(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階により核酸類を単離するための方法。
−所定の方向から膜の一方の側への核酸類の投入、ただし、該膜には一方の側と他方の側がある；
−前記膜の一方の側での核酸類の固定化；
−前記膜の一方の側からの固定化された核酸類の放出；及び
−前記膜の一方の側に放出された核酸類の投入と同じ方向における除去。
【請求項２】
前記投入は上方（top）から行われるという事実を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定化と放出段階との間で、少なくとも１種の洗浄バッファーを用いて固定化された核酸類の洗浄を行うという事実を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記洗浄が、各洗浄バッファーのために以下の段階を含むという事実を特徴とする請求項３に記載の方法。
− 予め決められた量の洗浄バッファーの前記膜の一方の側への輸送；及び
− 吸引による前記膜を通した前記洗浄バッファーの抜き取り。
【請求項５】
前記核酸類の投入及び固定化は以下の段階を含むという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
−固定化バッファーとの前記核酸類の混合；
−前記膜の一方の側への固定化バッファーを用いた核酸類の投入；
−前記膜を通した液体成分の投入と同じ方向における抜き取り。
【請求項６】
前記段階の少なくとも１つは、自動機械によって完全に自動で行われ得るという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法における全ての段階が制御配列（controlled sequence）における自動機械によって行われ得るという事実を特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸類の大部分が同時に単離され得るという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項９】
核酸類の固定化のために、鉱酸とアルカリ及びアルカリ土類金属類との塩類の水溶液が使用されるという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸類の固定化のために、アルカリ又はアルカリ土類ハロゲン化物類若しくは硫酸塩類が使用されるという事実を特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸類の固定化のために、硫酸ナトリウム又はカリウム又はマグネシウムのハロゲン化物が使用されるという事実を特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸類の固定化のために、アルカリ又はアルカリ土類金属と、一塩基若しくは多塩基又は多官能性（polyfunctional）有機酸類とからの塩類の水溶液が使用されるという事実を特徴とする請求項１〜８の１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸類の固定化のために、有機ジカルボン酸類のナトリウム、カリウム、又はマグネシウム塩類の水溶液が使用されるという事実を特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、又は琥珀酸であるという事実を特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
核酸類の固定化のために、ナトリウム又はカリウム塩類の水溶液が、ヒドロキシカルボン酸又はポリヒドロキシカルボン酸とともに使用され得るという事実を特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシカルボン酸がクエン酸であるという事実を特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸類の固定化のために、脂肪族又は非環式飽和又は不飽和炭化水素のヒドロキシル誘導体が使用されるという事実を特徴とする請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒドロキシル誘導体として、C1-C5アルカノール類が使用されるという事実を特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記C1-C5アルカノールとして、メタノール、エタノール、n-プロパノール、tert.-ブタノール又はペンタノールが使用されるという事実を特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒドロキシル誘導体として、アルダイト（aldite）が使用されるという事実を特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
核酸類の固定化のために、フェノール又はポリフェノールが使用されるという事実を特徴とする請求項１〜８に記載の方法。
【請求項２２】
固定化された核酸類の洗浄のために、請求項４〜２１の１項による塩溶液又はバッファー溶液が使用されるという事実を特徴とする請求項３〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸類の放出のために、水性塩又はバッファー溶液が使用されるという事実を特徴とする前述の請求項の1項に記載の方法。
【請求項２４】
核酸類の放出のために、水が使用されるという事実を特徴とする請求項１〜２２の１項に記載の方法。
【請求項２５】
核酸類の固定化のために、カオトロピック剤が使用されるという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記カオトロピック剤が、トリクロロ酢酸塩類、チオシアン酸塩類、過塩素酸塩類、ヨウ化物類、又は塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム又は尿素の群の塩であるという事実を特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
カオトロピック剤の0.01〜10Mの水溶液が、核酸類の固定化のために、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴とする請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
カオトロピック剤の0.1〜7Mの水溶液が、核酸類の固定化のために、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
カオトロピック剤の0.2〜5Mの水溶液が、核酸類の固定化のために、単独で、又は他の塩類との組み合わせで使用されるという事実を特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又はヨウ化カリウムの水溶液が、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項２５〜２９の１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記膜が、疎水性膜であるという事実を特徴とする請求項１〜３０の１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記疎水性膜が、極性基を有するポリマーから成るという事実を特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記膜が、疎水化された（hydrophobisized）表面を有する疎水性膜であるという事実を特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記膜が、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオルリド、ポリエチレン-テトラフルオロエチレン共重合化物（copolymerizate）、ポリエチレン-クロロトリフルオロエチレン共重合化物、又はポリフェニレンスルフィドから成るという事実を特徴とする請求項３１〜３３の１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記膜が、疎水化されたナイロンから成るという事実を特徴とする請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記膜が、ある場合には、アルミニウム又はジルコニウム塩類、四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコーン類、有機亜鉛化合物類、又はグルタル酸（glutaric）ジアルデヒドの混合物とともに、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類の群からの疎水性コート剤を用いてコートされるという事実を特徴とする請求項３３〜３５の１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記膜が、親水性又は親水化された（hydrophilized）膜であるという事実を特徴とする請求項３３〜３５の１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記膜が、親水化されたナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、ポリエチレン-テトラフルオロエチレン共重合化物、ポリエチレン-クロロトリフルオロエチレン共重合化物、又はポリフェニレンスルフィドから成るという事実を特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記膜における細孔が、0.001〜50μm、好ましくは0.01〜20μm、最も好ましくは0.05〜10μmの直径を有するという事実を特徴とする請求項１〜３８の１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記膜が、疎水性フリース（fleece）であるという事実を特徴とする請求項１〜２４に記載の方法。
