(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られる酸性ペプチドを食塩含有飲食品に添加することを特徴とする、飲食品の食塩味増強法。
【請求項２】
塩基性物質を添加する、請求項１記載の飲食品の食塩味増強法。
【請求項３】
塩基性物質が塩基性アミノ酸である、請求項２記載の飲食品の食塩味増強法。
【請求項４】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項３記載の飲食品の食塩味増強法。
【請求項５】
コハク酸を添加する、請求項１〜４のいずれかに記載の飲食品の食塩味増強法。
【請求項６】
蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られる酸性ペプチドを有効成分として含有する飲食品の食塩味増強剤。
【請求項７】
塩基性物質を含有する、請求項６記載の飲食品の食塩味増強剤。
【請求項８】
塩基性物質が塩基性アミノ酸である、請求項７記載の飲食品の食塩味増強剤。
【請求項９】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項８記載の飲食品の食塩味増強剤。
【請求項１０】
コハク酸を含有する、請求項６〜９のいずれかに記載の飲食品の食塩味増強剤。
【請求項１１】
蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られる酸性ペプチドおよび食塩を含有する食塩味調味料。
【請求項１２】
塩基性物質を含有する、請求項１１記載の食塩味調味料。
【請求項１３】
塩基性物質が塩基性アミノ酸である、請求項１２記載の食塩味調味料。
【請求項１４】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項１３記載の食塩味調味料。
【請求項１５】
コハク酸を含有する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の食塩味調味料。
【請求項１６】
請求項６〜１０のいずれかに記載の食塩味増強剤を添加してなる飲食品。
【請求項１７】
請求項６〜１０のいずれかに記載の食塩味増強剤を添加してなる食塩含有飲食品。
【請求項１８】
請求項１１〜１５のいずれに記載の食塩味調味料を添加してなる飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、食塩を含有する飲食品の食塩味増強方法ならびにそれに用いる食塩味増強剤および食塩味調味料に関する。また、該方法で得られる減塩飲食品に関する。
【背景技術】
食塩（塩化ナトリウム）は、飲食品の調味や加工において、飲食品への味の賦与、飲食品の保存性の向上、飲食品の物性の改善等の重要な役割を果たしている。食塩は、特においしいと感じさせる味（食塩味）を飲食品に与え、その構成成分であるナトリウムと塩素は人体の必須栄養素である。
しかしながら、食塩の構成成分であるナトリウムの過剰摂取は、多数の健康問題、例えば高血圧等の心臓病や血管系疾患の危険因子となると考えられている。日本だけでなく先進諸国では、これらの疾患に罹り易い高齢者層の増加に伴い、食塩、特にナトリウムの摂取量の減少が強く望まれている。
食塩摂取量の減少のためには、飲食品の調味や加工において食塩の使用量を減少させることがもっとも単純な方法である。しかし、家庭の調理食品であれ、加工飲食品であれ、飲食品に含まれる食塩量を１０％以上減少させると、その飲食品の美味しさは、一般に損なわれることになる。
食塩味を損なうことなく食塩、特にナトリウムの摂取量を減少させる方法、即ち一般に減塩方法と呼ばれているものとしては、それ自身食塩味を呈する物質（以下、食塩代替物質という。）を使用する方法と、それ自身食塩味を呈することはないが、食塩と共存させることによりその食塩味を増強する物質（以下、食塩味増強物質という。）を使用する方法等が知られている。
食塩代替物質としては、例えばカリウム塩、アンモニウム塩、塩基性アミノ酸、塩基性アミノ酸からなるペプチドおよびグルコン酸のアルカリ金属塩等が知られている。
カリウム塩は、食塩味の他に苦味を有し、特有の後味をもたらすという欠点を有する。この問題を解決することを目的とするものとしては、塩基性アミノ酸二塩酸塩、グルタミン酸のカリウム塩またはアンモニウム塩および塩化カリウムからなる組成物や、乳精ミネラルと塩化カリウムとの混合物や、グリシンエチルエステル塩酸塩またはトリプトファンエチルエステル塩酸塩と塩化カリウムとの組成物や、塩化カリウムとマグネシウム塩を主成分としさらにリジン塩酸塩等を含有する組成物や、塩化カリウム、食塩およびクエン酸塩からなりナトリウム／カリウム比が１以下である組成物等が知られている。
アンモニウム塩としては、例えばカリウム塩、アンモニウム塩および酸性コリン塩を含有する組成物や、食塩およびカプセル化されたアンモニウム塩を含有する組成物等が知られている。
塩基性アミノ酸に関しては、例えばリジンコハク酸塩、リジンコハク酸一水塩またはオルニチンアジピン酸一水塩を含有する組成物や、塩基性アミノ酸のコハク酸塩を含有する組成物や、塩基性アミノ酸塩酸塩、５’−ヌクレオチド、甘味成分およびクエン酸ナトリウムを含有する組成物や、リジンコハク酸塩等を含有する組成物等が知られている。
塩基性アミノ酸からなるペプチドとしては、例えばオルニチル−β−アラニン、リジルグリシン、オルニチルグリシン、オルニチルタウリンおよびリジルタウリン等が知られている。
また、グルコン酸のアルカリ金属塩としては、グルコン酸のカリウム塩等が知られている。
食塩味増強物質は、食塩を代替することはできないが、食塩の食塩味を増強することにより食塩の使用量を減少させ、減塩を可能とする物質である。
食塩味増強物質としては、例えば分子量が５０，０００ダルトン以下のコラーゲンを加水分解して得られるペプチド（特開昭６３−３７６６号）、甘味蛋白質であるソーマチン（特開昭６３−１３７６５８号）、クエン酸生産能を有する黒麹菌で製麹した黒麹および黄麹菌で製麹した黄麹の混合物を消化分解して得られる分解液（特開平２−５３４５６号）、陽イオン性界面活性剤であるセシチルピリジウム塩単独またはセシチルピリジウム塩とアルギニンやリジン等の塩基性アミノ酸との混合物（特表平３−５０２５１７号）、炭素数３〜８の飽和脂肪族モノカルボン酸（特開平５−１８４３２６号）、塩基性アミノ酸であるアルギニンと酸性アミノ酸であるアスパラギン酸との等モル混合物（米国特許５，１４５，７０７）、卵白蛋白質、ゼラチン、大豆蛋白質、小麦蛋白質、コーン蛋白質、魚蛋白質、乳蛋白質または肉蛋白質等の蛋白質加水分解物（特開平７−２８９１９８号）、トレハロース（特開平１０−６６５４０号）等が知られている。
蛋白質酵素分解物が食塩味増強作用を有することは、上記の特開昭６３−３７６６号および特開平７−２８９１９８号に記載されている。特開昭６３−３７６６号には、コラーゲン加水分解物が食塩味増強作用を有するが、この作用はコラーゲン加水分解物に特有の性質であり、大豆蛋白質や乳蛋白質の加水分解物にはないと記載されている。
前述の特開平７−２８９１９８号には、食塩味増強物質として蛋白質加水分解物を用いることが開示されているが、本発明の食塩味増強作用の活性成分は蛋白質の加水分解で生じるアルギニンおよびリジン等の遊離の塩基性アミノ酸であることが記載されている。
このように、減塩方法として食塩代替物質を使用する方法や、食塩味増強物質を使用する方法が数多く提案されている。しかし、嗜好性、効果、経済性、安全性等の点から未だ満足すべき減塩方法は開発されておらず、従って減塩食品は一般化していない。上記の問題点を解決した減塩方法が強く望まれている。
ペプチドの味に関しては数多くの研究がある。大豆分離蛋白質のペプシン分解物をキモトリプシンで処理したプラステイン反応生成物から、旨味を有するペプチドとしてグルタミン酸またはアスパラギン酸を含むジペプチドおよびトリペプチドが分離されている［Agr. Biol. Chem., 36, 1253 (1972）］。この結果は合成ペプチドを用いて確認されている［Agr. Biol. Chem., 37, 151 (1973）］。魚肉蛋白質濃縮物の酵素分解物から分子量１，０００以下のペプチドが分画され、それはさらにイオン交換樹脂を用いて、酸性、中性および塩基性のペプチドに分画され、酸性のオリゴペプチド画分が旨味を有していることが明らかにされている［Agr. Biol. Chem., 37, 2891 (1973)］。さらに、この酸性オリゴペプチド画分の構成ペプチドが同定されている［J. Agric. Food. Chem., 23, 49 (1975)］。
