(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノムの非コード領域に、
配列番号：１（Ljungan８７−０１２）
0004440345.tif 000012
および配列番号：１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する相同配列からなる群から選択されるｃＤＮＡ配列に相当するヌクレオチド配列を含んでなり、哺乳類の疾患を引起す、Ljunganピコルナウイルス。
【請求項２】
直径が２７ｎｍである、請求項１に記載のLjunganピコルナウイルス。
【請求項３】
ヒト肺ガン細胞（ＢＨＫ−２）にインキュベートすることができ、かつ低力価で成長し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が２週間かけてゆっくり進展する、請求項１または２に記載のLjunganピコルナウイルス。
【請求項４】
上記相同配列が
配列番号：２（Ljungan１７４Ｆ）
0004440345.tif 000013
および配列番号：３（Ljungan１４５ＳＬ）
0004440345.tif 000014
のいずれかである、請求項３に記載のLjuganピコルナウイルス。
【請求項５】
配列番号：４（Ljungan１４５ＳＬの部分構造タンパク質）
0004440345.tif 000015
および配列番号：４に少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する相同配列、およびこれらの配列の抗原断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、該タンパク質または抗原断片が請求項１〜４のいずれか一項に記載のウイルスに特異的な抗体を誘導し、またはその抗体と反応するタンパク質。
【請求項６】
配列番号：４のアミノ酸配列を有する構造タンパク質に対する抗血清または抗体。
【請求項７】
配列番号：４のアミノ酸配列を有する構造タンパク質を含んでなる抗原。
【請求項８】
請求項６に記載の抗血清または抗体、またはその抗原結合部分、請求項７に記載の抗原、
配列番号：１の配列に特異的な１個または数個のプローブ、および
配列番号：１の配列に特異的な１個または数個のプライマー
からなる群からの少なくとも１個の成分を含んでなる、診断キット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、新規なピコルナウイルス、このウイルスによって発現されるタンパク質、このウイルスに対する抗血清および抗体、このウイルスの構造タンパク質を含んでなる抗原、診断薬キット、ワクチン、このウイルス、抗血清または抗体および抗原の医薬における使用、および心筋炎、心筋症、ギャン−バレー症候群、および真性糖尿病、多発性硬化症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、筋委縮側索硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、自然流産、および乳児突然死症候群のようなこのウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防法に関する。
発明の背景
最近、スウェーデンのオリエンテーリング参加者の間に突然死症候群が見られている。約２００名のエリートオリエンテーリング参加者のうち、６名が１９８９〜１９９２年に心筋炎で死亡した(1)。数カ所のチェックポイントの間でかつ森林区域も多い所で最速／最短の道筋を見出だすことを目的とするオリエンテーリングは、著しく自然環境へ暴露にされる。従って、オリエンテーリング参加者の間の突然死症候群は、病原媒介動物（齧歯類または節足動物）によって運ばれる感染性物質によって引起されると考えられてきた。
北スウェーデンにおける心筋炎による死亡の発生により、土手ネズミ(Clethrionomys glareolus)の３〜４年の個体数の変動（サイクル）が１年の時間差で突き止められることが疫学的研究で示されている。以前は、齧歯類が天然リザーバーであるカルディオウイルスが、ヒトのギャン−バレー症候群（ＧＢＳ）、マウスの真性糖尿病（ＤＭ）、およびヒト以外の霊長類など幾つかの種の心筋炎を引起すことが示された。
心筋炎による死亡の他に、北スウェーデンにおいてギャン−バレー症候群（ＧＢＳ）および真性糖尿病（ＤＭ）と診断された患者の数から、様々な時間差での土手ネズミの３〜４年の個体数の変動が突き止められることも疫学的研究で示されている。
