(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エールリチア・カニス（Ehrlichia canis）の１２０ｋＤａタンパク質をコードする単離された核酸セグメントであって、前記タンパク質が抗エールリチア・カニス血清と免疫反応性があり、前記タンパク質が配列番号８のアミノ酸配列からなる単離された核酸セグメント。
【請求項２】
セグメントが配列番号７の配列からなる請求項１記載の核酸セグメント。
【請求項３】
請求項１記載の核酸セグメントを含むベクター。
【請求項４】
ベクターが、細胞内に導入されると配列番号７によってコードされたポリペプチドを発現する能力を有する発現ベクターである請求項３記載のベクター。
【請求項５】
配列番号８のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸配列が配列番号７の配列を含む核酸セグメントでコードされる請求項５記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
核酸セグメントが発現ベクター内に含まれたものである請求項６記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
それぞれの反復単位が３６個のアミノ酸を有する１４個のタンデム反復単位を含む請求項５記載の組換えタンパク質。
【請求項９】
反復単位が親水性である請求項８記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
抗原である請求項５記載の組換えタンパク質。
【請求項１１】
請求項１記載の核酸セグメントを含むホスト細胞。
【請求項１２】
配列番号８のアミノ酸配列と免疫反応する抗体。
【請求項１３】
薬学的に受け入れ可能な担体に分散された請求項１０記載の組換えタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は一般的には寄生バクテリアの分子生物学の分野に関連し、特にリッケチア・タイプの疾病及びエールリッヒ性バクテリアの薬品に関するものである。より具体的には、本発明は分子クローニング及びエールリチア・カニス（Ehrlichia canis）１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質遺伝子に関するものである。
【０００２】
エールリチア（Ehlichia）種は造血細胞のエンドソーム内に棲む細胞内グラム陰性菌で、ヒト、飼育及び野生タイプのイヌ、シカ、ウマ、ウシ、および野生の齧歯類を含む種々の動物ホストに感染する。エールリチアエ族の各メンバーはそれぞれ独自の標的細胞指向性を有している。エールリチアのほとんどの種は、ホストの上皮細胞内で成長するコウディア・ルミナンチウム（Cawdria ruminantium）と赤血球寄生性であるアナプラズマ・マルギナレ（Anaplasma marginale）だけは例外として、単一細胞指向性（Ｅ．カニス（E. canis）、Ｅ．チャフェンシス（E. chaffeensis）、Ｅ．センネツ（E. sennetsu）、Ｅ．リスチジ（E. risticii）及びＥ．ムリス（E. muris））あるいは顆粒球指向性（ヒト顆粒球エールリチア、Ｅ．イクィ（E. equi）、Ｅ．ファゴシトフィラ（E. phagocytophila）、及びＥ．イウィンギイ（E. ewingii））である。
【０００３】
エールリチアエは今世紀初期の文献にも述べられているが、この１０年間より以前は米国内では獣医学の分野でのみ病原として考えられていたので、ほとんど注目されなかった。ヒトに影響を及ぼすエールリチアエ類が出現したことからエールリチアエに対する新たな関心が高まっている。ここ２０年間に、２つの新しいヒト・エールリチアエ病原菌（Ｅ．チャフェンシス及びヒトＥ．ファゴシトフィリア状生物）が米国で発見された（Bakken JS 1994, Chen SM. 1994. JCM, Fishbein DB, 1987, Maeda, K. 1987）。この属の原種であるエールリチアエ・カニスはイヌのエールリッヒ症の病原因子で自然にイヌに感染する５つのエールリチアエ種のうちで唯一の急性病原因子である。イヌのエールリッヒ症は褐色のイヌ・ダニ、リピセファルス・サイギネウス（Rhipicephalus sanguineus）（Groves MG, 1975. Lewis GE Jr. 1977）によて伝播される世界中に広がった病気である。エールリチアエ・カニス（Ehrlichia canis）は軽度の一過性発熱性の病気で、重篤な病気に進行したり、致死的な症状に進行する場合もある（熱帯性イヌ・パンサイトペニア）（Buhces WC, 1974, Greene CE and J.W. Harvey. 1984, Walker, JS. 1070）。毎年、世界中で予防キャンペーンとエールリチアエ・カニスに感染されたイヌの措置で数百万ドルが使われている）。さらに、エールリチアエ・カニスは公衆衛生上の脅威にもなっている。エールリチアエ・カニス、あるいは抗原的に区別できない生物が最近ヒトからも単離されている（Perez  Ｍ．1996）。
【０００４】
E．カニスの遺伝子性及び抗原性組成物を理解することはイヌのエールリッヒ症の病原と効果的なワクチン開発の研究のために不可欠である。エールリチアエ・カニスは遺伝子的及び抗原的にＥ．チャフェエンシスと密接に関連している（Anderson  ＢＥ，1991, Chen SM 1994. Am J Tro Med Hyg）。従って、イヌのエールリッヒ症はＥ．チャフェエンシスを含む単一細胞指向性エールリキア種を研究する上で適切なモデルである。
【０００５】
先行技術はエールリチアエ・カニスの免疫反応性遺伝子のクローニング及び特徴づけの欠如という点で欠陥がある。さらに、先行技術はエールリチアエ・カニスのそうした免疫反応性の組換え蛋白質がないという意味で欠陥がある。本発明はこうしたこの技術分野での長年のニーズと願望に応えるものである。
【０００６】
本発明の１つの実施の形態で、エールリチアエ・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子が提供される。好ましくは、このタンパク質は配列番号８のアミノ酸を有しており、配列番号７の核酸配列を有している。
【０００７】
本発明の好ましい実施の形態で、エールリチアエ・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子で構成され、このベクターはそのベクターが細胞に導入されると遺伝子を発現することができる発現ベクターが提供される。
【０００８】
本発明の別の実施の形態で、配列番号８のアミノ酸配列で構成される組換えタンパク質が提供される。好ましくは、このアミノ酸は配列番号７の核酸配列でコードされる。好ましくは、この遺伝子組換えタンパク質はそれぞれ３６のアミノ酸で構成される１４タンデム反復単位で構成される。より好ましくは、この反復単位は親水性である。さらに好ましくはこの組換えタンパク質は抗原である。
【０００９】
本発明の１つの好ましい実施の形態で、操作されてプロモータに結合された配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列を含む発現領域を含むベクターを得るステップと、そのベクターを細胞にトランスフェクトするステップと、そしてその発現領域の発現に有効な条件下で培養するステップを含む組換えタンパク質をつくる方法が提供される。
【００１０】
本発明はいくつかの実施の形態では、エールリチアエ・カニスにさらされた、あるいは感染された疑いのある対象物を識別するステップと、エールリチアエ・カニスの１２０ｋＤａ抗原で構成される組成物を投与してエールリチアエ・カニス感染症を抑制するステップで構成されるエールリチアエ・カニス感染症を抑制する方法として述べられる。抑制はその対象物の体液または細胞性免疫反応を刺激するか、あるいは１２０ｋＤａ抗原の正常な機能を抑制するか、あるいはその対象物体内のいくつかの因子との作用に関して抗原と競合するなどの方法で起こさせることができる。
【００１１】
本発明の他のそしてさらなる側面、特徴、及び利点は開示の目的で提供される本発明の現段階での好ましい実施の形態に関する以下の説明で明らかになるであろう。
【００１２】
本発明によれば、この技術分野における従来の分子生物学、微生物学、及び遺伝子組換えＤＮＡ技術を用いることができる。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Maniatis,Fritsch & Sambrook, 杜olecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait et ed. 1984); Nucleid Acid Hybridization[B.D. Hames & Higgins eds. (1985)]; Transition and Translation[B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; Amimal Cell Culture[R.I. Freshiney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press, (1986)]; B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)等を参照されたい。
【００１３】
従って、ここに使われている用語は、以下に説明されるような意味を有する。
【００１４】
ここで用いられているアミノ酸は好ましくはＬ異性体形態である。しかしながら、“Ｄ”異性体形態の残基は免疫グロブリン結合の望ましい機能性特性がポリペプチドによって保有されている限り、Ｌアミノ酸残基と置換との置換が可能である。ＮＨ2はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味している。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味している。標準的なポリペプチドの命名法、Ｊ  Biol．Chem．，243：3552−59（1969）に従って、対照表にアミノ酸残基の略号を示す。
【００１５】
対照表
符号
1文字記号 ３文字記号 アミノ酸
Y              Try              チロシン
G              Gly              グリシン
F              Phe              フェニルアラニン
M              Met              メチオニン
A              Ala              アラニン
S              Ser              セリン
I              Ile              イソロイシン
L              Leu              ロイシン
T              Thr              トレオニン
V              Val              バリン
P              Pro              プロリン
