(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）フェムト秒パルスレーザー発生装置と、
（ｂ）該フェムト秒パルスレーザー発生装置からのフェムト秒パルスが入射されるハーフミラーと、
（ｃ）該ハーフミラーから反射されるフェムト秒パルスを検出する光検出器と、
（ｄ）前記ハーフミラーを透過したフェムト秒パルスが入射されるレーザースキャン型蛍光顕微鏡と、
（ｅ）前記光検出器からの出力電圧をゲートトリガーの基準信号とする前記レーザースキャン型蛍光顕微鏡の第１の蛍光検出器の手前に配置される第１の高速ゲーティング装置と、
（ｆ）前記基準信号により動作する前記レーザースキャン型蛍光顕微鏡の第２の蛍光検出器の手前に配置される第２の高速ゲーティング装置とを備え、
（ｇ）前記フェムト秒パルスレーザー発生装置からのフェムト秒パルスと同期して前記第１の高速ゲーティング装置の超高速シャッター及び前記第２の高速ゲーティング装置の超高速シャッターを切るようにし、蛍光を時間分解を行ってから前記第１の蛍光検出器及び第２の蛍光検出器に導入するようにし、試料中の蛍光分子が励起される時刻からある遅延と幅でゲートされた蛍光成分を前記第１の蛍光検出器及び第２の蛍光検出器に導入し、生体深部断層像の取得と蛍光寿命分布の可視化を同時に実現することを特徴とする多光子励起蛍光寿命画像化システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織等の深部断層多光子励起蛍光寿命画像化システムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
図３はかかる従来の多光子顕微鏡システムの構成図である。
この図において、１０１は光パルスレーザー、１０２は光レーザースキャン型の蛍光顕微鏡であり、スキャンニング・ミラー１０３、レーザースキャン装置１０４、対物レンズ１０５、ハーフミラー１０６、ハーフミラー１０６を透過する蛍光を検出する第１の蛍光検出器１０７、ハーフミラー１０６で反射する蛍光を検出する第２の蛍光検出器１０８を有する。１０９は第１の蛍光検出器１０７と第２の蛍光検出器１０８からの出力信号を取り込む制御装置、１１０は制御装置に接続され、データを処理するコンピュータ、Ｓは試料である。
【０００３】
上記した多光子顕微鏡は、光パルスレーザー１０１と光レーザースキャン型の蛍光顕微鏡１０２からなり、生体組織等標本深部の断層像を高い分解能で取得できるという特徴を持っている。
図４はかかる従来の蛍光寿命イメージングシステムの構成図である。
この図において、２０１はパルス化した励起光源、２０２はハーフミラー、２０３は顕微鏡であり、スキャンニング・ミラー２０４、レーザースキャン装置２０５を有している。また、２０６は対物レンズ、Ｓは試料、２０７はハーフミラー２０２から反射した光を検出する光検出器、２０８は高速ゲーティング装置であり、高速ゲーティング装置２０８からの出力信号は、ＣＣＤカメラ２１０、情報処理部２１１とディスプレイ２１２からなるカメラ付きデジタル情報処理装置２０９で蛍光寿命の可視化が試みられている。
【０００４】
このように、普通の蛍光顕微鏡で蛍光寿命の可視化は試みられているが、空間分解能は高くはなかった。
図５はかかる従来の多光子励起寿命断層イメージングシステムの構成図である。
この図において、３０１は超短光パルスレーザー、３０２は超短光レーザースキャン型の蛍光顕微鏡であり、スキャンニング・ミラー３０３、レーザースキャン装置３０４、対物レンズ３０５、レーザースキャン装置３０４から反射される蛍光を検出する蛍光検出器３０６を有している。この蛍光検出器３０６の出力信号は、外部電子装置である特殊な蛍光時間分解計数装置３０８、情報処理装置３０９及びディスプレイ３１０からなる特別な処理専用の電子計算機３０７に入力され、情報が処理され、表示される。なお、Ｓは試料である。
【０００５】
このように、多光子励起寿命断層イメージングシステムによれば、多光子励起の蛍光寿命画像化も試みられているものの、蛍光検出後に大がかりな外部電子装置を用いて時間分解をしており、画像解析の際にも特別な処理専用の電子計算機が必要であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように、従来の蛍光顕微鏡は、種々の問題を有しており、技術的に満足のいくものではなかった。
本発明は、上記状況に鑑みて、フェムト秒パルスレーザーと、レーザースキャン型蛍光顕微鏡と、高速ゲーティング装置とを組み合わせることにより、安価でかつ容易に使用できる深部断層蛍光寿命画像化を実現する多光子励起蛍光寿命画像化システムを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕多光子励起蛍光寿命画像化システムにおいて、フェムト秒パルスレーザー発生装置（１）と、このフェムト秒パルスレーザー発生装置（１）からのフェムト秒パルスが入射されるハーフミラー（２）と、このハーフミラー（２）から反射されるフェムト秒パルスを検出する光検出器（３）と、前記ハーフミラー（２）を透過したフェムト秒パルスが入射されるレーザースキャン型蛍光顕微鏡（４）と、前記光検出器（３）からの出力電圧をゲートトリガーの基準信号とする前記レーザースキャン型蛍光顕微鏡（４）の第１の蛍光検出器（１０）の手前に配置される第１の高速ゲーティング装置（９）と、前記基準信号により動作する前記レーザースキャン型蛍光顕微鏡（４）の第２の蛍光検出器（１２）の手前に配置される第２の高速ゲーティング装置（１１）と、前記フェムト秒パルスレーザー発生装置（１）からのフェムト秒パルスと同期して前記第１の高速ゲーティング装置（９）の超高速シャッター及び前記第２の高速ゲーティング装置（１１）の超高速シャッターを切るようにし、蛍光を時間分解を行ってから前記第１の蛍光検出器（１０）及び第２の蛍光検出器（１２）に導入するようにし、試料（Ｓ）中の蛍光分子が励起される時刻からある遅延と幅でゲートされた蛍光成分を前記第１の蛍光検出器（１０）及び第２の蛍光検出器（１２）に導入し、生体深部断層像の取得と蛍光寿命分布の可視化を同時に実現することを特徴とする。
