(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列で示されるアースロバクター アウレッセンスからの組み換えＬ−Ｎ−カルバモイラーゼのタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−Ｎ−カルバモイラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を有するベクター。
【請求項４】
請求項２記載の遺伝子を有するプラスミド。
【請求項５】
請求項２記載の遺伝子を有するゲスト細胞。
【請求項６】
請求項１記載のカルバモイラーゼを使用するＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
Ｎ−カルバモイルアミノ酸もしくはＮ−ホルミルアミノ酸を変換する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｎ−カルバモイルアミノ酸を、ヒダントイナーゼを使用して相応のヒダントインから製造する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
使用されるヒダントインを酵素的または化学的な方法によって恒常的にラセミ化する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
酵素反応用膜型リアクターで実施する、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
使用される酵素を担体に固定化する、請求項６、７または８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
組み換えＬ−Ｎ−カルバモイラーゼをＥＡＨ−セファロースに共有結合的に固定化する、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はアースロバクター アウレッセンス（Arthrobacter aurescens）からの新規の組み換え（ｒｅｃ−）Ｌ−Ｎ−カルバモイラーゼならびに該カルバモイラーゼを使用するＬ−アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
新規のｒｅｃ−カルバモイラーゼによって有利に製造できるＬ−アミノ酸は、例えば医薬品の有機合成のために重要なキラル出発材料であり、もしくはヒトおよび動物の栄養に重要性を有している。
【０００３】
相応のヒダントインからヒダントイナーゼによって提供されるＤ，Ｌ−カルバモイルアミノ酸のＬ−Ｎ−もしくはＤ−Ｎ−カルバモイラーゼによる立体選択的分割の有利な可能性によって、今までは工業的規模におけるＬ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の製造方法の確立がもたらされた。種々の微生物株に関して、Ｌ−特異的カルバモイラーゼの存在の証明がなされた（オガワ他（Ogawa et al）．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｌ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍ．１９９７，２，１６３−１７６；シルダック他（Syldatk et al）．ｉｎ Ｄｒａｕｚ，Ｋ．およびＷａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．：有機合成における酵素触媒（Enzyme Catalysis in Organic Synthesis），ヴァインハイム：ＶＣＨ−出版，１９９５）。
【０００４】
また株アースロバクター アウレッセンスの細胞中のＬ−Ｎ−カルバモイラーゼ活性の存在も既に久しい以前から知られている。更に該カルバモイラーゼを均一な形で単離することおよびＮ−末端配列を規定することに成功している（Lit. siehe Artikel; Mueller, Doktrarbeit TU Braunschweig 1990）。ただし該酵素をコードする遺伝子は知られておらず、かつそれに応じて今までのところクローニングされていなければ、過剰発現もされていない。従って組み換え酵素もしくはそのアミノ酸配列またはそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは文献において知られていない。文献から今までのところ３種の組み換えにより製造されたＬ−カルバモイラーゼを挙げることができる（Batisse et al., Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 763-766; Mukohara et al., Biosci. Biotechn. Biochem. 1993, 57, 1935-1937; Watabe et al., J. Bacteriology 1992, 174, 962-969）。ただし、そこに挙げられるＬ−Ｎ−カルバモイラーゼは比較的不安定であり、従って大規模な工業的方法での使用に適していない。
