(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液由来の無細胞試料を、トランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）のアポ形態およびハプトコリンのアポ形態と選択的に結合する固定化されたコバラミンまたはその同族体もしくは断片に接触させることと、
続いて前記接触後の試料を、ＴＣＩＩまたはコバラミンに結合したＴＣＩＩ（ホロＴＣＩＩ）に対して特異的に結合する固定化されたリガンドまたは固定化され得るリガンドと接触させることと、
リガンドに結合したフラクションをリガンドに結合していないフラクションと分離することと、
前記リガンド結合フラクションにおけるホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したコバラミンを測定することを含む、身体由来の試料（ｂｏｄｙ  ｓａｍｐｌｅ）中のＴＣＩＩに結合したコバラミンを定量するための検定方法。
【請求項２】
体液由来の無細胞試料を、磁化可能な粒子上に固定された、ＴＣＩＩまたはホロ−トランスコバラミンＩＩ（ホロＴＣＩＩ）に対して特異的に結合するリガンドと接触させることと、
磁場を適用することにより、リガンドに結合したフラクションをリガンドに結合していないフラクションと分離することと、
前記リガンド結合フラクションに含まれるホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したコバラミンを測定することを含む、身体由来の試料中のホロＴＣＩＩを定量するための検定方法。
【請求項３】
前記特異性結合リガンドが、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、オリゴペプチド、小さい有機化学薬品、組み合わせの化学（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）もしくはファージディスプレイライブラリから選択される特定のバインダー、ＤＮＡもしくはＲＮＡの特定結合配列、または細胞表面レセプターを含む群から選択される請求項１又は２に記載の検定方法。
【請求項４】
前記特異性結合リガンドが、ＴＣＩＩに対する高い程度の選択性および特異性を示し、かつ、その他のアポもしくはホロ形態のＴＣタンパク質または任意の他のコバラミン結合タンパク質に対しては低い親和性を示す請求項１から３のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項５】
前記特異性結合リガンドが、ＴＣＩＩに結合するモノクローナル抗体である請求項１から４のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項６】
前記コバラミンが、周囲の媒体の温度またはｐＨを変化させることによりホロＴＣＩＩ分子から放出される請求項１から５のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項７】
前記放出されたコバラミンが、コバラミンのための固定化された結合パートナーを、試料中の解離したコバラミンと、前記固定化された結合パートナーと結合することについて前記単離されたコバラミンと競合する標識リガンドの存在下で、接触させることによって行われる競合アッセイによって定量される請求項６に記載の検定方法。
【請求項８】
前記標識リガンドが、ルミネッセンス、化学ルミネッセンス、比色定量評価、フルオレッセンス、放射活性または酵素活性により定量することができるシグナル形成ラベルで標識される請求項７に記載の検定方法。
【請求項９】
前記標識リガンドが、化学ルミネッセンスにより定量することができるシグナル形成ラベルで標識される請求項７に記載の検定方法。
【請求項１０】
ＴＣＩＩ結合リガンドをその上に固定した固形担体を、調査しようとする試料および固定化されていないリガンド（非固定化リガンド）と接触させることと、
結合フラクションを非結合フラクションと分離することと、
前記結合フラクションにおけるリガンドに結合した前記非固定化リガンドまたは前記非結合フラクションにおける溶液中の前記非固定化リガンドを直接または間接的に定量することとを含み、
前記固形担体上に固定化されたリガンドが、ＴＣＩＩまたは前記ＴＣＩＩと前記非固定化リガンドとの複合体に結合することが可能であり、かつ、前記非固定化リガンドが、ホロＴＣＩＩと結合することが可能であり、
前記非固定化リガンドを結合する前記固定化されたリガンドの比率、または、前記非固定化リガンドとホロＴＣとの複合体を結合する前記固定化されたリガンドの比率が、前記試料中に存在するホロＴＣＩＩの量に依存し、
前記非固定化リガンドが、結合時または非結合時に、直接的にまたは間接的に探知可能なシグナルを生成することが可能であり、
前記固形担体との、前記試料および前記非固定化リガンドの接触は、個別に、同時にまたは連続的に行って良く、かつ、個別にまたは連続的に行う場合は、どのような順序で接触させても良い、
請求項１に記載の検定方法。
【請求項１１】
前記ＴＣＩＩに結合したリガンドが、少なくとも１０9Ｍ-1の親和定数を有する請求項１から１０のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１２】
前記親和定数が、１０11Ｍ-1を超える請求項１１に記載の検定方法。
【請求項１３】
ホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したリガンドの、ＨＣとの交差反応性の程度が０．１％と１％の間である請求項１から１２のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１４】
ホロＴＣＩＩまたはＴＣＩＩに結合したリガンドの、ＨＣとの交差反応性の程度が０．１％以下である請求項１から１２のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１５】
ホロＴＣＩＩを含む前記試料を、前記特異的に結合する固定化されたリガンド上の結合部位であって、ホロＴＣＩＩの結合部位と同じ結合部位を認識する標識化されたリガンドが結合できる固定化リガンドをその上に有している固形担体と接触させ、
前記試料中のホロＴＣＩＩは、前記結合した標識リガンドと前記結合部位において競合し、系が平衡に達した後、前記固形担体から分離され、溶液中で検出可能な標識リガンドの量と、前記当初の試料中に存在するホロＴＣＩＩの量との間は直接比例関係となり、前記溶液中の標識リガンドを、前記固形担体に適切に結合したまたは結合していない標識リガンドの量として直接的にまたは間接的に検出する請求項１に記載の検定方法。
【請求項１６】
前記ホロＴＣＩＩ含有試料を、その上に固定化されたホロＴＣＩＩを有する固形担体、および、ホロＴＣＩＩに特異的な標識され固定化されていないバインダーと接触させる請求項１に記載の検定方法。
ここで、前記サンプル中のフリーなホロＴＣＩＩおよび固定化されたホロＴＣＩＩは、標識された非固定化リガンドとの結合において競合し、かつ、前記固形担体に結合しているかまたは溶液中に残っている前記標識リガンドの定量は、ホロＴＣＩＩ濃度の定量を可能にする。
【請求項１７】
前記ホロＴＣＩＩ含有試料を、標識されたホロＴＣＩＩおよびホロＴＣＩＩに結合する固定化リガンドと接触させ、その結果、前記標識されたホロＴＣＩＩおよび標識されていないホロＴＣＩＩは、前記固定化リガンドと結合することにおいて競合し、平衡に達した後、前記固定化リガンドに結合した標識されたホロＴＣＩＩの量が、前記試料中のホロＴＣＩＩの量と間接的に比例する請求項１に記載の検定方法。
【請求項１８】
前記身体由来の試料が、精液、脳脊髄液、羊水または血液由来の試料を含む群から選択される請求項１から１７のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項１９】
前記血液由来の試料が、血清または血漿である請求項１８に記載の検定方法。
【請求項２０】
前記リガンド結合フラクションを、沈殿分離法、遠心分離、濾過またはクロマトグラフィー法により前記非リガンド結合フラクションから分離する請求項１に記載の検定方法。
【請求項２１】
較正（calibration）を、ホロＴＣＩＩ標準物質を使用することにより作る請求項１から２０のいずれか一項に記載の検定方法。
【請求項２２】
前記標準物質が、ヒトの、天然または組替えホロＴＣＩＩである請求項２１に記載の検定方法。
【請求項２３】
ＴＣＩＩおよびハプトコリンのアポ形態と選択的に結合する固定化されたコバラミンまたはその同族体もしくは断片、ＴＣＩＩまたはホロＴＣＩＩ特異性の、固定化されたまたは固定化され得る結合リガンドと、
既知の濃度のホロＴＣＩＩ溶液またはホロＴＣＩＩ複合体濃度の範囲を有するそのような溶液のセットと、
コバラミンをホロＴＣＩＩから放出させる放出剤（release  agent）と、
標識リガンドとを含む請求項１に記載の検定方法に使用するキット。
【請求項２４】
ホロＴＣＩＩの使用方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の検定方法における較正物質としての使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、体液中のコバラミンまたはビタミンＢ12の検定方法および、特に、コバラミンの代謝活性プール(metabolically active pool)の検定方法に関係する。
