(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号10の配列(ここで、R1およびR2はシステインを表すか、またはR1およびR2はセリンを表す)を少なくとも含むことを特徴とする、単離された天然または合成のペプチド。
【請求項２】
配列番号10の配列に相当することを特徴とする、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドの少なくとも1つの遊離のアミンおよび／またはカルボキシ官能基が、保護基により保護される請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項４】
分子内に存在するC-末端カルボキシ基および／またはその他のカルボキシ基が、エステルまたはアミドの形であることを特徴とする請求項3に記載のペプチド。
【請求項５】
分子内に存在するN-末端アミン基および／またはその他の遊離のアミン基が、アシル化された形であることを特徴とする請求項3に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1つに記載される少なくとも1つのペプチドと、少なくとも1つの適切な賦形剤とを含む組成物。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか1つに記載される少なくとも1つのペプチドの、植物の病原性物質に指向された抗菌剤としての使用。
【請求項８】
抗菌剤が、キサントモナス・カンペストリス、シュードモナス・シリンゲまたはエルウィニア・アミロボーラに特異的であることを特徴とする請求項7に記載の使用。
【請求項９】
配列番号10の配列(ここで、R1およびR2はシステインを表すか、またはR1およびR2はセリンを表す)を少なくとも含むかまたはそれに相当する少なくとも1つのペプチドの、植物細胞用の細胞毒性剤としての使用。
【請求項１０】
ペプチドが除草剤として用いられることを特徴とする、請求項9に記載の使用。
【請求項１１】
アラビドプシス・タリアナのゲノムのデオキシリボ核酸以外の、請求項1〜5のいずれか1つに記載のペプチドの少なくとも1つをコードする少なくとも1つの配列を含むことを特徴とする、単離された天然または合成のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号20の配列(ここで、R3およびR4はシステインコドンを表すか、またはR3およびR4はセリンコドンを表す)を少なくとも含むことを特徴とする、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号20の配列(ここで、R3およびR4はシステインコドンを表すか、またはR3およびR4はセリンコドンを表す)に相当することを特徴とする、請求項11または12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項11〜13のいずれか1つに記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドと、少なくとも1つの適切な賦形剤とを含む組成物。
【請求項１５】
請求項11〜13に記載のポリヌクレオチドのいずれか1つを含むベクター。
【請求項１６】
プラスミドベクターであることを特徴とする請求項15に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項11〜13のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、または請求項15もしくは16のいずれか1つに記載のベクターの、請求項1〜5のいずれか1つに記載のペプチドを製造するための使用。
【請求項１８】
請求項11〜13のいずれか1つに記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、または請求項15もしくは16のいずれか1つに記載の少なくとも1つのベクターの、改変生物系の製造における使用。
【請求項１９】
その細胞の全部または一部が、請求項11〜13のいずれか1つに記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド、または請求項15もしくは16のいずれか1つに記載の少なくとも1つのベクターを含むことを特徴とするヒト以外のトランスジェニック生物。
【請求項２０】
植物であることを特徴とする請求項19に記載のトランスジェニック生物。
【請求項２１】
請求項1〜5のいずれか1つに記載のペプチドの少なくとも1つに指向されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
【請求項２２】
請求項1〜5のいずれか1つに記載のペプチドの少なくとも1つおよび／または請求項15もしくは16のいずれか1つに記載のベクターの1つ、および／または請求項11〜13のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項19〜20のいずれか1つに記載のトランスジェニック生物もしくは請求項6もしくは14に記載の組成物から選択される少なくとも1つの抗菌剤および／または細胞毒性剤と、植物とを適切な手段により接触させる、抗菌および／または細胞毒性処理の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌活性を有する、新規な単離された天然または合成ペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターで形質転換された微生物および細胞、その細胞の全てもしくは一部が該ベクターを含有し、そして／または発現するヒト以外のトランスジェニック生物、該ペプチドおよび該ポリヌクレオチドの特に植物の特異的抗菌剤としての使用、ならびに植物の抗菌処理の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術において、抗菌活性を有する植物由来のペプチドが知られている。この関係において、哺乳動物由来のデフェンシン類、セクロピン類、チオニン類、メリチン類、または昆虫から単離されたデフェンシン類、マゲイニン類、アッタシン類、ジプテリン(dipterin)類、ザーペシン(sapecin)類、カエルリン(caerulin)類、ゼノプシン類のような溶解活性を有するペプチドを挙げることができる。これらのペプチドのハイブリッドも同様に記載されている。
【０００３】
ウサギからのペプチドは、それらの抗菌活性について同様に記載されており、キチナーゼまたはβ-1,3-グルカナーゼのような加水分解活性を有するペプチドについても記載されている。
【０００４】
植物由来のペプチドのうちでは、米国特許第6,147,281号、米国特許第6,150,588号または米国特許第5,424,395に記載されたものを挙げることができる。
【０００５】
米国特許第6,147,281号は、オオムギの黄化させた葉に存在し、植物病原菌に対して抗菌活性を有するペプチドについて記載している。これらのペプチドは、特にコリネバクテリウム・セペドニカム(Corynebacterium sepedonicum)に対して活性を有する。
米国特許第6,150,588号は、植物病原菌に対して抗菌活性を有し、タラノキ属(Aralia)またはホウセンカ属(Impatiens)の液果から単離することができるペプチドについて記載している。
米国特許第5,424,395号は、植物病原菌に対する抗菌活性を有するマゲイニン2に由来するペプチドについて記載している。
【０００６】
植物中に通常存在し、かつ抗菌活性を有するペプチドは、病原性物質(pathogenic agent)に対する生物学的な戦いの剤の特に興味深いクラスを形成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
植物に関して特異的抗菌活性を有し得る植物由来の新規化合物を同定することにより、新規な生物農薬の開発を考えることができ、これは耐性が出現する場合に物質の貯蔵庫を構成する。本発明は、このような関係にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、驚くべき、そして予期せぬ方法で、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)において、特に植物の病原性物質に対して抗菌活性を有する特性を有するペプチドを単離した。その抗菌活性において、該ペプチドは少なくとも静菌作用または殺菌作用を有する。特に具体的には、該ペプチドは特定の種類の細菌、特に、例えばキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)またはエルウィニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)のような植物の病原性種への特異的抗菌活性を有する。
【０００９】
抗菌活性は、2つの別個の作用の形で示される。それらは、微生物を殺すことにある「殺菌性」(殺細菌性、殺ウイルス性または殺真菌性)阻害；および微生物の増殖能力を減少させるか、または阻害することにある「静菌性」(静細菌性、静ウイルス性または静真菌性)阻害である。
【００１０】
よって、本発明は、次の配列番号1〜配列番号10の配列の少なくともいずれか1つを含む、単離された天然または合成のペプチドに関する。
配列番号1：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1
配列番号2：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala
配列番号3：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe
【００１１】
配列番号4：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg
配列番号5：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu
配列番号6：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg
配列番号7：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu
配列番号8：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu-R2
