(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで可溶化されたヒアルロン酸中に、分岐度が０．５以上の分子量フラクションを含む特徴を有する、ヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含む、徐放剤用担体の生産方法であって、
a)ヒアルロン酸水溶液を凍結、解凍し、ヒアルロン酸ゲルを生成する工程、
を含む生産方法。
【請求項２】
請求項１に記載の徐放剤用担体の生産方法であって、
b)前記ヒアルロン酸ゲル、または前記ヒアルロン酸ゲルを含む水溶液に対して、凍結、解凍を２回行う工程、
を含む生産方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の徐放剤用担体の生産方法であって、
前記凍結時間が、２０時間以上である、
生産方法。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載の徐放剤用担体の生産方法であって、
c)工程a)またはb)で得られるヒアルロン酸ゲルを緩衝液で浸漬中和する工程と、
d)工程c)で浸漬中和されたヒアルロン酸ゲルをろ過洗浄する工程と、
を含む生産方法。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載の徐放剤用担体の生産方法で得られる、徐放剤用担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含有する生体吸収性薬物担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、薬物は経口、静注、筋注等の経路で体内に投与された場合、循環系にのって全身に分布し、肝臓あるいは腎臓を経て代謝、排泄される。
しかし、薬物の持つ薬理活性を最も有効に活用する為には、薬物を対象部位に適切な濃度で適切な時間作用させることが望ましく、この観点から、薬物に生体吸収性の物質からなる担体を用いて投与剤形を工夫し、薬物の効果をより発揮させる試みがなされてきた。
【０００３】
このような用途に用いられる生体吸収性の材料としては、生体適合性が高く、用途に応じて様々な形態に成形可能なものが望ましく、乳酸／グリコール酸、コラーゲン、ヒアルロン酸等が用いられている。中でも、ヒアルロン酸は本来、ヒトの体内に存在する物質であり、さらに眼科手術補助剤や関節注入剤等の医薬品として長い使用実績があることから、その生体適合性は充分に確認されていた。しかし、ヒアルロン酸は、体内では速やかに吸収されることから、薬物担体としての利用には制限があった。
【０００４】
そこで、他の材料と組み合わせる、あるいは、ヒアルロン酸を化学的に修飾して難水溶性とする、試みがなされてきた。例えば、乳酸／グリコール酸共重合体でつくった円筒の中に、エリスロポイエチンとヒアルロン酸の混合物を入れた製剤（日経バイオテク１９９４．３．２８）や、ヒアルロン酸と脂肪族、芳香脂肪族、等との完全または部分エステルからなる薬理活性物質のための担体（特許２５６９０１２号）等がある。
【０００５】
しかし、これらは、ヒアルロン酸それ自体で担体を形成しておらず、前者は実質的に他の成分が担体として機能しており、又、後者は、化学構造が本来のヒアルロン酸とは異なる物質となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生体適合性の特長を最大限生かすために、何ら化学的架橋剤や化学修飾剤を使用することなく、またカチオン性の高分子化合物と複合体を形成することなくヒアルロン酸そのものを難水溶性にする手段はこれまで開発されていなかった。我々は、架橋剤等を使用しないでヒアルロン酸単独からなるヒアルロン酸ゲルを簡便な方法で製造することを初めて見出し（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０３５３６号）、今回、この難水溶性ヒアルロン酸ゲルの生体吸収性薬物担体への適用の可能性を鋭意検討し、その有用性を見出し本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、（１）中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含有する生体吸収性薬物担体、（２）次の（ａ）、（ｂ）の要件を満たすヒアルロン酸単独で形成されたゲルを含有することを特徴とする生体吸収性薬物担体、（ａ）中性の３７℃の水溶液で１２時間での溶解率が５０％以下である、（ｂ）ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで可溶化されたヒアルロン酸が分岐構造を有し、該可溶化されたヒアルロン酸中に、分岐度が０．５以上の分子量フラクションを部分的に含む、（３）ヒアルロン酸単独で形成されたゲルが、シート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、又はチューブ状からなる群より選択した１種であることを特徴とする（２）記載の生体吸収性薬物担体、（４）中性の３７℃の水溶液で１２時間での溶解率が５０％以下であり、ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで可溶化されたヒアルロン酸中に、分岐度が０．