(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクダ科の動物から得られる軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドの第１の可変断片（VHH）を含む１または数個の抗原に対して結合特異性を有する分子であって、当該可変断片がリンカー配列を介してラクダ科の動物から得られる軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドの他の少なくとも１つの可変断片（VHH）と結合しており、当該他の可変断片は第１の可変断片と類似又は異なる抗原特異性を有し、前記リンカー配列がラクダ科の動物から得られる軽鎖を欠く免疫グロブリンのヒンジドメインの配列由来であり、当該リンカーが二量体化の原因となるシステイン残基を欠いていることを特徴とする前記分子。
【請求項２】
前記の第１および他の少なくとも１つの可変断片が抗原に関して異なった特異性を有する請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記の第１および他の少なくとも１つの可変断片が類似の抗原特異性および異なったエピトープ特異性を有する請求項１に記載の分子。
【請求項４】
前記の可変断片が細菌の毒素または対応する類毒素に対して抗原特異性を有する請求項１ないし３のいずれかに記載の分子。
【請求項５】
前記抗原がクロストリジウム、スタフィロコッカス、シュードモナス、パスツレラ、エルシニア、バチルス・アントラシス、ナイセリア、ビブリオ、腸内毒素大腸菌、サルモネラ、赤痢菌およびリステリアの毒素または類毒素から選択される請求項４に記載の分子。
【請求項６】
クロストリジウム細菌がクロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・ボツリヌムまたはクロストリジウム・ペルフリンゲンスである請求項５に記載の分子。
【請求項７】
ビブリオ細菌がビブリオ・コレラである請求項５に記載の分子。
【請求項８】
可変断片が毒素または動物の毒に対して抗原特異性を有する請求項１ないし７のいずれかに記載の分子。
【請求項９】
前記抗原がアネモネ、サンゴ、クラゲ、クモ、ハチ、スズメバチ、サソリならびにビペリダエ、クロタリダエおよびラピダエ科に属するものを含むヘビによって産生される毒素または類毒素から選択される請求項８に記載の分子。
【請求項１０】
可変断片が以下の配列を有する請求項１ないし９のいずれかに記載の分子。
0004394162.tif 000009
（ここで、CDR1、CDR2およびCDR3はラクダ科の動物の免疫に用いられる抗原の決定されたエピトープの認識をもたらす可変アミノ酸配列を表し、CDR1、CDR2およびCDR3配列は５ないし２５個のアミノ酸残基から成る。）
【請求項１１】
CDR1が７から１２のアミノ酸残基から成り、CDR2が１６から２１のアミノ酸残基から成り、CDR3が７から２５のアミノ酸残基から成る請求項１０に記載の分子。
【請求項１２】
前記可変断片が破傷風毒素に対して抗原特異性を有し、以下のいずれかの配列を有する請求項６に記載の分子。
0004394162.tif 000010
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれかに記載の分子をコードするDNA構築物。
【請求項１４】
ａ．決定された抗原またはエピトープ特異性を有するラクダ科の動物から得られる軽鎖を欠く免疫グロブリンの第１の可変断片をコードするポリヌクレオチドをリンカーポリヌクレオチドに結合させてVHHリンカー断片を形成し、
ｂ．形成したVHHリンカー断片をコードするポリヌクレオチドを、同一または異なった抗原および／またはエピトープ特異性を有するラクダ科の動物から得られる軽鎖を欠く免疫グロブリンの他の断片をコードするポリヌクレオチドに連結させ、
ｃ．工程ｂで得られたDNA構築物を適当な宿主細胞内で発現させて得られた分子を回収する
工程を含む請求項１ないし１２のいずれかに記載の分子を製造する方法であって、可変断片間のリンカー配列がラクダ科の動物から得られる軽鎖を欠く免疫グロブリンのヒンジドメインの配列由来であり、当該リンカーが二量体化の原因となるシステイン残基を欠いている上記方法。
【請求項１５】
工程ｃの前に、ラクダ科の動物から得られる軽鎖を欠く免疫グロブリンの可変断片をコードする他の配列をVHHリンカー断片を介して連結させる工程をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は断片、特には、本質的に軽鎖を欠き、それにもかかわらず特定の抗原に対する認識及び結合活性を発現することが可能な免疫グロブリンの可変断片に関する。これらの免疫グロブリンの断片は、ホスト細胞、例えば、原核細胞又はラクダ科の動物のようないわゆる“２本鎖免疫グロブリン”を生来発現する動物から得られるヌクレオチド配列を有する真核細胞において発現させることにより得ることができる。
本発明は、さらに、少なくとも１つの重鎖可変断片から形成され、あるいはそれらから誘導される免疫グロブリン断片の治療又は獣医学上の目的のための、特には、受動免疫又は血清療法への使用に関する。
「２本鎖免疫グロブリン」又は「重鎖免疫グロブリン」と呼ばれる軽ペプチド鎖を欠く機能的免疫グロブリンがラクダ科の動物から得られており、２つの刊行物、特にはＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４と共にＷＯ９４／０４６７８号の番号で公開されている国際特許出願に説明されている。
これらの免疫グロブリンの単離及び特徴付けは、それらのクローン化及び配列決定と共に、上に引用された文献に説明されており、これらは参照することにより本出願に組込まれる。
ＷＯ９４／０４６７８号によると、生来それらを産生する動物から異なる分子を単離することができることが確立されている。これらの分子は既知の４本鎖免疫グロブリンの機能的特性を有しており、これらの機能は、幾つかの場合において、例えば軽鎖を欠くことにより、４本鎖免疫グロブリンの機能に含まれるものとは異なる構造的要素に関連している。
これらの２本の鎖のみを有する免疫グロブリンは、例えば、分解、特には天然の４本鎖モデルの免疫グロブリンの酵素的分解によって得られる断片にも、天然の４本鎖モデルの免疫グロブリンの不変もしくは可変領域又はこれらの領域の一部をコードするＤＮＡのホスト細胞における発現物にも、例えばマウス、ラット又はヒトにおけるリンパ管症において産生される抗原にも、相当しない。
これらの軽鎖を欠く免疫グロブリンは、それらの重鎖の可変ドメインが４本鎖免疫グロブリンの可変重鎖（ＶH）のものとは異なる特性を有するようなものである。明確にするため、このテキストにおいては本発明による可変ドメインをＶHHと呼んで古典的な４本鎖免疫グロブリンのＶHと区別する。本発明による重鎖免疫グロブリンの可変ドメインは、この重鎖免疫グロブリン中に存在しないＶL又はＣH１ドメインとの正常な相互作用部位を持たない。したがって、これは、溶解度及び主鎖の立体配座のようなその特性の多くにおいて新規な断片である。実際、本発明のＶHHは、Ｃｈｏｔｈｉｅｒ  Ｃ．及びＬｅｓｋ  Ａ．Ｍ．（１９８７−Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７，９０１−９１７）の記述による既知の４本鎖免疫グロブリンの三次元構造とは区別される三次元構造に適合し得る。
特許出願ＷＯ９４／０４６７８号に提示される結果によると、単離された本来軽鎖を欠く免疫グロブリンの抗原結合部位はそれらの重鎖の可変領域上に位置する。多くの場合、これらの２本鎖免疫グロブリンの重鎖可変領域の各々は抗原結合部位を含み得る。
これらの２本鎖免疫グロブリンのさらなる特徴は、それらの重ポリペプチド鎖がＲｏｉｔｔらの定義に従って可変領域（ＶHH）及び不変領域（ＣH）を含むものの、ＣH１と呼ばれる不変領域の最初のドメインを欠くことである。
上述の型の免疫グロブリンには、特許出願ＷＯ９４／０４６７８号又はＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓらの刊行物（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．７，Ｎ°９，ｐｐ１１２９−１１３５−１９９４）において確立された分類によるＧ型免疫グロブリン、特には、クラス２の免疫グロブリン（ＩｇＧ２）又はクラス３の免疫グロブリン（ＩｇＧ３）と呼ばれる免疫グロブリンが含まれる。
軽鎖及び第１不変ドメインの欠如は、Ｒｏｉｔｔらによる、酵素消化によって得られる免疫グロブリン断片の命名法の修正につながる。
一方でＦｃ及びｐＦｃ、他方でＦｃ’及びｐＦｃ’という、それぞれがパパイン及びペプシン消化断片に相当する用語は維持される。
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂｃ、Ｆｄ及びｆｖと言う用語は、これらの断片が軽鎖、軽鎖の可変部分又はＣＨ1ドメインを有するので、もはやそれらを本来の意味で適用することはできない。
ヒンジ部のＶHHドメインを含んでなる、パパイン消化又はＶ８消化によって得られる断片は、それらがジスルフィド結合による結合を保持しているかどうかに応じてＦＶHHｈ又はＦ（ＶHHｈ）２と呼ばれる。
上述の定義を引用する免疫グロブリンは、動物、特にはラクダ科の動物を源として得ることができる。これらのラクダ科の動物に存在する重鎖免疫グロブリンは、４本鎖免疫グロブリンに関連する異常な抗体の産生を誘発する病理学上の状況とは関係していない。旧世界のラクダ科動物（カメルス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）及びカメルス・ドロマデリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍａｄｒｅｉｕｓ）と新世界のラクダ科動物（例えば、ラマ・パッコス（Ｌａｍａ  Ｐａｃｃｏｓ）、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  Ｇｌａｍａ）及びラマ・ビキュグナ（Ｌａｍａ  Ｖｉｃｕｇｎａ）との比較試験に基づいて、本発明者らは軽ペプチド鎖を欠く免疫グロブリンが全ての種において見出されることを示している。とは言うものの、動物に応じてこれらの免疫グロブリンの分子量が相違することは明らかである。特には、これらの免疫グロブリンに含まれる重鎖の分子量は約４３ｋｄないし約４７ｋｄ、特には４５ｋであり得る。
