(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＰ２Ｙ４レセプターポリペプチド。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化することを特徴とする核酸分子。
【請求項３】
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の核酸分子。
【請求項４】
ｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の核酸分子。
【請求項５】
図１の配列番号１に示すＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求の範囲第３項または第４項に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求の範囲第２項から第５項までのいずれか１項に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７】
細胞における核酸分子の発現に必要なレギュレーター因子を含む細胞内発現用の請求の範囲第６項に記載のベクターであって、前記レギュレーター因子が請求の範囲第２項から第５項までのいずれか１項に記載の核酸分子と連係してその発現を可能にすることを特徴とするベクター。
【請求項８】
前記細胞を、バクテリア細胞、イースト細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から成るグループから選択したことを特徴とする請求の範囲第７項に記載のベクター。
【請求項９】
プラスミドまたはウィルスであることを特徴とする請求の範囲第６項から第８項記載までのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
バキュロウィルス、アデノウィルス及びセムリキ森林熱ウィルスから成るグループから選択されたウィルスであることを特徴とする請求の範囲第９項に記載のベクター。
【請求項１１】
請求の範囲第６項から第１０項までのいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項１２】
哺乳動物細胞であることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の細胞。
【請求項１３】
非ニューロン系細胞であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の細胞。
【請求項１４】
ＣＯＳ−７細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞及び１３２１Ｎ１細胞から成るグループから選択されたことを特徴とする請求の範囲第１１項から第１３項までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと結合可能であることを特徴とする抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の抗体。
【請求項１７】
請求の範囲第１項に記載したＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのエピトープに向けられた請求の範囲第１６項に記載のモノクローナル抗体であって、前記エピトープが、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを発現する細胞の表面に存在していることを特徴とする前記抗体。
【請求項１８】
リガンドが請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合できるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞を、レセプターに対するリガンドの結合を可能にする条件下でリガンドと接触させ、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合しているリガンドの存在を検出することによって、リガンドが前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合するかどうかを判断するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１９】
リガンドが請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合できるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞から細胞抽出物を作成し、細胞抽出物から膜成分を分離し、膜成分を、レセプターに対するリガンドの結合を可能にする条件下でリガンドと接触させ、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドと結合しているリガンドの存在を検出することによって、リガンドが前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合できるかどうかを判断するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２０】
リガンドが請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞を、細胞からの機能的レセプター反応の活性化を可能にする条件下でリガンドと接触させ、生物学的定量法によってレセプター活性の増大を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
リガンドが請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞から細胞抽出物を作成し、細胞抽出物から膜成分を分離し、膜成分を、機能的レセプター反応の活性化を可能にする条件下でリガンドと接触させ、生物学的定量法によってレセプター活性の増大を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２２】
リガンドが請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞を、既知レセプター・アゴニストの存在下で、かつ機能的レセプター反応の活性化を可能にする条件下でリガンドと接触させ、生物学的定量法によってレセプター活性の低下を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２３】
前記生物学的定量法が、細胞代謝の変化または２次メッセンジャー濃度の変化の測定であり、前記２次メッセンジャー濃度の変化の測定が、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内リン酸イノシトール、細胞内ジアシルグリセロール濃度または細胞内カルシウム動態の測定を含むことを特徴とする請求の範囲第２０項から第２２項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
リガンドが請求の範囲第１項に記載したＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞から細胞抽出物を作成し、細胞抽出物から膜成分を分離し、膜成分を、既知レセプター・アゴニストの存在下で、かつ機能的レセプター反応の活性化を可能にする条件下でリガンドと接触させ、生物学的定量法によってレセプター活性の低下を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２５】
