(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロゼプシス病態モデル動物（ヒトを除く）の作成方法であって、下記の工程：
(1)膀胱内にラセン状の弾性体用具が留置された動物に対して経尿道的に病原菌を接種する工程；
(2)上記工程(1)の後、該動物に免疫抑制剤を投与する工程；
(3)上記工程(2)の後、該動物の尿道口を物理的手段により閉塞する工程
を含み、病原菌接種の３日後に免疫抑制剤としてシクロフォスファミドを投与し、該免疫抑制剤投与の３日後に６〜１０時間尿道口を閉塞する工程を含む方法。
【請求項２】
ウロゼプシスに対して有効な薬剤のスクリーニング方法であって、請求項１に記載の方法で作成されたウロゼプシス病態モデル動物（ヒトを除く）に被検薬剤を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は尿路感染症から移行する敗血症であるウロゼプシスの病態を反映した実験動物の作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床において、患者の防御機構に障害があり、複雑性尿路感染症を有する状態で尿路が閉塞された場合、重篤な敗血症であるウロゼプシス（urosepsis：尿性敗血症とも呼ばれる）へ移行する場合がある。特に、緑膿菌などによる敗血症が引き起こされた場合には死亡する例も多いことから、その対策は重要であり、病態の基礎的解析が望まれている。しかしながら、実験動物においてウロゼプシスの臨床病態を反映した感染モデルの作成方法は従来報告されておらず、実験動物による病態の基礎的解析ができないという問題があった。
【０００３】
従来、ラットを用いて複雑性尿路感染症などの尿路感染症モデルを作成する方法が提案されている（特開平９−３１３０６９号公報）。この方法によれば、実験動物の膀胱内に例えばラセン状のポリエチレン樹脂からなる弾性体用具を留置することにより、尿路感染症の病態モデル動物を容易に、かつ再現性よく作成できる。しかしながら、この方法を利用してウロゼプシスの病体モデル動物を作成する試みは従来いなかる刊行物にも示唆ないし教示されておらず、その成功の可能性も未知であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、尿路感染症から移行するウロゼプシスの病態を反映した実験動物を容易に、かつ再現性よく作成する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ラットを用いて特開平９−３１３０６９号公報に記載された方法に従って尿路感染症モデル動物を作成した後、この動物に免疫抑制剤を投与して動物の防御機構を低下させ、さらに尿道を人為的に閉塞せしめることによって、ウロゼプシスに移行したラットを再現性よく作成することができることを見出した。また、このラットがウロゼプシスを発症する際の病態を反映したモデル動物として利用でき、病態の解明や薬剤の有効性の判定に利用できることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００６】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、ウロゼプシス病態モデル動物の作成方法であって、下記の工程：
(1)尿路感染症モデル動物に対して免疫抑制剤を投与する工程；
(2)上記工程(1)の後、該動物の尿道口を物理的手段により閉塞する工程
を含む方法を提供するものである。
また、本発明の第二の態様によれば、ウロゼプシス病態モデル動物の作成方法であって、下記の工程：
(1)膀胱内にラセン状の弾性体用具が留置された動物に対して経尿道的に病原菌を接種する工程；
(2)上記工程(1)の後、動物に免疫抑制剤を投与する工程；
(3)上記工程(2)の後、動物の尿道口を物理的手段により閉塞する工程
を含む方法が提供される。
【０００７】
これらの発明の好ましい態様によれば、動物がラットである上記方法；病原菌が緑膿菌である上記方法；免疫抑制剤がシクロフォスファミドである上記方法；及び尿道口をクリップにより閉塞する上記方法が提供される。上記第二の態様において、弾性体用具が熱可塑性樹脂、好ましくはポリエチレン樹脂からなる用具である上記方法は好ましい態様である。
