(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬学的に有効量の式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラート及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含む抗ガン組成物。
【化１】
0004498930.tif 000020
【請求項２】
式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートが1-10μｇ/ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ガンがヒトの肝臓、大腸、卵巣、または口（口内）のガンである、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエンと、アンホテリシンＢ、ニスタチン、クロトリマゾール等のようなアゾール抗生物質に耐性であるヒトの病原性真菌感染を治療するための、地衣植物(Everniastrum cirrhatum)から単離された式Ｉのすでに既知の生体分子メチル-β-オルシノールカルボキシラートの新規な使用に関する。
【化１】
0004498930.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
地衣植物は、真菌、緑藻、及び／またはシアノバクテリアの間で共生関係を有する。それらは各種の化学物質を有し、あまり報告されていないデプシド及びデプシドンのようなものを含む多くのポリケチド由来の化合物を生産する。デプシドはあるクラスの化合物であり、地衣植物に独特であるようである。これらの化合物は、様々に置換されたオルセリン酸のダイマー状エステルであり、地衣酸と称されるものの主要なソースである。地衣植物は、伝統的な医薬において評価されているが、無菌培養及び迅速な増殖のための条件を確立することが困難であって、最も従来のスクリーニング法におけるそのルーチンの使用を排除するため、その価値は近代の製薬業界によってほとんど無視されてきた。
【０００３】
真菌と藻類の間の関係は、特異的で選択的である。真菌成分の名前は、全ての地衣植物に対して与えられており、全ての既知の真菌のほぼ5分の1を含む＞13500の記載された種が存在する(Hawcksworth及びhill, 1984; The Lichen Forming Fungi, Mecorquodale Ltd)。個々のミコビオント及びフォトビオント（それぞれ真菌、及び光合成藻類またはシアノバクテリア）は小さくて、実験室の皿で培養すると目に付かないが、各種の美しい形態の十分な範囲で共に天然に存在している共生成分で、Ramalina menziessi（「フィッシュネット」地衣植物）のようなものは、木全体を覆うことができ、深遠な外観を形成できる(Arvis, W.O., 2000; Lichens, Smithsonian Situation Press)。それらは、南極大陸における限界生息地への入植、オーストラリアの半乾燥砂漠における土壌の確立、及び北アメリカの北太平洋森林における窒素ターンオーバーへの貢献のような各種の環境上の役割を果たしている。
【０００４】
それらは、高等植物のものに関して独特である特徴的な二次代謝産物を生産する。地衣植物は、広範囲の化学的な化合物を生産し、その中では約350の二次代謝産物が同定されている。これらのミコビオント由来の産物は通常、共生者の細胞壁の細胞外結晶として蓄積され、葉状体の乾燥重量の10％まで（例外的な場合40％まで）を数える(Galun, M.及びShomer-llan, A. (1988) CRC Handbook of Lichenology, Vol. III; Galun, M.,編, pp.3-8. CRC Press)；多くのものは地衣植物に独特である。ほとんどの地衣植物二次化合物は、ポリケチド経路によって形成される一方、他のものはシキミ酸とメバロン酸経路から由来し、これらは全ての生物における二次代謝の鍵となる経路である。いくつかの地衣植物抽出物は、民間療法において各種の治療薬として使用されており、地衣植物でのスクリーニング試験により、抗生物質特性、抗マイコバクテリア特性、抗ウイルス特性、抗藻類特性、及び抗発熱特性を有する代謝産物の頻繁な出現が示されている。
【０００５】