低分子量の酸性ペプチドが食塩味を有するとのいくつかの報告がある。デリシャスペプチドは牛肉のスープから発見された８個のアミノ酸からなる旨味ペプチドである。このペプチドの構造活性相関の研究の中で、塩基性のジペプチドと酸性のジペプチドとが食塩味を有することが見出されている［Agr. Biol. Chem., 53, 319 （1989）］。また、これらの酸性ペプチドおよび類似の酸性ペプチドとして、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸からなる４種類のジペプチドおよび８種類のトリペプチドが旨味と共に食塩味を有することが明らかにされ、さらに、デリシャスペプチドの構成部分ペプチドである５個のアミノ酸からなる酸性ペプチドも食塩味を有することが報告されている［Biosci. Biotech. Biochem., 59, 689 (1995）］。
蛋白質の酵素分解物中のペプチドが食塩味を有するとの報告もある。小麦蛋白質であるグルテンを蛋白質分解酵素アクチナーゼで処理し、さらにこの分解物を塩酸で脱アミドした後、分画して得た分子量５００〜１，０００の画分が、甘味、酸味、苦味、収斂味および旨味と共に、食塩味を有することが報告されている。しかし、この画分を煮干だし汁に添加すると、旨味のみが有意に強くなるが、甘味や食塩味などの他の味には有意差は認められないことが報告されている［日本家政学会誌，45, 615 (1994）］。
大豆蛋白質の酵素分解物から旨味ペプチドとして酸性ペプチドが分離され、その内のいくつかのペプチドは単独またはイノシン酸の存在下で食塩味を呈することが報告されている［Biosci. Biotech. Biochem., 63, 555 (1999）］。
また、酸性ペプチドがペプチドの苦味をマスキングするとの報告がある［J. Food Sci., 40, 367 (1975）］。
このように、ペプチドやその中の酸性ペプチドについてもそれら自身の呈味性や、それらが旨味、苦味等の他の味に及ぼす影響について数多くの研究があり、またペプチドは旨味や食塩味等を有し、苦味をマスキングすることが明らかになっている。しかし、蛋白質を加水分解処理および／または脱アミド処理して得られるペプチドを主成分とする蛋白質酵素分解物が食塩の食塩味を増強することは知られていない。食塩味を有するペプチドの食塩味増強作用に関して、食塩とオルニチル−β−アラニンの混合溶液の食塩味の強さを評価したところ、それぞれの食塩味は独立に発現して混合溶液の食塩味の強さは相加性を示し、相乗作用はないこと、即ち、オルニチル−β−アラニンに食塩の食塩味を増強する作用はないことが明らかにされている［J. Agric. Food. Chem., 38, 25 （1990）］。
以上のように、酸性ペプチドが食塩味増強作用を有することについては知られていない。また、市販されている蛋白質を酵素分解して得られた調味料や栄養食品素材等の酵素加水分解物は食塩味増強作用を有していない。
【発明の開示】
本発明の目的は、食塩を含有する飲食品の食塩味増強方法ならびにそれに用いる食塩味増強剤および食塩味調味料を提供することにある。また、該方法で得られる減塩飲食品を提供することにある。
本発明者は、酸性ペプチドまたは蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドが、それ自身が食塩味を有しないが、食塩の有する食塩味を強める作用（以下、食塩味増強作用という）があることを見出して本発明を完成した。
本発明は、下記（１）〜（４２）に関する。
（１）酸性ペプチドを食塩含有飲食品に添加することを特徴とする、飲食品の食塩味増強法。
（２）酸性ペプチドが蛋白質を加水分解処理して得られるものである、（１）記載の食塩味増強法。
（３）酸性ペプチドが蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるものである、（１）記載の食塩味増強法。
（４）塩基性物質を添加する、（１）〜（３）のいずれか記載の飲食品の食塩味増強法。
（５）塩基性物質が塩基性アミノ酸である、（４）記載の食塩味増強法。
（６）塩基性アミノ酸がアルギニンである、（５）記載の食塩味増強法。
（７）コハク酸を添加する、（１）〜（６）のいずれかに記載の飲食品の食塩味増強法。
（８）酸性ペプチドを有効成分として含有する食塩味増強剤。
（９）酸性ペプチドが蛋白質を加水分解処理して得られるものである、（８）記載の食塩味増強剤。
（１０）酸性ペプチドが蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるものである、（８）記載の食塩味増強剤。
（１１）塩基性物質を含有する、（８）〜（１０）のいずれか記載の飲食品の食塩味増強剤。
（１２）塩基性物質が塩基性アミノ酸である、（１１）記載の食塩味増強剤。
（１３）塩基性アミノ酸がアルギニンである、（１２）記載の食塩味増強剤。
（１４）コハク酸を含有する、（８）〜（１３）のいずれかに記載の飲食品の食塩味増強剤。
（１５）酸性ペプチドおよび食塩を含有する食塩味調味料。
（１６）酸性ペプチドが蛋白質を加水分解処理して得られるものである、（１５）記載の食塩味調味料。
（１７）酸性ペプチドが蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるものである、（１５）記載の食塩味調味料。
（１８）塩基性物質を含有する、（１５）〜（１７）のいずれか記載の飲食品の食塩味調味料。
（１９）塩基性物質が塩基性アミノ酸である、（１８）記載の食塩味調味料。
（２０）塩基性アミノ酸がアルギニンである、（１９）記載の食塩味調味料。
（２１）コハク酸を含有する、（１５）〜（２０）のいずれかに記載の食塩味調味料。
（２２）（８）〜（１４）のいずれかに記載の食塩味増強剤を添加してなる飲食品。
（２３）（８）〜（１４）のいずれかに記載の食塩味増強剤を添加してなる食塩含有飲食品。
（２４）（１５）〜（２１）のいずれに記載の食塩味調味料を添加してなる飲食品。
（２５）蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドを食塩含有飲食品に添加することを特徴とする、飲食品の食塩味増強法。
（２６）塩基性物質を添加する、（２５）記載の飲食品の食塩味増強法。
（２７）塩基性物質が塩基性アミノ酸である、（２６）記載の食塩味増強法。
（２８）塩基性アミノ酸がアルギニンである（２７）記載の食塩味増強法。
（２９）コハク酸を添加する、（２５）〜（２８）のいずれかに記載の飲食品の食塩味増強法。
（３０）蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドを有効成分として含有する食塩味増強剤。
（３１）塩基性物質を含有する、（３０）記載の食塩味増強剤。
（３２）塩基性物質が塩基性アミノ酸である、（３１）記載の食塩味増強剤。
（３３）塩基性アミノ酸がアルギニンである、（３２）記載の食塩味増強剤。
（３４）コハク酸を含有する、（３０）〜（３３）のいずれかに記載の食塩味増強剤。
（３５）蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドおよび食塩を含有する食塩味調味料。
（３６）塩基性物質を含有する、（３５）記載の食塩味調味料。
（３７）塩基性物質が塩基性アミノ酸である、（３６）記載の食塩味調味料。
（３８）塩基性アミノ酸がアルギニンである、（３７）記載の食塩味調味料。
（３９）コハク酸を含有する、（３５）〜（３８）のいずれかに記載の食塩味調味料。
（４０）（３０）〜（３４）のいずれかに記載の食塩味増強剤を添加してなる飲食品。
（４１）（３０）〜（３４）のいずれかに記載の食塩味増強剤を添加してなる食塩含有飲食品。
（４２）（３５）〜（３９）のいずれに記載の食塩味調味料を添加してなる飲食品。
本発明において酸性ペプチドとは、該ペプチドを構成するアミノ酸中の酸性アミノ酸数が塩基性アミノ酸数よりも多いペプチドをいう。酸性アミノ酸とは、アスパラギン酸およびグルタミン酸をいい、塩基性アミノ酸とは、リジン、アルギニンおよびヒスチジンをいう。
本発明の酸性ペプチドとしては、全アミノ酸数に対して酸性アミノ酸数が２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがさらに好ましい。全アミノ酸数に対して酸性アミノ酸数が２０％以上である場合には、塩基性アミノ酸数が１５％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましく、５％以下であることがさらに好ましい。また、全アミノ酸数に対して酸性アミノ酸数が３０％以上である場合には、塩基性アミノ酸数が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。
酸性ペプチドの分子量は、４００〜３０，０００が好ましく、５００〜３０，０００がより好ましく、７００〜２７，０００が特に好ましい。ペプチド鎖長は、３〜２５０が好ましく、４〜２５０がより好ましく、６〜２３０が特に好ましい。
