(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列の少なくとも１つを含んでなるポリペプチドからなる組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、細胞傷害性リンパ球への分化能を有する前駆細胞を培養し、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なうことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法（但し、該前駆細胞を抗原提示細胞と共にインキュベートする場合を除く）。
【請求項２】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法により得られるものと比較して、インターロイキン−２レセプターを高発現するものである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法により得られるものと比較して、ＣＤ８陽性細胞を高比率で含有するものである請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法により得られるものと比較して、細胞傷害活性が高く維持されたものである請求項１〜３いずれか記載の製造方法。
【請求項５】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法と比較して、拡大培養率が高い方法である請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物が固相に固定化されてなるものである請求項１〜５いずれか記載の製造方法。
【請求項７】
固相が細胞培養用器材または細胞培養用担体である請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
細胞培養用器材がシャーレ、フラスコまたはバッグであり、細胞培養用担体がビーズ、メンブレンまたはスライドガラスである請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物を培地中に溶解させて用いる請求項１〜５いずれか記載の製造方法。
【請求項１０】
組換えフィブロネクチンフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである請求項１〜９いずれか記載の製造方法。
【請求項１１】
組換えフィブロネクチンフラグメントが、
(1)  配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチド、又は
(2)  前記(1)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドからなり、（ｉ）細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性の維持機能、（ｉｉ）インターロイキン−２レセプターの発現量の増強機能、または（ｉｉｉ）ＣＤ８陽性細胞の比率向上機能を有するポリペプチド
である請求項１〜１０いずれか記載の製造方法。
【請求項１２】
細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを、組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう方法であり、
（ａ）培養開始時の細胞傷害性リンパ球への分化能を有する前駆細胞の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が、１ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、および
（ｂ）培養開始時の培地中の細胞傷害性リンパ球への分化能を有する前駆細胞の細胞の濃度が、１ｃｅｌｌ／ｍｌ〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌである、
のいずれかの条件を満たす、請求項１記載の製造方法。
【請求項１３】
希釈する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含しない請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む請求項１〜１３いずれか記載の製造方法。
【請求項１５】
外来遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はシミアンウイルスを用いて導入する請求項１４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用な、細胞傷害性リンパ球を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
【０００３】
Ｔ細胞は、ＣＤ（Cluster Designation）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、ＴHと記載する）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔ＴC；細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体〔ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある〕クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。
【０００４】
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特に免疫機能が正常なヒト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（イン・ビトロ、in vitro）で誘導した後、もしくは誘導を行わず、リンパ球を拡大培養し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルにおいて養子免疫療法がウイルス感染および腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されている〔グリーンバーグ（Greenberg, P. D.）著、アドバンセズ・イン・イムノロジー（Advances in Immunology）、1992年発行；ロイゼル  Ｐ．ら（Reusser P., et al.）、ブラッド（Blood）、第78巻、第5号、第1373〜1380頁（1991）〕。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。
【０００５】
上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、イン・ビトロでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。
【０００６】
ＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持および増強するためには、ＣＴＬについて抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られるＣＴＬ数が減少し、十分な細胞数が得られない。
【０００７】
疾病の治療に有効なＴ細胞を調製する方法としては、例えば、高濃度のＩＬ−２を用いて誘導した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる養子免疫療法〔ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N. Engl. J. Med.）、第316巻、第1310〜1321頁（1986）；ローゼンバーグ  Ｓ．Ａ．ら（Rosenberg S. A.,et al.）、N. Engl. J. Med.、第319巻、第25号、第1676〜1680頁（1988）；ホ  Ｍ．ら（Ho M., et al.）、Blood、第81巻、第8号、第2093〜2101頁（1993）〕が知られている。
【０００８】
次に、抗原特異的なＣＴＬの調製に関しては、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とインターロイキン−２（ＩＬ−２）〔リデル  Ｓ．Ａ．ら（Riddell S. A., et al.）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol.）、第146巻、第8号、第2795〜2804頁（1991）〕、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２〔リデル  Ｓ．Ａ．ら（Riddell S. A., et al.）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J. Immunol. Methods）、第128巻、第2号、第189〜201頁（1990）〕を用いて、それぞれＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法が報告されている。
【０００９】
さらに、国際公開第96/06929号パンフレットにはＲＥＭ法（rapid expansion method）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬおよびＴHを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供可能であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cell、末梢血単核細胞）とエプスタイン−バールウイルス（Epstein-Barr virus、以下ＥＢＶと略す）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増加させることが特徴である。
【００１０】
また、国際公開第97/32970号パンフレットには改変ＲＥＭ法が開示されており、当該方法はPBMCとは区別されるＴ細胞刺激成分を発現する分裂していない哺乳動物細胞株をフィーダ細胞として使用し、PBMCの使用量を低減させる方法である。
【００１１】
リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。この際、抗ＣＤ３抗体を加えて培養することにより、さらにＬＡＫ細胞の増殖は加速する。このようにして得られたＬＡＫ細胞は非特異的にさまざまながん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。ＬＡＫ細胞も上記ＣＴＬと同様に、養子免疫療法に使用される。
【００１２】
上記のとおり、細胞傷害性リンパ球、例えばＣＴＬ、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ等を取得する工程においてはＩＬ−２の利用を欠かすことができない。ＩＬ−２が細胞表面のインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）に結合することにより細胞はさらに活性化される。また、ＩＬ−２Ｒはリンパ球の活性化マーカーとして知られている。これらの点において、細胞表面のＩＬ−２Ｒの発現を上昇させることは重要である。また、ＣＴＬの誘導においては、抗原による刺激に供されたＣＴＬの前駆細胞がＣＴＬとして誘導される効率を向上させること、すなわち、誘導後の細胞群におけるＣＤ８陽性細胞の割合（比率）を向上させることが重要である。
【００１３】
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する。）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する。）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。（Deane F. Momer, FIBRONECTIN, ACADEMIC PRESS INC., p1-8 (1988)、Kimizuka F. et al., J. Biochem. 110 p284-291 (1991)、Hanenberg H. et al., Human Gene Therapy 8 p2193-2206 (1997)）
【発明の開示】
【００１４】
本発明の目的は、医療への使用に適した、細胞傷害活性を高いレベルで保持した細胞傷害性リンパ球を取得する方法を提供することにある。
【００１５】
すなわち、本発明は、
[１]  配列表の配列番号１〜７で表されるアミノ酸配列の少なくとも１つを含んでなるポリペプチドからなる組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、細胞傷害性リンパ球への分化能を有する前駆細胞を培養し、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なうことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法（但し、該前駆細胞を抗原提示細胞と共にインキュベートする場合を除く）、
[２]  細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法により得られるものと比較して、インターロイキン−２レセプターを高発現するものである前記[１]記載の製造方法、
[３]  細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法により得られるものと比較して、ＣＤ８陽性細胞を高比率で含有するものである前記[１]記載の製造方法、
[４]  細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法により得られるものと比較して、細胞傷害活性が高く維持されたものである前記[１]〜[３]いずれか記載の製造方法、
[５]  フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下における細胞傷害性リンパ球の製造方法と比較して、拡大培養率が高い方法である前記[１]記載の製造方法、
[６]  前記[１]に記載の組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物が固相に固定化されてなるものである前記[１]〜[５]いずれか記載の製造方法、
[７]  固相が細胞培養用器材または細胞培養用担体である前記[６]記載の製造方法、
[８]  細胞培養用器材がシャーレ、フラスコまたはバッグであり、細胞培養用担体がビーズ、メンブレンまたはスライドガラスである前記[７]記載の製造方法、
[９]  前記[１]に記載の組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物を培地中に溶解させて用いる前記[１]〜[５]いずれか記載の製造方法、
[１０]  組換えフィブロネクチンフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである前記[１]〜[９]いずれか記載の製造方法、
[１１]  組換えフィブロネクチンフラグメントが、
(1)  配列表の配列番号８〜１９で表されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチド、又は
(2)  前記(1)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドからなり、（ｉ）細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性の維持機能、（ｉｉ）インターロイキン−２レセプターの発現量の増強機能、または（ｉｉｉ）ＣＤ８陽性細胞の比率向上機能を有するポリペプチド
である前記[１]〜[１０]いずれか記載の製造方法、
[１２]  細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを、組換えフィブロネクチンフラグメント又はそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう方法であり、
（ａ）培養開始時の細胞傷害性リンパ球への分化能を有する前駆細胞の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が、１ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、および
（ｂ）培養開始時の培地中の細胞傷害性リンパ球への分化能を有する前駆細胞の細胞の濃度が、１ｃｅｌｌ／ｍｌ〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌである、
のいずれかの条件を満たす、前記[１]記載の製造方法、
[１３]  希釈する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含しない前記[１２]記載の製造方法、
[１４]  細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む前記[１]〜[１３]いずれか記載の製造方法、並びに
[１５]  外来遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はシミアンウイルスを用いて導入する前記[１４]記載の製造方法、
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、フィブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下に調製された細胞傷害性リンパ球において、細胞傷害活性が高く維持され、ＩＬ−２Ｒの発現量が有意に上昇し、およびＣＤ８陽性細胞の比率が向上することを見出し、完成するに至ったものである。
【００１７】
なお、本明細書において細胞傷害性リンパ球の製造とは、当該細胞の誘導（活性化）、維持、拡大培養の各工程、もしくはこれらを組み合わせた工程を包含する工程を指す。また、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造を、細胞傷害性リンパ球の培養とも称する。
【００１８】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１９】
（１）本発明に使用されるフィブロネクチン、およびそのフラグメント
本明細書中に記載のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、天然から得られたもの、または人為的に合成されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンおよびそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ruoslahti E., et al.、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、第256巻、第14号、第7277〜7281頁（1981）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
【００２０】
本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Kimiduka F., et al.、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. Biochem.）、第110巻、第284〜291頁（1991）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Kornbrihtt A. R., et al.、ＥＭＢＯ  ジャーナル（EMBO J.）、第4巻、第7号、1755〜1759（1985）〕、およびセキグチ  Ｋ．ら〔Sekiguchi K., et al.、バイオケミストリー（Biochemistry）、第25巻、第17号、4936〜4941（1986）〕等より得ることができる。
【００２１】
本発明においては、フィブロネクチンフラグメントとしては、例えば、少なくともＩＩＩ−８（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−９（配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１０（配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、およびＣＳ−１（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（第１図参照）が例示される。
【００２２】
また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法〔Williams D. A., et al.、ネイチャー（Nature）、第352巻、第438〜441頁（1991）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００２３】
さらにフィブロネクチンのフラグメントとしては、Ｃ−２７４（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２７１（配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２７１（配列表の配列番号１１で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列）、またはＣ−ＣＳ１（配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列）より選択されるポリペプチドが例示される。
【００２４】
上記のＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６はＶＬＡ−４に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。さらに、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１およびＣＨ−２９６はヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。
【００２５】
本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは３つのＩＩＩ型配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３ 、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型配列のうちの一つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合領域、Ｐｒｏ1239〜Ｓｅｒ1515）と一つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９０（配列表の配列番号１５で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９２（配列表の配列番号１６で表されるアミノ酸配列）、あるいは二つのIII型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列表の配列番号１７で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−１８１（配列表の配列番号１８で表されるアミノ酸配列）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３をそれぞれ含んでいる。