前記生物学的定量法が、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内リン酸イノシトール、細胞内ジアシルグリセロール濃度または細胞内カルシウム動態の測定を含む２次メッセンジャー測定であることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が哺乳動物の細胞であることを特徴とする請求の範囲第１８項から第２５項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が非ニューロン系細胞であることを特徴とする請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞及び１３２１Ｎ１細胞から成るグループから選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第２６項または第２７項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞表面における請求の範囲第１項に記載したＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドの存在を検出する方法において、細胞を、抗体とＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドの結合を可能にする条件下で請求の範囲第１５項に記載の抗体と接触させ、細胞と結合している抗体の存在を検出することにより、細胞表面におけるＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドの存在を検出するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項３０】
請求の範囲第１項に記載した精製Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドの製法において、
ａ）細胞内で発現可能なベクターを構築するステップであって、前記ベクターは、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する請求の範囲第２項から第５項までのいずれか１項に記載の核酸分子の発現を可能にするように前記核酸分子と連結されている、前記細胞内で核酸分子を発現させるのに必要なレギュレーター因子を含み、前記細胞は、バクテリア細胞、イースト細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から成るグループから選択されるステップ；
ｂ）ステップａ）のベクターを適当な宿主細胞に挿入するステップ；
ｃ）請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドの発現を可能にする条件下でステップｂ）の細胞をインキュベートするステップ；
ｄ）得られたＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを回収するステップ；及び
ｅ）回収されたＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを精製することにより、純粋な請求の範囲第１項に記載のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを調製するステップ
を含むことを特徴とする前記製法。
【発明の詳細な説明】
本発明の主題
本発明は、プリン・ヌクレオチドよりもピリミジン・ヌクレオチド、好ましくはウリジン三リン酸を優先する新規のレセプター、前記レセプターを符号化する核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ベクターによって形質転換された細胞、前記レセプターに向けられる抗体、前記核酸分子に向けられる核酸プローブ、前記生成物を含む薬剤、及び本発明のレセプターまたは前記レセプターの核酸分子を発現させるヒト以外のトランスジェニック動物に係わる。
本発明は、リガンド結合の検出方法、発現の検出方法、薬剤のスクリーニング方法、前記レセプターと特異的に結合する分子、及び本発明のレセプターを利用する治療にも係わる。
発明の背景
１９９３年以来、いくつかのＡＴＰレセプターのクローニングが報告されている。最近の分類法に従えば、これらのＰ２ピュリナージック・レセプターは、２つの亜類型に分類することができる：即ち、Ｇタンパク質共役レセプター、またはＰ２Ｙレセプターと、内在性イオン・チャンネル活性を有するレセプターすなわちＰ２Ｘレセプターとに分類できる（参照文献２）。輸精管（参照文献３）及びファエクロモシトマＰＣ１２細胞（参照文献４）からそれぞれ全く異なる２つのラットＰ２Ｘレセプターのクローニングが行われた：両者は２つの推定膜貫通疎水性セグメントと、カリウム・チャンネルと考えられるイオン細孔モチーフとから成る特徴的なトポロジーを有する。Ｐ２Ｙレセプターに関しては、いずれもホスフォリパーゼＣと共役結合している２つの亜類型が発表されている：（従来はＰ２Ｙと呼称されていた）Ｐ２Ｙ１レセプターとしては、ニワトリ（参照文献５）、七面烏（参照文献６）、ウシ（参照文献７）、マウス及びラット（参照文献８）Ｐ２Ｙ１レセプターが発表され；（従来はＰ２Ｕと呼称されていた）Ｐ２Ｙ２レセプターとしては、マウス（参照文献９，１０）、ラット（参照文献１１）及びヒト（参照文献１２）Ｐ２Ｙ２レセプターが発表されている。また、ＡＴＰよりもＡＤＴを優先するＰ２Ｙ３レセプターがニワトリの脳からクローニングされたが、その配列は未発表である（参照文献１３）。さらにまた、活性化されたニワトリＴリンパ球からクローニングされた６Ｈ１オーファン・レセプターは、Ｐ２Ｙ１及びＰ２Ｙ２レセプターとの高い相同性を示し、従って、Ｐ２Ｙファミリーに属することを示唆するものの、ヌクレオチドに対する反応性は未だ解明されていない（参照文献１４）。
発明の要約
本発明は、プリン・ヌクレオチドよりもピリミジン・ヌクレオチド、好ましくはウリジン三リン酸を優先するレセプターを提供する。プリン・ヌクレオチドよりもピリミジン・ヌクレオチドを優先するレセプターとは、このレセプターにとって、ピリミジン・ヌクレオチドとプリン・ヌクレオチドの活性及び効力が等しくないことを意味する。即ち、本発明のレセプターは、これらのアゴニストの存在において、プリン・ヌクレオチドに対してよりも、これよりも低濃度のピリミジン・ヌクレオチド、好ましくはウリジン三リン酸に対して機能的反応（好ましくは三リン酸イノシトール（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）またはカルシウム・イオンの蓄積）を示すか、または、濃度が同じ場合、プリン・ヌクレオチドに対してよりもピリミジン・ヌクレオチドに対してより顕著な機能的反応を示す。
前記アゴニストの添加後におけるリン酸イノシトール（ＩＰ３）の蓄積については、詳しく後述する。
本発明のレセプターは、プリン・ヌクレオチドよりもピリミジン・ヌクレオチドを少なくとも２倍、好ましくは１０〜１００倍優先するという利点を有する。
本発明のレセプターの好ましい実施例は、アデニン・ヌクレオチドよりもウリジン三リン酸を優先することを特徴とする。
本発明のレセプターは、構造上はプリナージック・レセプター・ファミリー（Ｐ２Ｙファミリー）に属するが、機能的にはピリミジナージック・レセプター、好ましくはＵＴＰ−特異レセプターと考えられるレセプター、好ましくはＧタンパク質共役レセプターである。
本発明の好ましい実施例では、レセプターがヒト・レセプターである。
前記レセプターは、図１の配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドである。好ましくは、本発明のレセプターのアミノ酸配列は、少なくとも図１の配列番号１に示すアミノ酸配列またはその一部を有する。