酸性ペプチドは、ペプチド合成法により得ることもできるが、通常は蛋白質をエンドペプチダーゼ等を用いて加水分解し、必要に応じてさらに脱アミド処理することにより得ることができる。
分解処理に供する蛋白質の構成アミノ酸のうち、酸性アミノ酸数が塩基性アミノ酸数よりも多い場合、該蛋白質を加水分解することにより、酸性ペプチドを得ることができる。また、該蛋白質に脱アミド処理を行うと、該蛋白質中のアスパラギン残基およびグルタミン残基が、それぞれアスパラギン酸およびグルタミン酸残基となるため、さらに多くの酸性ペプチドを得ることができる。
分解処理に供する蛋白質の構成アミノ酸のうち、酸性アミノ酸数とアミド数の総数が塩基性アミノ酸数よりも多い場合は、該蛋白質を加水分解することに加え、脱アミド処理することにより、酸性ペプチドを得ることができる。
酸性アミノ酸数または酸性アミノ酸数とアミド数の総数が塩基性アミノ酸数よりも少ない蛋白質でも、該蛋白質を加水分解することにより、酸性ペプチドが生成される場合は、これを本発明の酸性ペプチドとして用いることができる。
本発明の加水分解処理および脱アミド処理に供する蛋白質としては、アミノ酸組成でアミドを持つ蛋白質であれば、いずれも用いられるが、蛋白質のアミノ酸組成で、酸性アミノ酸数が塩基性アミノ酸数よりも多い蛋白質が好ましい。また蛋白質のアミノ酸組成で、酸性アミノ酸数とアミド数の総数が塩基性アミノ酸数よりも多い蛋白質がより好ましい。また、酸性アミノ酸数とアミド数の総数としては全アミノ酸数の１０％以上が好ましく、２０％以上がより好ましく、３０％以上が特に好ましい。
本発明でアミドとは、アスパラギンおよびグルタミンをいう。アスパラギンおよびグルタミンは脱アミド処理により、それぞれアスパラギン酸とグルタミン酸になる。
本発明の酸性ペプチド、または蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドを得るため供せられる蛋白質としては、例えば小麦グルテン（単にグルテンともいう）、コーン蛋白質（ツエイン、グルテンミール等）、分離大豆蛋白質（単に大豆蛋白質ともいう）等の植物蛋白質、ミルクカゼイン（単にカゼインともいう）、ミルクホエイ蛋白質等の乳蛋白質、畜肉蛋白質、魚肉蛋白質等の筋肉蛋白質、卵白蛋白質、コラーゲン等の動物蛋白質や、微生物菌体蛋白質または微生物の生産するポリペプチド等の微生物蛋白質などがあげられる。
蛋白質のアミノ酸組成で、酸性アミノ酸数が塩基性アミノ酸数よりも多い蛋白質としては、例えば大豆蛋白質、乳蛋白質、畜肉蛋白質、魚肉蛋白質、卵白蛋白質等があげられる。蛋白質のアミノ酸組成で、酸性アミノ酸数とアミド数の総数が塩基性アミノ酸数よりも多い蛋白質としては、例えば小麦グルテン等あげられる。
また、酸性アミノ酸数とアミド数の総数が全アミノ酸数の３０％以上の蛋白質としては、例えば小麦グルテンや分離大豆蛋白質等があげられる。酸性アミノ酸数とアミド数の総数が全アミノ酸数の２０％以上３０％未満の蛋白質としては、例えばミルクカゼインやミルクホエイ蛋白質、畜肉蛋白質、魚肉蛋白質、卵白蛋白質、コーン蛋白質等があげられる。酸性アミノ酸数とアミド数の総数が全アミノ酸数の１０％以上２０％未満の蛋白質としては、例えばコラーゲン等があげられる。
コラーゲンから得られるゼラチンも、本発明の蛋白質として使用できる。ゼラチンには酸処理により得られるゼラチン（タイプＡ）と、アルカリ処理により得られるゼラチン（タイプＢ）の二種類がある。両者ともに使用できるが、タイプＢのゼラチンではアミド結合の大部分が分解されているので、脱アミド処理をすることなく使用することもできる。
蛋白質の加水分解処理は、酸、アルカリ等を用いる化学処理方法または蛋白質加水分解酵素を用いる酵素処理方法等により行うことができるが、酵素処理法で行うのが好ましい。
蛋白質加水分解酵素としては、エンドペプチダーゼ（プロテイナーゼともいう）およびエキソペプチダーゼがあげられるが、エンドペプチダーゼを用いることが好ましい。
エンドペプチダーゼとしては、例えばトリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン等のセリンプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、フィシン等のチオールプロテアーゼ、ペプシン、キモシン等のカルボキシルプロテアーゼ、サーモリシン等のメタルプロテアーゼ等があげられる。
エンドペプチダーゼとして市販されているものとしては、例えばペプシン、マルチフェクトＰ−３０００（協和エンザイム社製）、ビオプラーゼ（長瀬産業社製）、アルカラーゼ（ノボ社製）等があげられる。
蛋白質加水分解酵素としてエキソペプチダーゼ活性を有するエンドペプチダーゼを使用すると、エキソペプチダーゼの作用により遊離のアミノ酸や低分子のペプチドに由来する旨味が生成したり苦味が減少するため、好ましい結果が得られる場合がある。
エキソペプチダーゼ活性を有する酵素としては、例えばスミチームＦＰ（新日本化学社製）やアクチナーゼ（科研製薬社製）があげられる。
蛋白質加水分解酵素の使用量は、使用する酵素と蛋白質の種類等により異なるが、加水分解処理する蛋白質の０．０５〜８％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、０．１〜６％（ｗ／ｗ）であることがより好ましく、１〜４％（ｗ／ｗ）であることが特に好ましい。
蛋白質の加水分解処理のｐＨや反応温度は、使用する酵素の最適条件またはそれに近い条件を採用することができる。反応条件は、最終的には得られる加水分解物の食塩味増強作用や味質を考慮して決定できる。蛋白質加水分解酵素の使用量、反応ｐＨ、反応温度、安定性等の情報は、酵素供給者から入手できる。
ｐＨの調整は、塩酸、酢酸、乳酸、クエン酸またはリン酸のような任意の適当な飲食品に許容しうる酸、または水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのような任意の適当な飲食品に許容しうるアルカリにより行うことができる。蛋白質の加水分解処理時間は、使用する蛋白質加水分解酵素の種類、その使用量、温度、ｐＨ条件等で異なるが、１〜１００時間が好ましく、６〜７２時間がより好ましい。
加水分解処理終了後、反応液をそのまま次の処理に供することもできるが、加熱処理や酸処理により酵素を失活させた後に次の処理に供することもできる。
脱アミド処理工程について、以下に説明する。
脱アミド処理方法としては化学的方法と酵素を用いる処理方法があげられる。脱アミド処理反応は、前述の蛋白質加水分解処理前に行うこともできるし、蛋白質加水分解処理後に行うこともできる。また、蛋白質加水分解処理と同時に行うこともできる。
化学的な脱アミド方法は、公知の方法を用いることができる。一般的には蛋白質を酸で加熱処理する。酸としては、塩酸、硫酸等の無機酸および酢酸、乳酸等の有機酸があげられ、高い脱アミド率を目的とする場合には塩酸を使用するのが好ましい。塩酸を使用する脱アミド反応は、例えば、塩酸濃度は０．４〜１．０ｍｏｌ／Ｌ、温度は５０〜１２５℃、加熱時間は１０〜１８０分間で行うことができる。
具体的方法としては、例えばFood Technol., 15(3), 141 (1961)、 J. Food Sci., 40, 1283 (1975)、 J. Agric. Food Chem., 24, 504 (1974)、日本農芸化学会誌、 55, 983 (1981)およびAgric. Biol. Chem., 49, 1251 (1985）等に記載の方法があげられる。
酸で脱アミド反応を行った場合には、反応終了後に中和剤等を用いて中和する必要がある。中和剤としては、水酸化ナトリウムが一般的に用いられるが、目的とする食塩味増強剤がナトリウムを含まないことを望むのであれば、水酸化カリウム等、飲食品加工に使用される他のアルカリ剤が用いられる。遊離の塩基性物質を中和剤の一部または全部に使用することもできる。遊離の塩基性物質としては、例えばアルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸があげられる。
酵素による脱アミド反応は、公知の方法で行うことができる。
第一の方法として、エンドペプチダーゼを用いる加水分解反応を用いる方法があげられる。本反応では、ペプチド結合の分解とともに脱アミド反応が進行する。使用する酵素としては、例えばパパイン、トリプシン、パンクレアチン、アルカラーゼ（ノボ社製）、プロナーゼ（科研化学製）等があげられる。反応は、通常ｐＨ８〜１１、１０〜７５℃で６〜４８時間行う。
