(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｃ）の少なくともいずれか１つを有効成分とするインスリン分泌誘導剤；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項２】
配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項３】
次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくともいずれか１つを有効成分とするインスリン分泌誘導剤；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｆ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
【請求項４】
配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項３記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項５】
インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドのフラグメントが配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドである請求項３記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項６】
インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドのフラグメントが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドである請求項３記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項７】
インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドのフラグメントが配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドである請求項３記載のインスリン分泌誘導剤。
【請求項８】
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくともいずれか１つを有効成分として含有するインスリン分泌誘導組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病をはじめとする種々の代謝性疾患の治療に有効なインスリン分泌誘導剤及びインスリン分泌誘導組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日本人のライフスタイルの欧米化により、糖尿病、高脂血症、高血圧や肥満といった生活習慣病がクローズアップされている。このような中で消化管は食事中の栄養分を吸収するだけでなく消化管ホルモンを産生する内分泌器官として注目されており、胃で産生されるグレリンの他、消化管から分泌されるグルカゴン様ペプチド-1(Glucagon-like peptide-1：GLP-1)や胃酸分泌抑制ポリペプチド(Gastric inhibitory polypeptide：GIP)などが既にクローニングされている。グレリンは摂食亢進作用を持ちエネルギー代謝と関連がある。GLP-1やGIPはインクレチンとして食事負荷により膵臓に働きインスリン分泌を誘導する。また、GIPは脂肪にも発現しておりGIPレセプターのノックアウトマウスは痩せる事からも肥満との関連も示唆されている。このように、消化管ホルモンはエネルギー代謝や摂食行動などに関わっており、生活習慣病においてその成因の新しいメカニズムの解明につながってきている。しかしながら、消化管ホルモンの全容は未だ明らかにされておらず、不明な部分も多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、これまでに知られていない消化管由来のタンパク質をコードする遺伝子の探索を行い、見出された遺伝子をもとに新たな医薬用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、SST法(Signal Sequence Trap法：Nat Biotechnol. 1999 May;17(5):487-90. A signal sequence trap based on a constitutively active cytokine receptor. Kojima T, Kitamura T.)を採用してマウスの腸管から単離したcDNA断片をもとに取得したクローンCF266(mCF266)が腸管において特異的な発現をしていること、このmCF266の培養上清にはインスリン分泌誘導作用があること、アデノウイルスベクターを使用した強制発現系においてmCF266がin vivoでインスリンの分泌誘導作用を示すことを見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明のインスリン分泌誘導剤は、請求項１記載の通り、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくともいずれか１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
また、請求項２記載のインスリン分泌誘導剤は、請求項１記載のインスリン分泌誘導剤において、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする。
また、本発明のインスリン分泌誘導剤は、請求項３記載の通り、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくともいずれか１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｆ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
また、請求項４記載のインスリン分泌誘導剤は、請求項３記載のインスリン分泌誘導剤において、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドが配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする。
また、請求項５記載のインスリン分泌誘導剤は、請求項３記載のインスリン分泌誘導剤において、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドのフラグメントが配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであることを特徴とする。
また、請求項６記載のインスリン分泌誘導剤は、請求項３記載のインスリン分泌誘導剤において、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドのフラグメントが配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであることを特徴とする。
また、請求項７記載のインスリン分泌誘導剤は、請求項３記載のインスリン分泌誘導剤において、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドのフラグメントが配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであることを特徴とする。
また、本発明のインスリン分泌誘導組成物は、請求項８記載の通り、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくともいずれか１つを有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、糖尿病をはじめとする種々の代謝性疾患の治療に有効なインスリン分泌誘導剤及びインスリン分泌誘導組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のインスリン分泌誘導剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくともいずれか１つを有効成分とすることを特徴とするものである；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチド、
（ｃ）インスリン分泌誘導作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
【０００８】
