(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０６）が産生する下記の理化学的性質を有するマンノースイソメラーゼ。
（1）作用
マンノースとフラクトース、及びリキソースとキシルロースを相互変換する。
（2）基質特異性
D−マンノース、D−フラクトース、D−リキソース及びD−キシルロースに作用し、D−グルコース、D−ガラクトース、L−アラビノース、D−キシロース、D−リボース、L−ラムノース、L−フコース、D−フコースには作用しない。
（3）最適温度：５５〜６０℃
（4) 最適pH：７〜９
（5）安定温度：６０℃迄
（6) 安定pH：６〜１０
（7）分子量：１４０，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
（8) 等電点：５．２（等電点電気泳動）
（9）Caイオンによる熱安定化：認められない
（10)マンノースに対するＫｍ値：０．０１Ｍ
【請求項２】
請求項１記載のマンノースイソメラーゼを生産する微生物を培養し、該マンノースイソメラーゼを生産させ、これを採取することを特徴とする新規マンノースイソメラーゼの製造方法。
【請求項３】
請求項１記載のマンノースイソメラーゼをフラクトース含有液に作用させてマンノースを生産し、これを採取することを特徴とするマンノースの製造方法。
【請求項４】
請求項１記載のマンノースイソメラーゼとグルコースイソメラーゼをグルコース含有液に作用させてマンノースを生産し、これを採取することを特徴とするマンノースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明は、フラクトースやグルコースを原料とし、新規なマンノースイソメラーゼを用いて、マンノースを製造する方法、及び、該マンノースイソメラーゼを製造する方法に関するものである。
［背景技術］
マンノースはグルコース、グルコサミンについで多く存在するヘキソースである。マンノースは、酵母、細菌、植物や動物の細胞膜及び細胞壁の構成成分として存在するほか、糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖中に多量に含まれ、遊離型で存在するのは希である。
マンノースは、生物の栄養源としては、グルコースやガラクトースと比較して劣るといわれているが、医薬品合成原料、マンニトールの原料として、又は、動物細胞培養原料として有用なものである。
また、マンノースの飼料添加によるサルモネラ定着抑制の研究は、米国農務省テキサス研究所の一派によって行なわれ、著しく腸内サルモネラ菌の増殖を抑制すると報告されており、家禽類の飼料としての利用が期待されている［Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｃｎｃｅ．６８．ｐ．１３５７，１９８９］。
マンノースは、マンノースを含有する多糖類（グルコマンナンやガラクトマンナンなど）の酸分解や酵素分解により、又はモリブデン酸塩を触媒として高温下でグルコースに作用させることにより、製造することができる。しかし、製造コストが高いためその用途が限られていた。
そこで、低コストでマンノースを生産する方法としては、原料として安価なフラクトースやグルコースを用い、フラクトースにマンノースイソメラーゼ（フラクトースとマンノースを相互変換する酵素）を作用させる方法、又はグルコースにグルコースイソメラーゼ（グルコースとフラクトースを相互変換させる酵素）とマンノースイソメラーゼを作用させる方法等が考えられてきた。
上記のマンノースイソメラーゼは、１９５６年、ＰａｌｌｅｒｏｎｉとＤｏｕｄｏｒｏｆｆらによって、シュードモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）に初めて見出されたものである［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１８．ｐ．５３５，１９５６］が、その後、ストレプトミセス・アエロコロリゲス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｅｒｏｃｌｏｒｉｇｃｎｅｓ）［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３１，ｐ．４３５，１９６７］、ミコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１０１，ｐ．７７７，１９７０］由来のマンノースイソメラーゼ等が報告されてきた。
しかし、これらの微生物由来のマンノースイソメラーゼは、耐熱性が低い（最適温度；３５〜４０℃）のに加え、フラクトースからマンノースへの変換効率は低く、工業的利用には適さないという欠点がある。
これに対して、耐熱性が高く、かつ、フラクトースからマシノースへの変換率が優れているマンノースイソメラーゼとしては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のもの（特開平６−２９２５７８、特許第３００３００９号）やサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）由来のもの（特開平１１−７５８３６）等が知られている。これらの酵素は、工業的利用に適した耐熱性を有し、フラクトースからマンノースへの変換率は約２５％である。
