(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラトニンを含む生体試料の流れ方向に対し試料注入装置の下流側で、かつ第１のカラムの上流側に、誘導体化処理の一部を実施するリアクター及び第２のカラムを設けた高速液体クロマトグラフィー装置を駆動する高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラムであって、
コンピュータに、
導入された前記メラトニンを含む生体試料の温度及び流体圧力を上昇させる昇温・昇圧手段の動作が安定したことを検知するステップと、
前記昇温・昇圧手段の動作が安定したことを検知した時、前記メラトニンを含む生体試料を前記昇温・昇圧手段に供給する第１の状態から、前記昇温・昇圧手段と前記メラトニンを含む生体試料から前記メラトニンを抽出処理する第２のカラムとを接続する第２の状態に切替えるステップと、
前記第１の状態から前記第２の状態への切換えが終了した後、前記生体試料の流れ速度を速めるステップと、
前記第２のカラムにおいて、前記メラトニンを含む生体試料から前記メラトニンを抽出する処理が終了したことを検知するステップと、
前記メラトニンを含む生体試料からの前記メラトニンの抽出処理が終了したことを検知した時、前記第２の状態から、前記第２のカラムを前記メラトニンを含む生体試料を分離処理する第１のカラムに接続する前記第３の状態に切替えるステップと、
を実行させるための高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラム。
【請求項２】
メラトニンを含む生体試料の流れ方向に対し試料注入装置の下流側で、かつ第１のカラムの上流側に、誘導体化処理の一部を実施するリアクター及び第２のカラムを設けた高速液体クロマトグラフィー装置を駆動する高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、
コンピュータに、
導入された前記メラトニンを含む生体試料の温度及び流体圧力を上昇させる昇温・昇圧手段の動作が安定したことを検知するステップと、
前記昇温・昇圧手段の動作が安定したことを検知した時、前記メラトニンを含む生体試料を前記昇温・昇圧手段に供給する第１の状態から、前記昇温・昇圧手段と前記メラトニンを含む生体試料から前記メラトニンを抽出処理する第２のカラムとを接続する第２の状態に切替えるステップと、
前記第１の状態から前記第２の状態への切換えが終了した後、前記生体試料の流れ速度を速めるステップと、
前記第２のカラムにおいて、前記メラトニンを含む生体試料から前記メラトニンを抽出する処理が終了したことを検知するステップと、
前記メラトニンを含む生体試料からの前記メラトニンの抽出処理が終了したことを検知した時、前記第２の状態から、前記第２のカラムを前記メラトニンを含む生体試料を分離処理する第１のカラムに接続する前記第３の状態に切替えるステップと、
を実行させるための高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラム及び記録媒体に係り、特にメラトニンの分析に用いて好適な高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラム及び記録媒体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
メラトニンは、トリプトファンから生合成される松果体ホルモンであり、古くから性腺調節機能を有することが知られているとともに、近年では視交叉上核に作用し、体内時計を調整している可能性が指摘されている。現代社会では、睡眠覚醒症候群等の体内時計異常が関与する疾患が急増しており、メラトニンの詳細な作用機序解明が望まれている。
【０００３】
しかし、一般に知られているメラトニンの分析法では、感度が不足しており、未だ不明な部分が多い。特に、行動学や時間薬理学的研究に汎用されるラットやマウスの内因性メラトニンは極微量であるため、ほとんどの組織でメラトニンの定量が困難であった。そこで、本発明者等は、メラトニン高感度定量法として、アルカリ性下、過酸化水素を用いるプレカラム蛍光誘導体化高速液体クロマトグラフィー装置（以下、ＨＰＬＣという）法の開発を試み、従来法と比較して約１０倍以上の高感度化を達成した。
【０００４】
以下、本発明者等が開発したメラトニンの分析方法（以下、本分析法という）について説明する。
