(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体表面近傍の流体内から細胞を射出するための方法であって、該流体から該細胞を射出するのに十分な集束音響エネルギーを該流体に送達する工程を包含し、ここで、該射出された細胞が該流体の液滴に含まれる、方法であって、ここで、該方法は、該集束エネルギーを該流体に送達する前に、該流体の液滴中に該細胞を射出し得るのに、該細胞が該表面に十分に近接しているか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２】
基材が、前記流体にわたって配置されており、該基材表面は該流体表面に面しており、その結果、前記細胞含有液滴が該基材表面上に射出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基材表面上の部位に複数の細胞を含有する流体内から細胞を射出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該基材表面が該流体表面に面するように、該細胞含有流体に対して該基材を配置する、工程；
（ｂ）該流体中の候補細胞を同定する、工程；
（ｃ）該候補細胞と該流体表面との間の距離を決定する工程；および、
（ｄ）該距離が、集束エネルギーを印加することによって、該流体から該基材表面上に該細胞を射出し得るに十分である場合、十分な集束音響エネルギーを該流体に送達して、該流体から該基材表面上の部位に該候補細胞を射出する工程であり、該射出された細胞が該流体の液滴に含まれる、工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）および／または（ｃ）が、前記流体と異なる音響インピーダンスを有する流体内の局在化された容量を音響的に検出することによって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）が、前記細胞を、前記流体と異なる屈折率を有する局在化された容量として同定することによって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）が、前記同定された候補細胞が特異的な特性を有するか否かを決定する工程をさらに包含し、かつ、前記工程（ｄ）において集束音響エネルギーを送達する工程は、該同定された候補細胞が該特性を有することを必要とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の細胞の各々が、実質的に同じサイズであり、かつ前記流体液滴が、単一細胞のみが含まれ得るように十分に少ない容量を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の細胞が、少なくとも２つの異なる群を含み、各群の細胞は、実質的に同じサイズの細胞であり、異なる群の細胞は、実質的に平均細胞サイズが異なっている、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記同定された候補細胞が、前記基材表面上の前記部位に特異的に結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）が、前記基材表面上に複数の候補細胞を射出するために繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補細胞の少なくとも１つの画分が、検出可能なマーカー分子を表示する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカー分子を表示する細胞が、該マーカー分子を介して前記基材表面に特異的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、各工程（ｄ）の後に、以下の工程：
（ｅ）前記マーカー分子を表示しない全ての細胞を取り除く状態に前記基材を曝し、これによって該マーカー分子を表示する候補細胞のみの選択的結合を提供する、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
複数の細胞において、マーカー分子を表示しない細胞からマーカー分子を表示する細胞を分離するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）複数の細胞を含有する流体を提供する工程であり、各細胞は、ほぼ等量を有し、流体中に最初から存在する該複数の細胞の少なくとも１つの画分が、検出可能なマーカー分子を表示する、工程；
（ｂ）基材表面が該流体表面に面するように、該細胞含有流体に対して該基材を配置する、工程；
（ｃ）該流体中の細胞を同定する、工程；
（ｄ）該細胞と該流体表面との間の距離を決定する工程；
（ｅ）該距離が、集束エネルギーを印加することによって、該流体から該基材表面上に該細胞を射出し得るに十分である場合、十分な集束音響エネルギーを該流体に送達して、該流体から該基材表面上の部位に該細胞を射出する工程であり、該射出された細胞は、該流体の液滴に含まれ、該液滴は、単一細胞のみが含まれ得るように十分に少ない容量を有する、工程；
（ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返して、同定された複数の細胞を該基材表面上に射出する、工程；および、
（ｇ）該マーカー分子を表示しない全ての細胞を取り除く状態に前記基材を曝し、これによって該マーカー分子を表示する候補細胞のみの選択的結合を提供する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記工程（ｄ）において決定された距離が、前記細胞を前記基材表面上に射出し得るのに不十分である場合、集束エネルギーを印加して、該流体表面のより近傍に細胞を移動させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
複数の細胞において、マーカー分子を表示しない細胞からマーカー分子を表示する細胞を分離するためのシステムであって、該システムは、以下：
（ａ）複数の細胞を含有する流体を収容する容器であり、各細胞は、ほぼ等量を有し、ここで、該複数の細胞の少なくとも１つの画分が、検出可能なマーカー分子を表示する、容器；
（ｂ）表面が該流体表面に面するように、該細胞含有流体に対して配置された基材であり、該表面は、該マーカー分子に特異的に結合して、該マーカー分子を表示する任意の細胞の特異的結合をもたらし得る、基材；
（ｃ）音響エジェクターであって、音響放射を発生させるための音響放射発生器、および、該発生させた音響放射を集束するための集束手段を備える、音響エジェクター；
（ｄ）該容器内の流体との音響カップリング関係において該エジェクターを配置するための、手段；ならびに、
（ｅ）該マーカーを表示する細胞が、該流体の液滴中に該細胞を射出することを可能にする程度に、該流体表面に対して十分に近接しているか否かを決定する手段；
を備える、システム。
【請求項１７】
前記容器が、該流体および細胞が該容器から自由に流れるのを可能にする出口チャネルをさらに備える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記表示された検出可能なマーカー分子の少なくともいくつかが、異なっている、請求項１６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、該して、細胞アレイを形成するための流体から、例えば、基材表面への細胞の射出に関する。より詳細には、本発明は、キャリア流体に懸濁された細胞の空間的に指向された射出をもたらす集束音響エネルギー（ｆｏｃｕｓｅｄ  ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｅｎｅｒｇｙ）の使用に関する。本発明はさらに、基材表面上にパターン化された細胞のアレイを形成するために、このような細胞を基材表面に堆積させる方法の使用に関する。
【０００２】
（背景）
単一の生存細胞のアレイは、個々の細胞を個々のウェル部位または頂部および底部の両方が開口している（頂部は所望の細胞が通過するのに十分大きく開口し、そして底部は所望の細胞が通過するには小さすぎる程度開口している）穴に挿入することにより作製され得る（Ｗｅｉｎｒｅｂら、米国特許第５,５０６,１４１号）。真核生物細胞の直径は約１０μｍよりも大きく、そして最も小さい真核生物細胞であるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属の直径は、約０．１５〜０．３０μｍであり；ウェル部位または穴のアレイを製造し、これらの直径の細胞を収容するためのするためのマイクロファブリケーション技術が周知である（例えば、Ｃｈｕら、米国特許第６,０４４,９８１号は、犠牲層（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｌａｙｅｒ）を用いることにより、約５ナノメートル（ｎｍ）の小ささの寸法を有する穴またはチャネルを作製するための方法を教示し；これらの寸法は、フォトリソグラフィーの解像限界（現在は３５０ｎｍ）によりも小さい）。現在使用されている細胞を操作する方法では、平面基材表面上で単一の細胞の順序付けられたアレイを作製することができない。さらに、細胞を大きさにより個々のアレイ部位に分類する方法は、Ｗｅｉｎｒｅｂら、前出により記載されるような物理的な穴またはウェルの大きさを制御して、異なる大きさの細胞集団が非平面的な穴またはウェルに侵入しそしてその中に含まれるのを可能にする方法以外に存在しない。
【０００３】
細胞のスクリーニングは、異なるライフサイクル段階にあり、他の特徴において異なる細胞の集団の中の特定細胞の機能または特徴の検出を保証するために、比較的大きな既知の数の個々の細胞を最初に必要することが理解されている（例えば、Ｗｅｉｎｒｅｂら、米国特許第５,５０６,１４１号により記載される）。スクリーニング試薬および他の試薬の同時送達が、各々の細胞容器とそれに最も近い隣接容器との間の流体のネクサスを必要とすることもまた、理解されている。Ｔａｙｌｏｒ、米国特許第６,１０３,４７９号は、物理的ウェルにアレイ配置された個々の細胞または複数の細胞に流体試薬を提供し得るマイクロチャネルにより、独立した試薬供給源にマイクロ流体接続された物理的ウェルに細胞を含む、細胞をスクリーニングするための小型化された細胞アレイ法およびデバイスを記載している。このようなシステムは、個々の細胞または多数の細胞に対して同時に試験することを可能にするように容易に変更され得るが、これらは、費用のかかる、細かい微小組み立てを必要とする。このようなアレイの部位密度は、物理的な仕様（例えば、物理的な統合性のための最小のウェル壁の厚みおよびチャネル自体のためのさらなる空間）の要求に従って個々のウェルを作製する必要性により制限される。従って、集団および亜集団をアッセイするためならびに微小組み立て時間、消費、および費用を削減するための高い柔軟性を維持しつつ、部位密度を最大化する必要性が存在する。物理的なウェルに含まれるかまたは仮想ウェルにおける平面基材上に位置するか否かに関わらず、対応するアレイも個々の微小組み立てチャネルも必要とせずに各々の部位に所望の試薬を提供する、アレイ配置された細胞への試薬のマイクロ流体送達のためのさらなる必要性が存在する。
【０００４】
細胞を死滅させることなく、流体から個々の細胞を基材表面に射出することにより、それらを操作する方法またはデバイスの存在は知られていない。従って、選択された表面位置または領域に流体から単一の細胞を射出して、表面上に細胞をパターン化するための選択的な射出を可能にする方法およびそれに対応するデバイスに対する必要性が存在する。このような選択的射出は、アレイを作製するため、および表面上での細胞のパターン化を必要とする他の用途（例えば、組織の操作など）のため、または単に細胞を分類するために使用され得る。
【０００５】
（発明の要旨）
従って、先行技術の上記の欠点を克服するデバイスおよび方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００６】
