(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の検出のための方法であり、サンプル由来のテンプレート核酸を
（ｉ）蛍光シグナリング系および
（ii）テンプレート結合領域ならびに、リンカー、標的結合領域およびブロッキング部分を含むテールを有するテール含有核酸プライマー
と、好適なヌクレオシド３リン酸およびそのポリメリゼーションのための試薬の存在下、プライマーのテンプレート結合領域がテンプレート核酸中の相補的配列にハイブリダイズし、伸長してプライマー伸長産物を生成するような条件下で接触させ、それらの産物をテンプレートから分離することを含み、ここでプライマーのテール中の標的結合領域は標的核酸に対応するプライマー伸長産物中の配列にハイブリダイズし、それらの標的特異的ハイブリダイゼーションによってシグナリング系の蛍光に検出可能な変化が誘引され、それによってサンプル中の標的核酸の存在または非存在が、シグナリング系の蛍光における検出可能な変化の存在または非存在を参照して検出され、
かつ、テール含有核酸プライマーを増幅系において増幅プライマーとして使用し、また核酸プライマーのテールが増幅の際にブロッキング部分によってコピーされないままである、上記方法。
【請求項２】
増幅系がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマー・テールが挿入色素を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プライマー・テールが蛍光分極による標的結合の検出のための蛍光体を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
蛍光シグナリング系が蛍光体および消光体種間のエネルギー伝達を含む、請求項１、２および４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
テール含有プライマーのテンプレート核酸へのハイブリダイゼーションが、関連するテンプレート配列上でプライマーが伸長できるようなストリンジェンシーで行われる、上記請求項のいずれか１つに記載される方法。
【請求項７】
関連するテンプレート配列がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）配列である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
プライマーのテンプレート結合領域および／または標的結合領域の相補的配列へのハイブリダイゼーションが対立遺伝子特異的である、上記請求項のいずれか１つに記載される方法。
【請求項９】
請求項１-８のいずれか１つに従った方法での使用のための診断プライマーであり、
（ｉ）テンプレート結合領域および
（ii）標的結合領域およびブロッキング部分を含むテール
を含有し、ここで標的結合領域は標的核酸に対応するプライマーの伸長産物中の相補的配列にハイブリダイズし、そして相補的配列がテンプレート結合領域から２００塩基対未満であり、またプライマーのプライマー伸長産物中の相補的配列への標的結合領域のハイブリダイゼーションを示すために組み込み型の蛍光シグナリング系の成分を少なくとも１つ更に含有し、そして増幅の際にブロッキング部分がテール領域のコピーを防止する、上記プライマー。
【請求項１０】
請求項１-８のいずれか１つに従った方法での使用のための診断プライマーであり、
（ｉ）テンプレート結合領域および
（ii）リンカー、標的結合領域およびブロッキング部分を含むテール
を含有し、ここで標的結合領域は標的核酸に対応するプライマーの伸長産物中の相補的配列にハイブリダイズし、またプライマーのプライマー伸長産物中の相補的配列への標的結合領域のハイブリダイゼーションを示すために組み込み型の蛍光シグナリング系の成分を少なくとも１つ更に含有し、そして増幅の際にブロッキング部分がテール領域のコピーを防止する、上記プライマー。
【請求項１１】
プライマー・テールが挿入色素を有する、請求項９または１０記載のプライマー。
【請求項１２】
プライマー・テールが蛍光分極による標的結合の検出のための蛍光体を含有する、請求項９または１０記載のプライマー。
【請求項１３】
請求項９-１２のいずれか１つに記載のプライマーであり、遊離可能な状態でプライマー・テールに結合した組み込み型のシグナリング系の成分を少なくとも１つ含有する別の種を更に有する、上記プライマー。
【請求項１４】
シグナリング系が蛍光体および消光体種間のエネルギー伝達を含む、請求項１３記載のプライマー。
【請求項１５】
プライマー・テールが消光体種として作用する、請求項１１-１４のいずれか１つに記載のプライマー。
【請求項１６】
プライマー・テールが１つ以上の内部ハイブリダイゼーション領域を含有して所定の位置におけるシグナリング系の１つ以上の成分を安定化する、請求項９または１０記載のプライマー。
【請求項１７】
プライマー・テールが消光体種によって消光された蛍光体を有する自己相補的ステム２本鎖を含有し、ここでステム２本鎖の分離の際に蛍光体が非消光状態となる、請求項１６記載のプライマー。
【請求項１８】
固相上の相補的配列にハイブリダイズする捕捉領域を更に含有する、請求項９-１７のいずれか１つに記載されるプライマー。
【請求項１９】
請求項１-８のいずれか１つに記載される方法であり、１つより多い核酸プライマーを１つより多い標的核酸配列の検出のために使用する、上記方法。
【請求項２０】
パッケージおよび使用のための説明書と共に請求項９-１８のいずれか１つに記載されるプライマーを少なくとも１つ含有するキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規のプライマーおよび組み込まれたシグナリング系を含む新規の検出系に関する。系を標的核酸配列の検出に使用する。
【０００２】
標的核酸配列の増幅および検出に使用できる方法にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用があり、例えば米国特許第4683195号および4683202号に記載されている。
【０００３】
上記の増幅および検出方法における著しい進歩は増幅不応性変異系（Amplification Refractory Mutation System, ＡＲＭＳ）であり、これはヨーロッパ特許第0 332 435号（Zeneca社）および相当する米国特許第5595890号に請求されている。
【０００４】
便宜的なプローブに基づく検出系にはタックマン（Taqman）（米国特許第5210015号および5487972号に開示）および分子ビーコン（Molecular Beacons）（国際特許公開第95/13399号に開示）がある。タックマンでは蛍光体／消光体種を含むプローブ分子をＰＣＲ増幅産物にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼの５’-３’エキソヌクレアーゼ活性によって消化する。これによって消光されていない蛍光体および付随する検出可能なシグナルが放出される。分子ビーコンでは、蛍光体および消光体種を接近させておくステム-ループ構造を有するプローブ分子がその相補的標的への結合と同時に開き、蛍光体が非消光状態となって検出可能なシグナルを生成する。
【０００５】
Nazarenkoら（NAR 1997, 25, 2516-2521）はいわゆる“サンライズ（Sunrise）”プライマーを開示した。これらは、５’末端でヘアピンループを形成して蛍光体および消光体対を接近させ、それによって蛍光を低くするプライマーである。これらのプライマーをＰＣＲ産物に導入すると、テールは２本鎖となり、ヘアピンが解離することによって蛍光が増加する。しかしながら、シグナル生成は増幅子（amplicon）依存的ではなく、いずれの２本鎖増幅子（プライマー２量体を含む）でもサンライズ・プライマーを導入するので、偽性のシグナルを生成してしまう。
【０００６】