【０００２】
コバラミン、あるいはビタミンＢ12は、食物中に見られるビタミンＢ複合体の一部を形成する水溶性ビタミンである。その核となる分子は、必須のコバルト原子を取り囲む４つのピロールユニットのコリン環からなる。コバラミンは、動物または植物により合成することができず、腸内で食物から吸収しなければならない唯一のビタミンである。しかしながら、コバラミンは、肝臓に貯えることができる。コバラミンは、微生物により、特に、嫌気性菌および酵母菌により合成される。
【０００３】
コバラミンは、in vivoでは、補酵素およびコバラミン酵素として機能し、三つの型の反応を触媒する。（ｉ）分子内転移、例えば、Ｌ−メチルマロニルＣｏＡからスクシニルＣｏＡの形成。（ii）メチル化、例えば、ホモシステインのメチル化によるメチオニンの形成、および（iii）ある微生物における、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元。哺乳類では、（ｉ）および（ii）で特別に述べた２の酵素反応のみが、コバラミンを補酵素として必要とすることが知られている。
【０００４】
消化の過程では、ハプトコリンと呼ばれる唾液タンパク質、以下、ＨＣと表すが（このものは、また、当技術分野では、集合名詞的に、Ｒ−バインダーまたはトランスコバラミンＩおよびIIIと表される。）、それが消化管上部の中でコバラミンと結合し、複合体を形成し、それは胃を通過する。膵酵素は、前記コバラミン−ハプトコリン（ホロＨＣ）複合体を回腸内で消化し、コバラミンを放出し、そのコバラミンは、つぎに胃粘膜から分泌される内因子と呼ばれるタンパク質と結合し、さらなる複合体を形成する。前記コバラミン−内因子複合体は、末端回腸の裏地(lining)の中で特定のレセプターと結合し、その上で、放出因子により解離させられ、そして、前記コバラミンは、回腸の膜を通して、血管走行の中に活発に輸送される。
【０００５】
コバラミンは、フリーの形態では、適切な量で身体内を循環しない。おそらく、９９％ほどのコバラミンは、トランスコバラミンタンパク質（ＴＣＩ−III）またはアルブミンの一つと結合している。
【０００６】
コバラミンを目標とする組織に輸送する原因であると信じられているタンパク質は、重要な微量タンパク質であるトランスコバラミンII（ＴＣII）であり、それなしでは、コバラミンは、細胞膜を通過することができない。この重要な代謝機能にもかかわらず、血清中の約６〜２５％のコバラミンしかＴＣIIに結合せず、かつ、ほとんどは、ＨＣにより運ばれる。ＴＣIIは、血清、精液および脳脊髄液(cerebro-spinal fluid)中に最初に発見された４５ｋＤａの単一鎖のポリペプチドである。コバラミンに結合したＴＣIIあるいはホロＴＣIIは、細胞膜上の特定のレセプターに付着し、そして、いったん結合すると、前記ホロＴＣIIの複合体は、飲作用により細胞内に取り込まれる。
【０００７】
ＴＣIIは、肝臓、脈管内皮、腸内細胞(enterocyte)、マクロファージおよび繊維芽細胞により合成され、主としてアポＴＣIIの形態で、すなわち、結合したコバラミンなしで循環する。このものの半減期は、ほぼ９０分と短い。
【０００８】
血漿中の全コバラミンの４分の１未満がＴＣIIと結合している。残りは、上に述べた他のトランスコバラミンまたはアルブミンと結合している。
【０００９】
コバラミンは食物から吸収しなければならないが、胃機能障害につながる任意の状態、例えば胃腸炎、または胃萎縮につながる状態、または機能的ハプトコリン、内因子、放出因子、ＴＣIIもしくはＴＣIIレセプターを生産できないことは、コバラミンの吸収障害および結果としての欠乏症につながり得る。
【００１０】
ある個体群の小群、例えば、高齢の妊娠した女性、慢性または急性の胃腸病患者、自己免疫疾患に苦しむそのような小群、悪性貧血およびエイズに苦しむ家族暦を持つそのような小群は、特に、コバラミン欠乏症に陥りやすい。
【００１１】
コバラミン欠乏症の臨床症状は、多様でありかつ多数であるが、しかし、根本的には、貧血、巨赤芽球の造血(haematopoiesis)ならびに神経系統の機能的および構造的な障害に関係している。コバラミン欠乏症と診断された個体の約６０％は貧血症であるが、しかし、多くの場合、神経症状だけが、観測される臨床症状である。約１０％の患者は、精神医学的な症状を示し、かつ、約４０％は、神経的および精神医学的の両方の症状を示す。
【００１２】
あるコバラミン欠乏症の現われ、特に、精神神経性効果は、早急に発見され、かつコバラミン療法により苦痛を和らげなければ元に戻せないので、コバラミン欠乏症の早期診断は、患者のための良い予想を確立するために重要である。
【００１３】
それゆえ、個人のコバラミンレベルを、適切かつ効果的な方法で、その個人がコバラミン欠乏症に苦しむか否かを確立する観点から、正確に評価することが望ましい。
【００１４】
血漿中コバラミン、すなわちトランスコバラミン（ＴＣ）タンパク質Ｉ、IIおよびIIIのうち任意の一つと結合したコバラミン（およびコバラミン類似物質）の総量の測定が、コバラミン欠乏を評価するための試みとして使用されてきている。この技術は、正常であると考えられる個体群における広範囲の濃度分布につながり、それゆえに、広い基準範囲を生み出す。個人に関しては、しかしながら、その個人について正常であると考えられる有効なコバラミンの範囲は極めて狭い。代謝活性コバラミンの濃度が自身の基準範囲から外に移動した個人であっても、その血漿中コバラミン総含有量は、個体群にとって正常であると考えられる範囲内に止まることが観測されたことがある。
【００１５】
そのような環境下では、コバラミン欠乏症は、発見されないまま進行する可能性がある。そのような信頼性に欠ける方法は、明らかに望ましくなく、また、そのような血清または血漿中のコバラミンの測定は、診断上、低い感度および特異性しか持たないことがよく認識されている。
【００１６】
微生物学的定量は、成長についてコバラミンに依存する微生物に関係し、血漿中コバラミン濃度を測定するために用いられるが、適切な基準範囲を確立することの困難さに加え、これらの方法は、コバラミンの抽出と変換とを必要とし、それは、実験室での迅速なスクリーニングのためには、非常に時間を消費し、煩雑であり、全体として適切でない。
【００１７】
コバラミン欠乏を評価するために他にとり得る方法は、血漿中の代謝物質の蓄積を測定することに関係し、コバラミンを、その変換として必要とする。血漿中マロン酸メチルおよび血漿中ホモシステインのレベルは、コバラミン欠乏症の個人においては増加し(Chanarin, The megaloblastic anaemia; London, Blackwell Scientific Publications, 1991)、ビタミンＢ12欠乏症との相関関係についての候補物質分子であることを実証している。しかしながら、ホモシステイン評価に基づいた方法は、複雑であり、実用的でなく、不十分な特異性および感度しか示さないことが示されている。マロン酸メチルの測定に基づく方法は、正確で信頼できるが、扱いにくく、かつ、ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルを組み合わせた分析を必要とし、かつ、それゆえに高価であり、これもまた日常的な臨床のスクリーニングには適していない(Nexo et al.(1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 61-76)。
【００１８】
血漿中コバラミンの総量に対するものとして、ＴＣIIに結合したコバラミンを測定することもまた、コバラミン欠乏症の可能性についての信頼できる臨床上の検出手段（indictor）を提供するであろうことが提案されている(Herbert et al. (1990) Am. J. Clin. Pathol. 46: 537-539; US Patent 4680273)。しかしながら、ホロＴＣII濃度を定量するためのそのような努力は、今日までは、ほとんど間接的であり、ホロＴＣII濃度を、血漿中コバラミンの総量とＴＣIIを除去した血漿中のコバラミン濃度との差として確立している。
【００１９】
そのようなＴＣIIの除去は、硫酸アンモニウム(Carmel (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62: 367-372)、マイクロシリカ(Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58: 332-337; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537-539)、マイクロファイングラス(microfine glass)(Vu et al. (1993) Am. J. Hematol. 42: 202-211)または固定化されたアンチＴＣIIポリクローナル抗体(Lindemans et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132:53-61)への吸着によって成し遂げられる。全血漿中およびＴＣII除去フラクション(depleted fraction)中のコバラミン濃度は、ラジオイムノアッセイまたは酵素イムノアッセイのような当業者に周知の方法により行われる。これらの方法は、自動化のまたは非自動化の日常的なスクリーニングには適していない。なぜならば、これらは、複雑で、時間がかかり、かつ、使用される前記吸着材の低い程度の特異性が、ホロＴＣIIとホロＨＣの不十分な分離につながり、さらに、ホロＴＣIIを多く見積もることにつながるからである。前記吸着材のロット間ばらつきはさらなる誤差を導き、かつ、さらに重要なことには、一の大きな体積から他の大きな体積の引き算は、受け入れられない不正確さおよび非信頼性につながる。
