(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いて増幅される、アルミニウム耐性因子に連鎖したＤＮＡマーカー。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡマーカーであって、上記アルミニウム耐性因子から約１．６センチモルガン（ｃＭ）の距離に位置することを特徴とするＤＮＡマーカー。
【請求項３】
配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行い、アルミニウム耐性オオムギの増幅パターンとアルミニウム感受性オオムギの増幅パターンとの相違から上記オオムギのゲノムＤＮＡがアルミニウム耐性因子を有するか否かを判定することを特徴とする、アルミニウム耐性因子の有無の判別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、かつアルミニウム耐性を付与する遺伝子（以下、「アルミニウム耐性因子」という）に連鎖するＤＮＡマーカー、及びその利用に関し、特に、これに限定されるものではないが、該アルミニウム耐性因子から約１．６センチモルガンの距離に位置し、該アルミニウム耐性因子と強連鎖するＤＮＡマーカー、及びその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酸性土壌は世界で338,517 ×104 ヘクタールも分布し、耕作地の30.7% を占めるとされている。このような土地で作物を栽培するには石灰等による土壌酸性の矯正を必要とするが、大面積の酸性土壌に石灰を散布することは経済的にも困難であるため、耐性品種を栽培することが対策として考えられている。
【０００３】
酸性土壌における作物の主な生育阻害要因はアルミニウムイオンによる根の伸長阻害とされており、禾穀類の中では特にオオムギが、アルミニウムイオンによる根の成長阻害を起こし易いことが知られている。そのためオオムギの酸性土壌耐性を評価することが水耕法などにより試みられてきた。
【０００４】
Ma et al. (1997)は、水耕栽培したオオムギにおけるアルミニウム耐性の種内変異にコムギを超えるものは見出されなかったものの、ある程度の変異を有していると述べている(Plant and Soil.191:133-137)。また、Stolen et al.(1978) は、複数組合せの耐性品種と感受性品種間のＦ2 集団を圃場で検定し、全ての交配組合せにおいて耐性は単因子支配であり、さらに、形質マーカー系統との交配によりアルミニウム耐性因子が染色体4Hの三叉芒(K) と連鎖すると述べている(Hereditas 88:101-105)。この他にも、耐性の分離をヘマトキシリン染色法により評価して単因子支配であるとする報告(Minella et al.(1992) Crop Sci.32:593-598)や、トリソミックス分析により‘Dayton’の耐性因子が染色体4Hに座乗するとした報告(Minella et al.(1997) Plant Breeding.116:465-469) がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、近年分子マーカーによる有用形質のマッピングが行われ、有用遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカーが多く見い出されている。このようなＤＮＡマーカーを利用すれば、特定の有用遺伝子の有無を高い確率で予測できるので、例えば、１）有用遺伝子を有する植物体の選抜、２）有用遺伝子の植物体への導入、３）植物体への有用遺伝子導入の成否判定、などに利用でき、特に作物育種の分野での応用が期待される。
【０００６】
しかしながら、オオムギではこれまで、植物体にアルミニウム耐性を付与する耐性因子（アルミニウム耐性因子）に、実用上充分な程度に連鎖したＤＮＡマーカーは見い出されていなかった。したがって、もしこのようなＤＮＡマーカーが得られれば、オオムギのアルミニウム耐性の有無の判別や、アルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片の単離が容易となり、ひいては、改善されたアルミニウム耐性を有する品種の作出など、各種育種プログラムへの応用が可能となる。
【０００７】
本発明は、上記従来の問題に鑑みなされたものであり、その目的は、オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、かつアルミニウム耐性因子に連鎖するＤＮＡマーカー、及びその利用方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかるＤＮＡマーカーは、上記の課題を解決するために、オオムギのゲノムＤＮＡ中に存在し、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いて増幅される、アルミニウム耐性因子に連鎖したＤＮＡマーカーであることを特徴としている。
【０００９】
