(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効な量のリラキシンを含む、血管形成の促進を要する哺乳動物における血管形成を促進するための医薬組成物、但し、前記医薬組成物は虚血性疾患及び強皮症治療用のものではない。
【請求項２】
少なくとも1ng/mlの血清濃度を維持するのに十分な量のリラキシンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
組換えヒトリラキシン（H2）を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
組換えヒトリラキシン（H2）を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
非経口的に投与するための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
皮下注射により投与するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
吸入により患者の気道へ投与するための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
血管形成の促進用の医薬を製造するためにリラキシンを使用する方法、但し、前記医薬は虚血性疾患及び強皮症治療用のものではない。
【請求項９】
リラキシンが組換えヒトリラキシン（H2）である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、例えば、糖尿病、強皮症などの疾患における循環不全による酸素欠乏から損傷が生じる虚血性創傷の、リラキシンの投与による治療に関する。また、本発明は、血管形成の促進に関する。
背景情報
成熟ヒトリラキシンは、約6000ダルトンのホルモン性ペプチドであり、出産前に生殖路の改造に関与し、それにより出産過程を促進することが知られている。このタンパク質は、標的器官内の結合組織の再構成を調節して、妊娠および出産中に器官構造の必要な変化を引き起こすようである。Hisaw,F.L.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,23:661-663（1926）;Schwabe,C.ら,Biochem Biophys.Res.Comm.,75:503-570（1977）;James,R.ら,Nature,267:544-546（1977）を参照されたし。リラキシンについては、Sherwood,D.,The Physiology of Reproduction,第16章,“Relaxin”,Knobil,E.およびNeill,J.ら（編）,（Raven Press Ltd.,New York）,第585-673頁（1988）中に簡潔に概説されている。リラキシンの循環濃度は、妊娠の全９ヵ月間は高く、分娩後に急減する。
リラキシンは主に妊娠のホルモンであるが、妊娠していない女性や男性においても検出されている（Bryant-Greenwood,G.D.,Endocrine Reviews,3:62-90（1982）およびWeiss,G.,Ann.Rev.Physiol.,46:43-52（1984））。
リラキシンは、ブタ、マウス、ウマ、サメ、トラ、ラット、小型のサメ、ヒトなどの様々な種から精製されており、インスリンおよびインスリン様増殖因子に対して少なくとも一次構造および二次構造における相同性を示す。ヒトにおいては、リラキシンは、妊娠の黄体（CL）中に最も豊富に見出される。しかしながら、脳内の特定の核はリラキシン受容体を有しており、また、リラキシンのメッセンジャーＲＮＡを含有する核もある。視床下部野には、リラキシン受容体を保持する細胞のいくつかの核が見出される。
（H1）および（H2）の２つのヒト遺伝子形態が、同定されている（Hudson,P.ら,Nature,301:628-631（1983）;Hudson,P.ら,The EMBO Journal,3:2333-2339（1984）および米国特許第4,758,516号および第4,871,670号）。それらの遺伝子形態のうちの一方（H2）だけが、CL中で転写されることが判明している。（H1）形態が別の組織部位で発現されるか否か、あるいはそれが偽遺伝子に相当するか否かは、依然として明らかでない。合成ヒトリラキシン（H2）およびある種のヒトリラキシン類似体の生物活性についての試験から、生物活性に必要なリラキシンコアと、生物活性に影響を及ぼさないメチオニンからある種のアミノ酸への置換とが明らかにされた（Johnstonら,Peptides:Structures and Function,Proc.Ninth American Peptide Symposium,Deber,C.M.ら（編）（Pierce Chem.Co.1985））。
