(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定ＲＮＡ配列を鋳型として、特定ＲＮＡ配列と相補的及び相同的配列を含み、該配列を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースによって前記特定配列のＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物を更に前記２本鎖ＤＮＡの鋳型とするＲＮＡ増幅方法において、少なくとも、（１）特定ＲＮＡ配列に対して、それぞれ相補的又は相同的な配列からなる２つのプライマーで、その一方のプライマーが５’末端側にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有するプロモータープライマー、（２）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、（３）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、（４）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、（５）デオキシリボヌクレオシド三リン酸、（６）リボヌクレオシド三リン酸、及び、特定ＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡの共存下、４８℃〜５１℃の一定温度で、かつ、１〜３％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度範囲で特定ＲＮＡ配列に相補的あるいは相同的なＲＮＡ増幅産物を得るのに十分な時間反応させることを特徴とする、増強された特定配列の増幅方法。
【請求項２】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースがトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素であることを特徴とする請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースがファージＳＰ６のＲＮＡポリメレースであることを特徴とする請求項１に記載の増幅方法。
【請求項４】
特定ＲＮＡ配列又は特定ＲＮＡ配列を含む標的核酸を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下、請求項１乃至３の増幅方法により増幅し、反応液の蛍光強度を経時的に測定することを特徴とする、特定ＲＮＡ配列又は特定ＲＮＡ配列を含む標的核酸の分析方法。
【請求項５】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、そのインターカレーター性蛍光色素部分が、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースによって生成されたＲＮＡと該プローブとの相補結合によって生じた２本鎖部分にインターカレーションする性質を有することを特徴とする請求項４に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合中に含まれると予想される特定核酸を分析する場合の標的核酸増幅方法に関するものであり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中に存在する微生物の定性または定量分析に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、ウイルス感染症の診断等では、臨床試料中の標的核酸（ウイルス核酸）が極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために信号強度を向上し高感度化する目的から、標的核酸を増幅する方法がとられる。一般的に特定DNA配列を増幅する方法として、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法が知られている。この方法は、特定DNA配列の両末端部に相補的あるいは相同な一組のプライマーと熱耐性DNAポリメレース存在下で、熱変性、プライマー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことによって特定DNA配列を増幅するものである。
【０００３】
一方、特定ＲＮＡ配列の増幅法としては、逆転写酵素及びＤＮＡ依存性RNAポリメレースの協奏的作用によって特定ＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。これらの方法は、標的ＲＮＡに対し、プロモーター配列を含むプライマーと逆転写酵素、及びリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースにより、特定ＲＮＡ配列からなるＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。
【０００４】
一般に、ＰＣＲでＲＮＡを増幅する場合、ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素によって、一旦ｃＤＮＡ合成してからＰＣＲを行う、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法を行うこととなり、実質的には２段階の工程を行わなければならない。また、ＰＣＲは急激な昇温、降温を必要とするため、特殊なインキュベーターを必要とし、大量処理を目的とした自動化への適用は容易ではないという課題がある。
【０００５】
