(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Xaa Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Thr Pro Asn Asn Asp Xaa（配列番号１）を有するペプチドの製造方法であって、該ペプチドを、以下の（i）〜（v）のフラグメントを結合させることによって製造することを特徴とする方法。
（v）Asn-Asn-Asp-Xaa（配列番号２）
（iv）Asp-Phe-Lys-Thr-Pro（配列番号３）
（iii）Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu（配列番号４）
（ii）Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu（配列番号５）
（i）Xaa-Ala-Ser-Glu（配列番号６）
（（i）、（v）において、Xaaは０を含む任意の数のアミノ酸残基を示す）
【請求項２】
以下の修飾ペプチドを結合させ、脱保護することにより配列番号１のペプチドを製造する、請求項1に記載の製造方法。
（V）Asn(R15)-Asn(R16)-Asp(R17)-Xaa
（配列番号７：R15とR16は(C6H5)3C-）または無保護であり、R17はC6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-である。）
（IV）Asp(R12)-Phe-Lys(R13)-Thr(R14)-Pro
（配列番号8：R12はC6H5CH2-又は(CH3)3C-であり、R13は(CH3)3C-O-CO-, C6H5CH2-O-CO-, 2-chlorobenzyloxycarbonyl-又は9-fluorenylmethoxycarbonyl-であり、R14はC6H5CH2-又は(CH3)3C-である。）
（III）Asn(R7)-Lys(R8)-Thr(R9)-Tyr(R10)-Asp(R11)-Leu
（配列番号9：R7は(C6H5)3C-または無保護であり、R8は(CH3)3C-O-CO-, C6H5CH2-O-CO-, 2-chlorobenzyloxycarbonyl-又は9-fluorenylmethoxycarbonyl-であり、R9はC6H5CH2-又は(CH3)3C-であり、R10はC6H5-CH2-又はCl2-C6H3-CH2-又は(CH3)3C-であり、R11はC6H5CH2-又は(CH3)3C-である。）
（II）Phe-Tyr(R3)-Asn(R4)-Ser(R5)-Glu(R6)
（配列番号10：R3はC6H5-CH2-, Cl2-C6H3-CH2-又は(CH3)3C-であり、R4は(C6H5)3C-または無保護であり、R5はC6H5CH2-又は(CH3)3C-であり、R6はC6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-である。）
（I）Xaa-Ala-Ser(R1)-Glu(R2)
（配列番号11：R1は（C6H5CH2-又は(CH3)3C-であり、R2はC6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-である。）
【請求項３】
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの組合わせ、2-(1H-ベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェートと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの組合わせ、またはO-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェートのいずれかを用いて前記ペプチドを縮合させることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれかに記載の方法によって配列番号1のペプチドを製造し、さらに、該ペプチドのN末端またはC末端の一方または両方に糖鎖配列、ペプチド、タンパク質、多糖、金属錯体、高分子担体、ゲル、フィルム、ラテックス粒子、金属微粒子またはプラスチックプレートを結合させる、末端が修飾された配列番号１のペプチドの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法によって配列番号1のペプチドを製造する工程、及び該ペプチドを医薬的に許容可能な担体と配合する工程を含む、マラリア原虫感染症の予防もしくは治療のための医薬、またはマラリア原虫感染症の診断薬の製造方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法によって末端が修飾された配列番号1のペプチドを製造する工程、及び該ペプチドを医薬的に許容可能な担体と配合する工程を含む、マラリア原虫感染症の予防もしくは治療のための医薬、またはマラリア原虫感染症の診断薬の製造方法。
【請求項７】
実質的にL体のみからなるNα-t-ブトキシカルボニル-グルタミン酸-γ-ベンジル-α-トリクロロエチルエステル。
【請求項８】
請求項７に記載のNα-t-ブトキシカルボニル-グルタミン酸-γ-ベンジル-α-トリクロロエチルエステルを用いることを特徴とする、ペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫エノラーゼの部分ペプチドの製造方法に関する。本発明はまたヒトおよび他の動物との免疫反応を利用したマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発することができるペプチド、マラリア感染への免疫状態の診断薬、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の増殖を抑える免疫用抗原ペプチドなどの医薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（１）マラリアを含めた感染症の現況：
近年まで克服されていたかに見えていた感染症は、人・物の移動、開発による地球環境変化、社会活動様式の変容などにより大きく様変わりしてきた。例えば、海外旅行や熱帯雨林での開発に関係する熱帯性疾患、感染症薬の繁用や乱用による薬剤耐性の出現など感染症を取り巻く状況はむしろ厳しさを増している。
熱帯性の原虫疾患であるマラリアは、感染症の中でも特に対策が遅れており、毎年、患者3-5億人と150-270万人の死者を出している（WHO report 1999）。ヒトに感染する原虫は４種類あるが、特に熱帯熱マラリア原虫は重症化と高死亡率をもたらす。またマラリアは健康問題のみならず、アフリカ諸国での経済活動の停滞と社会不安の一因ともなっている。
感染者の増加は、熱帯雨林開発や温暖化との関連も指摘され、International Panel on Climate Change報告（1996 & 1998）によると地球温暖化の場合２℃の温度上昇で5000-8000万人の増加が予測されている。日本国内に於いては近年の海外渡航者の増加により、感染者（輸入マラリア）は年間120-150人と増加傾向にある（1980年代は50-70人）。【０００３】
（２）従来の研究と問題点：
現在、多く用いられている医薬は、特許使用料を含んでいるため高価で発展途上国での普及を阻んでいる。クロロキンなど安価な薬もあるが、これまでの無制限な使用から非常に薬剤耐性が進んでしまっている。【０００４】
マラリア対策は多くの問題を抱えているが、国内外の製薬企業は治療・予防物質の開発をあまり積極的に行っていない。理由として研究開発が先進国にとって重要な加齢疾患に片寄っていること、開発途上国向けの製品は市場が小さいこと、などが挙げられる。このため、既存企業だけでは新たな物質開発が望めない状況にある。そこで安価で効果的な治療、予防薬、検査材料について製造法を実用化し、社会へ供給する必要性が出ている。【０００５】
現在のマラリア治療にはベトナム戦争で開発された化合物（メフロキン）が多く使用されている。最新の治療薬は2000年に米国で認可されたマラロンであるが、これも既存薬の転用である。最新の報告として既知の天然物治療薬（アルテミシニン）と同様の作用機序をもつ安価な合成化合物OZ227が注目されている（非特許文献１）。【０００６】
しかしマラリア原虫殺作用のある薬剤は頭痛、吐き気など副作用の非常に強いものが多い。そのため予防内服は一般に薦められていない。実際、既存の化合物（キニーネ、クロロキン）は劇物である。これに対し、ペプチドワクチンはアミノ酸を成分とするため、目的の予防免疫反応のみを起こし、既存治療物質に見られる強い毒性がない。【０００７】
ペプチドワクチンの欠点は、予防免疫の効果に個人差が予想されることである。しかし、もともと流行地に於ける罹患率の高いマラリアは、発症リスクを軽減するだけでも、十分に患者と死亡者の減少を期待できる。【０００８】
本発明者らは長年にわたり、流行地での疫学研究と実験室レベルでの分子論的解析を組み合わせたペプチドワクチン開発を行ってきた。すなわち、ヒトに感染した熱帯熱マラリア原虫が産生する解糖系酵素、エノラーゼが熱帯熱マラリアへの防御免疫分子として働いていることを見出し、これを利用したワクチン開発を行ってきた。【０００９】
例えば配列番号１２で示されるマラリア原虫エノラーゼの一部分のアミノ酸配列を選択した。【００１０】
この配列を含んだペプチド化合物を少量合成し（数ミリグラム）、人工抗原として用いることでマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発できること、マラリア感染に対する免疫状態の診断材料（免疫検査）、マラリア原虫の増殖を抑える免疫用抗原を誘導できること、などを見出した。この研究結果はその他のマラリア原虫エノラーゼの一部分のアミノ酸配列を用いた合成ペプチドの研究結果と合わせて特許文献１に報告されている。【００１１】
従来技術ではペプチドワクチンは一般に固相合成法または遺伝子組み替えを用いて製造される。これはどのような配列でもあまり経験を必要とせずに製造することが可能である。しかし固相合成法では一般に長鎖になるほど合成収率が低く、精製後に残る最終生成物の収量は少ない。また遺伝子組み換えでも、一般に最終生成物の得られる量は少ない。【００１２】
実際に配列番号１２で示されるマラリア原虫エノラーゼの部分アミノ酸配列を持つペプチドについて、実験室レベルで固相合成法により合成した場合、数百マイクログラム〜数ミリグラムを得るにすぎない。また遺伝子組み換え法により合成した場合、実験室レベルでは比較的大きな２リットル容器で大腸菌を培養した場合でも、１〜２ミリグラム（ワクチンとして約１人分）を得るにすぎない。また工業的に世界最大級の１０００リットル容器で行っても、ようやく５００〜１０００ミリグラム（ワクチンとして約５００人分）を得るにすぎない。【００１３】
また従来技術でフラグメント縮合法による配列番号12のペプチドの合成を計画した場合、グルタミン酸残基を末端に持つフラグメント合成が最大の問題である。なぜなら、実施例で示した合成中間体N-α-t-ブチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル-α-トリクロロエチルエステル、およびその他に選択可能な合成中間体、N-α-保護-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル-α-保護エステルを合成するためにはN-α-保護-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステルへのトリクロロエチルエステル基またはその他に選択可能なエステル基の導入が必要であるが、非特許文献２によると、N-α-保護-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステルのα位カルボン酸の保護を目的としたエステル化はラセミ化を起こしやすく、ペプチド合成に用いることは不適であると容易に考えつく。しかも、その後に合成が試された例はない。【００１４】
そのため、報告事例に基づきラセミ化を考慮して、従来技術でフラグメント縮合法による配列番号１２のペプチドの合成を実施した場合、用いる一つのフラグメントが１４残基以上になってしまう。一般に最大でも５〜７残基の大きさのフラグメントに分割するのは合成時と精製時の収率低下を防ぐためである。従って従来技術によれば、フラグメント縮合による大規模な合成は効率よく行うことができない。
【特許文献１】特開2002-371098
【非特許文献１】Nature 2004年430巻900-903
【非特許文献２】Journal of Organic Chemistry 1982年47巻1962-1965
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、ヒトおよび他の動物との免疫反応を利用した、熱帯熱マラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発するのに必要なペプチドの大規模合成に適した方法を提供することにある。本発明は特に、マラリア感染への免疫状態の診断材料、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の増殖を抑える免疫用抗原配列の大規模合成に適した方法を提供することも課題とする。
【００１６】
本発明者等は、フラグメント縮合法と呼ばれる均一反応系を用いた化学合成法に着目し鋭意検討した結果、５つのセグメントに分割して合成することを計画し、その際にグルタミン酸残基を末端に持つフラグメント、（II）Phe-Tyr(R3)-Asn(R4)-Ser(R5)-Glu(R6)（配列番号１０）および（I）Xaa-Ala-Ser(R1)-Glu(R2) （配列番号11）の合成について検討を行うことにより、５つのフラグメントの合成について成功した。
【００１７】
フラグメントのうち、式（I）と式（II）のペプチドの合成には従来不可能であった合成中間体、N-α-保護-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル-α-保護エステルが出発原料となる。この合成条件を詳細に検討したところ、驚くべきことに我々はラセミ化していないL体生成物を効率よく純粋に得ることに成功した。
【００１８】
続いて５つのフラグメントを逐次的に縮合するか、又は部分的に更に大きなセグメントにした後で縮合することを計画し、その際に用いる縮合剤について検討を行うことにより、５つのフラグメントを１本の保護ペプチド鎖とすることに成功した。
【００１９】
これらの手段、即ち、N-α-保護-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル-α-保護エステルの合成、５つのセグメントの合成、セグメントを縮合し１本の保護ペプチド鎖とすること、を合わせて実施することにより目的とするマラリア原虫エノラーゼの部分配列を持つペプチドまたはその類似体の合成を大規模に行う方法を見出し、本発明を完成したものである。この場合大規模とは、遺伝子組換法に比較し100倍以上の規模で生産できることを指している。即ち、実験室レベルの小スケールで行っても、約100〜500ミリグラム（ワクチンとして約５０〜２５０人分）を一度に得ることができる。実験室規模の合成をわずか２〜４回行うだけで、工業的に世界最大級の遺伝子組換体の生産設備で行うのと同じ規模のペプチドを得ることが可能である。さらに工業スケールで生産が実施されれば、年間の世界的需要に匹敵する数百万人分のペプチド供給が期待される。
【００２０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１のペプチドの製造方法であって、該ペプチドを、以下の（i）〜（v）のフラグメントを結合させることによって製造することを特徴とする方法。
（v）Asn-Asn-Asp-Xaa（配列番号２）
（iv）Asp-Phe-Lys-Thr-Pro（配列番号３）
（iii）Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu（配列番号４）
（ii）Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu（配列番号５）
（i）Xaa-Ala-Ser-Glu（配列番号６）
（（i）、（v）において、Xaaは０、１または複数の任意のアミノ酸残基を示す）
（２）以下の修飾ペプチドを結合させ、脱保護することにより配列番号１のペプチドを製造する、（１）の製造方法。
（V）Asn(R15)-Asn(R16)-Asp(R17)-Xaa
（配列番号７：R15とR16はアスパラギン残基の側鎖保護基（(C6H5)3C-）または無保護であり、R17はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（C6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-）である。）
（IV）Asp(R12)-Phe-Lys(R13)-Thr(R14)-Pro
（配列番号8：R12はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（C6H5CH2-又は(CH3)3C-）であり、R13はリジン残基の側鎖保護基（(CH3)3C-O-CO-, C6H5CH2-O-CO-, 2-chlorobenzyloxycarbonyl-又は9-fluorenylmethoxycarbonyl-）であり、R14はスレオニン残基の側鎖保護基（C6H5CH2-又は(CH3)3C-）である。）
（III）Asn(R7)-Lys(R8)-Thr(R9)-Tyr(R10)-Asp(R11)-Leu
（配列番号9：R7はアスパラギン残基の側鎖保護基（(C6H5)3C-）または無保護であり、R8はリジン残基の側鎖保護基（(CH3)3C-O-CO-, C6H5CH2-O-CO-, 2-chlorobenzyloxycarbonyl-又は9-fluorenylmethoxycarbonyl-）であり、R9はスレオニン残基の側鎖保護基（C6H5CH2-又は(CH3)3C-）であり、R10はチロシン残基の側鎖保護基（C6H5-CH2-又はCl2-C6H3-CH2-又は(CH3)3C-）であり、R11はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（C6H5CH2-又は(CH3)3C-）である。）