【０００５】
アースロバクター アウレッセンス（Ａ．ａ）からのＬ−特異的なカルバモイラーゼは今まで、Ｎ−カルバモイルアミノ酸から遊離Ｌ−アミノ酸への分割のために、主に均一に精製された酵素としてか、または遊離のまたは固定化された全ての休眠細胞の形でのみ使用されていた。後者の方法においては、同様の根本的な問題が生じる。それに加えて、就中輸送制限（特にＮ−カルバモイル−アミノ酸に関して）、場合により副反応（形成したアミノ酸の他の存在する酵素による分解）ならびに汚染が生じ、これによって使用される全細胞の溶解で生成物が汚染され、かつ費用のかかる精製手順が必要となる。
【０００６】
両者の使用形において、Ａ．ａからのＬ−Ｎ−カルバモイラーゼは非常に不安定であり、このことは休眠した固定化細胞を使用する場合には酵素の天然のタンパク質の代謝回転に起因している（Siemann, Doktorarbeit TU Braunschweig 1992）。均一に精製した酵素として使用する場合には不安定性は明らかにタンパク質濃度および塩含量の不可避の変化に起因している。更に、酸化に対する野生型の酵素の感受性が認められる。更に野生株からのカルバモイラーゼの精製において非常に僅かな２．７％の収率が達成されるに過ぎない（Mueller Doktorarbeit TU Braunschweig 1990）。前記の僅かな収率および不可避の精製法ならびに今まで内在していた酵素の不安定性は、Ｌ−アミノ酸を得るための競合可能な工業的方法での使用を妨げている。
【０００７】
従って本発明の課題は、従来のＬ−カルバモイラーゼおよび今までアースロバクター アウレッセンスから製造可能であったＬ−カルバモイラーゼと比較してより安定なＬ−カルバモイラーゼをより単純な形およびより良好な収率で得ることである。但しその際には工業的規模の方法が使用される触媒の邪魔をする更なる要求、例えば基質に関する活性または選択性および立体化学等は悪影響を与えない。
【０００８】
より詳細でないが、従来の技術から容易に判明する課題は、請求項１の対象である酵素によって解決される。請求項２において、そのアミノ酸配列が保護され、請求項３においては、それに由来する遺伝子配列が保護されている。請求項４は該遺伝子配列によって改変されたベクターに関し、請求項５は相応のプラスミドに関し、かつ請求項６は改変されたゲスト生物（guest organism）もしくはゲスト生物の細胞に関する。
【０００９】
請求項７から請求項１０は、本発明による酵素の使用下にＬ−アミノ酸を製造するための方法を含んでいる。
【００１０】
アースロバクター アウレッセンスもしくはその突然変異体からＬ−Ｎ−カルバモイラーゼを組み換えにより製造することによって、非常に良好な＞９０％の収率およびより非常に高い純度で、先行技術のカルバモイラーゼに対して当該生体内変換に関してより良好な活性およびより非常に良好な立体選択性にもかかわらずよりはるかに高い安定性を有するＬ−カルバモイラーゼが得られる。これらの事実は、Ｌ−アミノ酸の製造のための大規模な工業的方法におけるカルバモイラーゼの効果的な使用のために必須である。
【００１１】
安定性の研究において、均一に精製されたカルバモイラーゼは５０℃でほんの数分だけ活性を有することが見いだされた（Mueller Doktorarbeit TU Braunschweig 1990）。他方、ｒｅｃ−カルバモイラーゼは数時間にわたって活性である。３７℃ではｒｅｃ−カルバモイラーゼは約１００時間わたって不変である（図２）。このことは決して予測可能ではなく、それにも拘わらず更に有利である。
【００１２】
更に、前記の組み換えカルバモイラーゼの使用は初めて、（Ｄ，Ｌ）−Ｎ−カルバモイルアミノ酸を介する酵素的な生体内変換によってβ−アリール置換されたＬ−アミノ酸を大規模な工業的に得る可能性をもたらしている。当該カルバモイラーゼは、今まで知られているカルバモイラーゼのただ一つとして高いＬ−エナンチオ選択性の他にβ−アリール置換されたＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸を大規模な工業的方法のために十分な量で変換する可能性を提供する。本発明による酵素によって変換するために、起源である（Ｄ，Ｌ）−ホルミルアミノ酸も適当である。これから同様に有利には遊離Ｌ−アミノ酸も得られる。
【００１３】
アースロバクター アウレッセンスおよびその突然変異体からの組み換えＬ−Ｎ−カルバモイラーゼを特徴化したアミノ酸配列は、先行技術から知られているＬ−Ｎ−カルバモイラーゼのアミノ酸配列と僅かに３８％の一致を有するにすぎない。新規かつ本発明による、アミノ酸配列をコードする遺伝子配列は自体公知の生化学的方法によって製造することが可能である。同様に該遺伝子配列を有するベクター、プラスミドもしくはゲスト生物細胞が新規かつ独創的である。有利なプラスミドはｐＡＷ１６およびｐＡＷ１７８−２（図１）であり、有利なベクターはｐＪＯＥ２７０２である。ゲスト細胞としては原則的に当業者に公知であり、かつ目的のために考慮の対象となる全ての微生物を使用できるが、有利にはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９またはＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０である。
