(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シチメンチョウのヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域、マレック病ウイルスのユニークな短いウイルスゲノム領域、および非必須領域内に挿入された外来ＤＮＡ配列を含むゲノムを有するシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラであって、前記外来ＤＮＡ配列が、宿主細胞において発現可能である１型ウズラ インターフェロン サイトカインをコードし、且つ前記１型ウズラ インターフェロン サイトカインが配列番号３２のアミノ酸配列を含む、シチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。
【請求項２】
前記外来ＤＮＡ配列が、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第１項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。
【請求項３】
請求の範囲第１または２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラと、宿主に投与するための適切な薬学的担体とを含み、前記１型ウズラ インターフェロン サイトカインの有効な免疫量が宿主において発現される、免疫原用組成物。
【請求項４】
非必須領域内に挿入された外来ＤＮＡ配列を含むゲノムを有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が、宿主細胞において発現可能である１型ウズラ インターフェロン サイトカインをコードし、かつ前記１型ウズラ インターフェロン サイトカインが配列番号３２のアミノ酸配列を含む、シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス。
【請求項５】
前記外来ＤＮＡ配列が、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第４項のシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス。
【請求項６】
請求の範囲第４または５項のシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスと、宿主に投与するための適切な薬学的担体とを含み、前記１型ウズラ インターフェロン サイトカインの有効な免疫量が宿主において発現される、免疫原用組成物。
【発明の詳細な説明】
本願は、1997年2月21に出願のU.S.出願番号08/804,372号の優先権を主張する。
本願全体を通じて種々の文献は括弧内のアラビア数字で引用する。参考文献の詳しい内容は、請求項のすぐ後にアルファベット順で記載してある。これらの参考文献全体を、本願で参照することにより本願に組み込み、本願発明が属する技術分野での最新技術について詳細に記載する。
発明の背景
ＤＮＡを単離して、その単離されたＤＮＡを細菌プラスミドへクローニングすることが可能であることから、ウイルスワクチン調製の手法が発展した。本願発明で使用した方法では、動物の種々のウイルス性病原体からクローン化したＤＮＡ配列を、挿入、欠失、１またはそれ以上の塩基の変異、により修飾し、それに続いて、この修飾済み配列をウイルスゲノムへ挿入することを行った。外来性配列を付加することの一つの有用性は、外来性配列が、動物のウイルス感染時に発現される外来性タンパク質をコードする時に成し遂げられる。得られる生ウイルスを次いでワクチンに使用して、宿主動物での免疫反応を惹起して、該動物を疾患より保護する。このような特徴を有するウイルスはウイルスベクターと呼ばれるが、それは外来性タンパク質を運び、宿主動物内で外来性タンパク質を発現する生ベクターとなるからである。実際、それは外来性タンパク質の運搬用の精巧な系となる。
組換えＤＮＡ技術を動物ウイルスへ適用することは、比較的歴史が浅い。改変されたウイルスの最初の例は、ゲノムが最も小さいウイルスであった。パポバウイルスの場合は、これらのウイルスが小さく、余分なＤＮＡを保持できないために、それらは遺伝子工学で複製欠損レプリコンとして使用されていた。これらのウイルスを利用して、外来性遺伝子の発現を行うには、野生型のヘルパーウイルスが必要であり、細胞培養系に限定されている。アデノウイルスの場合は、外来性配列で置換することが可能な少量の非必須ＤＮＡが存在する。アデノウイルスで発現されたと思われる唯一の外来性ＤＮＡは、パポバウイルスのＴ抗原遺伝子群（Mansour et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US,1985；Thummel et al.,Cell 1983；Scolnick,et al.,Cell.1981；Thummel et al.,Cell.1981）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子（Haj-Ahmed and Graham,J.of Virology,1986）である。これらの文献では、外来性ＤＮＡが挿入されている可能性のある、ＨＶＴの非必須領域を同定しておらず、またＨＶＴ内で如何に外来性遺伝子を発現させるかについて、例えば、どのようなプロモータや終結配列を使用するかも教示していない。
改変された別のウイルス群はポックスウイルスである、この群の一つの構成員であるワクシニアは、外来性遺伝子発現に関しての多くの研究主題であった。ボックスウイルスは、感染細胞の細胞質内で複製する、大型のＤＮＡ含有ウイルスである。このウイルスは、正二十面体又は螺旋状の対称性に基づくカプシドを有さないという点において、ユニークな構造を有する。ポヅクスウイルスは、機能の喪失と縮退により、細菌様の微生物から進化した可能性が高い、一部、このユニークさのため、ポックスウイルスの遺伝子工学でなされた進歩は、ヘルペスウイルスやＨＶＴを含む他のウイルス系へ直接適用することができない。ワクシニアウイルスの組換え構築物は、数多くの研究室で作成されており、以下のような外来性の挿入遺伝子が発現されている：ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子（Mackett,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,1982；PanicalI and Paoletti,Proc.Natl.Acad.Sci USA,1982）、B型肝炎表面抗原（Paoletti et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984；Smith et al.,Nature,1983）、ＨＳＶ糖タンパク質Ｄ遺伝子、インフルエンザ血球凝集素遺伝子（Panicali et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,1983；Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1983）、マラリア抗原遺伝子（Smith,et al.,Science,1984）、及び水庖性口内炎ウイルス糖タンパク質G遺伝子（Macket,et al.,Scinece,1986）。ワクシニアの組換えＤＮＡ技術の全体の一般的特徴は、全てのウイルスで使用するものと同様であり、特に参考文献（Maniatis et al.,Molecular Cloning,1982）の技術に関してはそうである。しかしながら詳細には、ワクシニアでの技術はヘルペスウイルスやＨＶＴには適用できない。ワクチンベクターとしてのワクシニアの利用性には疑間がもたれているが、それはワクシニアがヒトの天然痘ウイルスに近縁であって、またヒトに対して病原性があることが知られているためである。故に、宿主特異的なヘルペスウイルスＨＶＴを使用することは、家禽のワクチン接種に対する、よりよい解決策である。
霊長類のヘルペスウイルスの中では、ヒトのＨＳＶのみが外来性ＤＮＡ配列を含有するように改変されていて、また、限られてはいるが、リスザルヘルペスウイルスも外来性ＤＮＡ配列を含有するように改変されている。組換えＤＮＡを使用してＨＳＶを操作した最初の例は、L-Sジャンクション領域のＤＮＡ断片をＨＳＶ ＤＮＡのユニークな長領域（long region）、特にチミジンキナーゼ遺伝子ベクローニングしていたものである（Mocarski et al.,Cell.1980）。この挿入物は外来性ＤＮＡ断片ではなくて、ゲノムの他の部位で増幅された、天然のヘルペスウイルスＤＮＡ断片であった。このＤＮＡ断片は、タンパク質を発現するために特別に改変したものではなく、よってこの実験では、ヘルペスウイルスでのタンパク質発現は行われていない。ＨＳＶの次の操作は、組換えＤＮＡ技術とチミジンキナーゼ選択との組み合わせにより、ウイルスゲノムに欠失を作りだすことである。この方法を使用して、ＨＳＶアルファー22遺伝子が欠失され（Post et al.,Cell.1981）、また15,000塩基対のＤＮＡ配列がＨＳＶの内部繰り返しから欠失された（Poffenberger,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1981）。
以下の場合では、タンパク質をコードする遺伝子の、ヘルペスウイルスへの挿入が行なわれている：ＨＳＶ中の該遺伝子の天然欠失変異体へのＨＳＶの糖タンパク質Cの挿入（Gibson and Spear,J.of Virology,1983）；1型ＨＳＶへの2型ＨＳＶの糖タンパク質Dの挿入（Lee et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982）（この遺伝子は「外来性」でないので、プロモータ配列の操作は行われていない）；ＨＳＶ ＩＣＰ４プロモーターの制御下でのＢ型肝炎表面抗原のＨＳＶへの挿入（Shih et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,1984）；及びＳＶ４０プロモーターを伴ったウシ成長ホルモンのリスザルヘルペスウイルスへの挿入（このプロモーターは、この系では機能しないが、内在性の上流プロモーターが該遺伝子の転写を行った）（Desrosiers et al.,1984）。
さらに二つの外来遺伝子（ニワトリ・オバルブミン遺伝子と、エプスタイン・バールウイルスの核抗原）がＨＳＶに挿入されていて（Arsenakis and Roizman,1984）、また仮性狂犬病ウイルスの糖タンパク質Ｘも、ＨＳＶへ挿入されている（Post et al.,1985）。
遺伝子の欠損、または挿入をヘルペスウイルスへ導入した、以上の例は、組換えＤＮＡ技術によりヘルペスウイルスのゲノムを遺伝的に改変することが可能であることを証明している、遺伝子を挿入するのに用いたこの方法では、プラスミドにクローニングされたウイルスＤＮＡと、同じ動物細胞にトランスフェクトされた、精製ウイルスＤＮＡとの間で相同性組換えを行わせる。しかしながら、欠損の位置と外来性遺伝子の挿入部位をどの程度一般化できるかは、これらの先行技術からは分からない。
本発明の一つの目標は、マレック病に対するワクチンである。マレック病ウイルス（ＭＤＶ）は、一般的なニワトリのリンパ球増殖性疾患であり、家禽の麻痺を伴うマレック病の病原体である。この疾患は生後2〜5ケ月の若いニワトリで最も頻繁に起こる。顕著な臨床的症状は、一以上の四肢の進行性麻痺、脚の麻痺による協働運動不能、翼の関与による肢のしおれ、及び首の筋肉の関与により、頭の位置が低くなることがあげられる。急性の場合、重度の抑鬱が起き得る。腫瘍性がことに高い株の場合は、特徴的なブルサ及び胸腺の萎縮がおきる。更に、生殖腺、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胸腺に影響するリンパ腫がある（Mohanty  and  Dutta,1981）。
多くのニワトリは、生涯ＭＤＶから保護するために、生後1日目にＭＤＶに対するワクチンを接種される。本発明よい以前は、ＭＤＶに対するワクチン接種方法の原理は、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）の天然株を使用するものであった。この、生後1日目のワクチンに他の抗原を取り込ませることは有益であると思われるが、病原体間での競合と免疫抑制のために、通常のワクチンと組み合わせる試みが満足のいくものであることは、現在のところ証明されていない。本発明で作成された、多価のＨＶＴベースのワクチンは、数多くの異なる病原体に対して、同時にワクチン接種する新規な方法となる。外来遺伝子がＨＶＴゲノムの非必須領域に挿入された組換えＨＶＴを初めて開示する。
これらのヘルペスウイルスに対して行なわれた遺伝子工学のタイプには、細菌プラスミドへのウイルスＤＮＡの一部のクローニング、ＤＮＡがある配列を欠失するように、クローン化した状態で前記ウイルスＤＮＡを再構築すること、さらに、外来性ＤＮＡ配列を上記の欠損部分と置き換えるか、または欠損により取り除かれた部位へ加えること、がある。
ＨＶＴのゲノムに挿入する外来性遺伝子は、如何なる所望の病原体から得てもよい。典型的には、興味ある遺伝子とは、家禽に疾患を引き起こす病原体で、家禽産業に経済的インパクトのあるものである。この遺伝子はすでにワクチンが存在している生物体から得てもよく、ベクター（Vectoring）技術の新規利点のため、ＨＶＴ由来ワクチンはより優れているであろう。さらに、所望の遺伝子は、現在ワクチンが存在していないが、その疾患を制御する必要性のある病原体から由来するものでもよい。典型的には、所望の遺伝子は病原体の免疫原性ボリペプチドをゴードしており、表面タンパク質、分泌型タンパク質、及び構造タンパク質であり得る。
ＨＶＴのベクター化の標的となる適切なトリの病原体は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）である。ILTVはヘルペスウイルス科の構成員であり、この病原体は、呼吸抑制、息切れ、及び血の濠出した疾で特徴付けられる、ニワトリの急性疾患を引き起こす。ウイルスの複製は、呼吸路の細胞に限られ、ここでは気管での感染が、組織の侵食と出血を引き起こす。ニワトリでは、病変形成の程度を減少させるか、または臨床的症状を減少させるのに効果的な薬剤はない。
細胞の継代、及び／又は煩雑な投与方法から得られたILTウイルスの種々の修飾型でトリにワクチン接種すると、感受性のあるニワトリに満足な保護が与えられる。現在のILTワクチンの弱毒化の程度からすると、正しいレベルのウイルスが確実に維持されるように注意を払わなければならない。すなわち、保護を与えるのには十分であるが、群れに疾患を引き起こすには不十分なものでなければならない。
ＨＶＴベクター法のさらなる標的は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって引き起こされる、伝染性で、極めて伝染性の高い衰弱性の疾病である、ニューカッスル病である。ＮＤＶは、パラミクソウイルス科の一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＮＤＶの様々な病原型（ヴェロ原性株、亜病原性株、レント原性株）は、疾病の重症度、特異性、及び症状が異なるが、多くの型は呼吸器型、及び神経系に感染するようである。ＮＤＶは主に、ニワトリ、シチメンチョウ、及びその他のトリの種に感染する。歴史的には、ワクチン接種が疾患予防のために使われてきたが、母親由来抗体の干渉、トリの寿命、及び投与経路のため、生産者は、特異的な要求に合うように、免疫化プロトコールを適合せしめる必要がある。
本発明のウイルスベクターで運ばれる治療薬は、ブタポックスウイルス複製の副産物である生物学的分子でなくてはならない。これは、第一の分析における治療薬をＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の何れかに限定する。このようなクラスの化合物で、次のような形態の治療薬の例がある：アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスRＮＡ（S.Joshi,et al.,J.of Virology,1991）、リボザイム（M.Wachsman,et al.,J.of General Virology,1989）、サプレッサーｔRＮＡ（R.A.Bhat,et al.,Nucleic Acids Research,1989）、インターフェロン誘導性二本鎖RＮＡ、及びインシュリンのようなホルモンから、インターフェロンやインターロイキンのようなリンホカイン、天然のオピオイドまでの種々のタンパク性治療薬の例。これら治療薬が発見され、またそれらの構造と機能が解明されたが、ウイルスベクターによるデリバリーシステムでそのような治療薬を使用する能力については明らかではない。
サイトカインをコードする多くの遺伝子が、哺乳類の種でクローニングされている。トリの種でクローニングされたサイトカイン遺伝子は、より数が少ない。1型及び2型インターフェロンをコードする遺伝子は、数種の哺乳動物でクローニングされ、特性が決定されている。ニワトリインターフェロンａの遺伝子はクローニングされており、哺乳類のインターフェロン1型のアミノ酸配列と比較され、20〜24%のアミノ酸配列の同一性を有することが示された。ＣｈＩＦＮ−ａは、哺乳類のＩＦＮ−ｇとは無関係である（59,65）。ニワトリインターフェロン-gの遺伝子がクローニングされており、ＣｈＩＦＮ−ａのアミノ酸配列と15%の同一性を有している。ＣｈＩＦＮ−ｇは、ウマ及びヒトのＩＦＮ−ｇと、それぞれ35及び32%同一である（62、63、66）。アヒルのインターフェロンの遺伝子がクローニングされ、アミノ酸レベルでＣｈＩＦＮ−ａと50%同一である（64）。ニワトリは、未だ分類されていない20を超えるインターフェロン遺伝子を有している。クローニングされたアヒルのＩＦＮが、ＩＦＮ−ａ、−ｂ、又は−ｇに分類されるかどうかは分かっていない。トリのインターフェロンの活性は、種特異的である。あるトリのインターフェロンは、別のトリ若しくは哺乳類の種、又は別のトリ若しくは哺乳類細胞株では不活性である。種間でインターフェロン活性がなく、異なる種のインターフェロンの間では、アミノ酸配列の同一性の割合が低いので、異なるトリ又は哺乳類の種から遺伝子をクローンニングして発現できるかは明らかでない。
発明の概要
本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのユニークなウイルスゲノム長領域とマレック病ウイルスのユニークなウイルスゲノム短領域とを具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。
図の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｃ：ＨＶＴ構築とマップデータの詳細。
図１Ａは、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩ制限断片のマップを示す図である。断片は、サイズが大きい順番に番号が付けられていて、文字は、比較上の大きさが決定されていない小断片を示す。
図１Ｂは、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩの＃16断片を示し、これはＳ−ＨＶＴ−００１中ベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。
図１Ｃは、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩの＃19を示し、これはベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。
凡例：Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｘ＝ＸｈｏＩ、Ｈ＝ＨｉｎｄIII、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｓ＝ＳａｌＩ、Ｎ＝ＮｄｅＩ、Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。
図2：ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ制限酵素地図。ユニークな長領域（UL）、及びユニークな短領域（US）を示している。長及び短領域の繰り返しは、四角で囲って示している。ＢａｍＨＩ断片はサイズの大きい順に番号を付している。プローブＰ１−Ｐ４の位置を示している。それぞれのプローブの期限は以下のとおりである：Ｐ１−ＢａｍＨＩ＃６、Ｐ２−ＢａｍＨＩ＃２、Ｐ３−ＢａｍＨＩ＃13、及びＰ４−ＨＶＴゲノムのＸｂａＩ断片＃５（8.0kb）のＢｇlIIからＳｔｕＩまでの４．０kbの亜断片。
図３Ａ〜３Ｂ：ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３３〜１３３８；配列番号12）に、合成ＤＮＡ配列を挿入することによって、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩ＃10断片のユニークなＸｈｏＩ部位をＰａｃＩ部位及びＮｃｏＩ部位に転換する方法を示している。図３Ａは、ＸｈｏＩ部位をＰａｃＩ部位に転換して作成したプラスミド654-45.1（配列番号17）を示し、図3Bは、ＸｈｏＩ部位をＮｏｔＩ部位に転換して作成したプラスミド686-63.A1（配列番号18）を示している。
図４：ＨＶＴの長いユニーク部分（配列番号12）内の挿入部位を取り囲む配列の制限酵素地図と読み取り枠。この地図は、外来性遺伝子の挿入に使用されたＸｈｏＩ制限部位（配列番号12；ヌクレオチド1333-1338）を示す。また、この配列内の４つの読み取り枠も示されている。ＯＲＦ  Ａは、ＸｈｏＩ部位へのＤＮＡの挿入により分断されている。ＯＲＦ  Ａのアミノ酸配列（配列番号14；ヌクレオチド1402-602；267アミノ酸）は、タンパク質データベースの既知の如何なるアミノ酸配列とも顕著な配列相同性を示さない。ＵＬ５４（配列番号13；ヌクレオチド146〜481；112アミノ酸）及びＵＬ５５（配列番号51；ヌクレオチド1599-2135；179アミノ酸）は、それぞれ、単純ヘルペスウイルス1型のUL54及びUL55タンパク質に顕著な配列相同性を示している。ＯＲＦ  Ｂ（配列番号16；２６３４〜２３０８；109アミノ酸）は、タンパク質データベースの既知の如何なるアミノ酸配列とも顕著な配列相同性を示さない。ブラスト・ソフトウェアを使用してNCBIデータベースのサーチを行った。コスミド４０７−３２．１Ｃ１、６７２−０１．Ａ４０、６７２−０７．Ｃ４０、及び６５４−４５．１の制限酵素地図。ＨＶＴゲノムＤＮＡ断片ＥｃｏＲＩ＃９とＢａｍＨＩ＃10と重なり合う部分を示している。ＥｃｏＲＩ＃９とＢａｍＨＩ＃10断片内のユニークなＸｈｏＩ部位は、プラスミド６５４−４５．１内ではＰａｃＩ部位に変換され、またプラスミド６８６−６３．Ａ１内ではＮｏｔＩ部位に変換された。
図５：コスミド４０７−３２．１Ｃ１、６７２−０１．Ａ４０、６７２−０７．Ｃ４０、及び６５４−４５．１の制限地図。ＨＶＴゲノムＤＮＡ断片ＥｃｏＲＩ＃９とＢａｍＨＩ＃10の重なりが示されている。ＥｃｏＲＩ＃９とＢａｍＨＩ＃10断片中のユニークなＸｈｏＩ部位は、プラスミド６５４−４５．１ではユニークなＰａｃＩ部位に、又はプラスミド６８６−６３．Ａ１ではユニークなＮｏｔＩ部位に変換されている。
図６：ＢＥＳ処置したニワトリ胚繊維芽細胞での一過性トランスフェクションアッセイにおけるニワトリ貧血ウイルスプロモーター及びＨＣＭＶ前初期プロモーターからのβ−ガラクトシダーゼの発現。β−ガラクトシダーゼの発現は、０、20、40、及び60分の時点で、ＯＮＰＧアッセイによって測定し、ＯＤ415として表した。プロトコールは、一過性トランスフェクションアッセイに記載されている。プラスミド３８８−６５．２は、前初期プロモーターを含有している。プラスミド８５０−８０．２、８５０−２５．１８及び８５０−６９．１は、物質と方法に記載されているように、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターを含有している。
図７：シチメンチョウ組換えヘルペスウイルス又はマレック病ウイルス短領域とシチメンチョウヘルペスウイルス長領域のキメラを具備する組換えキメラウイルスワクチン中の外来ＤＮＡを発現させるのに有用な伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）のＤＮＡ配列（配列番号  ）。
図８：シチメンチョウ組換えヘルペスウイルス又はマレック病ウイルス短領域とシチメンチョウヘルペスウイルス長領域のキメラを具備する組換えキメラウイルスワクチン中の外来ＤＮＡを発現させるのに有用な伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）のＤＮＡ配列（配列番号  ）。
発明の詳細な説明
本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスの長ウイルスゲノム領域とマレック病ウイルスの短ウイルスゲノム領域とを具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのユニークな長ウイルスゲノム領域とマレック病ウイルスのユニークな短ウイルスゲノム領域とを具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。
１の態様では、外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ−マレック病ウイルスキメラウイルスゲノムの非必須領域中に挿入され、宿主細胞中で発現され得る。別の態様では、外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ−マレック病ウイルスキメラウイルスゲノムのユニークな長領域のＥｃｏＲＩ＃９断片中に挿入される。
別の態様では、外来ＤＮＡ配列はポリペプチドをコードしている。例えば、外来ＤＮＡ配列は、ニワトリ骨髄性単球増殖因子（ｃＭＧＦ）、ニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）、又はウズラインターフェロン（qＩＦＮ）のようなサイトカインをコードし得る。あるいは、外来ＤＮＡ配列は、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、及び伝染性粘液ブルザ病ウイルスからなる群から選択される抗原性ポリペプチドをコードし得る。
別の態様では、外来ＤＮＡ配列は、内在性上流ヘルペスウイルスプロモーターの制御下にある。プロモーターの例には、ＰＲＶ  ｇｘ、ＨＳＶ-1α4、ＨＣＭＶ前初期、ＭＤＶ  ｇＡ、ＭＤＶ  ｇＢ、ＭＤＶ  ｇＤ、ＩＬＴ  ｇＢ、ＢＨＶ−１．１  ＶＰ８、ＩＬＴ  ｇＤ及びニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターのような異種性上流プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。組換えキメラウイルスの例には、Ｓ−ＨＶＹ−１４５、Ｓ−ＨＶＹ−１４９及びＳ−ＨＶＹ−１５２が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子のを具備するベクターを提供する。本発明は、該ベクターを含有する宿主細胞を提供する。本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子の相補配列を具備する組換えＤＮＡを提供する。相補配列はアンチセンス鎖である。ある態様では、アンチセンス核酸分子は、ニワトリインターフェロンのｍRＮＡにハイブリダイズする。
本発明は、外来ＤＮＡを具備する組換えウイルスを用いて動物にワクチン接種することによって、動物の免疫応答を増強する方法を提供する。外来ＤＮＡの例には、ウズラインターフェロン及びニワトリインターフェロンをコードする核酸配列のセンス鎖のようなサイトカイン、ニワトリ貧血ウイルス、ＭＤＶ、ＮＤＶ、ＩＬＴ、又はＩＢＤＶのようなウイルスが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、動物の免疫応答を増強するために、組換えウイルスから発現される単離されたポリペプチドを、不活化又は弱毒化したウイルスのワクチンと組み合わせて使用し得ると推定される。
本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子のセンス鎖の相補配列を具備するベクターを含有するワクチンを動物に接種することによって、動物の免疫応答を増強する方法を提供する。
本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子を具備するベクターを提供する。
本発明は、通常の状態ではニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）の遺伝子の転写に関与するプロモーター配列を具備する単離された核酸を提供する。
本発明は、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターをコードする単離された核酸を提供する。ある態様では、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターをコードする単離された核酸は、配列番号23に示されている核酸配列を有する。
本発明は、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターをコードする単離された核酸を具備するベクターを提供する。本発明は、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡ配列を具備する組換えヘルペスウイルスを提供する。
本発明は、ＨＶＴゲノム中の非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する組換えヘルペスウイルス又は組換えポックスウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列が組換えＨＶＴに感染した宿主細胞中で発現することができ、その発現がニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下にある組換えヘルペスウイルス又は組換えポックスウイルスを提供する。
本発明は、ＨＶＴゲノム中の非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する組換えキメラウイルスを提供する。前記外来ＤＮＡ配列は組換えキメラウイルスに感染した宿主細胞中で発現することができ、その発現は外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある組換えヘルペスウイルス又は組換えポックスウイルスを提供する。
本明細書において、組換えキメラウイルスゲノム又ＨＶＴゲノム中の「非必須部位」とは、ウイルス感染又は複製に必要のないウイルスゲノム中の領域を意味する。
本明細書において、「ウイルスゲノム」又は「ゲノムＤＮＡ」とは、ウイルス中に天然に存在するＤＮＡ全体を意味する。本明細書において、「外来ＤＮＡ配列」又は「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡにとって外因性である任意のＤＮＡ又は遺伝子をを意味する。
本明細書において、「読み取り枠」とは、アミノ酸配列に翻訳され得るRＮＡであり、停止コドンを含有していないRＮＡに転写され得るコドンを含有するＤＮＡのセグメントである。
本発明は、さらに、本発明の組換えキメラウイルスを構築するのに有用な、ＨＶＴ又はＭＤＶゲノムの何れかのウイルス中に存在する幾つかの適切な挿入部位を提供する。挿入部位には、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片及びＢａｍＨＩ＃10断片が含まれ、両断片内部の好ましい挿入部位は、ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼである。
本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片内に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する組換えキメラウイルスを提供する。前記外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現され得る。
ある態様では、外来ＤＮＡ配列は、ＥｃｏＲＩ＃９断片の読み取り枠Ａ（ＯＲＦＡ）内に挿入される。ＥｃｏＲＩ＃９のＸｈｏＩ部位中に外来ＤＮＡが挿入されてORFAを分断しているということは、ＯＲＦＡの全領域が、組換え体の複製に非必須であることを示している。
本発明の用途において、「組換えキメラウイルス」及び「組換えシチメンチョウヘルペスウイルス」とは、当業者に周知の組換え法、例えば、物質と方法中の組換え体を作成するためのＤＮＡトランスフェクションに示されている方法によって作成された生きたウイルスであり、該ウイルスは、組換えキメラウイルス又は組換えシチメンチョウヘルペスウイルスの複製に必須の遺伝物質を欠失している。精製された組換えキメラウイルス及び組換えシチメンチョウヘルペスウイルスは、ＥｃｏＲＩ＃９断片又はＢａｍＨＩ＃１０断片中に外来ＤＮＡ配列又は遺伝子を安定に挿入する。
本発明は、さらに、外来ＤＮＡ配列が、組換えキメラウイルスが導入された動物中で抗原性を示すポリペプチドをコードする組換えキメラウイルスを提供する。
ある態様では、ポリペプチドは検出可能なマーカーである。本発明の用途において、「検出可能なマーカーであるポリペプチド」には、二量体、三量体、及び四量体の形態であるポリペプチドが含まれる。大腸菌β−ガラクトシダーゼは、4つのポリペプチドすなわちモノマーサブユニットから構成される四量体である。ある態様では、ポリペプチドは大腸菌β−ガラクトシダーゼである。
本発明は、ＨＶＴゲノム中の非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を提供する。該外来ＤＮＡ配列は、組換えＨＶＴに感染した宿主細胞中で発現することができ、その発現は、外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある。
別の態様では、外来ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。別の態様では、サイトカインは、ニワトリ骨髄性単球増殖因子（ｃＭＧＦ）、ニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）、又はウズラインターフェロンである。好ましい態様では、組換えシチメンチョウヘルペスウイルスは、S-ＨＶＴ-144と称される。
本発明は、さらに、そのウイルスゲノムが、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、又は伝染性粘液ブルザ病ウイルス（IBDV）由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提供する。
本発明は、ＥｃｏＲＩ＃９断片中に外来ＤＮＡ配列が挿入された組換えシチメンチョウヘルペスウイルスであって、さらに、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、又は伝染性粘液ブルザ病ウイルスからなる群から選択される、抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列を具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提供する。
ある態様では、抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列は、マレック病ウイルスから得られ、マレック病ウイルス糖タンパク質ｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパク質ｇＢ、又はマレック病ウイルス糖タンパク質ｇＤをコードする。ある態様では、マレック病ウイルス糖タンパク質ｇＡ、糖タンパク質ｇＢ、又は糖タンパク質ｇＤをコードする外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウヘルペスウイルスのＵＳ２遺伝子コード領域のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入される。