本発明の１つの局面において、基材表面に対する堆積のために、各々単一の細胞を含む複数の液滴を、基材表面上の指定された部位に音響射出する方法が提供される。使用されるデバイスは、基材表面に対する堆積のために、基材表面上の指定された部位への複数の液滴の音響射出を可能にするデバイスである。このようなデバイスは：例えば、懸濁された細胞を運搬し得る液体を含むよう各々が適合された複数の細胞容器またはレザバ；音響放射を生成するための音響エジェクター、および各々のレザバの流体表面近くの焦点にそれを集束させるための集束手段；ならびにエジェクターを、各々の細胞容器またはレザバに対して音響カップリング関係に設置する手段、を備える。好ましくは、各々の容器は取り外し可能であるか、またはウェルプレート中の個々のウェルで構成され、そして／あるいはアレイに配置される。さらに、この細胞容器またはレザバは、好ましくは：実質的に音響的に互いに区別できず、含まれる流体の表面付近での、音響エネルギーのエネルギー的に十分な集束を可能にする適切な音響インピーダンスを有し、そして流体を含む試薬の条件に抵抗し得る。
【０００７】
本発明の別の局面において、細胞のアレイは、実質的に平面部位のアレイを含む基材表面上に提供され、ここで、各々の部位は、単一の細胞を含む。このアレイは、第１のキャリア流体中に１つの細胞型またはクローン、あるいは細胞型またはクローンの混合物の懸濁物を含む、第１の細胞懸濁物含有レザバと音響カップリング関係にあるように音響エジェクターを設置することにより調製される。流体表面に十分に近い細胞の存在の音響検出、および射出のための基準として使用される任意の特性の検出後、エジェクターは、キャリア流体内およびそれらの表面付近に焦点を有するよう音響放射を生成および指向し、そして単一の細胞を含み得る容量を有するキャリア流体の液滴を射出するのに十分なエネルギーを生成および指向するよう起動され、それによって液滴中に含まれる単一の細胞が、基材表面上の第１の指定された部位に射出される。さらなる細胞が、第１容器から射出され得る。あるいは、エジェクターは、第２の細胞懸濁物含有レザバと音響カップリング関係にあるよう再設置され得、そしてこのプロセスは、第２の流体の液滴に含まれる単一の細胞を、基材表面上の第２の指定された部位に射出するために上記のように繰り返される。ここで、第１および第２の指定された部位は、同じであってもそうでなくてもよい。所望の場合、この方法は、各々の容器からの複数の細胞を用いて繰り返される（各々のレザバは、一般的に、異なる細胞または細胞混合物の懸濁物を必ずしも含まないが）。従って、音響エジェクターは、基材表面上の異なる指定された部位に、各々のレザバからの単一細胞を含有する液滴を射出するために繰り返し再設置される。このような様式で、この方法は、基材表面上に細胞のアレイを作製する際の使用に容易に適合される。アレイ配置された細胞は、１つ以上の外部マーカー部分／同族部分特異的結合システムにより基材表面に結合され得る。１つのこのような特異的結合システムの例は、（形質転換によりもたらされる）外部マーカーとしてストレプトアビジンを使用し、同族部分としてビオチンを使用するシステムである。多特異的結合システムとして、外部から提示されたＩｇＭクローンおよびエピトープを同族部分として用いるシステムが挙げられる。
【０００８】
細胞のスクリーニングに有用な、別の局面において、本発明は、生存細胞が存在する基材表面上の指定された部位に、流体レザバから流体を射出する方法に関する。本発明のこの局面は、音響射出を用いてチャネルを要しないマイクロ流体送達により細胞アレイを体系的にスクリーニングするための方法、または試薬中の全アレイの液浸によりもたらされる全ての部位の同時のパラレルスクリーニングのための方法に関する。本発明の別の局面において、生存細胞アレイを作製、スクリーニング、および特徴付けするためのシステムが提供される。
【０００９】
なお別の局面において、本発明は、独立したチャネルに基づくマイクロ流体送達と共に穴または物理的ウェルの使用を必要とするアプローチによるよりも、単一生存細胞のアレイをより迅速に、柔軟に、そして経済的に形成する方法を提供する。
【００１０】
本発明のなお別の局面は、生存細胞の比較的高密度のアレイ（例えば、独立したチャネルに基づくマイクロ流体送達と共に穴または物理的ウェルの使用を必要とするアプローチによって達成可能なアレイよりも高密度を有するアレイ）を提供する。
【００１１】
本発明のなお別の局面は、流体からの選択された生存細胞の射出を提供する。
【００１２】
本発明の最後の局面は、特定の付着システムを有するかまたは有さない表面上での細胞の一様な空間的パターン化を提供する。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の流体、生体分子またはデバイス構造物に限定されない（これら自体は変化し得る）ことを理解するべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のみであり、限定することを意図していないことがまた、理解されるべきである。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形態の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のものを指図しないかぎり、複数対象を含む。従って、例えば、「細胞容器」または「レザバ」との言及は、単一細胞容器またはレザバおよび複数の細胞容器またはレザバを含み、「流体」との言及は、単一の流体または異なる流体の組み合わせおよび／または混合物を含み、「生体分子」との言及は、単一の分子ならびに生体分子の組み合わせおよび／または混合物を含む。
【００１５】
本発明の記載および特許請求するにあたって、以下の専門用語が、以下に示す定義に従って使用される。
【００１６】
本明細書中で使用される用語「音響カップリング」および「音響カップリングした」は、ある対象が別の対象と、直接的にかまたは間接的に接触するように配置され、その結果、音響反射が、音響エネルギーを実質的に損失することなしに、対象間で移行されるのを可能にすることをいう。２つの実体が間接的に音響カップリングされる場合、「音響カップリング媒体」は、音響反射が伝達され得る中継物を提供するために必要とされる。従って、エジェクターは、例えば、流体中にエジェクターを浸漬させることによってか、またはエジェクターと流体との間に音響カップリング媒体を置き、音響カップリング媒体を介してエジェクターにより生成される音響反射を流体中に移行させることによって、流体に音響カップリングされ得る。
【００１７】
用語「結合した（ｂｏｕｎｄ）」は、（例えば、「結合した」細胞を有する基材表面）共有結合、吸収および物理的固定化を含む。用語「付着した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」および「結合した（ｂｏｕｎｄ）」は、用語「付着した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」と同一の意味である。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「吸収する」は、基材表面による、分子、分子セグメントまたは細胞の非共有的保持をいう。すなわち、吸収は、基材表面と、吸収される実体上に存在する吸収部分との間の非共有的相互作用の結果として生じる。吸収は、水素結合、ファンデルワールス力、極性引力または静電力（すなわち、イオン結合を介して）を介して生じ得る。時折、基材は、特定の様式で相互作用するための吸収部分で官能化され得る。
【００１９】
本明細書中で使用される用語「アレイ」は、特徴物または材料（例えば、細胞）の二次元配列をいう。アレイは、一般的に、規則的な（ｒｅｇｕｌａｒ）、順序付けられた（ｏｒｄｅｒｅｄ）特徴物（例えば、直線の格子、平行なストリップ、らせん状など）から構成されるが、順序付けられていないアレイが、同様に有利に使用され得る。
【００２０】
用語「ライブラリー」および「コンビナトリアルライブラリー」は、本明細書中で交換可能に使用され、基材の表面上に存在する、複数の化学的部分または生物学的部分をいい、ここで、各部分は、お互いの部分と異なっている。この部分は、例えば、ペプチド分子および／またはオリゴヌクレオチドであり得る。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「流体」は、固体でないか、または少なくとも部分的に気体状および／もしくは液体である物質をいう。流体は、最小限に、部分的に、または完全に溶媒化、分散もしくは懸濁されている固体を含み得；ゲルまたは分散流体から構成される粒子もまた、流体に懸濁される。流体の例としては、水溶液（水自体および塩類水を含む）ならびに非水溶液（例えば、有機溶媒など）が挙げられるが、これらに限定されない。キャリア流体中に懸濁された生存細胞は、流体中に懸濁されたゲルまたは分散流体の例を表す。
【００２２】
用語「近傍（ｎｅａｒ）」は、焦点を合わせた音響反射の焦点から、射出されるべき液滴からの流体の表面までの距離をいうために、使用される。この距離は、流体に向いて焦点を合わせた音響反射が、流体表面からの液滴射出を生じるようになされるべきであり、そして当業者は、直接かつ慣用的な実験を用いて任意の所定の流体に対して適切な距離を選択し得る。しかし、一般的に、音響反射と流体表面との間の焦点の適切な距離は、流体において、音速の波長の約１〜約１５倍の範囲であり、より代表的には、この波長の約１〜約１０倍の範囲であり、好ましくは、この波長の約１〜約５倍の範囲である。
【００２３】
用語「集束手段」および「音響集束手段」とは、光学レンズと同様に作用する音響エネルギー源とは別個のデバイスによってか、または音響エネルギー源の空間的配置によってかのいずれかで、焦点において音波を集束させ、強め合う干渉および弱め合う干渉によって、焦点において音響エネルギーの集束をもたらすための手段をいう。集束手段は、湾曲した表面を有する固体部材程度に単純であり得るか、またはフレネルレンズ（これは、音響放射を指向するために、回折を使用する）において見出されるもののような複雑な構造を含み得る。適切な集束手段はまた、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｎａｋａｙａｓｕらに対する米国特許第５，７９８，７９９号、およびＡｍｅｍｉｙａら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９７  ＩＳ＆Ｔ  ＮＩＰ  １３  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，６９８−７０２頁に記載されるような、位相を合わせられた（ｐｈａｓｅｄ）アレイ方法を包含する。
【００２４】
用語「レザバ」とは、本明細書中において使用される場合、流体を保持または収容するための、レセプタクルまたはチャンバをいう。従って、レザバ内の流体は、必然的に自由表面（すなわち、液滴がそこから排出されることを可能にする表面）を有する。流体容器が、流体が排出され得る少なくとも１つの自由表面を有する限り、この容器は、特定の幾何学的構造にかかわらず、レザバである。従って、「レザバ」としては、例えば、液滴が排出される流れる流体を含む、微小流体チャネルが挙げられる。「細胞容器」または「細胞レザバ」とは、キャリア流体に懸濁された生存細胞の排出のために特殊化されたレザバであり、そして例えば、キャリア流体に懸濁された生存細胞が流れる、微小流体チャネルまたは他のチャネルが挙げられる。
【００２５】