アミノ酸配列の一部とは、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと同じ結合特性を有するペプチドまたはタンパク質（即ち、プリン・ヌクレオチドよりもピリミジン・ヌクレオチド、好ましくはＵＴＰを優先することを特徴とするペプチドまたはタンパク質）を意味する。
本発明はまた、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のような核酸分子にも係わる。
好ましい実施態様において、前記ＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子である。
好ましい実施態様において、前記核酸分子は、図１の配列番号１に示すＤＮＡ配列と６０％以上の同一性を有する。
好ましい実施態様において、本発明の核酸分子は、少なくとも図１の配列番号１に示すＤＮＡ配列またはその一部である。“核酸配列の一部”とは、上記アミノ酸配列の少なくとも一部を符号化する核酸配列を意味する。
本発明は、本発明の核酸分子を含む細胞内発現用のベクターにも係わる。好ましい実施態様においては、前記ベクターが、細胞中での発現に寄与し、前記細胞中に核酸分子を発現させるのに必要なレギュレーター因子を含み、前記レギュレーター因子が本発明の核酸配列と連係してその発現を可能にする。
好ましい実施態様においては、前記細胞をバクテリア細胞、イースト細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から成るグループから選択する。本発明のベクターは、プラスミドまたはウィルス、好ましくはバキュロウィルス、アデノウィルスまたはセミリキ森林熱ウィルスである。
プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３−Ｐ２Ｙ４であればよい。
本発明は、本発明のベクターによって形質転換された（好ましくは哺乳動物細胞、例えば１３２１Ｎ１細胞）のような細胞にも係わる。前記細胞は、非ニューロン系細胞であることが好ましく、ＣＯＳ−７細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞または１３２１Ｎ１細胞から選択される。
本発明は、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子配列に含まれる配列と高緊縮条件下で特異的にハイブリッド形成することができる少なくとも１５個のヌクレオチドの、本発明の核酸分子を含む核酸プローブにも係わる。前記核酸プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であればよい。
本発明は、本発明のレセプターを符号化するｍＲＮＡ分子と高緊縮条件下で特異的にハイブリッド形成することにより、ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止することができる配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、または本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化するｃＤＮＡ分子と高緊縮条件下で特異的にハイブリッド形成可能な配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドにも係わる。
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドまたはｍＲＮＡを不活性化する物質の化学的類似体を含むか、またはリボザイム活性を付与されたＲＮＡ分子中に含まれる。
本発明は、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと結合可能な抗体にも係わり、さらには、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドとＵＴＰとの結合を競合阻害できる抗体にも係わる。
前記抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明は、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドのエピトープに向けられるモノクローナル抗体にも係わる。前記エピトープは、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを発現する細胞の表面に存在する。
本発明は、細胞膜を通過し、細胞中の前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化するｍＲＮＡと高緊縮条件下で特異的に結合してその翻訳を阻止することにより、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドの活性を低下させるに充分な量の前記オリゴヌクレオチドを含む組成物にも係わる。
前記組成物において、オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活性化する物質、例えばリボザイムと共役結合していることが好ましい。
前記組成物は、ＵＴＰが本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと結合するのを阻害するに充分な量の前記抗体を含むことが好ましい。
本発明は、リガンドが本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合できるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞をリガンドと、該リガンドと前記レセプターとの結合を可能にする条件下で接触させ、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合しているリガンドの存在を検出することによって、リガンドが前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合するかどうかを判断するステップを含む前記方法に係わる。
本発明は、リガンドが本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合できるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞から細胞抽出物を作成し、細胞抽出物から膜成分を分離し、リガンドを、該リガンドと前記レセプターとの結合を可能にする条件下で膜成分と接触させ、前記レセプターと結合しているリガンドの存在を検出することによって、化合物が前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドと特異的に結合できるかどうかを判断するステップを含む前記方法に係わる。リガンドが既知でない場合に、前記方法を利用することが好ましい。
本発明は、リガンドが本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞を、該細胞からの機能的レセプター反応の活性化を可能にする条件下でリガンドと接触させ、生物学的定量法によって（好ましくは、培地の酸性化速度によって）レセプター活性の増大を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断するステップを含む前記方法に係わる。
