(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内外で細胞を培養又は再生させるための組織再生用基材であって、
三次元形状に形成された多孔質担体と、
前記多孔質担体の周りを囲うように形成され、前記組織再生用基材を生体に移植した場合に周りの生体組織をなす細胞が前記多孔質担体にアクセス可能なように該多孔質担体と外部とを連通した状態で該多孔質担体の三次元形状を維持するように該多孔質担体を支持する網状又は柵状の支持体と
を備え、
前記多孔質担体はコラーゲン、コラーゲン誘導体、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、キトサン、キトサン誘導体、ポリロタキサン、ポリロタキサン誘導体、キチン、キチン誘導体、ゼラチン、フィブロネクチン、ヘパリン、ラミニン及びアルギン酸カルシウムからなる群より選ばれた１種又は２種以上で形成され、前記支持体はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸ポリカプロラクトン共重合体及びポリグリコール酸ポリカプロラクトン共重合体からなる群より選ばれた１種又は２種以上で形成されている、
組織再生用基材。
【請求項２】
前記支持体は、少なくとも１本の縫合糸を有している
請求項１記載の組織再生用基材。
【請求項３】
前記縫合糸は、生体親和性材料又は生体吸収性材料により形成されている
請求項２記載の組織再生用基材。
【請求項４】
内視鏡下手術に使用可能な形状に形成されている
請求項１〜３のいずれかに記載の組織再生用基材。
【請求項５】
生体内で組織を再生させるための移植用材料であって、
細胞を保持した三次元形状の細胞保持担体と、
該細胞保持担体の周りを囲うように形成され、前記移植用材料を生体に移植した場合に周りの生体組織をなす細胞が前記細胞保持担体にアクセス可能なように該細胞保持担体と外部とを連通した状態で該細胞保持担体の三次元形状を維持するように該細胞保持担体を支持する網状又は柵状の支持体と
を備え、
前記細胞保持担体はコラーゲン、コラーゲン誘導体、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、キトサン、キトサン誘導体、ポリロタキサン、ポリロタキサン誘導体、キチン、キチン誘導体、ゼラチン、フィブロネクチン、ヘパリン、ラミニン及びアルギン酸カルシウムからなる群より選ばれた１種又は２種以上で形成され、前記支持体はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン及びポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体からなる群より選ばれた１種又は２種以上で形成されている
移植用材料。
【請求項６】
前記細胞保持担体は、三次元形状の多孔質担体に細胞を保持したものである
請求項５記載の移植用材料。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の移植用材料であって、
前記細胞保持担体に隣接しており細胞を有さない三次元形状の人工材料からなる人工移植部材
を備えた移植用材料。
【請求項８】
前記細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞及びこれらの前駆細胞、並びに、間葉系幹細胞、胚性幹細胞の少なくとも１つを含む
請求項５〜７のいずれかに記載の移植用材料。
【請求項９】
前記細胞は、前記細胞保持担体の片側半分に保持された細胞ともう片側半分に保持された細胞の種類が異なる
請求項５又は６に記載の移植用材料。
【請求項１０】
前記細胞は、前記細胞保持担体の片側半分に保持された軟骨細胞と前記細胞保持担体のもう片側半分に保持された骨芽細胞又は骨細胞である
請求項９記載の移植用材料。
【請求項１１】
前記人工移植部材は人工骨であり、前記細胞は軟骨細胞である
請求項７記載の移植用材料。
【請求項１２】
前記細胞保持担体は、前記軟骨細胞を包埋したコラーゲンゲルである
請求項１１記載の移植用材料。
【請求項１３】
関節における骨・軟骨欠損部分の治療に用いられる
請求項９〜１２のいずれかに記載の移植用材料。
【請求項１４】
前記支持体は、少なくとも１本の縫合糸を有している
請求項５〜１３のいずれかに記載の移植用材料。
【請求項１５】
前記縫合糸は、生体親和性材料又は生体吸収性材料により形成されている
請求項１４記載の移植用材料。
【請求項１６】
内視鏡下手術に使用可能な形状に形成されている
請求項５〜１５のいずれかに記載の移植用材料。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれかに記載の移植用材料を製造する方法であって、
