(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞または植物中で目的の遺伝子を発現する方法であって、該植物細胞または該植物の細胞にベクターを導入することを含み、該植物細胞または該植物の細胞において複製する第１次の組換えＲＮＡを産生し、
該ＲＮＡは、
（ｉ）発現すべき少なくとも１つの非ウイルス性遺伝子の配列を有する核酸を含み、
（ｉｉ）その下流に位置する該非ウイルス性遺伝子の翻訳に必要な少なくとも１つのリボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）要素を有し、
（ｉｉｉ）植物細胞中での該ＲＮＡの複製のためのレプリカーゼをコードし、
（ｉｖ）コートタンパク質をコードする遺伝子および細胞間または遠隔距離移動のためのタンパク質をコードする遺伝子を含み、そして
（ｖ）３’近位非翻訳領域（３’−ＮＴＲ）を含む、
上記方法。
【請求項２】
宿主植物の遺伝子を抑制するために、アンチセンス配向の宿主植物ゲノムの少なくとも１部分の配列をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アンチセンス配向の該配列が、植物中のｃａｐ依存性翻訳に必須の遺伝子を抑制する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ベクターが、その下流に位置し、かつ該ベクターの増幅に要求される遺伝子の翻訳に必要な少なくとも１つのＩＲＥＳ要素を有する核酸を含み、さらに、宿主植物の遺伝子を抑制するために、アンチセンス配向の宿主植物ゲノムの少なくとも１部分の配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ベクターが植物ウイルスから得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＩＲＥＳ要素が植物ウイルス由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＩＲＥＳ要素が１６コピーのＧＡＡＡセグメントからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＩＲＥＳ要素が、固有の１８Ｓ ｒＲＮＡのＩＲＥＳ結合セグメントに相補的な少なくとも１つの配列のマルチマーであるかまたはこれを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ベクターによりコードされる１個または数個の遺伝子の翻訳がｃａｐ非依存性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、植物中の遺伝子の増幅と発現および／または抑制が可能なベクター、さらにはその使用、特にタンパク質を産生するための使用、並びに該ベクターを作成するための、方法と前駆ベクター（pro-vector）に関する。本発明はさらに、遺伝子発現系、特に薬剤学的タンパク質の発現用、または同一植物または植物細胞中の２つまたはそれ以上の遺伝子の発現用の遺伝子発現系に関する。
【０００２】
（発明の背景）
植物の遺伝子操作のためのベクターは、タンパク質の産生のために、宿主植物に新しい形質を賦与するために、宿主植物の遺伝子を抑制するために、または遺伝子、特にゲノム科学により決定される遺伝子の機能を測定するために、非常に望まれている。
【０００３】
植物の遺伝子操作のための、ベクター、特にウイルス性ベクターは、既に知られている。これらは、遺伝子発現または抑制のための少なくとも１つの配列を有することに加えて、植物において感染、増幅および移動（細胞間および遠隔距離の両方）が可能でなければならない。先行技術のベクターは、転写要素としてサブゲノムプロモーターに基づいている。サブゲノムプロモーターは、トランスフェクションされた植物細胞において、ベクターの核酸配列の転写が、一部は該サブゲノムプロモーターで開始することにより、より短いＲＮＡを生成させる作用を有し、従って植物翻訳機構による該プロモーターから下流の遺伝子の翻訳が、可能になる。次に、翻訳はｃａｐ依存性に進行してもよい。このような多重転写は、レプリカーゼ能力の浪費のため、動態学的に不利である。
【０００４】
このようなベクターは、さらにいくつかの別の欠点を有する。ベクター配列へのウイルスサブゲノムプロモーターの導入は該配列を長くするために、効率が低下する。さらに、宿主での転写に充分に適応したいくつかの同一かまたは類似のサブゲノムプロモーターが存在すると、配列部分が消失されて、高頻度の組換えを引き起こし、不安定になる。これに反して、顕著に異なるサブゲノムプロモーターを使用すると、組換えは抑制されることもあるが、このようなプロモーターは、あまりに異なるため、転写系により有効に認識されないこともあり、このことは効率の消失を意味する。さらにベクターは通常、配列中に緊密に詰め込まれた、いくつかの相互依存性の機能性要素または遺伝子を含む、高度に統合された存在である。ある種の異種遺伝子などに対するベクターの機能が、多少独特でありそしてしばしば予測できない結果（特に感染性および発現に関して）を招くのは、このためである。さらに、上流遺伝子との配列の重複が存在するならば、プロモーターのための利用可能な配列のスペースは通常制限されている。
【０００５】
従って、本発明の目的は、宿主植物中の効率的で安定な機能することができる、植物の遺伝子操作のための新規なベクターを提供することである。さらに別の目的は、植物中で遺伝子の高レベル発現が可能なベクターを提供することである。
【０００６】
驚くべきことに、これらの目的は、発現すべき少なくとも１つの非ウイルス性遺伝子の配列を有し、かつその下流の遺伝子の翻訳に必要な少なくとも１つのＩＲＥＳ要素を有するかまたはコードする核酸を含む、植物中の遺伝子の増幅と発現が可能なベクターにより、達成できることが見い出された。
【０００７】
遺伝子発現の機能のみを有する（宿主ゲノム中への組み込み後に）組換えＤＮＡ分子中で、植物ＩＲＥＳ要素を使用することは、すでに示唆されている（ＷＯ  ９８／５４３４２）。しかし、この発現レベルは低い。この低い発現レベルの正確な理由は不明である。いずれにしても発現は、形質転換されるその植物細胞に限定されており、このため植物全体における全効率は、極めて低い。
【０００８】
驚くべきことに、植物ベクターは植物細胞中に導入されると、遺伝子発現の能力を持つだけでなく、植物全体の増幅および伝播に必要ないくつかの追加の機能を持ち、従って、全効率が極めて高い植物ベクターを構築できることが見い出された。これらの機能は、感染、増幅、細胞間移動および遠隔距離移動を含む。驚くべきことに、ベクター上の機能および構造要素の必要な高度の組み込みは、該ベクターからの遺伝子発現を障害しない。
【０００９】
該ベクターのＩＲＥＳ要素は、その翻訳を直接支持するために、発現すべき非ウイルス性遺伝子の上流に位置することができる。あるいは、該ＩＲＥＳ要素は、該ベクターの感染、増幅、ウイルス組み立て、植物細胞中のウイルス感染の発生のサイレンシングを抑制する能力、植物細胞中の代謝の方向を変える能力、および細胞間または遠隔距離移動よりなる群から選択される該ベクターの機能に必須である、別の遺伝子の翻訳を直接支持することにより、発現すべき該遺伝子の翻訳を間接的に支持してもよい。
さらには該ベクターは、宿主植物の遺伝子を抑制するために、アンチセンス配向の宿主植物ゲノムの少なくとも１部分の配列を含んでもよい。
【００１０】
さらに別の目的は、植物において遺伝子の有効な抑制が可能なベクターを提供することである。この目的は、該ベクターの増幅に必要であってＩＲＥＳ要素の下流に位置する遺伝子の翻訳に必要な、少なくとも１つの該ＩＲＥＳ要素を有するかまたはコードする核酸を含み、植物中で増幅が可能なベクターにより達成されており、このベクターはさらに、宿主植物の遺伝子を抑制するために、アンチセンス配向の宿主植物ゲノムの少なくとも１部分の配列を含む。
さらに別の好適な実施態様は、下位の請求の範囲に定義される。
【００１１】
ここでは、植物活性翻訳（ＩＲＥＳ）要素に基づく第１の植物発現と増幅ベクターが説明される。動物ウイルスから単離された既存のＩＲＥＳ要素は、植物細胞中での翻訳を支持できない。従って、動物発現系で蓄積された知識は植物には当てはまらない。動物ＩＲＥＳ要素は、残存プロモーター活性のような、他の機能に関して試験されたことがないため、本発明は、その下流の遺伝子の発現に必要なサブゲノムプロモーターによる、転写ではなく翻訳にのみ基づく、植物中の遺伝子発現の最初の真正なケースを開示する。
【００１２】
本発明のベクターは、ｃａｐ依存性翻訳を抑制することにより、好ましくは植物中の目的の遺伝子の調節および優先的発現を可能にする。別の好適な実施態様では、非常に短い相同的なまたは人工のＩＲＥＳ要素が使用され、これによって生じるベクターの安定性が上昇する。
【００１３】
この方法の好ましい利点は、ＩＲＥＳ配列を、ウイルス性遺伝子（例えば、タバコモザイクウイルスのコートタンパク質遺伝子）の上流または下流に挿入することができるため、それぞれ下流の外来遺伝子またはウイルス性遺伝子の翻訳は、ｃａｐ非依存性リボソーム内部侵入経路を介して起こりうる。即ち、外来遺伝子の該ｃａｐ非依存性翻訳は、２シストロン性および／または多シストロン性ＲＮＡから起きる。
【００１４】
（一般的な問題の状況と定義）
植物がウイルスに感染すると、ウイルス感染の初期事象（侵入およびゲノム脱外被）が起こる。次にこのウイルスは、そのゲノムの発現および複製を可能にする活動にしなければならない。ウイルスのゲノムは、単成分のまたは多成分のＲＮＡまたはＤＮＡ配列よりなっていてよく、そしてこれらのセグメントのそれぞれは、ある条件下で感染細胞中で複製可能である。ウイルスのレプリコンは、「ウイルス増殖サイクル中に宿主細胞中で複製されるウイルス配列の１つのポリヌクレオチド」として定義されている（フイスマン（Huisman）ら, 1992, 「植物ウイルスによる遺伝子操作」, ウィルソン（T.M.A. Wilson）とデービース（J.W. Davies）編, 1992, シーアールシープレス社（CRC Press, Inc.））。本発明において、我々は「増幅に基づく発現系」という用語を、（ｉ）野生型親ウイルスにとって非固有の外来配列を含有し、かつこれを発現でき、（ii）それ自体で、またはヘルパーウイルスもしくはトランスジェニック植物宿主の産物による相補性の結果として複製する、完全長ウイルスゲノムまたはウイルスＲＮＡもしくはＤＮＡの任意の断片のいずれか、を示すために使用する。「増幅に基づく発現系」および「組換えウイルスベクター」という用語は非常に類似している。これらの系は、ウイルスゲノムに対して、同種（固有の）または外来の異種（非固有の）の追加配列を含む組換え核酸を表す。「非固有の」という用語は、この核酸配列が、ウイルスの野生型ゲノムにおいては自然発生せず、そして別のウイルスに由来するか、または人工の合成ヌクレオチド配列を表すことを意味する。ウイルス要素に由来するこのような増幅に基づく系は、複製することができ、そして多くの場合に、正常植物および／または遺伝子操作したトランスジェニック宿主植物のいずれかにおいて、細胞間移動さらには遠隔距離移動をすることができる。後者の場合に、トランスジェニック植物は、ある種の機能が欠乏しているベクターのウイルス成分を補足するはずであり、即ち、その遺伝子のベクター複製および／または発現あるいは遠隔距離移動に必須の、トランス遺伝子の産物がトランスジェニック植物により提供されるはずである。植物により提供されるであろう機能のさらに別の例は、以下のものである：ベクターの増幅、ウイルス組み立て、植物細胞中のウイルス感染発生のサイレンシングを抑制する能力、植物細胞中の代謝の方向を変える能力、および該ベクターの細胞間または遠隔距離移動。
【００１５】
単成分（例えば、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または多成分（例えば、ブロモウイルス科のメンバー）ゲノムに基づく、植物ウイルス増幅に基づくベクターは、宿主植物中で外来遺伝子を発現することが証明されている（総説については例えば、「植物ウイルスによる遺伝子操作」, ウィルソン（T.M.A. Wilson）とデービース（J.W. Davies）編, 1992, シーアールシープレス社（CRC Press, Inc.）を参照）。
【００１６】
既知の植物ウイルスの大多数（約８０％）は、遊離ＲＮＡの形でビリオンから単離されると感染性である正センス１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ゲノムを含む。これは、ウイルス複製サイクルの最初の工程で、非感染植物細胞には存在せず、従ってウイルスＲＮＡ複製に必須であるウイルス特異的ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）を産生させるために、ゲノムＲＮＡが翻訳されなければならないことを意味する（総説に関しては、オカダ（Y. Okada）, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Soc., B, 354, 569-582を参照）。正センスｓｓＲＮＡウイルスは、ゲノム発現のために使用される翻訳方法において異なることを言及する：いわゆるピコルナ様ウイルスのゲノムは、リボソームにより翻訳されて大きなポリタンパク質になり、次にこれは、ウイルスにコードされる機能的に活性なタンパク質へとタンパク分解的にプロセシングされる、単一の連続する読み取り枠（ＯＲＦ）を示す。このウイルス特異的プロテイナーゼは、ポリタンパク質プロセシングに関与する。ピコルナ様ウイルスの第２の独特な特色は、これらのゲノムＲＮＡが、ｃａｐ構造の代わりにゲノムの５’末端に共有結合した小ウイルス性タンパク質を含むことである。
【００１７】
本発明において我々は、最も好ましくは、多くの植物ウイルス、特に、トバモウイルス（Tobamovirus）属に属する十種を超えるウイルスを含む、いわゆるシンドビス（Sindbis）様スーパーファミリーのウイルスに焦点を合わせる（総説に関しては、ギブス（A. Gibbs）, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Soc., B, 354, 593-602を参照）。この技術は、外来遺伝子のｃａｐ非依存性およびウイルスプロモーター非依存性発現を保証する。
【００１８】
トバモウイルス（ＴＭＶ Ｕ１は、この型のメンバーである）のゲノムは、４つの大きなＯＲＦを含む。レプリカーゼの２つの成分（１３０kDa およびその読み過し１８３kDa タンパク質）は、ゲノムＲＮＡの５’近位領域によりコードされ、そしてゲノムＲＮＡから直接翻訳される。ＴＭＶ  Ｕ１の１８０kDa タンパク質遺伝子の３’末端の１５ヌクレオチドは、ＴＭＶ感染の細胞間移動を担う３０kDa タンパク質（移動タンパク質、ＭＰ）をコードするＯＲＦと重複する。ＴＭＶ  Ｕ１において、この遺伝子は、（ＴＭＶ  Ｕ１中の）２０４ヌクレオチドよりなる３’近位非翻訳領域（３’−ＮＴＲ）の上流に位置する１７kDa コートタンパク質（ＣＰ）をコードする最後の遺伝子の開始コドンの前の２つのヌクレオチドを終わらせる。
【００１９】
トバモウイルスのＲＮＡの翻訳は、大多数の真核生物ｍＲＮＡに共通のリボソームスキャニング機構により起こる（総説に関しては、コザック（Kozak）, 1989, J. Mol. Biol. 108, 229-241；パイン（Pain）, 1996；メリック（Merrick）とハーシェイ（Hershey）, 1996, 「翻訳制御」, ハーシェイ（Hershey）, マシューズ（Matthews）とゾーネンバーグ（Sonenberg）編, コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbour Press）, pp.31-69；サックス（Sachs）とバラニ（Varani）, 2000, Nature Structural Biology 7, 356-360を参照）。この機構によると、構造的に多シストロン性のトバモウイルスＲＮＡは、機能的にモノシストロン性、即ち複製タンパク質（１３０kDa タンパク質およびその読み過し産物）をコードする５’近位ＯＲＦだけが、完全長ゲノムＲＮＡから翻訳することができる（パルカイチス（Palukaitis）とザイトリン（Zaitlin）, 1986, 「植物ウイルス」, ファンレーゲルモーテル（van Regermortel）とフレンケル−コンラット（Fraekel-Conrat）編, vol.2, pp.105-131, プレナムプレス（Plenum Press）, ニューヨーク州の総説がある）。オメガ（Ω）と呼ばれるＴＭＶ  Ｕ１の６８ヌクレオチドの５’末端非翻訳リーダー配列が、５’近位ＯＲＦの翻訳を刺激する効率的な翻訳エンハンサーの役割を果たすことが証明されていることを強調しておく。
【００２０】
５’遠位ＭＰおよびＣＰ遺伝子は、完全長ＴＭＶ  Ｕ１  ＲＮＡにおいて翻訳上サイレントであるが、これらは、サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる別々のｍＲＮＡから翻訳される。明らかにトバモウイルスｓｇＲＮＡは、負センスゲノムＲＮＡから転写され、共通の３’末端を共有する。ｓｇＲＮＡから翻訳されるＴＭＶ遺伝子の発現は、量的および時間的に両方とも独立に調節される：ＭＰは、感染の初期工程において一時的に産生され、比較的低いレベル（全植物タンパク質の約１％）まで蓄積するが、一方ＣＰは、全植物タンパク質合成の７０％までを占め、そしてＣＰは、全細胞タンパク質の１０％まで蓄積する（フレーザー（Fraser）, 1987, 「ウイルス感染植物の生化学」, pp.1-7, リサーチスタデイズプレス社（Research Studies Press Ltd.）, レッチワース（Letchworth）, イングランド）。
【００２１】
各ｓｇＲＮＡの産生は、「サブゲノムｍＲＮＡプロモーター」（ｓｇＰＲ）と呼ばれる異なるシス作用性配列により制御されることは明らかである。一般に、この用語は、ｓｇＲＮＡを産生するために内部に位置するｓｇＰＲ配列から転写を開始するために、レプリカーゼ複合体により認識可能であるウイルスゲノムの領域（恐らく負センスＲＮＡコピー中）を示す。しかし便宜上、「サブゲノムプロモーター」という用語により、我々は従来から、通常、コード配列およびｓｇＲＮＡの開始点の上流に位置し、そしてｓｇＲＮＡ合成の開始に機能的に関係する、正センスウイルスＲＮＡ中のヌクレオチド配列を意味する。しかし、いくつかのウイルスのｓｇＰＲは、制御されたウイルス遺伝子の上流に位置するだけでなく、この遺伝子と重複してもよいことを考慮すべきである（バルモリ（Balmori）ら, 1993, Biochimie (Paris) 75, 517-521）。各ｓｇＰＲは、ＴＭＶゲノム中の異なる位置を占める。ＴＭＶのｓｇＰＲはいずれも正確にはマッピングされていないが、ＣＰ遺伝子の上流の２５０ヌクレオチドは、ＣＰｓｇＲＮＡの合成を促進することが証明されている（ドーソン（Dawson）ら, 1989, Virology 172, 285-292）。
【００２２】