本発明は、リガンドが本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞から細胞抽出物を作成し、細胞抽出物から膜成分を分離し、機能的レセプターの反応活性化を可能にする条件下で膜成分をリガンドと接触させ、生物学的定量法によってレセプター活性の増大を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアゴニストであるかどうかを判断するステップを含む前記方法に係わる。
本発明は、リガンドが本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞を、既知のレセプター・アゴニストの存在において、かつ機能的レセプターの反応活性化を可能にする条件下でリガンドと接触させ、生物学的定量法によって（好ましくは、培地の酸性化速度によって）レセプター活性の低下を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断するステップを含む前記方法に係わる。
本発明は、リガンドが本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断する方法において、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞から細胞抽出物を作成し、細胞抽出物から膜成分を分離し、既知のレセプター・アゴニストの存在において、かつ機能的レセプターの反応活性化を可能にする条件下で膜成分をリガンドと接触させ、生物学的定量法によってレセプター活性の低下を検出することにより、リガンドがＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドのアンタゴニストであるかどうかを判断するステップを含む前記方法に係わる。
生物学的定量法が、細胞代謝の変化または２次メッセンジャー濃度の変化の測定であり、２次メッセンジャー濃度の変化の測定を、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内リン酸イノシトール（ＩＰ３）、細胞内ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）濃度または細胞内カルシウム動態の測定によって行うことが好ましい。
前記方法に使用される細胞は、哺乳動物の非ニューロン系細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞または１３２１Ｎ１であることが好ましい。
例えば、前記アゴニストまたはアンタゴニストは、のう胞性繊維症の治療薬に使用することができ、本発明の方法は、のう胞性繊維症の治療に使用される新しい薬剤成分の発見に応用できる。
従って、上記方法は、本発明のレセプターと特異的に結合する薬剤成分を識別するためのスクリーニングに利用できる。
本発明は、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドの発現を、Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化するｍＲＮＡの存在を検出することによって検出する方法において、細胞から全ＲＮＡまたは全ｍＲＮＡを得、得られたＲＮＡまたはｍＲＮＡを高緊縮ハイブリッド形成条件下で、本発明の核酸プローブと接触させ、プローブとハイブリッド形成しているｍＲＮＡの存在を検出することにより、細胞によるレセプターの発現を検出するステップを含む前記方法にも係わる。
本発明は、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドの活性と関連する障害の素因を診断する方法において、
ａ）前記障害が認められる被験者の核酸分子を採取し；
ｂ）前記核酸分子を制限酵素パネルで制限消化し；
ｃ）得られた核酸フラグメントを、サイズドゲルを介して電気泳動分離し；
ｄ）得られたゲルを、前記核酸分子と高緊縮条件下で特異的にハイブリッド形成可能な、かつ検出可能なマーカーで標識された核酸プローブと接触させ；
ｅ）検出可能なマーカーで標識された前記核酸分子とハイブリッド形成することにより、前記障害が認められる被験者に特異的な固有のバンド・パターンを形成する標識バンドを検出し；
ｆ）ステップａ）〜ｅ）によって診断用の核酸分子を調製し；
ｇ）障害が認められる被験者の核酸分子に特異的な固有の、ステップｅ）において得られたバンド・パターンと、ステップｆ）において得られた診断用核酸分子に特異的な固有のバンド・パターンとを比較することにより、両パターンが同じか、または異なるかを判定し、もしパターンが同じなら障害の素因を診断する
ステップを含む前記方法にも係わる。
本発明は、本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを調製する方法において、
ａ）核酸分子を発現させるのに必要なレギュレーター因子を含み、前記Ｐ２Ｙ４レセプターポリペプチドを符号化する核酸分子と連係してその発現を可能にする発現ベクターを細胞中に構成し、前記細胞をバクテリア細胞、イースト細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から成るグループから選択し；
ｂ）ステップａ）のベクターを適当な宿主細胞に挿入し；
ｃ）本発明のＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドの発現を可能にする条件下でステップｂ）の細胞をインキュベートし；
ｄ）得られたＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを回収し；
ｅ）回収されたＰ２Ｙ４レセプターポリペプチドを精製することにより、本発明の純粋レセプターを調製するステップ
を含む前記方法にも係わる。
【図面の簡単な説明】
図１の配列番号１は、本発明のヒトＰ２Ｙ4レセプターのヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を示す。膜を貫通していると考えられる領域にアンダーラインを付し、番号Ｉ〜ＶＩＩで示してある。すべてのＰ２Ｙレセプター間に保存される共通配列、及びＰ２Ｙ2レセプターの第１細胞外ループにおけるＲＧＤ配列に対応する３つのアミノ酸（ＡＨＮ）を太字で表わしてある。ＰＫＣによる、またはカルモジュリン依存プロテインキナーゼ及びＰＫＣによる推定リン酸化部位を黒い正方形（■）及び中抜き円（○）でそれぞれ示す。
図２は、クローンＰ２Ｙレセプターと、Ｇタンパク質共役レセプター・ファミリーにおけるこれに最も近いレセプターとの構造的な関係を示す樹状図である。この樹状図は、ＧＣＧパッケージ（参照文献２６）の多重配列アラインメント・プログラム・パイルアップ法を利用して作成したものである。各配列ごとに、最初の５つの膜貫通領域にまたがるセグメントを分析した。
図３は、Ｐ２Ｙ4レセプター発現のノーザン・ブロット分析の結果を示す。ノーザン・ブロットは、ヒト胎盤からの全ＲＮＡ１５μｇと、Ｋ５６２細胞及び２つの異なる胎盤からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ ４μｇを使用して実施した。プローブは、ＰＣＲによって増幅した（ＴＭ２からＴＭ７）ヒトＰ２Ｙ4遺伝子フラグメントである。
図４は、ヒトＰ２Ｙ4レセプターを発現させる１３２１Ｎ１細胞におけるＩｎｓＰ3蓄積の経時的変化を示す。3Ｈイノシトール標識細胞を、１０ｍＭ ＬｉＣｌが不在の条件下で（パネルＡ）またはその存在において（パネルＢ）、ＵＴＰ（１００μＭ）、ＵＤＰ（１００μＭ）及びＡＴＰ（１００μＭ）と共に、図示の時間にわたってインキュベートした。データは、三重実験点の平均を表わし、２つの独立した実験（パネルＡ，パネルＢ）の典型的データである。
