(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ］ ヒト、ラット、マウスまたはウサギの、腸細胞培養または回腸刷子縁細胞由来の腸組織または腸細胞である生物材料を用意し、
ｂ］ ａ］の生物材料を、放射標識された、タンパク質に特異的に結合することができる光反応性２−アゼチジノン化合物と共にインキュベートし、
ｃ］ ＳＤＳおよびｎ−オクチルグルコシドを含むまたはトリトンＸ−１００およびｎ−オクチルグルコシドを含む可溶化緩衝液を用いて該生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
ｄ］ 上清を、小麦胚芽レクチンアガロースを保持するデバイス上に加え、
ｅ］ ｄ］の小麦胚芽レクチンアガロースからの溶離液を、ヒドロキシルアパタイトカラムに施し、
ｆ］ ｅ］の放射標識画分を、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードし、
ｇ］ 該放射標識画分を回収し、また可能ならば沈殿させる、
ことからなる、１４５ｋＤａの大きさを有するタンパク質の単離方法であり、
ここで、光反応性２−アゼチジノン化合物が、次の式Ｉの構造：
【化１】
0004575772.tif 000016
を有し、
式中、Ｒは次の基ａ）およびｂ）：
【化２】
0004575772.tif 000017
の１つから選択される、単離方法。
【請求項２】
ａ］ ヒト、ラット、マウスまたはウサギの、腸細胞培養または回腸刷子縁細胞由来の腸組織または腸細胞である生物材料を用意し、
ｂ］ ａ］の生物材料を、放射標識されているかまたはビオチン標識されているコレステロール取込の光反応性阻害剤と共にインキュベートし、
ｃ］ ＳＤＳおよびｎ−オクチルグルコシドを含むまたはトリトンＸ−１００およびｎ−オクチルグルコシドを含む可溶化緩衝液を用いてｂ]の生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
ｄ］ 上清を、クロマトグラフィー処理に付すか、またはストレプトアビジン−アガロース上に加え、
ｅ］ 溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に加え、
ｆ］ １４０〜１５０ｋＤａの大きさの範囲に泳動したタンパク質を切り出し、溶離させ、また可能ならばリフォールドさせる、
ことからなる、１４５ｋＤａの大きさを有するタンパク質の単離方法であり、
ここで、ビオチン標識されているコレステロール取込の光反応性阻害剤が、次の構造：
【化３】
0004575772.tif 000018
を有し、
そして、ここで、ｄ］のクロマトグラフィー処理が、
Ｉ]  上清を、小麦胚芽レクチンアガロースを保持するデバイス上に加え、
II]  Ｉ］からの小麦胚芽レクチンアガロースの溶離液を、ヒドロキシルアパタイトカラムに施す、
単離方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法によって得られうるタンパク質と、式Ｉ：
【化４】
0004575772.tif 000019
［式中、Ｒは次の基ａ）およびｂ）：
【化５】
0004575772.tif 000020
の１つから選択される］
の化合物とから形成される、複合体。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法によって得られうるタンパク質と、次の構造：
【化６】
0004575772.tif 000021
を有する化合物とから形成される、複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸のコレステロール吸収に関与する腸タンパク質の単離方法、およびコレステロール吸収阻害剤に結合する能力に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいて、平均してコレステロールの約５０％は、腸の管腔に存在する。管腔内コレステロールは、主に食餌および胆汁に由来する。１日に約２ｇのコレステロールが胆汁から放出される。腸のコレステロール吸収は、胆汁酸塩の存在に大きく依存する。したがって、胆汁酸塩の再摂取阻害剤または胆汁酸塩封鎖剤の投与は、腸のコレステロール吸収の阻害をもたらす。
【０００３】
腸のコレステロール吸収の阻害は、脂質障害、動脈硬化および心血管疾患の治療の重要な目標である。専門家の間の多数の意見では、腸のコレステロール吸収は物理化学的な拡散によって行われるとされている。
【０００４】
コレステロール輸送に関し、タンパク質が関与していることを示す多数の所見が知られている。腸のコレステロール吸収は、個体間で大きな多様性が生じる。インビトロ実験からの生化学データは、タンパク質が、腸の小単層小胞と刷子縁小胞間のコレステロール交換に関係していることを示す。メチル基（β−シトステロール）とエチル基（カンペステロール）が異なるだけである、β−シトステロールとカンペステロールのような植物ステロールの腸の吸収において、大きな差を観察することできた。ヒトにおいて、β−シトステロールはとりわけコレステロール吸収の阻害を示した。内腔投与により腸のコレステロール吸収を阻害する、高度に活性な２種のクラスの化合物群が存在する。この化合物群は、１種はサポニンに由来する化合物、例えばチケシドおよびパマケシドであり、もう１種は２−アゼチジノンの特定の誘導体である。コレステロール吸収の阻害剤としての２−アゼチジノンの誘導体はCladerら, J. Med. Chem. 39, 3684-3693, 1996に記載されている。本発明の目的に関し、吸収とは、物質のタンパク質への付着、およびこのタンパク質の助けによるこの物質の輸送を意味することを意図する。
【０００５】
腸のコレステロール吸収は、血清コレステロールホメオスタシスに有意に関与する。エゼチミブまたはパマケシドのような腸のコレステロール吸収の阻害剤は、臨床試験において、新規のコレステロール低下剤としてのその有効性を証明した。それらの分子の作用様式および腸のコレステロール吸収機構は、多大な科学的努力にもかかわらず、今もなお分かっておらず、論争中である。一般に、コレステロールは原形質膜および腸の刷子縁細胞膜を超えて受動拡散すると考えられているが、腸のコレステロール吸収のためのタンパク質仲介過程の証拠が増えており：コレステロール吸収は、強力な種差を示し、比較可能な物理化学特性を有する構造的に近縁のβ−シトステロールまたはカンペステロールのような植物ステロールは、コレステロールとは対照的にわずかにしか吸収されない。これにより、単純拡散過程ではないと考えられる。意味深い構造活性的関係を有する、コレステロールの特異的輸送阻害剤である２−アゼチジノンおよびステロールグリコシドの存在は、腸のコレステロール吸収のためのタンパク質仲介過程を強く示唆する。
【０００６】
コレステロールは、人体の機能に（少量で）不可欠な多用途の化合物である。動物のみがこれを製造し；ラードのような動物由来の生産物が処理中に添加されない限り、いずれの植物生産物もコレステロールを含まない。ヒトにおいて、コレステロールは３つの主機能を果たす。コレステロールは、ステロイドまたはコルチゾン様ホルモン、例えば性ホルモンを製造する特定の腺によって用いられる。コレステロールは、肝臓が脂肪の消化にと
って必須である胆汁酸を製造するのを助ける。最後になったが特に重要なことに、コレステロールは、細胞膜および細胞構造の主成分であり、体組織の基礎的要素の一種である。コレステロールなしでは、哺乳動物の生命は存続しない。
