(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量サンプル液に励起光を合焦し蛍光発光を検出する蛍光相関分光測定法に採用され、
複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を具備し、
前記セル本体内には、前記励起光の焦点が設定される検出領域と、
導入口から導入される前記微量サンプル液を前記検出領域に導入する導入流路及び前記検出領域から前記微量サンプル液を排出口へ排出する排出流路と、が配設され、
前記検出領域は、前記流路を拡大して成ると共に、前記励起光の光軸を囲繞する周壁が、前記励起光の光路に入らない構成とされており、
前記導入流路及び前記排出流路は各々、前記検出領域に対して、前記励起光の光軸を挟んだ両側に位置すると共に前記光軸方向に沿って離間して配設されていることを特徴とするフローセル。
【請求項２】
前記流路は、前記検出領域の励起光入射側の端面と面一を成すように前記周壁に接続され、
前記検出領域の前記流路に対する接続部は、前記励起光入射側とは反対側の位置に、前記光軸側に向かうに従い前記励起光入射側とは反対側に拡大する傾斜面を有することを特徴とする請求項１記載のフローセル。
【請求項３】
前記排出流路は、前記検出領域の前記周壁の励起光入射側とは反対側に接続され、
前記検出領域の前記排出流路に対する接続部は、前記励起光入射側の位置に、前記光軸側に向かうに従い前記励起光入射側に拡大する傾斜面を有することを特徴とする請求項１記載のフローセル。
【請求項４】
前記排出流路は、前記検出領域の前記周壁の励起光入射側とは反対側に接続され、
前記検出領域の前記排出流路に対する接続部は、前記励起光入射側の位置に、前記光軸側に向かうに従い前記励起光入射側に拡大する段差部を有することを特徴とする請求項１記載のフローセル。
【請求項５】
前記励起光入射側の平板は、他の平板に比して薄くされていることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載のフローセル。
【請求項６】
前記励起光入射側の平板側に、前記導入流路が設けられ、
前記励起光入射側の平板には、その励起光入射側の端面で前記導入流路に対応する位置に、温度制御素子が設けられていることを特徴とする請求項５記載のフローセル。
【請求項７】
前記セル本体は、前記平板を三枚積層して構成され、
両側の平板に挟まれる中間板に、当該中間板を積層方向に貫通する貫通孔が設けられて前記検出領域とされていることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載のフローセル。
【請求項８】
微量サンプル液に励起光を合焦し蛍光発光を検出する蛍光相関分光測定法に採用され、
複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を具備し、
前記セル本体内には、前記励起光の焦点が設定される検出領域と、
導入口から導入される前記微量サンプル液を前記検出領域に導入する導入流路及び前記検出領域から前記微量サンプル液を排出口へ排出する排出流路と、が配設され、
前記検出領域は、前記流路を拡大して成ると共に、前記励起光の光軸を囲繞する周壁が、前記励起光の光路に入らない構成とされており、
前記セル本体は、前記平板を三枚積層して構成され、
両側の平板に挟まれる中間板に、当該中間板を積層方向に貫通する貫通孔が設けられて前記検出領域とされていることを特徴とするフローセル。
【請求項９】
前記中間板の一方側の端面に、前記検出領域の一方側に連設される一方側の溝が設けられて前記導入流路とされると共に、
前記中間板の他方側の端面に、前記検出領域の他方側に連設される他方側の溝が設けられて前記排出流路とされていることを特徴とする請求項７または８記載のフローセル。
【請求項１０】
前記励起光入射側とは反対側の平板には、当該平板を積層方向に貫通し前記導入流路に連通する導入流路がさらに設けられ、
この導入流路の外部に対する開口が、前記導入口とされ、この導入口を上側にして前記微量サンプル液が滴下されることを特徴とする請求項７〜９の何れか一項に記載のフローセル。
【請求項１１】
前記励起光入射側とは反対側の平板には、その励起光入射側とは反対側の端面で前記検出領域に対応する位置に、前記励起光を透過すると共に前記蛍光を反射するフィルタが設けられていることを特徴とする請求項７〜１０の何れか一項に記載のフローセル。
【請求項１２】
前記導入流路は、前記中間板と、前記中間板を挟む両側の平板のうちで励起光入射側の平板との間に設けられており、前記排出流路は、前記中間板と、前記中間板を挟む両側の平板のうちで励起光入射側とは反対側の平板との間に設けられていることを特徴とする請求項７〜１１の何れか一項に記載のフローセル。
【請求項１３】
前記導入口及び前記排出口は、前記セル本体に対して励起光入射側とは反対側に設けられていることを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載のフローセル。
【請求項１４】
微量サンプル液に励起光を合焦し蛍光発光を検出する蛍光相関分光測定法に採用され、
複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を具備し、
前記セル本体内には、前記励起光の焦点が設定される検出領域と、
導入口から導入される前記微量サンプル液を前記検出領域に導入する導入流路及び前記検出領域から前記微量サンプル液を排出口へ排出する排出流路と、が配設され、
前記検出領域は、前記流路を拡大して成ると共に、前記励起光の光軸を囲繞する周壁が、前記励起光の光路に入らない構成とされており、
