(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象の標本を配置するための配置部と、
多光子励起現象により蛍光を発するように前記標本を励起するためのパルスレーザビームを出射するためのレーザ光源と、
前記標本の蛍光を検出するための検出器と、
前記レーザ光源から前記標本へ前記パルスレーザビームを導くために前記パルスレーザビームの光路を形成する光学系と、
を具備し、前記光学系は、
入射した前記パルスレーザビームを短波長ほど先となるように波長順に出射させる作用を有するプレチャープコンペンセータと、
前記光路上に選択的に配置可能な光学部材と、
前記光路上に配置する前記光学部材の変更によって生ずる前記光路の光路長の変化を補正するための光学的補正手段を具備する補正機構と、を有し、
前記光学部材の変更に応じた前記プレチャープコンペンセータの作用の調整を不要にしたことを特徴とする多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記光学系は、前記標本を前記パルスレーザビームで走査するための走査機構を更に有することを特徴とする請求項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記光学部材は、前記標本に対して前記パルスレーザビームを集光するように、前記光路上に択一的に配置可能な複数の対物レンズであることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記光学部材は、前記標本に対して前記パルスレーザビームを集光するように、前記光路上に択一的に配置可能な複数の対物レンズと、前記プレチャープコンペンセータと前記対物レンズとの間に挿脱自在に設けられた平坦な光学素子とであることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項５】
前記平坦な光学素子は、ノマルスキー式の透過光観察用の光学素子であることと、前記顕微鏡は、前記パルスレーザビームの前記標本を透過した透過光を検出するための光学系及び検出器を更に具備することとを特徴とする請求項４に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項６】
前記光学的補正手段は、前記光学部材の切替えに連動して切替えられることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項７】
前記光学的補正手段は、前記光路上の前記パルスレーザビームが平行光束で且つ前記光束の角度変化がない位置に配置されることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項８】
前記光学的補正手段は、前記光学部材の光路長に応じて、前記光路の光路長が一定となるように前記光路上に択一的に配置可能な複数の光学的補正素子であることを特徴とする請求項１または７に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項９】
前記光学的補正手段は、前記光学部材の光路長に応じて、異なる電圧を印加することにより、前記光路の光路長が一定となるように調整可能な光学的補正素子であることを特徴とする請求項１または７に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項１０】
前記光学的補正手段は、前記光学部材の光路長に応じて、異なる圧力を印加することにより、前記光路の光路長が一定となるように調整可能な光学的補正素子であることを特徴とする請求項１または７に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項１１】
前記光学的補正手段は、いずれの前記光学部材が使用された場合でも前記光路の光路長が同一となるように、前記光学部材とペアとなって択一的に配置される補正板であることを特徴とする請求項１または７に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【請求項１２】
前記光学的補正素子は、電圧または圧力の印加により光路長が変化する平行平面板であることを特徴とする請求項９または１０に記載の多光子励起レーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はパルスレーザビームを観察対象である標本に照射するタイプのレーザ顕微鏡に関し、特に、標本の多光子吸収による化学反応及び蛍光を検出するための多光子励起走査型レーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多光子励起法は、通常の１光子（単光子）で行われる励起を多光子で行う方法である。例えば２光子励起法では、４００ｎｍ（単光子）の波長で行っていた蛍光励起が倍の波長８００ｎｍで行われる。この波長８００ｎｍでは２光子を用いて蛍光励起が行われる。
【０００３】
通常、蛍光顕微鏡に使用される水銀ランプや連続発振のレーザでは、単位時間当たりの光子密度が低いため、多光子励起現象を引き起こすためには、莫大な光強度が必要とされる。更に、光学系や標本へのダメージが大きくなる等の問題を解決しなければ実用には適さない。
