(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）1つ以上のコード化プローブを得る段階であって、各コード化プローブが、少なくとも1つのナノバーコードに接着したプローブ分子を含む段階；
b）ターゲット分子をコード化プローブと接触させる段階；
c）ターゲット分子に結合するコード化プローブを同定する段階；ならびに
d）ターゲット分子を検出および／または同定する段階
を含む方法であって、各コード化プローブがオリゴヌクレオチドを含み、ターゲット分子が核酸であり、該核酸は表面に接着され、ここで前記方法は、該核酸にハイブリダイスする隣接したコード化プローブをライゲートする段階、ならびにライゲートされたコード化プローブを核酸およびライゲートされていないコード化プローブから分離する段階をさらに含む方法。
【請求項２】
特定の長さのオリゴヌクレオチド用の可能なすべての配列を含むコード化プローブのライブラリをターゲット分子に接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ナノバーコードが、カーボンナノチューブ、フラーレン、マイクロメートル以下の金属バーコード、ナノ粒子、および量子ドットからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
コード化プローブが、分子コーミングによって表面に整列することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
コード化プローブを走査型プローブ顕微鏡検査によって同定する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
走査型プローブ顕微鏡検査手法が、原子間力顕微鏡検査、走査型トンネル顕微鏡検査、水平力顕微鏡検査、化学力顕微鏡検査、フォースモジュレーションイメージング、磁気力顕微鏡検査、高周波磁気力顕微鏡検査、磁気抵抗感受性マッピング、電気力顕微鏡検査、走査型容量顕微鏡検査、走査型広がり抵抗顕微鏡検査、トンネル原子間力顕微鏡検査および導電性原子間力顕微鏡検査からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
表面に整列されたコード化プローブを走査型プローブ顕微鏡検査によって同定する、請求項４記載の方法。
【請求項８】
核酸に結合するオリゴヌクレオチドの配列を決定することをさらに含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
核酸に結合するオリゴヌクレオチドの配列から核酸の配列を決定することをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
核酸に結合するコード化プローブから核酸を同定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明の方法、組成物および装置は、分子生物学および生体分子の分析の分野に関し、核酸、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない。特に、本発明は、ナノバーコードおよび走査型プローブ顕微鏡検査（SPM）を使用して、核酸および／または他の生体分子を検出、同定および／または配列決定するための方法、組成物および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
生体分子、例えば核酸またはタンパク質の同定および／または配列決定は、医療診断、法医学、毒物学、病理学、細菌戦争、公衆衛生および多数の他の分野で必須である。現在、多大な研究が核酸またはタンパク質の同定および／または配列決定に向けられているが、他の生体分子、例えば炭水化物、多糖類、脂質、脂肪酸等も重要でありうる。本明細書に開示される方法、組成物および装置は、核酸の同定および／または配列決定に限定されず、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない他の種類の生体分子の分析にも使用される。
【０００３】
核酸検出のための標準的な方法、例えば、サザンブロット法または核酸チップへの結合は、蛍光性または放射性のプローブ分子をターゲット核酸分子とでハイブリッド形成する方法に依存する。核酸配列決定の公知の方法は、典型的に、サンガージデオキシ技術または核酸チップへのハイブリッド形成のいずれかを使用する。
【０００４】
オリゴヌクレオチドハイブリッド形成に基づくアッセイは、ターゲット核酸の検出に広く使用されている。ターゲット核酸に対して配列が相補的であるプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光性部分、放射性部分または他の部分に接着し、Watson-Crick塩基対形成によって核酸へハイブリッド形成することが可能である。この技術に関する多くの変形例が公知である。より近年には、何百または何千ものオリゴヌクレオチドプローブを含むことができるDNAチップが設計されている。ターゲット核酸の、チップ上のオリゴヌクレオチドへハイブリッド形成は、蛍光分光法、放射能等を使用して検出されてもよい。感受性および／または特異性に関する問題が、正確に相補的ではない配列の間の核酸ハイブリッド形成から生じることもある。試料中の低レベルのターゲット核酸の存在が検出されないこともある。
【０００５】
サイズによって分けられる4色蛍光性または放射性の核酸の検出に基づくサンガージデオキシ核酸配列決定の方法は、配列決定されることが可能な核酸の長さによって限定される。典型的に、核酸配列の500から1,000の塩基しか1回に決定することができない。現在の方法を使用すると、完全な遺伝子配列の決定には、遺伝子の多くのコピーを生成し、重なり合うフラグメントに切断し、配列決定することが必要であり、その後、重なり合っているDNA配列を集めてもよい。このプロセスは、難儀であり、高価で、能率が悪く、時間がかかる。これは典型的に、蛍光性または放射性の部分も使用し、それは、安全および廃棄物処理問題を引き起こす可能性がある。オリゴヌクレオチドチップへのハイブリッド形成を使用するより近年の核酸配列決定の方法は、短い核酸配列を推察するか、または試料中の特異的な核酸の存在を検出するために使用することはできるが、長い核酸配列を同定する場合には適切ではない。
【０００６】
タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを同定するために、様々な技術が利用可能である。一般に、これらは、タンパク質上の1つ以上のエピトープドメインを認識することができる抗体の結合および検出を含む。タンパク質の抗体に基づく同定はかなり速いが、そのようなアッセイは、抗体の異なる抗原との交叉反応のため、ターゲット分析対象物の低い抗原性のため（アッセイの低い感度につながる）、抗体の様々な表面への非特異的な結合等のため、受け入れられないほど高いレベルの偽陽性または偽陰性の結果を示す場合がある。これはまた、個別のタンパク質またはペプチドを認識することができる抗体の調製を必要とする。そのため、予め特性決定されていない新規のタンパク質を同定するには、適しない。
【０００７】
生体分子、例えば核酸またはタンパク質を検出し、同定および／または配列決定するための速く正確で高い感感度の方法の必要性が生じる。
【発明の開示】
【０００８】
例示的な態様の説明
開示された方法、組成物および装置は、生体分子、例えば核酸を検出、同定および／または配列決定するために使用するものである。本発明の特定の態様において、方法、組成物および装置は、1,000を超えるか、2,000を超えるか、5,000を超えるか、10,000を超えるか、20,000を超えるか、50,000を超えるか、100,000を超えるか、またはそれさえも超える長さの塩基の非常に長い核酸分子の配列を得るために適切である。利点として、1回のシーケンスランで長い核酸配列を読み取る能力があること、配列データを高速で得ること、低コストで配列決定すること、および配列データの1ユニット当たりに必要な操作時間の量の点から効率が高いことが挙げられる。他の利点として、偽陽性結果の発生率が低く、高感度で正確な核酸の検出および／または同定が挙げられる。
【０００９】
下記の詳細な説明は、本発明の開示された態様の、より徹底的な理解を提供するために、多数の特定の情報を含む。しかし、これらの特定の情報なしで本発明の態様を実施してもよいことは、当業者には明らかである。その他の場合には、当技術分野において公知の装置、方法、手順および個別の構成要素は、本明細書で詳細には説明されていない。
【００１０】
定義
本願で使用される「1つの」（aまたはan）は、アイテムの1つ以上を意味してもよい。
【００１１】
本願で使用される「約」は、値の10％以内を意味する。例えば、「約100」は、90から110の間の値を意味する。
【００１２】
「核酸」は、DNA、RNA（リボ核酸）、一本鎖、二本鎖または三本鎖の、およびそのいずれかの化学修飾を包含する。事実上あらゆる核酸の修飾が考えられる。「核酸」は、2以上の塩基のオリゴヌクレオチドから、完全長の染色体DNA分子まで、ほぼいかなる長さであってもよい。核酸は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含むが、それらに限定されない。
【００１３】
「コード化プローブ」130、230、340、400は、1つ以上のナノバーコード420に接着したプローブ分子410を意味する。プローブ分子410は、1つ以上のターゲット分子への選択的および／または特異的な結合を呈する分子である。本発明の様々な態様において、各異なるプローブ分子410は、弁別可能なナノバーコード420に接着してもよく、そのため、特定のプローブ410の結合は、異なるプローブ分子410の集団から、検出されてもよい。本発明の態様は、使用されてもよいプローブ分子410の種類に関して限定されない。当技術分野において公知のいかなるプローブ分子410が使用されてもよく、例えば、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質、レセプタタンパク質、ペプチド、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、サイトカイン等を含むが、それらに限定されない。本発明の一定の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、オリゴヌクレオチドおよび／または核酸を含んでもよく、そのオリゴヌクレオチドおよび／または核酸の配列を同定する1つ以上のナノバーコード420に共有的にまたは非共有的に接着している。本発明の様々な態様において、コード化プローブ130、230、340、400の線系列は、一緒にライゲートされてもよい。ライゲートされた分子の各コード化プローブ130、230、340、400は、弁別可能なナノバーコード420に接着してもよく、その配列を同定するのを可能にする。ライゲートされた分子の各コード化プローブ130、230、340、400の配列もまた決定されてもよいため、ライゲートされた分子全体の配列が同定されてもよい。代替の態様において、オリゴヌクレオチドプローブ410内の各ヌクレオチドは、弁別可能なナノバーコード420に接着してもよく、コード化プローブ130、230、340、400の配列がヌクレオチドの配列から同定されるのを可能にする。