【０００７】
コレステロールに関する問題は、体が多すぎるコレステロールを有するか、またはふさわしくない場所にコレステロールの沈着がある場合に生じる。コレステロールが、心臓自身の筋組織への酸素の主要な供給者である、心臓の冠状動脈の内壁に沈着する場合、冠状動脈性心疾患が生じる。ここで、脂肪性の強固な、プラークと呼ばれる閉塞の形成にコレステロールが関与する。このプラークの蓄積には、動脈硬化、動脈の硬化および動脈硬化と様々な呼び方がある。コレステロールはまた、体内の他の場所の動脈内にも沈着し得、ここで卒中（脳内の閉塞した動脈から）および末梢血管疾患（脚の動脈の閉塞から）の発生に関与し得る。
【０００８】
全身にわたって移動するために、コレステロールはリポタンパク質と呼ばれる特別な分子で包まれなければならない。脂質、即ち脂肪コレステロール成分は、水溶性タンパク質の皮膜中に包まれる。異なる種類のリポタンパク質は、体内の動態的経済から異なるリポタンパク質、即ちある組織へコレステロールを輸送するもの、および他の組織からコレステロールを除去するもの、を含む。体内の主要なコレステロール運搬化合物は、低密度リポタンパク質即ちＬＤＬ−コレステロールである。ＬＤＬは、動脈内のコレステロールの沈着において重要な役割を果たしているようであるため、しばしば「悪玉コレステロール」と呼ばれる。ＬＤＬは非常に小さなタンパク質（分子中で最も密度の高い内容物）を有し、主に脂肪から成るため低密度と呼ばれる。高レベルのＬＤＬは、冠状動脈性心疾患の危険性の増加と関連している。高密度リポタンパク質、即ちＨＤＬは、コレステロールを動脈壁から取り除いて、それを肝臓に輸送して排出するのを助けるようであるため、しばしば「善玉コレステロール」と呼ばれる。ＬＤＬコレステロールとは対照的に、高レベルのＨＤＬは冠状動脈性心疾患を防ぐようであるのに対して、低レベルのＨＤＬは該疾患の危険性の増加と関係している。
【０００９】
コレステロール粒子の他の亜類型としては、脂肪が消化されるときに腸の細胞によって製造されるキロミクロン、およびＬＤＬコレステロール製造の重要な前駆体として肝臓により製造される超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）がある。ＶＬＤＬは、肝臓により製造されるトリグリセリドを輸送する主要リポタンパク質である。
【００１０】
心疾患の危険性を測定するためには、ＬＤＬおよびＨＤＬが鍵となる。
【００１１】
高脂肪、高コレステロールの食餌が高レベルの血中コレステロールの一因である証拠、および高い血液コレステロールが心疾患の明確な危険因子であるという証拠の全て考えると、食餌または他の手段で血液コレステロールを低下させることによって、その危険性が減少すると考えるのは当然であるように思える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、腸のコレステロール吸収に関与し、コレステロール吸収阻害剤のための分子タンパク質標的となるタンパク質を単離する方法を提供することである。このような方法は、高コレステロールレベルを制御する治療的試みにとって、大きな利点を提供すると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、タンパク質を単離する方法に関し、ここで、
ａ］  生物材料を用意し、
ｂ］  ａ］の生物材料を、放射標識された、前記タンパク質に特異的に結合することができる光反応性２−アゼチジノン化合物と共にインキュベートし、
ｃ］  該生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
ｄ］  上清を、小麦胚芽レクチンアガロースを保持するデバイス上に加え、
ｅ］  ｄ］の小麦胚芽レクチンアガロースからの溶離液を、ヒドロキシルアパタイトカラムに施し、これをリン酸緩衝液勾配によって溶離させて、
ｆ］  ｅ］の放射標識画分を、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードし、
ｇ］  該放射標識画分を回収し、また可能ならば沈殿させる。
【００１４】
生物材料は、好ましくは、ヒト、ラット、マウスまたはウサギの、腸細胞培養または回腸刷子縁細胞由来の腸組織または腸細胞から得られる。
【００１５】
光反応性２−アゼチジノン化合物は好ましくは、次の構造（Kramer, W.ら（2000）FEBS
Letters 487, 293-297）を有する：
式Ｉ
【化１】
0004575772.tif 000002
【００１６】
式中、Ｒは次の基ａ）〜ｅ）の１つから選択される：
【化２】
0004575772.tif 000003
【００１７】
式Ｉのａ、ｂおよびｃの化合物の合成は、２００２年３月２８日に発行されたDE 10042447 A1において開示されている。式Ｉのｄおよびｅの化合物の合成は、以下の実施例に記載される。
【００１８】
分子中の光分解性基は、直接的周辺に存在する分子、好ましくはタンパク質への共有結合をつくるために使用することができる。このために、光分解性基を有する化合物を、まず最初に、共有結合がつくられることになる分子の直接的周辺にもたらす。これは例えば、その化合物中の、タンパク質の特異的阻害剤、好ましくはコレステロール吸収阻害剤として作用する部分とは別の部分を介して行うことができる。該化合物を該分子と接触させて、次いでＵＶ光で照射する。ＵＶ光の照射によって、光分解性基が活性化され、相互作用する分子、特にタンパク質への共有結合の生成が開始される。光分解性基として適当なものは例えば、ジアジリン、アジドまたはカルボニル官能基である。
【００１９】
照射のためには、例えば挿入したエチジウムブロマイドでポリヌクレオチドを可視化するために、または実験室の表面を滅菌するために使用されるような慣用のＵＶランプ、または特に「The Southern Ultraviolet Company, Hamden, CT」から入手できる光化学反応
装置を用いることができる。ＵＶ光による照射後の細胞の破壊は、慣用の方法を用いて行われる。この例としては、凍結および融解の繰返し、細胞の超音波処理、フレンチプレスの使用または界面活性剤および酵素の添加が挙げられる。細胞溶解物のタンパク質の分画は、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿により、分画遠心法またはクロマトグラフィー技術の適用により行うことができる。この目的に適当なクロマトグラフィー技術としては、例えば、１次元もしくは２次元の変性もしくは未変性のポリアクリルアミドゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーがある。これらの技術は、熟練した技術者にはよく知られており、例えば「Current Protocols in Protein Science」; John E. Caligan; Ben M. Dunn; Hidde L. Ploegh; David W. Speicher; Paul T. Wingfield; Wiley and Sons; ISBNO-471-11184-8に詳細に取り扱われている。
【００２０】
