(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：37に対してアミノ酸位置２、17、27、36、84、91、101、105、125、144、145、173、183、194、203、204、220、221、234、249、262、294、353、354、356、357、386、394、399、412、413、499、500、502、538、542、543 及び544に変異を含むルシフェラーゼにおいて、インヒビターの存在下50℃にて３時間後に、活性の少なくとも50％を維持することを特徴とするルシフェラーゼ。
【請求項２】
配列番号：24のルシフェラーゼに比べて、pH4.5及び48℃にて60分後に、100倍以上の活性を維持する、請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項３】
位置２にＡ、位置17にＥ、位置27にＤ、位置36にＰ、位置84にＳ、位置91にＶ、位置101にＶ、位置105にＮ、位置125にＶ、位置144にＳ、位置145にＩ位置173にＳ、位置183にＹ、位置194にＩ、位置203にＩ、位置204にＰ、位置220にＩ、位置221にＡ、位置234にＳ、位置249にＭ、位置262にＶ、位置294にＬ、位置353にＫ、位置354にＧ、位置356にＡ、位置357にＫ、位置386にＰ、位置394にＰ、位置399にＧ、位置412にＤ、位置413にＮ、位置499にＤ、位置500にＹ、位置502にＡ、位置538にＬ、位置542にＴ、位置543にＮ及び位置544にＧを含む、請求項１又は２に記載のルシフェラーゼ。
【請求項４】
位置155にＤ及び 516にＩを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のルシフェラーゼ。
【請求項５】
位置34にＡ、位置193にＳ及び位置367にＬを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のルシフェラーゼ。
【請求項６】
配列番号：3６に対して増加した熱安定性を有し、そしてアミノ酸位置45、60、91、127、325、351、389、540、541、542及び543に変異を含むルシフェラーゼ。
【請求項７】
位置45にＶ、位置60にＶ、位置91にＶ、位置127にＴ、位置325にＡ、位置351にＲ、位置389にＩ、位置540に欠失、位置541にＡ、位置542にＧ及び位置543にＧを含む、請求項６に記載のルシフェラーゼ。
【請求項８】
位置457にＴを更に含む、請求項６又は７に記載のルシフェラーゼ。
【請求項９】
位置85にＴ、位置153にＡ、位置183にＦ、位置249にＴ、位置262にＦ、位置287にＳ及び位置288にＶを更に含む、請求項６又は７に記載のルシフェラーゼ。
【請求項１０】
位置85にＴ、位置183にＦ、位置249にＴ、位置262にＳ、位置267にＰ、位置287にＳ、位置288にＶ及び 位置356にＰを更に含む、 請求項６又は７に記載のルシフェラーゼ。
【請求項１１】
図19Bにおける30-4B02の配列、配列番号：26、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：47を含んで成るルシフェラーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜11のいずれか１項の記載のルシフェラーゼをコードする核酸セグメントを含んで成る核酸分子又はその相補体。
【請求項１３】
前記核酸セグメントが、配列番号：13、配列番号：42、配列番号：43又は配列番号：46の塩基配列を含んでなる、請求項12に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項12又は13に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
請求項12又は13に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜11のいずれか１項に記載のルシフェラーゼを有する固体基体。
【請求項１７】
請求項１〜11のいずれか１項に記載のルシフェラーゼを含んでなる融合タンパク質をコードする核酸セグメントを含む核酸分子。
【請求項１８】
請求項１〜11のいずれか１項に記載のルシフェラーゼに試薬を連結して標識された試薬を生じさせることを含んでなるルシフェラーゼの使用方法。
【請求項１９】
請求項１〜11のいずれか１項に記載のルシフェラーゼの使用であって、ATPを検出するため、遺伝的レポーターとして分子を標識するため、固体表面に固定化するため、ハイブリッドタンパク質を製造するため、高温反応のため、又は発光性溶液を形成するための使用。
【請求項２０】
ルシフェラーゼをコードするベクターの使用方法であって、
ａ）請求項14に記載のベクターを宿主細胞に導入し；そして
ｂ）当該宿主細胞中のルシフェラーゼの存在を検出又は決定する；
ことを含む方法。
【請求項２１】
請求項１〜11のいずれか１項に記載のルシフェラーゼを含む容器を含むキット。
【請求項２２】
前記容器が、ルシフェラーゼを含んで成る水性混合物を含むか、又は凍結乾燥したルシフェラーゼを含む、請求項21に記載のキット。
【請求項２３】
ルシフェリンを含む容器を更に含む、請求項22に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、天然ルシフェラーゼまたは本発明に係るルシフェラーゼが誘導されたルシフェラーゼと比較して、例えば水溶液中50℃で少なくとも２時間の半減期として測定される、著しく増大した熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼ酵素を目的とするものである。本発明は、基質インヒビター、例えば基質類似体による阻害に対し抵抗性である変異体ルシフェラーゼ酵素を包含する。さらに本発明は、この新規なルシフェラーゼをコードしているポリヌクレオチド、および該ルシフェラーゼを発現するよう形質転換された宿主を目的としている。
【０００２】
さらに本発明は、増大した熱安定性を有するルシフェラーゼを生成する方法、および既知のルシフェラーゼが常套的に使用される任意の方法におけるこれらのルシフェラーゼの用途を目的としている。この用途のうち幾つかはキットを使用する。本発明はさらに、インヒビターによる阻害に対し抵抗性である酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を生成する方法、および、増強された酵素的性質を有する酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を生成する方法を提供するものである。
【０００３】
発明の背景
ルシフェラーゼはルミネセンスを生成する能力によって定義される。甲虫ルシフェラーゼは、特異な進化上の起源および化学的機構を有する明確なクラスを形成している（Wood、1995）。
甲虫ルシフェラーゼとして知られる酵素は高感受性ルミネセンス検定におけるそれらの用途について広く認識されているが、熱安定性が低いため、それらの一般的有用性は限定されている。発光性甲虫からクローニングされたcDNA配列によりコードされているアミノ酸配列を有する甲虫ルシフェラーゼは、中位の温度でさえも安定ではない。例えば、蛍から得られる最も安定なルシフェラーゼLucPpe2でさえ、37℃という中等度の温度において殆ど安定性がない。蛍ルシフェラーゼは甲虫ルシフェラーゼの亜群である。歴史的には「蛍ルシフェラーゼ」という語は、単一の種Photinus pyralis由来の酵素LucPpyを指すものであった（Luc+はLucPpyの変異体相当物である。米国特許第5670356号を参照されたい。）。
【０００４】
ルシフェラーゼをコードしている天然cDNA配列を変異させ、熱安定性の改善された変異体を選択するという試みが報告されている（White等、1994；P.pyralisから、そしてKajiyamaおよびNekano、1993；Luciola lateralisから）。しかしながら、この重要なクラスの酵素の性質および多用途性を改善する必要性は依然として存在する。
【０００５】
発明の要約
本発明は、水溶液中、50℃で少なくとも２時間、または50℃で少なくとも５時間の半減期を有するルシフェラーゼ酵素を包含する、新規な且つ極めて熱安定性のルシフェラーゼを目的とするものである。下に述べるように、本発明に係る熱安定性ルシフェラーゼは、水溶液中50℃で２時間の後に、５％未満のルミネセンス活性を失っただけであった。本発明に係る変異体ルシフェラーゼは、水溶液中22℃で、そして水溶液中少なくとも60℃という高温で、著明な、そして従来実現されなかった熱安定性を示す。
【０００６】
例えば、本発明に係るルシフェラーゼは、水溶液中で、50℃で少なくとも10時間；60℃で少なくとも２時間、好ましくは少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも10時間、さらに好ましくは少なくとも24時間；そして／または22℃で少なくとも100日間、好ましくは少なくとも200日間、より好ましくは少なくとも500日間、さらに好ましくは少なくとも800日間、熱安定性である。
【０００７】
例えば、水溶液中22℃で30日後に本発明に係る熱安定性ルシフェラーゼは５％未満のルミネセンス活性を失ったに過ぎなかった。好ましくは、本発明に係る熱安定性ルシフェラーゼは、参照の、例えば天然の野生型ルシフェラーゼと比較して、増強したルミネセンス強度、増強したシグナル安定性、増強した基質利用性、および／または低下したKmを有する。本発明はさらに、新規なルシフェラーゼ酵素をコードしている変異体ルシフェラーゼ遺伝子（例えば、cDNAまたはRNA）を目的とするものである。本明細書中使用する用語は、例えば実験90、平板番号１、ウェルB5、大腸菌（E.coli）菌株で単離された変異体を90-1B5とし、その変異体遺伝子をluc90-1B5とし、そして変異したルシフェラーゼをLuc90-1B5とする。
【０００８】
本明細書中定義される「熱安定性の」酵素、例えばルシフェラーゼ、または「熱安定性」を有する酵素とは、水溶液中、或る条件、例えば或る温度下で、そして／または或る期間の間、参照酵素と比較して活性の保持が増大している酵素である。例えば、熱安定性ルシフェラーゼに対しては、参照ルシフェラーゼは天然の野生型ルシフェラーゼまたは組換え野生型ルシフェラーゼとすることができる。好ましくは、甲虫ルシフェラーゼに対しては、その活性は、ルシフェリンおよびATPによる飽和条件下でのルミネセンスである。酵素の熱安定性の一つの尺度は、定められた温度での水溶液中の酵素の半減期（活性の50％が失われる時間）である。
【０００９】
本発明はさらに、該変異体ルシフェラーゼを含む発現ベクターおよびその他の遺伝的組み立て物、ならびに該変異体ルシフェラーゼを発現するよう形質転換された、細菌およびその他の宿主を包含する。さらに本発明は、この新規なルシフェラーゼを含む組成物およびキット、ならびにルシフェラーゼが使用される任意の方法におけるこれらのルシフェラーゼの用途を目的とするものである。
【００１０】
無作為変異誘発の様々な手段が、ルシフェラーゼ遺伝子（ヌクレオチド配列）、最も詳細には、誤りがちなポリメラーゼを用いる遺伝子合成に適用されて、改変されたルシフェラーゼ遺伝子のライブラリーが創出された。このライブラリーをE.coliのコロニーで発現させ、有効なルミネセンスについて視覚的にスクリーニングし、改変されたルシフェラーゼのサブセットライブラリーを選択した。次いでこれら大腸菌（E.coli）菌株の溶菌液を作成し、ルシフェラーゼ活性および熱安定性について定量した。改変されたルシフェラーゼのより小さなサブセットをここから選び、選択された変異を合して、混成の改変されたルシフェラーゼを作成した。この混成の改変されたルシフェラーゼから無作為変異誘発によって新たなライブラリーを作成し、この工程を反復した。この工程を数サイクル反復した後に、最良の総合的能力を有するルシフェラーゼを選択した。
【００１１】
改善されたルシフェラーゼを生成する方法は、第一の甲虫ルシフェラーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を出発（親）配列として使用して、この酵素の他の性質を維持しつつ、第一のルシフェラーゼと比較して増大した熱安定性を有する第二のルシフェラーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を生成する、方向性のある進化を包含する。lucPpe2と呼称されるcDNAは、LucPpyと呼称され広く利用されているフォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼと比較して増大した熱安定性を示す、フォツリス・ペンシルバニカ（Photuris pennsylvanica）から誘導される蛍ルシフェラーゼをコードしている。
【００１２】
LucPpe2をコードしているcDNAが単離され、配列決定され、クローニングされた（Leach等、1997を参照されたい）。この遺伝子の変異体は第一のルシフェラーゼLucPpe2［T249M］をコードしている。しかしながら本発明に係る方法は甲虫ルシフェラーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を用いる用途に限定される訳ではなく、即ち本発明に係る方法は、他の酵素をコードしているポリヌクレオチド配列にも使用することができる。
【００１３】
変異体ルシフェラーゼの態様において、当該アミノ酸配列は、残基249位にLeach等により報告されたＴではなくＭが存在する（T249Mと表す）以外は図45に示されるLucPpe2のアミノ酸配列である。下線を付した残基（249）はＴからＭへの変異を示している。この酵素はE.coliで発現される時、インビボでおよそ５倍の光を生成した。
【００１４】
本発明方法により生成された変異体ルシフェラーゼを発現した組換え大腸菌（E.coli）の希釈抽出液を、光強度、シグナル安定性、基質利用性（Km）、および熱安定性を包含する多くの性質について同時にスクリーニングした。完全に自動化されたロボットシステムを用いて、膨大な数の、進化の各世代の変異体をスクリーニングした。数サイクルの変異誘発およびスクリーニングを行いそれによりルシフェラーゼの変異体ライブラリーを創出した後に、LucPpe2［T249M］の約35℃に比べて増大した熱安定性が、クローンLuc90-1B5について達成され、これはさらに、水溶液中、50℃で２時間、65℃で５時間、または22℃で６週間にわたり維持される酵素活性（無視できる５％の活性喪失があった）を本質的に維持した。
【００１５】
本発明に係る変異体ルシフェラーゼは、50℃で少なくとも２時間、好ましくは50℃で少なくとも５時間、そして50℃、60℃、および／または65℃までの温度で、少なくとも２時間、好ましくは少なくとも24時間、そしてより好ましくは少なくとも50時間の範囲の増大した熱安定性を示す。特に本発明は、適当な水溶液中に可溶化した時に、約50℃で約２時間以上、より好ましくは50℃で約10時間以上、さらに好ましくは50℃で５時間以上の熱安定性を有する。
【００１６】
本発明はさらに、適当な水溶液中に可溶化した時に、約60℃で約２時間以上、より好ましくは少なくとも５時間、さらに好ましくは約10時間以上、さらに好ましくは約24時間以上の熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼをも包含する。本発明はさらに、適当な水溶液中に可溶化した時に、約22℃で約３ヶ月間以上の熱安定性、より好ましくは22℃で少なくとも６ヶ月間の熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼを包含する。本発明の一つの態様は、６時間後に約５−６％の活性の喪失が見出された、65℃での熱安定性を有するルシフェラーゼ変異体である（２日間の半減期に相当する）。些少の相対的変化を示すデータから外挿した、本発明に係る最も安定なクローン由来の酵素の半減期は、65℃で２日間以上（６時間で６％の喪失に対応する）、そして22℃で約２年間（９週間で５％の喪失に対応する）である。
【００１７】
特に、本発明は、本明細書に開示したアミノ酸配列の態様を有するルシフェラーゼ酵素（例えば、Luc49-7C6、Luc78-0B10；Luc90-1B5、Luc133-1B2、およびLuc146-1H2と呼ばれる変異体ルシフェラーゼ、および、50℃で少なくとも２時間の半減期として測定される熱安定性を有する他の全ての甲虫ルシフェラーゼを包含する。本発明はさらに、参照の甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸をコンセンサスアミノ酸へと変換する型の、任意の単一変異または変異の任意の組み合わせを含むルシフェラーゼ酵素をコードしている変異したポリヌクレオチド配列をも包含する。
【００１８】
保存アミノ酸とは、与えられた関連酵素の組の全配列中で特定の位置に存在するアミノ酸として定義される。コンセンサスアミノ酸とは、与えられた酵素の組の配列の50％以上で特定の位置に存在するアミノ酸として定義される。一例は、LucPpe2を除外した、図19に示される甲虫ルシフェラーゼ配列の組である。
【００１９】
甲虫ルシフェラーゼをコードしているヌクレオチド配列を図19に並べる。自然界で様々な属、および属内の種に見出される、lucPpe2を包含する11の配列を並べる。増大した熱安定性を各々の変異体ルシフェラーゼには、増大した熱安定性を示す、少なくとも３個の変異が存在する。一般に、変異は共通アミノ酸残基の変異ではない。変異体ルシフェラーゼ中の変異を、下線を付すことによって図22〜47に示す。
【００２０】
本発明はさらに、１または複数の望ましい性質、例えば当該酵素の基質類似体による阻害に対する抵抗性、または増強された酵素的性質を有する酵素を製造する方法を提供する。この方法は、変異したポリヌクレオチド配列の第一の集団から、所望の性質、例えば酵素的性質を有する酵素をコードしている少なくとも一つの単離されたポリヌクレオチド配列を選択することを含む。次に、選択された、単離されたポリヌクレオチド配列を変異させて、変異したポリヌクレオチド配列の第二集団を得る。好ましくは、選択された単離されたポリヌクレオチド配列の混合物を変異させて、変異体ポリヌクレオチド配列の第二集団を得る。
【００２１】
この工程は、さらなるポリヌクレオチド配列が得られるまで、例えば選択され、そして／または単離されるまで、反復するが、このさらなるポリヌクレオチド配列は、所望の性質のうち少なくとも１個を有している。本明細書中使用する「単離され、そして／または「精製され」という語は、RNA、DNAまたはポリペプチド分子をその天然の細胞環境から、そして当該細胞の他の成分、例えば核酸またはポリペプチドとの結合からインビトロで単離し、例えばその結果、これが配列決定され、複製され、そして／または発現されるようにすることを指す。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に反復的変異誘発により、コード化遺伝子中に施される変異によって創出される酵素、例えば甲虫ルシフェラーゼに関するものであり、この変異した酵素は、参照酵素、例えば野生型酵素に比較して、１またはそれ以上の望ましい性質、例えば増大した熱安定性、インヒビターに対する増大した抵抗性、および／または増強した酵素的性質を有する。本発明に係る酵素をコードしているポリヌクレオチド配列は、本発明に係る酵素が誘導された酵素をコードしているポリヌクレオチド配列と比較して、数多くのアミノ酸置換をコードしている変異を含む。例えば、本発明は、熱安定性である酵素、例えばルシフェラーゼに関するものである。
【００２３】
増大した熱安定性は、ルシフェラーゼのような酵素をその活性を変えることなく保存することを可能にし、そしてこの変異したルシフェラーゼを使用する検定の再現性および制度を改善する。したがって、本発明の一つの態様は、増大した熱安定性を有する変異体ルシフェラーゼをコードしている単離されたポリヌクレオチド配列（cDNA）、該ポリヌクレオチド配列を含むベクター、および該ポリヌクレオチド配列を発現するよう形質転換された宿主を含む。第１表は、約250のクローンおよびそのクローン由来のルシフェラーゼの熱安定性を包含する性質の結果を示している。本発明はさらに、ルシフェラーゼが常套的に利用される任意の適用における変異体ルシフェラーゼの用途、および、その適用のうち幾つかにとって有用なキットを包含する。
【００２４】
思いがけないことに、必要とされる改善された熱安定性を有する甲虫ルシフェラーゼは、本発明において、反復的な変異誘発および選択（時に「有向性進化」と呼ばれる）の工程を通じて達成された。反復的変異誘発および選択の戦略、特に多パラメータ自動化スクリーニングの使用が、本発明の一つの態様である。したがって、熱安定性といったような単一の属性のみについてスクリーニングするのではなく、酵素活性および有効性のさらなる性質についての同時スクリーニングがなされた。この方法により、一つの性質が他の性質を犠牲にして「進化」する、例えば熱安定性は増大するが活性は低下する、という傾向は低い。
【００２５】
