(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成の又は天然のリボ核酸(ＲＮＡ)を標識するための方法であって、
-ＲＮＡを、非特異的な様式で化学的断片化して、複数のＲＮＡ断片を作り出し、
-標識に連結されている、又は標識に連結されることが可能である反応性官能基を、リボースに関して２’位、３’位、又は環状モノリン酸の２’-３’位にあるリン酸へ結合することにより、当該ＲＮＡの各断片を、断片化の最中にフリーとなった当該断片の３'末端に位置する末端リン酸で標識化することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記の断片化及び標識化が、一段階で実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の断片化及び標識化が、二段階で実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡ断片の３’末端の前記の断片化及び／又は標識化が、標識の有する、又はその後に少なくとも一の標識に連結されることが可能な求核性、求電子性、又はハロゲン化物の官能基を、前記末端リン酸基へ結合することにより実行されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記のＲＮＡの化学的断片化が、化学的触媒と組み合わされても、組み合わされなくてもよい、金属陽イオンにより実行されることを特徴とする請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記の金属陽イオンが、Mg++、Mn++、Cu++、Co++、及び／又はZn++イオンであり、そして前記の化学的触媒が、イミダゾール、例えばN-メチルイミダゾール等の置換類縁体、又は当該ＲＮＡに対する親和性を有し、そしてイミダゾール核又は置換類縁体を有する何れかの化学分子であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ断片の３’末端の標識化が、分子R-X（式中、Rは、前記標識からなり、Xは、当該標識をＲＮＡへ結合させるための薬剤であり、例えばヒドロキシル基、アミン基、ヒドラジン基、アルコキシルアミン基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化フェニルメチル基、ヨードアセタミド基や、マレイミド基等である）が、末端リン酸基へ結合することにより実行されることを特徴とする請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、合成又は天然のリボ核酸(ＲＮＡ)を標識化する新規な方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
合成のＲＮＡとは、ヒトが開発した技術、例えば増幅技術(後で転写を行うＰＣＲ)や、転写増幅技術(TMR)等により得られるＲＮＡを意味するものと理解される。天然のＲＮＡとは、細胞より抽出されるＲＮＡを意味するものとして理解されるが、例えばメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡや、転移ＲＮＡがある。
【０００３】
最新技術では、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドや、核酸を標識化する数多くの方法が示されているが、ここでオリゴヌクレオチド及び核酸とは、ポリヌクレオチドという用語で呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、合成中に、又は少なくとも一の標識化ヌクレオチドを導入することの何れかにより標識することができる。
【０００４】
第一の方法は、塩基が天然の塩基であるか、又は修飾した塩基であるかを問わず、塩基に標識を取り付けることからなる。第二の方法では、ここでも糖が天然の糖であるか、又は修飾した糖であるかを問わず、糖に標識を取り付けることが提案されている。第三の方法は、リン酸に標識を取り付けることに関係している。
【０００５】
塩基の標識は、特には標識済ヌクレオチドを直接的導入することによる核酸の標識化方法において使用されていた。
【０００６】
糖の標識済は、化学合成により調製される核酸プローブの場合に、しばしば使用されている。
【０００７】
リン酸の標識化もまた、ポリヌクレオチドを化学的に合成する場合に、官能基化されたアーム及び標識を導入することに使用されている。
【０００８】
実際に、ヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体、又は核酸を標識しようとする当業者は、塩基又は糖に標識を取り付ける傾向にあるが、これはより便利であり、より多くの選択枝を与えるものである。さらにこれは、例えば塩基の場合には、EP-A-0.329.198、EP-A-0.302.175、EP-A-0.097.373、EP-A-0.063.879、US-A-5,494,767、US-A-5,328,824、WO-A-93/16094、DE-A-3.910.151、そしてEP-A-0.567.841、そして糖の場合には、EP-A-0.286.898などの数多くの資料を調べることによりでてくるものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらこれらの技術には多くの欠点があり、その中の主要なものの二つは、立体的障害と、標識の存在により発生する効果である。
【００１０】
塩基が標識された場合には、立体的障害は、隣接する塩基が同じ鎖の隣のヌクレオチド又は相補鎖により有されているかに関らず、その隣接する塩基が存在している空間が侵食されることによるものである。塩基に標識が存在すると、酵素的取り込み中の効率と特異性が損なわれ、そして二つの相補鎖間の水素結合の質に影響を与えることがあることは明らかであるが、これはハイブリダイゼーションによって有害なものである。