前記細胞保持担体を得るにあたり、
（１）間葉系幹細胞を目的とする細胞に分化させ、得られた細胞の細胞懸濁液を調製し、細胞を保持可能で三次元形状の予備担体に前記細胞懸濁液を付与することにより前記細胞保持担体を得るか、又は、
（２）細胞を保持可能で三次元形状の予備担体に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与し、前記予備担体上で間葉系幹細胞を目的とする細胞に分化させることにより前記細胞保持担体を得る
移植用材料の製法。
【請求項１８】
請求項１０記載の移植用材料を製造する方法であって、
前記細胞保持担体を得るにあたり、
（１）細胞を保持可能で三次元形状の予備担体の片側半分に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与したあと培養し分化させることにより前記片側半分に軟骨細胞を保持させ、その後、前記予備担体のもう片側半分に予め間葉系幹細胞を分化させて得た骨芽細胞もしくは骨細胞を付与することにより前記細胞保持担体を得るか、又は、
（２）細胞を保持可能で三次元形状の予備担体の片側半分に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与したあと培養し分化させることにより前記片側半分に軟骨細胞を保持させ、その後、前記予備担体のもう片側半分に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与して前記予備担体上で培養し骨芽細胞もしくは骨細胞に分化させることにより前記細胞保持担体を得る
移植用材料の製法。
【請求項１９】
前記予備担体は、請求項１〜４のいずれかに記載の組織再生用基材の多孔質担体である
請求項１７又は１８記載の移植材料の製法。
【請求項２０】
請求項１１記載の移植用材料を製造する方法であって、
前記人工骨を人工骨材料で作成した後、該人工骨に隣接するように且つ前記支持体に囲まれるように前記軟骨細胞を保持した細胞保持担体を作製する
移植用材料の製法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、生体内外で細胞を培養又は再生させるための組織再生用基材及びそれを利用した移植用材料に関する。
背景技術
近年、細胞を生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。この場合、細胞は単体で培養されるばかりでなく、細胞増殖の足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）となる担体（組織再生用基材）に播種され、培養される場合が多い。殊に、厚みや高さを持たせた三次元形状の組織を作製するためには、担体は重要な役割を担うことになる。また、組織再生の足場となる担体を組織再生用基材として埋植し、自己治癒能力により生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で組織を再生させる技術も確立されつつある。これらの技術は、再生医療又は組織工学（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）と称され、注目を浴びている。
このような担体あるいは組織再生用基材としては、生体適合性の良好な材料のものや、生体吸収性の材料のものが利用されている。例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリロタキサン、ゼラチン、フィブロネクチン、ヘパリン、キチン、キトサン、ラミニン、アルギン酸カルシウム、ポリロタキサンヒドロゲル等が挙げられる。
しかしながら、これらの材料による組織再生用基材では強度が弱く、高さのあるものや、大きなもの、細長いもの等では十分な形状を保持することが困難である。さらに、組織再生用基材に十分な強度がないと培養時や移植時の取扱いが困難であり、操作性が悪く、作業者や術者に負担が掛かる。
本発明は上記従来技術の問題点を鑑み、取扱いが容易な組織再生用基材及び移植用材料を提供することを目的とする。また、そのような移植用材料の製法を提供することを別の目的とする。
発明の開示
本発明の第１は、生体内外で細胞を培養又は再生させるための組織再生用基材であって、三次元形状に形成された多孔質担体と、前記多孔質担体を囲うように形成され、前記組織再生用基材を生体に移植した場合に周りの生体組織をなす細胞が前記多孔質担体にアクセス可能なように該多孔質担体と外部とを連通した状態で該多孔質担体を支持する支持体とを備えた組織再生用基材である。