表１〜表２は、出発（親）配列として異なるルシフェラーゼを使用する実験から誘導されたパラメータ値（Li、タウ、KmおよびＳ。下記を参照されたい。）の例を表す。副題は、酵素の安定性が測定された温度および出発ルシフェラーゼ、例えば51℃でのLuc39-5B10等の明示を意味する。各実験中のパラメータは全てそれぞれの出発配列に対する相対的値として記録され、例えば任意の実験における出発配列についてのパラメータ値は「１」に等しい（定義については本明細書の実施例２を参照されたい）。
【００２６】
好熱性細菌に見出される熱安定性アイソザイムによって立証されるように、熱安定性は自然界で様々な酵素について進化してきた。自然の進化は、無作為変異誘発（塩基置換、遺伝子除去、遺伝子挿入）の工程と、これに続く、改善された性質を有する変異体の選択によってもたらされる。この工程は時間と共に反復される。自然界における熱安定性酵素の存在は、熱安定性が進化的な規模での変異誘発によって達成され得るという事を示唆するが、短期間の実験室的方法の使用により、特定のクラスの酵素について所定のレベルの熱安定性を達成することの実行可能性は予測し得なかった。一般に極めて大きな集団ならびに数百万の世代および遺伝子を含む、変異および選択による自然の進化の工程を使用して、有向的進化により改善された遺伝子を生成する近代的研究室の能力を予測することは、係る変異体が生成されるまではできない。
【００２７】
全ての甲虫ルシフェラーゼの全体的三次元構造はかなり似かよっているため、このような成功の後には、このクラスの一つの成員についてそれが可能であると示されたならば、同様の方法により他の甲虫ルシフェラーゼについても高い熱安定性が達成され得るという事が予測できる。図17は、甲虫ルシフェラーゼ間の進化上の関連性を示しているが、これらは全て類似の全体構造を持っている。
【００２８】
甲虫ルシフェラーゼが属する構造上のクラスは、二次構造によって決定される（例えば、ヘリックスは円柱によって示され、シートは矢印の集合によって示され、ループはヘリックスをシートと連結している（図18A）。図18Bは、LucPpe2ルシフェラーゼのアミノ酸を示しており、ここで小らせんは図18Aの円柱に対応し；図18Cは一般的な甲虫の構造がLucPpe2の構造と合致している（重複する）ことを示している。この事は、本発明に係る方法が全ての甲虫ルシフェラーゼに一般化され得るという予測を支持するものである。
【００２９】
酵素は、ヘリックス、シート、およびループといったような二次要素の三次元配置に基づく異なった構造上のクラスに属している。熱安定性は、二次要素がいかに効率的に三次元構造内に詰め込まれているかによって決定される。各々の構造上のクラスについて、熱安定性についての理論上の限界もまた存在する。全ての甲虫ルシフェラーゼは、それらの共通する祖先（図17）、ホモローガスなアミノ酸配列、および共通の触媒機構により明らかであるように、共通の構造上のクラスに属している。
【００３０】
変異誘発による限られた数のアミノ酸置換の適用が、全体的な三次元構造に有意な影響を及ぼすとは考えにくい（即ち、変異体ルシフェラーゼの構造上のクラスは変化しないと予想される）。いかなる構造上のクラスの熱安定性についての理論的限界も知られていないため、甲虫ルシフェラーゼの熱安定性の可能性は、本発明の立証がなされるまでは知られていなかった。
【００３１】
本発明の目的の達成に際しての先験的な障害は、以下の事柄を包含していた：
１．研究室的方法により施すことのできる変異の型は限定されている。
ｉ）無作為点変異によっては（例えば誤りがちなPCRによつては）、コドン当
たり１以上の塩基変化は稀である。したがって、最も可能性の高いアミノ
酸変化は稀である。
ii）他の型の無作為な遺伝子変化は、100bpより大きな領域について達成する
のは困難である（例えば、無作為遺伝子除去または挿入）。
【００３２】
２．スクリーニングされ得る可能性のあるルシフェラーゼ変異体の数は限定されている。
ｉ）除去および挿入を無視した天然ルシフェラーゼの配列比較に基づくと、10
189以上の機能的酵素配列が考えられる。
ii）１日に100000のクローンがスクリーニングできたとすると、同じ変異体が
２度スクリーニングされることはないと仮定して、全ての考え得る変異体
をスクリーニングするためには10179世紀を要することになる（本発明の
ための実際のスクリーニング速度は5000／日未満である。
【００３３】
３．共同的変異を要する機能的改善を発見する確率は稀である（特異的な共同的対を発見する確率は108クローンのうち１個である）。
したがって、たとえ熱安定性の理論的限界が知られていたとしても、可能性のあるルシフェラーゼ変異体のごく少数がスクリーニングできるに過ぎないため、係る熱安定性酵素を発見する先験的確率は低い。
しかしながら、ここに本発明は、高い熱安定性を有する新規な甲虫ルシフェラーゼを作り出すことが可能であり且つ実行可能であることを示す。
【００３４】
ａ）出発配列がlucPpe2またはlucPplYG由来のものである、本発明方法により
生成されるおよそ250の変異体は、この酵素のクラスのうち少なくとも１
個の成員が高い熱安定性を達成することが可能且つ実行可能であることを
証明する。
ｂ）甲虫ルシフェラーゼは同じ構造上のクラスに属しているため、いかなる甲
虫ルシフェラーゼも同じような手段によって改良することができる。
【００３５】
ｉ）甲虫ルシフェラーゼは全て同じ構造上のクラスに属しているため、これ
らはまた、安定化変異であると思われるものの同じプールを共有してい
る（この結論は、本発明に係るクローン中に見出される高率の安定化変
異は、他の甲虫ルシフェラーゼでの「コンセンサスアミノ酸」、即ち大
多数の甲虫ルシフェラーゼ配列中に出現するアミノ酸への変換であった
という知見によって支持される（図19を参照されたい）。
ii）同様の結果が、発光性甲虫Pyrophorus plagiophthalamus由来の充分相
違するアミノ酸配列で構成される甲虫ルシフェラーゼ（LucPplYG）を使
用して達成された。野生型lucPplYGは野生型lucPpe2に対して48％のヌ
クレオチド配列一致を有する。このLucPplYG変異体は、本明細書に記載
のLucPpe2変異体よりも少ないサイクルの有向性進化に付された。また
幾つかの例では、相対的熱安定性にそれ程重きを置かずに変異体が選択
された。この進化から得られた最も安定なクローン（Luc80-5E5）は、
溶液中50℃でほぼ3.8時間の半減期を有する。
【００３６】
有益な変異に比較して、予想される多数の有害な無作為変異によって惹起される統計学的影響を補償するため、検定精度を最大化し、且つ、過去に選択された変異を新たな順列で再スクリーニングする方法が用いられた。検定精度を最大化するための方法には、特化した培地を用いることにより培養条件を厳密に管理すること、成長速度を低下させること、熱移動を管理すること、そして中間対数期の培養の成長からパラメータを分析することがあった。精度を最大化したロボットプロセスは、このロボットスクリーニング工程中の混合、熱移動、および試料の蒸発を管理すること；および空間的に分布した対照試料に対してデータを正規化することを包含する。選択された変異の新たな順列が、校正ポリメラーゼを用いたDNAシャフリングの方法によって作り出された。
【００３７】
この反復法の結果を予測することの困難さが、これもまた選択されたルシフェラーゼの他の性質についての成功が変動しやすいことによって例証される。本来の焦点は酵素の熱安定性であったが、より明るいルミネセンスを生成し、より効率的な基質利用をし、そして拡大されたルミネセンスシグナルを有する変異体の選択もまた試行された。その定義は等式によって示す。選択プロセスは、この反復法のそれぞれの繰り返しについての、親クローンに比較した変化によって決定された。変化の量は、スクリーニング工程中に観察された変化全てであった。大腸菌（E.coli）におけるルシフェラーゼの発現は、Luc+に比べてLucPpe2については比較的非効率的であった。他のルシフェラーゼは様々であった（図21を参照されたい）。
【００３８】
基質利用の全体的効率を改善するため、ルシフェリンおよびATPの両者についての混成の見掛けの利用定数（即ち、Km［ATP＋ルシフェリン］）の低下を求めた。それぞれの利用定数（Km［ATP］、Km［ルシフェリン］）には予期し得なかった系統的変化があったが、総体的変化は殆ど無かった。最後に、酵素の効率を実質的に低下させなければ、ルミネセンスシグナルは中等度に影響を受けたに過ぎなかった。したがって、酵素の熱安定性は本発明方法により著しく増大するが、この酵素の他の性質は、受けた影響がずっと小さかった。
【００３９】
図１〜13、16、48〜53、60および62は、変異体ルシフェラーゼの熱安定性の測定値を示している。図48〜53は、変異体ルシフェラーゼの他の結果を示している。本発明に係る組成物は、自然のレベルの熱安定性よりも大きな熱安定性を有するルシフェラーゼを包含している。各々の変異体ルシフェラーゼは、それらの個別的性質が報告されたことがないため、新規である。特異的なルシフェラーゼはそれらの蛋白および遺伝子配列の両者によって知られている。
【００４０】
増大した高い熱安定性を有する他の多くのルシフェラーゼが単離されたが、それらの配列は未知である。これらのルシフェラーゼは有向性進化プロセスの最中に同定され、それらの酵素的性質により別個のものであると認められた。本発明に係る変異体ルシフェラーゼ、例えばLuc90-1B5は、22℃から少なくとも60℃という高温までの温度範囲で、著明な、そして従来実現されなかった熱安定性を示すことができる。
【００４１】
本発明の別の態様は、熱安定性ルシフェラーゼ、詳細には高い熱安定性を有する甲虫ルシフェラーゼを取り入れた方法、および、１またはそれ以上の望ましい性質、例えば基質インヒビターによる阻害に対する抵抗性、または増強した酵素的性質を有する、ルシフェラーゼを包含する酵素を製造する方法を包含する。したがって、本発明はさらに、少なくとも一つの増強された酵素的性質を有する酵素を製造する方法を提供する。変異に付される酵素をコードしている最初のポリヌクレオチド配列から誘導される酵素をコードしているポリヌクレオチド配列の集団から、増強された酵素活性を有する酵素をコードしている少なくとも１個のポリヌクレオチド配列が選択され単離される。
【００４２】
一つの態様では、次にオリゴヌクレオチド仲介変異誘発を使用して、コンセンサスアミノ酸をコードしている少なくとも１個のコドンを、該酵素をコードしている選択され単離されたポリヌクレオチド配列のうち少なくとも１個に導入し、該酵素をコードしており且つコンセンサスアミノ酸をコードしているコドンを有するさらなるポリヌクレオチド配列を得る［ここで、導入されるコドンは最初のポリヌクレオチド配列中には存在していない］。
【００４３】
本発明に係るルシフェラーゼの製造
増大した熱安定性を有するルシフェラーゼを製造する方法は、反復変異誘発とこれに続く選択である。本発明に係る高度に熱安定性の変異体ルシフェラーゼの態様は、出発ヌクレオチド配列、例えばlucPpe2［T249M］cDNAから始まる無作為点変異の反復プロセスによって生成された。組換え変異誘発は、点変異誘発と共に、変異誘発法の一部である。組換え変異誘発および点変異誘発は共に反復して実施される。この変異の工程は、有性生殖の最中の遺伝的要素の組換えに類似の様式で個々の変異体の組換えを引き起こすため、この工程は時に有性ポリメラーゼ連鎖反応（sPCR）と呼ばれる。例えば、1997年２月25日登録の、Stemmer、米国特許第5605793号を参照されたい。
【００４４】
lucPpe2 cDNA配列を出発点として、この遺伝子を変異させ、遥かに熱安定性である変異体ルシフェラーゼを生成した。lucPpe2配列に対する単一点変異は、その配列がT249Mと表されるルシフェラーゼを産み出した。この変異体はインビボでlucPpe2のおよそ５倍明るく、さらなる変異のための鋳型として利用された。これはまた、本明細書に記載の他の変異体ルシフェラーゼの熱安定性を測定するための基線に使用された。
【００４５】
本発明に係るルシフェラーゼの配列の態様
図45はLucPpe2ルシフェラーゼ（T249M）のアミノ酸配列を示している。この配列は249位にＴからＭへの１個の変異（下線を付した）を含んでおり、それがこの配列をLeach等（1997）によって報告された配列と区別している。このルシフェラーゼは552nmのスペクトル最大値を有し、それはLeach等のルシフェラーゼより黄色にシフトしている。この変異体はインビボでLeach等により報告されたもののおよそ５倍明るいため、これを実施例の幾つかにおける元の鋳型として使用するために選択したが、それによってこの検定によるより効率的なスクリーニングが可能となった。これらの配列は、出発配列からの変化（T249M）を、下線を付すことによって示してある。配列中の「ｘ」はアンビギュイティーを示していることに留意されたい。
【００４６】
有向性進化、反復プロセス
有向性進化は、変異誘発によって多様性を創出し、所望の変化を選択する反復プロセスである。多数のアミノ酸の累積作用の結果として生ずる酵素的性質に関して、有向性進化はこれらの性質を変化させる手段を提供する。このプロセスの各工程は典型的には酵素機能の小さな変化を産むが、何回ものこのプロセスの累積効果は実質的な総体的変化を導くことができる。
【００４７】
「熱安定性」という性質は、酵素の構造を作り上げている数多くのアミノ酸の合同作用によって決定されるため、有向性進化の候補である。改変されたルシフェラーゼのルミネセンス産出および基質結合の効率もまたスクリーニングされた。これは、熱安定性の変化が、他の重要な酵素的性質に望ましくない変化をもたらさないことを確認するためであった。
【００４８】
有害な変異の頻度は有用な変異よりずっと大きいため、本発明の精度限界内で各スクリーニングにおいて望ましくないクローンが選択され易い。これを補正するため、スクリーニング戦略に、最初に選択された変異の再スクリーニングを複数回取り入れた。ところが、再スクリーニングの前に、選択された変異は、無作為遺伝子内組換えのライブラリーを作り出すために「シャフル」された。このプロセスは、異なるクローンの中の有益な変異を再び合してより少ない共通コード化配列にすることを可能にし、そして、分離し削除すべき有害な変異を切り離す。したがって、本質上同一の選択された変異の組が再度スクリーニングされたのであるが、それらは組換えまたはシャフルの結果、異なる順列の下でスクリーニングされた。
【００４９】
進化的プロセスの各工程の結果を定量的測定によって検定したが、これらの測定は、精製された酵素ではなく細胞溶解液中で相互に行われた。さらに、それぞれの工程は、前行程に比較した酵素の能力の変化を測定したに過ぎず、酵素機能の包括的な変化を判断するのは困難であった。
表１〜表２は、本発明に係る方法を用いて得られた様々なクローンの性質をまとめたものである。
【００５０】
【表１】
0004520084.tif 000002
【００５１】
【表２】
0004520084.tif 000003
【００５２】
【表３】
0004520084.tif 000004
【００５３】
【表４】
0004520084.tif 000005
【００５４】
【表５】
0004520084.tif 000006
【００５５】
【表６】
0004520084.tif 000007
【００５６】
【表７】
0004520084.tif 000008
【００５７】
【表８】
0004520084.tif 000009
【００５８】
【表９】
0004520084.tif 000010
【００５９】
【表１０】
0004520084.tif 000011
【００６０】
【表１１】
0004520084.tif 000012
【００６１】
【表１２】
0004520084.tif 000013
【００６２】
酵素機能に及ぼす有向性進化の影響力を評価するため、このプロセスの始め、中程および終わりに得られたクローン（表13）を精製し、分析した。この分析のために選択されたクローンは、Luc［T249M］、Luc49-7C6、およびLuc78-0B10であった。引き続きオリゴヌクレオチド指定変異誘発およびスクリーニングの戦略により作り出された別のクローン、Luc90-1B5もまた分析用に精製した。
【００６３】
【表１３】
0004520084.tif 000014
【００６４】
熱安定性に及ぼす有向性進化の効果は劇的なものであった。親クローンが殆ど瞬時に不活性化された高温において、関連クローン由来の変異体の酵素は数時間に及ぶ熱安定性を示した（表１〜表12、および図１〜３、５〜８、11、13、50〜52および60をも参照されたい）。室温においてさえこれらの変異体は、親酵素の数倍の熱安定性がある（図４、９〜10、12、53、および62をも参照されたい）。
【００６５】
Luc90-1B5のその後の分析は、同じ緩衝液の条件下で試験する時、この酵素が65℃で27時間の半減期を持ち、さらに熱安定性であることを示した（図16A）。緩衝液の条件を最適化すると、この酵素は65℃で数時間にわたり殆ど活性の喪失を示さなかった（pH6.5のクエン酸緩衝液；図16A）。このルシフェラーゼはpH6.5でインキュベートする時、22℃で数週間にわたり安定であった（図16B）。時には４℃で100日間にわたり、この変異体の酵素は増大した熱安定性を有していた。４℃で15日以内は、変異体Luc49-7C6およびLuc78-0B10の熱安定性は親酵素と識別不可能であった（図49）。
【００６６】
KajiyamaおよびNakamo（1993）は、ルシオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）由来の蛍ルシフェラーゼにおいて、217位のＡからＩ、Ｌ、またはＶのいずれかへの単一アミノ酸置換が、増大した熱安定性を有するルシフェラーゼを生成することを示した。ロイシンによる置換は、50℃で１時間のインキュベーションの後にその活性の70％を維持するルシフェラーゼを生成した。
【００６７】
有向性進化により作り出された本発明に係る酵素の全ては、このルシオラ・ラテラリス（L.lateralis）変異体よりも遥かに安定である。一つのクローンLuc90-1B5は、同様の条件下での（50℃、25mol/Lクエン酸pH6.5、150mmol/LNaCl、１mg/mL BSA、0.1mmol/L EDTA、５％グリセロール）120時間（５日間）のインキュベーションの後に75％の活性を維持する。興味深いことに、Leach等により報告されたLucPpe2は、ルシオラ・ラテラリス（L.lateralis）変異体に関して記載されたホモローガスな位置にイソロイシンを既に含んでいる。
【００６８】
熱安定性は興味深い性質であるが、クローンを他の酵素学的パラメータに基づいてスクリーニングで選択した。より大きなルミネセンス発現を有するクローンを選択することにより、E.coliのコロニー中でより大きなルミネセンス強度を産む変異体が見出された。ところがこのプロセスは、この酵素にルミネセンスの動力学的プロフィールを変化させる能力が殆ど無いことを示した。この失敗は、定常状態のルミネセンスを支持する能力は、触媒機構にとって肝要なものであり、多くのアミノ酸の累積効果による影響を容易には受けない事を示唆している。
【００６９】
ルシフェリンおよびATPについての見掛けの混成Km（実施例２を参照されたい）を測定することにより、基質結合をスクリーニングした。見掛けの混成Kmは比較的一定に維持されたものの、後の分析では、個々のKmは系統的に変化することが示された。ルシフェリンのKmは上昇し、一方ATPのKmは下降した（表14）。この変化の理由は不明であるが、オキシルシフェリンまたはルシフェリンインヒビターのより効率的な放出が、より迅速な酵素の代謝回転につながるという事が推測できる。
【００７０】
それぞれの点変異がそれ自体で、野生型ルシフェラーゼに比較した変異体酵素の熱安定性を増大させる（程度の差はある）。個々の点変異を合した累積効果は、熱安定性がしばしばほぼ１等級またはそれ以上野生型よりも増大した、変異体ルシフェラーゼを産む。
【表１４】
0004520084.tif 000015
以下の実施例は本発明に係る方法および組成物ならびにそれらの態様を例示するものである。
【００７１】
実施例１．本発明に係る熱安定性ルシフェラーゼの製造
変異誘発法
例示的変異誘発戦略は以下の通りである：「最良の」野生型ルシフェラーゼクローン、即ち、増大した熱安定性があり、且つ他のパラメータに関する値の認知し得る低下が無いクローンから、誤りがちなPCRの３つの変形により、無作為変異誘発を実施した。無作為変異誘発の各サイクルから18個の最良クローンを選択した。これらのクローンからDNAを調製し、合計54個のクローンを得た。これらのクローンは新たな遺伝的多様性を表す。
【００７２】
これら54個のクローンを合し、組換え変異誘発を実施した。この集団から18個の最良クローンを選択した。
これら18個のクローンを先の集団の18個のクローンと合し、組換え変異誘発を実施した。このスクリーニングから、６群の機能的性質を表す、18クローンの新たなルシフェラーゼ集団を選択した。
【００７３】
このスクリーニングでは、元の配列コンフィギュレーションまたは組換えコンフィギュレーションである、選択された54のクローンの新たな変異を、２度目にスクリーニングした。各々の変異は平均で約10回分析した。組換え変異誘発に用いた90のクローンのうち、少なくとも10個が最良クローンと機能的に同等のようであった。したがって、最良クローンまたはその組換え体は少なくとも100回スクリーニングされることになる。これは組換えに使用されたクローンの数よりも多いので、最良のクローンと他のクローンとの生産的組換えを発見するかなりの見込みがあった。
