(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ２．０〜３．５のヒアルロン酸水溶液を１２時間以上凍結する工程と、次いで解凍する工程と、を含む生産方法で得られるヒアルロン酸ゲルであって、
中性の２５℃の水溶液中で１日後の溶解率が１８％以下であり、１４日後の溶解率が５０％以上であるヒアルロン酸ゲルを含む、
医用材料。
【請求項２】
請求項１に記載の医用材料であって、
前記ヒアルロン酸水溶液中のヒアルロン酸が、分子量６×１０５〜２×１０６ダルトンのヒアルロン酸を含む、
医用材料。
【請求項３】
請求項１または２記載の医用材料であって、
前記ヒアルロン酸水溶液のヒアルロン酸濃度が、１重量％である、
医用材料。
【請求項４】
癒着防止用の、請求項１乃至３いずれかに記載の医用材料。
【請求項５】
ｐＨ２．０〜３．５のヒアルロン酸水溶液を１２時間以上凍結する工程と、次いで解凍する工程と、
を含む、請求項１乃至４いずれかに記載の医用材料の生産方法。
【請求項６】
請求項５に記載の医用材料の生産方法であって、
前記ヒアルロン酸水溶液中のヒアルロン酸が、分子量６×１０５〜２×１０６ダルトンのヒアルロン酸を含む、
医用材料の生産方法。
【請求項７】
請求項５または６記載の医用材料の生産方法であって、
前記ヒアルロン酸水溶液中のヒアルロン酸濃度が、１重量％である、
医用材料の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶解速度が制御されたヒアルロン酸ゲル及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさか、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖球菌の培養物からも精製物が調製されている。
天然産のヒアルロン酸は、分子量について多分散性であるが、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植または注入した場合であっても優れた生体適合性示すことが知られている。さらに、生体に適用する場合のヒアルロン酸自体の易水溶性に由来する短所、生体内滞留時間が比較的短いことから、多種多様なヒアルロン酸の化学修飾物も提案されている。
【０００３】
これらの代表的なものとしては、ジビニルスルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二官能性試薬を架橋剤に使用して、得られた高膨潤性の架橋ヒアルロン酸ゲルを挙げることができる（米国特許第４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３０６０１号公報参照）。
【０００４】
また、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩がジメチルスルフォキシド等の有機溶媒に溶解する特徴を利用したヒアルロン酸の化学的修飾方法が開示されている（特開平３−１０５００３号）。また、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルスルフォキシド中で、トリエチルアミンとヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウムを加え反応させ、ヒアルロン酸のカルボキシル基と水酸基間でエステル結合を形成させる方法も開示されている（欧州特許０３４１７４５Ａ１）。
【０００５】
また、共有結合を形成する化学的試薬を使用することなく、ヒアルロン酸を水に不溶化する方法として、ヒアルロン酸とアミノ基あるいはイミノ基を有する高分子化合物とを、ヒアルロン酸のカルボキシル基と高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ基をイオン複合体として結合させてヒアルロン酸高分子複合体を調製する方法が開示されている（特開平６−７３１０３号公報参照）。
【０００６】
ヒアルロン酸水溶液を酸性、例えばｐＨ２．０〜２．７の範囲に調整するとパティーゲルと呼ばれるジェリー状に固化した状態のゲルを形成することは知られているが、ｐＨ２．０未満では、パティーゲルは形成されない。そして、このパティーゲルは、中性水溶液中に投入すると速やかに溶解するので、本発明でいうヒアルロン酸ゲルとは異なる。
【０００７】