具体的方法としては、例えばAgric. Biol. Chem., 50, 1989 （1986）、J. Agric. Food Chem., 35, 224 （1987）、J. Agric. Food Chem., 35, 285 （1987）、J. Food Sci., 55, 127 （1990）、特開平３−９１４４５号公報等に記載の方法があげられる。
第二の酵素的方法として、ペプチド中のグルタミンのアミド結合を加水分解するペプチドグルタミナーゼ［Biochemistry, 10, 1222 （1971）］を使用する方法があげられる。この方法により、より高い脱アミド率が得られる。ペプチドグルタミナーゼでの処理は、蛋白質を加熱処理した後、または蛋白質を酵素により加水分解処理した後に行うと効率を向上させることができるので好ましい［J. Food Sci., 53, 1132 （1988）、J. Food Sci., 54, 598 （1989）、JAOCS, 68, 459 （1991）およびJ. Agric. Food Chem., 40, 719 （1992）］。
蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドの分子量は、４００〜３０，０００が好ましく、５００〜３０，０００がより好ましく、７００〜２７，０００が特に好ましい。ペプチド鎖長は、３〜２５０が好ましく、４〜２５０がより好ましく、６〜２３０が特に好ましい。
蛋白質の脱アミド処理とそれに続く加水分解処理、あるいは加水分解処理とそれに続く脱アミド処理は、文献記載の方法［J. Cereal Sci., 21, 153 （1994）および日本家政学会誌，45, 615 (1994）］に準じて行うこともできる。本発明の食塩味増強作用をもつ蛋白質加水分解物を取得するのに必要な脱アミド率は蛋白質中の酸性アミノ酸の含量とアミドの含量により異なるが、２０％以上が好ましく、５０％以上がより好ましく、８０％以上が特に好ましい。
蛋白質を加水分解処理、および必要に応じて脱アミド処理して得られる溶液は、そのまま飲食品に添加したり、食塩味増強剤または食塩味調味料に用いてもよいが、該溶液を活性炭、限外濾過膜等による脱色処理、クロマトグラフィー、膜分離等による分離精製処理、減圧濃縮等による濃縮処理等をして得られる、脱色液、精製液、濃縮液等の液体、該液体を減圧乾燥、噴霧乾燥等、乾燥処理して得られる固形物、粉末等として、これを飲食品に添加したり食塩味増強剤または食塩味調味料に用いてもよい。
塩基性物質は、蛋白質を加水分解処理、および必要に応じて脱アミド処理して得られるペプチドの食塩味増強作用をさらに強化する。該塩基性物質としては、飲食品に添加でき、ペプチドの食塩味増強作用を強化するものであれば特に制限が無く、例えば塩基性アミノ酸があげられる。
塩基性アミノ酸としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチン等があげられ、特にアルギニンが好ましい。塩基性物質は対象とする食品中の濃度が３〜５０ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは８〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇになるように使用する。アルギニンの場合には、０．０４〜０．９％、好ましくは０．１５〜０．４％である。
本発明のペプチドによる食塩味増強作用は、コハク酸によっても強化される。コハク酸は貝特有の味として知られている。コハク酸は、コハク酸特有の味が感じられない閾値濃度である０．０２％以下の濃度でもその効果を発揮する。コハク酸は遊離酸または塩として対象とする食品中の濃度が０．００１〜０．１％、好ましくは０．００５〜０．０３％になるように使用する。
本願発明の食塩味増強方法の対象となる飲食品としては、食塩を含有しない飲食品でも食塩を含有する飲食品でも、飲食時に食塩が含まれる食品であれば特に制限はない。飲食品としては、例えば味噌、醤油、たれ、だし、ドレッシング、マヨネーズ、トマトケチャップ等の調味料、お吸い物、コンソメスープ、卵スープ、ワカメスープ、フカヒレスープ、ポタージュ、みそ汁等のスープ類、麺類（そば、うどん、ラーメン、パスタ等）のつゆ、スープ、ソース類、おかゆ、雑炊、お茶漬け等の米調理食品、ハム、ソーセージ、チーズ等の畜産加工品、かまぼこ、干物、塩辛、珍味等の水産加工品、漬物等の野菜加工品、ポテトチップス、煎餅、クッキー等の菓子スナック類、煮物、揚げ物、焼き物、カレー等の調理食品等があげられる。
本発明の食塩味増強剤は、酸性ペプチドまたは蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドを含有し、必要に応じて塩基性物質および／またはコハク酸を含有し、さらに必要に応じて無機塩、酸、アミノ酸類、核酸、糖類、賦形剤等の飲食品に使用可能な各種添加物を含有していてもよい。
また本発明の、食塩味調味料は、酸性ペプチドまたは蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドならびに食塩を含有し、必要に応じて塩基性物質および／またはコハク酸を含有し、さらに必要に応じて調味料、香辛料、無機塩、酸、アミノ酸類、核酸、糖類、賦形剤等の飲食品に使用可能な各種添加物を含有していてもよい。
無機塩としては、食塩、塩化カリウム、塩化アンモニウム等があげられる。酸としては、アスコルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、脂肪酸等のカルボン酸およびそれらの塩等があげられる。該塩としては、ナトリウムおよびカリウム塩があげられる。アミノ酸としては、グルタミン酸ナトリウム、グリシン等があげられる。核酸としてはイノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム等があげられる。糖類としては、ショ糖、ブドウ糖、乳糖等があげられる。調味料としては醤油、味噌、エキス等の天然調味料、香辛料としては各種の香辛料があげられる。賦形剤としては澱粉加水分解物であるデキストリン、各種澱粉等があげられる。これらの使用量は、使用目的に応じて適宜設定することができるが、例えばペプチド１００重量部に対して０．１〜５００重量部使用できる。
本発明において減塩飲食品とは、通常の食塩濃度に比べて食塩濃度が低い濃度の飲食品をいうが、一般には、食塩濃度が通常の食塩濃度の８０％（ｗ／ｗ）以下である飲食品をいう。通常の食塩濃度は、飲食品の種類、製品により異なるが、本願発明で適用される飲食品の食塩濃度は特に制限はない。
飲食品に使用する食塩味増強剤および食塩味調味料の量は、対象食品に対して酸性ペプチドとして０．０１〜1．５％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．１〜０．８％（ｗ／ｗ）である。蛋白質を分解して得られるペプチド混合物の場合には、原料蛋白質にもよるが通常はペプチドとして０．０２〜２．０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．２〜１．０％（ｗ／ｗ）である。食塩味増強剤中に食塩が含まれ、その含量が高すぎる場合には脱塩処理により食塩含量を低下させてから使用する。脱塩処理は電気透析法や逆浸透法で行うことができる。
以下に、本発明において用いた分析法について示す。
１．蛋白質およびペプチドの定量法
蛋白質および加水分解物中のペプチドの量は全窒素（Ｔ−Ｎ）の量より求めた。全窒素の定量はキエルダール法またはデュマ法により行った。平均ペプチド鎖長を求める際の窒素量としては、全窒素量から下記に述べる方法で測定したアンモニア量を差し引いた値を用いた。蛋白質の量およびペプチド量は全窒素量に換算係数を掛けて求めた。換算係数はグルテンでは５．７を用い、他の蛋白質では６．２５を用いた。
２．アミノ態窒素定量法
アミノ態窒素の定量は、トリニトロベンゼンスルフォン酸を発色試薬とする比色法［Agric. Biol. Chem., 50, 1217 (1986)］で行った。低分子のペプチドのみでなく高分子のペプチドも測定対象とするためトリクロロ酢酸による除蛋白質処理は省略した。標準物質としてロイシンを用いた。アンモニウムイオンもトリニトロベンゼンスルフォン酸と反応して発色するため、硫酸アンモニウム標準溶液の吸光度と試料中のアンモニウムイオン濃度に基づき算出したアンモニウムイオンの吸光度を差引き、アミノ態窒素濃度を求めた。
３．アンモニア定量法
アンモニアの定量はデタミナーＮＨ3（協和メデックス社製）を用いる酵素法により行った。
４．平均ペプチド長
平均ペプチド長は加水分解物中の全窒素量をアミノ態窒素の量で割って得た。
５．脱アミド率
蛋白質中のアミド結合の脱アミド率（％）は、蛋白質中のアミド態窒素に対する脱アミド反応により生成したアンモニア態窒素の割合で示した。蛋白質中のアミド態窒素は約１ｇの蛋白質を正確に秤量し、これを５０ｍｌの２ｍｏｌ／Ｌ塩酸中で、１２０℃で３０分間加熱した後、生成するアンモニアを測定して求めた。
