(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍剤をスクリーニングする方法であって、
（a）  （i）Sp3タンパク質の転写活性化ドメインの2つのglutamine-richドメインのうちの少なくとも1つを含む領域および異種タンパク質のDNA結合能を有する領域を含む融合タンパク質をコードするDNAを発現可能に含む第一のベクター、並びに（ii）該異種タンパク質の結合配列を含み、該融合タンパク質が結合した際に活性化する発現制御配列およびその下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含む第二のベクター、を保持する細胞を提供する工程、
（b）  該細胞に対し、被検試料を接触させ、該レポーター活性を測定する工程、
（c）  被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活性を増加させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項２】
異種タンパク質がGAL4タンパク質、LexAタンパク質、またはテトラサイクリンリプレッサータンパク質である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ヒト成長ホルモン、または分泌型アルカリホスファターゼをコードする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
Sp3タンパク質の転写活性化ドメインの2つのglutamine-richドメインのうちの少なくとも1つを含む領域がSp3タンパク質の転写活性化ドメインである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
融合タンパク質がSp3タンパク質のDNA結合ドメインの少なくとも一部を欠損している、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗腫瘍剤をスクリーニングする方法に関する。より詳しくは、腫瘍抑制のメカニズムに関連するＳｐ３タンパク質を標的とした抗腫瘍剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
癌とは、細胞周期、分化および形態を制御する正常な機構を破壊する一連の遺伝子変化の結果生じるものである。様々な癌細胞や形質転換細胞において、脱制御された細胞周期を停止させたり、分化を誘導したり、あるいは異常形態を正常形態に戻しうる能力に基づいて、数多くの天然化合物が単離されている。トリコスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ；以下ＴＳＡと略す）（Ｓｕｇｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２，１６８−１７２）およびｔｒａｐｏｘｉｎ  （Ｉｔａｚａｋｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，４３，１５２４−１５３２）もまた、脱形質転換能を有する物質として単離された。しかもこれらの物質は、分化および細胞周期の停止も誘導する。しかしながらこれらの物質がいかにしてそのような抗腫瘍活性示すかは不明であった。
近年、ヒストン脱アセチル化酵素（以下ＨＤＡＣと略）が、これら薬剤の標的であると考えられている。実際、ＴＳＡおよびｔｒａｐｏｘｉｎは、抗腫瘍活性効果が認められたのと同様の濃度において、ＨＤＡＣ活性を阻害する（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１７１７４−１７１７９；Ｋｉｊｉｍａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２４２９−２２４３５）。急速に累積されてゆく知見は、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質のアセチル化および脱アセチル化が、真核細胞の転写制御において重要な役割を果たしていることを示唆している（Ｗｏｌｆｆｅ  ＡＰ  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｓ  Ｄ．（１９９６）．Ｃｅｌｌ，８４，８１７−８１９、Ｗａｄｅ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．ＴＩＢＳ，２２，１２８−１３２；Ｐａｚｉｎ  ＭＪ  ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ  ＪＴ．（１９９７）．Ｃｅｌｌ，８９，３２５−３２８；Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．（１９９８）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２，５９９−６０６；Ｋｕｏ  ＭＨ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓ  ＣＤ．（１９９８）．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２０，６１５−６２６）。多くの転写因子、転写活性補因子および基本転写開始複合体タンパク質がヒストンアセチル化酵素活性を有していることから、ヒストンのアセチル化が転写開始および促進に重要な役割を果たしていることが明らかとなってきた。また、近年の幾つかのＨＤＡＣのクローニングや転写抑制因子、転写抑制補因子がＨＤＡＣと複合体を形成することから（Ｗｏｌｆｆｅ  ＡＰ．（１９９７）．Ｎａｔｕｒｅ，３８７，１６−１７）、ＨＤＡＣが転写抑制においては重要な役割を果たしていることが徐々に明らかとなってきた。ＨＤＡＣ阻害剤が抗腫瘍活性を示すことから、ＨＤＡＣは、その遺伝子産物が細胞増殖の停止や分化を誘導する抗腫瘍遺伝子群の転写を抑制していると考えられるのかも知れない（ＤｅＰｉｎｈｏ  ＲＡ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ，３９１，５３３−５３６）。
以前に本発明者らは、分化誘導剤としてよく知られており、ｍＭ濃度でＨＤＡＣ阻害剤としても作用する酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅ）が、ｐ５３非依存形式でサイクリン−ＣＤＫ阻害因子（負の細胞周期調節因子）であるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の発現を誘導することを証明した（Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２１９９−２２２０６）。さらに本発者らは、ｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅとＴＳＡの両方がＳｐ１結合配列を介して、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子プロモーターを活性化させることも報告した（Ｓｏｗａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４１，１４２−１５０）。興味深いことに、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターのＳｐ１結合部位はＴＧＦ−β、ｐｈｏｒｂｏｌｅｓｔｅｒ、ｏｋａｄａｉｃ  ａｃｉｄ、ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅあるいはｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ阻害剤ＧＧＴＩ−２９８によるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１誘導の際にも関与することが近年報告されている（Ｄａｔｔｏ  ＭＢ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２８６２３−２８６２８；Ｂｉｇｇｓ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９０１−９０６；Ａｄｎａｎｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８，６９６２−６９７０；Ｏｗｅｎ  ＧＩ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１０６９６−１０７０１）。