(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体が、重鎖に、
ａ）配列番号１０９に示されるＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号１１１に示されるＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号１１３に示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号６０に示されるアミノ酸配列と同一である１番目のＦＲ（ＦＲ１）、
ｅ）配列番号７４に示されるアミノ酸配列と同一である２番目のＦＲ（ＦＲ２）、
ｆ）配列番号８８に示されるアミノ酸配列と同一である３番目のＦＲ（ＦＲ３）、及び、
ｇ）配列番号１０２に示されるアミノ酸配列と同一である４番目のＦＲ（ＦＲ４）、並びに、
軽鎖に、
ｈ）配列番号４９に示されるＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｉ）配列番号５０に示されるＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｊ）配列番号５１に示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｋ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列と同一である１番目のＦＲ（ＦＲ１）、
ｌ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列と同一である２番目のＦＲ（ＦＲ２）、
ｍ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列と同一である３番目のＦＲ（ＦＲ３）、及び、
ｎ）配列番号４５に示されるアミノ酸配列と同一である４番目のＦＲ（ＦＲ４）、
を含んでいるヒト型抗体。
【請求項２】
配列番号１１４及び配列番号１１５に示される定常領域を更に含んでいる請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１１６及び配列番号１１７に示される定常領域を更に含んでいる請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１に記載のヒト型抗体の重鎖ＣＤＲ及びＦＲ、並びに、軽鎖ＣＤＲ及びＦＲを含有する断片であって、ヒトＴＦに結合するヒト型抗体の抗原結合部位を含む断片。
【請求項５】
断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ）２である、請求項４に記載のヒトＴＦに結合するヒト型抗体の抗原結合部位を含む断片。
【請求項６】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載のヒト型抗体。
【請求項７】
ヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合して複合体を形成し、そして当該複合体は血液凝固第Ｘ因子又は第ＩＸ因子と結合して、ＴＦ：ＶＩＩａによる第Ｘ因子又は第ＩＸ因子の活性化を阻害する、請求項１〜６のいずれかに記載のヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片。
【請求項８】
組織因子（ＴＦ）に対する解離定数（Ｋｄ）が０．５ｎＭ未満を示す請求項７に記載のヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片。
【請求項９】
抗体が、抗体濃度１５ｎＭ未満での標準プロトロンビン（ＰＴ）凝固アッセイによって測定される血液凝固時間を少なくとも５秒増加させることを、更に特徴とする請求項７又は８に記載のヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片。
【請求項１０】
抗体が、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２２５５として寄託された細胞株Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７から得られる抗体とＴＦに対して同じ親和性を有する、請求項７〜９のいずれかに記載のヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片。
【請求項１１】
請求項１に記載のヒト型抗体の重鎖及び軽鎖をコードする単離された核酸のセット。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離された核酸のセットを含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片、及び少なくとも一つの薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片を有効成分とする、哺乳動物の血液凝固阻害剤。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化抗体又はその抗原結合部位を含む断片の、哺乳動物の血液凝固を阻害する薬剤を製造するための使用。
【請求項１７】
複合体を形成する条件下で請求項１〜３のいずれかに記載の抗体に生物サンプルを接触させ、生物サンプル中のＴＦの存在を示す複合体を検出することからなる、生物サンプル中の組織因子（ＴＦ）を検出する方法。
【請求項１８】
１）請求項１に記載のヒト型抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部位を含む断片をコードする核酸を含む一つ目の発現ベクター、及び請求項１に記載のヒト型抗体の重鎖もしくはその抗原結合部位を含む断片をコードする核酸を含む二つ目の発現ベクター、又は
２）請求項１に記載のヒト型抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部位を含む断片、及び重鎖もしくはその抗原結合部位を含む断片の両方をコードする核酸を含む単独の発現ベクター、
によって宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を軽鎖及び重鎖の各々が発現する生育条件下に維持する工程を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片を製造する方法。
【請求項１９】
ヒト型抗体又はその抗原結合部位を含む断片を単離する工程を更に含む請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許出願ＵＳＳＮ０８／８１４，８０６（現、米国特許第５，９８６，０６５号）の分割出願である、米国特許出願第０９／２９３，８５４号（１９９９年４月１６日出願）に関連する、米国特許仮出願第０６／３４３，３０６号（２００１年１０月２９日出願）の優先権を主張して出願された、米国特許出願第０９／９９０，５８６号（２００１年１１月２１日出願）の優先権を主張するものである。
米国特許出願第０９／９９０，５８６号、第６０／３４３，３０６号、第０９／２９３，８５４号及び米国特許第５，９８６，０６５号の記載は、それぞれ参照として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒト組織因子の新規な抗体、並びに血液凝固、脈管形成、腫瘍転移及び炎症等の組織因子に関連する作用を阻害するための抗体の使用方法に関する。特に、生の（未変性の）ヒト組織因子と高親和性で特異的に結合し、血液凝固第Ｘ因子又は血液凝固第ＩＸ因子の結合及び活性化を阻害する新規な抗体に関する。本発明の抗体は多様な用途、特にインビボでの血液凝固を低下させるために有用である。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固作用は、失血を最小限にすることによって、ホメオスタシスの維持に貢献している。通常、血液凝固には、血管損傷、血小板凝集、凝固因子の活性化、及び線溶系の阻害が必要とされている。血液凝固因子は、血管損傷から血液凝固の生成に至るまでのカスケード全体に作用する（一般的には、L．Stryer，Biochemistry，3rd Ed，W.H.Freeman Co.，New York;およびA.G.Dilman et al.，The Pharmacological Basis of Therapeutics，8th Edition，McGraw Hill Inc.，New York，pp.1311-1331を参照）。
血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）が活性化して活性化血液凝固第Ｘ因子（ＦＸａ）（又は、血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）が活性化して活性化血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸａ））になることが、血液凝固のプロセスにおける臨界的な段階であることが知られている。通常、ＦＸ（又はＦＩＸ）は、「組織因子（ＴＦ）」を含有している触媒的な活性複合体に結合することによって、ＦＸａ（又はＦＩＸａ）に転換される。ＴＦは制御可能に発現している細胞膜タンパク質であって、血液凝固第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合して触媒的な活性を有する複合体(ＴＦ：ＦＶＩＩａ)を形成する。血液凝固はＦＸａが介在するプロトロンビンの活性化によって引き起こされる。ＴＦを不活化して、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体を最適に形成できない変性された（non-native）形態にすることによって、血液の凝固を最小限にすることができる。ＦＸａ（又はＦＩＸａ）の生成による血液凝固系のカスケードの過剰な活性化が、再狭窄を含む種々の血栓症の要因と考えられている。
【０００４】
血栓症は、心臓手術（例えば、血管形成）、腹胸手術、動脈手術、末梢血管バイパス移植、治療用機器（例えば、ステントやカテーテル）の装着、又は動脈血管内膜切除等の侵襲的な医療処置により誘発されることがある。さらに、血栓症は、脳梗塞、肺動脈塞栓症（例えば、塞栓形成を伴う心房細胞の繊維状組織の形成）、冠動脈疾患又は急性冠症候群（例えば、不安定狭心症又は心筋梗塞）、アテローム性動脈硬化又はその他の血栓性閉塞疾患、深部静脈血栓症及び播種性血管内凝固症候群等の種々の血栓塞栓性疾患や凝固障害を伴うことがある。体外循環を伴う処置（例えば、心肺バイパス手術）や腎臓透析以外に、特に輸血や体液のサンプリングといった体液操作も結果的に好ましくない血栓形成のおそれがある。
【０００５】
抗血栓剤は、血栓症に関連する血栓の形成を緩和したり、防止するために頻繁に使用されている。クマリン誘導体（例えば、ワルファリン、クーマディン又はジクマロール）、荷電ポリマー（例えば、ヘパリン、低分子ヘパリン、ヒルジン、ヒルログ（hirulog））又は抗血小板薬（例えば、レオプロ、インテグリリン、アグレスタット、プラビックス、チクリド、又はアスピリン）の１種以上を含む適当な抗血栓剤又はそれらの混合物を投与することによって、血栓の形成を最小限にするか又は排除できる場合が多い。例えば、上述のGilman et al.,R.J.Beigering et al.，Ann.Hemathol.，72:177(1996);J.D.Willerson，Circulation，94:866(1996)を参照されたい。
しかし乍ら、抗血栓剤の使用は、出血、再閉塞、白血塊症状（white clot syndrome）、刺激性過敏（irritation）、出産異常、血小板減少症や肝不全等の副作用をしばしば引き起こす。特に、抗血栓剤の長期にわたる投与は、生命を脅かす病に至る危険性を増加させる（例えば、上述のGilman et al.,を参照）。
【０００６】
また、抗血小板活性を持つある種の抗体が、多様な血栓を緩和するために使用されている。例えば、レオプロ（ReoPro（登録商標））は、血管形成、心筋梗塞、不安定狭心症や冠動脈狭窄症等によって引き起こされる様々な血栓塞栓性障害を緩和するために、一般的に投与される抗体製剤である。さらに、レオプロ（ReoPro（登録商標））は、心筋梗塞と狭心症（アンギナ）の危険性を低減する予防薬としても使用することができる（J.T.Willerson，Circulation，94:866(1996);M.L.Simmons et al.，Circulation,89:596(1994)を参照）。
【０００７】
また、抗血栓抗体も知られている。特に、ある種のＴＦに結合する抗体が、おそらく触媒的な活性ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の会合を阻害することによって、血液凝固を阻害するのではないかとの報告がある。（例えば、Jeske et al.，SEM in THROM．and HEMO，22:213(1996);Ragni et al.，Circulation，93:1913(1996);欧州特許番号0 420 937 B1号;W.Ruf et al.，Throm．Haemosp.，66:529(1991);M.M.Fiorie et al.，Blood，8:3127(1992)を参照）。
しかしながら、現状のＴＦに結合する抗体には、抗血栓剤としての適性を否定する程の重大な欠点がある。例えば、現状のＴＦに結合する抗体は、抗血栓活性を最適にするに十分な結合親和性を有さない。従って血栓症の多くの症状に於いては、不十分な結合親和性を補って血栓の形成を最小限に抑えるために、許容量を上回るような高レベルでの抗体の投与が必要となっている。
それ故、高い親和性及び選択性で未変性のヒトＴＦと結合する抗血栓剤を得て、好ましくない血液凝固及び血栓の形成を阻害することが望まれている。さらに、第Ｘ因子（又は第ＩＸ因子）がＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体に結合するのを阻害する抗血栓性の抗体を得ることが望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、未変性の（native）ヒト組織因子（ＴＦ）に高い親和性と特異性で結合して優れた抗血栓活性を有する抗体を見出した。本発明の抗体は、インビボで効果的に血液凝固を阻害することができる。本発明の抗体は、単独で若しくはＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体中に存在して、未変性のヒトＴＦと結合することができ、第Ｘ因子（又は第ＩＸ因子）がＴＦ又はその複合体に結合するのを効果的に阻害して、血液凝固を減少させることができる。
【０００９】
本発明における好ましい抗体はモノクローナル抗体であり、未変性のヒトＴＦの優位なエピトープの配座に特異的に結合するが、このエピトープは非常に強い抗体結合部位を有する。実際、従来の抗血栓抗体に比べ、本発明の好ましい抗体は少なくとも５倍、通常少なくとも１０倍の結合親和力で未変性のヒトＴＦに結合する。さらに、本発明の好ましい抗体は、生の（未変性の（ネイティブの））ヒトＴＦに対して選択的であり、非ネイティブまたは変性されたＴＦには十分に結合しない。Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７（ハイブリドーマＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-１２２５５より分泌されるもので、しばしばＨ３６と称される）は本発明において特に好ましい抗体である。
【００１０】
本発明における好ましい抗体はＴＦと結合して、ＦＸ（又はＦＩＸ）がＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体に効果的に結合せず、それによってＦＸ（又はＦＩＸ）がその活性型（ＦＸａ又はＦＩＸａ）に効果的に転換されないようにするものである。本発明における好ましい抗体は、ＦＸ（又はＦＩＸ）がＴＦ分子に結合または接近することを効果的に阻害又はブロックすることで、ＴＦの機能を阻害することができる。例えば、以下の実施例３の結果を参照されたい。
本発明の好ましい抗体は、ＴＦと第ＶＩＩａ因子との相互作用若しくは結合をあまり強くに阻害するものでないし、ＦＸ又はＦＩＸ以外の物質に対してのＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の活性をあまり阻害するものではない。例えば、以下の実施例４の結果を参照されたい。
【００１１】
また、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を提供するものである。Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の可変領域の核酸とアミノ酸の配列（配列番号１乃至４）は、図１Ａ及び図１Ｂに示されている。
好ましい実施態様において、本発明は血液凝固及び血栓の形成を阻害する方法、若しくはヒトＴＦのレベルを低下させる方法を提供するものである。
一般的に、本発明の抗体は、上記の血液凝固、炎症、ガンの脈管形成及び転移並びに他の疾患を含む、ＴＦ又はＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体に結合するＦＸ（又はＦＩＸ）に介在される殆どすべての生物学的応答を調節する上で有効であろう。
【００１２】
本発明の抗体は、様々な血栓症を和らげるのに、特に外科手術後の血管再狭窄(restenosis）を防止若しくは阻害するのに、又は動脈や心臓の手術（血管形成など）などの侵襲的な医療処置後に引き起こされるその他の血栓症を緩和するのに、非常に有効である。本発明の抗体はまた、これらに限定はされないが、冠動脈疾患、急性冠症候群（例えば、不安定狭心症又は心筋梗塞）及びアテローム性動脈硬化を含む外科的処置を要しない心血管の状況での血液凝固に起因する血栓性閉塞を減じるため、又は効果的に排除するためにも用いられる。また、本発明の抗体は、治療用器具の使用（例えば、カテーテル、ステントあるいはその他の医療機器）によって生じる血液凝固を減少させ、又は効果的に排除するためにも用いられる。本発明における好ましい抗体は、多くの抗血栓剤、抗血小板剤及び血栓溶解剤と併用される。それ故、血液凝固の阻害を促進又は延長するためのカクテル（多剤併用）投与が可能となる。
【００１３】
本発明の抗体は、哺乳動物、特にヒトの体外循環における抗凝血薬としても用いられる。この方法では、心肺バイパス手術、臓器移植手術、あるいはその他の長時間にわたる手術に於いて行われる体外循環の前、またはその間に、血液凝固を阻害するのに十分な量で、本発明の抗体を一種または複数種、当該哺乳動物に投与することからなる。
【００１４】
本発明の抗体は、特にストレポキナーゼ(strepokinase)、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ウロキナーゼなどの血栓との相互作用を目的とした医薬の担体としても用いられる。同様に、本発明の抗体は、適切な毒素（toxin）を抗体に結合（conjugate）させることによって細胞障害剤としても用いられる。
本発明の抗体の抱合体（conjugates）はまた、本発明の抗体の有効量を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物、特にヒトの組織因子のレベルを低下させるためにも用いられる。当該抱合体は、細胞毒（cytotoxic agent）又はエフェクター分子と強く結合して、補体結合能及び抗体依存性の細胞が介在する細胞障害性を有する。そして、この抗体の抱合体が、組織因子を発現している細胞と接触することにより、哺乳動物に於ける組織因子のレベルを低下させる。
【００１５】
本発明の抗体は、未変性のヒトＴＦのインビボ画像診断を含むインビボ診断法にも用いられる。
また、本発明の抗体は、体液（例えば、血漿や血清など）又は組織（例えば、生検サンプルなど）を含む生物サンプルに於ける未変性のＴＦを検出するためのインビトロ分析法にも用いられる。より具体的には、生物サンプル内の未変性のＴＦの存在、好ましくはその量を検出するために、競合的又は非競合的な測定原理に基づく種々の均一系及び不均一系のイムノアッセイ（免疫測定法）が用いられる。
本発明に於けるこのような分析法は、患者が血液凝固や血栓を有しているか、あるいはその可能性があるか、を測定するのに非常に有効である。つまり、血液凝固は、通常、単核白血球、マクロファージ及び脈管構造の内側の内皮細胞といった細胞の表面にＴＦが発現している結果として起こるものであると言える。したがって、本発明における分析法を用いて体液サンプル中のＴＦを検出することで、血液凝固の有無を示すことができる。
【００１６】
本発明の抗体は、実質的に純粋な未変性のＴＦ、特に未変性のヒトＴＦを生物サンプルから調製するためにも用いられる。本発明の抗体はまた、未変性のＴＦを発現している細胞を検出及び精製するのにも用いられる。
本発明の抗体は、例えば、生物サンプル中における未変性のＴＦを検出、より好ましくはその量を測定する等の診断用のキットの一部としても用いることができる。
本発明は更に、ヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合して複合体を形成するヒト型抗体を提供する。好ましい態様に於いては、血液凝固第Ｘ因子又は第ＩＸ因子が当該複合体に結合するのが顕著に阻害されている。好ましくは、このヒト型抗体は少なくとも１個のネズミ類（murine）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、好ましくは１個、２個、３個又は４個のネズミ類（murine）のＣＤＲを含む。更に、当該ヒトＴＦに結合するヒト型抗体の断片も提供される。
【００１７】
もう一つの態様に於いて、本発明は、ヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合して複合体を形成する、ヒト型抗体又はその断片の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に於ける血液凝固を阻害する方法を提供する。この方法に用いられる好ましい抗体は、血液凝固第Ｘ因子又は第ＩＸ因子が複合体に結合するのを顕著に低下させる。好ましい方法は更に、抗体とＴＦ又は抗体とＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体との間に血液凝固を阻害する特異的な複合体を形成することを含む。
本発明はまた、ネズミ類（murine）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも一つ含んで成る、ヒト型抗体又はその断片の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に於ける血液凝固を阻害する方法を提供する。この方法に用いられる好ましいヒト型抗体は、ヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合して複合体を形成する。好ましくは、第Ｘ因子又は第ＩＸ因子が当該複合体に結合すること、又は当該複合体に結合する若しくはしている第Ｘ因子又は第ＩＸ因子を顕著に減じられる。好ましい方法は更に、この抗体とＴＦが血液凝固を阻害する特異的な複合体を形成することを包含している。
本発明に於けるその他の態様は以下に記述される。
（発明の詳細な説明）
【００１８】
前述したように、本発明の好ましい抗体は未変性のヒトＴＦに実質的な親和性を示す。特に本発明の好ましい抗体は、表面プラズモン解析（特に後述する実施例１の手順に従ったＢＩＡｃｏｒｅ解析）によって測定されるように、少なくとも約１ｘ１０８の未変性のヒトＴＦに会合定数（Ｋａ，Ｍ−１）を示し、より好ましくは表面プラズモン解析によって測定されるように、少なくとも約５ｘ１０８であり、さらにより好ましくは表面プラズモン共鳴解析によって測定されるように、少なくとも約１ｘ１０１０の未変性のヒトＴＦにＫａ （Ｋａ，Ｍ−１）を示す。このような本発明の抗体の実質的な結合親和性は、かなり低い結合親和性しか有さない従来の抗体とは明確な対照を示す。
この点において、本発明の抗体の効果的な濃度は、極めて低い濃度で使用することができ、例えば、抗体の比較的低濃度での使用により、以下に述べる実施例３に記載されるようにインビトロのアッセイにおいて、所望のＴＦ機能の阻害（例えば、少なくとも約９５、９８又は９９パーセントの阻害）を達成することができる。
【００１９】
好ましい抗体は、未変性のヒトＴＦに非常に特異的でもあり、変性された（non-native）ＴＦには実質的に結合しない。 好ましい抗体は、変性されたＴＦ又は他の免疫学的に無関係な分子には実質的に結合せず、それは例えば標準的なドットブロットアッセイによって測定される（例えば、このようなドットブロットアッセイにより、変性されたＴＦへ結合しないこと又は本質的に結合しないことが視覚的に検出される。）。ここで述べる“変性されたＴＦ”とは、ＴＦが変性されるようカオトロピック剤で処置された天然の又は組み換えのヒトＴＦを意味する。典型的なカオトロピック剤としては、界面活性剤（例えばＳＤＳ）、ジチオトレイトール又はβ−メルカプトエタノールと結合した尿素；グアニジン塩酸塩等である。Ｈ３６、Ｈ３６．Ｄ２又はＨ３６．Ｄ２．Ｂ７抗体は、実質的にはこのような変性されたＴＦに結合しない。例えば、以下に述べるドットブロットアッセイの実施例８の結果を参照されたい。
【００２０】
前述したように、本発明の好ましい抗体はまた、ＦＸ（又はＦＩＸ）がＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体に効果的に結合しないように、ＴＦに結合せず、そのためＦＸ（又はＦＩＸ）はその活性体（ＦＸａ又はＦＩＸａ）に効果的に変換されない。特に、本発明の好ましい抗体は、ＴＦ：ＶＩＩａ複合体によってＦＸ活性を強く阻害するであろう。例えば、少なくとも約５０％の阻害、より好ましくは少なくとも約８０％、又はさらにより好ましくは少なくとも約９０％又は９５％の阻害であり、低ＴＦ濃度、例えば約１．０ｎＭ  ＴＦより低く、又は約０．２０ｎＭ又は０．１０ｎＭ  ＴＦよりも低く、本発明の抗体の存在下（すなわち、実験例）及び非存在下（すなわち、対照例）の両方においてＦＸ（又はＦＩＸ）をＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体と接触させ、当該実験例及び対照例におけるＦＸからＦＸａへの（又はＦＩＸからＦＩＸａへの）転換率の差（パーセント）を測定することを含む、後述する実施例３のような標準インビトロ結合アッセイによって測定される。
