(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載された配列からなるＤＮＡ、または配列番号１に記載された配列からなるＤＮＡの相補鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、大腸菌で発現させた場合に、Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質と、Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼをインビボで活性化する機能を有する蛋白質とをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡを含む発現ベクターが導入された、酢酸菌以外のグラム陽性菌またはグラム陰性菌である組換え微生物。
【請求項４】
請求項３に記載の組換え微生物を適当な培地中で培養する段階と、培養物から組換えＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを回収する段階とを含む、組換えＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを製造する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の組換え微生物を利用してＤ−ソルビトールをＬ−ソルボースに変換する段階を含む、Ｌ−ソルボースを製造するための方法。
【請求項６】
請求項３に記載の組換え微生物を利用した、２−ケト−Ｌ−グロン酸および／またはビタミンＣの製造方法であって、
Ｄ−ソルビトールをＬ−ソルボースに変換する段階と、
Ｌ−ソルボースをさらに２−ケト−Ｌ−グロン酸および／またはビタミンＣに変換する段階とを含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコノバクター属およびアセトバクター属を含む酢酸菌に属する微生物のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼをコードする新規のDNA、該DNAを含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む組換え生物体に関する。さらに、本発明は組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼの生産プロセス、ならびに該組換え酵素または該発現ベクターを含む組換え生物体を利用したL-ソルボースの生産プロセスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
L-ソルボースは、主にライヒシュタイン(Reichstein)法(Helvetica chimica Acta, 17: 311, 1934)により実施される、工業的なビタミンC生産プロセスの重要な中間体である。このプロセスにおいては、唯一の微生物による変換は、グルコノバクターまたはアセトバクター株による、D-ソルビトールからのL-ソルボースの生産である。この変換は、NAD/NADP非依存性のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ(SLDH)によって実行されると考えられる。L-ソルボースも、ビタミンCの生産の有用な中間体である2-ケト-L-グロン酸を、微生物により生産するための当技術分野で周知の基質である。
【０００３】
D-ソルビトールからL-ソルボースへの酸化を触媒するNAD/NADP非依存性のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼがあることが知られている。該D-ソルビトールデヒドロゲナーゼは、グルコノバクター・サブオキシダンス変種αIFO 3254（Gluconobacter suboxydans var αIFO 3254）(E. Shinagawaら、Agric Biol. Chem., 46: 135-141, 1982)から単離および解析され、分子量が63 kDa、51 kDa、および17 kDaの3つのサブユニットから構成されていることが判明した。最大のサブユニットは、FADをコファクターとして含むデヒドロゲナーゼであり、2番目のサブユニットはチトクロームc、最小のサブユニットは機能が不明のタンパク質である。該D-ソルビトールデヒドロゲナーゼは、至適pH 4.5を示す。かかるSLDHはG.サブオキシダンス（suboxydans）ATCC 621 (KCTC 2111)(E-S Choiら、FEMS Microbiol. Lett. 125:45-50, 1995)からも精製および解析されており、分子量が75 kDa、50 kDa、および14 kDaの3つのサブユニットから構成されることが判明した。最大のサブユニットは、ピロロキノリンキノン(PQQ)をコファクターとして含むデヒドロゲナーゼ、2番目のサブユニットはチトクロームc、最小のサブユニットは機能が不明のタンパク質である。本発明者らはまたG.サブオキシダンスIFO 3255 (T. Hoshinoら、欧州特許第728840号)からもNAD/NADP非依存性SLDHを精製し解析した。このSLDHは分子量が79.0 +/- 0.5 kDaの1種類のサブユニットからなり、至適pHは6〜7を示し、D-ソルビトール以外にもマンニトールおよびグリセロールにデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【０００４】
数種類のSLDHが精製されたにもかかわらず、その遺伝子はまだクローニングされていない。SLDH酵素を効率良く生産し、SLDH活性の上昇した組換え生物体を作製してL-ソルボースの生産収率を改善するために、SLDH遺伝子をクローニングすることは有用である。また、該SLDH遺伝子を、例えばL-ソルボースを2-ケト-L-グロン酸に変換するグルコノバクターなどの所望の生物体に導入して、D-ソルビトールから2-ケト-L-グロン酸を直接生産する組換え微生物を作製することも有用である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、 Ｄ−ソルビトール・デヒドロゲナーゼ遺伝子を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グルコノバクター属およびアセトバクター属などの酢酸菌に属する微生物由来のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ(SLDH)をコードするヌクレオチド配列（遺伝子）、該ヌクレオチド配列を含むDNA分子、該DNAと該SLDHをインビボで活性化する機能を有するタンパク質のヌクレオチド配列を含むDNAとの組み合わせ、SLDHヌクレオチド配列またはDNAの該組み合わせを含むDNAを有する発現ベクター、該発現ベクターを有する組換え生物体、組換えSLDHを生産するためのプロセス、および組換えSLDHまたは組換え生物体を利用してL-ソルボースを生産するためのプロセスを提供する。
【０００７】
本発明は、機能的誘導体にも関する。かかる機能的誘導体とは、本発明のアミノ酸配列を基として、該配列の1つまたは複数のアミノ酸残基が付加、挿入、欠失、および/または置換されているものであって、当技術分野で公知のアッセイまたは本明細書に具体的に記載したアッセイによって測定されるSLDH活性を有する誘導体と定義される。かかる機能的誘導体は、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成法、または当技術分野で公知であり例えばサムブルック(Sambrook)ら「分子クローニング(Molecular Cloning)」,( Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA、第2版1989)に開示されている方法による本明細書に開示されているDNA配列に基づく組換え法のいずれかにより作製できる。タンパク質およびペプチドにおける該分子の活性を通常変化させないようなアミノ酸の置換は、当技術分野で公知であり、たとえばH.ネウラス(Neurath)およびR.L. ヒル(Hill)、「タンパク質（The Proteins）」（Academic Press, New York, 1979、特に14ページ図6を参照）に記述されている。最も通常に起こる置換は、Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Glyおよびその逆である。
