(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺上皮細胞、及び前立腺上皮細胞によって調整された培地を含む培養液中で真皮乳頭（ＤＰ）細胞を培養する工程を含む、ＤＰ細胞の培養方法。
【請求項２】
前記ＤＰ細胞の毛髪誘導能が維持されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記調整培地が前立腺上皮細胞の細胞株を使用して得られる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞株が樹立された細胞株である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記培養液が組み換え遺伝子及び／又はその組み換え産物を含まない、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記培養液がウイルス性ベクターを含まない、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記調整培地が使用前に凍結されている、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記調整培地が、１０μg/mlを超える総蛋白含量を有する無血清成分を含む、請求項１〜７のいずれか１記載の方法。
【請求項９】
前記調整培地が、１００μg/mlを超える総蛋白含量を有する無血清成分を含む、請求項１〜８のいずれか１記載の方法。
【請求項１０】
前記調整培地が、１mg/mlを超える総蛋白含量を有する無血清成分を含む、請求項１〜８のいずれか１記載の方法。
【請求項１１】
前記調整培地が使用前に濃縮されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記調整培地が使用前に限外濾過によって濃縮されている、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
３以上の継代のための培養液中で前記ＤＰ細胞を継代培養する工程を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
７以上の継代のための培養液中で前記ＤＰ細胞を継代培養する工程を更に含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
培養もしくは継代培養されたＤＰ細胞を採取又は単離する工程を更に含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＰ細胞が非表皮性組織に対して同種異系である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＰ細胞が非表皮性組織に対して自系である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物種の真皮乳頭（ＤＰ）細胞の長期間培養方法であって、前立腺上皮細胞、及び前立腺上皮細胞よって調整された培地を含む細胞培養液中でＤＰ細胞を培養かつ継代培養し、それによってＤＰ細胞を増殖すると同時にそれらの毛髪誘導能を維持する工程を含む、方法。
【請求項１９】
移植のための真皮乳頭（ＤＰ）細胞を提供しかつ維持するための方法であって、対象から得られたＤＰ細胞を、請求項１〜１８のいずれか１項記載の条件下で培養する工程を含む、方法。
【請求項２０】
真皮乳頭（ＤＰ）細胞、並びに
前立腺上皮細胞、及び前立腺上皮細胞によって調整された培地を含む培養液、
を含む組成物。
【請求項２１】