【００１２】
配列番号9：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu-R2-His
配列番号10：Met-Trp-Trp-Leu-Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Leu-Ileu-His-Leu-R1-Ala-Phe-Arg-Glu-Arg-Leu-R2-His-Leu
(ここで、R1およびR2は独立してまたは同時にシステインもしくはセリンを表す)。
【００１３】
本発明によるペプチドは、少なくとも配列番号1の配列を含む。
本発明の有利な実施形態によると、該ペプチドは、上記で定義するような配列番号1〜配列番号10の配列のいずれか1つに相当する。
【００１４】
本明細書において、「単離された」とは、起源は何であってもよいがその起源を原料として少なくとも1つの富化(enrichment)工程を受けたいずれのペプチドをも意味すると解される。つまり、本発明は、本発明による少なくとも1つのペプチドを含む例えば植物または植物細胞の粗抽出物とともに、さらにより純粋な後者の形を包含する。
【００１５】
有利な方法において本発明によるペプチドは、植物(例えばアラビドプシス・タリアナ)から単離されるか、あるいは化学合成、または微生物、植物もしくは動物細胞、もしくは該ペプチドを通常は発現しない修飾生物さえも原料とするような生物工学的手法により得るかのいずれかであり得る。
【００１６】
また本発明は、その配列が、上記で定義されるような配列番号1〜配列番号10の配列の少なくとも1つと実質的に相同である単離されたペプチドに関する。
本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1〜配列番号10の配列の少なくとも1つのアミノ酸配列と少なくとも60％の類似性を有し、かつ該ペプチドがその当初の抗菌活性、特に植物の病原性微生物に関するその特異的活性を保持するときに、該ペプチドが実質的に相同な配列を有するとみなす。
【００１７】
ペプチドPと配列番号1〜10の配列との間の60％の類似性とは、2つのペプチドを並べたときに、Pのアミノ酸の60％が配列番号1〜10の配列の対応するアミノ酸と同一であるか、または同じ群のアミノ酸により置き換えられるという意味であると解される。
同じ群のアミノ酸とは、ほぼ同じ化学特性を有するアミノ酸を意味すると解される。具体的には、この用語はほぼ同じ電荷および／または同じサイズおよび／または同じ親水性もしくは疎水性および／または同じ芳香族性を有するアミノ酸を意味すると解される。
【００１８】
このようなアミノ酸の群は、特に：
(i)   グリシン、アラニン
(ii)  イソロイシン、ロイシン、バリン
(iii) トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン
(iv)  アスパラギン酸、グルタミン酸
(v)   アルギニン、リシン、ヒスチジン
(vi)  セリン、スレオニン
を含む。
【００１９】
他の置換も考えられ、ここでアミノ酸が、同等であるが天然のものではない別のアミノ酸(ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、シクロヘキシルアラニン、右旋性のアミノ酸など)で置換される。
【００２０】
本発明によるペプチドが上記の抗菌特性を有するという事実により、特に植物の病原性物質に指向された抗菌剤としてのその使用を考えることができる。より具体的には、本発明によるペプチドは、静菌剤または殺菌剤、より具体的にはキサントモナス・カンペストリス、シュードモナス・シリンゲまたはエルウィニア・アミロボーラの特異的抗菌剤として用いることができる。これにより、環境に対して二次的な毒性の影響を有さない生物農薬としてのその使用を考えることができる。
【００２１】
また本発明は、配列番号1〜配列番号10の配列の少なくともいずれか1つを含むか、またはそれに相当する単離されたペプチドの、特に植物の病原性物質に指向された抗菌剤としての使用に関する。
該使用の好ましい実施形態によると、本発明によるペプチドは静菌剤または殺菌剤、より具体的にはキサントモナス・カンペストリス、シュードモナス・シリンゲまたはエルウィニア・アミロボーラの特異的抗菌剤である。
【００２２】
本発明者らは、驚くべき方法で：
−配列番号1〜配列番号10の配列(ここで、R1はセリンを表す)の少なくともいずれか1つを含むかまたはそれに相当する本発明によるペプチドが、それらの抗菌活性を保持し；
−配列番号2〜配列番号10の配列(ここで、R1はシステインまたはセリンを表し、R2はシステインを表す)の少なくともいずれか1つを含むかまたはそれに相当する本発明によるペプチドが細胞毒性活性を有し；
【００２３】
−配列番号8〜配列番号10の配列(ここで、R1はシステインを表し、R2はセリンを表す)の少なくともいずれか1つを含むかまたはそれに相当する本発明によるペプチドが、抗菌活性は保持するが、その細胞毒性活性が大きく低下しているか、阻害されてさえおり；
−配列番号8〜10の配列(ここで、R1およびR2は同時にセリンを表す)の少なくともいずれか1つを含むかまたはそれに相当する本発明によるペプチドが細胞毒性活性を有する
ことを示している。
【００２４】
本発明によるペプチドの細胞毒性活性は、該ペプチドが配列番号1の配列だけを含むかまたはそれに相当するときに、失われる。
よって、本発明は、配列番号2〜配列番号10の配列(ここで、R1はシステインまたはセリンを表し、R2はシステインを表す)の少なくとも1つを含むかまたはそれに相当する少なくとも1つのペプチドの、あるいはそれが配列番号8〜配列番号10の配列(ここで、R1およびR2は同時にセリンを表す)の少なくとも1つを含むかまたはそれに相当するときの、細胞毒性剤、特に植物細胞用の細胞毒性剤としての使用にも関する。
【００２５】
本発明は、配列番号2〜配列番号10の配列(ここで、R1はシステインまたはセリンを表し、R2はシステインを表す)の少なくとも1つを含むかまたはそれに相当する本発明によるペプチドの、あるいはそれが配列番号8〜配列番号10の配列(ここで、R1およびR2は同時にセリンを表す)の少なくとも1つを含むかまたはそれに相当するときの、除草剤としての使用にも関する。
【００２６】
本発明は、本発明によるペプチドが配列番号8〜配列番号10の配列(ここで、R1はシステインを表し、R2はセリンを表す)の少なくとも1つを含むかまたはそれに相当するときの該ペプチドの、非細胞毒性抗菌剤、特に植物の病原性物質に指向された非細胞毒性抗菌剤としての使用にも関する。
【００２７】
有利な方法において、本発明によるペプチドのカルボキシ官能基および遊離のアミンは、保護できる。
通常の保護基は周知である。例えば、本発明によるペプチドは、その配列が配列番号1〜配列番号10の配列の少なくとも1つに実質的に相同であり、および／または、分子内に存在するN-末端アミン基および任意に分子内のその他のアミン基が、アシル化(例えばアセチル化)された形であるペプチドであり得る。より一般的には、本発明は、有機カルボキシル塩および酢酸塩とのペプチドの付加塩だけでなく、その他の付加塩、例えばトリフルオロ酢酸塩、ならびに硫酸塩、塩酸塩などのような無機塩とのペプチドの付加塩を含む。本発明は、カルボキシ基の塩化により得られる塩、特にナトリウム塩もしくはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩も含む。
【００２８】
本発明は、上記のような配列番号1〜配列番号10の配列の少なくともいずれか1つを含むかまたはそれに相当する少なくとも1つのペプチドと、少なくとも1つの適切な賦形剤とを含む組成物にも関する。
本発明による組成物は栄養上、医薬上もしくは獣医学上の使用のための組成物(抗菌または防腐組成物)、またはもちろん農業上の使用のための組成物(生物農薬および／または除草剤)でさえあり得る。
【００２９】
本発明は、アラビドプシス・タリアナのゲノムのデオキシリボ核酸(DNA)以外の、本発明によるペプチドの少なくとも1つをコードする少なくとも1つの配列を含むことを特徴とする、単離された天然または合成のポリヌクレオチドにも関する。
該ポリヌクレオチドの有利な実施形態によると、該ポリヌクレオチドは次の配列番号11〜配列番号20の配列の少なくとも1つを含む。
配列番号11：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3
配列番号12：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA
【００３０】
配列番号13：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT
配列番号14：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA
配列番号15：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG
配列番号16：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT
配列番号17：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC
【００３１】
配列番号18：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC R4
配列番号19：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC R4 CAT
配列番号20：ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC R4 CAT CTC
(ここで、R3およびR4は独立してまたは同時にシステインコドンもしくはセリンコドンを表す)。
【００３２】
この実施形態の有利な計画によると、本発明によるポリヌクレオチドは配列番号11〜配列番号20の配列(ここで、R3およびR4は、システインコドンまたはセリンコドンを表す)の1つに相当する。
【００３３】
本発明によるポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖デオキシリボ核酸(DNA)もしくはリボ核酸(RNA)の形であり得る。
本発明によるポリヌクレオチドは、本発明によるペプチドのいずれの1つの配列から導き出して、DNA合成装置を用いて合成することができる。該ポリヌクレオチドは、DNAバンク、特に植物細胞のDNAバンク、さらに具体的にはアラビドプシス・タリアナの細胞のDNAバンクから得ることもできる。
