(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウムの機能を利用した植物の形質転換に用いるベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ以外のＤＮＡが植物染色体へ挿入されにくいように左ボーダー配列が複数個設置されたことを特徴とする植物の形質転換用ベクター。
【請求項２】
アグロバクテリウムのｖｉｒタンパク質群によって認識されうる右ボーダー配列及び左ボーダー配列、それらのボーダー配列間に配置され、かつ植物へ導入しようとする遺伝子が挿入可能なＴ−ＤＮＡ配列、並びに細菌での前記ベクターの複製を可能にする複製開始点を有する植物の形質転換用ベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ以外のＤＮＡが植物染色体へ挿入されにくいように左ボーダー配列が複数個設置されたことを特徴とする前記ベクター。
【請求項３】
Ｔ−ＤＮＡ配列中に、形質転換体を選択可能とするマーカー遺伝子を含む請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
複製開始点が、ベクター生産用細菌及びアグロバクテリウムを含む細菌でのベクターの複製を可能にするものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクターを有するアグロバクテリウムを用いる植物の形質転換方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物の形質転換用ベクターに関する。より具体的には、アグロバクテリウムを利用した植物の形質転換方法において有用なベクターに関する。本発明はさらに、本発明のベクターを使用する植物の形質転換方法に関する。本発明は特に、食品として摂取されることのある遺伝子組換え植物を作出するのに有用である。
背景技術
土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が多くの双子葉植物に根頭癌腫病（Ｃｒｏｗｍ  ｇａｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こすことは古くから知られており、１９７０年代には、Ｔｉプラスミドが病原性に関与していること、さらにＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後このＴ−ＤＮＡには癌腫の誘発に必要なホルモン（サイトカイニンとオーキシン）の合成に関与する遺伝子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。Ｔ−ＤＮＡの切り出しと植物への伝達にはＴｉプラスミド上のヴィルレンス領域（Ｖｉｒ領域）に存在する遺伝子群が必要であり、またＴ−ＤＮＡが切り出されるためにはＴ−ＤＮＡの両端に存在するボーダー配列が必要である。このＴ−ＤＮＡの両端に存在するボーダー配列をそれぞれ右ボーダー配列、左ボーダー配列という。他のアグロバクテリウム属細菌であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｉｚｏｇｅｎｅｓｉｓもＲｉプラスミドによる同様なシステムを有している。
より具体的には、ｖｉｒ領域に存在する遺伝子群を基に造られるタンパク質群（ｖｉｒタンパク質群）が左右のボーダー配列を認識し、その間のＴ−ＤＮＡを植物ゲノムに組み込む。この性質をもとに、Ｔ−ＤＮＡ中に外来遺伝子を挿入することで植物の形質転換ができるようになり、アグロバクテリウムによる植物の形質転換が発展してきた。
しかし、近年、ある種の植物を形質転換する場合に、ボーダー配列でＴ−ＤＮＡが切り出されずに、Ｔ−ＤＮＡが左ボーダー配列の外側の部分も含めて植物の染色体に移される場合があることが分かってきた（Ｒａｍａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８，１１４９−１１５４（１９９５）、Ｋｏｎｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１，９４５−９５７（１９９７）など）。Ｔ−ＤＮＡ部分以外の不要なＤＮＡが植物の染色体に移ることにより、形質転換により作成された遺伝子組換え植物が予想していない形質をもつことが懸念され、遺伝子組換え植物を利用した食品の消費者の認識（パブリックアクセプタンス）にも重要な影響を与えることが考えられる。このためアグロバクテリウム内のＴ−ＤＮＡ部分以外の不要なＤＮＡが植物の染色体に移らないようにする方法が要求されている。
Ｔ−ＤＮＡ以外のＤＮＡ部分が植物の染色体に移るのは、アグロバクテリウムのｖｉｒタンパク質群がボーダー配列を認識していないためと考えられる。しかしながら、このような場合に対処し、ボーダー配列以外のＤＮＡ断片が移らない、あるいは移りにくいように工夫されたベクターは開発されていない。
