(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０を超えて３１０ｍｍｏl／Ｌの範囲にある１価のカチオンおよび／または０．１〜５００ｍｍｏl／Ｌの範囲にある２価のカチオンと、ポリアニオンとを存在させる検体中のSmall dense ＬＤＬの測定方法であって、第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋LargeＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬で１価のカチオン濃度を減少させて、Small dense ＬＤＬを混濁させ、吸光度の増加としてSmall dense ＬＤＬを測定する方法。
【請求項２】
０を超えて３１０ｍｍｏl／Ｌの範囲にある１価のカチオンおよび／または０．１〜５００ｍｍｏl／Ｌの範囲にある２価のカチオンと、ポリアニオンとを存在させる検体中のSmall dense ＬＤＬの測定方法であって、第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬ＋Small dense ＬＤＬを混濁させ、第２試薬で１価のカチオン濃度を増加させてSmall dense ＬＤＬのみを溶解させて、吸光度の減少としてSmall dense ＬＤＬを測定する方法。
【請求項３】
１価のカチオンがＮａ+、Ｋ+、およびＬｉ+から成る群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
２価のカチオンがＣａ２+、Ｍｇ２+、Ｍｎ２+、Ｃｏ２+、およびＳr２+から成る群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項５】
ポリアニオンが硫酸多糖類、硫酸アミロペクチン、およびリンタングステン酸から成る群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項６】
硫酸多糖類が硫酸デキストラン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸である請求項５記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、検体中のSmall dense ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し得るSmall dense ＬＤＬの測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中における脂質は、リポ蛋白の形で存在し、生体内組織間で輸送されている。リポ蛋白は、その比重からカイロミクロン、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）に大別される。
【０００３】
各リポ蛋白の機能としては、カイロミクロンは、腸管から吸収した中性脂肪を肝に運搬し、肝で生成されたＶＬＤＬは、中性脂肪を末梢組織に運搬しながらＬＤＬへと変化し、コレステロールを多く含むＬＤＬは、末梢組織において吸収される。
これに対し、肝で生成されたＨＤＬは、末梢組織のコレステロールを逆に肝へと運搬する役目を果たし、末梢組織への脂質蓄積を促す低比重リポ蛋白群とは明らかに異なった機能を有する。
【０００４】
低比重リポ蛋白群のＬＤＬ、ＶＬＤＬは、起源は一であるが、生体内の代謝機能の変化または疾病によりいずれかまたは両者の血中濃度の上昇が認められ、動脈硬化性疾患との関連が指摘されている。
【０００５】
従来、リポ蛋白の分画法としては、超遠心法と電気泳動法以外には有効な方法は無かったが、１９７２年にScholnickらによりヘパリンおよび塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよび塩化ナトリウムによりカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋ＬＤＬを濁らせる試薬と、カイロミクロン＋ＶＬＤＬを濁らせる試薬と、カイロミクロンだけを濁らせる試薬とが調製可能であることが報告されている（Fluids,19:289,1972)。
【０００６】
その後、小出らによりヘパリンと、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムとを適当な濃度を選択することにより同様の試薬が調製できるだけでなく、その濁りの差によりＬＤＬ、ＶＬＤＬが定量可能であることが報告されている（臨床病理、臨時増刊特集第21号：82,1975)。
【０００７】
本発明者も、動物由来のヘパリンに代えて合成可能な硫酸デキストランを用い、この硫酸デキストランと、一価のカチオンおよび／または二価のカチオンとの量を変えることによりリポ蛋白分画を段階的に混濁させる血清リポ蛋白分画の測定法を提案している（特開平７−２９４５３２号公報）。
【０００８】
ところで、ＬＤＬは、比重１．００６〜１．０６３の幅広いリポ蛋白の集合であり、粒子サイズの異なる亜分画より構成される。このうち比重１．０４４〜１．０６０の亜分画はSmall dense ＬＤＬと呼ばれている（Progress in Medicine 19:1854-1859,1999）。また、本出願においては、比重１．００６〜１．０４４の亜分画をLarge ＬＤＬと呼ぶことにする。
【０００９】
ＬＤＬ亜分画のうち、小型で比重の重いSmall dense ＬＤＬが主として出現しているヒトは、Large ＬＤＬが出現しているヒトに比べて冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性を生じている２型糖尿病が高頻度で出現していることが報告されている（ＪＡＭＡ 260:1917-1921,1988)。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このようにSmall dense ＬＤＬは、冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性を生じている２型糖尿病の鋭敏なマーカーとなり得るため、それらの診断法の確立が強く期待されている。
【００１１】
