(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプター融合複合体であって、ペプチドリンカーによって結合されるＴ細胞レセプターおよび生物学的に活性なポリペプチドを含有し、
ここでＴ細胞レセプターが、癌抗原の認識に特異的な１つの認識結合部位を有し、および生物学的に活性なポリペプチドが異なる認識結合部位を有する可溶性Ｔ細胞レセプター融合複合体において、
前記生物学的に活性なポリペプチドが、ＩＬ−２若しくはそのフラグメントであり、そして
前記Ｔ細胞レセプターが、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖及びＣ−β鎖を含む１本鎖Ｔ細胞レセプターである、
可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプター融合複合体。
【請求項２】
可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプター融合複合体を調製する方法であって、方法は以下の工程：
Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖及びＣ−β鎖を含む１本鎖Ｔ細胞レセプターを含有して成り、癌抗原の認識に特異的であるＴ細胞レセプター鎖を提供する工程；
ＩＬ−２若しくはそのフラグメントを含む生物学的に活性なポリペプチド鎖を提供する工程；
Ｔ細胞レセプター鎖および生物学的に活性なポリペプチド鎖をペプチドリンカーに連結する工程；ならびに
連結されたＴ細胞レセプター融合ポリペプチド複合体を回収し、それによって、Ｔ細胞レセプターが１つの認識結合部位を有し、生物学的に活性なポリペプチドがそれとは異なる認識結合部位を有する、可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプター融合複合体を作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項３】
癌又は腫瘍を治療するための治療用組成物であって、治療に有効な量の請求項１に記載の可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプター融合複合体、および滅菌の、薬学的に許容される担体を含有する、治療用組成物。
【請求項４】
ペプチドリンカーによって連結されたＴ細胞レセプターおよび生物学的に活性なポリペプチドを含有する可溶性Ｔ細胞レセプター融合複合体をコードする核酸であって、ここでＴ細胞レセプターが、癌抗原の認識に特異的な１つの認識結合部位を有し、および生物学的に活性なポリペプチドが異なる認識結合部位を有する可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプター融合複合体をコードする核酸であり、
前記生物学的に活性なポリペプチドが、ＩＬ−２若しくはそのフラグメントであり、そして
前記Ｔ細胞レセプターが、Ｖ−α鎖、Ｖ−β鎖及びＣ−β鎖を含む１本鎖Ｔ細胞レセプターポリペプチドである、
可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプター融合複合体をコードする核酸。
【請求項５】
核酸がＤＮＡである、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
核酸がＲＮＡである、請求項４に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は可溶性Ｔ細胞レセプター複合体、ならびにより詳細には可溶性Ｔ細胞レセプター融合複合体および可溶性Ｔ細胞レセプター結合複合体に、そしてこのような分子を作製および使用するための方法に関する。提供される分子は、多様な治療学的適用および診断の目的のために有用である。
【０００２】
（発明の背景）
ガン、自己免疫、および感染性（ウイルス性、細菌性、寄生性、および真菌性を含む）の疾患のような疾患の治療に対する伝統的なアプローチは、外科手術、放射線化学療法、抗体、またはそれらを組み合わせた治療を含んでいる。しかし、このような治療は多数のこれらの徴候に対して有効であることが証明されていなかった。ヒト疾患の予防および／または治療するための代替の治療法の開発が重大である。近年において、抗体およびＴリンパ球を利用する免疫治療および遺伝子治療アプローチが、ヒト疾患を治療するための新規で有望な方法として頭角を現してきた。
【０００３】
治療のための１つのこのようなアプローチは、特定の標的に対して治療学的または診断的薬剤を標的化するための抗体の使用を包含している。多くのグループが、標的化薬剤としての抗体の使用を巡る開発をしている。このような開発は、種々のエフェクター分子（放射性分子、化学療法剤、トキシン、およびさらなる生体活性タンパク質）に抗体を連結する、抗体融合タンパク質および抗体結合分子の構築を包含している。このような分子を使用して開発された治療または診断は、連結された抗体によって標的される特定の効果を引き起こすように設計される。
【０００４】
治療薬としての抗体の開発が本格化されてきたので、免疫系の卓越したエフェクター、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、治療を開発するための基盤として独特の利点を有する。抗体は、血液および細胞外空間における病原体の、または細胞表面上のタンパク質標的に対する認識に制限されるが、Ｔ細胞レセプターは、細胞表面上のＭＨＣ分子で提示される抗原（細胞内タンパク質に由来する抗原を含む）を認識し得る。提示される抗原を認識しおよび活性化になるＴ細胞のサブタイプに依存して、Ｔ細胞レセプターおよびＴ細胞レセプターを保有するＴ細胞は、種々の免疫応答を制御することに関与し得る。例えば、Ｔ細胞は、抗体産生細胞へのＢ細胞の分化を介して体液性免疫応答の調節に関与する。さらに、活性化Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫応答を開始するように作用する。従って、Ｔ細胞レセプターは抗体に利用可能でないさらなる標的を認識し得る。
【０００５】
Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）への抗原の結合によって調節される。ＴＣＲの１つのタイプは、免疫グロブリン可変（Ｖ）および定常（Ｃ）領域と類似するαおよびβ鎖からなる膜結合性ヘテロ２量体である。ＴＣＲα鎖は共有結合されたＶ−αおよびＣ−α鎖を含み、一方β鎖はＣ−β鎖に共有結合的に連結されたＶ−β鎖を含む。Ｖ−αおよびＶ−β鎖は、超抗原または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）（ヒトにおいてＨＬＡ複合体として知られる）の情況において抗原を結合し得るポケットまたは間隙を形成する。概して、Ｄａｖｉｓ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：５３７（１９８５）  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第３版、Ｗ．Ｐａｕｌ編、Ｒｓｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＴＤ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。
【０００６】
ＴＣＲは免疫系の発達および機能において重要な役割を果たすと考えられる。例えば、ＴＣＲは細胞殺傷を媒介し、β細胞増殖を促進し、そしてガン、アレルギー、ウイルス感染および自己免疫異常を含む種々の疾患の進行および深刻度に影響を与えることが報告されている。
【０００７】
従って、Ｔ細胞レセプターに基づく新規な標的化薬剤、ならびに治療学的および診断の設定のために、このような薬剤を生成および使用するための方法を提供することは望ましい。抗体標的化に基づく先行技術の複合体に比較して利点を有するような分子を提供することは特に望ましい。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明者らは今や、潜在的な治療学的有用性を有するいくつかの異なる改変されたＴＣＲ複合体を作製した。これらの改変されたＴＣＲは、局在化された毒性因子を、疾患のプロセスにおいて介入すべく、特定の部位に導き、標的化し、指向するために用いられる。例えば、ＴＣＲは、ＭＨＣ分子によって提示されるガン関連性タンパク質に由来するペプチドを特異的に認識し、生物学的に活性な分子に融合または結合され得、それによって、所望の治療学的結果を達成するために、この分子をガン細胞に導く。
【０００９】
本発明のＴＣＲは、ＴＣＲを生物学的に活性な分子に連結する方法において改変され得る。本発明は、このような結合を達成する為の方法として遺伝子融合および化学的結合の用法を教示する。生物学的に活性な分子が付着できるＴＣＲは、ネイティブなＴＣＲヘテロ２量体またはその可溶性のバージョン、詳細には可溶性の、１本鎖ＴＣＲである。生物学的に活性な分子は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質、または非タンパク質トキシン、免疫グロブリンドメイン、細胞傷害性因子、化学治療剤、放射性材料、検出可能な標識などを含むがこれらに制限されない多様な生体活性エフェクター分子であり得る。
【００１０】
いくつかの例において、可溶性ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、１つ以上の融合されたエフェクターまたはタグを含む。例えば、ある場合において、タグは融合タンパク質に典型的に付随する天然に存在する細胞成分からＴＣＲタンパク質融合複合体を精製するのを補助するために用いられる。他の場合において、タンパク質タグは、予め決定された化学的切断部位またはタンパク質分解性解裂部位を可溶性タンパク質に導入するために用いられる。詳細には、意図されるのは、タグを、例えば、融合タンパク質およびエフェクター分子鎖または適切なフラグメントをコードする配列間で、コードするセグメントのＤＮＡベクターへの導入であり、それによってＴＣＲ分子は、所望される場合エフェクター鎖またはフラグメントから解裂（すなわち、分離）される。
【００１１】
本発明における使用のために特に好ましいＴ細胞レセプター分子は、１本鎖Ｔ細胞レセプターである。
【００１２】
本発明の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡ、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）のような免疫グロブリンに共有結合的に連結される。適切なＴＣＲ融合複合体は、免疫グロブリンの定常領域に連結される。
【００１３】
本発明の別の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、例えばＩＬ−２のようなサイトカインに共有結合的に連結される。
【００１４】
本発明のなお別の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、例えばＭＩＰ−１βのようなケモカインに共有結合的に連結される。
【００１５】
さらに、本発明の別の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、例えばＧＣＳＦのような増殖因子に共有結合的に連結される。
【００１６】
本発明の別の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、例えばリシンのようなタンパク質または非タンパク質トキシンに共有結合的に連結される。
【００１７】
さらに、本発明の別の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、例えばドキソルビシンのような細胞傷害性因子に共有結合的に連結される。
【００１８】
本発明の別の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、例えばＩ１２５のような放射性材料に共有結合的に連結される。
【００１９】
本発明のなお別の好ましい局面において、ＴＣＲ融合複合体は、例えば蛍光、放射性、または電子伝達因子のような検出可能な標識に共有結合的に連結される。
【００２０】
具体的に提供されるのは、細胞トキシン、または診断、画像化、もしくは治療学的研究に適切な検出可能に標識される原子もしくは化合物であるエフェクターを含む可溶性ＴＣＲ融合タンパク質およびＴＣＲ結合複合体である。ＴＣＲ融合複合体およびＴＣＲ結合複合体は、インビボでの細胞または組織の検出および／または画像化、ならびにインビトロまたはインビボで細胞を傷害または殺傷するような治療学的使用を含む、多様な適用において用いられる。一般に、標的化される細胞または組織は、ＴＣＲを選択的に結合し得る１つ以上のリガンドを含む。例示的な細胞としては、黒色腫のような腫瘍細胞およびウイルス感染された細胞（例えば、それぞれサイトメガロウイルスまたはＡＩＤＳウイルスのような霊長類ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスで感染された細胞）を包含する。
【００２１】
本発明の他の局面および実施態様は以下に考察される。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
抗体ベースの分子の性能に対する改良を行う試みにおいて、本発明者らはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の使用に基づく抗原特異的治療薬を開発した。ＴＣＲベースの試薬は抗体分子よりもいくつかの利点を有する。第１に、抗体ベースの治療はしばしば、腫瘍抗原の分断に起因して予測されるよりも低い腫瘍細胞殺傷効果を伴う。ＭＨＣ分断の報告があるが、特異的ＭＨＣ／腫瘍ペプチドの循環レベルは遊離に循環する腫瘍抗原よりも非常に低い。第２に、抗体分子は、これらは細胞の表面上に曝露されず、抗体分子に接近可能でないので、多くの潜在的な腫瘍抗原を認識できない。多くの潜在的な腫瘍特異的タンパク質は細胞内であるが、通常は細胞内でペプチドにプロセスされて、これは次いで腫瘍細胞の表面にＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかで提示される。ＴＣＲとは異なり、抗体は通常は、ＭＨＣ分子の結合間隙を占有するこれらのプロセスされた抗原を認識しない。第３に、抗体によって認識される抗原の多くは、生来異種遺伝子性であり、これは抗体の有効性を単一の腫瘍組織学に制限する。対照的に、多くのＴ細胞エピトープは、いくつかの異なる組織から起源する広範な範囲の腫瘍に共通である。