米国特許第5573906号（Bannwarthら）は、増幅または伸長過程において自己相補的配列を含む５’標識したプライマーを使用する過程を、増幅または伸長された領域のための３’標識したプローブを使用するそれに続く検出段階と共に記載している。標識は、増幅または伸長産物に取り込まれたプライマーの自己相補的領域の折りたたみ（backfolding）に起因する２本鎖ＤＮＡの短部分に近接するプローブをハイブリダイズさせた後、空間的に接近してもよい。
【０００７】
しかしながら、上記の増幅および検出方法を使用して得られる配列特異性および検出感度のレベル、並びにシグナル発生の速度は限定されている。従って更に改善された診断方法が未だ必要とされている。
【０００８】
出願人はテール含有プライマーおよび組み込み型のシグナリング系を使用する新規の検出系を発明した。プライマーはテンプレート結合領域と、リンカーおよび標的結合領域を含有するテールを有する。使用には、テール中の標的結合領域がプライマーの伸長産物中の相補的配列にハイブリダイズする。この標的特異的ハイブリダイゼーション事象はシグナリング系に連結するが、ここでハイブリダイゼーションは検出可能な変化をもたらす。
【０００９】
従って、本発明の第一の観点では標的核酸の検出のための方法を提供するが、この方法はサンプル由来のテンプレート核酸を（ｉ）シグナリング系および（ii）テンプレート結合領域およびテール（リンカーおよび標的結合領域を含む）を有するテール含有（tailed）核酸プライマーと、好適なヌクレオシド３リン酸およびそのポリメリゼーションのための試薬の存在下、プライマーのテンプレート結合領域がテンプレート核酸中の相補的配列にハイブリダイズし、伸長してプライマー伸長産物を生成するような条件下で接触させ、それらの産物をテンプレートから分離することを含み、ここでプライマーのテール中の標的結合領域は標的核酸に対応するプライマー伸長産物中の配列にハイブリダイズし、それらの標的特異的ハイブリダイゼーションによってシグナリング系に検出可能な変化が誘引され、それによってサンプル中の標的核酸の存在または非存在が、シグナリング系における検出可能な変化の存在または非存在を参照して検出される。
【００１０】
本発明の検出方法には多くの重要な利点がある。これらには以下がある。単一のプライマー／検出器種しか必要としない。これは簡単であることを意味し、プライマー伸長産物とのハイブリダイゼーションのために標的結合領域を直ぐに利用できること（ready availability）に基づく向上した特異性が提供される。新たに合成されたプライマー伸長産物が標的種であるため、得られる出力シグナルは伸長されたプライマーの量に直接関係する。これは更なるハイブリダイゼーション事象または酵素的段階（タックマン開裂のような）に依存しない。プローブ部位をめぐる鎖内および鎖間競合は限定されているため、プローブの設計は簡素化される。出願人は、別のプローブ方式において標準的なアッセイ条件下で結合できなかったプローブが、本発明では良好に作用することを発見した。また、本発明により同種の（homogeneous）アッセイ方式の容易な発明が可能になる。更なる利点は、相互作用が単分子なのでシグナリング反応が非常に迅速でサイクリング速度が向上されることである。これはアッセイの設計のために重要な特徴である。
【００１１】
Wiltonら（Human Mutation, 1998, 11, 252-258）はスナップバック１本鎖コンフォメーション多型性（Snapback Single Strand Conformation Polymorphism, ＳＳＣＰ）と呼ばれる分析方法を開示している。これはテール含有プライマーを使用して増幅子の１本鎖に２次構造を導入することを含む。プライマーは標準的な３’末端および短いテールを有する５’末端から成る。これらのテールはプライマーからある程度離れた増幅子の内部領域に相補的であり、加熱および冷却後に生成する１本鎖のコンフォメーションをプロービングするのに使用できる。プローブ相補的部位での変異によって導入されたコンフォメーションの変化は、銀染色したポリアクリルアミドゲル上の移動度の変化で検出する。しかしながら本発明の特徴または利点は予測できない。
【００１２】
本発明の検出方法では、プライマーの伸長は１回以上、例えば５回まで、１０回まで、１５回まで、２０回まで、３０回まで、４０回まで、５０回まで、またはそれ以上反復してもよい。便宜的に、本発明の新規のプライマーを増幅系（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））における増幅プライマーとして使用する。そのような場合、標的結合領域およびテール領域を好適に調整し、テール領域を１本鎖のまま（すなわちコピーされない）とする。従ってテール領域はＰＣＲ増幅産物中で増幅されない。プライマー設計のこのような面はヨーロッパ特許第0 416 817号（Zeneca社）および相当する米国特許第5525494号に請求されている。便宜的にリンカーはブロッキング部分を含有し、これはプライマー・テンプレート上のポリメラーゼが介在する鎖の伸長を阻止する。好ましいブロッキング部分はヘキサエチレングリコール（hexethylene glycol）（ＨＥＧ）単量体である。あるいは、プライマー・テールは２-Ｏ-アルキルＲＮＡのようなポリメラーゼが介在する相補鎖の複製をさせないような物質を含有する。あるいはまた、テールはプライマーの５’末端に５’-３’の向きの核酸を含む。すなわち２つの配列は“背中合わせに”配置され、認識されるように、この態様ではテールの５’-３’核酸はリンカーおよび標的結合領域の両方として機能する。別の異なるリンカー部分は必須ではない。
【００１３】
プライマーのテンプレート結合領域はサンプル由来のテンプレート核酸にハイブリダイズする。領域は通常の技術者に可能な好適な設計のいずれかであり、実用上考慮すべき事項によってのみ制限される。これはポリメラーゼ介在型のプライマー伸長のための基質を提供するものであれば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のものでもよい。テンプレートの結合はいずれの所望のストリンジェンシーでも、すなわちプライマーのテンプレート結合領域が（テンプレート中に存在する場合は）テンプレート領域に他の領域を除外してハイブリダイズしうるような好適なハイブリダイゼーション・ストリンジェンシー条件下で行うことができる。あるいは、テンプレートの結合を低減したストリンジェンシーで行い、好適な数の関連するテンプレート配列、例えばヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、または他の保存された遺伝子、特に細菌もしくはリボソームＲＮＡ遺伝子上でプライマーを伸長させてもよい。テンプレート結合領域が一連の無作為な６量体配列のメンバーであるようなプライマーを提供してもよい。従って“相補的配列”という表現は、テンプレート結合領域およびハイブリダイゼーション条件によって所望の程度の配列の識別ができることを条件に、上に概略した配列全てを含むことを意図する。例としてテンプレート結合領域は１００％、９５％まで、９０％まで、８５％まで、８０％まで、７５％まで、または７０％までの対応するテンプレート配列に対する相補性を有してもよい。テンプレート結合領域は便宜的に６-５０ヌクレオチド、例えば１０-４０ヌクレオチド、１５-３０ヌクレオチド、特に２０-３０、１７-２２、１６-２３、または１５-２４ヌクレオチドである。上記の範囲のそれぞれは本発明の異なる独立した態様である。上記の全てはプライマーの標的結合領域にも同様に当てはまるが、これは標的結合領域が一般にテンプレート結合領域より（that）短いことを条件とし、便宜的かつ好適な範囲の例は以下に記載する。認識されるように、本発明の方法の総体的な選択性は、対立遺伝子特異的または複数の対立遺伝子の様式でテンプレート結合または標的結合領域のために独立して適合されうる。各変更（permutation)は本発明の特定の観点である。
【００１４】