【０００４】
このため、多光子励起法の光源としては、例えばサブピコ秒のパルスレーザビームを発振可能なものが用いられる。これは多光子励起現象がその単位面積、単位時間当たりの光子密度の２乗にほぼ比例した確率で発生するためである。このため、サブピコ秒のパルスレーザビームでは、複数の光子が存在する確率が高くなる。
【０００５】
例えば、特表平５−５０３１４９号公報には、サブピコ秒のパルスレーザビームを出射するレーザ光源と、このレーザ光源から出射されたパルスレーザビームで標本面（焦点面）を走査するための走査光学ユニットとを組合わせた２光子励起走査型レーザ顕微鏡が記載される。
【０００６】
一方、多光子励起に用いられるレーザ光源から出射されるサブピコ秒のパルスレーザビームは、完全に単色でなく、そのパルス幅と相関を持つある波長幅を有する。一般的に、光は、光学系を通過する場合、波長が短いほど媒質中での速度は遅く、波長が長いほど媒質中での速度は速くなる特性を有する。従って、上述の如くパルスレーザビームが波長幅を有していると、パルスレーザビームが光学系を通過する際、波長によって通過時間に差が生じる。その結果、光学系に入射する前のパルス幅に比べ、光学系を通過した後のパルス幅が時間軸方向に広がってしまう。
【０００７】
多光子励起現象が生じる確率は、光子密度に依存するため、光学系の標本面（焦点面）上でのパルス幅の広がりは、多光子励起現象が発生する確率を低下させる。従って、標本面上でパルス幅をなるべく広がらないようにすることが望まれる。
【０００８】
このような問題を解決するための一般的な方法として、所謂プレチャープコンペンセーションが知られている。プレチャープコンペンセーションは、パルスレーザビームをプリズムペア若しくはグレーティングペアに通すことにより、短い波長側の光を先に出す、言い換えれば長い波長側の光を遅らせるという方法である。
【０００９】
この方法は、例えば文献「Femtosecond pulse width control in microscopy by two-photon absorption autocorrelation; G.J. Brakenhoff, M. Muller & J. Squier; J. of Microscopy, Vol. 179, Pt. 3, September 1995, pp. 253-260」に記載される。詳しい説明は省略するが、この文献には、プレチャープコンペンセータとして使用されるプリズムペア若しくはグレーデイングペアを移動調整することにより標本面でのパルスレーザビームのパルス幅を任意に可変できることが記載される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、多光子励起走査型レーザ顕微鏡が、択一的に使用される複数の対物レンズを有する場合、対物レンズが夫々異なる光路長を有するため、プレチャープコンペンセータによる補正の程度も各対物レンズに応じて異なってくる。即ち、プレチャープコンペンセータを、ある１つの対物レンズに合わせて標本面におけるパルスレーザビームのパルス幅が最小となるように調整しても、他の対物レンズの場合は標本面におけるパルス幅が広がってしまう。ここで、本明細書において、単に光路長という場合は、光学素子の幾何学的長さではなく、光学素子が形成する光路の光学的長さを意味するものとする。
【００１１】
この走査型レーザ顕微鏡においても、顕微鏡観察と同様に、先ず広範囲の観察が可能な低倍率の対物レンズを使用して標本における観察対象を検索し、この後に細部を観察するための高倍率の対物レンズに切替えて使用するのが一般的である。この際、対物レンズを切替えることによって標本面でのパルスレーザビームのパルス幅が変化すると、最適な条件で多光子励起現象を引き起こすことができなくなる。
【００１２】
もし、この問題をプレチャープコンペンセータの調整により対応しようとすると、その調整に費やす時間に比例して標本から発せられる蛍光が褪色してしまうという問題が発生する。標本の蛍光の褪色を防ぐ対策としては、プレチャープコンペンセータの調整時に観察視野内から標本を移動するといった方法が考えられる。この方法では、プレチャープコンペンセータの調整後に再び観察視野内に標本を移動しなければならない。しかし、標本を移動前と全く同じ位置に戻すことは非常に困難であるため、この方法は観察及び測定に対して実用的ではない。
【００１３】
本発明の目的は、波長幅を有するパルスレーザビームを使用する多光子励起レーザ顕微鏡において、光路上に選択的に配置可能な光学部材の光路長に応じて、容易に最適な条件で観察することを可能とすることである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の視点は、多光子励起レーザ顕微鏡において、観察対象の標本を配置するための配置部と、多光子励起現象により蛍光を発するように前記標本を励起するためのパルスレーザビームを出射するためのレーザ光源と、前記標本の蛍光を検出するための検出器と、前記レーザ光源から前記標本へ前記パルスレーザビームを導くために前記パルスレーザビームの光路を形成する光学系と、を具備し、前記光学系は、入射した前記パルスレーザビームを短波長ほど先となるように波長順に出射させる作用を有するプレチャープコンペンセータと、前記光路上に選択的に配置可能な光学部材と、前記光路上に配置する前記光学部材の変更によって生ずる前記光路の光路長の変化を補正するための光学的補正手段を具備する補正機構と、を有し、前記光学部材の変更に応じた前記プレチャープコンペンセータの作用の調整を不要にしたことを特徴とする。