さらに、別個のクラスの地衣植物代謝産物はデプシドである。これらのクラスの化合物は、二つ以上のヒドロキシ安息香酸の縮合により、一つの分子のカルボキシル基が第二の分子のフェノール性ヒドロキシル基とエステル化することによって形成される。その化学構造のフェノール性の性質により、主要なクラスのインヒビターはしばしばヒドロキシル化芳香環を含むため(Fitzsimmons等, 1989)、ロイコトリエン生合成に対する効果を評価するための興味深い候補である。さらに、二つの小分子地衣植物由来代謝産物、プロトリヘステリン酸は、ブタ白血球由来の5-LOを阻害することが報告されている(Ogmundsdottir等, 1998)。後者は、ペプチドロイコトリエン形成を阻害することも示されている(Gissurarson等, 1997)。地衣植物デプシドは、プロスタグランジン生合成を阻害することも記載されている(Sankawa等, 1982)。
【０００６】
地衣植物及びその産物は、数世紀にわたり伝統的な医薬において使用されており、依然として世界の各地で代替的な治療してかなりの興味がもたれている。実際今日では、各種の地衣植物ベースのトニック、ローション、及びロゼンジがアイスランドで購入でき、それらは医薬的でもある。しかしながら、地衣植物が多様な構造を有する数多くの低分子量分子を生産し、地衣植物全体から得た抽出物において生物学的活性の証拠を提供する研究が存在するにもかかわらず（表１）、地衣植物は近代製薬業界によって必須に無視されている。これに対して二つの理由が寄与している：（１）地衣植物は天然でゆっくりしか増殖しないこと、及び（２）地衣植物は培養物として増殖させて再合成することが困難であること(Ahmadjian, 1993; The Lichen Symniosis, Blaisdell Publishing Company)。工業スケールの収穫は、経済的に意味がなくて持続的ではなく、多くの種について容易なことではない。地衣植物の培養がin vitroで確立されたとしても、典型的な地衣植物物質は生産せず、これに遭遇する技術はいまだ未知である。
【０００７】
【表１ａ】
0004498930.tif 000003
【表１ｂ】
0004498930.tif 000004
【表１ｃ】
0004498930.tif 000005
【０００８】
地衣植物のほとんどの二次的な代謝産物は、ミコビオントによって形成されると解される(Huneck及びYoshimura, (1996) Identification of Lichen Substances, Springer-Verlag)。真菌化合物は医薬において周知であるため（例えばペニシリン及びシクロスポリン）、これは驚くべきことではない。しかしながら、フォトビオントもまた、地衣植物代謝産物のレパートリーに貢献することも可能である。シアノバクテリアは、多くの生体活性二次代謝産物を生産し(Namikoshi, M.及びRinehart, K.L. (1996) Bioactive compounds produced by cyanobacteria. J. Ind. Microbiol. 17, 373-143)、地衣植物から単離されたNostocの株によって生産される特許化された抗真菌性化合物の例が存在する（米国特許第4,946,835号、Merck & Co）。
【０００９】
以前に信頼されていた標準的な抗生物質が、新規なマルチドラッグ耐性の病原体の株に対して次第に有効ではなくなってきたため、天然産物薬剤に対する研究が拡大するための説得力のある理由が存在する。抗生物質時代の終焉は迅速に近づいていることが示唆されている。一部では、製薬学的に活性な分子の探索は、研究室で培養できる微生物の産物に集約してきた。より近年の合成化学の方法体系には、非常に多くの注目が注がれており、コンビナトリアルケミストリーは、自動化ハイスループットスクリーニング法のための分子のソースとして進んできている。これらのアプローチは、いくつかのリード分子を提供してきてはいるが、治療上の用途のための新規な化学分子を発見することに対しては、依然として大きな需要が存在している。
【００１０】