【００２６】
また、上記の各フラグメントにさらにアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用することができる。当該フラグメントは、例えば、後述の製造例に記載のＨ−２７５−Ｃｙｓの製造方法に準じて上記各フラグメントに所望のアミノ酸を付加することにより製造可能である。例えば、Ｈ−２７５−Ｃｙｓ（配列表の配列番号１９で表されるアミノ酸配列）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。
【００２７】
なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。
【００２８】
アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものである。例えば、アミノ酸の置換は、（１）グリシン、アラニン；（２）バリン、イソロイシン、ロイシン；（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；（４）セリン、スレオニン；（５）リジン、アルギニン；（６）フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入である。
【００２９】
また、「同等な機能を有する」とは、フィブロネクチンフラグメントが有する、(i)細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性の維持機能、(ii)ＩＬ−２Ｒの発現量の増強機能、または(iii)ＣＤ８陽性細胞の比率向上機能の少なくともいずれかの機能を有することをいう。アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントが、それらの機能を有するかについては後述の実施例に記載の方法に準じて適宜確認することができる。また、アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適である。細胞接着活性およびヘパリン結合活性は、それらの前記活性測定方法に準じて評価することができる。
【００３０】
アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとして、例えば、２つの異なるドメイン間にリンカーとして１以上のアミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明に使用することができる。
【００３１】
なお、フィブロネクチン自体についても同様、そのポリペプチドのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、少なくとも前記(i)〜(iii)のいずれかの機能を有するポリペプチドを、本発明において使用することができる。
【００３２】
本明細書中に記載のフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第5,198,423号明細書の記載に基づいて遺伝子組換え体より製造することもできる。例えば、上記のＨ−２７１（配列番号９）、Ｈ−２９６（配列番号１０）、ＣＨ−２７１（配列番号１１）、ＣＨ−２９６（配列番号１２）の各フラグメントならびにこれらを取得する方法は当該特許明細書に詳細に記載されている。また、上記のＣ−２７４（配列番号８）フラグメントは米国特許第5,102,988号明細書に記載された方法により得ることができる。さらに、Ｃ−ＣＳ１（配列番号１３）フラグメントは日本特許第3104178号明細書に記載された方法により得ることができる。上記ＣＨＶ−８９（配列番号１４）、ＣＨＶ−９０（配列番号１５）、ＣＨＶ−１７９（配列番号１７）の各フラグメントは、日本特許第2729712号明細書に記載された方法により得ることができる。また、ＣＨＶ−１８１（配列番号１８）フラグメントは国際公開第97/18318号パンフレットに記載された方法に準じて得ることができる。ＣＨＶ−９２（配列番号１６）フラグメントは、日本特許第2729712号明細書および国際公開第97/18318号パンフレットを参照し、それらの文献に記載されたプラスミドに基づいて定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子工学的に取得することができる。
【００３３】
これらのフラグメントまたはこれらフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、〒305-8566日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託された微生物を用いて製造する、あるいは各微生物の保持するプラスミドを公知の方法により改変することにより製造することができる；
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年１月３０日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（ＣＨ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２０（Ｈ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９１５（Ｃ−２７４をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８８年６月１７日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２３（Ｃ−ＣＳ１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９０年３月５日）、
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８２（ＣＨＶ−８９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）、
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８３（ＣＨＶ−１７９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）。
【００３４】
フィブロネクチンは巨大な糖タンパク質であるため、天然起源のタンパク質を調製して使用することは産業上および医薬品製造上、必ずしも容易ではない。さらにフィブロネクチンは生体内では血しょう中に多量に存在しており、血液製剤として血しょうから得られるフィブロネクチンを使用する場合は、フィブロネクチン以外の成分のコンタミネーションの恐れがあり、安全面においても問題あることも考えられる。また、フィブロネクチンは多機能タンパク質であることから、その使用の状況によっては、本発明の方法に効果を示す領域とは異なる領域に起因する不都合が起こることも考えられる。これらのことから、本発明においては、入手、取り扱いの容易さ、安全面の観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメント、さらに好適には前記のようにして得られる組換えフィブロネクチンフラグメントを使用することができる。さらに、後述するリンパ球の拡大培養率の向上、拡大培養されたリンパ球におけるＩＬ−２Ｒの発現量の上昇、および拡大培養されたリンパ球集団中のＣＤ８陽性細胞の比率の向上等の効果を示すことができるフィブロネクチンフラグメントが特に好適に使用できる。また、本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量としては、特に限定はないが、好適には１〜２００ｋＤ、より好適には５〜１９０ｋＤ、さらに好適には１０〜１８０ｋＤである。
【００３５】
（２）本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法
以下、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法について具体的に説明する。本発明の方法は、前記したフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう細胞傷害性リンパ球の製造方法である。
【００３６】
本明細書において細胞傷害性リンパ球とは細胞傷害性リンパ球を含有する細胞群を意味する。なお、狭義には前記細胞群に含有されている細胞傷害性リンパ球のみを示すことがある。また、本発明において細胞傷害性リンパ球の製造とは、本発明の細胞傷害性リンパ球になり得る前駆細胞からの細胞傷害活性を有するリンパ球への誘導、細胞傷害性リンパ球の維持、細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞を用いた細胞傷害性リンパ球の拡大培養のいずれをも包含するものである。
【００３７】
本発明の細胞傷害性リンパ球としては、特に限定するものではないが、例えば抗原特異的な細胞傷害活性を有する、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞等が挙げられる。
【００３８】
本発明において、細胞傷害性リンパ球になり得る、すなわち、該リンパ球への分化能を有する前駆細胞としては、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球等が例示される。また、血球系細胞であれば本発明において前駆細胞として使用できる。これらの細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。なお、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
【００３９】
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物から選択される有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球を製造することを１つの大きな特徴とする。
【００４０】
本発明の方法において、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および／または拡大培養は、通常、本発明の前記有効成分の存在下に、所定の成分を含む培地中で行なわれる。
【００４１】
例えば、本発明の方法において、細胞傷害性リンパ球の誘導もしくは拡大培養を意図する場合、本発明において使用される培養開始時の細胞（細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞）数としては、特に限定はないが、例えば１〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好適である。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。
【００４２】
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法において使用される培地には特に限定はなく、細胞傷害性リンパ球、その前駆細胞の維持、生育に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍｌ、より好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍｌである。
【００４３】
また、抗ＣＤ３抗体をさらに含有する培地中で細胞傷害性リンパ球になり得る前駆細胞を共培養することもできる。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．０１〜１００μｇ／ｍｌが好適である。抗ＣＤ３抗体はリンパ球上のレセプターを活性化する目的で添加することができる。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００４４】
なお、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００４５】
いずれの場合も前記成分の固定化は、公知の方法、例えば、後述するフィブロネクチンフラグメントの固定化方法に準じて行なうことができる。
【００４６】
さらに、国際公開第02/14481号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖およびそれらの塩からなる群より選択される化合物や、下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いてもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
【００４７】
前記ＣＤ４４に結合活性を有する物質としては、例えばＣＤ４４リガンドおよび／または抗ＣＤ４４抗体が例示される。ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素の阻害剤が挙げられる。成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質としては、例えば成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質が挙げられる。さらに、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素の阻害剤が挙げられる。これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。
【００４８】
なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
【００４９】
本発明において前記有効成分の存在下とは、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持または拡大培養を行なう際に、前記有効成分がその機能を発揮し得る状態で存在することをいい、その存在状態は特に限定されるものではない。例えば、有効成分を使用する培地に溶解させる場合、共培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．０１〜１００００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、有効成分は、このように培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。培養された細胞傷害性リンパ球を生体に投与する観点からは、特に限定はないが、前記有効成分を固定化して使用することが望ましい。
【００５０】
前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法により細胞傷害性リンパ球を得た後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、有効成分等と該リンパ球とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐことができる。
【００５１】
本発明の有効成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。有効成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００５２】
例えば、フィブロネクチンのフラグメントの固定化は、国際公開第97/18318号パンフレット、ならびに国際公開第00/09168号パンフレットに記載の方法により実施することができる。
【００５３】
本発明の製造方法によって得られた細胞傷害性リンパ球についてＩＬ−２Ｒの発現量を測定すると、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なった細胞傷害性リンパ球に比較して有意なＩＬ−２Ｒ発現量の増加が認められる。ここで、ＩＬ−２Ｒ発現量は公知の方法、例えば、抗ＩＬ−２Ｒ抗体を使用して測定することができる。
【００５４】
上記のように、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球はＩＬ−２Ｒの発現量が増加している。ＩＬ−２Ｒは活性化Ｔ細胞表面に発現する活性化マーカーであり、この分子の発現に伴い、サイトカイン産生、細胞傷害活性、増殖活性等が活性化される。よって、本発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球は高い機能を有する細胞群である。
【００５５】
また、本発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球は、ＩＬ−２Ｒの発現量が増加していることから、培地中に添加されたＩＬ−２、あるいは細胞傷害性リンパ球の前駆細胞、リンパ球自体もしくは共存するその他の細胞が産生したＩＬ−２による刺激に対する感受性が向上している。このため、ＩＬ−２の少ない環境下（例えば体内等）でも自ら活性化することかできる。
【００５６】
さらに、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球では、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものに比べてＣＤ８マーカーを有する（ＣＤ８陽性）細胞の存在する比率が高い。このことは、例えば、（１）ＣＤ８陽性細胞はインターフェロン−γ等のサイトカインを産生して、免疫賦活を引き起こし、ヘルパーＴ細胞バランスをＴｈ１系にする、（２）ＣＤ８陽性細胞は細胞性免疫担当細胞であり、ウィルスや腫瘍細胞等の異物を効率よく排除することができる、（３）ＣＤ８陽性細胞を得る場合は、従来はマグネットビーズやフローサイトメーターでＣＤ８陽性細胞を精製していたが、本発明の方法では培養しながらＣＤ８陽性細胞をエンリッチにすることができる、（４）ＣＤ８陽性細胞比が多いことから、ＣＴＬを誘導する際の前駆細胞としての使用に適している、（５）ＣＤ８陽性細胞比の少ない細胞集団からでも、ＣＤ８陽性細胞比率を高めながら培養することができる、等の利点がある。よって、本発明の方法は細胞傷害性リンパ球の調製において極めて有用である。
【００５７】
なお、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率は、特に限定するものではないが、例えば抗ＣＤ８抗体を使用して測定することができる。
【００５８】
また、本発明の方法により調製された細胞傷害性リンパ球、特にＣＴＬについては培養後の細胞を長期間にわたって維持、あるいはこれを増殖させても、従来観察されたような細胞傷害活性の著しい低下がないという優れた性質を有している。すなわち、該細胞傷害性リンパ球は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、細胞傷害活性が高く維持されたものである。従って、培養された細胞傷害性リンパ球をクローン化することにより、安定した細胞傷害活性を有するリンパ球として維持することもできる。また、誘導されたＣＴＬに抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させ、拡大培養することができる。この細胞傷害性リンパ球の維持、拡大培養には、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。
【００５９】
上記の細胞傷害性リンパ球の維持とは、細胞傷害性リンパ球を細胞傷害活性を保ったままで維持することをいう。その際の培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は前記と同様である。
【００６０】
本発明の方法における細胞傷害性リンパ球の維持および拡大培養は、本発明の有効成分、すなわちフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地中で細胞傷害性リンパ球をそれぞれ継続培養および拡大培養することを１つの大きな特徴とする。拡大培養によれば、細胞傷害性リンパ球の有する細胞傷害活性を維持させた状態でその細胞数を増加させることができる。すなわち、本発明の方法は、１つの態様として、細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法を提供する。
【００６１】
本発明の細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法において、その培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ2等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は前記と同様である。
【００６２】
本発明の拡大培養方法によれば、例えばＣＴＬの拡大培養の場合、１４日間の拡大培養によって１００〜１０００倍に細胞数の増加したＣＴＬを得ることができる。また、ＬＡＫ細胞の拡大培養の場合の一例としては、７日間の培養で約２００倍、９日間の培養で１０００倍に増加したＬＡＫ細胞を得ることができる。さらに、こうして得られた細胞傷害性リンパ球、特にＣＴＬについては従来の細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法、例えばＲＥＭ法や改変ＲＥＭ法で得られたものに比べてより高い細胞傷害活性を保持している。このような本発明の効果は、本発明の方法で拡大培養されたＣＴＬ等の有する細胞傷害活性を後述の実施例に記載の方法により測定し、確認することができる。
【００６３】
さらに、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法の特徴として、低細胞数から培養を開始することが可能である。養子免疫療法を行うためには大量のリンパ球が必要となるが、患者から大量のリンパ球を取得することは困難である。また、通常の細胞傷害性リンパ球の拡大培養では、使用する細胞数に応じた適切な培養面積の細胞培養用器材の選択や、適切な培地量での培養が必要となる。すなわち、通常は細胞培養用器材における培養面積〔すなわち、培地に接触している器材表面部分の面積（ｃｍ２）〕に対する細胞量（個数）は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上、細胞濃度は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の高密度で培養が開始され、これ以下の細胞量条件では、拡大培養率〔拡大培養前の細胞数に対する拡大培養後の細胞数の比（拡大培養後の細胞数／拡大培養前の細胞数）〕が非常に低くなり、大量の細胞傷害性リンパ球を得るまでに長期の培養期間を要する。よって、一般的には、例えば、小さな細胞培養用器材を用いて培養を開始した後、段階的に大きなスケールの細胞培養用器材を使用する、もしくは細胞培養用器材の数を増やして希釈操作を繰り返す等の方法により、大量のリンパ球を製造するのが現状である。このように、通常の細胞傷害性リンパ球の拡大培養では、複数の培養系を必要とする。
【００６４】