本発明のＤＮＡマーカーは、アルミニウム耐性因子に連鎖しているので、例えば、オオムギのある品種がアルミニウム耐性因子を有するか否かを、このＤＮＡマーカーの有無を指標として、高い確率で予測できる。また、このＤＮＡマーカーの有無を指標として、オオムギのゲノムＤＮＡのライブラリーなどから、アルミニウム耐性因子を有するＤＮＡ断片をスクリーニングし、単離することも可能となる。
【００１０】
本発明のＤＮＡマーカーがアルミニウム耐性因子から約１．６センチモルガン（ｃＭ）の距離に位置することは好ましく、このようにアルミニウム耐性因子と強連鎖している程、アルミニウム耐性因子の有無を判別する指標として有効である。
【００１１】
本発明にかかるアルミニウム耐性因子の有無の判別方法は、上記の課題を解決するために、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行い、増幅パターンの相違から上記オオムギのゲノムＤＮＡがアルミニウム耐性因子を有するか否かを判定することを特徴としている。
【００１２】
上記の方法によれば、オオムギの様々な品種について、簡単な方法でアルミニウム耐性因子の有無を判定することが可能となる。よって、例えば、オオムギ品種の育種に際し、交配親の候補の中からアルミニウム耐性因子を有するものを比較的容易に選別することが可能となる。また、交配により得られた雑種についても、この雑種がアルミニウム耐性因子を有するか否かを比較的容易に判別することが可能となる。
【００１３】
本発明にかかるアルミニウム耐性の判定方法は、上記の課題を解決するために、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いてオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応を行い、増幅パターンの相違から上記オオムギのアルミニウム耐性の程度を判定することを特徴としている。
【００１４】
上記の方法によれば、オオムギの様々な品種について、簡単な方法でアルミニウム耐性の有無、並びに耐性の程度を判定することが可能となる。よって、例えば、オオムギ品種の育種に際し、交配親の候補の中からアルミニウム耐性の特に優れたものを比較的容易に選別することが可能となる。また、交配により得られた雑種についても、この雑種がアルミニウム耐性を有するか否か、また有する耐性の程度を比較的容易に判別することが可能となる。
【００１５】
本発明にかかるアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片の単離方法は、上記本発明のＤＮＡマーカーを用いてアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴としている。
【００１６】
上述したように、本発明のＤＮＡマーカーは、アルミニウム耐性因子に連鎖し、好ましくは該アルミニウム耐性因子から約１．６センチモルガン（ｃＭ）の距離に位置している。そのため、このＤＮＡマーカーを指標として、上記アルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片を単離することができる。
【００１７】
例えば、オオムギのゲノムＤＮＡ全てを断片化したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、上記のＤＮＡマーカーを有するＤＮＡ断片を取得すれば、該ＤＮＡ断片はアルミニウム耐性因子の一部または全長を有する可能性がある。なお、該ＤＮＡ断片がアルミニウム耐性因子の一部のみ、またはその近傍の領域のみを有する場合には、該ＤＮＡ断片に隣接するＤＮＡ断片についてコンティグ地図を作成し、アルミニウム耐性因子の全長の塩基配列を決定した上で、アルミニウム耐性因子の全長を含むようなＤＮＡ断片を調製すればよい。
【００１８】
また、本発明にかかる形質転換植物は、上記の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片を植物のゲノムＤＮＡに導入することによって作出された、アルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換植物である。
【００１９】
本発明の形質転換植物は、アルミニウム耐性がより増強されているため、これにより、酸性土壌でも生育可能な植物品種が得られることとなる。なお、形質転換植物の作出には、上記アルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片を、公知の方法により、アグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いて植物のゲノムＤＮＡに導入することによって、該形質転換植物を作出すればよい。
【００２０】
ここで、「形質転換植物」とは、形質転換植物およびその組織を含む意義であり、形質転換植物およびその組織は、遺伝子を導入したプロトプラスト、カルス、再生個体（初代植物）およびその子孫植物、さらには植物個体から単離された植物組織（根、茎、葉等）および種子等が含まれる。
【００２１】
