(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デヒドロゲナーゼの過剰発現によりステロイド骨格中に二重結合を選択的に導入する方法であって；
ａ）配列番号11に記載のアミノ酸配列又は配列番号11に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し且つデヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするデヒドロゲナーゼ遺伝子を、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）細菌から単離し、クローン化しそして増幅し；
ｂ）前記デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター要素又は他のプロモーター及びターミネーター要素を、同一か又は別の細菌から単離し、クローン化しそして増幅し；
ｃ）上記ｂ）由来の該デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターとターミネーター配列、又は他のプロモーターとターミネーター要素とに挟まれた、上記ａ）由来の前記デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを設計し；
ｄ）上記ｃ）のもとで生成された前記発現プラスミドにより、細菌を形質転換し；そして
ｅ）このようにして生成された細菌を培養し、そして前記ステロイド骨格における選択的脱水素をこれらの培養物により行い；これにより、
i）変更のない操作時間で高い基質濃度が使用され、そして
ii）分裂的な二次領域が生成されない；
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
Δ1-デヒドロゲナーゼの過剰発現によりステロイド骨格中に二重結合を選択的に導入する請求項１に記載の方法であって；
ａ）配列番号11に記載のアミノ酸配列又は配列番号11に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し且つΔ1-デヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするΔ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子を、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）細菌から単離し、クローン化しそして増幅し；
ｂ）前記Δ1-デヒドロゲナーゼのプロモーター及びターミネーター要素又は他のプロモーター及びターミネーター要素を、同一か又は別の細菌から単離し、クローン化しそして増幅し；
ｃ）上記ｂ）由来の前記Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターとターミネーター配列、又は他のプロモーターとターミネーター要素とに挟まれた、前記ａ）由来の前記Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを設計し；
ｄ）上記ｃ）のもとで生成された前記発現プラスミドにより細菌を形質転換し；そして
ｅ）このようにして生成された細菌を培養し、そして前記ステロイド骨格における選択的脱水素をこれらの培養物により行い；これにより、
i）変更のない操作時間で高い基質濃度が使用され、そして
ii）分裂的な二次領域が生成されない；
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼの過剰発現によりステロイド骨格中に二重結合を選択的に導入する請求項２に記載の方法であって；
ａ）配列番号11に記載のアミノ酸配列又は配列番号11に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し且つ3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードする3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子を、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）細菌から単離し、クローン化しそして増幅し；
ｂ）前記3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター要素又は他のプロモーター及びターミネーター要素を、同一か又は別の細菌から単離し、クローン化しそして及び増幅し；
ｃ）前記ｂ）由来の前記3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターとターミネーター配列、又は他のプロモーターとターミネーター要素とに挟まれた、上記ａ）由来の前記3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを設計し；
ｄ）上記ｃ）のもとで生成された前記発現プラスミドにより細菌を形質転換し、そして
ｅ）このようにして生成された細菌を培養し、そして前記ステロイド骨格の1位における選択的脱水素をこれらの培養物により行い、これにより
i）変更のない操作時間で高い基質濃度が使用され、そして
ii）分裂的な二次領域が生成されない；
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記ｂ）及びｄ）に記載の前記細菌が、グラム陽性バチルス（Bacillus）属及びアルトロバクター（Arthrobacter）属、ならびにグラム陰性大腸菌（Escherichia coli）及びシュードモナス（Pseudomonas）属を包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、タチルス・スペーシス（Bacillus spec）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・スフェアリカス（Bacillus sphaericus）、バツルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、アルトロバクター・シンプレックス（Arthrobacter simplex）、ブレビバクテリウム・マリス（Brevibacterium maris）及びシュードモナス（Pseudomonas）の種を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号10に記載のバチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）由来の3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子。
【請求項７】
配列番号11に記載のバチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）由来の3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
配列番号９に記載のバチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）由来の３-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
【請求項９】
請求項６又は８に記載の少なくとも１つのDNA配列を含むプラスミド。
【請求項１０】
細菌中でのΔ1-デヒドロゲナーゼの過剰発現のために適切なプロモーター及びターミネーターを含む、請求項９記載のプラスミド。
【請求項１１】
配列番号10に記載のバチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）の3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子の前記ターミネーター或いは大腸菌（Escherichia coli）又はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のターミネーターがターミネーターとして使用され、そして配列番号９に記載のバチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）の3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ遺伝子の前記プロモーター又は構成的プロモーター、或いはバクテリオファージΦ29及びSPO1のプロモーター、又はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の誘導性プロモーター又はハイブリッドプロモーターがプロモーターとして使用される、請求項10記載のプラスミド。
【請求項１２】
大腸菌（Escherichia coli）ターミネーターt(rrnB)、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ターミネーターt(senS)又はt(senN)がターミネーターとして使用され、そして構成プロモーターp(veg)がプロモーターとして使用され、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来のp(aprE)又はp(sacB)が誘導性プロモーターとして使用され、又は、lacI制御SPO1プロモーターがハイブリッドプロモーターとして使用される、請求項11に記載のプラスミド。
【請求項１３】
Δ1-デヒドロゲナーゼの過剰発現可能な細菌の形質転換のための、請求項９〜12のいずれか１項に記載のプラスミドの使用。
