(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とするセロトニン再吸収阻害剤。
【請求項２】
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とするセロトニン放出促進剤。
【請求項３】
ケール、プロポリス又はそれらの抽出物を含有することを特徴とするセロトニン受容体拮抗剤。
【請求項４】
ケール、プロポリス又はそれらの抽出物を含有することを特徴とするセロトニントランスポーター受容体結合阻害剤。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれかに記載の剤を含有するセロトニン再吸収阻害、セロトニン放出促進、セロトニン受容体拮抗及びセロトニントランスポーター受容体結合阻害のための経口用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、セロトニンが関与する疾患、特にセロトニン１Ａ受容体、及びセロトニン再吸収に関する障害により引き起こされる疾患に有用な組成物及びそれらを含有する経口又は非経口組成物に関する。
【０００２】
【従来技術】
現代は、社会の高度化、複雑化に伴い、ストレス時代となっている。ストレスの蓄積や過度のストレスによって、不眠、接食障害や鬱病などの疾患が増加しており、深刻な問題となっている。鬱病については、最近では「心の風邪」といわれるほど極めて身近なものになっている。鬱病と関係しているものの一つに、セロトニンという神経伝達物質がある。セロトニン（ ５−ヒドロキシトリプタミン；5―HT）はヒト体内において、中央神経系、腸管壁、血管などに存在しており、記憶、睡眠、血小板のホメオスタシスや筋肉収縮など様々な薬理作用を果たしている。脳内のセロトニンが不足すると、鬱病や記憶障害、過食症、ニコチンやアルコール依存症などを誘因するといわれている。
【０００３】
脳は、化学伝達物質を介して互いに伝達する多くのニューロンから成る。各ニューロンは、ニューロンの細胞膜上でレセプター（受容体）と呼ばれる部位で作用する神経化学物質又は神経伝達物質を生じる。セロトニンは、ポストシナプスレセプター活性を刺激するために、ニューロン間のシナプス間隙に放出される。モノアミン神経伝達物質の除去（又は不活性化）は、主にプレシナプス末端への再吸収メカニズムによって起こる。再吸収には、セロトニントランスポーターが関与しており、これにセロトニンが結合するのを阻害することによってセロトニンの生理学的活性の増加が生じる。
【０００４】
上記疾患の治療剤には、トランスポーターに結合しセロトニンの再吸収を阻害するものやプレシナプスからセロトニンの放出を促進させるものなどがある。しかしこれらの多くは、副作用を伴うことや効果がでるまでに時間を要することなどが問題となっている。そこで、安定性、安全性があり価格の面でも問題のないセロトニン再吸収阻害剤やセロトニン放出促進剤が必要とされている。これまでに、乳酸菌発酵乳などが脳内セロトニン濃度を高めること（特開平9−23848）や、Mesembryanthemaceae科の植物がセロトニン吸収阻害作用を有すること（特表2000−511896）などが報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安定性、安全性、価格に優れたセロトニンの再吸収阻害及び放出促進剤、それらを含有する組成物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ケール及びプロポリスがセロトニン1A受容体、トランスポーター受容体に親和性を有し、セロトニン再吸収阻害さらにはセロトニン放出促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とするセロトニン再吸収阻害剤、
ケール又はその抽出物を含有することを特徴とするセロトニン放出促進剤、
ケール、プロポリス又はそれらの抽出物を含有することを特徴とするセロトニン受容体拮抗剤
ケール、プロポリス又はそれらの抽出物を含有することを特徴とするセロトニントランスポーター受容体結合阻害剤、
1〜4のいずれかに記載の剤を含有するセロトニン再吸収阻害、セロトニン放出促進、セロトニン受容体拮抗及びセロトニントランスポーター受容体結合阻害のための経口用医薬組成物、
に関する。
【０００８】
【発明の実施形態】
本発明で使用されるケール（Brassicca Oleracea L.var.acephala DC.）には、キッチンケール、マローケール、ブッシュケール、ツリーケール、コラード、緑藻カンランなどがある。アブラナ科の植物でもともと南ヨーロッパ原産の野菜であり、キャベツの原種といわれている。葉など通常食用として供されているもので構わないし、栽培方法や栽培地も特に限定されるものでもない。
【０００９】