また、ヒアルロン酸水溶液を、ｐＨ２．０〜３．８、２０〜８０重量％水溶性有機溶剤存在下におくことを特徴とするヒアルロン酸ゲルの製造方法も開示されている（特開平５−５８８８１公報参照）。しかしながら、この製造方法で得られたヒアルロン酸ゲルは、コーティング等を施さない場合には、水中に投入すると溶解することが該公報に記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かし、かつ、生体内での滞留時間が調節されたヒアルロン酸ゲルは有用である。
本発明者らは、ヒアルロン酸自体の物理化学的性質を鋭意検討してきた結果、任意の溶解速度に制御された上記ヒアルロン酸ゲルを見出した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、（１）中性の２５℃の水溶液中で１日後の溶解率が５０％以下であり、３〜１４日後の溶解率が５０％以上であることを特徴とするヒアルロン酸ゲル、（２）ヒアルロン酸のｐＨ２〜３．５の水溶液を凍結し、次いで解凍することを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸ゲルの製造方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第9027号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第2319号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
【００１１】
ゲルとは、新版高分子辞典（朝倉書店  昭和６３年）によれば、「あらゆる溶媒に不溶の三次元網目構造をもつ高分子及びその膨潤体」と定義されている。理化学辞典（岩波書店  第４版  昭和６２年）によれば、「ゾル（コロイド溶液）がジェリー状に固化したもの」と定義されている。
本発明で言うヒアルロン酸ゲルとは、中性水溶液に少なくとも１日は難溶性であることを特徴とし、このヒアルロン酸ゲルを中性水溶液中に投入すると、ゲル化していないヒアルロン酸と比較して１日後に有意に難溶性を示す。難溶性は、中性の２５℃の水溶液中でのゲルの溶解率で規定する。ここで、中性水溶液とは、ｐＨ７に調整された緩衝能を有する生理的食塩水である。
【００１２】
本発明で得られるヒアルロン酸ゲルの製造方法は問わない。
例えば、ｐＨ２〜３．５の酸性ヒアルロン酸溶液を凍結し、次いで解凍して形成させる方法がある。その他には、ヒアルロン酸濃度５重量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液を中和処理前に熟成することにより形成させる方法がある。また、形成したヒアルロン酸ゲルを、熱や放射線等で分解して、溶解速度を制御しても良い。
【００１３】
本発明で得られるヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸単独で形成されるものも含む。ここでいうヒアルロン酸単独とは、ヒアルロン酸以外に化学的架橋剤や化学的修飾剤等を使用しないこと、また、カチオン性の高分子と複合体化しないことであり、自己架橋を意味するものである。化学的架橋剤や化学的修飾剤を使用することにより、それに起因する生体適合性への悪影響が考えられるので、ヒアルロン酸単独からなるゲルの方がより好ましい。
【００１４】
ヒアルロン酸の化学的架橋剤は、ヒアルロン酸のカルボキシル基、水酸基、アセトアミド基と反応して共有結合を形成する多価化合物であり、ポリグリシジルエーテル等の多価エポキシ化合物、ジビニルスルホン、ホルムアルデヒド、オキシ塩化リン、カルボジイミド化合物とアミノ酸エステルの併用、カルボジイミド化合物とジヒドラジド化合物の併用を例として挙げることができる。ヒアルロン酸と化学的架橋剤との反応により三次元網目構造が形成される。
【００１５】
ヒアルロン酸の化学的修飾剤は、ヒアルロン酸のカルボキシル基、水酸基、アセトアミド基と反応して共有結合を形成する化合物であり、無水酢酸と濃硫酸の併用、無水トリフルオロ酢酸と有機酸の併用、ヨウ化アルキル化合物を例として挙げることができる。ヒアルロン酸の親水性基を疎水化し、ヒアルロン酸の水溶性が減少する。
【００１６】
ヒアルロン酸と複合体化するカチオン性の高分子は、ヒアルロン酸のカルボキシル基と高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ基の間でイオン複合体を形成する高分子であり、キトサン、ポリリジン、ポリビニルピリジン、ポリエチレンイミン、ポリジメチルアミノエチルメタクリレートを例として挙げることができる。ヒアルロン酸とカチオン性の高分子は複合体化することにより、水に不溶化する。
【００１７】