一方、特定ＲＮＡ配列の増幅法（ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等）を用いた場合、比較的一定温度で反応が可能であるため、自動化への適用が容易である。しかし、試料中に存在する極微量の特定ＲＮＡ配列をより高感度に、再現性良く検出するためには、反応効率の更なる向上が必要であった。
【０００６】
これらの増幅法では、（１）ｃＤＮＡ合成の結果、生成されるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分（リボヌクレエースHの消化物）を解離させる、（２）プライマーどうしの結合による非特異産物を低減させる、等の目的で、終濃度１５％程度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＭＳＯは、過剰に添加すると酵素活性を低下させるため、酵素活性の観点からはＤＭＳＯ濃度はなるべく低いほうが増幅効率は向上できると考えられる。しかしながら、一般に特定ＲＮＡ配列の増幅法（ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等）は４１℃で反応を行っているため、ＤＭＳＯ濃度を低下させると、前述の（１）及び（２）が不良となり、増幅効率は低下してしまうという課題があった。
【０００８】
そこで本発明の目的は、ｃＤＮＡ合成の結果、生成されるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのRNA部分（リボヌクレエースHの消化物）の解離と、プライマーどうしの結合による非特異産物の低減を達成しつつ、ＤＭＳＯ濃度を使用しないか、又は従来と比較して低濃度のＤＭＳＯを使用するのみの、酵素活性の低下を防止できる、増強された特定核酸の増幅方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成べく、本発明者らが鋭意研究を行った結果、特定ＲＮＡ配列の増幅反応を４８℃〜５１℃の温度範囲で行うことによって、ｃＤＮＡ合成の結果、生成されるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分（リボヌクレエースＨの消化物）の解離、及び、プライマーどうしの結合による非特異産物の低減が可能であり、これによってＤＭＳＯ濃度を０〜３％という低濃度に抑え、酵素活性に対するＤＭＳＯの影響を低減できることが見出され、本発明が完成された。
【００１０】
即ち本発明は、特定ＲＮＡ配列を鋳型として、特定ＲＮＡ配列と相補的及び相同的配列を含み、該配列を転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースによって前記特定配列のＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物を更に前記２本鎖ＤＮＡの鋳型とするＲＮＡ増幅方法において、前記反応を４８℃〜５１℃の温度範囲、かつ、０〜３％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度範囲で行うことを特徴とする、増強された特定配列の増幅方法である。
【００１１】
また本発明は、特定ＲＮＡ配列又は特定ＲＮＡ配列を含む標的核酸をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下、上記増幅方法により増幅し、反応液の蛍光強度を経時的に測定することを特徴とする特定ＲＮＡ配列又は特定ＲＮＡ配列を含む標的核酸の分析方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本願発明の一つの態様は、標的ＲＮＡを含むと予想される試料に、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｉ）の試薬を用意し、試料にこれらを順次添加するか、これらの２つ以上を一度に添加するか、又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に添加することを要しない）を含み、これらの試薬を終濃度０〜３％のＤＭＳＯ存在下、４８℃〜５１℃で反応させる工程からなる増強された特定核酸の増幅方法である。
【００１３】
（Ａ）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｃ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸
（Ｄ）リボヌクレエースＨまたは同等のＲＮＡ分解活性を有する酵素、
（Ｅ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｇ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｈ）リボヌクレオシド三リン酸（アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、シチジン三リン酸、グアノシン三リン酸）
（Ｉ）イノシン三リン酸
本発明の別の態様では、上記試薬（Ａ）及び試薬（Ｅ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる以外に、以下の試薬（Ｊ）及び試薬（Ｋ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてもよい。
【００１４】
（Ｊ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｋ）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列の５’側末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド
特定ＲＮＡ配列とは、上記（Ａ）及び（Ｅ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した場合、５’末端が（Ｅ）で述べた第２の１本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列で始まり、３’末端が（Ａ）で述べた第１の１本鎖オリゴヌクレオチドと相補的な配列で終わる、前記１本鎖ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分であり、上記（Ｊ）及び（Ｋ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した場合、５’末端が（Ｋ）で述べた第２の１本鎖オリゴヌクレオチドと同一な配列で始まり、３’末端が（Ｊ）で述べた第１の１本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列に相補的な配列で終わる、前記１本鎖ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分である。特定ＲＮＡ配列は任意に決定することができるが、標的ＲＮＡを他の核酸から区別し得る程度に特異的な配列部分を含むようにすることが重要である。
【００１５】
試薬（Ａ）は、特異的塩基配列３‘末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬は標的ＲＮＡに相補結合し、後述する試薬（Ｂ）及び（Ｃ）の共存下で、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる該ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成が行われる際に、該ｃＤＮＡの５’側末端に特定ＲＮＡ配列の３’末端と相補的な配列が位置するようにするためのものである。
【００１６】
試薬（Ｂ）はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースであり、試薬（Ｃ）はその基質となるデオキシリボヌクレオシド三リン酸である。試薬（Ａ）〜（Ｃ）の共存下で、標的ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列３’末端に相補的な配列を５’末端に持つｃＤＮＡが合成される。このｃＤＮＡは、鋳型となったＲＮＡと、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖を形成した状態である。
【００１７】
試薬（Ｄ）は、上記ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有するリボヌクレエースＨであるか、同等のＲＮＡ分解活性を有する酵素を用いることもできる。トリ筋芽細胞腫ウイルス逆転写酵素（以下、ＡＭＶ逆転写酵素）に代表される逆転写酵素は、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有しており、この種の酵素を用いてもよい。
【００１８】
試薬（Ｅ）は、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定ＲＮＡ配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチドである。第２のオリゴヌクレオチドにおいて、（３）の部分は試薬（Ａ）〜（Ｄ）が共存することで合成されるｃＤＮＡの３’末端に結合する。従って試薬（Ｃ）と（Ｆ）の共存により、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端から該ｃＤＮＡを鋳型として、また同時に該ｃＤＮＡの３’末端から該第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりそれぞれの相補鎖が合成され、転写可能なプロモーター配列を有する完全な２本鎖ＤＮＡが合成される。
【００１９】
試薬（Ｆ）はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースである。ＡＭＶ逆転写酵素に代表される逆転写酵素には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性を有するものがあり、この種の酵素を用いてもよい。
【００２０】
試薬（Ｇ）は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースであり、試薬（Ｈ）と（Ｉ）はその基質となるリボヌクレオシド三リン酸及びイノシン三リン酸である。試薬（Ｃ）及び（Ｅ）及び（Ｆ）の共存により合成される２本鎖ＤＮＡはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端に有する。このため、試薬（Ｇ）、（Ｈ）及び（Ｉ）の共存下では該ＤＮＡ合成後、直ちに特定ＲＮＡ配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成が開始される。試薬（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースとしては、具体的に例えばＴ７  ＲＮＡポリメレースやＴ３  ＲＮＡポリメレース、ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース等を例示することができる。
【００２１】
試薬（Ｇ）〜（Ｉ）の共存により合成される１本鎖ＲＮＡは特定ＲＮＡ配列からなるＲＮＡである。従って、これらが合成されて試薬（Ａ）〜（Ｆ）と共存することにより、上述した一連の反応が繰り返し生じることとなる。このように、本発明では試料中に存在する極微量の標的ＲＮＡをもとにして前記の如きプロモータ領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが特定ＲＮＡ配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成源となる。合成された１本鎖ＲＮＡは新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与し、結果として時間の経過とともに特定ＲＮＡ配列からなる１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大する。