真皮乳頭（ＤＰ）細胞の培養のための培養液であって、前立腺上皮細胞、及び前立腺上皮細胞によって調整された培地を含み、かつ該ＤＰ細胞の毛髪誘導能を維持することができる、培養液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛髪誘導において使用するための培養細胞に関する。特に、本発明は、毛髪誘導細胞（例えば、真皮乳頭及び／又は真皮鞘細胞）を培養するための方法、当該方法に従う培養された細胞及びこれらの培養された細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の喪失は、３０代を超える男性の４０％以上及びかなりの女性を含む、多数の人々を襲っている。多くの人々は、例えば局所的に送達されるミノキシジル(登録商標)（ファルマシア）及び経口的に送達されるプロペシア(登録商標)（メルク）を含む種々の医薬その他の治療法に救済策を求めている。毛髪喪失の一つの解決策は、禿げていない頭皮部位からの毛髪を禿げた部分に移植する方法である、毛髪リンパ小節の移植である。禿げていない部位のリンパ小節は、新しい場所でもアンドロゲンに対してその低感受性を保持している。しかしながら、この方法は、禿げていない部位から取り出すことができ、毛髪のない部位に「提供する」ことができる、かなり少数の毛髪のリンパ小節に限定されている。例えば１０代の人に典型的なリンパ小節と等価な密度のリンパ小節を有する完全な形の毛髪は、毛髪のリンパ小節移植を用いても簡単には得られない。
【０００３】
真皮乳頭細胞（ＤＰ細胞）は、毛髪リンパ小節（例えば禿げていない部位由来）から取り、皮膚を構成するその皮膚の別の場所に直接移植して、新しい毛髪リンパ小節を形成することができる（Oliver, R. F., 1967, J. Embryol. Exp. Morphol. 18(1): 43-51）。この方法は、毛髪の修復のための代替的療法として開発することができる。しかしながら、当該代替的療法の開発の障害は、提供者のリンパ小節の使用可能性に関して同一の限界があるという課題である。
【０００４】
ＤＰ細胞は、慣用的条件を用いて培地中に置かれる場合に、多数増殖することができるが、当該慣用的条件下ではそれらは急速に新たな毛髪形成を誘導する能力を失う（Jahoda, C. & Oliver, R. F., 1981, Br. J. Dermatol. 105 (6): 623-7; Messenger, A. G. 1984, Br. J. Dermatol. 110 (6): 685-9）。ＤＰ細胞を保持しているものの中には、in vivoで、毛髪誘導能がそのため慣用的な細胞培養液中では欠落していることを示すものもある。ＤＰ細胞移植を用いる毛髪移植方法は、誘導能の欠落がなく細胞数を増やせる培養方法なしでは、商業的に実施できない。
【０００５】
近年、細胞数の増殖を支持し、同時にＤＰ細胞の毛髪誘導能をも維持することができる２つの方法が説明されている。第一の方法では、哺乳動物の表皮性細胞（ケラチノサイト）又はケラチノサイトとの共培養から採取された調整培地（ＣＭ）がＤＰ細胞数の増殖を支持すると共に、数々の培養継代を超えて毛髪誘導表現型の維持を支持することが判明した。この第一の方法は米国特許第5,851,831号明細書及びJ. Ivest. Dermatol. 111:767-75 (1998)に記載されている。
【０００６】
第二の方法は、ｗｎｔ促進シグナル形質導入の効果を模倣するｗｎｔ蛋白質又は薬剤の増加レベル存在下での真皮乳頭細胞の培養を記載している（国際公開第01/74164号パンフレットとして公開された国際特許出願第PCT/US01/10164号及びKishimoto et al., 2002, Genes & Development 14: 1181-85を参照）。この第二の方法では、ｗｎｔ蛋白質又はその機能性断片もしくは類縁体を、精製産物として、あるいはプロデューサー細胞中で組み換え蛋白質を発現させ、そしてｗｎｔプロデューサー細胞の増殖又はプロデューサー細胞との共培養によって調整された培地中にｗｎｔ蛋白質を提供することによって、培養液に添加する。
【０００７】
