(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の出生後の学習及び/又は記憶を改善するための組成物であって、該組成物が活性依存性神経栄養因子（ADNF）ポリペプチドを含み、ここで該ADNFポリペプチドが（a）以下のアミノ酸配列：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）を有する活性核部位を含むADNFＩポリペプチドと（b）以下のアミノ酸配列：Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）を有する活性核部位を含むADNFIII ポリペプチドとの混合物である、組成物。
【請求項２】
前記ADNFポリペプチドが、完全長ADNFＩポリペプチドと完全長ADNFIII ポリペプチドとの混合物である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ADNFＩポリペプチドの活性核部位が、少なくとも１つのD-アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ADNFＩポリペプチドの活性核部位が、全てD-アミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ADNFＩポリペプチドがSer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号１）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ADNFＩポリペプチドが：
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号14）；
Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号15）；
Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号16）；
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号17）；
Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号18）；
Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号19）；及び
Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）
から成る群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ADNFＩポリペプチドが、その活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ADNFIII ポリペプチドの活性核部位が、少なくとも１つのD-アミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ADNFIII ポリペプチドの活性核部位が、全てD-アミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ADNFIII ポリペプチドがAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ADNFIII ポリペプチドが：
Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号20）；
Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号21）；
Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号22）；
Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号23）及び
Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）
から成る群から選ばれるメンバーである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ADNFIII ポリペプチドが、その活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ADNFＩポリペプチド及びADNFIII ポリペプチドの両方の活性核部位が、少なくとも１つのD-アミノ酸を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ADNFＩポリペプチド及びADNFIII ポリペプチドの両方の活性核部位が、全てD-アミノ酸を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ADNFＩポリペプチドが、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）であり、かつ前記ADNFIII ポリペプチドが、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ADNFＩポリペプチドが：
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号14）；
Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号15）；
Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号16）；
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号17）；
Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号18）；
Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号19）；及び
Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）
から成る群から選ばれるメンバーであり、かつ、
前記ADNFIII ポリペプチドが：
Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号20）；
Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号21）；
Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号22）；
Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号23）及び
Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）
から成る群から選ばれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ADNFＩポリペプチドが、ADNFＩポリペプチドの活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含み、かつ、前記ADNFIII ポリペプチドが、ADNFIII ポリペプチドの活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
対象の出生後の学習及び/又は記憶を改善するための組成物であって、該組成物が活性依存性神経栄養因子（ADNF）ポリペプチドを含み、ここで該ADNFポリペプチドが（a）以下のアミノ酸配列：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）を有する活性核部位を含むADNFＩポリペプチドと（b）以下のアミノ酸配列：Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）を有する活性核部位を含むADNFIII ポリペプチドとの混合物である、組成物。
【請求項１９】
対象の出生後の学習及び/又は記憶を改善するための組成物であって、該組成物が（a）以下のアミノ酸配列：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）を有する活性核部位を含むADNFＩポリペプチド及び（b）以下のアミノ酸配列：Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）を有する活性核部位を含むADNFIII ポリペプチドをコードする核酸を含む、組成物。
【請求項２０】
前記対象が、神経病理に冒されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記対象が、アルツハイマー症である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記対象が、ダウン症候群である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記対象が、健常者である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記対象が、高齢である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記対象において、短期記憶が改善される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記対象において、参照記憶が改善される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
出生前の対象に投与され、該対象の出生後の学習及び/又は記憶を改善するための組成物であって、該組成物が活性依存性神経栄養因子（ADNF）ポリペプチドを含み、ここで該ADNFポリペプチドが（a）以下のアミノ酸配列：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）を有する活性核部位を含むADNFＩポリペプチドと（b）以下のアミノ酸配列：Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）を有する活性核部位を含むADNFIII ポリペプチドとの混合物である、組成物。
【請求項２８】
前記出生前の対象が、正常な知能を持つ、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記出生前の対象が、精神薄弱、精神薄弱の家族歴、ダウン症候群、又は対象を妊娠したときに少なくとも３５歳の母親を有する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記精神薄弱が、妊娠中の対象の母親によるアルコールの消費により引き起こされていない、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ADNFポリペプチドが、神経管発生及び／又は神経管の閉鎖の時期に使用される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ADNFポリペプチドが、妊娠中に出生前の対象の母親に対する腹腔内投与に適当である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ADNFポリペプチドが、妊娠中に出生前の対象の母親に対する経口投与に適当である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ADNFポリペプチドが、完全長ADNFＩポリペプチドと完全長ADNFIII ポリペプチドとの混合物である、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ADNFＩポリペプチドの活性核部位が、少なくとも１つのD-アミノ酸を含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ADNFＩポリペプチドの活性核部位が、全てD-アミノ酸を含む、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ADNFＩポリペプチドが、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）である、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ADNFＩポリペプチドの全てのアミノ酸がD-アミノ酸である、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ADNFＩポリペプチドが：
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号14）；
Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号15）；
Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号16）；
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号17）；
Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号18）；
Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号19）；及び
Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）
から成る群から選ばれる、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ADNFＩポリペプチドが、その活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ADNFIII ポリペプチドの活性核部位が、少なくとも１つのD-アミノ酸を含む、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ADNFIII ポリペプチドの活性核部位が、全てD-アミノ酸を含む、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ADNFIII ポリペプチドが、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）である、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ADNFIII ポリペプチドの全てのアミノ酸がD-アミノ酸である、請求項２７〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ADNFIII ポリペプチドが：
Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号20）；
Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号21）；
Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号22）；
Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号23）及び
Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）
から成る群から選ばれるメンバーである、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ADNFIII ポリペプチドが、その活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ADNFＩポリペプチド及びADNFIII ポリペプチドの両方の活性核部位が少なくとも１つのD-アミノ酸を含む、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ADNFＩポリペプチド及びADNFIII ポリペプチドの両方の活性核部位が全てD-アミノ酸を含む、請求項２７〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ADNFＩポリペプチドが、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）であり、かつ前記ADNFIII ポリペプチドが、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）である、請求項２７〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ADNFＩポリペプチドが：
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号14）；
Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号15）；
Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号16）；
Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号17）；
Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala（配列番号18）；
Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号19）；及び
Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）
から成る群から選ばれるメンバーであり、かつ、
前記ADNFIII ポリペプチドが：
Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号20）；
Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号21）；
Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号22）；
Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser（配列番号23）及び
Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）
から成る群から選ばれる、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ADNFＩポリペプチドが、ADNFＩポリペプチドの活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含み、かつ、前記ADNFIII ポリペプチドが、ADNFIII ポリペプチドの活性核部位のN末端及びC末端の一方又は両方に最大で２０のアミノ酸を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項５２】
出生前の対象に投与され、該対象の出生後の学習及び/又は記憶を改善するための組成物であって、該組成物が（a）以下のアミノ酸配列：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala（配列番号1）を有する活性核部位を含むADNFＩポリペプチド及び（b）以下のアミノ酸配列：Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）を有する活性核部位を含むADNFIII ポリペプチドをコードする核酸を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ADNFＩポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala(「SALLRSIPA」、あるいは短く「SAL」又は「ADNF-9」と称される)を含む活性コア部分を持つ。ADNFIII ポリペプチドは、いくつかのアミノ酸残基、すなわち、以下のアミノ酸配列：Asn-Ala-Pro-Val-Ser-lle-Pro-Gln(「NAPVSIPQ」、あるいは短く「NAP」と称される)を含む活性コア部分を持ちもする。これらのADNFポリペプチドが、それぞれそれら自身に、神経変性に関する動物モデルにおいて顕著な有効性及び活性を有することがすでにわかっている。
【０００２】
本発明の1の態様において、出生以後の投与により、例えば神経病理、アルツハイマー症、ダウン症候群、加齢、あるいは精神薄弱(例えば、脆弱X症候群)を患う動物モデル、並びに正常な動物において、前記ADNFポリペプチドが、能力、例えば学習と記憶を向上させもする。本発明のポリペプチドは、同様に短期及び参照記憶を向上させるために使われることができもする。
【０００３】
このように、本発明のADNFポリペプチドについての用途は、例えば、神経病理；知覚−運動の問題；認識のタスクの損なわれた対象の能力の改善；記憶欠陥の対象の能力の改善；正常な対象の能力の改善；などによる対象の能力を改善することを含む。従って、好適な処方により、本発明の態様を、認識、運動又は知覚タスクを身に付けるのに要する時間を減らすために使用することができる。あるいは、好適な処方により、発明の化合物を、認識、運動、あるいは知覚タスクが維持される時間を増やすために利用することができる。あるいは、好適な処方により、本発明の態様は、認識、運動あるいは知覚タスクの回復による誤りの量及び/又は重さの減少のために利用することができる。そのような治療が、神経系への負傷を負った、あるいは神経系の病気に耐えている個体に特に利益を提供しうる。ADNFポリペプチドが罹患した個体に投与され、そしてそれ以後、上記個体は認識、運動あるいは知覚タスクを投与される。しかも、ADNFポリペプチドは、彼らの能力(例えば、学習と記憶)を改善するために正常な対象に投与されうる。ADNFポリペプチドは、記憶能力(例えば、短期)が一般に低下している老人の集団に特に役立つかもしれない。
