(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制剤投薬処置により患者に生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法であって、
ａ）患者から採取した試料中に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１Ｃ→Ｔ（配列Ｘ０４５００の１４２３位置）でのヌクレオチド対の同一性を判定すること；および
ｂ）両方の対がＡＴである場合、その患者は高コレステロール上昇群とし、一対がＡＴで一対がＧＣである場合、その患者は中間のコレステロール上昇群とし、また両方の対がＧＣである場合、その患者は低コレステロール上昇群とすること；
を特徴とする方法。
【請求項２】
低コレステロール上昇群が免疫抑制剤投薬処置に付す群であり、高コレステロール上昇群または中間のコレステロール上昇群が別途の処置に付す群である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫抑制剤投薬がラパマイシン、エベロリムス、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、シクロスポリンおよびタクロリムスから選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
免疫抑制剤投薬がエベロリムスによるものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
別途の処置がコレスチポール、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、フルバスタチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチンおよびナイアシンから選択されるコレステロール低下剤投薬を追加することからなる請求項２、３または４に記載の方法。
【請求項６】
免疫抑制剤投薬処置により患者に生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法であって、
ａ）患者から採取した試料中に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１Ｔ→Ｃ（配列Ｘ０４５００の１９０３位置）でのヌクレオチド対の同一性を判定すること；および
ｂ）両方の対がＣＧである場合、その患者は高コレステロール上昇群とし、一対がＡＴで一対がＧＣである場合、その患者は中間のコレステロール上昇群とし、また両方の対がＡＴである場合、その患者は低コレステロール上昇群とすること；
を特徴とする方法。
【請求項７】
低コレステロール上昇群が免疫抑制剤投薬処置に付す群であり、高コレステロール上昇群または中間のコレステロール上昇群が別途の処置に付す群である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
免疫抑制剤投薬がラパマイシン、エベロリムス、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、シクロスポリンおよびタクロリムスから選択される請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
免疫抑制剤投薬がエベロリムスによるものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
別途の処置がコレスチポール、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、フルバスタチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチンおよびナイアシンから選択されるコレステロール低下剤投薬を追加することからなる請求項７、８または９に記載の方法。
【請求項１１】
免疫抑制剤投薬処置により患者に生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法であって、
ａ）患者から採取した試料中に存在するＩＬ−１β遺伝子を含む染色体の２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプ（ＩＬ−１β遺伝子の−５１１および−３１位置での多形の組合せからなるハプロタイプ）を判定すること；および
ｂ）当該コピーの両方が“高コレステロール”ハプロタイプ（−５１１がＴおよび−３１がＣ）を含む場合には、その患者を高コレステロール上昇群とすること；および
ｃ）当該コピーの一方が“高コレステロール”ハプロタイプを含み、もう一方が“低コレステロール”ハプロタイプ（−５１１がＣおよび−３１がＴ）を含む場合、その患者は中間のコレステロール上昇群とすること；および
ｄ）当該コピーの両方が“低コレステロール”ハプロタイプを含む場合、その患者は低コレステロール上昇群とすること；
を特徴とする方法。
【請求項１２】
低コレステロール上昇群が免疫抑制剤投薬処置に付す群であり、高コレステロール上昇群または中間のコレステロール上昇群が別途の処置に付す群である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫抑制剤投薬がラパマイシン、エベロリムス、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、シクロスポリンおよびタクロリムスから選択される請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫抑制剤投薬がエベロリムスによるものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
別途の処置がコレスチポール、クロフィブレート、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、フルバスタチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチンおよびナイアシンから選択されるコレステロール低下剤投薬を追加することからなる請求項１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
該ヌクレオチド対またはハプロタイプの同一性を判定する方法が、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１多形または−３１多形と連鎖不平衡にある当該染色体のどこかに存在するＳＮＰを見出し、当該１個またはそれ以上のＳＮＰの関係を用いて、対象のヌクレオチド対またはハプロタイプの性質を判定することを特徴とする請求項１、２、６、７、１１または１２に記載の方法。
【請求項１７】
患者におけるＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でのヌクレオチド対を判定するキットであって、
ａ）ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の薬物を含む容器；および
ｂ）当該ヌクレオチド対の性質にもとづき推奨される処置を選択するための説明書；
を含んでなる請求項１から５のいずれかに記載の方法において使用するためのキット。
【請求項１８】
患者におけるＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でのヌクレオチド対を判定するキットであって、
ａ）ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の薬物を含む容器；および
ｂ）当該ヌクレオチド対の性質にもとづき推奨される処置を選択するための説明書；
を含んでなる請求項６から１０のいずれかに記載の方法において使用するためのキット。
【請求項１９】
指摘されたハプロタイプの性質にもとづき推奨される処置を選択するための当該キットおよび説明書の結果から、ＩＬ−１β遺伝子のハプロタイプの性質を判定するための説明書を含む請求項１７および１８に記載のキットを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は薬理学および医薬の分野に属し、免疫抑制剤による処置に際し、どの患者が血清コレステロールレベルの上昇を起こし得るかを判定する方法を提供する。特に、本発明は免疫抑制剤療法に際してコレステロールレベルが上昇する危険性のある患者を同定するために、ゲノム解析を用いること、およびそれらの患者に最適な処置方策を決定する方法に関する。
【０００２】
関連分野の記載
免疫抑制剤は現代医学において多くの重要な適応を有する。これらの薬物は心臓、肺および腎臓などの移植臓器の拒絶反応を抑制し、移植臓器の有用な寿命を引き延ばすために使用される。さらに、免疫抑制剤は自己免疫疾患、心筋炎およびリウマチ様関節炎などの広範な他の疾患の処置に使用される。しかし、免疫抑制剤は癌およびリンパ腫の原因となり、腎臓などの内臓に様々な毒性作用を生じるなどの多くの、時には深刻な副作用を有する。
【０００３】
免疫抑制剤の毒性作用のために、毒性の少ない代替品を開発するために、また相乗作用の組合せ剤を用いて全体として副作用を低減させ得るような他の免疫抑制剤とは作用メカニズムの異なる薬物を見出すために、多くの努力がなされてきた。
【０００４】
最近、ラパマイシン（rapamycin）（シロリムス（sirolimus）およびラマパミューン（RAPAMUNE(TM)）としても知られる）と呼称される抗真菌、抗腫瘍および免疫抑制抗生物質が異種移植拒絶反応を阻害する効果のあることが判明した。ラパマイシンはユニーク、かつ他の免疫抑制剤とは明らかに異なる作用メカニズムを有する。ラパマイシンおよびその誘導体、たとえば、エベロリムス（everolimus）（セルチキャン（CERTICAN(TM)））（ＲＡＤ）は、Ｃａ２＋に依存しない様式で、活性化Ｔ細胞のＧ１−Ｓ期の進行に関与する生化学経路を阻害することにより作用する。参照文献：Schuler et al., Transplantation, Vol. 64, pp. 36-42 （1997）。この様式で、エベロリムスなどのラパマイシン誘導体は、シクロスポリンなどの他の免疫抑制剤の場合のようなサイトカインの産生を遮断するよりもむしろサイトカインのシグナル伝達を遮断する。
【０００５】
ラパマイシンとその誘導体およびミコフェノール酸は有効な免疫抑制剤ではあるが、一部の患者においてこれらの薬物投与は血清コレステロールおよびトリグリセリドの上昇を引き起こすこと、すなわち、高コレステロール血症および高脂血症の原因となることが分かっている。これらの症状は共にとりわけ糖尿病患者において、冠動脈疾患（ＣＡＤ）および一般的なアテローマ動脈硬化症アテローム性動脈硬化症の危険因子である。
