(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、ＣＸＣＬ１１の突然変異体からなるＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニスト。
【請求項２】
前記突然変異体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＸＣＬ１１野生型と比較して、減少したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合性を有する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
請求項１に記載のアンタゴニストをコードするＤＮＡ配列、又はその縮重配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のアンタゴニストの、過剰白血球遊走及び活性化に関連した疾病の治療又は予防用医薬の製造のための使用。
【請求項７】
前記疾病が、炎症性疾患、自己免疫疾患又は感染症である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記疾病が、多発性硬化症、関節リウマチ、ＨＩＶ−１感染症、Ｉ型糖尿病又は移植片拒絶である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１に記載のアンタゴニストの、血管新生の増加を必要とする疾病の治療又は予防用医薬の製造のための使用。
【請求項１０】
前記疾病が、虚血性心疾患である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１に記載のアンタゴニストの、癌の治療又は予防用医薬の製造のための使用。
【請求項１２】
請求項５に記載の形質転換細胞を培養することと、発現されたタンパク質を集めることとを含む、請求項１に記載のアンタゴニストの製造方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のアンタゴニストを活性成分として含有する医薬組成物。
【請求項１４】
過剰白血球遊走及び活性化に関連した疾病の治療又は予防のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記疾病が、炎症性疾患、自己免疫疾患又は感染症である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記疾病が、多発性硬化症、関節リウマチ、ＨＩＶ−１感染症、Ｉ型糖尿病又は移植片拒絶である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
血管新生の増加を必要とする疾病の治療又は予防のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記疾病が、虚血性心疾患である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
癌の治療又は予防のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
過剰白血球遊走及び活性化に関連した疾病の治療又は予防用医薬組成物の製造方法であって、請求項１に記載のアンタゴニストを、医薬として許容される担体とともに組み合わせることを含む、製造方法。
【請求項２１】
血管新生の増加を必要とする疾病の治療又は予防用医薬組成物の製造方法であって、請求項１に記載のアンタゴニストを、医薬として許容される担体とともに組み合わせることを含む、製造方法。
【請求項２２】
癌の治療又は予防用医薬組成物の製造方法であって、請求項１に記載のアンタゴニストを、医薬として許容される担体とともに組み合わせることを含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン、特にヒトＣＸＣＬ１１のアンタゴニストの構造及び特性に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、主に細胞の指向性移動及び活性化、とりわけこれらの細胞のリクルートメントを必要とする血液から組織局在化への白血球の溢血に関与している小寸法（７０〜１３０アミノ酸）の分泌炎症誘発性タンパク質である（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍ等，１９９７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＥＪ及びＬｏｌｉｓ  Ｅ，２００２）。
【０００３】
配列における保存されたシステインの数及び位置に応じて、ケモカインは、Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン及びＣＸ3Ｃケモカインに分類される。一連の細胞膜受容体、全てのヘプタヘリカルＧタンパク質共役型受容体は、状態及び/又は種類に応じて受容体の特異的組み合わせが得られる、ケモカインがそれらの生物学的活性を標的細胞に対して示すことができる結合パートナーである。ケモカインの生理学的効果は、同時相互作用の複合及び一体化系から得られる：受容体は、しばしば重複リガンド特異性を有し、その結果、単一の受容体は異なるケモカインを結合できるだけでなく、単一のケモカインは異なる受容体を結合できる。
【０００４】
通常、ケモカインは、パラクリン又は自己分泌により、損傷、炎症又は他の組織変更部位で産生される。しかしながら、炎症及び免疫プロセスにおける細胞型特異的遊走及び活性化は、ケモカインの唯一の活性ではなく、造血又は血管新生等の他の生理活動は、これらのタンパク質のある種のものにより調節されると思われる。
【０００５】
たとえ、治療剤としてケモカインを用いる際の潜在的欠点があるとしても（特に、凝集及び無差別な結合の傾向）、ケモカインにより、特に特異的ケモカイン及びそれらの受容体を、細胞、特に白血球の過剰のリクルートメント及び活性化を防止する範囲で阻害することにより、このようなプロセスに関連した病的状態における治療的介入の可能性がでてくる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  Ａ，２０００；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍ，２００１；Ｈａｓｋｅｌｌ  ＣＡ等，２００２）。
【０００６】
ケモカイン受容体のうち、ＣＸＣＲ３（Ｇタンパク質共役型受容体９又はＧＰＲ９としても知られている）は、ＩＬ−２活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球）、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞及び（より低レベル及び/又は細胞サイクル制限により）他の非造血細胞型、例えば、ニューロン、乳腺細胞及び近位尿細管細胞において高度に発現される膜受容体である。
【０００７】
ＣＸＣＲ３の固有の特徴は、他のケモカイン受容体とは異なり、特異的ＣＸＣケモカインリガンド（ＣＸＣＬ）数が減少することである：ＣＸＣＬ９（ガンマインターフェロン、ＭＩＧ、小誘発性サイトカインサブファミリーＢメンバー９又はＳＣＹＢ９により誘発されたモノカインとしても知られている）、ＣＸＣＬ１０（インターフェロン−ガンマ−誘発性タンパク質１０、ＩＰ−１０、小誘発性サイトカインサブファミリーＢメンバー１０又はＳＣＹＢ１０としても知られている）、及びＣＸＣＬ１１（インターフェロン誘発性Ｔ細胞アルファケモアトラクタント、Ｉ−ＴＡＣ、インターフェロン−ガンマ誘発性タンパク質９、ＩＰ−９、Ｈ１７４、ベータ−Ｒ１、小誘発性サイトカインサブファミリーＢメンバー１１又はＳＣＹＢ１１としても知られている）。
【０００８】
これらの３種のケモカインは、ナノモル濃度範囲でＣＸＣＲ３に対する親和性を有しているだけでなく、他の重要な特徴も有している：数多くのアミノ酸が、それらの配列に保存され、全てがアミノ末端で「ＥＬＲ」モティーフを欠き、これらは全てガンマインターフェロンにより誘発され、且つ全ては、炎症及び自己免疫との関係だけでなく、移植片拒絶及び虚血との関係で白血球（Ｔｈ１細胞）遊走において重要な役割を果たしていると思われる。これらの活性は、動物モデル、例えば、ノックアウトマウス、及びケモカイン又は受容体に特異的な抗体で処理したマウスにおいて示された。例えば、ＣＸＣＲ３の細胞外領域に対する抗体、又はそのリガンドに対する抗体の投与により、この受容体により介在される炎症反応の特異的阻害を生じる（ＷＯ０１／７２３３４；ＷＯ０１／７８７０８；ＷＯ０２／１５９３２）。
【０００９】
従来技術には、ＣＸＣＲ３とそのリガンドとの間の相互作用に関連した分子機構、及びヒト生理機能についてのそれらの重要性について数多くの確証が記載されている。ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０と比較して、ＣＸＣＬ１１は、ヒト及びマウス白血球におけるＣＸＣＲ３介在活性、取込み及び経内皮遊走の最も強力な誘導因子であると思われる（Ｃｏｌｅ  Ｋ等，１９９８；Ｌｕ  Ｂ等，１９９９，Ｓａｕｔｙ  Ａ等，２００１）。これらの分子の活性又は発現は、移植片拒絶（Ｍｅｙｅｒ  Ｍ等，２００１）、結核（Ｓａｕｔｙ  Ａ等，１９９９）、移植冠動脈疾患（Ｋａｏ  Ｊ等，２００３）、ＨＩＶ−１複製（Ｌａｎｅ  ＢＲ等，２００３）、I型糖尿病（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  Ｓ等，２００２）、腸管上皮の潰瘍形成（Ｓａｓａｋｉ  Ｓ等，２００２）、微生物感染（Ｃｏｌｅ  Ａ等，２００１）、サルコイド様肉芽腫反応（Ａｇｏｓｔｉｎｉ  Ｃ等，１９９８）、アテローム性動脈硬化症病変（Ｍａｃｈ  Ｆ等，１９９９）、多発性硬化症（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｔ等，１９９９；ＷＯ０２／０９８３４６）、癌（Ｔｒｅｎｔｉｎ  Ｌ等，１９９９；Ｒｏｂｌｅｄｏ  ＭＭ等，２００１）、皮膚病（ＷＯ０２／４３７５８；Ｆｌｉｅｒ  Ｊ等、２００１）、腎症（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｐ等，１９９９）、甲状腺の病気（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｐ等，２００２）、脳又は脊髄損傷（ＷＯ０３／００６０４５）及び数多くの他の自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連した動物モデル又は臨床サンプルに示されるような種々の病態との関係においてかなり上方制御及び調節できる。
【００１０】
さらに、内皮細胞の増殖は、ＣＸＣＲ３とそのリガンドとの間の相互作用により調節できることも分かった（Ｌｕｓｔｅｒ  Ａ等，１９９５；Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｐ等，２００１）。ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインは、抗ＣＸＣＲ３抗体により阻害されることができる内皮細胞に対するアンジオスタティック活性を示すことから、少なくとも内皮において、この受容体の活性化と細胞サイクルの調節との間には厳密な関係があることが分かる。
【００１１】
構造−活性の関係についての研究から、ケモカインは、それらの受容体と相互作用する２つの主要な部位、フレキシブルアミノ末端領域、及び第二システインに続く構造的にリジッドなループを有することが明らかである。ケモカインは、ループ領域により受容体に入ること考えられており、この接触は、受容体の活性化を生じるアミノ末端領域の結合を容易にすると思われる。また、アミノ末端領域の重要性は、この領域が修飾されるか、又は短くされる天然及び合成ケモカインを試験することによっても示された。アミノ酸のタンパク質分解消化、突然変異誘発又は化学的修飾後のこの処理により、活性化することができるか、又はこれらの分子を完全に不活性化して、アゴニスト活性及び/又はアンタゴニスト活性を有する化合物を生成できる（米国特許第５，７３９，１０３号；ＷＯ０２／５９３０１）。