好ましくは、分画後のタンパク質の検出は、腸のコレステロール吸収阻害剤と光分解性基とを含有する化合物の放射標識によって行われる。このために用いることができる放射性同位元素は、例えば3Ｈまたは14Ｃである。適当な検出方法は、例えばタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によりポリアクリルアミドゲル上に導入し、その後Ｘ線写真撮影に用いられるフィルム材を用いて共有結合した化合物を含むタンパク質を検出することである。他の適当な検出方法は、液体シンチレーション計数またはフラット・ベッド・スキャニングである。
【００２１】
生物材料は、好ましくは腸細胞から成る。腸細胞は、例えば動物の腸の解剖、および続けて精製、結合組織の酵素分解、および等張性緩衝液中での単細胞の懸濁によって得ることができる。腸細胞の提供に適当な腸組織は、とりわけ、屠殺後に残る動物の相当部である。腸細胞はまた、手術で得られた腸部からのヒト腸組織から提供されうる。腸細胞はまた、細胞培養技術の適用によって、本発明の目的のために提供される腸細胞培養からなることもできる。腸細胞の部分は、腸細胞の細胞小器官であってよい。細胞小器官は、好ましくは腸細胞膜である。腸細胞膜は、腸細胞の破壊後に、分画遠心法により得ることができる。腸細胞の部分はまた、好ましくはタンパク質画分である。腸細胞または腸細胞部分は、好ましくは哺乳動物の腸組織の刷子縁の細胞からなる腸細胞から得られる。好ましくその腸細胞を得ることができる哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたは他の脊椎動物種が挙げられるが、これに限定されない。これらの細胞は、このような生物の腸の刷子縁組織から、細胞懸濁液を調製することによって得ることができる。適当な腸材料は、例えば外科的処置によって得られる。他の供与源は、屠殺後に残る動物の部分に由来してもよい。腸細胞系の細胞は、ひとしく好適なものである。好適な細胞調製物を調製するために、腸組織を酵素処理に付して単細胞を開放し、分画遠心法を行ってもよい。続けて、得られた細胞または細胞小器官を適当な水性媒体中にとる。これらの水性媒体は、緩衝物質、塩、タンパク質およびその他に添加剤を含んでよい。
【００２２】
本発明はまた、腸のコレステロール吸収に関与し、コレステロール吸収阻害剤に結合する結合タンパク質を単離する方法に関し、ここで、
ａ］  生物材料を用意し、
ｂ］  ａ］の生物材料を、放射標識されているかまたはビオチン標識されているコレステロール再摂取の光反応性阻害剤と共にインキュベートし、
ｃ］  ｂ］の生物材料を可溶化し、細胞破片を除去し、
ｄ］  上清を、クロマトグラフィー処理に付すか、またはストレプトアビジン−アガロース上に加え、
ｅ］  溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に加え、
ｆ］  １４０〜１５０ｋＤａの大きさの範囲に泳動したタンパク質を切り出し、溶離させ、また可能ならばリフォールドさせる。
【００２３】
生物材料は、好ましくは、ヒト、ラット、マウスまたはウサギの、腸細胞培養または回腸刷子縁細胞由来の腸組織または腸細胞から得られる。
【００２４】
ビオチン標識されたコレステロール再摂取阻害剤は、好ましくは次の構造を有する：
【化３】
0004575772.tif 000004
【００２５】
本発明はまた、上述の本発明の方法により単離されたコレステロール吸収阻害剤に特異的に結合する能力を有するタンパク質に関する。該タンパク質は、好ましくは１４０〜１５０ｋＤａの大きさであり、最も好ましくは１４５ｋＤａの大きさである。該タンパク質はおそらくはグリコシル化されている。
【００２６】
該タンパク質の分子量は、使用されるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動方法によって生じる一定の範囲の不確実性を前提として表示されるが、この不確実性は他の相当する方法についても知られている。分子量の変動は、最大＋／−１０％の範囲である。表示される値は、複数回の実験の平均に相当する。表示される分子量が１４５ｋＤａであるタンパク質の場合、互いに独立して行った１０回のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動実験の分子量決定により、標準偏差＋／−７．５５ｋＤａで、平均１４５．３ｋＤａが得られた。
【００２７】
グリコシル化を調べるのに適当な方法の詳細は、熟練した技術者であれば、「Carbohydrate Biotechnology Protocols, Methods in Biotechnology, 10 （1999） Human Press, ISBN 0-89603-563-8, C. Bucke編」において見出すことができよう。
【００２８】
本発明は、さらに、本発明のタンパク質と、次の構造を有する化合物とから形成される複合体に関する：
【化４】
0004575772.tif 000005
【００２９】
本発明は、さらに、本発明のタンパク質、並びに薬剤処方用の製薬上許容し得る化合物および／または薬剤処方用の添加剤を含む医薬組成物に関する。このような物質は一般に知られており、例えばMack Publishing社によるRemingtons Pharmaceutical Sciences（第５版）に記載されている。
【００３０】
本発明はまた、本発明のタンパク質と上述の化合物との複合体、および薬剤処方用の製薬上許容し得る化合物を含む医薬組成物に関する。
【００３１】
本発明はまた、高コレステロールレベルとリンクしている疾患の治療用の医薬組成物の製造のための、本発明のタンパク質の使用を包含する。このような疾患は、例えば肥満、動脈硬化、高血圧、心不全等である。コレステロールレベルが１９９ｍｇ／ｄＬであると、高レベルとみなされる。
【００３２】
本発明はまた、高コレステロールレベとリンクしている疾患の治療用の医薬組成物の製造のための、本発明のタンパク質と上述の化合物との複合体の使用を包含する。
【００３３】
本発明はまた、コレステロール再摂取を阻害する化合物を同定するための本発明のタンパク質の使用に関し、ここで、
ａ］  本発明のタンパク質を含む生物材料を用意し、
ｂ］  化合物を用意し、
ｃ］  該生物材料と該化合物を接触させて、
ｄ］  ｃ］の生物材料により摂取されるコレステロール量を測定し、
ｅ］  ｄ］の結果を、ａ］の生物材料と同じ種類および／または組織特異性を有するがｂ］の化合物と接触させていない生物材料からコレステロール摂取を測定した対照実験の結果と比較し、
ｆ］  ｅ］の結果において、ｂ］の化合物と接触させた細胞のコレステロール摂取の減少が測定される場合、これは、コレステロール再摂取を阻害する化合物を示している。
【００３４】
本発明はまた、高コレステロールレベルとリンクしている疾患を治療するための、このような方法により同定される化合物および製薬上許容し得る添加剤を含む医薬に関する。
【００３５】
このような化合物の分子量は、好ましくは１００〜５００００Ｄａの範囲であり、より
好ましくは１００〜５０００Ｄａである。この化合物は、化合物を含むコレステロール類似物、タンパク質、ペプチド、または脂肪酸であってよい。
【００３６】
