(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）イントロンＡフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、全長イントロンＡ配列を欠き、かつ（ａ）ｈＣＭＶイントロンＡ配列の最初の５１個の５’ヌクレオチドの連続配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、および（ｂ）ｈＣＭＶイントロンＡ配列の最後の８０個の３’ヌクレオチドに少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ここで、該フラグメントが発現構築物中に存在する場合、該発現構築物は、イントロンＡ配列を完全に欠く対応する構築物によって達成される発現レベルよりも高い発現レベルを達成する、フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載のイントロンＡフラグメントであって、ここで（ａ）前記ｈＣＭＶイントロンＡ配列の最初の５１個の５’ヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１〜５１であり、そして（ｂ）前記ｈＣＭＶイントロンＡ配列の最後の８０個の３’ヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド７４５〜８２４である、フラグメント。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載のイントロンＡフラグメントであって、ここで、該フラグメントが、発現構築物中に存在する場合、該発現構築物は、イントロンＡ配列を完全に欠く対応する構築物によって達成される発現レベルよりも少なくとも２倍高い発現レベルを達成する、フラグメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のイントロンＡフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、配列番号３に示されるイントロンＡヌクレオチド配列、または該配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、フラグメント。
【請求項５】
請求項４に記載のイントロンＡフラグメントであって、ここで該フラグメントは、配列番号３に示されるイントロンＡヌクレオチド配列からなる、フラグメント。
【請求項６】
選択されたコード配列の転写を指向するのに有効な組換え発現構築物であって、該発現構築物は、以下：
（ａ）コード配列；
（ｂ）該コード配列に作動可能に連結された制御エレメントであって、ここで、該制御エレメントは、請求項１〜５のいずれかのイントロンＡフラグメントを含み、それによって、該コード配列は、宿主細胞中で転写され、そして翻訳され得る、
組換え発現構築物。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え発現構築物であって、ここで、前記制御エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、および単純疱疹ウイルスプロモーターからなる群より選択されるプロモーターをさらに含む、組換え発現構築物。
【請求項８】
請求項６または７に記載の組換え発現構築物であって、前記制御エレメントは、配列番号４のヌクレオチド４６０位〜１２６４位において見いだされるｈＣＭＶ最初期（ＩＥ１）エンハンサー／プロモーター領域をさらに含み、そして該該制御エレメントは、配列番号４の２０８９位〜２０９６位のヌクレオチド配列を含む５’−ＵＴＲのエキソン２をさらに含む、組換え発現構築物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかの組換え発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１０】
組換えポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項９に記載の宿主細胞の集団を提供する工程；および
（ｂ）組換え発現構築物のコード配列が発現される条件下で、該細胞の集団を培養し、それによって該組換えポリペプチドを産生する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
組換えポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項６〜９のいずれかの発現構築物を宿主細胞に導入する工程；および
（ｂ）該発現構築物のコード配列を発現させて、該組換えポリペプチドを産生する工程、を包含する、方法。
【請求項１２】
配列番号６に示される配列を含むポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、組換え遺伝子発現系に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子産物を発現するために発現構築物において使用するための、新規のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）イントロンＡフラグメント、およびそれを使用する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質は、種々の原核生物および真核生物の組換え発現系において簡便に産生される。例えば、大腸菌誘導プラスミドＤＮＡベクターは、インビトロとインビボとの両方でタンパク質を発現するために、広範に使用される。インビトロにおいて、このようなベクターは、例えば、タンパク質発現の性質の事前の評価から組換えタンパク質の大規模な製造までの範囲の目的のために使用される。インビボにおいて、ＤＮＡベクターは、例えば、遺伝子療法および核酸の予防接種のために使用され得る。
【０００３】
一般に、有効なベクターは、有効なプロモーターおよび他のコントロールエレメントの使用に起因して、高レベルのタンパク質を発現するベクターである。細胞の有効なトランスフェクトに寄与し得る他の因子は、以下を含む：（１）細胞によるプラスミドの取り込み；（２）エンドサイトーシス後のエンドサイトーシス小胞からのプラスミドの逸脱；（３）細胞質から核へのプラスミドのトランスロケーション；ならびに（４）核内でのプラスミドの転写。
【０００４】
いくつかの研究所からの研究により、有効なトランスフェクトに対する主要な障壁は、核内、特に、有糸分裂を受けない細胞（例えば、ミオサイト）におけるプラスミドのトランスロケーションであることが示唆されている。この段階に影響を及ぼし得る１つのパラメータは、プラスミドのサイズである。なぜなら、核内への高分子の取り込みに関与する核孔の複合体が有限サイズを有するからである。従って、高レベルでタンパク質を発現する能力を保持する小さいプラスミドを操作することが望ましい。このことは、ＤＮＡ送達を容易にするための可能性を有し、かつ大きなプラスミドにおいて可能であるよりも大きい遺伝子挿入物の挿入を可能にする。後者の点は、プラスミドをパッケージングする、制限された能力を有する特定の組換えウイルスベクター（例えば、アルファウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクター）の調製のために特に重要である。
【０００５】
組換えタンパク質の産生のための、特に有効な１つの系は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期（ＩＥ１）エンハンサー／プロモーター領域（この領域は、最初期のｈＣＭＶの７２，０００分子量のタンパク質の転写を制御する）を含むベクターを用いる。例えば、Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９〜３９８６；および米国特許第５，６８８，６８８号を参照のこと。ｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーターは、公知である、最も強力なエンハンサー／プロモーターのうちの１つであり、細胞型の広範囲において活性である。
【０００６】
ｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーター領域（図２）は、組織特異的モジュレータ、いくつかの異なる転写因子に対する複数の潜在的な結合部位、および複合体エンハンサーを含む。遺伝子の転写領域は、４つのエキソンおよび３つのイントロンを含む。「イントロンＡ」と命名された、最も大きなイントロンは、遺伝子の５’非転写領域内に見出される。例えば、ｈＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅにおけるこの領域の配列および構造についての、Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９〜３９８６、およびｈＣＭＶ株ＡＤ１６９における対応する領域の記載についての、Ａｋｒｉｇｇら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９８５）２：１０７〜１２１を参照のこと。ｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーターのイントロンＡ領域は、哺乳動物細胞における異種タンパク質の発現を増強するエレメントを含むことが示されている。例えば、Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９〜３９８６を参照のこと。
【０００７】
イントロンは、哺乳動物細胞核において産物される、大部分のプレｍＲＮＡ転写物中に存在する非コード領域である。イントロンの配列は、異種発現ベクターに含まれる場合、遺伝子発現を大いに増強させ得る。例えば、Ｂｕｃｈｍａｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：４３９５〜４４０５；Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９〜３９８６を参照のこと。近年の研究は、プレｍＲＮＡスプライシングと成熟ｍＲＮＡの核から細胞質への搬出との間の連絡を実証している。Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：４〜６；およびＬｕｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：１４９３７〜１４９４２。従って、増加した発現レベル（例えば、ｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーターのイントロンＡ領域内に見られる発現レベル）は、細胞質における転写可能な増加したｍＲＮＡレベルに起因し得る。
【０００８】
（発明の要旨）
従って、本発明は、発現構築物において使用するためのＣＭＶイントロンＡフラグメントを提供する。このフラグメントは、このような発現構築物中に存在する場合、発現レベルを増強させる能力を維持する。イントロンＡフラグメントの使用は、特に、プラスミドをパッケージングするためにサイズの制限を伴う組換えウイルスベクター（例えば、アルファウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクター）において使用される場合に、望ましい。従って、本発明は、インビトロとインビボとの両方で治療学的に有用な量の組換えタンパク質を産生するために非常に有効な発現系を提供する。
【０００９】
従って、１つの実施形態において、本発明は、ｈＣＭＶイントロンＡフラグメントに関し、ここでこのフラグメントは、全長イントロンＡ配列を欠失しており、かつ以下を含む：（ａ）図１Ａに含まれる１〜２５位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列、および（ｂ）図１Ａに含まれる７７５〜８２０位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列。さらに、このフラグメントが発現構築物中に存在する場合、この発現構築物は、完全にイントロンＡ配列を欠失している、対応する構築物によって達成されるレベルよりも高い発現レベルを達成する。特定の実施形態において、達成される発現レベルは、完全にイントロンＡ配列を欠失している対応する構築物によって達成されるレベルよりも、少なくとも２倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍より高い。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、以下を含むイントロンＡフラグメントに関する：（ａ）図１Ａに含まれる１〜５１位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列、および（ｂ）図１Ａに含まれる７４１〜８２０位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列（ここで、このフラグメントが発現構築物中に存在する場合、この発現構築物は、完全にイントロンＡ配列を欠失している、対応する構築物によって達成されるレベルよりも高い発現レベルを達成する）。特定の実施形態において、達成される発現レベルは、完全にイントロンＡ配列を欠失している対応する構築物によって達成されるレベルよりも、少なくとも２倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍より高い。
