(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二つの異なった細胞試料間のタンパク質組成を比較する方法であって：
（a）前記少なくとも二つの細胞試料のそれぞれから得られるタンパク質の抽出物を調製し；
（b）前記タンパク質の抽出物中のタンパク質と共有結合することが可能な染料から選択される適合発光染料のセットを用意し、このとき前記セット中の染料それぞれは、
（1）前記共有結合において、タンパク質の全体の正味電荷を維持するものである正味電荷を有し、そして前記染料のいずれか一つで標識されたタンパク質の相対的な移動が、前記セット中の他の一つの染料で標識された前記タンパク質の相対的移動と同様であるイオン及びpH特性を有し、
（2）前記セット中の残りの染料の放出発光とは充分に異なる波長で発光を放出して、検出可能な異なった光信号を与え；
（c）工程（a）のタンパク質のそれぞれの抽出物を、工程（b）の前記セットの異なった染料と反応させて、染料標識タンパク質を得て；
（d）前記染料標識タンパク質のそれぞれを混合して、異なった染料標識タンパク質の単一の混合物を形成し；
（e）前記混合物中の対象とする染料標識タンパク質をクロマトグラフ法で分離し；そして
（f）発光検出によって対象とする異なった染料標識タンパク質間の発光強度の差を検出すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記染料が、前記タンパク質のリシン残基の第一アミンに結合し、そして前記発光染料中の前記染料それぞれが、正味＋1の電荷を保有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
適合発光染料の前記セットが、以下の構造：
【化１】
0004589587.tif 000011
を有するシアニン染料であり、式中、点線は、それぞれの環中に5〜6個の原子を有するそれぞれ1〜3個の縮合環の形成に必要な炭素原子を示し、X及びYは、S、O及びCH3−C−CH3からなる群から選択され、mは、1〜3の整数であり、R1及びR2の一つは反応性基であり、そして他はアルキルである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
染料それぞれが、イソチオシアネート、イソシアネート、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、イミドエステル、グリオキサル、カルボン酸、ハロアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化酸、アジド、ヒドラジド、ヒドラジン、ケトン及びアミノからなる群から選択される少なくとも一つの反応性基を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
適合発光染料の前記セットが、正に荷電した結合体基によってタンパク質中のリシン残基の第一アミノに結合した天然染料である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
適合発光染料の前記セットが、タンパク質中のスルフヒドリル基に結合した天然染料である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
適合発光染料の前記セットが、ジピロメテンボロンジフルオリド染料の誘導体である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
クロマトグラフ法が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記染料標識タンパク質の混合に先立って、タンパク質及び染料間の反応をクエンチすることを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
放出される色の差を検出する工程が、発光顕微鏡法によって行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
放出される色の差を検出する工程が、電子的映像化法によって行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質が、リシン、カルボン酸及びスルフヒドリル基からなる群から選択される前記染料に共有結合する結合部位を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質が、末端糖基を有する糖タンパク質を含み、そしてタンパク質の抽出物を調製することが更に末端糖基を酸化して、アルデヒド基を形成する工程を含み；そして前記セット中の染料それぞれが、アルデヒド基と共有結合を形成することが可能な反応基を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が、リンタンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質の抽出物の調製が、ペプチドを生成するために酵素でタンパク質の少なくとも一部を消化することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも二つの異なった試料間の対象とするタンパク質を比較する方法であって：
（a）前記少なくとも二つの試料のそれぞれから得られるタンパク質の混合物を調製し；
（b）前記タンパク質混合物中の前記タンパク質と共有結合することが可能な染料から選択される適合発光染料のセットを用意し、このとき前記セット中の染料それぞれは、
（1）前記染料のいずれか一つで標識されたタンパク質の相対的な移動が、前記セット中の他の一つの染料で標識された前記タンパク質の相対的移動と同様であるイオン及びpH特性を有し、
（2）前記セット中の残りの染料の放出発光とは充分に異なる波長で発光を放出して、検出可能な異なった光信号を与え；
（c）工程（a）の前記タンパク質の混合物それぞれを、工程（b）の前記セットの異なった染料と反応させて染料標識タンパク質を得て；
（d）前記染料標識タンパク質のそれぞれを混合して異なった染料標識タンパク質を組み合わせた単一の混合物を形成し；
（e）前記組み合わせ混合物中の対象とする異なった染料標識タンパク質をクロマトグラフ法で分離し；そして
（f）発光検出によって対象とする異なった染料標識タンパク質間の発光強度の差を検出すること；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
適合発光染料の前記セットが、以下の構造：
【化２】
0004589587.tif 000012
を有するシアニン染料であり、式中、点線は、それぞれの環中に5〜6個の原子を有するそれぞれ1〜3個の縮合環の形成に必要な炭素原子を示し、X及びYは、それぞれS、O及びCH3−C−CH3からなる群から選択され、mは、1〜3の整数であり、R1及びR2の一つは反応性基であり、そして他はアルキルである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
染料それぞれが、イソチオシアネート、イソシアネート、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、イミドエステル、グリオキサル、カルボン酸、ハロアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化酸、アジド、ヒドラジド、ヒドラジン、ケトン及びアミノからなる群から選択される少なくとも一つの反応性基を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質が、リシン、カルボン酸及びスルフヒドリル基からなる群から選択される結合部位を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフ法が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質が、末端糖基を有する糖タンパク質を含み、そしてタンパク質の抽出物の調製が、末端糖基を酸化してアルデヒドを形成する工程を更に含み；そして前記セット中の染料それぞれが、アルデヒド基と共有結合を形成することが可能な反応基を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質がリンタンパク質であり、そして染料がイミダゾール基を含み、前記方法が、工程（c）のためにタンパク質及び染料の混合物にカルボジイミドを加えることを更に含む、請求項16に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質の抽出物の調製が、ペプチドを生成するためにタンパク質の少なくとも一部を酵素で消化することを更に含む、請求項16に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも二つの異なった試料間の対象とするタンパク質を比較する方法であって：
（a）前記少なくとも二つの試料のそれぞれから得られるタンパク質の混合物を調製する；
（b）前記タンパク質の混合物中のタンパク質と共有結合することが可能な一つの群の染料から選択される適合発光染料のセットを用意し、このとき前記セット中の染料それぞれは、
（1）前記染料のいずれか一つで標識されたタンパク質の相対的な移動が、前記セット中の他の一つの染料で標識された前記タンパク質の相対的移動と同様であるイオン及びpH特性を有し、
（2）前記セット中の残りの染料の放出発光とは充分に異なる波長で発光を放出して、検出可能な異なった光信号を与え；
（c）工程（a）のタンパク質の混合物それぞれを、工程（b）の前記セットの異なった染料と反応させて、染料標識タンパク質を得て；
（d）前記染料標識タンパク質のそれぞれを混合して異なった染料標識タンパク質を組み合わせた単一の混合物を形成し；
（e）前記組み合わせ混合物中の対象とする異なった染料標識タンパク質をクロマトグラフ法で分離し；そして
（f）発光検出によって対象とする異なった染料標識タンパク質間の発光強度の差を検出すること；
を含む、前記方法。
【請求項２５】
クロマトグラフ法が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質の抽出物の調製が、ペプチドを生成するためにタンパク質の少なくとも一部を酵素で消化することを更に含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
染料それぞれが、イソチオシアネート、イソシアネート、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、イミドエステル、グリオキサル、カルボン酸、ハロアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化酸、アジド、ヒドラジド、ヒドラジン、ケトン及びアミノからなる群から選択される少なくとも一つの反応性基を有する、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも二つの異なった試料のタンパク質含有量に存在する差を検出することに使用するためのキットであって：
発光染料の適合セットを含み、前記セット中の染料それぞれは、タンパク質に共有結合することが可能であり、そして一般的に同様なイオン及びpH特性を有するが、しかし染料の前記セット中の他の染料とは染料それぞれが光を放出する波長において異なり、染料それぞれが、励起された場合異なった色の発光を発し、少なくとも一つのクロマトグラフィーカラムを含むタンパク質分離装置を更に含む、前記キット。