K              Lys              リシン
H              His              ヒスチジン
Q              Gln              グルタミン
E              Glu              グルタミン酸
W              Trp              トリプトファン
R              Arg              アルギニン
D              Asp              アスパラギン酸
N              Asn              アスパラギン
C              Cys              システイン
【００１６】
なお、アミノ酸残基配列はここでは左右の向きがアミノ末端からカルボキシ末端への水平方向と一致する通常の方式で示されている。さらに、アミノ酸残基の始まりあるいは終端のダッシュは１つまたは複数の別の配列へのペプチド結合を示している。上の表は交互に現れる可能性のある１文字符号と３文字符号の対応を示している。
【００１７】
『レプリコン』とは、in  vivoでのＤＮＡ複製の自動的単位として機能する、つまり、それ自体の制御下で複製を行うことができる遺伝子要素（例えばプラスミド、クロモソーム、ウィルス）を意味する。『ベクター』とはそれに対して別のＤＮＡセグメントが取り付いて、その取り付いたセグメントの複製を起こさせることができるような、プラスミド、ファージ、あるいはコスミドなどのレプリコンを指している。
【００１８】
『ＤＮＡ分子』とは単鎖形態、あるいは二重鎖形態のデオキシヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシン）のポリマー形態を指している。この用語はその分子の一次及び二次構造だけを指し、三次形態については限定的意味を持たない。従って、この用語は特に線形ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウィルス、プラスミド、そしてクロモソーム内で見出される二重鎖ＤＮＡを含んでいる。以下の検討では、ＤＮＡの非転写ストランド（つまり、ｍＲＮＡと相同性を有する配列）に沿った５'−３’方向の配列だけを示す通常の方式に従う。
【００１９】
『複製の起点』とはＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。ＤＮＡ『コーディング配列』とは適切な規制配列の制御下に置かれるとin vivoでポリペプチドに転写、翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列である。このコード配列の境界は５'（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決められる。コード配列は、原核配列、真核性ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、Ｈ真核（例えば哺乳動物の）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、そして合成ＤＮＡ配列なども含む。ポリアデニル信号及び転写停止配列は通常はコーディング配列に対して３’位置に存在している。
【００２０】
転写及び翻訳制御配列はホスト細胞内でコード配列の発現をもたらすプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化信号、ターミネータなどのＤＮＡ規制配列である。
【００２１】
『プロモータ配列』とは、ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で結合させることができ、そして下流の（３'方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ規制領域である。本発明の定義に即して言えば、プロモータ配列は３'末端で転写開始サイトによって結合され、上流（５’方向）に延びてバックグランドに対して検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な数の塩基あるいは元素を取り込む。プロモータ配列内には転写抑止サイトと、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合領域（コンセンサス配列）を含んでいる。真核プロモータは、常にではないがしばしばＴＡＴＡボックスあるいはＣＡＴボックスを含んでいる。原核プロモータは−１０及び−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガノ配列を含んでいる。
【００２２】
『発現制御配列』とは別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御、規制するＤＮＡ配列のことである。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがそのコード配列をｍＲＮＡに転写し、それが次にコード配列によってコードされる蛋白質内に翻訳される場合に細胞内の転写及び翻訳制御配列の『制御下』にある。
【００２３】
『信号配列』はコード配列の近くに含まれている場合がある。この配列は信号ペプチド、ホスト細胞と交信してそのポリペプチドを細胞表面に向かわせるか、あるいはそのポリペプチドを培養液内に分泌させるＮ末端からポリペプチドをコードし、この信号ペプチドはタンパク質が細胞を出て行く時にホスト細胞によってクリップ・オフされる。信号配列は原核生物及び真核生物に天然に存在する種々のタンパク質に結合した状態で見出される。
【００２４】
本発明のプローブを指してここで使われている『オリゴヌクレチド』という用語は、２つ以上、好ましくは４つ以上のデオキシリボ核酸で構成される分子と定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、それら因子もそのオリゴヌクレオチドの最終的な機能と使用に依存している。
【００２５】
ここで使われている『プライマー』という用語は、精製制限消化におけるように天然に発生するか、合成的につくられるかには関係なく、核酸ストランドに対して相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発されるような条件下に置かれると、つまり、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在と適切な温度及びｐＨの下で合成開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを意味している。このプライマーは単鎖であってもよいが、誘発因子の存在下で望ましい延長生成物の合成を開始するのに十分な長さを有していなければならない。このプライマーの正確な長さは温度、プライマー供給源、及び使用し方法などの多くのファクターに依存している。例えば、診断目的の場合、標的配列の複雑さによって、オリゴヌクレオチド・プライマーは通常、１５−２２あるいはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それ以下の場合もある。
【００２６】
ここではプライマーは特定の標的ＤＮＡ配列のいろいろなストランドに対して『実質的に』相補的なように選択される。これはこれらのプライマーがその対応するストランドと交雑するのに十分に相補的でなければならないことを意味している。従って、プライマー配列はテンプレートの配列を正確に反映するものでなくてもよい。例えば、非相補的フラグメントをプライマーの５'末端に取り付け、そのプライマー配列の残りがそのストランドに対して相補的であるような場合もある。また、そのプライマー配列が配列と十分な相補性を有しており、それと交雑してそれによって延長生成物の合成のためのテンプレートを形成するのであれば、非相補的塩基あるいはより長い配列がプライマー内に入り込んでいる場合もある。
【００２７】
ここで用いられている『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』とは酵素であって、それぞれ二重鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列、あるいはその近くで切断するものを意味する。
【００２８】
細胞は、ＤＮＡが細胞内に誘導された場合に、それら外来性あるいは異種ＤＮＡによって『形質転換される』。ＤＮＡの形質転換はその細胞のゲノムに一体化される場合（共有結合）とされない場合がある。原核生物、例えばイースト菌や哺乳動物の細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどの上皮要素上に保持されている。真核生物の場合、安定的に形質転換される細部はその形質転換ＤＮＡがクロモソームに一体化されて、クロモソーム複製を通じて娘細胞により受け継がれるものである。こうした安定性は真核細胞のその形質転換ＤＮＡを含む娘細胞のポピュレーションで構成される細胞系統あるいはクローンを確立する能力によって示される。『クローン』とは、単一の細胞あるいは祖先から細胞分裂によって誘導される細胞のポピュレーションである。『細胞系』とは多くの世代にわたってin vitroで安定した成長を行うことができる一次細胞のクローンである。
【００２９】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％あるいは９５％）がＤＮＡ配列の定義された長さと一致する場合に、『実質的に相同』である。実質的に相同な配列は配列データ・バンクで利用できる標準的なソフトウエア、あるいは、例えば、その特定の系を定義する厳しい条件下でのサザン・ハイブリダイゼーション実験で比較することによって確認できる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、先行技術の範囲内である。例えば、上記Maniatis et al.,; DNA Cloning, Vol.I and II、Nucleic Acid Hybridization supra参照。
【００３０】
ＤＮＡ構成物の『異種』領域とは大型のＤＮＡで天然ではその大型分子と結合した状態では見られないＤＮＡの確認可能なセグメントを意味している。従って、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、この遺伝子は通常はその供給源生物のゲノムではその哺乳動物ゲノムＤＮＡには側鎖しないＤＮＡによって側鎖される。別の例で、コード配列はそのコード配列自体が天然では見られないような構成物である（例えば、そのゲノムコード配列がイントロン、あるいは天然の遺伝子とは異なったコドンを有する合成配列を含んでいるｃＤＮＡ）。対立遺伝子的変差、あるいは自然発生的な突然変異イベントはここで定義されているようなＤＮＡの異種領域は発生させない。
【００３１】
これらの研究に最も一般的に用いられるラベルは放射性元素、酵素、そして紫外線に露出されると発光する化学物質などである。多数の蛍光物質が知られており、ラベルとして用いることができる。これらには、フルオレシン、ローダミン、オーラミン、テキサス・レッド、ＡＣＭＡブルー、そしてルシファー・イエロウなどである。特殊は検出物質はヤギでつくられ、イソチオシアネートを介してフロオレシンと接合された抗ウサギ抗体である。