レト（Lehto）ら（1990, Virology 174, 145-157）は、ＣＰｓｇＰＲのサイズを推定するために、ＴＭＶゲノムに（ＭＰ遺伝子の前に）ＣＰ遺伝子に先行する配列（２５３および４９ヌクレオチド）を挿入した。この挿入は、未変性ＭＰｓｇＰＲを除去しなかったが、これをＭＰ  ＯＲＦから分離した。挿入した２５３ｎｔプロモーター領域を持つ変異体（ＫＫ６と呼ばれる）は安定に複製され、感染植物体全体に移動した。ＫＫ６変異体では、この挿入が、ＭＰｓｇＲＮＡリーダーの長さを変えることは、予想外ではなかった（レト（Lehto）ら, 1990, Virology 174, 145-157）（図９を参照）。ＣＰｓｇＲＮＡは９塩基対であったのに対し、ＫＫ６  ＭＰｓｇＲＮＡリーダーは、２４ヌクレオチドであった。
【００２３】
これとは対照的に、プロモーター領域の挿入された４９ｎｔ断片を持つ変異体は、一時的にのみ複製し、その後、挿入配列の欠失した野生型ウイルスの子孫が増えた。さらに、ＣＰｓｇＰＲ由来の９６ｎｔ領域を使用した時、ＣＰｓｇＲＮＡの産生が減少したことが証明されている（メシ（Meshi）ら, 1987, EMBO J., 6, 2557-2563）。ＣＰ遺伝子の上流の４９〜９６ｎｔ配列は、ＴＭＶ  Ｕ１  ＣＰ遺伝子の全ｓｇＰＲを含まなかったが、一方２５０ｎｔ配列は、完全なｓｇＰＲを含んでいたと結論づけられる。
【００２４】
ＴＭＶ  ＭＰ遺伝子の発現を制御するｓｇＰＲの構造およびマッピングに関する情報はほとんどない。推定ＭＰｓｇＰＲ配列は、１８３kDa レプリカーゼタンパク質と重複するために、ＭＰｓｇＰＲの突然変異分析は、複雑であった。最近報告されたドーソン（W. Dawson）と共同研究者の予備実験結果は、最小および完全長のＴＭＶ  Ｕ１のＭＰｓｇＰＲの境界を明確にした（グルゼリシュビリ（Grdzelishvili）ら, 2000, Virology 276, 印刷中）。ＭＰ遺伝子の上流の領域のコンピュータ折り畳みにより、ＭＰ遺伝子のＡＵＧコドンに先行する７５ｎｔ領域に対して５’近位に位置する、２つのステム−ループ構造が明らかになった。
【００２５】
ゲノムＲＮＡおよびＣＰｓｇＲＮＡとは対照的に、ＭＰ遺伝子のｓｇＲＮＡ（いわゆるＩ2 ｓｇＲＮＡ）は、ｃａｐ構造がないことが推定される（総説に関しては、オカダ（Okada）, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Soc., B, 354, 569-582を参照）。本発明は、ＴＭＶ  Ｕ１およびｃｒＴＭＶ両方のＩ2 ｓｇＲＮＡにｃａｐ構造が存在しないことを確認する結果を提供する（図７）。
【００２６】
ドーソン（W. Dawson）と共同研究者により、ベクターウイルスからの外来遺伝子の発現に影響を及ぼす重要な因子は、ウイルスゲノムの３’末端に対する外来遺伝子の位置であることが証明されている：発現の効率は、遺伝子が３’末端の近くに入れられると劇的に増大した（クルバー（Culver）ら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2055-2059）。最も高率に発現した遺伝子は、３つのシュードノットとこれに続くｔＲＮＡ様構造よりなる、３’−ＮＴＲ（ＴＭＶ  Ｕ１  ＲＮＡ中）に近接したＣＰの遺伝子である。３末端に対するよりもむしろシュードノット（pseudoknots）に対する遺伝子の近接性が、外来遺伝子の発現を増大させる主要な因子であることが示唆された（シブプラサド（Shivprasad）ら, 1999, Virology 355, 312-323）。ＴＭＶｓｇＰＲ構造の多くの重要な側面は、ドーソン（W. Dawson）グループの努力によって明らかになったが、これらの著者の一般的結論は、「我々はまだ、ベクター構築の経験的な段階にいる」であった（シブプラサド（Shivprasad）ら, 1999, Virology 355, 312-323）。
【００２７】
上記のことは、ＴＭＶゲノムの５’遠位遺伝子が、完全長ＲＮＡにおいて翻訳上サイレントであるため、ｓｇＲＮＡの合成は、これらの遺伝子の発現に必須であることを証明している。サブゲノム化による遺伝子の内因化の機構は、真核生物リボソームが、多シストロン性ｍＲＮＡから５’遠位遺伝子の翻訳を開始できないことを克服するために、ＴＭＶにより使用される方法とみなすことができる。伝統的リボソームスキャニングモデル（コザック（Kozak）, 1999, Gene 234, 187-208）では、多シストロン性真核生物ｍＲＮＡの内部遺伝子は、リボソームに近づけない。
【００２８】
最近、我々は、オレラチア・オフィチナリスＬ（Oleracia officinalis L.）植物から、クリーシファー感染性トバモウイルス（ｃｒＴＭＶ）を単離した。ｃｒＴＭＶの特色は、アブラナ科（Brassicaceae）のメンバーの植物体全体に感染するその能力であった。さらに、このウイルスは、ナス科（Solanaceae）の植物およびＴＭＶ  Ｕ１に感受性の他の植物を、植物体全体に感染することができた。ｃｒＴＭＶのゲノム（６３１２ヌクレオチド）は配列決定（ドロコフ（Dorokhov）ら, 1994, FEBS Letters 350, 5-8）され、そして１２２kDa （ＯＲＦ１）、１７８kDa （ＯＲＦ２）、１２２kDa タンパク質の読み過し産物、３０kDa ＭＰ（ＯＲＦ３）、および１７kDa ＣＰ（ＯＲＦ４）のタンパク質をコードする４つの伝統的ＯＲＦを含むことが証明された。ｃｒＴＭＶ  ＲＮＡの唯一の構造的特色は、他のトバモウイルスと異なり、ｃｒＴＭＶのＭＰおよびＣＰ遺伝子のコード領域が、７５ヌクレオチドだけ重複していること、即ちＣＰコード領域の５’近位部分もまた、ＭＰのＣ末端部分をコードすることであった。
【００２９】
本明細書および請求の範囲の明白かつ一貫した理解を提供するために、このような用語に対して本明細書で与えられる範囲を含めて、以下の定義が提供される：
【００３０】
近接した：所定配列に対してすぐ横の５’または３’のヌクレオチド配列にある位置。
増幅ベクター：宿主細胞中に導入されると、そこで複製できる遺伝子ベクター。
アンチセンス機構：翻訳されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なＲＮＡ分子の細胞内の存在による、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳の速度の制御に基づく遺伝子調節。
キメラ配列または遺伝子：少なくとも２つの異種部分に由来するヌクレオチド配列。この配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでよい。
【００３１】
コード配列：転写および翻訳されると、細胞内ポリペプチドを生成させるデオキシリボヌクレオチド配列、または翻訳されると細胞内ポリペプチドを生成させるリボヌクレオチド配列。
適合性：系の他の成分と共に機能できること。宿主と適合性のベクターまたは植物ウイルス核酸は、その宿主中で複製できるものである。ウイルス性ヌクレオチド配列と適合性のコートタンパク質は、そのウイルス性配列をキャプシド化できるものである。
【００３２】
遺伝子：別々の細胞性産物の基である別々の核酸配列。
発現すべき遺伝子：発現すべき技術的に関係する遺伝子。
宿主：ベクターまたは植物ウイルス核酸を複製することができ、そしてそのウイルスベクターまたは植物ウイルス核酸を含むウイルスで感染させることができる、細胞、組織または生物。この用語は、適宜、原核生物および真核生物細胞、器官、組織または生物体を含むことが意図される。
宿主植物ゲノム：この用語は、好ましくは宿主植物細胞の核ゲノムを意味するが、またミトコンドリアまたはクロロプラストＤＮＡを含んでもよい。
感染：ウイルスまたは増幅に基づくベクターの、その核酸を宿主に移動させるか、または核酸を宿主に導入する能力であって、そしてそこでウイルス核酸またはベクターが複製し、ウイルス性タンパク質が合成され、そして新しいウイルス粒子が組み立てられる。これに関連して、「伝染性」および「感染性」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００３３】
リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）要素、またはＩＲＥＳ：翻訳の段階で内部開始の基になる、ウイルス、細胞または合成起源のヌクレオチド配列。
その下流の遺伝子の翻訳に必要なＩＲＥＳ要素：このようなＩＲＥＳ要素なしには、この遺伝子の技術的に有意な翻訳は起こらないという意味で、該遺伝子の翻訳に有効なＩＲＥＳ要素。
非ウイルス性遺伝子：ウイルスの生活環には機能しない遺伝子。
表現型形質：遺伝子の発現により生じる観察可能な性質。
植物細胞：プロトプラストおよび細胞壁からなる、植物の構造的および生理的単位。
植物器官：根、幹、葉または胚のような、植物の別個の視覚的に識別される部分。
植物組織：生育または栽培する植物の任意の組織。この用語は、植物体全体、植物細胞、植物器官、プロトプラスト、細胞培養物、または構造的および機能的単位に組織化した植物細胞の任意の群を含むことが意図される。
産生細胞：ベクターまたはウイルス性ベクターを複製することができるが、そのウイルスにとって必ずしも宿主ではない、組織または生物体の細胞。この用語は、細菌、酵母、真菌および植物組織のような、原核生物および真核生物細胞、器官、組織または生物体を含むことが意図される。
【００３４】
プロモーター：コード配列の転写の開始に関係している、コード配列の上流に機能的に連結されている５’非コード配列。
プロトプラスト：細胞培養物または植物体全体に再生する能力を有する、細胞壁のない単離した植物細胞。
組換え植物ウイルス核酸：非固有の核酸配列を含むように修飾されている、植物ウイルス核酸。
組換え植物ウイルス：組換え植物ウイルス核酸を含む、植物ウイルス。
【００３５】
レポーター遺伝子：その遺伝子産物を容易に検出できる、遺伝子。
サブゲノムプロモーター（ｓｇＰＲ）：ベクターまたはウイルス核酸のサブゲノムｍＲＮＡのプロモーター。
実質的配列相同性：相互に実質的に機能的に同等であるように相同なヌクレオチド配列を意味する。実質的配列相同性を有するこのような配列の間のヌクレオチドの差は、このような配列によりコードされる遺伝子産物またはＲＮＡの機能への影響が最小であろう。
【００３６】
転写：ＤＮＡ配列の相補的コピーとしての、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の産生。
翻訳：リボソームによるポリペプチドの産生（しばしばメッセンジャーＲＮＡのスキャニングによる）。
【００３７】
ベクター：宿主細胞を遺伝子操作することができる核酸。ベクターは、１本鎖（ｓｓ）（＋）、ｓｓ（−）または２本鎖（ｄｓ）であってよい。
ウイルス：タンパク質中にキャプシド化された核酸を含む、感染性因子。ウイルスは、モノ−、ジ−、トリ−または多成分性ウイルスであってよい。
【００３８】
（本発明の利点）
本発明は、外来（異種、非先天的）遺伝子発現のための増幅に基づくベクターを作成するための新規な方法（これらの遺伝子の翻訳は、多シストロン性ＲＮＡからＩＲＥＳ介在性リボソーム内部侵入機構により、かつ／または感染細胞中のベクターから産生される２シストロン性および多シストロン性のｓｇＲＮＡからＩＲＥＳ介在性ｃａｐ非依存性リボソーム内部侵入機構により、起こりうる）を提供する。いずれの事象においても、ＩＲＥＳ要素は、遺伝子の翻訳に必要である。この方法の利点の１つは、ｓｇＰＲに関してどのような特別な操作も必要としないことである：ベクター中に挿入すべき唯一の配列は、翻訳すべき遺伝子の上流のＩＲＥＳ配列（固有のおよび／または非固有の）である。その結果、下流の遺伝子の翻訳は、挿入されたＩＲＥＳ配列により促進される、即ちこの翻訳は、ｃａｐ非依存性である。ＩＲＥＳ要素を収容する配列セグメントは、好ましくは技術的に有意なほどにはサブゲノムプロモーターとして機能しない。このことは、この配列セグメントが、対応するサブゲノムＲＮＡの検出可能な産生を引き起こさないか、または該配列セグメントの任意の残存サブゲノムプロモーター活性により形成されても、任意のこのようなサブゲノムＲＮＡの翻訳のために、このＩＲＥＳ要素は、下流の遺伝子の翻訳にやはり必要であることを意味する。従って、特別な場合には、ベクターにより産生される第１次の組換えＲＮＡは、以下を含む：好ましくはウイルス起源の１つまたはそれ以上の構造遺伝子、該ＩＲＥＳ配列、ＩＲＥＳの下流に位置する目的の（外来）遺伝子、および３’−ＮＴＲ。この方法により、直列の２つ（またはそれ以上）の外来遺伝子（それぞれが、別々のＩＲＥＳ配列により制御される）の挿入により、２つ以上の外来遺伝子の同時発現が可能になることは重要である。本発明は、好ましくは、ウイルスゲノムまたはそのサブゲノムＲＮＡまたは非固有の（外来）核酸配列のｃａｐ非依存性発現を特徴とし、そして追加の植物特異的ＩＲＥＳ要素を介して、宿主植物で植物体全体でこのような外来配列を発現することができる、核酸および組換えウイルスに関する。
【００３９】
第１の好適な実施態様において、固有のコートタンパク質コード配列および固有のＣＰサブゲノムプロモーターが、ウイルス核酸から欠失しており、そして植物ウイルスＩＲＥＳ要素が上流に位置する非固有の植物ウイルス性コートタンパク質コード配列が挿入されている植物ウイルス核酸が提供されており、このため宿主植物中のｃａｐ非依存性発現が可能になるが、一方組換え植物ウイルス核酸のパッケージング、およびこれに続く組換え植物ウイルス核酸による宿主の植物体全体の感染が維持される。
【００４０】
組換え植物ウイルス核酸は、翻訳要素として機能し、そして転写活性のない（即ち、サブゲノムプロモーターとして有効に機能できない）、１つまたはそれ以上の追加の固有のまたは非固有のＩＲＥＳ要素を含んでもよい。各固有のまたは非固有のＩＲＥＳ要素は、宿主植物において隣接遺伝子または核酸配列のｃａｐ非依存性発現を提供することができる。
【００４１】
第２の好適な実施態様において、外来核酸配列の上流に位置する固有のまたは非固有の植物ウイルスＩＲＥＳ要素が、固有のコートタンパク質遺伝子の下流に挿入された増幅および発現ベクターが提供される。挿入された植物ウイルスＩＲＥＳ要素は、宿主植物の隣接遺伝子のｃａｐ非依存性発現を指令する。非固有の核酸配列を、その配列が宿主植物中で、ＩＲＥＳ要素の転写制御下で発現されて所望の産物を合成するように、ＩＲＥＳ要素に隣接して挿入してもよい。
【００４２】
第３の好適な実施態様において、組換えベクターの核酸が、第２の実施態様と同様に提供されるが、下流に存在する外来の核酸配列を有する固有のまたは非固有の植物ウイルスのＩＲＥＳ要素は、固有のコートタンパク質のサブゲノムプロモーターとコートタンパク質遺伝子の上流に挿入される。
【００４３】
第４の好適な実施態様において、固有のまたは非固有の植物ウイルスのＩＲＥＳ要素が、下流の遺伝子の翻訳をｃａｐ非依存性とするように、ウイルスゲノムまたはウイルスサブゲノムＲＮＡの５’末端で使用される、組換えベクター核酸が提供される。
【００４４】
第５の好適な実施態様において、該ベクターからのｃａｐ非依存性翻訳のレベルを上昇させるために、ｃａｐ依存性翻訳が使用されている。
ウイルスに基づく増幅ベクターは、組換え植物ウイルスを産生するために、組換え植物ウイルス核酸によりコードされるコートタンパク質によりキャプシドに包まれる。組換え植物ウイルス核酸は、宿主中で複製され、宿主中で全体に広がり、かつ宿主中で外来遺伝子のｃａｐ非依存性発現またはウイルスゲノム全体またはサブゲノムＲＮＡのｃａｐ非依存性発現をして、所望の産物を産生することができる。そのような産物には、特に限定されないが、酵素、複合生物分子、またはポリペプチド、またはアンチセンス産生に由来する形質もしくは産物のような治療的および他の有用なポリペプチドを含む。
【００４５】
産生されるタンパク質の具体例には、抗体、抗原、受容体アンタゴニスト、神経ペプチド、酵素、血液因子、第VIII因子、第IX因子、インスリン、プロインスリン、ソマトスタチン、血液アルブミン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、造血因子（例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン３、インターロイキン１１、トロンボポエチン、エリスロポエチンなど）がある。
【００４６】
好ましい入力形質の例は、除草剤に対する耐性、昆虫に対する耐性、真菌に対する耐性、ウイルスに対する耐性、細菌に対する耐性、非生物的ストレスに対する耐性、および改良されたエネルギーと物質利用である。
好ましい出力形質の例は、改質された炭水化物、改質された多糖、改質された脂質、改質されたアミノ酸含有率と含有量、改質された２次代謝物、および薬剤学的タンパク質であり、酵素、抗体、抗原などを含む。
形質制御成分の例は、遺伝子スイッチ、遺伝子発現の制御、雑種の種子生産の制御、および無配偶生殖の制御である。
【００４７】
本発明はまた、植物細胞（および、おそらく酵母または動物細胞でも）で目的の遺伝子のｃａｐ非依存性かつプロモーター非依存性発現を提供する、人工の非固有のＩＲＥＳ要素（生きている生物から単離されたＩＲＥＳではない）の作成法に関する。人工のＩＲＥＳ要素は、いくつかの塩基の含量（特にアデニンとグアニン塩基の含量）に基づいて作成される（例１４を参照）。ＩＲＥＳが単離される生きた生物の例は、動物ウイルスと植物ウイルスである。動物ウイルスの例は、Ｃ型肝炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルスと脳心筋炎ウイルス）およびレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスおよびハービーマウス肉腫ウイルス）である。植物ウイルスの例は、ジャガイモウイルスＸ、ポティウイルス（例えば、ジャガイモウイルスＹおよびターニップモザイクウイルス）、トバモウイルス（例えば、クリーシファー（crucifer）感染性トバモウイルス）、およびコモウイルス（カウピーモザイクウイルス）である。あるいは、固有のＩＲＥＳは、アンテナペディアホメオティック遺伝子、ヒト繊維芽細胞増殖因子２、翻訳開始因子ｅＩＦ−４Ｇ、またはエヌ・タバクム（N. tabacum）熱ショック因子１から得られるような、植物または動物細胞メッセンジャーＲＮＡから単離される（例１４を参照）。人工のＩＲＥＳまたは植物と動物からのＩＲＥＳ要素に基づくＩＲＥＳは、あまり顕著にサブゲノムプロモーター活性を示さない。そのようなＩＲＥＳは、上記実施態様において植物ウイルスＩＲＥＳ要素の代わりに使用される。
【００４８】
第６の好適な実施態様において、真核細胞（酵母、動物細胞および植物細胞を含む）の１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する相補性に基づいて、人工の非固有のＩＲＥＳ要素が作成される。
第７の好適な実施態様において、アデノシン／グアノシン塩基の繰り返しの短いストレッチに基づいて、人工の非固有のＩＲＥＳ要素が作成される。
本発明の第８の好適な実施態様において、植物細胞中でのウイルスゲノム発現が、植物特異的人工の転写プロモーターの制御下で起きる、ウイルスに基づく増幅ベクターの作成法と使用法が提供される。