【０００８】
第二の態様の発明において、特に好ましい態様では、免疫抑制剤は病原菌を接種された動物の免疫を抑制するために十分な投与量と投与時期に投与される。通常は、病原菌接種の約３日後にシクロフォスファミドを投与することが望ましく、投与量は一般的に１００ｍｇ／ｋｇ動物である。
【０００９】
また、これらの発明において、尿道口の物理的閉塞は、尿路感染症モデル動物がウロゼプシスに移行するために適当な時期に十分な時間行われる。通常、免疫抑制剤投与の約３日後に約８時間尿道口を閉塞することが望ましい。
【００１０】
また、本発明により、上記方法により作成されたウロゼプシス病態モデル動物が提供される。さらに、上記のウロゼプシス病態モデル動物に被検薬剤を投与する工程を含む、ウロゼプシスに対して有効な薬剤のスクリーニング方法が本発明により提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる尿路感染症モデル動物の作成方法は特に限定されないが、膀胱内にラセン状の弾性体用具が留置された動物に対して経尿道的に病原菌を接種する工程を含む方法により作成された尿路感染症モデル動物を好適に用いることができる。この方法は、特開平９−３１３０６９号公報に記載されており、上記の第二の態様に従って用いられる膀胱内留置用具についても同公報に具体的に記載されている。上記刊行物の開示を参照のため本明細書の開示として含める。以下、上記の膀胱内留置用具を用いる第二の態様の方法について説明するが、本発明の方法はこの方法により作成された尿路感染症モデル動物を用いる場合に限定されることはない。
【００１２】
膀胱内留置用具の材質は弾性体であれば特に限定されないが、例えば、ゴム等のエラストマーのほか、熱可塑性樹脂、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタンなどを用いることができる。また、ヒトにおける尿道カテーテルと同じ材質、例えばシリコン等をコーティングした弾性体を用いることもできる。熱可塑性樹脂のうち、80〜 100℃程度で塑性成形でき、40℃以下、好ましくは室温下(0〜30℃)において弾性体（本明細書において、弾性体という用語は粘弾性体を含めて最も広義に用いる）の性質を有するものが好適である。
【００１３】
例えば、熱湯などを用いて容易に塑性成形できるとともに、室温下において外力の存在下で容易に変形し、外力を取り去ることにより速やかに元の形状に復帰することができるポリエチレンなどを特に好適に用いることができる。もっとも、材質はポリエチレンに限定されることはなく、加工の容易性、塑性成形の容易性、及び弾性変形の容易性などの観点から適宜のものを選択できる。なお、外力は、膀胱内留置のために好ましい用具の形状を尿道を通過させるために好ましい形状に一時的に変形させるために外部から加えられる力であり、チューブ状の部材を用いて製造された本発明の用具のチューブ内壁に対してガイドワイヤーの表面から外力が加えられる場合や、ガイドチューブ内に伸直された状態で挿入された本発明の用具の外壁に対してガイドチューブ内壁から外力が加えられる場合などがある。
【００１４】
膀胱内留置用具を製造するためには、ゴム等のエラストマーや上記の熱可塑性樹脂を当業者に利用可能な適宜の方法で成形又は切削すればよいが、本発明の用具を簡便に製造するためには、容易に入手可能なポリエチレン製のチューブを用いることができる。例えば、動静脈及び脳血管撮影用の穿刺用具として市販されているイントラメディック・ポリエチレン・チュービング #427410 (PE50, ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー製, 内径 0.58 mm×外径 0.965 mm)などは、膀胱内留置用具の製造に特に有用である。また、膀胱内留置用具を簡便に製造するためには、上記のポリエチレン製チューブのほか、ポリエチレン製のワイヤーなどを用いることができる。
【００１５】