（II）Phe-Tyr(R3)-Asn(R4)-Ser(R5)-Glu(R6)
（配列番号10：R3はチロシン残基の側鎖保護基（C6H5-CH2-, Cl2-C6H3-CH2-又は(CH3)3C-）であり、R4はアスパラギン残基の側鎖保護基（(C6H5)3C-）または無保護であり、R5はセリン残基の側鎖保護基（C6H5CH2-又は(CH3)3C-）であり、R6はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（C6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-）である。）
（I）Xaa-Ala-Ser(R1)-Glu(R2)
（配列番号11：R1はセリン残基の側鎖保護基（C6H5CH2-又は(CH3)3C-）であり、R2はグルタミン酸残基の側鎖保護基（C6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-）である。）
（３）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの組合わせ、2-(1H-ベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェートと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの組合わせ、またはO-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェートの何れかを用いて前記ペプチドを縮合させることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
（４）（１）〜（３）のいずれかの方法によって配列番号1のペプチドを製造し、さらに、該ペプチドのN末端またはC末端の一方または両方に糖鎖配列、ペプチド、タンパク質、多糖、金属錯体、高分子担体、ゲル、フィルム、ラテックス粒子、金属微粒子またはプラスチックプレートを結合させる、末端が修飾された配列番号１のペプチドの製造方法。
（５）（１）〜（３）のいずれかの方法によって配列番号1のペプチドを製造する工程、及び該ペプチドを医薬的に許容可能な担体と配合する工程を含む、マラリア原虫感染症の予防もしくは治療のための医薬、またはマラリア原虫感染症の診断薬の製造方法。
（６）（４）の方法によって末端が修飾された配列番号1のペプチドを製造する工程、及び該ペプチドを医薬的に許容可能な担体と配合する工程を含む、マラリア原虫感染症の予防もしくは治療のための医薬、またはマラリア原虫感染症の診断薬の製造方法。
（７）実質的にL体のみからなるNα-t-ブトキシカルボニル-グルタミン酸-γ-ベンジル-α-トリクロロエチルエステル。
（８）（７）のNα-t-ブトキシカルボニル-グルタミン酸-γ-ベンジル-α-トリクロロエチルエステルを用いることを特徴とする、ペプチドの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は本発明の一実施態様である、H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe- Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH（配列番号１３）の合成手順を示すフローチャートである。
【図２】図２は本発明の一実施態様である、H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe- Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH（配列番号１３）について、合成中間体となるN-α-t-ブチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル-α-トリクロロエチルエステルをCuKα線によるX線回折法で測定した反射データを解析することで得られた結晶構造である。
【図３】図３は本発明の一実施態様である、H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe- Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH（配列番号１３）について、合成生成物をMALDI-TOF法で質量分析したスペクトルデータ（質量範囲m/e 500-4500）である。
【図４】図４は本発明の一実施態様である、H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe- Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH（配列番号１３）について、合成生成物をMALDI-TOF法で質量分析したスペクトルデータ（質量範囲m/e 3180-3280）である。
【図５】図５は本発明の一実施態様である、H-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser-Glu-Phe- Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-OH（配列番号48）の合成手順を示すフローチャートである。
【図６】図６は本発明の一実施態様である、H-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser-Glu-Phe- Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-OH（配列番号48）について、合成生成物をESI法で質量分析（質量範囲m/e 860-1020およびm/e 1440-1530）したスペクトルデータである。
【図７】図７は本発明の一実施態様である、H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe- Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH（配列番号１３）について、合成生成物と様々な熱帯熱マラリア患者血清（1〜7）との蛍光ELISA法による抗体価（RFU値）測定を示したグラフである。比較として非感染者の血清（8〜12）によるデータを示す。
【図８】本発明のペプチド化合物が複数個連結された物質の構造を示す図。AD22は配列番号1のペプチド、又は配列番号１のアミノ末端とカルボキシ末端の何れかまたは両方に高次構造を誘導する化合物が導入された末端修飾ペプチドを示す。なお、点線はペプチド化合物が繰り返して直線状に連結されていることを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明においては、以下の（i）〜（v）のフラグメントを結合させることによってアミノ酸配列Xaa Ala Ser Glu Phe Tyr Asn Ser Glu Asn Lys Thr Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Thr Pro Asn Asn Asp Xaa（配列番号１）のペプチドを製造する。
（v）Xaa-Asn-Asn-Asp  （配列番号2）
（iv）Asp-Phe-Thr-Pro  （配列番号3）
（iii）Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu（配列番号4）
（ii）Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu（配列番号5）
（i）Ala-Ser-Glu-Xaa  （配列番号6）
（i）、（v）において、Xaaは０、１または複数の任意のアミノ酸残基を示し、その数は配列番号1のペプチドがマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発できる限り特に制限されないが、0〜20個が好ましい。なお、Xaaにはさらに担体が付加されていてもよい。【００２３】
（i）〜（v）のペプチドはそれぞれ通常のペプチド合成方法に従って製造することができ、好ましくは液相反応により製造することができる。
ただし、（ii）のペプチド及び（i）のペプチド（Xaaが０の場合）はC末端がL-グルタミン酸であるため、従来は合成が困難であったN-α-保護-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル-α-保護エステル、特に本発明者らが合成に成功したNα-t-ブトキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-ベンジル-α-トリクロロエチルエステルを反応開始ペプチドに用いて合成することが好ましい。【００２４】
配列番号1のペプチドを製造するためには、上記（i）〜（v）のペプチドを、配列番号1のペプチドにおけるN末端側またはC末端側のフラグメント、すなわち、（i）または（v）のフラグメントから順番に一フラグメントずつ結合させてもよいが、例えば、（i）と（ii）、（iii）と（iv）と（v）をそれぞれ別々に結合させ、得られた断片をつなぎ合わせるというようにしてもよい。【００２５】
ペプチドフラグメントの結合は、フラグメント同士の結合反応に関与しない側の末端、および各フラグメントの反応性側鎖を保護した状態で行うことが好ましい。例えば、（ii）Asp-Phe-Thr-Pro（配列番号3）と（iii）Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu（配列番号4）を結合させるときは、（ii）のアミノ末端のAsp及び（iii）のカルボキシ末端のLeuおよびこれらのペプチドに存在する反応性側鎖を保護して行うことが好ましい。
アミノ末端の保護基としては、例えば、(CH3)3C-O-CO-, C6H5CH2-O-CO-, 9-fluorenylmethoxycarbonyl-が挙げられ、カルボキシル末端の保護基としては、例えば、-O-CH2-CCl3, -O-CH2-CO-C6H5, -O-CH2-C6H5などが挙げられる。【００２６】
側鎖の保護基は各アミノ酸によって適切に選択されるが、側鎖が保護された上記（i）〜（v）のフラグメントとしては、以下のものが挙げられる。
（V）Asn(R15)-Asn(R16)-Asp(R17)-Xaa （配列番号7）
R15とR16はアスパラギン残基の側鎖保護基（例えば(C6H5)3C-）または無保護、R17はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-）を示す。【００２７】
（IV）Asp(R12)-Phe-Lys(R13)-Thr(R14)-Pro（配列番号8）
R12はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-又は(CH3)3C-）、R13はリジン残基の側鎖保護基(CH3)3C-O-CO-, C6H5CH2-O-CO-, 2-chlorobenzyloxycarbonyl-又は9-fluorenylmethoxycarbonyl-）である。R14はスレオニン残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-又は(CH3)3C-）である。【００２８】
（III）Asn(R7)-Lys(R8)-Thr(R9)-Tyr(R10)-Asp(R11)-Leu（配列番号9）
R7はアスパラギン残基の側鎖保護基（例えば(C6H5)3C-）または無保護、R8はリジン残基の側鎖保護基（例えば(CH3)3C-O-CO-, C6H5CH2-O-CO-, 2-chlorobenzyloxycarbonyl-又は9-fluorenylmethoxycarbonyl-）、R9はスレオニン残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-又は(CH3)3C-）、R10はチロシン残基の側鎖保護基（例えばC6H5-CH2-又はCl2-C6H3-CH2-又は(CH3)3C-）、R11はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-又は(CH3)3C-）である。【００２９】
（II）Phe-Tyr(R3)-Asn(R4)-Ser(R5)-Glu(R6)（配列番号10）
R3はチロシン残基の側鎖保護基（例えばC6H5-CH2-, Cl2-C6H3-CH2-又は(CH3)3C-）、R4はアスパラギン残基の側鎖保護基（例えば(C6H5)3C-）または無保護、R5はセリン残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-又は(CH3)3C-）、R6はアスパラギン酸残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-）である。【００３０】
（I）Xaa-Ala-Ser(R1)-Glu(R2) （配列番号11）
R1はセリン残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-又は(CH3)3C-）、R2はグルタミン酸残基の側鎖保護基（例えばC6H5CH2-O-又は(CH3)3C-O-）である。【００３１】
各フラグメントの結合は通常のペプチドの縮合反応にしたがって行うことができるが、縮合剤を用いて行うことが好ましい。縮合剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの組合わせ、2-(1H-ベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェートと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの組合わせ、またはO-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート単独を用いることができる。縮合反応は収率をより向上させるという観点からは液相で行うことが好ましい。【００３２】
上記のようにして結合させたペプチドを脱保護することによって配列番号1のペプチドを得ることができる。脱保護は通常の方法によって行うことができる。【００３３】
免疫学的応答を引き起こし易くするため、本発明のペプチドには、マラリア原虫のエノラーゼの高次構造を安定化しうるような設計と製造がなされることが望ましい。なお、本発明において「免疫学的応答」とは細胞性免疫学的応答と体液性免疫学的応答の両方を含む概念である。このうち、細胞性免疫学的応答とは、例えばマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）、好酸球、T細胞などにより引き起こされる免疫のことをいい、熱帯熱マラリア原虫に対する細胞性免疫学的応答としては、キラーT細胞が関与するものが知られている。また、体液性免疫学的応答とはとしては、熱帯熱マラリア原虫由来のタンパク質、糖鎖などに対して特異的に結合することができる宿主由来の抗体により引き起こされるものが知られている。本発明により製造される抗原ペプチドからは体液性免疫学的応答として抗体を誘導させることが望ましい。【００３４】
より具体的には、配列番号１のアミノ末端とカルボキシ末端の何れかまたは両方に高次構造を誘導する化合物を導入して末端修飾ペプチドを製造することが好ましい。このような高次構造はマクロファージやNK細胞、T細胞などの免疫系細胞、あるいは抗体により認識されやすい部分である。
高次構造を誘導する化合物としては、糖鎖配列、ペプチド配列、タンパク質、多糖、金属錯体、または高分子担体、ゲル、フィルム、ラテックス粒子、金属微粒子、プラスチックプレートなどを使用することができる。
これらは、修飾物質の種類に応じた結合様式、例えば、共有結合、イオン結合、配位結合などでアミノ末端とカルボキシ末端の何れかまたは両方に結合させることができる。
より具体的には、フィルムを結合させたペプチドは、スピンキャスト法で調製することができ、得られたフィルム上に試験試料をプロットすることにより試験試料中の抗体の存在を検出することができる。ラテックス粒子に結合したペプチドは、乳化重合法、懸濁重合法に従って調製することができ、得られたラテックス粒子は凝集反応に使用することができる。プラスチックプレート上またはマイクロビーズ上への結合は、ペプチドをプラスチックプレートのウェル中に適量を滴下することにより、またはペプチドの溶液中にマイクロビーズを浸すことにより行うことができる。【００３５】
さらに、本発明のペプチド化合物の製造方法を用いることで、１分子中に複数個のペプチド配列を含有する物質を作製することもできる。複数個のペプチド化合物を含有させるためにはペプチド化合物をリンカー物質により連結させていてもよい。このリンカー物質は直線状（図６）または分岐鎖状にペプチド化合物を並べて高分子量化するために利用される。連結させる個数は特に制限されないが、４〜８個が好ましい。
AD22は配列番号1のペプチド、又は配列番号１のアミノ末端とカルボキシ末端の何れかまたは両方に高次構造を誘導する化合物が導入された末端修飾ペプチドである。なお、点線はペプチド化合物が繰り返して直線状に連結されていることを表す。
ここで使用することができるリンカー物質には、共有結合、イオン結合、配位結合で結ばれたアミノ酸配列、糖鎖配列、ジカルボン酸化合物、ジアミン化合物、金属錯体、などから選ばれる１種類または幾つかの組み合わせで構成することができるが、これらのものには限定されない。また、上記リンカーは配列番号１のXaa部分のペプチド、またはこれに結合される上記の高次構造を誘導する化合物より構成されていてもよい。
キャリヤー分子もしくは高分子担体の一例として、破傷風トキソイド、オボアルブミン、血清アルブミン、ヘモシアニン等のような天然タンパク質などを挙げることもできる。【００３６】