【００１２】
これらの観察は、炎症反応又は免疫反応中の白血球リクルートメントの調節は、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン及び数多くの他のケモカインについて示されているこのようなアゴニスト及びアンタゴニスト効果の組み合わせに基づくものであることが示唆されている（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  Ｐ及びＣｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ，２００１；Ｌａｍｂｅｉｒ  Ａ等，２００１）。したがって、アミノ末端領域における特異的修飾を用いたケモカインは、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療に用いることができる可能性を有すると考えられる（Ｓｃｈｗａｒｚ及びＷｅｌｌｓ，１９９９）。
【００１３】
数多くの他の細胞シグナル伝達可溶性分子（インターロイキン、増殖因子）として、ケモカインは、親和性は異なるが、細胞受容体とだけではなく、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との生理学的相互作用を示す。これらの負に帯電した分子は、二糖反復（例えば、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸及びヒアルロン酸）により形成され、細胞外マトリックス又はサーキュレーションにおいて細胞表面に天然に生じる。これらは、セリン残基でのＧＡＧの翻訳後の付加後、単離された形態で存在してもよいし、タンパク質（プロテオグリカン又はＰＧ）に連結してもよい。
【００１４】
他のＧＡＧ結合タンパク質としてのケモカインは、これらの配列の短部分においてかたまりとなった塩基性残基（主にアルギニン及びリジン）を有する。これらの残基は、この目的には好適であるが、このようなモチーフは、各ケモカイン又は高度に相同なケモカイン群について異なる方法で構造化される。これらのＧＡＧ結合部位の一部は、特異的コンセンサス、例えば、ＢＢＸＢモティーフ（ここで、Ｂは塩基性残基を表し、Ｘはいずれかの他の残基を表す）又は他の配置と関連付けられた（Ｋｕｓｃｈｅｒｔ  Ｇ等、１９９９；Ｐｒｏｕｄｆｏｏt  Ａ等、２００１）。
【００１５】
この相互作用の主要なコンセンサスは、タンパク質分解からの保護が得られると思われる状態だけでなく、認識、及びオリゴマーとしての受容体へのケモカインの提供に関与する、ケモカインの制御され、且つ段階的に生成する放出についての機構である、ケモカインの凝集である（Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ  ＡＪ等、１９９７；Ｋｕｓｃｈｅｒｔ  Ｇ等、１９９９）。ＧＡＧとの相互作用及びこれらの傾斜の形成は、数多くのケモカインについて明瞭に示され、相対的親和性が測定された。したがって、このような相互作用の調節も、炎症性疾患の治療方法となる可能性があることが示唆された（Ａｌｉ  Ｓ等、２００１；Ｐａｔｅｌ  Ｄ等、２００１）。
【００１６】
当該技術分野において公知のＧＡＧ−ケモカイン相互作用に基づく治療効果を得るための手段には、内在性ＧＡＧとケモカインとの内での相互作用を調節するＧＡＧ類似体の生成（ＷＯ９４／２０５１２）、ＧＡＧを除去するためのヘパラナーゼの使用（ＷＯ９７／１１６８４）、ケモカイン−ＧＡＧ複合体の投与（ＷＯ９９／６２５３５）、ポリマーによるＧＡＧ結合領域の修飾（ＷＯ０２／０４０１５）、又はＧＡＧ結合活性に関与する残基の置換（ＷＯ０２／２８４１９）などが含まれる。
【００１７】
たとえある種のケモカインについて広範な検討を実施したとしても、限られた類似性又は公知のＧＡＧ結合タンパク質モティーフを有するケモカインとの配列相同性に基づいて、どの特異的塩基性残基を非保存的置換で修飾してＧＡＧ結合を弱める必要があるかを予測することはできないことは知られている。これは、ケモカインタンパク質ファミリーの間のＧＡＧ結合領域の構造的多様性が顕著であるからである（Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ  Ｈ等、２００２）。ＣＸＣＲ３のリガンド、インヒビター又はプロモーターを検出又は同定する方法も、当該技術分野において公知である（米国特許第６，１４０，０６４号）。しかしながら、これらのどの方法も、実際にＧＡＧ結合欠損ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１１を生成及び検討するのに適用できない。ＧＡＧとの相互作用についての構造的要件については、それらの三次元構造も、ＣＸＣＲ３もそのリガンドについても知られていない。従来技術においては、ＧＡＧ結合に関与するこれらのケモカインの残基だけでなく、突然変異体タンパク質におけるそれらの非保存的置換由来の生体内効果についても開示がない。
【発明の開示】
【００１８】
ヒトＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン（ＣＸＣＬ１１）のカルボキシル末端における特定の塩基性残基が、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との相互作用に関与することが分かった。
【００１９】
非保存的置換（例えば、アラニンによる）によりこれらの塩基性残基を排除すると、ＧＡＧとの相互作用がかなりしにくくなるだけでなく、ＣＸＣＬ１１に対する生体内拮抗作用を有するＣＸＣＬ１１突然変異体が生成する。このようなことは、ＣＸＣＬ１１の突然変異体及び最も類似したＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン（ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ９）の突然変異体を、対応の天然ケモカインのアンタゴニストとして使用するのに利用できる。本発明により得られる化合物は、ＣＸＣＲ３発現細胞に対するＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの活性をブロックするのに使用でき、それにより、過剰活性化Ｔ細胞遊走に関連する疾病、例えば、移植片拒絶及び自己免疫疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病）の治療、癌の治療、ＨＩＶ−１感染症の治療、及び血管新生の増加を必要とする疾病、例えば、虚血性心疾患の治療に使用される治療組成物を得ることができる。
【００２０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の主要な目的は、カルボキシル末端における保存塩基性残基の一つ以上が、非保存的置換により排除されたこれらのケモカインのＧＡＧ結合欠損突然変異体からなるＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの新規なアンタゴニストを提供することである。特に、拮抗性を有するＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ９の突然変異体は、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基：４６、６２、６６及び７０の少なくとも一つが、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されたものである。
【００２２】
好ましい突然変異体においてさらに突然変異されることができる塩基性残基は、一つ以上の特定のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインにおいて（ヒトケモカイン又は種全般において）保存されているもの、及び/又はこれらの保存塩基性残基を包囲しているものである。好ましくは、非保存的方法により少なくとも２個の連続的に保存された塩基性残基を置換することにより、複数の突然変異体を生成するが、他の可能な組み合わせが本発明により開示される。
【００２３】
本特許出願によれば、塩基性残基の特定の組み合わせがアラニンにより非保存的に置換された新規な組み換えＣＸＣＬ１１突然変異体の結合及び拮抗作用についての生体内及び生体外データが提供される。これらのことを、他の高度に保存されたＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの配列及び特性についての知識と組み合わせると、特定の保存塩基性部位は、これらのケモカインの生物学的活性において一般的な役割を果たすだけでなく、本発明により、天然ケモカインに対する拮抗性を有する一連の分子が得られるように修飾できることが示唆される。
【００２４】
主要な実施態様によれば、ヒトＣＸＣＬ１１のアンタゴニストは、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基：４９、５２、５７、５９、６７又は７１の少なくとも一つが、さらにアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されている、ヒトＣＸＣＬ１１の突然変異体からなる。より好ましくは、ＣＸＣＬ１１突然変異体は、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基の以下の組み合わせのうちの一つが、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されている：
ａ）４６、さらには４９及び／又は５２；
ｂ）６２、さらには５７及び／又は５９；
ｃ）６６及び７０、さらには６７及び／又は７１；又は
ｄ）６２及び６６、さらには５７、５９、６７、７０又は７１のうちの一つ以上。
【００２５】
実施例では、組み合わせ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の定義に含まれる突然変異体が開示されており、一方、組み合わせ（ｄ）は、２つの連続した保存塩基性残基を周囲の塩基性残基とともに含んでいる。
【００２６】
最後に、さらに突然変異されることができるＣＸＣＬ１１の塩基性残基は、別のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン及び/又は種全般（例えば、マウス）に保存されたものである。したがって、他の好ましいＣＸＣＬ１１突然変異体では、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基：５、６、８、１７、２０、２６又は３８の少なくとも一つが、さらにアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されている。
【００２７】
別の主要な実施態様によれば、ヒトＣＸＣＬ１０のアンタゴニストが、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基：４７、４８、５１、５２、５９、７４又は７５の少なくとも一つが、さらにアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されているヒトＣＸＣＬ１０の突然変異体からなる。より好ましくは、ＣＸＣＬ１０突然変異体において、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基の以下の組み合わせのうちの一つが、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されている：
ａ）４６及び５２、さらには４７、４８又は５１；
ｂ）５９及び６２；
ｃ）６６及び７０、さらには７４及び／又は７５；又は
ｄ）６２及び６６、さらには５９及び／又は７０。
【００２８】