【００１１】
糖が標識された場合には、立体的障害は、同じ鎖により有されている隣接する糖が存在する空間に標識が侵食することによるものである。標識がこのように存在することにより、同じ鎖により有されている隣の二つの塩基を離すことが可能であるが、その結果として、鎖間の水素結合が最適ではないという事実により、相補鎖との間の十分なハイブリダイゼーションが阻害される。
【００１２】
標識をリン酸に取り付ける技術は、塩基又は糖を官能基化する技術よりも更に複雑である。
【００１３】
そうであっても、複数の資料によれば、リン酸を標識する技術が提唱されている。例えば、資料EP-A-0.280.058が当てはまるが、これには、標識をリン酸に取り付けるが、ヌクレオチドがデオキシリボ核酸である場合にはリン酸を、２’及び／又は５’位において、そしてヌクレオチドがリボヌクレオチドである場合には２’、３’、５’位において、糖に取り付けることによりヌクレオチドを標識化することが記載されている。この資料にはまた、上述の少なくとも一の標識済ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが記載されているが、このヌクレオチドは合成中にポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに取り込まれる。
【００１４】
しかしながら、資料EP-A-0.280.058が提唱している標識化は、核酸を均一に標識することを可能にはしない。これは、標識済ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みが、制御できないからであるが、これは合成されるポリヌクレオチドの組成に完全に依存する。したがって、ポリヌクレオチドの中には、多くの標識済ヌクレオチドが含まれるものがある一方、全く含んでいないものもある。結果として、これらの核酸が放出するシグナル強度は均一ではなくなり、これは核酸を検出する場合の結果の容易な解釈を困難にするものである。
【００１５】
この場合、標識化は、標識されたヌクレオチドの位置を一切制御することなく生物学的に取り込まれる。
【００１６】
資料US-A-5,317、098は、その５’末端で標識された核酸に関する。この取り付けには、イミダゾールとリンカーアームを使用する。これにはいかなる断片化も関与しない。更に、リン酸が添加されるが、そのためのキナーゼが使用される。
【００１７】
しかしながら、リン酸は論理的には核酸のそれぞれのフリーな末端に存在するであろうから、少なくとも一つの付加的な工程が必要となる。この標識化は、いかなる断片化をも関与しない。
【００１８】
更に、上の二つの資料により記載される標識化は、大型の核酸で実行される。したがって、開裂段階ともよばれる断片化段階は、標識化工程前には一切ない。結果として、ハイブリダイゼーション後に形成される二重鎖は、これらの標的核酸が捕獲プローブにハイブリダイズしていると安定ではない。このことはまた、ポリヌクレオチドが検出プローブとして使用される場合にも当てはまる。これは立体的障害、又は、合成されたものであるポリヌクレオチドと、必ずしも同じサイズである必要のないその標的との間の特異性の欠如によるものである。したがってこのことによりシグナルの定量的及び定性的喪失が生じる。
【００１９】
立体的障害は、核酸の長さの結果のみならず、二次構造が存在又は保存されていることによるものかもしれない。断片化は、これらの構造を破壊することを可能にし、そしてこのようにしてハイブリダイゼーションを至適化する。この立体的障害は、Affymetrix社により開発されたＤＮＡチップ等の高密度の捕獲プローブを含む表面へのハイブリダイゼーションの場合に特に重要な役割を演じる("Accessing Genetic Informatin with High-Density DNA arrays” M.Sheeetel.、Science、274,610-614.;“Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis”, A. Caviani Pease et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1994、9l, 5022-5026)。この技術においては、捕獲プローブは、概してサイズが減少したものであるが、約２０のヌクレオチドである。
【００２０】
核酸を断片化する数多くの方法が最新技術において記載されている。
【００２１】
まず、断片化は酵素的にすることができるが、即ち、核酸をヌクレアーゼ（ＤＮアーゼやＲＮアーゼ）により断片化することができる。これにより、３’-OH、５’-OH、３’-リン酸、そして５’-リン酸の末端を有する断片が作り出される。
【００２２】
次に、断片化は化学的にすることもできる。例えば、ＤＮＡの場合にはＤＮＡを脱プリン化又は脱ピリミジン化することができるが、これを、次に塩基の存在下で、「β-除去」と呼ばれる機構により断片化する。ＤＮＡは特に、酸化、アルキル化、又は遊離基付加の機構により断片化することもできる。金属陽イオンは、化学触媒として使用される有機分子、例えばイミダゾールと組み合わされることが多いが、これはＲＮＡを断片化するのに使用される。この断片化は好ましくはアルカリ性の媒体中で行われ、そして３’-リン酸の末端を有する断片を作り出す。
【００２３】
しかしながら、これらの断片化の目的は、標識を容易にしたり可能にすることとは違う。
【００２４】
