(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを含み、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターを、宿主に導入することを特徴とする、宿主のホウ素吸収活性を促進する方法：
［１］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［２］配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［３］配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［４］配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［５］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ。
【請求項２】
宿主が酵母又は植物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを含み、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターが導入され、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現する形質転換体を、ホウ素吸収活性が促進された形質転換体として使用する方法：
［１］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［２］配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［３］配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［４］配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［５］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４】
形質転換体が酵母又は植物であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを含み、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターが導入され、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現する形質転換体に、被検物質の存在下、ホウ酸を接触させ、細胞内へのホウ素の取り込みの程度を測定・評価することを特徴とするホウ素吸収促進活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法：
［１］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［２］配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［３］配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［４］配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［５］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ。
【請求項６】
形質転換体が酵母又は植物であることを特徴とする請求項５記載のホウ素吸収促進活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
以下の（ｉ）〜（iii）のいずれかに記載のタンパク質を、吸収型ホウ素トランスポーターとして使用する方法：
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質：
（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質：
（iii）配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホウ素吸収促進活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウ素は、高等植物の生育に必須な微量要素である(例えば、非特許文献１参照)。高等植物においてホウ素は、細胞壁中でペクチン質多糖の一種であるラムノガラクツロナンII(ＲＧ−II)と複合体を形成し(例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照)、植物の細胞壁の構造を維持する機能に関与していることが知られている。さらに、ＲＧ−IIに含まれるＬ-フコース残基がＬ-ガラクトースに置き換わっているｍｕｒ１変異株を用いた解析で、ホウ酸アニオンがエステル結合により細胞壁中のＲＧ−IIのシスジオールを架橋することが、植物の生育に必須であることも知られている（非特許文献５参照）。【０００３】
ホウ酸はｐＫａが９．２４の弱酸で、細胞内のｐＨ(７．５)では９８％以上がＢ（ＯＨ）３、２％以下がＢ（ＯＨ）４−の形で存在すると考えられ、細胞外のｐＨ(５．５)では、９９．９５％がＢ（ＯＨ）３、０．０５％以下がＢ（ＯＨ）４−の形で存在すると考えられる (非特許文献６参照)。そのため、ホウ素は主に無電荷のＢ（ＯＨ）３の形で土壌より吸収されると考えられている。無電荷のホウ酸は膜透過性が高いと考えられることから、長い間、拡散によってのみ膜を透過すると考えられてきた。しかし、膜の脂質組成がホウ素の透過性に影響を与えることが、人工膜とシロイヌナズナの変異株を用いて示された（非特許文献７参照）。【０００４】
また、ホウ素の細胞への吸収や植物体内の移行には、トランスポーターを介したホウ素の能動輸送も関与していることが知られる。本発明者らは、生物界で初めて排出型ホウ素トランスポーターＢＯＲ１をモデル植物であるシロイヌナズナより単離し（例えば、特許文献１参照）、ＢＯＲ１が低ホウ素栄養条件下で導管への積極的なホウ素輸送を担っていることを示した（例えば、非特許文献８参照）。しかし、ＢＯＲ１は排出型のトランスポーターであり、植物体内ではホウ素の移行に関わってはいるものの、植物体の外部からのホウ素吸収には関与していない。植物体の外部からのホウ素吸収に関与する輸送体は不明であった。【０００５】
さらに、ホウ素の吸収に関与する機構として、チャネルであるMajor intrinsic proteins(ＭＩＰｓ)を介した促進輸送が示唆されている。例えば、ＭＩＰファミリーに属するＺｍＰＩＰ１をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させると、ホウ素の透過性が３０％増加することが示された(非特許文献９参照)。さらに、ズッキーニの体内に取り込まれる１０Ｂの量が、ＭＩＰタンパク質の阻害剤であるＨｇＣｌ２の存在下で４０−９０％阻害され、２-メルカプトエタノールの添加で回復することが示された（非特許文献１０参照）。また同時に、ホウ素の取り込みは尿素などの無電荷低分子と競合することも示された。これらの事実から、インタクトな植物におけるホウ素の吸収にＭＩＰが関与していることが示唆された。【０００６】
ＭＩＰファミリーは水チャネル (アクアポリン)を含む一群の膜タンパク質で、生物に広く存在する。ＭＩＰファミリーの基本構造は、６回の膜貫通領域と、前半と後半に１回ずつのＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａモチーフ(ＮＰＡモチーフ)である(非特許文献１２参照)。ＭＩＰファミリーのいくつかのタンパクについては水の他にもグリセロールなどの無電荷低分子のチャネルとして働くことが示されている(非特許文献１１参照)。シロイヌナズナのＭＩＰ遺伝子はゲノムに３５種類存在し、塩基配列の相同性から４つのサブファミリーに分けられ、それぞれＰＩＰ(plasma membrane intrinsic protein)、ＴＩＰ(tonoplast intrinsic protein)、ＮＩＰ(NOD-26-like intrinsic protein)、ＳＩＰ(small basic intrinsic protein)と名付けられた(非特許文献１２参照)。ＰＩＰは細胞膜局在型、ＴＩＰは液胞膜局在型のアクアポリンである。ＮＩＰはダイズの根粒内のペリバクテロイド膜で発現しているＮＯＤ２６(非特許文献１３参照)に配列が近いグループで、ＮＯＤ２６以外は植物における局在の報告がない。ＳＩＰは配列の相同性から最近見つかったが、局在についても機能についてもまだ報告がない(非特許文献１２参照)。【０００７】
ＮＩＰサブファミリーについては、物質の透過に関して以下のような報告がある。シロイヌナズナのＮＩＰ１；１(ＮＬＭ１)は、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いたスウェリングアッセイにより、水の輸送活性を持つことが示唆された(非特許文献１４参照)。ダイズのＮＯＤ２６は、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いたスウェリングアッセイにより水の輸送活性を持つこと、単離したダイズの共生膜を用いてグリセロールとホルムアミドの輸送活性を持つことが示唆された(非特許文献１５参照)。さらに、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いたスウェリングアッセイによっても、グリセロールの輸送活性を持つことが示唆された(非特許文献１６参照)。また、アンモニアガスの輸送活性を持つこと(非特許文献１７参照)やイオンチャネルとしての機能(非特許文献１８参照)も示唆されている。シロイヌナズナのＮＩＰ１；１、ＮＩＰ１；２は、酵母を用いた吸収実験と相補実験により、グリセロールの輸送活性を持つことが示唆された(非特許文献１９参照)。また、ミヤコグサのＬＩＭＰ２はアフリカツメガエルの卵母細胞を用いたスウェリングアッセイにより、水とグリセロールの輸送活性を持つことが示唆された(非特許文献２０参照)。さらに、ズッキーニのＮＩＰ１は酵母を用いた吸収実験と相補実験により、尿素の輸送活性を持つことが示唆された(非特許文献２１参照)。上記のように、ＮＩＰサブファミリーのタンパク質は、水だけでなくグリセロールや尿素など他の低分子の輸送活性を持つことが示唆されてきた。しかし、ホウ素吸収促進活性を有するタンパク質の同定には至っていなかった。【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２６２８７２号公報
【非特許文献１】Loomis, W.D. and Durst, R.W. (1992). Chemistry and biology of boron. Biofactors 3, 229-239
【非特許文献２】Kobayashi, M., Matoh, T., and Azuma, J.I. (1996). Two chainsof rhamnogalacturonan II are cross-linked by borate-diol ester bonds in higher plant cell walls. Plant Physiol. 110, 1017-1020
【非特許文献３】Ishii, T. and Matsunaga, T. (1996). Isolation and characterization of a boron-rhamnogalacturonan-II complex from cell walls of sugar beet pulp. Carbohyd. Res. 284, 1-9
【非特許文献４】O’ Neill, M.A., Warrenfeltz, D., Kates, K.,Pellerin, P., Doco, T., Darvill, A.G., and Albersheim, P. (1996). Rhamnogalacturonan-II, a pectic polysaccharide in the walls of growing plant cell, forms a dimmer that is covalently by a borate ester. J. Biol.Chem. 271, 22923-22930
【非特許文献５】O’ Neill, M.A., Eberhard, S., Albersheim, P., and Darvill, A.G. (2001). Requirement of borate cross-linking of cell wall rhamnogalacturonanII for Arabidopsis growth. Science 294, 846-849
【非特許文献６】Brown, P.H., Bellaloui, N., Wimmer, M.A., Bassil, E.S., Ruiz, J., Hu, H., Pfeffer, H., Dannel, F., and Romheld, V. (2002). Boron in plant biology. Plant Biol. 4, 205-223
【非特許文献７】Dordas, C. and Brown, P.H. (2000). Permiability of boric acid across lipid bilayers and factors affecting it. J. Membr. Biol. 175, 95-103
【非特許文献８】Takano, J.; Noguchi, K.; Yasumori, M.; Kobayashi, M.; Gajdos, Z.; Miwa, K.; Hayashi, H.; Yoneyama, T.; Fujiwara, T. (2002) Arabidopsis borontransporter for xylem loading. Nature 420 (6913): 337-340
【非特許文献９】Dordas, C., Chrispeels, M.J., and Brown, P.H. (2000). Permiability and channel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles isolated from squash roots. Plant Physiol. 124, 1349-1361
【非特許文献１０】Dordas, C. and Brown, P.H. (2001). Evidence for chanel mediated transport of boric acid in squash (Cucurbita pepo). Plant Soil 235, 95-103
【非特許文献１１】Tyerman, S.D., Niemietz, C.M., and Bramley, H. (2002). Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194
【非特許文献１２】Johanson, U., Karlsson, M., Johansson, I., Gustavsson, S.,Sjovall, S., Fraysee, L., Weig, A.R., and Kjellbom, P. (2001). The complete set of genes encoding major intrinsic proteins in arabidopsis provides a framework for a new nomenclature for major intrinsic proteins in plants. Plant Physiol. 126, 1358-1369