【請求項１４】
3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードし、配列番号10と比較して90％よりも大きい同一性を有するDNA。
【請求項１５】
3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードし、配列番号10と比較して95％よりも大きい同一性を有するDNA。
【請求項１６】
配列番号11と比較して少なくとも90％の同一性を有し、3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
配列番号11と比較して少なくとも95％の同一性を有し、3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１８】
請求項７に記載の3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ又は請求項16若しくは17に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項１９】
請求項18に記載のDNAを含むプラスミド。
【請求項２０】
配列番号19又は配列番号20に記載の配列から成るparSオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
プラスミド中で請求項６記載のDNA配列によってコードされるタンパク質又は請求項14若しくは15に記載のDNA配列によってコードされるタンパク質の、ステロイドの選択的脱水素のための使用。
【請求項２２】
ステロイドの選択的脱水素のための、請求項7に記載の3-ケトステロイド-Δ1-デヒドロゲナーゼ又は請求項16若しくは17に記載のタンパク質の使用。
【請求項２３】
前記脱水素されたステロイドが、ベタメサゾン、クロベタゾン、クロコルトロン、Δ1-11β,17α-ジヒドロキシ-6α,9α-ジフルオロ-16α-メチルプロゲステロン、11β,21-ジヒドロキシ-2’-メチル-5’βH−プレグン-4-エノ[17,16-d]オキサゾール-3,20-ジオン、デフラゾコート、デフラゾコートアルコール、デキサメタゾン、ジフルコルトロン、フルオシノロンアセトニド、フルオコルトロン、ヒドロキシ酸、及びプレドニソロンである、請求項21又は22に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デヒドロゲナーゼ、特にΔ1−デヒドロゲナーゼ、特に３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼの過剰発現のための方法、及びその過剰発現のために使用される細菌、プラスミド及びDNA配列に関する。
３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼは、ステロイド代謝において重要な機能を実現する酵素である。この酵素の助けにより、ステロイド骨格における１−位での二重結合の選択的導入が可能にされる。この反応は、広範囲の種類の活性成分（例えば、バタメタゾン、デフラゾコート、フルオコルトロン、ヒドロキシ酸、プレドニソロン、等）の合成のために非常に重要なものである。微生物反応のために多量のこの酵素を入手できるようにすることが所望される。
【０００２】
微生物材料転換、例えばステロイド形質転換方法のためには、野生型の酵母、菌類及び細菌が一般的に使用される（Kieslich, K. (1980), Steroid Conversions, In: Economic Microbiology-Microbial Enzymes and Transformation, Rose AH (ed), Academic Press, London, Vol. V, pp 370-453; Kieslich, K. and Sebek. O.K. (1980) Microbal transformations of steroids, In: Annual Reports on Fermentation Processes, Perlman D (ed), Academic Press, New York, Vol. 3, pp 275-304; Kieslich, K. (ed) (1984) Biotransformation, Biotechnology, Vol. 6a, Rehm HJ and Reed G (eds); Verlag Chemie, Weinheimを参照のこと）。
【０００３】
単離された場合、野生株に起因し、そして標準の突然変異誘発及び選択方法により得られる変異体が使用される（アメリカ特許第3,102,080号；Seidel, L. and Horhold, C. (1992) J. Basic Microbiol. 32: 49-44; EP0322081B1号；アメリカ特許第5,298,398号を参照のこと）。従って、例えば、選択的脱水素反応のための生物技法においては、異なった微生物、すなわちアルトロバクター・シンプレックス及びバチルス・スファエリカスの内因性触媒活性が使用される（Sodlaczek (1988) Crit. Rev. Biotechnol. 7: 187-236; アメリカ特許第2,837,454号；アメリカ特許第3,010,876号；アメリカ特許第3,102,080号）。
【０００４】
アルトロバクター・シンプレックス（Arthrobacter simplex)（Choi KP など. (1995) J Biochem 117: 1043-1049; Molnar I など. (1995) Mol Microbiol 15: 895-905）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosterone）（Plesiat, P.など. (1991) J. Bacteriol. 173: 7219-7227）及びノカルジア・オパカ（Nocardia opaca）（Drobnic K など. (1993) Biochem Biophys Res Com 190: 509-515; SUISS-PROT AC: Q04616）のΔ1―デヒドロゲナーゼ遺伝子が、クローン化され、配列決定され、そして機能的に特徴づけられた。また、DNA配列は、マイコバクテリウム・ツベルキロシス（Mycobacterium tuberculosis）及びロードコカス・ロードクロウス（Rhodococus rhodochrous）から公開されており、そして上記に言及されたΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子へのそれらの類似性のために、前記配列は、推定できるデヒドロゲナーゼ遺伝子として見なされ得る（http:/ / www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis; GenBank AC: 007847）。
【０００５】
既知の生物形成転換方法の限界は、前記方法が一般的に、反応条件及びパラメーター、例えば栄養物のタイプ及び組成、方法の実施、基質投与、等の改良において有力的に集中される方法の最適化である事実にある。特に、選択的脱水素反応の方法は、多くの欠点、例えばｉ）非常に低い基質濃度でのみの遊離体の完全な反応（アメリカ特許第3,102,080号、ii）長い操作時間、及びiii)費用の高い精製方法により分離されるプレドニソロンを形成するために、ヒドロコルチゾンの反応における二次領域、例えば11α−ヒドロキシアントロスタ−１，４−ジエン−３、17−ジオンの形成を有する。それらの欠点は、生成方法が非常に費用が高い事実をもたらす。
【０００６】
分子生物学的方法による材料転換を触媒する微生物の直接的な変更により、ステロイド分子のより効果的且つ意図的な生物形質転換が達成され得ることが現在、見出された。生物形質転換反応は、３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現のためのプラスミドを含む細菌により行われる。
使用される細菌は、特に代表的には、グラム陽性バチルス属、例えばバチルス・サブチリス、バチルス・スファエリカス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、及びバチルス・メガテリウム、グラム陽性代表物、例えばエスシェリチア・コリ及びシュードモナス種を包含する。
【０００７】
分子生物学的方法による指図された株開発によれば、iii) 開発される破壊的二次領域を伴わないで、ii) 可能である変更のない操作時間を伴って、i) 非常に高い基質濃度の使用により、活性成分の合成を促進し、そして単純化する微生物が企画される。
特に、ステロイド骨格の１−位での選択的脱水素反応が本明細書において記載され、それにより、微生物から単離される３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子が使用される。
【０００８】
本発明によれば、デヒドロゲナーゼの過剰発現によるステロイド骨格中への二重結合の選択的導入のための方法が現在記載され、ここで
ａ）デヒドロゲナーゼ遺伝子が、細菌から単離され、クローン化され、そして増幅され、
ｂ）前記デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター要素、又は他のプロモーター及びターミネーター要素が同じか又はもう1つの細菌から単離され、クローン化され、そして増幅され、
