(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同性をもつ２種の遺伝子を同一微生物体内で組換える方法であって、一の遺伝子が配列番号１で示される塩基配列又は該塩基配列に１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列又は配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に連結してなる第１プラスミドベクターと、他の遺伝子が該第１プラスミドベクターとは異なる複製開始領域に連結してなるローリングサ−クル複製形式によって複製をするタイプの他のプラスミドベクターとをバチルス属細菌に導入し、該遺伝子間の相同組換えを生じさせる組換え遺伝子形成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物体内で組換え遺伝子を形成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
近年、様々な生物のゲノム情報の解明をはじめとして、遺伝子解析の研究が盛んに行われており、これに伴って遺伝子工学や蛋白工学の重要性が益々高くなっている。蛋白、ＤＮＡ、ＲＮＡやそれらの複合体の立体構造が推定され、酵素など機能性分子の構造と機能の関係を解明する分野も進んできている。これら機能性分子の開発を行う上で、対象となる機能性分子にいかに多様性を持たせ、これら多様性分子から目的に適合する分子をいかに効率よく探索していくかが非常に大事なポイントとなる。
【０００３】
遺伝子に多様性をもたせる方法として目的遺伝子配列にランダムに変異を導入する方法が確立されてきた。ランダムに変異を導入する方法としては化学修飾剤を利用する方法やポリメラーゼチェインリアクションによる遺伝子増幅を利用する方法が主たる方法とされている。
【０００４】
しかしながら、ランダム変異法は試験管内で組換えを起こして目的遺伝子に多様性を持たせるために、これら組換え遺伝子をまた一つずつ生体内（微生物体内）に戻して目的に適合するものであるか否か調べるという余分な操作が必要である。特に、外来遺伝子による形質転換率の悪い宿主細胞や、生育の悪い宿主細胞に対してこの操作を行うのは非常に効率が悪いという問題があった。
【０００５】
本発明は、遺伝子組換えによって目的遺伝子に多様性をもたせる場合において、微生物体内のままで組換え遺伝子の機能を評価し、目的遺伝子を微生物体内で直接探索することを可能とする組換え遺伝子の形成方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、組換え遺伝子の作製について検討した結果、特定の複製開始領域をもつＤＮＡ断片を含有するプラスミドベクターと、これと異なる複製開始領域をもつ異種プラスミドベクターのそれぞれに相同性をもつ遺伝子を含有させ、微生物中で共存させることにより、遺伝子間に存在する相同性領域によって遺伝子組換えが起き、多様性をもつ組換え遺伝子が形成されることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、相同性をもつ２種以上の遺伝子を同一微生物体内で組換える方法であって、一の遺伝子が配列番号１で示される塩基配列又は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列又は配列番号２で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列に連結してなる第１プラスミドベクターと、他の遺伝子が該第１プラスミドベクターとは異なる複製開始領域に連結してなる他のプラスミドベクターとを微生物に導入し、該遺伝子間の相同組換えを生じさせる組換え遺伝子形成方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明における第１プラスミドベクターは、一の遺伝子が配列番号１で示される塩基配列又は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片又は配列番号２で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列に連結してなるプラスミドベクターをいう。
【０００９】
「一の遺伝子」とは、本発明方法により遺伝子組換えをして、多様性を付与すべき遺伝子であって、様々な酵素をコードする遺伝子や生体内の様々な機能、代謝調節に関与する遺伝子等をいい、一例を示せばアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリン、人成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニン、インターロイキン等の生理活性ペプチド、抗生物質耐性関与タンパク等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１０】
これらの遺伝子は、それぞれ生体内において発現される、或いは生体機能において何らかの影響を示すことから、微生物体内において多様性を持たせればその影響は即座に検出でき、目的遺伝子の選択が大変効率的に行われる。
【００１１】
また、第１プラスミドベクターは、配列番号１で示される塩基配列又は該塩基配列に１個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列又は配列番号２で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に１個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものである。