図５は、１３２１Ｎ１がトランスフェクトされた細胞においてＵＴＰにより誘発されるＩｎｓＰ3の蓄積に及ぼすＡＴＰの影響を示す。ＵＴＰ１０または１００μＭの存在において、３０秒間（パネルＡ）及び２０分間に現われるＡＴＰの濃縮作用曲線。ＵＴＰ（１０μＭ）の存在または不在において２０分間（パネルＣ）に現われるＡＴＰの濃縮作用曲線。データは三重実験点の平均±Ｓ．Ｄ．を表わし、２つ（パネルＡ）、５つ（パネルＢ）または３つ（パネルＣ）の独立した実験の典型的データである。
図６は、１３２１Ｎ１がトランスフェクトされた細胞の３通りの異なるクローンにおけるＩｎｓＰ3の蓄積に対するＵＴＰ及びＵＤＰの濃縮作用曲線を表わす。種々の濃度（０，０．１，１，３，１０及び１００μＭ）のＵＴＰ（●）及びＵＤＰ（■）の存在において細胞を３０秒間または２０分間インキュベートした。データは、１つの代表的な実験において得られた３つの実験点の平均±Ｓ．Ｄ．を表わす。ＥＣ50値は、カーブ・フィッティング（シグマ・プロット：バージョン２．０）によって求めた。
図７は、１３２１Ｎ１がトランスフェクトされた細胞におけるＩｎｓＰ3生成に対する種々のヌクレオチドの影響を表わす。同じ濃度１００μＭのＵＴＰ，ＵＤＰ，５ＢｒＵＴＰ，ｄＵＴＰ，ＩＴＰ，ＡＰ3Ａ，ＡＰ4Ａ，ＡＰ5Ａ及びＡＰ6Ａと共に、またはアゴニストなしで（対照）、細胞を３０秒間または２０分間にわたってインキュベートした。データは、３つの実験点の平均±Ｓ．Ｄ．を表わし、３通りのそれぞれ独立の実験の結果である。ＥＣ50値は、カーブ・フィッティング（シグマ・プロット：バージョン２０）によって求めた。
図８は、ヒトＰ２Ｙ4レセプターを発現する１３２１Ｎ１細胞におけるＩｎｓＰ3蓄積に対する種々のヌクレオチドの濃縮作用曲線を表わす。種々の濃度のＵＴＰ，ＵＤＰ，ｄＵＴＰ，５ＢｒＵＴＰ，ＩＴＰ及びＡＴＰの存在において、２０分間にわたって１３２１Ｎ１細胞をインキュベートした。データは、２つの実験のうち代表的な実験で得られた重複実験点の平均±最大最小差である。
図９は、１３２１Ｎ１がトランスフェクトされた細胞においてＵＴＰによって誘発されるＩｎｓＰ3生成に対する種々のＰ2アンタゴニストの作用を表わす。濃度１００μＭのスラミン、リアクティブ・ブルー２及びＰＰＡＤＳの存在において、かつ濃度の異なる（０．２及び１０μＭ）ＵＴＰの存在において、２０分間にわたって細胞をインキュベートした。データは、三重実験点の平均±Ｓ．Ｄ．を表わし、２つの独立した実験の典型的データである。
図１０は、１３２１Ｎ１がトランスフェクトされた細胞におけるＩｎｓＰ3のＵＴＰ刺激に対するＰＰＡＤＳの影響を表わす。ＰＰＡＤＳ（１００μＭ）の存在において、または不在において２０分間にわたって細胞に種々の濃度のＵＴＰを作用させた。データは、２つの実験のうちの代表的な実験で得られた三重実験点の平均±Ｓ．Ｄ．である。
図１１は、ヒトＰ２Ｙ4レセプターを発現する１３２１Ｎ１細胞におけるＵＴＰ誘発によるＩｎｓＰ3蓄積に及ぼす百日咳毒素の影響を表わす。２０ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素の存在または不在において、１８時間にわたって細胞を予備インキュベートした。次いで、ＵＴＰ１００μＭの存在または不在において、かつ百日咳毒素（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在または不在において、３０秒間、５分間または２０分間にわたり、細胞をインキュベートした。データは、三重実験点の平均±Ｓ．Ｄ．を表わし、２つの独立した実験の典型データである。
発明の詳細な説明
実験方法
１．材料
トリプシンをＦｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ビオッギオ、スイス）から、培地，試薬，Ｇ４１８，ウシ胎児血清（ＦＣＳ），制限酵素及びＴａｑポリメラーゼをＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（グランド・アイランド、ニューヨーク州）からそれぞれ購入した。放射性製品ミオ−Ｄ−［２−3Ｈ］イノシトール（１７．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び［ａ32Ｐ］ＡＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をＡｍｅｒｓｈａｍ（ゲント、ベルギー）から購入した。Ｄｏｗｅｘ ＡＧ１Ｘ８（ギ酸塩型）をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（リッチモンド、カリフォルニア州）から購入した。ＵＴＰ，ＵＤＰ，ＡＴＰ，ＡＤＰ，カルバコール，ＬｉＣｌ及びアピラーゼ・グレードＶＩＩは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セント・ルイス、ミズーリ４州）から得た。２ＭｅＳＡＴＰは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（ナティック、マサチューセッツ州）から得た。ｐｃＤＮＡ３は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サン・ディエゴ、カリフォルニア州）によって開発された発現ベクターである。
２．クローニング及び配列決定
マウスＰ２Ｙ２とニワトリＰ２Ｙ１レセプター配列の間の最良の保存セグメントに基づいて、縮重オリゴヌクレオチド・プライマーを合成した。これらのプライマーは、ヒト・ゲノムＤＮＡから出発する低緊縮ＰＣＲ法によって新規レセプター遺伝子フラグメントを増幅するのに利用した。増幅の条件は、９３℃で１分間、５０℃で２分間、７２℃で３分間；３５サイクルである。Ｐ２レセプター遺伝子フラグメントと適合するサイズのＰＣＲ生成物を、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９中でサブクローニングし、サンガー・ジデオキシ・ヌクレオチド鎖終結法によって配列決定した。サブクローニングの結果得られた、Ｐ２レセプターと類似性を有するクローンの１つをランダム・プライマーで標識し、λシャロン４ａベクター中に構成されるヒト・ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに利用した。６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び４０％ホルムアミド中で４２℃，１４時間にわたってハイブリッド形成させ、０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃の条件で最終洗浄した。プローブとの顕著なハイブリッド形成を示すいくつかのクローンについて、λファージ（参照文献１５）を調製した。制限マップ及びサザーン・ブロッティング分析により、１．４ｋｂ ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを分離し、該フラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ+ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９中でオーバーラップするフラグメントをサブクローニングした後、双方の鎖に、新レセプターを符号化する配列の完全な配列が得られた。
３．細胞培着及びトランスフェクション