全身性及び表面上の真菌感染には、世界中で数百万の人々が罹患している。これらの疾患のほとんどは、Candida albicans、Cryptococcus neoformans、Aspergillus種、Trichophyton種、Microsporum gypseum、Epidermophyton floccossumによって引き起こされており、それらは天然で感染性である。インドでは、非常に多くの人々が農業に関与しており、一般的に非衛生的な条件のため真菌感染の発生が著しい村で、その大多数が生活している。真菌感染はまた、特に器官移植出術、ガンの化学療法、及び後天性免疫不全症候群（AIDS）による免疫系の減退のため重要性を増していると推定されている。さらに皮膚感染は、衛生的条件の欠如と環境汚染のレベルの増加のため、全人口について急速に広がっている。入手可能な抗細菌剤は豊富であるが、これらの感染に対抗するために、グルセオフルビン、アンホテリシン、及びニスタチンのような少数の抗真菌剤しか市場で入手可能ではない。これらの抗真菌剤のほとんどは、ヒト及び動物に既知の副作用を有する合成誘導体である。この問題に輪をかけて、一般的に使用されている薬剤に対する耐性が形成されつつあり、化学療法はあまり有用ではなくなってきている。それ故、天然起源の新規な抗真菌性物質が、耐性現象を解消するために生成される必要がある。1990−96年の間で、抗真菌剤に対する世界の市場は、1,500,000,000USドルに達し、全世界の抗感染薬市場の1.5％を占めた。現在の抗真菌剤（局所的なものと全身的なものの両者）は、全抗感染剤の6％より多くを占める。抗真菌剤に対する世界の市場は、一年につき20％の割合で拡大しており、600,000,000USドル/年に達すると見積もられる。しかしながら、多くの合成薬剤は、免疫にストレスが掛かる患者に副作用を生ずる。他方で、天然産物及び草本ソースから作製された製剤は、抗性抗真菌剤よりも受容性が高いであろう。
【非特許文献１】Hawcksworth及びhill, 1984; The Lichen Forming Fungi, Mecorquodale Ltd
【非特許文献２】Arvis, W.O., 2000; Lichens, Smithsonian Situation Press
【非特許文献３】Galun, M.及びShomer-llan, A. (1988) CRC Handbook of Lichenology, Vol. III; Galun, M.,編, pp.3-8. CRC Press
【非特許文献４】Ahmadjian, 1993; The Lichen Symniosis, Blaisdell Publishing Company
【非特許文献５】Huneck及びYoshimura, (1996) Identification of Lichen Substances, Springer-Verlag
【非特許文献６】Namikoshi, M.及びRinehart, K.L. (1996) Bioactive compounds produced by cyanobacteria. J. Ind. Microbiol. 17, 373-143
【特許文献１】米国特許第4,946,835号、Merck & Co
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の主たる目的は、ヒトのポリエン薬剤耐性真菌感染を特異的に殺傷できる地衣植物抽出物を同定することである。
【００１２】
本発明の目的はまた、生体活性ガイド分画化によって活性地衣植物抽出物から生体活性分子の性質を単離、特徴づけ、及び確立することである。
【００１３】
本発明のまた別の目的は、in vitroアッセイを使用する生体活性分子のエルゴステロール結合活性を試験することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って本発明は、製薬学的に有効量の式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラート及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含む抗真菌／抗ガン組成物を提供することである。
【化２】
0004498930.tif 000006
【００１５】
本発明の一つの実施態様では、前記組成物は抗真菌性であり、式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートは、10-400μｇ/ｍｌの範囲の濃度で存在する。
【００１６】
本発明の別の実施態様では、前記組成物は抗ガン性であり、式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートは、1-10μｇ/ｍｌの範囲の濃度で存在する。
【００１７】
本発明の別の実施態様では、前記真菌は、Candida albicansによって例示されるCandida種からなる酵母の群から由来する。
【００１８】
本発明の別の実施態様では、前記ガンは、ヒトの肝臓、大腸、卵巣、または口（口内）のガンである。
