(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムがラブドウイルス由来機能性糖タンパク質G遺伝子を欠損し、少なくとも1種の外来ポリペプチドが組換え水疱性口内炎ウイルスのウイルスエンベロープ中で発現されるよう、ゲノムが前記外来ポリペプチドをコードする、複製能のある前記組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項２】
前記少なくとも１種の外来ポリペプチドの１つが他のウイルスの細胞受容体であり、前記細胞受容体が、前記他のウイルスが感染した細胞を標的とするのに十分な様式で前記水疱性口内炎ウイルス中で発現される、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項３】
前記少なくとも１種の外来ポリペプチドが少なくとも１種の病原性哺乳動物ウイルスの細胞受容体である、請求項１に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項４】
前記病原性哺乳動物ウイルスがHIV-1またはHIV-2である、請求項３に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項５】
前記病原性哺乳動物ウイルスがHIV-1である、請求項４に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項６】
少なくとも1種のHIV受容体、少なくとも1種のHIV共受容体、またはそれらの混合物をそのウイルスエンベロープ中で発現する、請求項４に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項７】
ゲノムがCD4およびCXCR4をコードする、請求項３に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項８】
前記糖タンパク質G遺伝子が、少なくとも１種の外来ポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子で置き換えられている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルス。
【請求項９】
外来ポリペプチドが病原性哺乳動物ウイルスに感染した哺乳動物細胞に結合するものである、請求項１〜３および８のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスを含む、前記病原性哺乳動物ウイルスに感染した患者を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
外来ポリペプチドが病原性哺乳動物ウイルスによって認識される細胞受容体である、請求項１〜３および８のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスを含む、前記病原性哺乳動物ウイルスに感染した患者を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスを含む、HIV-1またはHIV-2に感染した患者を治療するための医薬組成物。
【請求項１２】
外来ポリペプチドが病原性哺乳動物ウイルスに感染した哺乳動物細胞に結合するものである、請求項１〜３および８のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスを含む、前記病原性哺乳動物ウイルスに感染した患者を治療するための医薬。
【請求項１３】
外来ポリペプチドが病原性哺乳動物ウイルスによって認識される細胞受容体である、請求項１〜３および８のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスを含む、前記病原性哺乳動物ウイルスに感染した患者を治療するための医薬。
【請求項１４】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスを含む、HIV-1またはHIV-2に感染した患者を治療するための医薬。
【請求項１５】
病原性哺乳動物ウイルスに感染した患者を治療するための医薬の製造における、外来ポリペプチドが前記病原性哺乳動物ウイルスに感染した哺乳動物細胞に結合するものである、請求項１〜３および８のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスの使用。
【請求項１６】
病原性哺乳動物ウイルスに感染した患者を治療するための医薬の製造における、外来ポリペプチドが前記病原性哺乳動物ウイルスによって認識される細胞受容体である、請求項１〜３および８のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスの使用。
【請求項１７】
HIV-1またはHIV-2に感染した患者を治療するための医薬の製造における、請求項４〜７のいずれか１項に記載の組換え水疱性口内炎ウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願データ〕
本出願は、１９９７年７月１１日出願の同時係属米国特許出願第６０／０５２，３６６号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
〔発明の技術分野〕
本発明は、主に、機能性糖タンパク質遺伝子が欠損し、ウイルス外被中で他のウイルスに対する少なくとも１種の受容体を発現する複製能のあるラブドウイルスに関する。ＨＩＶのような他の病原ウイルスに対する少なくとも１種の細胞受容体および共受容体を発現する水疱性口内炎ウイルスなどの本発明の組換えラブドウイルスは、病原ウイルスに感染した患者の治療に有用である。
【０００３】
〔発明の背景〕
感染を引き起こすために、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）のような膜で包まれたウイルスは、最初に、細胞表面で受容体に結合し、続いて、自己の膜を細胞の膜に融合させなければならない。この融合プロセスにより、ウイルス遺伝物質が細胞質中に放出され、感染が開始される。ＨＩＶ−１が細胞中へ侵入するにはウイルスと細胞表面分子ＣＤ４との結合が必要であることは古くから知られていた（Ｍａｄｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｓａｔｔｅｎｔａｕ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，１９８８）。また、最近の研究により、ケモカイン受容体分子ＣＸＣＲ４（Ｆｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ＣＣＲ５（Ａｌｋｈａｔｉｂ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｈｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｄｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｄｏｒａｎｚ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｄｒａｇｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、およびＣＣＲ３（Ｃｈｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；Ｄｏｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）が、侵入に必要な共受容体であることが判明した。ＨＩＶの侵入は、いくつかの段階を経て行われる。最初に、ウイルスのエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０／４１と称する）がＣＤ４に結合し、続いて、共受容体への結合を可能にする配座変化が起こり、更に、ウイルスの膜と細胞の膜との融合が起こる（Ｌａｐｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｔｒｋｏｌａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＨＩＶ感染細胞は、細胞の表面上でｇｐ１２０／４１を発現するが、この発現は、感染時および出芽ＨＩＶ−１粒子中にそれが取り込まれる前に起こる。
【０００４】