発明者は、Ｔ−ＤＮＡの外側のＤＮＡがＴ−ＤＮＡと一緒に植物の染色体に移るのは、アグロバクテリウムのｖｉｒタンパク質群がボーダー配列を認識していないためと考えた。そこで、アグロバクテリウムを利用した植物の形質転換において用いるベクターを改変し、アグロバクテリウムのｖｉｒタンパク質群がベクターのボーダー配列を認識する確率を高め、目的とするＤＮＡ以外のＤＮＡが植物の染色体に移される確率を低くすることを課題とし、鋭意検討した。その結果、２つのボーダー配列のうち、形質転換用ベクターにおいて左ボーダー配列を複数並べることで、Ｔ−ＤＮＡの外側のＤＮＡが植物の染色体に挿入されにくくなることを見出し、本発明を完成するに至った。
発明の概要
本発明は、アグロバクテリウムの機能を利用した植物の形質転換に用いるベクターであって、目的とする形質転換のためには不要なＤＮＡ、すなわちＴ−ＤＮＡ以外のＤＮＡが植物染色体へ挿入されにくいように改良された左ボーダー配列を有することを特徴とする植物の形質転換用ベクターを提供する。より詳細には、ｖｉｒタンパク質群によって認識されうる右ボーダー配列及び左ボーダー配列、それらのボーダー配列間に配置され、かつ植物へ導入しようとする遺伝子が挿入可能なＴ−ＤＮＡ配列、並びに細菌（アグロバクテリウム及びベクター生産用細菌等）でベクターの複製を可能にする複製開始点（ｏｒｉ）を有するベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ以外のＤＮＡが植物染色体へ挿入されにくいように改良された左ボーダー配列を有することを特徴とする植物の形質転換用ベクターを提供する。
発明を実施するための好ましい形態
（１）ベクターの作製
本発明のベクターは、目的とする形質転換のためには不要なＤＮＡ、すなわちＴ−ＤＮＡ以外のＤＮＡが植物染色体へ挿入されにくいように機能する左ボーダー配列を有する。ｖｉｒタンパク質群によって認識され得る塩基配列（例えば、公知の左ボーダー配列）が複数個配置された配列を含むよう、左ボーダー配列が改良されたベクターは、本発明の好ましい一態様である。
左ボーダー配列が複数個配置されたＤＮＡ断片は、公知のボーダー配列を基に種々の公知の方法を用いて作成することができる。例えば、既存のＴｉプラスミド中に既に存在する左ボーダー配列と同一の配列の一本鎖ＤＮＡを合成し、そしてこれを二本鎖とし、必要であれば複数個連結することにより作成することができる。このように作成したＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターのＴ−ＤＮＡの下流の既存の左ボーダー配列の前及び／又は後ろの付近に、適当な制限酵素部位等を利用して挿入することにより本発明のベクターを容易に作成することができる。
左ボーダー配列を改良して本発明のベクターとすることができる植物転換用ベクターは、少なくとも、ｖｉｒタンパク質群によって認識されうる左右ボーダー配列、その間に配置され、かつ植物へ導入しようとする遺伝子が挿入可能なＴ−ＤＮＡ配列、並びにベクター生産用細菌（例えば、大腸菌）で機能可能な複製開始点を有することが必要である。好ましくは、アグロバクテリウムで機能することができる複製開始点を有するものがよい。
このような条件を満たすベクターであれば、左ボーダー配列の改良は、種々のベクターのいずれにも適用することができる。例えば、アグロバクテリウムを利用する植物の形質転換方法には（１）左右ボーダー配列を持ち、Ｔ−ＤＮＡ中に外来遺伝子を挿入したサイズの小さな中間クローニングベクター、及びｖｉｒ領域を有するアクセプターＴｉプラスミドから、相同組換えによりハイブリッドＴｉプラスミドベクターを形成し、これを含むアグロバクテリウムを植物に感染させる方法；（２）ｖｉｒ領域を有さないサイズの小さなＴｉプラスミド（ミニプラスミド又はミクロＴｉプラスミドと呼ばれ、多くの細菌内で複製可能である。）のＴ−ＤＮＡ中に外来遺伝子を挿入し、これを、ｖｉｒ領域を有するがＴ−ＤＮＡを欠失させたプラスミドをあらかじめ導入したアグロバクテリウムへさらに導入し、これらを含むアグロバクテリウムを植物に感染させる方法；又は（３）左右のボーダー配列を持ち、Ｔ−ＤＮＡ中に外来遺伝子を挿入したサイズの小さなクローニングベクター、及びｖｉｒ領域の一部（ｖｉｒ領域の全長から一部を欠失させたもの）を有するアクセプターＴｉプラスミドから、相同組換えによりハイブリッドＴｉプラスミドベクターを形成し、これをｖｉｒ領域（全長）を有するがＴ−ＤＮＡを欠失させたプラスミドをあらかじめ導入したアグロバクテリウムへさらに導入し、これらを含むアグロバクテリウムを植物に感染させる方法等があるが、これらの方法における種々のベクターの左ボーダー配列の改良が可能である。サイズの小さなＴｉプラスミドの左ボーダー配列を改良したものは、Ｔ−ＤＮＡ中の外来遺伝子の改良操作等において取り扱いが容易であり、本発明のベクターの好ましい一態様である。このようなサイズの小さなＴｉプラスミドの例としては、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１（いずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、又は後述する実施例中で用いたｐＳＢ１１がある。
