(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）に罹患すると予想される被験者からの体液のサンプルにおけるＴＳＥ、またはＴＳＥの可能性についての検出のための方法であって、
該サンプル中の心臓または脳の脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰ）の濃度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記被験者はヒトの患者であり、そしてＨ−ＦＡＢＰの濃度は第一のアッセイにおいて決定され、それによって、陽性の結果は、ＣＪＤまたは急性心筋梗塞のどちらかを示す、請求項１に記載の方法であって、
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）のみについて第二の検出アッセイを実行する工程であって、それによって、該Ｈ−ＦＡＢＰアッセイにおける陽性の結果、およびＡＭＩについての該アッセイにおける陰性の結果は、該患者がＣＪＤに罹患するか、または罹患し得ることを示す工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
ＡＭＩについての前記アッセイは、血漿中のトロポニン−１またはクレアチンキナーゼＭＢの濃度を決定する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｈ−ＦＡＢＰについての前記アッセイにおいて、Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体が使用される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記被験者は、ヒトの患者であり、そしてマウス抗ヒトＦＡＢＰモノクローナル抗体が使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｈ−ＦＡＢＰについての前記アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を包含する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
Ｂ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対する抗体と組合せたＡＭＩについてのアッセイを何ら行うことなくＢ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対する抗体が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｈ−ＦＡＢＰアッセイまたは前記Ｂ−ＦＡＢＰアッセイは、血漿または血清のサンプルについて実行される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明分野）
本発明は、タンパク質またはそれに対する抗体を使用する診断アッセイの分野にある。
【０００２】
（関連した技術の記述）
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）は中枢神経系の神経変性の疾患である。それらは、伝染され得、遺伝され得、または散発的に発生し得、および動物において、例えば、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）またはヒツジにおけるスクレイピー、ならびにヒトにおけるクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルトストマンシュトロイスラーシェインカー症候群、致死家族性不眠症またはクールーとして観察されている。それらは、長期の潜伏期間を有し、運動失調、痴呆、神経医学的障害および死をもたらす。神経病理学的変化としては、脳組織の空胞変性、大グリア細胞またはアミロイド斑の形成が挙げられる。これらの疾患は、死亡前に診断することが難しい。
【０００３】
ＣＪＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）は、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、２つのさらなるポリペプチドを示す[Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｇ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３１５，２７９（１９８６），Ｈｓｉｃｈ，Ｇ．，Ｋｅｎｎｅｙ，Ｋ．，Ｇｉｂｂｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｈ．，およびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｂ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３５，９２４（１９９６）]。これらの１４−３−３のポリペプチドの機能は、ＴＳＥにおいて不明確のままである。それらは、ＣＪＤの診断評価のために死亡前の試験において使用され得るが、低い特異性を有し得る。
【０００４】