ケール、その抽出物としては、ケール自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、圧搾汁、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全てを含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００１０】
例えば、ケールの葉、茎、花や根などの乾燥物1Kgに99.5％エタノール抽出液3Lを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液を、そのままセロトニン再吸収阻害又は放出促進剤として使用しても良いし、その抽出液を各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００１１】
プロポリスは、蜂が集めた樹脂状の黒い塊であり、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリス、オーストラリア産プロポリス、ウルグアイ産プロポリス、日本産プロポリスなど何れの産地のものでもよく、特に限定されるものではないが、汎用性の面から見て、ブラジル産プロポリス、中国産プロポリスが好ましい。
【００１２】
本発明におけるプロポリスは、プロポリス自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、超臨界抽出物、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、全てを含む。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００１３】
例えば、ブラジル産プロポリスの原塊乾燥物１Kgに99.5％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た抽出液を、そのまま使用しても良いし、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製したものを使用しても良い。
【００１４】
抽出されたケール、プロポリス抽出物の溶液中のケール、プロポリス抽出物濃度は特に制限はないが、１５〜７０重量％、好ましくは２０〜６０重量％程度が好ましい。この濃度が１５重量％未満では、乾燥時に多量のエタノールや水などの溶液を蒸発させる必要があり、７０重量％を超えると溶液の粘度が高くなり過ぎ、加工適性が悪くなる恐れがある。
【００１５】
ケール、プロポリス又はその抽出物は、セロトニン１Ａ受容体に対して拮抗作用を有し、セロトニントランスポーター受容体の結合阻害作用を有する。セロトニン１Ａ受容体は、細胞体に局在する自己受容体で、セロトニン神経活動を抑制し、セロトニン症候群と呼ばれる行動変化（振せん、筋剛直、異常姿勢、異常運動など）に関連する。セロトニントランスポーターは、神経細胞へのセロトニンの高親和性取り込みに関与し、セロトニントランスポーターにセロトニンが結合するのを阻害することによってセロトニンの生理学的活性の増加が生じる。ケール又はその抽出物は、セロトニンの再吸収を阻害し、セロトニンの放出を促進する。ケール、プロポリス又はその抽出物は、脳内のセロトニンの不足がその誘因であるといわれる鬱病、記憶障害、過食症、ニコチンやアルコール依存症のようなセロトニンの関与する疾病の予防、治療に有用である。
【００１６】
本発明のケール、プロポリス又はその抽出物を含有するセロトニン再吸収阻害又は放出促進作用を有する組成物は、経口用の食品、経口用あるいは非経口用の医薬として製造することができる。
【００１７】
医薬としての適用方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００１８】
食品としては、ケール、プロポリスの乾燥物又は抽出物などをそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、セロトニンの関与する疾患の治療及び予防に有用な保健用食品又は食品素材として使用できる。例えば、澱粉、乳糖、麦芽糖、植物油脂粉末、カカオ脂末、ステアリン酸などの適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。本発明の配合量は、当該食用組成物の種類や状態等により適宜設定される。
【００１９】
本発明のケール、プロポリス又はそれらの抽出物の有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態などにより、適宜決定することができ、例えば、ケール抽出物の経口投与の場合、乾燥重量として、通常成人換算で0.1g/体重kg以上である。１日に数回に分けて投与してもよい。プロポリス抽出物の経口投与の場合、一般に１日当たり10〜500ｍg/kg体重程度、好ましくは、１日当たり150〜350mg/kg体重程度とされ、１日に数回に分けて投与してもよい。
【００２０】