【００１５】
本発明の第２の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学系は、前記標本を前記パルスレーザビームで走査するための走査機構を更に有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の第３の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学部材は、前記標本に対して前記パルスレーザビームを集光するように、前記光路上に択一的に配置可能な複数の対物レンズであることを特徴とする。
【００１７】
本発明の第４の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学部材は、前記標本に対して前記パルスレーザビームを集光するように、前記光路上に択一的に配置可能な複数の対物レンズと、前記プレチャープコンペンセータと前記対物レンズとの間に挿脱自在に設けられた平坦な光学素子とであることを特徴とする。
【００１８】
本発明の第５の視点は、第４の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記平坦な光学素子は、ノマルスキー式の透過光観察用の光学素子であることと、前記顕微鏡は、前記パルスレーザビームの前記標本を透過した透過光を検出するための光学系及び検出器を更に具備することとを特徴とする。
【００１９】
本発明の第６の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、前記光学部材の切替えに連動して切替えられることを特徴とする。
【００２０】
本発明の第７の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、前記光路上の前記パルスレーザビームが平行光束で且つ前記光束の角度変化がない位置に配置されることを特徴とする。
【００２１】
本発明の第８または７の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、前記光学部材の光路長に応じて、前記光路の光路長が一定となるように前記光路上に択一的に配置可能な複数の光学的補正素子であることを特徴とする。
【００２２】
本発明の第９または７の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、前記光学部材の光路長に応じて、異なる電圧を印加することにより、前記光路の光路長が一定となるように調整可能な光学的補正素子であることを特徴とする。
【００２３】
本発明の第１０または７の視点は、第１の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、前記光学部材の光路長に応じて、異なる圧力を印加することにより、前記光路の光路長が一定となるように調整可能な光学的補正素子であることを特徴とする。
本発明の第１１の視点は、第１または７の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正手段は、いずれの前記光学部材が使用された場合でも前記光路の光路長が同一となるように、前記光学部材とペアとなって択一的に配置される補正板であることを特徴とする。
本発明の第１２の視点は、第９または１０の視点の多光子励起レーザ顕微鏡において、前記光学的補正素子は、電圧または圧力の印加により光路長が変化する平行平面板であることを特徴とする。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、以下の説明において、略同一の機能及び構成を有する構成要素については、同一符号を付し、重複説明は必要な場合にのみ行う。
【００２５】
図１は本発明の実施の形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡１を示す構成図である。
【００２６】
顕微鏡１は、標本Ｓに対して照射するパルスレーザビームを出射するためのレーザ光源４と、レーザ光源４と標本Ｓとの間でレーザビームを案内するための光路を形成する光学系３とを有する。光学系３は、標本Ｓを配置するためのステージ１５を有する顕微鏡本体２内の光学素子も含む多数の光学素子により構成される。
【００２７】
顕微鏡１は、床からの振動を排除するための除振台２６上に配設される。除振台２６上には、２つの架台２７、２８が配設される。架台２７上には、レーザ光源４、ビームコリメータ５及びプレチャープコンペンセータ６が配設される。架台２８上には、走査光学ユニット７及び補正機構２２が配設される。走査光学ユニット７及び後述するフォトマルチプライヤ２１は、操作パネル３１を有するコンピュータ３０に接続される。
【００２８】
レーザ光源４は、近赤外域の波長で、サブピコ秒の極短パルスＱＰを発振する。波長幅の広さは、パルス幅の大きさに反比例するため、ここで使用される極短パルスＱＰは、数ナノメータ程度の波長幅を有する。