【非特許文献１３】Weaver, C.D., Crombie, B., Stacey, G., and Roberts, D.M. (1991). Calcium-dependent phosphorylation of symbiosome membrane-proteins from nitrogen-fixing soybean nodules - evidence for phosphorylation of nodulin-26. Plant Physiol. 95, 222-227
【非特許文献１４】Weig, A.R., Deswarte, C., Chrispeels, M.J. (1997). The major intrinsic protein family of Arabidopsis has 23 members that form three distinct groups with functional aquaporins in each group. Plant Physiol. 114, 1347-1357
【非特許文献１５】Rivers, R.L., Dean, R.M., Chandy, G., Hall, J., Roberts, D.M., and Zeidel, M.L. (1997). Functional analysis of nodulin 26, an aquaporin in soybean root nodule symbiosomes. J. Biol. Chem. 272, 16256-16261
【非特許文献１６】Dean, R.M., Rivers, R.L., Zeidel, M.L., and Roberts, D.M. (1999). Purification and functional reconstitution of soybean nodulin 26. An aquaporin with water and glycerol transport properties. Biochemistry 38, 347-353
【非特許文献１７】Niemietz, C.M., and Tyerman S.D. (2000). Channel-mediated permeation of ammonia gas through the peribacteroid membrane of soybean nodules.FEBS Lett. 465, 110-114
【非特許文献１８】Weaver, C.D., Shomer, N.H., Louis, D.F., and Roberts, D.M.(1994). Nodulin 26, a nodule-specific symbiosome membrane protein form soybean,is an ion channel. J. Biol. Chem. 269, 17858-17862
【非特許文献１９】Weig, A.R., and Jakob, C. (2000). Functional identification of the glycerol permease activity of Arabidopsis thaliana NLM1 and NLM2 proteins by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 481, 293-298
【非特許文献２０】Guenther, J.F., Roberts, D.M. (2000). Water-selective and multifunctional aquaporins from Lotus Japonicus nodules. Planta 210, 741-748
【非特許文献２１】Klebl, F., Wolf, M., and Sauer, N. (2003). A defect in the yeast plasma membrane urea transporter Dur3p is complemented by CpNIP1, a Nod26-like protein from zucchini (Cucurbita pepo L.), and by Arabidopsis thaliana delta-TIP or gamma-TIP. FEBS Lett. 547, 69-74
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ホウ素の環境中からの取込みは重要な制御段階であるが、ホウ素吸収促進活性を有するタンパク質は知られていなかった。植物体におけるホウ素輸送機構を分子レベルで解明し、ホウ素輸送における主要な経路や制限要因を明らかにすることは効率的な施肥方法や育種戦略への知見を与えるものであると考えられる。また、植物体でホウ素吸収促進活性を有するタンパク質の遺伝子を同定することはホウ素欠乏・過剰耐性品種の作出に直接つながると考えられる。本発明の課題は、環境中からのホウ素の取込みや生体内でのホウ素の輸送をより効率良く制御することを可能とする、ホウ素の吸収促進に関与する遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究し、低ホウ素条件下のシロイヌナズナの根においてｍＲＮＡの蓄積が上昇する遺伝子としてＮＩＰ５；１を見出した。さらに、ＮＩＰ５；１プロモーター::ＧＵＳ形質転換シロイヌナズナを作製し、ホウ素濃度の異なる培地で栽培してＧＵＳ（β-glucuronidase）の活性を測定したところ、培地のホウ素濃度が低いほどＧＵＳの活性が強く、ＮＩＰ５；１プロモーターの活性は低ホウ素条件で誘導されることが示された。また、ＮＩＰ５；１プロモーター::ＧＵＳ形質転換シロイヌナズナを用いてＮＩＰ５；１の発現の組織特異性を調べたところ、根の伸長域の表皮細胞で強く発現していることがわかった。さらに、ＮＩＰ５；１の発現抑制変異株を作製し、それを低ホウ素条件で栽培したところ、その変異株の地上部のホウ素濃度は、同様の条件で栽培した野生株の地上部のホウ素濃度の２０〜３０％であった。本発明は上記知見に基づいて完成するに至ったものである。【００１１】
すなわち本発明は、
（１）以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを含み、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターを、宿主に導入することを特徴とする、宿主のホウ素吸収活性を促進する方法：
［１］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［２］配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［３］配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［４］配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［５］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：や、
（２）宿主が酵母又は植物であることを特徴とする上記（１）記載の方法や、
（３）以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを含み、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターが導入され、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現する形質転換体を、ホウ素吸収活性が促進された形質転換体として使用する方法：
［１］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［２］配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［３］配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［４］配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［５］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：や、
（４）形質転換体が酵母又は植物であることを特徴とする上記（３）記載の方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、
（５）以下の［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡを含み、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターが導入され、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現する形質転換体に、被検物質の存在下、ホウ酸を接触させ、細胞内へのホウ素の取り込みの程度を測定・評価することを特徴とするホウ素吸収促進活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法：
［１］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［２］配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［３］配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［４］配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：
［５］配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡ：や、
（６）形質転換体が酵母又は植物であることを特徴とする上記（５）記載のホウ素吸収促進活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法や、
（７）以下の（ｉ）〜（iii）のいずれかに記載のタンパク質を、吸収型ホウ素トランスポーターとして使用する方法：
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質：
（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質：
（iii）配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡと９５％以上の相同性を有し、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質：
に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ホウ素の条件に応じた、遺伝子の転写産物の蓄積を示す図である。シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度０．３μＭの水耕液に移し、さらに３日間栽培した。その植物体の全体からサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「−Ｂ」に示した。また、シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度１５０μＭの新たな水耕液でさらに３日間栽培した。その植物体の全体からサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「＋Ｂ」に示した。定量値は、ＥＦ−１αの定量値で標準化を行った。また、実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図２】ホウ素の条件に応じた、遺伝子の転写産物の蓄積を示す図である。シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度０．３μＭの水耕液に移し、さらに３日間栽培した。その植物体の根のみからサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「−Ｂ」に示した。また、シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度１５０μＭの新たな水耕液でさらに３日間栽培した。その植物体の根のみからサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「＋Ｂ」に示した。定量値は、ＥＦ−１αの定量値で標準化を行った。また、実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図３】ホウ素の条件に応じた、根、ロゼット葉、および花茎におけるＮＩＰ５；１の転写産物の蓄積を示す図である。シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度０．３μＭの水耕液に移し、さらに３日間栽培した。その植物体の根、ロゼット葉、および花茎からサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「−Ｂ」に示した。また、シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度１５０μＭの新たな水耕液でさらに３日間栽培した。その植物体の根、ロゼット葉、および花茎からサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「＋Ｂ」に示した。定量値は、ＥＦ−１αの定量値で標準化を行った。また、実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図４】ＮＩＰ５；１遺伝子の転写産物の蓄積の経時的変化を示す図である。シロイヌナズナＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度１００μＭの水耕液で３４日間栽培した後、植物体をホウ素濃度０．１μＭの水耕液に移し、移してから３、６、１２、２４、および４８時間後に根からサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。なお、栽培を開始してから３４日経過した直後の植物体の根からサンプリングしたサンプルをコントロールとした。また、それとは別に、栽培を開始してから３４日後にホウ素濃度０．１μＭの水耕液に移し、２４時間栽培した後、再びホウ素濃度１００μＭの水耕液に移し、２４時間後にサンプリングしたサンプルを「Ｒｅ＋Ｂ」に示した。
【図５】ホウ素の条件に応じた、ＮＩＰサブファミリー遺伝子の転写産物の蓄積を示す図である。シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度０．３μＭの水耕液に移し、さらに３日間栽培した。その植物体の根からサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「−Ｂ」に示した。また、シロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度１５０μＭの新たな水耕液でさらに３日間栽培した。その植物体の根からサンプリングしたサンプルを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を「＋Ｂ」に示した。定量値は、ＥＦ−１αの定量値で標準化を行った。また、実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図６】ｎｉｐ５；１−１およびｎｉｐ５；１−２におけるＴ−ＤＮＡの挿入位置を示す図である。