Sven Gardと共同研究者らは、１９５０年代初頭にスウェーデンにおける通常の人口における脳脊髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に対する抗体の普及度について検討した(2)。これらの研究の結果、血球凝集阻害試験によって抗体普及率が意外なほど高いことが分かったが、血清は中和試験によっては確かめることはできなかった。これらの結果は、その時には戸惑うものと見られたが、スウェーデンに広がっている１または数種類の関連ピコルナウイルスの存在によって説明することができた。
エンテロウイルスには多数の種類があるが、カルディオウイルスは２種類か、場合によっては３種類にすぎないという事実は、２つの属の真の相違点を示しており、またはヒトから新規なエンテロウイルスを単離することと比較して、齧歯類から新規なウイルスを単離するのに行った努力の量の結果に過ぎないということができる。
ピコルナウイルス科は、現在では５つの属（アフト−、エンテロ−、ヘパト−、リノ−およびカルディオウイルス）に分類される(3)。この分類法は、最初は形態学的、生理学的および血清学的特性、並びにウイルスの病原性に基づいていた。しかしながら、更に最近では、広範囲のデータが以前に用いられた特性決定の特性と一致することが明らかにされているので、ウイルスはそのゲノム配列に基づいて特性決定されている(4,5)。
カルディオウイルス属におけるプロトタイプウイルスはサイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）である。この属のもう一つ種類は、脳心筋炎ウイルスである。ロシアにおける退行性神経疾患の患者から単離されたビリュイスクウイルス(Vilyuisk virus)は、血清学的にＴＭＥＶに関係しているが、現在はカルディオウイルス属の第三の別の種類に含まれることについて検討中である(6)。
実際に、カルディオウイルスは地理的に広く分布しており、その天然リザーバーとしての齧歯類には多数の感染されやすい宿主がある。齧歯類の他に、ＥＭＣＶは、家畜のブタ、ゾウ、ライオン、ヒト以外の霊長類およびヒトから単離されている(7,8,9)。ＴＭＥＶおよびＥＭＣＶへの感染は、心筋症、ＤＭおよびマウスの脱髄疾患類似多発性硬化症のような様々な神経学的障害の誘発に対する優れた動物モデルを提供している(10〜16)。感染が発症因子であると思われかつ自己免疫成分もある他の神経または筋肉疾患は、心筋症、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、および筋委縮側索硬化症（ＡＬＳ）である。しかしながら、ヒトの疾患は、症例報告でまたは血清疫学的長鎖で測定された感染症として記載されているので、カルディオウイルスが重要なヒトの病原体であることは全く明らかになっていなかった(7〜17)。
従って、野生の齧歯類の個体群に広がっている未だ同定されておらず、時にはヒトに感染して、遺伝学的に感染を受けやすいヒトに心筋炎、心筋症、ギャン−バレー症候群、および真性糖尿病、多発性硬化症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、筋委縮側索硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、自然流産、および乳児突然死症候群を引起すピコルナウイルスがある可能性がある。
重要なヒトの疾患と小型の齧歯類の数との間の疫学的関連、およびピコルナウイルス／カルディオウイルスについて以前に知られていたことにより、小型齧歯類から新規なピコルナウイルスを単離する試みが促進された。
本発明の基礎としての実験作業の説明
動物の捕獲
小型齧歯類を北スウェーデンの数カ所で捕獲し、ストックホルム、スウェーデンのSwedish Institute for Infectious Disease Controlに生きたまま輸送した。捕獲した動物の種、日付、および場所を記録した。エーテル麻酔を用いて瀉血し、屠殺した。器官を直ちに取り出し、ウイルスの存在について試験を行うまで−７０℃で保存した。総数で５３匹のClethrionomys glareolusおよび２８匹のMicrotus agrestisをウイルスの単離について試験した。
ウイルスの単離
本研究に用いた単離技術は、多くの場合に用いられるものとは異なっていた。単離に用いる細胞を少なくとも２週間保持し、ウイルス成長をＣＰＥ（細胞変性効果）およびＩＦＴ（免疫蛍光試験）を用いる多数のヒト血清により細胞の染色によって検出した。本明細書に示される新規ウイルスは、いずれもカルディオウイルス／ピコルナウイルスの通常の検出法を用いては検出されていない。それらは、低力価に成長し、ＣＰＥの進展は遅い。