【００２３】
上述にまとめられるように、本発明者らは今やＴＣＲ融合および結合複合体、そして生物学的に活性なペプチドまたは分子に共有結合的に連結されるＴＣＲ分子を含有する、このような複合体をコードする発現ベクター、そしてこのような融合および結合複合体、ならびに発現ベクターおよび結合複合体の産生および使用のための方法を作製した。
【００２４】
Ｔ細胞は、細胞表面上に発現されるＴ細胞レセプターの働きによって、細胞の表面上に提示される抗体を認識する。ＴＣＲはジスルフィド結合されたヘテロ２量体であり、大部分αおよびβ鎖糖タンパク質からなる。Ｔ細胞は、Ｂ細胞で機能している抗体多様性を生み出すメカニズムに類似した方法で、Ｔ細胞もそのレセプター分子において多様性を生み出している（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７）。免疫グロブリン遺伝子に類似してＴＣＲ遺伝子はＴ細胞の発達の間に再配置するセグメントから構成される。ＴＣＲポリペプチドはアミノ末端可変領域およびカルボキシ末端定常領域からなる。カルボキシ末端領域は、膜貫通アンカーとして作用し、そしてレセプターが占有されている場合細胞内シグナル伝達に関与し、可変領域は抗原の認識を担う。ＴＣＲα鎖は、ＶおよびＤセグメントのみによってコードされる可変領域を含むが、β鎖は更なる結合（Ｊ）セグメントを含む。これらのセグメントの再配置、ならびに可変領域の変異および成熟によって、それぞれのＴＣＲ分子の状況に於いて提示される途方もなく多数の異なる抗原を認識し得るという、ＴＣＲの多様なレパートリーを生じる。
【００２５】
特定の抗原を認識し得る非常に特異的なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を生成するための技術が、以前に開発された。例えば、係属中の米国特許出願第０８／８１３，７８１号、および米国特許出願第０９／４２２，３７５号、本明細書中に参考として援用される；ならびに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４２７４およびＰＣＴ／ＵＳ９９／２４６４５、およびそこにおいて考察される参考文献は、特異的ＴＣＲを調製するおよび使用する方法を開示する。さらに、特定の特異的ＴＣＲが、可溶性の、１本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）として、組換え法によって生成された。ｓｃＴＣＲの生成および使用の方法が、係属中の米国特許出願第０８／９４３，０８６号、および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２６３において開示され、記載され、これらは本明細書中に参考として援用される。このようなＴＣＲおよびｓｃＴＣＲは、得られるＴＣＲおよびｓｃＴＣＲを治療薬として有用にするために融合物または結合体を作製するように変化され得る。本発明のＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ融合複合体を生成するために組換え的に生成されたＴＣＲまたはｓｃＴＣＲコード領域を、生物学的に活性なタンパク質をコードする遺伝子に遺伝子融合することによって作製され得る。あるいは、ＴＣＲまたはｓｃＴＣＲはまた、ＴＣＲ結合体タンパク質を生成するために生物学的に活性な分子と化学的に結合され得る。
【００２６】
用語「融合分子」によって、これが本明細書中で使用されるように、ＴＣＲ分子およびエフェクター分子の、通常組換え的、化学的、または他の適切な方法によって共有結合的に連結（すなわち融合される）タンパク質またはペプチド配列が意味される。所望される場合、融合分子は、ペプチドリンカーを介して１つまたはいくつかの部位で融合され得る。あるいは、ペプチドリンカーは、融合分子の構築において補助するために用いられる。具体的に好ましい融合分子は、融合タンパク質である。
【００２７】
「ポリペプチド」は、その大きさにかかわらず好ましくは任意の２０個の天然のアミノ酸から本質的になるポリマーをいう。用語「タンパク質」はしばしば、比較的大きなタンパク質に関して使用され、「ペプチド」は小さなポリペプチドに関して使用されるが、当該分野におけるこれらの用語の使用はしばしば重複する。用語「ポリペプチド」は概して、他で注記されない限りタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドをいう。概して本発明に有用なペプチドは、遠心分離またはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的な分子サイズ分析技術によって判断されるように、約０．１〜１００ＫＤまたはより大きな約１０００ＫＤの間の、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、５０ＫＤとの間である。
【００２８】
用語「結合分子」は、これが本明細書中で使用されるように、ＴＣＲ分子およびエフェクター分子においては、通常化学的なまたは他の適切な方法によって共有結合的に連結される（すなわち、融合される）化学的なまたは合成された分子が意味される。所望される場合、結合分子は、１つまたはいくつかの部位にて、ペプチドリンカー配列またはキャリア分子を介して融合され得る。あるいは、ペプチドリンカーまたはキャリアは、結合体分子の構築において補助するために用いられる。具体的に好ましい結合分子は結合トキシンまたは検出可能な標識である。
【００２９】
本発明のＴＣＲ融合複合体およびＴＣＲ結合複合体は、ＴＣＲ分子に共有結合的に連結される生物学的に活性な分子またはエフェクター分子（本明細書中で交換可能に使用される用語）を含有する。本明細書中で使用されるように、用語「生物学的に活性な分子」または「エフェクター分子」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのようなアミノ酸配列；糖または多糖；脂質または糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、または本明細書中で考察されるような所望される効果を生成し得る化学薬剤が意味される。また意図されるのは、生物学的に活性なまたはエフェクタータンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするエフェクター分子核酸である。従って、適切な分子は、調節因子、酵素、抗体、または薬物、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドを包含する。生物学的に活性なまたはエフェクター分子は、天然に存在し得るか、または公知の成分から、例えば、組換えまたは化学合成によって合成され得、および異種成分を包含し得る。生物学的に活性なまたはエフェクター分子は一般に、約０．１〜１００ＫＤまたはより大きな約１０００ＫＤまでの間、好ましくは、遠心分離またはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的な分子サイズ分け技術によって判断されるように、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、および５０ＫＤの間である。本発明の所望される効果は例えば、細胞増殖または細胞死を誘導すること、免疫応答を開始すること、または以下に開示されるアッセイによって決定されるように診断目的のための検出分子として作用することのいずれかであり、アッセイは、細胞を細胞が増殖するように培養し、そして細胞と本発明のＴＣＲ融合複合体とを接触し、および次いでＴＣＲ融合複合体が細胞の発達をさらに阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含する。
【００３０】
本明細書中で使用されるように、生物学的に活性な分子またはエフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質トキシン、免疫グロブリンドメイン、または酵素のような他の生体活性タンパク質を包含する。また含まれるのは、非タンパク質トキシン、細胞傷害剤、化学治療剤、検出可能な標識、放射性材料などである。
【００３１】
本発明のサイトカインは、他の細胞に影響し、および細胞性免疫の任意の多くの複数の効果を担う細胞によって生成される任意の因子によって規定される。サイトカインの例としては、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、およびＩＮＦ−γが挙げられるがこれらに制限されない。
【００３２】
本発明のケモカインは、サイトカインに類似して、他の細胞に曝露される場合、細胞性免疫の任意の多くの複数の効果を担う任意の化学因子または分子として規定される。適切なケモカインは、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、およびＲａｎｔｅｓが挙げられるがこれらに制限されない。
【００３３】
増殖因子は、特定の細胞に曝露される場合に、影響される細胞の増殖および／または分化を誘導する任意の分子を包含する。増殖因子は、タンパク質および化学分子を包含し、そのいくつかは：ヒト増殖因子および幹細胞増殖因子を包含する。さらなる増殖因子はまた、本明細書中に記載される用途のために適切である。
【００３４】
トキシンおよび細胞傷害剤は、細胞に曝露される場合、致死効果または増殖に対する阻害効果を有する任意の物質を包含する。より詳細には、エフェクター分子は、例えば、ジフテリアトキシン（ＤＴ）、シガトキシン、アルビン、コレラトキシン、リシン、サポリン、シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、またはゲロニンのような植物または細菌起源の細胞トキシンであり得る。このようなトキシンの生物学的に活性なフラグメントは当該分野において周知であり、および例えば、ＤＴ  Ａ鎖およびリシンＡ鎖を包含する。さらに、トキシンは、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）のような細胞表面で活性な薬剤であり得る。
【００３５】
さらにエフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、またはシスプラチンのような化学治療の薬物であり得る。
【００３６】
さらに、エフェクター分子は、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン、チクローム、またはテキサスレッドのような蛍光標識；または放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８、またはビスマス−２１２のような診断または画像化研究のために適切な検出可能に標識された分子であり得る。エフェクターおよびタグを含むタンパク質を作製および使用することに関する開示について、例えば、Ｍｏｓｋａｕｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ、Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ  ４７、６４１、１９８６：Ｐａｎｔａｎら、新規な治療剤としての組換えトキシン、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ、６１、３３１、（１９９２）；「化学トキシン」ＯｌｓｎｅｓおよびＰｈｉｌ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．、２５、３５５（１９８２）；公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２９３５０号；公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０４６８９号；および米国特許第５，６２０，９３９号を参照のこと。
【００３７】
共有結合的に連結されるエフェクター分子を含むＴＣＲ融合または結合複合体は、いくつかの重要な用途を有する。例えば、ＴＣＲ融合または結合複合体は、ＴＣＲを特異的に結合し得るある細胞にエフェクター分子を送達するために用いられ得る。従って、ＴＣＲ融合または結合複合体は、リガンドを含む細胞を選択的に障害または殺傷する手段を提供する。ＴＣＲ融合または結合複合体によって障害または殺傷され得る細胞または組織の例は、ＴＣＲによって特異的に結合され得る１つ以上のリガンドを発現する、腫瘍細胞およびウイルスまたは細菌で感染された細胞を包含する。障害または殺傷されることに敏感な細胞または組織は、本明細書中に開示される方法によって容易にアッセイされ得る。
【００３８】
エフェクター分子に融合されるＴＣＲ融合複合体の特定の例は以下のようである；実施例５において以下に開示される、図１において図示される２６４  ＤＮＡベクターで哺乳動物の細胞をトランスフェクトすることによって生成され得るｐ２６４ｓｃＴＣＲのようなｓｃＴＣＲ。ｓｃ−ＴＣＲ  ｐ２６４タンパク質融合複合体は、ヒトＨＬＡ抗原；ＨＬＡ−２．１の情況において提示される野生型ｐ５３腫瘍抑制タンパク質からのプロセスされたペプチドフラグメントを認識する。ｓｃ−ＴＣＲ  ｐ２６４およびそのペプチドリガンドは、Ｔｈｅｂａｌｄ、Ｍ．Ｊ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９９５）、９２：１１９９３において開示されている。ペプチド配列はＬＬＧＲＮＳＦＥＶである。腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の発現は、悪性細胞においてアップレギュレートされる。全ての腫瘍細胞の５０％が、表面上でｐ５３の増加されたレベルを発現した（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、２５３：４９）。それゆえ、このエピトープについて特異的なｓｃＴＣＲ分子は、トキシンで標識され、ｐ５３ペプチドフラグメントＨＬＡ−２．１リガンドを発現する悪性細胞に送達される。この標的特異的免疫治療は、悪性細胞のみを殺傷することに効果的である。インビトロでの細胞傷害性を測定するための方法は周知であり、以下に記載されるような従来の生存度アッセイを包含する。
