(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球を加えた細菌培養用基礎培地において、マイトマイシンＣを０．１〜５ｍｇ／Ｌの濃度で含むことを特徴とする志賀毒素産生性大腸菌エンテロヘモリシン検出用培地。
【請求項２】
ノボビオシン、バンコマイシン又はポリミキシンを更に含む、請求項１に記載の志賀毒素産生性大腸菌エンテロヘモリシン検出用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、志賀毒素産生性大腸菌の分離に有用な細菌培養用培地に関する。さらに詳しくは、細菌感染症が疑われる患者から採取した臨床材料又は細菌感染が疑われる食品や環境から採取した試料中の志賀毒素産生性大腸菌の分離に有用な細菌培養用培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
志賀毒素産生性大腸菌 (Ｓｈｉｇａ  Ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、以下ＳＴＥＣともいう)には多種類の血清型があり、それらのうち、Ｏ１５７：Ｈ７を除く血清型には、特徴となる生化学的鑑別性状が無いために適当な検出方法がない。一方、ＳＴＥＣは志賀毒素のほか、血清型とは無関係にエンテロヘモリシンと称される特殊な溶血素を産生することがＢｅｕｔｉｎによりすでに報告されており、今までＢｅｕｔｉｎの記載した培地を用いてエンテロヘモリシン産生を指標としたＳＴＥＣ同定が試みられてきたが、Ｂｅｕｔｉｎの原法培地ではエンテロヘモリシンによる溶血が不明瞭か、または溶血が発現しない菌株がしばしばあり、Ｏ１５７：Ｈ７以外のＳＴＥＣを正確に検出することができなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、エンテロヘモリシンの産生を促進し、その溶血性を明瞭にしてＳＴＥＣの検出を容易にする細菌培養用培地を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、血球を加えた細菌培養用基礎培地において、マイトマイシンＣを０．１〜５ｍｇ／Ｌの濃度で含むことを特徴とする志賀毒素産生性大腸菌エンテロヘモリシン検出用培地、に関する。以下、本発明を詳述する。
【０００５】
本発明者等は、上記課題について種々検討した結果、血球を加えた細菌培養用基礎培地に対して、エンテロヘモリシン産生誘導剤、細胞膜及び細胞壁合成阻害剤を添加した培地では、ほとんどのＳＴＥＣがエンテロヘモリシンを産生すること、及びＳＴＥＣによって形成されたコロニーの周囲には明瞭な溶血環が形成されることを見出した。従って、上記問題点は、本発明培地によって一挙に解決し、更には、菌の分離が簡便に行える細菌培養用培地を提供することが可能となった。本発明の細菌培養用培地は、志賀毒素産生性大腸菌の検出及び同定に有用である。
【０００６】
エンテロヘモリシンの産生はプラスミド遺伝子に規制される。本発明でいうエンテロヘモリシン産生誘導剤とは、例えばマイトマイシンＣ等のマイトマイシン系薬剤をいう。しかし、これらの物質がプラスミド上のエンテロヘモリシン遺伝子にどのように作用するのか、その機序はまだ明らかにされていない。また、細胞膜及び細胞壁合成阻害剤にはノボビオシン、バンコマイシンあるいはポリミキシンのようなペプチド系抗生物質が挙げられ、大腸菌よりも広く分布するグラム陽性菌の発育を阻害する。
【０００７】
本発明培地は、公知の血球を加えた細菌培養用基礎培地に上記エンテロヘモリシン産生誘導剤、細胞膜及び細胞壁合成阻害剤を１種類、あるいは２種類以上を組み合わせて添加して用いる。添加する濃度は、使用するエンテロヘモリシン産生誘導剤、細胞膜及び細胞壁合成阻害剤のＳＴＥＣに対する最小発育阻止濃度を測定して決定すれば良い。例えば、エンテロヘモリシン産生誘導剤としてマイトマイシンＣを使用する場合には、１リットルあたり、０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは０．１〜５ｍｇ、より好ましくは０．２〜２ｍｇの濃度で添加すれば良い。
【０００８】
