(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む水性溶液中のシキミ酸の検出方法：
ａ）シキミ酸を過ヨウ素酸、又は過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸を含有する試薬で酸化する；
ｂ）強塩基を添加して発色団を生成させる；
ｃ）亜硫酸塩を添加することにより該発色団を安定化する；
ｄ）該発色団の存在を検出する；及び所望により
ｅ）該発色団の量を定量する。
【請求項２】
強塩基が水酸化ナトリウムである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウムである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
亜硫酸塩及び強塩基を含有する混合物を使用して工程ｂ）及びｃ）を同時に行なう請求項１に記載の方法。
【請求項５】
過ヨウ素酸及び過ヨウ素酸塩を含有する試薬を使用して工程ａ）を行なう請求項１に記載の方法。
【請求項６】
次の工程を含む検体試料中のシキミ酸の検出方法：
（ａ）検体試料を過ヨウ素酸、又は過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸を含有する試薬で処理する；
（ｂ）該検体試料に強塩基を添加して発色団を生成させる；
（ｃ）亜硫酸塩を添加することにより該発色団を安定化する；
（ｄ）該発色団の存在を検出する；及び所望により
（ｅ）該発色団の量を定量する。
【請求項７】
強塩基が水酸化ナトリウムである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検体試料が植物組織である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウムである請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
亜硫酸塩及び強塩基を含有する混合物を使用して工程（ｂ）及び（ｃ）を同時に行なう請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
過ヨウ素酸及び過ヨウ素酸塩を含有する試薬を使用して工程（ａ）を行なう請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、シキミ酸の検出方法、特に植物物質中のシキミ酸を検出することが可能な方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
シキミ酸は、Ｄ−グルコースから芳香族アミノ酸フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを生合成する際の重要な中間体である。
除草剤グリホセート（glyphosate）、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン、は芳香族アミノ酸の生合成を阻害し、最終的には植物中にシキミ酸を蓄積させる。グリホセートは、芳香族アミノ酸生合成経路におけるキーとなる酵素である５−エノールピルビル−シキメート−３−ホスフェート（ＥＰＳＰ）シンターゼの有力な阻害剤である。グリホセートは、最初にＥＰＳＰシンターゼの基質であるシキメート−３−ホスフェートの蓄積を生じ、次にそれが植物中で加水分解されてシキメートになる。植物中のシキミ酸の検出は、植物がグリホセートに曝されたことがあるかどうかを判定するのに使用することができ、また植物がこの除草剤に対して耐性があるかどうかを判定するのに使用することができる。
【０００３】
ガイトンド及びゴードン、J. Bio. Chem., vol 230, no. 1, p.1043-1050に記載されたシキミ酸の定量方法では、シキミ酸の溶液が過ヨウ素酸により酸化され、水酸化ナトリウムを添加して黄色の発色団を形成し、グリシンを添加して色を安定化する。つぎに、溶液に水酸化ナトリウムの添加後１０分以内に溶液の光学密度を測定する。
【０００４】
ミリカン、Methods in Enzymology, vol. 17A, p.352-353, 1970に記載されたシキミ酸の検出方法では、シキミ酸を含有する溶液が過ヨウ素酸塩により酸化され、つぎに亜ヒ酸塩で処理される。チオバルビツル酸を添加すると溶液は赤色を呈する。つぎに該溶液をシクロヘキサノンで抽出する。透明な上層のシクロヘキサノン相は赤色を呈し、このシクロヘキサノン相の光学密度を測定する。
【０００５】