さらに具体的な実施態様において、植物起源の固有のＩＲＥＳのセグメントであるかまたはこれを含むＩＲＥＳ要素が、本発明のベクターと方法で使用される。
【００４９】
本発明の第９の好適な実施態様において、ウイルスに基づく増幅ベクターの構築法と使用法が提供され、このベクターは、１次核転写体プロセシングの結果として植物細胞中で形成されるレプリコンからの発現を可能にする。
本発明の第１０の好適な実施態様において、植物中での外来遺伝子のｃａｐ非依存性発現のための、環状１本鎖ウイルスに基づく増幅ベクターの使用法が提供される。
【００５０】
本発明の第１１の好適な実施態様において、ｃａｐ非依存性翻訳を促進する条件下で、細胞中で目的の遺伝子の発現を可能にする方法が提供される。ある例では、増幅ベクターで感染される細胞が、ｃａｐ依存性翻訳を阻害する化合物で処理される。別の例では、ベクター自体が、その生成物が宿主中のｃａｐ依存性翻訳に対して阻害作用を有する遺伝子、または該機能を有するアンチセンス配列を含有する。
【００５１】
本発明の第１２の実施態様において、インビボ遺伝子選択を使用することにより、発現ベクター中で目的の遺伝子またはレポーター遺伝子のｃａｐ非依存性発現を提供するＩＲＥＳ配列を同定することを可能にする方法が記載される。
【００５２】
第１３の実施態様において、ベクター中の配列の繰り返しを避け、ベクターの安定性を上昇させるために、本発明のベクターは、異なるウイルスから得られる配列から組み立てられる。この実施態様は、例１３で例示される。
【００５３】
第１４の実施態様において、本発明のベクターまたは前駆ベクターと、該ベクターの増幅と発現を支持する固有のまたは遺伝子操作した植物とを含む、遺伝子発現系が提供される。該系は好ましくは、薬剤学的タンパク質（例えば、抗体、抗原、受容体アンタゴニスト、神経ペプチド、酵素、血液因子、第VIII因子、第IX因子、インスリン、プロインスリン、ソマトスタチン、血液アルブミン、組織型プラスモノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、造血因子（例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン３、インターロイキン１１、トロンボポエチン、エリスロポエチンなど））の発現を支持する。
【００５４】
さらに好ましくは該系は、同じ植物細胞または同じ植物中の２つ以上の遺伝子の発現を提供する。あるいは該遺伝子発現系は、本発明の１つ以上のベクターもしくは前駆ベクターの送達を支持するアグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介宿主系をさらに含んでよい。該アグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介宿主は、発現すべき遺伝子の発現に必要なまたは好適な他の形質の、輸送と一過性もしくは安定な発現を、さらに支持してもよい。
【００５５】
（発明の詳細な説明）
本発明の第１の目的は、外来（異種、非固有）遺伝子発現のための増幅に基づくベクターの新規構築法を提供して、多シストロン性のゲノムウイルスＲＮＡから、および／または増幅ベクター（好ましくは植物細胞中のウイルスベクター）により産生される２シストロン性および多シストロン性のｓｇＲＮＡからの、ＩＲＥＳ介在ｃａｐ非依存性内部リボゾーム侵入機構により、これらの遺伝子の翻訳が起きるようにすることである。
【００５６】
植物での外来遺伝子の導入と発現のための組換え植物ウイルスＲＮＡの構築と増幅に基づくベクターの作成は、多くの著者により、異なる分類群に属するウイルスのゲノムを使用して証明されている（総説については、「植物ウイルスを用いる遺伝子工学（Genetic Engineering With Plant Viruses）」、１９９２年、ウィルソン（Wilson）とデービース（Davies）編、シーアールシープレス社（CRC Press, Inc.）を参照）。トバモウイルスは、ウイルスベクターの構築のための便利な対象であると考えられる。ドンソン（Donson）ら（米国特許第５，３１６，９３１号；５，５８９，３６７号および５，８６６，７８５号）は、宿主植物中で異なる外来遺伝子を発現することができるＴＭＶに基づくベクターを作成した。すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、α−トリコサンチンおよびいくつかの他の外来遺伝子が、ＴＭＶ  ＣＰのサブゲノムプロモーター（ｓｇＰＲ）に隣接して挿入された。ドンソン（Donson）ら（１９９３年、ＰＣＴ  ＷＯ９３／０３１６１）は、トバモウイルスに基づいて、「固有の植物ウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも１つの非固有の植物ウイルスサブゲノムプロモーターと、および植物ウイルスコートタンパク質をコードする配列とを含む組換え植物ウイルス核酸であって、該非固有の植物ウイルスサブゲノムプロモーターは、宿主植物中で隣接核酸配列の転写を開始することができ、組換え植物ウイルス核酸サブゲノムプロモーターと組換えすることができず、該組換え植物ウイルス核酸は、宿主植物で全体に感染することができる、組換え植物ウイルス核酸」を開発した。
【００５７】
ドンソン（Donson）らの技術と異なり、本発明は、ウイルスレプリコンに基づく植物発現系を構築するために、ｓｇＰＲに関係しない。ｓｇＰＲの代わりに、我々の技術は、起源の異なる（ウイルスについて固有のまたは非固有の）ＩＲＥＳ配列を操作し、その配列は、ｓｇＰＲ活性が効果的に欠如し、効果的にｓｇＲＮＡ産生を促進しない。従ってこれらのＩＲＥＳ配列は、ｓｇＰＲの非機能性セグメントであっても、ｓｇＰＲと見なすべきではない。
【００５８】
ｃＤＮＡクローンのインビトロ転写後に得られる完全長ウイルスＲＮＡのｃａｐの無い転写体は、一般的に完全な植物と単離されたプロトプラストに対して非感染性であると一般に考えられている。従って、ウイルス発現ベクターＲＮＡ転写体のキャッピングは、インビトロ転写体感染性の必要条件であると、一般に見なされる。ｃａｐのあるＲＮＡ転写体は、植物へのウイルスベクターＲＮＡの導入に一般的に使用される。ある場合には、ウイルスＲＮＡは、インビトロ組み立ての簡単な方法を使用して、コートタンパク質によりキャプシドに包まれる。すなわち、ベクターＲＮＡを含有するＴＭＶウイルス粒子ならびに偽ウイルス粒子は、ＣＰおよびインビトロ転写体または精製した真のウイルスＲＮＡから、容易に産生することができる。約１５年前、メシ（Meshi）ら（1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5043-5047）により、インビトロで産生された完全長ＴＭＶ  ＲＮＡのｃａｐの無い転写体は、ｃａｐ類似体の非存在下で感染性であるが、その特異的感染性は非常に低いことが証明されている。
【００５９】
本発明では、ＴＭＶ  ＣＰで再組み立てされたｃａｐの無い発現ベクターＲＮＡは、その低い感染性を克服するために、植物接種物中で使用することができる。本発明に記載の少なくとも１つの追加のアプローチは、ｃａｐ非依存性植物ウイルスベクターを用いる植物感染の技術的可能性を開く、これは、適当なＤＮＡプロモーターの制御下で、ウイルスベクターの完全長１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡのコピーを挿入する方法である。宿主植物に組換えウイルスＤＮＡを接種後、植物ウイルスベクター（これは複製可能であり、植物全体に広がることができる）の感染性完全長ＲＮＡが産生されるであろう。すなわち、これらの方法は、ＩＲＥＳ配列により促進される外来遺伝子のｃａｐ非依存性発現の事実とともに、両方のプロセス（すなわち、宿主植物接種と外来遺伝子発現）を完全にｃａｐ非依存性とする。
【００６０】
本発明の重要な好適な目的は、ＣＰ遺伝子と３’ＮＴＲの間に挿入される「ＩＲＥＳ−外来遺伝子」ブロックを用いる、一連のｃｒＴＭＶゲノムに基づくウイルスベクターの作成である。２つの異なるレポーター遺伝子（ＧＵＳとＧＦＰ）と組合せて、種々のＩＲＥＳと制御配列を使用した（図２を参照）。本発明のユニークな特徴は、ウイルスｓｇＰＲ配列の外に位置する外来遺伝子は、感染された植物中で、ベクターにより産生されたゲノムおよびｓｇＲＮＡの３’近位からｃａｐ非依存性に発現されたことである。特に、ｃｒＴＭＶｓｇＲＮＡ  Ｉ2 の５’非翻訳リーダー配列の３’末端部分であるＩＲＥＳMP,75CR配列は、ウイルスベクターで感染された植物中で３’近位外来遺伝子のｃａｐ非依存性発現を仲介するのに効率的であった。該ｃｒＴＭＶに基づくウイルスベクターは、感染植物中で３種類のウイルスとセンスｓｓＲＮＡを産生する：ｉ）完全長ゲノムＲＮＡ、ii）３シストロン性Ｉ2 ｓｇＲＮＡ（我々のデータは、完全長ＲＮＡと異なり、後者のｓｇＲＮＡがｃａｐの無いことを示す。）、およびiii）第１のＣＰ遺伝子と第２の外来遺伝子とを含有する２シストロン性ｓｇＲＮＡ。従って、これらのすべてのＲＮＡは、３’末端が共通であり、ｃａｐのある（完全長かつ２シストロン性）またはｃａｐの無い（３シストロン性）ＲＮＡからの３’近位遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳が、その前のＩＲＥＳ配列により促進される。
【００６１】
ウイルスに基づくベクターの１つの重要な特徴は、その安定性である。しかし外来遺伝子を有するＴＭＶに基づくベクターは、通常野生型ウイルスにより全体に感染することができる植物中で、篩部を介して効率的に移動することはない。これは、組換えウイルスＲＮＡの長さの増加、および／または繰り返し配列の存在（このため、組換えと欠失が起きて、野生型ウイルスへの復帰が起きることがある）が原因かも知れない。子孫集団の野生型ウイルスへの変換は、感染された葉の全体で起きる。そのような組換えを抑制する１つの可能性は、異なる起源（例えば、例１３に例示するようなウイルス起源）の配列要素を使用することである。
ウイルスに基づくベクターの１つの重要な特徴は、外来タンパク質遺伝子の発現レベルとタンパク質蓄積のレベルである。ベクターは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで染色されたＧＵＳに対応して容易に視覚化されるバンドを産生することができる。
【００６２】
宿主植物中で外来配列を発現することができる増幅に基づくベクターの構築に適した技術が、異なるウイルスゲノムに基づいて開発されている（例えば、デッラ−チオッパ（Della-Cioppa）ら、１９９９年、ＰＣＴ  ＷＯ９９／３６５１６を参照）。これらの発明の主要な特徴は、組換え植物ウイルス核酸は、「宿主植物中で隣接核酸配列を転写または発現することができる、１つ以上の非固有のサブゲノムプロモーターを含有する。この組換え植物ウイルス核酸をさらに改変して、固有のコートタンパク質をコードする配列のすべてまたは一部を欠失させ、固有のまたは１つの非固有の植物ウイルスサブゲノムプロモーターの制御下で、非固有のコートタンパク質とコードする配列を含有させるか、または固有のコートタンパク質をコードする配列を非固有の植物ウイルスサブゲノムプロモーターの制御下に置いてもよい」ことである。すなわち、その発明の最も重要な要素は、ウイルスベクターにより人工のｓｇＲＮＡ産生のために使用される、固有のおよび非固有のｓｇＰＲ配列である。本発明を他の発明から区別する重要な特徴は、ＷＯ９９／３６５１６では、外来遺伝子は必ずｓｇＰＲ配列の直接下流に位置することが必要であり、すなわち宿主植物中でウイルスベクターにより産生されるキメラｓｇＲＮＡの５’近位に位置する必要がある。これに対して我々の発明は、外来遺伝子が、３’近位に、またはベクターにより産生される機能活性のあるキメラｓｇＲＮＡ内に位置するように、外来遺伝子を、少なくとも１つ（またはそれ以上）のウイルスゲノムによりｓｇＰＲ（もし存在するなら）から分離されることを、提唱する。すなわち、外来遺伝子発現は、野生型ウイルスの固有のまたは非固有のＩＲＥＳ配列により促進される。
【００６３】
本発明の次の好適な目的は、真核生物の多シストロン性ｍＲＮＡからの５’遠位遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳を促進することができる、新規の非固有のＩＲＥＳ配列、すなわち人工の非固有の合成ＩＲＥＳの構築である。我々は、種々の長さと組成の１８Ｓ  ｒＲＮＡに相補的なシストロン内スペーサーが、２シストロン性Ｈ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＧＵＳ  ｍＲＮＡ中の３’近位ＧＵＳ遺伝子の、ｃａｐ非依存性翻訳を仲介することができることを示す（図１３）。さらに、１６コピーのＧＡＡＡセグメントからなるＩＲＥＳ要素を使用して、高いアデニンヌクレオチド含量を有する人工のＩＲＥＳ要素の翻訳制御下の遺伝子発現が証明される（例１４）。
【００６４】
本発明の最後ではあるが重要な利点は、２つ以上の外来遺伝子（それぞれが、増幅に基づくベクターゲノム中の固有のまたは非固有のＩＲＥＳ配列により先行される）の繰り返し配列を組合せる可能性である。「ＩＲＥＳ−外来遺伝子」のそのようなカセットの発現は、ベクターによる２つ以上の外来タンパク質の同時産生を可能にする。
【００６５】
本発明の原理に従って、ウイルスに基づくベクターの構築のために、異なる分類群に属するウイルスを使用することができる。これは、ＲＮＡおよびＤＮＡ含有ウイルスについても言えることであり、以下にその例を示す（本明細書を通して、それぞれの型の種の名前の前に、それが属する、目名、科名、および属名を記載する。目名、科名、および属名は、これらがＩＣＴＶにより認められている場合は、斜体で示す。引用符中の分類名（斜体ではない）は、この分類が、ＩＣＴＶ国際認可名を持たないことを示す。種名（俗名）は、通常の書体で示す。属または科の正式な割り当ての無いウイルスは、それを記載する）。
【００６６】
ＤＮＡウイルス
環状ｄｓＤＮＡウイルス：科：カリモウイルス（Caulimoviridae）、属：バドナウイルス（Badnavirus）、代表種：コメリナイエローモットルウイルス（commelina ellow mottle virus）、属：カリモウイルス（Caulimovirus）、代表種：カリフラワーモザイクウイルス（cauiiflower mosaic virus）、属「SbCMV様ウイルス」、代表種：ソイビーンクロロチクモトルウイルス（Soybean chloroticmottle virus）、属 「CsVMV様ウイルス"」、代表種：カッサバベインモザイクウイルス（Cassava vein mosaicvirus）、属 「RTBV様ウイルス」、代表種：ライスツングロバシルフォルムウイルス（Rice tungro bacilliformvirus）、属：「ペチュニアベインクリアリング（Petunia vein clearing）様ウイルス」、代表種：ペチュニアベインクリアリングウイルス（Petunia vein clearing virus）。
【００６７】
環状ｓｓＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス（Geminiviridae）、属：マストレウイルス（Mastrevirus）（亜群Ｉジェミニウイルス）、代表種：メイズストリークウイルス（maize streak virus）、属：クルトウイルス（Curtovirus）（亜群IIジェミニウイルス）、代表種：ビートカーリートップウイルス（beet curl top virus）、属：ベゴモウイルス（Begomovirus）（亜群IIIジェミニウイルス）、代表種：ビーンゴールデンモザイクウイルス（bean golden mosaic virus）。
【００６８】
ＲＮＡウイルス
ｓｓＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス（Bromoviridae）、属：アルファモウイルス（Alfamovirus）、代表種：アルファルファモザイクウイルス（alfalfa mosaic virus）、属：ラウイルス（llarvirus）、代表種：タバコストリークウイルス（tobacco streak virus）、属：ブロモウイルス（Bromovirus）、代表種：ブルモモザイクウイルス（brome mosaic virus）、属：ククモウイルス（Cucumovirus）、代表種：キュウリモザイクウイルス（cucumber mosaic virus）。
【００６９】
科：クロステロウイルス（Closteroviridae）、属：クロステロウイルス（Closterovirus）、代表種：ビートイエローウイルス（beet ellows virus）、属：クリニウイルス（Crinivirus）、代表種：レタス感染性イエローウイルス（Lettuce infectious yellows virus）、科：コモウイルス（Comoviridae）、属：コモウイルス（Comovirus）、代表種：ササゲモザイクウイルス（cowpea mosaic virus）、属：ファバウイルス（Fabavirus）、代表種：ブロードビーンウィルトウイルス１（broad bean wilt virus 1）、属：ネポウイルス（Nepovirus）、代表種：タバコリングスポットウイルス（tobacco ringspot virus）。
【００７０】
科：ポチウイルス（Potyviridae）、属：ポチウイルス（Potyvirus）、代表種：ポテトウイルスワイ（Potato virus Y）、属：リモウイルス（Rymovirus）、代表種：ライグラスモザイクウイルス（ryegrass mosaic virus）、属：ビモウイルス（Bymovirus）、代表種：オオムギイエローモザイクウイルス（barley yellow mosaic virus）。
【００７１】
科：セキウイルス（Sequiviridae）、属：セキウイルス（Sequivirus）、代表種：パースニップイエローフレックウイルス（Parsnip yellow fleck virus）、属ワイカウイルス（Waikavirus）、代表種：ライスツングロスフェリカルウイルス（Rice tungro spherical virus）。
【００７２】
科：トムブスウイルス（Tombusviridae）、属：カルモウイルス（Carmovirus）、代表種：カーネーション斑紋ウイルス（carnation mottle virus）、属：ディアンソウイルス（Dianthovirus）、代表種：カーネーションリングスポットウイルス（carnation ring spot virus）、属：マクロモウイルス（Machlomovirus）、代表種：メイズクロロティックモットルウイルス（maize chlorotic mottle virus）、属：ネクロウイルス（Necrovirus）、代表種：タバコネクロシスウイルス（tobacco necrosis virus）、属：トムブスウイルス（Tombusvirus）、代表種：トマトブッシィスタントウイルス（tomato bushy stunt virus）、ｓｓＲＮＡウイルスの割り当てられていない属。
【００７３】
