(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:5で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、アセトミドメチル（ＡＣＭ）基の付加により修飾されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
腫瘍の成長の抑制に使用するための、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がんを含む上皮分泌組織のがん、又は前立腺肥大(BPH)の成長の抑制に使用するための、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
腫瘍の成長の抑制において、抗がん剤とともに使用される、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記抗がん剤が、マイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール、タキソール誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
高ＦＳＨレベルと特徴とする疾患をもつ患者の治療において使用するための、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
医薬として許容される担体とともに、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項９】
抗がん剤をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗がん剤が、マイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール、タキソール誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物の連続投与を達成するための、リポソーム及び多糖類から成る群から選ばれる経時放出手段をさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がんを含む上皮分泌組織のがん、又は前立腺肥大(BPH)を患う患者における腫瘍の成長の抑制に使用するための、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
高ＦＳＨレベルと特徴とする疾患の治療において使用するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は前立腺がん、胃がん、乳がん子宮内膜及び卵巣がんなどのがんに由来する腫瘍、並びに前立腺肥大(BPH)を対象とする腫瘍抑制剤としての製剤(すなわち製剤組成物)に関連する。
【０００２】
発明の背景
哺乳類のオスに特有の前立腺は数種の精液及び血液成分並びに数種の調節ペプチドを産生する。前立腺は間質細胞と上皮細胞を含み上皮細胞群は柱状分泌細胞と基底非分泌細胞からなる。これらの基底細胞や間質細胞の増殖は一般的な前立腺疾患の一種である前立腺肥大(BPH)を引き起こす。もう1つの一般的な前立腺疾患は前立腺の腺がん(CaP)である。これは致命的な病態生理の前立腺がんとして最も一般的であり、また前立腺周辺領域の上皮細胞の悪性転換を伴う。前立腺がんと前立腺肥大は2大前立腺疾患であり、高齢男性で発生率が高い。55歳以上の男性では約4人に1人が何らかの前立腺疾患にかかっている。米国では前立腺がんは高齢男性のがん関連死因の第2位となっており、毎年約96,000人の罹患が診断され約26,000人の死亡が報告されている。
【０００３】
多様な前立腺疾患の病因の理解を目的に実施された正常、良性及びがん性病変前立腺で合成、分泌される種々の物質に関する研究から、そうした物質のなかには前立腺疾患の診断で免疫化学的腫瘍マーカーとして使用できるものもあると判明している。正常な前立腺で分泌される主要なタンパク質又はポリペプチドは(1)前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、(2)前立腺特異抗原(PSA)、及び(3)94個のアミノ酸からなる前立腺分泌タンパク質(PSP94)の3種類であり、最後のPSP94は別名、前立腺インヒビンペプチド(PIP)、ヒト精漿インヒビン(HSPI)、又はβ-ミクロセミノプロテイン(β-MSP)であるが、以下名称をPSP94に統一する。
【０００４】
PSP94はシステインに富む単純な、非グリコシル化タンパク質であり、前述の前立腺特異抗原(PSA)、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)と共にヒト精液中の3大タンパク質の1つである。PSP94は分子量が10.7kDaであり、完全なアミノ酸配列が既に決定されている(SEQ ID NO:1)。PSP94に対応するcDNA及び遺伝子の単離と解析も既に行われている(Ulvsback, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 164:1310, 1989; Green, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 167:1184, 1990)。PSP94は多様な分泌上皮細胞に存在するものの(Weiber, et al., Am. J. Pathol., 137:593, 1990) 、主に前立腺上皮細胞に局在することが免疫化学的及びin situハイブリダイゼーション手法により既に証明されている。PSP94が前立腺の腺がん細胞株LNCap中で発現することも証明されている(Yang, et al., J. Urol., 160:2240, 1998)。また、腫瘍細胞の増殖に対する外来性PSP94の抑制効果がin vivo、in vitroの両方で観測されているが(Garde, et al., Prostate, 22:225, 1993; Lokeshwar, et al., Cancer Res., 53:4855, 1993)、これはPSP94が腫瘍細胞上のコグネイト受容体との相互作用を介して前立腺がんの抑制物質となりうることを示唆する。
【０００５】
天然PSP94はホルモン療法抵抗性の前立腺がん(及び潜在的に他の前立腺適応症)の治療にモダリティーを有することが既に解明されている。
【０００６】
代謝及び免疫組織化学研究によれば、前立腺はPSP94の主要産生源である。PSP94はin vitroでもオス生体ラットのin vivoでも血中卵胞刺激ホルモン(FSH)のフィードバック制御に関与し、その分泌を抑制する働きをする。PSP94は前立腺だけでなく下垂体にも作用する。いずれもPSP94受容体部位をもつためである。PSP94はラット前立腺のFSH様ペプチドの合成/分泌におそらく影響を及ぼすだけでなく、下垂体でのFSH生合成及び放出を抑制することも既に解明されている。これらの研究成果はPSP94のin vivo腫瘍抑制効果が血中FSH濃度の低下に起因する可能性があることを示唆する。
【０００７】
PSAとPAPはともに前立腺疾患診断用の腫瘍マーカーとして研究されてきたが、前立腺肥大(BPH)ではどちらも高レベルを示すため、いずれも特異的ではなく、効用が限られる。
【０００８】
最近、BPH又はCaP患者の血中PSP94濃度は正常値を著しく上回ることが証明された。血中SPS94濃度は正常男性では最大でも約40ng/mlであるが、BPH又はCaP患者では300〜400ng/mlの範囲である。正常前立腺被検者とBPH又はCaP患者のPSP94濃度にはある程度の重なりが見られるため、血中濃度それ自体はほとんど価値がない。
【０００９】
前立腺がん治療は内分泌療法(androgen ablation)が主である。当初ほとんどの患者はこの処置に応答するものの、その効果は時間と共に薄れていく。それはおそらく、アンドロゲン依存性細胞とアンドロゲン非依存性細胞の異種混合個体群が存在し、その中のアンドロゲン不感性細胞が除去されずに増殖し続けるためであろう。
【００１０】
現在、死因の上位を占めるがんとして他に、女性の乳がん、及び胃腸管のがんがある。そうしたがんの処置には目下、種々の制がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン及びダウノマイシンなどが使用されている。そうした治療処置の難点は、制がん剤を効果的な処置に必要とされる用量範囲で投与した場合の副作用の問題である。
【００１１】
従って、前立腺がん、乳がん及び胃腸がんの細胞及び腫瘍の増殖・成長を抑える一段と有効な手段であって、アンドロゲン感性細胞とアンドロゲン不感性細胞の両方に対して効果的に使用しうるような手段を見つけ出すのが有利であろう。
【００１２】
本発明者は以前の研究(米国特許第5,428,011号)で、がん性の前立腺、胃腸管及び乳腫瘍のin vitro及びin vivo抑制を目的とした天然ヒト精漿PSP94製剤(すなわち製剤組成物)を提供した。該製剤は天然ヒト精漿PSP94を含み、然るべき剤型、用量及び用法で前立腺がん患者に投与することが可能であった。別の実施態様では、該製剤は天然ヒト精漿PSP94と抗がん剤の混合物を含み、然るべき剤型、用量及び用法で、たとえば胃腸管がん患者に投与することが可能であった。
【００１３】
ヒト精液由来PSP94は病原体[たとえばHIV、肝炎(A型、B型又はC型)及び他ウイルス及び/又はプリオンなど]による汚染という大きな危険をはらむ。たとえ厳しい薬剤処理を採用するとしても、そうした病原体の完全な排除は保証できない。加えて、ヒト精液は供給量が限られるため、PSP94の量産はきわめて困難である。従ってPSP94はヒト由来はもとより異種由来であっても規制当局、市場の双方にとって受け入れがきわめて困難であろう。
【００１４】
従って、PSP94生産に組換え技術が応用できれば、組換えPSP94なら病原体の排除も量産も可能なので、著しい前進となろう。さらに、単一ロットに由来する均質で、バッチ間変動のない目的物が得られよう。
【００１５】
発明の要約
本発明は第1態様では次のポリペプチド及びポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体に関連する: SEQ ID NO:3のポリペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド; SEQ ID NO:5のポリペプチド; SEQ ID NO:6のポリペプチド; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2CX2 CX3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体。上記ポリペプチド類似体は腫瘍の成長を抑制しうる可能性が、又はもっと厳密には前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがんの成長、もしくは前立腺肥大(BHP)を抑制しうる。
【００１６】
本発明は第2態様では、腫瘍又はより厳密には前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがんの成長、もしくは前立腺肥大(BHP)の抑制を目的とした、次のポリペプチド及びポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体の使用に関連する: SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2CX2C X3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物(類)。
【００１７】
本発明の第2態様の一実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール(すなわちパクリタキセル)、タキソール誘導体(ドセタキセル、タキサンなど)、及びそれらの混合物と併用されよう。
本発明の第2態様の別の実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は製薬上許容しうる担体と併用されよう。
【００１８】
本発明の第2態様の更なる実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は、該ポリペプチド又はポリペプチド類似体の連続投与の実施を目的に徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類と併用されよう。
【００１９】
本発明の第2態様のその他の実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は、抗がん剤及び製薬上許容しうる担体と、抗がん剤及び徐放性手段と、製薬上許容しうる担体及び徐放性手段と、又は抗がん剤、製薬上許容しうる担体及び徐放性手段と併用されよう。抗がん剤、製薬上許容しうる担体及び徐放性手段の若干の例は本書で示すとおりである。
【００２０】
本発明は第3態様では腫瘍患者又はより厳密には前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがん、もしくは前立腺肥大(BPH)の患者を治療する方法に関連し、該方法は該患者に次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体を含む製剤組成物を投与するステップを含む: SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2CX2C X3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物。上記ポリペプチド類似体は腫瘍の成長を抑制しうる可能性が、又はもっと厳密には前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがんの成長、もしくは前立腺肥大(BHP)を抑制しうる可能性がある。
【００２１】
前述のような治療方法はたとえば前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがん、もしくは前立腺肥大(BHP)の患者の腫瘍の成長抑制(たとえば鈍化、鎮静、減衰、制止)などをもたらす可能性がある。前述の方法は、たとえば本発明のポリペプチド、ポリペプチド類似体又はそれらの混合物を含む製剤組成物を患者に投与することによって行われよう。
【００２２】
本発明の第3態様の一実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール(すなわちパクリタキセル)、タキソール誘導体(ドセタキセル、タキサンなど)、及びそれらの混合物と併用されよう。
【００２３】
本発明の第3態様の別の実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は製薬上許容しうる担体と併用されよう。
本発明の第3態様の更なる実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は、該ポリペプチド又はポリペプチド類似体の連続投与の実施を目的に徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類と併用されよう。
【００２４】
本発明の第3態様のその他の実施態様では、ポリペプチド又はポリペプチド類似体は、抗がん剤及び製薬上許容しうる担体と、抗がん剤及び徐放性手段と、製薬上許容しうる担体及び徐放性手段と、又は抗がん剤、製薬上許容しうる担体及び徐放性手段と併用されよう。抗がん剤、製薬上許容しうる担体及び徐放性手段の若干の例は本書で示すとおりである。
【００２５】
本発明は第4態様では腫瘍患者又はより厳密には前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがん、もしくは前立腺肥大(BPH)の患者を治療する方法に関連し、該方法は該患者に、SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を収めたベクターと製薬上許容しうる担体とを含む製剤組成物、又はSEQ ID NO:9の10〜285以上の隣接残基を有するポリヌクレオチド及びSEQ ID NO:9の10〜50以上の隣接残基を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドと製薬上許容しうる担体とを含む製剤組成物を投与するステップを含む。
【００２６】
本発明の第4態様の一実施態様では、ベクター又はポリヌクレオチドは抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール(すなわちパクリタキセル)、タキソール誘導体(ドセタキセル、タキサンなど)、及びそれらの混合物と併用されよう。
【００２７】
本発明の第4態様の別の実施態様では、ベクター又はポリヌクレオチドはその連続投与の実施を目的に徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類と併用されよう。
【００２８】
本発明の第4態様の更なる実施態様では、ベクター又はポリヌクレオチドは抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール(すなわちパクリタキセル)、タキソール誘導体(ドセタキセル、タキサンなど)、及びそれらの混合物と、また該ベクター又はポリヌクレオチドの連続投与の実施を目的に徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類と併用されよう。
【００２９】
本発明は第5実施態様では腫瘍又はより厳密には前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがんの成長、もしくは前立腺肥大(BHP)の抑制を目的とした、次の成分を含む製剤組成物に関連する:
【００３０】