【００７４】
ロボットプロセシング法
ロボットアームにより96ウェル平板を配置した多くの位置に厚いアルミニウムを使用することにより、ロボットプロセスにおける熱移動を管理した。例えば、インキュベーターまたは冷蔵庫の全ての棚を1/4インチのアルミニウムで組み立てた。特に室温にある一つの位置は、寸法が4.5ｘ７ｘ6.5インチのアルミニウムのブロックで組み立てた。いかなる96ウェル平板も、高温（例えばインキュベーター）または低温（例えば冷蔵庫）から室温の装置へ動かす場合には、温度の平衡化のため、それをまずこの大きなアルミニウムブロック上に置いた。この手段により、平板全体が速やかに新たな温度に到達し、よって温度の相違による平板中の様々なウェルの一様でない蒸発が最小限となるであろう。
【００７５】
インキュベーター中に置いた（例えば大腸菌（E.coli）の一夜増殖のため）96ウェル平板の積み重なりにおける熱移動は、平板の間に厚さ１mmのアルミニウムシートを置くことによって管理した。これにより、この積み重なりの隅から中央まで、より効率的な熱移動が可能となった。ロボットプロセスにおける混合は、各試薬の添加後この平板を数秒間振盪機上に設置することにより管理した。
平板が分析される順序の概略図については図14を、そして以下の機能を実行するようプログラムされ得るロボット装置については図15を参照されたい：
【００７６】
１．培養希釈法
細胞（大腸菌（E.coli）JM109）を入れた蓋付き平板（Falcon 3075）を振盪機上に置き、３−５分間混合する。
平板（蓋付き）を回転式トレーから取り、試薬ディスペンサーに置く。蓋を取り除いた後、培地（M9最少培地）180μLを加え、ピペッター近傍のローケーター上に置く。次にこの平板をピペッター中に置く。
振盪機上の平板をピペッター中に置き、蓋を取りローケーター上に置く。ピペット操作を用いて細胞を新たな平板に移す（「新たな細胞平板中への細胞の希釈」を参照されたい）。
蓋を両平板上に戻す。新しい平板を冷蔵庫に入れ、古い平板を回転式トレーに戻す。
【００７７】
２．ルミネセンス検定法
細胞の入った平板を回転式トレーから回収し、３−５分間振盪機上に置いて細胞を完全に混合する。細胞は放置すると溶液から沈澱する傾向がある。
光学密度（O.D.）を測定するため、平板を振盪機から照度計近傍のローケーターに移し、蓋を取り、平板を照度計の中に入れる。620nmのフィルターを使用してO.D.を測定する。
終了したならば、次いで保存のため平板を冷蔵庫に入れる。
次のプロセスに進む前に上記工程を全平板について完了する。
【００７８】
細胞溶解液を調製するため、まず、細胞の平板を冷蔵庫から回収し、振盪機上で混合して細胞を再懸濁させる。回転式トレーからの新たな蓋無しの平板を試薬ディスペンサーに置き、各ウェルに20μLの緩衝液Ａを加える。これをピペッティングステーションに置く。
振盪機中の細胞の平板をピペッティングステーションに置く。娘平板をピペッティング操作を用いて作成する（「溶菌平板中への細胞のピペッティング」を参照されたい）。
ピペッティングの後、新たな娘平板を、混合のため振盪機上に置く。
【００７９】
混合後、溶解液平板を固体CO2冷凍ステーション中に入れて試料を冷凍する。次いでこの平板を融解ブロックに移し、10分間融解する。
次に平板を試薬ディスペンサーに移して緩衝液Ｂ 175μLを加え、次いで振盪機上で約15分間またはそれ以上混合する。冷凍／融解および緩衝液Ｂの組み合わせは細胞の溶解を惹起する。
回転式トレーからの新たな蓋付き平板を使用して、全検定が誘導される希釈平板を調製する。平板を試薬ディスペンサーに置き、蓋をピペッター近傍のローケーターに動かす。試薬ディスペンサーを用いて緩衝液Ｃ 285μLを各ウェルに添加し、次いで平板をピペッティングステーションに置く。
【００８０】
振盪機中の溶解液平板をピペッティングステーションに移し、ピペッティング操作を行う（「溶解平板からインキュベーション平板への希釈」を参照されたい）。ピペッティングの後、新たな娘平板を混合のため振盪機上に置く。溶解液平板は廃棄する。
２枚のホワイト検定平板（Labsystems#9502887）を平板フィーダーから得、ピペッターに置く。振盪機からのインキュベーション平板をピペッターに置き、蓋を取り、そばのローケーター上に置く。２枚の娘平板をピペッティング操作を用いて作成する（「インキュベーション平板からの娘平板の対の作成」を参照されたい）。後に蓋を親平板に戻し、この平板を高温インキュベーター中に入れる［クローンに応じて31℃から約65℃までの範囲］。
【００８１】
１枚の娘平板を照度計に入れ、1X検定法を使用する。この検定の後、平板を周囲温度のインキュベーターに入れ、２枚目の娘平板を照度計に入れる。２枚目の平板については0.02X検定法を使用する。この平板を廃棄し、１枚目の平板をインキュベーターから照度計に戻す。反復検定法を使用する（即ち、試薬は注入しない）。この後、平板を再度周囲温度のインキュベーターに戻す。
上記の工程を全ての平板について完了した後、プロセスを進める。
第２セットの測定を開始するために、高温インキュベーターからの平板を混合のため振盪機に入れる。
【００８２】
周囲温度のインキュベーター中の平板を照度計に戻し、反復検定法を再度使用する。この後平板を周囲温度のインキュベーターに戻す。
２枚のホワイト検定平板を再度平板フィーダーから得、ピペッターに置く。振盪機上の平板をピペッターに置き、蓋を取り、近傍のローケーター上に置く。２枚の娘平板をピペッティング操作を用いて再度作成する（「インキュベーション平板からの娘平板の対の作成」を参照されたい）。後に蓋を親平板に戻し、この平板を高温インキュベーターに戻す。
【００８３】
１枚の娘平板を照度計に入れ、１Ｘ検定法を再度使用する。この検定の後、平板は廃棄する。次に２枚目の娘平板を照度計に入れ、0.06X検定法を使用する。この平板もまた廃棄する。
上記の工程を全ての平板について完了した後、プロセスを進める。
最終セットの測定では、高温インキュベーターからの平板を混合のため再度振盪機に入れる。
周囲温度のインキュベーター中の平板を照度計に戻し、反復検定法を再度使用する。この後平板を廃棄する。
【００８４】
１枚のホワイト検定平板を平板フィーダーから取り、ピペッターに置く。振盪機からの平板をピペッターに置き、蓋を取り、近傍のローケーター上に置く。１枚の娘平板をピペッティング操作を用いて作成する（「インキュベーション平板からの単一娘平板の作成」を参照されたい）。蓋を親平板に戻し、この平板を廃棄する。
娘平板を照度計に入れ、1X検定法を使用する。この検定の後、平板は廃棄する。
【００８５】
緩衝液および検定試薬
緩衝液Ａ：325mM K2HPO2；6.5mM CDTA；0.1％トリトンX-100
緩衝液Ｂ：1X CCLR（Promega E153A）；1.25mg/mLリゾチーム；0.04％ゼラチン
緩衝液Ｃ：10mM HEPES；150mM NaCl；１mg/mL BSA；５％グリセロール；0.1mM EDTA
1X検定試薬：５μＭルシフェリン；175μM ATP；20mMトリシン、pH8.0；0.1mM EDTA
0.02X検定試薬：1X検定試薬の１：50希釈
0.06X検定試薬：1X検定試薬の１：16.7希釈
【００８６】
ピペッティング操作
Ａ．溶解平板への細胞のピペッティング
固定先端部を使用する非無菌操作
ピペッターデッキ上：
−ウェル当たりJM109細胞およそ200μLを入れた蓋無し平板を置く
−緩衝液Ａ 20μLを入れた溶解液平板
【００８７】
操作：
１．先端を洗浄ステーションに移動させ、１mLで洗浄する。
２．細胞平板に移動させ、60μLを吸い上げる。
３．溶解液平板に移動させ、45μLを分注する。
４．工程１−３を96の試料全てについて反復する。
５．この操作の終わりに、工程１を反復して先端をきれいにする。
操作後：
−溶解液平板を振盪機上に置く。
−細胞の入った平板上に蓋をし、回転式トレー上に置く。
−溶解液をCO2冷凍機中に入れる。
【００８８】
Ｂ．溶解平板からインキュベーション平板への希釈
ピペッターデッキ上：
−溶解液240μLを入れた溶解液平板
−緩衝液Ｃ 285μLを入れた蓋無しインキュベーション平板
操作：
１．先端を洗浄ステーションに移動させ、0.5mLで洗浄する。
２．溶解液平板に移動させ、30μLを吸い上げる。
３．インキュベーション平板に移動させ、緩衝液に直接接触させることにより15μLを分注する。
４．工程１−３を96の試料全てについて反復する。
５．この操作の終わりに、工程１を反復して先端をきれいにする。
操作後：
−インキュベーション平板を振盪機上に置く。
−溶解液平板を廃棄する。
【００８９】
Ｃ．インキュベーション平板からの娘平板の対の作成
この操作は２回行う。
ピペッターデッキ上：
−100〜300μＬの溶液を入れた蓋無しインキュベーション平板
−２枚の空の検定平板（ホワイト）
操作：
１．先端を洗浄ステーションに移動させ、0.5mLで洗浄する。
２．インキュベーション平板に移動させ、50μLを吸い上げる。
３．第一の検定平板に移動させ、20μLを分注する。
４．第二の検定平板に移動させ、20μLを分注する。
５．工程１−４を96の試料全てについて反復する。
６．この操作の終わりに、工程１を反復して先端をきれいにする。
【００９０】
操作後：
１．蓋をインキュベーション平板上に戻す。
２．インキュベーション平板をインキュベーターに入れる。
３．第一の検定平板を照度計に入れる。
４．第二の検定平板を回転式トレー上に置く。
【００９１】
Ｄ．インキュベーション平板からの単一娘平板の作成
ピペッターデッキ上：
−100−300μLの溶液を入れた蓋無しインキュベーション平板を置き、そして、
−空の検定平板（ホワイト）
【００９２】
操作：
１．先端を洗浄ステーションに移動させ、0.5mLで洗浄する。
２．インキュベーション平板に移動させ、40μLを吸い上げる。
３．検定平板に移動させ、20μLを分注する。
４．工程１−３を96の試料全てについて反復する。
５．この操作の終わりに、工程１を反復して先端をきれいにする。
操作後：
−インキュベーション平板およびインキュベーション平板上の蓋を廃棄する。
−検定平板を照度計に入れる。
【００９３】
Ｅ．新たな細胞平板への細胞の希釈
固定先端部を使用する無菌操作
ピペッターデッキ上：
−およそ200μLの細胞を入れた蓋無し平板
−増殖培地180μLを入れた新たな蓋無し細胞平板
【００９４】
操作：
１．細胞平板に移動させ、45μLを吸い上げる。
２．細胞平板に移動させ、直接的な液−液移動によって20μL容を分注する。
３．廃液入れに移動させ、過剰の細胞を排出する。
４．イソプロパノール洗浄ステーションに移動させ、イソプロパノールを吸引して先端部を滅菌する。
５．洗浄ステーションに移動させ、イソプロパノールを排出し、先端部を洗浄する。
６．工程１−４を96の試料全てについて反復する。
【００９５】
操作後：
−蓋を元の細胞の平板上に戻し、回転式トレー上に置く。
−蓋を新たな細胞平板上に戻し、冷蔵庫に入れる。
注：
この操作は、主分析操作に使用する細胞平板を作成するために用いられる。ピペッティング操作を開始する直前に、M9最少増殖培地180μLを試薬ディスペンサーにより新たな細胞平板の各々に添加する。培地を注入する前にディスペンサーは75％イソプロパノールで洗い流す。さらに培地は、汚染の可能性を低減させるため、選択的な抗生物質を含んでいる。
【００９６】
照度計操作
Ａ．1X検定法
１．平板を照度計内に入れる。
２．１Ｘ検定試薬100μLを注入する。
３．１ないし３秒間ルミネセンスを測定する。
４．次のウェルについて反復する。
５．全てのウェルを測定するまで続ける。
Ｂ．0.02X検定法
１．平板を照度計内に入れる。
２．0.02X検定試薬100μLを注入する。
３．１ないし３秒間ルミネセンスを測定する。
４．次のウェルについて反復する。
５．全てのウェルを測定するまで続ける。
【００９７】
Ｃ．0.06X検定法
１．平板を照度計内に入れる。
２．0.06X検定試薬100μLを注入する。
３．１ないし３秒間ルミネセンスを測定する。
４．次のウェルについて反復する。
５．全てのウェルを測定するまで続ける。
Ｄ．反復検定
１．平板を照度計内に入れる。
２．１ないし３秒間ルミネセンスを測定する。
３．次のウェルについて反復する。
４．全てのウェルを測定するまで続ける。
【００９８】
インビボ選択法
２枚のマイクロ平板（176クローン）につき、ディスク当たり200−500のコロニーを有する５ないし７個のニトロセルロースディスク（計1000−3500コロニー）をスクリーニングする（WoodおよびDeLuca、1987）。クローンは標準スクリーニング条件を用いて高温でスクリーニングする。
各マイクロ平板の８個の位置を、「最良の」ルシフェラーゼを用いて参照クローンから確保しておく（無作為変異誘発およびコドン変異誘発のための親クローン）。確保されたウェルの位置は、下記の「Ｘ」で示す。
【００９９】
【表１５】
0004520084.tif 000016
参照クローンは、親クローンから参照ウェルへと形質転換されたDNA由来のコロニーを置くことにより作成する。マイクロ平板の接種前にこれらのウェルを同定するために、ウェルは、各ウェルの底に黒のマーカーで印を付けておく。
【０１００】
スクリーニング選択基準
スクリーニング目的のため、以下の基準を使用した。酵素の安定性パラメータのために選択された温度は、親酵素が10時間で100ないし1000倍崩壊するような温度であった（第１表を参照されたい）。基準１は手動で達成され；基準２−６についてのデータはロボット分析により作られる。全ての基準について、記載のような最大値を選択する。
【０１０１】
１．インビボスクリーニング。与えられた温度において最も明るいクローンを選択する。
２．発現／特異活性。正規化したルミネセンスの値を、ルミネセンス対光学密度の比として算出する。この値は参照値との比として報告する。
３．酵素安定性。インキュベートした試料の正規化したルミネセンスの測定値（約15時間で３個を採用）を、ln（Ｌ）＝ln（L0）−（ｔ／τ）［式中、Ｌは正規化したルミネセンスであり、ｔは時間である。τは酵素安定性の尺度である。］に当てはめる。この値を参照値との比として報告し、相関係数を算出する。
【０１０２】
４．基質結合。1Xおよび0.02Xを用いた正規化したルミネセンスの測定値を初期読み取りセットで採用し、1Xおよび0.06Xを５時間セットで採用する。0.02X：1Xおよび0.06X：1Xの比は、0.02Xおよび0.06X濃度での相対的ルミネセンスを与える。これらの数値を1Xでの相対的ルミネセンス（即ち１）と共にラインウィーバー−バークプロットに当てはめて、基質ATP、ルシフェリン、およびCoAについてのKm：app,totalを求める。数値は参照値と共に逆比として報告し、相関係数を算出する。
【０１０３】
５．シグナル安定性。初期1Xルミネセンス反応のルミネセンスを約15時間かけてさらに３回再測定する。これらの値をln（Ｌ）＝ln（L0）−（ｔ／τ）に当てはめ、ｔ（15時間）についての積分を計算する。次いでシグナル安定性を、Ｓ＝（1-int（Ｌ）／L0t）2として算出する。数値は参照値と共に逆比として報告し、相関係数を算出する。
６．混成適合性。基準２ないし５の数値を合して適合性についての単一の混成値（または商業的有用性）とする。この値は他の基準の相対的重要性の判断に基づいている。この判断を下記に述べる：
【０１０４】
基準 相対値
酵素安定性          ５
シグナル安定性      ２
基質結合            ２
発現／活性          １
混成値、Ｃ＝合計（相対値により加重された基準２−５、例えば、安定性は主たる目標であったため、より大きく加重される）。
【０１０５】
実施例２．ソフトウェア
SQLデータベースへのデータの組織化
照度計（96ウェル、Anthos、オーストリア）により作られた各ファイルは１枚のマイクロ平板からのデータを表す。これらのファイルを照度計を制御するコンピューターに保存し、ネットワークリンクによりデータベースコンピューターに接続する。各々の試料のマイクロ平板から、９枚のマイクロ平板を照度計により読み取る（光学密度については元のマイクロ平板、そしてルミネセンスについては８枚の娘マイクロ平板）。
【０１０６】
合計90のファイルを作成するが、その各々に96の試料についてのデータセットが入っている。各データセットは、試料番号、その平板の最初の測定と比較した各測定の時間、照度計の読み取り値、およびバックグラウンドで補正した照度計の読み取り値を含んでいる。他のファイル標題の情報もまた与えられている。各マイクロ平板が読み取られた時間もまた分析に必要である。これはロボットの稼働記録またはファイル作成時間から入手することができる。ファイル命名の慣行がファイル作成中にロボットによって使用され、これはSQLによって認識することができる（例えば、YYMMDDPR.DAT［ここで、YYは年であり、MMは月であり、DDは日であり、Ｐは初期平板［０−９］であり、そしてＲは読み取り値［０−８］である］。
【０１０７】
データの縮小および組織化
ルミネセンスデータの正規化：８枚の娘平板におけるルミネセンスの測定値それぞれについて、相対光単位を元の平板の光学密度で除することにより、正規化されたルミネセンスを算出する。いずれかの正規化されたルミネセンス値が０未満であるならば、0.1sL［ここでsLは正規化されたルミネセンスの測定値についての標準偏差である］の値を割り当てる。
【０１０８】
相対測定時間の算出：正規化されたルミネセンス測定値の各々について、試料の最初の測定に比較した測定時間を算出する。例えば、平板７の試料B6（即ち７：B06）の全ルミネセンス測定の時間を、７：B06の最初の読み取りに対して算出する。この時間計算は、その平板が読み取られる時間およびその平板において試料が読み取られる相対的時間の両者を含んでいる。
【０１０９】
酵素安定性（τ）の算出：各試料について、1X基質濃度による３個のルミネセンス測定値（平板１、５、８）を用いてln（Llx）＝ln（L0）−（ｔ／τ）に当てはめるための線形回帰を使用する。回帰係数もまた算出する。
基質結合（Km:app,total）の算出：第一セットの読み取りからのマイクロ平板（平板１および２）を使用して、0.02Xの基質濃度で行われた測定値を1Xによる測定値で除することにより、L0.2x,relを算出する。同様に、第二セットの読み取りからのマイクロ平板（平板５および６）を使用して、0.06Xの基質濃度で行われた測定値を1Xによる測定値で除することにより、L0.06x,relを算出する。
【０１１０】
各々の試料について、
Ｌ                    ［Ｓ］
L0.02x,rel               0.02
L0.06x,rel               0.06
ｌ（Llx,rel）            1
を使用する１／Ｌ＝（Km:app,total／Lmax:app）（１／［Ｓ］）＋（１／Lmax:app）に当てはめるため、線形回帰を使用する。
Km:app,totalは傾斜／切片として算出する。回帰係数もまた算出する。
【０１１１】
シグナル安定性（Ｓ）の算出：各試料について、1X基質濃度の始発マイクロ平板の４個のルミネセンス測定値（平板１、３、４および７）を使用してln（Ｌ）＝ln（L0）−（ｔ／τ）に当てはめるため、線形回帰を使用する。回帰係数もまた算出する。算出したτおよびL0の値から、int（Ｌ）＝τL0（１−exp（−tf／τ））［式中、tfは最終測定の平均時間（例えば15時間）である］によってルミネセンスの積分を算出する。シグナル安定性は、Ｓ＝（１−int（Ｌ）／Litf）2［式中、Liは1x基質濃度を用いた正規化したルミネセンスの始発測定値である（平板１）］として算出する。
［注：蒸発を補正するため、等式Ｓ＝（１＋Ｋ−int（Ｌ）／Litf）2［ここで、１／Ｋ＝２（tfにおける液体体積の相対変化）である］を使用することができる。］
【０１１２】
参照値表面の算出：横軸にマイクロ平板内の試料の格子位置を、そして縦軸に試料の計算値（Li、τ、Km:app,total、またはＳ）を使用することにより、三次元座標系を定義することができる。この三次元系を「平板マップ」と称する。参照レベルを表す平板マップの平滑表面は、各マイクロ平板中の８個の参照クローンについて決定された数値を最小二乗法に当てはめることによって決定することができる。試料のうち10枚の始発マイクロ平板の各々について、それぞれの参照表面を、基準パラメータLi、τKm:app,total、およびＳ（合計40表面）について決定する。
【０１１３】
最小二乗法への当てはめにおいて、縦軸（即ち、基準パラメータ）は従属変数であり、横軸は独立変数である。一次表面（即ち、ｚ＝ax＋by＋ｃ）を参照クローンの値に当てはめる。この表面を計算した後、各参照クローンに対する残りの数を計算する。これらの残部のいずれかが所定のカットオフ範囲をはずれた場合は、異常な参照クローンを除外して参照表面を再計算する。
一次表面が参照クローンの値を充分表していない場合は、限定された二次表面を使用する（即ち、ｚ＝ａ（x2＋ky2）＋bx＋cy＋ｄ［式中、ｋは定数である］）。
【０１１４】
参照により正規化した値の算出：各試料の基準パラメータについて、それぞれの参照値を用いた比または逆比を算出することにより、参照により正規化した値を決定する。参照により正規化した値は、Li／Lir、τ／τr、Kmr／Km:app,total、およびSr／Ｓ［ここで、参照値は適当な参照表面の等式から算出する］である。