前記導入口及び前記排出口は、前記セル本体に対して励起光入射側とは反対側に設けられていることを特徴とするフローセル。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか一項に記載のフローセルを用い、励起光源、焦点光学系、検出部、分析部を備えた蛍光相関分光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローセル及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量分子検出法の一つである蛍光相関分光測定法には、蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy：以降単にＦＣＳと記す）や蛍光相互相関分光法（Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy：以降単にＦＣＣＳと記す）があり、ＦＣＳを用いた装置として、測定対象となる溶液をキャピラリーフロー管に流し、このキャピラリーフロー管を流れるサンプル液に励起光を合焦して極微少（ピンポイント）観察領域を設定し、蛍光分子の蛍光発光を検出することで、極微少観察領域内をブラウン運動している分子情報を得るものが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特許第３５１７２４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ここで、測定対象となる溶液が例えば貴重で量の少ない微量サンプル液の場合にあっては、微量サンプル液を無駄にしないように、上記キャピラリーフロー管を極細にする必要があるが、このように極細とすると、励起光の焦点が管内壁に接近することから管内壁の影響を受けてブラウン運動が束縛されたり、管内壁による散乱光や反射光の影響によって、検出精度が低下してしまう。特に、励起光の光路に管壁の縁部（角部）が入ってしまうと、励起光が散乱、予期せぬ屈折を生じ、検出精度が一層低下してしまう。【０００４】
本発明は、このような課題を解決するために成されたものであり、蛍光相関分光測定法に採用され、微量サンプル液を効率良く検出に供すると共に蛍光相関分光測定法の検出精度を向上するフローセル及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によるフローセルは、微量サンプル液に励起光を合焦し蛍光発光を検出する蛍光相関分光測定法に採用され、複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を具備し、セル本体内には、励起光の焦点が設定される検出領域と、導入口から導入される微量サンプル液を検出領域に導入する導入流路及び検出領域から微量サンプル液を排出口へ排出する排出流路と、が配設され、検出領域は、流路を拡大して成ると共に、励起光の光軸を囲繞する周壁が、励起光の光路に入らない構成とされていることを特徴としている。【０００６】
このようなフローセルによれば、微量サンプル液に対する励起光の焦点が設定される検出領域が、微量サンプル液の流路に対して拡大されるため、換言すれば、検出領域を除く流路が当該検出領域に対して縮小されるため、微量サンプル液が無駄無く用いられる。また、このように検出領域が流路に対して拡大されるため、検出領域と流路とを略同一の極細とする場合に比して、検出領域の内壁によるブラウン運動への影響や管内壁による散乱光や反射光の影響が低減される。また、励起光の光路に入らないように、検出領域の周壁が構成されているため、励起光の散乱、予期せぬ屈折が防止される。また、同一では無い微量サンプル液の検出の度に、導入口及び排出口を通して流路及び検出領域を洗浄すれば、複数のサンプルを収容した例えばマルチシートを用いシート替えごとに光軸調整等を行い検出していく場合に比して、スループット（単位時間当りの処理数）が向上される。【０００７】
また、本発明によれば、上記フローセルを用い、励起光源、焦点光学系、検出部、分析部を備えた蛍光相関分光測定装置を提供できる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、微量サンプル液が無駄無く用いられて効率良く検出に供され、且つ、分子のブラウン運動への影響及び管内壁による散乱光や反射光の影響が低減されると共に励起光の散乱、予期せぬ屈折が低減されて蛍光相関分光測定法の検出精度が向上され、且つ、スループットが向上されて検出コストが低減されるフローセル、及び、これを用いた蛍光相関分光測定装置を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の第１実施形態に係るフローセルを備えたＦＣＳ装置を示す概略構成図である。
【図２】図２は、図１中のフローセルを示す縦断面図である。
【図３】図３は、図２に示すフローセルの上面図である。
【図４】図４は、図３のIV−IV矢視図である。
【図５】図５は、図２に示すフローセルの検出領域及び流路の拡大図である。
【図６】図６は、図５に示すフローセルの検出領域に励起光を合焦した状態説明図である。
【図７】図７は、図２中の上板を示す上面図である。
【図８】図８は、図２中の中間板を示す上面図である。
【図９】図９は、図３中の検出領域の他の例を示す図であり上板を除いた状態で示す上面図である。
【図１０】図１０は、本発明の第２実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
【図１１】図１１は、図１０中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。
【図１２】図１２は、図１１中の検出領域の他の例を示す図である。
【図１３】図１３は、本発明の第３実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
【図１４】図１４は、図１３中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。
【図１５】図１５は、図１４中の検出領域の他の例を示す図である。
【図１６】図１６は、図１４中の検出領域のさらに他の例を示す図である。
【図１７】図１７は、本発明の第４実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
【図１８】図１８は、本発明の第５実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
【図１９】図１９は、本発明の第６実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
【図２０】図２０は、図１９中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。
【図２１】図２１は、図２０中の検出領域の他の例を示す図である。
【図２２】図２２は、本発明の第７実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。
