でハイブリダイズさせた後、前記核酸プローブから前記標的核酸を解離させるために前記液体試料に対して解離処理を施する解離処理手段と、前記解離処理手段による解離条件を変更する制御手段とを具備し、
前記標的核酸中の反復単位の個数に応じた解離条件の差に基いて、前記反復配列の多型の有無等を確認することを特徴とする装置を提供する。
【００１７】
ここで、「反復配列」とは、AGTAGTAGTのごとく、同一、あるいは極めて類似した「反復単位」（右の例ではAGT）が繰り返して存在する核酸配列を意味する。反復配列には、反復単位の間にスペーサー領域が介在している縦列反復配列と、反復単位の間にスペーサー領域が介在せずに、反復単位同士が直接隣接している直列反復配列があるが、本明細書にいう「反復配列」には両者が含まれる。
【００１８】
また、「多型」とは、遺伝的多型、すなわち一つの遺伝子座に複数の対立遺伝子が存在することを意味し、「多型を分析する」及び「多型分析」とは、所望の遺伝子座に存在する対立遺伝子の遺伝子型を決定するための分析を行うこと、及びその分析を意味する。それ故、反復配列における「多型分析」とは、反復単位の反復回数を決定するための分析を意味する。
【００１９】
また、「ハイブリダイズ」とは、いわゆる核酸（DNA、RNA等）の相補的配列間で起こる相補的結合を意味する。また、「解離」とは、ハイブリダイズに係る相補的結合が解けることで、一旦ハイブリダイズした標的核酸と核酸プローブが互いに分離可能な状態に離れることを意味する。また、「解離処理」とは、解離するために必要な処理を意味し、例えば、加温、アルカリ化処理等である。また、「解離条件の変更」とは、標的核酸中の反復配列の個数に応じて解離の可否が異なるように解離処理の強度を変化させることを意味する。解離処理の強度は、解離に必要な物質の濃度を変更させたり、温度変化させる方法が有る。解離条件の変更は、解離処理の強度を減らして比較する方法もあるが、逆に強度を増加させた方が条件変更による結果を測定し易いので好ましい。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００２１】
[実施例１]
本実施例では、液体試料の温度を微妙に制御することが可能な高密度DNAキャピラリーアレイモジュールを使用して、反復配列の多型を分析するための装置について説明する。
【００２２】
図１及び図２に示されているように、本実施例の装置は、基板１、該基板１の表面に設けられた液体試料を流すための細溝２、各細溝２の一端に配設された試料注入口３、試料注入口３が配設された末端とは反対側に位置する各細溝の末端が合流してなる合流路に連設された試料排出口４、細溝２の所定領域に固相化された核酸プローブ５、基板１の底に設置された薄膜６、該薄膜に埋設された加熱手段７及び温度制御手段８を具備する。
【００２３】
基板１は、微細加工に適した材質、好ましくは、ガラス、シリコン単結晶板、石英、パイレックス等の非晶質、アルミニウム、ステンレス等の金属、フッ素樹脂、ポリプロピレン等のプラスチックであり得る。シリコン単結晶板は、周知の半導体プロセス技術により容易に加工できるので最も好ましい。
【００２４】
基板１は、加工の容易さから矩形状であることが好ましいが、例えば、菱形、六角形及び八角形等の多角形、円形、楕円形のような任意の形状であり得る。
【００２５】
基板１は、任意の大きさであり得るが、基板1の形状が長方形である場合、長辺が0.1〜15cm、短辺が0.1〜15cmであることが好ましい。
【００２６】
基板１の厚さは、0.01〜0.5cmであり得る。
【００２７】
細溝２は基板１の表面に設けられており、細溝２には所定の反復配列を含有する液体試料が流し込まれる。
【００２８】
基板がシリコン単結晶板の場合には、細溝２は半導体製造プロセスにおいて周知のエッチング加工によって形成し得る。ガラスを基板として使用する場合、細溝２は、フッ化水素酸を用いたエッチングによって形成し得る。その他の材質を基板として使用する場合も、エッチング等の周知技術を用いて細溝２を形成し得る。細溝２に流し込んだ液体試料を効率的に回収し得るように、各細溝の一端は合流させ、合流路を形成することが好ましい。