混成評点の算出：各試料について、Ｃ＝５（τ／τr）＋２（Sr／Ｓ）＋２（Kmr／Km:app,total）＋（Li／Lir）を算出する。
【０１１５】
サブグループ分けの決定：基準パラメータLi、τ、Km:app,total、Ｓ、およびＣについて、サブグループ分けのための限界設定値（即ち、容器サイズ）をgL、gτ、gKm、gS、およびgCと定義する。Li、τ、もしくはＣについての最高値、またはKm:app,totalもしくはＳの最低値から始めて試料を各基準パラメータについて容器に割り当てる（第一の容器は＃１である、等）。
【０１１６】
参照により正規化した値の分類表の表示：各々の列に以下のデータを示す、各試料についてのデータの表を表す：
−試料の認識番号（例えば、７：B06）
−混成評点（Ｃ）
−参照により正規化した酵素安定性（τ／τr）
−酵素安定性のための相関係数
−酵素安定性のための容器番号
−参照により正規化したシグナル安定性（Sr／Ｓ）
−シグナル安定性のための相関係数
−シグナル安定性のための容器番号
−参照により正規化した基質結合（Kmr／Km:app,total）
−基質結合のための相関係数
−基質結合のための容器番号
−参照により正規化した発現／特異活性（Li／Lir）
−発現／特異活性のための容器番号
この表は混成評点（Ｃ）によって分類する。
【０１１７】
基準パラメータの分類表の提示
各々の列に以下のデータを示す、各試料についてのデータの表を表す：
−試料の認識番号
−混成評点（Ｃ）
−酵素安定性（τ）
−酵素安定性のための相関係数
−酵素安定性のための容器番号
−シグナル安定性（Ｓ）
−シグナル安定性のための相関係数
−シグナル安定性のための容器番号
−基質結合（Km:app,total）
−基質結合のための相関係数
−基質結合のための容器番号
−発現／特異活性（Li）
−発現／特異活性のための容器番号
この表は混成評点（Ｃ）によって分類し；参照クローンはこの表から除外する。上記のものと同じ、標準偏差によるエントリー（entry）のコード化。
【０１１８】
参照により正規化した値の分類表の提示
これはデータ縮小操作の最終工程と同じ操作である。表は以下の事柄を示す：
−試料の認識番号
−混成評点（Ｃ）
−参照により正規化した酵素安定性（τ／τr）
−酵素安定性のための相関係数
−酵素安定性のための容器番号
−参照により正規化したシグナル安定性（Sr／Ｓ）
−シグナル安定性のための相関係数
−シグナル安定性のための容器番号
−参照により正規化した基質結合（Kmr／Km:app,total）
−基質結合のための相関係数
−基質結合のための容器番号
−参照により正規化した発現／特異活性（Li／Lir）
−発現／特異活性のための容器番号
この表は混成評点（Ｃ）によって分類し；参照クローンはこの表から除外する。上記のものと同じ、標準偏差によるエントリーのコード化。
【０１１９】
参照クローンのための基準パラメータの分類表の提示
これは、参照クローンのみについてであることの他は上記の基準パラメータのための方法と同じである。この表は以下の事柄を示す：
−試料の認識番号
−混成評点（Ｃ）
−酵素安定性（τ）
−酵素安定性のための相関係数
−酵素安定性のための容器番号
−シグナル安定性（Ｓ）
−シグナル安定性のための相関係数
−シグナル安定性のための容器番号
−基質結合（Km:app,total）
−基質結合のための相関係数
−基質結合のための容器番号
−発現／特異活性（Li）
−発現／特異活性のための容器番号
この表は混成評点（Ｃ）によって分類する。上記のものと同じ、標準偏差によるエントリーのコード化。
【０１２０】
参照により正規化した値の分類表の提示
これは、参照クローンのみについてであることの他は上記の参照により正規化した値のための方法と同じである。表は以下の事柄を示す：
−試料の認識番号
−混成評点（Ｃ）
−参照により正規化した酵素安定性（τ／τr）
−酵素安定性のための相関係数
−酵素安定性のための容器番号
−参照により正規化したシグナル安定性（Sr／Ｓ）
−シグナル安定性のための相関係数
−シグナル安定性のための容器番号
−参照により正規化した基質結合（Kmr／Km:app,total）
−基質結合のための相関係数
−基質結合のための容器番号
−参照により正規化した発現／特異活性（Li／Lir）
−発現／特異活性のための容器番号
この表は混成評点（Ｃ）によって分類する。上記のものと同じ、標準偏差によるエントリーのコード化。
【０１２１】
分類表
いかなる表も、一次および二次キイとして任意のエントリーにより分類することができる。
表のヒストグラムの表示
任意の表について、基準パラメータ対容器番号のヒストグラムを、任意の基準パラメータについて表示することができる。
【０１２２】
平板マップの表示
任意の平板について、以下の項目のうちいずれかを示す平板マップを表示することができる：
−ルミネセンスまたは光学密度測定値
−Li
−Li参照表面
−Li／Lir
−τ
−τ参照表面
−τ／τr
−τの相関係数
−Ｓ
−Ｓ参照表面
−Sr／Ｓ
−Ｓの相関係数
−Km:app,total
−Km参照表面
−Kmr／Km:app,total
−Km:app,totalについての相関係数
−混成評点（Ｃ）
平板マップは三次元棒グラフとして表示する。好ましくは、参照クローンを表す棒は、着色またはその他の手段によって示す。
【０１２３】
各エントリーのドリルダウン（drill down）要約の表示
Li、τ、Km:app,total、およびＳについて、表中のエントリー値を選択し、その値の算出の基礎となるルミネセンスおよび光学密度の読み取り値、ならびに適当ならば曲線のグラフ表示を表示することができる。好ましくは、含まれる等式および最終結果および相関係数もまた表示する。
【０１２４】
LiまたはLi／Lr。平板０および平板１中の選択された試料由来の光学密度およびルミネセンス値を表示する。
τまたはτ／τr。平板０、平板１、平板５、および平板８中の選択された試料由来の光学密度およびルミネセンス値を表示する。データの点および最良の線を示すln（L1X）対ｔのグラフを表示する。
【０１２５】
ＳまたはSr／Ｓ。平板０、平板１、平板３、平板４、および平板７中の選択された試料由来の光学密度およびルミネセンス値を表示する。データの点および最良の線を示すln（Ｌ）対ｔのグラフを表示する。
Km:app,totalまたはKmr／Km:app,total。平板０、平板１、平板２、平板５、および平板６中の選択された試料由来の光学密度およびルミネセンス値を表示する。データの点および最良の線を示す１／Ｌ対１／［Ｓ］のグラフを表示する。
【０１２６】
実施例３．新規なルシフェラーゼの製造
図45に示される遺伝子は、249位にＴからＭへのアミノ酸置換をコードしている単一塩基対変異を含んでいる。このクローンは、Lucの配列から黄色にシフトした552nmに最大スペクトルを有する。この変異体は、インビボで５倍明るい明度をもたらすため、これを元の鋳型として選択し、それにより、より効率的なスクリーニングが可能となった。
【０１２７】
Ｃ末端変異誘発
ペルオキシソーム標的化シグナル（SKL）を排除するため、ＬをSTOPコドンに変異させ、上流に隣接した３コドンを本明細書に記載のオリゴヌクレオチド変異誘発に従って無作為化した。これを達成すべく設計された変異誘発オリゴヌクレオチドは、配列決定無しに変異体の同定を可能にする、ユニークなSpeI部位をも導入する。この変異体をインビボでスクリーニングし、13のコロニーを選び出したが、そのうち12個がSpeI部位を含んでいた。
【０１２８】
Ｎ末端変異誘発
発現が改善され得るかどうかを試験するため、開始Metの下流に隣接した３個のコドンを本明細書に記載のように無作為化した。これを達成すべく設計された変異誘発オリゴは、配列決定無しに変異体の同定を可能にする、ユニークなApaI部位をも導入する。７個のクローンを選択し、単離されたプラスミドのうち６個が変異体であると確認された。
【０１２９】
Ｃ−およびＮ−末端変異体のシャフリング
Ｃ−およびＮ−末端変異誘発を、並列させて実施した。Ｎ−およびＣ−末端変異を合するために、各々の変異誘発実験由来の選択されたクローンを、本明細書に記載の組換え変異誘発プロトコルに従う組換え変異誘発を使用して合した。シャフルされた変異体をampS pRAMバックボーン中にサブクローニングし、DH5 F’IQ（BRL；Hanahan、1985）でスクリーニングした。合計24個のクローンが選択され、４個だけがＮ−およびＣ−末端変異の両者を含んでいた。これら４個のクローンを、該遺伝子のシステイン位置の無作為化のための鋳型として使用した。
【０１３０】
システイン位置の無作為化のための変異誘発／Luc遺伝子の無作為変異誘発および組換え変異誘発
LucPpe2には７個のシステイン位置がある。これらの位置は、この蛋白の非安定化を惹起し得る酸化に対し感受性である。このシステイン位置を無作為化するため、７個のオリゴヌクレオチドを定めた。
このオリゴヌクレオチドを、異なるファミリー由来の他のルシフェラーゼ遺伝子中のシステインの保存に基づき、二つの群にまとめた。第１群は、保存されたシステイン位置Ｃ−60、Ｃ−80、およびＣ−162を無作為化する。第２群は、厳密には保存されていない位置Ｃ−38、Ｃ−127、Ｃ−221、およびＣ−257のシステインを無作為化する。
【０１３１】
Ｎ−およびＣ−末端変異誘発から選択された４個の鋳型をアンピシリン感受性バックボーン中にサブクローニングし、一本鎖DNAを鋳型のそれぞれについて調製した。これらの鋳型を同量ずつ合し、本明細書に記載のようにオリゴヌクレオチド変異誘発を完成した。mutS形質転換のアリコートを平板培養し、その後一夜インキュベーションすることによって、２群のそれぞれが２ｘ104の独立した形質転換体を含むことが確定した。この２群についてmutS-DNAを調製し、次いでスクリーニング用にJM109細胞中に導入した。
【０１３２】
第１群からの変異体をインビボでスクリーニングし、完全ロボット操作のために選択を行った。改善された性質を持っていた５個のクローンを選択した。第２群からの変異体をインビボでスクリーニングし、完全ロボット操作のために選択を行った。ロボット上の温度インキュベーターは、この実験セット用に33℃に設定した。改善された性質を持っていた10個のクローンを選択した。システイン変異誘発実験の両群から選択した15個の最良クローンを本明細書に記載のように共にシャフルし、18個の最良クローンをロボット操作後に選択した。
【０１３３】
上の実験由来の「最良の」クローン（Luc31-1G8）を、次回の変異誘発のための鋳型として選択した（高温ロボットインキュベーター温度は42℃に設定した）。変異誘発の完全なラウンドをもう一回実施した。
上の変異誘発からの18個の最良クローンを選択し、クローン（Luc39-5B10）を最良クローンとして選択し、変異のもう一つのラウンドの鋳型として使用した（高温ロボットインキュベーター温度は49℃に設定した）。
【０１３４】
このサイクルの後、最良クローンのうち６個を配列決定用に選択した（このクローンのうち５個のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ図22−26および27−31に示す）。配列データに基づき、無作為化のために９個の位置を選択し、これらの位置を含む７個のオリゴを設計した。ロボットの作成したデータに基づき、配列決定された６個のクローンの群のうち最良のクローンが、クローン（Luc49-7C6、図22および27）であることが決定された。このクローン由来のルシフェラーゼ遺伝子をアンピシリン感受性pRAMバックボーン中にサブクローニングし、一本鎖DNAを調製した。本明細書に列挙するオリゴヌクレオチド変異誘発に従い、選択された位置の無作為化を完成した。
【０１３５】
無作為化オリゴヌクレオチドを４群に分け、これらの実験由来の形質転換体を選び、ロボット操作を２回完了した。２回の実験から10個のクローンが選択された（ロボット上の高温ロボットインキュベーター温度は56℃に設定した）。
上の２つの実験から最良の10個を選び、前のクローンの集団由来の18の最良クローンを共にシャフルした（組換え変異誘発プロトコル）。
【０１３６】
最良のクローン18個を選択し、クローンLuc58-0A5が最良クローンであると決定した。次にこのクローンを別の回の変異誘発ラウンドのための鋳型に使用した。高温ロボットインキュベーター温度は58℃に設定した。クローンLuc71-504を新たな先導クローンとして選択し、変異誘発をもう１ラウンド完了した。インキュベーターは60℃に設定した。
最良の18個を選択した。実験78由来の４個のクローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ図32−35および36−39に示し、この群由来の最良クローンは、クローンLuc78-0B10であると決定した。様々な温度におけるクローンの熱安定性を図に示す。
【０１３７】
実施例4．クローンluc78−0B10からluc90−1B5への変異誘発法
28位置をコンセンサスに変化させるように、23のオリゴヌクレオチドを調製した。どのオリゴヌクレオチドが熱安定性の改良を与えるかを決定するために、鋳型としてクローンluc78−0B10からの一本鎖DNAによるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用して、オリゴヌクレオチドのすべてを個々に試験した。変異原性オリゴヌクレオチドを表16に記載する。
【０１３８】
【表１６】
0004520084.tif 000017
【０１３９】
鋳型としてクローンluc78−0B10を使用する3つのオリゴヌクレオチド特異的変異誘発実験を完結した。これらの実験のオリゴヌクレオチドを下記の法で分割した：
a.  6215、6234、6236、6284（は熱安定性を増加させることが見出された）。
b.  6215、6217、6218、6219、6220、6221、6222、6231、6233、6234、6236、6238、6247、6248、6249、6251、6253（は中性であるか、あるいは熱安定性を増加させることが見出された）。
c.  すべて23オリゴヌクレオチド。
【０１４０】
上に列挙した3つの実験からの選択物を、対照としてluc78−0B10を使用してロボット化スクリーニング手順（実験84、表1〜表12参照）によりスクリーニングした。実験84からの選択物を組換え変異誘発手順により組換え、次いでロボット化スクリーニング手順によりスクリーニングした（実験85）。
【０１４１】
一本鎖DNAを3つのクローン、luc85−3E12、luc85−4F12、luc85−5A4から調製した。luc85−4F12のヌクレオチド配列および推定したアミノ酸配列を、それぞれ、図40および図41に示す。これらのクローンをオリゴヌクレオチド特異的変異誘発のための鋳型として使用して、コドン使用頻度を改良した。位置はNucleic  Acids  Research、Vol.  18（補遺）1990、p.  2402に発表されているコドン使用頻度に基づいて選択した。大腸菌（E.  coli）におけるコドン使用頻度を改良するために使用したオリゴヌクレオチドを、下記表に記載する。
【０１４２】
【表１７】
0004520084.tif 000018
【０１４３】
第1実験において、実験85からの上記3つの鋳型を組合わせ、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドのすべてを1つの実験において組合わせ、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発から生ずるクローンを、実験88のようにロボット化スクリーニング手順によりスクリーニングした。この実験から生ずるルミネセンスコロニーの百分率は低かったので、他のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発実験を完結し、ここでオリゴヌクレオチドを下記のグループで組合わせた：
【０１４４】
a.  6258、6273、6280、6286
b.  6259、6274、6281、6293
b.  6260、6275、6282、6294
d.  6261、6276、6283、6305
e.  6262、6277、6284、9306
f.  6263、6279、6285
【０１４５】
グループbからの試料は小さい数のルミネセンスコロニーを有することが発見され、そしてグループbにおけるオリゴヌクレオチドの1つは問題を引き起こすと仮定した。実験bを除外して実験のすべてから選択を行った。次いでロボット化スクリーニング手順により、試料を実験した（実験89）。実験88および89からの選択物を組換え変異誘発プロトコルと一緒に無差別に混合し、次いでロボット化スクリーニング手順でスクリーニングした（実験90）。
【０１４６】
材料および方法
A.  変異誘発プロトコル
本明細書に開示する変異体ルシフェラーゼをランダム変異誘発を介して産生し、引き続いてコード化ルシフェラーゼ遺伝子産物の複数の特徴、例えば、光アウトプットおよび熱安定性について変異した遺伝子をin  vivoスクリーニングした。変異誘発を一般に下記の3工程法により達成した：
【０１４７】
1.  ランダム変異誘発により遺伝的多様性をつくる。ここで、出発配列の誤りがちなPCRを使用して、ヌクレオチド配列の中に点変異をつくった。誤りがちなPCRはDNA配列の中にほとんどもっぱら点変異を生ずるので、理論的に最大の7アミノ酸変化／ヌクレオチド変異が可能であった。しかしながら、実際には、ほぼ6.1アミノ酸変化／ヌクレオチドが達成可能である。ルシフェラーゼ中の550アミノ酸について、ほぼ3300変異体が点変異を通して可能である。
【０１４８】
2.  組換え変異誘発による単一点変異の強化  初期変異誘発によるつくられる遺伝的多様性を、sPCRにより、小さい数のクローンに組換える。このプロセスは変異体クローンの数を減少させるばかりでなく、かつまた変異誘発速度が高いので、陰性変異体に対する結合の確率は有意である。組換え変異誘発は陰性変異体から陽性変異体を分離する。変異体を組換え変異誘発により新しい遺伝子に「再結合」させて、新しい順列を生じさせる。組換え変異体を再スクリーニング後、「陰性変異」を有する遺伝的順列は選択されないことによって排除される。組換え変異誘発は、また、誤りがちなPCRにより調製された初期変異体の二次スクリーンとして働く。
【０１４９】
3.  選択されたコドンのランダム変異誘発による遺伝的多様性の拡大  ランダム点変異誘発は制限された数のアミノ酸置換を達成できるのみであるので、選択されたクローンの完全なランダム化はオリゴヌクレオチドの変異誘発により達成される。任意の所定の有益な置換について、同一位置における他のオールタネイトアミノ酸置換はなおより大きい利益を産生できるという仮定に基づいて、先行する変異誘発プロセスの結果から変異すべきコドンを選択する。選択したクローンのDNA配列決定により、変異すべき位置を同定する。
【０１５０】
B.  初期の変異誘発実験
出発配列のN末端およびC末端の両方をオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により修飾して、発現を最適化し、ペルオキシソームのターゲッティング配列を除去する。N末端において、開始コドンから下流の9塩基をランダム化された。C末端において、終止コドンから上流の9塩基をランダム化された。in  vivoスクリーンを使用して変異体を分析し、発現において有意な変化は生じなかった。このスクリーンから6コドンをプールし、7システインのコドンを変異させるために使用した。これらのコドンをオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によりランダム化し、そして変異体をロボット化スクリーニング手順によりスクリーニングした。このスクリーンから、15クローンを特異的進化のために選択した。
【０１５１】
C.  クローンの発生および試験
いくつかの非常に強力な、広く知られているプロトコルを使用して、本発明のクローンを発生させ、試験する。特記しない限り、これらの実験室の手順はこの分野においてよく知られている。特に当業者によく知られている手順は次の通りである：Mullisが案出したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および標準PCRプロトコルに対する変法（誤りがちなPCR、sPCR、およびその他）、任意の方法によるDNA配列決定（SangerまたはMaxxam  &  Glibertの方法）、任意の方法によるアミノ酸の配列決定（例えば、Edman分解）、およびポリヌクレオチドおよびポリペプチド／タンパク質の電気泳動分離。
【０１５２】
D.  ベクターの設計
変異誘発手順に使用するために好ましいベクター（pRAM）（図20参照）は、変異誘発を効率よく働かせる、いくつかの独特の特徴を含有する。
pRAMベクターは、一本鎖DNAの産生に必要な、フィラメント状ファージ起源、f1、を含有する。
2つのSfiI部位は遺伝子をフランクする。サブクローニングすべき遺伝子のみを適切な向きで挿入できるように、これらの部位を設計した。
【０１５３】
ベクターはtacプロモーターを含有する。
