(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法：
（ａ）組換えベクターと線状ｉＴＧＲ断片（insert for Target Gene and ＲＢＳ）とで相同組換えを実施する段階であって、
ここで、前記組換えベクターは
（ｉ）プロモーター；と
（ｉｉ）ベクターの前位リボソーム認識配列；と
（ｉｉｉ）後位リボソーム認識配列及び翻訳開始コドンが除去されて発現能の失われた第１選択標識遺伝子；と
（ｉｖ）発現可能な第２選択標識遺伝子とを含有することを特徴とし、
前記線状ｉＴＧＲ断片は、
（ｉ）目的遺伝子の塩基配列；と
（ｉｉ）前記目的遺伝子の５’−末端に位置し、前記組換えベクターの前位リボソーム認識配列及びプロモーター後方の一部個所と相同性を持つ塩基配列；と
（ｉｉｉ）前記目的遺伝子の３’−末端に位置し、前記組換えベクターの第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列、開始コドン及び第１選択標識遺伝子の５’−末端と相同性を持つ塩基配列；とを含み、
前記線状ｉＴＧＲ断片は前記組換えベクターの前位リボソーム認識配列と前記第１選択標識遺伝子との間に組み込まれて、前記目的遺伝子と前記第１選択標識遺伝子が発現できる前記段階；及び
（ｂ）第１選択標識及び第２選択標識を用いて目的遺伝子の導入された形質転換微生物を選り分けて目的遺伝子をクローニング及び発現させる段階。
【請求項２】
前記（ａ）段階は相同組換えを行う前、前記組換えベクターを含有する微生物に線状ｉＴＧＲ断片を導入させる段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターは、Ｔ７プロモーターであり、前記第１選択標識遺伝子はクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物は、相同組換えの促進遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記段階（ｂ）は、第１選択標識遺伝子を発現する微生物を目的遺伝子が導入されたものとして選り分けることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）プロモーター；と
（ｉｉ）ベクターの前位リボソーム認識配列；と
（ｉｉｉ）後位リボソーム認識配列及び翻訳開始コドンが除去されて発現能の失われた第１選択標識遺伝子；と
（ｉｖ）発現可能な第２選択標識遺伝子とを含有して、
線状ｉＴＧＲ断片が前位リボソーム認識配列と前記第１選択標識遺伝子との間に組み込まれる場合、前記目的遺伝子と前記第１選択標識遺伝子が発現できることを特徴とする組換えベクターであって、前記線状ｉＴＧＲ断片は
（ｉ）目的遺伝子の塩基配列；と
（ｉｉ）前記目的遺伝子の５’−末端に位置し、前記組換えベクターの前位リボソーム認識配列及びプロモーター後方の一部個所と相同性を持つ塩基配列；と
（ｉｉｉ）前記目的遺伝子の３’−末端に位置し、前記組換えベクターの第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列、開始コドン及び第１選択標識遺伝子の５’−末端と相同性を持つ塩基配列；とを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項７】
前記組換ベクターは配列番号８の塩基配列を有するｐＲＭＴベクターであることを特徴とする請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項８】
（ｉ）目的遺伝子の塩基配列；と
（ｉｉ）前記目的遺伝子の５’−末端に位置し、前記組換えベクターの前位リボソーム認識配列及びプロモーター後方の一部個所と相同性を持つ塩基配列；と
（ｉｉｉ）前記目的遺伝子の３’−末端に位置し、前記組換えベクターの第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列、開始コドン及び第１選択標識遺伝子の５’−末端と相同性を持つ塩基配列；とを含む線状ｉＴＧＲ断片。
【請求項９】
請求項６に記載の組換えベクター及び相同組換えの促進遺伝子を含有するプラスミドで形質転換された相同組換え用の微生物。
【請求項１０】
前記相同組換えの促進遺伝子は、Ｒｅｄα／βまたはＲｅｃＥ／Ｔ遺伝子であることを特徴とする請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
後位リボソーム認識配列、開始コドン及びクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）の５’−末端配列を含有する配列番号７からなるプライマー、及び請求項６の組換えベクターの前位リボソーム認識配列、プロモーター後方の一部箇所及び目的遺伝子の５’−末端一部箇所と相同性を持つ塩基配列プライマー、からなる相同組換え用プライマーセット。
【請求項１２】
前記線状ｉＴＧＲ断片は配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、目的遺伝子及び配列番号７と相補的な配列からなるＤＮＡで構成されることを特徴とする請求項８に記載の線状ｉＴＧＲ断片。
【請求項１３】