また、本発明は、Ｔｉプラスミドのみならず、Ｒｉプラスミドにおいても適用することができる。
本発明のベクターは、形質転換体を選択可能とするマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、発色性遺伝子等をＴ−ＤＮＡ配列中に含んでもよい。具体的には、通常使用されるものを常法により用いることができ、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシシ又はスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等の他、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等が例示される。また、これとは別に、Ｔ−ＤＮＡ配列の外側、好ましくは左ボーダー配列の下流にマーカー遺伝子を含んでもよい。このような位置に配置されたマーカー遺伝子は改良されたボーダー配列の効果を検討するために有用である。
ここで、複製開始点とは、複製開始反応が起こる特定のＤＮＡ領域をいい、一般にはＯｒｉと呼ばれる領域をいう。
（２）形質転換
本発明のベクターは、そのＴ−ＤＮＡ中に目的とする形質転換を行うための外来遺伝子を挿入して使用する。挿入する外来遺伝子は、通常、宿主植物体で機能可能なプロモーターとその下流の構造遺伝子（植物へ付与しようとする形質をコードする）を含む。必要に応じ、遺伝子（群）を複数個連結し、及び／又はプロモーターとその下流の構造遺伝子との間に発現効率を高めるための配列を介在させ、Ｔ−ＤＮＡ間へ挿入してもよい。
外来遺伝子を含む本発明のベクターは、目的とする植物に導入するためにその植物への感染能力を有するアグロバクテリウム属に属する細菌（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）内へ導入される。この操作には、当業者に周知の種々の方法を利用することができる。接合操作等を利用してアグロバクテリウム内に移してもよいし、可能であれば、外来遺伝子を含む本発明のベクターで直接アグロバクテリウムを形質転換してもよい。
本発明のベクターを含んだアグロバクテリウムを植物に感染させるには、従来の技術を利用することができる。例えば、植物体の一部を傷つけ、そこに細菌を感染させる方法、カルスに感染させる方法、プロトプラストと細菌を共培養する方法、又は葉組織の小片を細菌とともに培養する方法がある。これらの方法から得られた形質転換細胞は、適当なマーカーを指標とするか、又は所望の形質を発現しているか否かによって他の細胞から選択することができる。形質転換細胞はさらに、従来技術を利用して分化させることで組換え植物体とすることができる。
植物の染色体ＤＮＡに外来遺伝子を含むＴ−ＤＮＡが組み込まれる際には、ｖｉｒ領域が必要である。ｖｉｒ領域は、外来遺伝子を有するベクターから供給され得るし、また、外来遺伝子を有するベクターとは異なるベクターから供給され得る。
本発明のベクターを用いて形質転換された植物細胞は、従来技術を利用して分化させることで、組換え植物体とすることができる。形質転換植物は、適当なマーカーを指標とするか、又は所望の形質を発現しているか否かによって他のものから選択することができる。
目的とする形質転換のためには不要なＤＮＡが植物染色体へ挿入されたか否かの解析は、当業者に周知の種々の方法を用いて行うことができる。例えば、ボーダー配列の外側のベクターＤＮＡ配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これを用いたＰＣＲにより形質転換植物の染色体ＤＮＡを解析することができる。また、Ｔ−ＤＮＡ配列の外側にマーカー遺伝子を含むベクターを用いて形質転換した場合は、その発現の有無により、解析することができる。
本発明は、目的とする形質転換のためには不要なＤＮＡが挿入されにくいという機能を有するが、「挿入されにくい」とは、左ボーダー配列が改良されていないベクターを用いた場合と比較して、不要なＤＮＡが宿主植物染色体に挿入される割合が少ないこと、挿入される長さが短いこと、若しくは挿入されないこと、及び／又は、左ボーダー配列が改良されていないベクターを用いた場合と比較して、意図しない形質転換が起こる割合が少ないこと、起こったとしても軽微であること、若しくは起こらないことをいう。また、「目的とする形質転換のためには不要なＤＮＡ」とは、ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列の外側に位置するＤＮＡ（すなわちＴ−ＤＮＡ以外のＤＮＡ）部分又は断片をいう。それ自体で機能可能であるか又はポリペプチド又はタンパク質をコードしているかは問わない。