【請求項２９】
前記染料及び試験される試料中のタンパク質間の標識化反応をクエンチする物質を更に含む、請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
発光染料が以下の構造：
【化３】
0004589587.tif 000013
を有するシアニン染料であり、式中、点線は、それぞれの環中に5〜6個の原子を有するそれぞれ1〜3個の縮合環の形成に必要な炭素原子を示し、X及びYは、S、O及びCH3−C−CH3からなる群から選択され、mは、1〜3の整数であり、R1及びR2の一つは反応性基であり、そして他はアルキルであり、そしてこのときmは、前記染料のセット中の異なった染料に対して変化し、そして所望によりアルキルの長さは、一般的に前記染料のセット中の異なった染料の全体の分子量に適合するように前記染料のセット中の異なった染料に対して変化する、請求項28に記載のキット。
【請求項３１】
発光染料が、ジピロメテンボロンジフルオリド染料の誘導体である、請求項28に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明者：ジョナサン・ミンデン（Jonathan Minden）、アラン・エス・ワゴナー（Alan S. Waggoner）、スーザン・ジェイ・ファウラー（Susan J. Fowler）
【０００２】
連邦政府援助研究に関する陳述：適用されない。
発明の背景：
本発明は、翻訳後修飾を保有するタンパク質を含むタンパク質の組成の差を検出するための方法に関し、そして更に特定的にはこのような差を検出するための標識試薬の適合した対（matched pair）を使用する方法に関する。
【０００３】
細胞生物学の各種の側面を研究する研究者達は、細胞構造、機能及び発育の差を検出し、そしてモニターするために各種の手段を使用する。細胞の研究の本質的な部分は、異なった細胞型、発育の段階及び条件間のタンパク質の組成の差及び同一性を研究することである。例えば、正常細胞及び癌性細胞又は野生型及び突然変異細胞間のタンパク質含有量の差を決定することは、情報の価値ある供給源であり、そして価値ある診断手段であることができる。
【０００４】
タンパク質の混合物は、電気泳動及びクロマトグラフィーを含む各種の方法によって個々の成分に分離することができる。質量の差による分離は、変性条件下のポリアクリルアミドゲル中の電気泳動によって達成することができる。一次元及び二次元ゲル電気泳動は、タンパク質の研究のための標準的な手段となっている。円筒又はスラブ状ゲルによる一次元SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）電気泳動は、試験される試料中に存在する主要なタンパク質のみを明らかにする。等電点電気泳動、即ち一つの次元で電荷で、そして第2の次元で大きさによってタンパク質を分離する、二次元のポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D  PAGE）は、更に敏感な分離方法であり、そして試料中のほとんどのタンパク質の分離を与えるものである。
【０００５】
タンパク質は、一又は二次元のゲル中にそれぞれバンド又はスポットとして移動する。分離されたタンパク質は、各種の方法；タンパク質特異的染料で染色、タンパク質が介在する銀の沈殿、放出性標識されたタンパク質の自動式放出能検出、及び発光化合物の共有付着によって可視化される。後者の方法は、これまで2D  PAGEの等電点電気泳動工程後にのみ行うことが可能であった。電気泳動の直後に、得られたゲルのパターンは、肉眼、写真又は電子的映像捕獲、例えば冷却された電荷結合素子（CCD）を使用することによって可視化することができる。
【０００６】
異なった細胞又は細胞発育の異なった段階のような、異なった供給源から得られるタンパク質の試料を慣用的な方法で比較するために、現時点ではそれぞれの異なった試料を一次元ゲルの別個のレーン又は別個の二次元ゲルにかけられる。比較は、肉眼による検査又は電子的映像化、例えばデジタル化された一次元又は二次元ゲルのコンピューター補助映像分析によって行われる。
【０００７】
二次元電気泳動は、研究者たちによって頻繁に使用されている。O’Farrell，P．H．の“High  resorution  two−dimensional  electrophoresis  of  proteins”，Journal  of  Biological  Chemistry，250：4007−4021（1975）は、現在では公知の技術である等電点電気泳動によって第1の次元においてその対応する等電点に従って、そして不連続SDS電気泳動によって第2の次元において分子量によってタンパク質を分離した。Garrels，J．I．の“Two−dimensional  Gel  Electrophoresis  and  Computer  Analysis  of  Proteins  Synthesized  By  Clonal  Cell  Lines”，Journal  of  Biological  Chemistry，Vol．254，No．16，7961−7977（1979）は、二次元ゲル電気泳動系を使用して、神経細胞及び神経膠細胞におけるタンパク質合成のパターンを研究した。Garrelsは、多数の試料から得られたデータの比較分析を行って、特異的機能を持つ特定のタンパク質の存在を相関させた。コンピューター化走査装置を使用して、ゲルフルオログラムの区画を走査し、スポットを検出し、そしてその密度を積算した。情報を保存し、そしていくつかの異なった走査のそれぞれの強度に従ってプロットした。
【０００８】
Urwin，V．E．及びJackson，P．の“A  multiple  High−resolution  Mini  Two−dimensional  Polyacrylamide  Gel  Electrophoresis  System：Imaging  Two−dimensional  Gel  Using  A  Cooled  Charge−Coupled  Device  After  Staining  With  Silver  Or  Labeling  With  Fluorophore”，Analytical  Biochemistry  195：30−37（1991）は、数個の等電点電気泳動（IEF）ゲルを使用して、タンパク質を電荷によって分離し、次いでIEFゲルをスラブゲルの頂部に沿って端から端にわたって位置するように勾配スラブゲル上に付加する技術を記載している。次いでゲルは電気泳動された。得られたタンパク質のスポットを、二次元のスラブゲルを銀で染色することにより、又は等電点電気泳動工程に続く発光標識化のいずれかによって可視化した。電気泳動にかけた場合、タンパク質上の発光標識の存在がタンパク質の等電点を変化させるために、標識化は、最初の電気泳動、即ち等電点電気泳動の後に行われなければならない。更に、標識は、タンパク質の硫黄に付着して、不安定な結合を形成し、これは、標識が電気泳動工程に先立って付着された場合、等電点電気泳動中に分解する傾向がある。Santaren，J．等による文献“Identification  of  Drosophila  Wing  Imaginal  Disc  Proteins  by  Two−Dimensional  Gel  Analysis  and  Microsequencing”，Experimental  Cell  Research  206：220−226（1993）は、Drosophila  melanogaster中のタンパク質を同定するための高分離能二次元ゲル電気泳動の使用を記載している。乾燥ゲルをX線フィルムに5日間暴露した。現像したX線フィルムをコンピューターによって分析して、試料中の差を測定する。
【０００９】
二次元ゲル電気泳動は、タンパク質の複雑な混合物の分離の強力な手段である。しかしながら、タンパク質間の差は微妙であり得る。ゲルの不完全さは、正確な観察を阻害する。不完全さを最小にするために、商業的に入手可能な電気泳動系で提供されるゲルは、厳しい正確さで調製される。細心の制御によってさえ、二つのゲルが同一ということはない。ゲルはpH勾配又は均一性においてお互いに異なり得る。更に、一つの試験と次の試験の電気泳動の条件は、異なったものであり得る。異なったゲルの自動整合に対するコンピューターソフトウェアが開発されている。しかしながら、全てのソフトウェアパッケージは、二次元ゲルの片方又は両方の次元の直線的な拡大又は縮小に基づいている。ソフトウェアはゲルの局部的なゆがみを調節することはできない。
上で述べた難点を克服するための方法は、国際公開番号WO96/33406（国際出願番号PCT/US96/05435）に記載されている。
【００１０】
タンパク質試料は、更に電気泳動又はクロマトグラフィー技術のいずれによっても分離することができる。このような技術は、タンパク質又はペプチドの、特に直交的組み合わせにおける高分離能の分離が可能である。しかしながら、現時点のクロマトグラフ系は、電気泳動系より低い分離力しか有しない、即ち、分離されることが可能なタンパク質又はペプチドの数がより少ない傾向がある。典型的な溶出の記録は、製造業者のカタログ、例えば、Amersham  Pharmacia  Biotechの“BioDirectory  ’99”カタログの502ページから始まる“Chromatography  Columns  and  media”中に見出すことができる。しかしながら、クロマトグラフ系は、ある種の適用に対して電気泳動よりある種の利益を確かに有する。例えばこれらはしばしば自動化することが容易であり、そしてこれは、通常分離に続いてタンパク質の試料を得ることが容易である。
【００１１】
これらの理由から、例えばタンパク質集団の分布測定に対するクロマトグラフ系による分離は、興味あるものである。例えばOpiteck及びその同僚は、クロマトグラフ分離系から溶出された画分を、第2のクロマトグラフ系に適用する二次元クロマトグラフ系の例を公開している。（特定的には、逆相クロマトグラフ系と組み合わせたカチオン交換系の使用を記載している、Opiteck，Lewis  and  Jorgenson，Anal．Chem，vol．69，1518，（1997）、及び逆相クロマトグラフィーと組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーの使用を記載している、Opiteck  et  al．，Anal  Biochem．，vol．258，349，（1998）を参照されたい）。サイズ排除クロマトグラフィーの特に低い分離能力は、後者の文献において、逆相クロマトグラフィーによる溶出物の更なる分別に先立って、8本のサイズ排除カラムを連続して使用することによって解決している。この系に対して800種のタンパク質の理論的分離能力が推定された。
【００１２】
ある種のクロマトグラフィー及び電気泳動系の限定された分離能力は、更に分析段階で克服することができる。質量分析は、クロマトグラフ又は電気泳動による分離に続くタンパク質の同定に広く使用されるようになってきており、そしてそれ自体、質量に基づく分離方法として使用することができる。例えば、Jensen  et  al．，Anal．Chem．Vol．71，2076，（1999）は、毛管等電点電気泳動を分離の方法として使用し、そして次いでエレクトロスプレーイオン化フーリエ転換イオンサイクロトロン共鳴質量分析を、等電点電気泳動系から得られる溶出物中のタンパク質の更なる分離に使用し、同時に同定の手段を提供することを記載している。
