(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定乾燥ヒト血液血小板であって、
ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又はグルタルアルデヒドを固定剤として１．８ｗｔ％までの濃度で含む溶液中で、室温で６０分までの時間、ヒト血液血小板を固定し、次いでアルブミン又はトレハロースが安定剤として存在するもとで、乾燥して得られる固定乾燥ヒト血液血小板であり、
再構成により、
血栓表面に付着し、
非血栓表面に付着せず、
血栓表面への付着によって形状変化を受け、
互いに付着して血栓表面への付着によって止血プラグを形成し、そして
それらの粒状内容物を放出する、
固定乾燥ヒト血液血小板。
【請求項２】
上記血小板が凍結乾燥される、請求項１の固定乾燥ヒト血液血小板。
【請求項３】
上記固定剤がパラホルムアルデヒドである請求項１の固定乾燥ヒト血液血小板。
【請求項４】
固定乾燥血液血小板を含む医薬製剤であって、
上記固定乾燥血液血小板が、固定乾燥ヒト血液血小板であって、
ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又はグルタルアルデヒドを固定剤として１．８ｗｔ％までの濃度で含む溶液中で、室温で６０分までの時間、ヒト血液血小板を固定し、次いでアルブミン又はトレハロースが安定剤として存在するもとで、乾燥して得られる固定乾燥ヒト血液血小板であり、
再構成により、
血栓表面に付着し、
非血栓表面に付着せず、
血栓表面への付着によって形状変化を受け、互いに付着して血栓表面への付着によって止血プラグを形成し、そして
それらの粒状内容物を放出する、
固定乾燥ヒト血液血小板よりなる医薬製剤。
【請求項５】
上記固定乾燥ヒト血液血小板が凍結乾燥されている、請求項４の医薬製剤。
【請求項６】
水性の生理的に許容しうるキャリアー中で再構成された、請求項４の医薬製剤。
【請求項７】
固定乾燥ヒト血液血小板の製造法であって、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又はグルタルアルデヒドを固定剤として１．８ｗｔ％までの濃度で含む溶液中で、室温で６０分までの時間、上記固定剤にヒト血液血小板を接触させることによって、ヒト血液血小板を固定し、次いでアルブミン又はトレハロースが安定剤として存在するもとで、乾燥して固定乾燥ヒト血液血小板を生成させることを含み、
上記接触する段階は、上記固定乾燥ヒト血液血小板が、再構成により、
（ｉ）血栓表面に付着し、
（ｉｉ）非血栓表面に付着せず、
（ｉｉｉ）血栓表面への付着によって形状変化を受け、
（ｉｖ）互いに付着して血栓表面への付着によって止血プラグを形成し、
（ｖ）それらの粒状内容物を放出する、能力を失わせるには不十分な時間、実施すること、を含む固定乾燥ヒト血液血小板の製造法。
【請求項８】
上記接触する段階を、上記固定乾燥ヒト血液血小板を、上記固定剤を含む溶液と混合することにより実施する、請求項７の製造法。
【請求項９】
患者の血液凝固を促進するための薬剤の調製方法であって、
ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又はグルタルアルデヒドを固定剤として１．８ｗｔ％までの濃度で含む溶液中で、室温で６０分までの時間、上記固定剤にヒト血液血小板を接触させることによって、ヒト血液血小板を固定し、次いでアルブミン又はトレハロースが安定剤としての存在するもとで、乾燥して得られる固定乾燥ヒト血小板であって、
水性の製薬上許容しうるキャリアー中での再構成により、
（ｉ）血栓表面に付着し
（ｉｉ）非血栓表面に付着せず、
（ｉｉｉ）血栓表面への付着によって形状変化を受け、
（ｉｖ）相互に付着して、血栓表面への付着によって止血プラグを形成し、そして
（ｖ）それらの粒状内容物を放出する、
固定乾燥ヒト血小板を有効成分として含有せしめる薬剤の調製方法。
【請求項１０】
上記患者が血小板減少症にかかっている、請求項９の薬剤の調製方法。
【請求項１１】
上記再構成血液血小板製剤を静脈内に投与する、請求項９の薬剤の調製方法。
【請求項１２】
患者の創傷治癒を促進するための薬剤の調製方法であって、
ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又はグルタルアルデヒドを固定剤として１．８ｗｔ％までの濃度で含む溶液中で、室温で６０分までの時間、上記固定剤にヒト血液血小板を接触させることによって、ヒト血液血小板を固定し、次いでアルブミン又はトレハロースが安定剤としての存在するもとで、乾燥して得られる固定乾燥ヒト血小板であって、
水性の製薬上許容しうるキャリアー中での再構成により、
（ｉ）血栓表面に付着し
（ｉｉ）非血栓表面には付着せず、
（ｉｉｉ）血栓表面への付着によって形状変化を受け、
（ｉｖ）相互に付着して、血栓表面への付着によって止血血栓を形成し、そして
（ｖ）それらの粒状内容物を放出する、
