(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することよりなる、ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法。
【請求項２】
前記ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の作用によりリブリース−５−リン酸とホルムアルデヒドから３−ヘキスロース−６−リン酸を生成し、更に前記６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの作用により３−ヘキスロース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換することよりなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を付与された、ホルムアルデヒドに対する耐性を有する形質転換植物。
【請求項４】
前記植物が双子葉植物である、請求項３記載の形質転換植物。
【請求項５】
前記植物がナス科植物である、請求項４記載の形質転換植物。
【請求項６】
前記植物がタバコである、請求項５記載の形質転換植物。
【請求項７】
前記植物がアブラナ科植物である、請求項４記載の形質転換植物。
【請求項８】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項７記載の形質転換植物。
【請求項９】
ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することよりなる、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方法。
【請求項１０】
前記ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の作用によりリブリース−５−リン酸とホルムアルデヒドから３−ヘキスロース−６−リン酸を生成し、更に前記６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの作用により３−ヘキスロース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換することよりなる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を付与された、ホルムアルデヒド吸収能を有する形質転換植物。
【請求項１２】
前記植物が双子葉植物である、請求項１１記載の形質転換植物。
【請求項１３】
前記植物がナス科植物である、請求項１２記載の形質転換植物。
【請求項１４】
前記植物がタバコである、請求項１３記載の形質転換植物。
【請求項１５】
前記植物がアブラナ科植物である、請求項１２記載の形質転換植物。
【請求項１６】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項１５記載の形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルムアルデヒド代謝系酵素の遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することにより、ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法及び該方法により作製された形質転換植物に関する。更に本発明は、ホルムアルデヒド代謝系酵素の遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化させる能力を該植物に付与することよりなる、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方法及び該方法により作製された形質転換植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルムアルデヒドは建築資材などに存在している化学物質であり、大気中においてごく微量であっても人体に影響を及ぼすために、シックハウス症候群などの原因物質とされている。平成１５年７月１日の建築基準法の改正により、ホルムアルデヒドを放散する建築資材の使用が禁止されるなど、環境基準の規制は今後より厳しくなることが予想される。そこで環境汚染物質の低減（例えば植物を利用したファイトレメディエーション）の観点から環境中のホルムアルデヒド濃度を低減し、除去する方法が求められていた。
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３年  ８月，Ｖｏｌ．１３２，  Ｎｏ．４，ｐ．２２４８−２２５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