しかし、耐熱性が高く、変換率の優れているものは上記以外にはなく、まだ不充分であり、その開発が待たれているのが現状である。
［発明の開示］
現在、マンノースはマンナンの分解や化学合成によって製造されているため非常に高価な糖質である。そのため、工業的に食品や食品添加物、又は、飼料添加物用のマンノースを製造することができなかった。安価にマンノースを製造する方法として、マンノースイソメラーゼを使う方法が考えられる。しかし、フラクトースからマンノースへの変換率が低い、熱やｐＨ安定性が低いなどのハンドリングが製造現場における規格に適合しない場合が多い。
製造現場における多種多様の規格に適合させるため、また、盛んに行われている蛋白工学を用いた酵素の耐熱化研究において、様々な起源からの耐熱性のマンノースイソメラーゼが必要とされている。
本発明者らは、上記のような状況に鑑み、フラクトースからマンノースを生産する微生物を土壌から検索したところ、新たに、これまで全く知られていなかった新規なマンノースイソメラーゼを生産する微生物を発見し、その菌学的諸性質からアグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）と同定され、本発明を完成した。
即ち、本発明は、次の通りのものである。
１．下記の理化学的性質を有するマンノースイソメラーゼ
（１）作用
マンノースとフラクトース、及びリキソースとキシルロースを相互変換する。
（２）基質特異性
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−リキソース及びＤ−キシルロースに作用し、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、Ｄ−フコースには実質的に作用しない。
（３）最適温度：５５〜６０℃
（４）最適ｐＨ：７〜９
（５）安定温度：約６０℃迄
（６）安定ｐＨ：約６〜１０
（７）分子量：約１４０，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
（８）等電点：約５．２（等電点電気泳動）
（９）Ｃａイオンによる熱安定化：実質的に認められない
（１０）マンノースに対するＫｍ値：約０．０１Ｍ
２．アグロバクテリウム属由来のマンノースイソメラーゼ。
３．アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６が産生する上記１記載の理化学的特性を有するマンノースイソメラーゼ。
４．上記１記載のマンノースイソメラーゼを生産する微生物を培養し、該マンノースイソメラーゼを生産させ、これを採取することを特徴とする新規マンノースイソメラーゼの製造方法。
５．上記１記載のマンノースイソメラーゼをフラクトース含有液に作用させてマンノースを生産し、これを採取することを特徴とするマンノースの製造方法。
６．上記１記載のマンノースイソメラーゼとグルコースイソメラーゼをグルコース含有液に作用させてマンノースを生産し、これを採取することを特徴とするマンノースの製造方法。
本発明者らが見出した菌株は、その菌学的諸性質から、アグロバクテリウム・ラディオバクターと同定され、本発明者らは、アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  Ｍ３６）と命名した。
アグロバクテリウム・ラディオバクターは、国立予防衛生研究所の「病原体等安全管理規程」において、バイオセーフティレベル２以上に分類されておらず、科学技術庁の「組換えＤＮＡ実験指針」における安全度分類では、Ｐ２以上の封じ込めを必要としないものであり、遺伝子組換え技術でも多用されており、安全性の高い菌である。
本発明に用いるアグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６由来の酵素は、マンノースの工業的生産に用いることのできる耐熱性や変換効率を示している。また、遺伝子操作により特定の微生物の酵素生産性を飛躍的に向上させる技術が知られている。本発明者らはこの酵素に関する遺伝子配列の情報（特願平１１−２８６０３４）及び酵素生産性を向上させる技術（特願平１１−０６０９０４）を確立してきており、安価な酵素を用いることによるマンノースの低価格での製造の目途が立ちつつある。
また、上記反応の本マンノースイソメラーゼの作用条件（ｐＨ６．５〜９．５、反応温度６０℃：実施例５参照）は、グルコースイソメラーゼの作用条件（ｐＨ６．５〜７、温度６．０℃）と一致しているので、グルコースイソメラーゼを併用することにより、グルコースからマンノースの製造も可能である点で有利である。
なお、アグロバクテリウム属の微生物が、マンノースイソメラーゼを生産することについては未だ知られておらず、本発明のものが最初である。
本発明の酵素と公知の酵素の理化学的性質等を比較した結果を、表１に示す。