【００２９】
レーザ光源４からのレーザビームＱの光路上にビームコリメータ５及びプレチャープコンペンセータ６が配置される。ビームコリメータ５は、レーザ光源４から出射されたレーザビームＱを平行光束にコリメートする。プレチャープコンペンセータ６は、レーザビームＱが光学系３を通過する際に、パルスの波長幅に起因して生じるパルス幅の広がりを打ち消すように予め調整するために使用される。具体的には、プレチャープコンペンセータ６は、例えばプリズム等の光学素子６ａ〜６ｄから構成され、入射されたコリメート済みのレーザビームＱに対して、短波長ほど先となるように波長順にプレチャープコンペンセータ６から出射させる作用を有する。
【００３０】
走査光学ユニット７は、プレチャープコンペンセータ６から出射されたレーザビームＱにより標本Ｓの断面（焦点面）Ｓ’を走査するためのものである。この走査光学ユニット７の出射側には、リレーレンズ８、光路折り曲げユニット９を介して顕微鏡本体２が配設される。なお、これらリレーレンズ８、光路折り曲げユニット９及び顕微鏡本体２は、光軸が一致するように配置される。
【００３１】
顕微鏡本体２は除振台２６上に固定されたコ字形状の筐体１１を有する。コ字形状の筐体１１の上部には結像レンズ１２が配設され、且つ結像レンズ１２の下方側に倍率の異なる複数の対物レンズ、例えば３つの対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃを取り付けたレボルバ１３が回転自在に配設される。対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃは、択一的に光軸上に配置可能となるように構成される。レボルバ１３の下方には、標本Ｓを載置するためのステージ１５が配設される。ステージ１５は、筐体１１に対して上下に位置調整可能に取付けられる。
【００３２】
標本Ｓは極短パルスＱＰのレーザビームＱが照射されると、多光子励起現象により蛍光を発する。走査光学ユニット７には、標本Ｓで生じた蛍光とプレチャープコンペンセータ６から出射されたレーザビームＱとを分離するためのダイクロイックミラー１６が配設される。
【００３３】
ダイクロイックミラー１６を透過するレーザビームＱの光路上には、互いに直交した方向にレーザビームＱを走査駆動するための一対のガルバノミラー１７、１８と、走査駆動されたレーザビームＱを顕微鏡本体へ導くためのリレーレンズ８とが配置される。
【００３４】
一方、ダイクロイックミラー１６によって分離される蛍光検出のための光路上には、集光レンズ１９、ピンホール２０、及びフォトマルチプライヤ２１が配置される。集光レンズ１９は標本Ｓからの蛍光をピンホール２０に集光させるために使用される。ピンホール２０は標本Ｓと共役な位置に配置され、標本からの光に含まれる焦点面以外の雑光を除去する。なお、多光子励起走査型レーザ顕微鏡においては、対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃの焦点面、つまり標本Ｓの断面Ｓ’でのみ多光子励起現象が生じるので、ピンホール２０は走査光学ユニット７に必ずしも必要でない。
【００３５】
対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃは夫々異なる光路長を有する。このため、プレチャープコンペンセータ６を、対物レンズの１つに合わせて断面Ｓ’（光学系３の焦点面）における極短パルスＱＰのパルス幅が最小となるように調整しても、対物レンズを切替えた場合は断面Ｓ’におけるパルス幅が広がる可能性がある。この問題に対応するために、対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃのいずれを選択した場合にも、断面Ｓ’におけるパルス幅が一定で且つ最小となるように光学系３の光路長を補正するように補正機構２２が配設される。なお、前述の如く、本明細書において、単に光路長という場合は、光学素子の幾何学的長さではなく、光学素子が形成する光路の光学的長さを意味するものとする。
【００３６】
具体的には、本実施の形態において、補正機構２２は走査光学ユニット７と共通の筐体内に配設される。補正機構２２は、平行光束にコリメートされたレーザビームＱの光路上に択一的に配置可能な補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃを具備する。補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、夫々対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃに対応して光路長が設定された同一のガラス材からなる。対応する対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃと補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃとのペアのいずれが使用された場合にも、レーザ光源４から断面Ｓ’（光学系３の焦点面）の光路長が同一となるように設定される。
【００３７】