【０００８】
さらに、本発明は、例えば配列番号：2および配列番号：3として開示されるSLDH活性を有するポリペプチドと該SLDHをインビボで活性化する機能を有するポリペプチドとをコードするDNA配列、その相補鎖、またはこれらの配列を含む配列、該配列またはその断片と標準的条件下でハイブリダイズするDNA配列、および遺伝コードの縮重のために該配列とは標準的条件下でハイブリダイズしないが全く同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列にも関する。
【０００９】
本明細書におけるハイブリダイゼーションの「標準的条件」とは、当業者が一般的に特異的なハイブリダイゼーションシグナルを検出するために使用する条件で、例えば「分子クローニング（Molecular Cloning）」(Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA、第2版1989)に記述されている条件、または好ましくは、当業者に周知で例えばサムブルック（Sambrook）ら(前記)に記述されている、いわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェントな洗浄条件である。
【００１０】
本発明者らは、DNA組換え技術によってSLDH遺伝子と共にインビボでSLDH活性を発現させるための機能を有する遺伝子を単離し、そのヌクレオチド配列を決定した。
【００１１】
本発明は、グルコノバクターSLDHをコードするDNA配列、インビボでSLDH活性を発現させるための機能を有する遺伝子（以後ORF2遺伝子と称する）、 SLDHの該DNAを含む発現ベクター、および該発現ベクターを有する宿主細胞を提供する。
【００１２】
簡単に述べると、本発明で使用されるSLDHおよび/またはORF2遺伝子、該遺伝子を含むDNA分子、組換え発現ベクター、および組換え生物体は、次のような段階によって得られる：
【００１３】
(1) D-ソルビトールをL-ソルボースに変換するSLDH活性を提供できる微生物から染色体DNAを単離し、例えば大腸菌などの適当な宿主細胞中で、該染色体DNAの遺伝子ライブラリーを作製する段階；
【００１４】
(2) コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、またはサザンハイブリダイゼーション、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング、およびウェスタンブロット分析、などの方法で、染色体DNAからSLDHおよび/またはORF2遺伝子をクローニングする段階；
【００１５】
(3) 上記のようにして得られたSLDHおよび/またはORF2遺伝子のヌクレオチド配列を常法により決定し、該SLDHおよび/またはORF2遺伝子を含むDNA分子を選択し、 SLDHおよび/またはORF2遺伝子が効果的に発現できる組換え発現ベクターを構築する段階；
【００１６】
(4) 例えば、形質転換、形質導入、接合伝達、および/またはエレクトロポレーションなどの適当な方法でDNAを宿主細胞に導入することにより、SLDHおよび/またはORF2遺伝子を有する組換え生物体を作製する段階。
【００１７】
本発明に係るDNAにおいては、
（１）下記の(a)または(b)によって規定される、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAであることを特徴とする：
【００１８】
(a) 配列番号：2に記載された配列の1位から716位までのアミノ酸配列を有する蛋白質、または
【００１９】
(b) (a)で規定されたアミノ酸配列における1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加によって(a)の蛋白質から得られる蛋白質。
【００２０】
また、本発明に係るDNAにおいては、
（２）酢酸菌に属する微生物のソルビトールデヒドロゲナーゼをコードする、上記（1）記載のDNAであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係るDNAにおいては、
（３）微生物がグルコノバクター属またはアセトバクター属に属する、上記（2）記載のDNAであることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係るDNAにおいては、
（４）(c) 配列番号：1に示された配列の664位から2791位まで、または572位から2791位までのヌクレオチド配列を含むDNA、および
【００２３】
(d) (c)で規定されたDNAとのハイブリダイゼーションが可能であって、上記（1）の(a)で規定された蛋白質の機能を有する蛋白質をコードするDNA
からなる群より選択される、上記（1）〜（3）のいずれか一項に記載のDNAであることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係るDNAにおいては、
（５）(A) 上記（1）〜（4）のいずれか一項で規定されるDNAと、
【００２５】
(B) 配列番号：1に示された配列の192位から569位までのヌクレオチド配列を有するORF2をコードするDNA、および／または配列番号：3で規定された配列の1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られる、ORF2の機能と同等な機能を有するORF2の誘導体をコードするDNA
とを含む、DNAの組み合わせであることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係るDNAにおいては、
（６）(A) 配列番号：1に示された配列の644位から2791位まで、もしくは572位から2791位までのヌクレオチド配列を有するDNA、または上記（1）で規定された蛋白質の機能を有する蛋白質をコードするこのDNAとのハイブリダイゼーションが可能なDNA、および
【００２７】
(B) 配列番号：1に示された配列の192位から569位までのヌクレオチド配列を有するORF2をコードするDNA、または配列番号：3で規定された配列の1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加によって得られる、ORF2の機能と同等な機能を有するORF2の誘導体をコードするDNA
を含む、上記（5）記載のDNAの組み合わせであることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、
（７）上記（1）〜（6）のいずれか一項に記載のDNAを含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係るDNAにおいては、
（８）それぞれのDNAが異なる発現ベクター上にあるか、または同じ発現ベクター上にある、上記（5）または（6）記載のDNAの組み合わせであることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係るDNAにおいては、
（９）配列番号：1に記載のように直列に位置している、上記（5）または（6）記載のDNAの組み合わせであることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、
