(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々が以下の式Ｉ：
【化１】
0004593780.tif 000022
のアミノ酸配列を有する少なくとも105 の異なるペプチドのライブラリー。
【請求項２】
各々が前記式のアミノ酸配列を有する少なくとも106 の異なるペプチドを含有する請求項１のライブラリー。
【請求項３】
各々が前記式のアミノ酸配列を有する少なくとも107 の異なるペプチドを含有する請求項２のライブラリー。
【請求項４】
ペプチドが各々、以下の式ＩＩＩ：
【化２】
0004593780.tif 000023
のアミノ酸配列を有する請求項１のライブラリー。
【請求項５】
式III のアミノ酸配列を有する少なくとも106 の異なるペプチドを有する請求項４のライブラリー。
【請求項６】
バクテリオファージ粒子の表面に表示される請求項１〜５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV） 株の超可変領域１（HVR1）中のエピトープと免疫学的に交叉反応性であるエピトープを含有する１又は複数のペプチドを得るための方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドのライブラリーおよびHCV 株の前記HVR1を結合し得る抗体分子を接触させ、そして選択された１又は複数のペプチドとして前記抗体分子に結合し得るライブラリーの１又は複数のペプチドを選択することを含んで成る方法。
【請求項８】
前記選択された１または複数のペプチドが、2以上のHCV の株のHVR1と免疫学的に交叉反応性であるエピトープを含有する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドのライブラリーと、2以上のHCV株のHVR1に集合的に結合し得る複数の抗体分子とを接触させることを含んで成る請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の抗体分子がHCV に感染した個体の血清から得られる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライブラリーがバクテリオファージ粒子の表面に表示され、各粒子がその表面に表示されるペプチドをコードする核酸を含有する請求項７〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸を単離することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸から発現することによる前記選択されたペプチドを産生することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチド合成により、前記選択されたペプチドを産生することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択されたペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド、前記複数のペプチド、又は単離形態の前記複数のペプチドの混合物が、少なくとも１つの付加的構成成分を含有する組成物に製剤化される請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択された１又は複数のペプチドが、製薬上許容可能な賦形剤を含有する組成物に製剤化される、請求項７〜１３、又は１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択された1又は複数のペプチドが、アジュバントを含有する組成物に製剤化される、請求項７〜１３、又は１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択されたペプチドのアミノ酸配列が付加的アミノ酸との融合体で提供される請求項７〜１３、又は１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記融合体が、選択されたペプチド及びＨＣＶエンベロープタンパク質及びHVR1部分に当該ペプチドを有する非構造タンパク質１（E2/NS1）を含有する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記融合体が、少なくとも１つの付加的構成成分を含有する組成物に製剤化される請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記融合体が製薬上許容可能な賦形剤を含有する組成物に製剤化される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記融合体がアジュバントを含有する組成物に製剤化される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記融合体が組換えHCV 中に含まれる請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えHCV が少なくとも１つの付加的構成成分を含有する組成物に製剤化される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えＨＣＶが、製薬上許容可能な賦形剤を含有する組成物に製剤化される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組換えＨＣＶが、アジュバントを含有する組成物に製剤化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
１または複数の前記選択されたペプチドが、以下の式II：
【化３】
0004593780.tif 000024
のアミノ酸配列を各々有する、請求項７〜１３、１４、１６〜１９、２１〜２３、２５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
１08 の異なるペプチドの混合物であって、その各々が、以下の式II：
【化４】
0004593780.tif 000025
のアミノ酸配列を有する、混合物。
【請求項２９】
１又は複数のペプチドを含有する組成物であって、そのペプチドの各々が、以下の式ＩＩ：
【化５】
0004593780.tif 000026
により提供されるアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、２〜10の異なるペプチドからなり、その各々が、以下の式ＩＩ：
【化６】
0004593780.tif 000027
により提供されるアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
以下のペプチド：
【化７】
0004593780.tif 000028
のうちのいずれか１又は複数を含有する、請求項１に記載のライブラリーから得られる１又は複数のペプチドを含む組成物。
【請求項３２】
以下のペプチド：
【化８】
0004593780.tif 000029
を含有する請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
以下のペプチド：
【化９】
0004593780.tif 000030
を含有する請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
下記ペプチド：
【化１０】
0004593780.tif 000031
を含有する請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
１又は複数の前記ペプチドが付加的アミノ酸との融合体中に存在する請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記融合体が、選択されたペプチド及びＨＣＶエンベロープタンパク質、及びHVR1部分に当該ペプチドを伴う非構造タンパク質（E2/NS1）タンパク質からなる、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記融合体が組換えHCV 中に含入される請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
少なくとも１つの付加的構成成分を含有する請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物が製薬上許容可能な賦形剤をさらに含有する請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物がさらにアジュバントを含有する請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
以下の式ＩＩ：
【化７】
0004593780.tif 000032
により提供されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項４２】
以下の式Ｉ：
【化８】
0004593780.tif 000033
により提供されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項４３】
以下：
【化１３】
0004593780.tif 000034
から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項４２のペプチド。
【請求項４４】
以下のアミノ酸配列：
【化１４】
0004593780.tif 000035
のいずれかであるペプチド。
【請求項４５】
請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のペプチドを含有する組成物。
【請求項４６】
請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の複数のペプチドを含有する組成物。
【請求項４７】
前記ペプチドが、さらなるアミノ酸と融合している請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４８】
前記融合が、ＨＶＲ１位置において、前記ペプチドと、前記ペプチドを有するＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質からなる、請求項４７に記載のペプチド。
【請求項４９】
請求項４８に記載の前記融合体を含む組み換えＨＣＶ。
【請求項５０】
少なくとも１つの付加的構成成分を含有する請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の１以上の前記ペプチド、及び製薬上許容可能な賦形剤を含有する組成物。
【請求項５２】
請求項４１〜４３及び４７〜４８のいずれか１項に記載の１以上の前記ペプチド、及びアジュバントを含む組成物。
【請求項５３】
請求項４１〜４３、及び４７〜４８のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項５４】
コードされたペプチドの発現のために調節配列を作用可能に連結する請求項５３に記載の核酸。
【請求項５５】
請求項５４の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項５６】
請求項５４の核酸から発現させることを包含するペプチドの製造方法。
【請求項５７】
前記ペプチドの産生のための条件下で請求項５５に記載の宿主細胞を培養することを含んで成るペプチドの製造方法。
【請求項５８】
前記ペプチドの単離および／または精製をさらに含んで成る請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記１または複数のペプチドを少なくとも１つの付加的構成成分を含有する組成物に製剤化することを含んで成る請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ペプチドが製薬上許容可能な賦形剤を含有する組成物に製剤化される、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ペプチドがアジュバントを含有する組成物に製剤化される請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
2以上のHCV 株のHVR1のエピトープに結合可能な結合部位を含有する１又は複数の抗体分子の産生方法であって、抗体分子の集団および請求項４１〜４３及び４７〜４８のいずれか１項に記載の１以上のペプチドを抗体分子の集合と接触させ、そして前記１以上のペプチドの少なくとも１以上を結合できる集合の１又は複数の抗体分子を選択することを含んで成る、方法。
【請求項６３】
前記１または複数のペプチドを非ヒト哺乳類に投与して、そして当該１又は複数のペプチドに結合し得る１又は複数の抗体分子を哺乳類から単離する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記１または複数のペプチドを非ヒト哺乳類に投与して、当該１または複数のペプチドの少なくとも１以上に結合し得る１以上の抗体分子を産生する細胞を哺乳類から単離する請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞またはそれらの子孫が、当該１以上の抗体分子を産生する条件下で培養される請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記哺乳類が屠殺される請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
抗体分子の集団がバクテリオファージ粒子の表面に表示され、各粒子がその表面に表示される抗体分子をコードする核酸を含有する請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記１または複数のペプチドを結合し得る抗体分子を提示するバクテリオファージ粒子から核酸を単離することをさらに含んでなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記単離された核酸からの発現により、抗体分子をさらに生成することを含んでなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記１又は複数の抗体が、製薬上許容可能な賦形剤を含有する組成物に製剤化される、請求項６２及び６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類中で生じさせるための薬剤の製造における請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項７２】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類中で生じさせるための薬剤の製造における請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項７３】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類中で生じさせるための薬剤の製造における請求項４５に記載の組成物の使用。
【請求項７４】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類中で生じさせるための薬剤の製造における請求項５３〜５４のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項７５】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類（ヒトを除く）中で生じさせる方法であって、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の組成物を哺乳類（ヒトを除く）に投与することを含んで成る方法。
