(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団中の幹細胞の存在を検出するための方法であって、細胞集団をアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の検出可能な基質に接触させることからなるが、細胞集団中に存在するＡＬＤＨが上記基質を上記細胞集団中に存在する細胞により保持される検出可能な生成物に変換させるような条件下で接触させ、その際、上記幹細胞は検出可能な生成物を上記集団中に存在する非幹細胞よりも高い濃度で有する、ここにおいて、上記集団の細胞からの上記基質の流出を、上記細胞集団の多剤耐性（ＭＤＲ）阻害剤への暴露により阻害する、前記検出方法。
【請求項２】
細胞集団がヒトの細胞集団である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞集団が臍帯血、骨髄、末梢血または胎児肝臓に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
基質が蛍光標識をもつ、請求項１記載の方法。
【請求項５】
基質がＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＭＤＲ阻害剤がベラパミルである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＭＤＲ阻害剤を上記基質の添加と同時または添加前に上記細胞集団に添加する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（ＢＡＡＡ−ＤＡ）。
【請求項９】
コンテナー手段内に配置されたＢＡＡＡ−ＤＡを含むキット。
【請求項１０】
コンテナー手段内に配置されたＢＡＡＡおよび多剤耐性（ＭＤＲ）阻害剤を含むキット。
【請求項１１】
上昇したレベルのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）を含む細胞集団中の細胞を検出するための方法であって、上記集団の細胞により保持される検出可能な生成物に変換される検出可能な標識をもつＡＬＤＨ基質に上記細胞集団を接触させ、そして上記集団の他の細胞に比して上昇した濃度の検出可能な生成物を、上記集団のどの細胞が有するかを決定することからなるが、但し検出可能な生成物の上昇濃度を有する上記集団の細胞が上昇したレベルのＡＬＤＨを有する細胞である、ここにおいて、上記集団の細胞からの上記基質の流出を、上記細胞集団の多剤耐性（ＭＤＲ）阻害剤への暴露により阻害する、
上記方法。
【請求項１２】
上昇したレベルのＡＬＤＨを有する上記集団の細胞が腫瘍細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞の集団中に存在する幹細胞を単離する方法であって、上記細胞の集団をアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の検出可能な基質に接触させるが、細胞集団中に存在するＡＬＤＨが上記基質を上記細胞集団中に存在する細胞により保持される検出可能な生成物に変換させるような条件下で接触させ、その際、上記幹細胞は検出可能な生成物を上記集団中に存在する非幹細胞よりも高い濃度で有し、そして高い濃度の検出可能な生成物を基に上記集団の非幹細胞から幹細胞を分離することからなる、ここにおいて、上記集団の細胞からの上記基質の流出を、上記細胞集団の多剤耐性（ＭＤＲ）阻害剤への暴露により阻害する、上記単離方法。
【請求項１４】
細胞集団がヒトの細胞集団である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
基質が蛍光標識をもつ、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
基質がＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
ＭＤＲ阻害剤がベラパミルである、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
細胞集団が臍帯血由来である、請求項３、１１または１３記載の方法。
【請求項１９】
細胞集団が骨髄由来である、請求項３、１１または１３記載の方法。
【請求項２０】
細胞集団が末梢血由来である、請求項３、１１または１３記載の方法。
【請求項２１】
