(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）の塩基配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】
下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【請求項４】
前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項３に記載の組み換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【請求項６】
前記細胞は、エシェリヒア  コリに由来することを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項５または６に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項８】
下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
（ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項９】
前記タンパク質は、少なくともＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに対して作用することを特徴とする請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造するＮ−カルバミルアミノ酸製造工程と、を含むことを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させて光学活性アミノ酸を製造する光学活性アミノ酸製造工程と、
を含むことを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項１２】
光学活性アミノ酸がＬ−アミノ酸である、請求項１１記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項１３】
Ｎ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素が、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１１または１２記載の光学活性アミノ酸の製造方法。
（ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
（ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項１４】
請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造するタンパク質製造工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、ＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに作用させて光学活性チロシンを製造する光学活性チロシン製造工程と、
を含むことを特徴とする光学活性チロシンの製造方法。
【請求項１５】
光学活性チロシンがＬ−チロシンである、請求項１４記載の光学活性チロシンの製造方法。
【請求項１６】
Ｎ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素が、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１４または１５記載の光学活性チロシンの製造方法。
（ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
（ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法によって製造された光学活性アミノ酸を回収することを特徴とする光学活性Ｎ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法を用いて製造される光学活性Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的または酵素的にアミノ酸に変換させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡに関し、特に、Ｌ−チロシンに代表される光学活性アミノ酸の製造に好適に利用できるヒダントイナーゼをコードするＤＮＡ、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、形質転換された細胞、タンパク質の製造方法および光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素を用いたアミノ酸製法の一つとして、化学的に安価に合成される５置換ヒダントイン化合物を出発物質として、これを光学活性なアミノ酸に不斉分解する方法が知られている。この５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に重要な方法である。
【０００３】
この５置換ヒダントイン化合物からアミノ酸を製造する方法では、以下の▲１▼、▲２▼の酵素が必要である。
▲１▼５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素（ヒダントイナーゼ）。
▲２▼生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒する酵素（Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ）。
【０００４】
また、５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、上記▲１▼ヒダントイナーゼおよび▲２▼Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。
【０００５】
例えば、Ｄ−アミノ酸生産菌または当該菌が産生する酵素含有物を用いてＤ体アミノ酸を製造する方法として、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌を用いる方法（特公昭５６−００３０３４号公報）、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属細菌を用いる方法（特開平０３−０１９６９６号公報）等が知られている。これらのＤ−アミノ酸生産菌では、一般的に、そのヒダントイナーゼ活性がＤ体の５置換ヒダントインに対して特異的であることが多く、ＤＬ−５置換ヒダントインを出発物質とした場合、下記反応式（I）に示すように、Ｄ体のみが加水分解されてＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸となり、さらに加水分解されて最終的にＤ体のアミノ酸のみが得られる。
【０００６】
【化１】
0004529338.tif 000002
【０００７】
また、Ｌ−アミノ酸生産菌または当該菌が産生する酵素含有物を用いてＬ体アミノ酸を製造する方法としては、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属細菌を用いる方法（特公昭５４−００８７４９号公報）、バチルス(Bacillus)属細菌を用いる方法（特開昭６３−０２４８９５号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌を用いる方法（特開平１−０７１４７６号公報）、アースロバクター(Arthrobacter)属細菌を用いる方法（J.Biotechnol. ４６巻、６３ページ、１９９６年）等が報告されている。これらのＬ−アミノ酸生産菌においては、Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ活性がＬ体特異的であることが多い。したがって、ＤＬ−５置換ヒダントインを出発物質とした場合、下記反応式（II）に示すように、Ｄ体およびＬ体の両方が加水分解されてＮ−カルバミル−ＤＬ−アミノ酸となるが、Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を選択的に加水分解するので、最終的にＬ−アミノ酸のみが得られる。
【０００８】
【化２】
0004529338.tif 000003
【０００９】
さらに、上記Ｌ−アミノ酸生成菌のうち、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属細菌からはヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼが部分精製され、ヒダントイナーゼに関してはＤ体、Ｌ体いずれの５置換ヒダントイン化合物にも作用し得ることが知られている（Agric.Biol.Chem.  ５１巻、７３７ページ、１９８７年）。
しかしながら、該酵素精製は部分精製であって、単一の酵素による作用か否かは不明瞭であり、フラボバクテリウム由来のヒダントイナーゼのアミノ酸配列やコードする遺伝子の塩基配列については不明であった。
【００１０】
一方、アースロバクター(Arthrobacter)属細菌からはヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子が単離されており、該遺伝子を用いて作製した組換え体によってＬ−アミノ酸の製造が可能であることが知られている。しかしながら、アースロバクター属細菌由来のヒダントイナーゼはＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインには作用しないため、ＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインからのＬ−チロシンの製造には用いることが出来ない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、光学活性アミノ酸を効率良く製造するためには、ヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を単離し、遺伝子増幅、転写および翻訳活性を高めることによってこの酵素の生産量を高めた組換え体を用いることが好ましい。しかしながら、チロシンの出発原料であるＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに作用するヒダントイナーゼが単離されたという報告はなく、Ｌ−チロシンに代表される光学活性アミノ酸の合成に幅広く利用できるヒダントイナーゼを、組換え体を作製して効率良く製造することはできないという問題点がある。
【００１２】
また、Ｌ−アミノ酸生成菌の培養菌体を用いて５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造することも可能であるが、この場合には、反応に必要な酵素の生産量を増加させるため、ヒダントイン誘導体等の誘導物質を使用したり、培養菌体を大量に使用する必要があるなどの問題点がある。
【００１３】
本発明は上述の問題点を解決するために成されたものであり、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインをＬ−チロシンに変換する能力を持つ微生物よりヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を単離して、そのアミノ酸配列やコードする遺伝子の塩基配列を解明するとともに、該酵素の生産量を高めた組換え体を作製し、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに代表される５置換ヒダントインから、Ｌ−チロシンに代表される光学活性アミノ酸を効率良く製造する方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記問題に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインをＬ−チロシンに変換する能力を持つ微生物よりヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を単離することに成功し、本発明に想到した。
