(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハプトグロビンに結合することが可能な非架橋ヘモグロビンと、ヘモグロビンに結合した肝細胞修飾物質とを含むヘモグロビン複合体。
【請求項２】
肝細胞修飾物質が化学リンカーの媒介によりヘモグロビンに結合している、請求項１に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項３】
肝細胞修飾物質が肝細胞と相互作用可能で、かつ治療薬、診断薬およびマーカーから選択された薬剤である、請求項１又は２に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項４】
肝細胞修飾物質が、抗新生物物質、抗ウイルス物質、抗炎症物質、抗寄生虫物質、抗菌物質、抗酸化物質、肝防護薬、細胞防護薬、線維形成に影響をおよぼす薬、核酸、脂質代謝薬、抗毒物、蛋白質および酵素から選択される治療薬である、請求項３に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項５】
肝細胞修飾物質が核酸である、請求項４に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項６】
肝細胞修飾物質が興味対象となる蛋白質をコードする遺伝子である、請求項５に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項７】
肝細胞修飾物質がプトレッシンである、請求項４に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項８】
肝細胞修飾物質がプリマキンである、請求項４に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項９】
肝細胞修飾物質が抗ウイルス物質からなる、請求項４に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項１０】
肝細胞修飾物質がアラ−ＡＭＰ、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リバビリン、シタラビン、アシクロビル、ジドノシン、ビダラビン、アデフォビル、ザルシタビン、ラミブジン、フィアルブリジン、および他のヌクレオシド類縁体からなる群から選択される、請求項９に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項１１】
肝細胞修飾物質が診断薬である、請求項３に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項１２】
診断用化合物が放射性同位体標識された化合物または蛍光化合物である、請求項１１に記載のヘモグロビン複合体。
【請求項１３】
請求項１に記載のヘモグロビン複合体と、ヘモグロビンに結合したハプトグロビンとを含むヘモグロビン構築物複合体。
【請求項１４】
請求項２から１２のいずれか一項に記載のヘモグロビン複合体と、ヘモグロビンに結合したハプトグロビンとを含むヘモグロビン構築物複合体。
【請求項１５】
哺乳類患者に請求項１から１２のいずれか１項に記載の複合体を投与することによってインビボで形成された、請求項１から１２のいずれか一項に記載のヘモグロビン複合体と、ヘモグロビンに結合したハプトグロビンとを含む、ヘモグロビン構築物複合体。
【請求項１６】
肝細胞修飾物質と非架橋ヘモグロビンとの反応、及びハプトグロビンと非架橋ヘモグロビンとの反応により、生体外で形成された、請求項１３又は１４に記載のヘモグロビン構築物複合体。
【請求項１７】
哺乳類患者における医学的状態であり、肝細胞修飾物質が治療に有効な治療薬である医学的状態、を治療するための医薬品の調製における、請求項１から１２のいずれか１項に記載のヘモグロビン複合体又は請求項１３から１６のいずれか一項に記載のヘモグロビン構築物複合体の使用。
【請求項１８】
医学的状態が肝細胞障害である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ヘモグロビン構築物複合体が細胞のヘモグロビン−ハプトグロビン受容体と相互作用する、請求項１７又は１８に記載のヘモグロビン構築物複合体の使用。
【請求項２０】
ヘモグロビン構築物複合体が細胞のヘモグロビン−ハプトグロビン受容体と相互作用し、隣接する細胞や組織に効果を発揮する、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２１】
哺乳類患者における肝細胞障害であり、肝細胞修飾物質が診断薬である肝細胞障害、を診断するための医薬品の調製における、請求項１から３、１１、１２のいずれか一項に記載のヘモグロビン複合体、又は請求項１３から１６のいずれか一項に記載のヘモグロビン構築物複合体の使用。
【請求項２２】
哺乳類患者におけるヘモグロビン−ハプトグロビン受容体を有する転移細胞であり、肝細胞修飾物質が転移の治療に有効な治療薬である転移細胞を治療するための医薬品の調製における、請求項１から４のいずれか一項に記載のヘモグロビン複合体、又は請求項１３から１６のいずれか一項に記載のヘモグロビン構築物複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、蛋白質複合体および医学的応用におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、体の特定の部分および／または臓器に対する治療作用を有する、薬物、遺伝子、その他などの治療用物質とのヘモグロビン化合物の複合体、ならびにそのような複合体を体の特定の部分および臓器を標的として送る手段に関する。同様に、撮像剤などの診断用物質とのヘモグロビンの複合体も本発明の範囲内である。
【０００２】
発明の背景および従来技術
ヘモグロビンおよび修飾ヘモグロビンの薬物送達手段としての使用が以前に提唱されている。赤血球の本来の成分としてのヘモグロビンは、体全体に比較的大量に存在して循環しており、はっきりと確認された生体容認性と、薬物を体全体に送達する可能性とを有している。
【０００３】
したがって、Ｋｌｕｇｅｒらは米国特許第５３９９６７１号において、ヘモグロビン化合物の４量体構造の分子内安定性を得るために架橋されているが、送達するための薬物が共有結合できる官能性残基をクロスリンカー残基上に含むヘモグロビン化合物を記載している。
【０００４】
Ａｎｄｅｒｓｏｎらは米国特許第５６７９７７７号において、ヘモグロビン化合物とポリペプチド薬物との複合体を記載しており、この複合体においてポリペプチド薬物は、グロビン鎖に固有の、または遺伝子工学的に導入されたシステインユニットへのジスルフィド結合を介して、グロビン鎖に結合されている。
【０００５】
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、血清糖蛋白質の α2−グロビンファミリーの一部を構成している。ハプトグロビンは哺乳類の血漿中に存在し、ヒト血漿の α2−グロブリン画分の約４分の１を占める。個人はそれぞれ、緊密な構造的・化学的同一性を持つ、ハプトグロビンの３つの表現型の１つを有している。ハプトグロビンは複数のαβ２量体からなり、表現型は通常Ｈｐ１−１、Ｈｐ２−１、およびＨｐ２−２と表される。β鎖はすべてのハプトグロビン表現型で等しいが、α鎖は異なる（α1 およびα2 ）。すべての鎖のアミノ酸配列が知られている。Ｈｐ１−１は２つの α1β２量体からなり、分子量約９８ｋＤａである。Ｈｐ２−１およびＨｐ２−２の構造は次のとおりに書くことができる：それぞれ、(α1β)2(α2β)n、ただしｎ＝０、１、２、・・・および(α2β)m、ただしｍ＝３、４、５、・・・。
【０００６】
主に身体の１つの部分または１つの臓器に影響をおよぼす疾患または障害を患う患者への薬物送達は、治療を必要とする部分または臓器を高特異的に標的とする送達法を選択することによって、最もうまく達成される。そのような送達システムは、活性薬物を最も効果的に利用して、必要な用量レベルを低下させ、薬物の副作用を低下させる。
【０００７】
ハプトグロビンの１つの機能は、赤血球の溶解から生じる細胞外ヘモグロビンを結合し、肝臓の肝細胞上の特異的受容体によって認識される、本質的に不可逆的なハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成することである。このようにして、ヘモグロビンは肝臓を標的として送られ、代謝を受ける。
【０００８】
遺伝子および遺伝子産物の調節および操作は、様々な疾患および遺伝的障害の治療のための強力な手段となる可能性がある。細胞に特別に導入されているとき、遺伝子はそれがコードする治療用生体分子を発現するために宿主細胞の生合成装置を利用することができる。遺伝子治療を成功させるためには、インビボでの遺伝子送達の有効な方法を考案しなければならない。最近開発されたそのような技法の一つに、受容体仲介送達がある。これは、標的受容体を発現する細胞に、高特異的に送達されるという利点を有している。
