(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルカトニンを有効成分とする腫瘍の軟部臓器転移抑制剤。
【請求項２】
腫瘍転移抑制剤が、注射剤、直腸座剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤または経口投与剤である請求項１記載の腫瘍転移抑制剤。
【請求項３】
エルカトニンが、血清カルシウム値低下作用を指標として生物学的測定法で定量された０．５〜５０００単位のカルシトニン活性を有する請求項１記載の腫瘍転移抑制剤。
【請求項４】
１日あたりエルカトニン０．５〜５０００単位が、毎日または週１〜３回投与されるための請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルシトニン類を有効成分とする腫瘍の軟部臓器転移抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍の原発巣での増殖に伴い、他の軟部臓器、及び骨への転移を起こすことが知られており、抗癌剤によりこの増殖及び転移を抑制する事で患者の助命およびＱＯＬの改善がもたらされる。癌の増殖、転移抑制に関しては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、免疫腑活剤、抗癌性抗生物質等の抗癌剤が用いられており、治療効果を奏するものの、血液毒性、心臓毒性、肝臓毒性等、多くの重篤な副作用が懸念されている（日本医事新報；Ｖｏｌ．３７４０,３（１９９５））。また骨への転移に関してはビスフォスフォネート系製剤での治療効果が報告されているものの確証は得られていない。
【０００３】
カルシトニン類の腫瘍転移抑制作用に関しては、前立腺癌による骨転移をＰＴＨ拮抗作用により防止した報告（ｉｎ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  １９８０；２９５（１９８０））があり、骨転移に伴う骨破壊に対する適応も考えられてきた（Ｔｈｅ  Ｂｏｎｅ；Ｖｏｌ．１０，１２５（１９９６））。また骨転移後の骨転移巣に対しては、甲状腺癌後、骨転移した症例で甲状腺ホルモンとカルシトニン（エルカトニン）を投与して転移巣の腫瘤の消退と骨欠損部への石灰化による改善が認められ（ホルモンと臨床；Ｖｏｌ．３４（増刊号），１７４（１９８６））、また、尿管癌で血中カルシウム濃度が上昇したため、エルカトニンとプレドニゾロンを投与したが、結果的に血中カルシウム濃度は下がらなかったが、骨転移もなかった（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｖｏｌ．３３，１０７（１９９４）ことが報告されており、またこれらの症例では抗癌剤で懸念されている重篤な副作用は認められていない。
【０００４】
カルシトニン類は、１９６２年Ｃｏｐｐらにより発見された血清カルシウム低下ホルモンであり（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌ．７０，６３８（１９６３））、骨ページェット病（日整形学誌；Ｖｏｌ；５８，９３７（１９７９））、骨粗鬆症（綜合臨床；Ｖｏｌ．３９，３６２３（１９９０））、高カルシウム血症（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂ．；Ｖｏｌ．６，９３（１９８８））などの治療剤として有効性が確立され、低毒性の薬剤として臨床的に使用されている。また、腎臓に対してはナトリウム、リンなどの電解質排泄促進作用（Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．；Ｖｏｌ．２４６，９２７（１９８４））、胃に対して胃液分泌抑制作用（Ａｃｕｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（Ｓｕｐｐｌ）；Ｖｏｌ．１５５，２１６（１９７１））、膵臓に対して外分泌抑制作用（Ｇｕｔ；Ｖｏｌ．１８，６１５（１９７７））、骨粗鬆症の疼痛に対して鎮痛作用（Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ；Ｖｏｌ．４１，１２１（１９９４））などが知られている。
【０００５】
これらの作用は、各種標的細胞に存在するカルシトニンレセプターを介してシグナルを与えることによるものと考えられ、破骨細胞に対してはプロテインキナーゼＣを活性化するホスホリパーゼＣ経路を介して細胞内に情報を伝えることが示され（Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｖｏｌ．２５１，１０７８（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ；Ｖｏｌ．９１，２１１５（１９９１））、この作用により破骨細胞の運動性が調節を受け（Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．；Ｖｏｌ．１２６，４７３（１９９０））骨吸収を抑制することが考えられている。また、腫瘍細胞においてもカルシトニンレセプターの存在が報告されており（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌ．１３６，５３７７（１９９５））、腫瘍細胞に対する調節機能が予想される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、低毒性で重篤な副作用を有しないカルシトニン類による腫瘍の軟部臓器への転移抑制方法を提供し、肺、肝臓等の生命維持のために必須な臓器での腫瘍の増殖を抑制することで延命効果をもたらすことを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、全く意外にもカルシトニン類が、腫瘍の軟部臓器への転移抑制に対して有効であることを見出した。すなわち培養腫瘍細胞を皮下に接種したモデル系において、カルシトニン類は軟部臓器への転移を抑制し、延命効果をもたらした。
