(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を示すことを特徴とする、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ由来のバクテリオシン。
【請求項２】
請求項１記載のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ由来のバクテリオシンをコードするヌクレオチドフラグメント。
【請求項３】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド８８〜２２８を含む、請求項２記載のフラグメント。
【請求項４】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド１５４〜２２８を含む、請求項２または３記載のヌクレオチドフラグメント。
【請求項５】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド８８〜１５３を含む、請求項２または３記載のヌクレオチドフラグメント。
【請求項６】
菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６または菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７である、請求項１記載のバクテリオシンを産生するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株。
【請求項７】
バクテリオシンを産生するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株を発育に有利な培地および条件下で培養して、１０７〜１０１１菌株／ｍｌを含有する培養培地を得、その後生成培養物を遠心分離し、バクテリオシンを含有する上澄抽出物を調製することを特徴とする、請求項１記載のバクテリオシンの生産方法。
【請求項８】
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株は菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６または菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
食品、香粧品および医薬品の製造における請求項１記載のバクテリオシンの使用。
【請求項１０】
請求項７により得た抽出物および／またはバクテリオシンを産生するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株の形での請求項９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はバクテリオシン、このバクテリオシンを産生する菌株、このバクテリオシンの産生方法およびこのバクテリオシンおよび／またはこのバクテリオシンを産生する菌株の食品および香粧品における使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バクテリオシンは多数のグラム陽性菌およびグラム陰性菌から単離されている。バクテリオシンは事実上本質的にタン白性で、殺菌効果を有する分子であり、このためバクテリオシンはこれを産生する細菌と１種以上の異る細菌種間に拮抗反応を起こさせる。さらに、バクテリオシンの阻害スペクトルはしばしばこれを産生する細菌種に密接に関連する種に限定される。
【０００３】
特に、バクテリオシンは乳酸菌において実証された。例えば、ＥＰ０６４３１３６号明細書（ネスレ社）はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の２種のバクテリオシンの識別を記載する。同様に、バクテリオシンはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓから単離されている（Ａｐｐ．ａｎｄＥｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．５８，２７９〜２８４，１９９２；Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６８，１６３６１〜１６３６８，１９９３）。
【０００４】
しかし、現在までＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ由来のバクテリオシンは未知である。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓは現在食品分野で、特に例えばサラミソーセージやソーセージのような調整品を製造する目的で肉の発酵に多く使用される。従って、病原性作因と闘うためにバクテリオシン生産菌株を利用することはきわめて有用である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はこの要求に応答することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
このため、本発明のバクテリオシンはＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ由来のもので、このバクテリオシンはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または１〜４のアミノ酸のうち１個の置換、１個の欠失および／または１個の挿入により配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と異る任意のアミノ酸配列を示す。
【０００７】
さらに、このバクテリオシンをコードする任意のヌクレオチドフラグメント、特に配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を示すヌクレオチドフラグメントも本発明の範囲内にある。
【０００８】