【００１４】
発現の誘導は原則的に当業者に公知の全ての方法で達成できる。しかしながらラムノース系、ＩＰＴＧ系ならびにラクトース系が有利である。
【００１５】
アースロバクター アウレッセンスからのＬ−Ｎ−カルバモイラーゼ遺伝子ｈｙｕＣの単離および発現は以下のように実施する。
【００１６】
アースロバクター アウレッセンスの全ゲノムを示すＥ．ｃｏｌｉ λＲＥＳＩＩＩ−ベクター中の遺伝子ライブラリーを作成し、アースロバクター アウレッセンスからの精製されたヒダントイナーゼのＮ−末端アミノ酸配列に由来するオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングした。その際にアースロバクター アウレッセンスからの７．６ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＷ１６が得られた。そのヌクレオチド配列を完全に決定した。該ヌクレオチド配列からヒダントイナーゼ−遺伝子を同定した。ヒダントイナーゼ−遺伝子ｈｙｕＨのＣ−末端に接して他の読み枠が同定され、その際、誘導されるアミノ酸配列はシュードモナス種およびバシラス ステアロサーモフィルスからのＮ−Ｌ−カルバモイラーゼにホモロジーを示す。更に誘導されるタンパク質の始めの部分はアミノ酸配列決定によって決定されたアースロバクター アウレッセンスから精製されたＬ−Ｎ−カルバモイラーゼのＮ−末端と一致を示す。カルバモイラーゼ−遺伝子はＰＣＲによってｐＡＷ１６から増幅し、かつＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター中に挿入した。糖類ラムノースによって誘導可能なプロモーターを介してカルバモイラーゼは組み換え細胞中でより高い量で生産可能である。
【００１７】
配列表のＤＮＡの配列番号４およびペプチドの配列番号５の配列は、Ａ．ａからのｒｅｃ−カルバモイラーゼのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を記載している。
【００１８】
Ｌ−カルバモイラーゼの突然変異体とは、当業者によって場合により個々のアミノ酸の交換によって製造されるが、Ａ．ａからのｒｅｃ−カルバモイラーゼに由来する酵素を意味し、該酵素は前記に認められた特性に関して同様に良好であるかまたは、それどころかより良好な様式で記載されている方法での使用に適当である（より良好な後処理可能性、僅かな酸化感受性等）。また突然変異体とは、ｒｅｃ−酵素へのアミノ酸もしくはアミノ酸配列の付加によって生じる酵素も意味する。その際、Ｃ−末端にＨｉｓ−ＴＡＧまたはＡｓｐ−ＴＡＧ修飾を有するものが有利である。
【００１９】
本発明によれば、前記の有利なＬ−Ｎ−カルバモイラーゼを使用して相応のＬ−Ｎ−カルバモイル−アミノ酸もしくはＬ−Ｎ−ホルミル−アミノ酸から所望のＬ−アミノ酸が製造される。既に述べたように、請求されたＬ−Ｎ−カルバモイラーゼはβ−アリール置換されたＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸もしくはＬ−Ｎ−ホルミルアミノ酸からの変換を示す。これらのキラル化合物はキラルヒダントインから、有利にはヒダントイナーゼによって製造することができる。ヒダントインの化学的もしくは酵素的ラセミ化方法の更なる使用によって、より有利には容易に製造できるヒダントインから大規模な工業的にＬ−アミノ酸を得るための方法を構成することに成功している。有利にはその際、芳香族側鎖を有する５−一置換されたキラルのヒダントインが対象である。ヒダントインの立体異性体は、場合によりラセマーゼによる前記のラセミ化工程によって恒常的に平衡化され、一方ヒダントイナーゼは相応のＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸もしくはＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸をもたらす。立体特異的な本発明によるｒｅｃ−Ｌ−Ｎ−カルバモイラーゼはＬ−アミノ酸を製造するための最終工程を果たす。それというのもＡ．ａからのヒダントイナーゼはカルバモイラーゼとは対照的に完全な立体特異性を示さないからである。前記で行われたヒダントインの立体異性体の恒常的な平衡化によって、全ヒダントインはＤ−配置もしくはＬ−配置であろうと結局はＬ−アミノ酸に変換されることが保証される。
【００２０】