一方、ヒアルロン酸への架橋構造の導入やヒアルロン酸の不溶化、難溶化に直接関係しない物質を、本発明でいうヒアルロン酸ゲルを形成させる際に添加することはできる。ヒアルロン酸と同様に生体適合性に優れる材料、例えば、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース等を混合、複合化してヒアルロン酸ゲルを形成させることができるものであり、何ら制限されないものである。
また、ヒアルロン酸ゲルを形成させる際に、薬学的又は生理学的に活性な物質を添加して、これらを含有するヒアルロン酸ゲルを形成させることもできるものであり、何ら制限されないものである。
【００１８】
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は、所望の溶解速度により適宜選択されるが、約１×１０5 〜約１×１０7 ダルトンの範囲内のものが好ましい。
また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから、加水分解処理等を介して得られた低分子量のものも同様に使用できる。
なお、本発明にいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
【００１９】
本発明で得られるヒアルロン酸ゲルは、その使用目的に応じて、溶媒中に浸漬した状態、溶媒を含ませた湿潤状態、通風乾燥、減圧乾燥あるいは凍結乾燥等の処理を経た乾燥状態で供される。
【００２０】
ヒアルロン酸ゲルの成形加工等の処理は、作製時には、ヒアルロン酸及び調製されたヒアルロン酸酸性水溶液の容器や手法の選択によりシート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、及びチューブ状の所望の形態のヒアルロン酸ゲルの作製が可能である。ヒアルロン酸ゲルの作製後の加工としては、機械的粉砕による微細な破砕状や凍結、解凍によるスポンジ状、圧延によるフィルム化、紡糸等が例示される。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを蒸留水に溶解し、１重量％のヒアルロン酸の水溶液を調製した。調製されたヒアルロン酸の水溶液のｐＨは、６．０であった。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸でｐＨ２．０に調整した。このヒアルロン酸の酸性水溶液１５ｍｌを３０ｍｌのガラスビンに入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。２４時間放置した後、２５℃で解凍した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。
【００２３】
実施例２
実施例１に於いて、分子量が６×１０5 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを溶解してヒアルロン酸の水溶液を調製した後、実施例１と同様の操作を行い、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。２４時間放置した後、２５℃で解凍した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。
【００２４】
実施例３
実施例１に於いて、−２０℃に設定した冷凍庫に１２時間放置した後、２５℃で解凍した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。
【００２５】
実施例４
実施例３に於いて、分子量が６×１０5 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムを溶解してヒアルロン酸の水溶液を調製した後、実施例３と同様の操作を行い、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１２時間放置した後、２５℃で解凍した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。
【００２６】
実施例５
実施例１に於いて、調製されたヒアルロン酸の水溶液のｐＨを、１Ｎ塩酸でｐＨ２．５に調整した。このヒアルロン酸の酸性水溶液１５ｍｌを３０ｍｌのガラスビンに入れ、−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。２４０時間放置した後、２５℃で解凍した。その結果、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルが得られた。
【００２７】