固定乾燥ヒト血小板を有効成分として含有せしめる薬剤の調製方法。
【請求項１３】
上記固定乾燥ヒト血液血小板が、促進後、上記血小板誘導成長因子をその表面に発現する、請求項１２の薬剤の調製方法。
【請求項１４】
上記固定乾燥ヒト血液血小板が、再構成により、
血栓表面に付着し、
非血栓表面に付着せず、
血栓表面への付着によって形状変化を受け、
互いに付着して血栓表面への付着によって止血プラグを形成し、
それらの粒状内容物を放出する、
固定乾燥ヒト血液血小板よりなる、請求項１２の薬剤の調製方法。
【請求項１５】
固体の生理的に許容しうる基質、及び該基質材料により担持され固定化された固定乾燥血液血小板を組み合わせて含む外科補助具であり、
上記固定乾燥血液血小板が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、又はグルタルアルデヒドを固定剤として１．８ｗｔ％までの濃度で含む溶液中で、室温で６０分以内の間、血液血小板を固定し、次いでアルブミン又はトレハロースが安定剤として存在するもとで、乾燥して得られる固定乾燥血液血小板であり、
上記血小板は再構成により、
血栓表面に付着し、
非血栓表面に付着せず、
血栓表面への付着によって形状変化を受け、
互いに付着して血栓表面への付着によって止血プラグを形成し、そして
それらの粒状内容物を放出し、又
上記固定乾燥血液血小板はその表面に血小板誘導成長因子を発現することを含む、外科補助具。
【請求項１６】
上記基質が、創傷包帯剤、縫合糸、織物及び補綴用具からなる群から選ばれる、請求項１５の外科補助具。
【請求項１７】
無菌容器にパッケージされる、請求項１５の外科補助具。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９２年５月２９日に出願された、係属出願、出願番号０７／８９１，２２７の一部継続であり、その開示を全ての引用して明細書記載の一部とする。
発明の分野
本発明は、ヒト患者への投与に適した固定乾燥血液血小板及び固定乾燥血小板の局所適用による傷ついた組織の処置方法に関する。
発明の背景
輸注医療での血小板濃縮物の使用は、過去３０年間に十分に確立して来た。しかしながら、貯蔵期間中の血小板機能の急速な損失と細菌汚染の危険により、血液銀行での血小板濃縮物の有効な商品目録の取り扱いが非常に困難である。多くの場面で、血小板濃縮物の限られた貯蔵安定性はそれらの使用を劇的に減じて来た。
Ｅ．クレイン等、ジャーナル・オブ・ペディアトリクス ４９，５１７−５２２（1956）は、凍結乾燥血小板材料の調製及び急性白血病及び再生不良性貧血の小児への投与を記載している。注入の部位での痛みと静脈痙攣（venospasm）を示した。これらの材料の限られた有効性は本明細書の表２に示す。３０年以上も後でも、これらの材料は有効な治療処置に至っていない。
血液銀行用にもっと処理しやすい血小板注入治療をなすために、貯蔵期間中の血小板機能の損失を少なくするか又は遅らせるための工夫手段にかなりの関心が払われて来た。一つの試みは、血漿フリー貯蔵媒体の開発の関係である。例えば、Ｓ．ホーム、米国特許第４，６９５，４６０号参照。他の試みは、血小板を安定化するため生化学的技術を用いることである。例えばＡ．ボウド等、米国特許第４，９９４，３６７号参照。これらの技術は、貯蔵安定性の有効な延長を与えるけれども、これらは長期間、延長された貯蔵安定性を与えない。最終的に数ある中で、時代遅れの血小板からの血小板膜微小疱の調製がＦ．チアオ、米国特許第５，１８５，１６０号に記載されている。
診断検定に用いられる固定乾燥血液血小板がブリンクハウス等に対する米国特許第４，２８７，０８７号に記載されている。このような固定乾燥血小板調製品は、診断目的のため長期間、貯蔵できるが、これらはこれまでヒト製薬用途用の形で提供されなかった。従って、ヒト患者への投与に適した延長された貯蔵安定性を有する血液血小板調製品を調製する新規手段がずっと必要とされている。
発明の要約
本発明の第一の局面は、再構成によって、（ａ）トロンボゲン表面に付着し、（ｂ）非トロンボゲン表面に付着せず、（ｃ）トロンボゲン表面への付着によって形状変化（延展）を受け、（ｄ）互いに付着してトロンボゲン表面への付着に関する止血プラグを形成し、そして（ｅ）例えば刺激及び／又は延展後（例えば代謝的に活性な、生きた又は新鮮な血小板を普通に生じさせ、例えば傷ついた組織に触媒する、その粒状内容物を放出する生理的刺激を受けた後）、それらの粒状内容物を放出する、固定乾燥ヒト血液血小板である。
本発明の第二の局面は、固定乾燥血液血小板製剤より構成される医薬製剤である。固定乾燥血液血小板製剤は、上記した特性を有する固定乾燥ヒト血液血小板を含む。