本発明の形質転換植物の種類（対象）は、特に限定されるものではなく、すべての植物について本発明の形質転換植物として作出が可能であり、例えば、食用作物、果樹や野菜、花きその他の有効樹目を含む園芸作物、工芸作物、さらには飼肥料作物等の作物が作出可能な植物の代表例として挙げられる。なお、上記した食用作物、園芸作物、工芸作物、飼肥料作物に各々含まれる具体的な作物については、例えば、農学大辞典改訂第４版（養賢堂・1997年4 月30日発行) の目次８〜１６頁等にも詳しく記載されている。また、酸性土壌耐性は、ホウレンソウや甜菜などのアカザ科の作物、麦類などのイネ科作物など広範囲の植物で問題となっており、このような植物についても本発明を適用することにより、酸性土壌で充分生育可能な植物品種の獲得が期待できる。
【００２２】
また、本発明にかかる形質転換オオムギは、上記の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片をオオムギのゲノムＤＮＡに導入することによって作出された、アルミニウム耐性がより増強されてなる形質転換オオムギである。
【００２３】
本発明の形質転換オオムギは、アルミニウム耐性がより増強されているため、これにより、酸性土壌でも生育可能なオオムギ品種が得られることとなる。なお、形質転換オオムギの作出には、上記アルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片を、公知の方法により、アグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いてオオムギのゲノムＤＮＡに導入することによって、該形質転換オオムギを作出すればよい。
【００２４】
ここで、「形質転換オオムギ」とは、形質転換オオムギおよびその組織を含む意義であり、形質転換オオムギおよびその組織は、遺伝子を導入したプロトプラスト、カルス、再生個体（初代植物）およびその子孫植物、さらには植物個体から単離された植物組織（根、茎、葉等）および種子等が含まれる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、言うまでもないが、本発明は、特に本実施の形態の記載内容のみに限定されるものではない。
【００２６】
本発明において「アルミニウム耐性因子」とは、オオムギのゲノムＤＮＡ中、より具体的には４Ｈ染色体上に座乗する優性遺伝子であって、優性ホモ型およびヘテロ型の遺伝子型で、オオムギにアルミニウム耐性を付与する特性を有する遺伝子のことをいう。
【００２７】
また、本発明にかかる「ＤＮＡマーカー」とは、配列番号１および配列番号２に記載の一組のプライマーを用いて増幅される、上記アルミニウム耐性因子に連鎖したＤＮＡマーカーを指す。このようなＤＮＡマーカーは、上記アルミニウム耐性因子を有するオオムギのゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて増幅し、増幅ＤＮＡ断片として単離することができる。
【００２８】
増幅に際して鋳型として用いられるゲノムＤＮＡは、オオムギの植物体より従来公知の方法で抽出可能である。具体的には、植物体からゲノムＤＮＡを抽出するための一般法（Murray,M.G. and W.F.Thompson(1980) Nucleic Acids Res.8:4321-4325. など参照）が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムＤＮＡは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギの植物体を構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官（雄性・雌性生殖器官を含む）や種子も含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、オオムギの芽生え期の葉を用いて行われる。この理由としては、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。
【００２９】
オオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて増幅する方法は、従来公知のＤＮＡ増幅法を採用することができる。一般には、ＰＣＲ法（ポリメラ−ゼ連鎖反応法）や、その改変法が用いられる。ＰＣＲ法や、その改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。
【００３０】
なお、増幅の条件にもよるが、配列番号１および配列番号２に記載の配列を有するプライマーは比較的短いオリゴヌクレオチドであるため、長さが異なる複数種のＤＮＡ断片が増幅されてくる可能性がある。この場合、この中の約１１０ｂｐのＤＮＡ断片が、本発明のＤＮＡマーカーに相当する。
【００３１】
後に詳述するが、上記の約１１０ｂｐのＤＮＡ断片は、極めて高い確率で、アルミニウム耐性を有すると判定されたオオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には増幅され、アルミニウム感受性と判定されたオオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には増幅されない断片である。したがって、この約１１０ｂｐのＤＮＡ断片は、上記アルミニウム耐性因子に連鎖していると考えられ、また、染色体上でのマッピングを行うことにより、４Ｈ染色体上でアルミニウム耐性因子から約１．６センチモルガン離れた位置に座乗していることが確認された（マッピングについては後述する）。