有利には保護されたアミノ酸は酵素によって、いわゆる酵素反応用膜型リアクター（enzyme membrane reactor）中で変換される。酵素の安定性によって、限外濾過膜によってリアクター中に留まった酵素を何度か（＞１０回）Ｌ−アミノ酸製造のために続けて使用できることが保証される。それによって該方法に関する費用および消費が節約される。それというのも、単に基質を計量供給し、かつ生成物を分離するだけだからである。
【００２１】
選択的に酵素を担体上に固定してもよい。これはまず、ｒｅｃ−酵素を精製形で使用することができたので、より十分に高い収率で成功した。担体材料（シリカゲル、ＳｉＯ2、ＥＡＨ−セファロース、ニトロセルロース、オイパーギット(R)（Eupergit(R)）上に酵素を固定するための（共有的、吸着的など）当業者に公知の方法を全て使用できるが、カルボジイミドを介するＥＡＨ−セファロースへの共有結合が有利である。また酵素を固定床リアクター中で前記のように変性して使用することもできる。
【００２２】
以下の実施例により本発明を詳述するが、これは本発明を制限するものではない。
【００２３】
実施例：
アースロバクター アウレッセンスからの全ＤＮＡの単離：
酵母エキス培地Ｋ２（バクト−ペプトン４．０ｇ、酵母エキス４．０ｇ、グリシン７．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4２．０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4・Ｈ2Ｏ４．０ｇ、ｐＨ７．０、Ｈ2Ｏ１０００ｍｌ中）１８０ｍｌにアースロバクター アウレッセンスを接種し、かつ３０℃で振盪（２００ｒｐｍ）下にインキュベートした。細胞をゾルヴァール ＧＳＡローター（Sorvall GSA-Rotor）中で４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって回収し、ＴＥ−バッファー（１０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２０ｍｌ中でペレットを洗浄し、前記のように再度遠心分離し、かつＴＥＳ−バッファー（２５ｍＭのトリス塩酸、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のスクロース、ｐＨ８．０）１６ｍｌ中に再懸濁した。細胞溶解のために２ｍｌのリゾチーム溶液（１００ｍｇ／ｍｌのＴＥＳ−バッファー）を添加し、かつ３７℃で６０分間インキュベートした。引き続き１０％のＮａ−ラウリル−サルコシネート２ｍｌおよび２ｍｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、更に混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。次いで２０ｇのＣｓＣｌおよび０．６ｍｌのエチジウムブロミド（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、かつ３５０００ｒｐｍ、１７℃、Ｔ１２７０−ローター、４８時間でゾルヴァール−超遠心分離器中で遠心分離した。ＤＮＡをＵＶ光で同定し、使い捨ての注射器によって遠心分離管から分離し、かつ２リットルのＴＥ−バッファーに対して２時間透析した。エチジウムブロミドを２回のフェノール抽出によって、それぞれ２ｍｌの中和フェノールを使用して除去し、かつＤＮＡ溶液を再度それぞれ２ＬのＴＥ−バッファーに対して２回透析した。
【００２４】
λ遺伝子ライブラリーの構築：
アースロバクター アウレッセンスのゲノムＤＮＡ１０μｇを０．７５ユニットの制限酵素ＸｈｏＩＩを使用して３７℃で３０分間処理した。その際に、ゲノムＤＮＡは部分的にだけ切断した。該ＤＮＡを０．７％の“低融点アガロースゲル”中で分離し、該ＤＮＡをＵＶ光によって可視化し、かつ７ｋｂ〜１３ｋｂのサイズの断片を有するアガロースブロックを切り出した。アガロースブロックを６５℃で５００μｌの容量のバッファー（０．５ＭのＮａＣｌを含有するＴＥ−バッファー）中で溶解し、同量のフェノールで抽出し、かつアガロースとフェノールとを４℃での遠心分離によって１３０００ｒｐｍ、３０分間、４℃でエッペンドルフ遠心分離器中で分離した。水性フェノールを１０分の１容量の３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ６．２）および２．５容量のエタノールと混合し、−７０℃で３０分間インキュベートし、１０分間エッペンドルフ遠心分離器において遠心分離し、液体を除去し、かつ沈殿したＤＮＡを７０％エタノール１００μｌで洗浄し、空気中で乾燥させ、かつ１０μｌのＴＥ−バッファー中に再懸濁させた。λＲＥＳＩＩＩ−ベクターＤＮＡをサンブローク他（Sambrook et al）に記載されるように調製した。ファージは置換ベクターである、すなわち制限断片をベクターＤＮＡから分離し、かつ別の断片によって置き換えた。インサート無しでファージは増殖できない（Altenbucher, 1993）。前記の場合には細菌性Ｌｕｘ遺伝子を有する９ｋｂのＢａｍＨＩ−断片を、ベクターＤＮＡ１μｇを１０ユニットのＢａｍＨＩで１時間処理してベクターから分離し、該ＤＮＡを“低融点アガロース”によって分離し、λ−アームのＤＮＡを前記のようにゲルによって精製した。