化合物は、例えば化学合成によって得られる。該化合物は、完全合成プログラムによる化学化合物の貯蔵物およびカタログ（「化合物ライブラリ」）から得られるような、化学化合物のコレクションの一部であってもよい。他の例としては、該化合物は、微生物、特に細菌、真菌または動物または植物種により製造することもできる（天然物質）。天然物質の場合、適当な生物から単離することにより得ることもできる。タンパク質と化合物の接触は、大抵は、例えばジメチルスルホキシドまたはエタノールのような溶剤を一定の割合で混合した水溶液中で行われる。該水溶液は、緩衝物質、イオンまたは例えばタンパク質、グリセリン等のような安定化添加剤を含んでもよい。特定の一定条件、例えば温度、ｐＨ、イオン条件、タンパク質濃度もしくは化合物濃度、または体積は、該接触に都合のよいのものを用いることができる。したがって、例えば、接触させる間は温度を３７℃で一定に保つことが好ましいかもしれない。接触後の、該化合物の該タンパク質への結合は、例えば、放射標識したコレステロールまたはコレステロール吸収阻害剤との相互作用により、また別法として該タンパク質に対する該化合物の親和性の測度としてコレステロールまたはコレステロール吸収阻害剤の置換を用いて、測定を行う。
【実施例】
【００３７】
５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［２−（４−アジド−フェニル）−１−（４−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニルカルバモイル｝−ブチルカルバモイル）−エチル］アミドの合成
【００３８】
以下の節の番号１〜１４は、図１の一般的反応スキームに関連するものである。
【００３９】
ビオチン標識光反応性コレステロール阻害剤（５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［２−（４−アジド−フェニル）−１−（４−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニルカルバモイル｝−ブチルカルバモイル）−エチル］−アミド）の合成
【００４０】
前記ビオチン標識光反応性コレステロール阻害剤に関する以下の節の番号１〜１４は、図１および図２の反応スキームに関連するものである。
【００４１】
３−［５−（tert−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−５−フェニル−ペンタノイル］−４−フェニル−オキサゾリジン−２−オン（１）
【化５】
0004575772.tif 000006
３−（５−ヒドロキシ−５−フェニル−ペンタノイル）−４−フェニル−オキサゾリジン−２−オン、３０ｇをＤＭＦ５０ｍＬに溶解した。ＤＭＦ２５ｍＬ中のイミダゾール１４．３ｇおよびtert−ブチル−ジメチルシリルクロリド１９ｇを加えた後に、反応混合物を全成分が溶解するまで、室温で撹拌した（２〜４時間）。反応溶液を濃縮し、水を加えてから酢酸エチルエステルにより抽出した。有機相を硫酸マグネシウムにより乾燥し、蒸発させた後に、化合物１を得た：C26H35NO4Si (453.6) MS (ESI+) 476 (M+Na+)。
【００４２】
（４−メトキシ−ベンジリデン）−（４−ニトロ−フェニル）−アミン（２）
イソプロパノール１６０ｍＬ中のアニスアルデヒド５０ｇ（３７０ｍｍｏｌ）に、パラ−ニトロアニリン５１ｇ（３７０ｍｍｏｌ）を加えた。８０℃で２時間後に、生成物が沈殿した。反応混合物を室温に冷却し、ろ過した。残留物をイソプロパノールで洗浄した。乾燥後に、黄色結晶形態の生成物２、６２．９ｇを得た（収率６６％）：C14H13N2O3 (257.27)。
【００４３】
３−｛５−（tert−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−２−［（４−メトキシ−フェニル）−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−メチル］−５−フェニル−ペンタノイル｝−４−フェニル−オキサゾリジン−２−オン（３）
【化６】
0004575772.tif 000007
塩化メチレン１３５ｍＬ中の、生成物１、５．４ｇ（１２．０ｍｍｏｌ）、および生成物２、６．２ｇ（２４ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルエチルアミン８ｍＬを１０℃で加え、トリメチルシリルクロリド４．８ｍＬを滴下して加えた。１時間後に、塩化メチレン中の四塩化チタンの１モル溶液、１４ｍＬを−１０℃で滴下して加えた。これを−１０℃で３時間撹拌し、−３０℃で更に１２時間撹拌せずに保存した。その後、酢酸８ｍＬおよび酒石酸７％水溶液１４０ｍＬを加え、室温で更に２時間撹拌した。亜硫酸水素ナトリウム２０％水溶液５０ｍＬを加えた後に、更に１時間撹拌して、塩化メチレンで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、シリカゲル上のクロマトグラフィー、酢酸エチル／ヘプタン＝１／３→１／１により精製した。生成物３、６．３ｇ（７４％）を、明黄色固体化合物形態で得た：C40H47N3O7Si (709.92) MS (ESI+) 710 (M+H+)。
【００４４】
３−［３−（tert−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−３−フェニル−プロピル］−４−（３−メトキシ−フェニル）−１−（４−ニトロ−フェニル）−アゼチジン−２−オン（４）
【化７】
0004575772.tif 000008
生成物３、６．１ｇ（８．６ｍｍｏｌ）、ビストリメチルシリルアセタミド７．３ｍＬ、テトラブチルアンモニウムフルオリド０．５ｇ、およびtert−ブチルメチルエーテル１００ｍＬからなる混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で１０時間撹拌した。反応の終了後に、氷冷して酢酸５ｍＬをゆっくりと加え、濃縮した。残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン＝１／２）により分離した。生成物４、３．３ｇ（７０％）を明黄色固体化合物形態で得た：C31H38N2O5Si (546.74) MS (ESI+) 547.3 (M+H+)。
【００４５】
１−（４−アミノ−フェニル）−３−［３−（tert−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−３−フェニル−プロピル］−４−（３−メトキシ−フェニル）−アゼチジン−２−オン（５）
【化８】
0004575772.tif 000009
オートクレーブを使用して、５バールの水素雰囲気下で、酢酸エチル５０ｍＬ中の生成物４、３．０ｇ（５．５ｍｍｏｌ）、およびパラジウムチャコール１０％、１．０ｇを２時間反応させた。反応溶液を濾過し、濃縮し、シリカゲル上のクロマトグラフィー（塩化メチレン／メタノール＝１０／１）により分離した。生成物５、２．４ｇ（８６％）、を固体形態の無色化合物として得た。C31H40N2O3Si (516.76) MS (ESI+) 517.4 (M + H+)。
【００４６】
１−（４−アミノ−フェニル）−３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−４−（３−メトキシ−フェニル）−アゼチジン−２−オン（６）
【化９】
0004575772.tif 000010
２Ｎ塩酸水溶液１５ｍＬを、テトラヒドロフラン２０ｍＬ中の生成物５、２．３ｇに加えて、２時間撹拌した。炭酸水素ナトリウムの水溶液を反応液に加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、シリカゲル上のクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン＝１／１→１／０）により精製した。生成物６、１．１ｇを、固体形態の無色化合物として得た：C25H26N2O3 (402.50) MS (ESI+) 403.2 (M + H+)。
