(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化剤としてエラグ酸を含有する、活性化部分トロンボプラスチン時間測定用の液状試薬の凝固時間の経時的変化を抑制する方法であって、凝固時間の経時的変化の抑制剤として塩化アルミニウムを含有することを特徴とする、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬の凝固時間の経時的変化を抑制する方法。
【請求項２】
活性化剤としてエラグ酸を含有する、活性化部分トロンボプラスチン時間測定用の液状試薬であって、凝固時間の経時的変化の抑制剤として塩化アルミニウムを含有することを特徴とする、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬。
【請求項３】
塩化アルミニウムを、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬の凝固時間の経時的変化を抑制する有効量添加した請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
銅化合物をさらに含有する、請求項２又は３に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査に用いられる血液凝固能測定用試薬及び血液凝固能の検査用試薬に関する。より詳しくは、活性化部分トロンボプラスチン時間（以下ＡＰＴＴという）測定用試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＰＴＴの測定は、内因性凝固機序に関係する、凝固第VIII因子、IX因子、XI因子、XII因子等の血液凝固因子の異常を鋭敏に反映し、内因系止血異常のスクリーニングとして必須の検査手段である。
体外診断薬で用いられるＡＰＴＴ測定用試薬は、古くからタンニン酸から誘導させるエラグ酸、カオリン、又はセライト等を活性化剤として用いている。調製方法として、エラグ酸溶液に銅、ニッケル、コバルト類を混合させて活性化する方法が報告されている（米国特許3,486,981、R.E.Speckら、特表平５−５０６３０９、R.E.Speckら）。また、銅を用いる方法は、既にP.E.Bockらにより報告されている（Biochemistry,8,7258,1981.）。
しかし、これらの金属イオンを用いてエラグ酸を活性化させるＡＰＴＴ測定用試薬を調製する方法は、溶液での安定性、検体の希釈直線性の面とプレカリクレインに対する反応性で劣ることが問題となっている。
【０００３】
【解決すべき課題】
本発明の課題は、ＡＰＴＴ測定用試薬にあって、検体の希釈直線性、溶液状態での安定性に優れ、プレカリクレインの反応性の高い試薬組成物を提供することである。
【０００４】
【課題を解決する手段】
本発明者らは種々添加物の検討を行い鋭意研究を重ねた結果、ＡＰＴＴ測定用試薬にあって、アルミニウム化合物を含有させることにより上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
つまり、本発明は、
１．アルミニウム化合物を含有させることを特徴とする活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬組成物、
２．アルミニウム化合物が少なくとも塩化アルミニウムを含む前項１記載の試薬組成物、
３．アルミニウム化合物を、試薬組成物の保存安定化有効量添加した前項１又は２記載の試薬組成物、
４．アルミニウム化合物の添加する濃度が、10〜100μmol/Lである前項１〜３の何れか１に記載の試薬組成物、
５．前項１〜４のいずれか１に記載の試薬組成物を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間の測定方法、
からなる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の試薬は、広く既知のＡＰＴＴ測定用試薬に適用できる。ＡＰＴＴ測定用試薬とは、ＰＴＴ（部分トロンボプラスチン）測定用試薬（セファリン含有）に、カオリン、セライト、エラグ酸等の活性化剤を添加した試薬である。
【０００７】
すなわち本発明は、
（１）活性化剤としてエラグ酸を含有する、活性化部分トロンボプラスチン時間測定用の液状試薬の凝固時間の経時的変化を抑制する方法であって、凝固時間の経時的変化の抑制剤として塩化アルミニウムを含有することを特徴とする、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬の凝固時間の経時的変化を抑制する方法、
（２）活性化剤としてエラグ酸を含有する、活性化部分トロンボプラスチン時間測定用の液状試薬であって、凝固時間の経時的変化の抑制剤として塩化アルミニウムを含有することを特徴とする、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬、
（３）塩化アルミニウムを、活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬の凝固時間の経時的変化を抑制する有効量添加した前項２に記載の試薬、
（４）  銅化合物をさらに含有する、前項２又は３に記載の試薬、からなる。
【０００８】
その使用量は、試薬組成物の液状での保存安定化効果の確認により選定され、保存安定化有効量添加される。液状での添加の好ましい態様としては、1〜1000好ましくは10〜100μmol/Lの添加量である。
【０００９】