引き続き該ＤＮＡを、それぞれ約２５ｎｇの両側のベクターアームを２５ｎｇのＸｈｏＩＩで切断したＡ．アウレッセンスの断片を製造者（ベーリンガーＧｍｂＨ）のリガーゼバッファー１０μｌの容量および０．５ユニットのリガーゼ中で１７℃において一晩インキュベートしてライゲーションした。該混合物２μｌをインビトロ−パッケージングシステムにおいて使用し、かつファージ粒子中にパッケージングした。パッケージング混合物をサンブローク他に記載されるように両者のＥ．ｃｏｌｉ株のＥ．ｃｏｌｉ ＢＨＢ２６９０（ソニケーションした抽出物、ＳＥ）およびＢＨＢ２６８８（凍結融解抽出物、ＦＥ）から製造した。パッケージングのために７μｌのバッファーＡ（２０ｍＭのトリス塩酸、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０５％（Ｖ／Ｖ）の２−メルカプトエタノール、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、１０μｌのＦＥ−抽出物、６μｌのＳＥ−抽出物、１μｌのバッファーＭ１（１１３μｌのＨ2Ｏ、３μｌの１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．５、３００μｌの０．０５Ｍスペルミン、０．１Ｍのプトレシン、７５μｌの０．１ＭのＡＴＰ、１μｌの２−メルカプトエタノール、９μｌの１ＭのＭｇＣｌ2）および２μｌのライゲーション混合物からのＤＮＡを混合し、かつ２５℃で１時間インキュベートした。０．５ｍｌのＳＭバッファー（５．８ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５０ｍｌの１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．５、２ｇのゼラチン、１Ｌあたり）および１滴のトルエンの添加によってパッケージングを停止させた。
【００２５】
プラークハイブリダイゼーションによるヒダントイナーゼ遺伝子での組み換えファージの同定：
インビトロ−パッケージングから得られたファージ溶解物をＳＭバッファー中で約５０００ファージ／ｍｌに希釈した。０．１ｍｌの希釈したファージ溶解物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＡＰ９０のＬＢmal中の０．１ｍｌのオーバーナイト培養と一緒に室温で５分間インキュベートし、３ｍｌのＬＢmal−ソフトアガー中に取り、ＬＢプレートに注ぎ、かつ３７℃で一晩インキュベートした。（ＬＢmal：１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮａＣｌ、２ｇのマルトース、１リットルのＨ2Ｏあたり、ｐＨ７．５；ＬＢ−アガープレート：１．５％のアガーを有しマルトースを含有しないＬＢmal、ＬＢmal−ソフトアガーは０．７％のアガーを含有するＬＢmal）。その時点で認められるプラークがプレート上に発生した。アガープレート上にナイロンフィルター（キアブレン（Quiabrane）、キアゲンＧｍｂＨ（Quiagen GmbH））を載せ、それによってプラークにファージ−ＤＮＡをフィルター上で移行させた。フィルター上のＤＮＡを、変性溶液（０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ）を染み込ませたワットマンペーパー（Whatmann-Papier）を積み重ねた上にを載せることによって５分間変性させ、かつ同様に再生溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７．４）を使用して５分間再生した。該フィルターを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：８．７５ｇのＮａＣｌ、４．４ｇのクエン酸Ｎａ、１ＬのＨ2Ｏあたり、ｐＨ７．０）中で洗浄し、乾燥させ、かつ１２０℃で３０分間真空オーブン中でベーキングしてＤＮＡを固定した。次いでフィルターをハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、１％のブロッキング試薬（ベーリンガー・マンハイム）、０．１％のＮａ−ラウリル−サルコシネート、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム）を使用して３２℃でプレハイブリダイズさせた。２時間後に、放射性標識されたオリゴヌクレオチドを添加した。該オリゴヌクレオチドはＭＷＧビオテックＧｍｂＨ社（MWG Biotech GmbH）から市販されており、アースロバクター アウレッセンスからのＬ−ヒダントイナーゼのＮ−末端アミノ酸配列（ジーマン、学位論文１９９２）に由来する。
【００２６】
オリゴヌクレオチド：５’−ＡＴＧＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ／Ｇ）ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＧＴ−３’（配列１）