本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡがマレック病ウイルスから得られる抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、マレック病ウイルスの糖タンパク質、ｇＢ、ｇＡ、又はｇＤである。
ある態様では、外来ＤＮＡ配列を含有する組換えＨＶＴは、ＩＢＤＶ、ＶＰ２、ＭＤＶ  ｇＡ、及びＭＤＶ  ｇＢをコードする。好ましくは、このような組換えウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−１３７及びＳ−ＨＶＴ−１４３と称される。
本発明は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）から得られる抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列を含有する組換えキメラウイルスを提供する。このような場合、抗原性ポリペプチドは、ニューカッスル病ウイルス融合（Ｆ）タンパク質若しくはニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）であるか、又はニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）に融合された大腸菌β−ガラクトシダーゼを具備する組換えタンパク質であることが好ましい。
本発明は、ＭＤＶ由来の抗原性ポリペプチドをコードする一以上の外来ＤＮＡ配列とＮＤＶ由来の抗原性ポリペプチドをコードする一以上の外来ＤＮＡ配列を含有するように改変された組換えキメラウイルスも提供する。好ましくは、ＭＤＶ抗原性ポリペプチドは、ＭＤＶ ｇＢ、ｇＤ又はｇＡとＮＤＶ F又はＨＮである。
本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有し、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを具備する組換えキメラウイルスを提供する。
さらに、ある態様では、外来ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードし、且つ伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＢ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＩ、又は伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質ｇＤをコードする。
別の態様では、外来ＤＮＡ配列は、ＭＤＶ ｇＡ、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇＤ、ＮＤＶ ＨＮ、ＮＤＶ Ｆ、ＩＬＴ ｇＢ、ＩＬＴ ｇＩ、ＩＬＴ ｇＤ、ＩＢＶ、ＩＢＤＶ ＶＰ２、ＩＢＤＶ ＶＰ３、ＩＢＤＶ ＶＰ４、トリ脳脊髄炎ウイルス、トリレオウイルス、トリパラミクソウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリアデノウイルス、鶏ポックスウイルス、トリコロナウイルス、トリロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス（因子）、サルモネラ属、大腸菌、パスツレラ属、ボルデテラ属、アイメリア属、ヒストモナス属、トリコモナス属、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミ、家禽プロトゾアからなる群から得られる、又は得ることが可能な抗原性ポリペプチドをコードする。好ましい態様では、組換えシチメンチョウヘルペスウイルスはＳ−ＨＶＴ−１３６と称される。
本発明は、さらに、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列を含有する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提供する。抗原性ポリペプチドはＩＬＴＶ糖タンパク質ｇＢ、ＩＬＴＶ ｇＤ、又はＩＬＴＶ ｇＩであることが好ましい。
ある態様では、外来ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であり、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質ｇＤ、又は喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質ｇＩをコードする。
本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含有する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提供する。前記外来ＤＮＡ配列は、ニューカッスル病ウイルス由来であり、ニューカッスル病ウイルスＨＮ又はニューカッスル病ウイルスＦをコードする。
このような抗原性ポリペプチドは、以下のネコの病原体、イヌの病原体、ウマの病原体、ウシの病原体、トリの病原体、ブタの病原体、又はヒトの病原体から得られ、又は得ることが可能であり得る。
別の態様では、ヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス-1、単純ヘルペスウイルス-2、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、水痘−帯状ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザ、ヒト免疫不全症ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、及びC型肝炎ウイルスに由来する。さらに、ヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、熱帯熱マラリア原虫、百日咳菌、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれるマラリア又は悪性腫瘍と関連するものであり得る。
本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡがニューカッスル病ウイルス融合（Ｆ）タンパク質をコードする外来ＤＮＡを含有し、さらに組換えタンパク質をコードするＤＮＡを具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスであって、大腸菌β−ガラクトシダーゼがニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）に融合されている組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提供する。本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡがマレック病ウイルス糖タンパク質ｇＢとマレック病ウイルス糖タンパク質ｇＡを含有し、さらにニューカッスル病ウイルスのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードする外来ＤＮＡを具備する組換えキメラウイルスを提供する。
本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのユニークな長ウイルスゲノム領域とマレック病ウイルスのユニークな短領域とを具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。１の態様では、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラは、シチメンチョウヘルペスウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含有し、該外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現することができる。
一つの態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。このポリペプチドは、組換え型のヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となり得る。
別の態様において、ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ-ガラクトシダーゼである。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、サイトカインをコードする。別の態様において、サイトカインは、ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）またはウズラ・インターフェロンである。
本発明は更に、前記外来性ＤＮＡ配列が、組換え型のヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となるポリペプチドをコードする、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。
更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、以下のものから成る群より選択される抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備する：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、および伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルス。
本発明は、前記外来性ＤＮＡ配列が、内在性の上流ヘルペスウイルスプロモーターの制御下にある、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は、異種の上流プロモーターの制御下にある。別の態様において、該プロモーターは、以下のものより選択される：ＣＡＶ、ＰＲＶ ｇＸ、ＨＳＶ−１ アルファ４、ＨＣＭＶ前初期、ＭＤＶ ｇＡ、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇＤ、ＩＬＴ ｇＢ、ＢＨＶ−１．１ ＶＰ８、およびＩＬＴ ｇＤ。
本発明は、外来性ＤＮＡをウイルスゲノム内に挿入することにより、組換え型のキメラウイルスを産生させるための相同性ベクターを提供する。相同性ベクターの例には、以下のものを含む：３０１−０７．ＹＤ１、８５２−５２．ＩＩ４、８６４−７４．１８、８８１−２３．２８、および７３９−２７．１６。
本発明は、以下のものを本質的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備したシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内に外来性ＤＮＡを挿入することにより、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させるための相同性ベクターを提供する：ａ）シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内には通常存在しない二本鎖の外来性ＤＮＡ；ｂ）前記外来性ＤＮＡの一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのコード領域であるＥｃｏＲＩ ＃９部位の一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの；並びにｃ）前記外来性ＤＮＡのもう一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのコード領域であるＥｃｏＲＩ ＃９部位のもう一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの。相同性ベクターの例は、７５１−８７．Ａ８と称されるものである。
一つの態様において、ポリペプチドは、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性である。別の態様においては、抗原性ポリペプチドは、サイトカイン、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス由来である。好ましい態様において、抗原性ポリペプチドは、以下のものである：ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）もしくはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）、ウズラ・インターフェロン、伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルスのポリタンパク質、伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルスのＶＰ２タンパク質、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＢ、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＡ、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＤ、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＢ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＤ、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質。
別の態様において、前記相同性ベクター内の二本鎖の外来性ＤＮＡ配列は、ウマの病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードする。ウマの病原体の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスから由来することが可能である。このような抗原性ポリペプチドの例には、次のようなものがある：ウマインフルエンザウイルス  タイプＡ/アラスカ91  ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルス  タイプＡ/プラハ56  ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルス  タイプＡ/マイアミ63  ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルス  タイプＡ/ケンタッキー81  ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス  タイプ１  糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルス  タイプ１  糖タンパク質Ｄ。
別の態様において、前記相同性ベクター内の二本鎖の外来性ＤＮＡ配列は、ウシ呼吸器性シンシチアルウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスから由来する抗原性ポリペプチドをコードする。ウシ呼吸器性シンシチアルウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスから由来する抗原性ポリペプチドには、次のようなものがある：ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス  付着タンパク質（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス融合タンパク質（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス ヌクレオキャブシドタンパク質（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシパラインフルエンザウイルス タイプ３ 融合タンパク質、およびウシパラインフルエンザウイルス タイプ３ 血球凝集素・ノイラミニダーゼ。
別の態様において、前記相同性ベクター内の二本鎖の外来性ＤＮＡ配列は、ヒトの免疫応答を刺激することが可能なサイトカインをコードする。例えば、サイトカインは、インターロイキン−１、インターロイキン−１５、インターフェロン、ウズラ・インターフェロン、ニワトリ・インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体であり得るが、これらに限定されない。
本発明の目的に適した「相同性ベクター」は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノム上の特定部位に外来性ＤＮＡを挿入するように構築されたプラスミドである。
本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片内に存在するＤＮＡ配列に対して相同性がある。好ましくは、この相同性ベクターは、172-63.1と称されるものである。
別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、スクリーニング可能なマーカーをコードする。スクリーニング可能なマーカーの例には、Ｅ．ｃｏｌｉのβ-ガラクトシダーゼまたはＥ．ｃｏｌｉのβ-グルクロニダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本発明は更に、有効な免疫量の本発明の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。
本発明は、マレック病ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。
本発明は、ニューカッスル病ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。
本発明は、伝染性喉頭気管炎ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。
本発明は、伝染性気管支炎ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。
本発明は、伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。
本発明は、マレック病ウイルスおよびニューカッスル病ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワクチンを提供する。
本発明は、マレック病ウイルスおよび伝染性喉頭気管炎ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワクチンを提供する。
本発明は、マレック病ウイルスおよび伝染性気管支炎ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワクチンを提供する。
本発明は、マレック病ウイルスおよび伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワクチンを提供する。
本発明は更に、家禽を免疫化する方法を提供する。本発明の目的に適したこの方法には、以下のものに対して家禽を免疫化することが含まれる：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス。この方法は、家禽に対して、本発明のワクチンを免疫的に有効な量で投与することを具備する。このワクチンは、当業者によく知られた任意の方法により投与することができ、例えば、筋内接種、皮下接種、腹腔内接種、または静脈内接種による。あるいは、ワクチンは、鼻腔内または経口的に投与することが可能である。
本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞を提供する。一つの態様において、宿主細胞はトリの細胞である。
本発明の目的に適した「宿主細胞」は、ベクターおよびその挿入物を増殖させるのに使用される細胞である。細胞感染は、当業者によく知られた方法により行われるが、例としては、実験材料および実験方法の項の「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡトランスフェクション」に記載されているものがある。組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを構築し、選択し、精製する方法は、以下に詳述されている。
本発明は、上記ワクチンを投与したニワトリまたはその他の家禽を、天然のメレック病ウイルスに感染したものと識別する方法であって、ニワトリまたはその他の家禽から得た体液サンプルを分析して、天然のマレック病ウイルスに感染したニワトリまたはその他の家禽では通常発現している糖タンパク質ｇＧおよび少なくとも一の他の抗原の存在を調べることを具備した方法であり、感染したニワトリで通常発現しているこのような抗原は存在するが、糖タンパク質ｇＧが存在しないことは、上記ワクチンの接種を受けたことを示し、天然のマレック病ウイルスに感染していないことを示す、上記の方法を提供する。
本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、以下のものを含むがこれらに限定されない鳥類または哺乳類の種において、ワクチンとして有効な外来性ＤＮＡを発現しているものを提供する：ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、およびヒトを含む霊長類。本ワクチンは、不活化または生の組換え型ウイルスの何れを含んでいてもよい。
本発明の目的に適した、「免疫的に有効な量」の本発明の組換え型ネコヘルペスウイルスは、103〜109PFU/投与量の範囲にある。別の態様において、免疫量は、105〜107PFU/投与量である。好ましい態様において、免疫量は、106PFU/投与量である。
本方法は、動物に対して、本発明のワクチンを免疫的に有効な量で投与することを具備する。ワクチンは、当業者によく知られた任意の方法により投与することができ、例えば、筋内接種、皮下接種、腹腔内接種、または静脈内接種による。あるいは、ワクチンは、鼻腔内または経口的に投与することが可能である。
組み換え型ウイルスのための適切な担体は、当業者によく知られており、タンパク質、糖などが含まれるが、これらに限定されない。このような適切な担体の一例は、生理学的に均衡のとれた培養液であって、加水分解済タンパク質、ラクトースなどの一以上の安定化剤を含有するものである。好ましくは、生のワクチンは、組織培養液を採取して、安定性のある加水分解済タンパク質などの安定化剤を添加することにより作成される。好ましくは、不活化ワクチンは、ウイルスの不活化後すぐに組織培養液を使用する。
本発明は、ウズラ・インターフェロン タイプ１をコードする単離された核酸分子を提供する。一つの態様において、ウズラ・インターフェロン タイプ１をコードする単離された核酸分子は、配列認識番号３１に記載されているような核酸配列を有する。
一つの態様において、単離された核酸分子はゲノムＤＮＡである。別の態様において、単離された核酸分子はｃＤＮＡである。別の態様において、ＲＮＡは、単離された核酸分子に由来するか、あるいは単離された核酸分子とハイブリダイズすることができる。
「核酸配列」とは、５’末端から３’末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本または二本鎖ポリマーをいう。核酸配列には、自己複製するプラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、非機能的なＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
特定の配列表について言及する場合、その言及には、僅かな配列の間違い、一塩基の変化、欠失、置換などを許容範囲に含めた、配列表に実質的に該当する配列およびその相補鎖が含まれ、その結果、このような配列の変化が、その配列表に関する病原性生物もしくは疾患マーカーの核酸配列に該当することが、当業者に容易に理解されるであろう。
本発明は、少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子であって、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードする単離された核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができるものを提供する。本発明は、少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子であって、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードする単離された核酸分子のセンス鎖の相補的な配列に特異的にハイブリダイズすることができるものを提供する。相補的な配列は、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードする単離された核酸分子のアンチセンス鎖である。
一つの態様において、該分子は、８ないし３６ヌクレオチドである。別の態様において、該分子は、１２ないし２５ヌクレオチドである。別の態様において、該分子は１４ヌクレオチドである。一つの態様において、該分子はＤＮＡである。一つの態様において、該分子はＲＮＡである。
本発明は、単離された核酸分子にハイブリダイズすることができるアンチセンス分子を提供する。一つの態様において、アンチセンス分子はＤＮＡである。別の態様において、アンチセンス分子はＲＮＡである。別の態様において、アンチセンス分子は、核酸誘導体（例えば、タンパク骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡ）である。
本発明は、アンチセンス核酸でｍＲＮＡをマスクするか、あるいはリボザイムでｍＲＮＡを切断することにより、ポリペプチドの発現を妨害するのに使用され得る、アンチセンス核酸もしくはその断片、並びにリボザイムを調製することまで及ぶ。一つの態様において、アンチセンス核酸分子は、ウズラ・インターフェロンのｍＲＮＡにハイブリダイズする。
ＤＮＡを標的にする方法は、幾つかのカテゴリーに分類される。核酸を、二重らせんＤＮＡの主溝に結合するように設計して、三重らせん、即ち「トリプレックス」構造を形成することができる。あるいは、抑制性核酸は、複製または転写の間に二重らせんＤＮＡの開裂により得られる一本鎖ＤＮＡの領域に結合するように設計される。
より一般的には、抑制性核酸は、ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ前駆体に結合するように設計される。抑制性核酸は、ｍＲＮＡ前駆体の成熟を阻害するために使用される。抑制性核酸は、ＲＮＡプロセシング、スプライシングまたは翻訳を妨害するように設計することができる。単離された核酸分子に相補的な鎖は、アンチセンス鎖とも呼ばれる。
最後に、抑制性核酸は、標的遺伝子の化学的不活性化または切断を誘発するのに使用することができる。化学的不活性化は、抑制性核酸と標的核酸との間の細胞内での交差の誘発により起こり得る。適切に誘導体化された（derivatized）抑制性核酸により誘発された、標的核酸の他の化学的修飾を使用することもできる。
高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低い温度で選択される。Tmは、塩濃度の５０％がｐＨ７で少なくとも約0.02モルであるときの（規定のイオン強度およびｐＨにおける）温度であり、該温度は少なくとも約６０℃である。他の因子、とりわけ相補鎖の塩基組成およびサイズ、有機溶媒の存在（即ち塩もしくはホルムアミドの濃度）、および塩基ミスマッチの程度が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに有意に影響を及ぼすため、パラメーターの組み合わせは、どれか一つの絶対指標より重要である。例えば、高ストリンジェンシーは、約６８℃において６×ＳＳＣ溶液中で一晩ハイブリダイゼーションさせ、室温において６×ＳＳＣ溶液で洗浄し、次いで約６８℃において０．６×ＳＳＣ溶液中で洗浄することにより達成され得る。
適度なストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、例として以下の工程により達成され得る：１）３×ＳＳＣ溶液、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．５における０．１Ｍトリス緩衝液、５×デンハルト溶液によるフィルター・プレハイブリダイジングおよびハイブリダイジング；２）３７℃における４時間のプレハイブリダイゼーション；３）全体で3,000,000cpmに相当する量の標識プローブによる３７℃における１６時間のハイブリダイゼーシヨン；４）×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液中での洗浄；５）４×ＳＳＣ中で室温で各１分間、６０℃で各３０分間の４×洗浄；並びに６）乾燥およびフィルムへの露出。
核酸プローブ技術は当業者に公知であり、当業者は、プローブの検出を容易にするために、該プローブの長さを大きく変化させ、検出可能なラベル（例えば放射性同位元素もしくは蛍光色素）で標識できることを認識している。当該分野で公知の方法を用いて、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子の完全長もしくは断片を有するＤＮＡ分子を、適切なベクター（例えばプラスミドもしくはバクテリオファージ）に挿入し、次いで適切な細菌宿主細胞に形質転換し、形質転換された細菌宿主細胞において複製し、そしてＤＮＡプローブを回収することにより、ＤＮＡプローブ分子を産生することができる。あるいは、プローブはＤＮＡ合成機から化学的に作成することができる。
ＲＮＡプローブは、バクテリオファージ・プロモーター（例えばT3、T7、またはSP6）の下流に、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子の完全長もしくは断片を挿入することにより作成することができる。大量のＲＮＡプローブは、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ＤＮＡウイルスの単離された直鎖状核酸分子もしくはその断片であって、上流プロモーターを含有するものとともに、標識されたヌクレオチドをインキュベートすることにより産生することができる。
ここで規定したとおり、核酸プローブはＤＮＡもしくはＲＮＡ断片であり得る。ＤＮＡ断片は、例えばプラスミドＤＮＡを消化することにより、またはＰＣＲの利用により調製することができ、あるいはホスホラミダイト法（Beaucage and Carruthers,1981,Tetrahedron Lett.22,1859-1862記載）もしくはトリエステル法（Matteucciら,1981,Am.Chem.Soc.103：3185記載）により合成することができる。その後、所望ならば、適切な条件下で化学的に合成された一本鎖をアニーリングすることにより、あるいは適切なプライマー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成させることにより、二本鎖の断片を得ることができる。核酸プローブのための特定配列が規定されたところでは、相補鎖も同定され、包含されることが理解される。相補鎖は、標的が二本鎖の核酸である状況において、完全に同じ作用をするであろう。特定配列が、核酸プローブの使用のために同定されると、２５塩基対（bp）以上の長さのリスト配列のサブ配列も、プローブとしての使用に包含されることが更に理解される。
本発明の核酸分子には、更に、天然に存在する形態とは一以上のアミノ酸残基の同一性もしくは位置において異なるが、天然に存在する形態の特性を一部もしくは全て共有するような、抗原性ポリペプチドのポリペプチド類縁体、断片、もしくは誘導体（ポリペプチドを指定する全残基より少ない残基を含有する欠失類縁体、指定された一以上の残基が他の残基に置き換えられた置換類縁体、および一以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端部分もしくは中間部分に付加された付加類縁体）をコードする分子を含む。
「ＳＳＣ」という用語は、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭクエン酸ナトリウムのクエン酸−食塩水溶液のことをいう。溶液は、この濃度の倍数もしくは小数として表示される。例えば、６×ＳＳＣは、この量の６倍の塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム濃度、即ち０．９Ｍ塩化ナトリウムおよび１２０ｍＭクエン酸ナトリウムを有する溶液のことをいう。０．２×ＳＳＣは、０．２倍のＳＳＣ濃度、即ち０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび４ｍＭクエン酸ナトリウムの溶液のことをいう。
「特異的にハイブリダイズする」という用語は、細胞内の全ＤＮＡもしくはＲＮＡの調製液中に標的配列が存在するときに、特定の標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列にのみハイブリダイズ、二本鎖形成、もしくは結合する核酸プローブを説明している。選択的にハイブリダイズするとは、プローブが、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションの条件下において、非標的配列とは異なった、検出可能な方法で、所定の標的に結合することを意味する。
「コードする核酸分子」という用語は、特定のポリペプチドの発現を指図する核酸分子のことをいう。該核酸の配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列、それに相補的なＤＮＡ鎖、およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列を含む。該核酸分子には、完全長の核酸配列、並びに不完全な長さの配列を含む。該配列には、天然の配列の縮重コドン、もしくは特定の宿主細胞においてコドン選択を付与するために導入され得る配列の縮重コドンを含むことが更に理解される。
本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に連結した単離されたＤＮＡを提供する。ここで使用する「機能的に連結した」という用語は、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を仲介するように、ＤＮＡ配列の上流におけるプロモーターの連結をいう。
本発明は、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードする単離された核酸分子を具備するベクターを提供する。本発明は、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードする単離された核酸分子を具備する組換えＤＮＡを提供する。
本発明は、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードする単離された核酸分子のセンス鎖に相補的な配列を具備するベクターを提供する。本発明は、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードする単離された核酸分子のセンス鎖に相補的な配列を具備する組換えＤＮＡを提供する。
ベクターは、以下のものを含むがこれらに限定されない：プラスミド、コスミド、λファージ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、または単離された核酸分子を含有する組換え型ウイルス。
ベクターを得るために、挿入ＤＮＡとベクターＤＮＡの双方を、制限酵素にさらして、両分子上に互いに塩基対を形成する相補的な末端をつくり、次いで、ＤＮＡリガーゼで互いを連結することができる。あるいは、ベクターＤＮＡ内の制限部位に対応するリンカーを挿入ＤＮＡに連結し、次いでベクターＤＮＡを、制限部位で切断する制限酵素で処理することができる。その他の手段も利用することができ、当業者に公知である。
