(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料に核酸染色蛍光色素を加えて測定用試料を調製し、
前記測定用試料をフローサイトメータに併して試料中の粒子の各々について散乱光強度と蛍光強度を測定し、
測定された散乱光強度および蛍光強度に基づいて粒子の２次元分布を作成し、
２次元分布中に赤血球分布領域を設定してその領域内の粒子数から全赤血球数Ａを計数し、
前記赤血球分布領域内で散乱光強度および蛍光強度が低い領域に破砕赤血球分布領域を設定してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂを計数し、
Ｂ／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破砕赤血球含有率Ｆを算出する工程からなる破砕赤血球の測定方法。
【請求項２】
赤血球分布領域内で散乱光強度が破砕赤血球分布領域よりも高い領域に小型赤血球分布領域を設定してその領域の粒子数から小型赤血球数Ｃを計数し、
前記破砕赤血球含有率ＦをＣ／Ａに基づいて補正する工程をさらに備えた請求項１記載の破砕赤血球の測定方法。
【請求項３】
破砕赤血球含有率Ｆを算出する工程は、Ｃ／Ａが所定値αより大きいときに、ＦをＣ／Ａに基づいて補正することを特徴とする請求項２記載の破砕赤血球の測定方法。
【請求項４】
Ｆは、Ｃ／Ａが所定値α以下のときにＦ＝ｆ（Ｂ／Ａ）で算出され、Ｃ／Ａが所定値αより大きいときにＦ＝ｆ（Ｂ／Ａ）・ｅｘｐ｛−ａ（Ｃ／Ａ）｝（ａは定数）で算出される請求項２記載の破砕赤血球の測定方法。
【請求項５】
ａ＝０．４３である請求項４記載の破砕赤血球の測定方法。
【請求項６】
αは１〜３％の間の値である請求項３又は４記載の破砕赤血球の測定方法。
【請求項７】
換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）がＦ＝ｍ（Ｂ／Ａ）＋ｎ（ｍ，ｎは定数）で表わされる請求項１記載の破砕赤血球の測定方法。
【請求項８】
血液試料に核酸染色蛍光色素を加えて測定用試料を調製された測定用試料を流すフローセルと、
フローセルを流れる測定用試料中の粒子に光を照射する光源と、
照射された各粒子から生じる散乱光を検出し散乱光強度に変換する第１の検出部と、
照射された各粒子から生じる蛍光を検出し蛍光強度に変換する第２の検出部と、
第１の検出部で得られた散乱光強度および第２の検出部で得られた蛍光強度に基づいて粒子の２次元分布を作成し、
２次元分布中に赤血球分布領域を設定してその領域内の粒子数から全赤血球数Ａを計数し、前記赤血球分布領域内に破砕赤血球分布領域を設定してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂを計数し、
Ｂ／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破砕赤血球含有率Ｆを算出するデータ処理部を備える、破砕赤血球の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は破砕赤血球（ＦＲＣ）の測定方法に関し、とくに、心血管異常、先天性又は後天性溶血貧血、播種性血管内凝固、尿毒症、ＴＴＰのような種々の疾病において観察される末梢血の破砕赤血球の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
最近、ＢＭＴ−ＴＭＡ（骨髄移植後血栓性微小血管症）の研究により、末梢血におけるＦＲＣ％（破砕赤血球含有百分率）はその早期診断の重要な指標として注目され、ＢＭＴ−ＴＭＡ評価システム（グレード０〜４）が、次のように乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と共にＦＲＣ％に基づいて開発された（Bone Marrow Transplantation, 15, p. 247-253, 1995年）。
グレード０；ＬＤＨ正常及びＦＲＣ≦１．２％
グレード１；ＬＤＨ正常及びＦＲＣ≧１．３％
グレード２；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ１．３−４．８％