本発明の方法により、少量の細胞量より開始された場合でも細胞培養用器材の大きさに関わらず、高い拡大培養率で培養を行うことができる。よって、従来のような面倒な細胞培養用器材の交換や希釈操作は不要となる。すなわち、本発明の方法によれば、１つの細胞培養用器材を用いた培養操作により、換言すれば、１つの培養系により、充分な細胞傷害性リンパ球の拡大培養を行なうことができる。よって、本発明の方法は、希釈する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含しない細胞傷害性リンパ球の製造方法である。特に、本発明の方法でＬＡＫ細胞を拡大培養する場合、大容量の細胞培養用器材にＬＡＫ細胞となり得る細胞と培地を添加し、それ以降はＩＬ−２を添加するのみでＬＡＫ細胞の拡大培養を行うことが可能である。簡便な操作で大量のＬＡＫ細胞を得ることができる点において、本発明は非常に有用である。この際、使用する本発明の有効成分としては、より高い拡大培養率を得るという観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメントが使用できる。このように、本発明の方法によれば、短時間に必要量の細胞傷害性リンパ球を得ることができる。
【００６５】
例えば、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを、本発明の有効成分の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で低細胞数から開始する場合、培養開始時において、下記（ａ）および（ｂ）から選択される条件を満たす細胞量を使用して行うことができる。
（ａ）使用する細胞培養用器材における培養面積に対する細胞量の比率が、好適には１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好適には１０〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、特に好適には１×１０２〜５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。
（ｂ）培地中の細胞の濃度が、好適には１〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、より好適には１０〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、特に好適には１×１０２〜５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。
なお、ここで細胞量とは、細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞の個数をいう。
【００６６】
また、本発明の方法においては、細胞培養用器材の交換や希釈操作の工程を包含しない、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを１つの培養系で行なう方法が例示される。
【００６７】
以下、本発明の製造方法によりＣＴＬを製造することを例に説明する。
【００６８】
ＣＴＬの誘導は、前記有効成分の存在下、ＣＴＬに所望の抗原に対する認識能力を付与するために、適切な抗原提示細胞とともにＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞を、例えば、任意の培地中でインキュベート（培養）することにより実施される。前駆細胞はＣＴＬになる前段階で、しかもＣＴＬに分化するように運命付けられている細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブ細胞、メモリー細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞等が挙げられる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して認識すべき抗原を提示する能力を有する細胞であれば特に限定はない。例えば、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞等に所望の抗原を提示させ、本発明に使用することができる。
【００６９】
本発明においては、例えばＣＴＬを製造する際の前駆細胞等の培養条件は一般的な公知の条件〔例えば、カーター  Ｊ．ら（Carter J., et al.）、イムノロジー（Immunology）、第57巻、第1号、第123〜129頁（1986）を参照〕に従えばよい。
【００７０】
また、適切なフィーダ細胞と共培養することもできる。ＣＴＬをフィーダ細胞と共培養する場合には、ＣＴＬ、フィーダ細胞の両者の維持、生育に適した培地であることが望ましい。当該培地としては、市販の培地が使用できる。
【００７１】
本発明の方法に使用されるフィーダ細胞は、抗ＣＤ３抗体と協同してＣＴＬを刺激し、Ｔ細胞レセプターを活性化するものであれば特に限定はない。本発明には、例えば、ＰＢＭＣやエプスタイン−バールウィルスによって形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）が使用される。通常、フィーダ細胞は放射線照射のような手段で増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は公知の方法に従って決定すればよく、例えば、１×１０５〜７cells/mlが好適である。
【００７２】
特に好ましい態様においては、フィーダ細胞として、非ウィルス感染細胞、例えば、ＥＢＶ−Ｂ細胞以外のものが使用される。これにより、拡大培養されたＣＴＬ中にＥＢＶ−Ｂ細胞が混在する可能性を排除することができ、養子免疫療法のようなＣＴＬを利用した医療の安全性を高めることが可能となる。
【００７３】
抗原提示細胞は、抗原提示能を有する細胞に抗原ペプチドを付加し、その表面に抗原ペプチドを提示させることにより調製することができる〔例えば、ベンドナレク  Ｍ．Ａ．ら（Bednarek M. A., et al.）、J. Immunol.、第147巻、第12号、第4047〜4053頁 (1991)を参照〕。また、抗原提示能を有する細胞が抗原を処理（process）する能力を有している場合には、当該細胞に抗原を負荷することにより、抗原が細胞内に取り込まれてプロセッシングを受け、断片化された抗原ペプチドが細胞表面に提示される。なお、抗原ペプチドを抗原提示能を有する細胞に付加する場合、使用される抗原提示細胞、誘導しようとするＣＴＬのＭＨＣ拘束性に合致する抗原ペプチドが使用される。
【００７４】
なお、本発明において使用される抗原は特に限定されるものではなく、例えば、細菌、ウィルスなどの外来性抗原や腫瘍関連抗原（癌抗原）などの内存性抗原等が挙げられる。
【００７５】
本発明においては、抗原提示細胞は非増殖性とすることが好ましい。細胞を非増殖性とするためには、例えばＸ線等の放射線照射またはマイトマイシン（mitomycin）等の薬剤による処理を行えばよい。
【００７６】
本発明における、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物から選択される有効成分の存在下、ＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞とともにインキュベート（共培養）してＣＴＬを誘導するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、ベンドナレク  Ｍ．Ａ．ら（Bednarek M. A., et al.）、J. Immunol.、第147巻、第12号、第4047〜4053頁 (1991)を参照〕に従えばよい。共培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ2等の条件で培養することができる。この共培養は通常、２〜１５日程度実施されるが、その間に抗原提示細胞を新たに調製したものに取り替えて再刺激を行ってもよい。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。
【００７７】
本発明の方法により得られるＣＴＬは所望の抗原を特異的に認識する能力を有しており、例えば該抗原を有する細胞を、その細胞傷害活性により特異的に破壊する。このＣＴＬの細胞傷害活性は公知の方法により評価できる。例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対するＣＴＬの細胞傷害活性を、ＣＴＬにより破壊された標的細胞に由来する放射能や蛍光強度を測定することによって評価できる。また、ＣＴＬや標的細胞より抗原特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することもできる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させた後に第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（fluorescence-activated cell sorting）分析することによりＣＴＬの細胞傷害活性を評価することができる。
【００７８】
なお、本発明のＣＴＬの拡大培養方法については、前記有効成分が、当該方法に使用される培養系に存在しておれば特に限定は無く、上記以外の従来のＣＴＬ拡大培養方法において、その培養系に前記有効成分を存在させて、すなわち、本発明の有効成分の存在下に前駆細胞等の培養（例えば、培養に使用される培地に前記有効成分を添加して）が行なわれる態様も本発明に包含される。
【００７９】
次にＬＡＫ細胞の培養方法について詳細に説明する。
【００８０】
ＬＡＫ細胞の培養は、前記有効成分の存在下、ＩＬ−２とともにＬＡＫ細胞となり得る細胞をインキュベートすることにより実施される。ＬＡＫ細胞となり得る細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられる。
【００８１】
また、ＬＡＫ細胞を培養するための一般的な条件は、公知の条件〔例えば、細胞工学、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．２、ｐ２２３〜２２７、（１９９５年）；細胞培養、１７、（６）、ｐ１９２〜１９５、（１９９１年）；ＴＨＥ  ＬＡＮＣＥＴ、Ｖｏｌ．３５６、ｐ８０２〜８０７、（２０００）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １７，  ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。共培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ2等の条件で培養することができる。この共培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換してもよい。
【００８２】
上記のＣＴＬ、ＬＡＫ細胞の誘導、維持、拡大培養と同様に、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に培養することにより、ＴＩＬについても高い細胞傷害活性を有する細胞群を調製することができる。本発明においては、これらの細胞の活性化操作においてフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を共存させる他には特に限定はなく、前記細胞の培養、活性化に適した培地を使用して実施することができる。フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の使用量、添加方法等については前記方法に準じて適切なものを選択すればよい。
【００８３】
以上の本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法により、細胞傷害活性が高く維持され、ＩＬ−２Ｒの発現量が有意に上昇し、ＣＤ８陽性細胞の比率が向上した、医療への使用に適する細胞傷害性リンパ球が得られる。よって、本発明の方法は、その一態様として、さらに、本発明の有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球でのインターロイキン−２レセプターの発現を増大する方法、本発明の有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率を向上する方法、並びに本発明の有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう工程を含む、細胞傷害性リンパ球において細胞傷害活性を向上または維持させる方法を提供する。
【００８４】
本発明の別の態様として、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有する細胞表面上のＩＬ−２Ｒ発現増強剤が提供される。当該増強剤は、有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、たとえば、活性化しようとする細胞に適した培地、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また、前記増強剤を含有する培地は細胞傷害性リンパ球でのＩＬ−２Ｒ発現増強用培地として使用することができる。前記培地は細胞培養のための基本的な成分を任意に含むものである。なお、前記増強剤およびＩＬ−２Ｒ発現増強用培地は、本発明の有効成分を用い、公知の方法に準じて製造することができる。前記増強剤またはＩＬ−２Ｒ発現増強用培地中の本発明の有効成分等の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。また、前記増強剤は、直接生体に投与することにより、生体内細胞上のＩＬ−２Ｒの発現を増強させることもできる。
【００８５】
また、本発明の別の態様として、フィブロネクチン、そのフラグメントおよびそれらの混合物から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする、培養されたリンパ球集団におけるＣＤ８陽性細胞の比率向上剤が提供される。当該比率向上剤は、有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、たとえば、活性化しようとする細胞に適した培地、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また、前記比率向上剤を含有する培地は細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率向上用培地として使用することができる。前記培地は細胞培養のための基本的な成分を任意に含むものである。なお、前記比率向上剤および比率向上用培地は、本発明の有効成分を用い、公知の方法に準じて製造することができる。前記比率向上剤またはＣＤ８陽性細胞の比率向上用培地中の本発明の有効成分等の含有量は、前記ＩＬ−２Ｒ発現増強剤等の場合と同様にして、所望により、適宜、決定することができる。また、前記比率向上剤は、直接生体に投与することにより、生体中の細胞傷害性リンパ球の比率を向上させることもできる。
【００８６】
また、本発明の別の態様として、フィブロネクチン、そのフラグメントおよびそれらの混合物から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする細胞傷害性リンパ球における細胞傷害活性の向上剤または維持剤が提供される。当該向上剤または維持剤は有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、例えば、活性化しようとする細胞に適した培地、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また前記向上剤または維持剤を含有する培地は細胞傷害性リンパ球における細胞傷害活性の向上用または維持用の培地として使用することができる。前記培地は細胞培養のための基本的な成分を任意に含むものである。なお、向上剤、維持剤、向上用培地および維持用培地は、本発明の有効成分を用い、公知の方法に準じて製造することができる。前記向上剤、維持剤、向上用培地および維持用培地の本発明の有効成分の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。また、前記向上剤および維持剤は、直接生体に投与することにより、生体中の細胞傷害性リンパ球の活性を向上または維持させることもできる。
【００８７】
さらに、上記の発現増強剤、比率向上剤、細胞傷害活性の向上剤および維持剤はその成分が適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化された形態のものであってもよい。
【００８８】
上記の細胞傷害性リンパ球の製造方法を用いて得られたリンパ球含有培養物中には、通常、ヘルパーＴ細胞等の細胞傷害性リンパ球以外の細胞も混在している。しかしながら、本発明により得られたリンパ球含有培養物中には細胞傷害活性を保持するリンパ球が多く含まれているため、該培養物から遠心分離等により該培養物中の細胞を回収し、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球としてそのまま使用することができる。しかも、前記有効成分等を細胞培養用器材等に固定化しておけば、得られた細胞傷害性リンパ球における該成分等の混入の心配はない。
【００８９】
また、さらに該培養物から公知の方法により、細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団（あるいは培養物）を分離し、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球として使用することもできる。すなわち、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、当該方法により得られた培養物から細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団を選択する工程を含むことができる。
【００９０】
細胞傷害性リンパ球を高含有する該細胞集団の選択方法については特に限定はないが、例えば培養物から所望の細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ８抗体を結合させた細胞培養用器材もしくは担体を用いて目的の細胞のみを選択的に回収する方法や、フローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。前記担体としては磁気ビーズやカラムが例示される。また、培養物から所望の細胞以外の細胞を吸着除去することにより、目的の細胞を高含有する細胞集団を得ることもできる。例えば、ヘルパーＴ細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ４抗体を使用し、当該リンパ球培養物からヘルパーＴ細胞を除去することができる。この工程にはフローサイトメーターを用いることもできる。このようにして得られた細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団は、培養物から非選択的に回収された細胞集団と比較してより強い細胞傷害活性を有しており、特に医療分野において好適に使用できる。
【００９１】
さらに本発明は、上記の本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法で得られた、細胞傷害性リンパ球を提供する。当該リンパ球、特にＣＴＬは、高い細胞傷害活性を有しており、長期間にわたる継続培養や拡大培養を行っても細胞傷害活性の低下が少ないという性質を有する。また、本発明は、当該リンパ球を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。特に、当該リンパ球を含有する前記治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適した細胞傷害活性を有するリンパ球が、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該リンパ球を有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定できる。
【００９２】
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法においては、当該リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含することができる。すなわち、本発明は、その一態様として、細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む細胞傷害性リンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
【００９３】
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法、特に細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法を行うことにより、培養されるリンパ球のＤＮＡ複製能が増強される。よって、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法に、遺伝子の導入工程を包含することにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
【００９４】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、細胞傷害性リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記リンパ球の誘導、維持および／または拡大培養のいずれかの工程と同時に、あるいは該工程の後に実施するのが、作業効率の観点から好適である。
【００９５】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００９６】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはシミアンウイルスが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
【００９７】
レトロウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、細胞傷害性リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
【００９８】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００９９】
本発明において細胞傷害性リンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やリボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【０１００】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【０１０１】
本発明の方法によれば、例えば、がん等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子を細胞傷害性リンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのような細胞傷害性リンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（multidrug resistance gene）が例示される。
【０１０２】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子を細胞傷害性リンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
【実施例】
【０１０３】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