【図７】ｎｉｐ５；１−１の根における、ＮＩＰ５；１の転写産物の蓄積を示す図である。Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株であるｎｉｐ５；１−１と、コントロールであるＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度３０μＭの固形培地でそれぞれ１０日間栽培した後、それぞれの根からサンプリングしたサンプルを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量値は、ＥＦ−１αの定量値で標準化を行った。また、実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図８】ｎｉｐ５；１−２の根における、ＮＩＰ５；１の転写産物の蓄積を示す図である。Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株であるｎｉｐ５；１−２と、コントロールであるＷｓ株を、ホウ素濃度３０μＭの固形培地でそれぞれ１０日間栽培した後、それぞれの根からサンプリングしたサンプルを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量値は、ＥＦ−１αの定量値で標準化を行った。また、実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図９】ＮＩＰ５；１遺伝子および標準化に用いたＥＦ１α遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物についての電気泳動を示す図である。
【図１０】ホウ素の条件に応じた、ＮＩＰ５；１プロモーター：：ＧＵＳ形質転換ラインにおけるＧＵＳ活性を示す図である。ＮＩＰ５；１の翻訳開始点の上流約２．５ｋｂの下流にＧＵＳを融合させたコンストラクトでシロイヌナズナＣｏｌ−０株を形質転換した。ＮＩＰ５；１プロモーター：：ＧＵＳの独立した３つの形質転換ライン（ＧＵＳ  ｌｉｎｅ  １、４、８）のＴ２世代をホウ素濃度０．３、１５０、および１０００μＭの固形培地で１２日間栽培し、根のＧＵＳ活性を測定した。実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図１１】タマネギの表皮細胞における、ＮＩＰ５；１：：ＧＦＰフュージョンタンパクの細胞内局在を示す図である。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（以下３５Ｓと記す）の下流にｓＧＦＰ、ＮＩＰ５；１を順に連結させたコンストラクト（３５Ｓ−ｓＧＦＰ−ＮＩＰ５；１）、３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターの下流にＮＩＰ５；１、ＧＦＰを順に連結させたコンストラクト（３５Ｓ−ＮＩＰ５；１−ｓＧＦＰ）をそれぞれ作製した。それぞれのコンストラクトでタマネギの表皮細胞を形質転換し、その細胞内でのＧＦＰの蛍光を観察した。また、コントロールとして、３５Ｓ−ｓＧＦＰで形質転換したタマネギの表皮細胞におけるＧＦＰの蛍光も観察した。それぞれの図の右下のスケールバーは１００μｍを表す。
【図１２】シロイヌナズナにおける、ＮＩＰ５；１プロモーター：：ＧＵＳフュージョンタンパクの植物体での局在を示す図である。ＮＩＰ５；１プロモーターの下流にＧＵＳを連結させたコンストラクトで、シロイヌナズナＣｏｌ−０株を形質転換した形質転換体を、ホウ素濃度０．３μＭの固形培地で９日間栽培した後、その形質転換体をＧＵＳ染色して観察した。図１２Ａのスケールバーは５００μｍを、図１２Ｂ、Ｃのスケールバーは１００μｍを表す。
【図１３】シロイヌナズナの根の組織における、ＮＩＰ５；１プロモーター：：ＧＵＳフュージョンタンパクの局在を示す図である。ＮＩＰ５；１プロモーターの下流にＧＵＳを連結させたコンストラクトで、シロイヌナズナＣｏｌ−０株を形質転換した形質転換体を、ホウ素濃度０．３μＭの固形培地で９日間栽培した。その形質転換体の地上部との境目から約１ｃｍの成熟した部分の切片をＧＵＳ染色した結果を図１３Ａに示す。さらにそれを拡大したものを図１３Ｂに示す。また、同様に栽培した形質転換体の根の先端から約３００μｍの伸長域に当たる部分の切片をＧＵＳ染色した結果を図１３Ｃに示す。さらにそれを拡大したものを図１３Ｄに示す。図１３のスケールバーはすべて１００μｍを表す。
【図１４】シロイヌナズナの花およびロゼット葉における、ＮＩＰ５；１プロモーター：：ＧＵＳフュージョンタンパクの局在を示す図である。図１３の実験で用いたのと同様の形質転換体を、ホウ素濃度０．３μＭの水耕液で２５日間栽培した。抽苔していない植物体のロゼット葉をＧＵＳ染色して観察した結果を図１４Ａに示す。また、図１３の実験で用いたのと同様の形質転換体を、ホウ素濃度０．３μＭの水耕液で４０日間栽培した。この植物体の花およびロゼット葉をＧＵＳ染色して観察した結果を図１４Ｂに示す。図１４Ａのスケールバーは１００μｍを、図１４Ｂのスケールバーは１０００μｍを表す。
【図１５】シロイヌナズナにおける、ＮＩＰ５；１プロモーター：：  ＧＦＰフュージョンタンパクの植物体での局在を示す図である。ＮＩＰ５；１プロモーターの下流にＧＦＰを連結させたコンストラクトで、シロイヌナズナＣｏｌ−０株を形質転換した形質転換体を、ホウ素濃度０．３μＭの固形培地で６日間栽培した。その形質転換体における蛍光を観察した結果を図１５Ｂに示す。また、同様に栽培した野生株（Ｃｏｌ−０株）における蛍光を観察した結果を図１５Ａに示す。また、ＮＩＰ５；１プロモーターの下流にＧＦＰを連結させたコンストラクトで、シロイヌナズナＣｏｌ−０株を形質転換した形質転換体を、ホウ素濃度３００μＭの固形培地で１４日間栽培した後、ホウ素濃度０．１μＭの固形培地に移して３日間栽培した。その形質転換体における蛍光を観察した結果を図１５Ｃに示す。図１５Ａ、Ｂのスケールバーは５００μｍを、図１５Ｃのスケールバーは２００μｍを表す。
【図１６】ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）の地上部新鮮重を示す図である。  ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）をホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で１０日間栽培した。その植物体の地上部新鮮重を測定した。実験は８〜１０回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図１７】ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）の地上部新鮮重を示す図である。  ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）をホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で１０日間栽培した。その植物体の地上部新鮮重を測定した。実験は８〜１０回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図１８】ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）の根の長さを示す図である。  ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）をホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で７日間栽培した。その植物体の根の長さを測定した。実験は８〜１０回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図１９】ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）の根の長さを示す図である。  ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）をホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で７日間栽培した。その植物体の根の長さを測定した。実験は８〜１０回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図２０】低ホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）を低ホウ素条件であるホウ素濃度０．３μＭの固形培地で１０日間栽培した後、その形態を観察した。その結果を図２０に示す。スケールバーは２０ｍｍを表す。
【図２１】低ホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野生株）の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野生株）を低ホウ素条件であるホウ素濃度０．３μＭの固形培地で１０日間栽培した後、その形態を観察した。その結果を図２１に示す。スケールバーは２０ｍｍを表す。
【図２２】十分な濃度のホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）を低ホウ素条件であるホウ素濃度１５０μＭの固形培地で１０日間栽培した後、その形態を観察した。その結果を図２２に示す。スケールバーは２０ｍｍを表す。
【図２３】十分な濃度のホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野生株）の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野生株）を低ホウ素条件であるホウ素濃度１５０μＭの固形培地で１０日間栽培した後、その形態を観察した。その結果を図２３に示す。スケールバーは２０ｍｍを表す。
【図２４】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）をホウ素濃度３、１０、３０、および１５０μＭの水耕液により水耕栽培した。栽培後２６日目のＣｏｌ−０株（野生株）の形態を図２４のＡ〜Ｄに、ｎｉｐ５；１−１の形態を図２４のＥ〜Ｈに示す。スケールバーはすべて１０ｍｍを表す。
【図２５】様々なホウ素条件下における、Ｃｏｌ−０株（野性株）の形態を示す図である。Ｃｏｌ−０株（野性株）をホウ素濃度３、１０、３０、および１５０μＭの水耕液で３８日間水耕栽培した後、それぞれの植物体の様子を観察した。その結果を図２５に示す。
【図２６】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−１の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−１をホウ素濃度３、１０、３０、および１５０μＭの水耕液で３８日間水耕栽培した後、それぞれの植物体の様子を観察した。その結果を図２６に示す。
【図２７】様々なホウ素条件下における、Ｗｓ株（野性株）の形態を示す図である。Ｗｓ株（野性株）をホウ素濃度３、１０、３０、および１５０μＭの水耕液で３８日間水耕栽培した後、それぞれの植物体の様子を観察した。その結果を図２７に示す。
【図２８】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−２の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−２をホウ素濃度３、１０、３０、および１５０μＭの水耕液で３８日間水耕栽培した後、それぞれの植物体の様子を観察した。その結果を図２８に示す。
【図２９】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−１およびｎｉｐ５；１−２の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−１をホウ素濃度３、１０μＭの水耕液で３８日間水耕栽培した後、それぞれの植物体の様子を観察した。その結果を図２９ＡおよびＢに示す。また、ｎｉｐ５；１−２について同様に栽培した後の植物体の形態を図２９ＣおよびＤに示す。スケールバーはすべて１０ｍｍを表す。
【図３０】ホウ素濃度１０μＭで栽培したｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）をホウ素濃度１０μＭで４２日間水耕栽培した後、それぞれの植物体の形態を観察した。その結果を図３０に示す。
【図３１】ホウ素濃度１０μＭで栽培した後、ホウ素濃度１５０μＭで栽培したｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）をホウ素濃度１０μＭで４２日間水耕栽培した後、水耕液のホウ素濃度を１５０μＭに上げてさらに４日間栽培し、その形態を観察した。その結果を図３１に示す。
【図３２】ホウ素濃度１０μＭで栽培したｎｉｐ５；１−２の先端部の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−２をホウ素濃度１０μＭで４２日間水耕栽培した後、植物体の先端部の形態を観察した。その結果を図３２に示す。
【図３３】ホウ素濃度１０μＭで栽培した後、ホウ素濃度１５０μＭで栽培したｎｉｐ５；１−２の先端部の形態を示す図である。ｎｉｐ５；１−２をホウ素濃度１０μＭで４２日間水耕栽培した後、水耕液のホウ素濃度を１５０μＭに上げてさらに４日間栽培し、植物体の先端部の形態を観察した。その結果を図３３に示す。
【図３４】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）の地上部のホウ素濃度を示す図である。ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。それぞれの植物体の地上部のホウ素濃度を測定した。実験は３〜４回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図３５】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野生株）の地上部のホウ素濃度を示す図である。ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。それぞれの植物体の地上部のホウ素濃度を測定した。実験は３〜４回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図３６】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）の根のホウ素濃度を示す図である。ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。それぞれの植物体の根のホウ素濃度を測定した。実験は３〜４回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図３７】様々なホウ素条件下における、ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野生株）の根のホウ素濃度を示す図である。ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。それぞれの植物体の根のホウ素濃度を測定した。実験は３〜４回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図３８】ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９およびＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１におけるＴ−ＤＮＡの挿入位置を示す図である。