【００３９】
エフェクターに連結されるｐ１４９−ＴＣＲを含むｓｃ−ＴＣＲ分子は、他の重要な用途を有する。例えば、ｓｃ−ＴＣＲ分子は、２６４ペプチドを発現するヒト乳ガン細胞を選択的に殺傷するために用いられる。トキシンで標識された２６４細胞が乳ガン細胞を殺傷する能力は、Ｅｕ３＋放出細胞傷害性アッセイを用いる非放射性細胞・細胞傷害性アッセイで評価されるインビトロ研究が行われた。（Ｂｏｕｍａ、Ｇ．Ｊ．ら、（１９９２）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：８５）。融合されたエフェクター分子を含有するｓｃ−ＴＣＲ分子はインビボで容易に試験できる。例えば、インビトロ研究は、乳ガン細胞を発現するｐ２６４／ＨＬＡ．Ａ２１をＨＬＡ／Ａ２トランスジェニックマウスに移植することによって行われ得る（Ｔｈｅｏｂａｌｄら（１９９５）前出）。トキシンで標識されたｓｃＴＣＲ  ｐ２６４分子は、予め決定された投薬量でマウスに注射され、ｓｃ−ＴＣＲ分子の効力を調べるために腫瘍の大きさに対する効果が測定される。さらに、寿命の延長が、新規な抗腫瘍治療の効果を評価するための第２の基準として用いられる。
【００４０】
その他の適切なエフェクターまたはタグ分子は公知である。例えば、１つのタグは生理学的ｐＨで電荷を保有するポリペプチド、例えば６×ＨＩＳである。この例において、ＴＣＲ融合または結合複合体は、約ｐＨ６〜９にて６×ＨＩＳタグを特異的に結合し得るＮｉ−セファロースのような市販の金属−セファロース基質によって精製され得る。ＥＥエピトープおよびｍｙｃエピトープは、適切なタンパク質タグのさらなる例であり、これらのエピトープは１つ以上の市販のモノクローナル抗体によって特異的に結合される。
【００４１】
いくつかの設定において、例えば、ｓｃ−ＴＣＲの結合価を増加するために、本発明の多原子価のＴＣＲ融合または結合複合体を作製することが有用であり得る。簡潔に述べると、多価ＴＣＲタンパク質は、例えば、標準的なビオチン／ストレプトアビジン標識化技術を使用することによって、またはラテックスビーズのような適切な固体支持体への結合によって、１〜４個のタンパク質（同じものかまたは異なる）を共に共有結合的に連結することによって作製される。化学的に架橋される（例えば、デンドリマーに架橋される）タンパク質はまた適切な多価種である。例えば、タンパク質は、ＣｙｓまたはＨｉｓのような化学的に反応性の側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列によって改変され得る。化学的に反応性の側鎖を伴うこのようなアミノ酸は、融合タンパク質中の種々の位置に、好ましくはＴＣＲの抗原結合領域に対して遠位に、配置され得る。例えば、可溶性融合タンパク質のｃ−β鎖フラグメントのＣ末端は、タンパク質精製タグまたはこのような反応性アミノ酸を含む他の融合されるタンパク質に共有結合的に連結され得る。適切な側鎖は、多価分子作製において適切なデンドリマー粒子に２つ以上の融合タンパク質を化学的に連結するために必要である。デンドリマーは、それらの表面の多くの異なる官能基の任意の１つを有する合成化学ポリマーである（Ｄ．Ｔｏｍａｌｉａ、Ａｌｄｒｉｃｈｍｉｎａ  Ａｃｔａ、２６：９１：１０１（１９９３））。本発明に従う使用のために適切なデンドリマーは、例えば、Ｅ９スターバーストポリアミンデンドリマーおよびＥ９コンバーストポリアミンデンドリマーを包含し、これらはシステイン残基を連結し得る。
【００４２】
本明細書中で使用されるように、用語「細胞」は、任意の霊長類細胞または不死細胞株、組織または器官におけるようなこのような細胞の任意の群を包含する。好ましくは細胞は、哺乳動物、特にヒト起源のものであり、ならびに１つ以上の病原体によって感染され得る。本発明に従う「宿主細胞」は、感染された細胞であり得るか、またはこれは本明細書中に記載される核酸を増殖するために用いられるＥ．ｃｏｌｉのような細胞であり得る。
【００４３】
本発明に従うＴＣＲペプチドに共有結合的に連結されるエフェクター分子は、多くの異なる利点を提供する。単一のエフェクター分子を含む本発明のＴＣＲ融合複合体が、生成され得、公知の構造のこのようなペプチドを包含する。さらに、広範に多様なエフェクター分子が、類似のＤＮＡベクターにおいて生成され得る。すなわち、異なるエフェクター分子のライブラリーが、感染されたまたは罹患された細胞の提示のためにＴＣＲ分子に連結され得る。さらに、被験体へのＴＣＲ分子の投与ではなく、治療的適用のために、エフェクターペプチドに連結されたＴＣＲ分子をコードするＤＮＡ発現ベクターが、ＴＣＲ融合複合体のインビボ発現のために投与され得る。このようなアプローチは、組換えタンパク質の調製に典型的に付随される高価な精製工程を回避し、ならびに従来のアプローチに付随される抗原取込みおよびプロセシングの複雑性を回避する。
【００４４】
注記されるように、本明細書中に開示される融合タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質トキシン、免疫グロブリンドメインまたは他の生体活性な分子、および任意のペプチドリンカーのような生物学的に活性な産物は、ほとんど任意の様式において組織化され得るが、但し、融合タンパク質はこれが意図される機能を有する。特に、融合タンパク質の各成分は、所望により、別の成分から少なくとも１つ分の適当なペプチドリンカー配列間隔をおいて配置される。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の同定および／または精製を容易にするためにタグを含み得る。より特定の融合タンパク質は以下の実施例にある。
【００４５】
本発明のＴＣＲ融合複合体は好ましくはまた、ＴＣＲと生物学的に活性なペプチドとの間に挿入される柔軟なリンカー配列を包含する。リンカー配列は、ＴＣＲ分子結合溝に生物学的に活性なペプチドが効果的に配されるようにすべきで、それによってＴ細胞レセプターは、提示されるＭＨＣペプチド複合体を認識し、所望の部位に生物学的に活性な分子を送達することができる。エフェクター分子の首尾よい提示は、Ｔ細胞を細胞が増殖するように培養し、そしてＴ細胞と本発明のＴＣＲ融合複合体とを接触し、および次いでＴＣＲ融合複合体がさらなる細胞の発達を阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含するインビトロアッセイを含む以下に開示されるアッセイによって決定されるように、Ｔ細胞増殖を誘導もしくは阻害するための、または特定の部位に免疫応答を開始または阻害するかのいずれかの細胞の活性を調節し得る。
【００４６】
本明細書中に開示される手順によって、および例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡ調整、制限酵素でのＤＮＡの解裂、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、適切な細胞へのＤＮＡの導入、宿主の形質転換または増殖、宿主の培養を含む、認識される組換えＤＮＡ技術によって達成され得る。さらに、融合分子は、カオトロピック剤、ならびに周知の電気泳動、遠心分離、およびクロマトグラフィー法を使用して単離し精製され得る。これらの方法に関して開示されている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。
【００４７】
本発明はさらに、核酸配列、および特には本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、またはエピソームのような染色体外複製に適するベクターによって保有される。特に、所望される融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターは、本明細書中に記載される調製法を容易にするために、また融合タンパく質の有意な量を得るために用いられる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質コード配列の転写および翻訳について必要なエレメントを含むベクター中に挿入され得る。多様な宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現するために利用される。これらとしてはウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳動物細胞系；ウイルスで（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌等の微生物を包含する。利用される宿主−ベクター系に応じて、多くの適切な転写および翻訳エレメントの任意の１つが用いられる。概要は前出、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら、を参照のこと。
【００４８】
一般に、本発明に従う好ましいＤＮＡベクターは、５’から３’方向において、エフェクター分子をコードする配列に作動可能に連結されたＴＣＲ鎖をコードする第１のヌクレオチド配列の導入のための第１のクローニング部位を含む、ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
たいていの場合、ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質の各成分は、「カセット」形式で提供されることが好ましい。用語「カセット」は、標準的な組換え法によって、各成分が別の成分と容易に置換されることを意味する。ＤＮＡベクターがコードする融合複合体が、抗原型を発生させる能力があるかまたは発生させることができる病原体に対して使用される場合に、ＤＮＡベクターがカセットに組み込まれている形態が特に望ましい。
【００５０】
ＴＣＲ融合複合体をコードするベクターを作製するために、ＴＣＲ分子をコードする配列は、適切なリガーゼの使用によってエフェクターペプチドをコードする配列に連結される。示されるペプチドについてのコード配列は、適切な細胞株のような天然の供給源からＤＮＡを単離することによって、または公知の合成法、例えば、リン酸トリエステル法によって得ることができる。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）を参照のこと。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成器を使用して調製される。一旦単離されると、ＴＣＲ分子をコードする遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または当該分野において公知の他の手段によって増幅され得る。ＴＣＲペプチド遺伝子を増幅するために適切なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に制限部位を付加する。ＰＣＲ産物は好ましくは、エフェクターペプチドについてのスプライス部位、およびＴＣＲ−エフェクター融合複合体の適切な発現および分泌に必要なリーダー配列を含む。ＰＣＲ産物はまた好ましくは、リンカー配列、このような配列のライゲーションのための制限酵素部位をコードする配列を含む。
【００５１】
本明細書中で記載される融合タンパク質は好ましくは、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば、一旦ＴＣＲタンパク質をコードするＤＮＡ分子が単離されると、配列は、エフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子にライゲーションされ得る。ＴＣＲ分子をコードするヌクレオチド配列は、エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列、またはより典型的には、ＴＣＲ分子をコードする配列と、エフェクターペプチドをコードする配列との間に挿入され得る本明細書中に考察されるようなリンカー配列をコードするＤＮＡ配列に直接的に結合され得、および適切なリガーゼを使用して結合される。得られるハイブリッドＤＮＡ分子は、ＴＣＲ融合複合体を生成するために適切な宿主細胞中で発現され得る。ＤＮＡ分子は、ライゲーションの後に、コードされるポリペプチドの転写フレームが変化されない（すなわち、ＤＮＡ分子は互いにインフレームに連結される）ように、５’から３’の方向に互いに連結される。得られるＤＮＡ分子は、インフレームな融合タンパク質をコードする。
【００５２】
他のヌクレオチド配列がまた、遺伝子構築物において含まれ得る。例えば、プロモーター配列は、エフェクターペプチドに融合されたＴＣＲペプチドをコードする配列の発現を制御し、またはリーダー配列は、細胞表面もしくは培養培地にＴＣＲ融合複合体を指向し、構築物中に含まれ得るか、または構築物が挿入される発現ベクターに存在し得る。免疫グロブリンまたはＣＭＶプロモーターは特に好ましい。
【００５３】
融合タンパク質の成分は、それぞれの意図される機能を発揮できれば、ほとんど任意の順で組織化され得る。例えば、１つの実施態様において、ＴＣＲは、エフェクター分子のＣまたはＮ末端に配置される。
【００５４】