【請求項４１】
核酸類の固定化のために、カオトロピック剤が使用されるという事実を特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記カオトロピック剤が、トリクロロ酢酸塩類、チオシアン酸塩類、過塩素酸類、ヨウ化物類、又は塩酸グアニジニウ、イソチオシアン酸グアニジニウム、もしくは尿素の群からの塩であるという事実を特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
0.01〜10Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
0.1〜7Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
0.2〜5Mのカオトロピック剤の水溶液が、単独で、又は他の塩類と組み合わせて、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又はヨウ化カリウムの水溶液が、核酸類の固定化のために使用されるという事実を特徴とする請求項４１〜４５の１項に記載の方法。
【請求項４７】
固定化が、pH3〜11において行われるという事実を特徴とする前述の請求項の１項に記載の方法。
【請求項４８】
膜の片側における核酸類の固定化、及び同じ側におけるそれらの単離のための核酸類の放出のための少なくとも１つの膜の使用。
【請求項４９】
前記膜が、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、並びにアクリル酸共重合体、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリフルオロカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、ポリエチレン-テトラフルオロエチレン共重合化物、ポリエチレン-クロロジフルオロエチレン共重合化物、又はポリエチレンスルフィドからなるという事実を特徴とする請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記膜が、疎水化されたナイロン膜であるという事実を特徴とする請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記膜が、ある場合には、アルミニウム又はジルコニウム塩類、四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコーン類、有機亜鉛化合物類、又はグルタル酸（glutaric）ジアルデヒドの混合物とともに、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類の群からの疎水性コート剤を用いてコートされる親水性膜であるという事実を特徴とする請求項４８〜５０の１項に記載の使用。
【請求項５２】
前記膜の大部分が、マルチウェルプレート上の単離装置に設置されるという事実を特徴とする請求項４８〜５１の１項に記載の使用。
【請求項５３】
請求項１〜４６の１項において作動するという事実を特徴とする自動装置。
【請求項５４】
バッファー及び溶液の膜への及び膜から離す適用を実行する又は実行し得る少なくとも１つの真空装置とともに備えられるという事実を特徴とする請求項５２に記載の自動装置。
【請求項５５】
前記核酸類の固定化が、pH3〜11において行われるという事実を特徴とする請求項１〜４７の１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、表面上の核酸類の単離及び精製のための新しい方法に関する。
【０００２】
生物学的及び臨床的試料材料からの核酸類の単離及び精製は、核酸類に基づく処理技術が用いられ、又は核酸類に基づく科学技術が実際に利用（access）の秘訣である、作業分野のために極めて重要である。その例は、実父確定分析（paternity analysis）、組織適合試験、遺伝病の同定、ゲノム（genome）分析、分子診断、伝染病の決定、動物及び植物繁殖、移植遺伝子（transgenic）調査、生物学及び医薬、並びに多数の関連領域における基礎調査を包含する。それらの中に含まれる核酸類が、問題とされる分析手順において直接使用され得るようなやり方で、生物学的又は臨床的試料を調製する際に、一般に困難に遭遇する。
【０００３】
技術水準（the state of the art）は、DNAの精製のための多くの方法を既に包含している。我々は、例えば、バーンボイム（Birnboim）の方法[Methods in Enzymology 100 (1983) 243]により、クローニング、及び同様に他の実験的方法の目的のためにプラスミドDNAをどのように精製するかを知っている。この方法において、細菌由来の透明な溶解物は、４〜２４時間の間、塩化セシウム勾配（gradient）に曝され、そして遠心分離される。この段階の後に、DNAの抽出及び沈殿が通常行われる。この方法は、一方では非常に高価な装置を必要とし、他方では、長時間を要し、費用集約的（costintensive）であり、かつ自動化することができないという欠点を有する。
【０００４】
DNAの単離のために透明な溶解物が使用されるその他の技術は、イオン交換クロマトグラフィー[Colpan et al., J. Chromatog. 296 (1984) 339]及びゲル濾過[Moreau et al., Analyt. Biochem. 166 (1987) 188]からなる。これらの方法は、主に塩化セシウム勾配の代替として提供されるが、しかし、通常高濃度の塩類を含み、かつ著しく希釈された溶液中で行われるので、装置を多数要する（apparatus-intensive）溶媒供給系及び得られたDNAフラクションの沈殿を要する。
【０００５】
マルコ（Makco）ら[Analyt. Biochem.,121 (1982) 382]及びヴォゲルスタイン（Vogelstein）ら[Proc. Nat. Acad. Sci. 76 (1979) 615]は、核酸類を含む抽出物からのDNAが、高濃度のヨウ化ナトリウム又は過塩素酸ナトリウムに曝される場合に、DNAのみは小さなガラスシンチレーション（scintillation）管、機械的手法により細かく粒子状化された繊維ガラスシートのガラス繊維膜に密着する一方、RNA及びタンパク質類はそうではないことを見出した。この手法において結合されたDNAは、例えば、水を用いて溶出することができる。
【０００６】
例えば、WO 87/06621において、PVDF膜上での核酸類の固定化が説明されている。しかし、PVDF膜と結合した核酸類は、次の段階においては溶出しない。代わりにこの膜を、全ての結合された核酸類とともに、PCRアタッチメント(attachment)内に直接導入する。最終的に、この国際特許出願及び他の文献において、疎水性表面又は膜は、ほぼ十分な収量で核酸類を固定化し得るために、一般に前もって水又はアルコールを用いて湿らせなければならないことが記載されている。
【０００７】
一方、例えば、PCR、逆転写PCR、サンライズ（SunRise）、LCX-分岐DNA、NASBA又はタクマン（TaqMan）テクノロジー及びPCRのためのほぼリアルタイムの定量技術のような、いくつかの最近の応用のために、核酸類を、固体相から直接放出でき得ることは、明らかに必要である。この関連において、WO 87/06621は、核酸類が、この方法において使用された膜から事実回収され得る一方、この回収は問題をはらみ、かつ核酸類の定量的な単離には全く適さないことを我々に教示している。さらに、この方法において得られた核酸類は、比較的非常に希薄であるので、それらを濃縮及び単離するための次の段階が、明らかに必要となる。
【０００８】
上述の理由のために、技術水準において知られている方法は、特に核酸類を得るための方法の自動化に関しては、工程設計の観点から、できる限り単純かつ生産的な核酸の単離のための適当な開始点になり得ない。
【０００９】
本発明の目的は、それ故、核酸類の単離のために、技術水準において知られている方法の欠点を克服すること、及び多くのさらなる技術的消耗なしに、ほぼ完全に自動化され得る方法を利用できるようにすることである。
【００１０】
本発明に関して、前記方法は、独立特許請求項１、独立特許請求項５１による応用、及び独立特許請求項５６による自動装置により解決される。本発明のさらに有利な局面及び態様は、独立特許請求項、説明及び添付の図から明らかになる。
【００１１】
この関連において、本発明は、例えば、核酸類が、核酸類を含有する試験試料から、簡単な方法で固定化されることができ、かつ簡単な手順の（procedural）段階によって再度放出され得る多孔性膜のような表面を使用する方法に関する。特に、本発明が依存する簡単な手順は、この方法を完全に自動で行うことを可能にする。
【００１２】
本発明の他の態様は、後続の段階においてそれらがこの相から直ちに放出され、かつ所望により、例えば、制限的消化、RT、PCR若しくはRT-PCR、又は上記に記載のその他の適当な分析的若しくは酵素的反応のような、他の適用において使用され得るような手法において、特に核酸類を固定化相、とりわけ膜へ結合することである。
本発明は、以下の段階により、核酸類の単離のための手順を提供する。
-  核酸類を所定の方向から表面へ付加すること（loading）；