本発明の第三の局面は、上記した特性を有する固定乾燥血液血小板を生成する血液血小板を固定する方法及びそのように生成された血小板である。その方法は、血小板を、固定剤、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又は過マンガン酸塩に（例えば血小板を固定剤の溶液と混合することにより）血小板を固定又は安定化するのに十分であるが、上で挙げた特性の損失を生じさせるには不十分な時間、接触させることを含む。血小板は、次いで乾燥して上述した特性を有する固定乾燥血液血小板を得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、従来技術の固定乾燥血小板及び未活性コントロール血小板と比較した本発明の小血板によるトロンビン産生を示す。
発明の詳細な説明
本発明の固定乾燥血液血小板は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドからなる群から選ばれる化合物により固定しうる。このような試薬による固定は、血小板の生存度の損失を避けるために、米国特許第４，２８７，０８７号に記述される方法の注意深い修飾を必要とする。一般的に、洗浄血小板は、典型的には室温で１．８％までのパラホルムアルデヒド溶液中、６０分間までそれらをインキュベートすることにより固定する。以下、より詳しく検討するように、血小板を十分に固定するよう注意しなければならず、さもないと不都合な溶解がその乾燥の間に起きる。
別個技術は、過マンガン酸塩（例えば過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム）溶液中、血小板をインキュベートすることにより血小板を固定することである。一般に、洗浄血小板は、０．００１ないし１ｇ／dＬのＫＭnＯ4又はＮaＭnＯ4溶液中、５ないし２０分間それらをインキュベートすることによる、より好ましくは０．００５ないし０．５ｇ／dＬのＫＭnＯ4又はＮaＭnＯ4溶液中、５ないし１５分間それらをインキュベートすることによる、最も好ましくは、０．００５ないし０．０５ｇ／dＬのＫＭnＯ4又はＮaＭnＯ4溶液中８ないし１２分間それらをインキュベートすることによる本技術により調製しうる。
医薬製剤を調製するのに使用する血液血小板調製品は、外部成分、特に調製品が投与される患者に遊離のトロンボゲン試薬を与える溶解血液血小板が実質的にフリーであるべきである。従って、さもないと乾燥段階の間に不都合な溶解が生じるので、乾燥前に（上述の特性により示されるその生存度を壌すことなく）血小板を十分に固定するよう注意が必要である。例えば、ヒト医薬製剤の調製に用いるのに適した血小板調製品は、１ミリリットルの溶液中１０9血小板の再構成で、ミリリットル当り１０×１０6以下の微粒子（溶解血小板の断片残留）を示し、好ましくは再懸濁及びペレット化後、懸濁液中、乳酸デヒドロゲナーゼのリットル当り１５０国際単位（ＩＵ）以下（リットル当り２２００ＩＵは、１ミリリットル中１０9細胞の全溶解を示す）を示す。
固定後、血小板の乾燥は、全ての適当な手段により実施しうるが、好ましくは凍結乾燥により実施する。許容し得ないレベルの血小板溶解を起こすかも知れないので、乾燥前に血小板調製品を安定化するよう注意を払わなければならない。安定化は、適当な水置換分子（又は「安定剤」）、例えばアルブミン又はトリハロースを含む溶液に血小板を懸濁すること、次いで溶液を乾燥することにより実施しうる。一実施態様では、０．１ないし２０重量％のアルブミンが用いられ、より好ましくは１ないし１０重量％のアルブミンが用いられ、最も好ましくは５ないし１０重量％のアルブミンが用いられる。対象への投与に関しては、調製品中のアルブミンは対象と同じ種のもの（例えばヒトアルブミン）であるべきである。別法として、調製品は、異なる種のアルブミンと乾燥し得、アルブミンは再構成で血小板から分離され、そして同じ種のアルブミンが対象への投与用の再構成調製品に逆添加（add back）しうるが、全ての非種特異的アルブミンは処置されている対象の抗原でありうるので、これを除くよう注意すべきである。
本発明の医薬製剤は、滅菌無菌パッケージ中、パイロジェン−フリーで無菌の乾燥（好ましくは凍結乾燥）血小板を単に含みうる。アルブミンは上記したように含まれうる。医薬製剤は又、製薬的に許容しうる担体中に再構成された本発明の血小板調製品を含みうる。血小板を再水和し、それにより血小板が上で述べた特性を有し、静脈注射に適する全ての水性担体を用いうる（例えば滅菌、パイロジェンフリー、生理食塩水）。付加的試薬、例えば緩衝剤防腐剤及び他の治療的に活性な薬剤も再構成製剤に含みうる。例えば米国特許第４，９９４，３６７号参照（その開示を引用して明細書記載の一部とする）。
本発明の再構成医薬製剤は、典型的には静脈注射によりヒト患者に投与される。そのような処置が必要な患者は、（洗浄（washout）血小板減少症を含む）血小板減少症にかかった患者、出血性血小板機能障害にかかった患者及びひどい出血を経験している損傷被害者を含む。投与される医薬製剤の量は、患者の体重と状態によって変化するが典型的には容量で２０ないし３５０ミリリットル、濃度でミリリットル当り１×１０9ないし３×１０9血小板（より好ましくは、ミリリットル当り２×１０9ないし３×１０9血小板）にわたる。医薬製剤は、無菌のパイロジェンフリーの容器にパッケージされ、単位投与量としてこれらの容量と供与量を提供する。