【図２３】図２３は、本発明の第８実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
【図２４】図２４は、本発明の第９実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
【図２５】図２５は、本発明の第１０実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
【図２６】図２６は、本発明の第１１実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
【図２７】図２７は、本発明の第１２実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
【図２８】図２８は、図２７に示すフローセルの上面図である。
【図２９】図２９は、本発明の第１３実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００１０】
１…ＦＣＳ装置、１０〜２１…フローセル、３０，９０…セル本体、３１，９１…上板、３２，９２…下板、３３…中間板、３４，５０〜６１…検出領域、３４ａ…中間板の貫通孔、３４ｅ，５１ｅ〜５７ｅ…検出領域の光軸を囲繞する周壁、３５…導入口、３６，３６Ａ…排出口、３７，３７Ａ，３７Ｂ…導入流路、３７ａ…中間板の一方側の溝、３８，３８Ａ，３８Ｂ…排出流路、３８ａ…中間板の他方側の溝、５１Ｇ〜６０Ｇ，５４Ｈ，５８Ｈ，５９Ｈ，６０Ｈ…接続部、５１ｇ〜５６ｇ，５８ｇ〜６０ｇ，５４ｈ，５８ｈ，５９ｈ，６０ｈ…傾斜面、５７ｇ…段差部、８０…温度制御素子、８５…フィルタ、Ｐ…焦点、Ｒ…励起光。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明によるフローセルの好適な実施形態について図１〜図２９を参照しながら説明する。図１〜図９は、本発明の第一実施形態に係るフローセルを、以降の図１０〜図２９は、本発明の第２〜第１３実施形態に係るフローセルを各々示している。なお、各図において、同一の要素には同一符号を付し、重複する説明は省略する。先ず、第１実施形態について詳説する。図１は、本発明の第１実施形態に係るフローセルを備えた蛍光相関分光測定装置としてのＦＣＳ装置を示す概略構成図、図２は、図１中のフローセルを示す縦断面図、図３は、図２に示すフローセルの上面図、図４は、図３のIV−IV矢視図、図５は、図２に示すフローセルの検出領域及び流路の拡大図、図６は、図５に示すフローセルの検出領域に励起光を合焦した状態説明図、図７は、図２中の上板を示す上面図、図８は、図２中の中間板を示す上面図、図９は、図３中の検出領域の他の例を示す図であり上板を除いた状態で示す上面図である。【００１２】
ここで、本実施形態に用いられるＦＣＳ装置は、例えば抗原抗体反応の検出に用いられるものであり、抗原抗体反応によって分子量が大きくなることによりブラウン運動が遅くなるという性質を利用して、抗原抗体反応の有無を判定するものである。【００１３】
図１に示すように、ＦＣＳ装置１は、励起光源としてのレーザー２からの励起光を干渉フィルタ３、ダイクロイックミラー４を経由して、焦点光学系である対物レンズ５によってフローセル１０中の微量サンプル液に導き合焦して極微少（ピンポイント）観察領域を設定し、微量サンプル液中の蛍光分子からの蛍光発光を、対物レンズ５、フィルタ６、ピンホール７を通し、当該ピンホール７で焦点面以外のバックグラウンド光を取り除いてから検出部である光電子増倍管８へと導き、分析部としてのデジタル相関器９で解析する構成とされている。なお、本実施形態のＦＣＳ装置１を、抗原抗体反応の検出以外に用いることも勿論可能であるし、ＦＣＳ装置１の各構成も適宜変更可能である。例えば、フローセル１０中の微量サンプル液に励起光を導き合焦する光学系と微量サンプル液中の蛍光分子からの蛍光発光を集光する光学系は別でも良いし、検出部はアバランシェフォトダイオード等の半導体検出器でも良い。【００１４】
このＦＣＳ装置１に用いられるフローセル１０は、図２〜図４に示すように、平板を三枚積層して成るセル本体３０を備えている。図示上側の上板３１、図示下側の下板３２及びこれらの上板３１、下板３２に挟まれる中間板３３は、例えばガラス板等の透明板であり、例えば熱圧着等で重ねて固定されている。図２に示すように、上板３１及び中間板３３は、同程度の厚さ（例えば０．５ｍｍ）とされ、下板３２はこれらより薄くされ（例えば０．１５ｍｍ）、下板３２が励起光入射側となるように配置される（図６参照）。【００１５】
図２〜図６に示すように、セル本体３０内には、励起光Ｒの焦点Ｐ（図６参照）が設定される円柱空間形状の検出領域３４と、微量サンプル液をセル本体３０内に導入するための導入口３５と検出領域３４とを接続する導入流路３７と、微量サンプル液をセル本体３０外に排出するための排出口３６と検出領域３４とを接続する排出流路３８と、が設けられている。【００１６】
具体的には、上板３１には、図７に示すように、長手方向の一方の端側（図示左側）に、導入口３５を有し上下（積層方向）に貫通する貫通孔３７ｃが設けられると共に、長手方向の他方端側（図示右側）に、排出口３６を有し上下に貫通する貫通孔３８ｃが設けられている。また、中間板３３には、図８に示すように、上板３１の貫通孔３７ｃ，３８ｃの中間に対応する位置に、上下方向に貫通する貫通孔３４ａが設けられると共に、上板３１の貫通孔３７ｃと同軸位置に、上下に貫通する貫通孔３７ｂが設けられ、さらに、その下面に、貫通孔３４ａ，３７ｂの下面側に連設される下面側の溝３７ａが設けられると共に、その上面に、貫通孔３４ａの上面側に連設され上板３１の貫通孔３８ｃに対応する位置迄延びる上面側の溝３８ａが設けられている。そして、図２〜図４に示すように、これらの上板３１、中間板３３及び平板状の下板３２を積層することで、中間板３３の貫通孔３４ａが検出領域３４とされると共に、中間板３３の下面側の溝３７ａ、貫通孔３７ｂ及び上板３１の貫通孔３７ｃが導入流路３７とされ、さらに、中間板３３の上面側の溝３８ａ及び上板３１の貫通孔３８ｃが排出流路３８とされている。【００１７】
また、このように構成することで、検出領域３４の底壁３４ｄ、周壁３４ｅ及び上壁３４ｆにより検出領域３４の内壁が構成されている。また、このような構成において、導入流路３７が、検出領域３４の励起光入射側の端面である底壁３４ｄと面一を成すように周壁３４ｅに接続され、且つ、排出流路３８が、検出領域３４の励起光入射側とは反対側の端面である上壁３４ｆと面一を成すように周壁３４ｅに接続されている。【００１８】