同様に、本発明の菌株はこのバクテリオシンを生産するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株、特にＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７である。
【０００９】
本発明のバクテリオシンの生産方法では、バクテリオシンを産生するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株、特に菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６または菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７を１０7 〜１０11菌株を含有する培養培地を得るように、生育に有利な培地および條件下で培養し、その後、生成培養物を遠心分離し、バクテリオシン含有上澄抽出物を調整する。
【００１０】
最後に、本発明のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓバクテリオシンの使用はそのヌクレオチド配列およびそのシグナル配列およびバクテリオシンを含有する上澄抽出物およびバクテリオシンを産生するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株を食品および香粧品の製造に使用することを含む。
【００１１】
以下の記載で、本発明のバクテリオシンは「バリアシン」と称する。
【００１２】
本発明において、任意単位（ａｕ）は当業者に「寒天ウェル試験」として知られる試験で試料が尚殺菌効果を示す最大稀釈値の逆数として規定される。
【００１３】
本発明において、「フラグメント」または「ＤＮＡフラグメント」とは、部分的または全体の遺伝暗号を含み、例えば既知ポリメラーゼ連鎖反応方法により試験管内で複製され、または例えば生体内でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ型の細菌に複製、合成されうる一重鎖または二重鎖ＤＮＡフラグメントを意味する。
【００１４】
本発明において、「相同フラグメント」とは、少数の塩基の置換、欠失または挿入により本発明のフラグメントと僅かに異る任意のフラグメントを意味する。これに関連して、遺伝暗号の縮重により１つのポリペプチドおよび同一のポリペプチドをコードする２個のＤＮＡフラグメントは特に、相同性であると見做される。このフラグメントも相同フラグメントであると見做され、これは本発明フラグメントと８０％以上の相同を示す。後者の場合、相同は相同性フラグメントの塩基数と本発明フラグメント数間の比により決定される。
【００１５】
最後に、本発明の意味内で、「ハイブリド化するフラグメント」とはサザン法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９，ｃｈａｐｔｅｒ  ９．３１  ｔｏ  ９．５８）により本発明フラグメントとハイブリド化できる任意のフラグメントを意味する。好ましくは、ハイブリド化は厳重または厳格な條件下で行ない、非特異性ハイブリド化または比較的不安定なハイブリド化を回避する。
【００１６】
たん白因子、この場合強力な殺菌効果を有するバクテリオシンは菌株ＣＮＣＭＩ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７から単離された。このバクテリオシンはＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ由来で、従ってアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を示し、これは下記配列リストに示すが、バリアシンと呼ぶ。
【００１７】
バリアシンが提供する興味を考慮して、本発明は１〜４アミノ酸のうち１個の置換、１個の欠失および／または１個の挿入により配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と異るアミノ酸配列を有する任意のバクテリオシンにも関する。こうして１〜４アミノ酸のうち１個の置換、１個の欠失および／または挿入により配列ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１と異るアミノ酸配列を示すこのバクテリオシンは、例えばバリアシンのものより一層広い阻害スペクトルを細菌属または細菌種に対し有することができる。
【００１８】
本発明バリアシンをコードする染色体ヌクレオチドフラグメントを２種の菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７から選択することもできる。このフラグメントは下記配列リストに示す配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を示す。
【００１９】
本発明により供される興味を考慮して、本発明は本発明バリアシンをコードする任意のヌクレオチドフラグメント、特に配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と相同であり、またはハイブリド化するヌクレオチドフラグメントにも関する。
【００２０】
特に、本発明はバクテリアシンのシグナルペプチドをコードする配列ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド８８〜１５３、本発明の分泌バリアシンをコードする配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド１５４〜２２８、および／またはそのシグナルペプチドに融合したバクテリオシンをコードする配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド８８〜２２８に関する。
【００２１】