【００２９】
細溝２の寸法は、測定する液体試料の容量や流動性に応じて任意の寸法であり得るが、長さ5〜100mm、幅1μm〜10mm、深さ0.1〜50mmであることが好ましい。
【００３０】
大量の検体を同時に測定し得るように、細溝２は、0.01〜50mmの間隔で、10〜10000本形成することが好ましい。
【００３１】
試料注入口３は、手動又は自動の適切な分注手段によって、細溝２に前記液体試料を注入するための開口部として設けられており、試料排出口４は、所望の吸引手段によって、各細溝２に流し込まれた各液体試料を排出せしめるための開口部として設けられている。
【００３２】
細溝２は非常に細いものであり得るので、試料注入口３及び試料排出口４を具備すれば、液体試料の注入及び排出を容易に行うことができる。
【００３３】
試料注入口３及び試料排出口４は、核酸等の試料中の物質を非特異的に吸着しにくい材料であることが好ましい。テフロンチューブ、ポリプロピレンチューブは、非特異的吸着が少ないので好適な材料である。
【００３４】
核酸プローブ５は、液体試料中に含まれる所定の反復配列と相補的な配列を有する核酸を含む核酸群である。なお、本明細書において、「核酸」には、DNAとRNAの両者が含まれる。
【００３５】
細溝２に核酸プローブを固相化する方法は、例えばScience 251:767-773(1991)に開示されている。該方法の概略は、▲１▼シリコン基板上にシラン処理を施すことにより、該基板上にアミノ基を形成し、各アミノ基に光保護分子を結合させる、
▲２▼マスクを用いることにより、所望の位置に選択的に紫外線を照射し、該所望の位置の光保護分子を外して、該位置のアミノ基のみを露出せしめる、▲３▼露出したアミノ基のみに、光保護分子を連結させた所望の核酸塩基を結合させる、▲４▼ ▲２▼及び▲３▼の工程を繰り返し、核酸プローブを伸長させる、というものである。
【００３６】
また、国際公開WO93／09668号（特表平7-506561号）、国際公開WO99/11754号にも核酸プローブを固相化するための他の改良法が開示されている。
【００３７】
核酸プローブは、注入する液体試料の容量、液体試料の核酸含量に応じた適切な密度で細溝の所定領域に固相化される。図１に示されているように、核酸プローブは、必要に応じて、約1μm〜50mmの間隔で、細溝中の複数の箇所に固相化してもよい。
【００３８】
多型分析を実施すべき所定の反復配列の反復単位が３塩基であれば、核酸プローブ５には、図３に記載した20種類の組み合わせからなる群を使用すればよい。
【００３９】
例えば、反復単位がTTG、TGT、GTT（TTGを反復単位とするTTG/TTG/TTG/TTG/TTGなる配列は、TGTを反復単位とするT/TGT/TGT/TGT/TGT/TG及びGTTを反復単位とするTT/GTT/GTT/GTT/GTT/Gという反復配列と同一であることに注意されたい）である反復配列に対して相補的な配列は、反復単位がAAC、ACA、CAAの反復配列なので、３塩基の反復単位は、４種類の塩基の組み合わせ43=64から、AAA、TTT、CCC、GGGの4つの組み合わせを差し引いた60の組み合わせをさらに3で除した20種類存在することになる。従って、多型分析を実施すべき所定の反復配列の反復単位が３塩基であれば、最高に20種類の核酸プローブを固相化することによって、任意の反復配列の多型を分析することが可能となる。同様の計算により、反復単位が４塩基の反復配列に対しては60種類、５塩基の反復配列に対しては204種類の核酸プローブを細溝２に固相化すれば、任意の反復配列の多型を分析し得ることが明らかである。すなわち、多型分析を行うべき配列が反復配列であれば、無秩序な塩基配列の組み合わせからなる一般的な配列の分析に比べて、固相化すべき核酸プローブの種類が著しく少ないという大きな利点が存する。
【００４０】