従って本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、ＬＤＬのうち、Small dense ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し得る検体中のSmall dense ＬＤＬの測定方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定の濃度の１価のカチオンおよび／または２価のカチオンと、ポリアニオンとの存在下で、Small dense ＬＤＬを特異的且つ高感度に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明のSmall dense ＬＤＬの測定方法は、０を超えて３１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲にある１価のカチオンおよび／または０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲にある２価のカチオンと、ポリアニオンとを存在させることを特徴とする。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【００１４】
１価のカチオンは、イオン強度の調整に用いられるため、イオンの活量係数の高い化合物から選択することが好ましい。このような１価のカチオンとしては、Ｎａ+、Ｋ+、およびＬｉ+から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１５】
この１価のカチオンの濃度は、０を超えて３１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１５０〜２２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。１価のカチオンの濃度が３１０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、Small dense ＬＤＬ分別定量が困難になる。また、１価のカチオン濃度は使用するポリアニオンの種類や濃度によりその使用量が変動するので、至適濃度を限定することはできない。
【００１６】
２価のカチオンは、公知のカチオンの中から適宜選択すれば良い。その具体例としては、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃｏ2+、およびＳｒ2+から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１７】
この２価のカチオンの濃度は、０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。２価のカチオンの濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満になると、十分な感度が得られない。一方、２価のカチオン濃度は、一定濃度以上あれば良く、上限濃度は規定されないが、溶解度を考慮すると、濃度は５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましい。また、２価のカチオン濃度は、使用するポリアニオンの種類や濃度によりその使用量が変動するので、その至適濃度を限定することはできない。
【００１８】
本発明に使用されるポリアニオンも、公知のポリアニオンの中から適宜選択することができる。その具体例としては、硫酸多糖類、硫酸アミロペクチン、およびリンタングステン酸から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１９】
上記硫酸多糖類としては、硫酸デキストラン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸が挙げられ、その中でも、特に原料入手の容易さや価格の面から硫酸デキストランが好ましい。その分子量は、５，０００〜５０，０００の範囲内が好ましい。
【００２０】
本発明の実施の態様としては、所定量の一価のカチオン、好ましくはナトリウムイオンを含有する第１試薬と検体を混合後、一回目の測定を行い、次いで第２試薬で一価のカチオンの濃度を減少させて、２回目の測定を行い、その吸光度の増加からSmall dense ＬＤＬの量を求める方法が挙げられる。
具体的には、一価のカチオンを含む第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬で一価のカチオンを減少させて、Small dense ＬＤＬを混濁させ、吸光度の増加としてSmall dense ＬＤＬを測定する。
【００２１】
本発明の別の態様としては、第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬ＋Small dense ＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬で一価のカチオン濃度を増加させることにより、Small dense ＬＤＬのみを溶解させて、吸光度の減少としてSmall dense ＬＤＬを特異的に測定する方法が挙げられる。
【００２２】
本発明におけるSmall dense ＬＤＬの測定には、透過光による比濁法や散乱光による比ろう法があり、いずれも広く普及している。本発明に係るSmall dense ＬＤＬとポリアニオンとは、均質な混濁を形成するため、いずれの測定法を用いても正確な測定値が得られる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明は、Small dense ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し得る検体中のSmall dense ＬＤＬの測定方法を提供する。従って、本発明の測定法によれば、冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性を生じている２型糖尿病を精度良く診断することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（１）各リポ蛋白の分離
新生化学実験講座  脂質Ｉ（１９９３）に基づいて、超遠心法によりヒト血清を下記のような３つの各リポ蛋白質に分画したものを試料として実験に用いた。
0004593026.tif 000002
【００２６】
（２）試薬組成
硫酸デキストラン（特開平７−２９４５３２の実施例１に記載のものと同じ）０．０２ｗ／ｖ％、塩化カルシウム８０ｍｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム７．７ｍｍｏｌ／Ｌの溶液に、塩化ナトリウムを溶解してその濃度が０〜４５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３１種類の試薬を調製した。
【００２７】
（３）測定法