-  前記表面上での核酸類の固定化；
-  前記表面からの固定化された核酸類の放出；及び
-  主に付加方向における前記表面から放出された核酸類の除去。
【００１３】
投入(charging)は、好ましくは上方(top)から行われる。この場合には、重力は放出のため、及びそれ自身の放出のために使用されるべきバッファーを回収するために使用され得る。固定化と放出段階との間に、固定化された核酸類の洗浄が、少なくとも１種の洗浄バッファーを用いて行われ得る。各洗浄バッファーのために、この洗浄は、好ましくは以下の段階を含む。
-  予め決められた量の洗浄バッファーの表面への適用、及び
-  吸引による前記表面を介しての洗浄バッファーの引き抜き(pulling)。
【００１４】
核酸類の付加及び固定化は、再度以下の段階を含むことができる。
-  固定化バッファーと核酸類との混合、
-  前記表面へ固定化バッファーとともに核酸類を適用すること、及び
-  主に付加方向における前記表面を介しての液体成分の抜き取り。
【００１５】
この手順は、それが容易に自動化でき、その結果、少なくとも１つの段階が、自動装置を用いて完全に自動で行われ得るという利点を有する。この手順における全ての段階は、自動装置により、導かれた一連の段階（a guided series of steps）において行われ得ることもまた、可能である。
【００１６】
これらの場合において特に、手動操作においてもまた、核酸類の大部分が同時に単離が行われ得ることが可能である。
【００１７】
最終的に、本発明に関する方法において、以下の段階が放出と除去段階との間で、少なくとも１回行われ得る。
-  核酸類を用いた少なくとも１つの化学反応の実施；
-  前記表面における核酸類の固定化；及び
-  前記表面からの固定化された核酸類の放出。
【００１８】
上述のように、核酸類は、それが適用され、かつ固定化されたのと同じ方向における表面から主に溶出（放出）される。“同じ方向”とは、基本的に、180度以下の角度からのいずれの方向をも意味し、よって、溶出の間、前記核酸類は、いずれの環境下においても表面を貫通しないが、それらが表面へ適用された投入方向の反対方向において、表面から除去される。好ましい態様において、一方、他のバッファー、即ち、ある場合には洗浄バッファーを含む核酸類が投入中に見出され得るバッファーは、表面を通して抜き取られ、さもなければ輸送される。単離が、その膜がその装置の全直径を覆う装置中にある膜において行われる場合、投入の好ましい方向は、上方からである。この場合には、除去段階は、再度上方から行われる。図２は、例えば、上方から投入され、かつ核酸類の除去が上方向において行われる漏斗型単離装置を示す。
【００１９】
しかし、他の装置（arrangement）、即ち下からの核酸類の除去も考えられると理解すべきである。例えば、溶解物バッファーのような核酸類を含むバッファーは、真空装置によって反応装置から単離装置内に直接抜き取られることができ、それにより、その核酸類が、単離装置において膜の底側へ結合されることが考えられる。そのような場合には、表面からの核酸類の除去は、核酸類の放出後、装置内の下側に排出される、下から抜き取られた溶出バッファーを用いて行われる。この場合には、核酸類の除去は、下側方向において行われる。
【００２０】
例えば、流出（flow-through）過程のために配置された膜とともに、その側面上に置かれたカラムは、溶解物を投入され、かつ水平に置かれたカラムが、核酸類が結合された膜の側面において、溶出バッファーにより次いですすがれる際には、核酸類の横方向の除去でさえ、可能である。
【００２１】
可能な最大角度である180度のための例は、その上を種々の溶液又はバッファーが、下側へ流れる、核酸類の結合のために適当な表面を有する傾斜した表面である。全てのバッファーと同様に、この溶出バッファーもまた、一方の側から来て、他方の側へ流れ落ちる。この場合において、このバッファーの注入流及び核酸類を含むバッファーの排出流の方向は、180度の角度を形成する。しかし、その除去は、固定化と同様にその表面の同じ側において常に行われる。
【００２２】
本発明の意味において、核酸類により、生物学的材料又は生物学的試料を含む全ての核酸類と同様に、核酸類の全ての水溶液又はその他の溶液が包含される。本発明の意味において、この用語はフリーの核酸類、又は核酸を含む試料、又は、インビトロ（in vitro）転写、PCR反応、若しくはcDNA合成のために適した抽出物として役立ち得る核酸類を含むサンプリング、又はサンプリング手順を用いて[得られた]物質へ適用し得る。生物学的材料又は生物学的試料により、例えば、欧州特許出願第95909684.3.号に記載されたような、例えば、血漿、血液、唾液、尿、糞、精液のような体液、細胞、血清、白血球フラクション、クルスタ催炎（crusta phlogistica）、なすりつけ標本（smears）、あらゆる種類の組織試料、植物及び植物の部分、ウイルス、酵母等が意味される。本発明の意味において、核酸類により、例えば、２本鎖、１本鎖、環状及び鎖状、分岐等のような、全ての長さ及び配置（configuraions）の、リボ核酸類（RNA）及びデオキシリボ核酸類（DNA）、オリゴマー類、ウイルス性及び細菌性DNA並びにRNA、並びに動物及び植物細胞又は他の白血球からのゲノム、又は非ゲノムDNA及びRNA、処理された、又は未処理の形態のt-RNA、mRNA、hn-RNA、rRNA、及びcDNA、並びに他の想像し得る核酸類のような、全ての可能な種類の核酸類が意味される。
【００２３】
本発明の方法において、前述の核酸類を含む試料は、適当な塩類又はアルコール（類）を含有する溶液内へ導入され、次いで、適当な場合においては、その試料を溶出し、かつ混合し、かつ、真空を用いて、遠心分離機の使用を介し、プラスの圧力を用いて、毛管現象の力により、又は表面上で核酸類が固定化される方法により、多孔性表面を介する他の適当な手段により、この方法において得られた混合物を通す。
【００２４】
膜上での核酸類の固定化のための適当な塩類は、鉱酸類とのアルカリ又はアルカリ土類金属類の塩類、特に、アルカリ又はアルカリ土類ハロゲン化物又は硫酸塩、とりわけ好ましくは、硫酸ナトリウム又はカリウム又はマグネシウムのハロゲン化物を包含する。
【００２５】
アルカリ又はアルカリ土類金属類を有する一若しくは多塩基酸類又は多官能性（polyfunctional）有機酸類もまた、本発明の方法を行うために適合される。これらは、シュウ酸、マロン酸、又は琥珀酸のような有機ジカルボン酸類を有する、又はヒドロキシ若しくはポリヒドロキシカルボン酸類を有する、例えば、好ましくはクエン酸を有するナトリウム、カリウム、又はマグネシウム塩類を特に包含する。
【００２６】
いわゆるカオトロピック剤の使用が、とりわけ効果的であることが立証された。カオトロピック物質は、水素結合の３次元構造を妨害することができる。この方法はまた、第１、第２、第３又は第４構造(primary,  secondary,  tertiary or quanternary structures)を包含する、生物分子内における空間構造の形成に関与する分子内結合力を弱める。この種のカオトロピック剤は、技術水準において専門家に知られている（H.Dellwegにより発行されたRompp,Lexikon of Biotechnologie、R.D.Schmid 及びW.E.Fromm,Thieme Verlag,Stuttgart 1992）。
【００２７】
本発明における使用のために好ましいカオトロピック物質は、例えば、トリクロロ酢酸塩、チオシアン酸塩、過塩素酸塩又はヨウ化物群又は塩酸グアニジニウム及び尿素からの塩類である。
【００２８】
前記カオトロピック物質は、0.01〜10Mの水溶液中で、好ましくは0.1〜7Mの水溶液中で、最も好ましくは0.2〜5Mの水溶液中で使用される。上記のカオトロピック剤は、単独で又は組み合わせて使用され得る。特に、過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化ナトリウム、又はヨウ化カリウムの0.01〜10Mの水溶液、好ましくは0.1〜7Mの水溶液、最も好ましくは0.2〜5Mの水溶液。
【００２９】
本発明の方法の実施のために適当なアルコール類は、脂肪族又は非環式飽和又は不飽和炭化水素類の全てのヒドロキシル誘導体をまず第一に包含する。問題となる化合物が、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はグリセリンを包含する多価C1-C5アルカノール類のように、１-、２、３又はそれ以上の水酸基を含むか否かは、最初は重要ではない。
【００３０】
さらに、本発明のアルコール類は、ポリフェノールのようなフェノール類と同様に、糖誘導体、いわゆるアルダイト類（aldites）を包含する。
【００３１】
上述のヒドロキシル化合物の間で、メタノール、エタノール、n-プロパノール、第３（tertiary）ブタノール及びペンタノール類のようなC1-C5アルカノール類は、とりわけ好ましい。
【００３２】
固定は、酸性、中性又はアルカリ性条件下において行われ得る。それ故、固定化におけるpHは、3〜11の間であることができる。好ましくは、固定化はpH4〜8の間で行われる。RNAが単離されなければならない場合は、そのpHは、好ましくは中性領域にあり、一方、DNAの単離に関しては、酸性pHがより有利であり得る。よって、RNAの単離のためのpHは、例えば、6〜8の間に、好ましくは6.5〜7.5の間にあり得る。DNA単離のためには、そのpHは4〜8の間において最も有利であり、好ましくは4〜6の間であり得る。
【００３３】
本発明の意味において、親水性という用語は、それらの化学的性質に基づいて、水と容易に混合し、又は水を吸収するような材料又は膜に適用する。
【００３４】
