(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）、
【化１】
0004439079.tif 000006
で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体またはその塩の、
式（ＩＩ）、
【化２】
0004439079.tif 000007
で示されるプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体への生物学的変換方法による、式（ＩＩ）で示されるプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体の製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、ミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属する菌株またはその培養菌体の調製物の存在下で、式（Ｉ）で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体またはその塩をインキュベーション処理する工程、
（Ｂ）インキュベーション処理液から式（ＩＩ）で示されるプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体の少なくとも１種を採取する工程、
を含んでなる方法。
【請求項２】
インキュベーション処理される物質が、メバスタチンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
インキュベーション処理液から採取される物質がプラバスタチンまたはその塩である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属する菌株が、ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ１４５２５株である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗高脂血症剤として有用なプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体の生物学的変換による製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プラバスタチンの製造方法、特に生物学的変換方法によるものとしては、イヌおよびウサギ肝臓ホモジネートを用いて、メバスタチンから変換する方法が、特開昭５７−２２４０号に開示されている。微生物を用いてメバスタチンから変換する方法として、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、カニンガメラ（ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属、シンセファロスポラム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｕｍ）属およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属を用いる製法が、特開昭５７−５０８９４号および特開昭５７−６７５７５号に開示されている。また、特開昭５７−１５５９９５号および特開昭５８−１０５７２号には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、リゾープス（Ｒｈｉｓｏｐｕｓ）、チゴリンクス（Ｚｙｇｏｒｙｎｃｈｕｓ）、シルシネラ（Ｃｉｒｅｉｎｅｌｌａ）、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）、フィコマイセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ピタノポラス（Ｐｙｔｈａｎｏｐｏｒｕｓ）およびリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）の各属に属する微生物を用いる方法が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メバスタチンを出発原料とした、生物学的変換方法によるプラバスタチンの新規な製造方法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成するために広範な微生物群からメバスタチンの６β位水素原子を水酸基に変換しうる微生物のスクリーニングを試みたところ、希少放線菌に分類されるミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属する菌株が前記変換能を有することを見出した。
【０００５】
従って、本発明は、  式（Ｉ）、
【化３】
0004439079.tif 000002
で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体またはその塩（以下、これらを総称してメバスタチン類ということがある）の、
式（ＩＩ）、
【化４】
0004439079.tif 000003
で示されるプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体（以下、これらを総称してプラバスタチン類ということがある）への生物学的変換方法による、式（ＩＩ）で示されるプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体の製造方法であって、
（Ａ）前記生物学的変換方法を行いうるものであって、かつ、ミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属する菌株またはその培養菌体の調製物の存在下で、式（Ｉ）で示されるメバスタチン、そのラクトン開環体またはその塩をインキュベーション処理する工程、
（Ｂ）インキュベーション処理液から式（ＩＩ）で示されるプラバスタチン、その塩またはそのラクトン閉環体の少なくとも１種を採取する工程、
を含んでなる方法を、提供することにより達成できる。
【０００６】
本発明の生物学的変換方法では、ミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属する微生物であって、前記式（Ｉ）で示されるメバスタチン類から前記式（ＩＩ）で示されるプラバスタチン類へ変換する能力を有する微生物、並びにそれらの培養菌体調製物であれば、種および株の種類を問うことなく使用できる。好ましい微生物として、ミクロテトラスポーラ・レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ１４５２５株を挙げることができる。本菌株は、ＩＦＯ（（財）発酵研究所；ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ  ＦＯＲ  ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ，ＯＳＡＫＡ）から容易に入手できる。