【０１０４】
製造例１  フィブロネクチンフラグメントの調製
（１）フィブロネクチンフラグメントの調製
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｈ−２７１は、Escherichia coli HB101/pHD101（FERM BP-2264）より、米国特許第5,198,423号明細書に記載の方法により調製した。
【０１０５】
また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６はそれぞれ、Escherichia coli HB101/pHD102（FERM BP-7420）、Escherichia coli HB101/pCH101（FERM BP-2799）、Escherichia coli HB101/pCH102（FERM BP-2800）を用い、これを上記の明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
【０１０６】
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｃ−２７４は、Escherichia coli JM109/pTF7221（FERM BP-1915）を用い、これを米国特許第5,102,988号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
【０１０７】
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｃ−ＣＳ１は、Escherichia coli HB101/pCS25（FERM BP-5723）を用い、日本特許3104178号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
【０１０８】
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−１７９は、それぞれEscherichia coli HB101/pCHV89（FERM P-12182）、Escherichia coli HB101/pCHV179（FERM P-12183）を用い、日本特許2729712号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
【０１０９】
また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−９０は日本特許2729712号明細書に記載の方法で調製した。すなわち、当該明細書に記載の操作によってプラスミドｐＣＨＶ９０を構築したうえ、該プラスミドを保有する形質転換体を培養し、該培養物よりＣＨＶ−９０を調製した。
【０１１０】
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−１８１は、国際公開第97/18318号パンフレットに記載の方法で、ＣＨＶ−１８１をコードするＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＣＨＶ１８１）を構築した後、該プラスミドを導入された大腸菌（Escherichia coli HB101/pCHV181）を培養し、該培養物より、上記のＣＨＶ−１７９と同様の方法で調製した。
【０１１１】
（２）ＣＨＶ−９２の調製
上記のポリペプチドＣＨＶ−１８１を発現させるためのプラスミド  ｐＣＨＶ１８１について、ＣＨＶ−１８１をコードする領域中のIII−１３領域をコードする領域を欠失したプラスミドＣＨＶ９２を構築した。欠失操作は日本特許2729712号明細書に記載の、プラスミドｐＣＨＶ１７９からのIII−１４コード領域の欠失操作に準じて行った。
【０１１２】
上記のプラスミドｐＣＨＶ９２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Escherichia coli HB101/pCHV92）を培養し、該培養物より日本特許第2729712号明細書に記載のＣＨＶ−８９ポリペプチドの精製方法に準じて精製操作を行い、精製ＣＨＶ−９２標品を得た。
【０１１３】
（３）Ｈ−２７５−Ｃｙｓの調製
ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓを発現させるためのプラスミドは以下に示す操作に従って構築した。Escherichia coli HB101/pCH102（FERM BP-2800）よりプラスミドｐＣＨ１０２を調製した。このプラスミドを鋳型とし、配列表の配列番号２０に塩基配列を示すプライマー１２Ｓと配列表の配列番号２１に塩基配列を示すプライマー１４Ａとを用いたＰＣＲを行い、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインをコードする約０．８kbのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ（ともにタカラバイオ社製）で消化した後、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）とライゲーションすることにより、プラスミドｐＲＨ１を構築した。
【０１１４】
プラスミドベクターｐＩＮIII−ｏｍｐＡ1〔グーライェプ  Ｊ．ら（Ghrayeb J., et al.）、EMBO J.、第3巻、第10号、第2437〜2442頁（1984）〕をＢａｍＨＩとＨｉｎｃII（タカラバイオ社製）とで消化し、リポプロテインターミネーター領域を含む約０．９kbのＤＮＡ断片を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎｃIIで消化した上記のプラスミドｐＲＨ１と混合してライゲーションを行い、ｌａｃプロモーター、ヘパリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片およびリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ１−Ｔを得た。
【０１１５】
このプラスミドｐＲＨ１−Ｔを鋳型とし、配列表の配列番号２２に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ａと配列表の配列番号２３に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ｓとを用いたＰＣＲ反応の後、回収した増幅ＤＮＡ断片をＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で消化し、さらに該ＤＮＡ断片をセルフライゲーションさせた。こうして得られた環状ＤＮＡをＳｐｅＩとＳｃａＩ（タカラバイオ社製）とで消化して得られる２．３kbのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＲＨ１−ＴをＳｐｅＩとＳｃａＩ（タカラバイオ社製）とで消化して得られる２．５kbのＤＮＡ断片とを混合してライゲーションを行い、プラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓを得た。該プラスミドには、前記のＨ−２７１のＮ末端側にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒの４アミノ酸が付加され、さらにＣ末端にＣｙｓが付加されたポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓがコードされている。
【０１１６】
ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓは以下の方法により調製した。上記のプラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Escherichia coli HB101/pRH-Cys）を１２０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で１晩培養した。培養液より回収した菌体を４０ｍｌの破砕用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。遠心分離を行って得られた上清を精製用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化されたハイトラップ−ヘパリンカラム（ファルマシア社製）にかけた。同緩衝液でカラム内の非吸着画分を洗浄した後、０〜１Ｍ  ＮａＣｌ濃度勾配を持つ精製用緩衝液で溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、Ｈ−２７５−Ｃｙｓの分子量に相当する画分を集めて精製Ｈ−２７５−Ｃｙｓ標品を得た。
【０１１７】
実施例１  ＣＴＬにおけるＣＤ８陽性細胞比率
（１）PBMCの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたHLA-A2.1保有ヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をPBS(-)で2倍希釈し、Ficoll-paque（ファルマシア社製）上に重層して500×gで20分間遠心分離した。中間層の末梢血単核細胞(PBMC)をピペットで回収、洗浄した。採取したPBMCは90％ FBS（Bio Whittaker社製）／10％DMSO（SIGMA社製）からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存PBMCを３７℃水浴中にて急速融解し、10μg/ml  DNase（Calbiochem社製）を含むRPMI1640培地（Bio Whittaker社製）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
【０１１８】
（２）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導は、Bednarekらの方法〔J．Immunology、第147巻、第12号、第4047〜4053頁（1991）〕を一部改変して実施した。すなわち、5％ヒトAB型血清、0.1mM非必須アミノ酸、１mM ピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン（全てBio Whittaker社製)、10mM  HEPES(ナカライテスク社製)、1％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコBRL社製）を含むRPMI1640培地（Bio Whittaker社製）（以下5HRPMIと略す）に1〜4×106cells/mlとなるように実施例２−（１）で調製したPBMCを懸濁後、24穴細胞培養プレート（Falcon社製）に1ml/ウェルずつまき、5％ＣＯ2湿式インキュベーター中、３７℃で１．５時間インキュベートし、プラスチック接着性の単球を分離した。その後、非接着性の細胞をRPMI1640培地を用いて回収し、レスポンダー細胞として氷上に保存した。分離した単球には、抗原ペプチドとして5μg/mlのインフルエンザウイルスタンパク質由来エピトープペプチド（配列表の配列番号２４に記載のマトリックスプロテイン由来A2.1結合性ペプチド）および1μg/mlのβ２マイクログロブリン(スクリプス社製)を含む5HRPMIを0.5mlづつ添加し、２時間室温にてインキュベート後、Ｘ線照射（5500R）して抗原提示細胞とした。各ウェルからペプチド液を吸引除去し、ウェルをRPMI1640培地を用いて洗浄後、氷上保存しておいたレスポンダー細胞を0.5〜2×１06cells/mlとなるよう5HRPMIに懸濁し、1ml/ウェルづつ抗原提示細胞上に添加した。このとき、製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（以下、FNfrと記載する）を終濃度10μg/mlとなるように添加した。対照として、FNfrを添加しない群も設定した。プレートを５％ＣＯ2中、３７℃で培養した。培養開始後２日目に、60U/mlのＩＬ−２(塩野義製薬社製)と10μg/mlのFNfrを含む1mlの5HRPMI（対照は、IL−２のみ含有）を各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後同様のＩＬ−２およびFNfr含有培地（対照はＩＬ−２のみ含有）を1mlずつ添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあと、１週間培養したレスポンダー細胞を0.5〜2×106cells/mlとなるように5HRPMIに懸濁し、調製した抗原提示細胞上に1ml/ウェルずつ添加し、再刺激した。このとき、FNfrを終濃度10μg/mlとなるように添加した（対照は無添加）。再刺激後２日目に、60U/mlのＩＬ−２および10μg/mlのFNfrを含む（対照はＩＬ−２のみ含有）1mlの5HRPMIを各ウェルに添加した。また５日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を1mlづつ添加し、さらに培養を２日続け、ＣＴＬを誘導した。
【０１１９】
（３）ＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例１−（２）で調製した誘導開始後14日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Calcein-AMを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Lichtenfels R., et al.）、J. Immnol. Methods、第172巻、第2号、第227〜239頁(1994)〕にて評価した。一晩エピトープペプチドと共培養、もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したHLA-A2.1保持EBVトランスフォームB細胞（細胞名  221A2.1）を1×106cells/mlとなるよう5％FBS（Bio  Whittaker社製）を含むRPMI1640培地に懸濁後、終濃度25μMとなるようにCalcein-AM（ドータイト社製）を添加し、37℃で１時間培養した。細胞をCalcein-AMを含まない培地にて洗浄後20倍量のK562細胞（ATCC CCL-243）と混合し、Calcein標識標的細胞とした。なお、K562細胞はレスポンダー細胞中に混入するNK細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。
【０１２０】
実施例１−（２）で調製したメモリーＣＴＬをエフェクター細胞として1×105〜9×106cells/mlとなるように5HRPMIで段階希釈後、96穴細胞培養プレートの各ウェルに100μl／ウェルずつ分注しておき、これらに1×105cells/mlに調製したCalcein標識標的細胞を100μl／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを400×gで１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清１００μlを採取し、蛍光プレートリーダー（485nm／538nm）によって培養上清中に放出されたcalcein量（蛍光強度）を測定した。ＣＴＬの細胞傷害活性は以下の式１にしたがって算出した。
式１：細胞傷害活性（％）＝
〔（各ウェルの測定値−最小放出量）／最大放出量−最小放出量）〕×１００
【０１２１】
上式において最小放出量は標的細胞およびK562細胞のみ含有するウェルのcalcein放出量であり、標的細胞からのcalcein自然放出量を示す。また、最大放出量は標的細胞に界面活性剤であるTriton X−100（ナカライテスク社製）を0.1%加えて細胞を完全破壊した際のcalcein放出量を示している。この結果、誘導直後において、細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１２２】
（４）ＣＴＬ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例１−（２）で調製した2×105cellsのＣＴＬを１％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社製）を含むPBS（ニッスイ社製）を用いて固定した後、PBSで洗浄した。固定細胞を1％BSA（SIGMA社製）を含む100μlのPBS中に懸濁し、FITC標識マウスIgG1もしくはFITC標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ともにDAKO社製）を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再度１％パラホルムアルデヒドを含むPBSに懸濁した。この細胞をFACS Vantage（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表１に示す。
【０１２３】
【表１】
0004406566.tif 000002
【０１２４】
表１に示されるように、ＣＴＬ誘導時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、これらを添加しない対照に比較して、ＣＴＬ誘導開始後１４日目におけるＣＤ８陽性細胞の比率が高い。すなわち、フィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＣＤ８陽性細胞を有意に増殖させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかとなった。
【０１２５】
実施例２  インターロイキン−２レセプター発現の誘導
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１２６】
（２）ＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現率の測定
実施例２−（１）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現率の測定は、実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。なお、今回の操作ではFITC標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体をFITC標識マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）抗体（DAKO社製）に変更した。結果を表２に示す。
【０１２７】
【表２】
0004406566.tif 000003
【０１２８】
表２に示されるように、各種のフィブロネクチンフラグメントを添加して誘導されたＣＴＬにおいてはいずれも細胞集団中のＩＬ−２Ｒ発現率の上昇が見られた。すなわち、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導を行うことにより、ＩＬ−２Ｒ発現量を増加させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかとなった。
【０１２９】
実施例３  ＣＴＬの拡大培養
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１３０】
（２）ＣＴＬの拡大培養
実施例３−（１）で調製したＣＴＬを5HRPMIで洗浄後、3×104cells/mlに調製した。一方、実施例１−（１）と同様の方法により採取したＨＬＡ-Ａ2.1非保持allogenic PBMCをＸ線照射（3300R）し、培地で洗浄後2〜5×106cells/mlに調製した。これらのＣＴＬ（3×104cells）とallogenic PBMC（4〜10×106cells）を10mlの5HRPMIもしくは10％HycloneFBS、0.1mM非必須アミノ酸、１mM ピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン（全てBio Whittaker社製）、10mM HEPES(ナカライテスク社製)、1％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコBRL社製）を含むRPMI1640培地（Bio Whittaker社製）（以下、10HycloneRPMIと略す）に懸濁し、さらに終濃度50ng/mlの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５cm2のフラスコ（ファルコン社製）に入れ、３７℃  湿式ＣＯ2インキュベーター中で14日間培養した。この際、ＣＴＬ誘導の際に添加したものと同じ終濃度10μg/mlのFNfrを添加した。また、FNfrを添加せずに誘導を行った対照群にはFNfrは添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度120U/mlのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、60U/mlのＩＬ−２を含む5HRPMIもしくは10HycloneRPMI 5mlを各フラスコに添加した。この際、FNfr添加群の培地には同濃度のFNfrを添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの細胞傷害活性を測定し、拡大培養前の細胞傷害活性をどれだけ維持しているかを「細胞傷害活性維持（％）」として算出した。
「細胞傷害活性維持（％）」は以下の式２にしたがって算出した。
式２：細胞傷害活性維持（％）＝
〔拡大培養後の細胞傷害活性（％）／拡大培養前の細胞傷害活性（％）〕×100
【０１３１】
測定結果を表３に示す。なお、表中においてE/T ratioは標的細胞に対するエフェクター細胞の比を示す。
【０１３２】
【表３】
0004406566.tif 000004
【０１３３】
表３に示されるように、誘導時ならびに拡大培養時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群のＣＴＬは、フィブロネクチンフラグメントを添加しなかった対照に比べて、１４日間の拡大培養の後も特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導、拡大培養を行うことにより、高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養が可能であることが明らかになった。
【０１３４】
実施例４  ＣＴＬ拡大培養後細胞集団におけるＩＬ−２Ｒの発現
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１３５】
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセフ゜ター発現率の測定
実施例４−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養後のＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞の比率を測定した。結果を表４に示す。
【０１３６】
【表４】
0004406566.tif 000005
【０１３７】
表４に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも拡大培養後の細胞集団上におけるＩＬ−２Ｒ発現細胞の比率の上昇が認められた。
【０１３８】