【００１１】
別の実施形態において、イントロンＡフラグメントは、図１Ａに含まれるヌクレオチド７４１〜８２０に連結した、図１Ａに含まれるヌクレオチド１〜５１の配列を含む。
【００１２】
なおさらなる実施形態において、イントロンＡフラグメントは、図１Ｃに示されるイントロンＡヌクレオチド配列、またはイントロンＡヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
別の実施形態において、イントロンＡフラグメントは、図１Ｃに示されるイントロンヌクレオチド配列からなる。
【００１４】
なお別の実施形態において、本発明は、ｈＣＭＶイントロンＡフラグメントに関し、ここで、このフラグメントは、全長イントロンＡ配列を欠失しており、かつ以下を含む：（ａ）図１Ａに含まれる１〜２５位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列、および（ｂ）図１Ａに含まれる７７５〜８２０位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列（ここで、このフラグメントが発現構築物中に存在する場合、この発現構築物は、対応する、インタクトな全長イントロンＡ配列を含む発現構築物によって達成されるレベルと等しいか、またはそのレベルより高い発現レベルを達成する）。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、ｈＣＭＶイントロンＡフラグメントに関し、ここでこのフラグメントは、全長イントロンＡ配列を欠失しており、かつ以下を含む：（ａ）図１Ａに含まれる１〜５１位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列、および（ｂ）図１Ａに含まれる７４１〜８２０位において見出されるヌクレオチドの連続した配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列（ここで、このフラグメントが発現構築物中に存在する場合、この発現構築物は、対応する、インタクトな全長イントロンＡ配列を含む発現構築物によって達成されるレベルと等しいか、またはそのレベルより高い発現レベルを達成する）。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、以下を含む組換え発現構築物に関する：（ａ）コード配列；および（ｂ）このコード配列に作動可能に連結されるコントロールエレメント（ここで、このコントロールエレメントは、本明細書中に記載されるイントロンＡフラグメントを含み、これによって、このコード配列は、宿主細内に転写および翻訳され得る）。特定の実施形態において、このコントロールエレメントは、以下からなる群より選択されるプロモーターをさらに含む：ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、および単純疱疹ウイルスプロモーター。特に、このコントロールエレメントは、図２の４６０〜１２６４位のヌクレオチドにおいて見出される、ｈＣＭＶ最初期（ＩＥ１）エンハンサー／プロモーター領域、および図１Ａに含まれる８２１〜８３４位において示されるヌクレオチドの配列を含む、５’−ＵＴＲのエキソン２を含み得る。発現構築物を含む宿主細胞、および組換えポリペプチドを産生する方法もまた、提供される。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、図５Ｂに示される配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明白になる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の範囲内の、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学の従来の方法を用いる。このような技術は、参考文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ（第２版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｋ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇを参照のこと。
【００２０】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他に明白に示されていない場合、複数の対象を含むことに注意すべきである。従って、例えば、「抗体（単数）」に対する参照は、２種以上の抗体の混合物などを含む。
【００２１】
以下のアミノ酸の略語が、本文全体を通して使用される：
アラニン；Ａｌａ（Ａ）              アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）          アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）            グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）          グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）            イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）              リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）            フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）              セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）            トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）              バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００２２】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下に示すように規定されることが意図される。
【００２３】
「イントロンＡフラグメント」は、ＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター領域のイントロンＡ配列から誘導されるフラグメントを意味し、これは、完全なイントロンＡ配列を含まない。代表的なｈＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域が、図２に示される。インタクトなイントロンＡ配列は、図２の位置１２６５〜２０８８にわたる小文字のヌクレオチドおよび図１Ａのヌクレオチド１〜８２０によって表わされる。本発明のイントロンＡフラグメントは、全長配列からの欠失を含み、この領域が、イントロンＡフラグメントを含む一次転写物の核において忠実なスプライシングを可能にするように機能する限りは、この欠失は、イントロンＡ領域の内部あるいは５’末端および／または３’末端で生じ得る。好ましくは、「イントロンＡフラグメント」は、イントロンＡ配列を完全に欠失する対応する構築物で達成される発現レベルを超える発現レベルを達成するのに必要な、最小数の塩基またはエレメントを含む。さらに好ましくは、本発明のイントロンＡフラグメントを含む構築物によって達成される発現レベルは、イントロンＡ領域の存在なしに達成されるレベルを、イントロンＡ領域の存在なしに達成されるレベルよりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍を超えて、最も好ましくは、少なくとも２０〜５０倍を超えて、または、さらに超える。好ましくは、発現レベルは、インタクトな全長イントロンＡ配列が、対応する発現構築物中に存在する場合に達成されるレベルと、少なくとも同じか、またはそれを超えて、例えば、少なくとも２倍を超える。このような比較は、典型的に、試験構築物の全てのエレメントを含むが、イントロンＡ配列を完全に欠失しているか、または全長イントロンＡ配列を含むかのいずれかの発現構築物を作製することによってなされる（本明細書中の実施例を参照のこと）。
【００２４】
従って、本発明の「イントロンＡフラグメントは、一般的に、少なくとも５’スプライス連結配列（図１Ａに示されるようなヌクレオチド１〜７）、通常は、イントロンＡ領域の５’ヌクレオチドの少なくとも最初の２５まで（図１Ａのヌクレオチド１〜２５）、さらに好ましくは、少なくともイントロンＡ領域の最初の３０ヌクレオチドまで（図１Ａのヌクレオチド１〜３０）、さらにより好ましくは、イントロンＡ領域の最初の少なくとも４０ヌクレオチドまで（図１Ａのヌクレオチド１〜４０）、さらに好ましくは、イントロンＡ領域の少なくとも最初の５１ヌクレオチドまで（図１Ａのヌクレオチド１〜５１）、そしてイントロンＡ領域の最初の７５以上のヌクレオチドまで、そしてこれらの値の間の任意の整数、あるいはイントロンＡの５’領域のさらにそれ以上を含む。
【００２５】
さらに、上述の５’配列に加えて、「イントロンＡフラグメント」は、必要に応じて、少なくとも３’スプライス連結配列（図１Ａのヌクレオチド８１５〜８２０）を含む。一般的に、イントロンＡフラグメントは、以下を含む：図１Ａに示されるイントロンＡ配列の３’ヌクレオチドの少なくとも２５まで（図１Ａのヌクレオチド７９６〜８２０）、好ましくは、図１Ａに示される配列の３’ヌクレオチドの５０まで（図１Ａのヌクレオチド７７１〜８２０）、さらに一般的には、３’ヌクレオチドの７０まで（図１Ａのヌクレオチド７５１〜８２０）、好ましくは、３’ヌクレオチドの少なくとも８０まで（図１Ａのヌクレオチド７４１〜８２０）、または３’領域のさらにそれ以上（例えば、３’ヌクレオチドの１００〜１５０）、およびこれらの値の間の任意の整数、あるいはイントロンＡの３’領域のこれ以上を含む。
【００２６】
従って、イントロンＡフラグメントを含む発現構築物が、上で記載したように、イントロンＡ配列を完全に欠失する対応する構築物に対して発現を高めるか、または完全イントロンＡ配列を含む対応する構築物に対して等価な発現もしくは増強された発現を提供するかのいずれかである限り、本発明によるイントロンＡフラグメントが、種々の内部欠失（例えば、イントロンＡ配列の約１０〜約７５０またはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは、約２５〜約７００またはそれ以上のヌクレオチド、さらに好ましくは、約５０〜約７００ヌクレオチド、そして最も好ましくは、約５００〜約６８０〜６９０またはそれ以上のヌクレオチド、あるいは上述の範囲の間の任意の整数）を含み得ることは明らかである。
【００２７】
本発明のイントロンＡフラグメントの保持された５’領域および３’領域は、例えば、図１Ａに示されるように、お互いに直接的に結合され得るか、あるいはイントロンＡフラグメントの５’領域および３’領域は、リンカー配列を介して互いに連結され得る。リンカー配列は、１〜約４００までまたはそれ以上のヌクレオチドを含み得るか、あるいはこれらの値の間の任意の整数を含み得、そして特定の転写因子のための領域（例えば、ＮＦ１結合部位）、組織特異的エンハンサー配列（例えば、筋肉特異的エンハンサー）などを含み得る。
【００２８】
１つの代表的なイントロンＡフラグメント配列は、図１Ａのヌクレオチド７４１〜８２０に連結する位置１〜５１でヌクレオチド配列を含み、従って、図１Ａに示されるように、ヌクレオチド５２〜７４０の内部欠失を含む。この構築物においてまた、ｈＣＭＶ  エンハンサー／プロモーター領域の５’ＵＴＲのエキソン２（図１Ａのヌクレオチド８２１〜８３４）が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「イントロンＡフラグメント」は、例えば、ｈＣＭＶ株ＴｏｗｎｅおよびｈＣＭＶ株ＡＤ１６９のような、種々のｈＣＭＶ株のいずれかから単離されたイントロンＡフラグメントに対して同一性を有する配列、ならびに参照分子（以下に規定されるような）に対して実質的に相同体であり、上に記載されるようにさらに機能するポリヌクレオチドを含む。従って、例えば、図１Ｃに示されるフラグメントは、図１Ｂおよび図１Ｃに示されるように、ポリピリミジン区画中の分岐点にヌクレオチド置換を含み、コンセンサス配列に対してこれらの配列を一致させる。好ましくは、しかし必要ではないが、分岐点は、終止コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）を保持している。さらに、スプライスドナー領域およびスプライスアクセプター領域の外側の分子の部分は、さらに変化を受ける。この点で、５’スプライス連結部に見い出される５’ＧＴ、そして好ましくは５’スプライス部分で見い出される最初の６塩基対を保持することが好ましい。また、３’スプライシング連結部で見い出される３’ＡＧ、好ましくは３’スプライシング連結部で見い出される３塩基対（ＣＡＧ）を保持することも望ましい。これらの領域中に見い出されるヌクレオチドは、好ましくは、図１Ａに示されるネイティブ配列中に存在するヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％相同であるが、上述に規定されるように、イントロンＡフラグメントが機能を保持している限り、低い相同性であり得る。さらに、ポリピリミジン区画領域は、好ましくは、実質的に塩基のすべてがＴまたはＣである領域である。