【００２０】
ＴＣIIを評価するための他の試みは、ＴＣIIを、ＴＣＩおよびＴＣIIIを含む他の血漿成分と、その親油性を利用して分離することに関係する。Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta 172: 297-310, Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89: 195-199 and Toft et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:62  は、そのように、ヘパリンセファロース、シリカゲルまたはセルロースをそれぞれ用いて、ＴＣIIを他のトランスコバラミンと分離する方法を開示する。これらの方法は、しかしながら、前記と同じ吸着材に頼るため、前記間接的方法と同じ欠点により損害を被る。また、ホロＴＣIIの低い血漿中濃度は、これらの方法を、すでに存在するコバラミン定量方法と組み合わせることを不適切にする。ホロＴＣIIの正常範囲は３５〜１６０ｐＭであり、３５ｐＭ未満の数値は、一般的に、コバラミン欠乏症を示すと考えられている。血漿中コバラミンのためのもっとも日常的な方法について報告されている分析感度は、約４０ｐＭであるが、実際問題として、それはしばしばはるかに高く、典型的には約９０ｐＭである。このゆえに、正常なホロＴＣIIの血漿中レベルは、前記コバラミンの定量のための日常的な方法における前記感度限界よりも下かまたはその近くである。
【００２１】
ＴＣIIに結合したコバラミンを定量するための方法として最近認識された、あるいは最も正確であるかもしれない方法は、ＴＣIIをシリカに吸着させることと、つぎに、コバラミンを含む前記結合したフラクションを、例えば Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10: 2073-2077 に記載されているイムノアッセイ、または微生物学的検定法により検定することに関係し、後者の方が明らかに最良の結果を生む。この方法は、わずか２０の検定を実行するのに、丸１労働日を必要とする。これは、非常に高価につき、かつ、非実用的であり、日常的な臨床上の診断の研究室における調査にほとんど適していない。
【００２２】
そのように、日常的な臨床上の診断の適用において検査することができるコバラミンレベルをコバラミン欠乏症の可能性と関連付ける観点から、体液中の代謝活性なコバラミンレベルを検定する改良された方法についての多大な受容が存在する。
【００２３】
そのように、第一の観点によると、本発明は、体液由来の無細胞試料を、トランスコバラミンII（ＴＣII）またはコバラミンに結合したＴＣII（ホロＴＣII）のための固定化されたまたは固定化され得る特異性結合リガンドと接触させることと、リガンドに結合したフラクションをリガンドに結合していないフラクションと分離することと、そこに含まれるホロＴＣIIまたはＴＣIIに結合したコバラミンを測定することを含む、身体由来の試料(body sample)中のＴＣIIに結合したコバラミンを定量するための検定方法を提供する。
【００２４】
「特異性結合リガンド」とは、その特定の化学構造またはコンホメーションの効力によって、かつ、単に体液試料中の多くの成分に共通するであろう一般的な物理化学的性質（親油性のような）によってでなく、ＴＣII（すなわち、アポＴＣIIおよびホロＴＣII）またはホロＴＣIIと結合するものを意味する。前記リガンドの、前記方法に使用するために適切な結合親和力および特異性は、３倍、より好ましくは５倍、そしてさらに好ましくは１０倍、および最適には１０倍以上の濃度の試料中ＴＣIIまたはホロＴＣIIを許容し、そのゆえに、そのような方法は、ホロＴＣIIの正確で信頼できる数値を、ホロＴＣIIの標準範囲の低い部分において、およびまた標準以下の(sub-normal)範囲においても与えることができる。そのような、標的分子の分離および濃縮は、従来存在した、ＴＣIIまたはホロＴＣIIをＨＣまたはホロＨＣから有効に分離することができない方法では不可能である。前記ＴＣIIまたはホロＴＣIIを少なくとも３倍に濃縮する能力は、前記方法の実施において、自動化された分析装置を使用することを可能にする。そのような濃縮段階なしには、試料中に存在する分析物の量は、おそらく検出下限未満になる。そのような自動化された分析装置は、典型的には、４０および１００μＬの間の試料を、その運転のための典型的には１５０μＬまたはそれを超える総体積中に必要とする。そのように、低い濃度の分析物でさえも、分析のためにさらに希釈されてしまう。本発明の検定方法を用いることにより、しかしながら、前記分析物は、少なくとも３倍に濃縮される。典型的には１００〜７００ｐＭの制御範囲および約４０ｐＭの感度下限、しかし実際問題としては約９０ｐＭの下限に関係する自動化された分析装置を用いるため、５倍濃縮は、１８ｐＭ以上のホロＴＣIIの測定を助け、１０倍濃縮は、９ｐＭ以上のホロＴＣIIの測定を助ける。本発明は、１０倍を超える濃縮を助けるため、感度を高める程度の熟練者によれば、本発明が実際非常に強力な技術となることが容易に理解されるはずである。
【００２５】
分析物を濃縮する能力のために、そのような自動化された手順により分析するのを制御しやすいことは、本検定方法の重要な利点である。
【００２６】
開始時に６００μＬの体液試料から、つぎに任意に自動化された手順を用いて分析することができる、好ましくは１５０μＬ以下、より好ましくは１００μＬ以下、および最適には６０μＬ未満を生成させることができる。
【００２７】
任意のＴＣII特異性結合リガンドを、捕捉、濃縮および分離のためのリガンドとして、または検出のためのリガンドとして、前記本発明の方法に使用することができ、また、本発明の特定の実施形態によれば、ＴＣIIとアポ形態およびホロ形態の両方で結合することができ、または、ホロ形態と特異的にもしくは好ましく結合することができる。前記ＴＣII結合リガンドは、好ましくは、ＴＣIIに対し高い程度の選択性および特異性を示すことができ、かつ、他のＴＣタンパク質、すなわちＴＣＩもしくはＴＣIIIのアポもしくはホロのどちらかの形態、または任意の他のコバラミン結合タンパク質に対する親和性は、低いかまたはより好ましくは本質的に持たないことができる。前記ＴＣII結合リガンドがホロＴＣII特異性結合リガンドである場合、アポＴＣIIに対する親和性が低いかまたは好ましくは本質的にないという追加の要件と共に、前記と同じ性質を示す。
【００２８】
前記ＴＣIIまたはホロＴＣII結合リガンドは、一般的には、抗体、抗体フラグメント、または細胞表面レセプター、ポリペプチド、オリゴペプチド、小さい有機化学薬品等のＴＣIIまたはホロＴＣIIに対しそれぞれ親和性を持つ化合物であることができる。他の結合リガンドは、組み合わせの化学(combinatorial chemistry)もしくはファージ展示ライブラリ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの特定結合配列から選択される特定のバインダーであってよい。
【００２９】
前記結合リガンドが抗体である場合、それはポリクローナルであっても良いが、好ましくはモノクローナルである。モノクローナル抗体の方がポリクローナル抗体よりもはるかに大きい特異性および均質性を持たせて生産することができ、かつ、体液の他の成分、特に他のトランスコバラミンおよび適切には前記標的分析物の他のコンホメーションすなわちアポ形態との交差反応性を減少させる。モノクローナル抗体により与えられる均質性および再生産性は、ポリクローナル抗体のそれと比べて、検定において前記分析物がそのように低い濃度であるときに必要なより優れた精度を確立する。その他、それは、抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）2またはＦ（ｖ）断片であっても良い。前記抗体または抗体フラグメントは、一価または二価であって良く、かつ、ハイブリドーマ技術により生産されても合成由来でも、また、組替えＤＮＡ技術または化学合成により発生させても良い。一本鎖抗体または他の抗体誘導体もしくは疑似物質を、例えば使用することができる。前記抗体は、任意のエピトープ、ＴＣIIまたはホロＴＣIIタンパク質の構成要素または構造に対して適切に方向づけ(direct)するかまたは立ち上げて(raise)良い。
【００３０】
本発明で結合リガンドとして用いるのに好適な抗体は、例えば、Quadros et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:149-154; McLean et al. (1997) Blood 89(1) : 235-242 に開示されている。