【００２１】
本発明の抗体は、ここに開示される方法やアッセイで使用される場合には、好ましくは実質的に純粋である。“実質的に純粋”である抗体とは、天然に含まれている成分から分離された抗体又はタンパク質を意味する。例えば、標準的な免疫親和性又はプロテインＡ親和性による精製技術を使用することにより、抗原やプロテインＡレジンとして未変性のＴＦを用いてハイブリドーマ培養から本発明の抗体を精製することができる。同様に、本発明の抗体を用いて標準的な免疫親和性による精製技術で未変性のＴＦを本質的に純粋な状態で得ることができる。特に、全タンパク質の少なくとも５０％（サンプル中の全タンパク質に対する重量％）が本発明の抗体又はタンパク質であるときは、抗体又はタンパク質は実質的に純粋であるとされる。好ましくは、当該抗体又はタンパク質は少なくとも全タンパク質の６０重量％であり、より好ましくは少なくとも７５重量％であり、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％であり、もっとも好ましくは全物質の少なくとも９８重量％である。純度は、ＳＤＳ（ＰＡＧＥ）ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー（例えば、親和性クロマトグラフィー）又はＨＰＬＣ解析のような公知の方法で容易に評価できる。
【００２２】
本発明の好ましい抗体（Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７）の核酸配列（配列番号１及び３）及びアミノ酸配列（配列番号２及び４）は、図１Ａ及び１Ｂで示される。配列番号１及び２はそれぞれ軽鎖可変領域の核酸配列及びアミノ酸配列であり、配列番号３及び４はそれぞれ重鎖可変領域の核酸配列及びアミノ酸配列であり、これらの配列における下線部分は超可変領域（ＣＤＲｓ又は相補性決定領域）である。
【００２３】
さらに本発明の好ましい抗体は、図１Ａ及び１Ｂに示される軽鎖又は重鎖のどちらか一方又は両方と実質的に相同なアミノ酸配列を有するであろう。さらに好ましくは、好ましい抗体は、配列番号２及び／又は４に少なくとも約７０％の相同性（アミノ酸配列の相同性）、より好ましくは配列番号２及び／又は４に約８０％以上の相同性、さらにより好ましくは配列番号２及び／又は４に約８５、９０又は９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本発明の好ましい抗体は、配列番号２及び４の超可変領域（図１Ａ及び１Ｂにおいて二重線で示される）に非常に高い相同性のアミノ酸配列を有するであろう。特に本発明の好ましい抗体は、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の軽鎖可変領域の対応する１、２又は３つの超可変領域（図１Ａにおいて下線で示される超可変領域であり、以下の配列：１）ＬＡＳＱＴＩＤ（配列番号１１８）；２）ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号１１９）；及び３）ＱＱＶＹＳＳＰＦＴ（配列番号１２０））と非常に高い相同性（少なくとも９０％又は９５％のアミノ酸配列の相同性）を有するか又は相同である軽鎖可変領域の１、２又は３つの超可変領域を有するであろう。
【００２５】
特に本発明の好ましい抗体は、また、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の重鎖可変領域の対応する１、２又は３つの超可変領域（図１Ｂにおいて下線で示される超可変領域であり、以下の配列：１）ＴＤＹＮＶＹ（配列番号１２１）；２）ＹＩＤＰＹＮＧＩＴＩＹＤＱＮＦＫＧ（配列番号１２２）；及び３）ＤＶＴＴＡＬＤＦ（配列番号１２３））と非常に高い相同性（少なくとも９０％又は９５％のアミノ酸配列の相同性）を有するか又は相同である重鎖可変領域の１、２又は３つの超可変領域を有するであろう。
【００２６】
本発明の核酸は、好ましくは、３７℃の０．８Ｍ生理食塩水／０．０８Ｍクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファーの２０％のホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファーを使用し、３７℃でＳＳＣバッファーで１回洗浄したときに、ハイブリダイズした結合が残る適度にストリンジェントな条件下（これを、”通常のストリンジェント”条件下という。）で、配列番号：１及び／又は配列番号：３の配列に結合するのに十分な長さ（好ましくは少なくとも約１００、２００又は２５０塩基対）である。
【００２７】
より好ましくは、本発明の核酸（好ましくは少なくとも約１００、２００又は２５０塩基対）は、４２℃の０．９Ｍ生理食塩水／０．０９Ｍクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファーの２０％のホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファーを使用し、４２℃でＳＳＣバッファーで２回洗浄したときに、ハイブリダイズした結合が残る高ストリンジェントな条件下（これを、“高ストリンジェント”条件下という。）で、配列番号１及び／又は配列番号３の配列に結合するであろう。
本発明の核酸は好ましくは少なくとも２０塩基対、より好ましくは少なくとも約５０塩基対を含み、さらにより好ましくは少なくとも約１００、２００、２５０又は３００塩基対を有する。
一般に本発明の好ましい核酸は、ここで開示されるような好適な結合親和性や他の特性を示す本発明の抗体を発現するであろう。
【００２８】
本発明の好ましい核酸は、また、図１Ａ及び１Ｂで示される軽鎖又は重鎖のどちらか一方又は両方に実質的に相同な配列を有するであろう。さらに好ましくは、好ましい核酸は、配列番号１及び／又は３に少なくとも約７０％の相同性（ヌクレオチド配列の相同性）、より好ましくは配列番号１及び／又は３に約８０％以上の相同性、さらにより好ましくは配列番号１及び／又は３に約８５、９０又は９５％以上の相同性を有する配列を含むであろう。
【００２９】
本発明の特に好ましい核酸は、配列番号１及び３の超可変領域（図１Ａ及び１Ｂにおいて下線で示される）に配列の非常に高い相同性を有するであろう。特に好ましい核酸は、
抗体の軽鎖の可変領域をコードし、超可変領域をコードする１、２又は３つの配列を有し、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の対応する超可変領域をコードする、１、２又は３つの配列（図１Ａにおいて下線で示される超可変領域であり、以下の配列：１）ＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴ（配列番号１２４）；２）ＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴ（配列番号１２５）；及び３）ＣＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧ（配列番号１２６））と非常に高い相同性（少なくとも９０％又は９５％のヌクレオチド配列の同一性）を有するか又は相同の配列である。
【００３０】
特に好ましい核酸は、また、抗体の重鎖の可変領域をコードし、超可変領域をコードする１、２又は３つの配列を有し、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の対応する超可変領域をコードする、１、２又は３つの配列（図１Ｂにおいて下線で示される超可変領域であり、以下の配列：１）ＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣ（配列番号１２７）；２）ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号１２８）；及び３）ＧＡＴＧＴＧＡＣＴＡＣＧＧＣＣＣＴＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号１２９））と非常に高い相同性（少なくとも９０％又は９５％の配列の同一性）を有するか又は相同の配列である。
【００３１】
本発明の核酸は、単離されたものであり、特定の画分に存在する全核酸の重量の通常は少なくとも約０．５％、好ましくは少なくとも約２％、より好ましくは少なくとも約５％含有されている。部分的に精製された核酸としては、特定の画分に存在する全核酸の重量の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約６０％含有されている。精製された核酸は、特定の画分に存在する全核酸の重量の少なくとも約８０％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％含有されている。
【００３２】
本発明の抗体は、公知の技術で作成することができ、未変性のＴＦ、典型的には未変性のヒトＴＦ、好ましくは精製された組み換えヒト組織因子（ｒｈＴＦ）の精製サンプルから製造できる。組み換えヒト組織因子すなわち“ｒｈＴＦ”の断片（２４３アミノ酸から成り、細胞内領域を欠損している）は、本発明の抗体を製造ために特に好ましい。この抗体はまた、変性されたＴＦによっては提示されない未変性のＴＦの１個以上のエピトープ部位を含む免疫原性ペプチドから製造することができる。ここで述べる“未変性のＴＦ”とは、このようなｒｈＴＦを含み、このようなＴＦサンプルを含む。前述したように、モノクローナル抗体が一般に好ましいが、ポリクローナル抗体もまた使用することができる。
【００３３】
より好ましくは、抗体は、未変性のヒトＴＦの精製サンプル、又は前述した免疫原性ペプチドを単独又は担体との複合物で用いて、哺乳動物を免疫することにより製造することができる。好ましい哺乳動物は、一般的な実験動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスである。ラット及びマウス、特にマウスは、モノクローナル抗体を得るのに好ましい。抗原は、例えば皮下、腹腔、静脈、筋肉又は皮内注射のような多くのあらゆる適切な方法により哺乳動物に投与することができる。免疫を与えるのに最適な間隔、投与等は、比較的広い範囲にわたって変化させることができ、この開示に基づいて経験的に決定することができる。一般的な手順は、数ケ月にわたって数回、抗原を注射をすることを含む。抗体は、標準の技術によって免疫された動物の血清から集められ、未変性のヒトＴＦに特異的な抗体を見つけるためスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、抗体産生細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を形成するための標準的な細胞融合技術によって製造される。G. Kohler, et al., Nature, 256:456 (1975) を参照されたい。一般的には、ハイブリッド細胞を作る骨髄腫細胞のような不死細胞で抗体産生細胞を融合することを含む。あるいは、モノクローナル抗体は、Huse, et al., Science, 256:1275(1989)の方法によって細胞から製造することができる。
【００３４】
マウスを腹腔内投与で免疫する一つの適切なプロトコルは、精製ｒｈＴＦ複合体を含む組成物で約２〜７ヶ月の期間にわたり処理することである。脾臓細胞を免疫されたたマウスから摘出する。脾臓細胞を切除する前に免疫されたマウスの血清を用いて、ｒｈＴＦに特異的な抗体を滴定でアッセイする。切除されたマウスの脾臓細胞を、例えばヒポキサンチン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ）やチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ）のようなマーカーを有するリンパ系細胞株と均一化又は不均一化（好ましくは均一化）して、融合する。リンパ系細胞株としては、好ましくは骨髄腫細胞が使用される。骨髄腫細胞及び脾臓細胞は、例えば骨髄腫細胞と脾臓細胞の割合が１対４で混合される。細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）方法によって融合されることができる。前記G. Kohler, et al., Natureを参照されたい。このようなクローンのハイブリドーマは、例えば、RPMI-1640の培地で培養する。G.E. More, et al., Journal of American Medical Association, 199:549(1967)を参照されたい。融合された後に、培養されたハイブリドーマは、精製ｒｈＴＦに特異的に結合する抗体の分泌を、放射免疫測定や酵素免疫測定等によりスクリーニングされ、例えば、精製ｒｈＴＦに結合するが、変性されたＴＦには結合しない抗体が選定される。好ましくは、ＥＬＩＳＡがスクリーニングに使用される。このようなスクリーニングにおいて陽性を示すハイブリドーマをさらに増殖させ、限界希釈法によってクローン化される。さらにスクリーニングは、ヒト体液サンプルにおいてだけでなく溶液においてもｒｈＴＦに結合できる抗体を選定するために行われる。単離された抗体はさらに、親和性クロマトグラフィーを含むあらゆる適切な免疫学的技術によって精製することができる。特に好ましいＨ３６．Ｄ２．Ｂ７抗体を形成するハイブリドーマ菌株は、ブタペスト条約に従って、メリーランド州  １０８５２  ロックヴィル  パークローン・ドライブ  １２３０１所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されている。ハイブリドーマ菌株は、１９９７年１月８日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号はＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２５５である。
【００３５】
ヒトの治療の用途としては、キメラ抗体誘導体、例えばヒトでない動物の可変領域とヒトの定常領域を組み合わせる抗体分子を形成し、それにより対応する非キメラ抗体よりも被検人体において抗原性の低い抗体を与えることが望ましい。このようなキメラ抗体の様々なタイプは、例えば、ヒト可変領域キメラは、可変領域、可変領域の一部、特に抗体結合ドメインの保存領域がヒト由来のものであり、超可変領域のみがヒト由来でない部分として製造される。ヒト化されたキメラ抗体及びその製法については、S.L. Morrison, Science, 229:1202-1207(1985); Oi et al., Bio Techiques, 4:214(1986); Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:7308-7312(1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279(9183); Olsson et al., Meth. Enzymol., 9-3-16(1982) も参照されたい。さらに、トランスジェニックマウスを使用することができる。例えば、種々のヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスを作り、これを未変性のヒトＴＦで免疫する。このような免疫されたトランスジェニックマウスから採取された脾臓を、前述の未変性のヒトＴＦと特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るのに使用することができる。N. Lonberg et al., Nature, 368:856-859(1994); L.L. Green et al., Nature Genet., 7:13-21(1994); S.L. Morrison, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6851-6855(1994)を参照されたい。
【００３６】
本発明の抗体をコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（後述の実施例１に記載のプライマーを参照されたい）によっても製造することができる。一般には、Sambrook et al., Molecular Cloning (2d ed. 1989)を参照されたい。このような核酸はまた、公知の方法、例えばリン酸トリエステル化方法（IRL Press (M.J. Gait, ed., 1984) オリゴヌクレオチド合成参照）、又は市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用することによって合成されることができる。このようにして製造された本発明の核酸は、公知の技術により、本発明の抗体を発現させるために使用することができる。例えば、本発明の抗体をコードする核酸は、公知の方法、例えば、その構築物をベクターに挿入するために制限酵素を用いてベクターを切断し、次いで制限酵素を用いて結合させることにより、適切なベクターに挿入される。挿入された核酸配列を含有するベクターを、制御可能なプロモーター配列に適宜連結させて、発現のために宿主細胞に導入する。一般的には、前述のSambrook et al., を参照されたい。好適なベクターの選択は、クローニングのプロトコルに基づいて経験的に選択される。例えば、ベクターは互換性があり、使用される宿主細胞に適切なレプリコン（replicon）を有するものが使用される。さらに、ベクターは、挿入された核酸配列を収容できなければならない。好適な宿主細胞は、広範囲の真核細胞又は大腸菌等のような原核細胞を含んでよい。
【００３７】
本発明の抗体の分子量は、使用目的や、抗体が医薬品レベル又は検出可能なレベル、抱合化又は組み換えにより融合される毒素などを含有しているか等の様々な要因によって変化するであろう。また、分子量は、性質や、翻訳後の抗体の何らかの修飾（例えばグルコシル化）の程度によっても変化するであろう。このような修飾とは、糖鎖の無い抗体を産生する大腸菌や糖鎖を有する抗体を産生する哺乳類の細胞を用いて発現させるために使用される宿主細胞の有する機能によるものである。一般に本発明の抗体は、約２０〜１５０ｋＤａの範囲の分子量を有するであろう。このような分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動のような分子量による分離の後にタンパク質の染色やウエスタンブロット解析により測定される。
【００３８】
“本発明の抗体”や他の同様な用語は、未変性のＴＦに結合する免疫学的に活性な断片だけでなく全免疫グロブリンを包含している。免疫グロブリン及びその免疫学的に活性な断片は、抗体結合部位（すなわち、未変性のヒトＴＦを認識することができ、かつ未変性のヒトＴＦに特異的に結合することができる抗体に特異的に結合されるエピトープ）を含む。抗体フラグメントとしては、例えば、免疫グロブリンのジスルフィド結合を切断することにより誘導される“半分子”であり単鎖免疫グロブリンであるＦａｂ，Ｆ（ｖ），Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２ フラグメント、又は他の好適な抗体結合フラグメントである（例えば、Bird et al., Science, pp.242-424(1988); Huston et al., PNAS, (USA), 85:5879(1988); Webber et al., Mol. Immunol., 32:249(1955)参照）。抗体やその免疫学的に活性な断片は動物のもの（例えば、マウスやラットのような齧歯類）、キメラ型（Morrison et al., PNAS, 81:6851(1984); Jones et al., Nature, pp. 321, 522(1986)参照）であってもよい。本発明の単鎖の抗体は好ましい。
【００３９】
同様に、“本発明の核酸”とは、前記した本発明の抗体を提供するための発現し得る核酸配列を包含している。
【００４０】
前述したように、本発明の抗体は好ましくはヒトのような霊長類の哺乳動物に投与することができ、典型的には、１以上の医薬的に許容できる無毒の担体、例えば滅菌水や生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなグリコール、植物油などを含む組成物として投与され、ＴＦが介在する凝固活性に帰因する血栓閉塞疾患を予防又は緩和する。特に、生物学的適合を有する、生物分解性ラクチドポリマー、ラクチドグリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンコポリマーは、ここに記載される抗体を含む組成物の遊離を調節する有用な賦形剤である。他の潜在的に有用な投与システムはエチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透ポンプ（osmotic pumps）、及び移植可能な注入システム及びリポソームを含む。一般的に、本発明の抗凝固組成物は溶液又は懸濁液の形状（又は溶液又は懸濁液にもどすことができる凍結乾燥製剤）で、約０．０１％〜１０％（ｗ／ｗ）の本発明の抗体、好ましくは約０．０１％〜５％の抗体を含むのが好ましい。抗体は、組成物における単独の活性成分として、又は１以上の他の抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ヒルジン又はヒルログ、クマリン、ワルファリン）、抗血小板物質（例えば、アスピリン、プラビックス（Plavix）、チクリッド（Ticlid）、レオプロ（ReoPro）、インテグリリン（Integrilin）又はアグレスタット（Aggrestat））、又は血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）を含む混合製剤として投与することができる。さらに、本発明の抗体は、所望の抗凝固活性を高め増長するために１以上の適当な抗凝固剤、抗血小板又は血栓溶解剤の投与の前後に投与することができる。
【００４１】
前述したように、本発明の抗体は、医療器具、例えばカテーテル、ステント等の侵襲性のデバイスに生じる潜在的な血液凝固を少なくするために使用することができる。一つの好ましい方法において、これらの器具は、体液との接触する前に、本発明の抗体で処理される（例えば、１ｍｇ／ｍｌ生理食塩水溶液として）。その代わりに、あるいはそれに加えて、本発明の抗体は血液凝固を最小限にするのに十分な量で体液と混合することができる。
【００４２】
本発明の治療用の抗凝固剤組成物は、特に溶液の状態で、腸管外又は静脈内投与における使用に適している。このような組成物は、単位投与で簡便にく投与することができ、公知の医薬技術の方法に従って製造することができる。Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.,Easton PA,(1980)を参照されたい。“単位投与”は、ヒトのような霊長類への単位投薬量として適している物理的に分離された単位で使用される本発明の治療用組成物を意味しており、それぞれの単位は、適当な希釈剤又は担体と混合されて所望の治療効果を奏するように予め計算された量の活性物質を含有している。単位投与は、治療される血栓症のタイプや重症度、抗体を利用する対象の血液凝固システムの能力、所望のＦＸ（又はＦＩＸ）活性化の阻害又は中和の程度などの様々な要因によって決定される。一般に、投与される抗体の正確な量は、医師の判断によって決められるが、単位投与は、一般に投与の方法によって決まり、１日につき１０ｎｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、より一般的には１日につき１００ｎｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でる。追加免疫剤の最初の投与に好適な処方は様々であるが、最初の投与に続いて１時間以上の間隔でその後の注射剤や他の投与が繰り返されることが一般的である。あるいは、血中濃度が少なくとも約１０ｎＭから１０μＭの抗体の濃度を維持するために連続的又は断続的な静脈内注射が行われてもよい。
【００４３】
場合によっては、望ましい生物学的、化学的又は物理学的性質を与えるために、本発明の抗体を修飾することが好ましい。さらには、薬物、例えばフィブリン溶解活性を与えるｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼ、又はウロキナーゼのようなフィブリン薬剤へ、又はフィブリン結合ドメインのようなターゲティング剤と、抗体との抱合体（すなわち、共有結合による）を形成させることも有用となる。このような複合体は、例えばＳＰＤＰ、カルボジミド等のヘテロ二官能性タンパク質架橋剤のような架橋分子の使用などのいくつかの方法、又は組み換え法によって行われ得る。
【００４４】
フィブリン溶解剤のような薬物に加え、本発明の抗体は、例えば植物又は細菌由来のもの、例えばジフテリア毒素（すなわち、ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、プセウドモナス体外毒素（ＰＥ）、ヤマゴボウ抗ウィルスプロテイン、又はゲルオニンのような毒素と抱合化することもできる。生物学的に、このような毒素の活性断片は公知であり、例えばＤＴ  Ａ鎖及びリシン  Ａ鎖を含む。毒素は、ホスホリパーセ（例えばホスホリパーゼＣ）のような細胞表面で活性を有する物質であってもよい。他の例としては、毒素は、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトリキサート、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、又はシスプラチンのような化学療法剤であってもよく、又は毒素は、例えばヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８又はビスマス−２１２のような放射性核種であってもよい（一般には、Moskaug et al., J. Biol. Chem., 264:15709(1989); I. Pastan et al., Cell, 47:641(1986); Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem., 61:331(1992); Chimeric Toxins Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25:355(1982); ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／２９３５０；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／０４６８９；及び米国特許第５，６２０，９３９号を参照されたい）。また前述したように、毒素に加え、本発明の抗体は、哺乳動物への投与により補体結合能及び抗体依存細胞媒介性細胞毒性を与えるエフェクター分子（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３）と抱合化することができる。