また、リラキシンの製造法が、米国特許第4,835,251号および同時係属米国出願第07/908,766号（PCT US90/02085）および08/080,354（PCT US94/0699）に記載されている。心臓血管療法および神経変性疾患の治療においてリラキシンを使用する方法が、米国特許第5,166,191号および米国出願第07/902,637号（PCT US92/06927）に記載されている。ある種のヒトリラキシン製剤が、許可された米国出願第08/050,745号に記載されている。
組換えヒトリラキシン（H2）は、現在、強皮症患者における第１相ヒト臨床試験に付されている。強皮症は、組織再形成の失調を伴う疾患であり、コラーゲンの過剰産生を引き起こし、最終的に皮膚（および罹患器官）の膨張および硬化を引き起こす。
また、血管内皮増殖因子（VEGF）は、妊娠の黄体（CL）ならびに胎盤および子宮内膜内にin situで局在している。Sharkeyら,J.Reprod.Fert.99:609-615（1993）;Liら,Growth Factors 22:277-282（1994）;Phillipsら,Endocrinology 127:965-967（1990）を参照されたし。マクロファージから分泌される高度に保存された糖タンパク質であるVEGFは、in vivoでの新たな血管成長を誘導する強力な能力を示す。VEGFは、内皮細胞に特異的なマイトジェンであり、内皮細胞の移動ならびにセリンおよびメタロプロテイナーゼの発現を誘導しうる（概説としては、Thomas,K.A.,J.Biol.Chem.271:603-606（1996）を参照されたし）。VEGF発現の最強部位は、胎児および母体のマクロファージである。妊娠中の新たな血管成長を促進する役割のほかに、VEGFは、腫瘍転移、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチなどの病態における持続的で調節異常の血管成長に関与していることが提案されている。
発明の概要
１つの態様において、本発明は、治療的に有効な量のリラキシンを投与することによる、血管形成の促進を要する哺乳動物における血管形成の促進方法に関する。好ましい実施態様では、少なくとも約１ng/mlの血清濃度を維持するのに十分な量のリラキシンを投与する。さらに好ましい実施態様では、リラキシンは、組換えヒトリラキシン（H2）である。
もう１つの態様において、本発明は、治療的に有効な量のリラキシンを投与することによる、感染症または虚血性創傷の治療に関する。特に好ましい実施態様では、感染症または虚血性創傷の損傷は、循環不全による酸素欠乏から生じたものである。
本発明のさらに別の態様において、感染症または虚血性創傷の治療用の医薬を製造するため、あるいは血管形成の促進用の医薬を製造するためにリラキシンを使用する方法を提供する。これらの実施態様の好ましい形態においては、リラキシンは組換えヒトリラキシン（H2）である。
発明の詳細な説明
定義および一般的条件
本明細書中で用いる以下の語句は、一般に、それらが使用されている文脈において特に示されている場合を除き、以下に記載する意味を有すると意図される。
「所望の」または「所望により」は、その後に記載されている事象または状況が、生じても生じなくてもよいことを意味し、また、その記載が、前記の事象または状況が生じる場合およびそれが生じない場合を包含することを意味する。
「治療」または「治療する」なる語は、
（i）予防、すなわち、臨床症状を発生させないこと、
（ii）抑制、すなわち、臨床症状の発生を抑えること、および／または
（iii）軽減、すなわち、臨床症状を軽減すること
を含む哺乳動物における任意の治療的介入を意味する。
「有効な量」なる語は、治療すべき病状の治療を達成するのに十分な量を意味する。これは、患者、疾患および行なう治療に左右されるであろう。