属：カピロウイルス（Capillovirus）、代表種：アップルステムグルービングウイルス（apple stem grooving virus）；
属：カルラウイルス属（Carlavirus）、代表種：カーネーション潜在ウイルス（carnation latent virus）；
属：エナモウイルス（Enamovirus）、代表種：ピーエネーションモザイクウイルス（pea enation mosaic virus）、
属：フロウイルス（Furovirus）、代表種：ムギ類萎縮ウイルス（soil-borne wheat mosaic virus）、属：ホルデイウイルス（Hordeivirus）、代表種：ムギ斑葉モザイクウイルス（barley stripe mosaic virus）、属：イダエオウイルス（Idaeovirus）、代表種：ラズベリブッシィドワーフウイルス（Raspberry bushy dwarf virus）；
属：ルテオウイルス（Luteovirus）、代表種：オオムギイエローモザイクウイルス（barley yellow dwarf virus）；
属：マラフィウイルス（Marafivirus）、代表種：メイズラヤドフィノウイルス（maize rayado fino virus）；
属：ポテックスウイルス（Potexvirus）、代表種：ジャガイモウイルスＸ（potato virus X）；
属： ソベモウイルス（Sobemovirus）、代表種：インゲンマメ南部モザイクウイルス（Southern bean mosaic virus）、属：テヌイウイルス（Tenuivirus）、代表種：イネ縞葉枯ウイルス（rice stripe virus）、
属：トバモウイルス（Tobamovirus）、代表種：タバコモザイクウイルス（tobacco mosaic virus）、
属：トブラウイルス（Tobravirus）、代表種：タバコ茎えそウイルス（tobacco rattle virus）、
属：トリコウイルス（Trichovirus）、代表種：リンゴクロロティックリーフスポットウイルス（apple chlorotic leaf spot virus）、
属：ティモウイルス（Tymovirus）、代表種：ターニップイエローモザイクウイルス（turnip yellow mosaic virus）、
属：ウンブラウイルス（Umbravirus）、代表種：キャロットモットルウイルス（carrot mottle virus）。
【００７４】
陰性ｓｓＲＮＡウイルス：目：モノネガウイルス（Manonegavirales）、科：ラブドウイルス（Rhabdoviridae）、属：シトラブドウイルス属（Cyorhabdovirus）、代表種：レタス壊死性黄変病ウイルス（lettuce necrotic yellows virus）、属：ヌクレオラブドウイルス（Nucleorhabdovirus）、代表種：ポテトイエロードワーフウイルス（potato yellow dwarf virus）；
陰性ｓｓＲＮＡウイルス：科：ブニヤウイルス（Bunyaviridae）、属：トスポウイルス（Tospovirus）、代表種：トマト黄化えそウイルス（tomatc spotted wilt virus）。
【００７５】
ｄｓＲＮＡウイルス：科：パルティティウイルス（Partitjvrridae）、属：アルファクリプトウイルス（Alphacryptovirus）、代表種：シロクローバ潜在ウイルス１（white clover cryptic virus 1）、属：ベタクリプトウイルス（Betacryptovirus）、代表種：シロクローバ潜在ウイルス２（white clover cryptic virus 2）、科：レオウイルス（Reoviridae）、属：フィジーウイルス（Fijivirus）、代表種：フィジーディジーズウイルス（Fiji disease virus）、属：フィトレオウイルス（Phytoreovirus）、代表種：ウンドテュモアウイルス（wound tumor virus）、属：オリザウイルス（Oryzavirus）、代表種：イネラギットスタントウイルス（rice ragged stunt virus）。
【００７６】
割り当てられていないウイルス：ゲノムｓｓＤＮＡ：種バナナバンチイトップウイルス（banana bunch top virus）、種ココナツフォリアーディケイウイルス（coconut foiiar decay virus）、種サブタレニアンクローバースタントウイルス（subterranean clover stunt virus）。
【００７７】
ゲノムｄｓＤＮＡ、種キウリベインイエロイングウイルス（cucumber vein yellowin virus）、
ゲノムｄｓＲＮＡ、種タバコ矮化ウイルス（tobacco stunt virus）、
ゲノムｓｓＲＮＡ、種ニンニクウイルス（Garlic viruses）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種グレープバインフレックウイルス（grapevine fleck virus）、種トウモロコシホワイトラインモザイクウイルス（maize white line mosaic virus）、種オリーブ潜在ウイルス２（olive latent virus 2）、種オーミヤメロンウイルス（ourmia melon virus）、種テンジクアオイスポットウイルス（Pelargonium zonate spot virus）。
【００７８】
サテライトとウイロイド：サテライト：ｓｓＲＮＡサテライトウイルス：亜群２サテライトウイルス、代表種：タバコネクロシスサテライト（tobacco necrosis satellite）、
サテライトＲＮＡ、亜群２  Ｂ型ｍＲＮＡサテライト、亜群３  Ｃ型線状ＲＮＡサテライト、亜群４  Ｄ型環状ＲＮＡサテライト、
ウイロイド、代表種：ジャガイモやせいも病ウイルロイド（potato spindle tuber viroid）。
【００７９】
特に本発明の方法は、好ましくはトバモウイルス（Tobamovirus）属、またはブロモウイルス（Bromoviridae）科、ポチウイルス（Potyviridae）科に属する正センスｓｓＲＮＡウイルス、ならびにＤＮＡ含有ウイルスの組換えゲノムを使用して、ウイルスのレプリコンに基づくベクターの構築に適用することができる。後者の場合、外来遺伝子は、ウイルス遺伝子の下流に位置し、その発現は、ゲノム転写プロモーターからＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写される２シストロン性または多シストロン性のｍＲＮＡからのＩＲＥＳ配列により仲介することができる。
【００８０】
本発明の別の好適な態様は、ｓｓＤＮＡに基づくベクターの構築への本発明の方法の適用に関する。ＩＲＥＳ配列の制御下で外来遺伝子を発現するジェミニウイルス（geminivirus）に基づくベクターは、この態様を例示することができる。ジェミニウイルス（geminivirus）は、対になった準二十面体粒子を有する単成分または２成分の環状ｓｓＤＮＡを有する一群の植物ウイルスである（ハル（Hull）とデービース（Davies）の総説、1983, Adv. Virus Res. 28, 1-45；ムリノー（Mullineaux）ら、1992、「植物ウイルスを用いる遺伝子工学」、ウィルソン（Wilson）とデービース（Davies）編、1992、シーアールシープレス社（CRC Press, Inc.））。ＡおよびＢと呼ぶ２成分ジェミニウイルス（geminivirus）の２つのｓｓＤＮＡ成分は、それぞれ４つと２つのタンパク質をコードする。ＤＮＡ  Ａは、ＤＮＡ複製に関与するＣＰ遺伝子と３つの遺伝子を含有し、ＤＮＡ  Ｂ遺伝子は、ウイルス移動に必須の２つのタンパク質をコードする。トマトゴールデンモザイクウイルス（tomato golden masaic virus）（ＴＧＭＶ）のようなベゴモウイルス（Begomovirus）に属する２成分ジェミニウイルス（geminivirus）のゲノムは、ＣＰ遺伝子が欠失しているにもかかわらず、複製し、ある宿主植物にわたって広がり得ることが証明されている（ガーディナー（Gardiner）ら、1988、EMBO J. 7, 899-904；ジェフリー（Jeffrey）ら、1996, Virology 223, 208-218；アッザム（Azzam）ら、1994, Virology 204, 289-296）。ＢＧＭＶを含むいくつかのベゴモウイルス（Begomovirus）は、篩部制限を示し、管系の細胞に限定される。すなわち、ＢＧＭＶは篩部限定されており、一方ＴＧＭＶは、全体に感染した葉の葉肉組織に侵入することができる（ペティ（Petty）とモッラ（Morra）、2000、アメリカウイルス学会第１９回ミーティングの抄録、１２７頁）。
【００８１】
本発明は、２つの方法により、２成分ジェミニウイルス（geminivirus）ゲノムに外来遺伝子を挿入することを提唱する：（ｉ）その１つの（例えば、ＢＧＭＶ）遺伝子の下流に、特にＣＰ  ＯＲＦが完全であるかまたは３’末端が切断され、ＩＲＥＳ配列が外来遺伝子の上流に挿入されるように、ＣＰ遺伝子の下流に。従って、ｍＲＮＡ転写は、固有のＤＮＡプロモーターから進行し、第１のウイルス遺伝子（またはその一部）、ＩＲＥＳ配列、および３’近位外来遺伝子（その発現はＩＲＥＳにより仲介される）を含む２シストロン性のキメラｍＲＮＡが産生される。あるいは（ii）ウイルスベクターのＲＮＡゲノムの完全長ＤＮＡコピーを、ＣＰ遺伝子プロモーターの制御下で、ＣＰ欠損２成分ジェミニウイルス（geminivirus）のＤＮＡ中に挿入することができる。ＲＮＡベクターウイルスのＲＮＡゲノムは、組換えＤＮＡ  Ａと非修飾ＤＮＡ  Ｂの混合物を接種した植物細胞中のＤＮＡ  Ａ転写の結果として産生される。この方法の利点は、１次接種細胞にベクターを送るためにのみ使用されるビヒクルとして、ジェミニウイルス（geminivirus）ベクターが必要なことである：すべての他の工程は、タバモウイルス（tabamovirus）自身により行われ、細胞性ＲＮＡポリメラーゼによるジェミニウイルス（geminivirus）ベクターＤＮＡ転写後の、ＩＲＥＳを有するベクターＲＮＡの産生、その複製、翻訳、および宿主植物への全体的な拡散、および外来遺伝子発現がある。ｓｓＤＮＡベクターの作成の追加の可能性として、ウイルスｃＤＮＡと外来遺伝子のファジミドへのクローニング、および標準的方法によるｓｓＤＮＡの産生が、言及される。
【００８２】
タバモウイルス（tabamovirus）由来ＩＲＥＳ配列は、動物細胞中で機能活性があることが証明されている（我々の以前の特許出願）ことを考慮すると、本発明の方法は、植物ウイルス由来ＩＲＥＳ配列の制御下で外来遺伝子を発現する新しいベクターを産生するために、組換えウイルスＲＮＡを構築し、動物ウイルス（例えば、トガウイルス（Togaviridae）科、カリシウイルス（Caliciviridae）科、アストロウイルス（Astroviridae）科、ピコルナウイルス（Picornaviridae）科、フラビウイルス（Flaviviridae）科に属するウイルス）に基づいてウイルスベクターを産生するのに使用することができる。植物および動物のためのそのような動物ウイルスに基づくベクターは、ワクチン産生または遺伝子治療の分野で有用となり得る。
【００８３】
しかし、トバモウイルス（Tobamovirus）の棹状ウイルス粒子、特に繊維状のポテックスウイルス（Potexvirus）、カルラウイルス（Carlavirus）、ポティウイルス（Potyvirus）およびクロステロウイルス（Closterovirus）の柔軟で長いウイルス粒子は、本発明の方法を実現するための最適のモデルを提供する。
【００８４】
本発明の別の実施態様において、ウイルスに基づく増幅ベクターが、その５’ＮＴＲ内にＩＲＥＳ配列を含有するように、使用される。ＩＲＥＳ配列の挿入は、ウイルス複製を妨害しないが、ゲノムベクターＲＮＡの転写体の効率的なｃａｐ非依存性翻訳を確実にすることができる。従って該構築体は、ｃａｐ非依存性翻訳を促進するために、（ｉ）該ウイルスベクターに固有または非固有であり、５’近位遺伝子（ＲｄＲｐ）のｃａｐ非依存性翻訳を促進する、５’非翻訳リーダー配列内または下流にＩＲＥＳ配列と、（ii）１つ以上のウイルス構造遺伝子の下流で外来遺伝子の上流に位置する、少なくとも１つの固有のまたは非固有のＩＲＥＳ配列とを、含んでよい。この方法では、ｃａｐの無い完全長ベクター転写体の特異的感染性は、１次接種細胞中の親のＲＮＡ分子の効率的な５’−ＩＲＥＳ介在翻訳のために、上昇するであろう。
【００８５】
さらに好適な実施態様は、該外来遺伝子配列の上流に位置する植物の特異的なＩＲＥＳ配列により仲介される、モノまたは多シストロン性ｍＲＮＡ配列からの外来遺伝子の導入とｃａｐ非依存性発現に基づいて、植物細胞中で１個または数個の目的のタンパク質を産生する方法である。この方法の特徴は、この方法が、いくつかの化合物の助けにより、細胞性ｃａｐ依存性ｍＲＮＡ翻訳を選択的にスイッチオフすることを可能にする方法を含むことである。しかしこの方法は、植物細胞中で人工的に導入されたｍＲＮＡのｃａｐ非依存性のＩＲＥＳ介在翻訳に影響を与えず、従ってｃａｐ非依存性発現を制御し増強することを可能にする。
【００８６】
あるいは、細胞性のｃａｐのあるｍＲＮＡの翻訳を阻害する手段を、ｃａｐ非依存性に外来遺伝子を発現する該ウイルスベクター自体で感染された植物に、適用することができる。細胞性のｃａｐのあるｍＲＮＡの翻訳が妨害される時の条件下で、該ウイルスベクターからの外来遺伝子の選択的発現が起きるであろう。
【００８７】
本発明のベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡベクターでよい。これは、ｓｓ（＋）、ｓｓ（−）またはｄｓでもよい。これは、ウイルスからの既知の増幅法のいずれかを示す。これは、ベクター核酸の複製と、場合により、コートタンパク質の産生、および場合により細胞間の移動または遠隔距離移動のためのタンパク質の産生を含有する。必要な複製および／または被覆および／または移動のための遺伝子は、適切に作成した宿主植物中で、全体的または部分的にコードされる。こうして、互いに適合したベクターと宿主植物からなる系が作成される。
【００８８】
ベクターは、ウイルスから改変されたものでも、または新たに合成されたものでもよい。これは、有効にサブゲノムプロモーター活性の無いＩＲＥＳ要素のみを有してもよい。しかしベクターは、シストロンの数がプロモーターの数より多くなるように、１個または数個のサブゲノムプロモーターを、有効に、サブゲノムプロモーター機能の無い１個または数個のＩＲＥＳ要素とを組合せてもよい。
【００８９】
１つのＩＲＥＳ要素の最も単純な場合を考慮すると、該要素は、該ＩＲＥＳ要素により直接発現される目的の（外来）遺伝子の上流、および場合により、ＩＲＥＳ非依存性に発現されるように、例えば複製のための（ウイルス）遺伝子の下流に存在してもよい。あるいは目的の遺伝子は、ＩＲＥＳ要素の上流であり、ＩＲＥＳ要素非依存性に発現され、かつＩＲＥＳ要素は、下流ウイルス遺伝子の発現のために作用する。これらの最も単純な場合は、もちろん単独でまたは複数で、より複雑なベクター中に取り込まれてもよい。
【００９０】
ベクターは、宿主遺伝子を抑制するために、アンチセンス方向に配列を含有してもよい。この抑制機能は、単独で、または目的の（外来）遺伝子の発現と組合せて存在してもよい。特に好適な場合は、宿主植物の翻訳機構が、全体にベクター遺伝子翻訳の範囲内にあるように、ｃａｐ依存性翻訳に必須の遺伝子（例えば、ｃａｐ依存性翻訳に関連した翻訳開始因子（例えば、ｅＩＦ４）の遺伝子）の抑制を含む。この場合、ベクターは全体にｃａｐ非依存性でなければならない。もちろんベクターは、植物核酸プロセシング機構（例えば、イントロンスプライシング）により、前駆ベクターから植物細胞中で作成してもよい。
【００９１】
翻訳後遺伝子スプライシング（ＰＴＧＳ）を阻害することにより、ＩＲＥＳを介して翻訳されるウイルス遺伝子の発現レベルを増加させることが可能である。１つの方法は、いわゆる抗サイレンシングタンパク質を、目的のタンパク質（例えば、タバコエッチウイルス（tabacco etch virus）からのＨＣ−Ｐｒｏ、またはトマトブッシィスタントウイルス（tomato bushy stunt virus）によりコードされる１９Ｋタンパク質、カスチャウ（Kasschau）とカリントン（Carrington）、1998, Cell, 95, 461-470；ボイネット（Voinett）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, n24, 14147-14152を参照）とともに、同時発現することである。ＰＴＧＳのインヒビターは、安定に（トランスジェニック植物）または一過性に（ウイルスベクター、アグロイノキュレーション（agroinoculation））発現される。
【００９２】
ＩＲＥＳに基づくベクターから発現されるタンパク質はまた、グリコシル化またはタンパク質分解切断などの、宿主植物により支持される翻訳後修飾機構を使用して、修飾してもよい。
【００９３】
ＩＲＥＳ要素は、植物ウイルス起源でもよい。あるいはこれは、植物細胞中の操作要件を満足するなら、他の任意のウイルス起源でもよい。さらに植物細胞中で機能するＩＲＥＳ要素は、合成または人工の要素でもよい。合成は、宿主植物の１８Ｓ  ｒＲＮＡの配列（すなわち、ＩＲＥＳ結合について機能するセグメント）に支配される。これは、充分相補的でなければならない。相補性が充分かどうかは、ＩＲＥＳ機能を試験することにより簡単に追跡することができる。この意味で相補性は、ＧＣ、ＡＵ、およびある程度はＧＵ塩基対合を含む。さらに、そのようなＩＲＥＳ要素は、効率を上げるためにそのような相補配列のマルチマーでもよい。マルチマーは、同一の基本的に相補配列単位または異なる基本的に相補配列単位からなる。さらに、高い翻訳効率を有しかつ有効にサブゲノムプロモーター活性を持たない人工のＩＲＥＳ要素は、指向性進化の方法により作成される（例えば、ＵＳ６，０９６，５４８号またはＵＳ６，１１７，６７９号に記載されている）。これは、それ自体が公知のようにランダム化されたＩＲＥＳ要素配列を有するベクターの集団を用いて、細胞培養でインビトロで行われる。ＩＲＥＳ要素候補の機能的に連結したレポーター遺伝子を発現するクローンは、それ自体公知の方法により選択される。サブゲノムプロモーター活性を示すクローンは排除される。さらにランダム化と選択を行ってもよい。
【００９４】
