(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1のTat49-57ペプチドまたは配列番号：1のTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲート。
【請求項２】
生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(バレロラクトン)、ポリ(ヒドロキシブチレート)、ポリ(ヒドロキシバレレート)、ポリ(1,4-ジオキサン-2-オン)、ポリ(オルトエステル)、およびこれらの重合体に相当する単量体から製造された共重合体からなる群より選択される少なくとも一つの重合体である、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項３】
生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)、およびポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸) からなる群より選択される少なくとも一つの重合体である、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項４】
生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の重量平均分子量が500〜100,000である、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項５】
Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖(A)、および生分解性脂肪族ポリエステル系重合体(B)がA-B型またはA-B-A型として構成される、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項６】
Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体との間に塩基、リンカー、またはマルチリガンド化合物が付加される、請求項1記載のコンジュゲート。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲートを使用して製造されるナノ粒子。
【請求項８】
平均粒径が1,000nm以下である請求項7記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はTat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲート、およびこれを使用して製造されるナノ粒子に関する。本明細書で用いられる「Tat49-57ペプチド」という用語は、配列番号：1のアミノ酸配列を有するペプチドを指す。
【０００２】
【従来の技術】
最近ナノ粒子を利用した薬物送達システムの有用性が取沙汰されており、重合体の多様な合成経路を通じて効果的なナノ構造体を製造しようとする研究が特に注目されている。特に、高分子ナノ粒子が生体細胞に粘着する効率を向上させるために、ナノ粒子の表面に細胞が認識できる粘着分子を結合させようとする研究が活発に行われている。例えば、難溶性薬物を可溶化させてその生体利用能を増進させたり、タンパク質や遺伝子のような巨大分子量の薬物の細胞内吸収を高めたり、癌などの難治性疾患に使用する薬物を標的細胞に特異的に送達するために、細胞認識分子または細胞粘着分子を高分子ナノ粒子に導入させたりといった研究が含まれる。
【０００３】
上記の細胞認識分子または細胞粘着分子としては、糖鎖、抗体、ペプチドなどが挙げられ、これを薬物送達に応用しようとする試みとして、薬物-重合体プロドラッグコンジュゲートの概念が広く活用されている。1977年Ringsdorfは水溶性薬物と細胞認識分子などを導入した機能性重合体を薬物の送達に使用しており(H. Ringsdorf、J. Polymer Science (1977) 51, 155)、KopecekらはN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド (HPMA)の側鎖にモノクローナル抗体や肝細胞に特異的な糖鎖などを導入した後、リソソーム内にある酵素により特異的に切断されるペプチド結合を利用して薬物を高分子鎖に共有結合できることを報告している(R. Duncanら、Biochim. Biophys. Acta. (1983) 755, 518; P. A. Flanaganら、Biochim. Biophys. Acta. (1989) 39, 1125; D. PutnamおよびJ. Kopecek、J. Adv. Polymn. Sci. (1995) 122, 55)。
【０００４】
特に1990年代以後には、細胞粘着分子を高分子ナノ粒子に導入する研究等が活発に行われている。T. Akaikeらは肝実質細胞である肝細胞の表面に存在するアシアロ糖タンパク質受容体と強い結合力を持っていることが知られているガラクトース分子を疎水性高分子鎖に組み込むことにより、N-p-ビニルベンジル-O-ベータ-D-ガラクトピラノシル-(1,4)-D-グルコンアミドを合成した後、水溶液相で疎水性重合体と親水性ガラクトースの相分離現象を利用してナノ粒子を製造した。これらのナノ粒子に対するインビトロ実験とインビボ実験の結果、上記のナノ粒子は肝組織を構成する細胞中、クッパー(Kupper)細胞のような非実質細胞には吸収されず、肝細胞にのみ選択的に吸収されることが観察された(S. Tobeら、Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 184, 225; K. Kobayashiら、Macromolecules (1997) 30, 2016)。一方、M. Hashidaらはマクロファージに対して強い結合力を持つC型レクチンに属するマンノース受容体を導入することによりコレステロール誘導体であるコレステン-5-イルオキシ-N-(4-((1-イミノ-2-ベータ-D-チオマンノシルエチル)アミノ)ブチル)ホルムアミド (Man-C4-Chol)を合成し、これをリポソームに組み込むことによりマクロファージへの標的指向性を向上させた(P. Opanasopitら、Biochim. Biophys. Acta. (2001) 1511, 134)。
【０００５】