本発明のエフェクター分子は、そのドメインが意図する機能に応じたサイズになっているのが好ましい。本発明のエフェクター分子は、周知の化学架橋方法を含む多様な方法によって作製されＴＣＲに融合される。例えば、Ｍｅａｎｓ、Ｇ．Ｅ．およびＦｅｅｎｅｙ、Ｒ．Ｅ．（１９７４）タンパク質の化学修飾、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙを参照のこと。また、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）タンパク質結合および架橋の化学、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。しかし、インフレームな融合タンパク質を作製するために組換え操作を使用することが一般に好ましい。
【００５５】
注記されるように、本発明に従う融合分子または結合分子は、いくつかの方法によって組織化され得る。例示的な構築において、ＴＣＲのＣ末端が、エフェクター分子のＮ末端に作動可能に連結される。連結は、所望される場合、組換え法によって達成され得る。しかし、別の構築においては、ＴＣＲのＮ末端が、エフェクター分子のＣ末端に連結され得る。
【００５６】
あるいは、またはさらに、１つ以上のさらなるエフェクター分子が、必要に応じてＴＣＲ融合または結合複合体に挿入され得る。
【００５７】
本発明に従う好ましい融合および結合複合体は典型的に、配列中に作動可能に連結される（ＮからＣ末端）：１）ＴＣＲ／１つ以上のリンカー分子／および生物学的に活性な分子；２）ＴＣＲ／リンカー分子／および生物学的に活性な分子；ならびに３）ＴＣＲ／第１のリンカー分子／第１の生物学的に活性な分子のサブユニット／第２のリンカー分子／および第２の生物学的に活性な分子のサブユニット。さらに、ＥＥ、ＨＡ、Ｍｙｃ、およびポリヒスチジン、特に６×ＨＩＳのような１つ以上のタンパク質タグは、所望されるように、例えば、溶解度を改善するためにまたはＴＣＲ融合および結合複合体の単離および同定を容易にするために、ＴＣＲ鎖のＮ末端に融合され得る。
【００５８】
リンカー配列は好ましくは、提示する抗原の認識のために、ＴＣＲ分子の結合溝を効果的に配置し得るペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本明細書中で使用されるように、句「ＴＣＲ分子を連結する生物学的に活性なペプチドは効果的に配置される」、または他の類似の句は、ＴＣＲタンパク質に連結される生物学的に活性なペプチドが、生物学的に活性なペプチドが、細胞増殖を誘導するために、免疫反応を開始または阻害するために、または以下に開示されるアッセイによって決定されるように細胞発達を阻害または不活性化するためのいずれかで、エフェクター分子と相互作用でき、提示する細胞の活性を調節することができるように配置されることを意図的に意味するもので、アッセイは、細胞を細胞が増殖するように培養し、そして細胞と本発明のＴＣＲ融合複合体とを接触し、および次いでＴＣＲ融合タンパク質が細胞の発達をさらに阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含する。
【００５９】
好ましくは、リンカー配列は約７〜２０個のアミノ酸、より好ましくは約８〜１６個のアミノ酸を含む。リンカー配列は好ましくは、単一の所望されない配座において生物学的に活性なペプチドを保持しないように柔軟である。リンカー配列は、例えば、融合された分子から認識部位を間隔を空けて配置するために用いられる。具体的には、ペプチドリンカー配列は、ＴＣＲ鎖とエフェクターペプチドとの間に、例えば、これを化学的に架橋するために、および分子柔軟性を提供するために配置され得る。リンカーは好ましくは優先的に、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、およびセリンのような、小さな側鎖のアミノ酸を含む。好ましくは約８０または９０パーセントまたはそれ以上のリンカー配列は、グリシン、アラニン、またはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む。ヘテロ２量体ＴＣＲを含むＴＣＲ融合複合体について、リンカー配列はＴＣＲ分子のβ鎖に適切に連結されるが、リンカー配列はまた、ＴＣＲ分子のα鎖に付着され得る。あるいは、リンカー配列はまた、ＴＣＲ分子のαおよびβ鎖に連結され得る。ＴＣＲ  β鎖分子にエフェクター分子ペプチドを共有結合的に連結するために、リンカーのアミノ酸配列は、ＴＣＲ  β鎖のＮ末端残基からエフェクター分子ペプチドのＣ末端残基までの適切な距離をわたり得るべきである。このようなβ＋ペプチド鎖がα鎖と共に発現される場合、図１において一般に描写されるように、連結されたＴＣＲ−エフェクターペプチドは折り畳まれ、機能的なＴＣＲ分子になる。１つの適切なリンカー配列は、ＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（すなわち、Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ）であり、好ましくはＴＣＲのβドメインの第１のアミノ酸に連結される。異なるリンカー配列が使用され得、抗体可変領域をともに結合するために首尾よく使用されている任意の多くの柔軟性のリンカー設計を含む。Ｗｈｉｔｌｏｗ、Ｍ．ら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２：９７−１０５を参照のこと。適切なリンカー配列は、経験的に容易に同定され得る。さらに、リンカー配列の適切な大きさおよび配列はまた、ＴＣＲ分子の予測される大きさおよび形状に基づく従来のコンピューターモデリング技術によって決定され得る。
【００６０】
本発明のＴＣＲ融合複合体を発現するために多くの方法が用いられる。例えば、上記のＴＣＲ遺伝子融合構築物は、ベクターに制限酵素で解裂を作り該構築物を挿入するといった公知の手段によって適切なベクターに導入されライゲーションされる。次いで遺伝子構築物を含むベクターは、ＴＣＲ融合ペプチドの発現のために適切な宿主に導入される。概要は前出、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経験的に作製され得る。例えば、ベクターは、用いられる宿主と適合性であり、および宿主について正確な複製を有する。さらにベクターは、発現されるＴＣＲ融合複合体をコードするＤＮＡ配列を備えていなければならない。適切な宿主細胞は、真核生物および原核生物細胞、好ましくは容易に形質転換され得、および増殖培地中で迅速な増殖を示し得るこれらの細胞を包含する。具体的に好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓなどのような原核生物、および動物細胞および酵母株、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような真核生物である。哺乳動物細胞はまた一般に好ましく、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ、またはＣＨＯが好ましい、他の適切な宿主は、例えば、Ｓｆ９のような昆虫細胞を包含する。従来の培養条件が使用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと。次いで、適切な形質転換されたまたはトランスフフェクトされた細胞株が選択される。本発明のＴＣＲ融合複合体を発現する細胞は、公知の手順によって決定され得る。例えば、免疫グロブリンに連結されるＴＣＲ融合複合体の発現は、連結された免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡによって、および／または免疫ブロッティングによって決定され得る。
【００６１】
概ね上述のように、宿主細胞は、所望される融合タンパク質をコードする核酸を増殖するための調製目的のために用いられる。従って、宿主細胞は、融合タンパク質の産生が特異的に意図される原核生物または真核生物細胞を包含し得る。従って、宿主細胞は具体的には、融合物をコードする核酸を増殖し得る酵母、ハエ、ケムシ、植物、カエル、哺乳動物の細胞および器官を包含する。用いられる哺乳動物細胞株の制限されない例は、ＣＨＯｄｈｆｒ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０））、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））、または黒色腫細胞様ＳＰ２もしくはＮＳＯを包含する（Ｇａｌｆｒｅ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３（Ｂ）：３（１９８１））。
【００６２】
所望される融合タンパク質をコードする核酸を増殖し得る宿主細胞は、非哺乳動物真核生物細胞をまた包含し、昆虫（例えば、Ｓｐ．ｆｕｎｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｎｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ；概して、Ｆｌｅｅｒ、Ｒ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３（５）：４８６４９６（１９９２）によって概説される）、真菌、および植物細胞を含む。また意図されるのは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓのようなある原核生物である。
【００６３】
所望される融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするための標準的な技術によって宿主細胞に導入され得る。用語「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」は、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従来の技術を包含することが意図され、カルシウムリン酸共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入、および／または取込を包含する。宿主細胞をトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出および他の実験室教科書において見出され得る。
【００６４】
本発明はさらに、目的の融合タンパク質を単離するための生成プロセスを提供する。プロセスにおいて、宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌、または動物の細胞）は、調節配列に作動可能に連結される目的のタンパク質をコードする核酸が導入され、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するための融合タンパク質の存在下で培養培地中で生成規模にて増殖される。続いて、目的の融合タンパク質は採集された宿主細胞から、または培養培地から単離される。標準的なタンパク質精製技術が、培地からまたは採集された細胞から目的のタンパク質を単離するために用いられる。特に、精製技術は、ローラーボトル、スピナフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、または発酵器を含む多様な実施から大規模に（少なくともミリグラムの量において）所望される融合タンパク質を発現および精製するために用いられる。
【００６５】
発現されるＴＣＲ融合複合体は、公知の方法によって単離および精製され得る。典型的に培養培地は、遠心分離され、次いで上清は、親和性または免疫親和性クロマトグラフィー、例えば、連結されるＴＣＲまたはその免疫グロブリン領域のような発現される融合複合体を結合するモノクローナル抗体の使用を含むプロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマトグラフィープロトコルによって精製される。本発明の融合タンパク質は、公知の技術の適切な組み合わせによって分離および精製される。これらの方法は、例えば、塩沈降および溶媒沈降のような溶解度を使用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量における差異を使用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷における差異を利用する方法、親和性クロマトグラフィーのような特異的な親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性における差異を利用する方法、および等電点電気泳動のような等電点における差異を利用する方法、Ｎｉ−ＮＴＡのような金属親和性カラムを包含する。これらの方法に関する開示について、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと。
【００６６】
本発明の融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質は、融合タンパク質が少なくとも８０％または９０％〜９５％の均一性（ｗ／ｗ）において好ましくは存在するように、これに天然に付随する細胞基質から単離されている。少なくとも９８〜９９％の均一性を有する融合タンパク質が、多くの薬学的な、臨床的な、および研究的な適用について最も好ましい。一旦実質的に精製されると、融合タンパク質は治療学的適用についての混入物が実質的にあってはならない。一旦、部分的にまたは実質的な純度に精製されると、可溶性融合タンパク質は、治療学的に、または本明細書中に記載されるようなインビトロまたはインビボアッセイを行うにおいて、用いられる。実質的な純度は、クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動のような多様な標準的な技術によって決定され得る。
【００６７】
本発明の短縮されたＴＣＲ融合複合体は、ＴＣＲ融合複合体が発現後に培養培地に分泌され得るように十分に短縮されるＴＣＲ分子を含む。従って、短縮されたＴＣＲ融合複合体は、疎水性残基が豊富な領域、主としてＴＣＲ分子の膜貫通および細胞質ドメインを含まない。従って、本発明の好ましい短縮されたＤＲ１  ＴＣＲ分子について、ＴＣＲ分子のβ鎖の約１９９〜２３７残基およびα鎖の約１９３〜２３０残基が、短縮されたＴＣＲ融合複合体中に含まれない。
【００６８】
