(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０と結合するヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
配列番号４６の第２０番〜第１２５番のアミノ酸配列で表されるＬ鎖可変領域と
配列番号４１または４２のアミノ酸配列で表されるＨ鎖可変領域と
を含んでなる、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
少なくとも二つのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなり、少なくとも一つのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントである、抗体融合タンパク質。
【請求項３】
ＣＤ２０以外の抗原を標的とする少なくとも一つのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、請求項２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項４】
ＣＤ２２を標的とする少なくとも一つのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、請求項２に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含んでなる、単離されたＤＮＡ。
【請求項６】
請求項２に記載の抗体融合タンパク質をコードする核酸を含んでなる、単離されたＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５に記載のＤＮＡを含んでなる、発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のＤＮＡを含んでなる、発現ベクター。
【請求項９】
請求項５に記載のＤＮＡを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項６に記載のＤＮＡを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させる方法であって、
（ａ）哺乳類細胞を請求項５に記載のＤＮＡにてトランスフェクトすること；および
（ｂ）前記抗体またはその抗原結合フラグメントを分泌する前記細胞を培養すること
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
少なくとも一つのヒト化モノクローナル抗体を含んでなる請求項２〜４に記載の抗体融合タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）哺乳類細胞を請求項６に記載のＤＮＡにてトランスフェクトすること；および
（ｂ）前記抗体融合タンパク質を分泌する前記細胞を培養すること
を含んでなる、方法。
【請求項１３】
Ｂリンパ腫および白血病細胞を標的とする診断用または治療用複合体であって、抗体成分を含んでなり、該抗体成分が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、抗体またはその抗原結合フラグメント、または抗体融合タンパク質を含んでなり、前記細胞に結合するものであり、かつ前記抗体成分が少なくとも一つの診断薬または少なくとも一つの治療薬に結合されている、複合体。
【請求項１４】
前記診断薬が、６０〜４,０００keVの範囲のエネルギーを有する放射性標識である少なくとも一種の光活性診断薬を含んでなる、請求項１３に記載の診断用複合体。
【請求項１５】
前記抗体成分が抗体融合タンパク質であって、該抗体融合タンパク質が少なくとも一つの治療薬に結合している、請求項１３に記載の治療用複合体。
【請求項１６】
前記治療薬が、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬、細胞傷害剤、オリゴヌクレオチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１３または１５に記載の治療用複合体。
【請求項１７】
被検体におけるＢ細胞リンパ腫または白血病の治療用組成物であって、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび医薬上許容されるビヒクルを含んでなり、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、治療上有効な量で被検体に投与される、組成物。
【請求項１８】
被検体における自己免疫疾患の治療用組成物であって、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび医薬上許容されるビヒクルを含んでなり、
前記自己免疫疾患がＢ細胞の介在するものあり、
記抗体またはその抗原結合フラグメントが、治療上有効な量で被検体に投与される、組成物。
【請求項１９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが非経口投与される、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記投与が静脈投与である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記投与が皮下投与である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することを含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
１ｍｇ／ｋｇの用量で投与することを含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記用量が１週間に１回与えられる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記用量が４〜８週間与えられる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記用量が１週間おきに与えられる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記用量を２〜３週間おきに投与し、合計で少なくとも３回投与されるように繰り返す、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記用量を２〜３週間おきに２〜３ヶ月投与する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記用量の間隔が少なくとも２週間である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記用量が３ヶ月まで投与される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ１、または、ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ２を含んでなる、ＣＤ２０に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記ｈＡ２０Ｖｋが、配列番号４６の第２０番〜第１２５番のアミノ酸配列で表されるものであり、
前記ｈＡ２０ＶＨ１が、配列番号４１のアミノ酸配列で表されるものであり、
前記ｈＡ２０ＶＨ２が、配列番号４２のアミノ酸配列で表されるものである、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ１、または、ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ２をコードする核酸を含んでなる、単離されたＤＮＡであって、
前記ｈＡ２０Ｖｋが、配列番号４６の第２０番〜第１２５番のアミノ酸配列で表されるものであり、
前記ｈＡ２０ＶＨ１が、配列番号４１のアミノ酸配列で表されるものであり、
前記ｈＡ２０ＶＨ２が、配列番号４２のアミノ酸配列で表されるものである、ＤＮＡ。
【請求項３３】
請求項３２に記載のＤＮＡの一つを含んでなる、発現ベクター。
【請求項３４】
請求項３２に記載のＤＮＡの一つを含んでなる、単離された宿主細胞。
【請求項３５】
ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ１、または、ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ２を含んでなる、抗体または抗原結合フラグメントを発現させる方法であって、
（ａ）哺乳類細胞を、ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ１、または、ｈＡ２０ＶｋおよびｈＡ２０ＶＨ２をコードする核酸を含んでなるＤＮＡにてトランスフェクトすること；および
（ｂ）前記抗体または抗原結合フラグメントを分泌する前記細胞を培養すること
を含んでなり、
前記ｈＡ２０Ｖｋが、配列番号４６の第２０番〜第１２５番のアミノ酸配列で表されるものであり、
前記ｈＡ２０ＶＨ１が、配列番号４１のアミノ酸配列で表されるものであり、
前記ｈＡ２０ＶＨ２が、配列番号４２のアミノ酸配列で表されるものである、方法。
【請求項３６】
被検体におけるＢ細胞リンパ腫または白血病の治療用組成物であって、
請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および医薬上許容されるビヒクルを含んでなり、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、治療上有効な量で被検体に投与される、組成物。
【請求項３７】
被検体における自己免疫疾患の治療用組成物であって、
請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および医薬上許容されるビヒクルを含んでなり、
前記自己免疫疾患がＢ細胞の介在するものあり、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、治療上有効な量で被検体に投与される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０抗体、特にヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０抗体のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療用および診断用複合体、ならびにヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０抗体を用いてＢ細胞リンパ腫、白血病および種々の自己免疫疾患を治療する方法に関する。本発明は、少なくとも二つの抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、または少なくとも一つの抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、および抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメント以外に少なくとも一つの第二のＭＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなる、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントに関する。このヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、そのフラグメント、その抗体融合タンパク質またはそのフラグメントは、治療用複合体として単独で投与してもよく、または治療用免疫複合体、他の裸の抗体、もしくは治療薬と組み合わせて投与してもよく、または診断用複合体として投与してもよい。本発明は、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０ 抗体をコードするＤＮＡ配列、抗体融合タンパク質、前記ＤＮＡ配列を含んでなるベクターおよび宿主細胞、ならびにヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０抗体を製造する方法に関する。
【０００２】
２．背景技術
脊椎動物の免疫機構は、異種抗原を正確に認識し、特異的に結合し、そしてかかる異種抗原を排除／破壊するために進化した多数の器官および細胞型からなる。とりわけリンパ球は免疫機構にとって重要である。リンパ球は二つの大きなサブ集団、Ｔ細胞およびＢ細胞に分類される。相互依存的であるにもかかわらず、Ｔ細胞は細胞性免疫、Ｂ細胞は抗体産生（体液性免疫）に大きな役割を果たしている。
【０００３】
ヒトにおいては、各々のＢ細胞が膨大な数の抗体分子を産生できる。このような抗体産生は、異種抗原が中和された時点で通常は停止する（または実質的に減少する）。しかし時折、特定のＢ細胞の増殖が衰えずに継続され、Ｂ細胞リンパ腫として知られる癌を引き起こす。非ホジキンリンパ腫のＢ細胞サブタイプのようなＢ細胞リンパ腫は、癌死亡率に大いに寄与している。種々の形態の治療法に対するＢ細胞悪性腫瘍の反応は複雑である。例えば、非ホジキンリンパ腫の適当な臨床病期分類が可能な場合、領域放射線治療により満足のいく治療を行うことができる。それにもかかわらず、約半数の患者がこの疾患により死亡する（Devesa et al., J. Nat'l Cancer Inst. 79:701(1987））。
【０００４】
慢性リンパ性白血病の大多数は、Ｂ細胞系統である（Freedman,Hematol. Oncol. Clin. North Am. 4:405（1990））。この種類のＢ細胞悪性腫瘍は西欧社会において最も一般的な白血病である（Goodman et al., Leukemia and Lymphoma 22:1（1996））。慢性リンパ性白血病の自然な生長はいくつかの曲面に分類される。発症早期においては、慢性リンパ性白血病は無痛性の疾患であり、寿命の長い、小さな成熟した機能不全の悪性Ｂ細胞の蓄積を特徴とする。最終的に、悪性Ｂ細胞の倍増時間が短くなり、次第に患者に症状が出現する。治療により症状が軽減されるものの、患者の全体的な生存率にはあまり影響しない。慢性リンパ性白血病の後期では、顕著な貧血および／または血小板減少症が特徴的である。この時点での平均生存期間は２年未満である（Foon et al., Annals Int. Medicine 113:525（1990））。慢性リンパ性白血病は細胞増殖率が低いために、細胞傷害剤治療に対し耐性を示す。
【０００５】
化学療法および放射線療法をはじめとするＢ細胞悪性腫瘍を治療する従来の手法は、有害な副作用のためにその有用性に制限があった。放射性核種、毒素、または他の治療薬を導くためにモノクローナル抗体を使用することにより、かかる薬物が選択的に腫瘍部位に送達され、正常組織に対する毒性を制限できる可能性が与えられる。また、これらのＢ細胞悪性腫瘍上のＢ細胞抗原が、Ｂ細胞上のＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３およびＣＤ２２のようなマーカーに対する非結合型Ｂ細胞抗体を用いる治療法において最適な標的となる。ＨＬＡ−ＤＲおよび他の抗原も、他の細胞型上にも発現されるが、正常および悪性Ｂ細胞の標的として働き得る。さらに、ある種のＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４抗原、好ましくはＭＵＣ１もまた、ＣＤ２０および他のＢ細胞マーカーを発現するＢ細胞腫瘍をはじめとする種々の造血器悪性腫瘍において発現される。テネイシン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）をはじめとする腫瘍の血管上皮に関連する他の抗原標的、ならびに腫瘍産物のようなＢ細胞悪性腫瘍に関連する他の種類の抗原も、本発明において使用される相補性抗体のための好適な標的である。
【０００６】
Ｂ細胞は、分化および同定のためのマーカーとして利用できる細胞表面タンパク質を含んでなる。このようなヒトＢ細胞マーカーの一つとしては、ＣＤ２０と呼ばれるヒトＢリンパ球−制限分化抗原Ｂｐ３５がある。ＣＤ２０は前駆Ｂ細胞発達初期に発現され、形質細胞分化時まで残存する。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞およびその異常な増殖がＢ細胞リンパ腫を引き起こし得る悪性Ｂ細胞の双方で発現される。ＣＤ２０抗原に対する抗体はＢ細胞リンパ腫の治療のために研究されてきた。例えば、「ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８」と呼ばれるキメラ抗ＣＤ２０抗体は、非結合抗体として５００ｍｇ／注射を超える用量で反復注射された場合、Ｂ細胞リンパ腫に対して活性を有する（Maloney et al., Blood 84:2457(1994); Longo, Curr. Opin.Oncol.8:353(1996））。この投与計画で治療された、低悪性度の無痛型非ホジキン病患者の約５０％が反応を示す。治療に対する反応はまた、１３１Ｉ標識Ｂ１抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体を６００ｍｇ／注射を超える用量にて反復投与しても得られる。Kaminski et al., N. Engl. J Med 329:459(1993); Press et al., N. Engl. J:Med. 329:1219(1993); Press et al., Lancet 346:336(1995）。しかし、これらの抗体は非結合型として投与されても、放射性標識型として投与されても、より一般的で致死率の高い中悪性度または高悪性度のＢ細胞リンパ腫患者では、他覚的かつ持続的な反応を示す割合は高くない。従って、長期間持続する治療反応を達成する、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法を開発する必要がある。
【０００７】
さらに、ＣＤ２０表面抗原を標的とする試験が行われ、この試験では抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体である、ＩＦ５を用い、これをＢ細胞リンパ腫患者に持続的に静脈へ注入した。報告によれば、循環している腫瘍細胞を枯渇させるためには非常に高濃度の（２ｇを超える）ＩＦ５が必要であり、その結果は「一時的なもの」であったと記載された（Press et al.,"Monoclonal Antibody IF5(Anti-CD20) Serotherapy of HumanB-Cell Lymphomas." Blood 69/2:584-591 (1987））。しかし、このアプローチの問題点は、非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）は通常、ヒトエフェクター機能を欠いている、すなわちそれらは補体依存性溶解を媒介できず、また抗体依存性細胞傷害もしくはＦｃレセプター媒介食作用を介してヒト標的細胞を溶解できないことである。さらに、非ヒトモノクローナル抗体はヒト宿主により異種タンパク質として認識され、このためかかる異種抗体の反復注射は免疫応答を誘導し、有害な過敏症反応を引き起こす。これはしばしば、マウスに基づくモノクローナル抗体に関しては、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応と呼ばれる。
【０００８】
キメラ抗体はマウス抗体のような強いＨＡＭＡ反応を惹起しないので、キメラ抗体を使用するのがより好ましい。キメラ抗体は、２以上の異なる種由来の部分を含んでなる抗体である。例えば、Liu, A. Y. et al, "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J Immun. 139/10:3521-3526（1987）は、ＣＤ２０抗原に対するマウス／ヒトキメラ抗体について記載している。また、ＰＣＴ第WO88/04936号公開公報も参照されたい。しかし、Ｂ細胞の異常の治療にかかるキメラ抗体を使用する際のその活性、有用性または実用性に関する情報は、その参考文献には示されていない。in vitro機能アッセイ（例えば、補体依存性溶解（ＣＤＣ）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）よっては本来、in vivoにおいてのキメラ抗体が特定の抗原を発現する標的細胞を破壊または枯渇させる能力を予測し得るものではない。例えば、Robinson, R. D. et al.,"Chimeric  mouse-human anti-carcinoma antibody that mediate different anti-tumor cell biological activities," Hum. Antibod. Hybridomas 2:84-93(1991)（検出できないＡＤＣＣ活性を有するキメラマウス−ヒト抗体）を参照されたい。従って、キメラ抗体の治療有効性はin vivo実験、好ましくは関心の対象である種における特定の治療法に関する実験によってのみ、正確に評価し得る。
【０００９】
Ｂ細胞異常の治療におけるマウスモノクローナル抗体の有効性を改善した一つのアプローチとしては、標識または薬物が腫瘍部位に局在化されるように抗体に放射性標識または化学療法薬を結合させることがある。例えば、前記のＩＦ５抗体および他のＢ細胞抗体を１３１Ｉにて標識し、２人の患者における生物学的分布を評価した報告がある。Eary, J. F. et al.,"Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma"J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268(1990)を参照されたい。また、Press,O. W.et al., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1(Anti-CD37）Antibody" J. Clin. Onc. 7/8:1027-1038(1989)(１３１Ｉ標識ＩＦ５にて治療した１人の患者が部分的反応を示した）；Goldenberg, D.M.et al.,"Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with 131I-Labeled LL2 Monoclonal Antibody"J. Clin. Oncol. 9/4:548-564 (1991)（複数回注射を受けた８人中３人の患者がこのＣＤ２２マウス抗体に対するＨＡＭＡ反応を示したと報告されている）；Appelbaum, F.R. "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem./Oncol. Clinics of N.A. 5/5:1013-1025 (1991)(総説）；Press, O. W. et al.,"Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support."New England Journal of Medicine 329/17: 1219-12223 (1993)（１３１Ｉ標識抗ＣＤ２０抗体１Ｆ５およびＢ１）；およびKaminski, M. G. et al"Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with [131I]Anti-B1(Anti-CD20) Antibody".NEJM 329/7:459(1993)(１３１Ｉ標識抗ＣＤ２０抗体Ｂ１；以後「Ｋａｍｉｎｓｋｉ」という）；ＰＣＴ出願第ＷＯ92/07466号公開公報（ドキソルビシンまたはマイトマイシンのような化学療法薬に結合させた抗体）も参照されたい。しかし、多くのリンパ腫の患者は前もって積極的な細胞毒性化学療法を受けていたため免疫が抑制されており、これにより積極的に前治療されていない患者よりもＨＡＭＡ反応率が低かったという事実にもかかわらず、これらのアプローチはマウス抗体使用に関連する障害を排除したわけではない。
【００１０】
自己免疫疾患はＢ細胞の異常に関連する種類の疾患である。その例としては、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病などの免疫媒介性血小板減少症をはじめとして、重症筋無力症、狼瘡腎炎、紅斑性狼瘡、ならびに関節リウマチなどがある。最も一般的な治療法はコルチコステロイドおよび細胞傷害剤によるものであり、これは非常に強い毒性を発揮する可能性がある。これらの薬物はまた、免疫システム全体を抑制し、重篤な感染症を引き起こし、骨髄、肝臓および腎臓に対し副作用がある。III型自己免疫疾患の治療に用いられる他の治療法は、これまでＴ細胞およびマクロファージに向けられてきた。自己免疫疾患、特にIII型自己免疫疾患のより効果的な治療法が必要とされている。
【００１１】
Ｂ細胞の異常およびその治療法に関する多くの問題を解決するために、本発明は、本発明によるＣＤ２０抗原に結合する同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を提供するものであり、この抗体は、ヒトおよび他の哺乳類におけるＢ細胞リンパ腫、白血病および自己免疫疾患の治療のために、マウス抗体使用に関連する副作用を生ずることなく、単独で、治療薬との結合して、または他の治療様式と組み合わせて使用される。
【発明の概要】
【００１２】
従って、本発明は、ＣＤ２０と呼ばれるヒトＢ細胞マーカーに結合する、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０抗体であって、Ｂ細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患などのＢ細胞異常の治療または診断に有用なものを提供する。