周知の方法に伴ういくつかの問題は、規制された問題、製造コスト及び技術的問題に関連する実用上の性質である。第一の方法では、一般的には、製造者は非常に多くの細胞を低温保存し、製造において使用することができる同一の性質を有する細胞のバンクを提供するだろう。当該バンクから得られた細胞は、ヒト被提供者において疾患の原因となり得る感染剤を選別する試験を含めて、安全性のためのストリンジェントな試験を経る必要があるだろう。最後には当該細胞バンクは、使い果たされ、補充される必要があるだろう、そして新しいバンクが新しい試験には求められるだろう。培養中で限られた生命を持つ単一の皮膚ケラチノサイト等の一次組織から得られた細胞株の場合には、細胞バンクの大きさは培養中の細胞の増殖能力によって制限されるだろう、そのため、かかる組織起源の使用に関連するコストは、起源細胞が無制限に供給される場合よりも高くなるだろう。加えて、起源細胞株の提供体間では、再生不可能な製造状況をもたらす差異が存在し得る。本明細書に記載したような代替的な細胞起源の使用により、一度は試験する必要がある一様な性質を有する無制限な細胞起源を提供することができる。
【０００８】
上記の第二の方法では、組み換えｗｎｔ産生細胞由来のＣＭがＤＰ細胞増殖を促進するために使用される場合には、同様な試験が最低限求められるだろう。しかしながら、当該細胞は組み換え蛋白質を産生しているので、追加の安全性試験が求められる。当該プロデューサー細胞におけるｗｎｔ遺伝子発現の安定性はまた、大きな問題であり、終にｗｎｔ遺伝子発現が培養中で時間経過により喪失した又は減少した場合には、当該細胞を再誘導又はサブクローニングする必要があるだろう。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、一様な性質を有する代替的細胞起源を用いて毛髪誘導細胞を培養することによって、先行技術に関連する問題を解決する。
【００１０】
本発明の最初の局面に従えば、調整細胞によって調整された培地を含む培養液中で毛髪誘導細胞を培養する工程を含む例えば毛髪誘導細胞の毛髪誘導能を維持できるような毛髪誘導細胞の培養方法であって、当該調整細胞が非表皮性組織に由来する、前記方法を提供する。
【００１１】
毛髪誘導細胞の毛髪誘導表現型を維持する、非表皮性組織に由来する調整細胞によって調整された培地の能力は、非常に意外であった。表皮性細胞とin vivoで相互作用して毛髪細胞を形成するケラチノサイトについての米国特許第5,851,831号明細書に比較して、本発明で用いられる非表皮性組織由来細胞は、必ずしも毛髪誘導細胞とin vivoで関連しない。従って、本発明は、表皮性でない種々の最終分化細胞又は前駆細胞を、ケラチノサイトの代わりに使用して、例えば比較的少数のリンパ小節を含む小規模なバイオプシーから大量の毛髪を産生するために、いずれかの工程において重要な培養増殖期間に、毛髪誘導細胞の毛髪誘導能を保持するために培地を調整することができる、ことを示している。
【００１２】
一つの局面では、調整細胞が由来する組織が非外胚葉性である。
【００１３】
当該組織は中胚葉起源でもよい。本発明の範囲内の中胚葉起源の調整細胞の例は、以下の節において、培養中の毛髪誘導細胞の毛髪誘導能の維持に特に効果的であることが明かである前立腺上皮細胞である。別の実施態様では、当該調整細胞はヒト真皮繊維芽細胞である。中胚葉起源細胞の他の例は、腎上皮細胞、内皮細胞及び免疫系細胞である。本発明の一つの局面では、中胚葉起源の細胞は、骨格筋芽細胞を含まない。通常ＤＰ細胞等の毛髪誘導細胞の非常に近傍では発見されない中胚葉起源の細胞が、米国特許第5,851,831号明細書で用いられるケラチノサイトと異なるが、それでも毛髪誘導細胞に同様な合図を送り、その誘導能を維持することができる、ことは驚くべきことである。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、内胚葉起源の細胞由来の調整培地を使用する。内胚葉起源の細胞の例は、肝細胞及び膀胱上皮組織である。中胚葉細胞について内胚葉由来細胞を使用できることが、表皮性細胞とは異なった発生学的層由来の細胞種を示す、ことは驚くべきことである。