本発明の意味において、疎水性という用語は、それらの化学的性質に基づいて、水中に浸透しないで、又はその逆の、かつその中に留まることができないような材料又は膜に適用する。
【００３５】
本発明の意味において、表面という語により、いずれの微細孔分離（microporous-separating）層をも意味される。膜の場合には、その表面はポリマー材料のフィルムから成る。そのポリマーは、好ましくは極性基を有するモノマーから成り得る。
【００３６】
本発明の方法の他の好ましい態様において、より広い意味における表面の概念は、粒子又は粒状体又は例えばシリカゲルフリース（fleece）のような滑らかな（even）繊維の層を包含する。
【００３７】
疎水性膜の使用に関連して、本発明の意味において、それらの膜としては、市販の疎水化（hydrophobisized）ナイロン膜のように、親水性物質からなり、かつ今日の技術水準において知られている後続の化学的処理により疎水性にされ得る膜が好ましい。本発明の目的のために、疎水化膜は、初めは親水性であることもないこともあり、かつ以下に記載の疎水性コート剤を用いてコートされるそれらの膜を一般に包含する。この種の疎水性コート剤は、かなり長いアルキル鎖又はシロキサン基のような、疎水基の薄膜を用いて親水性物質を覆う。適当な疎水性コート剤は、技術水準において多数知られている。本発明の目的のために、これらは、必要ならばアルミニウム又はジルコニウム塩類、四級有機化合物類、尿素誘導体類、脂質修飾メラミン樹脂類、シリコーン類、有機亜鉛化合物類、グルタル酸（glutaric）ジアルデヒド及び類似物質の添加剤とともに、パラフィン類、ワックス類、金属石鹸類等を包含する。
【００３８】
さらに、本発明の目的のために使用され得る疎水性膜は、疎水性にされ、かつその基材が極性基を含むものである。これらの基準によれば、例えば以下の群からの材料、特に疎水化されたものが、本発明における使用のために適当である。
【００３９】
ナイロン、ポリスルホン類、ポリエーテルスルホン類、ポリカーボネート類、ポリアクリレート類及びアクリル酸共重合体類、ポリウレタン類、ポリアミド類、ポリ塩化ビニル、フルオロカーボネート類、ポリテトラフルオロエチレン類、ポリビニリデンフルオリド、ポリビニリデンジフルオリド、エチレン-テトラフルオロエチレン、ポリエチレン-クロロトリフルオロエチレン共重合化物（copolymerisate）、又はポリフェニレンスルフィド、及びセルロース混合（cellulose-mix）エステル類、又はニトロセルロース類、並びに疎水化ガラス繊維膜。とりわけ好ましくは疎水化ナイロン膜。
【００４０】
好ましい親水性表面は、それ自体が親水性の材料、かつ親水性にされた疎水性材料をも包含する。例えば、以下の物質が使用され得る。親水性ナイロン、親水性ポリエーテルスルホン類、親水性ポリカーボネート類、ポリエステル類、ポリプロピレン組織上の親水性ポリテトラフルオロエチレン類、ポリプロピレンフリース上の親水性ポリテトラフルオロエチレン類、親水化（hydrophilisized）ポリビニリデンフルオルリド、ポリビニリデンジフルオリド、親水化ポリテトラエチレン類、親水性ポリアミド類。
【００４１】
本発明の方法において使用される膜は、例えば0.001〜50μm、好ましくは0.01〜20μmそして最も好ましくは0.05〜10μmの細孔直径を有する。
【００４２】
洗浄バッファーのために、上述の塩類又はアルコール類、フェノール類又はポリフェノール類が使用され得る。洗浄段階における温度は、通常10〜30℃の範囲内であり得る一方、より高い温度もまた、良好に使用され得る。
【００４３】
本発明の目的のために結合された核酸類の溶出のために適当な溶出剤は、水又は水性塩溶液である。塩溶液としては、技術水準において知られたバッファー溶液、例えばモルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、トリス（ヒロドキシメチル）アミノメタン（TRIS）、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン酸（HEPES）が、0.001〜0.5モル/リットル、好ましくは0.01〜0.2モル/リットルの濃度において、最も好ましくは0.01〜0.05Mの溶液が使用され得る。0.001〜0.5、好ましくは0.01〜0.2M、最も好ましくは0.01〜0.05Mを含むアルカリ又はアルカリ土類金属塩類、特に、それらのハロゲン化物の水溶液、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム又は二塩化マグネシウムの水溶液もまた、使用のために好ましい。シュウ酸又は酢酸のようなカルボン酸又はジカルボン酸を有するアルカリ又はアルカリ土類金属類の塩類の水溶液、酢酸ナトリウム又はシュウ酸エステルの水溶液もまた、上記の濃度範囲、例えば、0.001〜0.5、好ましくは0.01〜0.2M、最も好ましくは0.01〜0.05Mにおいて、使用のために好ましい。
【００４４】
例えば、脱炭酸された（dimineralized）、二重蒸留された、又はミリポア（Milepore）水のような純水は、溶出手段としてとりわけ好ましい。
【００４５】
溶出は、10℃〜70℃の温度において、例えば、10℃〜30℃、そしてより高い温度においてでさえ、良好に行われる。蒸気を用いた溶出もまた、可能である。
【００４６】
個々の段階に関して、本発明の方法は、以下のように行われ得る。
【００４７】
核酸類又は本来フリーの核酸（類）の回収のために使用される試料の溶解物は、例えば、膜が固定された（プラスチック）カラム中に、例えば、底部の上に、ピペットで移される。それは、この膜が機械的支持体として作用するグリッドへ固定される場合に、より能率的である。この溶解物は、その後膜を通して運ばれ、それはカラムの排出口における真空の適用により達成され得る。その輸送はまた、溶解物へのプラスの圧力の適用によって達成され得る。さらに、上述の通り、溶解物の輸送は、遠心分離により、又は毛管現象力の効果により行われ得る。後者は、例えば溶解物又は濾過に接触させた膜の下に導入されるスポンジ様の材料を用いて行われ得る。
【００４８】
本発明の好ましい態様において追加された洗浄段階は、表面又は膜を通して洗浄バッファーが輸送されたことにより、又はそれが核酸類として、同じ側に残されたことにより、行うことができる。もし、洗浄バッファーが通過され、又は抜き取られるならば、これは、例えば膜の他方の上に置かれたスポンジにより、真空若しくは高圧装置により、又は遠心分離若しくは重力により、様々な方法で行うことができる。
【００４９】
装置の利点は、濾過液の供給のための簡単な、確かなかつ便利な可能性からなり、この場合においては、濾過液を用いて直ちに多少湿らされるスポンジのみが交換されることを要する。この点において、カラムは継続的に、又はバッチ法で用いられることができ、かつこれらの操作モードの両方が、膜が核酸により完全に飽和されるまで、全て自動で行われ得ることが明らかであろう。最終段階は、ピペットにより抜き取られ、若しくは除去され、又はその他の方法において上側へ除去されることができる核酸の溶出である。いずれに場合においても、本発明の基礎である手順における溶出段階のために重要なことは、核酸類が、その膜の、それらが膜へ適用されたのと同じ側から除去される、即ち、膜を通した核酸類の移動はないことである。この一連の手順は、当初の溶解バッファー又は洗浄バッファーのような、もはや必要とされない全ての流体を、真空又は重力により“消耗側”へ輸送することを可能にし、一方、溶出液は、もう一方の側に残存する。この種の装置は、溶解物の添加又は溶出液の除去のためのピペッティング（pipetting）装置が、表面の一方の側にのみ備えられなければならず、一方、表面の他方の側は、いかなる“清浄域（clean area）”をも有することを必要しないので、本発明が基づく方法を特に簡単な手法において自動化することを可能にする。この方法において、空間分離により、核酸類の未汚染（contamination-free）単離、とりわけRNaseからの解放は、非常に簡単な手段により保証され得る。さらに、この単離装置、例えば洗浄カラムは、別の場所へ移される必要はなく、一方では、消耗を回避し、他方では、装置の同じ開口部を通して溶出液を回収する。これはまた、手順の自動化方法の簡略化を意味する。
【００５０】
非常に希釈された溶液中に所望の核酸類を含有し、かつ後続の濃縮が要求されるフラクションの捕獲は、本発明の方法を用いると完全に必要なくなる。代わりに、所望の核酸類は、全ての分子生物学的分析手順のために極めて有用である、わずかな塩を含み、又は塩を含まない、非常に少量の溶液において得られる。なぜなら、これらは高濃度を有すると同時に可能な最少量において純粋な核酸類を要求するからである。可能な限り最少量の溶出液を得るという目的を達成するために、それらの膜は、表面として可能な限り薄いことが特に好ましく、それにより、わずかな流体のみがそれらの中に回収され得る。一方、シリカゲルフリースのようなフリースは、これらが比較的多量の溶出液を吸収しうるため、あまり望ましくなく、上側の溶出液の上方への除去をより困難にし、かつ好ましくない手法において溶出液の必要量を増加する条件も、あまり望ましくない。
【００５１】
さらに、本発明は、その装置が垂直位置に配置される（この膜はその後水平位置にされる）とき、膜の上側の空間は、反応領域として使用され得るという利点を有する。よって、例えば本発明の基礎である方法により生成された核酸類の単離及び放出の後は、それらを除去しないことだけでなく、それらを単離装置内に残留させ、かつそれらに制限消化、RT、PCR、RT-PCR又は酵素反応のような分子生物学的応用を施すこと、本発明が基づく手順に従い、これらの反応により膜内に生成された核酸類を再度結合すること、ある場合にはそれらを説明されたように洗浄すること、かつ次いでそれらを溶出すること、それらを単離、又は例えば顕微鏡、蛍光計、又は同様の測定技術により分析することが可能である。