なお、環境中のホルムアルデヒド濃度を生物学的な手段により低減させる技術として、ホルムアルデヒドを分解する微生物などを用いた方法が知られている。しかし、植物の代謝系の酵素を組み込んだ形質転換植物を作製することにより、該植物を用いてホルムアルデヒド濃度を低減させる技術はこれまで知られていない。また植物において遺伝子組み換えを行うことにより、各種ストレスに対する耐性を付与する技術は存在するが、環境浄化という観点から代謝遺伝子系を組み込んでいる例は見出されない。
【０００４】
なお植物を用いた環境浄化の報告の一例として、ナス科、アブラナ科、セリ科、アカザ科、マメ科、キク科、ユキノシタ科の植物に、アグロバクテリウム・リゾゲネス由来のＲｉプラスミドを導入して誘導される毛状根に、ダイオキシン含有媒体を接触させて、ダイオキシンを毛状根又は再生植物体に吸収・分解させることを特徴とするダイオキシン含有媒体の浄化方法（特開２０００−１７６４３３号公報）がある。しかしこの報告はホルムアルデヒドに関するものではない。
【０００５】
また植物におけるホルムアルデヒドの代謝に関する知見としては、シロイヌナズナ由来のグルタチオン依存性のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＡＬＤＨ）の発現量を操作した植物体を作製したことが報告されている（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３）。その結果ＦＡＬＤＨを過剰発現させた植物体においてはホルムアルデヒドの取り込みが促進されたが、ＦＡＬＤＨの発現量を低下させた植物体においてはホルムアルデヒドの取り込みが明らかに低下し、この結果よりＦＡＬＤＨがホルムアルデヒドの解毒に関与していることが示唆される。
【０００６】
ところで微生物において、メタノールなどの炭素数１つの化合物（Ｃ１化合物）を炭素源として生育できるメタノール資化性菌の存在が知られている。かかる微生物においてはメタノールから生じるホルムアルデヒドを炭素源として固定することができる代謝経路を備えている。そしてヘキスロース−６−リン酸合成酵素と６−ホスホヘキスロースイソメラーゼはメタノール資化性菌におけるその様な代謝経路に関与している。
【０００７】
それに関して、メタノール資化能を有さない微生物であるＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃａｐａｃｉａ ＴＭ１に、メタノール資化性菌由来の上記遺伝子の酵素を導入して過剰発現させたところ、ホルムアルデヒドの取り込みが増加し、バニリン酸を代謝してホルムアルデヒドを生成する代謝経路も活性化していることが報告されている（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３）。かかる知見は、非メタノール資化性菌においてもヘキスロース−６−リン酸合成酵素／６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの経路により、バニリン酸の分解能を改善することができることを示している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
よって本発明の課題は、環境中におけるホルムアルデヒド濃度を低減させるために、ホルムアルデヒドの代謝系を植物などに組み込むことにより該植物においてホルムアルデヒド吸収能を高める手段を提供することである。かかる植物はホルムアルデヒドに対する耐性を有していると考えられるが、植物などにおいてホルムアルデヒド耐性を高める手段を提供することもまた本発明の課題である。また、かかる手法を植物のみならず自家栄養生物一般に拡張することも本発明の課題である。
【０００９】
よって本発明は、カルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を人工的に発現せしめ、よって該自家栄養生物にホルムアルデヒドに対する耐性を付与する方法を提供するものである。かかる形質転換自家栄養生物もまた本発明の範囲内である。
【００１０】
更にカルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を発現せしめ、よって該自家栄養生物にホルムアルデヒドを吸収させる方法を提供するものである。かかる形質転換自家栄養生物もまた本発明の範囲内である。
【００１１】
更に本発明は、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することよりなる、ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法を提供するものである。かかる形質転換植物もまた本発明の範囲内である。
【００１２】
更に本発明は、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することよりなる、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方法を提供するものである。かかる形質転換植物もまた本発明の範囲内である。
【００１３】