上に概説するように、標的結合領域は必要によりコピー不能な種、例えば２’-Ｏ-メチルＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびこれらの変種を含んでもよい。この場合、別個の同定可能なリンカーは不要であり、標的結合領域はテンプレート結合および標的結合領域を分離するリンカーを含有するものと考慮される。標的結合領域は増幅子（増幅産物）へのハイブリダイゼーションのために伝統的に設計したものより短くてもよく、これは本発明の増幅子-標的相互作用が単分子のものであり、速度論的（および熱力学的に）に２分子相互作用より好ましいためである。非制限的な例として、標的結合領域は６以下、例えば７以下、８以下、９以下、または１０以下のヌクレオチドを含んでもよい。
【００１５】
理解されるように、プライマー・テールはプライマー内のテンプレート結合領域の一部に相補的な更なるヌクレオチドを含んでもよい。これらを使用して相補的配列に対するプライマーのテールの親和性を精密に調整してもよい。
【００１６】
リンカーはテンプレート結合および標的結合領域を分離する。リンカーの最適な特性は慣例的な実験で決定してもよい。理論上の考察に拘束されることは望まないが、リンカーは２００ヌクレオチド以下かそれ未満、例えば１００または５０ヌクレオチドを含んでもよい。一般にこれらの領域は互いに近接しており、出願人はこれが標的結合領域の標的領域へのハイブリダイゼーションに好ましいと考える。好ましい観点ではリンカーは増幅不能な部分（例えばＨＥＧ）を単独または更なるヌクレオチドと組み合わせて含有し、より好ましくは単独で含有する。プライマーのテンプレート結合領域およびテール領域を調整してプライマー・テールのポリメラーゼ介在型コピーを阻止する場合、リンカーは直接結合させてもよい。
【００１７】
本発明の更なる観点では、出願人は核酸プライマーを提供するが、これは（ｉ）テンプレート結合領域および（ii）リンカーおよび標的結合領域を含むテールを含有し、これによって使用の際に標的結合領域が標的核酸に対応するプライマーの伸長産物中の相補的配列にハイブリダイズする。好ましくはテンプレート結合領域およびテール領域を調整して、テール領域がＰＣＲ増幅産物中で１本鎖のままであるようにする。より好ましくは、ブロッキング部分がプライマーのテンプレート結合領域とテール領域の間に位置し、この部分はプライマー・テンプレートのテール領域のポリメラーゼ介在型コピーを阻止する。特定のブロッキング部分はヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）単量体である。好ましくは標的結合領域をプライマー伸長産物中の相補的標的配列にハイブリダイズするように選択し、プライマー中のテンプレート結合領域に相補的な配列から２００未満、例えば１００塩基対未満、例えば５０塩基対未満、例えば４０塩基対未満、３０塩基対未満、２５もしくは２０塩基対未満、例えば１５、１０、もしくは５塩基対未満である。
【００１８】
プライマーのテール中の標的結合領域が標的核酸に対応するプライマー伸長産物中の相補的配列へハイブリダイズすることにより、シグナリング系において検出可能な変化が誘引される。便宜的なシグナリング系のいずれを使用してもよく、非制限的な例として、出願人が挙げるのは蛍光標識種の蛍光分極（fluorescence polarisation）における変化の測定（ヨーロッパ特許第0 382 433, Zeneca社）、ＤＮＡ結合タンパク質、終点の検出のための２本鎖種における制限部位の生成、要素を接近させて標的部位を得ること、検出可能な（修飾型）ｄＮＴＰのプライマー伸長産物への取り込み、および更なるプローブ種である。更に、便宜的な配列特異的種のいずれを使用してもよく、例として波長特異的挿入物のような挿入物、また３本鎖構造を生成するのに使用される種がある。便宜的な挿入物は当業者に明白である（Higuchiら, Bio Technology, 1992, 10, 413-417参照）。
【００１９】
更なる系には２成分系があり、ここでは２つの成分が互いに接近するとシグナルが生成または廃絶される。あるいは標的結合領域の結合に次いで２つの成分が分離されるとシグナルが生成または廃絶される。
【００２０】
２成分系の両要素は同一または異なる分子上で提供されてもよい。例として要素は異なる分子上に配置され、標的特異的結合によって分子の１つが溶液中に排出され、検出可能なシグナルを生成する。
【００２１】
便宜的な２成分系は、例えば蛍光体および消光体間の、エネルギー伝達の使用に基づくものでもよい。本発明の特定の観点では、検出系は蛍光体／消光体対を含有する。エネルギー伝達パートナーの便宜的かつ好適な結合位置は慣例的な実験で決定してもよい。多くの便宜的な蛍光体／消光体対が、文献（例えばGlazerら, Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8, 94-102）およびカタログ（例えばMolecular Probes, Glen and Applied Biosystems (ABI)からのもの）に詳しく記載されている。使用できる装置で検出しうるものであれば、いずれの蛍光分子もシグナリングに好適である。最も好ましいのはABI PRISM 7700の４８８ｎｍレーザーと適合するものである（フルオレセインおよびローダミン誘導体）。消光体は問題の色素を消光できるものでなければならず、これは第２のレセプター蛍光体を含む蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）機構を介したものであってもよく、より好ましくはＤＡＢＣＹＬのような非蛍光産生（non-fluorogenic）消光体を含む衝突機構を介したもので、これは蛍光の“ユニバーサルな”消光体である。更に好ましくは、選択した蛍光体および消光体を、最も便宜的にはホスホルアミダイト化学によって、オリゴヌクレオチドに容易に導入する。便宜的なドナーにはＦＡＭ、ＨＥＸ、およびＴＥＴがある。
【００２２】
驚くべきことに、出願人は特定の消光体を含有させずにテールのみで蛍光を十分消光できることを発見した。標的結合領域がプライマー伸長産物中の相補的配列にハイブリダイズすると、明らかな蛍光シグナルが観察される。蛍光体の最適な結合位置は慣例的な実験によって決定してもよい。本発明の更なる観点では、シグナリング系はプライマーのテール領域に、便宜的にはプライマーの５’-末端またはその近傍で、結合する蛍光体を含有する。理論上の考察に拘束されることは望まないが、少なくとも５塩基対、例えば少なくとも１０または少なくとも１５、例えば少なくとも２０塩基対のＧ-リッチな配列を消光体種として使用してもよい。
【００２３】
更なる特定の態様では、プライマー・テールは挿入色素(intercalating dye)を含有し、標的結合領域のハイブリダイゼーションによって色素が２本鎖ＤＮＡの塩基間に取り込まれ、それによって蛍光が生ずる。色素は好ましくは挿入されていない時はわずかな蛍光を有し、挿入に際して強度の蛍光増加を有するものである。ここでも、好ましい分子は固相化学または単純な合成後添加によってオリゴヌクレオチドに容易に結合される。
【００２４】
認識されるように、プライマー・テールの全長は主にその個々の成分の意図する機能によって決定される。一般に、プライマー・テールは少なくとも１０塩基対、例えば少なくとも、２０、３０、４０、または５０塩基対、例えば１０-３０または１５-２５塩基対である。
【００２５】
好ましくは全ての色素、消光体、リンカー／ブロッカーは、複数回の高温への暴露を含むＰＣＲの反復ラウンドに耐性があるものである。
本発明の好ましい観点では、シグナリング系および核酸プライマーの少なくとも１成分は組み込み型の（integral）種である。
【００２６】