肺ホモゲネートおよび糞便と混合した唾液を、それぞれの動物について個別に分析した。材料を、コンフルーエントなＢＨＫ−２１細胞のＴ２５フラスコに接種した。細胞を、２週間の間に１週間に２回ブラインド通過させた(blind passed)。この期間の終了時またはＣＰＥの徴候が見られる場合には早めに、細胞をゴムポリスマンによってＴ２５フラスコから取り出し、１０ウェルのスポットスライドに置き、風乾して、アセトン固定した。次に、細胞を、５名の多発性硬化症患者、最近ＤＭと診断された５名の患者、および心筋炎末期でありかつ剖検で出血した５名の運動選手を含むヒト血清のパネルで染色した。総てのＴ２５フラスコ（個々に、唾液−肺および糞便）を、ヒト血清の完全パネルを１：１０倍に希釈したものを用いてＩＦＴによりそれぞれ試験した。
ヒト血清パネルを用いるＩＦＴによる陽性反応を示す細胞を選択して、更に分析を行った。これは、１日齢の乳児マウスの大脳内への接種、特性決定、および配列分析を含んでいた。
抗血清および血清学的処理法
ウイルス単離物に対する抗血清を、マウス(NMRI)およびモルモット(Dunkin Hartley)で作成した。動物にＢＨＫ−２１細胞からの細胞培養上清を腹腔内投与し、血清を４〜６週間後に集めた。免疫感作前血清をそれぞれ試験し、免疫感作後血清を総ての感染動物からプールした。
以前に報告された間接免疫蛍光試験（ＩＦＴ）(18,19)を用いて、免疫した動物の抗体力価を試験した。簡単に説明すれば、スポットスライドを、ウイルスをミドリザル腎（ＧＭＫ）細胞上で６〜１０日間インキュベーションすることによって調製した。明確なＣＰＥの徴候が見られたならば、細胞をゴムポリスマンによってフラスコから取り出し、顕微鏡スライドに載せて、風乾し、冷（４℃）アセトンで固定して、−７０℃で保存した。力価を、ＰＢＳで希釈した血清を湿潤室内でスライド中３７℃で１時間インキュベーションすることによって測定した後、上記の方法でインキュベーションしたＦＩＴＣ接合体（ヤギ抗ＩｇＧγ−鎖特異的なＦ（ａｂ′）２断片、Sigma Immuno Chemicals(F-1641)、またはウサギ抗マウス免疫グロブリン、Daco(F0313))を測定した。
ウイルスに対する抗体力価は、Earley et al.が報告した方法によるプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）の改良法によって測定した(20)。試験において、血清を４倍連続希釈し、５０μｌ当たり８０〜１００プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む等容積と混合した。次に、混合物を３７℃で６０分間インキュベーションした後、５０μｌをコンフルーエントなVero細胞単層を含む組織培養プレートの２ウェルずつに接種した。３７℃で６０分間吸着した後、ウェルを、１％アガロース１部と、アール塩、１７ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液、８％加熱ウシ胎児血清、１００／ｍｌのペニシリン、１００μｇストレプトマイシンを含む２Ｘ基本イーグル培地１部との４２℃混合物０．５ｍｌを重層した。組織培養プレートを、加湿した５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で３〜７日間インキュベーションした。次に、中性の赤色染料（１：９０００）を含む第二の重層物（０．５ｍｌ）を適用し、プラークを翌日計数した。プラーク数を、直線的に２倍希釈まで補外した。プラークの５０％減少を、ウイルス中和力価の基準として用いた。
電子顕微鏡法
細胞培地または脳組織ホモゲネートを、ネガティブ・コントラスト電子顕微鏡法（ＥＭ）によって検討した。１０μｌの小滴を、フォルムバール／炭素をコーティングしたグリッド上で１分間インキュベーションし、あるいは０．５ｍｌ試料を２０，０００×ｇで３０分間遠心分離して細胞細片を除き、最後に上清をグリッド上にBeckman Airfuge中１６０，０００×ｇで１０分間直接ペレット化した。グリッドを２％ホスホタングステート酸（ｐＨ６．０）で染色し、少なくとも４６，０００倍の倍率でPhilips CM 100電子顕微鏡で検討した。
配列データ