最後に、さらに突然変異されることができるＣＸＣＬ１０の塩基性残基は、別のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン及び/又は種全般（例えば、マウス）に保存されたものである。したがって、他の好ましいＣＸＣＬ１０突然変異体では、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基：５、８、２２、２６又は３８の少なくとも一つが、さらにアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されている。
【００２９】
さらに主要な実施態様によれば、ヒトＣＸＣＬ９のアンタゴニストは、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基６７が、さらにアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されているヒトＣＸＣＬ９の突然変異体からなる。より好ましくは、ＣＸＣＬ９突然変異体は、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基の以下の組み合わせのうちの一つが、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されている：
ａ）６２、さらには６６及び／又は６７；
ｂ）６６及び６７；又は
ｃ）６６及び７０、さらには６７、７４又は７５のうちの一つ以上。
【００３０】
最後に、さらに突然変異されることができるＣＸＣＬ９の塩基性残基は、別のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン及び/又は種全般（例えば、マウス）に保存されたものである。したがって、他の好ましいＣＸＣＬ９突然変異体は、ヒト成熟ＣＸＣＬ１１の配列について番号付けされた塩基性残基：５、６、８、２５、２８又は３８の少なくとも一つが、さらにアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンに置換されている。
【００３１】
塩基性残基を置き換えるアミノ酸は、好ましくはアラニン又はグリシンのような非極性小アミノ酸であるが、ＧＡＧ結合と不適合であるとともに、タンパク質の他の性質を妨害しにくい電荷と寸法を有するならば、他のアミノ酸も好適である。置換に好適なアミノ酸は、セリン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸又はアスパラギンである。本発明において定義されている塩基性残基の組み合わせにおいてアラニン置換を有するヒトＣＸＣＬ１１のアンタゴニスト（図１Ａ）は、ＣＸＣＬ１１−２Ｂ３（配列番号：３）、ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３（配列番号：４）又はＣＸＣＬ１１−４Ｂ４（配列番号：５）として開示される配列を有している。これらの例は、どのようにこれらのＣＸＣＬ１１突然変異体が、ヘパリン結合欠損性であり、且つ対応の天然ケモカインのアンタゴニストとしての役割を果たすかを示している。ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３が特に有効である。
【００３２】
表現「ＧＡＧ結合欠損突然変異体」又は「ヘパリン結合欠損突然変異体」は、本発明に開示されているアッセイにおいてＧＡＧに結合する能力が低い（すなわち、対応の野生型分子に関してこれらの突然変異体の各々がヘパリンのようなＧＡＧに結合する割合（％）がより低い）突然変異体を意味する。
【００３３】
本出願では、「ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン」は、図１Ｂに示すヒト非ＥＬＲケモカインである：ヒトＣＸＣＬ１１（Ｈ１７４、インターフェロン誘発性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質、Ｉ−ＴＡＣ、又はインターフェロンガンマ誘発タンパク質９としても知られている）、ヒトＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０又はインターフェロンガンマ誘発タンパク質１０としても知られている）、ヒトＣＸＣＬ９（ＭＩＧ又はインターフェロンガンマ誘発モノカインとしても知られている）。この定義には、これらの配列の哺乳動物相同分子種（例えば、図１Ｂに示されるマウスＣＸＣＬ１１）も含まれる。
【００３４】
従来技術では、ＣＸＣＬ１１のカルボキシル末端における塩基性アミノ酸の上記した組み合わせが、ＧＡＧ／ヘパリン結合部位を定義していること、及びこれらの残基の、対応の天然分子に対する拮抗作用を有する分子への非保存的置換を示すものはない。さらに、公知のヒトＣＸＣＲ３結合ケモカイン（ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ９）のうちのこれらの組み合わせに含まれる塩基性残基の一部の保存性については、これらのケモカイン群のアンタゴニストは、本特許出願におけるヒトＣＸＣＬ１１について機能的に特徴付けられるものに対応する残基の非保存的置換により得られることができると推測できる。したがって、本発明によれば、上記で定義した突然変異の組み合わせを含み、且つ対応の天然のケモカインについてのアンタゴニストとしての役割を果たすＣＸＣＲ３−結合タンパク質の突然変異体が提供される。本発明による調製される化合物は、ＣＸＣＲ３発現細胞に対するＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの活性をブロックするのに使用されることができ、それにより、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの過剰又は未制御産生に関連した疾病、例えば、自己免疫疾患又は移植片拒絶の治療に使用されるか、又はそれらの血管新生抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）作用に対向するための治療組成物を提供できる。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、本発明のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストの構造及び活性に基づく別の分子を提供することである。
【００３６】
第一の種類の別の分子は、上記で定義したＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインアンタゴニストの活性突然変異体により表される。これらのタンパク質は、本特許出願において例示される突然変異体の拮抗性を維持又は増強するものでなければならない。
【００３７】
この種の分子には、当該技術分野において公知であり、且つ以下の実施例で開示されている手段により測定したときに、同程度又はそれ以上のレベルで本発明において特徴付けられるのと同じ生物学的活性を示すことを条件に、一つ以上のアミノ酸残基が付加、欠失又は置換された前記配列の天然又は人工の類似体が含まれる。例えば、特異的突然変異体は、一つ以上のアミノ酸が、受容体結合に影響を与えることが知られているアミノ末端領域において付加、欠失又は置換されているものであることができる。特に、これらの突然変異は、保存されたＣＸＣモティーフ（図１Ｂ）のすぐ前のアミノ末端領域に位置する成熟ヒトＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの最初の９個のアミノ酸の一つ以上を含む。このような分子は、最終的に、突然変異された一つ以上のアミノ酸を含むことができ、他のケモカインについて示されるような凝集傾向が減少した変異体が得られる（ＷＯ９８／１３４９５）。
【００３８】
本発明によれば、これらの活性突然変異体における好ましい変化は、一般的に「保存的」又は「安全」置換として知られており、非塩基性残基を含む。保存的アミノ酸置換は、分子の構造及び生物学的機能を保存するために、十分に類似した化学的性質を有するアミノ酸によるものである。また、アミノ酸の挿入及び欠失は、特に挿入又は欠失が、数個のアミノ酸、例えば、１０個より少ないアミノ酸、好ましくは３個より少ないアミノ酸のみを含み、且つタンパク質又はペプチドの機能的構造にとって極めて重要であるアミノ酸を除去又は置き換えない場合には、それらの機能を変更することなく上記で定義した配列においておこなうことができることが明らかである。
【００３９】
文献には、保存的アミノ酸置換の選択が、天然タンパク質の配列及び/又は構造についての統計的及び物理化学的研究に基づいておこなうことができる、数多くのモデルが記載されている（Ｒｏｇｏｖ  ＳＩ及びＮｅｋｒａｓｏｖ  ＡＮ，２００１）。タンパク質の設計実験から、特定の一部のアミノ酸を使用することにより、折り畳み及び活性タンパク質を産生することができ、タンパク質構造により容易に収容されることができ、且つ機能的及び構造的ホモログ及びパラログを検出するのに使用できるアミノ酸「同義」置換の分類に役立つことが明らかとなった(Ｍｕｒｐｈｙ  ＬＲ等、２０００)。同義アミノ酸基、より好ましくは同義基は、表Ｉに定義されているものである。
【００４０】
これらの教示に基づいてなした置換により産生した活性突然変異体だけでなく、1個以上のアミノ酸が除去又は付加された活性突然変異体は、本発明の目的の一つ、すなわち、最初に選択された突然変異体のものに匹敵するか、又はできたら改善された対応のＣＸＣＲ３結合ケモカインに対するＧＡＧ結合性及び拮抗作用が悪いＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの新規な突然変異体である。同様の化合物を、コードＤＮＡの通常の突然変異誘発法からか、コードＤＮＡ配列のレベルでの組み合わせ技術(例えば、ＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレイ/選択)からか、又はコンピュータを使用した設計研究から得た後、従来技術及び以下の実施例に記載の所望の活性について検証することができる。
【００４１】
本発明の第二の種類の別の分子は、上記で定義したアミノ酸配列の一つと、対応のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列とを含むＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストにより表される。この異種の後者の配列により、拮抗作用を顕著に付与したり、ＧＡＧ結合性を改善することなく追加の性質を付与される。このような追加の性質としては、例えば、精製手順がより容易であること、体液における半減期が長い、追加の結合部分、エンドプロテアーゼ消化による成熟、又は細胞外局在化があげられる。この後者の特徴は、上記した定義に含まれる特定な融合又はキメラタンパク質群の定義にとって特に重要である。これは、本特許出願におけるＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインアンタゴニストとして定義される分子が、これらのポリペプチドの単離及び精製を容易とするだけでなく、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインとそれらの受容体が天然に相互作用する空間に局在化されるからである。
【００４２】
構成部分、リガンド及びリンカーだけでなく、融合タンパク質の構成、精製、検出及び使用についての方法及び方策が、文献に広範に論じられている（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊ等、１９９７；「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（キメラ遺伝子及びハイブリッドタンパク質の用途）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３２６−３２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；ＷＯ０１／７７１３７）。本発明のアンタゴニストを生成するのに使用できるさらなるタンパク質配列は、膜結合タンパク質の細胞外領域、免疫グロブリン定常部、多量体化領域、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、移行シグナル含有タンパク質から選択される。ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのＧＡＧ結合欠損突然変異体に融合されるこれらの配列の一つ以上を選択することは、前記薬剤の特定の使用及び/又は精製プロトコールに有効である。