【００３０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の最小の長さは限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義の中に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義によって含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）も含む。
【００３１】
本発明の目的のために、コード配列によって発現されるポリペプチドは、ワクチン、治療法または診断法において有用なポリペプチドであり得、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌のいずれか、ならびに種々の腫瘍抗原のいずれかから誘導され得る。あるいは、発現されるポリペプチドは、治療用ホルモン、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、酵素、代謝経路における中間体、免疫調節剤などであ得る。
【００３２】
さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換）（一般的に天然において保存的である）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるものとして意図され得るか、または例えば、タンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅に起因する誤差物（ｅｒｒｏｒ）によって発見され得る。
【００３３】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボで、ポリペプチドへと転写される核酸分子（ＤＮＡの場合）および翻訳される核酸分子（ｍＲＮＡの場合）である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端での翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、限定されないが、以下をいう：ウイルス性ｍＲＮＡ、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列。転写終止配列は、コード配列に対して３’に配置され得る。
【００３４】
「核酸」分子は、二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含み得、限定されないが、以下をいう：ウイルス性ｍＲＮＡ、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および特に合成ＤＮＡ配列。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を含む。
【００３５】
「作動可能に連結された」は、そのように記載される成分が、所望の機能を行うように構成されたエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、このプロモーターがこの発現自体を指向するように機能する限り、必ずしも、このコード配列と連続している必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に、転写され得るイントロンとして存在し得、そしてこのプロモーター配列はさらに、このコード配列に「作動可能に連結される」とみなされ得る。
【００３６】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合「組換え体」は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これは、この起源または操作によって、天然に関連するポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連しない。タンパク質またはポリペプチドに関連して使用される場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、発現され、次いで、さらに以下に示されるように、形質転換された生物中で発現される。宿主生物は、発現条件下で、外来の遺伝子を発現し、タンパク質を産生する。
【００３７】
「制御エレメント」は、連結して、コード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終止配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲｓ（例えば、ｈＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域のエキソン２の５’−ＵＴＲ）および３’−ＵＴＲｓならびに適切な場合リーダー配列およびエンハンサーを含有する）を含み、これらは、宿主細胞中のコード配列の転写および翻訳を集合的に提供する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてこのプロモーターに作動可能に連結した下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで、目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な、最小数の塩基またはエレメントを含む。このプロモーター配列内に、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。真核生物のプロモーターは、しばしば、しかし必ずというわけではないが、「ＴＡＴＡＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを含む。
【００３９】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合し、そしてこのコード配列をｍＲＮＡに転写する場合、細胞中のコード配列の「転写を指向」し、次いで、このｍＲＮＡは、コード配列によってコードされたポリペプチドへと翻訳される。
【００４０】
「宿主細胞」は、形質転換された細胞であるか、または外因性ＤＮＡ配列によって形質転換され得る細胞である。
【００４１】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然において他の分子との関連が見出されない別のＤＮＡ分子内の識別可能なセグメントであるか、またはこの別のＤＮＡ分子に連結する。例えば、最初期の７２，０００分子量のｈＣＭＶタンパク質以外のヒトタンパク質をコードする配列は、ｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーターに連結した場合、異種配列とみなされる。同様に、この最初期の７２，０００分子量のｈＣＭＶタンパク質をコードする配列は、通常は関連しないｈＣＭＶプロモーターに連結する場合、異種とみなされる。異種コード配列の別の例は、このコード配列自体が天然において見出されない構築物（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子改変体または天然に存在する突然変異事象は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡの異種領域を生じない。
【００４２】
「検出マーカー」とは、このマーカーを発現する細胞に対して表現型を与える遺伝子を意味し、その結果、この細胞は、適切な条件下で同定され得る。一般に、選択マーカーは、本質的な細胞の機能を阻害する化学的薬剤または他の薬剤の存在下または非存在下で成長する能力に基づいて、トランスフェクトされた細胞（ｔｒａｎｓｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）の選択を可能にする。従って、適切なマーカーは、細胞が適切な選択培地中で増殖される場合、薬物耐性または薬物感受性を与え、選択可能マーカーを含む核酸エレメントでトランスフェクトされたこれらの細胞に色を与えるか、またはこの細胞の抗原性特性を変化させるタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、選択マーカーとしては、以下が挙げられる：細胞障害性マーカーおよび薬物耐性マーカー（これにより、これらの細胞は、細胞毒素または薬物の１以上を含む培地上で増殖する能力によって選択される）；栄養要求性マーカー（これにより、これらの細胞は、特定の栄養素または栄養補充剤（例えば、チミジンおよびヒポキサンチン）を含むかまたは含まない規定の媒地上で増殖する能力によって選択される）；代謝マーカー（これにより、これらの細胞は、例えば、単独の炭素供給源として適切な糖を含む規定の媒地上で増殖する能力について選択される）、あるいは細胞に色素形成基質上で着色されたコロニーを形成する能力を与えるか、または細胞に蛍光を照射させるマーカー。代表的な選択マーカーは、以下でより詳細に記載されている。
【００４３】
「発現カセット」または「発現構築物」は、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る構築物をいう。この発現カセットは、上記のような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子（の転写を指向するよう）に作動可能に連結されるプロモーターまたはプロモーター／エンハンサー（例えば、ｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーター））を含み、そしてしばしば、同様にポリアデニル化配列を含む。発現カセットはまた、上記のようなイントロンＡフラグメント、および必要に応じてｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーター領域のエキソン２を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、１以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在するのを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つのマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含む。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」は、挿入のために使用される方法とは無関係に、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入（例えば、直接的な取り込み、トランスフェクション、感染などによる形質転換）をいう。トランスフェクションの特定の方法について、以下をさらに参照のこと。この外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（例えば、エピソーム）として保持され得るか、あるいは宿主のゲノムに組み込まれ得る。
【００４５】
「単離された」は、ポリペプチドに関する場合、示された分子が、この分子が天然に見出される全生物から分離（ｓｅｐａｒａｔｅ）もしくは分離（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）されているか、または同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、通常天然にこれと関連する配列；または天然に存在するが、これと共に異種配列を有する配列；または染色体から分離された分子を、全部または一部欠いた核酸分子である。
【００４６】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分間の同一性％をいう。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、これらの分子の規定された長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％（８０、８１、８２、８３、８４、８５％）、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約９５％〜９８％（９５、９６、９７、９８％）またはそれ以上、あるいは５０％〜１００％の範囲内の任意の整数の配列同一性を示す場合に、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とは、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列もまたいう。