これらのうち、ＴＧＦ−βやＧＧＴＩ−２９８はＳｐ１の転写活性を増強することにより、また、ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅについてもＳｐ１およびＣＢＰ／ｐ３００を介してｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の転写を誘導することが報告されている（Ｌｉ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，２４４９−２４５６；Ｏｗｅｎ  ＧＩ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１０６９６−１０７０１）。
これらの報告は、Ｓｐ１を介したヒストンアセチル化酵素の活性化による転写誘導を示唆するものと考えられる。ヒストンアセチル化は数多くの遺伝子の転写活性化に関与すると考えられてきている。逆にヒストン脱アセチル化は転写抑制に関与すると考えられているが、詳細な機構は明らかでない。近年、転写抑制因子であるＮ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴが核内転写因子に結合することによりＤＮＡ配列特異的に転写を抑制することが報告されている（Ｈｏｒｌｅｉｎ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｎａｔｕｒｅ，３７７，３９７−４０４；Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｎａｔｕｒｅ，３７７，４５１−４５４．；Ｃｈｅｎ  ＪＤ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ  ＲＭ．（１９９５）．Ｎａｔｕｒｅ，３７７，４５４−４５７）。また、これらの因子は同時にＨＤＡＣと結合して高次複合体を形成することから、ヒストン脱アセチル化を介してクロマチンの構造を強固にすることにより転写が抑制されることが示唆されている（Ｐａｚｉｎ  ＭＪ  ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ  ＪＴ．（１９９７）．Ｃｅｌｌ，８９，３２５−３２８；Ｈｅｉｎｚｅｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｎａｔｕｒｅ，３８７，４３−４８；Ａｌｌａｎｄ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８７，４９−５５）。実際に、ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａあるいはｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒタンパク質とレチノイン酸受容体の融合タンパク質を用いた検討からは、ＨＤＡＣの結合が転写抑制に必要であることが示されている（Ｌｉｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８１１−８１４；Ｇｒｉｇｎａｎｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８１５−８１８；Ｈｅ  ＬＺ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１８，１２６−１３５）。同様のＨＤＡＣを介したＤＮＡ配列特異的な転写抑制機構はＭｙｃ／Ｍａｄ／Ｍａｘ（Ｈａｓｓｉｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｃｅｌｌ，８９，３４１−３４７；Ｌａｈｅｒｔｙ  ＣＤ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｃｅｌｌ，８９，３４９−３５６）、Ｅ２Ｆ／Ｒｂ（Ｂｒｅｈｍ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ，３９１，５９７−６０１；Ｍａｇｎａｇｈｉ−Ｊａｕｌｉｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ，３９１，６０１−６０５；Ｌｕｏ  ＲＸ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｃｅｌｌ，９２，４６３−４７３）あるいはＤＮＡメチル化（Ｎａｎ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ，３９３，３８６−３８９；Ｊｏｎｅｓ  ＰＬ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１９，１８７−１９１）の場合にも明らかになっている。しかしながら、Ｓｐ１結合配列に結合能をもつ特異的転写因子が、ＨＤＡＣ阻害剤による転写活性化シグナルを介在するか否かは不明であった。
発明の開示
本発明は、効率的な抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、抗腫瘍効果を示し、またＨＤＡＣ阻害剤として知られているＴＳＡが、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターをＳｐ１結合配列を介して活性化することを報告している（Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，２７２，２２１９９−２２２０６、Ｓｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４１，１４２−１５０）。本発明者らは、このＴＳＡ刺激に応答したｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターの活性化におけるシグナル伝達に関与する新たな分子を同定することにより、該分子を標的とした抗腫瘍剤のスクリーニングが可能となると考えた。
そこで、本発明者らは、まず、ＴＳＡによるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターの活性化において、該プロモータのＳｐ１結合配列に結合している因子をＭＧ６３細胞核抽出物のゲルシフトアッセイにより検索し、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターのＳｐ１結合配列にはＳｐ１およびＳｐ３（Ｌａｎｉａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２９，１３１３−１３２３）が主に結合していることを明らかにした。
また、本発明者らは、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターとは別に、ＧＡＬ４結合配列依存性に活性化されるルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いたアッセイ系によりＳｐ１およびＳｐ３の機能の検討を行い、ＧＡＬ４とＳｐ３の融合タンパク質であるＧＡＬ４−Ｓｐ３の存在下ではＴＳＡによるレポーター遺伝子の転写誘導が起こるが、ＧＡＬ４とＳｐ１の融合タンパク質であるＧＡＬ４−Ｓｐ１にはこの作用がないことを明らかにした。さらに、Ｓｐ３の種々の欠失変異体を作成することにより、転写活性化ドメインに２箇所存在するグルタミンリッチ（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｒｉｃｈ）ドメインのうち少なくとも１つを有すれば、ＴＳＡ刺激に応答した転写活性化が生じうることを示した。さらに、転写活性化ドメインを欠失したドミナントネガティブＳｐ３の強制発現により、ＴＳＡによるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターおよびＳｐ１結合配列活性化プロモーターの活性化が抑制されることを明らかにした。