【００３１】
ＴＣIIのアポおよびホロ形態と結合することができるか、またはホロＴＣII形態と好んでもしくは特異的に結合するレセプター分子を、同様に用いることができる。好適なレセプターは、細胞表面または膜に結合したＴＣIIまたはホロＴＣIIレセプターであり、交差種(cross species)の反応性は、そのようなレセプター分子は、任意の哺乳類種からのものを用いることができるが、しかし、好ましくは、そのようなレセプターの源はヒトまたはウシであることを意味する。しかしながら、前記レセプター分子は、好ましくは、比較的精製された形態で、前記レセプターを好ましくは濃縮された形態で含む細胞膜または混合膜フラクションの使用もまた完了されて単離される。そのようなレセプターまたはレセプター含有膜または膜フラクションは、有利には、腎臓、胎盤または腫瘍細胞から単離することができる。沈降細胞(deposit cell)は、一般的には、そのようなレセプターの源として用いられるべきでない。しかしながら、沈降細胞は、ハプトコリンレセプターの源として用いることができる。
【００３２】
ＴＣIIレセプターを豊富化した膜フラクションは、Seligman et al., J. Biol Chem 253 : 1766-1722 (1978) および Nexo et al., Biochem Biophys Act 628 : 190-200 (1980)に記載の通りにして得ることができる。要点を述べると、組織、例えばヒトの胎盤またはウサギの肝臓を小片にカットし、ｐＨ７．４の、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡトリス緩衝液中で均質化させ、つづいて、２５，０００ｘｇで３０分間遠心分離する。残った血液を取り除くために、前記均質化／遠心分離を、少なくとももう一回繰り返す。この膜フラクションを、さらに洗剤、例えば、Ａｍｍｏｎｙｘ−ＬＯ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＣｈａｐｓｏで抽出し、かつ、４℃、１００，０００ｘｇで３０分間遠心分離して透明化する。
【００３３】
前記ホロＴＣII複合体と好んで結合する好適なレセプター分子の例は、非共有結合性ホモダイマーとして存在し、すべての組織の細胞表面に見られる６２ｋＤａの一本鎖糖タンパク質(Rothenberg & Quadros (1996) Balliere's Clinical Haematology 8(3) 499-514 ; WO 96/085150)である。本発明の前記検定方法に好適に用いることができるさらなるタンパク質は、ｇｐ３００、吸収上皮細胞、例えば、腎近位尿細管細胞中で、Moestrup et al., (1996) Proceedings National Academy Science 93: 8612-8617 に開示され記述されているようにして発現される６００ｋＤａのエンドシトーシス媒介膜タンパク質である。このレセプターは、ＬＤＬレセプターであり、ＴＣIIのアポおよびホロの両方の形態と結合する。
【００３４】
細胞表面レセプターが用いられた場合、それは、抱合(conjugation)により、表面、例えば、ビーズまたはシートの表面に固定化することが可能であり、また、代わりに、前記レセプターを、そのレセプターを展示するシートまたは小胞内に形成することもできる。
【００３５】
前記リガンドが固定化される場合、その場所は、例えば、固体表面、例えば、濾過膜、またはシートまたは管の内腔が可能であるが、粒子上、例えば、ノルウェーのＤｙｎｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｒ  ＡＳＡにより生産されるようなミクロスフェアへの固定化が特に好ましい。そのような粒子は、多孔性または非多孔性であることが可能であり、かつ、望むのであれば、それを集めることのできる手段、例えば、磁気感応性材料、例えば、超磁性酸化鉄結晶製粒子の封入により提供することができる。そのような磁気感応性ミクロビーズは、ノルウェーのＤｙｎｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｒ  ＡＳＡおよびＤｙｎａｌ  ＡＳ、米国のＢａｎｇ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、およびフランスのＰｒｏｌａｂｏから入手することができる。前記リガンドが、固定化されるのでなく、固定化され得る場合、それは、前記リガンドを特定の結合ペアのメンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）と連結(coupling)し、そして、任意に基質に結合した前記結合ペアの他のメンバーを、本発明の方法において行われる前記リガンド結合フラクションの前記非結合フラクションからの分離に先立ち、前記リガンドまたは前記リガンド：ＴＣIIまたはリガンド：ホロＴＣII複合体を集めるかさもなければ固定化するために使用することにより達成することができる。
【００３６】
親和性分子、例えば、抗体および抗体フラグメントを、分離の目的で固定化するために、例えば、前記リガンドを、任意にリンカーにより、カラムおよび任意の公知の方法において分離または固定化のために一般に広く用いられているかまたは提案されている任意の周知の固形担体またはマトリックスに結合または連結することが使用できることは、技術的に周知である。そのような固層は、粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、繊維、または毛細管または微量滴定用細片(microtitre strip)、管またはウェル板(plate of wells)等の形態を取ることが可能であり、かつ、好適には、ガラス、シリカ、ラテックスまたは高分子材料で形成することができる。前記リガンドを前記固形担体に結合させる技術は、それもまた、極めて良く知られており、かつ、文献中に広く記述されている。
【００３７】
前記リガンドを、基質または特定結合ペアの一員に連結させることは、従来技術により達成することができる。
【００３８】
本発明の方法では、前記アッセイが競争的結合アッセイとして行われる場合、それは、一般的に、さらに、前記リガンドとの結合に関して競争する標識化合物の試料に関係する。一般的に、この目的では、標識されたホロＴＣIIを用いることが好ましい。前記使用される標識は、直接的または間接的に、例えば、発色団（この用語は、蛍光団を含む意味で用いる）、放射性同位体（一般的には、共有結合性またはキレート結合性）による識別、酵素または酵素基質、磁気標識等により同定することができる任意の標識が可能である。
【００３９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、固定化されたまたは固定化され得るＴＣIIまたはホロＴＣIIに結合したリガンドを、調査する試料に接触させることと、
リガンド結合フラクションを非リガンド結合フラクションから分離することと、
結合したコバラミンを前記結合フラクション中のホロＴＣII分子から解離させ、放出されたコバラミンの濃度を定量することに関係する。その解離は、前記放出されたコバラミンの濃度が、当初の試料中のホロＴＣII濃度の少なくとも３倍、好ましくは５倍およびさらにより好ましくは１０倍を超えるように作用することが好ましい。
【００４０】
本発明のこの様相の本質は、前記方法において有用に用いられるコバラミン定量の標準的方法を可能にする、ＴＣIIまたはホロＴＣIIの分離および濃縮にある。上に示した通り、そのような濃縮の段階なしには、コバラミンはとても低い濃度でしか存在しないので、従来公知の方法は、コバラミンの定量には適さない。コバラミンをホロＴＣIIから放出させるために、任意の適切な方法を使用することができるが、好適には、熱または周囲媒体のｐＨの変化が、この目的のために使用される。異なるコバラミンの形態は、ＫＣＮ処理により、より光感応性の低いシアノコバラミンに変換することができる。フリーなコバラミンの定量のための任意の適切な方法、例えば、コバラミンのための固定化された結合パートナーを、試料中の解離したコバラミンと標識リガンドの存在下で接触させる競合アッセイを本発明の方法に採用することができる。前記標識リガンドは、前記固定化された結合パートナーと結合することについて、前記単離したコバラミンと競争する。例えば、Kuemmerk et al. (1992) Clin. Chem 38 : 2073-2077 に記述された方法が適切である。フリーのコバラミンを定量するための他の方法は、米国特許第５４５１５０８号に記載されており、イムノアッセイ技術に関係している。
【００４１】
本発明のこの実施形態では、ＴＣIIのための結合リガンドは、固定化され、かつ、ホロおよびアポＴＣIIの両方に結合していることが好ましい。
【００４２】
他の好ましい実施形態では、本発明の検定方法は、ＴＣIIまたはホロＴＣII結合リガンドをその上に固定した固形担体を、調査しようとする試料および固定化されていないリガンドと接触させることと、
結合フラクションを非結合フラクションと分離することと、
前記固定化リガンドに結合した前記非固定化リガンド（前記結合フラクション）または非結合かつ溶液中の前記非固定化リガンド（前記非結合フラクション）を直接的にまたは間接的に定量することを含み、