a) 次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体: SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2CX2CX3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物(類)、及び
【００３１】
b) 抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール、タキソール誘導体、及びそれらの混合物。
【００３２】
本発明の第5態様の一実施態様では、製剤組成物は該組成物の連続投与の実施を目的とした徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類をさらに含む。
【００３３】
本発明は第6実施態様では腫瘍又はより厳密には前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがんの成長、もしくは前立腺肥大(BHP)の抑制を目的とした、次の成分を含む製剤組成物に関連する:
【００３４】
a) 次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体: SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2CX2C X3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物(類)、及び
【００３５】
b) 製薬上許容しうる担体。
【００３６】
本発明の第6態様の一実施態様では、製剤組成物は該組成物の連続投与の実施を目的とした徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類をさらに含む。
【００３７】
本発明の第6態様の第2実施態様では、製剤組成物は抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール、タキソール誘導体、及びそれらの混合物をさらに含む。
【００３８】
本発明の第6態様の第3実施態様では、製剤組成物は、徐放性手段と抗がん剤とをさらに含もう。徐放性手段の例は本書で示すとおりである。
【００３９】
本発明は第7態様では次の成分を含む製剤組成物に関連する:
【００４０】
a)次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択される、治療有効量のポリペプチド又はポリペプチド類似体: SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2 CX2CX3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物(類)、及び
【００４１】
b) 治療有効量の抗がん剤、たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール、タキソール誘導体、及びそれらの混合物。
【００４２】
本発明の第7態様の一実施態様では、製剤組成物は該組成物の連続投与の実施を目的とした徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類をさらに含む。
【００４３】
本発明は第8態様では次の成分を含む製剤組成物に関連する:
【００４４】
a)次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択される、治療有効量のポリペプチド又はポリペプチド類似体: SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2 CX2CX3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物(類)、及び
【００４５】
b) 製薬上許容しうる担体。
【００４６】
本発明の第8態様の一実施態様では、製剤組成物は該組成物の連続投与の実施を目的とした徐放性手段たとえばリポソーム及び多糖類をさらに含む。
【００４７】
本発明の第8態様の第2実施態様では、製剤組成物は抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール、タキソール誘導体、及びそれらの混合物をさらに含む。
【００４８】
本発明の第8態様の第3実施態様では、製剤組成物は、徐放性手段と抗がん剤とをさらに含もう。徐放性手段の例は本書で示すとおりである。
【００４９】
本発明は第9態様では、前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがん、もしくは前立腺肥大(BHP)の患者の腫瘍の成長を抑制(鈍化、鎮静、減衰、制止)するための製剤組成物であって、SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を収めたベクターと製薬上許容しうる担体とを含む組成物、又はSEQ ID NO:9の10〜285以上の隣接残基を有するポリヌクレオチド及びSEQ ID NO:9の10〜50以上の隣接残基を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドと製薬上許容しうる担体とを含む組成物に関連する。
【００５０】
本発明の第9態様の一実施態様では、製剤組成物は抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール(すなわちパクリタキセル)、タキソール誘導体(ドセタキセル、タキサンなど)、及びそれらの混合物をさらに含む。
【００５１】
本発明は第10態様では、患者の腫瘍の成長を抑制するための製剤組成物であって、SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を収めたベクターと製薬上許容しうる担体とを含む組成物、又はSEQ ID NO:9の10〜285以上の隣接残基を有するポリヌクレオチド及びSEQ ID NO:9の10〜50以上の隣接残基を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドと製薬上許容しうる担体とを含む組成物に関連する。
【００５２】
本発明の第10態様の一実施態様では製剤組成物は抗がん剤たとえばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール(すなわちパクリタキセル)、タキソール誘導体(ドセタキセル、タキサンなど)、及びそれらの混合物をさらに含む。
【００５３】
本発明は第11態様では、高FSHレベルを特徴とする疾患の患者を治療する方法であって、次の成分を含む然るべき剤型の製剤組成物をヒト用量投与するステップを含む方法に関連する:
【００５４】
次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体: SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2CX2CX3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物、及び
【００５５】
製薬上許容しうる担体。
【００５６】
本発明は第12態様では、高FSHレベルを特徴とする疾患の患者の治療への、次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体の使用に関連する:
【００５７】
SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2 CX2CX3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物(類)。
【００５８】
本発明は第13態様では、前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがん、前立腺肥大(BHP)、もしくは高FSHレベルを特徴とする疾患の治療薬の製造への、次のポリペプチド又はポリペプチド類似体からなる群より選択されるポリペプチド又はポリペプチド類似体の使用に関連する:
【００５９】
SEQ ID NO:2のrHuPSP94; SEQ ID NO:3のデカペプチド; SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21); SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145); SEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94); SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の5以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:6の2以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:89のアミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2 CX2CX3X1X2からなるポリペプチド類似体−ただしX1はグルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)又はアスパラギン酸(Asp)のいずれかであり、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)であり、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)である; SEQ ID NO:5を含み、かつそのアミノ基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:59〜SEQ ID NO:88からなる群より選択される; SEQ ID NO:5を含み、かつそのカルボキシル基末端に1以上の追加アミノ酸を有するポリペプチド類似体−ただしSEQ ID NO:5を含む該ポリペプチド類似体はSEQ ID NO:10〜SEQ ID NO:58からなる群より選択される; 2〜50単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; 2〜10単位のSEQ ID NO:5を含むポリペプチド類似体; グルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)又はチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択される2〜14アミノ酸単位の配列からなるポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 及びSEQ ID NO:5のアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチド類似体; 並びにそれらの混合物。
【００６０】
本発明では、rHuPSP94は約10μg/kg/日〜約4mg/kg/日の用量範囲で、約500pg/kg/日〜約1mg/kg/日の用量範囲で、約5ng/kg/日〜約10μg/kg/日の用量範囲で、又は約5ng/kg/日〜約500ng/kg/日の用量範囲で使用してもよい。
本発明では、SEQ ID NO:3のデカペプチド、SEQ ID NO:4のポリペプチド、SEQ ID NO:5のポリペプチド、SEQ ID NO:6のポリペプチド、及びそれらの混合物は約100ng/kg/日〜約4mg/kg/日の用量範囲で使用してもよい。
【００６１】
本発明では、抗がん剤はポリペプチド又はポリペプチド類似体と混合しても混合しなくてもよいし、異なる経路で、又は異なる投与計画に沿って(たとえば時間又は日をずらして)別個に投与してもよい。
【００６２】
本発明では、組成物の投与は筋肉内(IM)、皮下(SC)、皮内(ID)、静脈内(IV)又は腹腔内(IP)注射による投与、又は任意好適の手段による口腔及び鼻腔粘膜を含む粘膜からの投与など、任意好適の経路によって行ってもよい。
【００６３】
本発明では、組成物は胃腸管がんの治療に使用してもよい。
【００６４】
本発明のタンパク質又はポリペプチドが公知の方法でつくれることは技術上周知である。本発明のポリペプチドはたとえば細菌細胞の抽出物から、又は組換え手法の使用により、製造してもよい。本発明のポリペプチドはたとえばrHuPSP94(SEQ ID NO:2)、SEQ ID NO:3のデカペプチド、SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21)、SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145)及びSEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94)の全部又は一部をコードするDNA配列を収めた好適な発現媒体による宿主細胞の形質転換(トランスフェクション、形質導入又は感染)により産生させてもよい。好適な発現媒体の例はプラスミド、ウイルス粒子、人工染色体及びファージなどである。宿主細胞ゲノムには発現媒体の全部又は一部を組み込んでもよい。場合によっては、誘導的発現ベクターを使用するのが望ましい。
【００６５】
組換えタンパク質の産生には多種多様な発現系のうち任意のものを使用してよい。使用宿主細胞の選択は本発明には重要でない。本発明のポリペプチドの産生に使用する宿主は原核宿主(E. coli又はB. subtilisなど)でも真核宿主[酵母たとえばSaccharomyces又はPichia pastoris; 哺乳類細胞たとえばサルCOS細胞、マウス3T3細胞(Todaro GJ and Green H., J. Cell Biol. 17:299-313, 1963)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)(Puck TT et al., J. Exp. Med. 108:945-956, 1958)、BHK、ヒト腎293細胞(ATCC: CRL-1573)又はヒトHeLa細胞(ATCC: CCL-2); 又は昆虫細胞]でもよい。
【００６６】
Pichia pastoris (P. pastoris) などのような酵母細胞発現系では、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列を好適な発現ベクターたとえばpPIC9 (Invitrogen) などにクローニングしてもよい。本発明のポリペプチドの全部又は一部をコードするDNA配列をP. pastoris宿主細胞に導入すると、たとえばAOX1遺伝子座で組換えが起ころう。そうした組換えは本発明の多様なポリペプチドに対応するDNA配列をAOX1遺伝子プロモーターの支配下に置くことになろう。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子(DNA配列)がうまく組み込まれれば、該ポリペプチドは宿主細胞の増殖培地に添加されたメタノールによる調節及び/又は誘導を受けて発現することになろう(Buckholz, R.G. and Gleeson, M.A.G., Biotechnology, 9:1067-1072, 1991; Cregg, J.M. et al., Biotechnology, 11:905-910, 1993; Streekrishna, K. et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278, 1988; Wegner, G.H., FEMS Microbiology Review, 87:279-284, 1990)。
【００６７】
哺乳類宿主細胞には多数のウイルス発現系が使用できよう。たとえばアデノウイルスを本発明のポリペプチドの発現ベクターとして使用する場合には、核酸配列をアデノウイルス転写/翻訳調節複合体[たとえば後期プロモーター及びトリパータイト・リーダー配列]に連結してもよい。このキメラ遺伝子はたとえばin vitro又はin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムへと挿入されよう。ウイルスゲノムの非必須領域(領域E1又はE3など)へのこうした挿入により、感染宿主中で生存し本発明のポリペプチドを発現することができる組換えウイルスが得られる結果となろう。
【００６８】
本発明のタンパク質及びポリペプチドはまた、植物細胞に産生させてもよい。植物細胞中での本発明のポリペプチドの発現にはカリフラワーモザイクウイルス及びタバコモザイクウイルスのような発現ベクターやプラスミド発現ベクター(Tiプラスミドなど)を使用してもよい。そうした細胞は広範囲の供給元(たとえばthe American Type Culture Collection, Rockland, Md.)から入手可能である。形質転換又はトランスフェクション方法及び発現ベクターはもちろん使用宿主細胞に応じて選択する。
【００６９】
昆虫細胞には、夜蛾科Spodoptera frugiperda細胞中で増殖するAutographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)などの発現系を外来遺伝子発現用ベクターとして使用してもよい。たとえば本発明のポリペプチドの全部又は一部をコードするDNA配列を、AcNPVウイルスの非必須領域(ポリヘドリン遺伝子など)中にクローニングしてAcNPVプロモーターの支配下においてもよい。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子(すなわちDNA配列)が首尾よく挿入されれば、ポリヘドリン遺伝子が不活化され非包埋組換えウイルス(すなわちポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク質性封入体を欠くウイルス)が産生される結果となろう。これらの組換えウイルスは挿入遺伝子が発現する場となるSpodoptera frugiperda細胞への感染に使用されよう。
【００７０】