ポリエチレン製チューブを用いた膀胱内留置用具の製造方法及び使用方法の一例を具体的に説明する。上記ポリエチレン製チューブを約 1.5 cm 程度の長さに切断し、内部にステンレス製などの金属製のガイドワイヤー (外径約 0.5 mm 程度、長さ 10 cm程度の直線状ワイヤー)を通して、ポリエチレン製チューブの部分をラセン状 (ラセンピッチ: 約 1 mm 程度; ラセン全長: 約 5 mm 程度; ラセン回数: 約２回)に加工する。加工にあたっては、18ゲージの注射針に巻き付けると簡便である。その後、ポリエチレン製チューブの部分を 100℃の熱湯に 2〜3 秒間浸漬し、冷却後にガイドワイヤーを抜去するこにより、ラセン状に加工された膀胱内留置用具を製造することができる。なお、適当な長さのポリエチレン製チューブを上記のようにして加工した後に、ラセン全長が約5 mm 程度になるように切断してもよい。
【００１６】
上記のようにして得た膀胱内留置用具のチューブ内部のガイドワイヤーを再び伸直させるか、またはチューブ内部に新たに直線状のガイドワイヤーを差し込み、ガイドワイヤーからの外力によってラセン状の膀胱内留置用具を直線状に変形させることができる。変形させた膀胱内留置用具を差し込んだガイドワイヤーの他端から未加工のポリエチレン製チューブを差し込んでガイドチューブとし、変形させた膀胱内留置用具の側からラットの尿道を通して膀胱内に導入する。直線状に変形した膀胱内留置用具を膀胱内部に完全に挿入した後、ガイドチューブを膀胱内部に向かって押し込んで膀胱内部に膀胱内留置用具を押し出すと、膀胱内留置用具が速やかにラセン状に復帰し、ラセン状の膀胱内留置用具が膀胱内部に確実に留置される。
【００１７】
ポリエチレン製ワイヤーを用いて膀胱内留置用具を製造する場合には、ステンレスなどの金属製のチューブ内にポリエチレン製ワイヤーを充填し、この金属製チューブを、例えば、18ゲージの注射針に巻き付けてラセン状 (ラセンピッチ:約 1 mm 程度)に加工すればよい。その後、ポリエチレン製ワイヤーを充填した金属製チューブを 100℃の熱湯に 2〜3 秒間浸漬し、冷却後にラセン状に加工されたポリエチレンワイヤーを引き抜き、ラセン全長が約 5 mm 程度（ラセン回数: 約２回）になるように切断することにより、膀胱内留置用具を製造することができる。
【００１８】
上記態様の膀胱内留置用具を膀胱内に留置するには、ラセン状の膀胱内留置用具を金属製の直線状ガイドチューブ内に充填して、ガイドチューブからの外力により膀胱内留置用具を直線状に変形させる。その後、膀胱内留置用具を充填したガイドチューブの先端を経尿道的に膀胱内に挿入し、金属製又はポリエチレン製などのワイヤーなどの押し棒をガイドチューブの他端からチューブ内に押し込んで、ガイドチューブ内に充填された膀胱内留置用具を膀胱内部に押し出す。膀胱内部に押し出された膀胱内留置用具は外力から開放され、速やかにラセン状に復帰して膀胱内部に確実に留置される。
【００１９】
本発明の方法は、ラットやマウスなどの小動物に対して好適に用いられるほか、モルモット、ウサギなどの比較的大型の動物に対して適用することも可能である。膀胱内留置用具の形状及び大きさは使用する実験動物の膀胱の大きさなどの条件に応じて適宜選択可能である。より具体的にいうと、膀胱内留置用具の形状と大きさは、直線状に変形した状態で経尿道的に膀胱内部に挿入することができ、かつ、留置後には実験動物の膀胱内で異物として認知されるとともに、経尿道的に容易に排出されないように選択されるべきである。ラットを用いる場合について具体的に説明したラセン形状とその大きさは、膀胱内留置用具の形状及び大きさの好ましい一例である。従って、膀胱内留置用具の形状はラセン状に限定されることはなく、例えば、渦巻き状、多角形状、又はこれらの組み合わせの形状など当業者が適宜選択可能である。
【００２０】
なお、本明細書において用いる「直線状」という用語は、本発明の用具が全体として尿道を通過させるために好ましい形状であることを意味しており、用具が概ね直線状態にあるという意味に解釈されるべきである。従って、全体及び細部において完全な直線状を呈する場合のほか、全体としては直線状であるものの、細部において非直線状（例えば曲線状）の部分を含むものなどを包含している。また、概ね直線状とは、その用具が多少の湾曲や凹凸を含む場合があることを意味している。