ｃ）上記ｂ）からのデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター配列、又は他のプロモーター及びターミネーター要素を端に有する、上記ａ）からのデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる発現プラスミドが企画され、
ｄ）細菌が、上記ｃ）の下で生成される発現プラスミドにより形質転換され、そして
ｅ）このようにして生成された細菌が培養され、そしてステロイド骨格での選択的脱水素がそれらの培養物により行われ、それにより、
ｉ）変更のない操作時間での高い基質濃度が使用され、そして
ii)破壊的な二次領域が生成されないことを特徴とする。
【０００９】
本発明は特に、Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現によるステロイド骨格中への二重結合の選択的導入のための方法に関し、ここで
ａ）Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子が、細菌から単離され、クローン化され、そして増幅され、
ｂ）前記Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター要素、又は他のプロモーター及びターミネーター要素が同じか又はもう1つの細菌から単離され、クローン化され、そして増幅され、
ｃ）上記ｂ）からのΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター配列、又は他のプロモーター及びターミネーター要素を端に有する、上記ａ）からのΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる発現プラスミドが企画され、
ｄ）細菌が、上記ｃ）の下で生成される発現プラスミドにより形質転換され、そして
ｅ）このようにして生成された細菌が培養され、そしてステロイド骨格での選択的脱水素がそれらの培養物により行われ、それにより、
ｉ）変更のない操作時間での高い基質濃度が使用され、そして
ii)破壊的な二次領域が生成されないことを特徴とする。
【００１０】
本発明は特に、３−ケトステロイドΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現によるステロイド骨格中への二重結合の選択的導入のための方法に関し、ここで
ａ）３−ケトステロイドΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子が、細菌から単離され、クローン化され、そして増幅され、
ｂ）前記３−ケトステロイドΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター要素、又は他のプロモーター及びターミネーター要素が同じか又はもう1つの細菌から単離され、クローン化され、そして増幅され、
ｃ）上記ｂ）からの３−ケトステロイドΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター配列、又は他のプロモーター及びターミネーター要素を端に有する、上記ａ）からの３−ケトステロイドΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる発現プラスミドが企画され、
ｄ）細菌が、上記ｃ）の下で生成される発現プラスミドにより形質転換され、そして
ｅ）このようにして生成された細菌が培養され、そしてステロイド骨格における１−位での選択的脱水素がそれらの培養物により行われ、それにより、
ｉ）変更のない操作時間での高い基質濃度が使用され、そして
ii)破壊的な二次領域が生成されないことを特徴とする。
【００１１】
段階ａ）、ｂ）及びｄ）において言及される細菌は、グラム陽性バチルス属、例えばバチルス spec.、バチルス・サブチリス、バチルス・スファエリカス、バチルス・メガテリウム、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、及びグラム陽性代表物、例えばアルトロバクター・シンプレックス及びブレビバクテリウム・マリス又はグラム陰性代表物、例えばエスシェリチア・コリ及びシュードモナス種であり得る。
【００１２】
本発明は特に、配列番号１に従ってのアルトロバクター・シンプレックスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子、配列番号９又は10に従ってのバチルス・スファエリカスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び配列番号12に従ってのブレビバクテリウム・マリスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子、並びに相応じて発現されるタンパク質、例えば配列番号11に従ってのバチルス・スファエリカスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子、配列番号13に従ってのブレビバクテリウム・マリスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び配列番号14に従ってのアルトロバクター・シンプレックスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子に関する。
【００１３】
上記に言及されるDNA配列は、適切なプラスミドにより宿主細胞中に導入され得る。適切な宿主細胞又は受容体は、生物形質転換反応において選択的にステロイド分子を脱水素化するために、Δ1−デヒドロゲナーゼの過剰発現のために使用され得るバチルス属のグラム陽性細菌である。特に、種、例えばバチルス・スファエリカス及びバチルス・サブチリスがこのために適切である。
前記細菌はまた、本発明の対象でもある。
【００１４】
宿主細胞中に発明のDNA配列を導入するためには、少なくとも１つの上記に言及されたDNA配列を含むプラスミドが使用される。そのプラスミドにおいては、Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子が、細菌における過剰発現のために必要である適切なプロモーター及びターミネーターを供給される。
【００１５】
適切なプロモーター及びターミネーターは、例えば配列番号９のバチルス・スファエリカスの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター、構成プロモーター、例えばp(veg), 又はバクテリオファージΦ29及びSPO1のプロモーター、誘発性プロモーター、例えばバチルス・サブチリスからのp(aprE)又はp(sacB), ハイブリッドプロモーター、例えばlacI-制御されたSPO1-プロモーター、E・コリからのターミネーター、例えばt(rrnB)又はバチルス・サブチリスからのターミネーター、例えばt(senS)又はt(senN)である（Doi, R.H. (1984) In: Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Vol 2, Russell, G.E. (ed), Intercept, Newcastle Upon Tyne, UK, pp 121-153; Le Grice, S.F.J. など. (1986) In: Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications, Ganesan, A.T. and Hoch, J.A. (eds), Academic Press, New York, 433-445; Mountain, A. (1989) In: Bacillus, Harwood CR (ed), Plenum Press, New York, pp 73-114; Le Grice, S.F.J. (1990) Meth Enzymol 185: 210-214; Wang and Doi (1992) In: Biology of Bacilli: Applications to Industry, Doi など. (eds), Massachusetts, Butterworth-Heinemann, pp 143-188を参照のこと）。
【００１６】
プラスミドはまた、本発明の対象でもある。
プラスミドは、Δ1−デヒドロゲナーゼを過剰発現することができる細菌の形質転換のために使用され得る。
本発明はまた、３−ケトステロイド−Δ1―デヒドロゲナーゼ活性及び、80％以上の相同性、特に90％以上の相同性及び好ましくは95％以上の相同性を有するDNA配列にも関する。
本発明はまた、少なくとも90％の相同性、特に少なくとも95％の相同性及び３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質配列にも関する。
【００１７】
本発明はまた、プロモーター、特にDNA配列配列番号９を有する、バチルス・フファエリカスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼプロモーター、及び配列番号９と80％以上、好ましくは90％以上、及び特に好ましくは95％以上の相同性を有する相同プロモーターにも関する。
本発明はまた、配列番号15, 16, 17及び18の配列に従ってのバチルス・スフェエリカス３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼオリゴヌクレオチド、及び配列番号19及び20の配列に従ってのparSオリゴヌクレオチド、並びにステロイド骨格中への二重結合の選択的導入のための方法へのそれらの使用にも関する。
【００１８】
本発明のDNA配列及びタンパク質は、ステロイドの選択的脱水素反応のために使用され得る。DNA配列及びタンパク質配列はまた、本発明の対象である。