用語「基材」とは、本明細書中において使用される場合、１以上の流体が堆積し得る表面を有する、任意の材料をいう。基材は、例えば、ウエハ、スライド、ウェルプレート、膜のような、任意の多数の形態で構築され得る。さらに、基材は、特定の流体の堆積のために必要とされ得るように、多孔性または非多孔性であり得る。適切な基材材料としては、固相化学合成のために代表的に使用される支持体（例えば、ポリマー材料（例えば、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、ジビニルベンゼンスチレンに基づくポリマー）、アガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））デキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、セルロースポリマーおよび他の多糖類、シリカおよびシリカに基づく材料、ガラス（特に、制御孔隙ガラス、すなわち「ＣＰＧ」）および官能基化ガラス、セラミック、ならびに表面コーティング（例えば、細孔ポリマー（特に、ニトロセルロースのようなセルロースポリマー）、細孔金属化合物（特に、細孔アルミニウム）、抗体結合タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬから入手可能）、ビスフェノールＡポリカーボネートなど）で処理されたような基材が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味深い多孔性基材としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：コーティングされていない多孔性スライドガラス（ＣＰＧスライドを含む）、ポリマーコーティング（例えば、アミノシランまたはポリ−Ｌ−リジンのコーティング）でコーティングされており、従って多孔性ポリマー表面を有する多孔性スライドガラス；および多孔性コーティングでコーティングされた非多孔性スライドガラス。多孔性コーティングは、多孔性ポリマーコーティング（例えば、セルロースポリマー（例えば、ニトロセルロース）またはポリアクリルアミドからなり得るようなコーティング）、あるいは多孔性金属コーティング（例えば、細孔アルミニウムからなる）であり得る。多孔性表面を有する市販の基材の例としては、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）から入手可能な蛍光アレイ表面技術（ＦＡＳＴＴＭ）スライド（これは、１０〜３０μｍの厚みの、多孔性の流体透過性ニトロセルロース層でコーティングされており、この層は、表面の単位面積あたりの利用可能な結合面積を実質的に増加させる）が挙げられる。他の市販の多孔性基材としては、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から現在入手可能な、ＣＲＥＡＴＩＶＥＣＨＩＰ（登録商標）透過性スライド、および整列された高度に多孔性の構造（これは、この構造全体の孔隙およびチャネルを通って試薬が流れ、そして浸透することを可能にする）によって「三次元」幾何学構造を有する基材が挙げられる。このような基材は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．から、「Ｆｌｏｗ−Ｔｈｒｕ  Ｃｈｉｐ」の商品名で入手可能であり、そしてＳｔｅｅｌら、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉ���ｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの第５章（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，２０００）によって記載されている。
【００２６】
「多孔性基材」または「多孔性表面を有する基材」におけるような用語「多孔性」とは、約１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約９９％、より好ましくは約１５％〜約９５％の範囲の間隙率（空隙の百分率）、および約１００Åと約１ｍｍとの間、代表的に約５００Åと約０．５ｍｍとの間の平均孔隙サイズを有する、基材または表面をそれぞれいう。
【００２７】
用語「不浸透性」とは、水または流体が通過することを可能にしないことを意味する、通常の意味で使用される。用語「浸透性」とは、本明細書中において使用される場合、「不浸透性」ではないことを意味する。従って、「浸透性基材」および「浸透性表面を有する基材」とは、水または他の流体が浸透し得る基材または表面をそれぞれいう。
【００２８】
前述の支持体材料は、従来使用される基材の代表的なものであるが、基材は事実上、任意の生物学的材料、非生物学的材料、有機材料および／または無機材料を含み得、そして種々の物理的形態（例えば、粒子、ひも、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレートなど）のいずれかであり得、そしてさらに、任意の形状（例えば、円盤、正方形、球、円など）を有し得ることが、理解されるべきである。基材表面は、平坦であっても平坦でなくてもよく、例えば、この表面は、隆起領域または陥凹領域を含み得る。基材はさらに、反応性官能基を含み得るか、または反応性官能基を含むように誘導体化され得る。これらは広く公知であり、そして例えば、反応性Ｓｉ−ＯＨ基を含む二酸化ケイ素支持体、ポリアクリルアミド支持体、ポリスチレン支持体、ポリエチレングリコール支持体などが挙げられる。
【００２９】
用語「表面修飾」とは、本明細書中において使用される場合、基材表面または基材表面の選択された部位もしくは領域の、１つ以上の化学的特性および／または物理的特性を変化させるための、加法プロセスまたは減法プロセスによる、表面の化学的変更および／または物理的変更をいう。例えば、表面修飾は、以下を包含し得る：（１）表面のぬれ特性を変化させること、（２）表面を官能基化すること、すなわち、表面の官能基を提供するか、修飾するか、または置換すること、（３）表面を脱官能基化すること、すなわち、表面の官能基を除去すること、（４）表面の化学的組成を他の様式で変更すること（例えば、エッチングによって）、（５）表面の粗さを増加または減少させること、（６）表面にコーティング（例えば、表面のぬれ特性とは異なるぬれ特性を示すコーティング）を提供すること、および／あるいは（７）表面に微粒子を堆積させること。本明細書中の基材表面のいずれかは、上述の様式の１つ以上で修飾され得、そして用語「表面」は、記載されたような修飾された表面を含むことが意図される。
【００３０】
「任意の」または「必要に応じて」とは、引き続いて記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その結果、この表現は、その状況が起こる例およびその状況が起こらない例を包含する。
【００３１】
例えば語句「アレイにおける実質的に全ての細胞」におけるような、用語「実質的に」とは、アレイにおける少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．９％の細胞をいう。用語「実質的に」の他の使用は、類似の定義を含む。
【００３２】
次いで、１つの実施形態において、本発明は、単一の細胞を含む複数の液滴を、基材表面上の指定された部位に向けて自動的に排出するためのデバイスに関する。このデバイスは、以下を備える：複数の細胞容器またはレザバであって、各々が、生存細胞が懸濁されるキャリア流体を含むよう適合されている、細胞容器またはレザバ；音響放射を発生させるための音響放射発生器を備える、エジェクター；レザバの各々における流体表面の内部および近くの焦点において、音響放射を集束させるための、集束手段；ならびにエジェクターを、レザバの各々に対して音響結合した関係で配置するための手段。
【００３３】
図１および５は、使用されるデバイスの代替の実施形態を、単純化した断面図で示す。図１は、細胞容器またはレザバが、放射状に対称的な従来の容器（例えば、従来のペトリ皿）である、細胞排出システムを図示する。図５において、細胞レザバは、流体チャネルであり、このチャネルを通って、生存細胞がキャリア流体中に流れる。デバイス１１は、複数の細胞容器またはレザバ（すなわち、少なくとも２つの容器またはレザバ）を備え、第１の細胞容器は、１３で示されており、そして第２の容器は、１５で示されており、各々、生存細胞が懸濁した流体を含むよう適合されており、そして各流体は、流体表面を有する；例えば、第１の細胞容器は、流体１４に懸濁した細胞を有し、そして第２の細胞容器は、流体１６に懸濁した細胞を有し、流体表面はそれぞれ、１７および１９で表されている。１４および１６の懸濁された細胞およびキャリア流体は、同じであっても異なってもよい。図示されるように、細胞容器またはレザバは、音響的に実質的に区別不可能であるように、実質的に同一の構成であるが、同一の構成は、必須要件ではない。細胞容器は、別個の取り外し可能な構成要素として示されるが、所望であれば、プレートまたは他の基材内に固定され得る。例えば、図１における複数の容器は、個々のウェルをウェルプレートに含み得るが、必要に応じて、必ずしもアレイに配置されなくてもよい。同様に、図５における複数の容器は、プレートにおける別個のチャネルまたは個々のチャネルを含み得、例えば、個々の微小流体チャネルのパターンが、フォトリソグラフィーによってなどで、プレートにエッチングされる。細胞容器またはレザバ１３および１５の各々は、好ましくは、左右対称（図５Ｂのチャネル）または軸対称（図１）である。これらの容器の各々は、実質的に垂直な壁２１および２３を有し、これらの壁は、容器の基部２５および２７から上方に延び、そしてそれぞれ、開口部２９および３１において終結するが、他のレザバ形状（特定の位置における排出のための開口部または開口を有する、閉じた流体チャネルを有する形状が挙げられる）が使用され得る。各細胞容器またはレザバ基部の材料および厚みは、音響放射がこれらを通ってこのレザバ内に収容される流体内に通り得るようなものであるべきである。
【００３４】
図１および５に示されるデバイスの実施形態はまた、音響放射を発生させるための音響放射発生器３５と、流体内（ここから液滴が射出される）の流体表面付近の焦点に音響放射を集束させるための集束手段３７とを含む、音響エジェクター３３を備える。図１および５に示されるように、この集束手段３７は、音響放射を集束するための凹型表面３９を有する単一の中実部分を含み得るが、この集束手段は、以下に議論されるような他の方法で構成され得る。従って、音響エジェクター３３は、それぞれ、レザバ１３および１５に、従って流体１４および１６に音響的に連結された場合に、流体表面１７および１９の各々から流体の液滴を射出するように、音響放射を生成し、そして集束するように適合される。音響放射発生器３５および集束手段３７は、単一のコントローラにより制御される単一のユニットとして機能し得るか、またはこれらはデバイスの所望の性能に依存して、独立して制御され得る。代表的に、単一エジェクター設計が、複数エジェクター設計よりも好ましい。なぜなら、液滴の配置の精度、ならびに液滴のサイズおよび速度の一貫性は、単一のエジェクターを用いた場合に、より容易に達成されるからである。
【００３５】
当業者に理解されるように、種々の集束手段のいずれかを、本発明と共に用い得る。例えば、１つ以上の湾曲表面を使用して、音響放射を流体表面付近の焦点に方向付けし得る。１つのこのような技術は、Ｌｏｖｅｌａｄｙらの米国特許第４，３０８，５４７号に記載される。湾曲表面を有する集束手段は、市販の音響変換器（例えば、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により製造される音響変換器）に組み込まれている。さらに、対象面から所定の焦点距離に音響エネルギーを方向付けするためのフレネルレンズが、当該分野で公知である。例えば、Ｑｕａｔｅらの米国特許第５，０４１，８４９号を参照のこと。フレネルレンズは、音響エネルギーの大部分を、レンズに対して半径方向に変化する回折角度の所定の回折次数に回折させる、半径方向の位相プロフィールを有し得る。この回折角は、所望の対象面上に、回折次数内の音響エネルギーが集束するように選択されるべきである。音響エネルギーエミッターの整相列はまた、整列された供給源により放射される音波の間の強め合う干渉および弱め合う干渉の結果の結果として、音響エネルギーを指定の点に集束するために使用されている（Ａｍｅｍｉｙａら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  １９９７  ＩＳ＆Ｔ  ＮＩＰ１３  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｐｐ．６９８−７０２）。