【請求項７６】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類（ヒトを除く）中で生じさせる方法であって、請求項４１〜４３及び４７〜４８のいずれか１項に記載のペプチドを哺乳類（ヒトを除く）に投与することを含んで成る方法。
【請求項７７】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類（ヒトを除く）中で生じさせる方法であって、請求項５１〜５２のいずれか１項に記載の組成物を哺乳類（ヒトを除く）に投与することを含んで成る方法。
【請求項７８】
HCV HVR1エピトープを結合し得る抗体を哺乳類（ヒトを除く）中で生じさせる方法であって、請求項５３又は５４のいずれか１項に記載の核酸を哺乳類（ヒトを除く）に投与することを含んで成る方法。
【請求項７９】
予防的である請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
哺乳類（ヒトを除く）がHCV感染を有する請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペプチド、特にＣ型肝炎ウイルス（HCV)の推定上のエンベロープタンパク質Ｅ２の超可変部１（HVR1) のミモトープ（mimotope) であるペプチドに関する。技術の組合せを用いて、天然HVR1配列のコンセンサス分析、および天然ではそのいずれのペプチドも生じない、異なる単離体に対する抗体との交叉反応性の実験的確定を基礎にした配列を有する多数のペプチドを、本発明者は創案した。ペプチドは、in vitro（例えば診断的）およびin vivo 目的のために抗体を生じさせそして得るのに個々に有用であり、ペプチドのライブラリーは、異なるHCV 株の複数のHVR1を結合し得る抗体との特定の交叉反応性についてペプチドを同定する場合に有用である。ペプチドは、それ自体で、または融合タンパク質の一部として、例えば組換え体HCV 粒子中に組み込まれ得る組換え体HCV E2ポリペプチドにおいて用い得る。
【０００２】
HCV のHVR1領域は、全ウイルスゲノム中で最も可変性の抗原断片であり、主として感染ウイルスの個体間および個体内の大きな不均一性に関与する。それは、主要中和エピトープを含有し、宿主免疫反応からの逸脱のメカニズムにおいて大きな役割を演じるものであると提案されている。抗HVR1抗体は、今日まで防御活性を保有することが示された唯一の種であるため、有効な予防療法の開発は非常に難しい仕事である。
【０００３】
本発明を創案する場合、発明者は、異なるウイルス単離物からの２００以上のHVR1配列からコンセンサスプロフィールを引き出すことによりHVR1変動性の問題にアプローチし、このコンセンサスを合成HVR1代用物の多大な貯蔵所を生成するための鋳型として用いた。これらは、バクテリオファージ粒子の表面に表示するためのＭ１３バクテリオファージの主要コートタンパク質ＩＩＩとの融合物として提供された。このライブラリーは、感染患者からの多数の異なる血清を用いてアフィニティー選択された。患者の血清と高頻度の反応性を示すが、非感染対照からの血清とは高頻度の反応性を示さないファージが同定された。選定配列は、天然HCV 変異体からHVR1を再生産するペプチドの大型パネルと交叉反応する血清抗体を結合することが示された。
【０００４】
これらの「ミモトープ」では、観察された交叉反応性に関与する配列パターンが同定された。実験動物に注入されると、最高の交叉反応性を有するミモトープは、天然HVR 変異体の同一パネルを認識し得る抗体を誘導した。
【０００５】
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV)は、全世界的な輸血関連および散発性の両方の非Ａ非Ｂ肝炎の主な病因であり、血液供与者集団の有病率は０．４〜２％であると概算される（Choo et al.,1989）。HCV 感染は、少なくとも７０％の症例にウイルス存続および慢性疾患をもたらし、この中で、有意の割合がついには肝硬変および肝細胞癌を発症する（総説のためにはH. Alter, 1995参照）。HCV 診断のための信頼できる血清学的試験の有効性にもかかわらず、全世界的に、コミュニティー獲得性感染が依然として一般的で、有意の罹病率および死亡率を引き起こす（Mast and Alter, 1993）。さらに、現時点で利用可能な唯一の抗ウイルス療法であるインターフェロン治療は、患者の２０〜３０％に有効であるに過ぎない（Fried and Hoofnagle, 1995 ）。したがって、HCV ワクチンの開発は、本分野では高度の優先プロジェクトを代表するものである。
【０００６】
広範な体液性および細胞性宿主免疫応答にもかかわらず、ウイルスが存続性感染を確立する高頻度は、HCV に対する防御免疫の存在についていくつかの問題を過去に提起した（Farci et al., 1992）。実際上、同種ウイルスを用いた試験に対する防御免疫は、推定上のエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２の組換え体形態を用いて、チンパンジー（HCV 感染に罹りやすい唯一のその他の種）のワクチン接種により誘導され得た（Choo et al., 1994 ）。しかしながら、この応答が異種ウイルス接種物に対してどれだけ有効であるかは未だ確定されていない。
【０００７】
HCV は、主に免疫圧力（immune pressure)（Weiner et al., 1992; Kato et al., 1993; Kojima et al., 1994; Shimizu et al., 1994; van Doorn et al., 1995; Weiner et al., 1995）の結果として疾病の経過中に変動するクアシスペーシス（quasispecies) として（Weiner et al., 1991; Martell et al., 1992; Martell et al., 1994; Kurosaki et al., 1994; Bukh et al., 1995 ）、感染患者の血流中に存在する。明らかに成りつつある見解は、HCV による慢性感染が体液性または細胞性応答の欠乏のためではなく、むしろこのような応答がウイルスの高突然変異率により無効にされるためで、これが逸脱変異体（escape variant) の出現をもたらす、というものである。
【０００８】
中和抗体の存在およびウイルス感染からの防御におけるそれらの役割は、チンパンジーに注入する前に血統の明らかなウイルス接種物のex vivo 中和により実証された（Farci et al., 1994）。それにもかかわらず、この中和抗体は単離物特異的で、対応する体液性応答の開始前に存在したウイルス変異体だけを遮断し得ると思われる（Farci et al., 1994）。このような中和抗体の特異性が十分明らかにされていない場合でも、免疫学的および分子的証拠はともに、中和抗体により認識されるエピトープがHCV ゲノムの超可変部1(HVR1) に局在することを示す（Farci et al., 1994）。これは、全体的HCV ポリタンパク質の最も可変性の領域であるＥ２糖タンパク質のＮ末端２７アミノ酸から成る。ウイルスクリアランスにおける抗HVR1抗体の役割に関する直接的証拠は近年、ex vivo 中和実験から得られた。感染性HCV 接種物の優勢変異体に対して生じたウサギ抗HVR1高度免疫血清は、あるチンパンジーにおけるその感染性を無くし、接種物中に存在する主要変異体の増殖を遮断することにより第二代目の動物を部分的に防御した（Farci et al., 1996）。
【０００９】
したがって、証拠は、HVR1がHCV に対する主要中和決定因子を含有し、その変動性の問題を克服し得る場合、それが無細胞HCV ワクチンの必須構成成分を構成するにちがいないということである。この問題に関連するのは、ヒト血清からの抗HVR1抗体が異なるHVR1変異体に対してある程度の交叉反応性を示すという観察である（Scarsell et al., 1995 ）。
【００１０】
ＷＯ94/26306（Chiron Corporation）は、1993年5 月12日のものと同様であると分かっていたといわれる９０株に関する配列比較を基礎にして、HCV のHVR1内のコンセンサス配列を同定する試みを開示する。開示された式は、以下の配列を含むペプチドのものである：aa1-aa2-aa3-aa4-aa5-aa6 （ここで、aa1 はＳ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＴであり；aa2 はＬ、Ｆ、Ｉ、ＭまたはＷであり；aa3 はＦまたはＬであり；aa4 は任意のアミノ酸であり；aa5 は任意のアミノ酸であり；aa6 はＧまたはＡである；が但し、そのモチーフは1993年5 月12日までにHCV 単離物の天然Ｅ２ＨＶドメインの３１アミノ酸内に含入されない）。さらなる実施態様では、aa7 が存在して、aa6 に結合されており、aa7 はＡ、ＰまたはＳである。６アミノ酸モチーフは、約55,000の異なる配列を示す。７アミノ酸モチーフは、約165,000 の異なる配列を示す。
【００１１】
本発明の局面は、HVR1のいくつかの位置が他の位置より低可変性であることを明示し、これは実際の構造的および免疫学的変動性が一次配列における異種性により示唆されるよりもさらに限定されることを示唆するHVR1の変動性の厳密な検査を一部基礎にしている。本発明は、種々の局面において、複数の、好ましくは多数の天然HVR1変異体と免疫学的に同様であり、したがって、異なるHCV 変異体の、好ましくはほとんどまたはすべてと交叉反応する中和抗体を誘導するために用い得るHCV HVR1の「合成変異体」の提供に関する。下記でさらに説明するように、本発明のペプチドに関して到達された式は、WO94/26306で提供されたものとは異なり、配列比較によるよりもむしろ、実際の交叉反応性評価に基づいている。
【００１２】
ペプチドライブラリーを表示したファージは、周期的選択／救済／増幅手法によりペプチド配列の大型コレクション（１０8 またはそれ以上）を迅速に探索する独特の機会を提供する。それらは、線状ペプチドから折り畳まれたタンパク質ドメインまで、そして炭水化物でさえの範囲の任意の種類の連結物に関するリガンドの同定を可能にする（Cortese et al., 1994、 Cortese et al., 1996 ）。これらのリガンドは、それらが元のエピトープの同一アミノ酸配列を必ずしも共有しないが、しかしそれらはその結合特性が類似するので、真のミモトープである。
【００１３】
免疫および非免疫個体からの臨床的に特性化された血清のみを利用する、疾病特異的ファージ表示ミモトープの同定のための戦略が過去に報告されている（Folgori et al., 1994、この記載内容は、参照におり本明細書中に含まれる）。さらに、良好な免疫原性であることが立証された疾病特異的ミモトープは、それらは異なる動物に注入された場合に天然抗原に対して特異的免疫応答を誘導することができたので、天然抗原によく似ている（ Folgori et al., 1994 およびMeola et al., 1995（ともにその記載内容は、引用により本明細書中に含まれる）、 Prezzi et al., 1996、 Mecchia et al., 1996 ）。したがって、ファージライブラリーは、疾病特異的抗体により認識される人工リガンドの供給源として用いられ、付加的に望ましい特徴が作られるという利点を有するが、但し、それらはライブラリー濃厚化中に選択され得る。
【００１４】
本発明を行うに際して、発明者は、バクテリオファージM13 の主要コートタンパク質（pVIII)との融合物としてHVR1代用物の多大な貯蔵を作ることにより、HVR1変動性の問題にアプローチした。選択力および臨床的に特性化されたHCV 感染個体からの多数の血清を用いて、多数の天然HCV 変異体の良好な抗原性および免疫原性類似体であることが明示されたペプチドを単離した。
【００１５】
実験の詳細を以下に示す。
本発明の種々の局面によれば、個々のペプチドが複数のHCV HVR1エピトープと交叉反応性であるエピトープを含有する多数の異なるペプチド、ならびにこのような異なるペプチドの混合物を含有するペプチドのライブラリーが提供される。本発明の一局面は、以下のコンセンサスプロフィールと一致するペプチドのライブラリーを提供する：
【００１６】
【化８】
0004593780.tif 000002
【００１７】
このプロフィールは、９ｘ１０7 の個々の配列の全体、即ち今日のＤＮＡクローニングおよび形質転換技術の実施上限（約１０8 ）に非常に近い数字を表す。後述するように、このコンセンサスプロフィールは、M13 に関してファージミドベクター中で主コートタンパク質（pVIII)をコードする遺伝子の５‘末端との融合物として縮重合成オリゴヌクレオチドをクローニングすることにより27aaペプチドライブラリーの構築に用いられた。ライブラリーはヒト血清を用いて広範にスクリーニングされ、１００より多い異なるクローン（ミモトープ）がそれらの特徴に関して選択されて、ヒト抗HCV-HVR1抗体を特異的に認識した。ほぼすべてのこれらのミモトープが異なるアミノ酸配列を有し、そのどれもが、発表済み（９８年１月まで）の天然HVR1に対応することが見出されなかった。
【００１８】
本発明のペプチドライブラリーの好ましい実施態様では、少なくとも約１０5 の、好ましくは少なくとも約１０6 の、さらに好ましくは少なくとも約１０7 の、例えば約９ｘ１０7 の異なるペプチドが存在する。ペプチドのライブラリーは、バクテリオファージ、特に糸状バクテリオファージ、例えばｆｄまたはM13 の表面に、例えばこのようなバクテリオファージの主コートタンパク質（pVIII)との融合物として、表示され得る。ペプチドのファージ表示は当業界では標準であり、その力は、その表面に表示されるペプチドをコードする核酸が各粒子内にパッケージされるようにバクテリオファージ粒子が構築されるという事実にある。１つ又はそれ以上の抗体（例えば、HCV の異なる系統のHVR1の多数のエピトープを結合し得る抗体）を結合し得るペプチドのような当該ペプチドを表示するファージ粒子の選定後、表示ペプチドをコードする核酸が回収され、そのアミノ酸配列を有するさらなるペプチドの産生に使用され得る。
【００１９】
下記の実験作業において、本発明者はヒト血清のパネルを用いて本発明のライブラリー中のミモトープを試験し、血清との反応性の異なる全体的頻度を有するものとして個々のミモトープを特徴付けた。３未満の血清と反応しただけの２４のクローンは「弱」と定義され、一方１１より多い血清と反応する２７のクローンは「強」と定義した。
「強」および「弱」クローンのコンセンサス配列の統計的分析により、ヒト血清との高頻度反応と相関するHVR1の配列モチーフ、ヒト抗HVR1抗体との交叉反応性ならびに実験動物における高交叉反応性血清の誘導が発見された。
本発明のペプチドおよびそれらの混合物は、以下のように定義され得るが、これは後述の実験の項でさらに詳細に説明する：
【００２０】
（１）次式（「式Ｉ」）により詳細に説明されるペプチドのライブラリー：
【化９】
0004593780.tif 000003
【００２１】
これは以下のように表記し得る：