５以上の分子量フラクションを部分的に含むヒアルロン酸ゲルと、ゲル化されていないヒアルロン酸を含む生体吸収性薬物担体、（５）シート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、又はチューブ状であるヒアルロン酸単独で形成されたヒアルロン酸ゲルと、ゲル化されていないヒアルロン酸を含む生体吸収性薬物担体である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいうヒアルロン酸ゲルとは、三次元網目構造をもつ高分子及びその膨潤体である。三次元網目構造はヒアルロン酸の架橋構造によって形成されている。
【０００９】
その一例としては、ヒアルロン酸のｐＨ３．５以下の水溶液を凍結し、次いで解凍することでシート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、又はチューブ状の中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸ゲルを得ることができる。より具体的には以下に述べる。
【００１０】
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第9027号) 、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
【００１１】
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は、約１×１０5 〜約１×１０7 ダルトンの範囲内のものが好ましい。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、より高分子量のものから、加水分解処理等をして得たものでも同様に好ましく使用できる。
なお、本発明にいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
【００１２】
本発明でいうヒアルロン酸単独とは、ヒアルロン酸以外に化学的架橋剤や化学的修飾剤等は使用しないことまた、カチオン性の高分子と複合体化しないことであり、自己架橋を意味するものである。
【００１３】
本発明でいうヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件下でヒアルロン酸ゲルを処理することで分解、可溶化することができる。可溶化されたヒアルロン酸が架橋構造を保持している場合、分岐点を有するヒアルロン酸として高分子溶液論的に直鎖状のヒアルロン酸と区別することができる。
【００１４】
本発明でいうヒアルロン酸の促進酸加水分解反応条件としては、水溶液のｐＨ１．５、温度６０℃が適当である。ヒアルロン酸のグリコシド結合の加水分解による主鎖切断反応が、中性の水溶液中と比較して、酸性やアルカリ性の水溶液中で著しく促進される。更に酸加水分解反応は、反応温度が高い方が促進される。
【００１５】
本発明ではＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法を用い、ＧＰＣで分離された分子量フラクションの分子量と分岐度をオンラインで連続的に測定した。本発明では、同一溶出体積のフラクションの可溶化されたヒアルロン酸の分子量と対照となる直鎖状ヒアルロン酸の分子量を比較して分岐度を計算する溶出体積法を使って分岐度の測定を行った。分岐度は可溶化されたヒアルロン酸の高分子鎖１コ当たりに存在する分岐点の数であり、可溶化されたヒアルロン酸の分子量に対してプロットされる。
【００１６】
可溶化されたヒアルロン酸は、ＧＰＣ溶媒で希釈して濃度を調製し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後測定に供した。
本発明でいうヒアルロン酸ゲル中に、ヒアルロン酸の促進酸加水分解条件下でも安定に存在する架橋構造がある場合、可溶化されたヒアルロン酸に分岐構造が高分子溶液論的に確認される。本発明でいうヒアルロン酸ゲルの分岐度は、０．５以上である。
【００１７】
ヒアルロン酸の水溶液のｐＨを調整するために使用する酸は、ｐＨ３．５以下に調整できる酸であれば、いずれの酸も使用することができる。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等を使用することが望ましい。
【００１８】
ヒアルロン酸の水溶液のｐＨは、ヒアルロン酸のカルボキシル基が充分な割合でプロトン化するｐＨに調整する。調整されるｐＨはヒアルロン酸塩の対イオンの種類、ヒアルロン酸の分子量、水溶液濃度、凍結及び解凍の条件、並びに生成するゲルの強さ等の諸特性により適宜決められるが、本発明では、ｐＨ３．５以下、好ましくは、ｐＨ２．５以下に調整することである。
【００１９】