用語「誤って折り畳まれた」は、融合タンパク質に関しては、部分的にまたは完全にアンフォールドされる（すなわち、変性される）タンパク質が意味される。融合タンパク質は、以下に考察されるような１つ以上のカオトロピック剤との接触によって部分的にまたは完全に誤って折り畳まれる。より一般には、本明細書中に開示される誤って折り畳まれた融合タンパク質は、対応するネイティブなタンパク質の高いＧｉｂｂｓ遊離エネルギー（ΔＧ）の形態の代表である。好ましいのは、通常正確に折り畳まれるネイティブな融合タンパク質であり、これは水溶液中で十分に可溶性であり、およびこれは比較的低いΔＧを有する。従って、ネイティブな融合タンパク質はほとんどの例において安定性がある。
【００６９】
従来のストラテジーの１つまたはその組み合わせによって融合タンパク質の誤った折り畳みを検出することが可能である。例えば、誤った折り畳みは、ネイティブな（コントロール）の分子および誤った折り畳みの分子を使用する旋光性測定を含む従来の生物理学的技術によって検出され得る。
【００７０】
用語「可溶性」または類似の用語によって、融合分子、および特に融合タンパク質が、低い重力遠心分離（例えば、標準的な遠心分離における１分間あたり約３０，０００未満の回転）のもとでは、水性緩衝液、例えば細胞培地から、容易に沈降されないことが意味される。さらに、融合分子は、約５〜３７℃以上の温度にて、またアニオンまたは非イオン洗浄剤の低濃度での存在下または非存在下、中性またはこれに近いｐＨで、水溶液中に残存する場合、可溶性である。これらの条件下、可溶性タンパク質はしばしば、低い沈降価、例えば、１０〜５０未満のｓｖｅｄｂｅｒｇ単位を有する。
【００７１】
本明細書中で参照される水溶液は主に、約５〜９のｐＨ範囲内にｐＨを、および約２ｍＭと５００ｍＭとの間にイオン強度範囲を確立する緩衝化化合物を有する。時折、プロテアーゼインヒビターまたは穏やかな非イオン性洗浄剤が添加される。さらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなキャリアタンパク質が、所望される場合、数ｍｇ／ｍｌに添加される。例示的な水性緩衝液は、標準的なリン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、または他の周知の緩衝液、および細胞培地処方物を包含する。
【００７２】
本発明のＴＣＲ融合および結合複合体は、１つ以上の疾患によって感染される、または感染され得る多様な細胞を用いる、インビトロまたはインビボでの使用に適切である。
【００７３】
ＴＣＲ融合／結合治療の使用の説明として、培養された細胞が、単一の血清型の病原体によって感染され、次いで感染された細胞は、インビトロで特定の融合タンパク質と接触される。以前に考察されたように、融合タンパク質は、ＴＣＲの会合によって、感染された細胞にトキシンドメインが提示されるように配置される。細胞に生体活性分子の導入を提供した後（一般的に約３０分未満）、細胞は約２〜２４時間、通常約１８時間までの間、その効力下に置かれ、その後適切な緩衝液または細胞培地中で洗浄され、次いで生存度について評価される。融合タンパク質による細胞殺傷または障害について割り当てられる時間は、選択される特定のエフェクター分子によって変わる。しかし生存度はしばしば、約２〜６時間、長くとも約２４時間後に評価される。以下により詳細に記載されるように、細胞生存度は、周知の染料（例えば、トリパンブルー）または蛍光の取り込みをモニターすることによって容易に測定され、および定量される。
【００７４】
本発明の融合分子によって形質導入された細胞は、標準的な方法によって生存度についてアッセイできる。１つのアプローチにおいて、細胞生存度は、形質導入後またはその間に、ＤＮＡ複製を測定することによって容易にアッセイされる。例えば、好ましいアッセイは、放射線標識されたチミジンのような１つ以上の検出可能に標識されたヌクレオシドの細胞取り込みを包含する。取り込みは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈降、続いてシンチレーションカウンティングを含むいくつかの従来のアプローチによって簡便に測定され得る。他の細胞生存度法は、周知のトリパンブルー排除技術を包含する。
【００７５】
本発明の融合複合体のＴＣＲ分子は適切に、天然に存在するＴＣＲ分子、例えば、ヒト、マウス、または他のげっ歯類、または他の哺乳動物のＴＣＲ分子にアミノ酸配列において対応する。
【００７６】
従って、自己免疫または炎症応答の阻害のための本発明の１つの治療方法は、Ｔ細胞レセプターアンタゴニストエフェクター分子を含むＴＣＲ複合体を包含する。好ましくは、「短縮された」可溶性ＴＣＲ複合体が投与され、すなわちＴＣＲ複合体は膜貫通部分を含まない。投与された可溶性ＴＣＲ融合複合体のエフェクター分子としては、ある細胞に特異的であるか、所望される結果を作製するのに特異的であるものが選択され得る。このようなエフェクター分子は、当業者の方法によって容易に同定および選択され得る。エフェクターペプチド、すなわち、Ｔ細胞レセプターアンタゴニストまたは部分的なアゴニストを含むＴＣＲ融合複合体は、アレルギーおよび自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、インシュリン依存性真性糖尿病、および慢性リウマチ関節）の治療に有用である。
【００７７】
免疫応答の誘導のための、本発明の別の治療方法は、サイトカインのような任意の同時刺激性エフェクター分子の存在下での本発明の１つ以上のＴＣＲ誘導複合体の有効量の投与を提供し、それによってＴＣＲを結合する提示される抗原の位置で所望される免疫応答を誘導する。ＴＣＲ融合複合体は、上記のように短縮された形態であり得、および可溶性タンパク質として投与され得る。あるいはＴＣＲ融合複合体は完全長であり得、すなわち、膜貫通部分を含む。これらの複合体での治療は、本発明の完全長ＴＣＲ融合複合体およびエフェクター分子をコードするＤＮＡベクターを含む有効量のＤＮＡ配列を哺乳動物に投与することを包含する。
【００７８】
本発明に於ける様々な治療法は、疾患（disorder）のより有効な治療を提供するために、組み合わせて用いてもよいし、抗炎症薬等、他の公知の治療剤とともに用いてもよい。例えば、自己免疫異常およびアレルギーの治療のために、免疫抑制ＴＣＲ融合複合体は、コルチコステロイドおよび非ステロイド剤等の抗炎症剤と組み合わせて用いてもよい。
【００７９】
本発明の化合物は、悪性の疾病、疾患があるか、またはその疑いのあるヒト患者に特に有用である。本発明の化合物は、ヒト患者において特定の腫瘍抗原を標的化するのに特に有用である。本発明により治療される疾患の特定の例は、ガン（例えば、乳ガン、前立腺ガンなど）；ウイルス感染（例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶなど）、ならびに本明細書中に言及される特定の疾患を包含する。
【００８０】
理論に拘束されるのは望まないが、複合的また特異的に共有結合された本発明の化合物（すなわち、少なくとも１つのＴＣＲと組み合わされた少なくとも１つの同定される抗ガン薬物）は、例えば被験体（患者）各々における標的抗原に薬物の標的化を増進することによって、抗ガン薬の効力を有意に向上させる。
【００８１】
共有結合により、本発明の結合体はさらに、抗ガン剤およびＴＣＲを、基本的に同時に対象の細胞に提示するが、該効果は、共有結合を伴わない本化合物の薬剤を「カクテル（混合）」処方にて投与する形態に於いては容易に得られないであろう。
【００８２】
１つの薬物での治療は次いで、もう一つの薬物に患者を感作するという報告があった。従って、本発明の結合体を介する被験体細胞への、抗ガン薬およびＴＣＲの基本的に同時の提示は、例えば、相乗効果的結果を提供することによって、および／または免疫応答の産生を増進することによって、薬物活性を向上させる。
【００８３】
本発明の化合物の投与は、経口、局所（経皮、頬側、または舌下を含む）、鼻内、および非経口（腹腔内、皮下、静脈内、皮内、または筋肉内注射を含む）を含む多くの適切な経路によってなされ得、経口または非経口が一般に好ましい。投与の好ましい方法および投薬量は、例えば、レシピエント（患者）の状態および年齢によって異なる。
【００８４】
本発明の化合物は、治療において、単独で、または所望の兆候を治療する認識された薬理学的活性を伴う医薬等、他の医薬と組み合わせて、用いられる。例示的な医薬としては、外科手術、放射線、化学治療、および他の形態の免疫治療（例えば、ワクチン、抗体ベースの治療）等、認識された治療を包含する。本発明の化合物は、必要に応じて、該治療の前に、間に、または後に投与される。
【００８５】
本発明の１つ以上の化合物は単独で投与され得るが、これらはまた、従来の賦形剤、すなわち非経口、経口、または他の所望される投与に適切であり、および活性な化合物と有害に反応せず、およびそのレシピエントに対しても有害でない薬学的に受容される有機または無機キャリア物質との混合物中の薬学的組成物の部分として示される。本発明の薬学的組成物は一般に、本発明の１つ以上のＴＣＲ融合複合体、またはこのような融合複合体をコードするＤＮＡ構築物を、１つ以上の好ましいキャリアとともに包含する。キャリアは構築物の他の成分と適合性があるという意味で、「好ましい」のもでなくてはならず、およびそのレシピエント（患者）に対して有害であってはならない。適切な薬学的に受容されるキャリアは、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド、ジグリセリド、ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ、ヒドロキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドンなどを含むが、これらに制限されない。薬学的調製物は滅菌され、そして所望により、補助剤、例えば、活性な化合物と有害に反応しない、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、浸透圧を影響するための塩、緩衝液、着色剤、香料、および／または芳香族物質などとともに混合される。
【００８６】
非経口適用について、特に適切なものは、溶液、好ましくは、油性または水性溶液、ならびに懸濁液、乳化液、または座薬のような植え込み錠である。アンプルは、簡便な単位投薬量である。
【００８７】
腸適用について、特に好ましいのは、錠剤、糖衣錠、またはタルクおよび／もしくは炭水化物キャリア結合剤を有するカプセルなどであり、キャリアは好ましくはラクトースおよび／またはコーンスターチ、および／またはジャガイモスターチである。甘味の媒体（vehicle)用にはシロップ、エリキシルなどが用いられる。これらを含む持続性放出組成物が処方され、その有効成分は、例えばマイクロカプセル化、多重コーティングのような、差別化分解性コーティング剤で保護される。
【００８８】
本発明の治療化合物はまた、リポソームに取り込まれ得る。取り込みは、公知のリポソーム調製手順、例えば超音波処理および押し出し成形処理等のに従って行われる。リポソーム調製に適する従来の方法としては、例えば、Ａ．Ｄ．Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３：２３８−２５２（１９６５）；Ｆ．Ｏｌｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、５５７：９〜２３（１９７９）；Ｆ．Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、７５：４１９４〜４１９８（１９７８）；Ｓ．Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７２８：３３９〜３４８（１９８３）；およびＭａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、８５８：１６１〜１６８（１９８６）に開示される。
【００８９】
本発明はまた、ヒトのような哺乳動物に免疫応答を誘起するための方法を提供し、感染因子またはガンのような標的される疾患に対して、ヒトのような哺乳動物をワクチン接種する工程を包含する。
【００９０】
これらの方法は、本発明のＴＣＲ融合複合体をコードするＤＮＡベクターを含むＤＮＡ配列の有効な量を哺乳動物に投与する工程を包含する。ＴＣＲ融合複合体の発現ベクターの調製は上記され、および以降の実施例において記載される。プラスミドＤＮＡの投与のための方法、投与された被験体の細胞によるＤＮＡの取込み、およびタンパク質の発現は報告されている。例えば、Ｕｌｍｅｒ、Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２５９：１７４５〜１７４９を参照のこと。
【００９１】
本発明のＴＣＲ融合複合体をコードするＤＮＡベクターは、好ましくは、筋肉内注入によってヒトを含む哺乳動物に適切に投与される。哺乳動物の骨格筋肉へのｃＤＮＡの投与は、その後の筋肉細胞による投与される発現ベクターの取込み、およびＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現とともに、Ｕｌｍｅｒらによって記載されており、および例示的なプロトコルを示す［Ｕｌｍｅｒ、Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９］。所定の治療に最適な投与量は従来の方法で決定される。
【００９２】
ヒト疾患の治療に加えて、本発明のＴＣＲ融合および結合複合体、ならびにこのような融合複合体をコードする本発明のＤＮＡ構築物は、獣医学的適用、例えばウシ、ヒツジなどのような家畜、ならびにイヌおよび猫のようなペットの疾患の治療に有意に用いられる。
【００９３】
所定の治療における本発明のＴＣＲ融合複合体またはこれをコードするＤＮＡ構築物の好ましい実際の投与量は、特定の活性化合物または使用される化合物、処方される特定の組成物、投与の態様、投与の特定の部位、患者の体重、健常度全般、性別等、治療されるべき特定の症状等、また担当医または獣医を含む当業者によって認識されるその他の因子によっても異なる。投与の所定のプロトコルについての最適な投与比率は、例えば、上述の指針に関して行われる従来の投薬量決定試験および本明細書中に開示されるアッセイにより、当業者によって容易に決定される。