この組織再生用基材では、三次元形状に形成された多孔質担体が自らその形状を維持することが難しい場合であっても、支持体がこの多孔質担体を囲うように形成されているため、支持体によって多孔質担体の三次元形状は維持される。したがって、組織再生用基材の取扱いが容易である。また、支持体は多孔質担体を外部と連通した状態で支持しているため、この組織再生用基材を生体に移植した場合に周りの生体組織が支持体を介して多孔質担体にアクセスでき、生体組織へのなじみがよくなる。したがって、組織再生に用いるのに適している。
この組織再生用基材は、そのまま生体組織に移植してもよいし、多孔質担体に細胞を保持させたあとに後述する移植材料として生体組織に移植してもよい。前者の場合、移植したあと周りの生体組織をなす細胞が支持体を介して多孔質担体に入り込んで増殖することにより生着する。後者の場合、移植先の生体組織に応じて多孔質担体に保持させる細胞の種類を決め、その細胞を多孔質担体に保持させておき、移植したあと周りの生体組織と多孔質担体に保持された細胞とが支持体を介してアクセスすることにより、比較的早くなじんで生着する。なお、後者の場合、多孔質担体の一部に細胞を保持させてもよいし全部に細胞を保持させてもよく、１種類の細胞を保持させてもよいし複数種類の細胞を保持させてもよい。また、多孔質担体に細胞を保持させた後に培養工程を行ってもよい。
この組織再生用基材において、前記多孔質担体は、多数の小さな孔（空隙）を有する形状の担体を意味し、具体的にはスポンジ状、ハニカム状又はそれらと同等なものが挙げられるが、このうちスポンジ状が好ましい。また、その孔径は、細胞を保持できる大きさであれば特に限定されない。また、多孔質担体は三次元形状に形成されているが、三次元形状とは例えば円柱、多角柱、円錐、多角錐、円錐台、多角錐台、球などの立体形状のほか、耳殻などの生体部位の形状などが挙げられる。
この組織再生用基材において、前記支持体は、前記多孔質担体の三次元形状を維持できるのであれば特に前記多孔質担体の全体を囲む必要はなく一部を囲むだけでもよい。また、前記支持体は、網状支持体、柵状支持体又は穴付き板状支持体であることが好ましい。この場合、多孔質担体を外部と連通した状態で支持するという機能を良好に発揮できる。
この組織再生用基材において、前記多孔質担体及び前記支持体のうち少なくとも一方は、生体親和性材料又は生体吸収性材料により形成されていることが好ましく、前記多孔質担体及び前記支持体の両方ともこのような材料で形成されていることがより好ましい。この場合、移植後に生体組織が組織再生用基材を異物とみなすことが少ないため、組織再生に適している。生体吸収性材料を用いた場合には、移植後に分解吸収されるため、組織再生に特に適している。
このような生体親和性材料又は生体吸収性材料としては、特に限定されることなく使用可能であるが、例えば前記多孔質担体についていえば、コラーゲン、コラーゲン誘導体、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、キトサン、キトサン誘導体、ポリロタキサン、ポリロタキサン誘導体、キチン、キチン誘導体、ゼラチン、フィブロネクチン、ヘパリン、ラミニン及びアルギン酸カルシウムからなる群より選ばれた１種又は２種以上が好ましく、前記支持体についていえば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸ポリカプロラクトン共重合体及びポリグリコール酸ポリカプロラクトン共重合体からなる群より選ばれた１種又は２種以上が好ましい。また、チタン、チタン合金、ステンレス鋼、コバルトークロム合金、コバルト−クロム−モリブデン合金等の金属材料や、アルミナセラミックス、カーボンセラミックス、ジルコニアセラミックス、炭化珪素セラミックス、窒化珪素セラミックス、ガラスセラミックス等のセラミックス材料などの生体不活性材料も、支持体の材料として使用することができる。さらにまた、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、バイオガラス等の生体活性を有する基質材料も支持体の材料として利用可能である。
この組織再生用基材において、前記支持体は、少なくとも１本の縫合糸を有していることが好ましい。この場合、移植先の生体組織にこの縫合糸を用いて固定することができる。この縫合糸は、前出の生体親和性材料又は生体吸収性材料により形成されていることが組織再生に適するため好ましく、また、支持体と同じ材質で形成されていることが製造しやすいため好ましい。
この組織再生用基材は、移植先の生体組織周辺を切開したあと移植してもよいが、患者負担を考慮すれば内視鏡下手術を行うことが好ましいため、内視鏡下手術に使用可能な形状に形成されていることが好ましい。例えば、柱状であって断面の径が２〜１５ｍｍのものが好ましい。