このように、反復単位が３塩基の反復配列の多型分析を行う装置では、１つの細溝に20種類の核酸を固相化すればよいが、図に示されているように、20種類の核酸が固相化された領域を複数設けることもできる。１つの装置の各細溝に反復単位の塩基数が異なる核酸プローブを固相化してもよい。あるいは、１つの細溝の異なる領域に、反復単位の塩基数が異なる核酸プローブを固相化してもよい。
【００４１】
核酸プローブ中の反復単位の個数、すなわち反復回数は２以上の任意の回数であり得るが、生体中に存在する反復配列の反復回数が、通常２〜６であることに鑑みれば、適切な分析を実施するためには、２〜６であることが好ましい。
【００４２】
薄膜６は、基板１の底部に配置されており、加熱手段７及び温度制御手段８が埋設されている。薄層６の素材は、優れた耐熱性を有し、且つ強度の高い任意の物質であり得る。本発明の装置においては、100℃程度までの耐熱性を備えていることが好ましい。薄層６に用いるのに好適な素材は、ポリイミド、ポリプロピレン樹脂、塩化ビニル樹脂、フッ素樹脂などであるが、耐熱性及び強度の観点からとりわけポリイミドが好適である。
【００４３】
加熱手段７は、細溝に注入された液体試料を加熱する機能を有する。従って、加熱手段は、細溝中の液体試料を加熱し得るように薄膜に埋設されることを要する。加熱手段は、液体試料を加熱するという機能を達し得る任意の部材であり得る。一例としては、ニッケルクロム、チタン等の金属と該金属に通電するための電圧負荷手段を有するものが挙げられる。細溝中の液体試料が一様に加熱されるように、加熱手段は、薄膜中に均等な間隔で複数個配置することが好ましい。
【００４４】
温度制御手段８は、温度検出部と温度制御部とを有し、加熱手段７によって加熱された液体試料の温度を検出して、所望の温度に達した時点で、さらなる加熱が行われないように加熱手段７による加熱を停止せしめる機能を有する。従って、温度制御手段は、細溝中の液温を検出して液温を制御し得るように薄膜に埋設されることを要する。
【００４５】
温度制御手段は、温度とともに抵抗値が直線的に変化する金属と前記抵抗値を温度に変換して、液体試料の温度が所望の温度になるように加熱手段への電圧を制御するためのマイクロコンピューターとを有する一般的なものであり得る。
【００４６】
細溝中の液体試料が一様な温度に保たれるように、温度制御手段は、均等な間隔で複数個配置することが好ましい。
【００４７】
本実施例には、液体試料中に含まれる所定の反復配列の多型を分析する方法も開示される。具体的には、上述した装置を用いた場合、以下の操作を行うようにすることができる。
【００４８】
▲１▼所定の反復配列を有する標的核酸を含有する液体試料を調製する。
【００４９】
▲２▼必要に応じて、前記標的核酸を標識する。
【００５０】
▲３▼試料注入口３から液体試料を注入して、標識した標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせる。この装置では、温度制御によって、標的核酸の二本鎖構造を一本鎖図津に解離させた後に二本鎖構造に戻す段階で核酸プローブ３との相補的結合が生じるものである。ハイブリダイズさせた直後に、好ましくは、ハイブリダイズしなかった標的核酸を除去するために、ハイブリダイズに影響を与えない組成の洗浄液（例えば、生理食塩水、緩衝液、イオン交換水等）をさらに注入して、試料排出口５から排出させる。但し、洗浄液は、温度制御を長引かせることの無いように、予め温度制御手段９による温度条件と同等の温度に加温されたものであることが好ましい。
【００５１】
▲４▼液体試料を所望の温度に加熱する。ここで、好ましくは、反復配列の個数に応じた解離条件に相当する温度に到達して解離した標的核酸を除去するために、上記の洗浄液をさらに注入して、試料排出口５から排出させる。解離条件を複数設定する場合には、異なる加熱温度毎に上記の洗浄除去してもよいし、断続的ないし連続的に上記洗浄液を注入し続けながら連続的に温度を上昇させるようにして効率化を図ってもよい。
【００５２】