日立７１７０型自動分析装置を用いて、上記のように塩化ナトリウム濃度が異なる３１種類の試薬をＲ１にセットし、分画した各リポ蛋白と血清を試料として吸光度を測定した。すなわち、超遠心により分画した血清５μＬを反応セルに分注し、次いで試薬２００μＬを分注撹拌し３７℃で反応させて、１０分後にその吸光度を主波長６６０ｎｍで測定した。
【００２８】
（４）結果
その結果を図１に示す。図１に示すように、Large ＬＤＬとSmall dense ＬＤＬとは、塩化ナトリウム濃度により濁度パターンが異なっている。すなわち、Large ＬＤＬは、塩化ナトリウム濃度０〜２８０ｍｍｏｌ／Ｌで一定の濁度を示すが、これを超える濃度では、吸光度が低下し、３５０ｍｍｏｌ／Ｌで澄明化する。
これに対して、Small dense ＬＤＬは、塩化ナトリウム濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌのとき最も強い濁度を示し、これを超える濃度では、吸光度が徐々に低下し、３００ｍｍｏｌ／Ｌで澄明になる。一方、カイロミクロン＋ＶＬＤＬは、塩化ナトリウム濃度０〜３２５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で一定の濁度を示す。また、データは省略したが、ＨＤＬはこの濃度範囲で混濁を生じない。
従って塩化ナトリウム濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌのときの濁度は、カイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬ＋Small dense ＬＤＬの合計量の濁度を示す。これに対し、塩化ナトリウム２８０ｍｍｏｌ／Ｌのときの濁度は、カイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬの濁度の合計量を示す。従ってSmall dense ＬＤＬ量は、この２つの組成における吸光度の差として測定することができる。
【００２９】
実施例２
実施例１で示したように、塩化ナトリウム濃度が異なる２種類の試薬を用いて濁度を測定し、この２つの試薬の濁度の差からSmall dense ＬＤＬ量を測定することが可能である。
しかし、この方法では２つの試薬を自動分析装置の２つのチャンネルにセットし、１検体を２回測定するため、つまり２つのチャンネルで１項目を測定するため効率が悪い。
本発明者らは、更に考えを進めて、１チャンネルで測定できる方法を考案した。通常、自動分析装置は、１つのチャンネルに第１試薬と第２試薬の２試薬をセットできるので、すなわち、第１試薬と第２試薬で塩化ナトリウム濃度を変化させることにより、自動分析装置の１チャンネルで測定できることを見出した。
この方法は、臨床検査に必要な試薬チャンネルの使用が少なく、かつ２チャンネルを使用しないため、演算が容易である。
【００３０】
すなわち、塩化ナトリウム濃度２８０ｍｍｏｌ／Ｌを含む第１試薬と試料を混和後１回目の測光を行い、次いで第２試薬により塩化ナトリウム濃度を２００ｍｍｏｌ／Ｌに希釈して２回目の測光を行い、液量補正後その吸光度の増加量からSmall dense ＬＤＬ量を求める方法である。つまり第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬを混濁させ、次いで第２試薬により塩化ナトリウム濃度を減少させて、Small dense ＬＤＬを混濁させ、すなわち吸光度の増加としてSmall dense ＬＤＬを測定する方法である（以下、１チャンネル法と呼ぶ）。
【００３１】
逆に、第１試薬でカイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋Large ＬＤＬ＋Small dense ＬＤＬを混濁させ、第２試薬で塩化ナトリウム濃度を増加させることにより、Small dense ＬＤＬのみを溶解させて、吸光度の減少としてSmall dense ＬＤＬを特異的に測定することも可能である。
【００３２】
実施例３
（１）公知の方法
文献（動脈硬化  Vol.25 No.1-2:67-70,1997)によれば、ＬＤＬ粒子サイズがLipophor System(製造元：Quantimetrix,CALIFORNIA,U.S.A. 輸入元：株式会社常光）により、簡便に測定でき、ＬＤＬ-ＭＩ値（相対移動度）が０．４０以上の場合、Small dense ＬＤＬが存在することが示されている。そこで、本発明の測定法による測定値とLipophor SystemによるＬＤＬ-ＭＩ値との相関性について検討した。
【００３３】
（２）本発明による測定
以下の試薬組成に基づいて１チャンネル法によりSmall dense ＬＤＬを測定した。
試薬組成
第１試薬
硫酸デキストラン  ０．０２ｗ／ｖ％
塩化カルシウム    ８０ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム    ２８０ｍｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
硫酸デキストラン  ０．０２ｗ／ｖ％
塩化カルシウム    ８０ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム  ７．７ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム    ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３４】
（３）測定法
日立７１７０型自動分析装置のＲ１に第１試薬をセットし、Ｒ３に第２試薬をセットし、ヒト血清３０例を測定した。具体的には、まず検体７μＬを反応セルに分注し、次に第１試薬１８０μＬを分注撹拌して３７℃で５分間反応させ、更に第２試薬９０μＬを分注撹拌して５分間反応させた後、その濁度を主波長６６０ｎｍで測定した。
【００３５】
（４）結果
上記ヒト血清をLipophor Systemにより電気泳動を行い、動脈硬化Vol.25 No1-2:67-70,1997に従って、ＬＤＬ−ＭＩ値を算出した。その結果を図２に示す。図２に示すように、本発明の測定法による測定値とLipophor SystemによるＬＤＬ−ＭＩ値とは、良好な相関性を示すことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】各リポ蛋白と血清の濁度を測定した結果を示すグラフである。
【図２】本発明の測定法による測定値とLipophor SystemによるＬＤＬ−ＭＩ値との相関性を示すグラフである。
【図１】
0004593026.tif 000003
【図２】
0004593026.tif 000004