本発明は、ベクターを含有する宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞には、細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、酵母、真菌、植物、昆虫、および哺乳動物の細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な動物の細胞には、ＣＥＦ、ＱＴ−３５、ＥＳＫ−４、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞、および種々の一次哺乳類細胞が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、ウズラ・インターフェロン  タイプＩの生物学的活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。別の態様において、単離されたポリペプチドは、ウズラ・インターフェロン  タイプ１をコードしており、配列認識番号３２に記載されているようなアミノ酸配列を有する。
ここで使用する「ポリペプチド」という用語は、核酸によりコードされる完全長の遺伝子産物またはその一部のことをいう。従って、「ポリペプチド」には、完全長のタンパク質だけでなく、５０アミノ酸残基より短いペプチドなど、不完全長の断片をも含む。
更に、単離されたポリペプチドは、単離された核酸分子を第二の核酸分子に結合させ、適切な宿主細胞で発現させることにより、第二のポリペプチドに結合して融合タンパク質を形成することができる。一つの態様において、第二の核酸分子は、β-ガラクトシダーゼをコードする。融合タンパク質を形成するために使用される他の核酸分子は、当業者に公知である。
本発明は、単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。一つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、ポリペプチドの一つのエピトープを認識する。別の態様において、抗体はポリクローナル抗体である。別の態様において、ポリペプチドの一以上のエピトープを認識する。別の態様において、抗体は抗イディオタイプ抗体である。
抗体、ポリペプチド、または単離された核酸分子は、以下のものを含むがこれらに限定されない検出可能なマーカーで標識することができる：放射性ラベル、または比色定量マーカー、発光マーカーもしくは蛍光マーカー、または金。放射性ラベルは、以下のものを含むがこれらに限定されない：3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、59Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、および186Ｒｅ。蛍光マーカーは、フルオレセイン、ローダミン、およびオーラミンを含むがこれらに限定されない。比色定量マーカーは、ビオチン、およびジゴキシゲニンを含むがこれらに限定されない。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生する方法は、通常の当業者に公知である。
更に、抗体、ポリペプチド、または核酸分子は、酵素、例えばアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し得る二次抗体により検出することができる。使用可能なその他の酵素は、通常の当業者に公知である。
本発明は、単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で宿主−ベクターシステムを増殖させることと、産生されたポリペプチドを回収することとを具備する方法を提供する。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、糸状真菌類、植物、昆虫、および哺乳動物の細胞が含まれる。ポリペプチドを産生し回収するための宿主−ベクターシステムは、当業者に公知であり、以下のものを含むがこれらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉおよびｐＭＡＬ（New England Biolabs）、Sf9昆虫細胞−バキュロウイルス発現システム、およびリポフェクション（Gibco-BRL）もしくはリン酸カルシウムの沈殿、またはベクターを細胞に導入するためのその他の方法により、哺乳動物の発現ベクターをトランスフェクトされた哺乳動物の細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、およびＨＥＫ２９３）。
本発明は、抗体を作成するためのポリペプチドの単離された核酸分子によりコードされるポリペプチド上の特定の領域を選択するための方法を提供する。アミノ酸配列は、当業者に公知の方法により分析することができ、そのアミノ酸配列が構築するポリペプチド内に疎水性領域もしくは親水性領域を作り出すかどうかを決定する。細胞膜のポリペプチドの場合、疎水性領域は、細胞膜の脂質二重層に挿入されるポリペプチド部分を形成し、親水性領域は水性環境の細胞表面に位置することが知られている。通常、親水性領域は、疎水性領域より免疫抗原性となるであろう。従って、親水性アミノ酸配列は、ＤＮＡウイルスをコードする単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドに特異的な抗体を作成するために選択し使用することができる。選択されたペプチドは、商業的に入手可能な機械を用いて調製することができる。あるいは、核酸をクローニングして発現させ、得られたポリペプチドを回収し、免疫抗原として使用することができる。
更に、酵素を標識として使用することができる。適切な酵素には、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼが含まれる。酵素免疫検定法の二種類の主要タイプは、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、および酵素増幅免疫測定法（EMIT,Syva corporation,Palo Alto,CA）としても公知のホモジニアス酵素免疫検定法である。ＥＬＩＺＡシステムにおいては、例えば固相に結合した抗体の使用により、分離を行うことができる。ＥＭＩＴシステムでは、トレーサーと抗体との複合体における酵素活性の不活化に依存する；従って、分離工程の必要性もなく、活性は測定される。
その上、化学発光性化合物を、標識として使用することができる。典型的な化学発光性化合物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが含まれる。同様に、生物発光性化合物を標識のために使用することができ、生物発光性化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが含まれる。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の記載は、以下のものに見出すことができる：Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology（1978）North Holland Publishing Company,New York、とりわけT.Chardによる「Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques」という題の章。種々のタイプの一般的な免疫定量アッセイの記載は、以下のものに見出すことができる：米国特許第4,376,110号（Davidら）、または第4,098,876号（Piasio）。
本発明は、組み換え型ウイルスであって、ウイルスゲノムの非必須領域に挿入され、且つ宿主細胞で発現させることができる外来性ＤＮＡを具備し、前記外来性ＤＮＡが、ウズラ・インターフェロン タイプＩであるものを提供する。
該ウイルスは、以下のものから構成される群より選択される：シチメンチョウヘルペスウイルス、豚痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、ラクーン痘ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、イヌヘルペスウイルス、伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアルファウイルス。
本発明は、有効な免疫量のウズラ・インターフェロン  タイプ１のポリペプチドおよび適切な薬学的担体を具備したワクチンを提供する。
前記ワクチンは、ワクチン投与に慣用的な任意の方法、例として経口的および非経口的（例えば皮下もしくは筋内）注入などの方法により投与することができる。好ましくは筋内投与である。その処置は、一回投与量のワクチン、もしくはある期間にわたっての複数回の投与量から構成され得る。該投与量が、生後８ヶ月以内にヒトの患者に投与されることが好ましい。本発明の抗原は、適切な投与量の化合物、例としてインフルエンザ抗原（例えばインフルエンザ  タイプＡ抗原）などの化合物と組み合わせることができる。また、本発明の抗原は、経口投与に適合し得る組換え型ワクチンの構成要素となり得る。
本発明のワクチンは、多価ワクチンを産生するために、他の疾患のための他のワクチンと組み合わせることができる。薬学的に有効な量の抗原は、タンパク質のような薬学的に許容し得る担体、または哺乳類、特にヒトのワクチン投与に有効な希釈剤とともに使用することができる。他のワクチンは、当業者によく知られた方法に従って調製することできる。
当業者なら、有効な免疫保護を引き出すためには、適切なエピトープに哺乳動物をさらすことのみが必要であると容易に認識するであろう。エピトープは、典型的にはタンパク質全体の一部であるアミノ酸断片である。組換え遺伝学を使用して、天然に存在するエピトープと同一もしくは実質的に同一の（免疫学的に等価な）エピトープを含む誘導体を生成するために、天然のタンパク質の一次構造を変えることは慣例である。このような誘導体には、ペプチド断片、ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸付加を含む。例えば、タンパク質の分野では、あるアミノ酸残基を、タンパク質の生物学的活性に影響を与えることなく、同じサイズおよび極性のアミノ酸と置換できることは公知である。
本発明は、組換え型ウイルスを高い力価まで増殖させる方法であって、ウズラ・インターフェロンをコードする単離された核酸分子のセンス鎖に相補的で且つ発現している配列を含有する細胞株内で、組換え型ウイルスを増殖させることによる方法を提供する。別の態様において、該ウイルスは、殺されているか、あるいは弱毒化されている。一つの態様において、核酸はセンス鎖である。別の態様において、核酸はアンチセンス鎖である。
本発明は、組換え型ウイルスの複製を増大させる方法を提供する。一つの態様において、該ウイルスは、殺されているか、あるいは弱毒化されている。本発明は、鳥類種のＩＦＮ産生を抑制する方法を提供する。一つの態様において、核酸はセンス鎖である。別の態様において、核酸はアンチセンス鎖である。
本発明は、ウズラ・インターフェロンを発現するトランスジェニック鳥類の種を提供する。鳥類の種には、以下のものを含むが、これらに限定されない：ウズラ、シチメンチョウ、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ハト、または家禽。
本発明は、動物の免疫応答を高めるための方法であって、動物に対して、ウズラ・インターフェロンをコードする単離された核酸分子を含むベクターまたはプラスミドを含有するワクチンを投与することによる方法を提供する。本発明は、動物の免疫応答を高めるための方法であって、動物に対して、ウズラ・インターフェロンをコードする単離された核酸分子のセンス鎖に相補的な配列を含むベクターまたはプラスミドを含有するワクチンを投与することによる方法を提供する。動物にワクチン投与するために使用される組換え型ウイルスと同時に、または引き続き、またはその後に、前記ベクターを投与し得ることは、本発明により想定される。
本発明は、動物の体重を増加させる方法であって、ウズラ・インターフェロンをコードする単離された核酸分子を含むワクチンを、鳥類の動物に投与することを具備する方法を提供する。一つの態様において、核酸はセンス鎖である。別の態様において、核酸はアンチセンス鎖である。
以下に続く実験の詳細な記載部で本発明を更に説明する。この部分は発明を理解する補助として書かれているが、その後に書かれている請求の範囲に示される発明を、如何なるようにしても限定することを意図しているものではなく、またそのように解釈すべきものでもない。
実験の詳細：
材料と方法：
シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料の調製。  ２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（これらの成分は、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたは同等の会社から得られ、以後完全ＤＭＥ培地と呼ぶ）に１％ウシ胎児血清を加えた培地中、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で組織培養細胞を感染させて、シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料を調製した。細胞変性作用が完了後、培地と細胞を採取し、細胞を臨床用遠心分離機中で３０００ｒｐｍで５分遠心分離してペレットにした。感染した細胞を２０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地中に再懸濁し、−７０℃で保存した。
シチメンチョウのヘルペスウイルスＤＮＡの調製。  シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のすべての操作は、ＦＣ−１２６株（ＡＴＣＣ＃５８４−Ｃ）を用いて行なった。感染細胞の細胞質からのＨＶＴウイルスＤＮＡの調製のために、初代ニワトリ胚線維芽細胞を、細胞の増殖が始まる前に広範な細胞変性作用を引き起こすのに充分な感染多重度で感染させた。インキュベートはすべて、空気中に５％炭酸ガスを有する加湿インキュベーター中で行なった。最大に感染したが不完全な細胞溶解を示した単層を採取することにより最大のＤＮＡ収率が得られた（典型的には５〜７日目）。細胞掻き取り器（Ｃｏｓｔａｒブランド）を用いて、培地中に感染した細胞を採取した。細胞懸濁液をＧＳ−３ロータ（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で３０００ｒｐｍで５℃で１０分間遠心分離した。得られたペレットを冷ＰＢＳ（２０ｍｌ／ローラービン（Ｒｏｌｌｅｒ  Ｂｏｔｔｌｅ））に再懸濁し、冷却してさらに３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＰＢＳをデカント後、細胞ペレットを４ｍｌ／ローラービンのＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。ＮＰ−４０（ノニデットＰ−４０TM、Ｓｉｇｍａ）を、０．５％になるように時々攪拌して試料に加えた。試料を３０００ｒｐｍで１０分冷却遠心分離して、核をペレットにし、細胞破片を除去した。上清液を注意深く、１５ｍｌのＣｏｒｅｘ遠心分離管に移した。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）とＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、ストック２０％）の両者を、それぞれ最終濃度５ｍＭと１％になるように試料へ加えた。試料４ｍｌに対して１００μｌのプロテイナーゼ−Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、混合し、４５℃で１〜２時間インキュベートした。インキュベート後、等量の水飽和フェノールを試料に加え、手で静かに混合した。臨床用遠心分離機で試料を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、相を分離した。ＮａＡｃを最終濃度０．３Ｍ（ストック溶液３Ｍ、ｐＨ５．２）になるように水相に加え、２．５容量の冷無水エタノールを添加後−７０℃で３０分間核酸を沈殿させた。ＨＢ−４ロータ中で５℃で８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して試料中のＤＮＡをペレットにした。上清を注意深く除去し、ＤＮＡペレットを２５ｍｌの８０％エタノールで洗浄した。真空下で短時間（２〜３分）乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の５０μｌ／ローラービンの感染細胞に再懸濁した。典型的にはウイルスＤＮＡの収率は、５〜１０μｇ／ローラービンの感染細胞の範囲であった。すべてのウイルスＤＮＡを約１０℃で保存した。
ポリメラーゼ埋め込み（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応。  ５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および４種類のデオキシヌクレオチドを各４００μＭを含有する緩衝液中にＤＮＡを再懸濁した。１０単位のクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を加え、室温で１５分反応を進行させた。次にＤＮＡをフェノールで抽出し、前述のようにエタノールで沈殿させた。
ＤＮＡ配列決定。ＵＳＢシーケナーゼキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｋｉｔ）と35Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いて、配列決定を行なった。ｄＧＴＰ混合物とｄＩＴＰ混合物の両方を用いて、圧縮のある領域を解明した。あるいは、圧縮のある領域をホルムアミドゲルで分離した。鋳型は２本鎖プラスミドサブクローンまたは１本鎖Ｍ１３サブクローンであり、プライマーは、配列決定されるべき挿入体のすぐ外でベクターに、またはあらかじめ得られた配列に作成した。得られた配列を集合させ、Ｄｎａｓｔａｒソフトウェアを用いて比較した。得られた配列の操作と比較は、Ｃｏｒａｌ  ＳｏｆｔｗａｒｅのＳｕｐｅｒｃｌｏｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｐｅｒｓｅｅプログラムを用いて行なった。
分子生物学的方法。  制限エンドヌクレアーゼによる消化、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、連結、キナーゼによるリン酸化、ホスファターゼによる処理、細菌培養物の増殖、ＤＮＡによる細菌の形質転換、および他の分子生物学的方法を含む、細菌やＤＮＡの操作方法は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）およびサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）により記載されている。種々のＤＮＡの操作に便利な制限部位を導入するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。使用した方法は、インニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（１９９０）により記載されたものである。一般に増幅された断片のサイズは５００塩基対未満であり、増幅断片の決定的に重要な領域は、ＤＮＡ配列決定により確認された。特に明記していない限りこれらの方法に若干変更を加えて使用した。
ＤＮＡのサザンブロッティング。  サザンブロッティングの一般的な方法は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）の方法を使用した。ＤＮＡを２０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中でニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ  ＢＡ８５）にブロットし、３０％ホルムアミド、１×デンハルツ溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％フィコール）、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．８、２００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡよりなるハイブリダイゼーション溶液中で、５５℃で４〜２４時間プレハイブリダイゼーションを行なった。Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）のキットと１つの32Ｐ−標識ヌクレオチドを用いてニックトランスレーションにより標識した標識プローブＤＮＡを加えた。ＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ）またはセファデックスＧ５０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、取り込まれなかったヌクレオチドからプローブＤＮＡを分離した。５５℃で一晩ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で２×ＳＳＣで１回洗浄し、次に０．１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で５５℃で３０分間の洗浄を２回行なった。フィルターを乾燥しオートラジオグラフィーを行なった。
ｃＤＮＡクローニング操作。  ｃＤＮＡクローニングとは、現状の技術を用いてＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に変換するために使用する方法を意味する。本出願人の方法は、グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ  １９８３）に記載されている。Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）は、本出願人の方法にきわめて類似したｃＤＮＡクローニングキットを考案し、これは我々と同じような結果を得るために使用できる試薬のセットと方法を含む。
ウイルスｍＲＮＡをクローニングするために、ウイルスによる感染に感受性の宿主細胞株を５〜１０プラーク形成単位／細胞で感染させた。細胞変性作用が明らかになったが、完全に破壊される前に、培地を除去し、１０ｍｌの溶解緩衝液（４Ｍグアニジンチオシアネート、０．１％消泡剤Ａ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１Ｍベータ−メルカプトエタノール）中で細胞を溶解させた。細胞溶解液を、滅菌したダウンスホモジナイザー中に注ぎ、溶液が均一になるまで氷の上で８〜１０回ホモジネートした。ＲＮＡ精製のために、８ｍｌの細胞溶解液をＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１遠心分離管中の３．５ｍｌのＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ  ＣｓＣｌ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））に静かに重層した。試料をＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ロータ中で２０℃で３６０００ｒｐｍで１８時間遠心分離した。遠心分離管を氷の上に置き、遠心分離管の上清を注意深く除去してＲＮＡペレットを乱さないように残した。ペレットを４００μｌのガラスで蒸留した水に再懸濁し、２．６ｍｌのグアニジン溶液（７．５Ｍグアニジン−塩酸、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５ｍＭジチオスレイトール）を加えた。０．３７容量の１Ｍ酢酸を加え、次に０．７５容量の冷エタノールを加え、試料を−２０℃で１８時間置いてＲＮＡを沈殿させた。ＳＳ３４ロータ中で４℃で１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を集めた。ペレットを１．０ｍｌの蒸留水に溶解し、１３０００ｒｐｍで再度遠心分離し、上清を採取した。ペレットからさらに２回上述のように０．５ｍｌの蒸留水でＲＮＡを再抽出し、上清をプールした。０．１容量の２Ｍ酢酸カリウム溶液を試料に加え、次に冷エタノールを２容量加えて、試料を−２０℃に１８時間置いた。沈殿したＲＮＡを、ＳＳ３４ロータ中で４℃で１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して集めた。ペレットを１ｍｌの蒸留水に溶解し、Ａ２６０／２８０の吸光度から濃度を求めた。ＲＮＡを−７０℃に保存した。
オリゴ−ｄＴセルロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＃２７  ５５４３−０）を用いて、ポリアデニル酸テイル（ポリ−Ａ）を含有するｍＲＮＡを選択した。３ｍｇの全ＲＮＡをボイルし、冷却して、結合緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ドデシル硫酸リチウム）中で１００ｍｇのオリゴ−ｄＴセルロースカラムにかけた。保持されたポリ−Ａ  ＲＮＡを、溶出緩衝液（５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）でカラムから溶出した。このｍＲＮＡを結合緩衝液中で再びオリゴ−ｄＴセルロースカラムにのせ、溶出緩衝液で再度溶出した。試料を２００ｍＭの酢酸ナトリウムで沈殿させ、２体積の冷エタノールを加えて、−２０℃で１８時間置いた。ＲＮＡを５０μｌの蒸留水に再懸濁した。
１０μｇのポリ−Ａ  ＲＮＡを２０ｍＭの水酸化メチル水銀中で２２℃で６分間変性させた。β−メルカプトエタノールを７５ｍＭになるように加え、試料を２２℃で５分間インキュベートした。第１の鎖のｃＤＮＡ合成のための反応混合物は０．２５ｍｌ中に、１μｇのオリゴ−ｄＴプライマー（Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃｌａｓ）または１μｇ合成プライマー、２８単位の胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＃５５１８ＳＡ）、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、１４０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．８ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１００μＣｉの32Ｐ−標識ｄＣＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ＃ＮＥＧ−０１３Ｈ）、および１８０単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ＃ＭＧ  １０１）を含有した。反応物を４２℃で９０分間インキュベートし、次に２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応を停止させた。試料を等体積のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、２Ｍの酢酸アンモニウムと２体積の冷エタノールで−２０℃で３時間沈殿させた。沈殿と遠心分離後、ペレットを１００μｌの蒸留水に溶解した。試料を緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１５ｍｌのＧ−１００セファデックスカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。溶出するＤＮＡ画分の先端をプールし、容量が約１００μｌになるまでＤＮＡを凍結乾燥して濃縮し、次に酢酸アンモウムとエタノールで前記したように沈殿させた。
第１の鎖の全試料を第２の鎖の反応に使用した。第２の鎖の反応は、全量５０μｌ中の５０μｇ／ｍｌ  ｄＮＴＰ、５．４単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＃６４２−７１１）、および１００単位／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＃２０５）を用いた以外は、グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８３））の方法に従った。第２の鎖の合成後、ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し沈殿させた。このＤＮＡを１０μｌの蒸留水に再懸濁し、１μｇのＲＮアーゼＡで２２℃で１０分間処理し、４０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．８５）中１％アガロースゲル（ＳｉｇｍａII型アガロース）で電気泳動した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、予想される範囲のサイズのＤＮＡをゲルから切り出し、８ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．８５）で電気泳動した。電気泳動したＤＮＡを凍結乾燥して約１００μｌにし、前記したように酢酸アンモニウムとエタノールで沈殿させた。ＤＮＡを２０μｌの水に再懸濁した。
クローニングを促進するためにＤＮＡにオリゴ−ｄＣを加えた。反応物は、５０μｌ中にＤＮＡ、１００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、８０μモルｄＣＴＰ、および２５単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ＃１００１）を含有した。３７℃で３０分後、１０ｍＭ  ＥＤＴＡで反応を停止させ、試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、前記したように沈殿させた。
ｄＣテイルのあるＤＮＡ試料を、２００μｌの０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中の、オリゴ−ｄＧテイル（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  ＃５３５５  ＳＡ／ＳＢ）を含有する２００ｎｇのプラスミドベクターｐＢＲ３２２に、６５℃で２分間、次に５７℃で２時間アニーリングさせた。新鮮なコンピタント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ−１細胞を調製し、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ（１９８３））が記載したように、２００μｌの一定分割量の細胞２０個中のアニーリングしたｃＤＮＡ試料の半分を用いて形質転換した。形質転換した細胞を１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有するＬ−ブロス寒天プレートに広げた。Ａｍｐｓｃｒｅｅｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＃５５３７  ＵＡ）を用いて、アンピシリン遺伝子中の挿入体の存在についてコロニーをスクリーニングし、陽性のクローンを取り上げて分折に供した。
組換えヘルペスウイルス作製のためのＤＮＡトランスフェクション。  本方法は、以下の変更を有する、カワイとニシザワ（Ｋａｗａｉ  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ（１９８４））のポリブレン−ＤＭＳＯ法に基づく。組換えＨＶＴウイルスの作製は、ＨＶＴウイルスＤＮＡと、適当なヘルペスウイルスクローン化配列が隣接する目的の外来性ＤＮＡを含有するプラスミド相同性ベクターとの相同的組換えに依存する。トランスフェクションは、６ｃｍのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｐｌａｓｔｉｃ）の５０％コンフルエンスの初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞中で行なった。細胞を前日に、４μｇ／ｍｌのポリブレン（１×ＨＢＳＳ中ストック４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＣＥＦ増殖培地（１×Ｆ１０／１９９、５％ウシ胎児血清、２％グルタミン、１％非必須アミノ酸、および２％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に広げた。ＣＥＦ細胞へのコトランスフェクション（cotransfection）のために、５μｇの完全なＨＶＴ  ＤＮＡを、３０μｇ／ｍｌポリブレン（１×ＨＢＳＳ中ストック４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＣＥＦ培地１ｍｌ中に懸濁した。次にＤＮＡ−ポリブレン懸濁液（１ｍｌ）を６ｃｍプレートのＣＥＦ細胞に加え、ここから培地を吸引し、３９℃で３０分間インキュベートした。接種物を再分散させるために、この間プレートを定期的に揺らせた。この時間の後、４ｍｌのＣＥＦ増殖培地を洗浄プレートに直接加え、３９℃でさらに２．５時間インキュベートした。この時、各プレートから培地を除去し、１×ＨＢＳＳ中の３０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）２ｍｌで室温で４分間細胞にショックを与えた。３０％ＤＭＳＯを注意深く除去し、単層を室温で１×ＨＢＳＳで１回洗浄した。次に５ｍｌのＣＥＦ増殖培地を添加後、細胞を３９℃でインキュベートした。翌日、残存するＤＭＳＯを除去し細胞増殖を刺激するために、培地を交換した。６日以内にウイルスの細胞変性作用が明らかになる。この日から通常１週間以内に、より高力価（８０％〜９０％ＣＰＥ）の作製が可能になる。感染細胞を、２０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯを含有するＣＥＦ増殖培地中に再懸濁してＨＶＴストック試料を調製し、−７０℃に保存した。
サブゲノムＤＮＡ断片からの組換えヘルペスウイルスの作製方法。  クローン化した重複サブゲノム断片のコ・トランスフェクションによるヘルペスウイルスを作製する能力は、仮性狂犬病ウイルス（Ｚｉｊｌら、１９８８）について証明されている。欠失および／または挿入は、コ・トランスフェクションの前に直接サブゲノム断片に行われるなら、この方法によりゲノム変更を含有する高頻度のウイルスが得られ、組換えウイルスの精製に必要なスクリーニングの量を大幅に低下させる。この方法は組換えＨＶＴの構築に使用された。
重複するＨＶＴサブゲノム断片を含有するサブクローンのライブラリーを、以下のように作製した。ＨＶＴ  ＤＮＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＦＣ−１２６（「Ｃａｌｎｅｋ」））から得た。これを剪断し、次にｖａｎ  Ｚｉｊｌら（１９８８）が記載したように、４０〜５０ｋｂの断片を挿入体集団として選択して、グリセロール勾配によりサイズ選択した。プールした画分をＴＥで２倍希釈し、１／１０容量の３Ｍ  ＮａＡａｃと２．５体積のエタノールを加え、ＤＮＡをＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ロータ中で３０Ｋｒｐｍで１時間沈殿させた。３’オーバーハングの除去を促進するために低濃度のＤＮＴＰを用いて、まずＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより剪断した断片を処理し、次にへこんだ３’末端をクレノウポリメラーゼで充填して平滑末端にした。次にこれらの挿入体断片を、ＢａｍＨＩで消化しウシ小腸ホスファターゼで処理し、クレノウポリメラーゼで平滑末端としたｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）コスミドベクターに連結した。次に、連結した混合物をＧｉｇａｐａｃｋ  ＸＬパッケージ抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージングした。連結とパッケージングは、製造業者の薦めるように行なった。
酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、およびＸｈｏＩの公開された制限酵素地図のため、サブクローニングした断片を特異的プローブとして使用して、ゲノムをまたぐサブクローニングのコスミドライブラリーをスクリーニングすることができた。サブクローニングした制限断片からプローブを作製した。次に非放射性システム（Ｇｅｎｉｕｓ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、断片を標識した。コロニーを取り上げて培地に入れ次に一晩増殖させてスクリーニングを促進させた。５個のフイルターとマスタープレートのセットを、マイクロタイターディッシュからスタンプして、再び一晩増殖させた。グリセロールを１５％になるようにウェルに入れ、プレートを−２０℃で凍結して、各コロニーのストック培養物を得た。フィルターは、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｌｉｆｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓであり、製造業者の薦めるように処理しハイブリダイズさせ、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄した。非放射性プローブとハイブリダイズしたコロニーを、Ｇｅｎｉｕｓキットの説明書に従って検出した。
２つまたはそれ以上の特異的プローブへのハイブリダイゼーションに基づき、さらに解析してコロニーを選択した。次にこれらをＢａｍＨＩで消化し、ＨＶＴの公開されている地図（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら、１９８８）と比較した。こうして３つのコスミド（４０７−３２．２Ｃ３、４０７−３２．ＩＧ７、４０７−３２．５Ｇ６）を得た。各クローンの詳細な説明は後述する。これらのコロニーから妥当な収率のＤＮＡを得るには、クロラムフェニコール増幅（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）が必要であることが見いだされた。さらに、１つのコスミドクローン（４０７−３２．５Ｇ６）は不安定であり、満足できるＤＮＡ調製物を得るには、元の凍結ストックから増殖する必要があった。
ｐＷＥ１５ベクターは、挿入体をＮｏｔＩで切断することを可能にする。しかし、ＨＶＴゲノムには４つのＮｏｔＩ部位があり、これらの部位にまたがっている挿入体はＮｏｔＩで切断できない。ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片にはＮｏｔＩ部位の２つがあり、この断片は直接ｐＳＰ６４中でクローン化された。他の２つの部位は、ＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークな短い領域中に存在した。この断片はｐＷＥ１５ベクター中で直接クローン化された。３つの剪断したコスミドと２つのＢａｍＨＩ断片は、ＨＶＴゲノムの末端のすべてのしかし小さな部分をカバーする。これらの領域はゲノムの内部で繰り返されているため、ゲノム情報のすべてが利用できる。
ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位は、「組換えヘルペスウイルスを作製するための相同的組換え法」（例６を参照されたい）を用いて、外来性ＤＮＡ挿入のための有用な部位として確立された。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子は、５つのＳｔｕＩ部位を含有するＢａｍＨＩ＃１断片内に位置する。この部位の使用を外来性ＤＮＡの挿入のために容易化するために、ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位をユニークなＨｉｎｄIII部位に変換した。このために、ＢａｍＨＩ＃１サブクローンをＳｔｕＩ部位で部分的に消化し、次にＨｉｎｄIIIリンカーを用いてこの部位内にカノマイシン耐性（ＮｅｏＲ）を与える１０ｋｂの断片を挿入した。カノマイシン耐性遺伝子により、組換えクローンの陽性の選択が可能になった。このＮｅｏＲ断片はＨｉｎｄIIIで消化して除去し、次に再連結してクローン４３０−８４．２１５を作製した。
ＨＶＴ挿入部分の外または隣接するサブクローンを切断する酵素で制限消化して、再構築実験のためにＤＮＡを調製した。ある場合には、再構築中の１つのコスミドを消化しないで使用した。消化したＤＮＡをフェノールで１回抽出し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを０．５〜１μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。トランスフェクションを仲介するためにウィルス再構築実験をリポフェクチン（ＢＲＬ）を用いて行なった。各サブクローン２〜３μｇを、１％非必須アミノ酸と２％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＭＥＭ培地（アール塩溶液）（ＭＥＭ＋）０．５ｍｌに加えた。対照は、ＤＮＡを含ないＭＥＭ＋であり、数μｇのＨＶＴ  ＤＮＡを含むかまたは５つのサブクローンのうち４つを含むものである。別途、３０μｌのリポフェクチンを別の０．５ｍｌのＭＥＭ＋に加えた。次に、これらの２つの混合物を一緒にし、ＲＴで１５分間インキュベートした。
ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞をトランスフェクションのために、以下のように調製した。ＣＥＦ（Ｓｐａｆａｓ）を６ウェルディッシュ中で、１％非必須アミノ酸、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および５％ウシ胎児血清を含有するＦ１０／Ｍ１９９（１：１）培地（ＣＥＦ＋）中で３９℃で増殖させた。細胞を９０〜９５％のコンフルエンスでトランスフェクトした。トランスフェクションのために、ウェルを吸引し、ＭＥＭ＋で３回洗浄し、次に前記の１ｍｌリポフェクチン／ＤＮＡ混合物とともに３９℃で４時間インキュベートした。次にさらに１ｍｌのＣＥＦ＋をウェルに加え、細胞を一晩インキュベートし、ＣＥＦ＋を与えた。次にプラークの出現について毎日プレートを試験した。
対照ＨＶＴ  ＤＮＡを有するリポフェクチンでは、５日以内にプラークが出現した。５クローンのうち４つのみを使用すると、プラークは得られなかった。ＨＶＴの５つの重複するゲノムの断片を使用してウイルスを再構築すると、最初のリポフェクション後５〜１９日のどこかでプラークが出現した。遅く出現するプラークの場合は、感染した単層に最初プラークは見えず、単層を継代して大きな表面に再度広げるとプラークが現れた。継代後、一般に３日以内にプラークが現れた。組換えウイルスを約３回プラーク精製し、次に、外来性ＤＮＡの挿入について解析した。
組換えヘルペスウイルスのＢｌｕｏｇａｌスクリーニング。  外来性ＤＮＡが酵素β−ガラクトシダーゼをコードする場合、その遺伝子を含有するプラークはより容易に目で見えた。プラーク測定の間、化学物質ＢｌｕｏｇａｌＴＭ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）は２００〜３００μｇ／ｍｌのレベルでアガロース重層中に取り込まれ、活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークは青くなった。赤色プラークのための化学物質ＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド  ガラクトピラノシド、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は、プラーク測定の間、アガロース重層中に取り込まれ、活性β−ガラクトシダーゼを発現するプラークは赤くなった。次に青色プラーク又は赤色プラークを取り上げ、さらに青色プラーク又は赤色プラークを単離して精製した。他の外来性ＤＮＡを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を置換するように相同的組換えにより挿入した。この場合、組換えウイルスの精製のために青くないプラークを取り上げた。
黒色プラーク測定法を用いる組換えＨＶＴでの外来遺伝子発現のスクリーニング。  組換えＨＶＴウイルスにより発現される外来性抗原の発現を解析するために、ＣＥＦ細胞の単層を組換えＨＶＴで感染させて、栄養アガロース培地を重層し、３９℃で４〜５日間インキュベートした。プラーク出現後、アガロース重層をディッシュから除去し、単層をＰＢＳで１回洗浄し、１００％メタノールで室温で１０分間固定し、細胞を空気乾燥した。ＰＢＳでプレートを再び水和した後、一次抗体をＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、室温で２時間から一晩細胞単層とともにインキュベートした。次に室温でＰＢＳで３回洗浄して、結合しなかった抗体を細胞から除去した。アルカリ性ホスファターゼ結合２次抗体をＰＢＳで希釈し、細胞単層とともに室温で２時間インキュベートした。次に室温で細胞をＰＢＳで３回洗浄して、結合しなかった２次抗体を除去した。発色緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ９．５）／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で単層を洗浄し、次に新たに調製した基質溶液（発色緩衝液中０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム＋０．１５ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）で室温で１０分〜一晩インキュベートした。最後に、基質溶液をＴＥ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で置換して反応を停止させた。正しい抗原を発現するプラークは黒く染色される。
組換えＨＶＴストックの純度を評価するためのプラークハイブリダイゼーション法。  組換えＨＶＴウイルス中の特定の抗原の存在を検出するための適当な免疫学的試薬が存在しない場合、ストックの純度を評価するためにプラークハイブリダイゼーション法が使用される。まずＣＥＦ細胞単層を種々の希釈率のウイルスストックでインフェクションさせて、約５０まで〜１００プラーク／１０ｃｍディッシュを得、栄養アガロース培地を重層し、３９℃で４〜５日間インキュベートする。いったんプラークが出現したら、各プラークの位置をディッシュの底にマークする。次にアガロース重層を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、残存するＣＥＦ単層をＰＢＳであらかじめ浸潤させたＮＣ膜またはＢｉｏＲａｄナイロン膜に移動させる（プレートに対して膜の位置を記録しておく）。次に膜を１．５ｍｌの１．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５Ｍ  ＮａＯＨに５分間入れて、ＮＣ膜上に含有される細胞を溶解する。膜を１．５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中に５分間入れて中和する。次に溶解した細胞からのＤＮＡを８０℃で１時間ベークしてＮＣ膜に結合させる。この時間の後、膜を、６×ＳＳＣ、３％スキムミルク、０．５％ＳＤＳ、（±）サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）を含有する溶液中で６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションする。次に、放射標識プローブＤＮＡ（アルファ32Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、膜を６５℃で一晩（約１２時間まで）インキュベートした。ハイブリダイゼーション後ＮＣ膜を６５℃で２×ＳＳＣで２回洗浄（各３０分）し、次に６５℃で０．５×ＳＳＣでさらに２回洗浄する。次にＮＣ膜を乾燥し、−７０℃で１２時間Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ  ＸＯＭＴ，ＡＲ）に露光させる。陽性のシグナルをディッシュ上のプラークの位置と合わせて、ストックの純度を、全体に対する陽性プラークのパーセントとして記録する。
ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子へのベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入のための相同ベクターの作製。  ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を、ＨＶＴ  ＥｃｏＲＩ＃７断片中のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入した。マーカー遺伝子はＵＳ２遺伝子と同じ配向である。これは標準的組換えＤＮＡ法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて、以下の供給源からの制限断片を合成ＤＮＡ配列と結合させて構築される。断片１は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら、１９８４）の約４１３塩基対のＳａｌＩからＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら、１９８５）の約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕII制限断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら、１９８４）の約７５４塩基対のＮｄｅＩからＳａｌＩ制限サブ断片である。
コンカナバリンＡで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ：  ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃの３週令のヒョコからニワトリ脾臓を切開し、洗浄し、そしてシリンジ／針で破壊し細胞を放出させた。間質と破片を沈降させた後、細胞をペレットにし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを低張溶解緩衝液で処理して赤血球を溶解し、脾臓細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。脾臓細胞を、５％ＦＢＳおよび５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡを含有するＲＰＭＩ中に５×１０6細胞／ｍｌで再懸濁し、３９℃で４８時間インキュベートした。グアニジンイソシアネート溶解試薬とＰｒｏｍｅｇａ  ＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マジソン、ウィスコンシン州）の試薬を用いて、細胞から全ＲＮＡを単離した。適当なアンチセンスプライマーとＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マジソン、ウィスコンシン州）を含有する各第１の鎖反応物に、４μｇの全ＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素反応後の同じ試験管中で、適当なセンスプライマーとＶｅｔｎｔ▲Ｒ▼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ベセスダ、メリーランド州）を用いて行なった。
組換えＦＰＶ又はＳＰＶを創製するための相同的組換え操作。  この方法は、ＦＰＶ又はＳＰＶ  ＤＮＡと、ＦＰＶ又はＳＰＶ  ＤＮＡ及びトランスフェクトされたプラスミド相同性ベクターの両者を含有する組織培養細胞において発生するプラスミド相同性ベクターＤＮＡとの間の相同的組換えに基づく。相同的組換えが発生するためには、単層のＣＥＦ細胞が、Ｓ−ＥＰＶ  ００１（弱い鶏痘ワクチン株（Ａｇｒｉ−Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇａｉｎｓｖｉｌｌｅ、ジョージア州からＢｉｏ−ＰｏｘTMとして入手可能））又はＳＰＶ−００１（カスザ（Kasza）株）により、細胞内に複製ＦＰＶを導入するために（すなわち、ＤＮＡ合成）又はＳＰＶを導入するために、０．０１ＰＦＵ／細胞の多重感染度でインフェクトされる。次いで、プラスミド相同性ベクターＤＮＡは、「インフェクション−トランスフェクション操作」に従い、これらの細胞内にトランスフェクトされる。
インフェクション−トランスフェクション操作。  ６ｃｍプレート内のＣＥＦ細胞（約８０％のコンフルエンス）をＳ−ＦＰＶ−００１により、ＣＥＦネガティブ培地中の０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度でインフェクションし、加湿５％ＣＯ2インキュベーター中で５時間インキュベートした。６ｃｍプレート中のＥＳＫ−４細胞ＣＥＦ細胞（約８０％のコンフルエンス）をＳ−ＳＰＶ−００１により、ＣＥＦネガティブ培地中の０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度でインフェクションし、加湿５％ＣＯ2インキュベーター中で５時間インキュベートした。用いたトランスフェクション操作は、本質的には、リポフェクチンＴＭ  試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＲＬ））のために推薦されるものである。要約すると、各々の６ｃｍプレートにてついて、１５マイクログラムのプラスミドＤＮＡをＨ2Ｏにより１００マイクロリットルにまで希釈した。別途、５０マイクログラムのリポフェクチンＴＭ試薬をＨ2Ｏにより１００マイクロリットルに希釈した。１００マイクロリットルの希釈したリポフェクチンＴＭ試薬を、ポリスチレン５ｍｌスナップキャップ試験管中に含有される希釈したプラスミドＤＮＡに滴下し、穏やかに混合した。次いで、混合物を室温で１５〜２０分間インキュベートした。この時間中、ウイルス摂取物を６ｃｍプレートから除去し、細胞単層をＣＥＦネガティブ培地により１回洗浄した。３ミリリットルのＣＥＦネガティブ培地をプラスミドＤＮＡ／リポフェクチン混合物に添加し、内容物を細胞単層上にピペットでかけた。加湿５％ＣＯ2インキュベーターにおいて３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした後、培地を除去し、５ｍｌのＣＥＦ完全培地で置換した。細胞を、ウイルスによる細胞変性作用が８０  １００％になるまで、３〜７日間、加湿５％ＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。ウイルスを上述したように回収し、ウイルスストックの調製物に供した。このストックをトランスフェクションストックといい、引き続き、「組換えＦＰＶを精製するためのプラークハイブリダイゼーション操作」により組換えウイルスをスクリーニングした。
組換え鳥類キメラＨＶＴ／ＭＤＶヘルペスウイルスを生成させるための相同組換えタンパク質：  コンフルエンス前（subconfluent）１°または２°ニワトリ胚繊維芽細胞単層（７０〜８０％コンフルエンス）をトランスフェクトする。使用の日に、培地（Ｆ１０培地＋Ｍ１９９培地（１：１ミックス）、１％胎児ウシ血清；２％グメタミン；１％  ＮＥＡＡ；１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を維持するために培地を交換する。（１）ＤＮＡ：２０μｌ親ウイルスＤＮＡ（ゲル上で目に見える量）；２−３μｇ挿入ベクター；ｄＨ2Ｏないし３００μｌを混合する。（２）リン酸カルシウムｐｐｔ．：３００μｌ  ＤＮＡ；３７μｌ  ２．５Ｍ  ＣａＣｌ2；３４０μｌ  ２×ＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水。（３）混合物を室温で１分間混合し、次いで細胞に（培地に）滴下し、反応混合物を２×３５ｍｍディッシュ（６−ウェルディッシュの２ウェル）上に均等に分割する。（４）３９℃で３時間インキュベートする。（５）培地／反応混合物をＰＢＳ中の１５％グリセロール１ｍｌで置き換えることによって細胞に１分間グリセロールショックを付す。（６）細胞に維持培地を供給し、３９℃で一晩インキュベートする。（７）次の日、新鮮な培地で置き換え、ＣＰＥが観察されるまでインキュベーションを継続し、培地を各２〜３日交換する。感染した培地を、ＣＰＥに到達するまでより大きなディッシュに１回以上継代する。
サブゲノミッククローン１７２−０７．ＢＡ２。  プラスミド１７２−０７．ＢＡ２を組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それはゲノミックＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ２５，０００塩基対領域を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用して構築することができる。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９９９塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのほぼ２５，０００塩基対ＢａｍＨＩ＃２断片である（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら、１９８８）。
相同性ベクター１７２−２９．３１。  プラスミド１７２−２９．３１は外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入する目的で構築した。それは、外来性ＤＮＡを挿入することができるユニークなＸｈｏＩ制限酵素部位を含有する。ＸｈｏＩ部位に外来性ＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを生成させるためのＤＮＡコ・トランスフェクション」または「重複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って使用し、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用して構築することができる。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９９９塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのほぼ３３００塩基対ＢａｍＨＩ＃１６断片である（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら、１９８８）。ＢａｍＨＩ＃１６断片の完全な配列は配列番号１に与えられる。該断片は、ＵＬ４３  ＯＲＦがｐＳＰ６４  β−ラクタマーゼ遺伝子に対して反対の転写向きであるようにクローン化する。
相同性ベクター１７２−６３．１。  プラスミド１７２−６３．１を外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入する目的で構築した。それは外来性ＤＮＡを挿入することができるユニークなＸｈｏＩ制限酵素部位を含有する。ＸｈｏＩ部位に外来性ＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを生成させるためのＤＮＡコトランスフェクション」または「重複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って使用し、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用して構築することができる。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９９９塩基対ＥｃｏＲＩないしＥｃｏＲＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのほぼ５５００塩基対ＥｃｏＲＩ＃９断片である。ＥｃｏＲＩ断片は、ユニークなＸｈｏＩ部位がｐＳＰ６４ベクター中のユニークなＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いようにクローン化する。
サブゲノミッククローン４０７−３２．１Ｃ１。  コスミド４０７−３２．１Ｃ１は、組換えＨＶＴならびにマレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ３８，８５０塩基対領域を含有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、断片１３のほぼ１２５０塩基対を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このコスミドは、恐らくは、「重複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において前記したごとくに構築することができる。それはプローブＰ１およびＰ４でスクリーニングすることによって、剪断をかけたＤＮＡライブラリーから単離した（図２に記載）。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続目的の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、受託番号７５４２８の下で、米国２０８５２、メリーランド州、ロックビル、パークレーン・ドライブ１２３０１番地のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９３年３月３日に寄託されている。
サブゲノミッククローン４０７−３２．２Ｃ３。  コスミド４０７−３２．２Ｃ３は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ４０，１７０塩基対領域を含有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨＩ断片１０、１４、１９、１７、５、および断片２のほぼ２，１００塩基対を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このコスミドは、「重複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において前記したごとくに構築することができる。それはプローブＰ１およびＰ２でスクリーニングすることによって、剪断をかけたＤＮＡライブラリーから単離した（図２に記載）。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続目的の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、受託番号７５４３０の下で、米国２０８５２、メリーランド州、ロックビル、パークレーン・ドライブ１２３０１番地のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。
サブゲノミッククローン４０７−３２．５Ｇ６。  コスミド４０７−３２．５Ｇ６は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ４０，０００塩基対領域を含有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨＩ断片９、３、２０、１２、１６、１３、および断片２のほぼ１，６５０塩基対を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このコスミドは、「重複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において前記したごとくに構築することができる。それはプローブＰ２およびＰ３でスクリーニングすることによって、剪断をかけたＤＮＡライブラリーから単離した（図２に記載）。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続目的の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、受託番号７５４２７の下で、米国２０８５２、メリーランド州、ロックビル、パークレーン・ドライブ１２３０１番地のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９３年３月３日に寄託されている。
相同性ベクター４３５−４７．１。  プラスミド４３５−４７．１は外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入する目的で構築した。それは、外来性ＤＮＡを挿入することができるユニークなＨｎｉｄＩＩＩ制限酵素部位を含有する。ＨｉｎｄＩＩＩＩ部位に外来性ＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドを、ＤＮＡ  「組換えヘルペスウイルスを生成させるためのＤＮＡコトランスフェクション」または「重複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って使用し、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用して構築することができる。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９９９塩基対ＥｃｏＲＩないしＥｃｏＲＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのほぼ７３００塩基対ＥｃｏＲＩ＃７断片である。ｐＳＰ６４ベクターのＨｉｎｄＩＩＩＩ部位は、ＨｉｎｄＩＩＩＩでサブクローンを消化し、続いて反応および再連結におけるクレノウ充填によって除去したことに注意されたし。次いで、合成ＨｉｎｄＩＩＩＩリンカー（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）をＥｃｏＲＩ  ＃７断片のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入した。
サブゲノミッククローン４３７−２６．２６。  コスミド４３７−２６．２６は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ１５，３００塩基対領域を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を利用して構築することができる。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９７０塩基対ＨｉｎｄＩＩＩＩないしＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片のほぼ１５，３００塩基対ＢａｍＨＩないしＳｔｕＩサブ断片である（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら，１９８８）。ＢａｍＨＩ＃２断片は５つのＳｔｕＩ部位を含有し、このサブクローニングで利用した部位は、「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、前記したごとくにＨｉｎｄＩＩＩＩ部位に変換した。
サブゲノミッククローン４１５−０９．ＢＡ１。  コスミド４１５−０９．ＢＡ１は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ２９，５００塩基対領域を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このコスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはｐＨＣ７９に由来するｐＳＹ１００５のほぼ４４３０塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ制限断片である（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）。最初の断片はＨＶＴゲノムのほぼ２９，５００塩基対ＢａｍＨＩ＃１断片である（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら，１９８８）。
サブゲノミッククローン６７２−０１．Ａ４０。  コスミド６７２−０１．Ａ４０は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクローンとして単離した（図２および３参照）。コスミド６７２−０１．Ａ４０はほぼ１４，０００塩基対ＮｏｔＩないしＡｓｃＩサブ断片およびコスミド４０７−３２．１Ｃ１のほぼ１３００塩基対ＡｓｃＩないしＢａｍＨＩサブ断片を含有する。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはＳｍａｌ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカーを含有するｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）から構築されたほぼ２７００塩基対ＮｔｏＩないしＢａｍＨＩ断片である。断片１はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ１５，３００塩基対である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１１および７、および断片１３のほぼ１２５０塩基対を含む。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。
サブゲノミッククローン６５４−４５．１。  プラスミド６５４−４５．１は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンとして単離した（図２および５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーが挿入されたｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築されたほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。断片１はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、および断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４；配列番号１２）は合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＰａｃＩ部位に変換されている。該ＰａｃＩ部位はＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ａ）参照。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。
サブゲノミッククローン６８６−６３．Ａ１。  プラスミド６８６−６３．Ａ１は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンとして単離した（図２および５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーが挿入されたｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築されたほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。断片１はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、および断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４；配列番号１２）は合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＮｏｔＩ部位に変換されている。該ＮｏｔＩ部位はＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。