オリゴヌクレオチド変異誘発に使用すべき鋳型は、ベクターをアンピシリン感受性とする4塩基対の欠失をbla遺伝子の中に含有する。オリゴヌクレオチド変異誘発手順において、変異オリゴヌクレオチドならびにbla遺伝子に対する機能を回復するアンピシリン修復オリゴヌクレオチドを使用する。これにより、高い百分率の変異体の選択が可能となる。（選択を使用しない場合、高い百分率の変異体を得ることは困難である。）
【０１５４】
E.  ルシフェラーゼの使用
本発明の変異ルシフェラーゼは、下記のものを包含する、従来知られているルシフェラーゼが使用された、任意の応用において使用するために適当である：
ATPアッセイ
より大きい酵素安定性は、ATPを検出するために設計された試薬が、より高い温度（例えば、室温）において、より大きい貯蔵寿命および操作寿命を有することを意味する。したがって、熱安定性が増加したルシフェラーゼを使用するATPを検出する方法は、新規でありかつ有効である。
【０１５５】
核酸、タンパク質、または分子のためのルミネセンス標識
ATPアッセイについての本発明のルシフェラーゼの利点に類似して、それらのより大きい貯蔵寿命および操作寿命は、ルミネセンス標識の信頼性および再現性に対する有益である。これは、ハイブリダイゼーション温度を比較的高く（例えば、40℃より高く）することができる、ハイブリダイゼーション手順における核酸の標識化に特に好都合である。したがって、本発明のルシフェラーゼを使用して核酸、タンパク質、または分子を標識化する方法は新規でありかつ有効である。
【０１５６】
遺伝的リポーター
問題の他の遺伝子またはプロセスの存在を推定するためにリポーターの検出を使用する、遺伝的リポーターとしてルシフェラーゼの広く応用において、ルシフェラーゼの熱安定性の増大は、生きている細胞および無細胞の翻訳および転写／翻訳系における、ルシフェラーゼの発現の温度依存性を低くする。したがって、遺伝的リポーターとして本発明のルシフェラーゼを使用する方法は新規でありかつ有効である。
【０１５７】
酵素の固定化
物理的表面に密接に近接する酵素は、酵素とその表面との相互作用により変性することができる。表面上にルシフェラーゼを高い密度で固定化して強い局在化されたルミネセンスを提供することは、熱安定性ルシフェラーゼの使用により改良される。したがって、本発明のルシフェラーゼを使用してルシフェラーゼを固体表面上に固定化する方法は新規でありかつ有効である。
【０１５８】
ハイブリッドタンパク質
ルシフェラーゼをコードする遺伝的融合遺伝子により、他の遺伝子から、または化学的カップリングプロセスを通して、作られたハイブリッドタンパク質は、より大きい貯蔵寿命および操作寿命を有することによって、有益である。したがって、本発明のルシフェラーゼを使用して遺伝的手段または化学的カップリングによりハイブリッドタンパク質を製造する方法は、新規でありかつ有効である。
【０１５９】
高温反応
ルシフェラーゼ反応の光強度は、ルシフェラーゼが変性し始めるまで、温度とともに増加する。熱安定性ルシフェラーゼを使用すると、より高い反応温度を使用することができるので、本発明のルシフェラーゼは高温反応を実行するために新規でありかつ有効である。
ルミネセンス溶液
ルミネセンスは、教育、証明、および娯楽を包含する、多数の一般的用途を有する。これらの応用は、より大きい貯蔵寿命および操作寿命を有する酵素の使用から利益が得られる。したがって、本発明のルシフェラーゼを使用してルミネセンス溶液を調製する方法は新規でありかつ有効である。
【０１６０】
F.  ホタルのルシフェラーゼ
特異的進化のための選択されたホタルのルシフェラーゼは、フォツリス・ペンシルバニカ（Photuris  pennsylvanica）から単離されたLucPpe2である。マリランド（Maryland）においてWood他が収集したホタルからルシフェラーゼをクローニングし、後にオクラホマ（Oklahoma）において収集されたホタルを使用してLeach博士により独立にクローニングされた（Ye他、1997）。Wood他はこのルシフェラーゼの変異体（T249M）をつくり、本発明において使用した。なぜなら、それは大腸菌（E.  coli）のコロニー中で発現させたとき、ほぼ5倍多い光を生成したからである。
【０１６１】
進化プロセスの外観：
特異的進化は周期的プロセスにより達成され、各工程は1）ホタルのルシフェラーゼの変異ライブラリーをつくり、次いで2）ライブラリーをスクリーニングして、複数の所望の酵素学的特徴を有する、新しい変異クローンを同定する、複数のサイクルから成る。
このプロセスを開始するために、誤りがちなPCR（Fromant他、1995）を使用して、3つの変異ライブラリーをつくった。まず大腸菌（E.  coli）のコロニー中のルミネセンスを視的に評価し（WoodおよびDe  Luca、1987）、次いで大腸菌（E.  coli）細胞ライゼイト中の酵素学的特性を定量的に測定することによって、各ライブラリーをスクリーニングした。
【０１６２】
ほぼ10,000コロニーを視的スクリーンで検査し、それらから704を定量分析のために選択した。各18コロニーの3組を一緒にプールし、新しい変異ライブラリーをDNAシャフリングによりつくって、遺伝子内組換え体を発生させた（sPCR；Stemmer、1994）。結果をスクリーニングして、18クローンの他の組を発生させた。18クローンのこの組を進化の前のラウンドからの18クローンと組合わせ、DNAシャフリングにより他の変異ライブラリーをつくり、前述したようにスクリーニングすることによって、全体のプロセスを完結させた。
【０１６３】
スクリーニング方法：
定量的視的スクリーンにおいて、コロニーを比較的輝いたルミネセンスを持続する能力についてのみ選択した。スクリーンの温度を増加させることによって、進化の連続的ラウンドにおいて、大腸菌（E.  coli）のコロニー内のルシフェラーゼの熱安定性を漸進的にチャレンジさせた。各々が200μlの成長培地を含有する96ウェルのプレートのウェルの中に、選択したコロニーを接種した。
【０１６４】
定量的スクリーンにおいて、大腸菌（E.  coli）培養物のライゼイトを、1）ルミネセンス活性、2）酵素安定性、3）持続酵素代謝回転、および4）基質結合について測定した。
「ルミネセンス活性」は、ルミネセンス強度／細胞培養物の光学密度の比として測定した。
「酵素安定性」は、10時間にわたる細胞ライゼイトからの活性喪失速度により決定した。進化の連続的ラウンドにおいて、ライゼイトのインキュベーション温度を増加させた。
【０１６５】
「持続酵素代謝回転」は、室温において10時間にわたるシグナル酵素反応のルミネセンス喪失速度により決定した。
「基質結合」は、希釈した基質混合物を使用してアッセイしたとき、ライゼイトの相対活性により決定した。それらの4つのパラメーターのうちで、選択の最高の優先権は熱安定性に置いた。
【０１６６】
ロボット自動化：
定量的スクリーンにおいてロボット自動化を使用して、培養した細胞について多数の必要な定量的アッセイを正確に実行した。一夜の培養物をまず新鮮な培地の中に希釈し、3時間成長させて対数中期成長の培養物を産生させた。次いで各培養物の光学密度を測定し、培養物のアリコートを凍結／融解およびリゾチームにより溶解した。生ずるライゼイトを分析前にさらに希釈し、高温においてインキュベートした。種々の時間に取った、希釈ライゼイトのアリコートからのルミネセンスを測定し、分析法により規定される種々の条件下に測定した（実施例2参照）。このデータのコンピューター解析は、本明細書に記載する定量的選択基準を生じた。
【０１６７】
進化的進行の要約：
N末端およびC末端の変異誘発、およびシステインコドンのランダム化後、15クローンのプールを本明細書において記載する2ラウンドの特異的進化にかけた。このプロセスから生ずる18クローンのうちの5つを配列決定して、変異を同定した。これらのクローンのうちの1つ、Luc49−7C6と表示する、をいっそう詳細な分析およびそれ以上の変異誘発のために選択した。このクローンは、ルシフェラーゼLuc［T249M］に比較して、14の新しいアミノ酸置換を含有した。
【０１６８】
これらの置換部位における他のアミノ酸置換についての可能性を評価するために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用してこれらのコドンをランダム化した。生ずるクローンを本明細書において記載するようにスクリーニングし、そして18の選択したクローンを使用して、特異的進化の新しいラウンドを開始した。この第2組のラウンドから生ずる18クローンのうちで、Luc78−0B10と表示するクローンを追加の研究および変異誘発のために選択した。このクローンは、Luc［T249M］に比較して、23の新しいアミノ酸置換を含有するルシフェラーゼをコードした。
【０１６９】
鋳型としてLuc78−0B10を使用するオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により、甲虫ルシフェラーゼの間で従来知られているコンセンサスアミノ酸に対する置換のためにコドンを選択した。この変異誘発実験からの選択物を一緒に無差別に混合し、次いで最も安定であることが決定された、3つのクローンをオリゴヌクレオチド変異誘発のための鋳型として使用して大腸菌（E.  coli）におけるコドン使用頻度を改良した。
【０１７０】
この実験から選択したLuc90−1B5と表示するクローンはLuc［T249M］に関して34アミノ酸置換を含有した（Luc90−1B5のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列について図42および第43図参照、そしてLuc［T249M］をコードするヌクレオチド配列およびその推定されたアミノ酸配列について図44および図45参照）。コンセンサスアミノ酸に対する変化のために選択した25コドンのうちで、11はLuc90−1B5と表示するクローンにおいて置換された。改良されたコドン使用頻度のために選択した30位置のうちの5つのみが置換され、酵素発現に対するほとんど効果をもたなかった。
【０１７１】
タンパク質精製：
本明細書に記載する4つの変異体（Luc［T249M］、Luc49−7C6、Luc78−0B10、およびLuc90−1B5）を、以前に発表された手順により精製した（Hastings他、1996）。
酵素学的特性決定：
精製したタンパク質を25mmol／lのHEPES  p7.8、150mmol／lのNaCl、0.1mmol／lのEDTA、1mg／mlのBSAの中に希釈した。異なる温度においてインキュベートした希釈タンパク質から酵素安定性を測定し、異なる時点においてアリコートを取出した。ルミネセンスおよび時間の自然対数の線形回帰を計算した。半減期を回帰のln（0.5）／勾配において計算した。
【０１７２】
G.  PCR変異誘発プロトコル（ランダム変異誘発）
PCR変異誘発反応
1.  問題の遺伝子を含有するベクターからのプラスミドDNAを調製し、ゲルからDNA濃度を推定する。
2.  2つの50μlの反応／グループを構成する。
異なる傾斜したヌクレオチド濃度を使用する、3グループの変異誘発条件が存在した。
【０１７３】
本明細書において列挙する条件は、各発生した親クローンについて表現型のサブクローニング後、8〜10％の範囲の野生型Lucコロニーを生じた。変異誘発後に存在するルミネセンスコロニーの数により、変異誘発速度を推定する。8〜10％の範囲の変異したクローンの結果に基づいて、この変異誘発レベルは平均2〜3アミノ酸変化／遺伝子を産生することが決定された。平均1アミノ酸変化／遺伝子が存在するように、変異誘発速度を選択する場合、クローンの平均50％は変異をもたないであろう。（Bowie他、1990）。
マスター混合物について、ポリメラーゼを除外したすべての成分（表18参照）を添加し、渦形成し、短時間回転し、ポリメラーゼを添加し、おだやかに混合する。
【０１７４】
【表１８】
0004520084.tif 000019
【０１７５】
MnCl2およびMgCl2を1Mの素材から新しく調製する。素材を濾過滅菌し、無菌水と混合して10mMおよび25mMの素材をつくり、次いでこれをポリスチレン・ナルゲン（Polystyrene  Nalgene）容器の中で4℃において貯蔵する。
＋＋  pRAMtailUP；5'−gtactgagacgacgccagcccaagcttaggcctgagtg−3'（配列番号38）；pRAMtailDN；5'−ggcatgagcgtgaactgactgaactagcggccgccgag−3'（配列番号39）
【０１７６】
10×PCRポリメラーゼ緩衝液：
−  100mMのTris−HCl、pH8.4、1Mの素材から。
−  500mMのKCl。
−  プライマーを1nmol／μlの素材から201nmol／μlの使用素材に希釈する。
サーマルサイクラーにおけるサイクル：94℃、1分間（94℃、1分間；72℃10分間）10×。
【０１７７】
3.  反応生成物をウィザード（Wizard）PCR精製キット（Promega  Corp.、ウイスコンシン州マディソン、part＃A718c）で精製する：
−  Promega  100μlの直接精製緩衝液（Promega、part＃A724a）を含有する新しい管の中にPCR反応を移す。
−  1mlのウィザードPCR精製樹脂（Promega、part＃A718c）Promegaを添加し、室温において1分間インキュベートする。
−  ウィザード・ミニカラムを通して樹脂を引く。
−  80％のエタノールで洗浄する。
−  マイクロフージ中で回転して過剰のエタノールを除去する。
−  50μlの無菌ナノピュアー（nanopure）水の中に溶離する（水をカラム上に少なくとも1分間残留させる）。
【０１７８】
変異誘発反応の増幅（注１）
1.  5つの50μlの反応（表19参照）／グループを構成する。
【表１９】
0004520084.tif 000020
【０１７９】
−  マスター混合物に、ポリメラーゼを除外したすべての成分を添加し、渦形成し、短時間回転し、ポリメラーゼを添加し、おだやかに混合する。
自然Pfuポリメラーゼのための10×反応緩衝液は20mMのMgCl2を含有するので、追加のMgCl2を添加する必要なはい。
＋  プライマー：
pRAM18UP；5'−gtactgagacgacgccag−3'（配列番号40）
pRAM19DN；5'−ggcatgagcgtgaactgac−3'（配列番号41）
サイクリング条件：94℃、30秒（94℃、20秒、65℃、1分、72℃、3分）25×
（Perkin  Elmer  Gene  AmpＲ  PCR  System  2400）
【０１８０】
注1.  Pfuポリメラーゼを使用するこの増幅工程は2つの理由で組込んだ：（a）  多数の形質転換体を産生のためにDNA収率を増加するため、（b）変異誘発PCR反応からキャリオーバーされる鋳型DNAの量を減少するため：（第2増幅反応のためのプライマーを変異誘発プライマー内にネストされる。それぞれ上流および下流のプライマーについて11および12塩基の非特異的テイルを使用して、変異誘発プライマーを設計した。ネステッドプライマーは変異誘発プライマーを使用して以前に増幅されたDNAを増幅するであろうが、pRAM鋳型DNAを増幅することができない。）
【０１８１】
2.  1μlをゲル上に負荷して増幅生成物をチェックする。
3.  ウィザードPCR精製キット（Promega  Corporation、part＃A718c）で増幅反応生成物を精製する：
−  100μlの直接精製緩衝液（Promega、part＃A724a）を含有する新しい管の中にPCR反応を移す。
−  1mlのウィザードPCR精製樹脂（Promega、part＃A718c）を添加し、室温において1分間インキュベートする。
−  ウィザード・ミニカラムを通して樹脂を引く。
−  80％のエタノールで洗浄する。
−  マイクロフージ中で回転して過剰のエタノールを除去する。
−  50μlの無菌ナノピュアー水の中に溶離する（水をカラム上に少なくとも1分間残留させる）。
【０１８２】
増幅されたPCR変異誘発生成物のサブクローニング
1.  DNAを次のようにしてSfiIで消化する：
−  2μlのSfiI（Promega  Part＃R639a）。
−  10μlの10×緩衝液B（Promega  Part＃R002a）。
−  ウィザードPCRprepから88μlのDNA（上記工程3参照）。
−  成分を混合し、2滴の鉱油でオーバーレイする；50℃において1時間インキュベートする。
2.  前述したように塩およびSfiI末端をウィザードPCR精製により除去し、50μlの無菌ナノピュアー水の中に溶離する。
【０１８３】
3.  pRAM（＋／r）バックボーンの中に結合する（4結合／グループを構成する）：
−  0.025pmolのpRAMバックボーン。
−  0.05pmolのインサート（通常6〜12μlの範囲のインサート）。
−  1μlのT4DNAリガーゼ（Promega  part  M180a）。
−  2μlの10×リガーゼ緩衝液（Promega  part  C126b、25μlのアリコートに分割する、2回より多い凍結／融解を行わない）。
−  水で20μlとする。
−  室温において2時間結合する。
−  反応を70℃に15分間加熱してリガーゼを不活性化する。
【０１８４】
形質転換およびプレーティング
1.  ブタノールで試料を沈降させて過剰の塩を除去する（n−ブタノール、Sigma、ミゾリー州セントルイス、から、part＃BT−105）：
（エタノール沈降をブタノールの代わりに使用する場合、必要に応じて70％のエタノールで洗浄する。過剰の塩はエレクトロポレーションの間にアーキング（arching）を引き起こし、反応を失敗させる。）
−  水を添加して50μlにする。
−  500μlのn−ブタノールを添加する。
−  ブタノール／結合混合物が透明となるまで混合し、室温において20分間回転する。
−  ヒュームフード中で廃棄物容器の中にブタノールを排出する。
−  12μlの水中に再懸濁させ、全速で30秒間回転させる。
【０１８５】
2.  細胞／DNA混合物の調製（4回の形質転換＋1回の参照クローンのDNAを使用する形質転換の構成）：
−  DNAが沈降すると間、エレクトロポレーションのキュベットを氷上に配置する。
−  15mlのファルコン（Falcon）スナップ・カップに3mlのS.O.C.培地を充填し、氷上に配置する。
−  JM109エレクトロコンピテント細胞を氷上で融解する（50μl／結合反応）。  −  工程1からの10μlの下部層（または0.5μlの参照クローンのDNA）をコンピテント細胞の中にピペットで入れる。
（少量のブタノールのキャリオーバーは形質転換効率に悪い作用を及ぼさない）  −  細胞／DNA混合物を氷上に配置する。
【０１８６】
3.  エレクトロポレーション：
−  管、キュベット、および細胞／DNA混合物を氷上でエレクトロポレーション装置に運ぶ。
−  細胞−DNA混合物をキュベットの中にピペットで入れ、急に動かす。計器の設定：
キュベットのギャップ：      0.2cm
電圧：                      2.5V
キャパシタンス：            25μF
抵抗：                      200オーム
時間定数：                  4.5ミリ秒
−  1mlのSOC（KClを含有する；培地prep＃KCLM）をキュベットの中にピペットで入れ、回収管の中に急速に注ぐ（細胞をキュベットの中に放置する場合、形質転換効率は減少する）。
【０１８７】
−  すべての試料がプロセスされるまで、回収管を氷上に配置する。
−  細胞を37℃において30〜60分間回収する。
−  LB＋ニトロセルロースフィルターを有するampプレート上にプレートする（細胞を60分回復させる場合、多分細胞の複製のために、コロニーの数は約20％高い。）
（スクリーニングのために最良のコロニー密度は500／プレートである。細胞の現在のバッチについて約500〜750μl）。
【０１８８】
H.  組換え変異誘発プロトコルまたはDNAシャフリング
プラスミドDNAのDNアーゼI消化：
1.  2％の低融点ゲルを調製する。
−  40mlの中の0.8gのアガロースを使用する（NuSiebe  ＃50082）。
−  大きいprep  combを使用する。
−  消化前に固化しないようにする。
2.  消化のために4μgのプールしたプラスミドDNAを調製する
3.  下記表に従い氷上で1単位／mlのDNアーゼを調製する：
【０１８９】
【表２０】
0004520084.tif 000021
【０１９０】
4.  消化（室温において構成する）
1.0単位および1.5単位のDNアーゼI／100μlの反応を使用して2つの消化物を調製する。
−  10μlの10×DNアーゼI緩衝液（500mMのTris、10mMのMgCl2  p7.8）。
−  xμlのDNA（工程2からの2μgのプールしたプラスミドDNA）。
−  1または1.5μlの1単位／mlの酵素希釈物。
−  100μlとする無菌ナノピュアー水。
−  室温において10分間インキュベートする。
−  1μlの100mMのCDTAの添加により反応を停止させる。
【０１９１】
アガロースゲルからの精製
1.  ゲル上にDNアーゼ消化フラグメントを展開する
−  10μlの10×負荷緩衝液を各DNアーゼI消化物に添加する。
−  2％の低融点アガロースゲル上にすべてを負荷する。
−  120〜150Vにおいて約30分間展開する。
−  中央レーンにpGEM  DNAマーカーを負荷する。
【０１９２】