資料WO-A-88/04300は、ＲＮＡを断片化及び標識化する方法を提唱しているが、この断片化は酵素的性質を有するＲＮＡ、即ちリボザイムを使用して行われる。それぞれの開裂とともに、リボザイムによるこの断片化は、核酸(５’)HO末端、及び核酸(３’)HO-PO2末端を放出する。標識化は、放射性標識のみであるが、これは導入酵素（キナーゼ）を使用することにより実行されるが、この酵素は添加した放射性のリン酸であってγ-GTP分子に由来するものを導入する。この取り込みは、５’末端においてのみ実行される。更にこの断片化は、リボザイムによってのみ実行されるが、これはリボザイムと、開裂される標的核酸との間の特性の存在を示唆している。そして、リン酸が標識として作用する。
【００２５】
【課題を解決する手段】
本発明は、標識を、開裂中に放出される核酸の断片のリン酸のみに取り付ける。特異性は全くなくて、何れのタイプの核酸もが無秩序に断片化される。したがって、本方法は、検出プローブ等を調製することを可能にする。最後に、リン酸は、核酸と標識との間のリンカーアームでしかない。
【００２６】
標識化前に一又は二段階で断片化する方法は、従来技術には一切記述されていない。
【００２７】
したがって本発明は、上に言及した欠点を克服する方法を提唱するものである。故に、一旦断片化されると均一に標識されるＲＮＡ断片をこの方法によって得ることができる。更に、断片化により、可能なハイブリダイゼーションに最適のサイズの断片を得ることができる。ハイブリダイゼーションの質が改善されたので、このハイブリダイゼーションの検出は、より迅速且つ効果的となるであろう。
【００２８】
【発明の実施の形態】
標識化とは、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に作り出すことができるラベルを取り付けることを意味するものと理解される。以下は、これらの標識についての非限定的リストである：
-例えば比色法、蛍光、発光により検出することが可能なシグナルを作り出す酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；
-発色団、例えば蛍光性及び発光性の化合物、並びに色素；
-電子顕微鏡、又は例えば電導性、電流測定、電圧測定、及び抵抗測定等、その電気的性質により検出することができる電子密度を有する基；
-検出可能な基、例えばその分子が、その物理的及び／又は化学的特徴における検出可能な修飾を誘導するのに十分なサイズを有するものであって、ここでこの検出は、例えば回折、表面プラズモン共鳴、表面変動及び接触角変動や、物理的手段、例えば原子間緑顕微鏡法、及びトンネル効果等により行うことができる；
-放射性分子、例えば32Ｐ，35Ｓ、125Ｉ。
【００２９】
間接的なシステムもまた、使用することができるが、例えば抗−リガンドと反応することができるリガンドがある。リガンド/抗−リガンドの対は、当業者によく知られているが、例えば以下のような対がある：ビオチン/ストレプトアビジン、ハプテン/抗体、抗原/抗体、ペプチド/抗体、糖/レクチン、そしてポリヌクレオチド/相補的ポリヌクレオチド。この場合には、結合性試薬を有するのはリガンドである。抗-リガンドは、上において記載された標識により検出することができるが、又はそれ自身、リガンド/抗-リガンドで検出可能なものである。
【００３０】
一定の条件下では、これらの間接的検出システムによって、シグナルの増幅が可能となる。このシグナル増幅技術は、当業者らには周知であるが、必要ならば本出願人の以前の特許出願である、FR98/10084や、WO-A-95/08000、又は論文、J. Histochem. Cytochem. 45:481-491、1997を参照されたし。
【００３１】
したがって本発明は、合成の又は天然のリボ核酸(ＲＮＡ)を標識化する方法であって：
-ＲＮＡを断片化し、そして
-当該ＲＮＡのそれぞれの断片の３’末端及び／又は5’末端に位置する末端のリン酸を標識する
ことからなることを特徴とする方法に関する。
【００３２】
好ましい実施態様によれば、ＲＮＡ断片のそれぞれの３’末端の標識化は出発ＲＮＡの３’末端を構成する断片からそれぞれの断片が離れる場合に実行され、及び／又は前記のＲＮＡのそれぞれの断片の５’末端の標識化は、出発ＲＮＡの５’末端を構成する断片からそれぞれの断片が離れる場合に実行される。
【００３３】
第一の態様によれば、断片化及び標識化が、一段階で実行される。
【００３４】
第二の態様によれば、断片化及び標識化が、二段階で実行される。
【００３５】
態様がどうであれ、ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端の標識化は、標識が有するか、又は少なくとも一の標識にその後に結合することが可能な反応性官能基を、リボースに関して２’位、３’位、又は環状モノリン酸の2'-３’位にあるリン酸に結合することにより行われる。少なくとも二つの標識がある場合には、この技術はシグナル増幅技術である。
【００３６】
ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端の断片化及び／又は標識化は、標識の有する、又はその後に少なくとも一の標識に連結されることが可能な求核性、求電子性、又はハロゲン化された官能基が、リボースに関して２’位、３’位、又は環状モノリン酸の２’-３’位にあるリン酸基へ結合することにより実行される。
【００３７】
ＲＮＡの断片化は、酵素的、化学的に、又は物理的に実行される。
【００３８】
ＲＮＡの酵素的断片化は、ヌクレアーゼにより実行される。
【００３９】
ＲＮＡの化学的断片化は、化学的触媒と組み合わされても、組み合わされなくてもよい、金属陽イオンにより実行される。
【００４０】
この場合、金属陽イオンは、Mg++、Mn++、Cu++、Co++、及び／又はZn++イオンであり、そして前記の化学的触媒は、イミダゾール、例えばN-メチルイミダゾール等の置換類縁体、又は当該ＲＮＡに対する親和性を有し、そしてイミダゾール核又は置換類縁体を有する何れかの化学分子である。
【００４１】
