(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素と該酵素の基質をそれぞれキャピラリーに注入し、ホウ酸緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行うことを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素反応解析方法。
【請求項２】
リン酸緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素と被検物質をそれぞれキャピラリーに注入し、ホウ酸緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行い、該酵素と被検物質の反応性を解析することを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の基質の同定方法。
【請求項３】
リン酸緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物及び被検酵素とをそれぞれキャピラリーに注入し、ホウ酸緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行い、該ポリヒドロキシ化合物と被検酵素の反応性を解析することを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の基質の同定方法。
【請求項４】
リン酸緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物関連酵素と該酵素の基質、及び被検物質をそれぞれキャピラリーに注入し、ホウ酸緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行い、該酵素と基質の反応性を解析することを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の活性調節因子の同定方法。
【請求項５】
一部が太くなっているキャピラリーを用いることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
反応に用いるポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の量が１０ｐｍｏｌ以下である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
リン酸緩衝液のｐＨが反応に用いる酵素の至適ｐＨであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ポリヒドロキシ化合物が糖類である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
キャピラリー電気泳動がキャピラリーゾーン電気泳動である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は生化学的に使用し得る緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素と該酵素の基質をキャピラリー電気泳動を用いて反応せしめ、反応生成物を分離検出することにより該反応を解析する方法、該酵素の基質及び特定のポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素を同定する方法、並びに該酵素の活性制御因子を同定する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キャピラリー電気泳動法は理論段数の高さ、分析の微量化に加え、再現性や迅速性、また、自動化の可能性から効果的な分析技術として認識されている。中でも酵素反応の解析においては、キャピラリーを分析手段としてのみ用いるのではなく、同時に酵素反応の場として利用する技法（Bao, J. et al., Chromatogr. 1992, 608, 217-224）が知られている。この方法によれば、キャピラリー内で試料成分を電場の影響で混合し、混合と同時に反応が進行して反応生成物が荷電圧下、検出器へ運ばれて随時分析される。この時、二つの成分を混合する方法には二種類ある。
【０００３】
一つは、酵素溶液を基質緩衝液を満たしたキャピラリー内に注入する方法（継続式；Avila, L.Z., et al. (1993) J.Org.Chem. 58, 5508-5512；及び、Wu, D and Rognier, F.E. (1993) Anal.Chem. 65, 2029-2035）で、一方は、酵素溶液と基質溶液を順次キャピラリー内に注入し、電気泳動することにより、個々の試料成分の移動速度の差により、二つの成分を混合するもの（プラグ・プラグ式；Avila, L. Z.,  et al., J. Org. Chem. 1993, 58, 5508-5512）である。後者は、より少ない試料で、分析可能であるが、反応時間が前者に比較して短いので感度が悪くなる。これまでに、この方法でアデノシン・ジアミナーゼ、アルカリ・フォスファターゼ、アミノ・オキシダーゼのミカエリス定数を評価した例（Van Dyck, S.,et al., Electrophoresis , 2001, 22, 1436-1442.； Xu, Y. et al., J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol., 1998, 21, 2781-2729.；Saevels, J., et al., Electrophoresis, 1996, 17, 1222-1227）が報告されている。しかし、これらのキャピラリー電気泳動を用いて糖鎖などのポリヒドロキシ化合物と、これを基質とする酵素との反応性を解析した例はなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、糖鎖などのポリヒドロキシ化合物と、これを基質とする酵素との反応と、該反応生成物の分離をキャピラリー電気泳動を用いて行い、該酵素反応を解析することにより、極微量の酵素と基質の反応の解析を実現することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リン酸緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物、及び該化合物を基質とする酵素をキャピラリーに注入して、ホウ酸緩衝液系の電気泳動を行うこと（プラグ・プラグ式）によりキャピラリー中で該酵素反応を行わせ、反応生成物を分離検出することに成功した。本発明はこられの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００６】
即ち、本発明によれば、以下の（１）〜（１２）に記載の発明が提供される。