前記組換ベクターは配列番号８の塩基配列からなるｐＲＭＴであって、前記線状ｉＴＧＲ断片は配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ、目的遺伝子及び配列番号７と相補的な配列からなるＤＮＡで構成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法に係り、さらに詳しくは、組換えベクターとリコンビナーゼ・システムを含むプラスミドで形質転換した宿主細胞に、目的遺伝子及び前記組換えベクターと相同性を持つ配列を含む線状ＤＮＡ断片を導入することを特徴とする相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡクローニングとは、目的遺伝子をプラスミド、ファージ、コスミドなどの自己複製能を持つベクターに結合し、大腸菌などの宿主に導入して増殖させることにより、同じ遺伝子集団を大量に作り出す技術を言う。大腸菌におけるクローニング及びサブクローニングは、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）の方法などにより増幅された目的遺伝子をＤＮＡリガーゼを用いて複製開始点と抗生剤の選択標識を持ったベクターに結合して大腸菌細胞の中に導入した後、抗生剤耐性を調べることでクローニングされた細胞を選り分ける方法で行われる。
【０００３】
かかる通常のクローニング技術は現代の生命工学の基礎をなしており、ヒトゲノムフロジェクトーが完成された以降に飛躍的な発展を成し遂げている、遺伝子情報に基づく大量遺伝子のクローニング及び高速なタンパク質発現などに幅広く用いられている。しかしながら、既存の遺伝子の操作方法においては、挿入ＤＮＡとベクターを同じ認識部位の制限酵素で切断することや、制限酵素を選択するときにも挿入ＤＮＡやベクターの内部を切断しないものを選択すること、などが求められるといった制限がある。また、制限酵素及びリガーゼを処理する過程で高度の技術が必要となり、しかも、高価な酵素によるコストも決して少なくない。
【０００４】
１９９０年代以降、特定の塩基配列を認識してＤＮＡ断片間の組換えを促すという配列特異的な遺伝子組換え酵素を用いた遺伝子操作技術への関心が高まりつつある。特に、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰなどの特異なＤＮＡ配列を認識する遺伝子インテグラーゼを用いて遺伝子をクローニングするゲートウェイ・システム（インビトロジェン(株)製）が開発されて、大量の遺伝子の素早いクローニング及びタンパク質の発現のために汎用されている。この方法は、通常の制限酵素−連結反応と同様に、細胞外の遺伝子操作により行われるが、ａｔｔＬまたはａｔｔＲを持つ線状ＤＮＡ断片を仲介するＬＲクロナーゼと、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間を認識するＢＰクロナーゼと、を用いる新規なクローニング方式である。同方法は、通常の遺伝子操作により目的遺伝子を挿入ベクターにクローニングした上で、相同組換えにより様々な発現ベクターに遺伝子を移動することが可能になることから、大量の遺伝子の素早いサブクローニング及び発現の検証に極めて有利であった。
【０００５】
一方、大腸菌細胞の中に、数百個以上の塩基が同じ配列を示すＤＮＡ断片が存在する場合、大腸菌自体のｒｅｃＡ及びｒｅｃＢＣＤが働く相同組換えが起こる場合がある。しかしながら、相同ＤＮＡの長さが４０−５０個以下である場合は、大腸菌自体による遺伝子組換えは起こることなく、ファージ由来の組換え酵素としてのレッド（Ｒｅｄα／β）またはＲｅｃＥ／Ｔシステムを導入した場合に限って、相同遺伝子間の組換えが起こることになる。このように短尺状の相同ＤＮＡ断片を用いた遺伝子組換えは、微生物の遺伝体を操作する技術、または制限酵素／リガーゼに影響されない細胞内クローニングなどに用いられる（Zhang et al., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128, Zhang et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 1314-1317）。
【０００６】
線状化させたプラスミドベクターとＰＣＲ産物との間の相同組換え反応により細胞内クローニングを行う場合、先ず、挿入ＤＮＡの両端に長さが４０〜５０塩基となる相同ＤＮＡを位置させ、ベクターにおいても、相同ＤＮＡ部位が両端に位置するように制限酵素を処理して、相同組換え酵素（リコンビナーゼ）を持つ大腸菌に導入する方法が用いられている。この場合、線状化されたクローニングベクターはプラスミドの複製能を失っているために抗生剤抵抗性が発現しないことから、抗生剤抵抗性を用いると、細胞内クローニングの成否を識別することが可能になる。この方法は、制限酵素やリガーゼに代えて、細胞内の組換え酵素を用いるところに特徴があるが、同じ相同ＤＮＡよりなる線状化されたベクターを調製して併用しなければならないという煩雑さがある。
【０００７】
近年急速な発展を重ねているプロテオミクス、プロテインチップ、構造生物学などは、大量の遺伝子を手軽にクローニングし、且つ、迅速に目的タンパク質を発現可能な遺伝子操作技術の必要性を示している。特に、高度の技術を要する既存のクローニング技術は、自動化及び高速化が極めて困難であったため、簡単でかつ迅速な遺伝子クローニング及びタンパク質発現技術の開発が望まれる。
【０００８】
そこで、本発明者らは、上記の問題点を解消するために、組換えベクターの前方のリボソーム認識配列とプロモーターの一部個所及び第１選択標識遺伝子の後方のリボソーム認識配列及び開始コドンを目的遺伝子の断片に含めて調製し、リボソーム認識配列と開始コドンの除去された第１選択標識遺伝子を含有する組換えベクター及びリコンビナーゼ・システムを含有するプラスミドで形質転換した宿主細胞に前記目的遺伝子の断片を導入する場合、相同組換えにより、ベクター及び挿入断片の制限酵素の切断、及びライゲーションなどの煩雑な遺伝子操作を行うことなく、簡単に目的遺伝子をクローニングして、高速にてタンパク質を発現可能になることを見出して本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ベクターの制限酵素の切断及び挿入断片のライゲーションなどの煩雑な遺伝子操作を行うことなく、簡単に目的遺伝子をクローニングして、高速にタンパク質を発現可能になる相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