上記のエンドサイトーシス以外にも、インポートセルシグナリング(import cell signaling)を担うペプチドにより巨大分子がエネルギー非依存的に真核細胞の細胞膜を透過して、効率的に細胞内に導入されるということが明らかにされたことにより、ウイルスの表面に存在する膜透過性タンパク質またはペプチドを利用してタンパク質のような巨大分子やリポソーム、ナノ粒子などの細胞内透過性を向上させようとする研究が急速に進行している(M. Lindgrenら、Trends in Pharmacological Sciences (2000) 21, 99)。これは低い生体膜透過性と比較的速い生体内半減期により、薬物としての使用において多くの制約があった治療用タンパク質や遺伝子のような巨大分子の薬学的価値が高められるという点で高く評価される。S. R. Schwarzeらは、細胞膜透過性ペプチドが、内皮細胞の単層から構成された脳血液関門を介した高分子量の薬物の送達にも使用できることを報告しており(S. R. Schwarzeら、Science (1999) 285, 1569)、C. Rousselleらは、抗癌剤であるドキソルビシンに配列番号：2のアミノ酸配列を有するD-ペネトラチン(D-penetratin、すべてのアミノ酸がD型で構成される)と配列番号：3のアミノ酸配列を有するSynB1という膜透過性ペプチドとを結合することにより、脳血液関門を介して薬物を送達する研究を行った(C. Rousselleら、Molecular Pharmacology (2000) 57, 679)。
【０００６】
このような細胞膜透過性ペプチドは主にタンパク質から誘導されたものであって、大きく3種類に分類できる。第一は、ホメオドメインに由来するペプチドであるペネトラチン(penetratin)であって、配列番号：2のアミノ酸配列を持つ。これはショウジョウバエ(Drosophila)のホメオプロテインであるアンテナペディア(Antennapedia)のホメオドメインで見いだされた(A. Joliotら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., (1991) 88, 1864)。本明細書で用いられる「ホメオプロテイン」という用語は、ホメオドメインと呼ばれるDNAと結合できる約60アミノ酸を有する一種の転写因子を指す。第二は、後天性免疫不全症候群(AIDS)を仲介する1型ヒト免疫不全ウイルス (HIV-1)の転写活性化タンパク質であるTatタンパク質の49〜57位アミノ酸の間に存在するTat49-57ペプチドであって、配列番号：1のアミノ酸配列を有する(P. A. Wenderら、PNAS (2000) 97, 24, 13003-13008)。第三は、膜転位配列(membrane translocating sequence、以下「MTS」と称する)またはシグナル配列に基づいたペプチドである。これは、RNAにより生成されたタンパク質をインビボで適当な細胞小器官の膜に位置づけることを助ける受容体タンパク質により認識される。また、核局在化シグナル(以下「NLS」と称する)と結合されたMTSは幾つかの細胞で細胞膜を通過して細胞核に蓄積されることも明らかになった。例えば、核転写因子カッパB(NF-κB)、サルウイルス40T抗原(SV40T抗原)、またはカポシ肉腫繊維芽細胞増殖因子1(以下、「FGF」と称する)に由来するNLSペプチドに結合されたK-FGF、ヒトベータ3インテグリン、HIV-1 gp41などでシグナル鎖の疎水性領域に由来するMTSにおいて、上記の事実が確認されている(Y. Linら、J. Biol. Chem. (1996) 271, 5305; X. Linら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1996) 93, 11819; M. C. Morris et al. Nucleic Acids Res. (1997) 25, 2730; L. Zhangら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998) 95, 9184; Chaloinら、Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 243, 601; Y. Linら、J. Biol. Chem. (1995) 270, 14255)。
【０００７】
このようなペプチドはカーゴ(cargo)分子と結合して細胞に近接した場合にインポートシグナル(import signal)として作用し、カーゴ分子の細胞内への転位を誘導する。M. Rojasらは、Grb2SH2ドメインを含む融合タンパク質のEGF刺激シグナル伝達経路に対する細胞内効果を調べるため、輸送ペプチドである配列番号：4のアミノ酸配列を有するシグナル鎖ペプチドが結合されたグルタチオン-S-トランスフェラーゼ-Grb2SH2融合タンパク質(41kDa)について研究を行った(M. Rojasら、Nature Biotech (1998) 16, 370)。S. Fawellらは、内在化効率を調節することによるタンパク質合成の阻害に関する研究を通じて細胞毒性を検出するために、Tatタンパク質の32〜72位アミノ酸鎖をRNase Aに結合させた(S. Fawellら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1994) 91, 664)。M. Rojasらは、ペプチドに結合されたGrb2SH2のSAA細胞への細胞内送達によるGrb2タンパク質のリン酸化効果を調べるために、配列番号：4のアミノ酸配列を有するシグナル鎖ペプチドをSHC Tyr 317領域(12残基)に結合させた(M. Rojasら、Biochem. Biophys. Res. Commun. (1997) 234, 675)。J. Oehlkeらは、両親媒性モデルペプチドの細胞への移動性を試験するため、両親媒性モデルペプチドである配列番号：5のアミノ酸配列を有するペプチドをSV40ラージT抗原に結合させた(J. Oehlkeら、Biochim. Biophys. Acta (1998) 1414, 127)。L. Theodoreらは、生きている神経細胞のPKC活性を抑制するためペネトラチンをPKC偽性-基質(pseudo-substrate) (14残基)に結合させた(T. Theodoreら、J. Neurosci. (1995) 15, 7158)。S. Calvetらは、生きている神経細胞の繊維芽細胞成長因子(以下「FGF」と称する)の受容体シグナル系を抑制するためペネトラチンをFGF受容体ホスホペプチド(9残基)に結合させた(S. Calvetら、J. Neurosci. (1998) 18, 9751)。