つまり、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬを誘導し、拡大培養することにより、ＩＬ−２Ｒの発現量を増加させながら、ＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
【０１３９】
実施例５  フィブロネクチン存在下でのＣＴＬ誘導、拡大培養
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、FNfrにかえてフィブロネクチン（カルビオケム社製）を終濃度10μg/mlとなるように添加した（対照は無添加）。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチン添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１４０】
（２）ＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現率の測定
実施例５−（１）で調製したＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞の比率を測定した。結果を表５に示す。
【０１４１】
【表５】
0004406566.tif 000006
【０１４２】
表５に示されるように、フィブロネクチン存在下に誘導されたＣＴＬでは、細胞集団上におけるＩＬ−２Ｒの発現量の上昇が見られた。
【０１４３】
つまり、フィブロネクチン存在下にＣＴＬの誘導を行うことにより、ＩＬ−２Ｒの発現量を増加させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかになった。
【０１４４】
（３）ＣＴＬの拡大培養
実施例５−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。このとき、誘導時にフィブロネクチンが添加されていたものにはフィブロネクチン（カルビオケム社製）を終濃度10μg/mlとなるように添加した（対照は無添加）。得られたＣＴＬの細胞傷害活性を実施例１−（３）と同様の方法にて測定し、拡大培養前の細胞傷害活性をどれだけ維持しているかを「細胞傷害活性維持（％）」として算出した。
測定結果を表６に示す。
【０１４５】
【表６】
0004406566.tif 000007
【０１４６】
表６に示されるように、フィブロネクチンの存在下にＣＴＬ誘導および拡大培養を行った群においては高い細胞傷害活性が保持されていた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもフィブロネクチンを添加しなかった対照の細胞傷害活性は明らかに低下していた。つまり、フィブロネクチンをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養が可能であることが明らかになった。
【０１４７】
実施例６  固定化されたフィブロネクチン（ＦＮ）フラグメント存在下でのＣＴＬ拡大培養
（１）ＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にフィブロネクチンフラグメントを固定化した。すなわち、24穴細胞培養プレート、12.5cm2フラスコに各種フィブロネクチンフラグメント（終濃度10μg/ml）を含むPBSを1〜2ｍｌずつ添加し、室温で５時間インキュベートした後、使用時まで４℃で保存した。また上記のプレート、フラスコは使用前にPBSで２回洗浄した。
【０１４８】
（２）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）の方法に準じて、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、培養器材としてFNfrを固定化したプレートを使用した（対照には固定化処理を行っていないプレートを使用）。誘導後のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時に使用したプレートのFNfr固定化の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１４９】
（３）ＣＴＬの拡大培養
実施例６−（２）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）の方法に準じて拡大培養した。この際、培養器材として各種FNfrを固定化したフラスコを使用した（対照には固定化処理を行っていないフラスコを使用）。また、培地には10HycloneRPMIを用いた。
【０１５０】
こうして拡大培養されたＣＴＬの細胞傷害活性が拡大培養前に比較してどれだけ維持されているかを「細胞傷害活性維持（％）」として表し評価した。
測定結果を表７に示す。
【０１５１】
【表７】
0004406566.tif 000008
【０１５２】
表７に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材（プレート、フラスコ）を使用した群のＣＴＬは拡大培養後にも特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもフィブロネクチンフラグメントを固定化しない器材を使用した対照では、細胞傷害活性は明らかに低下していた。つまり、固定化されたフィブロネクチンフラグメントを使用することにより、培地中に溶解しているフラグメントと同様に高い細胞傷害活性を長期的に保持したＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
【０１５３】
実施例７  ＣＴＬ拡大培養後細胞集団におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１５４】
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例７−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養後のＣＴＬについて、実施例１−（４）に記載の方法でＣＤ８陽性細胞含有比率を測定した。結果を表８に示す。
【０１５５】
【表８】
0004406566.tif 000009
【０１５６】
表８に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも拡大培養後の細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の上昇が認められた。
【０１５７】
つまり、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬを誘導し、拡大培養することにより、ＣＤ８陽性細胞を有意に増殖させながら、ＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
【０１５８】
実施例８  固定化されたフィブロネクチンフラグメント存在下で誘導されたＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現の誘導
（１）ＦＮフラグメント固定化
実施例６−（１）と同様の方法で、培養器材（容器）にフィブロネクチンフラグメントを固定化した。
【０１５９】
（２）抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）の方法に準じて、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、培養器材として実施例８−（１）で作成したFNfr固定化プレートを使用した（対照には固定化処理を行っていないプレートを使用）。誘導後のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時に使用したプレートのFNfr固定化の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１６０】
（３）ＣＴＬの拡大培養
実施例８−（２）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）の方法に準じて拡大培養した。この際、培養器材として実施例８−（１）で作成したFNfr固定化フラスコを使用した（対照には固定化処理を行っていないフラスコを使用）。また、培地には10HycloneRPMIを用いた。
【０１６１】
こうして得られた拡大培養前後のＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でIL-2R発現陽性細胞比率を測定した。
測定結果を表９に示す。
【０１６２】
【表９】
0004406566.tif 000010
【０１６３】
表９に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材（プレート、フラスコ）を使用した群のＣＴＬは拡大培養前後のどちらにおいても対照群と比較してIL-2R発現率の上昇がみられた。つまり、固定化されたフィブロネクチンフラグメントを使用することにより、培地中に溶解しているフラグメントと同様にIL-2R発現量を高く維持しながらＣＴＬを拡大培養することが可能であることが明らかになった。
【０１６４】
実施例９  ＣＤ８細胞表面上のインターロイキン−２レセプター発現の誘導
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス  メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１６５】
（２）ＣＴＬにおけるインターロイキン−２レセプター発現率の測定
実施例９−（１）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬ（特にＣＤ８細胞表面上）におけるインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現率の測定は、実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。なお、今回の操作では1次抗体としてFITC標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体を、2次抗体としてPE標識マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）抗体（DAKO社製）を使用した。結果を表１０に示す。
【０１６６】
【表１０】
0004406566.tif 000011
【０１６７】
表１０に示されるように、各種のフィブロネクチンフラグメントを添加して誘導されたＣＴＬにおいてはＣＤ８陽性細胞集団におけるＩＬ−２Ｒ発現率の上昇が見られた。すなわち、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導を行うことにより、ＣＤ８細胞表面上のＩＬ−２Ｒ発現量を増加させながらＣＴＬを誘導することが可能であることが明らかとなった。
【０１６８】
実施例１０  ＣＴＬ拡大培養前後細胞集団におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（フィブロネクチンとフィブロネクチンフラグメントとの比較）
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチンおよびFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１６９】
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるＣＤ８陽性細胞含有比率の測定
実施例１０−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養前後のＣＴＬについて、実施例１−（４）に記載の方法でＣＤ８陽性細胞含有比率を測定した。結果を表１１に示す。
【０１７０】
【表１１】
0004406566.tif 000012
【０１７１】
表１１に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも対照群に対して拡大培養前および拡大培養後の細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率の上昇が認められた。
【０１７２】
つまり、フィブロネクチンそのものに比べ、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬ誘導し、拡大培養を行う方が、ＣＤ８陽性細胞を拡大培養前および拡大培養後いずれにおいても有意に増殖させながら、ＣＴＬを拡大培養するのに好適であることが明らかになった。
【０１７３】
実施例１１  ＣＴＬ拡大培養前後細胞集団におけるIL-2R発現の誘導
（フィブロネクチンとフィブロネクチンフラグメントとの比較）
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチンおよびFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１７４】
（２）拡大培養されたＣＴＬにおけるIL-2R発現陽性細胞含有比率の測定
実施例１１−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。こうして得られた、拡大培養前後のＣＴＬについて、実施例２−（２）に記載の方法でIL-2R発現陽性細胞含有比率を測定した。結果を表１２に示す。
【０１７５】
【表１２】
0004406566.tif 000013
【０１７６】
表１２に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを添加した群においては、いずれも対照群に対して拡大培養前および拡大培養後の細胞集団中におけるIL-2R発現陽性細胞含有比率の上昇が認められた。この上昇率はフィブロネクチン添加した群と比較して有意に高いものであった。
【０１７７】
つまり、フィブロネクチンそのものに比べ、フィブロネクチンフラグメントの存在下にＣＴＬを誘導し、拡大培養を行う方が、IL-2R発現陽性細胞を拡大培養前および拡大培養後いずれにおいても有意に増殖させながら、ＣＴＬを拡大培養するのに好適であることが明らかになった。
【０１７８】
実施例１２  ＣＴＬの拡大培養（フィブロネクチンとフィブロネクチンフラグメントとの比較）
（１）抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−（１）に記載の方法で分離、保存したPBMCを用い、実施例１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のフィブロネクチンおよびFNfr添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。
【０１７９】
（２）ＣＴＬの拡大培養
実施例１２−（１）で調製したＣＴＬを実施例３−（２）と同様の方法で拡大培養した。また、培地には10HycloneRPMIを用いた。
【０１８０】
こうして拡大培養されたＣＴＬの細胞傷害活性が拡大培養前に比較してどれだけ維持されているかを「細胞傷害活性維持（％）」として表し評価した。
測定結果を表１３に示す。
【０１８１】
【表１３】
0004406566.tif 000014
【０１８２】
表１３に示されるように、誘導時ならびに拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを添加した群のＣＴＬは、フィブロネクチンフラグメントを添加しなかった対照群に比べて、１４日間の拡大培養後も特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。またその活性はフィブロネクチンを添加した群と比較して有意に高いものであった。
【０１８３】
つまり、フィブロネクチンそのものに比べ、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導、拡大培養を行うのが、高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養に好適であることが明らかになった。
【０１８４】
実施例１３  ＬＡＫ細胞(Lymphokine-activated killer cells)培養系における拡大培養率の測定
（１）抗ヒトCD3抗体およびFNもしくはFNフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（容器）に抗ヒトCD3抗体およびフィブロネクチンまたはFNフラグメントを固定化した。すなわち２４穴細胞培養プレートまたは12.5cm2細胞培養フラスコ（Falcon社製）に抗ヒトCD3抗体（ヤンセン協和社製）（終濃度5μg/ml）を含むPBSを１ml（24穴プレートの場合）または2ml（12.5cm2フラスコの場合）ずつ添加した。この時、フィブロネクチンまたはFNフラグメント添加群にはフィブロネクチンまたは製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（FNfr）を終濃度10μg/ml（24穴プレートの場合）または25μg/ml（12.5cm2フラスコの場合）となるように添加した。対照として、フィブロネクチンおよびFNfrを添加しない群も設定した。
【０１８５】
これらの培養器材を室温で5時間インキュベート後、使用時まで4℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・FNfrを含むPBSを吸引除去後、各ウェルをPBSで2回、５％ヒトＡＢ型血清（Bio  whittaker社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（ギブコＢＲＬ社製）を含むＸＶＩＶＯ２０培地（Bio  whittaker社製）（以下５ＨＸＶＩＶＯ２０と略す）で1回洗浄し各実験に供した。
【０１８６】
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
５ＨＸＶＩＶＯ２０に0.5〜1x106cells/mlとなるように実施例１−（１）で調製したPBMCを懸濁後、実施例１３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびフィブロネクチンもしくはFNfr固定化プレートに1ml/ウェルずつまき、終濃度1000U/mlとなるようにIL-2（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを5％CO2中37℃で培養した（培養0日目）。培養開始後2日目、3日目には1000U/mlのIL-2を含む５ＨＸＶＩＶＯ２０を1ml/ウェルずつ添加した。培養開始後4日目には適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度500U/mlとなるようIL-2を添加した。培養を継続し、2〜3日毎に培養開始5日目と同様に適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈し終濃度300〜500U/mlとなるようIL-2を添加した。培養開始後7〜15日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表１４に示す。
【０１８７】
【表１４】
0004406566.tif 000015
【０１８８】
表１４に示されるように、LAK細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してLAK細胞の拡大培養率が高い。また、各フィブロネクチンフラグメント固定化群の拡大培養率は培養開始後15日目にはフィブロネクチンを固定化した培養器材を使用した群よりも高いものであった。よって、拡大培養が長期に渡る場合、フィブロネクチンそのものに比べ、LAK細胞誘導初期にフィブロネクチンフラグメントを共存させることが、より高い拡大培養率でLAK細胞を誘導・培養するのに好適であることが明らかとなった。
【０１８９】
実施例１４  ＬＡＫ細胞培養系における増殖率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。この際の培養開始後4日目から7日目までの細胞の増殖率を算出した。結果を表１５に示す。
【０１９０】
【表１５】
0004406566.tif 000016
【０１９１】
表１５に示されるように、LAK細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して培養開始4日目から7日目までのLAK細胞の増殖率が高い。すなわちLAK細胞誘導初期にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、早い増殖速度でLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０１９２】
実施例１５  ＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（低細胞数からのLAK細胞誘導・培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。この際、培養開始時の細胞濃度を２×１０５〜１×１０６cells/ml（１×１０５〜５×１０５cells/cm２）となるようにした。培養開始後15日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。結果を表１６に示す。
【０１９３】
【表１６】
0004406566.tif 000017
【０１９４】
表１６に示されるように、LAK細胞誘導時に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養開始時の細胞数に関わらず、培養開始後15日目に高い拡大培養率が得られた。これに対して対照群では、培養開始時の細胞数が低い場合、培養開始後15日目の拡大培養率が低かった。すなわち低細胞数からLAK細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、培養開始時の細胞数に関わらず、高い拡大培養率でLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０１９５】
実施例１６  ＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（低細胞数からのLAK細胞誘導・培養／希釈操作なしでの培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
５ＨＸＶＩＶＯ２０に1x104cells/mlとなるように実施例１−（１）で調製したPBMCを懸濁後、実施例１３−（１）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびフィブロネクチンもしくはFNfr固定化6ウェルプレートに1ml/ウェルずつまき、５ＨＸＶＩＶＯ２０  4mlを加え（1x103cells/cm2）、さらに終濃度500U/mlとなるようにIL-2（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを5％CO2中37℃で培養した（培養0日目）。培養開始後2日目、3日目、4日目には終濃度500U/mlとなるようにIL-2を添加した。培養を継続し、培養開始後7日目以降2〜3日毎に終濃度500U/mlとなるようIL-2を添加した。この間培養液の希釈操作は全く行わなかった。
【０１９６】
培養開始後15日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。結果を表１７に示す。
【０１９７】
【表１７】
0004406566.tif 000018