また、細胞膜及び細胞壁合成阻害剤はグラム陽性菌阻止のために用いるもので、特に細胞膜及び細胞壁合成阻害剤中、ノボビオシンは糞便や食品中に広く常在するグラム陽性菌の発育を強く阻止する。これに加えて、プロテウス属の菌が夾雑菌として検体中に含まれると、その遊走性により寒天培地全表面を被い、ＳＴＥＣ集落の検出を不可能にするが、ノボビオシンはプロテウス属の遊走及び発育を阻害し、ＳＴＥＣコロニーの分離を容易にする。これらの理由のために、本培地はノボビオシンをマイトマイシン系薬剤と併用することが好ましい。この場合、ノボビオシンの配合量は１リットルあたり、０．５〜５０ｍｇ、好ましくは１〜２５ｍｇ、より好ましくは５〜１５ｍｇの濃度で使用する。
【０００９】
本発明でいう細菌培養用培地は、細菌の培養に汎用される公知の細菌培養用基礎培地に血球を含むものである。細菌培養用基礎培地としては細菌培養用として汎用される公知の培地を使用してもよく、例えば、トリプトースブラッドアガーベース培地、普通寒天培地、トリプトソーヤ培地、ミューラーヒントン培地、ハートインフュージョン培地、ブレインハートインフュージョン培地等を挙げることができ、トリプトースブラッドアガーベース培地がより好ましい。これらの細菌培養用基礎培地は、必要により添加される成分として当業者に周知のいかなる成分を含有してもよい。このような成分としては、例えばトリプトース、溶性デンプン、酵母エキス、肉エキスやビタミン類等を挙げることができる。これらの成分は、単独または配合して一般に培地全重量に対して１０重量％以下で配合される。
【００１０】
上記の細菌培養用基礎培地に加える血球は、ヘモリシン及びエンテロヘモリシンに対して溶血性を示す作用を有している。このような血球として、例えばヒツジ血球、ウマ血球、ウシ血球、ヤギ血球等を挙げることができ、ヒツジ血球がより好ましい。その配合量は一般に培地全重量に対して１〜１０容量％で使用される。血球は、血液を遠心分離処理（例えば５０００ｒｐｍで１０分間）した沈査を、さらに緩衝液で遠心洗浄し、血球に緩衝液を加えて原血量にした血球浮遊液を用いると良い。血球洗浄は溶血環の観察を妨げる血液成分の除去を目的とする。緩衝液としては血球が破損しない塩濃度やｐＨを有すればいかなるものを使用してもよい。このような緩衝液の例としては、例えば０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）等を挙げることができる。血球洗浄には遠心洗浄１回あたり血液量の５倍量の緩衝液を用い、合計３回以上の遠心洗浄を行い使用すれば良い。
【００１１】
本発明の細菌培養用培地は、一般には寒天を加えた寒天平板培地として製造される。本発明の培地は、例えば、細菌培養用基礎培地に蒸留水を加えて１２１℃で１５分間の高圧蒸気滅菌を行い、５０〜６０℃程度に冷却した後に、血球及びエンテロヘモリシン産生誘導剤および／または細胞膜及び細胞壁合成阻害剤を無菌的に添加し、得られた培地組成物を滅菌シャーレに分注し、冷却して固化させることにより製造することができる。予め寒天を含まない細菌培養用基礎培地に関しては、培地全重量に対して１〜２重量％の寒天を高圧蒸気滅菌前に加えておく。寒天の配合量を調節することにより半流動の培地とすることもできる。また、各成分が予め含有された乾燥粉末培地として製造しておき、用事に調製してもよい。
【００１２】
上記のように製した本発明の細菌培養用培地を使用する方法としては、患者または環境から採取した試料を直接本発明の細菌培養用培地に常法により塗抹し、約３７℃で２４〜４８時間程度培養する方法を例示することができる。培養後に菌の増殖及び、コロニー周囲の溶血環変化を観察することにより、エンテロヘモリシン産生菌を分離することができる。
【００１３】
本発明培地に適用できる試料は、ＳＴＥＣを含む可能性のあるものを全て対象とする。具体的には、患者から採取した試料としては、糞便、尿等をそのままあるいは適当な溶液で希釈した液等が挙げられる。また、環境から採取した試料としては、土壌、河川、遊泳地域の海水、水道水、下水、家畜の糞便、井戸水等を挙げられる。また、食品から採取した試料としては、牛乳及び乳製品、肉及び肉製品、魚介類及び魚介類製品、冷凍食品、日配食品、野菜、缶入り飲料、飲料水、飼料及び飼料製品等をそのままあるいはその拭き取り検体が挙げられる。
【００１４】