）後位リボソーム認識配列及び翻訳開始コドンが除去されて発現能の失われた第１選択標識遺伝子、発現可能な第２選択標識遺伝子、プロモーター及び前位リボソーム認識配列を含有し、前記前位リボソーム認識配列と前記第１選択標識遺伝子との間にｉＴＧＲ断片が組み込まれる場合、前記目的遺伝子と前記第１選択標識遺伝子が発現できるように構成された組換えベクターを調製する段階と；（ｂ）前記組換えベクターを相同組換えの促進遺伝子を含有するプラスミドを含む微生物に導入して相同組換え用の微生物を調製する段階と；（ｃ）（ｉ）目的遺伝子の塩基配列と、（ｉｉ）前記目的遺伝子の５’−末端に位置し、請求項１に記載の組換えベクターの前位リボソーム認識配列及びプロモーター後方の一部個所と相同性を持つ塩基配列と、（ｉｉｉ）前記目的遺伝子の３’−末端に位置し、請求項１に記載の組換えベクターの第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列、開始コドン及び第１選択標識遺伝子の５’−末端と相同性を持つ塩基配列と、を含む線状ＤＮＡ断片を前記相同組換え用の微生物に導入する段階と；（ｄ）第１選択標識及び第２選択標識を用いて目的遺伝子の導入された形質転換微生物を選り分ける段階と；を含む相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法を提供する。
【００１１】
本発明において、前記ｉＴＧＲ断片は、目的遺伝子、第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列及び翻訳開始コドンを含むことができる。
【００１２】
本発明において、前記プロモーターはＴ７プロモーターであり、第１選択標識遺伝子はクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）であることを特徴とする。また、前記相同組換えの促進遺伝子は、Ｒｅｄα／βまたはＲｅｃＥ／Ｔ遺伝子であることを特徴とする。
【００１３】
本発明において、前記段階（ｄ）は、第１選択標識遺伝子を発現する微生物を目的遺伝子が導入されたものとして選り分けることを特徴とする。また、前記段階（ｄ）は、第１選択標識の存在下で成長する微生物を目的遺伝子が導入されたものとして選り分けることを特徴とする。
【００１４】
本発明はまた、後位リボソーム認識配列及び翻訳開始コドンが除去されて発現能の失われた第１選択標識遺伝子、発現可能な第２選択標識遺伝子、プロモーター及び前位リボソーム認識配列を含有し、前記前位リボソーム認識配列と前記第１選択標識遺伝子との間にｉＴＧＲ断片が組み込まれる場合、前記ｉＴＧＲ断片と前記第１選択標識遺伝子が発現可能に構成された組換えベクターを提供する。
【００１５】
本発明において、前記ｉＴＧＲ断片は、目的遺伝子、第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列及び翻訳開始コドンを含むことができる。
【００１６】
本発明において、前記プロモーターはＴ７プロモーターであり、第１選択標識遺伝子はクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）であることを特徴とする。
【００１７】
本発明はまた、（ａ）目的遺伝子の塩基配列と、（ｂ）前記目的遺伝子の５’−末端に位置し、前記組換えベクターの前位リボソーム認識配列及びプロモーター後方の一部と相同性を持つ塩基配列と、（ｃ）前記目的遺伝子の３’−末端に位置し、前記組換えベクターの第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列、開始コドン及び第１選択標識遺伝子の５’−末端と相同性を持つ塩基配列を含む線状ＤＮＡ断片を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記組換えベクター及び相同組換え促進遺伝子を含有するプラスミドで形質転換された相同組換え用の微生物を提供する。
【００１９】
本発明において、前記相同組換えの促進遺伝子は、Ｒｅｄα／βまたはＲｅｃＥ／Ｔ遺伝子であることを特徴とする。
【００２０】
本発明はまた、後位リボソーム認識配列、開始コドン及びクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）の５’−末端配列を含有する配列番号７の相同組換え用のプライマーを提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、ベクターの制限酵素の切断及び挿入断片のライゲーションなどの遺伝子操作を行うことなく、手軽に目的遺伝子をクローニングし、高速にタンパク質を発現可能な相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法を提供することができる。本発明によれば、ベクターと目的遺伝子の制限酵素処理及びライゲーションなどの煩雑な遺伝子操作段階が不要になるため、高度の熟練技術が無くても遺伝子のクローニングを行うことができ、酵素コストが節減されて遺伝子の大量で且つ高速なクローニング及びタンパク質の発現に有効に利用することができる。さらに、本発明に係るｐＲＭＴ−ｉＴＧＲシステムは、高効率のリコンビナーゼを改良するための分析手段として活用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明において用いられる用語は、下記のように定義される。
【００２３】
本発明における組換えベクターとは、目的遺伝子との相同組換えにより宿主細胞において目的遺伝子を発現可能にするための組換えプラスミドを言う。
【００２４】
本発明におけるリボソーム認識配列とは、リボソーム結合部位（Ribosome Binding Site：ＲＢＳ）を含む配列を示す。
【００２５】