【０１９８】
表１７に示されるように、低細胞数からのLAK細胞誘導時に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、誘導途中の細胞の希釈操作を必要とすることなしに培養開始後15日目に高い拡大培養率が得られた。また、この拡大培養率はフィブロネクチンを固定化した培養器材を使用した群と比較しても高いものであった。これに対して対照群では培養開始15日目でもほとんど増殖しなかった。すなわち低細胞数からLAK細胞を誘導する際にフィブロネクチンもしくはフィブロネクチンフラグメント、好ましくはフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、全く希釈操作を必要とすることなく、高い拡大培養率でLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０１９９】
実施例１７  ＬＡＫ細胞におけるIL-2R発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。
【０２００】
（２）LAK細胞におけるIL-2R発現率の測定
実施例１７−（１）で誘導・培養したLAK細胞におけるIL-2R発現率の測定は実施例２−（２）に記載の方法に準じて行った。結果を表１８に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をIL-2R発現率（％）と表示する。
【０２０１】
【表１８】
0004406566.tif 000019
【０２０２】
表１８に示されるように、LAK細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のLAK細胞表面上におけるIL-2R発現率を高く誘導することができた。また、このIL-2R発現率はフィブロネクチンを固定化した培養器材を使用した群と比較しても高いものであった。すなわちLAK細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、フィブロネクチンそのものよりも好適にIL-2R発現率を高くしながらLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０２０３】
実施例１８  ＬＡＫ細胞におけるIL-2R発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。
【０２０４】
（２）LAK細胞におけるIL-2R発現率の測定
実施例１８−（１）で誘導・培養した7日目のLAK細胞中におけるCD4細胞、CD8細胞表面上におけるIL-2R発現率の測定を実施例９−（２）に記載の方法に準じて行った。なお、今回の操作では1次抗体としてFITC標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体またはFITC標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体を、2次抗体としてPE標識マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）抗体を使用した。結果を表１９に示す。
【０２０５】
【表１９】
0004406566.tif 000020
【０２０６】
表１９に示されるように、LAK細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のLAK細胞（CD4およびCD8陽性の両細胞）表面上におけるIL-2R発現率を高く誘導することができた。すなわちLAK細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、CD4およびCD8陽性の両細胞表面上のIL-2R発現率を高くしながらLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０２０７】
実施例１９  ＬＡＫ細胞集団中におけるCD8陽性細胞含有比率
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１３−（２）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。
【０２０８】
（２）LAK細胞におけるCD8陽性細胞集団含有比率の測定
実施例１９−（１）で誘導・培養した１５日目のLAK細胞中における、CD8陽性細胞含有比率の測定を実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。結果を表２０に示す。
【０２０９】
【表２０】
0004406566.tif 000021
【０２１０】
表２０に示されるように、LAK細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のLAK細胞中におけるCD8陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわちLAK細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、LAK細胞中のCD8陽性細胞の含有率を高くしながらLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０２１１】
実施例２０  ＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
５ＨＸＶＩＶＯ２０に0.5〜1x106cells/mlとなるように実施例１−（１）で調製したPBMCを懸濁後、実施例１３−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびFNfr固定化プレートに1ml/ウェルずつまき、終濃度1000U/mlとなるようにIL-2（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを5％CO2中37℃で培養した（培養0日目）。培養開始後2日目、3日目には1000U/mlのIL-2を含む５ＨＸＶＩＶＯ２０を1ml/ウェルずつ添加した。培養開始後4日目には適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度500U/mlとなるようIL-2を添加した。培養開始8または9日目には実施例１３−（１）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびFNfr固定化フラスコ（ただし、固定化に用いる抗ヒトＣＤ３抗体の濃度は0.5μg/mlとした）に適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を移し、終濃度500U/mlとなるようIL-2を添加した。培養開始11日目または12日目に再度適宜５ＨＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度500U/mlとなるようIL-2を添加した。培養開始15日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表２１および表２２に示す。表中においてdonorはＰＢＭＣドナーの記号を示す。
【０２１２】
【表２１】
0004406566.tif 000022
【０２１３】
【表２２】
0004406566.tif 000023
【０２１４】
表２１および表２２に示されるように、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗CD3抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してLAK細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗CD3抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。すなわちLAK細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗CD3抗体を用いて刺激することにより、より高い拡大培養率でLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０２１５】
実施例２１  ＬＡＫ細胞培養系における増殖率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２０−（１）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。この際の培養開始後４日目から8日目までの細胞の増殖率および培養開始後１１日目から１５日目までの細胞の増殖率を算出した。結果を表２３および表２４に示す。
【０２１６】
【表２３】
0004406566.tif 000024
【０２１７】
【表２４】
0004406566.tif 000025
【０２１８】
表２３および表２４に示されるように、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗CD3抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して誘導後期におけるLAK細胞の増殖率が高い。これらの増殖率は、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗CD3抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における誘導後期のLAK細胞の増殖率よりもはるかに高いものであった。すなわちLAK細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗CD3抗体を用いて刺激することにより、より高い増殖率でLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０２１９】
実施例２２  ＬＡＫ細胞におけるIL-2R発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２０−（１）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。
【０２２０】
（２）LAK細胞におけるIL-2R発現率の測定
実施例２２−（１）で誘導・培養後15日目のLAK細胞におけるIL-2R発現率の測定は実施例２−（２）に記載の方法に準じて行った。その結果を表２５および表２６に示す。かかる表においてはＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をIL-2R発現率(％)と表示する。
【０２２１】
【表２５】
0004406566.tif 000026
【０２２２】
【表２６】
0004406566.tif 000027
【０２２３】
表２５および表２６に示されるように、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗CD3抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して培養開始15日目のLAK細胞表面上のIL-2R発現率が高い。これらのIL-2R発現率は、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗CD3抗体のみを固定化した培養器材を使用した群におけるIL-2R発現率よりもはるかに高いものであった。すなわちLAK細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントを用いて刺激することにより、より高いIL-2R発現率でLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【０２２４】
実施例２３  ＬＡＫ細胞におけるCD8陽性細胞比率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２０−（１）と同様の方法でLAK細胞を誘導・培養した。
【０２２５】
（２）LAK細胞集団中におけるCD8陽性細胞含有比率の測定
実施例２３−（１）で誘導・培養した15日目のLAK細胞集団中におけるCD8陽性細胞含有比率の測定は実施例１−（４）に記載の方法に準じて行った。その結果を表２７に示す。
【０２２６】
【表２７】
0004406566.tif 000028
【０２２７】
表２７に示されるように、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗CD3抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較して培養開始15日目のLAK細胞集団中におけるCD8陽性細胞含有比率が高い。これらのCD8陽性細胞含有比率は、LAK細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗CD3抗体のみを固定化した培養器材を使用した群におけるCD8陽性細胞含有比率よりもはるかに高いものであった。すなわちLAK細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントを用いて刺激することにより、より高いCD8陽性細胞含有比率でLAK細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【０２２８】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:8 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:10 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:11 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:12 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:13 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:14 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:15 ; Fibronectin fragment named CHV-90.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CHV-179.
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CHV-181.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named H-275-Cys.
SEQ ID NO:20 ; Primer 12S.
SEQ ID NO:21 ; Primer 14A.
SEQ ID NO:22 ; Primer Cys-A.
SEQ ID NO:23 ; Primer Cys-S.
SEQ ID NO:24 ; Designed peptide based on matrixprotein derived from influenza virus.
【産業上の利用の可能性】
【０２２９】
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法によれば、細胞傷害活性が高く維持され、ＩＬ−２Ｒの発現量が有意に上昇し、ＣＤ８陽性細胞の比率が向上した細胞傷害性リンパ球が得られる。当該リンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【配列表】
SEQUENCE  LISTING
<110> TAKARA BIO INC.
<120> Process for the preparation of lymphocyte having cytotoxic activity
<130> 03-021-PCT
<150> JP 2002-84414
<151> 2002-03-25
<160> 24
<210> 1
<211> 87
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial region of fibronectin named III-8
<400> 1
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr
80                  85
<210> 2
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial region of fibronectin named III-9
<400> 2
Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala
1               5                  10                  15
Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr
20                  25                  30
Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro
35                  40                  45
Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr
50                  55                  60
Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu
65                  70                  75
Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr
80                  85                  90
<210> 3
<211> 94
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial region of fibronectin named III-10
<400> 3
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro
1               5                  10                  15
Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg
20                  25                  30
Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val
35                  40                  45
Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser
50                  55                  60
Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val
65                  70                  75
Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile
80                  85                  90
Asn Tyr Arg Thr
<210> 4
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial region of fibronectin named III-12
<400> 4
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
1               5                  10                  15
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
20                  25                  30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
35                  40                  45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50                  55                  60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
65                  70                  75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
80                  85                  90
Leu Glu
<210> 5
<211> 89
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial region of fibronectin named III-13
<400> 5
Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu
1               5                  10                  15
Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr
20                  25                  30
Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile
35                  40                  45
Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly
50                  55                  60
Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn
65                  70                  75
Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
80                  85
<210> 6
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial region of fibronectin named III-14
<400> 6
Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro
1               5                  10                  15
Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr
20                  25                  30
Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu
35                  40                  45
Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr
50                  55                  60
Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu
65                  70                  75
Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
80                  85                  90
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> partial region of fibronectin named CS-1
<400> 7
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His
1               5                  10                  15
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
20                  25
<210> 8
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named C-274
<400> 8
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp
<210> 9
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named H-271
<400> 9
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
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Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
20                  25                  30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
35                  40                  45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50                  55                  60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
65                  70                  75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
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Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
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Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr
125                 130                 135
Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
140                 145                 150
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr
155                 160                 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser
170                 175                 180
Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
185                 190                 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
200                 205                 210
Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
215                 220                 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
230                 235                 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
245                 250                 255
Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys
260                 265                 270
Thr
<210> 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named H-296
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Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
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Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
35                  40                  45
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
50                  55                  60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
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Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
80                  85                  90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
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Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
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Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr
125                 130                 135
Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
140                 145                 150
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr
155                 160                 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser
170                 175                 180
Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
185                 190                 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
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Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
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Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
230                 235                 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
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Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys
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Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named CH-271
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Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
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Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
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Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
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Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
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Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
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Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
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Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
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Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
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Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
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Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
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Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
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Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
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Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
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Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
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Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
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Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
380                 385                 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp
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Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys
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Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr
425                 430                 435
Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440                 445                 450
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser
455                 460                 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
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Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr
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Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
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Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
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Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser
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Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named CH-296
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Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
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Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
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Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
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Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
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Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
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Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
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Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
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Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
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Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
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Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
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Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
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Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
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Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
380                 385                 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp
395                 400                 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys
410                 415                 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr
425                 430                 435
Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440                 445                 450
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser
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Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser
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Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr
485                 490                 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg
500                 505                 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr
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Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser
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Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu
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Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp
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Val Pro Ser Thr
<210> 13
<211> 302
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named C-CS1
<400> 13
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
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Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
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Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr
275                 280                 285
Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro
290                 295                 300
Ser Thr
<210> 14