2.  フラグメントを単離する
−  かみそりの刃を使用して600〜1000bpのサイズ範囲のフラグメントを含有するアガローススライスを切出す。
−  約0.3gの重量の片を切出す。
−  ゲルスライスを70℃において溶融する。
−  溶融したゲルに300μlのフェノール（NaCl／Tris平衡化）を添加し、最大速度で約1分間渦形成する。
−  4℃において10分間回転する。
−  等しい体積のフェノール／クロロホルム／イソアミル（300mMのHCl／100mlのTris  pH8.0で飽和した）を含有する管の中に上部層を取出し、渦形成し、室温において5分間遠心する。
【０１９３】
−  クロロホルムを含有する管の中に上部層を取出し、渦形成し、遠心する。  −  2体積の95％冷エタノールを含有する管の中に上部層を取出；−70℃のフリーザーの中に10分間入れる（高塩フェノールのために塩は不必要である）。
−  4℃において15分間回転する。
−  70％のエタノールで洗浄し、廃液し、約10分間空気乾燥する。
−  25〜50μlの無菌ナノピュアー水の中に再懸濁させる。
−  すぐに使用できるまで−70において貯蔵する。
【０１９４】
アセンブリー反応
4反応を構成し（表21参照）完結したときプールする。
【表２１】
0004520084.tif 000022
サイクリング条件：94℃、30秒間（94℃、20秒間；65℃、1分；72℃、2分）25×。
【０１９５】
アセンブリーの増幅
通常5増幅反応（表22参照）は全8プレートのロボット化実験のために十分なDNAを産生するであろう。
【表２２】
0004520084.tif 000023
【０１９６】
アセンブリー増幅のサブクローニング
ウィザードPCR精製により増幅生成物を精製する：
−  5増幅反応をプールする。
−  100μlの直接的精製緩衝液を含有する新しい管の中に移す。
−  1mlのウィザードPCR精製樹脂を添加し、室温において1分間インキュベートする。
−  ウィザードミニカラムを通して樹脂を引く。
−  80％のエタノールで洗浄し、マイクロフージ中で回転して過剰のエタノールを除去する。
−  88μlの無菌ナノピュアー水の中に溶離する（水をカラム上に少なくとも1分間残留させる）。
【０１９７】
2.  SfiIを使用する消化：
−  2μlのSfiI。
−  10μlの10×緩衝液B。
−  ウィザードPCRprepから88μlのDNA。
−  成分を混合し、2滴の鉱油でオーバーレイする；50℃において1時間インキュベートする。
【０１９８】
3.  バンドの単離
アセンブリー反応の増幅後、時々、遺伝子サイズのフラグメントよりも小さいバンドが産生する。試料が単離されたバンドでない場合、小さいフラグメントは遺伝子サイズのフラグメントよりも約10倍サブクローニングされることが示された。この汚染するバンドが存在するとき、SfiI消化後バンドを単離することが必要である。
−  DNAを0.7％のアガロースゲルに負荷する。
−  バンドを単離し、ジーン・クリーン（Gene  Clean）キット（Bio  101から）で精製する。
【０１９９】
−  DNAを50μlの無菌ナノピュアー水で溶離し、ゲル上の濃度をチェックする（標準アガロースを使用するこの型の精製は、サブクローニング後、最大数の形質転換体を産生した。試みた1つの方法：フェノールクロロホルムを使用する低融点、低融点を使用するジーン・クリーン、標準アガロースを使用するウィザードPCR樹脂、低融点を使用するピアース・クシトレム（Pierce  Xtreme）回転カラム（これは標準アガロースでは働かなかった））。
4.  pRAM［＋／r］バックボーンの中への結合：（上記結合および形質転換プロトコル参照）
【０２００】
pRAMバックボーンの大規模調製
1.  LB  ampプレートをpRAMMCS［＋／r］でストリーキングする（このベクターは遺伝子の代わりにSacII部位を含有する合成インサートを含有する。このベクターは新しいリボソーム結合性部位を含有するが、ベクターをSfiIで切断するとき、それは切出されるであろう。
2.  ampを補充したLB中で10mlの一夜の培養物を調製する。
3.  次の日に1リットルのampを補充したLBを接種し、1620時間成長させる。
4.  ウィザードマクシ・プレプ（Maxi  Prep）キット（Promega  ＃A7270）でDNAを精製する（1リットルの細胞について4prepを使用する）。
【０２０１】
5.  プラスミドをSfiIで消化する（5単位／U／mgを使用する）鉱油でオーバーレイし、少なくとも2時間消化する。
6.  エタノール沈降により塩を除去する。水の中に再懸濁させる。
7.  SacIIで2時間消化する。（消化体積を2mlまたはそれより少なく保持する）。プラスミドの一部分が部分的に消化されることがある。ベクターを2つのSfiI部位の内部である酵素で培養する場合、ベクターは部分的に消化されたフラグメントが結合反応に参加させないようにする。
8.  全体の消化物をカラム上に負荷する（9参照）。試料の負荷体積は2mlの以下であるべきである。そうである場合、エタノール沈降を必要とするであろう。
【０２０２】
9.  カラムはセファクリル（Sephacryl）S−1000を含有し、20％のエタノールの中に貯蔵して細菌汚染を防止すべきである。試料の負荷前に、カラムを冷展開緩衝液と少なくとも24時間平衡化しなくてはならない。カラムを数カ月間以上放置した場合、カラムを空にし、樹脂を冷展開緩衝液中で3〜4回洗浄して平衡化し、次いでカラムを再び注ぐことが必要であることがある。カラムを注いだ後、それを一夜平衡化し、こうして樹脂を完全に充填する。
【０２０３】
10.  約0.5mlの画分を収集する。典型的にはDNAは画分25〜50において出現する。ある範囲の画分からの5μlのアリコートを負荷して、どの画分がバックボーンフラグメントを含有するかを決定する。バックボーンのすべてが溶離される前に、小さいインサートフラグメントは出現し始めるであろうから、画分をプールするとき、それは保存的であることが必要であろう。この理由で、典型的にはDNAの40〜60％がこの工程において喪失される。
11.  バックボーンを含有する画分をプールする。
【０２０４】
12.  試料をエタノール沈降させる。約10〜50ng/μlを産生する体積の中に再懸濁させる。
13.  −70において貯蔵する。
カラム展開緩衝液：（4℃において貯蔵する）
5mMのEDTA
100mMのNaCl
50mMのTris−HCl、pH8.0
10μg／mlのtRNA（R−8759、Sigma）
【０２０５】
1.  オリゴヌクレオチド変異誘発
変異すべき鋳型のアンピシリン感受性一本鎖DNAを調製する。すべての可能なアミノ酸コドンをランダムに発生させる変異誘発プライマーを設計する。
変異誘発反応：
【０２０６】
【表２３】
0004520084.tif 000024
反応を60℃に15分間加熱し、次いで直ちに氷上に配置する。
【０２０７】
合成反応：
【表２４】
0004520084.tif 000025
【０２０８】
37℃において90分間インキュベートする。
Mut−S株BMH  71−18（Promega  株Q6321）の中に形質転換する。
−  合成反応を17×100mmの管の中に入れる。
−  氷上上で融解したBMH  71−18を合成反応に添加する。
−  30分間インキュベートする。
−  42℃において90秒間細胞を熱ショックする。
−  4mlのLB培地を添加し、細胞を37℃において1時間成長させる。アンピシリンを1.25μg／mlの最終濃度に添加し、次いで37℃において一夜成長させる。
ウィザードPCR精製系（Promega  a7100）で単離する。単離されたDNAをJM109エレクトロコンピテント細胞の中に移し、LBアンピシリンプレート上に移す。
【０２０９】
J.  スクリーニング手順
JM109クローン（形質転換反応から）を約500コロニー／プレートのスクリーニング密度でLB  ampプレート上に配置されたニトロセルロースフィルター上に配置する。
組換え変異誘発手順において列挙したように、選択すべきクローンのほぼ10％は源と同一の安定性をもつか、あるいはそれよりすぐれた安定性をもたなくてはならないであろう。あるいは換言すると、約50コロニー／プレートは選択するために適当であろう。全8プレートロボット化実験のために利用可能な704ウェルが存在するので、少なくとも15のLB  ampプレートが全ロボット化実験のために必要であろう。
【０２１０】
37℃において一夜成長させた後、形質転換体を含有するプレートをインキュベーターから取出し、室温においてプレートする。
ニトロセルロースフィルターを1つの側において持ち上げ、500μlの10mMのIPTGを各プレートに添加する。次いでフィルターをプレートに戻して、異なる変異体ルシフェラーゼ遺伝子を含有するコロニーの中にIPTGを拡散させる。次いでプレートを4℃において約4時間インキュベートする。
【０２１１】
1mlの溶液は1mMのルシフェリンを含有し、100mMのクエン酸ナトリウムを50℃に設定したスライド加温器上にピペットで配置する。次いで、変異体ルシフェラーゼコロニーを含有しかつIPTGで処理したニトロセルロースフィルターをルシフェリン溶液の上部上に配置する。数分後、1％のゼラチンを含むM9−最小培地を含有するマイクロタイタープレート中のウェルを接種するために使用する小ようじで、最も輝いたコロニーを取り上げる。
【０２１２】
十分なコロニーを8マイクロタイタープレートに取り上げた後、プレートを30℃において350rpmでインキュベートするインキュベーターの中に入れ、一夜成長させる。
朝、一夜のプレートをロボット上に負荷し、細胞希釈手順を実行する。（この手順は誘導培地の中に培養物を1：10に希釈する）。新しいプレートを350rpm、30℃において3時間成長させる。
成長後、プレートを主アッセイ手順のためにロボットに負荷する。
【０２１３】
最小培地：
6g／lのNa2HPO4
3g／lのKH2PO4
0.5g／lのNaCl
1g／lのNH4Cl
2mMのMgSO4
0.1mM
1mMのチアミン−HCl
0.2％のグルコース
12μg／mlのテトラサイクリン
100μg／mlのアンピシリン
＊  一夜の培地は1％のゼラチンを含有する。
＊  誘導培地は1mMのIPTGを含有し、ゼラチンを含有しない。
【０２１４】
S.O.C.培地：
−  10mMのNaCl
−  2.5mMのKCl
−  20mMのMgCl2
−  20mMのグルコース
−  2％のバクトトリプトン
−  0.5％の酵母エキス
【０２１５】
典型的な進化進行の要約
1.  LucPpe2［T249M］を使用して出発する。
2.  3アミノ酸をN末端およびC末端において変異させる。
3.  7シトシンを変異させる。
4.  2反復の進化を実行する→Luc49−7C6
5.  変更されたコドン（9）の変異誘発
6.  2反復の進化→Luc78−0B10
7.  コンセンサスコドン（28）変異誘発
8.  コドン使用頻度（24）の変異誘発→Luc90−1B5
【０２１６】
リカーシブプロセスの1反復
1.  1クローン  →  誤りがちなPCRを使用する3ライブラリー
・3×視的スクリーン（各約10,000クローン）
・3×定量スクリーン（各704クローン）
2.  3×18クローン  →  sPCRを使用するライブラリー
・視的スクリーン（約10,000クローン）
・定量スクリーン（704クローン）
3.  18＋18  →  sPCRを使用するライブラリー
・視的スクリーン（約10,000クローン）
・定量スクリーン（704クローン）
4.  アウトプット：18クローン
【０２１７】
実施例5．クローンLuc90−1B5からLuc133−1B2およびLuc146−1H2に変異させ
る方法
貯蔵するとき、ルシフェリンは分解し、この分解生成物はルシフェラーゼを阻害する。インヒビターの産生は、ルシフェラーゼおよびルシフェリンの両方を含有する試薬における見掛けの不安定性を引き起こす。この問題を軽減する2つの方法が存在する：1）ルシフェリンおよびルシフェラーゼをpH5.5〜6.0において貯蔵して、ルシフェリンの分解速度を減少させる、および／または2）ルシフェリン分解生成物に対して耐性である酵素を添加する。
【０２１８】
クローンLuc90−1B5が進化後、低いpHにおいていっそう安定であるように進化し、ルシフェリン分解生成物に対する耐性を有するLucPpe2変異体。これらの変異体酵素は、例えば、ATP検出キットにおいて有用である。このようなキットの1つの態様は、ルシフェリンとルシフェラーゼとの混合物を含んでなる。ATPを含んでなる試料を混合物に添加するとき、ルミネセンス反応が起こる。
【０２１９】
クローンLuc90−1B5を使用して、ランダム変異体の集団を産生させた。これらの集団を実験114、115、および117としてロボット上でスクリーニングした。実験114、115、116、117、118、119、および122についてのロボット化スクリーンは前述したように完結されたが、ただしHEPES緩衝液p7.8の代わりにクエン酸塩緩衝液pH4.5を使用して緩衝液Cを調製し、そしてトリシン（Tricine）pH8.0および175μMのATPの代わりにHEPES  pH7.1および10μMのATPを使用してアッセイ試薬を調製した。
【０２２０】
pH4.5、48℃において経時的ルミネセンス活性の保持が増加しかつpH7.1において10μMのATPを使用してアッセイしたときルミネセンス活性が増加したクローンを選択するように、これらのスクリーニング条件をバイアスさせた。実験114からのいくつかのクローン、実験115からのいくつかのクローン、および実験116からの10クローンをsPCRにより一緒に無差別に混合し、このスクリーンから選択された変異体を実験117としてロボット上で展開した。
【０２２１】
最も改良された特性を有することが決定されたクローン（pH4.5、48℃において経時的ルミネセンス活性の保持が増加しかつpH7.1において10μMのATPを使用してアッセイしたときルミネセンス活性が増加した）はクローンLuc117−3C1であり、そしてそれはランダム変異誘発のための鋳型として選択した。ランダム変異体の2つの集団をスクリーニングし、次いで実験118および119としてロボット上で展開した。実験118からのいくつかのクローンおよび実験119からの5つのクローンを取って置いた。
【０２２２】
実験114、115、116、117、118、および119からのクローンを下記の特性に基づいて選択した：Luc90−1B5よりも輝いたルミネセンス、およびpH4.5における経時的ルミネセンス活性の保持の増加。これらの選択したクローンを一緒に無差別に混合し、実施例122としてロボット上で展開した。この実験から11クローンを取って置いた。
【０２２３】
ランダム変異体の3つの集団をLuc122−4D5から調製し、実施例125、126、および127としてロボット上で展開した。実験125からの13クローン、実験126からの4クローン、および実験127からの3クローンを一緒に無差別に混合し、実験128としてロボット上で展開した。実験125、126、127および128について、ルシフェリン分解生成物に対していっそう耐性であるクローンについて選択するように、Kmについてのスクリーンを変更した。また、pH4.5における経時的ルミネセンス活性の保持の増加について、クローンをスクリーニングした。
【０２２４】
基質利用についてスクリーニングする代わりに、インヒビターに対する耐性についてのスクリーニングを実施した。基質の0.06×希釈の代わりに、1×アッセイ緩衝液中のD／Lルシフェリンの75：25混合物を使用し、そして「0.75×」と表示した。基質の0.02×希釈の代わりに、1×アッセイ緩衝液中のD／Lルシフェリンの50：50混合物を使用し、そして「0.5×」と表示した。これらの実験における1×アッセイ緩衝液は下記の成分を含有した：10μMのATP、50mMのHEPES  p7.8、8mMのMgSO４、および0.1mMのEDTA。
【０２２５】
0.75×試料は75μMのD−ルシフェリンおよび25μMのL−ルシフェリンを含有した。0.5×試料は50μMのD−ルシフェリンおよび50μMのL−ルシフェリンを含有した。1×試料は250μMのD−ルシフェリンを含有した。Km回帰を前述したように使用し、Km値を計算した。1より大きい正規化値は、インヒビターに対するより大きい耐性を示す。L−ルシフェリンに対してより大きい耐性を有することが示された、これらの実験からのクローンはまたルシフェリン分解生成物に対して耐性であった。
【０２２６】
ロボット化系でインヒビターに対する耐性をいっそう容易に測定するために、新しい可変「Q」を設計した。「Q」変数を以前に使用したKm変数の代わりに使用する。ルミネセンス比をKm測定と同じように計算し、次いで各ルミネセンス比の自然対数（ln）を計算する（Y軸）。X軸はユーザーが入れた任意の時間である。第1時点はゼロであり、そして250μMのD−ルシフェリンを含有する1×アッセイ緩衝液を使用して試料を測定する。
【０２２７】
次の2つの時点は同一時間値（すなわち、ルシフェリンのインキュベーションをシミュレートするために4時間）を有し、D−ルシフェリン／L−ルシフェリンの50：50混合物（前述したように）を含有する1×アッセイ緩衝液を使用して試料を測定する。ln（lum比）を時間に相関させる線形回帰を計算する。ln（0.5）／勾配としてQを計算する。1より大きい「Q」の正規化値はインヒビターに対するより高い耐性を示す。このプログラムを使用して、実験133以上を実施した。
【０２２８】
実験128からの16クローンを実験122からのクローンと無差別に混合し、実験133としてロボット上で展開した。2つの試料、Luc133−1B2およびLuc133−0D11をランダム変異誘発の鋳型として選択し、それぞれ、実験145および146としてロボット上で展開した。pH4.5における経時的ルミネセンス活性の保持の増加およびインヒビターに対する最大の耐性を示したクローンは、Luc146−1H2であった。そのうえ、pH4.5および48℃において、Luc133−1B2およびLuc146−1H2は、Luc90−1B5に関して増加した熱安定性、および増加したインヒビターに対する耐性を有した（図54および図61）。
【０２２９】
Luc49−7C6、Luc78−0B10、Luc90−1B5、Luc133−1B2、およびLuc146−1H2についてのルミネセンスシグナルの比較を第59図に示す。クローンLuc49−7C6、Luc78−0B10、Luc90−1B5、Luc133−1B2、およびLuc146−1H2についての50℃における熱安定性の比較を図60に示す。図55〜図58は、Luc133−1B2およびLuc146−1H2をコードするヌクレオチド配列およびそれらの推定されたアミノ酸配列を示す。
【０２３０】
材料および方法
ルシフェラーゼインヒビターに対する耐性を検出するアッセイ
ルシフェリンの10mMの原溶液を50℃において50mMのHEPES、p7.8中でインキュベートして、ルシフェリン破壊生成物の産生を加速した。異なる時点において、アリコートを取出し、次いで−20℃で配置した。インキュベーションが完結した後、アッセイ試薬（100μMのルシフェリン、1μMのATP、50mMのHEPES、p7.8および8mMのMgSO４）を異なる時点の各々からのルシフェリンを使用して調製し、次いで各試薬を使用して希釈ライゼイトをアッセイする。
【０２３１】
ライゼイトを次のようにして調製する。100μg／mlAMPを補充したLB中で、試験すべきクローンの一夜培養物を調製する。1mMのIPTG、100μg／mlのAMPを補充したM−9最小培地中で培養物を1：10に希釈し、30℃において3時間成長させる。45μlの細胞を20μlの緩衝液Aと混合し、凍結させる。この混合物を融解し、175μlの緩衝液Bを添加し、生ずる混合物を緩衝液C中で1：10に希釈する。次いでルミネセンスの回帰／ルシフェリンインキュベーション時間を計算し、このグラフから半減期を外挿する。より長い半減期は、試験している突然変異体がルシフェリン破壊生成物に対していっそう耐性であることを意味する。
【０２３２】
実施例6．LucPplTGからクローンLuc81−6G01への突然変異誘発法
甲虫、ピロホルス・アギオフタラムス（Pyrophorus  plagiophthalamus）、からのルシフェラーゼは、異なるルミネセンス色を発生することが以前に示された（LucPpl）。これらのルシフェラーゼを分析すると、異なる色はそれらのタンパク質配列に対する離散したアミノ酸置換により引き起こされることが示された。これは多重ルミネセンスシグナルを放射することができる1対の遺伝的リポーターをつくることを可能とし、こうして同一の生きている系内から2つの生体分子の事象を同時に定量することができる。
下記の特性を有するアミノ酸置換LucPplを調製した：
【０２３３】
ルシフェラーゼの物理的安定性
大腸菌（E.  coli）内のLucPplのルミネセンス活性はライゼイト中で60℃以上まで熱安定性であるように思われたが、これらのルシフェラーゼは比較的低い安定性を有した。それらはトリトンX−100洗浄剤の存在下にの存在下に不安定であった。普通に使用されているホタルのルシフェラーゼを含有するライゼイトを調製したとき、酵素は室温において5時間にわたって90％より大きい活性保持する。対照的に、LucPplルシフェラーゼの活性は同一期間にわたって数倍減少する。  LucPplルシフェラーゼの熱安定性は、また、哺乳動物細胞の生理学的温度付近である。