本発明により、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現させることにより、カルビン回路を介してホルムアルデヒドを代謝する経路を有する形質転換植物を作製することが可能となった。そのような形質転換植物は、ホルムアルデヒドに対する耐性を有し、かつ環境中のホルムアルデヒドを有意に低減させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（Ｈｅｘｕｌｏｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：以下ＨＰＳと称する）遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｈｅｘｕｌｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ：以下ＰＨＩと称する）遺伝子を植物に導入することにより、該植物にホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を付与することができることを見出した。
【００１５】
即ち、有害な化学物質であるであるホルムアルデヒドがカルビン回路に取り込まれて資化されるので、環境中のホルムアルデヒドを該植物により吸収させ、ホルムアルデヒド濃度を低減させることが可能である。言い換えれば、本発明の形質転換植物は、カルビン回路を通じてホルムアルデヒドを代謝する経路を有しているので、環境中のホルムアルデヒドを処理することができる。また、かかる形質転換植物はホルムアルデヒドに対する耐性を有すると考えられる。
【００１６】
本発明のストラテジーを図１に示す。カルビン回路の中間生成物であるリブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）が、ＨＰＳによって触媒される酵素反応によりホル厶アルデヒド（ＨＣＨＯ）と結合し、３−ヘキスロース−６−リン酸が生成する。そして生成した３−ヘキスロース−６−リン酸はＰＨＩの作用によってフルクトース−６−リン酸（Ｆｒｕ６Ｐ）に変換される。Ｆｒｕ６Ｐはカルビンサイクルの中間生成物でもあるために、結果としてホルムアルデヒドはカルビン回路の中間体に組み込まれてカルビンサイクルの代謝系を介して資化される。
【００１７】
なお図１においてＲｕＢＰはリブロース−１．５−ビスリン酸を、ＦＢＰはフルクトース−１．６−ビスリン酸を、Ｘｕ５Ｐはキシルロース−５−リン酸を示す。またｒｍｐＡはＨＰＳをコードする遺伝子であり、ｒｍｐＢはＰＨＩをコードする遺伝子であり、これらの遺伝子を含むコンストラクトを構築した。上記のｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子を含むコンストラクトを構築するためのストラテジーについては、下記の実施例において詳しく述べる。
【００１８】
ＨＰＳの遺伝子とＰＨＩの遺伝子が導入されることによりそれらの酵素を過剰発現している形質転換植物は、環境中のホルムアルデヒドの処理能力が高められている。ＨＰＳとＰＨＩを発現させることにより、カルビンサイクルの経路を介してホルムアルデヒドを代謝するための新たな代謝経路を与えたという点に本発明の最も顕著な特徴がある。そのような本発明の思想の範囲内で種々の改変を適宜施して本発明を実施することが可能である。
【００１９】
下記の実施例で詳しく述べるように、かかる形質転換植物は空気中のホルムアルデヒドの濃度を低減させるのに有効であった。またかかる形質転換植物はホルムアルデヒドに対して耐性を示した。なお本発明に係る酵素であるＨＰＳとＰＨＩのアミノ酸配列、およびそれらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列自身は既知である（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＢ０３４９１３）。
【００２０】
環境中のホルムアルデヒド濃度を低減することを可能とする本発明に係る技術は、種々の用途に応用することができると考えられる。例えば、観葉植物、ガーデニング植物や街路樹などにＨＰＳの遺伝子とＰＨＩの遺伝子を導入することができる。かかる遺伝子導入植物は大気、土壌、水等環境中の環境汚染物質の低減（ファイトレメディエーション）に有効である。また、農業、水産業、工業などで用いられた残留ホルムアルデヒドの処理に、本発明に係る形質転換植物は有用である。
【００２１】
本発明の形質転換植物を作製するために、ＨＰＳの遺伝子を発現させるためのＤＮＡコンストラクトと、ＰＨＩの遺伝子を発現させるためのＤＮＡコンストラクトを構築する。かかるＤＮＡコンストラクトは、ＨＰＳをコードする遺伝子又はＰＨＩをコードする遺伝子を当然に有するが、これらの遺伝子の上流に、該遺伝子の植物における発現を促進するためのプロモーター配列、および該遺伝子を目的部位（例えば葉緑体）で発現させるためのトランジットペプチド、更には薬剤耐性によって形質転換体を選抜するための薬剤耐性遺伝子も更に有する。本発明の方法は光合成に関連しているカルビン回路を利用したものであるので、ＨＰＳとＰＨＩを葉緑体において発現させることは本発明において好ましい態様である。