0004439153.tif 000002
0004439153.tif 000003
本発明の酵素：アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６由来
酵素Ａ：シュードモナス・エスピーＡＭ−９５８２（特許第３００３００９号）
由来の酵素
酵素Ｂ：シュードモナス・エスピーＮ−２５（特開平６−２９２５７８）由来の
酵素
酵素Ｃ：サーモモノスポラ・エスピーＭＢＬ１０００３（特開平１１−７５８３
６）由来の酵素
表１の結果から、本発明の酵素は、▲１▼その由来の微生物において酵素Ａ〜Ｃとは異なること、▲２▼基質特異性や最適ｐＨ、最適温度などにおいて酵素Ｂや酵素Ｃと異なること、▲３▼安定温度やカルシウムイオンによる熱安定化作用等において酵素Ａと異なること、▲４▼マンノースに対するＫｍ値において酵素Ａと異なることが、それぞれ分かる。
従って、本発明の酵素は、公知の酵素と比較すると、マンノースをフラクトースに異性化するという共通の作用を示すものの、その理化学的性質が異なっているから、酵素タンパク質としては異なる物質であるといえる。
以上により、本発明の酵素は、従来知られている酵素とは全く異なる新規なマンノースイソメラーゼである。
［発明の実施の形態］
以下、本発明の実施の形態を更に説明する。
（イ）  菌株
本発明に使用するアグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株は、本発明者らによって土壌中より発見された菌種であり、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７７として寄託されている（平成１１年４月２３日）。
アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６株は、以下の菌学的諸性質を有する。
（１）形態
細胞の形及び大きさ：０．８×１．２〜１．５μｍのかん菌
運動性：＋
グラム染色性：−
胞子形成：−
コロニー形態：円形、低凸状、金縁なめらか、光沢、半透明
（２）生理学的性質
硝酸塩還元：＋
インドール産生：−
ブドウ糖酸性化：−
３−ケト乳糖産生：＋
アルギニンジヒドロラーゼ：−
ウレアーゼ：−
エスタリン加水分解：＋
ゼラチン加水分解：−
β−ガラクトシダーゼ：＋
オキシダーゼ：＋
カタラーゼ：＋
基質資化能：
ブドウ糖：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋
マルトース：＋
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：−
酢酸フェニル：−
Ｏ／Ｆ試験：−
（ロ）  マンノースイソメラーゼの産出
マンノースイソメラーゼを産出する微生物としては、上記の菌株が有利に用いられる。また、その他のアグロバクテリウム属に属する微生物も利用でき、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ（ＩＡＭ１２０４８）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＩＡＭ１３１２９）、等が挙げられる。また、これらの変異株や組換え微生物が産生する酵素も利用できる。分泌の場所は特に制限されず、菌体内、菌体外の何れでもよい。
この酵素は、以下のような、通常の培養手段により産出される。
フラクトース、グルコース、マンノース、ガラクトース、異性化糖、蔗糖、マルトース、キシロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉など種々な糖、糖アルコール及び澱粉やデキストリンなどを炭素源とし、それに微生物の増殖に必要な窒素化合物（酵母エキス、魚肉エキス、ペプトン、アミノ酸、などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、ミネラルを加えた培地で、２０〜４０℃、好ましくは３０℃前後で好気条件下において、１〜５日、好ましくは１〜３日培養する。
分泌の場所が菌体内の場合、培養後、濾過又は遠心分離により菌体を回収し、そのまま使用するか、又は超音波若しくは自己消化法等により該酵素を抽出し使用する。又、分泌の場所が菌体外の場合、培養後、濾過又は遠心分離により菌体を除去し、濾液又は上清をそのまま使用する。抽出された酵素は、必要により、硫酸アンモニウム、アセトン、メタノール、エタノール等で沈澱し、精製濃縮し、又は乾燥保存する。
（ハ）  マンノースの製造
ａ）  フラクトースを原料とする場合
フラクトースに、上記（ロ）で示した菌体や菌体処理物などを作用させると、マンノースを製造することができる。
菌体処理物としては、▲１▼菌体を通常の方法で固定化したもの、▲２▼菌体を機械的、酵素的、若しくは、界面活性剤や有機溶剤などで処理したもの、又は、それらを固定化したもの、▲３▼菌体を破砕して破砕残さを除去したもの、又は、それを固定化したもの、▲４▼酵素精製物、又は、それを固定化したもの、等が挙げられる。
工業的には、菌体を固定化処理するか、又は菌体から抽出した酵素を適当な担体に固定し、固定化酵素として使用するのが有効である。