前記のオリゴヌクレオチド１０ピコモルを８０μＣｉのγ−32Ｐ−ＡＴＰおよび６ユニットのポリヌクレオチドキナーゼによって１０μｌの容量中で３７℃で３０分間標識し、かつ標識されたオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション溶液に添加した。３２℃で２０時間ハイブリダイズさせた。まず該フィルターを０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを使用して短時間室温で洗浄し、３２℃で３０分間洗浄し、かつもう一度０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを使用して３２℃で１５分間洗浄した。乾燥後に、オートラジオグラフィーを介して陽性ファージを見つけだした。その際に２５００のファージから、プローブとハイブリダイズした２個が単離された。そのファージの１つを更に調査した。
【００２７】
組み換えファージのプラスミドへの変換：
ベクターλＲＥＳＩＩＩはλ−遺伝子および置換断片の他にＥ．ｃｏｌｉ−プラスミドＲｔｓ１の複製開始点、カナマイシン耐性遺伝子ならびに部位特異的組み換え系（トランスポゾンＴｎ１７２１からのリゾルベース）のための２個の認識配列（ｒｅｓ）を有している。トランスポゾンの誘導体を有する特異的Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｆ’Ｌａｃ［：：Ｔｎ１７３９ ｔｎｐＲ］）の感染によってファージをその増殖において阻害し、同時にプラスミドをトランスポゾンにコードされるリゾルベースを介して置換断片と一緒にファージＤＮＡから切り出し、そしてプラスミドに変換した。組み換えファージを、プローブとハイブリダイズしたプラークから、アガープレートからプラーク領域をくり抜くことで単離した。この材料を０．５ｍｌのＳＭバッファー中に再懸濁し、かつそのファージ懸濁液０．１ｍｌを株Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｆ’Ｌａｃ［：：Ｔｎ１７３９ ｔｎｐＲ］のオーバーナイト培養０．１ｍｌと混合し、室温で５分間インキュベートし、０．１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを有するＬＢ−培地２ｍｌ中に添加し、かつローラー上で３７℃で４５分間インキュベートした。引き続きアリコートを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ−培地上にプレーティングし、かつ該アガープレートを３７℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーからプラスミドＤＮＡをキーゼル（１９８４）によって記載された方法によって単離し、かつこうしてプラスミドｐＡＷ１６が得られた。ｐＡＷ１６は７．６ｋｂのサイズのアースロバクター アウレッセンスからの断片を有する。該断片をＡＬＦシーケンサーおよびファルマシア社のオートリードTM（AutoReadTM）配列決定キットを使用して完全に配列決定し、ＧＣＧ−ソフトウェア−パッケージ（GCG-Software-Paket）のプログラムを使用して分析した。オープンリーディングフレームは、誘導されるアミノ酸配列とヒダントイナーゼの配列決定されたＮ−末端との同一性に基づいてヒダントイナーゼのための遺伝子ｈｙｕＨとして同定した。他のオープンリーディングフレームがｈｙｕＨの末端に接して同定され、これは１つの塩基がｈｙｕＨ遺伝子の終止コドンＴＧＡの前の塩基であるＧＴＧ開始コドンから始まっている。オープンリーディングフレームに由来するアミノ酸配列は、バシラス ステアロサーモフィルスＮＳ１１２２Ａ（ムコハラ他、１９９３）およびシュードモナス種ＮＳ６７１（ワタベ他、１９９２）のＮ−Ｌ−カルバモイラーゼにホモロジーを示している。更にＮ−末端アミノ酸配列はＡ．ｓからのＮ−Ｌ−カルバモイラーゼのＮ−末端配列と一致している（ジーマン（Siemann）、学位論文１９９２）。該遺伝子を、Ｎ−Ｌ−カルバモイラーゼのためのｈｙｕＨと一緒に記載した。
【００２８】
ラムノースで誘導可能なプロモーターを介するＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９におけるｈｙｕＣの発現：
Ｅ．ｃｏｌｉのＮ−Ｌ−カルバモイラーゼ遺伝子ｈｙｕＣの発現のために、該遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。プライマーＳ９５６およびＳ９５７の両者はＭＷＧビオテックＧｍｂＨから市販されている。
【００２９】
Ｓ９５６：５’−ＡＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＧＡＡ−３’（配列２）