【００４５】
このような抗体−細胞毒性や抗体−エフェクター分子の抱合体は、その治療に有効な量を、癌細胞、免疫系細胞又はＴＦを発現できる内皮を有する又は有すると推定されている哺乳動物、好ましくはヒトのような霊長類に投与することができる。このような癌細胞、免疫系細胞や内皮の例は、乳及び肺の悪性腫瘍、単球及び血管内皮を含む。
【００４６】
本発明の抗体はまた、前述したものに加え、他の様々な薬剤、例えば薬物、酵素、ホルモン、放射性核種を結合できるキレート剤、及び病気の診断や治療に有用な他のタンパク質やポリペプチドとも抱合化することができる。診断目的に関しては、本発明の抗体は、検出用にラベル化するか又せずに使用することができる。例えば、種々のラベル、例えば放射性核性、フッ素、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、例えばハプテンのようなリガンド等をこの抗体を検出するためのラベルとして好適に使用される。
【００４７】
診断方法では、インビボでの画像診断も提供される［例えば、A.K. Abbas, Cellular and Molecular Immunology, pg.328 (W.B. Saunders Co.1991)参照］。ほとんどのインビボ画像用途では、本発明の抗体は、例えば１２５Ｉ、３２Ｐ、９９Ｔｃ又は他の検出タグで検出用にラベルされ、続いて哺乳動物、特にヒトに、抗体を所望の標的と接触させるに十分な予め決定された時間に投与することができる。その対象物を、抗体の結合を検出するためにシンチグラフカメラ解析のような公知の方法で走査する。その解析は、ここで具体的に開示されるような多くの血栓症の診断や治療において有用となる。その方法は、心臓外科、特に血管形成、又は血栓の望ましくない形成が起こりうる外科的処置に関して使用される時、血栓の成長や動きを視覚化し、特に有用である。
【００４８】
本発明の抗体は、また実質的に純粋（例えば、少なくとも約９０％純度、好ましくは少なくとも約９６又は９７％純度）な未変性のＴＦ、特に生物学的サンプルから採取される未変性のヒトＴＦを調製するために使用できる。例えば、未変性のＴＦは、既述されているように得られ（例えば、L.V.M. Rao et al., Thrombosis Res., 56:109(1989)を参照）、カップリング反応混合物を形成する抗体を含有する固体支持体と溶液を混合することによって精製される。固体支持体としては、例えば、マイクロタイタープレートのようなプレート壁を含み、またポリスチレン、ポリ塩化ビニル、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標登録）（ファーマシアファインケミカルズ）のような架橋デキストラン、アガロース、ポリスチレンビーズ（アボットラボラトリーズ）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋形ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又はナイロン等からなるか又はこれらを含んでいる支持体も含む。このＴＦは、標準的な免疫技術に従って実質的に純粋な形態で固体支持体から分離することができる。一般には前述のHallow and Lane 及び前述のAusubel et al.を参照されたい。
【００４９】
前述したように、本発明の抗体は、生物学的サンプルにおいて未変性のヒトＴＦ、特に血栓と関連した未変性のＴＦを検出するために使用することができる。生物学的サンプルとしては、例えば、血漿、血清、唾液、尿、大便、膣液、胆汁、リンパ液、眼水、脳脊髄液、細胞培地及び組織、特に心臓組織のような血管組織などが含まれる。サンプルは、例えば次に記載のものと関連する血栓症、好ましくは再狭窄を患っている疑いのある又は患っている哺乳動物から適切に選ぶことができる；経皮的経管的冠状動脈介入のような侵襲的処置、心肺バイパス外科、動脈内膜切除、末梢血管バイパス移植片、再建又は形成外科、関節置換術；心臓病、例えば心筋梗塞、心筋症、心臓弁膜症、安定狭心症、不安定狭心症、又は塞栓形成と関連した心房細動；播種性血管内凝固症候群を含む凝固障害、深部静脈血栓症、ステントやカテーテルのような医療器具の展開；ショック（例えば敗血症性ショックシンドローム）、血管損傷、肝臓病、脳出血、熱射病、悪性腫瘍（例えば膵臓、卵巣又は小肺細胞癌）、狼蒼、子癇、血管周囲閉塞症、及び腎臓病。
【００５０】
このようなアッセイでは、本発明の抗体は好適な原子又は分子、例えば放射性ヨード、トリチウム、ビオチン、又は例えばβ−ガラクトシダーゼ若しくはセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼのような酵素に結合して抗イディオタイプ抗体のような検出可能な生成物を生成することができる試薬、又は蛍光タグ（例えば、フルオレセイン又はローダミン）を、公知の方法に従って検出用にラベル化することができる。生物学的サンプルを検出用のラベル化された抗体と接触させた後、反応を起こしていないあらゆる抗体を、生物学的サンプルから分離し、ラベル（又は生成物）を、抗体キャプチャーアッセイ、抗体サンドウィッチアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫吸収等の従来の免疫学的方法によって検出することができる（前述のHarlow and Lane; 前述のAusubel et al.）。適切な対照サンプルにおいて検出されるよりも多く存在するラベル（又は生成物）は、当該生物学的サンプルに、未変性のＴＦの存在、特に血栓の存在を示すことになる。例えば、本発明の抗体は、検出用にラベル化して検出することができ、好ましくは未変性のＴＦの量を、抗体キャプチャーアッセイ、ＥＬＩＳＡ、抗体サンドウィッチアッセイ、ＲＩＡ、免疫沈降、免疫吸着等の標準的な免疫技術に従って計測することができる。ある場合では、特に組織が使用される時、免疫学的技術は、タンパク質構造を実質的に維持することが知られている試薬（例えば、稀ホルムアルデヒド）で組織を固定することを包含している。一般には、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989); Harlow and Lane in Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, NY (1988)を参照されたい。
【００５１】
本発明の抗体はまた、ある種の悪性細胞だけでなく、繊維芽細胞、脳細胞、免疫細胞（例えば単球）、上皮を含む未変性のＴＦを発現する細胞を検出し精製するために使用することができる。細胞を検出し精製する好ましい方法は従来の免疫学的方法（例えばＦＡＣＳのようなフローサイトメトリー法や免役パニング）を含む。未変性のＴＦを発現する細胞の実質的に純粋な集団は、臨床及び研究目的、例えばＴＦに結合する抗体をスクリーニングするための培養細胞のような細胞の株化に有用である。
【００５２】
本発明はまた、テストサンプル、特に血液、血漿等の体液、又は前述した組織  において未変性のＴＦ、特に未変性のヒトＴＦの検出用試験及び診断キットを提供する。診断用キットはＥＬＩＳＡフォーマットのようなあらゆる免疫学的に許容しうるフォーマットにおいて使され、生物学的サンプルにおける未変性のＴＦの存在や量を検出することができる。
【００５３】
また、上記で述べたように、本発明はヒト組織因子に特異的に結合し、結合複合体を形成するヒト型抗体に関する。組織因子は天然のものでも組み換えによるもの（ｒＨＴＦ）でもよい。好ましくは、複合体に結合する第Ｘ因子又は第ＩＸ因子が阻害される。本発明の好ましい態様において、ヒト型抗体はｈＴＦに対し、約１ｎＭ以下、好ましくは約０．５ｎＭ以下、より好ましくは約０．０１ｎＭから約０．４ｎＭの親和性定数（Ｋｄ）を有する。ヒト型抗体に対する親和性定数の決定に関しての詳細は実施例１１を参照されたい。「特異結合」という言葉は、このヒト型抗体がＴＦと共に検出可能な結合複合体を形成するが、その他の抗原とは結合しないで、当該複合体がＲＩＡ、ウェスタンブロット、及びＥＬＩＳＡ等の標準的な免疫学的方法により測定されることを意味する。
【００５４】
さらに、本発明のヒト型抗体のその他の特徴として、標準プロトロンビン（ＰＴ）凝固アッセイで測定される血液凝固にかかる時間を、少なくとも約５秒間延長する能力があげられる。好ましい態様において、アッセイにおけるヒト型抗体の量は約５ｎＭから約７５ｎＭ、より好ましくは約１０ｎＭから５０ｎＭである。例えば、下記の実施例１１（ヒト型抗体による標準ＰＴ凝固アッセイの方法を記載）を参照されたい。
【００５５】
本発明におけるその他の好ましいヒト型抗体は、組織因子好ましくはヒトＴＦに対してＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ−１２２５５のＨ３６．Ｄ２．Ｂ７から得られた抗体とほぼ同じかそれ以上の結合特異性を有する。同様に、ＴＦに対して、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ−１２２５５のＨ３６．Ｄ２．Ｂ７から得られた抗体とほぼ同じかそれ以上の結合親和性を有するヒト型抗体も好ましい。結合特異性及び結合親和性を測定する方法は、当業者に公知であり、例えば以下に記載する特異的アッセイなどがあげられる。
【００５６】
さらに本発明におけるヒト型抗体は、ネズミの相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含有する。当然ながら、免疫グロビンの軽鎖及び重鎖は、特定の構造上の類似点を共有する。例えば、両方とも比較的配列が保存されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ１−４）を有する。各々のＦＲ１−４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）は、それぞれ３つのＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に共有結合している。一般に、４つのＦＲは主にベータシート構造からなり、相互に連結したＣＤＲはベータシート構造の一部に結合、あるいは一部を形成しているループを形成すると考えられている。多くのＣＤＲは、隣接するＦＲの近くにあり、反対側の軽鎖又は重鎖の対応するＣＤＲと共に抗原結合部位の形成を助けている。種々のＣＤＲ及びＦＲが開示されている。例えば、「Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office (1987)」を参照されたい。
さらに、「ＥＰ−Ａ−０２３９４００」及び「米国特許番号５，９８５，２７９」（ＦＲではなく、ＣＤＲが異なる種に由来する変異した抗体（altered antibodies）の調製方法が記載されている。）も参照されたい。
【００５７】
「ヒト型」という言葉は、ヒトフレームワーク領域と、通常ラット又はマウスなどの齧歯類の動物の免疫グロビンに由来するＣＤＲを少なくとも１つ含有する免疫グロビンを意味する。ＣＤＲを提供する動物の免疫グロビンは「ドナー」と呼ばれ、ヒトの免疫グロビンは「アクセプター」と呼ばれる。例えば、これらの免疫グロブリンの定常領域には、特定のＴＦ結合フラグメントは、必ずしも存在する必要はない。もし存在する場合には、好ましい定常領域はヒトの免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一又は相同、即ちアミノ酸配列の少なくとも約９０％が相同であり、好ましくは、少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である。従って、ヒト型の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲを除いたほとんど全ての部分が、対応する天然のヒトの免疫グロブリンの配列と実質的に相同である。
【００５８】
「ヒト型抗体」という言葉は、ヒト型の軽鎖及びヒト型の重鎖の免疫グロブリンを含有する抗体を意味する。これらの抗体の製造方法及び使用方法は、すでに上記に記載されている。また、「S.L. Morrison,（上記記載）」、「Oi et al.,（上記記載）」、「Teng et al.,（上記記載）」、「Kozbor et al.,（上記記載）」、「Olsson et al.,（上記記載）」、及び既に引用されたその他の文献も参照されたい。
【００５９】
例えば、ヒト型抗体の具体例としては、１）アミノ酸配列のそれぞれ少なくとも約９０％好ましくは少なくとも９５％が、対応するヒトフレームワーク（ＦＲｓ）と相同である軽鎖及び重鎖のフレームワーク（ＦＲｓ）を含有し、２）マウス由来のＣＤＲを少なくとも１つ含有し、好ましくは全てのＣＤＲがマウス由来であり、３）少なくとも約９０％好ましくは少なくとも９５％が、対応するヒトの免疫グロブリンの定常領域と相同である免疫グロビン定常領域を含有するものがあげられる。ドナー抗体は、得られたヒト型抗体がＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されるため、「ヒト型」の過程において「ヒト型になる」と考えられる。
【００６０】
さらに、本明細書に記載されているヒト型抗体は、アミノ酸配列中の１つ又は２つ以上のアミノ酸が保存的に置換されていてもよく、それは連続的であっても非連続的であってもよい。例えば、このような置換は一般に抗原への結合又はその他の免疫グロブリン機能に対し、実質的にほとんど影響を与えないか、全く影響を与えない。複数形を含む「保存的な置換」という言葉は、ｇｌｙ←→ａｌａ、ｖａｌ←→ｉｌｅ←→ｌｅｕ、ａｓｐ←→ｇｌｕ、ａｓｎ←→ｇｌｎ、ｓｅｒ←→ｔｈｒ、ｌｙｓ←→ａｒｇ、及びｐｈｅ←→ｔｙｒの組み合わせを包含している。
【００６１】
さらに、ヒト型抗体は、少なくとも１つの未変性のヒト免疫グロブリン配列の対応する可変領域に対し、アミノ酸配列の少なくとも７０％が相同（例えば約７３％から７５％の相同性）である可変領域を有する。さらに、本発明のヒト型抗体は、少なくとも１つのヒト抗体に対し、抗体全体の少なくとも９０％が相同である。
【００６２】
本発明のより具体的なヒト型抗体としては、各フレームワーク（ＦＲ）１、２、３、４が、図１２Ａ（配列番号５乃至４８）に示される軽鎖ＦＲ配列、好ましくは図１２Ａにおいて「ＬＣ−０９」に示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列の相同、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同であるものがあげられる。より好ましくは、図１４Ａ又は図１５Ａ（配列番号１１４又は１１６）に示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列が相同、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上の配列が相同である軽鎖の定常領域を含有するヒト型抗体があげられる。
【００６３】
さらに具体的なヒト型抗体としては、各フレームワーク（ＦＲ）１、２、３、４が、図１３Ａ（配列番５２乃至１０７）に示される重鎖配列、好ましくは図１３Ａにおいて「ＨＣ−０８」に示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列が相同、好ましくは約９５％又はそれ以上が相同であるものがあげられる。その他のヒト型抗体は、図１４Ｂ又は図１５Ｂ（配列番号１１５又は１１７）に示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列が相同、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である重鎖の定常領域を有する。
ある特定の態様において、ヒト型抗体はＩｇＧ１（ｈＯＡＴ）又はＩｇＧ４（ｈＦＡＴ）のアイソタイプを有する。実施例９を参照されたい。
【００６４】
また本発明は、本明細書に記載されているヒト型抗体の機能的なフラグメントを提供する。好ましいフラグメントは約１ｎＭ以下、好ましくは約０．５ｎＭ以下、より好ましくは約０．０１ｎＭから約０．４ｎＭの親和性定数（Ｋｄ）で、ＴＦに特異的に結合する。特に好ましいものとして、抗原結合性のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２フラグメントがあげられる。
【００６５】
上記で述べたように、本発明は、ネズミの相補決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を少なくとも１つ含有するヒト型抗体に関する。好ましい態様において、抗体はヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合し複合体を形成する。特に、ＴＦ又はＴＦ：ＶＩＩａに結合する第Ｘ因子及び第ＩＸ因子、及び、ＴＦ：ＦＶＩＩａによる活性化が阻害される。上記で述べたように、好ましいＣＤＲ（軽鎖及び重鎖の）は、齧歯類の動物特にマウスに由来するものである。
本発明のヒト型抗体のある態様において、抗体はさらに、ヒトフレームワーク（ＦＲ）領域を少なくとも１つ含有する。好ましくは、全てのＦＲ領域（軽鎖及び重鎖の）がヒト由来のものである。
【００６６】
より好ましい態様において、重鎖超可変領域の第１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、図１３Ｂ（配列番号１０８及び１０９）に示されるＣＤＲ１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である。また、重鎖超可変領域の第２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、図１３Ｃ（配列番号１１０及び１１１）に示されるＣＤＲ２のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である。同様に好ましくは、重鎖超可変領域の第３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、図１３Ｄ（配列番号１１２及び１１３）に示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％が相同であり、より好ましくは約９５％又はそれ以上が相同である。
２つの核酸の配列の相同性は、解析及び／又はＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等の従来のコンピューターソフトウェアの使用によって測定することができる。
【００６７】
本発明のその他の態様において、軽鎖超可変領域の第１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、図１２Ｂ（配列番号４９）に示されるＣＤＲ１のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である。また、軽鎖超可変領域の第２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、図１２Ｃ（配列番号５０）に示されるＣＤＲ２のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％が相同であり、好ましくは約９５％又はそれ以上が相同である。好ましくは、軽鎖超可変領域の第３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、図１２Ｄ（配列番号５１）に示されるＣＤＲ３のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％が相同であり、より好ましくは約９５％又はそれ以上が相同である。
【００６８】
本発明のその他のヒト型抗体は、図１３Ａにおいて「ＦＲ１  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列（配列番号６０）に対し、少なくとも９０％が相同であり、好ましくは約９５％又はそれ以上が相同である重鎖超可変領域の第１番目のフレームワーク（ＦＲ１）を含有する。ある態様において、ＦＲ１は以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを含有する：Ｅ１→Ｑ、Ｑ５→Ｖ、Ｐ９→Ｇ、Ｌ１１→Ｖ、Ｖ１２→Ｋ、Ｑ１９→Ｒ、Ｔ２４→Ａ。好ましくは、ＦＲ１はこれらの置換のうち２、３、４、５、又は６個の置換を有し、これらすべてのアミノ酸が置換されることは種々の用途において好ましい。
【００６９】
さらに、本発明のヒト型抗体は、図１３Ａにおいて「ＦＲ２  ＨＣ−０８」に示される配列（配列番号７４）に対し、少なくとも９０％が相同であり、好ましくは約９５％又はそれ以上が相同である重鎖超可変領域の第２番目のフレームワーク（ＦＲ２）を含有する。ある態様において、ＦＲ２は以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する：４１Ｈ→Ｐ、４４Ｓ→Ｇ。好ましくは、ＦＲ２これらの両方のアミノ酸置換を有する。
【００７０】
本発明はまた、図１３Ａにおいて「ＦＲ３  ＨＣ−０８」に示される配列（配列番号８８）に対し、少なくとも９０％が相同であり、好ましくは約９５％又はそれ以上が相同である重鎖超可変領域の第３番目のフレームワーク（ＦＲ３）を有するヒト型抗体に関する。ある態様において、ＦＲ３は以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する：７６Ｓ→Ｔ、７７Ｔ→Ｓ、８０Ｆ→Ｙ、８２Ｈ→Ｅ、８４Ｎ→Ｓ、８７Ｔ→Ｒ、８９Ｄ→Ｅ、９１Ｓ→Ｔ。好ましくは、ＦＲ３はこれらのアミノ酸置換のうち２、３、４、５、又は６個の置換を有し、一般にこれら７個すべてのアミノ酸が置換されていることが好ましい。
【００７１】
また、図１３Ａにおいて「ＦＲ４  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列（配列番号１０２）に対し、少なくとも９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である重鎖超可変領域の第４番目のフレームワーク（ＦＲ４）を有するヒト型抗体に関する。好ましくは、ＦＲ４は以下のアミノ酸置換を有する：１１３Ｌ→Ｖ。
本発明のその他のヒト型抗体は、図１２Ａにおける「ＦＲ１  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列（配列番号１２）に対し、少なくとも約９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である軽鎖超可変領域の第１番目のフレームワーク（ＦＲ１）を有する。ある態様において、ＦＲ１は以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する：１１Ｑ→Ｌ、１５Ｌ→Ｖ、１７Ｅ→Ｄ、１８→Ｒ。好ましいＦＲ１はこれらのアミノ酸置換のうち２又は３個の置換を有し、一般にこれら４個すべてのアミノ酸が置換されていることが好ましい。
【００７２】
また、本発明は、図１２Ａにおいて「ＦＲ２  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列（配列番号２３）に対し、少なくとも約９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である軽鎖超可変領域の第２番目のフレームワーク（ＦＲ２）を有するヒト型抗体に関する。好ましいＦＲ２は以下のアミノ酸置換を有する：３７Ｑ→Ｌ。
本発明はまた、図１２Ａにおいて「ＦＲ３  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列（配列番号３４）に対し、少なくとも約９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である軽鎖超可変領域の第３番目のフレームワーク（ＦＲ３）を有するヒト型抗体を包含する。ある態様において、ＦＲ３は以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する：７０Ｋ→Ｄ、７４Ｋ→Ｔ、８０Ａ→Ｐ、８４Ａ→Ｖ、８５Ｎ→Ｔ。好ましくは、ＦＲ３はこれらのアミノ酸置換のうち２、３、又は４個の置換を有し、一般にこれら５個すべてが置換されていることが好ましい。
【００７３】
本発明のその他のヒト型抗体は、図１２Ａにおいて「ＦＲ４  ＬＣ−０９」に示される配列（配列番号４５）に対し、少なくとも約９０％が相同であり、好ましくは少なくとも約９５％又はそれ以上が相同である軽鎖超可変領域の第４番目のフレームワーク（ＦＲ４）を有する。ある態様において、ＦＲ４は以下のアミノ酸置換のうち少なくとも１つ、好ましくは全ての置換を有する：１００Ａ→Ｑ、１０６Ｌ→Ｉ。
本発明はまた、前述のヒト型抗体におけるヒトＴＦへの結合フラグメントに関する。これらのフラグメントの例としてＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）２があげられる。
【００７４】
ある特定の態様において、本発明は、齧歯類、一般にマウスの相補決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも１つ含有するヒト型抗体であることを特徴とする。好ましくは、その抗体は、ヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合し複合体を形成する。この複合体において、ＴＦ又はＴＦ／ＶＩＩａに結合する第Ｘ因子と第ＩＸ因子、及び、ＴＦ／ＶＩＩａによる活性化が阻害される。また、好ましくは、重鎖のヒト型抗体は、以下の構成要素のうち少なくとも１つ、より好ましくはすべてを含有する：
