(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともひとつのフカンを含み、歯周疾患に伴う結合組織障害を修復するための医薬組成物。
【請求項２】
フカンが、遅延放出デバイスに導入される請求項１による医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、結合組織の障害の修復に関して、特に線維芽細胞機能を調節するためのフカンの新規用途に関する。
線維芽細胞は、結合組織の平衡と修復において非常に重要な役割をする。それらは特に、細胞外マトリックスを回復させ、その代わりにそれらの機能は、このマトリックスに存在する物質によって修飾される。
【０００２】
特に、損傷後に起こる組織改造作用と治癒の過程において、結合組織は、この過程に関与する全ての細胞間の連続的な交換のための場である。これらの交換は、特に細胞外マトリックスによって伝達されるサイトカインまたは可溶性メディエーターを介して行われる。
【０００３】
例えば、歯肉および皮膚組織のような被覆結合組織において、治癒過程は仮のマトリックス（赤色血栓）の形成後、炎症細胞（白血球、マクロファージおよび多核細胞）の補充で始まり、それによって障害組織の破壊相(phase of destruction)が開始される。
【０００４】
これらの炎症細胞は、
−コラゲナーゼ（MMP8）、白血球エラスターゼまたはカテプシンＧのようなマトリックスプロテアーゼを分泌することによって、
−サイトカイン、特にインターロイキン１（IL１）を遊離して、線維芽細胞と上皮細胞の増殖および移動と、これらの細胞による間質コラゲナーゼ（MMP1）またはゲラチナーゼＢ（MMP9）のようなあるメタロプロテアーゼの発現を刺激することによって、破壊に関与する。
【０００５】
この損傷後に非常に早く始まる破壊相は、上皮細胞とその基底膜が再構築されたときに終わる。
【０００６】
それは、線維芽細胞がコラーゲンフレームワークを再構築して、かつ再編成する修復および分解相によって延長され、特に、線維芽細胞によるゲラチナーゼA（MMP2）の発現が観察され、マトリックスメタロプロテアーゼは、全ての組織改造現象に積極的に関与する。
【０００７】
いくつかの病変には、結合組織の慢性炎症状態が伴い、そのような状態では、破壊、修復および分解相の間の平衡がこわれ、障害組織の不完全な再構築を生じる。
【０００８】
この現象は、特に歯周疾患または歯周症の場合に観察される。
【０００９】
歯根膜は、その歯槽において歯の支持台を提供する構造のセット｛歯肉、歯槽靭帯、歯槽骨およびセメント質｝に相当する。
【００１０】
歯周症は、多少限局し、しばしば再発することによって、その終わりに歯根膜組織が正確に再構成されない感染起源の炎症のエピソードを示す。
【００１１】
この病変では、普通は、炎症反応の開始と感染性の障害に応じた細胞増殖が多少なりとも起こる。逆に、分解相は、あまり十分ではない。破壊された組織の完全な再生はないけれども、その最良の修復が観察され、疾患のそれぞれのエピソードは組織の損失を誘発する。
【００１２】
未治療の歯周症は、40歳以上の成人において、歯の動揺と次いでその脱落に向かって展開する。これらの歯周疾患は、多少広がって、人口のおよそ１０−１５％に関係があるので、それらは公衆衛生の見地からかなり重要である。
【００１３】
現在では、提案されたほとんどの治療は、障害を機械的に切り離され、消毒剤または抗生物質を投与することによって微生物作用を減少させる方向にむけられている。
【００１４】
別の治療のアプローチは、完全な再生を生じさせるように修復過程の特質を改良することであろう。しかしながら、このアプローチには、特に望ましい時点で、細胞増殖を修復し、組織修飾の過程を制御するように、適当な細胞集団を刺激できることが必要である。
【００１５】
この目的で、発明者らは、種々の多糖類の作用を研究した。グリコサミノグリカンのようなこれらの分子のいくつかは、細胞／細胞外マトリックスの界面に存在するプロテオグリカンの構造に関与し、細胞機能を調節する役割をすることが知られている。また、可溶型のグリコサミノグリカン、例えばヘパリンまたはデキストラン誘導体が、細胞外マトリックスの種々の成分との相互作用を介して細胞機能を修飾できることも知られている。