Ｓ９５７：５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＧＡＣＧＣＣＴＣＧＴＡ−３’（配列３）
前記のプライマーによって、Ｎ−末端に酵素ＮｄｅＩのための制限切断部位を導入し、Ｃ−末端にＢａｍＨＩ切断部位を導入した。両者の切断部位は、遺伝子をベクターｐＪＯＥ２７０２（Volff et al., 1996）のラムノースプロモーターの下流に挿入するために必要である。更にアースロバクター アウレッセンスにおいて遺伝子の翻訳のために使用されるＧＴＧ開始コドンをＡＴＧ開始コドンに変換する。
【００３０】
前記の混合物を１００μｌ中で実施した。１ｎｇのｐＡＷ１６のＤＮＡを、３０ピコモルの両者のプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１６ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、６７ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．８、０．０１％のＴｗｅｅｎ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ユニットのＴａｑ−ポリメラーゼにつき使用した。増幅を３段階、９４℃１分間、５０℃１分間および７２℃１．５分間で３０サイクルでミニサイクラー（MiniCycler）ＰＴＣ１５０（Biozym Diagnostik GmbH）中で実施した。増幅した断片をＱＵＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（キアゲンＧｍｂＨ）を介して精製した。５００ｎｇの断片を製造者によって提供されるバッファー中で制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ１０ユニット使用して２０μｌの容量で１時間処理した。同様に同じ条件下でベクターｐＪＯＥ２７０２のＤＮＡを前記の酵素で処理した。これらのＤＮＡを０．７％のアガロースゲルを介して分離し、前記のように断片をゲルから単離した。それぞれ２０ｎｇのＰＣＲ断片および２０ｎｇのベクターを前記の条件下でライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡでチュン他（Chung et al）のプロトコールによってＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート（ＬＢamp）上にプレーティングした。翌日、アンピシリン耐性コロニーからプラスミドを単離し、かつ制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを使用して特徴付けた。プラスミドｐＡＷ１７８−２は所望の方向でラムノースプロモーター下にｈｙｕＣ遺伝子を有する。
【００３１】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＡＷ１７８−２におけるｈｙｕＣの発現：
ＬＢamp中のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＡＷ１７８−２のオーバーナイト培養１ｍｌを１Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中の１００ｍｌの新しいＬＢamp培地中に添加し、かつこれを水浴中で振盪（２００ｒｐｍ）下に３０℃でインキュベートした。培地の光学密度が０．５になったら（フォトメーター中で６００ｎｍの波長で測定した）、２０％のラムノース溶液１ｍｌを培養に添加し（最終濃度０．２ｇ／Ｌ）、培養を更にインキュベートした。更に９時間インキュベートした後に、Ｎ−Ｌ−カルバモイラーゼ活性がほぼ最大に達し、その比活性は基質としてＮ−Ｌ−カルバモイル−Ｌ−トリプトファンを使用して測定して１．８ユニット／粗製抽出物のｍｇである。ラムノースで誘導しなかった培養中では活性は示されなかった。
【００３２】
Ａ．ａからのｒｅｃ−Ｌ−Ｎ−カルバモイラーゼの基質スペクトルの決定：
カルバモイラーゼの基質特異性を均一に精製した酵素を使用して調査した。これは細胞破壊および層流（streamline）−ＤＥＡＥ媒体およびＭｏｎｏＱ媒体上でのイオン交換クロマトグラフィーによって得られた。それぞれの基質の溶液を１．８ｍＭの濃度で（例外  Ｎ−カルバモイル−Ｌ−メチオニン：５０ｍＭ）０．１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８．５）中で製造し、標準基質の代わりに標準活性試験で使用した。標準試験において停止のために使用されるトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の代わりに、基質Ｎ−ホルミル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−チエニルアラニンおよびＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンの場合に熱変性（沸騰した水浴中で１０分間インキュベート）によって、かつ基質Ｎ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンの場合に９００μｌのメタノールを１００μｌのアッセイ溶液中に使用した。引き続きアミノ酸の濃度をＨＰＬＣによるかもしくは比色的のいずれかでニンヒドリンとの反応もしくはＨＰＬＣによって測定した。