前記固定化リガンドが、ＴＣIIまたはホロＴＣII、前記非固定化リガンドまたは前記ＴＣIIもしくはホロＴＣIIと前記非固定化リガンドとの複合体に結合することが可能であり、かつ、前記非固定化リガンドが、前記固定化リガンドのうち少なくとも一つ、ＴＣIIまたはホロＴＣIIおよび前記固定化リガンドとＴＣIIまたはホロＴＣIIとの複合体と結合することが可能であり、
前記検定方法がサンドイッチアッセイである場合、少なくとも一つの前記リガンドはホロＴＣII特異性であり、かつ、前記アッセイが競合アッセイである場合、前記固定化リガンドはホロＴＣIIおよびその競争物特異性であり、
ＴＣIIまたはホロＴＣIIにより、前記非固定化リガンドにより、または前記非固定化リガンドとＴＣIIもしくはホロＴＣIIとの複合体によりそれぞれ結合された前記固定化リガンドの比率が、前記試料中に存在するホロＴＣIIの量に依存し、
前記非固定化リガンドが、結合時または非結合時に、直接的にまたは間接的に探知可能なシグナルを生成することが可能であり、
前記試料および前記非固定化リガンドの前記固形担体との接触は、個別に、同時にまたは連続的に行って良く、かつ、個別にまたは連続的に行う場合は、それらはどちらの順序で接触させても良い。
【００４３】
それゆえ、本質的に、本発明の方法における別の好適な実施形態は、前記固定化リガンドと直接的もしくは間接的に結合しているか、または直接的もしくは間接的に結合することに失敗した前記非固定化リガンドを定量することに関係する。前記非固定化リガンドは、前記固定化リガンドと結合することに関してホロＴＣIIと競争するので、結合していない非固定化リガンドのレベルが高いことは、試料中のホロＴＣII濃度が高いことを示し、結合していない非固定化リガンドのレベルが低いことは、試料中のホロＴＣII濃度が低いことを示す。前記非固定化リガンドは、前記固定化リガンドと順番に結合したＴＣIIまたはホロＴＣIIと結合するので、したがって、結合した非固定化リガンドのレベルが高いことは、試料中のホロＴＣIIの濃度が高いことを示し、結合した非固定化リガンドのレベルが低いことは、試料中のホロＴＣIIの濃度が低いことを示す。
【００４４】
本発明の方法では、それゆえに、コバラミンの代謝活性プールは、アポおよびホロＴＣIIならびにアポおよびホロＨＣ（ハプトコリンまたはＴＣＩおよびＴＣIII）の両方を含む身体由来のサンプル中に存在するホロＴＣII複合体を測定するか、またはＴＣIIに結合したコバラミンの量を測定することにより定量される。
【００４５】
予備分離段階は、ＴＣIIおよびハプトコリン（ＨＣ）の両者のアポ形態と選択的に結合する固定化されたコバラミンまたはその同族体もしくは断片を使用して行うことができる。そのような予備分離段階では、前記ＴＣIIおよびＨＣタンパク質のアポ形態が前記固定化されたコバラミンまたはその同族体もしくは断片と結合し、前記ホロＴＣIIおよびホロＨＣ複合体と分離される。
【００４６】
この場合、前記分離されたＴＣIIのホロ形態の分析は、上記本発明の実施形態のうち任意のものにしたがって行われるが、明らかに、前記ホロＴＣII複合体の定量が、前記複合体の解離および続いての前記放出されたコバラミンの定量以外により行われることが最も有用である。そのような予備段階が、上記それぞれの好ましい実施形態に先立って行われる場合、サンドイッチアッセイにおける少なくとも一つのリガンドはＴＣIIに対してホロＴＣII特異性である必要があり、かつ、競合アッセイにおける前記固定化リガンドはホロＴＣII特異性である必要があり、かつ、そのＴＣIIに対する競争物は、前記ＴＣIIのアポ形態が捕捉されてもはや有効でなくなると、もはや関係がないことは、熟練者には明らかである。そのように、前記固定化または非固定化リガンドは、ホロＴＣIIまたはＴＣIIまたはそれらの競争物に対して特異性であることが可能である。
【００４７】
前記固定化されたコバラミンは、その支持体から解離することについて、どのような顕著な傾向も示すべきでない。これにより、アポＴＣIIと結合し、ホロＴＣIIに変換することが可能になるからである。ビオチン化されたコバラミンは、アビジン(avadin)／ストレプトアビジンが結合した固体表面に非常に安定な方法で結合し、また、コバラミンを支持体にこの方法でつなぐことは、この段階の実施のために好適である。実際、ビオチン化されたコバラミンが使用される場合、分析される試料に、非固定化形態で、前記ＴＣIIおよびＨＣのアポ形態と結合するように加えることが可能である。前記試料は、つぎに、ビオチン標本、アビジンのための結合パートナーが固定化された固体表面に接触させることが可能である。前記試料から容易に単離することが可能な、アビジン−ビオチン化されたコバラミン−ＴＣII複合体が、つぎに形成される。
【００４８】
本発明の一実施形態において、この予備分離段階を行う場合、前記ホロＴＣIIプールを、続いて、前記試料を、溶液中で前記ハプトコリンを放出する前記ホロＴＣII複合体を捕捉する固定化されたＴＣIIリガンドと接触させ、そしてつぎに、前記固定化されたホロＴＣIIを、標識され、上記のように検出できる第二のＴＣIIリガンドと接触させることにより定量する。好適なＴＣII結合リガンドの例は、オーバーラップしていない(non-overlapping)モノクローナル抗体であるか、または確実に(indeed)ＴＣII特異性のポリクローナル抗体が、ＴＣII分子状の異なるエピトープが認識されるため、この実施形態で捕捉および検出の両方のために好適である。
【００４９】
本発明の他の実施形態において、この予備分離段階を行う場合、前記ホロＴＣII分子は、前記固定化リガンドと結合することについて前記標識された非固定化リガンドと競争し、それゆえに、ホロＴＣIIの量は、前記固定化リガンドに結合しているかまたは結合していない標識された非固定化リガンドの量との関係から算出される。
【００５０】
好ましい実施形態では、前記予備分離段階において、前記アポＴＣIIおよびアポＨＣのコバラミン、その同族体または断片への結合が、続いて起こる、前記非固定化リガンドまたはＴＣIIの結合パートナーによる、前記ＴＣIIに結合した固定化されたコバラミンの認識および結合を阻害する部位または手法で起こる。この実施形態においては、本発明のアッセイを行う前に、前記ホロＴＣIIおよびホロＨＣを結合したアポ形態から分離する必要がない。この実施形態においては、前記非固定化結合パートナーまたはリガンドがそこに向かって方向づけられている部位が非常に重要である。それは、マスクもしくはシールドされ、または、さもなければ、アポＴＣIIおよびアポＨＣがコバラミン、その同族体または断片に固定化されたとき結合するのに不適切となり、ＴＣIIのエピトープとなるであろう。
【００５１】
前記初期分離段階は、ＴＣIIのための結合リガンドを使用することに関係するか、または、固定化されたコバラミン、その同族体または断片を用いる予備段階に先立って行われ、完全な分離、すなわち、すべてのアポおよびホロＴＣIIタンパク質の試料からの分離は、本方法においては必要とされず、かつ、フラクションが、少なくとも希望の「タンパク質のＴＣIIサブセット」の一部を含む試料から分離されれば十分である。
【００５２】
したがって、ある実施形態では、前記結合パートナーまたはリガンドおよび結合状態は、実質的に、選択した全ての「サブセット」の分離を達成するように選択することができる。このケースにおいて、前記非結合フラクションは、実質的にＴＣIIまたはホロＴＣIIタンパク質フリーであるとみなすことができる。すなわち、どちらの要素を分別の基本として選択するかに依存して、ＴＣIIまたはホロＴＣIIのどちらかに対して、少なくとも８０％、９０％または９５％フリーである。
【００５３】
その他の実施形態では、前記結合パートナーおよび条件は、前記試料中のＴＣIIタンパク質の一部だけがフラクション中に分離されるように選択することができる。このケースでは、前記部分的分離において、本アッセイのための標準検量線(standard calibration curve)を作図するために計算(account)を採用すべきである。この点では、検出されたホロＴＣII濃度に対しての標準検量線の生成は、技術的に周知な標準的技術を用いて決定することができる。
【００５４】
したがって、分別段階において、ＴＣII結合リガンドを用いるとき、少なくとも一部の前記ＴＣII結合コバラミンが前記結合フラクション中に存在し、かつ、試料中の、ＴＣII以外の分子に結合した任意のコバラミン、例えば、ＨＣまたはアルブミンが、前記非結合フラクション（すなわち、分離されていないフラクション）中に存在するべきである。前記結合フラクション中のＴＣIIは、アポおよびホロ形態のどちらであっても良く、かつ、コバラミンに加えて、コバラミン様物質または同族体と複合体を形成しても良い。
【００５５】
望むのであれば、前記本発明の方法は、さらなる予備分離段階に関係していても良い。その予備分離段階では、前記試料を、ハプトコリン（アポおよびホロの両方の形態か、またはホロ形態単独）に対する、固定化されたまたは固定化されていない特異性結合リガンドと接触させる。このやり方では、ホロＴＣIIに由来する前記ＴＣII結合コバラミンの定量における誤差への任意の寄与を減少させることができ、かつ、ハプトコリンに対していくらかの結合親和性を持つ、ＴＣIIまたはホロＴＣIIに対して特異性の結合リガンドを使用することができる。