ここで、図４及び図５に示すように、セル本体３０の長手方向をｘ方向、これに直交する水平方向をｙ方向、上下方向をｚ方向、検出領域３４のｙ方向幅をｙａ、導入流路３７及び排出流路３８のｙ方向幅をｙｂ、検出領域３４のｚ方向幅をｚａ、導入流路３７及び排出流路３８のｚ方向幅をｚｂ、検出領域３４のｘ方向幅をｘａとすると、ｙａ＞ｙｂ、ｚａ＞ｚｂ、ｘａ＞ｚｂ，ｙｂの関係を満足するように、検出領域３４、導入流路３７及び排出流路３８の大きさが設定されている。なお、本実施形態では、導入流路３７の導入端部を構成する上板３１の貫通孔３７ｃ及び中間板３３の貫通孔３７ｂ、排出流路３８の排出端部を構成する上板３１の貫通孔３８ｃを除いた部分である中間板３３の溝の大きさを、導入流路３７、排出流路３８の大きさと定義している。【００１９】
このように、本実施形態のフローセル１０にあっては、励起光Ｒの焦点Ｐが設定されると共に導入流路３７、排出流路３８を拡大して成る検出領域３４を備える構成とされている。【００２０】
ところで、対物レンズの開口数をＮＡ、溶媒の屈折率をｎ、図６に示すように焦点Ｐから距離ａ離れた位置での励起光Ｒの幅をｂとすると、幅ｂは次式で表される。【００２１】
ｂ＝２・ａ・ｔａｎ（ｓｉｎ―１（ＮＡ／ｎ））【００２２】
そして、ＮＡ＝１．１５、ｎ（水）＝１．３３、ａ＝２００μｍとすると、ｂ＝６８２μｍとなる。【００２３】
従って、本実施形態では、検出領域３４の底壁３４ｄの幅＞ｂ＝６８２μｍとされていて、検出領域３４の励起光軸を囲繞する周壁３４ｅが、励起光Ｒの光路に入らない構成とされている。【００２４】
このようなＦＣＳ装置１によれば、分注器のピペット（不図示）から微量サンプル液の液滴が導入口３５に滴下され、排出口３６に接続される吸引ポンプ（不図示）が駆動されることで、微量サンプル液は、導入流路３７を通して検出領域３４に至る。そして、当該微量サンプル液がポンプ停止により検出領域３４に停止している間、又は、検出領域３４を移動している間に、検出領域３４に励起光Ｒが合焦して蛍光が検出され、検出が終了すると、検出領域３４の微量サンプル液は、排出流路３８、排出口３６を通してフローセル１０の外部へ排出される。なお、微量サンプル液の検出ボリュームの大きさは０．２μｍ〜２０μｍが好ましい。【００２５】
この検出にあっては、検出領域３４が微量サンプル液の流路３７，３８に対して拡大されているため、言い換えれば、検出領域３４を除く流路３７，３８が当該検出領域３４に対して縮小されているため、微量サンプル液が無駄無く用いられる。このため、微量サンプル液が効率良く検出に供される。【００２６】
また、このように検出領域３４が流路３７，３８に対して拡大されているため、検出領域３４と流路３７，３８とを略同一の極細とする場合に比して、検出領域３４の内壁（底壁３４ｄ、周壁３４ｅ及び上壁３４ｆ）によるブラウン運動への影響及び同内壁による散乱光や反射光の影響が低減されると共に、励起光Ｒの光路に入らないように、検出領域３４の周壁３４ｅが構成されているため、励起光Ｒの散乱、予期せぬ屈折が防止されている。このため、ＦＣＳの検出精度が向上されている。【００２７】
また、同一では無い微量サンプル液の検出の度に、導入口３５及び排出口３６を通して流路３７，３８及び検出領域３４を洗浄するようにすれば、複数のサンプルを収容した例えばマルチシートを用いシート替えごとに光軸調整等を行い検出していく場合に比して、スループット（単位時間当りの処理数）が向上される。このため、検出コストの低減が可能とされている。【００２８】
また、対物レンズ５の開口数ＮＡは上述のように高く励起光Ｒの焦点距離は短い。これに対して、上記実施形態では、励起光入射側の平板である下板３２が、他の平板３１、３３に比して薄くされている。これにより、検出領域３４に励起光Ｒの焦点Ｐが適切に形成され、検出精度が高められている。特に、このフローセル１０は蛍光相関分光測定法に採用されるものであるため、微小領域の蛍光測定を前提として対物レンズの作動距離が短くなる場合があるが、励起光入射側の下板３２が薄い上記構成は、このようなレンズの作動距離の点に関しても有効である。【００２９】
また、導入流路３７及び排出流路３８は各々、検出領域３４に対して、励起光Ｒの光軸を挟んだ両側に位置すると共に光軸方向（ｚ方向）に沿って離間して配設されているため、微量サンプル液の検出領域３４に対する導入／排出が円滑に成される。【００３０】
また、導入口３５を上側にして微量サンプル液が滴下される構成としているため、微量サンプル液が無駄無く効率良くセル本体３０に導入される。また、導入口３５は排出口３６よりも大きくなっている。このような構成とすることも、微量サンプル液を効率良くセル本体３０に導入する上で、また、排出口３６から微量サンプル液を吸引する際に必要な吸引力を減らしたり、検出領域３４への導入時間を短縮する上でも有効である。【００３１】
また、本実施形態によるフローセル１０では、その導入口３５及び排出口３６が、セル本体３０に対して励起光入射側とは反対側（図１中の上側）に設けられている。蛍光相関分光測定法に採用されるフローセルでは、対物レンズをフローセルに対して近接させることが必要な場合がある。このような場合には、セル本体に対して励起光入射側に導入口及び排出口が設けられていると、フローセルに対して対物レンズを配置する際の妨げとなり、あるいは、対物レンズが汚染されることが考えられる。これに対して、上記のように導入口３５及び排出口３６を励起光入射側とは反対側に設ける構成によれば、フローセル１０を用いた蛍光相関分光測定を好適に行うことができる。また、図１に示したように、フローセル１０中の微量サンプル液への励起光の導光と、微量サンプル液からの蛍光発光の検出部への導光とを、フローセル１０の一方側に設けられた同一の対物レンズ５を用いて行う構成では、導入口３５及び排出口３６を励起光入射側とは反対側に設けることにより、励起光入射側と併せて蛍光発光の検出側についても同様の効果を得ることができる。【００３２】