（１０）グルコノバクター属、アセトバクター属または大腸菌に属するものから選択された微生物において機能的である、上記（7）記載の発現ベクターであることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る組換え生物体においては、
（１１）上記（7）および（10）のいずれか一項に記載の発現ベクターが導入された組換え生物体であることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明に係る組換え生物体においては、
（１２）宿主生物体の染色体DNA上に、上記（1）〜（4）のいずれか一項に記載のDNA、または上記（5）、（6）、（8）もしくは（9）のいずれか一項に記載のDNAの組み合わせを有する組換え生物体であることを特徴とする。
【００３４】
また、本発明に係る組換え生物体においては、
（１３）宿主生物体が、グルコノバクター属、アセトバクター属または大腸菌に属するものから選択される微生物である、上記（11）または（12）記載の組換え生物体であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼの製造方法においては、
（１４）上記（11）〜（13）のいずれか一項に記載の組換え生物体を適当な培地中で培養する段階と、培養物から該組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼを回収する段階とを含む、組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼを製造する方法であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼにおいては、
（１５）上記（1）〜（4）のいずれか一項に記載のDNA、または上記（5）、（6）、（8）もしくは（9）のいずれか一項に記載のDNAの組み合わせの発現によって産生される組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼであることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明に係る組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼにおいては、
（１６）上記（14）記載の方法によって製造される組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼであることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明に係る組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼにおいては、
（１７）固相酵素反応のために固体担体上に固定化された、上記（15）または（16）記載の組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼであることを特徴とする。
【００３９】
また、本発明に係るL-ソルボースの製造方法においては、
（１８）上記（16）または（17）記載の組換えD-ソルビトールデヒドロゲナーゼを利用してD-ソルビトールをL-ソルボースに変換する段階を含む、L-ソルボースを製造するための方法であることを特徴とする。
【００４０】
また、本発明に係るL-ソルボースの製造方法においては、
（１９）上記（11）〜（13）のいずれか一項に記載の組換え生物体の適当な培地中における発酵によってD-ソルビトールをL-ソルボースに変換する段階を含む、L-ソルボースを製造するための方法であることを特徴とする。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明の上記の局面に使用される材料および技術は、下記に詳細に例示する。
【００４２】
全染色体DNAは、当技術分野で周知の方法により精製できる。目的の遺伝子は、通常、以下の実施例にある方法のいずれかにより、全染色体DNAからプラスミドまたはファージベクターのいずれかにクローニングできる。
【００４３】
(i) 部分的アミノ酸配列は、精製タンパク質またはそのペプチド断片から決定できる。かかるタンパク質全体またはペプチド断片は、タンパク質全体の単離によって、またはペプチダーゼ処理後SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動したゲルから単離することによって調製できる。このようにして得られたタンパク質またはその断片を、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）自動気相シークエンサー470Aのようなタンパク質シークエンサーにかける。アミノ酸配列を利用して、オリゴヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーをデザインし、それらをアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）自動DNAシークエンサー381AのようなDNA合成装置によって調製することができる。該プローブは、目的の遺伝子を有する株の遺伝子ライブラリーから、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリダイゼーションによって、目的の遺伝子を有するクローンを単離するのに使用できる。
【００４４】
(ii) または、遺伝子ライブラリーから目的のタンパク質を発現するクローンを選択するために、目的のタンパク質に対して調製された抗体を用いる免疫学的方法も利用できる。
【００４５】
(iii) 目的遺伝子のDNA断片は、全染色体DNAから、プライマーのセット、すなわち、上記のようにして決定したアミノ酸配列にしたがって合成された2つのオリゴヌクレオチドを用いる、PCR法によって増幅できる。その後、例えば大腸菌において作製した遺伝子ライブラリーから、上記のように得られたPCR産物をプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、またはプラークハイブリダイゼーションによって、目的の遺伝子全体を有するクローンを単離できる。
【００４６】
(iv) クローニングのさらに別の方法は、化学的変異誘発による通常の変異誘発によって、または例えばトランスポゾンTn5を用いて目的遺伝子を破壊するような組換えDNA技術によって作製されたSLDH欠損株に相補的なクローンをスクリーニングする方法である。
【００４７】
本明細書に開示されているDNA配列に基づいてデザインされたプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって、当技術分野で公知の方法により作製できるDNA配列も、本発明の目的である。本発明のDNA配列は、例えば欧州特許第747 483号に記載されているように合成によって作製することもできる。
【００４８】
上記の抗体は、精製SLDHタンパク質またはそのペプチド断片を抗原として、「酵素学の方法（Methods in Enzymology)」(vol. 73, p 46, 1981)に記載されるような方法により、調製できる。
【００４９】
所望の遺伝子を有するクローンが得られたら、M13ファージを用いるジデオキシ・チェーン・ターミネーター法(Sanger F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977)のような周知の方法により目的遺伝子のヌクレオチド配列を決定できる。
【００５０】
本発明のD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を発現する所望の遺伝子を、図２および図３〜６に示す。この特異的遺伝子は、716アミノ酸残基を有するSLDH酵素と、24アミノ酸残基からなるシグナルペプチドとをコードしている。本発明者らは、上記SLDH構造遺伝子のすぐ上流にオープンリーディングフレームを見出し、これをORF2と命名した。このORF2遺伝子は、126アミノ酸残基を有するタンパク質をコードしており、特に、該SLDHが酢酸菌とは異なる属の宿主細胞において発現される場合に、本発明の組換えSLDHに所望の酵素活性を提供する機能を有することが示唆された。