【０００４】
他の態様において、本発明は、胎内で動物が活性依存性神経栄養因子(Activity Neurotrophic 神経栄養 Factor)(ADNF)ポリペプチドにより処置されたとき、ADNFポリペプチドが動物の出生後の学習及び記憶、特に空間学習を改善したという発見にある程度基づいている。驚いたことに、たとえ単回投与のADNFポリペプチドが妊娠開始期に出生前投与されたとしても、ADNFポリペプチドのこの長期の効果が観察される。 全く驚いたことに、ADNFポリペプチドのこの向上した学習及び記憶の効果は、正常な知能を持つ動物(例えば、少しも精神的欠陥のない正常なマウス)でさえ見られる。ゆえに、ADNFポリペプチドは、それらの学習と記憶の本来の能力を越えて正常な動物を押し進め、彼らの認識技量を改善することができる。
【０００５】
上で述べられるように、これらのADNFポリペプチドが、特に神経変性に関連付けられた、動物モデルにおいて注目すべき有効性と活性を持つことがすでに示されている。しかし、それらを出生後に前記動物に与えた時、ADNFポリペプチドの効果が観察された。ADNFポリペプチドによる出生前処置が、正常な動物又は精神的に欠陥をもつ動物の両方について、動物の出生後の学習及び記憶を高めることができることをここで初めて発見した。
【０００６】
本発見は、それらの学習、記憶、及び関連した精神作用を改善することでヒト対象における重要な適用がある。むしろ正常なヒト対象は、ADNFポリペプチドによる出生前処置から利益を得ることができる。しかも、本発見には精神的に支障をきたした対象における適用がある。例えば、精神薄弱又はダウン症候群を有するして胎児が診断される時、その出生後の学習及び記憶技量が改善されうるように、胎内でその胎児をADNFポリペプチドにより処置することができる。精神薄弱又はダウン症候群の特定の診断なしでさえ、特定の情況にある胎児にADNFポリペプチドを予防的に投与することができる。例えば、精神薄弱の家族歴(例えば、脆弱X症候群)がある場合、胎内において胎児にADNFポリペプチドを予防的に投与しうる。他の例において、もし母親が高齢(例えば35歳以上)であり、それにより、ダウン症候群又は他の遺伝的欠陥を持つ赤ちゃんが生まれるより高い危険を持っていれば、胎内において胎児にADNFポリペプチドを予防的に投与しうる。
【０００７】
ADNFポリペプチド又はADNFポリペプチドの組み合わせ物が、生体内で能力(例えば、学習と記憶）を改善するかどうかを決定するために様々なパラメーターを計測しうる。例えば、材料及び方法の項に記載のモリス水迷路を使用しうる隠し踏み台試験を使用することができる。一般に、ADNFポリペプチドにより処置したマウスと対照マウス(ADNFポリペプチドにより処置しない)を、隠された踏み台の位置を学習し、そしてその上に登ることで水泳タスクを回避する訓練をする。このタスクを完了するまでにそれらが費やした時間を、回避潜時と定義する。この試験は1日に1回以上、何日にも渡り実施することができる。改善された学習と記憶を示す1つのパラメーターは、隠された踏み台上に登ることにより水泳タスクを回避する潜時の減少がある。また、Gozes et al., Proc. Natl． Acad． Sci． USA 93:427-432の(1996)を参照のこと（本明細書中に援用）。好適なADNFポリペプチドにより処置したで動物は、ADNFポリペプチドにより処置されない対照に比べ、それらの学習及び記憶能力に改善を示すであろう。能力を測るために使用された試験の例により本発明の態様は限定されない。あらゆる好適な試験方法を能力、例えば学習及びと記憶の計測に使用しうる。
【０００８】
本技術分野で知られている他の方法を、ヒト対象でADNFポリペプチド又はADNFポリペプチドの組み合わせ物が生体内で能力(例えば、学習と記憶)を改善するかどうかの決定に使用しうる。例えば、これらの方法は、Randt記憶試験(Randt et al. , Clin. Neuropsychol. 2:184 (1980)、ウェクスラー記憶検査(J. Psych. 19:87-95 (1945)、フォワード桁スパン試験(Craik, Age Differences in Human Memory,: Handbook of the Psychology of Aging中, Binen and Schaie (Eds.), New York, Van Nostrand (1977), ミニ精神状態試験(Folstein et al., J. of Psych. Res. 12:189-192 (1975), 又はカリフォルニア言語学習試験(CVLT))による長い間にわたっての記憶か学習の評価を含む。また、米国特許番号第6,030,968を参照のこと。これらの試験で、ADNFポリペプチドの効果に関係がない因子(例えば、不安、疲労、怒り、うつ病、錯乱、あるいは活力)が制御されている。米国特許番号第5,063,206号を参照のこと。主体の因子について評価及び制御するための方法は、本技術分野で知られ、そして前述の標準的な臨床検査、例えば、BECK うつ病検査、スピルバーガー形質状態不安検査（Spielberger Trait State Anxiety test）、及びPOMS検査(気分の状況の特徴)によって決定される。
【０００９】
1つの側面において、本発明は、能力(例えば学習及び/又は記憶)を改善する方法を提供し、上記方法は、出生後あるいは出生前のいずれかに活性依存性神経栄養因子（ADNF）ポリペプチドを出生後の能力(例えば学習及び/又は記憶)を改善するのに十分な量で対象に投与することを含む。本発明の方法は、あらゆる対象、例えValツハイマー症、ダウン症候群などのような神経病理に冒された対象か、あるいは、若いか若しくは高齢の正常な対象、又は胎内の対象に適用されうる。1の態様において、ADNFポリペプチドは、正常な知的能力ある対象に対して出生前に投与される。他の態様において、前記対象は、精神薄弱(例えば脆弱X症候群)であるか、精神薄弱の家族歴であるか、ダウン症候群であるか、又はその対象を妊娠したとき母親が少なくとも35歳である。好ましくは、対象が精神薄弱である場合、妊娠中の母親のアルコール摂取過剰によって引き起こされていない(言い換えれば、精神薄弱は、胎児期アルコール症候群の一部ではない)。
【００１０】
1の態様において、態様において、ADNFポリペプチドは、出生前に、例えば妊娠した母親に、例えば、腹腔内投与又は経口投与で投与される。他の態様において、ADNFポリペプチドは、出生後に、例えば腹腔内投与又は経口投与によって投与される。1の態様において、ADNFポリペプチドは神経管発達及び/又は神経管の閉鎖の時期に投与される。
【００１１】
1の態様において、前記方法は、ポリペプチドをADNFの投与を含み、ここで、上記ADNFポリペプチドは、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(配列番号1)のアミノ酸配列を持つ活性核部位を含むADNFＩポリペプチドである。他の態様において、前記方法は、完全長のADNFＩポリペプチドの投与を含む。さらに他の態様において、前記方法は、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(配列番号1)のアミノ酸配列から成るADNFＩポリペプチドの投与を含む。さらに他の態様において、前記方法は、以下の：Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(配列番号14)； Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(配列番号15)；Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala(配列番号16)；Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(配列番号17)；Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-lle-Pro-Ala(配列番号18)；そしてGly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(配列番号19)から成る群から選ばれるADNFＩポリペプチドの投与を含む。さらに他の態様において、前記方法は、活性核部位のN末端又はC末端の少なくとも1方におよそ20までのアミノ酸を有するADNFＩポリペプチドのを投与を含む。ある態様において、ADNFＩポリペプチドは、ADNPＩポリペプチドのN末端とC末端の両方に20までのアミノ酸を有する。
【００１２】
他の態様において、前記方法は、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(配列番号2)のアミノ酸配列を持つ活性核部位を含むADNFIII ポリペプチドであるADNFポリペプチドの投与を含む。さらに他の態様において、前記方法は、完全長のADNFIII ポリペプチドの投与を含む。さらに他の態様において、前記方法は、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln（配列番号2）のアミノ酸配列から成るADNFＩポリペプチドの投与を含む。さらに他の態様において、前記方法は、ADNFIII ポリペプチドの投与を含み、ここで上記ADNFIII ポリペプチドは、以下の： Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(配列番号20)；Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(配列番号21)；Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(配列番号22)；及びSer-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser(配列番号23)から成る群から選ばれる。さらに他の態様において、前記方法は、活性核部位のN末端又はC末端の少なくとも1方におよそ20までのアミノ酸を有するADNFIII ポリペプチドのを投与を含む。ある態様において、ADNFIII ポリペプチドは、ADNPIII ポリペプチドのN末端とC末端の両方に20までのアミノ酸を有する。
【００１３】
さらに他の態様において、前記方法は、ADNFＩポリペプチドとADNFIII ポリペプチドの混合物の投与を含む。この又は他の態様において、本明細書中に記載のいずれか１以上のADNFＩポリペプチドを、本明細書中に記載のいずれか１以上のADNFIII ポリペプチドと混合しうる。
【００１４】
他の態様において、ADNFポリペプチドの活性核部位は、少なくとも1つD-アミノ酸を含む。他の態様において、ADNFポリペプチドの活性核部位は全てD-アミノ酸を含む。
【００１５】
さらに他の態様において、ADNFポリペプチドの少なくとも1つは、対象に投与される核酸によってコードされる。
【００１６】
さらに他の態様においてADNFポリペプチドは、短期記憶を改善する。さらに他の態様において、ADNFポリペプチドは、参照記憶を改善する。さらに他の態様において、ADNFポリペプチドは、経鼻あるいは経口で投与される。
【００１７】
本発明のこれらの及び他の態様は、以下の発明の詳細な説明、添付図面、及び添付の請求項から当業者に明白になる。
【００１８】
定義
用語「ADNFポリペプチド」は、活性依存性神経栄養因子(ADNF)又は保存的に修飾されたそれらの変異体の１以上に関する、ここで上記ADNFは、SALLRSIPA(「SAL」と呼ばれる)若しくはNAPVSIPQ(「NAP」と呼ばれる)アミノ酸配列を持つ活性核部位を有し、そして上記変異体は、例えばHill et al., Brain Res. 603, 222-233 (1993); Venner & Gupta, Nucleic Acid Res. 18, 5309 (1990);
及び Peralta et al., Nucleic Acid Res. 18, 7162 (1990); Brenneman et al., Nature 335, 636 (1988); 又は Brenneman et al. , Dev. Brain Res. 51 :63 (1990); Forsythe & Westbrook, J. Physiol. Lond. 396:515 (1988)により記載される生体外の皮質ニューロン培養アッセイにより計測される神経栄養/神経保護活性を持つ。ADNFポリペプチドは、ADNFＩポリペプチド、ADNFIII ポリペプチド、それらの対立遺伝子、多形性変異体、アナログ、種間相同体、又は、例えば生体外又は生体内のいずれかで中枢神経系に発生したニューロンに対し神経保護/神経栄養活性を示すそれらのサブシークエンスのいずれか(例えば、SALLRSIPA、あるいはNAPVSIPQ)であることができる。「ADNFポリペプチド」は、ADNFＩポリペプチドとADNFIII ポリペプチドの混合物に関することもできる。
【００１９】
用語「ADNFＩ」は、およそ14,000ダルトンの分子量を有するpI8.3±0.25の活性依存性神経栄養因子ポリペプチドに関する。前記のとおりADNFＩポリペプチドは、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(「SALLRSIPA」、「SAL」又は「ADNF-9」と呼ばれもする)のアミノ酸配列を含む活性部位を持つ。Brenneman et al., J. Clin Invest 97 2299 2307 (1996) Glazner et al.. Anat. Embryol. (In press), Brenneman et al., J. Pharm. Exp. Ther. , 285:619-27 (1998), Gozes & Brenneman, J. Mol. Neurosci. 7:235-244 (1996), 及び Gozes et al., Dev. Brain Res. 99: 167-175 (1997)を参照のこと、ここでこれらの全てを本明細書中に援用する。特別に他の指示のない限り、「SAL」は、Ser-Ala-Leuのアミノ酸配列を持つペプチドでなく、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Alaのアミノ酸配列を持つペプチドに関する。ADNFＩの完全長のアミノ酸配列は、WO 96/11948で見つけることができる（この全てを本明細書中に援用する）。
【００２０】
用語「ADNFIII 」及び「ADNP」は、およそ95kDa(およそ828のアミノ酸残基)の推定分子量を持ち、およそ5.99のplの活性依存性神経栄養因子ポリペプチドに関する。前記のとおり、ADNFIII ポリペプチドは、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-lle-Pro-Gln(「NAPVSIPQ」あるいは「NAP」と呼ばれもする)のアミノ酸配列を含む活性部位を持つ。Bassan et al., J. Neurochem． 72:1283-1293 (1999年)(本明細書中に援用する)。別段の指示のない限り、「NAP」は、Asn-Ala-Proのアミノ酸配列を持つペプチドではなく、Asn-Ala-Pro
-Val-Ser-lle-Pro-Glnのアミノ酸配列を持つペプチドに関する。ADNFIII の完全長配列は、WO 98/35042及びWO 00/27875で見つけることができる。
【００２１】
用語「学習及び/又は記憶の改善」は、学習及び記憶を示す少なくとも1のパラメーターの改善又は増大に関する。改善又は増大は、少なくとも10%、場合により少なくともおよそ20%、少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ100%、少なくともおよそ150%、少なくともおよそ200%などまでのパラメーターの変化である。学習と記憶の改善は、本技術分野で知られているあらゆる方法により計測されうる。例えば、学習及び記憶を改善するADNFポリペプチドは、モリス水迷路を用いて選別されうる（例えば、材料及び方法の項を参照のこと）。同様に、Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:427-432 (1996)を参照のこと。記憶と学習は、本明細書中に記載の方法、又は当業者に周知の他の方法、例えばRandt記憶検査、Wechler記憶等級、Forward Digit Span検査、若しくはカリフォルニア言語学習検査のいずれかを用いて選別されることもできる。
【００２２】
用語「記憶」は、記憶の全ての医学的分類項目を含んでいる、例えば ,知覚、即時、近時及び遠隔、並びに心理学で使用される用語、例えば、近時又は遠隔のいずれかの以前の経験から得た情報に関する参照記憶(例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, volume I , pp. 142-150 (Fauci et al., eds., 1988)を参照のこと。
【００２３】
本願発明の治療及び診断上の適用から恩恵を受けるだろう病理又は神経病理は、例えば以下の：
基底核(ハンチントン病、ウイルソン病、線条体黒質変性症、大脳皮質基底核変性症)に影響している変性状況、ツレット症候群、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、進行性球麻痺、家族性痙性対麻痺、脊髄筋萎縮症、ALS及びその変異体、室頂核脳幹萎縮症、オリーブ−橋−小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳変性症、並びにドーパミン中毒性を含む中枢運動系の病気；
感覚ニューロンに影響している病気、例えばフリードライヒ失調症、糖尿病、末梢神経障害、網膜神経変性症；
辺縁系及び大脳皮質系の病気、例えば脳アミロイド症、ピック萎縮症、レット症候群；
アルツハイマー病、エイズ関連性痴呆、リー病、レヴィー小体病の拡散、てんかん、多系統萎縮症、ギラン・バレー症候群、リソソーム貯蔵障害、例えば
リポフスチノーシス、ダウン症候群、アルパーズ病、CNS変性症の結果としてのめまいを含む複数の神経系及び/又は脳幹に関与する神経変性病理；
成長の遅延及び学習欠陥、並びにダウン症候群、そして酸化ストレスに誘発されたニューロンの死に関連する病理；
例えば、アルコール中毒による青斑、小脳、コリン作動性基底前脳部のニューロンの変性；小脳ニューロンと大脳皮質ニューロンの加齢変性による認識及び運動欠陥をもたらすこと；そして慢性のアンフェタミン乱用による、運動欠陥をもたらす基底核ニューロンの変性、を含む、加齢、並びに慢性的なアルコール又は薬物の乱用により引き起こされる病理；
脳卒中、病巣の虚血、脈管の機能障害、低酸素性虚血性脳症、高血糖、低血糖、非開放性の頭部外傷、又は直接的な外傷のような病巣の外傷から起こっている病変；
治療のための薬物及び治療の負の副作用として生じる病理(例えば、グルタミン酸塩レセプターのNMDAクラスの抗痙攣用量のアンタゴニストに応答した帯状及び内側皮質ニューロンの変性)；を含む。
【００２４】
用語「空間的学習」は、そのヒトの環境についての学習に関し、そしてどのようなオブジェクトがどこに存在するかの知識を必要とする。それは、環境中の複数の手がかりの間の関係についての学習、そしてそれらについての情報の使用に関しもする。動物の空間的学習を、動物に報酬の位置を学習させ、及び位置を覚えるための空間的手がかりの使用させることによって試験しうる。例えば、空間的学習を、放射状アーム迷路（すなわち、どのアームに食物があるかを学習）モリス水迷路（すなわち、踏み台がどこにあるかを学習）を用いて試験しうる。これらのタスクを実施するために、動物は、試験部屋からの手がかり(物体、臭気、などの位置)を使う。ヒトにおいて、空間的学習は、同様に試験されうる。例えば、対象は、絵を描くように頼まれ、その後その絵は持ち去られる。次に、前記対象は、そして記憶から同じ絵を描くように頼まれる。この対象によって描かれた後の絵は、対象の空間的学習の程度を反映する。
【００２５】
用語「対象」は、生涯のあらゆる段階にある全ての哺乳動物、特に、ヒトに関する。例えば、対象は、胚、胎児、乳児、小児、若者、あるいは成人に関しうる。
【００２６】
「正常な」対象又は「正常な知能」を持つ対象は、その知的な機能レベルが平均付近かそれを上回っている(例えば、75を上回るIQを持っている)対象に関する。同様に「正常な」対象は、対象、例えば(例えば、羊水穿刺試験により)少しの精神的欠陥も持っているように思われない、かつ/あるい、危険因子(例えば、精神薄弱の家族歴か、又は胎児アルコール症候群の原因となる妊娠中の過剰量のアルコールを消費した母親)を持たない胎児に関しうる。
【００２７】