【００１５】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
【００１６】
（請求項１）  下記(a)または(b)の塩基配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００１７】
（請求項２）  下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００１８】
（請求項３）  請求項１または２に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【００１９】
（請求項４）  前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項３に記載の組み換えＤＮＡ。
【００２０】
（請求項５）  請求項３または４に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００２１】
（請求項６）  前記細胞は、エシェリヒア  コリに由来することを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【００２２】
（請求項７）  請求項５または６に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【００２３】
（請求項８）  下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質。
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００２４】
（請求項９）  前記タンパク質は、少なくともＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに対して作用することを特徴とする請求項８に記載のタンパク質。
【００２５】
（請求項１０）  請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造する工程と、
を含むことを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
【００２６】
（請求項１１）  請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させて光学活性アミノ酸を製造する工程と、
を含むことを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【００２７】
（請求項１２）  請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、ＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに作用させて光学活性チロシンを製造する工程と、
を含むことを特徴とする光学活性チロシンの製造方法。
【００２８】
（請求項１３）  下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列
(b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００２９】
（請求項１４）  下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００３０】
（請求項１５）  請求項１３または１４に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【００３１】
（請求項１６）  前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項１５に記載の組み換えＤＮＡ。
【００３２】
（請求項１７）  請求項１５または１６に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００３３】
（請求項１８）  前記細胞は、エシェリヒア  コリに由来することを特徴とする請求項１７に記載の細胞。
【００３４】
（請求項１９）  請求項１７または１８に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【００３５】
（請求項２０）  下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質。
(c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００３６】
（請求項２１）  請求項１９に記載の製造方法を用いてＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
前記Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸に作用させてＬ−アミノ酸を製造する工程と、
を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【００３７】
（請求項２２）  請求項１９に記載の製造方法を用いてＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
前記Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質および５置換ヒダントインを加水分解する酵素または当該酵素含有物を５置換ヒダントインに作用させてＬ−アミノ酸を製造する工程と、
を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【００３８】
（請求項２３）   請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
請求項１９に記載の製造方法を用いてＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質および前記Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を５置換ヒダントインに作用させて、Ｌ−アミノ酸を製造する工程と、
を含むことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【００３９】
（請求項２４）   請求項７に記載の製造方法を用いてヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
請求項１９に記載の製造方法を用いてＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質を製造する工程と、
前記ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質および前記Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに作用させてＬ−チロシンを製造する工程と、
を含むことを特徴とするＬ−チロシンの製造方法。
【００４０】
（請求項２５）  請求項１１、１２および２２〜２４のいずれかに記載の方法によって生産される光学活性アミノ酸を回収することを特徴とする光学活性Ｎ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
【００４１】
（請求項２６）  請求項２５に記載の方法を用いて製造される光学活性Ｎ−カルバミルアミノ酸を化学的または酵素的にアミノ酸へと変換させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【００４２】
（請求項２７）  下記(a)または(b)の塩基配列を有し、Ｌ−アミノ酸の製造に係わるタンパク質をコードする構造遺伝子群。
(a)配列表配列番号５に記載の塩基配列
(b)配列表配列番号５に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００４３】
（請求項２８）  請求項２７に記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【００４４】
（請求項２９）  請求項２８に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００４５】
（請求項３０）  請求項２９に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＬ−アミノ酸の製造に係わる混成タンパク質を蓄積させ、該混成タンパク質を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造に係わる混成タンパク質の製造方法。
【００４６】
（請求項３１）  請求項３０に記載の製造方法を用いてＬ−アミノ酸の製造に係わる混成タンパク質を製造する工程と、
前記Ｌ−アミノ酸の製造に係わる混成タンパク質を５置換ヒダントインに作用させる工程と、
を含むことを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【００４７】
（請求項３２）  請求項３０に記載の製造方法を用いてＬ−アミノ酸の製造に係わる混成タンパク質を製造する工程と、
前記Ｌ−アミノ酸の製造に係わる混成タンパク質を、ＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに作用させる工程と、
を含むことを特徴とする光学活性チロシンの製造方法。
【００４８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、
[I]ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
[II]ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法
[III]光学活性アミノ酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
なお、本明細書においては、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をヒダントイナーゼと呼ぶことがあり、Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼと呼ぶことがある。
【００４９】
[I]ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡ
本発明のヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡは、特願２０００−２７８５７１号に記載のオーレオバクテリウム  リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）のヒダントインラセマーゼおよびそのＤＮＡに関する研究の過程で取得されたものである。なお、フラボバクテリウム  エスピー  ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）は１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であるが、再同定の結果、オーレオバクテリウム  リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens）に分類されることが判明した。現在では、種名変更により、オーレオバクテリウムリクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens）はマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）に分類され、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６４３、国際寄託移管日２００１年６月２７日）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００５０】
マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）について、細菌の分類学書であるバージェーズ  マニュアル  オブ  デターミネイティブ  バクテリオロジー  第１巻（第９版  1994年、ウイリアム  アンド  ウイルキンス社出版）に照らしあわせて生理性状試験を実施した試験結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
0004529338.tif 000004
【００５２】
また、本発明者らは、特願２０００−２７８５７１号に記載のオーレオバクテリウム  リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）のヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離の際、同時に得られたヒダントインラセマーゼ遺伝子下流の塩基配列がヒダントイナーゼ遺伝子の一部であると予想し、該ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、プローブとして利用することにより、当該菌株の遺伝子ライブラリーから本発明のヒダントイナーゼ遺伝子の全長の単離・取得に成功した。同様に、本発明のヒダントイナーゼ遺伝子の単離の際、ヒダントイナーゼ遺伝子下流の塩基配列がＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子の一部であると予想し、該ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、プローブとして利用することにより、本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子の全長の単離・取得に成功した。
【００５３】
すなわち、図１に示すように、本発明のヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子は、ヒダントインラセマーゼ遺伝子下流に存在し、ヒダントインラセマーゼ遺伝子とともにオペロンを形成していると考えられる。図１中、▲１▼はＥｃｏＲ Ｉ／Ｐｓｔ Ｉ断片であり、▲２▼はＫｐｎＩ／Ｓａｃ Ｉ断片であり、▲３▼はＢｇｌ ＩＩの切断物である。
【００５４】
なお、遺伝子の単離の際に用いたＰＣＲ法の操作については、White, T.J. etal., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されている。また、染色体ＤＮＡを調製する方法や、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【００５５】
さらに、単離されたヒダントイナーゼ若しくはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985)等に記載されている。また、Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。
【００５６】
なお、添付した本発明の配列表において、上記方法によって特定されたヒダントイナーゼをコードするＤＮＡを配列番号１に示し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡを配列番号３に示す。また、ヒダントインラセマーゼ遺伝子、ヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を含む構造遺伝子群をコードするＤＮＡを配列番号５に示す。
【００５７】
これらのＤＮＡは、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、いずれもＬ−アミノ酸の製造に係わるタンパク質をコードするものである。
【００５８】
また、配列表の配列番号２に、配列表の配列番号１の塩基配列がコードするヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列表の配列番号４に、配列表の配列番号３の塩基配列がコードするＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。さらに、配列表の配列番号６に、配列番号５に記載の構造遺伝子群に含まれるヒダントインラセマーゼ遺伝子がコードするヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列（特願２０００−２７８５７１号に記載のヒダントインラセマーゼ）を示す。
【００５９】
配列表の配列番号２に記載のヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質および配列表の配列番号４に記載のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質は、下記反応式（III）に示すように、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに代表される５置換ヒダントインから、Ｌ−チロシンに代表される光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒する。
【００６０】
【化３】
0004529338.tif 000005
【００６１】
次に、本発明のヒダントイナーゼをコードするＤＮＡおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡについて詳細に説明する。
【００６２】
(1)ヒダントイナーゼをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のヒダントイナーゼ遺伝子は、前述したようにマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知のアースロバクター(Arthrobacter)属細菌由来のヒダントイナーゼ遺伝子（J.Biotechnol.８０巻、２１７ページ、２０００年）と７９％（アミノ酸配列において８５％）の相同性を示し、既知のシュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のヒダントイナーゼ遺伝子（J.Bacteriol.１７４巻、９６２ページ、１９９２年）と４４％（アミノ酸配列において１７％）の相同性を示す。
ここで、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡがコードするタンパク質は、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに対してヒダントイナーゼ活性を有することを特徴とする。したがって、Ｌ−チロシンに代表される光学活性アミノ酸の製造に好適に利用できる。
【００６３】
また、本発明のヒダントイナーゼをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号１に示されるＤＮＡだけではない。すなわち、マイクロバクテリウム属、フラボバクテリウム属に属する細菌の種や株ごとに塩基配列の違いが観察される。
【００６４】
なお、本発明のＤＮＡは単離されたヒダントイナーゼをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、単離されたヒダントイナーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであっても、ヒダントイナーゼをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method in Enzymol.,154 (1987)等に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００６５】
また、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。また、「ヒダントイナーゼ活性」とは、５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによってＮ−カルバミルアミノ酸を生成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００６６】
さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡがコードするヒダントイナーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわち、
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡである。
【００６７】
なお、上記（a）または（b）のアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、ＤＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。また、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。「ヒダントイナーゼ活性」とは、５置換ヒダントイン化合物を加水分解することによってＮ−カルバミルアミノ酸を生成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００６８】
(2)Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡ
次に、本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡについて説明する。配列表の配列番号３の塩基配列を有する本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼは、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、既知のアースロバクター(Arthrobacter)属細菌由来のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子（J.Biotechnol.６８巻、１０１ページ、１９９９年）と７４．２％（アミノ酸配列において８１％）の相同性を示す。また、既知のシュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子（J.Bacteriol.１７４巻、９６２ページ、１９９２年）と４７％（アミノ酸配列において３９％）の相同性を示す。
【００６９】
なお、本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡは、配列表の配列番号３に示されるＤＮＡだけではない。すなわち、マイクロバクテリウム属、フラボバクテリウム属に属する細菌の種および株ごとに塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
【００７０】
また、単離されたＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡに人工的に変異が加えられたＤＮＡであっても、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method in Enzymol.,１５４ (１９８７)等に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００７１】
また、配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。また、「Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性」とは、Ｎ−カルバミルアミノ酸を加水分解することによってＬ−アミノ酸を生成する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００７２】
また、上記ＤＮＡがコードするＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわち、
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡである。
【００７３】
なお、上記（a）または（b）のアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、ＤＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