本明細書では、そのような処置の必要な対象の傷害治癒を促進する方法を開示する。その方法は、固定乾燥血液血小板を傷害治癒を促進するのに十分な量、傷害者に適用することを含み、該血小板は、その表面に血小板誘導生長因子を発現する。対象は、ヒト患者又は獣医薬の動物対象（即ち、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ等）でありうる。小血板は、全ての適当な種（即ち、ヒト、ウシ、ブタ等）のものでありうるが、好ましくは処置を受ける対象と同じ起源の種のものである。血小板は、それらがＰＤＧＦを発現する限り、全ての適当な手段により調製しうるが、好ましくは、例えば本明細書に記載される方法であって、それにより刺激及び／又は延展後（例えば代謝的に活性で、生きた又は新鮮な血小板を普通に生じその粒状内容物を放出する生理的刺激を受けた、例えば傷害組織と接触した後）血小板誘導生長因子を放出する手段により調製しうる。すり傷、切り傷、裂傷、やけど等を含むいずれの型の傷もその方法により処置しうる。傷は皮膚組織に対する傷でありうるし、又は他の器管に対する傷、例えば手術の間に受けたような腸、脾、肝臓等の内部器管の組織に対する傷でありうる。血小板は、全ての適当な手段により、例えば血小板を傷に振りかけ又は噴霧することにより、傷に適用しうるし、或は以下に検討するように外科補助具の手段により適用しうる。血小板を傷に直接振りかける場合、傷は所望により次いで清浄な高分子接着材料を噴霧しうるし、或は次いで何らかの他の適当な包帯又は包帯剤で被覆しうる。血小板の投与量は１cm2の外科補助具表面領域又は傷表面領域当り少なくとも０．５−１×１０9血小板であるべきである。供与量の上限は特に重要ではないが、一般に１cm2外科補助具表面領域又は傷表面領域当り５−１０×１０9血小板であろう。
固定乾燥血小板は、外科補助具の手段、例えば傷包帯剤又は包帯、縫合、織物、補綴処置等により傷に適用しうる。全てのそのような補助具は、組合せで固定された生理的に許容しうる基質材料及び基質材料によりもたらされる（例えばコーチングとして適用し、又は注入して）固定乾燥血液血小板を含み、血小板は、その表面に血小板誘導生長因子を発現する。典型的には、そのような外科補助具は、無菌容器にパッケージされた無菌の形で提供される。外科補助具基質は、（即ち、基質上に乾燥血小板を振りかけるか或は固定血小板の水性調製品中で又はその上で保持される固定血小板の水性調製品と、基質を乾燥（例えば凍結乾燥）させ、それにより幾らかの血小板を基質に付着させることにより）パッケージングの前に血小板で被覆し、血小板でパッケージして、それにより幾らかの血小板をパッケージ内の基質に付着させ、適当な接着材料で基質に付着させ、或は対象への適用前に手術補助剤に単に振りかける。
外科補助具基質は、如何なる形をもとりうるし、又は生理的に許容しうる疎水性又は親水性の全ての固体材料でありうる。例えば縫合は、モノフィラメント又はより合せでよく、生分解性又は非生分解性でよく、又、例えばナイロン、絹、ポリエステル、綿、ガット、グリコリド及びラクチドのホモポリマー及びコポリマー等の材料から造りうる。例えば補綴用具は、動脈、静脈、管、アソファジ（asophagi）の修復に用途を有する織った又は押し出した管状構造；掛けることができるか又は調和しており、そしてヘルニア修復に及び損傷した肝臓、腎臓及び他の内部器管を支持するのに外科的に有用な織った又はニットの織物；ピン、スクリュー及び補強板；心臓弁（例えば固定ブタ心臓弁）、人口腱又は軟骨材料等を含む。上記縫合に関して述べたような高分子材料は、別法として無菌の傷包帯材としての用途にパッケージされた薄いフィルムとして与えうる。包帯は、全ての適当な基質材料、例えば織った又は不織の綿或いは傷への又はその上方への適用に適した他の織物から造りうるし、所望によりパッキング材料を含みうるし、さらに傷上方の包帯を守るために、その表面上の一又はそれ以上の接着部分を所望により含みうる。
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に説明の目的のためだけであり、発明を限定するものと取るべきでない。
実施例１
凍結乾燥ヒト血小板の調製（プロトコール１）
ヒト血小板は、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）抗凝固剤（０．０８５Ｍクエン酸三ナトリウム、０．０７０２Ｍクエン酸、０．１１１Ｍデキストロース、pＨ４．５）、一部抗凝固剤対５．６６部血液にした血液から調製する。血小板を分画遠心分離により分離し、酸性クエン酸塩食塩水（０．００５４４Ｍクエン酸三ナトリウム、０．１５４Ｍ ＮaＣl、０．１Ｎ ＨＣlでpＨ６．５に調整）で３回洗浄した。