対象は、以下の3の判定基準に基づき「精神薄弱」であると考えられる：知機能レベル(IQ)が70〜75超である；重大な能力欠如が2以上の適応技能分野に存在する；及び上記状態が小児期(１８歳未満と定められている)から存在する(AAMR 1992)。適応技能分野は、生きて、働いて、地域社会に参加するために必要とされている日常生活技能である。それらは、コミュニケーション、自己投与、家庭生活、社会的技能、余暇、健康及び安全、自らによる方向決定、実質的に有効な学業(読み、書き、基本的な数学)、地域社会利用、並びに仕事を含む。http://www.thearc.org/faqs/mrqa.html．を参照のこと。
【００２８】
用語「ダウン症候群」は、染色体障害であり、そして第21染色体の２コピーの正常な相補物の代わりに全体か、又はそのうちの一部のさらなる第２１染色体が存在するときに生じる。
【００２９】
用語「接触」は、本明細書中で以下の：合わせた、加えた、混合した、通り過ぎた（passed over）、インキュベートした、流したなどと互換性を持って使われる。しかも、本発明によるADNFポリペプチド又はそれらをコードしている核酸は、従来の方法、例えば、非経口、経口、局所、及び吸入経路により「投与」されうる。目下の好ましい態様において、非経口、及び鼻腔吸入ルートが利用される。
【００３０】
「十分量」又は「有効量」は、能力(例えば、学習及び/又は記憶)を改善する与えられたADNEポリペプチドの量である。例えば、学習と記憶の改善との関連において、「十分量」あるいは「有効量」は、最初の毎日の試験(参照記憶を表す)、あるいは毎日の試験の2回目(短期記憶を表す)のいずれかの水迷路試験で踏み台を見つける潜時を減少させる、与えられたADNFポリペプチドの量である。その用量範囲は、前記ADNFポリペプチドが使用された、投与経路、及び特定のADNFポリペプチドの力価に依存して変化しうるが、しかし前記アッセイを用いてすぐに決定されうる。
【００３１】
用語「分離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋」は、その天然状態で見られるような通常それに伴う成分を本質的又は実質的に含まない物質に関する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような化学分析技術を用いて純度と均質性が一般に決定される。製剤中に存在する優れた種のタンパク質は、実質的に精製されている。特に、分離されたADNF核酸は、ADNF遺伝子の側面にある読み取り枠から分けられ、そしてADNF以外のタンパク質をコードする。用語「精製された」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に1のバンドを生じることを意味する。特に、核酸又はタンパク質が、少なくとも85%純粋であり、より好ましくは少なくとも95%純粋であり、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。
【００３２】
「核酸」は、１本鎖若しくは２本鎖形態いずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、あるいはそれらのポリマーに関する。前記用語は、前記標準核酸のような類似の結合特性を持ち、かつ、前記標準核酸に類似した様式で新陳代謝される、合成、天然、及び、非天然のヌクレオチド・アナログ、又は修飾された骨格残基、あるいはリンケージを含む核酸を含む。前述のアナログの例は、制限されることなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミドエート、メチルホスホン酸塩、キラル−メチルホスホン酸塩、2-O-メチル・リボヌクレオチド、ペプチド-核酸(PNAs)を含む。
【００３３】
別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたそれらの変異体(例えば、縮重コドン置換)及び相補配列、並びにはっきりと示されている前記配列にも関係する。用語核酸は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換性を持って使われる。
【００３４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」そして「タンパク質」は、互換性を持って本明細書中にアミノ酸残基のポリマーに関して使われる。前記用語は、1以上のアミノ酸残基が対応の天然アミノ酸、並びに天然アミノ酸重合体のアナログ又は模倣であるアミノ酸重合体適合する。
【００３５】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、並びに天然、及びアナログ・アミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸模倣体に関する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸であり、並びにあとに修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、及びO-ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、すなわち、天然アミノ酸と同じ基礎化学構造を持つ、すなわち、α炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン・スルホキシド、メチオニン・メチル・スルホニウム)、合成アミノ酸に関する。そのようなアナログは、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)、あるいは修飾されたペプチド骨格を有するが、しかし、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を維持している。天然、及びアナログ・アミノ酸の両者は、合成的に作成されうる。アミノ酸模倣体は、前記のアミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、しかし天然アミノ酸に類似した様式で機能する構造を持つ化合物に関する。
【００３６】
アミノ酸は、それらの一般に知られている3文字表記によるか又はIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推薦される１文字表記により本明細書中に言及される。同様に、ヌクレオチドが、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及される。
【００３７】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列に適合する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一であるかあるいは本質的に同一なアミノ酸配列をコードするか、あるいはその核酸が本質的に同一の配列にアミノ酸配列をコードしない核酸に関する。特に、縮重コドン置換は、1以上の選択された(あるいは全ての)配列の3番目の位置を混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基により置換する配列の作製により達成される(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al.; Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。遺伝子コードの縮退のために、多数の機能的に同一な核酸が、全ての指定のタンパク質をコードする。例えば、コドン、GCA、GCC、GCG、及びGCUの全てがアミノ酸アラニンをコードする。このように、アラニンがコドンによって指定される全ての位置で、上記コドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく対応のコドンのいずれにも変更されうる。そのような核酸変異は、「サイレント変異」であって、保存的に修飾された変異体の一種である。ポリペプチドをコードする、本明細書中のあらゆる核酸配列は、上記核酸のあらゆる可能性のあるサイレント変異についても記載する。当業者は、（通常メチオニンのための唯一のコドンであるAUG、及び通常トリプトファンのための唯一のコドンであるTGGを除き）核酸中の各々のコドンが機能的に同一な分子を得るために修飾されうることを認める。それ故に、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変異は、潜在的に各々の記載の配列に存在する。
【００３８】
アミノ酸配列に関しては、当業者は、１のアミノ酸、若しくはコードされた配列のアミノ酸のわずかな割合を変更、付加、又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、あるいはタンパク質配列へのそれぞれの置換、欠失、又は付加が、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異」であることを認める。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的な置換テーブル（tables）が、本技術分野で周知である。保存的に修飾された変異体は、本発明の多形性の変異体、種間同族体、及び対立遺伝子に加えて、そしてそれを除外することなく存在する。
【００３９】
以下の群の各々は、互いに保存的に置換するアミノ酸を含んでいる：
1) アラニン(A)、グリシン(G)；
2) セリン(S)、スレオニン(T)；
3) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
4) アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
5) システイン(C)、メチオニン(M)；
6) アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H)；
7) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)； 及び
8) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
【００４０】
2以上の核酸あるいはポリペプチド配列の関係において、用語「同一の」又は「同一」の割合は、同じものであるか又は指定された割合のアミノ酸残基若しくはヌクレオチド(すなわち、70％同一)を持つ2以上の配列又はサブシークエンスに関する。これらは、以下の配列比較アルゴリズムの内の１つを用いて、又は手で行なうアライメント及び目視検査により計測されるように、比較ウィンドウの上の最大の対応のために比較、並びにアラインされる時、同じものである。そのような配列が、つまり「実質的に同一であると言われる。この定義は、同様に試験配列の相補物に関する。好ましくは、前記同一の割合は、少なくともおよそ25のアミノ酸の長さの前記配列領域で、より好ましくはおよそ50又は100のアミノ酸の長さの領域に渡り存在する。
【００４１】
配列比較のために、典型的には参照配列として働くある配列が、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験、及び参照配列をコンピュータに入力し、必要ならば、サブシークエンス座標を指示し、そして配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指示する。デフォルト・プログラム・パラメータを使うか、あるいは代わりのパラメーターを指示することができる。次に、配列比較アルゴリズムが、プログラム・パラメータに基づき参照配列に対する試験配列に関する配列同一率を計算する。
【００４２】
本明細書中に使用する「比較ウィンドウ」は、配列を2の配列が場合によりアラインされた後に隣接位置の同じ数の参照配列と比較する、20〜600、通常およそ50〜およそ200、さらに通常およそ100〜およそ150から成る群から選ばれた隣接位置の多くの内の1のセグメントの参照も含んでいる。比較のための配列のアライメントの方法は、本技術分野で周知である。場合により、比較のための配列の最良アライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv, Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的な同一構造アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の同一性アライメント・アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)類似性検索法、これらのアルゴリズム(the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP, BESTFIT, FASTA, 及び TFASTA)のコンピューター化した実施、あるいは手で行なう配列と目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. , eds. 1995 supplement)を参照のこと)により実施されうる。
【００４３】
配列同一率と配列類似性の測定に好適な好ましいアルゴリズムの例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) 及び Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載のBLAST、及びBLAST2.0アルゴリズムである。本発明の核酸及びタンパク質について配列同一率を測定するために、本明細書に記載のパラメーターを用いてBLAST、及びBLAST2.0を用いる。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース中の配列の同じ長さのワードとアラインされるとき、ある正の値を持つしきい値スコアTと合致するか又は満たすクエリー配列中のショートワードの長さWを確認することによりスコアの高い配列ペア(HSPs)に関与する。Tは、近傍ワード・スコアしきい値（the neighborhood word score threshold ）(Altschul et al.、前記)と呼ばれる。これらの最初の近傍ワードのヒットは、それらを含むより長いHSPsを見つけるための検索を開始するのための種としての役割を持つ。ヒットしたワードは、累積アライメント・スコアが増加する限り、各々の配列に沿って両方向に広げられる。ヌクレオチド配列についてのパラメーターM (1組の一致残基についての報酬得点；常時>O)、及びN(不一致残基についての罰金得点；常時<O)を用いて、累積スコアが計算される。アミノ酸配列について、累積スコアを計算するために得点しているマトリックスを使用する。各々の方向のヒットしたワードの延長は、以下時に止められる：累積アライメント・スコアが、値に達したその最大値からの数量Xまで落下する；1以上の負のスコアを持つ残基アライメントの集積に起因して、累積スコアがゼロ以下になる；あるいはどちらの配列の終わりに達する。BLASTアルゴリズム・パラメーターW、T、及びXが前記アライメントの感度及びスピードを決定する。（ヌクレオチド配列のための）BLASTNプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)、10の期待値（E）、 M=5、N=-4、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムはデフォルトとして3のワード長、及び10の期待値(E)、並びにBLOSUM62スコアリング・マトリックス(Henikoff &Henikoff、Proc. Natl． Acad． Sci． USA 89:10915 (1989年) を参照のこと)、50のアライメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、及び両鎖の比較を使用する。
【００４４】
BLASTアルゴリズムは、同様に2の配列の間の類似性の統計的分析を実施する(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat 'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照のこと)。前記BLASTアルゴリズムによって提供された類似性の1の計量は、2つのヌクレオチドあるいはアミノ酸配列の間の一致が偶然に生じる可能性の兆候を提供する)最小合計可能性(P(N))である。例えば、参照核酸と試験核酸の比較における最小合計可能性がおよそ0.2未満、より好ましくはおよそ0.01未満、最も好ましくはおよそ0.001未満である場合、上記核酸は参照配列に類似すると考えられる。2の核酸配列又はかポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下に記載のとおり、第2の核酸によってコードされたポリペプチドに対して生じた抗体が、第1の核酸によってコードされたポリペプチドに免疫学的に交差反応性であることである。このように、例えば、2のペプチドが保存的な置換のみ異なる場合は、第2のポリペプチドと典型的には実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一である他の指標は、以下に記載のとおり、上記2の分子又はそれらの相補物がストリンジェント条件下で、ハイブリダイズすることである。2の核酸配列が実質的に同一であるさらなる他の指標は、同じプライマーが上記配列の増幅に使われるうることである。
【００４５】
用語「選択的に(あるいは特異的に)ハイブリダイズする」は、その配列が複雑な混合物(例えば、細胞全体又はライブラリーDNA若しくはRNA)中に存在する時にストリンジェントハイブリダイズ形成条件下、特定のヌクレオチド配列だけで結合、2本鎖形成、あるいは分子のハイブリダイズ形成することに関する。
【００４６】
用語「ストリンジェント・ハイブリダイズ形成条件」は、典型的には核酸の複雑な混合物中、プローブが、他の配列ではなくその標的サブシークエンスにハイブリダイズする条件に関する。ストリンジェント条件は、配列に依存し、そしてさまざまな情況で異なる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイズ形成への幅広い指導が、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes. "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays " (1993)に見られる。一般的に、ストリンジェント条件は、定義されたイオン強度pHで特定の配列の熱メルティング・ポイント(Tm)より約5〜10℃低くなるように選ばれる。前記Tmは、(標的配列が過剰に存在し、Tmでプローブの50%が平衡で占めるような)平衡点で標的配列に50%のプローブが相補的に標的ハイブリダイズする、(定義されたイオン強度、pH、及び核酸濃度下の)温度である。ストリンジェント条件は、pH 7.0〜8.3で塩濃度がおよそ1.0M未満のナトリウムイオン、典型的にはおよそ0.01〜1.0 Mのナトリウムイオン濃度(あるいは他の塩)、かつ、その温度は、短いプローブ(例えば、10〜50のヌクレオチド)のためにおよそ少なくとも30℃であり、そして長いプローブ(例えば、(50超のヌクレオチド)のために少なくともおよそ60℃である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により成し遂げられうる。選択的又は特異的ハイブリダイズ形成のために、陽性シグナルは、少なくとも2回のバックグラウンド、好ましくは10回のバックグラウンド・ハイブリダイズ形成である。代表的なストリンジェント・ハイブリダイズ形成条件は、以下のとおりである： 50%のホルムアミド、5x SSC、そして1%SDS、42℃でインキュベート、又は5x SSC、1%SDS、65℃でインキュベート、65℃での0.2x SSC及び0.1％SDSによる洗浄。
【００４７】
それらがコードするポリペプチドが実質的に同じ場合、ストリンジェント条件下でお互いにハイブリダイズを作らない核酸は、まだ実質的に同じである。例えば、核酸のコピーが遺伝子コードによってもたらされた最大のコドン縮重を用いて作製される時にこれを生じる。そのような場合、核酸は、一般に中程度のストリンジェントハイブリダイズ形成条件下でハイブリダイズする。代表的な「中程度のストリンジェント・ハイブリダイズ形成条件」は、40%のホルムアミド、１M NaCl、1%SDSの緩衝液中、37℃でのハイブリッド形成、および1x SSC中45℃での洗浄を含んでいる。陽性のハイブリダイズ形成は、少なくとも2度のバックグラウンドである。すぐに代わりのハイブリッド形成と洗浄条件が類似のストリンジェント条件を提供するために利用されうることを当業者は認める。
【００４８】
本発明の詳細な説明、及び好ましい態様
能力の改善方法
本現在は、対象の能力(例えば、学習及び/又は記憶)を改善する方法を提供する。前記方法は、出生前又は出生後に、出生後の能力の改善に十分な量のADNFポリペプチドを対象に投与することを含む。特に、出生前の投与は、対象の空間的学習を改善することができる。そのような出生後又は出生前処置から恩恵を受けうる候補対象者、投与されうるADNFポリペプチド、時期及び投与の様式、学習と記憶の改善を評価するための試験、並びにADNFポリペプチドの製造方法を、以下に詳細に記載する。
【００４９】
ADNFポリペプチドによる治療についての候補対象