【００２２】
本発明の別の態様は、反応温度４８℃〜５１℃、ＤＭＳＯ濃度０〜３％で行う前記特定核酸の増幅工程において、試薬（Ｌ）を添加し、反応液の蛍光強度を測定する工程を含む、特定核酸の分析方法である。
【００２３】
（Ｌ）前記特定ＲＮＡ配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の一本鎖オリゴヌクレオチド
試薬（Ｌ）は、特定ＲＮＡ配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチドである。第３のオリゴヌクレオチドは、例えばインターカレーター性蛍光色素が結合されたＤＮＡであれば良い。該ＤＮＡ部分は、特定ＲＮＡ配列の特異的分析のため、６〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは１０〜３０ヌクレオチドとすることが好ましい。むろん該ＤＮＡ部分は、特定ＲＮＡ配列中に存在する配列であって、標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列部分と相補的な配列であることが重要である。
【００２４】
ＤＮＡ部分は合成された特定ＲＮＡ配列からなる１本鎖ＲＮＡと相補結合を形成した場合に、既に添加されている試薬（Ｃ）におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースが作用してその３’末端からの伸長が生じないように、該３’末端が特定ＲＮＡ配列と非相補的な配列が付加されているか、または、その３’末端が化学的に修飾されていることが好ましい。
【００２５】
インターカレーター性蛍光色素は、ＤＮＡ部分が他の核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分にインターカレーションして蛍光特性が変化するものである。この目的のためには、インターカレーター性蛍光色素を、２本鎖部分へのインターカレションを妨げない程度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合することが例示できる。かかるリンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が２本鎖部分にインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はない。特に両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また、例えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ，商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を使用することもできる。
【００２６】
インターカレーター性蛍光色素としては、２本鎖にインターカレーションすることで、例えば発する蛍光波長が変動したりする等、その蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、測定の容易さ等の観点からインターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが特に好ましい。より具体的には特に蛍光強度の変化が著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体を特に好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。
【００２７】
インターカレーター性蛍光色素がリンカーを介してＤＮＡに結合される位置は、ＤＮＡの５’末端、３’末端または中央部等、インターカレーター性蛍光色素の２本鎖へのインターカレーションが妨げられず、かつ、ＤＮＡ部分とＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り特に制限はない。
【００２８】
プロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型として試薬（Ｇ）〜（Ｉ）により合成される１本鎖ＲＮＡ量は経時的に増加する。
【００２９】
試薬（Ｌ）を、上記特定ＲＮＡ配列を含むと予想される試料に、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｉ）とともに共存させ、増加する特定ＲＮＡ配列を有する１本鎖ＲＮＡを、蛍光信号として測定する。ここで、合成された１本鎖ＲＮＡと試薬（Ｌ）の第３のオリゴヌクレオチドが相補結合を形成し、蛍光信号を発した場合であっても、このＲＮＡは試薬（Ａ）〜（Ｃ）共存下でのＤＮＡ合成における鋳型として機能することが明らかとなった。即ち本発明では、各試薬の共存状態においてＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、２本鎖ＤＮＡの合成、２本鎖ＤＮＡからのＲＮＡ合成という一連の現象が、第３のオリゴヌクレオチド共存下で生じ、ＲＮＡの増加に比例して蛍光強度が増加する。
【００３０】
本発明の別の態様は、反応温度４８℃〜５１℃、ＤＭＳＯ濃度０〜３％で行う前記分析方法において、上記試薬（Ａ）及び試薬（Ｅ）及び試薬（Ｌ）の第１及び第２及び第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせて用いる代わりに、試薬（Ｊ）及び試薬（Ｋ）及び試薬（Ｍ）の第１から第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた特定配列の分析方法である。