さらに、宿主細胞は挿入配列の発現を調整する能力、又は遺伝子産物を所望・特有の仕方で修飾又はプロセッシングする能力に注目して選択してもよい。産物タンパク質のそうした修飾(グリコシル化など)及びプロセッシング(切断など)はタンパク質の機能にとって重要であろう。種々の宿主細胞はタンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセッシング及び修飾のための特徴的、特異的な機構を有する。もちろん、発現した異種タンパク質の所望の修飾及びプロセッシングを確実なものにするという見地から細胞株又は宿主系を選択してもよい。こうした目的のためには、一次転写産物の適正なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用されよう。そうした哺乳類宿主細胞の非限定的な例はCHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293及び3T3などである。
【００７１】
別の方法として、安定的にトランスフェクションした哺乳類細胞株に本発明のポリペプチドを産生させてもよい。哺乳類細胞株の安定的トランスフェクションに好適な多数のベクターだけでなく、そうした細胞株を構築する方法も公開されている。一例として、rHuPSP94タンパク質をコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子を含む発現ベクター中にクローニングしてもよい。該プラスミドの、従って本発明のポリペプチドに対応するDNA配列の、宿主細胞染色体への組込みは、細胞培地へのメトトレキサートの添加により選別されよう。こうした選別法はほとんどの細胞型で可能であろう。
【００７２】
前述のような好適な発現媒体に挿入されたDNA配列の効率的な翻訳には、特有の開始シグナルもまた必要となる場合があろう。そうしたシグナルはATG開始コドン及び隣接配列を含むであろう。たとえば本発明のポリペプチドをコードする遺伝子又はcDNAが独自の開始コドン及び隣接配列をもたないときは、追加の翻訳調節配列が必要となろう。たとえば外来翻訳調節シグナルが、おそらくATG開始コドンを含めて必要となろう。技術上周知のように、所望のポリペプチドの適正な翻訳が確実に行われるようにするには、開始コドンがポリペプチド配列のリーディングフレーム内に収まっていなければならない。外来の翻訳調節シグナル及び開始コドンは天然、合成を含めて由来が多様であろう。発現効率は然るべき転写エンハンサーエレメントや転写ターミネーターを含めることで増進されよう。
【００７３】
当然、本発明のポリペプチド及び断片には、その生物活性に悪影響が及ばない限り多数の修飾が加わってもよい。本発明のポリペプチドはたとえば、翻訳後プロセッシングなどのような天然過程による修飾又は技術上周知の化学修飾手法による修飾を受けたアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。修飾はポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ基又はカルボキシル基末端などを含むポリペプチドのどこにでも起こりうる。当然、任意のポリペプチドのいくつかの部位に同タイプの修飾が同じ又は異なる度合いで存在することもあろう。また、任意のポリペプチドが多タイプの修飾を含むこともあろう。ポリペプチドはユビキチン化の結果として枝分れしてもよいし、また枝分れの有無を問わず環状でもよい。環状、枝分れ及び枝分れ環状ポリペプチドは天然の翻訳後修飾過程の結果でもよいし、合成の結果でもよい。修飾の非限定的な例はアセチル化、アシル化、アセトアミドメチル(Acm)基の付加、ADPリボシル化、アミド化、フラビンとの共有結合、ヘム部分との共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのようなtRNA介在型のタンパク質へのアミノ酸付加、及びユビキチン化などである(Protein-structure and molecular properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993を参照)。
【００７４】
他タイプのポリペプチド修飾はたとえばポリペプチド配列中のアミノ酸の挿入(すなわち追加)、欠失及び置換(すなわち置き換え)などを包含しようが、それらはポリペプチドの生物活性を実質的に変えない限り、保存的修飾でも非保存的修飾でもよい(たとえばD-アミノ酸、デスアミノ酸など)。本発明のポリペプチドはたとえば生物活性を有する変異体、変種、断片、キメラ及び類似体を包含する。断片は1以上のアミノ酸を欠落させたアミノ酸配列を包摂するが、該欠落はタンパク質のアミノ基末端(N末端)、カルボキシル基末端(C末端)又は内側のいずれに由来してもよい。類似体は1以上のアミノ酸の挿入又は置換を伴う。変種、変異体、断片、キメラ及び類似体は本発明のポリペプチドの生物学的性質すなわち前立腺がん、胃がん、乳がん、子宮内膜又は卵巣がん等の上皮分泌組織のがんの成長もしくは前立腺肥大(BHP)を抑制する性質をもつであろう。
【００７５】
置換はたとえば保存的(すなわちある残基が同じアミノ酸グループ内の別の残基で置き換わるような)置換でもよい。周知のように天然アミノ酸は酸性、塩基性、中性・極性又は中性・非極性に下位分類される。さらに、3種の天然(遺伝子コード化)アミノ酸は芳香族である。注目に値することには、本発明の配列決定済みポリペプチドとそれとは異なる遺伝子コード化ポリペプチドでは同じグループ内のアミノ酸間に置換が見られる。従って場合により塩基性アミノ酸のLys、Arg及びHisは互換可能であり、酸性アミノ酸のAspとGluは互換可能であり、中性・極性アミノ酸のSer、Thr、Cys、Gln及びAsnは互換可能であり、非極性脂肪族アミノ酸のGly、Ala、Val、Ile及びLeuは互換可能であり(ただし、サイズ上の理由からGlyとAlaの関係がより深く、またVal、Ile及びLeuの関係がより深い)、また芳香族アミノ酸のPhe、Trp及びTyrは互換可能である。
【００７６】
さらに、合成ポリペプチドの場合には非天然アミノ酸で置換してもよい。置換残基の例は式NH2(CH2)nCOOH (式中nは2〜6である)で示されるωアミノ酸などである。これらはサルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン及びノルロイシンと同様に中性・非極性アミノ酸である。フェニルグリシンはTrp、Tyr又はPheに置き換われるし、シトルリン及びメチオニンスルホキシドは中性・非極性であり、システイン酸は酸性、オルニチンは塩基性である。ヒドロキシプロリンはプロリンに置き換われるが、コンホメーション付与特性は維持される。
【００７７】
技術上周知のように、変異体又は変種は置換的突然変異誘発で生成させうるし、本発明のポリペプチドの生物活性を維持しうる。これらの変異体はタンパク質分子中の少なくとも1個のアミノ酸残基を除去し、その代わりに別のアミノ酸残基を挿入してある。置換的突然変異誘発の関心部位の非限定的な例は、活性部位又は免疫部位として識別される部位であろう。他の関心部位は、様々な種に由来する特定の残基が同一であるような部位であろう。これらの位置は生物活性にとって重要であろう。「保存的置換」とされる置換の例を表1に示す。こうした置換が所望の変化をもたらさないときは、表1で「例示的置換」と命名している、又はアミノ酸の種類に関連して本書でさらに説明している他タイプの置換を導入し、産物をスクリーニングする。
【００７８】
場合によっては、アミノ酸の置換、挿入又は欠失によりポリペプチドの生物活性を変更することが重要かもしれない。たとえばあるポリペプチドの修飾は該ポリペプチドの生物活性を増進する結果となり、その毒性を変化させ、生体利用率又は安定性を変化させる結果となり、又はその免疫活性又は免疫学的自己同一性を変化させるかもしれない。機能又は免疫学的自己同一性の実質的変更は、次のものを維持するうえでの効果が著しく異なる置換を選択することにより実現される: (a)置換領域のポリペプチド骨格の、たとえばシート又はヘリカルコンフォメーションとしての構造、(b)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩高さ。天然残基は側鎖の共通特性に基づきいくつかのグループに分けられる:
【００７９】
(1) 疎水性: ノルロイシン、メチオニン(Met)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)
(2) 中性・親水性: システイン(Cys)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)
(3) 酸性: アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)
(4) 塩基性: アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)
(5) 残基が分子鎖配向に影響: グリシン(Gly)、プロリン(pro)、及び
(6) 芳香族: トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)。
【００８０】
非保存的置換は以上のうちの一グループの成員と他グループの成員との交換を伴う。
【００８１】
【表１】
0004520091.tif 000002
【００８２】
次にPCK3145 (SEQ ID NO:5)のアミノ酸置換による類似体を例示する。
【００８３】
【化１】
0004520091.tif 000003
【００８４】
たとえばX1はグルタミン酸(すなわちグルタミン酸塩)(Gln)、アスパラギン酸(アスパラギン酸塩)(Asp)又はアスパラギン(Asn)とし、X2はトレオニン(Thr)又はセリン(Ser)とし、またX3はチロシン(Tyr)又はフェニルアラニン(Phe)とすることができよう。
【００８５】
アミノ酸配列の挿入(たとえば追加)には、アミノ基及び/又はカルボキシル基末端の、長さが1残基〜ポリペプチド(100残基以上)にわたる融合、及び単数又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入などがある。他の挿入型変種の例はタンパク質のN-又はC-末端の、同種又は異種ポリペプチドとの融合によるキメラなどである。キメラ型のポリペプチド(すなわちキメラ、ポリペプチド類似体)は本発明のポリペプチド配列と同種又は異種配列との融合体を包含する。該同種又は異種配列は、本発明のポリペプチドとキメラを形成したときに1以上の生物又は免疫特性を保持するような配列を包摂する。以下、PCK3145 (SEQ ID NO:5)と融合体を形成する同種配列を1)〜79)として例示する。こうした同種配列はPCK3145の場合と同様、rHuPSP94 (SEQ ID NO:2)に由来する。
【００８６】
【化２】
0004520091.tif 000004
【化３】
0004520091.tif 000005
【化４】
0004520091.tif 000006
【化５】
0004520091.tif 000007
【化６】
0004520091.tif 000008
【化７】
0004520091.tif 000009
【００８７】
同種融合で生成される他タイプのキメラは本発明のポリペプチドの2回以上の反復により形成される新ポリペプチドなどである。反復単位数はたとえば2〜50単位(すなわち反復配列)であろう。反復単位数が50を超える新ポリペプチドが有用な場合もあろう。PCK3145 (SEQ ID NO:5)の反復により形成される新ポリペプチドの例を80)〜82)として示す。SEQ ID NO:5の反復単位は様々な長さのリンカー又はアダプターで隔てられる場合もあろう。
【００８８】
【化８】
0004520091.tif 000010
【００８９】
異種融合は本発明のポリペプチドと異種ポリペプチドの融合による新ポリペプチドの生成などである。そうした新ポリペプチドの非限定的な例は細菌ポリペプチド(βラクタマーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、又はE. coliのtrp遺伝子座によりコードされる酵素など)、酵母タンパク質、ウイルスタンパク質、ファージタンパク質、ウシ血清アルブミン、化学走性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域(又は他の免疫グロブリン領域)、アルブミン又はフェリチンなどである。
【００９０】
他タイプのポリペプチド修飾にはアミノ酸配列の欠失(たとえば欠落)などがある。欠失は一般に約1〜30残基、より好ましくは約1〜10残基、通常約1〜5残基にわたる。
【００９１】
本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドとのキメラタンパク質をコードする核酸で(すなわち本発明のポリペプチドに対応するDNA配列を収めたベクターで)形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞もまた本発明に包含される。本発明の生物学的特性を1以上有するポリペプチドの類似体、変異体、変種、断片又はキメラを産生する宿主細胞はどれも本発明に包含される。そうした宿主細胞の例は細菌、酵母、植物、昆虫又は哺乳類などの細胞である。さらに、本発明のポリペプチドは形質転換動物に産生させてもよい。形質転換(又はトランスフェクト)した宿主細胞及び動物は、当業者にごく普通に利用可能な資材及び方法を用いて獲得されよう。
【００９２】
用語の意味
分子生物学一般
特に明記しない限り、本発明で使用する組換えDNA手法は技術上周知の標準手法である。そうした手法の例は種々の文献たとえばJ. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984); J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); T.A. Brown (ed.), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Vols. 1 and 2, IRL Press (1991); D.M. Glover and B.D. Hames (eds.), DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. 1-4, IRL Press (1995 and 1996); 及びF.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Gene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 今日までの諸々の改訂版を含む)で説明されている。
【００９３】
「ポリヌクレオチド」は一般に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドをいい、非修飾RNA又はDNAでも修飾RNA又はDNAでもよい。「ポリヌクレオチド」の非限定的な例は一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖部分と二本鎖部分の混合体のDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、一本鎖部分と二本鎖部分の混合体のRNA、及び一本鎖の、より一般的には二本鎖の、又は一本鎖部分と二本鎖部分の混合体のDNA及びRNAを含むハイブリッド分子である。さらに「ポリヌクレオチド」はRNAかDNAを、又はRNAとDNAの両方を含む三本鎖部分をもいう。用語「ポリヌクレオチド」はまた、1以上の修飾塩基を含むDNA又はRNA、及び安定化等を目的に修飾された骨格を有するDNA又はRNAをも包含する。「修飾」塩基はたとえばトリチル化塩基、及びイノシンなどのような異常塩基を含む。DNAとRNAにはこれまで多様な修飾がなされてきた。従って「ポリヌクレオチド」は、ウイルスや細胞に特有の化学形態のDNAやRNAだけでなく、一般に天然に見られるポリヌクレオチドの化学的酵素的及び代謝的修飾形態をも包含する。「ポリヌクレオチド」は線状及び環状分子を非限定的に包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドとも呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドをも包摂する。
【００９４】
「ポリペプチド」はペプチド結合又は修飾ペプチド結合(すなわちペプチドイソスター)により互いに結合された2以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質をいう。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと呼ばれる短鎖と一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方をさす。前述のように、ポリペプチドは遺伝子にコードされたアミノ酸20種以外のアミノ酸を含んでもよい。
【００９５】
「ポリペプチド類似体」は本書では、任意のポリペプチドの変異体、変種、キメラ、融合体、欠失、追加及び他の任意タイプの修飾に関連する。
「同種」配列は本書では、rHuPSP94 DNA配列又はポリペプチドに由来するヌクレオチド又はアミノ酸配列に関連する。
「異種」配列は本書では、異種ポリペプチドのDNA配列又はアミノ酸配列に関連し、PSP94配列以外の配列を含む。
【００９６】
「腫瘍」は本書では、充実性又は非充実性腫瘍、転移又は非転移腫瘍であって、種々の組織に由来する腫瘍たとえば肝臓、肺、脳、リンパ節、骨髄、副腎、乳房、結腸、膵臓、前立腺、胃、又は生殖路(子宮頸管、卵巣、子宮内膜など)に由来する腫瘍に関連する。また「腫瘍」は本書では、悪性、両性を問わず諸々の新生細胞の成長及び増殖、並びに諸々の前がん及びがん細胞・組織に関連する。
【００９７】
「多糖」は本書では、2以上の糖単位からなる物質をいい、キトサン、ペクチン、コンドロイチン硫酸、シクロデキストリン、デキストラン、グアーガム、イヌリン、アミロース、及びローカストビーンガムなどを含む。
【００９８】