【００５２】
本発明に従って単離された核酸類は、核酸類を分解する酵素から影響を受けず、かつ、それらが非常に多様な手法で直ちに処理され、かつ加工され得る程度に非常に高い精製の値を有する。
【００５３】
本発明により生成された核酸類は、クローニングのために使用することができ、かつ、DNAポリメラーゼ類、DNA制限酵素類、DNAリガーゼ、及び逆転写酵素のような非常に多様な酵素のための基質として用いることができる。
本発明の方法により生成された核酸類は、増幅のために、特にPCR（ポリメラーゼ鎖反応）、鎖置換増幅(strand displacement amplification)、回転円法（rolling circle procedure）、リガーゼ鎖反応（LCR）、及び同様の手法のためにとりわけ良好に適合される。
【００５４】
さらに、本発明が基づく方法は、診断における使用のため、特に本発明の方法により精製された核酸が、後続の段階において増幅され、かつこの手法で増幅された核酸が、その後続けて、又は直ちに検出されるという事実を特徴とする診断手順のための核酸類の調製のために特に良好に適合される（z.B.Holland,P.M. et al.,1991. Proc.Natl.Acad.Sci.88,7276-7280.Livak,K.J. et al.,1995. PCR Methods Applic.4,357-362;Kievits,T.et al.,1991. J.Virol.Meth.35,273-286;Uyttendaele,M.et al.,1994.J.Appl.Bacteriol.77,694-701）。
【００５５】
その上、本発明が基づく方法は、本発明が基づく方法により生成された核酸類が、特に、“分岐核酸類”、とりわけ以下の文献（例えば、Bresters,D.et al.,1994.J.Med.Virol.43(3),262-286;Collins M.L. et al.,1997.Nucl.Acids Res.25(15),2979-2984）において説明された分岐DNA若しくは分岐RNA又は樹枝状（dendritic）核酸類と接触されることができ、かつ生じるシグナルが検出され得るという事実を特徴とするハイブリッド形成（hybridization）反応に基づくシグナル増幅段階へ続く段階において行われ得る核酸類の調製のために特に良好に適合される。
【００５６】
本発明の方法の自動化のための例は、以下に説明され、かつ異なる表面及び核酸類を用いる方法を行うための例もまた、説明されている。この説明において、参照は、以下に記載する添付図により得られる。
【００５７】
図１は、様式化された（stylized）グラフにおいて本発明の方法を行うために適当な自動装置を示す。
【００５８】
図２は、本発明の方法を行うための単離装置及び収集管(collection tube)の第１の態様を示す。
【００５９】
図３は、本発明の方法を行うための単離装置及び収集管の第２の態様を示す。
【００６０】
図４は、本発明の方法を行うための単離装置及び収集管の第３の態様を示す。
【００６１】
図５は、本発明による上部を有する単離装置の態様を示す。
【００６２】
図６は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【００６３】
図７は、本発明の方法による様々な試料の電気泳動分離の他の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
【００６４】
本発明の方法は、部分的にも、又は完全にも、即ち全ての段階において、自動手段において好ましくは行われる。適当な自動装置のための例は、図１に説明され、そこには、主部１が、コントロールエレクトロニクス並びに作業プラットフォーム３及び可動アーム２を有する運転エンジンとともに備えられている。様々な装置を保持する領域４のように、様々な構成要素が、その作業プラットフォーム上に配置される。真空マニホールド（manifold）５は、それらの上に置かれた単離装置から液体を吸収し、かつ底において開放するために、又、別の方法においてはその真空マニホールドと結合された装置とともに働く。例えば、生物試料を溶解するために使用され得る振とう機６もまた、提供される。使用される単離装置アセンブリー（assemblies）は、例えば、本発明による表面が含まれる、統合された単離装置を有する射出成形部である。典型的に、８、１２、２４、４８、９６又は１５３６までの単離装置は、これらが例えば現代のマルチウェルプレート（multi-well-plates）の形態において見られるように、使用され得る。対応する基準が利用できるならば、１つのプレートにおいてより多数の単離装置を有する場合であっても許容され得る。しかし、ルアーアダプター（Luer-adapters）の助けにより、そのアセンブリーの個々の底を利用可能にすること及び必要に応じて１つ又はそれ以上の単離装置とともにこれらを備えることもまた可能である。ルアーアダプターなしで個別に使用される単離装置もまた、本発明に包含される。
【００６５】
真空分配メカニズム８の下で、前記単離装置アセンブリーは、自動装置内に配置され、そしてこれらにより、液体が導入され、かつ排出され得る。このアセンブリーにおいて、いくつかの単一真空管は、単離及び反応装置の同時処理を可能にするように使用され得る。その真空分配メカニズム８は、それ故ピペットとして働く。真空及び圧力は、管９を介して真空分配メカニズム８へ与えられる。
【００６６】
核酸類の単離のために、細胞を用いる反応装置は、例えば、溶解バッファーが分配メカニズムの助けにより導入される振とう機/保持具（holder）６内に配置されることができる。混合の後に、その細胞溶解物は、単離装置へ輸送される。この溶解バッファーは、単離装置内の表面を介して続けて通される。次いで、この表面は、細胞溶解物残留物の除去のために、洗浄バッファーを用いて洗浄されることができ、そこで洗浄バッファーもまた、下側へ排出される。最終的に、溶出バッファーは、単離装置内へ分配され、かつ繰り返された振とうの後に、分離された核酸類は、上方から除去され、そして収集管へ輸送される。
【００６７】
試料の汚染防止のために、ディスポーザブルチップが真空分配メカニズム８において、通常用いられる。
図２〜４は、本発明において使用されるべき適当な単離装置のための異なる概略例を示す。
【００６８】
図２において、漏斗型単離装置１０には、表面１１、例えば溶解及び洗浄バッファーを吸収するために働くスポンジ様材料１３を含む収集管１２上に配置される膜が施される。スポンジ様材料１３の下で、超吸収性（superabsorbent）層１４は、真空効率を改善するために配置されることがある。代わりに、層１４は、アクリル酸塩のように、水と化学的に反応し得る材料をも含有することがある。この水も、それ故この手順から除去される。核酸類の溶解物又は他の調製物は、漏斗内に置かれる。スポンジ様材料１３は、膜１１を通して適用された液体を吸収する。溶出バッファーの添加前に、そのスポンジは、例えば収集管１２の内部メカニズム（図示されていない）により膜からいくらか動かされる。これは、最後の段階において溶出バッファーが、膜１１を通して吸い出されることをも防ぎ得る。このバッファーは、主に表面（図1b）上に留まり、かつ上方から核酸類とともに除去され得る。このアセンブリーを使用する際は、自動装置内の真空メカニズム５は、もはや必要ではない。
【００６９】
図３は、この場合にはスポンジは含まないが、マフ(muff)１８を介して真空メカニズムに連結されるルアーアダプター１７を介して、底に設置されたルアー接続（Luer-connection）を介して収集管１６に連結される単離装置の他の例を示す。溶解及び洗浄バッファーは、この場合には真空の適用により膜１１を通して吸引され得る。溶出バッファーが導入される際、その真空は止められたままであり、そのため、この溶出液は、上方から除去され得る。ルアー接続の使用により、個々の単離装置は、単離装置アセンブリーから除去され得る。しかし、真空収集管が固定された単離装置と組み合わせることもできることを忘れるべきではない。
【００７０】
図４は、その中で前記バッファーが重力又は遠心分離されることにより抜き取られる真空管のために提供する態様を最終的に示す。少量使用されるその溶出バッファーは、本来、自然に膜１１を貫通するのに十分なほど重くはなく、かつ上方から再度除去され得る。
【００７１】
上述の手順は、以下の実施例により説明される。これに関連して、実施例１〜１７は、疎水性表面の使用を、かつ実施例1b〜2bは、親水性表面の使用を主に包含する。これらの手順の使用の異なる様々な手法は、専門家には、前述の説明から、及び前記実施例から明らかであろう。参照は、これらの実施例及び対応する説明が、説明の目的のために単独で示され、かつ本発明における限界と見なされないという事実を明らかにする。
【００７２】
実施例１
ヒーラー(HeLa)細胞からの全RNAの単離
化学的後処理により疎水性にされた市販の疎水性ナイロン膜（例えば、MSI製材料：細孔直径12μmのマグナ（Magna）SH又はパル社（Pall GmbH）製材料：細孔直径1.2μmのヒドロロン（Hydrolon））が、プラスチックカラム内に単一層で設けられる。これらの膜は、機械的支持体として働くポリプロピレングリッド上に配置される。これらの膜は、リングを用いてプラスチックカラム内に固定される。
【００７３】
この手法において調製されたカラムは、ルアー接続により真空チャンバーに接続される。全ての単離段階は、真空の適用を介して行われる。
【００７４】