さらに本発明は、ヒトまたは家畜などの哺乳類被検体を治療する方法であって、１以上のヒト化、キメラおよびヒトＣＤ２０抗体を、単独で、抗体融合タンパク質として、治療用複合体として単独で、または抗体融合タンパク質の一部として、または他の抗体、他の治療薬もしくは免疫調節剤と組み合わせてまたはこれらと共に複合療法として、または少なくとも一つの治療薬、治療用放射性核種もしくは免疫調節剤と結合させた免疫複合体として用いる方法を提供する。これらのヒト化、キメラおよびヒトＣＤ２０抗体はまた、診断用造影剤として単独で、他の診断用造影剤と組み合わせて、および／または治療用途とあわせて使用し得る。
【００１３】
さらに本発明は、抗ＣＤ ２０ｍＡｂまたはそのフラグメントであって、ＣＤ２０に特異的な１以上のマウスまたはキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂ由来の、特異的マウスＣＤＲまたはマウスＣＤＲの組み合わせを含んでなるものに関する。これらのｍＡｂはヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ２０ｍＡｂであることができる。
【００１４】
本発明はまた、抗体融合タンパク質であって、少なくとも二つの抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなるもの、または抗ＣＤ２０ｍＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなる第一のＭＡｂおよび第二のＭＡｂを含んでなるものを提供する。
【００１５】
さらに本発明は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメントを有する治療用または診断用複合体、または少なくとも一つの治療薬もしくは少なくとも一つの診断薬に結合している抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくは他のｍＡｂもしくはそのフラグメントを有する抗体融合タンパク質に関する。本発明には、同じまたは異なるタイプの多様な治療薬を有する抗体融合タンパク質が包含される。
【００１６】
さらに本発明は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、またはその抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを治療に用いる方法であって、これらを、１以上の治療薬を有する治療用免疫複合体の抗体成分として単独かまたは互いに組み合わせて用いるか、またはそれぞれ１以上の治療薬と組み合わせてもしくは１以上の治療薬を有する免疫複合体と組み合わせて用いる方法を提供する。
【００１７】
さらに本発明は、抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、またはその抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを、１以上の診断薬と結合している診断薬として用いる方法を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、本発明による抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを用いて、Ｂ細胞リンパ腫、白血病または自己免疫疾患の患者の細胞をプレターゲッティングする方法を提供する。
【発明の具体的説明】
【００１９】
１．概説
前記のように、結合していないかまたは治療用放射性核種で標識された抗ＣＤ２０抗体は、中悪性度または高悪性度型のＢ細胞リンパ腫患者に他覚的で持続的な反応を高い割合で引き起こすことができなかった。本発明は、ヒトおよび家畜といった哺乳類被検体の治療に有用なヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０抗体ならびにその抗体融合タンパク質であって、単独で、複合体として、または他の裸の抗体および抗体治療用複合体を含む他の治療薬と組み合わせて投与されるものを提供する。
【００２０】
本発明による抗ＣＤ２０ ｍＡｂは、特定のマウスＣＤＲまたは１匹以上のマウス由来のマウスＣＤＲの組み合わせ、またはＣＤ２０抗原に特異的なキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂを含む。本発明による抗ＣＤ２０ ｍＡｂは、ヒト化、キメラまたはヒトｍＡｂであり、それらはマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＣＤＲのアミノ酸を包含し、マウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＢ細胞、Ｂ細胞リンパ腫および白血病細胞標的特性を実質的に保持している。この抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、ＲＡＳＳＳＬＳＦＭＨまたはＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨを含むＣＤＲ１；アミノ酸ＡＴＳＮＬＡＳを含むＣＤＲ２；およびアミノ酸ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、ＨＱＷＳＳＮＰＬＴまたはＱＱＳＦＳＮＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなり；かつ抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＳＹＮＭＨを含むＣＤＲ１；アミノ酸ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ、ＳＨＹＧＳＮＹＶＤＹＦＤＶまたはＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶを含むＣＤＲ３を含んでなる。
【００２１】
一つの態様によれば、このヒト化およびキメラＭＡｂまたはそのフラグメントは、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶを含むＨ鎖可変領域のＣＤＲ３を含まない。より好ましくは、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ３がＨＱＷＳＳＮＰＬＴを含みかつＨ鎖可変領域のＣＤＲ３がＳＨＹＧＳＮＹＶＤＹＦＤＶを含む時、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がＲＡＳＳＳＬＳＦＭＨを含まない。他の態様によれば、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がＲＡＳＳＳＬＳＦＭＨを含みかつＨ鎖可変領域のＣＤＲ３がＳＨＹＧＳＮＹＶＤＹＦＤＶを含む時、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ３がＨＱＷＳＳＮＰＬＴを含まない。さらに他の態様によれば、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がＲＡＳＳＳＬＳＦＭＨを含みかつＬ鎖可変領域のＣＤＲ３がＨＱＷＳＳＮＰＬＴを含む時、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ３がＳＨＹＧＳＮＹＶＤＹＦＤＶを含まない。他の態様によれば、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ３がＱＱＳＦＳＮＰＰＴを含みかつＨ鎖可変領域のＣＤＲ３がＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶを含む時、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨを含まない。
【００２２】
さらに他の態様によれば、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨを含みかつＨ鎖可変領域のＣＤＲ３がＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶを含む時、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＭＡｂ）またはそのフラグメントはアミノ酸ＱＱＳＦＳＮＰＰＴを有するＬ鎖可変領域のＣＤＲ３を含まない。さらに、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨを含みかつＬ鎖可変領域のＣＤＲ３がＱＱＳＦＳＮＰＰＴを含む時、抗ＣＤ２０ ＭＡｂはアミノ酸ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶを有するＨ鎖可変領域のＣＤＲ３を含まない。
【００２３】
好ましい態様によれば、ヒト化抗ＣＤ２０（ｈＣＤ２０）モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも一つのマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂ可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）および少なくとも一つのヒトＭＡｂ可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでなり、ここでヒト化抗ＣＤ２０ＭＡｂまたはそのフラグメントが上記マウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＢ細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞および白血病細胞に対する標的特性を実質的に保持する。このヒト化抗体の可変領域はＬ鎖可変領域、Ｈ鎖可変領域またはＬ鎖およびＨ鎖可変領域の両方を含んでいてもよい。ヒト化抗体またはそのフラグメントはさらに、少なくとも一つのヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域を含んでいてもよい。
【００２４】
本発明によるヒト化抗ＣＤ２０ ＭＡｂ またはそのフラグメントは、マウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＣＤＲならびにヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでなり、親マウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＢ細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞および白血病細胞に対する標的特性を実質的に保持し、かつマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸ＡＴＳＮＬＡＳを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸ＱＱＷＴＳＮＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなり、ならびにマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸ＳＹＮＭＨを含むＣＤＲ１、アミノ酸ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶを含むＣＤＲ３を含んでなる。しかし、このヒト化抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域のＦＲ中にマウスＭＡｂの相当するＦＲ由来の少なくとも一つのアミノ酸をさらに含んでいてもよい。このヒト化ＭＡｂは、さらにヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域を含んでいてもよい。具体的には、このヒト化抗ＣＤ２０ＭＡｂまたはそのフラグメントは、ｈＡ２０ＶＨ１またはｈＡ２０ＶＨ２と表される図４ＡのマウスＨ鎖可変領域の少なくとも一つのアミノ酸残基１、５、２７、３０、３８、４８、６７、６８、７０、９５、１１５および１１６を含み、またｈＡ２０Ｖｋと表される図４ＢのマウスＬ鎖可変領域の少なくとも一つのアミノ酸残基４、２１、３５、３８、４５、４６、５９、９９、１０４および１０６を含む。ＣＤ２０抗原への適当な結合を維持するため、または結合を強化するために必要ならば、１以上のマウスアミノ酸配列をヒトＬおよびＨ可変鎖のＦＲ領域中に維持できる。より好ましくは、本発明によるヒト化抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、図４ＢのｈＡ２０Ｖｋおよび図４ＡのｈＡ２ＶＨ１を含んでなる。最も好ましくは、本発明によるヒト化抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、図４ＢのｈＡ２０Ｖｋおよび図４ＡのｈＡ２ＶＨ２を含んでなる。この後者の配列はＶＨ２鎖のＦＲ中にＶＨ１鎖よりも多くのヒトアミノ酸配列を含んでいるため、よりヒト化されている。
【００２５】
本発明の好ましいキメラ抗ＣＤ２０（ｃＣＤ２０）ＭＡｂまたはそのフラグメントは、マウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＣＤＲおよびマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖およびＨ鎖可変領域のＦＲ領域（すなわち、親マウスＭＡｂのＦｖ）およびヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域を含んでなり、ここでこのキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントがマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＢ細胞、Ｂ細胞リンパ腫および白血病細胞に対する標的特性を実質的に保持し、キメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、ＲＡＳＳＳＬＳＦＭＨまたはＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨを含むＣＤＲ１；アミノ酸ＡＴＳＮＬＡＳを含むＣＤＲ２；およびアミノ酸ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、ＨＱＷＳＳＮＰＬＴまたはＱＱＳＦＳＮＰＰＴを含むＣＤＲ３を含んでなり；かつキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＨ鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸ＳＹＮＭＨを含むＣＤＲ１；アミノ酸ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧを含むＣＤＲ２、およびアミノ酸ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ、ＳＨＹＧＳＮＹＶＤＹＦＤＶまたはＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶを含むＣＤＲ３を含んでなり、ただし、
（ａ）Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がアミノ酸ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨを含み、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ２がアミノ酸ＡＴＳＮＬＡＳを含み、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ３がアミノ酸ＱＱＷＴＳＮＰＰＴを含み、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ１がアミノ酸ＳＹＮＭＨを含み、かつＬ鎖可変領域のＣＤＲ２がアミノ酸ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧを含む時、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ３がＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶを含まず;
（ｂ）Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１がアミノ酸ＲＡＳＳＳＬＳＦＭＨを含み、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ２がアミノ酸ＡＴＳＮＬＡＳを含み、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ３がアミノ酸ＨＱＷＳＳＮＰＬＴを含み、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ１がアミノ酸ＳＹＮＭＨを含み、かつＬ鎖可変領域のＣＤＲ２がアミノ酸ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧを含む時、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ３がＳＨＹＧＳＮＹＶＤＹＦＤＶを含まず; かつ、
（ｃ）Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１が、アミノ酸ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨを含み、Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ２がアミノ酸ＡＴＳＮＬＡＳを含み、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ３ がアミノ酸ＱＱＳＦＳＮＰＰＴを含み、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ１がアミノ酸ＳＹＮＭＨを含み、かつＬ鎖可変領域のＣＤＲ２がアミノ酸ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧを含む時、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ３がＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶを含まない。
【００２６】
より好ましくは、キメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントは、マウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、マウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖およびＨ鎖可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）と、ヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖定常領域とを含んでなり、ここで、このキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントがマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＢ細胞、Ｂ細胞リンパ腫および白血病細胞に対する標的特性を実質的に保持し、キメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲが図４Ｂおよび４ＡにそれぞれｃＡ２０ＶｋおよびｃＡ２０ＶＨと表されたＣＤＲを含んでなる。最も好ましくは、キメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂ またはそのフラグメントは、図４Ｂおよび４ＡにそれぞれｃＡ２０ＶｋおよびｃＡ２０ＶＨと表されたマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖およびＨ鎖可変領域を含んでなる。
【００２７】
本発明はまた、ヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変および定常領域を含むヒト抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントを包含し、ここで、このヒトＣＤ２０ ＭＡｂはＢ細胞、Ｂ細胞リンパ腫、および白血病細胞に対するマウス抗ＣＤ２０ ＭＡｂの標的特性ならびに細胞結合特性を実質的に保持し、ヒト抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＬ鎖可変領域のＣＤＲが上記キメラおよびヒト化抗ＣＤ２０ ｍＡｂならびに図４Ａおよび図４Ｂに示されたものと同じＣＤＲを含んでなる。
【００２８】
本発明はまた、上記のように、少なくとも二つの抗ＣＤ２０ ｍＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントも包含することが意図されている。本発明による抗体融合タンパク質またはそのフラグメントはまた、上記の少なくとも一つの第一の抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメント、および上記の抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを包含することが意図される。より好ましくは、この第二のＭＡｂはＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、Ｉａ、ＨＭ１. ２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、癌遺伝子、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせとの反応性を有し、そして本明細書に記載の抗ＣＤ２０ ＭＡｂとは異なる抗ＣＤ２０ ＭＡｂとさえも反応性があるＭＡｂである。本発明による抗体融合タンパク質は、種々の抗原に対する特異性を提供するために１つのＣＤ２０ ＭＡｂおよび１以上の第二のｍＡｂから構成されてよく、以下により詳細を記載する。
【００２９】
Ｂ細胞リンパ腫、白血病および自己免疫疾患をはじめとするＢ細胞異常の治療のための優れた治療薬を得るためにＣＤＲの突然変異および可変領域のＣＤＲおよび他の配列の操作を行った結果、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０抗体は、エピトープとの結合親和性が高く、抗腫瘍および抗Ｂ細胞活性を有している。抗体の結合特異性、親和性または結合活性の修飾については公知であり、ＷＯ９８／４４００１号公報にて親和力成熟として記載されており、さらにこの出願は修飾法について要約してあり、これは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【００３０】
また、エフェクター機能を改良する目的で、例えば、アンタゴニストの抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進する目的で本発明による抗体を修飾することも望ましい。１以上のアミノ酸置換またはＦｃ領域へのシステインの導入を行ってよく、それにより内在化能力が高まり、補体媒介性殺細胞作用およびＡＤＣＣが増大する。Caron et al., J. Ex.Med. 176:1191-1195（1991）and Shopes,B. J ImmunoL 148:2918-2022（1992）を参照されたい。この文献引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。補体溶解性およびＡＤＣＣ能力双方が促進された、二重Ｆｃ領域を有する抗体融合タンパク質を作製してもよい。
【００３１】
本発明はまた、ＤＮＡ配列であって、
（ａ）本明細書に記載の抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメント；
（ｂ）少なくとも二つの抗ＣＤ２０ ｍＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；
（ｃ）本明細書に記載の抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含む少なくとも一つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメント、および抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント; および
（ｄ）抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含む少なくとも一つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメント、および少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなり、この第二のＭＡｂが、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、Ｉａ、ＨＭ１. ２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、癌遺伝子、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせと反応性のあるＭＡｂである、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；