【００１６】
例えば、ヘパリンの場合には、細胞増殖刺激作用が、ハムスターの肺線維芽細胞、ウシの水晶体上皮細胞［Ulrichら., Biochem. Biophys. Res. Commun., 139, p. 728-732, （1986）］および毛細管内皮細胞［Sudlalterら., J. Biol. Chem., 264, p. 6892-6897, （1989）］において示された。
【００１７】
逆に、ヘパリンが、用量依存的に、ある細胞型の増殖を阻害することも観察されている。この抗増殖作用は、主に平滑筋細胞（SMC）の場合に研究され、その阻害は、培養液中のヘパリンの濃度が１μg/mlで明らかになる。ヘパリンは、ＳＭＣｓの移動と増殖の両方を妨害するが、再内皮化または結合組織の量には影響を及ぼさない［Clowes and Clowes, Lab. Invest, 52, p. 611-615,（1985）; Clowes and Clowes, Circ. Res., 58, p. 839-845, （1986）; Clowesら, J. Cell. Biol., 107, p. 1939-1945, （1988）］。
【００１８】
増殖の阻害はまた、例えば強膜線維芽細胞［Del Vecchioら, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 29, p. 1272-1276,（1988）］、３Ｔ３線維芽細胞（接触阻害を保持するマウス胚線維芽細胞）［Paulら, Thromb. Res., 18, p. 883-888,（1980）］、ラット頚管上皮細胞［Lyons-Gioradanoら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 148, p. 1264-1269,（1987）］およびヒト皮膚線維芽細胞のような他の細胞型においても観察されている。
【００１９】
フェラオ（Ferrao）とメイソン（Mason）［Biochem. Biophys. Acta. 1180, 225-230, （1993）］は、ヒト皮膚線維芽細胞の増殖に対する種々の多糖類の作用を研究し、約100μg/mlの濃度で、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ペントサンポリスルフェートおよびフコイダンがこの増殖を阻害し、一方コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸およびヒアルロン酸はなんの作用も有さないことを示した。増殖阻害作用は、I型コラーゲンの合成を刺激することが示されている。逆に、I型コラーゲンの合成の阻害は、密集した培地に多糖類を加えるときに観察される。
【００２０】
従って、細胞機能に対する多糖類の作用は複雑であり、多糖類、細胞型および関係している組織に応じて、ならびに使用した多糖類の濃度および細胞の状態に応じて変化することができることが明らかである。
【００２１】
線維芽細胞機能、特に組織再生に関与するそれらに対する種々の多糖類の作用メカニズムを明確にするための研究に関して、発明者らは、特にフカンに興味をもった。
【００２２】
フカンは、褐藻類（Pheophyceae）の苗条の細胞壁の構成に関与する硫酸化多糖類であり、それらはまた、うにおよびなまこのようないくつかの海洋動物にも存在する。生フカンは、フコイダンとも呼ばれ、褐藻類の苗条の細胞壁から酸抽出によって得られ、主に高い平均モル質量（100000−800000g/mol）を有する硫酸化Ｌ−フコースポリマーを含む異種の分子の集団からなる。
【００２３】