単離のために、５×105のヒーラー細胞が、遠心分離によりペレット状にされた。それらの細胞は、技術水準において完全に普通の手法で、市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー、例えば、キアゲン社（Qiagen Company）製のRLTバッファーの150μlの添加により溶解される。この溶解は、約5秒間のピペッティング又は攪拌（vortexing）によるおおまかな混合により促進される。その後、150μlの70%エタノールが、約５秒間、ピペッティング又は攪拌（vortexing）により添加されかつ混入される。
【００７５】
前記溶解物は、その後プラスチックカラム内へ輸送され、かつ真空チャンバーを取り去ることにより膜を通して吸引される。そのように得られた条件の下で、RNAは膜に結合したままである。次に、洗浄はイソチオシアン酸グアニジニウムを含む第１市販洗浄バッファー、例えば、キアゲンのRW1バッファーを用いて、かつその後、TRIS又はTRIS及びアルコールを含む第２洗浄バッファー、例えば、キアゲンのRPEバッファーを用いて行われる。それぞれの場合における洗浄バッファーは、真空チャンバーの取り除きにより、膜を通して吸引される。最終洗浄段階の後に、真空は、膜を乾燥するために約１０分の間維持され、その後真空チャンバーはスイッチを切られる。
【００７６】
溶出のために、70μlのRNaseを含まない（Rnase-free）水が、膜から精製されたRNAを放出するために膜上に輸送される。10〜30℃の範囲の温度における１分間のインキュベーションの後に、溶出液は上方から、膜から輸送され、そして溶出段階は、溶出が完全であることを確実にするために繰り返された。
【００７７】
この方法において得られた単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る（図５参照：（ヒドロロン1.2を通して単離された）全RNA）。
【００７８】
一方では親水性ナイロン（ニアフロ（Nyaflo））（３番）及びシリカ膜（４番）が使用された実験と比較して、疎水性ナイロン膜（１番及び２番）を用いた２つの単離の結果が、表１に示される。この表において報告された値は、印象的な（impressive）単離収量のための説得力のある（convincing）支持及び本発明に従って使用された材料の分離効果を提供する。それらは、シリカゲルフリースは、恐らくそのフリース様構造と大部分の溶出バッファーのその後の吸収に恐らく起因する、明らかにわずかな収量しかもたらさないことをも示す。
【００７９】
【表１】
0004440458.tif 000002
【００８０】
単離されたRNAは、臭化エチジウムを用いて染色されたアガロースゲル上で分析されることもできる。この目的のために、例えば、1.2%ホルムアルデヒドアガロースゲルが構築される。結果は、図６において示される。
【００８１】
図６において、レーン（Lane）１は、細孔直径1.2μmのマグナSHからの疎水性ナイロン膜によって単離された全RNAである。
【００８２】
レーン２は、細孔直径1.2μmのヒドロロンからの疎水性ナイロン膜によって単離された全RNAである。
【００８３】
レーン３は、シリカ膜によって単離された全RNAのクロマトグラムを示す。
【００８４】
それぞれの場合において、50μlの全RNA単離物が分析された。
図６は、シリカ膜が使用された際に、全RNAの測定可能な部分は何ら単離され得ないという説得力のある証拠を提供する。
【００８５】
実施例２
種々の塩-アルコール混合物を用いたRNAの疎水性膜への結合によるフリーのRNAの単離。この実施例において、溶解物及び洗浄溶液は、真空の適用により疎水性膜を通して導かれる。
【００８６】
疎水性ナイロン膜（例えば、パル社（Pall Company）製1.2μmヒドロロン）は、実施例１と同様の方法において、真空チャンバーと連結されたプラスチックカラム内へ導入される。
【００８７】
全RNAを含む100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウムを含む350μlの市販の溶解バッファー（例えば、キアゲン製RLTバッファー）、350μlの1.2M酢酸ナトリウム溶液、350μlの2M塩化ナトリウム溶液及び350μmの4M塩化リチウム溶液とそれぞれピペッティングにより混合され、さらにそれぞれピペッティングにより混合される。
【００８８】
次に、250μlのエタノールが、同様にピペッティングにより、各混合物へ添加され、そして混入される。その後、RNAを含むこれらの溶液は、プラスチックカラム内へ輸送され、そして真空チャンバーを取り除くことにより膜を通して吸引される。記載された条件の下で、RNAは膜へ結合して残存する。これらの膜は、実施例１に記載されたように、その後洗浄される。
【００８９】
上記RNAは、実施例１にも記載されたように、最終的に上方からピペッティングにより膜から除去される。
【００９０】
単離された全RNA量は、260nmにおける吸光度の分光学的測定により決定される。260及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。
【００９１】
【表２】
0004440458.tif 000003
【００９２】
実施例３
ヒーラー細胞からの全RNAの単離
市販の疎水性ナイロン膜が、プラスチックカラム内に単一層で設けられる。これらの膜は、機械的支持体として働くポリプロピレングリッド上に設けられる。これらの膜は、リングを用いてプラスチックカラム内に固定される。この方法において調製されたカラムは、収集管内に配置される。全ての単離段階は、遠心分離を介して行われる。
【００９３】
単離のために、5×105のヒーラー細胞が、遠心分離によりペレット状にされ、かつ上清物質が除去される。これらの細胞は、技術水準において完全に普通の方法で、150μlの市販のイソチオシアン酸グアニジニウムバッファー、例えばキアゲン製RLTバッファーの添加により溶解される。溶解は、約５分間のピペッティング又は攪拌（vortexing）によるおおまかな混合により促進される。150μlの70%エタノールが、約5分間のピペッティング又は攪拌（vortexing）によりその後添加されかつ混入される。
【００９４】
前記溶解物は、プラスチックカラム内へ続けて輸送され、かつ1分間10000×gにおける遠心分離により膜の中を通される。次いで、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する市販の洗浄バッファー、例えばキアゲンのRW-１バッファーを用い、その後、例えばキアゲン製RPEバッファーのようなトリス及びアルコールを含有する第２洗浄バッファーにより洗浄が行われる。これらの洗浄バッファーは、遠心分離により膜の中を通される。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために2分間20000×gにおいて行われる。
【００９５】
溶出のために、70μlのRNaseを含まない（RNase-free）水は、膜から精製されたRNAを放出するために膜の上へ輸送される。10〜30℃の範囲の温度における1〜2分間のインキュベーションの後に、その溶出物は、上方から膜から輸送され、かつその溶出段階は、溶出が完全であることを確実にするために繰り返される。
【００９６】
この方法において得られた単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。
異なる疎水性ナイロン膜を用いた単離の結果は、表３に示される。
【００９７】
膜当たり3〜5回の並行試験が行われ、そしてその平均値が計算される。シリカ膜の使用により、溶出物がそれを膜から上方から除去することにより回収される場合、測定可能な量の全RNAは、単離され得ない。
【００９８】
【表３】
0004440458.tif 000004
【００９９】
実施例４
水溶液からのフリーのRNAの単離
実施例１に従って、プラスチックカラムは、異なる疎水性膜と組み合わされた。
全RNAを含有する100μlの水溶液は、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する市販の溶解バッファー、例えばキアゲン製RLTバッファー、350μlと混合される。次いで、250μlのエタノールが、ピペッティングにより添加され、そして混合される。この混合物は、その後カラムへ輸送され、遠心分離（10000×g；１分）により、膜の中を通される。これらの膜は、続けてバッファー、例えばキアゲン製RPEにより２回洗浄される。このバッファーは、遠心分離により膜の中を通過させられる。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために20000×gで行われる。
【０１００】
次いで、実施例３で既に記載された通り、RNAは、RNaseを含まない水を用いて溶出され、そしてピペッティングにより上方から膜から除去される。
【０１０１】
単離された全RNAの量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定により続けて決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。
【０１０２】
種々の疎水性膜を用いた単離結果を、以下の表４に記載する。
膜当たり3〜5回の並行試験が行われ、そしてその平均値が計算される。シリカ膜の使用により、溶解物がそれを膜から上方から除去することにより回収される場合、測定可能な量の全RNAは、単離され得ない。
【０１０３】
【表４】
0004440458.tif 000005
【０１０４】
実施例５
膜の細孔サイズに依存するヒーラー細胞からの全RNAの単離
実施例１に従って、プラスチックカラムが異なる細孔サイズを有する異なる疎水性膜と組み合わされた。
実施例３に従って、細胞溶解物が5×105のヒーラー細胞から得られ、そしてこれらのカラムへ輸送される。次いで、これらの膜は、市販のバッファーであるキアゲンのRW1及びRPEを用いて洗浄される。最後の遠心分離段階が、膜を乾燥するために2分間20000×gにおいて行われる。溶出は、実施例１に記載の通りに行われる。