「リラキシン」なる語は、無傷の完全長のリラキシンまたは生物活性を保持するリラキシン分子の一部を含むヒトリラキシン［米国特許第5,023,321号に記載されているもの、好ましくは、組換えヒトリラキシン（H2）］、およびリラキシン様活性を有する他の活性物質、例えば、リラキシン様因子（同時係属の米国出願第08/484,219号に記載されているもの）、リラキシン類似体（同時係属の米国出願第08/483,476号に記載されているもの）、および結合リラキシンを受容体から競合的に置換する物質を意味する。リラキシンは、当業者に公知の任意の方法、好ましくは、米国特許第4,835,251号および同時係属米国出願第07/908,766号（PCT US90/02085）および第08/080,354号（PCT US94/0699）に記載されている方法により製造することができる。
血管形成を促進するリラキシンの役割
本発明の一部は、実施例により以下にさらに詳しく説明するとおり、リラキシンがin vivoアッセイにおいて血管形成を促進するという驚くべき知見に基づく。特に、リラキシンは、ウサギ角膜注射プロトコールおよびマトリゲル皮下挿入血管新生プロトコールの両方において血管形成性であることが判明した。
また、リラキシンが、強力な血管形成因子である血管内皮増殖因子（「VEGF」）の分泌を単球様細胞系THP-1において誘導するという新規知見を本明細書で記載する。さらに、この知見は、リラキシンの公知の生物活性の範囲を広げるものである。マクロファージは、妊娠中およびそれ以外の両方における血管形成で非常に重要な役割を果たしていることが公知であるため、リラキシンの潜在的な調節的役割は、その両方にまたがるものである。
THP-1細胞系において、リラキシンは、VEGFの４つのイソフォームのうちの少なくとも３つ（121、165および189アミノ酸のイソフォーム）の発現を刺激する。すべての形態が生物活性であると報告されているが、121および165アミノ酸の形態は分泌され、一方、それらより大きな分子は、酵素的に遊離されない限り、細胞外マトリックスに結合したままである。このリラキシンによる発現の刺激は、シクロヘキシミドの存在下においても転写レベルで生じたが、このことは、de novoタンパク質合成が全く要求されなかったことを示すものである。さらに、本明細書中に記載する結果は、THP-1細胞におけるリラキシンによるVEGFの誘導が、cAMPおよびプロテインキナーゼＣにより媒介されうることを示す。この知見は、他の細胞型でVEGF発現が刺激される場合のcAMPの公知の役割と一致する。例えば、Claffeyら,J.Biol.Chem.267:16317-16322（1992）およびGarridoら,Growth Factors 8:109-117（1993）を参照されたし。THP-1細胞をリラキシンで処理した後のVEGF転写の急激な増強は、フォルスコリン刺激後に前脂肪細胞で見られるもの（Garridoら,前掲）と同様である。さらには、誘導の迅速さおよびシクロヘキシミド効果の欠如は、THP-1細胞と前脂肪細胞との共通の経路を示唆しているかもしれない。
有用性、試験および投与
有用性
リラキシンは、血管形成を促進したり、血管新生不良性疾患部位およびマクロファージ関連炎症を伴う糖尿病、強皮症などの疾患に特徴的な感染症および虚血性創傷（例えば、虚血性潰瘍の治癒不良）を治療するのに有用である。マクロファージは、最も重要な血管形成因子源の１つである。驚くべきことに、ある種のマクロファージ系統がリラキシン結合部位を含有することが見出された。また、驚くべきことに、リラキシンがin vivoで血管形成を促進することが見出された。
試験
マクロファージへのリラキシンの結合に関するin vitro活性は、P32で標識されたリラキシン結合部位を用いて測定する。
血管形成に関するin vivo活性は、ウサギ角膜注射プロトコールおよびマトリゲル皮下挿入血管新生プロトコールにより測定する。
投与
リラキシンは、治療的に有効な量、例えば、血管形成を促進しおよび／または前記の病状の治療を達成するのに十分な量にて投与する。
リラキシンの投与は、同様の有用性を満足させる許容される任意の投与方法により、好ましくは全身投与により行なうことができる。