本発明のベクターのＩＲＥＳ要素は、プロモーター活性が有効に欠如している。これは、残存するサブゲノムプロモーター活性により、ＩＲＥＳ要素に機能的に連結した遺伝子の発現が起きないことを意味する。この作用モードは、標準的な分子生物学的方法、例えばノーザンブロッティング、プライマー伸長分析（分子生物学の最近の進歩（Current Protocols in Molecular Biology）、アウスベル（Ausubel）ら編、１９９９，ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons））、５’ＲＡＣＥ技術（ギブコビーアールエル（GibcoBRL）、アメリカ合衆国）などにより測定される。検出可能なサブゲノムプロモーター活性を示すが、基本的に、転写要素としてよりは翻訳要素として機能するＩＲＥＳ要素も、また本発明の対象であることをつけ加える。そのような区別は、例えばノーザンブロット上の２種類のｍＲＮＡ（すなわち、ｓｇＰＲ活性による短いｍＲＮＡと、ｓｇＰＲ活性によらない長いｍＲＮＡ）の相対量を定量測定することにより得られる。ＩＲＥＳ要素が、基本的に残存ウイルスｓｇＰＲとして機能しないなら、対応する短いｍＲＮＡの相対量は、短いｍＲＮＡと長いｍＲＮＡの合計の２０％未満、好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満でなければならない。すなわち我々は、好適な実施態様として、発現すべき少なくとも１つの非ウイルス遺伝子の配列を有し、植物中での該遺伝子の翻訳に必要な少なくとも１つのＩＲＥＳ要素を有するかまたはコードする核酸を含む植物中で、遺伝子の増幅が可能なベクターを提供するが、ただし、標準的な分子生物学方法により測定する時、該遺伝子の発現は、該ＩＲＥＳ要素配列の転写性ではなく翻訳性から、基本的に得られる。
【００９５】
本発明の新規ベクターは、植物の遺伝子操作の新しい道を開く。第１の可能性として、我々は、植物の構造遺伝子の機能測定に使用することを提案する。これは、遺伝子学に特に関係がある。すなわち、ゲノムが配列決定されている植物が特に関係がある。これは、小規模な（植物−植物）応用である。本発明のベクターは、目的の遺伝子の抑制および／または遺伝子の過剰発現を可能にし、遺伝子機能が強化された形で見つかるため、この用途に特に効果的である。
【００９６】
大規模応用ではベクターは、宿主植物中で形質を生成するかまたはタンパク質を産生するのに使用される。ベクターによる植物の感染は、あらかじめ修飾されていない植物を植えた農場で行われる。これは、野外での植物の遺伝的改変を初めて可能にし、こうして農民は、所望のタンパク質または形質を作成するために、種々の供給源からの種子やベクターの選択において、最大の自由を得る。
【００９７】
本発明の応用のための目的の植物種の例は、コムギ、トウモロコシ、コメ、オオムギ、オートムギ、キビなどの単子葉植物、またはナタネ、カノーラ、テンサイ、ダイズ、エンドウ、アルファルファ、綿、ヒマワリ、ジャガイモ、トマト、タバコなどの双子葉植物である。
【００９８】
以下において本発明を、具体例を使用してさらに説明する。標準的な分子生物学的方法は、サムブルーク（Sambrook）ら（１９８９年，モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）に従って行った。本発明で使用されるプラスミドは、過度の実験をすることなく当業者が明細書の記載に従って、当該分野で容易に入手できる材料を使用して、調製することができる。
【００９９】
（例１）
アブラナ科植物に感染するトバモウイルスの構築
アブラナ科植物の全体に感染することができるアブラナ科トバモウイルス（ｃｒＴＭＶ）と呼ぶ公知のトバモウイルスのウイルス粒子を、モザイク症状を有するオレアラシアオフィシナリス・エル（Olearacia officinalis L.）から単離した。ｃｒＴＭＶ宿主範囲試験の結果を、表１に示す。
【０１００】
プラスミド構築
ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡを、ジデオキシヌクレオチド配列決定法（ドロクホフ（Dorokhov）ら、1994 FEBS Letters 350, 5-8）により性状解析した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに基づく感染性ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡクローンは、ｃｒＴＭＶ  ＲＮＡから、オリゴヌクレオチドｃｒＴＭＶ１−Ｋｐｎ
0004477824.tif 000002
（上流）（ここで、斜体の太字は、ＫｐｎＩ部位の配列であり、下線を引いた小文字は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列であり、大文字は、ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡの５’末端由来であることを示す）；およびｃｒＴＭＶ２
0004477824.tif 000003
（下流）（ここで、斜体の太字は、ＮｏｔＩ部位の配列であり、大文字は、ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡの３’末端由来であることを示す）を使用したＲＴ−ＰＣＲと、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限部位の間へのｐＵＣ１９へのクローニングにより得られた（図１）。
【０１０１】
完全長ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに基づく感染性ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡクローンは、ｃｒＴＭＶ  ＲＮＡからオリゴヌクレオチドｃｒＴＭＶ１−ＳＰ６
0004477824.tif 000004
（上流）（ここで、斜体の太字は、ＫｐｎＩ部位の配列であり、下線を引いた小文字は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのヌクレオチド配列であり、大文字は、ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡの５’末端由来であることを示す）；およびｃｒＴＭＶ２
0004477824.tif 000005
（下流）（ここで、斜体の太字は、ＮｏｔＩ部位の配列であり、大文字は、ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡの３’末端由来であることを示す）を使用したＲＴ−ＰＣＲと、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限部位の間へのｐＵＣ１９へのクローニングにより得られた（図１）。
【０１０２】
完全長ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡクローンは、ジデオキシヌクレオチド配列決定法により性状解析した。ｃｒＴＭＶ感染性転写体がニコチアナ（Nicotiana）とアブラナ科の種に全体に感染する能力は、それぞれニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）サムスン（Samsun）変種とシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）への感染試験により確認した。
【０１０３】
0004477824.tif 000006
【０１０４】
（例２）
ウイルスＩＲＥＳを介するタバコとアブラナ科植物中のＧＵＳ遺伝子の発現のためのトバモウイルスベクターの構築
ＩＲＥＳ介在発現ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＧＵＳのシリーズを、以下のように構築した。第１に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と２対の特異的プライマーにより、Ｔ７／ｃｒＴＭＶベクター（図１）のＳａｃII／ＮｏｔＩ断片のＣＰ遺伝子の末端に、ＨｉｎｄIIIとＸｂａＩ部位を挿入した。第２に、スクラチェフ（Skulachev）ら（1999, Virology 263, 139-154）が記載したＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ、ＩＲＥＳMP,75UI−ＧＵＳ、ＩＲＥＳMP,228CR−ＧＵＳ、ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ、ＩＲＥＳCP,148UI−ＧＵＳ、ＰＬ−ＧＵＳ  ｃＤＮＡを、Ｔ７／ｃｒＴＭＶベクターのＳａｃII／ＮｏｔＩ断片を含有するＨｉｎｄIIIとＸｂａＩ中に挿入して、それぞれＳａｃII−ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ−ＮｏｔＩ、ＳａｃII−ＩＲＥＳMP,75UI−ＧＵＳ−ＮｏｔＩ、ＳａｃII−ＩＲＥＳMP,228CR−ＧＵＳ−ＮｏｔＩ、ＳａｃII−ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ−ＮｏｔＩ、ＳａｃII−ＩＲＥＳCP,148UI−ＧＵＳ−ＮｏｔＩ、ＳａｃII−ＰＬ−ＧＵＳ−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡを得た。第３に、Ｔ７／ｃｒＴＭＶベクターのＳａｃII−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡ断片を、ＳａｃII−ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ−ＮｏｔＩまたはＳａｃII−ＩＲＥＳMP,75UI−ＧＵＳ−ＮｏｔＩまたはＳａｃII−ＩＲＥＳMP,228CR−ＧＵＳ−ＮｏｔＩまたはＳａｃII−ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ−ＮｏｔＩまたはＳａｃII−ＩＲＥＳCP,148UI−ＧＵＳ−ＮｏｔＩまたはＳａｃII−ＰＬ−ＧＵＳ−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡで置換して、それぞれベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75UI−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,228CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148UI−ＧＵＳ（図２）、およびベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳ（図２）を得た。
【０１０５】
（例３）
トランスフェクションしたタバコとアブラナ科植物中のＧＵＳ遺伝子のウイルスＩＲＥＳを介する発現
この例は、ｃｒＴＭＶに基づくベクター：Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75UI−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,228CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148UI−ＧＵＳ（図２）、およびベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳ（図２）で感染させた、ニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthamiana）とシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物中の、ＧＵＳ遺伝子のトバモウイルスＩＲＥＳ介在発現を証明する。
【０１０６】
インビトロ転写
プラスミドＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75UI−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,228CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ（図２）、ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148UI−ＧＵＳ（図２）、およびベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳ（図２）を、ＮｏｔＩで線状化した。ドーソン（Dawson）ら（1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832-1836）が記載したように、組換えプラスミドをインビトロで転写した。ＲＮＡ転写体のアガロースゲル電気泳動は、これらが完全であることを確認した。ＲＮＡ濃度を、アガロースゲル電気泳動と分光光度法により定量した。
【０１０７】
ＧＵＳ検出
ｃａｐのある完全長転写体でトランスフェクションした１０〜１４日後に、接種した葉を採取した。既に記載されている（ジェファーソン（Jefferson）、1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405）ように、ＧＵＳ発現の組織学的検出により、ＩＲＥＳ活性を追跡した。比色法用ＧＵＳ基質を試料にしみこませたが、方法（デブロック（De Block）とデブロウワー（Debrouwer）、1992, Plant J. 2, 261-266）を改変して、反応の中間生成物の拡散を制限した：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）６００μg/mlを含有する０．１１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）；３mMフェリシアン化カリウム；１０mM  ＥＤＴＡ。３７℃で一晩インキュベート後、葉を７０％エタノール中で脱色させ、光学顕微鏡で観察した。
【０１０８】
（例４）
ＩＲＥＳMP,75CRはＭＰｓｇＰＲとして機能しないが、ＴＭＶ感染植物中の翻訳のｃａｐ非依存性内部開始を介してＭＰ遺伝子発現を提供する
本例は、目的の遺伝子のｃａｐ非依存性発現のために、ウイルスベクター中で使用されるＩＲＥＳMP,75CRの可能性を確認するために、異なるアプローチを使用する。
ｃｒＴＭＶ  ＭＰサブゲノムＲＮＡは、１２５ｎｔの長さの５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ）を有し、翻訳阻害性ステムループ２次構造を含有する。
【０１０９】
ＴＭＶ  ＵＩとｃｒＴＭＶ  ＭＰサブゲノムＲＮＡ（Ｉ2 ｓｇＲＮＡ）５’ＮＴＲの長さとヌクレオチド配列を決定するために、レト（Lehto）ら（1990, Virology 174, 145-157）が記載したプライマー伸長実験のプロトコールを、以下のように改変した：（ｉ）ＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ）；（ii）４５℃未満でＲＴ反応；（iii）ＧＣリッチプライマー；（iv）ｄＮＴＰ濃度の上昇；（ｖ）２次構造を避けるためのｄＩＴＰ。ｃｒＴＭＶＩ2 ｓｇＲＮＡの５’ＵＴＲは１２５ヌクレオチドからなることが証明された（図３）。この結果は、直接５ＵＴＲ  ＲＴ配列決定により確認された。図３Ｂは、ｃｒＴＭＶ  ５’ＮＴＲが、安定なヘアピンループ構造を有することを示す。これは、人工の転写体のＭＰ遺伝子のすぐ上流に位置しているため、インビトロでＭＰ遺伝子翻訳を阻害することができる（図４）。これは、５’ＨＩ2CRとＭＰ遺伝子の間に位置するＩＲＥＳMP,75CRが、翻訳の効率的なｃａｐ非依存性内部開始を提供することを意味する。図５は、５ＨＩ2CRと同様に、推定の翻訳阻害性ヘアピンループ構造が、他のトバモウイルスのＭＰ遺伝子の上流１２５ｎｔ配列に露出されることを示す。
【０１１０】
ｃｒＴＭＶとＴＭＶ  ＵＩ  ＭＰサブゲノムＲＮＡはｃａｐがない
ＴＭＶの３０Ｋ移動タンパク質（ＭＰ）遺伝子をコードするサブゲノムＲＮＡの５’末端の構造を調べるために、活性モチーフ（Active Motif）により与えられる「ジャンプ−スタート」法を使用した。ジャンプ−スタート（登録商標）は、ｃａｐのあるｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡタグを特異的に化学的連結する方法である。逆転写の間、既知の配列のリボオリゴヌクレオチドタグは、第１の鎖のｃＤＮＡの３’末端中に取り込まれる。こうして、ＰＣＲに適した公知のプライミング部位が作成される。
【０１１１】
まず、ｃａｐのあるＲＮＡの５’末端の２’−３’−シス−グリコール基を、過ヨウ素酸ナトリウム酸化によりジアルデヒドに変換した。試験ＲＮＡ（１μg/μl）の１〜２μlを、１４μlの純水および１μlの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と混合し、次に４μlの０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムを加え、反応混合物を１時間インキュベートした。
【０１１２】
次に３’−アミノアルキル誘導体化合成リボオリゴヌクレオチドタグを、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下の還元的アミノ化により、酸化ＲＮＡのジアルデヒド末端に化学的に連結させた。５μlの 次亜燐酸ナトリウムを加え、反応混合物を１０分インキュベートした。次に２３μlの水、１μlの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）および２μlのリボ−オリゴヌクレオチドタグ５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（２８．５pmol/μl）を反応混合物に加え、１５分インキュベートした。次に１０μlの水素化ホウ素ナトリウムを加え２時間インキュベートした。次にアセトン中２％過塩素酸リチウム４００μlを加え、−２０℃で１５分インキュベートし、５分遠心分離した。ペレットをアセトンで２回洗浄し、２０μlの水に溶解した。
【０１１３】
多量のＲＮＡタグを除去するために、０．３Ｍ  ＮａＣｌの存在下でＣＴＡＢ沈殿を使用した。ＣＴＡＢは、核酸に結合して不溶性複合体を形成する強陽イオン性界面活性剤である。複合体形成は、塩濃度に影響される：塩濃度が１Ｍより高い時、複合体形成は起きない；これが０．２Ｍより小さいとき、すべての核酸は、効率的に複合体中に含まれる；そして０．３Ｍ〜０．４Ｍの時、複合体への小さい１本鎖核酸の取り込みは非常に非効率的である（ベルヤフスキー（Belyavsky）ら、1989, Nucleic Acids Res. 25, 2919-2932；ベルチオリ（Bertioli）ら、1994, BioTechniques 16, 1054-1058）。１０μlの１．２Ｍ  ＮａＣｌ（最終濃度０．４Ｍまで）と３μlの１０％ＣＴＡＢ（最終濃度１％まで）を加え、反応混合物を室温で１５分インキュベートし、次に５分遠心分離した。ペレットを、１０μlのＮａＣｌに再懸濁し、２０μlの水、および３μlの１０％ＣＴＡＢを加え、反応混合物を室温で１５分インキュベートし、次に５分遠心分離した。ペレットを３０μlの１．２Ｍ  ＮａＣｌに溶解し、８０μlの９６％エタノールを加え、反応混合物を−２０℃で一晩インキュベートした。次にこれを５分遠心分離し、７０％エタノールで洗浄した。次にタグＲＮＡのペレットを２４μlの水に溶解した。
【０１１４】