【図３９】ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）における、ＮＩＰ５；１の転写産物の蓄積を示す図である。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１と、コントロールであるＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度３０μＭの固形培地でそれぞれ１０日間栽培した後、それぞれの根からサンプリングしたサンプルを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量値は、ＥＦ−１αの定量値で標準化を行った。また、実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図４０】ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）の地上部新鮮重を示す図である。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）をホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で１０日間栽培した。それぞれの植物体の地上部新鮮重を測定した。実験は５回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図４１】ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）の根の長さを示す図である。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）をホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で７日間栽培した。その植物体の根の長さを測定した。実験は５回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図４２】ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）の地上部新鮮重を示す図である。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭで水耕栽培し、３７日後に地上部新鮮重を測定した。その結果を図４２に示す。実験は４回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図４３】様々なホウ素条件下における、ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）の地上部のホウ素濃度を示す図である。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。それぞれの植物体の地上部のホウ素濃度を測定した。実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図４４】様々なホウ素条件下における、ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）の根のホウ素濃度を示す図である。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。それぞれの植物体の根のホウ素濃度を測定した。実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；の何れかのＤＮＡであれば特に制限されず、また、本発明のホウ素吸収促進活性を有するタンパク質としては、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ素吸収促進活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、ここで、「ホウ素吸収促進活性を有するタンパク質」とは、酵母、植物などの細胞内へ細胞外からのホウ素の吸収を促進する活性を有するタンパク質を意味し、「ホウ素吸収促進遺伝子」とは、ホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを意味する。【００１５】
あるタンパク質がホウ素の吸収に関与するかどうかは、例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いた実験系（Dordas, C., Chrispeels, M.J., and Brown, P.H. (2000). Permiability and channel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles isolated from squash roots. Plant Physiol. 124, 1349-1361）を用いることにより、確認することができる。すなわち、例えば、あるタンパク質をコードする遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、その遺伝子を導入しなかった場合に比べて、ホウ素の透過性が上昇した場合は、そのタンパク質はホウ素の吸収を促進する活性を有するといえる。【００１６】
配列番号１に示される塩基配列からなるホウ素吸収促進遺伝子としては、シロイヌナズナ由来のＮＩＰ５；１遺伝子を、また、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ素吸収促進活性を有するタンパク質としては、シロイヌナズナ由来のＮＩＰ５；１をそれぞれ挙げることができる。【００１７】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。【００１８】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。【００１９】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後"モレキュラークローニング第２版"と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００２０】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。【００２１】
本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１に示される塩基配列情報又は配列番号２に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。【００２２】
具体的には、本発明のＤＮＡが単離されたシロイヌナズナより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。【００２３】
また、上記（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。【００２４】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。【００２５】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。【００２６】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例をそれぞれ示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてシロイヌナズナ以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。【００２７】
本発明は、さらに、上記本発明のホウ素吸収促進遺伝子ＤＮＡを、ホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現させるために用いる方法や、上記本発明のタンパク質を、吸収型ホウ素トランスポーターとして使用する方法に関する。そしてまた、本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含み、かつ前記本発明のホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。例えば、本発明の遺伝子の５’と３’側双方の非翻訳領域を除いたＯＲＦ部分のｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流につないだコンストラクトを好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、植物細胞用発現ベクター、酵母用発現ベクター、細菌用発現ベクター、動物細胞用発現ベクター等を用いることができるが、植物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。【００２８】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ(Promega)、ｐＹＥＳ２（Invitrogen）、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。【００２９】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、ｐＢＩ１２１〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕などのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクター等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。【００３０】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつホウ素トランスポーターを発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換酵母や形質転換植物（細胞、組織、個体）が好ましい。【００３１】
形質転換酵母の作製に用いられる宿主酵母としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。【００３２】
形質転換植物（細胞、組織、個体）の作製に用いられる宿主植物（細胞、組織、個体）としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物や、それら植物の培養細胞、組織（種子、カルスなど）のうちから適宜選択することができる。この形質転換植物を作製するには、本発明のＤＮＡを含有した上記本発明の組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムＤＮＡ中に本発明のＤＮＡを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の組換えベクターを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。【００３３】
本発明のホウ素吸収促進活性を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法としては、組換えベクターが導入され、かつホウ素トランスポーターを発現する形質転換体に、被検物質の存在下、ホウ酸を接触させ、細胞内へのホウ素の取り込みの程度を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、上記形質転換体としては、酵母、植物細胞、植物を挙げることができ、また、酵母菌体のホウ素濃度の測定は、例えば、サンプルの乾燥重量を測定した後、８ｍｌ容のテフロン（登録商標）チューブ(Nalgene, Rochester, New York, USA)に移し、濃硝酸を加えて９０−１３０℃に設定したヒートブロックで分解し、乾燥させた。乾燥して得られたペレットを３ｍｌの５ｐｐｂ Ｂｅ、０．０８Ｎ ＨＮＯ３溶液に溶解し、さらに同溶液で分析に適当な濃度に希釈して、ＩＣＰ−ＭＳ ＳＰＱ−９０００ (Seiko Instrument Inc., Chiba, Japan)により定量することができる。測定・評価に際しては、ホウ素吸収促進活性を有するタンパク質を発現していない同種の細胞と比較することが好ましい。【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
（１）シロイヌナズナの栽培
シロイヌナズナの固形培地での栽培および水耕栽培は、特記した場合を除き、以下のように行った。
（ｉ）固形培地での栽培
１％（ｗ／ｖ）のショ糖、１．５％（ｗ／ｖ）のゲランガム(Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan)を含むMGRL固形培地(Fujiwara, T., Hirai, M.Y., Chino, M., Komeda, Y., and Naito, S. (1992). Effects of sulfur nutrition on expression of the soybean seed storage protein genes in transgenic petunia. Plant Physiol. 99, 263-268)を使用した。ホウ素濃度はホウ酸によって調整した。表面殺菌した種子を固形培地に播き、４℃にて１〜３日間、春化処理を行った。その後、２２℃、白色蛍光灯下で１６時間明条件、８時間暗条件に設定した人工気象器 (NK System Biotron, Nippon Medical and Chemical Instrument, Tokyo, Japan) 内にシャーレを垂直に立てて栽培した。【００３６】
（ii）水耕栽培
ホウ素濃度をホウ酸により調整したＭＧＲＬ水耕液(上記Fujiwara et al.,1992)を用いて、水耕栽培法 (平井 (横田) 優美、内藤哲、茅野充男 (1993) アラビドプシスの水耕栽培法  植物細胞工学、５ (6)) により栽培した。植物は、底を切り取った１．５ｍｌ容のチューブに固定したロックウール(Nittobo, Tokyo, Japan)の上で栽培した。１．６Ｌの水耕液を入れたプラスチックタッパーの蓋に１６本のプラスチックチューブを固定して用いた。1つのロックウール上に３〜４粒の種を播いて栽培し、１０日後に間引きしてひとつのロックウールに植物が１本になるようにして栽培を続けた。水耕液は通気し、はじめの２週間は週に１度、その後は週に２度交換した。約２２℃に制御された自然光型温室内で栽培した。【００３７】
（２）マイクロアレイ解析
低ホウ素条件下のシロイヌナズナの根においてｍＲＮＡの蓄積が増加する遺伝子を探索するため、以下のような方法でマイクロアレイ解析を行った。上記（１）の栽培方法で得られたシロイヌナズナＣｏｌ−０株をホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培した後、ホウ素濃度０．３μＭの水耕液に移し、３日間栽培した。また、ホウ素濃度１５０μＭの水耕液で３９日間水耕栽培したＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度１５０μＭの新たな水耕液でさらに３日間栽培し、コントロールとして用いた。この実験の水耕栽培に関しては、１．６Ｌの水耕液を入れたプラスチックタッパーの蓋に２１本のプラスチックチューブを固定して用い、１つのロックウールに５−６粒の種を播き、間引きしないでそのまま栽培した。プラスチックタッパー１つ分をまとめて１サンプルとした。これらの植物の根からセパゾール−ＣＴＡＢ法(Nakarai Tesque, Kyoto, Japan)によりＲＮＡを抽出した。約８３００遺伝子がのったArabidopsis Gene Array (Affymetrix, Santa Clara, USA) を用い、添付のプロトコールに従ってマイクロアレイ実験を行った。このマイクロアレイ実験の結果、ホウ素濃度０．３μＭの低ホウ素条件で通常の３倍以上にｍＲＮＡの蓄積が増加した１２個の遺伝子が選抜された。それらの１２個の遺伝子についての結果を表１に示す。【００３８】