【００３２】
ところで、オオムギ個体がアルミニウム耐性であるか否か（すなわちアルミニウム耐性であるかアルミニウム感受性であるか）は、アルミニウムイオン存在下での栽培試験を通して実際に評価することができる。そして、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１および配列番号２に記載のプライマーを用いて増幅した増幅パターンの相違が、アルミニウムイオン存在下での栽培試験の結果と対応することを確認することによって、本発明にかかるＤＮＡマーカーの有効性を確かめることができる。
【００３３】
上記の栽培試験は、例えば次のような方法で行うことができる。
【００３４】
判定対象となるオオムギ個体の種子を所定の条件で発芽させ、発芽後の芽生えを酸性（一般にはｐＨ４〜５）に調整した水耕液に植え付けて水耕栽培を行う。
芽生えを所定期間育成した後に水耕液を交換し、アルミニウム無処理区はこの水耕液のみで育成し、一方、アルミニウム処理区には、該水耕液に所定量のアルミニウムイオンが含有されるようアルミニウム化合物の水溶液を添加して育成を行う。アルミニウム処理区、アルミニウム無処理区ともにオオムギ個体を同一期間育成した後、得られた個体を地上部と根とに分けて秤量する。
【００３５】
なお、栽培試験において、水耕液のｐＨは試験期間を通じて常時一定の酸性条件に保たれるが、その値はオオムギ個体の種類や他の試験条件などにより適宜選択すればよい。また、試験期間（オオムギ個体の育成期間）や、アルミニウムイオン濃度などの各種試験条件についても試験毎に適宜選択すればよい。また、試験期間を通じて試験環境を一定とするために、試験は人工気象環境下で行うことが望ましい。
【００３６】
アルミニウム耐性の評価値となる耐性スコアは、根重を地上部重で割った値の、アルミニウム無処理区に対するアルミニウム処理区の相対値として求めることができる。そして、耐性スコアがある値よりも大きければ、そのオオムギ個体はアルミニウム耐性と判定され、耐性スコアがその値よりも小さければ、そのオオムギ個体はアルミニウム感受性と判定される。
【００３７】
後述の実施例では、アルミニウム耐性種‘むらさきもち’と、アルミニウム感受性種‘Morex ’とを交配し、Ｆ2 １００個体および両親各１０個体を上記試験に供して、アルミニウム耐性を評価した。その結果、耐性スコアの頻度分布はある値を境に耐性と感受性とに分けられ（図５参照）、つまり、この値を閾値とすると、アルミニウム耐性個体とアルミニウム感受性個体とが６７：３３の割合で分離された。このことから、‘むらさきもち’と‘Morex ’との交配において、アルミニウム耐性は優性の１因子に支配されているとみられた。
【００３８】
前述のように、本発明のＤＮＡマーカーは、４Ｈ染色体上でアルミニウム耐性因子から約１．６センチモルガン（ｃＭ）離れた位置に座乗していると認められるが、この距離は次のように算出された。
【００３９】
耐性スコアを耐性（Ｔ）と感受性（Ｓ）とに区分すると両者は３：１に分離した。また、上記ＤＮＡマーカーの遺伝子型をむらさきもち型（Ａ）とMorex 型（Ｂ）とすると、これらも３：１に分離する。もし両者に連鎖がない場合、メンデルの法則によってＦ2 におけるＴＡ：ＴＢ：ＳＡ：ＳＢ型の比率は９：３：３：１となるはずであるが、この分離比に適合しない場合は、耐性スコアとマーカーとに連鎖（すなわち染色体上の近傍に遺伝子が位置すること）が存在する。耐性遺伝子とマーカーとが近いほど、ＴＡ型およびＳＢ型の割合が多くなり、ＴＢ型およびＳＡ型の割合が少なくなるので、これを数学的に計算して（最尤法）染色分体あたりの乗り換え率を求めることができる。１．６ｃＭは、耐性スコアとマーカーとの間で染色分体あたり平均して１０００分の１６回乗り換えが起こることを示している。
【００４０】
オオムギ個体は、１）上記アルミニウム耐性因子をホモ型で有するか（以下、単にホモ型と称する）、２）ヘテロ型で有するか（以下、単にヘテロ型と称する）、３）劣性ホモ型となっている（すなわち、該アルミニウム耐性因子のアリールをホモ型で有する）か、のいずれかに大別されると考えられる。そして、本発明にかかるアルミニウム耐性因子の有無の判別方法は、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用いて取得される本発明のＤＮＡマーカーが、上記アルミニウム耐性因子に連鎖していることを利用する。つまり、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用い、上記ホモ型またはヘテロ型のオオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅した場合には本発明のＤＮＡマーカーの増幅が確認され、劣性ホモ型のオオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合には本発明のＤＮＡマーカーが増幅されないという増幅パターンの相違に基づいて、アルミニウム耐性因子の有無の判別が可能となる。
【００４１】