M. C. Morrisらは、ベクターペプチドによる細胞内伝達を検出するため、シグナル鎖の一種であるMPGをHIV天然プライマー結合部位 (36-mer)に結合させた (M. C. Morrisら、Nucleic Acid Res. (1997) 25, 2730)。B. Allinquantらは神経突起の生長に対する効果の研究に関してアミロイド前駆タンパク質の減少を調節するため、ペネトラチンをAPPアンチセンス(25-mer)に結合させた(B. Allinquantら、J. Cell Biol. (1995) 128, 919)。S. Dokkaらは、合成されたインポートシグナルと組み合わせることにより、オリゴ核酸塩の送達を研究するために、配列番号：4のアミノ酸配列を有するシグナル鎖ペプチドを10オリゴ核酸塩に結合させた(S. Dokkaら、Pharm. Res. (1997) 14, 1759)。M. Poogaらは、ガラニン受容体レベルを調整してインビボにおける痛症伝達(pain transmission)を変更するためペネトラチンおよびトランスポータン(transportan)をガラニン受容体アンチセンス(21-mer)に結合させた(M. Poogaら、Nature Biotech. (1998) 16, 857)。
【０００８】
本明細書で用いられる「Tatペプチド」という用語は、AIDSを仲介するHIVの転写に関与するTatタンパク質の鎖の一部を意味する。Tatタンパク質はウイルス株に応じて86〜102個のアミノ酸からなる転写活性化因子である。Tatタンパク質は次の3個の異なる機能性ドメインから構成される：トランス活性化に重要な酸性のアミノ末端領域；22〜37位アミノ酸に相当する領域であって、ジンク-フィンガーモチーフを含有しシステインに富んだ核酸が結合可能な領域；および核透過性に寄与する49〜58位アミノ酸に相当する塩基性領域。中でも塩基性領域は、カルシウムイオンとは独立的にタンパク質の細胞付着に関与する(S. Rubenら、J. Virol. (1989) 63, 1; B. E. Vogelら、J. Cell Biol. (1993) 121, 461)。このようなTatタンパク質は特定のホメオタンパク質やHSV-1タンパク質VP22(1型単純ヘルペスウイルスタンパク質 VP22)などと同様に、生きている細胞により分泌され、再び細胞内に内在化される(B. Ensoliら、J. Virol. (1993) 67, 277)。その細胞内転位は時間と濃度に依存的であり、温度の低い場合部分的に抑制されることもある。さらに、クロロキンやリソソーム指向性因子（lysosomotropic agent）はTatタンパク質が分解されるのを抑制し、ある細胞の場合にはその内在化を刺激することもあるので、Tatタンパク質がエンドサイトーシスにより内在化され得ると提唱されている(A. D. FrankelおよびC. O. Pabo、Cell (1988) 55, 1189)。しかし、Tatタンパク質の細胞内在化が温度に対して非常に低い依存性を見せるという点から(D. A. MannおよびA. D. Frankel、EMBO J. (1991) 10, 1733)、また別のメカニズム、特に競合的転位メカニズムが存在すると予想された。例えば、ヘパリンやデキストランスルフェートのようなカチオン性重合体を添加すると、Tatタンパク質の細胞内転位が減少することが知られている。このような効果は、細胞膜の上にある電荷を帯びた分子間の競合による結果であると考えられる。一方、Tatタンパク質の細胞内転位は、プロタミンもしくはTatタンパク質の部分ペプチド(38〜58位アミノ酸)のような塩基性ペプチドの添加により刺激されるという報告もある。細胞内に内在化された後、タンパク質全体またはTatタンパク質の1〜86位アミノ酸もしくは37〜72位アミノ酸が細胞核内に位置する。特に、48〜60位に存在するアミノ酸配列がもっとも効果的な領域であることが知られている。この領域はタンパク質の塩基性領域とNLSとを含んでいるため、細胞または核へのTatタンパク質の転位が可能となる。
【０００９】
このようなTatタンパク質の細胞内転位は、1988年ジョンズホプキンス医大のA. D. FrankelおよびC. O. Paboにより見いだされ、HIVウイルスにより生成される「Tatタンパク質」が細胞膜内に転位するだけでなく核に局在化されるNLSの特性を有すること、1ナノモルという低濃度のクロロキンによりこのような現象が促進されることが見出された(A. D. Frankel, C. O. Pabo, Cell (1988) 55, 1189)。その後、Tatペプチド中で膜透過性に寄与するペプチド領域を調査した結果、6個のアルギニン、2個のリシン、および一つのグルタミンからなる部位が、細胞透過性に重要な役割を果たすこと、およびその部位が配列番号：1のアミノ酸配列を有することが明らかにされた。
【００１０】
近年、Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖を用いて重合体またはタンパク質をインビボまたはインビトロで転位させる研究結果が報告されている。現在までに、Tatタンパク質から誘導された少なくとも10個のペプチドが異なる細胞の内部に移動することが明らかにされた。このような細胞内への転位または内在化はほんの数分間でなされ、温度に対してもあまり敏感ではないことが知られている。細胞内送達に有効なTatタンパク質のアミノ酸配列は49〜57位アミノ酸であることが現在知られている。このアミノ酸配列に様々なカーゴ分子を結合させることによる細胞内送達の研究が行われている。カーゴ分子により送達される分子の例としては、16型ヒトパピローマウイルス(HPV-16)の阻害剤、Cdk抑制剤p27Kip1、p16INK4a、カパーゼ-3(capase-3)タンパク質、主組織適合複合体(MHC)クラスI経路へのオブアルブミン、ベータ-ガラクトシダーゼなどがある。この他にも、Tatタンパク質のアルギニンに富んだ48〜60位アミノ酸配列を利用して、細胞内への分子の送達に関する多くの研究が行われている。これらの分子には、DNA、巨大分子、タンパク質、薬物、薬物担体、抗原、抗体、親水性重合体、無機ナノ粒子などが含まれる。
【００１１】