テンプレート核酸は分析に好適な核酸のいずれかである。最も一般的には、これはＰＣＲのような増幅反応由来のＤＮＡである。このＤＮＡ標的は逆転写（ＲＴ）反応から誘導されたものでもよい。実際、本発明のプライマーをＲＴ反応そのものに使用してもよく、また更なる増幅をせずに直接使用してもよい。他のin vitroにおける増幅技術、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＯＬＡ、ＮＡＳＢＡ、および鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification）（ＳＤＡ）も好適でありうる。しかしながら、１本鎖中間体が存在し、これによって標的結合領域がプライマー伸長産物の相補的配列にハイブリダイズすることが重要である。一般に、本発明の方法は上記方法の最終（検出）段階として使用される。認識されるように、ある程度の最適化／再構成が必要であるが、適切な段階は通常の技術を有する当業者に明白である。
【００２７】
サンプル核酸の供給源にはヒト細胞、例えば循環血、口腔内上皮細胞、培養細胞、および腫瘍細胞がある。他の哺乳動物の組織、血液、および培養細胞もテンプレート核酸の供給源として好適である。更に、ウィルス、バクテリオファージ、細菌、真菌、および他の微生物を分析のための核酸の供給源とすることができる。ＤＮＡはゲノムであるか、またはプラスミド、バクテリオファージ、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、もしくは他のベクターにクローニングしてもよい。ＲＮＡは関連する細胞から直接単離してもよく、またはin vitroでの好適なＲＮＡプロモーターからのプライミング（priming）もしくはin vitroでの転写によって生成してもよい。
【００２８】
本発明を、ゲノムＤＮＡ（ヒト、動物、または他のものでもよい）における変異を検出するのに使用してもよい。遺伝性または後天性の疾病または傷害の分析における特定の使用が見出される。ある特定の使用は遺伝性疾患の検出におけるものである。認識されるように、標的核酸を分析のために興味の配列または領域に直接的または間接的に結合させる。ある好ましい観点では、本発明のプライマーをＰＣＲの共通のプライマーとして、ＡＲＭＳプライマーと組み合わせて使用する（例えばヨーロッパ特許EP-B1-0 332 435号に開示されるように）。これは興味の配列または領域への間接的な結合の例である。あるいは、興味の配列または領域が対立遺伝子特異的にテンプレート特異的領域と相互作用する際に、これが、好ましくはＡＲＭＳプライマーとして、同定される（上記参照）。あるいは、興味の配列または領域を、プライマー・テール中の標的結合領域と対立遺伝子特異的に相互作用することによって同定してもよい。更に、興味の配列または領域は、プライマー・テール中の標的結合領域のハイブリダイゼーションがプライマー伸長産物の生成に依存していることを条件に、プライマー中の標的領域およびテンプレート結合配列の組み合わせであってもよい。
【００２９】
遺伝子に基づくヒト遺伝性疾患の診断に加え、本発明は他の供給源からの増幅子の検出に有用である。特定の使用はＨＩＶのような感染性抗原（細菌、ウィルスなど）の検出におけるものであり、ここで対立遺伝子特異的プライミングと標的結合領域を介する対立遺伝子の識別を組み合わせることにより、患者におけるウィルス集団内でのＨＩＶの特定の変異体の出現をモニタリングする機会が与えられる。定量データ（リアルタイムＰＣＲで測定される）が有用である他の感染性抗原にはＣ型肝炎ウィルスなどがある。
【００３０】
他の医微生物学的適用には、特定の種の微生物を検出および定量できることが重要である。蛍光スコーピオン（Scorpions）プライマーの使用により、これが非常に容易となる。
【００３１】
食物または他の生産物中の細菌の存在も、スコーピオン蛍光法を用いるリアルタイムＰＣＲを使用して有効にモニタリングできる。プローブ検出の特異性を修飾して関連する標的の検出を可能にする、または除外することができる。
【００３２】
ある特定の利点は、本発明の新規のプライマーが１００％のプライマー濃度で使用する必要がない、すなわち、従来のプライマーに対してわずかな割合の新規プライマーしか使用しない場合にでもこの検出方法は良好に作用することである。理論上の考察に拘束されることは望まないが、出願人が考えるところでは数パーセント（例えば１０％まで、２０％まで、例えば３０％まで、４０％まで、または５０もしくは６０％まで）という低いパーセントの新規プライマーを使用する。あるいは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の新規プライマーを使用する。
【００３３】
プライマーは増幅反応のいずれかの便宜的な段階、例えば最終の増幅サイクルで添加でき、必要なのは１回以上のプライマー伸長反応だけである。同種の（homogeneous）検出系では、増幅法の最初にプライマーを添加するのが好ましい。
【００３４】
プライマー・テールは多くの異なる形状であってもよく、唯一必要なのは、テール中の標的結合領域がプライマー伸長後にプライマー伸長産物中の相補的配列（もし存在すれば）とハイブリダイズできることである。その最も簡単な形式ではプライマー・テールはランダムなコイルを形成し、蛍光検出法を使用する場合であればプライマーが標的結合領域のハイブリダイゼーションに先立って自己消光する。
【００３５】
プライマーは１つ以上の内部ハイブリダイゼーション領域を含有してもよいが、これは所定の位置、すなわち特定の構造でシグナリング系の安定化を補助する。そのような領域はプライマー・テール内の便宜的な位置にあり、それぞれ２個以上の塩基対であってもよい。採用される構造は実用上考慮すべき事項によってのみ制限され、ヘアピン、アーム、エルボー、ステム、バブル、およびループから選択される１つ以上の構造の使用を含んでもよい。便宜的な構造が考案されれば、これらを本発明のテール含有プライマーの共通の特徴として使用してもよい。
【００３６】
標的結合領域は、その５’末端に便宜的な数の塩基が添加されてもよい。これらの添加塩基の全てまたは一部は内部ハイブリダイゼーション領域のいずれかの一部を形成してもよい。
【００３７】
本発明の更なる観点では、プライマーは捕捉領域を含んでもよい。これは便宜的な位置のいずれにあってもよく、好ましくはプライマー・テール上にある。捕捉領域は並列または分枝構造であってもよい（図８ｃ参照）。捕捉領域は、例えば固相上の、相補的な配列にハイブリダイズする。
【００３８】
便宜的なテンプレート依存型ポリメラーゼのいずれを使用してもよく、これは好ましくは熱安定性ポリメラーゼ酵素、例えばｔａｑ、より好ましくはｔａｑ  Ｇｏｌｄである。
【００３９】
同様に、便宜的な従来の塩基対形成のためのヌクレオシド３リン酸のいずれを使用してもよい。必要により、これらを蛍光のために修飾してもよい。これらはポリメリゼーション速度に影響しうるため、使用される２０ｄＮＴＰのうち約１までのみを修飾して最良の結果を得る。
【００４０】
更に詳細な便宜的なポリメラーゼ、ヌクレオシド３リン酸、他のＰＣＲ試薬、プライマー設計、装置、および消耗品は、C. R. NewtonおよびA. Grahamによる“ＰＣＲ”で得られる（バイオ技術シリーズ入門, 第２版, 1997, ISBN 1 85996 011 1, Bios Scientific Publishers社, Oxford）。更なる手引きは“変異検出のための実験プロトコール”Ulf Landegren編,Oxford University Press発行, Oxford, 1996, ISBN 0 19 857795 8）に見出される。
【００４１】
本発明を、以下の非制限的な特定の説明で例証するが、ここで本発明のテール含有プライマーをスコーピオン・プライマー（Scorpions Primers）と呼ぶ。
スコーピオン・プライマーの設計は周知のＰＣＲ増幅を行う者のための手引きに従ってもよい；スコーピオン・プライマーの３’末端および／または標的結合領域を、例えば既存のＰＣＲまたはＡＰＭＳアッセイから、直接得てもよい。
【００４２】