【００９４】
本明細書中で言及される全ての書類は、それらの全てが本明細書中に十分に援用される。以下の制限されない実施例は、本発明の説明である。
【００９５】
【実施例】
実施例１
２６４  １本鎖（ｓｃ）ＴＣＲの構築
Ｔ細胞クローン、２６４は、ＨＬＡ−Ａ２．１によって制限されるヒト野生型腫瘍抑制タンパク質ｐ５３のペプチドフラグメント（アミノ酸２６４〜２７２；ＬＬＧＲＮＳＦＥＶ）を認識する。Ｔ細胞受容体遺伝子は、可溶性ＴＣＲおよび機能的受容体分子を生成するために以前に示された３つのドメインの１本鎖形式にクローン化された。
【００９６】
簡潔には、ｍＲＮＡがＴ細胞クローンから単離され、ｃＤＮＡがマラソン（Marathon)ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して作製された。ｃＤＮＡクローンの配列決定は２つの異なるＶα鎖（Ｖα３およびＶα１３）、ならびに単一のＶβ鎖（Ｖβ３）を同定した。ｃＤＮＡは、プライマーＫＣ２２８およびＫＣ２２９またはＫＣ２２６およびＫＣ２２７を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における鋳型として使用されて、５’ＳｆｉＩ−３’ＳｐｅＩ  Ｖα３またはＶα１３フラグメントをそれぞれ生成した。次いで同じＤＮＡを、プライマーＰＲＩＢ４およびＫＣ１７６を用いるＰＣＲ鋳型として使用して、５’ＸｈｏＩ−３’ＸｍａＩ  ＶβＣβ鎖フラグメントを作製した。Ｃβ鎖は、完全長Ｃβ鎖のアミノ酸１２７でのシステイン残基の直前を短縮された。
【００９７】
αおよびβ鎖フラグメントは、ＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化された。正確なフラグメントは、制限消化され、そして発現ベクターｐＫＣ６０（係属中の米国特許出願第０８／８１３，７３１号において以前に記載される）にクローン化されて、２つのＶα−（Ｇ４Ｓ）４Ｖβ  Ｃβ  ｓｃＴＣＲ分子の、２６４−Ａ（Ｖα３を伴う）および２６４−Ｂ（Ｖα１３を伴う）を作製した。
【００９８】
上記のＤＮＡ構築物（２６４−Ａおよび２６４−Ｂ）は、それぞれ、プライマーＥＴ−ＴＣＲＦ１およびＫＣ１７０またはＥＴ−ＴＣＲＦ２およびＫＣ１７０を用いるＰＣＲによって再増幅されて、５’ＡｇｅＩ−３’ＣｌａＩ  ＤＮＡフラグメントを作製した。フラグメントは、ＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにクローン化された。
【００９９】
次いで、５’ＡｇｅＩ−３’ＣｌａＩ  ＤＮＡフラグメントは、それぞれ、プライマーＫＣ２３２およびＫＣ２０８またはＫＣ２３１およびＫＣ２０８を用いるＰＣＲにおいて鋳型として使用されて、ＣＤ３ζ融合分子（以下に記載される）および最終的に２６４  ＩＬ−２融合分子（以下に記載される）へのクローニングのための、５’ＡｇｅＩ−３’ＨｐａＩ  ＤＮＡフラグメントを生成した。
【０１００】
実施例２
ＣＤ３ζ融合ベクターの構築
２つのＶα鎖のどちらが機能的であるかを決定するために、２６４−Ａおよび２６４−Ｂ  ｓｃＴＣＲの両方が、ＣＤ３ζ融合分子として発現された。
【０１０１】
シャトルベクターの構築は、係属中の米国特許出願第０９／４２２，３７５号において以前に記載されている。
【０１０２】
簡潔には、αおよびβ鎖ＴＣＲフラグメントを、発現ベクターｐＫＣ６０にクローン化してＶα−（Ｇ４Ｓ）４  Ｖβ  Ｃβ  ｓｃＴＣＲ分子を作製した。新規なベクターはｐＮＡＧ２と命名された（図９）。次いで、ｐＮＡＧ２はプライマーＫＣ２０３およびＫＣ２０８を用いるＰＣＲによって再増幅されて、５’ＡｇｅＩ−３’ＨｐａＩ／ＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩ／ＣｌａＩ  ＤＮＡフラグメントを作製した。ｓｃＴＣＲフラグメントは、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにクローン化されて、そしてこの新規なｐＧＥＭベースのベクターは次いで、二特異的ｓｃ分子を作製するために他のＤＮＡフラグメントの導入のための「シャトルベクター」として使用された。
【０１０３】
次いでＳｃ−Ｆｖ  ＤＮＡは制限消化され、そしてｓｃＴＣＲの下流に「シャトルベクター」にクローン化された。ｓｃＴＣＲおよびｓｃＳｃ−Ｆｖをともに、１本鎖融合タンパク質として連結するために、「シャトルベクター」を適切な制限酵素で消化して、以前のリンカーＤＮＡフラグメントを除き、そしてｓｃＴＣＲとＳｃ−Ｆｖとの間のリンカー配列のライゲーションを可能にした。
【０１０４】
上述で概説されるように「シャトルベクター」設計において、停止コドンおよびスプライス部位が、「バック」プライマーＫＣ２０８を用いるｓｃＴＣＲのＰＣＲ増幅の部分としてＮｒｕＩ制限部位とＣｌａＩ制限部位との間に導入された。二特異的ｓｃタンパク質の下流精製を補助するために、アニールされたオリゴ（ＫＣ２３７およびＫＣ２３８）のセットを、停止コドンおよびスプライス部位とともに３’ＥＥタグ（ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ）を導入するために設計した。アニールされたオリゴ対は、５’ＮｒｕＩ−３’ＣｌａＩを、すでに完全な二特異的ｓｃ分子をコードする「シャトルベクター」にクローン化した。
【０１０５】
ｓｃＴＣＲ、Ｓｃ−Ｆｖ、リンカー、およびタグＤＮＡフラグメントを「シャトルベクター」にクローニングして、二特異的ｓｃ分子設計を完了した後、ＤＮＡを制限消化（ＡｇｅＩ−ＣｌａＩ）し、そして哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ２７にクローン化した（図１０）（ｐＢＩＳＰ／１４９を作製するための係属中の米国特許出願第０８／９４３，０８６号において以前に記載される）（図１１）。
【０１０６】
ＣＤ３ζ融合ベクターの構築
簡潔には、マウスｃＤＮＡを、プライマーＫＣ３１２およびＫＣ３０４を用いるポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として使用して、５’ＨｐａＩ−３’ＣｌａＩマウスＣＤ３ζフラグメントを生成した。
【０１０７】
マウスＣＤ３ζフラグメントを、ＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにクローン化した。正確なフラグメントを制限消化し、そして「シャトルベクター」にクローン化し、効果的に既存のリンカー、ｓｃＦＶ、およびＥＥタグを除去した。
【０１０８】
ＣＤ３ζ遺伝子を「シャトルベクター」にクローニングした後、ＤＮＡをＡｇｅＩ−ＨｐａＩで消化して、２６４−Ａおよび２６４−Ｂ  ｓｃＴＣＲフラグメント（上記される）とのライゲーションを許容して、２つの新規なｓｃＴＣＲ／ＣＤ３ζ融合体を作製した。最後に、新規なＤＮＡ調製物を制限消化（ＡｇｅＩ−ＣｌａＩ）し、そして係属中の米国特許出願第０９／４２２，３７５号において以前に記載される哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ２８（ｐＢＩＳＰ／ＤＯ１１．１０ベクター）、図１１にクローン化した。
【０１０９】
実施例３
２６４  ｓｃＴＣＲ／ＣＤ３ζ融合分子の発現
ジャーカット細胞を冷却ＤＰＢＳで洗浄することによってトランスフェクションのために調製した。細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁し、そして２０μｇのＰｖｕＩ直鎖化２６４−Ａ／ＣＤ３ζまたは２６４−Ｂ／ＣＤ３ζＤＮＡとともに混合した。氷上で５分間後、細胞を、２５０ボルトの１回のパルス、９６０ｕ  Ｆｄまたは０．２５ｕ  Ｆｄを送達するために設定されたＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してエレクトロポレートした。パルスされた細胞を、氷上に５分間置いた。細胞を１０ｍｌの１０％  ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  グルタミン）中に希釈し、そしてＴ−２５ｃｍ２ＴＣフラスコ中で、一晩、３７℃にて５％ＣＯ２で増殖した。翌日、細胞を選択的な培地（１０％  ＩＭＤＭ＋１．０ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）を伴う９６ウェルプレート中に置いた。１週間後、Ｇ４１８の濃度を２ｍｇ／ｍｌに増加した。増殖するコロニーをトランスフェクションの約２週間後に再栄養補充し、そして約１週間後にスクリーニングした。
【０１１０】
トランスフェクトされたジャーカット細胞を、フローサイトメトリー分析を使用してｓｃＴＣＲの表面発現についてスクリーニングした。ポジティブなトランスフェクト体を、マウスＴＣＲのＣβドメインの部分を検出する、蛍光でタグされたｍＡｂ（Ｈ５７−５９７）で染色することによって同定した。
【０１１１】
実施例４
正確な２６４  ｓｃＴＣＲ  Ｖαドメインの同定
ＣＤ３ζ融合分子２６４−Ａまたは２６４−Ｂバージョンのいずれかを発現するトランスフェクトされたジャーカット細胞を、細胞活性化アッセイにおいて使用した。アッセイにおいて、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞株Ｔ２が、ＡＰＣとして使用された。Ｔ２細胞を、２６４ペプチド（または非関連性のペプチド）とともに、一晩、３７℃にて、５％ＣＯ２で負荷された。翌日、トランスフェクトされたジャーカット株を添加し、そしてペプチドでパルスされたＡＰＣとの相互作用を一晩許容した。
【０１１２】
２６４で負荷されたＡＰＣによるトランスフェクト体の特異的な刺激が、ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡを使用して評価された。抗ヒトＩＬ−２  ｍＡｂを受動的に一晩、９６ウェルプレート上でコートした。プレートを洗浄し、そして１０％  ＦＢＳ／ＤＰＢＳで１時間ブロックした。ブロッキング試薬を弾き落とし、そしてアッセイからの上清をプレートに１時間３７℃にて添加した。洗浄後、結合されたＩＬ−２を、ビオチンに結合された別の抗ＩＬ−２ｍＡｂを使用して検出した。３７℃で４５分間後、プレートを洗浄し、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰを１５分間添加した。最後、プレートを洗浄し、そしてＡＢＴＳ基質を使用して呈色した。吸光度を、４０５ｎｍにて読み取った。
【０１１３】
細胞活性化アッセイに基づいて、Ｖα３ドメインは機能的であった。２６４−Ａ分子のみが、２６４ペプチドで負荷されたＡＰＣの存在下でＩＬ−２を生成するために刺激された。
【０１１４】
実施例５
２６４  ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合分子の構築
ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合分子を作製するために、ヒトＩＬ−２遺伝子が、ＤＮＡ発現ベクターにクローン化されることが必要であった。
【０１１５】
簡潔には、全ＲＮＡを、Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）およびＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ヒトジャーカット細胞から単離した。ＲＮＡを濃縮し、そして逆転写酵素および特異的なバックプライマー、ＫＣ３２８Ｂとの反応において使用し、そしてｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡを、プライマーＫＣ３２７ＢおよびＫＣ３２８Ｂを用いるＰＣＲにおける鋳型として使用して、５’ＢｓｐＩ−３‘ＮｒｕＩヒトＩＬ−２遺伝子フラグメントを生成した。
【０１１６】
ヒトＩＬ−２フラグメントを、配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにクローン化した。正確なフラグメントを制限消化し、そして「シャトルベクター」にクローン化し、効果的に既存するｓｃＦｖ遺伝子を取り出した。
【０１１７】
次いで「ＩＬ−２改変シャトルベクター」を、制限消化し（ＢｓｐＩ−ＮｒｕＩ）、そしてｓｃＴＣＲ（上記される）をライゲーションして、ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２設計を完了した。最後に、ＤＮＡをＡｇｅＩ−ＣｌａＩ切断し、そして哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ２８にクローン化した。
【０１１８】
実施例６
１４９ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合分子の構築
ＩＬ−２融合体の１４９ｓｃＴＣＲ（特許出願第０９／４２２，３７５号において詳細に記載される）バージョンを作製するために、１４９ｓｃＴＣＲを、５’ＡｇｅＩ−３’ＨｐａＩフラグメントとして「シャトルベクター」から切り出し（特許出願第０９／４２２，３７５号の実施例７を参照のこと）、次いで「ＩＬ−２改変シャトルベクター」（上記される）にライゲーションした。次いで１４９ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２フラグメントを制限消化（ＡｇｅＩ−ＣｌａＩ）し、そして哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ２８にクローン化した。
【０１１９】
実施例７
ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合分子の発現