最後に、３’遺伝子特異的プライマーを用いる逆転写により、５’タグ配列が第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端に取り込まれた。逆転写のために、１２μlのタグＲＮＡ、１μlの特異的３’末端プライマー、２５０mMのトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、３７５mM  ＫＣｌ、１５mM  ＭｇＣｌ2 を含有するスーパースクリプト（登録商標）II（ギブコビーアールエルライフテクノロジーズ（Gibco BRL Life Technologies）のための４μlの５×緩衝液を混合し、９５℃で３０分加熱し、次に氷上にのせた。次に反応混合物に、０．５μlのＤＴＴ（最終濃度が１mMになるように）、２μlの１０mM  ｄＮＴＰ、０．５μlのＲＮＡｓｉｎｅ、０．５μlのスーパースクリプト（登録商標）IIを加え、４２℃で１５分インキュベートした。反応混合物中のＭｎＣｌ2 の存在は、逆転写中でスーパースクリプト（登録商標）がより効果的にｃａｐ構造を克服することを可能にする。３mM  ＭｇＣｌ2 と２mM  ＭｎＣｌ2 を使用すると、逆転写酵素は、非常に高いｃａｐ依存性トランスフェラーゼ活性を示し、典型的にはこの酵素は、５’ｃａｐのあるｍＲＮＡ鋳型の存在下で３〜４個のシトシン残基を優先的に付加した（チェンチク（Chenchik）ら、1998、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子クローニングと分析（Gene cloning and analysis by RT-PCR）、ポールシーバート（Paul Siebert）とジェームズラリック（James Larrick）編、BioTechniques Books, ナティック（NaticK）、マサチューセッツ州；シュミット（Schmidt）とミーラー（Mueller）、1999, Nucleic Acids Res. 27, 331）。
【０１１５】
ＰＣＲ反応のために、各試験ＲＮＡについて２セットのプライマーを使用した（３’特異的／５’特異的プライマーと３’特異的／タグ特異的プライマー）（図６）。
ウイルスＲＮＡが、ｃａｐ構造へ特異的に、タグの公知の配列を有するＲＮＡを化学的連結する方法を使用する可能性を調べるために、ｃａｐがあることが公知（ヅニガン（Dunigan）とザイトリン（Zaitlin）、1990、J. Biol. Chem. 265, 7779-7786）のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）Ｕ１株のゲノムＲＮＡを使用した。特異的プライマーであるＵ１−Ｓｐｎと対応するＲＮＡタグプライマー７７９をＰＣＲ反応で使用すると、各ＰＣＲバンドが検出された（表２、図７）。
【０１１６】
0004477824.tif 000007
【０１１７】
対照として、ＴＭＶ（Ｕ１）の完全なｃＤＮＡクローンのｃａｐの無いＲＮＡ転写体を使用したが、予測したように、ｃａｐ構造は見つからなかった（表２、図７）。
ｃｒＴＭＶのゲノムＲＮＡの５’末端でのｃａｐ構造の存在を試験した。これらの実験のために、ＲＮＡ−タグに対応する特異的ＰＣＲプライマーＫ５、２ＰＭおよびプライマー７７９を取った（表１、図７）。興味深いことに、プライマー７７９と２ＰＭで観察されたＰＣＲバンドの移動度は、予測より速かった（図７）。これは、ｃｒＴＭＶのゲノムＲＮＡの５’末端での強い２次構造の存在を反映しているかも知れない（ドロクホフ（Dorokhov）ら, 1994, FEBS Letters 350, 5-8）。この２次構造は、関連するＴＭＶの５’末端部分には存在しない（ゴエレット（Goelet）ら、1982、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818-5822）。ＴＭＶの完全なｃＤＮＡクローンのｃａｐの無い転写体を用いる対照実験では、予測されたように各ＰＣＲバンドは観察されなかった。
【０１１８】
ＴＭＶ（Ｕ１）ＭＰ遺伝子をコードするサブゲノムＲＮＡについて、５’末端でのｃａｐ構造の欠如が提唱された。我々は、ＲＮＡ−タグに対応する特異的プライマー２２１１、ＵＭ５０−５４およびプライマー７７９を用いて各ｓｇＲＮＡを試験した。ｃａｐ構造は見つからなかった（表２、図７）。
ｃｒＴＭＶの各サブゲノムＲＮＡを用いて、同じ結果が得られ（表２，図７）、これは、トバモウイルスのサブゲノムＲＮＡの５’末端にｃａｐ構造が存在しないことを示している。
ＭＰ遺伝子発現が欠如したＴＭＶ  ＵＩに基づくベクターであるＫＫ６へのＩＲＥＳMP,75CRの挿入は、効率的なｃａｐ非依存性ＭＰ遺伝子発現を提供する。
【０１１９】
ＫＫ６ベクター（レト（Lehto）ら、1990, Virology 174, 145-157）は、２つのＣＰサブゲノムプロモーター（ｓｇＰｒ）を含有する。最初のＣＰｓｇＰｒ−１は、その正しい位置（ＣＰ遺伝子の上流）にあるが、第２のＣＰｓｇＰｒ−２は、ＭＰ遺伝子の上流に置いた。ＭＰ遺伝子は、固有のＭＰｓｇＰｒではなくＣＰｓｇＰｒ−２を介して発現されることが証明された。この挿入の結果として、ＫＫ６は、効率的な細胞間の移動能力を失なった。分析すると、Ｉ2 ｓｇＲＮＡは、その５’非翻訳リーダー中にＩＲＥＳMP,75CR要素を含有しないことが証明された。ＩＲＥＳMP,75CRが欠如したＫＫ６  Ｉ2 ｓｇＲＮＡは、ＭＰ遺伝子を効率的に発現できないと予測される。この仮説を調べるために、ＩＲＥＳMP,75CRを、ＫＫ６のＣＰｓｇＰｒ−２とＭＰ遺伝子の間に挿入すると、子孫中で安定なＫＫ６−ＩＲＥＳMP75を得ることができた（図８）。ＫＫ６−ＩＲＥＳMP75は、ｃｒＴＭＶ  ＩＲＥＳMP75を含有するＩ2 ｓｇＲＮＡの合成を与えることが証明された（図９）。
【０１２０】
ＫＫ６−ＩＲＥＳMP75  Ｉ2 ｓｇＲＮＡの開始は、ＫＫ６と比較して変化しておらず、これは、ＩＲＥＳMP75がＭＰｓｇＰｒとして機能しないことを意味する。
この挿入は、細胞間の移動を大幅に改良した。ＫＫ６はサムスン（Samsun）植物を全体に感染したが、最初の症状は、野生型ＴＭＶ（ＴＭＶ３０４）で誘導された症状（約７日）と比較して、ゆっくり出現した（１５〜１７日）。ＫＫ６感染植物の上の葉の症状が顕著であり、野生型ＴＭＶで、モザイク症状ではなく黄色のスポットが生成した。
【０１２１】
ＫＫ６ウイルスの子孫は、エヌ・グルチノサ（N. glutinosa）で無数の傷害を発生させ、これは野生型ＴＭＶ  Ｕ１が同様した傷害より遅く出現した。ＫＫ６に誘導される局所的傷害の平均サイズは、ＴＭＶ  Ｕ１に誘導されるもの（１．１mm）と比較すると、約０．１mmであった。
【０１２２】
ＫＫ６−ＩＲＥＳMP75を接種された植物は、ＫＫ６感染したサムスン（Samsun）植物のように見えたが：（ｉ）最初の全体的症状がより速く出現し（約１０日）、そして（ii）これらは、黄色のスポットとモザイクを含み、はるかに明るかった。ＫＫ６と比較して、エヌ・グルチノサ（N. glutinosa）中でＫ８６により誘導される局所的傷害の平均サイズは、０．６〜０．７mmに増加した。ＭＰ蓄積の経時変化を調べると、ＫＫ６−ＩＲＥＳMP75ＭＰは、接種された葉ではＫＫ６  ＭＰより早く検出された（図１０）。これらの結果から、ＫＫ６  ＭＰ遺伝子の上流のＩＲＥＳMP75CRの挿入は、細胞間と長距離輸送に欠陥があるＫＫ６の移動性を、部分的に回復させると結論することができる。
【０１２３】
ＴＭＶ  ｃＤＮＡベクターのｃａｐ非依存性ＭＰ遺伝子発現と、トバモウイルスの生活環とにおける、ＩＲＥＳの基本的な役割のさらなる証拠を得るために、一連の追加のＫＫ６に基づくベクターを構築した（図８）。ＫＫ６−ＩＲＥＳMP125 は、固有のヘアピンループ構造を含有し、これは、Ｉ2 ｓｇＲＮＡ（図４）とＩＲＥＳMP75のＷＴｃｒＴＭＶ  ５’リーダーの存在下で、インビトロでＭＰ遺伝子の翻訳を阻害することができる。ＫＫ６−Ｈ−ＰＬは、固有のヘアピンループ構造と７２ｎｔの人工のポリリンカー配列を含有する。ＫＫ６−ＰＬは、ポリリンカー領域のみを含有する。ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）の栽培種サムスン（Samsun）植物（全体的宿主）への感染性試験の結果を、表３に示す。
【０１２４】
図１１は、ＫＫ６に基づくベクターで感染されたタバコの葉へのＣＰ蓄積のウェスタン試験の結果を示す。ＩＲＥＳMP75CRを非機能性ＰＬ−配列で置換すると、ベクター複製が大幅に阻止された。
【０１２５】
0004477824.tif 000008
【０１２６】
（例５）
サブゲノムプロモーター活性の無い人工の非固有のＩＲＥＳ要素の作成は、真核細胞中の目的の遺伝子のｃａｐ非依存性発現を提供する
本例の目的は、サブゲノムプロモーター活性の無い非固有のＩＲＥＳ要素の作成法を示すことであり、これは、真核細胞中の目的の遺伝子のｃａｐ非依存性発現を提供する。
【０１２７】
ＩＲＥＳMP,75CRの１８ｎｔセグメントに基づく人工の非固有のＩＲＥＳ要素の構築
ＩＲＥＳMP,75CRヌクレオチド配列の分析は、これがマルチマー構造を有し、要素（−７２）ＧＵＵＵＧＣＵＵＵＵＵＧ（−６１）の変種であり、シロイヌナズナ（A. thaliana）の１８Ｓ  ｒＲＮＡに高い相補性を有する、４つのヌクレオチド配列セグメントを含有することを示す（図１２）。人工の非固有のＩＲＥＳを設計するために、１８ｎｔの配列ＣＧＵＵＵＧＣＵＵＵＵＵＧＵＡＧＵＡを選択した。
【０１２８】
４つのオリゴを合成した：
0004477824.tif 000009
【０１２９】
プライマーＭＰ１（＋）とＭＰ１（−）を互いにアニーリングして、ｄｓＤＮＡ断片Ａを得た：
0004477824.tif 000010
【０１３０】
プライマーＭＰ２（＋）とＭＰ２（−）を互いにアニーリングして、ｄｓＤＮＡ断片Ｂを得た。
【０１３１】
0004477824.tif 000011
【０１３２】
両方の断片をＰｓｔＩで消化し、互いに結合させた。アガロース電気泳動を使用して、結合産物Ａ＋Ｂを抽出し、ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで消化し、次にＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩクローニング部位を使用して、スクラチェフ（Skulachev）ら（1999, Virology 263, 139-154）が記載したｈＧＦＰ−ＧＵＳベクター中に連結した（図１３）。
【０１３３】
結果
図１３に示す転写体を、スクラチェフ（Skulachev）ら（1999, Virology 263, 139-154）が記載したように赤血球溶解物（ＲＲＬ）中で翻訳し、合成した生成物をゲル電気泳動により分析した。図１３に示した結果は、ＩＲＥＳMP,75CRの１８ｎｔセグメントに基づく人工の非固有の配列が、３’近位に局在化したＧＵＳ遺伝子発現を与えることを示す。これは、２つの特徴（すなわち、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対する相補性とマルチマー構造）が、ＩＲＥＳMP,75CR機能と有効性に必須であることを示す。
１８ｎｔセグメントのテトラマーは、ＩＲＥＳMP,75CR活性のレベルに達しないが、１８Ｓ  ｒＲＮＡに相補的な１２ｎｔセグメントＧＣＵＵＧＣＵＵＵＧＡＧを使用して、人工の非固有のＩＲＥＳ要素の活性を改良する方法がある。
【０１３４】
ＩＲＥＳCP,148CRの１９ｎｔセグメントを使用する人工の非固有のＩＲＥＳの構築
ＩＲＥＳCP,148CR活性に必須の構造要素（図１４〜１７）の分析は、ポリプリン（ＰＰ）セグメントがＩＲＥＳCP,148CR機能に決定的に重要であることを示す。ＰＰ領域の顕著な要素として、１９ｎｔ配列中の９ｎｔの直接の繰り返し：ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧ（直接繰り返し（ＤＲ）と呼ぶ）を、人工のＩＲＥＳの構築のために使用した。ＤＲのテトラマーを得るために、以下のプライマーを使用した。
【０１３５】
0004477824.tif 000012
【０１３６】
上記実験法に従って、以下のＩＲＥＳ要素をシストロン間スペーサーとして使用した：
0004477824.tif 000013
【０１３７】
結果
図１３に示す転写体を、スクラチェフ（Skulachev）ら（1999, Virology 263, 139-154）が記載したように赤血球溶解物（ＲＲＬ）中で翻訳し、合成した生成物をゲル電気泳動により分析した。図１３に示した結果は、ＩＲＥＳCP,148CRの繰り返し１９ｎｔセグメントに基づく人工の非固有の配列が、３’近位に局在化したＧＵＳ遺伝子の効率的な発現を与えることを示す。
【０１３８】
（例６）
感染細胞中でレプリカーゼ遺伝子をｃａｐ非依存性に発現するＴＭＶ  ｃＤＮＡ転写ベクター
本例の主要な目的は、ｃａｐ非依存性にレプリカーゼ遺伝子を発現させる５’ＵＴＲが修飾された２つの新しいＴＭＶ  Ｕ１に基づくウイルスを得ることであった：
【０１３９】
１）ＴＭＶのオメガリーダーは、ＩＲＥＳMP,75CRにより完全に置換した。
0004477824.tif 000014
２）ＴＭＶ  ５’ＵＴＲの最初の８ヌクレオチドは、ウイルス複製に必須であると考えられている（ワタナベ（Watanabe）ら, 1996, J. Gen. Virol. 77, 2353-2357）ため、ＩＲＥＳMP,75CRは、最初の８ヌクレオチドを完全なまま残してＴＭＶに挿入した：
0004477824.tif 000015
【０１４０】
以下のプライマーを使用した：
ａ）ＳＰ６−ＩＲＥＳ−１（第１の変種の場合）
0004477824.tif 000016
ｂ）ＳＰ６−ＩＲＥＳ−２（第２の変種の場合）
0004477824.tif 000017
ｃ）ＩＲＥＳ−ＮｃｏＩ（３’末端にＮｃｏＩ部位を持つＩＲＥＳを得るための逆進プライマー）：
0004477824.tif 000018
ｄ）ＴＭＶ−ＮｃｏＩ（ＴＭＶポリメラーゼを得るための前進プライマー、ＮｃｏＩ部位から開始）：
0004477824.tif 000019
ｅ）ＴＭＶ−Ｘｈｏ（ＡＵＧからＳｐｈＩ部位までのレプリカーゼの５’部分を得るための逆進プライマー）：
0004477824.tif 000020
【０１４１】
クローニング方法：
オリゴＳＰ６−ＩＲＥＳ１およびＩＲＥＳ−ＮｃｏＩならびにｃｒＴＭＶクローンを鋳型として用いて、ＰＣＲ断片Ａを得た。ＰＣＲ断片Ｂは、オリゴＴＭＶ−ＮｃｏＩおよびＴＭＶ−ＸｈｏＩならびにＴＭＶ−３０４Ｌクローンを用いて得た。断片ＡおよびＢは、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクター中にＸｂａＩおよびＸｈｏＩ部位を用いて同時にクローン化した（断片を、ＮｃｏＩ部位により連結した）。同じ手順を適用して、ＳＰ６−ＩＲＥＳ２オリゴを用いてウイルスの第２の変種を得た。
次の段階で、ウイルスゲノムを回復させるためにＳｐｈＩおよびＫｐｎＩ部位を用いて、ＴＭＶ  ｃＤＮＡ全体を、得られたベクター中にクローン化した（図１８）。
【０１４２】
（例７）
アクチン２転写プロモーターに基づくトバモウイルスベクター：Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶおよびＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ  ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ
本例の主要な目的は、新しいｃｒＴＭＶに基づくベクターの作成方法を示すことであり、これにより、植物細胞中のウイルスゲノムが効率的なアクチン２転写プロモーターの制御下に来る。これによって、植物中の遺伝子発現のために、ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳを使用することが可能になる。
【０１４３】
ｐＵＣ１９へのＡｃｔ２のクローニング
Ａｃｔ２転写プロモーター（約１０００bp）は、ＫｐｎＩおよびＰｓｔで消化してプラスミドｐＡＣＲＳ０２９から切り出して、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１９中にクローン化した。
【０１４４】
ｃｒＴＭＶゲノム開始点の上流のプラスミドＴ７／ｃｒＴＭＶ（図１を参照）におけるＰｓｔＩ部位の作成
前進プライマー：
0004477824.tif 000021
（ＰｓｔＩ部位は下線を引いてある）および逆進プライマー：
0004477824.tif 000022
（ＰｖｕＩ部位も下線を引いてある）を使用して、ＰＣＲにより得たｃｒＴＭＶゲノムの５’末端部分の３３４ｎｔのｃＤＮＡ断片を、ＭｕｎＩおよびＰｓｔＩで消化して、Ｔ７／ｃｒＴＭＶのＫｐｎＩとＭｕｎＩ制限部位の間にアクチン２プロモーター（ｐＵＣＡｃｔ２からのＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片）と一緒に挿入した。
【０１４５】
追加配列のないＡｃｔ２転写開始点へのｃｒＴＭＶの５’末端の融合
この工程は、最終構築体Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ（図１９）を得るためにＡｃｔ２およびｃｒＴＭＶの両方に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて部位特異的突然変異誘発により行った。
ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ（図２０）を得るために、プラスミドＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ（図１９）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡ断片を、ＩＲＥＳMP,75CRの制御下でＧＵＳ遺伝子を含むＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ構築体（図２）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ  ＤＮＡ断片で置換した。
【０１４６】
（例８）
環状１本鎖トバモウイルスベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ（図２１）の作成
本例の主要な目的は、植物中の外来遺伝子発現のために環状１本鎖ＤＮＡベクターの使用可能性を証明することである。