【００３２】
タンパク質は放射性元素や酵素でラベルすることができる。この放射性ラベルは現在利用できるいずれかのカウント手順によって検出することができる。好ましい同位元素は3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、及び186Ｒｅから選択される。
【００３３】
酵素ラベルも同様に有益であり、比色、分光光度、あるいは蛍光分光光度、電流測定、あるいはガス測定技術などで検出することができる。酵素はカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応で選択された粒子に接合される。これらの手順で用いることができる多くの酵素が知られており、利用することができる。好ましいのはペロキシダーゼ、β−グルラルアルデヒド、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース・オキシダーゼ＋ペロキシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号；３，８５０，７５２号；及び４，０１０，０４３号にラベリング用物質及び方法が開示されているので参照されたい。
【００３４】
先行技術で開発され利用されている特定のアッセイ・システムが受容体システムとして知られている。受容体アッセイでは、アッセイされる物質は適切にラベルされ、一定の細胞テスト・コロニーが一定量接種され、その後、ラベルされた物質がその細胞受容体に結合した程度を調べるために結合調査が行われる。こうした方法で、物質間の親和性における違いを確かめることができる。
【００３５】
先行技術で有益なアッセイは『シス／トランス』アッセイとして知られている。簡単に言うと、このアッセイは２つの遺伝子構成物を用い、そのうちの１つは通常は適切な細胞系にトランスフェクトされると特定の受容体を連続的に発現するプラスミドであり、第２のものは受容体／リガンド複合体の制御下でルシフェラーゼなどレポータを発現するスプラスミドである。従って、例えば、特定の受容体に対するリガンドとして１つの化合物を評価することが望ましい場合は、それらプラスミドの１つは選ばれた細胞株内で上記受容体の発現をもたらす構成物であり、第２のプラスミドはその特定の受容体に対する反応要素が挿入されているルシフェラーゼ遺伝子に結合したプロモータを含むことになろう。テストされる化合物がその受容体にとっての作用剤であれば、このリガンドはその受容体と複合化し、そして得られる複合体はその反応要素と結合してルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始する。そして得られる化学蛍光性を光度測定し、用量応答曲線を得て、知られているリガンドと比較する。上に述べた手順は米国特許第４，９８１，７８４号に詳細に述べられている。
【００３６】
ここで用いられている場合、『ホスト』という用語は原核生物ばかりでなく、イースト菌、植物、及び動物の細胞も含めて意味している。本発明によるエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子組換えＤＮＡ分子あるいは遺伝子を用い、当業者に知られているいずれかの技術を用いてホストを形質転換させることができる。特に好ましいのは原核生物の形質転換の目的で、本発明によるエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子のコーディング配列を含んだベクターの使用である。
【００３７】
原核生物ホストは大腸菌（E. coli）、Ｓ．チフィリミウム（S. typhimurium）、セルラティア・マルセスセンス（Serratia marcescens）、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）、及びバシラス・サブティリス（Bacillus subtillis）などでもよい。真核ホストはピチア・パストリス（Pichia pastoris）、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞などである。
【００３８】
全体として、挿入されたＤＮＡフラグメントの効率的な転写を促進するプロモータ配列を含む発現ベクターはホストとの関連で用いられる。発現ベクターは通常複製の起点、プロモータ、ターミネータ、及び形質転換された細胞内での表現型選択を行うことができる特殊な遺伝子を含んでいる。形質転換されたホストは最適な細胞成長を行わせるために公知の手段で醗酵、培養させる。
【００３９】
本発明はエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードするほぼ純粋なＤＮＡを含み、そのＤＮＡのストランドはかなり厳しい条件で（配列番号６）の少なくとも１５の連続したヌクレオチドの配列を含むプローブとハイブリダイズする。本発明によるＤＮＡでコードされたタンパク質は図３で示されているヌクレオチド（配列番号７）と少なくとも８０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％）の配列同一性を有している。より好ましくは、このＤＮＡは配列番号８のコーディング配列、あるいはそうした配列の縮重変種を含んでいる。
【００４０】
本発明のＤＮＡがハイブリダイズするプローブは好ましくは配列番号８に示されている核酸のコード配列あるいはその相補体の少なくとも２０個の連続的ヌクレオチド、より好ましくは４０個のヌクレオチド、さらに好ましくは５０個のヌクレオチド、そして最も好ましくは１００個あるいはそれ以上（最大１００％）のヌクレオチドで構成される。こうしたプローブは、（ａ）その細胞から得られたｍＲＮＡをラベルされた交雑プローブと接触させるステップと、（ｂ）そのプローブとｍＲＮＡとの交雑を検出するステップで構成される方法によって、ヒト細胞内のエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質の発現を検出するのに有益である。
【００４１】
本発明は（配列番号８）に示されているヌクレオチドの領域内の少なくとも１５個の連続的ヌクレオチド（好ましくは２０、より好ましくは３０、さらに好ましくは５０、そして最も好ましくはすべてのヌクレオチド）の配列を含むほぼ純粋なＤＮＡを含んでいる。
【００４２】
『かなり厳しい』とは、例えば、およそ０．１ｘＳＳＣ、あるいはその機能的同価の塩濃度で６５℃での洗浄濃度などの高温及び低塩濃度で特徴付けられＤＮＡ交雑及び洗浄条件を意味している。例えば、かなり厳しい条件には約５０％ホルムアミドの存在下で約４２℃での交雑、１％ＳＤＳを含む約２ｘＳＳＣを用いて約６５℃での第１回の洗浄、そして、約０．１ｘＳＳＣでの約６５℃での二回目の洗浄などが含まれる。
【００４３】
『実質的に純粋なＤＮＡ』という表現はその環境の分子の一部あるいはすべてが分離されているので（部分または全体分離）、あるいは権利請求されるＤＮＡから側鎖している配列の変性によって、その内部でＤＮＡが自然に発生する環境の一部になっていないＤＮＡを意味している。従って、この用語は例えばベクターや自動複製プラスミドあるいはウィルス、あるいは原核細胞あるいは真核細胞のゲノムＤＮＡ内に組み込まれる、または、他の配列とは無関係な別個の分子として存在している（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）あるいは制限エンドヌクレアーゼ消化によってつくられるｃＤＮＡあるいはゲノム性またはｃＤＮＡフラグメント）組換えＤＮＡなどである。それは、例えば融合タンパク質など、追加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含んでいる。さらに、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子の代替スプライス変種をコードする（配列番号８）に示されているヌクレオチドの一部を含む組換えＤＮＡも含んでいる。
【００４４】
このＤＮＡは配列番号８に示されているヌクレオチドのコーディング配列に対して少なくとも７０％配列、好ましくは少なくとも７５％（例えば，少なくとも８０％）、そして最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有している。２つの配列間の同一性は一致する、あるいは同じ位置の数の直接の関数として求められる。２つの配列の両方のサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占められている場合、例えば、１つの位置がそれら２つのＤＮＡ分子のそれぞれでアデニンによって占められている場合、それら２つの配列はその箇所において同一である。例えば、１０個のヌクレオチドで構成される長さの配列内の７つの位置が第２の１０−ヌクレオチド配列の対応する位置と同じであれば、これら２つの配列は７０％配列同一性を有している。比較配列の長さは一般的には少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド、そして最も好ましくは１００ヌクレオチドである。配列同一性は通常は配列同一性ソフトウエア（例えば、Genentics  Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence  Analysis  Software  Package）を用いて測定される。
【００４５】
本発明はエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを含んでおり、そのベクターは、操作可能な結合でａ）複製の起点、ｂ）プロモータ、及びｃ）前記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むホスト内で複製を行うことができる。好ましくは、本発明によるベクターは配列番号８で示されるＤＮＡ配列の一部を含んでいる。『ベクター』とはプラスミドやウイルス核酸など複製可能な核酸構築物である。ベクターはエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする核酸を増幅及び／または発現するために用いることができる。発現ベクターはその内部でポリペプチドをコードする核酸配列が細胞内でそのポリペプチドの発現を起こすことができる適切な制御配列に操作可能に結合された複製可能な構築物である。こうした制御配列の必要性は選択された細胞と選ばれた形質転換方法に応じて変わる。一般的に、制御配列は転写性プロモータ及び／またはエンハンサ、適切なｍＲＮＡリボソーム性結合サイト、及び転写と翻訳の停止を制御する配列を含んでいる。当業者に良く知られている発現ベクターを用いて適切な転写及び翻訳制御信号を含んだ発現ベクターを構成することもできる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N. Yに述べられている技術参照。１つの遺伝子とその転写制御配列は、その転写制御配列がその遺伝子の転写を有効に制御する場合に、『操作可能に結合されている』と定義される。本発明によるベクターはプラスミド・ベクター及びウィルス性ベクターなどである。好ましいウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ結合ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、あるいはヘルペス・ウイルスなどから誘導されるものである。
