(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオグロビン、アジ化水素酸のアルカリ金属塩、チオシアン酸のアルカリ金属塩及び水を含有してなり、ｐＨが７．０〜８．５であることを特徴とする免疫測定法によるミオグロビンの含有量測定に用いる標準液用のミオグロビン含有水溶液。
【請求項２】
ミオグロビン含有水溶液の重量を基準として、前記ミオグロビンの濃度が１〜５０００ｎｇ／ｇ、前記アジ化水素酸のアルカリ金属塩の濃度が０．０１〜０．１重量％、前記チオシアン酸のアルカリ金属塩の濃度が０．１〜１重量％である請求項１記載のミオグロビン含有水溶液。
【請求項３】
更に、ヘモグロビン及び／又はｐＨが７．５〜８．０の間に緩衝能を有する緩衝剤を含有する請求項１又は２記載のミオグロビン含有水溶液。
【請求項４】
ミオグロビン含有水溶液の重量を基準とする前記ヘモグロビンの含有量が１〜５０μｇ／ｇであり、ミオグロビン含有水溶液の体積を基準とする前記緩衝剤の含有量が１〜１００ｍＭである請求項３記載のミオグロビン含有水溶液。
【請求項５】
前記緩衝剤が、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸である請求項３又は４記載のミオグロビン含有水溶液。
【請求項６】
更に、タンパク質保護剤及び／又は塩化ナトリウムを含有する請求項１〜５のいずれか記載のミオグロビン含有水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はミオグロビンを含有する水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオグロビンは、動物の骨格筋組織中に存在するヘムタンパク質で酸素を貯蔵する役割を担っている。ヒトミオグロビンは、分子量約１７５００を持ち、１５３アミノ酸残基で構成される、１本のペプチド鎖に１つのヘム分子を付加した構造を有する。心筋梗塞のような筋肉組織の損傷が生じると、数時間の内に血中や尿中のミオグロビン濃度が顕著に上昇する。近年では、筋肉組織の損傷に伴うミオグロビン濃度の上昇が腎障害をもたらすことも指摘されている。
従ってミオグロビン濃度を高い精度で測定することは、心臓疾患や腎疾患を診断する上で極めて重要な意義がある。
【０００３】
免疫測定を行う際には、抗原を含有した標準液をキャリブレーターとして用いるのが一般的である。しかし、ミオグロビン標準水溶液は、保存温度等の保存条件によって変性が促進されたり、分解してしまうことも多い。このような変性・分解の結果、ミオグロビンの立体構造が破壊されて抗原性の低下を招くことになる。このため、免疫学的なミオグロビンの測定方法において、ミオグロビン標準水溶液に含まれるミオグロビンの変性・分解は誤った診断結果を生ずる原因となる。
【０００４】
抗原性の低下を防止する方法として、標準水溶液を凍結乾燥などの方法で水分を除去した形態で保存し、使用時に水を加えてこの固体を溶解し標準水溶液とする方法や、凍結保存する方法、牛血清アルブミンや動物血清などのタンパク質やグリセロールを添加して水溶液中での安定性を確保する方法などがとられている（非特許文献１及び２）。
しかし、従来の凍結乾燥による方法では、保存安定性は良いが使用時に水を加えなければならないため操作が煩雑となり、結果として標準液中の抗原濃度に誤差を生じやすい。また、凍結保存する方法では繰り返しの凍結融解操作によって抗原性が低下したり、融解状態によって測定値にバラツキが生ずる可能性がある。更に、牛血清アルブミンや動物血清などのタンパク質やグリセロールを添加しても、室温での液状保存では十分な安定性を保つことができない。
【非特許文献１】佐々木  實著、「免疫化学的同定法（第３版）」、東京化学同人、                    １９９３年、ｐ８２−ｐ９８
【非特許文献２】石川榮治著、「超高感度酵素免疫測定法」、学会出版センター、                    １９９３年、ｐ１３１−ｐ１７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、凍結乾燥等による操作の煩雑さが解消されると共に測定値のバラツキの少なく、室温での液状保存安定性に優れるミオグロビン含有水溶液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、ミオグロビン、アジ化水素酸のアルカリ金属塩、チオシアン酸のアルカリ金属塩及び水を含有してなり、ｐＨが７．０〜８．５であることを特徴とする免疫測定法によるミオグロビンの含有量測定に用いる標準液用のミオグロビン含有水溶液である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の抗原含有水溶液は以下の効果を奏する。
（１）ミオグロビン含有水溶液を、溶液状態で長期間安定して保存することができる。