ADNFポリペプチドでの出生前、出生後処置には、多くの種類の対象での適用がある。例えば、正常な対象は、それらの学習及び記憶を改善する点で、ADNFポリペプチドの出生前処置から恩恵を受けることができる。正常な対象又は正常な知能を持つ対象は、ADNFポリペプチドでの出生前処置の処置なしでさえ、その知的機能レベルが平均付近か、あるいはそれ以上であるもの(例えば、75を超えるIQを持つ)に関する。胎児との関連で、正常な対象は、どんな精神的欠陥(例えば、羊水穿刺試験による)かつ/あるいは精神薄弱に関する危険因子(例えば、精神薄弱の家族歴又は対象に胎児アルコール症候群を引き起こすのに十分なアルコールを妊娠中に消費した母親)を持たないように思われる対象に関することができる。生まれてくる胚あるいは胎児の学習と記憶の能力を高めることを望む母親は、胚あるいは胎児が胎内にある間にADNFポリペプチドを投与されうる。
【００５０】
しかも、本方法は、その精神の能力に支障をきたしている対象に対し利益をもらすことができる。例えば、胎児がおそらく精神薄弱又はダウン症候群を持っていると診断された場合、出生後の学習と記憶が改善されるように、胎児は胎内でADNFポリペプチドにより処置されうる。好ましい態様において、精神薄弱は、母親の妊娠中のアルコール消費によって引き起こされない。すなわち、精神薄弱の候補対象は、胎児アルコール症候群(通常は、軽度から中程度、時々重度の精神薄弱又は学習障害の症状を含みうる）ではない。
【００５１】
重度の精神薄弱(50以下のIQと定義されている)は、しばしば遺伝子障害に起因する。これらは、例えばダウン症候群、脆弱X症候群、クラインフェルター症候群、プラダ-ウィリー症候群、及びネコ鳴き症候群を含む。これらの症状の多くが出生前の遺伝子の試験で診断されうる。例えば、遺伝子障害は、一般に妊娠14〜18週に実施される羊水穿刺試験、又は妊娠9〜12週に実施される絨毛穿刺サンプリングよって試験されうる。ADNFポリペプチドによる胎児の出生前処置は、それらの出生後の学習及び記憶のためになりうる。
【００５２】
精神薄弱を引き起こす遺伝子障害の出生前診断なしでさえ、ADNFポリペプチドは、予防的に特定の情況の胎児に投与されうる。例えば、対象が精神薄弱の家族歴を持つ場合、この対象は出生前にADNFポリペプチドにより処置されうる。他の例において、対象が風疹、髄膜炎、CMV、などのような感染症により精神薄弱で生まれるより高い危険性がある場合、対象は出生前にADNFポリペプチドにより処置されうる。他の例において、母親が高齢（例えば、35歳以上）である場合、対象は、ある遺伝子障害、例えばダウン症候群を持って生まれるより高い危険性にさらされている。ADNFポリペプチドによる予防的な出生前処置は、対象の学習と記憶の能力を改善することができる。
【００５３】
他の態様において、対象は、例えば短期学習と記憶を改善するために、晩年期に処置されうる。例えば、アルツハイマー症のような特定の記憶と学習の障害は、晩年期まで明らかにされていない。ADNFポリペプチドによる出生後投与を用いて処置されうる症状は、神経病理；知覚-運動の問題；認識タスクにおいて損なわれた対象の能力を改善する；記憶欠乏の対象の能力を改善する；正常な対象の能力を改善する；等を含んでいる．したがって、好適な製剤中の本発明の態様は、認識、運動あるいは知覚タスクの学習に必要な時間を減少させるために使用される。あるいは、好適な製剤中、本発明の化合物は、認識、運動、あるいは知覚タスクが保持されている時間の増加のために利用される。またあるいは、好適な製剤中、本発明の態様は、認識、運動あるいは知覚タスクを思い出すことで生み出される誤りの  量及び／又は重症度の減少のために使用されうる。そのような処置は、神経系へ受けた傷害を持つか又は神経系の病気に耐えている個体で特に有利であると認められうる。しかも、ADNFポリペプチドは、それらの能力(例えば、学習と記憶)を改善するために正常な対象に投与されることができる。記憶能力(例えば、短期記憶)が一般的に低下している高齢者の集団で、ADNFポリペプチドが特に役立つかもしれない。
【００５４】
ADNFポリペプチド
あらゆる好適な好適なADNFポリペプチドも本発明の態様により投与されうる。例えば、ADNFポリペプチドは、ADNFＩポリペプチド、ADNFIII ポリペプチド、あるいはそれらの混合物でありうる。ある態様において、ADNFポリペプチドは、全てのL-アミノ酸、全てのD-アミノ酸、あるいはそれらの組み合わせ物を含むかもしれない。ADNFポリペプチドが経口的に投与される場合、好ましくはADNFポリペプチドは、その活性核部位中に、より好ましくはその活性核部位のN末端及び／又はC末端に、さらにより好ましくはその活性核部位全体又は上記分子の全長にわたり、少なくとも1のD-アミノ酸を含む。あるいは、D-アミノ酸はポリペプチド配列中のあらゆる好適な位置にも存在しうる。ポリペプチドのD-鏡像異性体は、それらのL鏡像異性体より酵素的に安定しているため、特に胃腸管において、D-アミノ酸を含むADNFポリペプチドが経口投与に特に有用である。
【００５５】
1の側面において、前記方法は、以下のアミノ酸配列を持つ活性核部位を含むADNPＩポリペプチドの投与を含む：Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala。1の態様において、ADNFＩポリペプチドは、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Alaのアミノ酸配列を持つ活性核部位から成る。他の態様において、ADNFＩポリペプチドは、活性核部位のN末端かつ/あるいはC末端に追加のアミノ酸を含むことができる。例えば、ADNFＩポリペプチドは、活性核部位のN末端及び／又はC末端に最大40のアミノ酸を含むことができる。他の例において、ADNFＩポリペプチドは、活性核部位のN末端及び／又はC末端に最大20のアミノ酸を含むことができる。さらに他の例において、ADNFＩポリペプチドは、活性核部位のN末端及び／又はC末端に最大10のアミノ酸を含むことができる。さらに他の態様において、ADNEＩポリペプチドは、完全長のADNFＩポリペプチドでありうる。
【００５６】
他の側面において、前記方法は、以下のアミノ酸配列を持つ活性核部位を含むADNPIII ポリペプチドの投与を含む：Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln。1の態様において、ADNFIII ポリペプチドは、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Glnのアミノ酸配列を持つ活性核部位から成る。他の態様において、ADNFIII ポリペプチドは、活性核部位のN末端かつ/あるいはC末端に追加のアミノ酸を含むことができる。例えば、ADNFIII ポリペプチドは、活性核部位のN末端及び／又はC末端に最大40のアミノ酸を含むことができる。他の例において、ADNFIII ポリペプチドは、活性核部位のN末端及び／又はC末端に最大20のアミノ酸を含むことができる。さらに他の例において、ADNFIII ポリペプチドは、活性核部位のN末端及び／又はC末端に最大10のアミノ酸を含むことができる。さらに他の態様において、ADNEIII ポリペプチドは、完全長のADNFIII ポリペプチドでありうる。
【００５７】
好ましい態様において、ADNFＩポリペプチドは、(Rl)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R2)yのアミノ酸配列を含み、そしてADNFIII ポリペプチドは、(R3)w-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-
Gln-(R4)z-のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
上述の式中、存在する場合には、R1、R2、R3、及びR4の各々は、１〜およそ40のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、その中の各々のアミノ酸は独立に選ばれる。用語「独自に選ばれた」は、例えばアミノ酸配列R1を作り上げるアミノ酸が同じであるかあるいは異なるかもしれない(例えばこのアミノ酸配列中のアミノ酸の全てがスレオニンである等)こと示すために本明細書中で使われる。しかも、先に説明したように、アミノ酸配列R1を作り上げるるアミノ酸が、天然アミノ酸、又は天然アミノ酸に類似した様式で機能する天然アミノ酸の既知のアナログ(アミノ酸模倣体)のいずれかである。R1に付随するこの論議は、R2、R3、及びR4に完全に適用されうる。
【００５９】
ADNFＩポリペプチドについての上述の式中、x、及びyは、独立に選ばれて、かつ、0又は１に等しい。用語、独立に選ばれたは、xとyが同じであるかあるいは異なるかもしれないことを示すために本明細書中に使用される。例えば、xとyのどちらもゼロか、あるいはxとyのどちらも１であるかもしれない。さらに、xがゼロであるかもしれず、yが１であるかもしれないか、あるいは、xが１であるかもしれず、yがゼロであるかもしれない。しかも、xとyが共に１であるとき、前記アミノ酸配列R1とR2が同じものか又は異なるものであるかもしれない。そのように、アミノ酸配列R1とR2は、独立に選ばれる。R1とR2が同じものである場合、それらは鎖の長さ及びアミノ酸組成の両方の条件で同一である。例えば、R1もR2もVal-Leu-Gly-Gly-Glyであるかもしれない。R1とR2が異なる場合、それらは、鎖の長さ及び／又はアミノ酸組成の及び／又はアミノ酸配列中のアミノ酸の順序に関して互いに異なる。例えば、R1がVal-Leu-Gly-Gly-Glyでり、R2がVal-Leu-Gly-Glyであるかもしれない。あるいは、R1がVal-Leu-Gly-Gly-Glyであり、R2がVal-Leu-Gly-Gly-Valであるかもしれない。あるいは、R1がVal-Leu-Gly-Gly-Glyであり、R2がGly-Val-Leu-Gly-Glyであるかもしれない。
【００６０】
ADNFIII ポリペプチドについての上述の式中、w、及びzは、独立に選ばれて、かつ、0又は１に等しい。用語、独立に選ばれたは、wとzが同じであるかあるいは異なるかもしれないことを示すために本明細書中に使用される。例えば、wとzのどちらもゼロか、あるいはwとzのどちらも１であるかもしれない。さらに、wがゼロであるかもしれず、zが１であるかもしれないか、あるいは、wが１であるかもしれず、zがゼロであるかもしれない。しかも、wとzが共に１であるとき、前記アミノ酸配列R3とR4が同じものか又は異なるものであるかもしれない。そのように、アミノ酸配列R3とR4は、独立に選ばれる。R3とR4が同じものである場合、それらは鎖の長さ及びアミノ酸組成の両方の条件で同一である。例えば、R3もR4もLeu-Gly-Leu-Gly-Glyであるかもしれない。R3とR4が異なる場合、それらは、鎖の長さ及び／又はアミノ酸組成の及び／又はアミノ酸配列中のアミノ酸の順序に関して互いに異なる。例えば、R3がLeu-Gly-Leu-Gly-Glyでり、R4がLeu-Gly-Leu-Glyであるかもしれない。あるいは、R3がLeu-Gly-Leu-Gly-Glyであり、R4がLeu-Gly-Leu-Gly-Leuであるかもしれない。
【００６１】
範囲内の、あるADNFＩ及びADNFIII ポリペプチドは、好ましくは、言い換えると、x、y、w、及びzの全てがゼロのもの（例えば、それぞれSALLRSIPA、及びNAPVSIPQ)である。等しく好ましくは、xが1であり；R1がVal-Leu-Gly-Gly-Glyであり；そしてyがゼロであるADNFＩポリペプチドである。同様に等しく好ましくは、xが１であり；R1がVal-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Glyであり；そしてyがゼロであるADNFＩポリペプチドである。同様に等しく好ましくは、wが１であり；R3がGly-Glyであり；そしてzがゼロであるADNFIII ポリペプチドである。同様に等しく好ましくは、wが１でありの；R3がLeu-Gly-Glyであり；zが１であり；そしてR4がGln-SerであるADNF III ポリペプチドである。同様に等しく好ましくは、wが１であり；R3がLeu-Gly-Leu-Gly-Gly-であり；zが１であり；そしてR4がGln-SerであるADNFIII ポリペプチドである。同様に等しく好ましくは、wが１であり；R3がSer-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Glyであり；zが１であり；そしてR4がGln-SerであるADNFIII ポリペプチドである。完全なADNFＩ又はADNF III 増殖因子が特別な生理活性を示す事実によって証明されるように生理活性の損失なしにこれらの活性部位のN末端及びC末端（SALLRSIPA又はNAPVSIPQ）の両方に、追加のアミノ酸を加えることができる。ADNFＩポリペプチドの説明に関する1994年10月17日出願U.S.S.N. 08/324,297(WO96/11948としても掲載されている)；並びにADNFIII ポリペプチドの説明に関する1997年2月27日出願U.S.S.N. 60/037,404、及び、1997年9月23日出願U.S.S.N 60/059,621（WO98/35042としても掲載されている）を参照のこと、そして上記文献の全てを本明細書中に援用する。
【００６２】
さらに他の側面において、ADNFＩポリペプチドとADNEIII ポリペプチドの混合物を対象に投与する方法が含む。本明細書中に記載のいずれか1以上のADNFＩポリペプチドは、本明細書中に記載のいずれか1以上のADNFIII ポリペプチドと混合されうる。ADNFＩポリペプチドとADNEIII ポリペプチドの混合物は、それらのポリペプチドの2以上の混ぜ合わせでありうる。ADNFＩポリペプチドとADNEIII ポリペプチドの混合物は、1以上のADNEIII ポリペプチドに（直接的又は間接的に）結合させた1以上のADNFＩポリペプチドに関する。例えば、ADNFＩポリペプチドはADNEIII ポリペプチドに共有的に結合しうる。ADNFＩポリペプチドとADNEIII ポリペプチドの混合物は、１の組成物として製造され、そして対象に投与される。あるいは、ADNFＩポリペプチドとADNEIII ポリペプチドは別個の組成物として製造されうる。前記の別個の組成物は、その後同時にあるいは連続して対象に投与されうる。さらに、異なる割合のADNFＩポリペプチドとADNEIII ポリペプチドが、対象に投与される。例えば、対象は、その中にADNFＩポリペプチドとADNEIII ポリペプチドの比率が1：100〜100:1、1：10〜10:1、又は1：2〜2:1の範囲内にありうるADNFポリペプチドを投与される。
【００６３】
さらに他の側面において、(それらの対立遺伝子、多形性変異体、種間相同体、及びそれらのサブシークエンスを含む)他のADNFポリペプチドは、能力の向上に使用されうる。
【００６４】
ADNFポリペプチドかADNFポリペプチドの混合物が対象の能力を改善するかどうかを決定するために様々なパラメーターが計測されうる。例えば、学習欠陥の程度は、対照(例えば、ADNFポリペプチドで未処理) とADNFポリペプチドで前もって処理された群と間で比較されうる。学習欠陥は、例えば、モリス水迷路を用いて評価することができる(例えば、実施例の項を参照のこと)。ADNFポリペプチドにより処置した群に関してこれらのパラメーターのいずらか1つが、対象と比較して、例えば、およそ10%、場合により少なくともおよそ20％、少なくともおよそ30％、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50％0、少なくともおよそ60％、少なくともおよそ70％、少なくともおよそ80％、少なくともおよそ90％、少なくともおよそ100%、少なくともおよそ150%、少なくともおよそ200%などまで変化する場合、このときこれらのADNFポリペプチドは本発明に有益に使用されうる。
【００６５】
投与と医薬組成物
ADNFポリペプチド及びADNFポリペプチドをコードする核酸が、本技術分野で知られているあらゆる好適な方法を用いて出生前又は出生後に対象に投与される。例えば、ADNFポリペプチドか核酸は、医薬として許容される希釈液、担体、あるいは賦形剤と一緒に医薬組成物として処方されうる。本発明の使用のために好適な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed. 1985)に見られる、上記文献を本明細書中に援用する。薬剤輸送の方法の簡単な総説が、例えばLanger, Science 249:1527-1533 (1990) に記載されもしている、上記文献を本明細書中に援用する。さらに、ペプチドとタンパク質を含んでいる医薬組成物は、例えばTherapeutic Peptides and Proteins Formulations, Processing. and Delivery Systems, by Banga, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA (1995)に記載されている。
【００６６】
1の態様において、ADNFポリペプチドは、例えば、対象への、あるいは、出生前投与のために対象の母親への、経口投与のために処方されうる。この態様において、全てのDアミノ酸を含んでいるADNFポリペプチドが使われる方が好ましい。通常利用される賦形剤のいずれかと、一般に10-95%の、そしてより好ましくは25%-75%の濃度で活性成分取り入れることによって医薬として許容される無毒の組成物が形成される。さらに、ADNFポリペプチドの経口吸収を改善するために、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、リン脂質、エマルジョン、赤血球などの様々な搬送システムを使用しうる。本発明のADNFポリペプチドを含んでいる経口剤は、液体、錠剤、カプセルなどの経口投与のためのいずれかの好適な形状であるかもしれない。経口製剤は、よりさらに表面をコートされるか、あるいは胃での溶解を防ぐか若しくは減らすために処理されうる。 見ること、例えば、Therapeutic Peptides and Proteins. Formulation. Processing, and Delivery Systems. by A.K. Banga, Technomic Publishing Company, Inc., 1995, を参照のこと。
【００６７】
さらに、ADNFポリペプチドは、非経口、局所、経鼻、舌下、胃管による、あるいは局部投与のために処方されうる。例えば、例えば前記医薬組成物は、非経口的に、例えば静中、皮下、皮内、又は筋中、あるいは経鼻的に投与される。このように、本発明は、非経口投与のための、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解、又は懸濁したADNFポリペプチドの混合物の溶液を含む組成物を提供する。例えば水、緩衝水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸などを含む種々の水性担体が使われるかもしれない。これらの組成物は、慣例の周知の殺菌技術によって殺菌されうるか、あるいはろ過滅菌されうる。得られた水溶液は、使用のためにそのままで包装されるか、あるいは凍結乾燥され、この凍結乾燥さた製剤は、投与前に無菌液と合わせられる。pH調整及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタン、モノラウレート、トリエタノールアミン、オレイン酸塩、などを含む生理学的な条件が要求される医薬として許容される助剤を含みうる。1の態様において、ADNFポリペプチドをコードする核酸が剥き出しのDNAとして投与される。
【００６８】
エアロゾル投与のために、ADNFポリペプチドは、好ましくは界面活性剤と噴射剤を伴った細かく分散した形状で供給される。前記界面活性剤は、もちろん無毒で、そして好ましくは噴射剤中に溶解する必要がある。そのような剤の代表が、エステルあるいは6〜22の炭素原子を含む脂肪酸の部分的エステル、例えば脂肪族の多価アルコール又はその環式無水和物を持つカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルチミン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（olesteric acid）、及びオレイン酸である。混合エステル、例えば混合、又は天然グリセリドが利用される。所望される場合、鼻腔デリバリーのためのレシチンを伴うように担体を含むこともできる。
【００６９】
固体組成物のために、慣習の無毒の固体担体が使われるかもしれない。固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどを含む。
【００７０】
本発明は、本明細書中に記載のADNFＩ及びIII ポリペプチドの１以上の混合物を医薬として許容される賦形剤との合剤で含む治療用組成物又は医薬品を提供し、ここでADNFＩとADNFIII ポリペプチドの混合物の量は、所望の治療効果を提供するのに十分である。
SALLRSIPA及びNAPVSIPQを含む小さいポリペプチドは、血液脳関門を越える。血液脳関門を越えないより長いポリペプチドについて、タンパク質の脳への投与方法がよく知られている。例えば、タンパク質、ポリペプチド、他の化合物、及び細胞が、脳室内(ICV)注射によって、あるいはカニューレによって哺乳類の脳にデリバリーされうる(例えば、Motta & Martini, Proc.