【００４３】
本発明の第三の種類の別の分子は、ペプチド又はポリペプチドの性質がアミノ酸側鎖のレベル、アミノ酸キラリティのレベル及び/又はペプチド主鎖のレベルで化学的に変性されたＣＸＣＲ３結合ケモカインの開示された突然変異体のペプチドミメティック（ペプチドミメティックとも称される）により表される。これらの変更により、改善された調製、有効性及び/又は薬物動態特性を有するアンタゴニストを提供することを意図している。
【００４４】
例えば、ペプチドが、被験者に注射後にペプチダーゼにより開裂されやすいことが問題であるときには、特に感受性のあるペプチド結合を非開裂ペプチドミメティックと置き換えることにより、ペプチドをより安定とでき、したがって、治療薬としてより有用とある。同様に、Ｌ−アミノ酸残基を置き換えることは、ペプチドをタンパク質分解に対する感受性を低下させ、且つ最終的にペプチド以外の有機化合物により類似させる標準的な方法である。また、アミノ末端ブロック基、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル（ｔｈｅｙｌ）、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル及び２，４−ジニトロフェニルも、有用である。効力の増加、活性の長期化、精製の容易化及び/又は半減期の増加のための数多くの他の修飾は、当該技術分野において公知である（ＷＯ０２／１０１９５；Ｖｉｌｌａｉｎ  Ｍ等、２００１）。
【００４５】
好ましい代替物であるペプチドミメティックに含まれるアミノ酸誘導体のための「同義」基を、表ＩＩに定義されたものである。また、アミノ酸誘導体には、アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−ＣＯＯＨ、インドリン−２−カルボン酸、４−ジフルオロ−プロリン、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｌ−ホモプロリン、３，４−デヒドロ−プロリン、３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン、シクロヘキシル−グリシン及びフェニルグリシンなどがあげられるが、これらには限定されない。
【００４６】
「アミノ酸誘導体」として、２０の遺伝学的にコードされた天然アミノ酸のうちの一つ以外のアミノ酸又はアミノ酸様化学物質が意図される。特に、アミノ酸誘導体は、直鎖又は分岐鎖又は環状であることができる置換又は非置換アルキル部分を含むことができ、且つ一つ以上のヘテロ原子を含むことができる。アミノ酸誘導体は、新たに調製してもよいし、又は商業ソース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＡＧ，スイス国；Ｂａｃｈｅｍ，米国）から得てもよい。
【００４７】
生体外及び生体内翻訳システムを用いて非天然アミノ酸誘導体をタンパク質に組み込んでタンパク質の構造及び機能を調査及び/又は改善する種々の方法が、文献に開示されている（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ＤＡ，２０００）。ペプチドミメティックだけでなく非ペプチドミメティックの合成及び発現の方法も、当該技術分野において周知である（Ｓａｗｙｅｒ  ＴＫ，１９９７；Ｈｒｕｂｙ  ＶＪ及びＢａｌｓｅ  ＰＭ，２０００；Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ  Ａ等、２００１）。
【００４８】
本発明のポリペプチド及びペプチドは、例えば、活性画分、前駆体、塩又は誘導体として所望の使用方法及び／又は製造方法にしたがって選択できる他の別の形態であることができる。
【００４９】
用語「活性」は、このような別の化合物が、本発明のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカイン突然変異体の機能的特徴を維持し、そして医薬として許容され且つ有用でもあることを意味する。
【００５０】
用語「画分」は、化合物自体のポリペプチド鎖のフラグメントを、単独又は関連する分子又はそれに結合した残基、例えば、糖類又はホスフェートの残基との組み合わせを意味する。また、このような分子は、通常一次配列を変更しない他の修飾、例えば、ペプチドの生体内又は生体外化学的誘導体化(アセチル化又はカルボキシル化）、その合成及び処理中又はさらなる処理工程におけるペプチドのリン酸化（ホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホスレオニン残基の導入）又はグリコシル化（ペプチドを、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば、哺乳動物グリコシル化又は脱グリコシル化酵素に暴露することによる）のパターンの一部を変更することにより得ることもできる。
【００５１】
「前駆体」は、細胞又は体に投与する前又は後の代謝及び酵素処理により本発明の化合物に転化できる化合物である。
【００５２】
本明細書で使用される用語「塩」は、本発明のペプチド、ポリペプチド又はそれらの類似体のカルボキシル基の塩と、アミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該技術分野において公知の手段により形成でき、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩又は亜鉛塩等並びに、例えば、アミン類、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカイン等と形成したものとしての有機塩基との塩などが挙げられる。酸付加塩には、例えば、鉱酸、例えば、塩酸又は硫酸との塩及び有機酸、例えば、酢酸又はシュウ酸との塩などがある。このような塩は、本発明のペプチド及びポリペプチド又はそれらの類似体と実質的に同様の活性を有しなければならない。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「誘導体」とは、公知の方法によりアミノ酸部分の側鎖又はアミノ又はカルボキシ末端基に存在する官能基から調製できる誘導体を意味する。このような誘導体には、例えば、カルボキシル基のエステル又は脂肪族アミド及び遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体又は遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体などがあげられ、例えば、アルカノイル基又はアロイル基としてのアシル基とともに形成される。
【００５４】
本発明のアンタゴニストの有用な接合体又は複合体は、受容体又は他のタンパク質(放射性又は蛍光性標識、ビオチン)、治療効力(細胞毒性薬）、薬物送達能の面で薬剤を改善できるもの、例えば、ポリエチレングリコール及び他の天然又は合成ポリマーとの相互作用の当該技術分野において公知の分子及び方法を用いて生成できる（Ｐｉｌｌａｉ  Ｏ及びＰａｎｃｈａｇｎｕｌａ  Ｒ，２００１）。後者の場合、アンタゴニストを、天然又は突然変異配列の内部又は末端位置での適当な残基の部位指向修飾により生成できる。
【００５５】
文献には、ポリマー修飾又は複合ケモカインを生成するための技術の例が記載されている（ＷＯ０２／０４０１５；ＷＯ０２／２００３３；ＷＯ０２／０２１３２）。ポリマーの結合に感受性を有する側鎖（すなわち、官能基を有するアミノ酸、例えば、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジン等の側鎖）を有する限りは、いずれの残基を結合に用いてもよい。別法として、これらの部位での残基は、ポリマーの結合に感受性のある側鎖を有する異なるアミノ酸と置き換えることができる。また、遺伝学的にコードされるアミノ酸の側鎖を、ポリマー結合できるように化学的に修飾してもよいし、又は適当な側鎖官能基を有する非天然アミノ酸を用いることができる。ポリマーは、アンタゴニストの特定の位置に天然に生じるアミノ酸の側鎖や、アンタゴニストの特定の位置に天然に生じるアミノ酸を置き換える天然又は非天然アミノ酸の側鎖だけでなく、アミノ酸の標的位置の側鎖に結合している糖質又は他の部分に対して結合させることができる。
【００５６】
これらの目的に好適なポリマーは、生体適合性、すなわち、生物学系に対して非毒性であり、数多くのこれらのポリマーが公知である。このようなポリマーは、実質的に疎水性若しくは親水性、生物分解性、非生物分解性又はそれらの組み合わせであることができる。これらのポリマーには、天然ポリマー（例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸）だけでなく、合成ポリマー（例えば、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物）などがあげられる。疎水性非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル及びポリメチルメタクリレートなどがある。親水性非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド及びそれらの共重合体などがある。好ましいポリマーは、連鎖繰り返し単位として、酸化エチレン、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００５７】
好ましい結合方法では、ペプチド合成と化学的ライゲーションの組み合わせを用いる。水溶性ポリマーの結合は、とりわけタンパク質のアミノ末端領域で生物分解性リンカーを介しておこなうのが有利である。このような修飾により、前駆体（又は「プロドラッグ」）の形態のタンパク質が得られ、リンカーの分解により、ポリマーの修飾なしにタンパク質が遊離される。
【００５８】
本発明のアンタゴニストは、組み換えＤＮＡ関連法及び化学合成法等の当該技術分野において公知の手順により調製できる。
【００５９】
本発明の別の目的は、上記したＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストをコードするＤＮＡ配列、例えば、実質的に同じヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子である。「実質的に同じヌクレオチド配列」とは、遺伝子コードの縮重により、一定のアミノ酸配列をコードする全ての他の核酸配列を含む。本発明のさらに別の目的は、上記ＤＮＡを含む発現ベクター、このようなベクターを形質転換した宿主細胞、及び上記したアンタゴニストの製造方法を提供することである。アンタゴニストの製造方法は、これらの形質転換細胞を培養すること、及び発現したタンパク質を集めることを含む。ベクターが、細胞外、移行シグナル又はシグナルペプチド含有タンパク質を有する融合タンパク質としてアンタゴニストを発現するとき、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインアンタゴニストは、細胞外空間に分泌でき、さらなる処理の面から培養細胞から容易に集め且つ精製してもよいし、又は細胞を直接に使用又は投与できる。
【００６０】