ＫＳ／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ（図２１）を構築するために、ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳの９．２kbのＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡ断片を、ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩで消化し、ファージｆ１複製開始点を含む、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ＋（ストラタジーン（Stratagene））中に挿入した。ベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳの１本鎖ＤＮＡは、サムブルーク（Sambrook）ら, 1989（分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク）により調製して、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）の葉による微粒子衝撃実験において使用した（前記例を参照）。ＧＵＳ発現は、射撃の２〜３日後に通常の組織化学染色により検出した。
【０１４７】
（例９）
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からのオレオシン（oleosin）イントロンを含むトバモウイルスベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ−Ｉｎｔ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳの作成
本例の主要な目的は、転写配列プロセシング後に除去すべきシロイヌナズナのオレオシン遺伝子イントロンを含むベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳを作成することである（図２２）。
【０１４８】
クローニング方法は、以下の工程を含む：
１．シロイヌナズナ（A. thaliana）のオレオシン遺伝子イントロンのクローニング
シロイヌナズナのオレオシン遺伝子イントロンは、シロイヌナズナゲノムＤＮＡおよび特異的プライマー：A. th./Int（前進）
0004477824.tif 000023
（ＰｓｔＩ部位は下線が引かれており、小文字はｃｒＴＭＶの５’末端配列を示す）およびA. th./Int（逆進）
0004477824.tif 000024
（ＳｔｕＩは下線を引いてある）を用いるＰＣＲにより得た。
【０１４９】
２．ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡの３３４ｎｔの５’末端断片へのシロイヌナズナのオレオシン遺伝子イントロンの挿入
シロイヌナズナのオレオシン遺伝子イントロンを含むｃＤＮＡは、ＰｓｔＩ／ＳｔｕＩで消化して、ｃｒＴＭＶゲノムの１０〜３３４位に対応するプライマー：
0004477824.tif 000025
（Ｓｔｕ位部位は下線を引いてある）および
0004477824.tif 000026
（Ｐｖｕ位部位は下線を引いてある）を用いるＰＣＲにより得たＤＮＡ断片と連結した。
次の工程は、例７に記載されるとおりとした（例１８も参照）。
【０１５０】
（例１０）
２シストロン性転写ベクター、３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳ（図２３）および３５Ｓ／ＧＵＳ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＣＰ（図２４）を含むＩＲＥＳMP,75CRでトランスフェクションしたタバコプロトプラスト中のＧＵＳ遺伝子発現に及ぼす、翻訳のｃａｐ依存性開始のインヒビターとしてのラパマイシン（rapamycin）の影響
【０１５１】
本例の目的は、目的の遺伝子のＩＲＥＳ介在性ｃａｐ非依存性翻訳の効率を上昇させるために、ｃａｐ依存性翻訳のインヒビターを使用することの主な可能性を証明することである。
翻訳のｃａｐ依存性開始のインヒビターとして、ラパマイシンを選択した。最近、４Ｅ−ＢＰ１（ｅＩＦ−４Ｅ結合タンパク質−１）またはＰＨＡＳ−１と呼ばれるｃａｐ介在性翻訳の新規なリプレッサーが性状解析された（リン（Lin）ら, 1994, Science 266, 653-656；ポーズ（Pause）ら, Nature 371, 762-767）。４Ｅ−ＢＰ１は、熱−および酸−安定性タンパク質であり、その活性は、リン酸化により調節される（リン（Lin）ら, 1994, Science 266, 653-656；Pauseら, Nature 371, 762-767）。４ＥＢＰ１をｅＩＦ−４Ｅと相互作用すると、インビトロでもインビボでもｃａｐ依存性翻訳の特異的阻害が起こる（ポーズ（Pause）ら, Nature 371, 762-767）。ラパマイシンが、４Ｅ−ＢＰ１の脱リン酸化およびその結果としての活性化を誘導することが証明されている（ベレッタ（Beretta）ら, 1996, EMBO J., 15, 658-664）。
【０１５２】
ＩＲＥＳ−およびＧＵＳ遺伝子−含有ベクター３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳ（図２３）、３５Ｓ／ＧＵＳ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＣＰ（図２４）の作成ならびに３５Ｓに基づくｃＤＮＡによるタバコプロトプラストトランスフェクションの方法は、スクラチェフ（Skulachev）らにより報告された（1999, Virology 263, 139-154）。ラパマイシンにより処理したタバコプロトプラストとＧＵＳ遺伝子を３’および５’近位の位置に含む２シストロン性ｃＤＮＡでトランスフェクションしたものにおけるＧＵＳ遺伝子発現を比較すると、ＧＵＳ遺伝子のＩＲＥＳ介在性ｃａｐ非依存性翻訳を増大させる可能性が示される。
【０１５３】
（例１１）
２シストロン性転写ベクター３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳ（図２３）および３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳを含む、ＩＲＥＳMP,75CRでトランスフェクションしたタバコプロトプラスト中のＧＵＳ遺伝子発現に及ぼす、翻訳のｃａｐ依存性開始のインヒビターとしてのポティウイルスＶＰｇの影響
【０１５４】
本例は、ｃａｐ依存性翻訳を阻害するために遺伝子産物を使用することの主な可能性を証明する（図２５）。最近、ターニップモザイクポティウイルス（ＴｕＭＶ）のゲノムに結合したウイルス性タンパク質（ＶＰｇ）とシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の真核生物翻訳開始因子ｅＩＦ（イソ）４Ｅの間の相互作用が、報告されている（ウィットマン（Wittman）ら, 1997, Virology 234, 84-92）。ＶＰｇの相互作用ドメインは、３５アミノ酸のストレッチにマッピングされ、この領域内のアスパラギン酸の置換は、この相互作用を完全に破壊した。ｃａｐ構造類似体ｍ7ＧＴＰ（ＧＴＰではない）は、ＶＰｇ−ｅＩＦ（イソ）４Ｅ複合体形成を阻害したが、このことは、ＶＰｇと細胞内ｍＲＮＡが、ｅＩＦ（イソ）４Ｅ結合に関して競合することを示唆している（レオナード（Leonard）ら, 2000, J. Virology 74, 7730-7737）。
【０１５５】
ｅＩＦ（イソ）４Ｅに結合するＶＰｇの能力は、ｃａｐ依存性翻訳の阻害のために使用することができた。我々は、ＣＰが、ポティウイルスジャガイモＡウイルスからのＶＰｇと融合した、ベクター３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳ（図２５）を使用することを提案する。３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳまたは３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳでトランスフェクションしたプロトプラスト中のＧＵＳ遺伝子発現を比較すると、ＩＲＥＳ介在性およびｃａｐ非依存性ＧＵＳ遺伝子発現を増大させることができるであろう。
【０１５６】
（例１２）
ＴＭＶベクターを用いるＩＲＥＳ配列またはサブゲノムプロモーターのインビボ遺伝子選択
本例は、ウイルスベクターにおいて目的の遺伝子のｃａｐ非依存性発現を与える、サブゲノムプロモーターまたはＩＲＥＳ配列のインビボ遺伝子選択法または指数的濃縮によるリガンドの系統的進化法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）の可能性を証明する。このアプローチは、多数のランダム配列からの並列選択法、さらには配列進化法を用いることを提案する（エリントン（Ellington）とゾスタック（Szostak）, 1990, Nature 346, 812-822；ターク（Tuerk）とゴールド（Gold）, 1990, Science 249, 505-510；カーペンター（Carpenter）とサイモン（Simon）, 1998, Nucleic Acids Res. 26, 2426-2432）。
【０１５７】
このプロジェクトは、以下を包含する：
１．以下の要素（５’−３’方向）を含む、ｃｒＴＭＶに基づく欠乏−干渉（defective-interfering）（ＤＩ）転写配列のインビトロ合成：（ｉ）Ｔ７転写プロモーター、（ii）ウイルスゲノム相補的（マイナス鎖）合成を担当する配列を含むＴＭＶゲノムの５’末端部分、（iii）ウイルスレプリカーゼのＮ末端部分をコードする配列、（iv）７５ｎｔのランダム化塩基を含む配列、（ｖ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）遺伝子、（vi）集合体（Ｏａ）のｃｒＴＭＶ開始点、および（vii）マイナス鎖ゲノムプロモーター配列を含むｃｒＴＭＶゲノムの３’末端部分（図２６）。
２．ｃｒＴＭＶゲノムＲＮＡ（図１）との、転写配列によるタバコプロトプラストの同時トランスフェクション。プロトプラストは、カナマイシンを含む培地中で増殖および再生する。
３．カナマイシンの存在下でプロトプラストの生存および再生を可能にするＩＲＥＳまたはサブゲノムプロモーター要素の選択および単離。
【０１５８】
（例１３）
異種ウイルスＩＲＥＳを含むＴＭＶ−Ｕ１に基づくベクターの作成
例２に記載したｃｒＴＭＶに基づくベクターのセットは、同じｃｒＴＭＶゲノムからとった相同的なウイルスＩＲＥＳ配列を含む。これは、異なる長さの直接反復を作成し、そしてこれが、植物感染中にしばしばベクターの不安定性を引き起こす（チャップマン（Chapman）ら, 1992, Plant J. 2(4), 549-557、シブプラサド（Shivprasad）ら, 1999, Virology 255, 312-323を参照）。これを避けるために、ＴＭＶ−Ｕ１ゲノムと異種ＩＲＥＳMP,75CR配列の組合せを選択した。ベクター作成のために異なるトバモウイルスを試みる別の理由は、ｃｒＴＭＶとは対照的に、ＴＭＶ−Ｕ１は、宿主範囲がより限定されている（表１を参照）が、またニコチアナ種においては毒性が高い（例えば、これは、より高レベルまで蓄積し、ニコチアナ・ベンサミアナ（N. benthamiana）およびニコチアナ・タバクム（N. tabacum）において、より重篤な症候を示す）ためである。
【０１５９】
プラスミドＴＭＶ３０４（図２７）（ドーソン（Dawson）ら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832-1836；レト（Lehto）ら, 1990, Virology 174, 145-157）を出発物質として採用した。ウイルスゲノムに追加のＨｉｎｄIIIおよびＸｂａ位制限部位を導入するために、４つのプライマーを注文した：
0004477824.tif 000027
【０１６０】
ＣＰおよびＭＰ遺伝子のＣ末端部分のＰＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチド１と２を使用し、３’非翻訳領域を増幅するために３と４を使用した（図２８）。次に両方のＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIまたはＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化して、ＴＭＶ３０４中に、ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ挿入配列（ｐＩＣＨ７６６、ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩからとった）またはＩＲＥＳMP,75CR−ｅＧＦＰ（ｐＩＣＨ１０４１、ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩ）挿入配列（４断片連結）（図２８）のいずれかと一緒に、ユニークなＮｃｏＩおよびＫｐｎＩの間にクローン化した。その結果、構築体ｐＩＣＨ１８６５（ＧＦＰを含む）およびｐＩＣＨ１８７１（ＧＵＳを含む）を得た（図２９）。植物感染のために、これらのプラスミドをＫｐｎＩで線状にし、ＳＰ６プロモーターを用いてインビトロで転写して、前述のようにニコチアナ・ベンサミアナ植物体に接種した。接種の７日後（days post inoculation）（dpi）にＧＵＳ染色を実施した（例３を参照）。図３１Ａは、接種された葉ではＧＵＳ発現を示すが、植物の葉全体では示されない。ＧＦＰ含有ウイルス構築体で同様の結果が得られた。
【０１６１】
（例１４）
ＴＭＶ−Ｕ１に基づくベクター：外来遺伝子は、植物由来のＩＲＥＳまたはサブゲノムプロモーター活性のない合成ＩＲＥＳを介して発現することができる
２つの追加のＴＭＶ−Ｕ１に基づくベクターを作成した。クローニングのために異なる非ウイルスＩＲＥＳ配列を使用した：第１に、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）熱ショック因子１（ＮｔＨＳＦ−１、ＥＭＢＬ／ジーンバンク（EMBL/Genbank）ヌクレオチドデータベース、受け入れ番号ＡＢＯ１４４８３）の４５３ｎｔの５’非翻訳リーダー配列、そして第２に、人工配列（ＧＡＡＡ）×１６。両方の配列とも、インビトロ（ウサギ赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物）およびインビボ（タバコプロトプラスト、ＨｅＬａ細胞）でＩＲＥＳ活性を示した。
【０１６２】
ＴＭＶ−Ｕ１に基づくベクターの新しいバージョンを得るために、ｐＩＣＨ１８７１（ＴＭＶ−Ｕ１−ＧＵＳ）プラスミド（図２９および前例を参照）をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化して、２つの挿入配列：ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片（同一構築体由来、ＣＰおよび部分的ＭＰ遺伝子）ならびにプラスミドｈＧＦＰ−ＮｔＨＳＦ−ＧＵＳおよびｈＧＦＰ−（ＧＡＡＡ）×１６−ＧＵＳ（未発表）由来のＨｉｎｄIII／Ｓａｌ断片（ＩＲＥＳ−ＧＵＳ）（図３０）と連結した。
【０１６３】
ｐＩＣＨ４２３５（ＮｔＨＳＦ配列を含む）およびｐＩＣＨ４２４６（人工ＩＲＥＳ  ＧＡＡＡ×１６を含む）から得られた転写配列のニコチアナ・ベンサミアナへの接種は、常法で実施した（前例を参照）。ＧＵＳ発現は、７dpiに分析した。結果は、両方の場合にＧＵＳ遺伝子の発現レベルが、ウイルス起源のＩＲＥＳ（例えば、ＩＲＥＳMP,75CRまたはＩＲＥＳCP,148CR、図３１Ｂ、Ｃ）により達成されたレベルに匹敵することを示している。これらの構築体に使用されるＩＲＥＳ配列（植物ゲノムから採られたか、または人工的に作成された）は、サブゲノムプロモーター活性を全く含まないことは明らかである。ｐＩＣＨ４２４６による感染はまた、ＧＵＳ遺伝子を含む他の全てのウイルス性構築体と同様に、ベクターの不安定性を示し、これは、野生型に復帰して、まもなく全体性感染の症候が現れた（７〜８dpi）。ｐＩＣ４２３５（ＮｔＨＳＦ配列）の場合には、上部の葉の症候は、１４dpiでも認識できないが、２０〜２１dpiにやっと出現し始めた。このことは、長く（４５３塩基対）高度に構造化された非ウイルスＩＲＥＳ配列を持つ４２３５が、他の関連ベクターよりもはるかに安定であり、そしてＧＵＳ（１．８kb）より小さい遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の安定な全体性発現の良好な機会を与えることを意味する。
【０１６４】
（例１５）
土壌浸潤は、植物中のＩＲＥＳに基づくウイルス性ベクターを介して外来タンパク質を発現するための迅速で安価で効率的方法を提供する
第１工程として、Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＦＰ構築体（プラスミドｐＩＣＨ３０１１）を、二元ベクターｐＩＣＢＶ１０（アイコン・ジェネティクス社（Icon Genetics GmbH））中にクローン化した。ｐＩＣＢＶ１０は、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄIIIにより消化して、ｐＩＣＨ３０１１からのＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ断片およびｎｏｓ転写ターミネーター（同一構築体からのＮｏｔＩ／ＨｉｎｄIII断片）と連結した。生じたプラスミド（ｐＩＣＨ４４７１）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＧＶ３１０１株）中に形質転換した。５mlの液体培養液中でコロニーを一晩増殖させて、普通の手順を用いてニコチアナ・ベンサミアナ植物体への土壌浸潤を実施した。接種葉におけるＧＦＰ発現は、浸潤の６〜７日後にＵＶ灯で検出できた。
【０１６５】
（例１６）
トバモウイルスベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CRからの薬剤タンパク質の発現
植物の葉における薬剤タンパク質発現のために、シロイヌナズナ（Arabidopsis）アクチン２プロモーターの制御下で、ｃｒＴＭＶに基づくウイルス性ベクターを使用した（アン（An）ら, 1996, Plant J. 10, 107-121）。この作成した基本ベクターｐＩＣ３０１１は、内部翻訳開始を介して、ＩＲＥＳｃｐ１４８の下流に挿入された外来遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を発現することができる。Ｂ型肝炎タンパク質を植物中で発現するために、対応するｃｒＴＭＶに基づくウイルス性ベクターを作成した。Ｂ型肝炎タンパク質遺伝子は、ｐＩＣ３０１１中に挿入し、続いて追加のＩＲＥＳｃｐ１４８を、ＣＰ遺伝子と３’末端非翻訳ウイルス性配列との間に入れた。生じるプラスミドは、ｐＩＣＰ１２６０（＃６２Ｃ、Ａｒａｂ．Ａｃｔ２プロモーター：ｃｒＴＭＶ：ＩＲＥＳｃｐ１４８ｃｒ：Ｂ型肝炎タンパク質）と呼んだ。これは、タングステン粒子と共に沈殿し、微粒子衝撃実験に使用した。分離したニコチアナ・ベンサミアナの葉の微粒子衝撃法は、モロゾフ（Morozov）ら（1997, Journal of General Virology 78, 2077-2083）に記載されたように、高圧ヘリウムに基づくＰＤＳ−１０００装置（バイオ−ラッド（Bio-Rad））によるフライングディスク法を用いて実施した。ｐＩＣＰ１２６０を射撃したニコチアナ・ベンサミアナの葉は、射撃の４日後（days post bombardment）（d.p.b.）にウェスタンブロッティングにより試験して、Ｂ型肝炎タンパク質のある程度の発現を示した（全タンパク質の０．０５％未満）。