【００５１】
グルコノバクター属およびアセトバクター属を含む酢酸菌から単離された所望の遺伝子/ヌクレオチド配列を、効果的に発現させるために、種々のプロモーターを使用することができる。例えば、この遺伝子の元来のプロモーター、Tn5（D.E. BergおよびC.M. Berg. 1983 Bio/Technology 1: 417-435)のカナマイシン耐性遺伝子およびpBR322のアンピシリン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子のプロモーター、大腸菌のβガラクトシダーゼ(lac)、trp-、tac-、trc-プロモーター、λファージのプロモーター、ならびに宿主生物で機能しうる任意のプロモーターが使用できる。この目的のために、宿主生物は、哺乳類細胞、植物細胞、および以下のような細菌を含む微生物から選択することができる：大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アセトバクター・パスツーリアヌス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・ハンゼニイ（Acetobacter hansenii）、グルコノバクター・アルビダス（Gluconobacter albidus）、グルコノバクター・カプシュラタス（Gluconobacter capsulatus）、グルコノバクター・セリヌス（Gluconobacter cerinus）、グルコノバクター・ディオキシアセトニカス（Gluconobacter dioxyacetonicus）、グルコノバクター・グルコニカス（Gluconobacter gluconicus）、グルコノバクター・インダストリウス（Gluconobacter industrius）、グルコノバクター・メラノジーナス（Gluconobacter melanogenus）、グルコノバクター・ノンオキシグルコニカス（Gluconobacter nonoxygluconicus）、ブダペスト条約の規定に基づいて1987年3月17日にDSM 4025として[the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, BRD]に寄託されたグルコノバクター・オキシダンスDSM 4025のようなグルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・オキシダンス・スフェリカス亜種（Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus）、グルコノバクター・ロゼウス（Gluconobacter roseus）、グルコノバクター・ルビギノーザス（Gluconobacter rubiginosus）、グルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）。
【００５２】
発現のためには、コード配列が導入される宿主細胞で機能的であるシャイン・ダルガーノ(SD)配列（例えば、AGGAGGなど、宿主細胞中で機能的な天然および合成配列を含む）、および転写終結因子（宿主細胞中で機能的な任意の天然および合成配列を含む逆方向反復構造）のような他の制御因子を、上述のプロモーターと共に使用することができる。
【００５３】
本発明のSLDH蛋白質のような膜結合型ポリペプチドの発現のためには、通常15〜50アミノ酸残基を含み、かつ完全に疎水性であるシグナルペプチドが結合していることが好ましい。シグナルペプチドをコードするDNAは、所望の宿主細胞中で機能的な任意の天然および合成配列から選択できる。
【００５４】
二本鎖DNAのクローニングには、広範囲の宿主/クローニングベクターの組み合わせが使用できる。通常、クローニングベクターは、複製開始点、制御因子、マルチクローニングサイトを含むクローニング部位、ならびにアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、およびスペクチノマイシン等の耐性遺伝子を含む抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを有するプラスミドまたはファージである。
【００５５】
本発明の遺伝子を大腸菌で発現させるのに好ましいベクターは、pBR322またはpUC18およびpBluescript II (ストレータジェン  クローニング  システムズ(Stratagene Cloning Systems)社、米国カリフォルニア州）を含めたその誘導体、pACYC177およびpACYC184 (J. Bacteriol., 134: 1141-1156, 1978)およびその誘導体、ならびにRK2 (C. M. Thomas, Plasmid 5: 10, 1981)およびRSF1010 (P. Guerryら、J. Bacteriol. 117: 619-630, 1974)などの広宿主域プラスミドに由来するベクターのように、通常大腸菌で使用される任意のベクターから選択できる。本発明のヌクレオチド配列を、グルコノバクター、アセトバクター、およびP.プチダ(putida)を含む細菌で発現させるのに好ましいベクターは、大腸菌のような好ましいクローニング生物におけると同様にグルコノバクター、アセトバクター、および/またはP.プチダ（putida）において複製可能な任意のベクターから選択される。好ましいベクターは、pVK100 (V. C. Knaufら、Plasmid 8: 45-54, 1982) のようなコスミドベクターおよびその誘導体ならびにRSF1010などの広宿主域ベクターである。クローニングされた遺伝子の安定かつ効果的な発現のため、およびクローニングされた遺伝子を有する宿主細胞の効果的な培養のために、ベクターのコピー数と安定性を注意深く検討する必要がある。Tn5のような転位因子を含むDNA分子も、所望の遺伝子を好ましい宿主、特に染色体上に導入するためのベクターとして使用できる。本発明の遺伝子と共に好ましい宿主から単離される任意のDNAを含むDNA分子も、この遺伝子を好ましい宿主、特に染色体上に導入するために有用である。かかるDNA分子は、宿主およびDNA分子の性質を考慮して、例えば、形質転換、形質導入、接合伝達、またはエレクトロポレーションなどの当技術分野で周知の任意の常法によって、好ましい宿主に導入することができる。
【００５６】
有用な宿主には、微生物、哺乳類細胞、および植物細胞などが含まれる。好ましい微生物としては、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アセトバクター・パスツーリアヌス（Acetobacter pasteurianus）、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・ハンゼニイ（Acetobacter hansenii）、グルコノバクター・アルビダス（Gluconobacter albidus）、グルコノバクター・カプシュラタス（Gluconobacter capsulatus）、グルコノバクター・セリヌス（Gluconobacter cerinus）、グルコノバクター・ジオキシアセトニカス（Gluconobacter dioxyacetonicus）、グルコノバクター・グルコニカス（Gluconobacter gluconicus）、グルコノバクター・インダストリウス（Gluconobacter industrius）、グルコノバクター・メラノジーナス（Gluconobacter melanogenus）、グルコノバクター・ノンオキシグルコニカス（Gluconobacter nonoxygluconicus）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・オキシダンス・スフェリカス亜種（Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus）、グルコノバクター・ロゼウス（Gluconobacter roseus）、グルコノバクター・ルビギノーザス（Gluconobacter rubiginosus）、グルコノバクター・サブオキシダンス（Gluconobacter suboxydans）のような細菌、ならびに組換えSLDHおよび/またはORF2遺伝子を発現する能力のある任意の細菌が挙げられる。該微生物の機能的同等株、継代培養物、変異株、および変種も、本発明で使用することができる。好ましい株は、大腸菌K12またはその誘導体、P.プチダ（putida）、グルコノバクター、またはアセトバクターの菌株である。