また、上記実施形態では、セル本体３０が、平板３１〜３３を三枚積層して構成され、中間板３３に、当該中間板３３を積層方向に貫通する貫通孔３４ａが設けられて検出領域３４とされ、当該中間板３３の下面に、検出領域３４の下端側に連設される下側の溝３７ａが設けられて導入流路３７とされると共に、当該中間板３３の上面に、検出領域３４の上端側に連設される上側の溝３８ａが設けられて排出流路３８とされる構成のため、製造コストが大幅に低減されている。因みに、コストは多少上がるが、検出領域３４に連通する導入流路３７及び排出流路３８を、中間板３では無く、下板３２の上面、上板３１の下面に、光路を妨げないように、各々設けることも可能である。なお、上記したように励起光入射側の下板３２を薄くした構成では、導入流路３７は、上記した溝３７ａのように中間板３３に形成することが好ましい。【００３３】
また、図２に示すように、導入流路３７を、中間板３３と、励起光入射側の下板３２との間に設けるとともに、排出流路３８を、中間板３３と、励起光入射側とは反対側の上板３１との間に設けることが好ましい。図２に示す構成では、励起光入射側の下板３２を薄くすることが好ましいが、この場合、導入流路３７及び排出流路３８を上記のように配置することにより、排出口３６からの吸引圧が直接かかる排出流路３８が、薄い下板３２とは反対側となるので、吸引圧に対するセル本体３０の強度が向上される。なお、図２においては、具体的には、中間板３３の励起光入射側の端面である下面に導入流路３７の溝３７ａを設け、中間板３３の励起光入射側とは反対側の端面である上面に排出流路３８の溝３８ａを設けることによって上記した配置構成を実現している。【００３４】
なお、検出領域３４に代えて、図９に示すように、四角柱空間形状の検出領域５０を採用することも可能である。また、溶液を流すフロー管については、国際公開ＷＯ０２／１０３３２３号パンフレット（特表２００４−５３０８９４号公報参照）に開示されたミクロ流体システムがある。ただし、このミクロ流体システムは吸光度検出法等に適用されるものであり、蛍光相関分光測定法に採用される本発明によるフローセルとは異なるものである。【００３５】
図１０は、本発明の第２実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図、図１１は、図１０中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。この第２実施形態のフローセル１１が第１実施形態のフローセル１０と違う点は、検出領域３４に代えて、周壁５１ｅで囲まれる円柱空間形状に、導入流路３７に対する所定の接続部５１Ｇを付設して成る検出領域５１を採用した点である。【００３６】
具体的には、検出領域５１は、導入流路３７に対する接続部５１Ｇが、平面視略半円形形状を成し、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側に向かう（図示右側に向かう）に従い励起光入射側とは反対側である上側に拡大する傾斜面５１ｇを有する構成とされている。【００３７】
このような検出領域５１を有するフローセル１１によれば、第１実施形態の効果に加えて、傾斜面５１ｇにより、励起光Ｒの光路を妨げること無く検出領域５１が流路方向（図示左右方向）に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域５１に対する導入が円滑に成される。【００３８】
なお、検出領域５１に代えて、図１２に示すように、周壁５２ｅで囲まれる四角柱空間形状の導入流路３７側に、平面視長方形形状を成し励起光入射側とは反対側の位置に光軸側に向かうに従い上側に拡大する傾斜面５２ｇを有する接続部５２Ｇを付設した検出領域５２を採用することも可能である。【００３９】
図１３は、本発明の第３実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図、図１４は、図１３中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。この第３実施形態のフローセル１２が第１実施形態のフローセル１０と違う点は、検出領域３４に代えて、周壁５３ｅで囲まれる円柱空間形状に、排出流路３８に対する所定の接続部５３Ｇを付設して成る検出領域５３を採用した点である。【００４０】
具体的には、検出領域５３は、排出流路３８に対する接続部５３Ｇが、平面視略半円形形状を成し、励起光入射側の位置に、光軸側に向かう（図示左側に向かう）に従い励起光入射側である下側に拡大する傾斜面５３ｇを有する構成とされている。【００４１】
このような検出領域５３を有するフローセル１２によれば、第１実施形態の効果に加えて、傾斜面５３ｇにより、微量サンプル液の検出領域５３からの排出が円滑に成される。【００４２】
なお、検出領域５３に代えて、図１５に示すように、周壁５４ｅで囲まれる円柱空間形状の排出流路３８側に、平面視略半円形形状を成し励起光入射側の位置に光軸側に向かうに従い下側に拡大する傾斜面５４ｇを有する接続部５４Ｇと、この接続部５４Ｇの上側でさらに排出流路３８側に、平面視略半円形形状を成し励起光入射側の位置に光軸側に向かうに従い下側に異なる傾斜角で拡大する傾斜面５４ｈを有する接続部５４Ｈと、を付設して成る検出領域５４を採用することも可能である。【００４３】
また、検出領域５３に代えて、図１６に示すように、周壁５５ｅで囲まれる四角柱空間形状の排出流路３８側に、平面視長方形形状を成し励起光入射側の位置に光軸側に向かうに従い下側に拡大する傾斜面５５ｇを有する接続部５５Ｇを付設した検出領域５５を採用することも可能である。【００４４】
図１７は、本発明の第４実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。この第４実施形態のフローセル１３が第３実施形態のフローセル１２と違う点は、検出領域５３に代えて、周壁５６ｅで囲まれる円柱空間形状又は四角柱空間形状の排出流路３８側に、接続部５３Ｇとは形状が異なる接続部５６Ｇを有する検出領域５６を採用した点である。【００４５】
具体的には、検出領域５６は、排出流路３８に対する接続部５６Ｇが、平面視略半円形状又は平面視長方形形状を成し、励起光入射側の位置に、光軸側に向かう（図示左側に向かう）に従い励起光入射側である下側に拡大する傾斜面５６ｇを有する構成とされ、当該傾斜面５６ｇが、周壁５６ｅの光軸方向の略中央から傾斜する構成とされている。【００４６】
このような検出領域５６を有するフローセル１３にあっても、第３実施形態と略同様な作用・効果を奏する。【００４７】