ａ）図１３Ｂ（配列番号１０８及び１０９）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｂ）図１３Ｃ（配列番号１１０及び１１１）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｃ）図１３Ｄ（配列番号１１２及び１１３）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｄ）図１３Ａ（配列番号５２乃至６５）において「ＦＲ１  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第１番目のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｅ）図１３Ａ（配列番号６６乃至７９）において「ＦＲ２  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第２番目のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｆ）図１３Ａ（配列番号８０乃至９３）において「ＦＲ３  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第３番目のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｇ）図１３Ａ（配列番号９４乃至１０７）において「ＦＲ４  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第４番目のフレームワーク（ＦＲ４）。
【００７５】
ある特定の態様において、軽鎖のヒト型抗体は同様に、以下の構成要素のうち少なくとも１つ、より好ましくはすべてを含有する：
ｈ）図１２Ｂ（配列番号４９）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｉ）図１２Ｃ（配列番号５０）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｊ）図１２Ｄ（配列番号５１）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｋ）図１２Ａ（配列番号５乃至１５）において「ＦＲ１  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第１番目のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｌ）図１２Ａ（配列番号１６乃至２６）において「ＦＲ２  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第２番目のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｍ）図１２Ａ（配列番号２７乃至３７）において「ＦＲ３  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第３番目のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｎ）図１２Ａ（配列番号３８乃至４８）において「ＦＲ４  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％が相同である第４番目のフレームワーク（ＦＲ４）。
好ましくは、ヒト型抗体はさらに、図１４Ａ（配列番号１１４）又は図１５Ａ（配列番号１１６）の軽鎖定常配列を含有する。同様に好ましくは、抗体は図１４Ｂ（配列番号１１５）又は図１５Ｂ（配列番号１１７）の重鎖定常領域を含有する。
【００７６】
また、本発明は以下の構成要素のうち少なくとも１つ、より好ましくはすべてを含有する重鎖のヒト型抗体に関する：
ａ）図１３Ｂ（配列番号１０８及び１０９）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列と相同である第１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｂ）図１３Ｃ（配列番号１１０及び１１１）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列と相同である第２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｃ）図１３Ｄ（配列番号１１２及び１１３）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列と相同である第３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｄ）図１３Ａ（配列番号５２乃至６５）において「ＦＲ１  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列と相同である第１番目のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｅ）図１３Ａ（配列番号６６乃至７９）において「ＦＲ２  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列と相同である第２番目のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｆ）図１３Ａ（配列番号８０乃至９３）において「ＦＲ３  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列と相同である第３番目のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｇ）図１３Ａ（配列番号９４乃至１０７）において「ＦＲ４  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列と相同である第４番目のフレームワーク（ＦＲ４）。
【００７７】
ある態様において、軽鎖のヒト型抗体はさらに、以下の構成要素のうち少なくとも１つ、より好ましくはすべてを含有する：
ｈ）図１２Ｂ（配列番号４９）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列と相同である第１番目のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｉ）図１２Ｃ（配列番号５０）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列と相同である第２番目のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｊ）図１２Ｄ（配列番号５１）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列と相同である第３番目のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｋ）図１２Ａ（配列番号５乃至１５）において「ＦＲ１  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列と相同である第１番目のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｌ）図１２Ａ（配列番号１６乃至２６）において「ＦＲ２  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列と相同である第２番目のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｍ）図１２Ａ（配列番号２７乃至３７）において「ＦＲ３  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列と相同である第３番目のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｎ）図１２Ａ（配列番号３８乃至４８）において「ＦＲ４  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列と相同である第４番目のフレームワーク（ＦＲ４）。
好ましくは、ヒト型抗体はさらに、図１４Ａ（配列番号１１４）又は図１５Ａ（配列番号１１６）の軽鎖定常配列を含有する。同様に好ましくは、抗体は図１４Ｂ（配列番号１１５）又は図１５Ｂ（配列番号１１７）の重鎖定常領域を含有する。
【００７８】
本発明のヒト型抗体は、抗体全体の形態の他に種々の適した形態で存在してもよい。例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２、及び、二官能性のハイブリッド抗体（例えばLanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)）、及び単鎖（例えばHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)、及びBird et al., Science 242, 423-426 (1988)これらの文献は、参照することにより本明細書に取り込まれる）などがあげられる。また、Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y.,2.sup.nd ed.(1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) and Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)（これらの文献は参照することにより本明細書に取り込まれる）も参照されたい。
【００７９】
複数形を含む「キメラ抗体」及びこれに関連する言葉は、軽鎖及び重鎖の遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリンの遺伝子のセグメントから、一般に遺伝子操作により構築された抗体を意味する。例えば、マウスモノクローナル抗体の遺伝子の可変（Ｖ）部分は、γ１γ３等のヒトの定常（Ｃ）部分に結合することができる。したがって、一般的な治療用キメラ抗体は、Ｖ（可変部分）又はマウス抗体の抗原結合ドメイン、及び、Ｃ（定常部分）又はヒト若しくはその他の哺乳類の抗体のエフェクタードメインからなるハイブリッド蛋白質である。特に好ましいキメラ抗体は、本明細書に記載されているｃＨ３６マウス−ヒトキメラである。
【００８０】
本発明のヒト型抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、必要に応じてＩｇＧ１又はＩｇＧ４のアイソタイプを有する。
本明細書に記載されているヒト型抗体は、上記ですでに参照したストラテジー又はそれらを組み合わせることによって製造することができる。例えば、S.L.Morrison,（上記記載）；Oi et al.,（上記記載）；Teng et al.,（上記記載）；Kozbor et al.,（上記記載）；Olsson et al.,（上記記載）；及び先に引用されたその他の文献を参照されたい。
【００８１】
１つの方法として、４つの一般的なステップにより抗体をヒト型にすることができる。まず、軽鎖及び重鎖のマウス抗体のアミノ酸配列をｃＨ３６マウス−ヒトキメラ抗体から得た。２番目に、ヒト抗体のどのフレームワーク領域が「ベストフィット」するか、すなわち対応するマウスのフレームワークのアミノ酸配列に最も近いものを決定することにより、ｃＨ３６抗体をヒト型にした。３番目に、該当する軽鎖及び重鎖のＦＲ配列をヒト型にし、４番目に、ヒト型の軽鎖又は重鎖（又は、ヒト型の軽鎖及び重鎖、以下に記載されるメガベクター参照）をコードする単離された核酸で形質転換し、発現させる。
【００８２】
例えば、ヒト型の免疫グロブリンにおけるフレームワークの限られた数のアミノ酸を、アクセプターではなくドナー側のアミノ酸と同じになるように選択した。この方法の利点の１つは、ヒト型の免疫グロビン鎖を有する抗体の親和性を強めることである。米国特許番号５，９８５，２７９、米国特許番号５，６９３，７６２、及び、ＥＰ−Ａ０２３９４００（ヒト型抗体の製造に関する一般的な方法を開示している。）も参照されたい。
【００８３】
より詳細には、「ベストフィット」法はキメラ抗組織因子抗体ｃＨ３６のヒト型に適用され、特に好ましい方法である。この方法は、図１Ａ及び１Ｂ（配列番号２及び４）に示されるネズミの軽鎖及び重鎖の可変配列を使って、ネズミの可変ドメインに最も一致するヒト抗体における可変ドメインの配列について入手できるすべての蛋白質データベースが検索（「比較」）された。Kabat et al.,（上記記載）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及び関連プログラムなどの容易に入手できる多くのコンピュータープログラムを使用して、このステップを実施することができる。軽鎖及び重鎖のフレームワーク１、２、３、４は、抗原結合のためにＣＤＲを正しい位置に保つことが広く認識されているため、特に興味深い。検索の結果得られたのは、主として、照会したマウス配列に最も一致した配列のリスト、各配列に対する相同性の割合、対応するネズミの配列に対する一連の各ヒト配列であった。この分析は軽鎖及び重鎖においてそれぞれ実施された。
【００８４】
「ベストフィット」法によると、ミスマッチのアミノ酸の数は、照会したマウスのフレームワークの配列とデータベース上の対応するヒトのフレームワークの配列の間が最も少なくなる。多くの場合、適したヒトのフレームワーク領域は、以下に示すアイデンティティー基準に基づいて選択される。軽鎖におけるネズミのＦＲ１のアミノ酸配列は対応するヒトのＦＲ１に対し少なくとも約８０％が相同であり、ネズミのＦＲ２は対応するヒトのＦＲ２に対し少なくとも約９０％が相同であり、ネズミのＦＲ３はヒトのＦＲ３に対し少なくとも約９０％が相同であり、ネズミのＦＲ４は対応するヒトのＦＲ４に対し少なくとも約７５％が相同である。また、重鎖におけるネズミのＦＲ１のアミノ酸配列は対応するヒトのＦＲ１に対し少なくとも約８０％が相同であり、ネズミのＦＲ２はヒトのＦＲ２に対し少なくとも約８５％が相同であり、ネズミのＦＲ３は対応するヒトのＦＲ３に対し少なくとも約７０％が相同であり、ネズミのＦＲ４は対応するヒトのＦＲ４に対し少なくとも約９０％が相同であるように選択される。特に、同様のヒトのフレームワーク配列の候補を同定する際は、保存的なアミノ酸置換が好まれる。これらの要因を検討した結果、得られたヒトのフレームワークがキメラｃＨ３６抗体のヒト型を示す基準となることが分かった。
また可能であれば、「ベストフィット」法により、軽鎖及び重鎖におけるすべてのヒトフレームワークが、同じヒト抗体クローンに由来することが好ましい。
【００８５】
目的のヒトのフレームワークが決定されたら、組み換えポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、軽鎖及び重鎖において目的のアミノ酸置換が行われる。一般に、変異させる必要が無い部分を含有するマウスの可変ドメインフレームワークが、変異のためのオリゴヌクレオチドとして調製され、使用された。種々の長さのオリゴヌクレオチドが使用される。組み換えＰＣＲ及び関連方法に関する一般的な開示についてはＷＯ９２／０７０７５を参照されたい。
一般に、通常のＰＣＲはクローニングに使用され、クローニング又は診断用エンドヌクレアーゼ部位を導入し、また、可変領域の端にあるアミノ酸を置換させる。ＰＣＲに基づく（ＰＣＲベースの）変異は、複数のアミノ酸を同時に置換させるために、特にこれらのアミノ酸が可変領域の中央にある場合に使われる。特定部位の変異は同時に１つ又は２つのアミノ酸置換を導入するために行われる。各ステップの後、部分的にヒト型であるクローンが配列化され（sequenced）、その後、これらの可変領域の一部が発現ベクターにクローンされた。この操作のより詳しい方法は実施例に記載されている。
【００８６】
上記の「ベストフィット」法によりキメラｃＨ３６抗体をヒト型にし、フレームワーク及び／又はＣＤＲをコードする変異した核酸を、軽鎖又は重鎖の定常領域をコードする適当なＤＮＡに結合させた。その後、この構成を発現ベクターにクローンし、宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞に形質転換した。これらのステップは、公知の組み換え及び細胞培養技術により行った。したがって、本発明のヒト型抗体は以下の一般的な方法により作製できる：
（ａ）発現宿主に適したレプリコン、及び、少なくとも、「ベストフィット」法により作製されたヒト型のフレームワーク領域１−４、及びｃＨ３６抗体によるネズミのＣＤＲ１−３を有する、Ｉｇ重鎖又は軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に、制御可能に結合した適当なプロモーターを有する第１の発現ベクターの調製、
（ｂ）少なくとも、上記の「ベストフィット」法により作製された相補的なヒト型のフレームワーク領域１−４、及びｃＨ３６抗体によるネズミのＣＤＲ１−３を有する、それぞれ相補的なＩｇ軽鎖又は重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に、制御可能に結合した適当なプロモーターを有する第２の複製可能な発現ベクターの調製、
（ｃ）第１の又は両方の調製されたベクターを、細胞株にトランスフェクトし、
（ｄ）トランスフェクトされた細胞株を培養し、変異した抗体を作製する。
好ましくは、ステップ（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖における適当な定常ドメインをコードする。適当なアイソタイプとしては、例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ４があげられる。
【００８７】
また、本発明の適当なヒト型抗体は、少なくとも、「ベストフィット」法により作製されたヒト型のフレームワーク領域１−４、及びｃＨ３６抗体によるネズミのＣＤＲ１−３を有し、Ｉｇ重鎖又は軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に制御可能に結合した適当なプロモーターを有する単一の複製可能な「メガ」ベクターを調製ことによっても製造される。好ましくは、メガベクターはさらに、少なくとも上記の「ベストフィット」法により作製された相補的なヒト型のフレームワーク領域１−４、及びｃＨ３６抗体によるネズミのＣＤＲ１−３を有する、それぞれ相補的なＩｇ軽鎖又は重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に実施可能に結合した適当なプロモーターを有する。通常、メガベクターの使用は、単一ベクターからのヒト型抗体の発現が必要である本発明の態様に適する。
【００８８】
本発明のヒト型抗体及びその断片を作り上げるのに、適している方法がある。ひとつの態様において、少なくとも一つ、好ましくは以下の全てのステップが含まれているのが望ましい。
ａ）げっ歯類、好ましくはマウスの抗体の軽鎖のフレームワークと、収集された対応するヒト抗体のフレームワークのアミノ酸配列を比較する、
ｂ）収集されたヒトのフレームワークの配列の中から、対応するげっ歯類の軽鎖のフレームワークのアミノ酸配列の相同性が最大となる（即ち、少なくとも約７０％の配列の相同性を有する）ものを選択する、
ｃ）げっ歯類の軽鎖のフレームワークをコードするＤＮＡの断片を、ステップｂ）で選択されたヒトのフレームワークと実質的に相同（即ち、少なくとも約９５％の相同性がある）のアミノ酸配列を有するヒト化された軽鎖フレームワークをコードするように変異を起こさせる、
ｄ）ステップｂ）で選択された対応するそれぞれのヒト化フレームワークが、好ましくは同じ又は異なったヒト抗体である、ヒト化軽鎖フレームワークをコードするそれぞれの配列に基づく複数個のＤＮＡ配列を製造するために、げっ歯類の軽鎖のそれぞれのフレームワークについて、その数だけステップａ）〜ｃ）を繰り返す、
ｅ）げっ歯類の抗体の少なくとも軽鎖の可変領域をコードしている第一のベクターに、ステップｄ）で製造されたヒト化フレームワークの配列をコードしているＤＮＡ配列を結合する、そして
ｆ）結合されたベクターをヒト化抗体を製造するのに十分な条件下で、適した宿主に導入する。この方法で使用される好ましい軽鎖のフレームワークは、本明細書に開示されている特異的なマウスのもの及びヒト化された軽鎖フレームワークを含有している。
【００８９】
他の態様において、ヒト型抗体を製造するための次の方法は、さらに少なくとも一つ、好ましくは以下の全てのステップが含まれているのが望ましい。
ｇ）げっ歯類の重鎖のフレームワークと、収集された対応するヒト抗体のフレームワークのアミノ酸配列を比較する、
ｈ）収集されたヒトのフレームワークの配列の中から、対応するげっ歯類の重鎖のフレームワークのアミノ酸配列の相同性が最大となる（即ち、少なくとも約７０％の配列の相同性を有する）ものを選択する、
ｉ）げっ歯類の重鎖フレームワークをコードするＤＮＡの断片を、ステップｂ）で選択されたヒトのフレームワークと実質的に相同（即ち、少なくとも約９５％の相同性がある）のアミノ酸配列を有するヒト化重鎖フレームワークをコードするように変異を起こさせる、
ｊ）ヒト化重鎖フレームワークをコードするそれぞれの配列に基づいて、複数個のＤＮＡ配列を製造するために、ステップｇ）〜ｉ）を、それぞれのげっ歯類の重鎖のフレームワークについて、その数だけ繰り返す。好ましくは、ステップｈ）で選択された対応するヒト化フレームワークのそれぞれは、同じ又は異なったヒト抗体である。この方法で使用される重鎖フレームワークの配列は、本明細書に開示されている特異的なネズミのもの及びヒト化重鎖フレームワークを画乳している。
【００９０】
さらには、ヒト型抗体を製造するより詳しい方法は、げっ歯類の抗体の少なくとも重鎖の可変領域をコードする第二のベクターに、ステップｊ）で製造されたヒト化フレームワークの配列をコードするＤＮＡ配列を結合する方法である。そして、これらの結合された第一及び第二のベクターをヒト型抗体を製造するのに十分な条件下で、宿主に導入する。
【００９１】
先に述べたとおり、本発明のヒト型抗体を発現させるのは、単一のベクターによる方法が好ましい。当該ベクターは、場合によっては「メガ」ベクターとすることもできる。ひとつの態様において、少なくともげっ歯類の抗体の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域をコードする第一のベクターに、ステップｊ）で製造されたヒト化フレームワークの配列をコードするＤＮＡ配列を結合し、そしてさらに結合された第一のベクターを、ヒト型抗体を製造するのに十分な条件下で、宿主に導入する。
【００９２】
「結合する(assembling)」又は「結合した(assembled)」という語句は、従属するヒト化フレームワークをコードするＤＮＡ配列をベクターに導入するための標準的な組み換え技術の使用を意味する。そのような結合は、以下の手法の一つあるいはそれらの組合せにより行うことができるが、これらに限定されるものではない。ひとつのフレームワークに変異を繰り返して（iterative changes）導入すること。フラグメントを切断し、結合すること（制限酵素及びリガーゼの使用による）。又は、合成法によりＤＮＡを合成すること。一般的には、上記のHarlow及びLane、Ausubel et al.を参照。
【００９３】
前述のヒト型抗体を製造する方法は、条件を満たしているほとんど全ての変異誘発法によって実施可能である。特に、前記のステップｃ）及びｉ）の片方あるいは両方のステップにおいては、部位に直結した変異誘発法（site directed mutagenesis）又は標準的なＰＣＲ法によって、げっ歯類のフレームワーク中の所望の部位のアミノ酸を適切なヒトアミノ酸に置換することができる。一般的に、修飾された（ヒト化された）フレームワークの配列は、データベースから選択されたヒトのフレームワークに対応している。
【００９４】
ヒト型抗体は、前述のS.L.Morrison, Oi et al., Teng et al., Kozbor et al. Olsson et al.その他の文献において開示されている、適切な組換え発現法により製造可能である。
例えば、本発明の核酸は、本明細書にて開示されているヒト型抗体又はその断片の重鎖又は軽鎖の少なくとも一つをコードするものである。一般的に、核酸は、単離された核酸を含む組換えＤＮＡベクターである。一般に、ＤＮＡベクターは、ヒト型化された免疫グロブリンのコーディング配列に制御可能に結合している、天然由来の又は異種プロモーター領域を含む発現制御ポリヌクレオチド配列をさらに含有している。好ましくは、発現制御配列は、宿主真核細胞に核酸を導入又は感染可能なベクター内の真核プロモーターシステムであるが、原核細胞の宿主のための制御配列もまた使用可能である。ひとたびベクターが適した宿主に組み込まれると、宿主は当該ヌクレオチド配列がハイレベルで発現できる条件に維持される。そして、必要であれば、次いでＬ鎖、Ｈ鎖、Ｌ鎖／Ｈ鎖二量体、もしくは完全な抗体、結合フラグメント、又はその他の免疫グロブリン型を採取し、精製する。
【００９５】
最終的に所望のヒト型抗体を発現することが可能な本発明の核酸配列は、多種多様な手法によってのみならず、多種多様なポリヌクレオチド（ゲノム、又はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、その他）、及びコンポーネント（即ちＶ、Ｊ、Ｄ及びＣ領域）から調製される。ゲノムの適切な部位に合成配列を結合させることは現在もっとも一般的な製造方法である。しかしｃＤＮＡ配列もまた利用できる。詳しくは、例えば前述のS.L.Morrison, Oi et al., Teng et al., Koabor et al., Olsson et al.；欧州特許出願公開番号０２３９４００、及びRiechmann, L. et al., Nature, 332,323-327(1988)及びそれらに引用されている文献を参照されたい。
【００９６】