本発明の製造方法によって得られるペプチドもしくは末端修飾ペプチドまたはこれらが複数個連結された化合物を医薬的に許容可能な担体と配合することによって、マラリア原虫感染症の予防又は治療のための医薬組成物を製造することもできる。ここで、「医薬的に許容可能な担体」とは、例えば、免疫賦活剤、希釈剤、安定剤、保存剤、緩衝剤等が挙げられる。
なお、マラリア原虫感染症の予防又は治療のための医薬とは、感染予防のためのワクチン、既に感染している患者においてマラリア原虫抗原に対する免疫を活性化させるための治療用のワクチンなどが挙げられる。また、マラリア原虫感染症の診断試薬としては、マラリア原虫抗原に対する抗体の存在を調べるための診断薬などが挙げられる。【００３７】
なお、本発明の製造方法と同様にして、配列番号1のペプチドの類似体を製造することもできる。ここで、「ペプチドの類似体」とは、配列番号１のペプチドを構成するアミノ酸が置換、欠失および/また挿入することにより生成されるペプチドであって、免疫学的応答に関して本発明のペプチドと同様の活性を有するペプチドのことをいう。置換、欠失および/また挿入されるアミノ酸の個数は特に制限されないが、１〜５個が好ましく、１〜２個がより好ましい。
類似配列体の利用方法として、化学合成時に於ける溶解性・結晶性、免疫反応に使用する際の溶解性、免疫学的応答をより効果的にすること、が考えられるが、これらに限定されるものではない。類似配列体を用いることによって、同様に医薬や診断薬を製造することもできる。【００３８】
本発明はまた、配列番号１のペプチドの合成に用いた、実質的にL体のみからなるNα-t-ブトキシカルボニル-グルタミン酸-γ-ベンジル-α-トリクロロエチルエステル（Boc-Glu(OBzl)-OTce）に関する。従来、純粋なL体のBoc-Glu(OBzl)-OTce は、ラセミ化の問題により合成が困難であると考えられていた（Journal of Organic Chemistry 1982年47巻1962-1965、非特許文献２）。これに対し、本発明者はNα-t-ブトキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステルとトリクロロエチルアルコールを、反応促進触媒としてのDMAPのモル比を従来の0.5等量より大幅に減じて0.1等量のみ用いて、DCCにより縮合反応させることによって実質的にL体のみからなるBoc-Glu(OBzl)-OTceを得ることができることを明らかにした。このL体のBoc-Glu(OBzl)-OTceは、配列番号１のペプチド以外にも、広くグルタミン酸を含むペプチドの合成に用いることができる。なお、「実質的にL体のみからなる」とは、95%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、特に好ましくは100% L体を含むことを意味する。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH （配列番号13）
の合成手順を図１に、および合成の詳細を実施例１〜１０に示す。
更に、
H-Cys-Gly-Gly-Ala-Ser-Glu-Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH （配列番号49）
の合成手順を図５に、および合成の詳細を実施例１１〜１７に示す。
しかし以下の具体例は本発明を限定するものではなく、例えば保護基や縮合剤を他の慣用のものと置換するなど、適宜変更できることは勿論である。【００４０】
なお、以下の実施例では次のような略号を使用した。
（アミノ酸誘導体）
p-Tos-OH・H-Gly-OBzl：グリシンベンジルエステル パラトルエンスルホン酸塩
Boc-Gly-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-グリシン
Boc-Ala-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-L-アラニン
Boc-Cys(Acm)-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-S-アセタミドメチル-L-システイン
Boc-Ser(Bzl)-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-O-ベンジル-L-セリン
Boc-Thr(Bzl)-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-O-ベンジル-L-スレオニン
Boc-Phe-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-L-フェニルアラニン
Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-O-2,6-ジクロロベンジル-L-チロシン
Boc-Asn-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-L-アスパラギン
Boc-Asp(OBzl)-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-L-アスパラギン酸-β-ベンジルエステル
Boc-Glu(OBzl)-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル
Boc-Lys(Cl-Z)-OH：Nα-t-ブトキシカルボニル-Nε-2-クロルベンジルオキシカルボニル-L-リジン
HCl・H-Gly-OTce：グリシン トリクロロエチルエステル 塩酸塩
HCl・H-Leu-OTce：L-ロイシン トリクロロエチルエステル 塩酸塩
HCl・H-Pro-OTce：L-プロリン トリクロロエチルエステル 塩酸塩
HCl・H-Glu(OBzl)-OTce：L-グルタミン酸-γ-ベンジルエステル-α-トリクロロエチルエステル 塩酸塩【００４１】
(アミノ酸の主鎖および側鎖保護基)
Acm：アセタミドメチル（CH3CO-NH-CH2-）
Boc：tert-ブトキシカルボニル（t-Bu-O-CO-）
OTce：トリクロロエチル（-CH2-CCl3）
Bzl：ベンジル（-CH2-C6H5）
OBzl：ベンジル（-O-CH2-C6H5）
Cl-Z：2-クロロベンジルオキシカルボニル（C6H4Cl-CH2-O-CO-）
Cl2-Bzl：2,6-ジクロロベンジル（-CH2-C6H3Cl2）【００４２】
（ペプチド合成用試薬）
DCC：N,N'-ジシクロロへキシルカルボジイミド
HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HATU：O-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート
DIEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
HBTU：2-(1H-ベンゾトリアゾール-１-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート
TFA：トリフルオロ酢酸
TFMSA：トリフルオロメタンスルホン酸
(Boc)2O：ジ-t-ブチルカルボネート
NMM：N-メチルモルフォリン
EDC・HCl：1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩
DMAP：N,N-ジメチルアミノピリジン
p-Tos-OH：パラトルエンスルホン酸【００４３】
（溶媒）
THF：テトラヒドロフラン
CHCl3：クロロホルム
CDCl3：重水素化クロロホルム
AcOEt：酢酸エチル
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO-d6：重水素化ジメチルスルホキシド
MeOH：メタノール
Et2O：ジエチルエーテル
【００４４】
[合成手順１：Boc-L-アミノ酸の合成]
L-アミノ酸または側鎖を保護したL-アミノ酸（1.0 mol）を4M NaOH水溶液 (250 ml)に溶かし、氷-MeOHで徐々に冷却しながら最小量のジオキサンに溶かした(Boc)2O (240.0 g, 1.1 mol)を30分かけて徐々に加えた。氷浴で１時間、室温で１時間半攪拌した。析出したNaHCO3をろ別した後、pH3.0にしてEtOAcで抽出する。抽出したEtOAc溶液は10％クエン酸水溶液で洗浄の後、Na2SO4で乾燥させた。ろ過後ろ液を減圧濃縮し、残渣をヘキサンで結晶化させた。その後、AcOEt-ヘキサンで再結晶を行い、Boc-L-アミノ酸を得た。【００４５】
[合成手順２：アミノ基末端の脱保護反応、脱Boc化合物の合成]
アミノ基をN-α-t-ブトキシカルボニル保護したペプチド化合物を300 mlナスフラスコに入れドラフト内でTFA（または4M HClのジオキサン溶液）を加え溶解させた。直ちに塩化カルシウム管で蓋をし、水分の混入を防いだ。TLCにより反応の終了を確認後、濃縮しTFA臭（または塩酸臭）がなくなるまで繰り返し蒸留Et2Oを加えて濃縮すると最終的にTFA塩（または塩酸塩）の白色粉末を得る。収率は、ほぼ定量的である。
【００４６】
[実施例１]
（１）Boc-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成 （配列番号14）
（１a：Boc-Gly-Gly-OBzlの合成）
p-Tos-OH・H-Gly-OBzl (5.13 g, 15.2 mmol)を蒸留ジクロロメタンに溶解し、Boc-Gly-OH (2.93 g, 16.7 mmol), DCC (3.45 g, 16.7 mmol)を加え、氷浴で一時間、室温で一晩撹拌した。DCUreaをろ過後、ろ液をエバポレーターで濃縮した。残さをAcOEtに溶かし、10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。濃縮後、ヘキサンで結晶化させた。得られた粗結晶をAcOEt-ヘキサンで再結晶を行った。
収量 4.56 g (93％).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：7.35 (5H, -Bzl); 6.58, 5.09(2H, NH), 5.19 (2H, Bzl -CH2-); 4.10, 3.84 (4H, αCH); 1.47 (9H, Boc t-Bu-).【００４７】
（１b：Boc-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成）
HCl・H-Gly-Gly-OBzl (3.15 g,12.17 mmol)を蒸留ジクロロメタンに溶解し、NMM (1.339 ml, 12.17 mmol)で中和後、Boc-Asp(OBzl)-OH (4.30 g,13.3 mmol), DCC (2.74 g, 13.3 mmol), HOBt (1.80 g, 13.3 mmol) を加えて撹拌した。
DCUreaをろ取後、ろ液をエバポレーターで濃縮した。残渣をAcOEtに溶かし、10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。濃縮後、得られたオイル状物質を真空ポンプで乾燥させた。
収量 5.53 g (86％)、[α]D20 = 7.9° (c 0.1, MeOH).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：7.26 (10H, Bzl); 7.06, 6.84, 5.52 (3H, NH); 5.16, 5.10 (4H, Bzl -CH2-); 4.52, 4.09, 3.95 (5H, αCH); 3.13, 2.80 (2H, Glu -CH2-); 1.44 (9H, Boc t-Bu).【００４８】
（１c：Boc-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成）（配列番号15）
HCl・H-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzl (1.95 g, 4.20 mmol) をDMFに溶解し、NMM (462μl, 4.20 mmol)で中和後、Boc-Asn-OH (1.024 g, 4.41 mmol), HOBt (1.195 g, 8.82 mmol), EDC・HCl (0.845 g, 4.41 mmol)を加えて撹拌した。濃縮後、残さをAcOEtに溶解し、10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。濃縮後、ヘキサンを加えて沈殿を得た。
収率 2.19 g (81％)、[α]D20 = -16.9° (c 0.1, MeOH)、融点 70-71℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 704.4 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO, 300 MHz)：7.35(10H, Bzl); 8.28, 8.20, 8.10, 7.35, 6.94 (6H, NH); 5.12, 5.07 (4H, Bzl -CH2-); 4.67, 4.21 (2H, αCH); 3.91, 3.89 (4H, Gly αCH); 2.86, 2.67, 2.52, 2.43 (4H, βCH2); 1.36 (9H, Boc t-Bu).【００４９】
（１d：Boc-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成）（配列番号14）
TFA・H-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzl （配列番号16）(1.73 g, 2.64 mmol) をDMFに溶解し、DIEA (493μl, 2.90 mmol) で中和した後、Boc-Asn-OH (0.67 g, 2.90 mmol), HOBt (0.71 g, 5.30 mmol), HBTU (1.10 g, 2.90 mmol)を加え、氷浴で1.5時間撹拌した。
得られた沈殿をCHCl3、MeOHに溶解し、エーテルを加え沈殿を得た。
収量 1.28 g (64％)、[α]D20 = -23.1° (c 0.1, MeOH)、融点 172-175 ℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 796.4 ([M+H]+), 818.4 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)：7.37 (10H, Glu OBzl, -OBzl); 8.37, 8.13, 8.06, 7.44, 7.33, 6.99, 6.92 (9H, NH); 5.12, 5.08 (4H, Bzl -CH2-); 4.65, 4.46, 4.24, 3.91 3.70 (5H, αCH); 2.89, 2.64, 2.56, 2.40 (4H, βCH2); 1.36 (9H , Boc t-Bu).【００５０】
[実施例２]
(2) Boc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTceの合成  （配列番号17）
（２a：Boc-Pro-OTceの合成）
300 mlナスフラスコにBoc-Pro-OH(6.46 g, 30.0 mmol)を入れ、蒸留CHCl3(80 ml)に溶かし、氷冷撹拌下で予め最少量の蒸留CHCl3に溶かしたDCC(6.82 g, 33.0 mmol)を加え、トリクロロエタノール(3.50ml, 37.0 mmol), DMAP(0.38 g, 3.0 mmol)を加えて氷浴で２時間、室温で一日撹拌した。DCUreaをろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残さをAcOEtに溶かし、10％クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を減圧濃縮しオイルを得た。
収量 10.08 g (97％)(オイル状生成物).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：4.92, 4.76, 4.64 (2H, -OTce -CH2-); 4.41 (1H,  αCH); 3.51 (2H, ProδCH2); 2.28, 2.11 (2H, ProβCH2); 1.94 (2H, ProγCH2); 1.44 (9H, Boc t-Bu). 【００５１】
（２b：Boc-Thr(Bzl)-Pro-OTceの合成）
（操作方法１）  300mlナスフラスコにHCl・H-Pro-OTce(14.16 g, 50 mｍol)を入れ、蒸留CHCl3 (50 ml)に溶かした。NMM (5.5 ml, 50 mmol)で中和した後、予め最少量の蒸留CHCl3に溶かしたDCC (11.35 g, 55 mmol)を加え、氷浴で2時間、室温で一晩撹拌した。反応終了後、DCUreaをろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え、10％クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を減圧濃縮しオイルを得た。このオイルは少し放置すると結晶化した。
収率：19.52 g (73％)、[α]D20：-49.4 (c 0.1, MeOH)、融点：98-99℃
（操作方法２）  HCl・H-Pro-OTce(4.29 g, 15.0 mmol)を、蒸留ジクロロメタンに溶かした。NMM (1.68 ml, 15.0 mmol)で中和した後、Boc-Thr(Bzl)-OH (3.08 g, 10.5 mmol), DCC (2.48 g, 11.7 mmol)を加え、撹拌した。反応終了後、DCUreaをろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え、10％クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液にヘキサンを加え結晶化を得た。
収量 4.20 g (74％)、[α]D20 = -55.8° (c 0.1, MeOH)、融点 102-103℃.