【００５７】
本発明で提供されるSLDHおよび/またはORF2遺伝子/ヌクレオチド配列を、上述の宿主細胞中で機能的なプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結因子のような調節領域を含む適当なベクター中に、当技術分野で周知の方法により連結することにより、発現ベクターが作製される。SLDHおよびORF2遺伝子を組み合わせてクローニングする場合は、この2つの遺伝子を、同一のプラスミド上に直列にクローニングするか、または別々にクローニングすることができ、さらに染色体DNA上にもクローニングできる。図７および図８に、プラスミド上にSLDHおよびORF2遺伝子を組み合わせてクローニングする形式を例示している。また、一方の遺伝子をプラスミド上にクローニングし、他方の遺伝子を染色体DNA上にクローニングしてもよい。
【００５８】
組換え発現ベクターを有する組換え微生物を構築するためには、形質転換、形質導入、接合伝達（「一般的および分子細菌学の方法（Methods for general and molecular bacteriology）第１４および１５章」、Philipp Gerhardtら編、American Society for Microbiology, 1994）、およびエレクトロポレーションを含む種々の遺伝子導入方法が使用できる。組換え生物体の構築方法は、分子生物学の分野で周知の方法から選択できる。大腸菌、シュードモナス、グルコノバクター、およびアセトバクターには、通常の形質転換系が使用できる。大腸菌には形質導入系も使用できる。接合伝達系は、大腸菌、P.プチダ( putida)およびグルコノバクターを含むグラム陽性菌およびグラム陰性菌において広く使用できる。好ましい接合伝達は、国際公開公報第89/06688号に開示されている。接合伝達は、液体培地または固体表面上で実施できる。 SLDHおよび/またはORF2遺伝子産生の好ましい受容株は、大腸菌、P.プチダ（putida）、グルコノバクター、およびアセトバクターから選択される。接合伝達の受容株には、通常、選択マーカーが添加される。例えば、ナリジクス酸またはリファンピシンへの耐性が通常選択される。天然の耐性も使用できる。例えば、ポリミキシンBへの耐性は、多くのグルコノバクターに有用である。
【００５９】
本発明は、組換えSLDHを提供する。本発明により提供されるSLDH遺伝子を、グルコノバクター属およびアセトバクター属などの酢酸菌を含む生物体に導入することにより、 SLDH酵素の生産収率を増加させることができる。本発明のSLDH遺伝子を、本発明のORF2遺伝子と組み合わせて使用することにより、グルコノバクター以外の微生物でも活性SLDHを生産させることができる。組換えSLDHは、固相酵素反応の固相担体上に固定化することができる。本発明はまた、組換え生物体も提供する。組換え生物体を用いてD-ソルビトールからL-ソルボースを生産することができる。また、SLDH遺伝子を本発明のORF2遺伝子と組み合わせて導入することにより、酢酸菌以外の宿主生物でも、D-ソルビトールからL-ソルボースを生産することができる。
【００６０】
【実施例】
実施例1. SLDHのアミノ酸配列の決定
【００６１】
(1) リジルエンドペプチダーゼ処理SLDHポリペプチドのN末端アミノ酸配列分析
【００６２】
SLDHタンパク質から調製されたペプチド1、3、および8の部分的アミノ酸配列を決定した（図1：配列番号：4〜6）。G.サブオキシダンスIFO 3255の精製SLDH (T. Hoshinoら、欧州特許第728840号）をリジルエンドペプチダーゼで消化した。反応液(25 ml)には、100 mMトリス塩酸緩衝液、pH 9.0中にリジルエンドペプチダーゼ1.2 mM、SLDHタンパク質3 nmolが含まれ、反応は37℃で15時間行った。得られたペプチド断片をHPLC（カラム：プロテインC-4、VYDAC、米国カリフォルニア州）により0.1% TFA中、アセトニトリル/イソプロパノール勾配によって、1.0 ml/minの流速で分離した。ペプチドの溶出は214 nmのUV吸光度でモニターし、ピーク画分は手動で採集し、アミノ酸シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ・モデル470A（Applied Biosystems model 470A）、パーキン・エルマー社（Perkin Elmer Corp.）、米国コネチカット州）によりN末端アミノ酸配列分析にかけた。
【００６３】
実施例2. PCRによる部分的SLDH遺伝子のクローニング
【００６４】
G.サブオキシダンスIFO 3255の染色体DNA、および図1に配列を示す縮重オリゴヌクレオチドDNAプライマーs7およびs6Rを用いてPCRを実施した。PCR増幅は熱安定性ポリメラーゼAmplitaq（パーキン・エルマー社（Perkin-Elmer）、ロシュ・モレキュラー・システムズ社（Roche Molecular Systems Inc.）、米国ニュージャージー州）により、サーマルサイクラー（ZYMOREACTOR II AB-1820, ATTO、東京）を用いて実行した。PCRには、供給業者から提供される緩衛液中に以下のものを含む反応液(50 μl)を使用した：dNTP 200 μM、各プライマー10〜20 pmol（縮重度54〜288）、G.サブオキシダンスIFO 3255の染色体DNA 6 ng、およびDNAポリメラーゼ0.5ユニット。反応は、1) 94℃での変性段階1分間；2) 48℃でのアニーリング段階1分間；3) 72℃での合成段階2分間を、30サイクル行った。この結果、1.6 kbのDNAが増幅され、増幅DNA断片を直接連結するための3'-ddT末端を有する大腸菌ベクターpUC57/T（MBI Fermentas, リトアニア、ヴィリニュス）にクローニングされ、組換えプラスミドpMT20が得られた。クローニングされたDNAはジデオキシ・チェーン・ターミネーション法(F. Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977)によりヌクレオチド配列を決定した。1.6 kbの断片は、ペプチド3および8をコードしていた。
【００６５】
実施例3. SLDH遺伝子の完全クローニング
【００６６】
(1) G.サブオキシダンスIFO 3255の遺伝子ライブラリーの構築
【００６７】
2日間MB寒天培地で培養した細胞から、G.サブオキシダンスIFO 3255の染色体DNAを調製した。染色体DNA(160 μg)を500μlの反応液中で20ユニットのEcoRIにより部分消化した。サンプルの一部を5、10、15、30、および60分後に採取し、アガロースゲル電気泳動により消化の程度を調べた。部分消化されたDNA断片を含む最初の4回に採取したサンプルを混合し、調製用のゲル電気泳動（アガロース：0.6％）にかけた。15〜35 kbの断片を切り出し、ゲルから電気的に溶出した。溶出液を濾過し、-80℃で酢酸ナトリウムおよびエタノールを用いて沈殿させた。遠心分離によりDNA断片を回収し、1 mM EDTAを含む200μlの10 mMトリス塩酸緩衝液pH 8.0に懸濁した。