【００４７】
（４−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニルカルバモイル｝−ブチル）−カルバミン酸−９H−フルオレン−９−イルメチルエステル（８）
【化１０】
0004575772.tif 000011
生成物６、０．８ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、および５−（Fmoc−アミノ）−バレリアン酸
７ （Fluka）、１．３５ｇ（４．０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）１
５ｍＬに溶解した。以下のもの：TOTU （Fluka）４．８ｇ、オキシム（ヒドロキシイミノ−cyanouceti acid−エチルエステル； Fluka）１．６ｇ、およびＮＥＭ（４−エチル−モルホリン）５．５ｍＬを段階的に加えた。室温で１時間後、反応液を酢酸エチル１００ｍＬで希釈し、水で３回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ｎ−ヘプタン２：１）で精製した。生成物８、０．５８ｇ（４１％）を、非晶質固体形態で得た：C45H45N3O6(723. 8) MS(ESI+) 724.4 (M + H+)。
【００４８】
５−アミノ−ペンタン酸−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニル｝−アミド（９）
【化１１】
0004575772.tif 000012
生成物８、５７０ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）、およびジエチルアミン０．８ｍＬを、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）５ｍＬに溶解した。これを室温で１時間後に濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（塩化メチレン／メタノール／濃アンモニア  ３０：１０：３）で精製した。生成物９、２２０ｍｇ（５６％）、を非晶質化合物形態で得た：C30H35N3O4 (501.63) MS (ESI+) 502.3 (M + H+)。
【００４９】
［２−（４−アジド−フェニル）−１−（４−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニルカルバモイル｝−ブチルカルバモイル）−エチル］−カルバミン酸−９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（１１）
【化１２】
0004575772.tif 000013
生成物９、２００ｍｇ（０．４０ｍｍｏｌ）、およびＦｍｏｃ−ｐ−アジド−Ｐｈｅ−ＯＨ １０ （Bachem）３４０ｍｇ（０．７９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）４ｍＬに溶解し、生成物８の製造に従い反応させた。生成物１１、３００ｍｇ（８２％）を、非晶質固体形態で得た：C54H53N7O7 (912.07) MS(ESI+) 912.5 (M + H+)。
【００５０】
５−［２−アミノ−３−（４−アジド−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ペンタン酸｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニル｝−アミド（１２）
【化１３】
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生成物１１、３００ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）、およびジエチルアミン０．８ｍＬを、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）４ｍＬに溶解し、化合物９の製造に従い反応させた。化合物１２、４２ｍｇ（１９％）を、非晶質固体化合物形態で得た：C39H43N7O5 (689.82) MS(ESI+) 690.3 (M + H+)。
【００５１】
５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペ
ンタン酸−［２−（４−アジド−フェニル）−１−（４−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニルカルバモイル｝−ブチルカルバモイル）−エチル］−アミド（１４）
【化１４】
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化合物１２、４０ｍｇ（０．０５８ｍｍｏｌ）、およびＤ−ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド １３ （Bachem）６０ｍｇを、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）０．５ｍＬに溶解した。これを室温で１時間後に濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（塩化メチレン／メタノール／濃アンモニア  ３０：５：１）により精製した。化合物１４、２９ｍｇ（５５％）を、非晶質固体化合物形態で得た：C49H57N9O7S (912.12) MS(ESI+) 916.6(M + H+)。
【００５２】
光親和性標識および結合研究：
ウサギの小腸の刷子縁組織からの小胞を、当業者に既知の方法により単離した（Kramerら、J. Biol. Chem. 268, 18035-18046 (1993)）。本発明の式Ｉａ）、またはＩｂ）、またはＩｃ）、またはＩｄ）、またはＩｅ）の放射標識化合物を用いて、Rayonet RPR-100型（The Southern Ultraviolet Company, Hamden, Conn.から入手可能）の光化学反応装置中で、光親和性標識を行った。その刷子縁膜小胞（タンパク質１００〜２００μｇ）を、１０ｍＭＴｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、１００ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭマンニトール中の該化合物の１種（体積２００μＬ）と共に、暗所で、２０℃で５分間インキュベートした。刷子縁小胞の代わりに、細胞小器官、特にその膜を使用することもできる。以下の記述は、これらに同様に適用される。暗所でのインキュベーションの後に、２０秒間または６０秒間２５４ｎｍのＵＶ光で照射した。次いで、刷子縁小胞を、上述の緩衝液で２回洗浄した。従来の技術、例えばエタノールの添加、塩もしくは界面活性剤の添加、加熱、凍結および融解の繰り返し、または当業者に既知の他の適当な方法により、タンパク質を沈殿させて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した。放射標識されたタンパク質は、ＬＳＣまたはフルオログラフィによって検出可能であった。刷子縁組織の標識されたタンパク質の、化合物に対する親和性は、１〜１００ｎＭの範囲であった。