最近の研究から、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、外来タンパク質をウイルスのエンベロープ中に取り込むことのできる高レベル発現ベクターとしての能力を有することが示された（Ｓｃｈｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，  １９９６ａ；Ｓｃｈｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ，  １９９６ｂ）。ＶＳＶは、培養ヒトＴ細胞を含むほとんどの動物細胞中で極めて急速に細胞変性感染を引き起こすが、ヒトに関しては、通常、病原性はない（レビューについては、Ｗａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅ，１９９６を参照されたい）。ＶＳＶは、感染後２〜３時間以内に、宿主細胞のタンパク質合成をブロックし、８時間以内に、後代ウイルス粒子を非常に多量に産生する。これらの粒子は、細胞溶解前に細胞表面から出芽する。ＶＳＶは、非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡゲノムを有する。このゲノムは、感染細胞の細胞質中でウイルスＲＮＡポリメラーゼによりコピーされ、５種の構造タンパク質をコードする５種のｍＲＮＡを発生する。これらのタンパク質のうちの１つだけ、すなわち、Ｇと称する糖タンパク質だけは、ウイルスの膜中に存在する。このため、ＶＳＶは非常に広範にわたる宿主域を有する。Ｇタンパク質は、細胞表面を認識し、ウイルスの膜と細胞の膜との融合を触媒する（Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅ，１９８４）。外来膜タンパク質、例えば、ＣＤ４および他のウイルス膜タンパク質は、組換えＶＳＶのゲノムから非常に高レベルで発現可能であり、この際、これらの分子は、Ｇタンパク質と共にウイルスの膜中に高レベルで取り込まれる（Ｓｃｈｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ）。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明の目的は、こうしたストラテジーを利用して、ＨＩＶのような他のウイルスが感染した細胞を標的にすべく使用可能な組換えウイルスを作製することである。
このほかのより特定的な目的は、ＨＩＶに感染した患者を治療するための方法を提供することである。
【０００６】
これらのおよび他の目的は、機能性糖タンパク質遺伝子が欠損し、ウイルス外被中で少なくとも１種の外来ポリペプチドを発現する、複製能のある組換えラブドウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を提供する本発明によって達成される。好ましい実施形態において、外来ポリペプチドは、他のウイルスに対する細胞受容体であり、他のウイルスが感染した細胞を標的にするのに十分な形で発現される。１つの実施形態において、本発明は、機能性Ｇ糖タンパク質遺伝子が欠損し、病原性哺乳動物ウイルスに対する少なくとも１種の細胞受容体をディスプレイする、複製能のある組換え水疱性口内炎ウイルスを提供する。他のウイルスがＨＩＶである場合、発現されるポリペプチドは、ＣＤ４のようなＨＩＶ受容体、ＣＸＣＲ４のようなＨＩＶ共受容体、および／またはこれらの混合物である。
【０００７】
これに応じて、本発明は、病原ウイルスに対する少なくとも１種の受容体をウイルスエンベロープ中で発現するＶＳＶのような本発明の組換えラブドウイルスを有効量で患者に投与することにより、該病原ウイルスに感染した患者を治療するための方法を提供する。以下に記載されているように、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に感染した患者の治療方法を開示する。
【０００８】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、複製能がありかつ細胞を急速に死滅させるがＨＩＶが最初に感染した細胞にだけ感染することのできる水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来の新しいウイルスの構築に基づくものである。このウイルスは、ＶＳＶエンベロープ糖タンパク質遺伝子が欠損し、その代わりに、ＨＩＶ受容体ＣＤ４およびＨＩＶ共受容体ＣＸＣＲ４に対する遺伝子を発現させる。このウイルスは、培養物中のＨＩＶ感染細胞を死滅させ、ＨＩＶ感染をコントロールする。
【０００９】
本発明を実施する場合、機能性糖タンパク質遺伝子が欠損し、ウイルスエンベロープ中で外来ポリペプチドを発現する複製能のある組換えラブドウイルスを発生させる。「外来」とは、形質転換されるラブドウイルス中に天然に存在するものではないことを意味する。外来ポリペプチドとは、多くの実施形態では哺乳動物細胞に結合するペプチド、例えば、他のウイルスに対する細胞受容体および／または共受容体であり、他の実施形態では抗体である。本発明は、特に、膜で包まれたウイルスが感染した細胞を標的とするのに好適である。本発明は、ウイルスエンベロープタンパク質が認識する受容体（１種または複数種）が周知でありかつウイルスタンパク質が膜融合活性を有する場合にウイルスを感染細胞にターゲッティングする一般的なストラテジーを提供する。同様に、病的細胞に対する従来型およびハイブリッド型抗体も周知であり、これらの抗体もこうした細胞を標的とするために使用される。いずれの場合においても、標的細胞を死滅させるのに十分な形で外来ポリペプチドをラブドウイルス中で発現する。従って、本明細書中で使用する場合、「機能性糖タンパク質遺伝子の欠損した組換えラブドウイルス」とは、糖タンパク質遺伝子が任意に変更もしくは破壊されている、ならびに／あるいは、僅かに機能性もしくは非機能性の糖タンパク質またはそれらの組合せを発現する、ウイルスを意味する。
【００１０】
以下の実施例において、機能性エンベロープ糖タンパク質Ｇもしくはそれに対応する遺伝子が欠損し、その代わりに、ＨＩＶウイルスに対する少なくとも１種の受容体もしくは共受容体を発現する組換えＶＳＶを発生させる。好ましい実施形態では、このＧ遺伝子を除去するが、ＶＳＶの宿主域特異性を変化させるかまたはＧタンパク質の機能を取り除く任意の遺伝子突然変異を利用することもできる。
【００１１】
この場合、病原ウイルスが感染した哺乳動物細胞に結合するポリペプチドのような外来ポリペプチドに対する遺伝子を、組換えラブドウイルスのゲノムに挿入および／または追加する。以上にまとめられているように、多くの典型的な実施形態において、追加される遺伝子は、ウイルス糖タンパク質が認識し哺乳動物細胞の表面上に存在する受容体に対するものである。しかしながら、他の細胞、例えば、癌細胞を死滅させるように作製された組換えラブドウイルスは、本発明に含まれる。これらの実施形態において、特異的抗体および膜融合タンパク質に対する遺伝子は、典型的には、機能性糖タンパク質遺伝子の欠損したラブドウイルス中に組み込まれる。
【００１２】
従って、本発明は、機能性Ｇ糖タンパク質遺伝子が欠損し、かつ病原ウイルスが感染した細胞を標的とするのに十分な形で病原ウイルスの受容体を外被中でディスプレイする、複製能のある組換え水疱性口内炎ウイルスを、有効量で患者に投与することにより、病原性哺乳動物ウイルスが感染した患者（ヒトまたは動物）を治療するための医学的または獣医学的方法を提供する。膜で包まれた病原ウイルスがＨＩＶであり、かつＶＳＶに追加されるエンベロープタンパク質がＨＩＶ受容体および特異的共受容体である例を、以下の実施例の節で提示する。その具体例では、Ｔ細胞向性ＨＩＶが使用されているが、他のＨＩＶ株の共受容体を発現すべく本発明の組換えＶＳＶを作製することが可能である。他の実施形態では、受容体は発現するが共受容体は発現しない。また本発明のいくつかの組換えＶＳＶは、１種以上のＨＩＶ共受容体を発現する。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態の実施においては、機能性糖タンパク質Ｇ遺伝子が欠損し、少なくとも１種のＨＩＶ受容体、例えば、ＣＤ４、および少なくとも１種のＨＩＶ共受容体、例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ３、および／またはそれらの混合物を発現する、複製能のある組換え水疱性口内炎ウイルスを、有効量で患者に投与することにより、ＨＩＶに感染した患者を治療する。具体的な構築物としては、以下で説明され図１に示されているＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が挙げられる。
【００１４】
ヒトまたは他の哺乳動物への本発明の組換えラブドウイルスの投与は、当業者に周知の任意の局所的または全身的方法で行うことができるが、好ましくは全身的方法を使用する。全身的投与としては、滅菌注射による静脈内、筋肉内、もしくは皮内投与、非経口投与など、典型的には、製薬上許容される担体、ならびに／あるいは他のアジュバント、または組換えＶＳＶウイルスもしくは他のラブドウイルスの生存能力を保持するかもしくはその効力を増強する補助化合物、との併用が挙げられる。種々の治療法を組み合わせて使用してもよい。
【００１５】
有効な治療を行うのに必要な組換えラブドウイルスの量は、それ自体で決定されるものではなく、必然的に重篤度すなわち疾患の程度に依存する。担体を用いると投与が容易になり、場合により、更なる治療効果が得られる。担体を用いる場合、組換えＶＳＶまたは他のラブドウイルスを不活性化しないという意味で、および投与される患者にいかなる悪影響をも及ぼさないという意味で、担体は不活性でなければならない。ほとんどの場合、用量は、患者の疾患の程度、年齢、体重、治療対象患者の臨床的状態、組換えウイルスの効力、使用するアジュバントまたは補助化合物（使用する場合）、組換えラブドウイルスおよび典型的には製薬上許容される担体と併用される他の成分の濃度に依存する。最も好ましくは、本発明の組換えラブドウイルスを投与すると、ほとんどまたはまったく検出できないほど顕著に患者の疾患細胞が減少する。
【００１６】