【００１５】
本発明の一つの局面では、毛髪誘導細胞の毛髪誘導能を維持する。
【００１６】
当該方法は毛髪誘導細胞の長期間培養に使用することができる。長期間培養は、継代数によって又は個体群の倍増によってより正確に定義することができる。一次的な繊維芽細胞、ケラチノサイト及び衛星細胞は、時には、若いドナーから１２０個体群の倍増まで増殖することができる。例えば、一つの繊維芽細胞が継代中に３分割する場合には、老化期になる前に４０継代まで達することができる。しかしながら、使用する植え付け密度が低い場合には、各継代間でより多くの個体群の倍増を経るだろう。絶対的な意味において、これは長期間培養になるだろう。毛髪の完全形の移植に十分な毛髪誘導細胞（例えばＤＰ細胞）は、細胞の最適植え付け密度を用いるｐ３（３継代）までの継代によって、３０未満のリンパ小節から得られる。従って、当該方法は、毛髪誘導細胞の長期間培養を可能にすると同時に完全な細胞の本来の能力（すなわち、毛髪誘導能）を維持することができる。
【００１７】
培養液は本質的に調整培地から成る。当該培養液は、非表皮性組織由来の調整細胞を含んでもよい。従って、当該調整培地は、当該調整細胞が毛髪誘導細胞の存在下で増殖するため、非表皮性組織由来の調整細胞によって「そのまま」製造することができる。
【００１８】
当該毛髪誘導細胞は真皮乳頭（ＤＰ）細胞及び／又は真皮鞘（ＤＳ）細胞でもよい。
【００１９】
当該調整培地は、細胞株（例えば樹立された細胞株）を用いて得ることができる。好適な細胞株は、毛髪誘導細胞を増殖するための現存の方法と比べて、より簡単に入手できるか又は培養するにはより簡便である。従って、米国特許第5,851,831号明細書及び国際公開第01/74164号パンフレットに記載の培地に比べて、本発明の培養液は、実質的に無制限供給可能な安定細胞株から調製することができる。あるいは、当該培養液は、より簡単に入手できるか又は培養するにはより簡便である非表皮性組織由来の細胞株から調製することができる。
【００２０】
当該細胞株は、移植に関連する危険因子について選別され、試験されているドナーから得ることができる。
【００２１】
当該培養液は、組み換え遺伝子及び／又はその組み換え産物を含まない。当該培養液はウイルス性ベクターを含まない。組み換え遺伝子、その産物及びウイルス性ベクターは、本発明の方法を用いて回避できる安全性に関する不安をもたらす。
【００２２】
当該調整培地は使用前に凍結することができる。
【００２３】
毛髪誘導細胞を継代培養する場合には、培養液を完全に交換しておくか、又は例えば新鮮調整培地を加えて当該培地の一部を交換することによって当該細胞を分割供給することができる。
【００２４】
当該調整培地は、血清を含まない培地で増殖した細胞から得られる。血清中に存在する可能性のある感染剤の感染の潜在的な問題により、細胞産物の産生に用いられる血清を得るための閉鎖群の使用に至った。これらの感染剤は、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を含む。全体的に血清の使用を含まない工程には重要な規制上の利点がある。
【００２５】
一つの実施態様では、調整細胞は好適な定義された培地で培養する。本発明に記載された調整培地の世代に用いることができる各細胞種の増殖及び培養に好適な定義された培地は当業者に周知であろう。
【００２６】
調整培地は、総蛋白含量が１０μg/mlを超える、例えば１００μg/mlを超える又は１mg/mlを超える無血清成分を有する。血清含有培地において、血清は一般的に主な蛋白質成分であろう。
【００２７】
調整培地は使用する前に（例えば限外濾過によって）濃縮することができる。これは、毛髪誘導表現型を維持するために必要な因子の濃度である。
【００２８】
本発明の別の局面では、当該方法は培養液中で毛髪誘導細胞を３以上の継代、例えば７以上の継代で継代培養する工程を更に含む。例えば、毛髪誘導細胞は、使用前に約３０個体群の倍増を経ることができる。
【００２９】