【００１９】
本発明は、製薬学的に有効量の式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラート及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含む抗真菌組成物を患者に投与することを含む、患者における真菌感染の治療方法に関する。
【化３】
0004498930.tif 000007
【００２０】
本発明の一つの実施態様では、前記式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートは、地衣植物Everniastrum cirrhatumから単離される。
【００２１】
本発明の別の実施態様では、前記真菌は、複数または単一の薬剤耐性株を含む。
【００２２】
本発明の別の実施態様では、前記式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートは、10-400μｇ/ｍｌの範囲の濃度で存在する。
【００２３】
本発明の更なる実施態様では、前記真菌は、Candida albicansによって例示されるCandida種からなる酵母の群から由来する。
【００２４】
本発明の更なる実施態様では、前記真菌はポリエン薬剤耐性株であり、前記ポリエン薬剤はニスタチン及びアンホテリシンによって例示される。
【００２５】
本発明のまた別の実施態様では、前記真菌はアゾール耐性株を含み、前記アゾール薬剤はクロトリマゾール、フルカノアゾール、イトラカノアゾール、及びミカナゾールによって例示される。
【００２６】
本発明のまた別の実施態様では、前記真菌は、ポリエン及びアゾールの両者のクラスの抗生物質に同時に耐性である。
【００２７】
前記患者は好ましくはヒトである。
【００２８】
本発明はまた、製薬学的に有効量の式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラート及び製薬学的に許容可能なキャリアーを患者に投与することを含む、ヒトのような患者における、肝臓、大腸、卵巣、及び口（口内）のガンのいずれかのガンの治療方法を提供する。
【化４】
0004498930.tif 000008
【００２９】
本発明の一つの実施態様では、式Ｉのメチル-βオルシノールカルボキシラートの濃度は、1-10μｇ/ｍｌの範囲で存在する。
【００３０】
本発明はまた、患者における真菌感染またはガンを治療するための、式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートの使用に関する。
【化５】
0004498930.tif 000009
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、アンホテリシンＢ、ニスタチン等のようなポリエン抗生物質に耐性であるヒトの病原性真菌感染を治療するための、地衣植物(Everniastrum cirrhatum)から単離された式Ｉの生体分子メチル-β-オルシノールカルボキシラートの使用に関する。しかしながら前記生体分子は、エルゴステロール結合特性を有しない。
【化６】
0004498930.tif 000010
【００３２】
Candida種による感染は、全ての主要な全身性の真菌感染の約80％を数える。Candidaは、現在では血流感染で見出される四番目に多い生物であり、免疫不全の人々における真菌感染の最も一般的な原因である。膣内カンジダは、特に抗生物質の使用の後の、正常な免疫を有するヒトを含む女性に一般的に罹患する。
【００３３】
地衣植物は、2002年4月の一月の間で、Narayan Ashram, Pithoragarh; Uttaranchal, Indiaから収集された。後に前記地衣植物は、分類学的にEverniastrum cirrhatumと同定された。収集した地衣植物を日陰で風乾し、細かいパウダーに粉砕した。パウダーにした地衣植物材料を、化学分析のためさらに使用した。エタノール抽出物を調製し、Candida albicans MTCC 1637（ATCC 18804と同等）に対して試験した。前記真菌は、ヒトにおいて各種の形態のカンジダ種を生じ、真菌の薬剤耐性ミュータントを生じる。アンホテリシン及びニスタチンは、化学療法において使用される標準的なポリエン抗真菌剤である。これらのポリエン抗生物質に対して耐性であるCandida albicans単離物はすでに報告されている。