(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでヘリコバクターの増殖又は生存を阻害することができる分子を同定するためのインビトロの方法であって、
（ａ）親ヘリコバクターを生物学的試料中の該分子と接触させる工程、
（ｂ）該活性分子の存在下又は非存在下で、ＵｒｅＩを欠損した株に対して親株の及び／又はｕｒｅＩを保持するプラスミドで補足されたＵｒｅＩ欠損株の細胞外pHに対する応答及び酸性に対する感受性を試験し比較する工程、並びに
（ｃ）ＵｒｅＩ欠損株と比較して異なる効果を親株または補足された株に対して示す該分子を選択する工程を含む方法。
【請求項２】
酸性に対する感受性の程度が工程（ｂ）において測定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分子がＵｒｅＩに特異的である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヘリコバクター株が、ヘリコバクター  ピロリ（Helicobacter pylori）、ヘリコバクター  フェリス（Helicobacter felis）、ヘリコバクター  ヘイルマンニ（Helicobacter heilmannii）、ヘリコバクター  ムステレ（Helicobacter mustelae）、ヘリコバクター  カニス（Helicobacter canis）、ヘリコバクター  ビリス（Helicobacter bilis）、ヘリコバクター  ヘパチクス（Helicobacter hepaticus）、ヘリコバクター  ムリダルム（Helicobacter muridarum）、及びヘリコバクター  トログンタム（Helicobacter troguntum）からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＵｒｅＩを欠損した株が、ｕｒｅＩ遺伝子の欠失を保持するＨ．ピロリの組換え株であって、前記遺伝子が非極性カセットにより置換されており、ここで非極性カセットは、それがオペロン内に存在する場合にオペロン内の下流の遺伝子の転写に影響を与えないカセットである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
非極性カセットがカナマイシン耐性カセットである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ｕｒｅＩ遺伝子の欠失が最初の２１コドン以外全ての欠失であり、そして非極性カセットが自己のプロモーター領域とターミネーター領域とを欠失しているａｐｈＡ−３カナマイシン耐性遺伝子から構成される、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
ｕｒｅＩを保持するプラスミドが、受託番号Ｉ−２２４５の下で１９９９年６月２８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された、Ｈ．ピロリにおいて安定的に複製することができ、ｕｒｅＩ遺伝子を保持し、かつｕｒｅＩ遺伝子の欠失を保持するＨ．ピロリの組換え株であって前記遺伝子が非極性カセットにより置換されている組換え株を補足する、プラスミドｐＩＬＬ８５０であり、ここで非極性カセットは、それがオペロン内に存在する場合にオペロン内の下流の遺伝子の転写に影響を与えないカセットである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ウレアーゼ活性を有し、そして酸性に対する感受性を有するヘリコバクター株の製造方法であって、ｕｒｅＩ遺伝子を欠失させ、そして前記遺伝子を非極性カセットにより置換する工程を含み、ここで非極性カセットは、それがオペロン内に存在する場合にオペロン内の下流の遺伝子の転写に影響を与えないカセットである、方法。
【請求項１０】
非極性カセットがカナマイシン耐性カセットである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ｕｒｅＩ遺伝子を欠失させ、そして前記遺伝子を非極性カセットにより置換する工程が、ｕｒｅＩ遺伝子の最初の２１コドン以外全てを欠失させ、それを自己のプロモーター領域とターミネーター領域とを欠失しているａｐｈＡ−３カナマイシン耐性遺伝子から構成される非極性カセットにより置換することによって行われる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
ヘリコバクター株がＨ．ピロリである、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ｕｒｅＩ遺伝子の欠失を保持するＨ．ピロリの組換え株であって、前記遺伝子が非極性カセットにより置換されており、ここで非極性カセットは、それがオペロン内に存在する場合にオペロン内の下流の遺伝子の転写に影響を与えないカセットである、組換え株。
【請求項１４】
非極性カセットがカナマイシン耐性カセットである、請求項１３記載の組換え株。
【請求項１５】
ｕｒｅＩ遺伝子の欠失が最初の２１コドン以外全ての欠失であり、そして非極性カセットが自己のプロモーター領域とターミネーター領域とを欠失しているａｐｈＡ−３カナマイシン耐性遺伝子から構成される、請求項１３または１４記載の組換え株。
【請求項１６】
受託番号Ｉ−２２４５の下で１９９９年６月２８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託された、Ｈ．ピロリにおいて安定的に複製することができ、ｕｒｅＩ遺伝子を保持し、かつｕｒｅＩ遺伝子の欠失を保持するＨ．ピロリの組換え株であって前記遺伝子が非極性カセットにより置換されている組換え株を補足し、ここで非極性カセットは、それがオペロン内に存在する場合にオペロン内の下流の遺伝子の転写に影響を与えないカセットである、プラスミドｐＩＬＬ８５０。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＵｒｅＩの活性を特異的に阻害することにより、インビボ（in vivo）でヘリコバクター、特にヘリコバクター  ピロリ（Helicobacter pylori）の生存を阻害することができる分子をスクリーニングする方法、これらの方法により同定された分子、及びヘリコバクター感染を処置又は予防するためのこれらの分子の使用に関する。
【０００２】
【従来の発明】
発明の背景
ヘリコバクター  ピロリは、ヒトの胃粘膜にコロニー形成する微好気性グラム陰性菌である（１０）。Ｈ．ピロリは、胃炎及び消化性潰瘍疾患に関連しており、胃癌のリスクを増加させることが示されている。ウレアーゼは、Ｈ．ピロリの主要な毒性因子である。それは、細菌の酸性微小環境の中和に関与しており、Ｈ．ピロリ代謝においても役割を果たしている（１１、２６）。
【０００３】
Ｈ．ピロリのゲノムのウレアーゼ領域は、全ての株（９及び図１）に共通の２つの遺伝子クラスターから構成されており、そのうちの一つは構造ウレアーゼサブユニットをコードするｕｒｅＡＢ遺伝子を含み、もう一つはウレアーゼ活性部位へのニッケルの取り込みに必要なアクセサリータンパク質をコードするｕｒｅＥＦＧＨを含有する。ｕｒｅＩ遺伝子は、この後者の遺伝子クラスターの直上流に位置し、同一の方向で転写される（図１）。ｕｒｅＡ遺伝子、ｕｒｅＢ遺伝子、ｕｒｅＥ遺伝子、ｕｒｅＦ遺伝子、ｕｒｅＧ遺伝子、ｕｒｅＨ遺伝子、及びｕｒｅＩ遺伝子、並びに遺伝子産物は、米国特許第５，６９５，９３１号及び認可された特許出願第０８／４７２，２８５号に記載され、請求の範囲にも記載されており、これらはいずれも参照として本明細書に特別に組み込まれる。