有利なことに、本発明の重鎖免疫グロブリンはラクダ科の動物の血液中に分泌される。
軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片は、ＷＯ９４／０４６７８号の例に詳細に説明される精製方法に従うラクダ科動物の血清からの精製によって得ることができる免疫グロブリンから開始して調製することができる。また、この可変断片は、パパイン又はＶ８酵素での消化によって重鎖免疫グロブリンから得ることも可能である。
また、これらの断片は、遺伝子工学又は化学的合成によりホスト細胞中で生成させることもできる。適切なホスト細胞は、例えば、細菌（例えば、大腸菌）、酵母もしくは哺乳動物細胞を含む動物細胞を包含する真核細胞又は植物細胞である。
ラクダ科の動物がそれらの機能的免疫グロブリンの相当部分をＣH１ドメイン及び軽鎖を欠く重鎖のホモダイマーとして産生する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３）という本発明者らの観察は、単一の可変抗体断片（ＶHH）を生産し及び選択するために、さらに対応するヌクレオチド配列を得るために、免疫したラクダを用いるという提案につながった。
クローン化されたラクダ単一ＶHH断片を、選択のためにバクテリオファージ上で、及び可溶性蛋白質の大スケール産生のために細菌中で発現させ、これらがマウス又はヒトＶH等価物と比較して優れた溶解挙動及び親和特性を有することが示された（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）。この戦略に従うことで、オリゴペプチドリンカーの存在によって隠される（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋら、１９９２）ことのない、あるいはＶＨ−ＶＬ複合体の分解によって不活性化される（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、１９９０）ことのない、小さなリガンド結合分子（１６，０００Ｄ近辺のＭＷ）が得られるであろう。ラクダのＶHH断片は、さらなる利点を有し、軽鎖の不在下においてイン・ビボで成熟した重鎖抗体であることで特徴的である。
本発明者らは、軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片が、それらが決定された抗原に対して産生される場合に、有効な治療活性を示し得るという証拠を得ている。
有用なラクダＶHH断片を調製及び同定するこの技術を開発するためには、（ｉ）ラクダを種々の抗原で免疫することが可能であり、（ｉｉ）免疫された抗原を用いてパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）によって容易に選択するために、ラクダＶHH遺伝子をクローン化して線状ファージ上及び大腸菌内で発現させることが可能であり、（ｉｉｉ）発現したラクダＶHHが正しく折り畳まれ、かつ（ｉｖ）それらが良好な溶解特性並びにそれらの抗原に対する高い親和性及び特異性を有することが、重要である。
軽鎖を欠く重鎖免疫グロブリンから誘導されるラクダＶHH遺伝子は、従来クローン化され、分析されている（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）。これらのラクダＶHHクローンのアミノ酸配列を比較することにより、特徴的な免疫グロブリンの折り畳みを保存するための重要な特徴が全て存在することが明確に示された。ラクダＶHHクローンで観察される特定のアミノ酸置換は、ＶＬ（可変軽鎖）の欠如及びラクダの単一ＶHHドメインの機能性に相関する可能性がある（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）。
したがって、本発明は軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片（ＶHH）に関し、これは以下の方法：
−決定された抗原で予め免疫されたラクダ科の動物の血液リンパ球又は他の適切な細胞を、それらのｍＲＮＡを得るために処理し、
−得られたｍＲＮＡから開始してｃＤＮＡの第１の鎖を合成し、
−得られたｃＤＮＡを、少なくとも２種類の異なるプライマーオリゴヌクレオチドと、該ｃＤＮＡに含まれる少なくとも２種類の相補性ヌクレオチド配列とのそれらのハイブリダイゼーションを可能にする条件で接触させ、ここで、該プライマーはヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧ（Ａ／Ｇ）ＧＧＡＧＧ−３’を有するＢＡＣＫプライマー（ｂａｃｋ  ｐ１）及びヌクレオチド配列５’−ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＧＴＴＧＡ−３’又は５’−ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＡ−３’に応答するＦＯＲプライマー（ｆｏｒ  ｐ１）を含み、
−該プライマーとハイブリダイズしたヌクレオチド配列の間に位置するＤＮＡ断片を増幅させ、かつ
−異なるサイズ順のバンドであって、
４本鎖免疫グロブリンの可変重鎖（ＶH）、ＣＨ1、ヒンジ及びＣＨ２領域の一部の増幅産物である７５０塩基対近辺のバンド、
ラクダ２本鎖免疫グロブリンＩｇＧ２の可変重鎖（ＶHH）、長ヒンジ、及びＣＨ２の一部の増幅産物である６２０塩基対近辺のバンド、
ラクダ２本鎖免疫グロブリンＩｇＧ３の可変重鎖（ＶHH）、短ヒンジ、及びＣＨ２の一部の増幅産物である５５０塩基対近辺のバンド
を含むバンドに相当する増幅されたＤＮＡを回収し、
−６２０及び５５０塩基対近辺の最も短い２つのバンドを、アガロースゲルから、例えばジーン・クリーン（Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ）によって精製し、
−ＶHH断片をコードするヌクレオチド配列を含む増幅ＤＮＡ断片を回収し、
−該増幅産物を、該増幅断片内及び／又はヌクレオチドプライマー内に標的部位を有する制限酵素、例えばＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩで消化し、
−消化された増幅ＤＮＡ断片を回収し、
−該増幅ＤＮＡ断片を、ファスミドベクター、例えばｐＨＥＮ４ベクターに、得られる組換えベクターがホスト細胞の形質転換に用いられる場合に該増幅断片の発現を可能にする条件でライゲートし、
−決定された細菌ホスト細胞、例えば大腸菌細胞を得られた組換えファスミドベクターで形質転換し、該細胞を選択培地において成長させてライブラリーを形成し、
−適当な選択培地で培養した後に得られる組換えホスト細胞のライブラリーを、バクテリオファージ、例えばＭ１３Ｋ０７バクテリオファージを用いて感染させて組換えファージミドビリオンを得、
−該組換えホスト細胞を、組換えファスミドを有する組換えファージミドビリオン粒子、例えばＭ１３ビリオン中にパッケージ化されているｐＨＥＮ４ファスミドの分泌を可能にする条件でインキュベートし、
−該組換えファージミドビリオンを単離及び濃縮し、
−該ファージミドビリオンを、予め固定化されている関心のある抗原を用いる数回のパニングに、該固定化抗原へのファージミドビリオンの吸着を可能にする条件で供し、
−吸着したファージミドビリオンを溶離してそれらを適切な細胞で成長させ、
−該細胞をヘルパーバクテリオファージに感染させることにより該ファージミドビリオンを増幅させ、
−該ビリオンを回収し、例えばＥＬＩＳＡにより、関心のある抗原に対する結合活性についてそれらを試験し、
−適切な結合活性を有するファージミドビリオンを回収し、
−該ファスミドベクターに含まれ、かつ該ファージミドビリオンで適切な結合活性を有するＶHHアミノ酸配列として発現することが可能なヌクレオチド配列を単離する、
ことによって得ることができるヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の好ましい態様において、上に説明されるＢＡＣＫ及びＦＯＲプライマー（ｐ１）を用いるｃＤＮＡの増幅工程に、上に説明されているオリゴヌクレオチド配列（ｂａｃｋ  ｐ１）に相当するＢＡＣＫプライマー及びヌクレオチド配列５’−ＣＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ−３’を有するＦＯＲプライマー（ＦＯＲ  ｐ２）を用いるさらなる増幅工程を追加することにより可変ＶHH断片が得られる。ｐＨＥＮ４ベクターへのクローニングに用いることができるＮｏｔ及びＢｓｔＥＩＩ部位には下線が付されている。このＦＯＲプライマーは、ＶHHヌクレオチド配列のフレームワーク４（ＦＲ４）領域のコドン位置（アミノ酸１１３−１０３位）へのハイブリダイゼーションを可能にする。
説明される方法の別形態によると、この追加の増幅工程は既に説明されている増幅工程をそれぞれ以下のヌクレオチド配列：
0004394162.tif 000002
を有するＢＡＣＫプライマー及びＦＯＲプライマーで置き換えることができる。制限部位には下線が付されている。
本発明の別の態様においては、合成ｃＤＮＡの増幅工程を、上述のＢＡＣＫプライマー及び以下の配列：
0004394162.tif 000003
を有するＦＯＲプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。
後者の態様によると、本発明のＶHH断片は、ＦＯＲプライマーの混合物が用いられる場合、１回の増幅（例えば、ＰＣＲ反応）によって直ちに、かつ特異的に増幅される。
これらの後者のプライマーは、それぞれ、ヒンジ／フレームワーク４及び短ヒンジ／フレームワーク４とハイブリダイズする。これらのＦＯＲプライマーは、各々、特許出願ＷＯ９４／０４６７８号の分類による１種類のＩｇＧクラスの増幅を可能にする。
この定義に一致する可変ＶHH断片は、それらの動物が従前の特許出願ＷＯ９４／０４６７８号に説明されるものによる軽鎖を欠く免疫グロブリンを生来産生することが可能であるならば、他の動物細胞の源から得ることも可能である。
これらの可変断片（ＶHH）は、上述の方法によって得ることができるＤＮＡ配列から開始して、化学合成又は遺伝子工学によって得ることも可能である。
