(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体と、カゼイン及び／又はホエイ蛋白と、アミド基、スルホ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を含有する緩衝剤とを含有してなり、ｐＨが５．５〜７．０であることを特徴とする免疫測定法によるＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の含有量測定に用いる標準液用の抗原含有水溶液。
【請求項２】
カゼイン及び／又はホエイ蛋白濃度が、抗原含有水溶液の重量を基準として、０．０１〜３％である請求項１に記載の抗原含有水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原を含有した溶液中での抗原の失活を防止し、安定して保存することができる抗原含有水溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定を行う際には、抗原を含有した標準液をキャリブレーターとして用いるのが一般的である。通常、この標準液中に含まれる抗原は希薄であるため、抗原種によっては溶液中で著しく失活する場合がある。特に、ホルモンや酵素などの抗原溶液は失活が激しく、水溶液状のキャリブレーターとして用いるのには困難な場合が多い。このような場合には、凍結乾燥などの方法で水分を除去した形態で保存し、使用時に水を加えてこの個体を溶解する方法や、牛血清アルブミンや動物血清などのタンパク質を添加して水溶液中での安定性を確保する方策がとられてきた（非特許文献１、２）。
【非特許文献１】佐々木  實，免疫化学的同定法（第３版），東京化学同人，１９９３
【非特許文献２】石川榮治，超高感度酵素免疫測定法，学会出版センター，１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら従来の凍結乾燥による方法では、保存安定性は良いが使用時に水を加えなければならないため操作が煩雑となり、結果として標準液中の抗原濃度に誤差を生じやすい。また、特にＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体水溶液を標準液とする場合には、牛血清アルブミンや動物血清などのタンパク質を添加しても、溶液中でのＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の安定性が悪く、長期間の保存安定性を確保することが困難である。すなわち本発明の目的は、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体を水溶液中で安定に保存することができる組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の抗原含有水溶液の特徴は、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体と、カゼイン及び／又はホエイ蛋白と、アミド基、スルホ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を含有する緩衝剤とを含有してなり、ｐＨが５．５〜７．０であることを要旨とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の抗原含有水溶液は以下の効果を奏する。
（１）失活し易いＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体を、溶液状態で長期間安定して保存することができる。
（２）従来行われた凍結乾燥しなくとも安定性を長期間維持できるようになり、抗原を溶解するという煩雑な調製操作により生じる濃度の誤差がなくなり、測定精度と再現性が良い免疫測定ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
ヒト由来のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体は、心筋細胞で合成されるナトリウム利尿ペプチド前駆体（ｐｒｏＢＮＰ）の分解物であり、７６個のアミノ酸から構成される。
本発明に使用するＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の由来には特に限定が無く、組織より抽出された天然物以外にも、遺伝子組み換え物や化学合成物を使用することが出来る。これらの抗原は、ＨｙＴｅｓｔ社やＩｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋＡＧ社等より市販されている。
【０００７】
Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の含有量は、抗原含有水溶液の重量を基準として１０ｍｇ／ｇ以下であれば、任意の濃度で使用することが出来るが、血液中のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体を定量する際に必要な濃度域の観点から、抗原含有水溶液の重量を基準として、１０ｐｇ／ｇ〜１μｇ／ｇが好ましく、さらに好ましくは１００ｐｇ／ｇ〜１００ｎｇ／ｇ、次にさらに好ましくは１ｎｇ／ｇ〜１０ｎｇ／ｇである。
【０００８】
カゼインとしては、牛乳中のカゼインが含まれ、例えば、「第五版食品添加物公定書解説書（廣川書店発行）」記載のカゼインを用いることができる。具体的には、α−カゼイン、β−カゼイン、γ−カゼイン、κ−カゼイン、λ−カゼインをあげることができる。
【０００９】
カゼインの濃度は、抗原含有水溶液中のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の保存安定性の観点から、抗原含有水溶液の重量を基準として、０．０１％〜３％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２．５％、次にさらに好ましくは０．５〜２％である。
【００１０】
ホエイ蛋白としては、牛乳中のホエイ蛋白が含まれ、例えば、「食品衛生法  乳及び乳製品の成分規格に関する省令」に記載されている濃縮ホエイやホエイパウダーを用いることができる。
【００１１】
ホエイ蛋白の濃度は、抗原含有水溶液中のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の保存安定性の観点から、抗原含有水溶液の重量を基準として、０．０１％〜３％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２．５％、次にさらに好ましくは０．５〜２％である。
【００１２】
本発明の抗原含有水溶液は、カゼイン及びホエイ蛋白をそれぞれ単独で使用することが出来るが、カゼイン及びホエイ蛋白を併せて使用することも出来る。併せて使用する場合のカゼイン及びホエイ蛋白の合計濃度は、抗原含有水溶液中のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の保存安定性の観点から、抗原含有水溶液の重量を基準として、０．０１％〜３％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜２．５％、次にさらに好ましくは０．５〜２％である。
【００１３】