ＣＨＯ細胞を、冷却ＤＰＢＳで洗浄することによってトランスフェクションのために調製した。細胞をＤＰＢＳ中に再懸濁し、そして２０μｇのＰｖｕＩ直鎖化２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２または１４９ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２とともに混合した。氷上で５分間後、細胞を、２５０ボルトの１回のパルス、９６０ｕ  Ｆｄまたは０．２５ｕ  Ｆｄを送達するために設定されたＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用してエレクトロポレートした。パルスされた細胞を、氷上に５分間置いた。細胞を１０ｍｌの１０％  ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  グルタミン）中に希釈し、そしてＴ−２５ｃｍ２ＴＣフラスコ中で、一晩、３７℃にて５％ＣＯ２で増殖した。翌日、細胞を選択的な培地（１０％  ＩＭＤＭ＋１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）を伴う９６ウェルプレート中に置き、約７日間後に再栄養補充した。
【０１２０】
トランスフェクト体をＥＬＩＳＡアッセイ形式において可溶性融合分子の発現についてスクリーニングした。抗ヒトＩＬ−２抗体を、受動的に一晩９６ウェルプレート上にコートした。アッセイの日に、プレートを１０％ＦＢＳ／ＰＢＳで１時間ブロックした。ウェルを洗浄し、そしてトランスフェクト体からの上清をプレートに添加した。インキュベートおよび洗浄後、ビオチン化された抗Ｃβ  ｍＡｂ  Ｈ５７−５９７（細胞株はＡＴＣＣから購入した）をプレートに添加し、続いて洗浄し、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰとともにインキュベーションした。ポジティブなウェルをＴＭＢ基質の添加によって同定し、１Ｎ硫酸でクエンチし、そして４５０ｎＭの吸光度にて読み取った。少数のポジティブなクローンが、増大のために使用され、そして限界希釈クローニングを、安定なトランスフェクト細胞株を確立するために行った。
【０１２１】
トランスフェクト体はまた、ｓｃＴＣＲのそれぞれを特異的に認識するｍＡｂを使用するＥＬＩＳＡアッセイ形式において融合分子の発現についてスクリーニングされ、続いてビオチン化抗Ｃβ  ｍＡｂおよびストレプトアビジン−ＨＲＰで検出された。１４９融合分子について、Ｖαドメイン（Ｂ２０．１、Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）に対する立体配座的なｍＡｂが、コーティング抗体として使用された。２６４融合分子は、そのＶβドメインに対する立体配座的なｍＡｂを使用して検出された（ＫＪ２５、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。
【０１２２】
実施例８
ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の精製
ＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を、標準的な親和性クロマトグラフィー法を使用して、トランスフェクト体上清から精製した。融合タンパク質を、濃縮するために抗ＴＣＲ Ｃｏｏ特異的ＣＮＢｒ結合化アガロースカラムに適用した。簡潔には、上清は、カラム床を１回通過させ、ＰＢＳでの洗浄後、低ｐＨのグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）の添加によって結合したタンパク質をカラムから溶出して取り出し、そして１〜１０希釈の２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を添加して即座に中和した。次いで精製されたタンパク質を、３０ｋＤ  ＭＶカットオフ濃度単位を使用してＰＢＳに緩衝液交換した。最終的なタンパク質濃度は、ＯＤ２８０読み取りによって決定された。精製されたタンパク質のクマシーブルー染色（図２）および精製されたタンパク質の免疫ブロット解析（図２）は、２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質の濃縮化を示す。
【０１２３】
実施例９
ＣＴＬＬ−２増殖アッセイ。
ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞株、ＣＴＬＬ−２を、非放射性細胞増殖アッセイを使用して、２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２活性を評価するために使用した。２６４  ｓｃＴＣＲ−Ｄ融合タンパク質を、ネガティブコントロールとしてアッセイにおいて使用した。簡潔には、アッセイのために使用されたＣＴＬＬ−２細胞を１０４細胞／ｍｌで播種し、そして残余のＩＬ−２を涸渇するために４８時間増殖させた。４８時間経過後、細胞は１．１５×１０５細胞／ｍｌの密度に増殖した。次いで細胞を採集し、そして１０％  ＩＭＤＭ（ｗ／ｏ  ＩＬ−２）を使用して数回洗浄して、任意の残存するＩＬ−２を除去した。９６ウェル平底プレートをアッセイのために使用した。先ず、５０μｌの培地（１０％  ＩＭＤＭ）、培地ｗ／ＩＬ−２または精製された２６４−ＩＬ−２もしくは２６４−ｋ融合タンパク質を各ウェルに添加した。ＣＴＬＬ−２細胞を１０５細胞／５０μｌにて各ウェルに添加した。ＩＬ−２標準を同じプレートに対して行った。プレートを３７℃にて５％ＣＯ２を伴って一晩インキュベートした。翌日、細胞死は、顕微鏡を使用して明らかに明白であった。細胞増殖／生存度を、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ａｓｓａｙを使用して評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．によって販売される水性の非放射性細胞増殖アッセイである。アッセイは、新規なテトラゾリウム化合物、ＭＴＳ、および電子結合試薬；ＰＭＳの溶液から構成される。ＭＴＳは細胞によって、組織培養培地中で可溶性であるホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に生体還元される。４９０ｎｍでのホルマザンの吸光度は、さらなるプロセシングを伴わないで９６ウェルアッセイプレートから直接的に測定される。水性可溶性ホルマザンへのＭＴＳの変換は代謝的に活性な細胞において見出される脱水素酵素によって達成される。４９０ｎｍ吸光度の量によって測定されるホルマザン産物の量は、培養物中における生存細胞の数の直接的な割合である。２６４／ＩＬ−２および２６４−ｋ融合タンパク質は、１．２５μｇ／ウェル〜０．００９８μｇ／ウェルに希釈することによって活性について試験された。
【０１２４】
１つの実験からの結果は、図３において示される。ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞株、ＣＴＬＬ−２は、非放射性細胞増殖アッセイで２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２活性を評価するために使用された。２６４  ｓｃＴＣＲ−ｋ融合タンパク質は、ネガティブコントロールとしてアッセイにおいて使用された。
【０１２５】
実施例１０
２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質でのペプチドパルス化細胞の染色は機能的なｓｃＴＣＲを実証する。
【０１２６】
フローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色が、ヒトＢリンパ腫細胞株Ｔ２の表面上でのペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体への、そのＴＣＲを介する融合タンパク質の直接的な結合を示すために使用された（図４）。
Ａ）０．５μｇ（１０μｇ／ｍｌ）の２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質での１４９または２６４ペプチドパルス化Ｔ２細胞の染色。２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質は、２６４ペプチドを提示するＴ２細胞に特異的に結合するが、１４９ペプチドを提示するＴ２細胞には特異的に結合しない。
Ｂ）Ｔ２細胞を５０μｇの１４９または２６４ペプチドのいずれかでパルスした。各ペプチドのＡ２負荷を評価するために、ペプチドでの細胞の一晩のインキュベーション後に、細胞をＨＬＡ−Ａ２特異的ｍＡｂ  ＢＢ７．２（０．０５μｇ）で染色した。これらの実験からの結果は、いずれかのペプチドでパルスされたＴ２細胞上での等価なレベルのＨＬＡ−Ａ２表面発現を示し、両方のペプチドの効果的なＨＬＡ−Ａ２結合を示す。
【０１２７】
実施例１１
２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質によって特異的に媒介される細胞間結合
本実施例において、Ｔ２細胞は１４９または２６４ペプチドのいずれかでパルスされた。ＣＴＬＬ−２細胞を、ハイドロジエチジューム（ＨＥ）標識し、そして２０分間室温で、５０μｇの１４９または２６４ペプチドのいずれかでパルスされた等数のカルセイン−ＡＭ標識化Ｔ２細胞とともにインキュベートした。図５は、１μｇの融合タンパク質が、ＣＴＬＬ−２細胞および２６４ペプチドで負荷されたＴ２細胞を含有するインキュベーション混合物に添加された場合の細胞間の結合を示す（Ａ；３．２５％）。対照的に、１４９ペプチドでパルスされたＴ２細胞を含んだ混合物では結合体形成は観察されなかった（Ｂ；０．８８％）。細胞サンプルを、フローサイトメーターでの分析の前に１回洗浄した。
【０１２８】
実施例１２
ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ（マウス）融合分子の構築は、係属中の米国特許出願第０９／４２２，３７５号において以前に記載され、本明細書中に参考として援用される。
【０１２９】
１４５−２ＣＩＩ  ｓｃＳｃＦｖ単独の、すなわち、二特異的ｓｃ分子の部分としてではない発現は非常に低いことが認識されていた。理論に拘束されることを望まないが、ｓｃ−Ｆｖ発現の低いレベルは、二特異的分子の発現における制限因子であり得る。ネイティブな１４５−２Ｃ  １１ハイブリドーマ細胞株を抗体供給源として使用し、そして細胞をマウスＩｇＧ２ｂ重鎖と融合されたｓｃＴＣＲでトランスフェクトした（図１２）。トランスフェクトされたハイブリドーマ細胞株は、宿主ハムスターＩｇＧがマウスＩｇＧ２ｂ重鎖と効果的に対合され得る場合、いくつかの１４５−２Ｃ１１／ｓｃＴＣＲキメラ分子を分泌するはずである。
【０１３０】
ｐ１４９ｓｃＴＣＲをＩｇＧ融合体としてクローン化するために、先ず、部位特異的変異誘発を使用して、内部ＥｃｏＲＩ制限部位を変異した。簡潔には所望される変異を含む、相補的なオリゴヌクレオチド、ＫＣ２９３およびＫＣ２９４の対を設計した。ｐＮＡＧ２  ＤＮＡ構築物を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。得られるＰＣＲ産物を、親ＤＮＡ鋳型を消化するＤｐｎＩで消化し、変異されたＤＮＡインタクトを残した。変異されたｓｃＴＣＲ  ＤＮＡを配列決定し、次いでプライマーＫＣ２７６およびＫＣ２６８を用いるＰＣＲによって再増幅して、５’ＮｒｕＩ−３’ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを作製した。変異されたｓｃＴＣＲ  ＤＮＡをＤＮＡ配列決定のために、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにクローン化した。正確なｓｃＴＣＲ  ＤＮＡを制限消化し、そして哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ７にクローン化して、ｐ１４９  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合分子を作製した。
【０１３１】
ＤＯ  １１．１０  ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合分子の構築
ｐＫＣ６０  ＤＮＡ構築物を、プライマーＫＣ２７５およびＫＣ２６８を用いるＰＣＲによって再増幅して、５’ＮｒｕＩ−３’ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを作製した。ｓｃＴＣＲフラグメントを、ＤＮＡ配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにクローン化した。正確なｓｃＴＣＲ  ＤＮＡを制限消化し、そして哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＵＮ７にクローン化して、ＤＯ  １１．１０ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合分子（図１２Ａ／１２Ｂを参照のこと）を作製した。
【０１３２】
マウスＩｇＧ２ｂ発現ベクターの構築
マウスＩｇＧ２ｂ（重鎖）発現ベクターの構築は以下のようであった。ベクターの主鎖は、プラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、そして「軽鎖ポリリンカー」ＤＮＡフラグメントを挿入して、開始材料の「軽鎖ベクター」ｐＣＤＮＡ３．ＬＣＰＬを作製した。このリンカーは、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＣｌａＩ、ＰｍＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｍａＩ、ＢａｒｎＨＩ、およびＸｈｏＩを含み、その後のクローニング工程を容易にした。軽鎖リーダー、マウス抗ＣＫＭＢκ軽鎖ゲノムフラグメント、および３’ＵＴＲを含有するＳｍａＩ−ＢｃｌＩ  ＤＮＡフラグメントを、ｐＣＤＮＡ３．ＬＣＰＬのＥｃｏＲＶ−ＢａｒｎＨＩ部位にクローン化した。次いで変異誘発を、ＮｒｕＩ、ＭｌｕＩ、およびＢｓｔＢＩ部位を排除するために、ならびにＮｈｅＩおよびＢａｒｎＨＩ部位を導入するために行い、プラスミドｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＬＣＰＬ．ＬＣＶＫを作製した。