「ベクター」は本書では、その中に外来DNA又はRNA断片を挿入し宿主細胞中で増殖させるようにした、外来DNA又はRNA分子の発現又は増幅を目的とする自己複製DNA又はRNA分子をいう。「ベクター」の非限定的な例は、ある生物から他の生物へとDNA配列を移すために使用することができるプラスミド(たとえば線状又は環状プラスミド)である。
【００９９】
「徐放性のカプセル封入手段」は、製剤組成物の調製に際して徐放性を実現するために使用される多糖、生体適合性高分子、他の高分子基剤、カプセル、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ボーラス剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフィア、ドライパウダー、又は経皮送達システムなどをいう。哺乳類に投与するとin situで固体又はゲルとなる液体類もまた本発明の徐放性組成物の例である。さらに、「徐放性のカプセル封入手段」又は「徐放性手段」は薬剤の制御放出を実現するうえで有用な生分解性ポリマー類たとえばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋又は両親媒性ブロックコポリマーを包含する。
【０１００】
「製剤組成物」は本書では、製薬上許容しうる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び/又は担体と混ぜた治療有効量の薬剤をいう。「治療有効量」は本書では、任意の状態及び/又は投薬計画に応じた治療効果をもたらす量をいう。そうした組成物は液剤、もしくは凍結乾燥した又は他の方法で乾燥した製剤であり、種々の緩衝剤(Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩など)濃度、pH及びイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防ぐための添加剤たとえばアルブミン又はゼラチン、洗剤(Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩など)、可溶化剤(グリセロール、ポリエチレングリセロールなど)、抗酸化剤(アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムなど)、保存剤(チメロサール、ベンジルアルコール、パラベンなど)、増量剤又は等張化剤(ラクトース、マンニトールなど); ポリマー(ポリエチレングリコールなど)のタンパク質への共有結合; 金属イオンとの錯化; 又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのようなポリマー化合物の微粒子体の内部又は表面への、もしくはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層又は多層膜小胞、ゴースト赤血球又はスフェロプラストの表面への、タンパク質の組込みを含む。そうした構成はその物理的状態、可溶性、安定性、in vivo放出率、in vivoクリアランス率に影響を及ぼそう。徐放性組成物の例には親油性デポ(脂肪酸、ワックス、油など)製剤が含まれる。また本発明には、ポリマー(ポロキサマー又はポロキサミンなど)で被覆した微粒子製剤も包摂される。本発明の組成物は他の実施態様では非経口、肺、鼻腔、口腔など多様な投入経路に合わせた微粒子状の保護層、プロテアーゼインヒビター又は透過促進剤を組み込む。一実施態様では製剤組成物の投与を非経口、傍がん(paracancerally)、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、腫瘍内的に行う。
【０１０１】
さらに、「製薬上許容しうる担体」又は「医薬品担体」は技術上周知であり、0.01〜0.1Mの、好ましくは0.05Mのリン酸緩衝液又は0.8%生理食塩水などを非限定的に含む。また、そうした製薬上許容しうる担体は水性又は非水性の溶液、エマルション及び懸濁液でもよい。非水性担体の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油たとえばオリーブ油、及び注射用有機エステルたとえばオレイン酸エチルなどである。水性担体の例は水、アルコール性/水性溶液、エマルション又は懸濁液などである。非経口用担体の例は塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンガー液、ブドウ糖+塩化ナトリウム、乳酸リンガー液又は不揮発性油などである。靜注用担体の例は脱水及び栄養補給液、ブドウ糖リンガー液などのような電解質補給液、その他などである。保存剤等の添加剤たとえば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどを使用してもよい。
【０１０２】
変異体、変種及び類似体タンパク質
変異体ポリペプチドは、アミノ酸残基の欠失(欠落など)、挿入(付加など)又は置換である突然変異を1以上有するであろう。変異体は天然体(天然源に由来する精製又は単離体)でも、(たとえばコード配列DNAに対する部位指定突然変異誘発による、又は化学合成など他の合成方法による)合成体でもよい。従って、本発明のポリペプチドが天然体又は(組換えDNA手法による)組換え体のいずれでもよいのは自明である。
【０１０３】
これらの本発明ポリペプチドとの同一性が、技術上周知の方法[たとえばSmith, T.F. and Waterman, M.S. (1981) Ad. Appl. Math., 2:482-489又はNeedleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol., 48:443-453に記載の方法]で求めたときに、50%以上であるタンパク質は、また本発明のタンパク質との同一性が70%又は80%以上、好ましくは90%以上であるタンパク質も同様に、本発明に包含される。この同一性は一般に、5個以上の、好ましくは20個以上の隣接アミノ酸からなる領域にまたがろう。
【０１０４】
「変種」は本書では、ポリヌクレオチド又はポリペプチドであって、それぞれ基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが本質的な性質は残しているものをいう。ポリヌクレオチドの一般的な変種は、基準となる別のポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列に見られる変化は、基準ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を変化させても変化させなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、基準配列がコードするポリペプチドにアミノ酸の置換、追加、欠失、融合及び欠落をもたらす結果となってもよい。ポリペプチドの一般的な変種は基準となる別のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に差異が小さいため、基準ポリペプチドと変種の配列は全体として酷似しており、また同一である領域も多い。変種と基準ポリペプチドはアミノ酸配列が1個又は複数個、置換、追加、欠失、又はそれらの組み合せによって異なってもよい。置換又は挿入アミノ酸残基は遺伝子によってコードされる場合も、コードされない場合もあろう。変種ポリヌクレオチド又はポリペプチドは天然型変種たとえば対立遺伝子由来の変種でも、非天然型の変種でもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの非天然型変種は突然変異誘発法により、又は直接合成法により、生み出すことができる。
【０１０５】
アミノ酸配列の変種はDNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又は所望ポリペプチドの直接合成により、つくることができる。そうした変種の例はアミノ酸配列中の残基の欠失、挿入又は置換などである。最終産物のタンパク質が所望の性質をもつ限りで、欠失、挿入及び置換を組み合せてもよい。アミノ酸配列の変化は翻訳後過程の変化、たとえばグリコシル化部位の数又は位置の変化、膜アンカー特性の変化、天然タンパク質の膜貫通配列の挿入、欠失又はその他の操作による細胞内位置の変化、又はタンパク質分解切断の受けやすさの調節などをもたらしてもよい。
【０１０６】
ある「範囲」又は「群」の物質(アミノ酸など)、置換基、その他について、もしくは他タイプの特定の性質(温度、圧力、化学構造、時間など)について言及がある場合、本発明はその中に含まれる諸々の個別成員及び「下位範囲」又は「下位群」に関連し、またそれらを明示に包摂するものとする。従って、任意の明示の範囲又は群はある範囲又は群の諸々の成員並びにその中に包摂される諸々の下位範囲又は下位群を明示するための省略法として理解されるものとする。また下位範囲又は下位群についても同様である。従って、たとえば
【０１０７】
−大気圧を超える圧力に関しては、これは大気圧を超える諸々の個別圧力状態並びに下位範囲を、たとえば2psig、5psig、20psig、35.5psig、5〜8psig、5〜35psig、10〜25psig、20〜40psig、35〜50psig、2〜100psig等々を明示に包摂するものとする;
【０１０８】
−100℃を超える温度に関しては、これは100℃を超える諸々の個別温度状態並びに下位範囲を、たとえば101℃、105℃以上、110℃以上、115℃以上、110〜135℃、115〜135℃、102〜150℃、210℃以下等々を明示に包摂するものとする;
【０１０９】
−100℃を下回る温度に関しては、これは100℃を下回る諸々の個別温度状態並びに下位範囲を、たとえば15℃以上、15〜40℃、65〜95℃、95℃以下等々を明示に包摂するものとする;
【０１１０】
−滞留又は反応時間に関して、1分以上の時間は1分以上の諸々の個別時間並びにその下位範囲を、たとえば1分、3〜15分、1分〜20時間、1〜3時間、16時間、3〜20時間等々を明示に包摂するものとする。
【０１１１】
−ポリペプチドに関して、特定配列の2個以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体は諸々の個別の可能性を、たとえばアミノ酸1と2からなるポリペプチド類似体、アミノ酸2と3からなるポリペプチド類似体、アミノ酸3と4からなるポリペプチド類似体、アミノ酸6と7からなるポリペプチド類似体、アミノ酸9と10からなるポリペプチド類似体、アミノ酸36と37からなるポリペプチド類似体、アミノ酸93と94からなるポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１１２】
−ポリペプチドに関して、特定配列の5個以上の隣接アミノ酸からなるポリペプチド類似体は諸々の個別の可能性を、たとえばアミノ酸1〜5からなるポリペプチド類似体、アミノ酸2〜6からなるポリペプチド類似体、アミノ酸3〜7からなるポリペプチド類似体、アミノ酸6〜10からなるポリペプチド類似体、アミノ酸9〜13からなるポリペプチド類似体、アミノ酸36〜40からなるポリペプチド類似体、アミノ酸90〜94からなるポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１１３】
−ポリペプチドに関して、特定の配列を含みそのアミノ基末端に1個以上のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体は諸々の個別の可能性を、たとえばアミノ基末端に1個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、アミノ基末端に2個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、アミノ基末端に3個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、アミノ基末端に10個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、アミノ基末端に18個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、アミノ基末端に40個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、アミノ基末端に200個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１１４】
−ポリペプチドに関して、特定の配列を含みそのカルボキシル基末端に1個以上のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体は諸々の個別の可能性を、たとえばカルボキシル基末端に1個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、カルボキシル基末端に2個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、カルボキシル基末端に5個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、カルボキシル基末端に20個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、カルボキシル基末端に53個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体、カルボキシル基末端に300個のアミノ酸が付加されたポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１１５】
−ポリペプチドに関して、特定配列2〜50単位からなるポリペプチド類似体は諸々の個別の可能性を、たとえば該特定配列2単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列3単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列6単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列13単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列35単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列50単位からなるポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１１６】
−ポリペプチドに関して、特定配列2〜10単位からなるポリペプチド類似体は諸々の個別の可能性を、たとえば該特定配列2単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列3単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列4単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列5単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列6単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列7単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列8単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列9単位からなるポリペプチド類似体、該特定配列10単位からなるポリペプチド類似体を明示に包摂するものとする。
【０１１７】
−ポリペプチドに関して、2〜14アミノ酸単位の配列からなり、該アミノ酸単位がグルタミン酸(Glu)、トリプトファン(Trp)、グルタミン(Gln)、トレオニン(Thr)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、システイン(Cys)及びチロシン(Tyr)からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸単位群より選択されるポリペプチド類似体は諸々の個別の可能性を、たとえばアミノ酸が順にGlu、Trpである2アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順にTrp、Gluである2アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順にTrp、Glu、Trpである3アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順にTrp、Trp、Trpである3アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順にGlu、Glu、Trpである3アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順序と無関係にTyr、Asp、Gluである3アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順序と無関係にThr、Asp、Asnである3アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順序と無関係にThr、Thr、Asnである3アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順序と無関係にGlu、Glu、Cys、Asnである4アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順序と無関係にGlu、Glu、Cys、Trpである4アミノ酸単位のポリペプチド類似体;アミノ酸が順序と無関係にCys、Cys、Cys、Cysである4アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順序と無関係にAsn、Asp、Glu、Gln、Trp、Cys、Tyr、Thr、Thr、Asp、Asn、Gln、Thr、Cysである14アミノ酸単位のポリペプチド類似体;アミノ酸が順序と無関係にAsp、Asp、Asp、Asp、Trp、Cys、Cys、Trp、Thr、Thr、Thr、Thr、Thr、Cysである14アミノ酸単位のポリペプチド類似体; アミノ酸が順序と無関係にTyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyr、Tyrである14アミノ酸単位のポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１１８】