プリオンタンパク質の異常型に対するモノクローナル抗体は、入手可能であり、そしてＰＣＴの明細書ＷＯ９８／２３９６２およびＷＯ９８／３２７１０ならびにＳｃｈｍｅｒｒ，Ｍ．Ｊ．，ｔｈｅ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐａｃｅ  Ｓｅｔｔｅｒ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ３（２）、１〜４（１９９９年６月）に記載されるように酵素結合免疫アッセイにおいて使用され得る。しかし、これらの手順はまだ充分に開発されていない。
【０００５】
新しい非進襲性血液のＣＪＤまたはＢＳＥのマーカーの開発は、医者が早期診断を確立するのを助ける。
【０００６】
（発明の要旨）
２つの脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）（心臓（Ｈ−ＦＡＢＰ）および脳（Ｂ−ＦＡＢＰ）として知られている）は、ＴＳＥについてのマーカーであることが今や、驚くべきことに見出された。従って、本発明は、ＴＳＥまたは罹患する予想される被験者から取られた体液のサンプルにおけるＴＳＥの可能性に関する診断アッセイを提供し、このアッセイは、サンプル中の心臓または脳の脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰ）の濃度を決定する工程を包含する。この方法は、ヒト患者におけるＣＪＤ、特に新しい改変体ＣＪＤの診断、およびウシのような反芻動物におけるＢＳＥに特に適用可能である。
【０００７】
好都合なことに、この方法は、Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対する抗体を使用して実行され、それによって、抗体とサンプル中のＦＡＢＰとの間の反応の程度は、アッセイされ、そしてサンプル中のＦＡＢＰの濃度に関連付けられる。このように、決定された濃度を用いて、診断を行うか、または診断を行うにおいて支援をする。
【０００８】
本発明は、ＣＪＴに関して高い感受性、特異性および予測精度のアッセイを可能とする。「感受性」は、臨床試験でＣＪＤが確認された患者から採取されたサンプルに対するアッセイによって与えられた真の陽性の割合と規定される。「特異性」はコントロールサンプル（すなわち、臨床試験ではＣＪＤが示されなかった患者からの）に対するアッセイによって与えられる真の陰性の割合を意味する。「予測精度」は、陽性の合計（真の陽性＋偽の陽性）に対する真の陽性を表した比率を意味する。
【０００９】
Ｈ−ＦＡＢＰは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の公知のマーカーである（Ｉｓｈｉｉ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｒｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ  ｖｓ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ−ｔｙｐｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｆａｔｔｙ−ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７；４３  １３７２〜１３７８を参照のこと）。従って、ヒトにおけるＣＪＤの診断のためのＨ−ＦＡＢＰについてのアッセイをより好都合に使用するために、ＣＪＤに関する診断からＡＭＩアッセイにおいて陽性の患者を取り除くために、ＡＭＩ（それのマーカーはＦＡＢＰでない）に関する別種のアッセイを実行することが望ましい。
【００１０】
従って、具体的な実施形態において、本発明は、上記に規定されたように第一アッセイにおいてＨ−ＦＡＢＰの濃度を決定する工程を包含する方法を提供し、それによって、陽性の結果はＣＪＤまたは急性心筋梗塞のどちらかを示す。そして、この方法は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）のみについて、第二診断アッセイを実行する工程をさらに包含し、それによって、Ｈ−ＦＡＢＰのアッセイにおける陽性の結果、およびＡＭＩについてのアッセイにおける陰性の結果は、この患者がＣＤＪに罹病し得ることを示す。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の初期の生化学的マーカーとしてトロポニン−Ｉおよびクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）を使用するアッセイは、周知であり、そして上記の目的に適切である。
【００１１】