【００５３】
動物および膜の調整：
体重４〜５ｋｇのオスニュージーランド白ウサギ（Harlem Winkelmann, Borchem,ドイツ）を、Altronine(R)標準食餌C 2023 (Altronin(R), Lage,ドイツ)で、自由な状態で飼育した。胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、大腸、直腸および腎臓の刷子縁膜小胞を、Ｍ
ｇ2+沈降方法により調製した。ラット肝ミクロソームおよびラット脂肪細胞膜を、標準技術により調製した。
【００５４】
コレステロール吸収の阻害：
腸のコレステロール吸収を、Zilversmit／Hughes方法の改良法により測定した。標準食餌(Altronin(R), Lage,ドイツ)で飼育したオスNMRIマウス（Charles River Deutschland GmbH, Salzfeld,ドイツ）を、１２時間食餌を与えず飢餓状態にした。ビヒクルとして０．５％メチルセルロース／５％Ｓｏｌｕｔｏｌ（BASF, Ludwigshafen,ドイツ）の溶液０．５ｍＬを、各コレステロール吸収阻害剤３ｍｇと共に、またはこれを含まずに、各動物に強制栄養によって与え、続けて０．２４μＣｉ［14Ｃ］コレステロールおよび０．２５μＣｉ［3Ｈ］シトステロールを含むIntralipid(R)溶液０．２５ｍＬ（Pharmacia & Upjohn, Erlangen,ドイツ）を与えた。動物（各群につき5匹のマウス）を代謝ケージで飼育し、糞を回収した。２４時間後に、動物を殺して糞および肝臓中の放射活性を燃焼分析により測定した。
【００５５】
コレステロール吸収阻害剤に結合する１４５ｋＤａ結合タンパク質の可溶化：
ウサギ小腸の刷子縁膜小胞を光親和性標識後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／３００ｍＭマンニトールで数回洗浄した。得られたペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／７５ｍＭ ＫＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ2／１ｍＭ ＥＧＴＡ／１ｍＭ ＤＴＴ／１％ （ｗ／ｖ） ｎ−オクチルグルコシド／１％ Triton X-100／１％ （ｗ／ｖ）（「可溶化緩衝液」）中で、４℃で６０分間可溶化して、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬとした。別法として、膜タンパク質は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中の１％ ＳＤＳを用いて、４℃で１０分間可溶化して、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬとして、続けて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／１％ ｎ−オクチルグルコシドで１：１０希釈してもよい。遠心分離後に、可溶化された膜タンパク質を含む上清を、界面活性剤として１％ｎ−オクチルグルコシドを含む適当なクロマトグラフィー用緩衝液と混合し、希釈した。
【００５６】
コレステロール吸収阻害剤に結合する放射標識１４５ｋＤａ結合タンパク質を、光反応性２−アゼチジノンＣ−１による光親和性標識後に精製する：
【００５７】
光親和性標識
ウサギ回腸刷子縁膜小胞（タンパク質２５０μｇ）の８個の試料を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭマンニトール中の６６ｎＭ（０．３μＣｉ） ［3Ｈ］Ｃ−１で、２０℃で３０分間、暗所でインキュベートした。4 RPR 2537Åランプを備えたRayonet RPR 100光化学反応装置（The Southern Ultraviolet Company, Hamden, コネチカット州,米国）中で、２５４ｎｍで３０秒間放射した後に、試料を回収し、遠心分離後に、膜小胞を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／３００ｍＭマンニトール、２ｍＬ中に再懸濁し、２０℃で２０分後、遠心分離した。この手順を３回繰返した。得られたペレットを「可溶化緩衝液」２ｍＬで可溶化した。遠心分離後、上清のアリコート４０μＬを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルを薄切りにして膜タンパク質中への放射活性の取り込みについて分析した。
【００５８】
小麦胚芽レクチンアフィニティークロマトグラフィー
可溶化された膜タンパク質を含む上清を、小麦胚芽レクチンアガロースゲル０．５ｍＬに添加した。２０℃で３０分後、遠心分離によりビーズを回収し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭマンニトール／１％ （ｗ／ｖ） ｎ−オクチルグルコシド、２ｍＬで３回洗浄した。摂取したタンパク質を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭマンニトール／３００ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、２ｍＬ、４部で溶離させて；全溶離液において、アミノペプチダーゼＮおよびスクラーゼの活性を測定し、各画分のアリコート１００μＬからタンパク質を沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００５９】
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
小麦胚芽レクチンクロマトグラフィーのＮ−アセチルグルコサミン溶離液を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチルグルコシドで１０倍希釈し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチルグルコシドで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム（高さ１０ｃｍ、直径１ｃｍ）に付して、一定速度０．２５ｍＬ／分で、１ｍＬ画分を回収した。続けてタンパク質を、次のようにして溶離させた：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／１％（ｗ／ｖ）ｎ−オクチルグルコシド、１０ｍＬ、続けて、ホスフェート勾配：ホスフェート１０〜２５０ｍＭで１５ｍＬ、２５０〜７００ｍＭで１５ｍＬ、そして７００〜１０００ｍＭで１０ｍＬ。各画分において、アミノペプチダーゼＮおよびスクラーゼの活性および放射活性を測定した。各画分１００μＬを取り出し、タンパク質を沈殿させ、続けてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルを２ｍｍ片に薄切りにして、放射活性標識されたタンパク質の分布を決定した。
【００６０】
分取ＳＤＳゲル電気泳動