本発明のケール、プロポリス又はその抽出物は、天然物であるためその毒性は低く、有害な副作用など報告されていない。また、ケールは栽培により入手できる野菜類であるから、ケール、ケール抽出物を有効成分とする本発明の組成物は、安全であるとともに、価格面においても問題のない優れたものである。また、プロポリスは日本を始め世界中で健康補助食品として一般に利用されていることから、プロポリス、プロポリス抽出物を有効成分とする本発明の組成物は、安全であるとともに、価格面においても問題のない優れたものである。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【００２２】
（製造例１）ケール抽出物
ケールの葉を90℃で乾燥させ、苦みの渋味成分となる酵素を失活させた。その粉砕物４kgを電熱式水浴機で加熱還流しながら、99.5％エタノール（和光純薬工業）20Ｌを用いて抽出を行い、ケール抽出物80ｇを得た。
【００２３】
（製造例２）プロポリス抽出物
ブラジル産及び中国産プロポリス原塊それぞれ10gに99.5％エタノール3Lを加え、50℃で一晩浸漬した後、ロータリーエバポレーターにてエタノールを除去することにより、プロポリス抽出物をそれぞれ324mg、216mgを得た。
【００２４】
（試験１）［セロトニン受容体結合阻害試験］
セロトニン受容体結合阻害試験は、Janet G.Mulheronらの方法（The Jornal of biological chemistry,269,17,1994）を参考に行った。バキュロウィルスSF9細胞にヒトセロトニン受容体を発現させ、これを実験に用いた。既存の方法に従って調製した膜は、湿重量に対して４０倍量の ５０mM Tris-HCl (pH7.4) を加え、氷浴中にて Teflon-glass homogenizer を用いてホモジナイズ (3分、1 stroke/ 分) し、その後遠心分離（37,000 × g、20分、4℃）した。得られた沈渣を氷冷緩衝液［ 50 mM Tris-HCl (pH7.4)］で再懸濁し、ポジティブコントロールである[3H]8-OH-DPAT（８−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン臭化水素酸塩）と製造例で得られたケール抽出物又はブラジル産プロポリス抽出物を表に示した濃度で添加した。室温で60分間反応させた後、ガラス繊維濾紙上に速やかに低圧吸引濾過した。それから、濾紙上に残存した受容体結合放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。結果を表１に示す。ここで示す阻害率とは、8-OH-DPATの作用を抑制する割合である。なお、8-OH-DPATのIC50値（セロトニン受容体結合を50％阻害する濃度）は、0.47 nMであった。表１に示したように、本発明のケール抽出物及びプロポリス抽出物に、セロトニン1A受容体結合阻害作用を有することがわかる。
【００２５】
【表１】
0004439788.tif 000002
【００２６】
（試験２）［セロトニントランスポーター受容体結合阻害試験］
セロトニントランスポーター受容体結合阻害試験は、Tatsumiらの方法を参考に行った（European Journal of Pharmacology 340,249-258,1997）。ヒトセロトニントランスポーターcDNAをpRc/CMVベクターに発現させ、HEK239細胞にトランスフェクションした。それから既存の方法に従って細胞膜を調製し、50 mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、120 mM塩化ナトリウム、5 mM 塩化カリウム、を含む緩衝液（pH7.4）で懸濁した。これに製造例で得られたケール抽出物又はプロポリス抽出物（ブラジル産及び中国産）を表に示した濃度で添加し、セロトニントランスポーター阻害剤である[3H]イミプラミンを添加し、22℃で30分間インキュベートした。それから、0.2％のポリエチレンイミン浸漬のGF/Bフィルターで濾過し、反応を停止した。フィルター上の放射活性は、液体シンチレーションカウンターによって測定した。結果を表２に示す。ここで示す抑制率とは、イミプラミンのセロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を抑制する割合である。なお、イミプラミンのIC50値（セロトニントランスポーター受容体結合を50％阻害する濃度）は、5.8 nMであった。表２に示したように、本発明のケール抽出物及びプロポリス抽出物は、イミプラミンのセロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を競合的に抑制すること、すなわち、セロトニントランスポーター受容体結合阻害作用を有することがわかる。
【００２７】
【表２】
0004439788.tif 000003