全ての主要なCandida種において観察されるアンホテリシンＢに対する高レベルの耐性は、アンホテリシンＢの長期的な過程を受けている好中球減少性の患者において最も一般的なものである。そのような薬剤耐性の感染は、臨床的に治療が困難であり、医師の悪夢の原因である。それ故我々は、in vitroでのCandida albicansのそのようなポリエン耐性株を開発し、それらに対する地衣植物抽出物／化合物の抗カンジダ効果を評価した。前記抽出物、及びその後の溶媒（ヘキサン及び酢酸エチル）分画は、アンホテリシン及びニスタチン耐性Candidaに対して活性であることが見出された。前記活性分画の生体活性ガイド分画化により、カラムクロマトグラフィーにより活性化合物の単離物が得られた。前記活性化合物は、96％ヘキサン：4％酢酸エチルの分画から結晶化できた。生成した化合物を、化学構造を明らかにするために、1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲ、ＬＣ-ＭＳ等を使用する分光測定法によって分析した。化合物は、式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートとして同定された。前記化合物は、137℃の溶融温度を有する無色の結晶である。Caccamese等(1985)は、メチル-β-オルシノールカルボキシラートが、Saccharomyces cerevisiaeのような酵母株の増殖を阻害することをすでに見出している。しかしながらこの研究では、我々は、メチル-β-オルシノールカルボキシラートが、Candida albicans及びSaccharomyces cerevisiaeのポリエン及びアゾール耐性株の増殖を特異的に阻害するという独特の特性を示した。真菌細胞膜における主要なステロールは、アンホテリシンＢ及びアゾールの作用の標的部位である。ポリエンであるアンホテリシンＢは、エルゴステロールに不可逆的に結合し、膜の完全性を破壊して、最終的に細胞死を導く。それ故、エルゴステロールに結合する地衣植物化合物の能力もまた、in vitroエルゴステロール結合アッセイを使用して調べた(Antonio & Molinski 1993; J. Natl. Prod. 56: 54-61)。その結果、前記化合物が、Candida種の野生型及び薬剤耐性株においてエルゴステロールにいずれの特性をも有しないことが示された。
【００３４】
それ故本発明は、製薬学的に有効量の式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラート及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含む抗真菌／抗ガン組成物を提供する。10-400μｇ/ｍｌの範囲の式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートの濃度が、Candida albicansによって例示されるCandida種を含む酵母の群に対する抗真菌活性を提供する。1-10μｇ/ｍｌの範囲の式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートの濃度が、ヒトの肝臓、大腸、卵巣、または口（口内）のガンに対する抗ガン活性を提供する。
【００３５】
式Ｉのメチル-β-オルシノールカルボキシラートは、地衣植物Everniastrum cirrhatumから単離される。
【００３６】
真菌は、マルチドラッグ耐性株またはシングルドラッグ耐性株のいずれでも良い。例えば真菌は、Candida albicansによって例示されるCandida種を含む酵母の群から由来して良い。問題となる薬剤は、ニスタチン及びアンホテリシンによって例示されるポリエン薬剤、またはクロトリマゾール、フルカノアゾール、イトラカノアゾール、及びミカナゾールによって例示されるアゾール薬剤であって良い。
【００３７】
以下の実施例は説明的なものであり、いずれの態様でも本発明の範囲を制限するものと考慮されるべきではない。
【実施例】
【００３８】
１．Candida albicans MTCC 1637（ATCC 18804と同等）のポリエン薬剤耐性ミュータント株の単離
C. albicansを、250rpmでシェーカーにおいて37℃で48時間サブローデキストロースブロス(5ml)中で対数増殖期に増殖させた。細胞を、4℃で5000rpmで遠心分離によりペレット化し、ペレットを5mlのリン酸緩衝生理食塩水PBS(6.8pH)中に溶解した。培養物を、エッペンドルフチューブにそれぞれ1mlで5の群に分割した。
【００３９】