当該方法は、培養もしくは継代培養された毛髪誘導細胞を採集し又は単離する工程を更に含んでもよい。
【００３０】
当該毛髪誘導細胞は、非表皮性組織に対して同種異系でもよい。あるいは、毛髪誘導細胞は非表皮性組織に対して自系でもよい。
【００３１】
本発明の最初の局面に関連して記載した特徴はまた、本明細書に記載の発明の他の局面に関する。
【００３２】
本発明の更なる局面によれば、哺乳動物種の真皮乳頭（ＤＰ）細胞及び／又は真皮鞘（ＤＳ）細胞の長期間培養の方法であって、非表皮性組織（例えば中胚葉組織及び／又は内胚葉組織等の非外胚葉性組織）由来の１以上の哺乳動物細胞によって調整された培地から本質的に成る又は当該培地で補充された細胞培養液中で、ＤＰ及び／又はＤＳ細胞を培養又は継代培養し、それによってＤＰ及び／又はＤＳ細胞を増殖させると同時にそれらの毛髪誘導能を維持する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３３】
別の局面では、移植のための真皮乳頭（ＤＰ）及び／又は真皮鞘（ＤＳ）細胞を提供し維持する方法であって、ＤＰ及び／又はＤＳ細胞を対象から取得し、上に記載のようにＤＰ及び／又はＤＳ細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３４】
本発明の更なる局面によれば、毛髪誘導細胞の増殖方法であって、共培養系で毛髪誘導細胞を培養する工程を含み、そのため当該毛髪誘導細胞が、フィーダー細胞、好ましくは非表皮性フィーダー細胞による毛髪誘導表現型の維持のために必要な因子を提供する、前記方法を提供する。当該フィーダー細胞は、好ましくは同一の培養容器中に存在する。かかる共培養系では、毛髪誘導細胞に対して当該因子を付与する細胞であるフィーダー細胞は、毛髪誘導細胞と混合するか、又は細胞は分離したままであるが同一の培養液を共有している膜性の境界を介して培養を支持する。
【００３５】
２種の細胞種を混合処理して培養する場合には、フィーダー細胞は分裂して不活性化されるため、それらは分割することができず、そのため移植のための毛髪誘導細胞をそれ程汚染しないだろう。分裂的不活性化は、当業者に周知の技術である薬物処理又は照射によって引き起こされる。膜性の境界を用いる場合には、フィーダー細胞は、培地の交換は可能であるが細胞種を互いに接触させない透過性膜によって、毛髪誘導細胞から分離することができる。このようにして、フィーダー細胞によって毛髪誘導細胞の汚染を回避する。膜性の境界を用いる共培養系の例は、トランスウェルプレート及びBoydenチェンバーであり、当業者に周知である。
【００３６】
本発明はまた、本明細書に記載の方法を用いて得られる例えばＤＰ細胞及び／又はＤＳ細胞等の培養毛髪誘導細胞を提供する。
本発明は更に、男性型はげ頭症の処置（例えば化粧法）のための、本明細書に記載の方法を用いて得られる例えばＤＰ細胞及び／又はＤＳ細胞等の培養毛髪誘導細胞の使用を提供する。
【００３７】
また、in vitro皮膚等価物の製造における、本明細書に記載の方法を用いて得られる例えばＤＰ細胞及び／又はＤＳ細胞等の培養毛髪誘導細胞の使用を提供する。
【００３８】
本発明の更なる局面では、毛髪誘導細胞及び非表皮性組織（例えば中胚葉組織及び／又は内胚葉組織等の非外胚葉組織）に由来する調整細胞によって調整された培地を含有する培養液を含む組成物を提供する。
【００３９】
本発明はまた、毛髪誘導細胞の増殖のための培養液であって、非表皮性細胞（例えば前立腺上皮細胞及び／又内胚葉由来の細胞等の中胚葉由来の細胞）によって調整された培地を含み、毛髪誘導細胞の毛髪誘導能を維持することができる、前記培養液を提供する。
【００４０】