【００５６】
その他、上に示した通り、ＴＣIIの血漿濃度は、アポおよびホロのどちらの形態でも非常に低いので、特に高い特異性および親和性を持つリガンドまたは結合パートナーが、本発明の操作のためには必要である。また、ＴＣIIの血漿濃度は約０．５〜１ｎＭであるが、ほろＴＣIIの濃度はわずか３５〜１６０ｐＭなので、本発明のリガンドに要求される親和定数は、前記リガンドがＴＣIIまたはホロＴＣII特異性かどうか、また、その有用性が捕捉リガンド向きかまたは検出リガンド向きかに依存する。したがって、ＴＣII捕捉リガンドとしては、親和定数は、少なくとも１０9Ｍ-1であり、好ましくは２×１０9Ｍ-1を超え、そして、より好ましくは、１０10Ｍ-1が望ましい。ホロＴＣII捕捉リガンドとしては、親和定数は少なくとも１０10Ｍ-1が望ましく、好ましくは２×１０10Ｍ-1であり、より好ましくは２×１０10Ｍ-1を超え、そして、最適には、１０11Ｍ-1を超える。前記アッセイの濃度効果により、バインダー(binder)の検出に必要な親和定数は、捕捉リガンドのそれよりも明らかに小さくて良い。
【００５７】
ホロＴＣIIまたはＴＣII結合リガンドの、ＨＣとの交差反応性の程度は、好ましくは１％未満、より好ましくは０．１％と１％の間、そして最適には０．１％未満が良い。同様に、ホロＴＣ結合リガンドは、アポＴＣIIとの交差反応性の程度の発現において、１％を超えないことが好ましく、より好ましくは０．１％と１％の間、そして、最適には、前記交差反応性は、０．１％未満であるべきである。
【００５８】
そのような高い親和性のリガンドを使用することにより、それらの機能は、単に捕捉および／または検出リガンドであることを超えて広げられ、それらは、ＴＣIIタンパク質を分析用サンプルから分離しかつ濃縮することを可能にする重要な役割をする。ＴＣIIまたはホロＴＣIIのための結合リガンドは、好ましくは前記リガンドを少なくとも３倍に、より好ましくは５倍に、かつ、さらにより好ましくは少なくとも１０倍に濃縮すべきである。
【００５９】
本アッセイ技術のさらなる実施形態は、競合アッセイよりも置換アッセイ(displacement assay)により近く、前記ホロＴＣII複合体を含む前記試料を、前記固定化リガンドの、ホロＴＣIIが結合しているのと同じ結合部位を認識する標識されたリガンドが結合されている固層と接触させる。
前記試料中のホロＴＣIIは、前記結合した標識リガンドと、前記結合部位について競争し、その競争は、前記系の均衡化の後、前記固形担体から置換され、溶液中で検出可能な標識リガンドの量と、前記当初の試料中に存在するホロＴＣIIの量との間に直接比例関係があるような競争であり、前記標識リガンドは、前記固形担体に適切に結合したまたは結合していない標識リガンドの量として直接的にまたは間接的に検出されてよく、また定量されて良い。事実上、本実施形態では、前に述べた前記非固定化リガンドを、前記試料の適用の前に前記固定化リガンドと結合するが、そのような結合は、前記リガンドが固定化されたことを意味すると解釈すべきでない。
【００６０】
さらなる好ましい実施形態は、前記ホロＴＣII含有試料を、その上に固定化されたホロＴＣIIを有する固形担体および標識された、固定化されていないホロＴＣII特異性バインダーと接触させることに関係する。前記サンプル中のフリーなホロＴＣIIおよび前記固定化されたホロＴＣIIは、標識された非固定化リガンドと結合することについて競争し、かつ、前記固形担体に結合しているかまたは溶液中に残っている前記標識リガンドの定量は、ホロＴＣII濃度の計算を可能にする。本発明の特に好ましい実施形態では、前記非固定化ホロＴＣII結合リガンドは、抗体である。
【００６１】
さらにもう一つの実施形態では、重要な分析物を含む試料を、標識されたホロＴＣIIおよび固定化リガンドと接触させる。前記標識されたおよび標識されていないホロＴＣIIは前記固定化リガンドと結合することについて競争し、かつ、均衡化が到達した後、前記固定化リガンドに結合した標識されたホロＴＣIIの量が、前記重要な試料中のホロＴＣIIの量と間接的に比例する。さらに、前記標識されたＴＣIIは、直接的または間接的に検出することができ、かつ、前記固形担体と結合したまたは結合していない標識されたホロＴＣIIの量として定量することができる。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態では、前記ホロＴＣII特異性であり、非固定化の、しかし固定化され得るリガンド（例えば、ビオチンまたはその他の特定結合ペアのメンバーと接合(conjugate)したリガンド）を、前記試料と接触させ、ホロＴＣII／非固定化リガンド複合体を形成させる。前記リガンド／ホロＴＣII複合体は、つづいて、公知の手段を用いることにより溶液から沈殿させ、分析のために単離することができる。
【００６３】
本発明のさらにその他の実施形態では、前記試料からＴＣIIおよびＨＣのアポ形態を枯渇させるような予備段階の後任意に、前記試料に二つの標識された結合パートナーを加える。このケースでの結合パートナーは、標識されたホロＴＣIIまたはその同族体もしくは断片およびその(thereof)標識された結合パートナー、例えば標識された抗体である。本実施形態では、検出可能なシグナルは、前記ラベルが互いに近接しているとき、すなわち、前記二つの標識された結合パートナーが結合するときは、そのラベルからのみ発生する。したがって、前記試料に加えて、前記ＴＣIIのための標識された結合パートナーは、検出可能なシグナルが発生しない場合には、試料中に存在する標識されていないホロＴＣIIと、または、検出可能なシグナルが発生する場合には、前記標識されたＴＣII結合パートナーと結合する標識されたホロＴＣIIまたはその同族体、断片もしくは変異体と結合させて良い。米国特許第４５６８６４９号に記述されているアマシャムシンチレーション近接アッセイ(Amersham scintillation proximity assays)におけるような標識物質がそのような実施例への取り込みには適切であり、この処理の高い感度は、分析物がそのように低い濃度で存在するアッセイに良く適合する。したがって、例えば、結合ペアの一員は、Ｉ125またはＨ3のようなβ線放出核種で標識することができ、他のメンバーは、適切なシンチラント分子(scintillant molecule)で標識することができる。放出されたβ粒子は、前記シンチラントが１．５μｍ以内となるまで、その水性環境中でエネルギーを失い、そして、検出可能なシグナルのために、両方の標識パートナーが互いに結合することを必要とする。二つの標識パートナーが互いに結合する可能性は、試料中に存在するホロＴＣII濃度により見積もられる。前記発生したシグナルが大きいほど、前記試料中のホロＴＣII濃度は低いからである。
【００６４】
本発明の検定方法で用いる身体由来の試料は、任意のコバラミン含有試料、例えば、体液または組織試料、または縣濁液等であって良い。しかしながら、好ましくは、前記試料は、体液、例えば、精液、脳脊髄液、羊水が良く、しかし、一般的には、血液由来の試料が良い。このケースでは、分析に用いられる資料は、好ましくは無細胞であり、血清または血漿のどちらかを用いることができる。前記試料は、本発明の検定方法に使用する前に処理して良い。例えば、緩衝液または他の水性媒体を加えることにより希釈して良く、かつ、分析前に、例えば冷蔵または冷凍により、保管(store)するかまたは保存(preserve)して良い。
【００６５】
本発明の実行では、結合フラクションを非結合フラクションから分離するとき、それは、例えば、沈殿分離法、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー法等、任意の適切な手段により実行して良い。
【００６６】
疑義を避けるために述べると、ここで「コバラミン」という用語は、「ビタミンＢ12」と同じ意味で使用しており、かつ、体内で生じ、そして代謝活性である（適切に存在している場合に）可能性のあるビタミンＢ12の全ての形態（シアノコバラミン、５−６−ジメチル−ベンズイミダゾリルシアノコバミド、メチルコバラミン、５’−デオキシアデノシルコバラミン）を含む。
【００６７】
上に示した通り、本発明の方法では、前記ＴＣ結合コバラミンの定量は、分離されたホロＴＣIIに結合したリガンドを検出することにより、または、ホロＴＣIIとの標識された競争物を用いて競合アッセイを行うか、または分離されたホロＴＣIIから放出されたコバラミンを検出することにより行って良い。前記競合アッセイにおいては、前記ホロＴＣIIは、前記標識された競争物と、その(therefor)結合リガンドと結合することについて競争する。
【００６８】
前記検出可能なリガンドは、好適には、任意の一般的な手段、例えばシグナル形成ラベルで標識して良く、そのシグナル形成ラベルは、例えば、ルミネッセンス、化学ルミネッセンス、比色定量評価、フルオレッセンス、放射活性または酵素活性により定量することができる。事実上、任意の技術上公知のシグナル形成ラベルを本発明の方法に用いることができる。
【００６９】