【００３１】
（Ｍ）前記一本鎖ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列に同一な配列を有し、該配列と相補的配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の一本鎖オリゴヌクレオチド
試薬（Ｊ）は、５’側末端から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬の（３）の部分は特定ＲＮＡ配列中の３’側末端に相補結合し、試薬（Ａ）を用いた場合と同様に、試薬（Ｂ）及び（Ｃ）及び（Ｄ）の存在下で、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。
【００３２】
試薬（Ｋ）は、該ｃＤＮＡの特定ＲＮＡ配列中の５’側末端に相補的配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬（Ｋ）は、該ｃＤＮＡの特定ＲＮＡ配列中の５’側末端に相補的結合をした後、試薬（Ｃ）及び試薬（Ｆ）の共存により、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが合成される。更に該２本鎖ＤＮＡは、試薬（Ｇ）〜（Ｈ）の共存により、特定ＲＮＡ配列に相補的な第２の１本鎖ＲＮＡが合成される。更に試薬（Ｉ）を共存させることにより、該１本鎖ＲＮＡの合成量は飛躍的に増大する。
【００３３】
更に、該第２のＲＮＡの３’側末端は試薬（Ｋ）と相補結合し、試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存下で、該第２のＲＮＡの第２のｃＤＮＡが合成される。該第２のｃＤＮＡは試薬（Ｊ）の（３）部分と相補結合し、試薬（Ｃ）及び試薬（Ｆ）によりプロモーター配列を含有する２本鎖ＤＮＡが合成され、試薬（Ｇ）〜（Ｉ）により該第２のＲＮＡが合成される。合成された特定ＲＮＡ配列に相補的な該第２のＲＮＡは、新たな２本鎖ＤＮＡの合成源となり、一連の反応が繰り返し生じることにより、結果として該第２のＲＮＡの量は飛躍的に増大する。
【００３４】
ここで得られた該第２のＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ配列と相補的な配列を有する。特定ＲＮＡ配列と同一な配列を有し、かつインターカレーター性蛍光色素で標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチドである試薬（Ｍ）を共存させることにより、合成された該第２のＲＮＡ量に比例して蛍光強度が増加する。
【００３５】
本願発明における蛍光信号の測定は、好ましくは試薬（Ａ）〜（Ｉ）及び試薬（Ｌ）または試薬（Ｍ）の添加直後から、又は、添加後所定時間経過後から経時的に行う。試薬（Ｌ）または試薬（Ｍ）の第３のＤＮＡは、１本鎖ＲＮＡの合成過程において、合成されたＲＮＡと結合・解離を繰り返すが、結合時に測定される蛍光信号は各測定時における該ＲＮＡの存在量を反映するため、１本鎖ＲＮＡの増加する様子を経時的に追跡することが可能である。なお、測定自体は連続的なものであっても一定時間毎の間欠的なものであっても良い。また、蛍光信号の測定装置は、本願発明の一部を構成しないが、１本以上の反応管中の蛍光信号を連続的または一定時間毎の間欠的に測定できるものであれば如何なる装置を用いても良い。
【００３６】
蛍光信号の測定時間は、一定量の標的ＲＮＡを含んだ試験区の蛍光強度が増加する時間が標的ＲＮＡを含まない試験区と有為に差の見られる時間を含み、一定量の標的ＲＮＡを含んだ試験区の蛍光強度がほぼ一定になるまでの時間で、概ね４時間、好適条件では１時間である。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
標的核酸増幅におけるＤＭＳＯ添加（終濃度１４．３％）、非添加の効果を検討した。
【００３９】
（１）標準ＲＮＡは、５’側からグアニン、アデニン、アデニン、ウラシル、アデニン、シトシン、アデニン、アデニンという塩基配列に引き続いて、ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基番号１１〜３００（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）からなり、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い５×１０6／２μｌとなるよう希釈した。陰性コントロール（Ｎｅｇａ）には、前記ＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００４０】
（２）以下の組成の反応液９．６６μｌをＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料２μｌを添加後、ミネラルオイル５０μｌを重層した。続いて、６５℃で５分間加温した。
【００４１】
反応液の組成
６２．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液  （ｐH８．１）
２１．０ｍＭ  酢酸マグネシウム
１９４．１ｍＭ  酢酸カリウム
１２．４％  ソルビトール
１５．５ｍＭ  ＤＴＴ
各１．５５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
０．３１μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号１）