【００４７】
一般に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド−ヌクレオチド、またはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。同一性％は、配列を整列させ、２つの整列した配列間の一致の正確な数を計数し、短い方の配列の長さによって除算し、そして結果を１００で乗算することによる、２つの分子間の配列情報の直接の比較によって、決定され得る。容易に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣのＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｆｏｈｈ，Ｍ．Ｏ．（これは、ペプチド分析についての、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９、１９８１の相同性アルゴリズムを適合させる））を使用して、分析を補助し得る。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから利用可能）において利用可能であり、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリスムに依存する。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、そして上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメータを用いて、容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性％は、デフォルトスコアリングテーブルおよび６ヌクレオチド位のギャップペナルティーを用いて、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリスムを使用して決定され得る。
【００４８】
本発明の文脈において、同一性％を確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって配給される、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有するＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを使用することである。このパッケージソフトから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリスムが使用され得、ここで、デフォルトパラメータがスコアリングテーブルについて使用される（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ１、およびギャップ６）。このデータから生じる「一致」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性％または類似性％を計算するための他の適切なプログラムは、一般に当該分野で公知であり、例えば、別の整列プログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメータを用いて使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４９】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた消化および消化されたフラグメントのサイズ決定によって、決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について規定されるような、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００５０】
（ＩＩ．発明を実行する様式）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方またはプロセスパラメータに限定されず、これらは当然変化し得ることが、理解されるべきである。また、本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定を意図しないこともまた理解されるべきである。
【００５１】
本明細書中に記載される組成物および方法と類似または等価である多数の組成物および方法が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【００５２】
上記のように、本発明は、新規ｈＣＭＶイントロンＡフラグメントの発見に基づき、このフラグメントは、イントロンＡ配列の非存在下で達成される発現レベルと比較して、下流（３’）配列の発現を増強し得るか、またはインタクトな全長イントロンＡ配列を使用して得られる発現レベルと等価な発現レベルを少なくとも提供する。上に説明したように、イントロンＡ配列が由来するｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーターは、既知の最も強力なエンハンサー／プロモーターの１つであり、広範な細胞型において活性である。例えば、Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６；および米国特許第５，６８８，６８８号を参照のこと。この領域由来の活性フラグメントの使用は、特定のコード配列の発現のためのプラスミドの全体のサイズを効果的に減少させる。このことは、大きいコード配列および／または大きい遺伝子をパッケージングする能力が限定されたウイルスベクターを使用する場合に、特に所望される。さらに、構築物の全体のサイズの減少は、発現効率を効果的に増強する。従って、本発明のイントロンＡフラグメントは、驚くべきことに、インビトロおよびインビボで高レベルでタンパク質発現を生じる能力を保持し、いくつかの場合、完全ｈＣＭＶ  ＩＥ１イントロンＡ配列を使用するベクターよりも、高い発現を提供する。実施例に示されるように、高レベルの発現は、親ベクターによって誘導される免疫応答に匹敵するか、またはこれより優れた免疫応答を提供した。
【００５３】
上に説明されるように、本明細書中で使用するためのイントロンＡフラグメントは、イントロンＡ領域の少なくとも最初の７ヌクレオチドまで、好ましくはイントロンＡ領域の少なくとも最初の２５ヌクレオチドまでを保持する（代表的なイントロンＡ配列については、図１Ａを参照のこと）。一般に、本発明のイントロンＡフラグメントは、イントロンＡ領域の少なくとも最初の３０ヌクレオチドまで（図１Ａのヌクレオチド１〜３０）、一般にイントロンＡ領域の少なくとも最初の４０ヌクレオチドまで（図１Ａのヌクレオチド１〜４０）、より好ましくはイントロンＡ領域の少なくとも最初の５１ヌクレオチドまで（図１Ａのヌクレオチド１〜５１）、そしてさらにイントロンＡ領域の最初の７５ヌクレオチドまたはそれ以上までを保持する。従って、５’領域は、５’ヌクレオチドの２５、２６、２７、２８、２９、３０．．．５０、５１、５２、５３、５４、５５．．．７０、７１、７２、７３、７４、７５．．．８５、８６、８７またはそれ以上を含み得る。イントロンＡフラグメントを含む発現構築物が、上で定義されたように機能する限り、上で特定された任意の数のヌクレオチド、ならびに特定された数以内のヌクレオチドは、本明細書中に包含されることが意図されることが明らかである。
【００５４】
イントロンＡフラグメントはまた、必要に応じて、本明細書中に記載されるように機能するに十分な量のイントロンＡの３’領域を含む。次いで、一般に、イントロンＡフラグメントは、少なくとも３’スプライス連結配列（図１Ａのヌクレオチド８１５〜８２０）、好ましくは、図１Ａに示されるイントロンＡ配列の少なくとも２５までの３’ヌクレオチド（図１Ａのヌクレオチド７９６〜８２０）、好ましくは、図１Ａに示されるイントロンＡ配列の５０までの３’ヌクレオチド（図１Ａのヌクレオチド７７１〜８２０）、より一般には、図１Ａに示されるイントロンＡ配列の７０までの３’ヌクレオチド（図１Ａのヌクレオチド７５１〜８２０）、好ましくは、図１Ａに示されるイントロンＡ配列の少なくとも８０までの３’ヌクレオチド（図１Ａのヌクレオチド７４１〜８２０）、またはなおさらなる３’領域（例えば、１００〜１５０の３’ヌクレオチド）、およびこれらの値の間の任意の整数もしくはそれ以上のイントロンＡの３’領域を含む。従って、イントロンＡフラグメントの３’部分は、イントロンＡ領域の３’ヌクレオチドの、５０、５１、５２、５３、５４、５５．．．７０、７１、７２、７３、７４、７５．．．８５、８６、８７．．．９０、９２、９３、９４、９５、９６．．．１１０、１１１、１１２などまたはそれ以上を含み得る。上記で特定された任意の数のヌクレオチド、ならびに特定の数以内のヌクレオチドが、本明細書中に包含されると意図されることが明らかである。
【００５５】
本発明のイントロンＡフラグメントの５’保持領域および３’保持領域は、互いに直接結合され得る。例えば、これらは、イントロンＡ配列の内部欠失であり得る。この欠失は、例えば、インタクトなイントロンＡ領域の１０〜７５０またはそれ以上の塩基対、好ましくは、約３００〜７００塩基対、そして最も好ましくは、約５００〜７００塩基対を含み得る。図１Ａに示されるように、１つの好ましいフラグメントは、約６８８塩基対の大きい内部欠失を含む。従って、このフラグメントは、図１Ａのヌクレオチド７４１〜８３４に、１〜５１位で直接結合されたヌクレオチド配列を含み、従って、図１Ａに示されるように、イントロンＡの５２〜７４０ヌクレオチドの内部欠失を含む。図１Ａのヌクレオチド８２１〜８３４は、５’−ＵＴＲのエキソン２を示す。図３は、５５〜６６１塩基対の範囲のイントロンＡ欠失を有する、種々のイントロンＡフラグメント構築物を示す。
【００５６】
あるいは、イントロンＡフラグメントの５’領域および３’領域は、リンカー配列を介して一緒に結合され得る。このリンカー配列は、１〜約４００以上のヌクレオチドまで、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド、またはこれらの値の間の任意の整数を含み得、そしてエンハンサー、特定の転写因子の領域（例えば、ＮＦ１結合部位）などを含み得る。
【００５７】
本発明のイントロンＡフラグメントは、適切なプローブ（ｐｒｆｆｏｂｅ）を使用して、ＣＭＶゲノムライブラリーおよびイントロンＡ領域を含むプラスミドから単離され得、将来の使用のためにクローニングされ得る。同様に、この配列は、既知のイントロンＡ配列に基づいて、公知のポリヌクレオチド合成方法（例えば、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙ，Ｅｒｎｅｓｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１）を使用して、合成的に生成され得る。ｈＣＭＶ株ＴｏｗｎｅにおけるイントロンＡ領域の配列および構造については、Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６、およびｈＣＭＶ株ＡＤ１６９における対応する領域の説明については、Ａｋｒｉｇｇら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９８５）２：１０７−１２１；ならびに本明細書中の図１Ａおよび１Ｃを参照のこと。
【００５８】
本発明のイントロンＡフラグメントを得るための１つの特定の簡便な方法は、当該分野で周知の技術および本明細書中の実施例に記載される技術を使用して、イントロンＡを含むことが知られている種々のプラスミドのいずれかから、イントロンＡを、（単独でか、またはｈＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域の残りと共にかのいずれかで）単離することである。特に、ｈＣＭＶイントロンＡは、Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９−３９８６および米国特許第５，６８８，６８８号に記載されるように、プラスミドｐＣＭＶ６から得られ得る。一旦得られると、イントロンＡ配列は、その欠失変異体を得るために、例えば、制限酵素を使用してイントロンＡ配列の部分を切り出すことによって、操作され得る。部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で一般に理解される条件下で（その詳細は、これらの市販の酵素の製造業者によって特定される）、適切な制限酵素を用いて処理することによって、実行される。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。例えば、種々の特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは、広範な原核生物から単離され、そして当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。適切な制限エンドヌクレアーゼの選択は、標的化される特定の配列に依存する。当業者は、所望の配列について、適切な制限酵素を使用することを容易に認識する。所望の場合、切断されたフラグメントのサイズ分離を、標準的な技術を使用して、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルの電気泳動によって実行し得る。サイズ分離についての一般的な記載は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に見出される。イントロンＡ配列は、次いで、公知の技術を使用して、他の制御配列（例えば、適切なプロモーター）（残りのｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーター領域を保持することなく、イントロンＡが単離される場合）および所望のコード配列に連結される。