（１）  生化学的に使用し得る緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素と該酵素の基質をそれぞれキャピラリーに注入し、ポリヒドロキシル基と錯体を形成し得る緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行うことを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素反応解析方法。
【０００７】
（２）  生化学的に使用し得る緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素と被検物質をそれぞれキャピラリーに注入し、ポリヒドロキシル基と錯体を形成し得る緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行い、該酵素と被検物質の反応性を解析することを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の基質の同定方法。
【０００８】
（３）  生化学的に使用し得る緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物及び被検酵素とをそれぞれキャピラリーに注入し、ポリヒドロキシル基と錯体を形成し得る緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行い、該ポリヒドロキシ化合物と被検酵素の反応性を解析することを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の基質の同定方法。
【０００９】
（４）  生化学的に使用し得る緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物関連酵素と該酵素の基質、及び被検物質をそれぞれキャピラリーに注入し、ポリヒドロキシル基と錯体を形成し得る緩衝液を用いたキャピラリー電気泳動により該酵素反応と、反応生成物の分離を行い、該酵素と基質の反応性を解析することを特徴とする、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の活性調節因子の同定方法。
【００１０】
（５）  一部が太くなっているキャピラリーを用いることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  反応に用いるポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素の量が１０ｐｍｏｌ以下である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  生化学的に使用し得る緩衝液がリン酸緩衝液であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  生化学的に使用し得る緩衝液のｐＨが反応に用いる酵素の至適ｐＨであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１１】
（９）  ポリヒドロキシル基と錯体を形成し得る緩衝液が、ホウ酸緩衝液である（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  ポリヒドロキシ化合物が糖類である（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  キャピラリー電気泳動がキャピラリーゾーン電気泳動である（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  一部が太くなっているキャピラリーに生化学的に使用し得る緩衝液に溶解した複数の物質をそれぞれ注入し、電気泳動により該物質を混合することを特徴とする物質混合方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）ポリヒドロキシ化合物及び該化合物を基質とする酵素のキャピラリー電気泳動を用いた反応
本発明に用いられるポリヒドロキシ化合物とは、ポリヒドロキシル基を有するものであれば如何なるものであってもよいが、例えば糖類などが好ましく用いられる。また、該化合物を基質とする酵素（以下、これを「本発明の酵素」と称することがある）は、公知のものでもまた、その基質が未知のものでもよい。またその活性は特に制限はなく、例えば加水分解、転移活性等が挙げられる。具体的な酵素と基質の組み合わせとしては、β−ガラクトシダーゼとガラクトシド、β−グルコシダーゼとグルコシド等が挙げられる。
【００１３】
ポリヒドロキシ化合物及び該化合物を基質とする酵素は、生化学反応に使用し得る緩衝液に溶解されて用いられる。生化学反応に使用し得る緩衝液とは、本発明の酵素反応が行えるものを意味する。このような緩衝液としてリン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。このような緩衝液の濃度は、用いる酵素及び基質やキャピラリーの系等によって適宜選択すればよいが、例えば、リン酸緩衝液を用いて糖と糖分解酵素を内径７５μmのキャピラリーを用いる場合には、３０〜４００ｍＭの範囲が好ましい。また、該緩衝液のｐＨは、４．０〜７．５の範囲で用いられるが、用いる酵素の至適ｐＨにすると反応効率が高いので好ましい。
【００１４】
本発明で行うキャピラリー電気泳動（以下ＣＥとも称する）は通常、内径１００μm以下のキャピラリー内で行う電気泳動である。装置的にはキャピラリー、高圧電源および検出器からなる簡単な構成である。キャピラリー内に緩衝液を満たし、キャピラリーの両端は同じ緩衝液の入った容器に入れる。試料は加圧、吸引、落差法もしくは電気的に注入される。よって、ＨＰＬＣあるいはＳＦＣで用いられる試料注入の装置（インジェクター）は不要である。試料注入後、キャピラリーの両端に高電圧（１０〜３０ｋｖ）をかけると、試料成分はそれぞれの移動度に基づいた速度でキャピラリー内を移動することにより分離が達成される。検出器には市販のＵＶ検出器、外ダイオードアレイ検出器、あるいは蛍光検出器がよく使用され、キャピラリーに直接紫外線を照射するオンカラム検出が用いられる。
【００１５】
さらにＣＥでは、ポンプの代わりに電圧を印加した際に発生する電気浸透流を利用する。これにより、サンプルゾーンの広がりが著しく抑えられ非常に高い分解能が得られる。
【００１６】
本発明の酵素反応方法に用いられるキャピラリー電気泳動法としては、キャピラリーゾーン電気泳動法（Capillary Zone Electrophoresis: CZE）、キャピラリーゲル電気泳動法（Capillary Gel Electrophoresis: CGE）、ミセル動電クロマトグラフィー（Micellar Electrokinetic Chromatography ; MEKC）等が挙げられる（キャピラリー電気泳動−基礎と実際、本田進、弄部茂編、講談社サイエンティフィク）。