シン及びシャナー、Weed Technology, vol. 12, p.527-530, 1998に記載された植物組織中のシキミ酸の検出方法では、シキミ酸を含有する検体試料が過ヨウ素酸で酸化された。つぎに、試料は水酸化ナトリウムと混合され、グリシンを添加し、光学密度が測定された。
【０００６】
シール、Herbicide Activity:Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, R.M. ロック等編集, IOS Press, 1997, p. 37-65,に記載された酵素ＤＡＨＰのアッセイ法では、該酵素はその基質ホスホエノールピルベート、及びエリスローズ−４−ホスフェートの存在下にインキュベートされる。反応は過ヨウ素酸を添加して停止される。亜硫酸ナトリウムを後に添加して過剰の過ヨウ素酸塩を還元する。つぎに、チオバルビツル酸を添加し、さらに１０分後にジメチルスルホキサイドを添加する。その後、５４９ｎｍにおける吸収を測定する。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、次の工程を含む水性溶液中のシキミ酸の検出方法を提供する：ａ）シキミ酸を過ヨウ素酸、又は過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸を含有する試薬で酸化する（過ヨウ素酸及び該試薬を合わせて本明細書では「過ヨウ素酸塩」という）；ｂ）強塩基を添加して発色団を生成させる；ｃ）亜硫酸塩を添加して該発色団を安定化させる；ｄ）該発色団の存在を検出する；及び所望によりｅ）該発色団の量を定量する。発色団の存在は、水性溶液中のシキミ酸の存在を示す。発色団の量は、水性溶液中のシキミ酸の量と直接相関する。本発明の好ましい態様では、過剰の過ヨウ素酸塩の還元と発色団の生成が同時に起るように、亜硫酸塩と強塩基を含む混合物を使用して工程ｂ）及びｃ）が同時に行なわれる。
【０００８】
本出願人は、過ヨウ素酸と過ヨウ素酸塩の使用が過ヨウ素酸単独よりも、特に室温以上の温度で酸化を行なう時に、より速い反応時間を与えることを発見した。本出願人はさらに、過剰の過ヨウ素酸及び過ヨウ素酸塩を還元するために亜硫酸塩を使用すると、シキミ酸の酸化とそれに続く強塩基の添化により生成した発色団の安定性が、大きく改善されることを発見した。
【０００９】
本出願人の方法は、また、組織、特に植物組織中のシキミ酸の検出に使用することができる。したがって、本発明の他の態様は、次の工程を含む検体試料中のシキミ酸の検出方法を提供する：（ａ）検体試料を過ヨウ素酸、又は過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸を含有する試薬で処理する；（ｂ）該検体試料に強塩基を添加して発色団を生成させる；（ｃ）該発色団を亜硫酸塩で安定化する；（ｄ）該発色団の存在を検出する；及び所望により（ｅ）該発色団の量を定量する。好ましくは、過剰の過ヨウ素酸塩の還元と発色団の生成が同時に起るように、亜硫酸塩と強塩基を含む混合物を使用して工程（ｂ）及び（ｃ）が同時に行なわれる。
【００１０】
従来のシキミ酸の検出方法とは異なり、本出願人の方法は、組織抽出物に直接使用することができる。適切な組織抽出物は、植物物質をすりつぶしたり長時間還流させることなく調製することができる。さらに、他の従来法とは異なり、本出願人の方法はより安定な発色団を生成するので、過ヨウ素酸酸化を制止した後にできる限り速く発色団の検出を行なう必要がない。本発明の方法を組織検体に直接使用できること、少なくとも１時間迄発色団の検出を延長できること、及び生成した発色団を所望により定量できることは、本発明を組織検体の高スループットスクリーニングに充分適合させるものである。
これらの及び他の本発明の特徴は、以下の本発明の詳細な説明中に記載されている。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
シキミ酸は、過ヨウ素酸によって酸化され、トランス−アコニット酸とジアルデヒドを生成する。ｐＨを１０以上に上げるのに十分な量の水酸化ナトリウムを添加して過剰の過ヨウ素酸を除去すると、静置することによって強い黄色が発色する。シキミ酸、キニン酸及びトリプトファンのみが、過ヨウ素酸で処理後、アルカリ条件下で黄色になる発色団を生成することが知られている。シキミ酸からの黄色の形成は、これは形成されたジアルデヒドの特性であるかもしれないが、シキミ酸を検出するいくつかの方法の基本である。黄色を生じる発色団は安定ではなく、数種の方法では色を安定化するためにグリシンのような化合物を採用する。本出願人は、亜硫酸塩が発色団を既知の方法よりもはるかに安定化させ、組織検体に直接使用できる方法を提供することを発見した。