【００６８】
並行して、1.8μgのコスミドベクターpVK100をEcoRIで完全に消化し、ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼで処理した。線状化し脱リン酸化したpVK100を、高重合DNAを得るために製造元が推奨する条件下で、20本のチューブ中、ライゲーションキット（宝酒造、京都）を用いてG.サブオキシダンスIFO 3255の染色体DNAの15〜35 kbのEcoRI断片(5μg)と連結させた。その後、製造元(アマーシャム社（Amersham）、日本)の方法に従って、連結したDNAをインビトロパッケージングに使用した。得られたファージ粒子を用いてゲノムライブラリーの宿主である大腸菌ED8767を感染させた。この結果、4,271コロニーが得られ、試験したすべてのコロニー（20コロニー）に、平均約25 kbのサイズの挿入DNAが含まれていた。
【００６９】
(2) 完全なSLDH遺伝子を得るためのコロニーハイブリダイゼーション
完全なSLDH遺伝子を有するクローンを単離するために、３２P標識した1.6 kbのpMT20のDNAを用いて、コロニーハイブリダイゼーション法により、上述のコスミドライブラリーをスクリーニングした。pVK100ベクター中に約25 kbのインサートを有する1つのクローンが単離され、pSLIIと命名した。pSLIIから6.2 kbのPstI断片を単離し、pUC18にクローニングしてプラスミドpUSLIIPを得た。pUSLIIPからORF2およびSLDH遺伝子を含む6.2 kbのPstI断片を単離し、pCRIIベクター（インビトロゲン社（Invitrogen）、米国カリフォルニア州）にサブクローニングしてpCRSLIIPを作製した。得られたプラスミドから、HindIII-XhoI断片として6.2 kbのPstI断片を含むDNA断片を単離し、pVK100のHindIII部位とXhoI部位との間にクローニングしてpVKSLIIPを得た。
【００７０】
(3) 大腸菌におけるSLDH遺伝子の発現
【００７１】
6.2 kbのPstI断片に目的のSLDHがコードされているかどうか確認するために、pUSLIIPを有する大腸菌JM109細胞を、上述のように抗SLDH抗体を用いたウェスタンブロット分析にかけた。分子量が約80 kDaの免疫陽性タンパク質が形質転換細胞で観察され、このことからPstI断片が完全なSLDHの分子量 (79 kDa +/- 0.5 kDa)を有するポリペプチドをコードしていることが示された。
【００７２】
(4) SLDH活性の相補性に関する試験用株としてのSLDH欠損グルコノバクター26A11株の作製
【００７３】
G.メラノジーナス（melanogenus）IFO 3293を親株として、トランスポゾンTn5による変異誘発を行った。KmｒをコードするトランスポゾンTn5は、宿主生物のDNA上で無作為にヌル（欠損）変異を誘発するため、グラム陰性細菌における突然変異源として広く使用されている。IFO 3293を親株として選択したのは、以下の理由による：(i) この株はD-ソルビトールからL-ソルボースを生産した、(ii) G.サブオキシダンス（suboxydans）IFO 3255から精製されたSLDHに対して調製された抗体を用いたウェスタンブロット分析で、約80 kDaの免疫陽性ポリペプチドを示した、および(iii) Tn5変異体を生成する頻度が、G.サブオキシダンス（suboxydans）IFO 3255よりもはるかに高かった。
【００７４】
G.メラノジーナス（melanogenus）IFO 3293は、25 g/lのマンニトール、5 g/lの酵母抽出物(ディフコ・ラボラトリーズ社（Difco Laboratories）)、3 g/l のバクトペプトン(Difco)を含むMB培地5 mlを入れた試験管にて30℃で一晩培養した。大腸菌HB101 (pRK2013) [D.H. Figurski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1648-1652, 1979]および大腸菌HB101 (pSUP2021) [R. Simonら、BIO/TECHNOL. 1:784-791, 1983]は、50μg/mlのカナマイシンを含むLB培地5 mlを入れた試験管にて、37℃で一晩培養した。細胞は遠心分離によりそれぞれ別々に回収し、半分量のMB培地に懸濁した。各細胞懸濁液を1:1:1の比で混合し、混合液をMB寒天プレート表面上のニトロセルロースフィルター上に置いた。プレートを27℃で一晩インキュベートし、フィルター上に得られた細胞をかき取り、適当な容量のMB培地に懸濁し、10μg/mlのポリミキシンBおよび50μg/mlのカナマイシンを含むMBの選択プレート(MPKプレート)上に播種した。MPKプレートを27℃で3〜4日間インキュベートした。
【００７５】
得られた3,436のTn5変異体を、抗SLDH抗体を用いた免疫ドットブロットスクリーニングにかけた。96穴マイクロタイタープレートで、各株の細胞を、62.5 mMトリス塩酸(pH 6.5)、10％グリセロール、2％SDSおよび5％βメルカプトエタノールよりなるラムリ（Laemmli）緩衝液50μl中に別々に懸濁し、60℃で2時間インキュベートした。無細胞抽出液(CFE)をニトロセルロールフィルター上に押し付け、CFE中の免疫陽性サンプルをAP結合基質キット(バイオ-ラッド・ラボラトリーズ社（Bio-RAD Laboratories）、米国カリフォルニア州リッチモンド）を用いてスクリーニングした。その結果、免疫ドットブロットスクリーニングで、陽性シグナルのない唯一の株26A11が得られた。
【００７６】
26A11株のSLDH欠損は、ウェスタンブロット分析で確認された。親株と比較して、発現するSLDHの量は、せいぜい1/500だった。26A11は完全なSLDH欠損株ではなく、Tn5の挿入によりSLDH遺伝子が抑制された株であった。Tn5挿入点付近のヌクレオチド配列を決定することにより、挿入部位がC末端に近いことが判明した。次に、26A11と野生型のグルコノバクター株の総SLDH活性を調べるために、休止菌体反応を実施した。2％D-ソルビトールを含む100 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)中で、26A11はわずかにD-ソルビトールをL-ソルボースに変換したが、野性株IFO 3293およびIFO 3255は30℃で39.5時間のうちに完全に変換した。
【００７７】
(5) 26A11におけるSLDH遺伝子の発現
【００７８】
得られたSLDHクローンのSLDH活性を確認するため、相補性試験を行った。プラスミドpSLIIおよびpVKSLIIPを接合伝達により26A11に導入した。pSLIIまたはpVKSLIIPを有する接合伝達体は、ミニ休止菌体反応でSLDH活性を回復し、ウェスタンブロット分析で約80 kDaの免疫反応性ポリペプチドを示した。
【００７９】
(6) SLDH遺伝子のヌクレオチド配列決定
【００８０】
プラスミドpUSLIIPを用いてSLDHおよびORF2遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。決定したヌクレオチド配列（配列番号：1、3,481 bp）により、SLDH遺伝子のORF（2,223 bp、配列番号：1のヌクレオチド572〜2794位）に、740アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号：2）がコードされていることが明らかになり、そのポリペプチド中には、 精製されたSLDHポリペプチドから決定された3つのアミノ酸配列（配列番号4〜6中に示されているペプチド1、3、および8）が含まれていた。図2および図3〜6に示すように、SLDH ORFの他にも、もう1つのORFであるORF2がSLDH ORFがすぐ上流に見つかった。ORF2のORF（381 bp、配列番号：1のヌクレオチド192〜572位）には、126アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号：3）がコードされていた。