本分析法では、例えばラットより松果体を摘出し、これより松果体試料を調製し、調製された松果体試料をＨＰＬＣに導入することにより分析処理を行なう。図６は、従来における松果体試料の調製手順を示している。
【０００５】
松果体試料を調製するには、例えば  ラット（Wistar系、雄性、６週齢、ＳＰＦ）及びマウス（種々の系統の雄性、８週齢、ＳＰＦ）のものを使用し、それぞれエーテル麻酔下で松果体を摘出し、これステップ３０（図では、ステップをＳと略称している）に示すように、氷冷した５００μｌのメタノールで均質化処理する。
【０００６】
続いて、均質化された松果体４５００ｇを５分間遠心分離し（ステップ３１）、その上清５０μｌ（マウスは２００μｌ）を注出する（ステップ３２）。次に、これに５ｎＭ内部標準物質（ＭＩＡＡ）及びメタノール（MeOH）を添加し（ステップ３３）、これを乾固する（ステップ３４）。続いて、これに４０μｌ（マウスでは３０μｌ）の水を加え（ステップ３５）、その上で、ステップ３６以降の誘導体化処理を実施する。
【０００７】
誘導体化処理では、先ず上記の松果体試料に２Ｍ  Na2CO3水溶液５μｌと５０ｍＭ  H2O2水溶液５μｌを加える（ステップ３６，３７）、その上でこれを１００℃、３０min加熱処理する（ステップ３８）。続いて、メラトニンの濃縮を行なうため、複数回（Ｎ回）にわたりメラトニンの抽出を実施し（ステップ３９，４０）、これを乾燥させる（ステップ４１）。
【０００８】
続いて、これに１０％  CH3CN水溶液５０μｌを添加（ステップ４２）した上でＨＰＬＣに導入し、メラトニンの分析を行なう（ステップ４３）。  上記したステップ３０〜ステップ４３に示す松果体試料の調製処理は、従来では全て手動（手作業）により行なわれていた。
【０００９】
図７は、メラトニンの分析に用いられていた従来のＨＰＬＣ３０を示す構成図である。このＨＰＬＣ３０は、移動相用容器３１，ポンプ３３，試料注入装置（試料注入装置）３５，カラム１０，検出器３７，及び廃液用容器３８等により構成されている。
移動相用容器３１は、移動相３２を貯めておく容器である。ポンプ３３は、配管３９を用いて移動相用容器３１内の移動相３２を吸引すると共に、吸引された移動相３２を配管４０に所定の圧力で吐出する機能を奏するものである。ポンプ３３から移動相３２が吐出される配管４０は、試料注入装置３５に接続されている。
尚、配管４０の途中位置には圧力計３４が配設されており、この圧力計３４の出力に基づき、ポンプ３３は配管４０内の移動相３２の圧力が一定となるよう制御される。
【００１０】
試料注入装置３５は、注入ポート４４から上記のように調製された松果体試料が導入（注入）される。注入ポート４４から注入された松果体試料は、移動相３２と混合され配管４１を介してカラム１０に送られる。
【００１１】
カラム１０は、松果体試料の分析処理を行なうためのカラム充填剤が充填されている。このカラム１０で成分分離された試料は、注入配管４２を介して検出器３７に注入され成分分析され、これによりメラトニンの定量を行なうことができる。前記したように、上記した本分析法によれば、従来のメラトニン分析法に比べて約１０倍の高感度化を図ることができる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら上記した本分析法では、全て手動により松果体試料の調製処理が行なわれていたため、分析処理に要する時間が長くなり、効率の良い分析を行なうことができないという問題点があった。
【００１３】
また、ステップ３８の加熱処理、及びステップ３９の抽出処理等においては、手動作業により必然的に誤差が発生し、この誤差が分析データに反映されてしまい、メラトニンの分析精度が低下するおそれがあるという問題点があった。
【００１４】
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、高精度のメラトニン分析処理を効率よく行なうための高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラム及び記録媒体を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明では、
メラトニンを含む生体試料の流れ方向に対し試料注入装置の下流側で、かつ第１のカラムの上流側に、誘導体化処理の一部を実施するリアクター及び第２のカラムを設けた高速液体クロマトグラフィー装置を駆動する高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラムであって、