本発明における前位リボソーム認識配列とは、組換えベクターに存在すると共に、目的遺伝子の５’−前方に位置して目的遺伝子の発現のためのリボソーム認識配列を意味し、後位リボソーム認識配列は、目的遺伝子の３’−後方に存在するリボソーム認識配列であって、目的遺伝子が組換えベクターに挿入される場合、前記組換えベクター内の第１選択標識遺伝子の発現を回復させる機能を果たす配列を意味する。
【００２６】
本発明における選択標識遺伝子は、形質転換が行われた形質転換体を選択的に分離するための遺伝子であって、各種の発色遺伝子、抗生剤抵抗性の遺伝子などの外部的に形質転換が行われていることが確認可能ないかなる種類の遺伝子も制限無しに用いることができ、好ましくは、抗生剤抵抗性の遺伝子を用いることができる。
【００２７】
本発明における第１選択標識遺伝子とは、前記組換えベクターに存在すると共に、自らの発現能はないが、目的遺伝子を含む線状ＤＮＡの組換えにより発現する選択標識遺伝子を意味し、第２選択標識遺伝子とは、前記組換えベクターに存在すると共に、自らの発現能をもっている選択標識遺伝子を言う。
【００２８】
本発明におけるｉＴＧＲ断片（insert for Target Gene and Ribosome recognition sequence）とは、目的遺伝子と第１選択標識遺伝子の発現のためのリボソーム認識配列及び開始コドンが含まれている線状ＤＮＡ断片を意味する。
【００２９】
本発明におけるリコンビナーゼ・システムを含むプラスミドとは、相同組換えを促すための遺伝子を含有するプラスミドを意味する。また、前記相同組換えを促す遺伝子としては、例えば、レッド−リコンビナーゼ・システムまたはＲｅｃＡをコードする配列などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３０】
本発明における前方相同性の塩基配列とは、前記組換えベクターのプロモーターにおいて、前位リボソーム認識配列を含む後方の所定の長さと相同な塩基配列を意味し、後方相同性の塩基配列とは、第１選択標識遺伝子の５’−末端の所定の長さと相同な塩基配列を意味する。前記相同性の塩基配列における「所定長さ」とは、相同組換えが起こるのに十分な長さを意味し、通常、４０〜５０個の塩基配列を示す。
【００３１】
本発明における相同組換えとは、線状ＤＮＡ断片とベクターがそれぞれに存在する相同性の塩基配列を介して結合し、リコンビナーゼにより未結合のその他の配列の塩基配列が合成されて、結果的に、線状ＤＮＡが挿入された完全な環状のプラスミドが生成されることを意味する。
【００３２】
本発明においては、下記のようにして２回の相同組換えが順次に起こる。
【００３３】
（１）リボソーム認識配列及び開始コドンが除去されて発現能の失われた第１選択標識遺伝子を出発プラスミドに挿入して組換えベクターを調整する過程
（２）（ｉ）目的遺伝子、（ｉｉ）前記目的遺伝子の５’−末端に位置する前記組換えベクターの前位リボソーム認識配列を含むプロモーターの後方の所定の長さと相同な塩基配列、及び（ｉｉｉ）前記目的遺伝子の３’−末端に位置する前記組換えベクターの第１選択標識遺伝子の後位リボソーム認識配列、開始コドン及び第１選択標識遺伝子の５’−末端の所定の長さと相同な塩基配列を持つ線状ＤＮＡ断片と組換えベクターを組換える過程
【００３４】
前記（１）及び（２）の過程において、それぞれ一対の相同性の塩基配列（５’−末端用と３’−末端用）が存在する必要がある。前記（２）の過程を経た相同組換えの結果、５’−（プロモーター→目的遺伝子→第１選択標識遺伝子）−３’を含む組換えベクターが得られる。
【００３５】
これにより、前記（２）の過程において、目的遺伝子の挿入のための３’−末端側の相同性の塩基配列は、前記（１）の過程における５’−末端側の相同性の塩基配列と同じ配列であってもよく、同じ配列を用いることが好ましい。
【００３６】
また、本発明において、相同組換え用のプライマーは、前記目的遺伝子含有線状ＤＮＡの作成に用いられるものであって、目的遺伝子の３’−末端にクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）の発現のための後位リボソーム認識配列、開始コドン、及びｃａｔ遺伝子の５’−末端の所定の長さだけ相同な塩基配列である後方相同性の塩基配列を与えるプライマーである。
【００３７】
前記相同組換え用のプライマーは、本発明に係る相同組換えにより目的遺伝子をクローニング及び発現する方法において、目的遺伝子の種類を問わずに、第１選択標識遺伝子がクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）である場合に限って制限無しに用いることができる。
【００３８】
以下、本発明によるリコンビナーゼにより媒介される相同組換えにより目的遺伝子をクローニング及び発現する方法を各段階別に詳述する。
【００３９】
（１）組換えベクター及び相同組換え用の微生物の構築
本発明の相同組換えにより目的遺伝子をクローニングするに当たって、発現ベクターの役割を果たす組換えベクターを構築する段階であって、この段階においては、第１選択標識遺伝子の発現に必要なリボソーム認識配列及び開始コドンが除去された第１選択標識遺伝子及び第２選択標識遺伝子を含む組換えベクターを構築し、前記組換えベクター及びリコンビナーゼ・システムを含むプラスミドを含有する相同組換え用の微生物を構築する。
【００４０】
前記第１選択標識遺伝子の５’−末端が、本発明の線状ＤＮＡ断片（ｉＴＧＲ）との相同組換えのための塩基配列となる。一般に、組換え微生物において、外来（目標）の遺伝子を発現させるためには、ポリペプチドを合成するリボソーム結合部位（ＲＢＳ）と翻訳開始コドンが必要となる。
【００４１】
組換えベクターは、第１選択標識遺伝子の発現に必要なリボソーム認識配列及び開始コドンが除去された第１選択標識遺伝子及び第２選択標識遺伝子を含めることができる方法であれば、いかなる方法も制限無しに用いることができるが、本発明の一態様として、下記の方法を用いることができる。
【００４２】