【００３６】
エジェクター３３を、個々のレザバの各々、従ってその中の流体に音響的に連結するための多数の方法もある。１つのこのようなアプローチは、例えば、Ｌｏｖｅｌａｄｙらの米国特許第４，３０８，５４７号に記載されるように、直接接触によるものであり、ここでセグメント電極（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を有する半球型クリスタルから構成された集束手段が、射出される液体中に沈められる。上記の特許は、この集束手段が液体の表面にかまたはこの表面の下に配置され得ることを開示する。しかし、エジェクターが複数の容器またはレザバから異なる流体を射出するために使用される場合、相互汚染を回避するために集束手段の度重なる洗浄が必要であるため、集束手段を流体に音響的に連結するためのこのアプローチは、望ましくない。必然的に、この洗浄プロセスは、各液滴射出事象の間の移行時間を延長する。さらに、このような方法において、流体中の細胞は、容器から取り出される場合に、エジェクターに付着して、稀少であるか代わりのない可能性のある細胞物質が無駄になる。最終的に、レザバが微細製造される場合（例えば、細胞容器が微小流体チャネルまたはマイクロウェルである場合）、流体中に沈めることは、その容器が小さすぎるために、従来の音響エネルギー集束手段を用いては可能ではない。
【００３７】
微細製造の当業者は、微細製造した湾曲部材を含む集束手段を作製し得る。同様に、セグメント電極を有する半球型クリスタルから構築された、微細製造された集束手段（例えば、Ｌｏｖｅｌａｄｙらの米国特許第４，３０８，５４７号に記載されるようなミニチュア集束手段）は、慣用的な微細製造技術によって作製され得る。次いで、流体中に沈めることは、上記と同じ欠点を伴って可能である。微量流体チャネルまたはウェルについて、次いで、集束手段および音響エネルギー源が、微細製造されたアセンブリに組み込まれ得る。
【００３８】
レザバの任意の寸法について実行可能なアプローチは、従来の微細製造されていないエジェクターまたはマクロスケールのエジェクターを、このエジェクターのいずれの部分（例えば、集束手段）も、射出されるいずれの流体とも接触させることなく、レザバおよびレザバの流体に音響的に連結することである。このために、本発明は、エジェクターを、細胞容器またはレザバ中の流体の各々と制御された反復可能な様式で音響カップリングして配置して、その流体の中にエジェクターを沈めることなくこの流体から液滴を射出するためのエジェクター位置決め手段を提供する。この方法は、代表的に、エジェクターと各レザバの外面との間の直接的または間接的な接触を包含する。直接接触は、エジェクターを各レザバに音響的に連結するために使用され、この直接接触が、効果的な音響エネルギー移動を保証するために完全に適合していることが好ましい。すなわち、このエジェクターおよびレザバは、嵌合接触に適合した対応する表面を有するべきである。従って、音響カップリングが、集束手段によってエジェクターとレザバとの間で達成される場合、このレザバが集束手段の表面プロフィールに対応する外側表面を有していることが望ましい。適合した接触がない場合、音響エネルギー移動の効率および精度が損なわれ得る。さらに、多くの集束手段は湾曲表面を有するので、直接接触アプローチは、特別に形成された逆向き面を有するレザバの使用を必要とし得る。
【００３９】
必要に応じて、音響カップリングは、図１Ａおよび５Ａに例示されるように、間接的接触によって、エジェクターと各々のレザバとの間で達成される。これらの図において、音響カップリング媒体４１が、３３とレザバ１３の基部２５との間に配置され、ここでエジェクターおよびレザバは、互いに所定の距離離れて位置している。この音響カップリング媒体は、音響カップリング流体であり得、好ましくは、音響集束手段３７および各レザバの両方と適合接触した音響的に均質な材料であり得る。さらに、流体媒体が、流体媒体自体とは異なる音響特性を有する材料を実質的に含まないことを保証することが重要である。示されるように、第１のレザバ１３は、音響集束手段３７に音響的に連結され、その結果、音波が、音響放射発生器によって生成され、そしてこの集束手段３７によって、音響カップリング媒体４１に向かって方向付けられ、これにより、次いで音響放射がレザバ１３に伝達される。
【００４０】
作動中、デバイスのレザバ１３および１５の各々は、図１および５に示されるように、それぞれ、第１のキャリア流体および第２のキャリア流体で満たされ、これらのキャリア流体は、それぞれ、その中に懸濁された細胞または細胞混合物１４および１６を有する。音響エジェクター３３は、音響カップリング媒体４１を介したエジェクターとレザバとの間の音響カップリングを達成するために、レザバ１３の下に示すエジェクター位置決め手段４３によって配置可能である。基材４５は、第１のレザバ１３の上かつ第１のレザバ１３の近位に配置され、その結果、この基材の一方の表面（図１および５において下側面５１として示される）は、レザバに面し、そしてこのレザバ内の流体１４の表面１７に対して実質的に平行である。一旦、エジェクター、レザバおよび基材が適切に整列すると、音響放射発生器３５は、音響放射を生成するように作動され、この音響放射は、集束手段３７によって、第１のレザバの流体表面１７付近の焦点４７に方向付けられる。結果として、液滴４９は、この流体表面１７から、基材の下側面５１上の指定した部位に射出される。この射出された液滴は、接触後に基材表面を凝固することによって、この基材表面上で保持され得；このような実施形態において、基材を低温（すなわち、接触後に液滴の凝固が生じる温度）で維持することが必要である。あるいは、またはさらに、液滴内の分子部分は、接触後に、吸着、物理的固定化または共有結合によって、基材表面に付着する。
【００４１】
次いで、図１Ｂおよび５Ｂに示されるように、基材位置決め手段５０は、基材４５をレザバ１５の上に再配置して、このレザバからの液滴を第２の指定された部位で受け取る。図１Ｂおよび５Ｂはまた、エジェクター３３が、エジェクター位置決め手段４３によってレザバ１５の下に、音響カップリング媒体４１によってこのレザバ１５と音響的に連結した関係で、再配置されていることを示す。一旦、図１Ｂおよび５Ｂに示されるように、適切に整列されると、エジェクター３３の音響放射発生器３５は、音響放射を生成するように作動され、この音響放射は次いで、集束手段３７によって、流体表面１９付近の流体１６内の焦点に方向付けられ、それにより液滴５３がこの基板に向かって射出される。このような操作は、用いられるデバイスをどのように使用して、流体液滴に含まれる複数の単細胞をレザバから射出し、細胞のパターン（例えば、アレイ）を基材表面５１上に形成し得るかの例示であることが明白でなければならない。同様に、このデバイスが、１つ以上のレザバから射出される流体液滴に含まれる複数の個々の細胞を、基材表面の同じ部位に射出するように適合され得ることも明白でなければならない。
【００４２】
別の実施形態では、デバイスがウェルプレート間の流体滴に含まれる細胞の移送を可能にするように構成され、この場合、基材は、基材ウェルプレートを含み、流体懸濁した細胞含有レザバは、レザバのウェルプレートにおける個々のウェルである。図２は、このようなデバイスを示し、レザバウェルプレート１２における４つの個々のウェル１３、１５、７３、および７５は、単一の細胞を含有する小滴の排出のための流体中で懸濁される、複数の特定の型の細胞または異なる細胞型の混合物を含むための流体レザバとして役立ち、そしてこの基材は、５５、５６、５７、および５８で示された４つの個々のウェルのより小さなウェルプレート４５を含む。図２Ａは、細胞容器またはレザバウェルプレートおよび基材ウェルプレートを上面図で示す。示されるように、各ウェルプレートは、ツーバイツーアレイに配置された４つのウェルを含む。図２Ｂは、使用されるデバイスを示し、細胞容器またはレザバウェルプレートおよび基材ウェルプレートがウェル１３、１５および５５、５７それぞれに沿った断面図で示される。図１および５に示されるように、レザバウェル１３および１５のそれぞれは、１７および１９でそれぞれ示されたキャリア流体表面を有するキャリア流体１４および１６中で懸濁された細胞を含む。細胞容器またはレザバウェルプレートのウェルの材料および設計は、図１および５に示された容器のものと同様である。例えば、図２Ｂ（ウェル）および図５Ｂ（チャネル）に示された細胞容器またはレザバは、実質的に音響的に区別不可能であるように実質的に同一の構成である。これらの実施形態において、細胞レザバのベースは、このベースを通って、含まれるキャリア流体に音響放射を効率的に伝達し得るような物質（例えば、適切な音響インピーダンスを有する物質）および厚さである。
【００４３】
図２および５のデバイスはまた、音響発生手段３５および集束手段３７を含む、図１に示されたエジェクターと同様の構成を有する音響エジェクター３３を含む。エジェクターは、音響発生手段３５および集束手段３７から構成される。図２Ｂは、間接的な接触を介してレザバウェルに音響的に接続されたエジェクターを示し、音響カップリング媒体４１は、エジェクター３３とレザバウェルプレート１２との間（すなわち、音響集束手段３７の曲がった表面３９と第１の細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１３のベース２５との間）に配置される。示されたように、第１の細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１３は、音響集束手段３７に音響的にカップリングされ、その結果、ほぼ上方向に生成された音響放射は、集束手段３７によって音響カップリング媒体４１に向けられ、次いで、音響放射を細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１３に伝達する。
【００４４】
動作時では、細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）の各々は、好ましくは、キャリア流体内で懸濁された異なる型の細胞または細胞の混合物を有するキャリア流体で充填される。示されるように、デバイスのレザバウェル１３および１５は、図１のように、第１の細胞混合物１４を有するキャリア流体および第２の細胞混合物１６を有するキャリア流体で各々充填されて、流体表面１７および１９をそれぞれ形成する。図１および５は、エジェクター３３が、音響カップリング媒体４１を介してレザバウェルとの音響結合を達成するために、エジェクター３３がエジェクター位置決め手段４３によってレザバ１３の下に位置決めされることを示す。
【００４５】
細胞容器から個々の細胞をウェルプレートに排出するために、図２Ａは、基材ウェルプレート４５の第１基材ウェル５５を、第１の細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）から排出された滴を受容するために、第１レザバウェル１３の上に位置決めされることを示す。
【００４６】