【００４６】
『実質的に純粋なタンパク質』とは通常伴われている成分の少なくとも一部が分離されたタンパク質を意味している。通常、そのタンパク質は、in vivoで自然に結合されているタンパク質や他の自然発生的有機分子ない部分が重量で少なくとも６０％の場合にほぼ純粋である。好ましくは、調製物の純度は重量で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９９％である。エールリチア・カニスのほぼ純粋な１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質は、例えば、天然の供給源から抽出することによって、また、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子組換え核酸の発現によって、あるいは化学的にそのタンパク質を合成することで得られる。例えば、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質に対して固有の抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィなどのカラム・クロマトグラフィ、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動、あるいはＨＰＬＣ分析など、いずれの適切な方法ででも測定することができる。タンパク質はその自然な状態で付随する汚染因子の少なくとも一部から分離されていれば自然に含まれている成分を基本的に含んでいないとされる。従って、化学的に合成されたり、あるいは自然発生の細胞から分化した細胞系でつくりされたタンパク質は、定義上、自然会合成分を実質的に含んでいないとされる。従って、実質的に純粋なタンパク質は大腸菌、他の原核生物、あるいはそれらが自然には発生しないいずれかの他の生物で合成された真核性タンパク質を含んでいる。
【００４７】
実質的に全長のタンパク質に加えて、本発明はエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質のフラグメント（配列番号７）（例えば抗原性フラグメント）も含んでいる。ここで用いられている『フラグメント』とは、ペリペプチドについて適用された場合、通常は少なくとも１０個の残基、より一般的には少なくとも２０個の残基、そして好ましくは少なくとも３０個（例えば５０個）の残基の長さを有しているが、その長さは本来の完全なものの全長よりは短い。エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質のフラグメントは、例えば、天然の、あるいは遺伝子組換えによるエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質の酵素消化、あるいはエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質の限定的フラグメントをコードする発現ベクターを用いた組換えＤＮＡ技術、あるいは化学合成など、当業者に公知の方法を用いて発生させることができる。候補フラグメントがエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質の特徴を示す能力（例えば、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質に固有な抗体に対する結合性）はここで述べられている方法で評価することができる。エールリチア・カニスの精製された１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質あるいはエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質の抗原性フラグメントを用いて新しい抗体を発生させたり、あるいは当業者に公知の標準的な手順を用いて既存の抗体（例えば、診断アッセイにおけるポジティブ・コントロールなど）をテストすることができる。エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質あるいはエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質のフラグメントを例えばウサギなどでの免疫原としてとして用いることで発生されたポリクローナル抗血清も本発明に含まれる。この技術分野の当業者に公知のモノクローナル及びポリクローナル抗体のための標準的手順が用いられる。この手順で発生されたモノクローナル抗体を組換えエールリチア・カニスｃＤＮＡクローンを識別し、それらを公知のｃＤＮＡクローンから区別する能力を持っているかどうかスクリーニングすることができる。
【００４８】
さらに、例えば別のｍＲＮＡスプライシング、あるいは別のタンパク質処理イベントの生成物やその内部でその配列の一部が欠失している生成物など、配列番号７の一部によって少なくとも部分的にコードされたエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質も本発明に含まれる。こうしたフラグメント、あるいは本来のエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質は、例えばラベルとして機能する他のポリペプチド、リガンド、あるいは抗原性を高める手段と共有結合で結合させることができる。
【００４９】
『薬学的に受け入れ可能な』とはヒトに投与された場合に、アレルギー性あるいは同様の不都合な反応をおこさない分子体あるいは組成物を指している。タンパク質を活性成分として含んでいる水性組成物の調製はこの技術分野では十分に知られている。通常、こうした組成物は液体溶液あるいは懸濁液などの注射液、あるいは注射前に液体に溶解あるいは懸濁させることができる固体形態で調製される。こうした製剤はエマルジョン化させることもできる。
【００５０】
タンパク質は中性あるいは塩形態の組成物に調製することができる。薬学的に受け入れ可能な塩としては、例えば、塩酸あるいはホウ酸など無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、マレイン酸などの有機酸で（タンパク質の遊離アミノ基と）形成された酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基で形成された塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、あるいは水酸化鉄などの無機塩基、あるいはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導することができる。形成されたら、溶液を用量調整と同様の方法で、そして、薬学的に有効な量で投与される。この製剤は注射用溶液などいろいろな用量形態で投与される。
【００５１】
水溶液で非経口投与する場合、例えば、その溶液を必要であれば適切に緩衝すべきであり、その液体希釈物は先ず十分な生理食塩水あるいはグルコースで等張化しておかねばならない。これらの特定の水溶液は静脈、筋肉内、皮下、及び腹膜内投与に特に適している。これとの関連で、用いることができる滅菌水性媒体は本発明に照らせば当業者には自明であろう。例えば、１回分の用量を１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶かして、１０００ｍＬの皮下注射用流体に加えたり、あるいは必要な液輸サイトに注入することができる。（例えば、Remington's  Pharmaceutical Science" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-2580参照）。措置される個人の状態に応じて、用量の一定の変更は必要であろう。いずれの場合でも、投与に対して責任を有する人がその個々の個人に対する適切な用量を決めることになろう。
【００５２】
この技術分野で良く知られているように、どのポリペプチドもその免疫原性が変わる場合がある。従って、免疫原（例えば本発明によるポリペプチド）を基質と結合させることがしばしば必要になる。具体例としての好ましい基質はキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）とヒト血清アルブミンである。他の基質は種々のリンフォカイン、及びＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ８その他の助剤を含んでいる場合もある。
【００５３】
ポリペプチドを基質タンパク質に接合する手段はこの技術分野で良く知られており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド・エステル、カルボ−ジイミド、及びビス−バイアゾ化ベンジジンなどである。このペプチドがこの技術分野で公知の遺伝子操作技術でタンパク質に接合されてもよいことも理解されるであろう。
【００５４】
この技術分野で良く知られているように、特定の免疫原に対する免疫原性はアジュバントとして知られる免疫反応の不特定刺激剤を用いて強化することができる。具体的な好ましいアジュバントは完全ＢＣＧ、Ｄｅｔｏｘ（RIRB，Immunochem  Research  Inc．）、ＩＳＣＯＭＳ、及び水酸化アルミニウムアジュバント（Superphs，Biosector）などである。
【００５５】
活性成分としてペプチド配列を含んだワクチンの調製は、米国特許第４，６０８，２５１号；第４，６０１，９０３号；第４，５９９，２３１号；第４，５９９，２３０号；第４，５９６，７９２号，及び第４，５７８，７７０号に具体的に示されているようにこの技術領域では一般的に知られており、これらの資料は参照によって本明細書に組み入れられる。通常、こうしたワクチンは溶液かあるいは懸濁液の状態で注射液として調製されるが、注射前に溶液にあるいは懸濁に適した固体形状で調製してもよい。これらの調製物はエマルジョン化することもできる。これらの活性免疫原性成分はしばしば薬学的に受け入れ可能で活性成分と共存し得る賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせである。さらに、必要であれば、ワクチンは加湿剤、ｐＨ緩衝剤、あるいはそのワクチンの有効性を強めるアジュバントを少量含むことができる。
【００５６】
この１２０ｋＤａタンパク質はエールリチア種の付着因子、あるいはE.チャフェンシスの濃密核細胞の表面上に異なって発現される場合もある。エールリチア・カニスを遺伝子をＥ．チャフェンシス遺伝子から側鎖しているＤＮＡ配列から誘導されるプライマーを用いたPCRで増幅した。エールリチア・カニス遺伝子をクローンし、配列決定して、そして大腸菌内で過剰発現させた。エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質はそれぞれ３６アミノ酸で構成される１４タンデム反復単位を含んでいる。これらの反復部分のＤＮＡ配列は相互に９４％相同性である。これらの反復単位は親水性で、確立分析で表面露出されることが予測される。エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質はＥ．チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質に対して３０％相同性である。これら２つの種の１２０ｋＤａタンパク質の反復領域は表面露出が予測される共通のアミノ酸配列を共有している。組換えエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質はイヌのエールリッヒ症からの回復過程にあるイヌからの血清と反応した。