脱水素化されたステロイドは、例えばベタメタゾン、クロベタゾン、クロコルトロン、Δ1−11β、17α−ジヒドロキシ−６α、９α−ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン、11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグン−４−エノ[17, 16-d]オキサゾール−3, 20-ジオン、デフラゾコート、デフラゾコートアルコール、デキサメタゾン、ジフルコルトロン、フルオシノロンアセトニド、フルオコルトロン、ヒドロキシ酸及びプレドニソロン、並びに上記化合物誘導体類である。
【００１９】
資料：
本出願に言及される菌株は、それぞれの出願場所から指図され得る：DSM => Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig; ATCC => American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA; NRRL => Northern Utilization Tesearch and Development Division, Peoria, Illinois, USA；等。
【００２０】
本発明に基づいて発明をより理解するために、まず、使用される方法が記載される。
１．制限酵素処理：
プラスミドDNA及びゲノムDNAの制限酵素処理が、使用されるDNAの量（１〜20μg）に基づいて15〜100μlの体積で実施された。酵素濃度は、DNA 1μg当たり１〜５単位の制限酵素であった。制限酵素処理は緩衝液において行われ、１〜３時間インキュベートされ、そして続いてアガロースゲル上で分析された（Sambrookなど. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。
【００２１】
２．アガロース−ゲル電気泳動：
ゲル電気泳動を、Minigel-（BioRad）, Midi-Widegel-（Biometra） 及び Maxigel装置（Biometra）において行った。分離問題に依存して、0.5×TBE緩衝液中、0.8〜４％（w/v）アガロースを含むアガロースゲルが使用された。電気泳動は、運転緩衝液として0.5×TBEを用いて行われた。DNAフラグメントを、臭化エチジウムにより染色し、そしてトランスイルミネーターにおいて可視化した（Sambrook など. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。
【００２２】
３．アガロースゲルからのDNAの溶出：
分離用制限調製物を、サイズに従ってアガロースゲルにおいて分離した。所望する体積を、メスにより切除した。単離されるべきDNAフラグメントを、“Jetsorb kit”（Genomed）の助けにより、その製造業者の説明書に従って回収し、そしてTE緩衝液に採取した。
【００２３】
４．オリゴヌクレオチドのリン酸化：
50pモルのオリゴヌクレオチドを、0.1mモルのATP及び20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で、製造業者により推薦される緩衝液において、37℃で45分間インキュベートした。酵素不活性化を、68℃で行った（Sambrook など. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。
【００２４】
５．連結：
連結のために、適切な量の脱リン酸化され、線状化されたベクター−DNA及びフラグメント−DNAを、１：５のモル比で使用した。反応を、製造業者により推薦される緩衝液中、１単位のT4−DNA−リガーゼ10μlの体積で、水浴において16℃で一晩、行った（Sambrook など. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。
【００２５】
６．E. コリの形質転換：
コンピテントE. コリ細胞を、CaCl2処理により得、そして−80℃で貯蔵した。一般的に、10μlの連結原液を、200μlのコンピテント細胞と共にインキュベートした。形質転換原液を、個々の場合、必要な抗生物質の添加を伴って、LB寒天上にプレートし、そして37℃で16時間インキュベートした。コンピテント細胞及び形質転換の生成を、Sambrook など. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harboc, New Yorkに従って行った。
【００２６】
７．バチルス・サブチリスの形質転換：
バチルス・サブチリスの形質転換を、Cutting SM and Vander Horn PB （In: Molecular Biological Methods for Bacillus (1990), Harwood CR and Cutting SM (eds), John Wiley & Sons, Chichester）により記載される２段階方法に従って行った。
【００２７】
８．バチルス・スファエリカスを、Taylorand Burke (1990)(FEMS  Microbiol. Lett. 66: 125-128) により公開される方法に類似する手段でエレクトロポレーションにより形質転換した。細胞を、MM2G培地（0.3％(w/v) の抽出物、0.8％（w/v）の酵母抽出物、１％（w/v）のペプトン、0.2％（w/v）のグルコース、0.7％（w/v）のNaCl、7.36g/lのK2HPO4、2.65g/lのKH2PO4、5ml/lの100％グリセロール、pH7）において一晩、培養し、１：２０で、新鮮なMM2G培地中に移し、そしてそれを、37℃で90分間、250rpmで培養した。
【００２８】
細胞をペレット化し、３×10％グリセロールにより洗浄し、そして次に、750μlのグリセロールに採取した。50μlの細胞懸濁液を、エレクトロポレーション細胞において、プラスミド−DNAを共に混合し、氷上でインキュベートし、そしてエレクトロポレーション装置（Biorad Gene PulserTM）(2.5kV, 25μF、600Ω)に配置した。細胞を、MM2G培地において30℃で90分間、再生のためにインキュベートし、そして続いて、TBAB寒天/５μgのネオマイシン（トリプトース血液寒天基材（Difco））上にプレートし、そして30℃で24時間インキュベートした。
【００２９】
９．E. コリからのプラスミドミニ−調製物。
ミニ−調製物を、アルカリ細胞溶解に従って製造した（Sambrook など. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Gold Spring Harbor, New York）。個々のコロニーを、4mlのLB培地と共に試薬ガラスにおいて一晩、培養し、そして選択した。その2mlを、調製のために使用した。
【００３０】
10．バチルス・サブチリス及びバチルス・スファエリカスからのプラスミドミニ−調製物：
バチルス・サブチリス及びバチルス・スファエリカスからのプラスミドの調製を、Genomed Companyのカラム（“Jetstar kit Mini”）上で、製造業者により規格されたプロトコールに従って行った。細胞の完全な細胞溶解を確保するために、緩衝液E1に取られた細胞ペレットを、5mg/mlのリゾチームと共に混合し、そして37℃で１時間インキュベートした。
【００３１】
11．E. コリ、バチルス・サブチリス及びバチルス・スファエリカスからのプラスミド最大−調製物：
プラスミド最大−調製物を、Genomed Companyの“Jetstar Kit Maxi”により製造した。菌株を、抗生物質の存在下で200mlのLB培地において一晩、培養した。プラスミドの調製を、製造業者により基底されたプロトコールに従って行った。パチルス・サブチリス及びバチルス・スファエリカスの完全な細胞溶液を確保するために、緩衝液E1に取られる細胞ペレットを、5mg/mlのリゾチームと共に混合し、そして細胞を37℃で１時間インキュベートした。
【００３２】
12．アルトロバクター・シンプレックス、バチルス種及びロードコカス・マリスからのゲノムDNAの調製：
200mlの集密的に増殖した細菌培養物を、ペレット化し、そして11mlの溶液I（50mモルのトリス−HCl、pH8；50mモルのEDTA；１％（v/v）のTritonX-100、200μg/mlのRnase）に懸濁した。その懸濁液を、リゾチーム（5mg/ml→A. シンプレックス、B. sp. /15ml/ml→R. マリス）及び500μlのプロテイナーゼK（20mg/ml）と共に混合し、そして37℃で30分以上インキュベートした。続いて、4mlの溶液II（3Mのグラニジニウム−塩酸塩、20％（w/v）のTween）を、添加し、そして原液を50℃で30分間インキュベートした。溶解されていない粒子をペレット化し、そして廃棄した。溶解物に溶解された染色体DNAを、アニオン交換クロマトグラフィー（Genomed Companyの“Jetstar kit Maxi”；製造業者により規定されるプロトコールを参照のこと）により精製した。
【００３３】
13．ポリメラーゼ鎖反応：
PCRについての反応条件は、それぞれ個々の場合のために最適化された。一般的に、0.1〜0.5μgの鋳型−DNA、10mモルのdNTP, 50pモルの個々の5’−及び3’−プライマー、及び2.5単位のPwo-ポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を、100μlの合計体積において、製造業者により推薦される懸濁液において組合した。鋳型−DNAに依存して、原液を10%DMSOに採取した。PCRを、“Biometra Trio Thermoblock”において行った。温度プロフィールを、新たに、個々の必要条件のために修正した。アニーリング温度は50℃（低い緊縮条件）〜65℃の間で変化した（PCR 1: A Practical Approach, McPherson など. (eds), Oxford University Press (1991)を参照のこと）。