【０００４】
ｕｒｅＩからｕｒｅＥまで（１塩基対、ｂｐ）及びｕｒｅＥからｕｒｅＦまで（１１ｂｐ）の距離は、ｕｒｅＩ−ｕｒｅＥ−ｕｒｅＦがオペロンを構成していることを示唆している。ｕｒｅＩ及びｕｒｅＥの共転写は、ノーザンブロット解析により証明されている（１）。ＭｉｎｉＴｎβ−Ｋｍトランスポゾンにより中断されたｕｒｅＩ遺伝子を有するＨ．ピロリＮ６突然変異体が、フェレロ（Ｆｅｒｒｅｒｏ）ら（１９９４）により以前に記載された（１３）。この株（Ｎ６−ｕｒｅＩ：：ＴｎＫｍ−８）はウレアーゼ陰性表現型を表し、従って、ｕｒｅＩは完全なウレアーゼ活性に必要なアクセサリー遺伝子であると結論付けられた。
【０００５】
Ｈ．ピロリ由来のＵｒｅＩと、シュードモナスアエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）及びロドコッカス（Rhodococcus）ｓｐ．Ｒ３１２の脂肪族アミダーゼオペロンによりコードされるＡｍｉＳタンパク質とは、配列が類似している（５、２７）。脂肪族アミダーゼは、相当する有機酸及びアンモニアを生成させるための、短鎖脂肪族アミドの細胞内加水分解を触媒する。Ｈ．ピロリも、インビトロ（in vitro）でアセトアミド及びプロピオンアミドを加水分解する、そのような脂肪族アミダーゼを有することが示されている（２３）。
【０００６】
ＵｒｅＩ及びＡｍｉＳとの配列類似性と、ウレアーゼ及びアミダーゼの基質（尿素：ＮＨ2−ＣＯ−ＮＨ2及びアセトアミド：ＣＨ3−ＣＯ−ＮＨ2）の極めて類似した構造、並びに両酵素によるアンモニアの生成とを考え合わせると、Ｈ．ピロリＵｒｅＩタンパク質の機能のより詳細な理解が必要である。この理解は、Ｈ．ピロリ感染の予防及び治療のための新規な機会を開くであろう。
【０００７】
発明の概要
本発明は、インビボのヘリコバクター種、特にＨ．ピロリの増殖及び／又は生存を阻害することができる分子を同定する方法を提供する。特に、本発明の方法は、ＵｒｅＩタンパク質機能を特異的に阻害する分子をスクリーニングすることを含む。
【０００８】
本発明は、本発明の方法により同定された分子、並びにヒト及び動物におけるヘリコバクター、特にＨ．ピロリの感染を処置又は予防するための、本発明の方法による分子の使用を包含する。
【０００９】
本発明のもう一つの面は、インビボでヘリコバクター種の増殖及び／又は生存を阻害することができる分子の、そのような処置を必要とするヒト又は動物への投与による、ヘリコバクター種感染を予防又は処置するための方法である。本発明に係るそのような分子の一つは、それが（ｉ）ヘリコバクター細胞の内部へ輸送されること、又は（ii）ＵｒｅＩの輸送特性を阻害すること、又は（iii）ＵｒｅＩとウレアーゼもしくはその他のヘリコバクター  タンパク質との相互作用を阻害することによりＵｒｅＩ機能を阻害すること、を可能にするＵｒｅＩに対する高親和性を特徴とする。ＵｒｅＩを阻害することにより、そのような分子は、細菌の酸性に対する感受性を高める。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの面は、免疫原性ＵｒｅＩ抗原の作製、並びにヘリコバクター種の感染及び／又は胃もしくは腸におけるコロニー形成を予防するためのワクチンとしてのそれらの使用である。これらのＵｒｅＩ抗原に対する抗体も、本発明の範囲に包含される。
【００１１】
本発明は、改変された遺伝子の産物が、in vivoでの細菌の生存能力の弱化に寄与し、従って病原性効果の弱化に寄与するよう、改変されたｕｒｅＩ遺伝子を含むＨ．ピロリの組換え株にさらに関する。
【００１２】
表２は、in vitro生存力試験及びpH測定で得られた結果を示す。
【００１３】
表３は、図４のグラフに表された株Ｎ６及びＮ６−８３４によるアンモニア生成の値を与える。
【００１４】
詳細な説明
ヘリコバクター種のウレアーゼクラスターは、特別の遺伝子ｕｒｅＩを有するという点で、配列決定されているグラム陰性菌の多くのウレアーゼオペロンの中で独特である（２０）。従って、ＵｒｅＩの機能は、多くの検討の対象となってきた。ほとんどの場合、ＵｒｅＩの機能は、ウレアーゼ活性部位へのニッケル取り込みに必要なアクセサリータンパク質、又はニッケルトランスポーターの機能であるとされてきた。非極性カセット（カナマイシン耐性カセット）により交換されたｕｒｅＩの欠失を保持するＨ．ピロリ株が構築されており、Ｎ６−８３４と命名された（３０）。その株は、１９９９年６月２８日にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．（Collection Nationale de Culture de Microorganismes、25 rue du Docteur Roux、75724 Paris Cedex 15、France）に寄託された。非極性カセット（１９）がＨ．ピロリで機能することが示されたのは、これが最初であった。これらの結果は、Ｃａｇ、多遺伝子病原性島（multigenic pathogenicity island）のような複雑なＨ．ピロリオペロンの遺伝学的分析のための貴重な道具を提供する。
【００１５】
この株を用いた研究は、中性pHにおけるin vitro増殖後に測定されるＨ．ピロリウレアーゼの完全な活性にとって、ＵｒｅＩが必要とされないということを証明した。Ｈ．ピロリにおいて既に同定されているそのようなタンパク質ＮｉｘＡ（３）が完全なウレアーゼ活性にとって必要であるため、この結果は、ＵｒｅＩがニッケル輸送に関与していることに論を唱えるものである。ＵｒｅＩ欠損株から発現されたウレアーゼと、相当する親株から発現されたウレアーゼとの比較は、（ｉ）それらが同一の活性最適pH（pH８）を示すこと、（ii）ウレアーゼ構造サブユニットＵｒｅＡ−Ｂが等しい量で産生されること、及び（iii）ウレアーゼの細胞内の位置が同一であること、を示している。
【００１６】
（ｉ）ＵｒｅＩがＨ．ピロリによるマウスにおけるコロニー形成にとって必須であること、（ii）ＵｒｅＩウレアーゼが酸性pHにおけるＨ．ピロリの生存にとって重要であること、及び（iii）ＵｒｅＩが低pHにおけるウレアーゼの「活性化」にとって必要であることが、本明細書において証明される。
【００１７】
胃におけるコロニー形成過程において、Ｈ．ピロリは、重要なpH変動に対処しなければならず、特に極酸性pH（pH１．４のような酸性）には迅速に適合しなければならない。本発明者らは、ＵｒｅＩが、マウス胃におけるコロニー形成の欠如と調和する、酸性に対するＨ．ピロリの適合にとって必要であることを示した。Ｈ．ピロリの酸性に対する耐性のための必須タンパク質として、ＵｒｅＩは、Ｈ．ピロリの感染、確立、及び持続において確実に重要な役割を果たしている。ＵｒｅＩは、尿素と構造的に類似した分子である短鎖アミドの輸送に関与していることが提唱されている（２７）ＡｍｉＳタンパク質の配列と類似した配列を有している。ＵｒｅＩ／ＡｍｉＳタンパク質は、内在性膜タンパク質、おそらくは細胞膜の内在性膜タンパク質の特徴を有する。