高コレステロール血症それ自体は一般的な症状であり、数種の主要分類の薬物で処置することができる。これらはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素インヒビターまたはいわゆるスタチン類、胆汁酸結合樹脂およびニコチン酸などである。
【０００６】
ラパマイシンまたはその誘導体などの免疫抑制剤、たとえば、限定されるものではないが、エベロリムス、（セルチキャンＴＭ）（ＲＡＤ）などでの処置、またはミコフェノール酸による処置に際し、血清コレステロールレベルの上昇することは、深刻かつ不利な副作用である。このことは臓器移植患者にとっては長期の（一般的には生涯）処置を必要とするため、特に重要である。血清中コレステロールレベルの上昇は患者ごとに大きく異なるが、本発明以前には、どの患者がこのような上昇に発展していくかを予知することは不可能であった。したがって、ラパマイシンおよびその誘導体またはミコフェノール酸などの免疫抑制剤を患者に投与したとき、とりわけ長期間の使用の場合、どの患者が血清コレステロールの上昇を経験するかを予知する方法が必要となる。
【０００７】
発明の要約
本発明は免疫抑制剤投薬による処置中の患者において生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法を提供することによりこの問題を克服する；当該方法は、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１Ｃ→Ｔ（配列Ｘ０４５００の１４２３位置）でのヌクレオチド対の同一性を判定すること；および両方の対がＡＴである場合、その患者は高コレステロール上昇群とし、一対がＡＴで一対がＧＣである場合、その患者は中間のコレステロール上昇群とし、また両方の対がＧＣである場合、その患者は低コレステロール上昇群とすること；からなる。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は免疫抑制剤投薬法により患者を処置するもう一つの方法を提供する；当該方法は患者に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１Ｃ→Ｔ（配列Ｘ０４５００の１４２３位置）でのヌクレオチド対の同一性を判定すること；および両方の対がＧＣである場合、その患者は免疫抑制剤投薬法により処置し、また一対がＡＴで一対がＧＣである場合、または両方の対がＡＴである場合、その患者には別途の処置を用いること；からなる。免疫抑制剤投薬法は表２のリストから選択することが可能であり、エベロリムスであり得る。さらに本発明は、別途の処置として表１に掲載した方法から選択されるコレステロール低下投薬法を追加することからなる。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は免疫抑制剤投薬による処置中の患者において生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法を提供する；当該方法は、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１Ｔ→Ｃ（配列Ｘ０４５００の１９０３位置）でのヌクレオチド対の同一性を判定すること；および両方の対がＣＧである場合、その患者は高コレステロール上昇群とし、一対がＡＴで一対がＧＣである場合、その患者は中間のコレステロール上昇群とし、また両方の対がＡＴである場合、その患者は低コレステロール上昇群とすること；からなる。
【００１０】
なおさらなる態様において、本発明は免疫抑制剤投薬法により患者を処置する方法を提供する；当該方法は、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１Ｔ→Ｃ（配列Ｘ０４５００の１９０３位置）でのヌクレオチド対の同一性を判定すること；および両方の対がＡＴである場合、その患者は免疫抑制剤投薬法により処置し、また一対がＡＴで一対がＧＣである場合、または両方の対がＣＧである場合、その患者には別途の処置を用いること；からなる。免疫抑制剤投薬法は表２のリストから選択することが可能であり、エベロリムスであり得る。さらに別途の処置として表１に掲載した方法から選択されるコレステロール低下投薬法を追加することからなる。
【００１１】
なおさらなる態様において、本発明は患者におけるＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でのヌクレオチド対を判定するキットであって、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；および当該ヌクレオチド対の性質にもとづき推奨される処置を選択するための説明書；を含んでなるキットを提供する。
【００１２】
なおさらなる態様において、本発明は患者におけるＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でのヌクレオチド対を判定するキットであって、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；および当該ヌクレオチド対の性質にもとづき推奨される処置を選択するための説明書；を含んでなるキットを提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は免疫抑制剤投薬による処置中の患者において生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法であって、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子を含む２つのコピーについて、ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプを判定することを特徴とする方法を提供する。用語“ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプ”とは、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１および−３１位置の多形の組合せからなるハプロタイプをいうものとする。両方の染色体が“高コレステロール”ハプロタイプを含む場合、すなわち、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１でＣの代わりにＴおよび−３１でＴの代わりにＣを含む場合、患者は高コレステロール上昇群とし、染色体の一方が“高コレステロール”ハプロタイプを含み、一方が“低コレステロール”ハプロタイプを含む場合、患者は中間のコレステロール上昇群とし、また両方の染色体が“低コレステロール”ハプロタイプを含む場合、すなわち、部位−５１１にＣを、部位−３１にＴを含む場合、患者は低コレステロール上昇群とする。
【００１４】
なおさらなる態様において、本発明は免疫抑制剤投薬法により患者を処置する方法であって、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子を含む２つの染色体について、ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプを判定すること；および当該染色体の両方が“低コレステロール”ハプロタイプを含むか、または染色体の一方が“低コレステロール”ハプロタイプを含み、もう一方が“高コレステロール”ハプロタイプを含む場合には、その患者を免疫抑制剤投薬法により処置し、また染色体の両方が“高コレステロール”ハプロタイプを含む場合には、その患者には別途の処置を用いること；を特徴とする方法を提供する。免疫抑制剤投薬法は表２のリストから選択することが可能であり、エベロリムスであり得る。別途の処置とは、表１に掲載した方法から選択されるコレステロール低下投薬法を追加することからなる。
【００１５】
さらなる態様において、本発明はＩＬ−１β遺伝子の−５１１多形または−３１多形と連鎖不平衡にある当該染色体のどこかに存在するＳＮＰを見出すことにより、患者のＩＬ−１β遺伝子の部位−５１１および−３１でのヌクレオチド対の同一性または患者のＩＬ−１β遺伝子のハプロタイプを判定し、当該１個またはそれ以上のＳＮＰの関係を用いて、対象のヌクレオチド対またはハプロタイプの性質を判定し、この情報を用いてＩＭ療法に際してのコレステロール上昇を推定して処置を判断することからなる方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−１β遺伝子のハプロタイプの性質を判定するキットであって、ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；およびＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でのヌクレオチド対の性質を検出する特異的な少なくとも１種の試薬を含む容器；上記の結果から、ハプロタイプを判定するための説明書および指摘されたハプロタイプの性質にもとづき推奨される処置を選択するための説明書；を含んでなるキットである。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１：ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−５１１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均総コレステロールレベル。
図２：ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−３１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均総コレステロールレベル。
図３：ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−５１１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＨＤＬコレステロールレベル。
図４：ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−３１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＨＤＬコレステロールレベル。
図５：ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−５１１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＬＤＬコレステロールレベル。
図６：ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−３１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＬＤＬコレステロールレベル。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明はラパマイシンまたはその誘導体などの免疫抑制剤投薬（ＩＭ）による処置中の患者において生じる血清コレステロールの上昇度を判定する方法を提供する。
一態様において、ＩＭ処置の有力な候補である患者は多形の存在、すなわち、ヌクレオチドの−５１１位置（アミノ酸変化のないプロモーター領域）でのシトシン（Ｃ）→チミン（Ｔ）を判定するために採血する；これは患者に存在するインターロイキン−１−ベータ（ＩＬ−１β）遺伝子の２つのコピーにおいて、配列Ｘ０４５００のヌクレオチド位置１４２３でのＣ→Ｔ変化である。位置−５１１での該ヌクレオチド対が該遺伝子の両方のコピーにおいてＡＴである場合、その患者はＩＭ処理の間に血清コレステロールレベルの高い上昇を経験することとなる。
【００１９】
位置−５１１でのヌクレオチド対が一方のコピーでＡＴであり、他のコピーがＣＧである場合、免疫抑制剤投薬で処置中の患者のコレステロールレベルは中程度の上昇となる。
位置−５１１でのヌクレオチド対が両方のコピーでＧＣである場合、ＩＭで処置中の患者のコレステロールレベルは低上昇となる。
【００２０】
もう一つの態様において、ＩＭでの処置を必要とする患者の処置にどの投薬法を使用するかの判定は、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子の位置−５１１におけるヌクレオチド対の性質の判定結果にもとづくものである。
ヌクレオチド対の両方がＧＣである場合、患者はＩＭで処置することとなる。この免疫抑制剤投薬は表２に示したもののいずれかであり、ラパマイシンまたはその誘導体の一つ、たとえば、制限されるものではないが、エベロリムス（everolimus）（セルチキャン（CERTICAN(TM)））（ＲＡＤ）などである。
【００２１】
両方のヌクレオチド対がＡＴであるか、または一方がＡＴで、一方がＧＣである場合、患者はコレステロールレベルを上昇させない別途の投薬法で処置するか、あるいは患者はＩＭに加えてコレステロール低下剤で処置し、処置の間、患者のコレステロールレベルをモニターする。ＩＭと組み合わせて使用するこのコレステロール低下剤は、下記表１のリストから選択する１種以上の投薬法であり得る。
【００２２】
さらなる態様において、ＩＭ処置の有力な候補である患者は、ヌクレオチドの−３１位置（アミノ酸変化のないプロモーター領域）での多形Ｔ→Ｃの存在を判定するために採血する；これは患者に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーにおいて、配列Ｘ０４５００のヌクレオチド位置１９０３でのＴ→Ｃ変化である。位置−３１での該ヌクレオチド対が該遺伝子の両方のコピーにおいてＣＧである場合、その患者はＩＭ処理の間に血清コレステロールレベルの高い上昇を経験することとなる。位置−３１でのヌクレオチド対が一方のコピーでＡＴであり、他のコピーがＣＧである場合、ＩＭで処置中の患者のコレステロールレベルは中程度の上昇となる。位置−３１でのヌクレオチド対が両方のコピーでＡＴである場合、ＩＭで処置中の患者のコレステロールレベルは低上昇となる。
【００２３】
もう一つの態様において、ＩＭでの処置を必要とする患者の処置にどの投薬法を使用するかの判定は、患者に存在するＩＬ−１β遺伝子の位置−３１におけるヌクレオチド対の性質の判定結果にもとづくものである。ヌクレオチド対の両方がＡＴである場合、患者はＩＭで処置することとなる。
この免疫抑制剤投薬は表２に示したもののいずれかであり、ラパマイシンまたはその誘導体の一つ、たとえば、制限されるものではないが、エベロリムス（セルチキャンＴＭ））（ＲＡＤ）などである。
【００２４】
両方のヌクレオチド対がＧＣであるか、または一方がＡＴで、一方がＣＧである場合、患者はコレステロールレベルを上昇させない別途の投薬法で処置するか、あるいは患者はＩＭに加えてコレステロール低下剤で処置し、処置の間、患者のコレステロールレベルをモニターする。ＩＭと組み合わせて使用するこのコレステロール低下剤は、下記表１のリストから選択する１種以上の投薬法であり得る。
【００２５】
本発明にて使用する適切なラパマイシンは、たとえば、米国特許第３,９２９,９９２および５,２５８,３８９号公報、および国際特許出願ＷＯ９４／０９０１０およびＷＯ０１／６０３４５公報に記載されているとおりである；これらの公報はすべてその全文を目的の如何を問わず参照により本明細書の一部とする。
【表１】
0004575775.tif 000002
【表２】
0004575775.tif 000003
【００２６】
以下の実施例はさらなる説明のみを目的とするものであり、開示した発明を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【００２７】
［ＲＡＤ Ｂ２５１の研究］
全般の研究設計
ＲＡＤ Ｂ２５１の研究は、無作為多施設での二重盲検並行群での研究であり、シクロスポリン（ＣｓＡ）（ネオーラル（NEORAL）登録商標）およびプレドニゾンとの組合せで使用したエベロリムス（セルチキャンＴＭ））（ＲＡＤ）対ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）の有効性と安全性についてのものであった。該研究は３期間で構成した：スクリーニング期間；ベースライン期間；および二重盲検処置期間。ベースライン評価に続いて、包含／除外基準に合致する患者であって、同種異系移植が機能しており、かつ経口投薬が寛容化した（移植後４８時間以内）ことを確認した患者につき、３群の処置群（１：１：１）の中の１群を無作為に選択した。同種異系移植の機能の判定は研究者の判断とし、適切な尿排出とクレアチニンレベルの低下の証拠にもとづいた。無作為選抜と研究投薬の最初の用量を投与した日を研究の第１日として記録した。３群の処置群を以下に記載する：
【００２８】
●  用量レベル１：０.７５ｍｇＲＡＤ（１日２回）＋ネオーラル（登録商標）＋
プレドニゾン
●  用量レベル２：１.５ｍｇＲＡＤ（１日２回）＋ネオーラル（登録商標）＋
プレドニゾン
●  比較対照：１ｇ ＭＭＦ（１日２回）＋ネオーラル（登録商標）＋プレドニゾン
【００２９】
［随伴療法］
ネオーラル（登録商標）の開始と維持
経口ＣｓＡ（ネオーラル（登録商標））の投与を６〜１２ｍｇ／ｋｇ／日（経口）で開始し、標準の標的アッセイ範囲を反映する１２時間最低濃度を維持するように調整した。ＣｓＡの静脈内投与（i.v.）は、臨床状況が要求しない限り、回避した。全血レベルはできるだけ迅速に下記にリストした治療範囲とした。これを達成した後、ＣｓＡの用量は最低血液濃度を標的範囲内に維持するためにのみ調整した。
●  １〜４週：２００〜３５０ｎｇ／ｍＬ
●  ２〜３６ヶ月：１００〜３００ｎｇ／ｍＬ
【００３０】
ＣｓＡまたはＲＡＤ測定のために採血した当日に、患者はネオーラル（登録商標）の事前投与を受け、採血の１２±１時間前に研究投薬を受けた。患者には適切なタイミングとなるように、採血の前日に投薬スケジュールを調整するように指示し、夕刻時用量投与の正確な時間を記録した。採血当日のため、患者は研究投薬とネオーラル（登録商標）を服用しなかったが、診療所に持って来て、採血終了後に服用した。
【００３１】
プレドニゾン
移植直前に、患者は１ｇまでのメチルプレドニゾロン（i.v.）、次いで、１２時間後に５００ｍｇまでのメチルプレドニゾロン（i.v.）の投与を受けた。移植手術後、できるだけ早期に、プレドニゾンの経口投与を０.３５〜２.０ｍｇ／ｋｇ／日で開始し、３０日目までに用量が２０ｍｇ／日または０.２５ｍｇ／ｋｇ／日となるように次第に減量したが、最初の６ヶ月間は５ｍｇ／日以下とならないような用量とした。
【００３２】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）予防
ＣＭＶの予防措置は、ＣＭＶに対してドナーのテストが陽性であって、受容者テストが陰性であるすべての事例で必須であった。ガンシクロビル、ＣＭＶ過免疫グロブリンまたはアシクロビルでの処置が可能であり、局所方式で投与した。ＣＭＶ陽性ドナーからＣＭＶ陰性受容者へ以外の事例については、すべて局所方式にしたがって処置した。ＣＭＶ予防措置は急性拒絶反応エピソードの抗体処置後にも推奨された。
【００３３】
ＰＣＰ予防
患者はすべてトリメトプリム−スルファメトキサゾールでも開始し、１日あたり１個の単強度錠剤として、経口投薬が寛容となった時点で開始し、移植手術後最初の６ヶ月間継続した。投与量は研究者の判断で、１個の単強度錠剤を１週間３回に減量し、さらに６ヶ月間とした。１年後の処置は局所方式に従った。トリメトプリム−スルファメトキサゾールに寛容となれない患者には噴霧化したペンタミジンまたはダプソンを投与した。
【００３４】
その他の随伴療法
研究の全処置期間、すなわち、スクリーニングの初日から最終の研究評価がすべて終了するまでの期間、研究薬物、研究予防薬および通常の患者の投薬以外の投薬は実施しなかった。この規則に対する例外は有害事象（ＡＥ）を処置するために必要な投薬にのみ適用した。他の投薬（薬局での投薬およびビタミン類を含む）の管理については事前および随伴投薬事例報告様式（Prior and Concomitant Medications Case Report Form （CRF））に詳細に記載されている。ＡＥについて必要な場合には、随伴投薬法がＡＥｓ ＣＲＦに詳細に記載され、関連文献も引用されている。
【００３５】
プロトコールにより特定した薬物以外の免疫抑制剤はすべて否定された。許容し得る抗拒絶反応療法としては、“急性拒絶反応エピソードの処置”（Treatment of Acute Rejection Episodes）のガイドラインによるメチルプレドニゾロンおよび抗リンパ球抗体療法である。レスキュー療法のためにタクロリムスまたはＭＭＦを必要とする患者は研究薬物を中断した。テルフェナジン、アステミゾールおよびシサプリドは患者が研究投薬にある間禁止した。フェノバルビタール、フェニトイン、カルバマゼピン、またはケトコナゾールの使用は痛く落胆させるものであった。
【００３６】