調整培地、すなわち非表皮性組織から得られる細胞によって調整された培地は、培養液中の生細胞の増殖によって得られる消費培地として定義することができる。調整培地は、発現される多数の分泌因子を含み、培養液中に培養生細胞によって分泌される。当該分泌因子は、多数の分子及び高分子（成長因子、プロテアーゼ、溶解性受容体、ホルモン等の蛋白質、糖蛋白質）並びに調整細胞によって産生される老廃物を含む。細胞の異なった系統は、異なった表現型を発現し、そのため異なった因子の組及び／又は異なった濃度での因子を培養液中に分泌するだろう。従って、例えば繊維芽細胞培養由来の調整培地は、ケラチノサイト培養由来の調整培地に対し、異なった分子を異なった濃度で含むだろう。
【００４１】
典型的には、生細胞は、標準的な組織培養フラスコ（例えばT175又はT75）の表層上、ローラーボトル又は微細担体ビーズ上を含む、種々の容器において単層培養で増殖することができる。調整培地は１以上の周知の基底培地（例えばDMEM，Chang’s，Hams F12等）を含む。調整培地はまた、３次元細胞培養又は組織もしくは器官の培養から得られる。調整培地は、血清を含まない又は血清を補充された培地での培養から得られる。特定の細胞数のために用いられる十分な濃度及び／又は培地の体積において細胞が因子を分泌するために必要な培養時間の最適化は、当業者によって経験的に構築することができる。一般的には、特定の体積のための細胞数が多くなればなるほど、また調整培地を製造するために細胞を長く培養すればするほど、細胞系統の典型的な「分泌因子」の濃度は高くなる。
【００４２】
調整培地は、以下の実施例の節に記載のように本発明に従う活性について試験することができる。調整倍地の製造を堅実にするために、全ての方法を詳細に定義することにおいて品質保証方法を採用することが望ましいだろう。例えば、細胞播種密度、供給計画、培地の体積、基底培地及び／又は補充物を厳密に定義し、適用することができる。
【００４３】
本発明の一つの実施態様では、得られた毛髪誘導細胞培地、すなわち得られる「産物」は、自系である。ＤＰ及び／又はＤＳ細胞等の毛髪誘導細胞は、一つのバイオプシーから採取できる。特定の非表皮性細胞は、別のバイオプシーから得ることができ、調整培地を提供するために培養する。調整培地は、それらの誘導能を保持するため、当該ＤＰ及び／又はＤＳ細胞に添加することができる。典型的には、当該ＤＰ及び／又はＤＳ細胞は、平均４００リンパ小節を含む１〜２cm2の皮膚バイオプシーから得ることができ、毛髪外科医その他によるＤＰ及び／又はＤＳ細胞移植のための十分な細胞を入手するために増殖（例えば３継代）させることができる。
【００４４】
本発明の他の実施態様では、ＤＰ及び／又はＤＳ細胞成分のみが自系である。当該ＤＰ及び／又はＤＳ細胞は、バイオプシーから上記のようにして得ることができる。しかしながら、調整培地が由来する非表皮性細胞は、別の起源（好ましくは同種異系又は異種の起源）から得ることができる。当該起源は、好ましくは、外来的な薬剤について選別されている、正当であると確認された細胞バンク由来である。当該細胞は万能細胞バンクとして保存されるため、周知の組織培養法を用いる大量の調整培地を製造することができる。この場合、調整培地は、ＤＰ及び／又はＤＳ細胞に好適な補充物として添加するために、標準的な蛋白質法、例えば限外濾過によって濃縮し、濃縮ストックとして保存することができる。当該方法は、調整培地の大量の一括処理が準備できる場合には、ＤＰ及び／又はＤＳ細胞を毛髪誘導試験において毛髪誘導能を維持させるために、小試料でその能力を試験することができる、という特定の利点を有する。毛髪誘導試験は時間がかかるので、品質コントロール（ＱＣ）試験活性が得られる、一括処理からの添加物の使用に対し、増殖したＤＰ及び／又はＤＳ細胞の使用は、信頼の点で更なる利点があるだろう。このことは、ケラチノサイト調整培地が、ＤＰ及び／又はＤＳ細胞の毛髪誘導能の保持をもたらす活性が保持されてきたかどうかに関するＱＣ試験の情報なしに使用することができる米国特許第5,851,831号明細書の方法と対照的である。
【００４５】
本発明の更なる実施態様では、増殖するＤＰ及び／又はＤＳ細胞は、同種異系起源から得ることができる。これは、上述の同種異系起源由来の調整培地と併用することができる。当該ＤＰ及び／又はＤＳ細胞はまた、好ましくは、外来性薬剤の存在下で選別された細胞起源由来であり、及び好適な管理機関によって承認された起源由来である。