本発明において、本発明者らがマウスの腸管から取得したｍＣＦ２６６は配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡであるが、このＤＮＡはマウスの筋肉に発現している膜タンパクＴｍ４ｓｆ２０（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ４  Ｌ  ｓｉｘ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２０）をコードするＤＮＡとして公知の全長１５０５ｂｐのものである（ＮＣＢＩ：ＬＯＣＵＳ  ＮＭ  ０２５４５３）。ｍＣＦ２６６のＣＤＳは４１．．７２１であり、配列番号３に記載の２２６個のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている（配列番号２参照）。しかしながら、このポリペプチドがインスリン分泌誘導作用を持つことについての報告はこれまでのところ存在しない。また、本発明者らは、ｍＣＦ２６６に対応するヒトＣＦ２６６（ｈＣＦ２６６）についてもｍＣＦ２６６と同様の作用を有することを確認している。ｈＣＦ２６６は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡであり、ヒトＴＭ４ＳＦ２０をコードするＤＮＡとして公知の全長２３０８ｂｐのものである（ＮＣＢＩ：ＬＯＣＵＳ  ＮＭ  ０２４７９５）。ｈＣＦ２６６のＣＤＳは３８．．７２７であり、配列番号６に記載の２２９個のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている（配列番号５参照）。しかしながら、このポリペプチドがインスリン分泌誘導作用を持つことについての報告もまたこれまでのところ存在しない。
【０００９】
配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドとしては、例えば、ｈＣＦ２６６の一塩基多型（ＳＮＰｓ）に基づく配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる配列番号９に記載の２２９個のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる（配列番号８参照）。配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの相違は、２７番目のアミノ酸が前者がバリン（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））であるのに対して後者がアラニン（ｈＣＦ２６６（２７Ａ））であることである。
【００１０】
インスリン分泌誘導作用を持つポリペプチドのフラグメントとしては、例えば、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの９８〜１１６番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＡＬＹＣＭＬＩＳＩＱＡＬＬＫＧＰＬＭＣ（配列番号１０）を少なくとも含むポリペプチド、同７８〜９６番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＣＮＮＲＴＧＭＦＬＳＳＬＦＳＶＩＴＶＩ（配列番号１１）を少なくとも含むポリペプチド、同１６１から１７９番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＴＳＮＤＴＭＡＳＧＷＲＡＳＳＦＨＦＤＳ（配列番号１２）を少なくとも含むポリペプチドが挙げられる。
【００１１】
本発明のインスリン分泌誘導剤の有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントは、例えば、自体公知の方法で配列番号１や配列番号４や配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを外来遺伝子として胎児腎臓上皮細胞であるＨＥＫ２９３細胞やＨＥＫ２９３Ｔ細胞の他、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に例示される動物細胞などを宿主細胞として組み込み、当該細胞を培養して遺伝子発現させることで、その培養上清から得ることができるが、化学合成により製造してもよい。これらの分離・精製は、例えば、イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどのペプチド化学において通常使用される方法によって行うことができる。
【００１２】
本発明のインスリン分泌誘導剤は、例えば、その有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントを必要に応じて自体公知の方法で薬学的に許容される塩酸塩などの無機酸塩、酢酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩などに変換した上で凍結乾燥品として製剤化し、必要時に生理食塩水などに溶解して注射剤の形態で静脈内投与することでインスリンの分泌を誘導することができる。その用法用量は患者の性別、年齢、体重、病態などによって適宜決定すればよい。なお、本発明のインスリン分泌誘導剤の有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントは、高度に精製された純品を単独で使用してもよいし、複数種類を混合して使用してもよく、種々のインスリン分泌誘導組成物の形態で使用することができる。
【００１３】
また、本発明の説明に供する、遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクターは、外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを組み込んでなることを特徴とするものである。ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、対象とするＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを採用することにより取得できるＤＮＡを意味し、例えば、コロニーやプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルタを使用し、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃条件下でフィルタを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどが挙げられる（必要であれば例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，  １９８９．などを参照のこと）。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列の、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列との相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。本発明の説明に供する、遺伝子治療によりインスリン分泌誘導を行うためのウイルスベクターの具体例としては、自体公知の方法で配列番号１、配列番号４、配列番号７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡをＣＡＧプロモーターなどに連結して構築したアデノウイルスベクターなどが挙げられ、このようなウイルスベクターは静脈内投与することで体内において優れたインスリン分泌誘導作用を示す。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１５】
参考例１：ｍＣＦ２６６が腸管に特異的に発現していることの確認
ＳＳＴ法を採用してマウスの腸管から取得したｍＣＦ２６６のｍＲＮＡの臓器発現分布をノザンブロット法により検討を行った。具体的には、マウスより各臓器を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により添付の説明書に従いｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、定法に従い１０μｇ／ｌａｎｅとなるようにメンブレンを作製し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを使用して標識したｍＣＦ２６６のｃＤＮＡ（ｍＲＮＡクローン）をプローブにしてハイブリダイズすることで行った。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ｍＣＦ２６６は小腸（Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）において特異的な発現をしていることがわかった。
【００１６】
実施例１：マウス膵β細胞由来培養細胞株ＭＩＮ６細胞に対するＣＦ２６６の培養上清のインスリン分泌誘導作用