【０００９】
低分子量の治療薬および診断薬の組織への特異的ターゲティング(targeting)は、受容体仲介送達の利用によりおおいに強化される。蛍光または放射性同位体標識された物質などの診断薬を標的受容体のリガンドとの複合体として投与すると、それら標的受容体を有する細胞の位置と量が示される。これらの複合体は、培養中の細胞における受容体の結合および輸送特性を特徴付ける際にも有用である。このような情報は、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、認識される細胞を含む組織の検出および／またはその治療設計において有用である。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的は、治療上活性な物質または診断薬とのヘモグロビン−ハプトグロビン複合体の受容体を有する肝細胞または他の細胞の特異的ターゲティングのための手段および組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、インビボで、哺乳類患者の肝臓に対して有益な効果を発揮するように選択された物質と、肝細胞を特異的に標的とする物質との新規な複合体を提供することである。
【００１２】
本発明は、肝細胞修飾剤が結合しているハプトグロビン−ヘモグロビン構築物複合体について記載する。このようなハプトグロビン−ヘモグロビン構築物複合体は、特定の肝細胞修飾剤（薬物、診断薬、撮像化合物、その他）を肝臓、および適当なヘモグロビン−ハプトグロビン受容体を有する他の細胞に送達するために、結合した薬剤のための有効な肝細胞ターゲティング媒体としてはたらく。
【００１３】
「構築物複合体」という表現は、本明細書では生物活性のある治療薬または診断薬が結合しているヘモグロビンとハプトグロビンとの組み合わせを指すために用いられる。本発明は、ヘモグロビン化合物、ハプトグロビン、および薬物、診断薬または遺伝子などの興味対象となる肝細胞修飾物質からなる構築物複合体を提供する。本発明の１つの態様において、構築物複合体を生体外で調製し、次いで患者に投与する。別の態様において、ヘモグロビン−肝細胞修飾物の複合体を体外で調製し、患者に投与し、患者の血清中に本来存在するハプトグロビンとハプトグロビン−ヘモグロビン−肝細胞修飾物質の構築物複合体を形成する。さらに別の態様において、ヘモグロビン−肝細胞修飾物質−構築物複合体の投与前、投与中、または投与後のいずれかに、知られている手法のハプトグロビン投与によって患者のハプトグロビンレベルを補足することができる。いずれの場合にも、構築物複合体は、そのハプトグロビンおよびヘモグロビン部分の存在によって、リガンドとして肝細胞受容体に特異的に標的を定め、結合する。
【００１４】
エクスビボまたはインビボのいずれかで形成された本発明の構築物複合体は、Ｈｂ−Ｈｐ複合体の受容体を有するいかなる細胞も標的とし、これは原発性肝細胞癌から生じた転移も含む。このような癌は全身に分布し、サイズが小さいため、転移を特定して治療することは、通常困難である。このような受容体を有する二次肝転移、すなわち肝臓外の肝細胞癌細胞も、肝臓の細胞と同様に、本発明の構築物複合体によって標的とされ、本明細書において用いられる用語の「肝細胞」とみなされるべきである。
【００１５】
さらに、本発明の構築物複合体は、肝細胞修飾物質が、例えば、隣接する細胞に対し、それらが肝細胞ではなくても活性を有する薬物である場合、隣接する細胞にも有益な効果を発揮することができる。また、構築物複合体は、肝細胞修飾のために他の方法で送達された、プロドラッグ、酵素、もしくは酵素をコードし、効果を引き出すために活性化を必要とする遺伝子などの、他の治療薬または診断薬の活性を調節または開始させることができる。肝細胞の修飾または他の薬剤もしくは細胞に対する効果を引き起こすこのような作用をもたらす薬剤は、本発明の肝細胞修飾剤である。
【００１６】
本発明の構築物複合体は、一般には下記の式によって表すことができる：
(Ｈｐ)a − (Ｈｂ)b − (Ｌc−Ａd)e
式中、ａ＝１〜約１０であり；
ｂ＝０．５〜約１０であり；
ｃ＝０〜約１０であり；
ｄ＝１〜約２０であり；
ｅ＝１〜約２０であり；
Ｈｐは本明細書に記載のハプトグロビンであり；
Ｈｂは本明細書に記載のヘモグロビンであり；
Ｌは本明細書に記載のリンカーであり；かつ
Ａは本明細書に記載の肝細胞修飾剤であり、
複合体中のＨｐのＨｂに対する化学量論は、２つの蛋白質上にある結合部位の利用可能な数によって規定されるが、一般にはおよそ１：０５〜１：２程度である。
【００１７】
好ましい実施形態の説明
広範囲の肝細胞修飾物質を、本発明の複合体において用いることができる。これらは、肝細胞と相互作用可能で、その結果、肝臓においてインビボで作用可能な、治療薬、診断薬、マーカーまたはこれらに類するものでありうる。これらは、正常な肝臓の細胞または転移を経たそのような細胞の治療のために設計することができる。したがって、肝細胞修飾物質は、抗新生物物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、リシン、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ａ）、抗ウイルス物質（例えば、アラ−ＡＭＰ、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リバビリン、シタラビン、アシクロビル、ジドノシン、ビダラビン、アデフォビル、ザルシタビン、ラミブジン、フィアルブリジン、および他のヌクレオシド類縁体）、抗炎症物質、抗寄生虫物質、抗菌物質、抗酸化物質、肝防護薬、撮像および診断薬、遺伝子療法を達成するための核酸およびその化合物、脂質を代謝させる薬剤、抗毒物、蛋白質、酵素、酵素およびプロドラッグの組み合わせ、ならびにこれらに類するものでありうる。
【００１８】
本発明の構築物複合体において有用な診断薬の例には、放射性同位元素で標識したリジンおよびプトレッシン、ならびに蛍光化合物のモノダンシルカダベリンおよびフルオレセインが含まれる。低分子量の治療薬を選択的に細胞に向け、非標的組織での副作用および血管クリアランスを最小にすることもできる。本明細書における治療薬の例には、細胞成長および活性のモジュレーターであるプトレッシンと、抗マラリア物質であるプリマキンとが含まれる。
【００１９】
より具体的には、本明細書の構築物複合体において用いることができる肝細胞修飾物質には、慢性肝損傷から肝硬変への動的プロセスである肝線維症を治療または予防するための薬剤、ならびにウイルス性肝炎やアルコール性および潜源性肝疾患を含む他の慢性肝障害を治療または予防するための薬剤が含まれる。これらの肝細胞修飾物質には、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、プロスタグランジンＥ１、Ｅ２、Ｉ２およびその類縁体、コルヒチン、ならびにシリマリンなどの細胞防護薬が含まれ、これらはすべて肝臓の損傷からの防護において効果的で、抗線維形成特性を有することが示されている。本発明の範囲内の肝細胞修飾物質である、他の肝臓防護物質には、グルタチオン、ＳＡ  ３４４３（環状二硫化物）、Ｓ−アデノシルメチオニン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、α−トコフェロール、ビタミンＣ、デフェロキサミン、（＋）シアニダノール−３、マンニトール、トリプトファン、パンテテイン、パントテン酸、シスタミン、システイン、アセチルシステイン、フォリン酸、ウリジンモノリン酸、硫酸亜鉛、シザンドリンＢおよびコプシニンなどのフリーラジカル捕捉剤／抗過酸化剤；前述のプロスタグランジンおよびその類縁体ジメチルＰＧＥ、ミソプロストールおよびエニソプロスト、ならびにプロスタサイクリンＰＧＩ２およびその類縁体イロプロストなどのリポキシゲナーゼ阻害剤；トリフルオロペラジン、ベラパミル、ニフェジピンおよび関連のジヒドロピリジン化合物、ならびにジルチアゼムなどのカルシウムチャネル遮断薬；プロテイナーゼ阻害剤；心房性ナトリウム排泄増加ペプチ； α2−マクロフェトプロテイン；合成直鎖テルペノイド；プトレッシン；コレスチラミン；ε−アミノカプロン酸；フェニルメチルスルホニルフッ化物；ペプスタチン；グリチルリチン；果糖１，６−２リン酸；およびウルソデオキシコール酸が含まれる。
【００２０】