【００１３】
本発明の目的は、ゲルのゆがみ又はカラムの変化性に伴なう問題を排除し、そして異なった試料のタンパク質含有量を比較及び対比する、簡単な、比較的早いそして信頼性のある方法を提供することである。
【００１４】
発明の概要：
上記の目的は、例えば異なった細胞から抽出され又は他の供給源から得られた、タンパク質の多数の試料間に差がある場合、その差を、このようなタンパク質のそれぞれの試料を、適合発光染料のセット（a set of matched luminescent dyes）の異なった染料で標識化することによって検出する、本発明の方法によって達成される。本明細書中で使用されるタンパク質は、ペプチドを含む翻訳後修飾を保有するタンパク質及びその部分を含む。該適合染料（matched dyes）は、一般的に同様なイオン及びpH特質を有するが、しかし異なった波長の光を吸収及び／又は発光を発し、異なった色の発光を発生する。更に、染料は大きさにおいて同じでなければならない。染料及びタンパク質の一つ又はそれ以上の付着部位間の共有結合の形成を可能にするために充分なインキュベーション期間後、標識された試料は、次いでいっしょに混合され、そしてタンパク質は、単一の分離工程で分離される。分離は、電気泳動又はクロマトグラフ法によることができる。分離が単一のゲルの電気泳動による場合、それぞれの試料に共通なタンパク質は、同一の位置にいっしょに移動する。同様に、分離が一つのカラムのクロマトグラフ法による場合、例えばそれぞれの試料に共通なタンパク質は、同じ位置に移動する。異なっているタンパク質は、単独でゲルの異なった場所に、又はカラムから異なった時間に移動するものであり、そして異なった色の発光を発するものであって、これによってどの最初の試料が、他の最初の試料又は複数の試料とは異なった一つ又はそれ以上のタンパク質を有するかを同定する。
【００１５】
本発明は、更に本発明の方法を行うためのキットを含む。キットは、染料の適合セットを含み、そして更にタンパク質を分離するための物質を含むことができる。タンパク質及び染料間の反応を停止するためのクエンチ物質を、必要な場合所望により備えることができる。これらの物質は、例えば電気泳動用ゲル又はクロマトグラフィー用カラムを含むことができる。
【００１６】
好ましい態様の詳細な説明：
本発明の方法は、染料の適合セットを使用し、このときセット中のそれぞれの染料は、一般的に他の染料とイオン及びpH特質、そしてタンパク質に共有付着する化学反応性において等しく、しかし異なった波長の発光を発し、それによって観察した場合異なった色の発光を示す。染料は、好ましくは分子量が概略等しいが、しかし必要なことではない。適合染料のセット中のそれぞれの染料は、それぞれの試料が染料のセット中の異なった染料で標識されるように、タンパク質の異なった試料のセットの、異なった一つ中のタンパク質を標識するために使用される。標識後、タンパク質は混合され、そして同一媒体中で、電気泳動又はクロマトグラフィーのような適当な既知の分離技術によって分離される。電気泳動技術は、一次元又は二次元電気泳動、毛管ゾーン電気泳動、毛管ゲル電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動、及びミセル界面動電クロマトグラフィーを含む。クロマトグラフ技術は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００１７】
図1の概略図において、第1のタンパク質の抽出物は、第1の細胞のグループから既知の技術によって調製され、次いで染料の適合対の第1の染料で標識される。第2のタンパク質の抽出物は、第2の細胞のグループから既知の技術によって調製され、次いで染料の適合対の第2の染料で標識される。タンパク質を標識するために、反応性の形態の染料及びタンパク質を、反応性の形態の染料及びタンパク質の可能な付着又は結合部位間の共有結合の形成を可能にするために充分な時間インキュベートする。時間は、温度にもよるが、15〜30分間である。温度範囲は、一般的に約0℃〜25℃である。染料及びタンパク質間の反応は、タンパク質分子の利用可能な結合部位の充分なパーセンテージが染料と共有結合した後で、クエンチすることができる。いかなる適当な既知のクエンチ用物質も使用することができる。ゲル濾過のような過剰の染料の除去のための他の方法も更に使用することができる。標識化反応を完結するまで行わせた場合、例えば反応性染料の全てが使用され切った場合のような状況では、クエンチ又は過剰の染料の除去は必要ないことがあり得る。
【００１８】
細胞の第1及び第2のグループは、タンパク質含有量の比較又は対比を所望する細胞のいかなる二つのセットであることができる。例えば、細胞の第1のグループは、野生型、即ち正常細胞であることができ、そして細胞の第2のグループは、同一種からの突然変異細胞であることができる。別の方法として、細胞の第1のグループは、正常細胞であることができ、そして第2のグループは、同一個体からの癌性細胞であることができる。同一の個体の発育の異なった段階又は細胞サイクルの異なった期の細胞も更に使用することができる。例えば、Drosophila  melanogasterの腹溝からの発育中の胚を、細胞の第1のグループとして回収することができ、そして腹溝細胞に隣接して発育中の細胞を細胞の第2のグループとして回収することができる。異なった種からの同一型の細胞間のタンパク質成分の差は、本発明の方法による研究にかけることができる。更に、本発明の方法は、各種の刺激又は薬物に対して細胞がいかに反応するかをモニターすることに使用することができる。タンパク質の変化により発現されるような細胞の行動を変化させるような事象の全ては、高精度の2D−PAGE系の必要性及び経費を要することなく検出することができる。当業者は、比較のためのタンパク質は、更に血清、尿、又は脊髄液のような生物学的流体から誘導することができることを認識するものである。
【００１９】
標識された試料は、混合され、そして図1に例示するように、計量されたアリコートで一つのゲルに適用され、次いで好ましくは2D  PAGEにかけられる。2D  PAGEの代わりに一次元SDS電気泳動を使用することができる。一次元及び二次元電気泳動を操作する方法は、当業者には公知である。
【００２０】
二つの細胞グループが共通に有するタンパク質は、一致したスポットを形成する。いずれかのグループからの同一のタンパク質間の発光強度の比は、広範囲の大多数のタンパク質に対して一定であるものである。二つのグループが共通に有していないタンパク質は、独立に移動するものである。従って、一つのグループに独特な又は異なった相対濃度のタンパク質は、大多数のタンパク質のスポットとは異なった比の発光強度を有するものであり、そして使用される標識にもよるが、一つの又は他のタンパク質抽出物に対して特定の色を発生するものである。例えば、第1の試料中のタンパク質は赤く標識することができ、一方第2のグループは青く標識することができる。それぞれのグループの正確に等しい量のタンパク質をいっしょに混合し、そして同一のゲルにかけた場合の条件下では、発光強度の比は、大多数のタンパク質に対しては1であるものである。一つの又は他のグループに独特なタンパク質は、順序又は比の取り方にもよるが、片方より小さいか又は大きい発光強度を有するものである。
【００２１】
ゲルは、二波長発光走査装置、発光顕微鏡又は発光を検出するためのいかなる既知の手段によっても分析することができる。ゲル分析は、コンピューター補助によるタンパク質の差の同定によって、完全に自動化することができる。光電子倍増管を持つレーザー走査系、又は荷電結合装置（CCD）カメラ及び白色光源のような電子式検出系を使用して、標識の異なったスペクトル特性に適応した異なった既知のフィルターセットを使用して、二種類の電子的映像が湿潤ゲルから作られる。一つの映像は、第1の染料の波長で放出されるもの以外の全ての光をフィルターにより除去するために適当な第1のフィルターを使用して、第1の染料の発光を示し、そして他の映像は、第2の染料の波長で放出されるもの以外の全ての光をフィルターにより除去するために適当な第2のフィルターを使用して、第2の染料の発光を示す。露出は約5〜500秒である。試料中の差は、電気泳動中又は電気泳動の1／2時間より少ない時間後のいずれかで同定することができる。いくつかのソフトウェアパッケージが商業的に入手可能であり、これらは第1の映像を第2から差し引いて、異なっているスポットを同定するか、又は別の方法として、映像を割り算して、両方の映像に共通ではないスポットを残すことができるかのいずれかである。映像を差し引く場合、同様なスポットはお互いに相殺し、異なっているもののみを残すものである。比の分析においては、同様なスポットは、1の値を与える。差は、1より大きいか1より小さい値となるものである。
【００２２】
慣用的な分析において、対照は、研究される細胞型に対して既知のタンパク質で行われる。試料ゲル上の既知のスポットは、対照及び第2のゲルと比較して同定し、そしてマークして、二つのゲル間の差を決定なければならない。本発明においては、一つのゲルがあるのみであり、従ってマークする必要はない。更に、タンパク質の差を比較及び対比するに先立って、異なったゲルの整合のために慣用的な方法で使用されるソフトウェアは、局部的なゆがみ及び二つ又はそれ以上のゲル間の不整合を補正しない。本発明の方法は、試験される全ての試料の標識されたタンパク質が混合され、そしていっしょに分離されるために、このような補正の必要を排除する。例えば、電気泳動ゲルのいかなるゆがみも、それぞれの試料が同等に経験する。
【００２３】
染料の適合セットの選択及び合成は重要である。本発明の方法において、発光染料は、タンパク質に、好ましくはタンパク質のリシン残基を経由して共有的にカップリングするが、しかしカップリングは、更にタンパク質中のスルフヒドリル又はカルボン酸基に対しても行うことができる。修飾されたタンパク質において、染料は修飾基に対してカップリングすることができ；例えば染料は、そのアルデヒドへの酸化に続いて、糖タンパク質の糖残基にカプリングすることができる。標識を一つのアミノ酸残基に付着させることを強制して、他のアミノ酸を除外するタンパク質のpHの調節は、R．Baker，Organic  Chemistry  of  Biological  Components，（Prentice  Hall，pub．1971）中に記載されているように公知の技術である。タンパク質の分析において、複数の付着部位が標識される。標識される付着部位の最適なパーセンテージは、染料及び選択される目標の官能基に依存するものである。本明細書中で以下で特定的に検討される好ましい染料がリシンを標識するために使用される場合、好ましくは付着部位の2％より多くない、そして更に好ましくは、タンパク質を不溶性にすることを避けるために、1％より僅かに少なく標識される。従って、典型的なタンパク質が約7％のリシンで構成される場合、1000当たり一つより少ない修飾されたアミノ酸が存在するものである。典型的なタンパク質は約450個のアミノ酸から構成されている。別の戦略は、タンパク質中でより優勢ではない特定の型の官能基、例えばシステイン中のスルフヒドリル基の全てを標識することである。リシンが付着部位である場合、共有結合は、リシンの第一アミンの正の電荷を消失させる。等電点電気泳動は、電荷に依存するために、電荷の損失を補償することは重要なことである。塩基性残基は、塩基性のままでなければならない。修飾された残基の塩基性又は酸性が、該当するそれぞれの場合、代わらないことを条件として、タンパク質当たりの一つの残基のpKaの3までの変化は許容することができる。ローダミン及びフルオレセインのような染料は、電荷の差のために適していない。