【０１３３】
「重鎖ベクター」ｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＨＣＰＬを、軽鎖発現領域（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ）を制限部位、ＨｐａＩ、ＢｓｐＥＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、およびＸｈｏＩからなる「重鎖ポリリンカー」で置き換えることによって、ｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＬＣＰＬ．ＬＣＶＫプラスミドから構築した。このプラスミドは、ＥｃｏＲＶおよびＫｐｎＩで消化された。重鎖リーダーおよび抗ＣＫＭＢ  ＩｇＧ２ｂマウス重鎖ゲノムフラグメントを含むＳｍａＩＫｐｎＩ消化ＤＮＡフラグメント（Ｎｅａｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎ．１９９０を参照のこと）は次いで、ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ消化プラスミドにライゲーションされた。３’ＵＴＲおよびＳａｌＩ部位の上流のＮｏｔＩ部位を含有するＫｐｎＩ−ＳａｌＩオリゴヌクレオチドフラグメントが続いて、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ消化プラスミドにクローン化されて（ＸｈｏＩ部位をノックアウトする）、プラスミドｐＣＤＮＡ３ｍｕｔ．ＨＣＰＬ．ＨＣＶ２ｂを作製し、これはまたマウスＩｇＧ２ｂ発現ベクターｐＳＵＮ７として知られる（図１３）。
【０１３４】
実施例１３−ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ（ヒト）融合分子の構築。（ｐＪＲＳ３５５へのｓｃＴＣＲ２６４のクローニング、およびＩｇＧ１融合体としての発現）。Ｋｉｎ  Ｃａｒｄによって提供された２６４  ｓｃＴＣＲのＤＮＡ調製物を、このｓｃＴＣＲ構築物のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ｓｃＴＣＲの再増幅を、２６４  ＴＣＲ１ｓおよびＫＣ２６８のプライマーセットを使用して行った。新規に設計された２６４  ＴＣＲ１ｓ配列は以下のように読める、５’−ＴＴＴＣｇＴＡＣｇＴＣＴＴｇＴＣＣＣＡｇＴＣＡｇＴｇＡＣｇＣＡｇＣ−３’。このオリゴヌクレオチドは、Ｂｓｉ  ＷＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびＢ６．２リーダーを伴うように設計された。Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｇポリメラーゼを、標準的なＰＣＲプロトコルに従う増幅反応において使用した。増幅プロフィールは以下のようであった、１サイクルについて９６℃／２分間；５サイクルについて９６℃／３０秒間、６２℃／１５秒間、７２℃／３０秒間；および３０サイクルについて９６℃／３０秒間、６８℃／１分間。Ｃｌｏｎｔｅｃｈプロトコルに従って正確なＭＷ（約１．３Ｋｂまでの）ＤＮＡバンドをゲル精製し、そしてＰｒｏｍｅｇａのｐＧｅｍ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローン化した。ライゲーションおよびＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞への形質転換後、６つのクローンが選択され、そしてＫｉｍ  Ｃａｒｄによって提供された２つのプライマー、ＫＣ２８５およびＫＣ２８８を用いた診断ＰＣＲによってスクリーニングされた。６つのうちの５つのクローンが、正確なＭＷのＤＮＡバンドを生成した。ＤＮＡ配列分析を、２つのクローン、ｓｃＴＣＲ２６４／ｐＧｅｍＡおよびＢに対して行い、各クローンは正確であることが見出された。二重消化（Ｂｓｉ  ＷＩおよびＲｃｏＲＩ）反応を、クローンＡおよびＢについて設定した。正確なＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてともにプールした。精製された２６４  ｓｃＴＣＲを、以前に調製されたｐＪＲＳ３５５ベクターＤＮＡにクローン化した。ライゲーションおよびＸＬ−１  Ｂｌｕｅへの形質転換後、２つのコロニーを選択した（Ａ２およびＢ１）。それらのＤＮＡのＡｌｗ  ＮＩ消化は正確な制限パターンを示した。Ａ２  ＤＮＡを用いた一過性のトランスフェクションは、ＴＣＲおよびＩｇＧ１イソタイプに特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定されるように、２６４  ｓｃＴＣｒ／ＩｇＧ１分子を生成した。
【０１３５】
実施例１４．インビトロでの改変されたＴＣＲの抗腫瘍効果の実証。
実施例１１において、本発明者らはＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が、Ｔ細胞と、正確なペプチドでパルスされた抗原提示細胞との間の結合を媒介し得ることを示した。本発明者らは今や、融合タンパク質によって媒介される架橋が、標的細胞の破壊を生じるか否かに興味がある。実際にそうであるか否かを決定するために、本発明者らはインビトロ殺傷アッセイを使用する。簡潔には、エフェクター細胞が、単離されたマウス脾細胞から作製され、および３日間、３７℃にて５％ＣＯ２中、可溶性組換えヒトＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ３０ｍＡｂ（１４５−２Ｃ１１；１０ｎｇ／ｍｌ）での刺激の存在下、培養する。刺激を伴った３日間の培養後、抗ＣＤ８および抗ＣＤ２５  ｍＡｂを使用する細胞の二重染色、ならびにフローサイトメトリーを行う。二重にポジティブな集団の検出は、エフェクターＣＴＬの首尾よい生成の指標である。
【０１３６】
殺傷アッセイを、カルセイン−ＡＭ染料で標識した標的細胞（例えばペプチドパルス化Ｔ２細胞、種々のガン腫）を用いて行う。生存細胞（標的）は染料を取り込み、次いで洗浄され、そしてエフェクター細胞およびＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質またはポジティブもしくはネガティブなコントロールタンパク質のＩＬ−２およびＴＣＲ−ｋ融合体をそれぞれ含有する９６ウェルプレートに添加される。エフェクター対標的細胞の比率は一般に５：１、１０：１、および２０：１である。アッセイ成分は次いで、２〜４時間、３７℃にてインキュベートされ、そして培養上清へのカルセイン−ＡＭの放出が測定される。カルセイン−ＡＭの特異的な放出が測定されるか、または自発的に放出されるカルセイン−ＡＭの非特異的コントロールに比較される。
【０１３７】
実施例１５
改変されたＴＣＲの抗腫瘍効果のインビボ実証。
ＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が、Ａ２およびｐ５３の両方を天然に発現するヒト腫瘍の排除を促進する能力を試験するために、本発明者らは、このような腫瘍が、ＮｕｄｅおよびＳＣＩＤマウスにおいて確立されたモデルを用いる。このモデルはまた、Ｔ細胞クローンおよびヒト腫瘍に対して指向される免疫サイトカインの効力を試験するためにＳｈｅｒｍａｎ博士の実験室において使用されている。ｐ５３を発現することが知られ、および２６４特異的ＣＴＬによって特異的に殺傷される腫瘍は、ＮｕｄｅおよびＳＣＩＤマウスにおいて増殖するそれらの能力について試験される。候補は、ＭＤＡ−２３８、ＢＴ５４９、ＭＣＦ−７、Ｃａｓｋｉ（頚ガン腫）、およびＨｅｐＧ２細胞を含む。細胞（１×１０６）は、ＮｕｄｅおよびＳＣＩＤマウスの皮下に移植され、そして治療の前の７日間確立させる。最初に、本発明者らは、ＴＣＲ−ＩＬ−２融合分子を単独でマウスが受ける場合、腫瘍増殖が阻害されるか否かの評価の下で各構築物について決定する。本発明者らは、Ｔ細胞が腫瘍排除のためにエフェクター細胞として必要とされることを予測しているが、ＮｕｄｅおよびＳＣＩＤに存在する漏出に起因する他のリンパ細胞が、融合タンパク質によって誘起されるエフェクター機能を有し、これが腫瘍増殖を阻害することも考えられる。これは特に、生得的な免疫系の非リンパ成分を刺激し得るＦｃＤｏｒサイトカインを有する二特異的抗体分子の存在下で確かに起こり得る。一旦本発明者らが、融合タンパク質が腫瘍増殖を影響する能力を決定すると、次いで本発明者らは、エフェクター機能について異なるＴ細胞集団を試験する。マウス腫瘍モデルにおける以前の実験は、ナイーブなまたは活性化Ｔ細胞が送達されるか否かを決定するために必要な情報を提供する。コントロールの目的のために、本発明者らは、同時のＴＣＲ−ＩＬ−２融合治療を伴わないで、活性化Ｔ細胞をエフェクターとしてマウスに送達する。
【０１３８】
実施例１６
ドキソルビシン（Ｄｏｘ）結合体の調製および抗腫瘍特性のインビトロでの特徴付け。
本実施例の目的は、２６４  ｓｃＴＣＲ−ｋおよびドキソルビシンのような細胞傷害性薬物を使用する免疫結合体を開発することである。Ｄｏｘ、薬物の多くのアントラサイクリンファミリーは、公知の最も強力な抗ガン薬物の１つであるが、臨床的な適用はその心毒性に起因して制限されている。心毒性を克服するための試みは、腫瘍部位に特異的に薬物を送達するために、抗腫瘍ｍＡｂのようなキャリア分子にＤｏｘを付着することであった。前臨床モデルにおける研究からの結果は、Ｄｏｘ−免疫結合体が、等量の遊離薬物よりも少ない毒性で腫瘍細胞をより効果的に殺傷し得ることを実証した。
【０１３９】
本実施例において、本発明者らは、２６４  ｓｃＴＣＲ−Ｄｏｘ結合体を調製および精製し、次いでインビトロおよびインビボでのその腫瘍殺傷効果を特徴づけするために免疫結合体を用いるいくつかの研究を行う。先ず、ｓｃＴＣＲ−ｋ融合タンパク質に結合される最適な数のＤｏｘ分子が決定される。細胞によって内部移行されるＤｏｘの量は、腫瘍殺傷の度合いおよび効果に直接的に影響する。それゆえ、本発明者らが、腫瘍細胞上で提示されるペプチド／ＭＨＣ標的の数が制限されると考える場合、漸増数のＤｏｘ分子をｓｃＴＣＲ上に結合することが所望され得る。しかし、ｓｃＴＣＲとＤｏｘ群との間の結合の安定性は、Ｄｏｘの分断と関連されるインビボでの非特異的細胞傷害性を防止するために十分に高くなければならない。集合的に、これらの研究からの知見は、前臨床研究においてＴＣＲ−Ｄｏｘ結合体の性能を予測するために用いられる。
【０１４０】
本発明の好ましい実施態様が特定の用語を使用して記載されたが、このような記載は例示の目的のためのみであり、および請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく変化および改変がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、可溶性２６４  １本鎖（ｓｃ）Ｔ細胞レセプター−κ定常鎖融合タンパク質（ＴＣＲ−κ）の構築物設計および発現である。
図１Ａは、κ定常鎖領域に共有結合的に連結される３つのドメインｓｃＴＣＲとして構築された２６４ＴＣＲを表す模式図。
図１Ｂは、還元および非還元の条件下で泳動された、精製された２６４ｓｃＴＣＲ−κ融合タンパク質ゲルを含有するクマシーブルー染色。
図１Ｃは、抗κ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された結合体でプローブされた精製された２６４ｓｃＴＣＲ−κ融合タンパク質の免疫ブロット。
【図２】  図２は、可溶性２６４  ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質の構築物設計および発現を示す。
図２Ａは、分子の検出を容易にするために含まれたＥＥペプチドタグを用いてＩＬ−２遺伝子に共有結合的に連結された２６４  ｓｃＴＣＲ遺伝子を示す模式図。
図２Ｂは、精製された２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２および２６４  ｓｃＴＣＲ−κ融合タンパク質を含有するタンパク質ゲルのクマシーブルー染色。
図２Ｃは、抗ＥＥタグｍＡｂおよびヤギ抗マウスＨＲＰ結合体でプローブされた精製された２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ−２融合タンパク質の免疫ブロット解析。
【図３】  図３はバイオアッセイにおけるＩＬ−２活性の例証的な結果を示す。
【図４】  図４は、２６４  ｓｃ−ＴＣＲ−ＩＬ２融合タンパク質で染色された抗原提示細胞の例証的な結果を示す。
【図５】  図５は細胞結合アッセイの例証的な結果を示す。
【図６】  図６は、Ｔ細胞レセプターベースの治療剤についての形式に対する模式図である。
【図７】  図７は、ｓｃＴＣＲ標的化薬物送達によって媒介される腫瘍細胞殺傷の模式図である。
【図８】  図８は、Ｆｃ依存性細胞媒介性の細胞傷害性によって媒介される腫瘍細胞殺傷の模式図である。
【図９】  図９はｐＮＡＧ２ベクターの模式的図解である。
【図１０】  図１０はｐＳＵＮ２７ベクターを示す模式図である。
【図１１】  図１１は、好ましい２特異性ハイブリッド分子ｐＢＩＳＰ／Ｄ０１１．１０およびｐＢＩＳＰ／１４９を示す図である。
【図１２】  図１２Ａは、キメラ２特異性抗体分子を作製するための方法を示す模式図である。方法は、細胞の内側でｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ融合分子（軽鎖）と結合する抗体鎖（重鎖）を作製するためにハイブリドーマ発現細胞（１４５−２Ｃ１１ハイブリドーマ）を使用する。図１２Ｂはｓｃ−ＴＣＲ／Ｉｇ分子についての好ましい構造を説明する。
【図１３】  図１３は、ベクターｐＳＵＮ７ベクターを示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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