【００２２】
使用するプロモーター配列は特に限定されるものではないが、下記の実施例で使用したＰｒｂｃＳは、作用が強力であり且つ光合成と相関性が高いために特に好適である。しかし、その他の本技術分野で汎用されている種々のプロモーターを使用することもできる。また使用する薬剤耐性遺伝子も特に限定されるものではないが、下記の実施例で使用したゲンタマイシン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子は好適であり、その他本技術分野で汎用されている種々の薬剤耐性遺伝子を使用することができる。なおこれらの薬剤耐性遺伝子は形質転換体の選抜については有効であるが、抗生物質耐性の拡散は社会的には好ましくないことを考えると、形質転換体が市場におかれる段階においては薬剤耐性が除去されていることが望ましいと考えられる。
【００２３】
上記のＤＮＡコンストラクトを、植物の芽やカルスに導入することにより形質転換を行う。形質転換の方法としては、アグロバクテリウム法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などの種々の方法が知られている。好適な実施態様として下記の実施例においてはアグロバクテリウムＥＨＡ１０１ｐＭＰ９０を用いているが、必要に応じて種々の遺伝子導入方法を適宜用いることができる。そして薬剤耐性を指標として遺伝子が導入された形質転換体を選抜することにより、形質転換植物を得ることができる。また一般的に外来遺伝子の発現は高くはないが、これらのコンストラクトに挿入されているプロモーターの作用のためにＨＰＳをコードする遺伝子とＰＨＩをコードする遺伝子の発現は増強され、その効果を発揮することができる。
【００２４】
ここで遺伝子を導入する対象の植物は特に限定されるものではない。下記の実施例においては代表的な植物としてシロイヌナズナとタバコに酵素の遺伝子を導入しているが、他の多くの植物にもＨＰＳをコードする遺伝子とＰＨＩをコードする遺伝子を同様に導入し、ホルムアルデヒドの除去・吸収能を付与できることは当業者ならば理解できることである。好適な植物にはナス科の植物やアブラナ科の植物、その他種々の双子葉植物が含まれるが、植物の種類はそれに限定されるものではなく、例えば単子葉植物にも理論的には本発明の方法を適用できるものと考えられる。
【００２５】
具体的な植物の例としては、観葉植物やガーデニング植物としては、ポトス、パキラ、ベンジャミン、コンシンネ、クレストゴールド、サンスベリアなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。また街路樹としては、サクラ、ケヤキ、イチョウ、プラタナス、ユリノキ、ポプラ、カエデなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００２６】
また本発明の方法は植物のみならず、カルビン回路を有する自家栄養生物一般に適用可能であると思われる。ここで自家栄養生物とは光合成又はそれに類似する反応を行う機能を有し、Ｈ２ＯとＣＯ２から有機物を作ることができる生物であって、従属栄養生物を除外する意味である。具体的な例としては、植物一般の他に、光合成細菌、ラン藻（シアノバクテリア）や藻類などが挙げられる。これらの自家栄養生物はカルビン回路を有するために、同様のストラテジーを用いてこれらの生物においてホルムアルデヒド資化能を付与することも可能である。
【００２７】
ホルムアルデヒドをカルビンサイクルの回路を通じて代謝するための具体的な手段としては、下記の実施例で行っているように、ＨＰＳをコードする遺伝子とＰＨＩをコードする遺伝子を植物に導入することが好ましい。しかし、その手段は上記の酵素をコードする遺伝子を導入することに必ずしも限定されるものではない。
【００２８】
例えばメタノール資化性酵母はジヒドロアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）及びジヒドロアセトンキナーゼを有しており、酵母由来のこれらの酵素の働きによってホルムアルデヒドをキシロース５−リン酸に固定してジヒドロキシアセトン３−リン酸と３−ホスホグリセリン酸を生成する。この反応において基質・生成物共にカルビン回路の中間体とほぼ共通であり、このような知見も本発明を実施するにあたって利用できるものと考えられる。
【００２９】
即ち、使用することができる他の酵素遺伝子として、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）をコードする遺伝子とジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子（ＤＡＫ１）の組み合わせを採用することも可能である。上記において述べた様に、この場合には、ジヒドロアセトンシンターゼにより、キシロース５−リン酸とホルムアルデヒドの反応が触媒されて３−ホスホグリセリン酸とジヒドロキシアセトンが生成し、後者の生成物はジヒドロキシアセトンキナーゼ（ＤＨＡＫ）による酵素反応の触媒によりジヒドロキシアセトン３−リン酸に変換され、よってカルビン回路を介して代謝系に組み込まれる。かかる態様も本発明において実施することが可能である。