米国マサチューセッツゼネラル病院(Massachusetts General Hospital)のM. Lewinらは、インビボでの前駆細胞または幹細胞の分化または分布を高解像度で画像化するための診断物質として機能する、Tatタンパク質の短い49〜57位アミノ酸配列を含むTatペプチドが結合された超常磁性ナノ粒子を開発した。このナノ粒子ではTatタンパク質の49〜57位アミノ酸の結合部分のためカルボキシ末端部分に4merのアミノ酸-Gly-Tyr-Lys-Cysが結合されており、システインの遊離-SH基に蛍光物質であるFITCと直径45nmのナノ粒子とを結合させることにより、一つの複合体が製造される(M. Lewinら、Nature Biotech (2000) 18, 410)。上記の研究結果において、Tatペプチドが修飾されたナノ粒子が造血細胞および神経前駆細胞に効率的に内在化されたことが、CD34+細胞を利用したインビトロ実験で立証された。さらに、 Tatペプチドが修飾されたナノ粒子を免疫不全マウスに静脈注射した場合にも、骨髄に由来するCD34+細胞が磁気共鳴映像法により確認された。
【００１２】
このような結果は、細胞内在化機能を持っているTatタンパク質の一部のアミノ酸配列、より具体的には49〜57位アミノ酸を、薬物を送達できる合成重合体に結合できることを示している。米国ユタ大学のJ. KopecekらはTatペプチドを利用してヒドロゲルのような巨大な水溶性重合体が細胞内に送達されるか否かを確認するため、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)共重合体に蛍光標識されたTatペプチドを結合させ、A2780ヒト卵巣癌種細胞を利用して細胞内への送達実験を行った。その結果、Tatペプチドの結合されたHPMAが時間依存的な非エンドサイトーシス経路により、細胞内部、特に核内部に蓄積されることが確認された(A. Noriら、28th Proceed. of International Symposium on Controlled Release Bioactive Materials, 2001, San Diego)。このような結果から、比較的高分子量の共重合体の場合でもTatペプチドとの結合を通じて、細胞内への送達が可能であることが示された。しかし、使用された重合体は水溶液に溶解されるヒドロゲルであるため、送達される薬物を重合体鎖に結合させる必要がある。特に、難溶性薬物の場合には達成困難である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は上記の問題点を考慮して成され、本発明の課題は、膜透過性のペプチド鎖を重合体に結合させることにより得られるコンジュゲートを提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、コンジュゲートの使用により、細胞内への透過性が増強されたナノ粒子を提供することである。
【００１５】
上記および他の本発明の目的、特徴、および他の利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明からより明らかに理解されると思われる。
【００１６】
【発明を解決するための手段】
本発明はTat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲート、およびこれを使用して製造されるナノ粒子を提供する。即ち、本発明はTat49-57ペプチドと生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲート、またはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲート、および上記コンジュゲートを使用して製造されるナノ粒子を提供する。
【００１７】
本発明に係るコンジュゲートにおいては、（１）配列番号：1のTat49-57ペプチドまたは配列番号：1のTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲートであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係るコンジュゲートにおいては、（２）生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(バレロラクトン)、ポリ(ヒドロキシブチレート)、ポリ(ヒドロキシバレレート)、ポリ(1,4-ジオキサン-2-オン)、ポリ(オルトエステル)、およびこれらの重合体に相当する単量体から製造された共重合体からなる群より選択される少なくとも一つの重合体である、上記(1)記載のコンジュゲートであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係るコンジュゲートにおいては、（３）生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)、およびポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸) からなる群より選択される少なくとも一つの重合体である、上記(1)記載のコンジュゲートであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係るコンジュゲートにおいては、（４）生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の重量平均分子量が500〜100,000である、上記(1)記載のコンジュゲートであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係るコンジュゲートにおいては、（５）Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖(A)、および生分解性脂肪族ポリエステル系重合体(B)がA-B型またはA-B-A型として構成される、上記(1)記載のコンジュゲートであることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係るコンジュゲートにおいては、（６）Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体との間に塩基、リンカー、またはマルチリガンド化合物が付加される、上記(1)記載のコンジュゲートであることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係るナノ粒子においては、（７）上記(1)〜(6)のいずれか一項に記載のコンジュゲートを使用して製造されるナノ粒子であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係るナノ粒子においては、（８）平均粒径が1,000nm以下である上記(7)記載のナノ粒子であることを特徴とする。
