(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識抗ＣＤ１４モノクローナル抗体と蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体を用いて腎炎が疑われるヒトから採取した尿沈渣を処理し、フローサイトメトリー法でＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球を検出し、尿中のＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数が３０／ｍｌ以上の場合に腎臓の活動性炎症があると判定することを特徴とする腎疾患の活動性判定法。
【請求項２】
蛍光標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体、蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡモノクローナル抗体、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体を用いて腎炎が疑われるヒトから採取した尿沈渣を処理し、フローサイトメトリー法でＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球を検出し、末梢血と比較してＴリンパ球全体に占めるＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の割合が高いときに腎臓の活動性炎症があると判定することを特徴とする請求の範囲１に記載の腎疾患の活動性判定法。
【請求項３】
ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴ細胞とを検出する蛍光活性化セルソーターと、この蛍光活性化セルソーターで検出されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴ細胞の数をそれぞれ記録する記録手段と、この記録手段に記録されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴ細胞の数に基づき腎臓の活動性炎症の有無を判定する判定手段とを備え、前記判定手段は、尿中のＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数が３０／ｍｌ以上であって、末梢血と比較してＴリンパ球全体に占めるＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の割合が高いときに腎臓の活動性炎症があると判定するコンピュータプログラムによって構成されたことを特徴とする腎疾患の活動性判定装置。
【請求項４】
請求の範囲２に記載の腎疾患の活動性判定法に用いられ、蛍光標識ＣＤ１４モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ３モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＡモノクローナル抗体とを備えたことを特徴とする腎疾患の活動性判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患の活動性判定法及びその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎炎など腎臓の炎症性疾患の活動性判定は、従来、腎生検を行って病理学的に判断するか、あるいは、尿蛋白量の増加の有無をもってなされていた。しかし、腎生検は、侵襲的な検査法であり、疾患の経過中に複数回施行することは困難であった。また、尿蛋白は、腎臓の炎症の程度だけでなく、高血圧など様々な原因によって影響を受け、活動性の指標としての特異性は低かった。
【０００３】
そこで、本発明者らは、多数の臨床例を検討した結果、腎臓に活動性炎症病変がある場合に、尿中に炎症性の活性型細胞が出現することから、免疫細胞特異的モノクローナル抗体とフローサイトメトリーを用いて炎症性免疫細胞の数の測定を行うことによって、腎臓の炎症の活動性を判定する方法を見出した（非特許文献１）。
【０００４】
この方法は、腎臓の活動性炎症の有無を判定する手段として、蛍光標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体と蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体を用いて尿沈渣を処理し、フローサイトメトリー法でＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球を検出し、その数が多数の場合と、蛍光標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体と蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体と蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡモノクローナル抗体を用いて尿沈渣を処理し、フローサイトメトリー法でＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＯ陰性ＣＤ４５ＲＡ陽性のＴリンパ球を検出し、その数が多数の場合に、腎臓の活動性炎症があると判定するものである。
【０００５】
この方法によれば、従来の腎生検や尿蛋白による判定法に代わり、非侵襲的に腎疾患の活動性の判定を行うことができる。
【０００６】
しかし、上記腎疾患の活動性の判定法は、Ｔリンパ球を検出するものであったが、判定結果の確実性が低いという欠点があった。
【０００７】