本発明の第２は、生体内で組織を再生させるための移植用材料であって、細胞を保持した三次元形状の細胞保持担体と、該細胞保持担体を囲うように形成され、前記移植用材料を生体に移植した場合に周りの生体組織をなす細胞が前記細胞保持担体にアクセス可能なように該細胞保持担体と外部とを連通した状態で該細胞保持担体を支持する支持体とを備えた移植用材料である。
この移植用材料では、例えば三次元形状の細胞保持担体が細胞懸濁液や培地等により湿潤して自らその形状を維持することが難しくなったとしても、支持体がこの細胞保持担体を囲うように形成されているため外観形状が崩れることはない。したがって、移植用材料の取扱いが容易である。また、支持体は細胞保持担体を外部と連通した状態で支持しているため、この移植用材料を生体に移植した場合に周りの生体組織が支持体を介して細胞保持担体にアクセスすることができ、周りの栄養分が支持体を介して細胞保持担体に保持された細胞へ供給されるので、生体組織へのなじみがよくなる。したがって、組織再生に用いるのに適している。
本発明の第２の移植用材料において、前記細胞保持担体は、三次元形状の多孔質担体（例えば多数の小さな孔（空隙）を有する担体）であってもよいが、細胞を包埋した状態のゲル状物、又はこれらと同等なものも利用できる。多孔質担体としては、スポンジ状、ハニカム状又はそれらと同等なものなどが挙げられるが、このうちスポンジ状が好ましく、その孔径は細胞を保持できる大きさであれば特に限定されない。
本発明の第２の移植用材料は、前記細胞保持担体に隣接する三次元形状の人工移植部材を備えていてもよい。ここで、人工移植部材は、細胞を有さない人工材料であって、特に限定されるものではなくどのような種類のものでも使用可能であるが、例えば、チタン等の金属材料やアルミナセラミックス等のセラミックス材料などの生体不活性材料、並びにヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の生体活性基質材料などの人工骨や人工関節等のインプラント材に利用され得る材料を所望される形状や強度等に応じて適宜選択し、用いることができる。なお、支持体は、細胞保持担体とともに人工移植部材も囲っていることが好ましく、このときには前記細胞保持担体のみならず人工移植部材も外部と連通した状態で支持していることが好ましい。また、人工移植部材と支持体とが同一材料によって一体的に形成されていてもよい。
本発明の第２の移植用材料において、前記細胞は、表皮細胞、上皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、肝細胞、心筋細胞及びこれらの前駆細胞、並びに間葉系幹細胞、胚性幹細胞のうち少なくとも１つを含むことが好ましく、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞及びこれらの前駆細胞、並びに、間葉系幹細胞、胚性幹細胞のうち少なくとも１つを含むことがより好ましい。なお、間葉系幹細胞やＥＳ細胞は未分化細胞のため、移植後、移植先の生体組織に応じた細胞へと分化することが予測されるが、移植に先立って、予めin vitroにおいて移植先の生体組織に応じた細胞へと分化させておくことが好ましい。
本発明の第２の移植用材料において、前記細胞は、前記細胞保持担体の片側半分に保持された細胞ともう片側半分に保持された細胞の種類が異なるものであってもよい。例えば、前記細胞は、前記細胞保持担体の片側半分に保持された軟骨細胞と前記細胞保持担体のもう片側半分に保持された骨芽細胞又は骨細胞であってもよい。この場合、関節等においては上層が軟骨組織で下層が骨組織であることから、骨・軟骨欠損部分の移植用として適している。なお、「片側半分」とは、必ずしも半分である必要はなく、軟骨細胞を保持する領域と骨芽細胞又は骨細胞を保持する領域とはどのような割合で分かれていてもよく、若干オーバーラップしていてもよい。
本発明の第２の移植用材料が前記細胞保持担体に隣接する三次元形状の人工移植部材を備えている場合、前記人工移植部材は人工骨であり、前記細胞は軟骨細胞であってもよい。この場合も、関節等においては上層が軟骨組織で下層が骨組織であることから、骨・軟骨欠損部分の移植用として適している。また、前記細胞保持体は軟骨細胞を包埋したコラーゲンゲルであってもよい。
本発明の第２の移植用材料において、前記支持体は、細胞保持担体の三次元形状を維持できるのであれば、特に細胞保持担体の全体を囲む必要はなく一部を囲むだけでもよい。この支持体は、網状支持体、柵状支持体又は穴付き板状支持体であることが好ましい。この場合、細胞保持担体を外部と連通した状態で支持するという機能を良好に発揮できる。更に、細胞保持担体及び支持体のうち少なくとも一方は、生体親和性材料又は生体吸収性材料により形成されていることが好ましく、両方ともこのような材料で形成されていることがより好ましい。この場合、移植後に生体組織が組織再生用基材を異物とみなすことが少ないため、組織再生に適している。生体吸収性材料を用いた場合には、移植後に分解吸収されるため、組織再生に特に適している。このような生体親和性材料又は生体吸収性材料の例示は前出の通りである。更にまた、支持体は、少なくとも１本の縫合糸を有していることが好ましい。この場合、移植先の生体組織にこの縫合糸を用いて固定することができる。この縫合糸は、支持体と同じ材質で形成されていることが好ましい。