【００５９】
イントロンＡの配列は、当該分野で周知の技術を使用して、特定の発現系における使用のために最適化され得る。さらに、このフラグメント配列の部分は、例えば、可能な分枝点および分子の他の領域を欠失または置換することによって、変化され得る。代表的イントロンＡのこれらの領域は、図１Ａに示される。イントロンＡフラグメントの１つの特定の最適化された配列は、図１Ｃに示される。実施例において説明されるように、このフラグメントは、最初にイントロンＡ領域の３’配列の大部分を欠失させ、次いで、合成オリゴヌクレオチドによって、イントロンＡ領域の最後の８０ヌクレオチドを、最適化された配列で置換し、５’ＵＴＲ領域のエキソン２を含むことによって得られた。最適化された配列は、公開された分枝点およびポリピリミジントラック（ｔｒａｃｋ）コンセンサス配列に基づいた。あるいは、変異誘発した配列は、当該分野で周知の技術（例えば、適切な場合、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）によって得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００６０】
一旦得られると、このフラグメントを使用して、広範な種々の細胞型において所望のタンパク質の転写を指向し得る。シスに作用する制御エレメントは、このエレメントに付随するコード配列の発現を最適化するために、イントロンＡフラグメントと簡便に結合し得る。この系において産生されるタンパク質が、天然に分泌されるかまたは操作されるかのいずれかである場合、形質転換された細胞は、延長された期間にわたってタンパク質産物を生成し、収率をさらに増大させる。この系は、標準の立体配置の、標準の翻訳後修飾を有する所望のタンパク質の、比較的純粋な形態および商業的に有用な量での産生を可能にする。
【００６１】
従って、本発明のイントロンＡフラグメントは、広範な種々の物質（抗生物質および抗ウイルス剤として作用するペプチド（例えば、ワクチンおよび診断薬において使用するための免疫原性ペプチド）；組換え抗体；抗腫瘍剤；免疫調節剤（例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４およびγインターフェロンを含む、種々のサイトカインのいずれか）；ペプチドホルモン（例えば、インスリン、プロインスリン、成長ホルモン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、ＡＮＰ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨおよびｈＣＧ）、性腺ステロイドホルモン（アンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲステロン）、甲状腺刺激ホルモン、インヒビン、コレシストキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、ジノルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリノトロピン、グルカゴン、ＧＴＰ−結合タンパク質フラグメント、グアニリン（ｇｕａｎｙｌｉｎ）、ロイコキニン、マゲイニン、マストパラン、ダーマセプチン（ｄｅｒｍａｃｅｐｔｉｎ）、システミン（ｓｙｓｔｅｍｉｎ）、ニューロメディン、ニューロテンシン、パンクレアスタチン（ｐａｎｃｒｅａｓｔａｔｉｎ）、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セクレチン、サイモシンなど；および増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、ＦＧＦなど）を含む）を発現するための発現構築物において用途を見出す。
【００６２】
より具体的には、ワクチンおよび診断薬において使用するためのタンパク質は、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物のタンパク質であり得、ヒトおよび動物のウイルスにコードされるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されず、そして構造タンパク質または非構造タンパク質のいずれかに対応し得る。例えば、本発明の系は、ヘルペスウイルス科に由来する広範な種々のタンパク質（１型および２型の単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）に由来するタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の糖タンパク質であるｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のタンパク質（ＣＭＶのｇＢおよびｇＨを含む）；ならびに他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）に由来するタンパク質）を組み換え的に産生するための用途を見出す。（例えば、サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の総説については、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０）１２５−１６９頁；種々のＨＳＶ−１コードタンパク質の考察については、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＢタンパク質およびｇＤタンパク質ならびにこれらをコードする遺伝子の考察については、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノム中のタンパク質コード配列の同定については、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７−２１１；そしてＶＺＶの総説については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を参照のこと）。
【００６３】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む、肝炎ファミリーのウイルス由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はまた、本明細書中に記載される技術において簡便に使用され得る。例としては、配列を得るための方法と同様に、ＨＣＶのウイルスゲノム配列が知られている。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、Ｅ１（Ｅとしてもまた知られている）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしてもまた知られている）を含む、いくつかのウイルスタンパク質をコードする。（例えば、Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の考察については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと。）これらのタンパク質ならびにその抗原性フラグメントの各々をコードする配列は、本発明の系において用途を見出す。同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原のコード配列は、公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの配列はまた、本発明の系において簡便に使用され得る。さらに、コア抗原、表面抗原（ｓＡｇ）、ならびにプレ表面配列（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２（以前にｐｒｅＳと呼ばれていた））のようなＨＢＶに由来する抗原、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅＳ１、ｓＡｇ／ｐｒｅＳ２、ｓＡｇ／ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２、およびｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２）は、本明細書中において用途を見出す。例えば、ＨＢＶ構造の考察については、「ＨＢＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ」、Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，１５９〜１７６頁；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００６４】
ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしてもまた知られる）（単離体ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ由来の抗原を含むがこれらに限定されない）；ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４；ＨＩＶ−２；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））のメンバー由来のタンパク質を含むが、これに限定されない、他のウイルスに由来するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列もまた、発現系において用途を見出す。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。
【００６５】
例えば、本発明は、上記のＨＩＶ単離体のいずれか由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を発現するために、発現構築物中で使用され得る。多くのＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２単離体（ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプのメンバーを含む）のｇｐ１２０配列は、公知であり、そして報告されており（種々のＨＩＶ単離体のエンベロープ遺伝子配列の比較については、例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ，１９９０、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）、そしてこれらの単離体のいずれかに由来する配列は、本発明の方法において用途を見出す。さらに、本発明は、ｇｐ１６０およびｇｐ４１のような種々のエンベロープタンパク質、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａｇ抗原、ならびにｐｏｌ領域に由来するタンパク質のいずれかを含む、種々のＨＩＶ単離体のいずれかに由来する他の免疫原性タンパク質に等しく適用可能である。本発明はまた、インフルエンザウイルスタンパク質の発現のための発現構築物において用途を見出す。詳細には、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生成するために特に興味深い。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプが同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、１２７〜１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。従って、これらの単離体のいずれかに由来するタンパク質をコードする遺伝子配列はまた、本明細書中に記載される組換え生成技術において使用され得る。
【００６６】
さらに、本明細書中に記載されるフラグメントは、種々の悪性の癌を処置するために有用なタンパク質を生成する手段を提供する。例えば、本発明の系は、問題の癌に特異的な特定のタンパク質（例えば、活性化オンコジーン、胎児抗原、または活性化マーカー）に対する体液媒介性および細胞媒介性の免疫反応の両方を高めるために順に使用され得る種々の腫瘍抗原を生成するために使用され得る。このような腫瘍抗原としては、とりわけ、種々のＭＡＧＥ（悪性腫瘍関連抗原Ｅ）（ＭＡＧＥ１、２、３、４（Ｂｏｏｎ，Ｔ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（Ｍａｒｃｈ  １９９３）：８２−８９などを含む）のいずれか；種々のチロシナーゼのいずれか；ＭＡＲＴ１（Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原）、変異ｒａｓ；変異ｐ５３；ｐ９７黒色腫抗原；ＣＥＡ（癌胎児性抗原）が挙げられる。