【００１７】
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、キャピラリー内に緩衝液を満たし、イオン性物質を分離する手法である。キャピラリー内壁のシラノール基が緩衝液のｐＨにより一部解離し、電気二重層を形成する。そこに電圧を印化すると内壁付近の陽イオンは陰極のほうへ移動する。これにより緩衝液全体が陰極のほうへ流れる。この流れが電気浸透流である。ＣＺＥでは、この電気浸透流とイオン性物質の有する静電的力による電気泳動の現象を利用して、イオン性物質を分離する。したがって原理的に中性物質の分離は不可能である。ＣＺＥは、低分子イオン、イオン性生体物質、無機イオンなどのイオン性物質の分離に幅広く応用されている。
【００１８】
ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）は、緩衝液に界面活性剤を添加して電気泳動を行う手法である。ＣＺＥと同様、電気浸透流を利用する方法であるが、ＣＺＥとの違いは中性物質を分離できる点であり、様々な中性物質の分離に利用されている。一般に界面活性剤には硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）がよく使用されているが、このような陰イオンを用いることによりミセルは負電荷をもつので、電気泳動により陽極方向へ移動するが緩衝液全体は電気浸透流により陰極方向へ移動する。一般にミセル移動度により電気浸透流の方が速いのでミセルも緩やかな速度で陰極方向へ移動する。ここで試料がミセルに取り込まれる度合いによってその移動速度が異なる。これにより中性分子でもミセルへの分配係数の違いで分離が可能となる。ＭＥＫＣのミセルは、逆相ＨＰＬＣの固定相に相当するが、よく擬似固定相（pseudo stationary phase）といわれる。また、さらにミセルにシクロデキストリンを添加することで選択性を変化させたり、光学分割を行った例が報告されている。本発明の方法の場合、キャピラリー動電クロマトグラフィーは、基質や酵素を含む緩衝液と電気泳動用緩衝液として、硫酸ドデシルナトリウム等が臨界ミセル濃度以上になるように添加されたものを用いることにより行うことができる。
【００１９】
キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）は、ゲルの形成する網目構造を利用した分子ふるい効果で分離を行うものである。ＣＺＥおよびＭＥＫＣとは対照的に電気浸透流を抑えた場で分離を行う場合がほとんどである。ＣＧＥは、ＤＮＡ、タンパク質、糖などの生体高分子の分離に広く利用されている。本発明の方法において、電気泳動法としてキャピラリーゲル電気泳動を用いる場合、担体としてポリアクリルアミドゲル、硫酸ドデシルナトリウムゲル等を予めキャピラリーに充填した後に、生化学的に使用し得る緩衝液に溶解した基質及び酵素を注入する。注入の方法としては、上記した方法により決定された順に、先に注入するべき溶液をゲルに電気泳動により適当距離移動させて導入した後、後に注入するべき溶液を導入する方法等が用いられる。
【００２０】
本発明の方法で用いられるキャピラリーとしては、キャピラリー電気泳動に用いられるものであれば特に制限はないが、キャピラリーゾーン電気泳動を行うためのキャピラリーとしては、好ましくは溶融シリカ製のものが挙げられる。また、内面がアクリルアミド被膜加工してあるもの等、使用酵素に併せて適宜選択することができる。また内径は、通常内径１００μm以下のものが用いられるが、電気泳動装置、検出器などに応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、電気泳動装置としてＰ／ＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ５５００（ベックマンコールター社製）を用いてキャピラリーゾーン電気泳動により酵素反応を誘導する場合には、内径７５μｍ、長さ２７ｃｍの溶融シリカキャピラリー（ベックマンコールター社製）が好ましく用いられる。
【００２１】
電気泳動用緩衝液（エレクトロライト）は、ポリヒドロキシ化合物の水酸基と反応して錯体を形成し、基質あるいは生成物を溶液中でイオン化せしめるものであれば特に制限はないが、具体的にはホウ酸緩衝液などが用いられる。電気泳動用緩衝液の濃度及びｐＨは、ポリヒドロキシ化合物の水酸基と反応して錯体を形成し、基質あるいは反応生成物を溶液中でイオン化せしめ得る範囲であって、かつ検出工程において検出感度を下げない範囲、具体的には、ｐＨ８．０〜１０．０の範囲で選択することができる。例えば、ｐ−ニトロフェニル基を結合した糖と糖鎖分解酵素をキャピラリー中で反応させ、該酵素反応を遊離したｐ−ニトロフェニル基をＵＶ検出器により検出する場合、ｐＨ９．２の４０ｍＭホウ酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００２２】
キャピラリーへの生化学反応に使用し得る緩衝液に溶解したポリヒドロキシ化合物及び該化合物を基質とする酵素、並びに電気泳動用緩衝液はこれらをキャピラリーに注入して電気泳動を行う。注入する順番は、該酵素及び基質が電気泳動によって移動することにより移動度の速いものが遅いものを追い越すような条件であれば特に制限はなく、酵素や基質などによって適宜選択することができる。移動度の測定方法としては、キャピラリーに酵素または基質を内部基準物質とともに注入し、電気泳動を行って検出器でエレクトロフェログラムを取得し、移動度を測定する。ここで、基質の移動度が酵素のものより大きければ基質を後に酵素を先に注入し、また基質の移動度が酵素のものより小さければ基質を先に酵素を後に注入する。
【００２３】
注入するポリヒドロキシ化合物及び該化合物を基質とする酵素の量は、Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式（Landers, J. P. "Appeendix 2, Calculations of Practical Use", in Handbook of Capillary Electrophoresis, Landers, J. P. ed., CRC Press, Boca Raton, 1994, pp617-618.）に基づいて決定することができる。いずれも総量で１０ｐｍｏｌ以下のものを好ましく用いることができる。
【００２４】
ポリヒドロキシ化合物及び該化合物を基質とする酵素をキャピラリーに注入した後、キャピラリーを上記した電気泳動用緩衝液で満たし、適当な電気泳動装置にセットし、電気泳動を行う。電気泳動の条件は、用いるポリヒドロキシ化合物及び該化合物を基質とする酵素の移動度や、検出器までの距離などによって適宜選択される。具体的には、検出器までの距離を本発明の酵素及び基質が移動するまでに両者が混合され、酵素反応に十分時間混合され続け、さらに反応生成物が検出器に移動するまでに十分分離され得る電圧を選択することが必要である。