(aa1)T(aa3)(aa4)(aa5)GG(aa8)(aa9)(aa10)(aa11)(aa12)(aa13)(aa14)(aa15)L(aa17)(aa18)LF(aa21)(aa22)G(aa24)(aa25)Q(aa27)
（式中、aa1 はＱまたはＴであり；aa3 はＨ、ＴまたはＲであり；aa4 はＶまたはＴであり；aa5 はＴまたはＶであり；aa8 はＳ、ＶまたはＱであり；aa9 はＡ、ＱまたはＶであり；aa10はＡ、ＧまたはＳであり；aa11はＲまたはＨであり；aa12はＴ、ＡまたはＱであり；aa13はＴ、ＡまたはＶであり；aa14はＳ、ＨまたはＲであり；aa15はＧ、ＳまたはＲであり；aa17はＴまたはＶであり；aa18はＳ、ＧまたはＲであり；aa21はＳまたはＲであり；aa22はＰ、Ｌ、ＳまたはＱであり；aa24はＡ、ＰまたはＳであり；aa25はＳ、ＫまたはＱであり；aa27はＮまたはＫである）。
（２）このようなライブラリーから得られる２７の「強」ペプチドは本発明の種々の観点の好ましいペプチドであり、以下のようなアミノ酸配列を有する：
【００２２】
【化１０】
0004593780.tif 000004
【００２３】
【化１１】
0004593780.tif 000005
【００２４】
本発明のさらに好ましいペプチドは、以下の配列のいずれかを有する：
【化１２】
0004593780.tif 000006
【００２５】
下方の文字は式１から変化したアミノ酸残基を特定するために用いられ、一方、下線を施した空間は、式１と比較した場合に欠失を意味するためであるが、くっつけて表記したアミノ酸はもちろん、関連ペプチド内で連続している。
これらは本発明のライブラリーから得られるペプチドの変異体であり、それ自体は式Ｉと一致しない。それらは、下記で確認された実験の途中で同定されたもので、ライブラリー増幅中のＰＣＲエラーにより生じた（材料と方法「HVR1ライブラリーの構築」参照）。
【００２６】
（３）前記（２）の高交叉反応性ペプチドのコンセンサスから得られた「強コンセンサス」（「式ＩＩ」）。
２５「弱」の頻度と比較した場合の２７「強」の任意の位置のａａの頻度の統計的分析を表ＩＩに示し、実験の項でさらに考察する。
【００２７】
式ＩＩ：
QT(aa3)TVGGQQS(aa11)QVHSLT(aa18)LF(aa21)(aa22)G(aa24)SQN
（式中、aa3 はＨまたはＴであり；aa11はＨまたはＲであり；aa18はＧ、ＳまたはＲであり；aa21はＳであり；aa22はＰ、ＬまたはＱであり；aa24はＡ、ＳまたはＰであって、
これは以下のように表記される：
【００２８】
【化１３】
0004593780.tif 000007
【００２９】
イタリック体で示した残基は、それらは低頻度を有するがしかし試験した最良反応性ミモトープ（前記ＩＩにおいて２７「強」ペプチド中で星印で目立たせた）のいくつかで見出されるために、含めた。
式ＩＩを導くために用いた２７ミモトープはその中にない。
１０８個のペプチドが式ＩＩと一致し、各々が本発明の１つの観点である。その配列を以下に示す：
【００３０】
【化１４】
0004593780.tif 000008
【００３１】
【化１５】
0004593780.tif 000009
【００３２】
【化１６】
0004593780.tif 000010
【００３３】
【化１７】
0004593780.tif 000011
【００３４】
【化１８】
0004593780.tif 000012
【００３５】
【化１９】
0004593780.tif 000013
【００３６】
（４）式ＩＩの配列を含めた式Ｉのライブラリー内のペプチドのさらなるライブラリー、２．５ｘ１０6 の配列を定義し、以下の式ＩＩＩと一致する：
【化２０】
0004593780.tif 000014
【００３７】
本発明のペプチドは、付加的アミノ酸との融合体で提供され得る。付加的アミノ酸は、ペプチドのＮ末端およびＣ末端の一方または両方で融合される。付加的アミノ酸はHCV E2タンパク質の断片でないアミノ酸配列であり得るか、またはそのタンパク質の一部であるアミノ酸配列であり得る。さらに、本発明のペプチドを含めた融合体は、HVR1位置に該ペプチドアミノ酸配列を有するHCV E2/NS1タンパク質を含み得る。即ち、本発明のミモトープHVR1ペプチドは天然HVR1配列に取って代わる。これを表現する別の方法は、「本発明のペプチドがHVR1に取って代わる組換えHCV E2/NS1タンパク質」と呼ばれるものである。
【００３８】
下記のように、本発明のペプチドおよびポリペプチド（融合体を含む）をコードする核酸は、本発明のペプチドがHVR1に取って代わる組換えHCV E2/NS1タンパク質の産生、ならびに集合HCV 粒子中への組換えタンパク質の組み入れを提供するために、例えばE2/NS1コード配列内に本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含めた組換えHCV ゲノムであり、本発明のさらなる観点として提供される。本明細書中に開示したような１つ又はそれ以上のペプチドまたはポリペプチドを含めた組合せHCV 粒子は、本発明のさらなる観点として提供される。
一般に、本発明のペプチドは免疫原性であるか、または個体への投与時に免疫応答を生じ得るか、あるいはHCV の複数の系統のエピトープと免疫学的に交叉反応性であるエピトープを含む。
【００３９】
本発明の別の観点は、HCV 株のHVR1中のエピトープと免疫学的に交叉反応性であるエピトープを含有する１つ又はそれ以上のペプチドを得るための方法であって、開示したようなペプチドのライブラリーと、HCV 株の前記のHVR1と結合し得る抗体分子とを接触させ、そして前記の抗体分子に結合し得るライブラリーの１つ又はそれ以上のペプチドを選択することを含んで成る方法を提供する。選択される単数または複数のペプチドは、HCV の複数の株のHVR1と免疫学的に交叉反応性であるエピトープを含有し得る。
【００４０】
このような方法は、ペプチドのライブラリーと、HCV の複数の株のHVR1を集合的に結合し得る複数の抗体分子とを接触させることを含んで成る。一実施態様では、前記の複数の抗体分子は、HCV に感染した個体の血清から得られる。
前述したように、前記のライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面に表示され、各粒子はその表面に表示されるペプチドをコードする核酸を含有する。選択後、前記の選択されたペプチドを表示するバクテリオファージ粒子から、核酸が採取される。前記の選択されたペプチドを表示するバクテリオファージ粒子から採取された核酸の配列を有する核酸は、発現によりこのようなペプチドの産生に用い得る（当業界での標準として、そしてさらに後述する組換えＤＮＡ技術を使用）。
【００４１】
前記の選択されたペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドは、例えばコード核酸からの発現によるその産生後に、単離形態で提供され得る。さらに後述するように、本発明の１つ又はそれ以上のペプチドは、ペプチド合成により提供され得る。
選択された異なるペプチドのアミノ酸配列を各々有する複数のペプチドは、別々にまたは混合物中に、単離形態で提供される。
選択された１または複数のペプチドは、各々、前記の式ＩＩのアミノ酸配列を有する。式ＩＩの１０８の異なるペプチドはすべて、混合物として提供され、さらに各々は別々に本発明の一局面を表す。これら１０８のペプチドは各々、多数のHCV 株のE2/NS2タンパク質のHVR1においてエピトープと交叉反応性である高い確率を有し、したがって抗体を得るために、そうでなければ免疫応答を生じるために特に有用である。
【００４２】
本発明の組成物は、式ＩＩの１０８のペプチドの混合物から得られる複数のペプチドを含み得る。このような組成物は、前記の混合物から得られる２〜約２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４または３つの異なるペプチドを含み得る。
混合物中にまたは別々に提供され得る好ましいペプチドとしては、Ｇ３１、Ｆ７８、Ｒ９、Ｄ６、Ｍ１２２およびＨ１と呼ばれるものが挙げられる。これらのアミノ酸配列は、図７（Ａ）に示されている。
好ましい混合物は、ペプチドＲ９、Ｆ７８、Ｈ１およびＤ６を含み（「ミックス１」）、ペプチドＭ１２２およびＧ３１（「ミックス２」）を含み、またはペプチド３１、Ｆ７８、Ｒ９、Ｄ６、Ｍ１２２およびＨ１（「ミックス３」を含む。
【００４３】
本発明の各ペプチドとHCV 株のHVR1との免疫学的交叉反応性は、以下で例示するように、実験的に査定され得る。これらのペプチドの種々の混合物が作製され、以下で実験的に例示するように同様に試験され得る。
本発明の直鎖または分枝鎖（例えばMAP)ペプチドおよびポリペプチド（例えば前記のようなペプチドを含めた融合分子）は、当業者の思い通りの種々の技術のいずれかを用いて製造され得る。
直鎖または分枝鎖ペプチドは、標準ペプチド化学を用いて、例えばAtherton and Sheppard （1989）, Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach, IRL Press, Oxfordに記載されているようなＦｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）t-Bu（tert−ブチル）を用いる一般法により、合成され得る。
【００４４】
本発明のペプチドまたはポリペプチドを生成するための便利な方法は、発現系においてそれをコードする核酸を用いることにより、その核酸を発現することである。
したがって、本発明は、（開示したような）ペプチドまたはポリペプチドの製造方法であって、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（一般的に本発明の核酸）からの発現を含めた方法も含む。これは、ポリペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にする適切な条件下でこのようなベクターを含有する宿主細胞を培養液中で増殖させることにより便利に成し遂げられる。ペプチドおよびポリペプチドは、網状赤血球溶解物のようなin vitro系でも発現され得る。
【００４５】
本発明のペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のさらなる観点を示す。１つの観点において、開示したようなペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。さらに別の観点では、開示したような融合物、特にHVR1一に本発明のペプチドのアミノ酸配列を含むHCV E2/NS1タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。さらに別の観点では、本発明のペプチドまたは開示したような融合体、特にHVR1に関連ペプチドアミノ酸配列を有するHCV E2/NS1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する組換えHCV ゲノムが提供される。
さらに別の観点では、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドが提供される。これは、単一発現反応におけるペプチドまたはポリペプチドの混合物の産生を可能にする。
【００４６】
本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸は、治療的または予防的目的のためにヒト個体のような哺乳類で、またはこのような目的のために非ヒト哺乳類で免疫応答を起こすために、あるいはその後の操作および／または使用（例えば、さらに後述するような診断的または治療的状況で）のための抗体を産生するために、核酸免疫感作に用いられる。
【００４７】
本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸は、HCV 感染の予防および／または治療における遺伝子療法の方法に用いられる。これは、発現のための適切な調節要素の使用、ならびに宿主細胞への発現ユニット（コード配列および調節要素）の輸送のための適切なベクターを要する。ウイルスベクターおよびプラスミドベクターの両方の種々のベクターが、当業界で知られている（例えば米国特許第5,252,479 号およびＷＯ93/07282参照）。特に、パポーバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、例えばHSV およびEBV 、ならびにレトロウイルスを含めた多数のウイルスが遺伝子運搬ベクターとして用いられてきた。従来技術の多数の遺伝子療法プロトコールは、無力化ネズミレトロウイルスを用いてきた。種々のアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターが開発されてきた。ウイルスベクターの代替物としては、リポソームおよび直接ＤＮＡ取込みによる運搬媒介、ならびに受容体介在性ＤＮＡ運搬が挙げられる。
【００４８】
本発明のペプチドまたはポリペプチド（またはそれらの混合物）をコードする核酸を含有する宿主は、それ自体、HCV 感染のためのまたはそれに対する個体の治療的または予防的処置（即ちHCV 感染を有する個体の治療的処理またはHCV 感染前の個体の予防的処置）に用い得る。
核酸は一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡとして提供されるが、しかし１つ又はそれ以上のヌクレオチド類似体を含有し得るし、全体的にまたは部分的に合成し得る。本発明の核酸分子およびベクターは、単離および／または精製形態で、例えば実質的に純粋なまたは均質の形態で提供され得る。「単離物」という用語は、これらの可能性のすべてを反映するよう用いられる。例えば形状に関して、ＤＮＡ配列が特定される場合、ＲＮＡ等価物を要する状況でない限り、ＵがＴに取って代わるということが起こることも包含される。
【００４９】
コード核酸からペプチドまたはポリペプチドを発現するのが望ましい場合、核酸は適切な調節制御配列を含む。適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー配列および適切な場合にはその他の配列を含有する適切なベクターが選択されるかまたは構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えば「ファージ」、または適切な場合にはファージミドであり得る。さらなる詳細に関しては、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞中への導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析に関する多数の既知の技術およびプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992 に詳細に記載されている。
【００５０】
種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、真核生物細胞、例えば哺乳類、酵母菌、ならびにバキュウロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当業界で利用可能な哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター乳仔腎細胞、COS 細胞および多数のその他の細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。
【００５１】