６．アミノ酸分析法
遊離アミノ酸はそのまま、蛋白質およびその加水分解物中のペプチドのアミノ酸組成は塩酸分解後、アミノ酸自動分析計で行った。
・  酸性ペプチドの分画
ペプチド混合物からの酸性ペプチド画分は、イオン交換体としてＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア バイオテック社製）を使用したイオン交換クロマトグラフィーにより取得した。
８．食塩濃度測定法
酵素加水分解処理および脱アミド処理に使用した水酸化ナトリウムの量と原料由来のナトリウムの量から酵素加水分解物中のナトリウム濃度を計算により求め、食塩濃度とした（計算法）。また、ナトリウムイオン選択電極（メトラートレド社製）により測定した（電極法）。両者の測定結果はほぼ一致していた。
９．食塩味増強作用評価法１
食塩濃度を０．１００ｍｏｌ／Ｌに調整した試験物質溶液の食塩味を、０．１００ｍｏｌ／Ｌ（０．５８％（ｗ／ｖ））、０．１２５ｍｏｌ／Ｌ（０．７３％（ｗ／ｖ））、０．１５０ｍｏｌ／Ｌ（０．８８％（ｗ／ｖ））および０．１７５ｍｏｌ／Ｌ（１．０２％（ｗ／ｖ））の食塩標準溶液の食塩味と比較し、どの標準食塩溶液の食塩味と同じかまたは近いか、パネルにより第１表に示す評点法で食塩味増強物質の食塩味増強作用を評価した。パネルは飲食品の調味の専門家で構成した。
【表１】
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１０．食塩味増強作用評価法２（恒常刺激法）
食塩濃度を０．１０ｍｏｌ／Ｌに調整したペプチド溶液を試験溶液とした。標準食塩溶液として、０．０８ｍｏｌ／Ｌ、０．０９ｍｏｌ／Ｌ、０．１０ｍｏｌ／Ｌ、０．１１ｍｏｌ／Ｌ、０．１２ｍｏｌ／Ｌ、０．１３ｍｏｌ／Ｌ、０．１４ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌおよび０．１６ｍｏｌ／Ｌの標準食塩溶液を調製した。これらの標準食塩溶液から試験溶液の食塩味の強さがほぼ中間になるように連続した５段階の標準溶液を選び、試験溶液の食塩味（恒常刺激にあたる）と比較し、どちらの食塩味が強いか不等号または等号で表した。それぞれの標準食塩濃度について、標準溶液の食塩味を強いとしたパネルメンバーの全パネルメンバーに対する割合（以下、この割合を判断出現率という）と標準溶液の食塩味を弱いとしたパネルメンバーの全パネルメンバーに対する割合を求め、これらの数値を横軸の標準食塩濃度（恒常刺激の強さ）に対して正規確率紙にプロットし、試験溶液が強い割合と弱い割合についてそれぞれ直線を引いた。この２本の直線上で５０％の判断出現率に対する２点の濃度の中間値が試験物質溶液の等価食塩濃度とした。なお、等価濃度は２本の直線の交点またはその近傍の濃度として得られる（佐藤信著、「統計的官能検査法」、第２版、３０４頁、１９９５年、日科技連出版社）。パネルは飲食品の調味の専門家１２〜１５名で構成した。
以下に本発明の実施例を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
実施例１
小麦グルテン粉末１３４ｇ（Ｔ−Ｎ：１１８ｍｇ／ｇ、アミド態窒素：１．８８ｍｍｏｌ／ｇ、ウェストンフーズ社製）を０．６ｍｏｌ／Ｌ塩酸８６６ｍｌに分散させ、オートクレーブ中１２０℃で２時間加熱し、脱アミドされたグルテン分散液９１０ｍｌを得た。この分散液のｐＨを２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで８．０に調整した後、蛋白質分解酵素マルチフェクトＰ−３０００（協和エンザイム社製）６ｍｌを加えて、４０℃で２０時間、加水分解反応を行なった。反応中、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した。反応後、加水分解液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨを６．０に調整した後、８０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、活性炭１０ｇを添加して脱色し、濾過して、小麦グルテンを加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドを有効成分とする食塩味増強作用を有するグルテン分解液１，２００ｍｌを得た。この分解液の窒素濃度は１２．８ｇ／Ｌ、食塩濃度は０．５０５ｍｏｌ／Ｌであった。
得られた分解液を用いて、第２表に示される組成の評価液を調製した。なお、評価液中のペプチド濃度は、分解液中のペプチド濃度の１／１０倍、評価液中の食塩濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌに、それぞれ調整した。
【表２】
0004445691.tif 000003
この溶液の食塩味増強作用を食塩味増強作用評価法１に従って評価したところ、評価液の食塩味は食塩濃度０．１２５ｍｏｌ／Ｌにほぼ等しく評点２であった。
食塩味増強作用評価法２で評価液の食塩味増強作用を評価したところ、等価食塩濃度は０．１２９ｍｏｌ／Ｌであった。
また、従来技術の中で食塩味増強作用ならびに味質の点から比較的評価の高いアルギニンとアスパラギン酸の等モル混合物（米国特許５，１４５，７０７号）を評価した。０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩、０．０２ｍｏｌ／Ｌアルギニンおよび０．０２ｍｏｌ／Ｌアスパラギン酸を含有する水溶液を調製し、等価食塩濃度を評価した結果は、０．１２５ｍｏｌ／Ｌであった。アルギニンおよびアスパラギン酸濃度をさらに上昇させても等価食塩濃度の上昇は生じなかった。また、０．０２ｍｏｌ／Ｌアルギニン（塩酸塩）および０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩を含有する水溶液、ならびに０．０２ｍｏｌ／Ｌアスパラギン酸（ナトリウム塩）および０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩を含有する水溶液について、等価食塩濃度はそれぞれ０．１１６ｍｏｌ／Ｌおよび０．１１１ｍｏｌ／Ｌであった。
評価液中のアルギニン濃度は０．０１２ｇ／Ｌ、リジン濃度は０．００７ｇ／Ｌ、アスパラギン酸濃度は０．１４８ｇ／Ｌであった。そこで、０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩、０．０１２ｇ／Ｌアルギニン、０．００７ｇ／Ｌリジンおよび０．１４８ｇ／Ｌアスパラギン酸を含有する水溶液を調製し、該水溶液の等価食塩濃度を評価した結果は０．１００ｍｏｌ／Ｌであった。
実施例２
小麦グルテン粉末１３４ｇを実施例１と同様に処理して脱アミド処理されたグルテン分散液９１０ｍｌを得た。この分散液にアルギニン４２ｇを加え、さらに２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０とし、以降の処理は実施例１と同様に行い、蛋白質を脱アミド処理および酵素分解処理して得られるペプチドとアルギニンを有効成分とする食塩味増強作用を有するグルテン分解液１，１００ｍｌを得た。この分解液の食塩濃度は０．３５１ｍｏｌ／Ｌであり、分解液の遊離アミノ酸の分析結果からアルギニン濃度は３４．２ｇ／Ｌであり、アルギニンを除く窒素量は１４．０ｇ／Ｌであった。
得られた分解物を用いて、第３表に示される組成の評価液を調製した。なお、評価液中のペプチド濃度は、分解液中のペプチド濃度の１／１０倍、評価液中の食塩濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌに、それぞれ調整した。
【表３】
0004445691.tif 000004
この溶液の食塩味増強作用を食塩味増強作用評価法１で評価したところ、１０倍希釈液の食塩味は食塩濃度０．１５ｍｏｌ／Ｌとほぼ同じで評点４であった。  評価法２に従って評価したところ、評価液の等価食塩濃度は０．１４９ｍｏｌ／Ｌであった。
本分解液とアルギニンを組合わせることによって食塩味増強作用が（分解液単独では、０．１ｍｏｌ／Ｌの食塩の食塩味が０．１２５ｍｏｌ／Ｌに上昇したことから、０．０２５量を１倍として比較すると）、アルギニンを使用することにより約２倍に上昇した。
等価食塩濃度が０．１２５ｍｏｌ／Ｌである、０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩、０．０２ｍｏｌ／Ｌアルギニンおよび０．０２ｍｏｌ／Ｌアスパラギン酸を含有する水溶液のアルギニン濃度は３．４８ｇ／Ｌであり、本評価液中のアルギニン濃度（３．４２ｇ／Ｌ）とほとんど同じである。このことから、評価液中の小麦グルテンを加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドはアルギニンと共に食塩味増強作用を発現する際にアスパラギン酸よりもはるかに優れていることを示している。