Ｐ２Ｙ4レセプターを符号化する配列を、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターのＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＶ部位間でサブクローニングすることにより、ヌクレオチドに反応せず、ピュリナージック・レセプターを発現するためにすでに使用されている細胞系である１３２１Ｎ１ヒト・星状膠細胞腫細胞にトランスフェクトした（参照文献６、１２）。後述するリン酸カルシウム沈殿法（参照文献１６）を利用して、細胞に組換えｐｃＤＮＡ３プラスミド（ｐｃＤＮＡ３−Ｐ２Ｐ4）をトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３ベクターだけ、またはＰ２Ｙ4レセプター符号化配列を含むベクターの存在において、６時間にわたって３７℃で１３２１Ｎ１細胞をインキュベートし、次いで洗浄し、培地（１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２．５μｇ／ｍｌアムフォテリシンＢをＤｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に混入したもの）中で培養した。トランスフェクションの２日後、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）による選択を開始した。ヌクレオチドに応答して高いＩＰ刺激係数を示すクローンを選択するため、限界希釈によって、トランスフェクト１３２１Ｎ１細胞のプールから個々のクローンを分離した。種々のクローンを４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地中に保存した。
４．リン酸イノシトール（ＩＰ）測定
５％ウシ胎盤血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍｌアムフォテリシンＢ及び４００μｇ／ｍｌＧ４１８を含有するイノシトール抜きのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地）中で２４時間にわたり、１０μＣｉ／ｍｌの［3Ｈ］イノシトールで１３２１Ｎ１細胞を標識した。（１２４ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１．２５ｍＭ ＭｇＳＯ4，１．４５ｍＭ ＣａＣｌ2，２５ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）及び８ｍＭグルコース）から成るＫＲＨ（クレブス−リンガー・ヘペス）緩衝液で細胞を２回洗浄し、この培地中で３０分間にわたってインキュベートした。ＬｉＣｌ（１０ｍＭ）の存在においてアゴニストを添加し、氷冷３％過塩素酸溶液を添加することによって、３０秒、５分後または２０分後にインキュベーションを停止した。経時的変化を観察するため、アゴニストを添加する５分前にＬｉＣｌ（１０ｍＭ）を添加し、インキュベーションの停止時間に変化を持たせた。試験に際しては、標識時間中及びアゴニストによる刺激時間中の１８時間にわたって百日咳毒素（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。リン酸イノシトールを抽出し、上述のダウエックス・カラム（参照文献１７）によるクロマトグラフィーによってＩｎｓＰ3を分離した。
５．放射性リガンド結合測定
２５〜５０μｇのタンパク質及び０．５ｎＭの放射性リガンドを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）、最終容積０．５ｍｌのＥＤＴＡ １ｍＭ中で細胞膜との［α32Ｐ］ＵＴＰの結合を測定した（参照文献２７）。測定は３０℃で５分間にわたって実施した。４ｍｌの氷冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）を添加するとともに、ワットマンＧＦ／Ｂフィルターにより減圧下に急速な濾過を行うことによって、インキュベーションを停止した。次いで、２ｍｌの同じ氷冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でフィルターを３回洗浄した。フィルターをシンチレーション混合液中に１晩インキュベートしたのち、液体シンチレーション・カウンティングによって放射能を定量した。
６．ノーザン・ブロット及びサザン・ブロット分析
グアニジニウム・チオシアネート−セシウム・クロライドを使用して種々の組織及びヒト細胞系から全及びポリ（Ａ）+ＲＮＡを調製し（参照文献１５）、グリオキサルによって変性させ、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸塩緩衝液中の１％のアガロース・ゲルでの電気泳動によって分別した。λシャロン４ａクローンから調製されたＤＮＡ試料を制限酵素で消化した。ノーザン及びサザン・ブロットを作成し（参照文献１５）、８０℃で９０分間焼いた。膜成分を少なくとも４時間にわたって予備ハイブリッド形成させ、スクリーニング用と同じプローブを使用して、ノーザン・ブロットの場合は５０％の、サザン・ブロットの場合には４０％のホルムアミドを含有する溶液中で、４２℃の温度において１晩ハイブリッド形成させた。室温の２×ＳＳＣ中で１５分間にフィルターを２回洗浄し、さらに６０℃の０．２×ＳＳＣ中で３０分間に２回洗浄したのち、強調スクリーンの存在において５日間（ノーザン・ブロット）または１時間（サザン・ブロット）にわたって−７０℃の温度に露出させた。
結果
１．クローニング及び配列決定
新規亜類型のＰ２レセプターを分離するため、ニワトリ脳Ｐ２Ｙ１（参照文献５）及びマウス神経芽腫Ｐ２Ｙ２（参照文献９）レセプターの公知配列中の最良保存セグメントに基づいて、一連の縮重オリゴヌクレオチド・プライマーを合成した。これらのプライマーを後述のヒト・ゲノムＤＮＡにおける低緊縮ＰＣＲに使用した（参照文献１８）。いくつかの組合わせは、Ｐ２レセプターに期待されるサイズと適応するサイズの不連続バンドを発生させた。例えば、第２トランスメンブラン部位に対応するプライマー［５′−ＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡ（ＣＴ）ＡＴＧＴＴ（ＣＴ）（ＡＣ）Ａ（ＣＴ）（ＣＴ）Ｔ（ＡＣＧＴ）ＧＣ−３′］及び第７トランスメンブラン部位に対応するプライマー［５′−ＴＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧ（ＡＧ）ＴＣ（ＡＣＧＴ）Ａ（ＣＧ）（ＡＧ）ＣＡ（ＡＧ）ＣＴ（ＡＧ）ＴＴ−３′］は、７１２ｂｐフラグメントを増幅した。配列決定後に得られた部分配列をペプチド配列に翻訳し、Ｇタンパク質共役レセプター配列を含む局部データバンクと比較した。これらＰＣＲ生成物から得られるクローンの大部分は、マウスＰ２Ｙ２レセプターとは５８％の相同性を、ニワトリＰ２Ｙ１レセプター部分配列とは４２％の相同性を有する新規レセプターの一部を符号化した。さらにまた、いくつかのクローンは、ニワトリＰ２Ｙ１レセプターと８７％の相同性を有するペプチド配列を符号化したから、ヒトＰ２Ｙ１遺伝子のフラグメントを表わすと考えられる。