類似のＨ−ＦＡＢＰおよびまた脳特異的脂肪酸結合タンパク質（Ｂ−ＦＡＢＰ）は、マウスの脳において見出される（Ｐｕ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８，６９〜７８（１９９９）を参照のこと）。脳のＨ−ＦＡＢＰ（Ｂ−ＦＡＢＰと混同すべきでない）は、１アミノ酸置換の分、心臓のＨ−ＦＡＢＰと異なると考えられる。しかし、Ｂ−ＦＡＢＰはかなり異なる。Ｓｅｌｌｎｅｒ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ」Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８９，３３〜４６（１９９５）は、ＤＮＡ相同性が６９％であると予測し、他方、Ａ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ−ｔｙｐｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．３６（５），２８３〜２８８（１９９８）は６４％のアミノ酸配列相同性としており、およびヒトＨ−ＦＡＢＰに対するモノクローナル抗体はたった１．７％の程度でヒトＢ−ＦＡＢＰと交差反応性であることを記載する。
【００１２】
本発明は、Ｈ−ＦＡＢＰがＣＪＤに関するマーカーであることを見出した今、Ｂ−ＦＡＢＰもまたそうであることは非常に合理的な予測である。Ｂ−ＦＡＢＰは、脳組織に対して特異的であり、そしてＨ−ＦＡＢＰに対するモノクローナル抗体と有意に反応しないようであることから、ＡＭＩに関して陽性を与えず、ＡＭＩに関して別々のアッセイを行うことが不必要となる。
【００１３】
（好ましい実施形態の説明）
アッセイの方法について、サンプルは、被験体の任意の好都合な体液から採取され得るが、好ましくは、血漿または血清（全血ではなく）から採取され得る。脳脊髄液（ＣＳＦ）は、特に、ウシのような動物を試験する場合、別の有用な液である。
【００１４】
その方法は、上記に参照されたこれらを包含するＴＳＥの全ての型、およびそれに罹患するまたは罹患すると予想される任意のヒトまたは動物に適用され得ると考えられる。特に、本発明は、新しい改変体、散発性および遺伝性（家族性）のものを包含するヒトにおける全ての型のＣＪＤに適用可能である。さらに、本発明は、ウシにおけるＢＳＥおよび他の動物（例えば、シカ）におけるＢＳＥ様の疾患にも適用可能である。
【００１５】
マーカーであるＨ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰは、好ましくはＨ−ＦＡＢＰに対する特異的抗体を使用し、そして抗原（Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰ）／抗体相互作用の程度を測定する免疫アッセイによって測定される。ヒトの患者の診断に関して、この抗体は、好ましくは抗ヒトＨ−ＦＡＢＰまたは抗ヒトＢ−ＦＡＢＰである。同様に、被験体が動物であったとき、この抗体は、好ましくは同じ動物の種類のＨ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対する抗Ｈ−ＦＡＢＰまたは抗Ｂ−ＦＡＢＰである（例えば、患者がウシのとき、抗ウシＨ−ＦＡＢＰまたは抗ウシＢ−ＦＡＢＰ）。しかし、それらは種間で抗体のいくらかの交差反応があり、頻繁に異種の抗体が使用され得る；例えば、抗ラット／マウスＨ−ＦＡＢＰは、ウシにおけるＢＳＥの検出に使用され得る。それはモノクローナル抗体（都合の良いことには、マウス）または操作された抗体があり得る。好ましくは、マウス抗ヒト、抗ウシなどのモノクローナル抗体が使用される。Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体は公知である（例えば、６６Ｅ２および６７Ｄ３は、Ｒｏｏｓ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ  ｔｙｐｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３  １４９〜１５３（１９９５）によって記載されている）。抗体６６Ｅ２は市販されている。また、通常のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ方法を使用して、Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰ抗体を惹起し得る。この目的のためのタンパク質の供給源は、天然に誘導されるか、または組換えＤＮＡ調製タンパク質であり得る。組換えヒトＨ−ＦＡＢＰおよびＢ−ＦＡＢＰは、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ａ．（前出）およびＳｈｉｍｉｚｕ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｂ−ＦＡＢＰ）」，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３５４，２４〜２８（１９９７）によってそれぞれ記載されている。あまり好ましくはないが、その抗体はポリクローナルであり得る。
【００１６】
任意の公知の免疫アッセイの方法が使われ得る。サンドイッチアッセイが好ましい。この方法において、ＦＡＢＰに対する第一の抗体は、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルのような固定相に結合され、そしてサンプルおよび検出されるべきＨ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰに対して特異的な、標識された第二の抗体とともにインキュベートされる。あるいは、抗体捕捉アッセイはここにおいて使用され得、試験サンプルは固定相に結合しておき、次いで抗ＦＡＢＰ抗体が添加され、そして結合され得る。結合していない材料を洗い流した後、固定相に結合した抗体の存在または量は、標識された第二の抗体（第一の抗体に対する抗ＦＡＢＰ）を使用して決定される。