ＰＣＲなどの増幅方法を用いて３’末端と５’末端に親ベクターと相同性を示す塩基配列をもち、且つ、開始コドンのない第１選択標識遺伝子の断片を得る。また、親ベクターを制限酵素で切断してプロモーター及び第２選択標識遺伝子を含む線状化された親ベクターを得る。
【００４３】
前記線状化された第１選択標識遺伝子の断片と線状化された親ベクターとを相同組換えを促すためのシステムを含有している宿主細胞に形質転換させ、第２選択標識を用いて、前記線状化された第１選択標識遺伝子の断片と親ベクターが成功的に相同組換えられている組換えベクターを含有する形質転換体を得る。
【００４４】
こうして、相同組換えを促すためのシステムを含むプラスミド及び組換えベクターを含有している宿主細胞を得ることができる。
【００４５】
本発明の実施例においては、Ｔ７プロモーターをもち、且つ、発現に必要なリボソーム認識配列及び翻訳開始コドンが除去されたｃａｔを内包するプラスミドｐＲＭＴを製作した（図１）。
【００４６】
本発明において、前記相同組換えを促すためのシステムとしては、例えば、Ｒｅｄα／βまたはＲｅｃＥ／Ｔシステムをコードするプラスミド（例えば、レッド−リコンビナーゼ・システムをコードするプラスミドｐＫＤ４６）などが挙げられ、本発明の下記の実施例においては、レッド−リコンビナーゼ・システムを用いているが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４７】
前記プラスミドの一例であるｐＫＤ４６は、相同組換えに不可欠な３つの遺伝子エキソ（ｅｘｏ）、ベータ（ｂｅｔ）、ガンマ（ｇａｍ）遺伝子を含んでいる（図３）。エキソ遺伝子は、２重鎖のＤＮＡを５’方向から３’方向に分解して３’−突出末端を作る核酸分解酵素をコードする。また、ベータ遺伝子は、核酸分解酵素の作用により露出された単一鎖のＤＮＡに結合して相補的な鎖間の遺伝子結合を促すタンパク質をコードする。さらに、ガンマ遺伝子は、微生物自体にある核酸分解酵素の活性を阻害するタンパク質をコードする。これらの３種の遺伝子は、アラビノーズ誘導プロモーターにより厳格に制御される（Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12:6640-6645, 2000）。
【００４８】
このため、本発明の組換えベクターは、目的遺伝子との相同組換えが行われると、第１選択標識の活性化及び目的遺伝子の発現が同時に起こる。
【００４９】
本発明の組換えベクターを用いた相同組換えによる目的遺伝子のクローニング方法は、組換えベクターを宿主細胞内に常駐させた状態で保存・使用可能であるため、プラスミドを制限酵素処理などにより線状化させるなどの別途の過程が不要になり、相同組換えが行われた場合は、選択標識による高速選別及び発現が可能になるベクターシステムである。
【００５０】
（２）目的遺伝子を含有するＤＮＡ断片（ｉＴＧＲ）の製造
本発明の相同組換えにより目的遺伝子をクローニングするために、目的遺伝子及び相同組換えに不可欠な配列を含有するＤＮＡ断片を調製する段階である。
【００５１】
すなわち、目的遺伝子の５’−末端に前方相同性の塩基配列である前記組換えベクターのプロモーターの後方に所定の長さと相同な塩基配列を連結させ、目的遺伝子の３’−末端に後位リボソーム認識配列と開始コドン及び後方相同性の塩基配列を連結させたｉＴＧＲ（insert for Target Gene and ＲＢＳ）断片を製造可能であれば、いかなる方法も制限無しに用いることができるが、本発明の一態様として、下記の方法を用いることができる（図４）。
【００５２】
先ず、組換えベクターの前位リボソーム認識配列を含むプロモーターの後方の所定の長さを含む第１のプライマー及び第１選択標識遺伝子の開始コドンと後位リボソーム認識配列が含まれている第２のプライマーを用いて目的遺伝子を増幅することにより、目的遺伝子、プロモーターの後方配列及び第１の選別標識遺伝子の開始コドンと後位リボソーム認識配列が含まれているＤＮＡ断片を得る。
【００５３】
前記ＤＮＡ断片を第１のプライマーと第１選択標識遺伝子の５’一部配列と相同性を示す配列を含む第３のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、目的遺伝子の５’−末端に前方相同性の塩基配列−プロモーターの後方に所定の長さと相同な塩基配列を連結させ、目的遺伝子の３’−末端に後位リボソーム認識配列と開始コドン及び後方相同性の塩基配列を連結させたｉＴＧＲを得る。
【００５４】
ここで、目的遺伝子は、形質転換した微生物において発現可能ないかなる遺伝子も使用可能であり、下記の実施例においては、発現の有無を簡単に観察可能にするために、赤色蛍光タンパク質の一種であるＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子を用いているが、これに限定されるものではない。
【００５５】
（３）線状ＤＮＡ（ｉＴＧＲ）の遺伝子組換え段階
前記（２）段階において調製された目的遺伝子含有線状ＤＮＡ、ｉＴＧＲ断片を、前記（１）段階において得られた相同組換えを促すためのシステムを含むプラスミド及び組換えベクターを含有している相同組換え用の微生物に形質転換する段階である。
【００５６】
本発明に係る線状ｉＴＧＲ断片は、前記相同組換え用の微生物に形質転換すると、線状ｉＴＧＲ断片の５’末端の塩基配列は組換えベクターのプロモーターの３’末端の塩基配列と相同性があるために、これと相補的な結合をし、線状ｉＴＧＲ断片の３’末端は第１選択標識遺伝子の５’末端と相同性があるため、これと相補的な結合をする。
【００５７】
相同組換えを促すためのシステムを含むプラスミドにより発現する相同組換えの促進遺伝子により、前記相補的な結合部位を中心として、目的遺伝子が挿入された組換えベクターの全体的な遺伝子組換えが行われる。
【００５８】