単離物８７−０１２、１７４Ｆおよび１４５ＳＬを、１６００ｃｍ２ローラーボトルでヒト肺癌細胞系Ａ５４９上で成育した。５〜１０日後に、完全なＣＰＥが観察された。上清(supernate)を０．４５μｍセルロースアセテートフィルター(Costar)で濾過して、ウイルスを４℃で２０時間２０，０００ｇでペレット化した。ＲＮＡを、記載された方法(Chomczynski and Sacchi)により酸性グアニジニウムチオシアネートを用いて、ウイルスを含むペレットから単離した。ｃＤＮＡの合成は、ＲＮＡ，ＡＭＶ逆転写酵素(Boehringer-Mannheim)１μｇ、および２０μｌの反応におけるプライマーとしてランダム１４マーオリゴヌクレオチドを用いて標準的条件下で行った。ウイルス５′１ＵＴＲの断片を、カルディオウイルス特異的コンセンサスプライマー、（センス）５′−ＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＡＴＡ−３′（ＳＥＭ）および（アンチセンス）５′−ＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧ−３′（ＡＴＶＥＭ）であって、いずれも以前に報告されたＥＭＣＶ２およびＥＭＣＶ１プライマーの後に改質されたプライマーであるものを用いて増幅した(Jongen et al.1993,Ann.Reum.Dis.52:575-578)。カルディオウイルス配列は、A.Palmenberg博士から得た（個人的情報）。増幅条件は、９４℃，３０秒間、５０℃，３０秒間、７２℃，２分間で３０サイクルであった。増幅した断片を、ｐＣＲＩＩ  Ｔ−ベクター(In-Vitrogen)にクローニングした。クローニングしたウイルス配列を、Ａ  ＴａｑポリメラーゼＦＳサイクル配列決定キットを用いて配列決定し、データをＭ１３〜２１およびＭ１３リバースプライマーを用いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３１０配列決定装置上に集めた(Perkin-Elmer)。５′−ＵＴＲからウイルスポリタンパク質配列に伸びている１．８ｋｂ断片を、１４５ＳＬ単離物からのｃＤＮＡのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅によって得た。プライマーは、（センス）５′−ＡＣＡＧＴＧＣＡＴＴＣＣＡＣＡＣ−３′（ＳＬＪＵ１）または５′−ＣＣＧＣＴＣＣＡＣＡＡＴＡＧＡ−３′（ＳＬＪＵ２）、および（アンチセンス）５′−ＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣ−３′（プライマー１１８）であった。ＳＬＪＵ１とＳＬＪＵ２プライマーを、互いに直接隣接して配置し、ウイルスのＥＭＣＶおよびＴＭＥＶ類に対して相同性ができるだけ少ない本発明のLjungan単離物のコンセンサスプライマーとして選択した。増幅条件は、９４℃，３０秒間、４２℃，１分間、７２℃，２分間で３０サイクルであった。アンチセンスプライマー１１８は、センスプライマーとしてのＳＬＪＵ１またはＳＬＪＵ２と共に同様に整粒したＰＣＲ生成物を生じたが、これらのプライマーを単独で用いたときにはＰＣＲ断片を生じなかった。プライマー１１８の配列は、以前に公表された(Bauer,D.,et al.1993,Nucl.Acids Res.21:4272-4280)。得られた１．８ｋｂＰＣＲ断片を、上記と同様にしてクローニングし、配列決定した。
実験作業の結果
３種類のウイルス単離物を、ヒト血清パネルとの反応に基づいて、ＥＭ上でピコルナウイルスと適合性のサイズおよび構造を示すものを選択した。第一の単離物を、Ljungan87-012と命名した。Ljunganは、動物を捕獲したスウェーデンのメデルパッド州の川である。
第二および第三の単離物を、それぞれLjungan174FおよびLjungan145SLと命名した。
３種類の単離物は、総てC.glareolusから得た。
これら３種類の単離物は、乳児マウスを３〜５日で殺した。
マウス脳の力価は、（約）１０９であったが、細胞培養物の力価は（約）１０５に過ぎなかった。
電子顕微鏡法
直径が２７ｎｍのウイルス粒子は、表面がほぼ単調な球状であり、それらは単独または小さな凝集体であると思われた。まれな場合には、染料が粒子に浸透し、中空シェルと思われた。
血清学的結果
多数の様々な細胞系を試験したところ、ミドリザル腎細胞が血清学用のＩＦＴドロップスライドの作成に最適であった。マウス血清を用いる交差ＩＦＴデータを、第１表に示す。
0004440345.tif 000002
ＰＲＮＴ（プラーク減少中和試験）データ、予備的結果。力価が１：１６０の同種のＴＥＭＶおよびＥＭＣＶに対するウサギ血清は、３種類の単離物に対しては力価が１０未満であった。土手ネズミ、マウス、ウサギおよびモルモットで中和力価を有する抗血清を作成する幾つかの試みは、失敗した。総ての動物で、ＩＦＴにより高力価抗体が作成されたが、ＰＲＮＴでは作成されなかった。土手ネズミでは、ＩＦＴ抗体の作成は不成功であった。