【００１８】
ＵｒｅＩの異なる役割も提唱されている。例えば、ＵｒｅＩは、低pHにおいて特に活性な尿素又は短鎖アミドの輸送（取り込み又は排出）に関与しているのかもしれない。しかし、脂肪族アミダーゼを欠損したＳＳ１変異体は、マウスコロニー形成実験において親株と同等の効率でコロニー形成するため、アミドトランスポーターとしてのＵｒｅＩの必須の役割は、低いであろう。さらに、アミダーゼ活性は、Ｎ６−８３４突然変異株（１９９９年６月２８日に提出されたＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）におけるｕｒｅＩの欠失によって有意には改変されない。尿素の取り込み又は排出は、尿素回路の存在と調和している可能性があり、これはＨ．ピロリの特徴の一つである（２８）。
【００１９】
又は、ＵｒｅＩは、能動的なアンモニウム排出系に関与しているのかもしれない。最後に、ＵｒｅＩは、細胞外pHが酸性である場合にウレアーゼの活性が高くなることを可能にする、ウレアーゼ活性と細胞周辺pHとの結びつけのメカニズムに関与しているのかもしれない。
【００２０】
本発明者らの結果は、ＵｒｅＩが酸性pH値において活性な尿素トランスポーターであるとする第１の仮説、及びＵｒｅＩが細胞周辺pHとウレアーゼ活性の間の一種のセンサー・タンパク質であるとする第３の仮説と一致している。本発明者らは、これらの２つの仮説は排他的なものではないと考える。ＵｒｅＩの役割が何であれ、in vivoでのＨ．ピロリの生存にとって必須な膜タンパク質として、それは、本発明において、新規な根絶療法及びＨ．ピロリに対するワクチンの強力な標的を提供する。
【００２１】
in vivoのヘリコバクターの増殖及び／又は生存を阻害することができる分子は、親ヘリコバクター株を生物学的試料中の該分子と接触させること、尿素の存在下又は非存在下で、親株の細胞外pHに対する感受性を試験し、ＵｒｅＩにおける欠損株又はｕｒｅＩで補足されたＵｒｅＩ欠損株と比較すること、ＵｒｅＩ欠損株と比較して異なる効果を親株又は補足された株に対して示す該分子を選択すること、及び該活性分子を収集すること、により同定されうる。
【００２２】
ＵｒｅＩに特異的な活性を有する分子は、中性pHにおいては株の挙動に影響を与えることなく、尿素の存在下で、Ｈ．ピロリを酸性pH（pH２．２）に対して感受性にするものであろう。尿素の存在下での酸性に対する感受性は、実施例に記載され、クライン（Ｃｌｙｎｅ）ら（８）から適合させたプロトコルに従い、すべてのＨ．ピロリ細胞において試験されうる。本発明者らは、プラスミド（ｕｒｅＡＢ−ｕｒｅＩＥＦＧＨ）上に全長ウレアーゼ遺伝子クラスターを保持するすべてのＥ．ｃｏｌｉ細胞において、この試験を転移することを現在試みている。尿素の存在下で、この組換えＥ．ｃｏｌｉの酸性に対する感受性を高める分子のスクリーニングは、実施例においてＨ．ピロリに関して記載されたのと同様にして実施される。ＵｒｅＩに対して作用する阻害分子とウレアーゼに対して作用する阻害分子とを区別するため、尿素の存在下でpH７ですべての細胞をインキュベートした後の培地のpHが測定されよう。目的の分子は、中性pHにおけるインキュベーションの後に観察される培地のアルカリ化を阻害することなく、酸性に対する応答に影響を与える分子である。
【００２３】
これらの方法は、ＵｒｅＩホモローグを保持するあらゆるヘリコバクター種を阻害する分子を同定するために用いられうる。これは、胃内ヘリコバクター種：ヘリコバクター  ピロリ、ヘリコバクター  フェリス（Helicobacter felis）、ヘリコバクター  ムステレ（Helicobacter mustelae）、ヘリコバクター  ムリダラム（Helicobacter muridarum）を含み、さらに、ヘリコバクター  ヘイルマンニ（Helicobacter heilmannii）、ヘリコバクター  カニス（Helicobacter canis）、ヘリコバクター  ビリス（Helicobacter bilis）、ヘリコバクター  ヘパチクス（Helicobacter hepaticus）、及びヘリコバクター  トロガンタム（Helicobacter troguntum）を含む。
【００２４】
本発明の方法により同定された分子は、（ｉ）尿素又は短鎖アミドの輸送の阻害、（ii）アンモニウム排出の阻害、又は（iii）低pHにおけるウレアーゼ「活性化」の阻害により、ＵｒｅＩ活性を阻害することができるであろう。要点（ｉ）及び（ii）による分子は、外膜全体に拡散することができるべきであり、低濃度でも活性を有するべきである。適当な候補分子は、尿素又は短鎖アミドの構造アナログ、アンモニウム誘導体、又はウレアーゼ阻害剤である。例えば、ＡＨＡ（アセトヒドロキサム酸）、ヒドロキシ尿素、馬尿酸、フルロファミド（flurofamide）、ヒドロキシルアミン、メチル尿素、チオ尿素（２９）、又はメチルアンモニウムである。要点（iii）による分子は、低pHにおけるウレアーゼの「活性化」にとって必要な、（おそらく細胞膜に挿入されている）ＵｒｅＩと、細胞周辺、膜、又は細胞質のＨ．ピロリタンパク質との接触を阻害するべきである。これらのタンパク質は、ウレアーゼ自体の構造サブユニット、アクセサリータンパク質、又はその他のタンパク質でありうる。本発明に従って得られた分子は、ウレアーゼ競合阻害剤であるべきではなく、in vivoで有毒又は変異原性であるべきではなく、抗生物質又は殺菌分子の作用を強化するかもしれない。そのような分子の作用の実証は、実施例に記載されたような同遺伝子株ＳＳ１及びＳＳ１−８３４の対を有するマウス動物モデルにおいて、in vivoで実施されうる。
【００２５】
本発明に係る分子の一例は、ＵｒｅＩに特異的なモノクローナル又はポリクローナルの抗体である。好ましくは、抗体は、ＵｒｅＩ活性を特異的に阻害することができる。
【００２６】
本発明の分子は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、ヘリコバクター感染に罹患した患者に投与されうる。又は、本発明に係る一つ又は複数の分子を含む免疫原性組成物を、ヘリコバクター種感染を予防するためのワクチン組成物として投与することができる。
【００２７】
本発明に係る免疫原性組成物は、ＵｒｅＩタンパク質の全部又は一部も含みうる。好ましくは、ＵｒｅＩ断片は、元来のＵｒｅＩ配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、より好ましくは、断片は、元来のＵｒｅＩ配列の少なくとも１８個、２０個、又は２５個の連続するアミノ酸を含む。適当なＵｒｅＩ断片は、天然ＵｒｅＩ配列の少なくとも４０個又は少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含有しうる。ヘリコバクター  ピロリの適当な断片は、例えば、Ｈ．ピロリ（GenBank accession No. M84338）のアミノ酸残基２２から３１、４９から７４、９４から１０４、及び１２３から１４２からなる群より選択される断片を含む。
【００２８】
以下の実施例を参照されたい。実施例は、本発明の純粋な例示であり、本発明を限定するためのものではない。
【００２９】
【実施例】
Ｈ．ピロリｕｒｅＩ遺伝子の限定された突然変異の構築