【００２８】
（試験３）［セロトニンの再吸収阻害試験］
セロトニンの再吸収阻害試験は、S.Perovicらの方法（Arzneim.-Forsch./Drug Res. 45 (II),11,1995）を参考に行った。断頭により殺した220−250 gのラットの脳から、シナプトソームを調製した。氷浴中にて脳皮質を湿重量に対して20倍量の0.32 Mのショ糖液で、ホモジナイズし、遠心（1000 × g、10分、4℃）を行った。得られたシナプトソーム画分をリン酸緩衝液で懸濁して、製造例で得られたケール抽出物を表に示した濃度で加え、30℃で5分間プレインキュベートした。リン酸緩衝液の組成は、1.2 mMリン酸二水素ナトリウム、25 mM 炭酸水素ナトリウム、118 mM 塩化ナトリウム、5 mM 塩化カリウム、2.5 mM 硫酸マグネシウム、50 μM アスコルビン酸、10 μM EGTA［エチレングリコールビス（2−アミノエチルエーテル）四酢酸］、11 mM グルコースである。その後、5μMの［3H］−セロトニンを加え、全量1 mlとし、37℃で20分間インキュベートを行った。反応は冷リン酸緩衝液を加え停止し、直ちにGF/Bフィルターで濾過した。フィルター上の放射活性は、液体シンチレーションカウンターによって測定した。結果を表３に示す。ここで示す阻害率とは、［100−（サンプルを添加した時の［3H］−セロトニン取り込み量）／（緩衝液のみのコントロールの［3H］−セロトニン取り込み量）×100］である。なお、本実験系でのポジティブコントロールであるイミプラミンのIC50値（セロトニン再吸収を50％阻害する濃度）は、0.024 μMであった。表３に示したように、本発明のケール抽出物に、セロトニン再吸収阻害作用を有することがわかる。
【００２９】
【表３】
0004439788.tif 000004
【００３０】
（試験４）［セロトニンの放出作用試験］
セロトニンの放出作用をみる実験系は、Giambattistaらの方法を参考に行った（Jornal of Neurochemistry, 63 (3),1163-1166,1994）。ラット大脳皮質より、既存の方法に従って粗シナプトソーム画分を調製し、以下の緩衝液で懸濁した。緩衝液の組成は、1.2 mM 塩化カルシウム、1.2 mM 塩化マグネシウム、1 mMリン酸二水素ナトリウム、25 mM 炭酸水素ナトリウム、125 mM 塩化ナトリウム、3 mM 塩化カリウム、22 mM炭酸水素ナトリウム、10 mMグルコースである。得られたシナプトソームに、0.08 μM［3H］―セロトニンを添加し、37℃で15分間インキュベートした。その後、ケール抽出物を表に示した濃度で加え、37℃で95％O2、5％CO2条件下において潅流を行い、最後にシナプトソームの放射活性を測定した。結果を表４に示す。誘発率とは、［100−（緩衝液のみのコントロールの［3H］−セロトニン放出量）／（サンプルを添加した時の［3H］−セロトニン放出量）×100］である。なお、本実験系でのポジティブコントロールであるフェンフルラミンのEC50値（セロトニン放出を50％促進する有効濃度）は、0.028 μΜであった。表４に示したように、本発明のケール抽出物は、セロトニン放出促進作用を有することがわかる。
【００３１】
【表４】
0004439788.tif 000005
【００３２】
（処方例1）[飼料の製造]
製造例で得られたケールのエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の飼料を製造した。
0004439788.tif 000006
【００３３】
この飼料を被験品として、二重盲検を実施し、脳内のセロトニン濃度への効果を検討することができる。雄のウィスター系3週令ラットを被験品摂取群とプラセボ摂取群に分け、１０週間飼育を行う。プラセボの成分としては、スターチを増量して、100％とした。飼育後既存の方法に従って脳内のセロトニン濃度を測定する。
【００３４】
（処方例２）[錠剤の製造]
製造例２で得られたブラジル産プロポリスのエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
0004439788.tif 000007
【００３５】
この錠剤を用いて、二重盲検を実施することにより、食欲の低下作用の効果を検討することができる。10時間程度絶食した健康な被験者を対象に、被験品摂取群とプラセボ摂取群に分け、各々５粒摂取する。プラセボの成分としては、乳糖を増量して、錠剤全体を100％とする。錠剤服用後の空腹感の有無、食事における飽満感などを指標として評価を行う。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のケール及びプロポリス、その抽出物は、セロトニン再吸収阻害及び放出促進作用を有し、鬱病、記憶障害、依存症や過食症などのセロトニンが関与していると考えられている疾患に使用することができる。