(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞を播種培養する人工皮膚モデルの作製において、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）からなる群より選ばれる少なくとも一種以上を培地に添加することを特徴とする、当該皮膚に正常脂質ラメラ構造を発現させる方法。
【請求項２】
支持体上に皮膚線維芽細胞を播種し培養した後、表皮角化細胞を播種培養することによって得られる人工皮膚を、更に、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）からなる群より選ばれる少なくとも一種以上を添加した培地により培養することを特徴とする、当該皮膚に正常脂質ラメラ構造を発現させる方法。
【請求項３】
支持体上に皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞を播種培養する人工皮膚モデルの作製において、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）からなる群より選ばれる少なくとも一種以上を培地に添加することを特徴とする、当該皮膚に正常な透過バリア機能を付与する方法。
【請求項４】
支持体上に皮膚線維芽細胞を播種し培養した後、表皮角化細胞を播種培養することによって得られる人工皮膚を、更に、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）からなる群より選ばれる少なくとも一種以上を添加した培地により培養することを特徴とする、当該皮膚に正常な透過バリア機能を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、３次元人工皮膚モデル及びその作製方法に関し、更に詳しくは、正常脂質ラメラ構造及び正常な透過バリア機能を有する３次元人工皮膚モデルおよびその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚、特に角層と表皮は外来からの抗原進入、体内からの水分放出防御の点で極めて重要な組織である。皮膚の物性は、ヒトの皮膚を非侵襲的に測定し調べることができる。しかし、皮膚の恒常性維持の詳細なメカニズムや、薬物の皮膚透過性・代謝・薬理・毒性作用は、主にモデル動物を用いて調べられている。一方、１９９２年に動物実験代替法としてヒト人工皮膚モデルが報告された［International  Journal  of  Cosmet.  Sci，Vol.14，p245-264］。この報告以降、多くの種類の人工皮膚モデルが開発・市販され、構造や機能が、より実際の皮膚に近くなるよう改良されている。これらの人工皮膚モデルは、ポリカーボネートフィルターやコラーゲンスポンジ等の支持体上に表皮細胞を播種し培養することで、実際の皮膚と同様の４層（基底層、有棘層、顆粒層、角層）からなる表皮層が形成される。また、これらの人工皮膚モデルの培養には、アミノ酸や無機塩類から成るＤＭＥＭ培地を基本組成とした培地が用いられている。
【０００３】
皮膚の恒常性維持のメカニズムや、薬物の皮膚透過性・代謝・薬理・毒性作用を調べる上で、人工皮膚モデルの透過バリア機能が、実際の皮膚の透過バリア機能に近く、正常であることが最も重要である。皮膚の透過バリア機能は、角層細胞を構成する蛋白と、細胞間に存在する脂質ラメラ構造から形成されている。特に細胞間脂質ラメラ構造は皮膚の透過バリア機能には必須の要素であり、この脂質ラメラ構造が正常な形態であることが望ましい。また皮膚の恒常性維持のメカニズムを検討するうえで、皮膚に透過バリア崩壊（紫外線照射等による誘発）や乾燥負荷した場合に、皮膚内部でモデル動物と同様の反応が惹起されることが望ましい。しかし従来の培養方法による人工皮膚モデルでは、脂質ラメラ構造の形態異常や、基底細胞の形態異常、ラメラボディ分泌の異常等、実際の皮膚とは異なる点が多く認められた［International  Journal  of  Pharmaceutics，Vol.203，p211-225］。さらに、透過バリア崩壊や乾燥負荷した場合に、モデル動物とは異なった反応が惹起されていた。このため、正常な透過バリア機能を有する人工皮膚モデルおよびその作製方法が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的とするところは、医薬品、化粧品等の安全性試験や皮膚生理研究等に有用な、正常な透過バリア機能を有する人工皮膚モデルを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）のうち１〜３種を添加した培地により組織培養された人工皮膚モデルで達成できる。
【０００６】
即ち、本発明は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群より少なくとも一種以上を添加した培地により培養することを特徴とする組織培養法、支持体上に細胞を播種し、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群より少なくとも一種以上を添加した培地により培養することを特徴とする人工皮膚モデルの作製方法、支持体上に皮膚線維芽細胞を播種し培養した後、表皮角化細胞を播種培養することによって得られる人工皮膚を、更に、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群より少なくとも一種以上を添加した培地により培養することを特徴とする人工皮膚モデルの作製方法、及びこれらの作製方法によって得られる人工皮膚モデル、正常脂質ラメラ構造を有する人工皮膚モデルにある。
【０００７】
【発明の実施の形態】