相同組換えが成功的に行われると、第１選択標識遺伝子は前記線状ＤＮＡに存在する後位リボソーム認識配列と開始コドンにより発現可能な状態へと変わり、挿入された目的遺伝子は組換えベクターに存在するプロモーターにより発現可能になる。
【００５９】
すなわち、本発明の相同組換えが行われると、第１選択標識遺伝子の活性化及び目的遺伝子の発現が同時に実行可能になる。
【００６０】
（４）形質転換微生物の選別及び目的遺伝子の発現
目的遺伝子と組換えベクターの相同組換えが成功的に行われた形質転換体を選別する段階である。
【００６１】
上述したように、本発明による線状ＤＮＡが組換えベクターと成功的に相同組換えられると、第１選択標識遺伝子が発現可能になるため、第１選択標識遺伝子が発現する条件（例えば、第１選択標識遺伝子が抗生剤抵抗性の遺伝子であれば、抗生剤含有培地）または前記遺伝子が発現することを確認可能な条件（例えば、第１選択標識遺伝子が蛍光発色遺伝子であれば、蛍光発色を引き起こす条件）下で、成功的に組換えられた目的遺伝子の発現微生物を選別することが可能になる。選別の効率を高めるために、必要に応じて、前記第１選択標識（例えば、クロラムフェニコール）のみならず、第２選択標識（例えば、カナマイシン）が同時に発現することを確認可能な条件下で、目的遺伝子で形質転換した微生物を選別することも可能である。
【００６２】
選択標識遺伝子の発現の確認とは別に、最終的な形質転換微生物において目的遺伝子が発現するかどうかは、前記目的遺伝子の生理化学的な特性によって各種の方法により確認することができる。
【００６３】
下記の実施例においては、発現の有無を簡単に確認するために、目的遺伝子を赤色蛍光タンパク質遺伝子として実験を行った。また、増幅された赤色蛍光タンパク質遺伝子を含む線状ＤＮＡで前記微生物を形質転換させた後、第１選択標識であるクロラムフェニコール耐性を用いて選別した。さらに、選別されたコロニーにＵＶ照射を行うことにより、赤色蛍光を帯びるコロニーを確認することができた（図７）。
【００６４】
本発明による組換えベクターは、本発明の技術的な思想とアイディアに基づいて種々な商用または普遍化した出発物質から通常公知の方法に従い調製可能なことは、当業者にとって自明である。
【００６５】
例えば、本発明の実施例によるｐＲＭＴは、下記の実施例に示すように、商業的に購入可能なベクターから通常のインビボクローニング方法により調製可能であるため、必ずしも寄託を要するとは限らない。このため、これについての寄託を省略した。
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることはない。
【００６７】
下記の実施例においては、発現を手軽に確認可能な赤色蛍光タンパク質遺伝子を目的遺伝子として発明を完成しているが、形質転換したときに宿主細胞において発現可能な遺伝子を用いても、下記の実施例と略同様な結果が得られるということは、当業界にとって自明である。また、任意の遺伝子を対象とし、本発明に係る方法により設計されたプライマーを用いてＰＣＲ産物を得、これをリコンビナーゼと発現ベクターを保持する宿主に形質転換させて大量の遺伝子を迅速にクローニングして、簡単なタンパク質の発現に活用可能であることは言うまでもない。
【００６８】
実施例１：発現ベクターｐＲＭＴ及びｐＲＭＴとｐＫＤ４６を含む形質転換細胞の調製
発現に必要なリボソーム認識配列及び開始コドンが除去されたクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子（ｃａｔ）を第１選択標識遺伝子として含み、第２選択標識遺伝子でカナマイシン抵抗性の遺伝子（ｋａｎ）を含む組換えベクターｐＲＭＴを構築するために、制限酵素で線状化したプラスミドベクター（ｐＥＴ２７ｂ）にＰＣＲにより調製された、開始コドンの除去されたｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を連結させる相同組換え技術を用いた（図１）。
【００６９】
すなわち、互いに相同部位を含む前記線状ベクター及び前記線状ＤＮＡ断片を、アラビノースによりレッド−リコンビネーションが活性化された（arabinose-induced ｐＫＤ４６／  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＤＥ３））組換え大腸菌に電気穿孔法により導入してクローニングする相同組換え技術を用いた。この方法は、通常の制限酵素−リガーゼを用いる技術に比べて、ＤＮＡ配列を選択する上で制約がないという長所がある。
【００７０】
開始コドンの除去されたｃａｔの構造遺伝子を増幅するために、ｃａｔ遺伝子配列を含むプラスミドであるｐＳＴＶ２８（タカラバイオ（株）製）を鋳型とし、下記の配列番号１と２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００７１】
配列番号１：５’−ＣＣＡＴＣＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧ−３’
配列番号２：５’−ＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣＧＣ−３’
（ここで、下線の部分はｃａｔのＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の両末端である）
【００７２】
前記配列番号１のプライマーは、非活性のｃａｔを増幅するためにｃａｔの開始コドン無しの形で調製された。また、相同組換えを円滑に行うには、相同性の塩基配列間の距離の確保が必要になるため（Zhang et al., Nature Genetics, 20:123, 1998）、別途の塩基配列を追加して調製した。
【００７３】