【０００７】
なお、本菌株の菌学的性状は次のとおりである。
１．形態
基生菌糸より直鎖状（Ｒｅｃｔｉｆｌｅｘｉｂｉｌｅｓ）の気中菌糸を伸長する。成熟した気中菌糸の先に４個の円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子のうは認められない。胞子の大きさは１．０×２．０μｍくらいで、胞子の表面は瘤状（ｋｎｏｂｂｙ）又は粗面状（ｒｕｇｏｓｅ）を示し、鞭毛は認められない。
【０００８】
２．各種培地における生育状態
培養は全て２８℃で行い、各種培地での生育結果を以下に示す。
（１）イースト・麦芽寒天培地
生育は良好で、その表面に気中菌糸を着生し、白色の胞子が見られる。培養裏面は薄い茶色である。溶解性色素は産生しない。
（２）オートミール寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を僅かに着生し、白色の胞子が見られる。培養裏面は薄い茶色である。茶色の溶解性色素を僅かに産生する。
（３）スターチ・無機塩寒天培地
生育は中程度で表面に気中菌糸を着生しない。培養裏面は無色である。溶解性色素は産生しない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を僅かに着生し、白色の胞子が見られる。培養裏面は無色である。溶解性色素は産生しない。
（５）チロシン寒天培地
生育は中程度で、その表面に気中菌糸を僅かに着生し、白色の胞子が見られる。培養裏面は無色である。培地中にメラニン色素を産生しない。
【０００９】
３．各種炭素源の同化性
プリードハム・ゴトリーブ寒天培地に各種の炭素源を加え生育を見た。
（１）Ｌ−アラビノース        ＋
（２）Ｄ−キシロース          ＋
（３）Ｄ−グルコース          ＋
（４）Ｄ−フルクトース        −
（５）シュークロース          ±
（６）イノシトール            ±
（７）Ｌ−ラムノース          ＋
（８）Ｄ−マンニトール        −
（９）Ｄ−ラフィノース        −
＋は同化する、±は多少同化する、−は殆ど同化しない。
【００１０】
４．化学分類学的性質
本菌の細胞壁成分であるジアミノピメリン酸（ｄｉａｍｉｎｏ  ｐｉｍｅｒｉｃａｃｉｄ）の異性体型はｍｅｓｏ型であった。全菌体の糖組成としてガラクトース、グルコース、マンノース、リボース、及びマジュロースらしき糖が検出された。
【００１１】
本発明によれば、これらの菌株またはその培養菌体調製物、さらに酸素の存在下で、出発原料（基質）であるメバスタチン類がインキュベーション処理される。この処理は前記菌株を好気的条件下で培養する際に、その培養液中に基質を添加して行うか、あるいは場合により前記菌株の培養菌体を、例えばそのまま、もしくはホモジナイズした調製物の懸濁液中に基質を添加し、酸素を含む気体、例えば空気を通気しながらインキュベーションして行うこともできる。
【００１２】
培養液への基質の添加は、培養前または培養開始後一定期間経過したときのいずれの時期に行ってもよい。上記菌体は上記いずれかの菌株を栄養源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造できる。かかる培養菌体の調製物を用意するための菌株の培養または基質が添加された状態で行われる菌株の培養は、原則的には一般微生物の培養方法に準じて行うことができるが、通常は液体培養による振とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で実施するのが好ましい。
【００１３】
培養に用いられる培地としては、ミクロテトラスポーラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ）属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも利用可能である。培地組成としては炭素源としてのグルコース、マルトース、キシロース、フルクトース、シュークロース等を単独または組合せて用いることができる。これらの炭素源は、培養途中で随時添加してもよく、例えばグルコースを３〜７ｇ／ｌの濃度範囲となるようにフィードするとメバスタチン類からプラバスタチン類への変換速度を相対的に増大させることができる。
【００１４】
窒素源としては、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、麦芽エキス、酵母エキス、尿素等の有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を、単独または組合せて用いることができる。その他、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト等の塩類、重金属類塩、ビタミン類も必要に応じ添加使用することができる。なお、培養中発泡が著しい場合には、公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。
【００１５】
培養条件は、該菌株が良好に生育し得る範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６〜９．５、２８〜３０℃で２〜８日程度培養する。上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じて適宜変更でき、最適条件を選択できる。
【００１６】
また、培養菌体調製物は、培養終了後、遠心分離または濾過により分離した菌体またはホモジナイズした菌体を適当な溶液に懸濁して調製する。菌体の懸濁に使用できる溶液は、前記した培地であるか、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの緩衝液を単独または混合したものである。緩衝液のｐＨは、好ましくは６．０〜９．０、さらに好ましくは７．０〜８．５である。
【００１７】
基質となるメバスタチン類は、粉末のままか、あるいは水溶性有機溶媒、例えばエタノールなどに溶解して培養液または菌体の懸濁液に添加することができ、その添加量は、例えば、培養液の場合、培養液１ｌ当り２００〜８００ｍｇが好ましい。添加量を１０００ｍｇ／ｌより多くすると、変換速度が著しく遅くなり好ましくない。基質添加後は、２７〜３１℃で３〜１０日間、好ましくは約６〜８日間、振とうあるいは通気攪拌などの操作を行い、好気的条件下で反応を進行させることにより基質であるメバスタチン類を目的のプラバスタチン類に変換することができる。