グレード３；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ４．９−９．６％
グレード４；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ≧９．７％
【０００３】
ところでＦＲＣ％は、末梢血の塗抹標本を目視で精査して算出することが可能であるが、その定量は一般的に行われず、ＦＲＣ（破砕赤血球）の存在の有無のみが検出される。また、自動赤血球計数装置において標準化された赤血球粒度分布でＦＲＣの形跡を検出できる旨を報告した例がいくつか見られる（American Journal of Clinical Pathology, 90, p. 268-273, 1988年）。しかしながら、今だにその定量は塗抹標本による目視試験につまり目視法に依存しているが、その結果さえ参照基準がないため試験する人の個人差によって大きくばらつくという問題がある。
【０００４】
この発明はこのような事情を考慮してなされたもので、フローサイトメータのスキャッタグラム上に特定の領域を設定することにより、精度よくＦＲＣ％を定量化することが可能な破砕赤血球の測定方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この発明は、血液試料に核酸染色蛍光色素を加えて測定用試料を調製し、前記測定用試料をフローサイトメータに併して試料中の粒子の各々について散乱光強度と蛍光強度を測定し、測定された散乱光強度および蛍光強度に基づいて粒子の２次元分布を作成し、２次元分布中に赤血球分布領域を設定してその領域内の粒子数から全赤血球数Ａを計数し、前記赤血球分布領域内で散乱光強度および蛍光強度が低い領域に破砕赤血球分布領域を設定してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂを計数し、Ｂ／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破砕赤血球含有率Ｆを算出する工程からなる破砕赤血球の測定方法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
この発明に必要な血液試料の量は、１０〜１００μＬ程度であり、この試料には、赤血球中のＲＮＡ（リボ核酸）を染色して蛍光による検出を可能にするため、核酸染色蛍光色素が加えられて測定用試料として調製される。
【０００７】
核酸染色蛍光色素としては、オーラミン−０、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、チオララビンＴ、ピロニンＹ、コリホスフィン０、３，３’−ジメチルカルボシアニンアイオダイド、オキサジン７５０、ポリメチン系蛍光色素などが挙げられる。
測定試料の調製にあたっては、上記色素を含む市販の網状赤血球測定試薬と血液試料とを、１００：１〜１０００：１の比で混合し、反応させることが好ましい。この際の反応温度は２５〜５０℃程度が好ましく、さらに好ましくは３５〜４５℃である。また、反応時間は試薬中に含まれる色素によって多少異なるが、１０秒〜５分程度が好ましく、より好ましくは２０秒〜２分程度、さらに好ましくは２０秒〜６０秒程度である。
【０００８】
この発明に用いるフローサイトメータとは、粒子含有液体試料をシースフローセルに流して、一列に配列した粒子に光を照射して各粒子から生じる散乱光と蛍光などを検出するようにした装置であり、これには例えばシスメックス株式会社製の自動網赤血球測定装置Ｒ−３５００を用いることができる。
【０００９】
この発明における２次元分布には、散乱光強度と蛍光強度を２軸とする座標平面に各血球（粒子）からの散乱光および蛍光の強度を表わす座標にドットをプロットしたスキャッタグラムを用いることができ、その場合には、プロットされた１つのドットが１つの血球（粒子）に対応する。
【００１０】
各血球の散乱光および蛍光強度は、それぞれ血球サイズとリボ核酸（ＲＮＡ）含有量を表わし、２次元分布上で血小板、成熟赤血球および網赤血球を識別するために用いられる。ＦＲＣは赤血球より小さく血小板よりＲＮＡ含有量が少ないので、２次元分布（スキャッタグラム）から検出可能となる。
【００１１】