洗浄後、血小板は５．０mlの１．８％パラホルアルデヒド溶液（９．０ml ４％パラホルムアルデヒド溶液プラス１．０ml ＡＣＤプラス１０．０ml ０．１３５Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4のように調製）中、１００mlの血液由来の洗浄血小板を４５分間室温でインキュベートすることにより固定する（固定時間は６０分まで延長しうる）。別法として、１．０％パラホルムアルデヒド溶液中、１００mlの血液由来の洗浄血小板を４５分間、室温でインキュベートする（固定時間は、６０分まで延長しうる）。
パラホルムアルデヒドを除くために、パラホルムアルデヒドインキュベーション後、等量のイミダゾール緩衝食塩水（０．０８４Ｍイミダゾール；０．１４６Ｍ ＮaＣl、１．０Ｎ ＨＣlでpＨ６．８に調整）を各管に加え、１５００倍ｇで８分間室温で遠心することにより血小板をペレット化する。上清をデカンテーションし、血小板を５−１０mlイミダゾール緩衝食塩水pＨ７．３５中に血小板ペレットを再び懸濁することにより洗浄する。洗浄を２回以上繰り返し、パラホルムアルデヒドを除去する。第三回洗浄後、血小板を血清アルブミンの５％溶液（クエン酸食塩溶液、０．００５４Ｍクエン酸ナトリウム、０．１５４Ｍ ＮaＣl、pＨ６．５の１００ml当り５gmアルブミン）に再び懸濁する。血小板を位相差顕微鏡とアメリカン・オプティカル・ブライト−ライン血球計数器を用い計数する。血小板濃度を立方ミリメータ（cmm）当り８００，０００に調整する。
血清アルブミン溶液中の濃度調整血小板のアリコート（１０ml）を２０mlガラスバイアルに入れ、−７０℃で凍結する。次いで血小板を１２時間又は粗い白色粉末が明らかになるまで凍結乾燥する。血小板生成物は、乾燥時間の間温度を−２５℃に上げたのち、１００ないし５００mlの大量で殻凍結（shell freeze）し、−４０℃で凍結乾燥することもできる。凍結乾燥生成物は使用まで−２０℃ないし−７０℃で貯蔵する。
凍結乾燥血小板は、１．０Ｍ ＮaＯＨで７．３５のpＨに調整した０．０８４Ｍイミダゾール緩衝液（塩無添加）により再び水和する。イミダゾール緩衝液の添加後、溶液は数分間掻き混ぜることなく保ち、次いでバイアルを横揺れ又は回転することなく静かに混合し、再水和単一血小板の等分懸濁液を生成する。
実施例２
凍結乾燥ヒト血小板の調製（プロトコール２）
全血液は、健康なボランティアドナーから抗凝固剤（ＣＰＤＡ−１）のその標準成分を含む商業血液収集パック（フェンワル ４Ｒ６４０２、バクスター・ヘルス・ケア）に集められる。収集された各単位の酸塩添加全血液の最終容量は５００ccである。各バッグの全血液を遠心して血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）を得、これをバッグから吸引し、（上記実施例１に記載されたのと同様）リン酸緩衝食塩溶液で３回遠心／再懸濁ステップにより洗浄する。次いで洗浄血小板を再び遠心し、血小板を（上記実施例１に記載されたのと同様）１．８％パラホルムアルデヒドを含む緩衝溶液で室温にて４５分から１時間、処理する。安定剤の除去及びパラホルムアルデヒドを除くための血小板洗浄後の血小板の収率は、安定化剤の血小板懸濁物中のカウントの６０−８０％である。安定化後アルブミンが洗浄緩衝液に含まれなくなると、血小板収量が減少する。
凍結乾燥前の最終血小板再懸濁液の組成は適切な収率を得るのに重要である。一般に、緩衝塩類液中、有効量の安定剤、例えばアルブミン又はトレハロースが凍結乾燥／再水和ステップによって８５−１００％の収率で血小板を得るのに必要である。アルブミンは０．１ないし５０ｇ／dＬの量、より好ましくは１ないし２５ｇ／dＬの量、最も好ましくは５−１０ｇ／dＬの量を含むべきである。トレハロースは０．１−１０．０Ｍ、より好ましくは０．２−５Ｍ、最も好ましくは０．５−１．０Ｍの量、含むべきである。幾つかの型の再水和溶液が、パラメーター結果：リン酸緩衝食塩水pＨ＝７．３、トリス緩衝食塩水pＨ＝７．４、イミダゾール緩衝食塩水又はユニソル（商標）生理均衝塩類溶液で目立って相違することなく用いられる。
本実施例に記載されるように調製した再水和血小板調製品についての典型的データは、以下の表１に与えられる。
0004445589.tif 000002
明細書に記載したように調製した血小板調製品の再水和後の微粒子カウントは、４．５×５．０−１０6／mＬであった。本実施例に記載したように調製した血小板の低張ショック試験反応は、０．０３０−０．０３６ ＯＤ／分（新鮮な血小板については０．１００−０．１５０）であった。放出乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、１ml溶液中１０9血小板の再懸濁後の上清中のＬＤＨの量は、５０ないし２００ＩＵ／Ｌ（＞１５０又は２５０は有意な細胞質漏出を示す）であった。
実施例３
過マンガン酸塩安定化による凍結乾燥ヒト血小板の調製