【００３３】
【表１】
0004445668.tif 000002
【００３４】
Ａ．ａからのｒｅｃ−Ｌ−Ｎ−カルバモイラーゼの温度安定性：
均一に精製した組み換えＬ−カルバモイラーゼは３７℃で保存した。１〜１００時間の時間間隔において、それぞれの活性測定のための標準試験を実施した。始めに測定した活性は約１００時間にわたり変化しなかった（図２）。
【００３５】
ｒｅｃ−Ｌ−Ｎ−カルバモイラーゼの固定化：
２５０μｌの酵素溶液（精製後、タンパク質濃度：２．３ｍｇ／ｍｌ）を水中の１ｍＭのＭｎＣｌ2の溶液１９．７５ｍｌで希釈した（タンパク質濃度：０．０２８ｍｇ／ｍｌ）。前記溶液からの４ｍｌを予め洗浄したＥＡＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア ビオテック、０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）で連続的に洗浄し、引き続き水中の１ｍＭのＭｎＣｌ2の溶液で洗浄した）１．５ｇに添加した。２０分間の吸着相の後に、混合物に水中の５００ｍＭのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミド−塩酸（ＥＤＣ）のカップリング溶液（ｐＨ６．０）５４５μｌを添加し（最終濃度  ＥＤＣ：６０ｍＭ）、オーバーヘッドシェイカー（overhead shaker）中で３０時間以下（有利には１５時間）振盪した。これを吸引濾過し、かつ０．２Ｍのトリスバッファー、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。最終的な洗浄溶液中で固定化物を１時間保存した。引き続き再度洗浄し（０．１Ｍのトリスバッファー、ｐＨ７．０）、そして０．１Ｍのトリスバッファー、０．１ｍＭのＭｎＣｌ2、ｐＨ７．０中に保存した。固定化酵素の活性は使用した酵素の活性と比較して１００％であった。
【００３６】
Ｎ−Ｌ−カルバモイラーゼの酵素測定：
ラムノースで誘導された細胞培養５ｍｌをヘラオイス メガヒューゲ（Heraeus Megafuge）中で３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５ｍｌのバッファー（２００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．０）で洗浄し、再度遠心分離し、１ｍｌのバッファー（２００ｍＭのトリス塩酸、０．１ｍＭのＭｎＣｌ2、ｐＨ７．０）中に取り、かつ超音波によって粉砕した（ウルトラソニックス ソニケーター、ミクロチップ、２×３０秒、デューティーサイクル５０％）。細胞の破片を遠心分離によってエッペンドルフ遠心分離器中で１３０００ｒｐｍにおいて１０分間分離した。粗製抽出物として記載される上清を酵素測定のために使用した。１００μｌの粗製抽出物または精製された酵素を３７℃まで予備加熱した、１００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．５）中の８００μｌの２ｍＭのＮ−カルバモイルアミノ酸と混合し、かつ３７℃で１０分間インキュベートした。反応を４００μｌのトリクロロ酢酸を添加することによって停止させた。沈殿したタンパク質を遠心分離によってエッペンドルフ遠心分離器中で１３０００ｒｐｍにおいて１０分間分離した。上清を引き続きＨＰＬＣにおけるか、または比色的（ニンヒドリン）に測定した。反応混合物の分離をＲＰ−１８カラムを有するＨＰＬＣ中で実施し、移動相は０．３％（Ｖ／Ｖ）のリン酸、８０％のメタノールであり、流速は１．０ｍｌ／分である。検出は２８０ｎｍの波長でのＵＶ吸収の測定によって実施した。
配列表
【００３７】
【外１】
0004445668.tif 000003
【００３８】
【外２】
0004445668.tif 000004
【００３９】
【外３】
0004445668.tif 000005
【００４０】
【外４】
0004445668.tif 000006
【００４１】
【外５】
0004445668.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はプラスミドｐＡＷ１７８−２を示している。
【図２】  図２はＡ．ａからのｒｅｃ−Ｌ−Ｎ−カルバモイラーゼにおけるインキュベーション時間に対する相対活性を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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