【表１】
0004550889.tif 000002
【００３９】
（３）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる転写産物の定量
上記（２）のマイクロアレイの結果により選抜された１２個の遺伝子の発現誘導について、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた検証を行った。１２遺伝子について検証を試みたが、増幅が見られず定量できないものがあったため、６遺伝子（Ａｔ１ｇ２７７３０、Ａｔ５ｇ２６１３０、Ａｔ４ｇ１０３８０、Ａｔ１ｇ２２８４０、Ａｔ３ｇ２７８９０、Ａｔ１ｇ０１０６０）についてのみ検証を行った。ＲＴ−ＰＣＲは以下のような方法で行った。【００４０】
上記（２）のマイクロアレイ解析に用いたものと同条件で栽培したシロイヌナズナＣｏｌ−０株の各部位を切り取った後、それらを直ちに液体窒素で凍らせ、RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)を用いてＲＮＡ抽出を行った。以後、特記した場合を除き、ＲＮＡの抽出はRNeasy Plant Mini Kitを用いて行った。抽出したＲＮＡ ５００ｎｇについて逆転写反応を行った。逆転写酵素としてMuLV Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, Foster City, USA)を、プライマーとしてＯｌｉｇｏ−ｄ（Ｔ）１６を用い、反応液の全量を２０μｌとして、添付のプロトコールに従って逆転写反応を行った。【００４１】
次に、逆転写産物２μｌを鋳型とし、反応液の全量を２５μｌとした上で定量的ＰＣＲを行った。その際、ＤＮＡポリメラーゼとしてEx Taq R-PCR Version (Takara Bio, Shiga, Japan)を、機器としてSmart cycler (Cepheid, Sunnyvale, USA)を用いた。転写産物の指標としては、SYBR Green 1によるインターカレーションの蛍光を用いた。各遺伝子の定量値は、発現量が一定と考えられる遺伝子であるＥＦ−１αの定量値で割ることで標準化した。Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株におけるＮＩＰ５；１のｍＲＮＡ蓄積量の定量の際には、ＰＣＲ産物を４％(ｗ／ｖ)のアガロースゲルにて電気泳動してエチジウムブロマイドで染色した後、波長３０２ｎｍのＵＶを照射して可視化し、おおよその分子量を確認した。【００４２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いた各遺伝子に特異的なプライマーは次のとおりである。Ａｔ１ｇ０１０６０遺伝子についてはプライマー１（配列番号３）およびプライマー２（配列番号４）、Ａｔ１ｇ２２８４０遺伝子についてはプライマー３（配列番号５）およびプライマー４（配列番号６）、Ａｔ１ｇ２７７３０遺伝子についてはプライマー５（配列番号７）およびプライマー６（配列番号８）、Ａｔ３ｇ２７８９０遺伝子についてはプライマー７（配列番号９）およびプライマー８（配列番号１０）、ＮＩＰ５；１（Ａｔ４ｇ１０３８０）遺伝子についてはプライマー９（配列番号１１）およびプライマー１０（配列番号１２）、Ａｔ５ｇ２６１３０遺伝子についてはプライマー１１（配列番号１３）およびプライマー１２（配列番号１４）、ＥＦ−１αについてはプライマー１３（配列番号１５）およびプライマー１４（配列番号１６）を用いた。この定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を図１に示す。図１の結果からわかるように、６遺伝子中５遺伝子（Ａｔ１ｇ０１０６０、Ａｔ１ｇ２７７３０、Ａｔ３ｇ２７８９０、Ａｔ４ｇ１０３８０、Ａｔ５ｇ２６１３０）に有意な発現上昇が見られた。【００４３】
次に、シロイヌナズナＣｏｌ−０株の各部位から抽出したＲＮＡの代わりに、シロイヌナズナＣｏｌ−０株の根のみから抽出したＲＮＡを用いて、同様の方法で定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を図２に示す。図２の結果からわかるように、上記の６遺伝子中、Ａｔ４ｇ１０３８０（ＮＩＰ５；１遺伝子）のみについて、低ホウ素条件下における有意な発現上昇が確認された。低ホウ素条件下におけるＮＩＰ５；１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積量は、コントロールに比べ平均で約１２倍に上昇していた。これにより、ＮＩＰ５；１遺伝子は根において低ホウ素条件に応答し、ｍＲＮＡレベルで発現誘導を受けることが明らかになった。【００４４】
（４）低ホウ素条件下におけるＮＩＰ５；１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積増加の組織特異性
ＮＩＰ５；１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積増加の組織特異性を調べるために、以下のような方法で定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。上記（２）のマイクロアレイ解析に用いたものと同条件で栽培したシロイヌナズナＣｏｌ−０株から根、ロゼット葉、および花茎をサンプリングした。サンプルからのＲＮＡの抽出は、セパゾール-CTAB法 (Nakarai Tesque, Kyoto, Japan) を用いた。定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う際のＮＩＰ５；１遺伝子のプライマーとして、プライマー１５（配列番号１７）およびプライマー１６（配列番号１８）を用いた。その他の条件は、上記（３）の定量的RT-PCRと同様に行った。その結果を図３に示す。図３の結果からわかるように、低ホウ素条件下でのＮＩＰ５；１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積量は、根以外の組織では有意には変化していなかった。この結果から、ＮＩＰ５；１遺伝子の発現誘導は主に根で起こることが判明した。【００４５】
（５）低ホウ素条件下におけるＮＩＰ５；１遺伝子の誘導の経時変化
低ホウ素条件下におけるＮＩＰ５；１遺伝子の誘導の経時変化を調べるために、以下のような実験を行った。人工気象器 (NK System Biotron, Nippon Medical and Chemical Instrument, Tokyo, Japan)を準備し、１０時間の明条件（白色蛍光灯）と１４時間の暗条件を順に繰り返すように設定した。また、人工気象器内の温度は、２２℃に設定した。この人工気象器内でシロイヌナズナＣｏｌ−０株を栽培した。【００４６】
まず、シロイヌナズナＣｏｌ−０株の種子を表面殺菌した。次に、シャーレ中に、１００μＭのホウ素,２％(ｗ／ｖ)のショ糖、１．５％(ｗ／ｖ)のゲランガム (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan)を含むＭＧＲＬ培地(Fujiwara, T., Hirai, M.Y., Chino, M., Komeda, Y., and Naito, S. (1992). Effects of sulfur nutrition on expression of the soybean seed storage protein genes in transgenic petunia. Plant Physiol. 99, 263-268、ただしＦｅは５０μＭとした)を流し込み、ＭＧＲＬ固形培地を作製した。ＭＧＲＬ固形培地上に１０×１０ｃｍ２のナイロンメッシュ(300μm pore size)を置き、その上に、表面殺菌したシロイヌナズナＣｏｌ−０株の種子を、ナイロンメッシュ１枚につき１６粒となるように播いた。播種後、シャーレのカバーを取り付け、明条件になったばかりの上述の人工気象器内にそのシャーレを２３日間静置した。その後、シャーレのカバーをはずし、それからさらに１日後にシロイヌナズナの植物体をメッシュごと培地から持ち上げて、その根を脱イオン水で洗浄し、ホウ素濃度１００μＭの水耕液の入った９００ｍｌ容のプラスチック容器に移した。そのプラスチック容器も、前述の人工気象器内に静置した。水耕液は４〜５日に１度の割合で新しいものに交換した。栽培を開始してから３４日後にホウ素濃度０．１μＭの水耕液に移し、３、６、１２、２４、および４８時間後にそれぞれ根をサンプリングした。栽培を開始してから３４日経過した直後の植物体の根からのサンプルをコントロールとした。また、それとは別に、栽培を開始してから３４日後にホウ素濃度０．１μＭの水耕液に移し、２４時間栽培した後、再びホウ素濃度１００μＭの水耕液に移し、２４時間後に根をサンプリングした（Ｒｅ＋Ｂ）。【００４７】
それぞれのサンプルから、RNeasy Plant Mini Kitを用いてＲＮＡを抽出し、上記(３）と同様の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う際のＮＩＰ５；１遺伝子のプライマーとして、プライマー１５（配列番号１７）およびプライマー１６（配列番号１８）を用いた。このような定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、低ホウ素条件にさらしてから２日間のＮＩＰ５；１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積量を経時的に解析した。その結果を図４に示す。図４の結果からわかるように、低ホウ素条件にさらしてから少なくとも３時間後にはＮＩＰ５；１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積が上昇し始め、２４時間後にピークを迎えた。また、低ホウ素条件にさらしてから２４時間後に再び通常のホウ素条件に戻してさらに２４時間栽培すると、ＮＩＰ５；１遺伝子のｍＲＮＡの蓄積が減少した。このように、ＮＩＰ５；１遺伝子は、外界のホウ素濃度の減少、増加に応答して発現量を変化させることが明らかとなった。【００４８】
（６）ＮＩＰサブファミリーに属する６つの遺伝子の低ホウ素条件下における発現誘導の有無
ＮＩＰ５；１はＭＩＰファミリーの中のＮＩＰサブファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子である。そこで、ＮＩＰサブファミリーの９遺伝子のうち、ＮＩＰ５；１以外の５遺伝子、ＮＩＰ１；１、ＮＩＰ１；２、ＮＩＰ２；１、ＮＩＰ３；１、およびＮＩＰ６；１についても低ホウ素条件下での根における発現を調べた。【００４９】
上記（３）と同様の方法で定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＮＩＰサブファミリーの６つの遺伝子の低ホウ素条件下での根における発現を調べた。ただし、サンプルとして、根由来のＲＮＡのみを用い、また、対象となる遺伝子が変更したことに伴ってプライマーも変更した。定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いた各遺伝子に特異的なプライマーは次のとおりである。ＮＩＰ１；１遺伝子についてはプライマー１７（配列番号１９）およびプライマー１８（配列番号２０）、ＮＩＰ１；２遺伝子についてはプライマー１９（配列番号２１）およびプライマー２０（配列番号２２）、ＮＩＰ２；１遺伝子についてはプライマー２１（配列番号２３）およびプライマー２２（配列番号２４）、ＮＩＰ３；１遺伝子についてはプライマー２３（配列番号２５）およびプライマー２４（配列番号２６）、ＮＩＰ６；１遺伝子についてはプライマー２５（配列番号２７）およびプライマー２６（配列番号２８）、ＮＩＰ５；１遺伝子のプライマーとして、プライマー１５（配列番号１７）およびプライマー１６（配列番号１８）を用いた。このような定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を図５に示す。図５の結果からわかるように、ＮＩＰ５；１以外の遺伝子については低ホウ素条件下での有意な発現誘導は見られなかった。すなわち、ＮＩＰ５；１は調べたＮＩＰサブファミリーの遺伝子の中では唯一、低ホウ素条件下の根で発現誘導を受けることがわかった。【００５０】
（７）Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株の取得とＴ−ＤＮＡの挿入をホモに持つ系統の確立およびＴ−ＤＮＡ挿入位置の決定
ＮＩＰ５；１遺伝子の植物体内における機能を明らかにするため、ＳＩＧｎＡＬ(Salk Institute Genomic Analysis Laboratory)のＴ−ＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)を検索し、シロイヌナズナにおいてＮＩＰ５；１にＴ−ＤＮＡの挿入があると予想される形質転換体を２系統取得した。その１系統はＳＡＬＫ_１２２２８７(nip5;1-1)であり、これはSALK Institute (La Jolla, USA)より提供された。背景となる野生株はＣｏｌ−０株である。もう１系統はＦＬＡＧ_２５０Ｆ０８ (nip5;1-2)であり、これはＩＮＲＡ(Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France)より提供された。背景となる野生株はＷｓ（Wassilewskija）株である。【００５１】
これらの２系統におけるＴ−ＤＮＡの挿入をホモに持つ系統を確立するため、提供されたＴ３世代の種を１０粒ずつ播いてバーミキュライト耕により栽培し、Kasajimaら（Kasajima, I., Ide, Y., Ohkama-Ohtsu, N., Hayashi, H., Yoneyama, T., and Fujiwara, T.(2004). A protocol for rapid DNA extraction from Arabidopsis thaliana for PCR analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 22, 49-52）の方法により葉からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型に、以下の２種類のプライマーセットでＰＣＲを行った。
１）プライマーセット１：Ｔ−ＤＮＡの挿入が予想される位置を挟む、シロイヌナズナのゲノムに特異的なプライマーセット
２）プライマーセット２：Ｔ−ＤＮＡのLeft borderの配列に特異的なプライマー とゲノムに特異的なプライマーセットのうちの一方【００５２】
ｎｉｐ５；１−１については、プライマーセット１としてプライマー２７（配列番号２９）およびプライマー２８（配列番号３０）、プライマーセット２としてプライマー２９（配列番号３１）およびプライマー２７（配列番号２９）を、ｎｉｐ５；１−２については、プライマーセット１としてプライマー３０（配列番号３２）およびプライマー３１（配列番号３３）、プライマーセット２としてプライマー３２（配列番号３４）およびプライマー３３（配列番号３５）を用いた。ＰＣＲに際しては、プライマーセット１を用いると野生株（Ｃｏｌ−０株またはＷｓ株）のＤＮＡからは常に増幅されることを確認しながら行った。プライマーセット１で野生株のＤＮＡを鋳型としたときに増幅されるサイズのＤＮＡ断片の増幅が見られず、かつ、プライマーセット２で増幅が見られたものを、Ｔ−ＤＮＡをホモに持つ系統と判断した。ｎｉｐ５；１−１およびｎｉｐ５；１−２についてのＰＣＲの結果を利用して、Ｔ−ＤＮＡをホモに持つ系統をそれぞれ選抜した。なお、両Ｔ−ＤＮＡと共にカナマイシン耐性遺伝子がｎｉｐ５；１−１およびｎｉｐ５；１−２に挿入されている。Ｔ−ＤＮＡをホモに持つｎｉｐ５；１−１およびｎｉｐ５；１−２から得られた後代は全てカナマイシン耐性であった。【００５３】