菌体処理物の固定化は、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、イオン交換担体、キトサンビーズなどを用いた通常の固定化方法が使用できる。
本酵素を用い、フラクトースからマンノースを製造する反応は、フラクトースまたは１〜７５％のフラクトース含有液を用いて、ｐＨ５．５〜１０、温度６５℃以下で行うのがよい。閉鎖した反応系で本酵素反応を行なった場合、反応平衡時ではフラクトース：マンノース＝約７５：約２５となる。
ｂ）  グルコースを原料とする場合
グルコースを原料とする場合には、グルコースからフラクトースを生成する反応と該フラクトースからマンノースを生成する反応との二種類の反応を生起させることに行われる。
従って、本方法の場合、本酵素のマンノースイソメラーゼの他に、グルコースイソメラーゼを併用するので、両酵素の作用条件が一致することが必要である。
前述したように、本酵素のマンノースイソメラーゼの作用条件は、グルコースイソメラーゼの作用条件（ｐＨ６．５〜７、温度６０℃）と一致するので問題はない。閉鎖した反応系で酵素反応を行なった場合、反応平衡時ではグルコース：フラクトース：マンノース＝約５０：約４０：約１０となる。
上記の二種類の反応に順じて、固定相式クロマト分離装置と疑似移動相式クロマト分離装置とを組み合わせて、連続反応製造とすることも当然可能である。
［実施例］
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。特別に標記がない場合、百分率はＷ／Ｖ％である。
実施例１  菌体の培養
ポリペプトン  １０％、酵母エキス５％、ＮａＣｌ  ５％からなる培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容量バッフル付き三角フラスコに入れ、常法により滅菌後、アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７７）を接種し、３０℃で２４時間振どう培養した。培養液を遠心分離機にて１２０００ｒｐｍの回転数で遠心分離し、菌体を回収した。得られた菌体は１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５ｍｌで２回洗浄した。１０ｍｌのリン酸緩衝液で菌体を懸濁した後、超音波破砕を行ない、遠心分離し、沈澱と粗酵素液に分けた。粗酵素溶液のマンノースイソメラーゼ活性は０．６３単位／ｍｌであった。
実施例２  マンノース変換率の測定
粗酵素液５００μｌに２０％フラクトース溶液５００μｌを加え、５０℃で２４時間反応を行なった。反応液の糖組成はＨＰＬＣによって確認した。ＨＰＬＣの条件を下記に示した。反応液中のマンノースを定量したところ、フラクトースからの変換率は２５．０％であった。
ＨＰＬＣ条件
ポンプ機種：日本分光（株）製  ＰＵ−１５８０
カラム：資生堂（株）製  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＮＨ２  ＵＧ８０
検出器：昭和電工（株）製  ＲＩ−７１型  示差屈折計
溶離液：アセトニトリル：水＝８０：２０
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
実施例３  アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物由来のマンノースイソメラーゼの酵素活性
アグロバクテリウムに属する微生物として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ（Ｍ３６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ（ＩＡＭ１２０４８）、Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＭ１３１２９）を用いた。これらの微生物から実施例１記載の方法に従って粗酵素液を調製し、マンノースイソメラーゼ活性について測定した。
尚、酵素活性の測定は以下の方法で行った。
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した２００ｍＭのマンノース溶液２００μｌに適宜希釈した酵素溶液２００μｌを加え、５０℃で酵素反応を行なった。次いで、酵素反応を１０分間の煮沸によって停止させ、ＨＰＬＣによって糖組成の分析を行なった。この条件下で、１分間に１μ  ｍｏｌのフラクトースを生成する酵素量を１単位とした。結果は表２に示した。
0004439153.tif 000004
上記の結果から、アグロバクテリウム属に属するいずれの微生物にもマンノースイソメラーゼ活性が認められ、特に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ（Ｍ３６）の酵素活性が高いことが分かる。
実施例４  マンノースイソメラーゼの酵素特性