からなる群から選択されるＭＡｂまたはそのフラグメントをコードするものも提供する。
【００３２】
本発明はまた、上記ＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターも包含する。ベクターがヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０ ｍＡｂまたはその抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを調製することに使用される場合、これらのベクターはヒト免疫グロブリンのＬ鎖およびＨ鎖定常領域およびヒンジ領域を含む。これらのベクターはさらに、必要ならば、選択された宿主細胞中でｍＡｂを発現するプロモーター、免疫グロブリンエンハンサーおよびシグナルまたはリーダー配列を含む。本発明による特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２またはＧＳであり、特にｇｉｇｓのようなキメラ、ヒト化またはヒト抗体を発現するため用いられる場合は、このベクターはＩｇＧ１のＨ鎖およびＬ鎖定常領域およびヒンジ領域をコードする。より好ましくは、Ｌ鎖およびＨ鎖定常領域ならびにヒンジ領域は、ヒトＥＵミエローマ免疫グロブリン由来であり、所望によりアロタイプ位置の少なくとも一つのアミノ酸が、異なるＩｇＧ１アロタイプに見出されるアミノ酸に変えられており、所望によりＥＵ番号システムに基づくＥＵのＨ鎖のアミノ酸２５３はアラニンで置換されていてもよい。Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA63:78-85（1969）を参照されたい。この文献は引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【００３３】
宿主細胞であって本発明による抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含んでなるもの、または宿主細胞であってこれらのＤＮＡ配列を含むベクターを含んでなるものが本発明に包含される。特に有用な宿主細胞は、哺乳類細胞であり、より具体的には、骨髄腫細胞のようなリンパ球細胞であり、以下により詳細を記載する。
【００３４】
本発明にはまた、抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを発現させる方法であって、（ａ）抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を用いて哺乳類細胞をトランスフェクトし、かつ（ｂ）このＤＮＡ配列を用いてトランスフェクトされた、抗ＣＤ２０もしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメント分泌する細胞を培養することを含んでなる方法、も包含される。ｍＡｂを発現する宿主細胞およびマーカーを容易に選別できる選択マーカー付きのベクターを含む公知の技術を用いてもよい。
【００３５】
本発明は特に、Ｂリンパ腫細胞および白血病細胞を標的とする診断用または治療用複合体であって、Ｂリンパ腫または白血病細胞に結合する本発明による抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含み、少なくとも一つの診断薬または少なくとも一つの治療薬と結合している抗体成分を含んでなるものを包含する。
【００３６】
この診断用複合体は、抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含む抗体成分を含んでなり、この診断薬は少なくとも一つの光活性診断薬を含んでなり、より好ましくはその標識が６０〜４,０００ｋｅＶの範囲のエネルギーを有する放射性標識または非放射性標識であるものである。この放射性標識は、好ましくはガンマ、ベータおよび陽電子放射性同位元素であり、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７６Ｂｒおよびその組み合わせからなる群から選択される。
【００３７】
また、本発明による診断用複合体には、例えばマンガン、鉄またはガドリニウムなどの造影剤のような診断薬を用いる。
【００３８】
本発明による治療用複合体は抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを含む抗体成分を含んでなり、それぞれの上記ｍＡｂまたはそのフラグメントは、少なくとも一つの治療薬と結合している。好ましい治療用複合体は、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬、薬物または毒素であってよい細胞傷害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明において有用な薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド剤、抗脈管形成剤、アポトーシス剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬学的特性を有するものである。より具体的には、これらの薬物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、アントラサイクリン、タキサンおよびそれらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明に包含される毒素は、リシン、アブリン、アルファトキシン、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）（例えばオンコナーゼ）、ＤＮアーゼ Ｉ、ブドウ球菌内毒素Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択される。
【００３９】
本発明による有用な治療用複合体は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫調節剤である。特に有用であるのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）のような造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−βまたは−γのようなインターフェロン、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子である。より具体的には、本発明において、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αまたはそれらの組み合わせのような免疫調節剤が有用である。
【００４０】
特に有用な治療用複合体は、６０〜７００ｋｅＶの範囲のエネルギーを有する１以上の放射性標識を含んでなる。かかる放射性標識は、２２５Ａｃ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の有用な治療用複合体は、色素原または色素のような光活性治療薬である。
【００４１】
他の有用な治療用複合体には、好ましくはＢ細胞悪性腫瘍の癌遺伝子、ｂｃｌ−２のような癌遺伝子産物に向けられる、オリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４２】
本発明は特に、ヒト、家畜またはイヌ、ネコのようなコンパニオンペットといった哺乳類のような被検体におけるＢ細胞リンパ腫または白血病細胞疾患または自己免疫疾患を治療する方法であって、医薬上許容されるビヒクル中に処方された治療上有効な量の本発明による抗ＣＤ２０ ＭＡｂまたはそのフラグメントを被検体に投与することを含んでなる方法を包含する。この治療法は治療薬が結合していない「裸の抗体」を利用する。「裸の抗ＣＤ２０抗体」の被検体への追加投与として、治療上有効な量のもう一つの「裸の抗体」であって、標的細胞の表面上の他の抗原に結合するか反応し、またはＭＡｂのＦｃ部分においてエフェクター機能のような他の機能を有し、治療用でありかつ本明細書に記載のものを同時または逐次に投与することができる。好ましい追加のｍＡｂは、医薬上許容されるビヒクル中に処方された少なくとも一つのヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（ヒトではない動物の場合）ＭＡｂであって、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１. ２４およびＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、 ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、癌遺伝子、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせと反応性のあるＭＡｂからなる群から選択されるものである。
【００４３】
上記の裸の抗ＣＤ２０抗体単独療法または他の裸のｍＡｂと組み合わせる治療法の両方とも、医薬上許容されるビヒクル中に処方された治療上有効な量の少なくとも一つの治療薬を同時または逐次にさらに追加投与できる。本明細書に記載のように、この治療薬は医薬上許容されるビヒクル中に処方された細胞傷害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療薬またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００４４】
他の治療法によれば、上記の裸の抗ＣＤ２０抗体単独療法または他の裸のｍＡｂと組み合わせる治療法の両方とも、医薬上許容されるビヒクル中に処方された治療上有効な量の少なくとも一つの本明細書に記載の治療用複合体を、同時または逐次にさらに追加投与することができる。この治療用複合体の抗体成分は、少なくとも一つのヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（ヒトではない被検体のための）ＭＡｂを含んでなり、このＭＡｂはＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、Ｉａ、ＨＭ１. ２４およびＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、癌遺伝子、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせと反応性のあるＭＡｂからなる群から選択されるものであり、医薬上許容されるビヒクル中に処方されるものである。本明細書に記載のように、この治療薬は医薬上許容されるビヒクル中に処方された細胞傷害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬またはそれらの組み合わせを含んむことができる。
【００４５】
本明細書に記載のように、本発明は特に、被検体のＢ細胞リンパ腫、白血病または自己免疫疾患を治療する方法であって、被検体に医薬上許容されるビヒクル中に処方された治療上有効な量の抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを投与することを含んでなり、ここで、この抗体融合タンパク質またはそのフラグメントが、本発明による少なくとも二種の抗ＣＤ２０ ｍＡｂもしくはそのフラグメントを含んでなるか、または本発明による少なくとも一種の抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメントおよび少なくとも一種のさらなるＭＡｂ（このＭＡｂは好ましくはＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、Ｉａ、ＨＭ１. ２４およびＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、癌遺伝子、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせと反応性のあるｍＡｂからなる群から選択される）を含んでなる、方法を包含する。
【００４６】
この治療法はさらに、医薬上許容されるビヒクル中に処方された治療上有効な量の少なくとも一種の治療薬を、被検体に同時または逐次に追加投与することが可能であり、この治療薬は好ましくは医薬上許容されるビヒクル中に処方された細胞傷害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬またはそれらの組み合わせである。
【００４７】
さらに、この抗体融合タンパク質は、医薬上許容されるビヒクル中に処方された治療上有効な量の少なくとも一種の治療薬に結合している少なくとも一種のＭＡｂを含んでなる治療用複合体として、被検体に対して同時または逐次に投与することが可能であり、この複合体のＭＡｂ成分は好ましくは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、Ｉａ、ＨＭ１. ２４およびＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、癌遺伝子、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせと反応性のあるＭＡｂからなる群から選択される少なくとも一種のヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（ヒトではない被検体のための）ＭＡｂを含んでなる。この抗体融合タンパク質それ自体が治療薬と結合することが可能であり、従って１以上の治療薬を抗体成分に結合させるためのビヒクルを提供し、これらの治療薬は種々の列挙された異なる薬物の組み合わせ、または二つの異なる治療用放射性標識のような同じ薬物の組み合わせも可能である。また、本発明は、被検体のＢ細胞リンパ腫または白血病を診断する方法であって、ヒトおよび家畜およびイヌ、ネコ、ウサギ、モルモットなどのコンパニオンペットを含む哺乳類のような被検体に、抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、またはリンパ腫もしくは白血病細胞に結合する本発明による抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる診断用複合体を投与することを含んでなり、抗ＣＤ２０ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは、医薬上許容されるビヒクル中に処方された少なくとも一種の診断薬と結合している方法を包含している。有用な診断薬は本明細書に記載されている。
【００４８】
２.定義
以下の説明において、多数の専門用語が使用されており、以下、本発明を理解を容易にするために定義を示す。
【００４９】
本明細書において「抗体」とは、完全な長さの（すなわち、天然または正常免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、特異的結合）である。
【００５０】
「抗体フラグメント」とは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、 Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような抗体の部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは完全な抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体フラグメントは、ＣＤ２０のエピトープと結合する。「抗体フラグメント」という語もまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子組換えタンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントには、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントのような可変領域からなる単離フラグメント、Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子、および超過変領域に類似(mimic)したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが含まれる。
【００５１】
「裸の抗体」は一般的に治療薬と結合していない完全な抗体である。これは抗体分子のＦｃ部分が補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）のような免疫機構を始動させ、細胞溶解を引き起こすエフェクター機能を示すためである。しかし、治療機能のためにはアポトーシスのような他のメカニズムを始動させるＦｃ部分は必要ないであろう。裸の抗体には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方ならびにキメラ、ヒト化またはヒト抗体のようなある種の組換え抗体が含まれる。
【００５２】
「キメラ抗体」は、一つの種、好ましくは齧歯類の抗体由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインと、ヒト抗体の定常領域由来の抗体分子の定常ドメインを含む組換えタンパク質である。獣医学領域への適用のためには、このキメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種由来のものであってよい。
【００５３】
「ヒト化抗体」は、一つの種、例えば齧歯類抗体由来の抗体のＣＤＲが齧歯類抗体のＨおよびＬ可変鎖からヒトＨおよびＬ可変ドメインに移された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメイン由来である。
【００５４】
「ヒト抗体」は、抗原惹起に応答して特定のヒト抗体を産生するために「操作された」トランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒトＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座のエレメントが、内在性Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子座が標的化破壊されている胚幹細胞株由来のマウス系統に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスをヒト抗体分泌ハイブリドーマを作製するために使用し得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13(1994), Lonberg et al., Nature 368:856(1994), and Taylor et al.,Int. Immun. 6:579(1994)に記載されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレイ技術により構築でき、これらはすべて当技術分野において公知である。例えば、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのin vitroにおけるヒト抗体およびそのフラグメントの産生に関してはMcCafferty et al., Nature 348:552-553（1990）を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子がフレーム内で糸状バクテリオファージの主要または微量コートタンパク質遺伝子へクローニングされ、機能的抗体フラグメントとしてファージ粒子表面上に提示される。この糸状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含み、抗体の機能特性に基づく選択も結果としてそれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択となる。このように、ファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイはさまざまな形式で行うことが可能であり、総説に関しては例えばJohnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)を参照されたい。
【００５５】
ヒト抗体はまた、in vitro活性化Ｂ細胞においても産生することができる。米国特許第５，５６７，６１０号公報および同第５，２２９，２７５号公報を参照されたい。これらの文献は引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【００５６】
「治療薬」は、個別に、同時にまたは逐次に、抗体部分とともにまたは抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と結合させて投与され、疾病の治療に有用な分子または原子である。治療薬の例としては、抗体をはじめとして、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬または色素および放射性同位元素などがある。
【００５７】
「診断薬」は、抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と結合させて投与され、その抗原を含む細胞を局在化することにより疾病の診断に有用である分子または原子である。有用な診断薬としては、限定されるものではないが、放射性同位元素、色素（ビオチン−ストレプトアビジン複合体）、造影剤、蛍光化合物または核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のための促進剤（例えば、常磁性イオン）などがある。米国特許第６，３３１，１７５号公報はＭＲＩ技術およびＭＲＩ促進剤に結合させた抗体の調製について記載しており、これらは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。好ましくは、この診断薬は放射性同位元素、核磁気共鳴影像法にて使用する促進剤、および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを装填するためには、イオンを結合させるための多様なキレート基を付着させた長い尾部を有する試薬と反応させる必要があろう。かかる尾部は、ポリリシン、多糖、またはキレート基に結合できるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導体化可能な鎖であることが可能であり、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリミキシン、およびこの目的のために有用なことが公知の基などが挙げられる。キレート剤は標準的な化学手法を用いてペプチド抗原に結合させる。キレート剤は通常、免疫反応性の損失が最小で、凝集および／または内部架橋結合が最小となる分子との結合を形成し得る基により抗体に連結される。キレート剤を抗体に結合させるその他のより一般的でない方法および試薬は、Hawthorneの米国特許第４，８２４，６５９号公報に記載されており、これは「抗体複合体」という表題で１９８９年４月２５日に発行され、引用することによりその開示内容を本明細書の一部とする。特に有用な金属−キレートの組み合わせには１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７６Ｂｒのような一般エネルギー範囲６０〜４００ｋｅＶの診断用同位元素と共に用いられる２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ、ラジオイメージングに用いられる。同じキレート剤がマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体を形成した場合は、本発明による抗体と共に使用するとＭＲＩにおいて有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環状のキレート剤は種々の金属および放射性金属と利用することができ、最も具体的にはそれぞれガリウム、イットリウム、および銅などの放射性核種が用いられる。かかる金属−キレート錯体は、環のサイズを目的の金属にあわせて調整することにより非常に安定となり得る。大環状ポリエーテルのような他のリング型キレート剤は、ＲＡＩＴのための２２３Ｒａのような、安定に結合する核種を対照とするものであり、本発明に包含される。
【００５８】
「免疫複合体」は、抗体成分と治療薬または診断薬との複合体である。この診断薬は、放射性または非放射性標識、造影剤（核磁気共鳴映像法、コンピューター断層撮影法または超音波診断法のためのもの）を含んでなり、この放射性標識はガンマ−、ベータ−、アルファ−、オージェ電子、または陽電子放射性同位元素であることができる。
【００５９】
「発現ベクター」は、宿主細胞中に発現された遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は構成または誘導プロモーターをはじめとして、組織特異的制御エレメントおよびエンハンサーなどの、ある種の制御エレメントの調節下にある。かかる遺伝子は制御エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。