全血液は、健康なドナーから抗凝固剤（ＣＰＤＡ−１）の標準成分を含む商業血液収集パック（フェンワル ４Ｒ６４０２、バクスター・ヘルスケア）に得られる。各単位の収集されたクエン酸添加全血液の最終容量は５００ccである。各バックの全血液を遠心して血小板リッチ血漿（ＰＲＲ）を得、これをバックから吸引し、上記実施例１に示したようなリン酸緩衝塩類溶液で３回遠心／再懸濁ステップにより洗浄した。洗浄血小板を１／１０量の緩衝食塩水に再び懸濁し、０．０１ｇ／dＬの最終濃度でＫＭｎＯ4又はＮaＭｎＯ4を含むリン酸緩衝塩類溶液を含む過マンガン酸塩溶液に滴加した。血小板の懸濁液は、過マンガン酸塩溶液中、室温で１０分間インキュベートし、次いで緩衝液中０．１−５．０g／dＬアルブミンで上記のように２回洗浄して過マンガン酸塩を除去した。過マンガン酸塩処理及び続く洗浄の間、血小板の損失はわずかに１０−２０％であった。
凍結乾燥／再度水和後７０−１００％の収集を維持するため、凍結乾燥前の最終再懸濁溶液中、安定剤、例えばトリハロース又はアルブミンを好ましくは上で与えた範囲に含むことが必要である。再水和溶液組成物は、臨界的ではないが（パラホルムアルデヒド固定血小板に対してと同様）等張でpＨ７．３−７．４に緩衝剤処理されるべきである。再水和過マンガン酸塩固定血小板の分析による典型的データを以下の表２に示す。
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本実施例に記載される過マンガン酸塩方法で固定した血小板調製品の再水和後の微粒子計数は２．６−４．０×１０6／mＬであった。本方法により調製された血小板に対する低張ショック試験反応は、０−０．０３０ ＯＤ／分（新鮮な血小板については０．１００−０．１５０）であった。放出ＬＤＨは５０−２００ＩＵ／Ｌであった。
実施例４（比較例Ａ）
パラホルムアルデヒド安定化血小板を特徴づけるための活性化マーカーの使用
本実施例の目的は、本発明のパラホルムアルデヒドで固定された血小板はトロンボゲン表面に接触後、それらの粒子内容物を放出するが、既知技術の血小板はそうではないことを示すことである。実験した血小板調製品は１．０％パラホルムアルデヒドで６０分間（パラホルム．１）そして１．８％パラホルムアルデヒドで６０分間（パラホルム．２）安定化した；これらはブリンクハウス等、特許に記載されるように調製した、即ち、２％パラホルムアルデヒドで１２０分間固定した血小板（ブリンクハウス）と比較した。
表３に記載した試験で使用したマーカー、ＣＤ６２及びＧＰ５３は、ベクトン−ディキンソン・インコーポレイテッドから得られる商業的に入手可能な抗体であり、血小板粒子から放出された抗原の血小板表面での存在を示すのに用いられる。血小板表面での粒子放出抗原の存在は、血小板活性化の証拠として取られる。これらの抗原に対する抗体は、活性化マーカーという。血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）に対する抗体は血小板膜結合ＰＤＧＦを検出するのに用いられる。ＰＤＧＦ抗体は、ゲンザイム（ケンブリッジ，ＭＡ）から得た。バウムガートナー接着試験に用いた脈管は正常犬から得た。
実験は、環状灌流チェンバーでの使用に関し、新鮮な未置換全血液に比較し、分画遠心分画により天然血小板をフリーとした新鮮な全血液に取り込むことによる分離凍結乾燥血小板調製品の活性化性（activatability）を示すために実施した。血液は、正常ヒトドナーからクエン酸塩抗凝固剤（ＣＰＤＡ−１）に収集した。２つの１cm条片のイヌ動脈管を先細の棒上に裏返し、蠕動性ポンプにより１３０mＬ／分で駆動する再循環ループに挿入した。ループは先ず緩衝液を、次いで血液（新鮮な又は冷凍乾燥した血小板のいずれかを含む）を室温で５分間灌流させ、次いで２％パラホルムアルデヒドの２分間灌流により付着性血小板を脈管に永久的に固定する。脈管表面上の血小板は、ＧＰIIbIIIaに対する蛍光モノクローナル抗体の付加により検出した。付着は、蛍光細胞により覆われた脈管表面のパーセントの概算としてエピー蛍光顕微鏡法により定性化した。又、（非付着性血小板を有する）残留血液は、採取して血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）とする。ＰＲＰはさらに２％パラホルムアルデヒドで室温にて１−２時間固定し、その後、ＣＤ６２又はＧＰ５３又はＰＤＧＦに対する蛍光標識モノクローナル抗体とインキュベートする。試料中の血小板表面上のこれらのマーカーの存在は、ベクトン・ディキンソン，ファクスカン（商標）流動血球計算器の標準流動血球計算器により検出した。結果の定性化は非特異性コントロール抗体（非免疫マウスＩgＧ２a）により回収されたバックグラウンドよりも大きな蛍光を有する血小板のパーセントとして表した。知見は、脈管条片の灌流の開始直前又は直後に採った血液試料について比較した。本比較の結果は表３に示す。
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表３から、安定化の濃度と時間が実質的に異なる性質を有する血小板をもたらすことが判る。パラホルム．１及びパラホルム．２血小板は、脈管壁のサブ内皮表面を越えて循環した血液中の血小板上に存在する増大する数々の活性化マーカーを示した。逆にブリンクハウス調製品は、ＣＤ６２マーカーとの循環後、実質的に何の活性化も示さず、ＰＤＧＦで最少変化しか示さない。