本物質の腫瘍転移抑制効果は、腫瘍細胞４Ｔ１をＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に接種し、これにカルシトニン１単位を毎日投与すると肝臓、肺への転移が著明に抑制され、延命効果がもたらされた。本発明は上記の知見に基づいてなされたものであり、カルシトニン類を有効成分とする腫瘍転移抑制剤である。
【０００８】
本発明におけるカルシトニン類とは、少なくともカルシトニンレセプターに対する結合能を有するペプチドホルモンであればいずれでもよく、その一部は臨床的に高カルシウム血症、骨ページェット病や骨粗鬆症に対する治療薬として使用されており、天然型カルシトニンまたはそのアナログペプチドが挙げられる。
天然型カルシトニンの例としては、ウナギカルシトニン、サケカルシトニン、ブタカルシトニン、ニワトリカルシトニン、ヒトカルシトニン等が挙げられる。またそのアナログペプチドの例としては、カルシトニン類の構造に基づいてその１，７位のジスルフィド結合をアミノスベリン酸にてエチレン結合に置換した合成誘導体が挙げられ、例えばエルカトニン（〔Ａｓｕ1.7〕ウナギカルシトニン、）、〔Ａｓｕ1.7〕ヒトカルシトニン、〔Ａｓｕ1.7〕サケカルシトニン、〔Ａｓｕ1.7〕ニワトリカルシトニン、〔Ａｓｕ1.7〕ブタカルシトニンなどが知られており、これらの物質や合成法については、英国特許第１５１６９４７号明細書などに記載されている。上記以外のカルシトニン類についても少なくともカルシトニンレセプターに対する結合能を有するペプチドホルモンであれば、本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
カルシトニン類が、ラットの血清カルシウム値低下作用を指標とした生物学的測定法（第十三改正日本薬局方第二追補,２７（１９９９））で定量された０．５〜５０００単位のカルシトニン活性を有していれば、本発明の範囲に含まれる。
これらのカルシトニン類は、極めて低毒性であり、例えばエルカトニンをマウス、及びラットに静脈内、筋肉内、皮下、経口の各経路で１３００または７４００単位／ｋｇ（体重）投与しても致死的毒性は全く観察されなかった。本発明における薬剤の形態としては、例えば注射剤、直腸吸収剤、膣吸収剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤、経口投与剤などが挙げられ、これらの投与形態は何ら限定されるものではない。
【００１０】
注射剤としては好ましくは筋肉内投与または、静脈内投与のために使用されるもので、直腸吸収剤・膣吸収剤は一般に坐剤の形態で使用され、経鼻吸収剤・経皮吸収剤は適当な吸収促進剤を添加した製剤の形態で使用され、経肺吸収剤は適当な分散剤もしくは水、及び噴射剤を含有するエアゾール組成物の形態で使用される。口腔内吸収剤は適当な吸収促進剤を添加して例えば舌下錠などの形態で使用され、また経口投与剤はリポゾーム製剤、マイクロカプセル製剤などの経口用としての形態で使用される。
【００１１】
これらの薬剤は通常のそれぞれの薬剤形態に適した剤型に調整される。注射剤は、例えばエルカトニンを緩衝剤、等張化剤、ｐＨ調整剤を適量溶解した注射用蒸留水に溶解し、除菌フィルターを通して滅菌したものをアンプルに分注することによって調整され得る。直腸吸収剤、膣吸収剤は、例えばエルカトニンをベクチン酸ナトリウムやアルギン酸ナトリウムなどのキレート能を有する吸収促進剤、塩化ナトリウムやグルコースなどの高張化剤を適宜選択使用して、蒸留水または油性ビヒクルに溶解または分散して直腸・膣注入坐剤又は坐剤として調整される（英国特許第２０９２００２号明細書、同第２０９５９９４号明細書参照）。
【００１２】
経鼻吸収剤は、例えばエルカトニンに水溶性有機酸であるグルクロン酸、コハク酸、酒石酸などの吸収促進剤を添加した液剤あるいは粉末剤として調整される（特開昭６３−２４３０３３号公報、特開昭６３−３１６７３７号公報、特開平１−２３０５３０号公報、特開平２−１１１号公報、特開平２−１０４５３１号公報）。更に、エルカトニンに適宜乳剤を加えて経鼻吸収剤を得ることもできる（特開平４−９９７２９号公報）。
【００１３】
経皮吸収剤は、例えばサケカルシトニンにエーゾン（Ａｚｏｎｅ）などの吸収促進剤を添加して皮膚からの吸収を促進させる方法が報告されている（日本薬剤学会第２年会、講演要旨集ｐ５７−５８）し、またイオントフォレーシスによる方法（Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．；Ｖｏｌ．５０７，３２（１９８８））でカルシトニン類の経皮吸収剤を得てもよい。
経肺吸収剤は、カルシトニン類を例えばアルラセル、スパン８０などの分散剤と共に粉砕研和して均質なペーストとし、次いでこのペーストを冷却したフレオン１１、フレオン１２などの噴射剤中に分散させた後、弁を備えた容器に充填して得る方法がある（特開昭６０−１６１９２４号公報）。