Soc. Exp, Biol. Med. 168:62-64 (1981); Peterson et al., Biochem. Pharamacol. 31 :2807-2810 (1982); Rzepczynski et al.. Metab. Brain Dis. 3:21 1-216 (1988); Leibowitz et al., Brain Res. Bull. 21 :905-912 (1988); Sramka et al., Stereotact. Funct. Neurosurg. 58:79-83 (1992); Peng et al., Brain Res. 632:57-67 (1993); Chem et al., Exp. Neurol. 125:72-81 (1994); Nikkhah et al., Neuroscience 63:57-72 (1994); Anderson et al.. J Comp. Neurol, 357:296-317 (1995); 及び Brecknell & Fawcett, Exp. Neurol. 138:338-344 (1996)を参照のこと)。特に、カニューレが神経栄養因子を哺乳動物に投与するために使用されうる(例えば、Motta & Martini, Proc. Soc. Exp. Biol, Med. 168:62-64 (1981) (neurotensin); Peng et al., Brain Res. 632:57-67 (1993) (NGF); Anderson et al., J. Comp. Neurol. 357:296-317 (1995) (BDNF, NGF, neurotrophin-3を参照のこと)。
【００７１】
あるいは、血液脳関門を越えないより長いADNFポリペプチドは、ADNFポリペプチドが血液脳関門を越える、並びに細胞の形質膜、又は細胞内成分、例えば核の膜を越えるのを助ける物質と対を成すことができる。細胞の膜は、小さくて、非イオン性の親油性化合物に対して自由浸透性の脂質-タンパク質二重層から構成され、極性化合物、高分子、及び治療又は診断薬を本質的に通さない。しかし、細胞膜を横切ってADNFポリペプチドのようなポリペプチドの転移能力を持つタンパク質及び他の化合物、例えばリポソームが、記載されている。
【００７２】
例えば「膜転移ポリペプチド」は、膜転移担体として働く能力を持つ両親媒性又は疎水性アミノ酸サブシークエンスを持つ。1の態様において、ホメオドメイン・タンパク質には細胞膜を越える転移能力がある。ホメオドメイン・タンパク質、アンテナペディアの最も短い内在ペプチドは、そのタンパク質、43位〜58位アミノ酸の3番へリックスであると分かった(例えば、Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6:629-634 (1996)を参照のこと)。他のサブシークエンス、シグナル・ペプチドの疎水性ドメインが、類似した細胞膜転移特性を持っていると分かった(例えば、Lin et al., J. Biol. Chem. 270:1 4255-14258 (1995)を参照のこと)。
【００７３】
細胞中へのADNFポリペプチドの取り込みを容易にするための本発明のADNFポリペプチドと連結しうるペプチド配列の例は、制限されることなく：HIVのtatタンパク質の11アミノ酸ペプチド(Schwarze et al., Science 285 :1 569-1572 (1999)を参照のこと)；p16タンパク質の第84〜103アミノ酸に対応する20残基のペプチド配列(Fahraeus et al., Current Biology 6:84 (1996)を参照のこと)；アンテナペディアの第3へリックスの60アミノ酸の長いホメオドメイン(Derossi et al.. J. Biol. Chem. 269:10444 (1994))；シグナルペプチドのh領域、例えばカポジ線維芽細胞増殖因子（K-FGF）h領域(Lin et al.,前記)；あるいはHSVからのVP22転移ドメイン(Elliot & O 'Hare, Cell 88:223-233 (1997))を含む。高められた細胞への取り込みを提供する他の好適な化学成分を、化学的にADNFポリペプチドに連結しうる。
【００７４】
毒素分子には、同様に細胞膜を越えてポリペプチドを輸送する能力がある。多くの場合、そのような分子は、少なくとも2つの部分から構成される(「2成分毒素」と呼ばれる)：転移又は結合ドメイン又はポリペプチド及び別個の毒素ドメイン又はポリペプチド。一般に、前記転移ドメイン又はポリペプチドは、細胞レセプターに結合し、そして次にその毒素は細胞内に輸送される。クロストリジウム属パーフリンゲンス（Clostridium perfingens）イオタ毒素、ジフテリア毒素(DT)、シュードモナス属（Pseudomonas）エクソトキシンA(PE) 、百日咳毒素(PT)、炭疽菌毒素、及び百日咳アデニレートシクラーゼ(CYA)を含む数種の細菌毒素が、内部又はアミノ介在性融合体として細胞の細胞質ゾルへペプチドをデリバリーするための試みに使用されてきた(Arora et al.. J. Biol. Chem., 268:3334-3341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun., 61 :5147-5156 (1993); Stenmark et al., J. Cell Biol. 113:1025-1032 (1991); Donnelly et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:3530-3534 (1993); Carbonetti et al,, Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295 (1995); Sebo et al.. Infect. Immun. 63:3851-3857 (1995); Klimpel et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10277-10281 (1992); and Novak et al., J. Biol. Chem. 267:17186-17193 (1992))。
【００７５】
そのようなサブシークエンスは、細胞膜を越えるADNFポリペプチド転移に使用されうる。ADNFポリペプチドは、前述の配列に慣習的に融合されるか又はその配列を用いて誘導体化されうる。一般に、転移配列は、融合タンパク質の一部として提供される。場合により、リンカーが、ADNFポリペプチドと転移配列の連結に使用されうる。あらゆる好適なリンカー、例えばペプチド・リンカーが使用されうる。
【００７６】
ADNFポリペプチド及びADNFポリペプチドをコードする核酸は、リポソーム及びリポソーム誘導体、例えば免疫リポソーム（immunoliposomes）及び脂質：核酸複合体によって動物の細胞、好ましくは哺乳動物細胞に導入されうる。用語「リポソーム」は、水相を閉じ込めた１以上の同心円状に整えられた脂質二重層から成る小胞に関する。前記水相は、細胞にデリバリーすべき化合物、すなわちADNFポリペプチドを典型的には含んでいる。
【００７７】
リポソームは、形質膜と融合し、それによって、細胞質ゾル中へADNEポリペプチドを放出する。あるいは、リポソームは、貪食されるか、あるいは輸送液胞を用いて細胞により取り上げられる。いったんエンドソームあるいは食作用胞内で、リポソームは、分解又は輸送液胞の膜と融合し、そして、その内容物が放出される。
【００７８】
リポソームによるドラッグ・デリバリーの最近の方法で、標的組織あるいは細胞において、リポソームは、最終的に浸透性になって封入した化合物(今回はADNFポリペプチド)を放出する。全身又は組織特異的デリバリーのために、これが、例えば、リポソーム二重層が長期にわたって体内の様々な作用物質の作用を通して分解される受動的様式で達成できる。あるいは、能動的薬剤放出は、リポソーム液胞の透過性変化を誘発するための作用物質の使用に関連する。環境がリポソーム膜に近い酸性になった時にそれらが不安定になようにリポソーム膜を構築できる(例えば、Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 84:7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989)を参照のこと)。リポソームが、例えば標的細胞によりエンドサイト−シスされる時、それらは不安定になり、そしてその内容物を放出する。この不安定化は、融合誘導（fusogenesis）と呼ばれる。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)は、多くの「融合誘導」システムのベースである。
【００７９】
そのようなリポソームは、一般にADNFポリペプチド及び脂質成分、例えば中性及び／又はカチオン性脂質を含み、場合により所定の細胞表面レセプタ又はリガンドに結合する抗体のようなレセプター認識分子を含む。(例えば、抗原)。例えば、Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)、米国特許番号第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774.085号、同第4,837,028号、同第4.235.871号、同第4.261,975号、同第4,485,054号、同第4.501,728号、同第4.774,085号、同第4,837.028号、同第4,946,787号、PCT掲載番号WO 91/17424、Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629-634 (1976); Fraley, et al., Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 76:3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812:55-65 (1985); Mayer et al,, Biochim. Biophys. Acta 858:161-168 (1986); Williams et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:242-246 (1988); Liposomes (Ostro (ed.), 1983, Chapter 1); Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) and Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993))に記載のとおり種々の方法が、リポソームの調製に入手可能である。例えば、超音波処理、押出し、高圧/均質化、微小流動化（microfluidization）、洗浄液透析、小リポソーム胞のカルシウム誘発性融合、及びエーテル融合法を含む好適な方法の全てが、本技術分野で周知である。
【００８０】
本発明のある態様において、特別の細胞型、組織などに特有な標的成分を用いて本発明のリポソームを標的とするのは望ましい。さまざまな標的成分(例えば、リガンド、レセプター、及びモノクローナル抗体)を用いたリポソームの標的化は、すでに記載されている(米国特許番号第4,957,773号及び同第4,603,044号を参照のこと)。リポソームに標的物質を連結するための標準法が使用されうる。これらの方法は、一般に脂質成分、例えば標的物質の付着のために活性化に関与するホスファチジルエタノールアミン又は誘導体化親油性化合物、例えば、脂質誘導体化ブレオマイシンのリポソームの中への取り込みを伴う。抗体標的リポソームは、例えば、タンパク質Aを含むリポソームを用いて構築されうる(Renneisen et al. , J Biol. Chem. , 265:16337,16342 (1990) 及び Leonetti et al,, Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 87:2448-2451 (1990)を参照のこと）。
【００８１】
あるいは、ADNFをコードする核酸は、治療量のADNFポリペプチドを提供するために使用されうる。これらの核酸は、標的細胞及び臓器にトランスフェクションするための多数の周知のベクターの全ての中に挿入されうる。例えば、核酸は、DNAプラスミド、剥き出しの核酸（naked nucleic acid）、及びリポソームのようなデリバリー担体と核酸の複合体としてデリバリーされる。ウイルス・ベクター・デリバリー・システムは、DNA及びRNAウイルスを含み、それらは細胞へのデリバリーの後のエピソーム又は組み込みゲノムのいずれかを持っている。遺伝子治療手法の総説について、Anderson, Science 256:808-8 13 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11 :21 1-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11 :162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11 :167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1):3 1-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and B6hm (eds) (1995); and Yu et al., Gene Therapy 1 :13-26 (1994)を参照のこと。
【００８２】
核酸の非ウイルス性デリバリー法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、あるいは脂質：核酸コンジュゲート、剥き出しのDNA、人工的なウイルス粒子、及びDNAの取り込みを高める剤を含む。リポフェクションは、例えば、米国特許番号第5,049,386号、同第4,946,787号、及び同第4,897,355号中に記載され、そしてリポフェクション試薬は、市販されている(例えばTransfectam（商標）及びLipofectin（商標）)売られる。ポリヌクレオチドの能率的なレセプター認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質は、Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024のそれらを含んでいる。デリバリーは、細胞(ex vivo投与)へ又は標的組織(生体内の投与)へであるかもしれない。
【００８３】
治療への適用において、本発明のADNFＩ及びADNFIII ポリペプチドの混合物が、対象の能力(例えば、学習及び／又は記憶)を改善するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療としての有効量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば使用した特定のADNFＩ又はADNFIII ポリペプチド、投与様式、患者の重量及び全身の健康状態、並びに処方内科医の判断依存するであろう。例えば、能力(例えば、学習と記憶)の改良のために、ADNFＩ又はかADNFIII ポリペプチドの量は、1μg〜50μgの範囲に収まり、好ましくはマウス１匹当り1日1度、経鼻的に与えられた(例えば、夕方)1μg〜10μgの用量が医薬としての有効量である。この用量は、マウスの平均の体重に基づく。従って、適切な服用量は、人体について推定されうる。
ADNFポリペプチドは、出生前に直接的又は対象の母親を通じて間接的に対象に投与されうる。ADNFポリペプチドは、妊娠中のどの時期にも投与されうる。好ましくは、ADNFポリペプチドは、対象の臓器と神経系が活発に発達している妊娠の最初の3ヶ月(すなわち、最初の12週間)の間に対象に投与される。より好ましくは、ADNFポリペプチドは、神経管発生時(受胎後およそ22日目辺り)とその閉鎖前の期間に投与される。ADNFポリペプチドは、好ましくは神経管発生の臨界期中の単回服用として投与されるか、あるいは妊娠全体にわたる複数回服用として投与されうる。
【００８４】
改善された学習及び／又は記憶を計測するための試験
ADNFポリペプチドが能力(例えば、学習と記憶)を改善するかどうかを決定するために生体内で様々なパラメーターが測られるうる。例えば、モリス水迷路(以下の実施例の項で述べられる)の隠された踏み台試験は、空間的学習と記憶の試験のために使用されうる。一般的に、ADNFポリペプチドで処置されたマウスと対照マウス(ADNFポリペプチドで処置されていない)は、隠された踏み台の位置とそこへ登ることを学ぶことによって水泳タスクを回避するように訓練される。このタスクを完了するのにそれらが要した時を、回避潜時と定義する。この試験は、1日1回以上、何日にも渡り行われうる。改善された学習と記憶を示す1のパラメーターは、隠された踏み台(以下の実施例の項を参照のこと)に登ることによる水泳タスクの回避潜時の削減である。methods described in Gozes et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :427-432 (1996)も参照のこと、ここで、上記文献を本明細書中に援用する。ADNFポリペプチド処置された動物は、ADNFポリペプチド処置されない対象に比べ、それらの学習及び記憶能力の改善を示す。本発明の態様は、能力の計測のために使用された試験の例により制限されない。あらゆる好適な試験方法が、能力、例えば学習と記憶の計測に使用されうる。
【００８５】
本技術分野で知られている他の方法は、ヒトの対象においてADNFポリペプチド又はADNFポリペプチドの組み合わせ物が生体内で能力(例えば、学習と記憶)を改善するかどうかを決定するために使用されうる。例えば、これらの方法は、Randt記憶試験(Randt et al. , Clin. Neuropsychol. 2:184 (1980)、ウェクスラー記憶検査(J. Psych. 19:87-95 (1945)、フォワード桁スパン試験(Craik, Age Differences in Human Memory,: Handbook of the Psychology of Aging中, Binen and Schaie (Eds.), New York, Van Nostrand (1977), ミニ精神状態試験(Folstein et al., J. of Psych. Res. 12:189-192 (1975), 又はカリフォルニア言語学習試験(CVLT))による長い間にわたっての記憶か学習の評価を含む。また、米国特許番号第6,030,968を参照のこと。これらの試験で、ADNFポリペプチドの効果に関係がない因子(例えば、不安、疲労、怒り、うつ病、錯乱、あるいは活力)が制御されている。米国特許番号第5,063,206号を参照のこと。主体の因子について評価及び制御するための方法は、本技術分野で知られ、そして前述の標準的な臨床検査、例えば、BECK うつ病検査、Spielberger Trait State 不安検査、及びPOMS検査(気分の状況の特徴)によって決定される。
【００８６】
空間的学習は、ヒトおいても試験されうる。例えば、対象は、絵を描くように頼まれ、その後その絵は持ち去られる。次に、前記対象は、そして記憶から同じ絵を描くように頼まれる。この対象によって描かれた後の絵は、対象の空間的学習の程度を反映する。
【００８７】
様々なパラメーターを、ADNFポリペプチドが学習と対象の記憶を改善するかどうかを決定するために計測しうる。例えば、学習と記憶の程度は、対象(例えば、ADNFポリペプチドで未処理)とADNFポリペプチドで前もって処理された群の間で改善が比較されうる。学習と記憶の改善は、齧歯類についてはモリス水迷路を使い(例えば実施例の項を参照のこと)、あるいはヒトについては前述のようないずれかの好適な試験を用いて評価されうる。これらのパラメーターのいずれか1以上が、対照と比べて、例えばおよそ10%、場合により少なくともおよそ20%、少なくともおよそ30%、少なくともおよそ40%、少なくともおよそ50%、少なくともおよそ60%、少なくともおよそ70%、少なくともおよそ80%、少なくともおよそ90%、少なくともおよそ100%、少なくともおよそ150%、少なくともおよそ200%などまで変化した場合、ADNFポリペプチドが対象の学習と記憶を改善したとは言われることができる。あるいは、連続的な変数のためのANOVA、非母数データのためのマン-ホイットニーU、カテゴリー変数のためのカイ二乗、あるいはフィッシャー精密試験を用いた統計分析は、p<0.05に該当するときに有意であると考えられる。
【００８８】
ADNFポリペプチドの製造方法
ADNFポリペプチドの製造のための組み換え法
ADNF核酸のクローニングと単離
ADNFポリペプチドをコードしている数個の特定の核酸を本明細書中に記載する。Brenneman & Gozes, J. Clin. Invest. 97:2299-2307 (1996), Brenneman, J. Pharm. Exp. Ther. 285:619-627 (1998), 及び Bassan et al., J, Neurochem 72: 1283-1293 (1999)も参照のこと、ここで、この教示の全てをを本明細書中に援用する。標準的な組換え又は合成技術を用いてこれらの核酸を作製しうる。本発明の核酸を与えることで、当業者は、同じADNFポリペプチドをコードする核酸のような機能的に同等の核酸を含んでいる種々のクローンを構築しうる。これらの目的を達成するクローニング方法論、及び核酸の配列を確認する配列決定法は、本技術分野で周知である。適当なクローニング及び配列決定技術の例、並びに多くのクローニング機能試験を通しての当業者を指揮するのに十分な指導の例がSambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed, 1989) 及び Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, , eds., 1994) に見られる。さらに、生物学的試薬及び実験装置のメーカーからの製品情報が、既知の生物学的方法に役立つ情報を提供しもする。そのような製造業者は、SIGMA chemical company (Saint Louis, MO),
R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ). CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research. Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen (San Diego, CA), 及び Applied Biosystems (Foster City, CA)、並びに当業者に知られる多くの他の商業的ソースを含む。
【００８９】
本願発明の核酸組成物は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、あるいは様々な混合物の混成であるかどうかにかからわず、生物起源、例えば神経膠星状細胞、神経芽細胞、あるいは線維芽細胞から分離されるか、又は試験管内で合成される。本発明の核酸は、形質転換又はトランスフェクト細胞中、形質転換又はトランスフェクト細胞ライセート中、あるいは部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形状で存在しうる。
【００９０】
分子プローブとして及びサブクローニングが続く核酸フラグメントの製造のための配列増幅に好適な生体外の増幅技術が知られている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、QBレプリカーゼ増幅、及び他のRNA合成酵素介在型の技術（例えば、NASBA）を含む、そのような生体外の増幅方法を通して当業者を導くのに十分な技術の例が、Berger, Sambrook et al. and Ausubel et al. , all supra, as well as in U.S. Patent No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds., 1990); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research 3 :8 1-94 (1991); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1 173 (1989); Guatelli et al., Proc, Natl. Acad. Sci, USA 87:1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem 35:1826 (1989); Landegren et al,, Science 241 :1077-1080 (1988); Van Brunt, Biotechnology 8:291-294 (1990); Wu & Wallace, Gene 4:560 (1989); Barringer et al., Gene 89: 117 (1990); 及び Sooknanan & Malek, Biotechnology 13:563-564 (1995)に見られる。生体外増幅された核酸をクローニングする改良された方法は、米国特許番号第5,426,039号に記載されている。大きな核酸を増幅する改良された方法は、Cheng et al,, Nature 369:684-685 (1994) に要約されており、ここで、上記文献を本明細書中に援用する。当業者は、本質的にどんなRNAも、制限酵素消化法、PCR伸長、及び逆転写酵素とポリメラーゼを用いた配列決定に好適な２本鎖DNAに変換しうることを理解するであろう。
【００９１】
例えば、生体外のADNF核酸増幅方法のためのプローブとして使用するための、あるいはADNF核酸を検出するための核酸プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、典型的にはBeaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts.