前記ＰＣＲにより調製された開始コドン無しｃａｔ遺伝子の断片は、相同組換え法により、親ベクターである線状化されたｐＥＴ２７ｂ（ノバジェン社製）ベクターに挿入するために、ｐＥＴ２７ｂの相同性の塩基配列が含まれているプライマーである配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて再びＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子とｐＥＴ２７ｂの相同性の塩基配列が含まれているＤＮＡ断片を得た。
【００７４】
配列番号３：５’−ＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＣＣＡＴＣＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＧ−３’
配列番号４：５‘−ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣＧＣ−３’
（ここで、下線の部分は前位相同性部分で、[ＴＴＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣＧＣ]はｃａｔのＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の３‘末端である）
【００７５】
親ベクターであるｐＥＴ−２７ｂは、制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、アルカリ性のホスファターゼ処理により脱リン酸化させた。
【００７６】
これとは別に、形質転換用の細胞を調製するために、バクテリア・リコンビナーゼシステムをコードするプラスミドであるｐＫＤ４６（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97:6640, 2000）を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）(プロメガ株式会社製)を、５０ｍＭアラビノーズが含まれている培地により３０℃でＯＤ値が０．５になるまで培養し、電気穿孔式の形質転換細胞を調製した。
【００７７】
前記レッド−リコンビナーゼ・システムであるｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍをコードするｐＫＤ４６（図３）は、温度感受性の複製開始点を含んでおり、ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍは、アラビノーズ誘導プロモーターの下において厳格に制御される（Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:6640, 2000）。
【００７８】
こうして調製された電気穿孔式の形質転換細胞に、前記調製されたｃａｔ遺伝子及びｐＥＴ２７ｂと相同性を持つ塩基配列が含まれているＰＣＲ産物２００ｎｇと線状化されたｐＥＴ−２７ｂ  １０ｎｇを電気穿孔式により形質転換した後、相同組換えを誘導するために、常温下で一晩中静置培養した。その後、培養菌株をカナマイシンを含むＬＢ（Luria-Bertani medium）寒天培地に塗抹した。
【００７９】
線状化されたｐＥＴ−２７ｂは、自ら環状ＤＮＡが形成できないため、前記ＰＣＲ産物と線状化されたｐＥＴ−２７ｂが適切に相同的に組換えられた場合にのみ完全な環状のプラスミドを形成し、カナマイシン耐性遺伝子が発現させられるので、カナマイシンの存在下で生存するため、選別が可能になる。
【００８０】
選別されたコロニーは、ｐＥＴ−２７ｂベクターの塩基配列であるＴ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、これを通じて１次的にクローンを確認した。また、ＤＮＡ塩基配列の決定を通じて配列を決定し、組換えベクターｐＲＭＴ（Recombinase-Mediated Translation ）と命名した（図２、配列番号８）。
【００８１】
前記選別された形質転換体であるｐＲＭＴとｐＫＤ４６を同時に含有する組換え大腸菌をｐＲＭＴ−ｐＫＤ４６と命名した（図３）。前記組換え大腸菌は、５０ｍＭのアラビノーズを添加した３０℃の培地中でＯＤ値が０．５になるまで培養して、レッド−リコンビナーゼの活性化を誘導した。誘導が完了した培養細胞は、冷却滅菌水で２回洗浄して、ＯＤ値１００に濃縮した。
【００８２】
前記ｐＲＭＴは組換え大腸菌中に常駐し、制限酵素処理を通じたプラスミドの線状化などの別途の準備過程が不要になる状態で、相同組換えの反応が起こる場合は、抗生剤標識による高速選別及び発現が可能である。
【００８３】
実施例２：目的遺伝子の加工
実施例１に従い調製された組換えベクターｐＲＭＴに適用するための目的遺伝子として、赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ２）を選択した。前記ＤｓＲｅｄ２は、タンパク質の発現有無をＵＶ照射により視認可能である。
【００８４】
赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ２）を下記のようにしてＰＣＲを行った。
【００８５】
ｐＤｓＲｅｄ２（クロンテック社製）ベクターを鋳型として、下記の配列番号５及び配列番号６のプライマーを用い、赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ２）を増幅した。
【００８６】
配列番号５：５’−ＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＧ−３’
配列番号６：５’−ＣＴＣＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧ−３’
（ここで、下線の部分は後位相同性部分で、配列番号６の[ＣＡＴ]及び[ＴＣＴＣＣＴ]は各々開始コドンと前位リボソーム認識配列のアンチセンス配列である）
【００８７】
前記配列番号５には、ｐＲＭＴのＴ７プロモーターの後方の所定の長さと相同な塩基配列が含まれており、前記配列番号６のプライマーは、ｐＲＭＴの選別標識であるｃａｔを発現させるための開始コドンと後位リボソーム認識配列を含んでいる。