標的結合領域は一般に約１７塩基（ＤＮＡ）であるが、（測定を行う温度によって）より短い（６から１０塩基程度の）標的結合領域を使用する。この点について、非天然核酸（例えばＰＮＡまたは２’-Ｏ-アルキル-ＲＮＡ（特に２’-Ｏ-メチルＲＮＡ））が有用であると考えられ、これはそれらがその標的に結合すると、より高いＴｍを有するからである。ＤＮＡ鎖上の増幅子結合領域と増幅子内のその相補的配列との間の間隔は３０塩基（これはプライマーに直接隣接する）程度の少なさであるか、または約２００-３００塩基程度の多さであってもよい。単分子相互作用の効率はこの距離が大きくなるに従って低下すると考えられる。
【００４３】
ステム領域を使用する場合、それらは２塩基（特に２’-Ｏ-メチルＲＮＡまたはＰＮＡに有用）から約６、８、１０、またはそれ以上の塩基の範囲であってもよい。ステム長と増幅子結合長のバランスは重要である：プローブ-標的複合体はアッセイ温度でステム２本鎖より強い（よりネガティブな）ΔＧ（自由エネルギー）を有するべきである。
【００４４】
ヨーロッパ特許EP-B1-0 416817号（Zeneca社）に記載されるようなポリメリゼーション・ブロッキング群はいずれも好適である。しかしながら、固相オリゴヌクレオチド化学によって容易に導入され、同化学で更なる伸長のための基質が生成されるのが好ましい。便宜的な例にはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）およびテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）ホスホルアミダイトがある。
【００４５】
スコーピオン・プライマーを使用して実施できるアッセイは広範である。検出は、例えばＰＣＲ増幅後、室温で行ってもよく、これは単分子ハイブリダイゼーション事象が迅速に起こり、長期間（少なくとも一晩）安定なためである。更にまた、ポジティブな蛍光シグナルが十分高く、バックグラウンドが十分低いため、蛍光は好適な照明下、室温で目視できる。これらは重要な利点である。
【００４６】
対立遺伝子の識別を終了点として使用する場合、不適合な標的を選択的に不安定化するための温度制御を使用する必要がありうる。
本発明のスコーピオン・プライマーは特にリアルタイム・アッセイに好適であり、これはシグナル生成が迅速であり、単分子相互作用しか必要としないからである。更に、バックグラウンドが低くシグナルが高いため、アッセイの設計においてかなり融通が利く。ＰＣＲを通した蛍光の連続的なモニタリングが好適な機材の使用によって可能である。
【００４７】
スコーピオン・プライマーはin situ技術、例えばin situ ＰＣＲ（ＩＳＰＣＲ）およびprimed in situ合成（ＰＲＩＮＳ）でかなりの利点がある。所望の産物を生成するプライミング事象のみがシグナルを生成し、これによって細胞内での産物の検出に関して他の技術よりかなりの利点が得られる。
【００４８】
一般に、スコーピオン・プライマーは反応の最初に含有させ、閉鎖した試験管で（homogeneous）連続的またはＰＣＲ後のいずれかに蛍光を測定するのが好ましい。あるいはまた、スコーピオン・プライマーを増幅のより遅い段階で添加してもよい；必要なのはスコーピオン・プライマーで１ラウンドの伸長を行い、単分子のテール／標的２本鎖を生成しなければならないことだけである。
【００４９】
好適なシグナリング系（例えば異なる蛍光体）を使用して、１つの反応でいくつかのスコーピオン・プライマーの生成を合一（複合）することが可能である。使用してもよいプライマーの数は実験上考慮すべき事項によってのみ制限される。
【００５０】
ここで以下の非制限的な実施態様を開示する：
蛍光体／消光体の実施態様
図１参照。消光はテールのランダムな折りたたみによって蛍光体／消光体（Ｆ／Ｑ）対が偶然に接近して起こる（図２）。この消光を最大にするために、蛍光体を分子の中間に、消光体を５’末端に含有するのが好ましいが、これは必須ではない。シグナルの“スイッチ・オン”はプローブのハイブリダイゼーションによって起こる同様の消光の喪失による（図３）。この態様では、ＦおよびＱがプロービング物質の反対の端にあることは重要ではなく、それらをプローブ部分内で接近させて配置するのが有利でありうる。しかしながら、テールの標的結合機能がかさのある非塩基対形成要素の導入によって崩壊されないことが重要であるが、蛍光体および消光体の両方をウラシルモノマーに導入し、プローブ中のチミジンを置換することができる。出願人はこの態様が増幅子検出として最も良好に作用しうると考える。
挿入の実施態様
この態様では、スコーピオン・プライマーの設計は更に単純であり、消光体を含まない。かわりに、テールは挿入色素を有し、これは２本鎖核酸分子の塩基間に取り込むことができ、その際高い蛍光を発する。このように、配列特異的な挿入が行われる（図４ａ、ｂ）。前の態様で記載した“非ステム”法とは対照的に、挿入蛍光体はスコーピオン分子の５’-末端、またはループの内部として配置されるのがより良い。プライマー内の内部折りたたみを最小限にして、その後挿入されて高いバックグラウンド・ノイズを誘引しうる２本鎖ＤＮＡが存在しないようにする。色素が分子のループ部分内に存在する場合、ヘアピン構造を有することも可能である（これはハイブリダイゼーションの対立遺伝子特異性を向上する）。使用する色素は好ましくは標準的な蛍光体ではなく、２本鎖標的の非存在下ではわずかな蛍光を有し、挿入に際して高く増加されるような挿入物である。好適な蛍光体にはMolecular Probesが開発したシアニン色素、臭化エチジウム、アクリジンなどがある。色素を修飾してスコーピオン・プライマーへの結合またはホスホルアミダイト（固相）化学を介した導入を容易にする必要がありうる。
ＦＲＥＴの実施態様
この基本的な系の修飾では、関与する色素はエネルギー伝達対を生成する。色素の１つは標的結合領域の３’-末端の近傍に位置し、他方は増幅子結合領域の３’-末端の近傍に位置する（図５ａ、ｂ参照）。プローブはプライマーに非常に密接にハイブリダイズしてＦＲＥＴ対を接近させ、向上された蛍光シグナルを生成しなければならない。
消光体を含まない実施態様
蛍光体をスコーピオン・プライマーのテールに結合させる（図６（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）参照）。蛍光体周辺のスコーピオン・プライマーのランダムな折りたたみにより蛍光体が十分消光される。これは主にヌクレオチド、グアニル酸によるものでありうると考えられる。消光を最大にするために、蛍光体をプライマーの中央、またはその周辺に、効率的に消光するための十分な更なるＤＮＡと共に含有するのが好ましいが、これは必須ではない。消光効率は周囲のＤＮＡの配列に依存する。標的領域にテールの標的結合領域が結合することによりＤＮＡのコンフォメーション十分が変更され、この消光が除去される。この態様は増幅子の検出に好ましい。
２分子の実施態様
蛍光体および消光体を２つの別個の、しかし相補的な分子に導入してもよい（図７ａ）。蛍光体および消光体をプローブまたは相補的配列のいずれかの末端に配し、２つの鎖のハイブリダイゼーションによって蛍光体／消光体対が接近するようにしてもよい。１ラウンドの変性、アニーリング、および伸長後、蛍光体は消光されたままであり、これは２分子部分が再形成されるためである（図７ｂ）。非スコーピオンの遊離鎖は過剰にあってこの２分子相互作用が確実に生じるようにし、この理由から、この分子が消光体を有してバックグラウンドを最小限にするのが好ましい。しかしながら、更なるラウンドの変性およびアニーリング後、自己プロービング鎖が生成し（図７ｃ）、遊離の消光体（オリゴ）は反応速度的または熱力学的にこの事象と競合できず、このため蛍光が増加する。
【００５１】
必要により、分子の１つはヘアピン構造のような２次構造を有することによって、例えば他の分子上の蛍光体のより効率的な消光のための消光体種を更に結合してもよい。
捕捉プローブの実施態様
上記の実施態様に加え、同じ増幅不能なテールを使用して増幅子を特異的に捕捉し、プロービングしてもよい（図８ａおよび８ｂ参照）。更なる特定の態様では、捕捉およびテール配列が隣接しないことを特徴としてもよい。すなわちテンプレート結合領域と共にそれらが分枝プライマー構造を形成する（図８ｃ参照）。増幅後、増幅子を固体表面上に捕捉させてもよいが、シグナル生成は増幅子特異的のままである。あるいはまた、捕捉配列およびシグナリング系が増幅子の反対の末端にあってもよい。この様式では、同一の捕捉配列を有する一般的な“チップ”を使用して多くの異なる標的を分析してもよく、捕捉領域は不変のままで、増幅物およびプローブ要素は多様である。