22(20):1859-1862 (1981)により記載される固相ホスホルアミド・トリエステル法によるか、又は例えば、Needham-VanDevanter et al,, Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載のとおり自動合成装置を用いて化学的に合成される。オリゴヌクレオチドは、オーダーメイドされ、当業者に知られた種々の商業的ソースに注文されるかもしれない。Pearson & Regnier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)に記載のとおり、オリゴヌクレオチドの精製は、必要であれば、一般には、ネイティブ・アクリルアミドゲル電気泳動法か、又は陰イオン交換HPLCのいずれかによって実施される。Maxam & Gilbert, in Methods in Enzymology 65:499-560 (Grossman & Moldave, eds., 1980)の化学分解方法を用いて合成オリゴヌクレオチド配列が確認されうる。
【００９２】
当業者は、与えられた核酸配列の変更を産み出す多くの方法を理解するであろう。そのような周知の方法は、部位指定突然変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅、核酸を含んでいる細胞の突然変異誘発剤若しくは放射への暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、大きな核酸を生じるための連結及び／又はクローニングに関連する)、並びに他の周知の技術(Giliman & Smith, Gene 8 :8 1-97 (1979); Roberts et al., Nature 328:73 1-734 (1987); 及び Sambrook et al. , Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)を参照のこと)を含んでいる。
【００９３】
ADNFポリペプチドの組換え発現
1の態様において、ポリペプチドあるいはそのサブシークエンスは、組み換え核酸方法論を用いて合成される。一般的に、これは、前記タンパク質をコードする核酸配列を作製し、特定のプロモーターの制御下で上記核酸を発現カセット中に配置し、宿主細胞内で上記タンパク質を発現させ、発現されたタンパク質を分離し、もし、必要とされれば、タンパク質を再生することを伴う。
【００９４】
本発明のADNFポリペプチドをコードする核酸は、分離され、そしてクローニングされるとすぐに、上記核酸は、場合によりに当業者に知られた組換えにより作製された細胞において発現される。そのような細胞の例は、制限されることなく、細菌、酵母、植物、糸状菌類、昆虫（特に、バキュロウイルスを使用）哺乳動物細胞。組み換え核酸は、選ばれた宿主における発現のために適当な制御配列に使用可能な状態で連結される。E.コリ（E.coli）のために、制御配列の例は、T7、trp、あるいはラムダプロモーター、リボソーム結合部位、そして好ましくは転写終止シグナルを含んでいる。真核生物細胞のために、制御配列は、一般にプロモーター及び好ましくは免疫グロブリン遺伝子由来のエンハンサー、SV40、サイトメガロウイルスなど、並びに、ポリアデニル化配列を含み、そして、スプライス供与体及び受容体配列を含んでいるかもしれない。
【００９５】
もし望まれれば、組み換えの核酸は、ADNFポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするように構築されることができる。例えば、ADNFＩポリペプチドをコードする核酸は、ADNFIII ポリペプチドをコードする核酸に連結され、ADNFポリペプチドの混合物を提供する。他の例において、ADNFポリペプチド(例えばADNFＩポリペプチド、ADNFIII ポリペプチド、あるいは融合ADNFＩ/ADNFIII ポリペプチド)をコードする核酸は、他の核酸、例えば組織中へのADNFIII ポリペプチドのデリバリーを容易にするHIV tat核酸の一部と連結されうる。さらに他の例において、ADNFポリペプチドをコードする核酸は、タンパク質精製プロトコルを容易にするためにアフィニティー・タグをコードする核酸と連結されうる。ADNF核酸及び異種ポリヌクレオチド配列は、それらの融合及び引き続く融合ポリペプチドの発現を容易にするために修飾されうる。例えば、ADNFポリヌクレオチド配列の3’s停止コドンを、制限部位及び／又は分割部位を提供しうるフレーム・リンカー配列により置換しうる。
【００９６】
本発明のプラスミドは、選ばれた宿主細胞中に周知の方法によって転移されうる。そのような方法は、例えばE.コリのための塩化カルシウム形質転換法及び哺乳類の細胞のためのリン酸カルシウム処置若しくは電気穿孔法を含んでいる。プラスミドにより形質転換された細胞は、プラスミドに含まれている遺伝子、例えばamp、gpt、neo、及びhyg遺伝子によって与えられた抗生物質抵抗性によって選ばれうる。
【００９７】
発現されるとすぐに、組み換え又は天然ADNFポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティ・カラム、カラム・クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などを含む本技術分野の標準的手順より精製されうる(例えばScopes, Polypeptide Purification (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Polypeptide Purification (1990)を参照のこと。
【００９８】
望まれるように部分的にあるいは均質精製されるとすぐに、そのADNFポリペプチドは、次に、例えば学習と記憶を改善するために使用される。例えば、Brenneman & Gozes, J. Clin. Invest. 97:2299-2307 (1996), Brenneman et al. , J. Pharm. Exp. Ther. 285:619-627 (1998), 及び Bassan et al. J. Neurochem 72: 1283-1293 (1999)を参照のこと、ここで、上記文献の教示の全てを本明細書中に援用する。
【００９９】
ADNFポリペプチドの合成
先の組み換えの技術に加えて、本発明のADNFポリペプチドは、幅広い周知の技術によって場合により合成により調製しうる。比較的に短いサイズのポリペプチドは、慣習の技術に従って、溶液中か又は固体支持体上で一般に合成される(例えば、Merrifield, Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)を参照のこと)。様々な自動合成装置及びシーケンサーが、商業的に入手可能で、そして既知のプロトコールに従って使用しうる(例えば、Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed. 1984)を参照のこと)。配列のC末端アミノ酸が不溶な支持体に付着し、続いてその配列の残りのアミノ酸の連続的な付加による固相合成は、本願発明のポリペプチドの化学合成に好ましい方法である。固相合成のための技術は、arany & Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis. Biology, Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963); and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed. 1984)により記載されている。
【０１００】
化学合成、生物学的発現、あるいは精製の後に、ポリペプチドは、構成ポリペプチドの天然配置と実質的に異なる構成を持つかもしれない。この場合、そのポリペプチドを変性し、還元し、そして好ましい配置への再形成をポリペプチドに引き起こすことは有益である。ポリペプチドの還元及び変性、並びに再折り畳みの誘発の方法は、本技術分野で周知である(Debinski et al.. J Biol. Chem. 268:14065-14070 (1993); Kreitman & Pastan, Bioconjug. Chem. 4:581-585 (1993); and Buchner et al., Anal, Biochem. 205:263-270 (1992)を参照のこと)。Debinskiらは、例えばグアニジンDTEへの封入ポリペプチド集団の変性及び還元を記載する。前記ポリペプチドは、次に酸化型グルタチオンとLアルギニンを含んでいる酸化還元緩衝物質で再び折り畳まれる。
【０１０１】
当業者は、修飾がそれらの生理活性を減少させることなくポリペプチドに加えられることができることを認める。いくつかの修飾が、クローニング、発現、あるいは融合ポリペプチドの中への標的分子の取り込みを容易にさせられうる。そのような修飾が、当業者に周知であり、例えば開始部位を提供するためにアミノ末端に加えられたメチオニン、あるいは制限部位か終止コドンか精製配列を作るためにいずれかの末端に配置された追加のアミノ酸(例えば、ポリHis)を含んでいる。
【０１０２】
ADNF核酸及びポリペプチドの保存的修飾
当業者は、本明細書中の提供されるADNF核酸及びポリペプチド配列の多くの保存的変異体が、機能的に同一な産物をもたらすことを認識する。例えば、遺伝子コードの縮重のために「サイレント置換」(すなわち、コードされたポリペプチドの変更をもたらさない核酸配列の置換)は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列の暗示された特徴がある。同じように、アミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸の「保存的なアミノ酸置換」は、高度に類似した性質の異なるアミノ酸で置換させられ(前記、定義の項を参照のこと)、そして開示されたアミノ酸配列、又はアミノ酸をコードする、開示された核酸配列に高度に類似している場合には容易に確認されもする。各々のはっきり列挙された核酸及びアミノ酸配列のそのような保存的に置換された変異体は、本発明の特徴である。
【０１０３】
当業者は、与えられた核酸配列の変更を生じる多くの方法を認める。そのような周知の方法は、部位指定突然変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅、核酸を含んでいる細胞の突然変異誘発剤若しくは放射への暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、大きな核酸を生じるための連結及び／又はクローニングに関連する)、並びに他の周知の技術(Giliman & Smith, Gene 8 :8 1-97 (1979); Roberts et al., Nature 328:73 1-734 (1987) を参照のこと）を含んでいる。例えば、アラニン・スキャニングは、SALLRSIPAかNAPVSIPQについての保存的修飾変異体を決定するために使われる、(すなわち、本明細書中に記載のとおり、各々のアミノ酸を順次アラニンあるいは他の小さい中性アミノ酸と置換し、そして活性について分析する)。
【０１０４】
対応する核酸配列を変更し、ポリペプチドを発現させることによってポリペプチド配列を変更することもできる。あらゆる所望のポリペプチドを製造するために市販のペプチド合成装置を用いてポリペプチド配列を場合により製造することもできる(Merrifield、前記、及びStewart＆Young、前記を参照のこと)。
【０１０５】
より特に、本発明のADNFポリペプチドが様々なアッセイ(例えば、モリス水迷路分析)を用いて効果を高めるそれらの能力にかんしてすぐにスクリーンされうることは当業者にすぐに理解される。
【０１０６】
これらのアッセイを用いて、当業者は、すぐに本発明の教えによるたくさんのADNFポリペプチドを作製することができ、次に本明細書中に記載したものに加えて、完全なADNF増殖因子の神経保護/神経栄養の活性を持つポリペプチドを見つけるために、前述のアッセイを用いてそれらをスクリーンする。例えば、出発点としてADNFIII -8（すなわち、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln）を使用することで、当業者は、計画的にADNFIII -8のN末端に、例えばGly-Gly-Gly-、Leu-Gly-Gly-の付加を行うことができ、次にそれらが神経保護/神経栄養活性を有するかどうかを決定するために先のアッセイによりこれらのADNFIII ポリペプチドの各々をスクリーンしうる。そうすることで、完全なADNFIII 増殖因子が特別な生物活動を示すという事実によって証明されるように生物活動の損失なしで、追加のアミノ酸が、新しく発見された活性部位、すなわちAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-GlnのN末端及びC末端の両方付加されうることが発見される。この論議は、ADNFＩポリペプチドにも適合される。
【０１０７】
実施例
実施例Ｉ： ADNFポリペプチドの出生後投与後の高められた学習及び/又は記憶
実施例Ｉは、ADNFポリペプチド、例えばADNFＩ由来のSALLRSIPA(「ADNF-9」)及びADNF-III 由来のNAPVSIPQ(「NAP」)、又はADNPの特性を、対照動物又はコリノトキシン（cholinotoxin）、エチルコリン・アジリジウム（ethylcholine aziridium）(AF64A)、コリン取り込みの遮断薬にさらされた動物により説明する(Fisher et al., Neurosci. Lett． 102:325-331 (1989))。完全なコリン作動性系が正常な脳機能のために必要とされるが、アルツハイマー症は、コリン作動性の細胞の死に関係する(Brumback and Leech, 1994)。このように、AF64A処置ラットは、コリン毒性によりもたらされる認識欠陥に対する保護する薬剤の生体内の効能を試験するための許容されるモデルをに提供する。 (Fisher et al., Neurosci. Lett． 102:325-331 (1989)； Gozes et al.,Proc． Nati． Acad Sci． US.A. 93:427-432 (1996)； Gozes et al., Proc． Nati． Acad． Sci． U.S.A. 96:4143-4148(1999))。以下に記載の実験は、ADNFポリペプチド、例えばADNF-9及びNAPの出生後の鼻腔内投与が、AF64Aコリン毒性に関係する短期記憶損失に対する神経保護を提供したことを示す。前記実験は、ADNPポリペプチドがどのように対照動物の学習及び記憶を高めることができるかを説明する。
【０１０８】
材料と方法
動物
雄ウィスター・ラット(300〜350g、Harlan Laboratories, Jerusalem, Israel)をコリン毒性アッセイに利用した。
【０１０９】
ペプチド合成
ペプチドを、固相技術を利用して合成し、高速液体クロマトグラフィーにより均質に精製した（HPLC；Gozese et al., Proc． Nati． Acad． Sci． U.S.A. 96:4143-4148(1999))。純度及び同一性を、アミノ酸分析とエレクトロスプレーイオン化質量分析(Micromass、Manchester, U.K.)を用いて確認した。追加のペプチドを、ペプチド技術、Bethesda, MD, USAから購入した。
【０１１０】
ラットにおけるコリン毒性及び水迷路による短期の空間的記憶の評価
ラットを、隠された踏み台を含む水迷路による2回の毎日の試験にかけた(Morris, R.、J. Neurosci． Methods 11：47-60の(1984)；Gordon et al., Neurosci． Lett． 199:1-4 (1995)；Gozes et al., J Neurobiol． 33:329-342． (1997a))。毎日、試験の1回目のために、踏み台も動物も、(プールを動かなくして)プールに関して新しい配置で置いた。
【０１１１】
以下の通り実験を実施した：動物を0.5分間踏み台上に置いた。次に水中に置いた。踏み台への到達に要した時間 (学習と完全な参照記憶を示す) を計測した(試験の1回目)。
【０１１２】
踏み台上での0.5分後に、追加の2番目の試験及び隠された踏み台(前のポジションで保たれている)の検索のために、上記動物を水中に戻した(前の位置)。試行の2回目における、短期(ワーキング)記憶を暗示する、踏み台に到着するのに要した時間を記録した。動物を、ランダム記憶欠陥がある動物を除くために4日間試験した。
【０１１３】