実施例３
分離大豆蛋白質（Ｔ−Ｎ：１３２ｍｇ／ｇ、アミド態窒素：０．９５８ｍｍｏｌ／ｇ、不二製油社製）５０ｇを水４５０ｍｌに分散させ、５０℃でアルカラーゼを１ｍｌ加えてｐＨ未調整のまま３０分間反応させた後、６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨを８に上昇させ、５０℃で２１時間反応させた。反応中、ｐＨは８に維持した。反応後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨを６．０に合わせ、８５〜９０℃で２０分間加熱して酵素を失活させた後、遠心分離と濾過を行って透明な分解液４４５ｍｌを得た。全窒素濃度は１３．１０ｇ／Ｌ、食塩濃度は０．１７７ｍｏｌ／Ｌであった。遊離アルギニン濃度は０．０１ｇ／Ｌ以下であった。なお脱アミド率は２０％であった。評価法１で、１０倍希釈した分解物の食塩味増強作用を評価したところ、アルギニンが存在しない場合には評点１、０．０１２ｍｏｌ／Ｌ濃度のアルギニンの存在下では評点２であった。
実施例４
アルカラーゼ８ｍｌを含む５５℃の温水３，４６０ｍｌに、グルテン５３２ｇを徐々に加え、温度を５５℃に保ち、２４時間反応させた。反応中、ｐＨを６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで７．０に調整した。得られた酵素分解液３，８４８ｍｌから３，８００ｍｌをとり、濃塩酸２２６ｍｌを加え、１１５℃で９０分間加熱し、脱アミド処理を行った。処理液３，９４０ｍｌを２等分し、一方には６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム２１８ｍｌを加え、もう一方には６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム１３５ｍｌとアルギニン８５．５ｇとを加えて、それぞれ中和液を得た。中和液にそれぞれ活性炭を３４ｇ加えて脱色した後、濃縮して、それぞれ１，６００ｍｌの塩味増強作用を有するペプチド溶液を得た。アルギニンを含有しないペプチド溶液（試料１）のペプチド濃度は９４．６ｇ／Ｌ、食塩濃度は０．９２ｍｏｌ／Ｌであった。アルギニンを含有するペプチド溶液（試料２）のペプチド濃度は９４．６ｇ／Ｌ、食塩濃度は０．６２ｍｏｌ／Ｌ、アルギニン濃度は５０．０ｇ／Ｌであった。
食塩味増強作用評価法２に準じてこれらの食塩味増強作用を評価した。試料１は食塩濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ中、ペプチド濃度１％で等価食塩濃度は０．１２６ｍｏｌ／Ｌであった。試料２はペプチド濃度０．４％で等価食塩濃度０．１２６ｍｏｌ／Ｌ、０．８％で０．１４０ｍｏｌ／Ｌ、１．０％（ｗ／ｖ）で０．１５６ｍｏｌ／Ｌ、１．２５％（ｗ／ｖ）で０．１６２ｍｏｌ／Ｌであった。
試料２のペプチドを０．８％含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．１０ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌおよび０．２０ｍｏｌ／Ｌの食塩溶液の等価食塩濃度は、それぞれ０．０６９ｍｏｌ／Ｌ、０．１４０ｍｏｌ／Ｌ、０．２２２ｍｏｌ／Ｌおよび０．２９１ｍｏｌ／Ｌであった。食塩溶液の塩味は、それぞれ１．３８倍、１．４０倍、１．４８倍および１．４６倍増強されたことになる。
実施例５
小麦グルテン（Ｔ−Ｎ：１１８ｍｇ／ｇ、アミド態窒素：１．８８ｍｍｏｌ／ｇ、ウェストンフーズ製品）６７ｇ、分離大豆蛋白質（Ｔ−Ｎ：１３２ｍｇ／ｇ、アミド態窒素：０．９５８ｍｍｏｌ／ｇ、不二製油社製）６０ｇ、カゼイン（Ｔ−Ｎ：１３３ｍｇ／ｇ、アミド態窒素：０．７８５ｍｍｏｌ／ｇ、シグマ社製）５０ｇおよびツエイン（Ｔ−Ｎ：１３５ｍｇ／ｇ、アミド態窒素：１．６２ｍｍｏｌ／ｇ、シグマ社製）５０ｇを、それぞれ０．６ｍｏｌ／Ｌ塩酸４３３ｍｌ、４４０ｍｌ、４５０ｍｌおよび４５０ｍｌに分散し、オートクレーブ中、１２０℃で１２０分間加熱して脱アミド処理を行った。脱アミド率は、グルテンと分離大豆蛋白質でそれぞれ約９０％、カゼインとツエインでそれぞれ約１００％であった。反応液を５０℃まで冷却後、それぞれの反応液を６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した後、蛋白質分解酵素アルカラーゼ（ノボ社製）１ｍｌを加え、５０℃で２０時間、加水分解処理を行った。反応中、ｐＨを６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで８．０に維持した。分解反応後、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨを６．０に合わせ、８５〜９０℃で２０分間加熱して酵素を失活させた後、遠心分離と、上清に濁りがある場合には濾過を行って透明な分解液をそれぞれ４１５ｍｌ、４１５ｍｌ、４９８ｍｌおよび４５２ｍｌ取得した。全窒素濃度は、それぞれ１６．２７ｇ／Ｌ、１４．９１ｇ／Ｌ、１２．７０ｇ／Ｌおよび１０．９９ｇ／Ｌで、食塩濃度は、それぞれ０．７０４ｍｏｌ／Ｌ、０．７７４ｍｏｌ／Ｌ、０．７３２ｍｏｌ／Ｌおよび０．６９０ｍｏｌ／Ｌであった。
評価液は、分解液の１０倍希釈液に、食塩濃度がそれぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌになるように食塩を添加して調製した。
評価液の食塩味増強作用を評価法１で評価したところ、評点はそれぞれ２であった。
次にアルギニンを使用した場合の食塩味増強作用を評価法１で評価した。評価液として、ペプチド濃度が分解液中のペプチド濃度の１／１０倍、食塩濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ、アルギニン塩酸塩を用い、アルギニン濃度が０．０１２ｍｏｌ／Ｌ（２．０９ｇ／Ｌ）となるように調製した溶液を用いた。
それぞれの評価液について、アルギニン塩酸塩を使用した分解液の評点は４であった。この結果から広範囲の蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドが食塩味増強作用を持ち、アルギニンでその作用がさらに増強することが示された。
蛋白質を分解して得られるペプチドが食塩味増強作用を有し、この食塩味増強作用がアミド結合の分解から生じたアンモニウム塩と酸処理や酵素分解から生じた遊離アミノ酸によるものでないことを確認するため、分解液を高架橋度強酸性陽イオン交換樹脂で処理し、分解液中のアンモニウムイオンと遊離アミノ酸ならびに一部の低分子量のペプチドを除去した分解液を調製し、この食塩味増強作用を調べた。なお高架橋度強酸性陽イオン交換樹脂としてダイヤイオンＳＫ１１６（三菱化学社製）を使用した。
分解液からのアンモニウムイオン、遊離アミノ酸および低分子量のペプチドの除去は以下の通り行った。イオン交換樹脂（Ｈ型）２５０ｍｌを充填したカラムに分解液５０ｍｌを通塔した後、水を流し、流出液７５０ｍｌを得た。得られた溶出液を濃縮し、ｐＨを６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨ６．５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。次にカラムに２ｍｏｌ／Ｌアンモニアを流し、溶出液７５０ｍｌを得てそれを濃縮し、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ６．５に調整し、水を加えて１００ｍｌにした。ｐＨ調整前のｐＨは６．５から７．２の範囲であった。分解液と流出液について、遊離アミノ酸濃度、アンモニア濃度、平均ペプチド長を求めた。
第４表に結果を示す。なお流出液と溶出液の濃度は分解液５０ｍｌに換算して表示した。
【表４】
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流出液の遊離アミノ酸とアンモニアの濃度は、分解液中の濃度の１００分の１以下であり、ほとんどの遊離アミノ酸とアンモニア除去されていた。平均ペプチド長の変化から遊離アミノ酸と低分子量のペプチドは溶出液に、長いペプチドは流出液に分画されていることが判る。分解液の平均ペプチド長がエンドペプチダーゼによる通常の分解物の平均ペプチド長に比較してかなり低いのは、脱アミドのために塩酸加熱処理を受けているからである。