【００１７】
別の実施形態において、競合アッセイは、そのサンプルと標識されたＦＡＢＰまたはＦＡＢＰに由来するペプチドとの間で実行され得、これらの２つの抗原は、固体支持体に結合される限定された量の抗ＦＡＢＰ抗体に対して競合する。標識されたＦＡＢＰまたはペプチドは、固定相で抗体とともにプレインキュベートされ得、それによって、サンプル中のＦＡＢＰは、抗体に対して結合されるＦＡＢＰまたはそのペプチドの一部に置き換わる。
【００１８】
さらに別の実施形態において、２つの抗原は、抗体と単一の共インキュベーションにおいて競合される。洗浄による支持体から結合していない抗原の除去後、その支持体に付着した標識の量が決定され、そしてサンプル中のタンパク質の量は、以前に確立された標準滴定曲線を参照することによって測定される。
【００１９】
標識は好ましくは酵素である。酵素のために基質は、色素形成性、蛍光性または化学発光性であり得る。
【００２０】
増幅されるアッセイの型を使用することは非常に好ましく、それによって、増強される「シグナル」は、相対的に低いレベル検出されるべきタンパク質から生成される。増幅される免疫アッセイの１つの特定の型は、増強された化学発光物質（ＥＬＣ）アッセイである。ここで、抗体は、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識され、西洋ワサビペルオキシダーゼは、ルミノール、ペルオキシダーゼ基質、ならびに放射光の強度および期間を増強する化合物（代表的には４−ヨードフェノールまたは４−ヒドロキシ桂皮酸）との化学発光反応に関与する。
【００２１】
別の好ましい増幅された免疫アッセイの型は免疫ＰＣＲである。この技術において、抗体は、ＰＣＲプライマーを包含する任意のＤＮＡの分子に共有結合的に結合され、それによって、任意のＤＮＡに付着した抗体をともなうＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅される（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３，５２２−５２９（１９９５）およびＳａｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」ｅｄ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍａｙｅｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．（１９９５），ｐａｇｅｓ  ４５８〜４６０を参照のこと）。そのシグナルは、前に記載されるように読み出される。
【００２２】
特に好ましい手段において、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、血清中のＨ−ＦＡＢＰを検出するように開発された。Ｈ−ＦＢＡＰはまたＡＭＩについてのマーカーでもあることから、トロポニン−ＩまたはＣＫ−ＭＢのレベルをアッセイして、任意の心臓障害を除いた。実施例において記載されるように、これらのアッセイは、系列的な血漿およびＣＳＦのサンプル（ＡＭＩおよびＣＪＤを欠く患者、ＡＭＩをともなう患者、痴呆をともなう患者および検死解剖を経て確認されたＣＳＦをともなう患者からの）において評価された。適切なカットオフのレベルを超えたＣＪＤにおいてＨ−ＦＡＢＰに関する感受性、特異性および予測精度は全て１００％であった。従って、トロポニン−ＩまたはＣＫ−ＭＢと結合されるＨ−ＦＡＢＰの検出アッセイは、ＣＪＤの診断または脳障害の有用な血清マーカーを提供する。
【００２３】
ＡＭＩの症例におけるＨ−ＦＢＡＰについて開発された敏速な微粒子増強濁度免疫アッセイの使用（Ｒｏｂｅｒｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４，１５６４〜１５６７（１９９８））はアッセイの時間を大幅に減少させた。従って、広く使用されている臨床試験の分析機器（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅからの「ＣＯＢＡＳ」ＭＩＲＡ  ＰｌｕｓシステムまたはＡｂｂｏｔｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの「ＡｘＳＹＭ」システム）における完全自動化は可能であり、そしてＣＪＤの慣用の臨床診断のために適用される。
【００２４】
Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰは、免疫アッセイ以外の手段によって測定され得る。例えば、サンプルは、１または２次元ゲル電気泳動に供され得、そしてＦＡＢＰの量は、ゲルまたはゲルからのブロットの濃度測定スクリーニングによって見積られ得る。
【００２５】
本発明のアッセイは、ＴＳＥについての１以上の他の死亡前のアッセイと一緒に使用され得、このアッセイは上記に記載された具体的なこれらのアッセイを包含する。そのように組み合わせた手順は、ウシのような反芻動物におけるＢＳＥを診断することにおいて特に有用である。
【００２６】
以下の実施例は本発明を例証する。