【０２３４】
緑色を放射するルシフェラーゼ（LucPplGR）および赤色を放射する（LucPplRD）は、細胞の遺伝的リポーターとして挙動の差を引き起こすことがある、異なる熱安定性を有する。温度の影響は酵素の変性点付近で最大であり、ここで温度の小さい変化はタンパク質構造に対して最大の作用を有するであろう。対照的に、温度が変性点より非常に低いとき、温度はタンパク質構造に対して非常に低い作用を有するであろう。こうして、2つのわずかに異なる変性を有する酵素に対する示差的作用は比較的低い温度において少ないであろう。したがって、リポーター酵素の変性温度は哺乳動物細胞の成長温度より有意に高いことが好ましいであろう。
【０２３５】
ルシフェラーゼ間のスペクトルオーバーラップ
着色フィルターを使用することによって混合物中の各ルシフェラーゼを定量する方法が開発されたが、ルシフェラーゼを判別する能力はルシフェラーゼのスペクトルオーバーラップにより制限される。ルシフェラーゼのルミネセンス強度が10倍より大きく異なる場合、このオーバーラップは両方のルシフェラーゼを正確に測定する能力を減少させる。ルミネセンス強度が50倍より大きく異なる場合、二量体ルシフェラーゼのルミネセンスシグナルは他のシグナルにより不明瞭となる。こうして、2つのルシフェラーゼのルミネセンススペクトルをさらに分離することが好ましいであろう。
【０２３６】
ルミネセンススペクトルを赤色にシフトする、多数の異なる突然変異体が同定された。赤色ルミネセンスについての限界は約620nmであるように見える。赤色を放射するルシフェラーゼのスペクトルをなおより長い波長にシフトさせる、それ以上の努力は、多少有益であることがある。緑色にシフトする突然変異は稀であることが見出されたが、広範な分析は実施されなかった。自然ルシフェラーゼからの測定値は、緑色を放射するプロトタイプ酵素よりも約15nm低い、530nm以下のルミネセンスの多少の例を示す。
【０２３７】
示差的物理的および酵素学的特徴
理想的には、2つのルシフェラーゼは、ルミネセンスの色を除外して、すべての特徴において同一であろう。しかしながら、前述したように、ルシフェラーゼの物理的安定性は同一ではない。また、赤色にシフトしたルミネセンスを生ずる突然変異もまたルシフェリンについてのKＭを増加させることが見出された。これらの差のいくつかは回避できないことがあるが、特性が基本的に関連するかどうかは明瞭ではない。例えば、異なる甲虫種からのルシフェラーゼは有意に異なるKＭを有するが、それらのルミネセンススペクトルは類似する。赤色を放射するルシフェラーゼのプロトタイプの熱安定性は、ルミネセンススペクトルを有意に変更しないで、増加したので、赤色を放射するルシフェラーゼの発生に関連する差は酵素構造の統合に対する付随的混乱のためであることがある。
【０２３８】
安定なルミネセンスシグナル
ホタルルシフェラーゼは遺伝的リポーターとして最初に記載されたとき、反応基質の注射時に開始される、比較的短時間のフラッシュであった。ルミネセンス化学の引き続く発展により、数分間の安定なシグナルを可能とする、いっそう便利なアッセイが開発された。現在、このような安定化されたアッセイは一般的実験室の応用のための標準である。しかしながら、薬学的研究において高い処理量のスクリーニングを可能するために、ルミネセンスシグナルは1時間にわたって延長するようにさらに安定化された。
【０２３９】
これは1バッチで数千の試料をアッセイするために十分な時間を得るために必要であった。新しい多重ルシフェラーゼのルミネセンスシグナルは数分間安定であったが、それらは高い処理量に必要な延長したシグナル安定性を提供しなかった。シグナル安定性をさらに増加させると同時に他の特性を最適化することができることは、好ましいであろう。
【０２４０】
ルシフェラーゼ性能を最適化する方法
ある種の性能を有するルシフェラーゼを調製するために、前述したように、酵素機能をin  vitroにおいて進化させる方法を使用した。簡単に述べると、この方法はランダム突然変異体を発生させかつ所望の特性についてスクリーニングする再帰的プロセスである。それは主としてルシフェラーゼの熱安定性を増加するために本来開発されたが、他の酵素学的特徴はまたスクリーニング基準により最適化される。2つの関係するルシフェラーゼを付随的に最適化することが必要であったので、前述の特性を達成するために、わずかに異なる戦略が使用された。
【０２４１】
最初に、単一プロトタイプ酵素をin  vitro進化に付して物理的安定性およびルミネセンスシグナルを最適化する。このプロセスにおいて、色変化を引き起こす新しい突然変異体について、突然変異体のライブラリーをまたスクリーニングする。緑色にシフトした突然変異体が特に強調される。普通のプロトタイプの初期の最適化後、緑色を放射する型および赤色を放射する型の酵素をつくり、そしてこれらを別々にさらに最適化して、それらの物理的特性および化学的特性を調和させる。特にルシフェリンについて、それらの物理的安定性およびそれらの基質結合定数を合致させることに、特に注目された。
【０２４２】
最適化のために初期のプロトタイプについて、発光甲虫から単離された野生型黄色−緑色放射性ルシフェラーゼが選択された（LucPplYG）。ピロホルス・アギオフタラムス（P.  plagiophthalamus）から本来クローニングされたルシフェラーゼのうちで、大腸菌（E.  coli）において発現されたとき、これは最も輝いたルミネセンスを産生する。さらに、前の突然変異誘発研究は既に最も緑色のルミネセンスを有するルシフェラーゼを使用して実施されたので、緑色にシフトする突然変異体が欠如するという問題が存在した。追加の緑色にシフトする突然変異体が存在した場合、赤色にシフトするバックグラウンドにおいてスクリーニングしたとき、それらはいっそう明らかとなることがある。突然変異誘発は次のようにして実行した：
【０２４３】
ペルオキシソームターゲッティング配列を除去する
ルシフェラーゼのC末端における転位シグナルを除去した。これはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用して実施して、正常−KSKLを−XXX＊に変換した（ここでXは任意のアミノ酸を表し、そして＊は終止コドンを表す）。輝いたを生ずるいくつかのコロニーを選択し、突然変異誘発の次の段階のための鋳型として使用した。
【０２４４】
感受性システインの除去
ピロホルス・アギオフタラムス（P.  plagiophthalamus）からのルシフェラーゼは13システインを有し、これらのシステインは酸化に対して潜在的に感受性である。これは普通に使用される、わずかに4システインを有するルシフェリンに対して対照的である。酵素安定性を制限することがあるシステインを除去するために、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用してシステインコドンをランダム化した。
【０２４５】
3組のオリゴヌクレオチドを使用した：低い配列相同性を有する領域における非保存的システイン（位置69、114、160、194、335、および460）、高い配列相同性を有する領域における非保存的システイン（位置127、213、310、および311）、および高度に保存的なシステイン（位置60、80、および388）。これらのスクリーンの各からの最良のクローンを単離し、新しい突然変異体ライブラリーをsPCRによりつくり、再びスクリーニングした。29℃のスクリーニング温度において、野生型黄色−緑色放射性ルシフェラーゼの活性は10時間にわたって約500倍減少した。最も安定な突然変異体（Luc20−4C10）の活性はいっそう安定であり、わずかに約2倍減少した。
【０２４６】
ランダム突然変異誘発の第1サイクル
前に開発された手順を使用して、誤りがちなPCRを使用して3つの突然変異体ライブラリーを発生させ、スクリーニングした。これらから最良の突然変異体をsPCRにより新しいライブラリーに組換え、再びスクリーニングした。最後に、このスクリーンの最良のクローンを前のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発からの最良のクローンとsPCRにより組換え、再びスクリーニングした。41℃において、このプロセスからの最良の突然変異体（Luc30−4B02）の活性は10時間にわたって63倍減少したが、親突然変異体（Luc20−4C10）の活性は100,000倍より大きく減少した。
【０２４７】
配列分析
最後のスクリーンから6つの最良の突然変異体を単離し、配列決定した。これにより、16位置におけるアミノ酸は6つのクローンの間で変化したことが明らかにされた。好ましい突然変異体Luc30−4B02において、13位置が変化した。変化のうちの4つはすべての単離された突然変異体におけるC末端に存在し、ここでオリゴヌクレオチド突然変異誘発は−KSKLの野生型配列を−AGG＊に変化させた。システインの2つのみが前のオリゴヌクレオチド突然変異誘発により変化された；位置60において高度に保存された1つはバリンに変化され、そして位置127において適度に保存された1つはトレオニンに変化された。
【０２４８】
残りのアミノ酸変化のすべてはDNAにおける点突然変異のためであり、誤りがちなPCRと一致した。興味深いことには、これらのうちの3つはアミノ酸を野生型緑色放射性ルシフェラーゼにおいて見出されるものに変化された（突然変異体Luc30−4B02における2つ）。残りの変化のうちの4つは、突然変異体配列を、他のクローニングされた甲虫ルシフェリンの中のコンセンサスアミノ酸にいっそう近接させた（突然変異Luc30−4B02における2つ）（図19B）。追加の4つのコドンは、アミノ酸配列に影響を与えないで、変化された。
【０２４９】
部位特異的突然変異誘発
配列決定された突然変異体において同定された突然変異の可能性をさらに調査するために、オリゴヌクレオチドを使用して追加の突然変異誘発実験を実行した。誤りがちなPCRにより突然変異されたコドンのうちの8つは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりランダム化または部分的にランダム化された。残りのシステインコドンの4つはランダム化された；2つの高度に保存されたシステイン（位置80および388）および配列相同性を有する領域における2つのシステイン（位置310および311）。1つのロイシンはロイシン／プロリンに突然変異された；プロリンは他の甲虫ルシフェリンの中のコンセンサスアミノ酸である。
【０２５０】
4組のオリゴヌクレオチド（表25）を使用して突然変異誘発を実行し、各組から最良のクローンを選択した。これらをsPCRにより前のランダム突然変異誘発から選択したクローンと一緒に組換え、再びスクリーニングした。このプロセスからの最良のクローン（Luc47−7A11）の活性は42℃において2.3倍減少した；親クローン（Luc30−4B02）の活性は2000倍より大きく減少した。
【０２５１】
【表２５】
0004520084.tif 000026
【０２５２】
ランダム突然変異誘発の第2サイクル
誤りがちなPCRを使用するランダム突然変異誘発プロセスを、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発からの最良のクローン（Luc47−7A11）に再び適用した。再び3つのライブラリーをつくり、スクリーニングし、そして選択した突然変異体をsPCRにより組換え、再びスクリーニングした。組換え後、最良の突然変異体（Luc53−0G01）の活性は43℃において1.2倍減少した。親クローン（Luc47−7A11）は150倍減少した。これらの新しい突然変異体の最良のものを前のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発からの最良の突然変異体と組換えた後、新しい最良の突然変異体（Luc55−2E09）の活性は47℃において31倍減少し、これに対して親クローン（Luc53−0G01）は80倍減少した。
【０２５３】
ランダム突然変異誘発の第3サイクル
突然変異誘発の前のサイクルからの最良のクローン（Luc53−0G01）を使用して、ランダム突然変異誘発プロセスを反復した。選択した突然変異体を突然変異誘発の第2サイクルからの突然変異体と組換えさせた後、最良のクローン（Luc81−6G01）の活性は47℃において100倍減少し、これに対して親クローン（Luc53−0G01）は750倍減少した。
【０２５４】
突然変異誘発の前のサイクルに比較して、このサイクルにおけるLuc53−0G01の測定した活性の不一致は、アッセイ手順の変化およびインキュベーター温度の再目盛定めのためであることがある。短縮されたアッセイ手順を使用して、突然変異誘発の各段階から記録された熱安定性をロボット化データから計算することに注意すべきである。熱安定性の正確な定量を提供するよりむしろ、同一スクリーンにおいてアッセイしたとき、データは酵素突然変異体の相対的安定性を示すことを意図する。
【０２５５】
ルミネセンス
緑色を放射するルシフェラーゼおよび赤色を放射するルシフェラーゼをつくる最良のクローンを最終的に選択するために、最終スクリーンからの最良のクローンをさらに分析した。特に3つのクローンは最終選択として強い候補であった：Luc81−0B11、Luc81−5F01、およびLuc81−G01。これらの3つの突然変異体酵素のルミネセンス特性を互いに比較した。また、それらを野生型黄色−緑色放射性ルシフェラーゼに対して比較して、in  vitro進化プロセスを測定した。
【０２５６】
ルシフェラーゼを発現する大腸菌（E.  coli）のコロニーから、Luc81−5F01およびLuc81−G01は室温においてルシフェリンを添加するときルミネセンスを最も急速に産生した。ルミネセンスは、野生型の緑色を放射するルシフェラーゼおよび黄色−緑色放射性ルシフェラーゼを発現するコロニーよりも、いっそう急速でありかつより輝いていた。すべての選択したコロニーからのルミネセンスは、黄色−緑色の親クローンに比較して、緑色にシフトしているように見えた。
【０２５７】
コロニーを65℃に加熱したとき、黄色−緑色クローンは大部分のルミネセンスを喪失し、緑色クローンは二量体となる。突然変異体クローンのいくつかは65℃においてルミネセンスを喪失するが、3つの好ましいクローンは70℃以上において輝いた状態を保持する。コロニーを加熱するときのスペクトル変化は70℃以上まで明らかでなかったが、ここで活性をなお保持するコロニーは赤色にわずかにシフトし始めた（時には、酵素変性の初期相はルミネセンスの赤色シフトを伴う）。3つの好ましい突然変異体のルミネセンス特徴は非常に類似する。
【０２５８】
細胞ライゼイトにおける突然変異体ルミネセンスの熱安定性を室温において比較した（図63）。希釈したライゼイトをpH7.5において緩衝化し、1％のトリトンX−100を含有した；哺乳動物細胞のライゼイトの典型的な条件。すべての3つの突然変異体酵素のルミネセンス活性は20時間にわたって減少を示さなかったが、野生型黄色−緑色放射性ルシフェラーゼは実質的に減少した。
【０２５９】
わずかに数秒を必要とするルミネセンスアッセイについて、野生型黄色−緑色放射性ルシフェラーゼは非常に安定なシグナルを産生する（最初の2秒において明らかなシグナルの初期上昇は、ルミネセンス反応の反応速度ではなく、ルミノメーターの応答時間のためである）（図64A）。しかしながら、シグナル強度はライゼイト（アッセイ試薬の添加により：5に希釈した）中の1％のトリトンX−100の存在のために約30％減少した。対照的に、突然変異体ルシフェラーゼのルミネセンス強度はトリトンX−100の存在により影響を受けなかった。
【０２６０】
これらの条件下に、最も安定なシグナルはLuc81−G01により産生されたが、シグナル強度はLuc81−5F01について多少より輝いていた。しかしながら、大腸菌（E.  coli）において発現された酵素の効率についてデータは補正されていない。こうして、ルミネセンス強度の差は酵素比活性の変化に相関することができず、大腸菌（E.  coli）における発現効率は必然的に哺乳動物細胞における発現に関係しない。
【０２６１】
プロセスするために1より多くを必要とするアッセイのバッチについて、黄色−緑色放射性ルシフェラーゼのシグナル安定性は試験した条件下で不適切である。ルミネセンス強度は数倍／時減少した（図64B）。in  vitro進化によりこれを補正する試みは混合した結果を生じた。すべての3つの突然変異体酵素のシグナル安定性は、基質添加後3時間に、親黄色−緑色酵素より一般に非常に改良された。しかしながら、これは最初の30分間においてより大きいルミネセンスの初期減少を伴う。この初期減少は、それがいっそう急速に起こった場合、いっそう許容されるので、シグナルが安定化するまで待機するとき、試料のバッチ式プロセシングは30分遅延しないであろう。アッセイ条件を調節することによって、この反応速度論的挙動を改良することが可能であろう。
【０２６２】
これらの結果から、引き続いて緑色放射性ルシフェラーゼおよび赤色放射性ルシフェラーゼをつくるとき使用する最良のクローンとして、突然変異体Luc81−G01を選択した。Luc81−G01の配列（図46〜図47）およびLuc81−0B11の配列を決定し、in  vitro進化プロセスの初期からのLuc30−4B02の配列と比較し、そして野生型黄色−緑色放射性ルシフェラーゼを初期親クローンとして使用した（図19B）。
【０２６３】
Luc30−4B02に関して、Luc81−G01突然変異体は9コドンにおける新しい突然変異を獲得し、それらのうちの8つはアミノ酸を変化させた。これらの8アミノ酸変化のうちの4つは、多分Luc30−4B02の単離前に発生したクローンとの組換えを通して獲得された。2つはLuc30−4B02と一緒に配列決定した他のクローンにおいて見出された突然変異と同一であり、そして2つは野生型親配列への復帰である。残りの4つはLuc81−G01の配列において新規である。新規な変化のうちの2つは、他のクローニングされたルシフェラーゼの間でアミノ酸をコンセンサスアミノ酸に変化させる。
【０２６４】
興味深いことには、Luc81−G01またはLuc81−0B11の配列のいずれにおいても、前のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発が有益な作用を有したという証拠は存在しない。新規なヌクレオチド配列はターゲッテッドコドンのいずれにおいても出現しない。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発後の改良された酵素性能は、前に獲得された突然変異の組換えのためであった。Luc81−G01およびLuc81−0B11における新規なアミノ酸変化のすべてはオリゴヌクレオチドがターゲットとしない部位に存在し、コドンの単一塩基修飾のためであり、誤りがちなPCRと一致する。
【０２６５】
Luc81−G01における新規な突然変異は以前の配列データの中に見出されなかったが、それらがプロセスにおいていつ発生したは確かではない。最もありそうなことには、それらはランダム突然変異誘発の第2および第3サイクルにおいて産生された；しかしながら、それらはLuc30−4B02の前に他の選択した突然変異の間に存在したことがありうる。初期の黄色−緑色放射性ルシフェラーゼに関して、Luc81−G01突然変異体は17アミノ酸変化を獲得し、3コドンの突然変異はアミノ酸配列に影響を与えなかった。
【０２６６】
大腸菌（E.  coli）のコロニー内のルミネセンスの開始は新しい突然変異体についてより速いという観測、およびルミネセンスはより高い温度においてより輝いているという観測は、多分タンパク質発現の差のためである。異なるルシフェラーゼを発現する細胞のイムノブロット分析は、存在するポリペプチドの量の有意差を示さなかった。前述したように、より高い温度におけるより大きい光強度は、突然変異体ルシフェラーゼの熱安定性が増加したためである。
【０２６７】
ATPおよびルシフェリンの親KＭは、また、in  vitro進化の過程の間に変化した（表26）。KＭ値を推定するために、硫酸アンモニウムを使用する示差沈降により、大腸菌（E.  coli）のライゼイトから突然変異体ルシフェラーゼを部分的に精製した（40〜65％の飽和画分）。ATPおよびルシフェラーゼの両方についてのKＭは10倍より多く低いことを結果は示した。
【０２６８】
ルシフェラーゼを発現する大腸菌（E.  coli）にルシフェリンを添加したとき、ルシフェリンが細胞膜を横切って拡散するにつれて、ルシフェリンの細胞内濃度はゆっくり増加する。こうして、ルシフェリンの細胞内濃度は、最低のKＭを有するルシフェラーゼについて、より早く飽和に到達する。それゆえ、突然変異体ルシフェラーゼは野生型親クローンよりも速く輝くように見える。また、赤色を放射するプロトタイプのクローンのルミネセンスは、緑色を放射するルシフェラーゼよりも非常に遅く、大腸菌（E.  coli）コロニーにおいて出現する。KＭの分析は、赤色ルミネセンスを引き起こす突然変異はまたルシフェリンについてのKＭを実質的に増加することを示す。
【０２６９】
【表２６】
0004520084.tif 000027
【０２７０】
ルミネセンスシグナルのin  vitro分析から、突然変異体ルシフェラーゼからのルミネセンスは、最初の30分間に、野生型ルシフェラーゼよりもいっそう急速に退色することが期待することができる。次いで、ルミネセンスは突然変異体において最も安定であろう。しかしながら、これは大腸菌（E.  coli）のコロニーにおいて認められてきていなず、そしてルミネセンスの反応速度は緩衝液中の希釈した酵素に比較して細胞内で異なることがある。