これら結果は、ＴＳＡによるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の転写活性化にＳｐ３が関与していることを証明するものであり、さらに、Ｓｐ３を標的として抗腫瘍剤のスクリーニングが可能であることを示唆するものである。本発明者らにより開発された、ＧＡＬ４結合配列依存性に活性化されるルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いたアッセイ系は、効率的な抗腫瘍剤のスクリーニングに特に好適である。
本発明は、腫瘍抑制のメカニズムに関連するＳｐ３タンパク質を標的とした抗腫瘍剤のスクリーニング方法、特にＧＡＬ４結合配列依存性に活性化されるルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いて効率的に抗腫瘍剤をスクリーニングする方法に関する。
より具体的には、本発明は、
（１）  抗腫瘍剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  （ｉ）Ｓｐ３タンパク質の転写活性化能を有する領域および異種タンパク質のＤＮＡ結合能を有する領域を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む第一のベクター、並びに（ｉｉ）該異種タンパク質の結合配列を含み、該融合タンパク質が結合した際に活性化する発現制御配列およびその下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含む第二のベクター、を保持する細胞を提供する工程、
（ｂ）  該細胞に対し、被検試料を接触させ、該レポーター活性を測定する工程、
（ｃ）  被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活性を増加させる化合物を選択する工程、を含む方法、
（２）  異種タンパク質がＧＡＬ４タンパク質、ＬｅｘＡタンパク質、またはテトラサイクリンリプレッサータンパク質である、（１）に記載の方法、
（３）  レポーター遺伝子がルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ヒト成長ホルモン、または分泌型アルカリホスファターゼをコードする、（１）または（２）に記載の方法、
（４）  Ｓｐ３を介する転写活性を促進する化合物を有効成分とする抗腫瘍剤、
（５）  （１）から（３）のいずれかに記載のスクリーニングにより単離しうる、（４）に記載の抗腫瘍剤、に関する。
実施例に示したように、Ｓｐ３の転写活性化ドメインは、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐプロモーターからの転写を上昇させる作用を有する。ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐは細胞増殖抑制効果を有しており、制癌作用を有することが知られているＴＳＡにより発現が上昇する遺伝子である。また、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐの発現は、抗腫瘍効果と深い関連がある複数のＨＤＡＣ阻害剤により、Ｓｐ１結合配列を介して誘導されることが知られている。本発明により、このＳｐ１結合配列を介した転写誘導には、Ｓｐ３が関与していることが示されたことから、Ｓｐ３の活性を促進させることにより細胞の異常増殖を抑制し、腫瘍に対する治療や予防を行うことが可能となると考えられる。
本発明の抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、このようにＳｐ３がＴＳＡ刺激による抗腫瘍効果の発現のシグナル伝達に関与するという、本発明者らにより見出された知見に基づくものである。さらに、本発明者らにより開発されたレポーター遺伝子を利用したＳｐ３の転写活性の検出系が、ＴＳＡのような抗腫瘍効果を示す化合物のスクリーニングに利用しうるという知見にも基づくものである。
本発明のスクリーニング方法の原理は、以下のごとくである。まず、Ｓｐ３タンパク質の転写活性化能を有する領域および異種タンパク質のＤＮＡ結合能を有する領域を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む第一のベクター、並びに該異種タンパク質の結合配列を含み、該融合タンパク質が結合した際に活性化する発現制御配列およびその下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含む第二のベクターを構築し、これを細胞に導入する。この細胞では、第一のベクターに由来して、Ｓｐ３タンパク質の転写活性化能を有する領域および異種タンパク質のＤＮＡ結合能を有する領域を含む融合タンパク質が発現し、その中の異種タンパク質由来のＤＮＡ結合領域を介して第二のベクター上の発現制御領域に結合する。この細胞に、ＴＳＡのような抗腫瘍のシグナルに正に作用する化合物が接触した場合、該融合タンパク質の中のＳｐ３タンパク質由来の転写活性化領域を介して第二ベクターの発現制御領域の下流に存在するレポーター遺伝子の転写を活性化するか、あるいは転写抑制を解除することにより、該レポーター遺伝子の発現が誘導される。従って、このレポーター遺伝子を用いたアッセイ系を利用すれば、被検試料を細胞に接触させた後の細胞におけるレポーター活性を検出することにより、効率的にＳｐ３を介した抗腫瘍剤のスクリーニングを行うことができるのである。
即ち、本発明のスクリーニング方法は、（ａ）（ｉ）Ｓｐ３タンパク質の転写活性化能を有する領域および異種タンパク質のＤＮＡ結合能を有する領域を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む第一のベクター、並びに（ｉｉ）該異種タンパク質の結合配列を含み、該融合タンパク質が結合した際に活性化する発現制御配列およびその下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含む第二のベクター、を保持する細胞を提供する工程、（ｂ）  該細胞に対し、被検試料を接触させ、該レポーター活性を測定する工程、（ｃ）  被検試料を該細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活性を増加させる化合物を選択する工程、を含むものである。
本発明のスクリーニングに用いられる第一のベクターは、Ｓｐ３タンパク質の転写活性化能を有する領域および異種タンパク質のＤＮＡ結合能を有する領域を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含む。「発現可能に含む」とは、融合タンパク質をコードするＤＮＡがベクターにおいてその発現を保証する発現制御領域（例えば、プロモーターやエンハンサー）に結合していることを指す。例えば、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ベクター内でＣＭＶプロモーターなどの適当なプロモーターの下流に挿入されており、該ベクターは、動物細胞や酵母細胞などの適当な宿主細胞内において、該融合タンパク質を発現することができる。