【００２７】
（実施例１)
（材料および方法）
（患者）
本研究の集団は、年齢および性別を適合させたコントロールの３人の患者（コントロール群）、３人の確認されたＡＭＩの患者（ＡＭＩ群）、３人の確認された痴呆の患者群（痴呆群）、および３人の確認されたＣＪＤの患者（ＣＪＤ群）からなった。コントロール群は、２人の男性、４６−８６歳の範囲で平均６６歳、および１人の女性、６３歳を含んだ。ＡＭＩ群は、２人の男性、４０−９０歳の範囲で平均６５歳、および１人の女性、７２歳を含んだ。痴呆群は、２人の男性、４３−８７歳の範囲で平均６５歳、および１人の女性、６４歳を含んだ。ＣＪＤ群は、２人の男性、６２−７４歳の範囲で平均６８歳、および１人の女性で、６５歳を含んだ。血液およびＣＳＦのサンプルを、それぞれのＣＪＤの患者について収集した。血液サンプルを、乾燥へパリン含有の試験管中に収集した。４℃で１５分間、１５００ｇで遠心分離した後、試験管を、分析まで−２０℃で保存した。ＣＪＤ群からの患者に、ＣＪＤの診断を確認するために神経科医による連続的な臨床評価を受けさせた。確認されたＡＭＩ（トロポニン−Ｉ濃度は２ｎｇ／ｍｌを超える）を伴うＡＭＩ群からの患者を病院に入院させた。臨床評価を、コントロール群からの全ての患者について実行して、ＣＪＤおよびＡＭＩを除外した。
【００２８】
（脳および心臓のＨ−ＦＡＢＰの測定）
Ｈ−ＦＡＢＰのレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によって血漿中で測定した。９６ウェルのポリスチレンマイクロプレート（ＮＵＮＣ）を、炭酸緩衝液０．１Ｍ  ｐＨ９．６中で全てのアイソフォームを検出する１００μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＦＡＢＰ（Ｓｐｅｃｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ＨＣ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＵＳＡ）（２０μｇ／ｍｌ）を用いて４℃で一晩被覆した。プレートを、ＢｉｏＲａｄ  ＮＯＶＡＰＡＴＨＴＭ洗浄器上でＰＢＳ（１５ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４−１２０ｍＭ  ＮａＣｌ−２．７ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ７．４，Ｓｉｇｍａ）で自動的に洗浄した。全ての洗浄工程を、新鮮なＰＢＳを用いて実行した。非特異的結合部位を、３７℃で２時間、２００μｌ／ウェルの炭酸緩衝液中の２％カゼインでブロックした。洗浄工程の後、このサンプルを、１００μｌ／ウェルでニ連でピペッティングした。このプレートは３７℃で２時間インキュベートされた。洗浄工程の後、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中の、１００μｌ／ウェルのマウス抗ヒト心臓ＦＡＢＰ（クローン６６Ｅ２、ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＢＶ，Ｕｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（０．３μｇ／ｍｌ）を振とうしながら、室温（Ｒ．Ｔ）で１時間インキュベートした。洗浄工程の後、ＰＢＳ中の、１００μｌ／ウェルの、アルカリホスファターゼで標識された抗マウスイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）（１．５ｍｇ／ｍｌ）は振とうしながら室温で１時間３０分インキュベートした。洗浄工程の後、ジエタノールアミン中の、５０μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ基質（すなわち１．５ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルホスファターゼ）を添加し、次いでこのサンプルを、３０分間インキュベートした。この反応を、１００μｌ／ウェルの１Ｍ  ＮａＯＨで停止した。発色現像を、４０５ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【００２９】
緩衝液中の「ブランク」アッセイもまた実行した。
【００３０】
（ＣＫ−ＭＢおよびトロポニン−Ｉ測定）
ＡＭＩを、臨床評価ならびにトロポニン−ＩおよびＣＫ−ＭＢの測定によって診断した。サンプルを、１５分間１５００ｇで遠心分離し、そして−２０℃で保存した。血清ＣＫ−ＭＢおよびトロポニン−Ｉのレベルを、自動化された分析化学機器「ＡｘＳＹＭ」システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて蛍光マイクロ粒子酵素免疫アッセイ（ＭＥＩＡ）を使用して検出した。蛍光産物の形成の比率は、サンプル中のトロポニン−Ｉの量に正比例した。トロポニン−Ｉに関する検出限界は、０．３μｇ／ｌであった。ＣＫ−ＭＢ測定は、蛍光プローブの量に比例的であり、そして検出限界は０．７μｇ／ｌであった。
【００３１】
（統計学的分析）