本発明のこれらの目的は、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストについての本特許出願による開示と、一般的な分子生物学法の知識とを組み合わせることにより達成できる。数多くの書籍及び雑誌には、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（実際のアプローチ）」，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ発行（「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＤＮＡクローニング２：発現系）」，１９９５；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＤＮＡクローニング４：哺乳動物系）」，１９９６；「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（タンパク質発現）」，１９９９；「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（タンパク質精製法）」，２００１）のシリーズにおいて一部の表題にあるように、ベクター及び原核宿主細胞又は真核宿主細胞を用いて組み換えタンパク質をクローニング及び産生する方法が教示されている。
【００６１】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、好適なエピソーム又は非／相同一体ベクターに挿入及びライゲーションし、それをいずれかの好適な手段により適当な宿主細胞に導入してそれらを形質転換（形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接ミクロ注入等）することができる。特定のプラスミド又はウイルスベクターを選択するのに重要な因子には、ベクターを含むレシピエント細胞が、ベクターを含有しないレシピエント細胞から容易に認識且つ選択できること；特定の宿主において望ましいベクターのコピー数；及び異なる種の宿主細胞間のベクターを「シャトル」できることが望ましいかどうか、などがある。
【００６２】
ベクターは、原核宿主細胞又は真核宿主細胞中、前記細胞において構成的に活性又は誘発可能であるように選択される転写開始／終止調節配列の制御下で、本発明のアンタゴニストを含む単離又は融合タンパク質が発現できなければならない。このような細胞において実質的に富化される細胞系を、次に単離して安定な細胞系を得ることができる。
【００６３】
真核宿主（例えば、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞）については、宿主の性質に応じて、異なる転写及び翻訳調節配列を用いることができる。これらは、ウイルスソース、例えば、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルス等から得たものでよい。この場合、調節シグナルが高レベルの発現を示す特定の遺伝子と関連させる。例えば、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター等があげられる。転写開始調節シグナルは、リプレッション及び活性化を可能とし、遺伝子の発現が調節されることができるようなものを選択できる。導入したＤＮＡにより安定的に形質転換された細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つ以上のマーカーを導入することによっても選択できる。マーカーは、栄養要求宿主に、殺生剤耐性、例えば、抗生物質、又は銅等の重金属等を付与することもできる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結してもよいし、共トランスフェクションにより同じ細胞に導入してもよい。また、本発明のタンパク質を最適に合成するのに、追加の要素を必要とすることがある。
【００６４】
宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。好ましいものは、真核宿主、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、サル、マウス及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。これは、正しい部位での正しいフォールディング又はグリコシル化等のタンパク質分子に翻訳後修飾できるからである。また、酵母細胞は、グリコシル化等の翻訳後ペプチド修飾を実施することができる。強力なプロモーター配列、及び酵母で所望のタンパク質を産生するのに利用できる高コピー数のプラスミドを利用する多数の組み換えＤＮＡ法がある。酵母は、クローニングした哺乳動物遺伝子産物におけるリーダー配列を認識し、且つリーダー配列を有するペプチド（すなわち、プレペプチド）を分泌する。
【００６５】
化学合成技術としては、例えば、固相合成及び液相合成があげられる。固相合成としては、例えば、合成されるペプチドのカルボキシ末端に対応するアミノ酸が、有機溶媒に不溶である支持体に結合され、且つ適当な保護基で保護されたアミノ基及び側鎖官能基を有するアミノ酸を、カルボキシ末端からアミノ末端まで順番に一つづつ縮合する反応と、樹脂に結合したアミノ酸、又はペプチドのアミノ基の保護基を遊離させる反応を、交互に反復することにより、ペプチド鎖が延長される。固相合成法は、使用される保護基の種類に応じてｔＢｏｃ法とＦｍｏｃ法に大きく分類される。典型的に使用される保護基には、アミノ基については、ｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４‘−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）及びＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基についてはＮＯ２（ニトロ）及びＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；及びヒドロキシル基についてはｔＢｕ（ｔ−ブチル）などがあげられる。所望のペプチドを合成後、脱保護反応に附し、固体担体から切り離す。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法についてはフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて実施でき、Ｆｍｏｃ法についてはＴＦＡを用いて実施できる。完全合成ケモカインが、文献に開示されている（Ｂｒｏｗｎ  Ａ等、１９９６）。
【００６６】
本発明の合成又は組み換えアンタゴニストの精製は、この目的について公知の方法のいずれか一つ、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動等の通常の方法により実施できる。本発明のタンパク質を精製するのに使用するのが好ましいさらなる精製方法は、標的タンパク質を結合し、且つカラム内に入れられたゲルマトリックス上で生成且つ固定化されるモノクローナル抗体又はアフィニティ基を用いたアフィニティークロマトグラフィーである。タンパク質を含有する不純な製剤を、カラムを通過させる。タンパク質は、ヘパリンによるか又は特異的抗体によりカラムに結合され、一方、不純物はカラムを通過する。洗浄後、タンパク質を、ｐＨ又はイオン強度を変化させてゲルから溶離させる。別法として、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用してもよい。溶離は、タンパク質精製に一般的に用いられる水−アセトニトリル−系溶媒を用いておこなうことができる。本発明には、本発明の化合物の精製品が含まれる。本明細書で使用される用語「精製品」は、本発明の化合物の乾燥重量基準で少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％である精製品を意味する。
【００６７】
本発明の別の目的は、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインアンタゴニストの、受容体を発現する白血球の過剰の移動及び活性化を生じるＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの望ましくない活性に関連した疾病、例えば、自己免疫疾患及び炎症性疾患、並びに癌又は細菌／ウイルス感染の治療又は予防するための薬剤、特に医薬組成物における活性成分（及び医薬として許容される担体、賦形剤、安定剤、アジュバント又は希釈剤と組み合わせて配合される）としての使用を提供することである。このような疾病としては、例えば、以下のものがあげられるが、これらには限定されない：関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、変形性関節症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、強皮症、多発生筋炎、糸球体腎炎、繊維症、肝繊維症又は肺繊維症及び炎症、アレルギー又は過敏性疾患、皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、敗血症性ショック、ＨＩＶ感染症、移植片拒絶、及びアムローム性動脈硬化症に関連する血管炎症。
【００６８】
ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの特異的拮抗作用を開示している従来技術に鑑みて、本発明のアンタゴニストは、虚血性動脈疾患、脳卒中及び遅延創傷治癒等の病的状態において生じるので、血管新生の増加を必要とする疾病の治療又は予防用医薬組成物における活性成分として使用できる。拮抗止血因子から得られる新しい血管成長の刺激は、適切な血液の循環を回復してこれらの状態を治療するのに役立つことができる。
【００６９】
本発明の別の目的は、上記で定義した形態でのＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストを活性成分として含有する医薬組成物である：タンパク質、ペプチドミメティック、誘導体、前駆体だけでなく、それらをコードするＤＮＡ又はそれらを発現する細胞。過剰白血球遊走及び活性化に関連した疾病、又は血管新生の増加を必要とする疾病の治療又は予防用の医薬組成物の製造方法は、このＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストを医薬として許容される担体とともに組み合わせることを含む。
【００７０】
本発明の別の目的は、上記した疾病のいずれかを治療又は予防する方法であって、本発明のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストの有効量を投与することを含む製造方法を提供することである。
【００７１】
医薬組成物は、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストの他に、動物に投与するのに好適な医薬として許容される担体、生物学的に適合するビヒクル及び添加剤（例えば、生理食塩水）、最終的には活性化合物を処理して医薬として使用できる製剤にしやすい補助剤（例えば、賦形剤、安定化剤、補助剤又は希釈剤）を含むことができる。このような組成物は、最終的には本発明のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのアンタゴニストと相乗的に作用するか、共同で作用する別の治療組成物と組み合わせることができる。例えば、ＣＣケモカインアンタゴニストの同様の相乗的性質が、シクロスポリンとの組み合わせで得られた（ＷＯ００／１６７９６）。別法として、特定の疾病に対して治療的に活性であることが知られている化合物（例えば、多発性硬化症についてはＩＦＮ−ベータ、関節リウマチについて可溶性ＴＮＦ受容体）を用いて他の組成物を基剤とすることができる。
【００７２】
医薬組成物は、投与方法の必要性を満たすいずれかの許容される方法で配合できる。例えば、生体材料及び薬剤送達の他のポリマーの使用、さらには特定の投与方法を有効にする種々の方法及び形態が、文献に開示されている（Ｌｕｏ  Ｂ及びＰｒｅｓｔｗｉｃｈ  ＧＤ，２００１；Ｃｌｅｌａｎｄ  ＪＬ等、２００１）。
【００７３】