実施例５（比較例Ｂ）
過マンガン酸カリウムで調製した血小板を特徴付けるための活性化マーカーの使用
本実施例の目的は、本発明の過マンガン酸塩で固定した血小板がトロンボゲン表面に接触後それらの粒子内容物を放出するが、既知技術の血小板は放出しないことを示すことである。本実施例は、血小板を上記実施例３に記載したように過マンガン酸塩で固定した以外は上記実施例４と実質的に同じ方法で実施した。３つの異なる過マンガン酸塩固定血小板調製品を使用した：０．０２Ｍ過マンガン酸塩で安定化し、トレハロースの存在で凍結乾燥した血小板（パーム．１）；０．０２Ｍ過マンガン酸塩で安定化し、ヒト血清アルブミンの存在で凍結乾燥した血小板（パーム．２）；及び０．０１Ｍ過マンガン酸塩で安定化し、ヒト血清アルブミンの存在で凍結乾燥した血小板（パーム．３）。比較目的のため、血小板は、又、２％パラホルムアルデヒドで１２０分間固定し、ウシ血清アルブミンの存在で乾燥した。データは以下の表４に示す。
表４から、本発明の過マンガン酸塩固定血小板に比べ、ブリンクハウス血小板調製品はトロンボゲン脈管にさらした後、実質的に何の活性化も示さなかったことが判る。
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実施例６（比較例Ｃ）
脈管サブ内皮への再水和血小板の付着
新鮮な再水和血小板の暴露されたサブ内皮脈管への付着能力を環状灌流チェンバーで試験した。ブリンクハウス血小板調製品と上記実施例４及び５に記載したように調製した血小板を比較した。血小板はＡＣＤ抗凝固全血液からとり、乾燥及び再水和血小板の種々の調製品で置き換えた。次いで全血液及び再水和血小板を含む血液を幾つかの裏返し脈管を含むチェンバーへポンプで入れた。流量及び剪断率は全ての調製品について一定であった。結果を以下の表５に示す。
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変化性は種類の間で高いが、ブリンクハウス血小板が他の調製品よりも「より粘着性（sticker）」であったことは明らかである。全調製品は脈管サブ内皮に付着するが、さらされた脈管壁の少しの領域しか本発明により調製された血小板によって被覆されない。もちろん、代謝的に「死んで」いる先行技術の血小板の付着は、適当な代謝反応後にはない受身の性質である。
実施例７（比較例Ｄ）
低張ショック回復試験
低張ショック回復試験は、水を除去して血小板による増加した水取り込みにより生じる腫脹を回復する血小板の能力を評価するのに用いる。腫脹の回復の程度を測定するため、クエン酸添加血漿中３×１０8／mＬの血小板懸濁液をクロノログアグレゴメーター（aggregometer）中３７℃で１／２容量脱イオン水で処置した。光透過率信号（％Ｔ）は、低張ショックのために血小板による水の取り込みで直ちに増加し（％Ｔ最大）、次いで、処理していない血小板により水が活発に放出されるので、基線近く（希釈に関し修正された、％Ｔ基礎）に％がもどる。１０分後の回復の程度は、
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として示される。低張ショックからの回復の程度は、非撹拌ペイトンアグレゴメーターで２２℃である以外、上記と同様に行った分離測定であった。回復の程度は、脱イオン水の添加後、１分から３分の％Ｔの変化の程度として算出した。表６に示す結果は、新鮮な血小板コントロールで得た％Ｔの変化の程度のパーセントとして表す。低張ショック試験での血小板の回復の率と程度は膜統合性と残余代謝活性に大きく依存する。ブリンクハウス血小板調製品は非反応性であり、一方、本発明の血小板調製品は４０ないし１０％回復を示した。
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実施例８（比較例Ｅ）
血小板調製品によるトロンビン産生
本実施例の目的は、固定剤の濃度及び固定化の時間の小さな変化が刺激に対する血小板の異なる反応となることを示すことである。４つの血小板調製品をトロンビン産生（それは血小板濃度依存である）及び血小板の表面のプロトロンビナーゼコンプレックスの支持について試験した。結果は図１に示す。血小板カウント×１０００は、水平軸に与えられる；単位でのトロンビン産生は垂直軸に与えられる。調製品は、（ｉ）パラホルム．１血小板（図１中三角）、（ii）パラホルム．２血小板（四角）、（iii）ブリンクハウス血小板（ダイアモンド）及び（iv）コントロールとして新鮮な洗浄血小板（円）であった。パラホルム．２血小板は、最大程度のトロンビン産生を示し、続いてパラホルム．１血小板、次いでブリンクハウス血小板であった。コントロール血小板は最低程度のトロンビン産生を示した。
実施例９
固定乾燥血小板上の血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）の発現