【００２５】
【発明の実施の形態】
上記Tat49-57ペプチドは、後天性免疫不全症候群(AIDS)を仲介する1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)の転写活性化タンパク質であるTatタンパク質の49〜57位アミノ酸を含み、配列番号：1のアミノ酸配列を有する。少なくとも一つのTat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖がコンジュゲートに組み込まれうる。
【００２６】
Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖は特に制限されないが、例えば、アミド4-メチルベンズヒドリルアミンヒドロクロライド(MBHA)樹脂とABI433合成機器を利用して、Fmoc(N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル)/t-ブチル法により固相ペプチド合成法(SPPS)で合成される(M. Bodansky, A. Bodansky、The Practice of Peptide Synthesis; Springer: Berlin, Heidelberg, 1984, J.M. Stewart, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed; Pierce Chemical Co: Rockford. IL, 1984)。
【００２７】
生分解性脂肪族ポリエステル系重合体は生体適合性の重合体であって、炎症または免疫反応を誘発させずに分解されるだけでなく、その分解産物もやはり人体に無害であることが要求される。このような条件を満たす最も一般的な重合体として、米国食品医薬局(FDA)により承認を受けている、乳酸とグリコール酸を基本単位とする生分解性脂肪族ポリエステル系重合体が挙げられる。生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の代表的な例として、下記化学式1のポリ(D,L-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、およびポリ(D-乳酸)、ならびに下記化学式2のポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)が挙げられる。生分解性脂肪族ポリエステル系重合体は、ポリ(D-乳酸)、ポリ(L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(バレロラクトン)、ポリ(ヒドロキシブチレート)、ポリ(ヒドロキシバレレート)、ポリ(1,4-ジオキサン-2-オン)、ポリ(オルトエステル)、およびこれらの重合体に相当する単量体から製造された共重合体からなる群より選択される少なくとも一つの重合体が挙げられる。
【化１】
化学式１
0004477815.tif 000002
(式中、nは少なくとも2の整数である。)
【化２】
化学式２
0004477815.tif 000003
(式中、mおよびnは各々独立に少なくとも2の整数である。)
【００２８】
上記化学式2のポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)の場合には、乳酸とグリコール酸の単量体の比率を調節させる、または重合体の合成経路を変更させることにより、多様な分解寿命を持つ生分解性重合体が得られる。このような生分解性脂肪族ポリエステル系重合体は薬物送達用担体または手術用縫合糸として長い間使用されてきており、その生体適合性がすでに証明されている。一方、これら生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の分子量は特に制限されないが、重量平均分子量が500〜100,000、好ましくは5,000〜50,000であるものがナノ粒子の製造時に良い効果が得られる。
【００２９】
上記Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖(A)、および上記生分解性脂肪族ポリエステル系重合体(B)は特に制限されないが、A-B型またはA-B-A型として構成されうる。まず、生分解性脂肪族ポリエステル系重合体の両末端に存在するカルボキシル基およびヒドロキシル基を、共有結合を促進させるよう他の官能基に置換する。次に、この重合体の置換された末端を、Tat49-57ペプチド末端またはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖の末端と反応させて上記の構成が得られる。例えば、Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲートはマレイミドに置換されたポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)と末端基をチオールに置換したTATペプチドとの共有結合を通じて合成することができる。
【００３０】
本発明において、共有結合は特に制限されないが、Tat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と上記の生分解性脂肪族ポリエステル系重合体との間に塩基、リンカー、またはマルチリガンド化合物を添加することによって形成される。
【００３１】
本発明はまた、上記のコンジュゲートを使用して製造されるナノ粒子に関する。この時、ナノ粒子の平均粒径は、コロイドの安定性の点から小さいほど好ましい。例えばナノ粒子の平均粒径は1,000nm以下、好ましくは300nm以下である。
【００３２】
本発明のナノ粒子はその表面にTatペプチド部分を露出させることにより、Tatペプチドの膜透過性を効果的に発揮させ、細胞内への透過性を高めることができる。本発明に係るナノ粒子を製造する方法は特に制限されないが、例えば次のような方法が含まれる。即ち、重合体を水溶液に直接分散させた後、超音波を加える方法；重合体を有機溶媒に分散または溶解させた後、過量の水で有機溶媒を抽出または蒸発させる方法；重合体を有機溶媒に分散または溶解させた後、ホモジナイザーまたは高圧乳化機を利用して、強く攪拌して溶媒を蒸発させる方法；重合体を有機溶媒に分散または溶解させた後、過量の水で透析する方法；重合体を有機溶媒に分散または溶解させた後、徐々に水を添加する方法；超臨界流体を利用して製造する方法などが挙げられる(T. Niwaら、J. Pharm. Sci. (1994) 83, 5, 727-732; C. S. Choら、Biomaterials (1997) 18, 323-326; T. Govenderら、J. Control. Rel. (1999) 57, 171-185; M. F. Zambaux et al, J. Control. Rel. (1998) 50, 31-40)。