前述の定義による軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片は、抗原に（この抗原は、それに対して、動物がこの抗原に自然に接触することにより、又はこの抗原に対する免疫応答を生起させるためにそれを投与することにより予め免疫されているものである）特異的に指向する。
本発明の可変断片をコードするヌクレオチド配列を調製するために上に提示される方法は、所望の特異性を有する重鎖の可変断片をコードするヌクレオチド配列の選別を可能にするファージ発現ライブラリー構築の工程を有する。
本発明の好ましい態様の１つによると、この免疫グロブリンの重鎖の可変断片は、毒素、特には細菌毒素又はこの毒素に対する免疫グロブリン、特には軽鎖を欠く免疫グロブリン、の産生を可能にするに十分なこの毒素の一部を用いて予め免疫されている動物から得ることができる。
本発明の別の態様によると、この免疫グロブリンの重鎖の可変断片は、動物の毒液中に含まれる物質を用いて予め免疫されている動物から得ることができる。
動物の免疫に用いられる抗原は、通常、非毒性形態にある。
本発明による可変断片は、異なるクラス、特には特許出願ＷＯ／０４６７８号の分類によるＩＧｇ２又はＩＧｇ３に属する免疫グロブリンから誘導することが可能である。
本発明の好ましい態様において、軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片はクロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）の破傷風毒素又はそれらの断片に指向する。
また、この軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片は、細菌のような病原生物に由来する毒素又はそれらの断片に対して産生させることも可能であり、特には以下の細菌：クロストリジウム、特にはクロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）もしくはクロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、スタフィロコッカス、シュードモナス、パスツレラ、エルシニア、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ナイセリア、ビブリオ、特にはビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、腸内毒素大腸菌、サルモネラ、赤痢菌、リステリアの毒素又は類毒素の中から選択することができる。
本発明のＶHH断片の調製に適する他の抗原は、以下の生物：アネモネ、サンゴ、クラゲ、クモ、ハチ、スズメバチ、サソリ、ビペリダエ（Ｖｉｐｅｒｉｄａｅ）、クロタリダエ（Ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）、ラピダエ（Ｌａｐｉｄｅａ）科に属するものを含むヘビから得ることができる。
本発明の別の態様によると、軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片ＶHHは以下のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
0004394162.tif 000004
（ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はラクダ科の動物の免疫に用いられる抗原の決定されたエピトープの認識をもたらす可変アミノ酸配列を表し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は５ないし２５個のアミノ酸残基を有し、好ましくはＣＤＲ１は７ないし１２個のアミノ酸残基を有し、ＣＤＲ２は１６ないし２１個のアミノ酸残基を有し、かつＣＤＲ３は７ないし２５個のアミノ酸残基を有する。）
ラクダのＶHHの特定のアミノ酸残基Ｓｅｒ１１、Ｐｈｅ３７、Ｇｌｕ４４、Ａｒｇ４５、Ｇｌｕ４６、Ｇｌｙ４７には下線が付されている。
本発明による好ましい可変断片の１つは、登録番号ＬＭＢＰ３２４７でＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（ベルギー）に寄託されている組換えファスミドｐＨＥＮ４−αＴＴ２（ＷＫ６）中に存在するヌクレオチド配列によってコードされる。
このｐＨＥＮ４αＴＴ２（図２に示す）は、ＰｅｌＢリーダーシグナル、そのタンパク質が破傷風類毒素に結合するラクダのＶHH遺伝子、（ストラタサイト（Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ）のイムノＺＡＰ  Ｈ（ｉｍｍｕｎｏＺＡＰ  Ｈ）からの）デカペプチドタグ及びＭ１３の遺伝子ＩＩＩｐをｐＵＣ１１９ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位の間に坦持するファスミドである。このファスミドは大腸菌ＷＫ６細胞内に形質転換された。
具体的な本発明による可変断片は、例えば、以下のαＴＴ１アミノ酸配列を有することを特徴とする。
0004394162.tif 000005
本発明の別の好ましい態様によると、可変断片は以下のαＴＴ２アミノ酸配列を有する。
0004394162.tif 000006
本発明の好ましい態様において、本発明の可変ＶHH断片は、その免疫原性を消去するために改変される。このような修正は、例えば受動免疫防御のためにヒトもしくは動物のいずれかのホストに投与された場合に、ＶHH断片に対する免疫学的反応の変更につなげることができる。
本発明は、さらに、上に定義されているものに従う免疫グロブリン重鎖可変断片を生理学的に許容し得る担体との混合状態で含有する医薬組成物に関する。
このような医薬組成物は、感染又はクロストリジウム、特にはクロストリジウム・ボツリヌムもしくはクロストリジウム・ペルフリンゲンス、スタフィロコッカス、シュードモナス、パスツレラ、エルシニア、バチルス・アントラシス、ナイセリア、ビブリオ、特にはビブリオ・コレラ、腸内毒素大腸菌、サルモネラ、赤痢菌、リステリア又はアネモネ、サンゴ、クラゲ、クモ、ハチ、スズメバチ、サソリ、ビペリダエ、クロタリダエ、ラピダエ科に属するものを含むヘビのもののような毒素による急性中毒の受動免疫化による治療に用いることができる。
本発明は、さらに、上に説明されている方法によって得ることができる、軽鎖を欠く免疫グロブリンの重鎖の可変断片（ＶHH）をコードするヌクレオチド配列に関する。
具体的なヌクレオチド配列は、図４Ａ及び４Ｂに示されるαＴＴ１及びαＴＴ２に相当するものである。
本発明の一態様によると、好ましいヌクレオチド配列は、ＬＭＢＰ３２４７という番号で１９９５年１月３１日にベルギーのＢＣＣＭ／ＬＭＢＰコレクションに寄託されたファスミドｐＨＥＮ４−αＴＴ２に含まれる配列である。
本発明は、さらに、軽鎖を欠く免疫グロブリンの可変断片の二価の、又は多価ですらある単特異的ＤＮＡ構築物及びそれらの発現産物の調製のための手段を提供する。したがって、これは、リンカー配列と結合されたＶHH断片をコードする配列から得られる一価の二特異性又は多特異性可変構築物の調製に近づく手段をもたらす。二価単特異的構築物は、同じ抗原もしくはエピトープに対するＶHH断片をコードする２つのヌクレオチド配列を有する。一価二特異的構築物は、１つの分子上に、１つの抗原もしくはエピトープに対するＶHH断片をコードする１つのヌクレオチド配列と別の抗原もしくはエピトープに対する断片をコードする別のヌクレオチド配列を有する。
対応する発現産物（タンパク質構築物）は遺伝子工学により、特には、細菌（例えば、大腸菌）又は真核細胞のようなホスト細胞における上記ＤＮＡ構築物の発現によって得ることができる。
したがって、決定された抗原特異性を有するＶHH型の可変断片を、抗原及び／又はエピトープ特異性の点で類似の、もしくは異なる決定された特異性を有する、少なくとも１つのさらなる可変断片ＶHHに結合させることができる。
（発現産物に関して）得られた構築物及び、特に、二価単特異的構築物は、それに対してこれらが得られた抗原（１種もしくは複数）に対する親和性を改良する手段を有利に提供する。
ＶHH断片の間のリンカー配列は、例えば、（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ら、１９９３）によって説明される、軽鎖を欠く免疫グロブリンのヒンジドメイン（例えば、長ヒンジドメイン）のコーディング配列に相当する配列又はそれらから誘導される配列であってもよい。
例として、これらの２つのＶHH断片の可変コーディング配列をライゲートして一価二特異的構築物を得るために、ヒンジ及びＣＨ2ドメインをコードする配列、特には軽鎖を欠く免疫グロブリンの長ヒンジ及びＣＨ2をコードする配列を用いることができる。これらのドメインはＷＯ９４／０４６７８号に説明されている。
別の例として、例えば二特異的もしくは多特異的ＤＮＡ構築物を調製するため、ＶHH断片の間のリンカーとして用いられる配列がヒンジのコーディング配列から誘導される。これは、システイン残基をコードするヌクレオチド配列を含んでいる末端部分を欠いているか、あるいは、より一般的には、ＶHH断片の二量体化を可能にするコドンを欠いている。
好ましいリンカーには、図１５に開示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４００から始まりヌクレオチド４７９もしくはヌクレオチド４７９と４８６との間で終わる配列、又は図１５のヌクレオチド配列のヌクレオチド４００から始まりヌクレオチド４９５もしくはヌクレオチド４８７と４９５との間で終わる配列が含まれる。
これらのリンカーは、例えば、上に記述され、かつ例に説明されるように、軽鎖を欠く免疫グロブリンのＶHH、ヒンジ及びＣＨ２ドメインのコーディング配列を有するプラスミドをＢｓｔ  ＥＩＩ及びＸｍｎｌ（又はＫｐｎｌ）エンドヌクレアーゼで消化し、この配列をヒンジコーディング配列の各末端までアニールするプライマーで増幅することにより得ることができる。
例として、２種以上の異なる毒素又は、一般には、細菌、ウイルスを含む異なる病原生物に関する特異性を有する構築物（一価もしくは多価、単特異的もしくは多特異的）を得ることが可能である。
また、本発明は、免疫グロブリンの重鎖の可変断片の一価二特異的構築物の調製方法であって、