本発明の複合体の成分として有用なヘモグロビン化合物は、患者または動物への投与のために必要な程度の生体適合性、興味対象となる肝細胞修飾物質の結合に必要な部位を提供し、ハプトグロビンに対して十分な結合親和性を有する、実質的にいかなるヘモグロビン化合物であってもよい。これらの制限の中で、これはヒトまたは動物由来の天然ヘモグロビンであってもよい。これは修飾された天然ヘモグロビン、例えばその２量体への解離を最小にするための分子内架橋型ヘモグロビン、オリゴマー型または重合体型であってもよい。これは天然のグロビン鎖または簡単な方法で変異されたグロビン鎖を有する、組換源および技法から誘導されたヘモグロビンであってもよい。これは、ハプトグロビンに親和性を有する、Ｈｂのサブユニットもしくはフラグメント、またはその誘導体からなっていてもよい。これはグロビン鎖の個々のアミノ酸が部位特異的突然変異生成または他の手段によって除去または置換されているヘモグロビンであってもよい。ハプトグロビンへの結合に対するヘモグロビンの親和性を低下させることが知られている特定の修飾は、本発明において用いられるヘモグロビン化合物では避けることが好ましい。
【００２１】
好ましいヘモグロビン化合物の１つの型は、２量体への解離を防ぐために分子内架橋されているヘモグロビン４量体を含み、官能基を、肝細胞修飾物質との化学反応に直接または化学リンカー分子を介してのいずれかで利用できる状態にしているものである。このようなヘモグロビン化合物は、興味対象となる治療用物質に特異的な、既知の調節された数の反応部位を提供するため、正確に調節された量の治療用物質を所定量のヘモグロビン化合物に結合することができるという利点を有する。また、これらは治療用活性物質に連結するためにグロビン鎖上の部位を利用することを避けて、グロビン鎖の立体配座崩壊を最小にし、ヘモグロビン−ハプトグロビンの結合、および構築物複合体の肝細胞上の受容体蛋白質への結合の妨害を最小にするという追加の利点も有する。
【００２２】
ヒトヘモグロビン、例えば、期限を過ぎた赤血球から得、Ｐｌｉｕｒａらの米国特許第５４３９５９１号に記載の置換クロマトグラフィ法によって精製したヒトヘモグロビンは、本発明の複合体において用いるヘモグロビン生成物調製のための好ましい原料の１つである。この物質は、前述のＫｌｕｇｅｒらの米国特許第５３９９６７１号に記載の３官能性架橋剤、すなわち、その官能基の２つをヘモグロビン４量体のサブユニット間の分子内架橋に用い、３つ目の官能基は続く求核分子との反応に利用できる状態にしておく試薬によって架橋されていてもよい。そのような架橋試薬の具体的な例は、トリメソイルトリス（３，５−ジブロモサリチレート）、ＴＴＤＳ、で、その化学式を添付の図１に示しており、その調製は前述のＫｌｕｇｅｒらの米国特許第５３９９６７１号に記載されている。
【００２３】
架橋ヘモグロビン、すなわち安定型４量体ヘモグロビンを複合体の成分として用いるとき、肝細胞修飾物質を直接または化学リンカーもしくはスペーサーを介してのいずれかでヘモグロビンに結合し、次いでこの複合体を患者に投与してインビボでハプトグロビン−ヘモグロビンの結合が起こるようにすることもできる。完全な構築物複合体（ハプトグロビン−ヘモグロビン−肝細胞修飾物質）を、望まれる場合には、生体外で形成し、次いで患者に投与することもでき、これは状況によっては肝細胞に最終的に送達される活性物質の量をよりうまく調節できることもある。しかし、そのような方法は、ハプトグロビンのレベルがゼロまたは低い例外的患者、例えば急性溶血の状態にある患者を除き、通常は必要ではない。このような患者には、本発明の構築物複合体の投与前、投与中、および／または投与後に、ハプトグロビンを投与することができる。しかし、通常は、患者血漿中にはインシトゥで構築物複合体を形成し、肝細胞にそれを送達するのに十分なハプトグロビンがある。２部分複合体を調製して患者に投与し、インシトゥで３部分複合体を形成することは、一般的により安価で複雑性も低い。
【００２４】
分子内架橋されているヘモグロビンを使用すると、ヘモグロビンおよびハプトグロビンにはそれぞれ２つの結合部位があるため、複数のヘモグロビンおよび／またはハプトグロビンを含む高分子量重合体を生じることになろう。非架橋ヘモグロビンを本発明の構築物複合体の成分として用いることには利点があると考えられる。このようなヘモグロビンに肝細胞修飾物質が結合したものは、分子量約３２ｋＤａの２量体ヘモグロビンに解離し、この解離した２つの２量体ヘモグロビン生成物がハプトグロビンの１個の分子に結合して、本発明の複合体を形成することになる。したがって、高分子量ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の形成が避けられる。αβ−２量体へのハプトグロビンの結合は一般に、架橋ヘモグロビンへのハプトグロビンの結合に比べて、非常に速やかに起こる反応である。非架橋ヘモグロビンの使用によって得られる、より低分子量の複合体は、改善された肝細胞受容体への結合と取り込みを示しうる。
【００２５】
２量体に解離する形のヘモグロビンを本発明の成分として用いる場合、またはヘモグロビン２量体自体を用いる場合、例えば、２量体が６４ｋＤａのヘモグロビンを再形成できないように修飾されている場合、本発明の構築物複合体を生体外で形成し、次いで完成された構築物複合体を患者に投与して、分子量が非常に小さい分子種を体内に投与すること、すなわち薬物を排泄を通じて非常に早く排出することに伴うリスクを回避することが好ましい。修飾された２量体の排出前に複合体がインビボで十分に形成される場合には、ハプトグロビンに事前に結合することなく、治療薬または診断薬を有するＨｂ２量体を投与することが可能であろう。
【００２６】
本発明の構築物複合体において有用なヘモグロビン化合物の他の例は、１９９７年１１月３日に出願されたＫｌｕｇｅｒおよびＬｉの「化学的に導入されたジスルフィド架橋を有するヘモグロビンとその調製」という表題の米国仮特許出願に記載の型の、チオール、好ましくは末端側鎖チオールを含む修飾基を有する２量体ヘモグロビンである。肝細胞修飾物質をこのような２量体ヘモグロビンに、露出したチオールとの直接反応、またはチオールの活性化型との直接反応、または混合ジスルフィド形成、またはリンカー分子を介してのいずれかによって、連結することができる。この型の構築物複合体は体外で作製し、この形で患者に投与する。ヘモグロビン−肝細胞修飾物質結合体も、インビボＨｐ結合のために投与することができる。解離可能なヘモグロビン（分子量３２ｋＤａ）は、ハプトグロビンの結合を容易にする露出した２量体−２量体界面を提供するため、これらの使用は架橋ヘモグロビン４量体の使用に比べて有益である。
【００２７】
本発明の構築物複合体は、酸化窒素結合を障害するような様式で修飾されたヘモグロビンも用いることができる。このような修飾ヘモグロビンは、当技術分野において知られている。ＮＯ結合が低下すると、一部のヘモグロビンで認められている作用である、たとえ少量でも投与したときにヘモグロビンが患者の血圧を改変する傾向を低下することができる。
【００２８】
構築物複合体形成において、選択したヘモグロビン上の反応部位と肝細胞修飾物質との間に、化学リンカーまたはスペーサー基を挿入しなければならないことがある。これは、ヘモグロビン上で連結に利用できる化学基の性質、および肝細胞修飾化合物上でこの目的のために利用できる化学基に応じて異なる。例えば、ポリリジンなどのポリカチオン部分は、ＴＴＤＳ修飾されたヘモグロビンの親電子部位に適当に結合して、ＤＮＡが静電的相互作用によって結合する部位を提供する。リジンの直鎖重合体は、この目的のために適当なカチオン部分を提供する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態の構築物複合体はハプトグロビン分子を含み、このハプトグロビンはハプトグロビン１−１またはいかなる他の表現型でもよく、ヘモグロビン化合物の１つまたは複数の分子に強い非共有相互作用によって結合されていてもよい。ヘモグロビンは、前述のとおり、架橋されているか、オリゴマー化されていてもよく、または修飾されていなくてもよい。
【００３０】
図１は、架橋ヘモグロビンの調製に関与する化学的段階であって、本発明の様々な実施形態に従って構築物複合体を形成するためのリンカーおよび／または薬剤、ならびにハプトグロビンとの反応のための段階を図示している。ＴＴＤＳをヘモグロビンと反応させ、その結果、３つの３，５−ジブロモサリチル酸基のうちの２つが残存する。ヘモグロビン上のＬｙｓ−８２およびβ−Ｌｙｓ−８２の１級アミンをアミド結合によってクロスリンカーに結合し、完全なままで、さらなる反応に利用可能な第３のジブロモサリチル酸基を有する、分子内架橋した安定型４量体ヘモグロビンを形成する。第２の段階において、架橋ヘモグロビンを、薬剤または薬剤を後に結合するために必要なリンカー（実施例１の場合はポリリジン）と反応させる。別の場合には、肝細胞修飾物質または活性薬剤が、図１のスキームのポリリジンに代わり、構築物を形成する。これで、複合体はいつでも患者に投与して構築物複合体をインシトゥで形成することができ、または代わりにハプトグロビンを生体外で形成された複合体と反応させ、複合体のヘモグロビン部分に結合させて、いつでも患者に投与可能な３部分複合体を形成することもできる。あるいは、最終段階として、リンカーが結合したＴＴＤＳ修飾ヘモグロビンを、ハプトグロビンおよび結合した薬剤と反応させることもできる。投与後、構築物複合体は肝細胞に結合し、そこでハプトグロビン−ヘモグロビンがその選択的受容体への結合を仲介し、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体に選択的な肝細胞受容体を用いて肝細胞修飾物質を肝細胞に送達し、これに進入できるようにする。