【００６７】
本発明は、広範な種々の疾患の予防、処置および／または診断のために有用な種々のタンパク質を生成するために使用され得ることが容易に明らかである。
【００６８】
上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはこれを含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することによって、組換え方法を使用して得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェノール抽出およびＰＣＲのような標準的な技術を使用して、これを含む細胞および組織から直接単離され得る。ＤＮＡを獲得および単離するために使用される技術の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。目的の遺伝子はまた、クローニングではなく、合成的に生成され得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列について適切なコドンを有するように設計され得る。一般に、配列が発現される意図される宿主について好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法によって調製される重複するオリゴヌクレオチドから構築され、そして完全なコード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
【００６９】
マーカーおよび増幅器はまた、本発明の発現系いおいて使用され得る。形質転換された細胞株を選択する際に有用な種々のマーカーが公知であり、そして一般に、細胞が適切な選択培地中で増殖される場合、その発現が、形質転換された細胞に選択可能な表現型を付与する遺伝子を含む。哺乳動物細胞株についてのこのようなマーカーとしては、例えば、細菌のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（これは、真菌フェノール酸およびキサンチンを含む培地中で選択され得る（Ｍｕｌｌｉｇａｎら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２−２０７６））およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン／カナマイシン誘導体の抗細菌作用を不活化するタンパク質を特定化する）（これは、哺乳動物細胞に通常毒性であるＧ４１８のようなネオマイシン誘導体を含む培地を使用して選択され得る（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４））が挙げられる。他の発現系に有用なマーカーは、当業者に周知である。これらおよび他の選択マーカーは、当該分野で周知の技術を使用して、市販のプラスミドから得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００７０】
発現はまた、コード配列に隣接するマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子のような増幅可能な遺伝子を配置することによって増幅され得る。次いで、細胞は、ｄｈｆｒ欠損細胞におけるメトトレキセート耐性について選択され得る。例えば、Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０；Ｒｉｎｇｏｌｄら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．およびＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：１６５−１７５を参照のこと。マーカーおよび増幅器のの両方を含む構築物は、例えば、米国特許第６，０９６，５０５号において記載される種々のＥＭＣＶ−ＤＨＦＲ／Ｎｅｏ構築物のいずれかのような、本発明の発現ベクターにおいて用途を見出す。
【００７１】
転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し得、コード配列の翻訳終止コドンの３’側に位置する。転写ターミネータ／ポリアデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出において記載されるような、ＳＶ４０に由来するもの、ならびにウシ成長ホルモンターミネータ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
プロモーター領域もまた、本発明の発現構築物中に存在する。このプロモーターは、フラグメントが由来するインタクトな全長イントロンＡ配列に通常関連する異種ｈＣＭＶ  ＩＥ１プロモーター、異種ＣＭＶ  ＩＥ１プロモーター（例えば、異なるＣＭＶ株に由来する）、または非ＣＭＶ  ＩＥ１プロモーターですらあり得る。プロモーターの選択は、発現に使用される細胞型に依存し、そして当業者によって容易に決定される。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、上記のＣＭＶプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、ＲＳＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペス単純ウイルスプロモーター、組織特異的プロモーターが挙げられる。本明細書中に記載される構築物中で使用される１つの特定のプロモーターは、図２に記載されるｈＣＭＶ  ＩＥ１エンハンサー／プロモーター領域に由来するプロモーター（例えば、図２のおよそヌクレオチド４６０位〜１２６４位）またはこの領域の機能的部分である。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーター）はまた、哺乳動物発現のための用途を見出す。昆虫細胞発現系（代表的には、バキュロウイルス系）は、一般に、ポリへドリンプロモーターを含む。細菌系における使用のためのプロモーターとしては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）およびマルトース）、トリプトファン（ｔｒｐ）のような生合成酵素に由来するプロモーター配列（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開番号０３６，７７６および同１２１，７７５）、ｂ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ」、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）、Ｔ５プロモーター（米国特許第４，６８９，４０６号）、ｔａｃのようなハイブリッドプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８３）８０：２１）のような、糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。酵母発現系において有用なプロモーターとしては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰＯ公開番号２８４，０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ公開番号３２９，２０３）プロモーターのような代謝経路における酵素をコードする配列由来のプロモーターが挙���られる。このような系における使用のための他のプロモーターとしては、酵母ＰＨＯ５遺伝子（ホスファターゼをコードする（Ｍｙａｎｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１））に由来するプロモーター、ならびに別の酵母プロモーター（合成ハイブリッドプロモーターを作製する）の転写活性化領域を有する１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列の融合によって形成されたプロモーターのような合成プロモーターが挙げられる。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰまたはＰｙＫのような糖分解酵素遺伝子の転写活性化領域（ＥＰＯ公開番号１６４，５５６）と組み合わせた、ＧＡＰ転写活性化領域に連結したＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）ならびにＡＤＨ２遺伝子、ＧＡＬ４遺伝子、ＧＡＬ１０遺伝子、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる。これらおよび他のプロモーターは、当該分野で周知の技術を使用して、市販のプラスミドから得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００７３】
特定のコード配列が、イントロンＡフラグメントおよび適切な調節配列と共にベクター中に位置し、制御配列に関するコード配列の位置および向きは、コード配列がコントロール配列の「制御」下で転写されるように（すなわち、プロモーターにおいてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）、発現ベクターは構築される。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成するために望ましくあり得る。例えば、いくつかの実施形態において、適切な向きで、プロモーターおよび他の制御配列に結合され得るように（すなわち、リーディングフレームを維持するために）、配列を改変することは必要であり得る。プロモーター配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、イントロンＡフラグメントおよび適切な制限部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
【００７４】
目的の遺伝子の変異体またはアナログを生成することはまた、望ましくあり得る。目的のポリペプチドの変異体またはアナログは、目的のポリペプチドをコードする配列の一部の欠失、配列の挿入および／または配列内の１つ以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら、（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６４０９を参照のこと。
【００７５】
一旦、発現構築物が構築されると、これらは、昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルスおよび酵母発現系を含む、広範な種々の系で使用され得、これらは全て、当該分野で周知である。目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の種々の遺伝子送達技術を使用して、宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中の安定なエピソームエレメント上で維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【００７６】
例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）において記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）からキット形態で市販されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出において記載されている。酵母発現系は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎにおいて記載されている。
【００７７】
上記の系での使用のための多数の適切な宿主細胞がまた公知である。例えば、哺乳動物細胞が当該分野で公知であり、そして例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト肝細胞性癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」細胞）ならびにその他に限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手可能な不死化細胞株が挙げられる。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．のような細菌宿主は、本発明の構築物での用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターでの用途のための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００７８】