このようなアルミニウム耐性因子の有無の判別方法を用いれば、オオムギの様々な品種について、簡単な方法でアルミニウム耐性因子の有無を判定することが可能となる。よって、例えば、オオムギ品種の育種に際し、交配親の候補の中からアルミニウム耐性因子を有するものを比較的容易に選別することが可能となる。また、交配により得られた雑種、新品種についてもアルミニウム耐性因子を有するか否かを比較的容易に判別することが可能となる。
【００４２】
例えば、上記‘むらさきもち’と‘Morex ’とを交雑した集団の個体のＤＮＡを抽出して本発明のＤＮＡマーカーの多型を解析し、むらさきもち型を示す個体を選抜すれば、９８．４％の確率でアルミニウム耐性を獲得できることになる。
【００４３】
また、後述のように、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用い、オオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅を行うと、上記ホモ型のオオムギ個体では確認されないものの、上記ヘテロ型の個体や劣性ホモ型の個体では増幅される約１４０ｂｐのＤＮＡ断片の存在も確認された。このことから、配列番号１および配列番号２で示す一組のプライマーを用い、オオムギ個体のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅を行うと、ホモ型、ヘテロ型、劣性ホモ型それぞれに特有な増幅パターンが得られる。つまり、本発明にかかるアルミニウム耐性因子の有無の判別方法は、該アルミニウム耐性因子をホモ型として有するか、ヘテロ型として有するかの判別まで可能である。したがって、ホモ型とヘテロ型との間でアルミニウム耐性の程度に違いが認められるときには、上記アルミニウム耐性因子の有無の判別方法は、オオムギ個体のアルミニウム耐性の程度を判定する方法としても利用可能である。
【００４４】
本発明のＤＮＡマーカーを用いてアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片を単離する方法としては、例えば次のような方法を挙げることができる。
【００４５】
オオムギではゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーが１種類作成されており、現在複数のＢＡＣライブラリーが開発中である。そこで、このようなＢＡＣライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、耐性遺伝子と連鎖する本発明のＤＮＡマーカーで当該マーカーを含むＢＡＣクローンを同定し、そこからＢＡＣのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的なアルミニウム耐性遺伝子に到達することができる。なお、オオムギのゲノムサイズは５０００Ｍｂであり、マップサイズを１５００ｃＭとすると、１ｃＭは約３．３Ｍｂになるから、１．６ｃＭだと約５Ｍｂの距離になる。
【００４６】
本発明にかかる形質転換植物、形質転換オオムギの作出には、上記の単離方法により得られたアルミニウム耐性因子を含むＤＮＡ断片を、公知の方法により、アグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いて植物やオオムギのゲノムＤＮＡに導入することによって作出すればよく、これにより、酸性土壌でも生育可能な品種が得られることとなる。例えば、雑誌The Plant Journal(1997) 11(6),1369-1376 には、Sonia Tingay等により、Agrobacterium tumefaciens を用いてオオムギを形質転換する方法が開示されており、この方法を利用して形質転換オオムギを作出可能である。
【００４７】
【実施例】
まず、本発明の実施例で用いた材料および方法について説明する。
【００４８】
〔アルミニウム耐性の評価〕
アルミニウム耐性種‘むらさきもち’とアルミニウム感受性種‘Morex ’およびそのＦ2 集団を２０℃で５日間催芽し、pH4.3 に調整した水耕液にＦ2 １００個体および両親を各10個体植付けた。各個体を３日間生育させた後、水耕液を交換し、無処理区は水耕液のみで育成し、アルミニウム処理区には、100 μM AlK(SO4)2 ・6H2O水溶液を30μM となるように加え処理を行った。実験は２０℃、１６時間日長の人工気象室内で行い、２反復を設けた。12日間処理条件下で育成した個体を地上部と根に分けて秤量し、地上部を鉢に移植してDNA 抽出用の葉を採取した。耐性スコアは根重を地上部重で割った値の無処理区に対するアルミニウム処理区の相対値により求めた。
【００４９】
〔DNA 抽出〕
Ｆ2 集団および両親の個体から、下記文献▲１▼に示された方法によってDNA を抽出し、分光光度計および1%アガロースゲル電気泳動によって濃度を測定し、100ng/μl に調整した。
▲１▼Peter Langrige, Angelo Karakousis and Jan Nield. (1997) Practical Workshop in Basic Recombinant DNA Techniques Course Manual. Waite Agricultural Research Institute University of Adelaide.