本発明はエールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子、及びその遺伝子によってコードされた組換え体タンパク質に関係している。本発明の１つの実施の形態で、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードする遺伝子が提供される。好ましくは、このタンパク質は配列番号８のアミノ酸配列を有しており、その遺伝子は配列番号７の核酸配列を有している。本発明の好ましい実施の形態で、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａ免疫反応性タンパク質をコードし、そのベクターが細胞内に導入されるとその遺伝子を発現することができる遺伝子で構成される発現ベクターが提供される。
【００５７】
本発明の別の実施の形態で、配列番号８のアミノ酸配列を含んだ組換えタンパク質が提供される。好ましくは、このアミノ酸配列は配列番号７の核酸配列によってコード配列される。好ましくは、この組換えタンパク質はそれぞれ３６個のアミノ酸で構成される１４のタンデム単複部分で構成されている。より好ましくは、この反復探知は親水性である。さらに好ましくは、この組換えタンパク質は抗原である。
【００５８】
本発明の好ましい１つの実施の形態で、プロモータに操作可能に結合された配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列で構成される発現領域を含むベクターを得るステップと、そして、その発現領域の発現に有効な条件下でその細胞を培養するステップで構成されるこの組換えタンパク質をつくる方法が提供される。
【００５９】
ここで用いられている『相補的』という用語は厳しい条件化で第１の核酸配列とハイブリダイズして二重鎖分子を形成する核酸ストランドを意味して使われている。厳しい条件とは高度の相同性と有する２つの核酸配列の交雑はかのうにするが、ランダムな配列の交雑は起きないようにする条件である。例えば、低温及び／または高イオン強度での交雑は低厳重度とされ、高温及び／または低イオン強度での交雑は高厳重度とされる。望ましい厳しさのための温度とイオン強度は特定のプローブ長さ、配列の長さ及び塩基含有量、そして混雑混合体におけるホルムアミドの存在などによって変わる。
【００６０】
ここで述べられている『操作された』あるいは『組換え』細胞とは、エールリチア・チャフェンシスをコードする遺伝子などの組換え遺伝子が導入された細胞を指している。従って、操作された細胞は遺伝子操作的に導入された遺伝子を含んでいない天然の細胞とは区別することができる。操作された細胞は従って、ヒトの手を通じて導入された１つまたは複数の遺伝子を有する細胞である。遺伝子操作的に導入された遺伝子はｃＤＮＡ遺伝子か、ゲノム性遺伝子のコピーのいずれかの形状をしており、あるいはその特定の導入遺伝子と自然には結合しないプロモータの近くに配置された遺伝子を含む。さらに、この遺伝子組換え遺伝子はホスト・ゲノムと一体化している場合もあれば、ベクター、あるいはホスト細胞にトランスフェクトされたバクテリアゲノム内に含まれている場合もある。
【００６１】
以下の実施例は本発明の異なる実施形態を説明する目的で示されており、本発明のいかなる限定をするものではない。
【００６２】
実施例１
エールリチア
エールリチア・カニス・オクラホマ株はJacqueline  Dawson博士（Centers for Disease Control, Atlanta, GA）から提供された。エールリチア・カニス・フロリダ株と３つのノース・カロライナ単離体（デーモン（Demon）,ＤＪ及びジェイク（Jake））はEdward  Ｂ．Breitschwert博士（College of Verterinary Medicine, North Carolina Sate University, Raleigh, NC）から提供されたものである。エールリチア・カニス・ルイジアナ株はＲ．Ｅ．Corstvet博士（Louisiana State University, Beton Rouge, Luoisiana）から提供された。エールリチアエはイヌのマクロファージ細胞系ＤＨ８２細胞（Dawson  JE．1991）で培養された。ＤＨ８２細胞はそれら細胞の１００％がエールリチアエによって感染された時に取出された。これらの細胞を１７，４００×ｇで２０分間遠心分離した。ペレットをＢｒａｕｎ−Ｓｏｎｉｃ２０００音波処理器を用いて４０Ｗで３０秒間、氷上で２回破砕した。この細胞溶解物を４２％−３６％−３０％レノグラフィンの断続的勾配上に負荷し、そして８０，０００×ｇで６０分間遠心分離した。重いバンド及び軽量バンド内のエールリチアエを回収して（Weiss  E,1975）、サクロース−ホスフェート−グルタミン緩衝液（ＳＰＧ、２１８ｍＭサクロース、３．８ ｍM  KH2PO4、７．２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、４．９ｍＭグルタメート、ｐＨ７．０）を用いて遠心分離することで洗浄した。
【００６３】
実施例２
ＤＮＡ調製
エールリチア・カニス・ゲノムＤＮＡをIsoQuick核酸抽出キット（ＯＲＣＡ  Research  Inc．，Bothell，WA）を用いて、メーカーの指示に従って精製されたレノグラフィン密度勾配から調製した。プラスミドＤＮＡは高純度プラスミド単離キット（Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN）を用いて精製された。ＰＣＲ生成物はQIAquick  PRC精製キット（GLAGEN  Inc．，Santa  Clarita,CA）を用いて精製した。
【００６４】
実施例３
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のＰＣＲ増幅
プライマーをＥ．チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子（配列番号１−６、図１）（Yu,X−J  1996）のＤＮＡ配列に基づいて設計した。エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子を、９４℃、３０秒間、５２℃分、及び７２℃２分を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲを行うことで増幅した。ＰＣＲ増幅生成物をｐＣＲ２．１  ＴＡクローニング・ベクター（Invitrogenn，Carlsbad，CA）内にクローンした。
【００６５】
実施例４
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡをＡＢＩ  Prism  377  DNA  Sequencer（Perkin−Elmer  Applied  Biosystems,  Foster  City，CA）で配列決定した。
【００６６】
実施例５
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の一方向性欠失
Ｓｐｅ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部分消化を用いて、エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の５’末端から反復領域を欠失させた。先ず最初に、エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の５’末端近くのプラスミド配列上に特有の切断サイトを有しているｐＣＲ１２０プラスミドをＸｂａ  Ｉで完全に消化した。そして、このプラスミドをＳｐｅ  Ｉで部分的に消化させた。Ｓｐｅ  Ｉはエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の各反復部分に特有の切断サイトを有していたが、そのプラスミド・ベクター配列を含め反復領域外では切断サイトは保有していなかった。適切な代表的部分消化を確実に行わせるために、５分間毎に消化混合物からアリコットを取出した。ＥＤＴＡを加えて最終濃度が５０ｍＭとなるようにし、７０℃で１０分間加熱することで消化を停止させた。Ｘｂａ  Ｉを用いての完全消化とＳｐｅ  Ｉでの部分的消化を行った後で、Ｘｂａ及び各Ｓｐｅ  Ｉ切断サイトとの間でいろいろな数の反復単位を取り除き（欠失させ）て、非互換末端（３’末端にはＸｂａ  Ｉ、そして５’末端ではＳｐｅ  Ｉ）を有する欠失プラスミドＤＮＡを発生させた。制限酵素で消化した混合物をＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理してそれら末端に入れた。次に、それらの分子サイズが大幅に異なっていたので、その制限混合物をアガロース・ゲル電気泳動で分離して、プラスミドを内部反復部分から分離した。欠失プラスミドの混合体をQIAquick  Gel  Extractionキット（QIAGEN  Inc．，Santa  Clatia）を用いてゲルから抽出して、Ｔ４リガーゼを用いて自己結合させた。この欠失プラスミドを大腸菌系統ＤＨ５α内に移して、そのサイズに従って配列決定のための選択を行った。また、エールリチア・カニスｋＤａタンパク質遺伝子の反復領域を、Erase−a−Base  System（Promega,Madison,ＷＩ）を用いて、そのメーカーの指示に従って３’末端から双方向欠失させた。
【００６７】
実施例６
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の反復部分の数の判定
すべてのエールリチア・カニスからのＰＣＲ増幅１２０ｋＤａ遺伝子をｐＣＲ２．１ＴＡクローニング・ベクター（Introgen）内にクローンした。この遺伝子組換えプラスミドを最初にＥｃｏｒＲで完全に消化して、次にＳｐｅ  Ｉで上に述べたように部分的に消化した。この消化混合物を１％アガロース・ゲルで分離して、ナイロン膜上に真空移送した。ナイロン膜上のＤＮＡバンドをエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の反復領域の上流の配列から誘導したオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズさせた。ＤＮＡプローブをDIG  Oligonucleotide  Tailingキット（Boehringer Mannheim Co., Indianapolis, In）を用いてメーカーの指示に従ってディグオキシゲニン−II−dUTPを使ってラベルした。
【００６８】
実施例７
