(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0004550279.tif 000006
の構造を有することにより特徴づけられる化合物およびそのジアステレオマー。
【請求項２】
請求項１記載の化合物を含むレボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物を測定するための対照剤であって、該不純物が請求項１記載の化合物である対照剤。
【請求項３】
本質的にピリダジニル化合物を含まない請求項２記載の対照剤。
【請求項４】
さらに分析学的に許容し得る担体を含む請求項２記載の対照剤。
【請求項５】
本質的にピリダジニル化合物を含まない請求項４記載の対照剤。
【請求項６】
請求項１記載の化合物を対照剤として用いることを特徴とする、レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物である請求項１記載の化合物を測定するための分析方法。
【請求項７】
レボシメンダンバッチのサンプルを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物である請求項１記載の化合物を測定するための分析方法であって、請求項１記載の化合物を溶液に溶解することにより対照標準溶液を調製すること、レボシメンダンバッチのサンプルを溶液に溶解することによりテスト溶液を調製すること、該対照標準溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを得ること、該テスト溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを得ること、およびサンプル中の請求項１記載の化合物の濃度を決定することからなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
本発明は［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（Ｉ）、およびレボシメンダン合成のバッチの分析における、とくにレボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物の測定における対照化合物（reference compound）としての、その用途に関する。本発明はまた、［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（Ｉ）を対照化合物として用いる、レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物を測定するための分析方法に関する。
【０００２】
［［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリルの（−）−エナンチオマーであるレボシメンダンおよびその製造方法は、たとえばＥＰ５６５５４６Ｂ１号に記載されている。レボシメンダンは心不全の治療に有効であり、トポロニンへの顕著なカルシウム依存性結合を有する。心筋虚血の治療におけるレボシメンダンの用途はＷＯ９３／２１９２１号に記載されている。ヒトにおけるレボシメンダンの血行力学的（hymodynamic）効果は、Sundberg, S. et al., Am. J. Cardiol., 1995; 75: 1061-1066に記載されている。レボシメンダンは以下の式によって表わされる。
【０００３】
【化２】
0004550279.tif 000002
【０００４】
臨床研究で心不全患者におけるレボシメンダンの有益な効果が確認されている。
【０００５】
レボシメンダンは高純度で、ほぼ定量的に、（−）−６−（４−アミノフェニル）−５−メチル−４，５−ジヒドロ−３（２Ｈ）−ピリダジノンを亜硝酸ナトリウムおよびマロン酸ニトリルで、ＥＰ５６５５４６Ｂ１号に記載されているように処理することによって製造することができる。しかしながら、合成されたレボシメンダンのサンプルは、細菌突然変異原性試験（エームス試験）において時折潜在的遺伝毒性を示すことがわかっている。
【０００６】
［発明の要約］
今回、レボシメンダンサンプルの潜在的遺伝毒性が、式（Ｉ）のアジド誘導体不純物によって引き起こされているということがわかった。
【０００７】
【化３】
0004550279.tif 000003
【０００８】
このアジド誘導体は、レボシメンダン合成中に、細菌突然変異原性試験において陽性を示すのに充分な量が形成され得る強力な突然変異原である。［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（Ｉ）と呼ばれるこの化合物は、したがって、レボシメンダン合成のバッチの日常分析（routine analysis）において、とくにレボシメンダンバッチにおける潜在的遺伝毒性不純物の測定において対照化合物として有用である。レボシメンダンバッチ中の（Ｉ）の存在は、医薬品としての用途に適するレボシメンダン材料を得るためにさらなる再結晶が必要であることを示している。
【０００９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物を測定するための、構造（Ｉ）を有する対照化合物を提供する。本発明はまた、任意に、分析学的に許容し得る担体とともに、とくに本質的にピリダジニル誘導体を含有しない化合物（Ｉ）からなる、レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物を測定するための対照剤（reference preparation）を提供する。
【００１０】