Ｈ−ＦＡＢＰのレベルを、平均の±ＳＤとして、または中央値および４分位値間の範囲としてのどちらかで光学密度測定（ＯＤ）値で表示した。トロポニン−ＩおよびＣＫ−ＭＢのレベルを、濃度の単位（ｎｇ／ｍｌ）で表現した。非パラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定、およびＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｈ検定を用いて、複数の群間の血漿におけるＨ−ＦＡＢＰ、トロポニン−ＩおよびＣＫ−ＭＢの濃度と比較した。「ＰＲＩＳＭ」ソフトウェアを用いて、ｂｏｘ／ｗｈｉｓｋｅｒおよび散布図を生成した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）「ＥＸＣＥＬ」のための「Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ」ソフトウェアによって規定された９５％の信頼区間（ＣＩ）および受信者動作持性（ＲＯＣ）曲線を用いて、その指示が識別可能な時点を評価した（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｓ」Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４４，５５０−５５５（１９８７）を参照のこと）。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとみなした。
【００３２】
（結果）
（臨床的特徴）
ＣＪＤ群からの患者に、完全な臨床評価を与えた。ＣＪＤを、検死解剖後に脳の免疫組織学の助力で最終的に診断した。コントロール群からの患者を、病院に入院させ、そしてＣＪＤおよびＡＭＩを、臨床評価によって除外した。
【００３３】
高いトロポニン−Ｉのレベル（＞２ｎｇ／ｍｌ）が確認された、ＡＭＩを伴うＡＭＩ群からの患者を病院に入院させた。
【００３４】
アッセイの結果を、以下の表１において示す。
【００３５】
【表１】
0004575635.tif 000002
ＡＭＩ群におけるＨ−ＦＡＢＰの血漿のレベル（ＯＤ測定値）は、コントロール群におけるそれぞれのレベルより有意に高かった（表２）。ＡＭＩ群は、２．８９（２．７０−３．０）の中央値レベル（２５−２７％の範囲）のＨ−ＦＡＢＰを有し、他方、コントロール群は０．２５（０．２３−０．２７）のレベルを有した。ＣＪＤ群におけるＨ−ＦＡＢＰの血漿のレベルは、ＡＭＩ群の傾斜とコントロール群の傾斜との間であった。血漿ＣＪＤ群におけるＨ−ＦＡＢＰの中央値（２５−２７％の範囲）レベルは０．７９（０．７４−０．８６）であった。０．３０カットオフ値を超えたＨ−ＦＡＢＰレベルの感受性、特異性および予測精度は、それぞれ１００％、１００％および１００％であった。ＡＭＩ群とコントロール群との間のＨ−ＦＡＢＰ濃度の相違を確認するために、トロポニン−Ｉをアッセイした。さらに、ＡＭＩおよびＣＪＤを識別するために、２つのアッセイを、ＣＪＤサンプルについても行った。トロポニン−Ｉの濃度を、それぞれの群において測定した。ＡＭＩ群におけるトロポニン−Ｉの濃度は、コントロール群における濃度より有意に（Ｐ＞０．０１）高かった。
【００３６】
（考察）
上記の結果は、Ｈ−ＦＡＢＰがＣＪＤについての陽性マーカーであることを示す。Ｈ−ＦＡＢＰは、数年前、急性心筋梗塞のマーカーとして提唱していたことから、ＣＪＤおよびＡＭＩは、トロポニン−ＩおよびＣＫ−ＭＢのような別のＡＭＩの生化学的なマーカーによって識別されなければならなかった。ＣＪＤに関するＡＭＩの識別後、血清およびＣＳＦ  Ｈ−ＦＡＢＰの濃度は、ＣＪＤの特異的マーカーとして使用され得た。
【００３７】
本研究において、Ｈ−ＦＡＢＰのアッセイは、１００％の感受性、特異性および予測精度（ＯＤ応答＞０．３０）を可能とした。これらの値は、ＣＪＤの死亡前の検出の別の方法（タンパク質１４−３−３（ダイマーのホスホセリン結合タンパク質）を利用する）において得られた値より有意に高い。この方法は、抗１４−３−３抗体タンパク質を用いてイムノブロッティングする工程を包含する。３人の痴呆患者は、抗１４−３−３イムノブロッティングに対して陽性であった。１４−３−３の特異性は、ＣＪＤに限定されず、これらはまた、アルツハイマー痴呆症、頭部の損傷からの大脳合併症、およびいくつかの他の痴呆の形状を会合する。
【００３８】
急性心筋梗塞は、心臓のトロポニン−Ｉ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビンおよび最近ではＨ−ＦＡＢＰアッセイのような生化学的マーカーのアッセイの助力で診断される。ＣＪＤに関するＨ−ＦＡＢＰのレベルは、ＡＭＩで干渉され、そしてＡＭＩとＣＪＤとの間の識別を、他のＡＭＩマーカーの使用により行った。
【００３９】
（実施例２）
血漿またはＣＳＦのサンプルを、ヒトの患者から摂取した。患者が罹患していた疾患は、検死解剖によって決定されるようにいくつかの場合において、散発的（ＳＰ）または新しい改変型（Ｖ）であれ、明確にＣＪＤのどちらかであった。他の症例（「ＣＪＤではないかもしれない」）において、患者を、ＣＪＤを有しないとして診断したが、これらの患者のいく人かはまだ生存しているので、これを検死解剖によって確認する必要性はない。サンプルを、抗１４−３−３の先行技術の方法、および本発明によってＣＪＤに関してアッセイした。
【００４０】