そこで、この発明では、２次元分布中に赤血球分布領域（ゲートＧ１）を設定してその領域内の粒子数を全赤血球数Ａとして計数し、前記赤血球分布領域内で粒子の大きさが小さく核酸量の少ない（散乱光強度と蛍光強度が低い）領域に破砕赤血球分布領域（ゲートＧ２）を設定してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂを計数し、Ｂ／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いてＦＲＣ％として算出する。なお、換算式ｆ（Ｂ／Ａ）は、Ｂ／Ａと目視法によるＦＲＣ％との相関を示す式を用いることができる。さらに、前記赤血球分布領域内で破砕赤血球分布領域よりも粒子の大きさが大きい（つまり、散乱光強度が高い）領域に小型赤血球分布領域（ゲートＧ３）を設定してその領域の粒子数から小型赤血球数Ｃを計数し、ｆ（Ｂ／Ａ）を破砕赤血球比率Ｆとして算出し、算出した破砕赤血球比率ＦをＣ／Ａの値に基づいて補正するようにしている。
【００１２】
ここで、ゲート３を設けたのは、鉄欠乏性貧血の患者の血液のように血液中に小型赤血球が多く存在する場合に、それがゲート２に出現してＦＲＣとして計数され、Ｆの値が実際よりも大きくなるため、それをＣ／Ａに対応して補正するためである。
なお、赤血球分布領域（ゲートＧ１）の設定方法には、公知の方法、例えば特許第２６７４７０４号に記載の方法を用いることができる。
【００１３】
この発明において、破砕赤血球含有率ＦＲＣ％を算出する工程は、Ｃ／Ａが所定値αより大きいときに、ＦをＣ／Ａに基づいて補正するようにしてもよい。
この発明は、Ｆは、Ｃ／Ａが所定値α以下のときにＦ＝ｆ（Ｂ／Ａ）Ｃ／Ａで算出され、Ｃ／Ａが所定値より大きいときにｆ＝（Ｂ／Ａ）・ｅｘｐ｛−ａ（Ｃ／Ａ）｝（ａは定数）で算出されるようにしてもよい。
してもよい。
定数ａは例えば０．４〜０．５程度の値であり、好ましくはａ＝０．４３である。
また、αには１〜３％の間の値を用いることができる。
上記換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）は一次式Ｆ＝ｍ（Ｂ／Ａ）＋ｎ（ｍ，ｎは定数）で表わすことができる。
【００１４】
実施例
以下、図面に示す実施例を用いてこの発明を詳述する。これによってこの発明が限定されるものではない。
１．フローサイトメータ
図１は、この発明の実施例にフローサイトメータとして用いる自動網赤血球測定装置（シスメックス株式会社製Ｒ−３５００）の基本構成を示す構成説明図である。
【００１５】
同図において、アルゴンレーザ光源１から出射された波長４８８ｎｍのレーザ光Ｌ１は照射レンズ系２によって集光されてシースフローセル３を照射する。粒子（血球）を含む試料液がシースフローセル３にサンプルノズル４から供給される。各粒子は図示しないシース液流により一列に配列されて流れ、粒子（血球）Ｐが出射する前方散乱光と前方蛍光は、コレクターレンズ５とピンホール板６のピンホールを介してダイクロイックミラー７に到達する。ダイクロイックミラー７はその光を４８８ｎｍの波長の前方散乱光Ｌ２と５２０〜５３０ｎｍの波長の前方蛍光Ｌ３に分離する。
【００１６】
前方散乱光Ｌ２は集光レンズ８で集光されてその強度がフィトダイオード９によって前方散乱光強度を表わす電気信号Ｓ１に変換される。前方蛍光Ｌ３はフィルタ１０を介して迷光が除去された後、フォトマルチプライヤチューブ１１によって蛍光強度を表わす電気信号Ｓ２に変換される。信号Ｓ１，Ｓ２はそれぞれアンプ１２，１３で増幅されてデータ処理部１４に入力され、データ処理部１４は処理した結果をディスプレイ１５に表示させるようになっている。
【００１７】
ここで、データ処理部１４は信号Ｓ１，Ｓ２から前方蛍光強度と前方散乱光強度をそれぞれパラメータとする２次元分布（スキャッタグラム）を作成してディスプレイ１５に表示させると共に、その２次元分布に設定される任意の領域内のドット数（粒子数）を計数し、所望の演算を行い計数結果や演算結果をディスプレイ１５に表示させる。なお、２次元分布中の領域の設定や演算プログラムのインストールなどは、図示しない入力装置（キーボードやディスクドライブ）によって行われる。
【００１８】
また、図１の装置のサンプルノズル４に供給される血液試料は例えば次のように調製される。