本発明の利点は、一方のウイルスの受容体を他方のウイルスの外被中に取り込む好ましい組換えＶＳＶが、他のウイルスの感染した細胞を迅速に死滅させることにより、感染をコントロールするという点である。本発明の更なる利点は、本発明の組換えＶＳＶまたは他のラブドウイルスが、特定の標的に対して遺伝子工学的に作製され、しかも感染した細胞または病原性の細胞だけを死滅させるという点である。
【００１７】
本発明について更に例示および説明するために以下の実施例を提示するが、いかなる点においてもこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
〔実施例〕
本明細書中に報告されている研究において、ＶＳＶ  Ｇ遺伝子の完全な欠損を呈し、その代わりに、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４に対する遺伝子が置換されたＶＳＶ組換え体を発生させる。これらのウイルスは、エンベロープ中にＣＤ４およびＣＸＣＲ４の両方を集積し、ＨＩＶ−１感染細胞に感染するように特異的に標的化されている。
【００１９】
（実験手順）
プラスミドの構築：  ＭｌｕＩおよびＳｐｈＩによる消化を利用して、ｐＶＳＶ−ＣＤ４から全ＶＳＶ  Ｇ遺伝子を除去した（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ）。得られたプラスミドをｐＶＳＶΔＧ−ＣＤ４と称した。ＨＡエピトープタグを有するＣＸＣＲ４タンパク質をコードするプラスミドについては既に報告されている（Ｂｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＶＥＮＴポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ならびにプライマー５’−ＡＣＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１）および５’−ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧ−３’（配列番号２）を用いて、このプラスミドからＰＣＲによりＣＸＣＲ４を増幅した。第１のプライマーにはＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）が含まれ、第２のプライマーにはＮｈｅＩ部位が含まれている（ＧＣＴＡＧＣ）。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＮｈｅＩで消化し、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩで消化されたｐＶＳＶ−ＸＮ１中にクローン化した（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６ａ）。得られたプラスミドをｐＶＳＶ−ＣＸＣＲ４と称した。ＸｈｏＩおよびＭｌｕＩを用いてｐＶＳＶ−ＣＸＣＲ４からＧ遺伝子を除去した。プライマー５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＴＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＧＧＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＴＣＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡＴＧＴＣＴＴＣ−３’（配列番号４）を用いてＰＣＲによりｐＣＤ４からヒトＣＤ４に対するコード配列を増幅した。第１のプライマーにはＭｌｕＩ部位（ＡＣＧＣＧＴ）が含まれ、第２のプライマーにはＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）およびＶＳＶ転写停止−開始シグナル（下線の文字）が含まれる。Ｇ欠損部位にＣＤ４遺伝子を挿入し、ｐＶＳＶΔＧ−ＣＣ４と称するプラスミドを発生させた。
【００２０】
ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現するＢＨＫ細胞系の構築：  使用したテトラサイクリン調節系については既に報告されている（Ｓｈｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＶＳＶ  Ｇ遺伝子は、ＸｈｏＩで消化することにより、ｐＢＳＧと称するプラスミドから調製した。Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて伸長部分をフィルインし、この断片を、ＥｃｏＲＶで開裂させたｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結した。得られたプラスミドをｐＴＥＴ−Ｇと称した。ＣａＰＯ４法（哺乳動物トランスフェクションキット；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて１０ｃｍプレート上のＢＨＫ細胞（集密度２０％）を１μｇ  ｐＴＥＴ−Ｇおよび１０μｇ  ｐＴｅｔ−ＴＡｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、０．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを添加してＢＨＫ細胞に有害なＧタンパク質発現を抑制し、０．７５ｍｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇ４１８）を添加することにより、安定なトランスフェクト細胞を選択した。トランスフェクションの１０日後、細胞コロニーを単離し、テトラサイクリンを除去することにより誘発を行った後、免疫蛍光顕微鏡法によりＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現に対してスクリーニングを行った。
【００２１】
ＶＳＶ組換え体の回収：  ５％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）中に、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１、ＡＴＣＣ）を保持した。１０ｃｍディッシュ上の細胞（集密度８０％以下）に、ＭＯＩ  １０でｖＴＦ７−３を感染させた（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。１時間後、Ｎ、Ｐ、Ｇ、およびＬタンパク質をコードするプラスミドおよび適切な組換え抗ゲノムＲＮＡを、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよびホスファチジルエタノールアミンを含有するカチオン性リポソーム試薬を用いて、細胞中にトランスフェクトした（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。プラスミドの量は、各全長プラスミド（ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４）１０μｇ、ｐＢＳ−Ｎ  ３μｇ、ｐＢＳ−Ｐ  ５μｇ、ＢＳ−Ｇ  ４μｇ、およびｐＢＳ−Ｌ２μｇであった。回収物の上清を０．２２μｍフィルターに通して濾過し、５ｍｌを用いて、テトラサイクリンを除去することにより１２時間にわたり誘発させた１０ｃｍプレート上のＢＨＫ−Ｇ細胞に感染させた。最初の継代の上清をシリンジフィルター（細孔サイズ０．１μｍ）に２回通して濾過することによりワクシニアウイルスをすべて取り出し、次に、これらのウイルスを４×１０６個のＢＨＫ−Ｇ細胞上に継代接種した。ＢＨＫ−Ｇ細胞上で上清の力価を測定し、−８０℃で凍結した。ウイルスストックを作製するために、ＢＨＫ−Ｇ細胞上で増殖させ、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、続いて、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地１０ｍｌまたは５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ  １０ｍｌを添加することにより得られたＶＳＶΔＧ−ＣＤ４またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の上清１０ｍｌを用いて、２時間にわたり１０ｃｍプレート上の２×１０６個のＢＨＫ細胞に感染させた。感染１６時間後、遠心分離により上清を清澄化し、実験に使用するかまたは−８０℃で保存した。
【００２２】