【００１２】
本発明は、次の工程を含む水性溶液中のシキミ酸の検出方法を提供する：ａ）シキミ酸を過ヨウ素酸、又は過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸を含有する試薬で酸化する（合わせて本明細書では「過ヨウ素酸塩」という）；ｂ）強塩基を添加して発色団を生成させる；ｃ）亜硫酸塩を添加して該発色団を安定化させる；ｄ）該発色団の存在を検出する；及び所望によりｅ）該発色団の量を定量する。発色団の存在は、水性溶液中のシキミ酸の存在を示す。発色団の量は、水性溶液中のシキミ酸の量と直接相関する。該水性溶液は、例えば標準を作製するために水性溶液に既知量のシキミ酸を添加したときのように、シキミ酸を含有することが既知であり、又は検体試料のようにシキミ酸を含有することが疑われる。
【００１３】
植物中のシキミ酸の検出は、植物が除草剤グリホセートに曝されたことがあるかどうかを判定するのに使用することができ、また植物がこの除草剤に対して耐性があるかどうかを判定するのに使用することができる。したがって、本発明の方法は、シキミ酸の検出及び／又は定量が必要である状況下で有用となる。例えば、本発明の方法は、植物或いは植物組織又は細胞が除草剤グリホセートに耐性であるかを判定するスクリーニングに使用することができ、或いは収穫植物がグリホセートに曝されたことがあるかを判定する試験に使用することができる。
【００１４】
本発明の方法は、水性溶液中で都合よく実施される。水性溶液は、水又は水と水混和性の有機溶媒の混合物であってよい。本発明の方法は、植物、動物及び微生物組織を含む種々のタイプの組織に好適に使用される。好ましくは、組織は植物組織である。組織試料が使用されるときには、最初にシキミ酸を水と水混和性の有機溶媒の溶液のような、適当な溶媒中に抽出することが必要であり、つぎに必要な場合には、得られた溶液の不純物を取り除く。
【００１５】
シキミ酸は、あらゆる適切な方法を使用して、組織から抽出することができる。本出願人は、シキミ酸は室温で、水及び水混和性の有機溶媒を含む溶液を使用して植物組織から容易に、かつ定量的に抽出できることを発見した。好ましくは、植物組織はあらかじめ約−４℃以下で凍結しておく。組織からシキミ酸を抽出するのに使用される溶液は、塩基性又は酸性のｐＨを有してよい。水混和性の有機溶媒は、シキミ酸がそれに溶解するどのような溶媒でもよいが、好ましくは低分子量アルコール、より好ましくはイソプロパノールである。組織は、全ての又は十分な量のシキミ酸が抽出されるまで、抽出溶液中でインキュベートされる。抽出は、一般に約２４時間後に完了するが、しかし通常は１６〜２４時間後に、又はより短時間で完了する。
【００１６】
シキミ酸を抽出するのに好ましい溶液は、０．０５Mアルカリ金属水酸化物（水中）とイソプロパノールの２：１（容量：容量）の混合物である。好ましくは、アルカリ金属水酸化物は水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。
【００１７】
植物組織からシキミ酸を抽出する好ましい方法では、約−４℃以下で凍結された組織が小片に切断され、十分な量の０．０５M水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム（水中）とイソプロパノールの２：１（容量：容量）の混合物中に浸漬される。一般に、利便性のために、植物組織各０．１gに対して１ｍLの抽出混合物が使用されるが、他の抽出混合物：組織の比率もまた使用できる。抽出は、これ以上シキミ酸が溶液中に抽出されなくなるまで、室温で進められる。多数の植物組織中のシキミ酸が、この方法により１６〜２２時間で完全に抽出される。
【００１８】
つぎに、抽出物の分画について、追加の操作を行わずに本発明の方法に従ってシキミ酸の存在を分析して、この工程を多数の試料の分析に都合のよいものとする。例えば、組織抽出は９６ウエル、又は同様のプラスチック板中で少量の植物組織について行うことができ、そこから自動化試料操作装置を使用して分画を取り出し、吸収の測定と植物試料中のシキミ酸の定量を行うことができる。
【００１９】