図１８は、本発明の第５実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。この第５実施形態のフローセル１４が第４実施形態のフローセル１３と違う点は、傾斜面５６ｇを有する接続部５６Ｇを備えて成る検出領域５６に代えて、段差部５７ｇを有する接続部５７Ｇを備えて成る検出領域５７を採用した点である。【００４８】
具体的には、検出領域５７は、排出流路３８に対する接続部５７Ｇが、励起光入射側の位置に、光軸側（図示左側）に向かうに従い励起光入射側である下側に拡大する段差部５７ｇを有する構成とされている。【００４９】
このような検出領域５７を有するフローセル１４によれば、第４実施形態の効果に加えて、微量サンプル液中に気泡がある場合には当該気泡が段差部５７ｇに円滑に逃げるため、検出精度が一層高められる。【００５０】
図１９は、本発明の第６実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図、図２０は、図１９中の検出領域及び流路を上板を除いた状態で示す上面図である。この第６実施形態のフローセル１５にあっては、検出領域を構成する円柱空間形状に対して、その導入流路３７側に、平面視略半円形状を成し励起光入射側とは反対側の位置に光軸側（図示右側）に向かうに従い上側に拡大する傾斜面５８ｇを有する接続部５８Ｇが付設されると共に、その排出流路３８側に、平面視略半円形状を成し励起光入射側の位置に光軸側（図示左側）に向かうに従い下側に拡大する傾斜面５８ｈを有する接続部５８Ｈが付設されている。そして、これらの傾斜面５８ｇ，５８ｈの傾斜角は同じとされている。【００５１】
このような検出領域５８を有するフローセル１５によれば、概念的には第２実施形態と第３実施形態を組み合わせたものであるから、第２実施形態及び第３実施形態の効果、すなわち、接続部５８Ｇにより、励起光Ｒの光路を妨げること無く検出領域５８が流路方向（図示左右方向）に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域５８に対する導入が円滑に成され、且つ、接続部５８Ｈにより、微量サンプル液の検出領域５８からの排出が円滑に成される。【００５２】
なお、検出領域５８に代えて、図２１に示すように、円柱空間形状を四角柱空間形状とし当該四角柱空間形状に対して、その導入流路３７側に、平面視長方形形状を成し励起光入射側とは反対側の位置に光軸側（図示右側）に向かうに従い上側に拡大する傾斜面５９ｇを有する接続部５９Ｇを備えると共に、その排出流路３８側に、平面視長方形形状を成し励起光入射側の位置に光軸側（図示左側）に向かうに従い下側に拡大する傾斜面５９ｈを有する接続部５９Ｈを備える検出領域５９を採用することも可能である。【００５３】
図２２は、本発明の第７実施形態に係るフローセルの要部を示す縦断面図である。この第７実施形態のフローセル１６にあっては、検出領域を構成する空間形状に対して、その導入流路３７側で、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側（図示右側）に向かうに従い上側に拡大する傾斜面６０ｇを有する接続部６０Ｇが付設されると共に、その排出流路３８側で、励起光入射側の位置に、光軸側（図示左側）に向かうに従い下側に拡大する傾斜面６０ｈを有する接続部６０Ｈが付設され、傾斜面６０ｈの垂線との成す傾斜角θ２が傾斜面６０ｇの垂線との成す傾斜角θ１より大きくされている。【００５４】
このような検出領域６０によれば、傾斜角θ２が大きいため、微量サンプル液中に気泡がある場合には当該気泡が接続部６０Ｈに円滑に逃げ、第６実施形態に比して検出精度が高められている。【００５５】
図２３は、本発明の第８実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第８実施形態のフローセル１７が第１実施形態のフローセル１０と違う点は、中間板３３の上側に導入流路３７Ａを設けると共に、中間板３３の下側に排出流路３８Ａを設けた点である。【００５６】
このように構成しても、第１実施形態と同様な効果を得ることができるというのはいうまでもない。【００５７】
なお、第８実施形態に、図１０に示す第２実施形態の構成を適用する場合には、導入流路３７Ａに対する検出領域３４の接続部が、励起光入射側の位置に、光軸側（図示右側）に向かうに従い励起光入射側である下側に拡大する傾斜面を有する構成とされる。これにより、微量サンプル液の検出領域３４に対する導入が円滑に成される。【００５８】
また、第８実施形態に、図１３に示す第３実施形態、図１７に示す第４実施形態、図１８に示す第５実施形態の構成を適用する場合には、排出流路３８Ａに対する検出領域３４の接続部が、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側（図示左側）に向かうに従い励起光入射側とは反対側である上側に拡大する傾斜面又は段差面を有する構成とされる。これにより、励起光Ｒの光路を妨げること無く検出領域３４が流路方向（図示左右方向）に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域３４からの排出が円滑に成される。特に、段差部の場合には、微量サンプル液中の気泡が当該段差部に円滑に逃げ、検出精度が一層高められる。【００５９】
また、第８実施形態に、図１９に示す第６実施形態、図２２に示す第７実施形態の構成を適用する場合には、導入流路３７Ａに対する検出領域３４の接続部が、励起光入射側の位置に、光軸側（図示右側）に向かうに従い励起光入射側である下側に拡大する傾斜面を有する構成とされると共に、排出流路３８Ａに対する検出領域３４の接続部が、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側（図示左側）に向かうに従い励起光入射側とは反対側である上側に拡大する傾斜面を有する構成とされる。これにより、励起光Ｒの光路を妨げること無く検出領域３４が流路方向（図示左右方向）に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域３４からの排出が円滑に成される。特に、第７実施形態に適用する場合には、微量サンプル液中の気泡が排出流路３８Ａ側の接続部に円滑に逃げ、検出精度が一層高められる。【００６０】