移植手術後、処置期間は３年とした。二重盲検処置期間、患者は７、１４および２８日目に、また月として２、３、６、９、１２、１８、２４、３０および３６ヶ月目に診察した。腎組織検査がベースライン（手術中であり得る）で、また拒絶反応の疑わしい時点で必要であった。盲検研究の薬物投与は３年で中止した。
【００３７】
一次死体生存非関連または非ＨＬＡ一致関連ドナー腎臓の移植手術を受ける予定の年齢１６〜６５歳の男女患者を本研究に加えた。研究未完のまま中断した患者は取り替えることをしなかった。本研究に参加適格であるために、各患者は包含／除外基準のすべてに合致せねばならなかった。
研究の図式
【化１】
0004575775.tif 000004
【００３８】
ＲＡＤ Ｂ２５１研究はあらたな腎移植受容者におけるＭＭＦと比較して、ＲＡＤの２通りの経口用量の安全性と有効性を評価するために設計したものであり、組織検査により証明した急性同種異系移植拒絶反応エピソード、移植片喪失または死亡の発生率により測定したものである。ＭＭＦは腎移植において広く使用されているという理由で、比較対照薬として選択した。
【００３９】
［薬理遺伝学的解析］
エベロリムス（ＲＡＤ）で処置した患者で観察されるコレステロールおよび脂質レベルの上昇と関連する遺伝因子を同定する努力において、ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験に参加した患者のゲノムポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）内の２４個の遺伝子からの４７個の一塩基多形（ＳＮＰ）について試験した。試験した４７個のＳＮＰの中、２１個は実験的に多形ではないと判定した。多形であるとした２６個の中、位置（−５１１）と（−３１）のＩＬ−１β遺伝子プロモーター中の２つのＳＮＰは、ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験に参加した患者のコレステロールレベルにおける変化に関連して、統計的に有意であることを示した。
【００４０】
ＩＬ−１β（−５１１）Ｃ→Ｔ塩基遷移（Ｔ−Ｔ）またはＩＬ−１β（−３１）Ｔ→Ｃ塩基遷移（Ｃ−Ｃ）についてホモ接合であった患者は、研究期間に受けた処置にもかかわらず、彼らの最終訪問時、総コレステロールの最小平均レベルが最高であった（それぞれｐ＝０.００１８およびｐ＝０.００１３）。（この数値は最終訪問時の絶対血清コレステロールレベルをいうが、統計的解析では、この数値が依存性変数と定義され、またベースラインでのコレステロールレベルは、自動的にベースラインレベルを考慮して、独立変数と定義された）。
【００４１】
総コレステロールレベルの上昇は、ＨＤＬおよびＬＤＬ両レベルの上昇によるものであった；（−５１１）位置でのＴ対立遺伝子または（−３１）位置でのＣ対立遺伝子についてホモ接合である患者は、最終訪問時に、最高の最小二乗平均レベルのＨＤＬ（それぞれ、ｐ＝０.０２１４およびｐ＝０.０５１４）およびＬＤＬ（それぞれ、ｐ＝０.０１５９およびｐ＝０.００９１）を示した。しかし、重要なことは、遺伝子型に関係なく、ＨＤＬとＬＤＬの比は同じままであったことである。
【００４２】
したがって、我々の知見が示唆することは、ＩＬ−１β遺伝子プロモーターの位置（−５１１）でのＴ対立遺伝子についてホモ接合であり、かつ位置（−３１）でのＣ対立遺伝子についてホモ接合である個体は、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）またはＭＭＦ／ネオーラル（登録商標）処方で処置したことにより、総血中コレステロールレベルがさらに上昇し易くなるということである。
【００４３】
［方法］
サンプル
ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験からの合計８２のユニークサンプルについて、薬理遺伝学的評価に参加するとの同意にもとづき、その遺伝子型を検討した。この数字はＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験に参加した総母集団の約１５％にあたる。各患者の血液サンプルは個々の試験施設で集め、コバンス（Covance）（ジュネーブ、スイス）に搬送した。各患者のゲノムＤＮＡはピュアージーン（PUREGENETM）ＤＮＡ分離キット（Ｄ−５０Ｋ）（ジェントラ（Gentra）、ミネアポリス、ミネソタ）を用いて、コバンスで血液から抽出した。
【００４４】
遺伝子型決定
２４遺伝子に相当する合計４７のユニーク多形について、各臨床試験のために解析した。薬物代謝、高コレステロール血症、高脂肪血症、免疫抑制および炎症に関わる候補遺伝子を本研究用に選択した。ＳＮＰアッセイは、ＯＭＩＭ、ＳＮＰ協会、遺伝子座リンクおよびｄｂＳＮＰ、およびサード・ウエーブ・テクノロジーズ・インク（ＴＷＴ、マジソン、ウィスコンシン）ウエブサイト（http://64.73.25.65:8080/coe/index.jsp）などの公共データベースからの情報を用いて設計した。遺伝子型決定アッセイ用の得られたプローブセットはＴＷＴが作製した。遺伝子型決定はＴＷＴ（９−１０）が開発したインベーダー（INVADER）（登録商標）アッセイを用い、製造業者の指示に従い、ゲノムＤＮＡ６０ｎｇにより実施した。参照文献：Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., Vol. 17, pp. 292-296 （1999）; and Ryan, Mol. Diagn., Vol. 4, pp. 135-144 （1999）。
【００４５】
（−５１１）ＩＬ−１βＳＮＰについてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、１０〜７０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１６０μＭ−ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ−ＫＣｌ、１.５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、０.６μＭ−ＩＬ−１β（−５１１）前進プライマー、０.６μＭ−ＩＬ−１β（−５１１）逆進プライマーおよび０.０３Ｕ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アップライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア）を含む２０μＬの反応液中で実施した。以下の条件で３６回の増幅を実施した：９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０秒。次いで、９種のサンプルを２％アガロースゲル上で分画（５μＬ）し、臭化エチジウム染色により可視化し、増幅を確認した。ＰＣＲ産物の１：７希釈は増幅ＤＮＡ用３８４穴バイプレックスプレートにより、ＴＷＴＳＮＰ＃１２８０６９に対し実施した。
プライマー配列は以下のとおりである：
IL-1β（-511）-前進 5’-GCAGAGCTCATCTGGCATTG-3’ （配列番号１）
IL-1β（-511）-逆進 5’-TATGTGGGACAAAG TGGAAG-3’ （配列番号２）
【００４６】
（−３１）ＩＬ−１βＳＮＰのＰＣＲは、１ｎｇのゲノムＤＮＡ、４０μＭ−ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ−ＫＣｌ、１.５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、０.７５μＭ−ＩＬ−１β（−３１）前進プライマー、０.７５μＭ−ＩＬ−１β（−３１）逆進プライマーおよび０.１５ＵゴールドＴaqＤＮＡポリメラーゼ（アップライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア）を含む２５μＬの反応液中で実施した。以下の条件で３８回の増幅を実施した：９４℃、３０秒；５８℃、３０秒；７２℃、３０秒。次いで、すべてのサンプルを２％アガロースゲル上で分画（５μＬ）し、臭化エチジウム染色により可視化し、増幅を確認した。
プライマー配列は以下のとおりである：
IL-1β（-31）-前進 5’-GCACAACGATTGTCAGGAAAAC3’ （配列番号３）; 
IL-1β（-31）-逆進 （5’-ATGCATACA CACAAAGAGGCAG-3’ （配列番号４）.
【００４７】
ＰＣＲ産物の１：１０希釈は増幅ＤＮＡ用３８４穴バイプレックスプレートにより、ＲＡＤ Ｂ２５１用のＴＷＴ ＳＮＰ＃２７４３３９に対し実施した。ＲＦＬＰ解析はＡｌｕ−Ｉ制限酵素（ニューイングランド・バイオラブス、ビバリー、マサチューセッツ）を用いて遺伝子型を決定するために使用した。ＲＦＬＰ消化物は、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１ｍＭ−ＤＴＴ（ｐＨ７.９）、８ｎｇ増幅ゲノムＤＮＡおよび０.５ｍＭ−Ａｌｕ−Ｉ酵素を含む２０μＬの反応液中で処理した。サンプルはすべて３７℃で１７時間インキュベートし、３％アガロースゲル上で分画（１９μＬ）し、臭化エチジウム染色により可視化し、バンドサイズを確認した。
【表３】
0004575775.tif 000005
【００４８】
対立遺伝子１（配列番号５）：
CTGCAATTGACAGAGAGCTCC［C］GAGGCAGAGAACAGCACCCAAGGTAGAGACCCA
対立遺伝子２（配列番号６）：
CTGCAATTGACAGAGAGCTCC［T］GAGGCAGAGAACAGCACCCAAGGTAGAGACCCA
【表４】
0004575775.tif 000006
【００４９】
対立遺伝子１（配列番号７）：
TCCTACTTCTGCTTTTGAAAGC［C］ATAAAAACAGCGAGGGAGAAACTGGCAGATACCAAACCTC
対立遺伝子２（配列番号８）：
TCCTACTTCTGCTTTTGAAAGC［T］ATAAAAACAGCGAGGGAGAAACTGGCAGATACCAAACCTC
【００５０】
［統計的解析］
２４ヶ月のlab_ｂ.sd２ＲＡＤＢ２５１臨床データセットを用い、コレステロールレベルに対する遺伝子型と処置の影響を解析するために、共分散モデルの解析を使用した。該モデルの条件は、最終コレステロールレベル、共変量としての初期コレステロールレベル、および主エフェクターとしての遺伝子型と処置である。適用し得る場合、オッズ比、９５％信頼限界、およびカイ二乗解析を計算した。統計解析はすべてＳＡＳ８.０２ソフトウエアにより実施した。多重テストの補正のために、ボンフェロニ補正を行った。