シキミ酸の酸化は、過ヨウ素酸、又は過ヨウ素酸及び過ヨウ素酸塩を含む試薬（過ヨウ素酸塩試薬）を使用して行うことができる。ここでは容易に参照できるように、過ヨウ素酸及び過ヨウ素酸と過ヨウ素酸塩を含む試薬を、一般に、過ヨウ素酸塩という。好ましくは、過ヨウ素酸及び過ヨウ素酸塩を１：１の比で含む試薬が酸化に使用される。この試薬は、水中で０．５％（重量／容量）の過ヨウ素酸及び０．５％（重量／容量）のナトリウムメタ−過ヨウ素酸塩が含まれるように調製される。過ヨウ素酸塩は、シキミ酸を含有するか、又は含有すると思われる水性溶液中に添加される。既知の又は存在すると思われる量の水性溶液中のシキミ酸に対して実質的にモル比で過剰の過ヨウ素酸塩が存在するように、十分な量の過ヨウ素酸塩を水性溶液に添加する。
【００２０】
シキミ酸の酸化は、室温で又はより高温で行うことができる。好ましくは、酸化は２５〜６５℃、より好ましくは３５〜５０℃の温度で行われる。本出願人は、シキミ酸の酸化は３７℃で約３０〜４５分後に完了することを発見した。酸化が室温で行われるときには、酸化に約３時間を要する。
【００２１】
シキミ酸の酸化は、水性溶液に強塩基を添加することによって停止又は制止され、発色団が生成し、そして過剰の過ヨウ素酸塩を還元するために亜硫酸塩が添加されて、発色団を安定化する。好ましくは、反応の制止と発色団の安定化を同時に行うために、水性溶液に強塩基と亜硫酸塩を含む混合物が添加される。しかしながら、塩基と新たに調製した亜硫酸塩溶液を別々に添加することによって、この工程を遂行してもよい。
【００２２】
好ましくは、塩基は水酸化物のような強塩基であり、より好ましくは塩基は水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物であり、最も好ましくは水酸化ナトリウムである。水性溶液ｐＨ１０以上、好ましくは１１以上のアルカリ性とするのに十分な量の塩基が添加される。好ましくは、塩基は水又は他の溶媒と混合され、より好ましくは塩基と水の混合物が本発明の方法に使用される。水性溶液に塩基及び亜硫酸塩を添加すると安定化された発色団が生成し、その存在は塩基及び亜硫酸塩の添加後約１時間までの間に水性溶液中で検出することができる。
【００２３】
亜硫酸塩は、分離して又は強塩基との混合物として、過ヨウ素酸塩酸化反応の完了後に強塩基の添加により生成した発色団を安定化させるのに十分な量で、水性溶液に添加される。亜硫酸塩は、少なくともモル比基準で過ヨウ素酸塩よりも多量の亜硫酸塩が存在するように水性溶液に添加される。過剰の亜硫酸塩は、本発明の方法を妨害しない。ナトリウム塩又はカリウム塩のような、あらゆる可溶性の亜硫酸塩が本発明の方法に使用することができるが、より好ましくは亜硫酸塩は亜硫酸ナトリウムである。好ましくは、亜硫酸塩は水又は他の溶媒と混合され、より好ましくは亜硫酸塩と水の混合物が本発明の方法に使用される。
【００２４】
水性溶液中の発色団の存在は、シキミ酸の存在を示すが、分光光度計を使用して３８２ｎｍにおける光学密度を測定するか、又は水性溶液の黄色を目視により確認する等の、あらゆる適当な方法によって検出できる。所望により、検体試料中の発色団の量は定量することができ、その際に水性溶液中のシキミ酸の量が得られる。定量は既知量のシキミ酸を使用し本発明の方法により調製したシキミ酸スタンダードと比較する等の、あらゆる適切な方法によって行うことができる。本発明の好ましい態様では、分光光度計を使用して３８２ｎｍにおける水性溶液の光学密度を測定し、既知量のシキミ酸を使用して分光光度計により３８２ｎｍにおける測定により調製したシキミ酸スタンダードとの比較によって、発色団を定量する。
【００２５】
本発明の方法によって発色団を検出するにあたって、発色団の分光光度計測定により最良の結果を得るためには、未処理対照用植物検体試料に対して少なくとも０．０５吸収単位（ＡＵ）の吸収を有し、最大量のシキミ酸／シキミ酸塩を含有する検体試料に対して２．０ＡＵよりも小さい吸収を有することが好ましい。本出願人は、致死量のグリホセートで処理された殆どの植物は、シキミ酸／シキミ酸塩を次のようなレベルに蓄積していたことを発見した。約１５０ｍｇの葉組織を８倍（ｗ／ｖ）の０．２５Ｎ塩化水素酸中ですりつぶして調製した５〜１０μＬの水性溶液を、２５０μＬの過ヨウ素酸塩試薬に添加し水を加えて０．５ｍＬの量とした。過ヨウ素酸塩試薬との反応後、亜硫酸塩及び水酸化ナトリウムを含有する混合物０．５ｍＬにより反応を制止すると、約１．８ＡＵの吸収を有する溶液１ｍｌが得られた。一方、未処理の対照用植物は、０．１ＡＵの吸収を与えた。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、本発明の方法は、植物組織の酸性水性抽出物中のシキミ酸の存在及び／又はレベルを検出するのに使用される。本発明のこの態様では、組織の検体試料、好ましくは本明細書の記載にしたがって調製された植物組織の水性溶液を含む検体試料が、シキミ酸を酸化するために、過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩及び過ヨウ素酸を含む試薬で処理される。強塩基を検体試料に添加して発色団を生成させ、この発色団を亜硫酸塩で安定化させる。つぎに、検体試料中のシキミ酸の存在を示す、発色団の存在を検出する。所望により、検体試料中の発色団の量が定量され、検体試料中のシキミ酸の量が得られる。