〔バルクセグレガント分析〕
Ｆ2 集団で耐性の大きい側と小さい側の両極端から10個体のDNA を等量ずつ混合し、耐性と感受性のバルクDNA をそれぞれ作成した。バルクDNA および両親のDNA を用いてAFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms)分析およびSSR (Simple Sequence Repeats) 分析を行った。
【００５０】
AFLP分析では、図１に示されるプライマーを用いて、128 のプライマー組合せによってバンドを確認した。Selective primerの組合せは他の文献を参考にして多型の得られやすいものを選択した。なお、図１において、E-000 は、EcoRI のuniversal primerを指し、E02,E03,E05,E08,E09,E12,E14,E15 は、EcoRI のselective primerを指し、各塩基排列が各記号の右側に示される。また、M-000 は、Mse I のuniversal primerを指し、M17-M32 の１６のプライマーは、Mse I のselective primerを指し、各塩基排列が各記号の右側に示される。
【００５１】
SSR 分析では、4H染色体上に座乗する8 個のSSR マーカーを選んで、それぞれバルク間での多型を調査した。以下、AFLP分析およびSSR 分析について更に詳細に説明する。
【００５２】
〔AFLP分析〕
下記文献▲２▼の方法に従って、150ng のDNA を各1.5UのEcoRI (TAKARA)およびMse I (NEW ENGLAND BioLabs) により、３７℃で12時間ダブルダイジェストした。
▲２▼Pieter Vos, Rene Hogers, Marjo Bleeker, Martin Reijans, Theo van de Lee, Miranda Hornes, Adrie Frijters, Jerina Pot, Johan Peleman, Martin Kuiper and Marc Zabeau. (1995) AFLP:a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Asids Research. 23:21:4407-4414.
制限酵素処理後のDNA 10μl に2pmol EcoRI adaptor と20pmol Mse I adaptorを50U のT4 ligase(TAKARA) によって２０℃、３時間ライゲーションし、10mMTris-HCl 0.1mMEDTA(pH8.0) によって20倍希釈した。PreamprificationのPCR 反応は全量を25μl としてライゲーションしたDNA 2.5 μl (20 倍希釈) とプライマーおよび各試薬の終濃度が1.5ng/μl EcoRI universal primer, Mse I universal primer, １×PCR Buffer, 0.2mMdNTP, 0.02U／μl ExTaq polymerase (TAKARA) となる条件で行った。Preamprificationしたサンプルは10mMTris-HCl 0.1mMEDTA(pH8.0) で50倍に希釈した。PCR 反応はPreamprification, Selective Amprification とも図２に示されるプログラムによって Gene Amp PCR system 9700 (A.B.I.)を用いて行った。以降は、下記文献▲３▼の方法に従って、Selective Amprification する際のプライマーの濃度を銀染色によって検出しやすいように反応液10μ当たり15ngとした。
▲３▼Y.Mano, S.Kawasaki, F.Takaiwa, T.Komatsuda. Development of a simple and efficient AFLP technique and construction of an STS-AFLP map in barley(in press).
Selective amplification はPreamplificationしたDNA(50倍希釈) 2.0 μl とプライマーおよび各試薬の終濃度が1.5ng/μl EcoRI selective primer, Mse I selective primer, １×PCR Buffer, 0.2mMdNTP, 0.025U/μl ExTaq polymerase (TAKARA) の条件全量を10μl としPCR 反応を行った。増幅したサンプルは等量のホルムアミドダイを加え、95℃ 5分間加熱し、氷中で急冷した。急冷したサンプルを16cm角スラブゲルを用いて7%変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド(Wako)：ビス(Wako)＝19：1, 0.5×TBE, 8.5M 尿素) で1 枚当たり32サンプルを同時に4 枚電気泳動(280V, 3時間) し、Sil-Best Stain for Protein/PAGE(nakalai tesque,INC.)を用いて銀染色によりバンドを検出した。なお、銀染色は下記文献▲４▼に記載されている。
▲４▼菅野  康吉 (1997) 増幅断片の検出と標識5 銀染色，PCR 法最前線  基礎技術から応用まで，関谷  剛男  藤永  編，共立出版，東京．85-87.