コンピュータに、
導入された前記メラトニンを含む生体試料の温度及び流体圧力を上昇させる昇温・昇圧手段の動作が安定したことを検知するステップと、
前記昇温・昇圧手段の動作が安定したことを検知した時、前記メラトニンを含む生体試料を前記昇温・昇圧手段に供給する第１の状態から、前記昇温・昇圧手段と前記メラトニンを含む生体試料から前記メラトニンを抽出処理する第２のカラムとを接続する第２の状態に切替えるステップと、
前記第１の状態から前記第２の状態への切換えが終了した後、前記生体試料の流れ速度を速めるステップと、
前記第２のカラムにおいて、前記メラトニンを含む生体試料から前記メラトニンを抽出する処理が終了したことを検知するステップと、
前記メラトニンを含む生体試料からの前記メラトニンの抽出処理が終了したことを検知した時、前記第２の状態から、前記第２のカラムを前記メラトニンを含む生体試料を分離処理する第１のカラムに接続する前記第３の状態に切替えるステップと、
を実行させることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明によれば、昇温・昇圧手段の動作が安定したことを検知した後、コンピュータは切替え装置を第１の状態から第２の状態に切替える。従って、第２の状態に切替わった際、第２のカラムには昇温・昇圧手段で加熱されたメラトニンを含む生体試料が導入される。この際、昇温・昇圧手段は安定状態であるため、メラトニンを含む生体試料の加熱状態も安定しているため、第２のカラムにおいてメラトニンを抽出処理する処理を確実に行なうことができる。
【００１７】
また、コンピュータは、第２のカラムにおけるメラトニンを含む生体試料からメラトニンを抽出する処理が終了したことを検知した後、切替え装置を第２の状態から第３の状態に切替える。従って、切替え装置が第３の状態に切替わった際、第１のカラムには第２のカラムにおいて確実にメラトニン抽出された試料が注入される。このため、第１のカラムにおいてメラトニンを含む生体試料からメラトニンを分離する処理を確実に行なうことができ、よって高精度のメラトニン分析を行なうことが可能となる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態について図面と共に説明する。
【００１９】
図１は、本発明の一実施例である高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＰＬＣ）１を示す構成図である。このＨＰＬＣ１は、大略すると第１のポンプ４，試料注入装置５，リアクター６（請求項に記載の昇温・昇圧手段に相当する），切替えバルブ９（請求項に記載の切替え装置に相当する），第２のポンプ１４，第１のカラム１６，第２のカラム１５，及び検出器１８等により構成されている。
【００２０】
第１のポンプ４及び第２のポンプ１４は、第１の移動相２或いは第２の移動相１２を吸引すると共に、吸引された移動相２，１２を所定の圧力で吐出する機能を奏するものである。この第１及び第２のポンプ４，１４としては、例えばプランジャータイプポンプ，シリンジタイプポンプ，ダイヤフラムタイプポンプ，エアシリンダータイプポンプ等を用いることができる。 特に、第１のポンプ４は、吐出する第１の移動相２の流速を変更できる構成とされている。
また本実施例では、第１の移動相２として1.3％  メタノール（MeOH）を用い、第２の移動相１２として10％CH3CN含有100mMリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を使用した。
【００２１】
一方、第１の移動相２の流れ方向に対して第１のポンプ４の上流側には第１の移動相脱気装置３が、また第２の移動相１２の流れ方向に対して第２のポンプ１４の上流側には第２の移動相脱気装置１３が配設されている。この第１及び第２の移動相脱気装置３，１３は、移動相２，１２に含まれ、メラトニンの分析に際しノイズの原因となる気泡を脱気する機能を奏するものである。
【００２２】
上記の第１のポンプ４から吐出された第１の移動相２は、試料注入装置５に送られる。試料注入装置５は、例えばユニバーサルインジェクタであり、注入ポート５ａから後述するように調製される松果体試料が注入される。注入ポート５ａから注入された松果体試料は、試料注入装置５において第１の移動相２と混合された上でリアクター６に送られる。