【００７４】
ここで、「数個」とは、タンパク質の立体構造や酵素活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。「Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性」とは、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を加水分解することによってＬ−アミノ酸を生成する活性であればいかなるものでもよい。ただし、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列においてかかる置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むタンパク質の場合には、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００７５】
[II]  ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの製造方法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを製造する方法について説明する。なお、組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００７６】
図２は、本発明のヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの製造工程のフローチャートである。
先ず、本発明のヒダントイナーゼ遺伝子および／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。
次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを生成蓄積させる(ステップＳ４)。
その後、ステップＳ５に進み、該酵素を回収・精製することによってヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを大量生産する。
また、ステップＳ５で生産した酵素またはステップＳ４の酵素が蓄積された培地を用いてアミノ酸を合成することで、目的とするアミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ６)。
【００７７】
なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡは、本発明のヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼが発現可能であればよい。
【００７８】
ここで、ベクターＤＮＡに接続されるヒダントイナーゼ遺伝子としては、上述の
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
などを使用できる。
【００７９】
また、ベクターＤＮＡと接続されるＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子としては、
(a)配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
(b)配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ
(c)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
(d)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
などを使用できる。
【００８０】
さらに、これらのＤＮＡの他、上記ヒダントイナーゼ遺伝子とＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡや、配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有するＤＮＡなどを用いることもできる。前者の場合は、本発明のヒダントイナーゼおよび本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼが同時に発現し、後者の場合は、本発明のヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの他、ヒダントインラセマーゼが発現することになる。
【００８１】
ところで、組み換えＤＮＡ技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。一般には、大腸菌を用いてタンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、大腸菌、好ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。以下、形質転換された大腸菌を用いてヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを製造する方法を説明する。
【００８２】
ヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモーターとしては、通常大腸菌においてタンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。
【００８３】
また、生産量を増大させるためには、タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【００８４】
ヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００８５】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましく、このようなプラスミドとして、例えば、ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）などのように強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている。
【００８６】
プロモーター、ヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードする遺伝子、ターミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得ることができる。
【００８７】
該組み換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換し、この細胞を培養すると、ヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼが発現生産される。なお、形質転換を行う方法および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (１９８９)等に記載されている方法を適用することができる。
【００８８】
また、生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。さらに、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。酵素生産量を高めるため、培地にイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加したり、温度上昇等の酵素誘導処理を行うことも好ましい。
【００８９】
培養菌体を遠心分離操作などにより回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、ヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを回収し、粗酵素液として使用することができる。菌体破砕には超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には卵白リゾチームや、ペプチターゼ処理、またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、これらの酵素を精製して用いることも可能である。この場合、これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００９０】
上述の組換え体を用いる方法によって得られる本発明のヒダントイナーゼは、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質である。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００９１】
また、上述の組換え体を用いる方法によって得られる本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼは、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質である。
（a）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
（b）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００９２】
なお、ここで、「数個」および「ヒダントイナーゼ活性」、「Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性」の定義は、[I]ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
【００９３】
[III]光学活性アミノ酸の製造方法
次に、本発明のヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを用いた光学活性アミノ酸の製造方法について述べる。
【００９４】
本発明の光学活性アミノ酸の製造方法は、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼのうち、少なくとも一方に本発明の酵素を用いるものであり、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの組み合わせとしては下記の３通りが考えられる。
(i) 本発明のヒダントイナーゼ ＋ Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ
(ii)ヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ
(iii)本発明のヒダントイナーゼ ＋ 本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ
【００９５】
(i)の場合、本発明のヒダントイナーゼとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
(a)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００９６】
また、このようなヒダントイナーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養することによって得られたヒダントイナーゼを用いることもできる。形質転換された細胞を用いて、ヒダントイナーゼを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からヒダントイナーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、ヒダントイナーゼ活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含む。
【００９７】