ＲＮＡの物理的断片化は、超音波処理又は放射線により実行される。
【００４２】
要するに全ての場合に於て、ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端の標識化は、分子R-X（式中、Rは、前記標識からなり、Xは、当該標識をＲＮＡへ結合させるための薬剤であり、例えばヒドロキシル基、アミン基、ヒドラジン基、アルコキシルアミン基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化フェニルメチル基、ヨードアセタミド基や、マレイミド基等である）が、リボースに関して２’位、３’位、又は環状モノリン酸の２’-３’位にあるリン酸基へ結合することにより実行される。
【００４３】
本発明はまた、上に詳細に説明した特色に沿って本発明の方法により得られるＲＮＡ断片からなるものであるが、このＲＮＡ断片は、一方で、当該ＲＮＡ断片の３’末端又は５’末端に位置する末端のリン酸のレベルで標識されて、当該末端リン酸は断片化中に遊離される単一のヌクレオチドを含み、他方で、少なくとも一の他のヌクレオチドであってその塩基（プリン：アデニン／グアニン、又はピリミジン：ウラシル／シトシン）が、標識されたヌクレオチドのものと同一であるものを含むことを特徴としている。
【００４４】
このＲＮＡ断片は、10乃至100のヌクレオチド、好ましくは30乃至70ヌクレオチド、そして好ましくは40乃至60のヌクレオチドを含む。
【００４５】
好ましい態様によれば、このＲＮＡ断片は、少なくとも一のチオリン酸のヌクレオチドを含む。
【００４６】
更に、標識済ヌクレオチドは、チオリン酸のヌクレオチドである。
【００４７】
本発明は上に定義したように、ＲＮＡ断片の、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ、又はＲＮＡ断片及び／又はＤＮＡ断片を検出するためのプローブとしての使用に関する。
【００４８】
本発明は最終的には、上に定義したＲＮＡ断片の、捕獲プローブに結合することが可能な標識済標的としての使用に関する。
【００４９】
添付の図は、本発明に沿って標識化されるＲＮＡ断片の合成の異なる方法、並びにそれによって得られる断片を示すものである。これらの図は、具体的な態様を示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５０】
添付の図に記載された方法は、図２に示されるように一工程の方法とすることができるが、ここでは断片化と標識化は、標識された求核試薬を使用して一緒に実行される。
【００５１】
本発明の方法はまた、二工程で実行することもできる。最初の工程は、図１に示される断片化工程であり、これは例えばイミダゾールの作用によるものである。第二及び最終の工程は、図３乃至５に非限定的に記載される標識を使用した標識化の一つであって、この標識化は、フリーなリン酸上で実行されるものであり、これは図６乃至８に示されている。
【００５２】
実施例１-
ＲＮＡ単位複製配列及びＲＮＡ転写産物の調製
Ａ.天然の単位複製配列の調製
天然の単位複製配列(一本鎖ＲＮＡ)は、Gen Probe社（San Diego、CA）が開発したTMA(転写-仲介性増幅)増幅技術を使用して調製した。増幅されたＲＮＡ鎖は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）(ATCC-27294)のリボソーム16SＲＮＡの配列に一致した。この16SＲＮＡを、プラスミドへクローン化し、そしてこのプラスミドを、TAクローニング二重プロモータキット(Ref.:K2050-01-Invitrogen、Groningen、オランダ)より得た細菌へ形質転換した。ＬＢ培地（例えばManiatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual Sec. Edition, p573, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載）で培養し、そして細菌ＤＮＡをアルカリ溶菌で抽出した後、当該鎖について、AmpliScribeT7転写キット(Ref.：AS2607-Epicentre Technologies(Madison,WI)を使用して転写した。一マイクロリットル当たりのコピー数は、260nmでの吸光度を測定して決定した。
【００５３】
B.TMAにより得たＤＮＡからのＲＮＡ転写産物の調製
まず、TMA増幅生成物が、ＲＮＡ単位複製配列に加えて、ＤＮＡ単位複製配列を約90%のＲＮＡ対約10%のＤＮＡの比率で含むことが分かった。これらのＤＮＡ単位複製配列を使用して、試験管内転写により一本鎖ＲＮＡを産生した。
【００５４】
上記の工程１-Ａに記載のプロトコールを使用した同様の方法において、Gen Probe(Ref.:1001E)のMycobacterium tuberculosis Direct(MTD)キットを使用して、単位複製配列をまず、最初の工程で得た。
【００５５】
次の工程では、第一工程において結核菌16SＲＮＡ鋳型を使用し、TMAで得られたＤＮＡ鋳型上で転写を行った。
【００５６】
転写は、５μｌのTMA生成物を、MEGA Script T7キット(AMBION, Austin,TX,Ref.:1334)で使用して行った。反応は、37℃で１時間であった。
【００５７】
C.PCRで得たＤＮＡからのＲＮＡ転写産物の調製
スパチュラを使用して、１つ又は２つのコロニー(直径が3-5mmで、108個の細菌に相当するもの)を、細菌単離株(ATCC-27294)から採集したが、これはLowenstein-Jensen培地で培養していたものであって、1.5mlのエッペンドルフ（商標）管内の250μｌの滅菌水中に再懸濁したものである。核酸は、ガラスビーズの存在下にボルテックスを使用して激しく振盪して、細胞性懸濁液の細胞材料から抽出した。このような抽出は、本出願人の、1997年9月23日出願の特許出願FR97/12164、及び1998年7月23日出願のFR98/09583に詳細に記載されている。