【００２４】
当業者は、記載された標識方法が、細胞から誘導される又は血漿、血清、尿、腹水又は脊髄液のような生物学的流体中に存在するペプチド分子に同等に良好に適用することができることを認識するものである。更に、標識化のためのタンパク質試料の調製において、ある状況下では、標識化及び分離に先立って、まずトリプシン又は他のプロテアーゼ酵素による酵素消化を行って、ペプチドを生成することに利益がある。
【００２５】
別の方法として、翻訳後修飾を保有するタンパク質のようなタンパク質の特定の基を、翻訳後修飾中の差及び二つ又はそれ以上の試料間のタンパク質に発生するその他の差を比較するために目標とすることが可能である。
【００２６】
このようなタンパク質の例は、糖タンパク質である。近年、タンパク質上の炭水化物の反応的な重要性が、ますます理解されてきている。炭水化物が、多くの細胞及び疾患の過程に関係していることがいまや知られている。糖タンパク質の末端炭水化物基を、Wilchek，M．and  Bayer，E．A．，“Methods  in  Enzymology”vol．138，429−442（1987）によって記載されているように、最初に末端糖基をアルデヒドに酸化し、続いてハプテン又はヒドラジドのような反応性基を保有するフルオロとの反応によって標識することが可能である。
【００２７】
更に特定的には、本発明は：二つ又はそれ以上のタンパク質試料の抽出物を調製し、前記タンパク質試料のそれぞれを、過ヨウ素酸塩の存在中で短時間インキュベートして、末端糖のビシナルなジオールをアルデヒド基に酸化することを含むものである。次いで過剰の過ヨウ素酸塩は、適合セットからの適当な発光染料で標識される前に、重亜硫酸塩の添加により破壊されるものである。別の方法として、シアル酸残基を、低濃度の過ヨウ素酸塩、典型的には1mMを使用し、0℃の温度を使用してその環外炭素を酸化することによって特定的に標識することが可能である。タンパク質試料を、ガラクトースオキシダーゼで処理して、末端ガラクトース残基にアルデヒド基を生成して、次いで適当なフルオロと反応させることができるC−6アルデヒド誘導体を形成させることも更に可能である。染料及び炭水化物の反応は、試料をいっしょに混合し、そして適当な分離法にかける前に、適当な物質の添加によってクエンチすることができる。
【００２８】
糖タンパク質の標識のために使用することができる発光染料は、ヒドラジド、セミカルバジド及びカルボヒドラジドのようなヒドラジン誘導体又はアミン誘導体を反応性基として有する染料を含む。糖タンパク質の全体の電荷を維持するために、適当な染料は、全体として中性の電荷を保有するものである。全体としての中性の電荷は、適当に荷電された結合体を染料分子に加えることにより、所望する全体の電荷を生成することによって得ることができる。適当な染料は、中性のシアニン誘導体、BODIPY誘導体又は本明細書中に記載されるような適合染料のセットとして利用可能な、そして全体として中性の電荷を保有する、他の発光誘導体を含むものである。
【００２９】
本発明の方法は、更にフルオロで特定的に標識することができるリンタンパク質に適用可能である。リンタンパク質は、細胞の信号化を含む重要な生物学的役割を行い、そして多くの調節機構に関係する。タンパク質上のリン酸基は、例えば本明細書中に参考文献として援用される、Giese  and  Wangの米国特許第5，512，486号によって記載されている方法のように、発光性又はハプテンイミダゾール誘導体を使用して、特定的に標識することができる。イミダゾール基を保有する標識用試薬が、標識化に作用する適当なカルボジイミドの存在中でタンパク質試料に加えられる。
【００３０】
更に特定的には、本発明の方法は、二つ又はそれ以上のタンパク質試料の抽出物を調製し、前記タンパク質試料のそれぞれを、適当な水溶性カルボジイミド及び適合染料のセットからの発光性イミダゾール誘導体とインキュベートすることを含む。カルボジイミドはリン酸と同様に側鎖のカルボキシルを活性化するものであるが、pHを約8に上昇させた場合、カルボキシル基との結合は不安定である。過剰の反応物質は、適当な既知のクエンチ物質の添加によって除去することができる。次いで試料は混合され、そして既知の分離技術によって分離される。
【００３１】
リンタンパク質の全体の電荷を維持するために適当な発光性イミダゾール誘導体は、全体として負の電荷を保有するものである。この全体的な負の電荷は、適当に荷電した結合体を染料分子に添加することによって得ることができる。使用することができる染料の例は、全体として負の電荷を保有するシアニン染料、全体として負の電荷を保有するスクアラート（squarate）染料又は全体として負の電荷を保有し、そして適合染料のセットとして利用可能な他の発光性の誘導体を含む。好ましいカルボジイミド分子は、（1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）（EDC）及び1−エチル−3−（4−アゾニア−4，4−ジメチルペンチル）カルボジイミドヨウ化物）（EAC）のような水溶性分子である。
【００３２】
評価された染料の第1のグループは、Mujumdar，R．B．et  al．，“Cyanine  dye  labeling  reagents  containing  isothiocyanate  groups”，Cytometry  10：11−19（1989）及び1993年に発行され、そして本明細書中に参考文献として援用される、“Method  for  labeling  and  detecting  materials  employing  arylsulfonate  cyanine  dyes”の表題のWaggoner等の米国特許第5，268，486号中に記載されている発光性シアニン染料であった。シアニン染料は、以下の一般構造：
【００３３】
【化４】
0004589587.tif 000002
を有し、式中、X及びYは、O、S又は（CH3）2−Cであることができ、mは、1〜3の整数であり、そしてR1、R2、R3、R4、R5、R6又はR7の少なくとも一つは、アミノ、ヒドロキシ又はスルフヒドリル求核分子と反応する反応性基である。点線は、それぞれの環が5〜6個の原子を有する単環〜3個の縮合環の形成のために必要な炭素原子を示す。R3、R4、R6及びR7は、環に付着している。反応性分子は、いかなる既知の反応性基であることができる。発色団に直接又は間接的に付着して、R1、R2、R3、R4、R5、R6又はR7基を形成することができる反応性基は、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−又はジ−ハロゲン置換ピリジン、モノ−又はジ−ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、ホスホルアミジト、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化酸、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、3−（2−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド、グリオキサル、ケトン、アミノ及びアルデヒドを含む基のような反応性分子を含む。
【００３４】
その固有の正の電荷のために、Waggoner等の特許に記載されているシアニン染料は、第一アミンを標識するために正の電荷が所望される場合、選択されるべき発光発光団である。シアニンは、活性化されたヘキサン酸のエステルを経由してタンパク質に付着される。カップリングは、リシンの側鎖の電荷を消失させるが、染料の固有の電荷が補償する。これは、実質的に電荷をタンパク質分子から離れた所へ移動するが、しかし電気泳動にかけられる試料の同じ全体の電荷を維持する。シアニン染料分子において、二つの官能化されたインドール環が、ポリエン結合体を経由して結合されている。シアニン染料のスペクトル特性は、染料のインドール環の間の結合体の長さを単純に変更することによって、容易に調節することができる。より長い又はより短い結合体の長さは、異なった波長の発光、そして従って異なった色となるものである。しかしながら、結合体の長さを変化させることは、染料の分子質量を変化させる。電気泳動は、更にタンパク質の質量に依存するために、染料のタンパク質の質量に対する影響も更に重要なことである。タンパク質は、電気泳動の前に標識されるために、タンパク質に付着される染料の質量は、抽出物中の各種のタンパク質の分子量の相対的な差を、有意に変更してはならない。しかしながら、タンパク質の比較的少ない数の部位のみが標識されるために、分子量は決定的ではない。先に示したように、好ましくは1％より少なく、約2％までのタンパク質上の可能な付着部位が標識される。更に多くが標識される場合、適合染料のセット中の染料の一般的に等しく維持された分子量が、より大きい関心事となる。
【００３５】
発光性シアニン染料中の結合体の長さを変化させることによって惹き起こされる分子量の差は、染料のインドール環の一つに付着した脂肪族鎖R1又はR2の大きさを調節することによって補償することができる。R1又はR2の一つは、反応性基でなければならない。これらの設計上の制約は、シアニンの修飾及び以下の一般式：
【００３６】
【化５】
0004589587.tif 000003
の染料の開発に導き、式中、X及びYは、S、O、又はCH3−C−CH3と等しく、mは、1〜3の整数であり、そしてR1又はR2のいずれかは、修飾されていないシアニン染料に対して先に記載した反応性基のような、タンパク質に共有結合することが可能な反応性基である。点線は、5又は6個の炭素原子をそれぞれの環に有する1、2又は3個の縮合環を示す。それぞれの側は、他の側と釣り合っていなければならない。
【００３７】
一般式に従って開発された染料の適合対の例は、赤の発光を発する以下の式：
【００３８】
【化６】
0004589587.tif 000004
（プロピルCy−3−NHS）及びスペクトルの赤外の発光を発する以下の式：
【００３９】
【化７】
0004589587.tif 000005
（メチルCy−5−NHS）であり、式中Rは反応性基である。先に記載したように、O又はS或いはその組み合わせは、（CH3）2C−の代わりにX及びYの位置を占めることができる。
【００４０】
シアニン染料は、本発明の染料の適合セットに対する一つの選択である。ジピロメテンボロンジフルオリド染料、Haugland等に付与され、そして本明細書中に参考文献として援用される、米国特許第4，774，339号に記載されている、BODIPY（登録商標）の商標でMolecular  Probes，Inc．によって市販されている、誘導された4，4−ジフルオロ−4−ボラ−3a，4a−ジアザ−S−インダセン染料のような他の染料化合物を、シアニンの代わりに使用することができる。正味の電荷を有しないBODIPY（登録商標）染料は、アミド結合を形成する、活性化されたn−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを使用してリシンの側鎖に共有結合する。結果としてリシンの正の電荷は失われる。従って、正に荷電された結合体基を本発明の適合染料に使用して、失われた第一アミンを結合体の第三アミンで置き換える。BODIPY（登録商標）染料を製造するための方法は、米国特許第4，774，339号に記載されている。正に荷電された結合体の付加は、当業者にとって公知の技術による。結合体は；（1）BODIPY（登録商標）−NHSエステルと反応する、（2）所望する電荷を保有する、及び（3）BODIPY（登録商標）−結合体構築物が、抽出物中のタンパク質の特定のアミノ酸残基と反応するものであるように活性化される、三つの官能基を伴なって設計することができる。