組成物は、アルミニウム化合物単独の添加でもよいが、他の金属化合物との併用も可能である。そのような金属化合物としては、好ましくは銅化合物（硫酸銅等）、鉄化合物（塩化第二鉄等）、マンガン化合物（塩化マンガン等）が例示され、より好適な化合物は銅化合物が挙げられる。
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１０】
【実施例１】
（ＡＰＴＴ測定用試薬の調製方法）
エラグ酸は、東京化成、SIGMA、FLUKA、和光純薬、ICNから市販品として購入することができる。エラグ酸を0.025gを秤量し、0.001M水酸化ナトリウム液１Lで溶解した。これに50μmol/Lになるように各種重金属を混合し、さらに、この溶液にトリスを0.22g、ヘペスを1.45g溶解させてエラグ酸溶液とした。別のガラス容器にウサギ脳由来セファリン（Bell and Alton法、Nature,174,880(1954)）を0.01g秤量し、上記エラグ酸溶液でセファリンを溶解してＡＰＴＴ測定用試薬を調製した。尚、セファリンは、精製リン脂質または合成リン脂質を用いても調製することができる。
【００１１】
（凝固アッセイ方法）
試料50μLを採取し37℃で60秒間加温した。調製されたＡＰＴＴ測定用試薬を 50μL混合し、さらに37℃で180秒間加温活性化した。20mM塩化カルシウム液を50μL混合し、凝固時間を測定した。尚、本測定は全自動血液凝固分析装置Coagrex-700を用いて行った。
【００１２】
（実験例１）
上記の調製法及びアッセイ法を使い、各種金属化合物の添加による効果を検討した。その結果、表１に示す各種金属化合物によるエラグ酸混合物の活性化効果についての成績が得られた。
【００１３】
表１に示すとおり、正常試料であるコアグトロ−ルＮを検体として、凝固時間をCoagrex-700を用いて測定した結果、硫酸銅、塩化マンガン、塩化アルミニウム、塩化第２鉄で活性化効果が認められた。さらに、コアグトロールＮを生理的食塩水で順次希釈し、２倍希釈液及び４倍希釈溶液を試料として、コアグトロールＮの希釈直線性を最小二乗法で回帰分析した。その結果、塩化アルミニウムの場合の希釈直線性が最も優れていた。また、プレカリクレイ欠乏症患者血漿では塩化アルミニウムが凝固時間の延長が優れ、硫酸銅、塩化マンガン、塩化第２鉄は同等レベルの延長度合いの悪い反応性を示した。一方、塩化第２鉄はエラグ酸と黒色のキレートを呈し沈殿物を生じた。
【００１４】
表１  各種金属化合物とエラグ酸の混合物の活性化効果
0004440452.tif 000002
【００１５】
（実験例２）
選択された金属化合物類で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の保存安定化性を、同様に検定した。その結果、表２に示す安定化効果についての成績が得られた。
【００１６】
表２  選択された金属化合物類で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の安定化効果
0004440452.tif 000003
【００１７】
表２に示すとおり、正常血漿であるコアグトロールＮを試料として、ＡＰＴＴ測定用試薬の37℃下における保存安定性を観察した結果、硫酸銅と塩化マンガンは凝固時間の経時的変化を与えるのに対して、塩化アルミニウムは凝固時間の変動を与えず一定した効果が得られ、安定性が極めて優れていた。
【００１８】
（実験例３）
実験例２で安定性に優れていた塩化アルミニウムと安定性に問題があった硫酸銅で混合調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の保存安定性を同様に検定した。その結果、表３に示す安定化効果についての成績が得られた。
【００１９】
表３  塩化アルミニウムと硫酸銅で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の安定化効果
0004440452.tif 000004
【００２０】
表３に示すとおり、硫酸銅と塩化アルミニウムを混合してエラグ酸を活性化させた場合であっても37℃における溶液の安定性は保持され、塩化アルミニウム添加により安定化されていることが明らかとなった。
【００２１】
（実験例４）
塩化アルミニウムと硫酸銅で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の性能を検定した。その結果、表４に示す成績が得られた。
【００２２】
表４に示すとおり、塩化アルミニウムと硫酸銅で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬を用いた場合は、３度の試行においていずれも硫酸銅単独で調製した測定試薬よりも優れた検体希釈直線性と安定性およびプレカリクレイン欠乏血漿における著しい凝固時間の延長を示した。このことにより、アルミニウム化合物の添加により、検体直希釈線性、安定性およびプレカリクレイン欠乏血漿における著しい凝固時間の延長が保持されることが明らかとなった。
【００２３】
表４  塩化アルミニウムと硫酸銅で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の性能
0004440452.tif 000005
【００２４】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば希釈直線性、溶液状態での安定性に優れ、プレカリクレインに対する反応性の高いＡＰＴＴ測定用試薬組成物が提供でき、凝固時間の測定において感度の向上が可能となる。