(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．５〜２ｍＭ／ｌのＥＤＴＡ、２〜５ｗｔ％のメタノール、及び１０〜４０ｗｔ％のグリセリンを含む水溶液からなる生体試料の保存液。
【請求項２】
ａ）液性生体試料と混合して後冷却保存するため前記試料の１〜５倍量を用意すべき前記保存液と、
ｂ）グリセリン水溶液からなる灌流液を前記保存液と混合した液性生体試料中に浸漬した透析膜チューブ内で灌流させ、分子量２０〜５０ｋＤ以上の物質の通過を阻止すると共に、回収液のグリセリン濃度目標値を１０〜２０ｗｔ％としたマイクロダイアリシス処理を行う装置と、
ｃ）前記マイクロダイアリシス処理による回収液から低分子ＤＮＡ関連物質を分離するためのカラムを有する高速液体クロマトグラフと、
ｄ）前記カラムの溶出流を紫外線吸収分析してＤＮＡ核酸量を測定するための紫外線吸収分析装置と、
ｅ）前記カラムの溶出流を電気化学的に検出することによりＤＮＡ酸化損傷物の量を測定するための電気化学検出器とを備え、
ｆ）測定されたＤＮＡ核酸量とＤＮＡ酸化損傷物の量との比率から生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標を求めること、を特徴とする請求項１記載の保存液を用いたＤＮＡ酸化損傷指標の測定システム。
【請求項３】
ａ）細胞成分を含んだ生体試料とその１〜５倍量の前記保存液とを密封し且つ冷却保存するための組織細胞破砕用チューブと、
ｂ）この密封・冷却後のチューブ内の生体試料中に含有する組織を破砕することにより細胞内外の遊離核酸を保存液中に溶出させると共に、その破砕試料から固形物を分離・沈降させるための細胞破砕及び固形物分離装置と、
ｃ）グリセリン水溶液からなる灌流液を前記保存液と混合した液性生体試料中に浸漬した透析膜チューブ内で灌流させ、分子量２０〜５０ｋＤ以上の物質の通過を阻止すると共に、回収液のグリセリン濃度目標値を１０〜２０ｗｔ％としたマイクロダイアリシス処理を行う装置と、
ｄ）前記マイクロダイアリシス処理による回収液から低分子ＤＮＡ関連物質を分離するた
めのカラムを有する高速液体クロマトグラフと、
ｅ）前記カラムの溶出流を紫外線吸収分析してＤＮＡ核酸量を測定するための紫外線吸収分析装置と、
ｆ）前記カラムの溶出流を電気化学的に検出することによりＤＮＡ酸化損傷物の量を測定するための電気化学検出器とを備え、
ｇ）測定されたＤＮＡ核酸量とＤＮＡ酸化損傷物の量との比率から生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標を求めること、を特徴とする請求項１記載の保存液を用いたＤＮＡ酸化損傷指標の測定システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標の簡易高感度測定システムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
総ての遺伝子（ＤＮＡ）情報は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の塩基対により暗号化されている。このＤＮＡ情報は、紫外線照射やＤＮＡの複製エラー、又は各種の発癌物質や活性酸素種の暴露等により一定頻度で損傷を受け、究極的にはこの遺伝子情報の欠失、組み換え又は変異等が生じ、その細胞や個体の死滅や、逆に新たな生物種の誕生の引き金となる。従って、ＤＮＡ情報がどの程度の頻度で損傷を受けているか定量することは、その個体の生命力（生存能力及び生殖能力）を推し量るうえで大変有力な情報となる。
【０００３】