第一のベクターにより発現される融合タンパク質に含まれるＳｐ３タンパク質の転写活性化能を有する領域としては、ＴＳＡ刺激に応答して転写活性化しうる領域を含む限り特に制限はない。好ましくは、転写活性化ドメインの少なくとも一部を含み、ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部を欠失している。Ｓｐ３由来のＤＮＡ結合領域は存在していても、本発明のスクリーニングは可能であるが、該領域が存在するとこれを含む融合タンパク質が内在性の種々のＳｐ１結合配列に結合するため好ましくない。ヒトＳｐ３タンパク質であれば、好ましくは２つのｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｒｉｃｈ領域（アミノ酸１０〜１２３およびアミノ酸２２３〜３５８）のいずれか一方または双方を含み、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ領域（アミノ酸４９５から５１７、５２５から５４７、および５５５から５７５）の少なくとも一部を含まない（Ｃｈｒｉｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１２：４２５１−４２６１）。Ｓｐ３タンパク質が由来する生物種に制限はない。例えば、ヒトや哺乳動物由来のＳｐ３タンパク質、その他の生物種のＳｐ３タンパク質を用いることができる。
具体的には、図３に示した、ヒトＳｐ３タンパク質のアミノ酸配列の１から３９８位の領域、８１から３９８位の領域、１６１から３９８位の領域、１から３２０位の領域、１から２４０位の領域、１から１６０位の領域を本発明において好適に利用することができるが、これらに制限されない。
また、第一のベクターにより発現される融合タンパク質に含まれる異種タンパク質としては、特定のＤＮＡ配列に特異的に結合しうるタンパク質であれば特に制限はない。例えば、ＧＡＬ４タンパク質、ＬｅｘＡタンパク質（Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ，７５：７９１−８０３）、テトラサイクリン  リプレッサータンパク質（Ｔｅｔ  Ｒ）（Ｍａｎｆｒｅｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）などが挙げられるが、これらに制限されない。また、特定のＤＮＡ配列に特異的に結合しうる限り、これらタンパク質の部分ペプチドであってもよい。異種タンパク質のＤＮＡ結合能を有する領域としては、例えば、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（例えばアミノ酸１〜９４、または１〜１４７）、ＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（例えばアミノ酸１〜２０２）（Ｅｒｉｃａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３００６−３０１４）、テトラサイクリン  リプレッサータンパク質（Ｔｅｔ  Ｒ）のＤＮＡ結合ドメイン（Ｍａｎｆｒｅｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）などを含むペプチドが挙げられるが、これらに制限されない。
本発明の第二のベクターは、異種タンパク質の結合配列を含み、該融合タンパク質が結合した際に活性化する発現制御配列およびその下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含む。
本発明の第二のベクターの構築に用いられる異種タンパク質の結合配列としては、第一の発現ベクターから発現誘導された融合タンパク質が特異的に結合しうる配列であれば特に制限はない。例えば、融合タンパク質がＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域を含む場合、結合配列としては、例えば「５’−ｃｇｇａｓｇａｃｗｇｔｃｓｔｃｃｇ−３’；ｓ＝ｃまたはｇ，ｗ＝ａまたはｔ」（Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４０８−４１４）が挙げられる。また、融合タンパク質がＬｅｘＡ  ＤＮＡ結合領域を含む場合、結合配列としては、例えば「５’−ｃｔｇｔｎｎｎｎｎｎｎｎａｃａｇ−３’；ｎ＝ａ、ｔ、ｇ、またはｃ」（Ｅｒｉｃａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３００６−３０１４）が挙げられる。また、融合タンパク質がテトラサイクリン  リプレッサータンパク質（Ｔｅｔ  Ｒ）のＤＮＡ結合ドメインを含む場合、結合配列としては、例えば「５’−ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ−３’」（Ｍａｎｆｒｅｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）が挙げられる。
該結合配列は、ベクターが導入される細胞の内因性タンパク質により認識されないものを用いることが好ましい。内因性タンパク質により認識される配列を用いた場合には、内因性タンパク質の作用に応答したレポーター活性が検出されるおそれがあるため好ましくない。
該結合配列に第一のベクター由来の融合タンパク質が結合した際の、下流のレポーター遺伝子の発現を保証するために、第二のベクターにおける発現制御配列には、該結合配列以外に、プロモーター配列（例えば、ＴＡＴＡ配列、Ｋｏｚａｋ配列などを含みうる）を含むことができる。
第一のベクターからの融合タンパク質がそのＤＮＡ結合能を有する領域として、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを用いる場合、第二のベクターに用いられる発現制御配列としては、例えば、５×ＧＡＬ４結合配列、Ｅ１Ｂ最小プロモーターおよびＴＡＴＡ配列を含むＤＮＡ配列を用いることができる。
本発明の第二のベクターにおいては、該発現制御配列の下流にレポーター遺伝子を機能的に結合する。「機能的に結合」とは、レポーター遺伝子が、第一のベクター由来の融合タンパク質の発現制御配列への結合に応答して発現するように、該発現制御配列に結合していることを指す。
本発明において用いられるレポーター遺伝子としては、その発現産物が検出可能であれば特に制限はないが、ノーザン解析やウェスタン解析などの煩雑な操作を行わずに該発現産物を検出できるものが好ましい。好ましいレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子などが挙げられる。
本発明のスクリーニングに利用する細胞としては特に制限はなく、例えばヒトまたは哺乳動物の細胞、例えばｐ５３が遺伝的に欠失したＭＧ６３細胞（ヒト骨肉腫由来の細胞株）を用いることができる。また、酵母細胞や大腸菌などの微生物細胞を用いることもできる。ベクターの作成のための遺伝子操作や細胞へのベクターの導入などは、当業者に公知の方法を利用することができる。
本発明のスクリーニングにおいては、上記２つのベクターが導入された細胞に対し、被検試料を接触させ、レポーター活性を測定する。
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、天然物抽出液などが挙げられるが、これらに制限されない。細胞への被検試料の接触は、被検試料の種類に応じて、被検試料の細胞培養培地への添加や被検試料の細胞内への導入（遺伝子導入も含む）などの方法で行うことができる。
レポーター活性は、レポーター遺伝子の種類に応じて当業者に公知の方法により検出することができる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、細胞抽出液にルシフェラーゼの基質を加え、酵素反応により発生する発光量を化学発光検出器により検出することができる。また、レポーター遺伝子としてＣＡＴ遺伝子を用いた場合には、細胞抽出液中のＣＡＴ量を抗ＣＡＴ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により検出することができる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた場合には、細胞抽出液にβ−ガラクトシダーゼの基質を加え、酵素反応により発生する発光量を化学発光検出器により検出することができる。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子を用いた場合には、細胞培養液中のｈＧＨ量を抗ｈＧＨ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により検出することができる。また、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を用いた場合には、細胞培養液にアルカリホスファターゼの基質を加え、酵素反応により発生する発光量を化学発光検出器により検出することができる。