配列データ
Ljungenウイルス単離物の５ＵＴＲおよびポリタンパク質遺伝子からの配列
カルディオウイルスコンセンサスプライマーは、ＥＭＣウイルスについては２８４ｂｐであるのと比較して、３種類の単離物８７−０１２、１７４Ｆおよび１４５ＳＬについて３０３ｂｐの生成物を生成した。増幅した断片を、ＥＭＣウイルスのポリＣトラクトの末端の直ぐ後に配置した。Ljungan単離物に特異的なＰＣＲ生成物は、再アニーリング温度が５０℃であるときにのみ得られ、ＥＭＣウイルスｃＤＮＡからの生成物を得るのに最適な５８℃では得られなかった。引続く配列分析の結果、ＡＴＶＥＭプライマーは４個の内部位置で不適性であることを示し、再アニーリング温度のこの差を説明していた。３種類のLjungan単離物、ＥＭＣＶおよびVilyuiskウイルスについての５′ＵＴＲ配列を整列したもの（第２表）は、２種類のいずれかとLjungan単離物とよりもＥＭＣＶとVilyuiskウイルスとの間により大きな類似性を示している。それぞれのLjungan単離物は、ヌクレオチド変化の数が他のものと異なっていることも示されている。１７４Ｆおよび１４５ＳＬは、単離物８７−０１２に類似している。１７４Ｆと８７−０１２との間の配列相同性はせいぜい９５％（配列中に３個の未決定塩基）であるが、８７−０１２と１４５ＳＬとの相同性は９１％であった。
Ljunganウイルス単離物から他のＰＣＲ断片を得る目的で選択した方法は、微分的に発現したｍＲＮＡを検出する手法の改良法であった(Bauer,D,,et al.1993,Nucl.Acids Res.21:4272-4280)。この方法の試験として、Ljungan１４５ＳＬ単離物からのｃＤＮＡを、センスプライマーとしてＳＬＪＵ１またはＳＬＪＵ２プライマーおよび「アンチセンス」プライマーとしてランダムに選択した配列の２０個の１０マーオリゴヌクレオチドの一つを用い、上記の条件を用いて増幅した。
ＳＬＪＵ１またはＳＬＪＵ２プライマーおよび特異的１０マーを用いて得たＰＣＲ生成物を同様に整粒し、これらのプライマーのいずれも、ＰＣＲ反応に単独で用いたときにこのサイズの生成物を生じない場合には、得られた断片を単離して、クローニングした。プライマーの一つの組合せだけ、すなわちＳＬＪＵ１またはＳＬＪＵ２プライマーを１１８の１０マーオリゴヌクレオチドと組合せたものであって、１．８〜１．９ｋｂＰＣＲ生成物を生じるものが、この基準を満足した。この断片のうち、８１９ｂｐを３′末端から配列決定した。この配列は、ウイルスポリタンパク質の意味において６６３ｂｐのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。このＯＲＦを用いて、デフォールト・サーチ・パラメーターを有するＥＭＢＬからのＢＬＩＴＺ検索サービスを用いてSwiss protein data bankで検索した。トップの１０スコアは、８個のカルディオウイルス配列を含むピコルナウイルスポリタンパク質配列であった。１８８個のアミノ酸に亙って相同性が見られた。ウイルスポリタンパク質のこの部分の以前に配列決定したカルディオウイルスに対する関連性を、第３表に示す。総てのカルディオウイルスの比較用整列は、A.Palmenberg博士により本発明者らが利用可能となった。第３表において、ＴＭＥＢｅＡｎの配列を指標品種(index strain)として採用した。整列中の１２個の残りのカルディオウイルスについては、アミノ酸配列の差異だけを示す。Ljungan１４５ＳＬ配列の整列も、同様に再上段に示す。ＢＬＩＴＺ検索アルゴリズムは、同一並びに類似のアミノ酸を考慮しているので、後者は小文字で表してオリエンテーリング、ＴＭＥＢｅＡｎに対する差異は整列中の他の品種について大文字で示している。
要するに、Ljungan単離物についての上記データは、３種類のウイルスに対して特徴的ではあるが、未だ不完全である。しかしながら、カルディオウイルスの５′−未翻訳領域の高度に保存された部分と、一つの単離物（Ljungan１４５ＳＬ）のウイルスキャプシドタンパク質についてのコード配列とからのクローニングした配列の比較により、Ljunganウイルスはカルディオウイルスに関係しているが、任意の以前に同定されたカルディオウイルスより離れた類縁物であることを明らかに示している。Theiler類内のウイルスのアミノ酸相同性（アミノ酸同一性）は９６〜９７％であるが、Vilyuiskウイルスの相同性は約８３％であり、ＥＭＣウイルスはＴＭＥＢｅＡｎに対して６７〜７４％相同であり、Ljungan１４５ＳＬのＴＭＥＢｅＡｎに対する同一アミノ酸は約３２％に過ぎない。相同性を同一および類似アミノ酸と考えても、この関係の尺度はLjungan１４５ＳＬとＴＭＥＢｅＡｎとの間の５０％にしか達しない（相当する数字は、ＥＭＣとＴＭＥＢｅＡｎとの間では７９〜８３％となる）。