すなわち、本発明者らが検討した結果、腎炎を伴わない原因不明の血尿を呈する特発性腎出血症例においては、末梢血型のＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陽性のＴリンパ球が、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球に比べ優位に出現する。しかし、尿中ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球も、尿中総Ｔリンパ球の３０〜５０％を占めることが分かった。また、活動性腎炎の尿にもＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陽性のＴリンパ球が１５〜４０％認められた。したがって、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球の数は、腎炎活動性の判定には適さないことが分かった。
［０００８］
なお、本発明者らは、ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球と単球を含む免疫細胞が、糸球体障害を示すマーカーと考えられることを開示している（非特許文献２）が、これはＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球を含んだ炎症細胞が活動性腎炎の症例で尿中に認められることを報告したものであり、これらの尿中炎症細胞の数から腎炎の活動性を判定する基準を示したものではなかった。
【非特許文献１】
Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １２：  ２６３６−２６４４，２００１．
【非特許文献２】
日本腎臓学会誌  ４５（３）：３０２，２００３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
［０００９］
以上のように、非侵襲的に腎疾患の活動性の判定を行うことができる腎疾患の活動性を知る方法としては、本発明者らが見出したＴリンパ球を検出する方法が知られていた。しかし、この従来の判定法は、判定結果の確実性が低いという欠点があった。
［００１０］
そこで、本発明は上記問題点に鑑み、より確実性の高い腎疾患の活動性判定法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
［００１１］
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、活動性腎炎を伴わない特発性腎出血では、尿にほとんどＣＤ１４陽性の単球は検出できず、一方、活動性腎炎を伴った場合には、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球が尿中のＣＤ１４陽性総単球の９０〜９９％に認められることを見出し、本発明に想到した。
［００１２］
すなわち、本発明の腎疾患の活動性判定法は、蛍光標識抗ＣＤ１４モノクローナル抗体と蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体を用いて腎炎が疑われるヒトから採取した尿沈渣を処理し、フローサイトメトリー法でＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球を検出し、尿中のＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数が３０／ｍｌ以上の場合に腎臓の活動性炎症があると判定することを特徴とする。
［００１３］
また、上記に加え、蛍光標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体、蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＡモノクローナル抗体、蛍光標識抗ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体を用いて腎炎が疑われるヒトから採取した尿沈渣を処理し、フローサイトメトリー法でＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球を検出し、末梢血と比較してＴリンパ球全体に占めるＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の割合が高いときに腎臓の活動性炎症があると判定することを特徴とする。
［００１４］
本発明の腎疾患の活動性判定装置は、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球とを検出する蛍光活性化セルソーターと、この蛍光活性化セルソーターで検出されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の数をそれぞれ記録する記録手段と、この記録手段に記録されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の数に基づき腎臓の活動性炎症の有無を判定する判定手段とを備え、前記判定手段は、尿中のＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数が３０／ｍｌ以上であって、末梢血と比較してＴリンパ球全体に占めるＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の割合が高いときに腎臓の活動性炎症があると判定するコンピュータプログラムによって構成されたことを特徴とする。
［００１５］
本発明の腎疾患の活動性判定キットは、上記の腎疾患の活動性判定法に用いられ、蛍光標識ＣＤ１４モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ３モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＡモノクローナル抗体とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