エチルメタンスルホナート（EMS)を各チューブに0.1％（ｖ/ｖ）で添加し、40℃で増殖させた。次いでミュータジェンを、細胞を繰り返しペレット化することにより二度完全に洗い落とし、PBS中に再懸濁した。ミュータジェナイズしたストックを、サブローデキストロースブロスで2倍に希釈し、250rpmでシェイカーにおいて37℃で6時間増殖させた。EMSでの処理前と、EMSでの処理直後の細胞の力価を計算し、5のチューブのそれぞれにおける殺傷パーセンテージを得た。ミュータジェナイズし固定化した培養物を、各種の濃度のアンホテリシン、ニスタチン、及びクロトリマゾールを含むサブローデキストロースアガーに配置した。
【００４０】
5のミュータジェナイズしたストックのそれぞれから第5日後に増殖が見出されたコロニーを、抗生物質を含む同じ培地においてストリークすることによって別個に三度精製した。
【００４１】
２．ポリエン及びアゾールに対するミュータント株の薬剤耐性
ミュータントの薬剤耐性特性を、わずかな修正を加えた標準化されたディスク拡散アッセイ(Bauer等, 1966, American Journal of Clinical Pathology 45: 493-496)によって研究した。８μｌの試験化合物を浸液し、予備イノキュレートしたアガー表面にそれらを配置することにより、ディスクを調製した（Whatman #3フィルター紙で形成された5ｍｍの直径）。
【００４２】
溶媒のみを含むディスクを、コントロールとして使用した。ディスクを取り囲む増殖阻害領域は、抗生物質に対する株の耐性の指標となる。この実施例の結果から明らかなように、全てのミュータント株は、アンホテリシン及びニスタチンに対して非常に耐性であり、増殖阻害領域は野生型の親株のものよりミュータントではかなり小さかった。しかしながら、Amph C7R、Amph C6R、Clo 31R、及びClo 28Rのみは、クロトリマゾールに対してのみ耐性であり、増殖阻害の領域が小さいことが示された。
【００４３】
【表２】
0004498930.tif 000011
【００４４】
３．地衣植物材料の収集と抽出
2ｋｇの地衣植物(Everniastrum cirrhatum)材料を、2002年4月の一月の間で、Narayan Ashram, Pithoragargh, Uttaranchalから収集した。それらを分別して日陰で室温（35℃-40℃）で風乾した。風乾後、それらを粉砕し、ミキサー粉砕機で細かいパウダーに篩い分けした。1.5ｋｇのパウダー化した材料を、室温（35℃-40℃）で72時間パーコレーターで無水エタノールに浸けた。
【００４５】
エタノール抽出物を、Whatmanフィルター紙No.1を使用して濾過し、減圧下で60℃で濃縮した。次いでエタノール抽出物を凍結乾燥し、15.5ｇの粗抽出物を得た。100ｍｇ/ｍｌのストックをDMSOで作製し、生体活性について試験した。
【００４６】
４．地衣植物材料の生体活性ガイド分画化
活性粗抽出物の溶媒分画化を実施して、活性成分を単離した。エタノール抽出物を500ｍｌのヘキサンに溶解した。次いでWhatman No.1フィルター紙を使用してそれを濾過した。不溶性部分を500ｍｌの酢酸エチルに溶解した。全ての溶媒分画を、減圧下で40℃で濃縮し、3ｇのヘキサンと1.5ｇの酢酸エチルの抽出物を得て試験した。その結果、粗抽出物から得られた酢酸エチルとヘキサンの両者の分画が、C. albicansの薬剤耐性株に対して生体活性を有することが示された。ヘキサン分画は、酢酸エチル抽出物よりもかなり活性であった。
【００４７】
【表３】
0004498930.tif 000012
【００４８】
５．活性分子の精製と特徴づけ
かくして得られたヘキサン及び酢酸エチル分画を共に混合し、3.0ｃｍの内径と72.0ｃｍの長さを有するガラスカラムでさらに分画化した。初期移動相としてヘキサンを使用し、定常相としてシリカゲル（粒径60-120メッシュ）を使用した。約100ｍｌの各種の分画を収集し、真空下で乾燥した。次いで濃縮分画をTLC相に稼動させ、同じTLCパターンの分画を共にプールした。約3リットルのヘキサン分画を回収した後、ヘキサンに酢酸エチルを添加することにより、移動相の極性を分画No.36から増加した（4％の酢酸エチルの最終容量）。同様に分画No.64から78を、TLCで出現したような同一の７のスポットのバンドに基づいて共に組み合わせた。上記分画を50ｍｌのアセトンに溶解し、化合物の結晶化のため室温（25-30℃）で維持した。かくして得られた結晶を、アセトンで再び正確に洗浄し、結晶のTLCを98％のベンゼン＋2％のアセトンの移動相を使用して実施した。TLCプレートは、ヨウ素ガスに曝すと単一のスポットを示した。バコパ試薬（バニリン3.5ｇ、H2SO417.8ｇ、無水アルコール332.5ｍｌ）に浸液して120℃で5分過熱した際に、これらのTLCスポットは単一の暗赤色のスポットを示した。約40ｍｇの結晶が、上述の稼動から回収できた。かくして得られた結晶の溶融温度は、137℃であると見出された。