この観点から、ＤＮＡの酸化に着目すると、プリン核をもったＤＮＡ（モノヌクレオシド）である２’‐デオキシグアノシン（ｄＧ）や２’‐デオキシアデノシン(dA)は、活性酸素種であるヒドロキシラジカル（ *ＯＨ）と結合して８‐ヒドロキシ‐２’‐デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ) や、２‐ヒドロキシ‐２’‐デオキシアデノシン（２ＯＨｄＡ) となって、（ｄＧ）や（ｄＡ）と置き換わり、本来Ｇ：ＣであるべきＤＮＡの塩基対がＴ：Ａに、Ａ：ＴがＧ：Ｃにそれぞれ変換してしまうことになる。このようなＤＮＡレベルでの遺伝子情報の書換え発生の頻度は、近年の医学界において、各種疾患の病態と相関する有力な情報として注目されている。
【０００４】
従来、白血球、実質臓器又は浮遊細胞溶液などの生体試料から、上記のような酸化ＤＮＡ物質の一つである８‐ヒドロキシ‐２’‐デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ) を測定する方法としては、これらの細胞成分から核ＤＮＡを抽出し種々の酵素処理の後、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に通じて溶離液を電気化学検出器に流し、モノヌクレオシドの形で測定するのが一般的である。この方法によれば、測定感度１０ｐｇ／ｍｌ程度で核ＤＮＡそのものの酸化的損傷を評価できるが、酸やアルカリ処理、酵素反応等のステップがあって操作が煩雑であり、これらの前処理操作による二次的なＤＮＡの酸化が避けがたく、実際には限られた施設でしか実施できない。
【０００５】
同じく８ＯＨｄＧを、それが大量に含まれる尿から測定する場合にも、除蛋白処理後、同様にＨＰＬＣと電気化学検出器に通す方法が用いられるが、尿自体が極めて酸化しやすい生体試料であるため、如何にして酸化を予防した条件で除蛋白をするかが最大の難関となっている。
【０００６】
最近、用いられつつある８ＯＨｄＧの定量法として、モノクローナル抗体を使った酵素抗体法がある。この方法はＨＰＬＣと電気化学検出器による方法と異なり、モノヌクレオシドの状態でなくても検出できるという特徴があるが、８ＯＨｄＧ以外にも交差反応すること、及び検出感度が１ｎｇ／ｍｌ程度と低いことが欠点であり、一般化するには未解決の問題が多い。
【０００７】
一方、生体試料中のモノヌクレオシド自体は、その核ＤＮＡ内の絶対量が８ＯＨｄＧ等の酸化物の約１０，０００〜１００，０００倍と比較的多量に存在しているため検出は比較的容易であり、その化学構造の特徴から一般的な検出方法としてＵＶ検出器が有効に用いられている。但し、測定検体の前処理は電気化学検出器を使った８ＯＨｄＧ測定の場合と同じであり、基本的に同様の問題点を抱えている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、広くは上記のような酸化ＤＮＡ物質、即ち８‐ヒドロキシ‐２’‐デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ) や、２‐ヒドロキシ‐２’‐デオキシアデノシン（２ＯＨｄＡ）の量を、その生体試料中の核ＤＮＡ量とともに簡便な方法で再現性よく、比較的正確に定量することにより、生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標を確実に測定しようとするものである。
【０００９】
本発明の具体的課題は、第一に生体サンプル中のＤＮＡの酸化損傷を防ぐことができる保存液を得ることである。
【００１０】
本発明の第二の課題は、生体サンプルからの効率的なＤＮＡ核酸の抽出システムを提供することである。
【００１１】