ステムの実施態様
この態様では、プライマー・テールは自己相補的ステム（またＤＮＡ、ＲＮＡ、２’-Ｏ-メチルＲＮＡ、ＰＮＡ、およびその変異体）を含み、これが増幅子結合領域に隣接し、蛍光体消光体対を有し、２つのステムによるヘアピン形成によってＦ／Ｑ対が接近することによって蛍光が実質的に消光状態（“オフ”）になるようにする。蛍光体および消光体は指向性または合成の簡便性によっていずれかのアームに配することができる；３’アーム上に（すなわち分子中央のブロッカーに隣接して）消光体を有するのが好ましい。
【００５２】
高温ではステム２本鎖が分離し、蛍光体が非消光状態（すなわち“オン”-図９ａ）となる；しかしながら低温ではステム２本鎖が形成され、蛍光は実質的にオフである（図９ｂ）。
増幅サイクルにおいて
最初の変性、アニーリング、および伸長後、スコーピオン増幅子はその５’-末端にループ領域と相補的な領域を含有する（図１０ａ）。第２ラウンドの変性（図１０ｂ）およびアニーリングの際、テールは新たに合成された領域に高い効率でハイブリダイズし（単分子相互作用）、蛍光は非消光状態のままである（図１０ｃ）。しかしながら、伸長されていないプライマーは消光状態のコンフォメーションを形成し続ける。一方、“逆向き”プライマーがこの同じ鎖にハイブリダイズし、合成が進行する。テールは（少なくとも部分的に）Ｔａｑポリメラーゼで置換され、プローブが短いため残存物は容易に溶解すると考えられる。この段階では、Ｔａｑポリメラーゼは増幅ブロッカーに遭遇するまでこの鎖の合成を完了する。シグナルが強く、プライミング機能が非スコーピオン変異体と同様であるため、全てのプライマーがスコーピオン型である必要はない。実際に、１０％以下のプライマーがスコーピオン型である場合にも強いシグナルを得た。これによって安価な反応が可能となり、また２つの異なる蛍光体を使用する場合にシグナル強度のバランスをとることが可能となる。
【００５３】
本発明のスコーピオン・プライマーをＰＣＲプライマーのような従来の増幅プライマーの代わりに使用してもよく、その増幅機能への干渉は予想されない。２試験管ＡＲＭＳ試験（正常および変異）では、スコーピオン・プライマーは便宜的にＡＲＭＳ増幅に依存するシグナル生成を伴う共通のプライマー（図１１ａ）であってもよい。
【００５４】
しかしながら、ＡＲＭＳプライマー上にシグナリング物質を配することも同様に可能である。それぞれのＡＲＭＳプライマーを異なる蛍光色素（Ｆ１、Ｆ２）で標識してもよく、それによって１試験管ゲノタイピング（ＳＴＧ）が可能となる-すなわち両方の反応が同一試験管内で行われ、増幅子は特徴的な“色”によって識別される（図１１ｂ）。
【００５５】
あるいはまた、シグナリング物質は対立遺伝子特異性を有してもよい（実施例２参照）：プライマーは標準的な（非ＡＲＭＳ）プライマーであり、２つの対立遺伝子変異体に適合する２つの異なるプローブ配列を１つのプライマーの２つの変異体に導入する（図１２ａ、ｂ）。標的の非存在下でヘアピンを形成できるプローブは、同一プローブのテールを有さない型より単一塩基の不適合をより良好に識別することが見出されている。別に明らかにされているところによれば、それぞれの変異体のプローブを２つの増幅物質に１つずつ導入し（図１２ｃ、ｄ）、それによって反応の異なる鎖をプロービングしてもよい。最終的に、これらの見解の組み合わせが可能である：あるサブセットのスコーピオン・プライマーを対立遺伝子の識別のために使用してもよく、同時に同一混合液中の他のプライマーが増幅子そのものを検出するためのコントロール・プローブとして作用してもよい（図１２ｅ）。これらの事象間の識別は蛍光波長によるか、または同一の蛍光体を有するが異なるＴmであるプローブ要素を使用して、その後温度範囲にわたって蛍光を測定することによって識別してもよい。
【００５６】
ここで本発明について以下の図面および実施例を参照して非制限的な例証を行う。
実施例
試料
プライマー／スコーピオン・プライマー：
Ｂ２０９８-ＢＲＣＡスコーピオン：ＦＡＭ-ＣＧＣＡＣＧＡＴＧＴＡＧＣＡＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＧ-ＭＲ-ＨＥＧ-ＴＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣＡＡＡ
下線の領域はヘアピン形成部分であり、ＦＡＭは蛍光色素である。ＭＲはウラシルに結合した非蛍光生成蛍光体であり、ＨＥＧは複製阻害ヘキサエチレングリコール単量体である。プローブはＢＲＣＡ２多型の“Ｃ-変異体”に適合し、“Ａ-変異体”には不適合である。
【００５７】
Ｒ１８６-９８：テールを有さないＢ２０９８相当物：ＴＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣＡＡＡ
Ｒ１８７-９８：Ｒ１８６-９８および相当するスコーピオンと反対のプライマー
Ｚ３７０２：スコーピオンＢ２０９８のプローブセグメント：
ＦＡＭ-ＣＧＣＡＣＧＡＴＧＴＡＧＣＡＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＧ-ＭＲ
テンプレートＤＮＡ：既に遺伝子型が得られているＤＮＡで、プロティナーゼＫおよびフェノール／クロロホルム抽出によって調製し、５０ｎｇ／５０μｌ反応液で使用した。遺伝子型は一般に１つのホモ接合体Ａ／Ａ、１つのホモ接合体Ｃ／Ｃ、および１つのヘテロ接合体Ａ／Ｃである。
バッファー（１Ｘ）：１０ｍＭ  トリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．２ｍＭまたは３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｄＮＴＰ（各１００μＭ）、ゼラチン（０．０１％（ｗ／ｖ））。
酵素：AmpliTaq Gold（Perkin-Elmer/ABI）を反応混液中に２ユニット／５０μｌ反応液で含有させた。
実施例１
リアルタイムで検出する増幅
均質な（homogeneous）増幅反応におけるスコーピオン・プライマーの挙動をモニタリングするために、ＢＲＣＡ２遺伝子における多型を隣接させたプライマーを使用してＰＣＲを実施した。選択した標的配列を２つの変異体の対立遺伝子識別のために使用したが、短すぎてリアルタイム検出はできなかった（プローブは熱サイクルにおける最も低い温度である６０℃でハイブリダイズしなかった）。（上流鎖の）プローブ物質を下流鎖のプライマーの一部として、２つの機能性（functionalities）の間にブロッキングＨＥＧを配して合成した。標的ＤＮＡを、プローブに適合する、または適合しない増幅子を生成させるように選択した。
【００５８】
反応条件：テンプレートＤＮＡの添加後、試験管を密封し、以下の条件下で反応サイクルを行った：Amplitaq Goldの活性化のために９４℃で２０分間；そして４０サイクルの｛９４℃で４５秒、６０℃で４５秒｝。反応はABI PRISM 7700蛍光ＰＣＲ装置で行った。
【００５９】
結果：図１３参照。増幅子が蓄積すると蛍光シグナルが生成することが非常に明らかである。それぞれの時点でいくつかの蛍光測定値があり、シグナルが鋭く段階的に増加しているのは熱サイクルの保持時間の初期におけるプローブ-標的２本鎖の迅速な生成を反映している。これはスコーピオン・プライマーの作用が単分子様式であるためであり、これによって好適な増幅子が即時に認識される。
実施例２
対立遺伝子の識別
上記の試料および方法。
【００６０】
結果：図１４参照。この実験では、プローブは多型塩基で増幅子と適合または不適合である。いずれの増幅も等しい効率であるが（アガロースゲルによる見解で［結果は示していない］）、適合する産物は不適合のものよりはるかに容易に検出された。これは増幅子の単一の塩基変化に対してでも系が強い特異性を有することを示している。