ＵｒｅＩタンパク質が活性なウレアーゼの産生にとって必要であるか否かを決定するため、対立遺伝子交換により、ｕｒｅＩの限定された突然変異を有するＨ．ピロリ株を作製した。この目的のため、ｕｒｅＩに挿入された抗生物質耐性遺伝子を保持するカセットを有する２つのプラスミド（ｐＩＬＬ８２３及びｐＩＬＬ８３４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて構築した。
【００３０】
一つのプラスミドｐＩＬＬ８２３（図２Ａ）においては、クロラムフェニコール（Ｃｍ）に対する耐性を与えるプロモーターないｃａｔ遺伝子の挿入により、ｕｒｅＩ遺伝子を不活性化した。ｐＣＭ４（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）由来の「ｃａｔカートリッジ」を含有する７８０ｂｐの平滑末端ＢａｍＨＩ制限断片を、ｐＩＬＬ７５３（９）中のｕｒｅＩのコドン２１及び２２の間の唯一のＨｐａＩ部位に導入した。得られたプラスミドｐＩＬＬ８２３（図２Ａ）においては、ｃａｔが、ｕｒｅＩと同一の向きにあり、ｕｒｅＩプロモーターの調節下で発現する。
【００３１】
第２のプラスミドｐＩＬＬ８３４は、最初の２１コドン以外が全て欠失しており、自己のプロモーター領域及びターミネーター領域（１９）から欠失されたａｐｈＡ−３カナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子（２５）から構成される非極性カセットと置換されているｕｒｅＩ遺伝子を保持していた。シゲラ  フレクスネリ（Shigella flexneri）（１９）及び（エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica、２のような）その他の生物において、このカセットは、これらの遠位の遺伝子が完全な翻訳シグナルを有している限り、オペロン内の下流の遺伝子の転写に影響を与えないことが示されている。ｕｒｅＩとｕｒｅＥの間には１塩基のみが存在し（図１）、ｕｒｅＥは自己のＲＢＳ（リボソーム結合部位）を有しないため、ｕｒｅＩ及びｕｒｅＥの発現は、転写及び翻訳に関して連結している。従って、ｕｒｅＩ欠失は、ｕｒｅＥの直上流へのＲＢＳの付加に付随して起こったものである。最終的なプラスミドｐＩＬＬ８３４（図２Ａ）を作製するために、３つの中間体ｐＩＬＬ８２４、ｐＩＬＬ８２５、及びｐＩＬＬ８３３（図２Ａ）が構築された。ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ部位とＨｉｎｄIII部位の間に、ｐＩＬＬ７５３（９）由来の１．８KbのＨｐａＩ−ＨｉｎｄIII制限断片を挿入し、ｐＩＬＬ８２４を得た。ｐＩＬＬ８２４のｕｒｅＥの最初の２つのコドンと重複するＢｃｌＩ部位へのＨ１９アダプター（ｕｒｅＥとインフレームでＲＢＳ及びＡＴＧを保持する、表１）の挿入により、ｐＩＬＬ８２５（図２Ａ）を作製した。次いで、ｐＩＬＬ８２５のＢａｍＨＩ断片を、ｐＩＬＬ７５３由来の１．３Kbの平滑末端ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片と置換した。これにより、完全なｕｒｅＩ遺伝子が再構築され、このプラスミドをｐＩＬＬ８３３と名付けた。最後に、ｐＩＬＬ８３３のＨｐａＩ−ＢｇｌＩＩ断片と、非極性Ｋｍカセットを含有するｐＵＣ１８Ｋ２（１９）の８５０ｂｐの平滑末端ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片との置換（それによりｕｒｅＩの最初の２１コドン以外の全てが欠失）により、ｐＩＬＬ８３４を得た。
【００３２】
【表１】
0004445128.tif 000002
【００３３】
Ｈ．ピロリへのｕｒｅＩ突然変異の導入
Ｈ．ピロリ株Ｎ６（１２）及びマウス適合Ｈ．ピロリ株ＳＳ１（シドニー株（Sydney Strain）、１７）由来のスコウロウブリス（Skouloubris）ら（２３）により以前に記載されたｐＩＬＬ８２３及びｐＩＬＬ８３４の濃縮された調製物のエレクトロポレーションの後、対立遺伝子交換によりＨ．ピロリｕｒｅＩ変異体を作製した。ｐＩＬＬ８２３との染色体対立遺伝子交換を有する細菌をＣｍ（４μg／ml）上で選択し、ｐＩＬＬ８３４との染色体対立遺伝子交換を有する細菌をＫｍ（２０μg／ml）上で選択した。適当なオリゴヌクレオチド（表１）を用いたＰＣＲを実施することにより、所望の対立遺伝子交換が株Ｎ６−８２３、Ｎ６−８３４、及びＳＳ１−８３４（図１）において起こっていることが決定された。これらの株のゲノミックＤＮＡを用いて得られたＰＣＲ産物は、予想通り、（ｉ）株Ｎ６−８２３については、プライマーＨ２８−Ｈ３４では１４０ｂｐ、Ｈ３５−９Ｂでは２２０ｂｐ、Ｈ２８−９Ｂでは１．２Kbであり、（ii）株Ｎ６−８３４及びＳＳ１−８３４については、プライマーＨ２８−Ｈ５０では１５０ｂｐ、Ｈ１７−１２Ｂでは１８０ｂｐ、Ｈ２８−１２Ｂでは１Kbであった。
【００３４】
ｕｒｅＩの非極性欠失を保持する株Ｎ６−８３４の増殖速度を、親株Ｎ６の速度と比較した。血液寒天培地プレート上で、コロニーサイズの違いは、観察されなかった。０．２％β−シクロデキストリン（Sigma）を含有するＢＨＩ（Ｏｘｏｉｄ）液体培地で増殖させた両方の株において、同一の倍化時間及び定常期ＯＤが測定された。従って、ＵｒｅＩは、in vitroのＨ．ピロリの増殖にとって必須ではない。
【００３５】
Ｈ．ピロリｕｒｅＩ変異体のウレアーゼ活性
クサック（Cussac）ら（９）により以前に記載されたようにして、株Ｎ６−８２３、Ｎ６−８３４、及びＳＳ１−８３４のウレアーゼ活性をインビトロで測定し、親株Ｎ６及びＳＳ１（図１）の活性と比較した。株Ｎ６−８２３においては、ウレアーゼ活性はほぼ完全に消失していた（０．３±０．１ユニット）。非極性ｕｒｅＩ突然変異を有する株Ｎ６−８３４及びＳＳ１−８３４は、野生型の活性レベルを有していた（Ｎ６−８３４及びＳＳ１−８３４：１２±２ユニット；親株Ｎ６：１０±１、ＳＳ１：１２±０．４ユニット）。
【００３６】
Ｎ６親株又はＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４のいずれかから作製されたウレアーゼの最適pHを測定し比較した。両方の株において、ウレアーゼは発表されているデータと一致する８という最適pHを有していた。
【００３７】