うつ状態の治療のためのヒトに対する投与レベルは、リラキシンについては未だ最適化されていないが、一般には、１日用量は、１日当たり約0.1〜500.0μg/kg体重、好ましくは約6.0〜200.0μg/kg、最も好ましくは約12.0〜100.0μg/kgである。一般に、リラキシンの血清濃度は、妊娠中の正常な循環濃度（すなわち、1.0ng/ml）付近またはそれ以上、例えば、0.5〜50ng/ml、好ましくは1.0〜20ng/mlとすることが求められる。進行中の臨床試験においては、約6.0μg/kg、12μg/kgおよび50μg/kgの投与量から、それぞれ、約1.8ng/ml±0.3、3.6ng/ml±0.6および11.8ng/ml±1.6の血清濃度が得られた。したがって、70kgの患者に投与する場合には、投与量は、１日当たり約7.0μg〜3.5mg、好ましくは、１日当たり約42.0μg〜2.1mg、最も好ましくは、１日当たり約84.0〜700.0μgの範囲となるであろう。勿論、リラキシンの投与量は、対象者、苦痛の重症度、投与の方法および計画、および処方する医師の判断に左右されるであろう。
前記状態の治療にリラキシンを使用する場合には、医薬上許容される任意の投与方法を採用することができる。リラキシンは、単独で又は他の医薬上許容される賦形剤と組み合わせて、固形、半固形、液状またはエアゾール状の剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、粉剤、液剤、ゲル剤、懸濁剤、坐剤、エアゾール剤などとして投与することができる。また、リラキシンは、前もって決められた速度で持続的に投与するために、持続放出または徐放剤形（例えば、徐放性の生分解性デリバリーシステムを用いるもの）、例えば、デポー注射剤、浸透ポンプ（例えば、Alza製のAlzetインプラント）、丸剤、経皮性および経皮的（エレクトロトランスポート（electrotransport）を含む）パッチなど、好ましくは、正確な用量の１回投与に適した単位投与形として投与することができる。該組成物は、典型的には、通常の医薬担体または賦形剤とリラキシンとを含むであろう。さらに、これらの組成物は、他の有効物質、担体、補助剤などを含んでいてもよい。一般には、この医薬上許容される組成物は、意図される投与方法に応じて、約0.1％〜90％、好ましくは約0.5％〜50％（重量％）のリラキシンを含有し、その残りは適当な医薬賦形剤、担体などである。そのような投与形態の実際の製造法は公知であるか、当業者に明らかであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,第15版,1975を参照されたし。米国出願第08/050,745号に記載されているヒトリラキシンの製剤が特に好ましい。
非経口投与は、一般に、皮下、皮内、筋肉内または静脈内のいずれか、好ましくは皮下への注射により特徴づけられる。注射剤は、液状の溶液または懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態、あるいは乳剤のいずれかとしての通常の形態に製造することができる。適当な賦形剤としては、例えば、水、塩水溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。さらに、所望により、投与する医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、溶解増強剤など、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート、シクロデキストリンなどの少量の非毒性補助物質も含有していてもよい。
そのような非経口組成物中に含有されるリラキシンの割合は、その特定の性質および対象者の要求に大きく左右される。しかしながら、溶液中の有効成分の割合は、0.01％〜10％が使用可能であり、前記の割合にまで後で希釈する固形組成物の場合には、それより高くなるであろう。好ましくは、該組成物は、溶液中に0.2〜２％のリラキシンを含む。
より最近になって考え出された非経口投与のためのアプローチは、一定レベルの用量を維持するために、持続放出性または徐放性の系を用いる。徐放性を制御し、リラキシンなどの有効物質の放出速度を徐々に減少させるための種々のマトリックス（例えば、重合体、親水性ゲルなど）が、当該分野で公知である。米国特許第3,845,770号（基本的な浸透ポンプを記載している）、第3,995,651号、第4,034,756号および第4,111,202号（小型の浸透ポンプを記載している）、第4,320,759号および第4,449,983号（プッシュプルおよびプッシュメルト（push-melt）浸透ポンプと称される多室式（multichamber）浸透系を記載している）および第5,023,088号（種々の投与単位の逐次時間調節分配（sequentially timed dispensing）形式の浸透ポンプを記載している）を参照されたし。