一旦、エジェクター、細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）、ならびに基材が適切に位置調整されると、音響放射発生器は、流体表面１７近くの焦点４７に音波を向けるための集束手段によって集束された音波（エネルギーの量は、流体を射出するには不十分である）を生成させるために起動する。集束された音響エネルギーの第１放出は、音響エネルギーの反射（細胞とキャリア流体との間の音響インピーダンスの違いに起因する反射）による排出のために、表面に十分近い細胞の存在の音響検出を可能にする。細胞を検出および局在化した後、他の特性が、排出するための決定がなされる前に測定され得る。また、どの細胞も排出するために表面の十分近くに存在しない場合、この音響エネルギーは、細胞が局在化され、そして集束された音響エネルギーによって表面のより近くまで駆動されるまで、この流体表面から次第により離れた距離で集束され得る。あるいは、均一な場（ｆｉｅｌｄ）を使用して、この細胞を表面のより近くまで移動させ得る。このような１つの場は、フォトン場であり、この場は、キャリア媒体および細胞の屈折率の違いによって決定される、断面積およびフォトンモーメントの変化に基づく力を及ぼす。別のこのような場は、電場であり、これは、正味の表面電荷に基づく力を及ぼす。流体表面から細胞の短い平均距離に影響を及ぼす種々の方法が存在することが理解される。チャネル（特に、微小構築されたチャネル）について、機械的な手段を使用して、このチャネルを横切るランプ様構造を配置することにより、流体表面から十分に近い距離をもたらし得、ランプを横切るチャネルの深さを、細胞の直径のオーダーの深さまで減少させ、これにより、細胞が表面近くを流れることのみを可能にし；図５Ｄに示されるように、チャネルの深さが最も浅い場所で、流体速度は最も速いので、細胞は、このランプで詰め込まれるようではない。図５Ｅは、細胞に作用する力によって、細胞を表面の方に移動させる、微小流体チャネルを示す。
【００４７】
微小流体チャネルは、細胞が配置され得る体積を減少させる小さな寸法で構築され得るので、この微小流体チャネルは、排出に適切な細胞の配置が非常に単純化される場合、音響排出と共に使用するのに特に好ましい。例えば、比較的均一な寸法を有する細胞型または細胞の混合物（例えば、平均直径１０．０μｍ、ＳＤ．０．５μｍ）に対して、チャネルが、約１２．０μｍの幅および深さとなるように操作され、流体表面（排出体積４／３πｒ３＝０．５２ｐＬ）から約１．０μｍの平均距離で細胞の単一ファイルを作製し得る。このような場合、この表面と細胞の位置との間の距離を短くするために、ランプまたは任意の他の手段を提供することは、必ずしも必要ではない。細胞が、流体流れ軸に沿って、一定の制限された距離範囲でチャネルから排出され得、スキャニングされる流体表面の領域を減少させる。例えば、細胞を排出するための５０μｍの開口が、閉口したキャピラリーに提供され得るか、または開口キャピラリーの流れ軸に沿った制限された距離が、排出のために使用され得、細胞がエジェクターを通過して移動し、細胞のためにスキャニングされた領域を減少させることが有意な利点である。このような方法を、ペトリ皿のような微小スケールの容器内で細胞を浮遊させるために使用する場合でさえ、有意な時間量が、排出するために細胞を配置するために、流体表面に対して平行なプレートにおいてスキャニングして浪費する。微小流体チャネルを使用する利点は、広範な範囲の細胞サイズ（例えば、前述の細胞型（平均直径１０．０μｍ、ＳＤ．０．５μｍ）と混合された赤血球（ＲＢＣ、平均直径７μｍ、ＳＤ．０．３μｍ、両凹面ディスク、高さ０．３μｍ））をわずかに減少させる。ＲＢＣは、流体排出体積に対して表面から有意な深さであり得、これによって、有意なエネルギーがＲＢＣを排出するために必要とされるが、この状態は、細胞を流体表面の方に集束する記載の方法によって克服され得る。ペトリ皿の数ｃｍの幅と対照的に、側方サーチを約１２μｍの幅まで制限する利点は、即座に明確である。
【００４８】
表面に有意に近接する細胞が配置され、そして排出のための任意の他の判断基準に合うように決定されると、この音響放射発生器が起動され、流体表面１７の近くの集束点４７の方にこの音波を向けるための集束手段によって集束される音波を生成し、このエネルギー量は、排出される細胞の体積に実質的に対応する流体の体積を排出するのに十分であるので、その結果、任意の排出された体積は、１個より多くの細胞を含まない。必要とされる体積以下のみを排出するために必要とされる正確な量のエネルギーは、適用されるエネルギーを排出に所望される細胞を排出するには不十分な量から標的される物質の位置に対して所望される距離で細胞に排出するために適用されたまさに十分なエネルギーが存在するまで、次第に増加させることによって最初に較正し得る。この最初の較正後、流体レベルの任意の変化に対して調節したほぼ同じエネルギーが、最初の較正細胞と実質的に同じ体積の細胞を排出するために適用され得る。結果として、小滴４９（単一の生存細胞を含む）は、流体表面１７から、基材ウェルプレート４５の第１の基材ウェル５５に排出される。細胞含有小滴は、表面張力によって基材のウェルプレート上に保持される。
【００４９】
次いで、図２Ｃに示されるように、基材ウェルプレート４５を、基材位置決め手段５０によって、基材ウェル５７が、それから細胞含有液滴を受けるために、細胞容器またはレザバ（ウェルまたはチャネル）１５上に直接位置決めされるように再配置する。図２Ｃはまた、エジェクター３３が、音響カップリング手段４１によりエジェクターおよび容器を音響的にカップルするために、細胞容器ウェル１５の下にエジェクター配置手段により再配置されることを示す。平面上基材上の基材ウェルプレートおよびレザバウェルプレートまたはチャンネルは異なるサイズであるので、エジェクター配置手段の動きと基材ウェルプレートの動きとの間には、同一でない対応のみが存在する。図２Ｃに示されように、一旦適正にアラインされると、エジェクター３３の音響照射発生器３５は活性化されて、次いで、集束手段３７により、流体表面１９近傍の焦点に向けられる音波を生成し；この波は、排出されるキャリア流体表面に十分近接している細胞の存在を検出するために用いられる。このような細胞が検出され、そして排出のための規準として用いられる任意の性質が測定された後、エジェクター３３の音響照射発生器３５は活性化され、次いで集束手段３７によって、流体表面１９近傍の焦点に向けられる音波を生成し、そこから、細胞含有液滴５３が基材ウェルプレートの第２のウェル上に排出される。このような操作は、１つのウェルプレートから異なるサイズの別のウェルプレートに、適切なサイズの液滴に含まれる複数の単一細胞を移入するために、採用されたデバイスが、どのように用いられ得るかの例示であることを明確にすべきである。当業者は、この型の移入が、細胞、キャリア流体、およびエジェクターおよび基材の両方が連続運動するときでさえ実施され得ることを認識する。レザバ、ウェルプレート、および／または基材の種々の組合せが、単一細胞を含む液滴を移入するための採用されたデバイスで用いられ得ることをさらに明確にすべきである。細胞を含有する流体液滴のさらなる移入のため（例えば、細胞アレイ配置のため）に、レザバの配置の前に、任意のレザバが、流体キャリアで、または懸濁された細胞を含む流体キャリアで、それぞれ、細胞フリーまたは細胞含有流体液滴の音響排出により充填され得ることもなおさらに明確にすべきである。
【００５０】
上記のように、個々の（例えば移動可能な）レザバ（ウェルまたはチャンネル）またはプレート（ウェルまたはチャンネル）を用い、排出のためにキャリア流体中の細胞懸濁物を含み得；ウェルプレートのレザバまたはウェルは、好ましくは、互いから、音響的には実質的に区別不能である。また、エジェクターが流体中に隠れることが意図されなければ、レザバまたはウェルプレートは、排出されるべき流体の表面に運搬されるエジェクターからの音響照射を可能にするに十分な音響的伝達性質を有さなければならない。代表的には、これは、それらが作製される材料の音響的インピーダンスに対して十分に薄いレザバまたはウェルベースを提供することを含み、受容されない浪費をなくしてそれを通って伝わる音響照射を可能にする。さらに、レザバの構築に用いられる材料は、含まれるキャリア流体と適合しなければならず、そして懸濁された細胞に非毒性でなければならない。
【００５１】
従って、レザバまたはウェルは、水性キャリア中に懸濁される生存細胞を含むことが意図されるので、水中に溶解もしくは膨潤する、または生存細胞に毒性の化合物を水性キャリア中に放出する任意の流体材料は、不適切であろう。水ベースの流体には、多くの材料がレザバの構築に適切であり；これらは、限定されないで、酸化ケイ素および酸化アルミニウムのようなセラミック、ステンレス鋼および白金のような金属、およびポリエステルおよびポリテトラフルオロエチレンのようなポリマーを含む。これらの材料は、細胞に毒性の物質が細胞に対しキャリア流体毒性を与えるに十分な量でキャリア流体中の漏出しないように調製され得る。採用されるデバイスとの使用に適切な多くのウェルプレートが市販されており、そして、例えば、ウェルプレートあたり９６，３８４または１５３６ウェルを含み得る。採用されたデバイスにおける使用のために適切なウェルプレートの製造は、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＧｒｅｉｎｅｒ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｍａｒｙ，Ｆｌｏｒｉｄａ）を含む。しかし、このような市販のウェルプレートの利用可能性は、少なくとも約１０，０００ウェル、または１００，０００ウェル程度またはそれ以上を含むカスタムメイドのウェルプレートの製造および使用を排除するものではない。アレイを形成する適用には、約１００，０００〜約４，０００，０００のレザバを採用し得ることが予期される。さらに、エジェクターを各レザバまたはレザバウェルとアラインするために必要な動きの量を低減するために、各レザバの中心は、任意の他のレザバ中心から、約１ｃｍより大きくなく、好ましくは約１ｍｍより多くなく、そして最適には、約０．５ｍｍより多くなく位置決めされることが好ましい。
【００５２】
一般に、デバイスは、実質的に任意の型および所望される量の流体を排出するように適合され得る。排出された流体は水性および／または非水性であり得るが、水性流体のみが生存細胞の移入に適合する。水性流体の例は、水それ自身、水溶媒和イオンおよび非イオン溶液、固体の懸濁液またはスラリー、ゲル、および分離した細胞を含む水液体を含む。本発明の技法を用いて可能である正確さのため、デバイスを用いて、約１００ナノリットルより多くない流体、好ましくは約１０ナノリットルより多くない流体を含むように適合されたレザバからの液滴を排出する。特定の場合には、エジェクターは、約１〜約１００ナノリットルの流体を含むように適合されたレザバから液滴を排出するように適合され得る。これは、排出されるべき流体が希少または高価な生体分子または細胞を含むとき特に有用であり、この場合、約１ピコリットルまでの容量を有する液滴を排出することが所望され得る。
【００５３】
上記の記載から、デバイスの種々の部材が、基材上の細胞のアレイを形成するために個々の制御または同調化を必要とすることが明らかである。例えば、エジェクター配置手段は、基材表面上に調製されるべきアレイと関連した予め決定されたシークエンスで、各細胞容器またはレザバから液滴を排出するように適合されている。同様に、エジェクターに対して基材表面を配置する、基材位置決め手段は、液滴をその上のパターンまたはアレイ中に受けるために基材表面を配置するように適合され得る。両方または片方の配置手段、すなわち、エジェクター配置手段および基材位置決め手段は、例えば、レバー、プーリー、ギア、リニアモーター、それらの組合せ、またはその他の当該分野で公知の機械的手段から構築され得る。基材の動きと、エジェクターの動きと、および適切なパターン形成を確実にするエジェクターの活性化との間の対応があることを確実にすることが好ましい。
【００５４】
さらに、デバイスは、性能を向上するその他の部材を含み得る。例えば、上記で暗示するように、デバイスは、基材表面の温度を低下させるための冷却手段をさらに備え得、例えば、排出液滴が基材に接着し、そして細胞がそれらの生存率を維持するために急速に凍結することを確実にする。この冷却手段は、基材表面を、細胞含有流体液滴がそれと接触した後、流体が部分的、または好ましくは完全に、すぐに凍結することを可能にする温度に維持するよう適合され得る。細胞を含む水性流体液滴の場合には、この冷却手段は、基材表面を、約０℃を超えないよう、好ましくはさらに低く維持する能力を有するべきである。さらに、音響エネルギーの流体のレザバへの繰り返し付与は、流体の加熱を生じ得る。加熱は、勿論、生存細胞に対し所望されない影響を生じる。従って、デバイスは、細胞容器またはレザバ内の流体を一定の温度に維持するための手段をさらに備え得る。このような温度維持手段の設計および構成は当業者に公知であり、そして、例えば、加熱エレメント、冷却エレメント、またはそれらの組合せのような部材を備え得る。生体分子および生存細胞配置適用には、一般に、生体分子または細胞を含む流体を、約１℃または２℃より大きくない偏差で一定温度に保つことが所望される。さらに、流体は、生存細胞には、冷却されなけば生存率が低いことが知られる特別の細胞型を除き、原核生物または真核生物である否かにかかわらず、温血生物の場合、細胞が由来する通常温度を約１℃を超えず、そしてその他すべての生物について約１６℃である温度に維持されることが好ましい。生存に冷却を必要とする細胞は、細胞を培養および維持する当業者によって、約４℃で適切な浸透圧（わずかに高浸透圧）の生理食塩水キャリア流体を必要とすることが認識される。従って、例えば、生体分子含有流体が水性であるとき、排出の間に流体を約４℃に保つことが最適であり得る。