これらの結果は、Ｎ６−ｕｒｅＩ：：ＴｎＫｍ−８（１３）のウレアーゼ陰性表現型及びＮ６−８２３株の極めて弱いウレアーゼ活性が、下流遺伝子ｕｒｅＥ及びｕｒｅＦ（図１）の発現に対する、挿入されたカセットの極性効果によるものであったことを強く示唆している。ｕｒｅＥ−Ｆ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ／Ｈ．ピロリのシャトルプラスミドによりトランスで補足された株Ｎ６−８２３のウレアーゼ活性を測定することにより、この仮説を試験した。このプラスミドｐＩＬＬ８４５（図２Ｂ）は、（ｕｒｅＢの３′末、ｕｒｅＩの非極性欠失、並びに完全なｕｒｅＥ遺伝子及びｕｒｅＦ遺伝子を含む）ｐＩＬＬ８３４の２．８KbのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片の、ヒュアマン（Heuermann）及びハース（Haas）（１５）により構築されたシャトルベクターｐＨｅｌ２の対応する部位への挿入により得られた。株Ｎ６−８２３に、スコウロウブリス（Skouloubris）ら（２３）により記載されたようなｐＩＬＬ８４５のＤＮＡ調製物をエレクトロポレーションにより導入し、形質転換体をカナマイシン（２０μg／ml）及びクロラムフェニコール（４μg／ml）上で選択した。ｐＩＬＬ８４５を保有する株Ｎ６−８２３において、野生型ウレアーゼ活性が回収され、株Ｎ６−８２３の極めて低いウレアーゼ活性が補助遺伝子ｕｒｅＥ−Ｆの発現に対する極性効果によるものであることが確認された。クレブシエラ  アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）において、ＵｒｅＥの欠如は、ウレアーゼ活性に対してほとんど効果を有しなかった（４）。対照的に、ＵｒｅＦは、アクセサリータンパク質複合体（ＵｒｅＤＦＧ）の一部として、活性なウレアーゼの産生にとって絶対的に必要である（２１）。従って、類推により、Ｈ．ピロリ極性ｕｒｅＩ変異体の表現型は、ｕｒｅＦ発現の欠如のためであった可能性が高い。
【００３８】
株Ｎ６又は株Ｎ６−８３４により産生されたウレアーゼ構造サブユニット、ＵｒｅＡ及びＵｒｅＢを、各ウレアーゼサブユニットに対する抗血清の混合物を使用したウェスタンブロット技術で比較した。２つの株により産生された各サブユニットの量は同一であることが観察された。株Ｎ６及びＮ６−８３４の細胞分画（膜関連タンパク質及び上清からの可溶性タンパク質の分離）の後、ＵｒｅＩの非存在下でウレアーゼの細胞内局在が影響を受ける可能性を調査した。これらの実験は、野生型株とＵｒｅＩ欠損突然変異体のウレアーゼの細胞内局在に差がないことを明らかにした。これらの結果は、中性pHにおいて、ＵｒｅＩが、ウレアーゼ構造サブユニットの安定化にも、ウレアーゼの特定の細胞区画へのターゲティング過程にも関与していないことを証明している。
【００３９】
マウス動物モデルにおけるＨ．ピロリＳＳ１−８３４変異体のコロニー形成試験
チェバリエ（Chevalier）ら（７）及びフェレロ（Ferrero）ら（１４）によりバリデートされたＨ．ピロリＳＳ１株（シドニー株、１７）感染に関するマウスモデルを使用して、in vivoのＵｒｅＩの機能を試験した。マウスに非極性ｕｒｅＩ突然変異体ＳＳ１−８３４、及び陽性対照としての（同数のインビトロ継代を経た）親株ＳＳ１を感染させた。この実験を３回繰り返し、同一の結果を得た（３０）。２つの独立に構築されたＳＳ１−８３４突然変異体を使用した。第１の変異株は３０回のインビトロ継代を経ていたが、第２の株は２０回のみであった。同一の実験条件下で、株ＳＳ１は、そのコロニー形成能を失うことなく、８０回超のインビトロ継代を経ることができる。
【００４０】
各実験において、ペプトンブロースにおいて調製された１０6個のＨ．ピロリ株ＳＳ１又はＳＳ１−８３４菌を含有する上清（１００μl）を、フェレロ（Ferrero）ら（１４）により記載されたようにして、それぞれ１０匹のマウス（６から８週齢のスイス（Swiss）特定病原体なしのマウス）に経口胃内（orogastrically）投与した。接種の４週間後にマウスを屠殺した。胃の半分に対して実施された生検標本における直接ウレアーゼ試験を用いて、Ｈ．ピロリの存在を試験した（１４）。残りの胃組織は、フェレロ（Ferrero）ら（１４）により記載されたようにして、Ｈ．ピロリの定量的培養のため使用した。各実験において、１０個全てのＳＳ１感染マウスの胃が、ウレアーゼ陽性と判定された。細菌負荷量は、胃１ｇ当たり５×１０4コロニー形成単位（CFU）と５×１０5CFUの間であった。株ＳＳ１−８３４を感染させたマウスの胃で、ウレアーゼ陽性と判定されたものは存在せず、それらからＨ．ピロリ細胞は培養されなかった。従って、ＵｒｅＩタンパク質は、Ｈ．ピロリのin vivoの生存及び／又はマウス胃におけるコロニー形成にとって必須である。
【００４１】
ＵｒｅＩはＨ．ピロリの酸性に対する耐性にとって必須である
株Ｎ６及びＮ６−８３４を用いて、１０mM尿素の存在下又は非存在下における酸性条件における生存を試験した。スコウロウブリス（Skouloubris）ら（３０）に詳述されている実験法は、クライン（Clyne）ら（８）に記載された手法に基づいている。対数増殖期の細菌を収集し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、およそ２×１０8CFU／mlを、１０mM尿素の存在下又は非存在下で、pH２．２又はpH７のＰＢＳに再懸濁させ、３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、（ｉ）細菌の生存を評価するためＨ．ピロリの定量的培養を実施し、（ii）細菌を遠心分離し培地のpHを測定した。得られた結果を、表２に示す。尿素の非存在下では、株Ｎ６及びＮ６−８３４はいずれも同一の表現型を示し、即ち、それらは、培地の最終pHを改変することなくpH２．２では死滅しpH７では生存した（表２）。尿素の存在下、pH７におけるインキュベーションの後は、最終pHがpH９に上昇したために、いずれの株も死滅した。尿素の存在下、pH２．２では、親株は、pHを中性にまで上昇させることができたため、生存率が高かった。対照的に、pHを上昇させることができず、その生存力が重大な影響を受けたＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４では、完全に異なる表現型が得られた（表２）。
【００４２】
ＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４のプラスミドｐＩＬＬ８５０による補足
Ｈ．ピロリの酸性に対する抵抗能におけるＵｒｅＩタンパク質の直接的な関与が、プラスミドｐＩＬＬ８５０（図２Ｂ制限地図及び構築の詳細）によるトランス補足により確認された。このプラスミド〔１９９９年６月２８日に提出されたＣＮＣＭ  Ｉ−２２４５〕は、Ｈ．ピロリ／Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐＨｅｌ２（１５）に由来する。プラスミドｐＩＬＬ８５０は、自己のプロモーターの制御下のｕｒｅＩ遺伝子を保持しており、以下のようにして構築された。プラスミドｐＩＬＬ７５３（９）の１．２KbのＢｃｌＩ制限断片を、ｐＨｅｌ２（図２Ｂ）のＢａｍＨＩ制限部位とＢｃｌＩ制限部位の間に導入した。株Ｎ６及びＮ６−８３４をこのプラスミドで形質転換し、前記の酸性感受性試験実験における補足された株の表現型を調査した。表２に示されたように、ｐＩＬＬ８５０により補足された株Ｎ６−８３４の表現型は、親株Ｎ６の表現型と同一である。興味深いことに、（スコウロウブリス（Skouloubris）ら（３０）に記載のような超音波処理された抽出物において測定された）補足された株のウレアーゼ活性は、ｐＩＬＬ８５０を含まない相当する株の活性と比較してわずかに高いことが見出された。ＣＮＣＭへの寄託の目的のため、ｐＩＬＬ８５０をＥ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１（Wertman KF.et al.,1986,Gene 49:253-262）に置いた。
【００４３】
アンモニウム産生の測定