凍結、解凍はヒアルロン酸の調整された酸性水溶液を、任意の容器に入れた後、所定の温度で凍結させ、凍結が終わった後、所定の温度で解凍させる操作を少なくとも１回行う。凍結、解凍の温度と時間は、容器の大きさ、水溶液量によりヒアルロン酸の酸性水溶液が凍結、解凍する温度と時間の範囲内で適宜決められるが、一般には、氷点以下の凍結温度、氷点以上の解凍温度が好ましい。
凍結、解凍時間を短くできることから、更に好ましくは−５℃以下の凍結温度、５℃以上の解凍温度が選ばれる。また、時間は、その温度で凍結、解凍が終了する時間以上であれば特に制限されない。
【００２０】
ヒアルロン酸の調整された酸性水溶液を凍結し、次いで解凍する操作の繰り返し回数は、使用するヒアルロン酸の分子量、水溶液濃度、水溶液のｐＨ、凍結及び解凍の温度と時間、並びに生成するゲルの強さ等の諸特性により適宜決められる。通常は１回以上繰り返すことが好ましい。
また、凍結、解凍の操作を繰り返すごとに、その凍結、解凍の温度及び時間を変えても構わない。
【００２１】
ヒアルロン酸の調整された酸性溶液の凍結解凍により得られたヒアルロン酸ゲルは、ヒアルロン酸の酸加水分解を避けるために、酸性に調整するために用いた酸等の成分を除く必要がある。酸等の成分を除くためには、通常は水性溶媒による洗浄か透析をする。
使用する溶媒は、ヒアルロン酸ゲルの機能を損なわないものであれば特に制限はないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等が用いられるが、好ましくは、生理食塩水、リン酸緩衝液等が用いられる。
【００２２】
また、洗浄・透析方法は、特に制限はないが、通常は、バッチ法、濾過法、カラム等に充填して通液する方法等が、また、透析の場合、透析膜、限外ろ過膜による方法等が好適に用いられる。これらの条件は、液量、回数等を含めて、除きたい成分を目標の濃度以下にできる条件であればよく、ヒアルロン酸ゲルの形態や用途により適宜選択することが可能である。
【００２３】
この洗浄・透析されたヒアルロン酸ゲルは、その使用目的に応じて、溶媒中に浸漬した状態、溶媒を含ませた湿潤状態、風乾、減圧乾燥あるいは凍結乾燥等の処理を経た乾燥状態で生体吸収性薬物担体として供される。
【００２４】
ヒアルロン酸ゲルの成形加工等の処理は、作製時には、ヒアルロン酸の調整された酸性溶液の凍結時の容器や手法の選択によりシート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、繊維状、又チューブ状の所望の形態のヒアルロン酸ゲルの作製が可能である。例えば、板上にキャスティングして凍結することによりフィルム状及びシート状の形態が得られるし、水と混和しない有機溶剤と激しく混合撹拌しながら凍結解凍することにより破砕状の形態が得られる。
【００２５】
ヒアルロン酸の分子量、濃度、等の条件を変えることで、生体吸収性の異なる種々の難水溶性ヒアルロン酸ゲルが得られる。
【００２６】
本発明の生体吸収性薬物担体は、それ自体で、あるいは他の生体適合性物質や通常自体公知の医薬用添加剤等ともに製剤化することができ、注入、吸入、インプラント、経口投与等の薬物担体として用いることできる。
【００２７】
本発明の難水溶性ヒアルロン酸ゲルを含有する生体吸収性薬物担体は、イオン結合等の非共有結合により、薬物の活性を損なうことなく、担体に保持することができる。本来、ヒアルロン酸に親和性のあることが知られている、４級アンモニウム塩（生化学実験講座４糖質の化学（上）ｐ１３６−）、クロルプロマジン（Ｎ．Ｃａｒａｍ−Ｌｅｌｈａｍｅｔａｌ．Ｂｉｏｐｏｌｙ，４１：７６５−１９９７）、各種金属イオン（特開平５−１２４９６８号、特表平２−５０２５４７号、特表昭６３−５０２６７０号）等は、本発明の難水溶性ヒアルロン酸ゲルにおいても同様に、水溶液中で容易に保持することができる。さらに、これらの親和性のある物質を介して別の薬物を保持させることもできる。例えば、金属イオンを介して、金属タンパク質を保持できる。
【００２８】
ヒアルロン酸と親和性のある薬物としては、具体的に、セチルピリジニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、カルニチン、ブチルスコポラミン、バレタメート、メチルベナクチジウム、イプラトロピウム、カルバコール、エチルピペタナート、チメピジウム、ブトロピウム、プリフィニウム、クロルプロマジン、プロマジン、ドキセピン、アミトリプチリン等が挙げられる。
【００２９】
ヒアルロン酸と親和性の無い薬物は、水溶液として、あるいは、ヒアルロン酸や血清アルブミンのような生体適合性物質の水溶液に溶解して、担体中に導入することができ、これを凍結乾燥する等の方法により製剤化することができる。
【００３０】
本発明は、様々な分野の治療に用いることができ、その適用部位によりシート状、フィルム状、破砕状、スポンジ状、塊状、繊維状、又はチューブ状からなる群より選択できる。経粘膜投与の場合は、シート状、フィルム状、スポンジ状が局所への貼付に好適であり、経肺投与の場合は破砕状で乾燥したサイズが１〜３μｍのものが咳の原因となる事もなく好適である。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