【００２５】
電気泳動法としてキャピラリーゲル電気泳動を用いる場合、担体としてポリアクリルアミドゲル、硫酸ドデシルナトリウムゲル等を予めキャピラリーに充填した後に、生化学的に使用し得る緩衝液に溶解した基質及び酵素を注入する。注入の方法としては、上記した方法により決定された順に、先に注入するべき溶液をゲルに電気泳動により適当距離移動させて導入した後、後に注入するべき溶液を導入する方法等が用いられる。
【００２６】
また、キャピラリー動電クロマトグラフィーは、基質や酵素を含む緩衝液と電気泳動用緩衝液として、硫酸ドデシルナトリウム等が臨界ミセル濃度以上になるように添加されたものを用いることにより行うことができる。
【００２７】
本発明における酵素反応の解析とは、酵素反応が起こったことをモニターすることを意味し、その方法としては反応生成物を分離検出、あるいは定量する方法等が挙げられる。このような解析を行うための酵素反応の検出器あるいは検出方法は、該酵素と基質の反応性を検出し得るものであれば如何なるものであってもよく、検出の指標となるものの種類によって適宜選択することができる。具体的には、例えば、加水分解酵素とその基質の反応性を解析する場合、予め基質の分解され得る断片にマーカーを付与し、該マーカーを使用とするエレクトロフェログラムを取得すること等によって行うことができる。
【００２８】
（２）基質及び酵素の同定
本発明のキャピラリー電気泳動を用いた酵素反応法によれば、ポリヒドロキシ化合物を基質とすることが知られている酵素について他のポリヒドロキシ化合物を基質とするか、またあるポリヒドロキシ化合物について、該化合物を基質とする酵素を同定することができる。
【００２９】
基質を同定する場合には、ポリヒドロキシ化合物を基質とすることが知られている酵素と被検物質となる化合物を上記（１）に記載した方法でキャピラリー電気泳動を用いて反応させ、該酵素反応が起こるかまたは起こらないかを解析することにより行うことができる。ここで、被検物質はポリヒドロキシ化合物に限定されることはない。
【００３０】
ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素を同定する場合には、あるポリヒドロキシ化合物と被検酵素を上記（１）に記載した方法でキャピラリー電気泳動を用いて反応させ、該反応生成物を分離した後、これを検出することにより行うことができる。ここで、被検酵素はヒドロキシ化合物を基質とするものに限定されることはなく、またその機能が既知のものでも未知のものでもよい。
【００３１】
（３）酵素活性調節因子の同定
本発明のキャピラリー電気泳動を用いた酵素反応法によれば、３成分による酵素反応を行うこともできるので、ポリヒドロキシ化合物を基質とする酵素と該基質、及び該酵素反応を阻害または亢進する可能性のある被検物質の３成分をキャピラリー内で混合し、反応生成物を分離・検出することにより酵素活性調節因子を同定することができる。
【００３２】
３成分以上を混合する場合には、上記したような電気泳動による移動度の差を用いる方法、さらに拡散効果を加えるために、電気泳動に用いるキャピラリーとして、一部が太くなっている（以下、これを「拡散部」と称することがある）ものを用いることが好ましい。拡散部はそれ以外の部分（以下、これを「分離部」と称することがある）より内径が３〜５倍程度太く、またその長さおよび位置は拡散部から検出器までの間に反応生成物の分離に十分な長さを残す程度がよい。また、拡散部がキャピラリーの末端より内側になる場合には、末端から５ｍｍ以内とすることが好ましい。
【００３３】
このようなキャピラリーを用いた電気泳動による解析法として、具体的には、あるポリヒドロキシ化合物、該化合物を基質とする酵素、及び被検物質を上記（１）に記載した方法でキャピラリー電気泳動を用いて反応させ、該反応生成物を分離した後、これを検出あるいは定量することにより行うことができる。ここで、被検酵素は酵素を阻害または亢進する可能性のあるものであれば如何なるものであってもよい。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１：糖類及び該糖類を基質とする酵素のキャピラリーゾーン電気泳動における酵素反応
（１）キャピラリーゾーン電気泳動における移動度の測定
プラグ法を用いて、４種類の異なる至適ｐＨを有する糖加水分解酵素とその基質の移動度及び反応をモニターした。プラグ法においては、基質と酵素が電気泳動中異なる速度で移動することにより混合され生成物が得られるが、反応時間が継続法に比較して短いので検出にはＵＶ官能基を有する基質を用いて反応を解析するのが有効である。そこで、ｐ−ニトロフェニル基を有する化合物を用い、生成物としてえられるｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）をアルカリ条件下で追跡した（図１）。
【００３５】
まず、Ｓｗｅｅｔ  ａｌｍｏｎｄ由来のβ−グルコース加水分解酵素（東洋紡社製）を４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し（０．１ｍｇ／ｍｌ）、基質であるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＰＮＰ−β−Ｇｌｃ；ナカライテスク社製）も２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した（１．０ｍＭ）。この時、基質及び酵素を溶解する緩衝液は、糖加水分解酵素では至適ｐＨが弱酸性から中性付近であるので、そのｐＨ付近で適当なリン酸緩衝液を、電気泳動用緩衝液は、ＰＮＰの検出に有利なｐＨのホウ酸緩衝液を用いた。
【００３６】
すべての分析は電気泳動装置Ｐ／ＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５５００（ベックマンコールター社製）で行った。キャピラリーは溶融シリカキャピラリーで、外側はポリイミドで被覆してあるもの（７５μｍ  ｉ．ｄ．×３７ｃｍ）を使用した。
【００３７】
試料のキャピラリーへの導入は圧力法でおこなった。試料をキャピラリーに導入する前に０．１Ｎ水酸化ナトリウムで２分間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１分間、泳動液で２分間洗浄した。図２に示すように、キャピラリー内では円柱状の溶液プラグが相互作用する間に酵素反応が進行する。反応に用いられた酵素と基質量については、Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式（下記式（１）Landers, J.P. "Appeendix 2, Calculations of Practical Use", in Handbook of Capillary Electrophoresis, Landers, J. P. ed., CRC Press, Boca Raton, 1994, pp617-618.）に基づいて計算した。