【００５１】
［結果］
ＲＡＤ Ｂ２５１研究において、ＲＡＤＢ２５１臨床試験に参加する薬理遺伝学解析に同意している各患者について、２４遺伝子に相当する４７のユニークＳＮＰを遺伝子型決定した。各それぞれの臨床試験について患者全体の分布に対する薬理遺伝学解析に同意した患者の比較を表３に示す。
【表５】
0004575775.tif 000007
【００５２】
唯一の統計的有意差は、ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験における全患者全体集団に比較して薬理遺伝学研究に使用した患者集団との間に見られた：薬理遺伝学患者集団の中の平均ＴＧＣ値とＲＡＤ Ｂ２５１患者母集団における平均値との差は、統計的に有意（ｐ＜０.００１）であることが判明した。したがって、この比較は薬理遺伝学研究に使用した患者母集団が、各治験で試験した全患者集団の典型であることを示唆する。本研究で試験した４７のＳＮＰの内、２１は実験的に多形ではないと判定した。それ故、２６のＳＮＰは下記の解析に使用した。
【００５３】
ＲＡＤ Ｂ２５１臨床データセットによる遺伝子型の統計的解析では、コレステロールレベルと有意な関連性をもつ（−５１１）位置でのＩＬ−１β遺伝子プロモーター内に多形が確認された。表４と図１に示すように、両処置群からの患者のＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）遺伝子型は共に、患者の最終訪問時に測定した総コレステロールレベルの最高上昇と相関した（ｐ＝０.００１８）。
【表６】
0004575775.tif 000008
【００５４】
同様の関連性はＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型（ｐ＝０.００１３）について観察された（表５および図２）。
【表７】
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【００５５】
この相関をさらに解析するために、ＩＬ−１β（−５１１）遺伝子型とＨＤＬおよびＬＤＬのレベル間に関連性があるかどうかを試験した。図３と表６に示すように、両処置群からの患者のＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）遺伝子型は共に、患者の最終訪問時に測定したＨＤＬの最高レベルと相関した（ｐ＝０.０２１４）。
【表８】
0004575775.tif 000010
【００５６】
すでに報告されていることであるが、ＩＬ−１β（−５１１）多形は、位置（−３１）でのＩＬ−１βプロモーターにおけるもう一つの多形に強い連鎖不平衡がある。参照：El-Omar et al., Nature, Vol. 404, pp. 398-402 （2000）。本研究において、２５４の対立遺伝子はＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験において薬理遺伝学的解析に同意している患者にて試験した。ＩＬ−１β（−５１１）および（−３１）多形には９９.２％の連鎖不平衡がある。それ故、同様の関連性がＩＬ−１β（−５１１）多形で起こり、コレステロールレベルはＩＬ−１β（−３１）多形によるものと検出され得る。ＩＬ−１β（−３１）多形に対するＲＡＤ Ｂ２５１臨床データセットの統計的解析では、コレステロールレベルとの有意な関連性が証明された。表５と図２に示すように、両処置群からの患者のＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型は共に、患者の最終訪問時に測定した総コレステロールレベルの最高上昇と相関した（ｐ＝０.００１３）。この相関をさらに解析するために、ＩＬ−１β（−３１）遺伝子型とＨＤＬおよびＬＤＬのレベル間に関連性が存在するかどうかを試験した。図４と表７に示すように、両処置群からの患者のＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型は共に、患者の最終訪問時に測定したＨＤＬの最高レベルと弱いながら相関した（ｐ＝０.０５１４）。
【表９】
0004575775.tif 000011
【００５７】
同様の相関はＬＤＬレベルでも同様に確認された（ｐ＝０.０１５９）（図５および表８）。
【表１０】
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【００５８】
より強力な相関性がＬＤＬレベルと−３１ＩＬ−１β多形に証明された（ｐ＝０.００９１；図６および表９）。
【表１１】
0004575775.tif 000013
【００５９】
重要なことは、ＨＤＬとＬＤＬの比が、遺伝子型群間で未変化のままであったことである。本研究にて示される知見は、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）処方での処置によるコレステロールレベルの持続的な上昇を経験するある種対立遺伝子をもつ個体の可能性が、該対立遺伝子をもたない個体よりも高くなることを予測している。同様の傾向がＭＭＦ／ネオーラル（登録商標）処方で処置した個体で示されたが、その結果は統計上の有意性ｐ＝０.０５に適合しなかった。
【００６０】
総血中コレステロールレベル≧２４０ｍｇ／ｄＬは上昇しすぎであると一般には考えられるので、総血中コレステロールレベルを上昇させ、最終濃度≧２４０ｍｇ／ｄＬとするために、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）またはＭＭＦ／ネオーラル（登録商標）処方で処置した後に、ＩＬ−１β（−５１１）またはＩＬ−１β（−３１）多形をもつ患者のオッズ比を決定することとした。参照：Cecil Textbook of Medicine, Goldman and Bennett, editors, Saunders, 6th Edition （2000）。
【００６１】
下記表１０に示すように、オッズ比が示すには、患者がＩＬ−１β遺伝子プロモーターの位置（−５１１）にＴを含むならば、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）処方で処理した場合、総血中コレステロールレベルが最終濃度≧２４０ｍｇ／ｄＬに上昇する可能性は５.６７倍（９５％信頼限界：１.２０〜９.０１）となり、あるいは患者がＩＬ−１β遺伝子プロモーターの位置（−３１）にＣを含むならば、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）処方で処理した場合、総血中コレステロールレベルが最終濃度≧２４０ｍｇ／ｄＬに上昇する可能性は７.２３倍（９５％信頼限界：１.２０〜９.０１）となる。これらの知見は統計的に有意であり（それぞれ、ｐ＝０.０２０７およびｐ＝０.００９６）、高コレステロール血症を容易に処置し得るため、ＲＡＤ／ネオーラル（登録商標）処方により移植手術患者を処置する際に、予防策として使用することができる。
【表１２】
0004575775.tif 000014
【００６２】
多重試験のボンフェロニの補正
補正因子は本研究で解析したＳＮＰ数のために必要である。そうするために、ボンフェロニ補正法を実施し、０.００１９のｐ値を規定した。
【数１】
0004575775.tif 000015
η＝テストＲＡＤ数（RAD_number_of_tests）
それ故、ＩＬ−１β（−５１１）とＩＬ−１β（−３１）多形および総コレステロールレベル間の知見はなお有意であると考える。
【００６３】
（−５１１）と（−３１）ＩＬ−１βＳＮＰの連鎖不平衡
ＩＬ−１β（−５１１）Ｃ→Ｔ多形が位置（−３１）に位置するＩＬ−１βプロモーター内のもう一つの多形と強力な連鎖不平衡（９９.５％）にあり、結果としてＴ→Ｃ塩基遷移を生じることは報告されている。参照：El-Omar et al., Nature, Vol. 404, pp. 398-402 （2000）。それ故、ＩＬ−１βプロモーターの位置（−５１１）にＴをもつ患者は、位置（−３１）にＣをもつであることが予知される。この知見はこれら２つの治験において試験した患者で確認される。野生型ＩＬ−１β遺伝子において、Ｔは−３１の位置に見出される。このＴはＩＬ−１βの転写開始に決定的な役割を果たすＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡＡＡＡ）の一部であるため、ＩＬ−１βの発現のために非常に重要である。一般に、ＴＡＴＡボックス配列は、転写が正しい位置で始まることを確かなものとするために、遺伝子内の正しい位置に転写機構を供給し、位置を定めることに関わっている。位置（−３１）でのＴ→Ｃ多形はこの重要なＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡＡＡＡからＣＡＴＡＡＡＡへ）を崩壊させて不活性化し、ＩＬ−１β遺伝子転写の効率的な開始を禁止する。この変化したＩＬ−１βＴＡＴＡボックス配列への転写機構の結合欠如はすでに示されている。上記参照：El-Omar。
【００６４】
したがって、ＩＬ−１βプロモーター（Ｔ→Ｃ塩基遷移を起こす位置（−３１）に位置する）内の多形またはＩＬ−１βプロモーターの−５１１（Ｃ→Ｔ）に位置する多形のいずれかと連鎖不平衡にある他の多形の存在は、ＩＭ処置中の患者に予測されるコレステロール上昇度に対して予知可能な影響をもつことになる。（−３１）多形と連鎖不平衡にある他の多形の判定手段は当業者周知である。現在既知の、または将来発見されるいずれの多形も本発明に使用可能であり、ＩＭで処置した患者のコレステロール上昇可能性の程度を予測すること、またはかかる患者にとっての処置選択判定の一助とすることができる。
【００６５】
該知見の生物学的意義
ＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型は臨床上の関連性を有する。ＩＬ−１βはコレステロールの生合成を２５％阻害することが示されている。上記参照：El-Omar。それ故、この多形の結果が意味することは、ＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）遺伝子型に相当するＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型をもつ患者はＩＬ−１βレベルが低下しており、そのためにＩＬ−１βによるコレステロール生合成の阻害力を失い、その結果、血中コレステロールレベルが上昇したことである。この型の知見はＲＡＤ Ｂ２５１の治験で観察された。表４と５および図１〜２に示すように、ＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）遺伝子型およびＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型をもつ患者は、処置に関係なく総コレステロールの最高最小二乗平均レベルを示した。