遺伝子分析
ＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列をWisconsin  GCGソフトウエア・パッケージ（Genetic  Computer  Group．Inc．，Madison，WI）とDNASTARソフトウエア（DNASTAR,Inc．，Madison,WI）を用いて分析した。推定タンパク質の信号配列をMcGeoch  （D.J.McGreoch, Virus research, 3,371, 1985）及びVon  Heijne  （von Heijne G., 1986. Nucl. Acid. Res., 14, 4683.）らの方法によって信号配列の存在を予測し、Klein, et al. (P. Klein, M. Kanehisa, and C. DeLisi, Biochem, Biophys. Acta, 815, 468, 1985)の方法で膜横断領域の可能性を検出するPROSTプログラム（World  Wide  Web  site  at  ULR：http：//psort.nibb.ac.jp）を通じて分析した。
【００６９】
実施例８
大腸菌内でのエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の発現
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子をｐＧＥＸ発現ベクター（Amersham  Pharmacia  Biotech，Piscataway,NJ）への直接クローニングはその１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列とｐＧＥＸベクターの多重クローニング・サイトの両方に適合した制限エンドヌクレアーゼ切断サイトが存在しないことから妨げられた。ヌクレオチド１７５−ヌクレオチド１９７３までのエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のコーディング領域をフォーワード・プライマー（配列番号１３）とリバース・プライマー（配列番号１４）によるＰＣＲを用いて増幅させた。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１ＴＡクローニング・ベクター（Invitrogen）にクローニングして、その挿入物の両方の末端上にＥｃｏＲ  Ｉ切断サイトを得た。組換えｐＣＦ２．１プラスミド内の挿入物はＥｃｏＲ  Ｉで切断して、アガロース・ゲルでプラスミドＤＮＡから分離した。その挿入物をQIAquick  Gel  Extractionキット（QLAGEN  Inc．，Santa  Clarita）を用いてアガロース・ゲルから抽出して、ＥｃｏＲＩ消化ｐＧＥＸベクター内にクローンした。エールリチア・カニスタンパク質は大腸菌ＢＬ２１系統内でＧＳＴ−融合タンパク質として発現された。ＣＳＴ融合タンパク質はGlutathione  Sepharose  4Bビーズ（Amersham  Pharmacia  Biotech,  Piscataway,NJ）を用いてアフィニティー精製した。エールリチア・カニス１２０ｋＤａ組換えタンパク質はトロンビンデＧＳＴ−融合タンパク質から切断された。
【００７０】
実施例９
マウスの免疫化
マウスを組換えエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質を用いて免疫化して抗血清をつくりだした。第１回の注射のためにこの組換えｐ１２０タンパク質を等体積のフロインド完全アジュバントと混合し、次の注射のためのフロインド不完全アジュバントと混合した。１２０ｋＤａタンパク質とＧＳＴの遺伝子組換え融合体５０μｇを用いて腹膜内あるいは皮下注射を用いて各４回づつ注射してマウスを免疫化した。
【００７１】
実施例１０
エールリチア・カニス１２０−ｋＤａタンパク質遺伝子の検出
サザーン・ブロッティングを用いて、エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子を検出することを試みた。ＰＣＲプライマｐｘｃｆ３ｂ（配列番号３）及びｐｘａｒ４（配列番号５、図１）のペアを用いてＥ．チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子から増幅された１．２ｋｂＤＮＡフラグメントをディグオキシゲニン−ｄ−ＵＴＰでラベルして、サザン・ブロットによるエールリチア・カニス内の相同遺伝子検出のためのプローブとして用いた。サザン・ブロットはＥ．チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子プローブがＥｃｏＲ  Ｉで消化したエールリチア・カニス・ゲノムＤＮＡと、そのプローブがＥ．チャフェンシス・ゲノムＤＮＡと強力に交雑する条件で、ＥｃｏＲ  Ｉで消化したエールリチア・カニス・ゲノムＤＮＡとはハイブリダイズできなかったことを示した。この結果はエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子が相同性のＥ．チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子とはかなり違っていることを示唆した。
【００７２】
エールリチア・カニスとエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の全体的な類似性は低いけれども、それらが両方の１２０ｋＤａタンパク質遺伝子と増幅するであろうＰＣＲプライマーを設計するために用いることができるであろういくつかの保存領域を含んでいるであろうと考えられた。従って、エールリチア・カニス（オクラホマ系統）内の１２０ｋＤａタンパク質の相同性遺伝子をＰＣＲによってさらに増幅した。エールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子から誘導されたプライマーとその遺伝子から側鎖した配列はこれまでにもエールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の配列決定のために用いられている（図１）。３つのフォーワード・プライマー（配列番号１−３）を３つのリバース・プライマー（配列番号４−６）とペア化して９ペアのプライマーを形成した。ＰＣＲの結果は、エールリチア・カニスＤＮＡはエールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のコード領域内のプライマーによっては増幅されないことを示した。２．５ｋｂ  ＤＮＡフラグメントはエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子を側鎖している非コーディングＤＮＡ配列から誘導されたプライマー・ペア、ｐｘｃｆ２−２及びｐｘａｒ３によってエールリチア・カニス・ゲノムＤＮＡから増幅された（図１）。
【００７３】
実施例１１
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子内の反復単位の数の判定
サザン・ブロットを用いてエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子がいくつの反復単位を有しているかを示した。オクラホマ系統の１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列の制限酵素分析を行ったところ、すべての反復部分は特有のＳｐｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ切断サイトを有していることを示した。ｐＣＲ１２０プラスミド内の挿入物をＳｐｅ  Ｉで部分的に消化した。エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のＳｐｅ  Ｉによる部分消化は３種類のＤＮＡフラグメント：５’末端非反復配列を有する反復部分、内部的反復部分、及び３’末端非反復配列を有する反復部分をつくりだした。Ｓｐｅ  Ｉ部分消化を行った後、その遺伝子の５’末端非反復配列を有するすべてのＤＮＡ配列は同じ箇所（その遺伝子の５’末端）から始まっていたが、種々の反復部分内部で終わっていた。これらのＤＮＡフラグメントをそれらの反復数に対応するそれぞれの長さに従ってアガロース・ゲルで分離した。ＤＮＡをナイロン膜上に移して、ＤＩＧでラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるために用いた。このオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を反復領域の上流のヌクレオチド３８−５９からのＤＮＡ配列から誘導された。従って、このオリゴヌクレオチドはその遺伝子の５’末端を有しているＤＮＡフラグメントとだけハイブリダイズしたが、内部反復あるいはその遺伝子の３’末端を有する反復部分とはハイブリダイズしなかった。従って、オリゴヌクレオチド・プローブによって検出されたバンドの数は反復部分の数を示している。サザン・ブロッティングはエールリチア・カニスにおいて１０８ｂｐづつの１４のバンドで構成される梯子状構成が明らかになった（図２）。これらの結果はエールリチア・カニスがそれぞれ１０８ｂｐづつの１４の反復部分を有していることを示した。
【００７４】
実施例１２
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列分析
ＰＣＲ増幅エールリチア・カニスＤＮＡフラグメントをｐＣＲ２．１ベクターでクローンした。得られた組換えプラスミドをｐＣＡ１２０と命名した。ｐＣＡ１２０プラスミドＤＮＡはエールリチア・カニスＤＮＡ挿入物の配列決定に使われた。ＤＮＡ配列は最初その挿入物を側鎖しているＤＮＡ配列に対して相補的なＴ７及びＭ１３逆プライマーを用いて得た。その後のＤＮＡの配列決定はその挿入物を含むプライマーとｐＣＡ１２０プラスミド内でのその挿入物の制限ヌクレアーゼあるいはエグゾヌゥレアーゼＩＩＩ単方向欠失によって行われた。ＤＮＡ配列分析の結果は、そのＤＮＡ挿入物は６８８個のアミノ酸（配列番号８）をコードしている２０６４個のエンドヌクレアーゼ（配列番号７）の開放読取りフレーム（ＯＲＦ）を含んでいることを示した。この開放読取りフレームはエールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子と命名した。その遺伝子の５’末端の近くに大腸菌プロモータのコンセンサスＤＮＡ配列は見られなかった。推定されたそのアミノ酸のＮ末端は大腸菌信号ペプチドとのコンセンサス配列を共有していなかった。このエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子内には１４個のタンデム反復部分が存在する。核反復部分はそれぞれ３６個のアミノ酸をコードする１０８個のヌクレオチドで構成されていた（図３）。すべてのアミノ酸相同性は９４％以上であった（図４）。最初の反復部分の前に７つのアミノ酸が欠失しており（図３）、他の反復部分と７０％しか相同性のない不完全な反復部分が存在している。
【００７５】