【００４１】
染料の適合セットに対する主要な考慮点は、電荷及び明確でそして異なったスペクトル特性の維持である。本明細書中に記載された要求を他の方法で満足する、好ましくはそれぞれ＋1の電荷を有する、正の結合体を伴なういかなる中性の染料又はいかなる正に荷電された染料も、本発明の染料の適合セット中の染料として提供することができる。標識されたタンパク質の試料中の概略等しい分子量が好ましいが、先に説明したように、決定的ではない。シアニン染料の固有の正の電荷は、リシンの正の電荷を置き換える好ましい態様において都合よく使用される。シアニン及びリシンのpKaは、むしろ異なっている；しかしながら、条件は、染料：タンパク質比が1より低くなるように選択された。この低い濃度の標識化は、二次元電気泳動ゲル上のタンパク質の移動における無視できる変化であるものであることを確実にする。染料は、リシンのpKaに更に接近して適合するように使用することができる。別の方法として、アミノ酸のイオン特性が修飾によって保存されることを条件として、他のアミノ酸残基を修飾する染料を使用することができる。リシンの代わりに、タンパク質上の付着部位が、スルフヒドリル又はカルボキシル基であることができる。スルフヒドリル基がタンパク質上の付着部位である場合、染料上の対応する付着部位は、インドアルキル又はマレイミド基である。カルボン酸基がタンパク質上の付着部位である場合、染料上の対応する付着部位は、クロロケトン又はカルボジイミドである。
【００４２】
本発明の方法が、更に異なった試料中の異なった核酸の存在の検出に使用することができることが予想される。核酸の電荷は、非常に負である。従って染料の付加は、核酸の全体の電荷を変化させず、従って核酸の分析が企図された場合、染料の適合セットの選択は、電荷の損失を補償しなくてもよい。染料の付着を促進するために、核酸は、核酸の核から得られる遊離アミノ酸を有するように、等業者にとって既知の技術によって修飾することができる。この場合もまた、リシンが適しているものである。
【００４３】
実施例1：
染料（メチルCy−5及びプロピルCy−3）の合成：
1．インドール誘導体の合成（両方の染料に共通）：
40mlの1，2−ジクロロベンゼン中の、4．8g（30mmols）の2，3，3−トリメチル−（3H）−インドール及び35mmolsの所望のブロモアルキル試薬（6−ブロモヘキサン酸又は1−ブロモプロパン）を、窒素ガス下で110℃に加熱し、そして還流で一晩撹拌した。産物（酸インドール、メチルインドール又はプロピルインドール）が、オレンジ色のガム状物として沈殿した。上清をデカントし、そしてガム状物をエチルエーテルで数回洗浄した。この中間体をそのまま使用した。
【００４４】
2．Cy−3中間体：
1．5g（7．5mmols）のプロピルインドールを、20mlの氷酢酸中の1．6g（7．6mmols）のN−N’ジフェニルホルムアミジンに加え、そして4時間還流した。溶媒を真空下で除去して、濃いオレンジ色のシロップ状物が残った。この中間体をそのまま使用した。
【００４５】
2a．Cy−5中間体：
Cy−5中間体の合成は、2−メチレン−1，3，3−トリメチルインドリンをプロピルインドールの代わりに使用し、そして結合体がマロンアルデヒドジアニルであった以外は、染料合成の工程2のCy−3中間体の合成と同様である。ガム状の青色がかった中間体を、エチルエーテルで2回洗浄した。
【００４６】
3．Cy−3：
2．5mlのトリエチルアミン及び1．8mlの無水Ac2Oを、工程2から得られた中間体に加え、そして混合物を5分間沸騰した。1．70g（5．0mmols）の酸インドールを加え、そして混合物を2時間還流した。溶媒を真空下で除去し、そして産物を10mlのEtOHに溶解した。
【００４７】
3a．Cy−5：
Cy−5の調製は、工程2a．から得られた中間体を工程2．から得られた中間体の代わりに使用した以外は、Cy−3の方法と同様である。
【００４８】
4．工程3．及び3a．から得られた産物の精製：
メチルCy−5及びプロピルCy−3を、シリカゲルの固体相及び移動相としてジクロロメタン中の40％MeOHによる、フラッシュクロマトグラフィーにかけることによって汚染副産物から分離した。
【００４９】
5．カルボキシル基の活性化：
それぞれの染料のカルボン酸分子を、ある量の精製した物質を5mlの乾燥ジメチルホルムアミジン（DMF）中に溶解することによって、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに転換した。1．5当量の炭酸N−N’ジスクシンイミジル（DSC）を、0．1mlの乾燥ピリジン／100mg染料と共に加えた。反応物を、60℃で90分間窒素下で還流した。
【００５０】
実施例2：
タンパク質の標識：
1．細菌の培養
最初の実験を、Chasman，D．E．et  al．“Activation  of  yeast  polymerase  II  transcription  by  Herpesvirus  VP16  and  GAL4  derivatives  in  vitro”，Molecular  Cell  Biology  9：4746−4749（1989）中に記載されているようなlacプロモーターの制御下でキメラのGAL4VP16タンパク質を発現しているE．coliで行った。二つの細菌の培養物を、50μg／mlのアムピシリンを含む125mlの標準のLB媒体中で、37℃で0．7のOD600まで増殖させた。
【００５１】
イソフェニルチオガラクトピラノシド（IPTG）、ラクトースの非加水分解性の類似体を、一つの培養物に最終濃度1mMで加えた。両方の培養物を更に2．5時間インキュベートした。
【００５２】
2．二次元ゲル電気泳動に対するタンパク質の単離：
タンパク質の単離は、次の通りである。細菌を遠心分離で単離した。それぞれの細菌のペレットを5mMのpH8．4のHepes  KOH、4．5mMのMg（OAc）2を含む超音波処理緩衝液で洗浄した。ペレットを50μg／mlのRNアーゼを含む超音波処理用緩衝液中に、100μlの最終体積に再懸濁した。次いでこれを溶液が透明になるまで、通常数分間、氷中で超音波処理した。DNアーゼを50μg／mlまで加え、そして試料を30分間0℃でインキュベートした。固体尿素及びCHAPSを、それぞれ8M及び5％の最終濃度で加えた。試料を氷中から取り出し、そして1体積の溶菌緩衝液を加えた。試料を直ちに標識するか、又は−80℃で保存した。
【００５３】
3．タンパク質の標識
2nmoleの染料／50μgのタンパク質の濃度で、プロピルCy−3−NHSを細胞抽出物の第1の試料に加え、そしてメチルCy−5−NHSを第2の試料に加えた。染料の原液は、典型的にはジメチルホルムアミド中の2mMであった。反応物を0℃で30分間インキュベートした。インキュベーションの時間は、温度及び研究される細胞の種類によって、約15分〜約30分間で変化することができる。温度が約25℃の場合、インキュベーションは15分間であることができる。温度は、タンパク質の分解を起こすものである温度より上であってはならない。標識された試料は、直ちに等電点電気泳動にかけられるか、又は−80℃で保存された。
【００５４】
4．タンパク質の単離及びSDS−ゲル電気泳動に対する標識：
細菌を増殖し、そしてRNアーゼ又はDNアーゼを加えなかった以外は、タンパク質標識方法の工程2．のように超音波処理によって単離した。細胞抽出物をタンパク質標識方法の工程3のように直接標識した。SDS、グリセリン、pH6．8のTris  HCl、及びブロモフェノールブルーを、それぞれ1％、10％、64mM、及び5μg／mlの最終濃度にするように加えた。次いで試料を沸騰水浴に2分間入れ、そして次いで電気泳動にかけた。
【００５５】
5．染料対タンパク質比の測定
標識されたタンパク質の溶解性の問題を回避するために、条件を選択して、細胞抽出物中のリシンの1〜2％のみを標識した。これは、平均のタンパク質のアミノ酸の7％がリシンであるという仮定に基づいている。染料対タンパク質比の測定の最初の工程は、SM−2ビーズ（Bio−Rad）への吸着による遊離の染料の除去であった。タンパク質濃度は、OD260／280により測定した。染料濃度は、プロピルCy−3及びメチルCy−5のそれぞれに対して、OD548及びOD650によって測定した（両方の染料に対してε＝100，000）。
【００５６】
実施例3：
ゲル電気泳動：
1．二次元電気泳動：
高分離能二次元ゲル電気泳動を、公知の技術によって行った。
【００５７】
2．SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動：
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を、既知の技術によって行った。
実施例4：
発光ゲルの映像化：
電気泳動の最後に、ゲルを25％のメタノール及び7％の酢酸の溶液に浸漬した。ゲル中の発光的に標識されたタンパク質を、次の方法で映像化した。ゲルをアノード化したアルミニウムの表面に置き、そしてスライド映写機に収納された300Wのハロゲンランプで60°の入射角で照射した。映写機を出た光線は、Cy−3及びCy−5のそれぞれに対して、545±10nm及び635±15nmの約2．5cm（1インチ）直径の帯域フィルター（Chroma  Technologies，Brattleboro  VT）を通過した。映像を、50mmレンズ（Nikon）及びCy−3及びCy−5のそれぞれに対して、587．5±17．5nm及び695±30nmの二重帯域放出線フィルター（Chroma  Technologies，Brattleboro  VT）を備えた、冷却したCCDカメラ（Photometrics  Inc．，Tucson  AZ）で収録した。CCDカメラは、Photometricsカメラコントローラーソフトウェアで操作される、Macintosh  II  siコンピューターによって制御された。映像集積化時間は十分の数秒〜数分の範囲であった。励起用フィルターは、映写機に付属したフィルター環に収納されていた。二つの連続した映像を、ゲルを移動することなく二つのフィルターからの照射によって収録した。
【００５８】
実施例5：
映像の加工：
映像ファイルを、Personal  Iris  4D／35（Silicon  Graphics  Inc．，Mountain  View  CA）に移した。次いで映像ファイルをDelta  VisionTMソフトウェア（Applied  Precision，Mercer  Island  WA）を使用して加工した。二種類のスキームを使用して、ゲル上の異なって標識された試料間の差を測定した：
1．引き算：
それぞれの映像を、ピクセルの各種の強度の網目状アレイとして考えることができる。これらの数値のアレイは、多くの算術的操作によって調節することができる。ここでは片方の映像が他の映像から差し引かれた。ゲル上に付加された二つの試料が全体的な発光に対して完全に釣り合っていないので、片方の映像は、均衡化係数によって掛け算された。この係数は、各試料間の差の数が小さく保たれるように適当に決められた。