【００３０】
このような態様も本発明の範囲内であり、本願明細書において「ホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子」とは、ＨＰＳをコードする遺伝子とＰＨＩをコードする遺伝子のみならず、例えば上記において述べたような、ホルムアルデヒドを代謝してカルビン回路に組み込むのに有用な他の酵素遺伝子も含む意味である。
【実施例】
【００３１】
下記の実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
実施例１：シロイヌナズナを用いた解析
（コンストラクトの構築）
シロイヌナズナにおいてＨＰＳとＰＨＩを発現させるためのベクターとして、ＨＰＳをコードする遺伝子（ｒｍｐＡ）とＰＨＩをコードする遺伝子（ｒｍｐＢ）を含むＤＮＡコンストラクトを作製した。作製した２つのＤＮＡコンストラクトの構造を図２に示す。なお、これらのＤＮＡコンストラクトに、ＨＰＳとＰＨＩをコードする遺伝子の他に、ＨＰＳとＰＨＩを葉緑体において発現させるためのトランジットペプチドと、形質転換体を選抜するために薬剤耐性遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子）も挿入した。
【００３３】
そこで、ｒｍｐＡ遺伝子を含むＨＰＳ発現用のコンストラクトと、ｒｍｐＢ遺伝子を含むＰＨＩ発現用のコンストラクトを作製するためのストラテジーを図３と図４に示す。そのｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子はマイコバクテリウム属のメタノール資化性菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ ＭＢ１９の同一オペロン内に位置している。なお本菌は原核生物であり、本菌のプロモーターは植物内においては作動しない。そのためにｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子のコード領域のみを採って、形質転換用の植物プロモーターを含むキメラ遺伝子を構築した。
【００３４】
ＰＣＲに１よりｒｍｐＡ遺伝子を増幅し（ｒｍｐＡ ｓｅｎｓｅ ＧＣＴＴＧＣＡＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧ：配列番号１、ｒｍ１１ｐＡ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＣＧＡＴＣＧＣ：配列番号２）、ＳｐｈＩとＢａｍＨＩによってＰＣＲ生成物とｐＵＣ−Ｒｂｃｓ−３Ｃを切断した。単離した６２４ｂｐのｒｍｐＡ遺伝子と４．６ｋｂのベクター断片を単離し、該ベクターにｒｍｐＡ遺伝子を結合し、ｐＵＣ−ＲｂｃＳ−ｒｍｐＡプラスミドを作製した。ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩによってｐＵＣ−ＲｂｃＳ−ｒｍｐＡとバイナリーベクターｐＰＺＰ２２１を消化し、２．４ｋｂのｐＲｂｃＳ−ｒｍｐＡインサートと１０ｋｂのベクターバンドｐＰＺＰ２１１を単離し、それらを結合させてｐＰＺＰ２２１ｒｍｐＡプラスミドを作製した。
【００３５】
なおトランジットペプチドの配列として使用した部分はａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：Ｘ０５９８６の塩基番号２９８−４６８であり、ｒｍｐＡ遺伝子の配列として使用した部分はａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＡＢ０３４９１３の塩基番号２５１８−２１５０である。このコンストラクトのプライマー、トランジットペプチド、ｒｍｐＡ遺伝子の配列をまとめたものを図５に示す。
【００３６】
またＰＣＲによりｒｍｐＢ遺伝子を増幅し（ｒｍｐＢ ｓｅｎｓｅ ＧＣＴＴＧＣＡＡＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧ：配列番号３、ｒｍｐＢ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＴＣＧＡＧ：配列番号４）、ＳｐｈＩとＸｂａＩによってＰＣＲ生成物とｐＵＣ−Ｒｂｃｓ−３Ｃを切断した。単離した６００ｂｐのｒｍｐＢ遺伝子と４．６ｋｂのベクター断片を単離し、該ベクターにｒｍｐＢ遺伝子を結合し、ｐＵＣ−ＲｂｃＳ−ｒｍｐＢプラスミドを作製した。ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩによってｐＵＣ−ＲｂｃＳ−ｒｍｐＢとバイナリーベクターｐＰＺＰ２２１を消化し、２．４ｋｂのｐＲｂｃＳ−ｒｍｐＢインサートと１０ｋｂのベクターバンドｐＰＺＰ２２１を単離し、それらを結合させてｐＰＺＰ２２１ｒｍｐＢプラスミドを作製した。