【００４６】
そのため本発明は、毛髪誘導細胞（例えばＤＰ及び／又はＤＳ細胞）移植の商業化のための再生可能で、かつコスト有効的方法の開発に対する従来の問題点を解決する。
【００４７】
本発明の特定の実施態様を添付図面を参考に以下に記載する。
【実施例】
【００４８】
以下に記載の実験は、本発明の調整培地（ＣＭ）中での増殖が、毛髪誘導能の保持及び毛髪誘導能に関連する形態学に帰結することを示すために、異なった培地中でのＤＰ細胞の増殖を例証する。
【００４９】
材料及び方法
調整培地（ＣＭ）の調製
ＣＭ試験用の増殖細胞がコンフルエント段階に近づいた時、新鮮培地を供給した。５日後、培地を除き、０．２２μmフィルターでろ過し、細胞及び残骸を除いた。当該ＣＭは、新鮮培地と１：１（体積：体積）の割合で混合し、培養した真皮乳頭細胞を供給するために用いた。ＣＭは標準的条件下で増殖したヒトのケラチノサイトから生成させた。
【００５０】
細胞株
以下の外胚葉性起源の細胞種を試験した：２種のヒト乳癌細胞株；ＭＣＦ−７（American Type Culture Collection; ATCC）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ATCC）及び胎児性腫瘍細胞株であるＮ−テラ−２（P. Andrews, Sheffield, UK）、ヒト乳房上皮細胞（Cascade Biologics, Oregon, USA）及びヒトメラノサイト（Cambrex, New Jersey, USA）。以下の中胚葉起源の細胞種を試験した：ヒト真皮繊維芽細胞（HDF、新鮮な摘出ヒト組織から単離し、標準的条件下で増殖した）、骨格筋芽細胞（Cambrex）、前立腺上皮細胞（Cambrex）。試験に使用できる他の細胞種は：腎上皮細胞、内皮細胞及び免疫系細胞（中胚葉起源）；及び肝細胞及び膀胱上皮組織（外胚葉起源）。特に断らなければ、細胞種は供給者によって推奨される条件下で培養する。
【００５１】
ヒトＤＰ細胞培養
ヒトＤＰは、毛髪リンパ小節からＤＰを顕微解剖した後、培地中に入れた。標準培地で５日後、培地を試験ＣＭと交換した。培養液を２〜３日毎に交換し、培養をコンフルエントになるまで継代した。培養を当該方法で数継代維持した。図２及び３に示す細胞は、３継代での写真である。
【００５２】
毛髪誘導試験
皮膚再構成試験（Lichti, et al., 1993, J, Invest. Dermatol. 101: 124S-129S; and Weinberg et al., 1993, J Invest. Dertmatol. 100: 229-236）を培養毛髪誘導（例えばＤＰ）細胞による毛髪誘導を試験するために使用した。麻酔したマススの背中に円形の十分に深い傷を作り、移植チェンバー（graft chamber）をその傷中に設置した。培養真皮乳頭細胞又は真皮繊維芽細胞（負のコントロールとして）と混合した齧歯動物のケラチノサイトを、移植チェンバーを通して注射した。１週間後、チェンバーを外し、外傷に包帯をした。移植細胞は十分に厚い皮膚を形成し、毛髪誘導真皮乳頭細胞が存在している場合には新しい毛髪リンパ小節も形成された。ＤＰ細胞によって誘導された新しい毛髪が移植から４週間以内に現れた。
【００５３】
結果及び議論
真皮乳頭細胞は、最初に単離された時に特徴的な形態を有する。当該細胞は小さく、丸く又は多角形で、かつ無規律な群集中で増殖する（図１）。いくつかの初期の群集の中には、分割していない大きな平坦な細胞が存在する。標準的培地中での培養で時間超過すると、大きな平坦な細胞の割合が増加する。当該細胞は毛髪リンパ小節形成を誘導する能力が低い。従って、理想的な培養条件下で観察された形態は、毛髪誘導能の最初の兆候として見ることができる。
【００５４】