【００３４】
本発明は、適切な媒体中に、上記のような少なくとも1つのポリヌクレオチドと、少なくとも1つの適切な賦形剤とを含む組成物にも関する。
【００３５】
本発明によるペプチドの発現のために、ポリヌクレオチドを適切なベクター内に有利に導入することができる。
用いられるベクターは、従来技術により知られているいずれのベクターでもあることができる。特に、本発明により用いることができるベクターとしては、プラスミド、ウイルスまたはバクテリオファージを挙げることができる。
【００３６】
本発明により用いることができるプラスミドのうち、R. L. RodriguezおよびD. T. Denhardt (A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses、Butterworths、Boston、1998)またはJ. Sambrookら(Molecular cloning、Cold Spring Arbor、2001)により記載されるものを挙げることができる。
特に、Amershamにより販売されるベクターpMOSBlue(登録商標)、Promegaにより販売されるベクターpGEM(登録商標)-TおよびpGEM(登録商標)-Tイージー、またはアグロバクテリウム(Agrobacterium) Tiタイプのプラスミド(H. De Greveら、J. Mol. Appl. Genet.、1 (1982)、499〜511)を有利に用いることができる。
【００３７】
上記のベクターは、ベクターの複製および／またはポリヌクレオチドによりエンコードされるペプチドの発現に必要な全ての調節配列(プロモーター、終結部位など)をさらに含み得る。
特に好ましい構築物において、本発明によるポリヌクレオチドは誘導プロモーターの支配下に位置する。これにより、ペプチドの合成が、予め定義される条件、例えば環境条件や、病原性物質または化学薬品の存在に依存することになる。
【００３８】
本発明は、配列番号11〜配列番号20 (ここで、R3およびR4は独立してまたは同時に、システインコドンまたはセリンコドンを表す)の少なくとも1つを含むかまたはそれに相当する上記のようなポリヌクレオチドのいずれか1つを含むベクターにも関する。
【００３９】
さらに本発明は、上記のようなポリヌクレオチドまたはベクターの、本発明によるペプチドを製造するための使用に関する。
【００４０】
本発明は、本発明による少なくとも1つのポリヌクレオチドまたは本発明の少なくとも1つのベクターが導入された修飾生物系にも関する。
このような生物系は、例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)のような細菌のような微生物；国際出願WO 90/13224号、WO 91/10363号、WO 87/03303号、WO 94/16076号または欧州特許出願第125468号に記載されるもののような内部寄生性植物；サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母；例えば昆虫細胞、動物細胞もしくは植物細胞のような細胞であり得る。
【００４１】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチドおよび／または本発明のベクターの、修飾生物系の製造のための使用にも関し、ここで該生物系は微生物、内部寄生性植物、酵母または真核細胞であり得る。
【００４２】
本発明は、上記のような少なくとも1つの生物系と、少なくとも1つの適切な賦形剤とを含む組成物にも関する。
【００４３】
本発明は、上記のような少なくとも1つの修飾生物系、または上記のような少なくとも1つの生物系を含む組成物の、特に植物の病原性物質に指向された抗菌剤および／または細胞毒性剤としての使用にも関する。
修飾生物系は、さらに、任意に培地中への本発明によるペプチドの分泌を許容することができ、これによりその抽出および精製がより容易になる。
【００４４】
本発明によるポリヌクレオチドおよび／またはベクターの宿主修飾生物系への導入は、例えばトランスフェクション、インフェクション、融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションもしくはバイオリスティクスのようないずれの既知の方法により行うことができる。
【００４５】
本発明は、その細胞の全部または一部が、本発明によるポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを、遊離もしくは組み込まれた形で含むヒト以外のトランスジェニック生物にも関する。
特に、本発明のトランスジェニック生物はトランスジェニック植物である。
【００４６】
トランスジェニック植物はいずれの植物種に属することもでき、特にキサントモナス・カンペストリスおよび／またはシュードモナス・シリンゲおよび／またはエルウィニア・アミロボーラが感染し得る植物種に属することができる。
キサントモナス・カンペストリスについては、例えばキャベツ、ムラサキウマゴヤシ(lucerne)、ダイズ、綿、エンドウマメまたはグレン；エルウィニア・アミロボーラについては洋ナシの木、リンゴの木またはジャガイモ；シュードモナス・シリンゲについてはバナナ、コムギまたはミカン科(Citrus family)の植物を挙げることができる。
【００４７】
本発明のトランスジェニック生物、特にトランスジェニック植物は、本発明によるペプチドを発現するときに、病原体、特に植物病原体、より具体的にはキサントモナス・カンペストリスおよび／またはシュードモナス・シリンゲおよび／またはエルウィニア・アミロボーラに対する耐性が向上する。
【００４８】
よって本発明は、病原体、特に植物病原体、より具体的にはキサントモナス・カンペストリスおよび／またはシュードモナス・シリンゲおよび／またはエルウィニア・アミロボーラに対する耐性が向上したヒト以外のトランスジェニック生物、特にトランスジェニック植物にも関する。
本発明のトランスジェニック生物の製造には、トランスジェニック生物のいずれの製造方法、特に植物に適用される方法を用いることができる。
この関係において、Plant Gene Transfer and Expression Protocols - Methods in Molecular Biology (Humana Press、H. Jones編、1995、49：39〜48)に記載される方法、またはPlant Cell Electroporation and Electrofusion Protocols - Methods in Molecular Biology (Humana Press、J. A. Nickoloff編、1995、55、89〜108)のP. Galloisらにより記載される方法を挙げることができる。
【００４９】
本発明のトランスジェニック生物の利点は、これらが本発明の抗菌ペプチドを構成的な様式で発現することにある。
【００５０】
本発明は、本発明によるペプチドの少なくとも1つに指向されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体にも関する。
従来技術により知られる抗体のいずれの製造法も、本発明の抗体を得るために用い得る。
【００５１】
さらに本発明は、第一の工程において上記のペプチドを含み得る媒質と本発明による抗体とを接触させ、第二の工程において抗体とペプチドとにより形成される複合体を検出することを特徴とする、本発明によるポリペプチドを検出する方法に関する。この方法は、特定の環境における生物農薬の痕跡の検出のために特に興味深い。
【００５２】
本発明は、生物、特に植物と、上記のようなペプチドの少なくとも1つおよび／またはベクターの1つおよび／またはポリヌクレオチドの1つおよび／または生物系の1つおよび／または上記の組成物から選択される少なくとも1つの抗菌剤および／または細胞毒性剤とをいずれの適切な手段(適用、拡散、噴霧など)により接触させる、抗菌および／または細胞毒性処理の方法にも関する。
【００５３】
農業において、本発明の処理方法は、例えば原野における外部適用による伝統的な様式で、例えば本発明の液体組成物の噴霧もしくは拡散により、種子コーティング(seed coating)添加物中に、またはトランスジェニック植物のストラテジーでのような、農業において用いられるいずれの形によっても適用することができる。
【００５４】
上記の計画の他に、本発明は、本発明の実施例および添付の図面について言及する以下の記載から明らかになるその他の計画も含む。ここで：
−図1は、アラビドプシス・タリアナの若い長角果のRNAから得られる相補的DNAのPCR増幅の間に得られる結果を示す。
−図2は、転写産物SUP25の機能的開始コドン(ATG)を示すために行われた試験の結果を示す。パネル2Aにおいて、矢印はATGの位置を示し、八角形は停止コドンの位置を示す。
【００５５】
−図3は、配列番号1の配列に相当する16アミノ酸のペプチド(SUP16)、および配列番号10の配列に相当する25アミノ酸のペプチド(SUP25)の植物毒性試験の結果を示す。
−図4は、配列番号10の配列に相当する25アミノ酸のペプチドの細胞毒性活性についての最適濃度を決定するために行われた試験の結果を示す。
−図5Aおよび5Bは、ペプチドの異なる変形にさらしたプロトプラストについてのTUNEL標識試験の結果を示す。
【実施例】
【００５６】
次の実施例は、本発明を説明するものであって限定するものではない。
実施例1：材料および方法
1) 命名法：
SUP25およびpep25は、配列番号10の配列に相当する25アミノ酸のペプチドを表す。
SUP16およびpep16は、配列番号1の配列に相当する16アミノ酸のペプチドを表す。
PepDSは、アミノ酸4〜15を除いたSUP25ペプチドを表す。
Pep1Sは、23の位置のシステインをセリンで置換したSUP 25ペプチドを表す。
Pep2Sは、16および23の位置のシステインをセリンで置換したSUP 25ペプチドを表す。
【００５７】
2) 植物材料
全ての実験を、アラビドプシス・タリアナについて行った。2つの野生型の生体型を用いた。
★植物体内での(in planta)方法による形質転換の全てについてコロンビア(Columbia) (Col-0)。
★プロモータートラップの構築に用いた生態型C24。
【００５８】
3) 細菌材料
エシェリヒア・コリ： DH5ct株
キサントモナス・カンペストリス  ピーブイ  カンペストリス：8004株