【００１４】
「ナノバーコード」420は、コード化プローブ130、230、340、400を検出および／または同定するために使用されてもよい組成物を意味する。下記において詳細に検討される非限定的な実施例において、ナノバーコード420は、1つ以上のマイクロメートル以下の金属バーコード、カーボンナノチューブ、フラーレン、または走査型プローブ顕微鏡検査によって検出され同定されることができる他のいずれのナノスケール部分を含んでもよい。ナノバーコード420は単一の部分に限定されず、本発明の一定の態様において、ナノバーコード420は、例えば、互いに接着した2つ以上のフラーレンを含んでもよい。図4に例示された非限定的な実施例は、ナノバーコード420内に組み込まれた6つの異なる部分を示す。部分がフラーレンである場合には、それは、例えば、特定の順番で一緒に接着した一連の大きなフラーレンおよび小さなフラーレンから構成されてもよい。ナノバーコード420の異なるサイズのフラーレンの順番は、走査型プローブ顕微鏡検査によって検出されてもよく、これを使用して、例えば、接着したオリゴヌクレオチドプローブ410の配列を同定してもよい。
【００１５】
「ターゲット」または「分析対象物」分子は、コード化プローブ130、230、340、400に結合してもよい分子であり、核酸、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない。本発明のいくつかの態様において、コード化プローブ130、230、340、400のターゲット分子への結合を使用して、試料中におけるターゲット分子の存在を検出してもよい。
【００１６】
分子コーミング
本発明の様々な態様において、ナノバーコード420、コード化プローブ130、230、340、400、および／またはコード化プローブ130、230、340、400に結合されたターゲット分子は、表面100、220、300に接着してもよく、分析のために整列されてもよい。いくつかの態様において、コード化プローブ130、230、340、400は表面に整列されてもよく、下記に検討されるように組み込まれたナノバーコード420が検出されてもよい。代替の態様において、ナノバーコード420は、プローブ分子410から取り外されてもよく、表面に整列され、検出されてもよい。一定の態様において、個別のターゲット分子に結合されたコード化プローブ130、230、340、400の順番は保持されてもよく、例えば、走査型プローブ顕微鏡検査によって検出されてもよい。他の態様において、ターゲット分子の複数のコピーが試料中に存在してもよく、ターゲット分子の同定および／または配列は、複数のコピーに結合するコード化プローブ130、230、340、400のすべての配列を重なり合っているターゲット分子配列内に集合させることによって、決定されてもよい。例えば、重なり合っている部分的な核酸またはタンパク質の配列を隣接する配列内に集合させることは、当技術分野においては公知である。様々な態様において、ナノバーコード420は、プローブ分子410に接着している間に検出されてもよく、または検出される前にプローブ分子410から取り外されてもよい。
【００１７】
表面100、220、300へ接着するための、および核酸等の分子、オリゴヌクレオチドプローブ410および／またはナノバーコード420を整列するための、方法および装置は、当技術分野においては公知である（例えば、Bensimonら、Phys. Rev. Lett. 74: 4754-57, 1995; Michaletら、Science 277: 1518-23, 1997；米国特許第5,840,862号、第6,054,327号、第6,225,055号、第6,248,537号、第6,265,153号、第6,303,296号および第6,344,319号を参照されたい）。ナノバーコード420、コード化プローブ130、230、340、400および／またはターゲット分子は、表面100、220、300へ接着してもよく、空気−水メニスカスまたは他の種類の界面に固有の物理的な力を使用して、整列されてもよい。この技術は、一般に、分子コーミングとして知られている。ナノバーコード420、コード化プローブ130、230、340、400、および／または水性媒体110、210中に溶解したターゲット分子は、一方の端もしくは両方の端で、表面100、220、300、例えば、シラン化ガラススライド、ビオチン化表面、金コート表面、またはそのような分子に結合することができることが当技術分野において知られている他のいかなる表面100、220、300に接着してもよい。表面100、220、300は、水性媒体からゆっくり引き抜かれてもよい（例えば、図1参照）。極性または荷電したターゲット分子、ナノバーコード420、および／またはコード化プローブ130、230、340、400は、親水性（水性）媒体110、210に優先的に分配する。このようにして、表面100、220、300を水性媒体110、210から除去することは、結果として、結合したターゲット分子、ナノバーコード420、および／またはコード化プローブ130、230、340、400を、メニスカスの運動の方向に平行に伸ばすことになる。伸ばされた分子の測定された長さとその実際のサイズとの間には直接相関があり、伸ばされた長さの1μmは、核酸配列の約2,000塩基に対応する（Herrickら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 222-227, 2000）。
【００１８】
ひとたび表面100、220、300が水性媒体110から完全に除去されると、接着したナノバーコード420、および／またはコード化プローブ130、230、340、400は、より容易に且つ正確に分析が可能なように平行に整列される。本発明の一定の態様において、コード化プローブ130、230、340、400の両端が表面100、220、300に接着する場合には、整列したコード化プローブ130、230、340、400はU字形構造に配列され、これもまた分析が容易である。この技術は、ターゲット分子、ナノバーコード420、および／または整列されるべきコード化プローブ130、230、340、400のサイズによって限定されず、染色体以内であれば、核酸に作用することができる（例えば、Michaletら、1997; Herrickら、2000）。メニスカスの運動の適切な速度で、発生した剪断力は、比較的低く、結果として、数百kbまたはそれより長い整列されたDNAフラグメントになる（Michaletら、1997）。
【００１９】
分子コーミングは、分子が処理された表面100、220、300へ強力に非特異的に吸着することによって阻害される（Bensimonら、1995）。このようにして、本発明の様々な態様において、ターゲット分子またはコード化プローブ130、230、340、400の1つ以上の端のみが表面100、220、300に結合するように、表面100、220、300は処理される。核酸および他の種類のコード化プローブ130、230、340、400を表面100、220、300へ結合するための方法は、当技術分野においては公知であり、下記に要約される。非限定的な実施例において、ターゲット分子、ナノバーコード420またはコード化プローブ130、230、340、400は、分子の一方の端または両方の端でビオチン残基で共有的に修飾されてもよい。アビジンまたはストレプトアビジンがコートされた表面100、220、300に露出されると、ビオチン化された端のみが表面100、220、300に結合する。表面100、220、300への非特異的な吸着は、疎水性である表面100、220、300、例えばシラン化された表面100、220、300の使用によって減少されてもよい。
【００２０】
本発明の態様は、使用されてもよい表面100、220、300の種類によって限定されない。表面100、220、300の非限定的な例として、ガラス、機能化ガラス、セラミック、プラスチック、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、PTFE（ポリテトラフルオロエチレン）、PVP（ポリビニルピロリドン）、ゲルマニウム、ケイ素、石英、ガリウムヒ素、金、銀、ナイロン、ニトロセルロース、または表面100、220、300に接着したナノバーコード420および／またはコード化プローブ130、230、340、400を有することができる当技術分野において公知の他の材料が挙げられる。接着は、共有相互作用によっても非共有相互作用によってもよい。本発明の一定の態様において、表面100、220、300はガラススライドまたはカバースリップの形態であるが、表面100、220、300の形状は限定されず、表面100、220、300はいかなる形状であってもよい。本発明のいくつかの態様において、表面100、220、300は平面である。
【００２１】
表面100、220、300にターゲット分子、ナノバーコード420および／またはコード化プローブ130、230、340、400を整列するための代替方法は、当技術分野において公知である。（例えば、Bensimonら、1995; Michaletら、1997、米国特許第5,840,862号、第6,054,327号、第6,225,055号、第6,248,537号、第6,265,153号、第6,303,296号および第6,344, 319号を参照されたい）。整列のいかなる公知の方法を、特許請求された主題の範囲内で使用してもよいと考えられる。本発明の一定の態様において、水性媒体110、210に溶解したターゲット分子、ナノバーコード420、またはコード化プローブ130、230、340、400が可動メニスカスを通って引かれるときに、整列が発生する。メニスカスが動く機構は重要ではなく、例えば、表面100、220、300をバッファ溶液110、210に浸漬して、これを溶液110、210からゆっくり引き抜くことによって、達成されてもよい。または表面100、220、300は、溶液110、210に浸漬されてもよく、メニスカスの高さは、蒸発によってまたは液体の除去によって、ゆっくり低下してもよい。本発明の別の態様において、溶液210の滴は、カバースリップ200と表面100、220、300、例えばガラススライド、との間に置かれてもよい。表面100、220、300は、カバースリップ200から離れてゆっくり引かれてもよい。溶液210がカバースリップ200に接着するため、これは、結果として、カバースリップ200が表面100、220、300に接触する縁で、空気−水界面が形成されることになる。この界面を動かして、ターゲット分子、ナノバーコード420および／またはコード化プローブ130、230、340、400を、表面100、220、300に整列させる。ナノバーコード420および／またはコード化プローブ130、230、340、400を整列させるための別の代替方法は、下記により詳細に検討される分子コーミングの代わりにまたはその最中のいずれかに、フリーフロー電気泳動を使用することを含む。