本発明のさらに別の観点は、本明細書中に開示したような核酸を含有する宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に組み込まれ得る。組込みは、標準技法にしたがって、ゲノムによる組換えを促進する配列の含入により促され得る。核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在し得る。
【００５２】
さらに別の観点は、核酸を宿主細胞中に導入することを含む方法を提供する。（特にin vitro導入に関して）一般的に「形質転換」のような制限を伴わないといわれている導入は、任意の利用可能な技術を用い得る。真核生物細胞に関しては、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたはその他のウイルス、例えばワクシニアを、あるいは昆虫細胞に関してはバキュウロウイルスを用いる形質導入が挙げられる。細菌細胞に関しては、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられる。あるいは、核酸の直接注入を用い得る。当業界で周知のように、当該核酸を含有するクローンを同定する場合には、抗生物質耐性または感受性遺伝子のようなマーカー遺伝子を用い得る。
【００５３】
導入後は、例えばコードされたペプチドまたはポリペプチドが産生されるように、遺伝子の発現のための条件下で、宿主細胞（実際に形質転換された細胞を含み得るが、しかし細胞は形質転換細胞の子孫である方が多いと思われる）を培養することにより、核酸からの発現が引き起こされるかまたは可能にする。ペプチドまたはポリペプチドが、適切なシグナルリーダーペプチドと結合して発現されると、細胞から培地中に分泌され得る。発現による産生後、ペプチドまたはポリペプチドは宿主細胞および／または培地から単離および／または精製されて、１つ又はそれ以上の製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む製剤組成物のような１つ又はそれ以上の付加的構成成分を含み得る組成物の処方に用い得るし、所望により実質的に用いられる（例えば、下記参照）。
【００５４】
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、免疫原として、またはそうでなければ結合抗体を産生する場合に用い得る。抗体は、ポリペプチドおよびペプチドの精製およびその他の操作に、診断的スクリーニングおよび治療的状況に、例えば受動免疫に有用である。これについて以下で考察する。
本発明のさらなる１つの観点に従うと、複数のHCV 菌株のHVR1内のエピトープと結合できる結合部位を含む１又は複数の抗体分子を得る方法において、抗体分子の個体群と本発明に従うペプチドを接触させる段階及び前記ペプチドと結合できる１又は複数の抗体分子を該個体群から選択する段階を含む方法が提供されている。
【００５５】
この方法は、本発明に従う複数のペプチドと抗体個体群を接触させることを含むであろう。
指摘したとおり、ペプチドは付加的なアミノ酸と融合した状態で提供されてもよい。
１又は複数のペプチドをヒト以外の哺乳動物に投与してそれらをその哺乳動物の免疫系により産生される抗体分子の個体群と接触させ、その後、１又は複数のペプチドと結合できる１又は複数の抗体分子を哺乳動物から取り出すこともでき、或いは又、かかる抗体分子を産生する細胞を哺乳動物から取り出すこともできる。
【００５６】
該哺乳動物を屠殺することもできる。
哺乳動物から細胞をとり出す場合には、抗体分子を前記細胞又はその子孫から取り出すことが可能である。特にかかる子孫はハイブリドーマ細胞を含むであろう。
動物を免疫化するか否かは別として、開示されている通りの抗体獲得方法は、含有するバクテリオファージ粒子の表面上に抗体分子の個体群を表示させることを含み、ここで各々の粒子はその表面上に表示された抗体分子をコードする核酸を含有している。コードされた抗体分子又はその誘導体（例えば融合タンパク質、定常領域又はその他のアミノ酸を含む分子など）の産生における使用及び/ 又は操作のため、問題の１又は複数のペプチドと結合できる抗体分子を表示するバクテリオファージ粒子から、核酸をとり出すことができる。表示のためにバクテリオファージを使用する代りに、例えばUS-A-5643768,US-A-5658754,WO95/ 11922 の中で開示されているようにリボソーム又はポリソームを使用することもできる。
【００５７】
抗体分子は、個別にか又は混合物として、分離形態で提供され得る。分離形態で、複数の抗体分子を提供することが可能である。
本発明に従う好ましい抗体は、その他のポリペプチドと結合できる抗体といったような汚染物質を含まずかつ/ 又は血清成分を含まないという意味で、分離されている。いくつかの用途についてはモノクローナル抗体が好まれるが、ポリクローナル抗体も本発明の範囲内に入る。実際、ここで論述されているように、いくつかの実施形態においては、本発明に従った１又は複数のペプチド又はポリペプチドと結合する能力をもつポリクローナル抗体が好まれる。かくして、さらにもう１つの態様において本発明は、本発明に従う１又は複数のペプチド又はポリペプチドと結合する能力をもつ異なる抗体の混合物に向けられている。このような混合物は、薬学的に受容可能な賦形剤又はビヒクルのごとき少なくとも１つの付加的な成分を内含する組成物の形で提供され得る。
【００５８】
本発明は同様に、本発明の１又は複数のペプチド又はポリペプチドを獲得しそして/ 又はかかるペプチド又はポリペプチドに対する抗体を生じさせる方法にまで拡張される。かかる方法には、哺乳動物に対しペプチド又はポリペプチド又はそれらの混合物を投与することが含まれる。治療又は予防という状況の下では、この哺乳動物はヒトであってもヒト以外の動物であってもよい。分離されさまざまな用途のうちのいずれかのために使用されるべき抗体又は抗体産生細胞の産生のためには、ヒト以外の哺乳動物の屠殺段階が含まれてよい。かかるヒト以外の哺乳動物は、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、旧世界ザル、チンパンジー又はその他の霊長類であってよい。抗体は、当該技術分野において既知のさまざまな技術のいずれかを用いて免疫化された動物から得ることができ、又好ましくは注目のペプチド又はポリペプチドに対する抗体の結合を用いてスクリーニングすることができる。例えば、ウエスタンブロット技術又は免疫沈降法などを使用することができる（Armitage et al, Nature, 357:80-82,1992) 。
【００５９】
ポリクローナル又はモノクローナル抗体の生産は、当該技術分野において充分確立されている。もとの抗体の特異性を保持するその他の抗体又はキメラ分子を産生するべくモノクローナル抗体を組換え型ＤＮＡ技術の技法に付すことが可能である。このような技術には１つの抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域に又は定常領域及びフレームワーク領域に導入する段階が含まれてよい。例えば、EP-A-184187,GB-A-2188638又はEP-A-239400 を参照のこと。
【００６０】
ヒト以外の親抗体より免疫原性が低い抗体を提供するべく、典型的にはフレームワークアミノ酸残基のいくつかの変更を伴って、ヒト以外の供給源からのＣＤＲがヒトフレームワーク領域上に移植されているヒト化抗体も同様に、本発明の範囲内に含まれる。本発明に従うモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、産生された抗体の結合特異性を変性する可能性もしない可能性もある遺伝子突然変異又はその他の変化を受け得る。キメラ抗体のクローニング及び発現については、EP-A-0120694及びEP-A-0125023の中で記述されている。
【００６１】
ペプチドで哺乳動物を免疫化することに代えて、又はそれに加えて、タンパク質に特異的な抗体を、発現される免疫グロブリン可変ドメインの組換え産生されたライブラリーから、例えばその表面上に機能的免疫グロブリン結合ドメインを表示するバクテリオファージ（例えばＷＯ９２/ ０１０４７参照）又は上述のとおりのリボソーム/ ポリゾームを用いて、得ることもできる。このライブラリーはナイーブであることができ、すなわち、いずれのタンパク質（又はフラグメント）によっても免疫化されていない生体から得られた配列から構築されてもよいし、或いは又、注目の抗原に暴露された生体から得られた配列を用いて構築されたものであってもよい。
【００６２】
本発明に従った抗体は、数多くの方法で修飾され得る。実際、「抗体」という語は、必要とされる特異性をもつ結合ドメインを有するあらゆる結合物質を網羅するものとみなされるべきである。かくして、本発明は、１つの抗原又はエピトープとの結合を可能にする抗体の形状を模倣した形状をもつ分子及び合成分子を含めた、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物及び相同体を網羅する。
【００６３】
抗原又は他の結合パートナーと結合する能力をもつ抗体フラグメントの例として、ＶＬ，ＶＨ，Ｃｌ及びＣＨ１ドメインから成るＦabフラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント；ヒンジ領域でジスルフィド橋によりリンクされた２つのＦabフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ( ａｂ')２フラグメント、及び分離されたＣＤＲ領域、がある。単鎖ＦＶフラグメントも同様に含まれる。
【００６４】
望ましい結合特性をもつ抗体を産生することのできるハイブリドーマは、（抗体フラグメントを含めた）抗体をコードする核酸を含有しそれらの発現能力をもつ真核性又は原核性の宿主細胞と同様に、本発明の範囲内に入るものである。本発明は同様に、抗体が産生され好ましくは分泌される条件の下で抗体を産生する能力をもつ細胞を増殖させる段階を含む、抗体産生方法をも提供する。
【００６５】
（例えば診断試験における）標本に対する抗体の反応性は、任意の適切な手段により決定することができる。個々のリポーター分子でのタグ付けも１つの可能性である。リポーター分子は直接的又は間接的に、検出可能なそして好ましくは測定可能なシグナルを生成することができる。リポーター分子の連結は、直接でも間接でもよく、例えばペプチド結合を介して共有結合によるものであっても又は共有結合によらないものであってもよい。ペプチド結合を介しての連結は、抗体及びリポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果としてもたらされてもよい。
【００６６】
１つの好ましい様式は、スペクトル的に隔離された吸収又は発光特性をもつ個々の螢光色素、リン又はレーザー染料と各々の抗体の共有結合によるものである。適切な螢光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フイコエリトリン及びテキサスレッドが含まれる。適切な色素産生染料としてはジアミノベンチジンが含まれる。
その他のリポーターとしては、磁性又は常磁性の着色されたラテックスビードといった分散粒子又は巨大分子コロイド粒子、及び直接的又は間接的に検出可能シグナルを視覚的に観察し、電気的に検出し又はその他の形で記録することのできるようにする生物学的又は化学的に活性な作用物質が含まれる。これらの分子は、発色もしくは変色させるか又は例えば電気的特性などを変更させる反応の触媒として作用する酵素であってもよい。これらは、分子的に励起可能で、そのためエネルギー状態間の電子遷移が、特徴的スペクトル吸収又は発光をもたらすものであろう。これらは、バイオセンサーと合わせて使用される化学物質を含んで成ることができる。又ビオチン/ アビジン又はビオチン/ ストレプトアビジン及びアルカリ性ホスファターゼ検出系を利用することもできる。
【００６７】
結合を決定する様式は、本発明の１特長ではなく、当業者であれば、自らの好み及び一般的知識に従って適切な様式を選ぶことができる。
本発明に従う抗体を、例えば論述した通りに細胞又は細胞溶解産物を含有するテスト標本中のペプチド又はポリペプチドの存在についてスクリーニングを行なう上で使用することが可能であり、又例えば、ペプチドをコードする核酸からの発現によるポリペプチドの産生に続いて、本発明に従ったペプチド又はポリペプチドを精製及び/ 又は分離する上でこれを使用することもできる。
【００６８】
抗体は同様に、受動免疫化として予防法においても、又治療法においても有用である。抗体を投与すべきである場合、例えば本発明に従った複数のペプチドと集合的に交叉反応性をもつ抗体といった抗体の混合物を含むことが好ましいであろう。
本発明に従うペプチドと結合する抗体はそれ自体、抗イディオタイプ抗体の産生における免疫原として使用されうる。これらは、例えば治療及び/ 又は予防目的で、個体内の免疫応答を高める上でペプチドエピトープを模倣するのに使用することができる。
【００６９】
抗体は、例えばテスト標本中の特定の物質の存在を決定する上でのその抗体の使用のための説明書を含みうる１つのキットの形で提供され得る。標識付け分子、緩衝溶液、溶離剤などといった１又は複数のその他の試薬を含めてもよい。試薬は、密封されたバイアルといった、外部環境からそれらを保護する容器内に入れて提供されてもよい。
診断方法は、１又は複数のHCV 菌株を含む可能性のある個体からの生体標本を使用する。生体標本の例としては、血液、血漿、血清、尿及び唾液といった流体及び組織標本が含まれる。
【００７０】
特定のペプチド又はポリペプチドがテスト標本内に存在するかしないかを決定するためにはさまざまな方法が存在し、これには検出されるべきポリペプチドが抗体である方法も含まれる。
本発明の１又は複数のペプチドに向けられた抗体（又は抗体混合物）といった特異的結合構成要素の存在について標本をテストすることができる。
本発明に従うペプチドは、標本内に存在する場合の抗HCV E2HVR1抗体に対する該ペプチドの結合を査定することによって、テスト標本内のHCV 菌株に対する抗体の存在又は不在を決定するために使用することができるものである。
【００７１】
理論上は、本発明の１又は複数のペプチドに向けられた抗体（又は抗体混合物）といった特異的結合構成要素について結合パートナーが標本中に存在することを識別することが可能であろう。しかしながら、今までのところ、HCV ウイルス粒子をヒト標本から分離するのに成功した者はいない。将来、ヒト標本中にHCV ウイルス粒子を同定しかつ/ 又はかかるウイルス粒子を免疫学的に検出することが可能であることが実証された場合には、本発明のペプチドそして特にそれに向けられた抗体がかかる検出において有用となるであろう。
【００７２】
HCV に対する抗体の検出のためには、例えば論述されているようなリポーター系を用いて、特異的結合のための適切な条件下で本発明の１又は複数のペプチドと接触させ、その後に結合を測定することによって、生体又はその他の標本をテストすることが可能である。一群のペプチドを使用する場合には、各々の結合を測定することができるように、各ペプチドについて異なるリポーター標識を利用することができる。
ペプチドといった特異的結合構成要素を用いて、その結合パートナー抗体をテスト標本から分離しかつ/ 又は精製し、抗体の配列及び/ 又は生化学分析を可能にすることができる。アミノ酸配列決定は、自動化された配列決定機を用いて、当該技術分野においてはありきたりの作業である。
【００７３】
標準的免疫検定は、標本中に適切な抗体が存在する場合に免疫複合体の形成を可能にするような条件下で本発明のペプチドとテスト標本とをインキュベートする段階、及び免疫複合体の存在又は不在を検出する段階を含むであろう。