【００３３】
本発明のナノ粒子の製造に使用することができる有機溶媒の例としては、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチルアセテート、アセトニトリル、メチルエチルケトン、メチレンクロライド、クロロホルム、メタノール、エタノール、エチルエーテル、ジエチルエーテル、ヘキサン、またはペトロリウムエーテルが含まれる。この時、溶媒を単独で使用することもまたは組み合わせて使用することもできる。
【００３４】
さらに、本発明のナノ粒子はその内部に特定の薬物を組み込むことにより、生体利用能が向上した薬物送達システムとして使用できる。
【００３５】
【実施例】
以下に、 実施例、比較例および実験例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。しかし、使用する材料、試薬、費用、操作などは、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく当業者であれば変更することができる。従って、これらの例は、本発明を説明するために提示するものであって、制限するものではない。
【００３６】
実施例１．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲート
Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖を、アミド4-メチルベンズヒドリルアミンヒドロクロライド(MBHA)樹脂とABI433合成機器を利用して、Fmoc(N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル)/t-ブチル方法により、固相ペプチド合成法(SPPS)で合成し、逆相高速液体クロマトグラフィを利用して、純度90%以上に精製した。これを質量分析機(Agilent 1100シリーズ)で分析した結果、分子量が1846であることが確認された。これにより、Tat49-57ペプチドを含み、リンカーとして4つのアミノ酸からなるGly-Tyr-Lys-Cysペプチドが付加された配列番号：6のアミノ酸配列を有するペプチドが合成されたことが確認された。
【００３７】
上記Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲートは、マレイミドに置換されたポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)と末端基をチオールに置換したTatペプチドとの共有結合により合成した。その製造過程は以下のとおりである。反応容器に無水1,4-ジオキサン80ml、10gのポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)、およびトリエチルアミン(TEA)0.2mlを入れ、充分に攪拌して完全に溶解した。この反応容器に1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)とN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)の混合物を添加して、重合体の主鎖にあるカルボキシル基を活性化した。この時カルボキシル基とジシクロヘキシルカルボジイミドとN-ヒドロキシスクシンイミドとのモル比は1:2:2であった。この混合物を室温、窒素下で4時間攪拌した。10mlの無水1,4-ジオキサンに溶かした200mgのヘキサメチレンジアミンを反応容器に添加し、さらに2時間攪拌した。得られた反応物を孔径0.45μmのナイロンフィルターで濾過して得た溶液を、無水のジエチルエーテルで沈殿化させた後、エーテルを除去して白色固体を得た。この固体反応物を再びメチレンクロライドに添加して残りの反応物、反応試薬、および副反応物を溶解させた。この混合物から、合成された重合体だけを沈殿させて回収した。この過程を3回繰り返して重合体をさらに精製させた。精製された重合体は真空乾燥した。
【００３８】
このようにして得られた重合体、即ち末端にアミン基を持つポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)をメチレンクロライドに溶解し、1.5倍(モル比率)過量のN-スクシンイミジル4-(4-マレイミドフェニル)-ブチレートを添加して、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)の末端にマレイミドを誘導した。合成された重合体は無水ジエチルエーテルで沈殿化し、上記のような沈殿法で精製し、真空乾燥した。反応容器にジメチルスルホキシド(DMSO)3mlと上記の合成された重合体100mgを添加し、充分に攪拌して完全に溶解させた。400μlの反応バッファー(83mMナトリウムリン酸化緩衝液、0.1M EDTA、0.9M塩化ナトリウム、0.02%アジ化ナトリウム、pH 7.2、安定化剤)に溶かした配列番号：6のアミノ酸配列を有するペプチド鎖5mgを添加して、少なくとも6時間室温下で反応させた。反応後、得られた表題化合物はセルロース膜と蒸留水を利用した透析により精製し、凍結乾燥した。
【００３９】
実施例２．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸)とのコンジュゲート
ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)の代わりにポリ(D,L-乳酸)を使用した以外には、実施例1の方法と同様にして表題の化合物を製造した。
【００４０】
実施例３．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(L-乳酸)とのコンジュゲート
ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)の代わりに、ポリ(L-乳酸)を使用した以外には、実施例1の方法と同様にして表題の化合物を製造した。
【００４１】