ＤＰ細胞がケラチノサイト由来のＣＭ（米国特許第5,851,831号明細書に記載のように）を用いて培養される場合、特徴的形態は多数の継代を経て維持される。図２は、ケラチノサイトＣＭ中で７継代まで増殖したＤＰ細胞の培養を示す。当該培地では、当該細胞は、その形態と共に毛髪形成を誘導するその能力を維持する。
【００５５】
ヒト前立腺上皮細胞から採集したＣＭ中で増殖したＤＰを図３に示す。当該細胞は、形態学的にケラチノサイトＣＭ増殖細胞に近似し、ヒト前立腺上皮調整培地がＤＰ細胞能を維持して毛髪形成を誘導できることを示唆している。
【００５６】
更なる実験では、ヒトＤＰ細胞又は負のコントロール細胞は、上述の種々の調整培地又はコントロール培地の存在下で増殖した。培地中で２１日後、当該細胞は、皮膚再構成試験において毛髪誘導を試験した。毛髪誘導が起こる場合には、新しい毛髪は移植後４週間内に一般的に移植片から生育するのが見られる。
【００５７】
図４〜６は、皮膚再構成試験の結果を示す写真である。図４は、標準培地で増殖したヒト真皮繊維芽細胞を移植し、毛髪形成を誘導できなかった負のコントロール実験の結果を示す。図５は、ケラチノサイト由来のＣＭ（米国特許第5,851,831号明細書に記載のように）で増殖したＤＰ細胞を移植し、毛髪形成を誘導した正のコントロール実験を示す。図６から明らかなように、前立腺上皮細胞由来のＣＭで増殖したＤＰ細胞は、ケラチノサイトＣＭで増殖したＤＰ細胞によって誘導される毛髪の量と同様な量で、毛髪形成を誘導した（図５）。従って、ケラチノサイトと同様に、前立腺上皮細胞は、培地にＤＰ細胞の毛髪誘導能を保持させることができる方法で培地を調整する。
【００５８】
表１は、皮膚再構成試験の結果を示す。試験した培養の中で、前立腺上皮細胞ＣＭで増殖したＤＰ細胞は最も強い毛髪誘導を示した。ヒト真皮繊維芽細胞（ＨＤＦ）ＣＭで増殖したＤＰは、低い毛髪誘導を示した。骨格筋芽細胞由来のＣＭは毛髪誘導を支持しないように見えた。メラノサイトＣＭ又はＮ−テラ−２ＣＭで増殖したＤＰ培養は育毛を誘導できなかった。同様に、外胚葉由来細胞種、すなわち乳房上皮組織（２種の乳癌細胞株）の他の実施例由来のＣＭで増殖したＤＰ細胞は、毛髪誘導することができなかった。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
ケラチノサイトすなわち上皮細胞種と、ＤＰ細胞間すなわち間葉細胞種との相互作用は、身体の他の間葉細胞相互作用に類似している。上皮−間葉細胞相互作用は、胚形成中に起こる基本的な工程であり、多くの器官及び身体の他の構造体の形成を導く。当該相互作用は、他の細胞種に特徴的な方法で反応するように指令する一つの細胞種によって産生されるシグナル分子によって仲介される。驚くべきことに、間葉細胞での応答を得るために、ケラチノサイトが同一又は類似のシグナル分子を産生する別の細胞種によって置換できることを、本発明は証明している。従って、本明細書に記載のこれらの他の細胞種は、培養中で毛髪誘導細胞を毛髪誘導状態に維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、単離直後の真皮乳頭細胞を示す写真である。
【図２】図２は、ケラチノサイトＣＭ中で増殖した真皮乳頭細胞を示す写真である。
【図３】図３は、ヒト前立腺上皮細胞から採集したＣＭ中で増殖した真皮乳頭細胞を示す写真である。
【図４】図４は、皮膚再構成試験を用いて行われた移植であって、当該移植された真皮細胞がヒト真皮繊維芽細胞であり、育毛を誘導することが期待できないことを示す写真である。
【図５】図５は、皮膚再構成試験を用いて行われた移植であって、当該移植された真皮乳頭細胞がケラチノサイトＣＭ中で増殖していることを示す写真である。
【図６】図６は、皮膚再構成試験を用いて行われた移植であって、当該移植された真皮乳頭細胞が前立腺上皮細胞トＣＭ中で増殖していることを示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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