細胞集団が胎児肝臓由来である、請求項３、１１または１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般的に、幹細胞に関し、特定すれば、幹細胞を単離する方法およびそのような方法における使用のために適した試薬に関する。本発明は、さらに、本方法に従って単離された幹細胞集団に関する。
【０００２】
背景
もっとも初期の造血幹細胞（HSC）は全寿命の間の造血系列の全てを再構成することになる。これらの多能性造血幹細胞（PHSC）は、最終的に幹細胞に基づく遺伝子治療における遺伝子送達の標的である移植可能な細胞である。PHSCに関しての一つの定義された特徴は、それらがもっとも細胞剥離性に条件化された養生法を生き延びることである。これらの毒性試薬に対してのそれらの耐性の機構は、これらの細胞がインビトロにおいて単離されうることによる有力な戦略を暗示する。薬剤耐性の一つの機構は、多剤耐性（MDR）ポンプを通して細胞外に毒性物質を流出する（efflux）能力にある。MDRポンプのための蛍光基質は、様々なアッセイ系における染料流出（dye efflux）に関するそれらの高い能力に基づくPHSCの単離を可能にした。薬剤耐性はもっと特別な機構によっても授与されるのかもしれない。例えば、細胞質のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）は、骨髄移植のための製造における細胞減数養生法において使用されるアルキル化剤であるシクロホスファミド（CPA）に対する耐性を媒介する。即ち、ALDHの発現は、真のPHSCの選択可能なマーカーであると考えることができる。
【０００３】
CPAの治療上の有効性は、PHSCと腸の陰窩細胞が薬剤養生法を生き延びる能力に大いに帰した。ヒトの造血始原細胞は細胞質のALDHを発現し、そして動員された末梢血液幹細胞由来の初期のヒトHSCはシクロホスファミドと７日間培養した場合に選択できる。Jonesらは、ALDHの膜透過性蛍光基質を用意し、そして次に高いレベルのALDH活性で細胞を選択することにより、長期間再構成マウスPHSCが単離できることを証明した（Jones，Blood 85：2742（1995）；Jones et al，Blood 88：487（1996））。これらの研究においては、ダンシルアミノアセトアルデヒド（DAAA）を使用して、逆電流洗浄（countercurrent elutriation）により調製されたマウス骨髄細胞を染色した。
【０００４】
DAAAを用いた予備研究は、この試薬がヒトの造血細胞の調製には使用不可能であることを示したが、なぜならばこの試薬のシグナル強度が、フローサイトメトリーにより異なる細胞集団を識別するには強すぎるからである。本発明は、DAAAに関連したこの問題がなく、そして原始ヒト造血細胞の精製に使用できる蛍光ALDH基質を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明は、ヒト幹細胞を含む幹細胞を単離するための新規な試薬および方法を提供する。上記試薬はALDHの蛍光基質である。上記方法は、原始幹細胞を含む細胞集団をMDR活性の阻害剤の存在下で上記基質により染色することを含む。上記細胞中に存在するALDHは、上記基質を、細胞内でトラップされる生成物に変換する。原始幹細胞は他の細胞種よりも高いレベルのALDH活性を有するから、これらの細胞は他の細胞種よりも明るく染色される。MDR阻害剤の存在は、幹細胞からの基質の流出を減少させる。
【０００６】
本発明の目的および利点は、以下の記載から明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明は、幹細胞を単離する方法およびそのような方法において使用するのに適した試薬に関する。上記方法は、幹細胞を含む細胞集団を、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）の検出可能な基質に接触させることを含み、該基質はALDHにより検出可能な生成物に変換されて細胞内に残される。好ましい態様において、上記基質は、BODIPY-アミノアセトアルデヒド（BAAA）であり、細胞、特に上記集団中に存在する幹細胞からのBAAAの流出は、MDR-阻害剤の併用により阻害される。
【０００７】
本発明における使用のために適した細胞集団の源は、臍帯血、骨髄、末梢血および胎児肝臓を含む。幹細胞を含む如何なる細胞集団でも組織の起源に拘わらず使用できる（例えば、消化管、皮膚筋肉、神経等）。本発明の方法は様々な非ヒト細胞集団に適用可能であることは予測しうるが、上で言及された源を含む源からヒト幹細胞を単離するのに特に有用である。
【０００８】