分泌バリアシンをコードするフラグメントは有利には本発明バリアシンを植物またはＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ以外の微生物に発現するために使用できる。このため、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド１５４〜２２８は読み枠に十分注意しながらプロモータまたはシグナル配列の下流およびターミネータの上流で発現ベクターにクローン化できる。次にこのベクターは植物、細菌または酵母に導入して例えば或る種の細菌に対しその阻害スペクトルを増大できる。
【００２２】
読み枠に十分注意しながら、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド８８〜１５３を問題の遺伝子に融合し、次に全体をＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ発現ベクターにクローン化して問題の遺伝子によりコードされたタン白を例えばＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓに発現および分泌できるように本発明シグナル配列を使用できる。
【００２３】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド８８〜２２８はＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ発現ベクターにクローン化し、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｖａｒｉａｎｓの別の菌株に導入することができ、その結果この後者の菌株は本発明バリアシンを産生する。
【００２４】
さらに、そのゲノムに組みこまれ、または発現ベクターにより本発明バリアシンをコードするＤＮＡフラグメントを含有するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株も本発明の主題の一部である。特に、ブダペスト條約に従ってＮａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ，２５  Ｒｕｅ  ｄｅ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＳＩ  ＣＥＤＥＸ  １５，Ｆｒａｎｃｅに１９９５年６月７日に寄託し、そこで寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７を与えられたＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株は本発明の主題の部分である。
【００２５】
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ細菌はグラム陽性、カタラーゼ陽性で、永久に非移動性の好気性細菌である。これらは球形で、配列が不規則の四連球形で見出される。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓコロニーはＢＨＩ培地で黄色である。本菌株の最適生育温度は２５〜３７℃である。本発明主題の部分である菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７はグルコースおよびフラクトースの双方を代謝する。さらにＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７菌株はシユクロースおよびフラノーズを代謝する。さらに、菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６は４および１２ｋｂの２つのプラスミドを持つが、菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７は単に７ｋｂの１つのプラスミドを持つに過ぎない。
【００２６】
菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７の培養上澄は他の細菌の生育に関し比較的広い阻害スペクトルを示す。この上澄に過敏の細菌のうち例として次のものを挙げることができる：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ，Ｌａｅｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ，Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃａｒｎｏｓｕｍ，Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの胞子および増殖細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｎｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ。
【００２７】
好ましくは、バリアシンの生産方法では、バクテリオシンを産生するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株は、生育に有利な培地および條件下で培養して、１０7 〜１０11菌株／ｍｌを含有する培養培地を得、その後生成した培養物を遠心分離し、バクテリオシンを含有する上澄抽出液を調整する。
【００２８】
この抽出液を調整するために、バリアシンを産生する本発明のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株、特に菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６または菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７はＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓの生育に有利な培地および條件下で培養できる。このため、例えばＢＨＩ培地で２５〜３７℃で好気條件下で振盪しながら１０7 〜１０11微生物濃度／ｍｌ培地を得るまで培養を行なうことができる。こうして得た標準培養物は４０００〜６０００ｇで遠心分離し、バクテリオシンを含有する上澄抽出液を集める。