実施例３
プライマーの力価測定
試料および方法は上記参照。プライマーＢ２０９８とそのテールを含有しない相当物（Ｒ１８６-９８）との力価測定は１００％スコーピオンから１０％スコーピオンであった；総プライマーは５００ｎＭで一定とした。
【００６１】
結果：図１５参照。全てのスコーピオン：テール非含有プライマー比で、反応はABI 7700で明白に検出された。実際、Ｃｔ（シグナルが“バックグラウンド”上部の域と交差する時点）はスコーピオンとテール非含有プライマーの比率と無関係に同一であり、シリーズを通してプライミング効率が同レベルであることを示した。変化したのは蛍光シグナルの絶対値のみであった（予想通り）。この系の効率は、高濃度のプローブが２分子プロービング事象を動的に作用させるのに必要である使用可能な方法と著しい対照をなしている。
実施例４
終点測定
試料および方法：反応は上記のように構成したが、２つの異なるマグネシウム濃度（１．２および３．５ｍＭ）で行った。３つの表現型全てのＤＮＡおよびテンプレート非含有コントロール（ＮＴＣ）を使用して蛍光を増幅前および後に測定した。蛍光数は重複サンプルからの少なくとも６つの別個の測定値の平均である。
【００６２】
【表１】
0004440469.tif 000002
【００６３】
蛍光測定値はＰＣＲの間、標的依存的に増加した。実際、ヘテロ接合体で生成されたシグナルはＣＣホモ接合体のものの約半分であり、これは単純な方法でのゲノタイピング、または対立遺伝子比が１００：０、５０：５０、または０：１００より広範囲なヘテロプラスミーの分析に有用でありうる。更に、不適合標的で生成されるシグナルはバックグラウンドレベルと同様であり、増幅は起きたがプローブは完全に適合しない限り効率的にハイブリダイズしないことを示している。マグネシウム濃度を増加させるとこの識別は低下するが、バックグラウンドは確実に更に低く、これはおそらく一般にハイブリダイゼーションを促進することによる。
【００６４】
蛍光計によるこれらのシグナル変化の観察に加え、増加した蛍光がＵＶ透視装置による試験管backlitの目視で検出できた。これは注目すべき観察であり、なぜならＦＡＭ色素は最適励起が-４９０ｎｍであるのに対し、ＵＶボックスは-３３０-３６０ｎｍで照射されるからである。これは、蛍光産生が全く最適ではなく、より好適な波長を使用することによってかなり向上しうることを意味している。
実施例５
スコーピオンによるヘテロプラスミーの分析
反応は実施例４のように構成したが、テンプレートＤＮＡはＣホモ接合体とＡホモ接合体の種々の混合物を含む標準量とした：１００％：０％、９０：１０、５０：５０、１０：９０、０：１００、およびＮＴＣ。４０サイクルのＰＣＲ後、ＦＡＭ蛍光測定を実施し、ＮＴＣをそれぞれから減じた。データを図１６に示す。
実施例６
スコーピオンの相対的挙動
２分子相当物に対するスコーピオンの相対的な挙動を試験するために、同一の増幅子およびプローブ配列をそれぞれのフォーマットで使用した。２分子フォーマットは各５００ｎＭのＲ１８６-９８およびＲ１８７-９８プライマー、そして５００ｎＭの分子ビーコンZ3702を含有し、単分子型ではＢ２０９８およびＲ１８７−９８をそれぞれ５００ｎＭで含有した。他の反応要素は前の実験と同一であり（１．２ｍＭ  Ｍｇ含有）、サイクルは上記のように４０サイクルとした。ホモ接合体Ｃ、ホモ接合体Ａ、またはヘテロ接合体Ａ／Ｃである標的を使用したリアルタイムのこれらの増幅の結果を図１７に示す。明らかに、２分子プロービング作用様式による反応ではバックグラウンドより高い実質的な増幅は観察されず、スコーピオン反応ではかなりの対立遺伝子特異的シグナルが生成された。ヘテロ接合体でのシグナルの最終レベルはホモ接合体Ｃ増幅で得られたものの半分であったこよは注目に値する。この実験は本発明の単分子ハイブリダイゼーション法の実質的な反応速度論的利点を例証するものである。
実施例７および８
ランダムコイルの実施態様および２分子の実施態様
スコーピオン  Ｂ２７３１：
ｆａｍ-ＡＧＧＴＡＧＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧ-ｍｒ-ｈ-ＧＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣ
スコーピオン  Ｂ４２４９（同一分子で消光体を含有しない）
ｆａｍ-ＡＧＧＴＡＧＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧ-ｈ-ＧＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣ
消光体オリゴヌクレオチド（Ｂ４２４９のテールの相補体）
ＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＣＣＴ-ｍｒ
ＡＲＭＳプライマー  Ｒ２８４-９７：
ＴＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣＴＣＡＡＣ
ＡＲＭＳプライマー  Ｒ２８３-９７：
ＴＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣＴＣＡＡＧ
標的はヒト遺伝性ヘモクロマトーシス遺伝子（ＨＨ）のＨ６３Ｄ多型であり、ＡＲＭＳプライマーＲ２８３-９７、Ｒ２８３-９７に対して、Ｂ２７３１およびＢ４２４９は“共通”プライマーである。サイクル条件および反応組成物は上記の通りである。プライマー（スコーピオン・プライマーを含む）は５００ｎＭの濃度で使用した。
【００６５】
２分子の例では、消光体オリゴヌクレオチドは０、０．５、２、および２０ｍＭ、すなわちスコーピオン・プライマーに比較して０、１、４、４０倍で取り込んだ。
【００６６】
ランダムコイルの態様（図１９）によって明らかになったところによれば、ランダムコイル形成だけで十分にプローブと消光体を接近させることができ、ＰＣＲの連続的なモニタリングにおいてシグナルは容易に増加される。（更に、留意すべきことに、この特定の増幅子はタックマンまたは分子ビーコン・アッセイにおけるプロービングに無反応であることが既に証明されている。
【００６７】
２分子の態様でも良好な結果が得られた（図２０および２１参照）。増幅子の非存在下で消光体を添加するほどバックグラウンドは低くなった。総体的な挙動が最適であったのは（シグナルの絶対強度とシグナル／ノイズを考慮）、等モルおよび４ｘ過剰の消光体を用いたものであった。
実施例９
消光体を含有しない実施態様
スコーピオン  Ｂ４２４９（消光体非含有）
ｆａｍ-ＡＧＧＴＡＧＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧ-ｈ  ＧＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣ
ＡＲＭＳプライマー  Ｒ２８４-９７
ＴＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣＴＣＡＡＣ
反応は前の実施例で記載したように構成した。プライマーは５００ｎＭで含有させた。標的はヒト遺伝性ヘモクロマトーシス遺伝子（ＨＨ）のＨ６３Ｄ変異体であった。２５ｎｇのＤＮＡを反応毎に添加した。Ｂ４２４９はＡＲＭＳ変異体プライマーＲ２８４-９７と組み合わせた共通プライマーである。サイクルは前の実施例に記載したようにした。結果を図１８に示す。
【００６８】
この実施例では、変異体特異的シグナルが消光体の非存在下で生成される。蛍光体を取り巻くスコーピオン・プライマーのランダムな折りたたみにより、蛍光体が十分に消光される。ＰＣＲの連続的なモニタリングに際してシグナルは容易に増加される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、便宜的なプライマー設計の基本的特徴を示す。テンプレート結合領域を陰をつけた矢印で示す。テール領域はＨで示すブロッキング群を含む。また消光体および蛍光体も示す。標的結合領域は消光体および蛍光体間の太線で示す領域内にある。