配列の整列
第２表は、３種類のLjunganウイルス単離物（１．８７−０１２，２．１７４Ｆ，３．１４５ＳＬ）［それぞれ配列番号：１、２および３］と公表されたカルディオウイルス配列（４．ＴＭＥＢｅＡｎ，５．Vilyuisk，６．ＥＭＣＶ）との整列を示す。整列した配列はＥＭＣＶのポリ−Ｃトラクトの末端の２９ｎｔ３′から開始し、この配列は異なるウイルスゲノムにおけるｎｔ５５７−８０８（およそ）に相当する。配列中の挿入したスペースは、ピリオド（．）によって表す。
0004440345.tif 000003
ウイルスゲノムのこの領域において、Ljungan１７４ＦはLjungan８７−０１２（ここでは比較のための指示品種として用いた）に対する相同性が９４％であり、Ljungan１４５ＳＬはLjungan８７−０１２に対して９１％相同性残基を有する。ＴＭＥＢｅＡｎ品種は、Ljungan８７−０１２に対して６９％の相同性残基を有し、Vilyuiskは６８％、ＥＭＣＶは６８％の相同性残基を有する。相同性を計算するための同じ基準を用いると、ＥＭＣＶはＴＭＥＢｅＡｎに対して８５％の相同性を有する。
第３表は、A.Palmenberg博士によって編集された比較整列におけるLjungan１４５ＳＬ単離物［配列番号：４］のポリタンパク質コード配列から、配列決定されたカルディオウイルスのアミノ酸配列間でのｃＤＮＡ配列の整列を示す（個人情報）。ＴＭＥＢｅＡｎ品種は任意に指示品種と考え、残りの品種のアミノ酸は、それらが指示品種と異なる場合にのみ示す。Ljungan１４５ＳＬ単離体については、類似しているが同一ではないアミノ酸を小文字で示す。Ljungan１４５ＳＬと他のカルディオウイルスとの間のアミノ酸相同性を、標準的検索パラメーターを有するＢＬＩＴＺ検索アルゴリズムを用いて全Swiss Protein Data Bankをスクリーニングすることによって確立した。
0004440345.tif 000004
Ljunganウイルスと真性糖尿病および心筋炎との関連性を示す血清学的分析法
ウイルスに感染したアセトン固定ミドリザル腎細胞を用いる間接免疫蛍光試験を用いる血清学的分析法を確立した。患者血清を１：８倍希釈でスクリーニングし、陽性血清を滴定した。１：３２以上の力価を有する血清を、陽性と考えた。
最近真性糖尿病（ＤＭ）と診断されたストックホルム地区の５９名の小児（１〜１６才）および同じ地理的地区の３４名のコントロール小児の血清を、本発明の３種類のウイルスに対する抗体の存在について試験した。５９名のＤＭ患者のうち１９名（３２％）が３種類のウイルスの１以上に対して陽性と判定され、３４名のコントロールのうち２名が陽性であった（有意差ｐ＝０．００２、フィッシャーの精密試験）。メデルパッド郡の９名の最近ＤＭと診断された患者（２３〜４６才）も、試験を行った。それぞれの成人ＤＭについて２名のコントロールを選択し、その年齢、性別および地理的居住地域を合わせた。９名のＭＤ患者のうち５名（５６％）および１８名のコントロール患者のうち１名（６％）が、３種類のウイルスの１以上に陽性であった（有意差ｐ＝０．００８、フィッシャーの精密試験）。
血清は、心筋炎で突然死した５名の運動選手からも入手した。それぞれの心筋炎間者に就いて３名のコントロールを選択し、その年齢、性別および地理的居住地域を合わせた。心筋炎で死亡した５名の患者のうち４名（８０％）および１５名のコントロールのうち１名（７％）は、３種類のLjunganウイルスの１以上に陽性であった（有意差ｐ＝０．００５、フィッシャーの精密試験）。
本発明の様々な態様
下記に、本発明の様々な面を開示する。しかしながら、これらの面は総て、新規な群のピコルナウイルスに関するものである。
従って、本発明の第一の面は、ピコルナウイルスの新規な群、すなわちそのウイルスゲノム、更に精確には非コード領域に、
0004440345.tif 000005
配列番号：１に対して少なくとも７５％の相同性を有する相同配列からなる群から選択されるｃＤＮＡ配列に相当するヌクレオチド配列を含んでなるピコルナウイルスに関する。
本発明のこの面の好ましい態様では、上記相同配列は、配列番号：１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の相同性を有する。
特に好ましい態様では、上記相同配列は、
0004440345.tif 000006
の１つである。