フカンは、各種の生物活性を有する。フカンは、抗凝固物質、抗トロンビン［T. NishinoおよびT. Nagumo, Carbohydr. Res. 229, p. 355-362,（1992）；EP出願第0403 377号；S. Colliecら,Thromb. Res. 64, p. 143-154（1991）；S. Soedaら, Thromb. Res. 72, p. 247-256（1993）；Maurayら, Thromb. Haemost.（5）1280-1285（1995）］、抗ウイルス［M. Babaら, J. AIDS, 3, p. 493-499,（1990）］、抗血管形成［R. HahnenbergerおよびA. M. Jackobson, Glycoconjugate J., 8,, 350-353（1991）］および抗補体［C. Blondinら, Mol. Immunol., 31, p. 247-253, （1994）］活性を有することが示されている。また、それらが、細胞接着［C. G. Glabeら, J. Cell Sci., 61, p. 475-490,（1983）］、成長因子の放出［D. A. Belfortら, J. Cell. Physiol. 157, p. 184-189,（1993）］、腫瘍細胞の増殖［M. Elloualiら, Anticancer Res., 13, p. 2011-2020（1993）；D. R. Coombeら, Int. J. Cancer, 39, pp.82-90,（1987）；D. Riouら, Anticancer Res., 16, 1213-1218（1996）］および血管平滑筋細胞［Logeartら, Eur. J. Cell. Biol., 74, pp. 376-384（1997）］ のモジュレーターとして作用することができ、種々の種において遊動精子／卵子の相互作用を遮断することができる［M. C. Mahonyら,Contraception, 48, p. 277-289,（1993）］ことも観察されている。
【００２４】
平均モル質量が20000より低い、さらには10000g/molより低いフカンの製剤は、治療面におけるそれらの使用を容易にし、例えば、高いモル質量を有するフカンの制御された酸加水分解によって（IFREMERの名称でのEP特許第0,403,377号）、またはラジカル解重合（IFREMERおよびCNRSの名称でのPCT出願第WO/9708206号）によって得られた。
【００２５】
以下に続く報告において、用語「フカン」には、高いモル質量を有するフカンとそれらから得られたより低いモル質量を有する製剤の両方が包含される。
【００２６】
発明者らは、フカンが、ヘパリンとは異なる線維芽細胞機能に対する活性のプロフィルを有することを観察した。彼らは特に、同じ条件下でこれらの２つの多糖類を試験することによって、ヘパリンは皮膚線維芽細胞の増殖と歯肉線維芽細胞の増殖の両方を阻害するが、フカンは皮膚線維芽細胞の増殖を活性化し、同時に歯肉線維芽細胞の増殖を阻害することを観察した。加えて、発明者らはまた、フカンは丸くなっている皮膚線維芽細胞の形態を修飾し、これに対して歯肉線維芽細胞は、線維芽細胞の体型を保持することにも注目した。
【００２７】
発明者らはまた、フカンが細胞層のタンパク質の量とMMP2（ゲラチナーゼA）の活性を増加させ、かつ白血球エラスターゼを阻害することをも観察した。
【００２８】
これらの作用は、皮膚線維芽細胞と歯肉線維芽細胞の両方に関して示される。
【００２９】
この発明の主題は、線維芽細胞メタロプロテイナーゼ、特にMMP2の発現および／または活性を修飾し、かつ白血球エラスターゼを阻害する医薬品を得るためのフカンの用途である。
【００３０】
このようにして、フカンは、皮膚および歯肉組織のような結合組織におけるタンパク質分解活性を制御し、特にエラスターゼ活性を制限することができ、結合高分子構造に関しては著しい破壊的なポテンシャルを示し、一方これに反して同時に、MMP2のような組織の再構成に関与するプロテアーゼの活性を促進する。
【００３１】
この発明の好ましい具体例によれば、上記の医薬品はまた、歯肉線維芽細胞の増殖を阻害するため、およびそれらのコラーゲン合成を活性化させるためにも用いることができる。分解相における改良によって歯根膜の病変が治療される。
【００３２】
特に、タンパク質分解活性（特にMMP2の活性化およびエラスターゼの阻害）の調節と、歯肉線維芽細胞増殖の阻害、生理学的マトリックスの合成の増加および線維芽細胞体型の保持との組み合わせによって、フカンが、組織の修復と再生のいずれかの過程で必要とされる改造作用の経路にこれらの歯肉線維芽細胞を関与させることを可能する。