本発明のヒダントイナーゼの基質としては、当該酵素の基質特異性において加水分解できる５置換ヒダントイン化合物であればいかなるものも使用でき、Ｄ体およびＬ体の５置換ヒダントイン化合物を基質として用いることが可能である。例えば、ＤＬ−５−ベンジルヒダントイン、ＤＬ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、ＤＬ−５−インドリルメチルヒダントイン、ＤＬ−５−（３,４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、ＤＬ−５−メチルチオエチルヒダントイン、ＤＬ−５−イソブチルヒダントイン、ＤＬ−５−カルバミルエチルヒダントイン、ＤＬ−５−カルバミルメチルヒダントインなどに代表されるような天然型アミノ酸に対応する５置換ヒダントイン化合物のほか、ＤＬ−５−ベンジルオキシメチルヒダントイン、ＤＬ−５−（３,４−メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ＤＬ−５−（３,４−ジメトキシベンジル）ヒダントイン、ＤＬ−５−メトキシメチルヒダントイン、ＤＬ−５−（４−メチル−４−ニトロペンチル）ヒダントインなどに代表されるような非天然型のアミノ酸若しくはその誘導体に対応する５置換ヒダントインなどが挙げられる。
【００９８】
本発明のヒダントイナーゼと組み合わせて用いるＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼとしては、Ｎ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することによりアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素または当該酵素含有物であれば、特に限定なく公知のものを用いることができる。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含む。ただし、本発明のヒダントイナーゼは光学選択性がないので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物を出発物質として光学活性アミノ酸を得ようとする場合は光学選択性を有するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼを用いる必要がある。Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解するＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼは、例えばシュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株にその存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公報)。再同定の結果、シュードモナス  エスピー ＡＪ１１２２０株は、アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.）に属することが判明している。アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.） ＡＪ１１２２０株は、１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４５が付与された微生物である。また、Ｎ−カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼは、本発明に示したマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばバチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特開昭６３−０２４８９４号公報）。バチルス  エスピー ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
【００９９】
次に(ii)の場合について説明する。本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
(a)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
(b)配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【０１００】
また、このようなＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を培養することによって得られたＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを用いることもできる。形質転換された細胞を用いて、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からヒダントイナーゼを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含む。
【０１０１】
また、本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの基質としては、当該酵素の基質特異性において加水分解できるＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸であればいかなるものも使用できる。即ち、上述した５置換ヒダントイン化合物より得られるＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸に加え、Ｎ−カルバミル−Ｌ−セリン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−グリシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−イソロイシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−バリン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アラニン、Ｎ−カルバミル−β−アラニンなども基質として使用することができる。
【０１０２】
さらに、本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼと組み合わせて用いるヒダントイナーゼとしては、５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素または当該酵素含有物であれば、特に限定なく公知のものを用いることができる。ここで、「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含む。ただし、本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼは、Ｌ体特異的であるので、光学特異性のないヒダントイナーゼまたはＬ体に特異的に作用するヒダントイナーゼを用いる必要がある。光学特異性のないヒダントイナーゼは、本発明に示したマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロバクター  オーレセンス（Arthrobacter aurescens）にその存在が知られている（J.Biotechnol.６１巻、１ページ、１９９８年）。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用するヒダントイナーゼは、例えばバチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特開昭６３−０２４８９４号公報）。バチルス  エスピー ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
【０１０３】
次に、(iii)の場合について説明する。(iii)では、(i)で説明した本発明のヒダントイナーゼおよび(ii)で説明した本発明のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを組み合わせて用いる。(i)〜(iii)のうち最も好ましい組み合わせは(iii)である。
【０１０４】
ここで、反応工程としては、ヒダントイナーゼとＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの混合物を５置換ヒダントイン化合物に作用させてもよいし、ヒダントイナーゼを５置換ヒダントイン化合物に作用させた後、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼを作用させてもよい。反応工程の簡素化の観点からは前者の方法が好ましい。
【０１０５】
また、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物を光学活性アミノ酸へと変換させる際には、ヒダントイナーゼの加水分解活性に光学選択性がなく、Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼに光学選択性があれば、生成アミノ酸はＤ−、若しくはＬ−の光学活性体となるが、反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバミルアミノ酸が残存することが想定される。即ち、Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼがＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を選択的に分解し、Ｌ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が残存し、又、逆にＤ−アミノ酸を生成させる場合にはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸が残存することが想定される。
しかしながら、このような場合においても、ヒダントイナーゼは残存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒する。
したがって、５置換ヒダントイン化合物の自発的ラセミ化若しくは化学的なラセミ化若しくはヒダントインラセマーゼを用いるラセミ化反応等を組み合わせることにより、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物からモル収率５０％以上で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
【０１０６】
換言すれば、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの他、さらにヒダントインラセマーゼを用いることが好ましい。ヒダントインラセマーゼとしては、例えば、特願２０００−２７８５７１号に記載のオーレオバクテリウム  リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来のヒダントインラセマーゼを好ましく用いることができる。この場合、Ｌ−アミノ酸の製造に係わるタンパク質をコードする配列表の配列番号５に記載の構造遺伝子群とベクターとが接続されて得られる組み換えＤＮＡを用いて形質転換された細胞を培養することによって得られたヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼからなる混成タンパク質を用いることもできる。当該混成タンパク質を用いた場合、下記反応式（IV）に示すように、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼが５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＬ−アミノ酸を製造することが可能となる。
【０１０７】
【化４】
0004529338.tif 000006
【０１０８】
なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例えば、上記混成タンパクにＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの阻害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造できる。
【０１０９】