「有効量」は、疾病の過程及び重症度に影響してこのような病状を減少又は緩和するのに十分である活性成分の量を意味する。有効量は、患者の投与経路及び状態に依存する。
【００７４】
「医薬として許容される」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず且つ投与される宿主に対して毒性がない担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与の場合、上記活性成分を、ビヒクル、例えば、食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル液に配合して注射用単位投与形態としてもよい。また、担体は、デンプン、セルロース、タルク、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール及び各種油、例えば、石油、動物、植物から得た油又は合成油（落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油）から選択できる。
【００７５】
許容される投与方法は、当業者により活性成分の血中レベルが所望レベルとなるように使用し且つ決定できる。例えば、投与は、種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、経皮経路、直腸経路、経口経路、又は口腔経路によりおこなうことができる。本発明の医薬組成物は、ポリペプチドを所定の速度で長期投与するための蓄積注射、浸透ポンプ等の持続又は制御放出投与形態、好ましくは、正確な投薬量の単一投与に好適な剤形で投与してもよい。
【００７６】
非経口投与は、ボーラス注入法か、又は経時的な徐々の潅流によりおこなうことができる。非経口投与製剤は、殺菌水溶液、殺菌非水溶液、懸濁剤及び乳剤などがあげられ、これらは、当該技術分野において公知の補助剤又は賦形剤を含有でき、且つ通常の方法で調製できる。さらに、活性化合物の懸濁剤を、適当な油状注射懸濁剤として投与できる。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油又は合成脂肪酸エステル、例えば、ごま油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル又はトリグリセリドなどがある。懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有することができる水性注射懸濁剤には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどがある。必要に応じて、懸濁剤は、安定剤を含有してもよい。医薬組成物は、注射投与に好適な溶液を含み、活性化合物約０．０１〜９９．９９％、好ましくは約２０〜７５％を、賦形剤とともに含む。直腸投与できる組成物には、坐剤などがある。
【００７７】
投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態及び体重、もしあれば併用療法の種類、治療頻度、並びに所望の効果の性質に応じて異なる。投与量は、個々の被験者に応じて調整でき、これは、当業者により理解及び決定できる。各処理で必要とされる総量は、複数回に分けて投与してもよいし、一回で投与してもよい。本発明の医薬組成物は、単独で投与してもよいし、状態を対象にした治療薬、又は状態の他の症状を対象とした他の治療薬といっしょに投与できる。通常、活性成分の1日投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重/日である。通常、１〜４０ｍｇ/ｋｇ/日を、分けて投与するか、又は除放性形態で投与するのが、所望の結果を得るのに効果的である。第二又は続いての投与は、個体に最初又は以前に投与したのと同じか、それよりも少ないか、又はそれよりも多い投与量で実施できる。
【００７８】
本発明を、具体的な実施態様により説明したが、説明の内容は、特許請求の範囲の意味及び目的を拡張することなく当業者によりなすことができる全ての修正及び代替を含む。
【００７９】
以下、本発明を、実施例により説明するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例では、添付図面を参照して説明をおこなう。
【実施例】
【００８０】
例１：ＣＸＣＬ１１突然変異体のヘパリン結合性の生体外特性付け
材料及び方法
ヒトＣＸＣＬ１１突然変異体の発現
ヒトＣＸＣＬ１１突然変異体を、ヒトＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受入Ｎｏ．０１４６２５）及び特に７３個のアミノ酸（ＣＸＣＬ１１−ＷＴ；図１；配列番号：１）を含む前駆体分子のセグメント２２〜９４に相当する成熟形態をコードするＤＮＡ配列の生体外ＰＣＲ突然変位誘発により生成した。
【００８１】
各ムテインに関連した点変異のクラスター（ＣＸＣＬ１１−１Ｂ３、配列番号：２；ＣＸＣＬ１１−２Ｂ３、配列番号：３；ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３、配列番号：４；ＣＸＣＬ１１−４Ｂ４、配列番号：５；図１Ａ）を、２５サイクルの１又は２ＰＣＲ工程（プルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いることにより、ＣＸＣＬ１１−ＷＴのコード配列に導入した。テンプレートは、成熟ヒトＣＸＣＬ１１の配列が、アミノ末端タグ（ＭＫＫＫＷＰ）の後にＣａｓｐａｓｅ８開裂部位（ＬＥＴＤ）を有する融合タンパク質として発現される、市販のベクターｐＥＴ−２４ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づくプラスミドであった。ＰＣＲにより得られた０．３Ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを、ＢｓｐＨｌ及びＸｈｏｌで消化し、Ｘｈｏｌ部位とＮｃｏｌ部位との間の空ｐＥＴ−２４ｄプラスミドにサブクローニングした。ＣＸＣＬ１１−ＷＴ、及び成熟形態で出発メチオニンを欠いている全てのムテインは、アミノ末端タグは、Ｃａｓｐａｓｅ８エンドプロテアーゼ消化を用いて除去されるので、他の追加の残基なしに７３個の残基を有するタンパク質として産生できる。
【００８２】
ＣＸＣＬ１１−ＷＴ及びムテインを、当該技術分野において公知の方法により発現し、試験した（「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ケモカインプロトコール）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３８，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）。全ての構築物を、標準分子生物技術（ＰＣＲ突然変異誘発及び増幅、ＤＮＡ配列決定、制限消化）により、得て、制御した後、クローニングプロセス中に大腸菌ＴＧ１菌株に維持した。大腸菌における発現に最適にコドンを利用するように、コード配列を選択した（Ｋａｎｅ  ＪＦ等、１９９５）。
【００８３】
ＣＸＣＬ−１１−ＷＴ又はその突然変異体のひとつをコードするｐＥＴ−２４ｄベースのプラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピーテント大腸菌細胞に移入し、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養に添加することにより、タンパク質の発現を誘発させた。誘発から３．５時間後、細胞を収集し、溶菌バッファに再懸濁した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭベンズアミジン／ＨＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ），Ｄｎａｓｅ  ２０ｍｇ／Ｌ）。フレンチプレッシャセルユニットを３回通過させて、細胞を破壊した。次に、懸濁液を、１００００ｘｇ、４℃で６０分間遠心分離した。ＣＸＣＬ−ＷＴを含有する封入体ペレット又はムテインの一つを、６Ｍグアニジン／ＨＣｌ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０に可溶化し（濃度：１ｍｇ／ｍｌ未満）、６０℃で３０分間攪拌した。タンパク質を、０．０１ｍＭ酸化型グルタチオン及び０．１ｍＭ還元型グルタチオンを含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０のグアニジン溶液（１０倍容積）に滴状希釈することにより再生した。この溶液を、４℃で一晩攪拌した。次に、ｐＨを、酢酸で４．５に調整し、水で希釈することにより導電率を２０ミリジーメンスに低下した。溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で予め平衡化したカチオン交換カラム（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に適用し、タンパク質を、同じ緩衝液で０〜２Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配を用いて溶離した。意図するタンパク質を含有する画分を、プールし、１％酢酸を３回交換して透析した。不溶性物質を、１００００ｘｇで３０分間遠心分離により除去し、上清を凍結乾燥した。
【００８４】
ＣＸＣＬ１１−ＷＴと全てのムテイン（ＭＫＫＫＷＰＬＥＴＤ）に共通のアミノ末端リーダー配列を、カスパーゼ８により、以下の手順で開裂した。凍結乾燥したタンパク質を、１５〜２０ｍｌ  Ｈ2Ｏに溶解し、カスパーゼ８開裂緩衝液（１５％グリセロール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で予め平衡化したＰＤ−１０カラムに適用した。タンパク質をタンパク質分解酵素（１：１００、酵素：基質、ｗ／ｗ）とともに室温で４〜５時間インキュベーションした後、開裂溶液のｐＨを４．５に調整し、導電率を、６Ｍ尿素で希釈することにより１〜２ミリシーメンスに低下させた（反応を、必要に応じて２〜３回反復した）。開裂したタンパク質を、未開裂タンパク質から、６Ｍ尿素を含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で予め平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いたカチオン交換クロマトグラフィーにより分離し、タンパク質を、同じ緩衝液で０〜２モル濃度のＮａＣｌ勾配で溶離した。開裂画分を、プールし、１％酢酸を３回交換して透析し、凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸で可溶化し、最後に再び凍結乾燥して長期保存した。
【００８５】
このようにして発現された全てのタンパク質の同一性を、質量分析により確認し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により純度を求めた。
【００８６】
ヒトＣＸＣＲ３を安定的に発現する細胞系の構築
ヒトＣＸＣＲ３を、コード配列全体をカバーしているヒトＣＸＣＲ３ｍＲＮＡ配列に基づいたプライマーを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりリウマチ様関節炎滑膜分離白血球から抽出した総ＲＮＡからクローニングした（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｘ９５８７６；ヌクレオチド６９〜１１７５）。ＲＴ−ＰＣＲ反応のための全ての試薬は、市販されており（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｔｒｉｚｏｌ（商標）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）；Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｏｌｉｇｏｄＴ15）、業者の取り扱い説明書に準じて使用した。得られた１．１ｋｂ  ＰＣＲ産物を、哺乳動物細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングしてｐＺｅｏ−ＣＸＣＲ３を得た。