ＩＬ−１βは細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化によりＬＤＬレセプター遺伝子発現を増大させるということも報告されている。参照：Kumar et al., J. Biol. Chem., Vol. 273, pp. 15742-15748 （1998）。
【００６６】
ＬＤＬレセプター発現の上昇は、細胞内に取込まれるコレステロール量の増加につながり、その結果、血中の総コレステロールレベルが低下する。これはこの薬物が後期Ｇ１を経てＳに入る細胞の発展に必要な生化学的経路を阻害することが示されているため、ＲＡＤ（エベロリムス）に関連性をもつ。重要なことは、この過程にはＥＲＫの関与が示されていることである。それ故、ＥＲＫ活性はエベロリムスにより低下させることが可能である。エベロリムスはＥＲＫ活性を阻害するため、ＬＤＬレセプターの発現がＩＬ−１βの発現から独立してすべての患者で低下し、その結果、ＬＤＬのレベルを低下させ、したがって、エベロリムスを服用した患者の総コレステロールを低下させる。エベロリムスがＥＲＫの活性化を完全に阻害することはありそうにない。それ故、ＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）およびＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型をもつ患者は、ＬＤＬレセプターの一部発現を誘導することができる。しかし、これらの患者はＩＬ−１βのレベルが非常に低い、そのため、ＬＤＬレセプターの発現が低く、その結果、細胞内に取込まれるコレステロール量が低下し、血中コレステロールレベルが上昇する。したがって、この説明はＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型をもつ患者に観察される最高レベルのコレステロールの説明となる。有意義なことは、ＩＬ−１β（−３１）（Ｃ−Ｃ）遺伝子型に相当するＩＬ−１β（−５１１）（Ｔ−Ｔ）遺伝子型をもつ患者は、他のＩＬ−１β遺伝子型をもつ患者に比較して、有意に高いＬＤＬ（ｐ＝０.０１５９）を有することであった（図３および表４）。
【００６７】
ＳＮＰの同定と特性化
ＳＮＰの同定と特性化には多くの異なる技法が使用し得るが、たとえば、一本鎖コンホメーション多形解析、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）によるヘテロ二本鎖解析、直接ＤＮＡ配列決定および計算法などである。参照：Clin. Chem., Vol. 47, pp. 164-172 （2001）。公共データベースの豊富な配列情報のお陰で、計算手段を使用し、所定の遺伝子についてそれぞれに提出された配列（ｃＤＮＡまたはゲノム配列のいずれか）を整列させることにより、コンピュータ内でＳＮＰを同定することができる。実験的に得られたＳＮＰとコンピュータで得たＳＮＰとを比較すると、ＳＮＰファインダー（http://Ipgws.nci.nih.gov:82/perl/snp/snp_cgi.pl）で見つかった候補ＳＮＰの５５％が実験的にも発見されたことを示した。参照：Cox et al., Hum. Mutal., Vol. 17, pp. 141-150 （2001）。しかし、これらのコンピュータによる方法では真のＳＮＰの２７％を見出しただけであった。
【００６８】
最も一般的なＳＮＰ型決定方法は、現在、ハイブリッド形成、プライマー伸張および開裂法である。これら方法のそれぞれは適切な検出システムに接続しなければならない。検出技法としては、蛍光偏光（参照：Chan et al., Genome Res., Vol. 9, pp. 492-499 （1999））、ピロリン酸放出の発光度検出（ピロ配列決定）（参照：Ahmadiian et al., Anal. Biochem., Vol. 280, pp. 103-110 （2000））、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）にもとづく開裂アッセイ、ＤＨＰＬＣ、および質量分析法（参照：Shi, Clin. Chem., Vol. 47, pp. 164-172 （2001）および米国特許第６,３００,０７６Ｂ１号公報）などである。その他のＳＮＰの検出および特性化法は米国特許第６,２９７,０１８Ｂ１号および６,３００,０６３Ｂ１号公報に開示された方法である。上記文献の開示はその全文を参照により本明細書の一部とする。
【００６９】
特に好適な態様において、多形の検出は、いわゆるインベーダー（INVADERTM）技法（サード・ウエーブ・テクノロジーズ・インク（ＴＷＴ、マジソン、ウィスコンシン）から入手可能）により実施し得る。本アッセイ法において、特異的上流“インベーダー”オリゴヌクレオチドおよび部分的に重なり合う下流のプローブが共に相補性ＤＮＡ鋳型に結合したとき、特異的構造を形成する。この構造をクリバーゼ（Cleavase）酵素が特定の部位で認識し、切断する；その結果、プローブオリゴヌクレオチドの５’フラップを放出する。次いで、このフラグメントが反応混合物に含まれる合成二次標的と二次蛍光標識シグナルプローブに関し、“インベーダー”オリゴヌクレオチドとして作用する。これがクリバーゼ酵素による二次シグナルプローブの特異的開裂を生じる。蛍光共鳴エネルギー移動し得る色素分子で標識したこの二次プローブが開裂するとき、蛍光シグナルを発生する。クリバーゼ酵素は重なり合うＤＮＡ配列またはフラップにより形成される構造に相関した緊縮要件を有し、それ故、下流ＤＮＡ鎖上、開裂部位の直ぐ上流の単一塩基対ミスマッチを特異的に検出するために使用し得る。参照：Ryan et al., Molecular Diagnosis, Vol. 4, No 2, pp. 135-144 （1999）; and Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., Vol. 17, pp. 292-296 （1999）; 参照関連米国特許第５,８４６,７１７号および６,００１,５６７号公報（これらの開示はその全文を参照により本明細書の一部とする）。
【００７０】
一部の態様において、組成物は２つ以上の多形部位でのヌクレオチドの同一性を同時にプローブするための２つ以上の異なる標識の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含む。さらに予測されることは、プライマー組成物が、対立遺伝子特異的プライマー対の２つ以上のセットを含み、多形部位を含む２ヶ所以上の領域の同時標的化と増幅を可能とすることである。
【００７１】
本発明のＩＬ−１β遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、マイクロチップ、ビーズまたはガラススライドなどの固体表面上に固定するか、またはその上で合成し得る（参照例：国際特許ＷＯ９８／２００２０およびＷＯ９８／２００１９）。かかる固相化遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは様々な多形検出アッセイ法、たとえば、限定されるものではないが、プローブハイブリッド形成およびポリメラーゼ伸張アッセイなどにおいて使用し得る。固相化した本発明のＩＬ−１β遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、多重遺伝子の多形についてＤＮＡサンプルを同時に迅速に選抜するために設計したオリゴヌクレオチドの定序アレイを含み得る。
【００７２】
本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、３’末端ヌクレオチドまたは好ましくは３’末端前ヌクレオチドを有し、それが特定のＳＮＰの唯一のヌクレオチドに相補性であり、それによって、そのヌクレオチドを含む対立遺伝子が存在する場合にのみ、ポリメラーゼ仲介伸張のためにプライマーとして作用する。コーディングまたは非コーディング鎖にハイブリッド形成する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが本発明の期待するものである。ＩＬ−１β遺伝子多形を検出するためのＡＳＯプライマーは、当業者既知の技法により開発し得た。
【００７３】
本発明の他の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは、ここに同定した新規多形部位の１つの下流にある標的領域に位置する１個ないし数個のヌクレオチドにハイブリッド形成する。かかるオリゴヌクレオチドは本明細書に記載した新規多形の１つを検出するポリメラーゼ仲介プライマー伸張法に有用であり、したがって、かかる遺伝子型決定オリゴヌクレオチドは“プライマー伸張オリゴヌクレオチド”と本明細書ではいう。好適な態様において、プライマー伸張オリゴヌクレオチドの３’末端は、多形部位に隣接して位置するヌクレオチドに相補性のデオキシヌクレオチドである。
【００７４】
もう一つの態様において、本発明は別個の容器に詰めた少なくとも２種類の遺伝子型決定オリゴヌクレオチドを含んでなるキットを提供する。該キットは、別個の容器に詰めた他の成分、たとえば、ハイブリッド形成バッファー（該オリゴヌクレオチドをプローブとして使用すべき場合）を含み得る。あるいは、該オリゴヌクレオチドが標的領域の増幅に使用される場合、該キットは、別個の容器に詰めて、ポリメラーゼおよびＰＣＲなどのポリメラーゼが仲介するプライマー伸張を最適化する反応バッファーを含み得る。上記のオリゴヌクレオチド組成物およびキットは個体におけるＩＬ−１β遺伝子の遺伝子型決定および／またはハプロタイプ決定の方法に有用である。
【００７５】
本明細書にて使用する場合、“ＩＬ−１β遺伝子に関するハプロタイプ”とは、ＩＬ−１β遺伝子の−５１１および−３１位置での多形の組合せからなるハプロタイプをいうものとし、これらのハプロタイプは以下の方法で命名するものとする；ＩＬ−１β遺伝子の多形部位−５１１でＣからＴへの多形（配列Ｘ０４５００の位置１４２３）およびＩＬ−１β遺伝子の多形部位−３１でＴからＣへの多形（配列Ｘ０４５００の位置１９０３）の両方がＩＬ−１β遺伝子の１コピーに存在する場合、ハプロタイプは“高コレステロール”と呼ぶものとする。逆に、これら多形の両方がＩＬ−１β遺伝子の所定のコピーに存在せず、したがって、このＩＬ−１β遺伝子の部位―３１のヌクレオチドがＴであり、このＩＬ−１β遺伝子の部位−５１１のヌクレオチドが、ＩＬ−１β遺伝子においてＣである場合、ハプロタイプは記載の染色体中において“低コレステロール”と呼ぶものとする。