また、リラキシンの製剤は、単独で又はラクトースなどの不活性担体もしくは他の医薬上許容される賦形剤と組み合わせて、噴霧器用の鼻または肺吸入エアゾールまたは溶液として、または通気用の微細粉末として、気道へ投与してもよい。そのような場合、製剤の粒子が、50ミクロン未満、好ましくは10ミクロン未満の粒径を有するのが有利であり得る。例えば、本発明におけるリラキシンの投与に適用可能なインスリンの投与方法を開示している米国特許第5,364,838号を参照されたし。
実施例
以下に記載する実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し実施するのを可能にするためのものである。それらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の例示および代表例にすぎないとみなされるべきである。
実施例１
ウサギ角膜アッセイ
試験物質および対照物質を、0.1ccディスク（小さなコンタクトレンズに類似したもの）中にヒドロン（hydron）と混合する。適当な麻酔法を用いて、該ディスクをウサギの角膜間質ミクロポケット中に移植する。１週間後、該ディスクへの新生毛細血管成長を測定し、標準的な解剖学的評価尺度を用いて得点化（０〜４）する。得点０は、成長が全くないことを意味する。得点１は、角膜縁からポケットに向かって角膜間質に正に進入しようとしている毛細血管（１本または２本）を意味する。得点３は、血管がインプラントの基部まで成長していることを意味する。得点４は、血管がインプラントの周囲にまで成長していることを意味する。
16個の盲検サンプルを試験する前記の方法に従い、１個の角膜硝子体に穴をあけ、15個の得点を得た。平均のプラシーボ得点（n=７）は0.6（標準誤差は0.3）であり、一方、平均のリラキシン得点（n=８）は1.5（標準誤差は0.5）であった。Ｐ値は、0.08であった。
結局、リラキシンは、このアッセイの試験において血管形成性であった。
実施例２
マウスマトリゲルアッセイ
マトリゲル（Collaborative Biomedical,Bedford,MA）は、主としてラミニンおよびIV型コラーゲンを含有する再構成された基底膜複合体である。それはエンゲルブレス・ホルム・スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm（EHS））マウス腫瘍から単離される。マトリゲルは、室温では液体であるが、マウスに皮下注射されるとゲルとして再構成する。
試験物質を、マトリゲル（１ccのマトリゲル中の１％ v/vの媒体）と室温で混合し、ついでマウス（５月齢の雌のSwiss-Webster）の背に皮下注射する。１週間後、そのマウスを犠牲にし、ゲルプラグを収穫する。サンプルを、緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、切片化（４μ）し、Ｈ＆Ｅ染色する。それらのサンプルを、１（陽性）、0.5（不定）または０（陰性）として得点化する。
リラキシンは、前記の試験においては、補充物のない対照ゲルプラグと比較して、内皮細胞（第VIII因子染色で確認）をゲル中へ移動させ、該細胞に線状構造を構成させ、該細胞に血球を有する血管を形成させた。このことは、内皮細胞浸潤が全くないことを支持した。16個の盲検サンプルを試験した。16個の得点を得た。平均の対照得点（n=８）は0.3（標準誤差は0.1）であった。平均のリラキシン得点は0.8（標準誤差は0.1）であった。Ｐ値は0.02であった。
結局、リラキシンは、このアッセイの試験において血管形成性であった。
実施例３
THP-1細胞におけるVEGF産生に対するリラキシンの効果
培養細胞に対するリラキシンの効果を調べるために、単芽球または未熟単球と称される白血病の１歳の男児の末梢血細胞に由来する細胞系THP-1を選択した。THP-1細胞（ATCC#TIB202）を、10％ウシ胎児血清および２mM L-グルタミンを補充したIscove培地中で増殖させた。実験として、THP-1細胞を、24ウェルプレート中で５×105細胞/mlにて培養し、20％O2、５％CO2、37℃でインキュベートした。細胞を、10mMクエン酸（pH5.0）中の組換えヒトリラキシン（H2）（0.04〜50ng/mlの用量）で、または希釈剤単独で、８時間処理した。ついで調整培地および細胞を集め、500gで５分間の遠心分離により細胞を取り出した。VEGFタンパク質分泌を、ELISAキット（R&D Systems,Minneapolis,MN）中で定量した。