【００８１】
ペプチド1の4番目のアミノ酸は、アミノ酸シークエンサーではGluと決定されたが、DNA配列によるとAlaであった。ペプチド3の11番目のアミノ酸はアミノ酸シークエンサーではGlnと決定されたが、DNA配列によるとProだった。推定アミノ酸配列にはシグナルペプチド様領域（配列番号：8）が含まれている可能性がある：これには (i) 多くの疎水性残基、(ii) N末端付近に正に荷電した残基、および (iii) 切断されるシグナルとしてAla-Xaa-Ala部位が含まれている。実際のシグナル配列は、実施例3(7)に説明されるようにして決定した。SLDH遺伝子の推定されるリボソーム結合部位（シャイン・ダルガーノ、SD配列）は、開始コドンの8 bp上流に見つかった（配列番号：1のヌクレオチド558〜564位のAGAGGAG）。ORF2遺伝子の推定SD配列は、開始コドンの10 bp上流に見つかった（配列番号：1のヌクレオチド177〜182位のGGGAGG）。図3〜6に示すように、 SLDH構造遺伝子のすぐ下流に、いくつかの逆方向反復配列（ヌクレオチド配列2803〜2833位および2838〜2892位）があった。これはSLDH遺伝子の転写終結ループとして機能している可能性がある。ORF2遺伝子には、逆方向反復配列が684〜704位に見つかった。
【００８２】
mpBlast（NCBI、米国メリーランド州ベセスダ）およびGCGのモチーフ（ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Genetics Computer Group）、米国ウィスコンシン州ユニバーシティ・リサーチ・パーク）のプログラムを用いて、SLDHとORF2の相同性を調査した。SLDHポリペプチドには、キノタンパク質に一般的に保存されているC末端付近の領域の配列（配列番号2のアミノ酸残基632〜692位）と、キノタンパク質モチーフとして同定されているもう1つの配列（Prosite No. PS00363: [DN]W.{3}G[RK].{6}[FY]S.{4}[LIVM]N.{2}NV.{2}L[RK]；配列番号：2のアミノ酸残基79〜107位）があった。
【００８３】
ORF2は、G.オキシダンス（oxydans）、大腸菌、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）の膜結合型PQQ依存性Dグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)のN末端領域と相同性を示した。この領域は、GDHを膜に結合させる膜貫通領域（membrane-spanning region）であることが知られている。G.オキシダンス、大腸菌、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）のGDHのN末端領域とORF2との同一性は、それぞれ30％、32％、および37％であった。ORF2タンパク質は、SLDHを膜結合型にする接着タンパク質として機能している可能性がある。
【００８４】
実施例４. 成熟SLDHポリペプチドのN末端およびC末端配列の決定
【００８５】
N末端を直接的に配列決定しても、結果は得られず、N末端がブロックされていることが示された。そこで、 SLDHポリペプチドを、基質対酵素の比率を20:1 (w/w)として、0.1 Mトリス塩酸中、エンドプロテイナーゼLys-C（和光、大阪）を用いて37℃で20時間処理した。全消化物を逆相HPLC（RP300、1 mm x 25 cm、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）、カリフォルニア州フォスターシティ）で分析し、各ピークを分子量決定のために質量分析計（TSQ700 3重4極装置、Finnigan-MAT、カリフォルニア州サンホゼ）にかけた。配列番号：7として示した一つの消化物は、質量分析、ならびにアミノ酸組成分析と配列番号：1として示されている決定済みヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸組成とを合わせて、N末端配列と決定された。さらに、衝突誘導解離(CID：collisional induced dissociation)による分析で、N末端配列を有するペプチドの同定が確認された。N末端は、ピログルタミン酸残基であると決定された。
【００８６】
SLDHのN末端は、配列番号：7に示されるように、Gln-Phe-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Gly-Gly-Glu-Pro-Ser-Ser-Ser-Val-Pro-Gly-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Pro-Thr-Glu-Asn-Ser-Pro-Lysであると決定されたため、シグナル配列は、配列番号：8に示されるように、Met-Arg-Arg-Pro-Tyr-Leu-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Gly-Leu-Ala-Leu-Ala-Cys-Ser-Pro-Leu-Ile-Ala-His-Alaの配列の24アミノ酸残基であると確認された。V8プロテアーゼ消化により回収されたペプチドを用いて、C末端配列もPro-Asp-Ala-Ile-Lys-Gln（配列番号：9）であると決定された。
【００８７】
実施例5. 大腸菌におけるSLDHおよび/またはORF2遺伝子の発現
【００８８】
実施例3(2)に記述されるpCRSLIIPから、図７に示されるように、lacプロモーターの制御下でSLDH遺伝子を持ち、ORF2遺伝子を有するプラスミドと持たないプラスミドを作製した。得られた3種類のプラスミドは、SLDHとORF2遺伝子とを有するpTNB114、SLDHとリボソーム結合部位および開始コドン(ATG)を含むN末端が切除されているORF2遺伝子とを有するpTNB115、ならびに大部分が切除されたORF2遺伝子と完全なSLDH遺伝子とを有するpTNB116である。これらの3つのプラスミドを、通常の形質転換法により大腸菌に導入した。 得られた形質転換細胞の無細胞抽出物のウェスタンブロット分析により、SLDHポリペプチドの生産が検出され、そのSLDH活性を休止菌体を用いて測定した。休止菌体反応は、0.3% NaCl、1% CaCO３、4% D-ソルビトール、および1 mM PMSからなる反応液中で、1μg/ml PQQの存在下および非存在下で、室温にて17時間行った。L-ソルボースを生産するためのSLDH活性は、展開溶媒としてn-プロパノール-H２O-1% H３PO４-HCOOH (400:100:10:1)を、スプレー試薬としてナフトレゾルシノールを用いて、シリカゲル60 F２５４、0.25 mm、メルク社（Merck）によるTLCによって分析した。その結果、ウェスタンブロット分析ではORF2遺伝子を発現しない形質転換細胞も含めてすべての形質転換細胞でSLDHポリペプチドが検出されたが、L-ソルボースを生産するためのSLDH活性は、PQQの存在下での休止菌体反応の条件下で完全なORF2遺伝子を含むpTNB114を有する形質転換細胞でのみ検出された。
【００８９】
実施例6. 大腸菌におけるSLDHおよび/またはORF2遺伝子の発現
【００９０】