ａ）決定された抗原又はエピトープ特異性を有する可変ＶHH断片をコードするヌクレオチド配列をリンカーヌクレオチド配列にライゲートしてＶHH−リンカー断片を形成する工程；
ｂ）ＶHH−リンカー断片をコードする形成されたヌクレオチド配列を異なる抗原及び／又はエピトープ特異性を有する別のＶHH断片をコードするヌクレオチド配列にライゲートする工程；
を包含し、ここで、該リンカー配列はヒンジドメインの一部をコードするヌクレオチド配列を含み、このヒンジドメインは、特には該ヒンジドメイン内の最後のシステイン残基間でのジスルフィド結合の形成によるＶHH断片の二量体化の原因となるコドンが欠失している方法も提供する。
好ましい態様によると、追加のライゲーション工程は、上記断片と同じもしくは異なる特異性を有する可変断片（ＶHH断片）をコードする配列を用いて行う。
このような場合、工程ｂ）から回収されるＶHH−ヒンジリンカー−ＶHH断片コーディング配列は、ヒンジリンカー−ＶHHという構造を有するヌクレオチド配列を生成するように消化しなければならない。これにより、ｎが２を上回る数である（ＶHH−ヒンジリンカー）nコーディング配列が得られる。
好ましくは、軽鎖を欠く免疫グロブリンのヒンジドメイン、好ましくは長ヒンジドメインをコードする配列は、図１５の配列のヌクレオチド４００ないし４７９又はヌクレオチド４８６までを含み、あるいはこれに相当するヌクレオチド配列である。
二価もしくは多価の単特異的もしくは多特異的構築物の調製方法の特定の態様においては、ヒンジドメインをコードするヌクレオチド配列に結合しているＶHH断片コーディング配列を増幅させなければならない。関心のある配列の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドプライマーは既に定義されている。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、それらの３’末端がＶHH遺伝子もしくはコーディング配列の始点及びヒンジコーディング配列の終点にアニールする。適切なプライマーは、例えば、
Ａ４（Ｓｆ  Ｉ部位に下線が付されている）：
0004394162.tif 000007
である。
これらの選択されたプライマーは特定のエンドヌクレアーゼの標的配列を含み、したがって、増幅された断片の消化産物を適切なベクターにクローン化することが可能である。
次いで、得られたＤＮＡ構築物をホスト細胞、例えば大腸菌の形質転換に用い、その後発現したタンパク質を単離して精製する。これらのＤＮＡ構築物の発現産物は本発明の範囲内にある。
ラクダから誘導されるもののような重鎖抗体及びそれらの断片は、他の動物から誘導される他の抗体又はそれらの断片を上回る明瞭な利点を提供する。これらは、重鎖抗体及び、特にこれらの重鎖抗体のヒンジ内でタンパク分解性の開裂を行ってＶHH及び（ＶHHｈ）２断片を産生させることにより生成することができる新規断片に特有の特徴と関連づけられる。この重鎖のＶHHドメインは、通常の抗体から誘導されるＶＨ断片には見出されない溶解特性を付与する、異なる遺伝的な本質を有する。この特性は、その小さなサイズ及びフレームワーク領域のアミノ酸配列がヒトのものと非常に相同性が高いという事実に加えて、免疫原性が最小のものであることを確実なものとする。これらの特性は、重鎖ＶHH断片を用いる受動免疫又は抗体療法のための繰り返し処置を可能にする。上述のように、ＶHH及び（ＶHHｈ）２断片は、ラクダの免疫グロブリンのタンパク分解性開裂により、又は組換えＤＮＡ技術により容易に生成することができる。
受動免疫の最も重要な分野は細菌毒素による中毒、特には急性中毒又は薬物耐性細菌による中毒である。ワクチン接種が実行不可能であったり、その効果が短い場合には、受動免疫又は抗体による治療が正当化される。これらは、治療せずに放置すると致死もしくは傷害効果を有するであろう急性中毒について特に正当化される。
以下の症例の一覧はすべてを含んでいるものではない。
−クロストリジウム・テタニの感染による破傷風は重要な外傷後感染であり、現在の免疫化は長続きしない。これは獣医学の分野においても重要である。
−クロストリジウム・ボツリヌム及び関連種が産生する毒素の摂取によるボツリヌス中毒。
−クロストリジウムの感染による壊疽。
−クロストリジウム・ペルフリンゲンスの摂取によるヒト及び家畜における壊死性腸炎及び腸内毒素中毒。
−抗生物質が勧められない場合におけるスタフィロコッカスの毒素による食中毒。
−抗生物質治療に耐性のシュードモナス感染、特には迅速な処置に値する眼の感染。
−ジフテリア毒素の感染。
−ヒト及び家畜において致死的な結果を引き起こすパスツレラ及びエルシニア感染。
−バチルス・アンテラキス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｘｉｓ）によって産生され、５つの主要家畜病の１つの原因である炭疽毒素。
−ナイセリアのような他の細菌性作用物質又はウイルス性作用物質による感染。
さらに、消化性酵素（例えば、ペプシン、トリプシン）によるタンパク分解性開裂に対するＶHH断片の相対的な耐性は、ビブリオ・コレラ及び他のビブリオ、腸内毒素大腸菌、サルモネラ種及び赤痢菌のような重要な腸内病原体又はリステリアのような食物と共に摂取される病原体に対する治療の可能性を提供する。
免疫療法の他の主な標的は、有毒無脊椎動物及び脊椎動物に噛まれたことによる、又はこれらと接触したことによる中毒の治療にある。無脊椎動物の中にはイソギンチャク、サンゴ及びクラゲ、クモ、ハチ及びスズメバチ、サソリが入る。脊椎動物の中では、毒蛇、特にはビペリダエ、クロタリダエ、ラピダエ科に属するものが特に重要である。
免疫された動物に由来する部分的に精製された免疫グロブリンを用いる受動免疫は既に用いられている。発展途上国においては、依然として抗破傷風及び抗ジフテリア抗血清が、通常ウマにおいて、非常に大規模なスケールで製造されている。より小さなスケールではあるが、毒、特にはヘビ毒に対して抗毒抗体が製造されている。
用途の他の分野は、ボツリヌス毒のような神経毒がますます用いられる医学上又は外科上の実務における毒素の治療上の使用との組み合わせにある。
また、本発明は、単独又はキットにおける上述のオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の他の特徴は、図及び以下に説明される例から明らかである。
図１：サイズマーカーとして用いられるＢＲＬの１２３ｂｐラダー（レーン４）と並んで、ラクダのＶHH遺伝子のＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ消化ＰＣＲ増幅産物（レーン１及び２）の１％アガロースゲル電気泳動。このＰＣＲ産物は、長さ３６９ｂｐのマーカーの３rdバンドと共に移動する。
図２：図の下方に示されているＶHHクローニング部位のヌクレオチド配列を有しているｐＨＥＮ４のマップ。ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ部位は、図１に示されるラクダのＶHHＰＣＲ産物のクローン化に用いることができる。
図３：１００個の個別のクローンを、元のラクダのＶHHライブラリーから（０）、又は第１（１）、第２（２）、第３（３）もしくは第４（４）回目のパニングの後に無作為に選択した。Ｍ１３感染の後、これらのビリオンを固定化破傷風毒素に対する結合活性について試験した。陽性クローンの数をパニングの回数の関数として示す。
図４：２つの同定されるラクダＶHH抗破傷風毒素クローンｐＨＥＮ４−αＴＴ１及びｐＨＥＮ４−αＴＴ２のヌクレオチド配列及びそれに対応するアミノ酸配列。フレームワークのＳｅｒ１１、Ｐｈｅ３７及びＡｒｇもしくはＣｙｓ４５はラクダのＶHH重鎖抗体に特有のものであり（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）、これらには二重下線が付されている。Ｋａｂａｔら（１９９１）による３つの超可変又はＣＤＲには下線が付されている。
図５：ＩＰＴＧで誘発されたＷＫ６培養物のペリプラズムから抽出されたタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。レーン１及び８、タンパク質サイズマーカー（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））のＭＷは（頂部から底部へ）９４，０００；６７，０００；４３，０００；３０，０００；２０，１００及び１４，４００Ｄである。レーン２及び７、ｐＨＥＮ４−αＴＴ２’及びｐＨＥＮＡ−αＴＴ１’クローニングベクターを有するＷＫ６細胞から抽出された発現ペリプラズムタンパク質。レーン３及び４、１０及び１マイクログラムでのｐＨＥＮ４−αＴＴ２の精製ＶHHドメイン。レーン５及び６、１０及び１マイクログラムでのｐＨＥＮ４−αＴＴ１の精製ＶHHドメイン。発現した可溶性ラクダＶＨタンパク質の位置を矢印で示す。これは、第２レーンには明らかに存在しない。
図６：ｐＨＥＮ４−αＴＴ２を坦持する１リットルのＷＫ６細胞の培養物の全ペリプラズム抽出物を５ｍｌに濃縮し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２を溶離液として用いるスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ファルマシア）でのゲル濾過により分画した。純粋なＶHHは矢印の間の画分に溶離する。
図７：経路長０．２ｃｍのキュベット内で測定した、水中３．９×１０-6Ｍの精製ＶHHドメインαＴＴ２のＣＤ（円二色性）スペクトル（吸光度対ｎｍでの波長）。２１７及び１８０ｎｍ近辺の負のバンド及び１９５ｎｍ近辺の正のバンドはβ構造の特徴である（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９０）。
図８：競合ＥＬＩＳＡによって示される抗原結合の特異性。この実験は、ｐＨＥＮ４−αＴＴ１及びｐＨＥＮ４−αＴＴ２の細菌性ペリプラズム抽出物を用いて３回行った。
図９：１００ｎｇの破傷風毒素（１０×ＬＤ５０）をＩ．Ｐ注射した後の、又は破傷風毒素と４もしくは４０マイクログラムの精製ＶHHαＴＴ１、αＴＴ２もしくは非特異的ｃＶＨ２１（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）とを同時注射した後の生存マウスの数。