【００２９】
本発明はバリアシン、特に抽出物形、またはこのバクテリオシンを産生するＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株を食品および香粧品の製造に対し使用することにも関する。
【００３０】
本発明のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株の１種の培養物は、例えばサラミの製造で肉を発酵する際Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａによる汚染と闘うために使用できる。
【００３１】
粗抽出物または精製形のバリアシンは、バリアシンに耐性のある細菌を使用して得られる発酵物、例えばチーズ、特にモザレラ型チーズの製造に、胞子が発酵後まで生き残るＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａが形成する孔を回避するために、およびバヘリン型のチーズの製造に、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる汚染と闘うために、添加、使用できる。
【００３２】
特に粗抽出物また精製形のバリアシン、または２種の菌株のうち１種は殺菌カスタードのようなデザートムースの製造に、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓなどの胞子、またはＬｉｓｔｅｒｉａのような細菌菌株の発育と闘うために病原菌に対し活性である添加物または剤として使用できる。
【００３３】
さらに、粗抽出物または精製形のバリアシン、または２種の菌株のうち１種は例えば加湿用クリームまたは脱臭剤などの香粧品の製造に、皮膚の病原菌と闘うために病原菌に対し活性である添加物または剤として使用できる。
【００３４】
本発明のバリアシンはその性質を説明する各種微生物的、生化学的および遺伝的発見により以下に一層詳細に特徴化される。％は重量による。
【００３５】
抗菌活性単位−「寒天ウェル試験」
本発明の記述において、殺菌活性は任意単位として規定される。
本発明のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ標準培養物の上澄（例えば例１記載の条件下で調整する）は一般的には６４０ａｕ／ｍｌの活性を示す。同様に、例えば例２記載の條件下で調整する上澄濃縮物は一般的には約２４０００ａｕ／ｍｌの活性を示す。
寒天ウェル試験は所定稀釈値で試料が尚殺菌活性を示すかどうかを測定するために使用する。
これを行なうために、１０5 〜１０6 ＣＦＵ／ｍｌ濃度の指示菌株を含有する１５ｍｌのＭＲＳ寒天培地をペトリ皿に接種する。バリアシンに過敏の菌株、この場合、例えば菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＹＬ５）または菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（Ｎ２）は指示菌株として使用する。
直径５ｍｍの凹みを培養培地にあける。上澄または上澄濃縮物の試験試料は５０μｌ／凹みの割合で凹みに注入する。皿は４℃で２時間予備インキュベートし、次に使用指示菌株により３０℃または３７℃で一夜インテュベートする。インキュベーション後、指示菌株は発育し、阻害環を見ることができる。試料がもはや殺菌活性を示さない稀釈値が、阻害環をもはや見出せない稀釈値である。
【００３６】
酵素による失活
寒天ウェル試験は本発明により単離したバリアシンがタン白加水分解酵素の存在で、またはカタラーゼの存在で失活するかどうかを測定するために使用する。
これを行なうために、例２記載の培養物上澄濃縮物に５ｍｇ／ｍｌの割合で酵素を添加する。酵素は試料が寒天ウェル試験に十分沈積する前にインキュベーション温度で６０分作用させる。
対照は平行してｐＨ７で同じ濃縮物を使用し、酵素を添加しないものを準備する。この対照試料は、酵素の存在で得られる阻害環と対照の阻害環とを比較する目的で、寒天ウェル試験で沈積する前に３７℃で６０分インキュベートする。対照阻害環の直径は２７ｍｍである。
表１は指示菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（Ｎ２）を使用し、酵素を加えて得た試験結果を示す。表２と同様に、この表では酵素はその型、供給者名および供給者のカタログ番号により示す。零の数字はもはや環がないことを示し、換言すればバリアシンの殺菌活性は後者を酵素と一緒にインキュベートすることにより失活したことを示す。２７の数字はバリアシンの完全な殺菌活性に相当する尚２７ｍｍの環があることを示す。
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表２は酵素により得たもので指示菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＹＬ５）を使用して試験した結果を示す。
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表１および表２で得た結果はすべてのタン白加水分解酵素はバリアシンの殺菌活性を抑制することを示す。これらの結果はバリアシンは現実にタン白質であり、このタン白部位は殺菌活性に関与していることを実証する。
カタラーゼはバリアシンの殺菌活性に何の影響をも及ぼさない事実は２種の指示菌株の生育阻害はＨ2 Ｏ2 の抗菌活性（バクテリオシンに似た活性を有することが既知である）によるものではないことも実証する。Ｈ2 Ｏ2 はカタラーゼにより分解するからである。
【００３７】
バリアシンを含有する培養上澄の阻害スペクトル
寒天ウェル試験は本発明のバリアシシンを含有する培養上澄の殺菌活性が胞子および細菌の異る菌株の生育に阻害的活性を示すかどうかを測定するために使用する。上澄の阻害スペクトルをこうして測定する。