０．３１μＭのＳＰ６プロモーター配列を有する第２のオリゴヌクレオチド（配列番号２；配列番号２のオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端から１７番目のアデニンまではＳＰ６プロモータ配列であり、また１８番目のグアニンから２５番目のアデニンまではエンハンサー配列である）
２２．２％（終濃度１４．３％）又は０％（非添加）のＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
（３）上記の反応液を、それぞれ４４℃、４７℃、５０℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液２．５９μｌを添加した。
【００４２】
酵素液の組成
８．１ Ｕ／μｌ  ＡＭＶ逆転写酵素  （宝酒造製）
３３．０ Ｕ／μｌ  ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース  （宝酒造製）
１１．６ Ｕ／μｌ  リボヌクレエース  インヒビター（宝酒造製）
０．０１６％ 牛血清アルブミン
（４）それぞれを４４、４７、５０℃で５分間反応させた後、２０ｍＭのＮＴＰ水溶液（各２．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を０．７５μｌ添加して、それぞれ４４、４７、５０℃で４時間反応させた。
【００４３】
（５）反応液８．３μｌを取り出し、２％ アガロース電気泳動を行った後、ゲルをＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ（宝酒造製）で染色した。
【００４４】
電気泳動の結果を図１に示した。また、この結果で得られた特異産物のバンドの黒化度をデンシトメーターで定量した結果を図２に示した。反応温度４４℃の場合、ＤＭＳＯ添加及びＤＭＳＯ非添加で特異産物のバンドが認められた。反応温度４７℃及び５０℃の場合、ＤＭＳＯ添加では特異産物は生成されず、ＤＭＳＯ非添加では顕著な特異産物が認められた。ただし、ＤＭＳＯ非添加の場合、４４℃及び４７℃では特異産物と同時に顕著な非特異産物も認められた（図１）。このことから、ＤＭＳＯ添加によって非特異産物の生成は低減されるが、同時に増幅効率も低下することが示された。増幅産物量（バンド黒化度）は、５０℃、ＤＭＳＯ非添加が最高で、４４℃、ＤＭＳＯ添加に比べて増幅効率が向上していると結論された（図２）。
【００４５】
実施例２
標的核酸増幅（反応温度４８、５０℃）における低濃度ＤＭＳＯ（終濃度０〜３％）の効果を検討した。
【００４６】
（１）ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基番号１１３〜２６７（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）を標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１０4コピー／４μｌとなるよう希釈した。陰性コントロール（Ｎｅｇａ）には、前記ＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００４７】
（２）以下の組成の反応液１５．２μｌをＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料４μｌを添加後、ミネラルオイル１００μｌを重層した。
【００４８】
反応液の組成
５９．２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液  （ｐH８．１）
１３．２ｍＭ  酢酸マグネシウム
１３０．２ｍＭ  酢酸カリウム
１５．８％  ソルビトール
１９．７ｍＭ  ＤＴＴ
各１．０ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
２．５ｍＭのＩＴＰ
０．４μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号３）
０．４μＭのＳＰ６プロモーター配列を有する第２のオリゴヌクレオチド（配列番号４；配列番号４のオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端から１７番目のアデニンまではＳＰ６プロモータ配列であり、また１８番目のグアニンからアデニンまではエンハンサー配列である）
０．０４９μＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された第３のオリゴヌクレオチド（配列番号５；配列番号５のオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端から５番目のシトシンと６番目のグアニンの間にインターカレーター性蛍光色素が標識され、またその３’末端はグリコール酸修飾されている。以後、ＹＯ−２７１と称する）
３．９Ｕ／μｌ  リボヌクレエース  インヒビター（宝酒造製）
各種濃度（０％、２．０％、４．０％、５．９％）のＤＭＳＯ、それぞれの終濃度は、０％、１．０％、２．０％、３．０％
容量調製用蒸留水
（３）反応液を６５℃で５分間加温した。
【００４９】
（４）上記の反応液を、５０℃で５分間保温後、あらかじめ５０℃、１分間保温した以下の組成の酵素液１０．８μｌを添加した。
【００５０】
酵素液の組成
８３．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液  （ｐH８．１）
１８．５ｍＭ  酢酸マグネシウム
１８２．４ｍＭ  酢酸カリウム
２２．２％  ソルビトール
３．９Ｕ／μｌ  ＡＭＶ逆転写酵素  （宝酒造製）
１５．７Ｕ／μｌ  ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース  （宝酒造製）
０．２８ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光度計を用い、５０℃に保温して、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。