それらの結果を以下の表5に記載する。
膜当たり3〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの平均値が計算される。
【０１０５】
【表５】
0004440458.tif 000006
【０１０６】
実施例６
水溶液からのゲノミック（genomic）DNAの単離
実施例３に従って、プラスチックカラムが、疎水性膜（例えばMSI社製マグナ-SH、5μm）と組み合わされる。精製は、市販のキアゲンバッファーを用いて行われる。
200μlの肝臓組織からのゲノミックDNAの水溶液が、PBSバッファー内へ導入される。200μlの塩酸グアニジニウムを含有するバッファー、例えばキアゲンのALがこの溶液へ添加され、そして混合される。次いで210μlのエタノールが添加され、そして攪拌（vortexing）を介して混合される。この混合物は、実施例３に従ってカラムへ輸送され、そして遠心分離の方法により膜の中を通される。この膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲンのRWを用いてその後洗浄され、そして乾燥される。溶出は、実施例３に記載されたように行われる。３回の並行試験が行われ、その平均値が計算される。
【０１０７】
単離されたDNAの量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定により、次いで決定され、開始量のおよそ30%である。260nmから280nmにおける吸収比率は、1.82である。
【０１０８】
実施例７
組織からのゲノミックDNAの単離
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜（例えばMSI製マグナ-SH、5μm）と組み合わされる。精製は、キアゲンの市販のバッファーを用いて行われる。
180μlのATLバッファーが10mgの腎臓組織（マウス）へ添加され、機械的ホモジナイザー（homogenizer）内ですり潰される。次いでプロテイナーゼ（proteinase）K（20μlの水において溶出されたおよそ0.4mg）が、添加され、そして55℃において10分間インキュベートされる。200μlの塩酸グアニジニウムを含有するバッファー、例えばキアゲン製ALを添加した後で、かつ70℃における10分間のインキュベーションの後に、200μlのエタノールが添加され、そしてこの溶液と混合される。この混合物は、カラム上へ置かれ、そして遠心分離により膜の中を通される。この膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン製AW1及びRWを用いてその後洗浄され、次いで遠心分離により乾燥される。溶出は、実施例３に記載されたように行われる。３回の並行試験が行われ、そしてその平均値が計算される。
【０１０９】
単離されたDNAの量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定により続けて決定され、平均は9.77μgである。260nmから280nmにおける吸収比率は、1.74である。
【０１１０】
実施例８
異なるカオトロピック剤の使用による水溶液からの全RNAの固定化
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。
100μlの全RNAを含有する水溶液が、異なる濃度においてイソチオシアン酸グアニジニウム（GITC）又は塩酸グアニジニウム（GuHCl）を含有するの異なる溶解バッファー350μlと混合される。次いで、250μlのエタノールが、ピペッティングにより添加され、そして混合される。この混合物は、その後カラム上に置かれ、そして遠心分離（10000×g；1分）の方法によって膜の中を通される。これらの膜は、アルコール含有バッファー、例えばキアゲン製RPEを用いて次いで２回洗浄される。このバッファーは、遠心分離の方法により膜の中を通過させられる。最後の洗浄段階が、膜を乾燥するために20000×gにおいて行われる。溶出は、実施例３に記載されたように行われる。２回の試験が行われ、平均値を決定する。
結果を表６に記載する。
【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
実施例９
異なるアルコール類の使用による水溶液からの全RNAの固定化
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、異なる量のエタノールとイソプロパノールが添加され、そして700μlまでのRNaseを含まない水とともに付加され、そして混合される。この混合物は、実施例３に従ってその後カラムへ輸送され、そして膜の中を通され、そして洗浄される。溶出は、実施例３と同様に行われた。
２回の試験が行われ、平均値が決定される。
結果を表７に記載する。
【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
実施例１０
種々のpH値を有する水溶液からの全RNAの固定化
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。このバッファーは、25mMのクエン酸ナトリウムを含有し、そしてHCl又はNaOHにより異なるpH値に調整される。次いで250μlのエタノールが添加され、そして混合される。この混合物は、実施例４に従ってその後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通され、そして洗浄される。溶出は、実施例３と同様に行われた。２回の試験が行われ、平均値が決定される。
結果を表８に記載する。
【０１１５】
【表８】
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【０１１６】
種々の塩類を含有する水溶液からの全RNAの固定化
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。
100μlの全RNA含有水溶液が、350μlの塩含有溶解バッファー（NaCl、KCL、MgSO4）と混合される。次いで、250μlの水又はエタノールが添加され、そして混合される。この混合物は、実施例４に従って、その後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通され、洗浄され、かつ溶出される。２回の試験が行われ、平均値が決定される。
結果を表９に記載する。
【０１１７】
【表９】
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【０１１８】
実施例１２
種々のバッファー条件による水溶液からの全RNAの固定
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。
全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度2.5M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。この溶解バッファーは、種々の濃度のpH7のクエン酸ナトリウム、又はpH7.2のシュウ酸ナトリウムと混合される。次いで、250μlのエタノールが、添加されそして混合される。この混合物は、実施例４に従ってその後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通され、そして洗浄され、かつ溶出される。
それらの結果を表１０に記載する。２回の試験が行われ、その平均値が決定される。
【０１１９】
【表１０】
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【０１２０】
実施例１３
フェノールによる水溶液からの全RNAの固定化
実施例３のように、疎水性膜を有するプラスチックカラム（例えば、パルゲルマンサイエンス社製ヒドロロン、1.2μm）が、組み立てられる。
RNA水溶液は、700μlのフェノールと混合され、遠心分離により膜全面に分配される。実施例４のように、この膜は洗浄され、RNAが溶出される。
二重測定が行われ、そしてそれぞれの場合において平均値が示される。260及び280nmにおける吸光度の間の比率から、RNA純度の評価を得る。
【０１２１】
実施例１４
異なる塩条件下において固定化された全RNAの洗浄
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。
全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、250μlのエタノールが、添加され、そして混合される。この混合物は、実施例４に従い、その後カラムへ輸送され、かつ膜の中を通される。この膜は、種々の濃度のNaClを含有するバッファー及び80%エタノールを用いて、その後２回洗浄される。そのバッファーは、遠心分離により膜の中を通される。最後の洗浄段階は、膜を乾燥させるために20000×gにおいて行われる。溶出もまた、実施例３に従って行われる。２回の試験が行われ、その平均値が決定される。
結果を表１１に記載する。
【０１２２】
【表１１】
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【０１２３】
実施例１５
異なる塩及びバッファー条件の下において固定化されたRNAの溶出
実施例３に従って、プラスチックカラムが疎水性膜と組み合わされる。
全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウム（濃度4M）を含有する350μlの溶解バッファーと混合される。次いで、250μlのエタノールが、添加され、そして混合される。この混合物は、実施例３に従いカラムへ輸送され、かつ膜の中を通過させられ、そして洗浄される。