【００２３】
リアクター６は、反応コイル７とヒータ８とにより構成されている。反応コイル７の上流側端部（図中、左側の端部）は試料注入装置５と接続されている。また下流側端部（図中、右側の端部）は、後述する切替えバルブ９のポートＰ１に接続されている。このリアクター６では、試料注入装置５から送られてくる松果体試料をヒータ８により所定の温度（例えば、100℃）まで加熱する処理を行なう。
【００２４】
切替えバルブ９は、６個のポート（Ｐ１〜Ｐ６）を有した電動の六方切替えバルブである。この切替えバルブ９は、後述するコンピュータ２０により各ポートＰ１〜Ｐ６の切替え処理を行なう。尚、この切替えバルブ９は、ＨＰＬＣにオプションとして付設されるものであり、比較的低コストのものである。
【００２５】
図１に示す状態では、ポートＰ１とポートＰ２、ポートＰ３とポートＰ４、及びポートＰ５とポートＰ６が連通している。以下の説明では、図１に示す切替えバルブ９の状態をバルブＡ状態というものとする。
【００２６】
前記のように、切替えバルブ９は６個のポート（Ｐ１〜Ｐ６）を有しているが、ポートＰ１はリアクター６に接続され、ポートＰ２は廃液容器１０に接続され、ポートＰ３は第２のカラム１５の図中下端に接続され、ポートＰ４は第２のポンプ１４に接続され、ポートＰ５は第１のカラム１６の図中右端に接続され、更にポートＰ６は第２のカラム１５の図中上端に接続されている。
【００２７】
尚、図では、連通しているポート間を実線で示しており、連通していないポート間を破線で示している。また、切替えバルブ９によるポート切替えの具体的動作については、説明の便宜上後述するものとする。
第１のカラム１６は内径1.0mm、長さ150mmのCAPCELL  PAK  C18MG(株式会社資生堂製)がカラムとして用いられている。この第１のカラム１６は、後述するように導入される松果体試料（メラトニンを含む生体試料）からメラトニンを分離する機能を奏するものである。また、第１のカラム１６はカラムオーブン１７内に配設されており、このカラムオーブン１７により温度管理される構成となっている。具体的には、第１のカラム１６は、カラムオーブン１７により４０℃に管理される。
【００２８】
第２のカラム１５は内径1.5mm、長さ35mmのCAPCELL  PAK  C18MG(株式会社資生堂製)がカラムとして用いられている。この第２のカラム１５は、後述するように松果体試料が導入された際、松果体試料中のメラトニンを濃縮する機能を奏するものである。
【００２９】
検出器１８は、本実施例では蛍光検出器を用いている。この蛍光検出器は、メラトニンに励起光源を照射したときに発生する特定波長の蛍光の蛍光強度を測定することにより、メラトニンの検出を行なう構成とされている。本実施例では、この蛍光検出は、励起波長245nm、蛍光測定波長380nmで行なった。
【００３０】
一方、コンピュータ２０はＨＰＬＣ１を統括的に制御するものである。このコンピュータ２０は、前記した第１のポンプ４,試料注入装置５，リアクター６，切替えバルブ９，第２のポンプ１４，カラムオーブン１７，及び検出器１８と接続されている。そして、後述するメラトニン分析処理プログラムに従い、メラトニンの分析処理を行なう。
【００３１】
続いて、本実施例における松果体試料の調製処理について説明する。図２は、本実施例における松果体試料の調製処理の手順を示すフローチャートである。
ここで、図２に示される本実施例に係る松果体試料の調製処理手順と、先に図６を用いて説明した従来の松果体試料の調製処理手順と比較すると、図２に示される松果体試料の調製処理手順のステップ１０〜ステップ１７は、図６を用いて説明した従来の松果体試料の調製処理手順のステップ３０〜ステップ３７と同一である。
しかしながら本実施例の調製処理では、従来実施されていたステップ３８〜ステップ４２の処理を実施していない。本実施例では、このステップ３８〜ステップ４２の処理をＨＰＬＣ１において実施させるよう構成したことを特徴とする。
【００３２】
先に説明したように、図６に示すステップ３０〜ステップ４２は、いずれも手動で行なう（人手により行なう）処理である。従って、従来ではステップ３８〜ステップ４２の処理も手動で行なっていた。手動による処理では、必然的に人的誤差や誤処理が発生してしまい、また機械的な自動処理に比べて処理速度も遅くなる。
【００３３】