Ｈ．ピロリ完全細胞の細胞外培地中に産生されたアンモニウムの量を、シグマ（Sigma）より市販されている酵素アッセイにより、供給元の指示に従い測定した。これらの実験は、異なるpH値におけるＰＢＳ中での細胞のインキュベーションの後、及び異なるインキュベーション時間の後に実施した。そのような実験は、異なる株におけるアンモニウムの産生及び分泌の正確な評価、並びにこの反応の動力学の測定を与えた。対照実験は、アンモニウム産生が尿素の非存在下では極めて低い（１０〜２０μM）ことを示した。
【００４４】
図４は、１０mM尿素の存在下で、pH２．２、pH５、又はpH７において、ＰＢＳ中でインキュベートされたＮ６親株（パネルＡ）及びＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４（パネルＢ）から放出された細胞外アンモニウムの動力学（０分、３分、５分、及び３０分のインキュベーション時間）を示している。得られた結果は、（ｉ）アンモニウムが多量に産生され細胞外培地に迅速に放出されること、及び（ii）Ｎ６野生型株（図４、パネルＡ、及び表３）においては、細胞外pHが酸性である場合に、アンモニウム産生が有意に増強されることを示している。この効果は、pH５で既にみられ、pH２．２においてはさらに強い。この最後の観察は、低pHにおけるウレアーゼの活性化を示唆したスコット（Scott）ら（３１）の結果と一致している。本発明者らの実験において、酸性に対する応答が迅速であったことは、ウレアーゼ活性化が、転写制御又はｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成に依存するものであることに異論を唱えるものである。
【００４５】
次いで、ＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４（図４、パネルＢ、及び表３）においてアンモニウム産生を測定した。中性pHにおいては、アンモニウム産生の動力学は野生型の動力学と類似していた。対照的に、pH５においては、アンモニウム産生は野生型株と比較して減少し、遅延した。pH２．２においては、ＵｒｅＩの欠如の劇的な効果が観察され、アンモニウムの量が極めて低かったが、それは、ＵｒｅＩが酸性に対する適合にとって必要であることを示す本発明者らの結果と一致している。
【００４６】
本発明者らの結果は、Ｈ．ピロリの酸性に対する耐性にとってＵｒｅＩが必須であることを証明している。ＵｒｅＩの非存在下においては、ウレアーゼは、大量に存在していても、酸性の攻撃から細菌を防御することができない。これは、in vivoのＵｒｅＩの必須の役割と一致している。酸性の胃内腔を通過する間、ＵｒｅＩ欠損株の生存力は影響を受ける。結果として、細菌の負荷量はコロニー形成が不可能なほどに低くなる。ＵｒｅＩに関して提唱されている異なる役割は、「詳細な説明」の部分に示されている。
【００４７】
ＵｒｅＩタンパク質及びＡｍｉＳタンパク質の配列の整列化並びに２次元構造予測
タンパク質データバンクにおけるＵｒｅＩホモローグの体系的な検索を実施した。ｕｒｅＩ遺伝子を有する尿素分解（ureolytic）細菌が、Ｈ．ピロリのみでないことが決定された。２つの系統発生的に関連したグラム陽性生物、ストレプトコッカス  サリバリウス（Streptococcus salivarius）という歯苔菌（６）及びラクトバチルス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）という乳酸菌（１６）は、ウレアーゼ構造遺伝子の直上流に位置するＵｒｅＩホモローグ（図３）の遺伝子を保持している。ｕｒｅＩ遺伝子は様々なヘリコバクター種において検出されており、Ｈ．フェリスのｕｒｅＩ遺伝子は完全に配列決定されている（図３、及び認可された米国特許出願第０８／４６７，８２２号、この内容は完全に参照として本明細書に組み込まれる）。ＰＣＲ実験は、Ｈ．ヘイルマンニ（２４）及びＨ．ムステレにｕｒｅＩ遺伝子が存在することを示唆した。
【００４８】
Ｈ．ピロリのＵｒｅＩタンパク質と、Ｐ．アエルギノサ（２７）及びロドコッカスｓｐ．Ｒ３１２（５）由来の脂肪族アミダーゼオペロンにより発現されるＡｍｉＳタンパク質との配列類似性が報告されている。ミコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）においては、アミダーゼ遺伝子の直上流に位置する遺伝子ＯＲＦ Ｐ３によりコードされる付加的なＡｍｉＳホモローグが存在する（１８）。
【００４９】
これらのＵｒｅＩ／ＡｍｉＳタンパク質の整列化〔クラスタル（Clustal）Ｗ（１．６０）プログラムを使用〕は、強く保存されたアミノ酸ストレッチ（図３）を決定した。これらの保存されたブロックのうち１つを除く全てが、高度に疎水性のセグメントに存在した。それぞれ１７から２２残基長のこれらの領域は、おそらく膜貫通型α−ヘリックスに折り畳まれる（図３）。Ｈ．ピロリ、Ｈ．フェリス、及びＰ．アエルギノサ由来のタンパク質については６個の膜貫通領域が予測され、ロドコッカスｓｐ．Ｒ３１２及びＭ．スメグマチス由来のタンパク質については７個が予測された（ロスト（Rost）ら（２２）に記載のようなプルフィール・フェッド・ニューラル・ネットワーク・システム（profile fed neural network system）、ｐＨＤを用いて実施された信頼性の高い予測）。膜におけるＵｒｅＩ／ＡｍｉＳタンパク質の方向は、これらのタンパク質において短い挿入された親水性領域の電荷から推定された（図３）。最初の５個のそのような領域は保存性が低く、様々な長さを有していた。これらのタンパク質に共通の最後のヘリックス間セグメントは、他よりも有意に保存性が高かった。細胞内であると予測されるこの領域は、ＵｒｅＩの活性部位、又は多量体化もしくは細胞内パートナーとの相互作用の部位であり得る。これらの結果は、グラム陽性菌及び陰性菌の両方に見出されるＵｒｅＩ／ＡｍｉＳファミリーのメンバーが、膜内在性タンパク質であることを強く示唆している。これらのタンパク質は、シグナル配列を有しておらず、従ってグラム陰性菌の細胞膜に挿入されるべきである。
【００５０】
ＵｒｅＩ配列から選択された２つのペプチドを合成し、ＵｒｅＩに対するポリクローナル抗体を含有する血清を得るため、２匹のウサギに注射した。１つのペプチドは、ＵｒｅＩの第一に予測された細胞内ループ（残基ｎＢ１５から３１まで、図３を参照のこと）に相当し、第二のペプチドはＵｒｅＩの第二に予測された細胞内ループ（残基ｎＢ１１８から１３４まで、図３を参照のこと）に相当した。これらの血清は、現在試験中であり、もしＵｒｅＩタンパク質を認識することが判明すれば、このタンパク質の局在を正確に決定し、図３に示された予測されたＵｒｅＩ２次元構造を確認することを可能にするであろう。
【００５１】
本明細書に引用された参照は、完全に参照として特別に組み込まれる。
【００５２】
【表２】
0004445128.tif 000003
【００５３】
【表３】
0004445128.tif 000004
【００５４】
参考文献
1. Akada, J. K., M. Shirai, H. Takeuchi, M. Tsuda, and T. Nakazawa. 1997. Transcriptional analysis of urease structural gene and the urel gene in Helicobacter pylori. Gut. 41:A9.