本発明の第２の移植用材料は、移植先の生体組織周辺を切開したあと移植してもよいが、患者負担を考慮すれば内視鏡下手術を行うことが好ましいため、内視鏡下手術に使用可能な形状に形成されていることが好ましい。例えば、柱状であって断面の径が２〜１５ｍｍのものが好ましい。
本発明の第３は、本発明の第２の移植用材料を製造する方法であって、前記細胞保持担体を得るにあたり、（１）間葉系幹細胞を目的とする細胞に分化させ、得られた細胞の細胞懸濁液を調製し、細胞を保持可能で三次元形状の予備担体に前記細胞懸濁液を付与することにより前記細胞保持担体を得るか、又は、（２）細胞を保持可能で三次元形状の予備担体に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与し、前記予備担体上で間葉系幹細胞を目的とする細胞に分化させることにより前記細胞保持担体を得るものである。
こうすれば、移植時の患者負担を軽くすることができる。即ち、移植用材料の製法としては、移植先の生体組織の周辺から組織を採取してその細胞を培養して予備担体に保持させることも考えられるが、その場合には患者負担が大きくなるため好ましくない。例えば、関節軟骨部の治療の場合、培養に供するための軟骨細胞を得るために、非荷重部ではあるが、健常部の軟骨組織を採取する必要がある。これを回避すべく、患者の骨髄細胞を採取してそこから得られる未分化の間葉系幹細胞を目的とする細胞（移植先の生体組織に適合する細胞）へ分化させることが好ましい。また、間葉系幹細胞を分化させて目的とする細胞を得たあとにその細胞を予備担体に付与してもよいが、間葉系幹細胞を予備担体に付与して予備担体上で目的とする細胞へ分化させてもよく、後者の場合、間葉系幹細胞は移植したあと周りの生体組織をなす細胞へと分化することが予測されるため、間葉系幹細胞を予備担体に付与したあと生体組織へ移植して生体内で分化させてもよい。
なお、予備担体は、細胞を保持可能な多孔質担体（例えば本発明の第１の組織再生用基材の多孔質担体）であってもよいが、細胞を包埋可能なゲル状物又はこれらと同等なものであってもよい。
また、片側半分に軟骨細胞を保持しもう片側半分に骨芽細胞又は骨細胞を保持した細胞保持担体を得るにあたっては、
（１）予備担体の片側半分に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与してその担体上で培養することにより軟骨細胞に分化させたあと、もう片側半分に予め間葉系幹細胞を分化させて得た骨芽細胞又は骨細胞を付与する方法、
（２）予備担体の片側半分に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与してその担体上で培養することにより軟骨細胞に分化させたあと、もう片側半分に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与して担体上で培養することにより骨芽細胞又は骨細胞に分化させる方法、
（３）予備担体の片側半分に予め間葉系幹細胞を分化させて得た軟骨細胞を付与したあと、もう片側半分に予め間葉系幹細胞を分化させて得た骨芽細胞又は骨細胞を付与する方法、
（４）予備担体の片側半分に予め間葉系幹細胞を分化させて得た軟骨細胞を付与したあと、もう片側半分に間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を付与してその担体上で培養することにより骨芽細胞又は骨細胞に分化させる方法、
あるいは、
前記（１）〜（４）において軟骨細胞と骨芽細胞を作製する順序を入れ替えた方法
などが挙げられる。
但し、間葉系幹細胞から軟骨細胞に分化させる方が、間葉系幹細胞から骨芽細胞に分化させるよりも一般的に難しいため、先に軟骨細胞に分化させる方が好ましい。また、移植用材料においては、移植部位で産生されている基質（細胞外マトリクス）と同等のものを有していることが治療を促進する上で重要である。これを鑑みると、予め間葉系幹細胞を分化させて得た軟骨細胞を担体へ付与する場合には、細胞を付与した後に、基質を産生させるために更なる培養を行う必要がある。さらに、関節部の軟骨組織は硝子様軟骨の形質を有しているが、培養操作によって軟骨細胞に硝子様軟骨の性質を持たせるためには、予備担体に細胞を付与して三次元的に培養する必要がある。つまり、このような場合においては、間葉系幹細胞から軟骨細胞を得るための培養工程に加えて、軟骨細胞に基質を産生させたり、硝子様軟骨を形成させたりするというような更なる培養工程が必要となる（２段階の培養工程）。これに対して、間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を予備担体へ付与してその担体上で培養する場合には、その担体上において、間葉系幹細胞による細胞増殖と、硝子様軟骨への分化による基質産生とが行われるため、１段階の培養工程で済む。このため、後者の方が好ましい。つまり、前記（１）〜（４）でいえば、（１）、（２）の方が（３）、（４）よりも好ましい。