【００１４】
口腔内吸収剤は、カルシトニン類に例えばアスコルビン酸類、酸性アミノ酸類、クエン酸類、不飽和脂肪酸類、サリチル酸類などを単独、あるいは２種類以上を組合せ、グルコースなどの賦形剤、メントールなどの矯味矯臭剤などを添加してトローチ剤、舌下錠、粉末剤などとして得ることができる（特開昭５６−１４０９２４号公報）。
経口投与剤は、例えばＷ／Ｏ／Ｗエマルジョンを用いた方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｊａｐａｎ；Ｖｏｌ．２３，４９３（１９７６））でカルシトニン類を調剤してもよいし、またリポゾーム製剤の方法（Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓ．；Ｖｏｌ．１６，２４９（１９８２））でカルシトニン類を調剤してもよい。
【００１５】
このような薬剤は、例えばエルカトニンの注射剤の場合、エルカトニンの１回投与量としては０．５〜５０００単位投与され、好ましくは１〜４００単位である。その他の製剤、その他のカルシトニン類の場合も、エルカトニンの力価単位に準じて投与すればよい。なお投与回数は１日、１〜２回でもよく、また毎日または週１〜３回であってもよい。更に、ソリタＴ−３などの適当な輸液にカルシトニン類を適量溶解して、例えば１〜数時間かけて静脈内に点滴投与してもよい。薬剤中におけるカルシトニン類の量は適宜決められるが、要は１回投与当たりカルシトニン活性において注射剤の０．５〜５０００単位の相当量に定めれば充分である。
このようにして製造・調整されたカルシトニン類は以下の実施例に示す通り、極めて良好に腫瘍の転移を抑制せしめ、腫瘍転移抑制剤として有用なものである。
【００１６】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、図および表中における略語は次の用語を意味する。
ｅＣＴ；Ｅｌｃａｔｏｎｉｎ
【実施例１】
マウス乳癌細胞、４Ｔ１細胞を１０ｃｍ細胞培養ディッシュに播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ；以下、ＦＣＳという）を添加したダルベッコ変法最少必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下、ＤＭＥＭという）中においてサブコンフルエントの状態になるまで培養した。培養後リン酸緩衝生理食塩水にて２回洗浄し、細胞溶解液（４Ｍ グアニジンチオシアン酸、０．５％ ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））０．８ｍｌにて溶解、回収後、１／１０量の１．６６Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）、等量のＰＣＩ液（水飽和フェノール５０：クロロホルム４９：イソアミルアルコール１）を加え、攪拌後、遠心分離した。上清の水層を回収し、０．８ｍｌのイソプロピルアルコールを加え、攪拌後、−３０℃に保存した。生じた沈殿を遠心沈降させ、０．８ｍｌの細胞溶解液にて再び溶解し、等量のイソプロピルアルコールを加え、攪拌後、−３０℃に保存した。
【００１７】
再び生じた沈殿を遠心にて沈降させ、８０％エタノール溶液にてリンスし、風乾させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ エチレンジアミン４酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ；以下ＥＤＴＡ、という）（ｐＨ ８．０）の緩衝溶液にて溶解し、これをＲＮＡ溶液として逆転写反応に用いた。逆転写反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．３)、７５ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ ジチオトレイトール、３ｍＭ 塩化マグネシウム、および、１０ｎＭ デオキシアデノシン三リン酸、１０ｎＭ デオキシチミジン三リン酸、１０ｎＭ デオキシシチジン三リン酸、１０ｎＭ デオキシグアノシン三リン酸（以下、この四塩基の混合物をｄＮＴＰ ｍｉｘという））に総ＲＮＡ，および，ランダムプライマー（ギブコＵＲＬ）２００ｎｇを加え、７０℃１０分間加温の後，氷中にて急冷し、ＲＮＡおよびランダムプライマーを変成させた。ここにＭＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ）を２００ユニット加え、３７℃にて１時間インキュベートし、逆転写反応を行った。
【００１８】
ＰＣＲ反応溶液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣl (ｐＨ９．１)、１８ｍＭ 硫酸アンモニウム、１．６ｍＭ 硫酸マグネシウム、１０ｎＭ  ｄＮＴＰ ｍｉｘ）にマウスカルシトニン受容体特異的プライマー（センス；５’ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＴＴＧＴＧ ＣＣＣ ＡＡＴ ＧＧＡ−３’アンチセンス；５’ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＡＡＴＧＡ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＡＧ−３’２０ｐｍｏｌｓ、逆転写反応溶液（総ＲＮＡ ５０ｎｇ相当）、およびＥｌｏｎｇａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（ＧＩＢＣＯ）を１ユニット加え、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲ、という）反応を行った。反応は、始めに９４℃で３分間の熱変性の後、９４℃ １０秒、５７℃ ３０秒、６８℃ １分の反応を３５サイクル行ない、その後６８℃１０分の伸長反応を行った。反応の終了したＰＣＲ反応溶液の１／５量をエチジウムブロマイド含有の１％アガロースゲルに展開し、増幅されたＤＮＡ断片を検索することでカルシトニンレセプターの発現を確認した。