（１）１０μＬの血液を定量する。
（２）定量した血液を希釈液１９５０μＬで希釈する。
（３）希釈した試料に染色液４０μＬを加え撹拌しながら３５℃で２５秒間インキュベートする。
（４）インキュベートした試料、約２．８μＬをサンプルノズル４を介してシースフローセル３の中央へ送り込む。
【００１９】
なお、この実施例では、上記希釈液と染色液にはそれぞれシスメックス株式会社製のレットサーチ希釈液（成分：ｐＨ８．２５のトリス緩衝液、プリピオン酸ナトリウム含有）とレットサーチ染色液（成分：オーラミンＯ２９．５ｇ／Ｌのエチレングリコール溶液）を使用している。
【００２０】
２．測定方法の開発
（１）模擬破砕赤血球によるＦＲＣ検出領域の確立
健常な男性ドナーから提供された血液中の赤血球を、１５００ｒｐｍの遠心分離によって白血球と血小板とを分離した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝剤）中で３回洗浄し、赤血球サンプルを作成した。赤血球サンプルの一部（サンプルＡ）を５０℃で１００秒間インキュベートして破砕赤血球を誘発させた。それによって適当な破砕赤血球が得られることを走査電子顕微鏡で確認した。
【００２１】
そこでサンプルＡを未処理の赤血球サンプル（サンプルＢ）に０〜８０％の間の種々の比率で混合し、一連の混合液サンプルを得た。各混合液サンプルを目視法で観察、つまりメイギムザ染色法で染色した後、それぞれについて１０００倍の倍率の顕微鏡で血液塗抹標本上の１０００個の赤血球を観察し、ＦＲＣ％を計数した。なお、ＦＲＣは大きさが２μｍ〜４μｍのものとした。
【００２２】
目視法によって得られた一連の混合液サンプルのＦＲＣ％は０〜７％の範囲の値となり、図３に示すようにサンプルＡのサンプルＢに対する含有率（％）と有意な相関を示し、これら一連の混合液サンプルがこの発明の測定方法の開発に適当な模擬サンプルであることが確認された。
【００２３】
次に、これら一連の混合液サンプルを図１に示す測定装置によって測定し、図２に示すように、横軸を前方蛍光強度、縦軸を前方散乱光強度とする２次元分布（スキャッタグラム）を得た。ここで、サイズの大きい血球ほど高い前方蛍光強度を示し、核酸量の多い血球ほど高い前方蛍光強度を示す。
【００２４】
図２においてゲート（領域）Ｇ１は、予め測定装置（図１）に設定されたプログラムによって区画された赤血球（網赤血球および成熟赤血球）分布領域である。なお、ゲートＧ１の下方の外側は血小板の分布領域である。
【００２５】
そして、一連の混合液サンプルに対する測定結果は、サンプルＡの含有率（％）が高くなるにつれて、血小板の分布領域の左上、つまり、ゲートＧ１内でサイズが小さく核酸量の少ない領域におけるドット数（粒子数）が増大する傾向を示したので、その領域中に適当なゲートＧ２を図２に示すように設定し、測定装置によるゲートＧ２中のドット（粒子）％を検出した。
【００２６】
その結果、図４に示すようにゲートＧ２の中のドット数（粒子数）と目視法によるＦＲＣ％との間には有意な相関が見いだされた。
ｙ＝７．４１ｘ−０．４４,……（１）
ｙ：目視法によるＦＲＣ％
ｘ：ゲートＧ２中のドット（粒子）％＝ゲートＧ２／ゲートＧ１
【００２７】
（２）実際の血液サンプルに対するＦＲＣ％の測定
正常なＭＣＶ（平均赤血球容積）および／又はＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）を有し破砕赤血球を含有する９０検体のサンプルについて、式（１）の相関を用いてＦＲＣ％を算出したところ、目視法による計数結果に対して、図５に示すように良好な相関を得た。また、算出ＦＲＣ％と目視法によるＦＲＣ％との間に有意差はなかった（paired t-test, P=0.77）。
【００２８】
（３）ＦＲＣ％の補正
鉄欠乏性貧血の患者などの小球性低色素性検体１７検体のサンプルについて測定を行うと、赤血球は、ＦＲＣ検出ゲートＧ２を設定したスキャッタグラム（図２）上で正常なサンプルよりも低くプロットされることが観察された。その結果、ゲートＧ２の中のドット（粒子）が著しく増加して見かけ上の高いＦＲＣ％が、式（１）から算出されることが分かった。
【００２９】