他の態様において、ＤＮＡ発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を検出可能にするために、一つあるいは二つ以上の選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はネオマイシンを含有している（詳しくは本明細書に援用されている米国特許番号第４，７０４，３６２号参照）。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングするのに特に有用な原核細胞の宿主の一種である。使用に適しているその他の微生物の宿主は、枯草菌等のバシラス菌科、サルモネラ菌、セラチア等のその他腸内細菌科、放線菌（例えばストレプトマイセス類）、イースト菌（例えばサッカロミセス類）、又はカビ（例えばアスペルギルス類）等の種々のシュードモナス菌類、及びその他の微生物を含むが、これに限定されるものではない。これら原核生物の宿主においては、一般的に宿主と相性がよい発現制御配列を含む発現ベクターを調製することができる（例えばプロモーター及び複製起点）。さらには、種々の既知のプロモーターが多数存在する。例えばラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ベータ−ラクタマーゼプロモーターシステム、又はファージ・ラムダのプロモーターシステム等である。プロモーターは一般的に発現を制御し、随意的にオペレーター配列を伴うことがある、そして複写及び翻訳を完了するためのリボソーム結合部位配列などを持つ。イースト菌等のその他の微生物もまた発現のために使用されることがある。サッカロミセスは、発現制御配列を持つベクター、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼ又はその他の糖分解酵素を含むプロモーター、並びに複製起点、ターミネーション配列及びその他の所望のものを持つベクターにおいて、好ましい宿主である。植物（例えばアラビドプシス、ニコチニア等）及び植物細胞もまた本発明の抗体を発現させ、製造するのに使用することができる。
【００９７】
前記した微生物に基づくシステムに加えて、哺乳類の組織細胞培養もまた本発明のポリペプチドを発現させ、製造するのに使用することができる（詳しくはWinnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y.,N.Y.(1987)を参照のこと。）。
多くの場合、真核細胞が一般的に好まれるが、主としてはＣＨＯ細胞株、多種のＣＯＳ細胞株、ＮＳＯ細胞、ＢＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株など、又はハイブリドーマの形質転換Ｂ細胞などが挙げられる。これらの細胞についての発現ベクターは、複製起点、プロモーター及びエンハンサー（詳しくはQueen et al., Immunol Rev.89, 46-68(1986)を参照）といった発現制御配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位といった必要な処理情報部位、及び転写ターミネータ配列を含有することができる。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルス、その他同種のもの由来のプロモーターなどが挙げられる。
【００９８】
本発明における好ましいＤＮＡベクターは、以下に示す配列が操作可能に結合した（operatively linked）配列を包含している。抗生物質に対する耐性マーカー、例えばアンピシリン耐性、Ｆ１起点及びＨ鎖（ＨＣ）又はＬ鎖（ＬＣ）の可変領域。その可変領域は、ＨＣ可変領域、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域、第一ポリＡ部位、ＳＶ４０プロモーター、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性マーカー、第二ポリＡ部位、アイトメガロウイルス（cytomegelovirus）（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、及び適したリーダー配列などの配列が操作可能に結合した配列を含有するＨＣ発現用（ベクター）に挿入することができる。
更に好ましいＤＮＡベクターは、適したヒトカッパー定常領域に操作可能に結合しているげっ歯類（例えば、マウス）のカッパーイントロンに操作可能に結合しているＬＣ可変領域、及びネオマイシン耐性などの抗生物質耐性マーカーを含有している。
【００９９】
既に述べられているとおり、本発明のヒト型抗体を単一の核酸により発現させることは、多くの場合極めて有効である。好ましいＤＮＡベクターは、本明細書中に「メガ」ベクターとして記載され、ＳＶ４０プロモーター、ネオマイシン等の抗生物質に対する耐性マーカー、第一ポリＡ部位、第一ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＬＣ可変領域、げっ歯類（例えば、マウス）カッパーイントロン、ヒトカッパーエクソン、第二ポリＡ部位、第二ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＨＣ可変配列、及びヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＨ鎖定常領域などが機能的に結合しているものである。そのようなメガベクターの具体例としては、後述の実施例に記載されているヒト型抗ＴＦＩｇＧ１抗体の発現ベクターが挙げられる。図１１も参照のこと。
【０１００】
ｐＳＵＮ３６（ヒト型抗ＴＦ抗体ＩｇＧ１−ＨＣ発現ベクター）、ｐＳＵＮ３７（ヒト型抗ＴＦ抗体ＩｇＧ４−ＨＣ発現ベクター）、及びｐＳＵＮ３８（ヒト型抗ＴＦ抗体−ＬＣ発現ベクター）の３種のベクターは、１０８０１  ユニバーシティーブルバード、マナッサス、ヴァージニア州  ２０１１０−２２０９のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に、ブダペスト条約に基づく寄託がなされており、受託番号はそれぞれＰＴＡ−３７２７（ｐＳＵＮ３６）、ＰＴＡ−３７２８（ｐＳＵＮ３７）、及びＰＴＡ−３７２９（ｐＳＵＮ３８）である。
【０１０１】
本明細書で開示されているヒト型抗体又はその断片を製造するのに、種々の適した宿主細胞が使用可能である。ひとつの態様においては、１）ヒト型抗体又はその断片のＬ鎖をコードする第一の発現ベクターとヒト型抗体又はその断片のＨ鎖をコードする第二の発現ベクター、又は２）ヒト型抗体又はその断片のＬ鎖及びＨ鎖を共にコードする単一の発現ベクターのいずれかで、宿主細胞を形質転換すること、宿主細胞をそれぞれの鎖が発現する培養条件に維持すること、及びヒト型抗体又はその断片を単離することを包含している。
【０１０２】
例えば、ヒト型抗体を製造するために核酸を導入する細胞株の例としては、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＢＫ細胞株、又はＮＳＯ細胞株などが挙げられる。更に、許容される細胞株としては、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマ又はクアドローマ細胞株などの好ましくはリンパ由来の不死化細胞株が挙げられる。この細胞株としては、エプステイン−バール（Epstein-Barr）等のウイルスによる形質転換により不死化されたＢ細胞などの正常なリンパ細胞を包含することもまた可能である。ＣＨＯ細胞を使用して種々のタンパク質を発現させる方法が報告されている。Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216-4220(1980)、及びＷＯ８７／０４４６２を参照のこと。後述の実施例にあるＮＳＯ細胞を使用する方法もまた好ましい。
ヒト型抗体の製造に使用される好ましい細胞株としては不死化細胞株であるが、それ以外の好ましい細胞株、例えばバクテリア細胞、植物細胞、昆虫細胞又は酵母菌もまた代替として使用可能である。特に大腸菌由来の細菌の菌株が使用可能であると考えられる。
【０１０３】
適切な細胞から発現された、本発明の、抗体全体、その二量体、Ｌ鎖若しくはＨ鎖のそれぞれ鎖、又は他の免疫グロブリンの形態、例えば、ヒト型抗体の断片は、標準的な方法で回収され、精製することができる。そのような方法としては、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など（一般的にScopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.(1982)を参照のこと）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明の実質的に純粋な抗体及びその断片は、少なくとも９０〜９５％のホモジェニティー（等質性）（homogeneity）、医学的な利用では一般的には好ましくは９８〜９９％のホモジェニティーであることを特色とする。所望される程度に同質化され、又は部分的に精製されたヒト型抗体は、治療に、又はアッセー法、免疫蛍光染色法など（一般的にImmunological Methods, Vols I and II, Lefkovits and Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979・1981) を参照のこと）の開発や、実施のために使用することができる。
【０１０４】
本発明のヒト化型体を精製する好ましい方法としては、従来のアフィニティー及びイオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられ、好ましくは組換えプロテインＡセファロース（ヒトＩｇＧＦｃと高い親和性を有する）を使用する方法が挙げられる。フラクションに含有されている抗体を集め、さらにイオン交換クロマトグラフィー、好ましくはＱセファロースにかけられる。タンパク質ピークを含む抗体を集め、適した溶液又はＰＢＳ等の緩衝液で透析する。
【０１０５】
本発明のヒト型抗体及びその断片は、標準的方法の一つあるいは組み合わせにより、その機能を試験することができる。好ましい試験方法としては、ＴＦの機能の抑制を検査する方法である。好ましい方法は、本明細書中において「標準プロトロンビン時間」アッセー又は関連の用語で記載されている。標準プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセーは、一般的には下記の少なくとも一つ、好ましくは全てのステップを含んでいる。
ａ）ＴＦ及びＶＩＩａ因子を結合させ、結合複合体を作る、
ｂ）Ｘａ因子（又はＩＸａ因子）が生成する条件下で、前記複合体をＸ因子（又はＩＸ因子）と接触させる、
ｃ）好ましくはＶａ因子及び脂質の存在下で、Ｘａ因子とプロトロンビンを接触させトロンビンを生成させる。
標準ＰＴアッセーを実施するのに必要なＴＦは、イノビン（Innovin）という市販品を用いるのが好ましい。血液因子は、Ｃｉ−Ｔｒｏｌ凝固調整剤（Ci-Trol Coagulation Control）という名称のヒト血小板製剤を用いるのが好ましい。
本明細書中のヒト型抗体及びその断片は、アッセーにより簡単に試験可能である。精製した抗体又はその断片のアリコート、好ましくは約２００ｎＭ〜約２０００ｎＭ程度のアｒコートが、ステップａ）の前に添加されるのが好ましいが、アッセイの他の段階で添加されるのが好ましいとされる応用例もある。一般的には、このヒト型抗体又はその断片は、ＴＦを添加した後のＣｉ−Ｔｒｏｌ凝固調整剤に添加される。
【０１０６】
ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２ 、及び単鎖の抗体（ヒト型抗体の抗原結合性の可変領域を含有している。）の全てを含むヒト型抗体及びその断片が極めて好ましく、少なくとも約１ｎＭ〜約２０ｎＭ程度の濃度、好ましくは約５ｎＭ〜約１５ｎＭ、より好ましくは約１０ｎＭの濃度で、標準アッセーにおいて血液の凝固時間を少なくとも５秒以上延長させる。標準的な試験対照は、抗体又はその断片を添加しないで行う標準ＰＴアッセーである。更に好ましい本発明の抗体及びその断片は、ＴＦ依存性の凝固を、対照と比較して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％又はそれ以上の阻害する。この標準ＰＴアッセーの具体例は実施例に記載されている。
【０１０７】
本発明の抗凝固剤組成物については前記してきたが、ヒト型抗体及びその断片を含有する他の組成物も、本発明の範囲に包含される。例えば、抗体及びその断片は、単独又は二つ以上を組合せて使用することにより、望ましい結果を達成することができる場合がある。抗体及びその断片は、他の抗体と組み合わせて使用することができるが、そのような他の抗体としては、その病気に対応する細胞の他のマーカーと反応する抗体、特にヒトモノクローナル抗体が好ましい。
【０１０８】
本発明の抗体及びその断片の重要な使用法が、前記において幅広く説明されている。例えば、生体サンプル中の未変性のＴＦの検出のための用途、ＴＦを発現する細胞の検出又は精製のための用途、そしてヒトの患者の望まない血液凝固といった病状の治療や予防のための使用である。実際には、ヒト型抗体は、アスピリン、クマジン（coumadin）、ヘパリン、ヒルジン（hirudin）、又はヒルログ（hirulog）などの抗凝固剤と組み合わせて、別々に投与される組成物として使用することができる。また、抗血小板剤（例えばレオプロ、インテグリリン、アグレスタット、プラビックス、及び／又はティクリッド）、及び／又は血栓溶解剤（例えば組織プラスミノゲン活性化因子、ストレポキナーゼ、及びウロキナーゼ）などとともに一緒に投与することもある。
【０１０９】
ヒト型抗体及びその断片の１種又は２種以上を含有する本明細書中に開示されている治療用の抗凝固剤組成物の他の態様は、その組成物は、抗体の溶液、又は許容される担体、好ましくは水性の担体に溶解したこれらの混合物を含有するものである。水性の担体としては、水、緩衝水溶液、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどの種々の水溶性の担体が挙げられる。これらの溶液は、無菌でかつ粒子状物質を含まないのが好ましい。これらの組成物は通常の減菌方法で無菌化することができる。組成物は生理的条件に近づけるため、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、無毒化剤（toxicity adjustment agents）等の製薬的又は薬学的に許容される補助物質を含有することができる。補助物質としては、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの処方物中の抗体の濃度は、広範囲であることが可能であり、例えば、重量で０．５％未満、通常は少なくとも１％以下〜１５％又は２０％の範囲で、主に液量、粘性等に基づき具体的な投与方法とともに選択される。一般的に前述のRemington's Pharmaceutical Scienceを参照のこと。
【０１１０】
本発明の治療用の抗凝固剤組成物は、必要に応じて、保存のために凍結乾燥し、使用の際に適した担体を用いて戻すことも可能である。この方法は、従来の免疫性グロブリンにおいて効果的であるとされている。あらゆる適した凍結乾燥法及び再生法を用いることができる。凍結乾燥及び再生、抗体の活性を損失させ、その損失の程度は抗体の種類により大きく異なる（例えば、従来の免疫性グロブリンにおいて、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より活性の損失量が大きい）ことが、当業者には広く知られており、使用レベルに応じて調整されている。
【０１１１】
予防的な薬剤の投与として、未だ発病に至っていない患者に対し、病気に対する抵抗力を高めるために抗凝固剤組成物を投与することは有用である。その投与量は「予防的有効投与量」として定義される。この使用法においては、その詳細な量は患者の健康状態及び一般免疫レベルに左右されるが、一般的には、１回の投与量として０．１〜２５ｍｇ、特に患者あたり０．５〜２．５ｍｇの範囲が挙げられる。好ましい予防的使用法としては、侵襲的な医療処置によって引き起こされる望ましくない血液凝固の予防が挙げられる。
【０１１２】
前記してきたように、本発明は、本発明の抗体又はその断片を含有するキットにも関する。ひとつの態様においては、このヒト型抗体又はその断片は、ＴＦ抗原に対して、又はその検出のために使用することができる。従って、例えば、１つ又はそれ以上の抗体、その断片、又は単鎖の抗体が、通常容器の中で凍結乾燥された状態で供給される。そのような抗体、断片、又は単鎖の抗体が、前述してきたラベル（標識）又は毒素と抱合化され、又は全く抱合化されずに、トリス、ホスフェート、炭酸塩などの緩衝液；安定剤、生物破壊剤（biocides）、血清アルブミン等の不活性タンパク質と共にキット中に含まれる。一般的に、これらの物質は活性抗体の量に対して５重量％未満存在し、通常では全体で抗体濃度に対し０．００１重量％未満存在する。活性有効成分を希釈するために、不活性増量剤または賦形剤を含むことがしばしば望ましく、組成物全体に対して、賦形剤は１〜９９重量％存在することができる。アッセーにおいてキメラ抗体と結合が可能な第二の抗体を用いる場合、この抗体は別々のバイアルに存在する。第二の抗体は一般的に標識化され、前記した抗体の処方と類似の態様で処方される。また、キットは、一般に使用に関する説明書一式を含む。
【０１１３】
前記してきたように、本発明は哺乳類、好ましくはヒトなどの霊長類に対する、血液凝固を阻害する種々の方法を提供する。
例えば、ひとつの態様として、この方法は、ヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合して複合体を形成する本発明のヒト型抗体又はその断片の、少なくとも１つ、好ましくは１、２、又は３つの治療上の有効量を投与することからなる。通常では、Ｘ因子又はＩＸ因子が、ＴＦ又はＴＦ：ＦＶＩＩａと結合し、ＴＦ又はＴＦ：ＦＶＩＩａによる活性化が抑制される。ほとんどの様態において、この方法には、さらに抗体とＴＦとの間に特異的な複合体を形成し、血液凝固を抑制することが含まれる。
【０１１４】
また、本発明のヒト型抗体又はその断片の治療上の有効量を哺乳類へ投与することからなる哺乳類の血液凝固を抑制する方法も提供される。標準的な抗体及び断片は特異的にヒト組織因子（ＴＦ）と結合し複合体を形成する。さらに、ＴＦ又はＴＦ：ＦＶＩＩａに結合しているＸ因子又はＩＸ因子、及びＴＦ：ＦＶＩＩａによるそれらの活性化が抑制される。多くの様態において、この方法はさらに抗体とＴＦとの間に特異的な複合体を形成し、血液凝固を抑制することを含む。
【０１１５】
より詳細な態様としては、ヒト型抗体又はその断片の治療上の有効量を哺乳類に投与することにより哺乳類の血液凝固を抑制する方法を提供する。一般に、抗体及びその断片は、特異的にヒト組織因子（ＴＦ）と結合し複合体を形成する。そして、さらにＴＦ又はＴＦ：ＦＶＩＩａに結合しているＸ因子又はＩＸ因子、及びＴＦ：ＦＶＩＩａによる活性化が抑制される。ヒト型抗体又は断片は、Ｈ鎖において、少なくとも１つ、好ましくは下記の事項の全てを含んでいる：
ａ）図１３Ｂ（配列番号１０８及び１０９）で示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第一のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｂ）図１３Ｃ（配列番号１１０及び１１１）で示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第二のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｃ）図１３Ｄ（配列番号１１２及び１１３）で示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第三のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｄ）「ＦＲ１  ＨＣ−０８」として図１３Ａ（配列番号５２乃至６５）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第一のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｅ）「ＦＲ２  ＨＣ−０８」として図１３Ａ（配列番号６６乃至７９）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第二のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｆ）「ＦＲ３  ＨＣ−０８」として図１３Ａ（配列番号８０乃至９３）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第三のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｇ）「ＦＲ４  ＨＣ−０８」として図１３Ａ（配列番号９４乃至１０７）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第四のフレームワーク（ＦＲ４）。
【０１１６】
より詳細な発明の様態では、ヒト型抗体はＬ鎖において、少なくとも一つ、好ましくは下記の事項の全てを含んでいる：
ｈ）図１２Ｂ（配列番号４９）で示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第一のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｉ）図１２Ｃ（配列番号５０）で示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第二のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｊ）図１２Ｄ（配列番号５１）で示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第三のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｋ）「ＦＲ１  ＬＣ−０９」として図１２Ａ（配列番号５乃至１５）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第一のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｌ）「ＦＲ２  ＬＣ−０９」として図１２Ａ（配列番号１６乃至２６）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第二のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｍ）「ＦＲ３  ＬＣ−０９」として図１２Ａ（配列番号２７乃至３７）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第三のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｎ）「ＦＲ４  ＬＣ−０９」として図１２Ａ（配列番号３８乃至４８）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性である第四のフレームワーク（ＦＲ４）、
ｏ）図１４Ａ（配列識別番号１１４）又は図１５Ａ（配列識別番号１１６）で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性であるＬ鎖定常領域、および
ｐ）図１４Ｂ（配列識別番号１１５）又は図１５Ｂ（配列識別番号１１７）で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の相同性であるＨ鎖定常領域。
【０１１７】
前記のより詳細な本発明の様態では、ヒト型抗体又はその断片は、Ｈ鎖において、少なくとも一つ、好ましくは下記の事項の全てを含んでいる：
ａ）図１３Ｂ（配列番号１０８及び１０９）で示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して、相同である第一のＣＤＲ（ＣＤＲ１）
ｂ）図１３Ｃ（配列番号１１０及び１１１）で示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して、相同である第二のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｃ）図１３Ｄ（配列番号１１２及び１１３）で示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して、相同である第三のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｄ）図１３Ａ（配列番号５２乃至６５）の「ＦＲ１  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第一のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｅ）図１３Ａ（配列番号６６乃至７９）の「ＦＲ２  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第二のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｆ）図１３Ａ（配列番号８０乃至９３）の「ＦＲ３  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第三のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｇ）図１３Ａ（配列番号９４乃至１０７）の「ＦＲ４  ＨＣ−０８」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第四のフレームワーク（ＦＲ４）。
そして、Ｌ鎖においては：
ｈ）図１２Ｂ（配列番号４９）で示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して、相同である第一のＣＤＲ（ＣＤＲ１）、
ｉ）図１２Ｃ（配列番号５０）で示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して、相同である第二のＣＤＲ（ＣＤＲ２）、
ｊ）図１２Ｄ（配列番号５１）で示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して、相同である第三のＣＤＲ（ＣＤＲ３）、
ｋ）図１２Ａ（配列番号５乃至１５）の「ＦＲ１  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第一のフレームワーク（ＦＲ１）、