溶出において、膜から精製されたRNAを溶出するために、70μlのNaCl含有溶液、トリス/HClバッファー（pH7）又はシュウ酸ナトリウム水溶液（pH7.2）が、膜上へ滴下される（pipetted）。1〜2分のインキュベーションの後に、10〜30℃の間の温度において、溶出物が膜から上方から滴下される。この溶出段階は、完全な溶出を達成するために、一度繰り返される。２回の試験が行われ、その平均値が決定される。
結果を表１２に要約する。
【０１２４】
溶出バッファーにおけるNaCｌ又はトリス/HClを含有する水溶液からのRNA収量
【表１２】
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【０１２５】
実施例１６
β-アクチン(actin)mRNAの増幅及び検出のための5'ヌクレアーゼPCR分析を使用する‘リアルタイム’定量RT-PCRにおける全RNAの使用
実施例３に従って、プラスチックカラムが市販の膜（パルゲルマンサイエンス、1.2μmの細孔サイズを有するヒドロロン）と組み合わされる。
RNAを単離するために、１×105のヒーラー細胞が使用され、そして全RNAの精製が、実施例３に記載されたように行われる。溶出は、実施例３に記載されたように、2×60μlの水を用いて行われる。DNAの残留量の完全な除去のために、試料は、分析前にDnaseを用いて処理される。
【０１２６】
“１装置（one-device）‘リアルタイム’定量RT-PCR”は、M-MLV逆転写を使用することによるパーキンエルマー（Perkin-Elmer）の市販の反応系（タクマン（TaqMan）（TM）PCR試薬キット）の使用により行われる。β-アクチンのための特異的プライマー及び特異的タクマンプローブ（パーキンエルマー製タクマン（TM）β-アクチン検出キット）の使用により、全RNA試料中のβ-アクチンmRNA分子は、β-アクチンcDNAにまず転換され、次いで全反応は、同じ反応装置において、妨害なしに直ちに増幅され、かつ検出される。この反応見本は、製造業者の指示に従い作成される。３種の異なる量の単離された全RNAが使用され（1、2、4μlの溶出液）、そして３回の決定試験が行われる。コントロールとして、RNAなしの３つの見本もまた、試験される。
【０１２７】
cDNA合成は、37℃において１時間行われ、その後直ちに40サイクルから成るPCRが行われる。それらの反応及び分析は、パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ（Perkin Elmer Applied Biosystems）により組み立てられたABI PRISM(TM)7700配列検出器において行われる。PCRサイクル中に発生したどのアンプリコン（amplicon）もみな、タクマンプローブからの分裂により発生した光放射分子を生成する。発生した全ての光シグナルは、発生したアンプリコン量に正比例し、従って全RNA試料において利用可能な転写物の当初の量に基づく。放射された光は、それらの装置により測定され、そしてコンピュータープログラムにより評価される。その間に光シグナルがバックグラウンドノイズ上で最初に検出されなければならないPCRサイクルは、“スレッシュホルドサイクル（Threshold Cycle）(ct) ”として呼ばれる。この値は、試料において利用可能な特異的に増幅されたRNA量のための尺度である。
【０１２８】
ここに記載された方法により単離された全RNAの１μlの使用量に対し、結果は、平均ct値が17.1であり、全RNAにおける2μlに対して、ct値は16.4であり、かつ4μlの全RNAに対して、そのct値は15.3である。これは、全RNAとct値との間で一次従属する結果となり、このことは、全RNAが増幅反応を阻害し得る物質を含まないことを示す。RNAを含まないコントロール見本は、いずれのシグナルをももたらさない。
【０１２９】
実施例１７
β-アクチンmRNAの増幅及び検出のためのRT-PCRにおける全RNAの使用
実施例３に従って、プラスチックカラムが市販の膜（パルゲルマンサイエンス、1.2又は3μmの細孔サイズを有するヒドロロン；サルトリウス（Sartorius）、0.45μmの細孔サイズを有するサルトロン（Sartolon））と組み合わされる。
【０１３０】
RNAの単離のために、２つの異なる原料が使用される。
1)   実施例４に記載の通りに精製、溶出が行われた、水溶液中の肝臓（マウス）由来の全RNA 、並びに
2)  実施例３に記載の通りに全RNAの精製及び溶出が行われた5×105のヒーラー細胞。
【０１３１】
それぞれの試験のために、20ngの単離された全RNAが使用される。コントロールとして、アールエヌイージー（RNeasy）キット（キアゲン）により精製されたRNA及びRNAを含まない試料が使用される。
【０１３２】
RT-PCRは、標準条件下において、これらの試料を用いて行われる。増幅のために、２つの異なるプライマー対が、β-アクチンのために使用される。150Bpのサイズに形成された（150Bp-sized）フラグメントは、感度の証拠として役立ち、1.7kBpのサイズに形成されたフラグメントは、RNAの完全な状態（integrity）を評価する。RT反応から、1μlが除去され、かつ後続のPCRへ輸送される。25サイクルは、小フラグメントに対して行われ、かつ27サイクルは大フラグメントに対して行われる。アニーリング（annealing）温度は55℃である。増幅された試料は、非変性（non-denaturizing）ゲル上に、次いで配置され、そして分析される。
【０１３３】
上述の方法において単離された全RNAの20ngの使用量に対して、対応するDNAフラグメントがRT-PCRにおいて示され得る。ここで使用される条件は、ヒトβ-アクチンのために調整されているので、マウス肝臓由来の全RNAを使用する際には、転写は何ら示されない。RNAを含まないコントロール見本は、いずれのシグナルをももたさらない。
【０１３４】
図７は、RT反応の電気泳動分離の臭化エチジウム染色ゲルを示す。
A:レーン1〜8：150BpフラグメントのRT-PCR；
レーン1、2：ヒドロロン1.2μm膜を用いて精製された水溶液からのRNA；
レーン3、4：サルトロン膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；
レーン5、6ヒドロロン3μm膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；
レーン7：アールエヌイージー・ミニキットにより精製されたRNA；
レーン8；RNAを含まないコントロール。
B:レーン1〜8：1.7kBpフラグメントのRT-PCR；
レーン1、2：ヒドロロン1.2μm膜を用いて精製された水溶液からのRNA；
レーン3、4：サルトロン膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；
レーン5、6：ヒドロロン3μm膜を用いて精製されたヒーラー細胞からのRNA；
レーン7：アールエヌイージー・ミニキットにより単離されたRNA；
レーン8：RNAを含まないコントロール。
【０１３５】
実施例１ｂ
親水性膜との結合によるヒーラー細胞からの全RNAの単離
種々の材料から成る市販の親水性膜が、プラスチックカラム内に単一層で設けられる。実施例３の通りに、その膜はポリプロピレングリッド上へ置かれ、そしてリングを用いて固定される。
【０１３６】
単離のために、5×105のヒーラー細胞が挿入される。単離及び核酸の溶出のための以降の段階は、実施例３に記載されたように行われた。
【０１３７】
単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。
【０１３８】
種々の親水性膜を用いた単離の結果は、以下の表1ｂ（表１３）に示される。膜当たり2〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの場合における平均値が計算された。溶出物が、それが上方から抜き取られることにより膜から採取される場合に、シリカ膜の使用により測定可能量の全RNAは単離され得ない。
【０１３９】
【表１３】
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【０１４０】
親水性膜との結合による水溶液からのフリーのRNAの単離
実施例１ｂの通りに、種々の親水性膜とともにプラスチックカラムが組み立てられる。
全RNAを含有する100μlの水溶液が、イソチオシアン酸グアニジニウムを含有する市販の溶解バッファー、例えばキアゲンのRLTバッファー 350μlと混合される。その後、250μlのエタノールが、ピペッティングにより添加され、そして混合される。この混合物は、その後カラムへ輸送され、そして実施例４のように膜の中を通され、洗浄され、そして乾燥される。
その後、そのRNAは実施例３において既に説明されたようにRNaseを含まない水を用いて溶出され、そしてピペットにより膜から抜き取られる。
【０１４１】
単離された全RNA量は、260nmの波長における吸光度の分光学的測定によりその後決定される。260nm及び280nmにおける吸光度間の比率から、RNA純度の評価を得る。
種々の親水性膜を用いた単離の結果を、以下の表2ｂ（表１４）に示す。膜当たり2〜5回の並行試験が行われ、そしてそれぞれの場合における平均値が計算された。溶出物が、それが上方から抜き取られることにより膜から採取される場合に、シリカ膜の使用により測定可能量の全RNAは単離され得ない。
【０１４２】
【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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