単なる例示として、本発明において結合リガンドを検出可能に標識するために用いることができる有色のまたは蛍光性の化合物のいくつかの好適な例は、アントラキノン類、アゾ染料、オキサジンおよびチアジンのようなアジン染料、トリアジン類、ポルフィリン類のような天然由来の色素、フィコエリトリン(phycoerythin)およびフィコクアニン(phycoquanin)を含むフィコビリタンパク質、クロロフィルおよびそれらの同族体と誘導体、カロチノイド、アクリニジン(acrinidine)、フルオレッセインおよびローダミンを含むキサンテン類、インジゴ染料、チオキサンテン類、クマリン類、ジおよびトリアリールメチンを含むポリメチン類およびその誘導体、フタロシアニン類および金属フタロシアニン類である。
【００７０】
同様に、広い範囲の放射活性化合物を前記試薬のシグナル形成ラベル部分を本発明に用いることができ、その中にはヨウ素１２５で標識した化合物がある。
【００７１】
その他、前記結合リガンドは、化学ルミネッセンスシグナルを生成し得る天然のまたは合成の化合物と接合して良く、それは、公知の方法で検定することができる(Cormier, M.J. et al.; Chemiluminescence and Bioluminescence, Plinum Press, New York 1973)。好適な化学蛍光化合物は、ルシフェリン、シュウ酸エステル、１,２−ジオキセタン、ルミノールまたはその誘導体を含むが、これらに限定されない。適切であれば、過酸化水素、酵素例えばルシフェラーゼ、またはその他の化学物質を、使用したシグナル生成分子から化学ルミネッセンスシグナルを生成させるために用いて良い。
【００７２】
強いアニオン性シグナルを形成する分子は、試料中に存在するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような血清タンパク質と結合する傾向があるため、本発明の方法に使用するのは好ましくない。用いることのできる特に好適な例は、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミンＢまたはＮ−（レゾルフィン−４−カルボニル）ピペリジン−４−カルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはレゾ(resos)である。
【００７３】
本発明の方法の一実施形態に基づけば、少なくとも一部のＴＣIIを含むフラクションを、体液試料から分離することができる。その分離は、前記体液をＴＣII特異性の結合リガンドと反応させ、つぎに、前記ＴＣII結合フラクションを前記試料の残部から分離し、それによって、そこに含まれる標的分析物を単離しかつ濃縮することにより行う。本発明の一実施形態では、ホロＴＣIIに向かって方向づけられている検出可能な結合リガンドを、前記分離した結合フラクション中に存在するＴＣII−コバラミン複合体を定量するために使用することができる。前記ホロＴＣII結合リガンドは、調査する試料と接触させて良い。その接触は、ＴＣII結合リガンドとの接触に先立ってか、同時にか、または後で行うことができ、かつ、前記ＴＣII結合フラクションを、前記試料の残部から分離する前または後で行うことができる。
【００７４】
それと対応して、コバラミン含有フラクション（例えば、ホロＴＣIIおよびホロＨＣを含む）は、前記試料の残部と分離して良い。その分離は、調査する体液を、アポＴＣIIおよびアポＨＣに結合する固定化されたまたはつながれたコバラミンまたはその同族体もしくは断片と反応させ、そして、前記結合フラクションから、ホロＴＣIIおよびホロＨＣを含む前記試料の残部を分離することにより行う。検出可能なＴＣII結合フラクションは、つぎに、前記分離したフラクション中に存在するＴＣII−コバラミン複合体を検出するために使用することができる。前記検出可能なＴＣII結合リガンドは、研究する試料と接触させることができる。その接触は、前記結合コバラミンとの接触に先立ってか、同時にか、または後で行うことができ、かつ、前記結合フラクションを、前記試料の残部から分離する前または後で行うことができる。
【００７５】
いくつかの実施例では、アポおよび／またはホロＴＣII／ＨＣ複合体のうち一つのまたは他の構成要素のための固定化リガンドは、カラム中で整理(arrange)することができる。前記ＴＣIIコバラミン複合体を含む体液は、前記カラムに適用し、前記結合リガンドと接触させて良い。
【００７６】
前記カラムは、流す(flush through)かまたは洗うかして良く、また、必要であれば、結合フラクションを前記カラムから放出させ、その収集を促進することを可能にするために、溶出剤を用いる。前記非結合フラクションの中身を、他の構成成分についても分析する場合は、前記カラムは、緩衝液または媒質で洗浄してよい。その緩衝液または媒質は、正確な知られた体積を管理しかつ集めることを確実にするために、目盛り付きマイクロピペットを用いて管理する。前記管理された体積は、好ましくは、望ましい（すなわち、検量(calibration)の）体積の３％以内、より好ましくは、１または２％以内である。さらに、分析しようとするフラクションを、検出前に前記カラムから放出する場合、前記複合体を放出するために用いる溶出剤は、目盛り付きマイクロピペットで管理すべきである。
【００７７】
その他の実施形態では、試料のフラクションを分離するために用いる前記結合リガンドは、微粒子状の固層支持体、例えば、ラテックスまたはポリマービーズ上に固定することができる。操作および分離を助けるために磁性ビーズを使用して良く、事実上、これが本発明の好ましい実施形態である。ここで使用する「磁性」という用語は、その支持体が磁場内に置かれたときに、それに与えられた磁気モーメントを持ち得ることを意味する。言い換えると、磁性粒子を含む支持体は、磁性集合(magnetic aggregation)により容易に取り除くことができ、リガンド結合に続くフラクションを分離するための迅速、単純かつ効果的な手法を与える。
【００７８】
したがって、本発明の方法を用いると、前記ＴＣII−コバラミン複合体が付着した前記磁性粒子は、磁場の適用、例えば永久磁石の使用により、適切な表面へと取り除くことができる。前記試料混合物を含む器の側面に磁石を適用することで、前記粒子を前記器の壁に集め、それらをさらなる分析のために単離するためには、通常は十分である。
【００７９】
特に好ましいのは、例えば、Sintefにより欧州特許公開１０６８７３号(EP-A-106873)で記述されている超磁性粒子であり、前記粒子の反応途中における凝集および凝固(aggregation and clumping)を回避することができる。Bang Particles（米国）製の周知の磁性ビーズは、本発明に特に好ましく使用することができる。
【００８０】
一般的に、評価(evaluate)しようとする試料の他に、ホロＴＣII複合体含有量の分かっている検量用試料(calibration sample)も、本発明の検定方法の実行において評価(assess)するのが良い。そのような定量は、検量線をプロットするのに使用することができ、その検量線から、調査しようとする試料中の前記ＴＣII結合コバラミン含有量を定量することができる。前記ホロＴＣII複合体の定量に使用する前記検量用試料の性質および換算係数または調整係数の選択は、例えば、結合に使用する特異性リガンドと、前記アッセイの分離段階と、前記方法において前記試料の結合および分離に影響を与えるその他の面、例えば、緩衝液の組成、アッセイの条件に依存して変化する。典型的には、ホロＴＣII含有量０から３００ｐｍｏｌ／Ｌの検量用試料を使用するのが良い。それによるＴＣII結合コバラミンの価の参照範囲(reference range)は、一般的には、３０から１６０ｐｍｏｌ／Ｌに見られる。
【００８１】
ホロＴＣIIの校正標準(calibration standard)は、典型的には、ヒトの、天然または組替えのホロＴＣIIである。ホロＴＣIIの、ホロＴＣIIアッセイにおける校正物質(calibrator)としての使用は、新規であり、本発明のさらなる面を形作る。
【００８２】
他のさらなる面から見ると、本発明は、本発明にしたがった診断上のアッセイに使用するキットを提供する。そのキットは、ＴＣIIまたはホロＴＣII特異性の、固定化されたまたは固定化され得る結合リガンドと、好ましくは既知の濃度のホロＴＣII溶液、より好ましくはホロＴＣII複合体濃度の範囲を有するそのような溶液のセットと、任意にコバラミンをホロＴＣIIから放出させる放出剤(release agent)と、任意に標識リガンドとを含む。
【００８３】
本発明の検定方法は、前記ホロＴＣII複合体を定量するか、または前記ホロＴＣII複合体を単離することによりコバラミンの代謝活性プールを定量し、そしてつぎに、そこに結合したコバラミンを定量し、そして、そのように、コバラミン欠乏症の臨床症状の開始前または後におけるコバラミン欠乏の定量のために便利な方法を提供する。前記検定方法は、コバラミンの陰性バランスにおける正確な予言値を持つため、病気の徴候が始まる前に有利に使用することができる。
【００８４】
本発明を、以下の限定しない実施例およびそれに伴う図により例示する。図１は、ホロＴＣIIの標準曲線であり、図２は、血清中の全コバラミンとホロＴＣII濃度との相関を示すプロットであり、そして、図３は、血清中の全コバラミンとホロＨＣ濃度との相関を示すプロットである。
【００８５】
実施例１