ｌ）図１２Ａ（配列番号１６乃至２６）の「ＦＲ２  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第二のフレームワーク（ＦＲ２）、
ｍ）図１２Ａ（配列番号２７乃至３７）の「ＦＲ３  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第三のフレームワーク（ＦＲ３）、
ｎ）図１２Ａ（配列番号３８乃至４８）の「ＦＲ４  ＬＣ−０９」に示されるアミノ酸配列に対して、相同である第四のフレームワーク（ＦＲ４）、
ｏ）図１４Ａ（配列識別番号１１４）又は図１５Ａ（配列識別番号１１６）で示されるアミノ酸配列に対して、相同であるＬ鎖定常領域、および
ｐ）図１４Ｂ（配列識別番号１１５）又は図１５Ｂ（配列識別番号１１７）で示されるアミノ酸配列に対して、相同であるＨ鎖定常領域。
【０１１８】
本発明は、生体サンプルにおける組織因子（ＴＦ）の種々の検出方法をも提供するものである。一つの様態では、この方法は、複合体を形成し、生体サンプル内のＴＦを明示することが可能な複合体を検出するために、本明細書に記載のヒト型抗体又はその断片を生体サンプルに接触させる方法を包含している。
本明細書に記載されている全ての文献は、参照として本明細書に全て取り込まれる。
【０１１９】
以下に示される実施例は、本発明を説明するためのものであり、これに限定されるものではない。
以下の実施例において、抗体Ｈ３６及びＨ３６．Ｄ２について説明する。
これらの抗体は、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７と同一の抗体であるが、Ｈ３６はマザー・クローン由来であり、Ｈ３６．Ｄ２は一次クローンより得られ、一方でＨ３６．Ｄ２．Ｂ７は二次クローンから得られる。これら３種のクローンは、組織因子阻害能又はその他の物理的特性において差異は認められていない。一般的な用法として、Ｈ３６は、これらいずれかのクローン、又は抗体を産生する関連の細胞株によって製造された抗ＴＦ抗体を示すものとしてよく用いられる。
【実施例１】
【０１２０】
抗ｒｈＴＦモノクローナル抗体の調製及びクローニング
ｒｈＴＦに対するモノクローナル抗体は以下のように調製された。
Ａ．免疫化と追加免疫
５匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、それぞれ脂質化され、精製された１０μｇのｒｈＴＦで免疫化した。マウスはまず、ハンター（)のタイターマックス（Hunter's Titermax）アジュバンドで腹腔内に感作された。最終的に追加免疫が０．８５％のＮａｃｌ溶液として３回投与された。追加免疫は最初の感作から２ヶ月、５．５ヶ月及び６．５ヶ月後に行われ、最初の追加免疫が皮下に投与された以外は全て腹膜内に投与された。最後の追加免疫は細胞融合の３日前に、２０μｇが投与された。
【０１２１】
Ｂ．マウス脾臓リンパ球とマウス骨髄腫細胞との融合
ｒｈＴＦで免役化されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からのリンパ球を、ＰＥＧ１５００を用いて、Ｘ６３‐Ａｇ８．６５３マウスの骨髄腫細胞に融合させた。ＰＥＧにさらした後、細胞を熱不活化ウシ胎仔血清中において、３７℃で１時間培養した。次いで融合した細胞をＲＰＭＩ１６４０で再懸濁させ、１０％の二酸化炭素中、３７℃で一晩培養した。翌日、その細胞をＲＰＭＩ１６４０を用いプレートに取り、マクロファージ培養物の上清を加えた。
【０１２２】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ発色
ＥＬＩＳＡアッセイ用のプレートを、炭酸塩の緩衝液中の１００μＬの組み換え型組織因子（０．２５μｇ／ｍｌ）で被覆した。全ての行程は室温にて行った。プレートをＢＳＡでブロックし、洗浄した後テストサンプル及びコントロールを加えた。ヤギの抗マウスＨＲＰ抱合体（Jackson ImmunoResearch Laboratories社）でプレートを培養し、次いでＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard and Perry Laboratories社）を用いて抗原と抗体の結合を検出した。吸収度は４０５ｎｍの波長で、自動プレートリーダーで読み出された。
【０１２３】
Ｄ．ｒｈＴＦハイブリドーマ細胞株の安定化
細胞融合の２週間後、特定のｒｈＴＦＥＬＩＳＡ法によるハイブリドーマコロニーのスクリーニングを開始した。新たなコロニーのスクリーニングを３週間継続した。連続した抗体製造のために陽性クローンを１週間から２週間ごとに検証した。
【０１２４】
Ｅ．第１次および第２次クローニング
限界希釈クローニング法を、陽性の安定したハイブリドーマのそれぞれについて行い、第１次クローンを得た。細胞を解凍し、短時間培養した。次に１０細胞／ウエルから０．１細胞／ウエルに希釈した。第一次クローンを、抗ｒｈＴＦＥＬＩＳＡ法により検証した。５つから６つの陽性クローンに増幅し、凍結した。
前述のようにして、抗ｒｈＴＦ抗体の第２次クローンであるＨ３６．Ｄ２．Ｂ７を、第一次クローンであるＨ３６．Ｄ２．より得、調製して、液体窒素中で保存した。第一次クローンにおける、４つの異なる希釈度、５細胞／ウエル，２細胞／ウエル，１細胞／ウエル，０．５細胞／ウエルを、９６穴のマイクロタイター板に用意し、第二次クローニングを開始した。
細胞を、次の添加剤を含むＩＭＤＭ組織培地で希釈する：
２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、ペニシリン１００単位／ｍｌ，ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ，１％ＧＭＳ−Ｓ，０．０７５％ＮａＨＣＯ３。抗ｒｈＴＦ抗体を分泌するクローンを検出するために、０．２細胞／ウエルのマイクロタイター板の５つのそれぞれのウエルの上澄液を培養２週間後に取り出し、上述のＥＬＩＳＡ法により、抗ｒｈＴＦ抗体の存在を試験した。５つのすべてのクローンは、ＥＬＩＳＡ法において陽性を示し、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７は最大の抗体産生を示した。５つのすべてのクローンは、次の添加剤を含むＲＰＭＩ培地に置き、増殖させた：
１０％ＦＢＳ，２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、ペニシリン１００単位／ｍｌ，ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、１％ＧＭＳ−Ｓ，０．０７５％ＮａＨＣＯ３、及び、オキサル酢酸０．０１３ｍｇ／ｍｌ。Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで、細胞培養の上澄液より精製し、ＦＸの活性アッセイによりＴＦ：ＶＩＩａの阻害能を試験した。Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７がＨ３６．Ｄ２抗体と同じ程度の阻害活性を持つという結果を得た。すべての細胞を、液体窒素で保存した。
【０１２５】
Ｆ．Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７から全ＲＮＡの分離
２．７ｘ１０５個のＨ３６．Ｄ２．Ｂ７ハイブリドーマ細胞から２６９μｇの全ＲＮＡを分離した。全ＲＮＡの分離は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔｓ  に記載されている手順に従い行った。ＲＮＡサンプルは、−２０℃にて保管した。
【０１２６】
Ｇ． Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７遺伝子の可変領域のクローニングとｃＤＮＡの合成
前記で得た全ＲＮＡ５μｇを含有し、重鎖（ＨＣ）用のリバース（ｂａｃｋ）プライマーＪＳ３００（全プライマーを下記に示す。）、軽鎖（ＬＣ）用のＯＫＡ５７、ＲＮａｓｅ阻害剤、ｄＮＴＰ類、ＤＴＴ  及び、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩの逆転写酵素を含有する反応混合物を調製し、４２℃で１時間インキュベートして、第一番目のｃＤＮＡのストランド得た。この反応管を６５℃で１５分間インキュベートして、転写を停止させた。冷却後、５単位のＲＮａｓｅ  Ｈを加え、３７℃で２０分間反応させた。ｃＤＮＡサンプルを−７０℃で保存した。
【０１２７】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を別に行い、前記した方法により得たｃＤＮＡから、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の、即ち抗-ｒｈＴＦの重鎖及び軽鎖の可変領域のクローンを調製した（重鎖及び軽鎖の可変領域における核酸及びアミノ酸配列を図１Ａ及び１Ｂに示す）。ＰＣＲを３ラウンド行った。第一ラウンド：ＰＣＲを、重鎖（ＨＣ）用に、フォーワードプライマーにＪＳ００２を、リバースプライマーにＪＳ３００を用いて、９６℃、５３℃及び７２℃の３５サイクルで行った。軽鎖（ＬＣ）用にフォーワードプライマーにＪＳ００９を、リバースプライマーにＯＫＡ５７を用い、９６℃、６３℃及び７２℃で３５サイクルで行った。第二ラウンド：ｐＭＣ−１８を重鎖のフォーワードプライマーとして、ｐＭＣ−１５を軽鎖のフォーワードプライマーとして用いることを除き、第一ラウンドと同様に、重鎖及び軽鎖の両方に対し、ＰＣＲを行った。第三ラウンド：重鎖（ＨＣ）用にＨ３６ＨＣＦ及び、Ｈ３６ＨＣＲプライマーを用い、９６℃、６０−６５℃、及び７２℃で３０サイクルのＰＣＲを行った。また、軽鎖（ＬＣ）については、Ｈ３６ＬＣＦ及び、Ｈ３６ＬＣＲプライマーを用い、９６℃、５８℃及び７２℃で３０サイクルのＰＣＲを行った。
【０１２８】
以下のプライマーは、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の重鎖及び軽鎖の可変領域のクローニングに用いたプライマーである。
ＯＫＡ５７：
５’−ＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）
ＪＳ３００：
５’−ＧＡＡＲＴＡＶＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１ＪＳ００９：
５’−ＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＭＴＧＷＣＭＣＡＲＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）
ＪＳ００２：
５’−ＡＴＴＴＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＲＧＴＹＣＡＲＣＴＫＣＡＲＣＡＲＹＣ−３’
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）
ｐＭＣ−１５：
５’−ＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＫＣＣＣＣＷＲＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＫＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）
ｐＭＣ−１８：
５’−ＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＲＡＴＧＳＡＧＣＴＧＫＧＴＭＡＴＳＣＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）
Ｈ３６ＨＣＦ：
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＣＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）
Ｈ３６ＨＣＲ：
５’−ＧＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）
Ｈ３６ＬＣＦ：
５’−ＴＴＡＡＴＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）
Ｈ３６ＬＣＲ：
ＴＡＡＴＣＧＴＴＣＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）
上記配列番号１３０から１３９において、ＫはＧ又はＴであり；ＭはＡ又はＣであり；ＲはＡ又はＧであり；ＳはＣ又はＧであり；ＶはＡ，Ｃ又はＧであり；ＷはＡ又はＴであり；ＹはＣ又はＴである。
【実施例２】
【０１２９】
実施例２−本発明の抗体における結合活性
前記の実施例１により調製した本発明の抗体を使用する。rhTF分子は大腸菌で発現させ、標準的な方法に従い、免疫アフィニティクロマトグラフィにより精製した（Harlow and Lane, supra, Ausubel et al. supra  参照）。
抗体の会合定数（Ｋａ）及び解離定数（Ｋｄ）は、ＥＬＩＺＡ法（酵素免疫測定法）及び表面プラスモン共鳴（i.e., BIA Core）分析法により測定した（参照  Harlow and Lane, supra; Ausubel et al. supra; Altschuh et al., Biochem., 31:6298(1992);及び、Pharmacia Biosensor社のBIA core法）。ＢＩＡ  ｃｏｒｅ分析は、業者のインストラクションに従い、ｒｈＴＦをバイオセンサーチップに固定した。それぞれの抗体における定数は、４種類の抗体濃度（０．１２５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、及び１ｎＭ）により測定した。
たんぱく質の濃度は、標準としてウシ血清アルブミンと市販の染料試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い、標準的アッセイ(M.M. Bradfor, Anal. Biochem., 72:248(1976)）により測定した。
図２は、それぞれの抗ＴＦ抗体の会合定数および解離定数を示す。抗体Ｈ３６は、いずれの抗ＴＦ抗体の実験においても、最も高い会合速度（Ｋａ＝３．１Ｘ１０１０Ｍ−１）及び、最も低い解離速度（Ｋｄ＝３．２Ｘ１０−１１Ｍ）を示した。
【実施例３】
【０１３０】
実施例３  ＦＸａに特異的な基質のアッセイ
一般に、以下の実験においては、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５中のホスファチジルコリン(０．０７ｍｇ／ｍｌ）及びホスファチジルセリン（０．０３ｍｇ／ｍｌ）を７０／３０ｗ／ｗの割合の混合物で、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で３７℃で３０分間で脂質付加して得られたｒｈＴＦを使用して行った。ＴＦ：ＶＩＩａ複合体のストック溶液は、５ｎＭの脂質付加したｒｈＴＦ、及び５ｎＭのＦＶＩＩａを３７℃で３０分間インキュベートして調製された。そのＴＦ：ＶＩＩａ混合物を分割したサンプルとし（aliquoted）、必要な時まで−７０℃で保存した。精製されたヒト第ＶＩＩ、ＶＩＩａ因子及びＦＸは、エンザイムリサーチラボラトリ社（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ. ）より入手した。次に示すバッファーを全てのＦＸａ及びＦＶＩＩａアッセイに用いた：２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ,ｐＨ７．５。
【０１３１】
モノクローナル抗体の、ＴＦ：ＶＩＩａを介するＦＸからＦＸａへの活性化の阻害能をスクリーニングした。ＦＸの活性化を２つの非連続的なステップで測定した。即ち、第１のステップ（ＦＸの活性化）で、ＦＸのＦＸａへの転換をＣａ＋２  の存在下でアッセイした。第２のステップ（ＦＸａ活性のアッセイ）では、ＦＸの活性化をＥＤＴＡにより停止させ、ＦＸａに特異的な色素原の基質（Ｓ−２２２２）を用いてＦＸａの生成を測定した。Ｓ−２２２２及びＳ−２２８８（下記参照）の色素原は、クロモジェニックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｅｐｅｒ  Ｉｎｃ．により配給）より入手した。１．５ｍｌのマイクロフュージ管で、抗ｔｈＴＦ抗体でプレインキュベートしたもの、又は対照としての緩衝液中の０．０８ｎＭのＴＦ：ＶＩＩａとインキュベートして反応させることにより、ＦＸを活性化した。次いで、この反応物を、３７℃で３０分間インキュベートし、３０ｎＭのＦＸを加え、更に３７℃で１０分間インキュベートした。ＦＸａ活性を、９６穴マイクロタイタープレートを用いて測定した。第１ステップから採取した２０μＬのサンプルに、等量のＥＤＴＡ（５００ｍＭ）をそれぞれのウェルに混合し、次いで０．１４４ｍｌのバッファーの及び５ｍＭのＳ−２２２２基質０．０１６ｍｌを加えた。反応物を、３７℃で更に１５分〜３０分インキュベートした。０．０５ｍＬの５０％の酢酸で反応を停止させ、その後それぞれの反応物の４０５ｎｍの吸光度が記録した。ＴＦ：ＦＶＩＩａの阻害活性は、試験サンプル（抗体を含む）及びその対照サンプル（抗体を含まない）におけるＯＤ４０５ｎｍ値から計算した。別の実験においては、競合的結合を測定する為に、抗ｈＴＦ抗体、ＴＦ：ＦＶＩＩａ及びＦＸを、それぞれ同時に添加した。Ｈ３６．Ｄ２ＭＡｂｓ（太字で表示）が、試験された抗ｒＨＴＦＭａｂｓよりも大幅（９５％）に、ＦＸに対するＶＩＩａ活性を阻害することが、図３に示されている。
【実施例４】
【０１３２】
実施例４  ＦＶＩＩａに特異的な基質のアッセイ
モノクローナル抗体を、ＦＶIIａに特異的なアッセイにより更にスクリーニングした。このアッセイでは、はじめに５ｎＭの脂質付加したｒｈＴＦを、９６穴マイクロタイタープレートで、バッファー（対照）若しくは５０ｎＭの抗体（試験）で、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで５ｎＭの精製したヒトＦＶＩＩａ（ＶＴ＝０．１９２ｍｌ）を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＦＶＩＩａに対して特異的な基質であるＳ−２２８８の２０ｍＭのストック溶液８μＬをそれぞれのウエルに加えた（最終的な濃度は０．８ｍＭであった。）。次いで、反応物を３７℃で１時間インキュベートした。そして、０．０６ｍｌの５０％の酢酸で反応を停止させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＴＦ：ＶＩＩａ活性の阻害率（％）を、試験サンプル及び対象サンプルのＯＤ４０５ｎｍ値からそれぞれ計算した。
抗体をＴＦ（ＦＶＩＩａを加える前に）とプレインキュベートしたとき、または、ＦＶＩＩａ（抗体を加える前に）とプレインキュベートしたＴＦを添加したときには、Ｈ３６抗体はＳ−２２８８の基質に対して有意なＴＦ：ＦＶＩＩａ活性の阻害を示さなかったことが、図４に示されている。このことは、Ｈ３６がＴＦとＦＶＩＩａ間の相互作用（結合）を妨害しないということ、及びＨ３６が、ペプチドの基質に対するＴＦ：ＦＶＩＩａ活性をも阻害しないということを示している。
【実施例５】
【０１３３】
実施例５  プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ
石灰化した血漿は、トロンプラスチン(ＴＦ）を添加した後数秒で凝固する。この現象は、プロトロンビン時間（ＰＴ）と呼ばれている。ＰＴの延長は、一般的に抗凝固活性の有用な指標である（例えばGilman et a. supra 参照）。
市販されているヒトの血漿（ Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．から入手可能のＣｉ−Ｔｒｏｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，  Ｌｅｖｅｌ  Ｉ）を用いる標準的な方法により、Ｈ３６.Ｄ２抗体のＰＴに影響を及ぼす能力を検討した。凝固反応を開始させるにあたり、Ｃａ＋２  の存在下で、脂質付加されたｒｈＴＦを添加した。凝固時間は自動凝固タイマー（ＭＬＡ  Ｅｌｅｃｔｒａ  ８００）で記録した。０．２ｍｌの脂質付加したｒｈＴＦ（０．１％ＢＳＡ、１４．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０７ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリン、及び０．０３ｍｇ／ｍｌのホスファチジルセリンを含むｐＨ７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬのバッファー中）をプラスチック製の二つ穴キュベットに注入して、ＰＴアッセイを開始した。キュベットは、それぞれ、０．０１ｍｌのバッファー（対照サンプル）もしくは、抗体（試験サンプル）のどちらかで１〜２分間プレインキュベートされた血清を０．１ｍｌ含有していた。ＴＦが介在する凝固のＨ３６．Ｄ２抗体による阻害は、ｌｏｇ凝固時間に対してｌｏｇ（ＴＦ）をプロットした標準ＴＦ曲線を用いて算出された。
図５は、Ｈ３６．Ｄ２抗体が、人の血漿中においてＴＦによって引き起こされる凝固を、大幅に阻害することを表わしている。Ｈ３６．Ｄ２抗体がＰＴ時間を著しく伸ばしたということは、抗体がＴＦによって引き起こされる凝固に対する有効な阻害剤であることを示している（約９９パーセントまで阻害した）。
【実施例６】
【０１３４】
実施例６  ＦＸ及び３６．Ｄ２抗体は、ＴＦ：ＶＩＩａ複合体との結合に競合する。
競合実験を、ＴＦ：ＶＩＩａ、ＦＸ及びＨ３６．Ｄ２抗体の間で行った。図６Ａは、前もって形成されたＴＦ：ＶＩＩａ複合体（０．０８ｎＭ）を、Ｈ３６．Ｄ２モノクローナル抗体を０．０２ｎＭ、０．０４ｎＭ，０．０８ｎＭ及び０．１６ｍＭそれぞれを含むバッファーで、３７℃で３０分間プレインキュベートした実験の結果を表している。次いで、ＦＸ（３０ｎＭ）をＴＦ：ＦＶIIa及びＨ３６．Ｄ２抗体の混合物に加え、そしてその混合物を更に３７℃で１０分間インキュベートした。ＦＸ活性化を前記のように前もってＥＤＴＡで停止させた。そのように製造されたＦＸaを、上記の実施例３に記載してあるＦＸaに特異的なアッセイにより検出した。
Ｈ３６．Ｄ２抗体、前もって形成されたＴＦ：ＶＩＩａ、及びＦＸを、ＦＸ活性化アッセイを同時に開始するために添加する以外は、上記の方法に準じて行った実験結果を、図６Ｂに示す。
図６Ａ及び６Ｂに示されるデータセットは、Ｈ３６．Ｄ２抗体及びＦＸが前もって形成されたＴＦ：ＶＩＩａ複合体との結合に競合することを示している。
【実施例７】
【０１３５】
実施例７  細胞培養におけるＴＦ活性の阻害
Ｊ−８２は、ヒトの膀胱の癌細胞株で（ＡＴＣＣより入手可能）、そこには細胞表面蛋白質として未変性のヒトＴＦが豊富に発現している。ＦＶIIの存在下にマイクロタイタープレートにてＪ−８２ＦＸ活性化アッセイを行い、細胞表面上に有る未変性のＴＦにＦＸが結合することを、Ｈ３６．Ｄ２抗体が防ぐことができるか否かを調べた（D.S.Fair et al., J.Biol, Chem., 262:11692(1987))。それぞれのウェルに、２×１０５ の細胞を加え、それに５０ｎｇのＦＶIIと、バッファー（対照サンプル）又は抗ＴＦ抗体（試験サンプル）とを加えて、２時間３７℃でインキュベートした。その後、それぞれのウエルは丁寧にバッファーで洗浄され、０．３ｍｌのＦＸ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を室温で３０分間で、それぞれのウエルに加えた。未変性のＴＦへの競合的な結合を判定するため、ＦＸと同時に抗体が加えられる場合もあった。その後、０．０５ｍｌを分取し、０．０２５ｍｌの１００ｍＭのＥＤＴＡの入っている９６穴マイクロタイタープレートの新しいウェルに加えた。ＦＸａ活性は、上記の実施例３に記載されているようにＦＸａに特異的なアッセイにより測定された。Ｊ−８２細胞の表面上のＴＦ活性の阻害は、抗体の存在下（試験サンプル）及び非存在下（対照サンプル）でＯＤ４０５ｎｍにより算出された。
図７は、Ｈ３６．Ｄ２抗体がＪ−８２細胞膜上に発現した未変性のＴＦに結合し、ＴＦが介在するＦＸの活性化を阻害したことを示している。これらの結果、細胞表面にある未変性のＴＦへの結合に、抗体がＦＸと競合することを示している。下記の実施例８によるデータいよってもそうであるが、この結果も、Ｈ３６．Ｄ２抗体が細胞膜上の未変性ＴＦのエピトープの立体配座に結合することを表している。
【実施例８】
【０１３６】
実施例８  Ｈ３６．Ｄ２抗体の未変性のｒｈＴＨへの特異的結合
未変性の又は変性されたｒｈＴＦへのＨ３６．Ｄ２の結合の評価を、簡略化されたドットブロットアッセイにより行った。具体的には、ｒｈＴＨを、以下の三種のバッファーにそれぞれ３０μｇ／ｍｌまで希釈した：ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ；８Ｍの尿素を含むｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、；８Ｍの尿素及び５ｍＭのジチオスレイトールを含むｐＨ８．０の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌである。これらのトリスバッファー中でのインキュベーションは、ｒｈＴＨを未変性の形態のままで維持するが、一方、８Ｍの尿素及び５ｎＭジチオスレイトールの処置は、変性した（非ネイティブの）ｒｈＴＨを生成させる。それぞれのサンプルを、２４時間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ミニポア  イムノビロン（Millipore Immobilon）膜（７×７ｃｍ四方）をあらかじめメタノールで濡らし、２０％のメタノールを含むｐＨ１０．４の２５ｍＭトリスで処理した。膜を空気乾燥した後、それぞれのサンプル（３０μｇ／ｍｌ）から約０．５μｌ、１μｌ及び２μｌを膜に塗布し、空気乾燥した。５％（ｗ／ｖ）のスキムミルク及び５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０を含むＰＢＳにより膜をブロッキングした後、その膜をＨ３６．Ｄ２抗体を用いてプローブし、その後、ペルオキシダーゼ抱合体ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．より入手した）でインキュベートした。そのＥＣＬウェスタンブロッティング試薬で、製品（Amersham)のインストラクションに従ってインキュベートした後、膜をビニールのフィルム（サランラップ）で包み、何度かＸ線フィルムにさらした。