サブゲノミッククローン６７２−０７．Ｃ４０。  コスミド６７２−０７．Ｃ４０は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクローンとして単離した（図２および５参照）。コスミド６７２−０７．Ｃ４０は、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のほぼ１１００塩基対ＢａｍＨＩないしＡｓｃＩサブ断片およびほぼ１３，０００塩基対ＡｓｃＩないしＮｏｔＩサブ断片を含有する。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはＳｍａＩ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカーを含有するｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２７００塩基対ＮｏｔＩないしＢａｍＨＩ断片である。断片１はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ１４，１００塩基対領域である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片６および１８、およびＢａｍＨＩ断片＃１内のほぼ２６００塩基対ＢａｍＨＩないしＮｏｔＩ断片を含む。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。
サブゲノミッククローン７２０−５１．３。  コスミド７２０−５１．３は、組換えＨＶＴを生成させ、およびマレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対領域を含有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、断片１３のほぼ１２５０塩基対、およびＢａｍＨＩ断片１のほぼ２，６００塩基対を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。コスミド７２０−５１．３は、以下の手法でコスミド４０７−３２．１Ｃ１から構築した。コスミド４０７−３２．１Ｃ１を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化して、ほぼ３４，７００塩基対ＨＶＴゲノム断片、ほぼ４，１００塩基対ＨＶＴゲノム断片、およびほぼ８，０００塩基対ｐＷＥ１５コスミドベクターを得た。該３４，７００塩基対ＨＶＴゲノム断片および８，０００塩基対ｐＷＥ１５コスミドベクターを連結して、コスミド７２０−５１．３を形成させた。コスミド７２０−５１．３は、コスミド４０７−３２．１Ｃ１に存在するＨＶＴ  ＢａｍＨＩゲノム断片からのほぼ４，１００塩基対を欠いている。コスミド７２０−５１．３は組換えＨＶＴへのおよびマレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンへの外来性ＤＮＡの挿入に有用なＨＶＴゲノム断片ＥｃｏＲＩ＃９内にＸｈｏＩ部位を含有する。
サブゲノミッククローン７２１−３８．１Ｊ。  コスミド７２１−３８．１Ｊは、ＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子をＨＶＴのユニークな短領域に挿入し、および組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。コスミド７２１−３８．１ＪはＨＶＴのユニークな短領域のＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉｎｄＩＩＩＩ部位に変換されたＨＶＴ  ＵＳ１遺伝子におけるＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤおよびｇＤ遺伝子を含有する。ＭＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴ  ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域はＳ−ＨＶＴ−０６２に由来した。コスミド７２１−３８．１Ｊは、Ｓ−ＨＶＴ−０６２  ＤＮＡのＢａｍＨＩでの部分的制限消化およびほぼ３９，３００塩基対断片の単離によって構築した。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的なＤＮＡ技術を利用して（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはコスミドベクターｐＷＥ１５からのほぼ８２００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。最初の断片はＨＶＴゲノムの反復領域からのほぼ９００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。第２の断片はＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１のほぼ１５，５００塩基対ＢａｍＨＩないしＳｔｕＩサブ断片である。第３の断片はＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子を含有するほぼ８４００塩基対カセットである。第４の断片はＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１のほぼ１４，５００塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。
サブゲノミッククローン７２２−６０．Ｅ２。  コスミド７２２−６０．Ｅ２は、ＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子およびＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子をＨＶＴのユニークな短領域に挿入する目的で、および組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。コスミド７２２−６０．Ｅ２はＨＶＴのユニークな短領域のＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉｎｄＩＩＩＩ部位に変換されたＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子におけるＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤおよびｇB遺伝子ならびにＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子を含有する。全ての５つの遺伝子はＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子と同一の転写向きに挿入された。ＭＤＶおよびＮＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴ  ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域はＳ−ＨＶＴ−１０６に由来した。コスミド７２２−６０．Ｅ２は、Ｓ−ＨＶＴ−１０６のＢａｍＨＩでの部分的制限消化およびほぼ４６，３００塩基対断片の単離によって構築した。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的なＤＮＡ技術を利用して（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはｐＨＣ７９（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）およびｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）に由来するコスミドベクターｐＳＹ１６２６からのほぼ６１００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。最初の断片はＨＶＴゲノムの反復領域からのほぼ９００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。第２の断片はＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１のほぼ１５，５００塩基対ＢａｍＨＩないしＳｔｕＩサブ断片である。第３の断片はＭＤＶ  ｇＡ遺伝子（配列番号：６）、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）、ＮＤＶ  ＨＮ遺伝子（配列番号：８）、ＰＲＶ  ｇＸポリアデニル化部位（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）、ＨＣＭＶ前初期プロモーター（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子（配列番号：１０）、ＨＳＶ  ＴＫポリアデニル化部位（ＭｃＧｅｏｃｈら，１９８５）、ＭＤＶ  ｇＤ遺伝子、ほぼ４５０塩基対ＩＬＴＶ  ＵＳ３ポリアデニル化部位、およびＭＤＶ  ｇＢ遺伝子を含有するほぼ１５，４００塩基対カセットである。第４の断片はＨＳＶのＢａｍＨＩ＃１のほぼ１４，５００塩基対ＳｔｕＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。
サブゲノミッククローン７３９−２７．１６。  コスミド７３９−２７．１６はユニークな長領域のＨＶＴ遺伝子およびユニークな短領域のＭＤＶタイプ１遺伝子を含有するキメラＨＳＶ／ＭＤＶウイルスを構築する目的で構築した。コスミド７３９−２７．１６はＭＤＶタイプ１の完全なユニークな短領域を含有する。この領域は、全ＳｍａＩ断片および２つのＳｍａＩ  Ｋ断片を含有する。コスミド７３９−２７．１６はＭＤＶ  ＤＮＡのＳｍａＩでの部分的制限消化およびほぼ２９，０００ないし３３，０００塩基対断片の単離によって構築した。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的なＤＮＡ技術を利用して（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはコスミドベクターｐＷＥ１５からの（レノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした）ほぼ８２００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。最初の断片はＭＤＶゲノムの短い内部反復領域からのほぼ４０５０塩基対ＳｍａＩ  Ｋ断片である。第２の断片はＭＤＶのほぼ２１，０００塩基対断片ＳｍａＩ  Ｂである。第３の断片はＭＤＶゲノムの短い末端反復領域からのほぼ３，６５０塩基対ＳｍａＩ  Ｋ断片である（Ｆｕｋｕｃｈｉら，１９８４，１９８５）。
サブゲノミッククローン７５１−８７．Ａ８。  プラスミド７５１−８７．Ａ８は組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。プラスミド７５１−８７．Ａ８はプラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球増殖因子（ｃＧＭＦ）遺伝子を含有する。該ｃＧＭＦ遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロモーターおよびＨＳＶ−１  ＴＫポリアデニル化シグナルを使用する。該コスミドは標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら．１９８９）を利用して構築した。以下の断片をＨＶＴサブゲノムクローン６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入した。最初の断片はＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ  Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第２の断片は、「コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ」の逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）によって誘導されたｃＭＧＦ遺伝子（５８）につきコードするほぼ６４０塩基対断片である。逆転写およびＰＣＲで使用したアンチセンスプライマーは５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号：１９）であった。ＰＣＲで使用したセンスプライマーは５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：２０）であった。ｃＭＧＦ断片を、ＰＣＲプライマーによって生じたＢａｍＨＩ部位を用い、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの次にサブクローンした。該ＤＮＡ断片は、アミノ末端の２３個のアミノ酸リーダー配列および成熟ｃＭＧＦタンパク質の１７８個のアミノ酸を含むｃＭＧＦタンパク質（５８）のアミノ酸１ないしアミノ酸２０１のコーディング配列を含有する。第３の断片はＨＳＶ−１  ＢａｍＨＩ制限断片Ｑのほぼ７８４塩基対ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ断片である（ＭｃＧｅｏｃｈら，１９８５）。
サブゲノミッククローン７６１−０７．Ａ１。  プラスミド７６１−０７．Ａ１は組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。プラスミド７６１−０７．Ａ１は、プセスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたニワトリ・インターフェロン遺伝子を含有する。該ニワトリ・インターフェロン遺伝子は、ＨＣＭＶ前初期プロモーターおよびＨＳＶ−１  ＴＫポリアデニル化シグナルを使用する。該コスミドは標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を利用して構築した。以下の断片をＨＶＴサブ断片クローン６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入した。最初の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ  Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ断片である。第２の断片は、「コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ」の逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）によって誘導されたニワトリ・インターフェロン遺伝子（５８）につきコードするほぼ５７７塩基対断片である。逆転写およびＰＣＲで使用したアンチセンスプライマーは５’−ＴＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２１）であった。ＰＣＲで使用したセンス・プライマーは５’−ＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡ−３’（配列番号：２２）であった。ニワトリ・インターフェロン遺伝子断片は、ＰＣＲプライマーによって生じたＢｇＩＩＩ部位を用いてＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの次にサブクローンした。該ＤＮＡ断片は、アミノ末端の３１個アミノ酸シグナル配列およびニワトリ・インターフェロンをコードする成熟タンパク質の１６２個アミノ酸を含むニワトリ・インターフェロンタンパク質（５９）のコーディング配列を含有する。第３の断片は、ＨＳＶ−１  ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅｏｃｈ，１９８５）のほぼ７８４塩基対ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ断片である。
サブゲノミッククローン３０１−０７．Ｙ＃Ｄ１：  外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＣワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下で発現させる。該ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２および５参照）。該コスミドは以下の源から制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。該ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜２３４４：配列番号１２）をＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で用いた。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片１０（Ｌｏｍｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｚｉら，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩＩ制限サブ断片である。プラスミド３０１−０７．Ｙ＃Ｄ１は組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンの構築のための「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」に従ってＳ−ＨＶＹ−１４５と組み合わせて使用した。
サブゲノミッククローンＢ５２−５２．ＩＩ４。  プラスミドＢ５２−５２．ＩＩ４は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンを生成させる目的で構築した。感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）およびタンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子はＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩプロモーターの制御下で発現させる。該ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１ＣｉのＡｓｃＩサブクローンである（図２および５参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片を連結させることによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域はＢａｍＨＩ断片１０および２１、および断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。該ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜２３４４：配列番号１２）をＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で用いた。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：該断片はＩＬＴＶ  Ａｓｐ７１８１ゲノム断片＃８（１０．６ｋｂ）のほぼ３５５６塩基対ＳａｌＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限サブ断片である。プラスミド８５２−５２．ＩＩ４はは組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノム断片からの組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノムクローンと組み合わせた使用した。
サブゲノミッククローンＢ５４−３３．６。  プラスミド８５４−３３．８は外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマグルチニン（ＨＮ）遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下で発現させる。ＨＶＤ融合（Ｆ）遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロモーターの制御下で発現させる。それらの各プロモーターの制御下のＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子は隣接ＨＴＶゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子から反対方向に転写される。該ＨＶＴ  ＤＮＡは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクローンであるコスミド７２０−５１．３に由来する（図２、５参照）。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対である。この領域はＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、および断片１３のほぼ１２５０塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む。該ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜２３４４：配列番号１２）をＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で用いた。（図３Ｂ参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはｐＮＷ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ断片である。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ断片＃１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は全長ＮＤＶ  ＨＮ  ｃＤＮＡクローンのほぼ１８１１塩基対ＡｖａＩＩないしＮａｅＩ制限断片である（Ｂ１株）。断片３はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ＃７（Ｂ．Ｌｏｍｎｉｃｚｉら）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩサブ断片である。断片４は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ  Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ断片である。断片５は全長ＮＤＶ  Ｆ  ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株：文献：ＷＯ９６／０５２９１）のほぼ１８１２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｓｔＩ制限断片である。断片６はＨＳＶ−１  ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅｏｎら，１９８５）のほぼ７８４塩基対ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ断片である。
相同性ベクター８６４−７４．１８：  プラスミド８６４−７４．１８は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下で発現させる。該ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｃＩサブクローンである。（図２および５参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶ  Ａｓｐ７１８１ゲノム断片＃８（１０．６ｋｂ）のほぼ３５５６塩基対ＳａｌＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限サブ断片である。断片２はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ断片である。プラスミド８６４−７４．１８を組換えキメラＨＴＶ／ＭＤＶワクチンの構築のために「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」に従ってＳ−ＨＶＹ−１４５と組み合わせて使用した。
サブゲノミッククローン８６７−９６．Ｂ９。  プラスミド８６７−９６．Ｂ９は外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は新規ニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下で発現させる。ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２および５参照）。このコスミドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ：Ｄ．Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド州：配列番号２３）からの３８６ｂｐ  ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターである。断片２はプラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ断片である。プラスミド８６７−９６．Ｂ９は組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。
サブゲノミッククローン  ８９０−７７．１０。  プラスミド８９０−７７．１０は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下で発現させる。ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロモーターの制御下で発現させる。ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２、５参照）。それらの各プロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子は、隣接ＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向で転写される。該コスミドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ断片＃１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、ｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら）のほぼ３００６塩基対ＰｖｕＩＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ＃７（Ｂ．Ｌｏｍｉｎｉｃｚｉら）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩサブ断片である。断片４は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ  Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ断片である。断片５は、全長ＮＤＶ  Ｆ  ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株；文献：ＷＯ９６／０５２９１）のほぼ１８１２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｓｔＩ制限断片である。断片６はＨＳＶ−１  ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅｏｃｈら，１９８５）のほぼ７８４塩基対ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ断片である。
サブゲノミッククローン９００−８７．Ｈ８。  プラスミド９００−８７．Ｈ８は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制御下で発現させる。ＣＡＶプロモーターの制御下のＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向で転写される。該ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２、５参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＣＡＶ株ＣＬ−１からの３８６ｂｐ  ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片（ＮＶＳＬ；配列番号  ）としてＰＣＲによって合成されたＣＡＶプロモーターである。ＢａｍＨＩ部位はこの構築においてＥｃｏＲＩ部位に変更した。断片２はプラスミド７７０−５４．１に由来するＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶ  Ｂｕｒｓｖａｃ  Ｍ大セグメントＲＮＡをまず重複する断片におけるｃＤＮＡとしてクローン化した。これらのクローンをユニークな制限部位で連結させてプラスミド２．４０／８４＃３を生成させた。プラスミド７７９−５４．１は、鋳型としてのプラスミド２．４０／８４＃３を用い、２パーツにて、ＰＣＲによって生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’および５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ−３’であった。２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位で連結した。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ  ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ  ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセン��およびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号  ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。
サブゲノミッククローン９２８−４７．１。  コスミド９２８−４７．１は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。該ベクターはｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ断片である。ウイルスＤＮＡ挿入物は、２つのセグメントよりなる。断片１は、組換えキメラウイルスＨＶＴ−１４５からのＨＶＴ長反復領域およびＭＤＶ短領域の間の連結領域を含有するほぼ８．６ｋｂ  ＡｓｃＩないしＳｃａＩ断片である。断片２は、７３９．２７．１６に由来する２８．８ｋｂのＳｃａＩないしＮｏｔＩ断片であり、そのクローンからのＭＤＶ短領域の残りを含有する。
サブゲノミッククローン９２８−５８．Ｊ２。  プラスミド９２８−５８．Ｊ２は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される。ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２、５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの２７９ｂｐ  ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成されたＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号  ）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３’（配列番号  ）であった。（図８参照）。断片２は、ｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら）のほぼ３００６塩基対ＰｖｕＩＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ  ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ  ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号  ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号ＸＸ）であった。
サブゲノミッククローン９２８−５８．Ｋ７。  プラスミド９２８−５８．Ｋ７は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される。ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２、５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの５３０ｂｐ  ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成されたＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターである。逆転写およびＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣＡＧＡＧＴＡＡＣ−３’（配列番号  ）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。（図７参照）。断片２は、ｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら）のほぼ３００６塩基対ＰｖｕＩＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ  ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ  ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号  ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。