【００５９】
2．比の映像化：
ここでは片方の映像を他の映像によって割り算した。この操作を行う前に、映像は、まず共通な強度の範囲に標準化された。これは、それぞれの映像の最小及び最大のピクセル値を、ゼロ及び適当な最大値、即ち使用したCCDカメラの最大可能出力値の4095に設定することによって行った。中間のピクセル値は、これらの値間を直線的に比例させて得た。次いで片方の映像を他の映像によって割り算した。均衡係数をここでも更に使用して、平均の商を1に保った。差の範囲は、1より大きい商を持つものであった。
【００６０】
実施例6：
1．細菌中の誘導されたGAL4VP16発現の差のSDSゲル電気泳動：
図2は、単一のSDSポリアクリルアミドゲルにかけられた、プロピルCy−3及びメチルCy−5標識タンパク質の映像を示す。
【００６１】
レーン1〜3は、Cy−3標識タンパク質を示す。これらのレーンに付加された試料は：
レーン1．プロピルCy−3標識IPTG−誘導細菌抽出物、
レーン2．プロピルCy−3標識IPTG−誘導細菌抽出物及びメチルCy−5標識の誘導されていない抽出物、
レーン3．プロピルCy−3標識精製GAL4VP16タンパク質、
であった。
【００６２】
レーン4〜6は、Cy−5標識タンパク質を示す。これらのレーンに付加された試料は：
レーン4．プロピルCy−3標識IPTG−誘導細菌抽出物、
レーン5．プロピルCy−3標識IPTG−誘導細菌抽出物及びメチルCy−5標識の誘導されていない抽出物、
レーン6．プロピルCy−3標識精製GAL4VP16タンパク質、
であった。レーン5のみがCy−5の発光を示した。
【００６３】
レーン7及び8は、レーン2−レーン5及びレーン3−レーン6のそれぞれの引き算の結果を示す。矢印は、レーン8の精製GAL4VP16のバンドの位置によって確認されるようなGAL4VP16の位置を指す。上部のバンドの正体は知られていない。しかしながら、β−ガラクトシダーゼを含むIPTGによって誘導されることが知られているいくつかのタンパク質がある。
【００６４】
レーン9〜11は、Cy−5標識タンパク質を示す。これらのレーンに付加された試料は：
レーン9．メチルCy−5標識IPTG−誘導細菌抽出物、
レーン10．メチルCy−5標識IPTG−誘導細菌抽出物及びプロピルCy−3標識の誘導されていない抽出物、
レーン11．メチルCy−5標識精製GAL4VP16タンパク質、
であった。
【００６５】
レーン12〜15は、Cy−5標識タンパク質を示す。これらのレーンに付加された試料は：
レーン12．メチルCy−5標識IPTG−誘導細菌抽出物、
レーン13．メチルCy−5標識IPTG−誘導細菌抽出物及びプロピルCy−3標識の誘導されていない抽出物、
レーン14．メチルCy−5標識精製GAL4VP16タンパク質、
であった。レーン12〜15のみが、全てある程度のCy−3の発光を示した。これは、帯域フィルター間の僅かな交錯による。これが、Cy−3光線で励起された場合、Cy−5で標識された物質が出現することを惹き起こす。逆は見られない。Cy−3物質は、Cy−5励起光線によって可視化されない。交錯の影響を除去する二つの方法がある；より良好な帯域フィルターを設計するか、又は交錯定数を知ることによってCy−3映像に対するCy−5の寄与を、コンピューター的に除去することである。
【００６６】
レーン15及び16は、レーン10−レーン13及びレーン11−レーン14のそれぞれの引き算の結果を示す。矢印は、レーン16の精製GAL4VP16のバンドの位置によって確認されるようなGAL4VP16の位置を指す。上部のバンドの正体は知られていない。しかしながら、β−ガラクトシダーゼを含むIPTGによって誘導されることが知られているいくつかのタンパク質がある。
【００６７】
2．細菌中の誘導されたGAL4VP16発現の差の二次元ゲル電気泳動：
図3は、プロピルCy−3標識IPTG−誘導細菌抽出物及びメチルCy−5標識の誘導されていない抽出物を付加した二次元ゲルの一部の映像を示す。
【００６８】
パネルA．IPTG−誘導タンパク質を示す、Cy−3励起光線で記録された映像。
パネルB．誘導されていないタンパク質を示す、Cy−5励起光線で記録された映像。
【００６９】
パネルC．Cy−5の映像で割り算されたCy−3の映像。
パネルD．赤に着色され、そして青に着色されたパネルBの映像の上に置かれたパネルCの映像のオーバーレイ。
【００７０】
3．外因的に加えられたタンパク質を伴なう細菌抽出物の差の二次元ゲル電気泳動：
図4は、外因的に加えられたカルボニックアンヒドラーゼを有するプロピルCy−3標識細菌抽出物及びカルボニックアンヒドラーゼを加えられていないメチルCy−5標識抽出物を付加した二次元ゲルの一部の映像を示す。
【００７１】
パネルA．細菌のタンパク質及びカルボニックアンヒドラーゼを示す、Cy−3励起光線で記録された映像。
パネルB．細菌のタンパク質のみを示す、Cy−5励起光線で記録された映像。
【００７２】
パネルC．Cy−5の映像で割られたCy−3の映像の比。
パネルD．赤に着色され、そして青に着色されたパネルBの映像の上に置かれたパネルCの映像のオーバーレイ。
【００７３】
本発明の方法は、異なった細胞又は他の供給源から得られる異なった試料のタンパク質含有量の差を分析する簡単でそして費用のかからない方法を提供する。この方法は、別個に電気泳動しなければならない二つの別個のゲルを使用することにより起こり得る問題を排除する。異なったタンパク質を標識するために使用される適合染料は、二つ又はそれ以上の異なった試料を単一のゲルで、同時に電気泳動することを可能にする。本発明は、タンパク質の二つの試料及び染料の適合対に関して記載されてきたが、当業者は、二つより多い試料を、等しい数の適合染料を使用して同時に試験することができることを認識するものである。染料のスペクトル特性を操作して、視覚的に別個の映像を得るように多くの異なった波長の発光を得ることができ、そして染料のpH及びイオン特性を一般的に等しくして、染料に共有結合することによってタンパク質に起こった変化を補償することができる限り、多数の染料を使用することができる。
【００７４】
＜糖タンパク質の差の分析＞
＜染料の合成＞
実施例7：
シアニン染料の中間体の合成は、先に記載した通りであった。次いでそれぞれのCy3及びCy5中間体のカルボン酸分子は、以下に詳細に記載するようにヒドラジドに転換された。
【００７５】
【化８】
0004589587.tif 000006
無水アセトニトリル（2ml）中の、Cy−3（50mg、8．9×10-5mol）の撹拌された溶液に、ジイソプロピルアミン（0．03ml、9．7×10-5mol）及びテトラフルオロホウ酸O−（N−スクシンイミジル）−N，N，N’，N’−ビス（テトラメチル）ウロニウム（TSTU）（30mg、9．7×10-5mol）を加え、そして反応物を周囲温度で1時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（TLC）による物質の分析は、いかなる出発物質も残存しないことを明らかにし、従ってジイソプロピルアミンの更なる当量（0．03ml、9．7×10-5mol）を加え、次いで、その後テトラブチルカルバザート（carbazate）（30mg、1．78×10-4mol）を加えた。反応物を周囲温度で一晩撹拌し、次いで溶媒を真空中で除去して、非常に濃く着色したピンク色の油状物を得た。油状物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ：ジクロロメタン／メタノールの勾配）を使用して精製し、ピンク色の固体（59mg、97％）を得た。産物は、透明であり、そして1H  NMR及びUV／VIS分光分析（λmax＝552nm）により正しかった。
【００７６】
【化９】
0004589587.tif 000007
クロロホルム（1ml）を、ピンク色の固体の一部（5mg）に加え、そして濁った溶液を得て、これをトリフルオロ酢酸（4滴）で処理した。1時間のインキュベーション後、TLCは、全ての産物が消費され、そして更に極性な産物が形成されたことを明らかにし、従って溶媒を真空中で除去し、そして得られた半固体をジエチルエーテルで摩砕し、次いで真空中で乾燥した。産物は透明で、そして1H  NMR及びUV／VIS分光分析により正しいことが明らかとなった（λ＝552nm）。
【００７７】
実施例8：
Cy5ヒドラジドの調製は、出発物質がCy5であった以外は、Cy3のそれと同様である。
【００７８】
実施例9：
タンパク質の標識：
1）細胞の培養。
【００７９】
最初の実験は、HBL100ヒト乳房（In  Vitro  Cell  ＆  Dev．Biol．，vol．26，933（1990）参照）及びBT474ヒト乳房管癌（J．Natl．Cancer  Inst．（Bethesda），vol．61，967（1978））上皮細胞系の培養物で行った。HBL100細胞を、10％の胎児ウシ血清及び2mMのグルタミンで補充したMcCoyの5A培地中で37℃で、5％CO2の大気雰囲気中で、単層として密集まで増殖した。BT474細胞は、10％の胎児ウシ血清、2mMのグルタミン、0．02mg／mlのウシインスリン、0．45％のグルコース及び1mMのピルビン酸ナトリウムで補充したRPMI1460培地中で37℃で、5％CO2の大気雰囲気中で、単層として密集まで増殖した。
【００８０】
2）細胞からのタンパク質の単離
細胞の単層のフラスコをPBSで2回洗浄して、培地を除去し、そして細胞をトリプシン中のインキュベーションによって回収した。細胞の懸濁液を2000rpmで5分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を捨て、そして細胞のペレットをTrisで洗浄して、過剰の塩を除去した。細胞のペレットを−70℃で保存した。
【００８１】
タンパク質を、超音波処理によって細胞から抽出した。細胞のペレット（約2×106細胞／ml）を、2Mの尿素、100mMのpH5．5の酢酸緩衝液、1％（v／v）のNP−40及び0．1％（w／v）のSDSを含む溶菌緩衝液中に再懸濁し、そして氷上で4回それぞれ20秒間超音波処理した。細胞溶解物をマイクロヒュージ中で4℃で13，000rpmで5分間遠心分離して、細胞の残骸を除去し、そして上清を保有した。細胞上清を−20℃で保存した。
【００８２】
3）染料：タンパク質の比の推定のためのタンパク質濃度の測定
標識されたタンパク質に伴なう溶解性の問題を回避し、そして矛盾のない染料：タンパク質比の使用を可能にするために、抽出されたタンパク質の濃度を、BioRad  Dcタンパク質アッセイ（BioRad  Laboratories）によって測定した。
【００８３】
4）ヒドラジド染料を使用した糖タンパク質上の炭水化物の標識
a）SDS−PAGEに対するモデル糖タンパク質の標識
i）個々の糖タンパク質の溶液を、水中の10mg／ml原液として調製した。標識のために、10μgのそれぞれのタンパク質を取り出し、そしてpH5．5の酢酸緩衝液で100mMの最終緩衝液濃度に希釈した。
【００８４】
ii）糖残基を、水中のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加して、10mMの最終濃度を得ることによって酸化し、そして20分間周囲温度で、暗所でインキュベートした。過剰のメタ過ヨウ素酸を、200mMのpH5．5の酢酸緩衝液中のメタ重亜硫酸ナトリウムの添加によって除去して、5mMの最終濃度を得て、そして5分間周囲温度でインキュベートした。