▲５▼前記反復配列の反復単位の個数に応じた解離温度の差に基づいて、前記反復配列の多型を分析する
「液体試料」は、それ自身液状である生物学的材料、又は適切な液体に生物学的材料を溶解若しくは懸濁したものであって、多型分析をなすべき所望の反復配列を含有していると考えられる試料である。液体試料には、血液、唾液、精液などの体液、血球成分、生検組織、培養細胞等を溶解又は懸濁したものであり得るが、これらに限定されない。
【００５３】
「標的核酸」は、反復配列を有することが知られている任意の核酸であり得るが、とりわけ反復配列の多型が、疾病の有無若しくは疾病確率のマーカー、又は遺伝解析のマーカーとなることが明らかとなっている核酸であることが好ましい。反復配列は著しい多型を示すものが多く、疾病マーカー、遺伝解析のマーカーとしての有用性が高いので、このような反復配列を有する核酸は多数存在する。反復配列が疾病マーカーであれば、該反復配列の多型が疾病の有無又は疾病確率の指標となり得る疾病を診断するためのデータを取得することができる。
【００５４】
前述したようなトリプレットリピート病の各原因遺伝子は、特に好ましい標的核酸である。また、マイクロサテライトDNAは、遺伝分析や個体識別に用いるのに、とりわけ有用である。トリプレットリピート病の各原因遺伝子では反復単位は３塩基であり、マイクロサテライトDNAでは反復単位は1〜5塩基である。
【００５５】
標的核酸は、必要に応じて、蛍光標識、放射性標識などで標識する。
【００５６】
標的核酸を含有する液体試料は、試料注入口から細溝に注入され、標的核酸は、該核酸中の反復配列と相補的な配列を有する核酸プローブとハイブリダイズする。
【００５７】
核酸プローブに標的核酸をハイブリダイズさせた後に、液体試料を所望の温度に加熱する。反復配列中の反復単位の個数が多い核酸ほど核酸プローブと強固に結合するので、反復単位の個数が多い核酸は、反復単位の個数が少ない核酸に比べて解離しにくい。従って、このような解離温度の差を利用することによって、標的核酸中の反復配列の多型を分析すること、及び該反復配列の多型が発症の有無又は発症確率の指標となり得る疾病を診断するためのデータを取得し得る。すなわち、「解離温度の差に基づいて」反復配列の多型を分析するとは、反復単位の個数が異なる反復配列の解離温度の差を利用した操作によって多型分析を行うことを意味し、具体的には、図４〜６のような操作が考えられるが、これらの操作には限定されない。
【００５８】
以下、図４〜６を参照しながら、解離温度の差を利用して反復単位の個数を測定するための操作について説明を加える。
【００５９】
図４は、最も基本的な操作であり、標識した異常な標的核酸１１及び正常な標的核酸１２（図中、標識はFと表記）を核酸プローブ１３に結合させた後に加熱して、正常な標的核酸１２のみを特異的に解離させる。このように正常な標的核酸１２のみを解離させるとバックグラウンドレベルが低下するので測定感度が顕著に増加し、液体試料中に異常な標的核酸１１が含まれているか否かを容易に測定することが可能となる。
【００６０】
なお、1mM Na(0.006×SSC)の溶液中では、解離温度は、以下の式により決定される。
【００６１】
解離温度＝81.5℃＋16.6log(Na濃度(M))＋0.41×(%GC含量)−675/配列長−0.65×(%ホルムアミド)−(%ミスマッチ)
図５の操作では、異常な標的核酸１及び正常な標的核酸２と標識したプライマー３とのハイブリッドを核酸プローブ４に結合させた後、加熱して正常な標的核酸２と標識したプライマー３とのハイブリッドのみを特異的に、核酸プローブ４から解離せしめる。
【００６２】
図から明らかなように、プライマー２３が正常な標的核酸２２より長くなるように設定しておけば、正常な標的核酸２２の配列の全部又は大部分がプライマー２３とハイブリダイズして、固相化されたプローブ２４とは結合し得ないが、結合したとしても、プライマー２３と対合していない短い突出部が弱い結合を形成しているにすぎない。これに対して、異常な標的核酸１はプライマー２３よりも長いので、プライマー２３と対合していない突出が長く、プライマー２３と強固に結合することができる。従って、正常な核酸２２とプライマー２３とのハイブリッドは、異常な核酸２１とプライマー２３とのハイブリッドに比べて、低い温度で解離する。