ここで記したとおり、今のところ技術的に実現可能ではないものの、原理的には、本発明の抗体は、標本中に存在する場合のE2HVR1エピトープに対する抗体の結合を試験することにより、テスト標本中のHCV 菌株の存在又は不在を測定するために使用することができる。
【００７４】
標準的免疫検定には、標本中に適切な抗体が存在する場合免疫複合体の形成を可能にするような条件下で本発明のペプチド又は抗イディオタイプ抗体と共にテスト標本をインキュベートする段階、及び免疫複合体の存在又は不在を検出する段階が含まれるであろう。
本発明の１又は複数のペプチドに対して導かれた抗体の存在について、１もしくは複数のこのようなペプチド（又はかかるペプチドを含有するポリペプチド）又は１もしくは複数の抗イディオタイプ抗体を用いて、標本をテストすることができる。例えば論述されているようなリポーター系を用いて、特異的結合のための適切な条件下でペプチドもしくはポリペプチド又は抗イディオタイプ抗体と接触させ、次に結合を測定することによって、生体又はその他の標本をテストすることが可能である。
【００７５】
本発明の免疫検定における結合複合体の形成の検出は、本発明の範囲を制限することなく、利用可能なあらゆる技術を用いて実施可能である。いくつかの適切な技術については、抗体標識付けを参考にして前述されている。検定には、場合によって、当業者の手に入るラテックス粒子、磁性又は非磁性ビーズ、膜、チップ、プラスチック、金属、シリコン又はガラス表面又はその他のあらゆる適切な材料といった適切な固相又は支持体上に抗体又はペプチドを固定化することが含まれるであろう。検出は、定性的であっても定量的であってもよい。標準的な実施方法に従って、１又は複数の適切な対照を含めることが可能である。
【００７６】
すでに記した通り、本発明のペプチド，ポリペプチド，抗体及び核酸を組成物の形に処理することができ、これらは薬学的分野において有用である。これらの組成物は、上述の物質のうちの１つに加えて、当業者にとっては周知のものである薬学的に受容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又はその他の材料を内含していてよい。かかる材料は、非毒性でなくてはならず、また有効成分の効力と干渉してはならない。担体又はその他の材料の正確な性質は、例えば経口、静脈内、経皮又は皮下、経鼻、筋肉、腹腔内といった投与経路によって異なる可能性がある。
【００７７】
経口投与のための組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態でありうる。錠剤には、ゼラチンといった固体担体又はアジュバンドが含まれてよい。液体薬学組成物には一般に、水、石油、動物又は植物油、鉱油又は合成油といった液体担体が内含されていてよい。生理食塩溶液、デキストロース又はその他の糖類溶液又はエチレンゴリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールを内含させることもできる。
【００７８】
静脈内、経皮又は皮下注入のためには、有効成分は、発熱素を含まず適切なｐＨ，等張力及び安定性をもつ非経口的に受容可能な水溶液の形をとることになる。当業者であれば、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤といった等張性ビヒクルを用いて適切な溶液を充分調製でき、必要とあらばその他の添加剤も内含させることができる。
単独か又は適切な担体にリンクされた状態で、免疫原調製のためＭＡＰ（Tam, J.P. 1988）といった有枝ペプチドを使用することができる。
【００７９】
免疫応答を発生させる上で使用するための線状ペプチドを、適切な担体に連結することも可能である。ジスルフィド形成試薬（ここでペプチドにはシステインが含まれるか又はこの目的でペプチドに対しシステインが添加される）、チオ−エーテル形成カップリング剤を含め、その他の分子にペプチドをカップリングするさまざまな方法が、当該技術分野において知られている。担体には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ），破傷風トキソイド、生理学的条件下で適正な半減期を有するその他のかなり大きなタンパク質、及び多糖類及びアミノ酸共重合体といったような安定した非タンパク様分子が含まれる。
【００８０】
アジュバンド、例えばミョウバン、水中油型乳剤又はフロインドアジュバンド（完全又は不完全）を含ませることもできる。ペプチド又はポリペプチド組成物の免疫原性を強化するためにサイトカインを使用することもできる。
免疫系に対する１又は複数のエピトープの適正な提示のため天然の折畳み環境を使用する目的で、HCV 外被（Ｅ２）タンパク質の環境にミモトープ配列をクローニングすることが可能である。
免疫化のためには裸のＤＮＡを使用することができ（例えば Cohen, J.1993参照）、１又は複数のミモトープ配列を適当なベクター内にクローニングすることができる（例えば Major et al.,1995参照）。裸のＤＮＡは、直接的注入を用いてか又は遺伝子ガン（Yang et al.,1990）又はその他の任意の適切な技法を用いて送達できる。
【００８１】
個体に対し与えるべきものが本発明のポリペプチド，抗体、ペプチド，核酸分子、小分子又はその他の薬学的に有用な化合物のいずれであろうと、投与は、その個体における免疫（特に抗体）応答を高めるのに充分である免疫原性量で行なうか、或いは又「予防的に有効な量」又は「治療上有効な量」（場合に応じて、ただし、予防法を治療法とみなすこともできる）で行なうことができる。予防的効果は、HCV,E2HVポリペプチド又はHVR1ペプチドでのその後の抗原投与に対する又はその後のHCV 感染に対する個体の免疫応答を強化するのに充分であり、好ましくは後者のケース（HCV 感染）ではその感染を全体的又は部分的に拮抗するのに充分である。
【００８２】
最も好ましくは、効果は、個体が、その後のHCV 感染の結果としての１又は複数の臨床的症候を予防しかつ/ 又は個体をＣ型肝炎から保護するのに充分である。治療的効果は、予め存在するHCV 感染に対する個体の免疫応答を強化するのに充分なものである。最も好ましくは、効果は、単数又は複数の慢性症候を改善し、かつ/ 又はＣ型肝炎を治療しかつ/ 又は個人におけるウイルス力価を低減させるのに充分である。投与される実際量、及び投与の速度及び時間的経過は、処置されているものの性質及び重症度に左右されることになる。処置の処方例えば用量についての決定などは一般開業医及びその他の医師の責任の範囲内に入り、標準的には、処置すべき障害、個々の患者の身体条件、送達部位、投与方法及び開業医にとって周知のその他の要因が考慮される。上述の技法及びプロトコルの例は、Remington's Pharmacentical Science, 第１６版、Osal A.(ed),1980の中で見い出すことができる。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、提供されたままの状態でのペプチド、ペプチド混合物、抗体分子又は抗体分子混合物の投与を含む処置方法；このようなペプチド，ペプチド混合物、抗体分子又は抗体分子混合物を含む薬学組成物；及び投与用薬剤の製造、例えば薬学的に受容可能な賦形剤を用いて特異的結合構成要素を処方することを含む薬剤又は薬学組成物の製造方法といった、投与のための薬剤の製造におけるこのようなペプチド、ペプチド混合物、抗体分子又は抗体分子混合物の使用、を提供する。
【００８４】
組成物は、単独で投与することもできるし、また処置すべき身体条件及び代替的処置又は付加的処置の利用可能性に応じて同時又は逐次的にその他の処置と組合わせて投与することもできる。
本発明の１つの態様は、HCV HVR1エピトープと結合できる抗体を哺乳動物の体内で発生させるための薬剤の製造における、開示された通りのペプチドの使用を提供する。
もう１つの態様は、HCV 感染に対し哺乳動物を免疫化する方法において、哺乳動物に対してペプチド又はペプチド混合物を投与する段階を含んで成る方法を提供している。
【００８５】
さらにもう１つの態様は、HCV 感染に対し哺乳動物を（受動）免疫する方法において、本発明に従った抗体又は抗体混合物を哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法を提供している。
同様にして、本発明のさらなる態様は、HCV 感染を患う哺乳動物の処置方法において、本発明に従ったペプチド又はペプチド混合物又は抗体又は抗体混合物を哺乳動物に投与することを含んで成る方法を提供している。
抗体は、抗イディオタイプ抗体であってよい。
本発明の態様及び実施形態について、ここでさらに詳しく説明し、さまざまな図面を参考にしながら実験的に例証する。本発明のさらなる態様及び実施形態が、当業者にとって明白なものとなるだろう。
【００８６】
例１．HVR1の変異性を模倣する特定化されたファージライブラリの設計と構築
配列データベースから抽出された２３４のHVR1ユニーク配列の多配列アラインメントを、HCVE2 糖タンパク質のＮ末端の２７の位置の各々における残基組成の変異を特徴づけする目的で作製した。この分析から１つの配列パターン（図１Ａ）が現われ、変更したコンセンサス配列の定義づけを可能にしている。
残りの位置での観察された天然の変異性を再現しながらこのような保たれた制約条件を含むような形で、HVR1配列の合成レパートリーが設計された。
【００８７】
各位置において最も頻度の高い残基を選択することによって全配列変異性の約８０％を説明する「コンセンサス−プロファイル」が誘導された。一定の与えられた位置で類似のアミノ酸が存在した時には、変異性を表わすものとして１つのみが選択され、より効率良く相互作用を形成できるような残基が好まれた。例えば、５の位置では、天然のレパートリー内に Ser及び Thrの両方が存在するが、ライブラリーを設計するには Thrのみが選択された（図１）。いくつかのケースにおいては、全体的変異性をより良く映し出すようにライブラリー内にはコンセンサス内に存在しない残基が含まれた。例えば、HVR1の天然のレパートリー内の Ser, Thr, Asnの存在を説明するよう、３の位置に Thrが含まれた。
【００８８】
結果として得られた最終的コンセンサスプロファイル（図１Ｂ）は、現行のＤＮＡクローニング及び形質転換技術の実践的上限（約１０8 ）に非常に近い９×１０7 の複雑性をもつ。天然のレパートリー内で最も頻繁に観察されるアミノ酸は、（Ｇluが最も頻繁に観察されるアミノ酸であるものの Gln及び Thrが選択された）位置１を除いて、つねに含まれた。２３４の天然HVR1変異体全体を通して局所的配列保存が高いことから、８つの位置（２，６，７，１６，１９，２０，２３及び２６）は、定常に保たれた。同様に特記に値するのは、負の電荷を受けた残基が全く存在しないということである。His, Glu, Asp, Gln, Asp 基を代表するのに Glnが選択された位置１を除いて、８０％分画内にはいかなる酸性残基も存在しなかった。定性的には、プロファイルは、保存された要素を含むＮ末端及びＣ末端尾部によりフランキングされた一般により可変的な中央領域として、描くことができる。
【００８９】
ライブラリーの構築は、Ｍ１３表示のためのファージミドベクター内の主要外皮タンパク質（ｐＶ III）をコードする遺伝子の５' 末端に対する融合として縮重した合成オリゴヌクレオチドをクローニングすることによって進められた。約２×１０8 の独立した形質転換体が得られた。ライブラリー（HVR1ライブラリー）の質及び複雑性を確認するため、５６の無作為選択された個々のクローンのインサートが配列決定された。この分析は以下の結果を導いた。
【００９０】
（１）全てのクローンは異なる配列を表示した；
（２）６３％のクローンが全長インサートを含有し、一方残りのクローンは小さい欠失を有していた；
（３）１９９８年３月１５日に探索されたウイルス分離株からの既知のHVR1に対応するペプチドをコードする、配列決定されたクローンは存在しなかった。
これらのデータから、このライブラリは、個々の形質転換体の数に近い複雑性を有することが推論された。
【００９１】
実施例２．HCV 患者の血清と高頻度で反応するHVR1ミモトープの同定
選択に使用された抗体のレパートリーがより複雑かつ多様になると、HVR1エピトープに対する多くの様々な抗体によって認識されるファージを豊富にする可能性がより高められるはずである。慢性的に感染したウイルス血症患者は、多くのHCV 変異体が生成されかつ免疫系が攻撃される間に、比較的長期のウイルス残存性を有し、おそらく高度に異種性の抗-HVR1 抗体群の蓄積に至るので、これらの患者から得た血清は前述の要件に合致するように見える。
【００９２】
5 種の異なる遺伝子型のウイルス：1a、1b、2a、2b、3a（Simmondsら、1993）に感染した慢性患者から得た8 種の血清を用いて、HVR1ライブラリーの6 種のアフィニティー選択を行った（表１）。対照として、感染していない患者の血清も使用した。全7 種の選択から得られたファージのプールを増幅し、かつELISA において選択される血清の各々に対するファージプールの反応性を試験した。この実験の結果は、選択されなかったライブラリーに対する反応性の増加によって立証されるように、セレクター抗体によって認識されたファージの顕著な増加を示した（図２）。
【００９３】
ほとんどの場合、HCV 血清によって豊富にされたファージプールは、1 名以上の患者の血清と反応した。HCV 感染とは無関係な抗体によって認識されたペプチドも、このライブラリーから豊富にされた。実際、対照血清で選択されたファージプールは、選択されないライブラリーよりも、この血清とのより高い反応性があった（図2 ）。しかし、健常者の血清では、HCV 血清によって豊富にされたファージプールとの反応性が検出されなかったので、患者の血清はHCV −関連ミモトープの選択へと向けられた（図2 及びデータは示さず）。
【００９４】
様々な患者の血清で選択されたミモトープの反応性頻度に対する洞察を得るために、2 つのプール（4R及び2R、表１）から40の個体クローンを無作為に選択し、かつ選択のために採用した患者とは異なるHCV 感染患者から得た20種の血清のパネルにより、ELISA におけるそれらの反応性を試験した。感染していない健常者の対照から得た同数の血清を用いて、抗-HCV抗体に対する特異性を評価した。24のクローンがHCV-特異性であることがわかった。これらのクローンの患者血清との反応性頻度の関数としてのそれらの分布を、図3 （上側パネル）に示した。それらの中に、1 種以上の血清と反応しているファージが確認された；これらの一部は、試験した血清の最高55% によって認識された。
【００９５】
多くの異なる抗-HVR1 抗体と反応するミモトープの単離を更に改善するために、豊富にしたファージプールについて、第１ラウンドに使用したものとは異なる患者血清を使って親和性選択の第２ラウンドを行った。ここでは、9 種の新規のプールを作成し（表l ）、かつELISA によって分析した。前述のように、セレクター抗体との反応性の一般的な増大が認められた。それに加えて、第２ラウンドのファージプールは全て、いずれかの選択に使用されたものとは異なるHCV-感染患者から得た血清のパネルと、第１ラウンドで選択されたプールよりもより頻繁に反応し、このことは、単離されたペプチドがより高い認識頻度を持つことを反映している。
【００９６】