−ポリペプチドに関して、特定アミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体は(100%を除く)諸々の個別の可能性を、たとえば該特定アミノ酸配列との同一性が90%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が91%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が93%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が97%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が99%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１１９】
−ポリペプチドに関して、特定アミノ酸配列との同一性が70%以上であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体は(100%を除く)諸々の個別の可能性を、たとえば該特定アミノ酸配列との同一性が70%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が71%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が73%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が88%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が97%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が99%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１２０】
−ポリペプチドに関して、特定アミノ酸配列との同一性が50%以上であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体は(100%を除く)諸々の個別の可能性を、たとえば該特定アミノ酸配列との同一性が50%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が51%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が54%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が66%であるポアミノ酸配列のリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が70%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が79%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が82%であるアミノ酸配列のポリペプチド類似体、該特定アミノ酸配列との同一性が99%であるポリアミノ酸配列のペプチド類似体等々を明示に包摂するものとする。
【０１２１】
また、他のパラメーターたとえば圧力、濃度、元素などに関しても同様とする。
【０１２２】
「g」又は「gm」はグラム重量単位であり、「℃」は摂氏温度単位であり、また「psig」は「ポンド/平方インチゲージ」である。
【０１２３】
発明の詳細な説明
酵母菌で発現させた組換えヒトPSP94 (rHuPSP94)は非グリコシル化体であり、10個のシステイン残基をもつ。分子量はrHuPSP94が11.5kDa、その天然体が10.7kDaと判明している。
【０１２４】
病変前立腺から分泌される天然PSP94と比較した場合のrHuPSP94 (SEQ ID NO:2)の腫瘍抑制物質としての効果を調べるために種々の実験研究を行った。SEQ ID NO:3のデカペプチド、SEQ ID NO:4のポリペプチド(ポリペプチド7〜21)、SEQ ID NO:5のポリペプチド(PCK3145)及びSEQ ID NO:6のポリペプチド(ポリペプチド76〜94)の腫瘍抑制物質としての効果を調べる研究も行った。本発明のポリペプチド類の腫瘍抑制活性は、in vivo、in vitroの両方で前立腺がん(CaP)の成長を抑制又は阻害する能力という点から評価した。以下、それらの結果をまとめる。
【０１２５】
研究はPC-3ヒト前立腺がん細胞株を用いて行ったが、それはヌードマウスへの異種移植片としin vivoでも、また細胞株としてin vitroでも維持することができる。さらに、CaP研究用の卓越した動物モデルであるラットDunning MAT-LyLu前立腺腫瘍も使用した。該Dunning腫瘍は急成長、低分化度の移植可能な腫瘍であり、Copenhagenラット中にin vivoで維持することも細胞株としてin vitroで維持することもできる。
【０１２６】
以下の実施例は限定ではなく例示が目的である。
実施例1
rHuPSP94 (SEQ ID NO:2)とポリペプチド類(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:6)の調製
rHuPSP94のクローニング、発現、それに続く精製及び解析を次の要領で実施した。
材料
使用材料とその入手先は次のとおりである: DEAE-セルロース(DE52)−Whatman (Fairfield, New-Jersey); 透析膜とエレクトロケミルミネセンス(ECL)検出キット−Biolynx Canada (Pierce Inc.);   広域分子量マーカーとフローアダプター付きEcono-packカラムは−Bio-Rad Labs Ltd. (California);ペリコン装置−Millipore (Massachusetts); Tris-HCl−ICN; MES [(2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸)水和物]−Sigma; ブタ抗ウサギIgGアルカリ性ホスファターゼ複合体−DAKO (Denmark); Pichia pastoris発現キットのバージョンG−Invitrogen (Carlsbad, California); 非放射性High Prime DIG (登録商標)ラベリングキット−Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana); MTS [3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、分子内塩]試験用のCell Titer Aqueous Non-radioactive細胞増殖試験キット−Promega (Madison, Wisconsin); MRXマイクロタイタープレートリーダー−Dynex Technologies (Chantilly, Virginia); PSP94に対するウサギポリクローナル抗血清−故Dr. A. Shethからの寄贈; すべてのプライマー−Procyon Biopharma Inc. (London, Ontario, Canada) が合成。
【０１２７】
細胞株と細胞培養
P. pastoris宿主株GS115 (his4) と諸々のPichia関連産物はInvitrogenから入手した。PC-3 (ATCC-# CRL 1435)細胞株はAmerican Type Cell Culture (ATCC)から入手し、OPTI MEM (最小必須培地)+10%ウシ胎仔血清(FBS)中で維持した。細胞培養産物はすべてGIBCO BRLから入手した。
【０１２８】
クローニング
然るべきプライマーの使用によるリーダー配列欠失ヒトPSP94の増幅に、20アミノ酸リーダー配列を含むPSP94 cDNAを収めたTAクローニングベクター(pCR TM 2.1) (Baijal-Gupta, M., et al., J. Endocrinol., 165:425-433, 2000)を使用した。PCR用プライマーはどちらかの末端にEcoRI制限部位を含むよう設計した。使用5’プライマーは5’-GGG AAG AAT TCT CAT GCT ATT TCA TA-3’ (SEQ ID NO:7) であり、3’プライマーは5’-TGG ATA TCT GCA GAA TTC GGC-3’ (SEQ ID NO:8)であった。前記5’プライマー配列の下線部はPSP94の(セリン残基の)+1開始部位である。
【０１２９】
PCRサイクルの内訳は94℃、12分間の1サイクル; 94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間の25サイクル; 最終ステップとなる72℃、10分間の1サイクルであった。産物のPCR増幅はBM Expand(登録商標)ハイフィデリティーPCRシステムを使用して行った。産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動し、Pharmacia Sephaglassキット(Bandprep)を用いて然るべきPCR産物を単離した。PSP94インサートをpPIC9ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。EcoRI酵素を使用して該プラスミドとPCR産物の両方を消化し(もってPSP94シグナル配列を除去し)、次いでライゲーションとDH5α細胞の使用による形質転換とを行った。単離クローンをアンピシリン耐性によって選別し、またインサートは制限地図の作成により同定した。該コンストラクトの配列を決定して(Robert’s Sequencing Services, London, Ontario)、正しい配列と適正な方向及び読み枠とを備えたPSP94インサートを同定した。
【０１３０】
rHuPSP94発現クローンのスクリーニング
Pichia pastorisの形質転換には、GS115及びKM71酵母株を使用してスフェロプラスト法をメーカー(Invitrogen)の説明書に従って実施した。PSP94インサートを含む又は欠くプラスミドpPIC9を、SalI制限酵素により線状化した。ヒスチジン産生能があり、従って無ヒスチジン培地でも生存していた形質転換コロニーをスクリーニング、選別した。GS115形質転換体はすべてMut+として記録し、またKM71はすべてMutsとして記録した。こうしてrHuPSP94を最高レベルで発現するGS115クローンを多数スクリーニングした。
【０１３１】
約100個のクローンを選別して2mlの倍地中で、600nmの光学密度(OD600)が約6に達するまで増殖させた。全DNAを単離して迅速ドットブロット分析にかけてから、高rHuPSP94発現クローンに対応する可能性のある多重組込みをサザンブロット法で検出するようにした。各培養試料200μlを変性処理し、ドットブロット装置に配した正荷電ナイロンメンブランフィルターに(2組ずつ)ブロットした。次いでフィルターを風乾した。フィルターを2枚のWhatman 3MM紙の間に挟み50mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2.5% βメルカプトエタノール(BME)を含む溶液pH 9に15分間浸し、次に1mg/ml Zymolyase 100Tと37℃で24時間インキュベートし、0.1N NaOH、1.5M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウムpH 7中で5分間、及び2 x生理食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)中で5分間2回、それぞれインキュベートした。最後に、フィルターを80℃で45分間乾熱処理してから、紫外線(UV)を15分間照射した。ヒトPSP94 cDNAプローブを非放射性High Prime DIG (登録商標)標識キット(Boehringer Mannheim)で標識し、ハイブリダイゼーションに使用した。ジゴキシゲニン標識cDNAプローブ(25ng/μl)とのハイブリダイゼーションはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)緩衝液[SDS 7%(w/v)、ホルムアミド50%(v/v)、5 x SSC、50mMリン酸ナトリウムpH 7.0、N-ラウロイルサルコシン0.1%(w/v)]中42℃で2日間行い、ブロッキング試薬のCSPD(登録商標)2%(w/v)(Boehringer Mannheim)をケミルミネセンス基質として使用した。ジゴキシゲニン(DIG)標識手順はすべてメーカーの説明書に従った。検出はHyper film-ECL用品(Amersham Life Science Inc., Arlington Hts., Illinois)を使用して行った。
どのフラスコ振とう培養にも最高シグナル強度のクローンを使用した。
【０１３２】
フラスコ振とう培養でのタンパク質発現の最適化
PSP94コンストラクトを含むクローンから該タンパク質を高レベルで発現するものを選別した。コロニーを25mlの基本最小増殖(BMG)培地中で、OD600が2〜6になるまで増殖させた。このクローンを、1リットルのBMG培地を入れたバッフル付三角フラスコ中で、OD600が約2.0〜6.0に達するまでさらに増幅させた。培養液を2500 x gで15分間遠心にかけ、ペレットを回収した。細胞ペレットを基本最小培地(BMM)に接種し誘導期(すなわちrHuPSP94の発現誘導)を実現した。増殖はInvitrogenの推奨に従いバッフル付フラスコ中で6日間行った。BMM添加量は回収ペレットのサイズに応じて異なった。培地リットルあたり5mlの100%メタノールを加えた。これを毎日ほぼ同じ時間に実施し、最終メタノール濃度が0.1%になるようにした。PSP94インサートを欠くプラスミドは陰性対照(ネガティブ・コントロール)とした。
【０１３３】
細胞倍地中で分泌されたrHuPSP94の最適回収時期を決めるために、誘導初日から開始し6日間にわたり24時間ごとに培養液を分取した。rHuPSP94タンパク質の発現レベルはOD600の計測により、またCoomassie Brilliant Blueで染色した15% SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)か又はポリクローナルPSP94抗体使用のウェスタンブロット分析により、求めた。
【０１３４】
サンプル調製
誘導後(たとえば96時間後)に最高レベルのrHuPSP94発現を示したクローンの培養上清を2500 x g、20分間の遠心で回収した。上清を0.8μmフィルターでろ過し、ペリコン装置(Millipore)を使用して約10倍に濃縮した。ろ過処理後の上清は3.5kDa分子量カットオフ膜を使用し0.05mM Tris-HCl緩衝液pH 8.0を外液として透析した。透析処理後の上清を分取してSDS-PAGEとウェスタンブロット法で分析し、残りの上清を更なる精製に回した。
【０１３５】
発酵のための培養条件
発酵はInstitute for Biological Science, National Research Council(NRC) (Ottawa, Ontario, Canada)で、メーカー説明書(Invitrogen)に従って行った。たとえば発酵手順はタネ菌液625mlを2.5リットルの培地に接種することで開始した。増殖期はBMG培地で約2日間、OD600が約0.5に達するまで続けた。誘導期はメーカー(Invitrogen)説明書に従いメタノール(100%)の添加で開始させた。95時間後(すなわち67時間にわたるメタノール誘導後)、培養液を回収した。培養液の最終容量は約13.5リットルであった。
【０１３６】
発酵培養液からのサンプル調製
大きな細胞塊を遠心で除去した。回収した無細胞培地(9リットル)を0.2μmろ過装置(ペリコン)でさらに除濁した。分泌rHuPSP94を含む残りの8.5リットルについてタンパク質の発現を検査し、タンパク質の更なる単離、精製に備えてマイナス20℃で保存した。
【０１３７】
タンパク質の定量
フラスコ振とう培養と発酵過程に由来する培養上清中の分泌rHuPSP94タンパク質量は、既知量の純粋な凍結乾燥PSP94をSDS-PAGEにかけて得られた検量線のバンド強度との比較によるサンプル・バンド強度の推定値から求めた。各精製段階の当初rHuPSP94推定量は280nmでのODによって求めた。最終精製段階での全タンパク質量の定量はウシ血清アルブミン(BSA)を基準とするBCA (ビシンコニン酸)法で行った。
【０１３８】
凍結乾燥
精製rHuPSP94のサンプルは3kDa分子量カットオフ膜により脱イオン水を外液として透析した後、凍結乾燥した。
【０１３９】
SDA-PAGE
SDS-PAGEは、分離用ゲルのアクリルアミド最終濃度を15%、濃縮用ゲルのアクリルアミド最終濃度を5%として実行した。ゲルは0.1%のSDSを含み、電気泳動は還元条件下で行った。タンパク質分子量の推定には広域分子量マーカーを使用した。タンパク質の染色にはCoomassie Brilliant Blue R-250を用いた。
【０１４０】
ウェスタンブロット法