ウイルスの調製および分析：  ビリオンを単離するために、１０ｃｍディッシュ上のＢＨＫ細胞の単層（集密度８０％以下）に、ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４もしくはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４（感染多重度、ＭＯＩ＝５）または野生型ＶＳＶ（ＭＯＩ＝０．０１）を感染させた。感染１６時間後、１，２５０×ｇで５分間遠心分離することにより細胞片および核を取り出し、次に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２０％蔗糖溶液を用いて１２０，０００ｇで超遠心分離することによりウイルスを２回精製した。ウイルスペレットを再懸濁させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）で分析した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーでゲルを染色するか、またはニトロセルロース膜にゲルを転写した。５％低脂肪粉乳を含むＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＴｗｅｅｎＴＭ−２０）を用いて室温で１時間にわたり膜をブロックし、次に、ＣＤ４指向性抗体（ヒツジα−ＣＤ４、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）またはＣＸＣＲ４中のＨＡエピトープに指向性の抗体１２ＣＡ５（Ｂｏｒｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、増強化学ルミネセンス（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）システムを用いて室温で１時間にわたりホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧまたはホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でタンパク質を可視化した。
【００２３】
電子顕微鏡法および金コンジュゲート抗体による標識化：  １０分間にわたり１，５００×ｇで細胞片を最初にペレット化することにより、１５ｃｍディッシュ上の約１０７個の細胞の感染から得られたウイルス粒子を培地から回収した。次に、先に述べたように遠心分離によりウイルスを濃縮し、精製した。ウイルスサンプルを炭素被覆グリッドに５分間吸収させ、次いで、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で１０分間ブロックした。次に、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：５０に希釈された抗ＣＤ４  Ｍａｂ  ＯＫＴ４（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）の液滴５０μｌ上にグリッドを配置した。１時間後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳの液滴５０μｌ上にそれぞれ２分間ずつ５回にわたり逐次的にグリッドを配置することにより、過剰の抗体を除去した。次に、１５ｎｍ金粒子（ＡｕｒｏＰｒｏｂｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｃ．）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）の液滴５０μｌ上にグリッドを配置した。ＰＢＳで逐次的に２分間ずつ５回洗浄することにより、未結合金コンジュゲートを除去した。次に、２％リンタングステン酸（ｐｈ７．２）の液滴５０μｌ上でグリッドを４分間インキュベートすることにより、ウイルス−免疫金複合体をネガティブ染色した。過剰の染色液を除去し、グリッドを空気乾燥させた。Ｚｅｉｓｓ  ＥＭ９１０電子顕微鏡を用いてウイルスの画像を得た。
【００２４】
感染および感染Ｊｕｒｋａｔ細胞の免疫蛍光顕微鏡法：  約３×１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６−１、ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−１２５）をＴ−２５フラスコ中に接種し、１０％ＦＢＳで補足されたＲＰＭＩ培地中で増殖させた。ＨＩＶ−１株ＩＩＩＢを用いてＭＯＩ約０．０１で感染させた。感染５日後、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を含有する培地５ｍｌを用いて細胞に重複感染させた。対照として、ＨＩＶ感染培養物の１つだけは重複感染を行わず、また第３の培養物はＶＳＶΔＧ−ＣＣ４だけを用いて感染させた。以下のように、それぞれの時点で細胞を回収し、分析に供した。培養物体積の半分を回収し、１０％ＦＢＳで補足された同体積のＲＰＭＩをもとの培養物に添加した。ＩＥＣ  Ｃｅｎｔｒａ−７Ｒ冷凍遠心機（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、５℃において１０００ｒｐｍで５分間かけて細胞をペレット化した。培地を廃却し、５ｍｌ  ＰＢＳ中で細胞を１回洗浄し、再びペレット化した。ＰＢＳを除去し、１００μｌ  ＰＢＳ中で細胞を再懸濁させた。次に、室温で１時間かけてまたは４℃で一晩かけて３％パラホルムアルデヒド１ｍｌ中で細胞を固定した。１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で浸透させた後、ＶＳＶ  Ｎタンパク質に対するモノクロナール抗体およびヒトポリクロナールＨＩＶ免疫グロブリン（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）で、続いて、ローダミンコンジュゲート抗マウス抗体およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で細胞を染色した。
【００２５】
エピ蛍光を測定するためにＮｉｋｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸ顕微鏡に倍率４０×のプランアポクロマート対物レンズを取り付けて、細胞の観察および写真撮影を行った。典型的には１００〜２００個の細胞が含まれる少なくとも３つのランダムな領域の細胞数を測定することにより、ＨＩＶ−１またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を用いた細胞の感染をモニターした。融合細胞は単一細胞として数えた。
【００２６】
ＨＩＶ力価の測定：  感染培養物から得られた上清を使用し、９６ウェルプレート中で逐次的に３倍希釈を行い、ＨＩＶ力価を求めた。ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＡＲＲＲＰ）から入手した１０，０００個のＭＴ−２細胞を各ウェルに添加し、ピペッティングによりウイルスと細胞を混合した。３７℃で３〜５日間にわたりプレートをインキュベートし、融合細胞の存在数を調べた。各時点における力価を３回ずつ測定し、各ウェルあたり２個以上の融合細胞が存在した場合、ＨＩＶ感染に対して陽性であるとみなした。既に報告されているように力価を計算し（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ，１９３８）、１ｍｌあたりの５０％組織培養物感染用量（ＴＣＩＤ５０）として報告する。
【００２７】
逆転写酵素アッセイ：  ９６ウェルプレート中で各アッセイを２回ずつ行った（Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。逆転写反応ミックス（０．０５％ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、７５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５単位オリゴ（ｄＴ）１２−１８、５ｍｇ／ｍｌポリＡ）２５μｌを添加し、続いて、無細胞培養物上清１０μｌを添加した。１０μＣｉ／ｍｌ  α−［３２Ｐ］−ｄＴＴＰを含有する反応ミックス２５μｌを更に添加し、反応液を３７℃で９０分間放置した。次に、各サンプル５μｌをＷｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１紙上にスポットし、空気乾燥させた。次に、ＤＥ８１紙を２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸ナトリウム）緩衝液中においてそれぞれ室温で５分間にわたり４回洗浄し、続いて、９５％エタノール中において室温で１分間にわたり２回洗浄した。空気乾燥させた後、この紙をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＰｈｏｓｐｏｒＩｍａｇｅｒスクリーンに一晩当てた。サンプルは、紙から切り出した後に、ホスホロイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）上でシンチレーション分光計を用いて計数することにより直接定量した。二重反復サンプルは５％以内で一致した。
【００２８】
ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による感染の中和：  ポリクロナールヒツジ抗ＣＤ４血清および抗ｇｐ１２０血清（ＡＲＲＲＰ）を、５６℃において１時間熱処理することにより、補体を不活性化させた。抗ＶＳＶ中和モノクロナール抗体（Ｉ１）はマウス腹水であった。中和は次のように行った。３７℃において１時間かけてＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルス（１０６個以下の感染ＢＨＫ細胞から得られた１ｍｌ液）を抗ＣＤ４  １００μｌまたは抗ＶＳＶ  １００μｌと混合し、次に、この混合液を、５日前にＭＯＩ０．０１でＨＩＶ−１  ＩＩＩＢを感染させた１０６個以下のＪｕｒｋａｔ細胞に添加した。このほか、３７℃において１時間かけて抗ｇｐ１２０血清１００μｌをＨＩＶ感染Ｊｕｒｋａｔ細胞１ｍｌに直接添加した。次に、これらの細胞にＶＳＶΔＧ−ＣＣ４  １ｍｌを添加した。３日後、臨床用遠心機を用いて５分間にわたり１０００ｒｐｍで細胞をペレット化し、ＰＢＳ中で１回洗浄した。細胞を固定および染色し、ＨＩＶおよびＶＳＶ  Ｎタンパク質抗原の検出を行った。