【００１８】
こうして生成した目的のプラバスタチン類を反応混合から単離するには、種々の既知精製手段を選択、組合せて行うことができる。例えば、疎水性吸着樹脂への吸着・溶出、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出、シリカゲル等によるカラム法あるいは薄層クロマトグラフィー、逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー等を、単独あるいは適宜組合せ、場合により反復使用することにより、分離精製することができる。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明について具体例を挙げてより詳細に説明するが、本発明をこれらの例に限定することを意図するものではない。なお、下記の例中のパーセント（％）は、特に断りのない限り、容量パーセントを示す。
【００２０】
例１〜６
表１に示した各種成分を含む各培地５ｍｌを試験管に入れ、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これにミクロテトラスポーラ・レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ１４５２５株を接種し、表１に示した時期にメバスタチンを最終濃度で５００ｍｇ／ｌとなるように添加し、２８℃にて１０日間培養した。
【００２１】
このようにして得られた培養液を２ｍｌ分取し、同量のメタノールを加えて振とうし、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。この上清をさらに１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、得られた上清を下記の条件にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析し、プラバスタチン濃度を測定した。なお、この条件では、プラバスタチンの保持時間は１７．６分である。結果を表１にまとめて示す。
【００２２】
【表１】
0004439079.tif 000004
【００２３】
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＳＴＲ  ＯＤＳ−ＩＩ（４．６φ×１５０ｍｍ）
移動相：メタノール／水／酢酸／トリエチルアミン（５００：５００：１：１）混液
流速：１．０ｍｌ／分
検出：２３８ｎｍ
【００２４】
例７
グルコース１．０％、マルトエキス０．２％、酵母エキス０．５％を含む培地５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これにミクロテトラスポーラ・レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ１４５２５株を接種し、２８℃で４日間、ロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養した。これにメバスタチンを最終濃度で５００ｍｇ／ｌとなるように添加し、さらに８日間、同条件で培養した。得られた培養液を前述の条件でＨＰＬＣ分析したところ、プラバスタチンの濃度は９１．０ｍｇ／ｌであり、メバスタチンからプラバスタチンへの変換率は、１５．６％であった。
【００２５】
例８〜１６
表２に示した濃度のグルコースを含み、さらにマルトエキス０．２％、酵母エキス０．５％、炭酸カルシウム０．２％を含む各種培地５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これにミクロテトラスポーラ・レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ１４５２５株を接種し、２８℃で４日間、ロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養した。これにメバスタチンを表２に示す濃度となるように添加し、さらに６日間、同条件で培養した。得られた培養液を前述の条件でＨＰＬＣ分析した結果を表２に示す。プラバスタチン生産量は、メバスタチン添加量５００ｍｇ／ｌまでは増加したが、１０００ｍｇ／ｌでは逆に減少した。
【００２６】
【表２】
0004439079.tif 000005
【００２７】
例１７
グルコース０．５％、マルトエキス０．２％、酵母エキス０．５％、炭酸カルシウム０．２％からなる前培養用培地５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これにミクロテトラスポーラ・レクチカテナ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｓｐｏｒａ  ｒｅｃｔｉｃａｔｅｎａ）ＩＦＯ１４５２５株を接種し、２８℃で２日間、ロータリーシェーカー（２２０ｒｐｍ）上で培養し、前培養液を調製した。次に３ｌ容のジャーファーメンテーター（ＭＤＬ３００：丸菱株式会社製）に前培養用培地と同組成の変換培養用培地１．５ｌを準備し、１２１℃、２０分間加熱滅菌した。これに前培養液１５０ｍｌを接種し、温度２８℃、攪拌数３００ｒｐｍ、通気量１．０ｖｖｍの条件で培養した。１日後、菌体が十分に増殖したことを確認してメバスタチンを濃度５００ｍｇ／ｌとなるように添加し、培養を継続した。メバスタチンを添加して１日後、４０ｍｇ／ｌのプラバスタチンが生産され、６日後には、１００ｍｇ／ｌに達した。この時の変換率は２０％であった。
【００２８】
例１８
例１７と同様に前培養液を調製し、３ｌ容ジャーファーメンターでの変換培養を行った。ただし、変換培養の培地は、次の組成を有する。溶性でんぷん６．０％、大豆粉２．０％、ＫＲ−酵母０．３％、ファーマメディア０．７％、酵母エキス０．１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、リン酸一カリウム０．０５％、プルロニック（旭電化社製）０．０５％。培養方法は、基本的に例１７と同様であるが、培養開始後、３日目にメバスタチンを濃度５００ｍｇ／ｌとなるように添加した。メバスタチンを添加して５日後、１９０ｍｇ／ｌのプラバスタチンが生産され、この時の変換率は３８％であった。
【００２９】
例１９
例１７と同様に前培養液を調製し、例１８で用いた変換培地を用いて、３ｌ容ジャーファーメンターでのｐＨ制御による変換培養を行った。ただし、ｐＨの制御は２Ｍ水酸化ナトリウムを用い、ｐＨ８．０に維持した。培養開始後、４日目にメバスタチンを濃度５００ｍｇ／ｌとなるように添加した。メバスタチンを添加して６日後、プラバスタチンの濃度は２８５ｍｇ／ｌに達し、この時の変換率は５７％であった。