（２）従来行われた凍結乾燥や凍結保存しなくとも安定性を長期間維持できるようになり、抗原を溶解するという煩雑な調製操作により生じる濃度の誤差や、融解状態の違いによる測定値のバラツキを生ずることなく、測定精度と再現性が良い免疫測定ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明におけるミオグロビンは、約１７５００の分子量を持ち、１５３アミノ酸残基で構成される、１本のペプチド鎖に１つのヘム分子を付加した構造を有する。
本発明に使用するミオグロビンの由来には特に限定が無く、組織より抽出された天然物以外にも、遺伝子組み換え物や化学合成物を使用することが出来る。
ミオグロビンは、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社やＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社等より市販されている。
【０００９】
本発明におけるアジ化水素酸のアルカリ金属塩としては、アジ化リチウム、アジ化ナトリウム及びアジ化カリウム等が挙げられる。これらの内、ミオグロビンの安定性の観点から好ましいのは、アジ化ナトリウムである。
【００１０】
本発明におけるチオシアン酸のアルカリ金属塩としては、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸ナトリウム及びチオシアン酸カリウム等が挙げられる。これらの内、ミオグロビンの安定性の観点から好ましいのは、チオシアン酸ナトリウムである。
【００１１】
本発明における水は、特に限定されないが、ミオグロビンの安定性の観点から、イオン交換水を用いることが好ましい。
【００１２】
本発明のミオオグロビン含有水溶液は、ヘモグロビンを含有することにより、ミオグロビンの安定性が更に向上する。
【００１３】
本発明におけるヘモグロビンは、特に制限されないが、ミオグロビンの安定性の観点から、哺乳動物の血液より分離精製されたものが好ましく、その具体例としては、ヒト、牛、馬、羊、ヤギ、ウサギ及びブタからなる群から選択される少なくとも１種の哺乳動物の血液から分離精製されたものが挙げられる。
【００１４】
本発明のミオグロビン含有水溶液のｐＨは、ミオグロビンの保存安定性を向上させる観点から、７．５〜８．０が好ましく、更に好ましくは７．７〜７．９である。尚、ｐＨは、ＪＩＳ  Ｋ０４００−１２−１０：２０００に記載の方法で測定できる（測定温度２５℃）。
【００１５】
本発明のミオグロビン含有水溶液のｐＨを上記の好ましい範囲に調整するために、無機アルカリ（水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウム等）又は無機酸（塩酸等）を用いることもできるが、ｐＨを一定に保つ観点から、ｐＨ７．５〜８．０の間に緩衝能を有する緩衝剤を使用することが好ましい。
【００１６】
ｐＨ７．５〜８．０の間に緩衝能をもつ緩衝剤としては、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）２水和物（ＰＯＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸１水和物（ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）及びＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等が挙げられる。これらの内、水溶液中のミオグロビンの安定性の観点から、ＨＥＰＥＳが好ましい。
緩衝剤は２種以上を併用してもよいが、ミオグロビンの安定性の観点から、１種を使用することが好ましい。
【００１７】
ミオグロビン含有水溶液のｐＨを、更に好ましい範囲である７．７〜７．９に調整する方法としては、前記のｐＨが７．５〜８．０の間に緩衝能を有する緩衝剤を添加した後、更に無機アルカリ（水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウム等）又は無機酸（塩酸等）を添加してｐＨを調整する方法が好ましい。
【００１８】
本発明のミオグロビン含有水溶液は、公知のタンパク質保護剤を含有することにより、ミオグロビンの安定化効果がより一層高まる。
タンパク質保護剤としては、アルブミンやゼラチンに代表される不活性タンパク質等が挙げられる。
【００１９】
アルブミンは、任意のものを使用することができるが、ミオグロビンの安定性の観点から、特に動物の血清や卵白に由来するアルブミンが好ましく、その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ及びこれらの動物の幼獣又は胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられる。このアルブミンには、上記したもの以外にその酵素分解物も知られているが、本発明におけるアルブミンには、このようなアルブミンの酵素分解物等、アルブミンから誘導される蛋白質も含まれる。
【００２０】
本発明のミオグロビン含有水溶液は、塩化ナトリウムを含有することにより、ミオグロビンの安定化効果がより一層高まる。
【００２１】
本発明におけるミオグロビンの濃度（ｎｇ／ｇ）は、任意の濃度に設定することが出来るが、血液中のミオグロビンを定量する際に必要な濃度域の観点から、ミオグロビン含有水溶液の重量を基準として、１〜５０００が好ましい。