【００３７】
なおトランジットペプチドの配列として使用した部分はａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：Ｘ０５９８６の塩基番号２９８−４６８であり、ｒｍｐＢ遺伝子の配列として使用した部分はａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ：ＡＢ０３４９１３の塩基番号１８４５−２４５６である。このコンストラクトのプライマー、トランジットペプチド、ｒｍｐＢ遺伝子の配列をまとめたものを図６に示す。
【００３８】
（形質転換体の選抜）
このようにして構築したプラスミドにより、アグロバクテリウム法を用いてシロイヌナズナを形質転換した。具体的にはシロイヌナズナｒｍｐＡで形質転換した後に形質転換体をｒｍｐＡと共に導入したカナマイシン耐性により選抜し、更に、ｒｍｐＢで形質転換した後に形質転換体をｒｍｐＢと共に導入したゲンタマイシン耐性により選抜することにより、ｒｍｐＡとｒｍｐＢの両者の遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。あるいは逆に、シロイヌナズナｒｍｐＢで形質転換した後に形質転換体をｒｍｐＢと共に導入したゲンタマイシン耐性により選抜し、更に、ｒｍｐＡで形質転換した後に形質転換体をｒｍｐＡと共に導入したカナマイシン耐性により選抜することにより、ｒｍｐＡとｒｍｐＢの両者のコンストラクトが導入された形質転換体を選抜した。
【００３９】
（導入された遺伝子の確認）
なおこのようにして作製したシロイヌナズナの形質転換植物について、ＲＴ−ＰＣＲとノザン解析により遺伝子が導入されているか検討を行った。その結果、ｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子を含むコンストラクトで処理することにより、両者の遺伝子が導入された形質転換植物が得られていることが確認された。更にＨＰＳに対する抗体を用いてウエスタン解析により導入された遺伝子の酵素蛋白質が発現しているか確認をしたところ、ｒｍｐＡ遺伝子に由来したＨＰＳ蛋白質の発現が確認された。
【００４０】
（ホルムアルデヒドに対する耐性）
これらの遺伝子（ｒｍｐＡ、ｒｍｐＢ）を導入した形質転換植物とコントロール植物におけるホルムアルデヒド耐性を、植物体の新鮮重量により検討した（図７）。抗生物質による選抜の後に抗生物質を含まない新たな寒天培地に苗を移し１週間生育させた。その後、ホルムアルデヒド（３７％）を１００ｍｌあたり５０μｌ添加した寒天培地に移し、４−５週間生育させた後に新鮮重量を測定した。図７において上段はホルムアルデヒドを添加していない寒天培地における結果を、中段はホルムアルデヒドを５０μｌ添加した寒天培地における結果を、下段はホルムアルデヒドを８０μｌ添加した寒天培地における結果を、それぞれ示す。また図７においてＡＢ１からＡＢ５はｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子の両者が導入された形質転換植物を、ＣＫ１からＣＫ５はコントロール植物を示す。
【００４１】
その結果、ホルムアルデヒドを含まない環境下における植物体の新鮮重量は、コントロール群（ＣＫ１−ＣＫ５）と両酵素の遺伝子が導入された形質転換体群（ＡＢ１−ＡＢ５）の間で差が見られなかった（上段）。一方、ホルムアルデヒドを含む環境下では、形質転換体（ＡＢ１−ＡＢ５）は良く生育したが、コントロール（ＣＫ１−ＣＫ５）では生育が阻害され、植物体の新鮮重量に差が認められた（中段、下段）。この結果は、形質転換体はホルムアルデヒドに耐性を有していることを示している。
【００４２】
（酵素活性の測定）
ＨＰＳとＰＨＩの酵素活性を３０℃で分光学的に測定した。具体的にはリボース５−リン酸を出発基質とし、ＨＰＳやＰＨＩによる酵素反応を介してホルムアルデヒドに依存的に生成するＮＡＤＰＨを３４０ｎｍで検出することにより、酵素活性を測定した。即ち、３０℃で２−３分プレインキュベートを行い、蛋白抽出物とホルムアルデヒド（５０ｍＭ）５０μｌを添加して下記の酵素反応溶液中で酵素反応を行った。酵素反応溶液１ｍｌの組成は以下の通りである。
【００４３】
【表１】
0004487071.tif 000002
【００４４】
なおこの反応液において、ＨＰＳの酵素活性を測定する際にはオーセンティックなＰＨＩを使用し、ＰＨＩの酵素活性を測定する際にはオーセンティックなＨＰＳを使用した。
【００４５】
このようにして測定したＨＰＳ活性とＰＨＩ活性を図８に示す（図８左：ＨＰＳ活性、右：ＰＨＩ活性）。なお図８の上において酵素活性のアッセイの原理を示す。図８に見られるように、ｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子の両方が導入されているＡＢ１とＡＢ２においては両者の酵素活性が検出された。またｒｍｐＡ遺伝子が導入されているＡ１においてはＨＰＳ活性のみが、ｒｍｐＢ遺伝子が導入されているＡ２においてはＰＨＩ活性のみが検出された。