免疫ブロット法では、Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio Rad)にHi-Bond C Superメンブラン(Amersham)、85mmろ紙を使用した。タンパク質サンプル(0.4μg)を前述の要領でSDS-PAGEに添加し、分離した。転写用緩衝液(25mM Tris、192mMグリシン、pH 8.3及び20%メタノール)と200ミリアンペア(mAmp)にセットした転写用装置を用いて、タンパク質をメンブランフィルターに4℃で2時間転写した。フィルターを一晩、トリス緩衝生理食塩水(TBS: 500mM NaCl、20mM Tris-HCl、pH 7.5) + 2%(w/v)脱脂粉乳(スキムミルク)中、室温(RT)でのインキュベーションによりブロッキングした。0.02% (v/v) Tween 20添加TBS(この緩衝液はTTBSという)でフィルターを3回洗った。次いでフィルターをRTで2時間、2%スキムミルク添加TTBSで希釈(1:2000希釈)した抗PSP94抗体とインキュベートした。フィルターをTTBSで5分間ずつ2回洗い、TTBSで希釈(1:5000希釈)した二次抗体(すなわちブタ抗ウサギ抗体HRP複合体)とRTでインキュベートした。フィルターを0.02% TTBSで5分間ずつ2回洗った。ECL検出システムを使用してメーカーの説明書に従いSuper Signal Substrateによりブロットを発現させ、Hyperfilm ECL (Amersham LS)に5〜20秒間焼き付けた。分子量の推定には染色済み分子量マーカーを用いた。
【０１４１】
DE52カラムクロマトグラフィーによるrHuPSP94精製
発酵培養液からP. pastoris細胞を除去した後、上清を約10倍に濃縮し、透析処理し、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。層容量が約40mlのDE52カラム[内径(id)2.5cm×高さ(h)8cm]を0.05 M Tris-HCl、pH 8.0 (平衡化緩衝液)で平衡化した。15〜20mgのrHuPSP94タンパク質を含むサンプル(24ml)をDE52カラムに1ml/分の送液量で添加した。
【０１４２】
280nm吸光度をモニターしながら40〜50mlの平衡化緩衝液でカラムを洗い、カラムから不純物を除去した。次いで100〜150 mlの0.05M Tris-HCl、pH 6.5を洗浄液のpHが約6.5になるまでカラムに加えた。カラムを100〜150mlの0.05M MES-酢酸緩衝液でさらに洗い、280nmの吸光度がゼロに迫るようにした。最後に0.05M MES-酢酸緩衝液、pH 5.0でrHuPSP94をカラムから溶出した。ピーク画分の特性を280nm吸光度により解明し、次いで前述の要領でSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析を行った。280nm吸光度の値が高い(0.5〜1.8)画分をプールし、水又はPBSを外液として透析しマイナス20℃での保存及び/又は凍結乾燥に回した。
【０１４３】
アミノ酸組成
DE52で精製したフラスコ振とう培養液及び発酵培養液のアミノ酸組成を分析した。Perkin Elmer Biosytems Derivatizer-AnalysisシステムとSperi-5 PTC C-18 5μカラム及びOD254でのUV検出を分析に使用した。
【０１４４】
質量分析
PSP94由来のポリペプチド類を合成し、それらが要求規格に適合することを確認し、また質量分析法で分析した。ポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)、PCK3145 (SEQ ID NO:5)及びポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)の質量分析結果はそれぞれ図1、2及び3のとおりである。
【０１４５】
ポリペプチド・サンプルは窒素レーザーの337nm光を用いるPerSeptive Biosytems (Framingham, MA) Voyager-DE MALDI-TOF質量分析計で分析した。各分析では約12〜50回の測定を平均した。
フラスコ振とう培養液と発酵培養液に由来する精製サンプルは窒素レーザー337nm光使用のPerSeptive Biosytems (Framingham, MA) Voyager-DE MALDI-TOF質量分析計で分析した。各分析では約50回の計測を平均した。天然PSP94由来のサンプルも比較のために同様の条件下で分析した。
【０１４６】
実施例2
PC-3細胞に対するrHuPSP94のin vitro効果(MTS試験)
rHuPSP94の生物活性を、ヒト前立腺がん細胞PC-3に対する増殖阻害効果によって評価した。生細胞のミトコンドリア活性を主に計測するMTS/PMS(フェナジンメトサルフェート)キットにより、PC-3細胞の細胞増殖をモニターした。生細胞のミトコンドリア酵素類はMTS/PMS色素を代謝させ、褐色沈殿物を形成するが、該沈殿物は分光光度計で490nmの吸光により光学密度(OD)として計測しうるので、そのOD値を求めればそれに比例する生細胞数も判明する、というのがこの方法の基本原理である。加えて細胞の形態学的状態もモニターした。細胞の形態学的状態はその健康状態を示唆しよう。たとえば生細胞は粘着質で伸び広がって見えようが、死細胞は培地中に懸濁し、また丸くなって粒状に見えよう。
【０１４７】
PC-3細胞に対するrHuPSP94のin vitro効果に関するMTS試験結果をまとめると表2のようになる。実験に使用したPC-3細胞(ATCC, Lot AT06)は継代数が70以下(n≧70)であった。Costar 96穴細胞培養平底プレートに50μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)と0.1μM FeSO4を含むサプリメント添加RPMI培地を加え、そこに細胞をまいた。ペプチドを同じ培地で希釈した。細胞を本発明のポリペプチドに、培地を代えずに72時間連続して接触させた。2倍に濃縮した天然PSP94又はrHuPSP94をウェルに直接加えてから元の濃度へと希釈して、細胞の操作を最小限に抑え剥離を防ぐようにした。
【０１４８】
PC-3細胞に対するrHuPSP94の増殖阻害効果を評価すると、細胞数(すなわち生存率)が80μg/ml及び120μg/mlのrHuPSP94濃度でそれぞれ37%〜57%の範囲で大幅に低減することが判明した。この効果は4回中3回の実験で観測された(表2)。トリパンブルー分染法によれば80μg/mlでの細胞生存率は62%であった。
【０１４９】
【表２】
0004520091.tif 000011
【０１５０】
実施例3
PC-3細胞に対するrHuPSP94のin vitro効果([3H]-チミジン取り込み試験)
rHuPSP94のin vitro増殖阻害効果を[3H]-チミジン取り込み試験で評価した。[3H]-チミジン取り込み試験は活発に増殖する細胞の細胞DNAに[3H]-チミジンが取り込まれる現象を利用する。MTS試験では処理後の生細胞数を定量するのに対して、この試験では細胞の増殖性指数を計測する。Costar 96穴細胞培養平底プレートに50μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)と0.1μM FeSO4を含むサプリメント添加RPMI培地を加え、そこに細胞をまいた。PC-3細胞を種々の濃度のrHuPSP94に72時間接触させたが、培養最後の16時間中に、細胞に1μCiの[3H]-チミジンを添加した。プレートの各ウェル内の放射能をβカウンターで計数し、総カウント数/分(cpm)として表す。PC-3細胞に対するrHuPSP94のin vitro効果に関する[3H]-チミジン取り込み試験の結果は表3のとおりであり、非処理細胞(その[3H]-チミジンの取り込み値を100%とする)の放射能計測値に対する処理細胞の放射能計測値の百分率で表わしている。
【０１５１】
試験結果によれば、濃度80μg/mlのrHuPSP94で72時間処理後の[3H]-チミジン取り込み細胞の百分率は非処理対照と比較して65%低下した。[3H]-チミジン取り込みの65%低下という結果は細胞増殖の65%低下を示唆することにもなろう。
【０１５２】
[3H]-チミジン取り込み試験とMTS試験を比較して、双方の相対的な感受性を評価するようにした。MTS試験用に追加のプレートを別に用意し、[3H]-チミジン取り込み試験に使用したものと同じロット(すなわちバッチ)のrHuPSP94で並行処理した。MTS試験の結果によれば濃度80μg/mlのrHuPSP94で処理した後の細胞生存率は35%低下したが、それは細胞増殖の65%低下を測定することができた[3H]-チミジン取り込み試験のほうがMTSよりも感受性が高いことを示唆するであろう。
【０１５３】
【表３】
0004520091.tif 000012
【０１５４】
実施例4
PC-3細胞に対するデカペプチド及び他ポリペプチドのin vivo効果
本書で既に明らかにされたように合成デカペプチド(SEQ ID NO: 3)は天然PSP94 (nPSP94) (SEQ ID NO:1)と生物活性がよく似ているので、PC-3細胞に対するその効果をクローン原性(コロニー形成)試験で調べた。Costar 96穴細胞培養平底プレートに50μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)と0.1μM FeSO4を含むサプリメント添加RPMI培地を加え、そこに細胞をまいた。種々の濃度のデカペプチドの存在下で増殖させたPC-3細胞について9日間培養後に、クローン原性を評価した(図4a)。同じ条件による並行実験を種々の濃度のnPSP94で行った(図4b)。他にもクローン原性の評価実験をデカペプチド(図5a)又はnPSP94 (図5b)を対象に10日間の培養及び21日間の培養で実施した(図6a: デカペプチド及び図6b: nPSP94)。
【０１５５】
図4〜6を参照すると、デカペプチド(SEQ ID NO:3)とnPSP94はPC-3細胞のin vitro研究で似たような阻害作用を示した。濃度1μg/mlのデカペプチド(SEQ ID NO:3)を接種した細胞ではコロニー数が40%減少する結果となった。濃度10μg/mlのデカペプチド(SEQ ID NO:3)では最高60%のコロニー数減少が観測された。
【０１５６】
実施例5
DNA断片化の検出
DNA断片化は細胞アポトーシスの結果として起こるが、DNAを1.2%アガロースゲル電気泳動にかけてDNAラダーとして視覚化することができる。PC-3細胞を種々の濃度のポリペプチド類と72時間接触させた後、DNAラダー検出(アポトーシス検出)試験を実施した。この実験に使用したポリペプチドはポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)、ポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)及びポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)である。DNAを単離し1.2%アガロースゲル電気泳動にかけて視覚化すると、試験したどのポリペプチドもアポトーシスに特有のDNAラダー化を誘発することが明らかとなった。ラダー化はPCK3145 (SEQ ID NO:5)処理後に特に明白であった(図7)。図7に示したゲルのレーン1は基準のλHindIII 消化である。レーン2はドキソルビシン処理細胞で得られたDNAラダーである。レーン3は40μgのnPSP94で処理した細胞で得られたDNAラダーである。レーン4は20μgのnPSP94で処理した細胞で得られたDNAラダーである。レーン5は22.5μMのPCK3145 (SEQ ID NO:5)で処理した細胞で得られたDNAラダーである。レーン6は45μMのPCK3145 (SEQ ID NO:5)で処理した細胞で得られたDNAラダーである。
【０１５７】
実施例6
ELISA plus法によるアポトーシス検出
3種類のポリペプチド(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)と陽性対照(ポジティブ・コントロール)としてのnPSP94をELISA plus法で試験し、アポトーシスによる細胞死の検出を試みた。ELISA plus法は簡単に言えば、2種類の抗体すなわちDNAとヒストンに対する抗体を用いて、細胞溶解物の細胞質画分中に存在するモノ-及びオリゴ-ヌクレオソームを検出することができるサンドウィッチ酵素イムノアッセイである。アポトーシス型細胞死は、二本鎖DNAを最も手近なヌクレオソーム間リンカー領域で切断してモノ-及びオリゴ-ヌクレオソームを生成させる内在エンドヌクレアーゼの(たとえばカルシウム及びマグネシウム依存性)活性化を特徴とする。アポトーシス細胞の細胞質中にモノ-及びオリゴ-ヌクレオソームが集積するのは、DNAの分解が原形質膜破壊の数時間前に起こるためである。
【０１５８】
Costar 96穴細胞培養平底プレートに50μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)と0.1μM FeSO4を含むサプリメント添加RPMI培地を加え、そこに4000個の細胞をまいた。PC-3細胞を種々の濃度(22.5 μM〜90μM)のポリペプチドで72時間処理した。アポトーシス検出試験はApotTagキット(Boehringer Mannheim)を用いてメーカーの説明書に従って行った。
【０１５９】
図8に示す試験結果は、いずれのポリペプチド(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)でもアポトーシス型細胞死が用量に依存して増加することを示している。濃度90μMではポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)が最も有効であった(図8)。
【０１６０】
実施例7
PSP94ポリペプチドによる細胞増殖阻害(図9〜11)
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及びSEQ ID NO:6のポリペプチドの生物活性を、ヒト前立腺がん細胞PC-3に対する増殖阻害効果により評価した。この実験には対照としてnPSP94、rHuPSP94、ポリペプチド22〜36及びPB111ポリペプチド(スクランブルド・ポリペプチド)も含めた。細胞増殖試験はMTS/PMSキット(Promega)を使用してPC-3細胞と正常線維芽細胞(対照として使用)を対象に行った。Costar 96穴細胞培養平底プレートに50μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)と0.1μM FeSO4を含むサプリメント添加RPMI培地を加え、そこに4000個(図9及び10)又は3000個(図11)の細胞をまいた。さらに、細胞の形態学的状態もモニターした。
【０１６１】
これらの実験の結果は図9〜11のとおりである。線維芽細胞を種々の濃度のポリペプチド(10〜90μM)で72時間処理しても、増殖阻害効果はまったく観測されなかった(図9)。しかし、SEQ ID NO:4とSEQ ID NO:6のポリペプチドでは、またポリペプチドPCK3145  (SEQ ID NO:5)ではさらに一段と、著しい増殖阻害が観測された(図10)。OPTI-MEM培地で増殖させたPC-3細胞を対象に種々の濃度のPCK3145とポリペプチド22〜36を使用してもう1つの実験を行った。図9〜11では処理細胞の増殖阻害率を非処理対照細胞(細胞生存率100%)との比較で評価している。
【０１６２】
実施例8及び9
in vivo実験(図12及び13)
次の要領で研究MLL-1及びMLL-2を実施した: 0日目にオスのCopenhagenラットに1頭あたり5×105個のMAT-LyLu細胞を皮下注射した。これらの細胞は10% (v/v)ウシ胎仔血清添加RPMI培地で増殖させたMAT-LyLu細胞株の対数増殖期培養液に由来した。細胞は培養フラスコからトリプシン処理により回収し、1200 rpmで遠心にかけ、ハンクス液(HBSS)で3回洗った。次いで細胞を数え濃度を5×106個/ml-HBSSへと調整した。5×105個の細胞を含む腫瘍細胞接種液0.1mlを各ラットの脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞移植(すなわっち接種)3日後から13日目まで毎日、動物を所望ポリペプチドの皮下注射により処理した。
【０１６３】
図12に掲げた実験結果からヌードマウス移植MAT-LyLu (MLL)腫瘍に対するrHuPSP94の抗腫瘍効果が確認される(プロトコールはS. Garde et al., The Prostate, 22:225-233, 1993に依拠)。
研究MLL-1 (図12)では腫瘍移植ヌードマウスを群分けし群ごとに種々の量のrHuPSP94又は対照試薬を投与した。群分けの内訳は次のとおりであり、各群は8頭のマウスからなった。
【０１６４】
群1: 陰性対照−PBSを皮下注射(s.c.)
群2: 陽性対照−5mg/kgのドキソルビシンを単一ボーラスで3日目に静脈内注射(i.v.)
群3: rHuPSP94、1μg/kg/日(s.c.)
群4: rHuPSP94、10μg/kg/日(s.c.)
群5: rHuPSP94、100μg/kg/日(s.c.)
【０１６５】
接種を図解すると次のようになる[腫瘍細胞移植(T.C.I.)、処理(Tx)、計測(M)、日目(D)]:
【化９】
0004520091.tif 000013
【０１６６】
図13に掲げた実験結果から重症複合型免疫不全(SCID)マウスに移植したMAT-LyLu (MLL)腫瘍に対するrHuPSP94の抗腫瘍効果が確認される(プロトコールはS. Garde et al., The Prostate, 22:225-233, 1993に依拠)。
【０１６７】
研究MLL-2 (図13)では腫瘍移植SCIDマウスを群分けし群ごとに種々の量のrHuPSP94又は対照試薬を投与した。群分けの内訳は次のとおりであり、各群は8頭のマウスからなった。
【０１６８】
群1: 陰性対照−PBSを皮下注射(s.c.)
群2: 陽性対照−5mg/kgのドキソルビシンを単一ボーラスで3日目に静脈内注射(i.v.)
群3: rHuPSP94、1μg/kg/日(s.c.)
群4: rHuPSP94、10μg/kg/日(s.c.)
群5: rHuPSP94、100μg/kg/日(s.c.)