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)： 7.30 (5H, Thr Bzl); 6.60 (1H , NH); 4.88 (2H, Bzl -CH2-); 4.53 (2H, -OTce -CH2-); 4.52, 4.35(2H, αCH); 3.76 (3H, ProδCH2, ThrβCH); 2.28, 1.97 (2H, ProβCH2); 1.97 (2H, ProγCH2); 1.39 (9H, Boc t-Bu); 1.09 (3H, ThrγCH3).【００５２】
（２c：Boc-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTce の合成）
（操作方法１）  300 mlナスフラスコにHCl・H-Thr(Bzl)-Pro-OTce (0.52 g, 1.1 mmol)を入れ、蒸留CHCl3 (25 ml)に溶かした。NMM (0.21 ml)で中和した後、Boc-Lys(Cl-Z)-OH (0.50 g, 1.2 mmol), DCC (0.25 g, 1.2 mmol)を加え、氷浴で2時間、室温で一晩撹拌した。反応終了後、DCUreaをろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を減圧濃縮し、オイル状物質を得た。得られたオイル状物質(0.86g)をAcOEt:ベンゼン=1:3, AcOEt:ベンゼン=1:1の展開溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。
収率 0.53 g (58％)(オイル状生成物)、[α]D20 = -42.6° (c 0.1, MeOH). 
（操作方法２）  HCl・H-Thr(Bzl)-Pro-OTce (4.74 g, 10mmol)をDMFに溶解させ、Boc-Lys(Cl-Z)-OH (3.31 g, 10.5 mmol), HATU (4.00 g, 10.5 mmol), DIEA (5.1 mL) を加え、一時間撹拌した。濃縮後、得られたオイルをAcOEt：ベンゼン = 1:3, AcOEt：ベンゼン = 1:1の展開溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
収率：7.2 g (86％)(オイル状生成物) 
質量分析（ESI法）： m/e = 835.4 ([M+H]+), 855.5 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)：7.82, 7.44, 7.36-7.27, 6.93 (12H, Thr Bzl, NH, Lys Cl-Z, Lys ε-NH); 5.07 (2H, Bzl -CH2-); 4.88 (2H, -OTce -CH2-); 4.53 (2H, Cl-Z -CH2-); 4.67, 4.48, 3.91, 3.78 (3H, αCH, ThrβCH); 3.78 (2H, ProδCH2); 2.94 (2H, Lys εCH2), 2.26, 1.94 (2H, ProβCH2), 1.94 (2H, ProγCH2), 1.54 (2H, LysβCH2), 1.35 (9H, Boc t-Bu, LysγCH2, LysδCH2), 1.11 (3H, ThrγCH3).【００５３】
（２d：Boc-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTceの合成）（配列番号18）
（操作方法１）  300 mlナスフラスコにHCl・H-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTce (1.46 g, 1.9 mmol)を入れ、DMF (20 ml)に溶かした。氷冷下、NMM (0.22 ml)で中和した後、Boc-Phe-OH (0.56 g, 2.1 mmol), HOBt (0.28 g, 2.1 mmol), EDC・HCl (0.40 g, 2.1 mmol)を加え、氷浴で2時間、室温で一晩撹拌した。反応終了後、真空ポンプを用いて減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え、10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を減圧濃縮し、オイル状物質を得た。オイル状物質をAcOEtに溶解し、石油エーテルを加えて白色の粉末を得た。
収率 1.45 g (78％)、[α]D20 = -39.2° (c 0.1, MeOH)、融点 70-71℃.
（操作方法２）  300 mlナスフラスコにHCl・H-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTce (2.28 g, 2.95 mｍol)を入れ、DMFに溶かした。氷冷下、NMM(0.22 ml)で中和した後、Boc-Phe-OH (0.88 g, 3.30 mmol), HOBt (0.44 g, 3.30 mmol), EDC・HCl (0.69 g, 3.3 mmol)を加え、撹拌した。反応終了後、真空ポンプを用いて減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え、10%クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を減圧濃縮し、オイルを得た。オイルをAcOEtに溶解し、石油エーテルを加えて白色の粉末を得た。AcOEt：ベンゼン = 1:3, AcOEt：ベンゼン = 1:1の展開溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
収率 2.01 g (69％)、[α]D20 = -35.4° (c 0.1, MeOH)、融点 69-71℃.
質量分析（ESI法）：m/e = 982.5 ([M+H]+), 1004.4 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)：7.82, 7.44, 7.36-7.27, 6.93 (12H, Thr Bzl, NH, Lys Cl-Z, Lys εNH); 5.07(2H, Bzl -CH2-); 4.88(2H, -OTce -CH2-); 4.53(2H, Cl-Z -CH2-); 4.67, 4.48, 3.91, 3.78 (4H,  αCH, ThrβCH); 3.78 (2H , ProδCH2); 2.94 (2H , Lys εCH2); 2.26, 1.94 (2H, ProβCH2); 1.94 (2H, ProγCH2); 1.54 (2H, LysβCH2); 1.35 (13H, Boc t-Bu, LysγCH2, LysδCH2); 1.11 (3H, ThrγCH3).【００５４】
（２e：Boc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTceの合成）（配列番号17）
（操作方法１）  300 mlナスフラスコにHCl・H-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTce（配列番号19） (0.50 g, 0.55 mmol)を入れ、蒸留CHCl3(10 ml)に溶かした。氷冷下、NMM(60 μl)で中和した後、Boc-Asp(OBzl)-OH (0.20 g, 0.61 mmol), HOBt (0.082 g, 0.61 mmol)を加え、予め蒸留CHCl3 (10 ml)に溶解したDCC (0.13 g, 0.61 mmol)を加えて氷浴で２時間、室温で一晩撹拌した。反応終了後、DCUreaをろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を減圧濃縮し、オイル状物質を得た。このオイル状物質をCHCl3に溶かし、石油エーテルを加えて白色沈殿を得た。
収率：0.55 g (85％)、[α]D20：-46.5 (c 0.1, MeOH)、融点：108-110℃.
（操作方法２）  300 mlナスフラスコにHCl・H-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTce (1.76 g, 1.92 mmol)を入れ、蒸留CHCl3に溶かした。氷冷下、NMM (211 ml)で中和した後、Boc-D(OBzl)-OH (0.68 g, 2.11 mmol), HOBt (0.29 g, 2.11 mmol), DCC (0.44 g, 2.11 mmol)を加えて撹拌した。反応終了後、DCUreaをろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え10%クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を減圧濃縮し、オイルを得た。残さをAcOEt に溶かし、ヘキサンを加えて白色沈殿を得た。
収率 1.71 g (78％)、[α]D20 = -40.1° (c 0.1, MeOH)、融点 108-109℃.
質量分析（ESI法）：m/e = 1185.3 ([M+H]+), 1207.5 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8.05, 8.12, 7.82, 7.44, 7.36-7.27, 7.19 (10H, Bzl; 4H, Cl-Z; 4H, NH; 1H, Lys εNH), 5.07(4H, Bzl -CH2-); 4.88 (2H, -OTce -CH2-); 4.53 (2H, Cl-Z -CH2-); 4.67, 4.48, 4.35, 3.83, 3.72 (4H, αCH, Thr βCH); 3.78 (2H, Pro δCH2); 2.94, 2.70, 2.55 (2H, Lys εCH2; 2H, Asp βCH2); 2.26, 1.94 (2H, Pro βCH2); 1.94 (2H, Pro γCH2); 1.54 (2H, Lys βCH2); 1.35 (9H, Boc t-Bu; 2H, Lys γCH2; 2H, Lys δCH2); 1.11 (3H, Thr γCH3).
【００５５】
[実施例３]
（３）Boc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTceの合成（配列番号20）
（３a：Boc-Asp(OBzl)-Leu-OTceの合成）
ナスフラスコにHCl・H-Leu-OTce (2.99 g, 10 mmol)を入れ、蒸留CHCl3 (60 ml)に溶かした。氷冷下、NMM(1.10 ml)で中和した後、Boc-Asp(OBzl)-OH (2.46 g, 11 mmol)、DCC (2.27 g, 11 mmol)を加え、氷浴で1.5時間、室温で一晩撹拌した。反応終了後、DCUreaをろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残さにAcOEtを加え10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥した。ろ液を濃縮しオイル状物質を得た。
得られたオイル状物質(5.65 g, 9.95 mmol)をAcOEt:ベンゼン=1:7、AcOEt:ベンゼン=1:5の展開溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、濃縮後透明のオイル状物質を得た。
収率 4.45 g (78％)、[α]D20 = 46.5° (c 0.1, MeOH)、融点 70-71℃.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 7.35 (5H, Bzl); 5.18, 5.14, 4.64, 4.60 (2H, -OTce -CH2-); 6.96, 5.71 (2H, NH); 5.14 (2H, Bzl -CH2-); 4.70, 4.55 (3H, αCH); 3.07, 2.77 (2H, Asp βCH2); 1.64 (2H, Leu βCH2; 1H, Leu γCH); 1.44 (9H, Boc t-Bu); 0.95 (6H, Leu δCH2).