実施例４．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲートを使用したナノ粒子
本発明のナノ粒子は相反転方法により製造された。実施例1で得られた100mgのコンジュゲートを10mlのアセトンに溶解し、0.5%w/vポリビニルアルコール(PVA、88%加水分解、分子量25,000)を含むリン酸塩緩衝溶液100mlに、素速く攪拌しながら徐々に加えた。アセトンに溶解した、質量比5%の蛍光標識Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲートを使用して蛍光標識された高分子ナノ粒子を製造した。
【００４２】
一方、蛍光標識されたコンジュゲートは、次のような方法で製造した。まず、実施例1で得られた10gのコンジュゲートを500mgのジシクロヘキシルカルボジイミドと300mgのN-ヒドロキシスクシンイミドとの反応によりエステル化させ、上記コンジュゲートのカルボキシル基を活性化させた後、蛍光アミンの第一級アミン基と共有結合させた。活性化されたコンジュゲートと蛍光アミンとのカップリング反応は0.5mgのトリエチルアミンを添加した後、室温にて窒素下で10時間行った。反応の副産物として沈殿したジシクロウレアは濾過により除去し、蛍光標識されたコンジュゲートは無水ジエチルエーテルで沈殿化させた後、上記のような沈殿法で精製した。
【００４３】
実施例５．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸)とのコンジュゲートを使用したナノ粒子
実施例1で製造されたコンジュゲートの代わりに、実施例2で製造されたコンジュゲートを使用した以外には、実施例4の方法と同様にして表題の化合物を製造した。
【００４４】
実施例６．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(L-乳酸)とのコンジュゲートを使用したナノ粒子
実施例1で製造されたコンジュゲートの代わりに、実施例3で製造されたコンジュゲートを使用した以外には、実施例4の方法と同様にして表題の化合物を製造した。
【００４５】
比較例１．ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)のナノ粒子
実施例1で製造されたコンジュゲートの代わりに、純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)を使用した以外には、実施例4の方法と同様にして表題の化合物を製造した。
【００４６】
実験例１．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖と生分解性脂肪族ポリエステル系重合体とのコンジュゲートの確認
本発明に係るコンジュゲートを、赤外線分光器を用いて確認した。図1に、実施例1で製造されたコンジュゲート(a)および純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)(b)の典型的なフーリエ変換赤外線分光スペクトルを示す。実施例1で製造されたコンジュゲート(a)の場合、1750cm-1付近のエステル特異的ピークに加えて、1656cm-1付近のアミン特異的ピークが観察された。これらのピークが存在することにより、ポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)にTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖が共有結合されたことが示される。
【００４７】
実験例２．ナノ粒子の分析
実施例4および比較例1で製造されたナノ粒子の表面電位を、Zetasizer 3000HS(Malvern, UK)を利用して測定した。比較例1で製造されたナノ粒子の表面電位値は-7.8mVであるのに対して、実施例4で製造されたナノ粒子は-0.9mVの表面電位値を示した。このことから、カチオン性アミノ酸であるリシンとアルギニンを多量に含んでいるTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖が、ナノ粒子の表面に配向され、それにより表面電位値が増加することが示唆される。
【００４８】
上記実施例4〜6および比較例1で製造されたナノ粒子の平均粒子サイズは、動的光散乱法(Zetasizer 3000HS, Malvern, UK)により測定した。散乱角度は90度に固定して測定し、実験は25℃で行った。受動力学的粒径はコンチン(Contin)方法により計算された。実験結果は表1および図2に示す。これらの結果からわかるように、比較例1で製造されたナノ粒子(d)の粒子サイズに比べて実施例4〜6で製造されたナノ粒子(c)の平均粒子サイズの方が大きい。これは、Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖に導入されたナノ粒子に比べて純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)のナノ粒子はより強い疎水性を有し、その疎水性相互作用により、より稠密な構造のナノ粒子が形成されるためであると推定される。
【００４９】
【表１】
0004477815.tif 000004
【００５０】
さらに、ナノ粒子の形状およびサイズ分布は、透過型電子顕微鏡(TEM, JEOL 2010)を使用して観察した。試片は1g/L濃度のナノ粒子が分散されたPBS溶液1滴を炭素でコートされた100メッシュ銅グリッドに載せ、1分経過後、2%ウラニルアセテート溶液で染色して調製した。図3に、実施例4で製造されたナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す。これにより、ナノ粒子が個々の球形を有することが示される。
【００５１】
実験例３．細胞培養による細胞毒性の検査
実施例4および比較例1で製造されたナノ粒子の細胞毒性は、HaCaT(ヒト角質細胞株)およびHS-68(ヒト繊維芽細胞株)を用いて評価した。上記の2種類の細胞を、1%容積の抗生物質 (ストレプトマイシン、10,000μg/ml；ペニシリン、10,000 IU/ml)および10%容積のウシ胎児血清(以下「FBS」と称する)を添加した細胞培養培地(Dulbecco改変Eagle培地；以下「DMEM」と称する)に加え、37℃に5%CO2を含む湿潤大気が充填されたインキュベーターで培養した。平底96ウェルプレートに75%細胞密度で培養された2種類の細胞を1.5〜50μg/ml濃度のナノ粒子とともに100μlの培養培地で1時間培養した。その後、10%容積のFBSを添加して、さらに48時間培養した後、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(以下「MTT」と称する)およびラクテート脱水素酵素(以下「LDH」と称する)分析を行い、細胞の毒性を評価した。