斯かる塩基配列は、複製開始領域を示すが、これは所謂ＲＣＲ（rolling circle-replicating）形態(Gros, M. F. et al., The EMBO Journal, 6, 3863-3869,(1987))を形成するグループには属さないと考えられる。また、当該塩基配列を持つ第１プラスミドベクターは、グラム陰性菌の１種から発見されたクロストリジウム由来のプラスミドｐＩＰ４０４（Garnier,T. and Cole,S.T., Plasmid,19,134-150(1988)）の複製開始領域とアミノ酸配列で約４０％の相同性を示し、それ以外のプラスミドの複製開始領域との相同性はアミノ酸配列で２０％以下である新規なプラスミドである。
【００１２】
斯かる第１プラスミドにおける当該領域の変異の程度は、配列番号２中のアミノ酸番号１〜４３２のうち４０％以上の相同性を有しているのが好ましく、６０％以上の相同性を有していることがより好ましく、７０％以上の相同性を有しているのが特に好ましい。尚、「１個以上」とは、１個若しくは複数個又はそれ以上を意味する。当該塩基配列を有するプラスミドベクタードベクターの好適な例としては、例えばバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）由来のプラスミドＤＮＡが挙げられる。
【００１３】
本発明の第１プラスミドベクターを構築するためのプラスミドＤＮＡは、例えばバチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）からアルカリ抽出法（Birnboim and Doly 1979 Nucleic Acids Res.,7:1513-1523）等の一般的なプラスミド回収法及び適当なプライマーを合成してのＰＣＲ法を用いることによって単離、取得することができ、得られたプラスミドＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片と上記の改変を目的とする遺伝子を連結することにより、本発明の第１プラスミドベクターを構築することができる。
【００１４】
本発明においては、第１プラスミドベクターの他に、これとは異なる少なくとも１種の他のプラスミドベクターが用いられる。
斯かる「他のプラスミドベクター」とは、第１プラスミドベクターとは異なる複製開始領域を持ち且つ該プラスミドベクターと微生物中で共存できるものであって、第１プラスミドベクター上に存在する一の遺伝子と相同性を有する遺伝子が該複製開始領域に連結してなるものである。
他のプラスミドベクターが有する複製開始領域としては、特に限定はされないが、ＲＣＲ形態を形成するタイプのものが比較的好ましく、斯かる複製開始領域を有するプラスミドベクターを用いることにより、第１プラスミドベクターとのより安定した共存が可能となる。
【００１５】
第１プラスミドベクターとは異なる複製開始領域を持ち、当該ベクターと共に微生物中で共存できるプラスミドベクターとしては、例えば、ストレプトコッカス  フェーカリス（Streptococcus faecalis）由来のプラスミドｐＡＭα１(Clewill, D. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1720-2724,(1975)やｐＨＹ３００ＰＬＫ(Ishiwa, H and Tsucida, N., Gene, 32, 129(1984))、スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のプラスミドｐＣ１９４（Gros, M. F. et al., EMBO J., 6, 3863-3869 (1987)）他、ＲＣＲ形式(Gros, M. F. et al., The EMBO Journal, 6, 3863-3869,(1987))によってプラスミド複製をするタイプのプラスミド等が挙げられる。
【００１６】
かくして構築された第１プラスミドベクターと少なくとも１種類以上の他のプラスミドベクターをエレクトロポレーション法等により微生物に導入し、同一宿主内に共存させたままで増殖させておいて目的遺伝子間の相同組換えを生じさせることにより、組換え体を得ることができる（図１参照）。
【００１７】
ここで用いられる微生物としては、原核生物が好ましく、安全性や酵素の分泌性の点からバチルス属細菌がより好ましい。
【００１８】
かくして、本発明の方法を用いれば、微生物体内において組換え遺伝子を形成することができる。
相同性組換えを利用して組換え遺伝子が作製された場合の多様性は、材料となる遺伝子同士の相同性が低ければ低い程、理論的にはほぼ無限種におよび、これを試験管内で構築して全て改めて宿主細胞に導入していくことは不可能に近い程困難であると考えられる。本発明の方法によれば、宿主体内での組換え遺伝子の創製は終わることなく無限に繰り返され、目的にあった組換え遺伝子が構築されたと同時にそれは表現系として形質転換体に現れることから、形質転換体のままの表現系でポジティブにスクリーニングを行えることができれば目的の遺伝子のみを優先的に取得できることになり効果的である。例えば、新規抗生物質耐性遺伝子の取得を試みる場合、耐性能力を有する遺伝子が構築されたと同時にこれが優先して生育ことになりスクリーニングが非常に容易となる。
【００１９】
実施例
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。
【００２０】
実施例１