本発明の第三の課題は、ＤＮＡ由来のモノヌクレオシド及びその酸化物の同時測定システムを提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達するため、本発明は、０．５〜２ｍＭ／ｌのＥＤＴＡ、２〜５ｗｔ％のメタノール、及び１０〜４０ｗｔ％のグリセリンを含む水溶液からなる生体試料の保存液を構成したものである。
【００１３】
本発明の上記保存液によれば、特にｄＧ（デオキシグアノシン）から８ＯＨｄＧが誘導されることを特異的に防止する。これは第１に陽イオンのキレート剤であるＥＤＴＡが、カルシウムをキレート化して生体反応や酵素反応を効率的に停止し、第２に抗酸化剤であるメタノールがヒドロキシラジカルの産生・遊離を予防し、更に第３の要因としてグリセリン溶液が、アルコール基（ＯＨ基）による酸化防止効果を有するとともに、検体を−２０〜４℃において安定的に保存する不凍液として作用するからである。グリセリンはまた、蛋白分解を阻止すると共に酵素反応の抑制効果をも有する。
【００１４】
上記保存液の有効性を確認するため、本発明者は、（１）各１７０μｇ／ｌ用意された各種保存液成分（候補）に、酸化剤（ＫＢｒＯ3 、５０ｍｇ／ｍｌ溶液）を各２０μｌ添加・混合し、（２）この混合液に市販のｄＧ標準溶液（２’‐デオキシグアノシン、４００μｇ／ｌ）を、それぞれ１０μｌずつ添加して検体を調製し、（３）３０分経過後に各検体５０μｌを等量（５０μｌ）の２０％グリセリン水溶液と混和し、（４）この混和液を後述する本発明の８ＯＨｄＧ／ｄＧ同時測定システムで測定することにより、各検体の酸化状態（８ＯＨｄＧの増加）を調べ、その結果を表１に纏めたものである。なお、酸化剤としてＫＢｒＯ3 を採用したのは、この物質がパンの漂白剤や防腐剤のような食品添加物として一般に用いられるものだからである。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
表１の第１行目には、前記（１）で得られる混合液の代わりに純水を用い「超純水検体」とした場合のデータを挙げ、第２行目には保存液成分の代わりに純水を用い、酸化剤（ＫＢｒＯ3 ）は規定通り含む混合液を用いた場合のデータを挙げたものである。表１から明らかな通り、超純水検体のｄＧ濃度は１．０３００Ｖｓ（紫外線吸光検出器の出力で標示したもの。この時の溶解した標準ｄＧ濃度は１０μｇ／ｍｌである。）、その調製・測定段階において既に存在する８ＯＨｄＧ濃度は０．２７１０ｍＶｓ（電気化学検出器の出力で標示したもの。濃度５ｎｇ／ｍｌの標準８ＯＨｄＧの出力は７．０ｍＶｓに相当する。）であり、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比は０．２６３×１０-3であった。次に純水／酸化剤検体において３０分経過すると８ＯＨｄＧ濃度は３．７７９ｍＶｓであり、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比は３．５４２×１０-3と超純水検体の場合の１３．４７倍となる。以下、各種保存液成分の効果を検討するのに、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比を用いるのは、各測定時において８ＯＨｄＧとｄＧ測定値の双方に同傾向で現れるべき被検溶液の濃度や容量のばらつきがデータに与える影響を軽減するためである。
【００１７】
保存液成分として陽イオンキレート剤であるＥＤＴＡ／４Ｎａ（測定時濃度：１ｍＭ／ｌ）を用いたものは、同様の酸化条件で８ＯＨｄＧ／ｄＧ比が１．１０１×１０-3と超純水検体の場合の４．１９倍に抑えられ、グリセリン（測定時濃度：１０ｗｔ％）を用いたものは、同酸化条件で同比１．５０６×１０-3と超純水検体の場合の５．７３倍に抑えられた。また抗酸化剤であるメタノール（測定時濃度：１ｗｔ％及び５ｗｔ％）を用いた２例では、それぞれ同酸化条件で同比２．７７１×１０-3及び２．２３８×１０-3となり、を１ｗｔ％及び５ｗｔ％添加した各場合に同様の酸化条件を適用した時も、それぞれ２．７７１×１０-3及び２．２３８×１０-3となり、それぞれ超純水検体の場合の１３．４７倍よりは低い１０．５４倍及び８．５１倍に抑えられた。