更に、細胞を保持した三次元形状の細胞保持担体と、該細胞保持担体を囲うように形成され、前記細胞保持担体を外部と連通した状態で支持する支持体と、前記細胞保持担体に隣接する三次元形状の人工移植部材とを備え、前記人工移植部材は人工骨であり、前記細胞は軟骨細胞である移植材料を製造する方法としては、前記人工骨を人工骨材料で作成した後、該人工骨に隣接するように且つ前記支持体に囲まれるように前記軟骨細胞を保持した細胞保持担体を作製することが好ましい。このとき、人工骨と細胞保持担体との間にはフィブロネクチン等の接着因子を介在させることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
［実施例１］組織再生用基材
図１は組織再生用基材の概略斜視図である。組織再生用基材１０は、円柱形状のコラーゲンスポンジ１１と、このコラーゲンスポンジ１１の外周を囲うように形成された網状支持体１２とを備えている。網状支持体１２は、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体）製であり、網目を介してコラーゲンスポンジ１１を外部と連通した状態で支持している。この組織再生用基材１０の大きさは、外径６ｍｍ，高さ１５ｍｍである。
［実施例２］移植用材料−その１
図２は本実施例の移植用材料の概略斜視図、図３は本実施例の移植用材料を作製する手順を表す概略説明図である。本実施例では、図２に示すように、実施例１の組織再生用基材１０を細胞増殖の足場とし、コラーゲンスポンジ１１の半分の領域１１ａにて軟骨細胞を保持し、他の半分の領域１１ｂにて骨芽細胞を保持している構成の移植用材料（以下、骨・軟骨柱という）２０を作製した。以下、図３に基づいてその作製手順を説明する。
まず、日本白色家兎の脛骨から、ヘパリンを少量含むシリンジで吸引することで骨髄細胞を得た（図３（ａ）参照）。これを１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）で１０倍に希釈し、細胞懸濁液を作製した。このときのＤＭＥＭには抗生物質を添加したものを使用した。この細胞懸濁液を１０ｃｍディッシュへ１０ｍｌ播種し、３７℃，５％ＣＯ2下で１週間培養した。１週間の培養の後、培地交換を行った。骨髄細胞は、血球系細胞と間葉系幹細胞とから構成されており、この培地交換によって浮遊型の血球系細胞のみが除去され、ディッシュ底面に付着する接着依存型の間葉系幹細胞のみを得ることができた。最初の培地交換の後は、３〜４日毎に培地交換を行い、間葉系幹細胞を増殖させた（図３（ｂ）参照）。また、充分な量の細胞数が得られるまでは、必要に応じて継代培養を行った。このように、継代培養によって充分な量の間葉系幹細胞が得られるが、間葉系幹細胞がディッシュの培養面全面に至るまで増殖する（コンフルエント）と分化し始めるため、細胞がコンフルエントな状態まで増殖しないようにし、間葉系幹細胞の未分化な状態を保つようにした。
充分量の間葉系幹細胞を得た後、５分間のトリプシン処理により間葉系幹細胞をディッシュ底面から剥離した。剥離処理の後、１５００ｒｐｍ、５分間の遠心処理を行い、間葉系幹細胞のペレットを軟骨誘導培地に懸濁して、４×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上の細胞密度の細胞懸濁液を調製した。軟骨誘導培地としては、ＤＭＥＭに１０-8Ｍのデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１０-5Ｍのβ−グリセロフォスフェート（β−Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．０５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２フォスフェート（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  ２−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び抗生物質を添加した無血清培地を使用した。