（１）バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のプラスミドＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片から構築したプラスミドベクターｐＴＳ４３ＴＣの構築：バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来プラスミドＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片は以下の様に取得した。即ち、バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株を０．５％ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％  酵母エキス（ディフコ社製）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4 、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及び０．５％Ｎａ2ＣＯ3 からなる培地１００ｍＬで３０℃で１２時間振盪培養した。遠心分離によって集めた菌体から、BirnboimとDolyの方法（Nucl. Acids. Res, 7, 1513-1523(1979)）に従ってプラスミドＤＮＡを取得した。該プラスミド約１0ｎｇ、ＰＣＲバッファー（ベーリンガー  Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ添付）１０μＬ、２種類のオリゴヌクレオチド（プライマー３；５’−GAATTCCTGCAAGAAAACGATTGTG−３’（配列番号３））、（プライマー４；５’−AAGATGAGCTATAAGTCTTGTTAC−３’（配列番号４））２０ｐｍｏｌ、及び４種類のヌクレオチド（A, T, G, C)各２０ｐｍｏｌを加え脱イオン水で１００μＬに調製した。９４℃  ２分間の処理後、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ２分の反応を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に、７２℃  ５分間の反応をＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン  エルマー社）を用いて行った後、バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来プラスミドＤＮＡの複製開始領域を含む２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をThe GENECLEAN キット (バイオ 101社製）を用いて単離し、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより末端の平滑化を行った。
【００２１】
次に、ストレプトコッカス  フェーカリス由来プラスミドｐＡＭα１上のテトラサイクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片１．６ｋｂｐをＰＣＲによって増幅した。ストレプトコッカス  フェーカリス由来プラスミドｐＡＭα１を鋳型として約１ｎｇ用い、ＰＣＲバッファー（ベーリンガー  Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ添付）１０μＬ、２種類のオリゴヌクレオチド（プライマー１；５’−TGCAATGTGGAATTGGGAACGG−３’（配列番号５））、（プライマー２；５’−CCCTTAACGATTTAGAAATCCC−３’（配列番号６））２０ｐｍｏｌ、及び４種類のヌクレオチド（A, T, G,C)各２０ｐｍｏｌを加え脱イオン水で１００μＬに調製した。９４℃  ２分間の処理後、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  １分の反応を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に、７２℃  ５分間の反応をＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン  エルマー社）を用いて行った後、テトラサイクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片１．６ｋｂｐをThe GENECLEAN キット (バイオ 101社製）を用いて単離し、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより末端の平滑化を行った後バチルスエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株由来プラスミドＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片２．２ｋｂｐとＴ4 ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反応物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株(leu A8, metB8, hsrM1)の形質転換をプロトプラスト法（S. ChangとS. N. Choen；Mol. Gen. Genet., 168, 111-115 (1978））に従って行ない、５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むプロトプラスト再生用ＤＭ３培地［０．５％コハク酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．３５％Ｋ2ＨＰＯ4 、０．１５％ＫＨ2ＰＯ4 、０．５％グルコース、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて形質転換体を選択した。