【００２９】
（結果）
ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を発現するＶＳＶ組換え体の回収：  ウイルスの最小感染単位がＲＮＡではなく、ヌクレオカプシド（Ｎ）およびポリメラーゼタンパク質（ＬおよびＰ）を含むリボ核タンパク質複合体中のウイルスＲＮＡゲノムであるという事実からみて、非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばＶＳＶの遺伝子工学的作製は複雑である。感染性ＶＳＶは、次のようにプラスミドＤＮＡから回収することができる。バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下で全長抗ゲノムＶＳＶ  ＲＮＡならびにＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子を発現する４個の別々のプラスミドを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス組換え体（ｖＴＦ７−３）が既に感染している細胞中にトランスフェクトする。ヌクレオカプシド中に抗ゲノムＲＮＡを細胞内組立てし、続いて、ＶＳＶ複製および転写を行って、複製能のある感染性ＶＳＶを発生させる（Ｆｕｅｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｗｈｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。追加の転写ユニットをＶＳＶゲノム中に導入することにより、他の遺伝子を発現することができる（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ）。
【００３０】
５種のＶＳＶタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、およびＬのほかにＣＤ４タンパク質を発現するＶＳＶ組換え体の構築については、既に報告されている（Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ）。ＶＳＶ  Ｇの代わりにＣＤ４およびＣＸＣＲ４を発現する組換え体を発生させるために、ＶＳＶＣＤ４構築物から上流ＶＳＶ  Ｇ遺伝子を除去した（図１）。次に、Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする相補性プラスミドのほかにＶＳＶ  Ｇタンパク質をコードする相補性プラスミドを導入することにより、ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４で表されるウイルスの回収を行った。次に、ＣＤ４の下流の位置にＣＸＣＲ４をコードする遺伝子を追加し、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４で表されるウイルスを回収した。回収したウイルスは、ＢＨＫ細胞に対して１ラウンドだけの感染を行うことができるので、最初に、回収したウイルスを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードしかつトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡ由来の相補性ＶＳＶ  Ｇタンパク質を一時的に発現するワクシニアウイルスを感染させた細胞上で増殖させた。
【００３１】
ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する細胞系では欠損ウイルスの増殖が可能である：ワクシニアウイルスの不在下でＶＳＶΔＧ−ＣＤ４およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルスを増殖させるために、誘導性プロモーター（Ｓｈｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）由来のＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現するＢＨＫ細胞系を発生させた。図２は、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルスがこの細胞系上でプラークを形成することを示している。このことから多重ラウンドの感染が示唆される。この系上で欠損ウイルスを増殖させた後で得られた力価は、０．５〜１×１０６ｐｆｕ／ｍｌの範囲であった。これらの力価は、野生型ＶＳＶの力価と比較して１／１０００以下まで減少する。これは恐らく、相補性細胞系から供給されるＧタンパク質のレベルが、野生型感染で発現されるレベルと比較して低いからである思われる。
【００３２】
組換えウイルス中へのＣＤ４およびＣＸＣＲ４の組み込み：  ＣＤ４およびＣＸＣＲ４分子が欠損ウイルスから発現され、ウイルス粒子中に組み込まれるかを調べるために、ＢＨＫ−Ｇ系で増殖させたＶＳＶΔＧ−ＣＤ４またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４をＢＨＫ細胞（ＶＳＶ  Ｇを発現しない）に感染させた（ＭＯＩ＝５）。すべての細胞が死滅した１６時間後、培地からウイルス粒子を精製した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりウイルスタンパク質を分離し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色することにより検出を行った。野生型ウイルスには、Ｌ、Ｇ、Ｎ、およびＭタンパク質が含まれているが（ＰはＮと一緒に共泳動する少量のタンパク質である）、ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルスにはＧが欠損し、ＣＤ４のサイズに相当する約５５，０００ダルトンの新しいタンパク質が含まれている。また、ヒツジ抗ＣＤ４抗体またはＣＸＣＲ４中のＨＡエピトープタグに対するモノクロナール抗体１２ＣＡ５を用いたウェスタンブロット法により、粒子中にＣＤ４が存在することを確認した。ＣＸＣＲ４タンパク質は、染色法によりＶＳＶΔＧ−ＣＣ４中に検出されなかった。これは恐らく、染色剤に結合しない７つの膜スパンニングセグメントが含まれているためと思われる。しかしながら、ウェスタンブロット法では容易に検出された。
【００３３】
ＶＳＶ  Ｇタンパク質の不在下でのＶＳＶの出芽効率は、その存在下での出芽効率の約１／２０以下であることが知られている（Ｋｎｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。狂犬病ウイルスに対しても同様の結果が得られている（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色により検出されたタンパク質の量はすべてのウイルスに対して同じような結果であったが、試験レーン中に充填したウイルスは、１０７個の感染ＢＨＫ細胞から誘導されたものであり、一方、対照レーン中の野生型ウイルスは、わずか２×１０５個の感染細胞から得られたものであった。従って、野生型ウイルスでは、１／５０の感染細胞から同じような染色が得られたことになる。これらの結果は、高い効率でウイルスの出芽を行うためにＶＳＶ  Ｇタンパク質が重要であることを実証するだけでなく、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の不在下でさえも多量のウイルスが産生されることを示している。
【００３４】
組換えウイルス粒子の形態を調べるために、またウイルス膜にＣＤ４が提示されることを確認するために、ＣＤ４に対する抗体および金コンジュゲート二次抗体で標識した後、電子顕微鏡により精製ウイルス粒子を調べた。ネガティブ染色したウイルス粒子の写真を図３に示す。野生型ＶＳＶ粒子は、観察可能なＧタンパク質スパイクを含有し（矢印）、ＣＤ４に対する抗体に結合しなかったが、ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４粒子またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルスは、観察可能なスパイクを含まず、抗ＣＤ４抗体に確実に結合した。ウェスタンブロット法で使用したＣＸＣＲ４に対する抗体は、ＣＸＣＲ４上の内部Ｃ末端ＨＡタグを認識するため、ウイルス粒子を標識するのに適していない。
【００３５】
ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４によるＨＩＶ−１感染細胞の感染：  ＨＩＶ−１が感染した細胞は表面上にｇｐ１２０／４１エンベロープタンパク質を有するため、これらの細胞にＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を感染させることが可能であろう。細胞表面上に存在するｇｐ１２０／４１分子は、ウイルス表面上のＣＤ４およびＣＸＣＲ４に結合し、ウイルスの膜と細胞の膜との融合を促進するはずである。この可能性を試験するために、ヒトＴ細胞系（Ｊｕｒｋａｔ）にＨＩＶ−１  ＩＩＩＢを感染させた。感染５日後、先の実験から、細胞の約半分にＨＩＶ−１が感染したと予測された。この時点でＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルスを添加した。２つの対照培養物、すなわち、一方はＨＩＶ−１だけを感染させた培養物、他方はＶＳＶΔＧ−ＣＣ４だけを感染させた培養物、を平行して作製した。