図２に示す如く、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは回転可能なターレット２４に取付けられる。ターレット２４を回転させることにより、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃが光学系３の光軸上に択一的に配置可能となる。
【００３８】
次に、図１に示す多光子励起走査型レーザ顕微鏡の作用について説明する。
【００３９】
レーザ光源４から極短パルスＱＰのレーザビームＱが出射されると、このパルスレーザビームＱは、先ずビームコリメータ５により平行光束に変換される。次に、レーザビームＱは、プレチャープコンペンセータ６に入射して、断面Ｓ’でレーザビームＱのパルス幅が最小になるように調整されて走査光学ユニット７に導入される。
【００４０】
次に、走査光学ユニット７に導入されたレーザビームＱは、各対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃに対応するいずれか１つの補正板２３ａ、２３、２３ｃ、例えば、対物レンズ１４ａに対応した補正板２３ａを通過し、この対物レンズ１４ａに対応して断面Ｓ’におけるレーザビームＱのパルス幅が一定となるように整形される。
【００４１】
次に、レーザビームＱは、走査光学ユニット７のダイクロイックミラー１６に入射する。ダイクロイックミラー１６を透過したレーザビームＱは、一対のガルバノミラー１７、１８で反射され、続いて、リレーレンズ８、光路折り曲げユニット９を通って顕微鏡本体２の光学系に入射する。
【００４２】
顕微鏡本体２に入射したレーザビームＱは、結像レンズ１２によって、対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃの１つ、例えば対物レンズ１４ａの瞳径を満足するような光束径に変換されて対物レンズ１４ａに導入される。次に、このように対物レンズ１４ａに導入されたレーザビームＱは、その対物レンズ１４ａにより、ステージ１５上に載置された断面Ｓ’に集光される。
【００４３】
標本Ｓは、パルスレーザビームＱの照射により、断面Ｓ’において２光子励起現象により部分的に励起される。これにより、標本Ｓの断面Ｓ’からは、染色した蛍光色素に応じた蛍光が発せられる。この蛍光は、再び対物レンズ１４ａに取り込まれ、結像レンズ１２、光路折り曲げユニット９、リレーレンズ８、一対のガルバノミラー１８、１７を通してダイクロイックミラー１６に入射し、パルスレーザビームＱと分離される。
【００４４】
蛍光は、ダイクロイックミラー１６によって反射され、集光レンズ１９によってピンホール２０に集光される。そして、ピンホール２０を通過した蛍光のみがフォトマルチプライヤ２１に入射する。このフォトマルチプライヤ２１は、蛍光を受光してその光量に応じた電気信号をコンピュータ３０に対して出力する。
【００４５】
上述の操作と共に、走査光学ユニット７の一対のガルバノミラー１７、１８がＸＹ方向に駆動され、レーザビームＱで断面Ｓ’がＸＹ方向に走査される。コンピュータ３０は、この走査により得られるフォトマルチプライヤ２１の出力信号をガルバノミラー１７、１８の走査駆動に同期させることで、標本Ｓの断面Ｓ’の２次元画像を構築することができる。
【００４６】
このようにして、標本Ｓの２次元画像を得る際、その用途に応じてレボルバ１３を回転させ、対物レンズ１４ａを、対物レンズ１４ｃ（または対物レンズ１４ｂ）に切替える場合がある。この場合、対物レンズの切替と略同時に補正機構２２のターレット２４を回転させることで、対物レンズ１４ｃに対応する補正板２３ｃを平行光束にコリメートされたパルスレーザビームＱの光路上に配置する。
【００４７】
上述の如く、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、対応する対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃと組合わされた場合、断面Ｓ’におけるパルス幅が一定となるように設定される。従って、例えば、対物レンズ１４ａと補正板２３ａとを用いて初期段階（装置セットアップ時）に断面Ｓ’でのレーザビームＱのパルス幅を最小に調整すれば、その後、他の対物レンズと補正板とのペアを使用した場合にも、プレチャープコンペンセータ６の調整は不要となる。即ち、対応する対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃと補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃとのペアのいずれが使用された場合にも、常に断面Ｓ’におけるパルス幅を一定で且つ最小とすることができる。
【００４８】
従って、図１に示す多光子励起走査型レーザ顕微鏡によれば、いずれの対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃを切替えて使用した場合にも、最適な条件で多光子励起現象を引き起こすことができる。また、瞬時に最適な状態で観察が開始できるため、蛍光の褪色を最小限に抑えることができ、作業効率が向上する。また、各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、平行光束にコリメートされたレーザビームＱの光路上に挿入されるので、各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃが各対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃの性能を劣化させることなく、システム全体の光学性能を容易に維持できる。