【００６０】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのどちらかを含む任意の原核または真核細胞であることができる。この語はまた、それらの原核または真核細胞、ならびに宿主細胞または宿主細胞の細胞の染色体またはゲノム中にクローン化された遺伝子を含むように遺伝子組換えされたトランスジェニック動物の細胞も含む。好適な哺乳類宿主細胞には、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ０細胞のような骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株および抗体発現に有用な他の哺乳類宿主細胞を含む。
また、ｍＡｂおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用なものはＷＯ ００６３４０３ Ａ２号公報に開示されたヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６であり、従来の哺乳類細胞株ＣＨＯ、ＣＯＳ、 Ｖｅｒｏ、 ＨｅＬａ、 ＢＨＫおよびＳＰ２に比べて２〜２００倍の組換えタンパク質を産生する。修飾された免疫機構を有する特別なトランスジェニック動物は完全なヒト抗体を作製するために特に有用である。
【００６１】
本明細書に記載のように、「抗体融合タンパク質」という語は、同じまたは異なる特異性の２以上の同じまたは異なる単鎖抗体もしくは抗体フラグメントのセグメントが連結されている、組換えにより作製された抗原結合分子を意味する。融合タンパク質の原子価は、この融合タンパク質が単一抗原またはエピトープに対する結合アーム(arm)または結合部位をいくつ有しているか（すなわち、一価、二価、三価または多価であること）を示す。抗体融合タンパク質が多価であるということは、抗原への結合において多様な相互作用を利用できることを意味し、従って抗原に結合する結合力が高まる。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープに結合できるかどうか；すなわち、一重特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示す。これらの定義により、例えばＩｇＧのような天然の抗体は、結合アームを２本持つために二価であるといえるが、この抗体は一つのエピトープに結合するために一重特異性である。一重特異性、多価融合タンパク質は、エピトープに対する１以上の結合部位を有するが、ただ一つのエピトープとしか結合せず、例えば二つの結合部位を持つダイアボディーは同じ抗原と反応性がある。融合タンパク質は単一抗体成分、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組み合わせ、または同じ抗体成分の複数のコピーを含むことができる。この融合タンパク質はさらに抗体または抗体フラグメントおよび治療薬を含むことができる。かかる融合タンパク質に好適な治療薬の例は、免疫調節剤（「抗体-免疫調節剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体-毒素融合タンパク質」）である。好ましい一つの毒素は、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）であり、好ましくは組換えＲＮアーゼである。
【００６２】
「多重特異性抗体」は、同時に少なくとも二つの異なる構造の標的、例えば二つの異なる抗原、同じ抗原上の二つの異なるエピトープ、またはハプテンおよび／または抗原、もしくはエピトープに結合できる抗体である。一つの特異性は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞および肥満細胞抗原またはエピトープに対してであろう。もう一つの特異性は、Ｂ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＭＵＣ１およびＣＤ２２のような、同じ細胞型上の異なる抗原であることが可能である。多重特異性、多価抗体は１以上の結合部位を有する構築体であり、その結合部位は異なる特異性を有する。例えばダイアボディー(diabody)では、一つの結合部位は一つの抗原と反応し、もう一方は他の抗原と反応する。
【００６３】
「二重特異性抗体」は、同時に二つの異なる構造の標的に結合できる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞および肥満細胞抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも一つのアーム、および治療薬または診断薬を担持する標的化可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを有する。分子工学技術を用いて種々の二重特異性融合タンパク質を作製することができる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば一つの抗原に対する一つの結合部位を有するｓｃＦｖおよび第二の抗原に対する一つの結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、この二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば一つの抗原に対する一つの結合部位を有するＩｇＧおよび第二の抗原に対する二つの結合部位を有する二つのｓｃＦｖからなる。
【００６４】
「イヌ化またはネコ化抗体」は、モノクローナル抗体の齧歯類（または他の種）の相補性決定領域が、齧歯類（または他の種）免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖可変領域から、それぞれイヌまたはネコの免疫グロブリン可変ドメイン中に移されている組換えタンパク質である。
【００６５】
「家畜」は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、アルパカおよびブタのような大動物、ならびにコンパニオン動物を含む。好ましい実施形態においては、家畜はウマである。
【００６６】
「コンパニオン動物」は、ペットとして飼われる動物を含む。これらは原則としてイヌおよびネコであるが、モルモット、ハムスター、ラットおよびフェレットのような小齧歯類、またサルのような類人霊長類も含まれる。好ましい実施形態において、コンパニオン動物とはイヌまたはネコである。
【００６７】
３．キメラ、ヒト化およびヒト抗体をはじめとするモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は特定の抗原に対する抗体の均質な集団であり、その抗体はただ一種の抗原結合部位を含んでなり、抗原決定基上のただ一つのエピトープに結合する。特定の抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、Kohler and Milstein, Nature256:495（1975), and Coligan et al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5. 1- 2.6. 7（John Wiley & Sons 1991）[以下「Coligan」]を参照されたい。簡単にいえば、マウスに抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体産生を確認し、脾臓を切除してＢリンパ球を採取し、そのＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製してクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、その抗体をハイブリドーマ培養液から単離することによりモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６８】
ＭＡｂは、ハイブリドーマ培養液から種々の十分確立された技術により単離、精製できる。かかる単離技術には、Ａタンパク質セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーをはじめとして、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどがある。例えば、Coligan at pages 2.7. 1-2.7. 12 and pages 2.9. 1-2.9. 3.を参照されたい。また、Baines et al.,"Purification of Immunogloburin G (IgG),"in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104（The Humana Press, Inc. 1992）も参照されたい。
【００６９】
免疫原に対する最初の抗体価上昇後に、その抗体の配列を決定し、次いで組換え技術により作製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は当業者に十分公知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンのＨおよびＬ可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、次いでフレームワーク領域中のヒト残基をマウスの対応部分と置換することにより作製する。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を使用することによってマウス定常領域の免疫原性に伴う問題を防ぐ。
【００７０】
マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングのための一般的な技術は、例えばOrlandi et al., Proc.Nat7 Acad. Sci. USA 86:3833(1989)に記載されており、これは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。キメラ抗体構築のための技術は当業者に十分公知である。例えば、Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994)は、ＬＬ２モノクローナル抗体、抗ＣＤ２２抗体のＶＫおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列をそれぞれのヒトκおよびＩｇＧ1定常領域ドメインと組み合わせてＬＬ２キメラを作製した方法が記載されている。この文献はまた、ＬＬ２のＬ鎖およびＨ鎖可変領域のヌクレオチド配列、ＶＫおよびＶＨをそれぞれ提供する。ヒト化ＭＡｂを産生する技術は、例えばJones et al., Nature321:522(1986),Riechmann et al., Nature 332:323(1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534(1988), Carter et al., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437(1992), and Singer et al.,J Immun. 150:2844(1993)に記載されており、これらはそれぞれ引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【００７１】
キメラ抗体は、齧歯類抗体のような一種の動物由来のＣＤＲを含む可変ドメインを含む組換えタンパク質であり、抗体分子の残りの部分、すなわち定常領域はヒト抗体由来である。従って、キメラモノクローナル抗体はまた、キメラＭＡｂの可変ドメイン中のマウスＦＲ配列を、１以上の異なるヒトＦＲと置換することによりヒト化し得る。具体的には、マウスＣＤＲをマウス免疫グロブリンのＨおよびＬ可変鎖からヒト抗体の相当する可変ドメインに移動させる。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単に移動させるだけでは、しばしば抗体親和性の低下または損失さえ起こるために、マウス抗体の元の親和性を回復させるためにはさらなる修飾が必要であろう。これは、そのエピトープに対する良好な結合親和性を有する抗体を得るために、ＦＲ領域の１以上のいくつかのヒト残基をマウスの相当部分と置換することにより達成し得る。例えば、Tempest et al., Biotechnology 9:266（1991）and Verhoeyen et al., Science 239:1534(1988）を参照されたい。さらに、ヒト化、キメラおよびヒトＭＡｂの特定のエピトープに対する親和性は、ＣＤＲの突然変異誘発により高めることができ、その結果、より低用量の抗体が突然変異前の高用量の低親和性ＭＡｂと同等の有効性を示し得る。例えば、Ｗ０００２９５８４Ａ１号公報を参照されたい。
【００７２】
本発明の抗体を作製するもう一つの方法は、トランスジェニック家畜のミルク中での産生である。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp., 63:141-147,1998 ; 米国特許第５，８２７，６９０号公報を参照されたい。双方とも引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。対をなす免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む二つのＤＮＡ構築体を調製した。このＤＮＡセグメントを、哺乳類上皮細胞中で優先的に発現されるプロモーター配列を含む発現ベクターへクローニングする。実施例は、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジのカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、およびマウスホエー酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターを含む。好ましくは、挿入されたフラグメントの３’部位に哺乳類特異的遺伝子由来の同族のゲノム配列が隣接する。これによりポリアデニル化部位および転写安定化配列が備わる。この発現カセットを受精した哺乳類の卵子の前核に同時注入し、次いでレシピエント雌の子宮に着床させて妊娠させた。出産後、トランス遺伝子の存在についてサザン分析でその子孫をスクリーニングした。抗体が存在するためには、Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子双方が同時に同じ細胞中で発現されなければならない。トランスジェニック雌動物から得たミルクを当技術分野で公知の標準的免疫学的方法により、該抗体または抗体フラグメントの存在と機能性を分析した。この抗体は当技術分野で公知の標準的方法により、ミルクから精製できる。
【００７３】
ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ２０抗体とともに組み合わせる療法のための、本発明の完全なヒト抗体、すなわちヒト抗ＣＤ２０ ＭＡｂ、または抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２３、または抗ＣＤ２１ＭＡｂのような他のヒト抗体は、トランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156（1997）; 米国特許第５，６３３，４２５号公報を参照されたい。これらは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。例えばヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収できる。このマウス体液性免疫機構は、内在性免疫グロブリン遺伝子を不活性化して、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化されている。このヒト免疫グロブリン遺伝子座は非常に複雑で、合わせてヒトゲノムのほぼ０.２％を占める多数の不連続セグメントを含んでなる。トランスジェニックマウスの適切な抗体レパートリー産生を確実にするために、ヒトＨ鎖およびＬ鎖遺伝子座の大部分をマウスゲノム中に導入しなくてはならない。これは、生殖細胞系構成における、ヒトＨ鎖またはＬ鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成から始まる段階的なプロセスで達成される。それぞれの挿入体はほぼ１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築体は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚幹細胞を融合させて、一つはＨ鎖遺伝子座、もう一つはＬ鎖遺伝子座を含む二つのＹＡＣを、別々にマウスに導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞に微量注入する。その結果得られたキメラ雄動物における生殖細胞系統を介するＹＡＣ伝達能力に関してスクリーニングし、マウス抗体産生を欠損しているマウスを繁殖させた。二種のトランスジェニック系統のマウスを繁殖させ、一種はヒトＨ鎖の遺伝子座を含み、もう一種はヒトＬ鎖遺伝子座を含み、免疫に反応してヒト抗体を産生する子孫をつくる。
【００７４】
二重特異性ｍＡｂを産生するさらなる最新の方法は、付加的なシスチン残基を有し、より一般的な免疫グロブリンアイソタイプよりもより強く架橋結合している人工的組換えＭＡｂを含む。例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10（10):1221-1225,1997を参照されたい。もう一つのアプローチは、２以上の異なる単鎖抗体または必要とされる二重特異性を有する抗体フラグメントセグメントを連結する組換え融合タンパク質の設計である。例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163,1997を参照されたい。分子工学技術を用いて様々な二重特異性融合タンパク質を作製できる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば一つの抗原に対する一つの結合部位を有するｓｃＦｖと第二の抗原に対する一つの結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、一つの抗原に対し二つの結合部位を有するＩｇＧと、第二の抗原に対する二つの結合部位を有するｓｃＦｖからなる。
【００７５】
２以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントを連結している二重特異性融合タンパク質も、同様の方法で作製する。組換え法は種々の融合タンパク質を作製するために用いることができる。例えば、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ２０抗体由来のＦａｂフラグメントおよびマウス抗ｄｉＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖを含んでなる融合タンパク質を作製することができる。
【００７６】
ＧＧＧＳのような柔軟なリンカーは、ｓｃＦｖを抗ＣＤ２０抗体のＨ鎖定常領域に結合させる。あるいは、ｓｃＦｖはもう一つのヒト化抗体のＬ鎖定常領域に結合し得る。Ｈ鎖ＦｄのｓｃＦｖとのフレーム内結合のために必要な適当なリンカー配列は、ＰＣＲ反応を介してＶＬおよびＶＫドメインに導入される。次いでｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントをＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むステージングベクターに連結する。これにより得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築体を切り取って、抗ＣＤ２０抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含むベクター中に連結する。得られたベクターは、二重特異性融合タンパク質発現のための哺乳類細胞のような適当な宿主細胞をトランスフェクトするために使用し得る。
【００７７】
４．抗体フラグメントの産生
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製し得る。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の抗原結合部位である。他の抗体フラグメントには、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作製できるＦ（Ａｂ）'２フラグメント、およびＦ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作製できるＦａｂ'フラグメントが含まれる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速で容易な同定を可能にするＦａｂ’発現ライブラリーを構築できる（Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281）。本発明は抗体および抗体フラグメントを包含する。
【００７８】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含んでなる。このＶＬおよびＶＨドメインは組み合わさって標的結合部位を形成している。これらの二つのドメインはペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合している。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ、またはＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＨ−Ｌ−ＶＬと表される。ｓｃＦｖ分子の作製法、および好適なペプチドリンカーの設計法は、米国特許第４，７０４，６９２号公報、同第４，９４６，７７８号公報, R. Raag and M. Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB Vol 9:73-80（1995）and R. E. Bird and B. W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH, Vol 9:132-137(1991）を参照されたい。これらは引用することによりその全開示内を本明細書の一部とする。
【００７９】
抗体フラグメントは、完全な長さの抗体のタンパク質加水分解、または大腸菌(E.coli)における発現、もしくはフラグメントをコードするＤＮＡの他の宿主中での発現により調製してよい。抗体フラグメントは、常法により完全な長さの抗体をペプシンまたはパパインを用いて消化することにより得られる。例えば、抗体フラグメントは抗体をペプシンで酵素的切断して、Ｆ（ａｂ’）２と表される５Ｓフラグメントを与えることにより作製し得る。このフラグメントはチオール還元剤、所望によりジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を用いてさらに切断可能で、３．５ＳＦａｂ’一価フラグメントが得られる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断により二つの一価Ｆａｂフラグメントと一つのＦｃフラグメントが直接的に生じる。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号公報および同第４，３３１，６４７号公報に記載されており、そこに含まれる参考文献、その特許は引用することによりその全開示内を本明細書の一部とする。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230(1960); Porter, Biochem. J 73:119(1959), Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422(Academic Press 1967), and Coligan at pages 2.8. 1-2.8. 10 and 2.10.-2. 10.4.も参照されたい。
【００８０】
抗体フラグメントのもう一つの形態は、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは抗体の可変領域のセグメントであり、抗体が結合するエピトープに対し相補的な構造であり、残りの可変領域よりもさらに変化に富んでいる。従って、ＣＤＲはしばしば超過変領域と呼ばれる。可変領域は三つのＣＤＲを含んでなる。ＣＤＲペプチドは、問題の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られる。かかる遺伝子は、例えば抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される。例えば、Larrick et al., Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991);Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185 （Wiley-Liss, Inc. 1995）を参照されたい。
【００８１】
Ｈ鎖を分離して一価Ｌ−Ｈ鎖フラグメントを形成し、さらにフラグメントを切断するような抗体を切断する他の方法、フラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合する限りは、他の酵素学的、化学的または遺伝子技術も用いてよい。
【００８２】
５．多重特異的および多価抗体