【００１８】
上述した保存液成分としてのＥＤＴＡ／４Ｎａ、グリセリン、及びメタノールの三要素以外に、それぞれラフィノース及びグルコースを用いた各２例を表１に示した。ラフィノースは甜菜（三糖類）の一種で、その物理・化学的な安定性から、精子保存液や臓器保存液に添加される組織安定化剤として用いられている。一方、グルコースは最も一般的な六単糖であると同時に、生体内に最も大量に存在する強力な抗酸化物質であることが知られている（二木他編、「抗酸化物質」、学会出版センター、１９９４年）。しかしながら表１からも明らかな通り、いずれも８ＯＨｄＧ／ｄＧ比が超純水の場合と比較して約１０〜１２倍程度と比較的大きく、本発明の保存液成分としては適さない。
【００１９】
その他、生体試料に対して抗酸化性を発揮する代表的な物質として、ＶＣ（アスコルビン酸）やＮａＮ3(アジ化ナトリウム）がある。しかしながら、ＶＣはそれ自体の極めて強力な抗酸化性（還元性）にも係わらず、陽金属イオンの存在下では逆に強力な酸化剤となり、実際、空気に触れた状態でｄＧ溶液に添加して長期保存すると、８ＯＨｄＧを大量に誘導することを確認している。またアジ化ナトリウムは、核酸の成分や各種酵素の保存液（安定化剤）として多用されているものであるが、これも化学反応性が強く、空気中やサンプル中の酸素と反応して大量の窒素酸化物を誘導することを確認している。
【００２０】
これらに対し、グリセリン、メタノール、及びＥＤＴＡは極めて安定な化学物質であり、微生物の繁殖も誘導せず、表１について説明したとおり、グルコースやラフィノースを凌駕する抗酸化能データを得たものである。
【００２１】
そこで、好ましい結果を得た上述の三要素の相乗効果を期待して調製された保存液、Ｎｏ．１０（測定時濃度：グリセリンが１０ｗｔ％、メタノールが２．５ｗｔ％、及びＥＤＴＡ／４Ｎａが１ｍＭ／ｌからなる混和物ＮＯ．１０）を用いたものは、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比が０．９２４、その対初期値倍率は３．５１となり、ｄＧの酸化が大幅に抑制されたことが分かる。従ってこのＮｏ．１０混和物の成分（上記三要素）こそは、本発明の保存液の成分として相応しいものであり、上記の配合比は液体クロマトグラフから始まる測定系に供されるべき、各好ましい成分濃度を与えるものである。
【００２２】
結局、保存液の成分配合比は、後述のダイアリシス除蛋白処理の灌流液として、典型的には２０ｗｔ％グリセリン水溶液を用いることにより変化する各成分の測定時濃度を、上記Ｎｏ．１０検体の値（但し、測定時グリセリン濃度は、この検体の１０ｗｔ％から４０ｗｔ％程度にまで高くなってもよいが、測定直前の除蛋白処理の精度との関連で上限は２０ｗｔ％程度が限度となる。）に近づけるように、前述の如くＥＤＴＡが０．５〜２ｍＭ／ｌ、メタノールが２〜５ｗｔ％、そしてグリセリンが１０〜４０ｗｔ％と定められたものである。
【００２３】
更に、表１において検体条件Ｎｏ．１１〜１７は、ｄＧ標準溶液を添加すべき混合液中の保存液成分の代わりに純水を用い、酸化剤（ＫＢｒＯ3 ）の濃度を３段階に変えた各場合の、時間経過に伴う検体酸化状態を示すものである。Ｎｏ．１１、１２は、測定時において第２行目データと同じ酸化剤濃度（ＫＢｒＯ3 １０ｍｇ／ｍｌ）を有するものであり、その１５分経過の８ＯＨｄＧ濃度３．９９１と、６０分経過の８ＯＨｄＧ濃度３．６７７は、第２行目データ（３０分）の８ＯＨｄＧ濃度３．７７９に近い値である。これらの値は、いずれもＫＢｒＯ3 濃度が１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌの場合における約０．７〜０．８程度及び０．２程度に比して極めて高く、ｄＧに保存液なしで酸化剤（ＫＢｒＯ3 ）を添加したときは、その添加量に応じて酸化されることをよく示している。