【００２１】
上記の方法により膀胱内部に本発明の膀胱内留置用具を留置した後、経尿道的に病原菌を接種することにより、上記動物に尿路感染症を成立させる。病原菌の種類は特に限定されないが、目的とするウロゼプシスの病態を反映できるように、緑膿菌や病原性大腸菌などを選択することが望ましい。２種以上の病原菌を接種することによって、複数菌に基づく尿路感染症を成立させることができる。病原菌の接種量は生成すべきモデルの種類に応じて適宜選択できるが、通常は1×106〜1×108 CFU/ml程度の菌液を調製して、経尿路的に0.01〜0.5 ml程度を膀胱内に接種すればよい。
【００２２】
上記のようにして病原菌を膀胱内に接種した後、免疫抑制剤を投与して動物の防御能を低下させる。免疫抑制剤の種類は特に限定されないが、シクロフォスファミドが特に好ましい。免疫抑制剤は動物の免疫を抑制するために十分な投与量で、かつ尿道口を物理的に閉塞する前に動物の体内にすでに存在していた菌によって敗血症が引き起こされないような投与量で投与される。また、免疫抑制剤は通常は病原菌の接種後の適当な時期に投与されるが、感染が成立しにくい病原菌を接種する場合には、病原菌の接種に先立って免疫抑制剤を投与しておくのが好ましい場合もある。より具体的には、動物としてラットを用いる場合には、病原菌接種の約２〜４日後、好ましくは３日後にシクロフォスファミドを投与することが望ましい。シクロフォスファミドの投与量は動物の種類や体重などを勘案して適宜選択できるが、一般的には100 mg/kg動物程度であり、ラットの場合には100 mg/kgラットであることが特に好ましい。もっとも、免疫抑制剤の投与量及び投与時期は適宜選択可能であることは言うまでもない。
【００２３】
その後、免疫抑制剤を投与した動物の尿道口を物理的に閉塞することにより、ウロゼプシスを惹起することができる。尿道口の物理的閉塞は、尿路感染症を発症した動物がウロゼプシスに移行するために適当な時期に十分な時間にわたって行われる。動物としてラットを用いる場合には、通常、免疫抑制剤投与の約２〜４日後、好ましくは３日後に約６〜１０時間、好ましくは約８時間尿道口を閉塞することが望ましい。尿道口の閉塞手段は特に限定されないが、小型のクリップによる閉塞などが好適である。この際、尿道口がクリップにより挫滅しないように、乾綿などの適宜のクッションをクリップに装着しておくことが望ましい。
【００２４】
このようにしてウロゼプシスを惹起した動物は、治療的措置を施さない場合には、血中菌数が経時的に増加して通常は数日で死に至る。本発明の方法により得た動物がウロゼプシスに移行しているか否かは、一般的には血中の病原菌を証明することにより確認することができる。また、ウロゼプシス病態モデル動物としての適格性は、本発明の方法で得た動物は全例が短期間に死に至るのに対して、対照として免疫抑制剤の非投与群、尿道の非閉塞群、及び／又は留置用具の非留置群などにおいて死亡例がないか、あるいはわずかであることを観察することにより容易に検定できる。
【００２５】
本発明の方法により作成されたウロゼプシス病態モデル動物は、ウロゼプシスの病態の解明のための実験動物として利用できるほか、例えば、合成抗菌薬や抗生物質などの各種化学療法剤のウロゼプシスに対する有効性の判定や、ウロゼプシスに対して有効な薬剤のスクリーニングに用いることができる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：膀胱内留置用具の製造
ポリエチレン製チューブ（イントラメディック・ポリエチレン・チュービング#427410, PE50, ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー製, 内径 0.58 mm×外径 0.965 mm × 1.5 cm）の内部にステンレス製のガイドワイヤー (外径0.5 mm)を通し、18ゲージの注射針に巻き付けてラセン状に加工した (ラセンピッチ: 約 1 mm;ラセン全長: 約 5 mm;ラセン回数: 約２回)。このチューブを100 ℃の熱湯に 2〜3 秒間浸漬した後に水中で冷却し、ラセン状の膀胱内留置用具を製造した。