本発明の形質転換方法により形質転換される植物は、トウモロコシ、モロコシ、ライ小麦、大麦、オート麦、ライ麦、小麦、タマネギ、若しくはイネ等の単子葉植物又は大豆、アルファルファ、タバコ、アブラナ、ヒマワリ、ジャガイモ、コショウ、若しくはトマト等の双子葉植物のいずれでもよい。本発明の方法によれば目的とする形質転換のためには不必要なＤＮＡが植物染色体へ挿入されにくく、また形質転換により作成された遺伝子組換え植物は予想していない形質をもつことが少ないことから、本発明の方法は、アグロバクテリウムによる形質転換ではＴ−ＤＮＡ部分以外の不要なＤＮＡが植物の染色体に移ることが特に懸念される、他の生物に食品として摂取されうる植物の形質転換に適している。特に、単子葉植物、とりわけイネの形質転換に適している。
なお、本明細書で「植物」というときは、特に明示しない限り、植物体（個体）の他、その種子（発芽種子、未熟種子を含む。）、部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む。）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
実施例
実施例１
（１）ベクターの作製
プラスミドベクターｐＳＢ１１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０２７２５６、Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０，１６５−１７４（１９９６））のＴ−ＤＮＡ内部にユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，６７５−６８９（１９９２））によりハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）を発現させるカセットを持つプラスミドを作成し、さらに制限酵素ＳｔｕＩで認識される部位に、ユビキチンプロモーターによりカタラーゼイントロンを含むＧＵＳ遺伝子（Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３１，８０５−８１３（１９９０））を発現させるカセットを挿入したプラスミドを作成した（ｐＳＬＢ０、図１、配列番号１）。ＰＳＬＢ０の塩基配列を配列番号１に示す。
次にＴｉプラスミドｐＴｉＡｃｈ５の塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ，Ｋ００５４８）を基に左ボーダー配列（以下「ＬＢ」と略す。）を含む合成ＤＮＡと、この合成ＤＮＡに相補的な合成ＤＮＡを作成し、２つをアニーリング、平滑化させて、ＬＢ配列を２つあるいは３つ持つＤＮＡ断片を作成した。合成した２つの合成ＤＮＡの塩基配列を配列番号２及び３に示す。このＤＮＡ断片をｐＳＬＢ０のＬＢとＧＵＳ発現カセットの間の制限酵素ＰｖｕＩＩで認識される部位に挿入し、ＬＢを複数付加させたベクターを作成した。合成ＤＮＡによるＬＢ（以下「ｓＬＢ」ということもある。）が２つ、すなわちＬＢが合計３つのものをｐＳＬＢ２、ｓＬＢが３つ、すなわちＬＢの合計が４つのものをｐＳＬＢ３とした（ｐＳＬＢ０、ｐＳＬＢ２、ｐＳＬＢ３の合成ＬＢ付近の地図を図２に示す）。これら３種のプラスミドをそれぞれ、プラスミドベクターｐＳＢ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０２７２５５、Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０，１６５−１７４（１９９６））を導入したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４に導入し、以下の試験に供試した。
（２）形質転換
ＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ０）、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ２）、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ３）を用い、イネ品種「朝の光」の未熟胚由来のカルスをそれぞれ形質転換した。形質転換は樋江井らの方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６，２７１−２８２（１９９４））に従った。
（３）形質転換体でのＧＵＳ遺伝子発現の解析