従って、これらのサンプルを識別するための特定のゲートＧ３を図６に示すように設定し、算出したＦＲＣ％を補正するために用いた。ゲートＧ３の中のドット（粒子）が増大するほど、図７に示すように算出ＦＲＣ％は真の値（ここでは目視法による計数値）に対する格差（倍率）が増大することから、図７に基づいて次式を導出した。
ｙ＝ｅｘｐ（０．４３ｘ）…（２）
ｙは（式（１）からの算出ＦＲＣ）／（目視法によるＦＲＣ）
ｘ：ゲートＧ３内のドット（粒子）％、つまり（ゲートＧ３）／（ゲートＧ１）（％）
【００３０】
なお、算出ＦＲＣ％の補正は、図７よりゲートＧ３内のドット（粒子）％（ゲートＧ３／ゲートＧ１）が１〜３％（例えば１．５％）を越えると必要となることが分かる。
また、真のＦＲＣ％は式（２）から次のように与えることができる。
ＦＲＣ％＝（式（１）からの算出ＦＲＣ）／ｅｘｐ（０．４３×ゲートＧ３／ゲートＧ１）      …（３）
【００３１】
前述の１７検体のサンプルについて、補正したＦＲＣ％と目視法による計数値との間には、図８に示すように有意な相関が見られ、有意差のないことも確認された（paired t-test, P=0.43）。
【００３２】
（４）正常な健常者のサンプルにおける平均ＦＲＣ％
健常者の正常な１８９検体のサンプルについて式（１）によって算出すると、算出したＦＲＣ％は１％以下（０．１４±０．１７％）となった。
これは、算出したＦＲＣ％が決定的な誤診を与える危険性は極めて低いことを示すものである。
【００３３】
（５）治療中のＨＵＳ（尿毒症）患者におけるＦＲＣ％
この発明の方法により一人のＨＵＳ患者についてその治療中のＦＲＣ％のモニターを行った。抗生物質と腹膜透析による臨床的な治療により、ＦＲＣ％が１２日間で８．６％から３．６％まで減少することが定量的に測定された。
【００３４】
【発明の効果】
破砕赤血球（ＦＲＣ）は、通常、血液塗抹標本によって検査されるが、一般的にわずか１０００個の赤血球に対して計数されるので再現性がよくないのに対し、フローサイトメータを用いると平均３万個の血球に対して計数されるので再現性が高い。従って、この発明の方法によれば被験者のＦＲＣ％を再現性よく正確にかつ能率的に算出できるので、この発明は疾病の診断に有効に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例に用いる自動網赤血球測定装置の構成説明図である。
【図２】実施例において得られる２次元分布とゲートＧ１，Ｇ２を示す説明図である。
【図３】実施例におけるサンプルＡの含有率（％）と目視法によるＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
【図４】実施例におけるゲートＧ２中のドット（粒子）％と目視法によるＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
【図５】実施例における目視法によるＦＲＣ％と算出したＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
【図６】実施例における２次元分布とゲートＧ３を示す説明図である。
【図７】実施例におけるゲートＧ３中のドット（粒子）％（Ｇ３／Ｇ１）と算出ＦＲＣ／目視法によるＦＲＣとの関係を示すグラフである。
【図８】実施例における１７検体の小球性低色素性検体において目視法によるＦＲＣ％と算出したＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１  アルゴンレーザ光源
２  照射レンズ系
３  シースフローセル
４  サンプルノズル
５  コレクターレンズ
６  ピンホール板
７  ダイクロイックミラー
８  集光レンズ
９  フォトダイオード
１０  フィルタ
１１  フォトマルチプライヤチューブ
１２  アンプ
１３  アンプ
１４  データ処理部
１５  ディスプレイ
Ｌ１  レーザ光
Ｌ２  前方散乱光
Ｌ３  前方蛍光
Ｐ    粒子
Ｓ１  信号
Ｓ２  信号
【図１】
0004464534.tif 000002
【図２】
0004464534.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004464534.tif 000009