人工皮膚モデルは、一般に、ポリカーボネートフィルター、コラーゲン等からなるスポンジ等の支持体上に表皮細胞（皮膚線維芽細胞、表皮角化細胞）を播種し、必要により浸漬培養、気液培養を組み合わせて作製されるものであり、作製された人工皮膚モデルやその作製キットが市販されている。市販されているものとして、Test  Skin  (Organogenesis社,  USA)、Skin  (Advanced  Tissue  Science社,  USA)、EpiDerm  (MatTek  Corporation社,  USA)  、Episkin  (Episkin  SNC社,  France)、  SkinEthic  (Laboratoire  SkinEthic社,  France)、LSE（東洋紡社、Japan）等を挙げることができる。支持体としては、播種した表皮細胞が接着又は固定され、その上で増殖するものであれば特に限定されるものではなく、支持体を基盤として三次元状に細胞が培養される。
【０００８】
本発明においては、これらのいずれも用いることができ、上記のキットを用い、培地調製から始めても良いし、出来上がった人工皮膚を購入して用いても良い。また用いる細胞としては、ヒトに限らず、マウス、ラット、ブタ等の表皮細胞でも良い。
【０００９】
本発明に用いるサイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γとしては、通常それぞれの人工皮膚モデルに応じた種由来の天然型、あるいは組み換え型サイトカインを用いるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ−γは、水や培地等に適宜溶解し、培地に添加する。添加量は、一概には規定できないが１ｐｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬ程度の濃度とすることが望ましい。
【００１０】
一般に行われる人工皮膚モデルの調製方法の概略は、皮膚線維芽細胞を播種したコラーゲンゲル等の支持体を調製し、それに表皮角化細胞を播種し気液培養するものである。
【００１１】
【実施例】
以下実施例によって本発明を説明する。以下の実施例に用いたサイトカインは以下のとおりである。
ＩＬ−４；recombinant  human  IL-4,  INTERGEN  COMPANY社,  USA
ＩＬ−１０；recombinant  human  IL-10,  INTERGEN  COMPANY社,  USA
ＩＮＦ−γ；recombinant  human  INF-γ,  INTERGEN  COMPANY,  USA
【００１２】
実施例１〜３、比較例１（ヒト人工皮膚モデルの作製）
既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）を用い、ＬＳＥアッセイ培地にＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−γを１０ｎｇ／ｍＬ添加し、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内にて３日間空気暴露培養して人工皮膚モデルを得た。無添加をコントロールとした。培養３日後にヒト人工皮膚モデル皮膚を採取し、グルタルアルデヒド・パラホルムアルデヒド含有カコジル酸緩衝液にて固定した。１％オスミウム酸による前固定後、０．２％ルテニウム酸染色を施し、電子顕微鏡（JEM100S,  JEL社,  Tokyo）により角層の脂質ラメラ構造を観察した。
【００１３】
（実施例１；図１）ＩＬ−４添加培地によって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真
【００１４】
（実施例２；図２）ＩＬ−１０添加培地によって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真
【００１５】
（実施例３；図３）ＩＮＦ−γ添加培地によって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真
【００１６】
（比較例１、図４）コントロール（既製ヒト人工皮膚モデル；ＬＳＥhigh，東洋紡社）の角層脂質ラメラ構造電顕写真
【００１７】
比較例１（図４）に示したように、既製ヒト人工皮膚モデルの角層では、正常な脂質ラメラ構造がほとんど観察されず、層構造をとらない脂質滴が多く観察された。一方、実施例１、２及び３に示したように、ＩＬ−４、ＩＬ−１０あるいはＩＮＦ−γ添加培地による培養により、正常な脂質ラメラ構造が観察された。以上の結果より、ＩＬ−４、ＩＬ−１０あるいはＩＮＦ-ｒ添加培地による培養により、正常な脂質ラメラ構造が形成されることは明白である。
【００１８】
試験例１（紫外線照射後のＤＮＡ合成能評価試験）
既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）にＵＶ−Ｂ（0．15Ｊ/ｃｍ2）を１回照射した。その後、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−γを１０ｎｇ／ｍＬ添加したＬＳＥアッセイ培地にて、人工皮膚モデルを３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内にて４８時間空気暴露培養した。ＤＮＡ合成能の測定のため、培養４８時間後に、さらに[3Ｈ]  Tymidine（1μＣｉ／ｍＬ）を含有したＰＢＳにて１時間培養した。皮膚モデルはＰＢＳで３回洗浄した後、表皮層を剥離した。表皮はＰＢＳ中でホモジネート処理および超音波処理にて粉砕した。２０％ＴＣＡを同量加え十分に攪拌後、遠心処理（2000Ｇ、4℃、5分）を行った。沈渣はさらに５％ＴＣＡを適量加えて攪拌後、遠心処理を行った。沈渣に５％ＴＣＡを加え９０℃で１５分間反応させ、遠心処理（2000Ｇ、4℃、5分）によりＤＮＡ画分（上清）を得た。ＤＮＡ画分中の放射活性は、液体シンチレーターにより測定した。またジフェニルアミン発色液による呈色法によりＤＮＡ量を測定し、ＤＮＡ量当たりの[3Ｈ]Tymidine取り込み活性をＤＮＡ合成能として算出した。サイトカイン無添加培地を用い、さらに紫外線未照射の人工皮膚モデルをコントロールとし、コントロールのＤＮＡ合成量に対する比率を算出した。