これは、第1 ラウンドの親和性選択後に溶出されたものの中から無作為に選択されたクローンのHCV 血清との反応性（図3 、上側パネル）を、第２ラウンドの異なる血清によるそれらの再選択によって得られたもの（図3 、下側パネル）とを比較することによって確かめられた。反応性の頻度だけでなく反応性の分布も、第２ラウンドの選択工程の後、かなり異なるように思われた。最初の選択からのファージの認識がかなり分散しているように見える一方、第2 ラウンドの選択を通して単離されたクローンは、反応性頻度のベル形の分布を示し（図3 、下側パネル）、平均値は60% であり、このことは、全てのファージ群が、要求された結合特性以上のものを実際に得たことを示している。増幅時の、生物学的に好ましいファージへのバイアスの導入を避けるために、追加の選択サイクルを省略することを決定した。
【００９７】
HCV 血清とだけ反応する合計171 のクローンを、全ての第２ラウンドのプールをスクリーニングすることによって同定した。HCV 血清による認識頻度の関数としてのそれらの分布は、図3 の下側パネルに示されるサブセットのそれを反映し、そして、最良のクローンは試験した検体の80% と反応した。更に重要なことは、選択されたミモトープの反応性のプロフィルは、関連する別の特徴を強調していることである。HCV 血清による全般的な認識の頻度は量的に類似しているにもかわらず、異なるクローンは反応性の特徴的パターンを示し（図4A）、全ての試験した血清中の抗-HVR1 抗体の存在についてスコア化することができるミモトープはほとんどないという正味の結果を示した。
【００９８】
次に、観察されたHCV 血清による認識の高い頻度が、試験された患者群に限られたものであるかどうか、あるいは、それが選択されたミモトープの固有の特性を反映したものであるかどうかを確かめた。この目的のために、感染した患者から得た血清のもう一つのセットをELISA によって分析し、各個々のファージの反応性頻度及び血清の全てを対象とすること(coverage)の両方について変化がないままであったことを明らかにしている（図4B）。
【００９９】
感染が治癒したHCV 感染患者は、多分比較的少ない数のウイルス変異株と接触し、かつおそらく慢性的感染患者よりも狭い変異株に特異的な抗-HVR1 抗体のスペクトルを示すであろう。これは、感染治癒患者からの血清が、慢性的に感染したウイルス血症患者と比べて、非常に稀に天然型単離体のHVR1を再生する合成ペプチドと反応するという知見（Scarselli ら、1995）によって裏付けられる。従って、ウイルス血症でない血清は、種々の抗-HVR1 抗体とHVR1ミモトープの交叉反応性を分析するための、より良好でよりストリンジェントな試験を構成することができる。
【０１００】
こうして選択されたミモトープの一部を、血中にウイルスRNA が存在しないことが繰り返してわかっているHCV 血清反応陽性の患者から得た41検体について試験した。この場合もミモトープは、ウイルス血症患者から得た血清で認められたものよりもより低い頻度であっても、これらの血清の多くと反応した（図4(A)、4 （B ）及び4 （C ）を比較）。これらのデータは、選択されたミモトープの多数の異なる抗-HVR1 抗体と交叉反応する能力の指標を提供する。
【０１０１】
実施例３．選択されたHVR1ミモトープの配列と血清HCV との反応性頻度の間の
相関関係の決定
本発明者らは、選択されたクローンのアミノ酸配列が、それらの反応性頻度と相関するかどうかについて確かめようとした。配列の目で見た比較では、明らかなパターンは認められなかったので、最低及び最大の頻度で反応しているクローンの配列パターンを分析することを決めた。
3 種未満の血清とのみ反応する24クローンを「弱い」と定義し、11種以上の血清と反応する27クローンを「強い」と定義した。弱いクローン及び強いクローンの各位置でのアミノ酸頻度は、下記の「材料及び方法」の項、及び表IIに記した。
【０１０２】
弱いクローン及び強いクローンのセットにおいて、異なるアミノ酸で占有されるいくつかの位置に関して明らかな傾向があり、かつこれは我々に「材料及び方法」に記した位置を基にしたスコア化システムの発見に役立つ定義を与えた（下記参照）。クローンのスコア（S-スコア）が高ければ高いと、その配列は、強いクローンの配列とより多く類似し、弱いクローンの配列とはより異なる。図5 で示すように、S-スコアは、合理的に各クローンの実験的に決定された反応性頻度とよく相関している（相関係数= 0.75）。S-スコアが「弱い」クローン及び「強い」クローン（171 の中の51）の配列だけを使って計算されたことは強調されなければならないが、しかし、これは全てのクローンの反応性頻度とも良く相関している。興味深いことに、弱い及び強いミモトープの残基の優先性が最も異なる6 箇所の位置（位置3 、11、18、21、22、24）だけを使っても、ほとんど同じ結果（相関係数= 0.72）を得ることができる。
【０１０３】
実施例４．HCV 単離体由来の多数のHVR1変異株と抗原性が似たHVR1ミモトープ
本発明者らは、ミモトープを認識するヒト抗体と、天然に生じるHVR1を表している配列との交叉反応性を計ることを試みた。この目的のために、感染した患者の血清中に存在する多量の抗-HVR1 から特異抗体を精製するための免疫吸着剤として、ミモトープを使用した。この実験のために、最も高いHCV 血清との反応性頻度を示したミモトープであることから、ミモトープ R9 、F78 、M122、R6、B14 、G31 、H1及びD6（図7 ）を選んだ。平均的な「よい」ミモトープよりもかなり低い率のHCV 血清によって認識されたミモトープ  であるN5も使用した（各々、60〜80% 及び35% ）。
【０１０４】
いくつかのリンパ球細胞株がHCV の限定的複製を支えることが示されているが（Shimizu ら、1992）、これらのシステムは、ウイルス増殖及び抗-HVR1 抗体の交叉反応性の詳細な研究のためには適していない。従って、観察された配列の変異性をほぼカバーする天然のHVR1変異株を再生する合成ペプチドのパネル上で免疫学的に精製された抗体の交叉反応性を決定した。
【０１０５】
この目的のために、多次元クラスタ解析（Casariら、1995）を、ライブラリーの構築のために使用した234 の並置した天然のHVR1配列と同じセットについて行なった。これらの中から、HVR1“配列空間”にわたってほとんど均一に分布された43の配列を選択し（下記「材料及び方法」を参照のこと）、かつ多抗原性ペプチド（MAP ；Tam 、J.P.、1988；Pessi ら、1990）として合成した。43のMAP の全パネルと集合的に反応している感染した患者からの8 種の血清のプールを、抗体の供給源として使用した。免疫学的に精製した抗体は、全血清と比較して、精製のために使用したミモトープに対し同じ反応性を示した。対照的に、組換え型HCV コア抗原又は市販のキット（下記「材料及び方法」参照）に含まれた抗原に対する反応性は、精製後は維持されることはなく、従ってこの精製の有効性及び特異性を証明している。
【０１０６】
全ての免疫学的に精製された抗体は、著しい数の天然のHVR1配列と反応し、ミモトープ R9 は天然のHVR1の79% と交叉反応する抗体を生じた（図6 ）。更にほとんどの免疫学的に精製された抗体が、天然の配列とは少しも重なることのない反応性を示したので、わずかに3 つの異なるミモトープ（R9、F78 及びM122、図6 ）から精製された抗体の個々の反応性の値を合計することで、全体的な交叉反応性のさらにより高いレベル（88% ）に到達することができる。これらのデータから、HVR1ミモトープの限られたセットで、多数の天然のHCV HVR1変異株の抗原性を模倣することができるということが結論された。
【０１０７】
より高いS-スコアを持つミモトープによって免疫学的に精製され、その結果より高い反応性頻度を持つような抗体も、より交叉反応性であることが示された。8 種のミモトープを使用したところ、図7Bで示すように、この配列に関連したスコアと対応する抗体の交叉反応性の間の相関性は、非常に良好であった（r = 0.86；図７B ）。
【０１０８】
実施例５．多くの天然のHVR1変異株を認識する抗体を誘発するHVR1ミモトープ
本発明以前の問題点は、最大数のHCV HVR1の天然の変異株と交叉反応する抗体を誘発することができる免疫原の作成であった。最良のHVR1ミモトープ（R9、F78 、M122、G31 、H1及びD6）のいくつかの免疫原性の可能性を、全ての精製されたファージとして、及び選択された当初の範疇外ではあるがMAP としての両方で、マウスにこれらを注射することにより調べた。
【０１０９】
質量分析により示されるように、おそらく各ファージへのHVR1ペプチドの不充分な負荷(loading) のために（全pVIII 含量のl%未満）、MAP の方がはるかに有力な免疫原であることがわかった。力価の違いで示されるような免疫感作効率の若干の変動性がミモトープ間で認められ、F78 は、免疫感作のために使用したものと同じペプチド上でのELISA による測定により、1/100,000 より高い抗体力価を誘発することができた（図8A）。
【０１１０】
その後抗-HVR1 ミモトープ血清を、天然の単離体からのHCV 配列を再生する43のMAP のパネル上で、ELISA によって、異種HVR1変異株を認識するそれらの能力について調べた。反応性は無関係な対照ペプチド上では認められなかったが、これらのMAP の大半が免疫血清によって認識された（図8A）。
ミモトープで免疫感作したマウス血清の交叉反応性は、同じミモトープで免疫学的に精製したヒト抗体の交叉反応性のようにはランク付けしなかった。しかし、両種のアッセイにおいて顕著に低い反応性レベルを示したミモトープ N5 は、非常に効率の低い免疫原であることが明らかにされ、このことは天然のHVR1配列の少数のみを認めることができる抗-HVR1 の応答をもたらしている（図8A）。
【０１１１】
ほとんどの場合、より高い力価は交叉反応性のより高いレベルに相当しているので（図8A）、免疫血清の交叉反応性の程度は、一般に個々のMAP の免疫原性を反映している。それにもかかわらず、抗-F78より低い力価を持つが、非常に多くの天然のHVR1ペプチドと反応するような抗-G31血清の場合に明確に示されるように、必ずしも力価単独では、交叉反応性の違い、及びミモトープ誘発性血清によって示される反応性のパターンの違いを説明することができない。同様に、抗-D6 血清は、力価が1/3 であるにもかかわらず、抗-R9 の交叉反応性と同じレベルを示す（図8A）。
【０１１２】
各種抗血清によって示される反応性のパターンは、部分的に他のパターンと重なっているだけであり、そして、一部の場合、独自の反応性が認められた。誘発された血清のこの特徴の結果として、全ての反応性を合計することによって、ほぼ全ての天然のHVR1ペプチドが認められる（91% 、図8A）。この知見は、広く反応する抗体を生成する目的にとって意味のある改良であり、ミモトープの混合液による一回の免疫感作で交叉反応性の同様の増加を得ることができる。従って、Balb/cマウスの3 群を、ミモトープ混合物で免疫感作した。
【０１１３】
混合物１は、ミモトープ R9 、F78 、Hl及びD6を含み；混合物2 は、ミモトープ M122 及びG31 から成り、混合物3 は6 種全てのミモトープを含んだ。3 つの混合物は全て、免疫原性であり、かつ高度に交叉反応性の抗血清を誘発した（図8B）。これら3 つの抗血清の各々は、この混合物中に含まれる各ミモトープによって誘発される抗血清の反応性を合計して測定されたものと同じか、もしくはより高くさえある交叉反応性を示した（混合物1 について84% 対84% 、混合物2 について84% 対81％、混合物3 について95% 対91％、図8B）。これらの血清の力価が高いにもかかわらず、これは個々のMAP で得られた値より低かった。従って、高い交叉反応性の応答を誘発する能力は、単純に免疫感作の効率の結果ではないと結論した。
【０１１４】
材料及び方法
ヒト血清
HCV-感染患者由来の血清及び健常者由来のヒト血清を、第二世代のHCV ELISA 試験システム（Ortho-HCV ELISA 、オルト・ダイアグノスティック・システム(Ortho Diagnostic System) 社、ベルセー、ベルギー）によって、及び第一世代のドットブロット・イムノアッセイ（RIBA-HCV試験、キロン(Chiron)社、エメリービル、CA）によって、HCV に対する抗体の存在について特徴づけた。HCV RNA の存在は、ウイルスゲノムの5'- 非コード領域に局在化された保存されたプライマー及び先に記された100 μl の血清から抽出された全RNA を使用する入れ子式逆転写-PCRによって検出した（Siliniら、1995）。
【０１１５】
HVR1ライブラリーの構築
図１B に関して先に記したコンセンサス配列(profile) を対応するヌクレオチド配列に逆翻訳するために、大腸菌コドンの利用表を用いて、高度に発現された遺伝子における最も頻度の高いコドンを選択した。ファージミドベクターへのこのライブラリーの挿入を促進するために、制限酵素PacI及びNotIの認識部位を含む別の2 つの定常配列を、各々、81bpセグメントの5'- 及び3'- に追加し、合計116bp とした。コンセンサス配列の逆翻訳においてNotI及びPacI制限部位が存在しないことは、コンピューターを利用した配列解析によって証明した。
【０１１６】
化学合成のために、コドンを基にした「split-and-pool」法（Cormack ら、1993）を利用し、ライブラリーの組成及び複雑度を要求されたレベルに保った。116bp のオリゴヌクレオチドは、9600型DNA サーマルサイクラー（パーキンエルマーセタス社、フォスターシティ、CA）を用いて、隣接する定常配列に相補性のプライマーで増幅した。PCR 産物を制限酵素PacI及びNotIで消化し、ゲルにより精製した。回収したDNA フラグメントを、下流にpelB分泌リーダー配列及び上流に全遺伝子のVIIIコード配列のあるpel8PNファージミドベクター（pc89誘導体；Feliciら、1991）のPacI及びNotI部位の間にクローニングした。組換え型ファージミドを、DH10B コンピテント細胞に電気穿孔した。DH10B 細胞は、繊維状ファージによって感染することができず、かつ青色/ 白色選択ができないので、形質転換された細胞を収集し、かつプラスミドDNA を調製した。このDNA を用いて、XL1-Blueコンピテント細胞の電気穿孔により形質転換した。
【０１１７】
アンピシリン耐性コロニーをプレートからこすり落とし、かつLB/100μg アンピシリン/ml 及び10% （v/v ）グリセロール中に再浮遊させ。この細菌の浮遊液の一部を、100 μg アンピシリン/ml を含有する6LのLB培地にOD600nm が0.05であるように接種し、O D600nmが0.25に到達するまで激しく振盪しながら増殖した。その後この培養液を、M13K07ヘルパーファージで重感染し、更に５時間増殖し、上澄み中にファージ粒子を得た。既報のように（Feliciら、1991）、ファージをポリエチレングリコールで二回沈殿させ、CsClで平衡密度勾配遠心分離することにより精製した。アプライド・バイオシステム社の373DNAシーケンサを使い、既報のように（Bartoli ら、1996）、DNA の塩基配列決定を行った。
【０１１８】
ライブラリーのアフィニティー選択