【００２２】
核酸
検出、同定および／または配列決定されるべき核酸分子は、当技術分野において公知のいかなる技術によって調製されてもよい。本発明の一定の態様において、核酸は、自然発生的なDNAまたはRNA分子である。事実上いかなる自然発生的な核酸が、開示された方法によって、検出、同定および／または配列決定されてもよく、例えば、染色体DNA、ミトコンドリアDNA、および葉緑体DNA、ならびに、リボソームRNA、トランスファーRNA、ヘテロ核RNA、およびメッセンジャーRNAを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、分析されるべき核酸は、天然のホモジェネート、または細胞、組織または器官の抽出物に存在してもよい。他の態様において、核酸は、分析前に部分的にまたは完全に精製されてもよい。代替の態様において、分析されるべき核酸分子は、化学合成によって、または当技術分野において公知の広く様々な核酸増幅、複製および／または合成方法によって、調製されてもよい。
【００２３】
様々な形態の細胞核酸を精製するための方法は公知である（例えば、Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, NY, 1987；Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、eds. Sambrook, FritschおよびManiatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照されたい）。引用された文献に開示された方法は、模範的なだけであり、当技術分野において公知のいずれの変形例を使用してもよい。一本鎖 DNA（ssDNA）が分析されるべき場合には、ssDNAは、いずれかの公知の方法によって、二本鎖DNA（dsDNA）から調製されてもよい。そのような方法は、dsDNAを加熱し、鎖が分離するのを可能にすることを含んでもよく、または例えばM13へのクローニング等の公知の増幅または複製の方法によって、dsDNAからssDNAを調製することを含んでもよい。いかなるそのような公知の方法を使用して、ssDNAまたはssRNAを調製してもよい。
【００２４】
本発明の一定の態様は、自然発生的な核酸の分析に関するが、実際にはいずれかの種類の核酸を使用することができる。例えば、様々な増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR（商標））増幅、によって調製された核酸を分析することができる。（米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号を参照されたい）。または分析されるべき核酸は、標準ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、BAC（細菌人工染色体）またはYAC（酵母人工染色体）によって、クローン化されてもよい（例えば、BergerおよびKimmel, 1987; Sambrookら、1989を参照されたい）。核酸インサートは、例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断したのち、アガロースゲル電気泳動によってベクターDNAから分離してもよい。核酸インサートを分離する方法は、当技術分野においては公知である。開示された方法は、分析されるべき核酸の源に関して限定されず、原核生物、細菌、ウイルス、真核生物、哺乳類および／またはヒトを含むいずれの種類の核酸が、特許請求された主題の範囲内で分析されてもよい。
【００２５】
本発明の様々な態様において、下記に検討されるように、単一の核酸の複数のコピーが、コード化プローブ130、230、340、400のハイブリッド形成によって分析されてもよい。例えば様々な増幅および／または複製方法によって単一の核酸を調製し、複数のコピーを形成することは、当技術分野においては公知である。または単一のクローン、例えば、BAC、YAC、プラスミド、ウイルス、または単一の核酸インサートを含む他のベクターを分離し、増殖させてもよく、分析のためにインサートを取り出し、精製してもよい。クローン化し、精製された核酸インサートを得るための方法は、当技術分野においてよく周知である。
【００２６】
特許請求された主題の範囲は、核酸の分析に限定されず、タンパク質、脂質および多糖類を含むがそれらに限定されない他の種類の生体分子の分析にも関係することを、当業者は完全に理解する。様々な種類の生体分子を調製および／または精製するための方法は、当技術分野において公知であり、そのような方法が使用されてもよい。
【００２７】
コード化プローブライブラリ
本発明の一定の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、プローブ分子410のライブラリを含んでもよく、各異なるプローブ410は、弁別可能なナノバーコード420に接着している。所与のライブラリ内で、特異的なプローブ分子410の2つ以上のコピーがあることが可能である。この場合、同一プローブ410の各コピーは、同一のナノバーコード420に接着する。使用されるプローブ410およびナノバーコード420の種類は限定されず、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質、レセプタタンパク質、ペプチド、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、サイトカイン等を含むが、それらに限定されないいかなる種類の公知のプローブ分子410が使用されてもよい。さらに、いずれの種類の弁別可能なナノバーコード420が使用されてもよい。
【００２８】
オリゴヌクレオチドライブラリ
本発明の様々な態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、オリゴヌクレオチドプローブ410、例えば、規定された配列のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチド410は、弁別可能なナノバーコード420に接着してもよく、分析されるべき核酸、および一緒にライゲートされた隣接するコード化プローブ130、230、340、400に、ハイブリッド形成されてもよい。核酸から分離した後に、ライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400は、上記に検討されたように、表面100、220、300に接着し、整列されてもよい。整列したコード化プローブ130、230、340、400は、次いで、走査型プローブ顕微鏡検査（SPM）によって分析されてもよい。SPM分析は、コード化プローブ130、230、340、400のナノバーコード420の検出および同定を可能にし、且つ、核酸に結合するコード化プローブ130、230、340、400の配列の決定を可能にする。その情報を使用して、核酸を同定および／または核酸配列を決定することができる。特許請求された主題は、SPM検出方法に限定されず、表面100、220、300に整列されたナノバーコード420および／またはコード化プローブ130、230、340、400を検出し、同定することができるいかなる分析方法を使用してもよいことを、当業者は完全に理解する。また、SPM分析は、オリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブ130、230、340、400の検出および同定に限定されず、いかなる種類のコード化プローブ130、230、340、400および／またはナノバーコード420で使用されてもよいことをも、当業者は完全に理解する。
【００２９】
本発明の代替の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、隣接するコード化プローブ130、230、340、400のライゲーションなしで検出されてもよい。コード化プローブ130、230、340、400は、同一ターゲット分子の複数コピーにハイブリッド形成されてもよい。ハイブリッド形成されていないコード化プローブ130、230、340、400が除去されてもよく、ハイブリッド形成されたコード化プローブ130、230、340、400が検出される。いくつかの態様において、依然としてターゲット分子にハイブリッド形成されながら、コード化プローブ130、230、340、400が検出されてもよい。またはコード化プローブ130、230、340、400は、例えば試料を加熱することによって、ターゲット分子から取り外されてもよく、次いで、検出される。そのような態様において、ナノバーコード420構成要素は、検出前にコード化プローブ130、230、340、400のプローブ410構成要素から除去されてもされなくてもよい。
【００３０】
本発明の一定の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、依然としてターゲット分子に接着しながら、検出されてもよい。短いオリゴヌクレオチドプローブ410とターゲット核酸との間の結合相互作用が比較的弱い強度であることを考えると、そのような方法は、例えば、コード化プローブ130、230、340、400が架橋試薬を使用してターゲット分子へ共有結合している場合に、または抗体−抗原相互作用のように、プローブ分子410とターゲットとの間の結合相互作用がより強い場合に、より適切であるかもしれない。
【００３１】
本発明の様々な態様において、オリゴヌクレオチド型のコード化プローブ130、230、340、400は、DNA、RNA、またはそのいずれの類似体、例えば、ペプチド核酸（PNA）であってもよく、これは、核酸の特異的な相補的な配列を同定するのに使用することができる。本発明の一定の態様において、1つ以上のコード化プローブ130、230、340、400ライブラリが、1つ以上の核酸分子へハイブリッド形成するために調製されてもよい。例えば、4096すべてまたは約2000の非相補的6-mer、または16,384すべてまたは約8,000の非相補的7-merを含有する1セットのコード化プローブ130、230、340、400を使用してもよい。オリゴヌクレオチドコード化プローブ130、230、340、400の非相補的サブセットが使用されるべきであれば、複数のハイブリッド形成および配列分析を実施してもよく、分析の結果は、算定方法によって単一のデータに統合されてもよい。例えば、ハイブリッド形成および配列分析のために非相補的6-merのみを含むライブラリを使用した場合、第1のライブラリから除外されたコード化プローブ130、230、340、400配列にハイブリッド形成された同一のターゲット核酸分子を使用する第2のハイブリッド形成および分析が実施されてもよい。