広範な種々の方法を使用して、発現構築物を細胞に送達し得る。このような方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリリジンまたはポリオルニチン媒介トランスフェクション、または他の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルク）を使用する沈澱などが挙げられる。トランスフェクションの他の有用な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、または微量注入が挙げられる。目的の細胞を形質転換するための技術の考察としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００７９】
例えば、この発現構築物は、細胞に送達する前にリポソーム中にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的に、核酸を安定に結合または捕捉および保持し得るリポソームを用いて達成される。濃縮されたＤＮＡ  対  脂質調製物の比は変化し得るが、一般的に、約１：１（ｍｇ  ＤＮＡ：μｍｏｌ脂質）であるか、または脂質の方が多い。核酸送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）、第１０１巻、５１２−５２７頁を参照のこと。
【００８０】
本発明に伴い使用するための脂質調製物として、特に好ましいカチオン性リポソームを有するカチオン性調製物（正電荷）、アニオン性調製物（負電荷）、および中性調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ−［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームが、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ．からＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎの商標名で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６もまた参照のこと）。他の市販の脂質として、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を用いて容易に入手可能な材料から調製され得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリエチルアンモニオ）プロパン）リポソーム）の合成の詳細については、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１４９−４１９８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を用いて調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３）、第１０１巻、５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【００８１】
ＤＮＡもまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３−４９１により記載されるのと同様の蝸牛殻状脂質組成物中で送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号もまた参照のこと。
【００８２】
選択される発現系および宿主に依存して、この分子は、上記の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、タンパク質が発現する条件下で増殖させることにより産生される。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系がタンパク質を増殖培地中に分泌する場合、この生成物は培地から直接的に精製され得る。タンパク質が分泌されない場合、このタンパク質は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当該分野の技術に含まれる。例えば、一旦発現されると、生成物は当該分野で周知の任意の数の技術により単離および精製され得る。これらの技術としては、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除など）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などが挙げられる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ編、１９８７）；およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ａｎｇａｌ編、１９９０）を参照のこと。
【００８３】
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いる核酸免疫および遺伝子療法のために使用され得る。遺伝子送達のための方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達され得るか、あるいは被験体由来の細胞にエキソビボで送達され、被験体に再移植され得るかのいずれかである。
【００８４】
多くのウイルスに基づく系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入ために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系の便利なプラットホームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。簡潔には、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、広範な種々のレトロウイルス（例えば、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型レトロウイルスならびにスプマウイルスおよびレンチウイルス（例えば、ＦＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶ）が挙げられる）から容易に構築され得る（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）。このようなレトロウイルスは、受託所または収集所（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９））から容易に獲得され得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【００８５】
多くのアデノウイルスベクターもまた記載されている。宿主細胞に統合するレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは、染色体外に存続することによって、挿入による変異誘発に関連する危険を最小限に抑える（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【００８６】
さらに、種々のアデノ随伴ウイスル（ＡＡＶ）ベクター系が、遺伝子送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ、Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【００８７】
分子結合ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されるアデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達に使用され得る。
【００８８】
アルファウイルス属のメンバー（例えば、シンドビス、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス、およびＶＥＥ由来のベクターであるが、これらに限定されない）もまた、目的の遺伝子を送達するためのウイルスベクターとしての用途を見出す。簡単な方法の実施のために有用なＳｉｎｂｕｓウイルス由来のベクターの説明については、例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；ならびに国際公開番号ＷＯ９５／０７９９５およびＷＯ９６／１７０７２を参照のこと。
【００８９】
本発明の発現構築物はまた、ウイルスベクターなしでも送達され得る。例えば、この構築物は、上記のように、直接的に送達され得るか、被験体または被験体由来の細胞への送達前にリポソームにパッケージングされ得る。
【００９０】
発現構築物はまた、粒子キャリアにカプセル化され得るか、粒子キャリアに吸着され得るか、または粒子キャリアと会合され得る。このようなキャリアは、複数コピーの選択分子を免疫系に提示し、そして局所的なリンパ節における分子の捕捉および保持を促進する。この粒子は、マクロファージにより貪食され得、そしてサイトカイン放出を通じて抗原提示を増強し得る。粒子キャリアの例として、ポリメチルメタクリレートポリマーから獲得される粒子キャリア、ならびにポリ(ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして知られている）から獲得される微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。
【００９１】
さらに、他の粒子系およびポリマーは、発現構築物のインビボまたはエキソビボの送達に使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、およびこれらの分子の結合体）は、目的の核酸を移入するのに有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、または他の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、珪酸アルミニウム（ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）およびカオリン（ｋａｏｌｉｎ）を含む）、酸化クロム、珪酸マグネシウム、タルクなど）を用いる沈殿は、本発明の系を伴う使用を見出す。遺伝子移入に有用な送達系の概説については、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。
【００９２】
さらに、粒子キャリア（例えば、金およびタングステン）を用いる微粒子銃送達系は、本発明の発現構築物を送達するのに特に有用である。この粒子は、送達される構築物でコーティングされ、そして一般的に還元雰囲気下で「遺伝子銃」からの銃粉末の放出を用いて高速に加速される。このような技術および有用な装置の詳細については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同５，３７１，０１５号；および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。
【００９３】
（本発明を実施する上で有用な菌株の寄託）
以下の菌株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに行った。指定された登録番号は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約およびその条約に基づく規則（ブタベスト条約）の規定の下で生存試験が成功した後で割り当てられ、必要な手数料を支払った。これは、生存培養物の寄託日から３０年間の管理を保証する。これらの生物は、ブタベスト条約の規約の下で、ＡＴＣＣにより利用に供され、米国特許商標庁長官により、米国特許法第１２２条およびそれらに準じた長官の裁定（特に８８６ＯＧ６３８に関しては、米国特許法施行規則第１．１２条を含む）に従いその権利を付与されることが決定された者に対する子孫の永久的および非限定的な利用を保証する。特許が付与されたら、寄託された培養物の公衆への利用における全ての制限は、不可逆的に排除される。
【００９４】
これらの寄託物は、当業者に対する利便性のみのために提供され、米国特許法第１２２条の下で寄託が必要とされることの承認ではない。これらの遺伝子の核酸配列およびそれによってコードされる分子のアミノ酸配列は、本明細書の記載とのいかなる矛盾の事象をも制御する。寄託物を作製、使用、または販売するためには許可が必要とされ得、そしてこのような許可は本願により付与されない。
プラスミド        ｐＣＯＮ３
寄託日            ２０００年９月２７日
ＡＴＣＣ番号      ＰＴＡ−２５０４
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、説明の目的のみのために提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００９５】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証する努力をしているが、いくらかの実験的誤差および逸脱が、当然、許容されるべきである。
【００９６】