【００３１】
具体的実施例
実施例１−ＴＴＤＳ架橋ヘモグロビン（ＴＨｂ）のポリ（Ｌ−リジン）への結合
ＴＴＤＳ架橋ヘモグロビンのポリ（Ｌ−リジン）結合体（ＴＨｂ−Ｋn ）を、ＴＨｂ−ＤＢＳ（１つの加水分解されていない３，５−ジブロモサリチル酸官能基を有するＴＴＤＳ架橋ヘモグロビン）にポリ（Ｌ−リジン）を１：１のモル比で加え、１つのポリ（Ｌ−リジン）鎖にヘモグロビン１分子だけが結合した結合体の形成を促進することによって合成した。この実験で用いたポリ（Ｌ−リジン）は、リジンのカルボキシル基とα−アミノ基との間にアミド結合を有する直鎖重合体である。平均分子量４ｋＤａ(Ｋ4kDa)、７.５ｋＤａ(Ｋ7.5kDa) 、２６ｋＤａ(Ｋ26kDa) および３７ｋＤａ(Ｋ37kDa) の重合体がＴＨｂに結合した。
【００３２】
ＴＴＤＳ（１３．９ｍｇ）／エタノール（１００μＬ）をデオキシヘモグロビン（５ｍＬ、８．５ｇ／ｄＬ）／５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ９．０に加えた。反応混合物を３０℃、窒素雰囲気下で４５分間撹拌した。次いで、ヘモグロビンをＣＯで充満させ（溶液は氷上に維持した）、ヘモグロビン溶液を５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ９．０で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（長さ２００ｍｍ×直径２５ｍｍ）を通過させることにより、過剰の架橋試薬を除去した。得られたヘモグロビン溶液（３．６ｇ／ｄＬ）を再度ＣＯで充満させた。ポリ（Ｌ−リジン）溶液を５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ８．０中で調製し、下記の表１に示すとおりにヘモグロビン（３．６ｇ／ｄＬ、１．９ｍＬ）に加えた。ポリ（Ｌ−リジン）のヘモグロビンに対するモル比は、４つの重合体すべてで１：１であった。ＴＨｂ−ポリ（Ｌ−リジン）結合体(ＴＨｂ−Ｋn) を血清びん中に密封し、再度ＣＯで充満させ、室温で２日間放置した。これらの試料のヘモグロビン濃度を、ドラブキン試薬を用いて定量した。
【００３３】
【表１】
0004406169.tif 000002
アニオン交換クロマトグラフィ：未精製のＴＨｂ−Ｋn 複合体を、ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ  ＡＸ−３００カラム（長さ２５０ｍｍ×直径４．６ｍｍ、SynChrom, Inc. ）でのアニオン交換クロマトグラフィを用いて分析した。塩化ナトリウム勾配を用いて様々な修飾ヘモグロビンを溶出した。溶出液を２８０ｎｍでモニターした。
【００３４】
分析時までに、未反応のＴＨｂ−ＤＢＳはすべて加水分解されてＴＨｂを生じた。反応の結果、生成物の混合物を生じ、これらはすべて、予期されたとおり、アニオン交換クロマトグラフィ媒質上でＴＨｂよりも前に移動した。収率は、早く溶出されたピークのピーク面積を加算し、全ピーク面積と比較することによって算出した。このようにして計算したポリ（Ｌ−リジン）修飾ヘモグロビンの収率は、Ｋ4kDa、Ｋ7.5kDa、Ｋ26kDaおよびＫ37kDaについて、それぞれ３７、３７、８１、および８４％であった。
【００３５】
ＴＨｂ−Ｋn結合体の精製：ＴＨｂ−Ｋn結合体を結合していないＴＨｂから、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．４で平衡化したＰＯＲＯＳ  ＨＱ／５０カラム（長さ５２ｍｍ、直径１４ｍｍ）でのアニオン交換クロマトグラフィによって分離した。修飾Ｈｂを塩化ナトリウム勾配によって溶出した。溶出液を２８０ｎｍでモニターし、集めたＴＨｂ−Ｋn結合体を含む分画を登録商標Ａｍｉｃｏｎ透析ろ過装置および３０ｋＤａ分離膜を用いて濃縮した。
【００３６】
サイズ排除クロマトグラフィ：精製したＴＨｂ−Ｋn結合体 およびそのハプトグロビン複合体の分子量分布を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．２を含む０．５Ｍ塩化マグネシウム、流速０．４ｍＬ／分で平衡化および溶出する、登録商標Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（長さ３００ｍｍ、直径１０ｍｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて調べた。溶出液を２８０ｎｍおよび４１４ｎｍでモニターした。ヘモグロビン対ポリ（Ｌ−リジン）の化学量論は、分子量標準に対応する溶出時間にしたがって、４ｋＤａのポリ（Ｌ−リジン）を用いての１：１から、分子量がより高いポリ（Ｌ−リジン）リンカーを用いての４：１までの化学量論による異質物からなる構築物までの範囲であった。未修飾ＴＨｂは存在しなかった。これらの構築物はクロマトグラフィの塩濃度が高い状態で安定であった。
【００３７】
実施例２−ＴＨｂ−Ｋnとハプトグロビン１−１との間の複合体形成
複合体の調製には下記の原液を用いた：１．７４ｍｇ／ｍＬのハプトグロビン１−１(Ｈｐ)／水および１．０ｍｇ／ｍＬの ＴＨｂ−Ｋn／５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ９.０溶液（ＴＨｂ−Ｋn濃度はすべてヘモグロビンの濃度を表す）。ハプトグロビン（１４μＬ）を ＴＨｂ−Ｋnのリン酸カリウムｐＨ７．０溶液に加えて、最終濃度を下記のとおりとした：２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０中、０．１２ｍｇ／ｍＬ（１．２２μＭ）のハプトグロビンおよび０．１９ｍｇ／ｍＬ（２．９μＭ）の ＴＨｂ−Ｋn（最終容積２００μＬ）。室温で１８０分間インキュベートした後、試料をＳＥＣを用いて分析した。
【００３８】
ＴＨｂ−Ｋn のハプトグロビン１−１との複合体：ＴＨｂ−Ｋn のハプトグロビンとの複合体形成を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて追跡することができる。図２Ａは、室温で１８０分間インキュベートした後のＴＨｂ−Ｋ4kDaのＨｐとの混合物組成を示している。新しい高分子量のピークが２５．５分に現れる。溶出期間全体の２８０ｎｍおよび４１４ｎｍにおける吸光度の比（Ａ280／Ａ414）のプロットにより、構築物複合体および他のピークにおけるハプトグロビンとヘモグロビンとの相対比が示される。新しいピーク全体の吸光度の比（Ａ280／Ａ414）は０．９で、ハプトグロビンおよびヘモグロビン成分の両方がこの複合体に存在することが示される。ハプトグロビン１−１は２９．７分で移動し、Ａ280／Ａ414比が高いことで容易に同定される。図２Ｂは、室温で１８０分間インキュベートした後のＨｐとのＴＨｂ−Ｋ7.5kDa混合物のＳＥＣを示している。ここでも、Ａ280／Ａ414比０．７３の新しいピークが２５．１分に現れ、続いてハプトグロビンが２９．７分に現れ、Ａ280／Ａ414比０．３のＴＨｂ−Ｋ7.5kDaが３５．８分に現れる。ＴＨｂ−Ｋ26kDaおよびＴＨｂ−Ｋ37kDaのハプトグロビンとの複合体のＳＥＣの分析は、それらの分子量分布が広範であるため、より複雑である。結果をそれぞれ図２Ｃおよび２Ｄに示している。ＴＨｂ−Ｋ26kDaおよびＴＨｂ−Ｋ37kDaがいずれもハプトグロビンと複合体を形成することは、図２Ｃおよび２Ｄから明白である。Ａ280／Ａ414比は、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐでは０．６４で、ＴＨｂ−Ｋ37kDa−Ｈｐでは０．６９である。
【００３９】
ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体形成の程度：ＴＨｂ−Ｋnの構造的に異なるすべての成分がハプトグロビンに結合するかどうかを調べるために、ＴＨｂ−Ｋ26kDaを１５％過剰のハプトグロビンと共に、様々な長さの時間インキュベートし、次いでＳＥＣを用いて分析した。複合体の調製には下記の原液を用いた：１．７４ｍｇ／ｍＬのハプトグロビン１−１／水および７．４ｍｇ／ｍＬのＴＨｂ−Ｋ26kDa／リン酸カリウムｐＨ７．０溶液で、最終濃度を下記のとおりとした：２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０中、０．７４ｍｇ／ｍＬ（７．５ｍＭ）のハプトグロビンおよび０．４１ｍｇ／ｍＬ（６．４ｍＭ）のＴＨｂ−Ｋ26kDa（Ｈｐ対Ｈｂのモル比１．２：１）。室温で様々な長さの時間インキュベートした後、混合物をＳＥＣを用いて分析した。反応の進行を、ＳＥＣ図のハプトグロビンピークの消失をモニターすることによって追跡した。２４時間後、ＴＨｂ−Ｋ26kDaの８５％がハプトグロビンと結合した。得られたＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体は、３７０ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの範囲の広い分子量分布を有している（図３）。
【００４０】
実施例３−ＴＨｂ−ＫnおよびＴＨｂ−Ｋn−ＨｐへのＤＮＡ結合。ゲル易動度シフトアッセイ：
ゲル易動度シフトアッセイを実施して、プラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶｂｅｔａ）のＴＨｂ−Ｋn結合体に対する結合の化学量論を評価した。このゲル電気泳動法は、ＤＮＡの移動特性が蛋白質を結合することによって変化するという知見に基づいている。蛋白質と、蛋白質が質量の大部分を構成するＤＮＡ−蛋白質複合体のいずれも、１％アガロースゲルに進入しない。ＴＨｂ−Ｋn 対ＤＮＡの比を漸増させて混合物を分析する場合、複合体の化学量論に対応する比およびそれ以上でＤＮＡバンドの消失が認められる。４つの結合体それぞれについて、および ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体について、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む３２μＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３中に、０．４〜６４００ｎｇの結合体（この重量はヘモグロビン成分に基づいている）を含む溶液を調製した。プラスミドＤＮＡ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２８μＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３中に５６０ｎｇ）を各試料に滴下し、混合物を室温で１時間インキュベートした。試料（１５μＬ）を、臭化エチジウム（０．２μｇ／ｍＬ）を含む１％アガロースゲル上で分析した。ゲルへのＤＮＡの進入を防止した結合体の量を求めた。結果を下記の実施例に記載している。
【００４１】
実施例４−ＴＨｂ−Ｋ26kDaおよびＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体へのＤＮＡ結合：チアゾールオレンジ蛍光消光法：
この色素蛍光アッセイは、ＤＮＡインターカレーション色素（チアゾールオレンジ）がＤＮＡに結合した場合にのみ蛍光を発するという知見に基づいている。ＴＨｂ−Ｋn とＤＮＡとの間の複合体形成が、インターカレーション色素のＤＮＡからの置換および全蛍光の低下を引き起こす。
【００４２】
この実験において下記の原液を用いた：０．０５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ（ｐＣＭＶｂｅｔａ）、０．０１０ｍｇ／ｍＬのＴＨｂ−Ｋ26kDaまたはＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体、１．７５×１０-6Ｍのチアゾールオレンジ（１％メタノール中０．１ｍｇ／ｍＬ溶液を水で１９０倍に希釈した）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３。プラスミドＤＮＡ（１０μＬ）、ＴＨｂ−Ｋ26kDa（容積は２．５から６０μＬまで変化する）および緩衝液（最終容積２００ｍＬとする）を一般的な９６穴プレート中で混合し、室温で２．５時間インキュベートする。ＨＥＰＥＳ緩衝液中にチアゾールオレンジを含む試料も調製し、バックグラウンド対照として用いた。蛍光をＰａｃｋａｒｄの登録商標ＦｌｕｏｒｅＣｏｕｎｔプレート読みとり器上で、励起４８５ｎｍおよび発光５３０ｎｍを用いて測定した。ＴＨｂ−Ｋ26kDa −Ｈｐ複合体を前述のとおりに調製し、精製せずに用いた。これを０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３で希釈し、最終濃度０．０１０ｍｇ  Ｈｂ／ｍＬとした。
【００４３】
ゲル易動度シフトアッセイおよび蛍光消光アッセイの両方で、ＴＨｂ−ＫnがＤＮＡに結合することが示された。図４Ａ（左）および４Ｂ（右）は、実施例４にしたがって生成したハプトグロビン−ヘモグロビン−ＤＮＡ結合体のゲル易動度シフトアッセイを示している。１４０ｎｇのＤＮＡを（Ａ）ＴＨｂまたは（Ｂ）ＴＨｂ−Ｋ26kDa の漸増量に加えた。両方のゲルのレーン１はＤＮＡ分子量マーカーを含む。他のレーンのＨｂ含量は、（Ａ２）５０ｎｇ、（Ａ３）１００ｎｇ、（Ａ４）２００ｎｇ、（Ａ５）４００ｎｇ、（Ａ６）８００ｎｇ、（Ａ７）１６００ｎｇ、（Ａ８）空、（Ｂ２）２５ｎｇ、（Ｂ３）５０ｎｇ、（Ｂ４）１００ｎｇ、（Ｂ５）２００ｎｇ、（Ｂ６）４００ｎｇ、（Ｂ７）８００ｎｇ、（Ｂ８）ＤＮＡのみである。ゲル易動度シフトアッセイに関しては、図４に示すとおり、ＤＮＡ試料中のＴＨｂ−Ｋn の比率を上げると、ＤＮＡの移動に影響をおよぼした。図４Ａは、蛋白質５０〜１６００ｎｇの範囲のＴＨｂ漸増量と共にインキュベートした後のＤＮＡの移動特性を示している。この濃度範囲では、ＤＮＡ移動の変化が検出できないため、ＴＨｂはＤＮＡと結合していない。ＴＨｂ−Ｋ26kDaはＤＮＡ結合において最も有効である。１００ｎｇのＴＨｂ−Ｋ26kDa（ＴＨｂ−Ｋ26kDa対ＤＮＡの比＝０．７重量比）は、ＤＮＡのアガロースゲルへの進入を完全に防止した（図４Ｂ）。すべてのＤＮＡを結合するために、約４００ｎｇの他のＴＨｂ−Ｋn調製物が必要とされた。ＴＨｂ−Ｋ26kDaについての結果は蛍光消光アッセイとよく一致しており、蛍光消光アッセイでは同じＴＨｂ−Ｋ26kDa対ＤＮＡの比で８６％の蛍光低下を示した。図５は、ＤＮＡ−チアゾールオレンジ蛍光に対するＴＨｂ26kDaの効果を示している。図５において、ＴＨｂ−Ｋ26kDaの量はヘモグロビン成分にのみ基づいている。
【００４４】
ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体もＤＮＡに結合する。２００ｎｇのＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐが１４０ｎｇのＤＮＡがアガロースゲルに進入するのを完全に防止することが明らかにされた（ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ対ＤＮＡの比＝１．４重量比）。図６は、ゲル易動度シフトアッセイによるＴＨｂ−Ｋ26kDa−ＨｐのＤＮＡへの結合を示している。１４０ｎｇのＤＮＡをＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐの漸増量に加えた：２５ｎｇ（レーン２）、５０ｎｇ（３）、１００ｎｇ（４）、２００ｎｇ（５）、４００ｎｇ（６）、８００ｎｇ（７）、重量はヘモグロビン成分に基づいている。分子量標準をレーン１にのせ、１４０ｎｇのＤＮＡをレーン８にのせた。同じＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ対ＤＮＡの比（１．４：１重量比）では、蛍光アッセイによりわずか４２％の蛍光低下が示され、２．８の比では８１％の蛍光低下が示されている。蛍光アッセイを図７に示している（結合体の重量はそのヘモグロビン成分のみに基づいている）。ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐに関するゲル易動度シフトアッセイの比較により、ハプトグロビン複合体を用いるとき、ＤＮＡがゲル中に移動するのを防止するためには、約２倍の蛋白質結合ポリ（Ｌ−リジン）が必要とされることが示されている。ヘモグロビン結合ポリ（Ｌ−リジン）の量は両方の実験で等しかったため、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−ＨｐのＤＮＡ結合能の低下はおそらく、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ―ＤＮＡ複合体が立体的に込み合っているためである。
【００４５】