［００１６］
本発明の腎疾患の活動性判定法によれば、尿沈渣中のＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球を検出することにより、非侵襲的かつ特異的に腎疾患の活動性の判定を行うことができるとともに、より確実性の高い腎疾患の活動性判定を行うことができる。
［００１７］
また、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球を検出することにより、より一層確実性の高い腎疾患の活動性判定を行うことができる。
［００１８］
本発明の腎疾患の活動性判定装置によれば、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の数に基づき腎臓の活動性炎症の有無を判定することにより、侵襲的かつ特異的に腎疾患の活動性の判定を行うことができるとともに、より確実性の高い腎疾患の活動性判定を行うことができる。
【００１９】
本発明の腎疾患の活動性判定キットによれば、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球を検出するための、蛍光標識ＣＤ１４モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ３モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＡモノクローナル抗体とを備えたことにより、簡便に、侵襲的かつ特異的に腎疾患の活動性の判定を行うことができるとともに、確実性の高い腎疾患の活動性判定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の腎疾患の活動性判定法による検出結果を示すグラフである。
【図２】ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球数と活動性炎症所見の相関を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本願発明は、尿中活性型免疫細胞の検出とその数の測定により、非侵襲的に腎臓における炎症の活動性判定を行うものである。
【００２２】
健常人の尿には免疫細胞は全く認められないが、腎臓に活動性の炎症病変が存在して炎症性免疫細胞が腎組織を破壊している場合には、この炎症性免疫細胞の一部が尿中に現れる。腎組織を破壊し尿に出現する炎症性免疫細胞の同定の手段として、尿を遠心分離して沈渣を得、免疫細胞の表面抗原に対する蛍光標識モノクローナル抗体を作用させ、フローサイトメトリー法で検出する。
【００２３】
免疫細胞を検出するために用いるモノクローナル抗体は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ４５ＲＯ，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ６２Ｌを対応抗原とする蛍光標識抗体である。フローサイトメトリーは多重染色が検出可能な機器を用いる。ＣＤ３はＴリンパ球、ＣＤ１４は単球・マクロファージ、ＣＤ４５ＲＯはメモリーＴリンパ球、ＣＤ４５ＲＡは非活性型Ｔリンパ球のマーカーである。ＣＤ６２Ｌは別名接着因子Ｌ−セレクチンである。ＣＤ６２Ｌを発現している免疫細胞は非活性型であり、発現していないものは活性型あるいはエフェクター型である。
【００２４】
これらの免疫細胞の表面マーカーを組み合わせることにより炎症性あるいは組織傷害性の免疫細胞を検出する。この方法によって同定する炎症性・組織傷害性の免疫細胞は、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性、あるいはＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球と、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球・マクロファージである。炎症性あるいは組織傷害性の免疫細胞の数は、フローサイトメトリーの取り込みゲートの細胞総数に、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性、あるいはＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球と、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球・マクロファージの割合から求める。尿にこれらの細胞数が多数認められる場合に、腎臓における活動性炎症病変ありと判断する。
【００２５】
本発明においては、尿蛋白や血尿が認められ腎炎が疑われる場合に、随時尿の解析により、より確実性の高い判定を行うために、特に、蛍光標識抗ＣＤ１４モノクローナル抗体と蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体を用いて尿沈渣を処理し、フローサイトメトリー法でＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球を検出し、その数が３０／ｍｌ以上の場合に、半月体形成や尿細管間質の炎症細胞浸潤など、腎臓の活動性炎症があると判定する。なお、ここでの単球の数は、尿の浸透圧で補正した数であり、補正値Ｙ＝実測値Ｘ×検体の浸透圧（ｍＯｓｍ／ｌ）／２９０（ｍＯｓｍ／ｌ）（２９０は血漿の浸透圧；この補正方法は非特許文献１に記載）の式から求められる。
【００２６】
特発性腎出血では、尿にほとんどＣＤ１４陽性の単球は検出できず、一方、活動性腎炎を伴った場合には、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球が尿中のＣＤ１４陽性総単球の９０〜９９％に認められるため、確実に腎臓の活動性炎症の判定を行うことができる。
【００２７】