また、光学活性アミノ酸を製造する際に、残存するＮ−カルバミルアミノ酸と光学活性アミノ酸とを分離してＮ−カルバミルアミノ酸を回収することにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造することも可能である。さらに、引き続き該Ｎ−カルバミルアミノ酸にＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ若しくは当該酵素含有物を作用させ、アミノ酸を製造することができるが、亜硝酸等による化学的な加水分解処理を施すことによっても、光学活性を維持したまま、高収率でアミノ酸を製造することが可能である。
【０１１０】
Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解するＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼは、例えばシュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp.）ＡＪ１１２２０株にその存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公報)。再同定の結果、シュードモナス  エスピー ＡＪ１１２２０株は、アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.）に属することが判明している。アグロバクテリウム  エスピー（Agrobacterium sp.） ＡＪ１１２２０株は、１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４５が付与された微生物である。また、Ｎ−カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼは、本発明に示したマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばバチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特開昭６３−０２４８９４号公報）。バチルス  エスピー ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６４６が付与された微生物である。
【０１１１】
本発明のヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液または精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
【０１１２】
また、本発明のヒダントイナーゼおよび／またはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするＤＮＡとベクターが接続されて得られる組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日培養することが好ましい。
【０１１３】
生成したアミノ酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
【０１１４】
【実施例】
以下、実施例１〜実施例５を参照して本発明をさらに説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。
【０１１５】
（実施例１）ヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子の単離
前述したように本発明者らは、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の培養菌体からヒダントインラセマーゼを単離精製する際、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の下流に位置する配列が既知のヒダントイナーゼとの相同性を示したことから、これがヒダントイナーゼ遺伝子の一部であると予想し、さらに下流にはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子が存在する可能性があると考え、該ＤＮＡ断片をプローブとして利用することにより当該菌株の遺伝子ライブラリーからヒダントイナーゼ遺伝子の全長およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子の全長を取得した。なお、遺伝子遺伝子ライブライリーの構築にはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１８若しくはｐＵＣ１９を用いた。
【０１１６】
１．菌体の取得
マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株をＣＭ２Ｇ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ グルコース、１．０ｇ／ｄｌ酵母エキス、１．０ｇ／ｄｌペプトン、０．５ｇ／ｄｌ塩化ナトリウム、２ｇ／ｄｌ 寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４時間培養し、リフレッシュした。これを５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ｍｌ容の坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。
【０１１７】
２．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００×ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌの５０:２０ ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ８．０)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心分離操作により、菌体を回収した後、再びこの菌体を１０ｍｌの５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁液に０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行った。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを０．５ｍｌ ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ProteinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、１倍容の１０:１ ＴＥ飽和のフェノールで除タンパクを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍｌの１０:１ ＴＥに溶解させた。
【０１１８】
３．ヒダントインラセマーゼ遺伝子の単離
特願２０００−２７８５７１号に記載の方法を用いて、マイクロバクテリウムリクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡより取得した約２．９ｋｂのＥｃｏＲ Ｉ／Ｐｓｔ Ｉ断片（図１の▲１▼）に、ヒダントインラセマーゼのＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、この遺伝子が既知のシュードモナス属細菌由来のヒダントインラセマーゼ（J.Bacteriol.１７４巻、９６２ページ、１９９２年）と４８％の相同性を示すヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子であることを確認した。この約２．９ｋｂの断片のうち、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の下流領域約６００塩基について相同性検索を行ったところ、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の終止コドンより数えて１８番目の塩基からＰｓｔ Ｉサイトまでにわたり、既知のヒダントイナーゼとの相同性が確認された。そこで、この配列の一部を用いてヒダントイナーゼ遺伝子全長取得を試みることとした。
【０１１９】
４．遺伝子ライブラリーからのヒダントイナーゼ遺伝子の単離
まず、ヒダントイナーゼ遺伝子の全長取得のために、サザンハイブリダイゼーションを行った。マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacteriumliquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片（上記約６００ｂｐのうちの約５００ｂｐ）をプローブとして用いた。該増幅断片を約５０ｎｇ／μｌに調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Prime（Boehringer Mannheim）のプロトコールに準じて３７℃で２４ 時間インキュベートすることによりDIG標識し、プローブとした。
【０１２０】
【表２】
0004529338.tif 000007
【０１２１】
染色体ＤＮＡ １μgを各種制限酵素の組合わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim, Nylon membranes positively charged）にブロッティングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hyb（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Boehringer Mannheim）を用いて行った。
【０１２２】
その結果、Ｋｐｎ Ｉ／Ｓａｃ Ｉの切断物（図１の▲２▼）において約１．５ｋｂの位置にバンドが検出された。そこで、該切断物より１．５ｋｂ付近の断片を回収してｐＵＣ１９に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にてライブラリー（４５０株）を作製した後、コロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Boehringer Mannheim, Nylon membranes for colony and plaque hybridization）に転写し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行い、４２℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後に、上述のDIG標識プローブを添加し、４２℃、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleotide Detection Kitを用いて行い、５株のポジティブクローンを選抜した。
【０１２３】
選抜したクローンが保有するプラスミドをMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (１９８９)に記載される方法に従って調製し、挿入断片の塩基配列を決定した。その結果、ヒダントインラセマーゼ遺伝子の下流に、約１．４ｋｂからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しており、ヒダントイナーゼ遺伝子であると推定された。ヒダントイナーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号１に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示した。得られたヒダントイナーゼ遺伝子は既知のシュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のヒダントイナーゼ遺伝子（J.Bacteriol.１７４巻、９６２ページ、１９９２年）とアミノ酸配列において１７％の相同性を示した。又、この約１．５ｋｂの断片からはヒダントイナーゼ遺伝子下流の配列が約４０ｂ得られたが、この配列には既知のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子との相同性が確認された。そこで、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子の全長を取得することを試みた。