これらの実施例において、ヒト肝細胞へのハプトグロビン受容体を介したインビボでの標的遺伝子送達に必要なすべての成分を有する構築物が合成され、特徴付けられた。ポリ（Ｌ−リジン）をＴＴＤＳ架橋ヘモグロビンに結合して、その正に荷電したε−アミン基とＤＮＡのリン酸基の負電荷との静電的相互作用によりＤＮＡを結合するための部位を提供した。過去に、ＤＮＡの負電荷の９０％よりも多くが中和されると、線状ＤＮＡ鎖は、より安定で細胞によって内部に取り込まれやすい形状のトロイド構造に圧縮されることが明らかにされている。電気的中性の複合体を生じるＤＮＡ対ポリ（Ｌ−リジン）の比で、最適な遺伝子発現が報告されている。
【００４６】
ゲル易動度シフトおよび蛍光アッセイによって、ＴＨｂ−Ｋ26kDa−Ｈｐ複合体がプラスミドＤＮＡに結合して、ハプトグロビン受容体仲介性のエンドサイトーシスによりオリゴヌクレオチドを送達することが可能な構築物の組み立てを完了することが示されている。
【００４７】
実施例５−トリチウム化または非トリチウム化リジンを有する架橋ヘモグロビンの合成
Ｌ−[3Ｈ]−リジンの溶液を窒素気流下で蒸発させて５９.５ｎｍｏｌ（５ｍＣｉ）の固体物質を得た。放射性同位体標識されていないＬ−リジン５９．５ｎｍｏｌを同様に調製した。ＴＴＤＳ（３９．８ｍｇ）をエタノール（２７０μｍＬ）に溶解し、この溶液の２００μＬを５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ９．０中のデオキシヘモグロビン（１０ｍＬ、９．２ｇ／ｄＬ）に加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で１時間撹拌し、次いで酸素化した。混合物の半分から、ゲルろ過によって過剰の架橋剤を除去し、次いで溶液をＣＯで充満して凍結し、Ｋｌｕｇｅｒ（米国特許第５３９９６７１号）によって記載されているように、クロスリンカー上に活性化エステルを有する架橋Ｈｂ（ＴＨｂ−ＤＢＳ、６２ｍｇ／ｍＬ）を得た。未精製反応混合物のもう一方の半分から、０．１Ｍ  Ｌ−リジン／Ｌ−リジン塩酸塩溶出緩衝液（ｐＨ９．０）を用いたゲルろ過によって未反応の架橋剤を除去した。溶出液をＣＯで充満し、室温で終夜放置した。この方法を用いて、リジンは活性化エステルを介してリンカーに結合し、ＴＨｂ−Ｌｙｓを得た。新しく解凍したＴＨｂ−ＤＢＳ（２９．５ｎｍｏｌ、３０．５μＬ）を、放射性同位体標識したリジンおよび放射性同位体標識していないリジンに毎日３日間加えた。ＴＨｂ−Ｌｙｓ（７００μＬ）を次いで両混合物に加え、生成物を脱塩した。反応の完了は、アニオン交換クロマトグラフィによって確認した。
【００４８】
実施例６−ハプトグロビン−ＴＨｂ−Ｌｙｓ複合体：
ハプトグロビン（水中１．６１ｍｇ／ｍＬのハプトグロビン１−１、１１μＬ）をＴＨｂ−Ｌｙｓ（５０ｍＭホウ酸ナトリウムｐＨ９．０中３８ｍｇ／ｍＬ）に加えて、下記の最終濃度とした：０．６８ｍｇ／ｍＬ（６．９μＭ）のハプトグロビンおよび０．４１ｍｇ／ｍＬ（６．４μＭ）のＴＨｂ−Ｌｙｓを、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０で最終容積２００μＬとした。１８時間以内に、ハプトグロビン−ＴＨｂ−Ｌｙｓ複合体がＳＥＣにより２８０および４１４ｎｍに吸収を示す高分子量種として観察され、本来のハプトグロビンおよび元のＴＨｂ−Ｌｙｓ生成物とは別に溶出された（図８）。構築物複合体をＳＥＣにより精製した。カラムはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で平衡化し、溶出した。
【００４９】
実施例７−ハプトグロビン−ＴＨｂ−[3Ｈ]−Ｌｙｓ複合体：
ＴＨｂ−[3Ｈ]−Ｌｙｓ（７５μＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、０.６５７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、部分精製したハプトグロビン１−１（０．２７３ｍＬ、３．７ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ  ｐＨ７．４溶液に加えた。混合物を室温で終夜インキュベートした。ＴＨｂ−[3Ｈ]−Ｌｙｓ−Ｈｐ複合体を、ＰＢＳ  ｐＨ７.４で平衡化および溶出するＳＥＣを用いて精製した。放射活性は主にＳＥＣにより同定された高分子量種で認められ、これは２８０および４１５ｎｍに吸収を示し、本来のハプトグロビンおよび元のＴＨｂ−Ｌｙｓ生成物とは別に溶出され、保持時間が実施例６の非放射性同位体標識生成物に対応していた。
【００５０】
実施例８−フルオレセイン−ヘモグロビン結合体（ＦＬ−Ｈｂ）の合成：
５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ、１１ｍｇ、２１μｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５０μＬ）溶液を、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０中のオキシヘモグロビン（６０ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ）に４℃で撹拌しながら徐々に加えた。４℃で３時間反応させた後、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２で透析液中に５−ＩＡＦが検出されなくなるまで透析することにより、過剰の５−ＩＡＦを除去した。生成物のＵＶ−可視吸光スペクトルから、４９６ｎｍに特徴的なフルオレセインの吸収帯が認められた。
【００５１】
実施例９−ＦＬ−Ｈｂのハプトグロビン１−１、２−１、および混合表現型ハプトグロビンとの複合体：
ＦＬ−Ｈｂ（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２中６ｍｇ／ｍＬ、４０μＬ）をハプトグロビン１−１、２−１または混合表現型（Ｈｐmix）（水中２．８ｍｇ／ｍＬ、３９μＬ）に加えて、下記の最終濃度とした：２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０の最終容積１８０μｌ中、０．６ｍｇ／ｍＬ（６．２μＭ）のＨｐおよび１．３ｍｇ／ｍＬ（２１μＬ）のＦＬ−Ｈｂ。室温で１０分間インキュベートした後、混合物をＳＥＣによって分析した。ＦＬ−Ｈｂのハプトグロビン１−１との複合体は３３分で移動し（図９Ａ−Ｈｐ１−１およびＨｐ１−１のＦＬ−Ｈｂとの複合体の重ね合わせＳＥＣクロマトグラム）、ハプトグロビンとはその４１４ｎｍの吸収によって明らかに区別することができる。ＦＬ−Ｈｂは４２．９分で移動した（図９Ａ）。ＦＬ−ＨｂのＨｐ１−１およびＨｐmix との複合体を、ＵＶ−可視分光法（図９Ｂ−ハプトグロビン１−１およびＨｐmix のＦＬ−Ｈｂとの複合体のＵＶ−可視スペクトル、矢印はフルオレセインに特徴的なバンドを示している）および蛍光分析法によって単離し、分析した。この物質は、４８０ｎｍで励起され、５２０ｎｍで発光する蛍光と、４９６ｎｍにλmax を持つフルオレセインの特徴的吸収帯を示す。ＦＬ−ＨｂのＨｐ２−１およびＨｐmix との複合体をそれぞれ図９Ｃおよび９Ｄに示している。構築物複合体をＳＥＣでＰＢＳ緩衝液で溶出して精製した。
【００５２】
実施例１０−トリチル化プトレッシンを有する架橋ヘモグロビンの合成：
２００ｍＬの精製したＨｂを５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０中に透析ろ過し、次いで脱酸素化して、濃度を７．１ｇ／ｄＬに調整した。Ｈｂを、ＴＴＤＳ対Ｈｂの比２：１で、３０℃で４５分間架橋し、次いで５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０緩衝液により脱塩して、最終濃度３．１ｇ／ｄＬとした。１．４３ｍＬの脱塩したＨｂを、放射性同位体標識したプトレッシン（１ｍＣｉ／ｍＬ、６．９４×１０-5ｍｍｏｌ／ｍＬ）１ｍＬのアリコート２つそれぞれに加え、室温で１．５時間反応させた（Ｈｂ：プトレッシン＝１０：１）。０．９ｍｇの冷プトレッシン（放射性同位体標識プトレッシンの４０倍過剰）を１７ｍＬのＴＨｂ−ＤＢＳと、ＴＨｂ−ＤＢＳ：プトレッシン＝１．５：１の比で反応させた。この溶液５ｍＬを２つの反応混合物それぞれに加え、室温で終夜混合した。両方の混合物を次いで、新しく架橋し、脱塩したＴＨｂ−ＤＢＳ（５．３×１０-5ｍｏｌ）に加え、室温で１．５時間反応させた。次いで、２０倍過剰の冷プトレッシン（１７２ｍｇ）を加え、終夜反応させた。ＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ を次いで乳酸リンガー液中に透析ろ過した。比活性は１．５Ｃｉ／ｍｏｌ、９０ｍｇ／ｍＬであった。
【００５３】
実施例１１−ハプトグロビン１−１のＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ との複合体：