【０１３７】
図８Ａは、トリスバッファーの存在下、又は８Ｍの尿素（１及び２列目）を含むトリスバッファーの存在下、未変性のＴＦの立体配座のエピトープに、Ｈ３６．Ｄ２モノクローナル抗体が結合することを示している。オートラジオグラムを４０秒間露光した。しかし、未変性のＴＦを８Ｍの尿素及び５ｍＭのＤＴＴで変性した時、Ｈ３６．Ｄ２の結合は、明らかに減少し、又は無くなっていた(３列目）。図８Ｂは、過剰のオートラジオグラムの露光による、非ネイティブの（例えば変性した）ｒｈＴＦへのＨ３６．Ｄ２抗体の残留した結合を示す。超過時間は約１２０秒間であった。８Ｍの尿素のみでの処置は、２つのＴＦ中のジスルフィド結合が減少しないため、おそらく未変性のｒｈＴＦの一部が変性しているだけとなった。後のブロッティングプロセスで尿素が取り除かれた場合、一部のみ変性したＴＦが元の天然型（native）のコンフォメーションに再び折りたたまれるという可能性もある。これらの結果はまた、変性されたＴＦに結合しない本発明の好ましい抗体と、立体配座のエピトープに選択的に結合せず、変性したＴＦにも結合する既に報告された抗体（図１８において、ウェスタンブロット分析でＳＤＳにより変性したＴＦへの結合を表している米国特許第５,４３７,８６４参照）との違いを明らかに表すものである。
【実施例９】
【０１３８】
抗組織因子抗体のヒト化
前記してきた実施例は、Ｈ３６．Ｄ２と呼ばれる特定のネズミの抗体（前記したように、時にはＨ３６とも称される。）を、どのように調製し、使用するか記載したものである。この実施例は、上記した抗体のヒト化されたものを、どのように調製し、使用するかを示す。ヒト化されたＨ３６抗体は、ヒトの抗マウス抗体（ＨＡＭＡ；human anti-mouse antibody）免疫反応の起こる可能性を最小化するのに役立つ等、様々な用途がある。これらの及び他の好ましくない反応は、ヒトへの治療に応用するのにＨ３６抗体を使用するにあたって問題を引き起こす。
【０１３９】
Ａ．抗組織因子抗体のキメラ（ｃＨ３６）の調製
前記したＨ３６抗体は、ＩｇＧ２ａネズミ抗体である。臨床的発展のために、まずＨ３６を、マウス−ヒトキメラ抗体に改造した。このために、Ｈ３６抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子をクローニングした（米国特許第５，９８６，０６５号参照）。重鎖の可変領域を、ヒトＩｇＧ４定常領域（Ｆｃ）に融合し、軽鎖の可変領域をヒトκ軽鎖定常領域に融合した。この結果生じたＩｇＧ４κキメラ抗体はＳｕｎｏｌ−ｃＨ３６と命名された。慢性疾患を持つ患者でのＨ３６もしくはｃＨ３６の多様な使用にとっては、あらゆるヒト抗マウス抗体免疫反応を減少もしく消失させるような完全にヒト化されたｃＨ３６が好ましい。ｃＨ３６のヒト化を以下に記載する。
【０１４０】
Ｂ．ｃＨ３６抗体のヒト化
抗組織因子抗体のキメラｃＨ３６のヒト化は「ベストフィット」法を用いて成し遂げられた。この方法は、多数のヒトＩｇＧの既知のアミノ酸配列が公的なデータベースで利用可能である事実を十分に利用するものである。ｃＨ３６のマウス重鎖及び軽鎖の可変領域の個々のフレームワークを、Ｋａｂａｔデータベース（http：//immuno.bme.nwu.eduを参照）にあるそれと対応するヒトのフレームワークと比較する。ヒト化に望ましいヒトＩｇＧフレームワークを選択するために以下の基準が用いる：（１）ミスマッチアミノ酸の数はできる限り低く保つ、（２）「バーニヤ（vernier）」区域（この区域のアミノ酸はＣＤＲ構造を調整し、抗原にフィットするようにうまく合わせる、Foote J. and Winter G.、J. of Mol. Bio.、224(2)、pp.487-499、1992年を参照）の中のアミノ酸は変えないでおく、（３）保存アミノ酸の置換は類似した候補を評価するときに行う。この比較のために使用されるマッチングプログラムはimmuno.bme.nwu.eduにあるＫａｂａｔのホームページ（Johnson G, Wu T.、“Kabat database and its application: Future directions.”Nucleic Acids Res.、29、pp.205-206、2001年）で見つけることができる。このプログラムは、Ｋａｂａｔデータベースにあるマウスの配列とヒトの配列の間の相同領域を見つけて整列する。この独特なベストフィット法を用いることにより、標的ＩｇＧのヒト化された軽鎖又は重鎖の可変領域が、少なくとも一つそして多くて４つのヒトＩｇＧ分子に由来する全部で４つのフレームワーク領域を持つであろうと予測される。
【０１４１】
（１）ヒトＩｇＧκ軽鎖の可変領域フレームワークの選択
ｃＨ３６軽鎖のそれぞれのフレームワークのアミノ酸配列を、ＫａｂａｔデータベースにあるヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域での対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較した。ベストフィットフレームワーク領域が上記の３つの基準に従って選択した。
ＫａｂａｔデータベースでのＩＤ Ｎｏ．００５１９１を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ｃＨ３６軽鎖のフレームワーク領域１（ＦＲ１）をヒト化するために選択された。ＫａｂａｔデータベースでのＩＤ Ｎｏ．０１９３０８を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、ｃＨ３６軽鎖のフレームワーク領域２（ＦＲ２）をヒト化するために選択された。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．００５１９１を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６軽鎖ＦＲ１に次の変異（１８番目のＱがＬに、１５番目のＬがＶに、１７番目のＥがＤに、１８番目のＳがＲとなる変異）を導入した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．０１９３０８を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６軽鎖ＦＲ２に一つの変異（３７番目のＱがＬとなる変異）を導入した（配列情報は表１Ａを参照）。
ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．０３８２３３を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、ｃＨ３６軽鎖ＦＲ３をヒト化するために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．００４７３３を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、ｃＨ３６軽鎖ＦＲ４をヒト化するために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．０３８２３３を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６軽鎖ＦＲ３に次の変異（７０番目のＫがＤに、７４番目のＫがＴに、８０番目のＡがＰに、８４番目のＶがＡに、８５番目のＮがＴとなる変異）を導入した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．００４７３３を有するヒトＩｇＧκ軽鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６軽鎖ＦＲ４に二つの変異（１００番目のＡがＱに、１０６番目のＬがＩとなる変異）を導入した（配列情報は表１Ｂを参照）。
【０１４２】
（２）ヒトＩｇＧ重鎖可変領域フレームワークの選択
ｃＨ３６重鎖のそれぞれのフレームワークのアミノ酸配列を、ＫａｂａｔデータベースにあるのヒトＩｇＧ重鎖可変領域での対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と比較した。ベストフィットフレームワーク領域が上記の３つの基準に従って選択した。
ＫａｂａｔデータベースでのＩＤ Ｎｏ．００００４２を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列を、ｃＨ３６重鎖のフレームワーク領域１（ＦＲ１）をヒト化するために選択した。ＫａｂａｔデータベースでのＩＤ Ｎｏ．０２３９６０を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列を、ｃＨ３６重鎖のＦＲ２をヒト化するために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．００００４２を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６重鎖ＦＲ１に次の変異（１番目のＥがＱに、５番目のＱがＶに、９番目のＰがＧに、１１番目のＬがＶに、１２番目のＶがＫに、１９番目のＱがＲに、２４番目のＴがＡとなる変異）を導入した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．０２３９６０を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６重鎖ＦＲ２に２つの変異（４１番目のＨがＰに、４４番目のＳがＧとなる変異）を導入した（配列情報は表２Ａを参照）。
ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．０３７０１０を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列を、ｃＨ３６重鎖ＦＲ３をヒト化するために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．００００４９を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列を、ｃＨ３６重鎖ＦＲ４をヒト化するために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．０３７０１０を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６重鎖ＦＲ３に次の変異（７６番目のＳがＴに、７７番目のＴがＳに、８０番目のＦがＹに、８２番目のＨがＥに、８４番目のＮがＳに、８７番目のＴがＲに、８９番目のＤがＥに、９１番目のＳがＴとなる変異）を導入した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ Ｎｏ．００００４９を有するヒトＩｇＧ重鎖可変領域のアミノ酸配列に一致させるために、ｃＨ３６重鎖ＦＲ４に一つの変異（１１３番目のＬがＶとなる変異）を導入した（配列情報は表２Ｂを参照）。
【０１４３】
表１Ａ及び表１Ｂ：ｃＨ３６とヒトの軽鎖（ＬＣ）フレームワーク配列（ＦＲ）の比較
【０１４４】
【表１】
0004439914.tif 000002
【０１４５】
表２Ａ及び表２Ｂ：ｃＨ３６とヒトの重鎖（ＨＣ）フレームワーク（ＦＲ）配列の比較
【０１４６】
【表２】
0004439914.tif 000003
【０１４７】
望ましいヒトフレームワークの決定がされれば、軽鎖と重鎖の両方で望ましいアミノ酸置換をするために、次の３つの技法が用いられる。（１）クローニングサイト又は分析用エンドヌクレアーゼサイトを導入する目的、及び、可変領域の末端に位置するアミノ酸残基を変更する目的で、クローニングに通常ＰＣＲを使用した。（２）一度に複数のアミノ酸残基を変更するため、特にこれらの残基が可変領域の中間部にあるときに、ＰＣＲに基づいた変異誘発を使用した。（３）一度に一つ又は２つのアミノ酸置換を導入するために、部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）を使用した。部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）は、ストラテジーン社の「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit」（カタログ＃２００５１８）に記載されたプロトコルに従って行われた。
【０１４８】
それぞれの段階の後、部分的にヒト化されたクローンがシークエンスされ、そののちこれらの可変領域の幾つかが発現ベクターにクローンニングされた。プラスミドｔＫＭＣ１８０が軽鎖変異体を発現するために使用され、ｐＪＲＳ３５５又はｐＬＡＭ３５６ベクターが、それぞれＩｇＧ１又はＩｇＧ４として軽鎖変異体を発現するために用いられた。そののち、これらのクローンのいくつかが結合され、ＥＬＩＳＡで発現レベルを決定するために、ＣＯＳ細胞で一過性に発現させた。
【０１４９】
最終的に完全にヒト化された形態の抗ＴＦ重鎖及び軽鎖可変領域は、ここでしばしば「メガベクター」と呼ばれるものにクローンニングされ、ＩｇＧを発現させるためにＣＨＯ及びＮＳＯ細胞に導入された。そののち、解析に十分な量のヒト化抗ＴＦ抗体を生産するために、定常細胞株が用いられた。この結果生じたヒト化変異体は（ＣＤＲ配列を考慮しない場合）、１００％ヒトを起源とするものである。ヒト化ＩｇＧ４κ変異体はｈＦＡＴ（humanized IgG Four Anti-Tissue Factor antibody；ヒト化ＩｇＧ４抗組織因子抗体）と命名され、ＩｇＧ１κ変異体は、ｈＯＡＴ（humanized IgG One Anti-Tissue Factor antibody）と命名された。これらの完全にヒト化されたｃＨ３６の変異体は、血栓症、ガン、炎症性疾患などの慢性症状の治療を目的とするものである。
【０１５０】
Ｃ．抗ＴＦ抗体重鎖のヒト化
１．プラスミドpJAIgG4TF.A8（キメラＨ３６の発現ベクター）をテンプレートとして用い、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２とＴＦＨＣ１ａｓ２を用いることにより、抗ＴＦモノクローナル抗体ｃＨ３６の重鎖（ＨＣ）可変領域のＰＣＲ増幅と、pGem T-easyへのクローニングを行った。プライマーＴＦＨＣ１ｓ２は、開始コドンの上流にＢｓｉＷ１サイトが導入され、フレームワーク（ＦＲ）１の一番目のアミノ酸ＥをＱに変更した。プライマーＴＦＨＣ１ａｓは、フレームワーク４（ＦＲ４）の１１３番目のアミノ酸ＬをＶに変更した。この段階でコンストラクトＨＣ０１を得た。
【０１５１】
２．前記したコンストラクト（ＨＣ０１）と次の４つのプライマーを用いたＰＣＲベースの変異誘発によって、コンストラクトＨＣ０２を構築した。上流側のＰＣＲにプライマーＴＦＨＣ１ｓ２とＴＦＨＣ７ａｓを使用した。下流側のＰＣＲにプライマーＴＦＨＣ７ｓとＴＦＨＣ１ａｓ２を使用した。上流側と下流側のＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２とＴＦＨＣ１ａｓ２を用いたオーバーラップＰＣＲによりＨＣ０２を調製した。プライマーＴＦＨＣ７ｓとＴＦＨＣ７ａｓの使用により、フレームワーク３（ＦＲ３）の二つのアミノ酸変化（３１番目のＨがＰに、４４番目のＳ→Ｇとなる変化）導入された。
【０１５２】
３．ＨＣ０２をテンプレートとして使用し、次の４つのプライマーを用いたＰＣＲベースの変異誘発によって、コンストラクトＨＣ０３を構築した。上流側のＰＣＲにプライマーＴＦＨＣ１ｓ２とＴＦＨＣ５ａｓ２を使用した。下流側のＰＣＲにプライマーＴＦＨＣ５ｓとＴＦＨＣ１ａｓ２を使用した。上流側と下流側のＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２とＴＦＨＣ１ａｓ２を用いたＰＣＲによりＨＣ０３を調製した。プライマーＴＦＨＣ５ｓとＴＦＨＣ５ａｓ２の使用により、フレームワーク２（ＦＲ２）の３つのアミノ酸変化（８７番目のＴがＲに、８９番目のＤがＥに、そして９１番目のＳがＴとなる変化）が導入された。ＢｇｌIIサイトも８７位に導入された。
【０１５３】
４．プライマーＴＦＨＣ２ｓ及びＴＦＨＣ３ａｓ、並びにテンプレートとしてｐＧＥＭ中のＨＣ０３を使用してＰＣＲによる増幅を行った。ＴＦＨＣ２ｓはｐＧｅｍのクローニングサイトの上流に位置する。ＴＦＨＣ３ａｓはフレームワーク３に位置し、ＦＲ３中の２つのアミノ酸変化（８２番目のＨがＥに、８４番目のＮがＳとなる変化）を導入する。結果として生じたＰＣＲバンドはｐＧｅｍにクローンニングされ、そののち適切なサイズのインサートがＢｓｉＷ１とＢｇｌIIによって切り出された。この断片をＨＣ０３にサブクローニングし、ＨＣ０４を調製した。
【０１５４】
５．テンプレートとしてのＨＣ０４と、次のプライマーを使用したＰＣＲベースの変異誘発により、ＨＣ０５を構築した。上流側のＰＣＲに、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２とＴＦＨＣ６ａｓを使用した。下流側のＰＣＲに、プライマーＴＦＨＣ６ｓとＴＦＨＣ１ａｓ２を使用した。上流側と下流側のＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２とＴＦＨＣ１ａｓ２を用いた変異誘発ＰＣＲによって、ＨＣ０５を調製した。この段階で、ＦＲ３に次のアミノ酸変化（７６番目のＳがＴに、７７番目のＴがＳに、そして８０番目のＦがＹとなる変化）が導入された。
【０１５５】
６．ＨＣ０５をテンプレートとして使用し、次の４つのプライマーを用いたＰＣＲベースの変異誘発により、ＨＣ０６を構築した。上流側のＰＣＲに、ＴＦＨＣ２ｓとＴＦＨＣ２ａｓ２を使用した。下流側のＰＣＲに、プライマーＴＦＨＣ３ｓ２とＴＦＨＣ１ａｓ２を使用した。ＴＦＨＣ２ａｓ２を使用した増幅によりＦＲ１に一つのアミノ酸変化（９番目のＰがＧとなる変化）が導入された。プライマーＴＦＨＣ３ｓ２によって、１９番目のＱがＲに、２４番目のＴがＡに変化した。上流及び下流のＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２及びＴＦＨＣ１ａｓ２を用いたＰＣＲにより、ＨＣ０６を調製した。
【０１５６】
７．ＦＲ１の２位でのＩからＭへのポイントミューテーションは、ＨＣ０６の構築の際に同時に導入された。ＨＣ０６をテンプレートとして使用し、ＴＦＨＣ１ｓ３及びＴＦＨＣ１ａｓ２をプライマーとして使用したＰＣＲによる増幅により、この誤った置換を訂正し、また、ＦＲ１に一つのアミノ酸変化（５番目のＱがＶとなる変化）を導入した。この結果生じたコンストラクトがＨＣ０７であった。
【０１５７】
８．テンプレートとしてＨＣ０７と次のプライマーを使用したＰＣＲベースの変異誘発により、コンストラクトＨＣ０８を構築した。ＴＦＨＣ２ｓ及びＴＦＨＣ２ａｓ３が上流側のＰＣＲ産物のために使用された。下流側のＰＣＲ産物は既にＴＦＨＣ１ｓ３とＴＦＨＣ１ａｓ２を用いて増幅されている（ステップ７を参照）。プライマーＴＦＨＣ２ａｓ３を使用することにより、ＦＲ１での二つのアミノ酸の置換（１１番目のＬがＶに、そして１２番目のＶがＫとなる変化）が導入された。自発的なポイントミューテンションにより、ＣＤＲ２の６４位のＦがＬへ変化していた。さらにスクリーニング及びシークエンスすることによって、ＣＤＲ２の６４位に正しい配列Ｆを有するコンストラクトＨＣ０８Ｒ１を調製した。
【０１５８】
９．二つのコンストラクトＨＣ１１及びＨＣ１２を、ＨＣ０７から部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）によって構築した。ＦＲ１に３つのアミノ変異（９番目のＧがＰに、１１番目のＬがＶに、そして、１２番目のＶがＫとなる変異）を含むＨＣ１１をつくるために、二つの相補的プライマーＴＦＨＣ８ｓＰ及びＴＦＨＣ８ａｓＰが、ＨＣ０７をテンプレートにして使用された。そののち、ＨＣ１１がメチル化され、次の回の部位特異的突然変異誘発（site-directed mutagenesis）のためにカラムで精製された。テンプレートとしてＨＣ１１と、相補的プライマーＴＦＨＣ９ｓＬ及びＴＦＨＣ０ａｓＬを使用したＰＣＲにより、ＦＲ１の１１番目のＶがＬに変異したＨＣ１２を調製した。
【０１５９】
１０．テンプレートとしてのＨＣ１２、並びに相補的プライマーＴＦＨＣ１０ｓＫ及びＴＦＨＣ１０ａｓＫを使用したＰＣＲを行うことにより、ＨＣ１２からコンストラクトＨＣ０９が誘導された。ＨＣ０９は、一つのアミノ酸変異（ＦＲ１の１２番目のＫがＶとなる変異）を有する。
【０１６０】
１１．コンストラクトＨＣ１０がＨＣ０９から調製された。テンプレートとしてＨＣ０９、並びに相補的プライマーＬＶ−１及びＬＶ−２を使用したＰＣＲにより、ＦＲ１の１１番目のＬがＶに変異したＨＣ１０を調製した。
【０１６１】
それぞれの変異段階の後、部分的にヒト化もしくは完全にヒト化されたクローンがシークエンスされ、これらの可変領域のいくつかが、後に発現ベクターにクローンニングされた。ｐＪＲＳ３５５もしくはｐＬＡＭ３５６ベクターを、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４と融合した軽鎖変異体を発現させるために使用した。
【０１６２】
図１３Ａはステップ１〜１１を要約しており、ＦＲ１〜４に導入されたアミノ酸の変化の増分を表している。ＨＣ０８を除き、他の全ての重鎖変異体及びｃＨ３６はＣＤＲ２の６４位にＦを有する。ＨＣ０８は６４位にＦからＬの変異を有する。図１３Ｂ〜Ｄは重鎖のＣＤＲ配列を表す。
【０１６３】
重鎖のヒト化に使用されるプライマー
ＴＦＨＣ１ｓ２
5' TTTCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGCAGCAGTC 3'
ＴＦＨＣ１ａｓ２
5' AGCGAATTCTGAGGAGACTGTGACAGTGGTGCCTTGGCCCCAG 3'
ＴＦＨＣ７ｓ
5' GTGAGGCAGAGCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGG 3'
ＴＦＨＣ７ａｓ
5' CCAATCCACTCAAGGCCCTTTCCAGGGCTCTGCCTCAC 3'
ＴＦＨＣ５ｓ
5' GCATCTCAACAGCCTGAGATCTGAAGACACTGCAGTTTATTTCTGTG 3'
ＴＦＨＣ５ａｓ２
5' CTGCAGTGTCTTCAGATCTCAGGCTGTTGAGATGCATGAAGGC 3'
ＴＦＨＣ３ａｓ
5' GTCTTCAGATCTCAGGCTGCTGAGCTCCATGAAGGCTGTGGTG 3'
ＴＦＨＣ２ｓ
5' TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG 3'
ＴＦＨＣ６ｓ
5' CTGTTGACAAGTCTACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAG 3'
ＴＦＨＣ６ａｓ
5' CTGCTGAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGGTAGACTTGTCAACAG 3'
ＴＦＨＣ２ａｓ２
5' GCACTGAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCACCTCCAGACTGCTGCAGC 3'
ＴＦＨＣ３ｓ２
5' CTGGGGCTTCAGTGCGGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCAC 3'
ＴＦＨＣ１ｓ３
5' TCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTGAGC 3'
ＴＦＨＣ２ａｓ３
5' GCACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCACCTCCAGACTGCACC 3'
ＴＦＨＣ９ｓＬ
5' GCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGG 3'
ＴＦＨＣ９ａｓＬ
5' CCCCAGGCTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGC 3'
ＴＦＨＣ８ｓＰ
5' GCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCC 3'
ＴＦＨＣ８ａｓＰ
5' GGCTTCTTCACCTCAGGTCCAGACTGCACCAGC 3'
ＴＦＨＣ１０ｓＫ
5' GCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC 3'
ＴＦＨＣ１０ａｓＫ
5' GAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGC 3'
ＬＶ−１
5' CAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGG 3'
ＬＶ−２
5' CCCAGGCTTCACCACCTCAGGTCCAGACTG 3'
【０１６４】
Ｄ．抗ＴＦ抗体軽鎖のヒト化
１．テンプレートとしてプラスミドpJAIgG4TF.A8（キメラＨ３６の発現ベクター）、並びにプライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１及びＴＦＬＣ１ａｓ２を使用したＰＣＲによる増幅を行った。このステップで、コード領域の上流にクローニングサイトＡｇｅＩが導入された。また、ＦＲ４の１０６番目のＬがＩになる変異が導入された。このステップによりコンストラクトＬＣ０３が調製された。
【０１６５】
２．相補的プライマーＴＦＬＣ５ｓ及びＴＦＬＣ５ａｓ、並びにテンプレートとしてＬＣ０３を使用して、部位特異的変異誘発を行った。このステップにより、ＦＲ２の３７番目のＱがＬとなる変異が導入され、分析の目的でＰｓｔＩサイトが付け加えられた。この新しいコンストラクトはＬＣ０４と命名される。
【０１６６】
３．テンプレートとしてＬＣ０４並びにプライマーＴＦＨＣ２ｓ及びＴＦＬＣ２ａｓ１を使用して、ＰＣＲによる増幅を行った。このステップにより、ステップ６で使用されるフラグメントＡが生成された。このステップでは、ＦＲ１の１１番目のＱがＬへ、１５番目のＬがＶになる変異が導入された。
【０１６７】