【００３８】
Ｖ＝ΔＰπｒ4ｔ／８ηＬ      （１）
ｒはキャピラリーの内径、ΔＰは試料注入時にキャピラリーにかかる圧力、ηは溶液の粘性、Ｌはキャピラリーの長さである。計算上、加圧インジェクションでリン酸緩衝液を３秒間とリン酸緩衝液を５秒間注入した場合、内径７５μｍでは約２９ｎｌと約４５ｎｌで、そこから計算されるプラグの長さは約６．５ｍｍと約１０．０ｍｍ、リン酸緩衝液の全プラグ長は約１８．５ｍｍで全キャピラリー長の５％である。
【００３９】
被膜しないキャピラリー（７５μｍｉ．ｄ．×３７ｃｍ）を用いた場合、上記酵素溶液はキャピラリー内に３秒導入した。また基質溶液（１．０ｍＭ）または生成物溶液は２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、５秒導入した。酵素反応は、酵素溶液を３秒導入後、２００ｍＭリン酸緩衝液を１秒導入した後、基質溶液（１．０ｍＭ）を５秒導入した。
【００４０】
該キャピラリーは、４０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を用い、荷電圧は１８ｋＶをプラス極からマイナス極にかけた。化合物の検出はマイナス極から６．５ｃｍの位置の外側のポリイミド被膜を剥がし、直接２１４ｎｍと４０５ｎｍの紫外吸収を測定した。試料の温度は室温で、キャピラリー内の温度は３７℃で行った。
【００４１】
図３に、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅを用いた酵素反応のエレクトロフェログラム（Ａ）および酵素β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｂ）、基質ＰＮＰ−β−Ｇｌｃ（Ｃ）、生成物ＰＮＰ（Ｄ）の各々のエレクトロフェログラムを示す。この酵素はホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を電気泳動用緩衝液に用いて電気泳動すると、１．５〜２．０分の間にブロードなピークとしてあらわれた。また、他の酵素も同様な位置にブロードなピークとしてあらわれた。一方、すべての基質は１．５分付近に、また生成物（ＰＮＰ）は３分付近にシャープなピークとしてあらわれた。このことから、移動速度の速い基質溶液を酵素溶液の後にキャピラリー内に注入すれば、基質が酵素に追い付き、追いこすことが予想できる。
【００４２】
（２）キャピラリー内壁への酵素吸着試験
一般にキャピラリー内での酵素反応では、酵素の内壁への吸着が問題となる。この点については、壁面をアクリルアミドで被膜して、被膜しないキャピラリーとの反応効率をβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅを用いて比較した。被膜しないキャピラリーには、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を用いた。被膜したキャピラリーでは電気浸透流が極端に低いため化合物の溶出時間が長くなるので、キャピラリーは短くし、泳動液と荷電圧も変更した。
【００４３】
酵素及び基質は実施例１に記載のものを用いた。試料の溶解溶液はリン酸緩衝液を選択したが、被膜したキャピラリーの泳動液のｐＨが中性付近であったため、試料の溶解溶液の濃度をあげると、負に荷電した試料の解離が抑制され分離能が極端に低下したので、被膜したキャピラリーでは、酵素も基質も各々４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解することとした。被膜しないキャピラリーでは、酵素を４０ｍＭ（ｐＨ４．５）、基質を２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解して用いた。
【００４４】
キャピラリー内壁のアクリルアミド被膜はＫｕｂｏ，Ｋ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２４１，４２−４６に記載の方法に従った。まず実施例１と同様のキャピラリーををＭｉｌｌｉ−Ｑ水で５分間、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで３０分間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１５分間、０．１Ｎ塩酸で３０分間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１５分間、アセトンで１５分間で順次洗浄した後、ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ３−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ−ｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌ  ｅｓｔｅｒ・アセトン（１：１）を室温で４５分間該キャピラリー内に流し、７０℃で一晩放置した。そして、アセトンで１５分間、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で３０分間洗浄した後、７％（ｗ／ｖ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ・１０％（ｖ／ｖ）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）・１０％（ｖ／ｖ）ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（１００：１：１）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した混液でキャピラリー内を満たし、７０℃で一晩放置した。キャピラリー壁面に被膜されなかった試薬はＭｉｌｌｉ−Ｑ水でポンプを使い押し流した。
【００４５】
キャピラリー内への溶液の導入時間は、実施例１と同様であり、酵素溶液、同濃度のリン酸緩衝液、基質溶液の順に導入した。
【００４６】
電気泳動は実施例１と同様の装置を用いて行った。アクリルアミドを被覆したキャピラリーには、電気泳動用緩衝液に２５ｍＭホウ酸緩衝液と２５ｍＭリン酸緩衝液の混液（ｐＨ７．５）を用い、荷電圧は１２ｋＶをプラス極からマイナス極にかけ、被膜しないキャピラリーには、４０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を用い、荷電圧は１８ｋＶをプラス極からマイナス極にかけた。化合物の検出はマイナス極から６．５ｃｍの位置の外側のポリイミド被膜をはがし、直接２１４ｎｍと４０５ｎｍの紫外線吸収を測定した。試料の温度は室温で、キャピラリー内の温度は３７度で行った。
【００４７】
この時、酵素濃度を変えて酵素のピーク形状も比較したところ、ピーク形状は異なったがどちもブロードであり、反応効率に差は認められなかったので、被膜しないキャピラリーを用いて以下の実験を行った。