図２４は、本発明の第９実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第９実施形態のフローセル１８が第８実施形態のフローセル１７と違う点は、下板３２に、排出流路３８Ａに連通する貫通孔を設けてその下面の開口を排出口３６Ａとした点である。【００６１】
このように構成しても、第８実施形態と同様な効果を得ることができるというのはいうまでもない。【００６２】
ところで、拡散定数Ｄは、分子を球と仮定すると、その半径ｒを用いてアインシュタイン・ストークス（Einstein-Stokes）の式として次式のように表される。【００６３】
Ｄ＝（ｋＢ・Ｔ）／（６π・η・ｒ）【００６４】
但し、ｋＢはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、ηは溶媒（水）の粘性である。【００６５】
このように、拡散定数Ｄは温度に比例するため、微量サンプル液を所定温度に維持するのが重要である。そこで、第１０実施形態では、温度制御素子を設ける。【００６６】
図２５は、本発明の第１０実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第１０実施形態では、第１〜第７実施形態のフローセルを利用している。具体的には、本実施形態のフローセル１９には、励起光入射側の平板側である下板３２側（中間板３３の下面又は下板３２の上面）に、導入流路３７が設けられている。【００６７】
そして、この第１０実施形態のフローセル１９が、第１〜第７実施形態のフローセル１０〜１６と違う点は、励起光入射側の平板である下板３２の下面の導入流路３７に対応し、励起光の光路に入らない位置に、例えばヒーターやペルチェ等の温度制御素子８０を設けた点である。【００６８】
このようなフローセル１９によれば、薄い下板３２を通して温度制御素子８０による導入流路３７に対する温度制御が容易とされ、微量サンプル液が素早く所定温度とされ検出精度が高められるという作用・効果が加えられる。なお、導入流路３７を蛇行させる等して流路を長くし、温度制御を一層し易くするのが好ましい。【００６９】
図２６は、本発明の第１１実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第１１実施形態のフローセル２０が、第１〜第１０実施形態のフローセル１０〜１９と違う点は、励起光入射側とは反対側の平板である上板３１の上面における検出領域３４，５０〜６０に対応する位置に、励起光Ｒを透過すると共に蛍光を反射するフィルタ８５を設けた点である。このフィルタ８５は、例えばダイクロイックミラー等より成り、例えば蒸着等により上板３１に固着されている。【００７０】
このようなフローセル２０によれば、フィルタ８５により、励起光Ｒの反射によるノイズ成分が低減されると共に蛍光が検出領域３４，５０〜６０に戻されて効率良く検出され、検出精度が高められるという作用・効果が加えられる。【００７１】
以上の実施形態では、特に好ましいとしてセル本体３０を三枚の平板３１〜３３を積層して構成しているが、以下の第１２実施形態では、セル本体が二枚の平板で構成されている。図２７は、本発明の第１２実施形態に係るフローセルを示す縦断面図、図２８は、図２７に示すフローセルの上面図である。【００７２】
この実施形態のフローセル２１は、そのセル本体９０が二枚の平板９１，９２を積層して成り、励起光入射側である下板９２が上板９１に比して薄くされている。そして、微量サンプル液の導入流路３７Ｂ及び排出流路３８Ｂ、これらの導入流路３７Ｂ及び排出流路３８Ｂを拡大して成ると共に励起光Ｒが合焦される検出領域６１は、上板９１の下面を凹設することで各々設けられている。なお、導入流路３７Ｂ及び排出流路３８Ｂは、下板９２の上面に設けることも可能である。【００７３】
このように平板が二枚であっても、ＦＣＳ装置１に適用されるフローセル２１を提供することが可能である。なお、検出領域６１の形状及びその接続部を、上記各実施形態のように構成しても勿論良い。【００７４】
図２９は、本発明の第１３実施形態に係るフローセルを示す縦断面図である。この第１３実施形態は、図２に示した第１実施形態のフローセル１０の変形例を示している。【００７５】
図２９に示すフローセル１０Ｂは、上板３１、下板３２、及び中間板３３を積層して成るセル本体３０を備えている。また、セル本体３０内には、円柱空間形状の検出領域３４と、微量サンプル液をセル本体３０内に導入するための導入口３５Ｂと検出領域３４とを接続する導入流路３７と、微量サンプル液をセル本体３０外に排出するための排出口３６Ｂと検出領域３４とを接続する排出流路３８と、が設けられている。【００７６】
具体的には、上板３１には、長手方向の一方の端側に、導入口３５Ｂを有し上下に貫通する貫通孔３７ｅが設けられると共に、長手方向の他方の端側に、排出口３６Ｂを有し上下に貫通する貫通孔３８ｅが設けられている。また、中間板３３には、上板３１の貫通孔３７ｅと同軸位置に、上下に貫通する貫通孔３７ｄが設けられ、さらに、その下面に、検出領域３４の貫通孔、及び貫通孔３７ｄの下面側に連設されて導入流路３７となる溝が設けられると共に、その上面に、検出領域３４の貫通孔の上面側に連設され上板３１の貫通孔３８ｅに対応する位置迄延びて排出流路３８となる溝が設けられている。【００７７】
また、本実施形態では、導入口３５Ｂの径ＤＡと、排出口３６Ｂの径ＤＢとがほぼ等しく（ＤＡ≒ＤＢ）設定されている。また、中間板３３の下面側の導入流路３７と、上板３１の貫通孔３７ｅとを接続する中間板３３の貫通孔３７ｄについて、その径ＤＣが、導入口３５Ｂ及び排出口３６Ｂの径よりも大きく（ＤＣ＞ＤＡ≒ＤＢ）なるように設定されている。また、中間板３３の上面側に形成されて排出流路３８となる溝は、上板３１の貫通孔３８ｅに対応する位置をやや超えて延びる溝部分３８ｄを有している。【００７８】
このように、中間板３３の貫通孔３７ｄの径ＤＣを導入口３５Ｂの径ＤＡよりも大きくすることにより、製造時における貫通孔３７ｄ、３７ｅの位置合わせが容易となる。同様に、中間板３３の上面側で排出流路３８となる溝を、上板３１の貫通孔３８ｅに対応する位置をやや超えて延びる長さとすることにより、製造時における貫通孔３８ｅの位置合わせが容易となる。また、このように位置合わせが容易な構成とした場合、貫通孔及び溝等の加工において、特別に高精度な加工方法を用いる必要がない。【００７９】
また、本実施形態においては、導入口３５Ｂの径ＤＡと排出口３６Ｂの径ＤＢとをほぼ等しく設定している。導入口３５Ｂ及び排出口３６Ｂにおいて同じ結合部材を用いるなどの場合には、このような構成としても良い。【００８０】