本発明はまた、レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物の測定における対照化合物としての（Ｉ）の用途を提供する。
【００１１】
本発明はまた、レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物を測定するための分析方法であって、化合物（Ｉ）を対照化合物として用いることを特徴とし、とくに該レボシメンダンサンプルが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析されるような分析方法をも提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、レボシメンダンバッチのサンプル中の潜在的遺伝毒性不純物を測定するための分析方法であって、化合物（Ｉ）を溶液に溶解することにより対照標準溶液を調製すること、レボシメンダンバッチのサンプルを溶液に溶解することによりテスト溶液を調製すること、該対照標準溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを得ること、該テスト溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを得ること、およびサンプル中の化合物（Ｉ）の濃度を決定することからなる方法を提供する。
【００１３】
用語「分析学的に許容し得る担体」とは、本明細書において（Ｉ）の定性的または定量的分析を妨げない担体を意味する。適切な分析学的に許容し得る担体の選択は当業者に周知である。分析学的に許容し得る担体の一例は、ジメチルスルホキシドである。
【００１４】
化合物（Ｉ）は６−（４−アミノフェニル）−５−メチル−４，５−ジヒドロ−３（２Ｈ）−ピリダジノンを亜硝酸ナトリウムおよびマロン酸ニトリルで処理し、反応混合物から（Ｉ）を分離することによって製造できる。このとき、亜硝酸ナトリウムは過剰に（in molar excess）使用される。その手順は実施例１に詳細に記載する。
【００１５】
レボシメンダンバッチの生成物は、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析される。適切な装置は、たとえば３６０ｎｍでのＵＶ−検出を有するＣ−８逆相ＨＰＬＣカラムを含む。移動相は、たとえばリン酸緩衝液ｐＨ２．１およびアセトニトリルの混合液である。レボシメンダンサンプルをジメチルスルホキシド、メタノールおよび水の混合液のような適切な溶媒に溶かす。対照溶液は化合物（Ｉ）を適切な溶媒に溶かして調製する。レボシメンダンおよび化合物（Ｉ）またはそれらのジアステレオマーの保持時間は、用いたクロマトグラフィーの条件で決定される。レボシメンダンサンプル中の（Ｉ）の量は、サンプル溶液および対照溶液に対して得られるクロマトグラムを比較することによって決定される。その手順は実施例２に詳細に記載する。
【００１６】
レボシメンダンバッチ中の望ましくない不純物（Ｉ）の量は、再結晶などの当業者に既知の方法によって減少させることができる。レボシメンダンの再結晶は、好ましい溶媒であるアセトンなどの適切な溶媒から実施することができる。
【００１７】
実施例
実施例１．［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（ジアステレオマー混合物）の製造。
【００１８】
６−（４−アミノフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−メチル−３（２Ｈ）−ピリダジノン（１５３ｇ、０．７５ｍｏｌ）を酢酸（７５０ｍｌ）に溶解した。固体亜硝酸ナトリウム（２１０ｇ、３．０ｍｏｌ）を、その溶液中にゆっくりと１０〜２０℃で添加した。添加後混合物を１０〜２０℃で９０分間撹拌した。反応混合物を、２０℃のマロン酸ニトリル（１５０ｇ、２．３ｍｏｌ）および水（１５００ｍｌ）の溶液に急速に注いだ。得られた混合物を２０〜２５℃で６０分間撹拌し、ついで、ろ過し水で洗浄した。湿性の固体（wet solid）を、テトラヒドロフラン（３００ｍｌ）および酢酸エチル（１９００ｍｌ）で連続的に抽出した。合わせた抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発した。残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）で粉砕し（triturate）、ろ過し、ろ液を減圧下で蒸発した。残渣（８．０ｇ）を、溶離液としてトルエン−酢酸エチル２：１を用いたシリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製した。トルエンからの結晶化後、ジアステレオマーの純粋な混合物の収率は１．０ｇであった。混合物中の主要な成分は、トルエンからの多重結晶化によって増加させることができるが、分析学的な目的に対しては、混合物で充分である。1H-NMR(400MHz, DMSO-d6, σ)主要ジアステレオマー  1.06(d, 3H, J=6Hz), 2.55(dd, 1H, J=16Hz, 11Hz), 2.67(m, 1H), 2.78(dd, 1H, J=16Hz, 8Hz), 7.59(d, 1H, J=9Hz), 7.62(d, 1H, J=9Hz), 12.6(ブロード s, 1H), 少量ジアステレオマー 0.60(d, 3H, J=7Hz), 2.43(dd, 1H, J=18Hz, 2Hz), 2.78(m, 1H), 3,14(dd, 1H, J=8Hz, 18Hz), 7.54(d, 1H, J=9Hz), 7.61(d, 1H, J=9Hz), 12.6(ブロード s, 1H).