組み合わせ療法で使用するための本明細書に記載の抗ＣＤ２０抗体、ならびに異なる特異性を有する他の抗体はまた、多重特異的抗体（ＣＤ２０エピトープまたは抗原に対する少なくとも一つの結合部位、およびもう一つのＣＤ２０上のエピトープまたはもう一つの抗原に対する少なくとも一つの結合部位を含んでなる）、ならびに多価抗体（同じエピトープまたは抗原に対する複数の結合部位を含んでなる）としても作製し得る。多価の標的結合タンパク質は、米国出願番号第０９／９１１，６１０号公報(Leung et al.)に記載されており、これは引用することによりその全開示内を本明細書の一部とする。
【００８３】
本発明は、標的細胞マーカーに特異的に結合する少なくとも一つの結合領域、および標的化可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他の結合領域を有する、二重特異的抗体または抗体フラグメントを提供する。標的化可能な複合体は、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも一つの結合領域により認識される少なくとも一つのエピトープを含んでなるか担持する、担体部分を含んでなる。
【００８４】
前記のような二重特異性抗体および抗体フラグメントを作製するために、様々な組換え法を使用できる。
【００８５】
本発明では、抗ＣＤ２０多価抗体もまた意図されている。この多価標的結合タンパク質は、第一および第二のポリペプチドの結合により構築される。第一のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリンＬ鎖可変領域ドメインである第一の免疫グロブリン様ドメインに共有結合した第一の単鎖Ｆｖ分子を含んでなる。第二のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリンＨ鎖可変領域ドメインである第二の免疫グロブリン様ドメインに共有結合した第二の単鎖Ｆｖ分子を含んでなる。それぞれ第一および第二の単鎖Ｆｖ分子は標的結合部位を形成し、第一および第二の免疫グロブリン様ドメインは結合して第三の標的結合部位を形成する。
【００８６】
ＶＬ−Ｌ−ＶＨ立体配置の単鎖Ｆｖ分子（ただしＬはリンカー）は、もう一つのＶＨ−Ｌ−ＶＬ立体配置の単鎖Ｆｖ分子と結合し、二価の二量体を形成し得る。この場合、第一のｓｃＦｖのＶＬドメインおよび第二のｓｃＦｖ分子のＶＨドメインは結合して一つの標的結合部位を形成し、一方、第一のｓｃＦｖのＶＨドメインおよび第二のｓｃＦｖのＶＬドメインは結合してもう一方の標的結合部位を形成する。
【００８７】
本発明の他の態様によれば、非共有結合して三つの結合部位を形成し、その内の二つが一つの標的に対し親和性を持ち、第三の結合部位は作製可能で診断薬および／または治療薬のための担体に結合しているハプテンに親和性を持つ、二つの異種ポリペプチド鎖を含んでなるＣＤ２０二重特異性、三価の標的化タンパク質である。好ましくは、その結合タンパク質は二つのＣＤ２０結合部位および一つのＣＤ２２結合部位を有する。この二重特異性、三価の標的化薬は二つの異なるｓｃＦｖを有し、第一のｓｃＦｖは短いリンカーにより他の抗体のＶＬドメインに連結された一つの抗体由来の二つのＶＨドメインを含み、第二のｓｃＦｖは短いリンカーにより他の抗体のＶＨドメインに連結された第一の抗体由来の二つのＶＬドメインを含む。ＶＨおよびＶＬドメインから多価、多重特異的薬剤を作製するこれらの方法によれば、多価および多重特異的ないずれの薬物でも１つのＶＨ鎖および１つのＶL鎖の非共有結合により作製し得るという方法により、宿主微生物中にてＤＮＡプラスミドから合成された個々の鎖が完全なＶＨドメイン（ＶＨ鎖）または完全なＶＬドメイン（ＶＬ鎖）から構成されることになる。例えば、三価の三重特異性薬物の形成では、ＶＨ鎖は三つのＶＨドメインのアミノ酸配列からなり、それぞれのドメインは異なる特異性の抗体由来であり、種々の長さのペプチドリンカーにより連結され、またＶL鎖は相補性ＶLドメインからなり、ＶH鎖に使用されたものと類似のペプチドリンカーにより連結される。抗体のＶＨおよびＶLドメインは逆平行に結合しているため、本発明の好ましい方法では、ＶL鎖のＶLドメインはＶＨ鎖のＶＨドメインとは逆の順序で配置されている。
【００８８】
６．ダイアボディー、トリアボディー(triabody)およびテトラボディー(tetrabody)
本発明による抗ＣＤ２０抗体はまた、ダイアボディー(diabody)とも呼ばれる、機能性二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）の調製に使用することができ、組換え法により哺乳類細胞中にて作製できる。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025,1995を参照されたい。例えば、ｂｓｃＡｂは組換え法によりグリシン−セリンリンカーを介して二つの単鎖Ｆｖフラグメントを結合させて作製する。問題の二つの抗体のＶＬ鎖（ＶL）およびＶＨ鎖（ＶＨ）ドメインは、標準的ＰＣＲ法により単離される。次にそれぞれのハイブリドーマから得られたｃＤＮＡのＶLおよびＶＨは、二つの工程の融合ＰＣＲにおいて結合されて単鎖フラグメントを形成する。第一のＰＣＲ工程では（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーを導入し、第二の工程ではＶLおよびＶL単位複製配列を結合させる。次いでそれぞれの単鎖分子を細菌発現ベクターへクローニングする。増幅後に単鎖分子の一つを切り出して問題の第二の単鎖分子を含む他のベクターへサブクローニングする。その結果得られたｂｓｃＡｂフラグメントを真核細胞発現ベクターへサブクローニングする。機能性タンパク質の発現は、そのベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞へトランスフェクトすることにより行われる。二重特異性融合タンパク質は同様の方法にて調製される。二重特異性単鎖抗体および二重特異性融合タンパク質は本発明の範囲内に含まれる。
【００８９】
例えば、ヒト化、キメラ、またはヒト抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を、抗原特異的ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーを作製するために使用し得る。この単一特異的ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーは選択的に標的抗原に結合し、分子上の結合部位数が増加すると標的細胞に対する親和性が高まり、所望の位置における滞留時間が長くなることが観察される。ダイアボディーに関しては、５つのアミノ酸残基リンカーによりヒト化ＣＤ２０ ＭＡｂのＶKポリペプチドに連結されたヒト化ＣＤ２０ ＭＡｂのＶHポリペプチドを含んでなる二つの鎖が利用される。各々の鎖はヒト化ＣＤ２０ダイアボディーの１／２を形成する。トリアボディーの場合、ヒト化ＣＤ２０ ＭＡｂのＶKポリペプチドにリンカーは介さず連結されたヒト化ＣＤ２０ ＭＡｂのＶHポリペプチドを含んでなる三つの鎖が利用される。各々の鎖はｈＣＤ２０トリアボディーの１／３を形成する。
【００９０】
本明細書に記載の二重特異性ダイアボディーは最終的に、後に続く診断薬または治療薬の特異的送達のために、ＣＤ２０陽性腫瘍をプレターゲッティングするために使用する。これらのダイアボディーは標的抗原に選択的に結合し、親和性を高め、所望の位置における滞留時間を延長する。さらに、抗原と結合していないダイアボディーは体内から迅速に排泄され、正常組織の曝露は最小限に抑えられる。クリアランス速度を増すための二重特異性抗体の点突然変異は、Qu et al.の米国仮出願第６０／３６１，０３７号公報（Atty Docket No. 18733/1037）に見出され得る。これは引用することによりその全開示内を本明細書の一部とする。親和性を高めるための二重特異性ダイアボディーは米国出願第１０／２７０，０７１号公報（Rossi et al.）、同第１０／２７０，０７３号公報（Rossi et al.）および同第１０／３２８，１９０号公報（Rossi et al.）に開示され、これらは引用することによりその全開示内を本明細書の一部とする。診断薬および治療薬には、放射性同位元素をはじめとして、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種および金属などがある。例えば、ガドリニウム金属が、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）に用いられる。放射性核種の例としては、２２５Ａｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒ、および２１１Ａｔなどが挙げられる。特にエネルギー範囲が６０〜４,０００ｋｅＶの他の放射性核種も診断薬および治療薬として利用可能である。
【００９１】
さらに最近では、二重特異性を持つ四価タンデムダイアボディー（ｔａｎｄａｂと呼ばれる）も報告されている(Cochlovius et al., Cancer Research(2000) 60:4336-4341）。この二重特異性ｔａｎｄａｂは二つの同一ポリペプチドの二量体であり、それぞれが二つの異なる抗体の四つの可変ドメインを含み（ＶＨ１、ＶL１、ＶＨ２、ＶL２）、これは自己会合に際してそれぞれの二つの異なる特異性のための二つの可能性のある結合部位の形成を容易にする方向に連結されている。
【００９２】
７．結合多価および多重特異性抗ＣＤ２０抗体
本発明の他の態様によれば、結合多価抗ＣＤ２０抗体が提供される。第一または第二のポリペプチドのＮまたはＣ末端に、さらなるアミノ酸残基を加えることができる。このさらなるアミノ酸残基は、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素（例えば、プロドラッグ活性化酵素）、ホルモン、シュードモナス外毒素のようなペプチド毒素、ペプチド薬、細胞傷害性タンパク質または他の機能性タンパク質を含むことができる。本明細書で使用されているように機能性タンパク質とは生物学的機能を有するタンパク質である。
【００９３】
ある一つの態様によれば、薬物、毒素、放射性化合物、酵素、ホルモン、細胞傷害性タンパク質、キレート剤、サイトカインおよび他の機能性薬を、多価標的結合タンパク質に結合させてよく、好ましくはこの多価標的結合タンパク質のアミノ酸残基の側鎖、例えばアミン、カルボキシル、フェニル、チオールまたはヒドロキシル基に共有結合を介して結合させることができる。
【００９４】
例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどの種々の慣用されるリンカーをこの目的のために用いてよい。多価タンパク質への薬物の結合は、このタンパク質のその標的に対する結合特異性または親和性にあまり影響しないことが好ましい。本明細書で用いられているように、機能性薬物とは生物学的機能を有する薬物である。好ましい機能性薬物は細胞傷害剤である。
【００９５】
さらに他の態様によれば、二重特異性抗体によって指示される治療薬またはプロドラッグポリマーのin vivo標的への送達は、放射性核種の二重特異性抗体送達と組み合わせることが可能なので、化学療法と免疫療法とを組み合わせることができる。各々の治療法では標的化可能な複合体と複合体形成させて同時に投与することができ、また核種は第一の標的化可能な複合体の一部として投与し、薬物は後の工程にて第二の標的化可能な複合体の一部として投与することができる。
【００９６】
他の態様によれば、細胞傷害剤は高分子担持体と結合させ、次いでその高分子担体を多価標的結合タンパク質と結合させてよい。この方法に関しては、Ryser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3867-3870, 1978, 米国特許第４，６９９，７８４号公報および同第４，０４６，７２２号公報を参照されたい。これらは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。複合体とすることは多価結合タンパク質の結合特異性または親和性に大きく影響しないことが好ましい。
【００９７】
８．ヒト化、キメラおよびヒト抗体の治療および診断への使用
本明細書に記載の本発明のヒト化、キメラおよびヒトモノクローナル抗体、すなわち抗ＣＤ２０ ＭＡｂおよび他のＭＡｂは、治療法および診断法における使用に好適である。従って、本発明は、本発明によるヒト化、キメラおよびヒト抗体の裸の抗体としての単独投与、または多様な療法として、投与計画に従って一時的に、治療薬と結合させずに投与することを含んでなる。裸の抗ＣＤ２０ ＭＡｂは、１以上の他の裸の抗体すなわちＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１. ２４およびＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、 ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、癌遺伝子、癌遺伝子産物、またはそれらの組み合わせのような特定の抗原に対するＭＡｂ、１以上の抗ＣＤ２０の免疫複合体、または治療薬（薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、治療用放射性核種など）を結合させた上記に列挙された抗原に対する抗体、ＭＡｂともに同時にまたは連続して、または規定の投与処方に従って投与される１以上の治療薬（薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、治療用放射性核種など）で補完することによりその有効性を増大させることができる。好ましいＢ細胞抗原には、ヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＣＤ５抗原と同等なものが含まれる。好ましいＴ細胞抗原には、ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５（ＩＬ-２レセプター）抗原と同等なものが含まれる。ＨＬＡ−ＤＲ抗原同等物はＢ細胞およびＴ細胞の異常双方の治療に使用できる。特に好ましいＢ細胞抗原はヒトＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＨＬＡ-ＤＲ抗原と同等なものである。特に好ましいＴ細胞抗原は、ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５抗原と同等なものである。ＣＤ４６は癌細胞表面上の抗原で、補体依存性溶解（ＣＤＣ）を阻害する。
【００９８】
さらに、本発明はＢ細胞リンパ腫および他の疾患または異常における診断および治療のための免疫複合体の投与を意図する。本明細書に記載のように、免疫複合体は、抗体成分および診断薬もしくは治療薬を担持するペプチドをはじめとする、治療薬または診断薬を含んでなる分子である。免疫複合体は、抗体成分の免疫反応性を保持しており、すなわち抗体部分の複合体形成前と複合体形成後の同起源抗原に対する結合能力はほぼ同等か、わずかに低下している。
【００９９】
多種多様な診断薬および治療薬が、本発明の抗体と有利にも結合できる。本明細書に列挙された治療薬は、前記のように裸の抗体とは別々に投与しても有用である。例えば治療薬には、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピトフィロトキシン、タキサン、抗代謝剤、アルキル化剤、抗キナーゼ剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗脈管形成剤およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、およびこれらまたは他の種類の抗癌剤由来の薬物などの化学療法薬が含まれる。免疫複合体および抗体融合タンパク質の調製に有用な他の癌化学療法薬には、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ錯体、ホルモンなどがある。好適な化学療法薬はREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,19th Ed.(Mack Publishing Co. 1995）, and in GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)およびこれらの出版物の改訂版に記載されている。実験薬のような他の好適な化学療法薬は、当業者に公知である。
【０１００】
これに加えて、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＯＴＡのようなキレート剤または好適なペプチドに、蛍光分子のような検出可能な標識または、重金属もしくは放射性核種のような細胞傷害剤を結合させ得る。例えば、治療上有用な免疫複合体は、光活性薬または抗体成分に対する色素を結合させることにより得られる。蛍光色素のような蛍光組成物、および他の色素原、またはポルフィリンのような色素は、可視光線に感受性であり、好適な光線を病巣に向けることにより病巣の検出および治療に使用されてきた。治療においては、これは光照射、光療法または光線力学療法と呼ばれている。（Jori et al. (eds.）, PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES（Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430（1986））さらに、光療法を行うためにはモノクローナル抗体を光活性化色素と結合させる。Mew et al., J.Immunol. 130:1473(1983);idem., Cancer Res. 45:4380(1985);Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744(1986); idem.,Photochem. Photobiol. 46:83(1987); Hasanet al., Prog. Clin. Biol. Res.288:471(1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med.9:422(1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529（1991)を参照されたい。しかし、これらの初期の研究には、特に抗体フラグメントまたはサブフラグメントを伴った内視鏡的治療の適用は含まれていない。従って本発明は、光活性薬または色素を含んでなる免疫複合体の使用を含んでなる。
【０１０１】
放射性および非放射性薬の診断薬としての使用もまた、本発明に包含される。好適な非放射性診断薬は、核磁気共鳴映像法、コンピューター断層撮影法または超音波診断法に好適な造影剤である。核磁気共鳴用造影剤には、本発明の抗体と共に用いられる場合には、例えば、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属キレート剤と、錯体を形成したマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属が含まれる。米国出願番号第０９／９２１，２９０号公報（filed on October 10,2001)を参照されたい。これは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【０１０２】
さらに、放射性標識抗体または免疫複合体は、画像診断に有用なγ線を放射する放射性同位元素または陽電子放射体を含んでよい。、特にエネルギー範囲が６０〜４,０００ｋｅＶの好適な放射性同位元素には、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７５Ｂｒなどが含まれる。例えば、米国特許出願「Labeling Targeting Agents with Gallium-68」Inventors G. L.Griffiths and W. J. McBride(米国仮出願第６０／３４２，１０４号）には、１８Ｆ、６８Ｇａおよび９４ｍＴｃなどのような造影を目的とする陽電子放射体が開示されており、これは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。特に有用な治療用放射性核種には、限定されるものではないが、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃが含まれる。特に有用な診断／検出放射性核種には、限定されるものではないが、１８Ｆ、５２Ｆe、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、および１７５Ｌｕが含まれる。
【０１０３】
シュードモナス外毒素のような毒素も複合体を形成し、本発明の抗ＣＤ２０抗体の抗体融合タンパク質の治療薬部分を形成してよい。かかる複合体または他の融合タンパク質の調製に適切に使用された他の毒素には、リシンをはじめとして、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼ Ｉ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が含まれる。例えば、Pastan et al., Cell 47:641(1986), and Goldenberg,CA-A Cancer Journal for Clinicians 44:43(1994)を参照されたい。本発明にて使用するために好適なさらなる毒素は当業者に公知であり、米国特許第６，０７７，４９９号公報に開示されており、これは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【０１０４】
サイトカインのような免疫調節剤もまた、抗体融合タンパク質の治療薬部分に結合させ、または抗体融合タンパク質の治療薬部分を形成してよく、または本発明のヒト化抗ＣＤ２０抗体とともに投与してよい。本発明に好適なサイトカインには、限定されるものではないが、後述のようにインターフェロンおよびインターロイキンが含まれる。
【０１０５】
米国出願番号第５，７３４，０３３号公報(Reed)に記載され、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とするｂｃｌ−２発現を阻害しているアンチセンス分子のオリゴヌクレオチドもまた抗体融合タンパク質の治療薬部分に結合させてよく、または抗体融合タンパク質の治療薬部分を形成してよく、または本発明のヒト化抗ＣＤ２０抗体とともに投与してよい。
【０１０６】
９．免疫複合体の調製
本発明によるいずれの抗体または抗体融合タンパク質も、１以上の治療薬または診断薬と結合し得る。一般に、一種の治療薬または診断薬がそれぞれの抗体または抗体フラグメントに結合しているが、二種以上の治療薬または診断薬が同じ抗体または抗体フラグメントに結合できる。本発明による抗体融合タンパク質は２以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、この融合タンパク質を構成するそれぞれの抗体は治療薬または診断薬を含み得る。その上、１以上の抗体融合タンパク質の抗体は、二種以上の治療薬または診断薬を結合することができる。さらに、この治療薬は同じである必要はなく、異なった治療薬であってもよい。例えば、同じ融合タンパク質に薬物および放射性同位元素を結合させることができる。特に、ＩｇＧは１３１Ｉにて放射性標識し、薬物に結合させることができる。この１３１Ｉは、ＩｇＧのチロシンに取り込まれ、薬物はＩｇＧリジンのイプシロン（epsilon）アミノ基に結合し得る。治療薬および診断薬も、還元ＳＨ基および炭化水素側鎖に結合できる。
【０１０７】
病気の組織の治療に好適な放射性核種は実質的にベータ粒子放出により崩壊し、限定されるものではないが、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂおよび２１３Ｂｉが含まれる。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５,０００ｋｅＶであり、より好ましくは１００〜４,０００ｋｅＶ、および最も好ましくは５００〜２,５００ｋｅＶである。また、オージェ放出粒子を伴い実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、５８Ｃｏ、６７Ｇａ、８０ｍＢｒ、９９ｍＴｃ、１０３ｍＲｈ、１０９Ｐｔ、１１１Ｉｎ、１１９Ｓｂ、１２５Ｉ、１６１Ｈｏ、１８９ｍＯｓ、および１９２Ｉｒである。有用なオージェ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１,０００ｋｅＶより小さく、より好ましくは１００keVより小さく、および最も好ましくは７０ｋｅＶより小さい。また、アルファ粒子を生じながら実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。かかる放射性核種には、限定されるものではないが、１５２Ｄｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２２３Ｒａ、２１９Ｒｎ、２１５Ｐｏ、２１１Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２１Ｆｒ、２１７Ａｔ、２１３Ｂｉおよび２５５Ｆｍが含まれる。有用なアルファ粒子放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２,０００〜１０,０００ｋｅＶであり、より好ましくは３,０００〜８,０００ｋｅＶであり、および最も好ましくは４,０００〜７,０００ｋｅＶである。
【０１０８】