【００５８】
溶菌物の5μｌを、直接ＰＣＲ反応へ添加した。20ngのプラスミドＤＮＡを直接的にPCRへ添加することも可能である。
【００５９】
超可変16S領域は、マイコバクテリウム属に特異的なプライマー(結核菌参考配列であるM20940(Genbank)上の213-236位、及び394-415位）であって、単位複製配列が２０２塩基対（bp）であるものを使用してＰＣＲで増幅した。このプライマーにはまた、バクテリオファージT3又はT7のプロモータ配列がその５’末端に含まれている。以下のプライマーの記載においては、このプロモータ配列は、太字の小文字で示され、一方、結核菌配列は大文字で示す。
「配列表１」
0004439735.tif 000002
【００６０】
PCRは、50mMKCl、10mMTris、pH=8.3、1.5mM MgCl2、0.001%(m/v)ゼラチン、5%(v/v)DMSO、0.5μMのそれぞれのプライマー、200μMの４つのデオキシヌクレオチド三燐酸のそれぞれ、及び1.5単位のTaqポリメラーゼ(AmpliTaq、Perkin-Elmer、Norwalk、CT)を含む100μｌの反応容積で行った。PCR反応は、Perkin-Elmer2400サーモサイクラー(Norwalk、CT)により、開始変性工程を94℃5分間、そして94℃45秒間、60℃30秒間、及び72℃30秒間を35サイクル、そしてその最後のサイクルの後に72℃10分間で行った。PCRの反応産物は、アガロース電気泳動で分析した。
【００６１】
プロモータを含む単位複製配列を使用して、一本鎖のＲＮＡを、試験管内転写を利用して産生した。それぞれの反応は、20μｌの容量を有するが、これには約50ngのＰＣＲ産物、20単位のT3又はT7ポリメラーゼ(Promega、Madison、WI)、40mMトリス-酢酸塩緩衝液、pH=8.l、100mM酢酸マグネシウム[Mg(AcO)2]、10mM DTT、及び1.25mMのヌクレオチド三リン酸のそれぞれ(ATP、CTP、GTP及びUTP)が含まれている。
【００６２】
D.チオリン酸を含むＲＮＡ転写産物についての、ＰＣＲにより得たＤＮＡからの調製
前述の工程1-Cに沿って得られ、且つプロモータを含めて、PCRにより得た単位複製配列を使用して、試験管内転写により、チオリン酸を含む一本鎖ＲＮＡを産生した。それぞれの反応は、20μｌの容量であるが、これは以下の二つの別個の溶液を使用して、約50ngのＰＣＲ産物、20単位のT3又はT7ポリメラーゼ(Promega、Madison、WI)、40mMトリス-酢酸塩緩衝液、pH=8.1、100mM酢酸マグネシウム[Mg(AcO)2]、10mM DTT、及び1.25mMのヌクレオチド三リン酸のそれぞれ又はチオリン酸(ATP-α-チオリン酸(ATP-α-Ｓ)又はCTP-α-チオリン酸(CTP-α-S)が含まれる：
-ATP-α-Ｓ、CTP、GTP、及びUTP、又は
-ATP、CTP-α-Ｓ、GTP、及びUTP。
反応は、３７℃で１時間起こった。
【００６３】
使用したチオリン酸ヌクレオチドは、1.25mMが100％で存在していたので、対応した天然のヌクレオチドを置き換えていることになる。それぞれの場合転写産物は、7Mの尿素存在下で、６％のポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した。臭化エチジウムで染色した後、転写産物のサイズを調べ、そしてゲルに乗せた標準物質との比較により定量化した。
【００６４】
ヌクレオチド、ATP-α-Ｓ及びCTP-α-Sは、N&N Life Science Products(Boston,MA-USA)から入手した。
【００６５】
実施例２-ＲＮＡの化学的断片化
ＲＮＡの化学的断片化は、金属陽イオン(Mn++、Mg++等）により触媒されることが多いが、これはリン酸基に結合することによって、酸素の陰電荷を中和し、したがってリボースの2'位のリン酸をヒドロキシル基が求核的に攻撃することを促進するものである。
【００６６】
求核的攻撃は、プロトンの供与体及び受容体である分子の存在により強化されるが、これには例えばイミダゾール核(R.Breslowand R.Xu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90、1201-1207、1993)があり、実際に図１に描写されている。
【００６７】
断片化は、異なる温度で、及び異なる条件下で行うことができる。二つの異なるタイプの断片化が、以下に記載のようにして実行された。
【００６８】
断片化は60℃で起きることができる。この場合、結核菌の16SＲＮＡ転写産物であって、以下においてマイコバクテリウム転写産物と呼ぶものは、330ヌクレオチド(約66pmol)からなるが、これをイミダゾール(30mM)及び塩化マンガン(30mM)の水溶液中で、60℃で30分間インキュベーションした。断片化溶液の総容積は、100μｌである。断片化したＲＮＡを次に、ポリアクリルアミドゲル(6X、7M尿素)で分析し、そして臭化エチジウムで染色した。
【００６９】
断片化は、95℃でも起きることが可能である。この場合、マイコバクテリウムの330ヌクレオチド(66pmol)の16SＲＮＡ転写産物は、塩化マグネシウム(30mM)の水溶液中で95℃で30分間インキュベーションした。断片化溶液の総容積は、100μｌである。断片化したＲＮＡは次に、ポリアクリルアミドゲル(6x、7M尿素)で分析し、そして臭化エチジウムで染色した。
【００７０】
この二つのタイプの断片化においては、出発化合物が消失し、そして複数の短い断片が出現することがゲル分析で示されたが、その中で最も顕著な集団は、20乃至50ヌクレオチドのサイズを有していた。