【００２２】
組換え枯草菌の保持する組換えプラスミドをBirnboimとDolyの方法（Nucl. Acids. Res, 7, 1513-1523(1979)）に従って調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析をアガロースゲル電気泳動法を用いて行って、プラスミドベクターｐＴＳ４３ＴＣ（図２）を得た。
【００２３】
（２）遺伝子組換え体作製の材料としてｐＵＢ１１０由来のカナマイシン耐性遺伝子（２０５アミノ酸からなるカナマイシン耐性酵素；Sadaie, Y et al., J. Bacteriol. 141, 1178-1182(1980))を用いた。
７６番目のアミノ酸の位置が１ｂｐ欠落しその結果フレームシフトがなされているカナマイシン耐性遺伝子Ａをコードする遺伝子をライゲーション反応によって上記（１）で構築されたｐＴＳ４３ＴＣと連結した。また、１２１番目のアミノ酸の位置が１ｂｐ欠落しその結果フレームシフトがなされているカナマイシン耐性遺伝子Ｂをライゲーション反応によってｐＡＭα１にクロラムフェニコール耐性遺伝子を連結したプラスミドと連結した。これら両プラスミドをエレクトロポレーション法によってバチスルエスピーＫＳＭ−ＫＰ４３株に導入した。（尚、Ａ、Ｂそれぞれの遺伝子のみによる形質転換体はカナマイシン耐性が無く、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地（バクトトリプトン  １％、塩化ナトリウム  １％、酵母エキス  ０．５％、炭酸ナトリウム  ０．０５％、寒天  １．５％）で生育できないことは事前に確かめた）。
【００２４】
次に、両プラスミドを含有する形質転換体をＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１％、塩化ナトリウム  １％、酵母エキス  ０．５％、炭酸ナトリウム  ０．０５％、寒天  １．５％、テトラサイクリン  １０μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬ）上で２日間生育させ、更にこの生育菌体を集めて１０００倍希釈した後、再び同ＬＢ寒天培地上で２日間生育させた。続いて、この生育菌体を集めて１００倍希釈した後、カナマイシン１５μｇ／ｍＬ入りのＬＢ寒天培地に蒔き、２日間インキュベートを行った。その結果、数百個の形質転換体が出現した。出現した形質転換体からプラスミドを調製し、その配列を解析したところカナマイシンに耐性を示す能力の有る蛋白をコードしている遺伝子が検出された。
【００２５】
実施例２
カナマイシン耐性タンパクの１〜１７８番目までのアミノ酸をコードする遺伝子と同カナマイシン耐性遺伝子の調節領域を含むカナマイシン耐性遺伝子Ｃ（約８００塩基）をライゲーション反応によって実施例１（１）で構築されたｐＴＳ４３ＴＣと連結した。また、１０２番目のアミノ酸から終始コドンを含むカナマイシン耐性遺伝子Ｄ（約６５０塩基）をライゲーション反応によってｐＣ１９４プラスミドと連結した。これら両プラスミドをエレクトロポレーション法によってBacillus subtilis ISW1214株に導入した（尚、Ｃ、Ｄそれぞれの遺伝子のみによる形質転換体はカナマイシン耐性が無く、１０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地（バクトトリプトン  １％、塩化ナトリウム  １％、酵母エキス  ０．５％、寒天  １．５％）では生育できないことは事前に確かめた）。次に、両プラスミドを含有する形質転換体をＬＢ液体培地（バクトトリプトン１％、塩化ナトリウム  １％、酵母エキス  ０．５％、テトラサイクリン  ７．５  μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール  ５μｇ／ｍＬ）で１日間生育させ、培養液１０μＬをカナマイシン１５μｇ／ｍＬ入りのＬＢ寒天培地に蒔き、１日間インキュベートを行った。その結果、数百個の形質転換体が出現した。出現した形質転換体からプラスミドを調製し、その配列を解析したところカナマイシンに耐性を示す能力の有る蛋白をコードしている遺伝子が検出された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の組換え遺伝子形成方法を用いれば、微生物体内のままで組換え遺伝子の機能を評価し、目的遺伝子を直接探索することが可能である。すなわち、従来の遺伝子組換え操作において行われているような組換え遺伝子をまた一つずつ微生物体内に戻すという余分な操作を行うことなく目的遺伝子を探索できる。
【００２７】
【配列表】
0004589540.tif 000002
0004589540.tif 000003
0004589540.tif 000004
0004589540.tif 000005
0004589540.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組換え遺伝子の形成方法を示した概念図である。
【図２】プラスミドベクターｐＴＳ４３ＴＣの構築の過程を示す図である。
【図１】
0004589540.tif 000007
【図２】
0004589540.tif 000008