【０２７１】
参考文献
【表２７】
0004520084.tif 000028
【０２７２】
すべての刊行物、特許および特許出願は引用することによって本明細書の一部とされる。前述の明細書において、本発明はそのある種の好ましい態様に関して記載され、多数の詳細な説明は例示の目的で記載されたが、当業者にとって明らかなように、本発明は追加の態様が可能であり、本発明の基本的原理から逸脱しないで細部のあるものはかなり変化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ｔ＝０に正規化した、LucPpe2［T249M］；Luc39-5B10；およびLuc49-7C6の37℃での熱安定性のグラフ表示である［Ｘ軸は時間（分）；Ｙ軸は残存活性％；そして「ｔ」は時間である］。
【図２】  図２は、ｔ＝０の読みに対して正規化した、Luc49-7C6およびLuc78-0B10の50℃での残存活性のグラフ表示である［Ｘ軸は時間（時間）；Ｙ軸は残存活性％；そしてｔは時間である］。
【図３】  図３は、ｔ＝０に対して正規化した、Luc49-7C6およびLuc78-0B10により60℃で生成されたルミネセンスのグラフ表示である［Ｘ軸は時間（時間）；Ｙ軸は残存活性％；そしてｔは時間である］。
【図４】  図４は、ルシフェラーゼLucPpe2［T249M］；Luc49-7C6；およびLuc78-0B10の22℃での熱安定性のグラフ表示である［Ｘ軸は時間（日）；Ｙ軸は正規化した光単位である］。
【図５】  図５は、回帰式Ｙ＝0.0043X＋10.91により予測された対数ルミネセンスと比較した、（Ｙ）Luc78-0B10により生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示であり、この酵素の半減期は144時間（６日間）と算出されている［Ｘ軸は時間（時間）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図６】  図６は、回帰式Ｙ＝0.154X＋10.86により算出された対数ルミネセンスと比較した、Luc78-0B10により60℃で生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示であり、この酵素の半減期は38時間（1.58日間）と算出されている［Ｘ軸は時間（時間）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図７】  図７は、回帰式Ｙ＝-0.0059X＋8.757により予測された対数ルミネセンスと比較した、Luc49-7C6により50℃で生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示であり、この酵素の半減期は100.5時間（4.2日間）と算出されている［Ｘ軸は時間（時間）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図８】  図８は、回帰式Ｙ＝-0.169X＋8.647により算出された対数ルミネセンスと比較した、Luc49-7C6により60℃で生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示であり、この酵素の半減期は2.9時間と算出されている［Ｘ軸は時間（時間）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図９】  図９は、予測された対数ルミネセンスと比較した、Luc78-0B10により22℃で生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示であり、この酵素の半減期は109日間である［Ｘ軸は時間（日）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図１０】  図10は、予測された対数ルミネセンスと比較した、Luc49-7C6により22℃で生成された実測のルシフェラーゼ対数ルミネセンスのグラフ表示であり、この酵素の半減期は64日間である［Ｘ軸は時間（日）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図１１】  図11は、予測された対数ルミネセンスと比較した、ルシフェラーゼLuc49-7C6により37℃で生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示である［Ｘ軸は時間（分）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図１２】  図12は、予測された対数ルミネセンスと比較した、ルシフェラーゼLucPpe2［T249M］により22℃で生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示である［Ｘ軸は時間（日）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図１３】  図13は、予測された対数ルミネセンスと比較した、ルシフェラーゼLucPpe2［T249M］により37℃で生成された実測の対数ルミネセンスのグラフ表示である［Ｘ軸は時間（分）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図１４】  図14は、インビボおよびインビトロでのルシフェラーゼルミネセンス（Li）；酵素安定性（τ）；検定動力学（Ｓ）；および基質結合（Km）の検定の工程を示すフローチャートである。
【図１５】  図15は、机上配置ロボットの模式的表示である。
【図１６Ａ】  図16Aは、65℃、pH6.5で測定したルシフェラーゼ変異体Luc90-1B5のルミネセンスのグラフ表示である（Ｘ軸は時間（時間）；Ｙ軸は％ルミネセンスである）。
【図１６Ｂ】  図16Bは、22℃、pH6.5におけるルシフェラーゼ変異体Luc90-1B5のルミネセンスのグラフ表示である（Ｘ軸は時間（日）；Ｙ軸は％ルミネセンスである）。
【図１７】  図17は、アミノ酸配列に基づく甲虫ルシフェラーゼ間の進化上の関係を示す図式である。
【図１８Ａ】  図18Aは、甲虫ルシフェラーゼ酵素の二次構造の表示である（ヘリックスは円柱で表し、シートは矢印の集合で表し、ループはヘリックスをシートと連結している）。
【図１８Ｂ】  図18Bは、LucPpe2ルシフェラーゼのアミノ酸（三次構造）を示し、ここで小らせんは図18Aの円柱に対応している。
【図１８Ｃ】  図18Cは、一般的な甲虫の構造がLuc90-1B5の構造と合致している（重複する）事を示している。
【図１９Ａ】  図19Aは、様々な甲虫種（それぞれLcr、Lla、Lmi、Pmi、Ppy、Lno、Ppel、Phg、GR、YG、Ppe2）由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号27−37）と、本発明に係るルシフェラーゼ（Luc49-7C6；Luc78-0B10；Luc90-1B5、Luc133-1B2；およびLuc146-1H2。各々配列番号14、19、24、44および45）とのアミノ酸配列の並置を示しており；配列は、配列が並べられない間隙を点（例えば．．．）で示して並べてあり；全配列ではなく、本発明に係るルシフェラーゼが幾つかの甲虫種のルシフェラーゼと相違しているアミノ酸のみを示してある。「Cons」は保存アミノ酸を一文字で示す配列であり、非保存アミノ酸は「−」で示す。
【図１９Ｂ】  図19Bは、様々な甲虫種（Lcr、Lla、Lmi、Pmi、Ppy、Lno、Ppel、Phg、GR、YG、Ppe2）由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号27−37）と、本発明に係るルシフェラーゼ（Luc30-4B02およびLuc81-6G01。各々配列番号47および26。）とのアミノ酸配列の並置を示しており；配列は、配列が並べられない間隙を点（例えば．．．）で示して並べてあり；本発明に係るルシフェラーゼが幾つかの甲虫種のルシフェラーゼと相違しているアミノ酸を太字で示してある。
【図１９Ｃ】  図19Cは、様々な甲虫種（Lcr、Lla、Lmi、Pmi、Ppy、Lno、Ppel、Phg、YG、Ppe2、Ppl）由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号27−34および36−37）の並置を示しており；配列は、配列が並べられない間隙を点（例えば．．．）で示し；YGの下の線では、Ｘは、変異がコンセンサスアミノ酸を産むYG中の位置を示し；Ｏは、変異がコンセンサスアミノ酸を産まないYG中の位置を示している。
【図２０】  図20は、pRAMバックボーン中の7216bp Ppe2ベクター地図である。
【図２１】  図21は、E.coliの組換えコロニーで発現されたルミネセンスの比較を示す棒グラフであり；このコロニーはルシフェラーゼコード化ベクターの実体が相違しており（Luc+；Luc90-1B5；Luc78-1B10；Luc49-7C6；LucPpe2［T249M］およびLucPpe2）；組換えコロニーにおいてはＹ軸で示す［Ｘ軸は正規化された光単位である］。
【図２２】  図22は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-7C6をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号１）であり；変異は下線によって示してある。
【図２３】  図23は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-6C10をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号２）であり；変異は下線によって示してある。
【図２４】  図24は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-0G12をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号３）であり；変異は下線によって示してある。
【図２５】  図25は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-7A5をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号４）であり；変異は下線によって示してある。
【図２６】  図26は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-4G11をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号５）であり；変異は下線によって示してある。
【図２７】  図27は、Luc49-7C6と呼ばれる変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号14）であり；変異は下線によって示してある。
【図２８】  図28は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-6C10のアミノ酸配列（配列番号15）であり；変異は下線によって示してある。
【図２９】  図29は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-0G12のアミノ酸配列（配列番号16）であり；変異は下線によって示してある。
【図３０】  図30は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-7A5のアミノ酸配列（配列番号17）であり；変異は下線によって示してある。
【図３１】  図31は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc49-4G11のアミノ酸配列（配列番号18）であり；変異は下線によって示してある。
【図３２】  図32は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc78-0B10をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号６）であり；変異は下線によって示してある。
【図３３】  図33は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc78-0G8をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号７）であり；変異は下線によって示してあり；Ｘは、或る位置における実体不明ヌクレオチドを示している。
【図３４】  図34は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc78-1E1をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号８）であり；変異は下線によって示してあり；Ｘは、或る位置におけるヌクレオチドの実体が不明であることを示している。
【図３５】  図35は、変異体ルシフェラーゼLuc78-2B4をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号９）であり；下線を付したヌクレオチドは変異であり；Ｘは、或る位置における実体不明ヌクレオチドを示している。
【図３６】  図36は、変異体ルシフェラーゼLuc78-0B10のアミノ酸配列（配列番号19）であり；下線を付したアミノ酸は変異である。
【図３７】  図37は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc78-0G8のアミノ酸配列（配列番号20）であり；下線を付したアミノ酸は変異であり；Ｘは、或る位置における不明アミノ酸を示している。
【図３８】  図38は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc78-1E1のアミノ酸配列（配列番号21）であり；下線を付したアミノ酸は変異であり；Ｘは、或る位置における不明アミノ酸を示している。
【図３９】  図39は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc78-2B4のアミノ酸配列（配列番号22）であり；下線を付したアミノ酸は変異であり；Ｘは、或る位置における不明アミノ酸を示している。
【図４０】  図40は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc85-4F12をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号10）であり；下線を付したヌクレオチドは変異であり；Ｘは、その位置における不明アミノ酸を示している。
【図４１】  図41は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc85-4F12のアミノ酸一覧（配列番号23）であり；下線を付したアミノ酸は変異であり；Ｘは、その位置における不明アミノ酸を示している。
【図４２】  図42は、変異体ルシフェラーゼ酵素Luc90-1B5をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号11）であり；下線を付したヌクレオチドは変異である。
【図４３】  図43は、Luc90-1B5と呼ばれる変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号24）であり；下線を付したアミノ酸は変異位置である。
【図４４】  図44は、ルシフェラーゼ酵素LucPpe2［T249M］をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号12）である。
【図４５】  図45は、LucPpe2［T249M］のアミノ酸配列（配列番号25）であり；下線を付したアミノ酸は残基249におけるThrからMetへの変異である。
【図４６】  図46は、ルシフェラーゼ酵素LucPpl81-6G1のアミノ酸配列（配列番号26）であり；下線を付したアミノ酸は開始配列からの変異であり；Ｘはアンビギュイティーを示す。
【図４７】  図47は、ルシフェラーゼ酵素Luc81-6G1をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号13）であり；下線を付したヌクレオチドは変異である。
【図４８】  図48は、ｔ＝０に対して正規化した60℃での変異体ルシフェラーゼLuc49-7C6およびLuc78-0B10のルミネセンスのグラフ表示である［Ｘ軸は時間（時間）であり、Ｙ軸は対数正規化されたルミネセンスである］。
【図４９】  図49は、初期値に対して正規化した、ルシフェラーゼLucPpe2［T249M］、Luc49-7C6、およびLuc78-0B10の４℃における熱安定性のグラフ表示である［Ｘ軸は時間（日）であり；Ｙは対数正規化した光単位である］。
【図５０】  図50は、ｔ＝０に対して正規化した50℃での変異体ルシフェラーゼLuc49-7C6およびLuc78-0B10のルミネセンスのグラフ表示である［Ｘ軸は時間（時間）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図５１】  図51は、ｔ＝０で正規化した50℃での変異体ルシフェラーゼLuc49-7C6およびLuc78-0B10のルミネセンスのグラフ表示である。
【図５２】  図52は、ｔ＝０に対して正規化した60℃での変異体ルシフェラーゼLuc49-7C6およびLuc78-0B10のルミネセンスのグラフ表示である［Ｘ軸は時間（時間）であり；Ｙ軸はルミネセンスである］。
【図５３】  図53は、22℃でのルシフェラーゼLucPpe2［T249M］、Luc49-7C6およびLuc78-0B10の熱安定性のグラフ表示である［Ｘ軸は時間（日）であり；Ｙ軸は対数ルミネセンスである］。
【図５４Ａ】  図54Aは、ｔ＝０に対して正規化したpH4.5および48℃でのLuc90-1B5；Luc133-1B2；およびLuc146-1H2のルミネセンスのグラフ表示である。
【図５４Ｂ】  図54Bは、pH4.5および48℃でのLuc90-1B5；Luc133-1B2；およびLuc146-1H2の半減期のグラフ表示である。これらの条件下でのLuc90-1B5の半減期は約３分間であり、Luc133-1B2は約20分間であり、そしてLuc146-1H2は約62分間である。
【図５５】  図55は、ルシフェラーゼ酵素Luc133-1B2をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号42）であり；変異は下線によって示してある。
【図５６】  図56は、ルシフェラーゼ酵素Luc146-1H2をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号43）であり；変異は下線によって示してある。
【図５７】  図57は、変異体ルシフェラーゼLuc133-1B2のアミノ酸配列（配列番号44）であり；変異は下線によって示してある。
【図５８】  図58は、変異体ルシフェラーゼLuc146-1H2のアミノ酸配列（配列番号45）であり；変異は下線によって示してある。
【図５９】  図59は、pH7.8、室温でのクローンLuc49-7C6；Luc78-0B10；Luc90-1B5；Luc133-1B2；およびLuc146-1H2のシグナル動態のグラフ表示である。
【図６０】  図60は、ｔ＝０から約８時間までの、Luc49-7C6；Luc78-0B10；Luc90-1B5；Luc133-1B2；およびLuc146-1H2の、pH7.8、50℃での正規化ルミネセンスのグラフ表示である。
【図６１】  図61は、選択されたルシフェラーゼの、基質インヒビターに対する抵抗性のグラフ表示である。このデータはLuc90-1B5；Luc133-1B5；およびLuc146-1H2についてのルミネセンスの対数対時間として表されている。
【図６２】  図62は、Luc90-1B5およびLucPpe2［T249M］についての、22℃、pH6.5における経時的なルミネセンスの対数のグラフ表示である。
【図６３】  図63は、室温において１％トリトンX-100を含有する水溶液中の、選択された変異体ルシフェラーゼおよびLucPplYGの熱安定性のグラフ表示である。
【図６４】  図64は、或るルシフェラーゼについての経時的なルミネセンス活性の保持のグラフ表示である（ルミネセンス／O.D.として表現）。
【図６５】  図65は、ルシフェラーゼ酵素Luc81-0B11をコードしているヌクレオチド（DNA）配列（配列番号46）であり；変異は下線によって示してある。
【図６６】  図66は、変異体ルシフェラーゼLuc81-0B11のアミノ酸配列であり；変異は下線によって示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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