１０ｃｍ  ｄｉｓｈに５％ＦＣＳと抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地で継代したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０６撒き、その翌日にｍＣＦ２６６発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＣＦ２６６）をＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしてｍＣＦ２６６を強制発現させ、その２４ｈ後にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換し、さらにその２４ｈ後に培養上清を回収した。１５％ＦＣＳと抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ）と２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＧＩＢＣＯ；現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で継代したＭＩＮ６細胞を２４ｗｅｌｌプレートに３×１０５／ｗｅｌｌ撒き、その翌日、ＫＲＢＨ緩衝液（２．８ｍＭグルコース）を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ添加して３０分間前培養した後、上記の培養上清とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ添加して１時間刺激を行い、ＭＩＮ６細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。測定は培養液中のインスリンをＥＬＩＳＡ法（シバヤギのレビスインスリンキットを使用：以下同じ）で測定することで行った。なお、インスリン値はＭＩＮ６細胞の総タンパクで補正した。その結果を、上記の方法と同様の方法で空ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして得た培養上清を添加した場合の結果（Ｍｏｃｋ）と、ヒト腸管ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック；現ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からクローニングした配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））と公知の方法でＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））に対して変異導入することで取得した配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ａ））のそれぞれの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしてそれぞれを強制発現させて得た培養上清を添加した場合の結果とともに図２に示す。図２から明らかなように、ＣＦ２６６を強制発現させた培養上清はＭＩＮ６細胞に対してグルコース応答性のインスリン分泌を誘導し、その作用はとりわけｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を強制発現させた場合が優れていた。
【００１７】
参考例２：ｍＣＦ２６６のｉｎ  ｖｉｖｏでのインスリン分泌誘導作用
ＣＡＧプロモーターにｍＣＦ２６６を連結して構築したアデノウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの商品名ＶｉｒａＰｏｗｅｒを使用して作製）を、高脂肪高ショ糖負荷食を与えた糖尿病モデルマウスＫＫ／Ａｙマウスに５×１０９ＰＦＵ静脈内投与した。その４日後、静脈内糖負荷試験（ｉ．ｖ．ＧＴＴ）を行い、経時的に採血し、血清中の血糖値、インスリン値を測定した。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、糖尿病モデルマウスの体内でｍＣＦ２６６を発現させると、対照としてＧＦＰを発現させた場合と比較して、血糖値は低い傾向が見られるに過ぎなかったが（図３左）、インスリン値は明らかに高く、ｍＣＦ２６６の発現はインスリンの分泌を誘導することがわかった（図３右）。
【００１８】
実施例２：マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対するｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の培養上清に含まれるポリペプチドのインスリン分泌誘導作用
実施例１に記載の方法でｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしてｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を強制発現させて得た培養上清を陰イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ  ＨＱカラム、ＡＢＩ）を使用して分画した。マウスから単離した膵臓ランゲルハンス氏島細胞を２４ｗｅｌｌプレートに１０ｉｓｌｅｔｓ／ｗｅｌｌ撒き、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ、ＧＩＢＣＯ；現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２時間培養した後、ＫＲＢＨ緩衝液（２．８ｍＭグルコース）を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ添加して３０分間前培養した後、上記の培養上清画分とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ添加して１時間刺激を行い、マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。測定は培養液中のインスリンをＥＬＩＳＡ法で測定することで行った。インスリン分泌誘導活性が認められた画分を質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＡＳ）で解析し、特異的に見られたピークの質量から予測された１９個のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＡＬＹＣＭＬＩＳＩＱＡＬＬＫＧＰＬＭＣ（ポリペプチドＡ：配列番号１０）、ＣＮＮＲＴＧＭＦＬＳＳＬＦＳＶＩＴＶＩ（ポリペプチドＢ：配列番号１１）、ＴＳＮＤＴＭＡＳＧＷＲＡＳＳＦＨＦＤＳ（ポリペプチドＣ：配列番号１２）を化学合成した。これら３種類のポリペプチドＡ〜ＣのそれぞれをＫＲＢＨ緩衝液に１０ｎＭの濃度で溶解した溶液を、上記の方法と同様の方法で３０分間前培養したマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ添加して３０分間刺激を行い、上記の方法と同様の方法でマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞のグルコース応答性のインスリン分泌を測定した。なお、インスリン値はマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞の総ＤＮＡで補正した。その結果を、ＫＲＢＨ緩衝液のみを添加して刺激を行ったこと以外は上記の方法と同様の方法で実験を行った場合の結果、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の培養上清とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を添加して刺激を行ったこと以外は上記の方法と同様の方法で実験を行った場合の結果、ヒトＧＬＰ−１（ペプチド研究所）をＫＲＢＨ緩衝液に１０ｎＭの濃度で溶解した溶液を添加して刺激を行ったこと以外は上記の方法と同様の方法で実験を行った場合の結果とともに図４に示す。また、ＫＲＢＨ緩衝液（２．８ｍＭグルコース）に代えてＫＲＢＨ緩衝液（２０ｍＭグルコース）を使用して実験を行った場合の結果を図４にあわせて示す。図４から明らかなように、配列番号４に記載の塩基配列からなるｈＣＦ２６６（２７Ｖ）によりコードされる配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントである３種類のポリペプチドＡ〜Ｃは、マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対してグルコース応答性のインスリン分泌を誘導することがわかった。
【００１９】
製剤例１：
自体公知の方法で配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを滅菌してから凍結乾燥することで静脈注射剤として製剤化した。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明は、糖尿病をはじめとする種々の代謝性疾患の治療に有効なインスリン分泌誘導剤及びインスリン分泌誘導組成物を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例におけるｍＣＦ２６６が腸管に特異的に発現していることを示すノザンブロットの結果である。
【図２】同、ＣＦ２６６の培養上清のインスリン分泌誘導作用を示すグラフである。
【図３】参考例における、ｍＣＦ２６６のｉｎ  ｖｉｖｏでのインスリン分泌誘導作用を示すグラフである。
【図４】実施例における、ｈＣＦ２６６によりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメントのインスリン分泌誘導作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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