【００５５】
本発明は、音響排出細胞含有液滴を受ける前の、基材表面の修飾を含み得る。表面修飾は、官能化または脱官能化、平滑化または粗面化、コーティング、分解、不動態化、または表面の化学的組成または物理的性質のその他の修飾を含み得る。１つの実施形態では、本発明は、外部に表示されるマーカー成分と同族である官能化を必要とするが、記載のその他の表面修飾が、特定の文脈における本発明の成功に影響し得る。
【００５６】
１つのこのような表面修飾方法は、表面のぬれ特性を変更することを含む。このような方法は、例えば、指定領域内の表面上に射出された液滴中に含まれる細胞の閉じ込めを容易にするため、または基材もしくは特定の基材位置を官能化（例えば、ビオチン化溶液の音響射出により達成されるパターン化されたビオチン化）するために用いられる分子部分の表面結合を増強するために用いられ得る。基材表面のぬれ特性を変更するための好ましい方法は、流体の音響射出前に基材表面の各指定部位に、適切な表面修飾流体の液滴を堆積して、そこにアレイを形成することを含む。このようにして、音響的に射出された液滴および含まれる細胞の「広がり」は最適化され得、そしてスポットの大きさ（すなわち、直径、高さおよび全体的な形状）における一貫性が確実にされ得る。この方法を実施する１つの方法は、エジェクターを、表面修飾流体を含むモディファイアレザバに音響的にカップリングし、次いで上記に詳細に記載されるように、このエジェクターを作動させて、表面修飾流体の液滴を生成し、そしてこれを、基材表面の指定部位に向かって射出することを含む。この方法は、所望により、表面修飾流体をさらなる指定部位に堆積させるために繰返される。生体分子（特に、形質転換細胞または非形質転換細胞の表面に提示されたマーカー部分に特異的に結合する、同族部分）のアレイを生成する他の方法もまた使用され得る。例えば、単一の同族部分（例えば、ビオチン）は、均一に、またはあるパターン（例えば、非ビオチン化領域によって取り囲まれたビオチン化領域のパターン）で、基材表面に連結され得る。パターン化されるべき細胞を形質転換して、その表面にストレプトアビジンを提示し得る。
【００５７】
図３は、単純化した断面図において、図１に図示したデバイスと類似であるが、流体表面６１を有する表面修飾流体６０を含むモディファイアレザバ５９を備えるデバイスを用いてダイマーが基材上で合成される、上記の方法の特定の実施形態を模式的に図示する。図３Ａは、基材４５の表面５１上の、ダイマーが合成されるべき指定部位のぬれ特性を変更するように選択された、表面修飾流体６０の液滴６３の射出を図示する。エジェクター３３は、音響カップリング媒体４１を介してモディファイアレザバ５９との音響カップリングを達成するために、エジェクター位置決め手段４３によってモディファイアレザバ５９の下に配置される。基材４５は、指定部位での表面修飾流体６０の液滴の音響堆積を可能にする位置で、モディファイアレザバ１９の上に配置される。一旦、エジェクター３３、モディファイアレザバ５９および基材４５が適切に整列されたら、音響放射発生器３５を作動させて、流体表面６１からの表面修飾流体６０の液滴６３の、基材の下側表面５１の指定部位への射出を可能にする様式で集束手段３７によって方向付けされる、音響放射を生じる。一旦、液滴６３が基材表面５１と接触したら、この液滴は、基材表面の領域を修飾して、堆積した流体に関するこの領域の表面エネルギーの増大または減少を生じる。
【００５８】
次に、図３Ｂに示すように、基材４５は、液滴６３によって修飾された基材表面領域が、レザバ１３上に直接的に位置するように、基材位置決め手段５０によって再配置される。図３Ｂはまた、エジェクター３３が、エジェクター位置決め手段によってレザバ１３の下に、音響カップリング媒体４１を介してエジェクターとレザバとが音響カップリングするように配置されることを示す。一旦、適切に整列されると、エジェクター３３は、液滴４９を基材上に射出するように再度作動される。液滴４９は、単一の細胞６５（好ましくは、その細胞外膜上に、この表面に連結した同族部分によって特異的に結合されるマーカー部分を提示して、この表面への特異的結合をもたらす）を含む。マーカー部分は、非形質転換細胞において生じ得るか、または形質転換もしくは遺伝子操作の結果であり得、そして必要に応じて形質転換を示し得、その結果、マーカー以外の遺伝子が発現される（例えば、このマーカーは、別の遺伝子による形質転換のレポーターである）。
【００５９】
図３Ｃに示すように、基材４５は再度、第一の単一の細胞６５が結合した部位とは異なる部位が、別の液滴に含まれる細胞を受けるようにレザバ１５上に直接位置するように、基材位置決め手段５０によって再配置される。図３Ｂはまた、エジェクター３３が、エジェクター位置決め手段によってレザバ１５の下に、エジェクターとレザバとが音響カップリング媒体４１を通して音響的にカップリングするように配置されることを示す。一旦、適切に整列されたら、エジェクター３３は、液滴５３を基材上に射出するように再度作動させられる。液滴５３は、第二の単一の細胞を含む。
【００６０】
同族部分は通常、オリゴヌクレオチドおよびペプチドを含む、リガンドである。マーカー部分は、ペプチドまたはペプチドグリカンであるようである。基材に結合したオリゴヌクレオチドを合成する際に用いられる化学は、音響流体液滴射出に適応され得る；同時係属中の米国第０９／９６４，２１２号（「Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ」）（発明者：Ｅｌｌｓｏｎ，ＦｏｏｔｅおよびＭｕｔｚ（上記で援用））を参照のこと。これらの方法は、本発明での使用のための基材表面にオリゴヌクレオチドのアレイを作製するために用いられ得る。このような適応は一般的に、核酸化学の当業者に公知である、ならびに／または適切な文献および教科書に記載される、現在〜従来の技術を含む。例えば、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）を参照のこと。すなわち、個々のカップリング反応は、オリゴヌクレオチドの合成のために用いられ、そして自動化オリゴヌクレオチド合成機で従来用いられる、標準条件下で実施される。このような方法論は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍａｔｔｅｕｃｉら（１９８０）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．５２１：７１９、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらに対する米国特許第４，５００，７０７号、ならびにＳｏｕｔｈｅｒｎらに対する米国特許第５，４３６，３２７号および同第５，７００，６３７号に記載される。焦点を合わせた音響エネルギーもまた、コンビナトリアルオリゴヌクレオチド、オリゴペプチドおよびオリゴ糖のインサイチュ合成に適応され得る；これらの合成を用いて、本発明で使用するためのコンビナトリアルアレイを生成し得る。同時係属中の米国第０９／９６４，１９３号（「Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、発明者ＭｕｔｚおよびＥｌｌｓｏｎ）（上記で援用）を参照のこと。
【００６１】
あるいは、オリゴマーは、基材表面への結合の前に合成され得、次いで本発明の方法論を用いてこの表面の特定の位置に「スポッティング（ｓｐｏｔ）」され得る。さらに、このオリゴマーは、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、オリゴ糖または任意の他の生体分子（もしくは非生体分子）オリゴマー部分であり得る。
【００６２】
本発明での使用のためのこれらの音響射出方法は、現行のアレイ調製技術（例えば、写真平板プロセス、圧電技術（例えば、インクジェット印刷技術を用いる）およびマイクロスポッティング）を用いて可能であるよりも実質的に高い密度を有する、分子アレイ（特に、生体分子のアレイ）の調製を可能にする。本発明のデバイスおよび方法を用いて達成され得るアレイ密度は、基材表面１平方センチメートルあたり少なくとも約１，０００，０００生体分子であり、好ましくは基材表面１平方センチメートルあたり少なくとも約１，５００，０００である。生体分子部分は、例えば、ペプチド性分子および／またはオリゴヌクレオチドであり得る。しばしば、このような密度は、他の細胞からある距離で隔てられている、個々の細胞を含む部位を作製するために必要ではない。しかし、例えば、マーカー部分に特異的に結合する同族部分を用いて、部位表面の別個の部分を官能化するためのこのような方法の適応は、細胞をその部位内に局在させる際に、または細胞を互いに極めて近接するように故意に配置する際に、有用であり得る。例えば、小さな細胞（８μｍ）、中間の細胞（１２μｍ）、大きな細胞（１４μｍ）からなるリンパ球アレイは、適切な同族部分を用いて、各１００μｍ×１００μｍ部位の中心において直径１０μｍのスポットを官能化して、スポッティングした細胞を選択的に結合させることによって作製され得る。この配置は、例えば、隣接部位の細胞を流体に曝露することなく、細胞を曝露または処理するに充分な容量の、音響的に堆積された試薬含有流体の液滴による、個々の細胞の試験またはスクリーニングを可能にするに充分な細胞分離を確実にする。従って、例えば、細胞のコンビナトリアルスクリーニングが許容される。
【００６３】
次いで、本発明の多くの改変が可能であることが明らかであるべきである。例えば、射出された細胞含有液滴の各々は、単離された「最終的な」特徴として堆積され得る。あるいは、またはさらに、射出された複数の液滴（各々、１つまたは複数の細胞を含む）は、各部位が、確認し得る数の複数の細胞を含む細胞アレイを合成するために、基材表面の同じ位置に堆積され得る。この方法を用いて、細胞を、他の目的のため（例えば、特定の組織学的構築物の複製に基づいて組織を操作するため）にパターン化し得る。細胞アレイ、および基質表面への細胞の結合を含むパターン形成製造技術に関して、洗浄工程が、液滴射出工程の間で用いられ得ると考えられる。このような洗浄工程は、例えば、細胞が堆積された基材表面全体を、洗浄流体中に浸漬することを含み得る。
【００６４】
本発明は、同じレザバから少なくとも約１，０００，０００滴／分の速度で、および異なるレザバから少なくとも約１００，０００滴／分の速度で、液滴の射出を可能にする。さらに、現在の位置決め技術は、１つの細胞容器またはレザバから別の容器またはレザバへ、迅速かつ制御された様式で移動させるためのエジェクター位置決め手段を可能にし、それによって、異なる流体の迅速かつ制御された射出を可能にする。つまり、現在の市販の技術は、各レザバでの繰り返し可能でかつ制御された音響カップリングを伴って、高性能位置決め手段については約０．１秒未満で、そして通常の位置決め手段については約１秒未満で、１つのレザバから別のレザバへエジェクターが移動されるのを可能にする。カスタム設計されたシステムは、繰り返し可能でかつ制御された音響カップリングを用いて、約０．００１秒未満で、１つのレザバから別のレザバへエジェクターが移動されるのを可能にする。
【００６５】