【００３３】
この発明の別の具体例によれば、上記の医薬品はまた、皮膚線維芽細胞の増殖とそれらのコラーゲン合成を活性化するためにも用いることができる。このようにして、障害組織の回復相を改良することによって皮膚の病変を治療する。
【００３４】
この発明によって得られる医薬品は、一般的に（経口的または非経口的）投与することができる。それらはまた、ゲル、クリーム、軟膏、ローション剤、ロゼンジ、マウスウオッシュ剤などの形態で、局所的に投与することもできる。
【００３５】
それらは、基質、例えば遅延放出担体または遅速度崩壊スポンジ（slowly-disintegrating sponges）のような再吸収可能なまたは再吸収できない装置によってその場で投与することもできる。
【００３６】
フカンはまた、美を目的とした治療、例えば抗しわ治療または皮膚の加齢の予防などに関して、線維芽細胞増殖活性剤として美容にも用いることができる。
【００３７】
この発明は、皮膚および歯肉線維芽細胞に対するフカンの活性を説明する実施例に関する以下の記載のたすけによって、より理解されるであろう。
実施例１：歯肉および皮膚の線維芽細胞の増殖に対するフカンの作用
多糖類
フカン:
使用したフカンは、EP特許第0,403,377号に記載の方法に従って海洋褐藻類であるアスコフィラム  ノドサム（Ascophylum nodosum）から得られた平均モル質量20000±2000を有するフラクションである。このフカンは、高いフコースレベル（44±5％）、少ないウロン酸（７±3％）、28±3％の硫酸塩群を有し、タンパクを有さない。
細胞
使用した線維芽細胞は、３人の異なるドナー由来の健康な歯肉および皮膚組織の体外移植組織片から得られた。
培養
培養のプロトコールは、歯肉線維芽細胞および皮膚線維芽細胞に関して同じである。
【００３８】
体外移植組織片から、細胞を、Ｄ−グルコースを１ｇ／ｌとグルタマックス（GLUTAMAX））を0.862ｇ／ｌ、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシンを1000U/ml）、フンギゾン［アンフォテリシンＢを250U/ml; GIBCO BRL］および20％の胎児仔牛血清（FCS）を含むDMEM［ダルベッコの修飾イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）］培養液で培養する。
【００３９】
検体を輸送培地から除去する。それらを培養液で３回すすぎ、およそ１mm2の小片に細かく分割する。それらを、25cm2の培養ディッシュと接触して、上皮層が上向きになり、結合層が下向きになるように配列する。そのディッシュを、接着を促進させるために、半時間37℃のインキュベーター（95％空気、５％二酸化炭素）の中に垂直に置く。
【００４０】
それぞれの組織フラグメントに１滴の培養液を加えた後、ディッシュを一晩インキュベーターにもどす。
【００４１】
次の日、培養液を新しい培養液と交換する。そのディッシュを４日間インキュベーターの中にこのように置く。
【００４２】
次いで、培養液を３日間毎日交換し、線維芽細胞が壁に接着するとすぐに体外移植組織片を除去する。線維芽細胞がディッシュの全底に侵入したとき、一次培養を終える。
次の経過
培養液を除去し、FCSの全ての痕跡を除去するために、ディッシュをDPBS（ダルベッコのリン酸緩衝食塩水）で３回すすぎ、次いで、トリプシン処理する（DPBSで0.05％に希釈され、ろ過されたトリプシン）。５分後、線維芽細胞は分離し、丸くなる。
【００４３】
細胞を、10％のFCSおよび1000U/mlのペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM（10−12ml）の入った３つのディッシュに分配する。
【００４４】
新しいディッシュの転移増殖が終わるまで、培養液を定期的に交換する。
細胞増殖のプロトコール