ジーンバンクデータベースでのＦａｓｔＡプログラムで調べたところ、このエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子はそのデータベース内のいずれの公知の配列とも有意な相同性を持っていないことが明らかになった。１２０ｋＤａタンパク質におけるエールリチア・カニス（配列番号１０）とエールリチア・チャフェンシス（配列番号９）のアミノ酸相同性は３０％である（図５）。これらの１２０ｋＤａタンパク質はそれらのＮ末端と反復領域により多く保存されている。アミノ酸相同性は、エールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質のＮ末端の最初の３２個のアミノ酸に関しては５０％である。ＤＮＡ配列相同性はこれら２つの種の１２０ｋＤａタンパク質遺伝子に対しては５８％である。Ｅ．カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の３４０ｂｐ上流の非コーディング配列ＤＮＡの配列を決定したところ、エールリチアのこの２種の１２０ｋＤａタンパク質遺伝子に隣接した非コーディングは８４％の相同性を有していることがわかった。
【００７６】
実施例１３
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質の予想された位置と抗原性
エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の推定されたアミノ酸配列の疎水性、表面確率、及び抗原性についてLasergeneソフトウエア（DNASTRA  Inc．，Madison，WI）のProteinプログラムを用いて分析した。すべての反復単位は親水性で表面露出していることが予想される（図６）。エールリチア・カニスとエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質を比較すると、両方のタンパク質のすべての反復部分が表面露出されていることを示した。これら反復部分の表面露出領域は２つのエールリチア種で共通のアミノ酸を有している（配列番号１１〜１２、図７）。これらの結果は、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質が外膜タンパク質であることを示唆している。これらの反復部分の親水性アミノ酸はそのタンパク質の表面露出部分である可能性がある。
【００７７】
抗原性決定因子である可能性を示唆するＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ法によってタンパク質を分析したところ、エールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシス両方の１２０ｋＤａタンパク質は高い抗原性がある可能性が高いことを示した（図６）。Ｔ−リンパ球抗原性決定因子の可能性部分を示すＲｏｔｈｂａｒｄ−Ｔａｙｌｏｒ法によるこれらタンパク質の分析は、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質が少数の予想されたＴ細胞エピトープを有しておりそれらすべてが反復領域外側の配列上に配置されていることを示した。対照的に、エールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質の各反復部分は２つのＴ細胞エピトープを有していた。
【００７８】
実施例１４
エールリチア・カニスの他の株における相同性遺伝子
ＰＣＲを用いて他の株のエールリチア・カニスから１２０ｋＤａタンパク質遺伝子を増幅させた。２．５ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをフロリダ、ルイジアナ、及び３つのノース・カロライナ系統のイヌからの単離物：デーモン、ＤＪ、及びジェイクを含むすべてのエールリチア・カニスからＰＸＣｆ２−２及びＰＸＡｒ３を用いて増幅した。すべてのエールリチア・カニス株の１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のセグメントを５’末端と３’末端上で配列決定した。ＤＮＡ配列の分析を行ったところ、この反復領域の上流及び下流のＤＮＡ配列はエールリチア・カニスのすべての株で同じであることを示した。配列決定のために遺伝子を欠失させねばならなかったので、すべてのエールリチア・カニス株の完全な反復領域の配列決定を行うことはできなかった。すべての株の最後の反復部分とＤＪ株の最初の反復部分について配列決定された。ＤＪ及びオクラホマ株の最初の反復部分の配列は同じであった。最後の配列はすべての株で同じであった。すべてのエールリチア・カニス株の１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の相同性はさらにそれらの同一のＳｐｅ  Ｉ制限物理マップによってさらに示された（図８）。
【００７９】
実施例１５
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロット
エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子を大腸菌内で過剰発現させた（図９）。１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の反復領域全体を含む１６２０ｂｐ  ＤＮＡフラグメントによってコードされた組換えタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。ＳＤＳゲルでの融合タンパク質の推定分子サイズは約１４０ｋＤａで、これはそのＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸に基づいた７３．６ｋＤａというＥ．カニス１２０ｋＤａタンパク質全体の推定分子量よりずっと大きい（図９）。組換え１２０ｋＤａタンパク質に対するマウス抗体はエールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質と反応した（図１０）。イヌの抗エールリチア・カニス血清は組換えエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質とも反応した（図１１）。
【００８０】
実施例１６
考察
エールリチア種は常に細胞内バクテリアであるが、エールリチアの付着因子も侵入遺伝子も確認されなかった。エールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子はこれまでにもクローンされ、配列決定されている（Ｙｕ、１９９７）。エールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質は最近エールリチア・チャフェンシスのデンスコア超構造形態で優先的に発現される外膜タンパク質であるが細網細胞では発現されないことが示された。１２０ｋＤａタンパク質を発現する大腸菌の非侵入性、非付着性株は培養された哺乳動物細胞に侵入、付着する能力を獲得した。これらの結果は、この１２０ｋＤａタンパク質が付着因子あるいは侵入因子であり得て、従ってワクチンの候補であることを示唆した。
【００８１】
エールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシスは遺伝子的、及び抗原性的に非常に関連性の高い種である。エールリチア・カニスとエールリチア・チャフェンシス間の相同性は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に関しては９８％、そしてｎａｄＡ遺伝子に関しては８９％である（Ｙｕ，１９９７）。この１２０ｋＤａタンパク質はエールリチア・チャフェンシスの付着及び侵入において重要な役割を果たしているようであり、これら２つのエールリチア種は相互に密接に関連しているので、エールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の類似物がエールリチア・カニス内にも存在しており、同様の生物学的機能を果たしている可能性があるという仮説が提出された。この仮説はエールリチア・チャフェンシス遺伝子から誘導されたプライマーを用いてエールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子をＰＣＲ増幅することによって確認された。しかしながら、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のＤＮＡ相同性はエールリチア・チャフェンシスの相同性遺伝子とはかなり違っていた。エールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の相同性はわずか３０％である。これら２つのエールリチア種の遺伝子の低相同性はエールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子プローブを用いてのエールリチア・カニスＤＮＡのサザン・ブロッティングにおいて交雑がおこなわれないこと、そしてエールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のコード領域から誘導されたプライマーによるエールリチア・カニス遺伝子のＰＣＲ増幅が行われないことの理由を示唆しているのかもしれない。１２０ｋＤａタンパク質遺伝子を側鎖している非コーディング配列がエールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子よる多く保存されていることは驚くべきである。進化論的な観点からすると、選択圧力下にあるコーディング配列は突然変異がその生物の生残に影響を及ぼさないことが予想される非コーディング配列より多く保存されることが予想されるであろう。
【００８２】
エールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の相同性はそれほど大きくないが、それらがそれぞれのゲノム内の類似位置にあり、３０％相同であり、特に、反復領域内で共通のモチーフを共有していることを考慮に入れて、エールリチア・カニス遺伝子はエールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質の相同物と考えられていた。しかしながら、エールリチア・チャフェンシスとエールリチア・カニスのアミノ酸配列と１２０ｋＤａタンパク質遺伝子内の反復部分の数の両方とも異なっている。エールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質はそれぞれ８０個のアミノ酸に構成される４つの反復部分を含んでおり、エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質はそれぞれ３６個のアミノ酸で構成される１４の反復部分を有している。しかしながら、両方のタンパク質の反復部分とも親水性であり、表面露出されていると予想される。これら２つのタンパク質の反復部分における表面露出された領域の総数は反復部分数の違いにもかかわらず非常に関連性が高い。両方のタンパク質の反復単位は親水性でこれらのタンパク質の表面露出された領域の核を形成している同じアミノ酸で構成される共通モチーフを共有している。両方のタンパク質の反復単位はセリン及びグルタミン酸を多く含んでいる。セリンとグルタミン酸はそれぞれエールリチア・チャフェンシス反復単位のアミノ酸の１９％を構成している。グルタミン酸とセリンはエールリチア・チャフェンシスの反復単位のアミノ酸の２２％と１５％をそれぞれ構成している。エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質のアミノ酸のＮ末端ではＰＳＯＲＴタンパク質位置決定予想プログラムでは信号配列は見出されなかったが、エールリチア・カニスの１２０ｋＤａタンパク質は、これも信号配列が存在していないエールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質と同様の表面露出タンパク質であると考えられている（Yu，１９９７）。