実施例２で得られたハイグロマイシン抵抗性植物の葉の一部をＸ−Ｇｌｕｃにより染色し、ＧＵＳ遺伝子の発現を調べた。ＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ０）で形質転換した植物では３４０個体のうち１７個体がＧＵＳ遺伝子の発現を示した。このことはＬＢが一つである従来のベクターで形質転換された植物の５％ではボーダー配列外のアグロバクテリウム由来のＤＮＡが植物に導入されたことを示す。これに対し、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ２）、ＬＡＢ４４０４（ｐＳＬＢ３）を形質転換した植物では合成ＬＢの数が増えるに従いＧＵＳ遺伝子の発現を示す個体は減少した（表１）。これは合成ＬＢをベクターに入れることにより左ボーダー配列外のＤＮＡが植物に移りにくくなったことを示す。
（４）ＧＵＳ遺伝子発現を示さなかった個体のゲノミックＤＮＡの解析
上記試験でＧＵＳ遺伝子の発現を示さなかった個体の中には左ボーダー配列外のＤＮＡが植物染色体に導入されているがＧＵＳ遺伝子を発現させるユビキチンプロモーターまでは至らないものが含まれていることが考えられる。そこで、ＧＵＳ遺伝子の発現を示さなかった植物からランダムに、それぞれ６０前後の独立の形質転換体を選んでゲノミックＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲ解析に用いたプライマーは本来のＬＢと合成ＬＢの間からＧＵＳ遺伝子の一部までを増幅できるように作成した。プライマーの配列を配列番号４及び５に示す。
ＰＣＲ解析の結果、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ０）で形質転換した植物では６７個体中７個体（１０．４％）でＤＮＡの増幅が確認され、ＬＢが一つである従来のベクターでは作出された形質転換体の１割以上の高頻度で目的とするＴ−ＤＮＡ以外のアグロバクテリウム由来ＤＮＡが染色体に組み込まれていることが明らかとなった。これに対し、合成ＬＢをもつＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ２）及びＬＢＡ４４０４（ｐＳＬＢ３）で形質転換した植物では、そのようなＤＮＡの増幅が確認された個体はなかった。
これらの結果を表１及び表２に示した。
0004394323.tif 000002
0004394323.tif 000003
以上の結果から、本発明により、ボーダー配列外のＤＮＡが植物染色体に組み込まれることが少なくなり、目的とするＴ−ＤＮＡだけを導入できる効率を向上させることが可能となった。
本明細書では、主として、複数の左ボーダー配列を使用する例によって本発明を説明した。この場合の複数の左ボーダー配列は、それぞれ同一のアグロバクテリウム由来のものであってもよいし、それぞれ異なるアグロバクテリウム由来のものであってもよい。しかし、本発明の主眼は、植物形質転換用ベクターの左ボーダー配列を、ｖｉｒタンパク質群によってより確実に認識されるように改良し、それによってＴ−ＤＮＡ以外の不要なＤＮＡが植物染色体に移らないようにできることである。したがって、そのように機能することのできる改良された左ボーダー配列を有するベクターであれば、本発明の範囲に含まれる。改良された左ボーダー配列は、上に説明したものの他、例えば、（１）プラスミド中に既に存在する左ボーダー配列において、一又は複数の塩基を欠失、置換若しくは付加することにより、ｖｉｒタンパク質群がより確実に認識しうる塩基配列としたもの；（２）プラスミド中に既に存在する左ボーダー配列付近の配列において、一又は複数の塩基を欠失、置換、挿入若しくは付加することにより、ｖｉｒタンパク質群がより確実に左ボーダー配列を認識しうるようにしたもの；（３）ｖｉｒタンパク質群によって認識され得る塩基配列を複数個含むような配列としたもの；及び（４）これらの任意の組み合わせを含み得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例で用いたｐＳＬＢ０ベクターを表す。ｐＳＢ１１のＴ−ＤＮＡ内部にユビキチンプロモーターとユビキチンイントロンによりハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）を発現させるカセットを持ち、さらに制限酵素ＳｔｕＩで認識される部位に、ユビキチンプロモーターによりカタラーゼイントロンを含むＧＵＳ遺伝子を発現させるカセットを挿入したものである。
図２は、ｐＳＬＢ０ベクター、ｐＳＬＢ２ベクター、ｐＳＬＢ３ベクターの、各々の左ボーダー配列（以下「ＬＢ」ということもある。）付近の地図を表す。ｐＳＬＢ０のＬＢとＧＵＳ発現カセットの間の制限酵素ＰｖｕＩＩで認識される部位に、左ボーダー配列を２つ又は３つ持つＤＮＡ断片を挿入したものである。合成ＤＮＡ断片により新たに挿入された左ボーダー配列（以下「ｓＬＢ」と表す）が２つ、すなわちＬＢが合計３つのものがｐＳＬＢ２、合成ＤＮＡ断片により新たに挿入されたｓＬＢが３つ、すなわちＬＢの合計が４つのものがｐＳＬＢ３である。
【図１】
0004394323.tif 000004
【図２】
0004394323.tif 000005
【配列表】
0004394323000001.app