カゼインとホエイ蛋白を共存させることにより、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体を含有する水溶液の保存安定性を更に向上させることができる。この時の濃度は、カゼイン０．５％〜１．２５％、ホエイ蛋白０．５％〜１．２５％が好ましく、特に好ましくは、カゼイン０．２５％〜０．６３％、ホエイ蛋白０．２５％〜０．６３％である。
【００１４】
本発明の抗原含有水溶液のｐＨは、５．５〜７．０であり、抗原含有水溶液中のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の保存安定性の観点から、５．８〜６．９が好ましく、さらに好ましくは６．１〜６．８である。
ｐＨが５．５未満では、カゼイン及び／又はホエイ蛋白の安定性が悪くなり、ｐＨが７．０を越えるとＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の保存安定性が悪くなる。
なお、ｐＨは、ＪＩＳ  Ｋ０４００−１２−１０：２０００で測定できる（測定温度２５℃）。
【００１５】
上記の範囲に抗原含有水溶液のｐＨを調整するには、後述する緩衝剤を用いてｐＨを調整することで行える。
ｐＨの調整は、一般的な緩衝液の作製方法と同様に、緩衝剤の水溶液に無機アルカリの水酸化物を用いて行われる。無機アルカリの水酸化物としては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、水酸化リチウム等が挙げられる。
【００１６】
本発明の抗原含有水溶液に含まれる緩衝剤としては、Ｇｏｏｄ緩衝液として知られる緩衝剤を使用することが好ましい。Ｇｏｏｄ緩衝剤の中でも、ｐＨ５．５〜７．０の間に緩衝能をもつ緩衝剤が保存安定性の観点から好ましい。
【００１７】
水溶液中の抗原安定の観点から、緩衝剤はアミド基、スルホ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を含有する緩衝剤を含有する。
緩衝剤は２種以上を併用してもよいが、水溶液中の抗原安定の観点から、１種を使用することが好ましい。
【００１８】
アミド基を含有する緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（以下、ＡＤＡと略す。後述の化合物名の括弧内の表記は同様に略号を示す。）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）等が含まれる。
【００１９】
スルホ基を含有する緩衝剤としては、２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等が含まれる。
【００２０】
カルボキシル基を含む緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）が等含まれる。
【００２１】
これらのうち、水溶液中の抗原安定の観点から、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳが好ましく、さらに好ましくはＡＤＡ、ＡＣＥＳ、次にさらに好ましくはＡＤＡである。
【００２２】
本発明の抗原含有水溶液は、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体、カゼイン及びホエイ蛋白、並びに緩衝剤を混合することで得られる。
混合方法としては、従来の抗原含有水溶液を製造する際と同様の方法でよい。
本発明の抗原含有水溶液は、製造のし易さや、製造時におけるＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の失活防止の観点から、緩衝液を作製した後でカゼイン及び／又はホエイ蛋白を添加混合して溶解させ、次いでＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体を添加混合する方法が好ましい。
【００２３】
本発明の抗原含有水溶液は、臨床検査の分野において酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、或いは免疫比濁法等の免疫測定を行う時に用いることができる。特に、抗原を含有した溶液中の抗原の失活を防止し、安定して保存することができることから、標準液として好適に使用できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
ａ）抗原含有水溶液の作製
常法により１００ｍＭのＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．６）を作製した。次いで、抗原含有水溶液の重量に対してそれぞれの濃度がカゼイン（牛乳製）０．５重量％、ホエイ蛋白（牛乳製）０．５重量％となるように加えて加熱溶解させた。
均一溶解を確認後に、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体を５０００ｐｇ／ｇとなるように添加し、抗原含有水溶液１を作製した。
ｂ）保存安定性の評価
作製した抗原含有水溶液１を４℃と２５℃で保存し、作製時、３カ月目、６カ月目、１２カ月目のＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体濃度を、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体測定試薬｛三洋化成工業（株）製｝で測定し、濃度の変化を調べた。結果を表２に示す。
【００２５】
＜実施例２〜９及び比較例１〜３＞
実施例１において、緩衝液の種類、ｐＨ、カゼイン、ホエイ蛋白及びＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の濃度を表１に示す値にした以外は実施例と同様にして、抗原含有水溶液２〜９及び比較抗原含有水溶液１〜３を得た。これらについて、実施例１と同様に評価し、その結果を表２に示す。
【００２６】
【表１】
0004568334.tif 000002
【００２７】
【表２】
0004568334.tif 000003
【００２８】
本発明の抗原含有水溶液は、比較用の抗原含有水溶液に比べて、Ｎ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体の濃度変化が少なかった。特に、実施例１、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７においては、１２ヶ月後でも非常に安定であった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の抗原含有水溶液は以下の効果を奏する。
（１）失活し易いＮ末端脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体を、溶液状態で長期間安定して保存することができる。
（２）従来行われた凍結乾燥しなくとも安定性を長期間維持できるようになり、抗原を溶解するという煩雑な調製操作により生じる濃度の誤差がなくなり、測定精度と再現性が良い免疫測定ができる。
よって、本発明の抗原含有水溶液は、臨床検査の分野において酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、或いは免疫比濁法等の免疫測定を行う時に用いることができる。特に、抗原を含有した溶液中の抗原の失活を防止し、安定して保存することができることから、標準液として好適に使用できる。