【００３４】
14．サザン分析：
アガロースゲルにおいて、サイズに従って分離されたDNAを、毛管−ブロット工程（Sambrook など. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）により、正に荷電されたナイロン膜に移し、そしてUV照射により膜に供有結合した。
ハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン−ラベルされたプローブにより行った。プローブのラベリングを、製造業者により推薦されるプロトコールに従って、Boehringer Mannheimの“DIG−High−Prime”又は“PCE DIG Probe Synthesis Kit”により行った。
【００３５】
ハイブリダイゼーションのために、SDS−リン酸緩衝液（7%SDS（w/v）；0.5Mのリン酸ナトリウム、pH7.0）を使用した。必要条件に依存して、緊縮又は低い緊縮ハイブリダイゼーション条件を選択した（Sambrook など. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。
結合されたDNAの検出を、製造業者により推薦される説明書に従って、Boehringer Mannheimの化学ルミネセンス試薬(CSPD（商標）)により行った。
【００３６】
14．コロニーハイブリダイゼーション：
Pall BIODYNE（商標）A膜（1.2μm及び0.2μmの孔サイズ）へのコロニーの移行を、製造業者により推薦される方法に従って行った。
ハイブリダイゼーションを、上記に示されるSDS−リン酸緩衝液においてジゴキシゲニンラベルされたプローブにより行い、そして検出を、Boehringer Mannheimの化学ルミネセンス試薬CSPD（商標）(“Pall Bio Support” 適用情報SD1359G)により行った。
【００３７】
15．DNA−配列分析：
DNA配列分析を、GATC（商標）1500システムにより行った。配列反応を、製造業者により推薦されるプロトコールに従って、GATC（商標）−BioCycle Sequencing Kitにより行い、そして４％ポリアクリルアミド−ウレアゲル（GATC（商標）1500−システムプロトコール）上で分析した。検出を、CSPD（商標）(GATC（商標）−BioCycle Sequencing Kit Protocol)により行った。
【００３８】
16．ヒドロコルチゾン/ヒドロコルチゾン−17−アセテート→プレドニゾロン：作業及び分析：
培養ブイヨンを、３倍体積のメタノール/１％酢酸により希釈し、超音波処理し、そして遠心分離した。上清液を、1ml/分の流速でアセトニトリル−水グラジエンによりCDS−HyRersilカラム（250×4.6mm）上でクロマトグラフィー処理した。
溶離剤の順序：ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、11β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−ジオン、ヒドロコルチゾン−17−アセテート、ヒドロコルチゾン−21−アセテート、プレドニゾロン−21−アセテート。
【００３９】
17．４−アンドロステン−３，17−ジオン→アンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−ジオン：作業及び分析：
培養ブイヨンのイソブチルメチルケトン抽出物を、次のガスクロマトグラフィーにより分析した：
カラム１：50m×0.25mm、Chrompack WCOT CB, フィルム厚0.4μm、
カラム２：30m×0.25mm、hp1701, フィルム厚0.4μm、
検出器：FID、
キャリヤーガス：水素、
予備カラム圧：175kPa、
溶離剤の順序：４−アンドロステン−３，17−ジオン、アンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−ジオン。
【００４０】
18．フルオコルトロンAアセテート→フルオコルトロン：作業及び分析：
培養ブイヨンを、酢酸によりpH４〜６で設定し、そして次に、４倍体積のイソブチルメチルケトンにより抽出した。抽出物を、蒸発により濃縮し、クロロホルムに取り、そして1.2ml/分の流速で、クロロホルム：イソオクタン：１，４−ジオキサン：エタノール：水（1000：100：50：10：2）の定組成グラジエントにより、Kromasil 100カラム（250×4mm）上でクロマトグラフィー処理した。
溶離剤の順序：フルオコルトロンAアセテート、フルオコルトロンA、フルオコルトロン。
【００４１】
19．11β、17α−ジヒドロキシ−６α、９α―ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン→Δ1―11β、17α−ジヒドロ−６α、９α−ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン：作業及び分析：
培養ブイヨンを、３倍体積のメタノール/1%酢酸により希釈し、超音波処理し、そして遠心分離した。上清液を、1ml/分の流速で、アセトニトリル−水グラジエンにより、ODS−Hypersilカラム（250×4.6mm）上でクロマトグラフィー処理した。
溶離剤の順序：11β、17α−ジヒドロキシ−６α、９α―ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン→Δ1―11β、17α−ジヒドロ−６α、９α−ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン。
【００４２】
20．11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグン−４−エノ[17, 15−d]オキサゾール−３，20−ジオン→11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグナ−１，４−ジエノ [17, 15−d]オキサゾール−３，20−ジオン（デフラゾコルトアルコール）：作業及び分析：
培養ブイヨンを、４倍体積のメチルイソブチルケトンにより抽出した。抽出物を乾燥状態に蒸発し、そして同じ体積のクロロホルムに採取した。サンプルを、Kromasil-100カラム（250×4.6mm）上に通用し、そして2ml/分の流速で、ジイソプロピルエーテル：ジクロロエタン：１，４−ジオキサン：水（250：150：75：４）によりクロマトグラフィー処理した。溶離剤の順序：11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグン−４−エノ[17, 15−d]オキサゾール−３，20−ジオン→11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグナ−１，４−ジエノ [17, 15−d]オキサゾール−３，20−ジオン（デフラゾコルトアルコール）。
【実施例】
【００４３】
下記のクローニング、単離及び構成例は、本発明の生物学的実行可能性を記載するが、それらは本発明を制限するものではない。
例１．種々の種からの３−ケトステロイド−Δ1―デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
1.1．アルトロバクター・シンプレックスATCC6946からの：
アルトロバクター・シンプレックスATCC6946から３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子を単離するために、読み取り枠を、アルトロバクター・シンプレックスのゲノムDNAからのプライマー対2026（5' CGG GAT CCA TGG ACT GGG CAG AGG AGT ACG ACG TAC TGG TGG1435-1468）及び2027（5' CGG AAT TCT CAT CGC GCG TCC TCG GTG CCC ATG TGC CGC ACG2982-2949）を用いてのPCR反応により増幅した。増幅された遺伝子を、ベクターpTrc99A （Pharmacia) のその対応する界面におけるNcoI-EcorIフラグメントとして、又はプラスミドpSP72 (Promega)のその対応する界面におけるBamHI-EcoRIフラグメントとしてクローン化した。その遺伝子配列を、GATC（商標）1500配列決定機（GATC）により確かめた。
【００４４】
１．２．バチルス・スファエリカスATCC13805からの：
バチルス・スファエリカスATCC13805からの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子を単離するために、バチルス・スファエリカスのゲノムDNAからの相同プローブを、PCR反応における変性されたプライマーの使用により単離した；低い緊縮条件下で、1468bpのフラグメントを、プライマー対2048（5' GAA TRY GAT NTW NTW GTW GYW GGW WSW GG）及び2054（5' NAR NCC NCC YTT NGT NCC）により増幅し、そしてpCRScriptTM Amp Sk(+) (Stratagene)においてクローン化した。
【００４５】