本実施例の目的は、その表面でのＰＤＧＦの発現用の種々の手段により固定され、乾燥された血小板を試験することである。抗体及び血小板調製品は、上記実施例５及び６に記載した通りである。データは以下の表７に示す。
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これらのデータは、ブリンクハウス血小板と本発明の血小板がその表面にＰＤＧＦを発現すること、及びパーム．２とパラホルム．２血小板が刺激の前又は後でブリンクハウス血小板よりも表面にＰＤＧＦをより多く発現することを示す。
実施例１０
ブタの傷害治癒を促進するＰＤＧＦを発現する固定乾燥血小板のに局所投与
本実施例は、ブタの傷害治癒を促進する、その表面にＰＤＧＦを発現する血小板の用途を記載する。
本実施例に用いるブタ血小板は、以下に記述するように修飾した、上記実施例１に記載した方法で実質的に調製した。パラホルムアルデヒドを除くために、等量のイミダゾール緩衝食塩水、（ＩＢＳ）pＨ７．３５を加える。血小板を室温にて１５００xgで８分間遠心することによりペレット化する。上清を排出し、ペレットを５−１０ml ＩＢＳ、pＨ６．８に再び懸濁する。洗浄を２回繰り返した。続いて手段は、ブタ血小板の濃度が８×１０4／μlである以外、実施例１に記載したものと同じである。ブタアルブミンを実施例２に記載したと同様の量、乾燥の安定剤として加えた。
血小板包帯剤は、１０cm直径ペトリ皿中、１平方センチメートル四方上にバイオブレインII（商標）外科包帯剤（ドンＢ・ホウランド・インコーポレイテッド、サガーランド、テキサス）を用い調製した。１cm2の包帯剤を、包帯剤に該当量の血小板を含む１mlの溶液をピペットで与えることにより３．２×１０9ブタ血小板で飽和し、次いで血小板を伴う包帯剤を凍結乾燥室に注意して移し、材料をあらい（cracked）白色粉末が明らかになるまで−４０℃で乾燥した。
２匹の成長したブタを研究した。ブタを麻酔し、直径３ミリメートル（mm）のパンチを用いコントロールパンチ傷害を与えた。０日に、３mm深さ×３mm巾の傷を、麻酔ブタの背中に沿った毛をそり落とした滅菌領域に生成させた。傷は表皮、真皮及び脂肪組織を通過する。３列の６つの傷がそれぞれ生じた。列１を乾燥血小板で処理した。列２を乾燥血小板を含んだメッシュで処理した。１日目に各列の傷一つを除去した。２日目に、各列の傷２を除去した。各日の続く４日に、各列の各スクリーニング傷を研究用に除去した。除去組織をホルムアルデヒドで固定し、標準的組織学的技術で処理し、染色し、傷害回復の証拠を顕微鏡で調べた。各セクションを血小板の存在、傷害上皮再発育の側面に沿って又は底部での線維芽細胞増殖及び炎症反応の証拠について試験した。各部位にパックした血小板の量は、正確に測定しなかった。列１の傷害を乾燥血小板で充填した。各パンチ傷害を乾燥血小板で毛細管充填した。列２の傷を、各傷に乾燥血小板を含む１cm2メッシュをパッキングすることにより処理した。
定性的に全ての処理セクションは、未処理の傷に比べて優れた回復を示した。
実施例１１
正常及びフォンウィルブランド病犬への固定乾燥血小板の静脈内投与
再水和血小板のインビボ止血効果を測定するために、２匹の正常犬と１匹のフォンブランド因子欠損（ホンウィルブランド病、vＷＤ）犬に再水和固定乾燥正常イヌ血小板を注入した。イヌ血小板は、血小板を０．６７％パラホルムアルデヒド溶液中、１時間固定した以外、上記実施例１及び２に記載したヒト血小板と実質的に同じ方法で固定し、乾燥そして再構成した。以下の表８はイヌの注入及び特性に関連する物理学的データである。
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イヌへの血小板注入後、上記上液試料を以下のように約４時間、実験によって収集した。麻酔犬に再水和血小板を注入する。頸動脈をさらす。血圧を測定するために大腿動脈にカヌーレを入れ、第二カヌーレを試料収集及び液体の投与用に大腿静脈に入れた。一本の頸動脈に既知技術（ニコルス等、サーキュレーション・リサーチ ５９，１５−２６（1988）参照）に従って付加狹窄によりピンチ傷害に付す。イヌは血圧心拍数、呼吸等の変化をモニターし、固定乾燥血小板の注入に対する如何なる逆反応をも評価する。再水和血小板を蛍光染料でラベルし、注入し、そして血液試料収集して、抹消循環中、形成した血栓中、崩壌血管壁（サブ内皮）及び正常血管壁の癒着の領域での標識再水和血小板の存在を試験する。イヌの耳の端で切断を行い、部分を付着再水和血小板について顕微鏡試験用に調製した。表９はこれらの研究の結果を示す。
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前述の実施例は本発明を示すものであって、それを限定するものと解してはならない。発明はそれに含まれる請求の範囲の均等物とともに以下の請求の範囲により定義される。
【図１】
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