【００５２】
96-ウェルプレートで培養されている細胞にMTTを最終濃度500μg/mlとなるように添加し、37℃で4時間培養した後、100μlの酸性イソプロパノール(イソプロパノールに0.04NのHClを溶解)をそれぞれのウェルに入れた後、混合して生細胞により転換された色素物質を溶解させた。96-ウェルプレートの各ウェルに含まれる転換された色素物質の吸光度を550nmでELISAプレートリーダー(ELx800, Bio-TEK Instr. Inc.)を用いて測定した。MTT分析の標準曲線は、96-ウェルプレートの各ウェルに細胞の個数を変えて添加し、細胞を上記の方法で培養してMTT分析を施行した後、生細胞の数に対する吸光度の変化の関係を分析することにより求めた。MTT分析による実施例4で製造されたナノ粒子の細胞毒性分析は生存している細胞の率（％）で示した。
【００５３】
細胞培養液に溶出したLDH量はCyto Tox 96 非放射性細胞毒性アッセイキット(Cyto Tox 96 Non- Radioactive Cytotoxicity Assay kit, Promega, Madison, WI, USA)を用いて測定した。培養液を250gの速度で4分間遠心分離することにより死んだ細胞の残骸を分離した。遠心分離後、上清50μlを96ウェルプレートの各ウェルに入れた。50μlの基質溶液を添加して室温で30分間放置した。溶出したLDHと基質溶液との反応を止めるため、50μlの1.0M酢酸を加えた。各ウェル中の試料の492nmにおける吸光度をELISAプレートリーダーで測定した。溶出したLDH(%)は、下記の数学式（式１）により求めた。
【式１】
溶出LDH(%)=(損傷された細胞から溶出したLDH(実験群)/溶解溶液での処理後、すべての細胞から溶出した最大LDH)×100
【００５４】
図4に、実施例4で製造されたナノ粒子および比較例1で製造されたナノ粒子のMTT細胞毒性アッセイ法の結果を示す。これらの結果から、Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖に導入されたナノ粒子と上記ペプチド鎖の導入されていないナノ粒子との細胞毒性には有意な差がないことが示される。
【００５５】
実験例４．Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖とポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)とのコンジュゲートのナノ粒子の細胞内転位
実施例4および実施例5で製造されたナノ粒子（このナノ粒子は実験例3により、細胞の生存にほとんどまたは全く影響しないことが確認されている）の細胞内転位を、共焦点顕微鏡(Radiance 2000/MP, Biorad)を使用しHaCaT細胞を用いて確認した。透明な35mm Delta T培養皿(厚さ0.15mm)で培養されたHaCaT細胞を1%容積の抗生物質および蛍光標識された高分子ナノ粒子(濃度＝50μg/ml)を添加した1mlのDMEM培養培地中で1時間次の2つの条件下でそれぞれ培養した。第一は37℃、5%二酸化炭素(CO2)を含む大気下で、第二は4℃、大気下であった。このような2つの異なる条件でそれぞれ培養した後、1mlのリン酸塩緩衝溶液で細胞を3回洗浄し、再び1mlのDMEM培養培地を培養皿に入れた後、染色された細胞の蛍光を観察した。その結果を図5に示す。
【００５６】
図5aは比較例1で製造されたナノ粒子の37℃における細胞内転位の程度を示す共焦点レーザー走査顕微鏡写真であり(図中の目量は10μmを示す)、図5bは実施例4で製造されたナノ粒子の37℃における細胞内転位の程度を示す共焦点レーザー走査顕微鏡写真(図中の目量は10μmを示す)である。これらの図からわかるように、純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)のナノ粒子の場合細胞内への転位が全く見られないが、実施例4で製造されたナノ粒子の場合細胞膜を透過して細胞内部にナノ粒子が転位している。したがって、Tat49-57ペプチドを含むペプチド鎖をナノ粒子に導入することにより、ナノ粒子の細胞内転位が増強できた。
【００５７】
【発明の効果】
本発明に係るナノ粒子の表面にTatペプチド部分を露出させることにより、Tat49-57ペプチドの細胞内透過性が増強されることを本発明者らは確認した。したがって、本発明に係るナノ粒子は、重合体の末端に高い生体膜透過性を有するTat49-57ペプチドまたはTat49-57ペプチドを含むペプチド鎖を共有結合させることにより、先行技術の高分子ナノ粒子の欠点を克服することができた。さらに、本発明に係るナノ粒子は、その内部に薬物を封入すると、インビボでの生体利用能が向上した効果的な薬物送達システムとして有用であることが期待される。
【配列表】
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0004477815.tif 000007
0004477815.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、実施例1で製造されたコンジュゲート(a)および純粋なポリ(D,L-乳酸-co-グリコール酸)(b)の典型的なフーリエ変換赤外線分光スペクトルを示す。
【図２】  図2は、実施例4で製造されたナノ粒子(c)および比較例1で製造されたナノ粒子(d)のサイズ分布を示す。
【図３】  図3は、 実施例4で製造されたナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図４】  図4は、 実施例4で製造されたナノ粒子および比較例1で製造されたナノ粒子のMTT細胞毒性アッセイ法の実験結果を示す。
【図５ａおよび５ｂ】  図5aは、 比較例1で製造されたナノ粒子の37℃における細胞内転位の程度を示した共焦点レーザー走査顕微鏡写真であり、図5bは実施例4で製造されたナノ粒子の37℃における細胞内転位の程度を示した共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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