〔SSR 分析〕
SSR 分析には、アルミニウム耐性因子が4H染色体に座乗するとする既報を参考に、4H染色体上に座乗する8 個のSSR マーカー（すなわち、HVM13, HVM40, HVM67, HVM68, HVM77, HVM3, Bmag0353 および Bmag0384 ）を選んだ。PCR 反応液の組成は0.05U/μl AmpliTaq DNA polymerase, 1×PCR Buffer, 0.25mMMgCl2, 0.6mMdNTPs, 1pmol／μl primer (forward, reverse共) を全量10.0μl とした。PCR 反応は、マーカーHVM3については図３のSSR3、マーカーBmag0353およびBmag0384については同図のSSR2、その他のマーカーについてはSSR4のプログラムで行った。
【００５３】
5'側を hex（黄）で蛍光標識しているHVM3は、サンプル1.0 μl にサイズスタンダード（TAMRA GS500 ）0.5 μl 、脱イオンホルムアミド 12.0 μl を加え、95℃で3 分間加熱後氷中で5 分以上急冷し、急冷したサンプルを ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (A.B.I.)によって検出した。PCR 産物のサイズ決定はフラグメント解析用ソフトウェアGeneScan (A.B.I.) により行い、alleleの決定にはDNA フラグメント解析用ソフトウェアGenotyper TM（Version1.1, A.B.I.）を用いた。また、蛍光標識されていないHVM3以外のマーカーについてはサンプルに等量のホルムアミドを加え、95℃ 5分間加熱後氷中で急冷し、急冷したサンプルをAFLPの方法に準じて16cm角スラブゲルを用いて7%変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、銀染色によりバンドを検出した。
【００５４】
上記SSR マーカーのうち、HVM3については文献「Z.W.Liu, R.M.Biyashev, M.A.Shaghai Maroof.(1996) Development of simple sequence repeat DNA markers and integration into a barley linkage map. Theor. Appl. Genet. 93:869-876」に記載されており、そのプライマー配列は、
0004575613.tif 000002
である。
【００５５】
また、Bmag0353は、Waugh からの私信で入手したマーカーであり、そのプライマー配列は、
0004575613.tif 000003
である。
【００５６】
〔連鎖分析〕
連鎖地図の作成はMAPMAKER/EXP3.0 を用いて連鎖検出の閾値をLOD 3.0 で行い、地図距離は下記文献▲５▼の方法によった。
▲５▼Kosambi, D.D. (1944) The estimation of map distance from recombination values. Ann. Eugen. 12:172-175.
次に、本実施例の結果について説明する。
【００５７】
〔アルミニウム耐性の評価〕
30μＭのアルミニウム処理条件下で12日間生育させた両親系統およびＦ2 個体の根の生育状態を図４に示した。同図において、Ａは‘むらさきもち’、Ｂは‘Morex ’、ＣはＦ2 耐性個体、ＤはＦ2 感受性個体を示す。
【００５８】
耐性スコアの頻度分布は、図５に示されるように0.24を境に耐性と感受性に分けられ（耐性：感受性 = 67 ：33  χ2=3.41  0.1<P<0.05) 、‘むらさきもち’と‘Morex ’の交配においてアルミニウム耐性は優性の１因子に支配されているとみられた。なお、図５のグラフにおいて、横軸は耐性スコアを、縦軸は植物体の数を示す。
【００５９】
〔アルミニウム耐性に関与するＤＮＡマーカーの探索〕
AFLPをバルクセグレガント法に適用し、128 のプライマー組合せについてバルク間および両親の間で多型を示すバンドをスクリーニングした結果、16のプライマー組合せについて多型が認められた。その16組合せに関して、耐性、感受性各４個体による２次スクリーニングを行ったところ、E05-M26 ，E12-M29 の組合せのプライマーについて再現性のある多型が得られた。この２つのマーカーをＦ2 集団60個体のマーカー型の調査に用いた。
【００６０】
また，SSR を適用したバルクセグレガントでは染色体4Hに座乗する８マーカーについてスクリーニングした結果、HVM3, Bmag0353の２マーカーについて多型が得られたため、AFLPマーカーと同様に個体のマーカー型の調査に用いた。