本実施例では、従来手動で行なわれていたステップ３８〜ステップ４２の処理をＨＰＬＣ１で実施させる構成としたため、メラトニンの分析精度を低下させる要因となる人的誤差及び誤処理の発生を低減することができ、これによりメラトニンの分析精度の向上を図ることができる。また、松果体試料の調製処理に要する時間を短くすることができるため、メラトニンの分析処理の効率化を図ることができる。
尚、ステップ１０〜ステップ１７の処理は、前記のようにステップ３０〜ステップ３７の処理と同一であるため、各々のステップのここでの説明は省略するものとする。
【００３４】
続いて、図１に示したＨＰＬＣ１によるメラトニンの分析処理について説明する。また、このメラトニン分析処理の説明の中において、上記のように松果体試料の調製処理において除去されたステップ３８〜ステップ４２の処理が、ＨＰＬＣ１のいずれの部位で実施されているのかを明確化する。
【００３５】
前記したように、ＨＰＬＣ１を構成する各駆動装置４，５，６，９，１４，１７，１８は、コンピュータ２０により駆動制御されることによりメラトニンの分析処理が行なわれる。図３は、コンピュータ２０が実施する高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラム（以下、駆動プログラムという）を示すフローチャートである。この駆動プログラムは、コンピュータ２０の記憶装置に格納しておく構成としても、またコンピュータ２０に読み取り可能な記録媒体（例えば、ディスク状記録媒体等）に格納しておき、メラトニン分析時毎にコンピュータ２０に読み込ませる構成としてもよい。
【００３６】
同図に示す駆動プログラムが起動すると、先ずコンピュータ２０は起動処理を実施する（ステップ２０）。この起動処理では、第１及び第２のポンプ４，１４の起動、リアクター６のヒータ８及びカラムオーブン１７への通電開始、及び切替えバルブ９のバルブＡ状態（図１に示す状態）への切替えが行なわれる（この状態が請求項記載の第１の状態である）。また、試料注入装置５には上記のように調製された松果体試料が導入（注入）される。
上記のように、第１のポンプ４が起動することにより、第１の移動相２は第１のポンプ４に吸引され、続いて試料注入装置５に向け例えば４０μｌ/minで吐出される。この際、第１の移動相２は、第１の移動相脱気装置３を通過することにより脱気処理が行なわれる。
【００３７】
第１のポンプ４から吐出された第１の移動相２は、試料注入装置５において松果体試料を導入される。そして、導入された松果体試料は第１の移動相２の流れに沿ってリアクター６に供給される。尚、図１において、松果体試料の流れを実線の矢印で示している。
【００３８】
リアクター６に供給された松果体試料は、反応コイル７を通過する間にヒータ８により加熱処理が行なわれ誘導体化反応が完結する。この加熱処理は、先に図６を用いて説明した従来の松果体試料調製処理における、ステップ３８の処理に対応するものである。
【００３９】
また、反応コイル７は完全に密閉されており、また反応コイル７の内径は他の配管部分に比べて小径とされている。よって、反応コイル７内の圧力は上昇し、リアクター６により松果体試料を加熱する際、短時間で所定温度（例えば、100℃）まで昇温させることができ、誘導体化反応を速やかに完結することができる。
このため、従来ステップ３８の加熱処理（図６参照）では３０分程度必要であった反応時間を、リアクター６を用いることにより６分程度で誘導体化反応を完結することができる。これにより、メラトニンの分析処理の効率化を図ることができる。
【００４０】
また、図６のステップ３８の処理は手動により行なわれていたが、本実施例では松果体試料に対する昇温・昇圧処理は自動的に行なわれるため、誘導体化反応において従来の手動処理で発生していた圧力バラツキ及び温度バラツキに起因したデータのバラツキを抑制することができる。 尚、ヒータ８の加熱温度はコンピュータ２０により制御されており、松果体試料を上記所定温度に安定して昇温できるよう構成されている。
【００４１】
また前記したように、起動処理時において切替えバルブ９はバルブＡ状態とされているため、リアクター６から流出した松果体試料は、ポートＰ１からポートＰ２に流れ、その後に廃液容器１０に廃棄される。
【００４２】
一方、第２の移動相１２は第２のポンプ１４が起動することにより吸引され、続いてポートＰ４，Ｐ５を介して第２のカラム１５に向け例えば５０μｌ/minで吐出される。この際、第２の移動相１２は、第２の移動相脱気装置１３を通過することにより脱気処理が行なわれる。
【００４３】