得られたエレクトロフェログラムによれば、アクリルアミドの被膜による酵素反応効率への影響は見られなかった。
【００４８】
（３）リン酸緩衝液の濃度がＰＮＰの検出感度に与える影響の解析１
酵素または基質を溶解するリン酸緩衝液の濃度がＵＶ検出機により取得されるエレクトロフェログラムのベースラインに与える影響について解析した。４０、２００、３２０、４００ｍＭリン酸緩衝液を実施例１と同様にしてキャピラリー中に注入し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を電気泳動用緩衝液として電気泳動し、ＵＶ検出器で測定したエレクトロフェログラムを図４に示す。図からも明らかなように、酵素反応の生成物であるＰＮＰが検出される領域で３２０及び４００ｍＭリン酸緩衝液ではノイズが検出されるため、本実験の酵素反応においては、酵素または基質を溶解するリン酸緩衝液は２００ｍＭ以下が適していることがわかった。
【００４９】
（４）リン酸緩衝液の濃度がＰＮＰの検出感度に与える影響の解析２
ＵＶ検出器によって測定される信号量とＰＮＰの濃度との並行性について解析した。
酵素及びＰＮＰは実施例１と同様のものを用い、酵素は４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、ＰＮＰ（１．０ｍＭ）は４０〜４００ｍＭ（ｐＨ４．５）に溶解した。ＰＮＰは０．５、０．０５、０．００５ｍＭの各濃度の溶液を用いた。また、内部標準として０．２ｍＭのウリジンを基質またはＰＮＰ溶液に添加して用いた。これらを実施例１と同様でアクリルアミド被膜のないキャピラリー内に酵素溶液を３秒導入後、ＰＮＰ溶液と同濃度のリン酸緩衝液を１秒導入、続いてウリジンを添加したＰＮＰ溶液を５秒導入して、実施例１と同様にしてエレクトロフェログラムを取得して生成物量を分析した。この結果を図５に示す。図中、ＡはＰＮＰのピークの面積をプロットしたものであり、ＢはＰＮＰピークの高さをプロットしたものである。図からも明らかなように２００ｍＭより高いリン酸緩衝液濃度では、ＰＮＰ測定値が低くなる傾向があり、本酵素反応は２００ｍＭ以下のリン酸緩衝液中で行うことが適していることがわかった。
【００５０】
さらに図５Ａの測定値をＰＮＰ濃度と検出器による測定値の相関をみるための標準曲線を作成したところ、２００ｍＭリン酸緩衝液までは０．００５ｍＭから０．１ｍＭの範囲で直線性が見られたが、３２０ｍＭ、４００ｍＭの緩衝液の場合、直線性が得られる範囲が狭かった。このことからも本酵素反応は２００ｍＭ以下のリン酸緩衝液中で行うことが適していることがわかった。
【００５１】
また、溶出時間も３２０ｍＭ以上の緩衝液の場合は速まった。これは、リン酸緩衝液が高濃度の場合、リン酸緩衝液とホウ酸緩衝液の濃度の違いによって、リン酸イオンが後方から追随するホウ酸緩衝液中に拡散し、そのプラグ内においては、フェノキシドの形成が抑制され、移動速度が変化すると同時に感度の低下がおこっていると考えられる。３２０ｍＭ以上の緩衝液の場合は、生成物が混合プラグ中でほとんど解離されることなくプラグの境界面に検出されるようだった。
【００５２】
次に、実際の酵素反応で得られるＰＮＰについて同様の結果が得られるかを解析した。酵素はβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（東洋紡社製）を４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、基質は１．０ｍＭの濃度で４０〜４００ｍＭのリン酸緩衝液に溶解し、被覆していないキャピラリーに酵素溶液を３秒導入後、基質溶液と同濃度のリン酸緩衝液を１秒導入、続いて基質溶液を５秒導入して、実施例１と同様に電気泳動を行いＵＶ検出器でエレクトロフェログラムを取得した。得られたエレクトロフェログラムのＰＮＰのピークの面積を上記で取得した内部標準の面積値で割った値をプロットした結果を図６に示す。図からも明らかなように、実際に酵素反応を行った生成物の測定値が、ＰＮＰを用いた値とほぼ同様に推移することがわかったため、上記で検討したリン酸緩衝液の濃度のＰＮＰ測定値への影響はそのまま酵素反応へ応用できることがわかった。
【００５３】
また、リン酸緩衝液のｐＨの影響を調べるため、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅを４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、ＰＮＰを２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２と６．０）に溶解して標準曲線を作成した。この時はどちらの測定波長でも標準曲線の傾きに差はほとんどなかった。
【００５４】
（５）β−グルコシダーゼ酵素反応条件の決定およびβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅのミカエリス定数（Ｋｍ）の測定
酵素反応はｐＨ、温度、反応時間等の環境によって反応の効率が著しく異なるので、キャピラリー内での反応領域のｐＨ変化による反応効率の変化を求めた。Ｓｗｅｅｔ  ａｌｍｏｎｄ由来のβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（β−Ｇｌｃ−ａｓｅ）（ＥＣ３．２．１．２１）は、分子量約１１万、至適ｐＨを５．５に有する酵素である（Heyworth, R., et al., Biochem. J. 1962, 83, 331-335）。酵素溶液のｐＨを４．５から７．０まで変化させ、４０ｍＭ（ｐＨ４．５）と２００ｍＭ（ｐＨ４．２）リン酸緩衝液に溶解した基質をキャピラリー内に酵素溶液を３秒導入後、基質を溶解した緩衝液と同濃度のリン酸緩衝液を１秒導入、続いて基質溶液を５秒導入した。実施例１と同様に電気泳動してＵＶ検出器により反応生成物量を測定したところ、どちらの濃度のリン酸緩衝液を用いても、反応効率はｐＨ４．５から６．２まで徐々に上昇し、６．６以上になると効率が悪くなった（図７）。そこで、酵素（０．１  ｍｇ／ｍｌ）をｐＨ４．５とｐＨ６．２の４０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、基質（０．５〜３．０ｍＭ）溶液に２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を用いて前述と同様の方法でキャピラリー内へ順次導入し電気泳動して室温下生成物をＵＶ検出器で測定し、Ｋｍを求めた（図８）。
【００５５】
ｐＨ４．５の場合１．５ｍＭ（２１４ｎｍ）、１．４ｍＭ（４０５ｎｍ）、ｐＨ６．２の場合２．９ｍＭ（２１４ｎｍ）、３．６ｍＭ（４０５ｎｍ）で、文献値によると、ｐＨ４．５で測定した値は３．２ｍＭ（Heyworth, R., et al., Biochem. J. 1962, 83, 331-335）で、同様の値であった。これらの結果より上記の条件でキャピラリーゾーン電気泳動を用いて行う酵素反応は通常の条件下で行うものと同様の反応が行われていることがわかった。かつ検出に用いた基質量は酵素のＫｍ値付近の濃度でおこなったので数十ｐｍｏｌ、酵素量は数ｐｇであった。