滅菌したシリコンチューブ（外径１０ｍｍ，内径６ｍｍ，高さ７ｍｍ）を２４ウェル・プレートに立て、上述の組織再生用基材１０をシリコンチューブ内に挿入し、シリコンチューブにより組織再生用基材１０を直立した状態で支持した（図３（ｃ）参照）。上述のように調製した細胞懸濁液（間葉系幹細胞＋軟骨誘導培地）をエッペンドルフピペットにて組織再生用基材１０のコラーゲンスポンジ１１の上方から１００μｌ滴下した。１００μｌを滴下すると、細胞懸濁液はコラーゲンスポンジ１１の上部分のみに浸透してこの部分に間葉系幹細胞が接着し、下半分には細胞が存在しない状態となった。この状態の組織再生用基材１０を細胞播種部分が下になるように倒置し、倒置する前と同様にシリコンチューブで直立状態に支持した。倒置後１時間を経過させることで間葉系幹細胞を組織再生用基材１０に接着させた後、上述と同様の成分からなる軟骨誘導培地を１．５ｍｌ注入し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２週間培養した。この間の培地交換は隔日（一日おき）で行った。培養後、組織再生用基材１０をホルマリンで固定し、パラフィン包埋後組織切片を作製し、軟骨基質を染色するアルシアンブルー染色法により断面染色像を作成した。この断面染色像を観察したところ、軟骨細胞によって特異的に産生される酸性ムコ多糖類が染色されており、間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化が適切に行われていることが確認できた。
一方、一部の１０ｃｍディッシュにおいて、間葉系幹細胞をコンフルエントな状態になるまで培養した。間葉系幹細胞がコンフルエントな状態になった後、培地を細胞増殖用のものから骨分化培地に切換え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２週間培養し、骨芽細胞へと分化させた（図３（ｄ）参照）。骨分化培地としては、１０％含有ＤＭＥＭに１０-7Ｍのデキサメタゾン、０．１５ｍＭのアスコルビン酸−２フォスフェート、１ｍＭのピルビン酸、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ  ＴＧＦ−β１（recombinant human ＴＧＦ−β）及び１／１００ｖｏｌ（培地量の1／１００量に相当）のＩＴＳプレミックス（ＩＴＳ  ｐｒｅｍｉｘ；日本ベクトンディッキンソン社製）を添加したものを使用した。
分化させた骨芽細胞をトリプシンおよびコラゲナーゼ処理によりディッシュ底面より剥離し、２×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度となるように抗生物質＋１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭにて骨芽細胞懸濁液を調製した。この骨芽細胞懸濁液を、軟骨細胞がコラーゲンスポンジ１１の半分の領域に形成されている組織再生用基材１０に滴下した。この際、軟骨細胞が保持されている側とは反対側の端部から、骨芽細胞懸濁液を滴下した（図３（ｅ）参照）。滴下後１時間静置することで、骨芽細胞をコラーゲンスポンジ１１に保持させた。これにより、図２に示すように、コラーゲンスポンジ１１の半分の領域１１ａにて軟骨細胞を保持し、他の半分の領域１１ｂにて骨芽細胞を保持している構成の骨・軟骨柱２０が得られた。
また、骨芽細胞を播種した後、抗生物質を添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養することで骨芽細胞から基質を産生させることにより、コラーゲンスポンジ１１の半分の領域１１ａにて軟骨細胞を保持し、他の半分の領域１１ｂにて骨細胞を保持している構成の骨・軟骨柱２０を作製した。
［実施例３］移植用材料−その２
図４は本実施例の移植用材料の概略斜視図、図５は本実施例の移植用材料を作製する手順を表す概略説明図である。本実施例では、図４に示すように、軟骨細胞を保持したコラーゲンゲル３１と、このコラーゲンゲル３１に積層された人工骨３３と、これらを囲うように形成された網状支持体３２とを備えた移植用材料である骨・軟骨柱３０を作製した。
以下、図５に基づいてその作製手順を説明する。
まず、滅菌したシリコンチューブ（外径１０ｍｍ，内径６ｍｍ，高さ１５ｍｍ）を２４ウェル・プレートに立て、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体）で形成された網状支持体３２（直径６ｍｍ，高さ１５ｍｍ）をシリコンチューブ内に挿入し、シリコンチューブにより網状支持体３２を直立した状態で支持した（図５（ａ）参照）。