第２のカラム１５を通過した第２の移動相１２は、切替えバルブ９がバルブＡ状態とされているため、ポートＰ６，Ｐ５を介して第１のカラム１６に導入される。カラムオーブン１７は第１のカラム１６を覆うように配設されており、第１のカラム１６を加熱処理する。
このため、第１のカラム１６は、カラムオーブン１７により例えば４０℃に加熱される。このカラムオーブン１７も、コンピュータ２０により温度制御が行なわれ、第１のカラム１６の温度が一定となるよう構成されている。第１のカラム１６から流出した第２の移動相１２は、検出器１８を通過した後、廃液容器１９に廃棄される。
【００４４】
上記した起動処理は、時間Ｔ１が経過するまで実施される（ステップ２１）。本実施例では、この時間Ｔ１を６分に設定している。上記の起動処理を時間Ｔ１が経過するまで実施することにより、第１及び第２のポンプ４，１２の動作は安定し、各ポンプ４，１２から吐出される移動相２，１２の流量も所定流速に安定する。また、ヒータ８及びカラムオーブン１７の温度も安定するため、反応コイル７を流れる松果体試料及び第１のカラム１６の温度を既定温度まで確実に昇温することができる。
【００４５】
ステップ２１で時間Ｔ１が経過したと判断されると、換言すればＨＰＬＣ１の各駆動装置４，５，６，１４，１７が安定したと判断されると、処理はステップ２２に進み、コンピュータ２０は第１のポンプ４の流速を変更する。具体的には、第１の移動相２の流速を４０μｌ/minから２００μｌ/minに変更する。
【００４６】
続くステップ２３では、コンピュータ２０は切替えバルブ９を図４に示す状態となるよう駆動する（以下、図４に示す切替えバルブ９の状態をバルブＢ状態という）。この切替えバルブ９がバルブＢ状態に切替えられることにより、ポートＰ１とポートＰ６、ポートＰ２とポートＰ３、及びポートＰ４とポートＰ５が連通された状態となる（この状態が請求項に記載の第２の状態である）。
【００４７】
よって、試料注入装置５で注入された松果体試料は、第１の移動相２の流れに沿って、リアクター６で加熱処理された後、ポートＰ１，Ｐ６を介して第２のカラム１５に導入される。この第２のカラム１５は、第１の移動相２と共に松果体試料が導入された際、松果体試料中に含まれる妨害物質（メラトニンの検出に際し、ノイズとなる物質）の除去を行なうと共にメラトニンを抽出する機能を奏する（この抽出処理は濃縮処理ということもできる）。この第２のカラム１５の機能は、先に図６を用いて説明した従来の松果体試料調製処理における、ステップ３９，４０の処理に対応するものである。
【００４８】
尚、このバルブＢ状態では、第２のポンプ１４により吸引された第２の移動相１２は、ポートＰ４，Ｐ５を介して第１のカラム１６に導入され、その後検出器１８を通過して廃液容器１９に廃棄される。
【００４９】
上記したバルブＢ状態は、時間Ｔ２が経過するまで実施される（ステップ２４）。この時間Ｔ２は、第１のカラム１６において松果体試料中のメラトニンを抽出するのに十分な時間が設定されている。本実施例では、この時間Ｔ２を２分に設定している。
【００５０】
ステップ２４で時間Ｔ２が経過したと判断されると、換言すれば第１のカラム１６において松果体試料中のメラトニンの抽出が確実に行なわれたと判断されると、コンピュータ２０はステップ２５において切替えバルブ９を再びバルブＡ状態に切替え、続くステップ２６において第１のポンプ４の流速を２００μｌ/minから４０μｌ/minに戻すよう流速変更する。
【００５１】
図５は、切替えバルブ９を再びバルブＡ状態に切替えた状態を示している（この状態が請求項に記載の第３の状態である）。切替えバルブ９がバルブＡ状態に切替えられることにより、ポートＰ１とポートＰ２、ポートＰ３とポートＰ４、及びポートＰ５とポートＰ６が連通された状態となる。
これにより、第２のカラム１５で濃縮された松果体試料中のメラトニンは、第２の移動相１２の流れに従いポートＰ６，Ｐ５を介して第１のカラム１６に導入される。即ち、ステップ２５の処理は、図６におけるステップ４２，４３の処理に対応するものである。
【００５２】
第１のカラム１６は、導入される松果体試料からメラトニンを分離する機能を奏するものである。このメラトニンの分離の際、第１のカラム１６はカラムオーブン１７により所定温度に加熱されており、また第１のカラム１６に導入されるメラトニンは第２のカラム１５において抽出（濃縮）処理が実施されているため、メラトニンの分離処理を円滑かつ確実に実施することができる。
【００５３】