カスタム設計されたシステムを提供するために、以下の２種の基本の運動が存在することを留意することが重要である：パルス性および連続性。パルス運動は、エジェクターをある位置に移動させ、音響エネルギーを放出し、そしてエジェクターを次の位置に移動させる、別々の工程を含み；また、このような方法と共に高性能位置決め手段を使用することによって、０．１秒未満での、各レザバにおける繰り返し可能でかつ制御された音響カップリングを可能にする。これに対して、連続運動設計は、エジェクターおよびレザバを連続的に移動させ（同じ速度ではないが）、そしてこれらの移動が生じている間に射出を提供する。パルス幅は非常に短いので、この型のプロセスは、レザバの移動が、１０Ｈｚよりも高い、そしてさらには１０００Ｈｚよりも高い速度で生じるのを可能にする。
【００６６】
流体射出の正確性を保証するために、エジェクターに対する、液滴が射出される流体表面の位置および方向を決定することが重要である。さもなければ、射出される液滴は、不適当な大きさにされ得るか、または不適当な軌道で移動し得る。従って、本発明の別の実施形態は、射出事象間のレザバ中の流体表面の高さおよび細胞の近位性を決定するための方法に関する。この方法は、音響放射発生器へ流体含有レザバを音響的にカップリングする工程、および、次いで、その発生器を起動して、検出音波を生成する工程を包含し、この音波は、流体表面へ移動し、そして反射音波として流体表面から反射される。次いで、反射された音響放射のパラメーターを、音響放射発生器と流体表面との間の空間的関係を評価するために分析する。このような分析は、音響放射発生器と流体表面との間の距離および／または音響放射発生器に対する流体表面の方向の決定を含む。
【００６７】
より詳細には、音響放射発生器は、流体表面から液滴を射出するのに不十分なエネルギーである、低エネルギーの音響放射を発生するように、起動され得る。これは、代表的には、液滴射出に通常必要とされるパルス（マイクロ秒オーダーでの）と比較して、極めて短いパルス（数十ナノ秒のオーダーでの）を使用して行われる。音響放射が流体表面によって反射され、音響放射発生器に戻るのに要する時間を決定し、次いで、その時間を流体中の音の速度と相関させることによって、距離（および従って、流体の高さ）が計算され得る。流体表面からの流体中の細胞の距離は、同じ様式で決定され得る。もちろん、レザバの基部と流体との間の界面によって反射される音響放射が考慮されることを保証するために、注意を払わなければならない。当業者は、このような方法が、従来のソナー技術または改良されたソナー技術を使用することを、認識する。
【００６８】
一旦、分析が行われると、流体の少なくとも１個の液滴を射出するために、流体表面付近の細胞中心に近い焦点を有する射出音波が生成され、ここで、射出音波の最適な強度および方向が、前述の分析を使用して、必要に応じて、さらなるデータと組み合わせて、決定される。「最適」な強度および方向は、一般に、一貫したサイズおよび速度の液滴を生成するために選択される。例えば、射出音波の所望の強度および方向は、上記で評価した空間的関係のみならず、以下を使用して決定され得る：レザバに関連する形状データ、射出される流体に関連する流体特性データ、細胞の大きさおよび結果としての細胞体積、および／または射出順序に関連する細胞含有液滴射出のヒストリカルデータ。さらに、これらのデータは、所望の場合、射出音波の焦点が流体表面付近にあることを保証するために、流体表面に対して音響放射発生器を再位置決めする必要性を示し得る。例えば、分析が、この射出音波が流体表面付近に焦点合わせされ得ないように、その音響放射発生器が位置決めされていることを示す場合、音響放射発生器は、垂直方向運動、水平方向運動および／または回転運動を使用して再位置決めされ、射出音波の正確な焦点合わせを可能にする。
【００６９】
本発明の１つの局面は、単一の細胞の射出であるので、本発明の選択的特性は、即座に理解される。単純な射出を使用することによって、最も小さい細胞の射出で開始して、十分に異なるサイズの細胞が分離され得る。従って、デバイスは、アレイを作製するためのその使用に加えて、１つの型のセルソーターとして使用され得る。例えば、単球（直径２０μｍ）は、小さいリンパ球（直径８μｍ）ならびに中程度および大きいリンパ球（直径１２〜１４μｍ）の両方よりもはるかに大きいので（単球の細胞体積は、大きいリンパ球の細胞体積よりも約３倍大きく、小さいリンパ球の細胞体積より約１６倍大きいことに対応する）、これらの細胞の混合物は、アレイ化またはソーティングのために選択的に射出され得る。小さいリンパ球を射出するのに十分な最小の音響エネルギーレベルは、大きいリンパ球および単球を射出するのに不十分である。
【００７０】
一旦、全ての小さいリンパ球が射出されると、大きいリンパ球は、より大きくかつ重い単球を射出する危険性をほとんど伴わずに、大きいリンパ球を射出するのに十分な最小の音響エネルギーレベル（中程度のリンパ球を射出するのに十分である）を使用して射出され得る。細胞の外側上で外部に提示されたマーカー部分に対する同族の部分での表面官能基化は、表面上への射出を必要とするが、さらなるレベルの選択性を提供する。最後に、本発明は、細胞の音響的な位置を提供し、細胞が、射出されるべき表面に十分に近いか否かを決定するので、種々の特性が、射出のさらなる基準として測定および使用され得る。細胞選別の当業者は、さらなる基準を用いるこのような射出が、射出された細胞を別の流体容器へ移すのに適切な軌道での射出によってか、または基材にスポットし、その後、容器内へ所望の細胞を洗い出すことによって、従来の細胞選別適用に適合され得ることを理解する。
【００７１】
本発明が細胞選別に使用されるのを可能にするのに加えて、射出基準としての特性を測定する能力は、非生物固体、ゲル、およびキャリア流体とは別の流体領域の選別を可能にする。例えば、固相コンビナトリアル合成に使用され、そのコンビナトリアル配列を識別するためのいくつかのマーカーまたは特性を有する、ビーズの射出が、本発明の方法によって分離され得ることが、容易に理解される。
【００７２】
本発明は、その好ましい特定の実施形態と共に記載されたが、前述の説明が、本発明を例示しそして本発明の範囲を限定しないことが意図されることが、理解される。他の局面、利点および改変は、本発明に関する当業者に明らかである。
【００７３】
以下の実施例は、本発明の実施の方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように示され、そして本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図されない。
【００７４】
（実施例１）
（アレイを形成するための基材上への単球の音響射出）
ヒトＭＨＣ（全ての細胞上に提示される）に対するウサギポリクローナルＡｂを作製し、個体に対して特異的なエピトープよりもむしろ、全てのヒトに共通のＭＨＣエピトープに結合する、単一のクローンを選択する。基材を、慣用的方法によってｍＡｂで官能基化する。Ｓｉを官能基化するための公知の方法の多さから、単結晶Ｓｉを、基材として選択する。２５μｍの幅、２５μｍの深さ、および約３ｃｍの長さ（最後の０．５ｃｍについては上部が開口）のチャネルを使用して、射出する細胞を検索するのに要する時間を節減する。このチャネルは、慣用的な微小加工技術によってカバーガラスプレートに熱融合された、ＨＦエッチガラスプレート製である。
【００７５】
チャネルは、慣用的な方法によって流体カラムに流体連結され、この流体カラムに細胞懸濁液が添加される。カラムの大きさは、５ｍＬの流体キャリアおよび細胞が添加されるのを可能にし、その結果、十分なカラム圧が存在し、チャネルを通る流体の流れを開始して、流体が、十分に短時間で開口した上部領域に到達するのを可能にする。次いで、カラムの上部を圧力調節器に連結し、この調節器は、カラム中のキャリア流体の上にある気体の圧力が調節されるのを可能にし、チャネルを通るキャリア流体の流れの精密な調整、終結および再開を可能にする。
【００７６】
キャリア流体は、生理学的食塩水、または血液の血清の浸透圧重量モル濃度とほぼ等しい浸透圧重量モル濃度を有する他の電解質溶液であり得る。単球を、約３８℃で維持された基材上にスポットする。使用される基材は、平面であり、そして１０，０００部位／ｃｍ２の密度が選択され、各部位は単一の細胞によって占有される。１０人の異なる個体由来の循環単球を、慣用的な方法によって獲得および精製する。
【００７７】
各個体の単球は、約４．２ｐＬの容量を有する液滴の音響射出によって、アレイに付着される。詳細には、各列の１０番目の部位ごとに、１人の個体由来の単球をスポットし、そして個体の細胞の分配を、その次の列へとずらし、個体由来の細胞間で増加された分離を生じる。個体の細胞の分離は、それが、異なる基材領域間の条件における変動に対して内部コントロールを提供するので、好ましい。残りの個体由来の単球を、音響的に射出された液滴で、アレイ部位上に同様にスポットする。１０個の２連のアレイが作製される。
【００７８】
単球は、走化性により炎症した組織へと誘引されるので、単球が、免疫メディエイターの影響下でマクロファージへとトランスフォーメーションされる場合、アレイを、ヒスタミン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＦＳ）、ロイコトリエン、および当該分野で公知の他の炎症性メディエイターのような、１つ以上の炎症メディエイターを含む、種々の生理学的溶液中に浸漬することにより研究した。アレイをまた、熱およびステロイドを含む公知の抗炎症剤、非ステロイド抗炎症薬物、ならびに無作為の物質またはマクロファージの活性に影響すると思われる物質のような、炎症に影響し得る条件に曝すことにより研究した。特定のメディエイターおよびこれらの組み合わせが、炎症誘発効果または抗炎症効果を有すること、ならびに個体の間で、および、より少ない程度で、個々の細胞の間で、差異があることが容易に理解される。単球がｍＡｂ／ＭＨＣ特異的付着により付着されるので、このアレイは、浸漬により破壊されない。
【００７９】
単球のマクロファージへのトランスフォーメーション、およびマクロファージの単球へ戻るトランスフォーメーションは、細胞の生存能力に影響することなく光学顕微鏡により観察され得る。他の公知の方法としては、個々の細胞のＥＭ（電子顕微鏡）およびＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）が挙げられる。免疫細胞（特に、活性化マクロファージ）が、免疫メディエイターおよび走化性剤の放出により免疫細胞を活性化し得るので、ある個体の単球が、免疫メディエイターまたは免疫状態に対して無応答であり得るが、実験条件に対して応答性であった別の個体のマクロファージにより放出された免疫メディエイターに対して、応答性であるという可能性が存在する。上記のコントロールとして、標準的なウェルプレートを、同一の方法を用いるコントロールとして用いる。このウェルプレートは、各ウェルに同じ個体由来の複数の単球を有する（９６ウェルプレートについて、９ウェル／個体、各１１０個の細胞）。ｍＡｂ／ＭＨＣ付着系を含まないウェルプレートを用いる最終コントロールをまた、記載した方法により作製した。このウェルプレートは、射出された細胞含有液滴を定所に保持するのに十分な表面張力を有する。各ウェルプレートに堆積させる１１０個の液滴は、好ましくは、複数の堆積物により形成されることによって液滴が大きくなり過ぎて、表面張力により定所に液滴を保持できなくなることを防ぐために、ウェル内の異なる場所に堆積されることが容易に理解される。
【００８０】
（実施例２）
（気道の免疫応答および炎症応答を研究するためのヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞アレイ）
前述の実施例の方法を、適切な寸法（ＨＡＥ細胞よりもわずかにより大きい）を有するチャネルを提供することにより、ＨＡＥ細胞に適合させる。あるいは、このチャネルの幅は、細胞よりもわずかにより広く；より速い充填のために、奥行きは細胞の直径の約３倍であり、そして図５Ｄに示されるように、傾斜路（ｒａｍｐ）を、開口している、チャネル領域の直前のチャネル流路において用いられる。あるいは、光子場（光ピンセットにおいて通常使用されるレーザーにより提供され得る）を、細胞を表面に近づけるために用い得る。ＨＡＥ細胞を、慣用的な生検により獲得し得、そして培養し得る。射出のために充填する前に、これらを、従来の組織培養法により脱凝集させ、次いで、個々の細胞として懸濁させなければならない。