【００７１】
以上は、蛍光性標識をＲＮＡ鎖へ、断片化中に導入するするのに使用した二つのプロトコールである。
【００７２】
実施例３-求核性官能基を有する標識を導入することによる、断片化中の標識化Ａ.リボースの2’位のヒドロキシルよりも更に求核性である官能基は、中和したリン酸を攻撃することが可能であるが、したがって、この官能基にリン酸基を介して結合している断片を作り出すことにより当該ＲＮＡを断片化することができる。図２に示すように、この官能基は、標識済みＲＮＡ断片を作り出すために標識に連結することができる。
【００７３】
フルオレセン-カダベリンは、図３に示され、そしてこれはアミン官能基を有し、また、フルオレセン-ヒドラジドは図４に示され、そしてこれはヒドラジド官能基を有するが、これらを使用してマイコバクテリアの（330ヌクレオチドの）16Ｓ  ＲＮＡを、65℃での断片化中に標識した。このＲＮＡは、実施例１Ｂに記載されるようにして得た。
【００７４】
フルオレセン-カダベリン及びフルオレセン-ヒドラジドを、DMF中に溶解して、最終濃度を7.5mMにした。これらは、Molecular Probe社(Eugene、OR、USA)から入手した。
【００７５】
１μｌの標識溶液(DMF中7.5mM)を標的16SＲＮＡ(66pmol)へ添加したが、これは65℃の断片化緩衝液（実施例１）の溶液中にある。65℃で30分間インキュベートした後、それぞれの反応生成物をハイブリダイズし、ＤＮＡチップ(Affymetrix、Santa Clara、CA、USA)上で、製造者が提供するプロトコールにしたがって検出及び分析した。このチップは、特定の配列、本願の場合には結核菌の16SＲＮＡの“Genbank”M20940配列中の213-415領域を同定するように設計されている。フルオレセン-カダベリン又はフルオレセン-ヒドラジドを使用する場合、配列の66%が見つかった。このことは、標識がそれぞれの場合に、断片化中に導入されて、これによって蛍光性の検出可能な断片が作り出されたことを示している。このような同定につてのよい記述が、論文（A.Troeschetal.、J. Clin. Microbiol.37(1)、pp.49-55、1999）に記載されている。
【００７６】
実施例４-ハロゲン化メチルを有する標識による、断片化中の標識化
モノリン酸は、ハロゲン化フェニルメチルを有する標識で置換できることはよく知られている。(T.Ferulaetal., J. Chem. Soc. Perkin Trans.13139-3142、1993を参照)。5-ブロモフルオレセンは、図５に示されているが、これはハロゲン化された標識のカテゴリーに属している。
【００７７】
断片化反応は、開いた形態と平衡している環状モノリン酸基の3'-末端を、フリーにするので、この断片化工程を使用してＲＮＡ断片の３’リン酸基へ標識を取り付けることができる。
【００７８】
Ａ.-TMA増幅により得たＲＮＡ単位複製配列の標識化
マイコバクテリアの(330ヌクレオチドの)16ＳＲＮＡ単位複製配列を、実施例１−Ａに記載されているようにしてTMA増幅により調製した。5-ブロモフルオレセンは、Molecular Probe社(Eugene、OR、USA)より入手した。塩化マンガンは、Sigma社から、イミダゾールは、Aldrich社から入手した。
【００７９】
A-１.標識化  50μｌのTMA：6mMのイミダゾール、及び60mMの塩化マンガンを使用したプロトコール
15μｌのイミダゾール溶液(0.1M)、15μｌの塩化マンガン溶液（1M）、2.5μｌの5-ブロモフルオレセン(100mM)(DMSO中)、及び50μｌのTMA生成物を、直径と長さがそれぞれ12mmと75mmである5mlのポリプロピレン管中の165μｌのＲＮアーゼフリー水(Sigma)中に添加した。この混合物をボルテックスで振盪してホモジナイズし、60℃で30分間インキュベートした。
【００８０】
インキュベーション後、この溶液を、更に精製することなく使用して、バイオチップとも呼ばれるＤＮＡチップ(Affymetrix、Santa Clara、CA、USA)へのハイブリダイゼーション、及び検出を行った。このハイブリダイゼーション工程に用いたプロトコールは、製造者が提供するものであった。これらのチップは、結核菌16SＲＮＡの"Genbank"M20940配列の213-415領域を同定するように設計されている。結果は以下の表１に示す。
【００８１】
【表１】
0004439735.tif 000003
【００８２】
バイオチップ技術による同定においては、同定割合又はスコアについての結果は、参考配列に対する割合分析に対応する。この配列の91.2%が、同定されて、その強度の中央値は、1727Rfuであった。このことは、それぞれに場合において断片化中に標識が導入され、これによって蛍光性且つ検出可能な断片が作り出されたことを意味している。標識化反応の生成物が、予め精製することなくチップに直接的にハイブリダイズしたことに気づくのは重要である。この結果は非常に興味深く、非精製のＲＮＡ転写産物がこの断片化プロトコールにより、イミダゾールと塩化マンガンを使用して効率的に標識化できることを示している。
【００８３】
引き続き、上に記載の標識化プロトコールと、ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション前の精製工程とを使用して、実施例１−Ａに記載のTMA反応の、50μｌ、そして100μｌ（総容積)を標識することを試みた。
【００８４】