サブゲノミッククローン９４９−０１．Ｉ２。  プラスミド９４９−０１．Ｉ２は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下のＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される。ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２、５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの２７９ｂｐ  ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成されたＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号  ）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３’（配列番号  ）であった。（図８参照）。断片２は、プラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶブルザＭ大セグメントＲＮＡをまず２つの重複断片にてｃＤＮＡとしてクローン化した。これらのクローンをユニークな制限部位において連結してプラスミド２．４０／８４＃３を生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’および５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ−３’であった。２つの半体をユニークなＳａｌＩ部位にて連結した。断片３はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ  ＳａｌＩ断片とし��ＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ  ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号  ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。
サブゲノミッククローン９４９−１９．２。  プラスミド９４９−１９．２は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接ＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向で転写される。該ＨＶＴ  ＤＮＡは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクローンであるコスミド７２０−５１．３に由来する。（図２、５参照）。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、および断片１３のほぼ１２５０塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ部位である。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの２７９ｂｐ  ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成されたＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用されるセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号  ）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３（配列番号  ）であった。（図８参照）。次いで、ＢａｍＨＩ部位をリンカーを用いてＥｃｃＲＶ部位に変更させた。断片２はプラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶ  Ｂｕｒｓｖａｃ  Ｍ大セグメントＲＮＡをまず重複する断片におけるｃＤＮＡとしてクローン化した。これらのクローンをユニークな制限部位で連結させてプラスミド２．４０／８４＃３を生成させた。プラスミド７７９−５４．１は、鋳型としてのプラスミド２．４０／８４＃３を用い、２パーツにて、ＰＣＲによって生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’および５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ−３’であった。２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位で連結した。断片３は、ＩＬＴＶ���ＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ  ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ  ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号  ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。
サブゲノミッククローン９４９−２４．Ｄ１。  プラスミド９４９−２４．Ｄ１は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接ＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向で転写される。該ＨＶＴ  ＤＮＡは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクローンであるコスミド７２０−５１．３に由来する。（図２、５参照）。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、および断片１３のほぼ１２５０塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ部位である。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの５３０ｂｐ  ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成されたＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターである。逆転写およびＰＣＲで使用されるセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣＡＧＡＧＴＡＡＣ−３’（配列番号  ）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。（図７参照）。断片２はプラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶ  Ｂｕｒｓｖａｃ  Ｍ大セグメントＲＮＡをまず２つの重複する断片におけるｃＤＮＡとしてクローン化した。これらのクローンをユニークな制限部位で連結させてプラスミド２．４０／８４＃３を生成させた。プラスミド７７９−５４．１は、鋳型としてのプラスミド２．４０／８４＃３を用い、２パーツにて、ＰＣＲによって生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’および５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ−３’であった。２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位で連結した。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ  ＳａｌＩ��片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ  ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号  ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。
サブゲノミッククローン９４９−２４．Ｉ２。  プラスミド９４９−２４．Ｉ２は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接ＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向で転写される。該ＨＶＴ  ＤＮＡは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクローンであるコスミド７２０−５１．３に由来する。（図２、５参照）。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、および断片１３のほぼ１２５０塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ断片である。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの２７９ｂｐ  ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成されたＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用されるセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号  ）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３’（配列番号  ）であった。（図８参照）。断片２はプラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶ  Ｂｕｒｓｖａｃ  Ｍ大セグメントＲＮＡをまず２つの重複する断片におけるｃＤＮＡとしてクローン化した。これらのクローンをユニークな制限部位で連結させてプラスミド２．４０／８４＃３を生成させた。プラスミド７７９−５４．１は、鋳型としてのプラスミド２．４０／８４＃３を用い、２パーツにて、ＰＣＲによって生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’および５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ−３’であった。２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位で連結した。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ  ＳａｌＩ断片としてＰＣ��によって合成したＩＬＴＶ  ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号  ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号  ）であった。
相同性ベクター８８１−２３．＃２８：  プラスミド８８１−２３．＃２８は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＨＳＶ−１  ＴＫプロモーターの制御下で発現させる。ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマトグルチニン（ＨＮ）遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下にあり、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロモーターの制御下にある。該ＨＶＴ  ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｃＩサブクローンである。（図２および５参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ  ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴゲノムＤＮＡのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＨＳＶ−１  ＢａｍＨＩ制限断片Ｎのほぼ２６６塩基対ＲｓａＩないしＨａｅＩＩＩ制限サブ−断片である。断片２はプラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３３３０塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｌＩ制限断片である。断片３はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片４は、全長ＮＤＶ  ＨＮｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のほぼ１８１１塩基対ＡｖａＩＩないしＮａｅＩ制限断片である。断片５は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ断片である。断片６はＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ  Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ断片である。断片７は全長ＮＤＶ  Ｆ  ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のほぼ１８１２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｓｔＩ制限断片である。断片８はＨＳＶ−１  ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅｏｃｈら，１９８５）のほぼ７８４塩基対ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ−断片である。プラスミド８８１０２３．＃２８は組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンの構築のためのＤＮＡ  ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＶＩＲＵＳ（組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション）に従ってＳ−ＨＶＹ−１４５と組み合わせて使用した。
相同性ベクター８８３−１０．Ａ１：  相同性ベクター８８３−１０．Ａ１は、新規ニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下にあるｌａｃＺマーカー遺伝子をユニークなＮｏｔＩ部位における鶏痘ウイルス（ＥＰＶ）に挿入する目的で構築した。２．８ＫＢ  ＦＰＶゲノムＥｃｏＲＩ断片は外来性ＤＮＡのＦＰＶへの挿入のために使用した。ＮｏｔＩ／ＳｆｉＩリンカーはＦＰＶ断片中のユニークなＳｎａＢＩ部位に挿入した。該カセットは、示された合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を利用した構築した。ＦＰＶのＮｏｔＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ．Ｓｎｙｄｅｒら，Ｕｎｉｖ．メリーランド州：配列番号２３）からの３８６ｂｐ  ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成されたＣＡＶプロモーターである。断片２はプラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３はＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。組換え鶏痘ウイルスは「組換えＦＰＶを生成させるための相同組換え手法」の手法によって生成させた。
一過性トランスフェクションアッセイ：  ６ｃｍディッシュ中の８０〜９０％コンフルエンスのニワトリ胚繊維芽細胞またはＱＴ−３５細胞は増殖培地を除去され、５ｍｌの維持培地を添加する。１０〜２０μのプラスミドＤＮＡを水中に希釈し、ＣａＣｌ2を０．２５Ｍの濃度および６００μｌの体積まで添加する。これに、６００μｌの２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．２８Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．０５）を添加して、室温で１分間インキュベートし、次いで、この溶液を２つの６００μｌアルコットに分割し、２つの６ｃｍディッシュ上に滴下する。３時間後、該溶液を除去し、ＰＢＳ中の１０％グリセロール溶液を添加し、細胞上で１時間放置する。これを除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５ｍｌの維持培地を補充する。２４〜４８時間後、細胞を収穫し、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ７中２．８Ｋでペレット化し、５００μｌ  ＰＢＳに再懸濁する。試料を３サイクルの凍結および解凍に付し、細胞夾雑物をミクロ遠心管中で回転させる。１１μｌの各上清よりなる二連の試料を、１００μｌのＯＮＰＧアッセイ溶液（０．８ｍｇ／ｍｌオルト−ニトロ−フェニル−ガラクトシド、６０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、４０ｍＭ  Ｎａ2Ｈ2ＰＯ4、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、５０ｍＭ  β−メルカプトェタノール、ｐＨ７．５）を用いてマイクロタイタープレート中でテストし、３７℃でインキュベートし、４１５ｎｍにおける読みを、各１５分毎に、ＢｉｏＲａｄモデル４５０マイクロプレートリーダーで取る。
プラスミド３８８−６５．２。  プラスミド３８８−６５．２は外来性ＤＮＡ配列を発現させるためのＨＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーターを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１はＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のＸｂａＩ  Ｅ断片のほぼ１１４９塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩサブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ断片である。プラスミド３８８−６５．２は「一過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、ＣＡＶプロモーターの強度を測定する。
プラスミド８５０−２５．１８。  プラスミド８５０−２５．１８は外来性ＤＮＡ配列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣＲプライマー５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：２４）および５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＣ−３’（配列番号：２５）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの８５４ｂｐ  ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターである。断片２は、ｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８５０−２５．１８を「一過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、ＣＡＶプロモーターの強度を測定する。
プラスミド８５０−６９．１。  プラスミド８５０−６９．１は外来性ＤＮＡ配列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣＲプライマー５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：２４）および５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＣ−３’（配列番号：２５）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの８５８ｂｐ  ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターである。ＢａｍＨＩ部位近くのＨｉｎｄＩＩＩ部位はＣＡＶアポプチンリーディングフレーム内にある。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ、９８８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８５０−６９．１を「一過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、ＣＡＶプロモーターの強度を測定する。
プラスミド８５０−８０．２。  プラスミド８５０−８０．２は外来性ＤＮＡ配列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣＲプライマー５’−ＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧ−３’（配列番号：２６）および５’−ＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＴＡＣＧ−３’（配列番号：２７）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの３８１ｂｐ  ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片（配列番号：２３）としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターである。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８５０−８０．２を「一過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、ＣＡＶプロモーターの強度を測定する。
プラスミド８８３−１１．Ａ５。  プラスミド８８３−１１．Ａ５は外来性ＤＮＡ配列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣＲプライマー５’−ＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧ−３’（配列番号：２８）および５’−ＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＴＡＣＧ−３’（配列番号：２７）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの３８１ｂｐ  ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターである。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ  ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８８３−１１．Ａ５を［一過性トランスフェクションアッセイ］に従って使用して、ＣＡＶプロモーターの強度を測定する。
相同性ベクター８４８−６９．Ａ１：  相同性ベクター８４８−６９．Ａ１は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換え豚痘ウイルスベクターを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＬＰ１プロモーターの制御下で発現させる。ウズラ・インターフェロンのタイプＩ（ｑＩＰＥ−１）遺伝子はＬＰ２ＥＰ２プロモーターの制御下で発現させる。ｑＩＰＥ−１  ＯＲＦ（５９４塩基対）は、ＳＰＶ相同性ベクター７５２−２２．１にクローニングするための適合するＥｃｏｒＲＩおよびＢａｍＨＩ末端を用いる（例２３Ｂで記載した）ＰＣＲによって生成させた（ＷＯ９６／２２３６３参照）。プラスミド８４８−６９．Ａ１は組換えウイルスベクターの構築のための「組換えＦＰＶまたはＳＰＶを生成させるための相同組換え手法」の手法によって生成させた。
例１９Ａ        Ｓ−ＨＶＹ−１４５
組換えＨＶＴ／ＭＤＶキメラウイルス
Ｓ−ＨＶＹ−１４５はＭＤＶを含有する組換えキメラウイルスであり、ワクチン処方にてマレック病に対して保護するＨＶＴゲノム配列は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って、ビルレントＭＤＶ血清タイプ１の重要な保護抗原およびＨＶＴゲノムＤＮＡのコスミドにつきコードする遺伝子を含有するＭＤＶゲノムＤＮＡのコスミドを組合せことによって生成したマレック病に対してワクチン処方にて保護するＭＤＶおよびＨＶＴゲノム配列を含有する組換えキメラウイルスである。得られたウイルスは、ビルレントＭＤＶ血清タイプ１に対する保護免疫応答およびＨＶＴの弱減化された増殖特徴を有する。１つの例において、該キメラウイルスは、ユニークな短領域のＨＶＴ遺伝子およびユニークな長領域を含有し、ニワトリにおいてマレック病に対するワクチンとして有用である。もう１つの例において、該キメラウイルスは、該短領域のＭＤＶ遺伝子および該長領域のＨＶＴ遺伝子を含有し、ニワトリにおいてマレック病に対するワクチンとして有用である。
該ユニークな短領域内のＭＤＶ保護抗原（ｇＤ、ｇＥおよびｇＩ）はＭＤＶに対する保護免疫応答を誘導し、他方、ＭＤＶのユニークな長領域に存在するビルレンスエレメント（５５、５６、５７）は、ＨＶＴの弱毒化ユニーク長配列によって置き換える。その結果、マレック病に対して保護する弱毒化ウイルスワクチンが得られる。マレック病、感染性喉頭気管炎、感染性ブルザ病、ニューキャッスル病、またはもう１つの家禽病原体に対する多価保護は、ＩＬＴＶ  ｇＢ、ｇＤおよびｇＩ遺伝子、ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子、ＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子、または家禽病原体からの抗原遺伝子を、ＨＶＴ／ＭＤＶ組換えウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ  ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中においてＰａｃＩ部位またはＮｏｔＩ部位に変換されたＸｈｏＩ部位に挿入することによって達成される。
全ＭＤＶ短領域を含有するコスミドを構築した。ＭＤＶゲノムＤＮＡは該ウイルスのユニーク長および内部および末端反復中にＳｍａＩ部位を含有するが、該ウイルスのユニーク短領域内にＳｍａＩ部位を含有しない。ＭＤＶの全短領域は、ＳｍａＩでのＭＤＶゲノムＤＮＡの部分的制限消化によって単離した。ほぼ２９，０００ないし３３，０００塩基対のＤＮＡ断片を単離し、コスミドベクターｐＷＥ１５の平滑末端部位にクローン化した。Ｓ−ＨＶＹ−１４５、組換えＨＶＴ／ＭＤＶキメラウイルスを生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って、ＭＤＶ短領域を含有するコスミドをＨＴＶ長領域を含有するコスミドと組み合わせた。サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを用いた：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと４０７−３２．１Ｃ１、およびＮｏｔＩと７３９−２７．１６。
得られたウイルスワクチンは、マレック病に対する優れた保護を供し、またはマレック病および感染性喉頭気管炎、感染性ブルザ病、ニューキャッスル病、またはもう１つの家禽病原体に対する多価ワクチンとして供される。このワクチンは、ＨＶＴ／ＭＤＶキメラワクチンにおけるＭＤＶ遺伝子の発現が、ＨＶＴおよびＭＤＶタイプ２（ＳＢ−１）またはＨＶＴ単独を含有する現在入手可能なワクチンよりも安全でマレック病に対して良好な保護を供するので、優れている。第２に、診断および調整目的双方のために、相同ＨＶＴ遺伝子の不存在下におけるＭＤＶ糖タンパク質遺伝子の発現を証明することができる。これは、ＭＤＶ糖タンパク質に対する抗体が相同ＨＶＴ糖タンパク質と交差反応するので有用である。最後に、各糖タンパク質の単一コピーを含有する組換えＨＶＴ／ＭＤＶウイルスは、相同組換えによって欠失できるＨＶＴおよびＭＤＶからの相同糖タンパク質遺伝子の２つのコピーを含有する組換えウイルスよりも安定している。
別の例において、ユニーク長領域からのＭＤＶ保護抗原を含有するコスミド（ＭＤＶ  ｇＢおよびｇＣ）を、短および長領域からのＨＶＴ遺伝子配列を含有するコスミドと組合せ、ユニーク長／内部反復連結およびユニーク長／末端反復連結においてＭＤＶビルレンス遺伝子を回避する（５５、５６および５７）。
ＳＢ−１株は弱毒化病原性を持つＭＤＶ血清タイプ２である。ＨＶＴおよびＳＢ−１生ウイルスの組合せのワクチン接種は、いずれかのウイルス単独でのワクチン接種よりもビルレントＭＤＶ攻撃に対して良好に保護する。本発明の別の例において、組換えウイルスワクチンは、ＳＢ−１およびＨＶＴのごとき、非ビルレントＭＤＶ血清タイプ１および３の弱毒化遺伝子と組み合わせたビルレントＭＤＶ血清タイプ２の保護抗原遺伝子を含む。ユニーク長領域に対応するゲノムＤＮＡはＳＢ−１血清タイプによって寄与される。ユニーク短領域に対応するゲノムＤＮＡはＨＶＴ血清タイプによって寄与される。ＭＤＶ血清タイプ１からの３つの主要糖タンパク質抗原（ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ）は該ウイルスのユニーク短領域に挿入される。
ＨＶＴサブゲノムクローン７２１−３８．１Ｊを利用して組換えウイルスを構築して、ユニーク短領域を再構築する。サブゲノムクローン７２１−３８．１ＪはＭＤＶ  ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子の挿入を含有する。大モル過剰のこれらのクローンを、Ｓｂ−１ゲノムＤＮＡの亜感染性用量とコトランスフェクトする。適当な亜感染性用量を決定するために、ＳＢ−１でのトランスフェクションを、細胞培養においてウイルスプラークをもはや生じない用量まで滴定する。かかる用量は、ＨＶＴユニーク短サブゲノムクローンと組換えられるＳＢ−１のユニーク長領域にわたるサブゲノム断片を含有する。従って、ＳＢ−１およびＨＶＴサブゲノム断片の重複する相同領域間の組換えから得られるウイルスはかなり有利となる。あるいは、ユニーク長領域からのＳＢ−１ゲノム断片をコスミドベクターにクローン化する。「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」を用い、ＳＢ−１のユニーク長およびＨＶＴのユニーク短領域を含有する組換えウイルスを生成させた。また、この手法は、限定されるものではないが、感染性喉頭気管炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルスおよび感染性ブルザ病ウイルスを含めた他の鳥類病原体からの抗原遺伝子を挿入するために、ＨＶＴサブゲノムクローンと共に使用される。
例１９Ｂ        Ｓ−ＨＶＹ−１４９
Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、マレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、該キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む。該ＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩ遺伝子はＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩプロモーターの制御下にある。該組換えキメラウイルスワクチンはビルケントマレック病ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスでの攻撃に対して有用である。
Ｓ−ＨＶＹ−１４９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと８５２−５２．ＩＩ４、およびＮｏｔＩと７３９−２７．１６。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４９を精製し、ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、回復しつつあるＩＬＴウイルス抗血清を用いるＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であった。
例１９Ｃ        Ｓ−ＨＶＹ−１５１
Ｓ−ＨＶＹ−１５１はマレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ−１５１は、該キメラウイルスのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ．ｃｏｌｉからの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。該Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下にある。組換えキメラウイルスワクチンはビルレントなマレック病ウイルスでの攻撃に対して有用である。
Ｓ−ＨＶＹ−１５１はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」手法において、相同性ベクター３０１−０７．Ｙ＃Ｄ１およびウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。トランスフェクションストックから得られた青色ウイルスは、「組換えヘルペスウイルスのためのブルオガルスクリーン」手法を用いる順次プラーク精製によって精製される。
Ｓ−ＨＶＹ−１５１は、マレック病ウイルスでの攻撃に対するワクチンとして有用である。
例１９Ｄ        Ｓ−ＨＶＹ−１５２
Ｓ−ＨＶＹ−１５２はマレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ−１５２は、該キメラウイルスのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子および感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。該Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下にある。ＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩプロモーターは、各々、ＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩプロモーターの制御下にある。
Ｓ−ＨＶＹ−１５２はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」手法において、相同性ベクター８６４−７４．１８およびウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。Ｓ−ＨＶＹ−１５２は、ＩＬＴウイルスに対する回復しつつある抗血清およびウサギ抗−β−ガラクトシダーゼ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によって純度につきテストし、順次プラーク精製および「黒色プラークアッセイ」によって精製した。
Ｓ−ＨＶＹ−１５２は、マレック病ウイルスおよび喉頭気管炎ウイルスでの攻撃に対するワクチンとして有用である。
例１９Ｅ        Ｓ−ＨＶＹ−１５３
Ｓ−ＨＶＹ−１５３はマレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ−１５３は、該キメラウイルスのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子およびニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマトグルチニン（ＨＮ）および融合（Ｆ）遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。該Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＨＳＶ−１  ＴＫプロモーターの制御下にある。ＮＤＶ  ＨＮ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下にあり、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロモーターの制御下にある。