2. Allaoui, A., Schulte, R. and G. R. Cornelis. 1995. Mutational analysis of the Yersinia enterocolitica virC operon: characterization of yscE,F,G,H,I,J,K required for Yop secretion and ysch encoding YopR. Mol. Microbiol. 18:343-355.
3. Bauerfeind, P., R. M. Garner, and H. L. T. Mobley. 1996. Allelic exchange mutagenesis of nixA in Helicobacter pylori results in reduced nickel transport and urease activity. Infect. Immun. 64;2877-2880.
4. Brayman, T. G., and R. T. Hausinger. 1996. Purification, characterization, and functional analysis of a truncated Klebsiella aerogenes UreE urease accessory protein lacking the Histidine-Rich carboxyl terminus. J. Bacteriol. 178:5410-5416.
5. Chebrou, H., F. Bigey, A. Arnaud, and P. Galzy. 1996. Amide metabolism: a putative ABC transporter in Rhodococcus sp. R312. Gene. 182:215-218.
6. Chen, Y.-Y. M., K. A. Clancy, and R. A. Burne. 1996. Streptococcus salivarius urease: genetic and biochemical characterization and expression in a dental plaque Streptococcus. Infect. Immun. 64:585-592.
7. Chevalier, C., J.-M. Thiberge, R. L. Ferrero, and A. Labigne. 1999.  Essential role of Helicobacter pylori g-Glutamyltranspeptidase (GGT) for the colonization of the gastric mucosa in mice.  Mol. Microbiol. 31:1359-1372.
8. Clyne, M., A. Labigne, and B. Drumm. 1995.  Helicobacter pylori requires and acidic environment to survive in the presence of urea.  Infect. Immun. 63:1669-1673.
9. Cussac, V., R. L. Ferrero, and A. Labigne. 1992.  Expression of Helicobacter pylori urease genes in Escherichia coli grown under nitrogen-limiting conditions.  J. Bacteriol. 174:2466-2473.
10. Dunn, B. E., H. Cohen, and M. Blaster. 1997.  Helicobacter pylori. Clin. Microbiol. Rev. 10:720-741.
11. Eaton, K. A., and S. Krakowka. 1994.  Effect of gastric pH on urease-dependent colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori. Infect. Immun. 62:3604-3607.
12. Ferrero, R. L., V. Cussac, P. Courcoux, and A. Labigne. 1992.  Construction of isogenic urease-negative mutants of Helicobacter pylori by allelic exchange. J. Bacteriol. 174:4212-4217.
13. Ferrero, R., L., V. Cussac, P. Courcoux, and A. Labigne. 1994.  Construction of isogenic mutants of Helicobacter pylori deficient in urease activity. pp179-182. In Basic and Clinical Aspects of H. pylori infection. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
14. Ferrero, R. L., J.-M. Thiberge, M. Huerre, and A. Labigne. 1998.  Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infect. Immun. 66:1349-1355.
15. Heuermann, d., and R. Haas. 1998.  A stable shuttle vector system for efficient genetic complementation of Helicobacter pylori strains by complementation and conjugation. Mol. Gen. Genet. 257:519-528.
16. Kakimoto, S., Y. Sumino, K. Kawahara, E. Yamazaki, and I. Nakatsui. 1990.  Purification and characterization of acid urease from Lactobacillus fermentum. Appl. Microbiol. & Biotechnol. 32:538-543.
17. Lee, A., J. O'Rourke, M. Corazon De Ungria, B. Robertson, G. Daskalopoulos, and M. F. Dixon. 1997.  A standardized model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney Strain.  Gastroenterology.  112:1386-1397.
18. Mahenthiralingam, E., P. Draper, E. O. Davis, and M. J. Colston. 1993.  Cloning and sequencing of the gene which encodes the highly inducible acetamidase of Mycobacterium smegmatis. J. Gen. Microbiol. 139:575-583.
19. Menard, R., P. J. Sansonetti, and C. Parsot. 1993.  Nonpolar mutagenesis of the ipa genes defines IpaB, IpaC, and IpaD as effectors of Shigella flexneri entry into epithelial cells. J. Bacteriol. 175:5899-5906.
20. Mobley, H. L. T., M. D. Island, and R. P. Hausinger. 1995.  Molecular biology of ureases.  Microbiol. Rev. 59:451-480.
21. Moncrief, M. B. C., and R. P. Hausinger. 1997.  Characterization of UreG, identification of a UreD-UreF-UreG complex, and evidence suggesting that a nucleotide-binding site in UreG is required for in vivo metallocenter assembly of Klebsiella aerogenes urease. J. Bacteriol. 179:4081-4086.
22. Rost, B., R. Casadio, P. Fariselli, and C. Sander. 1995.  Prediction of helical transmembrane segments at 95% accurancy. Prot. Science. 4:521-533.
23. Skouloubris, S., A. Labigne, and H. De Reuse. 1997.  Identification and characterization of an aliphatic amidase in Helicobacter pylori. Mol. Microbiol. 25:989-998.
24. Solnick, J. V., J. O'Rourker, A. Lee, and L. S. Tompkins. 1994.  Molecular analysis of urease genes from a newly identified uncultured species of Helicobacter. Infect. Immun. 62:1631-1638.
25. Trieu-Cuot. P., G. Gerbaud, T. Lambert, and P. Courvalin. 1985.  In vivo transfer of genetic information between Gram-positived and Gram-negative bacteria.  EMBO J. 4:3583-3587.
26. Williams, C. L., T. Preston, M. Hossack, C. Slater, and K. E. L. McColl. 1996. Helicobacter pylori utilizes urea for amino acid synthesis.  FEMS Immunol. Med. Microbiol. 13:87-94.
27. Wilson, S. A., R. J. Williams, L. H. Pearl, and R. E. Drew. 1995.  Identification of two new genes in the Pseudomonas aeruginosa amidase operon, encoding and ATPase (AmiB) and a putative integral membrane protein (AmiS). J. Biol. Chem. 270:18818-18824.