【００５６】
（３b：Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTceの合成）
ナスフラスコにHCl・H-Asp(OBzl)-Leu-OTce (2.05 g, 4.07 mmol) を蒸留CHCl3 (10 ml)に溶かした。氷冷下、NMM (0.45 ml)で中和した後、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH (1.52 g, 4.47 mmol)、HOBt (0.61 g, 4.52 mmol), EDC・HCl (0.86 g, 4.49 mmol)を加え、氷浴で1時間、室温で一晩撹拌した。反応終了後、濃縮し、残さをDMFに溶解し減圧濃縮した。残さにイオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ろ過後、ガラスフィルター上で10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄した。デシケーターで乾燥し、白色粉末を得た。
収率 3.06 g (85％)、[α]D20 = -46.5° (c 0.1, MeOH)、融点 101-104℃.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 7.37, 7.33, 7.14, 6.98, 6.95 (5H, Bzl; 3H, Cl2-Bzl; 4H, Tyr C6H5-; 3H, NH); 4.87, 4.83, 4.64, 4.60 (2H, -OTce -CH2-); 5.12, 5.24 (2H, Bzl -CH2-; 2H, Cl2-Bzl -CH2-); 4.80, 4.62, 4.30 (3H, αCH); 3.05, 3.02, 2.65 (2H, Asp βCH2; 1H, Tyr βCH2); 1.71, 1.58 (2H, Leu βCH2; 1H, Leu γCH); 1.41 (9H, Boc t-Bu); 0.94 (6H, Leu δCH2).
【００５７】
（３c：Boc-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTceの合成）（配列番号21）
ナスフラスコにHCl・H-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTce (2.48 g, 3.0 mmol)入れ、DMF(30 ml)に溶かした。NMM (330μl)で中和した後、Boc-Thr(Bzl)-OH (1.02 g, 3.3 mmol), HOBt (0.45 g, 3.3 mmol), EDC・HCl (0.63 g, 3.3 mmol)を加え、氷浴で3時間、室温で4時間撹拌した。反応終了後、濃縮し、残さにイオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ろ過後、ガラスフィルター上で10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水溶液の順に洗浄した。デシケーターで乾燥し、白色粉末を得た。
得られた粉末をCHCl3-ヘキサンで再結晶し、白色結晶を得た。
収率 2.45 g (76％)、[α]D20 = -46.5° (c 0.1, MeOH)、融点 149-151℃.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 7.36, 7.34, 7.32, 7.11, 6.99, 6.97, 6.87, 6.84 (10H, Bzl; 3H, Cl2-Bzl; 4H, Y-Ph; 3H, NH); 5.35 (1H, NH); 4.87, 4.83, 4.65, 4.61 (2H, -OTce -CH2-); 5.18, 5.11 (4H, Bzl -CH2-; 2H, Cl2-Bzl -CH2-); 4.87, 4.83, 4.65, 4.43, 4.08 (4H, αCH; 2H, Bzl -CH2-; 1H, Thr βCH); 3.05, 3.02, 2.65 (2H, Asp βCH2; 1H, Tyr βCH2); 1.71, 1.58 (2H, Leu βCH2; 1H, Leu γCH); 1.41 (9H, Boc t-Bu); 1.18 (3H, Thr γCH3); 0.94 (6H, Leu δCH2).
【００５８】
（３d：Boc-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTceの合成）（配列番号22）
ナスフラスコにHCl・H-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTce （配列番号23）(2.14 g, 2.10 mmol)を入れ、DMF (40 ml)に溶かした。NMM (230μl)で中和した後、Boc-Lys(Cl-Z)-OH (0.95 g, 2.3 mmol), HOBt (0.31 g, 2.3 mmol), EDC・HCl (0.44 g, 2.3 mmol)を加え、氷浴で3時間、室温で4時間撹拌した。反応終了後濃縮し、残さにイオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ろ過後、ガラスフィルター上で10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄した。デシケーターで乾燥し、白色粉末を得た。
カラムクロマトグラフィー（展開溶媒CHCl3:MeOH=98:2）により精製を行った。
収率 2.56 g (89％)、[α]D20 = -46.5° (c 0.1, MeOH)、融点 149-151℃.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 7.36, 7.34, 7.32, 7.11, 6.99, 6.97, 6.87, 6.84 (10H, Bzl; 4H, Cl-Z; 3H, Cl2-Bzl; 4H, Tyr C6H5; 4H, NH; 1H, Lys εNH); 5.35 (1H, NH); 4.87, 4.83, 4.65, 4.61 (2H, -OTce -CH2-); 5.18, 5.11, 4.60 (4H, Bzl -CH2-; 2H, Cl2-Bzl -CH2-; 2H, Cl-Z -CH2-); 4.87, 4.83, 4.65, 4.43; 4.08 (5H, αCH, 2H, Bzl -CH2-; 1H, Thr βCH); 3.45, 3.05, 3.02, 2.94, 2.65 (2H, Asp βCH2; 2H, Tyr βCH2; 2H, Lys εCH2); 1.71, 1.69, 1.58 (2H, Leu βCH2; 1H, Leu γCH; Lys βCH2; Lys γCH2); 1.41 (9H, Boc t-Bu); 1.18 (3H, Thr γCH3); 0.94 (6H, Leu δCH2).
【００５９】
（３e：Boc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTceの合成）（配列番号20）
ナスフラスコにHCl・H-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTce （配列番号24）(2.30 g, 1.75 mmol) を入れ、DMF (20 ml) に溶かした。NMM (193μl)で中和した後、Boc-Asn-OH (0.45 g, 1.93 mmol)、HOBt (0.52 g, 3.85 mmol)、EDC・HCl (0.37 g, 1.93 mmol)を加え、氷浴で3時間、室温で4時間撹拌した。反応終了後、濃縮し、残さにイオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ろ過後、ガラスフィルター上で10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄した。デシケーターで乾燥し、白色粉末を得た。
収率 2.45 g (94％)、[α]D20 = -46.5° (c 0.1, MeOH)、融点 207-209℃.
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8.35, 7.36, 7.34, 7.32, 7.11, 6.99, 6.97, 6.87, 6.84 (10H, Bzl; 4H, Cl-Z; 3H, Cl2-Bzl; 4H, Tyr C6H5; 6H, NH; 1H, Lys εNH; 2H, Asn γNH2); 4.87, 4.83, 4.65, 4.61 (2H, -OTce -CH2-); 5.18, 5.11, 4.60 (4H, Bzl -CH2-; 2H, Cl2-Bzl -CH2-; 2H, Cl-Z -CH2-); 4.87, 4.83, 4.71, 4.55, 4.43, 4.30, 4.23 (6H, αCH; 2H, Bzl -CH2-; 1H, Thr βCH); 3.15, 3.05, 3.02, 2.94, 2.65 (2H, Asp βCH2; 1H, Tyr βCH2; 2H, Lys εCH2; 2H, Asn βCH2); 1.71, 1.69, 1.58 (2H, Leu βCH2; 1H, Leu γCH;2H Lys βCH2;2H Lys γCH2); 1.41 (9H, Boc t-Bu); 1.18 (3H, Thr γCH3); 0.94 (6H, Leu δCH2).
【００６０】
[実施例４]
（４）Boc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成（配列番号25）
（４a：Boc-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）
（操作方法１）  100 mlナス型フラスコにHCl・H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce(8.45 mmol)を入れ、蒸留CHCl3 (10 ml)に溶かした。NMM (0.930 ml, 8.45 mmol)で中和し、DMF(10ml)に溶かしたBoc-Asn-OH (2.16 g, 9.30 mmol)、HOBt (2.51 g, 18.6 mmol)を加えた。別にDCC (1.92 g, 9.30 mmol)を蒸留CHCl3(20 ml)に溶かし、少量ずつ加えた。反応終了後、DCUが出なくなるまで濃縮とろ過を繰り返し、AcOEtに溶かした。10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮しCHCl3-石油エーテルで白色沈殿を得た。ゲルろ過カラムクロマトグラフィー (Sephadex LH20, MeOH)を行い精製した。
収量 4.62 g (72％)、[α]D20 = -24.2° (c 0.1, MeOH)、融点 64-66℃.
（操作方法２）  300 mlナス型フラスコにHCl・H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce (10 mmol) を入れ、DMF (40 ml)に溶かした。NMM (1.1 ml, 10 mmol) で中和し、Boc-Asn-OH (2.55 g, 11 mmol)、HOBt (2.97 g, 22 mmol)、EDC・HCl (2.11 g, 11 mmol) を加えた。反応終了後、残さをAcOEtに溶かし、10% クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、AcOEt-エーテルから白色沈殿を得た。
収量 5.48 g (72％)、[α]D20 = -22.2° (c 0.1, MeOH)、融点 64-66℃.
質量分析（ESI法）：m/e = 781.2 ([M+Na]+).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：7.52, 7.36, 5.88, 5.54 (5H, NH, AsnγNH2); 7.36, 7.24 (10H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.08 (2H, Glu OBzl -CH2-); 4.60 (2H, -OTce -CH2-); 4.52 (2H , Ser -Bzl -CH2-); 4.68, 4.56, 4.42 (3H,  αCH); 4.00, 3.60 (2H, Ser  βCH2); 2.84, 2.68 (2H, Asn  βCH2); 2.50 (2H, Glu  βCH2); 2.32, 2.10 (2H, Glu  γCH2); 1.38 (9H, Boc t-Bu). 【００６１】
（４b：Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号26）
（操作方法１）  100 mlナス型フラスコにHCl・H-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce (0.766 g, 1.10 mmol)を入れ、DMF(20 ml)に溶かした。NMM (0.120 ml, 1.10 mmol)で中和し、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH (0.528 g, 1.21 mmol)、HOBt (0.327 g, 2.42 mmol)を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl (0.230 g, 1.21 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮しAcOEtに溶かした。10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮しCHCl3-石油エーテルで白色沈殿を得た。TLCによりBoc-Tyr(Cl2-Bzl)-OHと考えられるスポットが確認されたためカラムクロマトグラフィー (CHCl3:MeOH = 93:7)により精製を行った。CHCl3-石油エーテルにより結晶化を行い、白色沈殿を得た。
収量 0.87 g (73％)、[α]D20 = -18.4° (c 0.1, MeOH)、融点 150-152℃.
（操作方法２）  300 mlナス型フラスコにHCl・H-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce (4.18 g, 6.0 mmol)を入れ、DMF (40 ml) に溶かした。NMM (0.66 ml, 6.0 mmol) で中和し、Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH (2.77 g, 6.3 mmol)、HOBt・H2O (0.96 g, 6.3 mmol) を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl (1.21 g, 6.3 mmol) を加えた。反応終了後、濃縮し、水を加えて生じた沈殿をろ過した。THF-エーテルで再結晶を行い、白色結晶を得た。
収量 5.35 g (82％)、[α]D20 = -18.4° (c 0.1, MeOH)、融点 150-152℃.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：7.68, 7.54, 7.43, 7.37, 5.92, 5.34 (6H, NH, AsnγNH2); 7.34, 7.30, 7.26 (13H , Tyr Cl2-Bzl, Glu OBzl, Ser Bzl); 7.12, 6.94 (4H, Tyr C6H5); 5.22 (2H, Tyr Cl2-Bzl -CH2-); 5.07 (2H, Glu OBzl -CH2-); 4.85, 4.64(2H, -OTce -CH2); 4.46 (2H, Ser Bzl -CH2-); 5.01, 4.66, 4.48, 4.20 (4H,  αCH); 3.96, 3.78 (2H, Ser  βCH2); 3.07, 2.83 (TyrβCH2); 2.75, 2.58 (2H, Asn  βCH2); 2.52 (2H, Glu  βCH2); 2.33, 2.17 (2H, Glu  γCH2); 1.37 (9H, Boc t-Bu-).【００６２】
（４c：Boc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号25）
（操作方法１）  100 mlナス型フラスコにHCl・H-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce （配列番号27）(1.83 g, 1.80 mmol)を入れ、DMF (50 ml)に溶かした。NMM (200μl, 1.80 mmol)で中和し、Boc-Phe-OH (0.525 g, 1.98 mmol)、HOBt (0.535 g, 3.96 mmol)を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl (0.380 g, 1.98 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し水を加え生じた沈殿をろ過した。ガラスフィルター上で10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行った。TFE-エーテルで再結晶を行い、白色沈殿を得た。
収量 2.11 g (95％)、[α]D20 = -16.7° (c 0.1, DMF)、融点 202-204℃.