【００４９】
なお、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、手動による切替の他に、対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃの切替に電気的または機械的に連動して切替えるようにすることもできる。この場合、装置の操作が簡単となり、作業効率が向上すると共に、各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃの誤挿入が発生しなくなる。例えば、これらの切替の電気的に完全に連動させる機構としては、図１に破線で示すようなものを採用することができる。
【００５０】
即ち、この連動機構においては、レボルバ１３及びターレット２４が夫々ステップモータ３２、３３で駆動される。また、ステップモータ３２、３３の回転軸に夫々エンコーダ３４、３５が連結される。これらの部材３２〜３５はコンピュータ３０に接続される。また、コンピュータ３０に、いずれの対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃを使用するかを選択入力するための操作パネル３１が配設される。これにより、操作パネル３１からの入力に基づいて、対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃと補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃとを連動して自動的に切替えることができる。
【００５１】
また、上述した切替機構の他、例えば、レボルバに取付けられる対物レンズの位置及び倍率を予め設定しておき、手動によるレボルバの回転時に、切替えられた対物レンズに対応した補正板を判別し、補正板を切替えるようにしてもよい。
【００５２】
補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、レーザビームＱが平行光束で且つ光束の角度変化がない位置、例えばレーザ光源４からダイクロイックミラー１６までの間の位置で光路上に配置することが望ましい。このため、プレチャープコンペンセータ６と走査光学ユニット７との間の位置（図１に示す位置）の他、例えばビームコリメータ５とプレチャープコンペンセータ６との間に設置することができる。
【００５３】
また、図３に示す如く、各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、各対物レンズ１４ａ、１４ｂ、１４ｃの光学系が無限遠系であれば、レボルバ１３または対物レンズに内蔵することも可能であり、機械的に連動する機構の代用とすることもできる。この構成によれば、装置構成がシンプルとなると共に安価となり、且つ誤動作の心配もなくなる。
【００５４】
また、上記実施の形態では、補正板に同一のガラス材を用い、板厚を変えることで光路長を変化させていたが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、同じ板厚に形成した補正板のガラス材を変えることで屈折率を変化させ、光路長を設定することができる。この場合、各補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、幾何学的寸法が全く同じになるので、補正機構２２に取り付けるための部品を共通化できる。
【００５５】
図４乃至図６は補正機構２２の変更例に係る補正機構４１、４６、５１を示す概略図である。
【００５６】
図４に示す補正機構４１は、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃを夫々矩形のブロック４２に取付けた例である。矩形のブロック４２は矩形の回転子４３に着脱自在に固定される。この場合、回転子４３の回転により、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃが光学系３の光軸上に択一的に配置可能となる。
【００５７】
図５に示す補正機構４６は、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃをスライド可能なスライダ４７に取付けた例である。この場合、スライダ４７の直線動作により、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃが光学系３の光軸上に択一的に配置可能となる。
【００５８】
図６に示す補正機構５１においては、駆動部５３による電気的或いは物理的な外部作用により、異なる光路長を光路上に択一的に提供可能な単一の光学的補正素子５２が使用される。光学的補正素子５２としては、電圧の印加により光路長が変化する平行平面板（ＥＯＤ素子）や、圧力の印加により光弾性を利用して光路長が変化する平行平面板を使用することができる。