レポーター活性の測定の結果、被検試料を接触させない場合（対照）に比べレポーター活性の有意な上昇が認められれば、用いた被検化合物は腫瘍の増殖を抑制する化合物の候補となる。
本発明において、抗腫瘍効果に関連するＴＳＡからのシグナル伝達において、Ｓｐ３を介する転写活性が促進することが示された。この事実は、Ｓｐ３を介する転写活性を促進することができる化合物が、抗腫瘍効果を有しうることを示すものである。従って、本発明は、また、Ｓｐ３を介する転写活性を促進する化合物を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
このようなＳｐ３活性を促進する化合物としては、種々の作用点を有するものが考えられる。例えば、Ｓｐ３に直接作用してその機能を促進するもの、Ｓｐ３に結合する分子に作用して間接的にＳｐ３の機能を促進するもの、Ｓｐ３のＤＮＡへの結合から転写に至るまでの反応に関与するタンパク質群に作用するもの、Ｓｐ３とＨＤＡＣとの相互作用を阻害するもの、ＨＤＡＣの活性を阻害するもの、Ｓｐ１の機能を阻害するものが含まれる。このような化合物は、上記の本発明のスクリーニングにより単離することが可能である。
本発明のＳｐ３を介する転写活性を促進する化合物は、広範囲の腫瘍に適用可能と考えられる。特に、Ｓｐ３を介したｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の発現誘導はｐ５３非依存的であることから、ｐ５３に変異または欠失を持つ腫瘍に対しても適用できることが期待される。
本発明のＳｐ３を介する転写活性を促進する化合物を、医薬品として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることが可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。
患者への投与は、化合物の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われうる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターのＳｐ１結合配列のゲルシフトアッセイ
ＴＳＡはｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＳｐ１結合配列を介して、ｐ５３非依存性にｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子の転写を誘導する。そこで、この誘導機序を解明する目的で、ＴＳＡによる転写誘導に必須である転写開始点より−８７〜−７２ｂｐをｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プローブとして以下のようにしてゲルシフトアッセイ（Ｅｌｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ；ＥＭＳＡ）による結合タンパク質の解析を行った。
（１−１）  細胞培養および核抽出液の調製
まずＭＧ６３細胞を、１０％牛胎仔血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５％ＣＯ２大気湿条件下、３７℃にて培養した。この細胞の核抽出液を、Ｄｉｇｎａｍらの方法（Ｄｉｇｎａｍ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１４７５−１４８９）に従い、ＴＳＡ刺激および未刺激細胞より調製した。まず、ディッシュ（１００ｍｍ）に培養した細胞を５００ｎｇ／ｍｌのＴＳＡ（和光純薬）で２４時間インキュベートした後、０．５ｍＭ  ４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｅｉｄｅ・ＨＣｌ（ｐ−ＡＢＳＦ）（和光純薬）を含む冷ＰＢＳで２回洗浄し、ディッシュより掻き取って、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ＮａＶＯ４、０．５ｍＭ  ｐ−ＡＢＳＦを含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）に懸濁した。氷上で１０分間静置した後、ダウンス型ホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。３，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心の後、核を４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ＮａＶＯ４、０．５ｍＭ  ｐ−ＡＢＳＦを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）に再懸濁し、４℃にて６０分間撹拌、核成分を溶出した。その溶出液を３５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃で遠心し、その上清を核抽出液として回収した。得られた核抽出液は、４００ｍＭ  ＫＣｌ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  ＮａＶＯ４、０．５ｍＭ  ｐ−ＡＢＳＦを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）に対して透析を行い、−８０℃に保存した。
（１−２）  ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
次に、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子の転写開始点より−８７〜−７２ｂｐに存在するＴＳＡ依存性のプロモーター配列（５’−ＣＧＧＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴ−３’／配列番号：１）をもとにオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＣＴＣＧＧＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴ−３’／配列番号：２、および５’−ＴＣＧＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＣＣＣＧ−３’／配列番号：３）を合成し、アニール後、［α−３３Ｐ］ｄＣＴＰ、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＤＮＡをラベルし、これをＤＮＡプローブとした。上記の核抽出液（８μｇ）を２０μｌの反応液（８ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２４ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＣｌ（ｐＨ７．９）、１２０ｍＭ  ＫＣｌ、２４％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））中で５分間インキュベートした後、３３ＰラベルしたＤＮＡプローブ（比活性５０，０００ｃｐｍ／μｌ）を加えてさらに２０分間結合反応を行った。なお、後述の抗体によるスーパーシフトの実験では、さらに２μｇの抗Ｓｐ１あるいは１μｇ抗Ｓｐ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−５９Ｘ  ａｎｄ  ｓｃ−６４４Ｘ）を加えて２０分間インキュベートした。反応液を６％アクリルアミドゲルにて泳動し、ＢＡＳ  ２０００（Ｆｕｊｉｘ）を用いてｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プローブに結合するタンパク質を検出した。
（１−３）  結果