【００２７】
発色団の検出及び／又は定量を少なくとも約１時間まで延長できること、及び追加の操作を必要とせずに組織抽出物を使用できることによって、本発明の方法は高スループットスクリーニングや多数の試料が試験される他の機会に好適に用いられるものとなる。
【００２８】
例えば、組織抽出は９６ウエル、又は同様のプラスチック板中で少量の植物組織について行うことができ、そこから自動化試料操作装置を使用して分画を取り出して吸収を測定し、シキミ酸スタンダードと吸収を比較することによって植物試料中のシキミ酸の定量を行うことができる。
【００２９】
（実施例）
実施例１：試薬のバックグラウンド吸収
水２５０μｌ、過ヨウ素酸塩試薬２５０μｌ、１Ｎ  ＮａＯＨ０．３ｍｌ及び０．０５６Ｍ  Ｎａ２ＳＯ３０．２ｍｌを混合し、３８２ｎｍにおける吸収を測定した。吸収は０．０４７であり、５分間以上顕著な移動は示さなかった。亜硫酸ナトリウムの０．０５６Mという濃度は、添加した過ヨウ素酸塩と等モルとなるように選択された。
過ヨウ素酸塩試薬は、水中で０．５重量％の過ヨウ素酸と０．５重量％のナトリウムメタ−過ヨウ素酸塩が含まれるように調製した。
【００３０】
実施例２：シキミ酸の検出
２ｍＭシキミ酸試料１０μｌを２４０μｌの水に添加した。つぎに、過ヨウ素酸塩試薬２５０μｌを加えた。３７℃で３０分後に、ａ）１Ｎ  ＮａＯＨ０．３ｍｌ及びその後で０．０５６Ｍ  Ｎａ２ＳＯ３０．２ｍｌにより、又はｂ）１Ｎ  ＮａＯＨ０．３ｍｌ及び０．０５６Ｍ  Ｎａ２ＳＯ３０．２ｍｌを混合することによって調製した混合溶液（以下、「混合溶液」という）０．５ｍｌにより反応を制止した。３８２ｎｍにおける溶液の吸収（Ａ）を直ちに測定し、その後室温で５分、３０分及び６０分放置した後に測定した。表１に示した３検体から得られた平均値は、添加したシキミ酸の存在により３８２ｎｍにおける吸収が増加することを示す。
【００３１】
0004410946.tif 000002
【００３２】
塩基添加後Ｎａ２ＳＯ３ を添加した場合には、発色団は３０分以上優れた安定性を示し、６０分後にわずか約３％の吸収の損失を示した。一方、混合溶液を添加した場合には、感度がわずかに上昇するとともに同様の安定性を示した。混合溶液は、室温で約１２時間安定であったが、さらに試験をすればより長時間安定であることが判明するであろう。
【００３３】
（検量線の調製）
表２に示した各量の２ｍＭシキミ酸をポリプロピレン製の１．５ｍｌマイクロ試験管に入れ、水を加えて２５０μｌとした。つぎに、過ヨウ素酸塩試薬２５０μｌを添加後、試験管を３７℃に３０分間維持し、その時にＮａＯＨ／亜硫酸塩混合試薬０．５ｍｌを加えた。得られた各溶液について３８２ｎｍにおける吸収を５分以内に測定し、２検体についての平均値を表２の第２欄に示した。
【００３４】
0004410946.tif 000003
【００３５】
ロリウムペレネ（Lolium Perrenne）を温室の土中で植物が３〜４枚の葉を付けるまで２〜３週間成長させた。植物の空気中に出た部分を収穫し、直ちに−８０℃に維持した冷凍庫に入れた。植物抽出物を調製するために、組織約１ｇの試料を溶解し秤量した。組織は液体Ｎ２  中で凍結し、乳鉢と乳棒を使用して微粉末になるまですりつぶした。つぎに、組織重量の４倍にあたる０．２５Ｎ  ＨＣｌを添加し、スラリーをさらに５分間すりつぶした。この物質を２５，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄液をピペットで取り出し琥珀色のガラスバイアル中に保存した。
【００３６】
各試験管に未処理のロリウム抽出物５μｌを添加した以外は、検量線を調製するのに使用した方法を繰り返した。結果を表２の第３欄に示した。もしこれらのデータが吸収対添加シキミ酸としてプロットされたならば、２本の平行な直線が得られる。シキミ酸塩のみを試験したデータは、このアッセイ方法が少なくとも約１．２５の吸収までは、存在するシキミ酸塩と３８２ｎｍにおける吸収が直接の相関関係を有することを示す。シキミ酸塩とともに植物抽出物を添加した試験のデータは、未処理のロリウムペレネが少量のシキミ酸塩を含有すること、及び植物抽出物の添加はシキミ酸塩についての本化学アッセイ法を妨害しないことを示す。