【００２４】
この結果からわかることは、（１）ＫＢｒＯ3 の濃度依存的にｄＧからの８ＯＨｄＧの誘導が見られ、（２）１５分と６０分とではその誘導量に実質的な差はないため、ＫＢｒＯ3 による酸化反応は速やかに生じた後に安定化すると考えられる。従って本発明の測定システムにより、ＫＢｒＯ3 を始め、日常的に経口摂取している各種の食品添加物のＤＮＡ酸化機能を明確に把握することが可能であり、その許容濃度の再検討に役立てることができる。
【００２５】
本発明はまた、ａ）液性生体試料と混合して後冷却保存するため前記試料の１〜５倍量を用意すべき前記保存液と、
ｂ）グリセリン水溶液からなる灌流液を前記保存液と混合した液性生体試料中に浸漬した透析膜チューブ内で灌流させ、分子量２０〜５０ｋＤ以上の物質の通過を阻止すると共に、回収液のグリセリン濃度目標値を１０〜２０ｗｔ％としたマイクロダイアリシス処理を行う装置と、
ｃ）前記マイクロダイアリシス処理による回収液から低分子ＤＮＡ関連物質を分離するためのカラムを有する高速液体クロマトグラフと、
ｄ）前記カラムの溶出流を紫外線吸収分析してＤＮＡ核酸量を測定するための紫外線吸収分析装置と、
ｅ）前記カラムの溶出流を電気化学的に検出することによりＤＮＡ酸化損傷物の量を測定するための電気化学検出器とを備え、
ｆ）測定されたＤＮＡ核酸量とＤＮＡ酸化損傷物の量との比率から生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標を求めること、を特徴とする前記保存液を用いたＤＮＡ酸化損傷指標の測定システムを構成したものである。
【００２６】
本発明は更に、ａ）細胞成分を含んだ生体試料とその１〜５倍量の前記保存液とを密封し且つ冷却保存するための組織細胞破砕用チューブと、
ｂ）この密封・冷却後のチューブ内の生体試料中に含有する組織を破砕することにより細胞内外の遊離核酸を保存液中に溶出させると共に、その破砕試料から固形物を分離・沈降させるための細胞破砕及び固形物分離装置と、
ｃ）グリセリン水溶液からなる灌流液を前記保存液と混合した液性生体試料中に浸漬した透析膜チューブ内で灌流させ、分子量２０〜５０ｋＤ以上の物質の通過を阻止すると共に、回収液のグリセリン濃度目標値を１０〜２０ｗｔ％としたマイクロダイアリシス処理を行う装置と、
ｄ）前記マイクロダイアリシス処理による回収液から低分子ＤＮＡ関連物質を分離するためのカラムを有する高速液体クロマトグラフと、前記カラムの溶出流を紫外線吸収分析してＤＮＡ核酸量を測定するための紫外線吸収分析装置と、
ｅ）前記カラムの溶出流を電気化学的に検出することによりＤＮＡ酸化損傷物の量を測定するための電気化学検出器とを備え、測定されたＤＮＡ核酸量とＤＮＡ酸化損傷物の量との比率から生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標を求めること、を特徴とする前記保存液を用いたＤＮＡ酸化損傷指標の測定システムを構成したものである。
【００２７】