４．テンプレートとしてＬＣ０４、並びにプライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１及びＴＦＬＣ１ａｓＲを用いてＰＣＲによる増幅を行った。このステップにより、ＬＣ可変領域の末端にＫｐｎＩサイトが導入された。このＰＣＲフラグメントをｐＧＥＭへクローンニングすることにより、ステップ６で使用されるｐＧＥＭ０４Ｋが調製された。
【０１６８】
５．テンプレートとしてＬＣ０４、並びにプライマーＴＦＬＣ２ｓ及びＴＦＬＣ４ａｓを使用してＰＣＲによる増幅を行った。このステップにより、ステップ６で使用されるフラグメントＣが生成された。このステップで３つの変異（ＦＲ１の１７番目のＥがＤに、１８番目のＳがＲに、そしてＦＲ４の１００番目のＡがＱとなる変異）が導入された。
【０１６９】
６．テンプレートとしてフラグメントＡ及びフラグメントＢ、並びにプライマーＴＦＨＣ２ｓ及びＴＦＬＣ４ａｓを使用したＰＣＲベースの突然変異誘発によりフラグメントＤを調製した。フラグメントＤをｐＧＥＭ０４Ｋにクローンニングすることにより、コンストラクトＬＣ０４を構築した。
【０１７０】
７．テンプレートとしてｐＧＥＭ０４Ｋ、並びにプライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１及びＴＦＬＣ４ａｓを使用して、ＰＣＲによる増幅を行った。このステップにより、のちにｐＧＥＭ０４ＫにクローニングされるフラグメントＨが生成した。これにより、ＦＲ４の１００番目のＡがＱとなる変異が導入され、このコンストラクトはＬＣ０６と命名される。
【０１７１】
８．テンプレートとしてＬＣ０６、並びにプライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１及びＴＦＬＣ３ａｓを使用して、ＰＣＲによる増幅を行った。このステップにより、ステップ１０で使用されるフラグメントＩが生成された。これにより、ＦＲ３の７０番目のＫがＤとなる変異及び７４番目のＫがＴとなる変異が導入された。
【０１７２】
９．テンプレートとしてＬＣ０６、並びにプライマーＴＦＬＣ３ｓ２及びＴＦＬＣ４ａｓを使用して、ＰＣＲによる増殖を行った。このステップにより、ステップ１０で使用されるフラグメントＦが生成された。これによりＦＲ３で８０番目のＡがＰとなる変異が導入された。
【０１７３】
１０．テンプレートとしてフラグメントＩ及びフラグメントＦ、並びにプライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１及びＴＦＬＣ４ａｓを使用したＰＣＲにより、フラグメントＪを調製した。ｐＧＥＭへのフラグメントＪのクローニングによりコンストラクトＬＣ０７を調製した。
【０１７４】
１１．相補的プライマーＴＦＬＣ０８ｓｄｓ及びＴＦＬＣ０８ｓｄｓａ、並びにテンプレートとしてＬＣ０７を使用することにより、部位特異的変異誘発がもたらされた。このステップにより、ＦＲ３の８４番目のＶがＡに、８５番目のＮがＴとなる変異が導入された。このコンストラクトはＬＣ０８と命名される。
【０１７５】
１２．１１番目のＱがＬに、１５番目のＬがＶに、１７番目のＥがＤに、１８番目のＳがＲに、そして３７番目のＱがＬとなる変異を有するＬＣ０５から、ＡｇｅＩからＥｃｏＯ１０９Ｉまでの断片を得て、ＬＣ０８にクローニングした。これによりコンストラクトＬＣ０９を構築した。
【０１７６】
１３．テンプレートとしてＬＣ０９、並びに相補的プライマーＬＣ１０５及びＬＣ１０３を使用して、部位特異的突然変異誘発がもたらされた。このステップにより、８５番目のＴがＮとなる変異がＦＲ３に導入され、コンストラクトＬＣ１０を構築した。
【０１７７】
１４．テンプレートとしてＬＣ１０、並びに相補的プライマーＬＣ１１５及びＬＣ１１３を使用して、部位特異的突然変異がもたらされた。このステップによりＦＲ３の７０番目のＤがＫとなる変異が導入された。これによりコンストラクトＬＣ１１を構築した。
【０１７８】
１５．テンプレートとしてＬＣ１１、並びに相補的プライマーＬＣ１２５ａ及びＬＣ１２３ａを使用して、部位特異的変異誘発がもたらされた。このステップによりＦＲ２の４２番目のＫがＱとなる変異が導入された。これによりコンストラクトＬＣ１２を構築した。
それぞれの変異ステップの後、部分的にヒト化又は完全にヒト化された軽鎖のクローンがシークエンスされ、これらの可変領域のいくつかが、後に発現ベクターｔＫＭＣ１８０にクローニングされた。
図１２Ａは、ステップ１〜１５を要約しており、軽鎖のＦＲ１〜４に導入されたアミノ酸の変化の増分を表している。図１２Ｂ〜Ｄは軽鎖ＣＤＲの配列を表している。
【０１７９】
軽鎖のヒト化に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー
ＴＦＬＣ１ａｓ２：
5' TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAG 3'
ＴＦＬＣ１ｓ２．１：
5' ACCGGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC 3'
ＴＦＬＣ５ｓ：
5' GGTTAGCATGGTATCTGCAGAAACCAGGG 3'
ＴＦＬＣ５ａｓ：
5' CCCTGGTTTCTGCAGATACCATGCTAACC 3'
ＴＦＨＣ２ｓ：
5' TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG 3'
ＴＦＬＣ２ａｓ１：
5' CCACAGATGCAGACAGGGAGGCAGGAGACTG 3'
ＴＦＬＣ１ａｓＲ：
5' TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTACCAGCACCGAACG 3'
ＴＦＬＣ２ｓ：
5' CCTGTCTGCATCTGTGGGAGATAGGGTCACCATCACATGC 3'
ＴＦＬＣ４ａｓ：
5' GATCTCCAGCTTGGTACCCTGACCGAACGTGAATGG 3'
ＴＦＬＣ３ａｓ：
5' GTAGGCTGCTGATCGTGAAAGAAAAGTCTGTGCCAGATCC 3'
ＴＦＬＣ３ｓ２：
5' CACGATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGTAAATTATTACTGTC 3'
ＴＦＬＣ０８ｓｄｓ：
5' GCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAAG 3'
ＴＦＬＣ０８ｓｄｓａ：
5' CTTGTTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGC 3'
ＬＣ１０５：
5' CAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAAATTATTACTGTCAAC 3'
ＬＣ１０３：
5' GTTGACAGTAATAATTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGCTG 3'
ＬＣ１１５：
5' CAGTGGATCTGGCACAAAGTTTTCTTTCACGATCAGCAGC 3'
ＬＣ１１３：
5' GCTGCTGATCGTGAAAGAAAACTTTGTGCCAGATCCACTG 3'
ＬＣ１２５ａ：
5' CTGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTCAGCTCCTG 3'
ＬＣ１２３ａ：
5' CAGGAGCTGAGGAGATTGCCCTGGTTTCTGCAG 3'
【０１８０】
図１４は、軽鎖（図１４Ａ）及び重鎖（図１４Ｂ）のｈＯＡＴ（human cH36-IgG1）定常領域の配列を示す。図１５は、軽鎖（図１５Ａ）及び重鎖（図１５Ｂ）のｈＦＡＴ（humanized cH36-IgG4）定常領域の配列を示す。それぞれの図において、フレームワーク４（ＦＲ４）可変領域の最後のアミノ酸残基が、ｈＯＡＴ及びｈＦＡＴの定常領域の最初のアミノ酸残基と結合している。
【実施例１０】
【０１８１】
ヒト化抗ＴＦ抗体の発現及び精製
部分的にヒト化されもしくは完全にヒト化された軽鎖及び重鎖のクローンを、発現ベクターにクローニングした。ヒトκ鎖に融合した軽鎖変異体を発現させるために、プラスミドｔＫＭＣ１８０（図１０Ａ−Ｂを参照）を使用し、ヒトのＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のＦｃと融合した重鎖変異体を発現させるために、ｐＪＲＳ３５５（図９Ａ−Ｂを参照）もしくはｐＬＡＭ３５６（図９Ｃ−Ｄを参照）ベクターを使用した。そののち、重鎖及び軽鎖クローンのいくつかの組み合わせをＣＯＳ細胞に共に導入した。ＩｇＧの総生産とＴＦに対する結合について、ＣＯＳ細胞で一過性に発現させたＩｇＧをＥＬＩＳＡで分析した。
【０１８２】
最後の完全にヒト化された抗ＴＦ重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣ０８とＬＣ０９の組み合わせ）を、スノールのメガ発現ベクター（Sunol's Mega expression vector、ｐＳＵＮ３４、図１１参照）にクローニングし、ＩｇＧ発現のためにＣＨＯ細胞及びＮＳＯ細胞に導入した。ＩｇＧ４κもしくはＩｇＧ１κであるヒト化された抗ＴＦ抗体を生産する定常化した導入細胞がクローン化された。そののち、分析に十分な量のヒト化抗ＴＦ抗体を生産するために、選抜された定常細胞株が使用された。この結果生じたヒト化変異体は９５％近くヒトを起源とするものであった（ＣＤＲ配列を考慮しない）。ヒト化されたＩｇＧ４κ変異体はｈＦＡＴ（humanized IgG Four Anti-Tissue Factor antibody）と命名され、ＩｇＧ１κ変異体はｈＯＡＴ（humanized IgG One Anti-Tissue Factor antibody）と命名された。これらの完全にヒト化されたｃＨ３６の変異体は、ガン及び炎症性疾患のような慢性症状の治療を目的とするものである。
【０１８３】
ｈＯＡＴ（ＨＣ０８とＬＣ０９の組み合わせ）を発現するＮＳＯ細胞株の一つ（ＯＡＴ−ＮＳＯ−Ｐ１０Ａ７）を解凍し、１５ｍｌのチューブの中で、１０％ＦＢＳを添加した１０ｍｌのＩＭＤＭ培地中に懸濁し、遠心分離を行った。細胞ペレットを１０ｍｌの新鮮な培地の中で再懸濁し、Ｔ２５フラスコに注いで、５％ＣＯ２のもと３７℃でインキュベートした。中空繊維バイオリアクターへの植え付けに充分な数の細胞を準備するために、総数で６×１０８を得るまで細胞を増殖させた。バイオリアクターは、製造元の使用説明書に従って準備をした。採取した細胞をペレット化して、３５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ６０ｍｌ中に再懸濁し、バイオリアクターの毛管外空間へ注入した。グルコースと乳酸塩の濃度を毎日モニターし、採取したものを遠心分離してプールしておいた。採取されたものについて、ＥＬＩＳＡ分析により抗ＴＦ抗体の濃度を試験した。抗ＴＦ抗体（ｈＯＡＴ）を含むプールされたサンプルをそののち精製し、以下に記載するように分析した。
【０１８４】
Ａ．ｒプロテインＡのセファロースファーストフロークロマトグラフィー
組換え型ヒト化抗ＴＦモノクローナル抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖からなる。軽鎖はマウスの可変領域（変更されていないか、もしくは、上記のようにヒト化されているもの）とヒトκドメインを含んでいるのに対し、重鎖は、マウスの可変領域（変更されていないか、もしくは、上記のようにヒト化されているもの）と、ヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４のＦｃドメインとの融合体である。ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、プロテインＡ又は組換え型プロテインＡ（ｒプロテインＡ）に対する高い親和性を有することが十分に確立されている。
ヒト化抗ＴＦ抗体（ｈＯＡＴ）を含む採取されたプールを、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）をサンプル１ｍｌあたり０．０８ｍｌ加えることにより、ｐＨ８．０±０．１に調整した。そののち、低タンパク結合性０．２２ミクロンフィルター（例えば、ポリエーテルスルホン膜付きのナルジーン滅菌ディスポーザブル組織培養フィルターユニット、Nalge Nunc International、カタログＮｏ．１６７−００２０）でサンプルを濾過した。サンプル添加の後、媒体のタンパク質（media proteins）などの結合しない物質を取り除くために、ｒプロテインＡカラム（Pharmacia製）を５倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）で洗浄した。採取した培地は高濃度のウシ血清を含んでいるので、カラムからウシＩｇＧを取り除くために、段階的ｐＨ勾配による洗浄を行った。段階的ｐＨ勾配は、バッファーＡ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム）中のバッファーＢ（１００ｍＭ酢酸）の比率を増すことにより行われた。典型的なｐＨの段階的洗浄は、２０％、４０％そして６０％のバッファーＢを用いるものである。１００％のバッファーＢでカラムを抽出して、Ａ２８０に基づいて画分を収集した。プールされた画分は、１Ｍのトリス塩基を加えることによりｐＨ８．５に調整された。
【０１８５】
Ｂ．Ｑセファロースファーストフロークロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーは、その電荷によりタンパク質を分離するのにとても効率的である。抽出されｐＨを調整されたｒプロテインＡカラムからのサンプルを２倍量の水で希釈し、ｐＨを確認して８．５に調整した。そののちサンプルを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で平衡化した５ｍｌ（１．６ｃｍ×２．５ｃｍ）のＱセファロースファーストフロー（Q Sepharose Fast Flow）にロードし、そのカラムを（１）５倍量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（２）４倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５であり１００ｍＭのＮａＣｌを含む）で洗浄した。そののち、５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの数倍量で、ＩｇＧタンパク質を抽出した。タンパク質のピークをプールし、超濾過装置を用いてバッファーをＰＢＳに交換した。
同様の形質転換、細胞培養及び精製方法を用いて、ｈＦＡＴも産生され、精製された。
【実施例１１】
【０１８６】
ヒト化抗ＴＦ抗体の特性
Ａ．ヒト化抗ＴＦ抗体によるＴＦ機能の阻害
抗ＴＦ抗体の重要な特性の一つは、組織因子に由来する血液凝固を阻害する能力である。標準的なＰＴ分析により、精製されたｈＯＡＴ及びｈＦＡＴのＴＦ活性を阻害する能力を測定した。ＰＴ分析は、組織因子による血液凝固時間を測定するために広く用いられている。この分析の原理は、組織因子（ＴＦ）が血漿中でＶIIa因子と複合体を形成することである。この複合体は、そののちＸからＦＸａまでの因子を活性化する；ＦＸａはその後、Ｖａ因子及びリン脂質の存在下にプロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは、最終的に血餅を形成させる。標準的なＰＴ分析では、脂質が付加されたＴＦが血漿に添加されて血液凝固が始まり、その凝固がOrganon Teknika Coag-A-Mate Coagulation Analyzerもしくはそれと同等な装置によって記録される。
【０１８７】
抗ＴＦ抗体、Ｈ３６は独特な機構によりヒトＴＦ活性を阻害する。Ｘ及びIＸ因子がＴＦ−ＶIIa複合体に結合するのを妨害して、ＴＦ−ＶIIa複合体によるＦＸ及びＦIＸの活性化を阻害することになるように、Ｈ３６はＴＦ（遊離体もしくはＶIIa因子との複合体）と結合する（米国特許第5,986,065号参照）。ＰＴテストにおいて、抗ＴＦ抗体が加えられたヒト血漿での凝固時間が延長されたことから、このＴＦによる凝固が阻害されたことが明らかに示された。凝固時間はＴＦの活性量に関係するものである。連続的に希釈されたＴＦでのＰＴ凝固時間の測定から、ＴＦ標準曲線がつくられる。ＴＦ標準曲線のデータから、抗ＴＦ抗体によるＴＦ活性の阻害が定量された。
【０１８８】
試薬：イノビン（Innovin、カタログNo.68100-392）及びＣｉ−Ｔｒｏｌ凝固コントロール、レベルＩ（カタログNo.68100-336）をＶＷＲから入手した。脂質付加された組み換え型ヒトＴＦを、実施例３に記載したように製造した。
【０１８９】
方法：ＰＴテストは、凝固分析装置を用いて３７℃で実施した。０．０１ｍｌのバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ）、又は抗ＴＦ抗体を含む０．１ｍｌのヒト血漿（Ｃｉ−Ｔｒｏｌコントロール、レベルＩ）中に、脂質付加された組み換え型ヒト組織因子（例えば、イノビン）を０．２ｍｌ添加することにより、ＰＴ反応が開始された。
【０１９０】
１．使用説明書に従って、１瓶のイノビンに精製水を加える。試薬を３７℃まで温める。試薬は４〜８℃で保存すれば数日間安定である。
２．Ｃｉ−Ｔｒｏｌのそれぞれの瓶に１ｍｌの精製水を加える。これを混ぜて溶解させる。一瓶よりも多く使用する場合には、それらを一つの容器（例えば、１０ｍｌの試験チューブ）で一緒にする。１ｍｌのＣｉ−Ｔｒｏｌで５回分析することができる（各分析で２×０．１ｍｌ＝０．２ｍｌ使用する）。Ｃｉ−Ｔｒｏｌは氷上で保存でき、２、３時間は保存可能である。
３．抗ＴＦ抗体のストックから、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ、で、抗ＴＦ抗体の連続希釈（２００ｎＭから１６００ｎＭまで）を作成した。
４．０．１ｍｌのＣｉ−Ｔｒｏｌの入った二つのウェルのキュベットのそれぞれのウェルに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡを１０μｌ、又は、希釈抗ＴＦ抗体１０μｌを加える。０．１ｍｌのチップをつけたピペットを使用して、それぞれのウェルを混合する。抗ＴＦ抗体（もしくはバッファー）を血漿（Ｃｉ−Ｔｒｏｌ）に混ぜた後、０．２ｍｌのイノビンを加えたことによる凝固時間を１０分以内で測定する。
【０１９１】
表３は、ｃＨ３６、ｈＯＡＴ及びｈＦＡＴのＰＴ凝固時間に対する効果をまとめたものである。表４のデータと比較して、ｃＨ３６、ｈＦＡＴ及びｈＯＡＴはＴＦ機能を非常に強力に阻害することが示された。１２．９ｎＭ以上のタンパク濃度では、全ての抗体が約９５％の阻害を成し遂げた。表３の結果はまた、上記に記載した方法により抗ＴＦ抗体であるｃＨ３６をヒト化することは、ｃＨ３６の阻害活性に大きな効果を及ぼさないことを示している。なぜなら、ｈＦＡＴ及びｈＯＡＴは、ＴＦによる血液凝固を阻害する能力がｃＨ３６に見られるものと非常に似ていたからである。
【０１９２】
表３．キメラ（ｃＨ３６）並びに（ヒト化された）抗ＴＦ抗体（ｈＦＡＴ及びｈＯＡＴ）のプロトロンビン時間に対する効果
【０１９３】
【表３】
0004439914.tif 000004
【０１９４】
表中の全ての分析は同じ１００％のＴＦ活性（濃度）のサンプルを使用している。
【０１９５】
表４．凝固時間と組織因子活性比（濃度）
【０１９６】
【表４】
0004439914.tif 000005
【０１９７】
Ｂ．親和定数の定量
ＣＭ５センサーチップに組換え型ヒト組織因子が共有結合で固定された表面プラズモン共鳴装置（surface plasmon resonance; Pharmacia Biosensor製のBIAcore）により、ＴＦに対するヒト化抗ＴＦ抗体の親和性を定量化した。親和定数は、BiAcoreコンピューターソフトウェアにより、抗ＴＦモノクローナル抗体の４つの濃度（０．１２５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ及び１ｎＭ）から計算された平均データである。表５の結果から、抗ＴＦ抗体であるｃＨ３６を上記の方法によりヒト化することは、ＴＦに対するｃＨ３６の親和性に大きな影響を与えないことが示される。なぜなら、ｃＨ３６とｈＦＡＴの両方はＴＦに対して同じ親和性を有するからである。
【０１９８】
表５．抗ＴＦ抗体の見かけ上の親和定数と分離定数
【０１９９】
【表５】
0004439914.tif 000006
【０２００】
本発明は、その好ましい具体例に関して詳細に記載されている。しかしながら、当業者が本発明の開示を考慮して、本発明の趣旨及び範囲内で修正や改良を行うことは歓迎されることである。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の軽鎖および重鎖の可変領域における核酸（配列番号１及び配列番号３）とアミノ酸（配列番号２及び配列番号４）の配列を示す。超可変領域（ＣＤＲ即ち相補性決定領域）を下線で示す（一重下線は核酸配列、二重下線はアミノ酸配列を示す）ものである。および重鎖の
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡやＢＩＡＣｏｒｅ分析によって測定された、抗組織因子抗体の会合定数（Ｋａ）と解離定数（Ｋｄ）を示すものである。
【図３】図３は、抗組織因子抗体と共にプレインキュベートしたＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体が介在するＦＸの活性化の阻害を示すものである。
【図４】図４は、ＦＶＩＩａに特異的な色素原の基質Ｓ−２２８８に対するＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の活性化が、抗組織因子抗体によって阻害されていることを示すものである。
【図５】図５は、ＴＦ初期凝固アッセイにおけるプロトロンビン時間（ＰＴ）を延長させるためのＨ３６抗体の能力を示す図である。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、ＦＸａ形成と、Ｈ３６抗体及びｒＨＴＦのモル比との関係をグラフで示したものであり、図６Ａでは、Ｈ３６がＦＸ添加前にＦＴ：ＦＶＩＩａ複合体と共にプレインキュベートされており、図６Ｂでは、Ｈ３６、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体及びＦＸが同時に添加されている。
【図７】図７は、Ｊ−８２細胞活性分析法におけるＨ３６抗体によるＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の活性化の阻害を示すものである。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、Ｈ３６抗体がｒｈＴＦ上のエピトープの立体配座中に結合するブロティングをドットで示す。レーン１は、ネイティブｒＨＴＦ、レーン２は、８Ｍの尿素で処理したネイティブｒＨＴＦ、レーン３は、８Ｍの尿素と５ｍＭのＤＴＴで処理したネイティブｒＨＴＦを示す。図８Ａでは、ブロットを約４０秒間露光した、一方図８Ｂでは、ブロットを１２０秒間露光した。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ及び図９Ｂは、ヒトＩｇＧ１−ｃＨ３６の重鎖可変領域のクローニングベクター及び発現ベクターを示す図面である。重鎖のクローニングベクター（図９Ａ）及び重鎖の発現ベクター（図９Ｂ）。
【図９Ｃ−９Ｄ】図９Ｃ及び図９Ｄは、ヒトＩｇＧ４−ｃＨ３６の重鎖可変領域のクローニングベクター及び発現ベクターを示す図面である。重鎖のクローニングベクター（図９Ｃ）及び重鎖の発現ベクター（図９Ｄ）。
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、ｃＨ３６の軽鎖可変領域のクローニングベクター及び発現ベクターを示す。軽鎖のクローニングベクター（図１０Ａ）及び軽鎖の発現ベクター（図１０Ｂ）。
【図１１】図１１は、ヒト型の抗−ＴＦＩｇＧ１抗体の発現ベクター（ｐＳＵＮ３４）のプラスミドマップを示す。
【図１２】図１２Ａ乃至図１２Ｄは、部分的及び完全にヒト型化された軽鎖（ＬＣ）可変領域を示す。軽鎖のＣＤＲの配列及びｃＨ３６の配列が図１２Ｂ乃至図１２Ｄに示されている。配列「ＬＣ−０９」は完全なヒト型の軽鎖（ＬＣ）フレームワーク領域を示す代表的な配列である。
【図１３】図１３Ａ乃至図１３Ｄは、部分的及び完全にヒト型化された重鎖（ＨＣ）可変領域を示す。ｃＨ３６及びＨＣ−０８の重鎖ＣＤＲの配列が図１３Ｂ乃至図１３Ｄに示されている。配列「ＨＣ−０８」は完全なヒト型の重鎖（ＨＣ）フレームワーク領域である。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、ヒト型ＩｇＧ１抗組織因子抗体（ｈＯＡＴ）（ＩｇＧ１）の定常領域を示す。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、ヒト型ＩｇＧ４抗組織因子抗体（ｈＦＡＴ）（ＩｇＧ４）の定常領域を示す。
【図１−Ａ】
0004439914.tif 000007
【図１−Ｂ】
0004439914.tif 000008
【図２】
0004439914.tif 000009
【図３】
0004439914.tif 000010
【図４】
0004439914.tif 000011
【図５】
0004439914.tif 000012
【図６−Ａ】
0004439914.tif 000013
【図６−Ｂ】
0004439914.tif 000014
【図７】
0004439914.tif 000015
【図８】
0004439914.tif 000016
【図９Ａ−９Ｂ】
0004439914.tif 000017
【図９Ｃ−９Ｄ】
0004439914.tif 000018
【図１０Ａ−１０Ｂ】
0004439914.tif 000019
【図１１】
0004439914.tif 000020
【図１２】
0004439914.tif 000021
【図１３】
0004439914.tif 000022
【図１４】
0004439914.tif 000023
【図１５】
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【配列表】
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