【００５１】
各点の蛍光強度からバックグラウンドの蛍光強度を差し引いた結果を図３ に示した。反応温度５０℃の場合、ＤＭＳＯ濃度０〜２％で顕著な蛍光増加が認められた。ＤＭＳＯ濃度０％及び１％では、反応時間３０分で急激な蛍光強度の増加（立ち上がり）が認められたが、ＤＭＳＯ濃度２％における立ち上がりは約４０分であった。反応温度４８℃の場合、 ＤＭＳＯ濃度１〜３％で顕著な蛍光増加が認められた。いずれの反応温度の場合もＤＭＳＯ濃度を上げると増幅効率が低下する傾向が見られた。以上の結果から、反応温度４８℃、あるいは５０℃と設定した場合、ＤＭＳＯ濃度は０〜３％の範囲で設定するのが妥当であり、特に反応温度５０℃、ＤＭＳＯ非添加の条件で最も高い増幅効率が得られることが示された。
【００５２】
実施例  ３
ＤＭＳＯ非添加の核酸増幅における反応温度の検討を行った。
【００５３】
（１）ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基番号１１３〜２６７（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）を標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１０6、１０4コピー／４μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅｇａ）には、前記ＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００５４】
（２）以下の組成の反応液１５．２μｌをＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料４μｌを添加後、ミネラルオイル１００μｌを重層した。
【００５５】
反応液の組成
５９．２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液  （ｐH８．２）
１３．２ｍＭ  酢酸マグネシウム
１１８．７ｍＭ  酢酸カリウム
１５．８％  ソルビトール
１９．７ｍＭ  ＤＴＴ
各１．０ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
２．０ｍＭのＩＴＰ
０．４μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号３）
０．４μＭのＳＰ６プロモーター配列を有する第２のオリゴヌクレオチド（配列番号４）
０．０４９μＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された第３のオリゴヌクレオチド（ＹＯ−２７１、配列番号５）
３．９Ｕ／μｌ  リボヌクレエース  インヒビター（宝酒造製）
容量調製用蒸留水
（３）上記の反応液を、５０℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液１０．８μｌを添加した。
【００５６】
酵素液の組成
８３．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液  （ｐH８．２）
１８．５ｍＭ  酢酸マグネシウム
１６６．７ｍＭ  酢酸カリウム
２２．２％  ソルビトール
３．９Ｕ／μｌ  ＡＭＶ逆転写酵素  （宝酒造製）
１５．８Ｕ／μｌ  ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース  （宝酒造製）
０．２７μｇ／μｌ  牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光度計を用い、５０℃に保温して、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。
【００５７】
蛍光強度比（各反応時間における蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図４に示した。
【００５８】
ＤＭＳＯ非添加、反応温度４８℃〜５１℃で顕著な蛍光増加が認められたが、５０℃における蛍光増加が最高であった。
【００５９】
以上のことから、ＤＭＳＯ非添加の場合、反応温度４８℃〜５１℃で顕著な増幅効率が得られるが、反応温度を５０℃とすることによって最も高い増幅効率が得られることが示された。
【００６０】
実施例  ４
標的核酸増幅（反応温度５０℃）における低濃度ＤＭＳＯ（終濃度０〜４％）の効果を検討した（プロモーター配列を持つ第一のオリゴヌクレオチドを用いた場合）。
【００６１】
（１）ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基番号１１３〜２６７（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）を標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い、１０3、及び、１０6コピー／４μｌとなるよう希釈した。陰性コントロール（Ｎｅｇａ）には、前記ＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００６２】
（２）以下の組成の反応液１５．２μｌをＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料４μｌを添加後、ミネラルオイル１００μｌを重層した。
【００６３】
反応液の組成
５９．２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐH８．１）
１３．２ｍＭ  酢酸マグネシウム
１３０．２ｍＭ  酢酸カリウム
１５．８％  ソルビトール
１９．７ｍＭ  ＤＴＴ