密集した細胞を、トリプシン処理し、7000〜10000細胞／mlの割合でDMEM中に懸濁し、次いで、24穴プレートのウエルに分配する。10％のFCSを含む培養液をウエルに加え、接種したプレートを接着させるために２時間インキュベーターにもどす。細胞を接種してから３時間後に、培養液をDMEM／10％FCS培養液（対照群）または試験される多糖類（フカンまたはヘパリン）の1, 10, もしくは100μg/mlを含むDMEM／10％FCS培養液と交換する。細胞を４日まで毎日カウントする。
【００４５】
増殖の割合は、関係：
％ｐ＝［（生成物での正味の増殖−１）／対照における正味の増殖］×１００
を用いて計算される。
【００４６】
計算値が正であるならば細胞の増殖があり、それが負であるならば細胞増殖の阻害がある。
【００４７】
種々のフカン濃度の存在下での増殖の割合に関する結果が、以下の表Ｉａ（歯肉線維芽細胞）およびＩｂ（皮膚線維芽細胞）に示されている。
【００４８】
【表Ｉａ】
0004589528.tif 000002
【００４９】
【表Ｉｂ】
0004589528.tif 000003
これらの結果は、フカンが歯肉線維芽細胞の増殖と皮膚線維芽細胞の増殖に対して異なって影響することを示している。すなわち、
−歯肉線維芽細胞（表Ｉａ）：指数的成長相でその最大限に達する増殖の阻害を観察することができる。この阻害は、用量依存的であるようにみえる。
−皮膚線維芽細胞（表Ｉｂ）：種々の実験は、皮膚線維芽細胞の培養に対するフカンの増殖作用を示している。この作用は、培養の４日目に最大限であり、10μｇ／ｍｌが最も有効な濃度である。
実施例２：MMP2（ゲラチナーゼA）活性と線維芽細胞形態に対するフカンの影響：
細胞を24穴プレートに接種し（7000〜10000細胞/ml）、DMEM／10％FCSの存在下で培養する。密集した時点で、培養液を、対照用のDMEM、もしくは種々のフカン濃度（1,10または100μg/ml）を含むDMEMと24時間交換する。次いで、プロ−MMP2（pro-MMP2）のゲラチン融解活性を検出するために培養液を回収し、固定されかつ着色（メタノール／GIEMSA）された細胞をカウントし、BIOCOM 20コンピューターで生物形態計測的に分析する。
ゲラチン融解活性の決定
非還元条件下、SDSポリアクリルアミドゲル＋ゲラチンで電気泳動し、次いでSDSを除去した後で、培養液中に示されるゲラチン融解活性をザイモグラフィーによって検出する。
【００５０】
結果は、BIOCOM 2000コンピューターでの半自動イメージ分析によって測定される。ゲル上に現れるそれぞれのバンドに関して、灰色の密度（grey density）（D）を有する生成物が、バンドの表面積（S）によって決定される。この生成物は、細胞数で報告され、それによって種々のゲラチン融解活性を評価しかつ比較することができる。
【００５１】
結果を以下の表IIに示す。
【００５２】
【表ＩＩ】
0004589528.tif 000004
これらの結果は、フカンが、調べた両方の線維芽細胞型において、より低い濃度から、プロ−MMP2の分泌を有意に増加させることを示している。
細胞生物形態計測
４つのパラメーターを調べた：円周（μｍで表す）、細胞の表面積（μｍ2で表す）、その相当する直径（equivalent diameter）（μｍで表す）およびそのシェープファクター。
【００５３】
相当する直径は、完全に細胞を含む最も小さい円の直径である。それは、細胞の最も大きい長さを定義する。
【００５４】
シェープファクターは、比率４πS／C2（Sは表面積を示し、Cは円周を示す）によって決定される。それがゼロに近づくときは伸長した構造を示し、それが増加するときは形状が丸くなっていることを示す。
【００５５】
結果を以下の表IIIａ（歯肉線維芽細胞）および表IIIｂ（皮膚線維芽細胞）に示す。
【００５６】
【表ＩＩＩａ】
0004589528.tif 000005
【００５７】
【表ＩＩＩｂ】
0004589528.tif 000006
これらの結果は、歯肉および皮膚の線維芽細胞がフカンに対して異なって反応することを示している。
【００５８】
歯肉線維芽細胞：表面積と細胞の直径は減少するが、それらの円周は増加する。これらのパラメーターによって、ゼロに近づくシェープファクターを計算することができ、それは、線維芽細胞型の伸長した細胞を意味している。
【００５９】