このようにして選抜されたｎｉｐ５；１−１株およびｎｉｐ５；１−２株について、Ｔ−ＤＮＡの挿入位置を決定するためにＰＣＲを行った。ｎｉｐ５；１−１についてはプライマー３４（配列番号３６）およびプライマー２８を、ｎｉｐ５；１−２についてはプライマー３５（配列番号３７）およびプライマー３１を用いた。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物と、上述のプライマーセット２を用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を鋳型として、それぞれのＴ−ＤＮＡのLeft borderおよびRight borderのプライマーを用いてＰＣＲを行った。Ｔ−ＤＮＡのLeft borderのプライマーとして、ｎｉｐ５；１−１についてはプライマー３４を、ｎｉｐ５；１−２についてはプライマー３２を、ｎｉｐ５；１−２のＲＢプライマーとしてはプライマー３５を用いた。これらのＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の配列を、310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, USA)を用いて決定した。配列の決定は、310 Genetic Analyzerに添付されたプロトコールに従って行った。決定した配列の情報から、ｎｉｐ５；１−１およびｎｉｐ５；１−２におけるＴ−ＤＮＡの挿入位置が分かった。ｎｉｐ５；１−１およびｎｉｐ５；１−２におけるＴ−ＤＮＡの挿入位置を図６に示す。図６に示してあるとおり、ｎｉｐ５；１−１株は第１イントロンにＴ−ＤＮＡの挿入を持ち、挿入箇所のゲノムの１７塩基が失われていることが分かった。一方、ｎｉｐ５；１−２株は翻訳開始ＡＴＧの約８３０  ｂａｓｅ上流にＴ−ＤＮＡの挿入を持ち、挿入箇所のゲノムの１５塩基が失われていることが判明した。【００５４】
（８）Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株におけるＮＩＰ５；１のｍＲＮＡの蓄積量
ｎｉｐ５；１−１株およびｎｉｐ５；１−２株について、ＮＩＰ５；１の機能が失われていることを確認するため、根におけるＮＩＰ５；１のｍＲＮＡの蓄積量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株であるｎｉｐ５；１−１と、コントロールであるＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度３０μＭの固形培地でそれぞれ１０日間栽培した後、それぞれの根からサンプリングした。それぞれのサンプルから、RNeasy Plant Mini Kitを用いてＲＮＡを抽出し、上記（３）と同様の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う際のＮＩＰ５；１遺伝子のプライマーとして、プライマー１５（配列番号１７）およびプライマー１６（配列番号１８）を用いた。このような定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を図７に示す。また、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株に代えて、ｎｉｐ５；１-２およびＷｓ株を用いて行った同様の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を図８に示す。図７および図８の結果からわかるように、ｎｉｐ５；１−１株についてはＣｏｌ−０株（野性株）に比べて平均で１．１％に、ｎｉｐ５；１−２株についてはＷｓ株（野性株）に比べて平均で２５％にＮＩＰ５；１遺伝子の発現が抑制されていることが明らかとなった。【００５５】
この定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験が正しくなされていることを確認するために、ＮＩＰ５；１遺伝子および標準化に用いたＥＦ１α遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物についてそれぞれ電気泳動を行った。その結果を図９に示す。図９の結果からわかるように、ＮＩＰ５；１、ＥＦ１αのプライマーから予想されるサイズのみが増幅されており、定量が正しくなされていることが確認された。以下、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２を総称してＮＩＰ５；１発現抑制変異株と呼ぶ。【００５６】
（９）ＮＩＰ５；１プロモーター::ＧＵＳ、ＧＦＰ形質転換シロイヌナズナの作製と解析
ＮＩＰ５；１遺伝子は、低ホウ素条件下においてｍＲＮＡレベルで発現誘導を受けることがわかった。この発現誘導がプロモーターの制御で起こっているのかどうかを調べるため、ＮＩＰ５；１の翻訳開始点の上流約２．５ｋｂの配列の下流にレポーターとしてＧＵＳの配列をつないだコンストラクトを挿入した形質転換シロイヌナズナを作製した。形質転換シロイヌナズナの作製は具体的には以下のような方法で行った。【００５７】
ＢＡＣクローンＦ２４Ｇ２４(Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, USAより分譲) を鋳型とし、プライマー３６（配列番号３８）およびプライマー３７（配列番号３９）を用いたＰＣＲによって、ＮＩＰ５；１のプロモーター領域を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ− (Toyobo, Osaka, Japan) を用いた。ｐＴＦ４５６（ＧＵＳ、ＮＯＳターミネーターの配列を含む）をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断して得られたベクター断片に、前述のＰＣＲにより得られた約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで切断したものをサブクローニングした。これをｐＭＷ１と名付けた。ｐＴＦ４５６の代わりにｐＴＦ４４１（ｓＧＦＰ、ＮＯＳターミネーターの配列を含む）を用いて同様にサブクローニングして得られたものをｐＭＷ２と名付けた。ｐＭＷ１、２のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＴｋａｎ＋(Schumacher and Schaaf, unpublished)へＢａｍＨＩとＢｓｐ１２０−１を用いてサブクローニングした。このようにして、ＮＩＰ５；１の翻訳開始点の上流約２．５ｋｂの下流にＧＵＳを融合させたコンストラクトが作製された。これらのコンストラクトをアグロバクテリウムに導入し、減圧浸潤法（植物細胞工学シリーズ１５−モデル植物の実験プロトコール  秀潤社）によってシロイヌナズナＣｏｌ−０株を形質転換した。こうして得られたＴ１世代の種子からカナマイシン耐性のものを選抜し、Ｔ２世代の種子を得た。プロモーターＧＵＳについては独立した形質転換ラインを２３ライン、プロモーターＧＦＰについては３４ライン選抜し、それぞれＧＵＳライン１、ＧＵＳライン２、…ＧＵＳライン２３、ＧＦＰライン１、ＧＦＰライン２、…ＧＦＰライン３４と名付けた。【００５８】
ＮＩＰ５；１プロモーター::ＧＵＳの独立した３つの形質転換ライン（ＧＵＳ  ライン１、４、８）のＴ２世代をホウ素濃度０．３、１５０、および１０００μＭの固形培地で１２日間栽培し、２０個体の根をまとめて採取してＧＵＳ活性を測定した。ＧＵＳ活性はJefferson et al.の方法（Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., and Bevan, M.W. (1987).GUS fusions -beta -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907）に従い測定した。具体的には、以下のような方法で測定した。【００５９】
採取した植物の根に３００μｌのＧＵＳ抽出バッファーを加え、１．５ｍｌ容のチューブ内で破砕した。１８０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上清を回収しＧＵＳ抽出液とした。基質として4-methylumbelliferyl-b- D-glucronideを加え、３７℃で１時間反応を行い、停止液を加えて反応を止め、生成した4-methylumbelliferon(以下４ＭＵと記す)の蛍光強度を、励起波長365 nm、蛍光波長４５５ｎｍにて測定した。反応開始時の４ＭＵの量を０とし、時間あたりのＧＵＳ活性を算出した。ＧＵＳの活性はProtein Assay Kit (BioRad, Hercules, USA)により定量したタンパクの量で標準化した。タンパク定量の際の標準タンパクとしてウシ血清アルブミンを用いた。ＧＵＳ活性の測定結果を図１０に示す。【００６０】
図１０の結果からわかるように、ＧＵＳライン１におけるプロモーター活性は、ホウ素濃度１５０μＭを基準として、ホウ素濃度０．３μＭでは平均で４．２９倍、ホウ素濃度１０００μＭでは平均で０．０９倍に制御されていた。ＧＵＳライン４、ＧＵＳライン８でも同様の傾向が見られた。これらの結果から、ＮＩＰ５；１のプロモーター活性は低ホウ素条件で誘導されることが明らかとなった。【００６１】
（１０）ＮＩＰ５；１、ｓＧＦＰ融合タンパク質のタマネギ表皮細胞での発現
ＮＩＰ５；１の細胞内局在を調べるために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（以下３５Ｓと記す）の制御下で、ＮＩＰ５；１のＮ末端、またはＣ末端にｓＧＦＰを連結したタンパク質を発現するコンストラクト（タマネギの表皮細胞）を、パーティクルボンバードメントにより作製した。具体的には以下のような方法でコンストラクトを作製した。【００６２】
１）35S-sGFP-NIP5;1 in pUC18 (ＮＩＰ５；１のＮ末端側にｓＧＦＰを連結したもの)
ＮＩＰ５；１のｃＤＮＡクローンＣＥＲＥＳ ３６６５５ (Ceres, Los Angeles, USAより分譲)を鋳型にプライマー３８（配列番号４０）およびプライマー３９（配列番号４１）を用いてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼはKOD -plus- (Toyobo, Osaka, Japan)を使用した。ＰＣＲ産物を、添付のプロトコールに従ってpGEM-Teasy (Promega, Madison, USA)へＴＡクローニングし、配列を決定してデータベース(TAIR: the Arabidopsis Information Resource; http://arabidopsis.org/)上の配列と比較し、増幅の誤りがないことを確認した。ＮＩＰ５；１のＯＲＦをＢｓｒＧＩとＮｏｔＩで切り出して、同制限酵素で切断したｐＴＨ２(Chiu, W.L., Niwa, Y., Zeng, W., Hirano, T., Kobayashi, H., and Sheen, J. (1996). Engineered GFP as a vital reporter in plants. Curr. Biol. 6,325-330)へサブクローニングした。【００６３】
２）35S-NIP5;1-sGFP in pBI221 (ＮＩＰ５；１のＣ末端側にｓＧＦＰを連結したもの)
ＮＩＰ５；１のｃＤＮＡクローンＲＺＬ５５ｂ０１(Kazusa DNA research Institute, Kisarazu, Japanより分譲された)を鋳型にプライマー４０（配列番号４２）およびプライマー４１（配列番号４３）を用いてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼはPfu turbo DNA polymerase(Stratagene, La Jolla, USA)を使用した。ＰＣＲ産物を、添付のプロトコールに従ってpGEM-Teasy (Promega, Madison, USA)へＴＡクローニングし、配列を決定してデータベース(ＴＡＩＲ)上の配列と比較し、増幅の誤りがないことを確認した。ＮＩＰ５；１を含むＸｂａＩ-ＮｃｏＩ断片と、ｐＢＩ２２１(Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., and Bevan, M.W. (1987). GUS fusions - beta -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907)のＸｂａＩ-ＥｃｏＲＩ断片(vectorbackboneを含む断片)と、ｐＴＨ２(前述のChiu et al., 1996)のＮｃｏＩ-ＥｃｏＲＩ断片(ｓＧＦＰおよびＮＯＳターミネーターを含む断片)をライゲーションし、クローニングした。結果、ＮＩＰ５；１とｓＧＦＰの間にGly-Gly-Gly-Gly-Alaのリンカーが挿入された。【００６４】
３）ＤＮＡ材料として上記２種類のプラスミド、35S-sGFP-NIP5;1 in pUC18および35S-NIP5;1-sGFP in pBI221とｐＴＨ２(35S-sGFP in pUC18)(前述のChiu et al., 1996)を用いた。また、コントロールとして３５Ｓプロモーター制御下でｓＧＦＰを発現するコンストラクト(ｐＴＨ２)のＤＮＡを用いた。それぞれのＤＮＡを金粒子(直径１μｍ)にコーティングした。【００６５】
市販のタマネギのりん片の最外層から数えて３−４層目の内側の表皮を１／２ＭＳ固形培地にのせ、ＤＮＡをコーティングした前述の金粒子をPDS-1000/He system(BioRad, Hercules, USA)により、タマネギの表皮細胞にそれぞれ打ち込んだ。その際ガス圧は７．６Ｍｐａとした。ＤＮＡを打ち込んだタマネギサンプルを２２℃、暗条件で１６時間インキュベートし、共焦点レーザー顕微鏡Zeiss LSM510(Carl Zeiss, Jena, Germany)により励起波長４８８ｎｍを照射したときの５０５-５３０ｎｍの蛍光を観察した。その結果を図１１に示す。図１１の結果からわかるように、コントロールでは主に細胞質と核に蛍光が見られたが、ＮＩＰ５；１のN末端にｓＧＦＰを融合させたもの、およびＮＩＰ５；１のＣ末端にｓＧＦＰを融合させたものでは、主に細胞の周縁部に蛍光が見られた。これにより、ＮＩＰ５；１は主に細胞膜に局在することが明らかとなった。【００６６】
（１１）シロイヌナズナ体内におけるＮＩＰ５；１の発現の組織特異性−ＧＵＳ染色を用いた解析
シロイヌナズナ体内でのＮＩＰ５；１の発現の組織特異性を調べるため、ＮＩＰ５；１プロモーター::ＧＵＳ形質転換シロイヌナズナを栽培し、ＧＵＳ染色を行った。具体的には、上記の（９）で作製した、ＮＩＰ５；１プロモーター::ＧＵＳの独立した８つの形質転換ライン（ＧＵＳライン１−８）のＴ２世代を、ホウ素濃度０．３μＭの固形培地で９日間栽培した。栽培した植物全体についてＧＵＳ染色を行った。ＧＵＳ染色は以下のような手順で行った。【００６７】