【００１９】
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【００２０】
モデル動物（ヘアレスマウス）では、紫外線（ＵＶ−Ｂ）照射により細胞内ＤＮＡダメージが起こり、これがシグナルとなり種々の反応が惹起され、透過バリアが崩壊することが報告されている[Photodermatol  Photoimmunol  Photimed，Vol.13，p117-128，1997］。またＤＮＡ合成能亢進は、透過バリア崩壊の重要な指標であり、へアレスマウスではＵＶ−Ｂ照射４８時間後に顕著にＤＮＡ合成が亢進する[J  Invest  Dermatol，Vol.108，p769-775,1997］。通常培地（サイトカイン無添加）により培養したヒト人工皮膚モデルでは、ＵＶＢ照射後にＤＮＡ合成能は変動しなかった。一方、ＵＶＢ照射後にＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−γを添加した培地にて培養することで、ＤＮＡ合成が顕著に亢進した。またＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−γ添加培地による培養だけではＤＮＡ合成は亢進しなかった。以上の結果から、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−γ添加培地でヒト人工皮膚モデルを培養することにより、正常な透過バリア機能が形成され、透過バリア崩壊誘発刺激に対しても、生体と類似の反応を惹起させたことは明白である。
【００２１】
試験例２（乾燥負荷に対するＤＮＡ合成能評価試験）
既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、もしくはＩＮＦ−γを１０ｎｇ／ｍＬ添加した、又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ−γを各々１０ｎｇ／ｍＬ添加した培地に交換し、乾燥負荷条件（湿度１０％、温度３７℃）にて６時間空気暴露培養した。通常培地（サイトカイン無添加）により通常培養条件（湿度９０％、温度３７℃）にて培養したヒト人工皮膚モデルをコントロール（比較例８）とした。更に、ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＩＮＦ−γを１０ｎｇ／ｍＬ添加した培地にて通常培養条件にて６時間培養した人工皮膚モデル（比較例９〜１１）と比較した。培養６時間後に、表皮層を剥離し、ＤＮＡ合成能を測定した（試験例１の方法に準ずる）。ＤＮＡ合成能は、コントロールに対する比率で示した。
【００２２】
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【００２３】
比較例７に示したように、従来のヒト人工皮膚モデルは、湿度１０％による乾燥負荷条件で、ＤＮＡ合成能が顕著に低下することが示された。なおモデル動物では乾燥負荷により、ＤＮＡ合成能が顕著に亢進することが報告されている[Arch  Dermatol  Res，Vol.290，p634-637］。実施例７〜１０に示したように、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、もしくはＩＮＦ−γを添加した、又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ−γを添加した培地を用い湿度１０％で培養すると、モデル動物と同様に、ＤＮＡ合成能が顕著に亢進することが示された。なお比較例９〜１１で示したように、これらの培地を用い、通常の培養条件（湿度９０％）にて培養した場合、ＤＮＡ合成能の亢進は認められなかった。以上の結果より、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γを添加した培地により既存のヒト人工皮膚モデルを培養することで、正常な透過バリア機能応答が惹起され、乾燥負荷に対して、モデル動物と類似した反応を誘発するヒト人工皮膚モデルが作製されたことは明白である。
【００２４】
これらの結果より、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γの１〜３種を添加した培地にて人工皮膚モデルを培養することにより、正常な角層ラメラ構造を有し、また種々の負荷に対して生体と類似した反応を誘発することができる正常な透過バリア機能を有する人工皮膚モデル作製が可能であることが明らかとなった。
【００２５】
【発明の効果】
以上のごとく、本発明により、正常な透過バリア機能を有する人工皮膚モデルの取得が可能となり、医薬品、化粧品等に対する有用性評価、安全性評価等における優れた動物代替試験法が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＬ−４添加培地によって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図である。
【図２】ＩＬ−１０添加培地によって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図である。
【図３】ＩＮＦ−γ添加培地によって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図である。
【図４】コントロール（既製ヒト人工皮膚モデル；ＬＳＥhigh，東洋紡社）の角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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