リラキシンは、THP-1細胞において、プラスチックへの付着またはクランピングなどの観察される形態学的変化を引き起こさず、また、チミジンの取込み、メタロプロテイナーゼの発現パターンまたは五酸化二窒素（nitric oxide）産生に影響を及ぼさなかった。しかしながら、リラキシンは、VEGFタンパク質分泌を用量依存的に誘導し、その誘導は、リラキシンが１ng/mlのときにピークとなることが示された。
１ng/mlおよび100ng/mlのリラキシンで処理した後の発現を時間経過と共に調べてみると、VEGFは、調整培地中で少なくとも72時間まで、ほぼ直線的に増加することが示された。
これと同じアッセイを用いて、VEGF誘導に対する他のリラキシンファミリーメンバー（特にインスリン、IGF-IおよびIGF-II（Promega,Madison,WI））の効果を、同等のモル濃度（17nM）で比較した。IGF-1およびIGF-IIはいずれも、VEGF産生を誘導しなかった。しかしながら、インスリンは、少量ではあるが有意量（リラキシンで誘導された場合の約30％）のVEGF発現を刺激した。
エストロゲン処理はいくつかの細胞型に対するリラキシンの結合をアップレギュレーション（すなわち増加）するらしいため、THP-1細胞を、１μＭの17−β−エストラジオールで、リラキシンと同時に処理するか、あるいはリラキシンの添加前に48時間、前処理した。いずれの処理プロトコールにおいても、リラキシンの単独処理と比べて、VEGF刺激の相違は生じなかった。
したがって、その結果は、リラキシンがTHP-1細胞においてVEGF分泌を用量依存的に誘導し、これがエストロゲンの効果と無関係であることを示した。
実施例４
VEGF転写のリラキシンによる調節
リラキシンで誘導されるVEGFタンパク質の増加が転写レベルで示されるか否かを確認し、VEGFイソフォーム調節を特徴づけるために、定常状態のVEGF ｍＲＮＡのPCR分析を行なった。組換えヒトリラキシン（H2）（10ng/ml）で２時間処理した後、RNAzol（Tel-Test,TX）を製造業者の指示に従い使用して、106個のTHP-1細胞から全ＲＮＡを抽出した。全部で４個のVEGFイソフォームを増幅し識別するよう設計された以下のプライマーを使用した：5’-CCA TGA ACT TTC TGC CCT-3’（センス）（配列番号１）および5’-TGC ATC GTT CTG TAT CAG TCT-3’（アンチセンス）（配列番号２）。これらのプライマーは、エキソン１からエキソン８の遺伝子にわたり、ｍＲＮＡプロセシング中にスプライスされたエキソンの数に基づき、４個の異なる産物サイズを与えた。520bpの産物サイズはVEGF121転写体の存在を示し、650bpのサイズはVEGF165に、730bpのバンドはVEGF189に、そして780bpのバンドはVEGF206にそれぞれ相当する。0.7μＭの各プライマーを2.5UのTaqポリメラーゼと共に反応混合物中で使用した。サンプルを95℃で30秒間変性させ、60℃で30秒間アニーリングし、72℃で30秒間の伸長を行なった。増幅は、30サイクル以上行なった。
PCR産物を、1.5％アガロースゲル上でサイズ分画し、臭化エチジウムで染色した。そのゲルの結果は、組換えヒトリラキシン（H2）が、VEGF121、165および189に相当する３つのバンドの発現のレベルを増加させることを示した。その増加は、30分の時点で検出可能であり、２時間までに約２倍になった。シクロヘキシミドを加えても、この増加の抑制や増幅は生じなかったが、このことは、de novoタンパク質合成がこの効果に関与していないことを示すものである。
ついで、転写体間で識別するプローブを使用して、PCR産物のサザンブロット分析を行なった。ゲル分画したPCR産物をGenescreenに移し、エキソン４、６および７内の配列に特異的な32P末端標識プローブでプローブした。プローブは以下のとおり設計した:Ex4:5’-TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC-3’（配列番号３）;Ex6：5’-AAA TCA GTT CGA GGA AAG GGA AAG-3’（配列番号４）;Ex7:5’-AAG CAT TTG TTT GTA CAA GAT G-3’（配列番号５）。VEGF遺伝子のエキソン４内の配列に従い設計したEx4プローブは、サザンブロッティングにおいて、４個すべてのイソフォームの転写体を認識した。Ex6プローブは、VEGF189および206に相当する転写体を認識し、Ex7プローブは、VEGF165、189および206イソフォームの転写体とハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、６×SSC／0.01％ SDSおよび10×Denhardts中、56℃で２時間行なった。ブロットを２×SSC／0.1％ SDS中で２時間洗浄し、ついでKodak X-Omat X線フィルムに対し露光した。