（操作方法２）  300 mlナス型フラスコにHCl・H-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce (3.87 g, 3.8 mmol) を入れ、DMF (50 ml) に溶かした。NMM (418 ml, 3.8 mmol)で中和し、Boc-Phe-OH (1.11 g, 4.18 mmol)、HOBt・H2O (0.64 g, 4.18 mmol) を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl (0. 80 g, 4.18 mmol)を加えた。反応終了後、水を加え生じた沈殿をろ過した。ガラスフィルター上で10% クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄を行った。CHCl3:TFE (3:1)で溶解させ、MeOHを徐々に加えることで再結晶を行い、白色沈殿を得た。
収量 4.24 g (91％)、[α]D20 -16.7° (c = 0.1, DMF)、融点 202-204℃
質量分析（ESI法）： m/e = 1251.1 ([M+Na]+), 1267.4 ([M+K]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)：8.52, 8.41, 8.20, 7.89, 6.87 (7H, NH, AsnγNH2); 7.52, 7.43, 7.33-7.16, 6.90 (22H, Phe C6H5-, Tyr -C6H4-, Tyr -Cl2 -Bzl, Glu -OBzl, Ser -Bzl); 5.13, (2H, Tyr -Cl2-Bzl -CH2-); 5.06 (2H, Glu -OBzl -CH2-); 4.90, 4.79 (2H, -OTce -CH2-); 4.46 (2H , Ser -Bzl -CH2-); 4.65, 4.52, 4.41, 4.10 (5H, αCH); 3.65 (2H, Ser  βCH2); 2.96, 2.87 (Phe βCH2); 2.74, 2.66 (Tyr βCH2); 2.51, 2.48 (2H, Asn  βCH2); 2.41 (2H, Glu  βCH2); 2.10, 2.00 (2H, Glu  γCH2); 1.26 (9H, Boc t-Bu).【００６３】
[実施例５] 
（５）Boc-[Glu(OBzl)]4-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成（配列番号28）
（５a：Boc-Glu(OBzl)-OTceの合成）
500 mlナス型フラスコにBoc-Glu(OBzl)-OH (33.8 g, 100 mmol)を入れ、蒸留CHCl3(150 ml)に溶かし、トリクロロエチルアルコール (10.6 ml, 110 mmol)を加えた。別にDCC (22.7 g, 110 mmol)を計り、蒸留CHCl3 (100 ml)に溶かした。これを氷冷撹拌下、パスツールピペットを用いて500 mlナス型フラスコに加えた。ここでエステル結合の生成を促進する触媒として、極微量のDMAP (1.22 g, 10 mmol)を加えた。反応の進行は薄層クロマトグラフィーで追跡した。このスケールならば、反応は１〜３時間で完結する。DMAPの添加量を精査した結果、従来の方法（非特許文献２）で用いられてきた0.5等量が生成物のラセミ化を促進していることがわかった。そこで添加量は0.1等量が適当であることを明らかにした。反応終了後、DCUが出なくなるまで濃縮とろ過を繰り返し、AcOEtに溶かした。10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後に減圧濃縮を行い、粗結晶を得た。AcOEt-ヘキサンにより再結晶を行うと、きれいな無色プリズム状結晶が得られた。驚くべきことに従来の技術では達成されえなかった、ラセミ化の阻止が、つまりL-アミノ酸であることがX線単結晶構造解析と旋光度測定により確認された。結晶構造は図２に示す。旋光度は[α]D20として下に示した。
収率 39.4 g (84％)、[α]D20 = -27.8° (c 0.1, MeOH)、融点 94-96℃.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：7.36 (5H, Glu -OBzl); 5.13 (3H, NH, -Bzl -CH2-); 4.89, 4.66 (2H, -OTce -CH2-); 4.46 (1H, αCH); 2.52 (2H, Glu  βCH2); 2.29, 2.07 (2H, Glu  γCH2); 1.42 (9H, Boc t-Bu-).
結晶学的データ：a = 9.995(2) A, c = 12.970(4) A, V = 1122.0(4) A3, 空間群P31(#144).【００６４】
（５b：Boc-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）
300 mlナス型フラスコにHCl・H-Glu(OBzl)-OTce (4.05 g, 10.0 mmol)を入れ、蒸留CHCl3 (100 ml)に溶かした。NMM (1.10 ml, 10.0 mmol)で中和した後、Boc-Ser(Bzl)-OH (3.25 g, 11.0 mmol)を加えた。別にDCC (2.27 g, 11.0 mmol)を蒸留CHCl3に溶かし、氷冷撹拌下、300 mlナス型フラスコに少量ずつ加えた。反応終了後、DCUが出なくなるまで濃縮とろ過を繰り返し、残さをAcOEtに溶かした。10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、無色オイルを得た。カラムクロマトグラフィー (CHCl3:MeOH=98:2)により精製した。
収率 5.46 g (オイル状物質)(85％).
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz)：7.33, 7.29 (10H, Glu OBzl, Ser Bzl); 7.19 (1H, Glu NH); 5.38(1H, Ser NH); 5.10 (2H, Glu -OBzl -CH2-); 4.86, 4.65 (2H, -OTce -CH2-); 4.77 (1H, Ser αCH); 4.53 (2H, Ser -Bzl -CH2-); 4.30 (1H, Glu αCH); 3.91, 3.57 (2H, Ser βCH2); 2.45 (2H , Glu  βCH2); 2.32, 2.05 (2H, Glu  γCH2); 1.54 (9H, Boc t-Bu).【００６５】
（５c：Boc-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）
300 mlナス型フラスコにHCl・H-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce (10.0 mmol)を入れ、蒸留CHCl3 (50 ml)を入れた。NMM (1.10 ml, 10.0 mmol)で中和し、Boc-Ala-OH (2.08 g, 11.0 mmol)、HOBt (1.49 g, 11.0 mmol)を加えた。別にDCC (2.27 g, 11.0 mmol)を蒸留CHCl3(20 ml)に溶かし、少量ずつ加えた。反応終了後、DCUが出なくなるまで濃縮とろ過を繰り返し、残さをAcOEtに溶かした。10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、エーテル-石油エーテルで結晶化を行い、白色結晶を得た。
収量 5.51 g (77％)、[α]D20 = -24.3° (c 0.1, MeOH)、融点 90-93℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 738.1 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)：8.48, 7.86, 6.95 (3H, NH); 7.33, 7.29 (10H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.08 (2H, Glu OBzl -CH2-); 4.86 (2H , -OTce -CH2-); 4.54, 4.47, 4.00 (3H , αCH); 4.47 (2H , Ser Bzl -CH2-); 3.60 (2H, SerβCH2); 2.49 (2H, Glu  γCH2); 2.11, 1.98 (2H, Glu  βCH2); 1.35 (9H, Boc t-Bu); 1.15 (3H, Ala αCH3).【００６６】
（５d：Boc-Glu(OBzl)-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号29）
500 mlナス型フラスコにHCl・H-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce (1.44 g, 2.20 mmol)を入れ、DMF (80 ml)に溶かした。NMM (0.242 ml, 2.20 mmol)で中和し、Boc-Glu(OBzl)-OH (0.891 g, 2.64 mmol)、HOBt (0.357 g, 2.64 mmol)を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl (0.506 g, 2.64 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し、残さをAcOEtに溶かした。10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、AcOEt-ヘキサンで再結晶を行い、白色結晶を得た。
収量 1.94 g (94％)、[α]D20 = -21.4° (c 0.1, MeOH)、融点 101-103℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 935.2 ([M+H]+), 957.2 ([M+Na]+), 973.2 ([M+K]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)： 8.43, 8.12, 7.89, 6.94 (4H, NH); 7.33-7.26 (15H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.07, 5.06 (4H, Glu OBzl -CH2-); 4.90, 4.81 (2H, -OTce -CH2-); 4.45(2H, Ser Bzl -CH2-); 4.55, 4.45, 4.33 3.93 (4H, αCH); 3.58 (2H, SerβCH2); 2.46, 2.35(4H, GluγCH2); 2.10, 1.93, 1.76 (4H, Glu  βCH2); 1.35(9H, Boc t-Bu), 1.18 (3H, AlaβCH3).【００６７】
（５d：Boc-[Glu(OBzl)]2-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号30）
500 mlナス型フラスコにHCl・H-Glu(OBzl)-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce （配列番号31）(1.48 g, 1.70 mmol)を入れ、DMF (80 ml)に溶かした。NMM (0.187 ml, 1.70 mmol)で中和し、Boc-Glu(OBzl)-OH (0.631 g, 1.87 mmol)、HOBt (0.253 g, 1.87 mmol)を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl (0.358 g, 1.87 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し、残さをAcOEtに溶かした。10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、AcOEt-ヘキサンで再結晶を行い、白色結晶を得た。
収量 1.81 g (92％)、[α]D20 = -17.9° (c 0.1, MeOH)、融点 175-179℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 1154.4 ([M+H]+), 1176.4 ([M+Na]+), 1192.2 ([M+K]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)： 8.45, 8.10, 8.08, 7.89, 7.02 (5H, NH); 7.32-7.28 (20H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.08, 5.04 (6H, Glu OBzl -CH2-); 4.90, 4.80 (2H, -OTce -CH2-); 4.44 (2H, Ser Bzl -CH2-); 4.56, 4.44, 4.30, 3.92 (5H, αCH); 3.58(2H, SerβCH2); 2.44, 2.38 (6H, GluγCH2); 2.11, 1.90, 1.77 (6H, Glu  βCH2); 1.33 (9H, Boc t-Bu); 1.28 (3H, AlaβCH3).【００６８】
（５e：Boc-[Glu(OBzl)]3-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号32）
500 mlナス型フラスコにHCl・H-[Glu(OBzl)]2-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce（配列番号33） (1.31 g, 1.20 mmol)を入れ、DMF (80 ml)に溶かした。NMM (0.132 ml, 1.20 mmol)で中和し、Boc-Glu(OBzl)-OH (0.445 g, 1.32 mmol)、HOBt (0.178 g, 1.32 mmol)を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl(0.263 g, 1.32 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し、水を加えて沈殿を析出させた。ろ過し、ガラスフィルター上で10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水の順に洗浄を行った。CHCl3-ヘキサンで再結晶を行い、白色結晶を得た。
収量 1.47 g (89％)、[α]D20 = -25.0° (c 0.1, MeOH)、融点 222-224℃.
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)： 8.46, 8.08, 7.89, 7.00 (6H, NH); 7.30-7.26 (25H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.04 (8H, Glu OBzl -CH2-); 4.90, 4.80 (2H, OTce-CH2); 4.44 (2H, Ser Bzl -CH2-); 4.56, 4.45, 4.28, 3.91 (6H, αCH); 3.58 (2H, SerβCH2); 2.46, 2.37 (8H, GluγCH2); 2.11, 1.90, 1.78 (8H, Glu  βCH2); 1.34 (9H, Boc t-Bu), 1.16 (3H, AlaβCH3).【００６９】
（５f：Boc-[Glu(OBzl)]4-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号28）
500 mlナス型フラスコにHCl・H-[Glu(OBzl)]3-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce（配列番号34）(1.18 g, 0.90 mmol)を入れ、DMF (80 ml)に溶かした。NMM (99μl, 0.90 mmol)で中和し、Boc-Glu(OBzl)-OH (0.334 g, 0.99 mmol)、HOBt (0.134 g, 0.99 mmol)を加えた後、氷冷撹拌下、EDC・HCl (0.190 g, 0.99 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し、水を加えて沈殿を析出させた。ろ過し、ガラスフィルター上で10% クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水の順に洗浄を行った。DMF-水で再沈殿を行い、白色沈殿を得た。
収量 1.26 g (90％)、[α]D20 = -24.0° (c 0.1, DMF)、融点 240-243℃.
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)：8.46, 8.08, 7.90, 7.00 (7H , NH); 7.32-7.26 (30H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.04 (10H, Glu OBzl -CH2); 4.90, 4.80 (2H, -OTce -CH2-); 4.43 (2H, Ser Bzl -CH2-); 4.55, 4.43, 4.24, 3.90 (7H, αCH), 3.58 (2H, SerβCH2), 2.47, 2.38 (10H, GluγCH2), 2.10, 1.90, 1.78 (10H, Glu  βCH2); 1.32 (9H, Boc t-Bu), 1.16 (3H, AlaβCH3).【００７０】
[実施例６]
（６）フラグメント縮合によるBoc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn- Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成（配列番号35）
（６a：Boc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OH（配列番号36）の合成）
（操作方法１）  ナスフラスコにBoc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTce （配列番号17）(0.55 g, 0.46 mmol)を入れ、CH3COOH (9 ml)に溶かし、H2O (1 ml)を加えた。亜鉛粉末 (1.0 g) を加えて室温で1時間撹拌した。反応終了後、ろ過し、ろ液を濃縮した。10%クエン酸水溶液を加え、得られた沈殿をガラスフィルター上でイオン交換水により洗浄した。
収率 0.39 g (81％)、[α]D20 = -36.1° (c 0.1, MeOH)、融点 88-91℃.