【００５９】
図７は図１に示す顕微鏡１にノマルスキー式の透過光観察機能を追加した場合の変更例を示す概略図である。
【００６０】
この変更例においては、偏光子６１及びノマルスキープリズム等に代表される複屈折素子６２がスライダ（図示せず）に取付けられ、走査光学ユニット７の内部で且つダイクロイックミラー１６よりプレチャープコンペンセータ６側の光路上に一体的に挿脱自在となる。この場合、フォトマルチプライヤ２１による蛍光の検出のみを行う際、偏光子６１及び複屈折素子６２を光路上から外すと光路長が変わってしまう。この問題に対応するため、偏光子６１及び複屈折素子６２の光路長に対応した補正板２３ｄが、ターレット２４とは別体で且つ補正機構２２の一部をなすスライダ２４ａに取付けられる。補正板２３ｄは、偏光子６１及び複屈折素子６２が光路上から外れるのに連動して光路上に挿入される。
【００６１】
また、顕微鏡本体２の筐体１１の下部には、ステージ１５の開口１５ａの下方に位置するように、複屈折素子（ノマルスキープリズム）６５及び偏光子６６が取付けられる。更に、顕微鏡本体２の筐体１１には、偏光子６６を通過した透過光を反射し且つ検出するためのミラー６７及び検出器６８が取付けられる。
【００６２】
偏光子６１、複屈折素子６２、６５及び偏光子６６は、部分的に屈折率が僅かに異なる無色透明の物体や、微少な段差を有する不透明物体の表面など、目では検出できない位相情報を、偏光干渉により、干渉色のコントラストを付けて可視化する。従って、前述のフォトマルチプライヤ２１で検出される蛍光から得られる情報に加えて、検出器６８で検出される透過光から得られる情報から、標本Ｓの構造を立体的に捉えることができる。
【００６３】
なお、フォトマルチプライヤ２１による蛍光の検出のみが必要な場合は、上部側の偏光子６１及び複屈折素子６２を光路上から外せばよい。また、これに連動して偏光子６１及び複屈折素子６２の光路長に対応した補正板２３ｄを光路上に挿入する。これにより、ノマルスキー式の透過光観察機能と、フォトマルチプライヤ２１による蛍光検出とを切替えて使用する顕微鏡であっても、常に断面Ｓ’におけるパルス幅が一定で且つ最小とすることができる。なお、図示の構成に代え、偏光子６１及び複屈折素子６２の光路長を考慮した補正板（図示せず）を、補正板２３ａ、２３ｂ、２３ｃに加えてターレット２４上に配設するようにしてもよい。
【００６４】
また、図７図示の顕微鏡においては、ノマルスキー式の透過光観察をおこなうための平坦な偏光子６１及び複屈折素子６２に対応する補正板２３ｄに関して述べているが、本発明はこれに限られるものではなく、他の平坦な光学素子に関しても、これに対応した補正板を配設する場合に適用することができる。
【００６５】
また、上述の実施の形態及び変更例においては、標本ＳをパルスレーザビームＱで走査するための走査機構として、レーザビームＱを走らせるための一対のガルバノミラー１７、１８等を有する走査光学ユニット７を使用している。しかし、標本Ｓの走査は、標本ＳとレーザビームＱとを相対的に移動させることにより達成できるものであるから、この走査には種々の機構を採用することができる。例えば、レーザビームＱを静止させ、顕微鏡本体２のステージ１５を走査のために駆動するような走査機構を使用してもよい。
【００６６】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、パルスレーザビームを使用すると共に複数の対物レンズを有する多光子励起レーザ顕微鏡において、光路上に選択的に配置可能な光学部材の光路長に応じて、容易に最適な条件で観察が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る多光子励起走査型レーザ顕微鏡を示す構成図。
【図２】図１に示す顕微鏡で使用される光路長の補正機構を示す概略平面図。
【図３】光路長の補正機構の変更例を示す概略側面図。
【図４】光路長の補正機構の別の変更例を示す概略平面図。
【図５】光路長の補正機構の更に別の変更例を示す概略平面図。
【図６】光路長の補正機構の更に別の変更例を示す概略側面図。
【図７】図１に示す顕微鏡にノマルスキー式の透過光観察機能を追加した場合の変更例を示す概略図。
【符号の説明】
１：顕微鏡、
２：顕微鏡本体
３：光学系
４：レーザ光源
５：ビームコリメータ
６：プレチャープコンペンセータ
７：走査光学ユニット
１２：結像レンズ
１３：レボルバ
１４ａ、１４ｂ、１４ｃ：対物レンズ
１５：ステージ
１６：ダイクロイックミラー
１７、１８：ガルバノミラー
１９：集光レンズ
２０：ピンホール
２１：フォトマルチプライヤ
２２、４１、４６、５１：補正機構
２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ：補正板
２４：ターレット
３０：コンピュータ
３１：操作パネル
３２、３３：ステップモータ
３４、３５：エンコーダ
５２：光学的補正素子
６１：偏光子
６２、６５：複屈折素子
６６：偏光子
６７：ミラー
６８：検出器
Ｓ：標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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