ＴＳＡ刺激および未刺激のＭＧ６３細胞より調製した核抽出液をｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プローブと反応させ、上記のゲルシフトアッセイを行ったところ、２本の特異的なバンドが検出された（図１、１および５）。ついで、抗Ｓｐ１あるいは抗Ｓｐ３抗体を用いて、上述の方法によりスーパーシフトによる各バンドの反応性を見たところ、抗Ｓｐ１抗体により上側のバンドの一部、抗Ｓｐ３抗体で上側のバンドの一部と下側の２本のバンドがシフトし、抗Ｓｐ１抗体と抗Ｓｐ３抗体を両方加えることで、すべてのバンドのシフトが観察された（図１）。Ｓｐ３の２本のバンドはそれぞれ高分子（９７ｋＤａ）と低分子（６０ｋＤａと６５ｋＤａ）のＳｐ３タンパク質に由来すると考えられる（Ｇｕｓｔａｖ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３，３８４３−３８５１；  Ａｄｄａｎｋｉ  Ｐ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，２０１２−２０１９）。したがって、ＭＧ６３細胞の核抽出液に存在するＳｐ１およびＳｐ３が実際にｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１のＳｐ１結合部位と結合することが示され、Ｓｐ１およびＳｐ３がＴＳＡ依存性の転写誘導に関与することが示唆された。これらの結果は以前の本発明者らの報告（Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２１９９−２２２０６）および他のグループの報告（Ｄａｔｔｏ  ＭＢ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２７０，２８６２３−２８６２８；Ａｄｎａｎｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８，６９６２−６９７０）と一致した。しかしながら、ＴＳＡによる刺激の有無によりＳｐ１およびＳｐ３のＤＮＡ結合量には差が認められなかった（図１）。このことから、ＴＳＡ依存性の転写誘導はＳｐ１あるいはＳｐ３の発現量あるいはＤＮＡ結合能の変化以外の機序によるものと推察された。これは同じくＨＤＡＣ阻害剤であるｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅを用いた本発明者らの報告（Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２１９９−２２２０６）およびＴＧＦ−β依存性の転写誘導をみたＤａｔｔｏらの報告（Ｄａｔｔｏ  ＭＢ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２８６２３−２８６２８）と一致したが、ｇｅｒａｎｙｌ  ｇｅｒａｎｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉ  阻害剤を用いたＡｄｎａｎｅらの報告（Ａｄｎａｎｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８，６９６２−６９７０）とは異なる。
［実施例２］  ＧＡＬ４結合配列を用いたレポーターアッセイ
ＴＳＡは、ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターのＳｐ１結合配列を介して転写誘導を起こすのと同様に、ＳＶ４０プロモーターに挿入したコンセンサスな３ｘＳｐ１結合配列を介しても転写誘導を起こすことができる（Ｓｏｗａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４１，１４２−１５０）。そこで、このＳｐ１結合配列に結合が認められたＳｐ１あるいはＳｐ３が実際にＴＳＡ刺激による転写誘導に関与するかどうかを、ＧＡＬ４結合配列を用いたレポーターアッセイ系で検討した。すなわち、Ｓｐ１やＳｐ３の作用を強制発現で見ようとする際に、Ｓｐ１結合配列をレポーター遺伝子のプロモーターとして用いても内因性のＳｐ１あるいはＳｐ３の作用を検出しまうため、バクテリアのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインとＳｐ１あるいはＳｐ３との融合タンパク質を強制発現させ、ＧＡＬ４結合配列依存性の転写活性がＴＳＡで誘導されるかどうか、また、その誘導がＳｐ１とＳｐ３のいずれで制御されるのかを解析した。
（２−１）  発現プラスミドおよびレポータープラスミド
ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端側にＳｐ１（アミノ酸８３〜７７８）、全長Ｓｐ３（アミノ酸１〜６５３）、転写活性化ドメイン欠失Ｓｐ１（アミノ酸５９２〜７７８）（ＤＮＳｐ１）および転写活性化ドメイン欠失Ｓｐ３（アミノ酸３９９〜６５３）（ＤＮＳｐ３）をそれぞれ融合したタンパク質を発現させる目的で、ＧＡＬ４結合ドメインを含むｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に各遺伝子を挿入し、ｐＭ−Ｓｐ１、ｐＭ−Ｓｐ３、ｐＭ−ＤＮＳｐ１およびｐＭ−ＤＮＳｐ３を作成した。各Ｓｐ１およびＳｐ３遺伝子はＰＣＲ法により増幅した。具体的には、ｐＭ−Ｓｐ１の作製には、Ｓｐ１−Ｓプライマー（５’−ａｃａｇｇｔｇａｇｃｔｔｇａ−３’／配列番号：４）およびＳｐ１−ＡＳプライマー（５’−ｔｃａｇａａｇｃｃａｔｔｇｃｃ−３’／配列番号：５）を用いて、ｐＰａｃＳｐ１を鋳型にして増幅を行った（Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ，５１：１０７９−１０９０）。ｐＭ−ＤＮＳｐ１の作製には、ＤＮＳｐ１−Ｓプライマー（５’−ｃｃａａａａａａｇａａｇａｇａａａｇｇｔａａｃｃｃｇｇｃｇｇ−３’／配列番号：６）およびＤＮＳｐ１−ＡＳプライマー（５’−ｇａａｇｃａｔｇｃａｃｃｔｇｃ−３’／配列番号：７）を用いて、ｐＭ−Ｓｐ１を鋳型にして増幅を行った（Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ，５１：１０７９−１０９０）。ｐＭ−Ｓｐ３の作製には、Ｓｐ３−１８Ｆプライマー（５’−ｃｇｇｇａｔｃｃａｔｔｃｃａａｇｔｇｃｔｇｃｔ−３’／配列番号：８）およびＳｐ３−２Ｒプライマー（５’−ａｔａｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｃｃａｔｔｇｔｃｔｃａｔｔｔｃｃ−３’／配列番号：９）を用いて、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ．＃７４０３−１）を鋳型にして増幅を行った（Ｃｈｒｉｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１２：４２５１−４２６１）。ｐＭ−ＤＮＳｐ３の作製には、Ｓｐ３−１１Ｆプライマー（５’−ｃｇｇｇａｔｃｃａａｃｔｃｔａｔａｇａｔｔｃｔｇｃｔ−３’／配列番号：１０）およびＳｐ３−２Ｒプライマー（配列番号：９）を用いて、ｐＭ−Ｓｐ３を鋳型にして増幅を行った（Ｃｈｒｉｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１２：４２５１−４２６１）。ＰＣＲの反応は、全て「９４℃１分、５５℃３０秒、７２℃３０秒」を３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲの増幅産物はｐＭベクターに挿入し、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３５５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）により塩基配列の確認を行った。トランスフェクション試験の対照としてはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインのみを発現するｐＭを用いた。ＧＡＬ４依存性の転写活性の指標となるレポータープラスミド（ｐＧ５−ｌｕｃ）としては、５ｘＧＡＬ４結合配列、Ｅ１Ｂ最少プロモーターおよびＴＡＴＡ配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