５倍に希釈した流出液と溶出液の食塩味増強作用を、０．０１２ｍｏｌ／Ｌ濃度のアルギニンの存在下、評価法１で評価したところ、いずれの流出液も評点４であり、溶出液の評点は０であった。流出液と溶出液を同時に含む５倍希釈液の食塩味増強作用は分解液と同じで評点４であった。アルギニンを使用しない場合も流出液は評点２、溶出液は評点０、両者の組み合わせでは評点２と、同様の傾向を示した。
これらの結果から、分解液中の遊離アミノ酸とアンモニウム塩は分解物の食塩味増強作用の発現に必須ではないことが確認された。
各蛋白質の分解液１００ｍｌを、それぞれ透析チューブ（和光純薬社製、分画分子量１２，０００〜１４，０００）に注入し、流水にて２昼夜透析した。透析内液に蒸留水を加えてそれぞれ２００ｍｌにあわせた。このようにして調製した溶液中を用い、透析内液の遊離アミノ酸濃度、アンモニア濃度および平均ペプチド長を求めた。
結果を第５表に示す。なお、それぞれの濃度は分解液１００ｍｌに含まれる濃度と対応するように換算して表示した。
【表５】
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透析により透析内液の遊離アミノ酸とアンモニアの濃度は分解液中の濃度の１％以下に減少していた。
食塩味増強作用は食塩濃度を０．１ｍｏｌ／Ｌに調整した透析内液５倍希釈液と、同時に対照として、同じ食塩濃度の分解液１０倍希釈液について、評価法１により評価した。アルギニンが存在しない場合には透析内液希釈液も加水分解液希釈液も評点２でほぼ同等の増強作用を示し、アルギニンが存在する場合には何れの希釈液も評点４であり、ほぼ同等の増強作用を示した。この結果は、先のイオン交換樹脂による分画実験の結果と同様、遊離アミノ酸やアンモニウム塩が本発明の食塩味増強作用発現に必須の成分でないことを示している。また本透析実験の結果からは食塩味増強作用を発揮する有効成分は低分子ペプチドでないことを示している。透析内液そのものは、いずれも食塩味が感じられなかった。
原料蛋白質、分解液および透析内液を塩酸で分解し、それぞれのアミノ酸組成を測定し、全アミノ酸重量に対する酸性アミノ酸重量の比率（重量％）を求めた。
結果を第６表に示す。
【表６】
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また、アミノ酸組成から全アミノ酸に対する酸性アミノ酸の比率（モル％）を求めた。
結果を第７表に示す。
【表７】
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食塩味増強作用の活性を有する透析内液では、重量％およびモル％ともに原料蛋白質および分解液に比較して酸性アミノ酸の比率が高まり、酸性ペプチドの存在比率が高まっていることを示している。
食塩味増強作用を有するペプチドの分子量を求めるため、ゲル濾過をおこなった。試料はそれぞれの分解液を活性炭で脱色後、もとの分解液の２倍に濃縮し、脱塩して食塩を除去した濃縮分解液を使用した。脱塩はマイクロ・アシライザーＳ１（旭化成工業社製）を使用する電気透析で行なった。ゲルとしてはＳｕｐｅｒｄｅｘ 7５ Ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅ（ファルマシア バイオテック社製）を使用した。ゲル濾過は０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸−０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩緩衝液（ｐＨ６．８）で緩衝化したカラム（ゲルベッド：直径５ｃｍ、高さ５０ｃｍ）で行った。あらかじめ標準物質として分子量１，３５５のビタミンＢ１２および分子量６，５００から６７，０００の標準蛋白質を分画し溶出位置を測定し、分子量２，３００未満、２，３００〜７，３００および７，３００より大の３画分の溶出位置を求めた。食塩味増強作用の官能評価の対照として０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸−０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩緩衝液（ｐＨ６．８）を使用した。試料の量は１０ｍｌとした。
各画分の食塩味増強作用を官能評価した結果、４種の蛋白質について、いずれの画分にも増強活性が認められ、活性ペプチドの分子量は広い範囲に及んでいた。また、試料中のペプチドの最大分子量は２７，０００〜３０，０００であった。
実施例６
グルタミンを高濃度で含有する市販のペプチド製品を脱アミド処理を行って得られる処理液について、食塩味増強作用を調べた。
ペプチド製品としては、「グルタミン ペプチド ＷＧＥ ８０ ＧＰＮ」および「グルタミン ペプチド ＷＧＥ ８０ ＧＰＵ」（いずれもＤＭＶ インタナショナル社製）を使用した。「グルタミン ペプチド ＷＧＥ ８０ ＧＰＮ」はグルタミンを２５％（ｗ／ｗ）含み、平均分子量が６７０であり、５００未満の分子量のペプチドを６６％（ｗ／ｗ）、５００〜１，０００の分子量のペプチドを１９％、１，０００〜１０，０００の分子量のペプチドを１５％（ｗ／ｗ）含む。「グルタミン ペプチド ＷＧＥ ８０ ＧＰＵ」はグルタミンを２９％（ｗ／ｗ）含み、平均分子量が６，７００であり、５００未満の分子量のペプチドを１４％（ｗ／ｗ）、５００〜１，０００の分子量のペプチドを１１％（ｗ／ｗ）、１，０００より大きな分子量のペプチドを７５％（ｗ／ｗ）含む。また、「グルタミン ペプチド ＷＧＥ ８０ ＧＰＵ」は１０，０００より大きな分子量のペプチドを２３％含んでいる。
これらのペプチド製品を、それぞれペプチド濃度１０％となるように０．６５ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解させ、１１５℃で９０分間加熱して脱アミド反応させた後、反応液を６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで中和した。
これらの中和液を用いて、食塩味増強作用を評価した。評価液としてペプチド０．４％（ｗ／ｖ）、食塩０．１ｍｏｌ／Ｌおよびアルギニン０．０１２ｍｏｌ／Ｌを含有する水溶液を調製し、食塩０．１ｍｏｌ／Ｌおよびアルギニン０．０１２ｍｏｌ／Ｌを含有する水溶液を対照液として塩味の強さを評価した。その結果、低分子量の「グルタミン ペプチド ＷＧＥ ８０ ＧＰＮ」の脱アミド処理物の塩味は対照液の塩味と同じで増強作用は認められず、高分子量の「グルタミン ペプチド ＷＧＥ ８０ ＧＰＵ」の脱アミド処理物の塩味は対照液の塩味より強く、増強作用が認められた。
実施例７
アルカラーゼ８ｇを溶解した６０℃の温水３，４００ｍｌにグルテン６００ｇを分散させ、６０℃で２０時間反応させた。反応中、６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に保持した。次に温度を５５℃に下げ、スミチームＦＰ（新日本化学工業社製）１ｇを加え、１０時間反応させ酵素分解液３，８０５ｍｌを得た。この分解液３，７８０ｍｌに濃塩酸２８０ｍｌを加え、１２０℃で１５分間加熱し、脱アミド処理を行った。処理液に６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを４９０ｍｌ加えて中和させた後、活性炭を７０ｇを加えて脱色させた。脱色して得られた溶液を濃縮し、濃縮液２，０６０ｍｌを得た。
本濃縮液１，９６０ｍｌにアルギニン１７２ｇとクエン酸１水塩７２ｇを溶解し、アルギニンを含有する液状の食塩味増強剤２，１３０ｍｌを得た。この組成は、ペプチド１６１ｇ／Ｌ、アルギニン８１ｇ／Ｌ、食塩７９ｇ／Ｌであった。
また、濃縮液の一部を、熱風供給温度１７５〜１８０℃、排風温度９０℃で噴霧乾燥し、粉末状の食塩味増強剤を得た。この組成は、ペプチド３８．０％（ｗ／ｗ）、アルギニン１９．０％（ｗ／ｗ）、食塩１６．９％（ｗ／ｗ）であった。この粉末の塩味増強作用を、ペプチドを０．４％（ｗ／ｖ）および０．６％（ｗ／ｖ）含む０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩溶液で評価したところ、等価食塩濃度はそれぞれ０．１２７ｍｏｌ／Ｌおよび０．１３５ｍｏｌ／Ｌであった。
実施例８
ペプチドを酸性画分と中性および塩基性の画分の２画分に分画し、それぞれの画分の食塩味増強作用とアミノ酸組成を調べた。
ペプチド混合物からの酸性ペプチド画分と中性および塩基性画分への分画はイオン交換クロマトグラフィーで実施した。イオン交換体としてＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア バイオテック社製）を使用した。