新規レセプターの部分配列を、ヒト・ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして利用した。高緊縮条件においてプローブと顕著なハイブリッド形成を行ういくつかのクローンが得られ、これを精製した。クローンの挿入断片は、１２〜１７ｋｂであり、制限分析の結果、すべてのクローンが単一の座に属することが判明した。１．４ｋｂ ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントの完全配列が得られ、イントロンを欠く１０９５ｂｐの読取り枠が識別された。図１の配列番号１に示す配列において、推定膜貫通領域にはアンダーラインを付し、Ｉ〜ＶＩＩの番号を添えてある。符号化タンパク質の予想分子量は、３６．５ｋＤａである。この分子量は、生体内で変化しないと考えられる。なぜなら、想定される外面部位にＮ−グリコシル化共通配列が存在しないからである。ヒトＰ２Ｙ２レセプターとは対照的に、推定される第１細胞外ループには、ＲＧＤモチーフすなわちインテグリン結合共通配列が存在しない。Ｐ２Ｙ２レセプターの第１細胞外ループ中のＲＧＤ配列に対応する３個のアミノ酸（ＡＨＮ）を、図１に太字で示した。第３細胞内ループ及びレセプターのカルボキシ末端部には、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）またはカルモジュリン依存プロテインキナーゼによってリン酸化される部位が識別された。ＰＫＣまたはカルモジュリン依存プロテインキナーゼとＰＫＣによる推定リン酸化部位のそれぞれを図１に塗り潰した正方形と中抜きの円とで示した。ＡＴＰ及びＵＴＰによるＰ２Ｙ２レセプター活性化に関与すると報告されている（参照文献１）４個の正帯電アミノ酸が、Ｐ２Ｙ４配列中に保存されている：即ち、Ｈｉｓ262，Ａｒｇ265，Ｌｙｓ289及びＡｒｇ292（図１）。Ｐ２Ｙ４アミノ酸配列をニワトリＰ２Ｙ１及びマウスＰ２Ｙ２アミノ酸配列と比較するとともに、Ｇタンパク質共役レセプター・ファミリー中の隣接配列とも比較した（図２）。作図にはＧＣＧパッケージの多重配列整列プログラム・パイルアップ（参照文献２６）を利用した。それぞれの配列ごとに、最初から数えて５つの推定膜貫通域を分析の対象とした。構造上の観点から、新しくクローニングされたレセプターが、ニワトリＰ２Ｙ１レセプター（３５％）よりもヒトＰ２Ｙ２レセプターに近いことは明白である（完全配列間の同一性は５１％）。
２．Ｐ２Ｙ４レセプターの組織分布
Ｐ２Ｙ４転写配列の組織分布を、ノーザン・ブロッティングによって観察した。種々のラット組織（心臓、脳、肝臓、精巣及び腎臓）を、低緊縮のヒト・プローブを使用して試験したが、ハイブリッド形成信号は得られなかった。次に列挙するヒト細胞系からＰ２Ｙ４転写配列を検出することはできなかった：Ｋ５６２白血病細胞（図３）、ＨＬ−６０白血病細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞。ヒト胎盤からの全ＲＮＡ１５μｇとＫ５６２細胞及び２つの異なるヒト胎盤からのポリ（Ａ）+ＲＮＡ４μｇを使用してノーザン・ブロット分析を実施した。プローブは、ＰＣＲによって（ＴＭ２からＴＭ７に）増幅されたヒトＰ２Ｙ４遺伝子フラグメントであった。この試験では、ヒト胎盤に１．８ｋｂｍＲＮＡに相当する強い信号が観察された（図３）。
３．１３２１Ｎ１細胞における新規Ｐ２レセプターの機能発現
１３２１Ｎ１細胞にｐｃＤＮＡ３−Ｐ２Ｙ４構造をトランスフェクトしたのち、抗Ｇ４１８クローンのプールについて、ＡＴＰ及びＵＴＰに対するこれらクローンの機能的反応（ＩＰ３蓄積）を試験した。どちらのヌクレオチドもＰ２Ｙ４レセプターのアゴニストであることは判明したが、ＵＴＰに対する反応の方が強かった。次いで約２０個のトランスフェクトされたクローンを分離し、ＵＴＰに対するその反応を試験した。ＵＴＰに反応して最高のＩＰ蓄積係数を示すクローンを選択し、以後のすべての実験に使用した。Ｐ２Ｙ4レセプターの機能を特徴付けするため、１０ｍＭ ＬｉＣｌの存在においてアゴニストと共に２０分間インキュベートしたのち、ＩｎｓＰ3蓄積を測定した。ＵＴＰに対する反応は２段階に分かれ、３０秒後にピークに達し、以後は低い刺激が持続した（図４Ａ）。ＡＴＰの場合には、第２段階だけが検出可能であった：即ち、１分間の刺激後に初めて効果が現われ、少なくとも２０分間は安定であった（図４Ａ及び４Ｂ）。ＵＴＰについては、ＵＤＰによる刺激は２段階であったが、やや遅れて現われた（図４Ａ及び４Ｂ）。ＬｉＣｌの介在は、ＵＴＰまたはＵＤＰによる初期ピークにほとんど影響しなかったが、続くプラトー段階を著しく強めた（図４Ｂ）。
２０分間のインキュベーション後に観察されたＡＴＰの最大効果は、ＵＴＰの約２７±９％（１０回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．）であった。ＡＴＰがＵＴＰ反応に拮抗できることを立証するため、ＡＴＰだけと、またはＵＴＰと組合わせて１３２１Ｎ１細胞をインキュベートした。図５から明らかなように、高濃度（５００μＭ以上）では、３０秒後でも２０分後でもＡＴＰはＵＴＰの作用を抑止できた。３０秒後では、ＵＴＰ １０μＭに対する反応がＡＴＰ２ｍＭによって完全に拮抗された。このことは、この時点では、ＡＴＰはヒトＰ２Ｙ4レセプターに対して全く作用しないことを意味する（パネルＡ）。２０分後の時点では、２ｍＭ ＡＴＰの存在において、ＵＴＰとＡＴＰの作用差に相当するＵＴＰ作用（１０μＭ）の６２±１１％が抑止された（５つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）（パネルＢ及びＣ）。ＵＴＰの濃度が増大すると、ＡＴＰの濃縮抑制曲線が右に移動したが、このことは、抑制作用の競合性を示唆するものである（パネルＡ及びＢ）。他方、低濃度（３０〜３００μＭ）においては、ＡＴＰがＵＴＰに対する反応を２９％だけ強めた（１２〜４７％、４つの実験の平均）（パネルＢ）。それ自体は全く作用せず、ＵＴＰの作用を抑止しなかったＡＤＰも上記ＵＴＰに対する反応を強めた：即ち、ＡＤＰ（１００μＭ）の存在において、ＵＴＰ（１０μＭ）による刺激は、ＵＴＰだけによる刺激（データは示さないが）の１５８±１５％（３つの独立した実験の平均）であった。ただし、ＡＴＰ及びＡＤＰによるこの強調作用は、特異的なものではない。事実、１３２１Ｎ１細胞に内因的に発現するムスカリン・レセプターによって仲介されるカルバコール（参照文献６）の作用も、これらのヌクレオチドの存在において増強された。組換えＰ２Ｙ4−ｐｃＤＮＡ３プラスミドまたはベクターだけをトランスフェクトされた細胞でも、ＡＭＰ及びアデノシンをトランスフェクトされた細胞でも、同様の所見が得られた（ただしデータは掲示しない）。
発明者等は、ＩｎｓＰ3生成に関与するＵＴＰ及びＵＤＰの濃縮作用曲線を、いくつかのトランスフェクトされた細胞を対象に比較した。この比較は、３０秒後と２０分後の２つの時点で実施した（図６）。クローン１１（薬理学的特徴付けのため選択された１３２１Ｎ１をトランスフェクトされた細胞のクローン）に対して実施した一連の実験において、２０分間インキュベートした時点でＵＴＰはＵＤＰよりも１０倍以上強力であり、この差は他の２つのクローンにおいても観察された（図６）。ＵＴＰ及びＵＤＰに対するＥＣ50値は、クローン２では０．３±０．１μＭ及び３．３±０．６μＭ、クローン１１では２．４±０．１μＭ及び１９．８±４．８μＭ、クローン２１では０．３±０．１μＭ及び３．２±０．８μＭであった（２つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）。３０秒間のインキュベーションでは曲線が明らかに右へ移動したから、ＥＣ50値の測定は不可能であったが、両アゴニストの作用力の差は歴然としている（図６）。クローン２，１１及び２１を含むいくつかのクローンの結合性向を［α32Ｐ］ＵＴＰで試験したが、（データは掲示しないが）ベクターだけをトランスフェクトされた細胞と比較して特異な結合増強は観察されなかった。