本発明における使用のために適した基質は、ALDHの基質、特に、ALDHの検出可能な生成物または検出可能な標識を生じる生成物への作用により、検出可能であるかまたは検出可能な標識を生じて変換され、そして上記生成物は細胞内、特に幹細胞内に保持される、ALDHに特異的な基質である。好ましい態様において、上記基質は、FITCと同一の別個の蛍光放射プロフィールを有する蛍光基質である。そのような基質の一例はBAAAである。
【０００９】
細胞集団に加えられる基質の最適な量は、当業者により容易に決定されうる（実施例参照）。BAAAの場合、濃度を変更することができ、例えば、約１μMから５μMの濃度を使用することができる。
【００１０】
上記基質の濃縮された溶液を直接染色される細胞を含む培地に加えることができるか、または回収された細胞を基質含有培地に懸濁することができる。
細胞からの本発明の基質の流出を阻害するためには、MDRの阻害剤の併用が好ましい。如何なる様々なMDR阻害剤を使用することもでき、ベラパミルを含む。該阻害剤はは、基質と共に同時にあるいは基質添加前に細胞に添加することができる。使用されるMDR阻害剤の最適量は容易に決定することができる（例えば、染色の損失を監視することにより）。ベラパミルの場合、濃度を変更することができ、例えば約50μMの濃度を使用することができる。
【００１１】
細胞集団の基質（およびMDR阻害剤）への暴露後（例えば、約30分後）、高い濃度の標識生成物を含む細胞を、低濃度しか含まない細胞から分離することができる。蛍光標識の使用の場合、蛍光活性化細胞分類技術を使用することができる。フローサイトメーター上の低い直交光散乱（リンパ球のような小さな細胞を同定する）および／または蛍光の明るさを基にして、最初の集団の他の細胞から、幹細胞を単離することができる。以下の実施例に示されるとおり、最も明るい１％の細胞を分類することは、長期の培養を開始する細胞に関してほぼ40倍の富裕化を生じた。回収された細胞集団は65％までがCD34＋細胞であって、そのほとんどがCD38-/dimCD71-/dimであった。本発明は、その範囲において、50％より多いCD34+細胞、好ましくは75％より多いCD34+細胞、より好ましくは90％より多いCD34+細胞を含む細胞調製物を含む。
【００１２】
本発明に従い単離された幹細胞は様々な治療および診断法における適用を有する。それらは移植並びに遺伝子治療の両方の目的に適している。例えば、骨髄細胞または末梢細胞からの幹細胞の単離は、癌細胞からの幹細胞の分離を提供することができる。自己由来の移植を受けた患者においては、そのような分離を使用することにより、癌細胞が患者に戻る機会を減らすことができる。精製された自己の幹細胞をエクスビボにおいて展開することにより、自己移植後の好中球、赤血球および血小板移植片を促進することができる。エクスビボの展開は、限定されたサイトカイン類内、ストロマ層上およびまたはバイオリアクター中での成長によりもたらされ得る（Emerson et al，Blood 87：3082（1996））。さらに、移植の失敗の発生率を減らすことができる。これは、自己由来の移植を受けた患者、自己免疫疾患を罹患した患者、そして遺伝子治療を受けた患者に有益である。
【００１３】
本細胞を含む遺伝子治療のアプローチは、一つの態様において、自己幹細胞の単離、単離された細胞の遺伝子送達ベクターへの暴露および修飾された細胞の患者への再注入を含む（Smith，J．Hematother．1：155（1992））。このアプローチは、遺伝子を非分割細胞に移入することができるベクターのエクスビボ培養または使用、それによりエクスビボ培養を不要にさせることを含みうる。遺伝子治療は、例えば先天的疾患、例えば鎌状赤血球貧血を治療するのに有用でありえ、変異β-グロビン遺伝子を他の野生型グロビン遺伝子で置換するかまたは抗鎌状赤血球グロビン遺伝子を追加する。癌の治療においては、薬剤耐性遺伝子を幹細胞に導入することにより、細胞毒性薬剤に対する耐性を授けることができる。これは、骨髄抑圧現象の発生率および発病度を低下させ得る。HIVを含む感染性疾患の治療のためには、抗ウイルス遺伝子を幹細胞に導入することができ、それらはウイルスに対して耐性になる（Gilboa and Smith，Trends in Genetics 10：139（1994））。
【００１４】
幹細胞の単離は、GvHDを引き起こすＴ細胞の排出をもたらす。この排出は同種異系のレシピエントにおけるGvHDの発生率と発病度を低下させることが期待され得る。
【００１５】