各１．０ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各２．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
２．０ｍＭのＩＴＰ
０．４μＭのＳＰ６プロモーター配列を有する第１のオリゴヌクレオチド（配列番号６；配列番号６のオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端から１７番目のアデニンまではＳＰ６プロモータ配列であり、また１８番目のグアニンから２５番目のアデニンまではエンハンサー配列である）
０．４μＭの第２のオリゴヌクレオチド（配列番号７）
０．０４９μＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された第３のオリゴヌクレオチド（配列番号８；配列番号８のオリゴヌクレオチドにおいて、５’末端から１４番目のアデニンと１５番目のシトシンの間にインターカレーター性蛍光色素が標識され、またその３’末端はグリコール酸修飾されている。以後、ＹＯ−ＨＣ１ｂと称する）
３．９Ｕ／μｌ  リボヌクレエース  インヒビター（宝酒造製）
各種濃度（０％、、４．０％、７．９％）のＤＭＳＯ、それぞれの終濃度は、０％、２．０％、４．０％
容量調製用蒸留水
（３）反応液を６５℃で５分間加温した。
【００６４】
（４）上記の反応液を、５０℃で５分間保温後、あらかじめ５０℃、１分間保温した以下の組成の酵素液１０．８μｌを添加した。
【００６５】
酵素液の組成
８３．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液  （ｐH８．１）
１８．５ｍＭ  酢酸マグネシウム
１８２．４ｍＭ  酢酸カリウム
２２．２％  ソルビトール
３．９Ｕ／μｌ  ＡＭＶ逆転写酵素  （宝酒造製）
１５．７Ｕ／μｌ  ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース  （宝酒造製）
０．２８ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光度計を用い、５０℃に保温して、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。
【００６６】
各種濃度のＤＭＳＯ存在下での蛍光強度比（各反応時間における蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図５に示した。ＤＭＳＯ濃度０％の場合は１０6コピー／テストのみが約２０分で顕著な蛍光増加を示した。ＤＭＳＯ濃度２％の場合は１０6コピー／テストが約２０分で、１０3コピー／テストが３０〜４０分で顕著な蛍光増加を示した。ＤＭＳＯ濃度４％の場合は、１０6コピー／テストが約２０分で顕著な蛍光増加を示した。また、１０3コピー／テストは３０〜４０分で蛍光増加を示したが、蛍光増加の傾きの小さいものが認められた。以上から、プロモーター配列を持たせた第一のオリゴヌクレオチドを用いた場合も、反応温度５０℃、ＤＭＳＯ濃度０〜４％の条件で、核酸増幅が認められたが、ＤＭＳＯ濃度２％で最大の増幅効率が得られた。
【００６７】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、試料中の特定ＲＮＡ配列を含む１本鎖ＲＮＡについて、反応液を急激に昇温・降温するという操作を繰り返すことなく、概ね一定温度で、反応開始時に行う１段階の手動操作のみで、かつ、迅速に試料中に元来存在した特定ＲＮＡ配列を増幅する方法において、反応温度を４８℃〜５１℃、ＤＭＳＯ濃度を０〜３％とすることによって増幅効率を飛躍的に向上させることが可能となる。
【００６８】
また、本発明では、試料中の標的ＲＮＡをもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便かつ、迅速に初期ＲＮＡを測定する方法を提供する。
【００６９】
【００７０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の電気泳動結果を示した。標準マーカーとして１０12コピー／レーンの標準ＲＮＡ（２９８ヌクレオチド）、サイズマーカーとしてφＸ１７４／Ｈａｅ  ＩＩＩを泳動した。特異増幅産物のバンドは標準ＲＮＡと同位置に現れる。特異産物と非特異産物のバンドの位置を矢印で示した。
【図２】実施例１の電気泳動結果で得られた特異産物のバンドの濃さをデンシトメーターで定量した結果を示した。
【図３】実施例２で行った測定結果を示した。グラフは、各反応時間における蛍光増加を示したものである。蛍光増加とは、各反応時間における蛍光強度からバックグラウンドの蛍光強度（反応時間０分の蛍光強度）を差し引いた値である。図中、バツ（×）は０コピー／テストの、黒丸（●）は１０4コピー／テストの、そして黒三角（▲）は１０4コピー／テストの結果をそれぞれ示す。
【図４】実施例３で行った測定結果を示した。グラフは、各反応時間に対する蛍光強度比を示したものである。蛍光強度比とは、バックグラウンドの蛍光強度（反応時間０分の蛍光強度）を１とした場合の各時間の蛍光強度の比である。
【図５】実施例４で行った測定結果を示した。グラフは、上から順に、０、２、４％ ＤＭＳＯ添加の場合の各反応時間における蛍光強度比を示したものである。蛍光強度比とは、バックグラウンドの蛍光強度（反応時間０分の蛍光強度）を１とした場合の各時間の蛍光強度の比である。黒菱形（◆）は陰性コントロール、白四角（□）は１０3コピー／テストのＲＮＡ標準、黒丸（●）は１０6コピー／テストのＲＮＡ標準を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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