これらの分析を実施するために、前夜中準備した、１５μｌの試験菌株培養物を接種した１５ｍｌの標準培地をペトリ皿に注入し、１０5 〜１０6 細菌濃度／ｍｌ標準培地を得る。標準培地は試験菌株の生育に有利な培地である。
さらに、試験菌株が胞子から発育しなければならない場合、１０5 〜１０6 胞子／ｍｌ被覆培地を接種する。
直径５ｍｍの凹みを各ペトリ皿に開ける。例１記載の５０μｌの培養上澄試料をそこに入れる。皿は４℃で２時間予備インテキュベートし、次に見ることができる細菌芝生でプレートを菌株が被覆するのに必要な時間試験下で菌株の生育に有利な温度でインキュベートする。
阻害効果、または阻害程度は認められる阻害環の直径により特徴化される。阻害は環が１８〜２８ｍｍの直径を示す場合、非常に強い（＋＋＋＋）、１０〜１７ｍｍの直径の場合、強い（＋＋＋）、５〜９ｍｍ直径の場合平均（＋＋）、直径が１〜４ｍｍの場合弱い（＋）、および環が認められない場合零（−）であると見做される。
異る種および亜種の乳酸菌の３２の菌株をこの方法で試験し、これらすべてが上澄に対し耐性がないことは注目される。これらの試験の詳細の結果は表３に示す。この表３では、以下の表におけると同様に、菌株の名称または示した菌株番号はネスレコレクション（住所：ＮＥＳＴＥＣ  Ｓ．Ａ．，Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅＲｅｃｈｅｒｃｈｅ，Ｖｅｒｓ−ｃｈｅｚ−ｌｅｓ−Ｂｌａｎｃ，ＣＨ−１０００  Ｌａｕｓａｎｎｅ  ２６，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のものの番号である。示す温度は試験中のインキュベーション温度である。示す培地は試験菌株の生育に有利な標準培地である。
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この表３では、上澄の阻害スペクトルは阻害程度が異る試験種に対し畧畧同一レベルであるという意味で広汎であることは注目される。
本発明バリアシンを産生する培養物上澄の阻害スペクトルは乳酸菌種に限定されることなく、グラム陽性菌の他の種、特に望ましくない、または病原菌Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｈｉａ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよび表５に示す結果により証明されるように例えばＢａｃｉｌｌｉの胞子にまで拡大されるという意味で広汎であると見做される。
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表４に示す結果は、特にこの上澄または精製バリアシンが食品の製造における添加物として、病原菌、特に肉製品におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉａに対し、チーズのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対し、デザートムースのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａに対し、または新鮮ペーストまたは新鮮ペースト用ソースのＢａｃｉｌｌｉに対し、正確には例えば上記菌株の由来する細菌に対し魅力的使用を予測することができる。
最後に、バリアシンは表５に示す結果から注目できるようにグラム陰性菌の生育に対し阻害作用を全く示さない。
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【００３８】
バリアシンを含有する上澄濃縮物の阻害スペクトル
手順は例２記載のように得た上澄濃縮物により提示される胞子および細菌の異る菌株の生育に及ぼす阻害効果を測定することを除いて上記記載の通りである。同じ種および亜種は上記のように試験する。これらの試験結果は表６、７および８に示す。菌株名称または示す菌株番号はネスレコレクション（住所：ＮＥＳＴＥＣ  Ｓ．Ａ．，Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ，Ｖｅｒｓ−ｃｈｅｚ−ｌｅｓ−Ｂｌａｎｃ，ＣＨ−１０００  Ｌａｕｓａｎｎｅ  ２６，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のものの番号である。示す温度は試験中のインキュベーション温度である。示す培地は試験菌株の生育に有利な標準培地である。
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表６、７および８に示す結果は、上澄と比較して多数の試験菌株の生育を阻害することで上澄濃縮物の効果の高いことを実証する。阻害スペクトルは同一種および亜種に対し認められるが、阻害レベルは一層高い。
これは例２記載のバリアシン上澄濃縮物の製造および例えば食品および香粧品の製造で病原菌と闘うためにその使用を示唆する。
【００３９】
ｐＨ耐性
寒天ウェル試験は、本発明により単離したバリアシンがｐＨ依存性であるかどうかを測定するために使用する。
このため、上記「寒天ウェル試験」に記載のよに、寒天に指示菌株を接種する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（Ｎ２）を指示菌株として使用する。
例２記載の培養上澄濃縮物の抽出物のｐＨは２Ｎ  ＮａＯＨおよび／または２Ｎ  ＨＣｌにより２〜１０のｐＨに調整し、抽出物は３７℃で６０分インキュベートし、次にｐＨを６〜７に再調整した後抽出物試料を寒天ウェル試験の凹みに入れる。
ｐＨ７の同じ上澄濃縮物を使用する対照を平行して設け、３７℃で６０分インキュベート後対照試料を寒天ウェル試験の凹みに入れて試験試料の阻害環と対照の阻害環とを比較する。対照の阻害環の直径は２７ｍｍである。
表９では、表１０および１１と同様に、２７の数字はバリアシンの完全な殺菌活性に相当する２７ｍｍの環であることを示す。
0004440999.tif 000025