65℃でインキュベーションした後、50μｌそして100μｌのTMAを含む二つの標識化反応生成物を、1-ブタノールで処理して過剰の5-ブロモフルオレセンを抽出した。この抽出は、1mlの水飽和済1-ブタノールをそれぞれの場合に使用して二回行った。この抽出は、以下のものと同様に、当該技術分野では周知である。補充的な情報は、特に、Sambrook、Fritsch&Maniatis、Molecular Cloning (Second Edition,1.46）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989に見ることができる。結果は以下の表２に示す。これらの測定は、バイオチップへハイブリダイズして結果を読み取って行った。
【００８５】
【表２】
0004439735.tif 000004
【００８６】
割合同定又はスコアについての結果は、100%の近傍であり、強度についての結果は非常に高い。このことは、ハイブリダイゼーション前の精製により、同定割合及び標識強度を改善し、バックグラウンドを低減することが可能であることを示している。いかなる付加的なハイブリダイゼーション後洗浄サイクルはもはや不要であることは明らかである。
【００８７】
A-2、標識化  50μｌのTMA：30mMのイミダゾール、及び30mMの塩化マンガンを使用したプロトコール
75μｌのイミダゾール溶液（0.1M）、7.5μｌの塩化マンガン溶液(1M)、2.5μｌの5-ブロモフルオレセン(100mM)（DMSO中）、及び50μｌのTMA生成物を、5mlポリプロピレン管中の112μｌのＲＮアーゼフリー水(Sigma)へ添加した。この混合物をボルテックス振盪してホモジナイズし、そして60℃で30分間インキュベートした。
【００８８】
インキュベーション後、50μｌのTMA生成物から得られた二つの標識化反応生成物を、1-ブタノールで処置して、過剰の5-ブロモフルオレセンを抽出した。この抽出は、1mlの水飽和済1-ブタノールをそれぞれの場合に使用して二回行った。結果は以下の表３に示す。これらの測定は、バイオチップへハイブリダイズして結果を読み取って行った。
【００８９】
【表３】
0004439735.tif 000005
【００９０】
増幅した配列の92.7%を同定したが、その強度の中央値は、444Rfuであった。これらの結果は、30mMイミダゾール及び30mMのMnCl2を使用したプロトコールにより、標識済みの単位複製配列の断片が産生されることを示す。しかしながら、強度レベルは、イミダゾール/MnCl2=6mM/60mMのプロトコールで得たものよりも低い。
【００９１】
この方法は最適化することができる。金属塩が高濃度であることは、標識化反応には非常に重要である。他の金属又は他の緩衝液を使用してこの標識化反応を断片化中に行うことができる。
【００９２】
B.-  TMA増幅転写後に得られるＲＮＡ転写産物の標識
標的のマイコバクテリウムの(330ヌクレオチドの)16SＲＮＡ転写産物を、実施例１-Ｂに記載の転写により調製した。
【００９３】
15μｌのイミダゾール溶液（0.1M）、15μｌの塩化マンガン(1M)溶液、2.5μｌの5-ブロモフルオレセン(100mM)（DMSO中）、及び50μｌの転写生成物を、5mlのポリプロピレン管中の165μｌのＲＮアーゼフリー水(Sigma)へ添加した。混合物は、ボルテックスで振盪してホモジナイズし、60℃で30分間インキュベーションした。
【００９４】
インキュベーション後、溶液を実施例３（Ａ-１）のようにして処理して、過剰の5-ブロモフルオレセンを除去した。標識した断片を次に、結核菌16Ｓ  ＲＮＡの”Genbank”M20940配列の213-415領域を同定するように設計されたＤＮＡチップ(Affymetrix、Santa ClarotCAUSA)にハイブリダイズして検出した。結果は、以下の表４に示す。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
配列の97.6%が同定され、そして強度の中央値は1426Rfuであった。この結果は、TMA転写後に作り出されるＲＮＡを標識化するために使用する、この断片化中標識化方法が、効果的であることを示している。これらの標的ＲＮＡ転写産物は、精製することなく標識化反応において使用される。
【００９７】
C.チオリン酸を含む、ポスト-ＰＣＲ増幅ＲＮＡ転写産物の標識化
標的のマイコバクテリウムの(330ヌクレオチドの)16SＲＮＡ試料は、実施例１-Ｄに示されるように、アデノシン三リン酸(ATP)が、ATP-α-チオで置換されるか(二つの実験を行っている)、又はシチジン三リン酸(CTP)の100%がCTP-α-チオ(一つの実験を行っている)で置換されている、ポスト-ＰＣＲ転写反応により産生した。
【００９８】
これらのＲＮＡ試料は、上に記述したプロトコールを使用して、イミダゾール及び塩化マンガンの存在下に標識した。65℃で30分間インキュベートした後、反応生成物を、製造者提供のプロトコールにそってＤＮＡチップ(Affymetrix、Santa Clara CA USA)にハイブリダイズして検出した。結果は以下の表５に示す。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
ATP-α-Sの場合には配列の97.1及び100%が同定され、CTP-α-Sの場合には配列の93.6%が同定された。強度の中央値は、1000乃至1300Rfuの間である。この結果は、チオリン酸を含むＲＮＡ試料を標識化するのに使用した断片化中標識化方法が、イオウを一切含まないヌクレオチドの場合と同様に効果的であることを示している。これらの標的ＲＮＡ転写産物は、精製することなく標識化反応に使用される。
【０１０１】
実施例５-天然のＲＮＡの標識
培養懸濁液を、固体培地上で単離された純粋な株から得た。この懸濁液は、無菌の水で調製したものであるが、これはMcFarland指標の２（即ち約3.108個の細菌/ml）に標準化されたものであり、次いで、エッペンドルフ管で1分間遠心した。
【０１０２】