【００７６】
遺伝子型決定法の一態様は、個体から個体に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピー、またはそのフラグメントを含んでなる核酸混合物を単離し、２つのコピーにおける１ヶ所以上の多形部位でのヌクレオチド対の同一性を判定し、ＩＬ−１β遺伝子型を個体に対応させることからなる。当業者なら直ぐに理解するように、個体の遺伝子の２つのコピーは同じ対立遺伝子であり得るし、または異なる対立遺伝子であり得る。とりわけ好適な態様において、遺伝子型決定法は各多形部位でのヌクレオチド対の同一性を判定することからなる。
【００７７】
典型的には、核酸混合物またはタンパク質は、個体から採取した生体サンプル、たとえば、血液サンプルまたは組織サンプルなどから単離する。適当な組織サンプルとは、全血、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、口腔内塗抹、皮膚、および特定の臓器組織、たとえば、筋肉もしくは神経組織および毛髪などのバイオプシーである。核酸混合物はゲノムＤＮＡ、メッセンジャーポリリボヌクレオチド（ｍＲＮＡ）、またはｃＤＮＡからなるが、後者の２種についてはＩＬ−１β遺伝子を発現する臓器から生体サンプルを採取しなければならない。さらに、当業者の理解するところであるが、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物は、イントロン、５’および３’非転写領域またはプロモーター領域に位置する多形の検出には使用しない。ＩＬ−１β遺伝子フラグメントが単離される場合、それについて遺伝子型決定するには多形部位を含まなければならない。
【００７８】
ハプロタイプ決定法の一態様は、個体から個体に存在するＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーの一方のみ、またはそのフラグメントを含んでなる核酸分子を単離し、当該コピーにおける１ヶ所以上の多形部位でのヌクレオチドの同一性を判定し、ＩＬ−１βハプロタイプを個体に対応させることからなる。該核酸はＩＬ−１β遺伝子の２つのコピーまたはフラグメントを分離し得る方法を用いて単離し得るが、上記のＩＬ−１βイソ遺伝子の調製法などによるものであって、制限されるものではなく、標的インビボクローニング法が好適な方法である。
【００７９】
当業者であれば容易に認めるように、個体のクローンは個体に存在する２つのＩＬ−１β遺伝子コピーの１つについて、ハプロタイプの情報を提供するだけである。ハプロタイプの情報が個体の他のコピーについて欲しい場合には、追加のＩＬ−１βクローンを試験する必要がある。一般的に、個体におけるＩＬ−１β遺伝子の両コピーについてハプロタイプ決定する確率を９０％以上とするためには、少なくとも５つのクローンを試験すべきである。特に好適な態様においては、各多形部位でのヌクレオチドを同定する。
【００８０】
好適な態様において、ＩＬ−１βハプロタイプ対は、個体に存在するＩＬ−１β遺伝子の各コピーにおける１ヶ所以上の多形部位でのヌクレオチドの位相配列を同定することにより、個体について判定する。特に好適な態様において、ハプロタイプ決定法は、ＩＬ−１β遺伝子の各コピーにおける各多形部位でヌクレオチドの位相配列を同定することを含む。遺伝子の両コピーについてハプロタイプ決定する場合、同定ステップは、好ましくは別個の容器に収容した遺伝子の各コピーにより実施する。しかし、２つのコピーが異なるタグ標識で標識してあるか、またはさもなくば別々に識別し得るかもしくは同定し得る場合、ある場合には同じ容器中でこの方法を実施することが可能であるとも想定し得る。たとえば、遺伝子の第一および第二コピーをそれぞれ異なる第一および第二蛍光色素により標識し、さらに第三の異なる蛍光色素で標識した対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用して多形部位（１または複数部位）をアッセイする場合、第一および第三色素の組合せを検出することで第一遺伝子コピー中の多形を同定し、一方、第二および第三色素の組合せを検出することで第二遺伝子コピー中の多形を同定する。
【００８１】
遺伝子型決定法およびハプロタイプ決定法の両方法において、多形部位（１または複数部位）でのヌクレオチド（またはヌクレオチド対）の同一性は、多形部位（１または複数部位）を含む標的領域（１または複数箇所）をＩＬ−１β遺伝子の１コピーもしくは両コピーまたはそのフラグメントから直接増幅することにより判定し、増幅した領域（１または複数箇所）の配列は常套法で決定する。当業者であれば容易に認めるように、同じヌクレオチドは当該部位でホモ接合である個体における多形部位で２回検出し、一方、２つの異なるヌクレオチドは該個体が当該部位に対してヘテロ接合である場合に検出される。該多形は直接同定し得るものであり、陽性型同定として知られるか、または推論して陰性型同定という。たとえば、ＳＮＰが対照母集団においてグアニンとシトシンであることが分かっている場合、一つの部位は当該部位でホモ接合である個体すべてについてグアニンまたはシトシンのいずれかであると明確に判定し得るし、個体が当該部位でヘテロ接合である場合には、グアニンおよびシトシンの両方であると判定し得る。あるいは、該部位はグアニンではない（したがって、シトシン／シトシン）か、またはシトシンではない（したがって、グアニン／グアニン）と否定的に判定し得る。
【００８２】
さらに、本明細書に記載した新規多形部位のいずれかに存在する対立遺伝子の同一性は、対象である該多形部位と連鎖不平衡にあるここには記載していない多形部位を遺伝子型決定することにより間接的に判定することができる。１部位に特定の変異体が存在し、第二部位のもう一つの変異体の予測可能性を高めるならば、２つの部位は連鎖非平衡であると言われる。参照：Stevens, Mol. Diag., Vol. 4, pp. 309-317 （1999）。ここに開示された多形部位と連鎖不平衡にある多形部位は、該遺伝子の領域に、またはここでは試験していない他のゲノム領域に位置し得る。ここに記載した新規多形部位と連鎖不平衡にある多形部位の遺伝子型決定は、限定されるものではないが、多形部位での対立遺伝子の同一性を検出する上記方法のいずれかにより実施し得る。
【００８３】
標的領域（１または複数箇所）はオリゴヌクレオチド配向増幅法、たとえば、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４,９６５,１８８号公報）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（参照：Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 189-193 （1991）; 国際特許出願ＷＯ９０／０１０６９号公報）、およびオリゴヌクレオチド連結反応アッセイ（ＯＬＡ）（参照：Landegren et al., Science, Vol. 241, pp. 1077-1080 （1988））などにより増幅し得る。かかる方法においてプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドは、多形部位を含むかあるいはそこに隣接する核酸の領域に特異的にハイブリッド形成する。典型的には、該オリゴヌクレオチドはその長さが１０個ないし３５個のヌクレオチドであり、好ましくは１５個ないし３０個のヌクレオチドからなる。最も好ましくは、該オリゴヌクレオチドは２０個〜２５個のヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドの確かな長さは、当業者が通常考え、また実施する際の多くのファクターに左右される。
【００８４】
他の既知核酸増幅手法を使用して標的領域を増幅することができるが、その手法としては転写にもとづく増幅システム（参照：米国特許第５,１３０,２３８および５,１６９,７６６号公報；欧州特許ＥＰ３２９,８２２号公報；および国際特許ＷＯ８９／０６７００号公報）および等温法である。参照：Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 392-396 （1992）。
【００８５】
標的領域における多形は、技術上既知の数種のハイブリッド形成にもとづく方法の一つにより、増幅の前または後にアッセイすることもできる。典型的には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをかかる方法の実施に利用する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは異なる標識化プローブ対として使用可能であり、その場合、対の一方は標的配列の１変異体に完全な合致を示し、他方は別の変異体に完全な合致を示す。一部態様において、１ヶ所を超える多形部位が対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対のセットを用い、一度に検出し得る。好ましくは、セットのメンバーは、検出すべき多形部位のそれぞれにハイブリッド形成したときに、互いに５℃以内の融点、より好ましくは２℃以内の融点を有する。
【００８６】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの標的オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成は、両因子を溶液として実施するか、またはかかるハイブリッド形成はオリゴヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドが固体支持体に共有結合として、または非共有的に附着する場合に実施し得る。附着には、たとえば、抗体−抗原相互作用、ポリ−Ｌ−Ｌｙｓ、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン、塩橋、疎水性相互作用、化学的結合、ＵＶ架橋ベーキングなどが仲介する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは固体支持体上で直接合成するか、または合成に続いて固体支持体に附着させ得る。本発明の検出法での使用に適する固体支持体は、シリコン、ガラス、プラスチック、紙などで作られた基板であり、たとえば、ウエル（９６穴プレートなどの）、スライド、シート、膜、ファイバー、チップ、皿、およびビーズなどに加工し得るものである。固体支持体は処理、被覆または誘導化して対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドまたは標的核酸の固相化を容易にすることもできる。