【図２】  図２に示すのは、テールがランダムコイルを形成して蛍光体および消光体対を接近させることによって起こる消光である。
【図３】  図３に示すのは、標的領域に対応するプライマー伸長産物中の相補的配列への標的結合領域のハイブリダイゼーションである。
【図４】  図４（ａ）に示すのはプライマーのテール中の挿入蛍光体（ＩＦ）の包含およびサンプル・テンプレート上のプライマーの伸長であり、（ｂ）に示すのは標的領域に対応するプライマー伸長産物中の相補的配列への標的結合領域のハイブリダイゼーション後の挿入物である。
【図５】  図５（ａ）はプライマーに組み込まれた色素（Ｒ＆Ｆ）の使用を示し、これはエネルギー伝達対を生成する。（ｂ）はハイブリダイゼーションの際のその相当する位置を示す。
【図６】  図６（ａ）は５’末端に結合する１個の蛍光体（Ｆ）を有するプライマーの使用を示す。ブロッキング群（Ｈ）を示す。標的結合領域は右方向の矢印で示す。（ｂ）は溶液中のランダムコイルの形成および蛍光体の消光を示す。そして（ｃ）はプライマー伸長後の標的結合領域のハイブリダイゼーションを示す。
【図７】  図７（ａ）は本発明の２分子の態様を示す。蛍光体および消光体は別の種で提供する。（ｂ）では、プライマーがサンプルテンプレート上で伸長し、（ｃ）では標的結合領域のハイブリダイゼーションの際の蛍光体および消光体の分離を示す。
【図８】  図８（ａ）は本発明の捕捉プローブの態様を示し、（ｂ）では増幅子が固相に捕捉され、同じ増幅不能なテールを使用してプロービングされる。（ｃ）ではプライマーはテールおよび捕捉配列の分枝構造を含む。
【図９】  図９は本発明のステムの態様を示し、（ａ）高温では、ステム２本鎖が分解して蛍光体が非消光、すなわち“オン”となるが；（ｂ）低温では、ステム２本鎖が形成されて蛍光体が実質的にオフとなる。
【図１０】  図１０は増幅サイクルで使用されるプライマーを示す。（ａ）最初の変性、アニーリング、および伸長後、スコーピオン増幅子はその５’-末端にループ領域と相補的な領域を含有し；（ｂ）変性およびアニーリングの第２ラウンドでテールは（ｃ）新たに合成された領域に高い効率でハイブリダイズし（単分子相互作用）、蛍光体は非消光状態のままである（図１０ｃ）。しかしながら、未伸長のプライマーは消光されたコンフォメーションをとり続ける。
【図１１】  図１１は、（ａ）２試験管ＡＲＭＳ試験における共通のプライマー、および（ｂ）１試験管ＡＲＭＳ試験における対立遺伝子特異的プライマー“ａ”および“ｂ”としてのプライマーの使用を示す。
【図１２】  図１２は、標的結合領域のハイブリダイゼーションが対立遺伝子特異的に起こるプライマーの使用を示し、（ａ）ではプライマーの伸長により対立遺伝子“ａ”または“ｂ”に対応する産物が得られ、（ｂ）ではハイブリダイゼーションは対立遺伝子特異的であるか、または不適合であり、（ｃ）および（ｄ）では各変異体のプローブは２つの増幅物質のそれぞれについて提供され、それによって反応の異なる鎖をプロービングし、そして（ｅ）では、異なるプライマーを対立遺伝子識別のために同一混合液中で、増幅子検出のためのコントロールプライマーとして使用してもよい。
【図１３】  図１３は増幅のリアルタイム検出を示し、不適合な標的と対照的に、適合する標的結合領域がハイブリダイズすると蛍光シグナルが生成される。
【図１４】  図１４は対立遺伝子の識別を示す。テンプレート非含有コントロールおよび不適合標的と対照的に、適合する標的結合領域がハイブリダイズすると蛍光シグナルが生成される。
【図１５】  図１５はプライマーの力価測定を示す。不適合な標的と対照的に、適合する標的結合領域がハイブリダイズすると蛍光シグナルが生成される。以下の割合のスコーピオン・プライマーを使用した：（ａ）１００％、（ｂ）８０％、（ｃ）５０％、（ｄ）２０％、および（ｅ）１０％。
【図１６】  図１６はヘテロプラスミー分析を示す。Ｃホモ接合体およびＡホモ接合体の種々の混合物をそこに示すように使用し、４０サイクルのＰＣＲ後に測定した。
【図１７】  図１７は本発明と２分子の相当物との比較を示す。（ａ）において、不適合な標的では明らかな増幅が見られない。（ｂ）および（ｃ）において、実質的に対立遺伝子特異的なシグナルは適合するスコーピオン・プライマーによってのみ生成される。図１７において、スコーピオン・プライマーを使用して得た結果を三角および×印で示す。
【図１８】  図１８は本発明の消光体を含有しない態様を示す。非テンプレート・コントロールと対照的に、適合する標的結合領域がハイブリダイズすると蛍光シグナルが生成される。
【図１９】  図１９は、本発明のプライマーのランダムコイル形成が蛍光体と消光体を接近させるのに十分であることを示す。
【図２０】  図２０は本発明の２分子の態様を示す。種々の量の消光体オリゴヌクレオチドを添加した：（ａ）なし、（ｂ）０．５μＭ、（ｃ）２μＭ、および（ｄ）２０μＭ。
【図２１】  図２１に示すのは、（ａ）遊離消光体とスコーピオン・プライマーの割合、すなわちそれぞれ４０Ｘ、４Ｘ、１Ｘ、および０Ｘ、そして（ｂ）消光体なしでの効果である。
【配列表】
0004440469.tif 000003
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0004440469.tif 000005
0004440469.tif 000006
【図１】
0004440469.tif 000007
【図２】
0004440469.tif 000008
【図３】
0004440469.tif 000009
【図４】
0004440469.tif 000010
【図５】
0004440469.tif 000011
【図６】
0004440469.tif 000012
【図７ａ】
0004440469.tif 000013
【図７ｂ】
0004440469.tif 000014
【図７ｃ】
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【図８】
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0004440469.tif 000017
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【図９】
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【図１０ａ】
0004440469.tif 000020
【図１０ｂ】
0004440469.tif 000021
【図１０ｃ】
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【図１１】
0004440469.tif 000023
0004440469.tif 000024
【図１２】
0004440469.tif 000025
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0004440469.tif 000027
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【図１３】
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【図１４】
0004440469.tif 000031
【図１５】
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0004440469.tif 000033
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0004440469.tif 000042
【図２０】
0004440469.tif 000043
0004440469.tif 000044
0004440469.tif 000045
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【図２１】
0004440469.tif 000047
0004440469.tif 000048