【００４６】
（ホルムアルデヒドの取り込み）
シロイヌナズナの苗（各群２０個体）を植物箱（３７０ｍｌ）の中に移し、ボルティング段階に達するまで３−４週間生育させた。その後５０μｌのホルムアルデヒド（３７％）を５００μｌのマイクロチューブに添加して植物箱の角に置いた。３−４週間後に植物箱のカバーを、中央に孔を有している新しいものに交換した。ホルムアルデヒド検出器をその孔に設置し、ホルムアルデヒドの取り込みを検出した。検知菅を設置して３．５時間後に測定を停止し、写真を撮影した。
【００４７】
形質転換体であるＡＢ１（左側）とＡＢ２（中央）、更にコントロール（ＨＰＳの遺伝子とＰＨＩの遺伝子を含まない空のベクターで形質転換した植物体）であるＣＫ（右側）における結果を図９に示す。図９の写真より、形質転換体において苗は良く生育しているが、コントロールにおいては生育が阻害されており、形質転換体はホルムアルデヒド耐性を示した。また３．５時間後におけるホルムアルデヒド濃度は、ＡＢ１とＡＢ２については４ｐｐｍ程度であった。一方コントロール植物については２０ｐｐｍ以上であり、ＡＢ１とＡＢ２においては空気中のホルムアルデヒドが吸収されていることが確認された。なお検知管により検出される量は検出時間に比例するために、実際のホルムアルデヒド濃度は検知管の検出値を検出時間で割った値である。
【００４８】
更に水溶液中のホルムアルデヒドの取り込みについて検討を行った。抗生物質で選抜を行った後に、抗生物質を含まないＭＳ寒天培地上で苗を２週間生育させた。植物体０．３ｇを１０ｍｌのホルムアルデヒド溶液に浸し、３０時間後に溶液中のホルムアルデヒド濃度を測定した。
【００４９】
その結果、コントロール（ＣＫ：左カラム）と比較して、形質転換体（ＡＢ：右カラム）においては顕著にホルムアルデヒドが減少していることが観察された（図１０）。なお図１０において縦軸はホルムアルデヒドの残存率を示す。ことにホルムアルデヒドの初期濃度が５ｍＭである場合において、形質転換体におけるホルムアルデヒドの残存率は約１０％まで低下し、コントロールと比較して顕著な相違が認められた。この結果もまた、形質転換体がホルムアルデヒドを取り込んでいることを示している。
【００５０】
実施例２：タバコを用いた解析
（遺伝子の導入およびその確認）
シロイヌナズナにおける実験と同様に、ｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子をタバコに導入して形質転換したタバコを作製した。ＰＣＲ、ノザン解析により検討を行ったところ、ｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子を導入した形質転換植物について、両者の遺伝子の存在が確認された。更にウエスタン解析により導入された遺伝子による蛋白質の発現を確認したところ、ｒｍｐＡ遺伝子に由来してＨＰＳ蛋白質が発現していることが確認された。
【００５１】
（酵素活性の測定）
作製した形質転換タバコ植物におけるＨＰＳとＰＨＩの酵素活性を図１１に示す（上：ＨＰＳ活性、下：ＰＨＩ活性）。図１１に見られるように、ｒｍｐＡ遺伝子とｒｍｐＢ遺伝子が両方とも導入されているＡＢ２、ＡＢ５、ＡＢ６において、ＨＰＳとＰＨＩの両者の酵素活性が検出された。また野生型（ＷＴ）とコントロール（ＣＫ）においてはＨＰＳとＰＨＩの酵素活性は低かった。
【００５２】
（ホルムアルデヒドの取り込み）
形質転換したタバコを差し芽により増殖させ、抗生物質を含まない寒天培地中に移植して根を成長させた。２週間後に１００μｌのホルムアルデヒド（３７％）を植物箱（３７０ｍｌ）の中に入れて空気中に消散させた。２カ月後にシロイヌナズナの場合と同様にホルムアルデヒド検出器を設置し、設置４時間後に測定を停止し、写真を撮影した。
【００５３】
形質転換体であるＡＢ５（左側）と、コントロールであるＣＫ（右側）における結果を図１２に示す。図１２の写真より、形質転換体において苗は良く生育しているが、コントロールにおいては生育が阻害されており、形質転換体はホルムアルデヒド耐性を示した。また検知菅を設置してから３．５時間後における発色の程度から、植物箱内のホルムアルデヒド濃度はＡＢ５については３ｐｐｍ程度であった。一方コントロール植物については２０ｐｐｍ以上であり、その差から、ＡＢ５においては空気中のホルムアルデヒドが吸収されていることが確認された。
【００５４】
（ホルムアルデヒドに対する耐性）
抗生物質による選抜を行った後に、形質転換したタバコの芽を抗生物質を含まないＭＳ培地上に移し、１週間生育させた。１０μｌの３７％ホルムアルデヒドをマイクロチューブに添加して植物箱の中に入れた。２週間後、１０μｌのホルムアルデヒドを同じマイクロチューブ中に再補給した。更に２週間後にこの操作繰り返した。４週間植物を生育した後に写真を撮影した（図１３）。図１３において上段は形質転換体を、下段は野生型植物又はコントロール植物を示す。その結果、形質転換体（ＡＢ７，ＡＢ８）においてはホルムアルデヒト処理（図１３：上段の中央と右側）による影響は認められず、非処理群（図１３：上段の左側）と差がなかった。一方、野生型（ＷＴ）とコントロール（ＣＫ）においてはホルムアルデヒト処理により、非処理群との比較において明らかに成長阻害が認められた（図１３：下段の中央と右側）。