最良の実行者は、AF64A (Sigma RBI, Saint Louis, Missouri, USA 3 nmol/ 2 μl/side)を0.21μ/分の速度でi.c.v. 注入されていた； 対照動物は、生理食塩液の注射を受けていた(Gozes et al., Proc Nati． Acad Sci． U S.A. 93：427-432(1996))。動物を、1週間回復させ、続いて5%のSefsol (Sigma, Rehovot, Israel）40μlの鼻腔内の投与、及び20%のイソプロパノール(対照)又は1μgペプチド(実験的)に毎日晒した(Gozes et al., Proc Nati. Acad Sci. US.A.93:427-432 (1996))。
【０１１４】
ペプチド処置の1週間後に、前記動物を、水迷路による2回の毎日の試験にかけた（前記同様）。試験期間中、動物にペプチド又は担体の鼻腔内投与を毎日の試験の1時間前に与えもした。様々な処置群の促進活性の変化に関連するかたよりを避けるために、空間的記憶を評価するプローブ試行試験を以下の通り利用しもした。訓練及び試験の4日後に、踏み台を取り除き、5日目に、動物を踏み台のないプール(120秒)での水泳にかけた；これらの実験において、以前踏み台があったプールの象限で過ごしている時間を記録した。
HVSビデオ追跡システム(HVS Image社, Hampton, UK)を用いて計測を実施した。
【０１１５】
鼻腔内の投与に続いての体内分布
ハイドロプロリンを含むようにNAP (M.W. 824.9)を、合成し、[3H]−標識ペプチドを製造するためにそれらを交換した(NAP、プロピル3-3,4-[3H]、American Radiolabeled化学薬品社、セントルイス、MO、米国)。比活性は、50Ci/mmolであった。NAPの純度及び同一性を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC) Zorbax SB-C18 (250 x 4.6 mm)5μm、及び20分間の0.1%のトリフルオロ酢酸中、5-25%メタノールグラジエントによる溶出、そして220 nmのUVと[3H]検出器β-Ramを用いて確かめられた。1 mCi/ミリリットルを含む2.5マイクロリットルの溶液を、雄ウィスター・ラット(200-300 g)の各々の鼻孔に適用された。ラットを、指定の時点で屠殺し、組織を55℃で12時間可溶化した(1ミリリットル中の100 mgのLumac Solve, Lumac bv, Landgraaf, Netherlands, Netherlands)。ベータ・シンチレーション・カウンターにより放射能を、Optiflour (10ml/100 mg、Packard, Groningen, Netherlands)の添加に続いて測定した。
【０１１６】
脳内の完全なNAPの定量のために、大脳皮質の組織を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と一緒に4℃で均質し(100 mg/1ml)、そしてこのホモジェネートを4℃で10,000g遠心分離(10分)に供した。得られた上清を-80℃で冷凍し、そしてさらに0.1%トリフルオロ酢酸含有水中35%のアセトニトリルと75%のアセトニトリルの間で確立された線形グラジエントを用いたHPLC (RP-18、メルク、250x4 mm；5μm)に供した(Gozes et al., Proc Nati． Acad． Sci． U.S.A. 96 : 4143-4148 (1999))。
【０１１７】
コリン作動性の活性の計測
コリン・アセチルトランスフェラーゼ(ChAT)活性を、確立された手法(Fonnum, 1975)に従って前記(Gozes etal., J Neurobiol 33:329-342． (1997a))と同様に計測した。行動に関する実験の終了で動物を屠殺し、そして脳(大脳皮質)を解剖し、前記のように(Gozes etal., J Neurobiol 33:329-342． (1997a))処理した。対照、AF64A処置、及びAF64A +ペプチド処置動物の間で比較を行った。
【０１１８】
統計分析
統計上の試験を、全てのペアの多重比較手法（スチューデント-ニューマン-クルーズ法)によるANOVA一元配置分散分析を使用した。
【０１１９】
結果
ADNF-9の鼻腔内投与は、生体内においてAF64A処置に関係する短期記憶の喪失に対して保護をする。
【０１２０】
ADNF-9が短い疎水性ペプチドの時、それは、脳機能に影響するという可能性は鼻腔内の投与を通して試験された。隠された踏み台の発見に要する時間の計測による空間的学習及び記憶の評価を水迷路で実施した。2回の毎日の試験を実施した。踏み台位置と動物の起始点を毎日の試行の各々の組の中で一定に保ったが、しかし、踏み台と動物の起始点の位置を毎日変更した。
【０１２１】
試験2日目で明らかなように、参照記憶を表わす、毎日の試験の1回目で、AF64A処置動物は、対照動物との比較で遅れていた(p<0.016)。ADNF-9での処置は、はっきりとしないわずかな改善(図１A)に終わった。対照的に、毎日の試験の２回目(完全な短期記憶を表わす(Gordon et al., 1995))で、AF64A処置動物が、著しく遅れ(全ての実験日に対しp<0.001)、そしてADNF-9-AF64A処置動物は、かなりの改善、そして実験を通して減少した潜時を示した（図１B、p<0.001)。
【０１２２】
図１Cは、空間的記憶を評価したプローブ試行の結果を示す。4日の訓練及び試験の後に、踏み台を取り除き、5日目に、動物を踏み台のないプールで泳がせた。ADNE-9を与えられたAF64A処置動物において、踏み台が前に配置されていたプールの象限で費やす時間が大幅に増加した(p<0.001)ことがプローブ試行から明らかになった。
【０１２３】
NAPの鼻腔内投与は、生体内においてAF64A処置に関係する短期記憶の喪失に対して保護をする。
【０１２４】
ADNF-9に関する記載と同様の実験を、対照動物とAF64A処置動物を用いて実施した。ここでも、ペプチドを鼻腔内適用によって投与した。1日目、毎日の試験の１回目に、隠された踏み台(参照記憶を試験)の配置後すぐにNAP処置動物が、媒質処置対照と比べて大幅に改善された(図2A、p<0.001)。先に示したように、AF64A処置は、水迷路の実例及び本明細書中において低下した能力をもたらし、試験の4日目に、NAP処置AF64A障害動物は、媒質処置AF64A障害動物と明らかに異なった(図2A、p<0.041)。短期記憶を表わす毎日の試験の２回目で、NAP処置AF64A障害動物は、実験全体にわたって改善され、試験2日目にすでに対照レベルに達した(図2B、p<0.001)。訓練及び試験４日後に、踏み台を取り除き、5日目に、動物を、踏み台なしのプールで泳がせた(前記同様)。結果は、AF64A-媒質処置動物と比較したときNAP与えられたAF64A処置動物において、踏み台が以前は位置されていたプールの象限で過ごした時間が大幅に増加したことを示した(図2C、p<0.001)。さらに、ペプチド処置群(対照-偽病変、あるいはAF64A病変)は、対照（偽病変）と大きく異なることなく、そして対照（偽病変）動物と比較して、NAP処置群においてはっきりしないわずかな改善を記録した(図2C)。
【０１２５】
NAPの経鼻投与は、生体内で対象動物の記憶を保護する。
【０１２６】
先に記載したのと同様の実験を実施した。ここでも、ペプチドを鼻腔内適用によって投与した。図2Aに示したとおり、毎日の試験の１回目に、隠された踏み台(参照記憶を試験)の配置後すぐにNAP処置対照動物が、NAPにより処置されていない対照動物と比べて大幅に改善された(図2A)。
【０１２７】
NAPの生物学的利用能及び安定性
前述の水迷路試験において、NAP投与が、ADNF-9適用に比べて明らかに高められていて行動改善をもたらした(図1対図2)。すでに、ADNF-9は、アポリポ蛋白E欠損マウス(Bassan et al., J. Neurochem 72： 1283-1293 (1999))の記憶欠損の改善においてNAPより有効ではなく、そしてADNF-9のPBS溶液が<4℃の温度での保存で生理活性を失った(Brenneman et al., J. Pharmacol Exp． Therap． 285:619-627 (1998))。よって、将来の療法として生物学的利用能及びNAPの安定性を評価するためにこのように決められた。
【０１２８】
経鼻的に適用された[3H]-NAP分布のタイム・コースを体の様々な臓器で計測した。結果(図3A)は、投与後30分で、腸において最高レベルとなり、腸及び肝臓における高レベルの総放射能(fmoles NAP/ g組織として計算される)を証明した。脳(大脳皮質)における総放射能は、投与後60分が最も高かった (図3B)。各々の動物が、250万dpm(22.75 pmole)を含む5マイクロリットルの[3H]-NAPを受けた。250gのラットに均一に分配された場合、その後91fmoles/g組織が推測される(300gラットは、75.5 fmoles/g組織を持つ)。これらの結果は、45fmoles/g組織を示した。逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)は、ペプチドが適用後30分は脳内で完全なままであることを示した(図3C)。前記カラムから溶出された807.8fmole/g組織の内の、完全なNAPと一緒に移動する98fmoles/g組織は、少なくとも１２％の物質が投与後３０分間は脳内でもとのままであったことを示す。適用の60分後、カラムから溶出された1198.9fmoles/ g組織の内の、2%だけが完全な放射性NAPと一緒に溶出された（図３D）。
【０１２９】
これらの結果は、大脳皮質のNAPの半減期がおよそ15分であることを暗示した。図3A及び3Bの厳密な調査が、特に投与後3時間で、血中の放射性NAPのレベルが大脳皮質中より高くなり、この時点でペプチドが多分完全に崩壊しているであろうことを示した（図３D）。このように、少なくともペプチド適用後の血中の放射能レベルの増加は、ペプチド崩壊と損失を反映する。
【０１３０】
ペプチドが脳の血管内よりも脳組織に存在するのかという問題を検査するために、追加の実験を実施した。ここで、200gの雄ラットを前記同様に処置し、そしてペプチド適用後30分(ペプチドがまだ完全な時点、図3C)で、脳を解剖し、そして、小さな目に見える血管を慎重に取り除いた。結果は、放射能のいくらかは小さな目に見える血管に起因したが、それのほとんどが、明らかな脳組織で見られ、目に見える血管の貢献は取るに足らないことを証明した。(図3E)。さらに、大脳皮質より嗅球から離れて遠くにある小脳(小さな目に見える血管を含まない)は、明らかに低い放射性ペプチドの蓄積を有する。しかし、大脳皮質と小脳の間の相違は有意ではなく、迅速なペプチド分布を暗示している(図3B,及び3E)。
【０１３１】
AF64A処置処置動物は、コリン・アセチルトランスフェラーゼ活性の低下とNAPによる保護を示す。
【０１３２】
実験(図4A)の終了時に、AF64A処置動物及び偽処置対照(1群につき3匹、各々3つ組) から得た脳抽出物の酸素のアッセイが、コリン・アセチルトランスフェラーゼ活性の非常にわずかな減少(11+2.6％)を明らかにした。AF64A動物のNAP処置は、対照(偽手術)値と大差のない増加したコリン作動性活性をもたらした(図4A、100%のコリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、130pmol/mgタンパク質/分を示した)。
【０１３３】
動物の4群で、3つをAF64A処置し、1週間回復させ、その後2群をADNF-9あるいはNAPのいずれかで(経鼻的に)処置した。5の処置日に続いて、2日間動物を回復させ、そしてその後毎日の水迷路試験（図1,及び2と同様)にかけた。この実験と前記実験(図1、及び2）の間の相違は、動物が行動に関する試験より前にペプチドの毎日鼻腔内投与を受けなかったことである。NAP処置AF64A動物は、対照ラットと大きく異なることはなく、そしてADNF-9処置AF64Aラットに比べたとき、水迷路の隠された踏み台の発見がはるかに速かった(p<0.022)。
【０１３４】
論議
本研究は、ADNF神経保護についての生体内の効果を証明した。ADNF-9あるいはNAPの鼻腔内の投与は、AF64A処置に関係する短期記憶の損失から保護した。NAP投与は、同様に対照動物の参照記憶を改善した。さらに、NAPは、以前アポリポ蛋白E欠損マウスについても説明されたように、コリン・アセチルトランスフェラーゼ活性の低下に対して保護した(Bassan et al., J. Neurochem 72： 1283-1293(1999))。
【０１３５】
脳及び体のNAP分布は迅速だった。脳におけるNAPの計算された半減期は、鼻腔内の投与後およそ15分だった。HPLC分析は、そのNAPが活性代謝物質の可能性を暗示する複数のフラグメントに生体内で新陳代謝されることを示した。
【０１３６】
コリン作動性活性(図4A) そして行動に関する試験(図4B)に対するADNF-9及びNAPの効果は、ごく短期的な効果を持つADNF-9を伴い、認識機能を改善するために2つのペプチドが異なる機構を通して作用するという可能性を暗示する。さらに、鼻腔内の適用によってNAP処置された動物は、ADNF-9処置動物(図１及び２)と比べて水迷路試験により学習及び記憶能力の増加が示された。同じように、生まれたばかりのアポリポ蛋白E欠損マウスへのNAPの（そして、ADNF-9の注射ではない）注射は、生後3週間の仔マウスの短期記憶喪失を防いだ(Bassan et al., J. Neurochem 72： 1283-1293(1999))。
【０１３７】
これらの研究は、NAPに関する広い範囲の神経保護活性を暗示する。実際には、NAP（広範囲の濃度にわたる）は、ブチオニン・スルホキシイミン（buthionine sulfoximine）で誘発された神経芽細胞腫細胞生存率の減少(70-90%)に対する保護を提供した(Offen et al., Brain Research 854:257-262 (2000))。グルタチオン合成の選択的な抑制剤であるブチオニン・スルホキシイミンは、減少した生存率を導く神経細胞モデルにおけるグルタチオンの著しい低下を引き起こす(Offen et al., Brain Research 854:257-262 (2000))。
【０１３８】
このように、NAPによる神経保護の機構は、酸化ストレス、細胞生存に影響する一般的な機構に対して細胞の耐性を上げることを通して仲介されうる。さらに、予備的な毒物学的検査は、このペプチドに関して毒性作用を示していない。
【０１３９】
最後に、NAPの説明された生体内の効果は、その生物学的利用能及び明らかな安定性と合わせて、それを神経変性疾病に対する治療薬の開発のための魅力的なリード化合物と確認させる。アルツハイマー症の対症療法のための現在入手可能な薬剤は、直接的にコリン作動性システムの機能を狙う。例は、アセチル・コリン・エステラーゼ阻害剤のタクリンである(van Reekum et al., Can. J. Psychiatry 42 suppi.1：35S-50S(1997))。しかし、増殖因子処置は、広い範囲の神経保護を提供し、それゆえに神経栄養因子の生体内における効果が、重要な基本的情報を提供し、そしてドラッグ・デザインのための新しい展望を開く。
【０１４０】
実施例II：ADNFポリペプチドの出生前の投与が出生後の高められた学習及び/又は記憶を提供する
材料と方法
動物と処置
C57-B16J雌マウス(Jackson Labs)を、飼料と水が常に用意されている12h明12h暗の管理の下で飼育した。このマウスは、その世話と実験動物の使用に関して「Guideline for Care and Use of Experimental Animals」に従って人道的な動物の世話を受けた。6週齢の雌(21〜24グラム)を4時間C57-B16J雄とつがわせた。腟栓の存在を妊娠O日目と考えた。
【０１４１】
動物に、ADNFポリペプチドを、妊娠8日目に腹腔内に注射したか、あるいは妊娠8日目の絶食１時間後チューブにより投薬した。NAPを50μl DMSOで希釈し、そしてろ過したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で希釈した。SALを溶解し、そしてろ過したDPBSで希釈した。対照動物を、媒質(DPBS)で処置した。全ての処置をコード化した。
【０１４２】
20日目に出産し、生命の20日目に離乳した。雄の子孫を、暗号化された処置と無関係の全体の識別マーカーを用いた耳標を付けた。
【０１４３】
モリス水迷路試験