【００２２】
アジ化水素酸のアルカリ金属塩の濃度（重量％）は、ミオグロビンの安定性及び防腐剤としての適正な使用量の観点から、ミオグロビン含有水溶液の重量を基準として、０．０１〜０．１が好ましく、更に好ましくは０．０５〜０．１、特に好ましくは０．０７〜０．０９である。
【００２３】
チオシアン酸のアルカリ金属塩の濃度（重量％）は、ミオグロビンの安定性の観点から、ミオグロビン含有水溶液の重量を基準として、０．１〜１が好ましく、更に好ましくは０．２５〜０．７５であり、特に好ましくは０．４〜０．６である。
【００２４】
本発明のミオグロビン含有水溶液がヘモグロビンを含有する場合、その濃度（μｇ／ｇ）は、ミオグロビンの安定性の観点から、ミオグロビン含有水溶液の重量を基準として、１〜５０が好ましく、更に好ましくは１０〜４０、特に好ましくは２０〜３０である。
【００２５】
本発明のミオグロビン含有水溶液が、ｐＨが７．５〜８．０の間に緩衝能を有する緩衝剤を含有する場合、その濃度（ｍＭ）は、ミオグロビンの安定性の観点から、ミオグロビン含有水溶液の体積を基準として、１〜１００が好ましく、更に好ましくは２５〜７５、特に好ましくは、４０〜６０である。
【００２６】
本発明のミオグロビン含有水溶液がタンパク質保護剤を含有する場合、その濃度（重量％）はミオグロビンの安定性の観点から、ミオグロビン含有水溶液の重量を基準として、０．１〜３が好ましく、更に好ましくは０．５〜１．５、特に好ましくは０．８〜１．２である。
【００２７】
本発明のミオグロビン含有水溶液が塩化ナトリウムを含有する場合、その濃度（重量％）は、ミオグロビンの安定性の観点から、ミオグロビン含有水溶液の重量を基準として、０．１〜２が好ましく、更に好ましくは０．５〜１、特に好ましくは０．８〜０．９である。
【００２８】
本発明のミオグロビン含有水溶液は、水、ミオグロビン、アジ化水素酸のアルカリ金属塩、チオシアン酸のアルカリ金属塩並びに必要によりヘモグロビン、緩衝剤、タンパク質保護剤及び塩化ナトリウムを混合することで得られる。
混合方法としては、従来のミオグロビン含有水溶液を製造する際と同様の方法でよい。
本発明のミオグロビン含有水溶液の製造において、混合の順序は、製造のし易さや、製造時におけるミオグロビンの失活防止の観点から、水（又は、必要により緩衝剤と混合した緩衝液）に、タンパク質保護剤及び塩化ナトリウムを必要に応じて添加混合して溶解させ、次いでアジ化水素酸のアルカリ金属塩、チオシアン酸のアルカリ金属塩及び必要によりヘモグロビンを添加混合し、次いでミオグロビンを添加混合する方法が好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１〜２０及び比較例１〜２＞
（ａ）抗原含有水溶液の調製
表１に記載の各成分を、表１に記載の濃度となるようにイオン交換水に溶解して実施例１〜２０及び比較例１〜２のミオグロビン含有溶液を調製した。
具体的には、イオン交換水又は必要により２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）とイオン交換水とを混合した緩衝液に、アルブミン及び塩化ナトリウムを必要に応じて添加混合して溶解させ、次いでアジ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム及び必要によりヘモグロビンを添加混合し、均一溶解を確認後、ミオグロビンを添加混合した。
更に、実施例１、３〜６、１７及び比較例１のミオグロビン含有水溶液については水酸化ナトリウムを用いて、また、実施例１８のミオグロビン含有水溶液については塩酸を用いて、ｐＨを表１に記載の値に調整した。
（ｂ）保存安定性の評価
調製した各ミオグロビン含有水溶液を４℃及び４０℃で保存し、作製時、３日目、７日目及び１４日目のミオグロビン濃度を測定し、濃度の変化を調べた。結果を表２に示す。
ミオグロビンの濃度は、全自動化学発光免疫測定装置［スフィアライト（登録商標）１８０、オリンパス株式会社製］により発光量を測定し、検量線から求めた。検量線は４℃で冷蔵保存しておいたミオグロビンを使用し、測定日毎に作製した。
【００３０】
【表１】
0004593665.tif 000002
【００３１】
【表２】
0004593665.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明のミオグロビン含有水溶液は、溶液状態で長期間安定して保存することができるため、従来行われた凍結乾燥や凍結保存を行う必要がなく、抗原を溶解するという煩雑な調製操作により生じる濃度の誤差や、融解状態の違いによる測定値のバラツキを生ずることなく、測定精度と再現性が良い免疫測定ができる。
よって、本発明のミオグロビン含有水溶液は、臨床検査の分野において酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、或いは免疫比濁法等の免疫測定を行う時に用いることができる。特に、抗原を含有した溶液中の抗原の失活を防止し、安定して保存することができることから、標準液として好適に使用できる。