これらの配列（配列番号：２および３）は、配列番号：１に対してそれぞれ９４％の相同性および９１％の相同性を有する。
本発明の様々なウイルスのコード領域における相同性はかなり変化することができるが、非コード領域では、それらは、配列番号：１と少なくとも７５％の相同性を共有する。
ヌクレオチド配列、配列番号：１、２および３は、脳脊髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のゲノムのヌクレオチド５５７〜８０８（保存領域）にほぼ相当する。これらの３種類のウイルスは、野生齧歯類、更に精確には土手ネズミから単離されている。これらのウイルスは、細胞系で増殖させることができ、ピコルナウイルス生成物の大規模生産のために、ウイルスゲノムを他の微生物に挿入することができる。
本発明の第二の面は、
0004440345.tif 000007
および配列番号：４に少なくとも７５％の相同性を有する相同配列、およびこれらの配列の抗原断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質に関する。
本発明の１態様では、相同配列は、配列番号：４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の相同性を有する。
配列番号：４は、ウイルスLjungan１４５ＳＬ単離物のポリタンパク質コード配列からのｃＤＮＡ配列の予備的部分配列決定の結果である。上記のアミノ酸配列、配列番号：４、上記の相同配列、および上記の抗原断片を含んでなる上記タンパク質は、医薬の活性成分として、また診断キットの診断試薬として有用である。
本発明の第三の面は、本発明の第一の様相で定義されたウイルスの構造タンパク質に対する抗血清または抗体に関する。このような構造タンパク質の一例は、本発明の第二の面で定義されている。このような抗血清または抗体は、医薬の活性成分として、また診断キットの診断試薬として有用である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体のいずれも用いることができ、これらは、哺乳類を免疫するため上記ウイルスまたはそのウイルスに特異的なその断片を用いることによって好ましく産生される。
本発明の第四の面は、本発明の第一の様相で定義されたピコルナウイルスの構造タンパク質の少なくとも一部であって、そのサブユニットを包含するものを含んでなる抗原に関する。このような抗原の一例は、本発明第二の面で定義されたタンパク質およびその抗原部分である。本発明のこのような抗原は、医薬の活性成分として、また診断キットの診断試薬として有用である。
本発明の第五の面は、
a)  本発明の第三の面による抗血清または抗体、またはその抗原結合部分、
b)  本発明の第四の面による抗原、またはその抗体結合部分、
c)  本発明の第一の面によるウイルスのゲノムに対してデザインされた１または数種類のプローブ、および
d)  本発明の第一の面によるウイルスのゲノムに対してデザインされた１または数種類のプライマー
からなる群からの少なくとも１種類を含んでなる診断キットに関する。
診断キット様々な成分は、用いられる実際の診断法によって変化する。上記の診断キットの用いることができる成分の他に、このキットは、ホジティブ・リファレンス試料、ネガティブ・リファレンス試料、希釈剤、洗浄溶液、および緩衝液を適宜含むことができる。キットには、更に使用説明書も添付される。
上記の成分a)およびb)は、酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または免疫蛍光分析法のような免疫診断法に用いられる。
上記の成分c)およびd)は、直接ウイルス検出に用いられる。好ましくは、このようなプライマーを用いるＰＣＲ（ポリマー連鎖反応）法に基づいた診断法は、本発明によるウイルスの直接検出に利用される。
上記の診断法は総て当該技術分野で周知であり、当該技術分野で通常の技術を有する者であれば、用いられる診断法に関する診断キットについての有用な成分を容易に選択するであろう。
本発明の第六の面は、
a)  本発明の第一の面によるウイルス、
b)  弱毒化した形態での本発明の第一の面によるウイルス、
c)  減殺形態での本発明の第一の面によるウイルス、
d)  本発明の第一の面によるウイルスのサブユニットを包含する本発明の第四の様相による抗原、および
e)  本発明の第一の面によるウイルスのゲノムＲＮＡに相当するＤＮＡ
からなる群から選択される成分を免疫感作または中和成分として有するワクチンに関する。