精製された同種異系幹細胞をエクスビボにおいて展開することにより、同種異系移植後の好中球、赤血球および血小板移植片を促進することができる。さらに、移植の失敗の発生率を減じることができる。これは、幹細胞の用量が移植の成功を制限するような、臍帯血移植のレシピエントにとって特に重要である見込みがある。
【００１６】
幹細胞を用いた移植の成功は、寛容を誘導することも期待される。そのようなことは個体の器官の移植を明らかに向上させるはずである。
本発明の細胞が新規な遺伝子（例えば、サイトカイン類およびサイトカイン受容体類）、例えば成長および発生に重要な遺伝子を含む新規遺伝子の源として使用し得ることは、認識されることになる。
【００１７】
治療および診断の戦略におけるそれらの応用に加えて、本発明の幹細胞をスクリーニングプロトコルにおいて使用することにより、例えば造血細胞の分化または成長および／または移植を促進するために使用可能な薬剤を同定することができる。そのようなプロトコルの一つにおいては、幹細胞を、分化を誘導すると信じられた試験化合物と接触させ、そして上記試験化合物が分化をもたらす能力を測定する（例えば、顕微鏡およびフローサイトメトリー試験を使用して）。別のスクリーニングプロトコルにおいては、幹細胞を、増殖および／または移植を誘導すると信じられた試験化合物と接触させ、そしてインビトロ長期間コロニーアッセイまたはインビボ免疫欠損マウスモデル（例えばSCID NODマウス）を使用して上記試験化合物が増殖および／または移植をもたらす能力を測定する（Peault et al，Leukemia 7：s98-101（1993）を参照）。
【００１８】
上記に加え、本発明の基質を使用することにより、ALDHのアップ制御を通してシクロホスファミドに耐性であるかもしれない腫瘍を同定することができる。この態様によれば、上記腫瘍の細胞を、検出可能な基質、例えばBAAA、およびMDR阻害剤と共に、上記基質が細胞内に侵入してその中で検出可能な生成物に変換されるような条件下で接触させることができる。明るく染色される細胞（例えばBAAAにより）はシクロホスファミド耐性であると期待され得る。
【００１９】
本発明は、本発明の細胞を調製するために使用可能なキットにも関する。キットは、幹細胞の単離をもたらすのに使用可能な試薬（例えば、ALDH基質）を含み得る。好ましい態様において、上記キットはコンテナー手段内に配置されたBAAAを含む。上記キットは、コンテナー手段内に配置されたBAAA、MDR阻害剤、例えばベラパミルを含む。
【００２０】
本発明の特定の側面は、以下の非制限実施例においてより詳細に記載される。
実施例１
実験手法
BODIPYアミノアセトアルデヒドの製造
アルデヒドデヒドロゲナーゼ基質をBODIPYアミノアセタールとして調製して、0.5マイクロモルアリコート中で凍結乾燥する。これらの調製物は-20℃において保存する場合いつまでも安定である。上記アセタールを次にDMSO中に溶解して最終濃度5mMにする。この溶液は４℃において１週間までは安定であることがわかった。上記アセタールをアルデヒドに変換するために、この溶液のアリコートを最終濃度1N HClにした。これらの条件下では、上記アセタールは15分の半減期を有する。1N HCl中で２時間後、上記BODIPYアミノアセタールの大部分はBODIPYアミノアセトアルデヒド（BAAA）に変換され、そして次にダルベッコリン酸緩衝塩溶液（PBS）中で200-250mMに希釈する。このストックを、2% FCSを最終濃度１から５μMの範囲で含むIscoveの修飾ダルベッコ培地（IMDM）中で調製された細胞に直接加える（図６も参照）。
【００２１】
抗体試薬
ベクトンディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ（BDIS；サンホセ、CA）からのCD2（Leu5；FITC），CD3（Leu4；PerCP），CD5（Leu1；PE），CD7（Leu9；FITC），CD10（CALLA；FITC），CD11b（Leu15；PE），CD14（LeuM3；PE），CD19（Leu12；FITC），CD13（LeuM9；PE），CD34（HPCA2；FITCおよびPE），CD38（Leu17；PE），CD56（Leu19；PE）およびHLA-DR（FITC）に対する、直接コンジュゲートされた蛍光抗体を使用した。抗-CD7（3A1；PE）および抗-CD45（KC56；PE）はコルターコーポレーション（ハイアレア、CA）から購入し；イムノテック社（ウエストブルック、ME）からの抗-CD3（UCHT1；PE），抗-CD16（3G8；PE），抗-CD19（J4.119；PE）並びにプールされた抗-CD34抗体（QBEnd10，Immu-133，Immu-134；PE）；バイオソースインターナショナル（カマリロ、CA）からの抗-CD3（B-B11；FITC）およびCD38（B-A6；FITC）；サザンバイオテクノロジーアソシエーツ社（バーミンガム、AL）からの抗-CD45RA（F8-11-13；PE）；およびファーミンゲン社（サンディエゴ、CA）からの抗-CDw90（5E10；PE）。