【００４９】
TLCにより得られた活性スポットを、反復的カラムクロマトグラフィーにより更に精製し、それは当業者に実施でき、1H＆13C NMR、LC-MSによって分析でき、活性純粋化合物の構造を決定した。分光測定データに基づいて、単離された化合物はメチル-β-オルシノールカルボキシラートと同定された。
【００５０】
６．ポリエン及びアゾール耐性株に対するメチル-β-オルシノールカルボキシラートの特異的抗カンジダ活性
単離された純粋化合物を、Candida albicansのポリエン及びアゾール耐性株に対して試験した。以下に記載されたデータは、化合物メチル-β-オルセリン酸が投与量依存的な態様で薬剤耐性株の増殖を阻害することができる一方、野生型株には不活性であったことを示す。別の実験では、Saccharomyces cerevisiaeの十分に定義されたアンホテリシン及びニスタチン耐性株を前記アッセイで使用した。erg2及びerg6と名づけられたこれらの株は、エルゴステロール生合成経路においてミューテーションを有し、それ故ポリエン薬剤の結合部位であるエルゴステロールを合成できない。それ故エルゴステロールの不存在は、ポリエン耐性を導く。この結果は、メチル-β-オルシノールカルボキシラーゼが、ポリエン薬剤耐性のSaccharomyces cerevisiaeの増殖を特異的に阻害できたことを示唆する。
【００５１】
【表４】
0004498930.tif 000013
【００５２】
【表５】
0004498930.tif 000014
【００５３】
７．ヒトガン細胞系に対するメチルβ-オルセリン酸の抗ガン特性
in vitroでの細胞毒性試験を、Woerdenbag等, 1993; J. Nat. Prod. 56(6): 849-856の方法によって実施した。2×103細胞/ウェルを、24時間CO2インキュベーターにおいてインキュベートし、それらを96穴ポリスチレンミクロプレート(Grenier, Germany)に正確に接着させた。少なくとも5の投与量で100％DMSO(Merck, Germany)に溶解した試験化合物を添加し、6時間放置し、その後前記化合物＋培地を新鮮な培地で置換し、細胞を37℃でCO2インキュベーターにおいて更に48時間インキュベートした。この実験で使用されたDMSOの濃度は1.25％を超えず、細胞に対して非毒性であると見出された。次いで10μlのMTT[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-いる)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド; Sigma M 2128]を添加し、プレートを37℃で4時間インキュベートした。100μlのジメチルスルホキシド(DMSO, Merck, Germany)を全てのウェルに添加し、徹底的に混合し、暗青色の結晶を溶解した。室温で数分後、全ての結晶を溶解したことを確認するために、プレートをSpectraMax 190 Microplate Elisaリーダー(Molecular Devices Inc., USA)で570nmで読み取った。プレートを通常DMSOの添加後1時間に以内で読み取った。実験を三重で実施し、阻害濃度（IC)値を以下のように計算した：阻害％＝[1-サンプルウェルのOD(570nm)/コントロールウェルのOD(570nm)]×100。IC90は、非処理コントロールのものと比較した細胞増殖の90％の阻害に必要な濃度μｇ/ｍｌである。記載された結果は、地衣植物のエタノール生粗抽出物、及び単離された純粋化合物メチル-β-オルシノールカルボキシラートが、肝臓(WRL-68)；大腸(Caco-2)；卵巣(MCF-7及びPA-1)、及び口(KB403)のヒトガン細胞系に対して活性であったことを示す。
【００５４】
【表６】
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【００５５】
［参考文献］
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