図６で観察される時間差にかんがみ、ヌクレオチドの測定値を２つの時点：３０秒後及び２０分後に求めた。図７から明らかなように、いくつかのアゴニストは３０秒後では、ほとんど、または全く作用を示さなかった（ＵＤＰ，５ＢｒＵＴＰ，ｄＵＴＰ，ＩＴＰ）が、２０分後では顕著な作用を示した。２０分後における完全な濃縮作用曲線が得られた。作用力のランクは、ＵＴＰ＞ＵＤＰ＝ｄＵＴＰ＞５ＢｒＵＴＰ＞ＩＴＰ＞ＡＴＰ（図８）であった。ＥＣ50値は次のとおりであった：ＥＣ50ＵＴＰ＝２．５±０．６μＭ、ＥＣ50ＵＤＰ＝１９．５±３．９μＭ（８つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）、ＥＣ50ｄＵＴＰ＝２０．０±２．３μＭ、ＥＣ50５ＢｒＵＴＰ＝２７．１±１．９μＭ、ＥＣ50ＩＴＰ＝３２．８±５．４μＭ（２つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）。ＡＴＰについて得られた近似ＥＣ50値は、４３±１２μＭ（５つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）であった。ジアデノシン・ポリホスフェートもまた、トランスフェクトされた細胞中のＩｎｓＰ3生成を増大させ、そのＥＣ50値は３〜７μＭ（データは掲示しない）であったが、その最大効力はＵＴＰの２０〜２５％に過ぎず、ＡＴＰの値に近い（４つの独立した実験の平均）（図７）。ＵＭＰ，ウリジン，ＡＭＰ，アデノシン及びＡＴＰγＳは、全く作用を示さなかった。（データは掲示しない）。
Ｐ２Ｙ亜類型に特異的なアンタゴニストは、得られなかった。ただし、スラミン，ＲＢ２またはＰＰＡＤＳのようないくつかの非選択アンタゴニストがＰ2レセプターに対して試験されており、これらの亜類型に対する相対的な作用が弁別の手段となる可能性がある（参照文献２７）。そこで、発明者等は、この３つのアンタゴニストがヒトＰ２Ｙ4レセプターのモデルにおいてＵＴＰ反応を抑制する能力を試験した。図９から明らかなように、ＰＰＡＤＳは最も活性の強いアンタゴニストであり（７３±１４％抑制；ＩＣ50約１５μＭ（データは掲示しない））、スラミンは不活性であり、ＲＢ−２はＵＴＰ反応の３３±５％を抑制する（２つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）。図１０は、ＵＴＰ反応に対するＰＰＡＤＳによる拮抗作用の複合性質を示す：即ち、ＥＣ50値にもＵＴＰの最大効果にも影響を及ぼす。ＰＰＡＤＳの不在においてＵＴＰに対するＥＣ50値が３．３±０．６μＭであるのに対して、１００μＭ ＰＰＡＤＳの存在において１２．２±４．５μＭであった（２つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）。
ＵＴＰ（１００μＭ）を添加した後のいくつかの時点で、百日咳毒素（２０ｎｇ／ｍｌ、１８時間予備処理）の影響を観察した（図１１）。３０秒後の時点では、ＵＴＰ反応が明らかに抑制されたが（抑制率６２±５％：２つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．）、５分後及び２０分後の時点ではほとんど影響が観察されなかった。
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１７．Ｃｏｍｍｕｎｉ，Ｄ．，Ｒａｓｐｅ，Ｅ．，Ｐｉｒｏｔｔｏｎ，Ｓ．，ａｎｄＢｏｅｙｎａｅｍｓ，Ｊ．Ｍ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６，１９１−１９８．
１８．Ｌｉｂｅｒｔ，Ｆ．，Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ，Ｍ．，Ｌｅｆｏｒｔ，Ａ．，Ｄｉｎｓａｒｔ，Ｃ．，Ｖａｎ Ｓａｎｄｅ，Ｊ．，Ｍａｅｎｈａｕｔ，Ｃ．，Ｓｉｍｏｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｄｕｍｏｎｔ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｖａｓｓａｒｔ，Ｇ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４，５６９−５７２．
１９．Ｚｅｎｇ，Ｄ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ，Ｄ．Ｄ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｌｕ，Ｚ．，ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ｋ．Ｒ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７，３１０２−３１０６．
２０．Ｎｏｍｕｒａ，Ｈ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂ．Ｗ．，ａｎｄ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｋ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．５，１２３９−１２４９．
２１．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，Ｋ．Ｒ．（１９９４）Ｎｅｕｃｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １６９，８５−８９．２２．Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｇ．（１９８９）ＴｉＰＳ１０，３６５−３６９．
２３．Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ａ．，Ｌａｚａｒｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｒ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ Ｈａｒｄｅｎ，Ｔ．Ｋ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４０，６４８−６５５．
２４．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｄａｉｎｔｙ，Ｉ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｆｆ，Ｐ．（１９９１）ＴｉＰＳ １２，１３７−１４１．２５．Ｌａｚａｒｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｒ．ａｎｄ Ｈａｒｄｅｎ，Ｔ．Ｋ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１１８３０−１１８３６．
２６．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｈａｅｂｅｒｌｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ Ｏ．Ａ，（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５．
２７．Ｍｏｔｔｅ Ｓ．，Ｓｗｉｌｌｅｎｓ Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｅｙｎａｅｍｓ Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３０７，２０１．
２８．Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｚｏｈｎ，Ｉ．Ｅ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｋ．Ａ．ａｎｄＨａｒｄｅｎ，Ｔ．Ｋ．（１９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１３，６１４．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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