【０００８】
本発明によれば、蛍光顕微鏡装置の蛍光検出器の前に高速ゲーティング装置を設置することにより、励起用光パルスと同期して超高速シャッターを切るようにし、蛍光を時間分解を行ってから蛍光検出器に導入するようにした。
本発明は、既存の多光子蛍光寿命イメージング手法と比べると、既存の装置やソフトウェアが流用できるので、必要となる時間、コストの面でも著しく改善される上に、操作性、利便性も改善される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明する。
図１は本発明の実施例を示す多光子励起蛍光寿命画像化システムの構成図である。
この図において、１は超短光パルス〔フェムト秒（ｆｓ）パルス〕レーザー、２は第１のハーフミラー、３は励起光パルスの光検出器、４はレーザースキャン型の蛍光顕微鏡であり、スキャンニング・ミラー５、レーザースキャン装置６、対物レンズ７、第２のハーフミラー８、第１の高速ゲーティング装置９、第１の蛍光検出器１０、第２の高速ゲーティング装置１１、第２の蛍光検出器１２、制御装置１４とディスプレイ１５からなるパーソナルコンピュータ１３を備えている。なお、Ｓは試料である。
【００１０】
この実施例によれば、蛍光顕微鏡４の第１，第２の蛍光検出器１０，１２の前に第１，第２の高速ゲーティング装置９，１１を設置することにより、励起用光パルスと同期して超高速シャッターを切るようにし、蛍光を時間分解を行ってから第１，第２の蛍光検出器１０，１２に導入するようにした。すなわち、励起光のフェムト秒パルスの光検出器３からの出力電圧をゲートトリガーの基準信号とした。これにより、試料Ｓ中の蛍光分子が励起される時刻から、ある遅延と幅でゲートされた蛍光成分を蛍光検出器に導入することができるようになった。
【００１１】
本発明の多光子励起蛍光寿命画像化システムは、既存の多光子蛍光寿命イメージングシステムと比べると、既存の装置やソフトウェアが流用できるので、必要となる時間、コストの面でも著しく改善される上に、操作性、利便性も改善される。
本発明の多光子励起蛍光寿命画像化システムを用いて測定された蛍光寿命の例を表１に示す。
【００１２】
【表１】
0004593739.tif 000002
上段に本発明による実測値、下段に他の研究者がかって測定した文献値が示されている。この表１から明らかなように、上段と下段の２つの値は非常によく一致しており、本発明の多光子励起蛍光寿命画像化システムは、間違いなく蛍光寿命を計測することができる。
【００１３】
図２は本発明の多光子励起蛍光寿命画像化システムによる蛍光寿命の測定例を示す図である。
この図において、横軸は時間（ｎｓ）、縦軸は蛍光強度（ａ．ｕ：相対単位）を示しており、■はフルオレセイン、◆はスルフォローダミン、●はＹＧ蛍光ビーズの蛍光減衰曲線を示している。
【００１４】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、それらを本発明の範囲から排除するものではない。
【００１５】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
（１）生体等深部の断層像の取得と蛍光寿命分布の可視化を同時に容易に実現することができる。
【００１６】
よって、蛍光スペクトラム変化の無い分子の測定でも蛍光比画像を取得でき、観察の障害となる色素濃度変動や励起光強度の変動等の要因を排除できる。
従って、生体深部での生理活性物質の分布、活性を高精度で測定することができる。
（２）特に、生体サンプル中でドラッグスクリーニングや光記憶媒体の読み出し検査等、医学から産業まで広い分野での利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例を示す多光子励起蛍光寿命画像化システムの構成図である。
【図２】  本発明の多光子励起蛍光寿命画像化システムによる蛍光寿命の測定例を示す図である。
【図３】  従来の多光子顕微鏡システムの構成図である。
【図４】  従来の蛍光寿命イメージングシステムの構成図である。
【図５】  従来の多光子励起寿命断層イメージングシステムの構成図である。
【符号の説明】
１    超短光パルス（フェムト秒パルス）レーザー
２    第１のハーフミラー
３    励起光パルスの光検出器
４    レーザースキャン型の蛍光顕微鏡
５    スキャンニング・ミラー
６    レーザースキャン装置
７    対物レンズ
８    第２のハーフミラー
９    第１の高速ゲーティング装置
１０    第１の蛍光検出器
１１    第２の高速ゲーティング装置
１２    第２の蛍光検出器
１３    パーソナルコンピュータ
１４    制御装置
１５    ディスプレイ
Ｓ    試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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