皮膚線維芽細胞：フカンの影響を受けて、表面積と細胞の直径は増加するが、それらの円周は一定のままである。シェープファクターは増加し、それは、丸くなっている細胞を意味している。
実施例３：白血球エラスターゼ活性に関するフカンの影響
フカン（１μg/mlまたは10μg/ml）またはヘパリンH108（１IU/mlまたは10IU/ml）の存在下での白血球エラスターゼ活性を、Bizot-Foulonら［International Journal of Cosmetic Science, 17, p.255-264,（1995）］に記載されているプロトコールに従って、合成ペプチド：
N-MeO-Succ-Ala-Ala-Pro-Val-PA
を基質として用いて測定する。
【００６０】
結果を以下の表IVに示す。
【００６１】
【表ＩＶ】
0004589528.tif 000007
これらの結果は、ヘパリンの場合には白血球エラスターゼの阻害が制限され、ヘパリンの濃度が増加するとき阻害効果は減少し、これに反して、フカンの場合には、阻害は１μg /mlの濃度から非常に大きいことを示している。
実施例４：原線維コラーゲンの生合成に対するフカンの影響
コラーゲンの生合成を三重水素化プロリン（3H-Pro）の導入後に測定する。
【００６２】
細胞を、密集するまでDMEM／10％FCSで培養する。次いで、培養液を、対照としてアスコルビン酸（50μg /ml）および3H-Pro（25μCi/ml）を含むDMEM、または種々の濃度（1, 10または100μg /ml）で加えられるフカンあるいは400μg /mlの濃度で加えられるヘパリンH108を含む同じ培養液と交換する。24時間後、培養液と細胞層を回収する。
【００６３】
プロリン、およびRojkindおよびGonzalesの方法［Anal. Biochem. 57:1-7（1974）］によって放射標識されたヒドロキシプロリンの特別な抽出によって、全コラーゲン合成／全タンパク合成の割合を決定することができる。
【００６４】
結果を以下の表Vａ（歯肉線維芽細胞）および表Ｖｂ（皮膚線維芽細胞）に示す。
【００６５】
【表Ｖａ】
0004589528.tif 000008
【００６６】
【表Ｖｂ】
0004589528.tif 000009
これらの結果は、フカンの影響をうけて、両方の型の線維芽細胞が、細胞層に優先的に付着するマトリックスを合成する傾向にあることを示している。このマトリックス付着は、コラーゲンのみならず、全てのタンパクに関係するように思われ、それによって、両方の細胞型においてどんな線維症のリスクも除外される。
【００６７】
歯肉線維芽細胞：全部のコラーゲン合成／全部のタンパク合成の割合は変化しない。細胞層のコラーゲンの割合は、用量依存的に、タンパクの割合と平行して増加する。
【００６８】
皮膚線維芽細胞：細胞層に存在するコラーゲンの割合は（細胞内＋細胞周囲）低い用量で増加し、100μg /mlで変化しない。一方、このコンパートメントに存在するタンパクの量は、フカンの濃度とともに増加する。全部のコラーゲン合成／全部のタンパク合成の割合は減少する。
歯肉線維芽細胞によって合成された細胞周囲コラーゲンの付着に関するフカンまたはヘパリンの影響
細胞を、三重水素化プロリンの存在下で上記のように培養し、フカンを100μg/mlの濃度で、またはヘパリンH108（平均モル質量は21000±2000、活性は173IU/mg、Choay Sanofiによって売られた）を400μg/mlの濃度で加える。原線維コラーゲンの量を評価するために、細胞内および細胞周囲コラーゲンを、区別して、デオキシコレート［本質的に細胞内プロコラーゲン（procollagen）を抽出する］およびSDS（細胞外マトリックスに蓄積した細胞周囲コラーゲンを溶解させる）で抽出する。
【００６９】
結果を以下の表VIに示す。
【００７０】
【表ＶＩ】
0004589528.tif 000010
これらの結果により、細胞層のコラーゲンの増加が確かにマトリックス付着（細胞周囲）によるものであり、極端な細胞内保持によるものではないことが確認できる。それらはまた、このマトリックス付着が、ヘパリンの存在下よりもフカンの存在下でより多いことも示している。