Ｓ−ＨＶＹ−１５３はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」手法において、相同性ベクター８８１−２３．＃２８およびウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。トランスフェクションストックから得られた赤色プラークウイルスは、「組換えヘルペスウイルスのためのブルオガルおよびＣＰＲＧスクリーン」手法を用いる順次プラーク精製によって精製した。
Ｓ−ＨＶＹ−１５３は、抗−β−ガラクトシダーゼおよび抗−ＮＤＶ抗体を用いるＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。
Ｓ−ＨＶＹ−１５３はマレック病ウイルスおよびニューキャッスル病ウイルスでの攻撃に対するワクチンとして有用である。
例２０
ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）、ニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）又はウズラインターフェロン（ｑＩＦＮ）を発現する組換えＨＶＴは、マレック病ウイルスに対するワクチンとして、および家禽の他の疾患に対する免疫応答を増強するために有用である。ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物Ｇ−ＣＳＦやインターロイキン−６タンパク質と関係があり（５８）、ニワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）は哺乳動物インターフェロンタイプ１と相同性がある（５９）。前記例で記載したワクチンと組合せて使用すると、Ｓ−ＨＶＴ−１４４またはｃＩＦＮを発現するＨＶＴは、鳥に疾患を引き起こすウイルス（例えば、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、伝染性咽頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ブルザウイルスがあるが、これらに限定されない）に対する粘液性、体液性または細胞性免疫を与えるのに有用である。ｃＭＧＦまたはｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、例１５に記載の鳥類の疾患を引き起こす生物に対して増強された免疫を与えるのに有用である。
例２０Ａ
Ｓ−ＨＶＴ−１４４
Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ｃＭＧＦ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片内のオープン読みとり枠（ＯＲＦ  Ａ）と反対の転写配向である（図４；配列認識番号１２と１３）。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築した。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。
例２０Ｂ
ニワトリインターフェロンを発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えＨＶＴは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
ｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。
鳥類サイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するために鳥類の疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。ＨＶＴ中で発現され、免疫刺激作用を有する追加のサイトカインには、トランスフォーミング増殖因子ベータ、上皮増殖因子ファミリー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフイン、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体があるが、これらに限定されない。これらのサイトカインは、鳥類種またはヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌもしくはブタを含む他の動物由来である。
例２０Ｃ
マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリインターフェロン遺伝子を発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ｃＩＦＮ並びにＭＤＶ  ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
ＭＤＶ遺伝子とｃＩＦＮ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築する。サプゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７２１−３８．１Ｊ。
例２０Ｄ
マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝子およびニワトリインターフェロン遺伝子を発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子並びにＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤＶ  ＨＮ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮ並びにＭＤＶ  ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル病に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７２２−６０．Ｅ２。
例２０Ｅ
マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリ骨髄単球性増殖因子遺伝子を発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ｃＭＧＦ並びにＭＤＶ  ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
ｃＭＧＦ遺伝子およびＭＤＶ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、および切断しない７２１−３８．１Ｊ。
例２０Ｆ
マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝子、およびニワトリ骨髄単球性増殖因子遺伝子を発現する組換えＨＶＴ
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＧＭＦ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ  ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子並びにＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子を含有する。ｃＧＭＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤＶ  ＨＮ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮ並びにＭＤＶ  ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル病に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＧＭＦ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って創製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６．とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７５１−８７．Ａ８、および切断しない７２２−６０．Ｅ２。
例２１
疾患を引き起こす微生物からの抗原を発現するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、鳥類種とともに動物からの疾患を引き起こす微生物の抗原を発現するのに有用である。組換えＨＶＴは、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、およびネコを含む動物のワクチンとして有用であるが、これらに限定されるものではない。
組換えＨＶＴは、疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される場合、ウマの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス−１およびウマヘルペスウイルス−４があるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される場合、ウシの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、ウシヘルペスウイルスタイプ１、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシの呼吸器性シンシチアルウイルス、ウシパラインフルエンザウイルスがあるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される場合、ブタの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、仮性狂犬病ウイルス、ブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ／ＳＩＲＳ）、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタロタウイルスがあるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される場合、ネコまたはイヌの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、および糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｉｔｉｓ）（心糸状虫症）があるが、これらに限定されない。イヌの疾患を引き起こす微生物には、イヌヘルペスウイルス、イヌジステンパー、イヌアデノウイルスタイプ１（肝炎）、アデノウイルスタイプ２（呼吸系疾患）、パラインフルエンザウイルス、レプトスピラカニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、黄疸性出血病、パルボウイルス、コロナウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、イヌヘルペスウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｉｔｉｓ）（心糸状虫症）および狂犬病があるが、これらに限定されない。
例２２
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスをベクターとして用いるヒトワクチン
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、ヒトの疾患に対するワクチンとして有用である。例えば、ヒトのインフルエンザは、中和性ウイルスエピトープが急速に変化する、急速に進化するウイルスである。有用な組換えＨＶＴワクチンはインフルエンザ中和性エピトープがインフルエンザウイルスの新しい株に対して防御するように急速に変化するものである。ヒトのインフルエンザＨＡとＮＡ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して組換えＨＶＴにクローン化される。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される場合、他のヒトの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス（ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、おたふくかぜウイルス、マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ジフテリア、リケッチア・プロワゼキイ（Ｒｉｃｈｅｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ボレリア・ベルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｅｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、破傷風毒素、悪性腫瘍抗原があるが、これらに限定されない。
ヒトサイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するためにヒトの疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。追加のサイトカイン（ヒトおよび他の動物のトランスフォーミング増殖因子ベータ、上皮増殖因子ファミリー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフィン、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性腫瘍壊死因子受容体があるが、これらに限定されない）は、ＨＶＴ中で発現され、免疫刺激作用を有する。
例２３Ａ
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスワクチンの改良製造法
インターフェロンやインターロイキンのようなサイトカインは、培養細胞や動物のウイルスの複製を阻害する。細胞性インターフェロンまたはインターロイキンの産生の阻害は、細胞培養による組換えＨＶＴの増殖を改良する。組換え豚痘ベクターから発現されるニワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）を、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞培養物に加え、β−ガラクトシダーゼを発現するＳ−ＨＶＴ−０１２でインフェクションした。細胞培養培地に加えたｃＩＦＮは、β−ガラクトシダーゼの発現とＳ−ＨＶＴ−０１２力価の両方を用量依存的に低下させた。この結果は、ＨＶＴの増殖は、ニワトリインターフェロンの外因性添加により制限されることを示す。ＣＥＦ細胞中でニワトリインターフェロン活性を除去または不活性化することにより、ＣＥＦ細胞中のＨＶＴの増殖を改良するためにいくつかの方策が利用可能である。
一つの態様において、ニワトリインターフェロン中和性抗体は、ニワトリインターフェロン活性を阻害し、ＣＥＦ細胞培養物中の組換えＨＶＴの増殖を改良するために、培地に加えられる。抗−ｃＩＦＮ抗体は、ニワトリンターフェロンタンパク質を注射したマウス又はウサギの血清から得られ、好ましくはｃＩＦＮは、ニワトリインターフェロンを発現する組換え豚痘ウイルス由来である。
ポックスウイルスは、免疫逃避方法としてサイトカイン阻害性タンパク質を分泌する。ある型のポックスウイルス免疫逃避機序では、サイトカインを不活性化し、ウイルスの複製を可能にするインターロイキン、インターフェロン、または腫瘍壊死因子のポックスウイルス可溶性受容体が関与する（６０）。本発明の一つの態様において、鶏痘ウイルスは、ニワトリインターフェロン阻害性タンパク質及び他の免疫逃避タンパク質の供給源として有用である。インターフェロン活性を阻害しＨＶＴ力価を増加させるために、ＦＰＶ感染ＣＥＦ細胞培養物からの調整培地をＨＶＴ感染ＣＥＦに加える。さらなる態様において、組換えニワトリインターフェロン阻害性タンパク質又は他のポックスウイルス免疫逃避タンパク質は、ＨＶＴ力価を増加させるためにＨＶＴワクチン組成物と組み合わせてベクター中で発現される。
外来性遺伝子を発現するために、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞が作製された（６１）。さらなる態様において、ニワトリインターフェロンのアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子を発現するベクターをＣＥＦ細胞株に導入して、インターフェロン陰性ＣＥＦ細胞株を作製する。インターフェロン陰性ＣＥＦ細胞株中で増殖させた組換えＨＶＴは、インターフェロン産生性ＣＥＦ細胞株中で増殖させたＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。さらなる態様において、ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を発現するベクターをＣＥＦ細胞に導入して、ｃＭＧＦ陽性ＣＥＦ細胞株を構築する。ｃＭＧＦ陽性ＣＥＦ細胞株中で増殖させた組換えＨＶＴは、ｃＭＧＦ陰性ＣＥＦ細胞株中で増殖させたＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。
前記例で概説したように、本発明の組換えＨＶＴは、マレック病及び他の疾患に対するワクチンとして有用である。ＣＥＦ細胞での組換えＨＶＴの増殖効率が上昇すれば、ワクチンの生産に有用である。
例２３Ｂ
ウズラ・インターフェロン、タイプ１のクローニング
サザーンブロットは、32Ｐ−標識ニワトリ・インターフェロン−１遺伝子断片がウズラ細胞系ＱＴ−３５からの５．０ｂｐ  ＢａｍＨＩゲノムＤＮＡ断片にハイブリダイズすることを示した。この情報に基づき、ニワトリ・インターフェロンのタイプ１に対する相同プライマーにてＰＣＲ方法を利用して、ウズラ・インターフェロンのタイプ１についての遺伝子をクローン化した。（ＰＣＲプライマーは、ウズラＩＦＮ遺伝子の５’末端からの５’−ＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号：２９）；ウズラＩＦＮ遺伝子の３’末端からの５’−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣＡＣＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：３０）であった。）平滑５９４ｂｐ  ＱＴ−３５ゲノムＰＣＲ  ＤＮＡ断片はＰＣＲによって生成させ、ｐＢＬＵｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ−プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の多重クローニング部位中のユニークＳｍａＩ部位に挿入した。得られたプラスミドは８３２−７１．Ｂ１１である。ＤＮＡおよびアミノ酸配列を分析し、３つの公表されている鳥類インターフェロンタイプＩ遺伝子、例えば、アヒル、シチメンチョウおよびニワトリ間の重要な構造的遺伝モチーフの配列相同性および保存に基づき、ウズラ・インターフェロンタイプＩの完全なオープンレーディングフレーム（配列番号３１および３２）であると決定された。ウズラＩＦＮ−１  ＯＲＦは、翻訳開始出発コドンＡＴＧおよびアンバー翻訳停止シグナルＴＡＧを含めた、１９８アミノ酸をコードする５９４ヌクレオチドを含有する。該配列は６個のシステイン残基を含有し、これは他の鳥類ＩＦＮタイプＩ遺伝子間で保存されたモチーフである。該アミノ酸配列は３１個のアミノ酸疎水性シグナル配列および２つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含有する。ニワトリ、シチメンチョウおよびアヒルＩＦＮ−１と比較したウズラＩＦＮ−１の配列相同性（Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄ，ＤＮＡＳＴＡＲ  ＭｅｇＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）は、各々、８２．０％、７６．０％および４９．０％である。タンパク質疎水性Ｌｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットは、ウズラＩＦＮ−１タンパク質構造および電荷特性がニワトリ、シチメンチョウおよびアヒルＩＦＮ−１と同様であることを示す。ウズラＤＮＡを含有するプラスミドｐＳＹ８３２−７１．Ｂ１１は、特許手続目的の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従い、ＡＴＣＣ受託番号９７８９２の下で、１９９７年２月２１日に、米国２０８５２メリーランド州、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。
発現プラスミド８３２−７１．Ｂ１１はニワトリ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウ、バンタム、ホロホロチョウその他のごとき鳥類種における鳥類病に対するワクチンとして有用である。ウズラＩＦＮ−１は、鳥類ベクター単独または他の鳥類病を引き起こす抗原と組み合わせて供すると、病気を引き起こす微生物に対する免疫反応を改良する。発現プラスミド８３２−７１．Ｂ１１は鳥類種における体重増加を改良するためのワクチンとして有用である。
例２３Ｃ
アンチセンス・ウズラ・インターフェロン用の発現プラスミド：８６６−７９．２
ビシストロニック発現プラスミドｐＩＲＥＳｌｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）をクローニングベクターとして使用した。この発現カセットはヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期タンパク質／エンハンサー、続いて多重クローニング部位（ＭＣＳ）；合成イントロン；および脳心筋炎ウイルス内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、続いてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルと共に含有する。ウズラ・インターフェロンタイプＩのＤＮＡオープンリーディングフレーム用のアンチセンスをＣＭＶプロモーターおよびｐＩＲＥＳｌｎｅｏの転写開始部位のＭＣＳ下流のユニークなＢａｍＨＩ部位に挿入した。ウズラ・インターフェロンタイプ１を含有する得られた発現ｐＩＲＥＳｌｎｅｏプラスミドは８６６−７９．２であった。
アンチセンス・ウズラ・インターフェロンタイプ１プラスミド８６６−７９．２で安定に形質転換された細胞系ＱＴ−３５
安定に形質転換されたニワトリ細胞系はニワトリ・インターフェロンマウナイ細胞系を作成するのに容易に入手できるので、ウズラＩＦＮ−１アンチセンス発現プラスミドで形質転換されたＱＴ−３５細胞系を設計して、ＨＶＴのごとき鳥類ウイルスの増殖用の新しい改良された細胞基質を作成した。該ＱＴ−３５は細胞系を安定に形質転換し、ウズラ・インターフェロン・タイプ１に対するアンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを利用した。
ウズラＩＦＮ−１タイプ１用のアンチセンスＤＮＡおよび選択マーカー遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを含有するプラスミドでＱＴ−３５細胞をトランスフェクトした。該ＤＮＡプラスミド８６６−７９．２をカルシウムおよびＨＥＰＥＳ緩衝液の存在下で沈殿させ、ＱＴ−３５増殖培地と混合し、３９℃でＱＴ−３５細胞の単層と共にインキュベートした。５−６時間後、細胞を１５％グリセロールで３分間ショックを与え、ＰＢＳで洗浄し、増殖培地を供給した。細胞に密集単層を形成せしめ、次いで、トリプシン処理し、密集下濃度にて６ｃｍディッシュ上に平板培養した。細胞がプラスチックに付着し、順応した後、培地を４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する増殖培地で置き換えた。Ｇ４１８に対して耐性の細胞に、４００−８００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で２−３週間、またはＧ４１８に耐性でない非トランスフェクトＱＴ−３５細胞が死滅するまでコロニーを形成させ、１０ｃｍの培養皿上に平板培養した。クローンを継代培養し、要すれば、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地中、１週間に１回増殖させた。
８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で、その増殖安定性に基づいてＱＴ−３５クローンを選択した。Ｇ４１８耐性クローンおよび親ＱＴ−３５細胞からのゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析を行った。ジコキシゲニンｄＵＴＰ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で標識したネオマイシンホスホトランスフェラーゼＤＮＡプローブを用いて、ゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた遺伝子構築体の存在を同定した。Ｇ４１８に耐性でサザーンブロットによるネオマイシン遺伝子につき陽性の細胞クローンは、染色体ゲノム細胞ＤＮＡに安定にクローン全発現プラスミド８６６−７９．２を有すると考えられる。
ウズラＩＦＮ−１アンチセンス発現プラスミドで形質転換した改良されたＱＴ−３５細胞系は、ＨＶＴ、ＨＶＴ／ＭＤＶリワトリウイルスベクター、鶏痘ウイルス、アビポックスウイルスその他のウイルスのごとき鳥類ウイルスの生産で有用である。鳥類ウイルスは、当該細胞系におけるインターフェロン生産の阻害のため、改良されたＱＴ−３５細胞系において高力価まで増殖する。
Ｓ−ＳＰＶ−１２９
Ｓ−ＳＰＶ−１２９は、ＳＰＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍゲノム断片のＨｉｎｄＩＩＩないしＢｇｌＩＩサブ断片内の（ＯＩＬ  ＯＲＦ内の）ユニークなＡｃｃＩ部位に挿入された２つの遺伝子、ウズラ・インターフェロンタイプ１（ｇＩＦＮ−１）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する組換え豚痘ウイルスである。ｇＩＦＮ−１遺伝子は後期プロモーター２初期プロモーター２（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、ｌａｃＺ遺伝子は後期プロモーター１（ＬＰ１）の制御下にある。
Ｓ−ＳＰＶ−１２９は、ＥＳＫ−４細胞系におけるＳ−ＳＰＶ−００１および相同性ベクター８４９０６９．Ａ１間にて「組換えＦＰＶおよびＳＰＶを生成させるための相同組換え手法」によって生成させた（ＷＯ９６／２２３６３参照）。トランスフェクションショックは、「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」によってスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−１２９と命名された組換えウイルスであった。このウイルスを、材料および方法に記載したごとくに、青色プラークアッセイによってモニターした多重継体により、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入物安定性につきアッセイした。精製の最初の３ラウンドの後、観察された全てのプラークは青色であり、これは該ウイルスが純粋で、安定であって、マーカー遺伝子を発現することを示す。
ウズラＩＦＮ−１の生物学的活性を確認するために、Ｓ−ＳＰＶ−１２９を感染させたＥＳＫ−４細胞からの上清を収集し、ＣＥＦ細胞の小胞口腔炎ウイルス（ＶＳＶ）インターフェロンを阻害するその能力につきテストした。
Ｓ−ＳＰＶ−１２９はニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、バンタム、ホロホロチョウその他のごとき鳥類種において鳥類病に対するワクチンとして有用である。ウズラＩＦＮ−１は、単独または他の鳥類病を引き起こす抗原と組み合わせて供すると、病気を引き起こす微生物に対して免疫応答を改良する。Ｓ−ＳＰＶ−１２９は鳥類種において体重増加を改良するワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−１２９におけるまたはｐＩＲＥＳｌｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のごとき真核生物発現プラスミドにおけるウズラＩＦＮ−１の発現は、トランスジェニックニワトクまたは他の鳥類種を生成するためにニワトクまたは他の鳥類種の生殖系に注入すると有用である。
例２４
新規ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターをＨＭＣＶ前初期プロモーターと比較する一過性発現アッセイ
ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）は、１つの主要オープンリーディングフレーム（５１ｋｄａｌカプシド）およびいくつかのより小さいＯＲＦを含有する、２３００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＣＡＶはニワトリのリンパ芽球様細胞を感染し、１つの区別されるプロモーター領域からの２１００ヌクレオチドＤＮＡ転写体を生産する（文献６７〜７２）。
β−ガラクトシダーゼを発現する４つの異なるＣＡＶプロモーター構築体を一過性アッセイにおいて活性につきアッセイした。これらのプロモーター構築体はプラスミド８５０−２５．１８、８５０−６９．１、８５０−８０．２および８８３−１１．Ａ５であり、その全ては異なるＣＡＶプロモーターを使用して、β−ガラクトシダーゼの発現を駆動する。ＣＥＦおよび他の細胞系における多数の一過性アッセを、これらの構築体およびＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターを使用してβ−ガラクトシダーゼを発現させるプラスミド３８８−６５．２で行った。
プラスミド８５０−２５．１８は、ＯＲＦ１および２用の最初の２つの転写開始を通って、ＯＲＦ３、ＣＡＶカプシドタンパク質遺伝子用の転写開始まで延びるＣＡＶプロモーターの８５４ｂｐバージョンを含有する。このプロモーターはアポプチン遺伝子（ＯＲＦ２）用の機能的コーディング配列を含む。
プラスミド８６０−６９．１は、アポプチンリーディングフレーム内のＨｉｎｄＩＩＩ部位が満たされて、とりわけ３’末端近くのアポプチンリーディングフレームを破壊する以外は、８５０−２５．１８と同様である新規ＣＡＶプロモーターである。
プラスミド８８３−１１．Ａ５は、従前の２つのプロモーターと同一の上流部位において開始するＣＡＶプロモーターを含有するが、３８１ｂｐ長に過ぎず、ＯＲＦ１の転写開始まで延びる。
プラスミド８５０−８０．２は、８８３−１１．Ａ５と同様であるＣＡＶプロモーター（配列番号２３）を含有するが、転写開始に対して−３位はヌクレオチドＴからＡに変更されており（配列番号２３のヌクレオチド３７７）、これはＫｏｚａｃによって他の真核生物プロモーターにつき記載されているごときコンセンサスリボソームエントリー部位により近い。
一過性トランスフェクションアッセイの結果は、ＣＡＶプロモータープラスミド８５０−８０．２が、高度に活性にＨＭＣＶ  ＩＥプロモーターを含有する、プラスミド３８８−６５．２で観察されたレベルに匹敵する高レベルのβ−ガラクトシダーゼを発現することを示す。提案されたリボソームエントリー部位でＴからＡのヌクレオチド変化を有するＣＡＶプロモータープラスミド８５０−８０．２は、ＣＡＶプロモータープラスミド８５０−２５．１８、８５０−６９．１および８８３−１１．Ａ５よりも高い一過性レベルのβ−ガラクトシダーゼを発現する（図６参照）。一過性トランスフェクションアッセイの結果は、ニワトリ胚繊維芽細胞およびＱＴ−３５（ウズラ）細胞双方で観察される。プラスミド８５０−８０．２におけるＣＡＶプロモーターは、高レベルのウイルスもしくは細菌抗原、サイトカイン、免疫調節タンパク質および細胞質もしくは細胞表面受容体を発現するワクチンとして有用であり、それを組換えウイルスで使用される優れたプロモーターとする。プラスミド８５０−８０．２におけるＣＡＶプロモーターを用いて、組換えＳ−ＨＣＴ−１４８およびＳ−ＦＰＶ−１０６を作成する。
例２５
ニワトリ貧血ウイルスプロモーターからの外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴおよび組換えＦＰＶ
Ｓ−ＨＶＴ−１４８
Ｓ−ＨＶＴ−１４８はＨＶＴのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片におけるＸｈｏＩ部位に挿入されたイー・コリ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。このプラスミドはニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。該ＣＡＶプロモーターはＣＡＶの最初のＯＲＦまでのＣＡＶプロモーター配列を含有する３８１ｂｐ断片であり、−３位はＴからＡに変化している（配列番号２３のヌクレオチド３７７）。
Ｓ−ＨＶＴ−１４８は「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って構築した。サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用する：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ａ４０、ＮｏｔＩと６７２−０７．Ｃ４０、および未切断の相同ベクター８６７−９６．Ｂ９。ＨＶＴ−１４８は純粋なウイルスであって、ＯＮＰＧおよび青色プラークアッセイによって証明されるごとくベータ−ガラクトシダーゼを発現する。
Ｓ−ＨＶＴ−１４８はマレック病に対する家禽におけるワクチンとして有用である。注目する他の外来性ＤＮＡは、家禽におけるワクチンとして使用されるＣＡＶプロモーターの制御下で挿入される。ＣＡＶプロモーターはＨＶＴ、キメラＨＶＴ／ＭＤＶウイルスワクチン、および他のヘルペスウイルスで有用であり、病気を引き起こす微生物かせの外来性ＤＮＡを挿入すると、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒト種においてワクチンとして有用である。
Ｓ−ＦＰＶ−１０６
Ｓ−ＦＰＶ−１０６は２．８ｋｂのＦＰＶゲノムＥｃｏＲＩ断片におけるユニークなＳｎａＢＩ部位（ＮｏｔＩ部位に変換されたもの）に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する組換え鶏痘ウイルスである。Ｓ−ＦＰＶ−１０６は、新規ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。該ＣＡＶプロモーターはＣＡＶの最初のＯＲＦまでのＣＡＶプロモーター配列を含有する３８１ｂｐ断片であり、−３位はＴからＡに変更されている（配列番号２３のヌクレオチド３７７）。
Ｓ−ＦＰＶ−１０６は、８８３−１０．Ａ１および相同性ベクターＳ−ＦＰＶ−００１間にて「組換えＦＰＶおよびＳＰＶを生成させるための相同組換え手法」によって生成された（ＷＯ９４／１９０１５参照）。トランスフェクションショックは、「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」によってスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＦＰＶ−１０６と命名された組換えウイルスであった。このウイルスを、材料および方法に記載したごとくに、青色プラークアッセイによってモニターした多重継代により、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入安定性につきアッセイした。精製の最初の３ラウンドの後、観察された全てのプラークは青色であり、これは該ウイルスが純粋で、安定であって、マーカー遺伝子を発現することを示す。