次いで、リン酸カルシウム化合物を主成分とするペースト状の骨充填材（商品名バイオペックス、三菱マテリアル社製）２００μｌを周囲がシリコンチューブに囲まれている状態にある網状支持体３２内に充填した。この時の骨充填材の高さは約７ｍｍであった。骨充填材の充填後、約１０分間静置することで骨充填材が硬化してヒドロキシアパタイトつまり人工骨３３が形成された（図５（ｂ）参照）。
一方、日本白色家兎の関節部から軟骨組織を採取し、トリプシンＥＤＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。得られた軟骨細胞を洗浄した後、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを加え、細胞密度が４×１０6個／ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液と３％アテロコラーゲンインプラント（高研社製）が１：１の割合になるように混合し、軟骨細胞−コラーゲン混合液を調製した。この混合工程により、４×１０6個／ｍｌだった細胞密度は、２×１０6個／ｍｌに希釈された。この細胞−コラーゲン混合液２００μｌを前述した網状支持体３２内の人工骨３３上に充填した。この軟骨細胞−コラーゲン混合液充填の際、フィブロネクチン等の接着因子を人工骨３３上に載置した。
その後、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で１時間静置して軟骨細胞−コラーゲン混合液をゲル化させ、軟骨細胞に基質を産生させるべく培地を加えて３週間培養し、骨・軟骨柱を得た。このときの培地には、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含有する１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを使用した。
［実施例４］骨・軟骨柱の評価
実施例２で得た骨・軟骨柱（半分が軟骨組織、他の半分が骨芽組織）を実際にウサギの骨・軟骨欠損部分に移植して修復程度を評価した。即ち、日本白色家兎（２７週齢）を麻酔したのちに膝関節部分を切開し、膝蓋骨を脱臼させた。次いで大腿骨を露出し、膝蓋溝中央にドリルで直径５ｍｍ、深さ８ｍｍの全層欠損を作製した。この欠損部の深さに適合するように実施例２で得た骨・軟骨柱２０を切って骨・軟骨欠損部に埋め込み、ＰＬＧＡ製の網状支持体１２のメッシュ部分に同じくＰＬＧＡ製の縫合糸をかけて周囲の健常軟骨部分と縫着して固定した。コントロール群としては細胞を播種していない組織再生用基材１０を骨・軟骨欠損部に埋め込み、同様に周囲の健常部分と縫着して固定した。いずれも、手術部位周辺部を抗生物質を含んだ生理食塩水で洗浄したのち、切開部を縫合した。また、いずれも十分な強度を有しており、形状が崩れることがなく容易に取り扱うことができた。
これらのウサギを８４日間飼育したのち麻酔下にて屠殺し、移植部を含む大腿骨膝関節部分を切離し組織標本を作製し、この組織標本をホルマリン固定後、組織切片を作製しアルシアンブルー染色、サフラニンＯ染色による組織学的観察を行った。その結果、骨・軟骨柱移植群において欠損部はアルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色で陽性に染まっており、骨・軟骨柱による骨組織及び軟骨組織の再生が認められた。コントロール群においては十分な再生が認められなかった。なお、更に長期に飼育した場合にはコントロール群においても周囲健常部から細胞が入り込んで修復されると思われる。
上記と同様に、実施例３で得た骨・軟骨柱３０（半分が軟骨組織、他の半分が人工骨）を実際に兎の骨・軟骨欠損部分に移植して修復程度を評価したところ、移植後８４日後のウサギの骨・軟骨柱移植分における欠損部で修復が認められた。
なお、本発明は上記実施例に何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることは勿論である。
産業上の利用の可能性
本発明の組織再生用基材及びそれを利用した移植用材料は、生体内外で細胞を培養又は再生させるために利用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１の組織再生用基材の概略斜視図である。
図２は、実施例２の移植用材料（骨・軟骨柱）の概略斜視図である。
図３は、実施例２の移植用材料（骨・軟骨柱）を作製する手順を表す概略説明図である。
図４は、実施例３の移植用材料（骨・軟骨柱）の概略斜視図である。
図５は、実施例３の移植用材料（骨・軟骨柱）を作製する手順を表す概略説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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