【００１９】
実施例２．ＨＰＬＣクロマトグラフィーにおける対照化合物としての［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（Ｉ）の用途
レボシメンダン原料における化合物（Ｉ）の分析のためのＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）法は、３６０ｎｍでのＵＶ検出を有するＣ−８逆相ＨＰＬＣカラムにもとづく。移動相はアセトニトリルおよびリン酸緩衝液ｐＨ２．１で構成された。
【００２０】
試薬：
１  メタノール、ＨＰＬＣ用
２  リン酸二水素ナトリウム、ＮａＨ2ＰＯ4×Ｈ2Ｏ、メルク社製
３  オルトリン酸、Ｈ3ＰＯ4、メルク社製
４  リン酸緩衝液  ｐＨ２．１：
水にリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）１．８ｇを溶かし、２．０ｍｌのリン酸を添加する。必要があれば、２Ｍの水酸化ナトリウムまたは１Ｍのリン酸でｐＨを調節する。水で１０００．０ｍｌに希釈。
５  ジメチルスルホキシド、ＢＤＨ
６  アセトニトリル、ＨＰＬＣ用
７  溶媒：メタノール２００ｍｌと水８００ｍｌを混合
８  ［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル対照標準
【００２１】
標準溶液（化合物（Ｉ）の対照剤）：
原液（stock solution）：［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル１０．００ｍｇを、１００ｍｌメスフラスコに入れ、ジメチルスルホキシド２０ｍｌで溶解し、メタノールで容量まで満たす。
標準溶液１（５０μｇ／ｍｌ）：原液５．００ｍｌを溶媒で１０．０ｍｌまで希釈する。
【００２２】
標準溶液２（０．４μｇ／ｍｌ＝４０ｐｐｍ）：原液１．００ｍｌを溶媒で２５０．０ｍｌまで希釈する。
定量限界溶液（０．１μｇ／ｍｌ＝１０ｐｐｍ）：５．００ｍｌの標準溶液２を溶媒で２０．０ｍｌまで希釈する。
【００２３】
テスト溶液
テストサンプル１００ｍｇを１０ｍｌメスフラスコ中で、ジメチルスルホキシド８ｍｌに溶解し、溶媒で容量まで満たす。
【００２４】
クロマトグラフィーの条件：
装置                液体クロマトグラフ
検出器              ＵＶ−ＶＩＳ、検出波長３６０ｎｍ
カラム              シンメトリーＣ８、３．０μｍ、７．５ｃｍ×４．６ｍｍ
オーブン温度        周囲（ambient）
移動相              Ａ：リン酸緩衝液  ｐＨ２．１
Ｂ：アセトニトリル
％Ｂ                  ０分  ２０％
５分  ３０％
１５分  ３０％
３０分  ９０％
流速                ０．８ｍｌ／分
注入量              １００μｌ
作動時間            ３０分
後時間（post time） １０分
保持時間            レボシメンダン  約１３分
化合物（Ｉ）主要ジアステレオマー：約２４分
化合物（Ｉ）少量ジアステレオマー：約２５分
【００２５】
システムの適性化
１  定量限界溶液の重複注入が繰り返されるべきである；
６注入、ＲＳＤ＝１０．０％
【００２６】
手法
システム適性化判定標準が満たされたのち、続けて標準およびサンプルの注入を行なう。
【００２７】
計算
ｐｐｍでの化合物（Ｉ）の主要ジアステレオマーの濃度は次式にしたがって算出される：
【００２８】
【数１】
0004550279.tif 000004
【００２９】
Ｃst＝［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル標準溶液における化合物（Ｉ）の主要ジアステレオマーの濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｒx＝テスト溶液のクロマトグラムにおける化合物（Ｉ）の主要ジアステレオマーのピーク面積
Ｒst＝［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル標準溶液のクロマトグラムにおける化合物（Ｉ）の主要ジアステレオマーのピーク面積
ｗ＝サンプル重量
１０＝サンプルの希釈因子（ｍｌ）
ｐｐｍでの化合物（Ｉ）の少量ジアステレオマーの濃度は次式にしたがって算出される。化合物（Ｉ）の主要ジアステレオマーを対照標準として用いる。
【００３０】
【数２】
0004550279.tif 000005
【００３１】
Ｃst＝［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル標準溶液における化合物（Ｉ）の少量ジアステレオマーの濃度（ｍｇ／ｍｌ）
Ｒx＝テスト溶液のクロマトグラムにおける化合物（Ｉ）の少量ジアステレオマーのピーク面積
Ｒst＝［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル標準溶液のクロマトグラムにおける化合物（Ｉ）の少量ジアステレオマーのピーク面積
ｗ＝サンプル重量
１０＝サンプルの希釈因子（ｍｌ）
１．０２３＝化合物（Ｉ）の少量ジアステレオマーに対する補正因子
【００３２】
得られた［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル標準溶液（０．４μｇ／ｍｌ）のクロマトグラムを図１に示す。化合物（Ｉ）の主要ジアステレオマーの保持時間は２５．１８０分であり、化合物（Ｉ）の少量ジアステレオマーの保持時間は２４．８６６分である。レボシメンダン原料のクロマトグラムは図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、［［４−（２−アジド−３−メチル−５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル標準（０．４μｇ／ｍｌ）のＨＰＬＣ−クロマトグラムである。
【図２】  図２は、レボシメンダン原料のＨＰＬＣ−クロマトグラムである。
【図１】
0004550279.tif 000007
【図２】
0004550279.tif 000008