ハプトグロビン（水中３.０ｍｇ／ｍＬ、５１μＬ）をＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ（ＰＢＳ  ｐＨ７．２中１０ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）に加えて、下記の最終濃度とした：２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０の最終容積１１０μｌ中、１．４ｍｇ／ｍＬ（１４μＭ）のハプトグロビンおよび１．８ｍｇ／ｍＬ（２８μＭ）のＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ 。混合物を室温で２時間インキュベートした後、ＳＥＣにより分析した。溶出液のフラクション（０．４ｍＬ）を集め、シンチレーション計数によって分析した。ＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ−Ｈｐ 複合体は溶出時間２０〜２８分の高分子量種として移動し（図１０）、３０分のハプトグロビンのバンドおよび３７分のＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ とよく分離された。ＴＨｂ−[3Ｈ]Ｐｕ−Ｈｐ は２８０ｎｍおよび４１４ｎｍの両方で吸収を示し（Ａ280nm／Ａ414nm＝０．７４）、ＴＨｂ[3Ｈ]Ｐｕ とほぼ同等の比放射活性（ｃｐｍ／ｍｇ  Ｈｂ）を有している。構築物複合体をＳＥＣによって精製した。
【００５４】
実施例１２−モノダンシルカダベリンを有する架橋ヘモグロビンの合成：
精製したＨｂ（８．０ｇ／ｄＬ、１００ｍＬ、１．２５×１０-4ｍｏｌ）を５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０中に透析ろ過し、次いで酸素化し、脱酸素化した。ＴＴＤＳ（Ｈｂモル数の２倍過剰、０．２６ｇ、２．５×１０-4ｍｏｌ）脱酸素化溶液を加え、混合物を３５℃で１時間撹拌し、次いでＣＯで充満した。この時点でのイオン交換クロマトグラフィでは、少量の未反応Ｈｂ（１．７％）が認められたにすぎなかった。約２０ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌ中、モル数にして１５倍過剰のモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０で２５ｍＬに調整したものを、架橋Ｈｂ（０．６３ｇ、１．８８×１０-3ｍｏｌ）に加えた。室温で６０時間後、ＭＤＣ−Ｈｂを１０ｍＭ  ホウ酸ｐＨ９．０に対して透析ろ過した。生成物をゲルろ過によって精製し、乳酸リンガー液中に透析ろ過した。
【００５５】
実施例１３−ハプトグロビン１−１のＴＨｂ−ＭＤＣとの複合体：
ＴＨｂ−ＭＤＣ（乳酸リンガー液ｐＨ７．２中２０ｍｇ／ｍＬ、３．５μＬ）をハプトグロビン１−１（水中１．１ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ）に加えて、下記の最終濃度とした：１．１ｍｇ／ｍＬ（１１μＭ）のＨｐおよび０．３４ｍｇ／ｍＬ（５．４μＭ）のＴＨｂ−ＭＤＣ。混合物を室温で２４時間インキュベートした後、ＳＥＣにより分析した。ＴＨｂ−ＭＤＣのハプトグロビンとの複合体は溶出時間２１〜２９分の高分子量種として移動した（図１１）。この物質はハプトグロビン（３０．９分）とは分離して移動し、２８０ｎｍおよび４１４ｎｍの両方で吸収を示した（Ａ280nm／Ａ414nm＝０．７０）。ＴＨｂ−ＭＤＣは３７．９分で溶出し、Ａ280nm／Ａ414nm＝０．２９である。構築物複合体をＳＥＣによって精製することができる。
【００５６】
実施例１４−プリマキンを有する架橋ヘモグロビン（ＴＨｂ−ＰＱ）の合成：
ＴＴＤＳ（１４．０ｍｇ）／エタノール（１００μＬ）をデオキシヘモグロビン（１０ｍＬ、５８ｍｇ／ｍＬ）／５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０に加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で１時間撹拌した。次いで、過剰の架橋剤をゲルろ過で５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０で溶出することによって除去し、生成物（ＴＨｂ−ＤＢＳ、４３ｍｇ／ｍＬ）をＣＯで充満した。プリマキン２リン酸（０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液のｐＨを１０Ｍ  ＮａＯＨで８．５に調整した（プリマキンが一部沈殿した）。ＴＨｂ−ＤＢＳ（１０ｍＬ）をプリマキンに加え、反応混合物を暗所、室温で終夜撹拌した。次いで、生成物をろ過し、ろ液を５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０に対して透析した。生成物のアニオン交換クロマトグラフィ（図１２）により、ＴＨｂ−ＰＱは混合物中のすべてのヘモグロビン成分の６８％を構成することが明らかにされた。生成物を逆相クロマトグラフィを用いて分析すると、プリマキンに結合したＴＨｂ−ＤＢＳはすべてのβ鎖の６４％を構成している。
【００５７】
実施例１５−ハプトグロビン１−１のＴＨｂ−ＰＱとの複合体：
ＴＨｂ−ＰＱ（５０ｍＭホウ酸ｐＨ９．０中１５ｍｇ／ｍＬ、６７μＬ）をハプトグロビン１−１（水中４．０ｍｇ／ｍＬ、５００μＬ）に加えて、下記の最終濃度とした：２．０ｍｇ／ｍＬ（２０μＭ）のＨｐおよび１．０ｍｇ／ｍＬ（１５．７μＭ）のＴＨｂ−ＰＱ。混合物を室温で２１時間インキュベートした後、ＳＥＣおよびアニオン交換クロマトグラフィにより分析した。ＴＨｂ−ＰＱのハプトグロビンとの複合体は溶出時間２１〜２９分の高分子量種として移動した（図１３）。この物質は非架橋ヘモグロビンと複合したハプトグロビン（２９．９分）およびハプトグロビン（３０．６分）とは分離して移動し、２８０ｎｍおよび４１４ｎｍの両方で吸収を示した（Ａ280nm／Ａ414nm＝０．７０）。アニオン交換クロマトグラフィにより、すべての未修飾ヘモグロビンと、ＴＨｂ−ＰＱおよびＴＨｂの両方の７４％とがＨｐと反応したことが示された。この結果は、ヘモグロビンの７８％がＨｐと反応したことを示すＳＥＣ分析とよく一致している。
【００５８】
実施例１６−ハプトグロビン−［ポリ−Ｏ−ラフィノース−Ｈｂ］およびハプトグロビン−［６４ｋＤａ−Ｏ−ラフィノース−Ｈｂ］複合体
Ｐｌｉｕｒａ（米国特許第５５３２３５２号）の方法に従い、ＨｂＡ０を酸化ラフィノース（ＯＲ）を用いて架橋し、重合した。重合したＨｂ（＞６４ｋＤａのＯＲ−Ｈｂ）に相当する６４ｋＤａよりも大きい分子量種を、サイズ排除クロマトグラフィによって６４ｋＤａの種から分離した。Ｈｂ調製物を、水中のヒトハプトグロビン１−１と別々に合わせ、最終濃度０．２ｍｇ  Ｈｂ／ｍＬおよび０．１２５ｍｇハプトグロビン／ｍＬとした（最終Ｈｂ：Ｈｐ＝約２．２：１）。混合物を２２℃で１時間インキュベートし、次いで解離、非変性溶出条件（０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2、２５ｍＭトリスｐＨ７．４）でのサイズ排除クロマトグラフィによって分析した。図１４は２８０ｎｍ（実線）および４１４ｎｍ（破線）で検出したサイズ排除クロマトグラフィの溶出特性を示しており、これによって修飾ヘモグロビンがハプトグロビンと結合していることが明らかにされている。修飾ヘモグロビンをハプトグロビンとインキュベートすることにより、修飾ヘモグロビンまたはハプトグロビンのいずれにも対応しない高分子量種が得られ、これは４１４ｎｍに吸収を示すことからヘモグロビンの含有を示唆している。
【００５９】
実施例１７−修飾ヒトＨｂ([3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂ）の血漿中ラットハプトグロビンへの結合