【００８５】
約25nmol／10μgタンパク質の濃度で、Cy3ヒドラジドを第1の細胞試料に加え、そしてCy5ヒドラジドを第2の細胞抽出物に加えた。染料の原液は、典型的にはジメチルホルムアミド中の10mMであった。標識化反応物を周囲温度で30分間インキュベートした。インキュベーションの時間は、約10〜60分間で変化することができ、そしてインキュベーションの温度は、研究される細胞の種類にもよるが、0℃〜約25℃で変化することができる。温度は、タンパク質の分解が起こるものである温度より上であってはならず、そして時間は、非特異的な標識が起こり得るより長くてはならない。
【００８６】
iii）ゲル付加試料緩衝液を標識された試料に加えて、2％（w／v）のSDS、10％（v／v）のグリセリン、62．5mMのpH6．8のTris−HCl、5％（v／v）のメルカプトエタノール、0．01％のブロモフェノールブルーの最終濃度を得る。試料を沸騰水浴中に4分間入れ、次いで電気泳動にかける。
【００８７】
b）SDS−PAGEに対する簡単な糖タンパク質混合物の標識
12又は14種類の異なったモデルタンパク質の簡単な混合物を、10mg／mlのタンパク質原液からの約10μgのそれぞれのタンパク質を含んで調製して、分子量のはしごを得た。タンパク質の溶液を、200mMのpH5．5の酢酸緩衝液で1：1に希釈した。タンパク質の混合物を、上記工程4a（ii）に記載した方法に従って標識した。試料を記載したような試料緩衝液の添加後、SDS−PAGEによって分析した。
【００８８】
c）二次元ゲル電気泳動に対する細胞抽出物中の糖タンパク質の標識
タンパク質を、この実施例の工程3に記載したように、細胞から抽出し、そして糖タンパク質上の炭水化物基の標識に直接使用した。約150μgの抽出されたタンパク質を、上記工程4a（ii）に記載したように標識した。標識された試料（約25〜50μg）を、2倍のIEF試料緩衝液（8Mの尿素、4％（w／v）のCHAPS、2％（v／v）のPharmalytes、20mg／mlのDTT）と混合し、そして等電点電気泳動片（固定化pH勾配、Amersham  Pharmacia  Biotech）上に直接付加した。
【００８９】
5）NHS染料を使用したタンパク質中のリシン残基の標識
タンパク質を、リシン残基において、先に記載したようにアミン反応性NHS染料で、200pmolのCy2−NHSエステル／5mMのTris緩衝液中の50μgのタンパク質を使用して標識した。細胞抽出物から得られたタンパク質を、先に記載したようにCy2で直接標識した。
【００９０】
6）ゲル電気泳動
1．二次元電気泳動：高分離能二次元電気泳動を、Laemmli［Nature，vol．227，680−685（1970）］に従った公知の技術によって行った。
【００９１】
2．SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動：SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、既知の技術によって行った。
7）発光ゲルの映像化
電気泳動の最後に、ゲル中の発光的に標識されたタンパク質を、商業的に入手可能な走査装置を使用して、適当な励起及び放出波長［Cy2励起480／30放出530／30；Cy3励起540／25、放出590／35；Cy5励起620／30、放出680／30］で映像化した。
【００９２】
実施例10：
モデルの糖タンパク質の標識：
図5a）及びb）は、それぞれSDS−PAGEにかけたCy2−NHS及びCy3ヒドラジド標識タンパク質の映像を示す。
【００９３】
レーン1及び3は、リシン残基でCy2NHSエステルで標識され、Cy2励起及び放出で可視化されたタンパク質を示す。
レーン1．Cy2標識トランスフェリン（分子量約76kDa）。
【００９４】
レーン3．Cy2標識ダイズトリプシン阻害剤（分子量約20kDa）。
レーン2及び4は、炭水化物基でCy3ヒドラジドで標識され、Cy3励起及び放出で可視化された同じタンパク質を示す。
【００９５】
レーン2．Cy3で標識されたトランスフェリン。
レーン4．Cy3で標識されたダイズトリプシン阻害剤。
レーン1及び3は、トランスフェリン及びトリプシン阻害剤の両方が、Cy2リシン染料で標識されたことを示す。レーン4は、トランスフェリンのCy3ヒドラジドによる標識化を示す。レーン4のトリプシン阻害剤は、このタンパク質がグリコシル化されていなく、そして従ってCy3で標識されないために、Cy3では見えない。
【００９６】
実施例11：
簡単なタンパク質混合物の差のSDS−PAGE分析：
図6a）及びb）は、SDS−PAGEにかけたCy3（6a）及びCy5（6b）ヒドラジド標識タンパク質混合物の映像を示す。タンパク質混合物Bは、それぞれ10mgの次のタンパク質−フェチュイン、アルブミン、カルボキシペプチダーゼY、リボヌクリアーゼB、α−1酸性糖タンパク質、トリプシン阻害剤、ラクトグロブリン、シトクロムC、α−ラクトアルブミン、リゾチーム、ミオグロビン及びアクチンを標識することによって調製した。タンパク質混合物Aは、混合物Bと同一のタンパク質並びにトランスフェリン及びカルボニックアンヒドラーゼを含む。
【００９７】
図6（a）のレーン1及び3は、Cy3標識のタンパク質混合物A及びBを示す。
図6（b）のレーン2及び4は、Cy5標識のタンパク質混合物A及びBを示す。
レーン5は、Cy3標識タンパク質混合物A及びCy5標識タンパク質混合物Bを示す。
【００９８】
レーン6は、Cy5標識タンパク質混合物A及びCy3標識混合物Bを示す。
同一レーンで試験されたタンパク質混合物によるレーン5及び6は、混合物A中の二つの追加されたタンパク質の差の検出を示す−レーン5においてはCy3の映像上で見ることができ、そしてレーン6ではCy5の映像上で見ることができる。
【００９９】
実施例12：
哺乳動物の細胞抽出物の差の2DE分析：
図7（a）及び（b）は、Cy3（7a）ヒドラジド標識HBL100細胞抽出物及びCy5（7b）ヒドラジド標識BT474細胞抽出物を付加した2DEゲルの一部分の映像を示す。細胞系の糖タンパク質の含有量の差は、二つの細胞抽出物で得られるスポットの異なった分布から明白である。いくつかの定性的及び定量的な差は、矢印で強調してある。
【０１００】
実施例13：
外因的に加えたタンパク質を含む哺乳動物細胞抽出物の差の2DE分析
細胞抽出物を、上記実施例9の工程1〜4に記載したように調製した。複雑な細胞溶解物の差を模倣するために、細胞抽出物を、Cy3及びCy5ヒドラジドで標識し、そしてCy5で標識した既知の糖タンパク質をCy5標識試料中に加えた。次いでCy3及びCy5標識試料を、2DEの前に等体積で混合した。
【０１０１】
図8a）及びb）は、Cy3（8a）標識細胞抽出物（外因的に加えられるタンパク質を含まない）及び外因的に加えられたタンパク質を含むCy5（8b）標識細胞抽出物を付加した2DEゲルの映像を示す。加えられたタンパク質は以下の通りである：
【０１０２】
【数１】
0004589587.tif 000008
強調されたゲルの一部分は、約15〜80kDaの範囲及び5〜6のpHの範囲のタンパク質を示す。従ってこの部分は、Cy5の映像で検出されるタンパク質、フェチュイン、α−1酸性糖タンパク質及びアルブミンを含まない。
【０１０３】
Cy3及びCy5の映像は、二つの染料を使用して、同じBT474細胞試料を標識して検出されたスポットの良好な再現性を示し、そして差は、外因的に加えられたタンパク質に帰することができる。トランスフェリン及びカルボニックアンヒドラーゼは、Cy5の映像上では強調されているが、しかしCy3の映像では見ることができない。Cy5試料中のカルボキシペプチダーゼ−Yの存在は、明瞭には表示されていないが、しかしこれは、分離することを阻害する外因の細胞タンパク質との重なり又はタンパク質上の炭水化物の低い濃度のような多くの理由によることができる。
【０１０４】
＜カラムクロマトグラフィーによるタンパク質の差の分析＞
実施例14：
タンパク質の標識：
タンパク質を、それぞれのタンパク質に一つの標識を加えるために立案された最小標識法によって標識した。この方法は、それぞれのタンパク質の少ない比率のみが標識されることになる。以下の文章中に示されるタンパク質濃度は、合計のタンパク質の量であり、そして実際に標識されたタンパク質の比率は考慮していない。1個の正味の正の電荷を含む染料が、タンパク質の第一アミン基と反応して、タンパク質の全体の荷電状態の変化を回避した。
【０１０５】
1個の正の電荷を含む、分子量に対して適合したCy3及びCy5誘導体のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Amersham  Pharmacia  Biotech）を、タンパク質又はペプチドを、46μlの全体の体積中に200マイクログラムのタンパク質当たり800ピコモルの染料の比で含む緩衝液（20mMのpH7．6のTris／HCl）に加えた。溶液を氷上で暗所で30分間インキュベートした。次いで反応を4μlの10mMリシン溶液を加えて停止し、そして氷上で更に10分間インキュベーションした。
【０１０６】
精製されたタンパク質を、別個に標識するか、又は混合し、そして標識した。抗マウス免疫グロブリンG（IgG）を供給業者（Amersham  Pharmacia  Biotech）から入手し、Cy3又はCy5のいずれかで容易に標識した。
【０１０７】
器具：
ポンプ、弁及び制御器からなるFPLC系（Amersham  Pharmacia  Biotech）を使用して、試料をクロマトグラフィーカラムを通して送入した。それぞれのカラムからの溶出物は、F4500発光計（Hitachi）中に設置された、8μlの石英製フロースルーセル（Hellma）に送入した。しかしながら、フロースルーセルが垂直の窓を有し、そして光線ビームが水平の配列を有していて、この特定の系の可能な感度が制約されたために、光学系は、最適化されなかった。二つの励起及び放出波長に応答指令信号を送るように設計されたソフトウェアを使用して、Cy3及びCy5標識タンパク質の存在を連続的にモニターすることを可能にした。Cy3の測定のために使用した設定波長は、530nm（励起）及び570nm（放出）であった。Cy5測定のための設定は、630nm（励起）及び670nm（放出）であった。励起及び放出のスリット幅は、10nmであった。
【０１０８】
クロマトグラフィー：
Cy3及びCy5標識タンパク質又はペプチドを、クロマトグラフィーカラムからの溶出に従って同時に、そして連続的に検出した。タンパク質又はペプチドの混合物を、各種のカラムの種類により特性付けした。二つのタンパク質間の差も、試料を異なったフルオロで標識し、そして次いで混合し、続いてクロマトグラフィーにかけ、そして二つのフルオロの発光を検出することによって更に試験することができた。
【０１０９】
実施例15：
イオン交換カラム：
MonoQ  HR5／5アニオン交換カラム（50×5mm内径）（Amersham  Pharmacia  Biotech）を、開始緩衝液（20mMのpH7．6のTris／HCl）で平衡化した。開始緩衝液中で調製したタンパク質試料を、100μlループを使用してカラムに適用した。タンパク質を、350mMのNaClを含む同じ緩衝液の直線的勾配を使用して25分間にわたって毎分0．5mlの流速でカラムから溶出した。Cy3及びCy5標識タンパク質を、イオン交換カラムから溶出するに従って同時にそして連続的に検出した。