本発明のこの面の一態様では、このワクチンは、更にアジュバントを含んでなることができる。このようなアジュバントは、動物またはヒトの医薬についての信頼できる権威者によりワクチンでの使用について確認されているアジュバントでなければならないことはもちろんである。
このワクチンは、経口、皮下、筋肉内または皮内投与を目的とする特異的製剤に必要とされる他の成分を含むことができる。適当な追加成分は、欧州または合衆国薬局方に開示されている。
代替成分a)、b)およびc)は総て、通常のウイルス全体、弱毒化したウイルスおよび他の種類のウイルスに対して開発されたサブユニットワクチンの例であり、成分d)は、身体に特異的な細胞へのＤＮＡの配合を表し、これは次にウイルスに特異的な構造を発現し、このウイルスに対する免疫を誘導する。
本発明の第七の面は、（動物またはヒトに使用する）医薬で使用するための本発明の第一の面によるピコルナウイルスであって、場合によっては弱毒化または減殺形態でのもの、本発明の第三の面による抗血清または抗体、または本発明の第四の面による抗原に関する。このような医薬の一例は、本発明の第六の様相に開示された本発明によるワクチンである。
本発明の第八の面は、このウイルスによって引起される疾患の予防または治療処置のための医薬の製造において、本発明の第一の様相によるピコルナウイルスであって、場合によっては弱毒化または減殺形態でのもの、本発明の第三の様相による抗血清または抗体、または本発明の第四の面による抗原の使用に関する。
上記の使用の態様では、上記のウイルスによって引起される疾患は、心筋炎、心筋症、ギャン−バレー症候群、および真性糖尿病、多発性硬化症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、筋委縮側索硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、自然流産、および乳児突然死症候群の一つである。
本発明の第九の面は、ヒトなどの哺乳類において本発明の第一の面によるウイルスによって引起される疾患の予防または治療処置の方法であって、
a)  本発明の第一の面によるウイルス、
b)  弱毒化した形態での本発明の第一の面によるウイルス、
c)  減殺した形態での本発明の第一の面によるウイルス、
d)  本発明の第一の面によるウイルスのサブユニットを包含する本発明の第四の面による抗原、および
e)  本発明の第一の面によるウイルスのゲノムＲＮＡに相当するＤＮＡ
からなる群の一員を活性成分として含んでなる医薬の予防または治療上有効量を上記哺乳類に投与することを含んでなる方法に関する。
上記の方法の一態様では、上記のウイルスによって引起される疾患は、心筋炎、心筋症、ギャン−バレー症候群、および真性糖尿病、多発性硬化症、慢性疲労症候群、重症筋無力症、筋委縮側索硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、自然流産、および乳児突然死症候群の一つである。
実際の投与法は、動物実験および臨床試験に基づいてワクチン生産者によって決定される。
参考文献
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配列リスト
配列番号１（SEQ ID NO:1）
配列の長さ：２６４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル：ＮＯ
直接の起源
生物名：PICORNAVIRIDAE
株名：LJUNGAN87-012
配列
0004440345.tif 000008
配列番号２（SEQ ID NO:2）
配列の長さ：２６１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル：ＮＯ
直接の起源
生物名：PICORNAVIRIDAE
株名：LJUNGAN174F
配列
0004440345.tif 000009
配列番号３（SEQ ID NO:3）
配列の長さ：２６４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：cDNA to mRNA
ハイポセティカル：ＮＯ
直接の起源
生物名：PICORNAVIRIDAE
株名：LJUNGAN145SL
配列
0004440345.tif 000010
配列番号４（SEQ ID NO:4）
配列の長さ：１７９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：ＮＯ
フラグメント型：中間部
直接の起源
生物名：PICORNAVIRIDAE
株名：LJUNGAN145SL
配列
0004440345.tif 000011