上記表に示す結果はバリアシンの殺菌活性は失活しないことを実証する。従ってバリアシンの殺菌活性はｐＨ依存性でないと結論できる。
【００４０】
熱耐性
寒天ウェル試験は本発明に従って単離したバリアシンが熱依存性であるかどうかを測定するために使用する。
このため、上記寒天ウェル試験に記載のように寒天に指示菌株を接種する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（Ｎ２）を指示菌株として使用する。
ｐＨ７に調整した例２記載の培養上澄の濃縮物抽出物は１００℃で１５〜６０分インキュベート後寒天ウェル試験の凹みに入れる。
ｐＨ７の同じ上澄濃縮物を使用して得た対照を平行して設け、３７℃で６０分インキュベートする。これにより温度試験試料の阻害環を対照の阻害環と比較できる。対照の阻害環の直径は２７ｍｍである。
0004440999.tif 000026
これらの結果はバリアシンが熱依存性でないことを実証する。こうして、バリアシンの殺菌活性は１００℃、６０分のインキュベーション後でさえ失活しない。
バリアシンの熱耐性は食品および香粧品の製造でバリアシンの使用に関連して非常に重要な生化学的特徴である。こうして、バリアシンは、特に粗抽出物または精製形で殺菌食品の製造に、例えば熱耐性のＢａｃｉｌｌｉのような胞子の発育と闘うために使用できる。
【００４１】
熱耐性およびｐＨ耐性
さらに、ｐＨおよび熱を組み合せた場合のバリアシンの安定性を試験する。
このため、上記「寒天ウェル試験」に記載のように寒天に指示菌株を接種する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（Ｎ２）を指示菌株として使用する。
例２記載の培養上澄の抽出濃縮物は２Ｎ  ＨＣｌおよび／または２Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨ４または７に調整し、１１５℃で２０分インキュベートする。次に抽出物のｐＨは６〜７に再調整後寒天ウェル試験の凹みに入れる。
ｐＨ７で得た対照は平行して設け、３７℃で２０分インキュベートした後対照試料を寒天ウェル試験の凹みに入れ、試験試料の阻害環を対照の阻害環と比較する。対照の阻害環の直径は２７ｍｍである。
0004440999.tif 000027
上記に示す結果はバリアシンの殺菌活性はｐＨ４または７で、高温と組み合わせても低下しないことを実証する。
【００４２】
バリアシンの精製
４リットルのＢＨＩ培地にＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓの培養物を接種する。この培養物は本発明バリアシンを産生する。この標準培養物は好気條件下で、振盪しながら３０℃で一夜インキュベートし、その後５０００ｇで遠心分離して受器に上澄を集め、これに７２ｇのＸＡＤ−７樹脂（アンバーライト（商標））を添加する。
混合物は２５℃で３０分攪拌してバリアシン分子が樹脂に粘着するのを有利にし、次に全体はガラス濾過器に移し、そこで上澄は真空濾過する。
樹脂はｐＨ４の２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよびインプロパノールを含有する３種の緩衝液で連続洗浄する。最初の緩衝液は１０％イソプロパノール、第２の緩衝液は１５％イソプロパノールおよび第３の緩衝液は２０％イソプロパノールを含有する。
樹脂はカラムに移し、バリアシンはｐＨ４の２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２５％イソプロパノールを含有する７００ｍｌの緩衝液で溶離する。バリアシンの殺菌活性は上記寒天ウェル試験を使用して監視する。
活性画分を混合し、イソプロパノールは蒸発させる。ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）用の５ｍｌのＳ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅカラムを２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液と平衡して準備する。活性画分の蒸発混合物はこのカラムに装填し、次にカラム内容物は１００ｍＭ〜４００ｍＭの勾配を有するＮａＣｌ緩衝液で溶離する。
画分を集め、こうして精製したバリアシンの殺菌活性は寒天ウェル試験を使用してチェックする。
【００４３】
バリアシンの配列決定
菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７から精製したバリアシンのＮ−末端部分はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７７４オートマチックシーケンサーを使用して配列を調べる。これは５個のアミノ酸のペプチド配列を示し、その配列は下記配列リストに記載の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ−末端部分のものと同一である。配列調査中５個以上のアミノ酸を有するペプチドの存在を実証することはできなかった。
さらに、菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７から精製したバリアシンは６Ｎ  ＨＣｌにより１０分加水分解する。３個のペプチドを得る。これらはＨＰＬＣにより通例方法で単離する。単離した３個のペプチドのうち１個だけ配列を調べることができた。他の２個はペプチド修飾を間違いなく含むと思われたからである。この方法で単離したペプチドの配列は下記配列リストに記載の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１９〜２２を含むものと同一である。
最後に、菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７から精製したバリアシンを含有する画分はマススペクトロメトリにかけ、バリアシンは２６５９ダルトンの分子量を有することが分かった。
【００４４】
相同