【００１９】
その結果４Ｔ１細胞においては図１に示す通り、コントロールとしておいたマウスの腎臓、脳および成長板軟骨の組織と同様にＣ１ａタイプのカルシトニンレセプター発現が確認され、カルシトニン類が腫瘍細胞に対して直接作用をもたらす可能性が示唆された。
【００２０】
【実施例２】
４Ｔ１細胞を２４穴プレートに、１万細胞個／ｗｅｌｌの密度で播種し、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ；以下ＢＳＡ、という）を含むクエン酸緩衝液にて希釈した各濃度のエルカトニンを播種当日から添加し単層培養に及ぼす効果を確認した。培地は毎日交換し、５日間培養後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水にて２回洗浄、０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤTＡにて回収し、その細胞数を血球計算板上において計測した。その結果は図２に示す通りに１０-10モル濃度（０．０２単位／ｍｌ相当）以上で細胞の増殖を抑制した。
【００２１】
また５％子牛血清および５％ FＣＳを含むＤＭＥＭで希釈した４Ｔ１細胞を、０．３％軟寒天中に懸濁し、２４穴プレートに１０００細胞個／ｗｅｌｌになるように播種した。寒天がゲル化した後、各濃度のエルカトニンを軟寒天上に添加し、培養７日目にも、同様にエルカトニンを添加した。この際培養１４日目に、５０個以上の細胞からなるコロニーの数を位相差顕微鏡下にて計測した。その結果は図３に示す通り、エルカトニン１０-10モル濃度以上で細胞の増殖を抑制した。
これらのことはエルカトニンが直接腫瘍細胞に対して増殖抑制作用をもたらしていることを示し、このことが軟部臓器への転移抑制剤として作用する少なくとも一つのメカニズムであることを示唆している。
【００２２】
【実施例３】
６週齢メスＢａｌｂ／ｃマウス（体重約２０ｇ）の右乳房部の皮下に、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した４Ｔ１細胞を１００万細胞個／個体で移植した。１週間後、原発腫瘍が形成されるのを確認した後、エルカトニン１単位を、０．１％ＢＳＡを含むクエン酸緩衝液に溶解し腹腔内に毎日投与した。コントロール群には、０．１％ＢＳＡを含むクエン酸緩衝液のみを投与した。
移植２０日目にマウスを屠殺し、肺および肝臓のルシフェラーゼ活性を計測し、臓器湿重量当りのルシフェラーゼ活性によって腫瘍の臓器への転移抑制効果を評価した。なお、ルシフェラーゼ活性はＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｔｅｒ Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ケミルミノメーターにて測定した。その結果は図４に示す通り、著明に臓器への転移を抑制するものであった。
【００２３】
【実験例４】
６週齢メスＢａｌｂ／ｃマウス（体重約２０ｇ）の右乳房部の皮下に、４Ｔ１細胞を１００万細胞個／個体で移植し、１週間後、原発腫瘍が形成されるのを確認した後、エルカトニン１単位を、０．１％ＢＳＡを含むクエン酸緩衝液に溶解しマウスの腹腔内に毎日投与した。コントロール群には、０．１％ＢＳＡを含むクエン酸緩衝液のみを投与した。マウスの生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存率曲線により評価したところ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定において図５に示す如く、両群に有意差が認められ、エルカトニンの延命効果が確認された。
【００２４】
【発明の効果】
以上のことから本発明は、カルシトニン類が腫瘍の転移を抑制し、さらには延命に対して効果を発揮しうることを示したものであり、かつカルシトニン類が低毒性であることからも、予防の範囲を含む有用な腫瘍転移抑制剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】４Ｔ１細胞のカルシトニンレセプターの発現を示すものである。
【図２】４Ｔ１細胞の単層培養における増殖に及ぼすエルカトニンの抑制効果を示すものである。
【図３】４Ｔ１細胞の軟寒天中における増殖に及ぼすエルカトニンの抑制効果を示すものである。
【図４】４Ｔ１細胞の臓器転移に及ぼすエルカトニンの抑制効果を示すものである。
【図５】エルカトニンの４Ｔ１細胞臓器転移抑制による延命効果を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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