１ｍＣｉの 3Ｈ−Ｎ−エチルマレイミド([3Ｈ]−ＮＥＭ)／ペンタンを０．５ｍＬのリン酸緩衝液中で蒸発させ、緩衝液１ｍＬ中２５ｍｇのＨｂを加えて、ＮＥＭ：Ｈｂの最終比を０．０６：１、すなわち３７μＣｉ／ｍｇ  Ｈｂとした。４℃で２４時間後の逆相ＨＰＬＣ分析により、放射性同位体標識の大部分が修飾されたベータピークに取り込まれたことが示された。４７時間後、１５倍過剰（βＣｙｓ９３のチオールに対し）の非標識ＮＥＭを加えた。塩および結合していないＮＥＭをゲルろ過によって除去し、最終濃度を１０．２ｍｇ  Ｈｂ／ｍＬに調整した。次いで、この物質（3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂ）の少量をハプトグロビンを含むラット血清と合わせ、放射性同位体標識した成分がすべてＨｐに結合したかどうかを調べた。ラット血清のＨｐ結合能を６７０μｇ  Ｈｂ／ｍｇ血清に調整した。Ｈｂ結合能に基づいて、０．５および２．０当量の 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂを血清と合わせ、０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2、２５ｍＭトリスｐＨ７．４を用いた解離、非変性条件で溶出したサイズ排除クロマトグラフィによって分析した（図１５）。 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂ調製物において、放射活性はすべて３２ｋＤａのピークで認められた。０．５当量の 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂでは、放射活性はすべてＨｂ−ハプトグロビンのピーク（３１分）中に現れた。２．０当量では、ハプトグロビンは飽和し、過剰の 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂは結合せずに残存する（４１分）。血漿成分と組合わされた放射活性の７３％は、約２２分の高ＭＷピークに現れる。これらの知見は、修飾ヒトＨｂ、 3Ｈ−ＮＥＭ−Ｈｂ、のすべての成分は、血漿中のラットハプトグロビンとの結合が可能であることを示すものである。
【００６０】
実施例１８−ラットにおける修飾Ｈｂおよびハプトグロビン複合体の生体分布
修飾Ｈｂを肝臓を標的として送るＨｐの能力を、放射性同位体生態分布試験で測定した。２つの試験品を、トリチウム標識したＮ−エチルマレイミドで修飾した精製ヒト ＨｂＡ0([3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂ)から調製した。すなわち、乳酸リンガー液中 [3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂ単独、およびラット血漿中わずかに過剰のラットハプトグロビンと複合した [3Ｈ]−ＮＥＭ−Ｈｂである。次の３つの処置群を分析した：（Ａ）血漿中の修飾Ｈｂ−ハプトグロビン複合体投与を受けた健常ラット、（Ｂ）修飾Ｈｂだけの投与を受けた健常ラット（ラットのＨｂ結合能のおよそ２倍）、および（Ｃ）修飾Ｈｂだけの投与を受けたハプトグロビン欠乏ラット。それぞれの場合に、約３ｍｇのＨｂを意識のあるスプレーグ  ドーリー（Sprague-Dawley）ラットに投与した。肝臓および血漿試料を、投与後３０、６０、および１２０分の時点で採取し、可溶化およびクエンチング後に放射活性をカウントした。値を全用量のパーセンテージおよび濃度／用量に変換し、様々な分析を図１６に示している。これは放射活性の含有量を示しており、用量パーセンテージを示すものである。図１６Ａは、血漿中の用量のパーセンテージを示している。図１６Ｂは肝臓における用量のパーセンテージを示している。図１６Ｃは、肝臓＋血漿における用量のパーセンテージを示している。図１６Ｄは、肝臓／血漿濃度を示している。星印（*および**）は異なる時点の処置群内の差（ｐ＜０.０５）を示している。十字記号（†および‡）は異なる処置群の同時点での差（ｐ＜０．０５）を示している。
【００６１】
血漿の保持はＡ群で最も高く、Ａ群およびＢ群はいずれもＣ群よりも高かった。血漿含量における最大の差は１２０分の時点で、Ａ群の血漿はＣ群の３倍、Ｂ群の３．５倍の放射活性を含んでいた。ＡおよびＢ群の肝臓含量は、すべての時点でＣ群よりも高かった。３０分では、ＡおよびＢ群は肝臓に全用量の約２０％を有していたのに対し、Ｃ群は１１％であった。ＡおよびＢ群において肝臓含量は３０分および６０分の時点で同等で、１２０分の時点までに低下した。１２０分までに、ＡおよびＢ群の肝臓含量はＣ群に比べてそれぞれ５倍および２倍高かった。ＡおよびＢ群は、３０分の時点で血漿および肝臓区画に用量の６０％を含み、これに比べてＣ群の動物ではそのおよそ半分の量を含んでいた。肝臓対血漿の濃度／用量比は、すべての群で時間と共に上昇し、ＡおよびＢ群の肝臓濃度は１２０分までに血漿濃度の約４倍となり、同じ時点でのＣ群の比のおよそ２倍であった。群間の肝臓および血漿を合わせた平均含量を比較することによって、血漿保持および肝臓ターゲティングの改善がさらに示され、図１７に、すなわち合計用量に対し肝臓および血漿を合わせた平均パーセンテージの比を示している。網掛けバーはＡ／Ｃ群から、黒いバーはＢ／Ｃ群から、白いバーはＡ／Ｂ群からのものである。ＡおよびＢ群の肝臓および血漿を合わせた含量は、一貫してＣ群よりも高く、１２０分の時点でＡ群は合わせた含量がＣ群よりも４倍高かった。分布曲線下面積を時点ゼロに外挿せずに計算し（表２）、ＡおよびＢ群の肝臓取り込みがＣ群の約２倍であることが示された。データは全般に、あらかじめ形成された修飾Ｈｂとの複合体、または投与されたＨｂと複合体を形成することが可能な場合に内在性Ｈｐの形のいずれかでＨｐが存在するとき、肝臓内に生成物を濃縮する能力がより大きいことを示している。また、薬物結合体がより長い時間組織の取り込みに利用可能となるように、Ｈｂ結合体の血漿保持がハプトグロビンとの組み合わせによって増大するということが明らかに示されてもいる。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
したがって、薬剤は、側鎖官能基、分子内クロスリンカー、または分子内クロスリンカーに結合した第２のリンカーのいずれかへの結合を用いて、３２ｋＤａのヘモグロビン２量体および６４ｋＤａの分子内架橋Ｈｂのいずれにも結合できることが明らかにされた。これらの構築物はすべてハプトグロビンに結合した。このようなインビボまたはエクスビボで形成された構築物複合体の肝臓への選択的ターゲティングおよび循環半減期の延長も、さらに示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の構築物複合体の１つの実施形態を製造するプロセスを図によって例示した反応スキームを示す図である。
【図２】  ２８０ｎｍおよび４１４ｎｍの吸光度を溶出時間に対してプロットした形で表したサイズ排除クロマトグラフィの結果で、実施例２の４つの生成物の分子量分布を示す図である。複合体は、分子量がＡは４ｋＤａ、ｂは７．５ｋＤａ、Ｃは２６ｋＤａおよびＤは３７ｋＤａのポリ（Ｌ−リジン）を用いて形成した。
【図３】  実施例２で生成した、ハプトグロビンと２４時間インキュベートした後の２６ｋＤａのポリ（Ｌ−リジン）を用いる生成複合体に関する、同様のプロットを示す図である。
【図４】  ＡはＴＨｂ、およびＢは実施例４にしたがって生成したＴＨｂ−ポリ（Ｌ−リジン）存在下でのＤＮＡのゲル易動度シフトアッセイを示す図である。
【図５】  実施例４の生成物の色素蛍光アッセイを示す図である。
【図６】  実施例４の生成物のゲル易動度シフトアッセイを示す図である。
【図７】  実施例４のもう１つの生成物の蛍光アッセイを示す図である。
【図８】  実施例６の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図９】  Ａはハプトグロビン１−１、Ｃはハプトグロビン２−１、Ｄはハプトグロビン２−２を用いた、実施例９の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
また、Ｂは実施例９の生成物のＵＶ−可視スペクトルを示す図である。
【図１０】  実施例１１の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図１１】  実施例１３の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図１２】  実施例１４の生成物および出発物質のアニオン交換クロマトグラム（重ね合わせ）を示す図である。
【図１３】  実施例１５の生成物の重ね合わせたサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図１４】  実施例１６の生成物について、２８０ｎｍ（実線）および４１４ｎｍ（破線）で検出したサイズ排除クロマトグラフィの溶出特性を示す図である：Ａはハプトグロビン１−１、Ｂは６４ｋＤａのＯＲＨｂ、Ｃはハプトグロビン−［６４ｋＤａ  ＯＲＨｂ］、Ｄは＞６４ｋＤａのＯＲＨｂ、Ｅはハプトグロビン−［＞６４ｋＤａ  ＯＲＨｂ］。
【図１５】  実施例１７の生成物のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図１６】  Ａ〜Ｄは実施例１８で得られた結果の分析のグラフ表示の図である。
【図１７】  実施例１８で得られた結果のさらなる分析のグラフ表示の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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