【００３６】
最初に、間接的な免疫蛍光顕微鏡法を用いてＨＩＶ−１タンパク質およびＶＳＶヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の両方を検出することにより、ＨＩＶ−１およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による感染を追跡した。ＨＩＶ感染１９日後における免疫蛍光分析で得られた結果の例が、同じ領域の細胞のＮｏｍａｒｓｋｉ画像と一緒に図４に示されている。実験全体を通して得られた免疫蛍光データが、まとめて図５のグラフに示されている。図４に示されている領域は、ＨＩＶ−１だけを感染させた対照培養物において、ＨＩＶ抗原に対しては、ほぼすべての細胞がポジティブ染色されたが（ＡおよびＢ）、ＶＳＶ  Ｎタンパク質に対しては、ポジティブ染色された細胞はなかった（Ｃ）。ＨＩＶ−１およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を感染させた細胞では、ＨＩＶ−１抗原に対してポジティブであった細胞の割合はごくわずかであり（ＤおよびＥ）、更に、これらの細胞の大部分は、ＶＳＶ  Ｎタンパク質に対してポジティブであった（Ｆ）。このことは、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が重複感染したことを示唆するものである。また、ＶＳＶ  Ｎタンパク質発現に対して非常にポジティブであったわずかな細胞には、ＨＩＶタンパク質がほとんどまたはまったく存在しなかったことも注目に値する。これらの細胞は、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が細胞タンパク質およびＨＩＶタンパク質の合成を停止させたために生じたかまたは他の感染機構により生じたものと考えられる（後述の考察を参照されたい）。ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４だけを感染させたＪｕｒｋａｔ細胞では、ＨＩＶ抗原またはＶＳＶ  Ｎ抗原の存在を示す細胞は観測されなかった（Ｈ、Ｉ、およびＪ）。
【００３７】
図５の定量結果から明らかなように、細胞にＨＩＶ−１だけを感染させた場合、ＨＩＶ−１＋細胞のパーセントはほぼ１００％近くまで達し、実験期間中、高い値に保たれた。最初にＨＩＶ−１を感染させ、続いてＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を感染させた場合、ＨＩＶ＋細胞のパーセントは、１４日目に減少し始め、２１日目に５〜１０％ＨＩＶ＋の間のレベルに落ち着いた。また、図５から分かるように、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４も感染したＨＩＶ−１＋細胞のパーセントは増大し、ほぼ９０〜９５％の横這い状態に達する。従って、ＨＩＶ−１が感染した細胞にＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が急速に重複感染し、高レベルのＨＩＶ−１が放出される前に細胞が死滅してしまうものと考えられる。この場合、２種のウイルスの間のバランスが所定の状態に達し、ＨＩＶ感染は、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染によりコントロールされ、低いレベルに保持される。ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢがよく増殖する他の細胞系であるＨ９Ｔ細胞系を用いて行った実験でも、非常に類似した結果が得られた。
【００３８】
共受容体遺伝子の欠損したＶＳＶΔＧ−ＣＤ４ウイルスがＨＩＶ−１感染細胞に感染する可能性についても試験した。１つの実験において、ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４による低レベルの感染（ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４で観測されたレベルの約１０％）が起こることが分かった。しかしながら、初期感染は、ＶＳＶ  Ｇに対する抗体を用いて完全に中和することができた。このことは、感染を開始するのに十分な痕跡量のＧタンパク質がビリオン中に存在していた可能性があることを示唆する。このＧタンパク質は、恐らく、ＢＨＫ−Ｇ系中で増殖させたインプットウイルスからＢＨＫ細胞系に運ばれ、次に、放出されるビリオン中に組み込まれたものであろう。興味深いことに、ＨＩＶ感染Ｊｕｒｋａｔ細胞中で感染が一度成立した場合、感染は数週間持続した。このことは、それ自体の共受容体をコードしないウイルスが増殖可能であることを示唆するものである。恐らく、出芽ビリオンは、細胞がコードする共受容体をピックアップして増殖することができると考えられる。しかしながら、ＨＩＶ−１感染のコントロールは、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の場合ほど強くない。このことから、ウイルスは高レベルの共受容体をコードすることが好ましいことが分かる。ＨＩＶ感染のコントロールは、共受容体がない場合にはそれほど有効ではないため、このウイルスを用いた研究は、これ以上行わなかった。
【００３９】
ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染は感染性ＨＩＶ−１の放出をコントロールする：  ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が感染性ＨＩＶ−１の産生およびＨＩＶ−１粒子の放出に及ぼす影響を調べるために、図４および５に記載の実験を繰り返した。ただし、ＨＩＶ−１力価および培地中への逆転写酵素（ＲＴ）の放出を追跡した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＨＩＶ−１感染の３日後にＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を添加した時点では、ＨＩＶ力価および培地中のＲＴレベルは低かった。ＨＩＶ−１だけを感染させた対照の細胞またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を重複感染させた細胞において、ＨＩＶ−１力価およびＲＴ活性はいずれも、感染１０日後にピークに達した。ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を重複感染させた細胞では、その後、１４日目までＲＴ活性が低下していき、対照の細胞で観測されたＲＴレベルの約１０％で横這い状態になった。感染性ＨＩＶ−１の力価に関する結果は、かなり劇的なものであり、１４日目に感染性ＨＩＶ−１は完全に消失し（対照よりも＞４  ｌｏｇ低い）、続いて、３４日目まで、１ミリリットルあたりわずか０〜３９個の感染性粒子のレベルで変動した。これらの力価は、当然のことながら、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を感染させなかった対照培養物に対する一定した力価約１０４個／ｍｌに匹敵する。
【００４０】
ＲＴの結果は、前述の免疫蛍光を用いて観測された図５に記載の結果と一致したが、感染性ＨＩＶ力価がかなり大きく低下することは予測されなかった。ＨＩＶエンベロープをほとんどまたはまったく発現しないためにエンベロープは欠損するがＲＴは含まれるＨＩＶ粒子を産生するＨＩＶ感染細胞に対して、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染が選択性を示すと仮定すれば、こうした力価の低下を説明することが可能である。
【００４１】
抗ＣＤ４または抗ｇｐ１２０はＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による感染をブロックする：  ＨＩＶ感染細胞中へのＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の侵入がＣＤ４およびｇｐ１２０に依存することを確認するために対照の中和実験（表１）も行った。ＣＤ４に対する抗体、またはＶＳＶ−Ｇに対する中和抗体と共に、または抗体を用いずに、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４をインキュベートした後、図５に示されているように５日間かけてＨＩＶ−１を感染させたＪｕｒｋａｔ細胞に添加した。表１から分かるように、抗ＣＤ４はＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染を完全に停止させたが、Ｇに対する抗体では完全な停止は見られなかった。
【００４２】
【表１】
0004434478.tif 000002
ａＶＳＶ  Ｇを発現しないＢＨＫ細胞上で増殖させたウイルスを抗ＶＳＶ  Ｇもしくは抗ＣＤ４と共にインキュベートしたか、または抗ＨＩＶ  ｇｐ１２０と共に細胞をインキュベートした後でウイルスと細胞を混合した。