DNAプローブとしての挿入体を用いて、Zero Background TM /Kan Cloning Kits （Invitrogen）の使用により生成されたDNAライブラリーからのオーバーラッピングゲノムクローンを単離した。バチルス・スファエリカス３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子の配列を、GATC（商標）1500配列決定機（GATC）により決定した。前記遺伝子配列に起因するタンパク質配列は、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosterone）からの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼの配列に対して34％同一である。その類似性は54％である。34％の同一及び54％の類似性が、アルトロバクター・シンプレックスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼに存在する。
【００４６】
１．３．ブレビガクテリウム・マリスATCC21111からの：
ブレビバクテリウム・マリスATCC21111から３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子を単離するために、まず、異種DNAプローブを、アルトトロバクター・シンプレックスの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子から単離し、そしてDIG−ラベルし；109bpのフラグメント（2066−2175）を、プライマー対2017（GAC GCC GTA CTT CTG GCG GAG CTC GTC ATT GGC C2175-2142）及び2032（CGA TCG TCG AGA CCG ACG G2066-2084）により増幅し、190bpのフラグメント（1428−1618）を、プライマー対2016（GAT CAC GAT GGA CTG GGC AGA GGA GTA CGA CG1428-1459）及び2055（GCA GCA CCG GGT TCG CGG GGA ACC AGG1618- 1592）により増幅し、そして747bpのフラグメント（1428−2175）を、プライマー対2016及び2017により増幅した。
【００４７】
サザン分析においては、プレビバクテリウム・マリスDNAへの上記プローブの続く特異的結合が検出された。前記条件が、Zero BackgroundTM/Kan Cloning Kits (Invitrogen) の使用により生成された、ブレビバクテリウム・マリスのDNAライブラリーにおける３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子配列により同定するために使用された。これに関しては、２種のオーバーラップするクローンを同一した。ブレビバクテリウム・マリス３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子の配列を決定した。前記遺伝子配列に由来するタンパク質配列は、コマモナス・テストステロニからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼの配列に対して28％同一である。その類似性は44％である。72％の同一性及び83％の類似性が、アルトロバクター・シンプレックスからの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼに存在する。
本明細書に記載される新規配列を包含するすべての既知３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼの比較は、コンセンサスの長さに関して、わずか10%の同一性及びわずか18％の類似性を生成する（図１）。
【００４８】
1.4．マイコバクテリウム種NRRLB−3683からの：
マイコバクテリウム種NRRLB−3683からの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングに関しては、第１に、上記に類似して、マイコバクテリウムsp. DNAへの結合が、前記DNAプローブにより検出され、そして次に、遺伝子ゲノムDNAライブラリーから単離された。
【００４９】
1.5．マイコバクテリウム種NRRLB−3805からの：
マイコバクテリウム種NRRLB−3805からの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングに関しては、第１に、上記に類似して、マイコバクテリウムsp. DNAへの結合が、前記DNAプローブにより検出され、そして次に、遺伝子ゲノムDNAライブラリーから単離された。
【００５０】
例２．プロモーター及びターミネーター配列の単離及び特徴づけ
３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子の過剰発現のための調節配列として、バチルス・スファエリカスからの３−ケトステロイド−Δ1―デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーター要素が使用された。両要素を単離し、そして遺伝子のクローニングと調和して特徴づけた。
【００５１】
開始コドン以上の位置84bp又は61bpでのプロモーターは、個々の場合、偏差を伴って、細菌プロモーターのコンセンサス（-10/-35 Box）に対応する、２種のヘキサヌクレオチド（TTGACT-84--79/TATACT-61--56）を含む。２種の要素の17個のヌクレオチドからのお互いに対する距離は、細菌コンセンサスに正確に対応する（Record MT など. (1996) In: Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt FC (ed), 2 Edition, ASM Press, Washington DC, Vol 1, pp 792-821を参照のこと）。
【００５２】
開始コドン以上の16bpは、バチルスに典型的であるリボソーム−結合部位に存在する（AGGGAGG-16--10; Band L and Henner DJ (1984) DNA 3: 17-21）。
プロモーター活性が、lacZアッセイにおいて、位置−126（SalI）から位置−28（ClaI）及び位置−258（PstI）から位置−28（ClaI）のフラグメントに関して検出された。
開始コドンの後部の9bpは、p−独立ターミネーターとして作用するパリンドローム（AAGCCCTTCCT1698-1706/AGGAAGGGCT1731-1741）である（Richardson JP and Greenblatt J (1996) In: Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt FC (ed), 2 Edition, ASM Press, Washington DC, Vol 1, pp 822-848を参照のこと）。
【００５３】
原則的に、他のプロモーター及びターミネーターもまた使用され得る（Doi RH (1984) In: Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Vol 2, Russell GE (ed), Intercept, Newcastle Upon Tyne, UK, pp 121-153; Le Grice SFJ など. (1986) In: Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications, Ganesan AT and Hoch JA (eds), Academic Press, New York, 433-445; Mountain A (1989) In: Bacillus, Harwood CR (ed), Plenum Press, New York, pp 73-114; Le Grice SFJ (1990) Meth Enzymol 185: 210-214; Wang and Doi (1992) In: Biology of Bacilli: Applications to Industry, Doi et al. (eds), Massachusetts, Butterworth-Heinemann, pp 143-188を参照のこと）。
【００５４】
例３．発現プラスミドの構成
発現プラスミドの生成のために、第１に、pSP72 (Promega)、及びpUB110 (McKenzieなど(1986) Plasmid 15: 93-103)の一部から成る“シャトル”プラスミドを企画した。このためには、pUB110を、EcoRI及びRvuIIにより分解し、そして得られる3.6kbのフラグメントを、pSP72のEcoRI及びEcoRV界面に挿入した。プロモーター及びターミネーター配列（位置−126（SalI）〜位置1861（ScaI））を端に有する、バチルス・スファエリカスの３−ケトステロイド−Δ1―デヒドロゲナーゼ遺伝子を、上記“シャトル”ベクター（→ｔS＃196、図２を参照のこと）のXbaI及びPvuII界面におけるXbaI−ScaIフラグメントとして連結した。
【００５５】