シュードモナス・シリンゲ  ピーブイ  トマト：DC3000株
エルウィニア・アミロボーラ：1430株
【００５９】
4) 核酸材料
4. 1. プラスミド
4.1.a. PCR断片および消化産物のクローニングプラスミド
「TAクローニング」の原理を用いることによりPCR断片をクローニングするのに用いたプラスミドは、Amershamにより販売されるpMOSBlue(登録商標)、Promegaにより販売されるベクターpGEM(登録商標)-TおよびpGEM(登録商標)-Tイージーである。これらの3種のベクターは、これらを有する細菌にアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。さらに、これらは挿入物を有効に組み込んだプラスミドの選択を許容する遺伝子lacZを有する。これらの宿主は、細菌イー・コリ(DH5α)である。それら自身で閉じたこれらと同じプラスミド、またはベクターpBluescript II SK(登録商標) (pBSK、Stratagene)を、消化産物のクローニングに用いた。
【００６０】
4.1.b. 一過性形質転換ベクターとして用いられるクローニングプラスミド：
上記の全てのプラスミドは、一過性発現ベクターとして用いることができる。
★翻訳での融合のために用いたプラスミドは、pRTL2-EGFP (Restrepo A、Freed DD、Carrington JC.、Nuclear transport of plant polyviral proteins. Plant Cell. 1990 Oct.; 2(10)：987〜98)であった。
★タンパク質SUP25のセンスおよびアンチセンス発現カセットの構築のために、遺伝子またはアンチセンス遺伝子のPCR増幅を、プライマーpepS-3XおよびpepS-5H、またはpepAS-5SおよびpepAS-3Hを用いて行う。増幅断片をpGEM(登録商標)-Tにクローニングし、挿入物を制限酵素NcoIおよびNotIで切り出し、次いで同じ酵素により線状化したpRTL2-EGFPに挿入してアガロースゲル上で精製する。
【００６１】
4.2. オリゴヌクレオチド
用いるプライマーの配列を次に示す。
【００６２】
【表１】
0004445855.tif 000002
【００６３】
T7、T3、T7 term、SP6およびU19のような他の市販のプライマーを、クローニング実験において日常的に用いた。
【００６４】
5) 培地および溶液
5.1. 植物用培地
MS発芽培地：ビタミンB5 (Duchefa) 2.2 g/lを含むムラシゲおよびスクーグ培地；MES (Sigma) 0.5 g/l；グルコース5 g/l；1M KOHを用いてPH 5.7にする；植物用アガー7 g/l (Duchefa)。
【００６５】
5.2. 選択培地：
抗生物質：
カナマイシン：50 mg/l. (nptII遺伝子のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を選択する)。
ハイグロマイシン：30 mg/l. (hpt遺伝子のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を選択する)。
メトトレキサート：0.1 mg/l (dhfr遺伝子のジヒドロフォレートレダクターゼ活性を選択する)。
【００６６】
5.3. エシェリヒア・コリの培地：
液体LB (Luria-Bertani)培地：酵母エキス5 g/l；バクトトリプトン10 g/l；NaCl 10 g/l。
液体2XL培地：酵母エキス10 g/l；バクトトリプトン20 g/l；NaCl 1 g/l；グルコース2 g/l。
液体テリフィックブロス培地：酵母エキス24 g/l；バクトトリプトン12 g/l；グリセロール4 ml/l；KH2PO4 4.62 g/l；K2HPO4 25.08 g/l。
【００６７】
固体培地：液体培地と同じ + 15 g/l バクトアガー (Difco)。
イー・コリ用の抗生物質：アンピシリン：100 mg/l；カナマイシン：50 mg/l；クロラムフェニコール (エタノール中のストック)：12.5 mg/l。
【００６８】
5.4. 溶液およびバッファー：
5.4.a. 核酸に関するバッファー
抽出：
植物ゲノムDNA抽出バッファー：
デラポルタ(Dellaporta)法：Tris HCl (pH 8) 100 mM；EDTA (pH 8) 50 mM；NaCl 0.5 M；β-メルカプトエタノール 10 mM。
植物RNA抽出バッファー(REB)：Tris HCl (pH 8) 25 mM；EDTA (pH 8) 25 mM；NaCl 75 mM；SDS 1%。
TEバッファー：Tris HCl (pH 8) 10 mM；EDTA (pH 8) 2 mM。
【００６９】
5.4.b. アガロースゲルでの電気泳動に関するバッファー：
★DNAゲル
TBEバッファー：Tris HCl 89 mM；ホウ酸89 mM；EDTA (pH 8) 2 mM。
TAEバッファー：Tris HCl 40 mM；酢酸40 mM；EDTA (pH 8) 1 mM。
10×DNAローディングバッファー：キシレンシアノールFF 0.25%；ブロモフェノールブルー0.25%；グリセロール 30%。
【００７０】
★RNAゲル
5×MOPSバッファー：MOPS 0.1 M；酢酸ナトリウム 40 mM；EDTA (pH 8) 5 mM。
RNAローディングバッファー、サンプル当たり：5×MOPSバッファー 2μl；ホルムアルデヒド 3.5μl；ホルムアミド 10μl；1 mg/mlまでエチジウムブロマイド(BEt) 0.2μl。
【００７１】
5.4.c.サザンブロットタイプのハイブリダイゼーションに関するバッファー
脱プリン化バッファー：HCl 0.25 N。
変性バッファー：NaOH 0.5 N - NaCl 1.5 M。
20×SSC：NaCl 3 M；クエン酸ナトリウム 0.3 M。
20×SSPE：NaCl 3.6 M；NaH2PO4 0.2 M；EDTA (pH 7.7) 0.02 M。
【００７２】
デンハルト50×：フィコール(商標) 10 g/l；PVP (ポリビニルピロリドン) 10 g/l；BSA 10 g/l。
ハイブリダイゼーションバッファー：EDTA 10 mM；6×SSPE；SDS 0.5%；デンハルト5×。
洗浄バッファー I：2×SSC；SDS 0.1%。
洗浄バッファー II：1×SSC；SDS 0.1%。
【００７３】
5.4.d. GUS酵素活性の研究に関するバッファー
★組織化学
GUS着色バッファー：KH2PO4 40 mM；KHPO4 60 mM、1 mg/mlのジメチルホルムアミド(DMF)中の溶液の5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルグルクロニド(X-gluc、Biosynth AG、Switzerland)；アジ化ナトリウム 0.02%；NaCl 50 mM；フェリシアン化ナトリウム 0.5 mM；フェロシアン化ナトリウム 0.5 mM；トリトン X 100 0.1% (v/v)。
★分光光度法
GUSまたはGFP抽出バッファー：Tris HCl (pH 7) 50 mM；SDS 0.1%；EDTA 10 mM；ジチオスレイトール (DTT) 3 mM。
【００７４】
5.4.e.タンパク質のイムノインプリントのためのバッファー
イムノインプリントのための抽出バッファー：Tris HCl (pH 8.3) 10 mM；NaCl 10 mM。
アクリルアミドゲルでのローディングバッファー：Tris HCl (pH 6.8) 125 mM；SDS 4 %；グリセロール10%；DTT 0.2 M；ブロモフェノールブルー 0.2%。
クマシーブルー染色：クマシーブルーR250 0.5 g/200 ml；90% エタノール；10% 酢酸。
脱色溶液：10% エタノール；10% 酢酸；3.5% グリセロール。
【００７５】
トランスファーバッファー：トリスベース20 mM；グリシン150 mM；20% メタノール(v/v)。
TBS：トリスベース2.42 g/l；NaCl 8 g/l；pH 7.6に調整。
TRS-T：TBS + 0.1% Tween 20。
スキムミルク。
【００７６】
6) 方法：
6.1) 植物生理学の方法
6.1.1) 培養条件
★土培養
土培養は、125℃で20分間オートクレーブすることにより滅菌した園芸用コンポストおよびバーミキュライトの混合物で行った。植物を培養チャンバにて20〜22℃で不断の光の下に培養した。
【００７７】
★インビトロ培養
インビトロ培養のために、種子を、ラミナーフローフードの下で、蒸留水中の10% (v/v)の滅菌製品(Domestos、Unilever)中で10分間インキュベーションすることにより滅菌した。次いでこれらを滅菌蒸留水中に5回リンスする。次いで種子を抗生物質を含むかまたは含まないMS寒天培地を含むペトリ皿(20×100 mm)中で発芽させる。植物を培養チャンバ中で、20〜22℃で不断の日光の下に培養した。
【００７８】
6.2) 分子生物学の方法
6.2.1) DNA操作
6.2.1.A) 抽出方法
★プラスミドDNA
細菌のプラスミドDNAを、アルカリ溶解法に従って抽出し、必要なプラスミドの量により2つの異なるキットを用いて精製した。Boehringer Mannheimのキット"High Pure Plasmid Isolation Kit"は、飽和培養物(イー・コリDH5α株) 5 mlからのプラスミド(約20μg)のミニ調製を行うために用いた。このキットは、DNAを保持するためにシリコーンカラムを用いる。Promegaのキット"Wizard (登録商標) Plus Midiprep DNA Purification System"は、飽和培養物(イー・コリDH5α株) 50 mlからのより多量のプラスミド(多コピーのプラスミドについて約100μg)を抽出するために用いた。このキットは、DNAを保持するために、グアニジン塩酸塩のカラムを用いる。
【００７９】
★ゲノムDNA
デラポルタ法：この方法は、トランスジェニック植物のPCR確認を目的とするゲノムDNAの多数のバッチを迅速かつ容易に抽出するために用いた。Dellaporta (Dellaportaら、PMB、1983、1、19〜21)により記載されたこの方法は、500μlチューブで実現可能なようにより小さい容量に適合させた。各抽出物は、アラビドプシス・タリアナの単一植物の2〜4枚の葉(サイズにより)から得た。
【００８０】