【００８３】
エールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質と同様、エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質の予想分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の電気泳動移動性で見積もられた分子サイズよりずっと大きい。アナプラズマ・マルギナレ（Anaplasma marginale）（Allred  DR  et  al，1990）、プロスモジウム（Plasmodium）（Kemp  DJ，1987）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（Hollingshead,  1986，Signas  1989）、及びヒト顆粒球エールリチア（ＨＧＥ）の１００ｋＤａ及び１３０ｋＤａタンパク質（Storey  JR  1998）などを含む反復領域を含む他のタンパク質についても同じ現象が報告されている。ＨＧＥ１００ｋＤａ及び１３０ｋＤａタンパク質の反復単位はエールリチア・チャフェンシス１２０ｋＤａタンパク質のものと共通の配列を有している（Storey，1998）。エールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質の異常な移動は、その分子量が予想されたアミノ酸の総分子量より大きいので、一定のアミノ酸が高い割合で存在していても起きない。１２０ｋＤａタンパク質の異常な移動はグリコシル化などタンパク質の翻訳後の修飾に関係している可能性が高い。エールリチア・カニス及びエールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質の翻訳後修飾については現在調査中である。エールリチア・チャフェンシスの１２０ｋＤａタンパク質はエールリチア・チャフェンシスの異なった超構造形態では異なって発現されたので、このタンパク質はエールリチア・チャフェンシス感染の病原において一定の役割を果たしている可能性がある。エールリチア・カニス１２０ｋＤａタンパク質がエールリチア・カニスの濃密核細胞内で優先的に発現されるのかどうかについても現在調査中である。ほとんどのエールリチア・カニス株の１２０ｋＤａタンパク質遺伝子は完全に配列決定は行われてはいないが、非反復領域と最初及び最後の反復部分を含む分かっている配列がこれらの株において同じであるという事実に基づいて、この１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の配列がエールリチア・カニスのすべての株で同じであると想定するのは妥当であろう。エールリチア・カニスの株間で１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列の高度の相同性と反復部分の数が同じであることは、エールリチア・カニス系統が、１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の反復部分の数が株間で違いを示すエールリチア・チャフェンシスと比較して、遺伝子的に多様性の程度が低いことを示唆した。
【００８４】
本明細書では以下の文献を引用した。
1.  Allred, D. R., et al., 1990.  Proc. Natl.  Aca.  Sci.  USA.  87:3220-40
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4.  Bakken, J. S., et al., 1994.  JAMA. 277:212-8.
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26.  Yu, X-J., et al., 1997.  FEMS Microbiol Letters, 154:53-8
【００８５】
本明細書で述べられているすべての特許あるいは刊行物は本発明が関係している技術分野の当業者のレベルを示している。これらの特許と刊行物はそれらが具体的、個別的に参照によって本明細書に組み込まるのと同じレベルで、全体としても本明細書に組み込まれる。
【００８６】
当業者であれば、本発明は上に述べた、そしてそれらの本質的に関連した課題を実行し、目的と利点を達成するのによく適合していることは容易に理解できるであろう。本実施例はここに述べられている方法、手順、措置、分子、及び具体的な化合物と共に現段階での好ましい実施の形態を示すものであり、本発明の範囲の限定は意図していない。当業者は特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲内に含まれる変更や他の使用法は想起できるであろう。
【００８７】
本発明の上に述べた特徴、利点、及び目的をより詳細に理解できるように、上に要約的に説明したより具体的な発明の具体的な説明を添付された図面に示されるいくつかの実施の形態を参照して以下に説明する。これらの図面は明細書の一部を形成するものである。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、従ってその範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はＥ．チャフェエンシス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド・プライマーのＤＮＡ配列及び位置（白い四角）とその遺伝子から分岐しているＤＮＡ配列（線）を示している。プライマーの位置は１２０ｋＤａタンパク質遺伝子のぞれぞれ上流と下流のＤＮＡ配列を−と＋で示す。プライマーの９つのペアが各フォーワード・プライマー（配列番号１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１−３））を各リバースプライマー（配列番号４−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：４−６））と組み合わせて形成し、ＰＣＲでエールリチアエ・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子を増幅させるために用いた。
【図２】  図２ＡはＥ・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子の反復単位のアガロース・ゲル電気泳動を示す。ｐＣＡ１２０は最初にＥｃｏＲＩで消化して挿入物を放出させ、その後、いくつかの時点でＳｐｅ  Ｉで消化した。図２Ｂは反復部分の数を判定するためのサザン・ブロットを示している。パネルＡのゲルからのＳｐｅ  Ｉで３５分間消化したＤＮＡをナイロン膜に移して、エールリチアエ・カニス１２０ｋＤａタンパク質遺伝子につながったデゴキシゲニンでラベルしたオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズさせた。ＮＤ＝非消化ＤＮＡ。
【図３】  図３はＥ・カニス１２０ｋＤａ遺伝子（配列番号７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））のＤＮＡ配列と論理的に演繹されたアミノ酸（配列番号８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））を示している。核酸配列１、３、５、７、９、１１及び１３に下線を付してある。
【図４】  図４はＥ・カニス１２０ｋＤａ遺伝子の反復単位の系統樹を示している。スケールはＤＮＡ配列の相違度％を示す。
【図５】  図５はＥ・カニスの１２０ｋＤａ遺伝子タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０））とＥ．チャフェエンシスの１２０ｋＤａ遺伝子タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））の位置的整合を示している。バーは同じアミノ酸を示している。コロンは保存された置換部分を示している。
【図６】  図６はＥ・カニス及びＥ．チャフェエンシスの１２０ｋＤａ遺伝子タンパク質の表面確率及び疎水性を示している。矢印間の領域は反復領域を示している。両方のタンパク質のすべての反復は親水性で、表面露出されている。Ｅ・カニス１２０ｋＤａタンパク質の第２の反復単位とＥ．チャフェエンシス１２０ｋＤａタンパク質の第１の反復単位のピークは２つの矢印の間にあり、図７に拡大して図示してある。
【図７】  図７はＥ．カニスとＥ．チャフェエンシスの１２０ｋＤａタンパク質の反復単位の表面露出アミノ酸の比較を示している。図７Ａはアミノ酸の表面確立を示している。対応する領域は図６で２つの矢印で示してある。太字はＥ・カニスとＥ．チャフェエンシスとの間の保存アミノ酸を示している。図７ＢはパネルＡ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１１−１２））に示されているアミノ酸配列の位置的整合を示している。バーは同じアミノ酸を示す。点は保存された置換部分を示す。
【図８】  図８はＳｐｅ  Ｉで部分的に消化されたすべてのＥ．カニス株のＥ．カニス１２０ｋＤａ遺伝子のアガロース・ゲル電気泳動を示している。組換えｐＣＲ２．１プラスミドは最初にＥｃｏＲ  Ｉで消化されて、ベクターからの挿入物を放出し、その後、Ｓｐｅ  Iで部分的に消化される。非消化：オクラホマ系統１２０kDa遺伝子ＤＮＡはＥｃｏＲ  Ｉで消化されたが、Ｓｐｅ  Ｉでは消化されず、挿入物のサイズが示された。
【図９】  図９Ａは大腸菌発現Ｅ．カニス１２０ｋＤａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。１：ＧＳＴ融合タンパク質；２：ＧＳＴ融合タンパク質からトロンビンによって切断されたＥ．カニス組換え１２０ｋＤａタンパク質。図９ＢはＥ．カニス１２０ｋＤａタンパク質を発現するｐＧＥＸプラスミドのアガロース・ゲル電気泳動を示している。挿入物を矢印で示している。
【図１０】  図１０はＥ．カニス抗原と反応されたマウス抗Ｅ．カニス１２０ｋＤａ組換えタンパク質血清（線１）と１２０ｋＤａ遺伝子組換えタンパク質（線２、矢印）を示す。
【図１１】  Ｅ．カニスの組換え１２０ｋＤａタンパク質と反応させたイヌ回復期血清のウエスタン・ブロットである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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