【００２２】
細胞系
K562，L1210およびL1210/cpa細胞（ATCC）は、10%ウシ胎児血清（FCS）と5ｘ10-5Mのβ-メルカプトエタノールを付加されたRPMI1640培地中に懸濁液として保持した。
【００２３】
ヒト臍帯血の調製
処分されることを意図されたヒト臍帯血（UCB）を、抗凝血性クエン酸バッファーを含む滅菌ボトル中に回収した。これらの研究において使用されるUCBは回収から24時間以内に加工した。予備的な赤血球細胞の凝集を通して白血球細胞を富裕にし、UCBを室温においてダルベッコリン酸緩衝塩溶液（PBS）で1:2に希釈した。これらの細胞は次に最終濃度1% Hespan（デュポンファーマ、ウイルミントン、DE）にして、１時間そのまま静置した。凝集しなかった白血球を回収して、残りの赤血球を10mM Tris-HCl，pH7.2および200mM EDTAを含む0.17M NH4Cl中で37℃において溶血させた。回収された細胞を2% FCSを含むIMDM中で洗浄し、そして次にFicoll-Hypaqueを使用して精製した（1.077g/ml）。一晩保持して、細胞を氷上で４℃の冷却室において20% FCSを含むIMDM中で保持した。
【００２４】
細胞染色および蛍光−活性化細胞分類
単核UCB細胞を2% FCS含有IMDM中で106細胞／mlにおいて懸濁し、そして１μM BAAAで30分間標識した。使用に際しては、ベラパミルを50mMにて含ませた。染色後、細胞を氷冷やした染色媒体で洗浄し、そしてそれらの分析および分類まで氷上に保持した。次に細胞を10mg/mlの７-アミノアクチノマイシンＤ（7AAD）を含む染色媒体中に懸濁した（モリキュラープローブ；ユージーン，OR）。複数パラメーターの分析を可能にする抗体染色のために、細胞を染色媒体（100μl）中に懸濁し、そして抗体を細胞懸濁液に直接加えた。上記細胞を氷上にて20分間インキュベートし、そして次に氷冷染色媒体中で再び洗浄した。上記細胞を、次に、デュアルコヒーレントI-90アルゴン染色レーザーを備えたFACStarプラス細胞ソーター（BDIS）上で分析または分類した。BAAAは488nmにおいて励起されて、放射はFL1中で515 DF20フィルターを使用して検出した。死細胞および死にゆく細胞は、それらの7AAD取り込みによる遠赤外波長におけるそれらの高い放射に基づいて排除した。
【００２５】
BAAA染色に基づいて前に分類された細胞上の細胞表面抗原の分析のため、上記細胞を沈殿させ、そして2% FCSを含むIMDM中に懸濁した。次に、細胞を37℃において1-2時間保つことにより流出を許容した。次に、細胞を沈殿させ、そして蛍光コンジュゲートした抗体を直接細胞に加えた。20分間インキュベーション後、細胞をPBS／2% FCSで洗浄して、PBS／2% FCS中の1%ホルムアルデヒドに固定した。すべての表面マーカー分析において、BAAAと抗体で同時に染色した細胞を用いた分析とのちに抗体染色されたFACS分類細胞上に実施した分析との間で相違は示されなかった。
造血始原細胞コロニーアッセイおよび長期間培養
ALDHbr細胞を、直接、BAAA染色された単核UCB細胞から単離した。これらのアッセイのため、ALDHbrはUCBの白血球ゲート1%として定義した。
【００２６】
造血始原細胞コロニーアッセイは、100-200の細胞を、寒天白血球コンディショニングされた培地および組換えヒトエリスロポエチンを含むMethoCult H4431中にプレートすることにより実施した（ステムセルテクノロジーズ社）。上記細胞を湿らせたチェンバー内で37℃において5% CO2と共にインキュベートした。造血コロニー（>100細胞）を次に培養開始後14から18日目に計数した。長期間培養は、マウスMS-5細胞（Tadashi Sudo博士、キリン医薬研究所、群馬、日本から提供された）のストロマ層上で保持した（Issaad，Blood 81：2916（1993））。MS-5ストロマ細胞は24ウエルプレート（コーニングコスター社、ケンブリッジ、MA）内に5X104細胞／ウエルにて10% FCSを付加されたDMEM中でまき、そして37℃において培養した。