図１０：ラクダ科動物のＶHH配列（ＣＤＲ３及びフレームワーク４領域は含まず）の可変性プロット。
ラクダ及びラマのＶHHアミノ酸配列の整列化（総計４５配列）をＫａｂａｔらに従って行った。各位置での可変性を、最も普通のアミノ酸の頻度で除した所定の位置で生じる異なるアミノ酸の数として算出した。位置にはＫａｂａｔらに従って番号がふられている。水平のバーの上の位置は、コンセンサス配列中（ＣＤＲ１）及び（ＣＤＲ２）と呼ばれるアミノ酸を示す。
１に等しい可変性数はその位置で完全に保存されているアミノ酸を示す。可変性数が大きくなればなるほど、その位置のアミノ酸がコンセンサス配列から逸脱する傾向がある。
図１１：ＬＹＳ２  ＶHHの核酸配列及びそれらの翻訳産物。
図１２：ＬＹＳ３  ＶHHの核酸配列及びそれらの翻訳産物。
図１３：二価の単特異的抗ＬＹＳ３ラクダＶHHを構築するための図式。
図１４：一価の二特異的抗ＬＹＳ３−長ヒンジリンカー−抗ＬＹＳ２−タグを構築するための図式。
図１５：抗ＬＹＳ３−長ヒンジ／ＣｙＳ−タグのヌクレオチド及びアミノ酸配列。このタンパク質は自発的に二量体化する。
二重下線：ラクダ科動物ＶHHに特異的なアミノ酸
ボックス：ＣＤＲ
断続下線：長ヒンジリンカー
下線：タグ
ボックス入りのＳ：ドメイン間ジスルフィド結合に関与するシステイン
図１６：抗ＬＹＳ３−長ヒンジリンカー−抗ＬＹＳ２−タグポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列。
下線及びボックスについては図１５の凡例を参照のこと。
実施例Ｉ：破傷風毒素に対する特異的ラクダＶHH断片の生成
この応用においては、示された折り畳み及び良好な結合親和性を有する特異的ラクダＶHH断片を産生することが実現可能であることを立証する結果を提示する。これは、ヒトコブラクダのＩｇＧ２及びＩｇＧ３アイソタイプから誘導されるラクダＶHH断片のライブラリーを作製し、このＶHHライブラリーをバクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク質を用いてファージ上で融合タンパク質として発現させて抗原結合体の選択を可能にし、最後に大腸菌で可溶性かつ機能性のＶHH断片を発現させて抽出することにより行った。抗原として、公開データとの比較が可能であることから、我々は破傷風毒素を選択した。加えて、破傷風毒素は、中和抗体を誘発するためにヒトにおいてワクチンとして日常的に用いられる非常に免疫原性の高いタンパク質である。同定された２種類のラクダＶHH断片は特異的であり、高い親和性を有していた。これらの２種類のラクダＶHH断片の親和性は、近年Ｍｕｌｌｉｎａｓら（１９９０）及びＰｅｒｓｓｏｎら（１９９１）によって得られたヒト抗破傷風毒素ＦABに匹敵するものと思われる。
ラクダの免疫
ラクダ（カメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ））の血清は破傷風毒素と反応しないことが示された（ＲＩＴ、スミス・クライン・ビーチャム、リキセンザルト（Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ）、ベルギー）。このラクダに、１００μｇの破傷風毒素を第９、３０、５２、９０日に、５０μｇを第２２０、２９３及び４４９日に注射した。各注射の３日後に血液を採取した。
ラクダの血液リンパ球のｍＲＮＡ精製
末梢血リンパ球を、第４５２日の採血からリンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（ナイコメド（Ｎｙｃｏｍｅｄ）、ファルマ（Ｐｈａｒｍａ））を用いて精製した。１．１０6−５．１０6細胞のアリコートをペレット化して−８５℃で凍結した後、抗破傷風毒素のためのＢ細胞ｍＲＮＡの富化源として用いた。
総計１０6個の末梢血リンパ球から、製造者の勧めに従って“マイクロ・ファースト・トラック（Ｍｉｃｒｏ  Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ）”ｍＲＮＡ単離キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））又はファルマシアの“クィック・プレップ・マイクロｍＲＮＡピュアリフィケーション（Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）”キットのいずれかによりｍＲＮＡを調製した。両プロトコルを用いて数μｇのｍＲＮＡが得られ、これを続くｃＤＮＡ合成工程において用いた。
ラクダＶHH遺伝子のｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅
第１鎖ｃＤＮＡを、インビトロジェンの“ｃＤＮＡ−サイクル（ｃＤＮＡ−ｃｙｃｌｅ）”又はファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の“レディ−トゥ−ゴー（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ）”キットを用いて合成した。その直後に、この第１鎖ｃＤＮＡをＰＣＲによるラクダＶHH領域の特異的な増幅に用いた。用いられたプライマーは以下の配列を有する：ＢＡＣＫプライマー（５’−ＧＡ  ＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧ（Ａ／Ｇ）ＧＧＡＧＧ−３’）、内部ＰｓｔＩ部位に下線が付されている）はラクダＶHHのフレームワーク１領域（コドン１ないし１０）にハイブリダイズするように設計されているが、ＦＯＲプライマー（５’−ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＡ−３’）はＣＨ２領域内でハイブリダイズする。ＰＣＲは、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）からのＴａｑポリメラーゼを用いて行った。
ＰＣＲ産物を標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って精製し、その標的部位がＢＡＣＫプライマー中に現われるＰｓｔＩ制限酵素及びラクダＶHH領域のフレームワーク４に天然の部位を有するＢｓｔＥＩＩで消化した。得られた約３６０ｂｐの断片（図１）を、同じ制限酵素で切断したｐＨＥＮ４ベクターにライゲートした。このｐＨＥＮ４ベクター（図２）は、ｍｙｃ−タグがイムノＺＡＰ  Ｈベクター（ストラタサイト（Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ）に存在するデカペプチドタグで置換されているｐＨＥＮ１プラスミド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１）−ｐＵＣ１１９ベースのベクターである。また、ＰｅｌＢリーダーシグナルの後並びにデカペプチドタグ及びバクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩの前に位置するＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ部位の間へのラクダのＶHH遺伝子のクローン化が可能となるように、ポリリンカーも修飾した。
ラクダＶHHのライブラリーの構築
ライゲートしたＤＮＡ材料を１０容量で沈殿させて１０μｌの水に再懸濁させ、大腸菌ＸＬ１ブルーＭＲＦ細胞（ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に電気形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）した。推奨されるプロトコル（ストラタジェン）に従うエレクトロポレーションの後、１００μｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢプレートに塗布する前に細胞を１ｍｌのＳＯＣ培地中に３７℃で１時間保持した。３７℃で一晩のインキュベートの後に形質転換細胞はコロニーに成長し、約５００，０００個の組換えクローンが得られた。無作為に選択した約２０のコロニーを楊枝で取り出し、選択培地（ＬＢ／アンピシリン）で成長させてプラスミドＤＮＡを調製し、配列決定によりそれらのインサートを調べた。試験したクローンの各々について、ラクダの重鎖免疫グロブリンに由来するＶHHに特有のアミノ酸及び内容（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）を有する異なるＶHH領域が見出された。これは、膨大なラクダＶHHのライブラリーが生成したことを示す。
残りの５００，０００個のクローンは５０％グリセロールを含有する最小量のＬＢでプレートからこすり落とし、さらに使用するまで−８５℃で保存した。
破傷風毒素を用いるパニング
このライブラリーを、パニングにより抗破傷風毒素ラクダＶHHの存在についてスクリーニングした。その最後に、Ｍ１３Ｋ０７バクテリオファージを用いて感染させる前に、約１０9個の細胞（＝凍結組換えクローンの５ｍｌ懸濁液）を、１％グルコース及び１００μｇアンピシリン／ｍｌを補足した２００ｍｌのＬＢ培地中で対数中期まで成長させた。バクテリアファージを大腸菌細胞上に室温で３０分間吸着させた後、これらの細胞を遠心により回収し、アンピシリン及びカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ培地で洗浄した。これらの細胞を３７℃で一晩インキュベートし、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質の幾つか（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１）と融合したラクダＶHHを含むＭ１３ビリオン内にパッケージ化された組換えｐＨＥＮファスミドを分泌させた。Ｂａｒｂａｓら（１９９１）によって説明されるプロトコルに従いファージミドビリオンを調製した。このファージペレットをブロッキング溶液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中１％のカゼイン）に再懸濁させ、０．２μｍフィルターを通して無菌の管に濾過してパニングに用いた。パニングのため、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３０４６プレートをＰＢＳもしくは炭化水素ｐＨ９．