図８にpTNB110およびpTNB143の作製段階を示す。DSM4025（T. Hoshinoら、欧州特許出願第9611500.8号）の酵素A (pA)遺伝子のプロモーターの制御下にORF2およびSLDH遺伝子を有するプラスミドpTNB110は、pAを含むHindIII-KpnI断片とpTNB114のKpnI-XhoI断片を、pUC18のHindIII-XhoIの間に挿入して作製した。ORF2とSLDH遺伝子を独立した発現ユニットとして有する、すなわち、pAを有するORF2遺伝子とpAを有するSLDH遺伝子とを有する、プラスミドpTNB143は、図８に示すように、pTNB141の0.9 kb SalI断片およびpTNB135の3.2 kbのHindIII-XhoI断片を、pUC57/pCRIIハイブリッドベクター（pUC57由来のplacを有するScaI-HindIII断片およびpCRII由来のplacを持たないXhoIからScaIの断片）に挿入して作製した。これらのプラスミドpTNB110およびpTNB143を、通常の形質転換法により大腸菌に導入した。得られた形質転換細胞について、実施例5に説明されるようにウェスタンブロット分析および休止菌体反応を行った。その結果、pTNB110およびpTNB143を有する両方の形質転換細胞とも、SLDHタンパク質を生産し、PQQの存在下でD-ソルビトールからL-ソルボースを生産するSLDH活性を示した。
【００９１】
実施例7. G.オキシダンスDSM 4025におけるSLDH遺伝子の発現
【００９２】
強いL-ソルボースおよびLソルボソンデヒドロゲナーゼ活性と、L-ソルボースを生産する弱いD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性とを有するG.オキシダンスDSM 4025においてSLDH遺伝子を発現させるためのプラスミドpTNB136は、pTNB135（図８）のHindIII-XhoI断片を、pVK100のHindIII部位とXhoI部位との間に挿入して作製した。プラスミドpTNB136およびそのベクターpVK100は、接合伝達によりG.オキシダンスDSM 4025の変異体であるGOBΔKに導入した。GOBΔKでは、L-ソルボースを生産するD-ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素B（欧州特許第832 974号）の遺伝子の欠失が、酵素B遺伝子を含む2つのEcoRI遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子カセット（pUC4Kの1.28 kbのEcoRI断片；ファーマシア社（Pharmacia）、スウェーデン、ウプサラ）との置換によって起こっている。この遺伝子の破壊は、当技術分野で周知の組換えDNA技術によって行った。得られた接合伝達体、PTNB136またはpVK100を有するGOBΔKは、30℃で4日間フラスコで発酵（培地：10% D-ソルビトール、1.6%尿素、0.05%グリセロール、0.25% MgSO４・7H２O、3%コーンスティープリカー、6.25%パン酵母湿潤細胞、および1.5% CaCO３）させたところ、10% D-ソルビトール中、それぞれ5 g/Lまたは2 g/l未満の2KGAが生産された。抗SLDH抗体を用いたウェスタンブロット分析により、pTNB136を有する接合伝達体が免疫反応性SLDHポリペプチドを発現していることが明らかとなった。
【００９３】
【発明の効果】
本発明により、下記の(a)または(b)によって規定される、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターにより形質転換された宿主、該蛋白質の調製方法、およびそれらの使用が提供された：
【００９４】
(a)配列番号：2に記載された配列の1位から716位までのアミノ酸配列を有する蛋白質、または
【００９５】
(b)(a)で規定されたアミノ酸配列における1つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加によって(a)の蛋白質から得られる蛋白質。
【００９６】
【配列表】
0004394761.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】  SLDHポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドの部分的アミノ酸配列を示す図である。図中の太字のアミノ酸配列は、PCR用の2つのオリゴヌクレオチド配列（S7およびS6R）の合成に使用した。矢印はDNA合成の方向を示す。すべてのプライマーはグルコノバクターのコドン使用の偏向を有する縮重DNA混合物である。
【図２】  本発明でクローニングされたSLDH遺伝子の制限酵素地図、ならびにSLDHおよびORF2をコードするDNA領域の遺伝子構造を示す図である。
【図３】  図３〜６は、SLDHおよびORF2をコードするヌクレオチド配列をその上流および下流の配列と共に示したものであり、図３では、このヌクレオチド配列1位から900位までと共に、対応するSLDHおよびORF2の推定アミノ酸配列を示している。さらに、SLDHおよびORF2遺伝子で推測されるリボソーム結合部位（SD配列）、転写終結因子と考えられる配列も示されている。なお、点線部はペプチド３の配列、図中の矢印で示したIR1は、ORF2遺伝子の転写終結因子と考えられる逆方向反復配列である。
【図４】  SLDHおよびORF2をコードするヌクレオチド配列をその上流および下流の配列と共に示したものの一部（ヌクレオチド配列901位から1800位まで）で、それと共に対応するSLDHの推定アミノ酸配列を示している。さらに、点線部はペプチド１の配列を示している。
【図５】  SLDHおよびORF2をコードするヌクレオチド配列をその上流および下流の配列と共に示したものの一部（ヌクレオチド配列1801位から2700位まで）で、それと共に対応するSLDHの推定アミノ酸配列を示している。さらに、点線部はペプチド８の配列を示している。
【図６】  SLDHおよびORF2をコードするヌクレオチド配列をその上流および下流の配列と共に示したものの一部（ヌクレオチド配列2701位から3481位まで）で、それと共に対応するSLDHの推定アミノ酸配列を示している。なお、図中の矢印で示したIR2（またはIR2'）は、SLDH遺伝子の転写終結因子と考えられる逆方向反復配列である。
【図７】  lacプロモーターの制御下で大腸菌においてSLDHおよび/またはORF2遺伝子を発現させるためのプラスミドpTNB114、pTNB115およびpTNB116の作製段階を示す図である。pTNB115の作製段階において、リボソーム結合部位と開始コドンATGとを含む領域を切除したためORF2は発現しない。
【図８】  共通のpAプロモーターの制御下にORF2およびSLDH遺伝子を有するプラスミドpTNB110（以下実施例6に説明）、ならびに上流に隣接して位置するpAの制御下のORF2遺伝子と上流に隣接して位置する別のpAプロモーターの制御下のSLDH遺伝子とを有するプラスミドpTNB143の作製段階を示す図である。
なお、＊１、＊２、および＊３は以下の注釈を意味する。
＊１  以下のプライマー対を用いたPCRにより、DSM4025の酵素A遺伝子のプロモーター(pA)を、該遺伝子を有するDNA断片、例えば、DSM4025自身の染色体DNAまたはpSSA202(T. Hoshinoら, 欧州特許出願第9611500.8号)から、pUC18のHindIII-BamHI部位へクローニングし、pUCAＰを作成した。
5'-CCAAGCTTATCGCCGCGTTTGTCAT-3'
5'-CCGGATCCGGTTGGTGCAGCGGTCA-3'
＊２  以下のプライマー対を用いたPCRにより、DSM4025の酵素A遺伝子のプロモーターからシグナル配列までを、pSSA202よりサブクローニングした。
5'-CCAAGCTTATCGCCGCGTTTGTCAT-3'
5'-GCTAGCAAAGGCGGGTGCGG-3'
＊３  以下のプライマー対を用いて、pTNB110に対してPCRを行った。
5'-GTCGACATCGCCGCGTTTGTCA-3'
5'-GCCGGCGCACTAGACGGCTCC-3'
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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