ガンマ線検出を利用する、診断薬として有用な放射性核種には、限定されるものではないが、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、１９７Ｈｇ、および２０１ＴＩが含まれる。有用なγ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜２,０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、および最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
陽電子放射断層撮影に有用な放射性核種には、限定されるものではないが、１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１２０Ｉ、および１２４Ｉが含まれる。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは２,０００ｋｅＶより小さく、より好ましくは１,０００ｋｅＶを下回り、および最も好ましくは７００ｋｅＶより小さい。
【０１０９】
本発明の二重特異性抗体はプレターゲッティング法において有用であり、二種の治療薬または二種の診断薬を被検体に送達する好ましい方法を提供する。 米国出願番号第０９／３８２，１８６号公報および同第０９／３３７，７５６号公報は、二重特異性抗体を用いるプレターゲッティング法を開示しており、その方法は二重特異性抗体を１２５Ｉで標識して被検体に送達し、次に９９ｍＴｃで標識した二価のペプチドを送達するものであり、これらは引用することにその全開示内容を本明細書の一部とする。また、プレターゲッティング法については米国出願番号第０９／８２３，７４６号公報（Hansen et al.）および同第１０／１５０，６５４号公報（Goldenberg et al.）、ならびに米国仮出願「"Methods and Compositions for Administration of Therapeutic and Diagnostic Agents, Atty Docket 第０１８７３３／１１０３号公報（McBride et al., filed January 31, 2003）に記載されており、これらは総て引用することにより本明細書の一部とする。送達の結果、１２５Ｉおよび９９ｍＴｃに関して腫瘍／正常組織比は良好であり、従って二つの診断用放射性同位元素の有用性を示している。抗体および抗体融合タンパク質を標識するために公知の治療薬または診断薬の任意の組み合わせが使用できる。ＭＡｂ複合体の抗体成分の結合特異性、治療薬または診断薬の有効性および抗体のＦｃ部分のエフェクター活性は、複合体の標準的な試験により判定できる。
【０１１０】
本発明は、Ｂ細胞リンパ腫、白血病または自己免疫疾患を患う患者の細胞をプレターゲッティングするための方法であって、
（ｉ）その細胞に特異的に結合する少なくとも一つのアームおよび標的化可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを有する、多重特異性の抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを投与すること；（ii）所望により、患者に除去用組成物を投与し、その組成物により抗原に結合していない抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを循環中から取り除くこと；および、（iii）その患者に、標準化可能な複合体（該複合体は、この抗体融合タンパク質またはそのフラグメントの少なくとも一つの他のアームにより認識され得る少なくとも一つのエピトープを含んでなるかまたは、担持担体部分を含んでなり、かつ少なくとも一種の第一の治療薬または診断薬と結合しているものである）標的化可能な複合体を投与することを含んでなる方法を提供する。本発明による抗体融合タンパク質は、多重特異性抗体でなくてはならない。好ましい態様によれば、この抗体は二重特異性抗体であり、ダイアボディーであることができる。第一の治療薬は放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬、細胞傷害剤、オリゴヌクレオチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、第一の診断薬は少なくとも一種の放射性標識、光活性診断薬または非放射性標識である。この抗体融合タンパク質またはそのフラグメントはまた、少なくとも一種の放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療薬、細胞傷害剤、オリゴヌクレオチドおよびそれらの組み合わせのような第二の治療薬と結合してよく、または少なくとも一種の放射性標識、光活性診断薬または非放射性標識のような第二の診断薬と結合してもよい。ある一つの態様によれば、第一および第二の治療薬または診断薬は同じである。
【０１１１】
治療薬または診断薬は、ジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域に結合し得る。あるいは、かかるペプチドはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて抗体成分に結合させ得る。Yu et al., Int. J. Cancer 56 : 244(1994)を参照されたい。かかる結合に関する一般的な技術は当技術分野で十分公知である。例えばWong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING （CRC Press 1991）; Upeslaciset al.,"Modification of Antibody by Chemical Methods, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al.(eds), pages 187-230（Wiley-Liss, Inc. 1995）; Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 60-84（Cambridge University Press 1995）を参照されたい。あるいは、治療薬または診断薬は抗体のＦｃ領域の炭化水素部分を介して結合することができる。この炭化水素基は、チオール基に結合している同じペプチドの添加を増大させるために使用でき、または炭化水素部分は異なるペプチドに結合するために使用し得る。
【０１１２】
抗体の炭化水素部分を介して抗体成分にペプチドを結合させる方法は当業者に十分公知である。例えば、Shih et al., Int.J. Cancer 41:832(1988）; Shih et al.,Int. J. Cancer 46:1101(1990）; and Shih et al., 米国特許５，０５７，３１３号公報を参照されたい。これらは総て引用することよりその全開示内容を本明細書の一部とする。一般的な方法にあっては、酸化された炭化水素部分を有する抗体成分と、少なくとも一つの遊離アミン官能基を有しかつ複数のペプチドを添加した担体ポリマーとを反応させることが含まれる。この反応により最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これは第二級アミンへの還元により安定化され最終複合体を形成し得る。
【０１１３】
抗体が免疫複合体の抗体成分として用いられる場合、Ｆｃ領域は存在せず、これは抗体フラグメントである。しかし、炭化水素部分を完全な長さの抗体または抗体フラグメントのＬ鎖可変領域中へ導入することが可能である。例えば、, Leung et al., J ; Immunol. 154:5919(1995）; Hansen et al.,米国特許第５，４４３，９５３号公報(1995）, Leung et al., 米国特許第６，２５４，８６８号公報を参照されたい。これらは総て引用することにより本明細書の一部とする。この操作された炭化水素部分は、治療薬または診断薬を結合させるために用いられる。
【０１１４】
１０．医薬上許容される賦形剤
被検体に送達されるヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ２０ ＭＡｂは、ＭＡｂ単独、免疫複合体、融合タンパク質から構成されるか、または１以上の医薬上許容される好適な賦形剤、１以上の付加的成分またはこれらのある組み合わせを含むことができる。
【０１１５】
本発明による免疫複合体または裸の抗体は、医薬上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って調剤され、この免疫複合体または裸の抗体は混合物中で医薬上好適な賦形剤と結合する。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は医薬上好適な賦形剤の一つの例である。他の好適な賦形剤は当業者に十分公知である。例えばAnsel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition （Lea & Febiger 1990), and Gennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition(Mack Publishing Company 1990）およびそれらの改訂版を参照されたい。
【０１１６】
本発明による免疫複合体または裸の抗体は、例えばボーラス注射または持続点滴による静脈内投与のために処方できる。好ましくは、本発明による抗体は約４時間以内で、より好ましくは約３時間以内の時間で持続点滴される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇは３０分以内、好ましくは１５分以内に、そして残りは以後の２〜３時間にわたり点滴する。注射製剤は、例えばアンプルのような単位投与形、または保存剤を加えた複数回投与用容器にて与え得る。この組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションの形態をとり、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、その活性成分は例えば滅菌パイロジェンフリー水のような好適なビヒクルに用時溶解するための粉末形態であることができる。
【０１１７】
追加の調剤方法は、治療もしくは診断用複合体または裸の抗体の作用時間を制御するために用いられる。徐放性製剤は、免疫複合体または裸の抗体と複合体形成または吸収するためにポリマーを使用して調製できる。例えば、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）マトリックスおよびステアリン酸ダイマーおよびセバシン酸のポリ無水コポリマーマトリックスが含まれる。Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446(1992）を参照されたい。かかるマトリックスからの免疫複合体または抗体の放出速度は、免疫複合体または抗体の分子量、マトリックス中の免疫複合体、抗体の量、および分散した粒子のサイズに依存する。Saltzman et al., Biophys. J. 55:163(1989); Sherwood et al.,前掲。他の固形投与形は、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition（Lea & Febiger 1990), and Gennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition(Mack Publishing Company 1990）およびその改定版に記載されている。
また、免疫複合体、抗体融合タンパク質、または裸の抗体は、哺乳類に皮下投与または他の非経口経路でも投与できる。さらに、投与は持続点滴でも単回または複数回ボーラス注射であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は約４時間以内、より好ましくは約３時間以内にわたって点滴される。最初はゆっくりと点滴するのが好ましい。例えば、２５〜５０ｍｇの用量を１５〜３０分間で点滴し、その残りの用量を２〜３時間までにわたって点滴する。一般に、ヒトに投与された免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な病状および以前の病歴といった因子により変化する。通常、単回静脈内点滴として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量の免疫複合体、抗体融合タンパク質または裸の抗体をレシピエントに与えるのが望ましいが、状況によってはより高い、またはより低い用量も投与してよい。従って、７０kgの患者のための１〜２０ｍｇ／ｋｇは、たとえば用量は７０〜１,４００ｍｇ、または１.７ｍの患者にとっての用量は４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。この用量は必要に応じで繰り返してよく、例えば、１週間に１回の投与を４〜１０週間、好ましくは１週間に１回の投与を８週間、そしてより好ましくは、１週間に１回の投与を４週間繰り返してもよい。また、１週間おきの投与を数ヶ月というふうに、頻度を減らして投与してもよい。より具体的には、裸の抗ＣＤ２０のような本発明の抗体は、１用量として２または３週間おきの投与を繰り返して合計少なくとも３用量を投与してよい。また、好ましくは本発明の抗体は１週間に１回投与を４〜８週間行ってもよい。言い換えると、用量をおよそ２００〜３００ｍｇ／ｍ２よりも低くした場合（これは１.７ｍの患者では３４０ｍｇ／用量、または７０ｋｇの患者では４．９ｍｇ／ｋｇ）、１週間に１回投与を４〜８週間行ってよい。あるいは、例えば、用量が３００〜５００ｍｇ／  ｍ２の場合、２または３週間おきに２〜３ヶ月と投与回数を減らしてもよい（すなわち、１.７ｍの患者では５１０〜８５０ｍｇ、または７０ｋｇの患者では７．３〜１２ｍｇ／ｋｇ）。投与量および日程を適切に調節して、所望により他の投与間隔で投与日程を繰り返すことが可能であり、また種々の非経口経路により投与してよい。
【０１１８】
治療目的のために、治療上有効な量の免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体を哺乳類に投与する。ヒトではない動物被検体もまた含まれるが、本発明のための好適な被検体は通常、ヒトである。投与された量が生理的に有効である場合に、「治療上有効な量の」抗体調製物が投与されたという。薬物は、その存在がレシピエント哺乳類の生理機能に検出可能な変化をもたらした場合に、生理学的に有効である。特に、本発明の抗体調製物はその存在が抗腫瘍反応を誘発するかまたは自己免疫疾患の徴候および症状を緩和した場合に、生理的に有効である。生理的に有効な作用はまた、レシピエント哺乳類に体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こす。
【０１１９】
１１．治療方法
本発明はＢ細胞疾患およびその他の疾病の治療のための基本組成物としての本発明による裸の抗ＣＤ２０抗体の使用を含む。特に本明細書に記載の組成物は、種々の自己免疫性ならびに無痛性Ｂ細胞リンパ腫、悪性型Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症の治療に特に有用である。例えば、ヒト化抗ＣＤ２０抗体成分および免疫複合体を用いて無痛性および悪性非ホジキンリンパ腫の双方を治療することができる。
【０１２０】
治療用組成物としては、少なくとも一つのヒト化、キメラまたはヒトモノクローナル抗ＣＤ２０抗体を、単独で含むかまたは他のヒト化、キメラ、またはヒト抗体、治療薬もしくは免疫調節剤と組み合わせて含む。特に完全なヒト抗体との組み合わせ療法も意図され、これらは上記に示される方法によって製造される。
【０１２１】
また、裸のあるいは同じもしくは異なるエピトープまたは抗原と結合させた抗体を、本発明による１以上の抗体と組み合わせてもよい。例えば、ヒト化、キメラまたはヒト裸抗ＣＤ２０抗体を他の裸のヒト化、裸のキメラまたは裸のヒト抗ＣＤ２０と組みあわせてもよく、ヒト化、キメラまたはヒト裸抗ＣＤ２０抗体を抗ＣＤ２０免疫複合体と組みあわせてもよく、裸の抗ＣＤ２０抗体を抗ＣＤ２２放射性複合体と組みあわせてもよく、あるいは、抗ＣＤ２２裸抗体を同位元素、１以上の化学治療薬、サイトカイン、毒素またはそれらの組み合わせと結合させたヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ２０抗体と組みあわせてもよい。ヒト化、キメラまたはヒトＣＤ２０抗体と毒素もしくは免疫調節剤との融合タンパク質、あるいは少なくとも二つの異なるＢ細胞抗体（例えば、ＣＤ２０とＣＤ２２  ＭＡｂ）の融合タンパク質も本発明において使用できる。上記にて既に挙げたようなＢ細胞疾患に関連する少なくとも二つの異なる抗原を標的とする多くの異なる抗体の組み合わせが、裸の抗体として、または一部は裸で一部は治療薬もしくは免疫調節剤と結合したものとして、あるいは細胞傷害剤などの他の治療薬または放射線療法と組み合わせて構築することができる。
【０１２２】
本明細書において「免疫調節剤」としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、ならびにインターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンなどの造血因子が挙げられる。好適な免疫調節剤部分としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｌ−２１、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。あるいは、被検体に裸の抗ＣＤ２０抗体を投与してもよく、別にサイトカインを投与することもでき、これは裸の抗ＣＤ２０抗体の投与前、同時または投与後に投与することができる。上記に述べたように、抗ＣＤ２０抗体はまた、免疫調節剤と結合させてもよい。この免疫調節剤はまた、異なる抗原と結合する１以上の抗体からなるハイブリッド抗体と結合させてもよい。
【０１２３】
本発明による多様な療法はさらに、裸の抗体、融合タンパク質または免疫複合体の形態での抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ４６またはＨＬＡ−ＤＲ（不変鎖を含む）抗体の投与によって補われた、裸の抗ＣＤ２０抗体による免疫療法も含む。裸の抗ＣＤ２０抗体またはそのフラグメントに特定のＢ細胞にて発現するＭＵＣ１抗原に対する裸の抗体を補ってもよい。これらの抗体としては、これらの抗原決定基上の少なくとも一つのエピトープを認識するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体を含む。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２抗体は当業者に公知である。例えば、引用することによりそれらの全開示内容を本明細書の一部とする、Ghetie et al., Cancer Res. 48:2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991); Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996)、ならびに米国特許第５，７９８，５５４号および同第６，１８７，２８７号を参照されたい。
【０１２４】
多様な療法の別の態様によれば、被検体に裸の抗ＣＤ２０抗体および／または免疫複合体を、標準的な癌の化学療法と組み合わせて投与する。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２シクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ２エトポシド、および１５０〜２００ｍｇ／ｍ２カルムスチン）は、非ホジキンリンパ腫を治療するのに用いられる投与計画である。Patti et al., Eur. J. Haematol. 51:18 (1993)を参照されたい。その他の好適な組み合わせ化学療法計画も当業者に周知である。例えば、Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas," in CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3rd Edition, Holland et al. (eds. ), pages 2028-2068 (Lea & Febiger 1993)を参照されたい。記載したように、中悪性度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療のための第一世代化学療法計画としては、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニソン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニソン）が挙げられる。有用な第二世代の化学療法計画としては、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）があり、好適な第三世代の計画としては、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）がある。さらなる有用な薬物としては、フェニルブチレートおよびブロスタチン−１がある。好ましい多様療法によれば、化学療法薬とサイトカインの双方を本発明による抗体、免疫複合体または融合タンパク質と同時に投与する。サイトカイン、化学療法薬および抗体または免疫複合体はいずれの順序で投与してもよく、一緒に投与してもよい。
【０１２５】
ある好ましい態様によれば、ＮＨＬまたは自己免疫疾患にあっては、連続４週間毎週２００〜４００ｍｇ／ｍ２の用量にてヒト化抗ＣＤ２０抗体を１週１回、４回点滴し（２〜６時間かけて静脈投与）、必要があれば次の月／年にわたって繰り返す。好ましくはヒト化抗ＣＤ２０抗体は１週間ごと、または３週間毎に１度、４〜８回にて、２００〜３００ｍｇ／ｍ２の用量で投与する。また好ましくは、ＮＨＬは、上記のように４週間の点滴にて、または上記より頻度は少ないが同じ日に、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の点滴前、点滴中または点滴後に１時間にわたる静脈点滴として投与される３６０ｍｇ／ｍ２の用量のエプラツズムＡｂ（抗ＣＤ２２ヒト化抗体）と組み合わせて治療される。あるいは、組み合わせ療法に用いる抗体は、週ごとに交互に、１週おきにそれぞれ一連の全点滴が４〜８またはそれ以上の投与数となるように交互に一連の点滴を行ってもよい。その後、これらの投与計画を、患者の臨床状態および各治療計画に対する応答に応じて、３〜６ヶ月おきといった種々の間隔で繰り返すことができる。一層好ましくは、ＮＨＬは、イットリウム−９０（Ｙ−９０の総用量は数週間または数ヶ月という期間における１回以上の注入として５〜３５ｍＣｉ／ｍ２である）などの治療用同位元素により放射性標識したＣＤ２２ ＭＡｂの２回以上の注入と組み合わせて、上記抗ＣＤ２０抗体の１週１回を４回またはそれより少ない頻度の点滴により治療される。米国出願番号第０９／５９０，２８４号(Goldenberg et al.)は抗ＣＤ２２抗体を用いた自己免疫疾患の免疫療法を開示しており、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
【０１２６】
さらに、本発明の治療組成物は異なる非ブロッキングＣＤ２０エピトープに向けられた裸のモノクローナル抗ＣＤ２０抗体の混合物またはハイブリッド分子を含むことができる。よって、本発明は、少なくとも二つのＣＤ２０エピトープと結合するモノクローナル抗ＣＤ２０抗体の混合物を含んでなる治療組成物を提供する。さらに、本明細書に記載の治療組成物はＣＤＲ配列の異なる抗ＣＤ２０抗体の混合物を含むことができる。
【０１２７】
裸の抗ＣＤ２０抗体はＢ細胞リンパ腫および自己免疫疾患の治療のための基本治療組成物であるが、このような抗体療法の効力は、この裸の抗体に、ＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγをはじめとするインターフェロン；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１をはじめとするインターロイキン；Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦをはじめとするサイトカインのような免疫調節剤などの添加剤を補うことにより増強することができる。よって、ＣＤ２０抗体は、混合物として（個別に、または所定の用量計画によって投与される）または抗ＣＤ２０抗体との複合体もしくは融合タンパク質として抗体およびサイトカインと組み合わせることができるだけでなく、薬物との組み合わせとしても投与することができる。例えば抗ＣＤ２０抗体は４一薬化学療法計画としてのＣＨＯＰと組み合わせてもよい。さらに、裸の抗ＣＤ２０抗体は、ＮＨＬ療法用の薬物組み合わせとして裸の抗ＣＤ２２抗体およびＣＨＯＰまたはフルダラビンと組み合わせることができる。抗ＣＤ２２抗体を用いたＢ細胞悪性腫瘍の免疫療法は米国特許第６，１８３，７４４号公報(Goldenberg et al.)および米国出願番号第０９／３０７，８１６号公報(Goldenberg et al.)に記載されており、これらは引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。これらの補助的治療組成物は抗ＣＤ２０抗体の投与前、投与と同時または投与後に投与することができる。
【０１２８】