ELISA 用のマルチウェルプレート（ヌンク・マキシソープ(Nunc Maxisorp) 社、ロッキルド、デンマーク）を、50mM NaHCO3 、pH9.6 中の0.5 μg/mlの抗ヒトポリクローナル抗体（Fc特異性）（免疫学的に純粋なヤギの抗ヒトIgG Fc- 特異性；ピアス社、ロックフォード、IL）と共に、4 ℃で一晩被覆した。このプレートをPBS/0.1%  Tween20 （洗浄バッファー）で洗浄し、かつ阻害バッファー（5 ％脱脂粉乳、PBS ／0.05% Tween20 ）の100 μl ／ウェルと共に、37℃で１時間インキュベーションした。PBS ／0.1%  BSA で1:100 に希釈したヒト血清1 μl を、各ウェルに添加し、かつ4 ℃で一晩インキュベーションした。洗浄後、PBS ／0.1% Tween20、0.01% BSA で希釈した紫外線で死滅したM13K07の粒子1012個を、次に各ウェルに添加し、4 ℃で4 時間インキュベーションした。
【０１１９】
このプレインキュベーションの後、HVR1ライブラリーの1012粒子／ウェルを加え、かつ4 ℃で一晩インキュベーションした。未結合のファージを取り除き、数回洗浄した。結合したファージは、溶出バッファー（グリシンでpH 2.5に調節した0.1M HCl、1mg/ml BSA）200 μl で溶出し、2M Tris-HCl pH 9で中和した。溶出したファージは、細菌XL1-Blueの感染によって力価決定し、かつ増殖性挿入物を含むクローンの割合を、X-gal ／IPTGインジケータープレートの上に、感染された細菌を塗布して決定した（Feliciら、1991）。増幅後（上記参照）、増えたファージを、同じ手順に従って親和性選択の第二サイクルで処理した。
【０１２０】
ミモトープの配列分析及びS-スコアの定義
合計193 の選択されたクローン中171 が、点突然変異（最初のライブラリーデザインに関して）又は欠失が見られず、これらを３種類のクラスに分類した：24の弱いクローン（20種の被験血清中3 種未満と反応する）、27の強いクローン（少なくとも12種の血清と反応する）、及び中程度（残りのクローン）。
27-merアミノ酸配列の位置i での各アミノ酸について、本発明者らは、強い及び弱いクローンのセットの位置i の中に同じアミノ酸が認められる頻度を、それぞれ、Fs(i、aa) 及びFw（i 、aa）と称した。この頻度の値を表IIに示した。
【０１２１】
次にS-スコア(i) を、Fs（i,aa）及びFw(i,aa)の平方根の差として定義した。S-スコア(i) の全27-mer配列の合計が、我々の配列ベースのS-スコアである。実際には：
S-スコア= Σi （√Fs(i,aa)−√Fw(i,aa)）
（式中、aaは、S-スコアを計算する配列の位置i の中に認められたアミノ酸である。）。頻度の平方根は、差を増大するために使用した。点突然変異又は欠失が起こったクローンについては、対応する位置をスコアの計算において省略した。
【０１２２】
天然HVR1配列を代表するセットの選択
HCV BK株（残基384-411 ）に由来するNS1 HVR1配列を用いて、いろいろなデータベースを検索し（1995年12月13日）、タンパク質（SwissProt 、PIR 及びGenpept 、後者はGenbank 及びEMBL  からの割り当てられたオープンリーディングフレームを表している）及びヌクレオチド配列（EMBL  、Genbank 及びEST ）の両方を検索した。234 の天然のHVR1配列の独自のセットを得るために、重複した配列及び不完全な配列は、配列に合致したリストから削除した。
【０１２３】
主要成分分析（Principle component analysis）を用いて、このセット全体に均等に分布された40の配列を選択した。最初に、234 の配列の間の全ての対の距離を、Sequencespace を使って算出した最初の6 個の固有値を使って計算した（Casariら、1995）。40の配列のみが残るまで、近隣の配列との距離が最小であるような配列を、段階的に除外していった。Eigenvectorsの全ての可能なペアに沿った二次元への投影は、40の配列のセットが塊とならず、均等に分布されたことを示した。
寄託番号及び配列は、以下の通りである：
【０１２４】
【化２１】
0004593780.tif 000015
【０１２５】
【化２２】
0004593780.tif 000016
【０１２６】
＊配列13は、Genbank 登録S73387のCDS 特徴において報告される翻訳されたアミノ酸配列（aa190-aa216 ）に相当する。
更に3 つの追加配列が、MAP として合成された：2 つの配列は、系統付けられたHCV 接種菌H77 に由来し（Farci ら、1994、図2 ）：
【０１２７】
【化２３】
0004593780.tif 000017
【０１２８】
１つの配列は、免疫応答が特徴づけられた患者の主要単離物に由来した（Scarselli ら、1995。）：
【化２４】
0004593780.tif 000018
【０１２９】
ファージ調製及びELISA
ファージの上澄みを、先に記したように、XL-1 Blue に感染した細胞から調製した（Folgori ら、1994）。ELISA は、Dente らの（1994）方法に従い、25μl ファージ上澄み／ウェルを使って行った。特に具体的に記さない限りは、血清は種−特異的抗-IgG（Fc特異性）アルカリホスファターゼが結合した二次抗体（シグマ社、A-9544；ELISA 阻害バッファー中で1 ：5000に希釈）の添加により、1:100 に希釈した。結果は、自動化されたELISA リーダー（ラボシステム・マルチスキャン・ビクロマティック(Labsystems Multiskan Bichromatic)社、ヘルシンキ、フィンランド）によって、OD405nm とOD620nm の間の差として記録した。
【０１３０】
ファージプールによるELISA を、CsCl精製（上記参照）の後、増幅したファージの当量（1010のアンピシリン導入単位）を使うことによって同様に実行した。天然のHVR1配列を表しているMAP の100 μl を用いて、被覆バッファー（50mM NaHCO3 、pH9.6 ）中の最終濃度が10μg/mlになるようにELISA プレート（ヌンク・マキシソープ社、ロッキルド、デンマーク）を被覆した。自由な結合部を阻害した後、血清又はアフィニティー精製した抗体を100 μl ／ウェルで加えた。
【０１３１】
マウス及びウサギの血清は、阻害バッファー中に最終的にl ：100 になるよう希釈して試験し；アフィニティー精製した抗体は、最終濃度150ng/mlで試験した。プレートは4 ℃で一晩インキュベーションした。洗浄後、アルカリホスファターゼが結合した二次抗体（ヤギ抗マウスIgG シグマ社のA-7434をl ：2000希釈したもの；ヤギ抗ウサギIgG シグマ社のA-8025をl ：5000希釈したもの；ヤギ抗ヒトIgG シグマ社のA-9544をl ：5000希釈したもの）100 μl ／ウェルを添加し、かつ室温で1 時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、かつ前述のようにアルカリホスファターゼを明らかにした。
【０１３２】
ヒト血清由来の抗体のアフィニティー精製
種々のミモトープの配列を再生している多抗原性ペプチドは、ELISA においてHCV 血清とファージと同じ結合プロファイルを示すが、抗体の親和性選択においてより有効であることがわかっているので、これらを用いた。活性化されたCHセファロース4Bカラム（ファルマシア・バイオテック社、17-0490-01）に、結合バッファー（0.1M NaHCO3 、pH8 ／0.5M NaCl ）中1g乾燥セファロース／1mg  MAPの比で、対象のMAP を結合した。結合の後、0.1M Tris-HCl 、pH8 で、遊離アミノ基をブロッキングした。試料は、結合バッファーで1 ：5 に希釈した8 種のHCV 血清のプールとして流した。室温で吸着し、多量のPBS で洗浄した後、結合した抗体を、最終濃度が10μg/mlになるようにBSA を添加した0.1Mグリシン−HCl 、pH2.7 で溶出し、直ちに2M Tris-HCl 、pH9.4 で中和した。
【０１３３】
溶出した抗体の濃度は、ヒトIgG 標準（シグマ社、I-2511）を用いるELISA によって決定した。アフィニティー精製した抗体を、精製に使用したミモトープを用いるELISA において、それらの反応性について調べ（MAP 及びファージの両方の形）、かつ対照としてHCV と無関係のMAP についても調べた。精製の特異性は、更に溶出した抗体を、HCV コアタンパク質を細菌により発現した組換え体上のELISA により（Prezziら、1996）試験すること、及び第二世代のHCV ELISA 試験（オルソ・ダイアグノスティック・システム、ベルセー、ベルギー）によって、確認した。血清プールの標準量1ml から各アフィニティー精製により回収されるイムノグロブリンの総量は同等であり、0.8 〜1.5 μg の範囲であった。被験MAP 上のELISA については、濃度を全ての場合で150ng/mlに調節した。
【０１３４】
動物の免疫感作
免疫感作するファージを、先に説明したように精製したXL1-Blueに感染した細胞及びCsClから調製した（Feliciら、1991）。3 〜5 週齢のメスのBALB/Cマウス（チャールズ・リバー、コモ、イタリア）を、第0 、21及び42日目に、抗原溶液100 μl を腹腔内投与することによって免疫感作し、かつ第52日目（3 回目の採血）及び第148 日目（4 回目の採血）に採血した。ファージは、アジュバントなしで、濃度約0.3mg/ml（2 .5 x 1013 ファージ粒子／ml）で、0.9%  NaCl懸濁液として注射した。
【０１３５】
ペプチドの免疫感作のために、MAP を、PBS を溶媒として最終的な総濃度400 μg/mlになるよう溶解し、かつフロイント完全アジュバント（初回免疫）又はフロイント不完全アジュバント（追加免疫）の両方において1 ：2 希釈物として注射した。４〜7 週齢のメスのBalb/cマウス４匹（チャールズ・リバー、Como、イタリア）に、第0 、３及び６週目に、抗原液100 μl を腹腔内注射することによって免疫感作し、かつ各追加注射の後0 日目（プレ採血）及び10日目に採血した。1 個以上のペプチドを免疫感作に使用する場合は、各ミモトープを等量混合し、かつ400 μg/ml溶液の100 μl を使用した。
【０１３６】
実施例６．ペプチド及びＥ２組み換え体蛋白の免疫原特性。in vivo でのＤＮ
Ａ免疫感作
選択された幾つかのHVR1ミモトープの免疫原特性について、それ単独またはＥ２蛋白エクトドメインのＮ−末端との融合体の場合について調べた。
一般に、hcv E2蛋白はHCV ポリ蛋白のアミノ酸３８４ないしアミノ酸８０９に広がるペプチドとして認識されている。一般に、HVR1領域はアミノ酸３８４ないし４１０として認識されている。以下の実施例では、ΔE2はHCV ポリ蛋白のaa411 ないしaa683 に相当するペプチドである。
【０１３７】
組み換え体プラスミドの構築
３種類のプラスミドを作成し、その構造を図９に報告する：
（ｉ） pΔE2-HVR1 およびＣ末端疎水性領域の両方を欠失しているＥ２蛋白断片(HCV株N,Nishihara ら、；Gene;1993;129pp207-214;HCVポリ蛋白のaa411 ないしaa683)合成用；
（ｉｉ）HVR1ミモトープの一つを発現する第２プラスミドｐＦ７８；
（ｉｉｉ）１１種類のHVR1をコードするＤＮＡ配列が、プラスミド pΔE2内のΔE2コード配列の５’末端で融合している１１種類の構築体(pMimoE2) のセット。
【０１３８】
全ての組み換え体は、抗原スクリーニングが実施できるよう組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列の下流のフレーム内にクローニングされている。
ΔＥ２遺伝子（即ちaa411 ないしaa683 の範囲のペプチドをコードしている）を、E2N 株を含むベクター(Nishiharaら;Gene;1993;129pp207-214)をPCR の鋳型に用いてクローニングした。ＰＣＲ断片は合成オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴｆｗｄ＝GCGAGATCTTAATTAACGATATCCAGCTTATAAAC;オリゴrev=TCCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCGGLAG）を利用して得た。
【０１３９】
これらプライマーを利用して得たPCR 産物は、ΔE2遺伝子に加えて５’末端のBglII 、PacI及びEcoRV 制限酵素部位、６個のヒスチジン残基をコードする配列(His tag) 、及び３’末端のBamHI 制限酵素部位が続くＴＡＡ終止コドンを有している。次に、このPCR 産物をBg1II とBamHI で切断し、TPA リーダー配列を持つフレームの中でV1JnsTPAベクター(J.J.Donnelly ら。The Jopurnal of Infect.Diseases;1996;713;pp314-320) のBglII 部位と接続し、プラスミドV1JnsTPA- ΔE2（図９中、 pΔE2と認める）。
【０１４０】
HVR1ミモトープ配列を、 pΔE2内のΔE2遺伝子の５’末端にサブクローニングした。HVR1断片は、選択したファージ上清から直接PCR で増幅した。５’プライマーはPacI制限酵素部位を含んでおり、HVR1ミモトープ配列の定常部位である５’配列(GGCGGCCGTTTAATTAAC)に相補的である；３’プライマーは少なくとも１５ヌクレオチドは相補的であるが、クローン化されたミモトープ配列によって別種となっている。PCR 増幅された断片はＰａｃＩ切断され、 pΔE2プラスミド内に連結された。合計１１種類のpMimoE2 （図９）プラスミドが作られた。
【０１４１】
さらにＦ７８配列（オリゴｆｗｄ＝GCGAGATCTTAATTAACCAGACCCATACCACC；オリゴｒｅｖ＝TCCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGTTTCGCGCC)のPCR 増幅及びV1JnsTPAベクターのBg1II 部位でのクローニングによって、pF78（図９）プラスミドを構築した。
大規模ＤＮＡ調整は、メーカー（Qiagen,Hilden,ドイツ）の取り扱い説明書に従い、Qiagen2500−チップカラムを利用し行った。
【０１４２】
ミモトープ／Ｅ２組み換え体蛋白の特徴
２９３細胞を一過性にトランスフェクションし、哺乳動物系に於けるpF78、 pΔE2及びpMimoE2 プラスミドの組み換え体蛋白発現能を調べた。 pΔE2及びpMimoE2 でトランスフェクトされた細胞は、HVR1の下流に位置するエピトープを認識する抗Ｅ２モノクローナル抗体(mAb-185) で染色すると、強く特異的な染色を示した。エピトープF78 のアミノ酸配列を再現するMAP で免疫して得たマウス抗血清による、２９３細胞の免疫細胞化学からmF78の発現も示された。これらのデータは、トランスフェクトした細胞からの全細胞抽出物によるELISA から確認された。トランスフェクトされた細胞からの細胞培養上清によるELISA で測定したところ、全ての組み換え体蛋白について有意な量が培地中にも分泌されたいた。
【０１４３】
細胞内および分泌された蛋白は共に不均一にグリコシル化されていることが、SDS PAGEで移動度の遅いバンドの集合体が認められることから示唆された。細胞外蛋白分画がより高分子であることは、グリコシル化の程度が多様であることを示しており、蛋白が能動的に分泌されるものであって、単に細胞が分解し放出されたものではないことを確認する。いずれの場合も、エンドグリコシダーゼ処理により、アミノ酸組成よりきたいされる移動度に比べ移動度は速くなる。全ての組み換え体ミモトープ／Ｅ２融合蛋白、ならびにΔE2変異は、２種類の立体構造感受性モノクローナル抗体により効果的に認識された。
【０１４４】