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のラクチシン４８１と本発明バリアシンの配列間に相同が実証された。この相同は特に、２種のバクテリオシンのＮ−末端部分の配列に関連する。こうして、バリアシンのＮ−末端配列アミノ酸１〜５は下記配列リストに記載したラクチシン４８１の配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸３〜７と同一である。それでも、これは部分相同であって、同一ではない。
さらに、分泌ラクチシンはマススペクトロメトリにより２９００ダルトンの分子量を有することが示されるが、一方分泌バリアシンの分子量は上記のように２６５９ダルトンである。
ラクチシン４８１を産生するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ菌株は、上記阻害スペクトル試験で記載したバリアシン抽出物の存在で接種する場合、この菌株の生育は阻害されることが分かる。ラクチシン４８１を産生するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ菌株はそれ自身のバクテリオシン、ラクチシン４８１に対し免疫性を有するが、本発明の２種のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ各菌株が産生するバリアシンに免疫性がない。上記阻害スペクトル試験で得たこれらの結果は、これらの２種のバクテリオシンは異ることを確証する。
上記遺伝的発見は、ラクチシン４８１およびバリアシンは配列相同を示すが、その配列は同一ではないことを実証する。生化学的発見および微生物学的発見は、ラクチシン４８１およびバリアシンは２種の異るバクテリオシンであることを確証する。
【００４５】
バリアシン遺伝子の配列決定
下記配列リストに記載され、上記配列決定したバリアシンのペプチドのＣ−末端部分に相当する変性ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は通例方法で構築される。次にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４配列混合物はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの作用により放射活性にする。
染色体ＤＮＡの調整は菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７から通例方法で行なわれる。このＤＮＡ調整品は酵素供給者の勧告に従ってＳａｌ１，Ｓａｃ１，Ｓｐｈ１およびＢａｍＨ１により消化される。次に２μｇの消化生成物をアガロースゲル上に流す。ゲル上のＤＮＡは２５０ｍＭ  ＨＣｌで洗浄し、次いでアルカリ媒体の移動生成物はゲルから「Ｚｅｔａｐｒｏｂｅ」（Ｂｉｏｒａｄ）膜に移される。次にＺｅｔａｐｒｏｌｅ膜は５５℃の温度で、６×ＳＳＣ，１％ＳＤＳおよび０．２５％脱脂乳を含む培地で、温度を４０℃まで２時間毎に５℃づつ下げて予備ハイブリド化する。この膜は上記ハイブリド化培地で、同じ温度條件下で配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を示す変性放射性プローブによりハイブリド化する。次に４０℃で４時間インキュベートし、その後膜は６×ＳＳＣで４０℃で洗浄する。最後に、−８０℃で１６時間オートグラフィフィルムに暴露する。
ハイブリド化は各種の移動バンド：７ｋｂのＳａｌ１バンド、１．４ｋｂのＳａｃ１バンド、１．８ｋｂのＢａｍＨ１バンドおよび１５ｋｂより大きいＳｐｈ１バンドを示す。
次に菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６由来の５μｇのゲノムＤＮＡは制限酵素ＢａｍＨ１により消化され、１．６〜２ｋｂのフラグメントはアガロースゲルクロマトグラフィにより分離し、次いでフラグメントを含有するゲルの部分を溶離する。溶離ＤＮＡフラグメントは、予めＢａｍＨ１により消化され、次に仔牛腸管ホスフアターゼにより処理された（ベーリンガン・マンハイム、ｐａｒｔ  ＮＯ．７１３０２３）ベクター１９に連結する（Ｇｅｎｅ，５６（１９８７）３０９〜３１２）。
予めコンピテントになったＥｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株ＢＺ２３４（Ｂｉｏｚｅｎｔｒｕｍ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ−バーゼル大学、スイス）は次に通例方法で連結媒体により形質転換される。インサートを含有するクローンは５０μｇ／ｍｌカナマイシン、６０ｎｇ／ｍｌ  ＩＰＴＧ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，ｐａｒｔ  ＮＯ．７２４８１５）および３００ｎｇ／ｍｌＸ−ガル（ベーリンガー・マンハイム，ｐａｒｔ  ＮＯ．６５１７４５）を補充した寒天培地で、３７℃で１６時間インキュベートして確認される。
通常インサートを含有する白色コロニーは９６個の凹みのミクロ量プレート中に採取する。各白色コロニーはこの凹みの１つに採取し、各凹みは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１５０μｌのＬＢ培地を含有し、３７℃で２０時間インキュベートしてミニ培養物を生産する。
反対の配向を有する２個のプライマーはベクターｐＫ１９の遺伝子の配向が未知であるので調整する。このため、プライマーは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を示し、一部ラクチシン４８１をコードするヌクレオチドフラグメントからこれらを組み合わせて構築し、これはｐＵＣベクターの１つまたは他の万能性プローブに連結し、このプローブは配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６または配列ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：７を示す。