<211> 367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named CHV-89
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Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
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Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg
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Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp
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Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val
305                 310                 315
Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp
320                 325                 330
Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr
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Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro
350                 355                 360
Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
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<213> Artificial Sequence
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Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
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Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
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Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
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Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
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Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn
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Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp
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Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu
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Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro
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Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu
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Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu
350                 355                 360
Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
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<211> 370
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
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Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
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Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
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Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
275                 280                 285
Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
290                 295                 300
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
305                 310                 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro
320                 325                 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
335                 340                 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
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Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu
365                 370
<210> 17
<211> 457
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named CHV-179
<400> 17
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
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Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg
275                 280                 285
Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp
290                 295                 300
Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val
305                 310                 315
Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp
320                 325                 330
Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr
335                 340                 345
Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro
350                 355                 360
Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu
365                 370                 375
Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln
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Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys
395                 400                 405
Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
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Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr
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Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro
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Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
455
<210> 18
<211> 459
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named CHV-181
<400> 18
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg
1               5                  10                  15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu
20                  25                  30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu
35                  40                  45
Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu
50                  55                  60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln
65                  70                  75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp
80                  85                  90
Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe
95                 100                 105
Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
110                 115                 120
Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp
125                 130                 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr
140                 145                 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg
155                 160                 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp
170                 175                 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu
185                 190                 195
Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
200                 205                 210
Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
215                 220                 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys
230                 235                 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg
245                 250                 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg
260                 265                 270
Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp
275                 280                 285
Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp
290                 295                 300
Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr
305                 310                 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro
320                 325                 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys
335                 340                 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg
350                 355                 360
Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
365                 370                 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile
380                 385                 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp
395                 400                 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys
410                 415                 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr
425                 430                 435
Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser
440                 445                 450
Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr
455
<210> 19
<211> 276
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin fragment named H-275-Cys
<400> 19
Met Ala Ala Ser Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr
1               5                  10                  15
Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn
20                  25                  30
Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys
35                  40                  45
Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser
50                  55                  60
Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser
65                  70                  75
Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly
80                  85                  90
Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg
95                 100                 105
Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr
110                 115                 120
Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala
125                 130                 135
Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg
140                 145                 150
Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile
155                 160                 165
Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val
170                 175                 180
Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe
185                 190                 195
Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro
200                 205                 210
Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly
215                 220                 225
Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr
230                 235                 240
Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile
245                 250                 255
Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile
260                 265                 270
Gly Arg Lys Lys Thr Cys
275
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 12S
<400> 20
aaaccatggc agctagcgct attcctgcac caactgac              38
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 14A
<400> 21
aaaggatccc taactagtct ttttccttcc aatcag                36
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer Cys-A
<400> 22
aaaagcggcc gctagcgcaa gccatggtct gtttcctgtg            40
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer Cys-S
<400> 23
aaaagcggcc gcactagtgc atagggatcc ggctgagcaa c          41
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Designed peptide based on matrixprotein derived from influenza virus
<400> 24
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1               5
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
第１図は、フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【図１】
0004406566.tif 000029