（操作方法２）  ナスフラスコにBoc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OTce （配列番号17）(3.56g, 3.00 mmol)を入れた。これをCH3COOH (9 ml)に溶かし、H2O (1 ml)を加えた。亜鉛粉末 (1.0 g) を加えて室温で1時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにより反応を追跡した。反応終了を確認の後、ろ過し、ろ液を濃縮した。10%クエン酸水を加え、得られた沈殿をガラスフィルター上でイオン交換水により数回洗浄した。
収率 1.71 g (91％)、[α]D20 = -51.0° (c = 0.1, MeOH)、融点 88-90℃.【００７１】
（６b：Boc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成）（配列番号35）
ナスフラスコにTFA・H-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzl（配列番号37） (0.25 g, 0.33 mmol)をいれ、DMF (10 ml)に溶かした。NMM (36μl)で中和し、Boc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)- Pro-OH（配列番号36） (0.37 g, 0.37 mmol)、HOBt (0.094 g, 0.69 mmol)、EDC・HCl (0.066 g, 0.37 mmol)を加えた。氷-MeOH浴で13.5時間撹拌し、反応終了後、DMFを濃縮し、イオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ガラスフィルター上で10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄した。デシケーターで乾燥し、白色粉末を得た。ゲルろ過カラムクロマトグラフィー (Sephadex LH20、DMF)により精製を行った。
収率 0.35 g (63％)、[α]D20 = -34.9° (c 0.1, DMF)、融点 94-97℃.【００７２】
[実施例７]
（７）Boc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-
Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成（配列番号38）
（７a：Boc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH（配列番号39）の合成）
（操作方法１）  ナスフラスコにBoc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTce（配列番号19） (2.40 g, 1.61 mmol)を入れ、CH3COOH (27 ml)に溶かし、H2O (3 ml)を加えた。亜鉛粉末 (4.0 g)を加えて室温で1時間撹拌した。反応終了後、ろ過し、ろ液を濃縮した。10%クエン酸水溶液を加え、得られた沈殿をガラスフィルター上でイオン交換水により洗浄した。
収率：1.93 g (88％)、[α]D20：-21.2 (c 0.1, MeOH)、融点：192-194℃
（操作方法２）  ナスフラスコにBoc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OTce（配列番号19）(1.17 g, 0.78 mmol)を入れ、CH3COOH (27 ml)に溶かし、H2O(3 ml)を加えた。亜鉛粉末 (4.0 g)を加えて室温で1時間撹拌した。反応終了後、ろ過し、ろ液を濃縮した。10%クエン酸水を加え、得られた沈殿をガラスフィルター上でイオン交換水により数回洗浄した。
収率 0.95g (89％)、[α]D20 = -17.3° (c 0.1, MeOH)、融点 191-193℃.
1H-NMR (DMSO, 300 MHz): 8.35, 7.83, 7.53, 7.43, 7.25, 7.14, 6.91, 6.87 (10H, Bzl; 4H, Cl-Z; 3H; 3H, Cl2-Bzl; 4H, Tyr C6H5; 6H, NH; 1H, Lys εNH; 2H, Asn γNH2); 5.18, 5.11, 4.60 (4H, Bzl -CH2; 2H, Cl2-Bzl -CH2-; 2H, Cl-Z -CH2-); 4.87, 4.83, 4.71, 4.55, 4.43, 4.30, 4.23 (6H, αCH; 2H, Bzl -CH2-; 1H, Thr βCH); 3.15, 3.05, 3.02, 2.94, 2.65 (2H, Asp βCH2; 1H, Tyr βCH2; 2H, Lys εCH2; 2H, Asn βCH2); 1.71, 1.69, 1.51 (2H, Leu βCH2; 1H, Leu γCH; Lys βCH2; Lys γCH2); 1.41 (9H, Boc t-Bu); 1.02 (3H, Thr γCH3); 0.81 (6H, Leu δCH2).【００７３】
（７b：Boc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-
Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成）（配列番号38）
ナスフラスコにTFA・H-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzl（配列番号40） (0.27 g, 0.16 mmol)を入れ、DMF (10 ml)に溶解した。DIEA (27μl, 0.16 mmol)で中和した。Boc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH （配列番号39）(0.23 g, 0.17 mmol)、DIEA (29μl, 0.17 mmol), HATU (0.065 g, 0.17 mmol)を加え、氷-MeOH浴で1.5時間撹拌した。反応終了後、濃縮し、イオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ガラスフィルター上で10%クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水の順に洗浄した。デシケーターで乾燥し、白色粉末を得た。
収率 0.47 g (94％)、[α]D20 = -23.3° (c 0.1, DMF)、融点 201-203℃.【００７４】
[実施例８]
（８）フラグメント縮合によるBoc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)- Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)- Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzl（配列番号41）の合成
（８a：Boc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH（配列番号42）の合成）
300 mlナス型フラスコにBoc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce （配列番号23）(1.23 g, 1.00 mmol)を入れた。90％酢酸 (30.0 ml)に溶かし、亜鉛粉末 (2 g)を加え撹拌した。反応終了後、ろ過、濃縮を行い、10% クエン酸水溶液、を加えた。析出した沈殿をろ過し、ガラスフィルター上で水洗を行った。
収量 1.05 g (95％)、[α]D20 = -23.9° (c 0.1, DMF)、融点 205-208℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 1097.2 ([M+H]+), 1119.4 ([M+Na]+), 1135.2 ([M+K]+).【００７５】
（８b：Boc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)- Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn- Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzlの合成）（配列番号41）
300 mlナスフラスコにTFA・H-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu- Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzl （配列番号43）(0.354 g, 0.12 mmol)を入れ、DMF (80 ml)に溶かし、DIEA (20.4μl, 0.120 mmol)で中和した。別にBoc- Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH （配列番号42）(0.138 g, 0.126 mmol)をDMF(50 ml)に溶かしDIEA(21.4μl, 0.126 mmol)で中和したものを用意し、氷冷撹拌下、500 mlナス型フラスコに加えた。HATU (0.048 g, 0.126 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し飽和NaHCO3水溶液、を加え、生じた沈殿をろ過した。ガラスフィルター上で飽和NaHCO3水溶液、水、10% クエン酸水溶液、水の順に洗浄を行った。ゲルろ過クロマトグラフィー (Sephadex LH60, DMF)による精製を行った。
収量 = 0.352 g (73％)、[α]D20 = -14.4 (c 0.1, DMF)、融点 = 115-117℃.【００７６】
[実施例９]
（９）Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Phe-
Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)- Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly- OBzlの合成（保護28残基ペプチドの合成）（配列番号44）
（９a：Boc-[Glu(OBzl)]4-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH（配列番号45）の合成）
300 mlナス型フラスコにBoc-[Glu(OBzl)]4-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OBzl（配列番号46） (1.28 g, 0.800 mmol)をいれた。酢酸 (36 ml)とDMF (36 ml)によりこれを溶解させ、続いて亜鉛粉末 (2 g)を加え撹拌した。反応終了後、ろ過、濃縮を行い、10% クエン酸水溶液を加えた。析出した沈殿をろ過し、ガラスフィルター上で水洗を行った。
収量 1.06 g (90％)、[α]D20 = 57.5° (c 0.1, DMF)、融点 194-198℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 1484.5 ([M+Na]+).【００７７】
（９b：Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Phe-
Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)- Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly- OBzlの合成）（配列番号44）
300 mlナス型フラスコにTFA・H-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-
Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-
Gly-Gly-OBzl （配列番号47）(386 mg, 96μmol)を入れ、DMF (60 ml)で溶解させ、DIEA (16.32μl, 96.0μmol)を加えた。別にBoc-[Glu(OBzl)]4-Ala -Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH（配列番号45） (148.0 mg, 100.8μmol)をDMF (30 ml)に溶かしDIEA (17.14μl, 100.8μmol)で中和したものを用意し、氷冷撹拌下、300 mlナス型フラスコに加えた。HATU (38.0 mg, 100.8μmol)を加えた。反応終了後、濃縮し飽和NaHCO3水溶液、を加え、生じた沈殿をろ過した。ガラスフィルター上で飽和NaHCO3水溶液、水、10% クエン酸水溶液、水の順に洗浄を行った。ゲルろ過カラムクロマトグラフィー (Sephadex LH60, DMF)による精製を行った。
収量 0.40 g (77％)、[α]D20 = -14.1° (c 0.1, DMF)、融点 305-308℃.【００７８】
[実施例１０]
（１０）H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-
Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH の合成（最終脱保護反応）（配列番号13）
50 mlナス型フラスコに氷冷下、m-クレゾール(0.167 ml, 1.60 mmol)、チオアニソール (374 mg, 3.20 mmol)、TFA (2.38 ml), TFMSA (0.283 ml, 3.20 mmol)を入れた。ここに、
Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Ser-Glu(OBzl)-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)- Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu- Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Gly-OBzl （配列番号44）(0.350 mg, 0.0640 mmol)を加え静置した。2時間後、蒸留エーテルを加え、冷蔵庫に一晩放置した。遠沈管に移し、遠心器にかけて上清を除いた。これを３回繰り返した。乾燥した後、得られた粉末をDMFに溶解させた。これをゲルろ過カラムクロマトグラフィー (Sephadex LH60, DMF)にかけることで精製を行った。生成物の確認は質量分析法により行った。図３、４にスペクトルデータを示す。
収量 0.160 g (81％)、[α]D20 = -21.3 (c 0.1, DMF)、融点 274-276℃.
質量分析（MALDI-TOF法）：m/e = 3242.1 ([M+H]+), 3224.1 ([M+H-H2O]+).【００７９】
[実施例１１] 
（１１）Boc-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce の合成（配列番号50）
（１１a：Boc-Asp(OBzl)-Gly-OTceの合成）
HCl・H-Gly-OTce (5.09 g,20.0 mmol)を蒸留ジクロロメタンに溶解し、NMM (2.20 ml, 20.0 mmol)で中和後、Boc-Asp(OBzl)-OH (7.11 g,22.0 mmol), DCC (4.54 g, 22.0 mmol), を加えて撹拌した。
DCUreaをろ取後、ろ液をエバポレーターで濃縮した。残さをAcOEtに溶かし、10%クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。濃縮後、得られたオイルをAcOEt：ベンゼン = 1:3, AcOEt：ベンゼン = 1:1の展開溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量 6.24 g (61％) (オイル状生成物)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 7.26 (10H, -Bzl), 4.73 (2H, -OTce -CH2-), 7.06, 5.56 (2H, NH), 5.16, 5.10 (4H, Bzl -CH2-), 4.52, 4.09 and (3H, αCH), 3.13 and 2.80 (2H, AspβCH2), 1.44 (9H, Boc t-Bu).【００８０】
（１１b：Boc-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTceの合成）
HCl・H-Asp(OBzl)-Gly-OTce (5.68 g, 12.7 mmol)をDMFに溶解し、NMM (1.34 ml, 12.7 mmol)で中和後、Boc-Asn-OH (3.11 g, 14.0 mmol), HOBt (3.62 g, 28.0 mmol), EDC・HCl (2.57 g, 14.0 mmol)を加えて撹拌した。濃縮後、残さをAcOEtに溶解し、10%クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。濃縮後、ヘキサンを加えて沈殿を得た。
収量 5.08 g (64％)、[α]D20 = -3.8° (c 0.1, MeOH)、融点 93-95℃.
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz)：7.35 (10H, Bzl), 4.88 (2H, -OTce -CH2-), 7.60, 6,02, 5.93, 5.55 (5H, NH), 5.12, 5.07 (4H, Bzl -CH2-), 4.87, 4.41 (2H, αCH), 4.11, 4.08 (2H, GlyαCH), 2.86, 2.67, 2.52, 2.43 (4H, βCH), 1.36 (9H, Boc t-Bu).【００８１】
（１１c：Boc-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce の合成）（配列番号50）
TFA・H-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce (1.12 g, 2.00 mmol)をDMFに溶解し、NMM (220 ml, 2.00 mmol)で中和した後、Boc-Asn-OH (0.51 g, 2.20 mmol), HOBt (0.60 g, 4.40 mmol), EDC・HCl (0.44 g, 2.20 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し、残さにイオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ろ過後、ガラスフィルター上で10%クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄した。
得られた沈殿をDMFに溶解し、エーテルを加え沈殿を得た。
収量 1.29 g (87％)、[α]D20 = -26.4° (c 0.1, DMF)、融点 206-208℃.