【００２７】
例２：ウロゼプシス病態モデルラットの作成
例１で製造した膀胱内留置用具のチューブ内部のガイドワイヤーを伸直させ、膀胱内留置用具を直線状に変形させた後、ガイドワイヤーの反対側からガイドチューブとして未加工のポリエチレン製チューブを差し込んだ。これを、ケタミン・キシラジン麻酔下で膀胱内留置用具の側からラット（Crj:CD(SD)IGS系, 雌性, 7週齢, 日本チャールズ・リバー、各群10匹）の尿道に挿入し、さらにガイドチューブを押し込んで膀胱内留置用具を膀胱内部に押し出し、膀胱内で膀胱内留置用具をラセン状に復帰させた。この後、ガイドチューブ及びガイドワイヤーを尿道から抜去した。留置後、尿道常在菌の関与を防ぐ目的で飲水中にアンピシリン (1 mg/ml)を添加して自由摂水させ、全ての試験ラットにおいて常在菌の混入がないことを確認した。
【００２８】
留置４日後、前日より絶水にした留置ラットをケタミン・キシラジン(2:1)の筋肉内投与により全身麻酔し、腹部を圧迫して排尿させた。排尿後、経尿路的に針先を鈍磨した22G留置針を挿入し、緑膿菌 910735 株（尿路感染症由来、MIC:レボフロキサシン 0.39μg/ml、シプロフロキサシン 0.1μg/ml、トリプソイ斜面培地で37℃で一夜培養したものを0.033 Mリン酸緩衝液に懸濁して5×107 CFU/mlに調製したもの）の菌液0.1 mlを膀胱内に接種した。尿道口付近の常在菌の尿路への混入を防ぐ目的でアンピシリン含有水(1 mg/ml)を留置後から実験終了日まで継続して給水した。
【００２９】
感染３日後に100 mg/kgのシクロフォスファミド（エンドキサン、塩野義製薬株式会社）を腹腔内投与し、シクロフォスファミドの投与３日後にケタミン・キシラジン麻酔下でラットの尿道を８時間小型クリップで閉塞した。閉塞時には、尿道口の挫滅防止の目的で、クッションとして乾綿を小型クリップに装着した。モデルの解析のため、尿道口閉塞直前、閉塞解除直後、１，２，３，４及び７日後に尾静脈から50μlの血液を採取し、トリプトソイ寒天培地に接種後37℃で一夜培養して発育した菌数を測定した。比較のため、上記の方法により作成したウロゼプシス病態モデル動物（Clamp群）の他、免疫抑制剤の非投与群、尿道口の非閉塞群、及び留置用具の非留置群（上記の各群において他の条件はすべてClamp群と同じ）についても血中菌数を同様に測定した。
【００３０】
この結果、本発明の方法で処理した群では全例で血中菌数が増加し、5日後には全例が死に至ったのに対して（10/10例）、対照として用いた免疫抑制剤非投与群、尿道口非閉塞群、及び用具非留置群では血中菌数の増加はわずかであり、死亡例は各群10匹中、免疫抑制剤非投与群で１例、尿道口非閉塞群で0例、用具非留置群で3例であった。結果を図１に示す。本発明の方法により、宿主の防御機構に障害があり、基礎疾患として尿路感染症を有する状態で尿路が閉塞された場合、致死的敗血症へ移行することが示され、このモデル動物は臨床において尿路感染症患者がウロゼプシスを発症する際の病態を反映するものと考えられた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、ウロゼプシスの病態モデル動物を簡便かつ再現性よく作成することができ、得られた病態モデル動物はウロゼプシスの病態の解明、及びウロゼプシスに対する化学療法の効果の確認などに有用である。
【００３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】  緑膿菌により惹起されたラットウロゼプシス病態モデル動物の生存率の推移を示した図である。図中、Clampは本発明の方法により作成したモデル動物を示し、Non-cyclophosphamideは免疫抑制剤の非投与群、Non-clampは尿道口の非閉塞群、及びNon-PTは留置用具の非留置群についての結果を示し、横軸は尿道閉塞後の日数、縦軸は生存率を示す。
【図１】
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