雄のマウスだけを水迷路試行のために使用した。1日２回(2の試行)7日の間の、マウスの試験を、35-50日目、一般に38日目に開始した。使われたモリス水迷路試験を、「Repeated acquisition of a spatial navigation task in mice:Effects of spacing of trials and of unilateral middle cerebral artery occlusion」 Klapdor & Van der Staay. Physiology & Behav. 63 (5)、903-909(1998)から適合させる。試行は、4の設置位置から隠された踏み台の発見を試みることから成る。特に、マウスの試験を、朝、一般に9:00〜9:30に開始した。一貫したタイミングがあらゆる行動研究にとって重要である。時間的なのかたよりを防ぐためにランダムな順序でマウスの試験を研究者によって実施した。水の室温への調節時間を与えるために、迷路をその前日に用意した。100〜150 mlの無毒な白いテンプラ（Tempura）が加えられて、そして混合される。各々の日の開始前に、塗料を均質にするために水を撹拌し、蒸発にもかかわらず踏み台より高い７〜10 mlの一貫した水位を維持することのためにさらに水を加えた。マスキングを最適にするためにソフトウェアは設置し、そして各々2回の試行を60秒で記録した。使用できる踏み台を1番象限に設置した。
【０１４４】
それらの環境に慣らし、そして回避踏み台がどこに位置するのかの最初の感覚を獲得させるために、1日目にマウスを踏み台の上に1分間座らせた。この最初の段階で、マウスは踏み台から跳ね降り、そして探険で泳ぎ回るのが普通である。これは簡単に容認されるであろう、しかし、数秒の水泳が完了した後にマウスは踏み台に戻るはずである。
【０１４５】
マウスを、迷路の外部に直面している、正中線で分けた第2、及び3(西側)象限から迷路内に放した。それらは、60秒間か、又は踏み台上に彼ら自身が到着するまで泳げる。もし踏み台を見つけることに失敗すれば、それらを手でそこに戻す。全てのマウスを、それらの最初の試行後15秒間踏み台に残す。
【０１４６】
次に、2回目の試行を最初と同じやり方で施行し(同じリリース位置、同じ踏み台位置など)、乾いている檻にそれらを返す前に再びマウスを15秒間踏み台上に置いた(余分な水を吸収するchix雑巾を備えた)。
【０１４７】
2〜7日目に、1回目の試行の前にマウスに、踏み台上で15秒間ただ与えた。それらが水温に合わせられるようになるためにこれで十分である。ほとんどのマウスが踏み台を離れようとせずにとどまるように、このステージの間の踏み台を避けようとするそれらの傾向は1日目から顕著な下降したを示す。毎日の平均の回避潜時を計算し、試験施行のための7日間に沿って描く。減少させられた空間的学習と記憶を示す多くのマウスが、接触走性(壁の抱きしめ)及び浮揚を含めた行動に関係する変則を表わす。これは、Minichiello et al., Neuron 24 (2)、401-414 (1999)によって証明されている。
【０１４８】
2回の試行の平均を取り、そして統計分析のために使用した。統計分析は、多重分析のためのボンフェローニの補正(総体的なP<.007、有意とみなされる)、及び明らかに異なるペアの定量のためのフィッシャーのpost hocを用いたANOVAによる。
【０１４９】
統計値
連続的な変数のためのANOVA、非母数データのためのマン-ホイットニーU、カテゴリー変数のためのカイ二乗、あるいはフィッシャー精密試験を含む統計分析は、p<0.05に該当（Statview 4.5(Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA)）するときに有意であると考えられる。別段の指示がない限り、結果を平均±標準誤差として示す。
【０１５０】
結果
出生前のL-NAP+L-SAL処置の効果
妊娠8日目の妊娠した母親をL-NAP(ADNFIII からのNAPVSIPQ)； (0.2 ml；20 μg)及びL-SAL(ADNFＩからのSALLRSIPA)(0.2 ml、20 μg)(n=8)、あるいは媒質のみ(n=50)の腹膜内注射により処置した。
【０１５１】
学習の評価は、材料及び方法の項で述べられるようにモリス水迷路を利用した。38日目を始めるとき、1日2回の試行を、モリス水迷路を用いて7日間実施し、一方に他方を直ちに続けた。隠された踏み台を発見するまでの潜時を記録した。全ての動物を毎日ランダムな順序で試験した。2回の試行の平均を分析のために使用した。
【０１５２】
図5に示したように、出生前にL-NAP+L-SALにより処置された仔動物は、対照兄弟からの仔動物と比べて学習のより早い発現を有した(P<.03)。
【０１５３】
経口D-NAP+D-SAL投与の効果
妊娠8日目、1時間絶食後の妊娠した母親をD-NAP(40 μg)及びD-SAL(40 μg)(n=27)、あるいは媒質のみ(n=34)のチューブによる投薬（0.2 ml）により処置した。
【０１５４】
学習の評価は、材料及び方法の項で述べられるようにモリス水迷路を利用した。38日目を始めるとき、1日2回の試行を、モリス水迷路を用いて7日間実施し、一方に他方を直ちに続けた。隠された踏み台を発見するまでの潜時を記録した。もし動物が60秒以内で踏み台を見つけることができなければ、彼を踏み台の上に手で戻した。全ての動物を毎日ランダムな順序で試験した。2回の試行の平均を分析のために使用した。
【０１５５】
図6に示したように、妊娠中に経口D-NAP+ D-SALにさらされた動物は、早い学習開始及びこの研究終了までの全体的な全体的に減少した潜時を持ち、対照より有意に早く学習した。
【０１５６】
経口D-SAL投与の効果
妊娠8日目、1時間絶食後の妊娠した母親をD-SAL(40 μg)(n=14)、あるいは媒質のみ(n=16)のチューブによる投薬（0.2 ml）により処置した。学習の評価は、材料及び方法の項で述べられるようにモリス水迷路を利用した。1日2回の試行を、モリス水迷路を用いて7日間実施し、一方に他方を直ちに続けた。隠された踏み台を発見するまでの潜時を記録した。もし動物が60秒以内で踏み台を見つけることができなければ、彼を踏み台の上に手で戻した。全ての動物を毎日ランダムな順序で試験した。2回の試行の平均を分析のために使用した。
【０１５７】
図7に示したように、経口D-SALにさらされた動物は、より速い潜時の経口を示すであろう。
【０１５８】
経口D-NAP投与の効果
妊娠8日目、1時間絶食後の妊娠した母親をD-NAP(40 μg)(n=13)、あるいは媒質のみ(n=14)のチューブによる投薬（0.2 ml）により処置した。
【０１５９】
学習の評価は、材料及び方法の項で述べられるようにモリス水迷路を利用した。1日2回の試行を、モリス水迷路を用いて7日間実施し、一方に他方を直ちに続けた。隠された踏み台を発見するまでの潜時を記録した。もし動物が60秒以内で踏み台を見つけることができなければ、彼を踏み台の上に手で戻した。全ての動物を毎日ランダムな順序で試験した。2回の試行の平均を分析のために使用した。
【０１６０】
図8に示したように、経口D-NAPにさらされた動物は、より速い潜時の経口を示すであろう。
【０１６１】
経口D-SAL（2倍用量、80μg）投与の効果
妊娠8日目、1時間絶食後の妊娠した母親をD-SAL(80μg)(n=19)、あるいは媒質のみ(n=19)のチューブによる投薬（0.2 ml）により処置した。学習の評価は、材料及び方法の項で述べられるようにモリス水迷路を利用した。1日2回の試行を、モリス水迷路を用いて7日間実施し、一方に他方を直ちに続けた。隠された踏み台を発見するまでの潜時を記録した。もし動物が60秒以内で踏み台を見つけることができなければ、彼を踏み台の上に手で戻した。全ての動物を毎日ランダムな順序で試験した。2回の試行の平均を分析のために使用した。
【０１６２】
図9に示したように、2倍用量の経口D-SALにさらされた動物は、上記対照動物に類似した能力を示すであろう。
【０１６３】
プローブ試験におけるD-NAP+D-SAL投与の効果
妊娠8日目、1時間絶食後の妊娠した母親をD-NAP(40 μg)及びD-SAL(40 μg)(n=27)、あるいは媒質のみ(n=34)のチューブによる投薬（0.2 ml）により処置した。水迷路試験で試験されたそれらの動物について、プローブ試験を用いて、マウスにおける学習をさらに評価した。プローブ試験において、踏み台を取り除くことによって、前記水迷路試験を変更した。動物が以前に踏み台があった象限で過ごした時間の長さを計測した。図10に示したように、D-NAP+D-SALにさらされた動物は、対照に比べ明らかに長時間、前記象限（踏み台があった象限）内で過ごした。
【０１６４】
本発明はADNFポリペプチドを用いて能力(例えば、学習及び/又は記憶)を改善する方法を提供する。特定の例を提供しているが、上述の記載は説明のためのものであり、制限するものではない。前述の実施例の特徴のいずれか1以上を、あらゆる様式において、本発明の他の実施例の特徴のいずれか1以上と組み合わせることができる。さらに、本発明の多くの変形が、本明細書の検討により当業者に明らかになるであろう。従って、前述の記述に関して決定されるべきであるが、本発明の範囲は、先の記載に関して決定されるのではなく、むしろ添付した請求項に加えてそれらの同等物の完全な範囲に関して決定されるべきである。
【０１６５】
個々の刊行物及び個々の特許文献をそれぞれ示したのと同等にするための全ての目的のために本願明細書中に記載の全ての刊行物及び特許文献の全体を援用する。この書面中への様々な参考文献のそれらの引用により、出願人は、いずれか特定の参考文献がそれらの発明に対する「先行技術」であると認めることはない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  AF64A処置ラットは、学習及び記憶の欠陥を示し、ADNF-9の経鼻投与により改善される。2の毎日の水迷路試験(AとBそれぞれ)を成体ラットに実施した。試験した群は：１．媒質により処置した対照動物(20匹、白ぬき丸)；2．媒質を経鼻投与したAF64A処置動物(27匹、白ぬき四角)；3.ADNF-9の経鼻投与によって処置された対照動物(黒丸、１2匹)；4．ADNF-9を経鼻投与したAF64A処置動物(19匹、黒四角)である。(A)その新しい日々の位置(完全な参照記憶の提示、Gordon et al., Neurosci. Lett. I 99: I -4 (1995))の隠された踏み台に到達するまでの秒で計測した潜時(平均±平均の標準誤差)示す。試験を連続した4日間実施した。
【図１Ｂ】  AF64A処置ラットは、学習及び記憶の欠陥を示し、ADNF-9の経鼻投与により改善される。2の毎日の水迷路試験(AとBそれぞれ)を成体ラットに実施した。試験した群は：１．媒質により処置した対照動物(20匹、白ぬき丸)；2．媒質を経鼻投与したAF64A処置動物(27匹、白ぬき四角)；3.ADNF-9の経鼻投与によって処置された対照動物(黒丸、１2匹)；4．ADNF-9を経鼻投与したAF64A処置動物(19匹、黒四角)である。(B)その上に着いた0.5分後に隠された踏み台に到達するまでの秒で計測された潜時(完全な作動記憶プロセスの提示、Gordon et al., Neurosci. Lett. 199:1-4 (1995); Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329-342. (, 1997a)）を連続した4日の間試験した。媒質により処置した動物と未処理の動物(データ未掲載)の間の違いはなかった。
【図１Ｃ】  AF64A処置ラットは、学習及び記憶の欠陥を示し、ADNF-9の経鼻投与により改善される。2の毎日の水迷路試験(AとBそれぞれ)を成体ラットに実施した。試験した群は：１．媒質により処置した対照動物(20匹、白ぬき丸)；2．媒質を経鼻投与したAF64A処置動物(27匹、白ぬき四角)；3.ADNF-9の経鼻投与によって処置された対照動物(黒丸、１2匹)；4．ADNF-9を経鼻投与したAF64A処置動物(19匹、黒四角)である。(C)試験の5日目に、踏み台を取り除き、空間のプローブ試験を実施した。 動物を120秒間泳がせ、踏み台・クワドラントにおいて動物が過ごした時間を記録した。
【図２Ａ】  AF64A処置ラットは、NAPの経鼻投与によって改善される学習及び記憶の欠陥を示す。使用したペプチドがNAPであることと実験群の各々の動物の数が１０から２０及びAF64A処置群については２７であること除いて、図１で報告したのと同じ実験(それぞれ、A、B、C)を繰り返した。
【図２Ｂ】  AF64A処置ラットは、NAPの経鼻投与によって改善される学習及び記憶の欠陥を示す。使用したペプチドがNAPであることと実験群の各々の動物の数が１０から２０及びAF64A処置群については２７であること除いて、図１で報告したのと同じ実験(それぞれ、A、B、C)を繰り返した。
【図２Ｃ】  AF64A処置ラットは、NAPの経鼻投与によって改善される学習及び記憶の欠陥を示す。使用したペプチドがNAPであることと実験群の各々の動物の数が１０から２０及びAF64A処置群については２７であること除いて、図１で報告したのと同じ実験(それぞれ、A、B、C)を繰り返した。
【図３Ａ】  経鼻適用した[3H]-NAPは体と脳に到達する。(A)投与後の示された時間に動物を屠殺し、そして組織サンプルを計量し、さらにβカウンタにより放射能についてアッセイ（２重で）し、4匹の動物の平均を示す。
【図３Ｂ】  経鼻適用した[3H]-NAPは体と脳に到達する。(B)脳を、示された時点で解剖し、そして放射能を観察した。
【図３Ｃ】  経鼻適用した[3H]-NAPは体と脳に到達する。(C、D)完全な[3H]-NAPが、鼻腔内投与後に脳に到達した。放射性組織サンプル(大脳皮質)を均質化し、低速遠心分離にかけた。上清(適用後30分、黒丸、C、そして適用後60分、黒三角、D)をHPLC分画によって[3H]-NAP貯蔵量(白ぬき丸)に対して分析した。βカウンタによりサンプルの放射能(dpm)について観察した。NAPのfmoles/g組織として放射能を示すために全ての結果を計算した。
【図３Ｄ】  経鼻適用した[3H]-NAPは体と脳に到達する。(C、D)完全な[3H]-NAPが、鼻腔内投与後に脳に到達した。放射性組織サンプル(大脳皮質)を均質化し、低速遠心分離にかけた。上清(適用後30分、黒丸、C、そして適用後60分、黒三角、D)をHPLC分画によって[3H]-NAP貯蔵量(白ぬき丸)に対して分析した。βカウンタによりサンプルの放射能(dpm)について観察した。NAPのfmoles/g組織として放射能を示すために全ての結果を計算した。
【図３Ｅ】  経鼻適用した[3H]-NAPは体と脳に到達する。（E)実験を3匹の追加の動物により繰り返した、ここでは上記動物をA-Dの２５０〜３００gの代わりに各２００gにし、小さくて目に見える血管を時計屋の鉗子(No. 5)を用いて取り除いた。
【図４Ａ】  NAPの鼻腔内投与は、AF64A処置ラットのコリン・アセチル・トランスフェラーゼ活性の低下を防ぐ。アセチル・コリン中への放射標識したコリンの取り込みを示す。結果を対照(１００％)に対して較正した。1群につき3匹の動物を利用した実験(各々３重)を行い、そして本文に記載のとおり分析した。
【図４Ｂ】  AF64A処置ラットは、学習と記憶の欠陥、ADNF-9処置ではなくNAPの長期にわたる効果を示す。(方法の項に記載のとおり)1の実験群につき10匹の雄ラットを使した。4の群を使用し、3をAF64Aにより処置し、そして1の群を生理食塩液(対照)により処置した。ラットを1週間回復させ、そして次に2のAF64A群をADNF-9又はNAPのいずれかで(経鼻的に)処置した。5日の処置日に続いて、この動物を2日間回復させ、次に（図１及び２にあるように）毎日の水迷路試験を受けさせた。この実験と図１および２の実験の間の相違は、この動物が行動に関する試験の前にペプチドの毎日鼻腔内投与を受けていない点である。この図は、短期記憶を表わす毎日の試験の秒数を示す。
【図５】  モリス水迷路試験により評価れる学習に対する、L-NAPとL-SALの混合物(腹腔内注入)による動物の出生前処置の効果を説明する。
【図６】  モリス水迷路試験により評価される学習に対する、D-NAPとD-SALの混合物(経口投与)による動物の出生前処置の効果を説明する。
【図７】  モリス水迷路試験により評価される学習に対する、D-SAL(経口投与)による動物の出生前処置の効果を説明する。
【図８】  モリス水迷路試験により評価される学習に対する、D-NAP(経口投与)による動物の出生前処置の効果を説明する。
【図９】  モリス水迷路試験により評価される学習に対する、２倍用量のD-SAL(経口投与)による動物の出生前処置の効果を説明する。
【図１０】  プローブ試験により評価される学習に対する、D-NAPとD-SALの混合物(経口投与)による動物の出生前処置の効果を説明する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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