【０１１０】
図9は、Cy3標識ウシ血清アルブミン（BSA）及びCy5標識トランスフェリンの分離を示す。
図10は、Cy5標識ミオグロビン、トランスフェリン及びウシ血清アルブミンの混合物の分離を示す。
【０１１１】
イオン交換クロマトグラフィー及び発光検出による差の分析を、図14に示す。Cy3標識トランスフェリンを含む一つの試料を、Cy5標識トランスフェリン及びCy5標識ウシ血清アルブミン（BSA）を含むもう一つの試料と混合した。第2の試料にBSAが存在しないことは明白である。
【０１１２】
実施例16：
逆相カラム：
ProRPCカラム（シリカ基剤C1／C8混合物）（100×5mm内径）を、溶出剤A（70％）及び溶出剤B（30％）の混合物で平衡化した。溶出剤Aは、水（95％）、アセトニトリル（5％）中の、0．1％のトリフルオロ酢酸、0．1％のトリエチルアミンを含んでいた。溶出剤Bは、水（25％）、アセトニトリル（75％）中の、0．1％のトリフルオロ酢酸、0．1％のトリエチルアミンを含んでいた。溶出剤A中で調製したタンパク質試料を、100μlループを使用してカラムに適用し、そして70％溶出剤A／30％溶出剤Bから20％溶出剤A／80％溶出剤Bへの直線的勾配を使用して、25分間にわたって毎分0．5mlの流速で溶出した。Cy3及びCy5標識タンパク質を、逆相カラムからの溶出に従って同時にそして連続的に検出した。
【０１１３】
図11は、Cy5標識リボヌクレアーゼA、シトクロムC、ホロ−トランスフェリン及びアポミオグロビンの混合物の逆相分離を示す。
実施例17：
サイズ排除カラム：
Superose  6HR10／30カラム（300×10mm内径）（Amersham  Pharmacia  Biotech）を、10mMのpH7．4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で平衡化した。同じ緩衝液中で調製したタンパク質試料を、100μlループを使用してカラムに適用し、そして毎分0．5mlの流速で溶出した。Cy3及びCy5標識タンパク質を、サイズ排除カラムからの溶出に従って同時にそして連続的に検出した。
【０１１４】
図12は、Cy3標識チログロブリン、アポフェリチン、IgG及びβ−ラクトグロブリンの混合物のサイズ排除クロマトグラフィーによる分離を示す。
図13は、サイズ排除クロマトグラフィーによる差の分析を示す。Cy3標識試料は、4種類のタンパク質（チログロブリン、アポフェリチン、IgG及びβ−ラクトグロブリン）を含み、そしてCy5標識試料は4種類のタンパク質の3種類しか示していない（IgGを含まない）。四番目のタンパク質が存在しないことは明白である。
【０１１５】
実施例18：
アフィニティー精製による差のタンパク質分析
細胞増殖、溶菌及びアフィニティー精製：
GSTを発現しているか、又はGSTを発現していない、いずれかのE  coli細菌の溶解物を、複雑なタンパク質の試料のモデルとして使用した。E  coli系JM109細胞を、GTSをコードするプラスミドpGEX−5X又はGTSをコードしない対照プラスミドpTrc99（Amersham  Pharmacia  Biotechから入手したプラスミド）のいずれかで形質転換し、そして寒天プレート上に置いた。次いで液体培養物（10ml）を、一晩37℃で、100μg／mlのアムピシリンを含むLBブロス中で増殖させた。次いで新鮮な媒体（典型的には150ml）を、0．5％の出発培養物と共に注入し、そして1．0のA600まで増殖させた。次いで細胞を、IPTGを0．5mMの最終濃度まで添加し、そして更に2〜3時間インキュベートすることによって誘発した。細胞を2800gの遠心分離により回収し、7．5mlのPBSに取り込み、そして氷上の超音波処理（MSE150Soniprep）によって溶解した（30秒間、90秒休み、3回繰り返した）。細胞の残骸を2800gの遠心分離により除去し、そして上清を新しい試験管に移した後、遠心分離を繰り返した。次いで上清（A280の示度により決定された濃度に対して標準化した100μlのアリコート）を、1．5nmolのCy染料で、氷上で、暗所で60分間標識し、そして上記のようにリシンでクエンチした。
【０１１６】
この時点で、溶解物は、別個に処理されるか、又はこれらは混合されるかのいずれかをされ、例えばCy3で標識されたpGEX細胞溶解物の試料は、等体積のCy5で標識されたpTrc細胞溶解物と混合された。次いでGSTを、Glutathione  Sepharose  4B（cat．no．17−0756−01，Amersham  Pharmacia  Biotech）を使用し、融合タンパク質のスクリーニングに対して供給業者によって提供されたバッチ法のプロトコルを使用して、細胞抽出物からアフィニティー精製した。
【０１１７】
試料を、Cy3を530nmで励起し（放出のピークは565nmで検出した）、そしてCy5を630nmで励起して（放出のピークは661nmで検出した）、励起及び放出に対して5nmのスリットを使用して、Hitachi発光計で読み取った。アフィニティー基質と結合しない物質は、発光測定用洗浄液と混合された。アフィニティー基質と結合した物質は、過剰の標識されていないGSTで溶出した。読み取りに先立って、それぞれの試料の15μlのアリコートを、100μlの全体積に希釈した。洗い流された試料を、その相体的に高い数値のために、読み取りに先立って更に10倍に希釈した。その後、結合した及び洗い流された画分の相対的な体積及び希釈を考慮して、読み取り値を補正した。
【０１１８】
アフィニティー精製：
アフィニティー精製による差の分析を、細胞溶解物中の特異的タンパク質（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、GST）を同定するために使用した。最初の実験は、Cy3又はCy5のいずれかで標識され、そして別個に分析された細菌の細胞溶解物において、GSTの存在を測定することが出来ることを証明した。GSTをコードするpGEXプラスミドを含む誘発された細菌から得られた試料は、アフィニティーグルタチオン基質から遊離のグルタチオンで特異的に溶出されたフルオロによって示されるように、明確にGSTタンパク質を含んでいた（表1）。この物質は、Cy5−標識精製CST（Sigma）及び先に記載したようなアフィニティー精製GSTを含むSDS−PAGEゲルの発光の映像化によって、GSTであることが確認された。GSTをコードしない以外は他の面では非常に似ているpTrcプラスミドを含む誘発された細菌から得られる試料は、GSTタンパク質を含んでいるようには見受けられない。この結論は、アフィニティー基質から溶出されるフルオロの低い濃度及びSDS−PAGEゲル上の補正された分子量の発光バンドが存在しないことによって示された。
【０１１９】
【表１】
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その後の実験は、二つの別個の溶解物を異なった染料で標識し、そしてアフィニティー精製に先立って混合した場合、二つの試料のGST含有率の差は、これらの相対的発光性によって測定することができることを示した。例えば、Cy3標識誘発pGEX細胞溶解物を、Cy5標識誘発pTrc細胞溶解物と混合し、そしてアフィニティー精製した。GST発現細胞中に含まれる結合した物質の比率は、GSTを発現していない細胞中のそれより10倍より大きく高かった（表2）。次の試料において、Cy3標識誘発pGEX細胞溶解物を、Cy5標識の誘発されていないpGEX細胞溶解物と混合し、そしてアフィニティー精製した。GST発現細胞中に含まれる結合した物質の比率は、GSTを発現していない細胞中のそれより再び10倍より大きく高かった（表2）。
【０１２０】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、本発明の方法の概略図である。
【図２】  図2a）及び2b）は、本発明の標識の好ましい適合対で標識され、単一のSDSポリアクリルアミドゲルにかけられたタンパク質の映像である。
【図３】  図3a）〜d）は、本発明の方法による染料の適合対の染料の異なった一つで標識された、一つはIPTG誘導し、そして他は誘導していない二つの異なった細菌抽出物を付加した二次元ゲルの一部の映像である。
【図４】  図4a）〜d）は、本発明の方法による染料の適合対の染料の異なった一つでそれぞれ標識された、一つは外因的に加えられたカルボニックアンヒドラーゼを有し、そして一つはカルボニックアンヒドラーゼを持たない二つの異なった細菌抽出物を付加した二次元ゲルの一部の映像である。
【図５】  図5a）及びb）は、SDS−PAGEにかけたCy2−NHS及びCy3ヒドラジドで標識したタンパク質の映像であり、ヒドラジド染料が糖タンパク質の炭水化物部分を特異的に標識していることを証明している。
【図６】  図6a）及びb）は、Cy3及びCy5ヒドラジドで標識したタンパク質混合物の、SDS−PAGEの映像である。
【図７】  図7a）及びb）は、Cy3ヒドラジド標識HBL100細胞抽出物及びCy5ヒドラジド標識BT474細胞抽出物を付加した、2DEゲルの一部分の映像である。
【図８】  図8a）及びb）は、外因的に加えられたタンパク質を含まないCy3ヒドラジド標識BT474細胞抽出物及び外因的に加えられたタンパク質を含むCy5ヒドラジド標識BT474細胞抽出物を付加した、2DEゲルの映像である。
【図９】  図9は、Cy3標識ウシ血清アルブミン（BSA；33μg）及びCy5標識トランスフェリン（33μg）のイオン交換クロマトグラフの結果を示すグラフである。
【図１０】  図10は、Cy5標識ミオグロビン、トランスフェリン及びウシ血清アルブミン（それぞれ13μgのタンパク質）のイオン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図１１】  図11は、Cy5標識リボヌクレアーゼa、シトクロムc、ホロ−トランスフェラーゼ及びアポミオグロビン（それぞれ3．3μgのタンパク質）の逆相クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図１２】  図12は、Cy3標識チログロブリン、アポフェリチン、IgG及びβ−ラクトグロブリン（それぞれ23．5μgのタンパク質）のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図１３】  図13は、Cy3又はCy5で標識された試料を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによる差のタンパク質分析の結果を示すグラフである。Cy3標識タンパク質は、チログロブリン（38μg）、アポフェリチン（28μg）、IgG（2．6μg）、及びβ−ラクトグロブリン（12μg）である。Cy5標識試料は、IgGを含んでいない。Cy3及びCy5標識試料は、クロマトグラフィーに先立って混合された。
【図１４】  図14は、Cy3又はCy5標識試料のイオン交換クロマトグラフィーによる差の分析の結果を示すグラフである。Cy3標識試料は、トランスフェリンを含み、そしてCy5標識試料は、トランスフェリン及びウシ血清アルブミンを含む（それぞれ13μgのタンパク質）。Cy3及びCy5標識試料は、クロマトグラフィーに先立って混合された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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