Ｓ−ＦＰＶ−１０６は鶏痘病に対して家禽におけるワクチンとして有用である。注目する他の外来性ＤＮＡは家禽においてワクチンとして使用するＣＡＶプロモーターの制御下にて挿入される。該ＣＡＶプロモーターはＦＰＶ、豚痘ウイルス、ラコーンポックスウイルスおよび他のポックスウイルスにおいてワクチンとして有用であり、病気を引き起こす微生物からの外来性ＤＮＡを挿入すると、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒト種においてワクチンとして有用である。
例２６        Ｓ−ＨＶＹ−１４８
Ｓ−ＨＶＹ−１４８は、マレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ−１４８は、該キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲ１＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入されたニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマトグルチニン（ＨＮ）および融合（Ｆ）遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスである。該ＮＤＶ  ＨＮ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下にあり、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＣＮＶ前初期プロモーターの制御下にある。それらの各プロモーターの制御下にあるＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＹ−１４８を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＳｆｉＩと８５４−３３．６、およびＮｏｔＩと７３９−２７．１６。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４８を精製し、ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４８は、抗−ＮＤＶ−Ｆモノクローナル抗血清（＃３−１Ｇ５）および抗−ＮＤＶ−ＨＮモノクローナル抗血清を用いるＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であった。
ＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＨＶＹ−１４８で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。該ゲルをブロットし、ＷＥＳＴＥＲＮ  ＢＬＯＴＴＩＮＧ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥ（ウェスタンブロッティング手法）を用いて分析した。ＮＤＶ  ＨＮおよびＦに対する抗血清を用いて、ＮＤＶ  ＨＶおよびＦタンパク質の発現を検出した。Ｓ−ＨＶＹ−１４８感染細胞からの溶解物は、天然ＮＤＶ  ＨＮおよびＦで予測されるサイズにおいてバンドを呈した。
組換えキメラウイルスワクチンＳ−ＨＶＹ−１４８はビルレントマレック病ウイルスおよびニューキャッスル病ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＹ−１４８は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＮＤＶ  ＨＮおよびＦの生産で有用である。
例２７        Ｓ−ＨＶＹ−１５４
Ｓ−ＨＶＹ−１５４は、マレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ−１５４は、該キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲ１＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入されたニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスである。該ＮＤＶ  Ｆ遺伝子はＨＣＮＶ前初期プロモーターの制御下にあり、該Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ  ｇＸプロモーターの制御下にある。それらの各プロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子およびＮＤＶ  Ｆ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＹ−１５４はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワトリひな胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」手法において相同性ベクター８９０−７７．１０およびウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。トランスフェクションスショックから得られた魚色ウイルスは、「組換えヘルペスウイルス用のＣＰＲＧスクローン」手法を用い、順次プラーク精製によって精製する。
ＮＤＶ  ＨＮおよびＦ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＨＶＹ−１５４で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。該ゲルをブロットし、「ウェスタンブロッティング手法」を用いて分析した。ＮＤＶ  ＨＮおよびＦに対する抗血清を用いて、ＮＤＶ  ＨＶおよびＦタンパク質の発現を検出した。Ｓ−ＨＶＹ−１５４感染細胞からの溶解物は、天然ＮＤＶ  ＨＶおよびＦで予測されるサイズにおいてバンドを呈した。
Ｓ−ＨＶＹ−１５４はビルレントマレック病ウイルスおよびニューキャッスル病ウイルスでの攻撃に対するワクチンとして有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＹ−１５４は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＮＤＶ  Ｆの生産で有用である。
例２８        Ｓ−ＨＶＴ−１４９
Ｓ−ＨＶＴ−１４９は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子からの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子はニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制御下にある。ＣＡＶプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１４９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９００−８７．Ｈ８、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ａ４０およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４９を精製し、ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いるＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であった。
ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＨＶＴ−１４９で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動に付した。該ゲルをブロツトし、ＷＥＳＴＥＲＮ  ＢＬＯＴＴＩＮＧ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥ（ウェスタンブロッティング）手法を用いて分析した。ＩＢＤＶ  ＶＰ２に対する抗血清を用いて、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質の発現を検出した。Ｓ−ＨＶＴ−１４９感染細胞からの溶解物は天然ＩＢＤＶ  ＶＰ２で予測されるサイズにバンドを呈した。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＹ−１４９はマレック病ウイルスおよび感染性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１４９は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＩＢＤＶ  ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１４９は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＣＡＶプロモーターの利用性を説明する。
例２９        Ｓ−ＨＶＴ−１５４
Ｓ−ＨＶＴ−１４９は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子からの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子はニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制御下にある。ＣＡＶプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１４９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９００−８７．Ｈ８、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ａ４０およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４９を精製し、ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いるＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であった。Ｓ−ＨＶＴ−１４９によって生産された組換えタンパク質ＩＢＤＶ  ＶＰ２はＷＥＳＴＥＲＮ  ＢＬＯＴ  ＡＳＳＡＹ（ウェスタンブロットアッセイ）によって天然ＩＢＤＶ  ＶＰ２とサイズが同様であることが示された。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１５４を精製し、ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１５４は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であった。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＹ−１５４はマレック病ウイルスおよび感染性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＹ−１５４は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＩＢＤＶ  ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５４は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの利用性を説明する。
例３０        Ｓ−ＨＶＴ−１５５
Ｓ−ＨＶＴ−１５５は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子からの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と同一方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１５５を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩとＩ−ＳｃｅＩと９４９−１９．２、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１５５を精製し、「黒色プラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１５５は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であった。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５５はマレック病ウイルスおよび感染性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５５は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＩＢＤＶ  ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５５は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの利用性を説明する。
例３１        Ｓ−ＨＶＴ−１５６
Ｓ−ＨＶＴ−１５６は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子からの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１５６を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｉ−ＳｃｅＩと９４９−２４．Ｄ１、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１５６を精製し、ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１５６は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であった。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５６はマレック病ウイルスおよび感染性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５６は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＩＢＤＶ  ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５６は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターの利用性を説明する。
例３２        Ｓ−ＨＶＴ−１５９
Ｓ−ＨＶＴ−１５９は、マレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンである。Ｓ−ＨＶＴ−１５９は、キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と同一方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１５９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｉ−ＳｃｅＩと９４９−１９．２、およびＮｏｔＩと９２８−４７．１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１５９を精製し、「黒色プラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＴ−１５９は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であった。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５９はマレック病ウイルスおよび感染性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５９は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＩＢＤＶ  ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５９は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの利用性を説明する。
例３３        Ｓ−ＨＶＴ−１６０
Ｓ−ＨＶＴ−１６０は、マレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンである。Ｓ−ＨＶＴ−１６０は、キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１６０を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｉ−ＳｃｅＩと９４９−２４．Ｉ２、およびＮｏｔＩと９２８−４７．１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１６０を精製し、ＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＴ−１６０は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いるＢＬＡＣＫ  ＰＬＡＱＵＥ  ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であった。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１６０はマレック病ウイルスおよび感染性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１６０は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＩＢＤＶ  ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１６０は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの利用性を説明する。
例３４        Ｓ−ＨＶＴ−１５０
Ｓ−ＨＶＴ−１５０は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子からの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１５０を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６７２−０７．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９２８−５８．Ｊ２、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ａ４０、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１５０を精製し、「黒色プラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＴ−１５０は、抗−β−ガラクトシダーゼ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であった。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５０はマレック病ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５０は、診断アッセイで、またはワクチンとして有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５０は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターの利用性を説明する。
例３５        Ｓ−ＨＶＴ−１５１
Ｓ−ＨＶＴ−１５１は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子からの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ  ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。
Ｓ−ＨＶＴ−１５１を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンおよび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６７２−０７．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９２８−５８．Ｋ７、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ａ４０、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。
平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１５１を精製し、「黒色プラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＴ−１５１は、抗−β−ガラクトシダーゼ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であった。
組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５１はマレック病ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５１は、診断アッセイで、またはワクチンとして有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５１は組換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターの利用性を説明する。
参考文献
0004440347.tif 000002
0004440347.tif 000003
0004440347.tif 000004
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配列表
（１）一般情報：
（i）出願人：コークラン，マーク  Ｄ
ワイルド，マーサ  Ａ
バーバラ  Ｊ．ウィンスロー
（ii）発明の名称：組換えキメラウイルスおよびその使用
（iii）配列の数：３２
（iv）通信宛先：
（Ａ）名宛人：ジョン  Ｐ．ホワイト
（Ｂ）通り：１１８５  アヴェニュー・オブ・ジ・アメリカズ
（Ｃ）市：ニューヨーク
（Ｄ）州：ニューヨーク
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：１００３６
（ｖ）コンピュータ読取り可能な形態：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：Patent In  リリース#1.0、バージョン#1.25
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）アトニー／エージェント情報：
（Ａ）氏名：ホワイト，ジョン  Ｐ．
（Ｂ）登録番号：２８，６７８
（ix）電信情報：
（Ａ）電話：（２１２）２７８−０４００
（Ｂ）テレファックス：（２１２）３９１−０５２５
（Ｃ）テレックス：４２２５２３
（２）配列認識番号：１のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：５２４６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：７３．．１１８２
（Ｄ）他の情報：  ／産物（product）＝「ＨＶＴ  ＵＬ４２」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１３０６．．２５７４
（Ｄ）他の情報：  ／産物＝「ＨＶＴ  ＵＬ４３」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：２７９０．．４２５９
（Ｄ）他の情報：  ／産物＝「ＨＶＴ  ｇＡ」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：４７０１．．５３３９
（Ｄ）他の情報：  ／産物＝「ＨＶＴ  ＵＬ４５」
（xi）配列の記載：配列認識番号：１：
0004440347.tif 000006
0004440347.tif 000007
0004440347.tif 000008
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0004440347.tif 000012
（２）配列認識番号：２のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３６９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：２：
0004440347.tif 000013
（２）配列認識番号：３のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：４２２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：３：
0004440347.tif 000014
0004440347.tif 000015
（２）配列認識番号：４のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：４８９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：４：
0004440347.tif 000016
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（２）配列認識番号：５のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２１２アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：５：
0004440347.tif 000018
（２）配列認識番号：６のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１５０６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．１５０６
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（xi）配列の記載：配列認識番号：６：
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0004440347.tif 000020
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（２）配列認識番号：７のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：５０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：７：
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（２）配列認識番号：８のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１７３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．１７３４
（xi）配列の記載：配列認識番号：８：
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（２）配列認識番号：９のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：５７７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：９：
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（２）配列認識番号：１０のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１６６２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．１６６２
（xi）配列の記載：配列認識番号：１０：
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（２）配列認識番号：１１のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：５５３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：１１：
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0004440347.tif 000033
（２）配列認識番号：１２のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２６８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１４６．．４８１
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：補体（complement）（６０２．．１４０２）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１５９９．．２１３５
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：補体（complement）（２３０８．．２６３４）
（xi）配列の記載：配列認識番号：１２：
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（２）配列認識番号：１３のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１１１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１３：
0004440347.tif 000036
（２）配列認識番号：１４のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２６６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１４：
0004440347.tif 000037
（２）配列認識番号：１５のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１７８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１５：
0004440347.tif 000038
（２）配列認識番号：１６のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１０８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１６：
0004440347.tif 000039
（２）配列認識番号：１７のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１７：
0004440347.tif 000040
（２）配列認識番号：１８のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：６３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１８：
0004440347.tif 000041
（２）配列認識番号：１９のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１９：
0004440347.tif 000042
（２）配列認識番号：２０のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２０：
0004440347.tif 000043
（２）配列認識番号：２１のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２１：
0004440347.tif 000044
（２）配列認識番号：２２のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２２：
0004440347.tif 000045
（２）配列認識番号：２３のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３８７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２３：
0004440347.tif 000046
（２）配列認識番号：２４のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２４：
0004440347.tif 000047
（２）配列認識番号：２５のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２６塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２５：
0004440347.tif 000048
（２）配列認識番号：２６のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２６：
0004440347.tif 000049
（２）配列認識番号：２７のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２７：
0004440347.tif 000050
（２）配列認識番号：２８のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２８：
0004440347.tif 000051
（２）配列認識番号：２９のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２９：
0004440347.tif 000052
（２）配列認識番号：３０のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：３０：
0004440347.tif 000053
（２）配列認識番号：３１のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：５９４塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iv）アンチ・センス：ＮＯ
（xi）配列の記載：配列認識番号：３１：
（ix）配列の特徴：
（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．５９４
（Ｄ）他の情報：  ／産物＝「ウズラインターフェロン１型」
0004440347.tif 000054
（２）配列認識番号：３２のための情報：
（i）配列特性：
（Ａ）長さ：１９７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：３２：
0004440347.tif 000055
【図１Ａ】
0004440347.tif 000056
【図１Ｂ】
0004440347.tif 000057
【図１Ｃ】
0004440347.tif 000058
【図２】
0004440347.tif 000059
【図３Ａ】
0004440347.tif 000060
【図３Ｂ】
0004440347.tif 000061
【図４】
0004440347.tif 000062
【図５】
0004440347.tif 000063
【図６】
0004440347.tif 000064
【図７】
0004440347.tif 000065
【図８】
0004440347.tif 000066