６に溶解した０．２５ｍｇ／ｍｌもしくは２ｍｇ／ｍｌの破傷風毒素で一晩コートした。続いて、これらのウェルを洗浄し、残留するタンパク結合部位をブロッキング溶液を用いて室温で２時間ブロックした。固定化抗原へのファージミドビリオンの吸着並びに洗浄及び溶離条件はＭａｒｋｓら（１９９１）に従い、あるいはファルマシアの「組換えファージ抗体系（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）」に説明されるプロトコルから採用した。４回のパニングを連続して行った。第４回のパニングの後、溶離したファージミドビリオンを指数的に成長したＴＧＩ細胞（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１）に添加し、アンピシリン含有ＬＢプレート上に塗布した。一晩成長させた後、幾つかのコロニーを個別にＬＢ培地中で対数成長中期まで成長させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて感染させた。ビリオンを調製し、マイクロタイタープレートに固定化されている破傷風毒素に対するそれらの結合活性について試験した。固定化抗原に結合するビリオンの存在は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３結合体を用いるＥＬＩＳＡにより明らかにした。パニングの各回の後には結合パーセントが増加した。元のライブラリーの中には、固定化破傷風毒素との結合を示したクローンが９６個のうち３個見出された。この数は、第１回、第２回及び第３回のパニングの後には１１、４８及び８０に増加した。第４回のパニングの後に試験した個々のクローンは、ＥＬＩＳＡによる測定で、全て抗原を認識することが可能であった（図３）。１０個の陽性クローンを成長させ、ＶHH遺伝子の適正サイズを有するインサートの存在を調べるためにＰＣＲによって試験し、最後にそれらのＤＮＡの配列決定を行った。これらの配列決定データは、この１０個のクローンの組の中に２種類の異なるクローンが存在していることを明らかにした。これらのクローンのファスミドＤＮＡはｐＨＥＮ４−αＴＴ１及びｐＨＥＮ４−αＴＴ２（���のｐＨＥＮ４−αＴＴ２ファスミドＤＮＡは、ＬＭＢＰ３２４７の登録番号で１９９５年１月３１日に“ベルギアン・コーディネイティッド・コレクションズ・オブ・マイクロオーガニズムス（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）”ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託された）と命名され、これらの２種類の異なるクローンがラクダＶHHをコードするｃＤＮＡを有することが示された（図４）。これらのクローンのアミノ酸と以前に分析されたラクダＶHHクローン（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）との比較は、抗破傷風ラクダＶHHがＣＨ１ドメイン及び軽鎖を欠く重鎖免疫グロブリンに由来することを明瞭に示した。特に、１１位（Ｓｅｒ）、３７位（Ｐｈｅ）及び４５位（ＡｒｇもしくはＣｙｓ）及び４７位（ＬｅｕもしくはＧｌｙ）の鍵となる残基の同一性はこの主張（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）を裏付けた。
抗破傷風毒素活性を有する可溶性ラクダＶHHの製造
破傷風毒素ＥＬＩＳＡにおいて陽性と評価された２個のクローンのファスミドＤＮＡをＷＫ６細胞に形質転換した。これらの細胞は、ベクター内のデカペプチドタグと遺伝子ＩＩＩタンパク質との間に存在する終止コドンを抑制することができない。これらのｐＨＥＮ４−αＴＴ１又はｐＨＥＮ４−αＴＴ２ファスミドを有するＷＫ６大腸菌細胞を、３７℃で、１００ｍｇアンピシリン／ｍｌ及び０．１％グルコースを含む１リットルのＴＢ培地中で成長させた。細胞のＯＤ550が１．０に達したときに、５０００ｒｍｐで１０分間遠心することにより細胞を回収した。この細胞ペレットを、アンピシリンは含むもののグルコースは除いたＴＢ培地で１回洗浄した。最後に、これらの細胞をアンピシリン（１００μｇｒ／ｍｌ）を含む１リットルのＴＢ培地に再懸濁した。１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、２８℃で１６時間細胞をさらに成長させることによりラクダＶHHドメインの発現を誘発した。発現したタンパク質を、Ｓｋｅｒｒａ及びＰｌｕｃｔｈｕｎ（１９８８）によって説明されるプロトコルに従ってペリプラズム空間から抽出した。４０００ｇで１０分間（４℃）遠心することにより大腸菌細胞をペレット化した。これらの細胞を１０ｍｌのＴＥＳバッファー（０．２Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍショ糖）に再懸濁した。この懸濁液を氷上に２時間保持した。ペリプラズムタンパク質を、水で１／４に希釈した２０ｍｌＴＥＳを添加することによる浸透圧衝撃により除去した。この懸濁液を氷上に１時間保持した後、１２，０００ｇで３０分間、４℃で遠心した。その上清は発現したラクダＶHHドメインを含んでいた。４００μｌの細胞培養物に相当する抽出物を、還元条件下において、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドタンパク質ゲル上に塗布した。このＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル中において、クーマシーブルー染色により抽出タンパク質を可視化した（図５）。組換えクローンを含み、ＩＰＴＧで誘発された大腸菌培養物中には、１６，０００Ｄの見かけの分子量を有するタンパク質バンドが明らかに存在した。あるいは、ＩＰＴＧで抽出物中のラクダＶHHタンパク質の存在が明らかとなった。あるいは、特異的ウサギ抗ラクダＶHHもしくはウサギ抗ヒトコブラクダＩｇＧ血清又は抗タグ抗体を用いるウェスタンブロットにより、抽出物中のラクダＶHHタンパク質の存在が明らかとなった。
我々は、クーマシー染色ゲルにおいて観察されたバンド強度から、１０ｍｇを上回るラクダＶHHタンパク質（非精製）を１リットルの誘発大腸菌細胞のペリプラズムから抽出することができるものと見積る。
抗破傷風毒素ラクダＶHHを精製するため、ペリプラズム抽出物を限外濾過（５０００Ｄａのカットオフを有するミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）メンブラン）により１０回濃縮した。濾過の後、ｐＨＥＮ４−αＴＴ２からの濃縮抽出物を、その分子量に従い、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したスーパーデックス−７５（ファルマシア）を用いるゲル濾過により分離した（図６）。抗破傷風毒素活性を有するピークは期待される１６，０００Ｄａの分子量で溶出した。これは、このタンパク質が単量体として振る舞い、溶液中で二量体化しないことを示す。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した）純粋なＶHHをプールし、その濃度を、１．２及び２．３の算出Ｅ280（０．１％）をそれぞれαＴＴ１及びαＴＴ２に対して用いて分光光度法により測定した。プールした画分の２８０ｎｍでのＵＶ吸収から、細菌培養物１リットル当り６ｍｇの精製タンパク質の収量を算出することができた。この精製タンパク質は、ＵＶスペクトルで分かるように、凝集のいかなる徴候も示すことなく、限外濾過によりＰＢＳもしくは水中に６ｍｇ／ｍｌまでさらに濃縮することが可能であった。
大腸菌内での発現収量に関しては、我々はこの段階では発現又はタンパク質抽出条件を最適化しようとしていなかったことを理解すべきである。しかしながら、精製αＴＴ２ラクダＶHHの収量が細菌培養物当り６ｍｇに達し、可溶性蛋白質が６ｍｇ／ｍｌの濃度で得られたことから、その発現が大腸菌内で発現する他のｓｃＦｖ又はＦABに匹敵するか、もしくはそれを上回ることは明らかである。さらに、ラクダＶHHαＴＴ２の可溶性はマウスＶＨ断片について得られるものよりも確実に度良好である。収量及び可溶性は、確実に、大部分の用途に必要とされる範囲内にある。
精製タンパク質の適正な折り畳みを立証するため、αＴＴ２を３．９×１０-6Ｍの濃度とし、それをＣＤ測定に用いた（図７）。そのＣＤスペクトルは、十分に構造化された免疫グロブリンの折り畳み（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９０）について期待されるβ−ひだ付きシートの折り畳みを有するポリペプチドに特有のものであった。
ラクダ抗破傷風毒素ＶHHの親和性測定
マイクロタイタープレート上に固定されている破傷風毒素へのラクダＶHH抗体の結合を、最初にウサギ抗ラクダＶHH又はウサギ抗ヒトコブラクダＩｇＧ、次いでヤギ抗ウサギ／アルカリホスファターゼ結合抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と共に連続的にインキュベートすることにより明らかにした。ラクダＶHHタンパク質の破傷風毒素に対する見かけの親和性を、阻害ＥＬＩＳＡにより、大腸菌内で産生されたヒト抗破傷風毒素ＦAB断片についてＰｅｒｓｓｏｎら（１９９１）によってまさに説明される通りに評価した。
遊離抗原の結合と競合させるＥＬＩＳＡ実験から、可溶性ラクダＶHHの破傷風毒素に対する特異性が示唆された。ＶHH断片の両者について１０-7、１０-8Ｍ付近の見かけの阻害定数が観察された（図８）。これは、好ましいことに、１０-7ないし１０-9Ｍの範囲にあったＰｅｒｓｓｏｎら（１９９１）によってクローン化されたヒト抗破傷風毒素ＦAB断片の阻害定数に匹敵する。
しかしながら、Ｆｒｉｇｕｅｔら（１９８７）の手順に従って決定すれば、ＥＬＩＳＡによる親和定数の測定のほうが信頼をおくことができる。このプロトコルを用いて、αＴＴ１及びαＴＴ２のそれぞれについて６．１０7Ｍー1および２．１０7Ｍー1の親和定数が見出された。これらの親和性は特異的ＶHH−抗原相互作用と一致する（多特異的抗体は、一般に、それらの抗原と１０6Ｍー1以下の親和性で結合する（Ｃａｓａｌｉら、１９８９））。
αＴＴ１及びαＴＴ２のエピトープ認識