【００３２】
本発明のいくつかの態様において、コード化プローブ130、230、340、400ライブラリは、所与のオリゴヌクレオチド長さに可能な配列すべてを含んでもよい（例えば、6-merライブラリは、4096コード化プローブ130、230、340、400から構成される）。そのような場合には、一定のコード化プローブ130、230、340、400は、相補的なコード化プローブ130、230、340、400配列とハイブリッドを形成する。そのようなハイブリッドは、ハイブリッド形成されていないコード化プローブ130、230、340、400と同様に、公知の方法、例えば、高速液クロマトグラフィ（HPLC）、ゲル透過クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、限外濾過、および／またはハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィを使用して、ターゲット分子にハイブリッド形成されたコード化プローブ130、230、340、400から分離されてもよい。所与の長さのすべての可能な配列のオリゴヌクレオチドの完全セットまたは特定のサブセットを選択し生成するための方法は、公知である。様々な態様において、長さが2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれ以上のヌクレオチドのコード化プローブ130、230、340、400が使用されてもよい。
【００３３】
本発明の一定の態様において、コード化プローブ130、230、340、400ライブラリは、一方または両方の端で不変の核酸配列に接着したコード化プローブ130、230、340、400の中間にランダム核酸配列を含んでもよい。例えば、12-merコード化プローブ130、230、340、400のサブセットは、各端で不変の2-merに接着したランダム8-mer配列の完全セットから構成されてもよい。これらのコード化プローブ130、230、340、400ライブラリは、その不変の部分にしたがって再分割されることができ、核酸に別個にハイブリッド形成されることができ、その後、各異なるコード化プローブ130、230、340、400ライブラリの組み合わされたデータを使用して分析され、核酸配列を決定する。必要なサブライブラリの数は、ランダム配列に接着する不変の塩基の数の関数であることを当業者は完全に理解する。代替の態様は、ランダムオリゴヌクレオチド配列に接着した特異的な不変の部分を含む単一のコード化プローブ130、230、340、400ライブラリで、複数のハイブリッド形成および分析を使用してもよい。核酸上のいずれかの所与の部位に、異なるが重なり合っている配列の複数のコード化プローブ130、230、340、400が、わずかにずれたやり方でその部位に結合することが可能である。このようにして、単一のライブラリで複数のハイブリッド形成および分析を使用して、重なり合っているずれたコード化プローブ130、230、340、400配列をコンパイルすることによって、核酸の完全な配列を得ることができる。
【００３４】
オリゴヌクレオチドライブラリに関与する本発明の態様において、オリゴヌクレオチドは、いかなる公知の方法によって、例えば、Applied Biosystems 381A DNA合成装置（Foster City、CA）または類似の器具で合成することによって、調製されてもよい。またはオリゴヌクレオチドは、様々な販売元（例えば、Proligo, Boulder, CO; Midland Certified Reagents, Midland, TX）から購入することができる。オリゴヌクレオチドが化学的に合成される態様において、ナノバーコード420は、合成に使用される1つ以上のヌクレオチド前駆物質に、共有結合させてもよい。またはナノバーコード420は、オリゴヌクレオチドプローブ410が合成された後に、接着してもよい。他の代替において、ナノバーコード420は、オリゴヌクレオチド合成と同時に接着してもよい。
【００３５】
本発明の一定の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、ペプチド核酸（PNA）を含んでもよい。PNAは、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシン用の単量体単位を備えたDNA類似体のポリアミド型である。PNAは、例えば、PE Biosystems（Foster City, CA）のような企業が販売している。またはPNA合成は、第3アミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在下で0-（7-アザベンゾトリアゾル-1-yl)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）を使用する、9-フルオロエニルメトキシカルボニル（9-fluoroenylmethoxycarbonyl）（Fmoc）モノマー活性、およびカップリングで実施されてもよい。PNAは、逆相高速液クロマトグラフィ（RP-HPLC）によって精製することができ、マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析によって実証することができる。
【００３６】
ナノバーコード
各コード化プローブ130、230、340、400は、少なくとも1つの共有的または非共有的に結合したナノバーコード420を組み込んでもよい。ナノバーコード420を使用して、個別のコード化プローブ130、230、340、400を検出および／または同定してもよい。本発明の一定の態様において、各コード化プローブ130、230、340、400は、2つ以上の接着したナノバーコード420を有してもよく、その組み合わせは、特定のコード化プローブ130、230、340、400に独特である。ナノバーコード420の組み合わせを使用して、ライブラリ内のコード化プローブ130、230、340、400を特異的に同定するために利用することができる弁別可能なナノバーコード420の数を拡大することができる。本発明の他の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、各々が、接着した単一の独特のナノバーコード420を有してもよい。唯一必要なことは、各コード化プローブ130、230、340、400から検出された信号が、そのコード化プローブ130、230、340、400を異なるコード化プローブ130、230、340、400から弁別可能に同定することができなければならないということである。
【００３７】
本発明の一定の態様において、ナノバーコード420は、コード化プローブ130、230、340、400の合成の前に、前駆物質内に組み込まれてもよい。オリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブ130、230、340、400では、アデニン（A）およびグアニン（G）の位置で共有結合の内部アミノ酸修飾が考えられる。内部接着は、市販のホスホロアミダイトを使用して、チミン（T）の位置で実施されてもよい。いくつかの態様において、A位置およびG位置にプロピルアミンリンカーを備えたライブラリセグメントを使用して、ナノバーコード420をコード化プローブ130、230、340、400に接着してもよい。内部アミノアルキルテールの導入によって、ナノバーコード420の合成後接着が可能になる。リンカーは、Synthetic Genetics（San Diego, CA）等のベンダーから購入してもよい。本発明の1つの態様において、ナノバーコード420の適切なホスホロアミダイト誘導体を使用する自動カップリングが考えられる。そのようなナノバーコード420は、オリゴヌクレオチド合成中に、5'-末端に連結されてもよい。
【００３８】
一般に、ナノバーコード420は、コード化プローブ130、230、340、400がターゲット分子へ結合するのを、例えば、核酸へハイブリッド形成するのを、を容易にするために、ナノバーコード420との立体障害を最小限にするようなやり方で、プローブ410に共有的に接着する。コード化プローブ130、230、340、400へ一定の程度の可撓性を提供するリンカーを使用してもよい。ホモまたはヘテロの二官能価リンカーは、様々な市販品製造元から入手可能である。
【００３９】
オリゴヌクレオチド塩基へ接着する点は、塩基によって異なる。いずれの位置で接着することも可能であるが、一定の態様において、接着は、相補的塩基への水素結合に関与しない位置で発生する。このようにして、例えば、ウリジン、シトシンおよびチミン等のピリミジンの5位置または6位置への接着が、可能である。アデニンおよびグアニン等のプリンでは、リンカーは、8位置を経由してもよい。特許請求された方法および組成物は、例えばオリゴヌクレオチド等のいずれの特定の種類のプローブ分子410にも限定されない。ナノバーコード420を他の種類のプローブ410、例えば、ペプチド、タンパク質および／または抗体プローブ410へ接着するための方法は、当技術分野においては公知である。
【００４０】
本発明の態様は、使用されてもよいナノバーコード420の種類に関して限定されない。当技術分野において公知のいずれの種類のナノバーコード420が使用されてもよいと考えられる。非限定的な例として、カーボンナノチューブ、フラーレン、およびマイクロメートル以下の金属バーコードが挙げられる。
【００４１】
金属バーコード
ナノバーコード420として使用される可能性のあるマイクロメートル以下の金属バーコードの例は、当技術分野においては公知である（例えば、Nicewarner-Penaら、Science 294: 137-141, 2001）。Nicewarner-Penaら（2001）は、異なる種類の金属から構成されたマイクロメートル以下のストライプでエンコードされたマルチメタルマイクロロッドを調製する方法を開示している。このシステムによって、非常に大きな数、2種類の金属を使用した場合で4160まで、3種類の異なる金属を使用した場合で8×105までの弁別可能なナノバーコード420を作ることが可能である。そのようなナノバーコード420は、コード化プローブ130、230、340、400内に組み込まれてもよく、SPM技術によって読み取られてもよい。金属粒子、例えば金または銀をオリゴヌクレオチドおよび他の種類のプローブ分子410へ接着する方法は、当技術分野においては公知である（例えば、米国特許第5,472,881号を参照されたい）。
【００４２】
カーボンナノチューブ