実施例１〜５のヒアルロン酸ゲルの調製条件を、表１にまとめる。
【００２８】
【表１】
0004460662.tif 000002
【００２９】
実施例６
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムの粉末１００ｍｇを３００ｋｇｆ／ｃｍ2 で３分間加圧し、８ｍｍ×８ｍｍ×２ｍｍの直方体の成型物を得た。この成型物を、スチロール製の角型容器に入れ、１Ｎの塩酸を４００ｍｇ、ヒアルロン酸濃度にして２０重量％になるように含浸させ容器を密閉した後、２５℃で４日間静置保存した。その結果、直方体の透明なヒアルロン酸ゲルが得られた。
【００３０】
実施例７
実施例６に於いて、ヒアルロン酸濃度が５重量％になるように１Ｎの塩酸を１９００ｍｇ含浸させた後、５℃に設定した冷蔵庫に６日間静置保存した。その結果、直方体の透明なヒアルロン酸ゲルが得られた。
【００３１】
比較例１
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムの粉末を、ヒアルロン酸ゲルの溶解性試験に用いた。
【００３２】
比較例２
分子量が２×１０6 ダルトンのヒアルロン酸ナトリウムの粉末を３００ｋｇｆ／ｃｍ2 で３分間加圧し、直方体の成型物を得た。該成型物をヒアルロン酸ゲルの溶解性試験に用いた。
【００３３】
比較例３
実施例４に於いて、１Ｎの塩酸の代わりに蒸留水を用いて同様の操作を行った。その結果、透明なヒアルロン酸ゲル状の溶液が得られた。該ヒアルロン酸溶液をヒアルロン酸ゲルの溶解性試験に用いた。
【００３４】
実施例６
ヒアルロン酸ゲルの溶解性試験
生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水を調製した。上記の実施例で得られたヒアルロン酸ゲルを、乾燥重量で１０ｍｇのヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ゲルに対して、５０ｍｌのリン酸緩衝生理的食塩水の割合で、リン酸緩衝生理的食塩水中に浸漬した。また、比較例の各形態のヒアルロン酸も、乾燥重量で１０ｍｇを５０ｍｌのリン酸緩衝生理的食塩水中に浸漬した。そして、２５℃で撹拌下のリン酸緩衝生理的食塩水中に溶出するヒアルロン酸の割合を、リン酸緩衝生理的食塩水中のヒアルロン酸濃度から求めた。
従って、中性の２５℃の水溶液中でのヒアルロン酸ゲルの溶解性は、上記試験により規定されるものである。
【００３５】
ヒアルロン酸濃度の測定
リン酸緩衝生理的食塩水中のヒアルロン酸の濃度は、ＧＰＣを使って、示差屈折率検出器のピーク面積から求めた。
【００３６】
上記に従い、具体的に実施例１〜７及び比較例１〜３のヒアルロン酸ゲルの溶解性試験を行った。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
例えば、実験Ｎｏ．１の実施例１で得られたヒアルロン酸ゲルの溶解率を調べると、１日経過後では６％の溶解率であり、３日経過後では１０％の溶解率であり、７日経過後では２０％の溶解率であり、更に１４日経過後では５６％の溶解率であった。即ち、１日経過後は９０％以上のヒアルロン酸ゲルが残存していたが、１４日後には５０％以下しか残存していない。一方、実験Ｎｏ．５の実施例５で得られたヒアルロン酸ゲルの溶解率を調べると、１日経過後では１５％の溶解率であり、３日経過後では６１％の溶解率であり、更に７日経過後では１００％の溶解率であり、ヒアルロン酸ゲルは全て溶解している。そして、ヒアルロン酸ゲルの溶解率は、時間にほぼ比例して増加している。
それに対して、実験Ｎｏ．８の比較例１でのヒアルロン酸粉末の溶解率は、１日経過後で１００％の溶解率であり、完全に溶解した。
よって、比較例（実験Ｎｏ．８〜１０）で得られたヒアルロン酸ゲル状の溶液は水中での溶解速度が極めて速いのに対して、本願発明のヒアルロン酸ゲル（例えば、実験Ｎｏ．１〜７）は水中の溶解速度が遅く、また、任意の溶解速度を有することが見出された。そして、実施例１〜５に示すように、ｐＨ２〜３．５の酸性ヒアルロン酸水溶液を凍結し、次いで解凍することによって、上記のような溶解速度が制御されたヒアルロン酸ゲルが得られることが示唆された。
【００３９】
【発明の効果】
以上、本発明によれば、ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かしつつ、生体内での滞留時間が所望に調節されたヒアルロン酸ゲルを提供することができる。本発明のヒアルロン酸ゲルにより、例えば癒着防止の用途に於いて、手術部位によって所望の生体内滞留時間を有するものを選択することができるようになる。