上記にて述べたように、本発明による抗体はＢ細胞リンパ腫および白血病、ならびにその他のＢ細胞の疾病または疾患を治療するために使用できる。例えば、抗ＣＤ２０抗体は、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病などの免疫媒介性血小板減少症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天瘡、真性糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、溶血性連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑らい、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、類肉腫症、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェジナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、および繊維性肺胞炎といった第III種自己免疫疾患をはじめとするＢ細胞関連免疫疾患の治療に使用できる。
【０１２９】
抗ＣＤ２０抗体はまた、ＣＤ２０抗原を発現する細胞においてアポトーシスを誘導し得る。この誘導の証拠は文献によって支持されている。例えば、架橋したＣＤ２０  ＭＡｂのＩｇＧ１−Ｆｃと反応性のあるＦｃ受容体を有するリンパ系細胞を用いてアポトーシスが誘導できたことが実証されている。Shan et al., Cancer Immunol. Immunother. 48 (12):673-683 (2000)を参照されたい。さらに、キメラＣＤ２０  ＭＡｂの集合体、すなわちホモポリマーがアポトーシスを誘導したことも報告されている。Ghetie et al., Blood 97(5):1392-1398 (2000)およびGhetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94(14):7509-7514 (1997)を参照されたい。
【０１３０】
Ｂ細胞のＣＤ２０表面抗原に特異的な抗体を哺乳類被験体に注射することができ、これは次に正常Ｂ細胞と悪性Ｂ細胞の両のＣＤ２０細胞表面抗原と結合する。哺乳類被験体としてはヒトおよびイヌやネコなどのペットをはじめとする家庭内動物が挙げられる。本発明による抗ＣＤ２０  ＭＡｂ、すなわちヒト化、キメラ、ヒト、イヌ化およびネコ化、さらにはマウス抗ＣＤ２０  ＭＡｂは、ＣＤ２０抗原に対して特異的交差反応性のある非ヒト哺乳類被検体を治療するのに使用できる。下記実施例１０および１１を参照されたい。
【０１３１】
ヒトにおいて免疫原性のあるマウスＭＡｂは通常、非ヒト哺乳類被検体では免疫原性が低い。ＣＤ２０表面抗原に結合している抗ＣＤ２０抗体は腫瘍性Ｂ細胞の破壊と枯渇をもたらす。正常なＢ細胞も悪性Ｂ細胞もＣＤ２０抗原を発現することから、抗ＣＤ２０抗体はＢ細胞の死滅をもたらしてしまう。しかし、正常なＢ細胞だけが再分布し、悪性Ｂ細胞は根絶されるか、あるいは著しく少なくなる。さらに、腫瘍を破壊する可能性を有する化学薬剤または放射性標識を抗ＣＤ２０抗体に結合させて、この薬剤を腫瘍性Ｂ細胞を特異的に標的とするようにすることもできる。
【０１３２】
１２．発現ベクター
ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ２０  ＭＡｂをコードするＤＮＡ配列は、核酸の増幅をもたらす種々の既知の宿主ベクター中へ組換え操作することができる。これらのベクターは公知の方法を用い、核酸が送達される細胞内で核酸の転写、翻訳またはその双方を命令するために必要なエレメントを含むよう設計することができる。既知の方法論を用い、適当な転写／翻訳制御シグナルと作動可能に連結されたタンパク質コード配列を有する発現構築物を作製することができる。これらの方法としてはin vitro組換えＤＮＡ技術および合成技術を含む。例えば、Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (New York); Ausubel et al., 1997, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (New York)を参照されたい。また、本発明は、ベクターと会合していないポリヌクレオチドの送達も提供する。
【０１３３】
本発明における使用に好適なベクターはウイルス系であっても非ウイルス系であってもよい。ウイルスベクターの特定の例としては、アデノウイルス、ＡＡＶ、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。非ウイルス系ベクターの例としては、プラスミドがある。好ましい態様によればでは、ベクターはプラスミドである。
【０１３４】
本明細書に記載の発現ベクターは、宿主細胞で発現される遺伝子を含むポリヌクレオチドである。典型的には、遺伝子発現は構成的または融合型プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーをはじめとする、ある特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子はそれら調節エレメントに「作動可能に連結される」と言われる。
【０１３５】
好ましくは本発明による発現ベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖可変および定常領域を含むヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ２０をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。しかし、一方がＨ鎖可変および定常領域を含み、他方がＬ鎖可変および定常領域を含むといったように二つの発現ベクターを用いてもよい。この発現ベクターはさらにプロモーターを含むことが一層好ましい。任意の強力なプロモーターを使用できるので、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ヒトＩｇＧ１Ｈ鎖定常領域をコードするゲノム配列、Ｉｇエンハンサーエレメント、および選択マーカーをコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含むことができる。
【０１３６】
また、本明細書では、ヒト化抗ＣＤ２０ ＭＡｂを発現させる方法を提供し、その方法は、（ｉ）ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ２０ ＭＡｂをコードするＤＮＡ配列を含んでなる少なくとも一つの発現ベクターをインターナライズすること、（ii）少なくとも一つの該インターナライズベクターによって哺乳類細胞をトランスフェクトすること、（iii）マーカー遺伝子を発現するトランスフェクト細胞を選択すること、および（iv）それらのトラスフェクト細胞からヒト化抗ＣＤ２０ ＭＡｂを分泌する細胞を同定することを含んでなる。
【０１３７】
１３．抗ＣＤ２０抗体の作製方法
一般に、抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＶκ（可変Ｌ鎖）およびＶＨ（可変Ｈ鎖）配列はＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの種々の分子クローニング手順によって得ることができる。特に、抗ＣＤ２０ ＭＡｂのＶ遺伝子はマウスまたはキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂを発現する細胞からＰＣＲ増幅によりクローニングし、配列決定することができる。それらの忠実性を確認するため、クローニングしたＶＬおよびＶＨ遺伝子を、引用することにより本明細書の一部とするOrlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989))が記載しているように、キメラＡｂとして細胞培養にて発現させることができる。このＶ遺伝子配列に基づき、次にヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂを、引用することにより本明細書の一部とするLeung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995))が記載しているように設計および構築することができる。ｃＤＮＡは一般的な分子クローニング技術(Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual,2nd Ed (1989))により、いずれかの公知のハイブリドーマ系統またはマウスまたはキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂを産生するトランスフェクション細胞系統から調製してもよい。ＭＡｂのＶκ配列はプライマーＶＫ１ＢＡＣＫおよびＶＫ１ＦＯＲ(Orlandi et al., 1989)または引用することにより本明細書の一部とするLeung et al. (BioTechniques, 15:286 (1993))が記載している伸張プライマーセットを用いて増幅してもよく、一方、ＶＨ配列はプライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ(Orlandi et al., 1989, 前掲)または引用することにより本明細書の一部とするLeung et al. (Hybridoma, 13:469 (1994))が記載しているマウスＩｇＧの定常領域へアニーリングするプライマーを用いて増幅することができる。１０μＬの第一鎖ｃＤＮＡ産物、１０μＬの１０Ｘ  ＰＣＲバッファー［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．０１％（ｗ
／ｖ）ゼラチン］（Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭのプライマー、および５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を含有するＰＣＲ反応混合物に対して３０サイクルのＰＣＲを行うことができる。各ＰＣＲサイクルは好ましくは９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間の重合からなる。増幅されたＶκおよびＶＨフラグメントは２％アガロース(BioRad, Richmond, CA)上で精製することができる。同様に、Leung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995))が記載しているようなヒト化Ｖ遺伝子は長いオリゴヌクレオチド鋳型合成とＰＣＲ増幅の組み合わせにより構築することができる。ヒト化Ｖ遺伝子を構築する際に用いる自動ＲＮＡ／ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystems, foster City, CA)でのオリゴＡおよびオリゴＢの合成のための方法については実施例３を参照のこと。
【０１３８】
ＶκのＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、およびＶκＰＣＲ産物のフレーム内連結を容易にする便宜な制限部位を含む、ｐＢＲ３２７に基づく足場ベクターＶＫｐＢＲ中にサブクローニングすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づくＶＨｐＢＳなどの同様の足場ベクター中へサブクローニングすることができる。各ＰＣＲ産物を含む個々のクローンは、例えば引用することにより本明細書の一部とするSanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74:5463 (1977))の方法により配列決定してもよい。
【０１３９】
本明細書に記載のＤＮＡ配列は、天然に存在するものであれ誘導されたものであれ、総てのその対立遺伝子、突然変異体および変異体を含むといえる。
【０１４０】
ＶκおよびＶＨを含む発現カセットをプロモーターおよびシグナル配列とともに、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として二重制限消化により、それぞれＶＫｐＢＲおよびＶＨｐＢＳから切り出すことができる。次に、ＶκおよびＶＨ発現カセットをそれぞれｐＫｈおよびｐＧ１ｇなどの適当な発現ベクターの連結することができる(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))。これらの発現ベクターは適当な細胞、例えば骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ，  ＶＡ）へ同時トランスフェクトし、コロニーをハイグロマイシン耐性に関して選択し、上清液を例えば、下記のように、ＥＬＩＳＡによりキメラまたはヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂの産生に関してモニタリングすることができる。あるいは、ＶκおよびＶＨ発現カセットを改変足場ベクターＶＫｐＢＲ２およびＶＨｐＢＳ２中に組み立て、それぞれＸｂａＩ／ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として切り出し、Gilles et al. (J. Immunol. Methods 125:191 (1989)が記載しているように（また、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞での発現に関してはLosman et al.,Cancer, 80:2660 (1997)にも示されている)ｐｄＨＬ２などの単一の発現ベクター中へサブクローニングすることができる。本発明において有用なその他のベクターとしては、Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123 (2000)が記載しているようなＧＳベクターがあり、これはＮＳ０細胞系統およびＣＨＯ細胞で好ましく発現される。他の適当な哺乳類発現系がWerner et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II), Nr. 8,870-880 (1998)に記載されている。
【０１４１】
同時トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンのアッセイは次のようにして行うことができる。引用することにより本明細書の一部とするCo et al., J Immunol., 148:1149 (1992)に従うエレクトロポレーション(BioRad, Richmond, CA)による５×１０６個のＳＰ２／０骨髄腫細胞のトランスフェクションには、約１０μｇのＶＫｐＫｈ（Ｌ鎖発現ベクター）および２０μｇのＶＨｐＧ１ｇ（Ｈ鎖発現ベクター）を用いることができる。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下、９６ウェルマイクロタイタープレートにて完全ＨＳＦＭ培地(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)中で増殖させればよい。選択プロセスは２日後、ハイグロマイシン選択培地(Calbiochem, San Diego, CA)を最終濃度５００単位／ｍｌハイグロマイシンで加えて開始することができる。コロニーは通常エレクトポレーション後２〜３週間で出現する。次に、これらの培養物をさらなる分析のために拡張することができる。
【０１４２】
キメラまたはヒト化Ｈ鎖の分泌に関して陽性のトランスフェクトーマのクローンはＥＬＩＳＡアッセイにより同定することができる。要するに、トランスフェクトーマ培養物からの上清サンプル（〜１００μＬ）を、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)をプレコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに３反復で添加する。プレートを室温にて１時間インキュベートする。洗浄バッファー（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することにより結合していないタンパク質を除去する。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)をウェルに加える（１００μＬの抗体原液希釈物×１０４に、非結合抗体を最終濃度１．０μｇ／ｍＬまで添加）。１時間インキュベートした後、プレートを通常３回洗浄する。反応溶液［ＰＢＳ１００μＬ中、１６７μｇのオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）(Sigma, St. Louis, MO)、０．０２５％過酸化水素を含有］をウェルに加える。暗所にて３０分間、発色させる。各ウェルに５０μＬの４Ｎ  ＨＣｌ溶液を加えることで反応を停止させた後、自動ＥＬＩＳＡリーダー(Bio-Tek instruments, Winooski, VT)で４９０ｎｍにて吸光度を測定する。次に、無関係なキメラ抗体標品(Scotgen, Ltd., Edinburg, Scotlandから入手可能）に対して結合キメラ抗体を測定する。
【０１４３】
抗体は細胞培養培地から次のようにして単離することができる。トランスフェクトーマ培養物を血清フリー培地に適用する。キメラ抗体の生産のためには、ＨＳＦＭを用い細胞を回転瓶中５００ｍｌの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分子し、上清を０．２μメンブランで濾過する。濾過した培地をＡタンパク質カラム（１×３ｃｍ）に流速１ｍｌ／分で通す。次にこの樹脂を約１０倍カラム量のＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５）を用いて、Ａタンパク質結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍＬ画分を、１０μＬの３Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）の入った試験管に回収し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求める。ピーク画分をプールし、ＰＢＳの対して透析し、例えばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０(Amicon, Beverly, MA)を用いて抗体を濃縮する。抗体濃度は上記のようにＥＬＩＳＡにより測定し、その濃度をＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍＬに調整する。保存のためにはサンプルにアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を加えると便宜である。
【０１４４】
下記は抗ＣＤ２０抗体を調製するために用いたプライマーのヌクレオチド配列である。
【０１４５】
【化１】
0004498746.tif 000002
0004498746.tif 000003
0004498746.tif 000004
【０１４６】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は単に例示のために示されるものである。本発明はこれらの実施例に限定されず、本明細書に示される技術から明らかな総ての改変を含む。
【実施例】
【０１４７】
実施例１．ヒト化抗ＣＤ２０抗体の構築
抗ＣＤ２０抗体Ａ２０のＶＨおよびＶκ遺伝子を、それぞれOrlandi et al.,（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3833 (1989））に記載のプライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲおよびＶＫ１ＢＡＣＫ／ＶＫ１ＦＯＲを用いてＲＴ−ＰＣＲにより得た。複数の独立したクローンを配列決定してＰＣＲ反応から生じた可能性のあるエラーを除いた。最終ＰＣＲ産物としてのクローニングされたマウスＶＨおよびＶκ配列をそれぞれＡ２０Ｖｋ（図１Ａ）およびＡ２０ＶＨ（図１Ｂ）と呼んだ。キメラＡ２０（ｃＡ２０）抗体を構築し、Ｓｐ２／０細胞で発現させた。ｃＡ２０のＶκおよびＶＨ配列は図２に示されている。このｃＡ２０抗体はＲａｊｉ細胞に結合し、ハイブリドーマ細胞培養上清から精製された放射性標識Ａ２０と競合する（図３）。この結果からクローニングされたＶ遺伝子の忠実性が確認された。
【０１４８】
ヒト化抗ｈＣＤ２０（ｈＡ２０）抗体をコードする一つのＬ鎖可変領域配列と二つのＨ鎖可変領域配列を設計および構築した。ＶκについてはヒトＲＥＩフレームワーク配列を用い（図１Ａ）、ＶＨについてはＥＵとＮＥＷＭフレームワーク配列の組み合わせを用いた（図１Ｂ）。最初のヒト抗体フレームワークと比べたとき、ＣＤＲ領域の外側の各鎖にいくつかのアミノ酸変異がある。ｈＡ２０のＨ鎖、ｈＡ２０ＶＨ１はＥＵフレームワークから９つの変異を含み、一方、ｈＡ２０ＶＨ２は３つの変異を含んでいる（図４Ａ）。ヒト抗体フレームワークからのアミノ酸変異が多いので、ｈＡ２０ＶＨ２がｈＡ２０ＶＨ１よりも好ましい。ｈＡ２０のＬ鎖、ｈＡ２０ＶκはＲＥＩフレームワークから７つのアミノ酸変異を含む（図４Ｂ）。
【０１４９】
実施例２．ｈＡ２０抗体の構築方法
各可変鎖をそれぞれ「Ａ」および「Ｂ」と呼ばれる５’−ハーフおよび３’−ハーフの２つの部分として構築した。各ハーフは、Ｔａｑポリメラーゼを用い、２つの短いフランキングプライマーを有する一本鎖合成オリゴヌクレオチド鋳型のＰＣＲ増幅により作製した。増幅した断片をまず、Invitrogen (Carlsbad, CA)から得たｐＣＲ４ ＴＡクローニングベクター中へクローニングし、ＤＮＡ配列決定を行った。これらの鋳型およびプライマー対は次の通りである。
鋳型            プライマー                                        
ＶＫＡ          ＶｋＡ−Ｂａｃｋｗａｒｄ／ＶｋＡ−Ｆｏｒｗａｒｄ
ＶＫＢ          ＶｋＢ−Ｂａｃｋｗａｒｄ／ＶｋＢ−Ｆｏｒｗａｒｄ
ＶＨ１Ａ        ＶＨＡ−Ｂａｃｋｗａｒｄ／ＶＨ１Ａ−Ｆｏｒｗａｒｄ
ＶＨ１Ｂ        ＶＨ１Ｂ−Ｂａｃｋｗａｒｄ／ＶＨＢ−Ｆｏｒｗａｒｄ
ＶＨ２Ａ        ＶＨＡ−Ｂａｃｋｗａｒｄ／ＶＨ２Ａ−Ｆｏｒｗａｒｄ
ＶＨ２Ｂ        ＶＨ２Ｂ−Ｂａｃｋｗａｒｄ／ＶＨＢ−Ｆｏｒｗａｒｄ
【０１５０】
Ｌ鎖
ヒト化Ｖκ配列の全長ＤＮＡを構築するため、オリゴｈＡ２０ＶＫＡ（１２０mer）およびｈＡ２０ＶＫＢ（１３０mer）を自動ＲＮＡ／ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystems)にて合成した。ｈＡ２０ＶＫＡおよびＢはｈＡ２０  Ｖκのそれぞれｎｔ２６〜１４５および１６６〜１９５に相当する（図５Ａ参照）。オリゴｈＡ２０ＶＫＡおよびＢは濃水酸化アンモニウムで処理することにより支持体から切断し、脱保護した。サンプルを真空処理した後、１００μＬの水に再懸濁させ、ＣｈｏｒｍａＳｐｉｎ−１００カラム(Clontech, Palo Alto, CA)にて遠心分離することにより不完全なオリゴマー（１００mer未満）を除去した。合成副生成物を除去するためにＣｈｒｏｍａＳｐｉｎ−３０を用いたこと以外は、総てのフランキングプライマーを同様に精製した。１μＬのＣｈｒｏｍａＳｐｉｎカラムで精製したｈＡ２０ＶＫＡを、１０μＬの１０×ＰＣＲバッファー［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭのＶｋＡ−ＢａｃｋｗａｒｄおよびＶｋＡ−Ｆｏｒｗａｒ、および５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を含有する反応用量１００μＬにてＰＣＲ増幅した。この反応混合物に対して、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間の重合からなる３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。ｈＡ２０ＶＫＢは同様の条件下、プライマー対ＶｋＢ−ＢａｃｋｗａｒｄおよびＶｋＢ−ＦｏｒｗａｒｄによりＰＣＲ増幅した。増幅したＶＫＡおよびＶＫＡフラグメントを２％アガロース(BioRad, Richmond, CA)上で精製した。ＤＮＡ連結反応による連結を容易にするため、各フラグメントの末端に固有の制限部位を設計した。増幅されたＶＫＡフラグメントは５’末端にＰｖｕＩＩ制限部位ＣＡＧＣＴＧを、３’末端には，ＢｓｔＢＩ制限部位ＴＴＣＧＡＡを含んでいた。増幅されたＶＫＢフラグメントは５’末端にＢｓｔＢＩ制限部位を、３’末端にはＢｇｌＩＩ制限部位ＡＧＡＴＣＴを含んでいた。
【０１５１】
全長Ｖκ鎖の構築は各フラグメントを適当な５’および３’酵素で制限酵素消化し、あらかじめＰｖｕＩＩおよびＢｅｌＩで消化した（ＢｃｌＩ消化末端はＢｇｌＩＩ消化末端と適合する）ＶＫｐＢＲ２ベクターへ連結することにより達成した。得られた連結産物はＰｖｕＩＩに連結されたフラグメントＡと、ＢｅｌＩ部位に連結されたフラグメントＢを含み、このフラグメントＡとＢはＢｓｔＢＩ部位でともに連結していた（図５Ａ）。ＶＫｐＢＲ２はＶＫｐＢＲ(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))の改変型足場ベクターであり、ＸｂａＩ制限部位が転写開始コドンの１４塩基上流に導入されている。ＤＮＡ配列決定よる正確なオープンリーディングフレームが確認されたところで、ＶＫｐＢＲ２から完全な鎖をＸｂａＩ〜ＢａｍＨＩ断片として取り出し、ｐｄＨＬ２発現ベクターへ連結した。Ｖκ配列だけを含むベクターをｈＡ２０ＶκｐｄＨＬ２と呼んだ。ｐｄＨＬ２はＩｇＨエンハンサーおよびＭＴ１プロモーターの制御下にヒトＩｇＧ１Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびヒンジ領域（図７Ａ）、そしてヒトカッパ鎖Ｃｋ（図７Ｂ）の両者の発現カセット、ならびにトランスフェクト物の選択およびトランス遺伝子の同時増幅のためのマーカーとしての、弱いＳＶ４０プロモーターによって制御されるマウスｄｈｆｒ遺伝子を含んでいる(Gillies et al., J Immunol. Methods 125:191(1989); Losman et al., Cancer 80:2660 (1997))。ｐｄＨＬ２のＶκおよびＶＨセグメントを置換することにより種々のキメラまたはヒト化Ａｂを発現させることができる。