開示された方法に使用されるナノバーコード420の別の例として、単層カーボンナノチューブ（SWNT）が挙げられる。ナノチューブは、SPM方法によって弁別されてもよい様々な形状およびサイズに作られてもよい（例えば、Freitagら、Phys. Rev. B 62: R2307-R2310, 2000; Claussら、Europhys. Lett. 47: 601-607, 1999; Claussら、Phys. Rev. B. 58: R4266-4269, 1998; Odomら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 960: 203-215, 2002を参照されたい）。Odomら（2002）は、サイズが10nm以下のSWNTのトンネルスペクトルにおける別々のピークを検出することができるSTM（走査型トンネル顕微鏡）技術を開示している。そのようなピークは、カーボンナノチューブの電子状態密度（DOS）におけるバンホーブ特異点を表してもよい。
【００４３】
カーボンナノチューブの電子特性は、チューブの長さおよび直径によって調節される。電子波動関数の長さに対する感受性は、長さLのチューブのエネルギーレベル分割の概算によって示される。
ΔE=hvF/2L  （式 1）
ただし、hはプランク定数であり、vFはフェルミ速度（8.1×105m／秒）である（Venemaら、「Imaging Electron Wave Functions of Carbon Nanotubes」、Los Alamos Physics Preprints: cond-mat/9811317, 23 Nov. 1996）。電子エネルギーレベルの間の差は、ナノチューブの長さに反比例し、より長いチューブではより微細な分割が観察される。
【００４４】
カーボンナノチューブの光学的性質もまた、チューブ直径の関数である。基本的エネルギーギャップ（最高占有分子軌道−最低非占有分子軌道）とチューブ直径との間の関係は、下記の関数によってモデル化されてもよい
Egap=2y0acc/d  （式 2）
【００４５】
ただし、y0は、炭素−炭素密接結合オーバーラップエネルギ（2.7±0.1eV）であり、accは、最も近い隣接炭素−炭素距離（0.142nm）であり、dはチューブ直径である（Jeroenら、Nature 391: 59-62, 1998）。
【００４６】
本発明の一定の態様では、ナノバーコード420として使用されるナノチューブは、約10から200nmのチューブ長さおよび約1.2から1.4nmの直径を有してもよい。ナノバーコード420として使用されるべきナノチューブの長さまたは直径は限定されず、事実上いかなる長さまたは直径のナノチューブをも考慮してもよい。
【００４７】
ナノチューブは、公知の方法によって調製されてもよく、または商業的供給元、例えば、CarboLex (Lexington、KY), NanoLab (Watertown、MA), Materials and Electrochemical Research (Tucson, AZ) またはCarbon Nano Technologies Inc. (Houston, TX)、から得られてもよいと考えられる。使用前に、合成されたかまたは購入されたかのいずれかのナノチューブに、幾分の処理をすることが、適切である場合もある。処理は、ナノチューブをプローブ410へ接着するのを容易にし、コード化プローブ130、230、340、400を形成するために、ナノチューブを他の汚染物質から精製すること、混合直径および／または長さのナノチューブを別々の直径および長さのナノチューブに分離すること、ナノチューブ端キャップを除去すること、および／または共有修飾すること、を含んでもよい。
【００４８】
本発明の一定の態様において、変動する長さおよび／または直径のカーボンナノチューブは、当技術分野において公知の様々な技術によって作られてもよく、炭素アーク放電、炭化水素の触媒熱分解による化学蒸着、プラズマ支援化学蒸着、触媒金属含有グラファイトターゲットのレーザアブレーション、または凝縮相電気分解を含むが、それらに限定されない（例えば、米国特許第6,258,401号、第6,283,812号および第6,297,592号を参照されたい）。いくつかの態様において、ナノチューブは、質量分析法によってサイズソートされてもよい（Parkerら、J. Am. Chem. Soc. 113: 7499-7503, 1991を参照されたい）。またはナノチューブは、コード化プローブ130、230、340、400内に組み込む前に、個別のナノチューブの形状を正確に測定するために、AFM（原子間力顕微鏡）またはSTM（走査型トンネル顕微鏡）を使用して、ソートされてもよい。当技術分野において公知のサイズ細分化の他の方法、例えば、ガスクロマトグラフィ、飛行時間型質量分析法、限外濾過法または等価の技術が考えられる。ひとたびソートされると、カーボンナノチューブは、誘導体化し、公知の配列のオリゴヌクレオチドプローブ410にまたは他のいずれの種類のプローブ410に共有結合させることができる。
【００４９】
カーボンナノチューブに可能なチューブ長さの最小漸進的変化は炭素−炭素結合の長さであり、すなわち、約0.142nmである。200nmのチューブ長さの範囲で、これは、約1400の別々のナノバーコード420を可能にする。しかし、この方法は、1つのコード化プローブ130、230、340、400につき単一のナノチューブに限定されない。代替の態様において、異なる長さおよび直径の複数のナノチューブが、単一のコード化プローブ130、230、340、400に接着してもよい。異なる長さのナノチューブを使用して、可能な弁別可能なナノバーコード420の数は指数関数的に増大する。いくつかの態様において、分析を簡略にするために、単一のナノチューブが単一のプローブ分子410に接着してもよい。
【００５０】
本発明の他の態様は、規定された長さおよび直径のカーボンナノチューブを作る方法に関する。非限定的な模範的な態様において、チップは、予め選択された厚さのSiCの層を含んでもよく、例えばケイ素または触媒（例えばニッケル等の金属原子）がドープ塗布されたケイ素から構成された層に重なり合っている。標準チップ処理方法、例えば、フォトリソグラフィおよびエッチングまたはレーザアブレーション等を使用して、SiC層は、いずれの長さ、幅、厚さおよび形状のSiC沈殿物に分割されてもよい。その後、チップは、真空下で加熱されてもよく、例えば、約1400℃で約10-7トールで、または約10-3から10-12トール、10-4から10-10トール、または10-5から10-9トール、および1200から2200℃または1400から2000℃である。これらの状態下で、SiC結晶は自発的に分解し、ケイ素原子を失う（米国特許第6,303,094号）。残っている炭素原子は、カーボンナノチューブ内に自発的に集まる。SiC沈殿物のサイズおよび形状は、いずれの長さおよび直径のカーボンナノチューブを作るために、正確に制御されてもよい。
【００５１】
上記に検討された本発明の模範的な態様は、限定的なものではなく、選択された長さおよび直径のカーボンナノチューブを作るいずれの方法が使用されてもよい（例えば、米国特許第6,258,401号、第6,283,812号および第6,297,592号）。いくつかの態様において、ナノチューブの長さは、レーザビーム、電子ビーム、イオンビームまたはガスプラズマビームを使用して端をトリムすることによって、調整されてもよい。またはナノチューブの端は、チューブの端を酸化的に除去するために、酸素含有雰囲気中でホットブレードに接触されることができる。ナノチューブを含むブロックはまた、ナノチューブの先端を切り取るために、切削または研磨されることができる。
【００５２】
本発明の一定の態様において、カーボンナノチューブは、プローブ分子410への接着を容易にするために、反応基で誘導体化されてもよい。非限定的な実施例において、ナノチューブは、カルボン酸基を含むように誘導体化されてもよい（米国特許第6,187,823号）。カルボン酸誘導体化ナノチューブは、標準化学反応によって、例えば、プローブ410に位置する第1級または第2級のアミン基とアミド結合のカルボジイミド媒介形成によって、プローブ分子410に接着してもよい。誘導体化および架橋の方法は限定的ではなく、当技術分野において公知のいずれの反応基または架橋方法が使用されてもよい。
【００５３】
フラーレン
本発明の代替の態様において、フラーレンが、ナノバーコード420として使用されてもよい。フラーレンを作る方法は周知である（例えば、米国特許第6,358,375号）。フラーレンは、カーボンナノチューブ用に上記に開示されたものに類似した方法によって、誘導体化し、プローブ分子410に接着してもよい。フラーレン含有コード化プローブ130、230、340、400は、ナノチューブ用に上記に開示されたものに類似したSPM技術によって同定されてもよい。
【００５４】
本発明の一定の態様において、フラーレンは、オリゴヌクレオチドコード化プローブ130、230、340、400内の個別のヌクレオチドに接着してもよい。そのような場合には、2つの異なる種類の弁別可能なフラーレンが必要なだけであるが、それは、オリゴヌクレオチドには4種類のヌクレオチドしか見出されず、2種類のフラーレンが4つの異なる組み合わせ（例えば、AA、BB、ABおよびBA）に組み合わされてもよいからである。個別のヌクレオチドがナノバーコード420に接着する場合には、ターゲット核酸へのハイブリッド形成との立体障害を回避するために、ヌクレオチドとフラーレンとの間に公知の連結基を使用することが適切であるかもしれない。
【００５５】
開示された方法に使用されるナノバーコード420は、本明細書に開示された態様に限定されず、プローブ410に接着されて検出されることができる他のいかなる種類の公知のナノバーコード420を含んでもよいことを当業者は完全に理解する。使用される可能性のあるナノバーコード420の他の非限定的な例として、量子ドットが挙げられる（例えば、Schoenfeldら、Proc. 7th Int. Conf. on Modulated Semiconductor Structures, Madrid, pp. 605-608, 1995; Zhaoら、1st Int. Conf. on Low Dimensional Structures and Devices, Singapore, pp. 467-471, 1995）。量子ドットおよび他の種類のナノバーコード420は、公知の方法によって合成されてもよいし、市販品販売元（例えば、Quantum Dot Corp., Hayward, CA）から得られてもよい。使用される可能性のある他のナノバーコード420として、例えば、Nanoprobes Inc.（Yaphank、NY）およびPolysciences, Inc.（Warrington、PA）が販売しているナノ粒子が挙げられる。
【００５６】
ハイブリッド形成およびオリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブのライゲーション
本発明の様々な態様において、ターゲット核酸のオリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブ130、230、340、400ライブラリへのハイブリッド形成は、完全に相補的な核酸配列の間にしかハイブリッド形成を可能にしない厳しい状況下で発生してもよい。厳重さの低いハイブリッド形成は一般に、20℃から50℃までの温度範囲で0.15Mから0.9MのNaClで実施される。厳重さの高いハイブリッド形成は一般に、50℃から70℃までの温度範囲で0.02Mから0.15MのNaClで実施される。適切な厳重さの温度および／またはイオン強度は、部分的には、オリゴヌクレオチドプローブ410の長さ、ターゲット配列の塩基含有量、およびホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたはハイブリッド形成混合物内の他の溶媒の存在、によって決定されることが理解される。上述の範囲は模範的なものであり、特定のハイブリッド形成反応のための適切な厳重さは、正および／または負の対照と比較することによって、経験的に決定されることが多い。当業者は、日常的にハイブリッド形成状態を調整することができ、正確に相補的な核酸配列の間にしか厳重なハイブリッド形成が発生しないことを可能にする。
【００５７】
ひとたび短いコード化プローブ130、230、340、400が核酸にハイブリッド形成されると、隣接するコード化プローブ130、230、340、400は、公知の方法を使用して、一緒にライゲートされてもよい（例えば、米国特許第6,013,456号を参照されたい）。6塩基から8塩基ほどの短いオリゴヌクレオチド配列が、ターゲット核酸に効率的にハイブリッド形成されてもよい（米国特許第6,013,456号）。プライマ独立ライゲーションは、長さが少なくとも6塩基から8塩基のオリゴヌクレオチドを使用して、達成されてもよい（KaczorowskiおよびSzybalski、Gene 179: 189-193、1996；Kotlerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4241-45, 1993）。核酸テンプレートにハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドコード化プローブ130、230、340、400をライゲートする方法は、当技術分野においては公知である（米国特許第6,013,456号）。隣接するオリゴヌクレオチドコード化プローブ130、230、340、400の酵素ライゲーションは、DNAリガーゼ、例えば、T4、T7またはTaqリガーゼまたは大腸菌DNAリガーゼを使用してもよい。酵素ライゲーションの方法は公知である（例えば、Sambrookら、1989）。
【００５８】
分子の固定化
本発明の様々な態様において、分析されるべきターゲット分子は、コード化プローブ130、230、340、400結合の前、後および／またはその最中に、固定化されてもよい。例えば、ターゲット分子の固定化を使用して、結合されたコード化プローブ130、230、340、400を、結合されていないコード化プローブ130、230、340、400から、分離するのを容易にしてもよい。一定の態様において、ターゲット分子の固定化を使用して、コード化プローブ130、230、340、400の検出および／または同定の前に、結合されたコード化プローブ130、230、340、400を、ターゲット分子から分離してもよい。下記の検討は核酸の固定化に関するが、様々な種類の生体分子を固定化する方法が当技術分野においては公知であり、特許請求された方法に使用されてもよいことを当業者は完全に理解する。
【００５９】
核酸の固定化を使用して、例えば、ターゲット核酸をライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400から、およびハイブリッド形成されていないコード化プローブ130、230、340、400から、または互いにハイブリッド形成されたコード化プローブ130、230、340、400から、分離するのを容易にしてもよい。非限定的な実施例において、ターゲット核酸は固定化されて、コード化プローブ130、230、340、400へハイブリッド形成するのを可能にしてもよく、その後、ハイブリッド形成された隣接するコード化プローブ130、230、340、400が、一緒にライゲートされる。結合された核酸を含む基質は、徹底的に洗浄されて、ハイブリッド形成されていないコード化プローブ130、230、340、400、および他のコード化プローブ130、230、340、400へハイブリッド形成されたコード化プローブ130、230、340、400を除去する。洗浄に続いて、ハイブリッド形成されライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400は、約90から95℃で数分間加熱することによって、固定化されたターゲット核酸から除去されてもよい。ライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400は、表面100、220、300へ接着してもよく、上記に開示されたように、分子コーミングによって整列されてもよい。次いで、整列したコード化プローブ130、230、340、400は、SPMによって分析されてもよい。
【００６０】
核酸の固定化は、当技術分野において公知の様々な方法によって達成されてもよい。本発明の模範的な態様において、固定化は、基質にストレプトアビジンまたはアビジンをコートし、その後、ビオチン化核酸を接着することによって、達成されてもよい（Holmstromら、Anal. Biochem. 209: 278-283, 1993）。固定化は、ケイ素、ガラスまたは他の基質にポリエルリジン（リジン）（poly-L-Lys（lysine））でコートし、その後、二官能価架橋試薬を使用して、アミノ修飾またはスルフヒドリル修飾された核酸を結合させることによって発生してもよい（Runningら、BioTechniques 8: 276-277, 1990; Newtonら、Nucleic Acids Res. 21: 1155-62, 1993）。アミン残基は、架橋にアミノシランを使用することによって、基質に導入されてもよい。
【００６１】
固定化は、化学的に修飾された基質に5'-リン酸化核酸を直接共有結合させることによって実施してもよい（Rasmussenら、Anal. Biochem. 198: 138-142, 1991）。核酸と基質との間の共有結合は、水溶性カルボジイミドまたは他の架橋試薬を用いる縮合によって形成される。この方法は、5'-リン酸を経由する核酸の優勢な5'-接着を容易にする。模範的な修飾された基質は、酸浴内で処理され、SiOH基をガラスに露出するガラススライドまたはカバースリップを含む（米国特許第5,840,862号）。
【００６２】
DNAは、最初にガラス基質をシラン化し、次いでカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドで活性化することによって、通例、ガラスに結合する。代替的な手順は、分子の3'末端または5'末端のいずれかで組み込まれたアミノリンカーを経由して連結されたDNAを備えた、3-グリシドキシプロピルトリムエトキシシラン（GOP）、ビニルシラン、またはアミノプロピルトリムエトキシシラン（APTS）等の試薬を使用してもよい。DNAは、紫外線を使用して膜基質に直接結合されてもよい。核酸用の固定化技術の他の非限定的な例は、米国特許第5,610,287号、第5,776,674号および第6,225,068号に開示されている。例えば、Covalink, Costar, Estapor, BangsおよびDynal等の核酸結合用の市販の基質が入手可能である。開示された方法は、核酸の固定化に限定されず、例えば、オリゴヌクレオチドコード化プローブ130、230、340、400の一方または両方の端を基質に接着するために使用される可能性もあることを、当業者は完全に理解する。
【００６３】
核酸または他のターゲット分子を固定化するために使用されるべき基質の種類は、限定されない。本発明の様々な態様において、固定化基質は、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、平面的な基質、またはほぼいかなる材料を含む固体基質の他のいかなる構造であってもよい。使用されてもよい基質の非限定的な例として、ガラス、シリカ、シリケート、PDMS（ポリジメチルシロキサン）、銀または他の金属コート基質、ニトロセルロース、ナイロン、活性クォーツ、活性ガラス、ポリビニリデンジフロライド（PVDF）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、他のポリマー、例えば、ポリ塩化ビニルまたはポリメチルメタクリレート、および核酸分子と共有結合を形成することができるナイトレン、カルベンおよびケチルラジカル等の光反応種を含有するフォトポリマーが挙げられる（米国特許第5,405,766号および第5,986,076号を参照されたい）。
【００６４】
二官能価架橋試薬を本発明の様々な態様に使用してもよい。二官能価架橋試薬は、その官能基、例えば、アミノ、グアニジノ、インドール、またはカルボキシル特異性基、の特異性にしたがって分類することができる。これらの中で、遊離アミノ基に関する試薬は、その市販品としての入手可能性、合成の容易さ、およびそれを加えることができる穏和な反応状況のため、人気がある。架橋分子の模範的な方法は、米国特許第5,603,872号および第5,401,511号に開示されている。架橋試薬として、グルタルアルデヒド（GAD）、二官能価オキシラン（OXR）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（EGDE）およびカルボジイミド例えば1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）が挙げられる。
【００６５】
走査型プローブ顕微鏡検査
走査型プローブ顕微鏡（SPM）は、マイクロメートルおよび／またはナノメートルの尺度で、物体の物理的特性を測定するために使用される器具の種類である。SPM技術の異なる様相が利用可能であり、下記においてより詳細に検討する。SPM分析のいずれかの様相は、コード化プローブ130、230、340、400検出および／または同定のために使用してもよい。一般に、SPM器具は、物体の特性を測定するために、表面100、220、300の非常に近くに、非常に小さな先の尖ったプローブを使用する。いくつかの種類のSPM器具において、プローブは、長さ数百ミクロンおよび厚さ約0.5〜5.0ミクロンであってもよいカンチレバーに装着されてもよい。典型的に、プローブ先端は、表面100、220、300特性の局所変動をマッピングするために、xyパターンで表面100、220、300上をラスター走査される。生体分子をイメージングしたり、ナノバーコード420として使用される分子を検出したりするために使用されるSPM方法は、当技術分野においては公知である（例えば、Wangら、Amer. Chem. Soc. Lett., 12: 1697-98. 1996; Kimら、Appl. Surface Sci. 130, 230, 340-132: 602-609, 1998; Kobayashiら、Appl. Surface Sci. 157: 228-32, 2000; Hiraharaら、Phys. Rev. Lett. 85: 5384-87, 2000; Kleinら、Applied Phys. Lett. 78: 2396-98, 2001; Huangら、Science 291: 630-33, 2001; Andoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12468-72, 2001）。