実施例４で取得したアルギニンを含有しないペプチド溶液（試料１）および実施例５で分離大豆蛋白質から取得した分解液を分画試料とした。分離大豆蛋白質からの分解液は実施例４に準じて脱色し濃縮した。これらのペプチド溶液を濃縮後、脱塩処理を行なった。ペプチド濃度が約１００ｇ／ＬでｐＨが３．５となるように１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液と水で調整し、７０ｍｌを０．０２ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）で緩衝化したイオン交換体のカラム（ゲルベッド：直径２．６ｃｍ、高さ２６ｃｍ）に通塔した。次に同じ緩衝液を流し、最初の流出液１１０ｍｌを除く３００ｍｌの流出液を酸性ペプチド画分とした。その後、０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．８）と０．５ｍｏｌ／Ｌ食塩を含有する水溶液により吸着ペプチドを溶出し、溶出液３００ｍｌを中性および塩基性画分とした。それぞれの画分は６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した。中性および塩基性画分は約４０ｍｌに濃縮して脱塩した。
脱塩後の分解液および分画画分について遊離アミノ酸と、塩酸分解して全アミノ酸を測定し、それぞれのアミノ酸について全アミノ酸の値から遊離アミノ酸の値を差し引いて、ペプチドのアミノ酸組成を求めた。このアミノ酸組成から全アミノ酸に対する酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸の比率（モル％）を求めた。
結果を第８表に示す。
【表８】
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第８表から明らかなように、それぞれの蛋白質について、酸性画分では分解液に比べて、酸性アミノ酸の比率が上昇し、塩基性アミノ酸の比率が低下した。中性および塩基性画分では分解液に比べて、酸性アミノ酸の比率が低下し、塩基性アミノ酸の比率が上昇した。
本試験結果での分解液の酸性アミノ酸比率が、実施例５の第７表に示されている酸性アミノ酸の比率よりも低いのは、酵素分解処理および酸による脱アミド処理で蛋白質中の酸性アミノ酸、特にアスパラギン酸の半分以上が遊離アミノ酸に変化していることが原因である。
分解液およびそれぞれの画分について、食塩味増強作用を比較した。分解液からはペプチド濃度が０．４％（ｗ／ｖ）で食塩濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの評価液を作製した。それぞれの画分からは分解液換算で分解液の評価液と同じ希釈度で、食塩濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの評価液を作製した。対照として０．１ｍｏｌ／Ｌの食塩溶液を使用した。
これらの評価液の食塩味増強作用を評価したところ、食塩味増強作用は酸性画分に存在し、中性および塩基性画分には増強作用は認められなかった。
なお、分解液、酸性画分、中性および塩基性画分のいずれにおいても、食塩味は認められなかった。また、０．１ｍｏｌ／Ｌ食塩および０．０２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．０）の塩味の強さは０．１ｍｏｌ／Ｌの食塩溶液と同じであり、上記結果に影響しないことを確認した。
実施例９
実施例１および実施例２で取得した分解物を食塩味増強剤として、野菜風味スープに使用し、その食塩味増強作用を調べた。食塩を除いたスープミックスの配合を第９表に示す。
【表９】
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第９表に示される配合のスープミックスと食塩または分解物を熱水に溶解し、スープ１Ｌを調製した。
試験区と配合量を第１０表に示す。
【表１０】
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第１０表における対照１のスープは、上記スープミックス０．５％（ｗ／ｖ）および食塩１％（ｗ／ｖ）なるよう調製した。また、試料１〜３には、ペプチド量としてスープ中の食塩量とほぼ等量の分解物を含む。なお、原料由来のナトリウムは僅かであるので、その減塩率の数値への影響は無視した。
食塩味の強さの評価は、食品の官能評価で汎用される評点法で行い、食塩濃度１％（ｗ／ｖ）のスープの食塩味の強さを５とする７段階評価法により行った。２０％または３０％減塩し、本発明の食塩味増強剤を使用しないスープも調製し、塩味の強さの評価の対照とした。
２０％減塩スープの食塩味について、１０名のパネルにより官能試験した結果を第１１表に示す。なお、ｔ検定により対照１（食塩濃度１％のスープ）と比較して５％の危険率で有意差が認められた試験区の結果に＊印をつけた。
【表１１】
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第１１表に示されるとおり、試料１は２０％減塩の対照２と比較して明らかに食塩味が増強されていた。試料２は対照１よりも有意差のある明らかに強い食塩味をもっていた。なお、食塩味増強剤の使用は、食塩味以外のスープの味に大きな影響を与えなかった。
３０％減塩スープの食塩味について、１０名のパネルにより官能試験した結果を第１２表に示す。
【表１２】
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第１２表に示されるとおり、実施例２の食塩味増強剤を使用して３０％減塩スープを作製した場合、食塩味は３０％減塩スープよりは、食塩味は強くなっていた。なお、本食塩味増強剤の使用は、食塩味以外のスープ味に大きな影響を与えなかった。
実施例１０
実施例９記載の試料３のスープにコハク酸二ナトリウムを０．０２％（ｗ／ｖ）となるよう添加し、３０％減塩スープ（試料４）を調製した。
３０％減塩スープの食塩味について、１４名のパネルにより官能試験した結果を第１３表に示す。
【表１３】
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第１３表に示されるとおり、０．０２％コハク酸二ナトリウムの添加により、蛋白質を加水分解処理および脱アミド処理して得られるペプチドの食塩味増強剤の作用が強化された。なお、本食塩増強剤の使用は、食塩味以外のスープの味に大きな影響を与えなかった。
実施例１１
実施例７で得られた液状の食塩味増強剤１，０００ｍｌに、食塩８０ｇを加え、噴霧乾燥して食塩味増強調味料を得た。これはペプチドと食塩をほぼ等量含み、減塩食卓塩として使用できる。
実施例１２
実施例７で得られた粉末状の食塩味増強剤を味噌汁、めんつゆおよびラーメンスープにそれぞれ添加し、その食塩味増強作用を評価した。
味噌汁は、第１４表に示される処方で調製した。なお、だし汁は、かつお節４０ｇを熱水４Ｌに加えて得た。
【表１４】
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めんつゆは、第１５表に示される処方で調製した。なお、だし汁は水３Ｌに、煮干し４０ｇ、昆布３０ｇおよび椎茸１５ｇを入れて加熱し、沸騰しかけたら昆布を引き上げ、弱火にしてけずり節５０ｇを入れ、椎茸が煮えるまで加熱して得た。醤油は減塩醤油（キッコーマン社製「 減塩しょうゆ」）を使用した。
【表１５】
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ラーメンスープは、第１６表に示される処方で調製した。なお、豚骨エキスは、「香露清湯」（協和醗酵工業社製）を使用した。スープミックスは、グルタミン酸ナトリウム１００ｇ、ＷＭＰ（イノシン酸ナトリウムとグアニル酸ナトリウムの等量混合物、協和醗酵工業社製）４ｇ、上白糖３０ｇ、ペッパー５ｇ、ジンジャー３ｇ、オニオン２０ｇ、ガーリック５ｇおよびメンマ末２ｇ（いずれも粉末）からなる。醤油はめんつゆに使用したものと同じである。
【表１６】
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評価結果を第１７表に示す。減塩しない食品（対照１）と本発明の食塩味増強剤を使用した２５％減塩食品の評点の間には、いずれの食品においても５％の危険率で有意差は認められなかった。塩味以外の味については特に味噌汁とめんつゆについて、だし風味と旨味の向上が明らかに認められた。また、この結果は、食塩味増強作用評価法２で得られる等価食塩濃度により、減塩効果を予測できることを示している。
【表１７】
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【産業上の利用可能性】
本発明により、食塩を含有する飲食品の食塩味増強方法ならびにそれに用いる食塩味増強剤および食塩味調味料が提供される。また、本発明により減塩飲食品が提供される。