以上、本発明をその実施形態に基づき具体的に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、上記実施形態においては、微量サンプル液を無駄無く効率良くセル本体３０、９０に滴下するため、導入口３５をセル本体３０，９０の上面に設けているが、導入口３５をセル本体３０，９０の側面又は下面に設けるようにしても良く、排出口３６の位置も限定されるものではない。また、導入流路３７及び排出流路３８の形成についても、中間板３３のみ、または上板３１及び下板３２のみに形成する構成に限らず、どちらか一方のみを中間板３３に形成し、他方を別の板に形成する構成としても良い。【００８１】
また、上記実施形態においては、セル本体３０，９０を、三枚又は二枚の平板を積層することで構成しているが、四枚以上の平板を積層して構成することも可能である。【００８２】
また、上記実施形態においては、検出領域３４，５０〜６１の形状を、特に好適であるとして、円形断面又は四角形断面を有する形状としているが、これらの形状に限定されるものではない。【００８３】
また、上記実施形態においては、ＦＣＳに採用されるフローセル１０〜２１について述べているが、勿論ＦＣＣＳにも適用することが可能である。【００８４】
本発明によるフローセルは、微量サンプル液に励起光を合焦し蛍光発光を検出する蛍光相関分光測定法に採用され、複数枚の平板を重ねて構成されるセル本体を具備し、セル本体内には、励起光の焦点が設定される検出領域と、導入口から導入される微量サンプル液を検出領域に導入する導入流路及び検出領域から微量サンプル液を排出口へ排出する排出流路と、が配設され、検出領域は、流路を拡大して成ると共に、励起光の光軸を囲繞する周壁が、励起光の光路に入らない構成とされていることが好ましい。【００８５】
ここで、導入流路及び排出流路は各々、検出領域に対して、励起光の光軸を挟んだ両側に位置すると共に光軸方向に沿って離間して配設されていると、微量サンプル液の検出領域に対する導入／排出が円滑に成される。【００８６】
また、流路は、検出領域の励起光入射側の端面と面一を成すように周壁に接続され、検出領域の流路に対する接続部は、励起光入射側とは反対側の位置に、光軸側に向かうに従い励起光入射側とは反対側に拡大する傾斜面を有していると、この傾斜面により、励起光の光路を妨げること無く検出領域が流路方向に小さくされると共に、微量サンプル液の検出領域に対する導入／排出が円滑に成される。【００８７】
また、排出流路は、検出領域の周壁の励起光入射側とは反対側に接続され、検出領域の排出流路に対する接続部は、励起光入射側の位置に、光軸側に向かうに従い励起光入射側に拡大する傾斜面を有していると、この傾斜面により、微量サンプル液の検出領域からの排出が円滑に成される。【００８８】
また、排出流路は、検出領域の周壁の励起光入射側とは反対側に接続され、検出領域の排出流路に対する接続部は、励起光入射側の位置に、光軸側に向かうに従い励起光入射側に拡大する段差部を有していると、サンプル液中に気泡がある場合には当該気泡が段差部に円滑に逃げ、検出精度が高められる。【００８９】
ここで、対物レンズの開口数ＮＡは高く励起光の焦点距離は短いため、励起光入射側の平板は、他の平板に比して薄くされているのが好ましい。これにより、上記検出領域に励起光の焦点が適切に形成されて検出精度が高められる。【００９０】
また、励起光入射側の平板側に、導入流路が設けられ、励起光入射側の平板には、その励起光入射側の端面で導入流路に対応する位置に、温度制御素子が設けられていると、薄い平板を通して温度制御素子による導入流路に対する温度制御が容易とされ、微量サンプル液が素早く所定温度とされ検出精度が高められる。【００９１】
ここで、上記作用を効果的に奏する具体的な構成としては、セル本体は、平板を三枚積層して構成され、両側の平板に挟まれる中間板に、当該中間板を積層方向に貫通する貫通孔が設けられて検出領域とされていることが好ましい。あるいはさらに、当該中間板の一方側の端面に、検出領域の一方側に連設される一方側の溝が設けられて導入流路とされると共に、当該中間板の他方側の端面に、検出領域の他方側に連設される他方側の溝が設けられて排出流路とされる構成とすることが好ましい。このような構成を採用することで、製造コストが大幅に低減される。【００９２】
また、微量サンプル液を無駄無く効率良くセル本体に導入する構成としては、具体的には、励起光入射側とは反対側の平板には、当該平板を積層方向に貫通し上記導入流路に連通する導入流路がさらに設けられ、この導入流路の外部に対する開口が導入口とされ、この導入口を上側にして微量サンプル液が滴下される構成が挙げられる。【００９３】
また、励起光入射側とは反対側の平板には、その励起光入射側とは反対側の端面で検出領域に対応する位置に、励起光を透過すると共に蛍光を反射するフィルタが設けられていると、当該フィルタにより、励起光の反射によるノイズ成分が低減されると共に蛍光が検出領域に戻されて効率良く検出され、検出精度が高められる。【００９４】
また、上記した構成においては、導入流路は、中間板と、中間板を挟む両側の平板のうちで励起光入射側の平板との間に設けられており、排出流路は、中間板と、中間板を挟む両側の平板のうちで励起光入射側とは反対側の平板との間に設けられていることが好ましい。具体的な構成としては、例えば、中間板の励起光入射側の端面に導入流路となる溝を設け、中間板の励起光入射側とは反対側の端面に排出流路となる溝を設ける構成がある。【００９５】
また、フローセルにおいては、導入口及び排出口は、セル本体に対して励起光入射側とは反対側に設けられていることが好ましい。【００９６】
また、本発明によれば、上記フローセルを用い、励起光源、焦点光学系、検出部、分析部を備えた蛍光相関分光測定装置を提供できる。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、蛍光相関分光測定法に採用され、微量サンプル液を効率良く検出に供すると共に蛍光相関分光測定法の検出精度を向上するフローセル、及びこれを用いた蛍光相関分光測定装置として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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