【００８７】
ヒトＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡ及びＬ１．２細胞に、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いたリン酸カルシウム沈殿によりｐＺｅｏ−ＣＸＣＲ３用精製プラスミドＤＮＡをトランスフェクションし、陽性のクローンを、製造業者のプロトコールにしたがってＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて選択した。ＣＸＣＲ３の発現を、ＦＩＴＣ蛍光体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ．ｎｏ．ＭＡＢ１６０）で標識したヒトＣＸＣＲ３に対する市販のモノクローナル抗体を用いた個々のクローンのＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析、及び放射性リガンド平衡結合アッセイにより確認した（以下参照）。
【００８８】
ＣＸＣＬ１１−ＷＴ及びその突然変異体のクロマトグラフィーアッセイ
ＣＸＣＬ１１−ＷＴ又はその突然変異体の各々を、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（タンパク質５０μｇ使用）又はＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換カラム（タンパク質５０μｇ使用）にローディングした。両方の場合において、カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｈｃｌ、ｐＨ７．５及び５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化し、タンパク質を、同じ緩衝液で０〜２Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶離した。
【００８９】
ＣＸＣＬ１１−ＷＴ及びその突然変異体のヘパリン結合アッセイ
ＣＸＣＬ１１−ＷＴ又はその突然変異体のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）への階段希釈液（０．０２〜３０μＭ）を、２．５μｇ／ｍｌの［3Ｈ］−ヘパリンとともに、３７℃で１時間インキュベーションした。各試料の２０μｌの３重反復分を、リン酸セルロースフィルターを取り付けた９６ウェルＰ８１Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート（Ｗｈａｔｍａｎ社）に移した。このプレートを、真空ポンプを用いてＰＢＳ２００μｌで３回洗浄して未結合標識ヘパリンを除去した。シンチレーション流体（５０μｌ）を各ウエルに添加し、放射能を、ベータカウンターでカウントした（１分／ウェル）。データを、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ社）を用いて分析した。
【００９０】
平衡競合受容体結合アッセイ
トレーサーとして［125Ｉ］−ＣＸＣＬ１１により、Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＳＰＡ）を用いて、ＣＸＣＲ３を安定的に発現するＨＥＫ細胞から膜についてアッセイを実施した。放射性標識したＣＸＣＬ１１（組み換えヒトＩ−ＴＡＣ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、生成し、［125Ｉ］サプライヤー（Ａｍｅｒｓｈａｍ；比活性２２００ｍＣｉ／モル）にしたがって試験して、ＣＸＣＲ３−発現ＨＥＫ及びＬ１．２クローン（ＦＡＣＳ分析中に陽性に染色）も確認した。
【００９１】
未標識ＣＸＣＬ１１又はその突然変異体のひとつを結合緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．５％牛血清アルブミン）に階段希釈（１０-6〜１０-12Ｍの範囲）することにより、カンペティターを調製した。コムギ胚芽ＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、ＰＢＳで可溶化して５０ｍｇ／ｍｌとし、結合緩衝液で希釈して１０ｍｇ／ｍｌとし、アッセイにおける最終濃度を０．２５ｍｇ／ウェルとした。ＣＸＣＲ３を発現する細胞膜を、−８０℃で保存し、結合緩衝液で希釈して２０μｇ／ｍｌとした。等容積の膜とビーズストックを、混合してアッセイをしてバックグランドを減少させた。最終膜濃度は、５μｇ／ウェルであり、［125Ｉ］−ＣＸＣＬ１１の最終膜濃度は、０．０５ｎＭであった。プレートを、攪拌しながら室温で４時間インキュベーションした。放射活性を、ベータカウンターでカウントした（１分／ウェル）。３重反復試料から得たデータを、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析した。
【００９２】
結果
ヒトＣＸＣＬ１１を、４つの突然変異形態で発現して、配列及び非ヘパリン結合変異体の性質を同定した。突然変異の標的は、塩基性残基の４つのクラスタであり、全てのＣＸＣＲ３結合ケモカインに保存した少なくとも一つの塩基性残基が、各ムテインに含まれていた（図１）。
【００９３】
成熟型ヒトＣＸＣＬ１１（ＣＸＣＬ１１−ＷＴ）及び対応の４種のムテインを、大腸菌（図１Ａ）で発現させた。第一のムテインであるＣＸＣＬ１１−１Ｂ３は、ＣＸＣＬ１１−ＷＴのアミノ末端の塩基性クラスタを除去する３つのアラニン置換を含む（リジン５、アルギニン６及びリジン８）。第二ムテイン（ＣＸＣＬ１１−２Ｂ３）は、ＣＸＣＬ１１−ＷＴの残基５０を包囲している塩基性クラスタを除去する３つのアラニン置換を含む（リジン４６、リジン４９及びアルギニン５２）。第三ムテイン（ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３）は、ＣＸＣＬ１１−ＷＴの残基６０を包囲している塩基性クラスタを除去する３つのアラニン置換を含む（リジン５７、リジン５９及びアルギニン６２）。最後に、第四ムテイン（ＣＸＣＬ１１−４Ｂ４）は、ＣＸＣＬ１１−ＷＴの残基７０を包囲している塩基性クラスタを除去する４つのアラニン置換を含む（リジン６６、リジン６７、アルギニン７０及びリジン７１）。
【００９４】
ＣＸＣＬ１１−ＷＴムテインの性質に及ぼす置換の影響は、最初にヘパリン及びカチオン交換クロマトグラフィーにより試験した。このようなクロマトグラフィー媒体についての溶離プロファイルの比較により、塩基性アミノ酸による非特異的静電相互作用のヘパリン結合性への影響についての定性的目安が得られる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  Ａ等、２００１）。表ＩＩＩに示すように、ＣＸＣＬ１１−ＷＴと各ムテインとの間のＮａＣｌの溶離濃度の差を、カチオン交換（ＭｏｎｏＳ）カラム及びヘパリンカラムについて算出した。ＭｏｎｏＳカラムについて得られた値を、次にヘパリンカラムについて得られた値から引く。得られた値が正の場合、このことは、突然変異残基がヘパリンとの相互作用に寄与することを示している。この分析から、ＣＸＣＬ１１−１Ｂ３における突然変異した残基は、ヘパリンへの結合には寄与せず、一方、ＣＸＣＬ１１−２Ｂ３、ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３及びＣＸＣＬ１１−４Ｂ４において突然変異したものは、ＧＡＧの特異的認識に関与すると思われる。
【００９５】
次に、ヘパリンへの結合の直接測定を、トリチウム化ヘパリン及び組み換えＣＸＣＬ１１−ＷＴ突然変異体の階段希釈を用いて実施した（図２）。得られた放射性標識複合体を、反応をリン酸セルロースフィルターと接触させることにより未結合［3Ｈ］−ヘパリンから分離した。これらのフィルターは、タンパク質を効率的に保持し、したがって、結合ヘパリンの量を直接に評価することができる。このアッセイにより、ＣＸＣＬ１１−１Ｂ３が、ＣＸＣＬ１１−ＷＴと類似のヘパリン結合性を有し、一方、全ての他の突然変異体が減少したヘパリン結合性（最高５０％少ない結合ヘパリン）を示すことが明らかとなり、クロマトグラフィーアッセイ（表ＩＩＩ）を用いて得られた結果が確認された。ＣＸＣＬ１１−１Ｂ３において突然変異された塩基性クラスタが、ＲＡＮＴＥＳ（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  Ａ等、２００１）の一つである他の公知のヘパリン結合モチーフにさらに類似しているモティーフ（ＢＢＸＢ）として配列しているので、これらのことは特に重要であり、顕著な構造的多様性があることと、ケモカインにおけるＧＡＧ結合部位の予測性がよくないことが確認された（Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ  Ｈ等、２００２）。
【００９６】
最後に、平衡競合受容体結合アッセイを実施して、特異的受容体ＣＸＣＲ３（図３）の結合についてムテインの性質を比較した。一定量の放射性標識市販のＣＸＣＬ１１を含有する試料を、ＣＸＣＬ１１−ＷＴ又はムテインの一つの階段希釈液と混合した後、ＣＸＣＲ３発現ＨＥＫ細胞から調製した膜とともに、インキュベーションした。ヘパリン結合ムテインＣＸＣＬ１１−１Ｂ３は、ＣＸＣＲ３に対する親和性が、２桁を超える減少（サブナノモル濃度からサブミクロモル濃度に変化）したことを示したのに対して、他のムテインは、ＣＸＣＲ３に対する親和性の低下が限定されたものであり、ナノモル濃度範囲（一桁以下の減少）である。したがって、受容体に対する親和性は、ヘパリン結合欠損ＣＸＣＬ１１−ＷＴカルボキシル末端突然変異体に実質的に保持され、一方、アミノ末端体における突然変異は、特異的に受容体結合に影響する（明らかに異なると思われる特徴）。
【００９７】
例２：ヘパリン結合欠損ＣＸＣＬ１１ムテインの特性付けの細胞ベースのアッセイ
材料及び方法
走化性アッセイ
アッセイを、前Ｂリンパ腫細胞系（Ｌ１．２細胞）を用いて実施し、プラスミドでトランスフェクションし、これらの細胞及び９６ウエルマイクロプレート（ＣｈｅｍｏＴＸシステム、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）においてＣＸＣＲ３の発現を可能とした。
【００９８】
ＣＸＣＲ３発現Ｌ１．２細胞（上記説明参照）を、５％不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５ｍＭ  Ｂ−メルカプトエタノール及び０．８ｍｇ／ｍｌジェネテシンＧ−４１８を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。アッセイの前日に、５ｍＭ  ｎ−酪酸を、培地に添加した。細胞を、室温、６００ｘｇで遠心分離して集め、フェノールレッドなしで５％不活性化ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に１×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁した。上記したように、受容体発現を、ＦＩＴＣ蛍光体で標識した抗ＣＸＣＲ３抗体を用いてFACS分析により確認した。
【００９９】
組み換えＣＸＣＬ１１ムテインを、フェノールレッドなしでＲＰＭＩ培地３０μｌで階段希釈し（１０-6〜１０-12Ｍの範囲）、下ウエルに入れ、フィルター（細孔サイズ８μｍ）をそれらの上に配置し、確実に気泡がトラップしないようにしてから、システムをシールした。ＣＸＣＲ３発現Ｌ１．２細胞（同じ培地において２．５×１０4細胞／ｍｌの濃度の細胞懸濁液の２５μｌ）を、上ウエルに配置した。チャンバーを、５％ＣＯ2下、３７℃で４時間インキュベーションした。次に、細胞懸濁液を、上ウエルから捨て、フィルターを除去した。下ウェルの細胞を、黒９６ウエルプレートに移し、−８０℃で少なくとも１時間凍結した。プレートを解凍し、２００μｌ／ウェルＣｙＱＵＡＮＴ染料／細胞溶解緩衝液混合物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加して、移動した細胞の数を数えた。蛍光を、Ｖｉｃｔｏｒ2  Ｗａｌｌａｃプレートリーダーでカウントした。データを、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析した。