【０１６９】
接種を図解すると次のようになる[腫瘍細胞移植(T.C.I.)、処理(Tx)、計測(M)、日目(D)]:
【化１０】
0004520091.tif 000014
【０１７０】
両研究の結果によればヌードマウスとSCIDマウスでは腫瘍のサイズと成長に差があった。SCIDマウスのほうが腫瘍は小さく、その成長も遅い。これはこのマウス系統には腫瘍の成長を抑制する何らかの特定の因子が存在するためかもしれない。ドキソルビシン(陽性対照)を注射したマウスで有意の腫瘍減少という結果も得られた。たとえばドキソルビシンを注射したヌードマウス(研究MLL-1)の腫瘍重量の減少は48% (p=0.006)であった(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。ドキソルビシン投与SCIDマウス(研究MLL-2)の腫瘍重量の減少は82% (p=0.002)であった(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。1μg/kg/日のrHuPSP94で処理したマウスでも有意の腫瘍減少という結果が得られた。たとえば1μg/kg/日のrHuPSP94で処理したヌードマウス(研究MLL-1)の腫瘍重量の減少は26% (p=0.042)であった(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。1μg/kg/日のrHuPSP94で処理したSCIDマウス(研究MLL-2)の腫瘍重量の減少は65% (p=0.010)であった(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。
【０１７１】
実施例10
PC-3細胞株の使用によるin vivo実験(図14)
PC-3ヒト前立腺腫瘍をATCCから入手した(ATCC 1435)。PC-3細胞を10% (v/v)ウシ胎仔血清添加RPMI培地で増殖させ、対数増殖期にトリプシン処理により回収した。細胞を1200 rpmで遠心にかけ、ハンクス液(HBSS)で3回洗った。次いで細胞を数え濃度を1×107個/ml-HBSSへと調整した。1×106個の細胞を含む腫瘍細胞接種液0.1mlを各ヌードマウス(系統:Nu/Nu、BALB/c background)の両脇腹に皮下注射した。腫瘍の成長を18日間モニターした。ひとたび腫瘍の成長が確立した(腫瘍容量が50mm3に達した)ら、rHuPSP94 (SEQ ID NO:2)による処理を開始し、表4に示す処理群の割り振りに基づき皮下注射を毎日14日間にわたり実行した。
【０１７２】
【表４】
0004520091.tif 000015
【０１７３】
実験結果(図14)によれば、1μg/kg-体重/日の投与レベルでrHuPSP94により処理したマウス群では腫瘍の成長が鈍化した。これは、最高の基準として使用される化学療法薬であるドキソルビシン(投与レベル5mg/kg/日)で観測される鈍化に匹敵した。
【０１７４】
実施例11
PC-3細胞株の使用によるin vivo実験(図15〜17)
ATCCから入手したPC-3ヒト前立腺腫瘍(ATCC 1435)をヌードマウスに両側移植し、腫瘍の成長を18日間モニターした。PC-3細胞はマウスの両脇腹に1回皮下注射した。ひとたび腫瘍の成長が確立した(腫瘍容量が0.25〜0.50cm3に達した)ら、デカペプチド(SEQ ID NO:3)、天然PSP94 (SEQ ID NO:1)及び対照スクランブルド・ポリペプチドPB111による処理を開始し、表5に示す処理群の無作為割り振りに基づき皮下注射を毎日14日間にわたり実行した。
【０１７５】
【表５】
0004520091.tif 000016
【０１７６】
図15はデカペプチド(SEQ ID NO:3)で処理した腫瘍移植ヌードマウスと非処理対照に関する結果の比較である。図16はスクランブルド・ポリペプチドPB111で処理した腫瘍移植ヌードマウスと非処理対照に関する結果の比較である。図17は天然PSP94 (SEQ ID NO:1)で処理した腫瘍移植ヌードマウスと非処理対照に関する結果の比較である。実験結果(図15〜17)によれば、10μg/kg-体重/日の投与レベルでデカペプチド(SEQ ID NO:3)により処理したマウスでは腫瘍成長の有意の(p<0.05)鈍化が見られた。
【０１７７】
実施例12
ポリペプチドの調製
PCK3145 (SEQ ID NO:5)を含むPSP94由来ポリペプチド類をFMOC及びBOC固相ポリペプチド合成法(Merrifield, B., Science, 232:341-347, 1986)により合成した。ポリペプチドを同定するために質量スペクトル分析を行った。窒素レーザーの337nm光を用いるPerSeptive Biosytems (Framingham, MA) Voyager-DE MALDI-TOF質量分析計でポリペプチド・サンプルを分析した。各分析では約50回の測定を平均した。天然PSP94由来のサンプルも比較のために同様の条件下で分析した。ポリペプチドの計量にはMettler AE 163微量天秤を使用した。計測は0.1mg単位で行った。ポリペプチドは10mM PBS(pH 7.3)で還元し最終濃度を1mg/ml及び5mg/mlとした。ポリペプチドは比較的よく溶けたが、0.2μmシリンジフィルターでろ過滅菌した。2ml/試験管のアリコートとしマイナス80℃で保存した。
【０１７８】
pHの差が変動因子とはならないようにするため、ポリペプチドのpHを還元後に計測した。各溶液について3つの濃度すなわちニート、100μg/ml及び12.5μg/mlでpH値をとった。pH範囲は約7.0〜7.5であったが、このpH範囲内では細胞の生存率がきわめて高いため、これは試験結果に有意の差をもたらさなかった。濃度をモル値に変えるために、近似量の1mg/mlストックをPBS (pH 7.3)で希釈した。ストックはいずれも450μMのポリペプチド溶液を含むように調製した。ポリペプチドの新鮮ストックを還元するときはPBS (pH7.3)で直接還元した。
当初のスクリーニングとPC-3細胞に対するポリペプチドの増殖阻害活性の確認の後、優良製造規範(GMP)グレードのポリペプチドを試験した。このポリペプチドを計量し、PBSに溶解し、2mg/mlストック液を調製し、0.2μmシリンジフィルターで滅菌ろ過し、マイナス80℃で保存した。
【０１７９】
実施例13
PC-3細胞に対するPCK3145のin vitro効果(MTS試験)(図18〜21)
実施例12の要領で調製したPCK3145を、腫瘍成長阻害物質の最有力候補として評価した。
MTS/PMSキット(Promega)を用いてPCK3145の生物活性をヒト前立腺がん細胞株PC-3に対する増殖阻害効果の点から評価した。これは生細胞のミトコンドリア活性を計測する試験法である。生細胞のミトコンドリア酵素類はMTS/PMS色素を代謝させ褐色沈殿物を形成するが、該沈殿物は分光光度計で490nmの吸光により光学密度(OD)として計測しうるので、そのOD値を求めればそれに比例する生細胞数も判明する、というのがこの方法の基本原理である。
【０１８０】
加えて、細胞の目視観察も行い、細胞増殖状態の指標ともなりうる細胞の形態学的変化もモニターした。MTS試験では次の条件を採用した: PC-3細胞(ATCC, Lot AT06)、継代数n≧70; 細胞株を無血清OPTI-MEM培地及びBSA (50μg/ml)とFeSO4 (0.1μM)を含むサプリメント添加RPMI培地で増殖するよう順応させ、培地を代えずに(すなわち2倍に濃縮したPCK3145をウェルに直接添加し、それを1:2希釈して元の濃度に戻すことにより細胞の操作を最小限に抑え剥離を防ぐようにして)72時間連続PCK3145に接触させる。図18に示すように、サプリメント添加培地で増殖させたPC-3細胞(ATCC)に対するPCK3145の効果を次の濃度で評価した: 12.5、25、50、100、200、300及び400 μg/ml。MTS試験は5回反復したが、PC-3細胞の増殖に対する濃度依存性の阻害効果が一貫して再現され、最高PCK3145濃度の400μg/mlでの細胞増殖阻害は約40%であった。
【０１８１】
GMPグレードのポリペプチドを使用して、MTS試験を反復し再現性とPC-3細胞に対する細胞傷害性を確認するようにした。並行して、PC-3細胞を基準陽性対照としての天然PSP94で処理する試験及び無処理の試験(陰性対照すなわち対照)も実施した。図19は、4000個の細胞をまいてPCK3145 (GMPグレード)に48時間接触させたMTS試験の結果である。500μg/ml濃度のPCK3145で処理した後では30%の増殖阻害効果が認められた。接触時間を72時間にするとこの効果は約40%に増大した(図20)。反復試験では500μg/ml濃度の該ポリペプチドに48時間接触させても20%の増殖阻害効果にとどまったが、72時間の接触後ではそれが30%に増大した(図21)。in vitro細胞増殖状態を反映した試験ごとの変動にもかかわらず、ポリペプチドPCK3145は有意の細胞増殖阻害を示した。
【０１８２】
実施例14
PC-3細胞に対するPCK3145の効果−[3H]-チミジン取り込み試験(図22〜24)
[3H]-チミジン取り込み試験は活発に増殖する細胞の細胞DNAに[3H]-チミジンが取り込まれる現象を利用する。MTS試験では処理後の生細胞数を定量するのに対して、この試験では細胞の増殖性指数を計測する。PCK3145とPSP94のアミノ基及びカルボキシル基末端に由来する他の2合成ポリペプチド(それぞれSEQ ID NO:4及びSEQ ID NO:6)、それに天然PSP94に匹敵する生物活性を有することを既に示したデカペプチド(SEQ ID NO:3)について、PC-3細胞を対象とする[3H]-チミジン取り込み試験でその抗増殖効果を評価した。GMPグレードのPCK3145で2件の別個の実験を行った。
【０１８３】
図22と23に示すように、ポリペプチドPCK3145は[3H]-チミジン取り込み率として表わされる有意の増殖阻害活性を示した。第1実験では200μg/mlのPCK3145濃度で40%近い[3H]-チミジン取り込みの低下が観測された。第2実験では濃度を2倍に高めた(すなわち400μg/ml) PCK3145の使用にもかかわらず、25%の阻害が観測されたにすぎない。試験ごとの変動はあるものの、PC-3細胞に対するGMPグレード品の総合的な増殖阻害効果は顕著であった。基準陽性対照として使用した天然PSP94によるPC-3細胞の処理では有意の濃度依存性の細胞増殖阻害効果が認められ、[3H]-チミジン取り込み量は72時間接触後でほぼ50%低下した(図24)。
【０１８４】
実施例15
PC-3細胞に対するPCK3145のin vitro効果(アポトーシス検出、図25)
濃度500μg/mlのPCK3145に72時間接触させた後のPC-3細胞のアポトーシスをサプリメント添加培地中でDNA断片化検出法により評価した。基準陽性対照としてドキソルビシンを使用した。非処理細胞とPCK3145処理細胞を回収しDNAを単離した。単離DNAを臭化エチジウム(EtBr)添加1.2%アガロースゲル上で電気泳動にかけた。図25に示すように、ポリペプチドPCK3145によるPC-3細胞の処理はDNAの断片化を招き、断片化DNAに特有のラダー形成によりそれが裏付けられた。図25に示したゲルのレーン1はDNAマーカー(200bpのDNAラダー)である。レーン2は対照の非処理PC-3細胞である。レーン3は濃度2μg/mlのドキソルビシンで処理した細胞で観測されたDNAラダー化である。レーン4はPCK3145 (SEQ ID NO:5)で処理した細胞で観測されたDNAラダー化である。
【０１８５】
実施例16
ヒトPC-3前立腺がん細胞株を使用したin vivo実験(図26〜27)
実験研究PC3-6とPC3-12 (図26〜27)は連続した群試験であり、その目的はヒトPC-3前立腺がんのヌードマウス異種移植モデルでPCK3145のin vivo活性を評価し、また投与量、経路及び計画と抗腫瘍効果パラメーター(容量)との関係を解明することである。
【０１８６】
対数増殖期の半ばに回収したPC-3細胞5×106個/マウスをマウスの背中に皮下注射で接種した。この接種液から成長した腫瘍を移植後(p.t.i.)約32〜35日目に、腫瘍容量が200〜300mm3に達した時点で摘出した。壊死組織を除去し、生存腫瘍塊を小片(約1〜3mm3)に切り刻んでマウスの両脇腹に皮下注射で移植した。種々の濃度のPCK3145による処理を腫瘍移植後(p.t.i.)3日目に開始し、21日間続行した。皮下注射は腫瘍成長部位の下から行った。腹腔内注射は腹部から行った。静脈内注射は尾部支脈から行った。実験は最終処理の24時間後に終了した。腫瘍の計測は、腫瘍移植後(p.t.i.) 11、14、16、18、20、22及び24日目に行った。腫瘍容量の計算は公式(a×b2×0.5)に従った(ただしaは長径であり、bはそれと直交する短径である)。
【０１８７】
研究PC3-6では、PC-3移植ヌードマウスにおける皮下注射PCK3145の腫瘍増殖抑制効果が明らかである。マウスを群分けし各群に種々の量のPCK3145 (SEQ ID NO:5)又は対照試薬を投与した。実験に使用したマウス群の内訳は表6のとおりである。各群は10頭のマウスからなった。ドキソルビシンは腫瘍移植後(p.t.i) 3日目と11日目に単一ボーラス静脈内注射で投与した。
【０１８８】
【表６】
0004520091.tif 000017
【０１８９】
この研究の結果(図26)によれば、PCK3145、10μg/kg/日による処理後のPC-3細胞増殖に有意の鈍化が見られるのは明らかである。この抗腫瘍効果は対照PBS処理群と比較した場合の、腫瘍移植後11、14、16、18、21及び24日目に観測された統計的に有意の腫瘍成長率低下からも裏付けられた(p値はそれぞれ0.001〜0.002であり、カットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。強力な化学療法薬であるドキソルビシンは基準対照として使用したが、有意性の高い抗腫瘍治療効果を示した。観測抗腫瘍効果の統計的有意性はデータのANOVA(分散分析)、ダネット検定、クラスカル-ワリス検定及びダン検定でも確認された。
【０１９０】
研究PC3-12では、PC-3移植ヌードマウスにおける皮下注射PCK3145の腫瘍成長抑制効果が明らかである。マウスを群分けし各群に種々の量のPCK3145 (SEQ ID NO:5)又は対照試薬を投与した。実験に使用したマウス群の内訳は表7のとおりである。各群は9頭のマウスからなった。
【０１９１】
【表７】
0004520091.tif 000018
【０１９２】
実験結果(図27)によれば、PCK3145の100μg/kg/日静脈内注射で処理した後のPC-3細胞の増殖にかなりの鈍化が見られるのは明らかである。この抗腫瘍効果はステューデントt検定で比較すると腫瘍移植後13、17及び20日目に統計的に有意であった(各時点のp値はそれぞれ0.005、0.025及び0.011であり、カットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。PCK3145の他の投与レベル(10、500及び1000μg/kg/日)の静脈内注射で処理した後には有意の抗腫瘍効果が観測されなかった。しかし、500及び1000μg/kg/日のPCK3145投与による処理後には有意性への傾向が観測された。PCK3145の100及び1000μg/kg/日腹腔内注射によるマウスの処理では似たような腫瘍抑制傾向が見られたが、最高投与レベルの1000μg/kg/日では腫瘍移植後13日目に観測された差異の統計的有意性は低かった(p=0.056)(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)(図27)。
【０１９３】
ヒトPC-3腫瘍細胞のヌードマウス異種移植モデルによる実験で得られた結果は、少なくとも採用した試験条件(試験したPCK3145投与レベル: 10μg/kg/日及び100μg/kg/日)ではマウスの腫瘍部位から離れた部位(すなわち首筋)へのPCK3145の皮下注射が有効ではない可能性があり、従って抗腫瘍効果をもたらす見込みが薄いことを示唆した。皮下注射部位としての首筋は治療薬投与ではなく免疫応答誘発にとっての最適の部位であって、抗腫瘍効果の評価ではこの部位の選択は次善の選択であると見られる。
【０１９４】
実施例17
DunningラットMAT-LyLu前立腺がん細胞株を使用したin vivo実験(図28〜30)
Copenhagenラットに移植したMAT-LyLu (MLL)腫瘍に対するPCK3145の抗腫瘍効果の確認を行った(プロトコールはS. Garde et al., The Prostate, 22:225-233, 1993に依拠)。MAT-LyLu腫瘍細胞を培養フラスコから対数増殖期の半ばにトリプシン処理により回収し、1200 rpmで遠心にかけ、ハンクス液(HBSS)で3回洗った。次いで細胞を数え濃度を5×106個/ml-HBSSへと調整した。5×105個の細胞を含む腫瘍細胞接種液0.1mlを各ラットの脇腹に皮下注射した。腫瘍移植後(p.t.i)3日目に、種々の濃度のPCK3145の局所(すなわち背部の腫瘍移植部位のすぐ下の剃毛部)皮下注射による処理を開始し、16日間にわたり毎日実行した。実験は最終処理の24時間後に終了した。腫瘍の計測は7、9、11、14、16及び18日目に行った。腫瘍容量の計算は公式(a×b2×0.5)に従った(ただしaは長径であり、bはそれと直交する短径である)。19日目に個別ラットの腫瘍を摘出し計量した。
【０１９５】
研究MLL-5では、MAT-LyLu移植CopenhagenラットにおけるPCK3145 (SEQ ID NO:5)の、ポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)及びポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)との比較で見た腫瘍増殖抑制効果が明らかである。ラットを群分けし各群に種々の量のPCK3145 (SEQ ID NO:5)又は対照試薬を皮下注射で投与した。実験に使用したラット群の内訳は表8のとおりである。各群は8頭のラットからなった。
【０１９６】
【表８】
0004520091.tif 000019
【０１９７】