（２−２）  トランスフェクションアッセイ
Ｓｐ１あるいはＳｐ３の各種ＧＡＬ４融合タンパク質をコードする上記発現ベクターは、コンセンサスな５ｘＧＡＬ４結合配列の下流にルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つ上記ベクターとともに、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔを用いたＱＩＡＧＥＮ社の方法に従ってＭＧ６３細胞にトランスフェクトした。すなわち、１２穴プレートに０．８×１０５個／ｗｅｌｌの細胞を捲き、２４時間後に、あらかじめ０．５μｇのレポータープラスミド、２．５μｇの発現ベクターおよびＳｕｐｅｒＦｅｃｔを混合した反応液をＭＧ６３細胞に添加して２時間反応させた。引き続き通常の培養条件下で２４時間培養し、５００ｎｇ／ｍｌのＴＳＡ存在下あるいは非存在下（対照）でさらに２４時間培養した後、細胞を溶解しルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性をＬＢ−９６Ｐ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定した。測定値は同一タンパク量当たりの活性に換算して表し、ＴＳＡによる転写誘導はＴＳＡ非存在下の対照値との比（ＴＳＡによる活性化倍率）として計算した。
（２−３）  結果
その結果、ＴＳＡ未刺激の状態でもＧＡＬ４−Ｓｐ１およびＧＡＬ４−Ｓｐ３とも転写活性を示したが、これはＳｐ１およびＳｐ３自体に存在する転写活性化ドメインを介したものと推察された。ところが、ＴＳＡで刺激した際には、ＧＡＬ４−Ｓｐ３を発現させた細胞では著明なルシフェラーゼ遺伝子の転写誘導作用が見られたのに対し、ＧＡＬ４−Ｓｐ１を発現させた細胞では対照のＧＡＬ４と同じ割合の増強しか認められなかった（図２）。さらに、上記したＮ末端側の転写活性化ドメインを欠失したＳｐ１あるいはＳｐ３とＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質について同様の検討を行ったところ、ＧＡＬ４−ＤＮＳｐ３はもはやＴＳＡ依存性の転写誘導作用を示すことができなかった（図２）。このことから、ＴＳＡ刺激によるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子の転写誘導はプロモーターのＳｐ１結合配列に結合したＳｐ３の転写活性化ドメインを介して起こることが示唆された。
［実施例３］  Ｓｐ３のＴＳＡ応答領域の同定
つぎに、Ｓｐ３のＴＳＡ応答領域を同定する目的で、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合した種々のＳｐ３欠失変異体を用いたレポーターアッセイを行った。まず、ｐＭ−Ｓｐ３（１−３９８）、ｐＭ−Ｓｐ３（８１−３９８）、ｐＭ−Ｓｐ３（１６１−３９８）、ｐＭ−Ｓｐ３（２４１−３９８）、ｐＭ−Ｓｐ３（１−８０）、ｐＭ−Ｓｐ３（１−１６０）、ｐＭ−Ｓｐ３（１−２４０）およびｐＭ−Ｓｐ３（１−３２０）を作成した。それぞれ、記載のアミノ酸番号に相当する領域を持つ。各Ｓｐ１およびＳｐ３遺伝子はＰＣＲ法により増幅した後、ｐＭベクターに挿入し、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３５５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）により塩基配列の確認を行った。なお、ＰＣＲ法による増幅に用いたプライマー配列を表１に示す。ＰＣＲは鋳型にｐＭ−Ｓｐ３を用い、「９８℃１５秒、６５℃２秒、７４℃３０秒」を２５サイクルの条件で行った。
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トランスフェクション試験の対照としてはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインのみを発現するｐＭを用いた。ＧＡＬ４依存性の転写活性の指標となるレポータープラスミド（ｐＧ５−ｌｕｃ）としては、上記のｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
これらの遺伝子を用いて、上記と同様の方法によりトランスフェクションを行い、ＴＳＡ刺激による転写誘導がこれらの変異体によって起こるかどうかを測定した。その結果、Ｓｐ３のＤＮＡ結合ドメインを欠失したＧＡＬ４−Ｓｐ３（１−３９８）のみでもＴＳＡ依存性の転写誘導が起こり、その誘導はＧＡＬ４−Ｓｐ３よりむしろ強いものであった（図３）。これは先に述べたＮ末端側の転写活性化ドメインの欠失でＴＳＡ刺激による転写誘導が消失する結果（実施例２）と相関した。また、Ｓｐ３に存在する２つのｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｒｉｃｈドメインのうちのＣ末端側のドメインとＤＮＡ結合ドメインの間に存在する抑制性ドメインがＳｐ３の転写活性を抑制するという報告とも相関を示唆した（Ｄｅｎｎｉｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５，５６５９−５６６７；Ｍａｊｅｌｌｏ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，４０２１−４０２６）。
また、図３に示すように、Ｓｐ３（１−３９８）のＮ末端側もしくはＣ末端側から欠失を加えた場合、ＧＡＬ４−Ｓｐ３（２４１−３９８）およびＧＡＬ４−Ｓｐ３（１−８０）においてＴＳＡ刺激による誘導が消失した。これらの結果から、Ｓｐ３（８１−１６０）がＴＳＡ刺激による転写誘導に重要と考えられたが、ＧＡＬ４−Ｓｐ３（８１−１６０）のみでは活性はほとんど認められなかった。ＧＡＬ４−Ｓｐ３（２４１−３９８）およびＧＡＬ４−Ｓｐ３（１−８０）とも完全なｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｒｉｃｈドメインを欠くことから、ＴＳＡによる転写誘導にはＳｐ３の転写活性化ドメインの２つのｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｒｉｃｈドメインのうち少なくともいずれか一方が存在することが必須であることが示された。また、Ｓｐ３の８０−１６０の部分にはＴＳＡ刺激による転写誘導に重要な領域の一部が含まれていることが考えられる。
［実施例４］  ドミナントネガティブＳｐ３
さらに、Ｓｐ３がｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１のＳｐ１結合配列を介するＴＳＡの転写誘導に実際に関与するかいなかを検討する目的で、転写活性化ドメインを欠失し、ＤＮＡ結合ドメインのみをもつＳｐ３変異体（ＤＮＳｐ３）（アミノ酸３９９〜６５３）をｐＣＭＶ３．１−Ｈｉｓ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込んだｐＣＭＶ−ＤＮＳｐ３を作成した。対照としてはｐＣＭＶ３．１を用いた。レポータープラスミドには以前に報告したｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーター、ＴＳＡに依存性のｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１最少プロモーターをそれぞれルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したｐＷＷＰおよびｐＷＰｄｅｌ−ＢｓｔＸＩ、また、３ｘＳｐ１結合配列、変異型３ｘＳｐ１結合配列をそれぞれルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入したＳｐ１−ｌｕｃおよびｍｔＳｐ１−ｌｕｃを用いた（Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２１９９−２２２０６、Ｓｏｗａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４１，１４２−１５０）。