【００６１】
図６の（ａ）には、AFLPの上記E05-M26 のプライマー組合せにおける電気泳動後のゲル像が示され、図６の（ｂ）には、SSR のマーカーBmag0353における電気泳動後のゲル像が示される。図中、ＢＴとＢＳはそれぞれ耐性と感受性のバルクDNA であり、１〜７は耐性のＦ2 個体、８〜１４は感受性のＦ2 個体である。耐性と感受性との間で多型が認められたバンドが、図中矢印で示されている。
【００６２】
同図（ｂ）に示されるように、上記マーカーBmag0353の場合、特徴的な２つのバンドが認められ、このうち、より短いバンド（約110bp)は、耐性のＢＴおよび１〜７で認められ、感受性のＢＳおよび８〜１４では認められなかった。したがって、このマーカーBmag0353を、本発明のＤＮＡマーカーとして用いることにより、アルミニウム耐性種か否かを高い確率で予測でき、耐性種の選抜も容易になる。
【００６３】
また、特徴的な２つのバンドのうち、より長いバンド（約140bp)は、感受性のＢＳおよび８〜１４のみならず、耐性の３〜５、７でも認められた。このことから、耐性の１〜７のうち、１、２、６はアルミニウム耐性因子についてホモ型であり、３〜５、７はヘテロ型であると推測される。つまり、上記マーカーBmag0353を、本発明のＤＮＡマーカーとして用いることにより、アルミニウム耐性因子をホモ型として有するか、ヘテロ型として有するかの判別まで可能である。したがって、ホモ型とヘテロ型との間でアルミニウム耐性の程度に違いが認められるときには、上記マーカーBmag0353は、アルミニウム耐性の程度を判定する方法としても有効である。
【００６４】
〔アルミニウム耐性のマッピング〕
Ｆ2 集団より無作為に60個体を抽出した。頻度分布から耐性はほぼ1 因子により支配されているとみられたので、スコア0.24を境にして個体を耐性と感受性に分け、耐性スコアとSSR マーカー2 種類，AFLPマーカー2 種類の連鎖を計算した。しかし，AFLPマーカーのうち１種類(E12-M29) については誤分類の可能性が認められたため解析からはずし計算したところ，耐性は図７に示すように4H染色体上にマップされた。
【００６５】
同図に示すように、マーカーBmag0353は、アルミニウム耐性因子（図中、Al Toleranceと記載) から約１．６センチモルガン（ｃＭ）の距離に位置しており、このようにアルミニウム耐性因子と強連鎖している程、アルミニウム耐性因子の有無を判別する指標として有効である。
【００６６】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡマーカーは、以上のように、アルミニウム耐性因子に連鎖しているので、例えば、オオムギのある品種がアルミニウム耐性因子を有するか否かを高い確率で予測できる、という効果を奏する。
【００６７】
【配列表】
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0004575613.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】AFLP分析に使用されたuniversal primerおよびselective primerを示す表である。
【図２】AFLP分析において、PreamprificationおよびSelective Amprification の各増幅に使用されたPCR 反応のプログラムを示す表である。
【図３】SSR 分析において、各マイクロサテライトの増幅に使用されたPCR 反応のプログラムを示す表である。
【図４】アルミニウム処理条件下で12日間生育させた両親系統およびＦ2 個体の根の生育状態を示す図であり、Ａは‘むらさきもち’、Ｂは‘Morex ’、ＣはＦ2 耐性個体、ＤはＦ2 感受性個体を示す。
【図５】‘むらさきもち’と‘Morex ’との交配によるＦ2 個体のアルミニウム耐性スコアの頻度分布を示すグラフである。
【図６】‘むらさきもち’と‘Morex ’とを交配させてアルミニウム耐性をバルクセグレガント分析した結果を示すゲル電気泳動像であり、（ａ）は、E05-M26 のプライマー組合せを用いた場合のゲル像であり、（ｂ）は、マーカーBmag0353を用いた場合のゲル像である。
【図７】オオムギ4H染色体上における、アルミニウム耐性のマイクロサテライトマーカー（Bmag0353，HVM3）およびAFLPマーカー（E05-M26 ）を含む連鎖地図を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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