6.2.1.b) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)：
★抽出後、プラスミドまたはゲノムDNAに対して：
反応を500μlのチューブ内で最終容量25μlで行う。
「ミックス」：すべてPCR反応のために調製された次の成分の混合物；
2つの特異的オリゴヌクレオチドのそれぞれ10 pmol、
各dNTP 11μM
ポリメラーゼを販売する会社により供給された10×バッファー2.5μl
1.25 mMのMgCl2 (または用いる酵素によりMgSO4)、
熱安定性DNAポリメラーゼ1ユニット、
鋳型(matrix) DNA (用いられるポリメラーゼおよび鋳型DNAのタイプの関数(function))、
25μl (qsp)までの滅菌脱イオン水。
【００８１】
鋳型のものと厳密に同一の配列産物を得る必要がない通常のPCR反応のために、熱安定性DNAポリメラーゼDynazyme (Ozyme)、Taq (Promega)およびTfl (Promega)を用いた。
この場合、プラスミドDNA 5 ngまたはゲノムDNA 200 ngが、実験を行うのに充分である。
【００８２】
鋳型のものと同じ配列の増幅断片を得るために、正確な(fidelity)酵素Pfu (Stratagene)を用いた。この酵素はより多量の鋳型を必要とする。供給業者の推奨により、通常、100〜150 ngのプラスミドを用いた。ゲノムDNAの鋳型の場合、500〜1000 ngを用いた。
【００８３】
最後に、2 kbより大きいサイズのPCR産物が予想される場合は、PfuTurbo (商標) (Stratagene)を選択した。用いた鋳型DNAの量は、プラスミドDNAについては10 ngからで、ゲノムDNAについては約500 ngであった。
【００８４】
反応条件は：
変性  93℃、3分
変性  93℃、1分
ハイブリダイゼーション  48〜55℃の間、1分
伸長  72℃、変動可能**
最終伸長    72℃、10分
**プライマー対により変動可能
TflおよびPfuTurbo(商標)：1分/増幅されるkb
Pfu：2〜3分/増幅されるkb
【００８５】
PCRサイクルの数nは、Dynazyme (Ozyme)、Taq (Promega)およびTfl (Promega)での運転に導く反応については30〜40の間である。正確な酵素を用いて行われる反応については、サイクルの数は、エラーを制限するために、より少ない(25まで)。
【００８６】
★細菌細胞内に含まれるプラスミドDNA
プラスミド配列の増幅を、細菌のコロニーを原料として直接行うことができ、これは(目的の挿入を含むプラスミドを有効に結合した)組換え細菌についての対応するコロニーを探索するためである。PCR「ミックス」(上記と同じ組成)を調製し、いくつかの500μlチューブに25μlを分配する。用いる酵素はDynazyme (Ozyme)、Taq (Promega)またはTfl (Promega)である。
【００８７】
コロニーを、いずれの適切な選択手段(コーン(cone)、拡大鏡など)を用いて固体培地の表面から選択し、固体LB培地を含む新しい皿に移し、そして選択手段を「ミックス」中に浸して少し攪拌する。
PCR条件は、上記と同じである。
全ての場合において、10×DNAローディングバッファー1μlを添加したPCR産物10μlをアガロースゲルに入れる(観察する増幅断片のサイズの関数としてアガロースのパーセンテージは変動可能、TBEバッファー)。
【００８８】
6.2.1.c) クローニング方法：
分子クローニングは、クローニングされる断片の単離(制限エンドヌクレアーゼの作用の後かまたは作用なしに−「TAクローニング」型のベクターに直接クローニングするPCR産物の場合−)、クローニングベクターの開裂(「TAクローニング」型のベクターの場合を除く)、これらの2つの要素のライゲーション、および新規な構築物の、その細菌細胞への導入後の増幅を含む種々の工程を経る。
【００８９】
★組換えプラスミドの創作
・制限または消化酵素による加水分解：
制限酵素は、供給業者により推奨される条件下で用いる。用いる酵素の容量は、消化反応の最終容量の多くて10％までに相当する。
【００９０】
・消化後の末端の脱リン酸化：
脱リン酸化のストラテジーは、単一の制限酵素で消化したベクターがそれ自身で閉じることを防ぐために必要であった場合に用いる。この場合、Boehringer Mannheimのアルカリホスファターゼを供給業者の推奨に従って用いた。
【００９１】
・DNA断片の精製
DNA断片の精製は、場合に応じて３種の異なる方法で行った：
透析
DNAの脱塩のみが問題である場合(例えば制限エンドヌクレアーゼの作用後)、事例および処理される容量に応じて、単純なMilliporeメンブレン「スピンカラム」 (Sephadex G-50)、またはエタノール沈殿およびその後の得られた沈殿の70％エタノールを用いる洗浄を行った。
【００９２】
フェノール/クロロホルム
より塩が多く、タンパク質(制限酵素またはアルカリホスファターゼ)の除去が必要であることが明らかな場合、フェノール/クロロホルム混液による精製と、それに続くエタノール沈殿を行った。
アガロースゲルを原料として
目的のDNA断片をその他の混入DNA断片から分離するために、アガロースゲルでの電気泳動(TAEバッファー)を行った。次いで目的の断片を、ゲルからQiagenのキット"QIAQuick Gel Extraction Kit"またはPromegaの"Wizard(登録商標) PCR Prep"を用いて抽出した。DNAを含むアガロースの一片を加熱により液体にし、次いでDNAを固定化するカラムを通過させる。一連の洗浄の後、DNAを水で溶出し、次いでベクターへのクローニングに直接用いることができる。
【００９３】
・挿入およびベクターのライゲーション
組み込まれるDNA断片とクローニングベクターとの悪影響を及ぼさない部位でのライゲーションを、T4ファージのDNAリガーゼ1ユニット (PromegaまたはBoehringer Mannheim)の存在下に、特に16℃で一晩、または周囲温度で2〜4時間行った。用いるDNAの総量は、最終容量10〜20μl 中に200 ng〜500 ngの間、ベクターと挿入との間のモル比に関しては1:3〜1:5であり、供給業者の推奨する条件に相当する。
【００９４】
・アダプターのライゲーション
所望の付着末端を残して組み合わせるために、オリゴヌクレオチドを選択する。オリゴヌクレオチドを、tfl 1×バッファー10μl中に1 pmol/μlでハイブリダイズさせる。これらを95℃で1分間、次いで45℃で10分間インキュベートする。次にオリゴヌクレオチド20 ng (最大容量2μl中に)およびベクター100 ngを、ライゲーション反応物中に導入する。
【００９５】
★PCR産物の直接クローニングの特別な場合
PCRにより得られた産物を直接クローニングする特別な場合に、二本鎖DNAの3'末端に時々アデノシンを付加する特性を有する酵素であるDynazyme (Ozyme)、Taq (Promega)またはTfl (Promega)を用いる。この特性を利用するライゲーション系を発展させる：これらは、pMOSBlue (登録商標) (Amersham)、pGEM (登録商標)-TおよびpGEM (登録商標)-T イージー (Promega)システムであり、酵素EcoRVにより消化して平滑末端を発生し、ベクターの3'末端にチミジンを付加したベクターを用いる。つまり、アガロースゲルから精製したPCR産物とベクターとの間の結合は、いわゆる「TAクローニング」の原理を用いる。ライゲーション反応は10μl中にキットに供給されるリガーゼを用いて、製造業者の使用説明に従って行う。
【００９６】
正確な酵素であるPfuまたはPfuTurbo (商標) (Stratagene) (これは増幅DNAの3'末端に再びアデノシンを付加しない)を用いる必要がある場合、「A-テイリング」の手法を用いた：これは、得られるPCR産物3μlを採取し、10×バッファー1μl、25 mMのMgSO4 1μl、2 mMのdATP 1 μl、Tfl (5ユニット/μl) 1μlおよび脱イオン滅菌水3μlに再び添加する。全体を70℃で30分間インキュベートし、次いで脱イオン滅菌水に対して周囲温度で1時間透析する。このようにして調製した断片は、「TAクローニング」ベクターでのライゲーション反応のために直接使用するために準備ができている。
【００９７】
★コンピテント細菌の調製および形質転換
プラスミドは、Sambrookら(Molecular cloning：a laboratory manual、第2版、1989)により記載されるプロトコルに従う熱ショックにより取り込まれる。
次いで組換え細菌は、ベクターおよび／または挿入に存在するプライマーを用いるPCR増幅により、上記のプロトコルに従って検出される。
【００９８】
6.2.1.d) シーケンシング：
シーケンス反応を、異なる蛍光色素によりそれぞれ標識したジデオキシヌクレオチドの存在下で、鎖伸長終結法(Sangerら、PNAS、74、5463〜5467、1977)により行った(PRISM Read Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit、Applied Biosystems)。各反応は、二本鎖鋳型DNA 250 ngおよびプライマー5 pmolを、4倍希釈のDye Deoxy Terminator混合物4μlを含む最終容量10μl中に必要とする。反応産物を、AB1377Aシーケンサーを用いる電気泳動により分析した。
【００９９】
6.2.1.e) サザンブロットタイプのハイブリダイゼーション
★放射性プローブの調製
サザンブロットタイプのハイブリダイゼーション実験に用いるプローブを、リン32 (32P)でPCR法により標識した：これは、α32P-dCTP (3000 Ci/mmol)を取り込むことにある。PCRによる標識は、次のようにして行う：最終容量25μlの反応混合物は、プローブを含むプラスミド2 ng、各特異的プライマー2 pmol、α32P-dCTP 50μCi、冷dCTP 3.6μM、その他の冷dNTP 60μM、およびTfl (5ユニット/μl) 1μlを含む。PCR反応を上記のようにして行い、20〜25サイクルを含む。
【０１００】
得られるプローブの質を、ナイロンメンブレン上にトランスファーして放射線フィルムに2分間露光させたアガロースゲルで試験する。
次いで、放射性プローブを、用いる前にMicroSpin7m G25 Columns (Amersham)の系を用いてカラム上で精製する。
【０１０１】