これらの遺伝子を上記と同様にトランスフェクションにより強制発現させて、これがＴＳＡの転写誘導に対してドミナントネガティブに働くかどうかを検討した。その結果、ＤＮＳｐ３によりＴＳＡによるｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の転写誘導は著明に抑制され、これはＳｐ１結合配列を含むＴＳＡ依存性のｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターの最少単位（転写開始点より＋１６〜−１０１）をもつｐＷＰｄｅｌ−ＢｓｔＸＩでも確認された（図４ａ，ｂ）。また同様に、コンセンサスなＳｐ１結合配列からのＴＳＡによる転写誘導も著明に抑制された（図４ｃ）。変異Ｓｐ１結合配列を用いたときにはＴＳＡによる転写誘導は起こらないが、ＤＮＳｐ３による影響もみられなかった（図４ｄ）。いずれのプロモーターを用いた場合にも、ＴＳＡ未刺激の基本転写活性に対してはＤＮＳｐ３は抑制作用を示さなかった。以上のことから、Ｓｐ３の転写活性化ドメインがＴＳＡ依存性のｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の転写誘導に重要であることが明らかになった。Ｓｐ３はＴＳＡ未刺激時には転写因子として極めて弱い活性しかもたないが、ＴＳＡ刺激時には恐らくＨＤＡＣを抑制することでアセチル化された何らかの分子を認識することにより強力な転写活性を発現するものと予想される。
近年、癌に対する新しいアプローチとして転写調節化学治療あるいは転写調節化学予防が提唱されている（Ｓａｋａｉ  Ｔ．（１９９６）．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｈｙｇ．，５０，１０３６−１０４６）。すなわち、細胞増殖抑制性のｐ５３の標的遺伝子に対して、それらの転写を誘導することにより制癌作用を発揮させようとするものである。しかし、ｐ５３が多くのヒト癌細胞において変異が認められる（Ｓａｋａｉ  Ｔ．（１９９６）．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｈｙｇ．，５０，１０３６−１０４６；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ．（１９９２）．Ｃｅｌｌ，７０，５２３−５２６）点で、転写誘導の標的として欠点を有するのに対し、ｐ５３の標的遺伝子の１つであり細胞周期抑制作用を持つｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１はヒト癌細胞において変異がほとんど報告されていないことから（Ｃｈｅｄｉｄ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９，３０２１−３０２４；Ｌｉ  ＹＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１０，５９９−６０１）、その転写誘導によって制癌作用を期待することができる。本発明においてヒストンアセチル化を介してｐ５３非依存性にｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の転写誘導を起こす経路が存在することが見い出されたが、これはｐ５３が変異している癌に対しても転写調節化学治療あるいは転写調節化学予防が可能であることを示唆している。ＨＤＡＣ阻害剤は１つの可能性として考えられるが、実際に、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸抵抗性の急性白血病（ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）では、ＨＤＡＣ阻害剤でありサラセミア（ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ）やアンモニア過剰血症（ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉｃ  ｓｔａｔｅｓ）の治療に用いられていたフェニル酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ）がａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸と併用することにより完全治癒させることが認められている（Ｗａｒｒｅｌ  ＲＰ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９０，１６２１−１６２５）。これらの結果は癌治療における１つの標的分子としてＨＤＡＣの可能性を示唆するものである。
産業上の利用の可能性
本発明により、ＨＤＡＣを制御するＳｐ３が癌治療における新たな標的分子となり得ることが示された。また、本発明により、Ｓｐ３を標的とした効率的な抗腫瘍剤のスクリーニング方法が提供された。本発明のスクリーニングにより単離される化合物は、癌に対する新しい転写調節化学治療や予防への応用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＳＡ依存性のｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーター活性化に必要なＳｐ１結合配列へのＳｐ１およびＳｐ３の結合を示す電気泳動写真である。ＴＳＡ刺激（レーン５−９）および未刺激（レーン１−４）のＭＧ６３細胞核抽出液にてＥＭＳＡを行った。ＴＳＡ依存性のプロモーター活性化に必要なＳｐ１結合配列（転写開始点より−８７〜−７２）をＤＮＡプローブとした。各バンドに対するスーパーシフトアッセイを抗Ｓｐ１抗体（レーン２，４，６または８）あるいは抗Ｓｐ３抗体（レーン３，４，７または８）を用いて行った。Ｓｐ１およびＳｐ３のバンドの位置を図左に示した。
図２は、Ｓｐ３によるＴＳＡ依存性の転写誘導を示す。２．５μｇのＧＡＬ４−Ｓｐ１あるいはＧＡＬ４−Ｓｐ３プラスミドと０．５μｇのｐＧ５−ｌｕｃレポータープラスミドをＭＧ６３細胞に同時にトランスフェクションした。２４時間後にＴＳＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに２４時間後に細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定した。ＴＳＡによる転写誘導はＴＳＡ未刺激の対照値との比で示した。実験は３連で行い、示したデータは５回の実験の代表的な結果である。
図３は、Ｓｐ３のｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｒｉｃｈドメインを介するＴＳＡ依存性の転写誘導を示す。各種ＧＡＬ４−Ｓｐ３の欠失変異タンパク質の配列を図に示した。また、各タンパク質をＭＧ６３細胞に発現させた時のＴＳＡによる転写誘導の割合を図右にそれぞれ示した。トランスフェクションおよびＴＳＡ刺激は図２と同様に行った。実験は３連で行い、示したデータは３回の実験の代表的な結果である。
図４は、ドミナントネガティブＳｐ３によるＴＳＡ依存性のｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターあるいはＳｐ１プロモーター転写誘導の抑制を示す。０、１．２５、２．５または５．０μｇのｐＣＭＶ−ＤＮＳｐ３を、対照のｐＣＭＶ３．１を加えてプラスミド量を合計５．０μｇに調整し、０．５μｇのレポータープラスミドと同時にＭＧ６３細胞にトランスフェクションした。レポータープラスミドにはｐＷＷＰ（ａ）、ｐＷＰｄｅｌ−ＢｓｔＸＩ（ｂ）、Ｓｐ１−ｌｕｃ（ｃ）あるいはｍｔＳｐ１−ｌｕｃ（ｄ）を用いた。トランスフェクションおよびＴＳＡ刺激は図２と同様に行った。実験は３連で行い、３回の実験の代表的な結果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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