単層が80%コンフルエントに達したら、それらをセシウム源からγ照射した（40Gy）。照射後、新鮮な培地を培養液に加えた。MS-5細胞に関しては、培養培地を、10% FCS，10%ウマ血清、β-メルカプトエタノール、ピルビン酸を付加したMEMαに完全に置き換えた。長期間培養は400-2000の造血始原細胞／ウエルにより開始し、そして33℃において5% CO2と共に保持した。週間隔において、各ウエルからの媒体半分を除去して、媒体を補充することができた。付着性および非付着性細胞を５または８週間後に回収し、そして上記のとおりにHPCアッセイにおいた。続く実施例に示すとおり、もっとも明るい1%の細胞の分類は、長期間培養を開始する細胞に関してほぼ40倍の富裕化を生じる（如何にして高いレベルの富裕化が達成されるのかまたはこの点において細胞クローニングは使用されるであろうか？？）。回収された細胞調製物は65%に至るまでがCD34+細胞であり、そのほとんどはCD34+細胞であって、そのほとんどがCD38-/dimCD71-/dimであった。
【００２７】
結果
BODIPYアセタールの合成
水溶液中におけるアルデヒドの固有の不安定性のため、該試薬はアセタールとして製造して保存した。その使用直前に、該アセタールを1N HCl中でアルデヒドに変換した。該アルデヒドはPBSに自由に溶解し、そして2%胎児ウシ血清を含むIMDM中で106細胞／mlにて調製された細胞に直接添加することができる。アミノアセトアルデヒドとして、上記試薬は膜透過性である；しかしながら、アルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下では、アルデヒド部分は細胞中に保持されるカルボキシル酸に変換される。細胞内蛍光を使用することにより細胞を選択することができる。
【００２８】
BAAAはALDHの特異的基質である
BAAAがALDH+細胞の特異的選択を可能にするか否かをアッセイするために、研究は最初に、ALDH+として知られる、シクロホスファミド耐性に関して以前に選択されたマウス細胞系L1210/cpaにおける上記BAAA試薬の最適応答投薬量を決定した（図１）。親の細胞系L1210（図1Aおよび1B）はシクロホスファミド感受性でありALDH-である。この細胞系はBAAAに対する応答を完全に呈さなかった。さらに、ALDHの有力な阻害剤、ジエチルベンズアルデヒド（DEAB）を使用して、BAAAシグナルの特異性を証明した。10倍過剰モルのDEABは蛍光応答を全くブロックした（図1C）。よって、BAAAはALDH+細胞を検出できた。これらの研究において、BAAAは5μMより低い最終濃度において使用できた。このモル濃度はダンシル化剤を用いる濃度よりも10倍低い。
【００２９】
複数の異なるALDHイソ酵素が存在し、そしてこれらはBAAAの変換に関して異なる能力を示すかもしれない。シクロホスファミドに対するそれらの耐性が第一に特定のALDHイソ酵素ALDH1により媒介されることが示唆されてきた。よって、ALDH1、K562を発現することが知られているヒト細胞系を、この新規な試薬でアッセイした。K562細胞はBAAAを変換し、そしてこれらのアッセイにおいてALDHに関して陽性であった。この応答はDEA3により完全に阻害された。即ち、BAAAはヒトALDH1の特異的基質として作用することができ、そしてシクロホスファミドに対する耐性を証明する原始ヒト細胞を同定するのに使用することができる。
【００３０】
原始UCB細胞調製物はALDHbr細胞のサブセットを含む
継代細胞系上でのこの試薬の効果を証明するため、BAAAを原始ヒト細胞上においてアッセイした。移植可能な造血幹細胞のための源としてのその有望性の増加に関して臍帯血（UCB）を選択した。これらの研究のため、Ficoll-Hypaque上の単核細胞に関して調製されたことを除いて、UCBは分画しなかった。この分離は二つの成熟ALDH+細胞種、赤血球および巨核球を除去することにおいて意義がある。2% FCSを含むIMDMにおいて106細胞／ウエルにて調製されたUCB細胞上でBAAAを試験した（図２）。上記UCB細胞はBODIPY試薬に対して極めて応答性であり、そして上記継代細胞系よりもはるかに感受性であるらしかった。BAAAはしたがって1μMの最適濃度に滴定された。これはALDHbr亜集団を解析するのにもっとも良好な濃度であった。上記応答は過剰なDEABの存在下で阻害されたことから、ALDH特異的である。このモル濃度は、マウスの多能性造血幹細胞を検出するために以前に使用されたダンシルアミノアセトアルデヒドの濃度よりも50倍低い。