抗１４−３−３のイムノブロットを、Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ−グリシン緩衝液中の１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でサンプルを流すことによって実行した。その後、タンパク質を、ＣＡＰＳ緩衝液中でＰＶＤＦメンブレン上に、３時間、一定の２００ｍＡでセミドライのエレクトロブロッティングによって移した。そのメンブレンをブロッキングし、抗１４−３−３のポリクローナルウサギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｉｎｃ．（Ｃａｔ  ｓｃ  ６２９，Ｌｏｔ  Ｌ１１７））とともにインキュベートし、緩衝液で洗浄し、そして第二の抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されるヤギ抗ウサギイムノグロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ））でインキュベートした。次いで、このメンブレンを再度洗浄した。それぞれのインキュベーション後の洗浄工程を、５％の「Ｔｗｅｅｎ」を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で素早く３回、および各回につき５分間で５回行った。次いでペルオキシダーゼを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍキット「ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）」を使用し、標準的な増幅された化学発光法でアッセイした。観察された発光物質は、イムノブロッティングにおける陽性の結果を表示した。
【００４１】
本発明の方法は、適用される感受性カットオフ（ＲＯＣ曲線を使用して）が、血漿のサンプルに関してＯＤ＞０．２、およびＣＳＦのサンプルに関してＯＤ＞０．１であったことを除き、実施例１において記載したとおりであった。表２は結果を示す。
【００４２】
表２を参照して、抗１４−３−３試験を、本発明者の研究室における異なる操作によって、２回実行し、同じ結果を生じた。抗１４−３−３の結果と抗Ｈ−ＦＡＢＰの結果との間の相関の結果は、その結果がなかったサンプルＣＳＦ−１０を除き、ほぼ１００％であった。血漿のサンプルは、抗１４−３−３の試験で陰性を与えたうち、４つの場合において抗Ｈ−ＦＡＢＰを用いて陽性を与えた。このことは、抗１４−３−３の試験は、全ての場合において真の結果を与えているとはいえないことを意味し得る。
【００４３】
【表２】
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＊異なる研究者によって、２回行われ、同一の結果を得た。
【００４４】
（実施例３）
本発明の方法を、ＢＳＥを有すると診断された４頭のウシ、およびコントロールとして３頭の健全なウシからのプールし、濃縮したＣＳＦのサンプルについて実行した（そのサンプルは、シグナルをバックグラウンドの比率まで増加させるため、「Ｍｉｃｒｏｃｏｎ」（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した）。
【００４５】
ラット／マウスＨ−ＦＡＢＰのＥＬＩＳＡキット（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂ．Ｖ．，Ｕｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、製造業者の取扱説明書（実施例１において記載したサンドイッチＥＬＩＳＡ法に原則的に類似しているアッセイ）に従って使用した。しかし、ウェルに結合した第一の抗体は、抗ヒトＨ−ＦＡＢＰではなくて抗ラット／マウスＨ−ＦＡＢＰであり、そして第二の抗体は、抗ラット／マウスを標識したペルオキシダーゼであった（これらの抗体は、ラットおよびマウスの両方に対して抗ラット／マウスであるように見える。このキットは、ウシのＨ−ＦＡＢＰを検出することを目的としないことを説明すべきである。抗ラット／マウスＨ−ＦＡＢＰ抗体が、ウシのＨ−ＦＡＢＰを認識することは、本発明において予想外に見い出された）。そのアッセイは、ＳＭＰ基質を使用し、そして４５０ｎｍでの読み取り値を用いて比色分析する。
【００４６】
表３で示された結果は、再現アッセイの平均であり、そして健全なウシと比較してＢＳＥに冒されたウシに関して観察された相違を明確に示唆した。
【００４７】
【表３】
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それぞれ上記の引用された刊行物は、本明細書中において、その刊行物の各々が本明細書中において依拠する程度で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図は、（ａ）ＣＪＤもＡＭＩも、どちらも有しないコントロール群（ｂ）ＡＭＩを有する群、および（ｃ）ＣＪＤを有する群に関して、本発明の方法によって決定されたように、４０５ｎｍの光学密度測定によって表されたＨ−ＦＡＢＰの濃度のｙ軸上でのグラフ表示である。
【図１】
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