6.2.2) RNA操作：
6.2.2.a) 抽出方法
全RNAを、アラビドプシス・タリアナの種々の組織から、REB抽出バッファー を用い、Kayら(Science、236、1299〜1302、1987)のプロトコルに従って抽出した。ポリA+ RNAを、polyAtractキット(Promega)を用いて、供給業者の指示に従って得る。
【０１０２】
6.2.2.b) RNAのハイブリダイゼーション：ノザンブロット
★放射性プローブの調製
ノザンブロットタイプのハイブリダイゼーション実験に用いるプローブは、上記のようなPCR法によりリン32を用いて標識した。
【０１０３】
★ゲル、メンブレンへのトランスファーおよびハイブリダイゼーション
容量4.5μl中の50μgまでの全RNAを、15.5μlのローディングバッファーに添加し、次いで65℃で5分間変性させた。これらを1%のアガロースゲル (1×MOPSバッファー、2.2 M ホルムアルデヒド)に入れ、1×MOPSバッファー (125 Vで5分、次いで75 Vで2時間30分)中の電気泳動により分離した。RNAを、異なるトラック間で同じローディングであることを確かめるために、エチジウムブロマイドで染色した。ゲルを洗浄バッファー中で15分間、2回経過した後、RNAをナイロンメンブレン(Hybond N+メンブレン、Amersham)に一晩、毛細管現象(Sambrookら、Molecular cloning：a laboratory manual、第2版、1989)により、SSC 20×の溶液の存在下にトランスファーさせた。RNAをメンブレンに80℃で2時間のインキュベーションにより固定した。プレハイブリダイゼーションを、変性仔ウシ胸腺DNA 20 mg/l を含むハイブリダイゼーションバッファー25 mlまたは50 ml (メンブレンのサイズにより)中で行った。65℃で30分〜2時間のプレハイブリダイゼーションの後、変性DNAプローブを、65℃で16時間のインキュベーションのためのバッファーに添加した。ついでメンブレンを65℃で20分間、2回、洗浄バッファー Iで洗浄する。次いで、最後の洗浄を65℃で最大10分間バッファー IIを用いて行う。ハイブリダイゼーションシグナルを、BIOMAXTmフィルム(Kodak)の露光またはPhosphorimager (Storm 640、Molecular Dynamics)でのイメージ解析のいずれかにより検出した。連続するハイブリダイゼーションのために、メンブレンをAmershamのマニュアルに記載の推奨に従って脱ハイブリダイゼーションした。
【０１０４】
6.2.2.c) RT-PCR法
逆転写によるPCRアプローチは、本研究において、若い長角果における、標識DNA領域に対応する転写産物を探索するために用いられる。この方法を2つの連続する工程に分ける：全RNAからの相補的DNA (cDNA)の取得、および正確に言えばこれらのcDNAからのPCR反応である。
【０１０５】
★cDNAの取得
逆転写反応を、キットProSTARTulirst-Strand RT-PCR Kit (Stratagene)を用いて、(ゲノムDNAによる将来のcDNAの汚染を制限するように) DNase 1で処理した全RNAから行った。このキットは、モロニーマウス白血病ウイルス(MuMLV)の逆転写酵素およびオリゴdTプライマーを用いる。
【０１０６】
★cDNAについてのPCR
逆転写産物を、PCRの鋳型として用いる。条件は上記と同様である(PCRに関する段落を参照されたい)。唯一の違いは、最終反応容量(50μl)およびより多いサイクル数(場合により30〜45サイクル)である。
【０１０７】
実施例2：SUP25転写産物の証明：
1) SUP25タンパク質に対応するメッセンジャーの証明：
1.1) アラビドプシス・タリアナのRNAの抽出：
アラビドプシス・タリアナの種々の組織から、REB抽出バッファーを用いて、Kayら(Science、1987、239：1299〜1302)のプロトコルに従って全RNAを抽出した。ポリA+ RNAを、polyAtractキット(Promega)を用いることにより、供給業者の使用説明書に従って得た。
【０１０８】
1.2) ノザンタイプのハイブリダイゼーション
ノザンタイプのハイブリダイゼーションの通常の方法では、示されることとなるタンパク質SUP25に対応するメッセンジャーは、アラビドプシス・タリアナの未成熟の長角果の抽出物中に存在することを許容しなかった(Varoquaux、thesis、University of Perpignan、France、2000)。
よって、対応する天然の遺伝子の発現レベルは、方法の検出閾値より低いと考えられる。
【０１０９】
実験の感度を向上させるために、遺伝子の発現をポリA+ RNA抽出物を用いるポリアクリルアミドゲルでのノザン法により分析した。4μgの抽出物についてハイブリダイゼーションシグナルを検出できなかったことが、遺伝子の発現がないか、または非常に弱いことを証明した。
【０１１０】
1.3) 逆転写によるポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)：
アラビドプシス・タリアナの若い長角果中のシグナルを探索するために、逆転写RT-PCR法を用いる。
実験は2工程で行う：長角果の全RNAの逆転写を行い、続いてこのようにして得られるポリA+ cDNAのPCRを行う。
【０１１１】
1.3.a) 相補的DNA (cDNA)の取得：
逆転写反応を、キットProSTARTulirst-Strand RT-PCR Kit (Stratagene)を用いて、(ゲノムDNAによる将来のcDNAの汚染を制限するように) DNase 1で処理した全RNA 10μgを原料として行った。このキットは、モロニーマウス白血病ウイルス(MuMLV)の逆転写酵素およびオリゴdTプライマーを用いる。
【０１１２】
1.3.b)      cDNAsのPCR：
選択したプライマーの2対 (05、Pend3)および(15、Pend3)を、図1Aに示す。
ゲノムDNAでの増幅 (図1B、DNAgのトラック05および15)は、反応産物のサイズを示し、かつ増幅の質を認識することを可能にする。これらの2対を用いて行った増幅産物は、それぞれ0.23 kb (対15、Pend3)および0.81 kb (対05、Pend3)の2つの断片を示すことを可能にするはずである。
【０１１３】
偏在するアクチン2遺伝子の増幅(トラックA)は、RNAの増幅レベルを調節し、かつ用いる2つのプライマー間のイントロンの存在によるゲノムDNAの汚染を評価することを可能にする。
逆転写産物2.5μl (α)を、PCRの鋳型として用いる。条件は上述したものと同じである(PCRに関する段落を参照されたい)。唯一の違いは、最終反応容量(50μl)およびより多いサイクル数(場合により30〜45サイクル)である。
【０１１４】
次に、PCR反応で得られる産物を、アガロースゲルでの電気泳動後に、ペプチドの領域に相当する放射性PCRプローブを用いてサザンブロッティングによるハイブリダイゼーションに付す(図1A)。このハイブリダイゼーションの結果を図1Cに示す。
あるアクチン転写産物は、苗木の抽出物に比べて長角果の抽出物中のRNAレベルが非常に低いことを示す(図1B)。
矢印3 (図1C)は、予想されるサイズの0.23 kbで増幅産物が存在することを明らかにし、このことは未成熟の長角果のポリA+ RNA抽出物中に転写産物が存在することを証明する。矢印4は、予想されるサイズ0.81 kbでのごくわずかなシグナルを示す。ゲノムDNAによる抽出物の汚染は非常に低い。
【０１１５】
0.23 kbの転写産物は、未成熟の長角果の抽出物(受精後0〜5日)、ならびに(アクチンについて比較すると)低いレベルで苗木に存在する(図1C、矢印2)。
図4Bの人工物の(artefactual)バンドの存在(矢印1)が注目される。この増幅産物をクローニングして配列を決定したが、本発明の遺伝子といずれの相同性も含まない。このバンドは、さらに、ハイブリダイゼーションプロフィールも有さない(図1C)。
0.23 kbの産物(SUP25転写産物)のシーケンシングにより、図1Dに示す227塩基対の配列が明らかにされた。
【０１１６】
2.) 転写産物中の機能的なATGの証明：
SUP25転写産物のRT-PCRにより増幅された配列の分析は、開始コドン(ATG)、およびそれによる3つのオープンリーディングフレーム(ORF)の存在を示す。
より大きいオープンリーディングフレームから導き出されるアミノ酸配列は、25アミノ酸のペプチド(SUP 25)に相当する。
【０１１７】
ATGについてタンパク質合成を開始する翻訳機構の傾向を示すために、一過性発現実験を行った。その開始コドンを除去した「グリーン蛍光タンパク質」 (GFP) (PRTL2-EGFPプラスミド)を、異なるATG (図2A、0 atg： ATGなし、1 atg：1 ATG、など)を有する翻訳融合によりクローニングした。このようにしてクローニングされた各構築物を、プラスミドpRTL2-GUS (Restrepo A、Freed DD.、Carrington JC.、Nuclear transport of plant polyviral proteins. Plant Cell. 1990 Oct.；2(10)：987〜98)と共に一定のモル比でタマネギの表皮にコトランスフェクションし、これにより内部調節を得ることが可能となる。各サンプルについて、GFPを発現する細胞の副次集団を数え、ついでこれをタンパク質GUSを発現している副次集団とし、このようにして評価したスポットのそれぞれの比はレポーター遺伝子の発現レベルを反映する(図2B)。ATGがない最初の構築物は、ネガティブコントロールにおいて、ATGを有さないGFPが翻訳されず、GFPを発現するいずれの細胞も計数されないことを証明することを許容する。その他の3つの翻訳融合物について、GFPの発現レベルはほぼ同じであるので、3つのATGの機能的特徴を証明する。コーディング配列の上流の小さいサイズの読み取り枠の存在は、GFPの発現レベルに影響しない。これは、小さいサイズの読み取り枠の停止コドンがリボソーム複合体を停止させず、これが次いで転写産物の下流の翻訳を再び開始することを可能にする。言い換えると、この実験結果は、翻訳が、遺伝子座の3つ目のATGで開始されるかまたは再開されることができることをはっきりと示す。よってこの結果は、ペプチドの存在に関する仮定を補助することを許容する。
【０１１８】
実施例3：イムノインプリント：
3.1) ペプチドに指向された抗体の調製：