Ex4プローブは３個の異なるバンドを、Ex6プローブは１個のバンドを、そしてEx7プローブは２個のバンドを認識した。これらの結果は、VEGF121、165および189の転写体がTHP-1細胞中に存在することを示した。おそらくVEGF206に相当する２番目に大きなバンドは、時々、Ex6プローブにより認識される。重要なことは、リラキシン（100ng/ml）を加えた後に、すべてのバンドの強度が増加することであり、このことは、リラキシンがVEGF産生を転写レベルで刺激することを示すものである。
実施例５
VEGF刺激における第２メッセンジャー経路
リラキシンはTHP-1細胞においてcAMPを増加させるため、本発明者らは、リラキシンにより誘導されるVEGF分泌におけるこのメディエーターについての潜在的役割を調べた。したがって、第２メッセンジャー経路を改変することが知られているいくつかの異なる物質を、THP-1細胞におけるVEGF分泌に対するそれらの効果に関して試験した。これらの実験のために、フォルスコリン、dbcAMP、dbcGMPおよびイソブチルメチルキサンチン（IBMX）を、Sigma（St.Louis,MO）から入手した。コレラ毒素、百日咳毒素、H-89およびビスインドリルマレイミドを、Calbiochem（La Jolla,CA）から購入し、Ro、スタウロスポリン、KT5720およびSQ22536を、Biomol（Plymouth Meeting,PA）から入手した。これらの実験の結果を、以下の表Ｉに示す。
0004568383.tif 000002
THP-1細胞をホスホジエステラーゼ阻害物質であるIBMXで処理したところ、該細胞のVEGFの分泌が有意に増加した。IBMXの存在下で組換えヒトリラキシン（H2）（１ng/ml）で処理したTHP-1細胞は、リラキシンまたはIBMXのいずれかのみで処理した細胞より大量のVEGFを分泌した。より特異的なcAMPホスホジエステラーゼであるRoも、VEGF発現を増加させた。アデニル酸シクラーゼを刺激するジテルペンであるフォルスコリンは、VEGF産生を用量依存的かつ二相的に誘導した。ジブチリルcAMP（10-6Mおよび10-4M）も、VEGF発現を用量依存的に刺激したが、ジブチリルcGMPはそうではなかった。これらの細胞においてcAMPレベルを上昇させるコレラ毒素は、VEGF発現を刺激したが、百日咳毒素はそうではなかった。
以前の実験から、VEGF遺伝子発現の誘導におけるプロテインキナーゼＣについての役割が示唆されていたため、本発明者らはTHP-1細胞においてVEGF産生を調節するPMAの能力を調べた。PMA（１ng/ml）は、VEGFタンパク質発現を有意に増加させた。しかしながら、PMAはこれと同じ用量で、これらの細胞においてcAMPレベルを増加させない（データは示していない）。
PKAおよびPKCの選択的阻害物質を使用して、リラキシンによるVEGF誘導を遮断した。PKA阻害物質（H-89、SQ22536、KT5720）をそれらのKi用量以上で使用しても、ELISAによる測定ではVEGF刺激を完全には阻害しなかった（データは示していない）。さらに、PKA阻害物質とPKC阻害物質（それぞれKT5720およびビスインドリルマレイミド）を組み合わせても、KF5720単独の場合を上回る反応阻害は得られなかった。
本発明は、その特定の実施態様に関して記載されているが、当業者であれば本発明の真の思想および範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えたり均等物を置換し得ると理解できるはずである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、方法、方法の工程を本発明の目的、思想および範囲に適合させるために、多数の変形を施すことが可能である。そのようなすべての変形は、本明細書に添付する請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。前記で引用されているすべての特許および刊行物を、参考として本明細書に組入れるものとする。