さらに、補助的判定基準として、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球が尿に認められ、かつ、末梢血と比較して、Ｔリンパ球全体に占めるＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の割合が高いときに、腎臓の活動性炎症があると判定することによって、より一層確実性の高い腎疾患の活動性判定を行うことができる。
【００２８】
腎臓の炎症性病変の存在診断あるいはその活動性判定は、腎疾患診療において治療法の選択、追加あるいは変更にあたって重要な意味がある。これまでは腎生検がそのための検査方法として採用されてきていた。しかし腎生検は侵襲的であり、実施後に死亡例も報告されている。そのため、病状によっては実施が困難な状況を経験することがあり、患者から実施の同意を得られないこともあった。また診療経過中に複数回実施することは難しかった。その他には、一般検尿検査による尿蛋白・血尿の程度を手がかりにしていたが、特異性が低く、活動性の判定が困難であった。そこで腎臓の炎症性病変の存在診断あるいは活動性判定のために、非侵襲的な新たな検査手段の導入が待たれていた。本願発明による検査は、このような腎疾患診療の問題点を解決することが可能となる。
【００２９】
本願発明により、腎臓の炎症性疾患の病態の把握が簡便に行えるようになり、腎疾患の早期診断、早期治療に役立つ。
【００３０】
また、治療経過中の治療効果判定や活動性変化の測定を迅速に行うことができるようになり、過度の治療を防ぐことができる。また逆に、治療の不足も防ぐことができ、最適な治療を行うことが可能となる。
【００３１】
また、腎生検を行わずに、あるいはその結果を待たずに、腎臓疾患が活動性の高い炎症疾患であるか否かの判定に役立てることもできる。これは急性進行性糸球体腎炎症候群を呈する患者の早期診断に特に有用で、迅速な病態把握と早期治療に役立てることができる。
【００３２】
本願発明により、腎疾患の病態把握が簡便かつ迅速に行うことができ、腎疾患の治療効率が飛躍的に向上し、結果として、毎年増加を続ける人口透析患者の増加に歯止めを掛けることも期待できる。
【００３３】
また、本発明は、上記の腎疾患の活動性判定法に用いられる装置を提供する。この装置は、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球を検出する蛍光活性化セルソーターと、この蛍光活性化セルソーターで検出されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数を記録する記録手段と、この記録手段に記録されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数に基づき腎臓の活動性炎症の有無を判定する判定手段とを備えている。これら記録手段と判定手段は、コンピュータプログラムで構成されている。そして、判定手段は、記録手段に記録されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数の補正値が予め決められた数となった場合に、腎臓の活動性炎症があると判定するように構成されている。さらに、判定手段によって判定された結果を表示する表示手段を設けてもよい。表示手段としては、コンピュータ等のディスプレイ装置で構成することができる。なお、蛍光活性化セルソーターは、一般に用いられるものと構成が同じであるので、その詳細な説明は省略する。
【００３４】
この装置を用いて腎疾患の活動性判定を行う場合には、蛍光標識抗ＣＤ１４モノクローナル抗体と蛍光標識抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体を用いて尿沈渣を処理した後、これを蛍光活性化セルソーターへ導入する。蛍光活性化セルソーターでは、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球がソートされ、その数が記録手段に記録される。そして、判定手段は、記録手段に記録されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数の補正値が予め決められた数を超えた場合に、腎臓の活動性炎症があると判定する。
【００３５】
本発明の装置を用いることによって、簡便かつ確実に腎臓の活動性炎症の判定を行うことができる。
【００３６】
また、本発明の装置は、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球を対象とした判定法に限らず、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球などの数に基づき腎臓の活動性炎症の判定を行う場合にも同様に用いることができる。具体的には、例えば、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴ細胞とを検出する蛍光活性化セルソーターと、この蛍光活性化セルソーターで検出されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴ細胞の数をそれぞれ記録する記録手段と、この記録手段に記録されたＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴ細胞と、ＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴ細胞の数に基づき腎臓の活動性炎症の有無を判定する判定手段とから装置を構成する。そして、補助的判定基準として、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球が尿に認められ、かつ、末梢血と比較してＴリンパ球全体に占めるＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球とＣＤ３陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性のＴリンパ球の割合が高いときに、腎臓の活動性炎症があると判定するように構成することによって、より一層確実性の高い腎疾患の活動性判定を行うことができる。