本発明培地を用いて上記試料におけるＳＴＥＣを正確に検出できる。例えば、上記試料を本発明培地に公知の手段によって植菌、３７℃で１８〜２４時間培養し、培地上に形成されるコロニーの状態を観察することで、ＳＴＥＣ感染の有無を確実に検出できる。本発明の培地には、ＳＴＥＣのほか、ほとんど全てのグラム陰性好気性発酵性桿菌が成育するが、それらの菌は通常溶血性が無く、発育コロニー周囲に溶血環を生じない。菌株によっては、エンテロヘモリシン以外の溶血素を産生するものがあるが、それらの溶血素による本培地での溶血環は、培養の比較的早期に現れるのみならず、溶血環が透明、明瞭である。これに対し、エンテロヘモリシンによる溶血環の出現は遅く、かつ溶血環はやや不透明で、一般細菌の溶血性とは明らかに区別できる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例：
基礎培地としては、Ｂｅｕｔｉｎ原法培地を用いた。詳細には、基礎培地として１リットル中にトリプトースブラッドアガーベース３３ｇ、トリプトース５ｇ、塩化カルシウム二水和物１．５ｇ及び溶性デンプン５ｇに精製水９４０ｍｌを加えた後、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した。滅菌終了後、培地組成物を５５℃に冷却し、濾過滅菌したマイトマイシンＣ溶液(蒸留水に溶解して濃度を１００μｇ／ｍｌに調整した溶液、マイトマイシン入手先：和光純薬工業)１０ｍｌおよびヒツジ血液（入手先：日本バイオテスト研究所）５０ｍｌを５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した沈査に、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２５０ｍｌで３回遠心洗浄した後、同緩衝液で原血量に戻したヒツジ洗浄血球５０ｍｌを加えた。この培地組成物を直径９０ｍｍの滅菌シャーレに２０ｍｌずつ分注し、水平に固めて平板培地を製造した。同様に、マイトマシンＣ溶液とノボビオシン溶液（蒸留水に溶解して濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整した溶液、ノボビオシン入手先：シグマ）１０ｍｌを含む平板培地を製造した。更に、同様に、但しマイトマイシンＣおよびノボビオシンを除いた平板培地を製造し、従来法培地（Ｂｅｕｔｉｎ原法培地）とした。
【００１６】
上記のように製造した本発明の細菌培養用培地に、試験菌として、患者下痢便から分離・同定した１９６株を用いた。前記分離・同定方法は、ソルビトールマッコンキー寒天培地に塗抹してソルビトールを分離しないコロニーはＯ１５７抗血清との凝集テストを行い、テスト陽性のものをＯ１５７とした。それ以外についてはマッコンキー寒天培地に塗抹して乳糖分解性の大腸菌らしいコロニーを取り、インドールテスト陽性及びβ・グルクロニダーゼテスト陽性のものを大腸菌であると同定した。いずれの寒天培地からの分離菌も最終的に、血清学的に菌体抗原Ｏ血清型および鞭毛抗原Ｈ血清型を決め、志賀毒素の遺伝子（ｓｔｘ１およびｓｔｘ２）がＰＣＲ法［宝酒造：Ｏ１５７（ベロ毒素遺伝子）ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  ＰＣＲ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｋｉｔ］で検出された場合をＳＴＥＣとした。このＳＴＥＣの１９６株をハートインフュージョンブイヨンで３７℃一夜培養し、その１白金耳ずつを本発明培地に塗抹し３７℃、２４時間培養した後、エンテロヘモリシンによる溶血環を観察した。同様に、従来のＢｅｕｔｉｎ原法培地を用いて試験菌を塗抹した。
【００１７】
結果を表１に示す。従来法のＢｅｕｔｉｎ原法培地では、１９６株中、１４３株（７２．９％）が溶血性を示したのに対し、本発明の細菌培養用培地では、１９６株中、１８５〜１８７株（９４．４〜９５．４％）が溶血性を示し、ＳＥＴＣのエンテロヘモリシン陽性率が高められることが確認された。
【００１８】
【表１】
0004394771.tif 000002
【００１９】
【発明の効果】
本発明培地によれば、エンテロヘモリシンの発現量と産生量を高めかつ、エンテロヘモリシンの産生を指標として志賀毒素産生性大腸菌の分離を精度良く、容易に行うことができる。さらにグラム陽性菌及び大腸菌以外の腸内細菌の発育を阻害することで、大腸菌の選択性を向上させることができる。