【００３１】
BAAA染色されたUCB細胞からの蛍光の放射は二つのモードの応答を呈した。蛍光放射のより明るいピークは成熟した単球に帰したことから、単球が均質なレベルのALDHを発現することが示唆される。造血幹細胞は小さくて、複雑ではない細胞である。事実、マウスのALDH+PHSCは逆電流洗浄を使用して最初に富裕化された。よって、BODIPYシグナルは低い固有の直交光散乱を呈した非複雑性細胞においてのみ試験された（SSClo）（図3A）。大多数のSSCloUCB細胞はALDHneg/dimであった（図1B）。これは予測されなかったが、なぜならばSSClo細胞はリンパ球が優位を占め、そしてほとんどのリンパ球はALDHを発現しないからである。しかしながら、小さくて明確に定義された亜集団のSSCloUCB細胞はALDHbrであった（図3A）。
【００３２】
BODIPYアミノ酢酸はMDR流出ポンプの基質である
ALDHを発現することに加えて、PHSCも高いレベルのＰ-糖蛋白質または多剤耐性（MDR）流出ポンプを発現するべきである。この試薬が以前に特徴付けされたことはないので、BAAAのMDR流出に対しての感受性をアッセイした。BODIPYアミノアセトアルデヒドは活性輸送体なしに細胞膜を通過するが、ALDH変換の産物（BODIPYアミノ酢酸）はおそらくMDRポンプの基質である。この可能性を調査するため、UCB細胞をMDR流出ポンプの競合性阻害剤であるベラパミルの50μMの存在下においてBAAAで染色した。ベラパミル処理された細胞は、ベラパミルで同時に処理されなかったBAAA染色細胞と比較した場合、首尾一貫して高い蛍光を呈した（図２）。ALDHdim細胞の実質的な集団はベラパミル処理により影響された。もっとも重要なことは、ALDHbr亜集団のパーセンテージがベラパミルの存在下で1.8倍増加したことである。ベラパミル処理された細胞において、ALDHbr亜集団は0.8％のSSClo細胞と均等であった。対照的に、ベラパミルを受容しなかった細胞調製物においては、同じ蛍光強度はたった0.46±％のSSClo細胞にしか相当しなかった。これは、MDRポンプの流出活性を阻害すれば、ALDHbrSSCloUCB細胞がより効率よくBAAAを変換したことを示した。
【００３３】
ALDHbrSSCloUCB細胞は原始CD34+細胞に関して大いに富裕化される
ベラパミル処理により、ALDHbrSSCloUCB細胞はほとんど90％のCD34+細胞を含んだことから、少なくともいくつかの造血始原細胞が存在することが示される（図3D）。しかしながら、CD34は、系列拘束細胞（lineage committed cells）を含む広い範囲の造血始原細胞並びに多能性始原細胞により発現される。よって、ALDHbrSSCloUCB細胞の分化能力を分析した。最初に、これらの細胞の免疫表現型をより注意深く定義した。免疫表現型は決して決定的ではない；しかしながら、上記細胞集団の始原性は、より系列拘束性の造血細胞CD38およびCD71への始原細胞の分化に典型的に関連する２つの活性化マーカーを試験することにより推論することができた。CD34+細胞のもっとも始原性のサブセットは活性化抗原CD38またはCD71の発現をほとんどまたは全く有さない。BAAAおよびCD34およびCD38に特異的な抗体を用いたUCB細胞の調製物において、ALDHbrSSCloUCB細胞は完全に精製されたCD34brCD38dim細胞に関して１段階の富裕化を提供した。さらに、CD34+UCB細胞を独立に試験したときは、ALDH発現はCD38とCD71の両方の発現に逆比例した（図4Aおよび図4B）。即ち、ALDHbrSSCloUCB細胞は免疫表現型により定義されたとおりの原始性CD34+細胞を含むらしい。
【００３４】
ALDHbrSSCloUCB細胞の分化能力をアッセイするために、これらの細胞を単離して骨髄赤血球始原細胞に関しての短期間と長期間の両方のアッセイ中においた。使用された短期間アッセイは造血始原細胞コロニーアッセイ（HPCA）であり、最初の単離の時における系列拘束細胞を定量する。より初期の始原細胞も、HPCAを実施する前の５週間または８週間、ストロマ上でALDHbrSSCloUCB細胞を維持することによりアッセイした（図５）。
【００３５】
結果：
HPCA  −  ALDHbrSSCloは完全にCD34+細胞と均等であった。
LTC  −  ５週  −  ALDHbrSSCloは完全にCD34+細胞と均等であった。
LTC  ＝  ８週  −  ALDHbrSSCloはCD34+細胞よりも性能が優れている。
【００３６】