【００８８】
こうして得られたＰＣＲ産物を鋳型として、相同性の塩基配列を延ばすために、前記配列番号５のプライマーと下記の配列番号７のプライマーとしてＰＣＲを繰り返し行った。
【００８９】
配列番号７：ＧＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣ
【００９０】
前記配列番号７の［ＧＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴ］がｃａｔ遺伝子の５’−末端を示す。また、下線の部分は後位相同性部分で、[ＣＡＴ]及び[ＴＣＴＣＣ]は各々開始コドンと後位リボソーム認識配列のアンチセンス配列である）
【００９１】
このとき、目的遺伝子であるＤｓＲｅｄ２にアニールされる配列は、配列番号５と配列番号６にのみ存在するが、配列番号７には存在せず、ｐＲＭＴと結合する前方相同性及び後方相同性の塩基配列は５と７に含まれている（下線部）。このため、配列番号７のプライマーは、目的遺伝子とアニールする個所が存在しないため、第１の選択遺伝子としてｃａｔ遺伝子を用いる相同組換えシステムにおいていかなる目的遺伝子を用いるとしても、ＰＣＲ反応に利用可能になる。すなわち、各目的遺伝子に適したプライマーは、２つのみを合成しても十分である。
【００９２】
前記ＰＣＲ反応により、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ２の前方にｐＲＭＴのプロモーターと相同性を示す前方相同性の塩基配列を、後方にｃａｔ遺伝子に対する後位リボソーム認識配列、開始コドン及び後方相同性の塩基配列が連結された線状ＤＮＡ（ｉＴＧＲ）を得た（図４）。
【００９３】
実施例３：電気穿孔法を用いた形質転換
実施例１に従い調製されたｐＲＭＴとｐＫＤ４６を同時に含有する組換え大腸菌である、ｐＲＭＴ−ｐＫＤ４６の電気穿孔式の形質転換用の細胞に、実施例２に従い調製されたｉＴＧＲ（ＤｓＲｅｄ２遺伝子を含有する線状ＤＮＡ断片）１００ｎｇを電気穿孔法により形質転換させた後、相同組換えを誘導するために、常温下で１晩中静置した。ｐＲＭＴとｉＴＧＲとの相同組換えが成功的に行われた形質転換体において、第１の選択遺伝子であるクロラムフェニコール耐性遺伝子が発現するため、クロラムフェニコールが含有されたＬＢ寒天培地に塗抹してコロニーを選別した（図５）。
【００９４】
実施例４：インビボクローニングされたクローンの分析
実施例３に従い選別された形質転換体に対してＴ７プロモーターのプライマーとＴ７ターミネータのプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、次いで、電気泳動した（図６）。また、目的遺伝子であるＤｓＲｅｄ２が強く発現すると、赤い蛍光を帯びるため、ＵＶを照射してタンパク質の発現有無を確認した（図７）。
【００９５】
コロニーＰＣＲの場合、全コロニーからｐＲＭＴ−ｉＴＧＲのクローニングが認められた。また、ＰＣＲ帯のサイズが極めて多岐に亘っていることから、細胞によりインビボクローニングが起こる度合いも多種多様であることが分かる。
【００９６】
相同組換えによる目的遺伝子のクローニング有無は、第１の抗生剤耐性により選別できるが、定量性に劣っているため、インビボクローニングのレベルが最も高いコロニーをフラット培地から直接的に選別することが困難であった。これに対し、ＤｓＲｅｄ２の蛍光は目視し易いため、定量的に確認可能であり、発現率が最も高いコロニーを選別することができた（図７）。
【００９７】
一方、ｉＴＧＲが結合されていないｐＲＭＴは、第１の抗生剤に対する抵抗性を与えられないため、選別されたコロニーを少量の液体培地中で培養するだけで、容易に淘汰させることができた。
【００９８】
タンパク質の発現は、プロモーターの強度またはプラスミドの複製数によっても調整可能である。ｐＲＭＴの複製起点はｐＢＲ３２２由来であるため、目的遺伝子の強い発現を得たい場合は、複製起点をｐＵＣ由来のものに置換すればよく、同様に、目的遺伝子の弱い発現を得たい場合は、複製起点をｐ１５Ａ由来のものに置換すればよい。
【００９９】
以上、本発明の内容の特定な部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施の態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明に係る組換えベクターｐＲＭＴの調製過程を示す図である。
【図２】本発明に係る組換えベクターｐＲＭＴにおいて、相同性の塩基配列及びリボソーム認識部位（ＲＢＳ）が除去されたｃａｔ部位の塩基配列を示す図である。
【図３】本発明に係る発現用の微生物である大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＲＭＴ−ｐＫＤ４６を示す模式図である。
【図４】本発明に係る目的遺伝子ＤｓＲｅｄ２とリボソーム認識配列を結合したＤＮＡ断片（ｉＴＧＲ）の模式図及びこの電気泳動写真である。
【図５】本発明に係る目的遺伝子を含むＤＮＡ断片が組換えベクターｐＲＭＴと相同的に組換えられる過程を示す図である。
【図６】本発明の組換えベクターｐＲＭＴとＤＮＡ断片（ｉＴＧＲ）の相同組換えの結果を示す電気泳動写真である。
【図７】本発明に係る目的遺伝子ＤｓＲｅｄ２で形質転換した組換え大腸菌ｐＲＭＴ−ｐＫＤ４６の赤色蛍光遺伝子の発現を確認した写真である。
【図１】
0004575338.tif 000002
【図２】
0004575338.tif 000003
【図３】
0004575338.tif 000004
【図４】
0004575338.tif 000005
【図５】
0004575338.tif 000006
【図６】
0004575338.tif 000007
【図７】
0004575338.tif 000008
【配列表】
0004575338000001.app