ＲＮＡを、以下の様式で細菌性のバイオマスから抽出した。細菌性のペレットは、100μｌの溶菌緩衝液(30mMトリス-HCl、5mM EDTA、100mM NaCI、2% SDS、5mg/mlプロテナーゼＫ、ｐＨ  7.3、フランスVIAL社製の直径が100μm-の丸いガラスビーズが50μｌ存在する）に再懸濁して溶解した。この混合物を、30秒間、ボルテックスした。次いでこれを37℃で15秒間インキュベーションした。100μｌの飽和フェノールを添加した。この混合物を30秒間ボルテックスした。水相を回収して、次に100μｌのクロロホルムで抽出した。この混合物をもう一度、30秒間ボルテックスした。この水相をもう一度回収した。エーテル抽出を二回行い、そして溶媒を蒸発させた。そうするとここで、約50μｌの、全ＲＮＡを含んだ水性相が残る。Qiagen Rneasy（商標）キットを、この抽出の代わりに使用することができる。
【０１０３】
本発明において記載する技術は、以下のようにして、試薬を以下の順序で添加して、細菌性バイオマスからの全ＲＮＡ標識するのに使用することができる：
-全ＲＮＡを抽出（50μｌ）、
-水(100μｌまでの必要量)、
-6μｌの1Mイミダゾール(最終濃度60mM)、
-6μｌの1M MnCl2(最終的濃度60mM)、
-この溶液を10秒間、ボルテックスする、
-2μｌの50mM 5-ブロモフルオレセン(最終濃度1mM）
-この混合物を、数回ピペッティングしてホモジナイズする
-この混合物を、1秒間ボルテックスする、
-この混合物を1秒間遠心して、チューブの底面に収集する、そして
-チューブを60℃で30分間インキュベーションする。
【０１０４】
以下の手順を使用して、過剰なフリーの標識を除去した。100μｌの標識した混合物へ、以下のものを添加した：
-40μｌのサケ精子ＤＮＡ
-100μｌの3M酢酸ナトリウム(最終濃度610mM)、pH5.2
-250の冷イソプロパノール(-20℃)
【０１０５】
この混合物をボルテックスし、そして次に1分間遠心した。この上清を捨てた。ペレットを次に、ハイブリダイゼーション緩衝液（6xSSPE（リン酸ナトリウム生理食塩水エチレン時アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））、5mM DTAB（臭化ドデシルトリメチルアンモニウム）、3Mベタイン、0.05%トリトン、250μg/mlのニシンの精子ＤＮＡ）に再懸濁した。
【０１０６】
臭化エチジウムを使用して、1%アガロースゲル中の以下の試料を可視化した：
本発明により標識化する前の全ＲＮＡ試料(A)、
本発明により標識化した後の全ＲＮＡ試料(B)。
【０１０７】
紫外(ＵＶ)光の下で臭化エチジウムを可視化すると、以下のものが見られた：
Aのウェルの場合、主要なＲＮＡ種に特徴的なバンドの存在が、上から下へ以下のものについて見られた：23Ｓ、16Ｓ、そしてメッセンジャーＲＮＡの集団に対応した拡散したバンド、
Bのウェルの場合、断片化ＲＮＡ全体の混合物に対応した集団が、ゲルの底面に存在した。
【０１０８】
フルオレセンの可視化後、以下のことが判明した：
-Aのウェルの場合、何もなかった；
-Bのウェルの場合、断片化ＲＮＡ全体の混合物に対応し、フルオレセンで共有結合された集団が、ゲルの底面に存在したが、これはこのＲＮＡ試料が断片化されて、標識されたことを証明している。この対照は、以下に記載される全ての細菌種に対して行った。
【０１０９】
このようにして標識されたＲＮＡの一部を、オリゴヌクレオチドが写真平板法で移植されたガラス製の固形支持体(バイオチップ)にハイブリダイズした。これらのオリゴヌクレオチドは、A.Troeschらによる論文（J. Clin Microbiol.、37(1)、pp.49-55、1999）に記載されるものと同様の方法により、異なる種を同定することを可能にする。結果は、以下の表６に示す。
【０１１０】
【表６】
0004439735.tif 000008
【０１１１】
バイオチップ上で最も高いスコアを有する種は、常に探索後（sought-after）の種であり、得られたスコアは、右側のカラムに示してある。
【０１１２】
同定は、それぞれの種についてはあっていて、これは本発明の方法が、天然のＲＮＡ試料でも、増幅技術由来のＲＮＡ試料と同様にに効果的であることを証明している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この図は、Mn++陽イオン及びイミダゾール存在下にＲＮＡを化学的に断片化することを示すものである。
【図２】  この図は、断片化、及び求核性官能基を有する標識でのＲＮＡの標識化を示すものである。
【図３】  この図は、図２に示される方法とともに使用することが可能な標識であって、フルオレセン-カダベリンからなるものを示すものである。
【図４】  この図は、図２に示される方法とともに使用することが可能な標識であって、フルオレセン-ヒドラジドからなるものを示すものである。
【図５】  この図は、本発明の方法で使用することが可能なハロゲン化された標識を示すものである。
【図６】  この図は、本発明の方法により得られたＲＮＡ断片の３’末端を示すものであるが、ここで標識は天然のリン酸に取り付けられていて、Ｚはスペーサーアームとも呼ばれる、カップリングしたアームであり、これは本出願人の以前の特許出願である、1997年8月1日出願のPCT/PR97/01445に定義されている通りである。このＺの定義は、図７及び８にも適用される。
【図７】  この図は、本発明の方法により得られたＲＮＡ断片の３’末端であって、標識がチオリン酸に結合したものを示すものである。
【図８】  この図は、本発明の方法により得られたＲＮＡ断片の５’末端であって、標識が天然のリン酸に結合したものを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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