【００５６】
（６）α−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのキャピラリー中での酵素反応
（６−１）α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．由来のα−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（α−Ｇｌｃ−ａｓｅ）（ＥＣ３．２．１．２０）は、分子量約５．２万、至適ｐＨを７．０付近に有する酵素であり、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＰＮＰ−α−Ｇｌｃ）のＫｍは文献値より０．３ｍＭ（Takabayashi, M., et al., J.Org.Chem. 1999, 64, 5280-5291）である。この酵素は、酵素溶液のｐＨが至適ｐＨを外れると反応効率が極端に低下したので、酵素（東洋紡社製）の溶解溶液の４０ｍＭリン酸緩衝液のｐＨを６．２から８．１まで変化させ基質ＰＮＰ−α−Ｇｌｃ（ナカライテスク社製）を２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し上記（４）と同様にして酵素反応を行った結果、至適ｐＨ付近が最も反応効率が高くｐＨが上がるに従い下がった（図９Ａ）。そこで酵素を４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、基質を２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して上記（４）と同様にしてＫｍを求めたところ０．８ｍＭ（２１４ｎｍ、４０５ｎｍ）で文献値と同様であった（図１０Ａ）。
【００５７】
（６−２）β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（β−Ｇａｌ−ａｓｅ）（ＥＣ３．２．１．２３）は、分子量約１０．６万、至適ｐＨを４．５付近に有する酵素であり、この酵素のｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＰＮＰ−Ｇａｌ）のＫｍは文献値より０．７ｍＭ（Saotome, C., et al., Bioorg.Med.Chem. 2000, 8, 2249-2261）である。基質ＰＮＰ−β−Ｇａｌ(シグマ社製)の溶解溶液は２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）にして、酵素（シグマ社製）の溶解溶液の４０ｍＭリン酸緩衝液のｐＨを４．５から７．０まで変化させた結果、ｐＨを４．５からｐＨ６．６付近までは徐々に反応効率が下降し、ｐＨ７．０ではｐＨ４．５と同程度まで反応効率が上がった（図９Ｂ）。そこで、酵素を４０ｍＭリン酸緩衝液後（ｐＨ４．５）に溶解し、基質を２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し上記（４）と同様にしてＫｍを求めたところ０．８ｍＭ（２１４ｎｍ）、０．７ｍＭ（４０５ｎｍ）で文献値と同様であった。（図１０Ｂ）
【００５８】
（６−３）β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ
Ｂｏｖｉｎｅ  ｋｉｄｎｙ由来のβ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ（β−Ｇｎ−ａｓｅ）（ＥＣ３．２．１．３０）は、至適ｐＨを４．５付近に有する酵素であり、この酵素のｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ（ＰＮＰ−β−ＧｌｃＮＡｃ）のＫｍは文献値より４．１ｍＭ（Takabayashi, M., et al., J.Org.Chem. 1999, 64, 5280-5291）である。酵素反応はのｐＨの影響については、８０ｍＭリン酸緩衝液に基質を溶解した場合に少しながら反応効率がよかったので、基質ＰＮＰ−β−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社製）の溶解溶液は８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．４）を用い、酵素β−Ｇｎ−ａｓｅ（シグマ社製）の溶解溶液の８０ｍＭリン酸緩衝液のｐＨを４．５から７．０まで変化させた結果、ｐＨを４．５からｐＨ７．０付近までは徐々に反応効率が下降した（図９Ｃ）。そして、酵素を４０ｍＭリン酸緩衝液後（ｐＨ４．５）に溶解し、基質を８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し上記（４）と同様にしてＫｍを求めたところ４．１ｍＭ（２１４ｎｍ）、３．６ｍＭ  （４０５ｎｍ）で文献値と同様であった（図１０Ｃ）。
【００５９】
実施例２：三成分混合を目的とする拡散室付キャピラリーを用いて電気泳動する酵素阻害実験法
モデル反応として、ガラクトース加水分解酵素の反応を阻害物質はガラクトース加水分解酵素に高い阻害活性を示すｄｅｏｘｙｇａｌｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎを用いてプラグ・プラグ式で解析した。キャピラリー内で電場の影響下で複数のプラグを一点で混合することは個々の化合物が異なる移動度を有するので非常に困難であるので、はじめに阻害物質を基質溶液または酵素溶液に混合し阻害反応が起こるかを調べたが、高濃度の阻害剤を加えることで阻害反応は観測されたが、試験管内で行う時よりも高濃度の阻害剤が必要であり再現性が確認できなかった。
【００６０】
そこで、各溶液の拡散効果を最大限に活用するため、キャピラリー先端の試料注入口に内径の太いキャピラリーを接続した（図１１）。キャピラリーは溶融シリカキャピラリーで、外側はポリイミドで被覆してあり、内壁面は被膜しないもの（７５μｍｉ．ｄ．ｘ３７ｃｍ）に長さ約１ｍｍ、太さ３５０μｍのキャピラリーを接続したものを使用した。
【００６１】
（１）酵素反応