ペプチドは、Eurogentecにより合成された。抗体は、短い合成ペプチド(sup 16)についてEurogentecにより製造された。
【０１１９】
3.2) 長角果のタンパク質の抽出：
タンパク質を、イムノインプリントのための抽出バッファー中で、グラインダーRZE2021 (Heidolph)に接続した小さい杵(mini-pilons) (Kontes)を用いて、長角果をすりつぶすことにより抽出した。遠心分離(10 000 gで20分間)の後、上清のタンパク質濃度を、ブラッドフォード法によりBio-Radにより販売される試薬を用いて測定した。
【０１２０】
3.3) 電気泳動分析：
ポリアクリルアミドでの電気泳動(SDS-PAGE)を、Laemmli (1970)により記載される方法に従って行った。濃縮ゲルは3%までのアクリルアミド/ビスアクリルアミド混合物(30%/0.8%)であり、分離ゲルは18%までのProsieve混合物である。1×の最終濃度までローディングバッファーを添加した全タンパク質15μgを、3分間100℃に加熱し、各トラックに入れる。
【０１２１】
タンパク質は、ゲル当たり15〜20 mAの定電流により約1時間分離される。イムノインプリントのためではないゲルをクマシーブルーで30分間染色し、次いでタンパク質に対応するバンドが現れるまで脱染色する。
【０１２２】
3.4) イムノインプリント：
イムノインプリントのために、タンパク質を、ゲルでの移動後にニトロセルロースメンブレン (Pure Nitrocellulose membranes、0.1μm、Protan)に、Temblot Ae-6675セミドライエレクトロトランスファータンク(Touzart and Matignon)中で40分間、2.5 mA.cm2の下でトランスファーした。
標識反応は、37℃で穏やかな攪拌下に行った。
【０１２３】
メンブレンを1時間、5%のゼラチンを含むTBS-T 100 ml中でインキュベートし、次いでTBS-T (15分間、3回)で洗浄する。次にメンブレンを別々に、1.2％のスキムミルクおよび1次抗体(Sup 16を認識する血清) 2μlと混合したTBS-T 20 mlの存在下に2時間インキュベートする。次に、メンブレンをTBS-T 200 ml (15分間、3回)で洗浄し、次いで1.2％のスキムミルクおよび2次抗体(ラディッシュペルオキシダーゼと結合したヤギ抗体抗ウサギIgG、Bio-Rad) 1μlを含むTBS-T 20 ml中に1時間インキュベートする。次にメンブレンをTBS-T 200 ml (15分間、3回)で洗浄する。
【０１２４】
視覚化は、ECLキット "Western Blotting Detection Reagents" (Amersham)を用い、供給業者により推奨される条件に従う。
【０１２５】
実施例4：ペプチドの抗菌活性：
先行する実施例で精製した25アミノ酸のペプチド(SUP 25)の、種々の細菌に対する毒性実験を行った。
種々の細菌をLB培地または株に適する培地5 mlで培養し、次いで3000 gの遠心分離により沈降させ、最後に細菌の容量と同じ容量のLB中に採取する。細菌50μlを液体TOPagar (LB + バクトアガー7 g/l) 9 ml に48℃で植菌し、各辺10 cmの方形LBアガーディッシュに素早く注ぐ。種々の濃度のペプチドの10μlの滴を、固まったTOPagar上におく。ディッシュを16時間培養する。
【０１２６】
抗菌活性を有することが認められている昆虫ペプチドである20μMのセクロピンをポジティブコントロールとして用いる。
結果：
【０１２７】
【表２】
0004445855.tif 000003
【０１２８】
25アミノ酸のペプチドは、エシェリヒア・コリに対していずれの活性も有さないが、キサントモナス・カンペストリス、シュードモナス・シリンゲおよびエルウィニア・アミロボーラに対して活性を有する。このことは、特に植物病原体に指向され、より具体的には少なくともキサントモナス・カンペストリス、シュードモナス・シリンゲおよび／またはエルウィニア・アミロボーラに対する抗菌剤としてのその使用を想定することを許容する。
【０１２９】
実施例5：アラビドプシス・タリアナのプロトプラストに対するペプチドSUP 20の細胞毒性効果：
細胞壁を有さない単離された植物細胞について行われた毒性試験により、培地への合成ペプチドの添加により誘導される生存性の喪失が示される。ペプチドのアミノ酸配列のある変異は、毒性を破壊する。
【０１３０】
5.1) フルオレセインジアセテート(FDA)を用いる染色による生存性の測定：
FDAを用いる染色による生存性の試験は、生細胞に特異的に存在するエステラーゼ活性の検出にある。FDAは、細胞に浸透し、アセテート残基がエステラーゼ活性により切断されてフルオレセインが遊離し、青色の励起の下で生細胞にグリーンの着色を与える。死細胞については、それらが葉緑素を含んでいると、それらが有する色素のために赤色の蛍光を発する。
【０１３１】
アラビドプシス・タリアナの葉のプロトプラストは、DanonおよびGallois (FEBS letters、1998、437：131〜136)により記載される方法に従って取得して培養する。
25アミノ酸の合成ペプチド(SUP25)を、培養中のアラビドプシス・タリアナの葉のプロトプラストに添加する。
10 μMのSUP25の用量は、細胞個体群の生存性を2.5分の1に低下させるのに充分である(図3)。
その代わりに、10 μM の16アミノ酸の短くしたペプチド(pep 16)は、生存プロトプラストの割合に1.3分の1の影響しか与えない。
【０１３２】
16アミノ酸のペプチドの強い疎水性のために、これを50％のジメチルホルムアミド (DMF)中で用いる。コントロールのDMFは1.2分の1しか生存性に影響せず、このことは、完全ペプチドの効果に比べて、短くしたペプチドのプロトプラストの生存性に対する影響は非常に弱いか、またはゼロでさえあるということを可能にする。
ペプチドの毒性は、ペプチドSUP25のC-末端領域の10アミノ酸に特に関係すると結論付けることができる。
【０１３３】
一方、効果に関係する用量は、種々の既知の抗菌ペプチドの致死用量(1〜100μM)の大きさのオーダーに相当する(Bulet P.、Med.& Sc.、1999、1、23〜9)。
【０１３４】
5.2) ペプチドの細胞毒性活性についての最適濃度の決定：
種々の濃度のペプチドSUP25 (1 μM、5 μM、10 μMおよび100 μM)を、アラビドプシス・タリアナの葉のプロトプラストに適用した(図4)。一見したところでは、最適な効果が5μMで観察されるが、ペプチドの活性は用量に依存しない。実験方法が理由で、またプロトプラストに多すぎる容量を添加しないために、実験は、それぞれ1 mM、5 mM、10 mMおよび100 mMの濃度の4種のストック溶液を用いて行った。
【０１３５】
ストック溶液の均質性を確かめるために、各ペプチド溶液について同じ容量の一定量の画分を、変性条件下のポリアクリルアミドゲルに入れた(図4、挿入図)。高い濃度では、ペプチドは30 kDaより大きいマルチマー複合体の形成に関係する。これらの複合体の安定性は、SDS処理に唯一抵抗することができるジスルフィドブリッジの形成にシステインが関与することを示唆する。
【０１３６】
この実験は、ペプチドのモノマーの形が最も効果があり、そして5μMの濃度のペプチドが、生存性の非常に有意な低下に導くことを示す。
【０１３７】
5.3) DNAの断片化の測定とそれに続く種々の修飾ペプチドを用いる処理：
この実験は、アラビドプシス・タリアナのプロトプラストの生存性に対するペプチドの効果が、細胞の壊死か、またはプログラムされた細胞死もしくはアポトーシスの過程の実行に相当するのかを測定することを目的とする。
【０１３８】
アポトーシスは、遺伝子的に調節される事象の組により時々中断される死の厳密な進度により壊死とは区別される(VauxおよびKorsmeyer (Cell、1999、96：245〜254)；PennellおよびLamb (Plant Cell、1997、9：1157〜1168)；Greenberg (P.N.A.S.、1996、93：12094〜12097))。工程の1つは、核のDNAの断片化で、これはTUNEL 法(「ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ-媒介dUTPニックエンドラベリング」)により、Negoescu (Negoescuら、Plant J.、1997、13：803〜814)のプロトコルに従って実証することができる。TUNEL反応は、核内に大量に存在し、そのDNAがアポトーシスの過程において断片化される遊離の3'OH末端を標識することを許容する。図5は、ペプチドの種々の変形にさらしたプロトプラストのTUNELラベリングの結果を示す。
【０１３９】
25アミノ酸のペプチドをアラビドプシス・タリアナのプロトプラストに5μMで2時間、外部適用することは、陽性のTUNELプロトプラストの個体数の増加が観察されることを許容する(図5B)。DNA断片化特性を示す核は、コントロールに比べて4倍多い。16アミノ酸の短くしたペプチド(pep16)は、いずれの効果も誘発しない
【０１４０】
5.4) システインのレベルにおける修飾ペプチドの生物学的活性の研究：
5.4.1) 修飾ペプチドの構築および合成
観察される生物学的活性に対するシステインの影響を研究するために、pepDs、Pep1SおよびPep2Sの3種の修飾ペプチドをEurogentechにより合成した(図5A)。
【０１４１】
5.4.2) 修飾ペプチドの細胞毒性活性
これらの修飾ペプチドにより誘発される核のDNAの断片化は、TUNEL法(図5B)により証明される。
pepDsは、残存活性を有する。
Pep1Sは、もはや細胞毒性活性を有さない。
Pep2Sは、細胞毒性活性を有する。
この結果は、システインが分子間のジスルフィドブリッジの形成に含まれており、それによりペプチドを遊離で活性なままにさせていることを示唆する。
【０１４２】
実施例6：ペプチドSUP25を発現するトランスジェニック植物の取得
遺伝子SUP25の配列は、異なる種類の植物細胞においてペプチドの産生を転写レベルで調節するために、種々のプロモーターを用いる発現カセットに導入することができる。
【０１４３】
6.1) 遺伝子の配列の合成：