【０１２４】
５．遺伝子ライブラリーからのＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子の単離
Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子取得のためにサザンハイブリダイゼーションを行った。マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、表３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片（ヒダントイナーゼ遺伝子の一部；約０．８ｋｂ）をプローブとして用いた。該増幅断片を約５０ｎｇ／μｌに調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Primeのプロトコールに準じて３７℃で２４ 時間インキュベートすることによりDIG標識し、プローブとした。
【０１２５】
【表３】
0004529338.tif 000008
【０１２６】
この標識プローブを用いて、上述の方法でサザンハイブリダイゼーションを行った結果、Ｂｇｌ ＩＩの切断物（図１の▲３▼）において約３．４ｋｂの位置にバンドが検出された。そこで、該切断物より３．４ｋｂ付近の断片を回収してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にてライブラリー（１５０株）を作製した。以下、上述の方法でコロニーハイブリダイゼーションを行い、１株のポジティブクローンを選抜した。
【０１２７】
選抜したクローンが保有するプラスミドを調製し、挿入断片の塩基配列を決定した結果、ヒダントイナーゼ遺伝子下流に約１．２ｋｂからなるＯＲＦが存在しており、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子であると推定された。Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子全長の塩基配列を配列表の配列番号３に、対応するアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示した。得られたＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子は既知のシュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子（J.Bacteriol.１７４巻、９６２ページ、１９９２年）とアミノ酸配列において３９％の相同性を示した。
【０１２８】
（実施例２）ヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
１．発現プラスミドの構築
両遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流に両遺伝子を連結したプラスミドｐＵＣＨＨおよびｐＵＣＣＨを以下のようにして構築した。まず、マイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、表４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより各遺伝子を増幅した（ヒダントイナーゼ遺伝子は終止コドンの下流２９塩基目までを増幅）。これらの断片をＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉにて処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に導入した。アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを持った株を選択し、それぞれのプラスミドを発現プラスミドｐＵＣＨＨおよびｐＵＣＣＨと命名した。
【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
２．無細胞抽出液の調製
ｐＵＣＨＨを持つＥ．ｃｏｌｉ 形質転換体およびｐＵＣＣＨを持つＥ．ｃｏｌｉ 形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、１６時間シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容坂口フラスコにこのシード培養液を１ｍｌ添加し、３７℃にて本培養を行った。一部の培地について、培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培養を行った。
培養終了後、集菌、洗浄を行い、菌体を５ｍｌの５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)に懸濁し、０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分間（３０秒×６回、９０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕した。溶液を回収し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
【０１３１】
３．ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性測定
ヒダントイナーゼ活性の測定は、１２０ｍｇ／ｄｌ ５−ベンジルヒダントイン（ＢＨ；Ｄ体、Ｌ体およびＤＬ体）、５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)および酵素溶液を含む反応液を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた後、生成したＮ−カルバミルフェニルアラニン（Ｎ−Ｃａｒ−Ｐｈｅ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量することによった。酵素活性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍｏｌのＮ−カルバミルフェニルアラニンを生成する酵素活性をもって１Ｕと定義した。
【０１３２】
Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性の測定は、８０ｍｇ／ｄｌＮ−カルバミル−Ｌ−フェニルアラニン、５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)および酵素溶液を含む反応液を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の１．１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた後、生成したＬ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）をＨＰＬＣにて定量することによった。酵素活性の単位としては、この条件にて１分間に１μｍｏｌのＬ−フェニルアラニンを生成する酵素活性をもって１Ｕと定義した。
【０１３３】
両酵素活性測定において分析に用いたＨＰＬＣの条件は以下の通り。
カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ
移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ｍＭＣｕＳＯ4
カラム温度：５０℃
流速：１．５ ｍｌ/分
検出：ＵＶ210
【０１３４】
その結果を表５に示す。ｐＵＣＨＨを用いて形質転換した株ではヒダントイナーゼ活性が検出され、ｐＵＣＣＨを用いて形質転換した株にはＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性が検出されたことから、両遺伝子がマイクロバクテリウム  リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２由来ヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子であり、Ｅ．ｃｏｌｉの菌体内で発現されていることを確認した。また、ヒダントイナーゼ活性に関しては、基質としてＤ体、あるいはＬ体の５−ベンジルヒダントインを用いた場合にはそれぞれＤ体、Ｌ体のＮ−カルバミルフェニルアラニンのみが生成していたことから、Ｄ体、Ｌ体両方に作用し得る酵素であることが明らかとなった。
【０１３５】
【表５】
0004529338.tif 000010
【０１３６】
４．Ｌ−５−ベンジルヒダントインからのＬ−フェニルアラニンの生産
上述の無細胞抽出液のうち、ヒダントイナーゼ活性およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ活性が高かったＩＰＴＧ添加区を０．０１ｍｌずつとり、０．５ｇ／ｄｌ Ｌ−５−ベンジルヒダントイン、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)とともに３０℃で静置反応させた。反応液を経時的にサンプリングして９倍容の１．１ｍＭ ＣｕＳＯ4、１１．１ｍＭ Ｈ3ＰＯ4を添加し、２０，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により沈澱を取り除いた後、ＨＰＬＣを用いて生成したＬ−フェニルアラニンを定量した。
【０１３７】
その結果を表６に示した。この表に示されるように、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉより調製した無細胞抽出液を用いることにより、Ｌ−５−ベンジルヒダントインから効率良くＬ−フェニルアラニンを生成させることができた。
【０１３８】
【表６】
0004529338.tif 000011
【０１３９】
（実施例３）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いたＬ−フェニルアラニンの生産
０．５ｇ／ｄｌ (２６ｍＭ) Ｌ−５−ベンジルヒダントイン、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ７．５)、１ｇ／ｄｌのＪＭ１０９／ｐＵＣＨＨ洗浄菌体および１ｇ／ｄｌのＪＭ１０９／ｐＵＣＣＨ洗浄菌体を混合し、３０℃で反応させた。反応液を経時的にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成したＬ−フェニルアラニンを定量した。
【０１４０】
その結果を表７に示した。この表に示されるように、ヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、Ｌ−５−ベンジルヒダントインから効率良くＬ−フェニルアラニンを生成させることができた。
【０１４１】
【表７】
0004529338.tif 000012
【０１４２】
（実施例４）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いた２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸の生産
１００ｍｇの Ｌ−５−（４−メチル−４−ニトロペンチル）ヒダントイン（ＭＮＰＨ）を１６ｍｌの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)に懸濁させ、２ｍｌのＪＭ１０９/ｐＵＣＨＨ洗浄菌体および２ｍｌのＪＭ１０９/ｐＵＣＣＨ洗浄菌体を添加し、３７℃で反応させた。反応液を経時的にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成した２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸（ＡＭＮＨＡ）を定量した。その結果を表８に示した。なお、ＨＰＬＣの条件は以下の通り。
【０１４３】
カラム：ＧＬサイエンス  イナートシルＯＤＳ−２ ０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ
移動相：３０ｍＭリン酸水溶液／メタノール＝８／２（Ｖ／Ｖ）
カラム温度：５０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ.