研究結果(図28)によれば、PCK3145の10μg/kg/日投与後のかなりの抗腫瘍効果が明らかである。この抗腫瘍効果は対照PBS処理群と比較した場合の腫瘍移植後11、13、16及び18日目の有意の腫瘍容量減少からも裏付けられた(p値はそれぞれ0.006、0.00001、0.002及び0.004であり、カットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。PCK3145の1μg/kg/日投与後は有意の効果が検出されなかった。興味深いことにアミノ基末端ポリペプチド7〜21もまたPC-3ヌードマウス異種移植モデルの場合と同様に同等の抗腫瘍効果を示したが、それは活性部位がPSP94タンパク質のN末端基領域と中央領域に重なっているという可能性を示唆する。これはポリペプチド7〜21で処理したラットで13、16及び18日目に観測された有意の腫瘍容量減少により裏付けられた(p値はそれぞれ0.05、0.00005及び0.01であり、カットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。
【０１９８】
研究MLL-6では、MAT-LyLu移植CopenhagenラットにおけるPCK3145 (SEQ ID NO:5)の腫瘍増殖抑制効果が明らかである。ラットを群分けし各群に種々の量のPCK3145 (SEQ ID NO:5)又は対照試薬を皮下注射で投与した。実験に使用したラット群の内訳は表9のとおりである。各群は8頭のラットからなった。ドキソルビシンはp.t.i. 3日目に単一ボーラスとして静脈内注射で投与した。
【０１９９】
【表９】
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【０２００】
その研究結果(図29と30)によれば、PCK3145 (SEQ ID NO:5)を10及び100μg/kg/日投与した後の投与量依存性の有意の抗腫瘍効果は明らかである。この抗腫瘍効果は腫瘍移植後14、16及び18日目の、特に100μg/kg/日PCK3145による処理後の有意の腫瘍容量減少(対照比で31%)からも裏付けられた(図29)。陰性対照(すなわちスクランブルド・ポリペプチドPB111)処理群と対比した有意水準はp=0.0000062できわめて高かった(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。スクランブルド・ポリペプチドによる投与レベル100μg/kg/日での処理後にも中程度(対照PBS処理群と対比した有意水準がp=0.03で、ぎりぎりの統計的有意性)の成長抑制が観測された(図29) (p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。ドキソルビシン処理は80%余りの腫瘍容量の減少をもたらし、高い有意性を示した。PCK3145の投与レベル100μg/kg/日でのこうした抗腫瘍効果は腫瘍重量データの分析からも確認された。図30 (腫瘍重量データ)に示すように、p.t.i. 8日目に腫瘍重量の有意(p=0.0003)の減少が観測された(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。これは対照群(56.6g)とPCK3145 (100μg/kg/日)処理群(37.2g)の間の20グラムの差を表わし、腫瘍重量の34%の減少に相当した。この腫瘍重量差もまた、同じ投与レベル(100μg/kg/日)での対照スクランブルド・ポリペプチド処理ラットの腫瘍重量と比較すると統計的に有意(p=0.003)であった(p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。スクランブルド・ポリペプチド腫瘍重量と対照PBS処理腫瘍重量との差は統計的に有意でなかった(p=0.06) (p値はカットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)。
【０２０１】
実施例18
PCK3145+タキソテール併用治療の効果
併用治療の腫瘍抑制効果を検定するために、予めPC-3腫瘍細胞を接種しておいたヌードマウスにPCK3145とタキソテール(すなわちドセタキセル)を同時投与した。マウスは群分けして、各群にPCK3145を単独で、又はタキソテールと組み合せて(別個の経路で)、又は対照試薬(すなわちPBS)を投与するようにした。この実験では比較的大きな全身腫瘍組織量に対して併用治療を適用した。腫瘍を、PCK3145治療が通常は無効となるような50〜60mm3サイズまで成長させた。PCK3145は50〜60mm3サイズの皮下腫瘍が明白になった1日目から28日間にわたり隔日で皮下注射した。タキソテールは皮下腫瘍が明白になった後の4日目と11日目に部分最適量の2mg/kgを腹腔内注射した。この実験に使用したマウス群の内訳は表11のとおりである。各群は11頭のマウスからなった。
【０２０２】
【表１０】
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【０２０３】
実験結果(図31)によれば、PCK3145とタキソテールの併用治療後の有意の(かなりの)腫瘍抑制効果が明らかである。この効果は腫瘍細胞接種後の19日目と22日目にステューデントのt検定で比較すると統計的に有意であり(p値はそれぞれ0.02及び0.047であり、カットオフ限界をp<0.05とし、対応のないステューデントのt検定により求めた)、またタキソテールだけを2mg/kg(部分最適量)の同じ投与レベルで投与した場合よりも顕著であった。
【０２０４】
本明細書で引用した諸々の刊行物及び特許出願は、たとえ各個別刊行物又は特許出願について明示かつ個別にその旨が表示されていなくても、本書に採用される。任意の刊行物の引用は本出願日前にそれが公開されていたという事実の反映であって、本発明がそうした刊行物に対して優先権を主張する資格を欠くことを認めるという意味ではない。
以上、本発明についての理解を深めるために例証や実施例をもって詳しく説明したが、当業者には本発明の教示に照らして、請求項の本質又は範囲から逸脱することなくある種の変更や修正を加えうることは自明であろう。
【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
0004520091.tif 000029
【化１９】
0004520091.tif 000030
【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
0004520091.tif 000042
【化３２】
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【化３３】
0004520091.tif 000044
【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図1はポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)の質量スペクトルである。
【図２】  図2はポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)の質量スペクトルである。
【図３】  図3はポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)の質量スペクトルである。
【図４ａ】  図4aは培養9日後のPC-3細胞に対するデカペプチド(SEQ ID NO:3)のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図４ｂ】  図4bは培養9日後のPC-3細胞に対する天然PSP94 (nPSP94)のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図５ａ】  図5aは培養21日後のPC-3細胞に対するデカペプチド(SEQ ID NO:3)のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図５ｂ】  図5bは培養21日後のPC-3細胞に対する天然PSP94 (nPSP94)のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図６ａ】  図6aは培養10日後のPC-3細胞に対するデカペプチド(SEQ ID NO:3)のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図６ｂ】  図6bは培養10日後のPC-3細胞に対する天然PSP94 (nPSP94)のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図７】  図7はポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)でPC-3細胞を処理した後のDNA断片化を示すゲル電気泳動パターンである。
【図８】  図8は、種々の濃度のポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)、ポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)、ポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)又は天然PSP94 (nPSP94)(SEQ ID NO:1)によりPC-3細胞をポリペプチド処理した後の、ELISA plusキットによるアポトーシス検出の結果を示すグラフである。
【図９】  図9は、種々の濃度の天然PSP94 (nPSP94)(SEQ ID NO:1)もしくは種々の濃度のrHuPSP94 (SEQ ID NO:2)又はポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)、ポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)、ポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)に72時間接触させた後の線維芽細胞in vitro増殖を示すグラフである。
【図１０】  図10はポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)、ポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)、ポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)及びポリペプチド61〜75の、PC-3細胞in vitro増殖に対する72時間後の効果を示すグラフである。
【図１１】  図11はポリペプチド22〜36及びポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)の、PC-3細胞のin vitro増殖に対する72時間後の効果を示すグラフである。
【図１２】  図12はヌードマウスに移植したMAT-LyLu (MLL)腫瘍に対するrHuPSP94 (SEQ ID NO:2)の抗腫瘍効果の確認に関する研究No. MLL-1の結果を示すグラフである。
【図１３】  図13はヌードマウスに移植したMAT-LyLu (MLL)腫瘍に対するrHuPSP94 (SEQ ID NO:2)の抗腫瘍効果の確認に関する研究No. MLL-2の結果を示すグラフである。
【図１４】  図14はrHuPSP94で処理したヌードマウスの腫瘍容量(腫瘍の成長鈍化)を示すグラフである。
【図１５】  図15はデカペプチド(SEQ ID NO:3) で処理したヌードマウスの腫瘍容量(腫瘍の成長鈍化)を示すグラフである。
【図１６】  図16は対照スクランブルド・ポリペプチド(PB111)で処理したマウスの腫瘍容量(腫瘍の成長鈍化)を示すグラフである。
【図１７】  図17は天然PSP94 (nPSP94)で処理したマウスの腫瘍容量(腫瘍の成長鈍化)を示すグラフである。
【図１８】  図18は、MTS [3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、分子内塩]試験で計測した、PCK3145 (SEQ ID NO: 5)のPC-3細胞に対する72時間処理後のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図１９】  図19はMTS試験で計測した、天然PSP94 (nPSP94)(SEQ ID NO:1)及びPCK3145 (SEQ ID NO:5)(GMP―優良製造規範―グレード)のPC-3細胞に対する48時間処理後のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図２０】  図20はMTS試験で計測した、PCK3145 (SEQ ID NO:5)(GMPグレード)のPC-3細胞(ATCC)に対する72時間処理後のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図２１】  図21はMTS試験で計測した、PCK3145 (SEQ ID NO:5)(GMPグレード)のPC-3細胞(ATCC)に対する48時間又は72時間処理後のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図２２】  図22は[3H]-チミジン取り込み試験で計測した、デカペプチド(SEQID NO:3)、ポリペプチド7〜21(SEQ ID NO:4)、ポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)又はポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)のPC-3細胞に対するin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図２３】  図23は[3H]-チミジン取り込み試験で計測した、デカペプチド(SEQID NO:3)、ポリペプチド7〜21(SEQ ID NO:4)、ポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)又はポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)のPC-3細胞に対するin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図２４】  図24は[3H]-チミジン取り込み試験で計測した、PC-3細胞に対する72時間処理後の天然PSP94 (nPSP94)のin vitro阻害活性を示すグラフである。
【図２５】  図25はポリペプチドPCK3145 (SEQ ID NO:5)又はドキソルビシンでPC-3細胞を処理した後のDNA断片化を示すゲル電気泳動パターンである。
【図２６】  図26はヌードマウスに異種移植したヒトPC-3腫瘍に対するPCK3145 (SEQ ID NO:5)(0.1μg/kg/日及び10μg/kg/日)のin vivo阻害活性を示すグラフである。
【図２７】  図27はヌードマウスに異種移植したヒトPC-3腫瘍に対するPCK3145 (SEQ ID NO:5)(10μg/kg/日〜1000 μg/kg/日、静脈内又は腹腔内投与)のin vivo阻害活性を示すグラフである。
【図２８】  図28はDunning MAT-LyLu腫瘍を移植したCopenhagenラットに対するポリペプチド7〜21 (SEQ ID NO:4)、PCK3145 (SEQ ID NO:5)又はポリペプチド76〜94 (SEQ ID NO:6)(用量1μg/kg/日又は10μg/kg/日)のin vivo阻害活性を示すグラフである。
【図２９】  図29はDunning MAT-LyLu腫瘍を移植したCopenhagenラットに対するPCK3145 (SEQ ID NO:5)又はスクランブルド・ポリペプチド(用量10μg/kg/日又は100μg/kg/日)のin vivo阻害活性を示すグラフである。
【図３０】  図30はDunning MAT-LyLu腫瘍を移植したCopenhagenラットをPCK3145 (SEQ ID NO:5)又はスクランブルドポリペプチドで処置(用量10μg/kg/日又は100μg/kg/日)した後18日目の腫瘍重量を示すグラフである。
【図３１】  図31はPC-3腫瘍細胞を移植したヌードマウスに対するPCK3145とタキソテール(すなわちドセタキセル)の併用治療の腫瘍増殖抑制効果を示すグラフである。
【配列表】
0004520091.tif 000057
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【図１】
0004520091.tif 000081
【図２】
0004520091.tif 000082
【図３】
0004520091.tif 000083
【図４ａ】
0004520091.tif 000084
【図４ｂ】
0004520091.tif 000085
【図５ａ】
0004520091.tif 000086
【図５ｂ】
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【図６ａ】
0004520091.tif 000088
【図６ｂ】
0004520091.tif 000089
【図７】
0004520091.tif 000090
【図８】
0004520091.tif 000091
【図９】
0004520091.tif 000092
【図１０】
0004520091.tif 000093
【図１１】
0004520091.tif 000094
【図１２】
0004520091.tif 000095
【図１３】
0004520091.tif 000096
【図１４】
0004520091.tif 000097
【図１５】
0004520091.tif 000098
【図１６】
0004520091.tif 000099
【図１７】
0004520091.tif 000100
【図１８】
0004520091.tif 000101
【図１９】
0004520091.tif 000102
【図２０】
0004520091.tif 000103
【図２１】
0004520091.tif 000104
【図２２】
0004520091.tif 000105
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0004520091.tif 000109
【図２７】
0004520091.tif 000110
【図２８】
0004520091.tif 000111
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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