【０１６６】
ヒト抗体（ＦＡＴおよびＯＡＴ重鎖および軽鎖；スノール（Sunol）から受領）の発現のために、別のｐＩＣ３０１１に基づくベクターを作成した。植物シグナルペプチドと融合したヒト化抗ＴＦメガＩｇＧ１（ＦＡＴ）およびＩｇＧ４（ＯＡＴ）の重鎖を、ｃｒＴＭＶ  Ａｒａｂ．Ａｃｔ２駆動のベクター中にクローン化して、ｐＩＣＰ１２８４（＃１０１Ｃ、Ａｒａｂ．Ａｃｔ２プロモーター：ｃｒＴＭＶ：ＩＲＥＳｃｐ１４８（ｃｒ）：ｐｓｐＦＡＴ−ＨＣ）およびｐＩＣＰ１２８３（＃８９Ｃ、Ａｒａｂ．Ａｃｔ２プロモーター：ｃｒＴＭＶ：ＩＲＥＳｃｐ１４８（ｃｒ）：ｐｓｐＯＡＴ−ＨＣ）が得られた。軽鎖ｐｓｐＬＣＩｇＧＥ：Ｅを植物シグナルペプチドと融合して、ｃｒＴＭＶ  Ａｒａｂ．Ａｃｔ２駆動のベクター中にクローン化して、ｐＩＣＰ１２８８（＃２０８Ｃ、Ａｒａｂ．Ａｃｔ２プロモーター：ｃｒＴＭＶ：ＩＲＥＳｃｐ１４８（ｃｒ）：ｐｓｐＬＣＩｇＧＥ：Ｅ）が得られた。次にＨＣおよびＬＣをコードする構築体を、分離したニコチアナ・ベンサミアナの葉に射撃した。さらにＨＣとＬＣ発現構築体の間の比を同時射撃で変化させ（１：１、２：１、３：１）、射撃葉を射撃の５、６、７、８日後に試験した。集合ＩｇＧに対するＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットは、充分測定可能な量のタンパク質（重鎖および軽鎖断片の両方）の生成を示した。しかしＨＣに比較してＬＣの有意な過剰発現がウェスタンブロットにより検出された。最良の発現は、ＨＣ／ＬＣ比１：２で７d.p.b.であることが見い出された（データは示していない）。
【０１６７】
（例１７）
感染細胞中でレプリカーゼ遺伝子をｃａｐ非依存性に発現するＴＭＶ  ｃＤＮＡ転写ベクターの構築
本例の主要な目的は、ｃａｐ非依存性にレプリカーゼ遺伝子を発現させる、５’ＵＴＲが修飾された６個の新しいＴＭＶ  Ｕ１に基づくウイルスを得ることであった（ＴＭＶ−Ｕ１オメガ配列の部分は下線を引いてある）：
【０１６８】
１）野生型ＴＭＶ−Ｕ１−ＮｃｏＩ部位の対照変異体を、レプリカーゼ遺伝子の開始コドンに導入する：
0004477824.tif 000028
２）ＴＭＶ−Ｕ１のオメガ−リーダーを、ＩＲＥＳMP,75CRにより完全に置換された：
0004477824.tif 000029
３〜４）ＴＭＶ−Ｕ１  ５’ＵＴＲの最初の８ヌクレオチドは、ウイルス複製に必須であると考えられる（ワタナベ（Watanabe）ら, 1996, J. Gen. Virol. 77, 2353-2357）ため、ＩＲＥＳMP,75CRを、ＴＭＶ−Ｕ１オメガの代わりに挿入して最初の８ヌクレオチドを完全なまま残す：
0004477824.tif 000030
または最初の１８ヌクレオチドを完全なまま残す：
0004477824.tif 000031
５）ＩＲＥＳMP,75CRをオメガリーダーのヌクレオチド８と１８の間に挿入した：
0004477824.tif 000032
６）ＩＲＥＳMP,75CRをオメガリーダーのヌクレオチド１８と１９の間に挿入した：
0004477824.tif 000033
【０１６９】
以下のプライマーを使用した：
１）Ｈ３−Ｔ７−オメガ（最初の変種の場合）：
0004477824.tif 000034
２）Ｈ３−Ｔ７−ＩＲＥＳｍｐ（第２の変種の場合）：
0004477824.tif 000035
３）Ｈ３−Ｔ７−８Ｕ１−ＩＲＥＳｍｐ（第３の変種の場合）：
0004477824.tif 000036
４）Ｈ３−Ｔ７−１８Ｕ１−ＩＲＥＳｍｐ（第４の変種の場合）：
0004477824.tif 000037
オメガバージョン５および６では、プライマー３および４に加えて、もう２つのオリゴヌクレオチドをが注文した：
５）ＩＲＥＳｍｐ−１９Ｕ１−プラス：
0004477824.tif 000038
６）１９Ｕ１−ＩＲＥＳｍｐ−マイナス：
0004477824.tif 000039
オメガ変異体を得るために使用した残りのプライマー：
７）ＩＲＥＳｍｐ−ＮｃｏＩ（３’末端にＮｃｏＩ部位を持つＩＲＥＳを得るための逆進プライマー）：
0004477824.tif 000040
８）Ｕ１−ＲｅｐＩ−Ｎｃｏ−プラス（ＮｃｏＩ部位から開始する、ＴＭＶ−Ｕ１ポリメラーゼを得るための前進プライマー）：
0004477824.tif 000041
９）Ｕ１−ＲｅｐＩ−Ｓｐｈ−マイナス（ＡＵＧからＳｐｈＩ部位のレプリカーゼの５’部分を得るための逆進プライマー）：
0004477824.tif 000042
１０）オメガ−Ｎｃｏ−マイナス（レプリカーゼＡＵＧコドンにＮｃｏＩ部位を持つオメガ配列の３’末端を得るための逆進プライマー）：
0004477824.tif 000043
【０１７０】
クローニング方法：
ＴＭＶ３０４クローン（図２７）（ドーソン（Dawson）ら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832-1836；レト（Lehto）ら, 1990, Virology 174, 145-157）は、オメガ特異的プライマーとの全てのＰＣＲ反応の鋳型とした；ＩＲＥＳMP,75CRは、プラスミドｐＩＣＨ７６６から増幅した。
ＰＣＲ断片１は、プライマー１と１０を用いて得た；断片２はプライマー２と７で得た。断片３と４には、オリゴヌクレオチドの組合せ３＋７と４＋７を使用した。
【０１７１】
ＰＣＲ断片５と６は、２工程で増幅した。最初に、中間体断片５ａ、６ａ（プライマー３＋６と４＋６）および５ｂ（５＋１０）を得た。次に断片５ａ／５ｂと６ａ／５ｂを相互にアニーリングして、以下のプライマー組合せで増幅に使用した：３＋１０と４＋１０により、最終ＰＣＲ産物５と６を得た。ＴＭＶ−１ＵレプリカーゼのＮ末端部分（ＰＣＲ断片７、ゲノム６８〜４５０のヌクレオチド位置）を、オリゴヌクレオチド８と９により増幅して、レプリカーゼ遺伝子の始点にＮｃｏＩ部位を導入した。断片１は断片７と一緒に、ＨｉｎｄIIIとＳｐｈＩ部位を用いて、ｐＵＣ１９ベクター中に同時にクローン化した（断片はＮｃｏＩ部位により連結して、プラスミドｐＩＣＨ４５５２が得られる）。中間体構築体の全ての他の変種（ＰＣＲ産物２〜６）を得るために、同一のクローニング法を適用した（ＨｉｎｄIII−Ｔ７プロモーター−オメガ変異体−ＮｃｏＩ−レプリカーゼ−ＳｐｈＩ、プラスミドｐＩＣＨ４５６５、ｐＩＣＨ４５７９、ｐＩＣＨ４５８４、ｐＩＣＨ４５９７、ｐＩＣＨ４６０２）。
【０１７２】
次の段階でＨｉｎｄIII／ＳｐｈＩ断片を、中間体構築体のそれぞれから、ＴＭＶ３０４プラスミド（図２７を参照）中にＥｈｅＩおよびＳｐｈＩ制限部位の間に、ＥｈｅＩ／ＨｉｎｄIII断片と一緒にクローン化して、最終のＴＭＶ−Ｕ１変異体の完全長ｃＤＮＡ構築体を得た（ＩＲＥＳｃｒｍｐ７５を含む（および含まない）６つの異なるバージョンのオメガ領域、プラスミドｐＩＣＨ４７３５、４７４４、４７５２、４７６５、４７７１、４７８８）。
【０１７３】
これらの構築体をインビトロで転写して、ニコチアナ・ベンサミアナ（全身性宿主）およびニコチアナ・タバクム・サムスンＮＮ（Nicotiana tabacum Samsun NN）（壊死性宿主）への感染性に関してＴＭＶ−Ｕ１野生型クローン（ＴＭＶ３０４）と一緒に試験した。野生型ウイルスおよびｐＩＣＨ４７３５（対照変異体、ＮｃｏＩ部位が、レプリカーゼ遺伝子の始点に導入されている）は、接種の３〜４日後（dpi）にニコチアナ・ベンサミアナの全身性感染およびサムスンＮＮ植物の典型的な壊死性傷害を示した。他はどの変異体もＮＮ植物への局所的傷害を引き起こさなかったが、少なくとも１つの構築体ｐＩＣＨ４７７１（オメガ１〜８b.p.／ＩＲＥＳMP75／オメガ１８〜６７b.p.）は、全身性に蔓延した明らかな症候を引き起こした；これらの症候の発生は、野生型ＴＭＶ−Ｕ１とｐＩＣＨ４７３５感染に比較して遅延した（７dpi）。この結果は、ｃａｐ非依存性にウイルスのレプリカーゼ遺伝子を発現させる、例えば、ＩＲＥＳMP,75CRまたは植物細胞中で機能性の他の任意の既知ＩＲＥＳから翻訳されるｃａｐの無いＲＮＡ転写配列を持つ植物を感染させる、主要な可能性を示している。
【０１７４】
（例１８）
アクチン２転写プロモーターに基づく、トバモウイルスベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶおよびＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ  ＩＲＥＳMP,75CR（ＩＲＥＳCP,148CR）−ＧＦＰの構築
本例の主要な目的は、植物細胞におけるウイルスゲノム発現が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの効率的アクチン２転写プロモーターの制御下で起こる、新しいｃｒＴＭＶに基づくベクターの構築方法の証明である（アン（An）ら, 1996, Plant J., 10, 107-121）。これによって植物中の遺伝子発現のために、ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＦＰおよびＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＦＰを使用することができる。
【０１７５】
１．ｐＵＣ１９中へのＡｃｔ２プロモーターのクローニング
Ａｃｔ２転写プロモーターは、プラスミドｐＡＣＲＳ０２９（ｐＩＣ０４）から、ＫｐｎＩとＰｓｔでの消化により切り出して、ＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１９中にクローン化した（構築体ｐＩＣＨ１３６４）。
２．追加の配列なしの、ｃｒＴＭＶゲノムの５’末端のＡｃｔ２転写開始点への融合。
この工程のために、以下のプライマーを使用した：
0004477824.tif 000044
【０１７６】
ＰＣＲ断片１は、プライマー１と４を用いて得て、断片２は、オリゴヌクレオチド２と３を使用して増幅した。次に両方の断片を相互にアニーリングして、第２ラウンドの増幅に使用して、プライマー１と２によりＰＣＲ産物３を得て、これをｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Promega））中にクローン化した。その結果、アクチン２プロモーターの３’末端（ＢｓｒＧＩ部位から転写開始点まで）およびｃｒＴＭＶゲノムの５’末端部分（ユニークなＰｖｕＩ部位まで）を含む構築体ｐＩＣＨ１８２３を得た。この構築体において、ウイルスゲノム（Ｇ）の最初のヌクレオチドは、アクチン２プロモーターの提唱される転写開始点（Ａ）のすぐ下流に位置したため、予想されるウイルス特異的転写配列は、さらに１つのヌクレオチド（Ａ）を５’末端に含むはずであるが、これは、通常ウイルスゲノムの効率的複製に影響しない。
【０１７７】
３．最後の構築体とために残りのゲノムのクローニング
構築体ｐＩＣＨ１３６４を、ＢｓｒＧＩ／ＨｉｎｄIIIで消化して、以下の断片と一緒に連結した：ｐＩＣＨ１８２３からのＢｓｒＧＩ／ＰｖｕＩ、ｃｒＴＭＶ  ｃＤＮＡクローンからとられたＰｖｕＩ／ＳａｃＩとＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ、ならびにプラスミドｐＩＣ０２からのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII挿入配列（ｎｏｓ転写ターミネーター）。最終構築体（ｐＩＣＨ１９８３）は、既に報告されている（モロゾフ（Morozov）ら, 1997, Journal of General Virology 78, 2077-2083）ようにニコチアナ・ベンサミアナの葉による微粒子衝撃実験で試験して、感染性は、射撃の３日後ニコチアナ・ベンサミアナ葉材料によりニコチアナ・タバクム・サムスンＮＮ植物（壊死性宿主）を再接種後にチェックした。
【０１７８】
４．ＧＵＳおよびＧＦＰ遺伝子を含むアクチン２プロモーターによるベクターのクローニング
最終ベクター構築体を得るために、Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳとＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ（図２）またはＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＦＰとＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＦＰのいずれかからのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片を、ｐＩＣ１８２３構築体中にクローン化した。生じたプラスミドも微粒子衝撃により試験すると、ニコチアナ・ベンサミアナ葉におけるＧＵＳおよびＧＦＰ発現が示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶとＳＰ６／ｃｒＴＭＶを示す。
【図２】  ベクターＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ、Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75UI−ＧＵＳ、Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,228CR−ＧＵＳ、Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳCP,148CR−ＧＵＳ、Ｔ７／ｃｒＴＭＶ／ＳＰＡＣＥＲCP,148UI−ＧＵＳ、およびＴ７／ｃｒＴＭＶ／ＰＬ−ＧＵＳを示す。
【図３】  プライマー伸長（Ａ）とＩ2 ｓｇＲＮＡ  ５’ＮＴＲの推定２次構造によるｃｒＴＭＶＩ2 ｓｇＲＮＡの５’末端のマッピング。
【図４】  ｃｒＴＭＶ  Ｉ2 ｓｇＲＮＡ  ５’ＮＴＲは、翻訳阻害性ヘアピン構造を含有する。（Ａ）は、コムギ胚芽抽出物（ＷＧＥ）中のインビトロ翻訳に使用される人工の転写体を示す；（Ｂ）は、ＷＧＥ中で合成される翻訳産物を示す。
【図５】  トバモウイルスは、ＭＰ遺伝子の上流の推定の翻訳阻害性ヘアピン構造を含有する。
【図６】  ｃａｐのあるｍＲＮＡの特異的検出法。Ａ、Ｂ：既知配列を有するＲＮＡタグを、試験されるＲＮＡのｃａｐに特異的に連結させる。Ｃ：３’特異的プライマーを用いる逆転写と、ｃＤＮＡの第１の鎖の合成。タグ配列は、ｃＤＮＡの配列に含まれる。Ｄ：タグ特異的かつ３’特異的プライマーを用いるＰＣＲ。各ＰＣＲバンドの出現は、試験したＲＮＡ中のｃａｐ構造の存在を示す。Ｅ：５’特異的かつ３’特異的プライマーを用いるＰＣＲ。ＰＣＲバンドの出現は、ＰＣＲ反応の対照となり、反応物中の特異的な試験ＲＮＡの存在を示す。Ｆ：得られたＰＣＲバンドの長さの相対的比較。
【図７】  ２％アガロースゲル中のウイルスＲＮＡの５’末端でのｃａｐ構造の存在の検出。矢印は、各ＰＣＲバンドを示す。
【図８】  ＫＫ６に基づくＴＭＶベクターを示す。
【図９】  ＫＫ６とＫＫ６−ＩＲＥＳMP,75CR Ｉ2 ｓｇＲＮＡの５’ＮＴＲのヌクレオチド配列。
【図１０】  ＫＫ６−ＩＲＥＳMP,75CR（Ｋ８６）、ＫＫ６およびＴＭＶ  ＵＩを接種した葉における、ＣＰとＭＰ蓄積の経時変化。
【図１１】  ＫＫ６、ＫＫ６−ＩＲＥＳMP,75CR、ＫＫ６−ＩＲＥＳMP,125CR、およびＫＫ６−Ｈ−ＰＬとＫＫ６−ＰＬを感染させたタバコにおける、ＣＰ蓄積。
【図１２】  ｃｒＴＭＶ  ＩＲＥＳｍｐマルチマー構造と、１８Ｓ  ｒＲＮＡとの相補性を示す。
【図１３】  ＩＲＥＳMP,75CR、ＩＲＥＳCP,148CRの１８ｎｔセグメントのテトラマー、ＩＲＥＳMP,75CRの１９ｎｔセグメント、シストロン間スペーサーとしてのポリリンカー（ＰＬ）を含有する２シストロン性転写体、およびＲＲＬ中のこれらの翻訳産物を示す。
【図１４】  ＩＲＥＳCP,148CR構造を示す。
【図１５】  インビトロとインビボのＩＲＥＳCP,148CR配列要素試験で使用される構築体を示す。
【図１６】  図２１に示す転写体の翻訳後のＷＧＥでのＧＵＳ活性試験。
【図１７】  図２１に示すものと類似の３５Ｓプロモーターに基づく構築体でトランスフェクションした、タバコプロトプラストでのＧＵＳ活性試験。
【図１８】  ５’ＮＴＲにＩＲＥＳMP,75CRを含有する２つの感染性ＴＭＶベクターのクローニングのためのスキームを示す。
【図１９】  ベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶを示す。
【図２０】  ｐＵＣに基づくベクターＡｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳを示す。
【図２１】  環状１本鎖ベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳを示す。
【図２２】  ベクターＫＳ／Ａｃｔ２／ｃｒＴＭＶ／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳを示す。
【図２３】  構築体３５Ｓ／ＣＰ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳを示す。
【図２４】  構築体３５Ｓ／ＧＵＳ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＣＰを示す。
【図２５】  構築体３５Ｓ／ＣＰ−ＶＰｇ／ＩＲＥＳMP,75CR／ＧＵＳを示す。
【図２６】  発現ベクター中での目的の遺伝子のｃａｐ非依存性発現を提供する、ウイルスサブゲノムプロモーターまたはＩＲＥＳ配列を同定するための、インビボ遺伝子選択のための構築体を示す。
【図２７】  ＴＭＶ−Ｕ１  ｃＤＮＡクローンの制限地図を示す。
【図２８】  ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳとＩＲＥＳMP,75CR−ｅＧＦＰ挿入体を含有する２つの感染性ＴＭＶ−Ｕ１ベクターのクローニングのスキームを示す。
【図２９】  ベクターＳＰ６／ＴＭＶ−Ｕ１／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ、ＳＰ６／ＴＭＶ−Ｕ１／ＩＲＥＳMP,75U1−ｅＧＦＰを示す。
【図３０】  植物起源（ＮｔＨＳＦ）と人工のＩＲＥＳ（（ＧＡＡＡ）ｘ１６）のＩＲＥＳを含有するＳＰ６／ＴＭＶ−Ｕ１／ＧＵＳのクローニングのスキームを示す。
【図３１】  ウイルスベクターＳＰ６／ＴＭＶ−Ｕ１／ＩＲＥＳMP,75CR−ＧＵＳ、ＳＰ６／ＴＭＶ−Ｕ１／ＮｔＨＳＦ−ＧＵＳ、ＳＰ６／ＴＭＶ−Ｕ１／（ＧＡＡＡ）Ｘ１６−ＧＵＳからの、ＧＵＳ発現の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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