植物をＧＵＳ染色液（１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．０、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ Ｋ３Ｆｅ［ＣＮ］６、２ｍＭ Ｋ４Ｆｅ［ＣＮ］６、０．５ｍｇ／ｍｌ ５-bromo-４-chloro-３-indolyl-b-D-glucronic acid (以下Ｘ−Ｇｌｕｃと記す) (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan))に浸し、減圧下で２０分浸潤させた後、３７℃で２日間インキュベートした。その後７０％エタノール、１００％エタノールで洗浄し、ＦＡＡ溶液（５％酢酸、６０％エタノール、５％ホルムアルデヒド）に移した。このようなＧＵＳ染色の結果を図１２に示す。図１２の結果からわかるように、ＧＵＳの活性は、根全体で見られ、特に根の先端から約２００−７００μｍの伸長域に強く見られた。観察した８ライン中６ラインに同様の傾向が見られた。また、５つの形質転換ライン（ＧＵＳライン１、２、４、６、８）をホウ素濃度０．３μＭの水耕液で水耕栽培し、植物の地上部についてＧＵＳ染色を行ったが、地上部での活性は見られなかった。これらの事実から、若い植物では、ＮＩＰ５；１は主に根の伸長域に発現していることが示唆された。【００６８】
さらに、根のどの部位でＮＩＰ５；１の発現が見られるかをより詳細に調べるため、根の横断面の切片についてＧＵＳ染色を行った。ＧＵＳライン４、ＧＵＳライン８の根の先端から約３００μｍの伸長域に当たる部分、および、地上部との境目から約１ｃｍの成熟した部分をエタノールシリーズで脱水してTechnovit 7100 resin (Heraeus Kulzer GmbH,Wehrheim, Germany) に包埋し、それをミクロトームＬＲ−８５(Yamato-kohki, Saitama, Japan)で１０μｍにスライスして切片を作製した。切片は０．０５％（ｗ／ｖ）のRuthenium red(Sigma Aldrich, St. Lois, USA)に約３０秒間浸して染色し、５０℃に設定したホットプレート上で乾燥した。染色像は光学顕微鏡ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ５０ＷＩ (Olympus, Tokyo, Japan) にて観察した。その結果を図１３に示す。図１３の結果からわかるように、伸長域でも成熟域でも根の組織全体にＧＵＳの活性が見られたが、伸長域では特に表皮に強い活性が見られた。また、伸長域では、表皮に比べると若干弱いものの、皮層、内皮にも強いＧＵＳ活性が見られた。中心柱におけるＧＵＳの活性は、伸長域および成熟域のどちらにおいても弱かった。この傾向は観察した２ラインの両方に見られた。【００６９】
同様の実験を、水耕で２５日間栽培した抽苔していないＧＵＳライン１、２、４、６、８について行ったところ、根では９日目の植物と同様に伸長域での強い活性が見られた。また、ロゼット葉では、トライコーム（毛状突起）に弱いＧＵＳの活性が見られた（図１４Ａ）。この傾向は観察した５ライン中３ラインにおいて認められた。また、同様の実験を、水耕で４０日間栽培したＧＵＳライン１、２、４、６、８について行った。その植物は、抽苔して花をつけた状態だった。この植物の花およびロゼット葉を観察したところ、柱頭および花柱にＧＵＳの活性が見られた（図１４Ｂ）。この傾向は観察した５ライン中４ラインにおいて認められた。【００７０】
（１２）シロイヌナズナ体内におけるＮＩＰ５；１の発現の組織特異性−ＧＦＰを用いた解析−
シロイヌナズナ生体内でのＮＩＰ５；１の発現の組織特異性を調べるため、ＮＩＰ５；１の翻訳開始点の上流約２．５ｋｂの配列の下流にレポーター遺伝子であるＧＦＰの配列をつないだコンストラクトを挿入した形質転換シロイヌナズナを独立して１２ライン作製した（ＧＦＰライン１−１２）。ＧＦＰライン１−１２のＴ２世代とＣｏｌ−０株をホウ素濃度０．３μＭの固形培地で６日間栽培し、FluorImager 595（Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA）とImagerQuant （Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA）を用いて植物全体のＧＦＰの蛍光像を観察した。観察条件は以下のように設定した。対象を波長４８８ｎｍのアルゴンレーザーにて励起し、ＧＦＰの観察用に５１５−５４５ｎｍの蛍光を、クロロフィルの自家蛍光の観察用に６１０ｎｍの蛍光をスキャンした。ＧＦＰライン８の結果を図１５Ｂに示す。同様に栽培した野生株（Ｃｏｌ−０株）について観察した結果を図１５Ａに示す。図１５の結果からわかるように、ＧＦＰは根の先端に強く検出され、地上部ではほとんど検出されなかった（図１５Ａ、Ｂ参照）。観察した１２ライン中１１ラインで同様の傾向が見られた。【００７１】
さらに、ＧＦＰライン６についてはホウ素濃度３００μＭの固形培地で１４日間栽培した後、ホウ素濃度０．１μＭの固形培地に移して３日間栽培し、共焦点レーザー顕微鏡Zeiss LSM510(Carl Zeiss, Jena, Germany)により励起波長４８８ｎｍを照射したときの５０５−５３０ｎｍの蛍光を観察した。その結果を図１５Ｃに示す。図１５からわかるように、ＧＦＰの蛍光は伸長域の他、根冠や分裂域でも強く、成熟域に近づくにつれて徐々に弱くなっていった。この傾向はＧＵＳの局在パターンと似ていたが、共焦点レーザー顕微鏡で細部を観察すると、少し異なっていた。すなわち、ＧＵＳの活性は根の伸長域で最も強く、その下の分裂域付近では強い活性が見られなかったのに対し、ＧＦＰの蛍光は伸長域の他、根冠や分裂域でも強く、成熟域に近づくにつれて徐々に弱くなっていった。【００７２】
（１３）ＮＩＰ５；１発現抑制変異株の異なるホウ素条件下での生長量
ＮＩＰ５;１の発現抑制変異株の生育が、異なるホウ素条件下でどのような影響を受けるかを調べるために以下のような実験を行った。【００７３】
ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２、Ｃｏｌ−０株（野生株）およびＷｓ株（野生株）を、ホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で栽培し、７日後に根の長さ、１０日後に地上部新鮮重を測定した。根の長さは定規で測定した。また、地上部新鮮重は、刈り取ってすぐ、電子天秤(METTLER TOLEDO AG204, METTLER TOLEDO, Tokyo, Japan)で０．１ｍｇ単位まで測定した。ｎｉｐ５；１−１とＣｏｌ−０株（野生株）の地上部新鮮重についての結果を図１６に、根の長さについての結果を図１７に示す。
また、ｎｉｐ５；１−２と野性株Ｗｓ株の地上部新鮮重についての結果を図１８に、根の長さについての結果を図１９に示す。【００７４】
３０μＭ以上のホウ素濃度の培地で栽培した場合は、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２共に、野生株と同程度の地上部新鮮重および根の長さを示したが、３  μＭ以下のホウ素濃度の培地で栽培した場合は、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２共に、野生株よりも有意に低い地上部新鮮重および根の長さを示した（図１６〜図１９）。Ｃｏｌ−０株（野生株）と比較した場合の、ｎｉｐ５；１−１の地上部新鮮重は０．３μＭのホウ素濃度では平均で野生株の７％、３μＭのホウ素濃度では野生株の２１％（図１６）、根の長さは０．３μＭのホウ素濃度では野生株の１１％、３μＭのホウ素濃度では野生株の８０％であった（図１７）。Ｗｓ株（野生株）と比較した場合の、ｎｉｐ５；１−２の地上部新鮮重は０．３μＭのホウ素濃度では野生株の３％、３μＭのホウ素濃度では野生株の２８％（図１８）、根の長さは０．３μＭのホウ素濃度では野生株の２５％、３μＭのホウ素濃度では野生株の６９％であった（図１９）。これらの結果から、ＮＩＰ５；１の発現抑制変異株は、低ホウ素条件下での生育が野生株よりも強く阻害されることが明らかとなった。【００７５】
（１４）ＮＩＰ５；１発現抑制変異株の異なるホウ素条件下での形態
ＮＩＰ５；１の発現抑制変異株の形態が、異なるホウ素条件下でどのような影響を受けるかを調べるために、まず、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２、Ｃｏｌ−０株（野生株）およびＷｓ株（野生株）を低ホウ素条件であるホウ素濃度０．３μＭの固形培地で１０日間栽培した。ｎｉｐ５；１−１とＣｏｌ−０株（野生株）の栽培後の形態を図２０に示す。また、ｎｉｐ５；１−２と野性株Ｗｓ株の栽培後の形態を図２１に示す。図２０および図２１の結果からわかるように、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２共にそれぞれ野生株と比べて顕著に生育阻害を受けた。また、地上部については、野生株では４−６枚の葉が展開していたのに対し、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２では子葉２枚のみが展開していた。子葉の大きさを比べると、野生株よりもｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２の方が明らかに小さかった。根については、野生株では主根が伸び、側根の発達も見られるのに対し、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２ではわずかに主根が伸びるだけで側根の発達は見られなかった。【００７６】
一方、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２、Ｃｏｌ−０株（野生株）およびＷｓ株（野生株）をホウ素濃度１５０μＭの固形培地で１０日間栽培した。ｎｉｐ５；１−１とＣｏｌ−０株（野生株）の栽培後の形態を図２２に示す。また、ｎｉｐ５；１−２とＷｓ株（野生株）の栽培後の形態を図２３に示す。図２２および図２３からわかるように、野生株と変異株の形態に顕著な差は見受けられなかった。【００７７】
さらに詳細な観察のため、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株（野生株）をホウ素濃度３、１０、３０、および１５０μＭの水耕液により水耕栽培した。栽培後２６日目のＣｏｌ−０株（野生株）の形態を図２４のＡ〜Ｄに、ｎｉｐ５；１−１の形態を図２４のＥ〜Ｈに示す。３μＭのホウ素濃度では、ｎｉｐ５；１−１の子葉の展開は野生株と同様であったが、第１ロゼット葉の展開から抑制され、以降の葉は濃緑色で萎縮した形態を示した（図２４ＡおよびＥ）。１０μＭのホウ素濃度では、ｎｉｐ５；１−１の子葉、ロゼット葉の色、形態は、野生株とほとんど変わらなかったが、全体的なサイズはｎｉｐ５；１−１の方が小さかった（図２４ＢおよびＦ）。３０、１５０μＭのホウ素濃度では野生株と同様の生長、形態を示した（図２４Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨ）。一方、ｎｉｐ５；１−２に関しては、この濃度範囲では抽苔前の地上部の形態にＷｓ株（野生株）との差はほとんど見られなかった。【００７８】
次に、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２、Ｃｏｌ−０株（野性株）およびＷｓ株（野性株）をホウ素濃度３、１０、３０、および１５０μＭの水耕液で３８日間水耕栽培した後、それぞれの植物体の様子を観察した。その時のＣｏｌ−０株（野性株）、ｎｉｐ５；１−１、Ｗｓ株（野性株）およびｎｉｐ５；１−２の形態を、それぞれ図２５、図２６、図２７および図２８に示す。さらに、前述の３８日間水耕栽培した後のｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２のより詳細な形態を図２９に示す。図２９のＡおよびＢは、ホウ素濃度３および１０μＭで栽培したｎｉｐ５；１−１をそれぞれ示す。図２９のＣおよびＤは、ホウ素濃度３および１０μＭで栽培したｎｉｐ５；１−２をそれぞれ示す。【００７９】
図２５、図２６からわかるように、ｎｉｐ５；１−１は１０μＭ  Ｂ区以下で生育阻害を受けた。また、ｎｉｐ５；１−１は、３μＭ  Ｂ区では抽苔せず（図２９Ａ）、１０μＭ  Ｂ区では抽苔はするが頂芽優勢が失われ、短い茎が数本伸びている状態だった（図２９Ｂ）。図２７、図２８からわかるように、ｎｉｐ５；１−２も低ホウ素で生育阻害を受けたが、ｎｉｐ５；１−１と比較すると少し程度が異なっていた。また、ｎｉｐ５；１−２は、３μＭ  Ｂ区では抽苔はするが頂芽優勢が失われ、短い茎が数本伸びている状態（図２９Ｃ）、１０μＭ  Ｂ区では植物の丈は正常だが不稔の形質を示した（図２９Ｄ）。【００８０】
次に、ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）をホウ素濃度１０μＭで４２日間水耕栽培した後、水耕液のホウ素濃度を１５０μＭに上げてさらに４日間栽培し、その形態を観察した。ｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）をホウ素濃度１０μＭで４２日間水耕栽培した直後のｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）の形態を図３０に、ホウ素濃度１５０μＭでさらに４日間栽培した後のｎｉｐ５；１−２およびＷｓ株（野性株）の形態を図３１に示す。また、図３０および図３１におけるｎｉｐ５；１−２の先端部の形態を拡大したものを、それぞれ図３２および図３３に示す。図３２および図３３からわかるように、低ホウ素状態後に十分なホウ素を与えると稔性の回復が観察された。ｎｉｐ５；１−２をより厳しい低ホウ素状態であるホウ素濃度０．０３および０．３μＭで水耕栽培すると、抽苔が起こらなかった。【００８１】
（１５）ＮＩＰ５；１発現抑制変異株の体内ホウ素濃度
ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２は野生株と比較して低ホウ素状態で生育阻害を受けやすいこと、低ホウ素状態の植物が示した頂芽優勢の損失や不稔などの性質は、一般的なホウ素欠乏症状として知られている(Marschner, H. (1995). Mineral Nutrition of Higher Plants. Academic Press, San Diego, USAおよびDell, B. and Huang, L. (1997). Physiological response of plants to low boron. Plant Soil 193, 103-120)こと、さらに不稔となったｎｉｐ５；１−２に十分量のホウ素を与えると稔性が回復したことから、ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２では体内ホウ素濃度が低下しているのではないかと思われた。培地中のホウ素濃度と植物体内のホウ素濃度の関係を調べるために以下のような実験を行った。【００８２】
ｎｉｐ５；１−１、ｎｉｐ５；１−２、Ｃｏｌ−０株、およびＷｓ株を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。栽培は、人工気象器(NK System Biotron, Nippon Medical and Chemical Instrument, Tokyo, Japan)内で行った。人工気象器は、１０時間の明条件（白色蛍光灯）と１４時間の暗条件を順に繰り返すように設定した。また、人工気象器内の温度は、２２℃に設定した。【００８３】