【０１００】
結果
ＣＸＣＬ１１−ＷＴムテインの性質、細胞系アッセイを使用して試験した。ＣＸＣＲ３を発現するために修飾Ｌ１．２細胞における走化性アッセイにおいて得た結果は、上記した受容体結合アッセイにおいて得られた結果とよく一致する。ＣＸＣＲ３に対する親和性が低いため、ＣＸＣＬ１１−１Ｂ３突然変異体は、Ｌ１．２／ＣＸＣＲ３発現細胞（図４）を補充することはできなかった。他の３種の突然変異体は、ＣＸＣＬ１１−ＷＴよりも活性が低かったが、この走化性アッセイにおいて測定可能な応答を発現させることができた。
【０１０１】
例３：ヘパリン結合欠損ＣＸＣＬ１１ムテインの特性付けの動物ベースのアッセイ
材料及び方法
腹膜細胞リクルートメント
８〜１２週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、０日目に感作した。全てのマウスに、１０ｎＭ  ＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）と１００μｇ卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ社、Ｇｒａｄｅ  Ｖ）とを殺菌ＰＢＳで混合したものを５回皮下注射した（各肢に４×５０μｌ及び頸部のスクラッフに１×１００μｌ）。１週間後、細胞リクルートメントを、０．２ｍｌの殺菌リポ多糖類非含有食塩（０．９％）で希釈した組み換えＣＸＣＬ１１タンパク質１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することにより、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに誘発させた。ＣＸＣＬ１１ムテインの性質を試験したとき、同じ殺菌溶液０．２ｍｌで希釈した表示量のタンパク質を、アゴニスト投与の３０分前に投与した。マウスを、４時間後にエアゾール化したＣＯ2により屠殺し、腹腔洗浄を、５ｍｌＰＢＳで３回実施した。洗浄液をプールし、１５００ｘｇで５分間遠心分離し、ペレット化細胞を、再懸濁して１ｍｌの最終容積とした。各試料について、誘発された白血球の総数を、血球計でカウントした。
【０１０２】
遅延接触過敏性アッセイ
接触過敏性を測定するためのマウス耳膨潤試験を、記載のようにして実施した（Ｇａｒｒｉｇｕｅ  ＪＬ等、１９９４）。簡単に述べれば、アセトン／オリーブ油（４：１）の０．５％２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）溶液２５μｌを、削った腹部に適用することにより、マウスを局所的に予備感作した。５日後、同じビヒクルに添加した０．２％ＤＮＦＢの２０μｌを、右耳に適用し、左耳には、ビヒクルのみを適用した。マウスを、５日目〜９日目まで毎日、０．５ｍｇ／ｋｇ  ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３又は対照群ではビヒクルのみを、腹腔内投与した。最初の処置は、ＤＮＦＢチャレンジの１時間前におこなった。耳の厚さを、ダイヤルシックネスゲージ（株式会社ミツトヨ）で測定し、そして耳の膨潤を、チャレンジ後の値からチャレンジ前の値を引き、さらにビヒクルチャレンジ対側性耳において検出された膨潤を引くことにより推定した。
【０１０３】
結果
ＣＸＣＬ１１−ＷＴムテインの生体内の性質のさらなるものを、２つの動物モデルを利用することにより得た。
【０１０４】
最初のアッセイは、腹膜細胞リクルートメントアッセイであった（図５）。ＣＸＣＲ３が活性化Ｔｈ１細胞で発現されるので、マウスを、アッセイ前にＣｐＧ−ＯＤＮで感作してＴｈ１応答を誘発させた。ＣＸＣＲ３結合タンパク質としての活性が低く且つ生体外で細胞をリクルートメントできないので、ＣＸＣＬ１１−１Ｂ３突然変異体は、腹膜に投与したときに生体内で細胞をリクルートメントできなかった。ＣＸＣＬ１１−２Ｂ３及びＣＸＣＬ１１−４Ｂ４の両方は、弱い活性を示したが、ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３は、リクルートメントを誘発できなかった（図５）。
【０１０５】
次に、この後者の突然変異体が生体内でＣＸＣＬ１１−ＷＴを阻害する能力について試験した（図６）。ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３は、それ自身のリクルートメント特性を示さないが、同じ投与量（１０μｇ／マウス）で事前投与したとき、腹膜への細胞リクルートメント誘発について、ＣＸＣＬ１１−ＷＴに対してかなりの拮抗作用を示す。したがって、ＣＸＣＬ１１におけるヘパリン結合の破壊により、ＣＸＣＬ１１により誘発された細胞リクルートメントを生体内で阻害できるアンタゴニストを産生する。
【０１０６】
最後に、ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３の性質を、皮膚炎症モデル、遅延接触過敏性アッセイで試験した。このハプテン特異的皮膚炎症は、Ｔ細胞が介在し、マウスにハプテンとして接触感作剤２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）をチャレンジ後、測定可能な膨潤を生成する。誘発された膨潤は、処置期間を通じてビヒクルのみを投与したマウスにおいて観察された効果と比較して、ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３を腹腔内投与したマウスでは顕著に低かった（図７）。
【０１０７】
本発明の例において得られた結果から、ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの新規なアンタゴニストを、この特許出願の知見に基づいて、特にカルボキシ末端における保存塩基性アミノ酸、及び最終的には一つ以上の特異的ＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインに保存された他の塩基性残基及び/又はそれらを包囲する一つ以上の塩基性残基の単一又は複数の置換を含むヒトＣＸＣＬ１１、ヒトＣＸＣＬ１０及びヒトＣＸＣＬ９のヘパリン結合欠損突然変異体に基づいて設計できる。
【０１０８】
本願において開示されている別の分子の性質は、上記した方法のいずれかによるか、又は文献（「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ケモカインプロトコール）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１３８，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；「Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ケモカイン受容体）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２８８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）において広範に検討されている当該技術分野において公知の他の確認法を利用することにより試験できる。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】（Ａ）は、実施例で述べたようにして発現し且つ試験した成熟ヒトＣＸＣＬ１１（ＣＸＣＬ１１−ＷＴ；配列番号：１）のアミノ酸配列及びこの配列に基づいて生成する突然変異体のアミノ酸配列（突然変異アミノ酸は、ボールド体とし且つ下線を附してある；配列番号：２〜５）。番号付けは、２１アミノ酸−長シグナルペプチドを欠く成熟ヒト配列に基づくものである。（Ｂ）は、以下のＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインの成熟形態に共通の配列のアラインメントである：マウスＣＸＣＬ１１（ｍＣＸＣＬ１１；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受入Ｎｏ．Ｑ９ＪＨＨ５；配列番号：８）、ヒトＣＸＣＬ１１（ｈＣＸＣＬ１１；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受入Ｎｏ．Ｏ１４６２５；配列番号：１）、ヒトＣＸＣＬ１０（ｈＣＸＣＬ１０；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受入Ｎｏ．Ｐ０２７７８；配列番号：６）、及びヒトＣＸＣＬ９（ｈＣＸＣＬ９；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ受入Ｎｏ．Ｑ０７３２５；配列番号：７）。ヒトＣＸＣＬ１１配列におけるボールド体と下線の残基を、実施例において示した種々の変異体においてアラニンに突然変異させた（残基５、６、８、４６、４９、５２、５７、５９、６２、６６、６７、７０及び７１）。ヒトＣＸＣＬ１１の他の塩基性残基、及びマウスＣＸＣＬ１１、ヒトＣＸＣＬ１０及びヒトＣＸＣＬ９における全ての塩基性残基には、下線を附してある。ヒトＣＸＣＲ３結合ＣＸＣケモカインのうち、保存されるシステイン及び塩基性残基を、それぞれアラインメントの下のボックスラインにＣ及びＢとして示してある。番号付けは、Ｎ末端２１（ｍＣＸＣＬ１１、ｈＣＸＣＬ１１及びｈＣＸＣＬ１０）又は２２（ｈＣＸＣＬ９）アミノ酸を含むシグナルペプチドを欠く成熟ヒト配列に基づいている。成熟型ｍＣＸＣＬ１１、ｈＣＸＣＬ１１及びｈＣＸＣＬ１０の全体を示してあるが、一方、成熟型ｈＣＸＣＬ９は、カルボキシル末端にさらに２５個のアミノ酸を有している。
【図２】［3Ｈ］−ヘパリンを用いて実施したヘパリン結合アッセイの結果を示したグラフであり、ＣＸＣＬ１１−ＷＴの活性と表示のＣＸＣＬ１１突然変異体の活性をミクロモル濃度範囲で比較している。
【図３】ＣＸＣＬ１１−ＷＴ及び表示ＣＸＣＬ１１突然変異体（ピコ／ミクロモル濃度範囲）を添加後、ＣＸＣＲ３発現ＨＥＫ細胞の膜から移動した［125Ｉ］−ＣＸＣＬ１１の百分率をモニターすることにより実施した平衡競合受容体結合アッセイの結果を表すグラフである。
【図４】ＣＸＣＬ１１−ＷＴ又は表示ＣＸＣＬ１１突然変異体を用いたＣＸＣＲ３発現Ｌ１．２細胞について実施した走化性アッセイの結果を示すグラフである。
【図５】ＣＸＣＬ１１−ＷＴ又は他の表示ＣＸＣＬ１１突然変異体を用いて雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて実施した腹腔細胞リクルートメントアッセイの結果、生理食塩水緩衝液を用いた対照と比較してまとめたグラフである。統計的有意性のレベルを、星印数を用いて表す。
【図６】ＣＸＣＬ１１−３Ｂ３がＣＸＣＬ１１−ＷＴにより誘発される細胞リクルートメントを阻害する能力についての結果をまとめたグラフである（両方とも１０μｇの量を投与）。生理食塩水又はＣＸＣＬ１１−３Ｂ３を、ＣＸＣＬ１１−ＷＴを投与する３０分前に投与した。
【図７】対照として生理食塩水又はＣＸＣＬ１１−３Ｂ３を０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で用いた遅延接触過敏性アッセイについての結果をまとめたグラフである。効果は、処理後の日数（Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７等）における耳膨潤容積をダイヤルシックネスゲージを用いて測定する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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