放射活性標識された１４５ｋＤａタンパク質を含む画分を回収し、タンパク質をクロロホルム／メタノールで沈殿させた。試料を、ＳＤＳ−試料緩衝液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２％ＳＤＳ／５％２−メルカプトエタノール／１０％グリセロール／０．００１％ブロモフェノールブルー）中に溶解した後に遠心分離し、透明な上清を分取７．５％ＳＤＳゲル（直径２８ｍｍ；分離ゲル長：５ｃｍ）の分離ゲルに付した。５００Ｖ（４０ｍＭ、６Ｗ）で電気泳動を行い、溶離液を１．５ｍＬ画分に分けた。各画分のアリコート１５０μＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質組成の分析に用いた。
【００６１】
ストレプトアビジン−ビオチンアフィニティークロマトグラフィーによる、コレステロール吸収阻害剤に結合する１４５ｋＤａ結合タンパク質の精製：
ウサギ回腸刷子縁膜小胞（タンパク質２００μｇ）の１０個の試料を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１００ｍＭマンニトール中で、２００μＭビオチン標識コレステロール阻害剤Ｃ−４と共に、暗所で３０分間、２０℃でインキュベートし、次いで4 RPR 2537Åランプを備えたRayonet RPR-100光化学反応装置中で、２５４ｎｍで３０秒間放射した。小胞を回収後、Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／３００ｍＭマンニトール、２ｍＬで３回洗浄した。最終的に得られたペレットを「可溶化緩衝液」２ｍＬ中に４℃で１時間懸濁した。遠心分離後、透明な上清を、ストレプトアビジン−アガロースビーズ０．５ｍＬと混合し、４℃で２時間撹拌を続けた。遠心分離後、ビーズを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／３００ｍＭマンニトール／１％ｎ−オクチルグルコシド／４ｍＭ ＰＭＳＦ／４ｍＭヨードアセタミド／４ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＬと共に４℃で１０分間インキュベートし、続けて遠心分離した。この手順を２回繰り返した後、タンパク質が、ストレプトアビジン−アガロースビーズから、５ｍＭビオチンを含む上記の緩衝液２ｍＬ、３部中に溶離した。アミノペプチダーゼＮおよびスクラーゼの酵素活性を測定するために、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析するために、全溶離液からアリコートを取り出した。最終精製のために、コレステロール吸収阻害剤に共有結合する、修飾型１４５ｋＤａ結合タンパク質を含むビオチン溶離液を、上述の分取ＳＤＳゲル電気泳動によって得た。
【００６２】
酵素断片化：
両方の手順により単離した１４５ｋＤａタンパク質を、クロロホルム／メタノールで沈殿させて、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）／６．２％ SDS／０．５％ ２−メル
カプトエタノール／０．０００５％ブロモフェノールブルー、３μＬ中に再溶解した。上記の緩衝液中に新しく調製したキモトリプシン溶液（３５ｎｇ／ｍＬ）５μＬを加え、３０℃で１時間インキュベートして、酵素断片化を行った。４ｍＭ EDTA／４ｍＭ PMSF／４ｍＭヨードアセタミドを含むＳＤＳ試料緩衝液を加え、９５℃で５分間加熱することにより反応を停止し、続けてＴｒｉｓ／トリシンゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００６３】
ＳＤＳゲル電気泳動
電気泳動システムＬＥ２／４（Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,ドイツ）を使用して垂直スタッブゲル（２０×１７×０．１５ｃｍ）中で、ゲル濃度７〜１０．５％、アクリルアミド９７．２％およびＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド２．８％の比で、または、分析のために、電気泳動システムXcell II （Novex社製）を使用してプレキャストNOVEXゲル（４〜１２％、１２％または１５％、Invitrogen （Groningen， The Netherlands））中で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ペプチド断片の電気泳動による分離を、Schaeggre & Jagowに従い、Ｔｒｉｓ／トリシン ゲル（１６．５％）中で行った。電気泳動後、ゲルを１２．５％トリクロロ酢酸中で固定し、続けてServa Blue R 250で染色した。放射活性の分布を測定するために、ゲルレーンをそれぞれ２ｍｍ片に切り、組織可溶化剤Biolute S ２５０μＬでタンパク質を加水分解し、シンチレーターQuickszint 501、４ｍＬを用いて液体シンチレーションを計数した。
【００６４】
コレステロール吸収阻害剤に結合する１４５ｋＤａ結合タンパク質の可溶化：
コレステロール吸収阻害剤に結合する１４５ｋＤａ結合タンパク質の精製の必須条件は、この内在性膜タンパク質が非変性状態で十分に可溶化することである。種々の界面活性剤による可溶化実験から、CHAPS、NP-40、ジギトニンおよびTriton-X-114では有意な可溶化が達成されないのに対して、ＳＤＳを用いると光標識タンパク質の約８０〜９０％が、およびZwittergent９〜１３を用いると約６０％が可溶化され得ることが明らかになった。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／３００ｍＭマンニトール中の、Triton-X-100、ｎ−オクチルグルコシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシドまたはコレステロールへミスクシネート／ドデシルマルトシドのような非イオン性界面活性剤の１％溶液は、１４５ｋＤａタンパク質を部分的に可溶化するのみであり、従ってこれの精製を阻害した。最終的に、１４５ｋＤａタンパク質の６０〜８０％を可溶化して、これによって精製手順を可能にする、２種のプロトコルを見出した、即ち：ａ）１％ＳＤＳで可溶化し、続けて１％ｎ−オクチルグルコシドで希釈して、出発濃度０．１％ＳＤＳ／１％ｎ−オクチルグルコシドとする；ｂ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）／７５ｍＭ ＫＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ2／１ｍＭ ＥＧＴＡ／１ｍＭ ＤＴＴ／１％ Triton X-100／１％ｎ−オクチルグルコシド（「可溶化緩衝液」）で可溶化する。可溶化手順は、クロマトグラフィー手順による刷子縁膜タンパク質の良好な分画を可能した。
【００６５】
ビオチン標識２−アゼチジノン光親和性プローブの設計：
コレステロール吸収阻害剤の標的タンパク質のワンステップ精製のために、本発明者らは、ビオチン含有光分解性基であるＮ−（ビオチニル）−４−アジドフェニルアラニンを、スペーサーを介して、２−アゼチジノンコレステロール吸収阻害剤のＮ−フェニルまたはベンジルアミノ環のパラ位に結合させた。構造活性相関により、腸のコレステロール吸収の阻害についての生体内効力を維持する重要な化学修飾が、この位置で可能であることが示された。ビオチン標識光親和性ラベルＣ−４をＮＭＲＩ−マウスに適用後、腸のコレステロール吸収は容量依存性で阻害され、ビオチン標識光分解性コレステロール吸収阻害剤の生物学的有効性を示し、タンパク質を同定するための前提条件は、このプローブにより腸のコレステロール吸収に関連づけられた。ビオチン標識コレステロール阻害剤Ｃ−４の増加濃度の存在下で、ウサギ小腸ＢＢＭＶをアジドベンゾイル誘導性［3Ｈ］Ｃ−１で光親和性標識することによって、１４５ｋＤａタンパク質の標識の程度が濃度依存性で減少し、これは、小腸細胞の刷子縁膜における、コレステロール吸収阻害剤に結合する１４５ｋＤａ結合タンパク質とのＣ−４の特異的相互作用を示唆する。