各凹みからの１μｌは１００ｐモルの１つのこのプライマー、６μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓおよび２．５μｌのＴａｑ緩衝液（Ｐ．Ｈ．Ｓｔｅｈｅｌｉｎ＆Ｃｉｅ  Ａｇ．ｃａｔ，Ｎｏ．ＴＰＯ５ｂ）と混合し、全体は１滴のＤｙｎａ−ｗａｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ，０２２０１  Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）に被覆し、９８℃で１０分加熱して細菌を溶解する。次にＰＣＲを行なう。
正のクローンは電気泳動で８００ｂｐのバンドを示す。
正のクローンはこの方法で選択し、これらのクローンのプラスミドＤＮＡを抽出する。次にｐＫ１９ベクター中にクローン化されたＤＮＡフラグメントは配列決定用キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｐａｒｔ  Ｎｏ．２７−１６８２−０１）および万能性プライマーを使用してジデオキシヌクレオチド方法により配列し、次いで配列に基づく特定プライマーをこうして得る。
これによりヌクレオチド配列が形成され、下記配列リストに記載のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を得る。ヌクレオチド配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１をコードし、これは成熟前バリアシンのアミノ酸配列に相当する。
下記列は本発明バクテリオシンの生産方法および使用を説明するために提示する。例の％は特記しない限り重量により示す。
【００４６】
【実施例】
例１
ＨＢＩ培養基を準備し、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓ菌株生体を含有する培養物をこれに添加する。全体は振盪しながら好気條件下で一夜３０℃でインキュベートし、その後培地は１０8 菌株／ｍｌを含有する。こうして得た標準培養物は遠心分離する。標準上澄を集める。
【００４７】
例２
７５０ｍｌの例１記載のよに得たこの上澄から上澄濃縮物を得、これに１５ｇのＸＡＤ−７樹脂（アンバーライト（商標））を添加する。混合物は４℃で６０分振盪し、次にＮｏ．６０４  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（ドイツ）フィルターを通して濾過する。次にフィルターは１％クエン酸ナトリウムにより洗浄してすべての非吸着性タン白を溶離する。次に樹脂は単離し、クエン酸ナトリウムを含有する受器に移し、全体は２分間振盪する。クエン酸ナトリウムと一緒に樹脂はカラムに移し、クエン酸ナトリウムは５０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡにより溶離する。溶出液は蒸発し、残留物はｐＨ６．８の５０ｍＭリン酸塩緩衝液に再懸濁する。
【００４８】
例３
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｒｉａｎｓの１０リットルの培養物は振盪しながら、好気條件下で一夜３０℃でＢＨＩ培地に生育させる。次に２００ｇのＸＡＤ−７樹脂（アンバーライト）を直接培養物に添加し、全体は４℃で１時間温和に振盪する。次に混合物はＮｏ．６０４  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（ドイツ）フィルターを通して濾過し、フィルターに保留された樹脂は次に１０リットルのｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸溶液で洗浄して細菌を除去する。その後、１００％エタノールおよび２０ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する４５０ｍｌの溶液を樹脂に添加し、全体は濾過して樹脂を除去する。次に濾液は凍結乾燥して本発明バリアシンを含有する粉末を得、これは食品工業で使用できる。
予め水に稀釈したこの粉末の殺菌活性は上記寒天ウェル試験により測定する。この粉末は少なくとも１０5 ａｕ／ｇ粉末を有する。
最後に、上記粉末は伝統的方法で製造中肉フォームに０．５ｇ／ｋｇの割合で添加する。これによりその１ｇが５０ａｕのバクテリオシンを含有し、病原菌、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの発育を完全に阻害できる肉フォームを形成する。
【００４９】
例４
本例は例３記載の粉末を０．０５ｇ／ｋｇの割合で、すなわち、従って皮膚に望ましくない細菌、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの発育を５ａｕ／ｇの割合で阻害しうるバリアシンを含有する皮膚ケア用加湿クリームの製造に関する。
このエマルジョンを製造するために、脂肪相Ａの成分は混合し、７５℃に加熱する。水性相Ｂを調整し、同様に７５℃に加熱する。次に脂肪相Ａをゆっくり混合しながら添加し、その後全体はゆっくり混合しながら環境温度、すなわち約２５℃に冷却する。Ｃ成分は処方順序で、この温度でゆっくり添加する。
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【００５０】
例５
例３記載のバクテリオシン粉末は０．５ｇ／ｋｇの割合でうがい剤に添加する。その結果としてこのうがい剤は口腔の病原菌、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓの発育を阻害できる。
【００５１】
例６
１％の割合で水に稀釈した例３のバクテリオシンを含む溶液を、滅菌して包装中の後−感染を予防するための食品に噴霧する。
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