ＴＣII特異性抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を、磁化できる粒子上に固定する。同体積のＰＢＳと混合した血清のアリクォット(aliquot)（１００〜５００μＬ）を、過剰の固定化された抗体および過剰の、オーバーラップしていない、Ｉ125で放射性同位体ラベルされた抗ホロＴＣII抗体（例えば、モノクローナル抗体）と共に１５分間反応させる。前記磁化できる粒子は、強力な磁石を用いて沈殿させ、上澄みを除去し、前記粒子をＰＢＳで洗浄する。
放射活性を測定し、試料のホロＴＣII濃度を、標準曲線上への内挿(interpolation)により定量する。
【００８６】
実施例２
ＴＣII特異性抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を、磁化できる粒子上に固定する。同体積のＰＢＳと混合した血清のアリクォット(aliquot)（６００μＬ）を、過剰の固定化された抗体と共に３０分間反応させる。前記磁化できる粒子は、強力な磁石を用いて沈殿させ、上澄みを除去する。前記粒子をＰＢＳで洗浄し、続いて、シアン化カリウム（１００μＭ）とジチオトレイトール（１５ｍＭ）を含む水酸化ナトリウム（０．３Ｍ）および一定量(fixed amount)の、Ｉ125またはＣｏ57で放射性同位体ラベルされたシアノコバラミンで、総量１００μＬで１５分間処理することにより、前記固定化されたホロＴＣIIに結合したコバラミンを放出し、かつ、同時に、コバラミンの全ての形態をシアノコバラミンに変換し、そして、一定量の標識されたシアノコバラミンと混合する。１００μＬのホウ酸緩衝液中の限定された量の内因子を加え、１０分間反応させる。前記磁化できる粒子を、強力な磁石により沈殿させ、１５０μＬの上澄みを、放射活性の測定のために除去する。血清試料中のＴＣII結合コバラミンの濃度を、標準曲線から定量する。
同時に、前記放出されたコバラミンは、アボットのＩＭｘ法（Abbot's IMx method)または同様の方法を用いて測定することができる。
【００８７】
実施例３
ホロＴＣII特異性抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を、磁化できる粒子上に固定する。同体積のＰＢＳと混合した血清のアリクォット(aliquot)（１００〜５００μＬ）に、一定量の、Ｉ125で放射性同位体ラベルされたホロＴＣIIおよび限定された量の抗ホロＴＣII抗体を加える。１５分間の浸漬(incubation)の後、前記磁化できる粒子を、強力な磁石を用いて沈殿させる。前記粒子をＰＢＳで洗浄し、その放射活性を測定する。ホロＴＣII濃度は、標準曲線から定量する。
【００８８】
実施例４
組替えホロＴＣIIを、磁化できる粒子上に固定する。同体積のＰＢＳと混合した血清のアリクォット(aliquot)（１００〜５００μＬ）に、一定量の、固定化されたホロＴＣIIおよび過剰量の、Ｉ125で放射性同位体ラベルされたホロＴＣII特異性抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を加える。１５分間の浸漬(incubation)の後、前記粒子を、強力な磁石を用いて沈殿させる。前記粒子をＰＢＳで洗浄し、その放射活性を測定する。ホロＴＣII濃度は、標準曲線から定量する。
【００８９】
実施例５
血清のアリクォットに、過剰の、ビオチン化された(biotinylated)コバラミンを加え、全てのアポＴＣIIおよびアポＨＣと結合するようにする。１０分間の浸漬の後、前記血清試料を、アビジンで被覆した磁性粒子で１０分間処理する。前記粒子を、強力な磁石を用いて沈殿させる。上澄みを回収し、二つのオーバーラップしていないモノクローナル抗ＴＣII抗体と混合する。一つはＩ125で放射性同位体ラベルされており、他はビオチンと接合(conjugate)している。１０分後、アビジンで被覆された磁化できる粒子を加え、１０分間、ビオチン化アダクトと結合させる。続いて、前記粒子を強力な磁石で沈殿させ、ＰＢＳで洗浄する。放射活性を測定し、ホロＴＣII濃度は、標準曲線上への内挿により定量する。
【００９０】
実施例６
実施例５と同様に、しかし、アポＴＣIIの枯渇した血清を、一定量の、Ｉ125でラベルしたホロＴＣIIおよび限定された量の、磁化できる粒子上に固定された抗ＴＣII抗体と混合する。１５分間の前記粒子を、強力な磁石を用いて沈殿させる。
前記粒子をＰＢＳで洗浄し、その放射活性を測定する。
【００９１】
実施例７
コバラミンを磁化できる粒子上に、例えば共有結合により、またはビオチン−（ストレプト）アビジン結合の使用により固定する。典型的には、ストレプトアビジンで被覆した磁化できる粒子は、１μＭのビオチン化されたコバラミンに、室温で、暗所において、３０分間浸漬する。前記ビーズを磁石を用いて沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ＋５ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ中、１％で再縣濁させる。血清のアリクォット（１００〜５００μＬ）に、同体積のＰＢＳおよび十分の一の体積の、コバラミンで被覆された磁化できる微粒子を加える。その混合物を、室温で、暗所において３０分間浸漬し、全てのアポＴＣIIおよびアポＨＣと結合させる。前記粒子を磁石により沈殿させ、その上澄みを回収し、二つのオーバーラップしていないモノクローナル抗ヒトＴＣII抗体と混合する。一つはＩ125で放射性同位体ラベルされており、他はビオチンと接合(conjugate)している。１０分後、（ストレプト）アビジンで被覆された磁化できる粒子を加え、１０分間、ビオチン化アダクトと結合させる。続いて、前記粒子を強力な磁石で沈殿させ、ＰＢＳで洗浄する。放射活性を測定し、ホロＴＣII濃度は、標準曲線上への内挿により定量する。
【００９２】
実施例８
実施例７と同様に、しかし、過剰のビオチン化されたコバラミンを、直接に血清試料＋ＰＢＳに加え、全てのアポＴＣIIおよびアポＨＣと結合させる。１０分間浸漬後、前記血清試料を、（ストレプト）アビジンで被覆した磁化できる微粒子で、３０分間、室温で、暗所において処理する。
【００９３】
実施例９
ヒトＴＣII特異性であり、明らかに５×１０9Ｍ-1を超える結合定数を有するウサギ抗体を、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｄｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で被覆した、１μｍの磁化できる微粒子上に固定化した。４９名の健康なボランティアからの、それぞれ４００μＬの血清試料を、同体積のＰＢＳおよび４０μＬの前記固定化された抗体（１％）と混合した。その混合物を、室温で、暗所に、１時間保持し、続いて、微粒子を、磁石を用いて沈殿させた。その沈殿物を、氷冷の洗浄用緩衝液（ＰＢＳに加え０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０）で一度洗浄し、続いて、５０ｍＭのジチオトレイトール、０．００１％のシアン化カリウム、および一定量の５７Ｃｏ−ＣＮ−コバラミン（アマシャム）を含んだ、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液５０μＬ中で再縣濁させた。これを室温で３０分間静置し、その後、２５μＬの０．５Ｍ水酸化ナトリウムを加え、１５分後、ｐＨ８．６のホウ酸緩衝液中でデキストラン上に固定された（５０％の追跡物(tracer)と結合するのに十分な）内因子３００μＬを加えた。室温、暗所で１時間後、試料を１０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄みを注意深く除去し、ペレットを、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｒｉａｓｒａｒでカウントした。ＴＣII結合コバラミンの濃度は、試料ごとに取り扱った８の校正物質（０〜５００ｐＭのホロＴＣII）により作図した標準曲線から定量した。また、３７の血清試料を、血清中の全コバラミンについて、アボットのＩＭｘ  Ｂ１２アッセイを用いて分析した。
前記ホロＴＣIIについての標準曲線を図１に示す。また、３７名の健康なボランティアにおける、血清中の全コバラミンとホロＴＣII濃度との関係を、図２に示す。ｒ2＝０．５０であるから、相関が低いことは明らかである。対照的に、ホロＨＣと血清中の全コバラミンとの相関は高く、ｒ2＝０．９６である（図３）。４９名の健康なボランティアについての平均ホロＴＣII濃度は、６４±２８ｐＭであり、９５％参照範囲(reference range)は、２３〜１２７ｐＭであった。
本アッセイは、１０％のＣＶ、１０ｐＭ以下での分析感度（０校正物質、３標準偏差(0-calibrator-3 s.d.)）を有し、ハプトコリンと交差反応をしない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ホロＴＣIIの標準曲線である。
【図２】  血清中の全コバラミンとホロＴＣII濃度との相関を示すプロットである。
【図３】  血清中の全コバラミンとホロＨＣ濃度との相関を示すプロットである。
【図１】
0004394285.tif 000002
【図２】
0004394285.tif 000003
【図３】
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