まず、実験条件を検討するために酵素と基質による反応を行いその生成物について測定した。酵素はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．由来前述のβ−ｇａｌａｃｔｓｉｄａｓｅ（β−Ｇａｌ−ａｓｅ）（ＥＣ３．２．１．２３）（０．１ｍｇ／ｍｌ）を４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した。また基質ＰＮＰ−Ｇａｌは０．２から２．０ｍＭとなるように２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解した。上記したキャピラリーに酵素溶液を３間注入後、リン酸緩衝液を３秒間注入し、基質溶液を５秒間注入した。続けて泳動用緩衝液として４０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を２５秒間を注入することで細いキャピラリーに移動させ１８ｋＶをプラス極からマイナス極へ電圧をかけた。反応は、生成物としてえられるｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）を、アルカリ条件下、４００ｎｍ付近の紫外吸収を測定して検出した。
【００６２】
上記の酵素と基質の加圧インジェクションは、計算上のインジェクション量ＶｃはＰｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式に従うと、内径３５０μｍ、長さ１ｍｍのキャピラリーと内径７５μｍ、長さ３７０ｍｍのキャピラリーの抵抗（８ηＬ／πｒ4ｔ）を比較したところ計算上、内径７５μｍのキャピラリーの方が２０００００倍大きいので、内径３５０μｍのキャピラリーの抵抗を無視すると仮定し、４０ｍＭリン酸緩衝液を３秒間加圧インジェクションした場合と２００ｍＭリン酸緩衝液を５秒間加圧インジェクションした場合約２９ｎｌと約４５ｎｌで、内径３５０μｍのキャピラリー内でのプラグの長さは約０．３ｍｍと約０．５ｍｍであり、断面積は内径７５μｍの場合の約１／２０である。成分ゾーンの広がりについては、分子拡散のみによると仮定したアインシュタインの式によればδ2＝２Ｄｔで、Ｄは泳動液中での成分イオンの拡散係数で、ｔは成分イオンが一定の距離を移動するのに要する時間である。この拡散係数は、キャピラリー中ではその断面積に比例する値である。実際の分析に於いては、試料溶液の幅や試料成分とキャピラリー内壁の相互作用による効果も考慮すべき点であるが、この場合キャピラリー内壁の相互作用は極端に減小していると期待できるので、試料ゾーンの広がる速度は約２０倍速くなっていると考えられる。
【００６３】
尚、物質の定量の際に内部標準物質の添加は、ＣＺＥにおいても再現性の良い値を得るのに有効な補正法であるので、ウリジンを内部標準物質として０．１ｍＭから１．０ｍＭとなるように基質溶液または生成物溶液に添加し、前述の方法に従って、注入および電気泳動して、生成物（ｐＮＰ）を定量した。
【００６４】
上記のとおり電気泳動すると、ピークは前述の順序でエレクトロフェログラム上に現れた。酵素反応領域のｐＨは至適ｐＨに近づけ、分析領域のｐＨをｐ−ニトロフェニル基の検出に有効な糖の分析に繁用されるホウ酸緩衝液でアルカリ性でおこなった。この条件で、Ｋｍを求めたところ１．３ｍＭであった（図１２）。
【００６５】
（２）β−ガラクトース加水分解反応阻害試験
既知阻害物質ｄｅｏｘｙｇａｌｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎを用いて、β−Ｇａｌ−ａｓｅへの阻害をＰＮＰ−β−Ｇａｌを基質に用いてプラグ・プラグ式で試みた。４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した酵素（０．１  ｍｇ／ｍｌ）を用い、ＰＮＰ−β−Ｇａｌ（１．０ｍＭ）に様々な濃度（０．００５〜５０μＭ）のｄｅｏｘｙｇａｌｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎを混合し２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、上記（１）と同様ににキャピラリー内へ順次導入し電気泳動した。この結果を図１３に示す。図からも明らかなように阻害剤によるβ−ガラクトース加水分解酵素の阻害が観察された。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によれば、糖などのポリヒドロキシ化合物と該化合物を基質とする酵素のキャピラリー電気泳動を用いた混合反応が可能となった。キャピラリー内での酵素反応は試験管内のそれと酵素量が１／１０００程度でよいことから、微量しか取得できないような新たな酵素の機能解析や、既知の酵素の新たな基質の解析などに非常に有用なツールとなる。また、本発明の一部が太くなったキャピラリーを用いることにより電気泳動による物質の混合法にさらに拡散による効果が付加されたものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で行った反応の反応式を示す。
【図２】図２は、実施例１で用いたキャピラリーを示す。
【図３】図３は、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅを用いた酵素反応のエレクトロフェログラム（Ａ）、および酵素β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｂ）、基質ＰＮＰ−β−Ｇｌｃ（Ｃ）、生成物ＰＮＰ（Ｄ）の各々のエレクトロフェログラムを示す。
【図４】図４は、リン酸緩衝液の濃度がＰＮＰの検出感度に与える影響を解析した結果を示す。
【図５】図５は、リン酸緩衝液の濃度がＰＮＰの検出感度に与える影響を解析した結果を示す。ＡはＰＮＰのピークの面積をプロットしたものであり、ＢはＰＮＰピークの高さをプロットしたものである。
【図６】図６は、実際の酵素反応で得られるＰＮＰについて、リン酸緩衝液の濃度がＰＮＰの検出感度に与える影響を解析した結果を示す。
【図７】図７は、キャピラリー内での反応領域のｐＨ変化による反応効率の変化を測定した結果を示す。
【図８】図８は、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅのミカエリス定数（Ｋｍ）を測定した結果を示す。
【図９】図９は、α−グルコシダーゼ（Ａ）、β−ガラクトシダーゼ（Ｂ）、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｃ）のキャピラリー中での酵素反応に及ぼすｐＨの影響を調べた結果を示す。
【図１０】図１０は、α−グルコシダーゼ（Ａ）、β−ガラクトシダーゼ（Ｂ）、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｃ）のキャピラリー中での酵素反応のＫｍを測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、実施例２で用いたキャピラリーを示す。
【図１２】図１２は、拡散室付キャピラリーを用いて電気泳動する酵素阻害実験においてＫｍを測定した結果を示す。
【図１３】図１３は、β−ガラクトース加水分解反応阻害試験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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