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１４４】
【表８】
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【０１４５】
反応後、反応液を水にて２００ｍｌに希釈し、遠心分離操作(１２，０００×ｇ、１０分)によって菌体を除去した。その後、上澄を陽イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲ−１２０ｂ、２．６ｃｍφ×２０ｃｍ）に流速３ｍｌ／分にて通液し、２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸を吸着させた。５００ｍｌの水にてカラムを洗浄後、２％アンモニア水３００ｍｌをカラムに３ｍｌ／分にて通液し、２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸を溶出させた。溶離液は、ロータリーエバポレーターで４０℃において３ｍｌまで減圧濃縮し、これにアセトンを滴下することによって、２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸をアンモニウム塩として得た（乾燥物重量３１ｍｇ）。得られた２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸を光学分割カラムを利用したＨＰＬＣ分析に供した。分析条件は、以下に示すとおりである。
【０１４６】
カラム：ダイセル化学  ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）４．６ｃｍφ×２５ｃｍ
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．８）／アセトニトリル＝８／２（Ｖ／Ｖ）
カラム温度：５０℃
流速：１．０ ｍｌ／ｍｉｎ.
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１４７】
この条件により、Ｄ−２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸は、４．４分、Ｌ−２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸は、６．１分のリテンションタイムにて分別定量できる。
その結果、本反応により生成した２−アミノ−６−メチル−６−ニトロヘプタン酸はＬ体であることが判明し、その光学純度は、９９％ ｅ.ｅ.以上であった。
【０１４８】
（実施例５）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いたＬ−（３’−ピリジル）−アラニンの生産
１００ｍｇのＬ−５−（３’−ピリジル）-メチルヒダントインを１６ｍｌの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ、２ｍｌのＪＭ１０９／ｐＵＣＨＨ洗浄菌体および２ｍｌのＪＭ１０９／ｐＵＣＣＨ洗浄菌体を添加し、３７℃にて４８時間反応させた。反応液を遠心後、上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成した３’−ピリジル-アラニンを定量した。なお、ＨＰＬＣ条件は以下の通り。
【０１４９】
カラム：ダイセル化学  CROWNPAK  CR（＋）４．６ｃｍφ×２５ｃｍ
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）
カラム温度：１５℃
流速：０．７５ｍｌ／ｍｉｎ．
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１５０】
この条件により、Ｄ−（３’−ピリジル）−アラニンは、２．０分、Ｌ−（３’−ピリジル）-アラニンは、２．３分のリテンションタイムにて分別定量できる。
その結果、本反応により生成した３’−ピリジル-アラニンはＬ体であることが判明し、その光学純度は、９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、Ｌ−（３’−ピリジル）-アラニンの生成量は０．４ｇ／ｄｌであった。
【０１５１】
（実施例６）Ｅ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いたＬ−アミノ酸の生産
上記のＬ−フェニルアラニンの生産と同様にして、各種５置換ヒダントイン化合物と１ｇ／ｄｌのＪＭ１０９／ｐＵＣＨＨ洗浄菌体および１ｇ／ｄｌのＪＭ１０９／ｐＵＣＣＨ洗浄菌体を混合し、３０℃で反応させた。それぞれ反応２４時間後にサンプリングし、遠心上清をＨＰＬＣで解析することにより、生成したＬ−アミノ酸を定量した。
【０１５２】
その結果を表９に示した。この表に示されるように、ヒダントイナーゼ遺伝子およびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼ遺伝子を発現させたＥ．ｃｏｌｉ洗浄菌体を用いることにより、各種５置換ヒダントイン化合物から効率良くＬ−アミノ酸を生成させることができた。
【０１５３】
【表９】
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【０１５４】
【発明の効果】
本発明によって、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの遺伝子を大腸菌などの宿主において安定に大量に発現させることが可能となった。この結果、このような形質転換体から該酵素を容易に調製することができるようになり、該形質転換体やその抽出液、精製酵素等を用いることによって医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に有用な光学活性アミノ酸を効率良く生産できるようになった。
【０１５５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードする構造遺伝子群の構造を示す図である。
【図２】本発明のヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの製造工程を示すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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