【００６３】
図6の操作では、異常な標的核酸３１及び正常な標的核酸３２より短い核酸プローブ３３に、異常な標的核酸３１又は正常な標的核酸３２の一部をハイブリダイズさせた後、標識核酸３４を加え、核酸プローブ３３とハイブリダイズしなかった異常な標的核酸３１又は正常な標的核酸３２の残部に、標識された核酸３３をハイブリダイズさせる。図に示されているように、異常な標的核酸３１は、正常な標的核酸３２に比べて長いので、より多くの標識核酸３４がハイブリダイズすることができる。続いて、標識核酸３４が解離する温度付近に加温することによって、バックグラウンド値を低下させれば、異常な標的核酸３１と正常な標的核酸３２の反復回数の差が僅かであっても両者を識別し、両者の反復回数を決定することが可能となる。
【００６４】
以上のようにして、被験者から採取した検体（血液、組織抽出液等）中の反復配列の多型の有無等を確認することにより、反復配列の多型に起因する各種病態、遺伝的性格等の遺伝学的特徴の有無又はこの遺伝学的特徴の発生ないし発症の確率の指標となり得るような、疾病ないし性格診断可能なデータを取得することができる。なお、本発明は、上述した実施例に限定されることなく、公知の遺伝子工学技術を適用して、種々の自明な変更が可能である。例えば、上述した実施例は、所定量の核酸プローブを基板表面に固相化したが、基板に固相化せずにハイブリダイズさせて分子の運動状態又は分布状態を画像解析したり観察評価することによって、分析を実行させることもできる。また、ハイブリダイズの後及び解離工程の後で、それぞれ上述したような洗浄工程を実行する場合には、標識を用いない測定（例えば、エリプソメーター、走査型原子顕微鏡等）によって分析を実行してもよい。
【００６５】
本発明による反復配列の多型分析用装置及び方法を用いれば、反復回数が異なる反復配列を有する標的核酸の多型を簡易に識別し、決定することができる。本装置及び方法は、標的核酸に含まれる反復配列の反復回数が異なれば、相補的な核酸との間で形成されたハイブリッドから前記標的核酸が解離する温度が異なることを利用して標的核酸の多型を決定するものであるが、本装置及び方法は、溶液状態の試料を使用できるので、反復回数の僅かな差も検出し得るように、試料の温度を精密に制御できる。
【００６６】
また、本発明の装置及び方法を用いる反復配列の多型分析法は、電気泳動、ブロッティング法、及びPCR法を用いる従来の方法に比べて、操作が非常に簡便であり、且つ多くの検体を一度に測定できるという極めて顕著な効果を有している。
【００６７】
【発明の効果】
本発明による装置及び方法によれば、反復配列を有する標的核酸について、反復回数が異なる多型を簡易に分析することができる。また、解離条件を変更させながら、反復回数に応じたハイブリダイゼーションの変化をリアルタイムで検出することが可能であり、操作性に優れる。更に、反復回数の差が僅かであっても有無および反復数を確認できる。
【００６８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置の斜視図。
【図２】図１の線l-l'で切断した本発明の装置の縦断面図。
【図３】３塩基の反復単位からなる反復配列を有する標的核酸の多型を分析するために、本発明の装置に固相化すべき核酸プローブの組み合わせを示す図。
【図４】本発明の装置を用いた反復配列の多型分析法の一態様を示す図。
【図５】本発明の装置を用いた反復配列の多型分析法のさらなる態様を示す図。
【図６】本発明の装置を用いた反復配列の多型分析法のさらなる態様を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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