上記の各測定システムによれば、保存液に混入した生体試料を、分子量２０〜５０ｋＤのカットオフ機能を有する透析膜に灌流させる、いわゆるマイクロダイアリシス法により、抗酸化環境において同試料から除蛋白操作することができるとともに、灌流後、高速液体クロマトグラフに通して得られた溶出成分の紫外線吸収分析によるＤＮＡ物質の定量と、電気化学的検出によるＤＮＡ酸化損傷物の定量を同時に行うことで、同一条件下での両者の値を正確に測定し、正確にＤＮＡ酸化損傷状態を検出することができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好ましい実施例における保存液と、それを用いたＤＮＡ酸化損傷指標の測定方法について説明する。
【００２９】
保存液
本発明の保存液は、基本的に陽イオンのキレート剤と抗酸化剤を、１０〜４０％のグリセリン水溶液に溶解させたものであり、生体試料を混入するまで氷冷条件以下の温度及び遮光状態で保管される。好ましい組成配合比は以下の通りである。
（１）グリセリン・・・・・１０〜４０ｗｔ％
（２）メタノール・・・・・２〜５ｗｔ％
（３）ＥＤＴＡ／４Ｎａ・・０．５〜２ｍＭ／ｌ
【００３０】
上記の組成配合比中、メタノール及びＥＤＴＡ／４Ｎａについては適宜の追加もあり得る。調製された保存液それ自体、又は生体試料混入後の保存はいずれも遮光・密封状態において、次の温度条件で実施される。
（１）２〜３日程度の短期保存は冷蔵庫（４°Ｃ）にて行う。
（２）半年程度の中期保存は冷凍庫（−１０〜−２０°Ｃ）にて行う。
（３）半年以上の長期保存はサンプルチューブ内の空気を窒素ガスと置換後、冷凍庫（−８０°Ｃ以下）にて行う。
【００３１】
実施例１
この実施例は、生体の液体試料、すなわち全血、血漿、血清、尿、髄液、組織液等の被検物質を溶解した水溶液に対して適用された。保存液の組成はグリセリン４０ｗｔ％、メタノール５ｗｔ％、ＥＤＴＡ／４Ｎａ２ｍＭであり、サンプルの前処理として、これら３成分を混成した水溶液（保存液）に、等容量の液体試料を混和して後、上記（２）の条件で中期保存し、マイクロダイアリシスシステムから始まる測定操作の直前に保存検体を室温に戻す。マイクロダイアリシス法により灌流・回収された被検溶液は高速液体クロマトグラフに供給され、ｄＧピーク及び８ＯＨｄＧピークを含むその溶出流は、本発明に従って構成された８ＯＨｄＧ／ｄＧ同時測定システムに供給され、それらの測定値から最終的に生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標が演算される。
【００３２】
実施例２
この実施例は、細胞成分を含んだ生体試料、すなわち全血、細胞浮遊液、臓器、組織など、破砕を必要とするものに適用された。保存液の組成はグリセリン２０ｗｔ％、メタノール２．５ｗｔ％、ＥＤＴＡ／４Ｎａ１ｍＭであり、これら３成分の混成水溶液（保存液）が先ず組織破砕用チューブに０．５〜１．０ｍｌ注入される。この組織破砕用チューブとしては、物理的に細胞破砕に適するとともに生化学的にはＤＮＡ酵素不感応、又はＲＮＡ酵素不感応の滅菌チューブ、例えば、アメリカ合衆国のバイオ１０１社から製造販売されている“Ｆａｓｔ  ＤＮＡチューブ”を用いることができる。
【００３３】
次に、生体細胞試料１００〜２００ｍｇを上記のチューブに入れ、直ちに氷冷する。細胞破砕及び関連操作の準備が整うと、専用の破砕装置、例えば、アメリカ合衆国のバイオ１０１社から製造販売されている“ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１２０" 型装置を用いて組織を破砕し、細胞内外の遊離核酸を保存液中に溶出させる。この遊離核酸を含む保存液は、固形物を遠心分離し、その上澄み液をもって保存検体とする。保存検体は、測定直前に室温に戻され、マイクロダイアリシスシステムに供される。マイクロダイアリシス法により灌流・回収された被検液は、実施例１と同じく高速液体クロマトグラフに供給され、ｄＧピーク及び８ＯＨｄＧピークを含むその溶出流は、８ＯＨｄＧ／ｄＧ同時測定システムに供給されて、それらの測定値から最終的に生体試料中のＤＮＡ酸化損傷指標が演算される。