ORFの小さいサイズのために、ペプチドSUP25をエンコードする配列を合成することができる。ペプチドの配列に相当するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの対を、注文製で合成する。配列は、オリゴヌクレオチドの対のハイブリダイゼーションが、DNA断片の5'末端でBamHI、および3'末端でPstIの制限部位に相当する付着末端を導くように計画される。部位BamHI/PstIは、プロモーターCaMV 35Sおよび35Sの3'領域が、導入される遺伝子の発現を支配するプラスミドpDH51 (Pietrzak M.ら、Expression in plants of two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast transformation with a new plant expression vector. Nucleic Acids Res. 1986、14 (14)：5857〜68)の発現カセット内に遺伝子がクローニングされるのを許容する。
【０１４４】
配列#1：(配列番号28)
gatcATGTGGTGGCTAGTTGGACTTACACCAGTTGAGTTGATCCATCTTTG
CGCATTTCGAGAGCGTCTCTGTCATCTCTAAtgca
【０１４５】
配列#2：(配列番号29)
TTAGAGATGACAGAGACGCTCTGAAATGCGCAAAGATGGATCAACTCA
ACTGGTGTAAGTCCAACTAGCCACCACAT
【０１４６】
6.2) 発現カセット中のペプチドの配列のライゲーション
オリゴヌクレオチドは、1 pmol/μlで、10μlのtfl 1×バッファー (Sambrook J.ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual. Ed. CSHLP、2001)中でハイブリダイズされ、そして95℃で1分間、次いで45℃で10分間インキュベートされる。次に、オリゴヌクレオチド20 ng (2μl)を、BamHI/PstI部位を用いて100 ngのpDH51ベクターにライゲーションする(Sambrookら、2001)。ライゲーション産物をイー・コリXL1-B (Stratagene)に化学的方法を用いて形質転換する(Sambrookら、2001)。形質転換体を、抗生物質のアンピシリン上で選択する。挿入の存在は、形質転換体内で、基質X-GAL (Sambrookら、2001)を含む培地での青色の不在により直接検出できる。5つの独立した形質転換体を、市販のキットであるHigh pure plasmid Isolation kit (Roche/Boehringer)を用いてプラスミドを抽出するために用いる。挿入の存在は、酵素EcoRI (Sambrookら、2001)を用いる制限により証明される。構築物の配列の正確さは、プロモーター35S [op35S52：CTTCGTCAACATGGTGGAGC]：(配列番号30)またはターミネーター35-S [oter35：CTAGCTAGAGGATCGATCC]：(配列番号31) (Sambrookら、2001)と対になるプライマー(a primer pairing)を用いることによるシーケンシングにより、配列SUP25の存在について証明される。
【０１４７】
6.3) バイナリー形質転換ベクターへのトランスジーンのトランスファー
次に、トランスジーンを、植物に抗生物質のカナマイシンに対する耐性を与える選択遺伝子NPTIIを含むバイナリープラスミドpZP111 (Hajdukiewicz P.ら、The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for Plant transformation. Plant Mol Biol.、1994、(6)：989〜94)のT-DNA領域のEcoRI部位にサブクローニングする。プラスミドは、イー・コリまたはアグロバクテリウム中でのクロラムフェニコール選択のための選択遺伝子aadAも含む。ライゲーション産物を、イー・コリXL1-B (Stratagene)に、化学的方法(Sambrookら、2001)を用いて形質転換する。形質転換体をLB培地(Sambrookら、2001) + 25 mg/lのクロラムフェニコール上で選択する。プラスミドpZP111中の挿入の存在は、細菌形質転換体中で、基質X-GAL (Sambrookら、2001)を含む培地中の青色の不在により直接同定できる。
【０１４８】
6.4) アグロバクテリウムへのバイナリーベクターのトランスファー
陽性の株を選択し、市販のキットHigh pure plasmid Isolation kit (Roche/Boehringer)を用いてプラスミドを精製する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) C58C1の無毒化(disarmed)株(Koncz C.およびSchell, J.、The promoter of TI-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chaemeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector、Mol. Gen. Genet.、204：383〜396)をコンピテントにし、次いでT-DNAの構築物を含むバイナリープラスミドを用いてエレクトロポレーションにより形質転換する(Shen WJ.およびForde BG.、Efficient transformation of Agrobacterium spp. by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 1989、17(20)：8385)。28℃での3日間の培養後、クロラムフェニコール 25 mg/l、リファンピシン 50 mg/l、ゲンタマイシン 25 mg/lに耐性のあるコロニーは、35S プロモーター[op35S52：CTTCGTCAACATGGTGGAGC]：(配列番号30)およびターミネーター35-S [oter35：CTAGCTAGAGGATCGATCC]：(配列番号31) (Sambrookら、2001)を検出するプライマーを用いるPCRにより、陽性であると確認される。
【０１４９】
6.5) トランスジェニック植物の取得：
次に、トランスジェニック植物は、C58C1株 (Koncz C.およびSchell、1986)、およびBechtold, N.ら(In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants、C.R. Acad. Sci. (1993) Paris、316、1194)に記載のプロトコルに従うアラビドプシス・タリアナの花芽の形質転換方法を用いることによるアグロインフェクションにより得られる。簡単に、YEP (酵母エキス 10 g/l；ペプトン 10 g/l；グルコース 20 g/l；カナマイシン 50 mg/l；リファンピシン 50 mg/l；ゲンタマイシン 25 mg/l) 10 mlの前培養物をアグロバクテリウムのコロニーと共に植菌する。28℃で16時間の攪拌後、YEP 500 mlを培養する。培養物がOD600 = 0.8に達したときに、3000 gでの遠心分離後に細菌を回収し、浸潤培地(infiltration medium) (MS培地2.16 g/l (Duchefa)；MES (Sigma) 0.5 g/l；スクロース 5%；pH 5.7 KOHで調整；Silwet L-77 (Osi Specialises Ins.) 0.02%)に、0.5の最終ODで溶解する。
【０１５０】
花梗が最初の花をつけ始める段階のアラビドプシス・タリアナの植物を、デシケータ中に真空(-1 atm)下で10分間、浸潤溶液に浸漬する。次いで、植物の水気を切り、種子の収穫まで培養するが、培養の最初の2日間はプラスチックフィルムの下である。浸潤後4週間で種子を収穫する。最短で15日間の貯蔵の後、種子を70％エタノール溶液で10分間滅菌し、次いで抗生物質のカナマイシン(この耐性はT-DNAが有する) 400 mg/lを含む Gamborg B5発芽培地 (Duchefa) 1.85 g/lおよびPhytagel (Sigma) 3 g/l 上でインビトロで選択する。耐性植物(種子の約1%)を土壌に移植し、プラスチックの下で4日間保持し、種子の収穫まで培養する。
【０１５１】
トランスジーンの挿入遺伝子座の数の分析は、選択遺伝子(ここではカナマイシンについて)のメンデルの分離(segregation)の統計学的試験により、抗生物質のカナマイシン400 mg/lを含む Gamborg B5発芽培地 (Duchefa)およびPhytagel (Sigma) 3 g/l 上でインビトロで行われる。単一の挿入遺伝子座を有する10の植物を選択する (分離 3:1)。トランスジーンの存在は、10のうち約8の植物において、方法(Dellaportaら、Plant. Mol. Biol. Rept.、1983、1、19〜21)による、35Sプロモーター[op35S52：CTTCGTCAACATGGTGGAGC]：(配列番号30)およびターミネーター35-S [oter35：CTAGCTAGAGGATCGATCC]：(配列番号31)を用いる植物の精製DNAのPCR分析により確認される。ペプチドの発現は、トランスジェニック植物のタンパク質抽出物のウェスタン分析 (Sambrookら、2001)により、野生型ペプチドSUP25の全配列に対する抗体およびECL検出キット(Amersham)を用いることにより確認される。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図1は、アラビドプシス・タリアナの若い長角果のRNAから得られる相補的DNAのPCR増幅の間に得られる結果を示す。
【図２】図2は、転写産物SUP25の機能的開始コドン(ATG)を示すために行われた試験の結果を示す。
【図３】図3は、配列番号1の配列に相当する16アミノ酸のペプチド(SUP16)、および配列番号10の配列に相当する25アミノ酸のペプチド(SUP25)の植物毒性試験の結果を示す。
【図４】図4は、配列番号10の配列に相当する25アミノ酸のペプチドの細胞毒性活性についての最適濃度を決定するために行われた試験の結果を示す。
【図５】図5Aおよび5Bは、ペプチドの異なる変形にさらしたプロトプラストについてのTUNEL標識試験の結果を示す。
【図１】
0004445855.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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