【００６６】
走査型トンネル顕微鏡検査（STM）
走査型トンネル顕微鏡検査は、1980年代初期に開発された最初のSPM技術であった。STMは、プローブ先端と表面100、220、300との間に量子力学的電子トンネルが存在することに依存する。先端は単一原子点へと鋭利化され、表面100、220、300上でラスター走査され、表面100、220、300に実際に接触せずに数オングストロームのプローブ−表面100、220、300ギャップ距離を維持する。小さな電圧差（ミリボルトから数ボルトのオーダで）が、プローブ先端と試料との間に加えられ、先端と試料との間のトンネル電流が測定される。先端が表面100、220、300を走査するため、試料の電気特性および位相的性質の差が、トンネル電流の量に変動を生じさせる。本発明の一定の態様において、先端の相対高さは、コンピュータとのインタフェースを有し、フィードバック制御を備えた圧電要素によって制御されてもよい。コンピュータは、電流強度をリアルタイムでモニタすることができ、先端を上または下に動かし、比較的一定の電流を維持する。異なる態様において、先端の高さおよび／または電流強度は、走査された表面100、220、300の画像を展開するためにコンピュータによって処理されてもよい。
【００６７】
STMは、試料の電気特性および試料位相を測定するため、異なる種類の導電性材料、例えば、金属バーコードの異なる種類の金属を弁別することができる。STMは、局所電子密度も測定することができる。トンネルコンダクタンスは状態の局所密度（DOS）に比例するため、ナノチューブの直径および長さに依存して電子特性が変動するカーボンナノチューブを弁別するために、STMを使用することもできる。STMを使用して、電気特性が異なるいずれかのナノバーコード420を検出および／または同定してもよい。
【００６８】
STMプローブ先端は、表面100、220、300上の各コード化プローブ130、230、340、400を検出し同定するために、整列されたコード化プローブ130、230、340、400を含む表面100、220、300上で走査されてもよい。ライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400を同定することもできる。ターゲット分子は、どのコード化プローブ130、230、340、400がターゲット分子に結合するかを決定することによって、同定されてもよい。コード化プローブ130、230、340、400が特異的な配列（例えばオリゴヌクレオチド配列）の存在を示す本発明の態様において、生体分子の配列は、ターゲット分子に結合するコード化プローブ130、230、340、400の配列から決定されてもよい。
【００６９】
原子間力顕微鏡検査
SPMの別の様相は、原子間力顕微鏡検査（AFM）である。AFMによる生体分子分析の方法は、一般に当技術分野において公知である（例えば、Uchihashiら、「非接触モード原子間力顕微鏡検査の分子イメージングへの適用（Application of Noncontact-Mode Atomic Force Microscopy to Molecular Imaging）」、http://www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi）。AFM顕微鏡検査において、プローブは、分析されるべき表面100、220、300に接触するバネ荷重のまたは可撓性のあるカンチレバーに接着する。接触は、分子力範囲内で起こる（すなわち、ファンデルワールス力の相互作用の範囲内）。AFM内で、異なるモードの作用が可能であり、接触モード、非接触モードおよびタッピングモード（TappingMode）（商標）を含む。
【００７０】
接触モードにおいて、プローブ先端と試料表面100、220、300との間の原子間力が、先端−試料距離を一定に保ちカンチレバーの撓みを測定することによって、典型的に、位置感受性デテクタでレーザをカンチレバーに反射することによって、測定される。カンチレバー撓みは、結果として、反射したレーザビームの位置の変化になる。STMの場合、プローブ先端の高さは、フィードバック制御を備えた圧電要素を使用してコンピュータ制御されてもよい。本発明のいくつかの態様において、比較的一定の撓みの程度は、プローブ先端を上げるかまたは下げるかによって、維持される。プローブ先端は試料に実際にファンデルワールス（Van der Waal）接触してもよいため、接触モードAFMは、非剛性試料を変形する傾向がある。非接触モードにおいて、先端は、試料表面100、220、300上で約50から150オングストロームの間に維持され、先端は振動する。先端と試料表面100、220、300との間のファンデルワールス相互作用は、先端振動の相、振幅または周波数の変化に反映する。非接触モードで達成される解像度は比較的低い。
【００７１】
タッピングモード（TappingMode）（商標）において、カンチレバーは、圧電要素を使用して、その共鳴周波数でまたはその近辺で振動する。AFM先端は、空気中で1秒当たり約50,000から500,000サイクルの周波数で、ならびに液体中ではより低い周波数で、試料表面100、220、300に周期的に接触（タップ）する。先端が試料表面100、220、300に接触し始めるときに、振動の振幅は減少する。振幅の変化を使用して、試料の位相的性質を決定する。AFM分析は電気伝導度に依存しないため、これを使用して非導電性材料の位相的性質を分析してもよい。カーボンナノチューブ、フラーレンおよびナノ粒子を含むがそれらに限定されない位相的性質が異なる一定の種類のナノバーコード420が、AFM技術によって検出および／または同定されてもよい。
【００７２】
AFMの代替モードにおいて、試料の位相的プロファイル以外の追加情報が得られてもよい。例えば、水平力顕微鏡検査（LFM）において、プローブはその長さ方向に垂直に走査され、カンチレバーの捩れの程度が決定される。カンチレバーの捩れは、表面100、220、300の摩擦特性に依存する。コード化プローブ130、230、340、400の摩擦特性はその組成に依存して変動するため、LFMは、異なるコード化プローブ130、230、340、400を検出し同定するのに有用であってもよい。
【００７３】
別の変形例は、化学力顕微鏡検査（CFM）であり、プローブ先端を化学種で官能化し、試料上で走査して、化学種と試料との間の接着力を検出する（例えば、Frisbieら、Science 265:2071- 2074、1994）。ナノバーコード420材料用に異なる親和力を備えた化学物質、例えば金または銀は、AFMプローブ先端に組み込まれてもよく、表面100、220、300上を走査して、ナノバーコード420を検出し同定してもよい。使用される可能性のある別のSPMモードは、フォースモジュレーションイメージングである（Maivaldら、Nanotechnology 2: 103, 1991）。Uchihashiら（http://www. foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi）は、非接触モードAFMで周波数変調を使用する生体分子イメージングの方法を開示している。
【００７４】
コード化プローブ130、230、340、400を検出および／または同定するために使用されてもよい可能性がある他のSPMモードとして、磁気力顕微鏡検査（MFM）、高周波MFM、磁気抵抗感受性マッピング（MSM）、電気力顕微鏡検査（EFM）、走査型容量顕微鏡検査（SCM）、走査型広がり抵抗顕微鏡検査（SSRM）、トンネルAFMおよび導電性AFMが挙げられる。一定のこれらの様相において、試料の磁気特性が決定されてもよい。磁気特性および電気特性によって同定することができる金属バーコードおよび他の種類のナノバーコード420が設計されてもよいことを、当業者は完全に理解する。
【００７５】
コード化プローブ130、230、340、400検出および同定に使用されるSPM器具は、市販されている（例えば、Veeco Instruments, Inc., Plainview, NY; Digital Instruments, Oakland, CA）。または注文設計されたSPM器具が使用されてもよい。
【００７６】
情報処理および制御システムおよびデータ分析
本発明の一定の態様において、生体分子分析用のシステムは、情報処理および制御システムを具備してもよい。態様は、使用される情報処理システムの種類に限定されない。そのようなシステムを使用して、SPM器具から得られた情報を分析したり、SPMプローブ先端の運動、使用されるSPMイメージングの様相、およびSPMデータが得られる正確な技術を制御したりしてもよい。模範的な情報処理システムは、情報を通信するためのバスおよび情報を処理するためのプロセッサを具備するコンピュータを組み込んでもよい。1つの態様において、プロセッサは、プロセッサのPentium（登録商標）シリーズより選択され、Intel Corp.（Santa Clara、CA）が販売するプロセッサのPentiumII（登録商標）シリーズ、PentiumIII（登録商標）シリーズ、Pentium4（登録商標）シリーズを含むが、それらに限定されない。本発明の代替の態様において、プロセッサは、Celeron（登録商標）、Itanium（登録商標）、X-Scale（登録商標）またはPentium Xeon（登録商標）プロセッサ（Intel Corp., Santa Clara, CA）であってもよい。本発明の様々な他の態様において、プロセッサは、Intel（登録商標）アーキテクチャ、例えば、Intel IA-32（登録商標）またはIntel IA-64（登録商標）アーキテクチャに基づいてもよい。または他のプロセッサが使用されてもよい。
【００７７】
コンピュータは、ランダムアクセスメモリ（RAM）または他の動的記憶装置、リードオンリーメモリ（ROM））または他の静的記憶装置、およびデータ記憶装置例えば磁気ディスクまたは光ディスクならびにその対応ドライブをさらに具備してもよい。情報処理システムは、当技術分野において公知の他の周辺装置、例えば、ディスプレイ装置（例えば、ブラウン管または液晶ディスプレイ）、英数字入力装置（例えば、キーボード）、カーソル制御装置（例えば、マウス、トラックボールまたはカーソル方向キー）および通信装置（例えば、モデム、ネットワーク界面カード、またはイーサネット、トークンリングまたは他の種類のネットワークに連結するために使用される界面装置）も具備してもよい。