破傷風毒素は３つのドメインからなる。Ｃ断片はニューロン細胞に結合し、神経特異的結合ドメインであると言われる。Ｂドメインは、Ａドメイン、すなわちＬ鎖のニューロン侵入に関与するものと思われる（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ及びＳｃｈｉａｖｏ、１９９３）。このＬ鎖が細胞内活性の原因である。
Ｃドメインは破傷風毒素の最も免疫原性が高い部分であり、組換えＣ断片が市販されている（ベーリンガー・アンド・コールバイオケム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｌｂｉｏｃｈｅｍ）。ＥＬＩＳＡにより、αＴＴ１細菌抽出物が完全な破傷風毒素及び組換えＣ断片の両者に等しく良好に結合することが示された。反対に、αＴＴ２抽出物は完全な破傷風毒素には結合するものの、Ｃ断片には結合しない、したがって、αＴＴ２はＡ又はＢドメイン上に位置するエピトープを認識する。
破傷風毒素の毒性のイン・ビボでの中和
破傷風毒素に対する精製ラクダαＴＴ１又はαＴＴ２ＶHHドメインの中和活性を試験した。対照として、８匹の８ないし１２週齢のＮＭＲＩマウス（８０ないし１００ｇ）に０．１ｍｌのＰＢＳ中４００ｎｇの破傷風毒素（スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルズ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））（＝ＬＤ５０の１０倍）をＩ．Ｐ．注射した。ラクダＶHHαＴＴ１又はαＴＴ２の中和活性を試験するため、マウスへのＩ．Ｐ．注射に先立って、この精製組換えタンパク質４もしくは４０ｍｇを０．１ｍｌのＰＢＳ中４００ｎｇの破傷風毒素と共に３０分間予備インキュベートした。マウスの生存を２週間にわたって追跡した（図９）。破傷風毒素を単独で、あるいは非特異的精製ラクダＶHH（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４のｃＶＨ２１）の存在下において注射したマウスの全てが３日以内に死亡したことが明らかである。破傷風毒素を注射したマウスの生存は、僅か４ｍｇの精製ラクダαＴＴ１又はαＴＴ２を同時投与することにより有意に増加した。この生存は、破傷風毒素と４０ｍｇのラクダＶHHとの同時投与についてより顕著であった。αＴＴ１はαＴＴ２よりも僅かに高い中和活性を有していたようである。これは、破傷風毒素を結合するためのそれに固有の高い親和性に由来する可能性がある（Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９９０）。あるいは、αＴＴ１ＶHHが破傷風毒素の断片Ｃに結合する結果生じるものである可能性もある。この結合は、Ｃ断片の外部のエピトープへのαＴＴ２の結合よりも毒性効果を阻害する。
実施例ＩＩ：リゾチームに対する特異的ラクダＶHH断片の生成
破傷風毒素に対する特異性及び親和性を有する特異的ラクダＶHH断片の生成について実施例Ｉにおいて説明されるものと同じプロトコル（実施例Ｉのものを修正する具体的な工程及び条件は以下に示す）を用いて、リゾチームに対してＶHH断片が得られている。
ラクダ（カメルス・ドロメダリウス）を免疫するための抗原としてニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）を選択した。このタンパク質は、同じ抗原を認識する他の幾つかのマウスモノクローナル抗体断片との比較が可能であり、その抗原との複合体での構造さえ既知であることから選択した。
ラクダの免疫
ラクダの血清はリゾチームと反応しないことが示されている。このラクダに、１００μｇのリゾチーム（ベーリンガー）を第９、３０、５２、９０日に、５０μｇを第２２０、２９３及び４４９日に注射した。各注射の平均３日後に血液を採取した。
その後、以下の工程を実施例Ｉと同様に行った。
・ラクダの血液リンパ球のｍＲＮＡ精製。
・ラクダＶHH遺伝子のｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅。
・ラクダＶHHライブラリーの構築。
・リゾチームを用いるパニング（ファルコン３０４６プレートを１ｍｇ／ｍｌリゾチームでコートした）。
９６個のクローンを無作為に選択し、個別にＬＢ培地で成長させた。
ビリオンを調製し、マイクロタイタープレートに固定されているリゾチームに対するそれらの結合活性について試験した。
各回のパニングの後には結合パーセントが増加した。２０個の陽性クローンを成長させ、適正サイズのＶHH遺伝子を有するインサートの存在を調べるためにＰＣＲにより試験し、最後にそれらのＤＮＡの配列決定を行った。その配列決定データは、この１０個のクローンの組の中に２種類の異なるクローンが存在することを明らかにした。これらのクローンのファスミドＤＮＡはｐＨＥＮ４−αＬＹＳ２及びｐＨＥＮ４−αＬＹＳ３と命名され、これらの２種類の異なるクローンがラクダＶHHをコードするｃＤＮＡを含むことが示された（図１１、１２）。これらのクローンのアミノ酸を我々が以前に分析したラクダＶHHクローン（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）と比較することにより、この抗リゾチームラクダＶHHがＣＨ１ドメイン及び軽鎖を欠く重鎖免疫グロブリンに由来することが明瞭に示された。特に、１１位（Ｓｅｒ）、３７位（Ｐｈｅ）、４４位（Ｇｌｕ）、４５位（Ａｒｇ）及び４７位（Ｇｌｙ）の鍵となる残基の同一性はこの主張（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、１９９４）を裏付けた。
・抗リゾチーム活性を有する可溶性ラクダＶＨＨの製造
抗リゾチームラクダＶHHを精製するため、限外濾過（５０００Ｄａのカットオフを有するミリポア・メンブラン）によりペリプラズム抽出物を１０倍に濃縮した。濾過の後には、ｐＨＥＮ４−αＬＹＳ２からの濃縮抽出物をプロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーによって精製することが可能である。αＬＹＳ２ＶHHの溶離は１００ｍＭトリエタノールアミンで行う。溶出液のｐＨを１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で直ちに中和する。残念なことに、発現したα−ＬＹＳ３ＶHHはプロテインＡには結合しない。したがって、精製はアフィニティクロマトグラフィーによって行わなければならない。濃縮抽出物をＣＮＢｒ−セファロース（ファルマシア）に固定化した抗リゾチームのカラムにかける。抗リゾチームＶHHの溶離は１００ｍＭトリエタノールアミンを用いて行う。溶出液は上述の通り中和しなければならない。ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したスーパーデックス−７５（ファルマシア）でのゲル濾過により、両抗リゾチームＶHHをさらに精製することができる。抗リゾチーム活性を有するピークは１６，０００Ｄａの期待される分子量で溶出した。これは、このタンパク質が単量体として挙動し、溶液中で二量体化しないことを示す。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で）純粋なＶHHを含む画分をプールし、その濃度を分光光度法により測定した。細菌培養物１リットル当り５ｍｇの精製タンパク質という収量が算出された。この精製タンパク質は、ＵＶスペクトルから分かるように、凝集のいかなる徴候も示すことなく、限外濾過によりＰＢＳもしくは水中に１０ｍｇ／ｍｌまでさらに濃縮することが可能であった。
・ラクダ抗リゾチームＶHHの親和性の測定
遊離抗原との結合と競合させるＥＬＩＳＡ実験から、リゾチームに対する可溶性ラクダＶHHの特異性が示唆された。α−ＬＹＳ２及びα−ＬＹＳ２のそれぞれについて５．１０ー7及び５．１０ー8Ｍ付近の見かけの阻害定数が観察された。これらの親和性は特異的ＶHH−抗原相互作用と一致する（多特異性抗体は、一般に、それらの抗原と１０6Ｍー1以下の親和性で結合する）（Ｃａｓａｌｉら、１９８９）。
・α−ＬＹＳ２及びα−ＬＹＳ３のエピトープ認識
この２種類の抗リゾチーム活性を有するラクダＶHHが同じエピトープに結合するのか、あるいは異なるエピトープに結合するのかを分析するため、ＥＬＩＳＡにおいて相加結合（ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の技術（Ｆｒｉｇｕｅｔら、１９８９）を用いた。４０を上回る相加指数は抗原に同時に結合することが可能な抗体の対を示す。これに対して、２０未満の相加指数はエピトープが重複する抗体の対に特有のものである。我々のラクダα−ＬＹＳ２及びα−ＬＹＳ３は４５の相加指数を有していた。この実験から、α−ＬＹＳ２及びα−ＬＹＳ３はリゾチーム分子の異なるエピトープに結合するものと思われる。
実施例３：ラクダＶHHからの二価単特異的又は一価二特異的結合構築物の作製
ｐＨＥＮ−４細菌発現ベクターにクローン化された、破傷風毒素に対する特異性を有する（α−ＴＴ１もしくはα−ＴＴ２）、又はリゾチームに対する特異性を有する（α−ＬＹＳ２もしくはα−ＬＹＳ３）ラクダＶHHから、以下の特徴を有する構築物を作製した。
１．３つのＣｙｓ及びＣＨ２ドメインの一部を含むラクダ長ヒンジのＰｒｏＸ繰り返し配列を有するＶHH。これらの構築物は次の構築物の中間体として用いることもできる。
２．ｐＨＥＮ４における停止コドンが続く１つのＣｙｓを有するラクダの長ヒンジのＰｒｏＸ繰り返し配列を有するＶHH。これらは単特異性を有する二価の構築物である。
３．第２のＶHHが続くラクダの長ヒンジのＰｒｏＸ繰り返し配列（Ｃｙｓを含まず）と結合するＶHH。これらは、そのＶHHに応じて、二特異性を有する一価の構築物であるか、又は単特異性を有する二価の構築物である。
１．ラクダの長ヒンジ及びＣＨ２ドメインの一部を有するラクダＶHH
（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３）又は（ｐＨＥＮ４−α−ＴＴ２）プラスミドをＢｓｔＥＩＩ及びＸｍｎＩで消化した。ＢｓｔＥＩＩはラクダＶHHのフレームワーク４内を切断し、ＸｍｎＩはｐＨＥＮ４のβ−ラクタマーゼ遺伝子内を切断する。ラクダＶHHを含むこのＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離する。
ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（ストラタジェン）にクローン化された、未知の特異性を有するラクダＶHH、ラクダ長ヒンジ及びＣＨ２ドメインの第１の部分を含むクローンを同じ酵素（ＢｓｔＥＩＩ及びＸｍｎＩ）で切断し、ヒンジ及びＣＨ２の部分を含むＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離した。
これらの２つのＤＮＡ断片（一方は決定された特異性を有するＶHHを含み、他方はヒンジ及びＣＨ2ドメインのコーディング配列を含む）を混合し、互いにライゲートして大腸菌細胞の形質転換に用いた。その結果として、（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３−長ヒンジ−ＣＨ２）プラスミド及び（ｐＨＥＮ４−α−ＴＴ２−長ヒンジ−ＣＨ２）プラスミドが得られている。
２．二価の単特異的構築物（図１３、１５）
（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３  長ヒンジ−ＣＨ２）プラスミドを、プライマーＡ４及びＡＭ００７を用いる増幅のテンプレートとして採用した。
Ａ４（Ｓｆ  Ｉ部位に下線が付されている）：
0004394162.tif 000008
これらのプライマーは、それらの３’末端が、それぞれ、ＶHHの始点及びラクダ長ヒンジ配列の構造的に上部のヒンジの終点にアニールする。プライマーＡＭ００７は、（テンプレートに応じて）α−ＬＹＳ３又はα−ＬＹＳ２遺伝子の３’末端をＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣで伸長する。ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ部位に下線が付されている。ＮｏｔＩ部位までのこれらのヌクレオチドはアミノ酸ＰｒｏＭｅｔＧｌｕＣｙｓをコードする。
このＰＣＲ断片をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで二重に消化し、得られた断片を同じ酵素で開裂したｐＨＥＮ−４ベクターにクローン化する。このライゲートした材料をＷＫ６大腸菌細胞に形質転換し、アンピシリンで選択する。これらの形質転換されたクローンを、ＰＣＲ及び配列決定により、それらのインサートについて調べる。プラスミド（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３−長ヒンジ／Ｃｙｓ）及び（ｐＨＥＮ４−α−ＴＴ２−長ヒンジ／Ｃｙｓ）が生じた。
長ヒンジ内のＣｙｓ残基間にジスルフィド結合が形成されるため、発現したＶHHα−ＬＹＳ３−長ヒンジ／Ｃｙｓ又はα−ＴＴ２−長ヒンジ／Ｃｙｓタンパク質の抽出は二量体化分子の単離につながる。ラクダＶHH二量体構築物（α−ＬＹＳ３長ヒンジ／Ｃｙｓ）2及び（α−ＴＴ２長ヒンジ／Ｃｙｓ）2の両者はＩＰＴＧでの誘発により大腸菌内で十分に発現し、周辺質から容易に得られる。これらは非常に可溶性であり、元の抗原と高い親和性及び高い特異性で結合する。
３．一価二特異的タンパク質構築物（図１４、１６）
前述のプラスミド構築物（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３−長ヒンジ／Ｃｙｓ）及び（ｐＨＥＮ４−α−ＴＴ２−長ヒンジ／Ｃｙｓ）にはＮｃｏＩの２つの制限部位が存在する。このプラスミドをこの酵素で消化することにより、長ヒンジが続くもののＣｙｓコドンは含まないラクダＶHH遺伝子を単離することが可能となる。（α−ＬＹＳ３−長ヒンジ）断片をＮｃｏＩで直線化されたｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ２又はｐＨＥＮ４−α−ＴＴ２プラスミドにライゲートすることによりプラスミド（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３−長ヒンジリンカー−α−ＬＹＳ２）又は（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３−長ヒンジリンカー−α−ＴＴ２）が作製される。この遺伝子の発現は、ラクダ長ヒンジの構造的に上部のヒンジをベースとするリンカーを介してα−ＬＹＳ２ＶHH又はα−ＴＴ２ＶHHに結合するα−ＬＹＳ３ＶHHの生成につながる。
このプロトコルに従い、α−ＬＹＳ２のラクダＶHHに結合するα−ＬＹＳ３のラクダＶHHからなる一価二特異的タンパク質及びα−ＴＴ２のラクダＶHHに結合するα−ＬＹＳ３のラクダＶHHからなる一価二特異的タンパク質を単離することができる。これらのタンパク質の両者は大腸菌内で十分に発現し、ペリプラズムから抽出することが可能である。ＥＬＩＳＡにおいて、後者のタンパク質の破傷風毒素及びリゾチームに対する結合特性を示すことができる。
近い将来、これらの遺伝子構築物を用いて、いずれかのＶHHを別の特異性を有する他のあらゆるＶHHに交換することが可能に、かつ容易になる。
・例えば、このプラスミドをＰｓｔＩ又はＮｃｏＩで消化し、ＶHH−長ヒンジリンカーを含むＤＮＡ断片をＰｓｔＩ又はＮｃｏＩのいずれかで直線化したｐＨＥＮ４−ＶHHにライゲートすることにより第２のラクダＶHHを交換することができる。
・同様に、（ｐＨＥＮ４−α−ＬＹＳ３−長ヒンジリンカー−α−ＬＹＳ２）プラスミド構築物に由来する第１のラクダＶHHα−ＬＹＳ３遺伝子を（ｐＨＥＮ４−α−ＴＴ１−長ヒンジリンカー−α−ＬＹＳ２）に交換した。これは、プラスミドをＢｓｔＥＩＩで切断し、さらに、（長ヒンジリンカー−α−ＬＹＳ２）を含むＤＮＡ断片をＢｓｔＥＩＩで直線化した（ｐＨＥＮ４−α−ＴＴ１）プラスミドにライゲートすることにより行った。
・このプロトコルを僅かに変更して、多価構築物を生成させることさえ可能になる。この場合、（ＶHH−長ヒンジリンカー−ＶHH）プラスミドをＢｓｔＥＩＩで消化し、（長ヒンジリンカー−ＶHH）遺伝子を含むＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離する必要がある。ＢｓｔＥＩＩの認識部位における非対称性のため、自己ライゲーションによる全体的なライゲーションだけを行わせることが可能である。その後、この自己ライゲートしたＤＮＡを（前サイズ選別を行い、もしくは行うことなく）ＢｓｔＥＩＩで直線化したｐＨＥＮ４−ＶHHプラスミドにライゲートする。これにより、（ｐＨＥＮ４−［ＶHH−長ヒンジリンカー］n）型のプラスミドが作製される。
先行する例において引用された参考文献
Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，６９７−６９８．
Ｃａｓａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，５１３−５３６．
Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６０，３５１  ｅｔ（１９８９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｄ．Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ｐ．２８７−３１０）．
Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，１３６２−１３６７．
Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３，４４６−４４８．
Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４１３３−４１３７．
Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｗ．Ｃ．，（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，２０５−２１４．
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）５ｔｈ  Ｅｄ．
Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７．
Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ＆  Ｓｃｈｉａｖｏ（１９９３）ＴＩＢＳ  １８，３２４−３２９．
Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７，８０９５−８０９９．
Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，２４３２−２４３６．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２５４，９８−１０３．
Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０３８−１０４０．
【図１】
0004394162.tif 000011
【図２】
0004394162.tif 000012
【図３】
0004394162.tif 000013
【図４Ａ】
0004394162.tif 000014
【図４Ｂ】
0004394162.tif 000015
【図５】
0004394162.tif 000016
【図６】
0004394162.tif 000017
【図７】
0004394162.tif 000018
【図８】
0004394162.tif 000019
【図９】
0004394162.tif 000020
【図１０】
0004394162.tif 000021
【図１１】
0004394162.tif 000022
【図１２】
0004394162.tif 000023
【図１３Ａ】
0004394162.tif 000024
【図１３Ｂ】
0004394162.tif 000025
【図１４Ａ】
0004394162.tif 000026
【図１４Ｂ】
0004394162.tif 000027
【図１５Ａ】
0004394162.tif 000028
【図１５Ｂ】
0004394162.tif 000029
【図１６Ａ】
0004394162.tif 000030
【図１６Ｂ】
0004394162.tif 000031
【図１６Ｃ】
0004394162.tif 000032