【００６６】
トリチウム標識２−アゼチジノンコレステロール吸収阻害剤Ｃ−１で光標識した、１４５ｋＤａ結合タンパク質の精製：
光標識した１４５ｋＤａ結合タンパク質は、ＳＤＳゲル上でスクラーゼ／イソマルターゼ複合体またはアミノペプチダーゼＮのような刷子縁膜の非常に多量の膜タンパク質が移動する分子量範囲に局在化し、従って、配列決定のためには、これらのタンパク質から完全に分離することが不可欠である。生化学研究を行い、この１４５ｋＤａタンパク質は、Ｎ−グリカナーゼによる脱グリコシル化に際して分子量が１４５ｋＤａから１１０ｋＤａに移動したことから、グリコシル化された内在性膜タンパク質であると同定された。従って本発明者らは、アフィニティークロマトグラフィーのための推定のリガンドとして種々のレクチンを調べた。小麦胚芽レクチンアガロースにより、スクラーゼおよびアミノペプチダーゼＮ活性の７０〜８０％が溶離したのに対して、光標識１４５ｋＤａタンパク質は完全にその溶離が遅滞（retardation）された。Ｎ−アセチルグルコサミンにより、放射標識１４５ｋＤａタンパク質の全量を、３０〜５０％のアミノペプチダーゼＮおよびスクラーゼ活性と共に溶離することができた。全体として、コレステロール吸収阻害剤に結合する１４５ｋＤａ結合タンパク質を４〜５倍濃縮することができた。更に精製するために、多数の異なる手法を評価した。ＭｏｎｏＱまたはＭｏｎｏＳカラム上でイオン交換クロマトグラフィーを行うことによって、スクラーゼ／イソマルターゼから完全に分離されたが、アミノペプチダーゼＮからは部分的にしか分離されなかった。一方、金属−キレート−アフィニティークロマトグラフィーでは、はっきりとした分離は得られなかった。ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーでは、１４５ｋＤａタンパク質が大幅に濃縮され、スクラーゼおよびアミノペプチダーゼＮから分離することができた。至適化されたホスフェート勾配プロフィールにより、１４５ｋＤａタンパク質を他の膜タンパク質からほぼ完全に分離することができた；１４５ｋＤａタンパク質は、高濃度のホスフェートで溶離し、スクラーゼまたはアミノペプチダーゼＮの有意な酵素活性は見られなかった。ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーからの溶離液を、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して、最終精製を行った。純粋な１４５ｋＤａタンパク質の推定量は、ヒドロキシルアパタイトカラムに付された材料の１〜３％であり、濃縮係数は、刷子縁膜について、１５０倍＜濃縮係数＜５００倍であり、腸細胞総タンパク質について、２５００〜１００００倍であった。
【００６７】
ビオチン標識光分解性コレステロール吸収阻害剤による光親和性標識後の、ストレプトアビジン−ビオチンアフィニティークロマトグラフィーによる、コレステロール吸収阻害剤に結合する１４５ｋＤａ結合タンパク質の精製
ウサギ小腸ＢＢＷＶを、２００μＭのＣ−４と共にインキュベートし、２５４ｎｍで紫外線照射して架橋した。可溶化後、ビオチン標識２−アゼチジノンコレステロール吸収阻害剤を含む共有結合修飾したタンパク質を、ストレプトアビジン−ビーズで抽出した。十分に洗浄した後、結合したタンパク質を１０ｍＭビオチン溶液で溶離させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ストレプトアビジン−ビーズによって、主にＭｗ１４５ｋＤａの１種のタンパク質が保持されており、一方、紫外線照射を行わないと、タンパク質は全く検出されなかった。これは、１４５ｋＤａタンパク質が、ビオチン標識された光分解性コレステロール吸収阻害剤Ｃ−４に結合する１次結合タンパク質であることを示している。ストレプトアビジン−ビーズからのビオチン抽出物は、スクラーゼ／イソマルターゼまたはアミノペプチダーゼＮの検出可能な酵素活性を有さず、これは、溶離した１４５ｋＤａタンパク質が、おそらくは、ビオチン標識コレステロール吸収阻害剤の共有結合によって修飾された、単一のタンパク質部分であることを示している。Ｃ−４による光標識の際に、エゼチミブのような他のコレステロール吸収阻害剤が２００μＭ存在することによって、ストレプトアビジンビーズで抽出可能な１４５ｋＤａタンパク質の量は減少する。これは、同一の結合部位についての、Ｃ−４とのコレステロール吸収阻害剤の直接的競合を示して
いる；対照的に、胆汁酸、脂肪酸、グルコース、オリゴペプチドまたはアミノ酸のための他の腸の栄養輸送体の基質は、抽出可能な１４５ｋＤａタンパク質の量に影響しなかった。種々の器官からの細胞膜を用いたこれらの標識実験を行うことにより、ウサギの胃、盲腸、大腸、直腸、腎臓、肝臓または脂肪細胞からのＢＢＭＶの標識後には、ストレプトアビジン−ビーズで遅滞される１４５ｋＤａタンパク質は抽出されなかったのに対して、小腸（十二指腸、空腸および回腸）からのＢＢＭＶの標識によってのみ、１４５ｋＤａタンパク質が抽出されることが明らかになった。従って、１４５ｋＤａ結合タンパク質は、腸コレステロール吸収が起こる解剖学的部位、即ち十二指腸、空腸および回腸から精製できるのみであった。小麦胚芽レクチンクロマトグラフィーおよびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによって、およびストレプトアビジン−ビオチン−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した１４５ｋＤａタンパク質は、ＳＤＳゲル上では区別できない。キモトリプシンによる酵素断片化の後に、４〜３５ｋＤａの分子量範囲の多数のペプチドとほぼ一致したペプチドパターンが得られ、これは両方法によって精製された１４５ｋＤａタンパク質が同一のものであり、排他的にではないにしても、大部分は、ただ１種のタンパク質部分のみを含んでいることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［２−（４−アジド−フェニル）−１−（４−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニルカルバモイル｝−ブチルカルバモイル）−エチル］アミド（１４）の合成のための反応スキームの第１部
【図２】５−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［２−（４−アジド−フェニル）−１−（４−｛４−［３−（３−ヒドロキシ−３−フェニル−プロピル）−２−（４−メトキシ−フェニル）−４−オキソ−アゼチジン−１−イル］−フェニルカルバモイル｝−ブチルカルバモイル）−エチル］アミド（１４）の合成のための反応スキームの第２部
【図１】
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【図２】
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