【００３４】
マイクロダイアリシスシステム
上記各実施例のマイクロダイアリシス（微細透析）においては、２０〜５０ｋＤの高分子量成分を阻止するカットオフ機能を有する透析膜チューブを検体中に浸漬し、このチューブ内に灌流液を通ずる灌流システムを含む装置により、検体から効率的に低分子のＤＮＡ成分を回収する。回収成分は、ｄＧ，Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ４，ＭＷ２６７，８ＯＨｄＧ，Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ５，ＭＷ２８３などである。灌流条件は、
灌流液・・・・・２０％グリセリン溶液
灌流温度・・・・室温
灌流速度・・・・０．５〜２マイクロリットル／分
を基本とする。しかしながら、回収率を上げたり、目的成分のＳ／Ｎ比を改善するために、これらの条件を適当に変えることができる。
【００３５】
８ＯＨｄＧ／ｄＧ同時測定システム
マイクロダイアリシスにより回収された低分子ＤＮＡ成分は、高速液体クロマトグラフのカラムに送り込まれ、８ＯＨｄＧ、ｄＧ等の成分ピークごとにカラムから溶出する。カラム溶出流は先ず紫外線吸収分析装置の試料セルに送られ、ｄＧ量を測定された後、電気化学検出器に送られて８ＯＨｄＧ量を測定される。
【００３６】
以上述べた本発明実施の形態を、図１のフローチャートに従って整理すると次のようになる。
ステップ１：生体試料の採取。
ステップ２：生体試料を保存液と混合して冷却保存する。
ステップ３：チューブ内保存液に混ぜた細胞分析用試料の破砕と固形物分離。
ステップ４：保存した液性試料、又は破砕及び分離後の細胞分析用試料のマイクロダイアリシス処理。
ステップ５：ダイアリシス灌流・抽出された試料成分を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）に供給する。
ステップ６：クロマトグラフ・カラムの溶出流を紫外線（ＵＶ）吸収分析装置の試料セルに送り、ｄＧ量を測定する。
ステップ７：上記試料セルを通りすぎたカラム溶出流を、電気化学検出器に通して８ＯＨｄＧ量を測定する。
ステップ８：ステップ６及び７の測定値を用いて８ＯＨｄＧ／ｄＧ比その他をデータ処理する。
【００３７】
生体試料実測データの検討
図２は、８ＯＨｄＧ、ｄＧ及び生体で産生される代表的な酸化物である硝酸（ＮＯ3)イオンを、上記保存液で冷却・保存した検体を使って測定した結果を示す相関グラフである。一般的に尿中には大量の酸化物が溶存し、常温で大気中に開放された環境では検体が速やかに酸化することが知られている。そして、この測定で得られた８ＯＨｄＧ値、及び８ＯＨｄＧ／ｄＧ比のいずれにおいても、これまでの報告と大きな食い違いは見られなかった。
【００３８】
図２のグラフのＹ軸は８ＯＨｄＧ（ｐｇ／ｍｌ）／ｄＧ（ｎｇ／ｍｌ）濃度比の対数変換値、Ｘ軸はＮＯ3 （μＭ）／ｄＧ（ｎｇ／ｍｌ）濃度比であり、従って８ＯＨｄＧ及びＮＯ3 の濃度を、尿の濃縮率と正の相関をするｄＧ濃度で割っているため、尿濃縮によるデータへの影響がキャンセルされている。打点データより、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比の対数変換値とＮＯ3 ／ｄＧ比とは正の相関を示していることから、８ＯＨｄＧ／ｄＧ比は酸化損傷程度をより合理的に表すことができるものと考えられる。
【００３９】
本発明の測定システムによる予備試験の結果、以下の総ての検体の８ＯＨｄＧ及びｄＧを同時測定することができた。ここに、本システムによる測定限界は、（１）８ＯＨｄＧが０．５ｐｇ／ｍｌ（サンプル量５０μｌ）であり、従来のＥＬＩＳＡ法での測定限界1ng/mlを大きく凌駕し、