【００８１】
この実験を、細胞分裂が可能な条件下で行ってもよい。上記の要求およびこれに必要とされる条件は、当業者により理解される。ウェルプレートを用いるコントロールは、有用であるが、単球を有するプレートほど重要ではない。
【００８２】
（実施例３）
（発癌のための代用物としての変異誘発に対する個々の感受性を研究するためのＨＡＥ細胞アレイ）
上記実施例の方法を、化学突然変異誘発原および他の突然変異誘発原（例えば、熱および放射線）に、アレイ化したＨＡＥ細胞を曝露するように適合する。遺伝子の損傷は、慣用的な方法（例えば、架橋の破壊およびＤＮＡに対する他の損傷の生化学的アッセイ）によって、曝露が停止された後の様々な時間で測定される。ＤＮＡ修復酵素の遺伝学における差異は、曝露後の種々の時間での回復（損傷の低減の程度）を比較することにより研究され得る。ウェルプレートアレイは、コントロールとして依然有用であり、そして細胞をこのウェルプレート中で培養し得るか、またはアレイ細胞を取り出しそして培養して、曝露後の引き続く細胞世代における、形成異常細胞または新生物細胞の実際の出現があるか否かを決定する。
【００８３】
（実施例４）
（細胞パターン化（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）：）
実施例１および２の方法を、基底扁平上皮細胞をパターン化するように適合する。基底扁平角質化上皮細胞および扁平非角質化上皮細胞を、実施例１のように、官能化したニトロセルロース基材上にパターン化する。生成したパターンは、唇の朱色の輪郭をエミュレートする。次いで、基材上のパターン化した細胞を、適切な培養培地中に浸漬し、そして研究を、皮膚／非角質化接合部の形成に関して行う。
【００８４】
（実施例５）
（血液からのリンパ球のエピトープアレイ上への音響射出：）
小さいリンパ球、中程度のリンパ球、および大きなリンパ球を、クローンエピトープアレイを形成するための、上記実施例の方法により射出する。２つの平行に隣接するチャネルを異なる幅で構築し、そして細胞を表面に近づけるように適切に設計する。より幅広いチャネルは、培地および大きなリンパ球を収容するために約１５μｍの幅であり；より狭いチャネルは、小さなリンパ球を収容するために１０μｍの幅である。小さなリンパ球を、慣用的な方法または音響射出により、大きなリンパ球および中程度のリンパ球から分離し得る。小さなリンパ球を射出するのにかろうじて十分なエネルギーの量を、混合物中の全てのリンパ球が１つの共通チャネル（１５μｍの幅）を通過するように加える。このエネルギーを、各リンパ球に加えて、射出領域を形成するチャネル開口部またはアパーチャで検出する。射出されたリンパ球を、基材上に射出し、そしてペトリ皿または他の容器中に洗い流し得る。あるいは、音響エネルギーを、非垂直軌道で液滴を射出するように送達し得、その結果、この液滴は、容器（例えば、上部が開口しており、そして射出チャネルに十分に近いチャネル）のすぐ近くに着地する。
【００８５】
エピトープアレイは、天然に存在するアミノ酸から形成したコンビナトリアルテトラペプチドアレイである。他のエピトープは、タンパク質において、非一次構造の結果として、ハプテンを有するペプチド分子において、およびペプチドグリカンおよび多糖類のような他の生体分子の両方において存在することが容易に理解される。約１０１２個のエピトープの小さな画分のみをアレイ化する。Ｔ細胞およびＢ細胞の両方を、容易に理解されるような、わずかに異なる機構により、これらのエピトープに結合する。テトラペプチドアレイを、種々の方法によって（例えば、上記のコンビナトリアル化学についての同時係属出願に記載されるような、試薬の集束させた音響射出を用いるデバイスに対する、固相ペプチド合成技術の適用によって）、作製し得る。１．６×１０４個の異なる天然のテトラペプチドが存在する場合、１６  １−ｃｍ２のアレイ面積（各々１０００個のアレイ部位を含む）は、全てのテトラペプチドの合成に利用可能であり、そして個々の細胞の分離を可能にする適切な密度を維持しなければならない。
【００８６】
細胞を、可能な限り速くアレイ部位上にスポットする（従って、２つのチャネルに対する、異なるサイズにもかかわらず、チャネル中で細胞の一列の線を維持する必要性）。１６，０００個のアレイ部位の各々が、これらの部位上に射出された液滴を有しているときに、このアレイを洗浄して、堆積部位でエピトープに結合しない細胞を取り除く。これらのアレイを画像化して、どの部位が細胞を結合しているのかを決定し、そしてサイクルを細胞を結合していない部位に対して繰り返す（これらの部位に再スポットする）。このプロセスは、洗浄後のアレイの画像化を必要とし、そして自動化されなければならないことが直ぐに理解される。このようなシステムの自動化は、容易に達成でき、そしてクローン分離に対する貴重な情報が、計画の完了の前に導き出される。異なる型のエピトープの使用は、さらに、分類分け（ｃａｔａｌｏｇｕｉｎｇ）に及ぶ。
【００８７】
（実施例６）
（形質転換した細菌を選択するための細菌の射出）
Ｅ．ｃｏｌｉを、細胞表面上のストレプトアビジンの発現および提示もまた引き起こす構築物によって、汎サイトケラチン（ｐａｎｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）（真核生物タンパク質）を発現するように、慣用的な方法により形質転換する。この細胞を、上記実施例１〜５に記載されるように、慣用的な方法によりビオチン化された基材上に音響射出する。このチャネルサイズを、細菌の寸法（１μｍ）に適合させなければならないが、これは、公知の微小組み立て法により達成される。形質転換した細胞を、マーカー部分（ストレプトアビジン）によりビオチン同族部分に特異的に結合させる。基材を洗浄して、形質転換していない細胞を取り除き、基材に付着した形質転換した細胞のみを残す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａおよび１Ｂ（まとめて図１という）は、本発明と関連して有用なデバイスの１つの実施形態を、簡単な断面図で概略的に示す。このデバイスは、第１および第２の細胞容器またはレザバ、音響エジェクターおよびエゼクターポジショニング手段を備える。本明細書中で参照される全ての図面において同じ部材を、同じ数字により参照するので、図１を一定の比例に拡大縮小せずに、特定の寸法を、提示の明確さのために誇張し得る。図１Ａは、音響エジェクターを示す。この音響エジェクターは、第１の細胞容器またはレザバに音響カップリングされ、そして基材表面上の指定部位に向けて、第１の細胞容器またはレザバから単一細胞を含む流体の液滴を射出するように作動される。図１Ｂは、音響エジェクターが第２の細胞容器またはレザバに音響カップリングしたことを示す。
【図２】  図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ（まとめて図２という）は、図１の本発明の実施形態のバリエーションの概略図を示す。ここで、この細胞容器またはレザバは、レザバウェルプレートに別個のウェルを備え、そして基材はウェルの数に対応するより小さなウェルプレートを備える。図２Ａは、２つのウェルプレート（すなわち、細胞容器またはレザバウェルプレートおよび基材表面（流体液滴中に含まれるアレイ化細胞を有する）の平面図を図示する。図２Ｂは、音響エジェクターに音響カップリングした図２Ａの、細胞容器またはレザバのウェルプレートを備えるデバイスの断面図を示す。ここで、液滴中に含まれる細胞は、細胞容器またはレザバウェルプレートの第１のウェルから、基材ウェルプレートの第１のウェルへと射出される。図２Ｃは、図２Ｂにおいて図示したデバイスの断面図を示す。ここで、この音響エジェクターは、細胞容器またはレザバウェルプレートの第２のウェルに音響カップリングされ、そしてさらに、このデバイスは、音響エジェクターが液滴を細胞容器またはレザバウェルプレートの第２のウェルから基材ウェルプレートの第２のウェルに射出し得るように整列される。
【図３】  図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ（まとめて図３という）は、本発明の方法の１つの実施形態を、簡単な断面図で概略的に示す。ここで、外面的に提示されるマーカー部分を有する細胞は、図１のデバイスを使用して、基材上に射出される。図３Ａは、基材表面の指定部位上への、細胞を含有する流体液滴の射出を示す。図３Ｂは、修飾された基材表面に付着するように適合された、第１のマーカー部分を提示する第１の細胞を含む液滴の射出を示す。図３Ｃは、第１の分子に付着するように適合された、第２の分子部分を含む第２の流体の液滴の射出を示す。図３Ｄは、基材および図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃにおいて示されるプロセスによって、インサイチュで合成された２量体を示す。
【図４】  図４Ａおよび４Ｂ（まとめて図４という）は、図１のデバイスを用いる音響射出により堆積された液滴中に含まれるアレイ化細胞を示す。図４Ａは、隣接するアレイ部位に常在する２つの異なる細胞を示す。これらの細胞は、表面張力によって基材表面の指定部位に接着されている流体液滴に含まれており、各細胞はさらに、ビオチン化（ビオチン（Ｂ）結合した）表面へのストレプトアビジン（ＳＡ）の結合により、この部位に結合される。外面提示標的化（ｅｘｔｅｒｎａｌ−ｄｉｓｐｌａｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）ストレプトアビジンの遺伝子コード配列による形質転換の結果として、ストレプトアビジンは細胞外面上に提示される。図４Ｂは、隣接するアレイ部位に常在する２つの異なる細胞を示す。これらの細胞は、表面張力によって基材表面の指定部位に接着されている流体液滴に含まれており、各細胞はさらに、２つの異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ−Ｅ１、ｍＡｂ−Ｅ２）に対するこれらの細胞（ここでは、Ｅ１およびＥ２）に特異的な外面に提示された２つの抗原性エピトープの結合によってこれらの部位に付着される。これらのモノクローナル抗体は、異なるエピトープに対してそれぞれ特異的であり、各ｍＡｂは、隣接するアレイ部位の１つのみで表面に連結される。
【図５Ａ】  図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ（まとめて図５という）は、細胞が基材上に射出される容器として流体チャネルを有するデバイスを示す。図５Ａは、このデバイスを模式的に示す。
【図５Ｂ】  図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ（まとめて図５という）は、細胞が基材上に射出される容器として流体チャネルを有するデバイスを示す。図５Ｂは、このデバイスを模式的に示す。
【図５Ｃ】  図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ（まとめて図５という）は、細胞が基材上に射出される容器として流体チャネルを有するデバイスを示す。図５Ｃは、流体液滴中に含まれるアレイ化細胞を有する基材表面を有する、生存細胞を含むチャネルの平面図を示す。
【図５Ｄ】  図５Ｄは、射出のために、細胞を流体表面へ十分に近づける、チャネル底部の上向きの突出部を示す。
【図５Ｅ】  図５Ｅは、射出するために、細胞を流体表面へ十分に近づけるために、集束したエネルギー（例えば、音響エネルギー）の使用を示す、チャネルの断面図を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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