【００８７】
個体のＩＬ−１β遺伝子の遺伝子型またはハプロタイプは、該遺伝子のコピーの一方または両方を含む核酸サンプルを、国際特許出願ＷＯ９５／１１９９５に記載されているような核酸アレイおよびサブアレイにハイブリッド形成させることによっても判定し得る。該アレイは遺伝子型またはハプロタイプに含まれているはずの多形部位のそれぞれを提示する一連の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含む。
【００８８】
多形の同一性はミスマッチ検出技法を用いても判定し得る；該方法は限定されるものではないが、リボプローブを用いるＲＮアーゼ保護法（参照：Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 7575 （1985）; and Meyers et al., Science, Vol. 230, p. 1242 （1985））および大腸菌mutＳタンパク質などのヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質を用いる方法などである。参照：Modrich, Ann. Rev. Genet., Vol. 25, pp. 229-253 （1991）。別法として、変異体対立遺伝子は一本鎖コンホメーション多形（ＳＳＣＰ）解析（参照：Orita et al., Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 （1989）; and Humphries et al., Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Elles, Ed., pp. 321-340 （1996））または変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）によって同定し得る。参照：Wartell et at., Nucl. Acids Res., Vol. 18, pp. 2699-2706 （1990）; and Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 232-236 （1989）。
【００８９】
また、ポリメラーゼ仲介プライマー伸張法を用いて多形を同定することもできる。かかる方法の幾つかは特許および科学文献に記載されており、“遺伝的ビット分析”法（国際特許出願ＷＯ９２／１５７１２号公報）およびリパーゼ／ポリメラーゼ仲介遺伝的ビット分析（米国特許第５,６７９,５２４号公報）を包含する。関連方法は国際特許出願ＷＯ９１／０２０８７、ＷＯ９０／０９４５５、ＷＯ９５／１７６７６、米国特許第５,３０２,５０９および５,９４５,２８３号公報に開示されている。多形を含む伸張プライマーは米国特許第５,６０５,７９８号公報に記載されているように質量分析法により検出し得る。もう一つのプライマー伸張法は対立遺伝子特異的ＰＣＲである。参照：Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 17, p.8392 （1989）; Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 19, pp. 6877-6882 （1991）; WO93/22456;および Turki et al., J. Clin. Invest., Vol. 95, pp. 1635-1641 （1995）。さらに、多重多形部位はワレイスら（Wallace et al. （ＷＯ８９／１０４１４））が記載しているように、対立遺伝子特異的プライマーのセットを用いて核酸の多重領域を同時に増幅することにより検討し得る。
【００９０】
好適な態様において、各民族的地理的群についてのハプロタイプ頻度データは、それがハーディ−ワインバーグ平衡と矛盾がないかを判定するために試験した。ハーディ−ワインバーグ平衡（参照：Hartl et al., Principles of Population Genomics, Sinauer Associates, 3rd Edition, Sunderland, MA （1997））は、ハプロタイプ対Ｈ１／Ｈ２を見出す頻度が、もしＨ１≠Ｈ２であれば、ＰＨ−Ｗ（Ｈ１／Ｈ２）＝２ｐ（Ｈ１）ｐ（Ｈ２）に等しく、もしＨ１＝Ｈ２であればＰＨ−Ｗ（Ｈ１／Ｈ２）＝ｐ（Ｈ１）ｐ（Ｈ２）に等しいと仮定する。観察されるハプロタイプ頻度と予測されるハプロタイプ頻度との間の統計的有意差は、母集団における有意な近親交配、遺伝子に対する強い選択圧、サンプル採取の偏り、および／または遺伝子型決定過程における誤差などの１つ以上のファクターによるものである。もしハーディ−ワインバーグ平衡から大きな偏差が民族的地理的群に観察されるならば、その偏差がサンプル採取の偏りによるものかどうかを見るために、その群の個体数を増加させることができる。サンプルサイズを大きくしても観察されるハプロタイプ対の頻度および予測される頻度間の差が小さくならない場合には、直接的ハプロタイプ決定法、たとえば、クラスパー・システム（CLASPER SystemTM）技法（米国特許第５,８６６,４０４号明細書）、ＳＭＳまたは対立遺伝子特異的長距離ＰＣＲなどを使用して、個体のハプロタイプ決定を考慮してもよい。参照：Michalotos-Beloin et al., Nucl. Acids Res., Vol. 24, pp. 4841-4843 （1996）。
【００９１】
ＩＬ−１βハプロタイプ対を予知するこの方法の一態様において、対応させるステップは以下の解析を実施することからなる。先ず、可能性のあるハプロタイプ対のそれぞれを対照母集団のハプロタイプ対と比較する。一般に、対照母集団におけるハプロタイプ対の一つのみが可能性のあるハプロタイプ対と合致し、その対をその個体に対応させる。時により、対照ハプロタイプ対に提示される唯一のハプロタイプは、個体に対し可能性のあるハプロタイプ対と矛盾せず、そのような場合には、個体にはこの既知のハプロタイプと新しいハプロタイプを含むハプロタイプ対を対応させる；新しいハプロタイプは可能性のあるハプロタイプ対から既知のハプロタイプを差し引くことにより誘導されるものである。希な事例において、対照母集団には可能性のあるハプロタイプ対と調和するハプロタイプは存在しない；あるいは多重対照ハプロタイプ対は可能性のあるハプロタイプ対と矛盾しない。かかる事例において、個体は好ましくは、直接分子ハプロタイプ決定法、たとえば、クラスパー・システム（CLASPER SystemTM）技法（米国特許第５,８６６,４０４号明細書）、ＳＭＳまたは対立遺伝子特異的長距離ＰＣＲなどを使用してハプロタイプ決定する。参照：Michalotos-Beloin et al., 上記。
【００９２】
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【００９３】
［引用文献］
本明細書に引用した文献は、それぞれ個々の出版物または特許または特許出願が具体的かつ個別的にその全文を目的の如何を問わず参照により取込むことを表明したと同様の程度に、すべてその全文を目的の如何を問わず参照により本明細書の一部とする。本明細書の文献についての考察は、これらの著者がなした主張を要約しようとしただけのものであり、いずれの文献も先行技術を構成すると認めたものではない。出願人は引用文献の正確さおよび適切さについて争う権利を保有する。
【００９４】
さらに、本明細書中に引用したジェンバンク受託番号、ユニジーン・クラスター番号およびタンパク質受託番号は、それぞれのかかる番号が具体的かつ個別的にその全文を目的の如何を問わず参照により取込むことを表明したと同様の程度に、すべてその全文を目的の如何を問わず参照により本明細書の一部とする。
【００９５】
本出願に記載した特定の態様は、本発明の個々の側面を単に説明するためのものであって、本発明を制限しようとするものではない。当業者にとって明らかなように、本発明ではその精神と範囲から逸脱することなく、多くの改良および変更をなし得る。本明細書に列挙したことに加えて、本発明の範囲内で機能的に等価な方法および装置が、これまでの記載と添付の図面から、当業者には明らかである。かかる改良および変更も添付の請求項の範囲内に包含されるものとする。本発明は添付の請求項によってのみ制限されるものであり、その請求項に等価のすべての範囲とともにかかる請求項には権利がある。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−５１１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均総コレステロールレベル。
【図２】ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−３１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均総コレステロールレベル。
【図３】ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−５１１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＨＤＬコレステロールレベル。
【図４】ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−３１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＨＤＬコレステロールレベル。
【図５】ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−５１１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＬＤＬコレステロールレベル。
【図６】ＲＡＤ Ｂ２５１臨床試験内でまとめたすべての処置群における（−３１）ＩＬ−１βＣＣ、ＣＴまたはＴＴ遺伝子型と比較したＬＳ平均ＬＤＬコレステロールレベル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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