ｂ図４および５に示されているように、間接的な免疫蛍光顕微鏡法によりＨＩＶ＋細胞およびＶＳＶ  Ｎ＋細胞を同定した。各測定に対して、ランダムな領域から約１００個の細胞をカウントした。ＨＩＶ抗原またはＶＳＶ  Ｎタンパク質が陽性である細胞のパーセントを記す。
【００４３】
同様に、ポリクロナール抗ｇｐ１２０抗体と共にＨＩＶ感染細胞をプレインキュベートしたところ、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による感染が完全に阻止された。ＣＤ４は細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩに結合することができるので（Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，１９８７）、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が細胞上のＭＨＣクラスＩＩに結合した後、低レベルの感染が起こると考えられるが、膜融合タンパク質がない場合にはこうした感染は起こらないと推定される。この可能性を試験するために、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を多量に発現することが知られているリンパ球細胞系であるＤａｕｄｉ細胞（Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を使用した。これらの細胞へ野生型ＶＳＶは容易に感染するが、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による感染は観測されなかった。
【００４４】
（考察）
それ自体のエンベロープタンパク質遺伝子（Ｇ）が欠損し、その代わりにＨＩＶ−１受容体分子および共受容体分子を発現する組換えＶＳＶを構築した。この新規なウイルスは、正常な細胞への侵入について欠陥があるが、相補性ＶＳＶエンベロープタンパク質を発現する細胞上で増殖させることができる。次に、こうして補完されたウイルスは、Ｇタンパク質を発現しない細胞上で増殖させることができ、ウイルスの膜中にＣＤ４およびＣＸＣＲ４を含有する粒子を出芽する。これらのウイルスは複製能を有するが、ＨＩＶ−１を最初に感染させてＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を発現する細胞にのみ侵入し、増殖することができる。これらの細胞へのＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の感染は、ＣＤ４に対する抗体を細胞に添加するか、またはＨＩＶ  ｇｐ１２０に対する抗体をウイルスに添加することによって、中和される。
【００４５】
こうした結果から分かるように、約半分がＨＩＶ−１感染細胞であり半分が未感染細胞である混合細胞集団の場合、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による重複感染により、最終的に、ほとんどまたはまったく検出できないレベルまで、少なくとも、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を重複感染させない対照細胞により得られるＨＩＶ力価の１／３００〜１／１０４以下のレベルまで、感染性ＨＩＶ−１の産生が制限された。この減少は、恐らく、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルスがＨＩＶ−１感染細胞を死滅させた結果であろう。ＨＩＶ−１力価の減少は、ＨＩＶ−１感染細胞の数の分析またはＲＴアッセイから予測された力価よりも大きかった。ＨＩＶ陽性細胞の数は、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染により約１／１０に減少し、ＲＴの放出は、同程度まで減少した。ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４作用の機構を考慮すると、この食い違いを説明することができる。なぜなら、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４は、ＨＩＶエンベロープタンパク質を発現する細胞を標的にしてこれらの細胞を死滅させ、ＨＩＶエンベロープをほとんどまたはまったく産生しない細胞に対して選択性を示すと考えられるからである。このような細胞は、依然として、ＨＩＶ−１抗原産生に対して陽性値を示し、ＲＴを含有するＨＩＶ様粒子を正常なレベルで産生するであろうが、これらの粒子の大多数は非感染性であろう。
【００４６】
ＨＩＶ−１およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の共感染が培養下で１ヶ月にわたり低レベルに保持されたことから、両方のウイルスが複製を継続し、それらがある均衡状態に達したことが示唆される。こうしたデータから判断して、恐らく、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が培養物中でＨＩＶ−１感染を完全に停止させることはないであろう。この低レベルが持続するのは、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が、細胞表面上にｇｐ１２０／４１を発現した後のＨＩＶ−１感染細胞にだけ感染することができ、このような細胞は、恐らく、いくらかのＨＩＶ−１を放出した後で死滅すると考えられるからである。
【００４７】
ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４ウイルスは、既にＨＩＶ−１が感染している細胞に感染するが、ＨＩＶ−１ビリオンに直接融合する可能性もある。このような融合ウイルスには、ＨＩＶおよびＶＳＶのヌクレオカプシドが含まれており、膜上に依然として十分なｇｐ１２０／４１が存在している場合には感染を開始することができるであろう。このような感染が起こると、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の複製が優位になることは、ほぼ間違いないであろう。なぜなら、ＶＳＶは、たとえ、ＨＩＶが逆転写および組込みを行うのに十分な時間に達する前であっても、２〜３時間以内に細胞タンパク質合成を停止させると考えられるからである。こうした融合ウイルスが感染することから、ＶＳＶタンパク質を産生するが、合成されたＨＩＶタンパク質を含むとは思われない細胞の存在を説することが可能である（図４）。いずれの理論にも束縛されることを望むものではないが、ＶＳＶがこうした細胞中でＨＩＶタンパク質合成を阻害した可能性もある。ＨＩＶエンベロープタンパク質を有するＶＳＶΔＧ−ＣＣ４プソイドタイプがＨＩＶ感染細胞中に生成した場合、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による未感染細胞への感染が起こる可能性もある。ＶＳＶ粒子中への野生型ＨＩＶエンベロープの取り込みは、極めて非効率的であり（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、従って、この後者の機構を生じることは稀であろう。このようなプソイドタイプに対する直接的な試験を行うために、ＨＩＶ−１およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を共感染させた細胞から得られた上清を用いてＪｕｒｋａｔ細胞の短期間感染を行った。これらの細胞中ではＶＳＶタンパク質の発現は検出されなかったが、同じ上清を用いてＨＩＶ感染Ｊｕｒｋａｔ細胞に感染させたときには容易に検出された。ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４（ＨＩＶ）プソイドタイプは、もし仮に存在したとしても極めてわずかであろうと結論付けられた。
【００４８】
この系の特筆すべきいくつかの側面。第１に、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４は、ＨＩＶ−１が既に感染した細胞を特異的に標的とするため、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染レベルは、ＨＩＶ感染レベルと同程度であり、ＨＩＶが存在しなくなれば消失すると予想される。第２に、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４は、そのエンベロープタンパク質としてヒトタンパク質だけをコードするため、中和抗体の産生を誘発しないと思われる。内部ＶＳＶタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発すると予想されるが、このような応答は、ＨＩＶ−１およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４が感染した細胞を急速に死滅させることにより、ＨＩＶ感染を一掃する働きを有する可能性がある。第３に、薬剤耐性に対する突然変異は、ＨＩＶ−１中で迅速に選択されが、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４による感染に対する耐性は、ＨＩＶがＣＤ４または共受容体に結合する能力を失うことが必要であるため、選択されることはないと思われる。