アグロバクテリウム・ラディオバクターＭ３６由来のマンノースイソメラーゼについて、実施例１に準じて粗酵素液を調製した後、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって酵素精製を行い以下の試験に供した。
（１）基質特異性
基質には、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−リキソース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、Ｄ−フコースの各高純度品（試薬）を用いた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた２００ｍＭの各基質２００μｌに適宜希釈した酵素溶液２００μｌを加え、５５℃で３時間反応させ、ＨＰＬＣで解析した。その結果、本マンノースイソメラーゼはＤ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−リキソース及びＤ−キシルロースに作用し、Ｄ−マンノースとＤ−フラクトース及びＤ−リキソースとＤ−キシルロースをそれぞれ相互変換した。また、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、Ｄ−フコースには実質的に作用しないことが判明した。
（２）最適温度：
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた２００ｍＭマンノース溶液２００μｌに適宜希釈した酵素溶液２００μｌを加え、４０、５０、５５、６０、６５℃で３０分間反応させた。酵素失活させた後、生成したフラクトース量をＨＰＬＣによって定量した。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、本酵素の最適温度は５５℃〜６０℃であった。
（３）最適ｐＨ：
１００ｍＭの各種ｐＨの緩衝液に溶解させた２００ｍＭマンノース溶液２００μｌに適宜希釈した酵素溶液２００μｌを加え、５０℃で３０分間反応させた。酵素失活させた後、生成したフラクトース量をＨＰＬＣによって定量した。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、本酵素の最適ｐＨは７〜９であった。
（４）安定温度
適宜希釈した酵素溶液２００μｌを４０、５０、５５、６０、６５℃で１０分間インキュベートした後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた２００ｍＭマンノース溶液２００μｌを加えて反応させた。酵素失活させた後、生成したフラクトース量をＨＰＬＣによって定量した。結果を図３に示す。
図３から明らかなように、本酵素は約６０℃まで安定であった。
（５）安定ｐＨ
各種ｐＨの緩衝液で適宜希釈した酵素溶液２００μｌを２５℃で３時間インキュベートした後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた２００ｍＭマンノース溶液２００μｌを加えて反応させた。酵素失活させた後、生成したフラクトース量をＨＰＬＣによって定量した。結果を図４に示す。
図４から明らかなように、本酵素はｐＨ約６〜１０まで安走であった。
（６）分子量と等重点
ゲル濾過ＨＰＬＣによる分子量は約１４０，０００、等電点電気泳動による等重点は約５．２であった。
（７）カルシウムイオンによる熱安定化作用
塩化カルシウムを終濃度５ｍＭになるように含む２５ｍＭのＰＩＦＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸））緩衝液（ｐＨ７．０）で適宜希釈した酵素溶液を５５℃、６０℃、６２．５℃で１０分間インキュベートした。次いで２５ｍＭのＰＩＦＥＳ緩衝液に溶解した２００ｍＭのマンノース溶液２００μｌに本酵素溶液２００μｌを加え、５５℃で３０分間反応させ、反応停止後生成したフラクトースをＨＰＬＣで定量し、各温度のカルシウムイオンの安定化作用を以下の安定化率により評価した。
安定化率（％）＝（カルシウム添加の反応系におけるフラクトース変換率／カルシウム未添加の反応系におけるフラクトース変換率）×１００
結果を表３に示した。
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0004439153.tif 000006
表３の結果から、各温度条件においてフラクトース変換率は実質的に変化なく、本酵素は、カルシウムイオンにより殆ど安定化されないことが判明した。
（８）Ｋｍ（ミカエリス定数）値の測定
酵素反応速度論に基づき、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットにより本酵素のマンノースに対するＫｍ値を求めたところ、約０．０１Ｍであった。
実施例５  マンノース生成反応時の特性
実施例１で調製したマンノースイソメラーゼを用いて酵素の諸性質について確認した。
（１）反応温度の影響