実施例２
ALDHbrUCB細胞はCD34+CD38-/loが優位を占め、そして初期の骨髄始原細胞に関して大いに富裕化されたことがわかった。この研究は、ALDHbrCD34+UCB細胞がリンパ性の始原細胞に関してなお富裕化されたか否かを決定するために企画された。３つの実験において、ALDHbrCD34-UCB細胞の培養物を、様々な希釈のキットリガンドFlt3リガンド、IL-3（１日目のみ）、IL-2およびIL-7存在下でAFT024ストロマ細胞上で確立した。7-8週後、上記培養物を、CD56，CD10，CD19またはCD20の発現により測定される、リンパ球成長に関して分析した。
【００３７】
【表１】
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AFT024培養物は、推定上のNK細胞の成長を主として好んだので、ALDHbrCD34+UCB細胞がB-リンパ性始原細胞を含んだか否かをより効率よく試験するために、それらを、同じサイトカインの組み合わせを付加されたW20ストロマ細胞系上で培養した。100のALDHbrCD34+細胞を用いて確立された12の培養物のうち、全てがCD56+細胞とCD10+細胞をほぼ等しい比率で生じさせた。12ウエルのうちの２つはCD19+細胞も含んだ。
【００３８】
要約すると、ALDHbrCD34+UCB集団は、骨髄性およびリンパ性の両方の造血始原細胞を大いに富裕化するらしい。
前で引用された全ての書類発現それらの全てを引用により編入する。
【００３９】
当業者は、この開示の知識から、本発明の真の範囲を逸脱することなしに、形式および詳細における様々な変化がなされうることを認識することになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1A-1D。BAAA染色は高いレベルのALDH活性を有する細胞を同定する。L1210/cpaは、ALDHを過剰発現するL1210白血病性細胞系の誘導体である。（図1Aおよび1Bは、L1210細胞、それぞれプラスDEABおよびマイナスDEABを表し；図1Cおよび1DはL1210/cpa細胞、それぞれプラスDEABおよびマイナスDEABを表す。）
【図２】  図2A-2D。BAAAは造血細胞、特に原始CD34+細胞からのMDRポンプにより流出され、BODIPYbrightであるCD34+細胞の間の違い（図2B）をMDR阻害剤ベラパミルの存在および不在下で明らかにしたとおりである（図2Aおよび2Bはt=0における、それぞれマイナスおよびプラスのベラパミルであり；図2Cおよび2Dはt=30分であり、それぞれマイナスおよびプラスのベラパミルである。）。
【図３】  図3A-3D。ALDHbr細胞（即ち、MDR阻害剤の存在下においてBAAAにより明るく染まる低SSC特性の細胞）を、原始幹細胞に伝統的に関連する原始CD34+CD38lo/-免疫表現型を有する細胞に関して富裕化する。
【図４】  図4Aおよび4B。BAAAによる染色強度は、CD34+細胞においてCD38（図4A）およびCD71（図4B）と逆に相関する。
【図５】  図5A-5C。ALDHbr細胞を、CD34+細胞に均等な初期の始原細胞に関しておよびCD34+細胞よりもはるかに原始的な始原細胞にしてより富裕化する。（図5A=始原細胞（HPCA）、図5B=初期始原細胞（５週LTC）および図5C=原始的始原細胞（８週LTC）。）
【図６】  図６。BAAAの製造。琥珀色のバイアルを使用して、乾燥テトラヒドロフラン（THF，0.5mL）中のアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（0.019mmol，アルドリッチケミカル社）の溶液を、乾燥THF（0.5mL）中のBODIPY FL，SE（0.013mmol，モリキュラープローブズ）に滴下した。全部添加後に、バイアルに蓋をして、反応混合物を30分間撹拌した。THFは蒸発させ、そして残余物を最小のメチレンクロリド中に溶解し、そして次に、酢酸エチル−ヘキサン（1:1）を希釈剤として使用してシリカゲル上でクロマトグラフをした。生成物、BODIPY-アミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（BAAA-DA）を定量できる収量にて回収し、そしてプロトンNMRにより同定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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