質量分析（ESI法）：m/e = 639.0 ([M+H]+), 1279.4 ([2M+H]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 7.37 (10H, Bzl), 4.90 (2H, -OTce -CH2-), 8.37, 8.13, 8.06, 7.44, 6.99, 6.92 (8H, NH), 5.12, 5.08 (4H, Bzl - CH2-), 4.65, 4.46, 4.24, 3.91 (5H, αCH), 2.89, 2.64, 2.56, 2.40 (4H, βCH), 1.36 (9H, Boc t-Bu).【００８２】
[実施例１２]
（１２）Boc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成（配列番号51）
（１２a：Boc-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号52）
300 mlナス型フラスコにHCl・H-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce(4.5 mmol)、蒸留THF (40 ml) を入れた。NMM (495 ml, 4.5 mmol) で中和し、Boc-Gly-OH(0.867 g, 4.95 mmol)、HOBt (0.867 g, 4.95 mmol)、EDC・HCl (0.949 g, 4.95 mmol) を加えた。反応終了後、残さをAcOEtに溶かした。10% クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、CHCl3-ヘキサンで結晶化を行い、白色沈殿を得た。
収量 3.10 g (89％)、[α]D20 = -27.4 (c 0.1, MeOH)、融点 142-144℃.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 7.35, 6.89, 6.68, 5.09 (4H, NH); 7.33, 7.30 (10H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.09 (2H, Glu OBzl -CH2-); 4.86, 4.65 (2H, -OTce -CH2-); 4.73, 4.43, 3.92, 3.72 (5H, αCH); 4.53 (2H, Ser Bzl -CH2-); 3.61 (2H, Ser βCH2); 2.47 (2H, Glu γCH2); 2.30, 2.11 (2H, Glu βCH2); 1.44 (9H, Boc t-Bu); 1.42, 1.39 (3H, Ala βCH3).【００８３】
（１２b：Boc-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成）（配列番号53）
300 mlナス型フラスコにHCl・H-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce（配列番号54）(4.5 mmol)、DMF (40 ml) を入れた。NMM (495 ml, 4.5 mmol) で中和し、Boc-Gly-OH(0.867 g, 4.95 mmol)、HOBt (0.867 g, 4.95 mmol)、EDC・HCl (0.949 g, 4.95 mmol) を加えた。反応終了後、残さをAcOEtに溶かした。10% クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、AcOEt-ヘキサンで結晶化を行い、白色沈殿を得た。
収量 3.43 g (92％)、[α]D20 = -24.4° (c 0.1, MeOH)、融点 132-134℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 830.2 ([M+H]+), 850.2 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8.40, 8.10, 8.01, 7.95, 6.98 (5H, NH); 7.33, 7.29 (10H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.07 (2H, Glu OBzl -CH2-); 4.91, 4.81 (2H, -OTce -CH2); 4.53, 4.41, 4.35, 3.60, 3.54 (7H, αCH); 4.47 (2H, Ser Bzl -CH2-); 3.61 (2H, Ser βCH2); 2.49 (2H, Glu γCH2); 2.12, 1.96 (2H, Glu βCH2); 1.37 (9H, Boc t-Bu); 1.20, 1.17 (3H, Ala βCH3).【００８４】
（１２c：Boc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTceの合成（配列番号54）
300 mlナス型フラスコにHCl・H-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce（配列番号55）(1.07 g, 1.4 mmol)、DMF (30 ml) を入れた。NMM (154 ml, 1.4 mmol) で中和し、Boc-Cys(Acm)-OH (0.45 g, 1.54 mmol)、HOBt (0.236 g, 1.54 mmol)、EDC・HCl (0.295 g, 1.54 mmol) を加えた。反応終了後、残さをAcOEtに溶かした。10% クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄を行い、無水Na2SO4により乾燥した。ろ過後、減圧濃縮し、CHCl3-ヘキサンで結晶化を行い、白色結晶を得た。
収量 1.21 g (86％)、[α]D20 = -29.8° (c 0.1, MeOH)、融点 142-143℃、質量分析（ESI法）：m/e = 1026.3 ([M+Na]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8.49, 8.43, 8.15, 8.03, 7.01 (7H, NH); 7.35, 7.31 (10H, Glu OBzl, Ser Bzl); 5.08 (2H, Glu OBzl -CH2-); 4.92, 4.82 (2H, -OTce -CH2-); 4.56, 4.38, 4.35, 4.25, 3.74, 3.62 (8H, αCH); 4.48 (2H, Ser Bzl -CH2-); 4.19 (2H, Acm -CH2-); 3.62 (2H, Ser βCH2); 2.92, 2.67 (2H, Cys βCH2); 2.49 (2H, Glu γCH2); 2.13, 1.97 (2H, Glu βCH2); 1.84 (3H, Acm -CH3); 1.38 (9H, Boc t-Bu); 1.21, 1.19 (3H, Ala βCH3).【００８５】
[実施例１３]
（１３）フラグメント縮合によるBoc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly -OTceの合成（配列番号56）
ナスフラスコにTFA・H-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce（配列番号57）(0.64 g, 0.85 mmol)をいれ、DMFに溶かした。NMM (93ml)で中和し、Boc-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-OH (配列番号36)(0.94 g, 8.9 mmol)、HOBt (0.67 g, 0.50 mmol)、EDC・HCl (0.47 g, 2.50 mmol)を加え撹拌した。反応終了後、DMFを濃縮し、イオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ガラスフィルター上で10%クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄した。デシケーターで乾燥し、白色粉末を得た。
得られた結晶をDMF-エーテル-ヘキサンで2度再結晶を行い、白色の結晶を得た。
収量 0.94 g (66％)、[α]D20 = -60.5° (c = 0.1, DMF)、融点 172-174℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 639.0 ([M+H]+).【００８６】
[実施例１４]
（１４）フラグメント縮合によるBoc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTceの合成（配列番号58）
TFA・H-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce （配列番号59）(0.87 g, 0.52 mmol)をDMFに溶解し、Boc-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-OH （配列番号19）(0.74 g, 0.54 mmol)、DIEA (263 ml, 1.56 mmol), HATU (0.21 g, 0.55 mmol)を加え、氷-MeOH浴で1.5時間撹拌した。反応終了後、濃縮し、イオン交換水を加えて沈殿を析出させた。ガラスフィルター上で10%クエン酸水、水、飽和NaHCO3水、水、飽和食塩水の順に洗浄した。
得られた結晶をCH3Cl:TFE=3:1-MeOHで再結晶を行い精製した。
収量 1.14 g (75％)、[α]D20 = -26.5° (c 0.1, DMF)、融点 236-238℃. 【００８７】
[実施例１５]
（１５）フラグメント縮合によるBoc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTceの合成（配列番号60）
ナスフラスコにTFA・H-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce （配列番号61）(1.10 g, 0.38 mmol)を入れDMFに溶かし、Boc-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH（配列番号42） (0.45 g, 0.40 mmol)、DIEA (211 μl, 1,24 mmol)、HATU (0.048 g, 0.126 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し飽和NaHCO3水を加え、生じた沈殿をろ過した。ガラスフィルター上で飽和NaHCO3水、水、10% クエン酸水、水の順に洗浄を行った。ゲルろ過クロマトグラフィー (Sephadex LH60, DMF) による精製を行った。
収量 0.63 g (42％)、[α]D20 = -16.5° (c 0.1, DMF)、融点 188-189℃. 【００８８】
[実施例１６]
（１６）フラグメント縮合によるBoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTceの合成（配列番号62）
（１６a：Boc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OHの合成）（配列番号63）
200 mlナス型フラスコにBoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OTce （配列番号51）(0.603 g, 0.60 mmol) を入れた。90％酢酸水溶液 (10 ml)に溶かし、亜鉛粉末(2 g)を加え撹拌した。反応終了後、ろ過、濃縮を行い、10% クエン酸水を加えた。析出した沈殿をろ過し、ガラスフィルター上で水洗を行った。
収量 0.380 g (72％)、[α]D20 = -23.0° (c = 0.1, DMF)、融点：139-141℃.
質量分析 (ESI法): m/e = 896.4 ([M+Na]+), 912.4 ([M+K]+).
1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz): 8.45, 8.10, 8.01, 6.98 (7H, NH); 7.33, 7.30 (10H, Glu OBzl; Ser Bzl); 5.06 (2H, Glu OBzl -CH2-); 4.49, 4.36, 4.24, 3.73, 3.61 (8H, αCH); 4.47 (2H, Ser Bzl -CH2-); 4.18 (2H, Acm -CH2-); 3.61 (2H, Ser βCH2); 2.91, 2.67 (2H, Cys βCH2); 2.40 (2H, Glu γCH2); 2.05, 1.89 (2H, Glu βCH2); 1.83 (3H, Acm -CH3); 1.37 (9H, Boc t-Bu); 1.19, 1.12 (3H, Ala βCH3).【００８９】
（１６b：Boc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTceの合成）（配列番号62）
フラスコにTFA・H-Glu(OBzl)-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce （配列番号64）(0.59 g, 0.13 mmol)を入れDMFに溶かし、別にBoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH （配列番号63）(0.157 g, 0.18 mmol)、 DIEA(77.0 ml, 0.45 mmol)、HATU(69.0 mg, 0.18 mmol)を加えた。反応終了後、濃縮し飽和NaHCO3水を加え、生じた沈殿をろ過した。ガラスフィルター上で飽和NaHCO3水、水、10% クエン酸水、水の順に洗浄を行った。ゲルろ過クロマトグラフィー(Sephadex LH60, DMF)による精製を行った。
収量 0.48 g (69％).【００９０】
[実施例１７]
H-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser-Glu-Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr- Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-OH の合成（最終脱保護反応）（配列番号48）
（１７a：Boc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OHの合成）（配列番号65）
フラスコにBoc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OTce（配列番号62）(0.48 g, 0.10 mmol)を入れ、DMF (7 ml)に溶かし、CH3COOH (3 ml)を加えた。Zn粉末 (1.0 g)を加えて室温で1時間撹拌した。反応終了後、ろ過し、ろ液を濃縮した。10%クエン酸水を加え、得られた沈殿をガラスフィルター上でイオン交換水により洗浄した。
収量 298 mg (62％).【００９１】
（１７b：H-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser-Glu-Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-OH の合成（最終脱保護反応）（配列番号48）
フラスコに氷冷下、m-クレゾール (0.33 ml, 3.2 mmol)、チオアニソール (0.37 ml, 3.2 mmol)、TFA(0.94 ml), TFMSA (0.352 ml, 3.2 mmol)を入れた。Boc-Cys(Acm)-Gly-Gly-Ala-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Phe-Tyr(Cl2-Bzl)-Asn-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Tyr(Cl2-Bzl)-Asp(OBzl)-Leu-Asp(OBzl)-Phe-Lys(Cl-Z)-Thr(Bzl)-Pro-Asn-Asn-Asp(OBzl)-Gly-OH （配列番号65）(298 mg, 64 mmol)を加え静置した。2時間後、蒸留エーテルを加え、上清を除いた(×３)。乾燥した後、ゲルろ過クロマトグラフィー(Sephadex LH60, DMF)による精製を行った。生成物の確認は質量分析法により行った。図６にスペクトルデータを示す。
収量 150 mg (77％)、融点 197℃.
質量分析（ESI法）： m/e = 1480.1 ([M+2H]2+)、987.1 ([M+3H]3+).【００９２】
[実施例１８]
（１８）H-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Glu-Phe-Tyr-Asn-Ser-Glu-Asn-Lys-Thr-Tyr-
Asp-Leu-Asp-Phe-Lys-Thr-Pro-Asn-Asn-Asp-Gly-Gly-OH （配列番号13）を用いた蛍光ELISA法による熱帯熱マラリア患者の検出
実施例１０で合成された、ペプチド化合物（配列番号13）500μgを抗原として、ジメチルスルホキシド100μlに溶解させ、次いでこの溶液に0.05 Mのカーボネートバッファー（pH9.6）1900μlを加えた。これを抗原溶液として９６穴のプラスティックプレートの各穴に70μlづつ注入し、プレート上にペプチド化合物を固着させた。【００９３】
被検血清としては日本国内の病院でインフォームドコンセントのもとに採血された熱帯熱マラリア患者血清を、対照血清としては日本国内でインフォームドコンセントのもとに採血された非感染者の血清を、それぞれ用いた。これらの被検血清と対照血清を各穴に加えて血清中の抗体をペプチド化合物（配列番号13）と反応させた。【００９４】
血清を除いた後、ヒトイムノグロブリンに対する酵素標識２次抗体を反応させた。最後に各穴に残った酵素を蛍光基質液（0.1 Mトリス-HClバッファー溶液で200μMに希釈した4-メチルアンベリフェリル-フォスフェート溶液）と反応させる。測定はマイクロフルオロリーダー（ダイナテックック社製）で行った。抗体価の測定結果は相対蛍光単位（RFU値）で表示した。【００９５】
図７には、ペプチド化合物（配列番号13）を用いて蛍光ELISA法で測定された、熱帯熱マラリア患者血清の抗体価（1〜7）を示す。比較として非感染者血清の抗体価（8〜12）を示す。患者の抗体価の平均値（181）は非感染者の抗体価の平均値（67）より大きいことがわかった。すなわち実施例で合成されたペプチド化合物（配列番号13）は免疫診断に用いることのできる材料であるとわかる。すなわち免疫診断材料として有用である。
【産業上の利用の可能性】
【００９６】
本発明に従ってペプチド化合物を合成することで、マラリア原虫エノラーゼの部分ペプチドを含む化合物を得ることができる。本発明の方法で得られたペプチドはヒトおよび他の動物との免疫反応を利用したマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発することができる。さらに、マラリア感染への免疫状態の診断材料、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の増殖を抑える免疫用抗原として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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