【０１５２】
Ｈ鎖
ｈＡ２０ＶＨ１の構築のため、それぞれｎｔ２３〜１４３および１７９〜３２９に相当するオリゴＶＨ１Ａ（１２１mer）およびＶＨ１Ｂ（１５１mer）（図５Ｂ参照）を上記のように合成した。同様に、ｈＡ２０ＶＨ２については、オリゴＶＨ２ＡおよびＶＨ２Ｂを調製した。これらのオリゴを、実施例２に挙げたような個々のプライマー対によりＰＣＲ増幅した。Ｖκに対して行ったものと同じ構築処理を両タイプのＶＨについても行い、以下の改良を施した：フラグメントＡの５’末端制限部位はＰｓｔＩ（ＣＴＧＣＡＧ）とし、フラグメトＢの３’末端制限部位はＢｓｔＥＩＩ（ＧＧＴＣＡＣＣ）とした。共通のＮｃｉＩ部位（ＣＣＣＧＧ）によるＶＨｐＢＳ２ベクターへの連結の際にこれらのフラグメントを連結して全長ＶＨ配列（図５Ｂおよび５Ｃ）を得て、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＶＨｐＢＳ２はＶＨｐＢＳ(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))の改変型足場ベクターであり、翻訳開始コドンの１６塩基上流にＸｈｏＩ制限部位が導入されている。構築されたＶＨ遺伝子を、Ｖκ配列を含む発現ベクターｈＡ２０ＶＫｐｄＨＬ２へ、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限断片としてサブクローニングした。ｐｄＨＬ２のＨ鎖領域はＢａｍＨＩ制限部位を欠いていることから、この連結反応には、ｐｄＨＬ２ベクターに存在する可変鎖のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間を架橋するためにＨＮＢリンカーを用いることを必要とした。得られた発現ベクターはｈＡ２０−１ｐｄＨＬ２およびｈＡ２０−２ｐｄＨＬ２と呼んだ。
ＨＮＢリンカー  ５’−ＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’
３’−ＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＡＧ−５’
【０１５３】
実施例３．トランスフェクションおよびｈＡ２０抗体の発現
ｈＡ２０のための発現ベクター約３０μｇをＳａｌＩにて消化して線状化し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞へトランスフェクトした（４５０Ｖおよび２５μＦ）。トランスフェクト細胞を９６ウェルプレートで２日間平板培養した後、培地中にＭＴＸを最終濃度０．０２５μＭを加えることにより薬剤耐性に関して選択した。２〜３週間にてＭＴＸ耐性コロニーが出現した。選択に生き残ったコロニーからの上清をＥＬＩＳＡアッセイによりヒトＡｂ選択に関してスクリーニングした。すなわち、１００μＬ上清を、ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的Ａｂをプレコートマイクロタイタープレートのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄バッファー（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）にて３回洗浄し、結合していないタンパク質を除去した。ＨＲＰ結合ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的Ａｂをウェルに加えた。１時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄した。結合したＨＲＰ結合Ａｂは、４ｍＭ  ＯＰＤおよび０．０４％Ｈ２Ｏ２を含有する基質溶液を添加した後、４９０ｎｍで読みとることによって明らかにした。陽性細胞クローンを拡張し、細胞培養上清から、Ａタンパク質カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによりｈＡ２０−１とｈＡ２０−２を精製した。
【０１５４】
実施例４．抗ＣＤ２０抗体の結合活性
親のｃＡ２０および抗ＣＤ２０ Ａｂ ｃ２Ｂ８に対するｈＡ２０の免疫反応性を評価するため、競合細胞結合アッセイ行った。一定量の１２５Ｉ標識マウスＡ２０またはｃ２Ｂ８（１００，０００ｃｐｍ，〜１０μＣｉ／μｇ）を、４℃にて１〜２時間、種々の濃度（０．２〜７００ｎＭ）のｈＡ２０−１、−２、マウスＡ２０、ｃＡ２０またはｃ２Ｂ８の存在下でＲａｊｉ細胞とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄することで結合していないＡｂを除去した。洗浄後、細胞に会合した放射活性を測定した。図６にて示したように、両ヒト化Ａ２０  ｍＡｂ、すなわちｈＡ２０−１およびｈＡ２０−２は、Ｒａｊｉ細胞に対する１２５Ｉ−Ａ２０または１２５Ｉ−ｃ２Ｂ８の結合と競合する場合、Ａ２０、マウス抗ＣＤ２０  ＭＡｂ、ｃＡ２０、およびｃ２Ｂ８、キメラ抗ＣＤ２０  ＭＡｂに匹敵する結合活性を示した。
【０１５５】
Ｒａｊｉ細胞へ放射性標識ＭＡｂを直接結合させ、スケッチャードプロット分析を行うことにより、３．９ｎＭのＣ２Ｂ８と比較し、ｃＡ２０およびｈＡ２０に関してそれぞれ２．９および４．２ｎｍにて解離定数を測定した。in vitro架橋実験では、抗体との複合体に対するヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体はｃＡ２０およびｈＡ２０間でＣ２Ｂ８同様のＲａｊｉ  ＮＨＬ細胞の死滅を示した。
【０１５６】
実施例５．再発性中度非ホジキンリンパ腫患者の治療
ある中度非ホジキンリンパ腫患者は、ＣＨＯＰ×６で４ヶ月間完全緩解を示し、再度のＣＨＯＰ×６で進行を示し、Ｄ−ＭＯＰＰ×２で３ヶ月間安定疾患を示し、さらに末梢幹細胞移植を伴ったＣＶＢで５ヶ月間部分的緩解を示すといった過去の強い化学療法で上手く行かなかった。この患者には頸部リンパ節にコンピューター断層写真および触診で測定可能な再発リンパ腫を有していた。
【０１５７】
この患者に０日、１４日、２８日および４２日に４５０ｍｇのヒト化ＣＤ２０モノクローナル抗体Ａ２０を３時間以内で点滴したところ、点滴中および点滴直後に重大な副作用は見られなかった。８週後、頸部リンパ節の肥大を触診したところ、約５０％の測定可能な退縮を示した。治療後２０週で追跡測定を行ったところ、コンピューター断層写真法により確認しても頸部にも他のいずれの部位にも疾病の痕跡はないことが示された。新たな疾患はどこにも認められないことから、この患者は完全緩解状態にあるとみなされた。１０〜１２週ごとの追跡調査でも、治療後少なくとも１０ヶ月は完全緩解が確認された。
【０１５８】
実施例６．慢性特発性血小板減少性紫斑病患者の治療
慢性特発性血小板減少性紫斑病を有する４５歳の女性はプレドニソン、γグロブリン、および高用量デキサメタゾンで処置されたが、病状が進行した。この患者は脾臓摘出を受けたが、病状を安定化できなかった。この患者の血小板数は３０，０００／μＬより少なくなり、敗血頻度が増えた。次に、この患者にヒト化ＣＤ２０  Ａ２０  ＭＡｂ、第一週目には５００ｍｇ静脈投与し、以降は毎週１回２５０ｍｇの用量を、計４回注射した。最後のＡ２０投与の１週間後、血小板数の顕著な増加が見られ、１５０，０００／ｍＬまでになり、敗血現象がなくなった。最後の抗体注入後５ヶ月で疾病は緩解状態となった。
【０１５９】
実施例７．進行性慢性関節リウマチ患者の治療
指関節、手首および肘に重度の進行性慢性関節リウマチ患者を有する７０歳の女性は、メトトレキサート治療が上手く行かず、Ｅｎｂｒｅｌ療法を施してもわずかな軽減しか見られなかった。次にこの患者を毎週３００ｍｇのＡ２０ヒト化ＣＤ２０ ＭＡｂにて４週間、静脈投与した。３ヶ月後、疾病の活動指標に４０％の改善が見られ、これが５ヶ月間持続した。この患者に再び同じ用量および頻度でＡ２０処置を行った。患者の改善は続き、２回目のＡ２０ ＭＡｂ処置後６ヶ月で６０％の改善が見られた。ヒト抗Ａ２０抗体はＡ２０処置中、または処置後は全く見られなかった。血液から正常なＢ細胞が枯渇していたが、感染合併症またはその他の薬物関連の重大な毒性は見られなかった。
【０１６０】
実施例８．重症性筋無力症患者の治療
６５歳の男性は重症性筋無力症の通常のあらゆる治療が上手く行かず、神経科集中治療施設に入っていた。患者は血漿交換により安定化し、抗アセチルコリン受容体抗体の力価を引き下げるため免疫グロブリンを静脈投与した。患者は寝たきりで、次に、Ａ２０ヒト化ＣＤ２０  ＭＡｂを１週間に１回、１０週間静脈投与した。最後のＡ２０投与の１週間後、血中Ｂ細胞が検出されず、抗アセチルコリン抗体の力価に著しい低下が見られた。最後のＡ２０  ＭＡｂ投与後４週間で患者は動けるようになり、退院した。
【０１６１】
実施例９．リンパ節および骨髄に高悪性度非ホジキンＢ細胞リンパ腫を有するイヌの治療
６５ポンド、７歳の雄ゴールデンレトリーバーが広汎性大細胞高悪性度リンパ腫と診断された。このイヌにビンクリスチン、シクロホスファミド、プレドニソロン、およびドキソルビシンによる組み合わせ化学療法を施したところ、応答は良好であった。しかし、このイヌはその後、進行性リンパ節障害を有すると診断され、この後７ヶ月で骨髄の広範なリンパ腫浸潤、頸部、胸部、腹部、骨盤の広範なリンパ腺症および脾臓腫大症を有することがわかった。
【０１６２】
このイヌに１Ｆ５キメラモノクローナル抗体による処置を施した。イヌに１２０ｍｇの１Ｆ５抗体を静脈注入し、この処置を最初の治療後４週間、毎週繰り返した。最後の１Ｆ５投与後４ヶ月にて、この罹患動物のコンピューター断層スキャンではリンパ腫の痕跡はないことが示され、疾病のあらゆる徴候も症状も見られなかった。
【０１６３】
実施例１０．再発性中度非ホジキンリンパ腫を有するイヌの治療
７８ポンド、９歳の中度非ホジキンリンパ腫を有するジャーマンシェパード犬に化学療法を施し、最初５ヶ月間は完全緩解に至り、その後もう一回化学療法行ったところ、６ヶ月間病状は安定していた。その後、このイヌは胸部と頸部リンパ節に再発性のリンパ腫が見られ、双方ともそれぞれコンピューター断層写真および触診によって診断できるものであった。
【０１６４】
この罹患動物に、毎週各１００ｍｇの用量のＡ２０ヒト化ＣＤ２０抗体の注入と組み合わせて、２週間毎週にてＬ２４３（ＨＬＡ−ＤＲ）モノクローナル抗体の９０Ｙ標識免疫複合体を５０ｍｇ抗体タンパク質中８ｍＣｉの線量で注入した。３週間後、頸部リンパ節の肥大を触診したところ測定可能な低下を示し、一方、胸部のコンピューター断層スキャンを繰り返し行ったところ著しい腫瘍の退縮が示された。処置後１０週目に追跡測定を行ったところ、頸部または胸部の疾病の痕跡は約６０％低下していることが示された。新たな疾患はどこにも認められないことから、この罹患動物は部分的緩解状態にあるとみなされた。１０〜１２週ごとの追跡調査でも、治療後少なくとも７ヶ月は部分緩解が確認された。
【０１６５】
実施例１１．再発性リンパ腫を有するネコの治療
１０ポンド、１２歳のドメスティックショートヘアーは一つの顎下リンパ節の肥大を有していた。切除後、６ヶ月で病巣の再発が見られた。この病巣を再び切除したが、６ヶ月後にまた再発した。次に、このネコに４週間毎週にて、抗ＣＤ２０  Ｂ１モノクローナル抗体の１３１標識免疫複合体を４５ｍｇ抗体タンパク質中１５ｍＣｉの線量にて処置した。３ヶ月後、この処置を繰り返した。最後の処置後３ヶ月で検査したところ、著しい低下を触診することができた。疾病の再発は１年を超えて見られなかった。
【０１６６】
実施例１２．培養またはＳＣＩＤマウスに異種移植されたヒトＮＨＬ細胞におけるキメラおよびヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂの評価
キメラ（ｃＡ２０）およびヒト化（ｈＡ２０）ＣＤ２０抗体の特性をＮＨＬ細胞系統において評価した。これらの結果としては、ｃＡ２０およびｈＡ２０がリツキシマブと同様に挙動し、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ＲＬ、ＤａｕｄｉおよびＳｕ−ＤＨＬ−６細胞の９９％を超えるものが染色され、約５％のリンパ球（推定Ｂ細胞％）と反応した。総てのＢ細胞系統において、Ｍａｂにより特異的増殖阻害が見られたが、阻害のレベルは細胞系統間で異なり、Ｓｕ−ＤＨＬが最も感受性が高かった。架橋していない状態では、マウス抗ＣＤ２０、ｃＡ２０、ｈＡ２０およびリツキシマブは総て７７〜９０％の間の阻害を示した。架橋状態では、増殖阻害は９４〜９８％の範囲であった。リツキシマブ、ｃＡ２０、およびｈＡ２０はまた、架橋二次モノクローナル抗体の存在下で、Ｒａｊｉ細胞においてアポトーシスを誘導する能力が同等であった。
【０１６７】
また、ＳＣＩＤマウスに、第０日に２．５×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈注射した。マウス、キメラおよびヒト化抗ＣＤ２０抗体、ならびにｃＡ２０  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの注射は、１日目に完全抗体１００  ｇ／注射、またはＦ（ａｂ’）２フラグメント６７  ｇ／注射で始め、２週間は週に５回、３週間は週に２回とした。ある試験では、対照マウスは腫瘍接種後１５日（５０％生存期間）で播種性疾患にて死に至ったが、ｃＡ２０処置マウスの５０％生存期間は３８日、ｈＡ２０処置マウスでは２２．５日、およびマウス抗ＣＤ２０処置マウスでは２１日に延長された（ログランク分析により総て統計学的に有意であった（ｐ＞０．００５））。別の研究では、ＣＮＳ麻痺を示す対照マウスは腫瘍接種後１６．５日（５０％生存期間）で播種性疾患にて死に至ったが、ｃＡ２０処置マウスの５０％生存期間は１０５日、ｈＡ２０処置マウスでは７０日、およびリツキシマブ処置マウスでは９８日に延長された（ログランク分析により総て統計学的に有意であった（ｐ＞０．０００１）、図１１））。
【０１６８】
実施例１３．競合的細胞表面結合アッセイ
Ａタンパク質カラムにてアフィニティークロマトグラフィーにより精製したヒト化抗ＣＤ２０  Ａｂ（ｃＡ２０、ｈＡ２０およびｃ１Ｆ５）のＡｇ結合特異性およびアフィニティー研究を、マウス２Ｂ８とリツキシマブ(IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, CA）との細胞表面競合結合アッセイにより評価した（図８）。すなわち、一定量（１００，０００ｃｐｍ〜１０ｉＣｉ／ｉｇ）の１２５Ｉ標識（Ａ）ｍ２Ｂ８または（Ｂ）リツキシマブを、４℃にて１〜２時間、種々の濃度（０．２〜７００ｎＭ）の競合Ａｂ（ｃＡ２０、ｈＡ２０、ｍ２Ｂ８、ｃ１Ｆ５またはリツキシマブ）の存在下でＲａｊｉ細胞とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄することで結合していないＡｂを除去した。洗浄後、細胞と会合した放射活性を測定した。図８（Ａ）はｃＡ２０（四角）、ｈＡ２０−１（三角）、およびｈＡ２０−１（丸）の結合活性をｍ２Ｂ８（ひし形）の結合活性を比較したものであり、図８（Ｂ）はｃＡ２０（四角）、ｃ１Ｆ５（三角）およびリツキシマブ（ひし形）の結合活性を比較したものである。
【０１６９】
別の試験では、ｈＡ２０の結合活性をその他の抗ＣＤ２０  Ａｂ、リツキシマブおよびマウスＢ１と、細胞表面競合結合アッセイにより比較したものである（図９）。すなわち、一定量（１００，０００ｃｐｍ〜１０ｉＣｉ／ｉｇ）の１２５Ｉ標識リツキシマブを、４℃で１〜２時間、種々の濃度（０．２〜７００ｎＭ）の競合Ａｂ、ｈＡ２０（三角）、ｍＢ１（逆三角）またはリツキシマブ（四角）の存在下でＲａｊｉ細胞とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄することにより結合していないＡｂを除去した。洗浄後、細胞と会合した放射活性を測定した。これら３つのＡｂのＩＣ５０値はそれぞれ６．８、３４および５と算出された。
【０１７０】
実施例１４．培養リンパ腫細胞に対する架橋ｈＡ２０およびその他のＣＤ２０  Ａｂの細胞傷害作用
ＣＤ２０抗体複合体を得るため、架橋剤（抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体）の存在下、種々のＣＤ２０ ＡｂにてＲａｊｉ細胞を処理した（図１０）。最終濃度５ｉｇ／ｍＬのｈＡ２０、ｃＡ２０、リツキシマブまたは陽性対照ＡｂであるｈＬＬ１を、２０ｉｇ／ｍＬの架橋剤（赤）を伴って、または架橋剤を伴わずに（オレンジ）、または抗マウスＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体（青）を伴って、Ｒａｊｉ細胞とともに４８時間インキュベートした。全細胞集団および生存細胞集団を、（Ａ）トリパンブルー染色と細胞の計数、または（Ｂ）ＭＴＴアッセイ（Ｂ）により測定した。このデータにより、Ｒａｊｉ  ＮＨＬ細胞の生存に対するｈＡ２０およびリツキシマブの同等の作用が示され、この細胞傷害作用は抗体の特異的架橋に依存することを示した。
【０１７１】
実施例１５．ｈＡ２０およびｈＬＬ２によるin vivo療法
Ｒａｊｉ細胞を２．５×１０６細胞／１００μＬ／マウスにて６０個体のＳＣＩＤマウスに静脈投与した（図１２）。１〜１１日目にＭＡｂを腹腔内投与し、その後、週に２回、約３週間ＭＡｂ注射を行った。試験が終わるまで、毎日動物の体重を測定した。これらの動物の後脚の麻痺を毎日調べた。麻痺が起こっていた場合、動物を犠牲にし、播種性腫瘍瘤の視診のため剖検を行った（特に、肺、腎臓および卵巣）。対照ヒト化ＩｇＧｌ  ＡｂであるｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡ抗体）で処置した対照マウスはＣＮＳ麻痺を示す播種性疾患で死に至った。５０％生存期間は腫瘍静脈接種後１３日であった。ｈＡ２０で処置した群の５０％生存期間は約２５日に延長された。この値はｈＡ２０の約２倍の生存期間の延長に相当する。ｈＬＬ２単独で処置した群は対照マウスと同等の５０％生存期間を示したが、ｈＡ２０およびｈＬＬ２の組み合わせ処置はマウスの５０％生存期間を約３０日に引き延ばした。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】マウス抗ＣＤ２０を産生するハイブリドーマ細胞株からＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたＶ遺伝子配列を示し、Ａ２０抗体の可変Ｌ鎖（図１Ａ）およびＨ鎖（図１Ｂ）の推定アミノ酸配列をそれぞれＡ２０ＶｋおよびＡ２０ＶＨとして示している。下線矢印は、クローニングに使用したＰＣＲプライマー配列を示す。Ｋａｂａｔのナンバリング法により定義される推定ＣＤＲ領域配列が太字および下線で示されている。アミノ酸配列は、一文字コードとして相当するヌクレオチド配列の下に示されている。このＫａｂａｔのナンバリング法は、アミノ酸残基に用いられる。一つの文字によりナンバリングされるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔに従って挿入残基を表し、前の残基の番号と同じ番号を持っている。例えば、図１Ｂの残基８２、８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃは、それぞれ８２Ａ、ＢおよびＣとして示される。
【図２】可変Ｌ鎖Ｖｋおよび可変Ｈ鎖ＶＨ、ｃＡ２０配列、キメラ抗ＣＤ２０抗体を示す。ＣＤＲ領域の配列が太字および下線で示されている。アミノ酸残基およびヌクレオチドは順次ナンバリングされ、同じナンバリングシステムがヒト化Ｖ配列に用いられている。Ｌ鎖可変領域を図２Ａに、そしてＨ鎖可変領域を図２Ｂに示している。ナンバリングシステムは図１と同様である。ｃＡ２０の構築に用いられた制限部位には下線が施されている。
【図３】１２５Ｉ標識Ａ２０に対する細胞表面競合結合アッセイにおけるキメラＡ２０（ｃＡ２０）およびマウスＡ２０（Ａ２０）の結合親和性の比較を示す。マウスＡ２０（黒ひし形）と同様に、ｃＡ２０の濃度が増加すると放射性標識Ａ２０のＲａｊｉ細胞への結合が阻害される（黒丸で示す）。
【図４】ヒト抗体およびキメラならびにヒト化抗ＣＤ２０抗体の可変Ｈ鎖（ＶＨ）と可変Ｌ鎖（Ｖｋ）のアミノ酸配列の比較である。図４Ａはヒト抗体、ＥＵおよびＮＥＷＭ（ＦＲ４のみ）、キメラ抗体（ｃＡ２０ＶＨ）および二つのヒト化抗体（ｈＡ２０ＶＨ１およびｈＡ２０ＶＨ２）の可変Ｈ鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列の比較であり、図４Ｂはヒト抗体（ＲＥＩＶｋ）、キメラ抗体（ｃＡ２０Ｖｋ）、およびヒト化抗体（ｈＡ２０Ｖｋ）の可変Ｌ鎖（Ｖｋ）のアミノ酸配列の比較である。点は、Ａ２０中の残基がヒト抗体中の相当する残基と同一であることを示す。ＣＤＲは四角で囲んだ領域である。アミノ酸残基のナンバリングにはＫａｂａｔのナンバリング法を用いた。
【図５】ｈＡ２０のＬ鎖Ｖ遺伝子（ｈＡ２０Ｖｋ）（図５Ａ）のヌクレオチド配列、および、ｈＡ２０ＶＨ１（図５Ｂ）およびｈＡ２０ＶＨ２（図５Ｃ）のＨ鎖Ｖ遺伝子のヌクレオチド配列、ならびにＶＫｐＢＲ２（図５Ａ）およびＶＨｐＢＳ２（図５Ｂおよび５Ｃ）ステージングベクターの隣接フランキング配列をそれぞれ示す。非翻訳ヌクレオチド配列は小文字で示してある。サブクローニングに用いた制限部位には下線を施して示している。分泌シグナルペプチド配列は二重下線を施して示している。ＶｋおよびＶＨアミノ酸残基のナンバリングは図２と同様に行った。
【図６】二つのヒト化Ａ２０抗体（ｈＡ２０−１およびｈＡ２０−２）の結合活性と、Ａ２０、ｃＡ２０およびキメラ抗ＣＤ２０ ＭＡｂ、ｃ２Ｂ８の結合活性を比較する細胞表面競合結合アッセイの結果を示す。図６ＡはｈＡ２０−１（黒三角）およびｈＡ２０−２（黒丸）およびマウス抗ＣＤ２０抗体、Ａ２０（黒四角）がＲａｊｉ細胞への１２５Ｉ−Ａ２０の結合についてほぼ等しく競合していることを示す。図６ＢはｈＡ２０−１（黒丸）、ｃＡ２０（黒四角）およびｃ２Ｂ８（黒ひし形）がＲａｊｉ細胞への１２５Ｉ−ｃ２Ｂ８の結合についてほぼ等しく競合していることを示す。
【図７】ヒトＩｇＧ１（ＣＨ-ヒンジ）の定常領域（図７Ａ）、およびヒトカッパ鎖（Ｃｋ）の定常領域（図７Ｂ）を示す。
【図８】競合細胞表面結合アッセイを示す。ヒト化抗ＣＤ２０Ａｂｓ  （Ａタンパク質カラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたｃＡ２０、ｈＡ２０およびｃ１Ｆ５）のＡｇ−結合特異性および親和性試験を、マウス２Ｂ８およびリツキシマブ（IDEC Pharmaceuticals Corp. , San Diego, CA）を用いる細胞表面競合結合アッセイにより行った。図８（Ａ）は、ｃＡ２０（四角）、ｈＡ２０−１（三角）およびｈＡ２０−１（丸）の結合活性と、ｍ２Ｂ８（ひし形）のそれとを比較したものであり、図８（Ｂ）はｃＡ２０（四角）、ｃ１Ｆ５（三角）およびリツキシマブ（ひし形）の結合活性を比較したものである。
【図９】ｈＡ２０の結合活性を、リツキシマブおよびマウスＢ１を含む他の抗ＣＤ２０Ａｂと細胞表面競合結合アッセイにより比較した試験である。一定量（１００,０００ｃｐｍ、〜１０ｉＣｉ／ｉｇ）の１２５Ｉ標識リツキシマブを、種々の濃度の（０.２〜７００ｎＭ）の競合Ａｂ、ｈＡ２０（三角）、ｍＢ１（逆三角）またはリツキシマブ（四角）の存在下、４℃にてＲａｊｉ細胞と１〜２時間インキュベートした。
【図１０】架橋結合したｈＡ２０および他のＣＤ２０Ａｂの、培養リンパ腫細胞に対する細胞傷害作用を示す。総細胞数および生存細胞数は、（Ａ）トリパンブルー染色および細胞計数または（Ｂ）ＭＴＴアッセイにより測定した。
【図１１】種々の抗ＣＤ２０および他のＡｂを用いるin vivo治療試験のグラフである。ＳＣＩＤマウスにＲａｊｉ細胞を静脈内注射し、播種性疾患であるＲａｊｉリンパ腫モデルを作製した。
【図１２】ｈＡ２０およびｈＬＬ２を用いるｉｎ ｖｉｖｏ治療試験のグラフである。ＳＣＩＤマウスにＲａｊｉ細胞を静脈内注射し、播種性疾患であるＲａｊｉリンパ腫モデルを作製した。
【図１Ａ】
0004498746.tif 000005
【図１Ｂ】
0004498746.tif 000006
【図２Ａ】
0004498746.tif 000007
【図２Ｂ】
0004498746.tif 000008
【図３】
0004498746.tif 000009
【図４Ａ】
0004498746.tif 000010
【図４Ｂ】
0004498746.tif 000011
【図５Ａ】
0004498746.tif 000012
【図５Ｂ】
0004498746.tif 000013
【図５Ｃ】
0004498746.tif 000014
【図６Ａ】
0004498746.tif 000015
【図６Ｂ】
0004498746.tif 000016
【図７Ａ】
0004498746.tif 000017
【図７Ｂ】
0004498746.tif 000018
【図８】
0004498746.tif 000019
【図９】
0004498746.tif 000020
【図１０】
0004498746.tif 000021
【図１１】
0004498746.tif 000022
【図１２】
0004498746.tif 000023