第２の発現プラスミドは、修飾されたΔ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターp(Δ1)mutを担持する；PCR−突然変異誘発により、個々の場合、塩基が−35（TTGACT→TTGACA）及び−10Box（TATACT→TATAAT）において交換され、細菌プロモーターのコンセンサスに対する正確な応答が達成された。このためには、プロモーターをまず、突然変異誘発プライマー2089mut (CCA TCG ATG AAT CTG GTC TTC CTA TTA AAA ATT ATA GAA TTA AAC TAA TAT TCT GTC AAT TTT TCC-29--91)及びプライマー2090（CAT GAC AAA ATT ATT TGA TTT AAT CAC-258--284）により増幅し、そしてpBluescrip IIKS（＋）のその対応する界面中に、PstI−ClaIフラグメントとして挿入した。突然変異を、配列分析により確めた。p(Δ1)mutを、XbaI−ClaIフラグメントとして切除し、そしてTS#196のその対応する界面に連結した。これに関しては、wtプロモーターを、p(Δ1)mutにより交換した（→TS#251）。
【００５６】
さらに、2種の他のプラスミドは、プラスミド−安定化シグナル、すなわちparSを担持する（Lin DC and Grossman AD (1998) Cell 92: 675-685）。後者は、TS#196 (→AD#82)及びTS#251（→＃255）のBamHI界面において、お互い相補的である次の２種のオリゴヌクレオチド、2091parS (GAT CCT GTT CCA CGT GAA ACA G)及び2092parS (GAT CCT GTT TCA CGT GGA ACA G)を通してクローン化された。
【００５７】
E. コリDH5α（＝DSM6897）における発現のために、プロモーター及びターミネーター配列を端に有する、バチルス・スファエリカスの３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼ遺伝子を、BamHI及びXhoIにより切断されたプラスミドpZErOTM-2において2865bpのSalI−部分Sau3Aフラグメント（位置126−2739）としてクローン化し、そしてE. コリDH5αを形質転換する（→プラスミドMS#46又は株MS#46MS#46）。
【００５８】
例４．ステロイド対するΔ1−脱水素反応の導入のためのバチル属の組換え株の生成
発現プラスミドTS#196、TS#251、AD#82及びTS#255を用いて、バチルス・サブチリスDSM402（German Strain Collection for Microorganisms, Brunswick）及びバチルス・スファエリカスATCC13805を形質転換した。バチルス・サブチリス及びバチルス・スファエリカスは、グラム陽性の非病原性生物である。それらは培養するのに単純である。バチルス・スファエリカスに比較して、バチルス・サブチリスは、分子−遺伝子に関して十分に特徴づけられている。組換え遺伝子生成物の生成のためのタンパク質の異種発現及び分泌についての多くの例が存在する（Wand and Doi (1992) In: Biology of Bacilli: Applications to Industry, Doi など. (eds), Massachusetts, Butterworth-Heinemann, pp 143-188）。適切なプロモーター及びターミネーターもまた記載されている。
【００５９】
組換え株に関しては、プレドニゾロン（Pln）を形成するために、ヒドロコルチゾン（F）、ヒドロコルチゾン−17−アセテート（MAF）及びヒドロコルチゾン−21−アセテート（EAF）の混合物の反応を、振盪フラスコにおいて例の手段により行った。出版物F, MAF及びEAF並びに所望する生成物Plnの他に、プレドニゾロン−21−アセテート（Pln−21−アセテート）及び所望しない二次領域11β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−ジオン（11β−OH−ADD）を追跡した。組換え株の反応能力を示すために、前記方法を、バチルス・スファエリカスATCC13085が20％以下のPlnを形成する基質濃度で実施した。
【００６０】
株AD#67TS#196、AD#94TS#251、AD#95TS#255、AD#96TS#255、AD#116TS#251及びAO#205TS#196を、バチルス・スファエリカスATCC13085から生成し、そして個々の場合、示される発現プラスミドを含む。株AD#89TS#196及びAD#90TS#196を、バチルス・サブチリスDSM402から生成し、そして個々の場合、示される発現プラスミドを含む。
【００６１】
例５．Plnを形成するためのEAF/MAF/Fの反応
バチルス・スファエリカスATCC13805、AD#67TS#196, AD#94TS#251, AD#95TS#255, AD#96TS#255, AD#116TS#251, バチルス・サブチリス DSM 402, AD#89TS#186, AD#90TS#196, E.コリ DH5 α DSM 6897 及び MS#46MS#46を、LB培地（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）において、5μg/mlのネオマイシン（バチルス・スファエリカス誘導体）、50μg/ml又は100μg/mlのカナマイシン（E. コリ又はバチルス・サブチリス誘導体）の存在下で、又は抗生物質（wt-株）を添加しないで、37℃及び220rpmで培養した。
【００６２】
Plnを形成するためのEAF/MAF/Fの反応においては、新鮮なLB培地において１：10の比での接種材料を抗生物質の添加を伴わないで転換し、そして培養物を上記のようにして振盪した。原則的に、生物が増殖できるいずれの他の培地でも使用され得る。基質は、３時間後に添加された。24時間後、フラスコを除去し、そして遊離物及び生成物を抽出し、そしてHPLC−分析した（表１；反応ダイアグラム、下記を参照のこと）。予測されるように、バチルス・サブチリスDSM402及びE. コリDH5αはいずれの反応も示さず、バチルス・フファエリカスATCC13085は、24時間後、20％以下の生成物を形成し、ところがバチルス株のすべての組換え株（AD#67TS#196, AD#94TS#251, AD#95TS#255, AD#96TS#255, AD#89TS#196 及び AD#90TS#196）は、同じ期間で、80％以上のPlnを生成する。48時間にわたっての基質又は生成物の変性は観察され得なかった。
【００６３】
下記に記載されるすべての試験は、AD#67TS#196又はAD#116TS#251による例により行われた。標準として、バチルス・スファエリカスATCC13085を使用した。試験は、ステロイド分子に対して、Δ1−脱水素反応に関して、上記に言及された組換え株の複数倍高められた反応活性を示す。
【００６４】
例６．Pln（1g/l）を形成するためのEAF/MAF/Fの反応の動力学
最初に、Plnを形成するためにEAF/MAF/Fの反応例におけるΔ1−脱水素反応を、振盪フラスコ（LB培地、37℃、220rpm）において、1g/lの基質濃度で上記に類似して行った。基質の添加を、３時間後に行った。反応の経過を追跡することができるよう、サンプルを、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12及び24時間後に採取し、そして遊離物及び生成物を、抽出し、そしてHPLC−分析した。菌株ATCC13805は基質をPlnに完全に転換するために24時間を要するが、菌株AD#67は、10時間以下で、その対応する量のPlnをすでに形成している（図３；反応ダイアグラム、下記参照のこと）。
【００６５】
例７．Pln（10g/l）を形成するためのEAF/MAF/Fの反応の動力学
同じ試験を、10g/lの基質添加で行った。基質を、３時間後に添加し、サンプルを、6, 9, 12, 24, 30及び36時間後に採取し、そしてステロイドを抽出し、そして分析した。６時間後、ATCC13085培養物はわずか１％のPlnを有したが、ところが菌株AD#67は、15％以上の生成物をすでに形成していた。12時間後、菌株AD#67は、50％以上の基質をPlnにすでに転換したが、しかしながら、TCC13805はわずか5%を転換した（図４；反応ダイアグラム、下記参照のこと）。
菌株AD#67の高い反応活性は、EAF/MAF/Fからのプレドニソロンの生成方法に制限されず、むしろ一般的にステロイド分子中へのΔ1の導入に適用される。
【００６６】
例８．アンドロスタ−１，２−ジエン−３，17−ジオン（ADD）への４−アンドロステン−３，17−ジオン（AD）の転換
菌株AD#67又はATCC1380によるADのADDへの転換を、振盪フラスコ（LB培地、37℃、220rpm）において、上記に類似して研究した。基質を３時間後に添加し、そしてサンプルを、4，5，6，7, 9及び10時間後に採取した。PlnへのMAF/Fの転換におけるように、生成物形成は、菌株ATCC13805の使用によるよりも菌株AD#67による発酵の場合、相当に早く行われる。10時間後、バチルス・スファエリカスATCC13805は、30％以下の基質をADDに転換するが、しかしこの時点での菌類AD#67においては、70％以上の生成物が単離され得た（図５）。
【００６７】
例９．フルオカルトロン（FC）を形成するためのフルオカルトロンAアセテート（FCAA）の反応
弗素化されたステロイドはまた、利用できる生物−触媒により今まで可能であったよりも、1−位において相当により効果的に、組換え株により脱水素化される。これは、バチルス・スファエリカスATCC13805に比較して、AD#116による振盪フラスコにおける上記に類似して、FCへのFCAAの転換を示す（図６；反応ダイアグラム、下記を参照のこと）。
【００６８】