更に、本実施例では、大きな内径の第２のカラム１５に松果体試料を導入した後、小さな内径の第１のカラム１６に松果体試料を導入する構成としているため、松果体試料の流速を高めても確実にメラトニンの分離を行なうことができる。また、小さな内径の第１のカラム１６で分離処理が行なわれるため、短時間でメラトニンの分離を行なうことができる。
【００５４】
第１のカラム１６で分離処理が行なわれた松果体試料は、続いて検出器１８に送られメラトニンの検出処理が行なわれる（ステップ２７）。  前記したように、検出器１８は蛍光検出器を用いており、メラトニンに励起光源を照射したときに発生する特定波長の蛍光の蛍光強度を測定することによりメラトニンの検出を行なう構成とされている。
【００５５】
本実施例では、上記したようにメラトニンをアルカリ性下過酸化水素と反応させている。これにより、メラトニンには新たな蛍光体が生成し、その励起極大波長は245nm、蛍光最大波長は380nmである。この蛍光体は、優れた安定性を有していることに加え、その検出限界は、500amolと非常に高感度である。このため、本実施例に係るＨＰＬＣ１を用いることにより、高精度のメラトニン分析を行なうことが可能となる。
【００５６】
また、ＨＰＬＣ１は、松果体試料の流れ方向に対し試料注入装置５の下流側で、かつ第１のカラム１６の上流側に誘導体化処理の一部を実施するリアクター６及び第２のカラム１５（誘導体化装置）を設けたことにより、松果体に対する誘導体化処理の一部がＨＰＬＣ１内で自動的に実施される。
このため、従来のように手動処理を実施していた時に発生していたデータのバラツキを抑制することができ、高精度のメラトニン分析を行なうことが可能となる。また、手動で行なう場合に比べ、短時間で誘導化を行なうことができ、分析効率の向上を図ることができる。
【００５７】
尚、上記した実施例ではリアクター６（ヒータ８及びカラムオーブン１７）の温度が安定するのを検知する手段として時間Ｔ１を測定する構成としが、このリアクター６の安定状態の検知はこれに限定されるものではなく、例えばリアクター６に温度センサを配設し、この温度センサの出力により安定したか否かを検知する構成としてもよい。
【００５８】
【発明の効果】
上述の如く本発明によれば、第２のカラムにおいてメラトニンを抽出処理する処理を確実に行なうことができ、また第１のカラムでは第２のカラムにおいて確実にメラトニン抽出された試料に基づきメラトニンを分離処理が実施されるため、高精度のメラトニン分析を行なうことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例である高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラムにより制御される高速液体クロマトグラフィー装置の起動処理状態を示す構成図である。
【図２】高速液体クロマトグラフィー装置に導入する松果体試料の調製処理を示すフローチャートである。
【図３】本発明の一実施例である高速液体クロマトグラフィー装置駆動プログラムを示すフローチャートである。
【図４】松果体試料を第１のカラムに供給している状態の高速液体クロマトグラフィー装置を示す構成図である。
【図５】メラトニンの分析処理を実施している状態の高速液体クロマトグラフィー装置を示す構成図である。
【図６】従来の一例である松果体試料の調製処理を示すフローチャートである。
【図７】従来の一例である高速液体クロマトグラフィー装置の構成図である。
【符号の説明】
１  ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー装置）
２  第１の移動相
３  第１の移動相脱気装置
４  第１のポンプ
５  試料注入装置
６  リアクター
７  反応コイル
９  切替えバルブ
１０  廃液容器
１２  第２の移動相
１３  第２の移動相脱気装置
１４  第２のポンプ
１５  第２のカラム
１６  第１のカラム
１７  カラムオーブン
１８  検出器
１９  廃液容器
２０  コンピュータ
【図１】
0004394842.tif 000002
【図２】
0004394842.tif 000003
【図３】
0004394842.tif 000004
【図４】
0004394842.tif 000005
【図５】
0004394842.tif 000006
【図６】
0004394842.tif 000007
【図７】
0004394842.tif 000008