（２）ｄＧの測定限界が０．２ｎｇ／ｍｌ（サンプル量５０μｌ）であった。
【００４０】
検体ごとに、実際に検出される核酸成分の含量
人尿
８ＯＨｄＧ・・・１０〜５０００ｐｇ／ｍｌ
ｄＧ・・・・・・５０〜２０００ｎｇ／ｍｌ
人血漿
８ＯＨｄＧ・・・１〜５０ｐｇ／ｍｌ
ｄＧ・・・・・・５〜２５ｎｇ／ｍｌ
人髄液
８ＯＨｄＧ・・・２〜１５ｐｇ／ｍｌ
ｄＧ・・・・・・５０〜２００ｎｇ／ｍｌ
マウス脳海馬組織
８ＯＨｄＧ・・・２０〜５０ｐｇ／ｇ
ｄＧ・・・・・・２００〜１０００ｎｇ／ｇ
ラット肝臓灌流液
８ＯＨｄＧ・・・１０〜５０ｐｇ／ｍｌ
ｄＧ・・・・・・２０〜５０ｎｇ／ｍｌ
【００４１】
【発明の効果】
本発明のシステムによる高い測定感度、及びその測定結果の信頼性は、（１）生体試料（特に核酸成分）の保存液、（２）抗酸化環境下での除蛋白処理（マイクロダイアリシス法の応用）、（３）本発明の８ＯＨｄＧ／ｄＧ同時測定システム、の総てがそろったときに最も好ましく発揮され、ほぼ総ての生体サンプルのための画期的なＤＮＡ酸化損傷指標の測定システムを提供するものである。すなわち、電気化学検出器で検出可能な核酸酸化物、例えば、８ＯＨｄＧと同様にＡＴ→ＧＣ変換を生じさせる冒頭記載の２ＯＨｄＡや、その還元型のｄＡの同時測定も８ＯＨｄＧ／ｄＧとほぼ同じ測定条件で検出可能である。
【００４２】
更に、本発明の各論的効果に言及すると、まず本発明の保存液は、（１）採取直後から酸化傾向がある生体試料について、酸化物濃度が更に高くなる恐れがある従来の単純な凍結又は冷蔵保存とは異なり、保存中の酸化を実質的に抑制することができる。（２）特に、核酸由来のモノヌクレオシド及びその酸化物の濃度変動が最小となるように調整されているため、ＤＮＡ酸化損傷指標の測定用検体の保存に最適である。（３）組成が比較的単純であるため安価であると共に、内容成分も安定し長期保存が可能である。
【００４３】
次に本発明の測定方式中に用いられるマイクロダイアリシスシステムは、（１）液性試料や細胞含有試料のいずれにも対応できる。（２）除蛋白処理に酸やアルカリ、また酵素反応を使わず、総ての操作を低温下で行えるため、検体の劣化が少ない。（３）ＤＮＡ関連物の抽出効率は、透析膜からの回収率にのみ依存するため、灌流条件を一定化すれば誤差は少なくなる。（４）灌流液を保存液と同じにすれば、灌流後の検体の長期保存も可能である。
【００４４】
最後に本発明の８ＯＨｄＧ／ｄＧ同時測定システムは、（１）同一サンプルで、非酸化型と酸化型のモノヌクレオシドを同時に定量できると共に、両者を比としてデータ処理することにより、検体注入量などの誤差要因を排除もしくは軽減することができる。（２）一回の注入サンプル量が１０〜１００マイクロリットルという極小量で測定可能である。（３）カラムへの主な注入液が透析膜灌流液であるため、測定ノイズが小さく従来よりも高感度が期待できる。これにより、カラムの耐用年数も長くなり経済的となる。（４）測定サンプルが低温で安定しており、恒温冷却装置の付いたオートインジェクタ装置と連結することにより、システムの省力化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の生体試料測定システムを実施するためのフローチャートである。
【図２】８ＯＨｄＧ、ｄＧ及び生体で産生される代表的な酸化物である硝酸（ＮＯ3)イオンを、本発明の保存液で冷却・保存した検体を、本発明の前処理及び測定システムを使って測定した結果を示す相関グラフである。
【図１】
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【図２】
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