例10．Δ1−11β、17α−ジヒドロキシ−６α、９α−ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン（Δ1DDFMP）を形成するための11β、17α−ジヒドロキシ−6α、9α−ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン（DDFMP）の反応
上記例に類似してのΔ1DDFMPへのDDFMPの転換はまた、バチルス・スファエリカスATCC13805によりもAD#116により相当により効果的に実施される（図７、反応ダイアグラム、下記を参照のこと）。
【００６９】
例11．10Lの発酵物に（20/l）においてPlnを形成するためのEAF/MAF/Fの転換：菌株AD#67/バチルス・スファエリカスATCC13805の比較
菌株AD#67のΔ1−脱水素化能力を、10Lの発酵物におけるEAF/MAF/F→Flnの例におけるバチルス・スファエリカスATCC13805に比較して試験した。反応を、20倍の高い基質添加で実施した。接種機材の培養を、第１段階においては、5μg/mlのネオマイシン（AD#67）の存在下で、又は抗生物質（ATCC13805）の添加を伴わないで、LB培地において37℃及び220rpmで一晩、行った。続いて、その一晩の培養物（1：100）を、1000mlの中間培養物に添加し、そして37℃及び220rpmで９時間、2.4の光学密度まで振盪した。発酵を、抗生物質の添加を伴わないで、LB培地において行った。しかしながら、原則的には、生物が増殖できるいずれか他の培地が使用され得る。
【００７０】
３時間後、基質を30時間、連続して添加した。pHを８で維持した。発酵の間、サンプルを摂取し、そして生成物及び遊離物の内容物について試験した。発酵プロフィールは、バチルス・スファエリカスATCC13805が、この程度の基質濃度を超えることはできないことを示し：反応は、80％以上の基質が残存する場合、停止する。しかしながら、菌株AD#67の転換能力が考慮でき：基質適用のすぐ後、相は終結し、反応は、十分に（95％以上）完結される（図８）。菌株AD#67の転換活性は、１時間当たり約0.6g/lである。しかしながら、菌株ATCC13805は、１時間当たり0.1g/lの活性を示す。いずれの場合においても、破壊的二次領域、例えば11−β−OH−ADDは、追跡において観察された。Plnの結晶収率は、理論値の約80％以上であり、そして従来の方法により達成される値に対応する（反応ダイアグラム、下記参照のこと）。
【００７１】
例12．11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグナ−１，４−ジエノ[17、16−ｄ]オキサゾール−３，20−ジオン（デフラザコートアルコール）を形成するための11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグン−４−エノ[17, 16-d] オキサゾール３，20−ジオンの反応
上記例に類似して、振盪フラスコにおいて、1g/lの11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグン−４−エノ[17, 16-d] オキサゾール３，20−ジオンのデフラザコートアルコールへの転換は、バチルス・スルファエリカスによるよりもAO#205によって有意により効果的に実施される（図９；反応ダイアグラム、下記参照のこと）。上記とは異なって、12g/lの67％酵母抽出物、27g/lのトウモロコシ浸せき液及び9.2g/lのNaClから成る培地を使用した。
【００７２】
【化１】
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【００７３】
【化２】
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【００７４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、すべての既知の３−ケトステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを示す（CLUSTAL, W. Algorithmus, Thompson, J.D. など. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673-4680）。図においては、Bm3os-デルタ１−DHは、ブレビバクテリウム・マリス３−オキソステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを意味し；Rr3os−デルタ１−DHは、ロードコーカス・ロードクロウス３−オキソステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを意味し；As3os−デルタ１−DHは、アルトロバクター・シンプレックス３−オキソステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを意味し；Bs3os−デルタ１−DHは、バチルス・スファエリカス３−オキソステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを意味し；Mt3os-デルタ１−DHは、マイコバクテリウム・ツベルキュロシス３−オキソステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを意味し；No3os−デルタ１−DHは、ノカルジア・オパカ３−オキソステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを意味し；Ct3os−デルタ１−DHは、コマモナス・テストステロニ３−オキソステロイド−Δ1−デヒドロゲナーゼを意味し；完全な適合の数：61 => 10.34%；高い類似性の数：48 => 8.14%；低い類似性の数：54 => 9.15%；Bm3os-delta1-DH [この研究]; Rr3os-デルタ-DH [GenBank AC: AB007847]; As3os-デルタ-DH [Molnar I など. (1995) Mol Microbiol 15: 895-905; GenBank AC: D37969]; Bs3os-デルタ-DH [この研究];Mt3os-デルタ-DH [Cosmid Z82098, complement 16520. . .18211; http:/ / www.sanger.ac.uk/M_tuberculosis]; No3os-デルタ-DH [Drobnic K など. (1993) Biochem Biophys Res Comm 190: 509-515; SUISS-PROT AC: Q04616]; Ct3os-デルタ-DH [Plesiat P et. (1991) J Bacteriol 173: 7219-7227; SUISS-PROT AC: Q06401]。
【図２】図２は、発現プラスミドTS#196を示す。
【図３】図３は、Pln (1g/l)を形成するためのEAF/MAF/Fの反応を示す：菌株AD#67とバチルス・スファエリカスATCC13805とを比較する。図においては、EAF＝ヒドロコルチゾン−21−アセテート；MAF＝ヒドロコルチゾン−17−アセテート；F＝ヒドロコルチゾン；pln＝プレドニゾロン。
【図４】図４は、Pln (10g/l)を形成するためのEAF/MAF/Fの反応を示す：菌株AD#67とバチルス・スファエリカスATCC13805とを比較する。図においては、EAF＝ヒドロコルチゾン−21−アセテート；MAF＝ヒドロコルチゾン−17−アセテート；F＝ヒドロコルチゾン；pln＝プレドニゾロン。
【図５】図５は、ADD (1g/l)を形成するためのADの反応を示す：菌株AD#67とバチルス・スファエリカスATCC13805とを比較する。図においては、AD＝４−アンドロステン−３,17−ジオン；ADD＝アンドロスタ−１,４−ジエン−３,17−ジオン。
【図６】図６は、FC (1g/l)を形成するためのFCAAの反応を示す：菌株AD#116とバチルス・スファエリカスATCC13805とを比較する。図においては、FCAA＝フルオコルトロンAアセテート；FCA＝フルオコルトロンA；FC＝フルオコルトロン。
【図７】図７は、Δ1−DDFMP (1g/l)を形成するためのDDFMPの反応を示す：菌株AD#116とバチルス・スファエリカスATCC13805とを比較する。図においては、DDFMP＝11β、17α−ジヒドロキシ−６α、９α−ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン；Δ1−DDFMP＝Δ1−11β、17α−ジヒドロキシ−６α、９α−ジフルオロ−16α−メチルプロゲステロン。
【図８】図８は、10Lの発酵物（20g/l）におけるPlnへのEAF/MAF/Fの転換を示す。菌株AD#67/バチルス・スファエリカスATCC13805を比較のこと。略語の意味については、上記を参照のこと。
【図９】図９は、11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグナ−１，４−ジエノ[17、16−ｄ]オキサゾール−３，20−ジオン（デフラザコートアルコール）（１g/ｌ）を形成するための11β、21−ジヒドロキシ−2’−メチル−5’βH−プレグン−４−エノ[17, 16-d] オキサゾール３，20−ジオンの反応：菌株AO#205/バチルス・スファエリカスATCC13805の比較を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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