フラクトース各２００ｍｇに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、マンノースイソメラーゼ０．２単位を加え、全量を１ｍｌとし、４５、５０、５５、６０℃で３日間反応させた。経時的にサンプリングを行ない、生成したマンノース量をＨＰＬＣによって定量した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように、反応初期では６０℃反応が最も良かったが、反応終期では５５℃の反応が最も良く、７２時間目で変換率２５．６％に達した。
（２）反応ｐＨの影響
フラクトース各２００ｍｇに、１００ｍＭの各種酸緩衝液、マンノースイソメラーゼ０．２単位を加え、全量を１ｍｌとし、５０℃で２４時間反応させた。反応開始２４時間目にサンプリングを行ない、生成したマンノース量をＨＰＬＣによって定量した。結果を図６に示す。
図６から明らかなように、ｐＨ６．５〜９．５という、幅広いｐＨにおいて実質的なマンノース生産が可能であることが明らかにされた。
（３）高濃度基質での反応
フラクトース  ５００ｍｇに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、マンノースイソメラーゼ４、２、１、０．５単位を加え、水で全量を１ｍｌとし、５５℃で２日間反応させた。経時的にサンプリングを行ない、生成したマンノース量をＨＰＬＣによって定量した。結果を図７に示す。
図７から明らかなように、本酵素は、高濃度のフラクトース溶液（５０％）を効率良くマンノースに変換することがわかった（変換率約２５％）。
実施例６  フラクトースからマンノースの製造
実施例１の方法で調製したマンノースイソメラーゼを硫酸アンモニウムによる分画処理を行なった。脱塩して部分精製した酵素溶液５ｍｌを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２倍希釈し、キトサンビーズ（富士紡績（株）製、「キトパールＢＣＷ−３５０５」８ｍｌを加え、３０℃で２時間振とうさせて固定化を行なった。酵素を固定化したキトサンビーズをカラムに充填し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍｌを通液した。通液した液には酵素の溶出は確認できず、酵素は完全にキトサンビーズに吸着されたことがわかった。５５℃で保温したカラムに２０％フラクトース溶液を流速０．２５ｍｌ／分で３日間循環させた。反応３日目に反応液を回収し、生成したマンノース量をＨＰＬＣによって定量した。その結果、フラクトースからの変換率は２４．５％であった。
実施例７  グルコースからマンノースの製造
実施例１で調製したマンノースイソメラーゼと市販のストレブチマイセル・ムリヌス由来のグルコースイソメラーゼ（スウィートザイムＴ（ノボノルディスク  バイオインダストリー（株）製））を用い、グルコースからマンノースの生産試験を行なった。
グルコース４００ｍｇに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、マンノースイソメラーゼ０．４単位及びグルコースイソメラーゼ０．４単位を加え、全量を１ｍｌとし、５０℃で３日間反応させた。反応３日目に酵素を失活させ、生成したマンノース量をＨＰＬＣによって定量した。その結果、グルコース：フラクトース：マンノース比は４９．１：４０．７：１０．２であった。
［産業上の利用可能性］
（１）本発明のマンノースイソメラーゼは、その諸性質からこれまでにない新規なものであり、遺伝子操作の点から有用である。
（２）本発明のマンノースイソメラーゼは、広い作用ｐＨ域を有し、高濃度のフラクトース溶液において、効率良くマンノースへ変換することが出来る。
（３）本マンノースイソメラーゼの作用条件は、グルコースイソメラーゼの作用条件と一致しているので、グルコースイソメラーゼを併用することにより、フラクトースからだけではなくて、グルコースからマンノースの製造も可能である点で有利である。
（４）従って、安価なフラクトースやグルコースから、マンノースを低コストで大量に製造することが出来るので、工業的に有利である。
（５）なお、アグロバクテリウム属の微生物が、マンノースイソメラーゼを生産することについては未だ知られておらず、本発明のものが最初であり、その技術的価値は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
［図１］  本発明のマンノースインメラーゼの最適温度を示す。
［図２］  本発明のマンノースイソメラーゼの最適ｐＨを示す。
［図３］  本発明のマンノースイソメラーゼの安定温度を示す。
［図４］  本発明のマンノースイソメラーゼの安定ｐＨを示す。
［図５］  本発明のマンノースイソメラーゼを用いた、フラクトースからマンノースを得る反応での反応温度の影響を示す。
［図６］  本発明のマンノースイソメラーゼを用いた、フラクトースからマンノースを得る反応でのｐＨの影響を示す。
［図７］  本発明のマンノースイソメラーゼを用いた、フラクトースからマンノースを得る反応での酵素濃度の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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