栽培後、植物は根と地上部に分けてサンプリングした。水耕液の混入を避けるため、根を脱イオン水で数秒間すすいでから地上部と根を切り取り、キムタオルで水分を除いた後、６０℃に設定した乾熱器で６０時間以上乾燥させた。サンプルの乾燥重量を測定した後、８ｍｌ容のテフロン（登録商標）チューブ (Nalgene, Rochester, New York, USA) に移し、濃硝酸を加えて９０−１３０℃に設定したヒートブロックで分解し、乾燥させた。乾燥して得られたペレットを３ｍｌの５ｐｐｂ Ｂｅ、０．０８Ｎ ＨＮＯ３溶液に溶解し、さらに同溶液で分析に適当な濃度に希釈して、ＩＣＰ−ＭＳ ＳＰＱ−９０００(Seiko Instrument Inc., Chiba, Japan) によりホウ素濃度を定量した。このようにして測定したｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株の地上部のホウ素濃度を図３４に、ｎｉｐ５；１−２とＷｓ株の地上部のホウ素濃度を図３５に、ｎｉｐ５；１−１およびＣｏｌ−０株の根のホウ素濃度を図３６に、ｎｉｐ５；１−２とＷｓ株の根のホウ素濃度を図３７に示す。【００８４】
ｎｉｐ５；１−１は、０．３μＭおよび１５０μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合には地上部のホウ素濃度についてＣｏｌ−０株（野生株）との間に有意な差が見られず、３および３０μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合にはＣｏｌ−０株（野生株）と比較してそれぞれ平均で２８％、５９％に低下していた（図３４）。また、ｎｉｐ５；１−１の根のホウ素濃度については、０．３および３μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合は根が短すぎて測定できなかったが、３０μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合はＣｏｌ−０株（野生株）と比較して平均で８３％に低下していた。また、１５０μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合の根のホウ素濃度は、ｎｉｐ５；１−１とＣｏｌ−０株（野生株）との間に有意な差が見られなかった（図３６）。【００８５】
ｎｉｐ５；１−２は、０．３μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合には地上部のホウ素濃度について、ｎｉｐ５；１−１と同様にＷｓ株（野生株）との間に有意な差が見られず、３μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合にはＷｓ株（野生株）と比較して平均で２２％に低下していた（図３５）。また、３０および１５０μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合には、地上部のホウ素濃度について、ｎｉｐ５；１−２とＷｓ株（野生株）との間に有意な差が見られなかった（図３５）。根のホウ素濃度については、０．３μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合には根が短すぎて測定できなかったが、３および３０μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合にはＷｓ株（野生株）と比較してそれぞれ平均で５６％、８９％に低下していた（図３７）。また、１５０μＭのホウ素濃度の培地で栽培した場合の根のホウ素濃度は、ｎｉｐ５；１−２とＷｓ株（野生株）との間に有意な差が見られなかった（図３７）。【００８６】
（１６）アクチベーションタグ挿入変異株の取得とＴ−ＤＮＡの挿入をホモに持つ系統の確立
ＮＩＰ５；１を過剰発現させるとどのような表現型が現れるかを調べるため、ＮＩＰ５；１過剰発現変異株の取得を試みた。ＮＩＰ５；１過剰発現変異株の取得するために、ＳＩＧｎＡＬ(Salk Institute Genomic Analysis Laboratory)のＴ−ＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓを検索し、シロイヌナズナにおいてＮＩＰ５；１の付近に、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターを含むＴ−ＤＮＡアクチベーションタグの挿入があると予想される形質転換体(Rosso, M.G., Li Y., Strizhov, N., Reiss, B., Dekker, K., and Weisshaar, B. (2003). An Arabidopsis thaliana T-DNA mutagenized population (GABI-Kat) for flanking sequence tag-based reverse genetics. Plant Mol. Biol. 53, 247-259)を３系統（ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１）取得した。ＳＩＧｎＡＬのＴ−ＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓに公開されている隣接配列から予想されるＴ−ＤＮＡの挿入位置を図３８に示す。これらの３系統は全てMax Planck Institute fur Zuchtungsforschung(Koln, Germany)より提供された。それらの３株の変異株の背景となる野生株はＣｏｌ−０株である。【００８７】
これらの３系統におけるＴ−ＤＮＡアクチベーションタグの挿入をホモに持つ系統を確立するため、提供されたＴ３世代の種を１０粒ずつ播いてバーミキュライト耕により栽培し、Kasajimaら（Kasajima, I., Ide, Y., Ohkama-Ohtsu, N., Hayashi, H., Yoneyama, T., and Fujiwara, T. (2004). A protocol for rapid DNA extraction from Arabidopsis thaliana for PCR analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 22, 49-52）の方法により葉からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型に、以下の２種類のプライマーセットでＰＣＲを行った。
１）プライマーセット１：Ｔ−ＤＮＡの挿入が予想される位置を挟む、シロイヌナズナのゲノムに特異的なプライマーセット
２）プライマーセット２：Ｔ−ＤＮＡのLeft borderの配列に特異的なプライマー とゲノムに特異的なプライマーセットのうちの一方【００８８】
ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９については、プライマーセット１としてプライマー４２（配列番号４４）およびプライマー４３（配列番号４５）、プライマーセット２としてプライマー４４（配列番号４６）およびプライマー４２（配列番号４４）を、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１については、プライマーセット１としてプライマー４５（配列番号４７）およびプライマー４６（配列番号４８）、プライマーセット２としてプライマー４４（配列番号４６）およびプライマー４５（配列番号４７）を用いた。【００８９】
ＰＣＲに際しては、プライマーセット１を用いると野生株（Ｃｏｌ−０株またはＷｓ株）のＤＮＡからは常に増幅されることを確認しながら行った。プライマーセット１で野生株のＤＮＡを鋳型としたときに増幅されるサイズのＤＮＡ断片の増幅が見られず、かつ、プライマーセット２で増幅が見られたものを、Ｔ−ＤＮＡをホモに持つ系統と判断した。ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９およびＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１についてのＰＣＲの結果を利用して、Ｔ−ＤＮＡアクチベーションタグをホモに持つ株をそれぞれ選抜した。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２についてはＰＣＲによる選抜がうまくいかなかった。しかし、Ｔ−ＤＮＡアクチベーションタグと共にスルファジアジン耐性遺伝子が挿入されていることを利用して、後代が全てスルファジアジン耐性をもつ系統をＴ−ＤＮＡアクチベーションタグをホモに持つＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２の系統と判断して選抜を行った。なお、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９およびＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１から得られた後代は全てスルファジアジン耐性（ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９およびＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１）であった。【００９０】
（１７）Ｔ−ＤＮＡアクチベーションタグ挿入変異株におけるＮＩＰ５；１のｍＲＮＡの蓄積量
ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１株において、ＮＩＰ５；１の発現が実際に上昇しているかを調べるため、それぞれの株の根におけるＮＩＰ５；１のｍＲＮＡの蓄積量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。具体的には以下のような方法で実験を行った。
ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１と、コントロールであるＣｏｌ−０株を、ホウ素濃度３０μＭの固形培地でそれぞれ１０日間栽培した後、それぞれの根からサンプリングした。それぞれのサンプルから、RNeasy Plant Mini Kitを用いてＲＮＡを抽出し、上記（３）と同様の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う際のＮＩＰ５；１遺伝子のプライマーとして、プライマー１５（配列番号１７）およびプライマー１６（配列番号１８）を用いた。なお、各遺伝子の定量値は、発現量が一定と考えられる遺伝子であるＥＦ−１αの定量値で割ることで標準化した。このような定量的RT-PCRを行った結果を図３９に示す。図３９からわかるように、Ｃｏｌ−０株に比べてＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２株では平均で２．９倍、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１株では平均で３．４倍にＮＩＰ５；１の発現が上昇していた。ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９株では野生株に対して有意な発現上昇は見られなかったものの、発現の上昇傾向は確認された。以下、これらの系統を総称してＮＩＰ５；１過剰発現変異株と呼ぶ。【００９１】
（１８）ＮＩＰ５；１過剰発現変異株の異なるホウ素条件下での生長量
ＮＩＰ５；１の過剰発現変異株の生育が、異なるホウ素条件下でどのような影響を受けるかを調べるために次の実験を行った。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）を、ホウ素濃度０．３、３、３０、１５０、および３００μＭのそれぞれの固形培地で栽培し、７日後に根の長さ、１０日後に地上部新鮮重を測定した。根の長さは定規で測定した。また、地上部新鮮重は、刈り取ってすぐ、電子天秤（ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ  ＡＧ２０４，ＭＥＴＴＬＥＲ  ＴＯＬＥＤＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で０．１ｍｇ単位まで測定した。地上部新鮮重に関する結果を図４０に、根の長さに関する結果を図４１に示す。図４０および図４１の結果からわかるように、ＮＩＰ５；１の過剰発現変異株とＣｏｌ−０株（野生株）との差はほとんど見られなかった。【００９２】
次に、ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭで水耕栽培し、３７日後に地上部新鮮重を測定した。その結果を図４２に示す。図４２の結果からわかるように、ＮＩＰ５；１の過剰発現変異株とＣｏｌ−０株（野生株）との間に差が見られた。すなわち、０．３μＭのホウ素濃度ではＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１株が平均でＣｏｌ−０株（野生株）の１．９倍に生育が良くなっており、３０μＭのホウ素濃度ではＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９株、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１株がそれぞれ平均で野生株の０．７倍、０．６倍に生育が悪くなっていた。【００９３】
（１９）ＮＩＰ５；１過剰発現変異株の体内ホウ素濃度
ＮＩＰ５；１過剰発現変異株の植物体内のホウ素濃度が、培地中のホウ素濃度によりどのような影響を受けるかを調べるために次の実験を行った。ＧＡＢＩ  ０４６Ｃ１２、ＧＡＢＩ  １７０Ｈ０９、ＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１およびＣｏｌ−０株（野生株）を、ホウ素濃度０．３、３、３０、および１５０μＭの水耕液で３７日間水耕栽培した。栽培は、人工気象器(NK System Biotron, Nippon Medical and Chemical Instrument, Tokyo, Japan)内で行った。人工気象器は、１０時間の明条件（白色蛍光灯）と１４時間の暗条件を順に繰り返すように設定した。また、人工気象器内の温度は、２２℃に設定した。【００９４】
栽培後、植物は根と地上部に分けてサンプリングした。サンプリング時、すべての株で抽苔は見られなかった。水耕液の混入を避けるため、根を脱イオン水で数秒間すすいでから地上部と根を切り取り、キムタオルで水分を除いた後、６０℃に設定した乾熱器で６０時間以上乾燥させた。サンプルの乾燥重量を測定した後、８ｍｌ容のテフロン（登録商標）チューブ(Nalgene, Rochester, New York, USA)に移し、濃硝酸を加えて９０−１３０℃に設定したヒートブロックで分解し、乾燥させた。乾燥して得られたペレットを３ｍｌの５ｐｐｂ  Ｂｅ、０．０８Ｎ  ＨＮＯ３溶液に溶解し、さらに同溶液で分析に適当な濃度に希釈して、ＩＣＰ−ＭＳ  ＳＰＱ−９０００(Seiko Instrument Inc., Chiba, Japan)によりホウ素濃度を定量した。地上部新鮮重に関する結果を図４３に、根の長さに関する結果を図４４に示す。Ｃｏｌ−０株（野生株）と比べて有意差があったのは、１５０μＭのホウ素濃度で栽培したＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１株の地上部新鮮重の結果のみであった。そのＧＡＢＩ  ２９７Ｇ１１株の地上部ホウ素濃度は、平均でＣｏｌ−０株（野生株）の１．２倍になっていた。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明のホウ素吸収促進活性を有するタンパク質をコードするホウ素吸収促進遺伝子を用いると、植物におけるホウ素吸収を人為的に制御し、成長調節を行なったり、微生物のホウ素の吸収効率を高めることが可能になる。また、ホウ素の環境からの効率的な除去や集積が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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