28. Mendz, G. L. and S. L. Mazell. 1996.  The Urea Cycle of helicobacter pylori. Microbiology 142:2959-2967.
29. Nicholson, E. B., E. A. Concaugh and H. L. T. Mobley. 1991.  Proteus mirabilis urease: use of ureA-lacZ fusion demonstrates that induction is highly specific for urea.  Infection and Immunity. 59(10):3360-3365.
30. Skouloubris, S., J.-M. Thiberge, A. Labigne and H. De Reuse (1998) The Helicobacter pylori UreI protein is not involved in urease activity but is essential for bacterial survival in vivo.  Infect. Immun. 66:4517-4521.
31. Scott, D. R., Weeks, C. Hong, S. Postius, K. Melchers and G. Sachs (1998)  The role of internal urease in acid resistance of Helicobacter pylori. Gastroenterology. 114:58-70.
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｈ．ピロリ親株Ｎ６及びＳＳ１、並びにＵｒｅＩを欠損した誘導された突然変異体株Ｎ６−８２３、Ｎ６−８３４、及びＳＳ１−８３４のウレアーゼ遺伝子クラスターを示す図である。遺伝子は、転写方向を示す矢印を含むボックスにより示されている。ｕｒｅ遺伝子間の距離は塩基対、ｂｐで与えられている。株Ｎ６−８２３、Ｎ６−８３４、及びＳＳ１−８３４における正確な対立遺伝子交換を確認するために使用されたプライマーにハイブリダイズする部位が示されている。空白のボックスは、Ｃｍ（ｃａｔ）又はＫｍ（ａｐｈＡ−３）に対する耐性を与える遺伝子を含有するカセットを表す。これらの株のウレアーゼ活性は、図の右側に与えられている。ウレアーゼ活性は、以前に記載されたようにして（９）血液寒天プレート上で４８時間増殖させた細菌の粗抽出物におけるアンモニアの放出として測定された。１ユニットは、１分当たり全タンパク質１mg当たりの１μmolの尿素を加水分解するために必要な酵素の量に相当する。データは、３から５回の決定から計算された平均±標準偏差である。
【図２Ａ１】  ｐＩＬＬ８２３、ｐＩＬＬ８２４、ｐＩＬＬ８３３、及びｐＩＬＬ８３４の制限地図を示す図である。小さいボックスは各プラスミドのベクターを示し、大きなボックスは遺伝子に相当する。Ｏｒｉは、ＣｏｌＥ１複製開始点の位置を示す。ＳｐR及びＡｐRは、それぞれスペクチノマイシン及びアンピシリンに対する耐性を与える遺伝子である。ｕｒｅＩに挿入され、クロラムフェニコール（ｃａｔ）又はカナマイシン（ａｐｈＡ−３）に対する耐性を与えるカセットも、示されている。アダプターＨ１９が挿入されたＢｃｌＩ部位を含む、ｕｒｅＩ終止コドン及びｕｒｅＥ開始コドンを含むＤＮＡ領域の配列が与えられている。ｐＩＬＬ８２４のＢｃｌＩ部位へのＨ１９の挿入により、ｐＩＬＬ８２５が作製され、得られたｕｒｅＩ−ｕｒｅＥ遺伝子間領域も示されている。ｕｒｅＩの終止コドン及びｕｒｅＥの開始コドンはボックスで示され、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は下線で示されている。括弧は、ライゲーションにより除去された制限部位の位置を示す。
【図２Ａ２】  ｐＩＬＬ８２３、ｐＩＬＬ８２４、ｐＩＬＬ８３３、及びｐＩＬＬ８３４の制限地図を示す図である。
【図２Ｂ】  ２つのＨ．ピロリ／Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクター、ｐＩＬＬ８４５及びｐＩＬＬ８５０の制限地図を示す図である。小さいボックスは各プラスミドのベクターを示し、大きなボックスは遺伝子に相当する。Ｏｒｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣｏｌＥ１複製開始点の位置を示し、ｒｅｐＡはＨ．ピロリのｐＨｅｌ２の自律複製に必要なＲｅｐＡタンパク質をコードする遺伝子を示す。ＣｍRは、クロラムフェニコールに対する耐性を与える遺伝子である。ｕｒｅＩプロモーターは、転写方向を示す矢印を含む「Ｐ」により示されている。その他の記号は図１と同様である。
【図３Ａ】  Ｈ．ピロリ由来のＵｒｅＩのアミノ酸配列と、類似タンパク質の配列との整列化、及びＵｒｅＩ／ＡｍｉＳタンパク質ファミリーのメンバーの２次元構造の予測を示す図である。少なくとも４つの配列の１つの位置で同一である残基はボックスで示されており、点線は整列化を最適化するために挿入されたギャップを示す。配列の起源生物及びＨ．ピロリＵｒｅＩタンパク質との同一性の程度は、ＵｒｅＩ−Ｈｐ、ヘリコバクター  ピロリ（１９５残基、accession No. M84338）；ＵｒｅＩ−Ｈｆ、ヘリコバクター  フェリス（１９６残基で７４％同一、accession No. A41012）、ＵｒｅＩ−Ｌａｃｔｏ、ラクトバチルス  ファーメンタム（４６残基長の部分配列で５５％同一、accession No. D10605）；ＵｒｅＩ−Ｓｔｒｅｐｔｏ、ストレプトコッカス・サリバリウス（１２９残基長の部分配列で５４％同一、受託番号Ｕ３５２４８）；ＡｍｉＳ−Ｍｙｃｏ、ミコバクテリウム  スメグマチス（１７２残基で３９％同一、accession No. X57175）；ＡｍｉＳ−Ｒｈｏｄ、ロドコッカスｓｐ．Ｒ３１２（１７２残基で３７％同一、accession No. Z46523）；及びＡｍｉＳ−Ｐｓｅｕｄｏ、シュードモナス・アエルギノサ（１７１残基で３７％同一、accession No. X77161）である。予測される膜貫通α−ヘリックスは影付きのボックスとして示されている。これらのボックスを隔離している領域は、細胞内であると予測される場合には「内」、細胞外であると予測される場合には「外」と記された親水性ループである。
【図３Ｂ】  Ｈ．ピロリ由来のＵｒｅＩのアミノ酸配列と、類似タンパク質の配列との整列化、及びＵｒｅＩ／ＡｍｉＳタンパク質ファミリーのメンバーの２次元構造の予測を示す図である。
【図４Ａ】  Ｎ６親株（パネルＡ）及びＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４（パネルＢ）からのアンモニウム放出の動力学を示す図である。細菌（２×１０8／ml）を収集し、（スコウロウブリス（Skouloubris）ら（３０）に記載のようにして）洗浄し、１０mM尿素の存在下でpH７、５、又は２．２でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。０分、３分、５分、及び３０分後、０．５mlを採取し、細菌を排除するため遠心分離した。シグマ（Sigma）より市販されているアッセイ（キットリファレンス＃１７１）を使用してアンモニウム濃度を測定するまで、上清を氷上に維持した。
【図４Ｂ】  Ｎ６親株（パネルＡ）及びＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４（パネルＢ）からのアンモニウム放出の動力学を示す図である。
【図４Ｃ】  Ｎ６親株（パネルＡ）及びＵｒｅＩ欠損株Ｎ６−８３４（パネルＢ）からのアンモニウム放出の動力学を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ１】
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【図２Ａ２】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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