【００７８】
本発明の特定の態様において、SPM（走査型プローブ鏡検）ユニットは、情報処理システムに接続されてもよい。SPMからのデータはプロセッサによって処理されてもよく、データはメインメモリに記憶されてもよい。プロセッサは、SPMからのデータを分析して、表面100、220、300に接着したコード化プローブ130、230、340、400の配列を判定および／または検出してもよい。ライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400の配列を重なり合わせることによって、コンピュータは、ターゲット核酸の配列をコンパイルしてもよい。またはコンピュータは、表面100、220、300に接着したコード化プローブ130、230、340、400の同定に基づいて、試料中に存在する異なる公知の生体分子種を同定してもよい。
【００７９】
異なって装備された情報処理システムを一定の実施に使用してもよいことが評価される。したがって、システムの構成は、本発明の異なる態様では変動してもよい。本明細書に記載された処理は、プログラムされたプロセッサの制御下で実施されてもよいが、本発明の代替の態様では、処理は、いずれかのプログラム可能なロジックまたはハードコード化されたロジック、例えば、Field Programmable Gate Arrays（FPGA：ユーザ書き込み可能型ゲートアレイ）、TTLロジック、またはApplication Specific Integrated Circuits（ASIC：特定用途向け集積回路）によって、完全にまたは部分的に実施されてもよい。さらに、開示された方法は、プログラムされた汎用コンピュータのコンポーネントおよび／または注文設計のハードウェアコンポーネントのいずれの組み合わせによって実施されてもよい。
【００８０】
本発明の一定の態様において、注文設計されたソフトウェアパッケージを使用して、SPMから得られたデータを分析してもよい。本発明の代替の態様において、情報処理システムおよび入手可能な市販の汎用ソフトウェアパッケージを使用して、データ分析が行われてもよい。DNA配列分析用に入手可能なソフトウェアの非限定的な例として、PRISM（商標） DNA Sequencing Analysis Software (Applied Biosystems、Foster City, CA), Sequencher（商標）パッケージ（Gene Codes, Ann Arbor, MI）、およびNational Biotechnology Information Facility、ウェブサイトwww.nbif.org/links/1.4.1.phpを通して入手可能な様々なソフトウェアパッケージが挙げられる。
【００８１】
実施例
実施例1：ナノバーコードおよび走査型プローブ顕微鏡検査
本発明の模範的な態様が図1〜図4に例示されている。図1Aおよび図1Bは、表面100、220、300にコード化プローブ130、230、340、400を整列するための非限定的な方法を例示する。表面100、220、300、例えば、公知の方法によってストレプトアビジンでコートされているガラス顕微鏡スライド表面100、220、300が、ビオチン化されたコード化プローブ130、230、340、400を含有する溶液110、210に浸漬される。溶液は、容器120に含まれてもよい。
【００８２】
非限定的な例において、コード化プローブ130、230、340、400は、ターゲット核酸分子にハイブリッド形成されているオリゴヌクレオチドプローブ410を含む。核酸分子は、ナイロン膜、96ウェルマイクロタイタープレートまたは他の固定化基質に接着することによって、固定化されてもよい。例えば全4096の可能な6-mer配列を含むビオチン化されたオリゴヌクレオチドは、市販品販売元（例えば、Midland Certified Reagents, Midland, TX）から得られてもよい。ビオチン化されたオリゴヌクレオチドは、例えば、マイクロメートル以下の金属バーコード（Nicewarner-Penaら、2001）に接着して、コード化プローブ130、230、340、400を形成してもよい。コード化プローブ130、230、340、400は、ターゲット核酸にハイブリッド形成することが可能である。ハイブリッド形成後、隣接するコード化プローブ130、230、340、400は、リガーゼを使用して一緒にライゲートされる。ハイブリッド形成されていないコード化プローブ130、230、340、400、および互いにハイブリッド形成されたコード化プローブ130、230、340、400は、徹底的な洗浄によって除去され、核酸にハイブリッド形成されたコード化プローブ130、230、340、400のみを残す。コード化プローブ130、230、340、400は、溶液110、210を95℃で5分間加熱することによって、除去される。固定化基質に接着した核酸が除去され、ライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400のみを溶液110、210に残す。
【００８３】
ビオチン化されたコード化プローブ130、230、340、400は、一方の端で、ストレプトアビジンがコートされた表面100、220、300に接着する。表面100、220、300は、溶液110、210からゆっくり除去される。または溶液110、210からの液体は、例えば、蒸発または緩徐なポンプ作用によって、容器120からゆっくり除去される。空気−水界面のメニスカスが表面100、220、300上をゆっくり動くため、接着したコード化プローブ130、230、340、400は、表面100、220、300に整列される。整列したコード化プローブ130、230、340、400は、AFM、STMまたは他の走査プローブ方法によって分析されてもよい。
【００８４】
本発明の別の模範的な態様が図2に例示されている。コード化プローブ130、230、340、400を含む溶液210の滴が、ガラススライド等の表面100、220、300に置かれる。一定の態様において、スライド100、220、300を、上記に開示されたように処理して、コード化プローブ130、230、340、400の一方または両方の端に結合させてもよい。滴210は、表面100、220、300とガラスカバースリップ200との間に挟まれる。様々な態様において、カバースリップ200は一定の位置に保持されてもよく、一方、表面100、220、300は、カバースリップ200からゆっくり引き離される。これによって、カバースリップ200の縁に、コード化プローブ130、230、340、400を整列するように作用するメニスカスが形成される。
【００８５】
本発明の種々の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、一方の端ではなく両方の端で、表面100、220、300に接着してもよい。この場合、コード化プローブ130、230、340、400の整列は、結果として、線形に並んだ分子ではなく、U字形の分子になる（例えば、米国特許第5,840,862号）。図1および図2に例示した模範的な態様は、コード化プローブ130、230、340、400の両端を表面100、220、300（図示せず）に接着することによって実施することもできる。
【００８６】
図3に例示されたもう一つの模範的な態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、フリーフロー電気泳動によって表面100、220、300に整列されてもよい。表面は、導電性材料および非導電性材料の交互のバンド、例えば、ガラスシート320にコートされた金フィルム310を含んでもよい。交流電場330の存在で、荷電残基、例えばリン酸基をオリゴヌクレオチドに含むコード化プローブ130、230、340、400が、電場330とで整列する。コード化プローブ130、230、340、400を表面100、220、300に整列するために、分子コーミングに加えてまたはその代わりに、フリーフロー電気泳動が使用されてもよい。フリーフロー電気泳動を実施する方法は公知である（例えば、AdjariおよびProst, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 4468-71, 1991）。しかし、本願は、分子を表面に整列するためのフリーフロー電気泳動の最初の使用を呈する。
【００８７】
本明細書に開示され、特許請求される方法、組成物および装置のすべては、本開示を踏まえて、過度に実験を労することなく、構成し、使用することができる。特許請求された主題の概念、本質および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載された方法、組成物および装置に変形を加えてもよいことは、当業者には明らかである。より具体的には、関係のある一定の物質が本明細書に記載された物質に置き換えられても、同一のまたは類似の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変はすべて、特許請求された主題の本質、範囲および概念内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明で開示された態様の一定の様相をさらに明示するために含まれる。本発明の態様は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、1つ以上のこれらの図面を参照することによって、より良好に理解される。
【図１】コード化プローブ130、230、340、400を整列するための模範的な方法を例示し、各々は、表面100、220、300に、プローブ分子410に接着した1つ以上のナノバーコード420を含む。（A）コード化プローブ130、230、340、400を含む溶液110内への表面100、220、300の浸漬。（B）整列したコード化プローブ130、230、340、400を含む表面100、220、300の溶液110からの除去。
【図２】コード化プローブ130、230、340、400を表面100、220、300に整列するための代替の模範的な方法を例示する。（A）コード化プローブ130、230、340、400を含む溶液210の滴が、カバースリップ200とガラススライド220との間に挟まれる。カバースリップ200が適所に保持される間に、スライド220が動かされ、結果としてコード化プローブ130、230、340、400が整列される。
【図３】コード化プローブ130、230、340、400を表面100、220、300に整列するための別の代替の模範的な方法を例示する。
【図４】プローブ分子410に接着したナノバーコード420を含む模範的なコード化プローブ400を例示する。個別のナノバーコード420は、下記により詳細に検討されるように、1つ以上の部分から構成されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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