調製例１：難水溶性ヒアルロン酸ゲルの作製
分子量２×１０6ダルトンのヒアルロン酸を蒸留水に溶解し、１％の溶液を調製した。この水溶液に１Ｎ硝酸を添加しｐＨ１．５に調整した後、ヒアルロン酸２５ｍｇ分をバイアル瓶に入れ、−２０℃に設定した冷凍庫で凍結した。２０時間後に取り出し２５℃で２時間解凍する操作を３回繰り返し難水溶性ゲルを得た。
次に、このゲルをｐＨ７の２５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１００ｍｌに２４時間浸漬中和した後、蒸留水で十分にろ過洗浄し、塊状の難水溶性ゲルを得た。
【００３３】
実施例１：難水溶性ヒアルロン酸ゲルの溶解性試験
生理食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水を調製した。調製例１で作製した難水溶性ゲルを５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に浸漬し緩やかに攪拌した。３７℃でリン酸緩衝生理食塩水中に溶出するヒアルロン酸の割合を、リン酸緩衝生理食塩水中のヒアルロン酸濃度から求めた。
【００３４】
ヒアルロン酸濃度の測定
リン酸緩衝生理食塩水中のヒアルロン酸濃度は、ＧＰＣを使って、示差屈折率検出器のピーク面積から求めた。
【００３５】
その結果、調製例１で得られたヒアルロン酸ゲルの溶解率は、１２時間経過後では、３％であり、２４時間経過後では、５％であり、２４時間経過しても８５％のヒアルロン酸ゲルが残存していた。
よって、調製例１で得られたヒアルロン酸ゲルが中性水溶液に難溶性であることが示唆される。
【００３６】
実施例２：難水溶性ヒアルロン酸ゲルの分岐度測定
調製例１で得られた難水溶性ヒアルロン酸ゲルを、ｐＨ１．５の塩酸水溶液１５ｍｌに浸漬し、６０℃、６時間の加水分解を行った。ゲルは加水分解により可溶化され、これをＧＰＣ溶媒で２倍に希釈して濃度を０．０５重量％に調製し、０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、０．１ｍｌ注入してＧＰＣ−ＭＡＬＬＳの測定を行った結果、分岐度０．５以上であった。
【００３７】
実施例３：生体吸収性試験
マウス（ＩＣＲ♀８週令）の腹腔内に開腹手術により調製例１の難水溶性ゲルあるいは比較として、１ｍｌ１％ヒアルロン酸溶液を入れた。術後２、４、８日後に開腹し、残存するゲルを回収し、腹腔内に生理食塩水２ｍｌを注入し、よく撹拌し液を回収した。このゲルと液をアルカリ処理（０．１Ｎ  ＮａＯＨ、２ｈ）した後、中和し、ゲルろ過（ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｋＫＢ８０６）によりヒアルロン酸濃度を測定し、残存率を算出した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0004460665.tif 000002
【００３９】
表１より、調製例１で得られたヒアルロン酸ゲルは、４日後で３３％残存していたのに対し、ヒアルロン酸溶液は０％であり、本発明のヒアルロン酸ゲルは、生体内滞留時間が長いことが示唆される。
即ち、ヒアルロン酸溶液と比較して、生体内での分解吸収速度が遅く、薬物担体として有用な性質を有していることが示唆される。
【００４０】
実施例４：薬物保持試験
調製例１の難水溶性ゲルを各種薬物の２５ｍｇ／５ｍｌ水溶液に入れ、２５℃２４時間静置後のゲル周囲の水溶液中の各薬物濃度を吸光度により測定し、ゲルへの薬物の保持率を算出した。その結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
0004460665.tif 000003
【００４２】
表２より、いずれの薬物もヒアルロン酸ゲルへの保持率は９５％以上と高かった。
【００４３】
実施例５：薬物放出試験
実施例２において薬物を保持したゲルを透析チューブに入れ、５００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４に対して３７℃で透析した。経時的に透析外液の吸光度を測定し、ゲルからの薬物の放出率を算出した。その結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
0004460665.tif 000004
【００４５】
表３より、各薬物ともいずれも、持続的に放出されていることがわかる。  即ち、持続放出システムにも利用できることが示唆される。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、ヒアルロン酸単独で形成された難水溶性のヒアルロン酸ゲルを含有する生体吸収性薬物担体を提供することができる。かかる本発明の生体吸収性薬物担体は、架橋剤等を使用していないため、安全性及び生体適合性に優れ、それ自体で、あるいは他の生体適合性物質と組み合わせて、注入、吸入、インプラント、及び経口投与等の薬物担体として利用でき、さらに、持続放出システムにも利用できる効果を奏する。