【００４９】
また、こうした結果から、ＶＳＶの出芽および組立ての重要な側面が示される。ウイルスタンパク質の収量および力価から判断して、野生型ＶＳＶが感染した各ＢＨＫ細胞は、約１００，０００個の粒子を産生し、これらの粒子のうちの１０％までは感染性であると推定される。ＶＳＶ  Ｇ遺伝子の欠損により、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４またはＶＳＶΔＧ−ＣＤ４の粒子収量は約１／３０〜１／５０に減少した。このことは、出芽の促進にＧが重要な役割を果たすことを示唆するものである。しかしながら、こうした出芽の減少にもかかわらず、Ｇタンパク質の不在下で少なくとも２，０００個のＶＳＶΔＧ−ＣＣ４またはＶＳＶΔＧ−ＣＤ４が各ＢＨＫ細胞から産生される。これらの粒子中へのＣＤ４およびＣＸＣＲ４の取り込みは、細胞表面からのウイルス出芽としてタンパク質をトラップする受動的プロセスによって生じるものと推定される。なぜなら、いずれのタンパク質にも、取込みを促進する特異的シグナルが含まれているとは考えられないからである。ＶＳＶは、宿主タンパク質合成をブロックし、そのｍＲＮＡおよびタンパク質をかなり多量に発現するので、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４が、細胞表面上の主要なタンパク質であり、従って、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４エンベロープ中の主要なタンパク質であると思われる。
【００５０】
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0004434478.tif 000004
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【００５１】
本明細書中に引用されている論文の全内容は、参照によりそのまま本明細書に組み入れる。
【００５２】
本発明は、ＮＩＨ認可第ＡＩ２４３４５号および第ＡＩ４９２３５号に基づいて部分的に政府の支援を得て行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【００５３】
以上の説明は、本発明の実施方法を当業者に教示することを目的とするものであって、説明を読むことにより当業者には明らかになるであろう自明な修正および変更をすべて網羅することを意図するものではない。しかしながら、このような自明な修正および変更はいずれも、以下の請求の範囲で規定される本発明の範囲内に含まれるものとする。これらの請求の範囲は、特に矛盾した関係が生じないかぎり、特許請求された成分およびステップを、本発明が意図した目的を効果的に満足する任意の順序で、含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  組換えＶＳＶゲノムの図を表している。野生型ＶＳＶ中および記載の組換えＶＳＶ中の遺伝子の序列が示されている。ＶＳＶポリメラーゼ転写の開始および終了を指示する適切なシグナルを含むように、それぞれの追加の遺伝子を挿入した。プラスミドの構築および組換えウイルスの誘導についての詳細は、実施例中に記載されている。３’−５’配向で示されているマイナス鎖ＲＮＡゲノムの左から右に遺伝子が転写される。
【図２】  Ｇ遺伝子の欠損したＶＳＶが相補性細胞系上でプラークを形成することを実証する培養物の写真を示している。６ウェルプレート上にＢＨＫ−Ｇ細胞を接種し（各ウェル中の細胞数は１．５×１０５個である）、テトラサイクリンを除去することによりＧタンパク質発現を誘発した。１６時間後、図中に示した希釈度のＶＳＶΔＧ−ＣＤ４ウイルス（１０−２、１０−３、および１０−４）１００μｌを添加し、続いて、２％メチルセルロースを含有するＤＭＥ  ２ｍｌを添加した。細胞を４８時間インキュベートし、次いで、ナフタレンブラックで染色して小さなプラークを可視化した。野生型ＶＳＶのプラークはかなり大きく、１８時間後に肉眼で観測されるが、この細胞系上での欠損ウイルスによるプラークの形成は、より遅かった。これは、恐らく、発現された相補性ＶＳＶ  Ｇタンパク質のレベルが低かったためと考えられる。
【図３】  ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４のエンベロープ中のＣＤ４を免疫電子顕微鏡法により可視化した結果を示している。精製した野生型ＶＳＶ粒子、ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４粒子、またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４粒子を、ＣＤ４指向性モノクロナール抗体で、続いて金コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ粒子で標識した後、リンタングステン酸でネガティブ染色した。野生型ＶＳＶ粒子は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質三量体の観察可能なスパイクを含有し（矢印）、ＣＤ４に対する抗体に結合しなかったが（野生型ＶＳＶ、左側パネル）、ＶＳＶΔＧ−ＣＤ４粒子またはＶＳＶΔＧ−ＣＣ４粒子は、抗ＣＤ４抗体に結合し、表面上に観察可能なスパイクは生じなかった。
【図４】  ＨＩＶ−１およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の感染を免疫蛍光顕微鏡法により解析した結果を示している。Ｊｕｒｋａｔ細胞の二重反復培養物にＨＩＶ−１株ＩＩＩＢを感染させ、５日後、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を重複感染させるか（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）または重複感染させずに増殖させた（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）。また、ＨＩＶ−１を感染させなかったＪｕｒｋａｔ細胞にＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を感染させた（パネルＧ、Ｈ、Ｉ）。ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染の１４日後、細胞を固定し、ＶＳＶ  Ｎタンパク質に対するマウスモノクロナール抗体で、更に、第２のアフィニティー精製ローダミンコンジュゲート抗マウス抗体で標識し（パネルＣ、Ｆ、Ｉで検出される）、またヒトポリクロナール抗ＨＩＶ免疫グロブリンで、続いて、アフィニティー精製ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒト抗体で標識した（パネルＢ、Ｅ、Ｈで検出される）。パネルＡ、Ｄ、およびＧは、右側の２つの画像中に染色されて示されている細胞の同じ領域のＮｏｍａｒｓｋｉ画像を表している。
【図５】  Ｊｕｒｋａｔ細胞中のＨＩＶ−１およびＶＳＶΔＧ−ＣＣ４の感染量を定量した折れ線グラフを示している。０日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞の二重反復培養物にＨＩＶ−１  ＩＩＩＢを感染させ、５日後に、ＶＳＶΔ−ＣＣ４を重複感染させるか（■）または重複感染させずに増殖させた（□）。所定の日に、免疫蛍光顕微鏡法によりＨＩＶ＋細胞のパーセントを測定した（図５Ａ）。免疫蛍光顕微鏡法によりＶＳＶ  Ｎタンパク質を検出することにより、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４も感染したＨＩＶ＋細胞のパーセントを測定した。多数のランダムな領域から１００〜２００個の細胞を計数し、ＨＩＶ抗原またはＶＳＶ抗原に対してポジティブ染色された細胞のパーセントを求めた。
【図６】  感染性ＨＩＶ−１の産生およびＲＴの放出に及ぼすＶＳＶΔＧ−ＣＣ４感染の影響を表す折れ線グラフを示している。実施例に記載されているように、Ｊｕｒｋａｔ細胞培養物の培地を分析し、感染性ＨＩＶ力価およびＲＴ活性を調べた。力価（図５Ａ）は、３回測定してＴＣＩＤ５０／ｍｌとして報告されている（□、ＨＩＶのみ感染；■、ＨＩＶ＋ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４）。このアッセイで求めた力価は、ＨＩＶ抗原を検出する間接的な免疫蛍光アッセイにより求めた力価と一致した。ＲＴ活性（図５Ｂ）は、１分間にＤＥＡＥ紙に結合した全カウント数（ｃｐｍ）から５０ｃｐｍ未満のバックグラウンドを差し引いた後の値として報告されている（□、ＨＩＶのみ感染；■、ＨＩＶ＋ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４；△、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４のみ感染）。プロットした数値は、反復測定値の平均であり、反復測定値は、５％以内で一致した。サンプルは、ＶＳＶΔＧ−ＣＣ４を重複感染させた後、所定の日にＪｕｒｋａｔ細胞培養物から採取した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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