さらに、各クローンの細胞性または分泌型分画のいずれについても、非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥのウエスタンブロットではシステイン架橋された多価凝集体は認められなかった。同様の結果は、トランスフェクションしたマウスのラブドーム肉腫細胞からも得られており、これによりマウス筋細胞へのin vivo トランスフェクションに関し効果的発現が達成されたことが示された。
【０１４５】
プラスミドＤＮＡ免疫感作
免疫感作には、４週齢の雌Balb/cマウス(Charles River,Como,Italy)を用いた。全身麻酔したマウスに、１００μｇのプラスミドＤＮＡを溶解した１００μｌの生理食塩緩衝液(PBS) を投与した。インシュリン用注射器を用いて（B-D,U-10024G1/2 微細針）、両側の大腿四頭筋にＤＮＡを５０μｌづつ注射した。マウスに３週間隔で３回ないし４回注射し、各注射後２週目に採血した。血清を抗体力価と交叉反応性について調べた。
【０１４６】
αΔE2およびαHVR1抗体の血清学
ELISA 用９６ウエル型プレート(Immunoplate Maxisorp;Nunc、Roskilde,Denmark) を、１μｇ／ウエルGNA(Sigma L9275)の５０mMNaHCO3液、pH9.6 と一晩、４℃反応し、コートした。プレートを洗浄し（PBS/0.1%Tween20)、250 μｌ／ウエルのブロッキング緩衝液(2%BSA、0.1%Tween20)と１時間、３７℃で反応した。２９３細胞を一過的にトランスフェクションし、F78E2 またはΔE2蛋白を作製した。１０倍濃縮された上清をELISA の標的抗原として用いた。各蛋白／ウエルの飽和量を、ブロッキング緩衝液中、３時間、室温でGNA コートプレートと反応させた。
【０１４７】
免疫血清の希釈系列(1:100ないし1:72900)を、mockをトランスフェクトした２９３細胞より得た１μｌ／ウエルの１０倍濃縮上清のブロッキング緩衝液と、２時間、室温で前反応した。血清反応を４℃で行った。室温１時間のIIab反応（αマウスIgG Fc特異的ＡＰ標識、SIGMA 7434、ブロッキング干渉液で1:2000に希釈）後、プレートを３０分間３７℃で発色させた。
各血清に関しMAP 形式が相同であるペプチド配列を利用したELISA アッセイを用い、抗HVR1ミモトープ抗体の力価検定を行った(1:100ないし1:72900 の血清希釈）。
いずれの場合も、吸光度が0.3O.D.(ほぼバックグランド値の６倍）となる最大希釈率を抗体力価とした。
【０１４８】
交叉反応アッセイ
材料と方法に記載した４３種類の代表的なMAPSのセットを用いて、血清の持つ各種HVR1の天然変異体に対する交叉反応性を調べた。
構築体をコードするミモトープの筋肉内注射は強い体液性反応を誘導する。
プラスミド pΔE2およびpF78E2を用い、体液性反応誘導の最適条件を確立した。HVR1の外側に位置するエピトープに対する抗体の誘導は、一過性にトランスフェクトした２９３細胞より発現されるΔＥ２蛋白を利用したELISA を用い調べた。
【０１４９】
Balb/C及びC57 黒マウスを免疫し、各種遺伝的バックグランドに於けるミモトープをコードした構築体の免疫原性を試験した。注射回数（１回から４回）と注射ＤＮＡ量の両方が抗体反応の強さに直接相関した。ΔＥ２蛋白に対する最高の抗体力価は、マウス当たり５０μｇまたは100 μg の pΔE2DNA を、３週間隔で３回注射した時得られた。それ以上注射しても、力価は改善しなかった。マウスをプラスミドpF78E2で免疫感作した場合にも、ΔＥ２蛋白に対する抗体誘導について同様の動態が観察された。後者の動物群に於ける抗HVR1抗体の誘導は、MAPF78のELISA により試験した。免疫感作の最適条件に関する限り、調べ範囲で２種類の株間に有意な差は認められなかったが、C57 黒マウスの方が平均して反応は良好であった。
【０１５０】
F78 HVR1ミモトープのみを発現する構築体(pF78)で感作したマウスの抗血清もまた特異的反応を誘導したが、その力価は関連するpF78E2構築体を利用し得た抗血清に比べて遙かに低かった。F78 ミモトープ単独に比べて融合構築体で強い反応が得られるのは、その発現レベル、組み換え体産物の立体構造、またはより強いＴヘルパーエピトープの存在といった複数のファクターが関係していると考えられた。
【０１５１】
抗ミモトープ抗血清は各種天然HVR1変種との交叉反応する
ＤＮＡをベースとした免疫感作による交叉反応性反応を惹起するミモトープ／Ｅ２融合体の能力を、天然分離株のHVR1を再現した４３種類の合成ペプチドのパネルを固相抗原とするＥＬＩＳＡ（材料と方法を参照）を用いて評価した。表ＩＩＩには、各種プラスミド単独またはプラスミド混合体でＢａｌｂ／ｃマウス（上）及びC57 黒マウス（下）を免疫感作した時の平均力価を示す。交叉反応性は、試験した４３種類の内陽性とスコアされたペプチドの数として示されている。
【０１５２】
関連血清中には、相同的なミモトープ配列を提示するペプチドに対し特異的な抗体が有意レベル存在しているにも関わらず、pB14E2及びpB24E2プラスミドは交叉反応性免疫反応を誘導しなかった（表ＩＩＩ）。多の全ての構築体は、天然HVR1配列の幾つかに対し交叉反応する抗血清を惹起し、抗Ｆ７８血清は試験したペプチドの２８％を認識できた。
【０１５３】
一般的に、免疫血清の交叉反応性の広さは個々のプラスミドの免疫原性を反映しており、多くの場合力価が高い程交叉反応性はのレベルも高い（表ＩＩＩ）。しかし、プラスミドpR6E2 はpD6E2 、pH1E2 及びpM63E2に比べ誘導力価は低いものの、それで免疫されたマウスの血清はより多くの天然HVR1ペプチドと反応することから分かる様に、必ずしも力価のみかで交叉反応性の違いを説明することはできない。同様に、pF7E2 、pM122E2 及びpR9E2 で免疫されたマウスの血清は、同様の力価を持つpG31E2免疫血清に比べて２倍高い交叉反応性を示した（表ＩＩＩ）。
C57 黒マウスにpF78E2キメラ遺伝子を注射した場合、Balb/Cマウスに比べてより高い交叉反応性を持つ、より強い反応が起こった（４９％対２８％）。
【０１５４】
プラスミドの混合体による免疫感作は反応の交叉反応性を改善する
各マウスに総量100 μg DNA ／注射を行い、３群のＢａｌｂ／Ｃマウスをミモトープ／Ｅ２キメラをコードするプラスミドの混合体で免疫した。
混合体ＡはＥ２にＤ６、Ｆ７８、Ｇ３１、Ｈ１、Ｍ１２２及びＲ６が融合したものをコードするプラスミドを含む。混合体Ｂはさらに交叉反応性抗体を誘導する別の３種類の構築体、pE19E 、pM63E2及びpR9E2 も含んでおり、一方混合体Ｃは１１種類全てのプラスミドを含んでいる。（混合体Ａ、混合体Ｂ及び混合体Ｃそれぞれによるペプチド及びペプチドをコードする核酸の混合体は、本発明の別の観点を表す。）
【０１５５】
３種類の混合体全てが免疫源性を有しており、高い交叉反応性抗血清を誘導した（表ＩＩＩ）。混合体Ａにて免疫された動物の抗体は、該混合体に含まれる個別のプラスミドを注射した時に得られる抗体に比べて交叉反応性は高く無かった。しかし、前者の力価はおよそ５０倍低いことから、免疫の効率を上げれば混合体Ａがより広い交叉反応性反応を誘導できることが示唆されていることを強調する必要がある。混合体Ｂによる結果はさらにこの仮説を支持している。プラスミドの第２混合体を投与されたマウスは交叉反応性の実質増加を示しており、試験した天然HVR1配列の約５０％を認識できる抗血清を生じた。またこの場合、個別のプラスミドで免疫された動物より得た最も交叉反応性の広い抗血清に比べて平均力価が一桁低かった（表ＩＩＩ）。
【０１５６】
ミモトープ／Ｅ２キメラをコードする全てのプラスミドを含む最も複雑な混合体を筋肉内に投与しても、得られた血清の反応性がこれ以上改善されることはなかった。この結果は、この混合体中に存在する２種類の追加構築体（pB14E2及びpB24E2）で動物を免疫しても、交叉反応性が認められないことと一致した。
同様のデータはＣ５７黒マウスの免疫でも得られた。
【０１５７】
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【０１６１】
表Ｉ−選択のスキーム
表上部にはHCV 感染患者の血清による第一回及び第二回のHVR1ライブラリー濃縮を示す。左のカラムには、血清名と対応する感染ウイルスの遺伝子型（かっこ内）を示す。右カラムには得られたファージプールの名称を示す。
【０１６２】
表ＩＩ−”強”及び”弱”交叉反応性ミモトープのセットに観察されたアミノ酸頻度
ｉはアミノ酸の場所を示す（１ないし２７）；aaは標準１文字コードによるアミノ酸を示す；Fs(i,aa)は、”強”ミモトープ中ｉ位置のアミノ酸ａａの頻度であり；Fw(i,aa)は、”弱”ミモトープ中ｉ位置のアミノ酸ａａの頻度である。
【０１６３】
【表１】
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【０１６４】
【表２】
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【０１６５】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１（Ａ）】  図１（Ａ）は、この研究作業において使用されているHCV HVR1配列の２３４の天然の変異体のコンセンサスパターンの誘導体化を例示する。囲み内の影の無い残基は単独で、観察された変異体の約８０％を説明している。残基は、上から下へ観察された頻度の下降順で列挙されている。
【図１（Ｂ）】  図１（Ｂ）は、バクテリオファージ上で表示された初期HVR1ペプチドライブラリー内の組成を示す。
【図２】  図２は、アフィニティー選択の第１ラウンドにより得られたファージプールの、選択血清中に存在する抗体に対する反応性を示す。各々の血清標本（σ１，σ４Ｒ，σ３，σ２Ｐ，σ２Ｒ，σ３Ｒ及びσＮ）について、ファージプール（プール１，４Ｒ３，２Ｐ，２Ｒ，３Ｒ及びＮ），野生型ファージ（ｗｔ）及び未選択ライブラリー（HVR1 lib）の抗体認識が測定された。２つの独立した実験からの平均値（Ａ４０５ｎｍ）が決定された。
【図３】  図３は、感染を受けた患者からの血清とのその反応性頻度の関数として、HVR1ライブラリーから選択されたHCV 特異的ファージの分布を示している。選択のために使用したものとは異なる２０のヒト血清の中に存在する抗体に対して１（上図版）又は２（下図版）サイクルのアフィニティー選択により富化されたファージについて結合が示されている各々の血清について、２つの独立した実験からの平均値（A405nm）が、選択されたファージ及び野生型ファージ上で決定された。値は、野生型ファージについて観察された背景シグナルから３σmax(p<0. 003) 以上異なるとき、統計学的に有意であるとみなされた。各々のヒストグラムは、示された数の血清と反応するファージの数（垂直軸に示されている）を、テスト標本合計数（水平軸として表現された）に対する百分率として、表わしている。
【図４】  図４は、選択されたミモトープが、HCV 感染患者からのヒト血清の中に存在する抗体によって頻繁に認識されることを示している。ヒト血清中に存在する抗体に対する選択されたミモトープの結合は、固定化されたファージ上でのELISA によって検出された。ミモトープの名前は、各列の上部に示されている。（各行の左側に示されている）各血清について、２つの独立した実験からの平均値（A405nm）が決定された。結果は、テストされたファゴトープの平均値と野生型ファージの平均値の間の差異として表現されている。正の値は、太字で表わされている。値は、野生型ファージについて観察された背景シグナルと３σmax (p<0.003) 以上異なっているとき、統計学的に有意であるとみなされた。各ミモトープの反応性の頻度及び４つのミモトープ全てで観察された反応性の合計の結果得られた頻度は、各図版の下部に示されている。
【図４（Ａ）】  図４（Ａ）は、スクリーニング段階のために用いられた２０人のHCV 患者の一群の血清と選択されたミモトープの反応性を示す。
【図４（Ｂ）】  図４（Ｂ）は、HCV 感染したウイルス血症患者からの付加的な一群の血清と選択されたミモトープの反応性を示す。
【図４（Ｃ）】  図４（Ｃ）は、市販のキットを用いて抗HCV 抗体について陽性と評点の付いた非ウイルス血症患者からの血清との反応性を示す。
【図５】  図５は、Ｓ評点と、選択されたミモトープの反応性頻度の間の相関関係を示す。直線はデータの線形最小自乗適合度を表わす。相関係数は０. ７９である。
【図６】  図６は、選択されたミモトープが、天然に発生する多数のHVR1の抗原模倣物であることを示している。HCV 感染患者の血清プールの抗体は、選択されたミモトープの配列（図の上部に表わされている）を再現するMAP 上で免疫精製された。免疫精製された同量の抗体の反応性は、（左列に示されている）MAP として合成されたHVR1配列の代表的なパネル上でELISA により測定された。２つの独立した実験からの平均値が決定された。値は、（１）それが２つの無関係のペプチド上で観察される背景シグナルと３σmax(p<0.003)以上異なっていた；（２）それが、天然のHVR1を表わす各ペプチド上で未感染個体からの血清を用いて観察された平均シグナルと３σmax (p<0. 003)以上異なっていた、という２つの基準が同時に満たされたときに、充分に有意であるものとみなされた。灰色の囲みは、0.15〜0.50D(405nm)の間で、無関係のMAP 上で観察されたシグナルと異なるシグナルを示す。黒色囲みは、0.5OD(405nm)以上異なる値を表わす。免疫精製された抗体の各プールの交叉反応性レベルは、各列の下部に示されている。
【図７】  図７は、ミモトープ配列と交叉反応性の相関関係を示す。
【図７（Ａ）】  図７（Ａ）は、分析中で使用されたミモトープの配列を示す。
【図７（Ｂ）】  図７（Ｂ）は、ミモトープのＳ評点と、４３の天然HVR1配列のパネルと、免疫精製されたヒト抗体の交叉反応性の間の相関関係を示す。直線は、データの線形最小自乗適合度を表わしている。相関係数は0.86である。
【図８】  図８は、選択されたミモトープが天然に発生する多数のHVR1の免疫原性模倣物であることを示している。
MAP の形での単一のHVR1ミモトープ（図８（Ａ））及びミモトープ混合物（図８（Ｂ））で免疫化されたマウスからの血清の反応性を、（左列に示した）天然のHVR1の配列のパネル上でELISA により検定した。免疫化用ミモトープは最初の列に示されている。HIX1はミモトープＲ９，Ｆ７８，Ｈ１及びＤ６を含む；MIX2は、M122及びＧ３１ペプチドを含有する；MIX3は６つのMAP で構成されている。力価（相同なペプチド上でのELISA において最大シグナルの半分を得るのに必要とされる希釈度として定義される）は、第２列に示されている。血清は、１：１００の割合で希釈した。２つの独立した実験からの平均値が決定された。値は、２つの無関係なペプチド上で得られた背景シグナルと３σmax(p<0. 003) 以上異なるときに統計学的に有意であるとみなされた。灰色の囲みは0.15〜0.5OD(405nm)の間で、無関係なMAP 上で観察されたものと異なっているシグナルを表わし、黒色囲みは、0.5OD(405nm)以上異なる値を表わしている。各血清の交叉反応性レベルは各列の下部に示されている。
【図９】  図９は、例６で記述されたインビボでの核酸免疫化実験で利用されたプラスミドを例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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