【００５５】
（タバコ植物における根の成長に対するホルムアルデヒドの影響）
抗生物質により選抜を行った後に、形質転換した芽を抗生物質を含まないＭＳ培地に移して１週間生育させた。ホルムアルデヒドをマイクロチューブに添加して植物箱に入れた。２週間後に植物を取り出して、ホルムアルデヒドが根の生育に及ぼす影響を検討した（図１４）。その結果、形質転換植物（ＡＢ５）においては２μｌのホルムアルデヒド（３７％）処理は殆ど根の成長に影響せず、１０μｌのホルムアルデヒド（３７％）処理においても根の成長が認められた（図１４：上段）。一方コントロール植物（ＣＫ）においては、２μｌのホルムアルデヒド（３７％）処理により、根の成長は明らかに抑制された（図１４：下段）。
【００５６】
（植物系統の交雑の検討）
ｒｍｐＡ遺伝子が発現している植物系統（Ａ−１）と、ｒｍｐＢ遺伝子が発現している植物系統（Ｂ−１）を掛け合わせる交雑（Ａ−１×Ｂ−１）を行い、その種子を採取した。抗生物質を含まない寒天培地上で３週間生育を行い、４週間後に写真を撮影した（図１５）。左側に２０μｌのホルムアルデヒドで処理したサンプルを、右側にホルムアルデヒド処理を行わなかったサンプルを示す。
【００５７】
その結果、ＨＰＳのみが発現しているＡ−１（図１５：上段）とＰＨＩのみが発現しているＢ−１（図１５：中段）においては、２０μｌのホルムアルデヒド（３７％）処理により生育が阻害された。一方両酵素が発現していると思われるＡ−１×Ｂ−１（図１５：下段）においては、ホルムアルデヒド処理により生育は影響されなかった。よってホルムアルデヒド耐性を獲得するには、ＨＰＳとＰＨＩの両者が発現していることを要することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素の遺伝子及び６−ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現させることにより、カルビン回路を介してホルムアルデヒドを代謝させる経路を有する形質転換植物が与えられた。本発明の形質転換植物は、ホルムアルデヒドに対する耐性を有し、かつ環境中のホルムアルデヒドを有意に低減させることが可能である。よって本発明の形質転換植物を住居やオフィスなどに設置することにより、環境浄化を行うことができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の方法によりホルムアルデヒド資化能を付与するためのストラテジーを示した図である。
【図２】実施例で使用したｒｍｐＡ遺伝子またはｒｍｐＢ遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトの構造を示す図である。
【図３】ｒｍｐＡ遺伝子を含むプラスミドを構築するストラテジーを示す図である。
【図４】ｒｍｐＢ遺伝子を含むプラスミドを構築するストラテジーを示す図である。
【図５】ｒｍｐＡ遺伝子を含むプラスミドのプライマー、トランジットペプチド、ｒｍｐＡ遺伝子の配列を示す図である。
【図６】ｒｍｐＢ遺伝子を含むプラスミドのプライマー、トランジットペプチド、ｒｍｐＢ遺伝子の配列を示す図である。
【図７】シロイヌナズナにおいて、形質転換植物とコントロール植物の植物体の新鮮重量に対してホルムアルデヒドが及ぼす影響を示すグラフである。
【図８】シロイヌナズナにおいて、形質転換植物とコントロール植物におけるＨＰＳ活性とＰＨＩ活性を示すグラフである。
【図９】シロイヌナズナにおいて、形質転換植物とコントロール植物における、ホルムアルデヒド耐性とホルムアルデヒドの取り込みを示す写真である。
【図１０】シロイヌナズナにおいて、形質転換植物とコントロール植物における液体ホルムアルデヒドの取り込みの取り込み率を示すグラフである。
【図１１】タバコにおいて、形質転換植物とコントロール植物におけるＨＰＳ活性とＰＨＩ活性を示すグラフである。
【図１２】タバコにおいて、形質転換植物とコントロール植物における、ホルムアルデヒド耐性とホルムアルデヒドの取り込みを示す写真である。
【図１３】タバコにおいて、形質転換植物とコントロール植物における、ホルムアルデヒドに対する耐性を示す写真である。
【図１４】タバコにおいて、ホルムアルデヒドが形質転換植物とコントロール植物の根の生育に及ぼす影響を示す写真である。
【図１５】ｒｍｐＡ遺伝子が発現している植物系統（Ａ−１）、ｒｍｐＢ遺伝子が発現している植物系統（Ｂ−１）、それらの交雑種（Ａ−１×Ｂ−１）におけるホルムアルデヒド耐性を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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