【００３７】
また、本発明は、上記の腎疾患の活動性判定法に用いられるキットを提供する。このキットは、蛍光標識ＣＤ１４モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ３モノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＯモノクローナル抗体と、蛍光標識ＣＤ４５ＲＡモノクローナル抗体とを備えている。このキットを本発明の腎疾患の活動性判定法に用いることで、簡便に、侵襲的かつ特異的に腎疾患の活動性の判定を行うことができるとともに、確実性の高い腎疾患の活動性判定を行うことができる。
【００３８】
以下、具体的な実施例を例にとって説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではなく、種々の変形実施が可能である。
【実施例１】
【００３９】
患者の新鮮尿５０ｍｌを採取後、４℃で尿沈渣を遠心分離（１５００×ｇ）した。そして、この尿沈渣をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、１００μｌの染色緩衝液（３％のウシ血清と０．０５％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液）に懸濁させ、５本の試験管（ベクトンディッキンソン社製ファルコン２０５２）に２０μｌずつ分けた。すぐに、１０μｌのＦＩＴＣが結合したモノクローナル抗体（抗ＣＤ１４モノクローナル抗体（Ｍ５Ｅ２、マウス、ＩｇＧ１、κ）、抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体（Ｄｒｅｇ５６、マウス、ＩｇＧ１、κ））で懸濁液を４℃で３０分間インキュベートした。アイソタイプの同等のＦＩＴＣが結合した非特異的な抗体（マウス、ＩｇＧ１、κ）を陰性コントロールに用いた。
【００４０】
その後、１ｍｌの溶血緩衝液（０．８３％の塩化アンモニウムを含む２０ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液）を加え、３７℃で３分間インキュベートした後、３ｍｌの染色緩衝液で２回洗浄した。これを遠心分離した後、ペレットを０．５ｍｌの染色緩衝液に懸濁させ、フローサイトメトリー分析を行うまで冷暗所に保管した。
【００４１】
そして、ベクトンディッキンソン社製の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳｃａｎ）とソフトウェア（CellysisあるいはCell Quant）を用いて２色フローサイトメトリー分析を行い、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球を検出した。
【００４２】
また、上記の比較として、ＦＩＴＣが結合したモノクローナル抗体として、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＵＣＨＴ１、マウス、ＩｇＧ１、κ）と、抗ＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体（Ｄｒｅｇ５６、マウス、ＩｇＧ１、κ））を用いたほかは上記と同様の操作によって、尿中のＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球を検出した。
【００４３】
さらに、患者の末梢血についても、上記とほぼ同様の操作によって、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球と、ＣＤ３陽性ＣＤ６２Ｌ陰性のＴリンパ球を検出した。
【００４４】
その結果を図１に示す。尿（図右）のＣＤ３陽性リンパ球はＣＤ６２Ｌ陰性、ＣＤ１４陽性単球・マクロファージはＣＤ６２Ｌ陰性であり、いずれも活性型であった。同一患者の末梢血（図左）の同じ細胞群では、ＣＤ３陽性リンパ球のほとんどがＣＤ６２Ｌ陽性で、ＣＤ１４陽性単球・マクロファージはＣＤ６２Ｌ陽性であり、非活性型であった。これら尿の活性型免疫細胞数は尿１ｍｌ当たり２００個と多数認められ、腎炎の活動性は高いと判定された。
【実施例２】
【００４５】
尿中のＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の細胞の数と、腎生検で確認した活動性炎症所見との相関を調べた。なお、細胞数は尿浸透圧で補正し、活動性炎症所見として細胞性半月体形成あるいは間質尿細管細胞湿潤の程度を見た。
【００４６】
１０２例の症例の内訳は、ＩｇＡ腎症５４名、ＡＮＣＡ関連腎炎１７名、メサンギウム増殖性腎症（非ＩｇＡ腎症）１４名、膜性腎症７名、アミロイド腎１名、微小変化型８名、高血圧腎症１名である。
【００４７】
尿中に検出される尿浸透圧で補正したＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数が３０／ｍｌ以上の場合に、針生検による腎生検で半月体形成や尿細管間質の炎症細胞湿潤などの腎炎活動性所見が確認できる感度は、８５％、特異度は８９％であった。すなわち、カットオフ値を３０／ｍｌとしたとき、感度８５％、特異度８９％であった。
【００４８】
以上の結果より、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数と、臨床診断の結果との間には非常に高い相関性が認められ、本発明の腎疾患の活動性判定法が確実性の高い方法であることが確認された。そして、ＣＤ１４陽性ＣＤ６２Ｌ陰性の単球の数が３０／ｍｌ以上の場合に、腎臓の活動性炎症があると判定することができることが確認された。
【図１】
0004487081.tif 000002
【図２】
0004487081.tif 000003