制限酵素および修飾酵素、ならびにＤＮＡ操作のための他の試薬を、商業的な供給源から購入し、そして製造者の指示に従って使用した。ＤＮＡフラグメントのクローニングにおいて、注意書きがなされない限り、全てのＤＮＡ操作を、標準的な手順に従い実施した。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００９７】
（実施例１）
（イントロンＡフラグメントを含む発現構築物の生成）
スプライスドナーおよび分枝点部位と接しているイントロンＡのコア領域内から５４〜６８８ヌクレオチドを欠失した一連の１３の発現構築物を作製した。発現構築物を、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子またはコドン最適化ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ遺伝子に連結した（Ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：２６２８−２６３５）。
【００９８】
イントロンＡの最初の欠失物を、プラスミドｐＣＭＶｋｍＬｕｃ（国際公開番号ＷＯ９８／０６４３７）由来の７７８塩基対のＮｓｉＩ−ＳａｌＩフラグメントを、５’−ＵＴＲのエキソン２（図１Ａのヌクレオチド８２１−８３４）を有するイントロンＡの少なくとも８０ヌクレオチドを回復した合成オリゴヌクレオチド（図１Ｂ）（図１Ｂに示されるように最適化された分枝点およびポリピリミジン区画配列を有する）で置換することにより調製した。得られた構築物は、イントロンＡから６８８ｂｐ欠失を含んだ。これを図１Ａに示す。得られた発現プラスミド（ｐＣＯＮ３）は、１３０ｂｐのイントロンＡフラグメントを有するｈＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域を含む。ｐＣＯＮ３中のイントロンの最終的な配列を図１Ｃに示す。
【００９９】
１２のさらなるイントロンＡ欠失構築物を、プラスミドｐＣＭＶＩＩ（米国特許第６，０９６，５０５号）中での漸進的欠失（固有のＮｓｉＩ部位から固有のＨｐａＩ部位の方へ５’→３’方向にかまたは、固有のＨｐａＩ部位からＮｓｉＩ部位の方へ３’→５’方向へのいずれか）により作製した（図３および表１を参照のこと）。制限酵素消化後、プラスミドをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび過剰のｄＮＴＰで処理した。得られた平滑末端ベクターフラグメントを、ゲル精製および自己連結した。図３に示されるように、これらの構築物は、５４〜６６３塩基長の範囲のイントロン内での欠失を含んだ。得られたイントロン改変を保有する発現ベクターを生成するために、短縮プラスミド由来のＮｄｅＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化したプラスミドｐＣＭＶｋｍＬｕｃに置換した。プラスミドｐＣＭＶｋｍ２．ＧＡＧｍｏｄ．ＳＦ２の消化により獲得されたコドン最適化ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ遺伝子の挿入のために、これらの構築物の中から選択された構築物をＳａｌＩ−ＸｂａＩで消化して、レシピエントベクターフラグメントを生成した（Ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：２６２８−２６３５。
【０１００】
【表１】
0004445703.tif 000002
0004445703.tif 000003
（実施例２）
（イントロンＡフラグメントを用いた異種コード配列の発現）
２９３細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５７３）およびＲＤ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−１３６）を、ウシ胎仔血清（１０％  ｖ／ｖ）を補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。トランスフェクションの１４時間前に、２×１０５細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種した。一過性トランスフェクションを、１つの構築物につき６個の複製ウェルにて、製造業者らの指示書に従って１２μｇのＦｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、１ウェルにつき、上記のベクターＤＮＡの２μｇを用いて実施した。トランスフェクションの４８時間後、レポーター遺伝子発現について細胞溶解物を分析した。ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ発現を、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）によって評価した。各プレート（構築物）にわたる幾何平均力価（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ  ｔｉｔｅｒ）を計算した。
【０１０１】
２９３細胞の一過性トランスフェクションおよびルシフェラーゼ発現の評価によって、これらの誘導体ほぼ全てが親ベクター（全長イントロンＡ配列を含むｐＣＭＶｋｍ−ルシフェラーゼ）と同様かまたは親ベクターよりも良好に発現されたことが、示された。２つの最も大きいイントロン欠失を含む構築物（ｐＣｏｎ３、ΔＨｐａＩ−ＣｅｌＩＩ）は、最も大きい増強（おおよそ、親ベクターよりも２倍大きい）を示した（図４）。
【０１０２】
より小さいイントロンの発現に対する効果をさらに評価するために、イントロンＡの全長配列を、ウサギβ−グロビン遺伝子由来の１２６塩基対のイントロンＩ（ＲβＧ−ＩＶＳＩ）と置換した。図５Ａは、使用した野生型ウサギβ−グロビン遺伝子配列を示す。ｐ５５ｇａｇ発現のインビトロ分析によって、野生型構築物が親ベクター（ｐＣＭＶｋｍ−ルシフェラーゼ）よりも約１．８倍まで発現したことが示された（図６）。ＲβＧ−ＩＶＳＩのスプライスドナー、分枝点およびポリＹトラクトについての野生型配列は、これらのエレメントのコンセンサス配列と比較して、最適下限である。従って、ＲβＧ−ＩＶＳＩを含む構築物を、これらの配列エレメントが最適化されるように改変した。図５Ｂは、使用された最適化したウサギβ−グロビン遺伝子配列（ＲβＧ−ＯＰＴＩと称する）を示す。この構築物の分析によって、インビトロにおいて、親ベクターと比較した場合に、約４倍高いｐ５５ｇａｇ発現が示された（図６）。
【０１０３】
１４個全ての改変イントロン構築物を、ＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡ転写スプライシングの効率について分析した。ＲＮＡ転写分析について、２９３細胞を一過性にトランスフェクトし、次いで、ＲＮＡｓｔａｔ６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ  Ｂ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用いて溶解し、総細胞ＲＮＡを生成した。抽出したＲＮＡを、ＲＱ１−Ｄｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて消化し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてＲＴ−ＰＣＲに供した。イントロンの領域にわたるＰＣＲを、５’ＵＴＲのエキソン１の上流プライマー［プライマー「ＫＢＴ−１６２」；配列ＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡ（配列番号７）］およびルシフェラーゼレポーター遺伝子由来の下流プライマー［プライマー「ＫＢＴ−１６３」；配列ＧＴＴＧＡＧＣＡＡＴＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ（配列番号８）］を用いて実施し；アクチン転写物のコントロールＰＣＲもまた、各ＲＮＡ調製物について実施した。このアッセイの感度の範囲内において、全変異体が効率的にスプライシングされた。なぜなら、スプライシングされていないメッセージについて推測される長さの産物が検出されなかったからである。
【０１０４】
（実施例３）
（イントロンＡフラグメントを用いた核酸免疫）
イントロンＡフラグメントがインビボにおいて転写を指向する能力を試験するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６匹の群）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃｏ．，Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、１箇所の注射あたり５μｇの裸のベクターＤＮＡ（エンドトキシン不含で調製され［Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ］、そして通常の生理食塩水中に処方した）を用いて前脛骨筋に、一回左右相称に（ｂｉｌａｔｅｒａｌｌｙ）免疫した。免疫の３週間後および６週間後に採取した血液を、Ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：２６２８−２６３５に記載されるように、抗ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ抗体についてＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１０５】
評価した構築物を、図７に示す。変動性の免疫原性が、単回免疫の後に見出された（図７を参照のこと）。重要なことに、イントロンＡの約８５％を欠失しているｐＣＯＮ３ベクターは、親ｐＣＭＶｋｍ２．ＧＡＧｍｏｄ．ＳＦ２ベクターよりも高い幾何平均力価を生じた（図７）。免疫の３週間後、この力価は、親ベクターの約２倍であったが、これは、免疫の６週間後までに低下した。
【０１０６】
従って、新規ｈＣＭＶイントロンＡフラグメントおよびこの新規ｈＣＭＶイントロンＡフラグメントを使用する方法が開示される。上記より、本発明の特定の実施形態が例示目的のために本明細書中に記載されるが、種々の改変が添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａ（配列番号１）は、ｈＣＭＶ株Ｔｏｗｎｅ由来の、代表的なＣＭＶ  ＩＥ１イントロンＡの配列を示す。欠失変異体ｐＣＯＮ３から欠失された配列の一部もまた、図１Ａに示される。スプライスドナー配列は太文字であり、矢印で示す。スプライスアクセプター配列には下線を施し、矢印で示す。潜在的な分枝点が示される。
【図１Ｂ】  図１Ｂ（配列番号２）は、野生型イントロンＡの３’部分と比較して、ｐＣＯＮ３の欠失したイントロンＡ構築物の保持された３’部分に対応するオリゴヌクレオチドを示す。
【図１Ｃ】  図１Ｃ（配列番号３）は、欠失変異体ｐＣＯＮ３のイントロンＡ配列を示す。
【図２】  図２（配列番号４）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６０３２１、およびＣｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３９７９〜３９８６）は、ｈＣＭＶの主要な最初期遺伝子の５’領域（エンハンサー／プロモーター領域を含む）のヌクレオチド配列を示す。エンハンサー領域（ヌクレオチド約６００〜約１０８１）、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（ヌクレオチド１０８１〜１１４３）、５’ＵＴＲのエキソン１（ヌクレオチド１１４４〜１２６４）、イントロンＡ（ヌクレオチド１２６５〜２０８８）、および５’ＵＴＲのエキソン２（ヌクレオチド２０８９〜２０９６）が示される。ＴＡＴＡＡおよびＣＡＡＴ、ならびに開始コドンを四角で囲む。
【図３】  図３は、実施例において記載されるような種々のイントロンＡ欠失変異体を示す。
【図４】  図４は、図１Ｃおよび図３に示される種々の欠失変異体による、規格化されたルシフェラーゼ発現を示す。
【図５Ａ】  図５Ａ（配列番号５）は、実施例において使用される野生型ウサギβ−グロビン遺伝子配列を示す。
【図５Ｂ】  図５Ｂ（配列番号６）は、実施例において使用される最適化したウサギβ−グロビン遺伝子配列を示す。
【図６】  図６は、ＲβＧ−ＩＶＳＩ（図４Ａに示される野生型ウサギβ−グロビン遺伝子配列を含む）およびＲβＧ−ＯＰＴＩ（図４Ｂに示される最適化したウサギβ−グロビン遺伝子配列を含む）と比較して、親ベクター（ｐＣＭＶｋｍ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）によるｐ５５ｇａｇ発現の測定と同じルシフェラーゼ発現を示す。
【図７】  図７は、実施例において記載されるような種々の構築物（イントロンＡフラグメントを含む）で免疫したマウス由来の抗ｐ５５ｇａｇタイターを示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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